/
Author: Murray R.K. Granner D.K. Rodwell V.W.
Tags: biologia chemia nauki biologiczne nauki przyrodnicze biochemia
ISBN: 978-83-200-3573-5
Year: 2008
Text
h:
BIOCHEMIA
HARPERA
ilustrowana
Redakcja naukowa ttumaczenia
Franciszek Kokot, Aleksander Koj
Andrzej Kozik, Tadeusz Wilczok
WYDAWNICTWO
LEKARSKIE PZWL
BIOCHEMIA
HARPERA
ilustrowana
Robert K. Murray
Daryl K. Granner
Yictor W. Rodwell
HARPERA
ilustrowana
Wydanie VI uaktualnione
Redakcja naukowa tłumaczenia
prof. dr hab. Franciszek Kokot
prof. dr hab. Aleksander Koj
prof. dr hab. Andrzej Kozik
prof. dr hab. Tadeusz Wilczok
WARSZAWA
WYDAWNICTWO LEKARSKIE PZWL
Tytuł oryginału: HARPER’S ILLUSTRATED BIOCHEMISTRY, Twenty-Seventh Edition
The McGraw-Hill Companies, Inc., New York
Copyright © 2006 by The McGraw-Hill Companies, Inc. Ali rights reserved.
Previous edition copyright © 2003 by The McGraw-Hill Companies, Inc.; 2000, 1996, 1993, 1990 by Appleton & Lange;
copyright © 1988 by Lange Medical Publications.
Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1994, 1998, 2002, 2008
Zdjęcia na okładkę: Agencja Fotograficzna EAST NEWS
Wszystkie prawa zastrzeżone.
Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości lub części książki
bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.
Podręcznik akademicki dotowany przez Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego.
Tłumacze:
Prof. dr hab. ZENON ALEKSANDROWICZ (rozdz. 11-18)
Prof. dr hab. MIECZYSŁAW CHORĄŻY (rozdz. 32-39)
Prof. dr hab. ZOFIA KILIAŃSKA (rozdz. 2, 3)
WO -CDI
Prof. dr hab. LEOKADIA KŁYSZEJKO-STEFANOWICZ (rozdz. 1, 4, 5, 29, 30)
Prof. dr hab. FRANCISZEK KOKOT (Przedmowa, rozdz. 41-44, 52, Dodatek)
Prof. dr hab. WANDA M. KRAJEWSKA (rozdz. 6, 9, 31)
Prof. dr hab. EUGENIUSZ J. KUCHARZ (rozdz. 46, 47, 49-51)
Dr hab. ANDRZEJ LEWANDOW1CZ (rozdz. 1,4, 5, 29, 30)
Prof. dr hab. BOGDAN LEWARTOWSKI (rozdz. 48)
Prof. dr hab. ANNA LIPIŃSKA (rozdz. 7, 8, 27, 28)
Dr med. ALEKSANDER SOCHANIK (rozdz. 32-39)
Dr MAGDALENA TKACZ (rozdz. 10, 40, 45)
Prof. dr hab. LUDMIŁA WĘGLARZ (rozdz. 10, 40, 45)
Dr hab. ADAM WILCZOK (rozdz. 10, 40, 45)
Prof. dr hab. TADEUSZ WILCZOK (rozdz. 10, 40, 45)
Prof. dr hab. MARIUSZ M. ŻYDOWO (rozdz. 19-26)
Redaktor ds. publikacji medycznych: Anna Plewa
Redaktor merytoryczny: Małgorzata Wiśniewska
Redaktor techniczny: Jan Grzegorz Janowski
Korekta: Krzysztof Nalepa
Projekt okładki i stron tytułowych: Maria Sosnowska
Autorzy, Tłumacze i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były
zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych
i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi
brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we
wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza
w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.
ISBN 978-83-200-3573-5
Wydanie VI uaktualnione
Nakład 2400 egz.
Objętość 75,0 ark. wyd.
Wydawnictwo Lekarskie PZWL
00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10
tel. +48(0-22) 695-40-33
Księgarnia wysyłkowa:
tel. +48(0-22) 695-44-80,
infolinia: 0-801-142-080
www.pzwl.pl
e-mail: promocja@pzwl.pl
Skład i łamanie: „Polico-Art”, Warszawa, ul. Borowskiego 2
Druk i oprawa: Drukarnia Naukowo-Techniczna, Warszawa
%ot k
Spis treści
Biblioteka Główna
Akademii Medycznej w Gdańsku
4QO/OOS-Cz y-fc .
001-007341—002
Przedmowa do wydania polskiego VII
Przedmowa VIII
1. Biochemia a medycyna 1
2. Woda i pH 6
CZEŚĆ I. BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
3. Aminokwasy i peptydy 17
4. Białka: określanie struktury pierwszorzędowej 26
5. Białka: struktura wyższych rzędów 38
6. Białka: mioglobina i hemoglobina 53
7. Enzymy: mechanizm działania 63
8. Enzymy: kinetyka 77
9. Enzymy: regulacja aktywności 91
10. Bioinformatyka i biologia obliczeniowa 102
CZĘŚĆ II. BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
11. Bioenergetyka: rola ATP 111
12. Utlenianie biologiczne 118
13. Łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna 125
14. Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym 139
15. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym 149
16. Przemiany metaboliczne i zaopatrzenie w „paliwo” metaboliczne 162
17. Cykl kwasu cytrynowego: katabolizm acetylo-CoA 178
18. Glikoliza i utlenianie pirogronianu 185
19. Metabolizm glikogenu 195
20. Glukoneogeneza i kontrola stężenia glukozy we krwi 205
21. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz 217
22. Utlenianie kwasów tłuszczowych: ketogeneza 229
23. Biosynteza kwasów tłuszczowych i ikozanoidów 241
24. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów 257
25. Transport i magazynowanie lipidów 266
26. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu 282
VI SPIS TREŚCI
CZEŚĆ III. METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
27. Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w pożywieniu 295
28. Katabolizm białek i azotu aminokwasów 301
29. Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów 311
30. Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty 328
31. Porfiryny i barwniki żółciowe 337
CZĘŚĆ IV. BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
32. Nukleotydy 354
33. Metabolizm nukleotydów purynowych i pirymidynowych 362
34. Struktura i funkcja kwasów nukleinowych 374
35. Organizacja, replikacja i naprawa DNA 387
36. Synteza, przekształcanie i metabolizm RNA 418
37. Synteza białek i kod genetyczny 439
38. Regulacja ekspresji genu 457
39. Techniki: rekombinacji DNA, molekulamo-genetyczne oraz genomiczne 483
CZĘŚĆ V. BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNATRZKOMÓRKOWEJI WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
40. Błony: struktura i funkcja 507
41. Różnorodność morfologiczna i czynnościowa układu wewnątrzwydzielniczego 531
42. Działanie hormonów i transdukcja sygnałów 557
CZĘŚĆ VI. WYBRANE ZAGADNIENIA
43. Żywienie, trawienie i wchłanianie 578
44. Mikroelementy odżywcze: witaminy i składniki mineralne 588
45. Wewnątrzkomórkowy transport i sortowanie białek 609
46. Glikoproteiny 630
47. Substancja pozakomórkowa 656
48. Mięsień i szkielet komórkowy (cytoszkielet) 680
49. Białka osocza i immunoglobuliny 706
50. Proces krzepnięcia krwi i choroba zakrzepowa 728
51. Erytrocyty i leukocyty 742
52. Metabolizm ksenobiotyków 762
Dodatek m
Skorowidz
lis
Przedmowa do wydania polskiego
Oddajemy do rąk Czytelników tłumaczenie 27. wydania Biochemii Harpera. Ukazuje się ono 5 lat po
publikacji polskiej wersji 25. wydania z 2002 r. Mimo tak krótkiego czasu dzielącego te dwa wydania
w biochemii klinicznej zanotowano ogromne postępy. Wyrazem tego jest obecne wydanie różniące
się od wydania jubileuszowego (25.) nie tylko objętością (obecne 27. wydanie liczy ponad 25% stron
mniej w porównaniu z wydaniem 25.), lecz także liczbą współautorów (wzrosła ona z 4 do 10). Już te
liczby dowodzą rewolucyjnych zmian, jakie zaszły w zakresie biochemii na przestrzeni ostatnich lat.
Wprowadzenie nowych technik analitycznych oraz liczne odkrycia w zakresie genomiki, proteomiki
i metabolomiki sprawiły, że zaistniała potrzeba poszerzenia liczby redaktorów naukowych i tłumaczy
27. wydania na język polski, by mogli sprostać wymaganiom współczesnego podręcznika biochemii
lekarskiej. Wyrażamy nadzieję, że obecne wydanie Biochemii Harpera - podobnie jak wydania po¬
przednie - znajdzie ciepłe przyjęcie wśród Czytelników.
Niniejsze wydanie nie mogłoby się ukazać, gdyby nie harmonijna współpraca tłumaczy z redaktora¬
mi naukowymi i redaktorami Wydawnictwa Lekarskiego PZWL. Wszystkim wymienionym składamy
serdeczne podziękowania za okazaną pomoc, wyrozumiałość i życzliwość.
Franciszek Kokot
Aleksander Koj
Andrzej Kozik
Tadeusz Wilczok
Przedmowa
Zarówno autorzy, jak i wydawca mają przyjemność zaprezentowania Czytelnikom 27. wydania
Ilustrowanej Biochemii Harpera. Pierwsze wydanie książki ukazało się w 1939 r. pod tytułem
Przegląd chemii fizjologicznej (Review of Physiological Chemistry), a w postaci unowocześnionej
- w 1944 r. i szybko zyskało sobie szerokie grono Czytelników. W 1951 r. ukazało się wydanie trzecie
napisane przez H. A. Harpera (University of Califomia, San Francisco). Dr Harper pozostał jedynym
autorem do wydania dziewiątego, po czym był współautorem kolejnych 8 wydań. Współautorami
wydania dziesiątego byli: P. Mayes i V. Radwell, wydania dwudziestego - D. Granner, a wydania
21. - R. Murray. W obecnym wydaniu żegnamy - z wyrazami wielkiej wdzięczności - P. Mayesa,
który zrezygnował z dalszej aktywnej współpracy przy opracowywaniu obecnego wydania. Na proś¬
bę H. Harpera P. Mayes uczestniczył w redakcji wydań książki od 9. do 26., wykazując unikalną
zdolność sporządzania diagramów integrujących kluczowe ogniwa szlaków metabolicznych, obej¬
mujących enzymy, pośrednie metabolity oraz wiodące mechanizmy regulujące przepływ reakcji
biochemicznych. Jego wyjątkowe umiejętności pisarskie, precyzyjny i komunikatywny język oraz
przyjazny stosunek do współautorów książki przyczyniły się w istotnym stopniu do sukcesu, jakim
cieszy się podręcznik. Jego nieobecność wśród autorów książki będzie zapewne odczuwalna dla jego
kolegów współautorów oraz Czytelników.
Narastająca złożoność wiedzy biochemicznej sprawiła, że do obecnego wydania dokooptowano
kilku nowych współautorów. Obowiązki P. Mayesa przejęli Jego dawniejsi współpracownicy: pan
D. Bender i pani K. Botham, utrzymując długoletnie więzy transatlantyckie w zakresie współpracy
wydawniczej. Dr P. A. Weil również w obecnym - podobnie jak i poprzednim - wydaniu skutecznie
współdziałał z D. Grannerem w opracowaniu kilku rozdziałów. Kolejnymi współautorami obecnego
wydania i wydań poprzednich są F. Keeley i pani M. Rand, którzy uczestniczyli w opracowaniu
rozdziałów autorstwa R. Murraya, oraz P. Kennelly - współautor niektórych rozdziałów autorstwa
V. Rodwella. Dawniejsi współautorzy książki są wdzięczni nowym kolegom za przekazanie swojego
doświadczenia i nowych perspektyw do tekstu obecnego wydania.
Zmiany w 27. wydaniu podręcznika
Celem obecnego wydania książki - podobnie jak wydań poprzednich - jest dostarczenie studentom
medycyny lub innych nauk związanych ze zdrowiem tekstu opisującego i ilustrującego podstawy bio¬
chemii w postaci zwięzłej, przyjaznej i interesującej. Szczególny nacisk położono na znaczące postępy
biochemii mające istotne znaczenie dla medycyny. Już w wydaniu 26. dokonano radykalnych zmian,
które wynikały z wyrażanych przez studentów postulatów skrócenia tekstu. Zmiany wprowadzone do
wydania 27. można ująć w następujących punktach:
• Wszystkie rozdziały unowocześniono, włączając liczne nowe ryciny i zalecane pozycje piśmienni¬
ctwa.
• W sposób jasny omówiono pochodzenie i znaczenie pojęcia pH.
• Włączono całkowicie nowy rozdział omawiający bioinformatykę i biologię komputerową oraz rosną¬
ce znaczenie tych dyscyplin dla medycyny w przyszłości.
PRZEDMOWA IX
• Przedstawiono nowoczesne metody odkrywania leków oparte na postępach genomiki i proteomiki.
• Wprowadzono koncepcję „cyklu życiowego” białek, ułatwiającą kształtowanie podstawowej wiedzy
niezbędnej do zrozumienia sprzężonych procesów dojrzewania, potranslacyjnej modyfikacji, regula¬
cji syntezy i biodegradacji białek.
• Podkreślono znaczenie spektrometrii mas dla identyfikacji białek i małych cząsteczek w diagnostyce
chorób metabolicznych.
• Włączono opis cyklu komórkowego i szlaku ubikwitynowo-proteasomowego biodegradacji białek.
• Całkowicie unowocześniono opis łańcucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej zgodnie ze
współczesnym stanem wiedzy.
• Uzupełniono zgodnie z aktualnym stanem wiedzy tekst dotyczący zaburzeń metabolicznych cyklu
mocznikowego oraz biosyntezy i roli metabolicznej selenocysteiny - nowo poznanego 21. aminokwa¬
su.
• Włączono aktualną wiedzę dotyczącą „wysp lipidowych”, kanałów jonowych, kanałów bramkowa¬
nych napięciem, transportu glukozy i połączeń typu „gap”.
• Rozdział dotyczący śródkomórkowego ruchu i sortowania białek uzupełniono o informacje dotyczące
odpowiedzi niesfałdowanych białek i degradacji białek w siateczce endoplazmatycznej.
• Włączono omówienie roli glikoprotein w patogenezie licznych chorób, w tym wrzodu trawiennego
żołądka, pewnych wrodzonych dystrofii mięśni i włóknienia torbielowatego.
• Włączono opis nowo odkrytych białek uczestniczących w przemianie żelaza i patogenezie hemochro-
matozy.
• Podano uaktualnione informacje dotyczące hemostazy, krzepnięcia i funkcji płytek krwi.
Układ książki
Po dwóch wprowadzających rozdziałach („Biochemia a medycyna” oraz „Woda i pH”) dokonano po¬
działu tekstu na 6 głównych części:
Część I poświęcona jest budowie oraz funkcji białek i enzymów, będących „końmi roboczymi” ży¬
wego organizmu. Ponieważ prawie wszystkie reakcje zachodzące w komórkach katalizowane są przez
enzymy, istotne znaczenie ma zaznajomienie się z ich właściwościami przed omówieniem innych za¬
gadnień.
W części II przedstawiono różne reakcje komórkowe zużywające lub wytwarzające energię, a także
szlaki syntezy oraz biodegradacji węglowodanów i lipidów. W części tej scharakteryzowano również
funkcje tych ostatnich dwóch klas związków.
Przedmiotem części III są aminokwasy, ich rozmaite losy metaboliczne, kluczowe reakcje kataboli¬
zmu białkowego oraz biochemia porfiryn i barwników żółciowych.
W części IV znajduje się opis budowy i czynności nukleotydów i kwasów nukleinowych, replikacji
i naprawy DNA, syntezy i modyfikacji RNA, syntezy białek, zasad rekombinacji DNA i technologii
genomowych oraz regulacji ekspresji genów.
Część V poświęcona jest aspektom komunikacji poza- i śródkomórkowej. W części tej podano opis
budowy i czynności błon komórkowych, mechanizmu działania hormonów na poziomie molekularnym
oraz transdukcji sygnałów.
Przedmiotem części VI są wybrane tematy, takie jak żywienie, trawienie i wchłanianie, witaminy,
gospodarka mineralna, śródkomórkowy ruch i sortowanie białek, glikoproteiny, macierz pozakomór-
kowa, mięśnie, struktura cytoszkieletu, białka osocza krwi, immunoglobuliny, hemostaza i krzepnięcie
krwi, budowa oraz czynność krwinek czerwonych i białych, a także metabolizm ksenobiotyków.
W Dodatku podano listę użytecznych stron internetowych i czasopism biochemicznych lub czaso¬
pism zawierających dużo prac o tematyce biochemicznej. We wszystkich częściach znajdują się liczne
ilustracje mające konkretne odniesienie do biochemii lekarskiej.
X PRZEDMOWA
Podziękowania
Autorzy książki dziękują panu J. Halleyowi za udział w planowaniu i aktualizacji obecnego wydania.
Współpraca z nim była wielką przyjemnością. Dziękujemy pani K. Davis za wysoki profesjonalizm
i przyjemną atmosferę, jaką stworzyła przy opracowywaniu obecnego wydania; dziękujemy też człon¬
kom zespołu wydawniczego, którzy sprawili, że procedura wydawnicza przebiegała bez zakłóceń. Wy¬
rażamy wdzięczność paniom K. Edmonson, S. Kelly i S. Conner za ich pomoc w opracowaniu tekstu.
Wyrażamy wdzięczność artystom, drukarzom i innym anonimowym osobom za udział w pracach zwią¬
zanych z 27. wydaniem Ilustrowanej Biochemii Harpera. W powstawaniu obecnego wydania bardzo
pomocne były sugestie studentów i kolegów z całego świata. Liczymy na podobną pomoc przy opraco¬
waniu kolejnego wydania.
Robert K. Murray (Toronto, Ontario, Kanada)
Daryl K. Granner (Nashville, Tennessee)
Victor W. Rodwell (West Lafayette, Indiana)
Biochemia a medycyna
Robert K. Murray, MD, PhD
WPROWADZENIE
Biochemia może być zdefiniowana jako nauka
dotycząca chemicznych podstaw życia (gr. bios
- „życie”). Komórka jest strukturalną jednostką
żywych organizmów, a zatem biochemia może
być również określona jako nauka opisująca che¬
miczne składniki żywych komórek oraz zachodzą¬
ce w komórkach reakcje i procesy. Zgodnie z tą
definicją, biochemia obejmuje rozległe obszary
biologii komórki, biologii molekularnej oraz ge¬
netyki molekularnej.
Zadaniem biochemii jest opisanie
i wyjaśnienie na poziomie molekularnym
wszystkich procesów chemicznych
zachodzących w żywych komórkach
Głównym celem biochemii jest dogłębne po¬
znanie na poziomie molekularnym wszystkich
procesów chemicznych związanych z życiem ko¬
mórki. Aby wypełnić to zadanie, biochemicy usi¬
łują wyizolować liczne cząsteczki znajdujące się
w komórkach, określić ich strukturę i zbadać, jak
funkcjonują. Wykorzystują przy tym wiele tech¬
nik; niektóre z nich podano w tab. 1-1.
Znajomość biochemii jest istotna
dla wszystkich nauk przyrodniczych,
z medycyna włącznie
Biochemia kwasów nukleinowych jest podstawą
genetyki; z kolei zastosowanie metod genetycz¬
nych umożliwiło wyjaśnienie wielu problemów
z dziedziny biochemii. Fizjologia, badająca funk¬
cjonowanie organizmu, niemal całkowicie pokry¬
wa się z biochemią. Immunologia posługuje się
licznymi technikami biochemicznymi, a wiele
metod immunologicznych znalazło powszechne
zastosowanie w biochemii. Farmakologia i far¬
macja opierają się na rzetelnej znajomości bio¬
chemii i fizjologii, zwłaszcza że większość leków
jest metabolizowana w reakcjach enzymatycz¬
nych. Trucizny wpływają na reakcje i procesy bio¬
chemiczne, co stanowi przedmiot toksykologii.
Biochemiczne podejście znajduje coraz więcej
zastosowań w badaniu podstawowych aspektów
patologii (nauki o chorobach), np. stanów zapal¬
nych, uszkodzeń komórek i nowotworów. Wielu
naukowców z dziedziny mikrobiologii, zoologii
i botaniki posługuje się niemal wyłącznie me¬
todami biochemicznymi. Powiązania te nie są
zaskoczeniem, ponieważ życie, jak wiadomo, to
reakcje i procesy biochemiczne. Istotnie, dawne
bariery między naukami przyrodniczymi zanika¬
ją, a biochemia w coraz większym stopniu staje
się ich wspólnym językiem.
Związek miedzy biochemią i medycyną
stymuluje postęp w obu dziedzinach
Dwa podstawowe problemy do rozwiązania sta¬
wiane przed naukowcami z dziedziny medycyny
- a zwłaszcza lekarzami - to zrozumienie, co to jest
zdrowie i jak go zachować oraz zrozumienie, co to
jest choroba i jak ją skutecznie leczyć. Biochemia
zapisała się na trwałe w obu tych fundamentalnych
zagadnieniach medycyny. Rzeczywiście, wzajem¬
ne oddziaływanie biochemii i medycyny można
porównać do szerokiej dwukierunkowej ulicy.
Analizy biochemiczne wyjaśniły wiele aspektów
zdrowia oraz choroby i odwrotnie, badanie róż¬
nych przejawów zdrowia i choroby odsłania coraz
2 1. BIOCHEMIA A MEDYCYNA
Tabela 1-1. Główne metody stosowane w laboratoriach
biochemicznych
Metody rozdziału i oczyszczania biomolekuf1
Frakcjonowanie za pomocą soli (np. strącanie (wysalanie) bia¬
łek siarczanem amonu)
Chromatografia: bibułowa, jonowymienna, powinowactwa,
cienkowarstwowa, ciecz-gaz, cieczowa wysokosprawna,
filtracja żelowa
Elektroforeza: bibułowa, wysokonapięciowa, na agarozie, na
octanie celulozy, w żelu skrobiowym, w żelu poliakrylami-
dowym, w żelu poliakrylamidowym z SDS
Ultrawirowanie
Metody określania struktury biomolekuf
Analiza elementarna
Spektroskopia w świetle widzialnym, UV i podczerwieni
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (ang.
Nuclear Magnetic Resonance, NMR)
Kwasowa lub zasadowa hydroliza badanej cząsteczki do jej
elementarnych składników
Zastosowanie wielu enzymów o znanej specyficznej aktywno¬
ści do degradacji badanej cząsteczki (np. proteazy, nuklea-
zy, glikozydazy)
Spektrometria mas
Specyficzne metody sekwencjonowania (np. białek i kwasów
nukleinowych)
Krystalografia rentgenowska
Preparaty wykorzystywane
do badania procesów biochemicznych
Całe zwierzęta (włączając zwierzęta transgeniczne i zwierzęta
z nokautem genowym)
Izolowane narządy perfundowane
Skrawki tkanek
Całe komórki
Homogenaty
Izolowane organelle komórkowe
Subfrakcjonowane organelle
Oczyszczone metabolity i enzymy
Izolowane geny (także w przypadku reakcji polimerazy łańcu¬
chowej i miejscowej mutagenezy)
1 Większość z tych metod jest odpowiednia do analizy składni¬
ków obecnych w homogenatach komórkowych oraz innych pre¬
paratach biochemicznych. Kolejne stosowanie kilku technik za¬
zwyczaj umożliwia oczyszczenie większości biomolekuł. Więcej
informacji Czytelnik może znaleźć w tekstach dotyczących metod
stosowanych w badaniach biochemicznych.
to nowe horyzonty przed biochemią. Kilka przy¬
kładów takiego współdziałania, na zasadzie ulicy
dwukierunkowej, przedstawiono na ryc. 1-1. Na
przykład poznanie struktury i funkcji białka było
niezbędne do wyjaśnienia jedynej biochemicznej
różnicy między hemoglobiną krwinki prawidło¬
wej i sierpowatej. Z kolei analiza hemoglobiny
sierpowatej przyczyniła się znacząco do pozna¬
nia struktury i funkcji prawidłowej hemoglobiny,
a także innych białek. Analogicznym przykładem
wzajemnych korzyści ze współdziałania biochemii
i medycyny mogą być choroby wymienione na ryc.
1-1. Kolejnym przykładem jest również pionierski
wysiłek Archibalda Garroda, lekarza pracującego
w Anglii we wczesnych latach dwudziestego stu¬
lecia. Badał on pacjentów cierpiących na wiele
stosunkowo rzadko występujących schorzeń (al-
kaptonuria, albinizm, cystynuria i pentozuria; są
one opisane w dalszych rozdziałach) i ustalił ich
genetyczne uwarunkowanie. Garrod określił je
jako wrodzone błędy metabolizmu. Jego badania
stały się fundamentem dla rozwoju genetyki bio¬
chemicznej człowieka.
Dalsze wysiłki w celu poznania etiologii cho¬
roby uwarunkowanej genetycznie, znanej jako
rodzinna hipercholesterolemia, będącej przy¬
czyną zaawansowanej miażdżycy tętnic w mło¬
dym wieku, doprowadziły do pogłębienia wiedzy
o receptorach komórkowych i mechanizmach
przyswajania cholesterolu przez komórki. Bada¬
nia onkogenów w komórkach rakowych zwróci¬
ły uwagę na mechanizmy molekularne związane
z kontrolowaniem prawidłowego wzrostu komór¬
ki. Te i wiele innych przykładów pokazuje, jak
badania kliniczne nad chorobami mogą odsłonić
szerokie obszary funkcjonowania komórek dla
badań biochemicznych.
Wzajemna zależność między medycyną i bio¬
chemią ma ważne implikacje filozoficzne w me¬
dycynie. Jak długo postępowanie lekarskie będzie
mocno zakorzenione w gruntownej znajomości
biochemii oraz innych pokrewnych naukach pod¬
stawowych (np. fizjologii, mikrobiologii, naukach
o żywieniu), tak długo medycyna praktyczna bę¬
dzie miała racjonalną podstawę dla zastosowania
coraz to nowych osiągnięć wiedzy. Kontrastuje to
jaskrawo z kultem medycyny niekonwencjonalnej
[np. homeopatia -przyp. tłum.\, która często opie¬
ra się na mitach i myśleniu życzeniowym.
PRAWIDŁOWE PROCESY BIOCHEMICZNE
SA PODSTAWA ZDROWIA
Światowa Organizacja Zdrowia (World Health
Organization, WHO) definiuje zdrowie jako stan
„w pełni dobrego samopoczucia fizycznego, umy¬
słowego i socjalnego, a nie tylko jako brak cho-
1. BIOCHEMIA A MEDYCYNA 3
Kwasy
nukleinowe
Choroby
genetyczne
BIOCHEMIA
Białka
Niedokrwistość
sierpowatokrwinkowa
Lip
idy Węglov
vodany
Miaż(
tęt
jżyca Cukr
nic
zyca
MEDYCYNA
Ryc. 1-1. Przykłady wzajemnych powiązań biochemii i medycyny, efekt ulicy dwukierunkowej. Wie¬
dza o związkach biochemicznych znajdujących się w górnej części wykresu wpłynęła na rozpoznanie
chorób wymienionych w dolnej połowie rysunku; i odwrotnie, analiza chorób wymienionych poniżej
pomogła w wyświetleniu wielu dziedzin biochemii. Należy zauważyć, że niedokrwistość sierpowa¬
tokrwinkowa jest chorobą genetyczną, a zarówno miażdżyca tętnic, jak i cukrzyca mają genetyczne
uwarunkowania.
roby lub osłabienia.” Z czysto biochemicznego
punktu widzenia zdrowie może być rozważane
jako sytuacja, w której wszystkie spośród wielu
tysięcy reakcji wewnątrz- i zewnątrzkomórko-
wych przebiegają z szybkością odpowiednią dla
optymalnego funkcjonowania całego organizmu.
Jest to jednak bardzo redukcjonistyczny punkt wi¬
dzenia i staje się oczywiste, że troska o zdrowie
pacjentów wymaga szerokiej wiedzy dotyczącej
reguł nie tylko biologicznych, lecz także psycho¬
logicznych i społecznych.
Wyniki badań biochemicznych maja
wpływ na naukę o żywieniu i medycynę
prewencyjna
Głównym warunkiem zachowania zdrowia jest
pobieranie w pożywieniu optymalnej ilości związ¬
ków chemicznych; najważniejszymi z nich są
witaminy, niektóre aminokwasy, pewne kwasy
tłuszczowe, różne substancje mineralne i woda.
Wiele zagadnień z biochemii oraz żywienia do¬
tyczy badania różnych aspektów tych właśnie
związków chemicznych, a zatem współdziałanie
obu wymienionych dyscyplin jest bardzo ścisłe.
Ponadto większe znaczenie zyskują obecnie sy¬
stematyczne działania w celu utrzymania zdrowia
i zapobieżenia chorobom, czyli medycyna pre¬
wencyjna. Podejście żywieniowe do przeciwdzia¬
łania np. miażdżycy tętnic i nowotworom otrzy¬
muje więc coraz większe wsparcie. Zrozumienie
znaczenia odżywiania zależy w dużym stopniu od
znajomości biochemii.
Większość chorób, a być może wszystkie,
ma podłoże biochemiczne
Większość chorób, jeżeli nie wszystkie, są od¬
zwierciedleniem nieprawidłowości w cząstecz¬
kach, zaburzeń w reakcjach chemicznych i pro¬
cesach zachodzących w organizmie. Główne
czynniki odpowiedzialne za powstawanie chorób
u ludzi i zwierząt wymieniono w tab. 1-2. Wszyst¬
kie z nich mogą wpłynąć na jedną lub kilka pod¬
stawowych reakcji chemicznych albo cząsteczek
będących elementami żywego organizmu.
Tabela 1-2. Główne przyczyny chorób. Wszystkie wymienione
czynniki działają przez wpływ na różnorodne mechanizmy bio¬
chemiczne w komórce lub organizmie1
1. Czynniki fizyczne: urazy mechaniczne, ekstremalne tempera¬
tury, nagłe zmiany ciśnienia atmosferycznego, promieniowa¬
nie, wstrząs elektryczny
2. Czynniki chemiczne i leki: pewne związki toksyczne, środki
terapeutyczne itp.
3. Czynniki biologiczne: wirusy, bakterie, grzyby, wyższe formy
pasożytów
4. Brak tlenu: niedokrwienie, zmniejszenie pojemności tlenowej
krwi, zatrucie enzymów oksydacyjnych
5. Wady genetyczne: wrodzone, molekularne
6. Reakcje immunologiczne: anafilaksja, choroba autoimmuno-
logiczna
7. Zaburzenia w odżywianiu: niedobory i nadmiary
8. Zachwianie równowagi wewnątrzwydzielniczej: niedobory
i nadmiary hormonów
1 Zaadaptowano za zgodą z: Robbins SL, Cotram RS, Kumar V:
The Pathologic Basis ofDisease, 3rd ed., Saunders, 1984. © Else-
vier. Przedrukowano za zgodą Elsevier.
4 1. BIOCHEMIA A MEDYCYNA
Wiele przykładów biochemicznych podstaw
chorób będzie wymienionych w dalszym tekście.
W większości tych przypadków badania bioche¬
miczne mają swój udział zarówno w diagnozie,
jak i metodach leczenia. Kilka przykładów głów¬
nych zastosowań badań biochemicznych oraz te¬
stów laboratoryjnych do diagnostyki chorób za¬
mieszczono w tab. 1-3.
Tabela 1-3. Niektóre zastosowania badań biochemicznych i te¬
stów laboratoryjnych w odniesieniu do stanów chorobowych
Zastosowanie
Przykład
1. Ujawnienie kluczowych
przyczyn i mechanizmów
chorób
Wykazanie uwarunkowań
genetycznych
w mukowiscydozie
2. Propozycja właściwej
terapii oparta na (1)
Dieta uboga w fenyloalaninę
w terapii fenyloketonurii
3. Pomoc w diagnozowaniu
specyficznych chorób
Wykorzystanie enzymu osocza,
kinazy kreatyninowej MB
(CK-MB), w diagnostyce
zawału serca
4. Testy przesiewowe we
wczesnej diagnozie pewnych
chorób
Wykorzystanie pomiaru
stężenia tyroksyny i hormonu
stymulującego tarczycę (TSH)
we krwi w neonatalnej diagnozie
wrodzonej niedoczynności
tarczycy
5. Pomoc w monitorowaniu
postępu (tj. polepszenia,
pogorszenia, remisji lub
nawrotu) pewnych chorób
Wykorzystanie enzymu osocza,
aminotransferazy alaninowej
(ALAT) w monitorowaniu
postępu wirusowego zapalenia
wątroby
6. Pomoc w określeniu reakcji
choroby na terapię
Wykorzystanie pomiaru
poziomu antygenu
karcynoembrionalnego (CEA)
we krwi u niektórych pacjentów
leczonych na raka okrężnicy
Wpływ Programu poznania genomu
ludzkiego (Humań Genome Project, HGP)
na biochemie i medycyno
Godny uwagi postęp w zakresie ustalenia sekwen¬
cji genomu ludzkiego został dokonany w późnych
latach 90. XX w. Momentem kulminacyjnym był
lipiec 2000 r., kiedy liderzy dwóch zespołów ba¬
dawczych zaangażowanych w to przedsięwzięcie
(The International Humań Genome Seąuencing
Consortium i prywatna firma Celera Genomics)
ogłosili, że rozpoznali 90% genomu. Wstępne
wersje sekwencji zostały opublikowane na po¬
czątku 2001 r. Z wyjątkiem kilku luk, sekwencja
całego genomu ludzkiego została określona do
2003 r., tj. 50 lat po scharakteryzowaniu podwój¬
nej helisy DNA przez Watsona i Cricka.
Wpływ tego programu na rozwój biochemii,
całej biologii i medycyny jest ogromny, a wspo¬
mniano tutaj tylko o kilku aspektach. Wykryto
wiele nieznanych dotychczas genów, a ich pro¬
dukty białkowe czekają na scharakteryzowanie.
Badania te rzuciły nowe światło na zagadnienie
rozwoju człowieka, a procedury identyfikacji
genów związanych z chorobami zostały znacz¬
nie dopracowane. Główne efekty tych osiągnięć
widać w takich dziedzinach, jak proteomika, bio-
informatyka, biotechnologia i farmakogenomika.
Odwołania do analizy ludzkiego genomu znajdzie
Czytelnik w wielu miejscach tej książki.
STRESZCZENIE
• Biochemia to nauka zajmująca się badaniem
różnorodnych cząsteczek występujących w ży¬
wych komórkach i organizmach oraz ich che¬
micznych reakcji. Reakcje biochemiczne leżą
u podstaw życia, biochemia stała się więc wspól¬
nym językiem wszystkich nauk biologicznych.
Biochemia zajmuje się różnorodnymi formami
życia, od prostych wirusów i bakterii do bardzo
skomplikowanych istot ludzkich.
• Biochemia i medycyna są bezpośrednio po¬
wiązane. Zdrowie zależy od harmonijnej rów¬
nowagi reakcji biochemicznych zachodzących
w organizmie, a choroby są oznaką odchylenia
od normy w biomolekułach oraz w reakcjach
i procesach biochemicznych.
• Postęp w dziedzinie biochemii umożliwia roz¬
wiązanie wielu problemów natury medycznej.
I odwrotnie, badanie chorób odkrywa często
wcześniej niezgłębione i nieoczekiwane aspek¬
ty biochemii. Poznanie sekwencji genomu
ludzkiego odbije się znacznie we wszystkich
obszarach biologii, włączając biochemię, bioin-
formatykę i biotechnologię.
• Podejście biochemiczne jest niejednokrotnie
kluczowe w rozpoznawaniu przyczyn chorób
i w opracowywaniu odpowiedniej terapii.
• Rozsądne stosowanie różnych biochemicznych
testów laboratoryjnych jest nieodłącznym ele-
1. BIOCHEMIA A MEDYCYNA 5
mentem stawiania diagnozy i monitorowania
leczenia.
• Znajomość biochemii i pokrewnych dziedzin
nauki jest dziś podstawą praktyki medycznej.
• Wyniki Programu poznawania genomu ludz¬
kiego będą miały głęboki wpływ na przyszłość
medycyny i innych nauk o zdrowiu.
PIŚMIENNICTWO
Burtis CA, Ashwood ER: Tietz Fundamentals of Clini-
cal Chemistry, 5th ed. Saunders, 2001.
Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley, 2001. (Za¬
wiera około 3000 wyczerpujących artykułów doty¬
czących różnych aspektów nauk o życiu. Dostępna
online na www.els.net poprzez biblioteki w syste¬
mie subskrypcji).
Fruton JS: Proteins, Enzymes, Genes: The Interplay of
Chemistry and Biology. Yale Univ Press, 1999.
(Podaje tło historyczne wielu dzisiejszych badań
biochemicznych).
Garrod AE: Inbom Errors of metabolism. (Croonian
Lectures.) Lancet 1908; 2:1, 73, 142, 214.
Guttmacher AE, Collins FS: Genomie medicine - A Pri-
mer. N Engl J Med 2002; 347:1512. (Artykuł ten
stanowił pierwszy z serii jedenastu comiesięcznych
artykułów publikowanych w New England Journal
of Medicine, opisujących różne aspekty medycyny
genomu).
Komberg A: Basic research: The lifeline of medicine.
FASEB J 1992; 6:3143.
Komberg A: Centenary of the birth of the modem bio-
chemistry. FASEB J 1997; 11:1209.
McKusick VA: Mendelian Inheritance in Man, Cata-
logs of Humań Genes and Genetic Disorders, 12th
ed. Johns Hopkins Univ Press, 1998 [Abbreviated
MIM]
Online Mendelian Inheritance in Men (OMIM): Center
for Medical Genetics, Johns Hopkins University
and National Center for Biotechnology Informa¬
tion, National Library of Medicine, 1997, http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/omim. (Liczby przypisane
do haseł MIM i OMIM będą cytowane w wybra¬
nych rozdziałach tej pracy. Skonsultowanie tego
wyczerpującego wykazu chorób i innych pokrew¬
nych haseł - specyficznych białek, enzymów itp.
- znacznie rozszerzy wiedzę Czytelnika oraz
rozumienie różnych tematów przedstawionych
i dyskutowanych w tej książce. Wersja dostępna
w intemecie /online/ jest aktualizowana prawie
codziennie).
Scriver CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 7th ed. McGraw-Hill,
1995.
Woda i pH
Peter J. Kennelly, PhD; 1Hctor W. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Woda stanowi główny składnik chemiczny orga¬
nizmów żywych. Jej niezwykłe właściwości fi¬
zyczne i chemiczne, do których należy zdolność
rozpuszczania wielu organicznych i nieorganicz¬
nych związków, wynikają z dipolowej struktury
cząsteczki wody i wyjątkowej zdolności tworze¬
nia wiązań wodorowych. Sposób oddziaływania
wody z rozpuszczanymi biocząsteczkami wpływa
na ich strukturę. Woda, będąc doskonałym czyn¬
nikiem nukleofilowym, służy jako reagent bądź
produkt wielu reakcji metabolicznych. Woda
wykazuje słabą skłonność do dysocjacji na jony
wodorotlenowe i protony. Kwasowość roztworów
wodnych jest ogólnie wyrażana za pomocą ska¬
li logarytmicznej. Wodorowęglan i inne bufory
utrzymują właściwe pH płynu pozakomórkowe-
go, które wynosi 7,35-7,45. Podejrzenia o zabu¬
rzenia równowagi kwasowo-zasadowej weryfiku¬
je się, mierząc pH krwi tętniczej i zawartość C02
w krwi żylnej. Najczęstsze przyczyny kwasicy
(wartość pH krwi < 7,35) to ketonemia cukrzyco¬
wa i kwasica mleczanowa. Zasadowica (pH krwi
> 7,45) może wystąpić np. po wymiotach kwaśną
treścią żołądkową. Złożona regulacja równowa¬
gi wodnej zależy od mechanizmów podwzgórza
kontrolujących pragnienie, od hormonu antydiu-
retycznego (ADH), zatrzymywania czy wydala¬
nia wody przez nerki oraz utraty wody przez pa¬
rowanie. Nerkopochodna moczówka prosta, która
objawia się niezdolnością zatężania moczu czy
dostosowania się do subtelnych zmian osmolar-
ności płynu pozakomórkowego, jest następstwem
braku odpowiedzi nerkowych osmoreceptorów na
hormon ADH.
WODA STANOWI DOSKONAŁY
ROZPUSZCZALNIK
Cząsteczki wody tworzą dipole
Cząsteczka wody ma budowę nieregularnego,
lekko pochyłego czworościanu, w którego cen¬
trum znajduje się atom tlenu (ryc. 2-1).
Ryc. 2-1. Tetraedryczna struktura cząsteczki wody.
Dwa atomy wodoru i wolne pary elektronowe
pozostałych dwóch orbitali zhybrydyzowanych
sp3 znajdują się w narożach czworościanu. Kąt
105° między wiązaniami O—H jest nieco mniej¬
szy od kąta w idealnym tetraedrze (109,5°).
Cząsteczka amoniaku także tworzy czworościan,
z tym że kąt między wiązaniami N—H wynosi
107°. Woda jest dipolem, którego ładunek elek¬
tryczny jest rozłożony asymetrycznie wokół
cząsteczki. Silnie elektroujemny atom tlenu od¬
ciąga elektrony od atomów wodoru, nadając im
cząstkowy ładunek dodatni, natomiast jego dwie
wolne pary elektronowe stanowią region o cząst¬
kowym ładunku ujemnym.
Woda wykazuje wysoką stałą dielektryczną.
Zgodnie z prawem Coulomba, siła F oddziaływa¬
nia między przeciwnie naładowanymi cząstkami
2. WODA I pH 7
jest odwrotnie proporcjonalna do stałej dielek¬
trycznej s otaczającego środowiska. Stała dielek¬
tryczna próżni wynosi 1, heksanu - 1,9, etanolu
- 24,3, a wody - 78,5. Woda zatem znacznie
osłabia siłę przyciągania między naładowanymi
i polarnymi cząstkami w porównaniu z bezwod¬
nymi środowiskami, charakteryzującymi się ma¬
łymi wartościami stałych dielektrycznych. Silna
dipolowość cząsteczek i duża stała dielektryczna
wody umożliwia jej rozpuszczanie dużych ilości
naładowanych związków, takich jak sole.
Cząsteczki wody tworzą wiązania
wodorowe
Odsłonięte częściowo jądro atomu wodoru zwią¬
zanego kowalencyjnie z odciągającym elektrony
atomem tlenu lub azotu może oddziaływać z wol¬
ną parą elektronową innego atomu tlenu bądź azo¬
tu, tworząc wiązania wodorowe. Ponieważ czą¬
steczki wody wykazują obydwie cechy, wiązania
wodorowe sprzyjają asocjacji cząsteczek wody
w uporządkowaną sieć (ryc. 2-2).
V
V
ń
H i
i
/
s/
O
o-
Ryc. 2-2. Strona lewa: asocjacja dwóch dipolowych cząsteczek
wody. Linia kropkowana przedstawia wiązanie wodorowe. Strona
prawa: asocjacja cząsteczki wody (środkowej) z czterema innymi
cząsteczkami wody. Należy zauważyć, że woda może służyć za¬
równo jako donor, jak i jako akceptor wodoru.
Wiązanie wodorowe znacznie wpływa na fi¬
zyczne właściwości wody i jej wyjątkowo wy¬
soką lepkość, napięcie powierzchniowe i tempe¬
raturę wrzenia. Każda cząsteczka wody w stanie
ciekłym asocjuje dzięki wiązaniom wodorowym
średnio z 3,5 innych cząsteczek. Wiązania te są
względnie słabe i nietrwałe, wykazują bowiem
okres połowicznego rozpadu ok. 10 ps. Rozerwa¬
nie wiązania wodorowego w wodzie (w stanie
ciekłym) wymaga tylko ok. 19 kJ/mol, czyli mniej
niż 5% energii wymaganej do zerwania wiązania
kowalencyjnego O—H. Dzięki tworzeniu wiąza¬
nia wodorowego woda może rozpuszczać wiele
organicznych biocząsteczek zawierających grupy
funkcyjne, które uczestniczą w wiązaniu wodoro¬
wym. Atomy tlenu aldehydów, ketonów i amidów
dostarczają par elektronów, które mogą służyć
jako akceptory wodoru. Alkohole i aminy mogą
być zarówno akceptorami wodoru, jak i donorami
nieosłoniętych atomów wodoru w tworzeniu wią¬
zań wodorowych (ryc. 2-3).
, /H
ch3— ch2 —o-pT-oj
H
H
I h
CH3 — CH2— 0-f-H— 0 1
CH2— ch3
R R"
\ _r 1 /
c4o--h4-n
R1 R'"
Ryc. 2-3. Dodatkowe grupy polarne uczestniczą w wiązaniach
wodorowych. Rycina przedstawia powstawanie wiązań wodoro¬
wych między cząsteczkami etanolu i wody, między dwiema czą¬
steczkami etanolu oraz między atomem tlenu grupy karbonylowej
i grupą N—H w sąsiadujących peptydach.
ODDZIAŁYWANIE BIOCZĄSTECZEK
Z WODA WPŁYWA NA ICH STRUKTURĘ
Cząsteczki biologiczne sa stabilne dzięki
wiązaniom kowalencyjnym
i niekowalencyjnym
Wiązania kowalencyjne są najsilniejszymi wię¬
zami utrzymującymi strukturę cząsteczki (tab.
2-1).
Tabela 2-1. Energia wiązań atomów w cząsteczkach o znaczeniu
biologicznym
Typ
wiązania
Energia
[kJ/mol]
Typ
wiązania
Energia
[kJ/molJ
0—0
142
0=0
402
S-S
213
C—H
414
C—N
292
c=s
452
S—H
339
0—H
460
C—C
343
c=c
615
C—0
351
C=N
615
N—H
393
C=0
686
8 2. WODA I pH
Wiązania niekowalencyjne również mają
udział, choć w mniejszym stopniu, w utrzyma¬
niu struktury, stabilności i cech funkcjonalnych
makrocząsteczek w żyjących komórkach. Siły
te, które mogą przyciągać albo odpychać bioczą-
steczki, biorą udział w oddziaływaniach między
nimi i wodą, która tworzy główny składnik ota¬
czającego środowiska.
Biomolekuły eksponują polarne
i naładowane grupy na swej powierzchni
Większość biocząsteczek jest amfipatyczna, co
oznacza, że zawierają one regiony bogate w nała¬
dowane czy polarne grupy oraz regiony o charak¬
terze hydrofobowym. Białka wykazują tendencję
do przyjmowania konformacji, w której hydrofo¬
bowe łańcuchy boczne aminokwasów są zwróco¬
ne do wnętrza cząsteczki. Aminokwasy z nała¬
dowanymi lub polarnymi łańcuchami bocznymi
(np. arginina, kwas glutaminowy, seryna) zwykle
znajdują się na powierzchni białka w bezpośred¬
nim kontakcie z wodą. Podobny układ występuje
w dwuwarstwie lipidowej, w której naładowane
grupy (głowy) fosfatydyloseryny czy fosfaty-
dyloetanoloaminy stykają się z wodą, natomiast
ich hydrofobowe łańcuchy boczne kwasów tłusz¬
czowych skupiają się razem (ang. cluster), wypy¬
chając wodę. To zwiększa możliwość występo¬
wania energetycznie korzystnych oddziaływań:
ładunek-dipol, dipol-dipol i za pośrednictwem
wiązań wodorowych między polarnymi grupami
biocząsteczek i wodą. W ten sposób zmniejsza się
energetycznie niekorzystne oddziaływanie mię¬
dzy wodą i grupami hydrofobowymi.
Oddziaływania hydrofobowe
Oddziaływanie hydrofobowe przedstawia się jako
tendencję niepolamych związków do samoaso-
cjacji (ang. self-association) w środowisku wod¬
nym. Samoasocjacja nie wynika z wzajemnego
przyciągania się, ani z tego, co czasami błędnie
nazywa się „wiązaniami hydrofobowymi”. Samo¬
asocjacja wynika z potrzeby zmniejszenia ener¬
getycznie niekorzystnych oddziaływań między
niepolamymi grupami i wodą. Wprawdzie atomy
wodoru niepolamych grup, takich jak grupy me¬
tylenowe węglowodorów, nie tworzą wiązań wo¬
dorowych, wpływają jednak na strukturę wody,
która je otacza. Cząsteczki wody przylegające
do grupy hydrofobowej mają ograniczoną moż¬
liwość orientacji (mała liczba stopni swobody),
co nie pozwala im uczestniczyć w maksymalnej
liczbie energetycznie korzystnych wiązań wodo¬
rowych. Wysoka zdolność tworzenia wielu wią¬
zań wodorowych może być podtrzymywana tylko
przez rosnące uporządkowanie przylegających
cząsteczek wody, czemu towarzyszy zmniejsze¬
nie entropii.
Z drugiego prawa termodynamiki wynika,
że optymalna entalpia swobodna mieszani¬
ny węglowodór-woda jest funkcją zarówno
największej entalpii (wiązania wodorowego)
i najwyższej entropii (największa liczba stopni
swobody). Niepolame cząsteczki dążą zatem do
tworzenia kropelek o małym polu eksponowanej
powierzchni, zmniejszając liczbę oddziałujących
na nie cząsteczek wody. Z tej samej przyczyny,
w środowisku wodnym żywej komórki hydro¬
fobowe części biopolimerów wykazują tenden¬
cję do chowania się we wnętrzu cząsteczki albo
wnętrzu dwuwarstwy lipidowej, co ogranicza ich
kontakt z wodą.
Oddziaływania elektrostatyczne
Oddziaływania między naładowanymi grupami
pomagają kształtować strukturę biocząsteczek.
Oddziaływania elektrostatyczne między przeciw¬
nie naładowanymi grupami wewnątrz biocząste¬
czek oraz między nimi są nazywane mostkami
solnymi. Siła mostków solnych jest porównywal¬
na do siły wiązań wodorowych, z tym że mogą
one działać z większych odległości. Dzięki temu
oddziaływania te często ułatwiają wiązanie nała¬
dowanych cząsteczek z białkami i kwasami nu¬
kleinowymi.
Siły van der Waalsa
Siły van der Waalsa wynikają z przyciągania się
chwilowych dipoli, powstających na skutek szyb¬
kiego ruchu elektronów wszystkich obojętnych
atomów. Są one znacznie słabsze niż wiązania
wodorowe, lecz występują dość powszechnie. Ich
moc zmniejsza się proporcjonalnie do odległości
między atomami podniesionej do potęgi szóstej.
Działają one zatem na bardzo krótkich odległoś¬
ciach, zwykle 0,2-0,4 nm (2-4 A).
2. WODA I pH 9
Biocząsteczki są stabilizowane przez
różnorodne sity
Podwójna helisa DNA jest przykładem makroczą¬
steczki, którą stabilizują różnorodne siły. Podczas
gdy każdy z łańcuchów DNA jest utrzymywany
poprzez wiązania kowalencyjne, obydwa łań¬
cuchy helisy są utrzymywane wyłącznie przez
oddziaływania niekowalencyjne. Te niekowalen-
cyjne oddziaływania obejmują wiązania wodoro¬
we między zasadami nukleotydów (według reguł
parowania Watsona i Cricka) oraz oddziaływania
między ustawionymi w stosy parami zasad pury-
nowych i pirymidynowych (tzw. oddziaływania
stakingowe). Helisa stanowi szkielet naładowa¬
nych grup fosforanowych i polarnych reszt cu¬
kru - rybozy, skierowanych do wody, natomiast
względnie hydrofobowe zasady są ukryte we¬
wnątrz. Wydłużony szkielet maksymalnie oddala
od siebie reszty fosforanowe, zmniejszając nieko¬
rzystne oddziaływania elektrostatyczne.
WODA JEST DOSKONAŁYM
CZYNNIKIEM NUKLEOFILOWYM
Reakcje metaboliczne często wymagają ataku
wolnych par elektronów bogatych w elektro¬
ny cząsteczek zwanych nukleofilami na ubogie
w elektrony atomy nazywane elektrofilami. Nu-
kleofile i elektrofile nie muszą mieć formalnego
ładunku ujemnego czy dodatniego. Woda, której
dwie wolne pary elektronów sp3 niosą cząstkowy
ujemny ładunek, jest doskonałym nukleofilem.
Do innych biologicznie ważnych nukleofili zali¬
czają się atomy tlenu w fosforanach, alkoholach
i kwasach karboksylowych, atomy siarki tioli,
atomy azotu amin i pierścień imidazolowy hi-
stydyny. Powszechnie występujące elektrofile to
m.in. atomy węgla grup karbonylowych w ami¬
dach, estrach, aldehydach i ketonach, a także ato¬
my fosforu w estrach fosforanowych.
Atak nukleofilowy wody ogólnie prowadzi do
rozszczepienia wiązań amidowych, glikozydo-
wych czy estrowych, które utrzymują strukturę
biopolimerów*. Proces ten nazywa się hydrolizą.
* Zgodnie z prawidłową terminologią chemiczną,
większość biologicznych makrocząsteczek (białek, po¬
lisacharydów, kwasów nukleinowych i in.) to polikon-
densaty, a nie polimery \przyp. tłum.].
Odwrotnie, jeśli jednostki monomerów łączą się,
to tworzą biopolikondensaty, takie jak białka czy
glikogen; jak pokazano poniżej, woda stanowi
produkt uboczny tworzenia wiązania peptydowe-
go między dwoma aminokwasami.
Chociaż hydroliza jest reakcją uprzywilejowa¬
ną pod względem termodynamicznym, to jednak
wiązania amidowe i fosfoestrowe polipeptydów
i oligonukleotydów są stabilne w środowisku
wodnym komórki. To pozornie paradoksalne zja¬
wisko odzwierciedla fakt, że termodynamika rzą¬
dząca równowagą reakcji nie określa szybkości,
z jaką reakcja przebiega. Katalizatory białkowe
występujące w komórce, nazywane enzymami,
przyspieszają reakcje hydrolityczne, kiedy jest
to potrzebne. Proteazy katalizują hydrolizę bia¬
łek do ich składników - aminokwasów, natomiast
nukleazy katalizują hydrolizę wiązań fosfodie-
strowych w DNA i RNA. Niezbędna jest ostrożna
kontrola aktywności tych enzymów, aby działały
one tylko na właściwe cząsteczki docelowe i w od¬
powiednim czasie.
Wiele reakcji metabolicznych przebiega
z przeniesieniem grup
W reakcjach przeniesienia grup, grupa G jest
przenoszona z donora D na akceptor A i tworzy
kompleks akceptorowy A-G:
D-G + A*=*A-G + D
10 2. WODA I pH
Hydroliza i fosforoliza glikogenu reprezentu¬
ją reakcje przeniesienia grup, w których grupy
glukozylowe są przenoszone na wodę lub na or-
tofosforan. Stała równowagi hydrolizy wiązań
kowalencyjnych sprzyja powstawaniu produktów
rozszczepienia.
Biosynteza makrocząsteczek także obejmuje
reakcje przeniesienia grup, w których termodyna¬
micznie niekorzystne tworzenie wiązań kowalen¬
cyjnych jest sprzężone z reakcjami uprzywilejowa¬
nymi w taki sposób, że całkowita zmiana entalpii
swobodnej sprzyja syntezie biopolikondensatów.
Biorąc pod uwagę nukleofilowy charakter wody
i jej wysokie stężenie w komórkach, nasuwa się py¬
tanie: dlaczego biopolimery, takie jak białka i DNA,
są względnie stabilne? I jak może zachodzić synte¬
za biopolikondensaty w środowisku wodnym?
Istotą tych dwóch pytań są właściwości enzy¬
mów. W sytuacji braku katalitycznego działania
enzymów nawet wysoce korzystne pod względem
termodynamicznym reakcje nie mogą przebiegać
szybko. Precyzyjna i zróżnicowana kontrola ak¬
tywności enzymatycznej i rozmieszczenie enzy¬
mów w specyficznych organellach determinuje
warunki fizjologiczne, w jakich dany biopoli-
kondensat będzie syntetyzowany lub rozkładany.
Nowo syntetyzowane polimery nie są natychmiast
hydrolizowane, częściowo ze względu na fakt,
że centrum aktywne enzymów syntetyzujących
utrzymuje substraty w środowisku nie wodnym.
Cząsteczki wody wykazują nieznaczną,
lecz ważną skłonność do dysocjacji
Skłonność wody do dysocjacji, choć słabej, ma
kluczowe znaczenie dla życia. Ponieważ woda
może reagować zarówno jako kwas, jak i jako
zasada, jej dysocjacja może być przedstawiona
jako między cząsteczko we przeniesienie protonu
tworzącego jon hydroniowy (H30+) i jon wodo¬
rotlenowy (OH-)
H20 + H20 5=£ H30+ + OH"
Przenoszony proton asocjuje z ugrupowaniem
(ang. cluster) cząsteczek wody i występuje w roz¬
tworze nawet nie jako H30+, lecz czasami jako
H502+ czy H703+. Chociaż w praktyce proton jest
prawie zawsze zapisywany jako H+, nie należy
zapominać, że faktycznie jest on silnie hydrato-
wany.
Ponieważ jony hydroniowy i wodorotlenowy
są w ciągłym ruchu, tworząc cząsteczki wody
i dysocjując, trudno określić, czy pojedynczy
atom wodoru lub tlenu występuje jako jon, czy
jako część cząsteczki wody. W danym momencie
może on być jonem, a w następnym częścią czą¬
steczki. Jonów oraz cząsteczek wody nie rozpatru¬
je się pojedynczo. Wiedząc, że 1 g wody zawiera
3,46 x 1022 cząsteczek, jonizację wody można opi¬
sać statystycznie. Należy znać prawdopodobień¬
stwo występowania wodoru w formie jonu lub
części cząsteczki wody.
Jeśli prawdopodobieństwo występowania wo¬
doru w formie jonu wynosi 0,01, oznacza to, że
atom wodoru ma 1 szansę na 100 bycia jonem,
a 99 szans na sto istnienia w cząsteczce wody.
Faktyczne prawdopodobieństwo znalezienia ato¬
mu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wy¬
nosi ok. 1,8 xl0-9. Zatem jest on prawie zawsze
częścią cząsteczki wody. Wynika z tego, że w czy¬
stej wodzie na każdy jon wodorowy i wodorotle¬
nowy przypada 1,8 x109 tj. 1,8 mld cząsteczek
wody. Jony wodorowe i wodorotlenowe mają jed¬
nak znaczny wpływ na właściwości wody. Dyso-
cjację wody wyraża się następująco:
„ [H+] [OH"]
[H20]
Nawiasy oznaczają stężenia molowe jonów
wodorowych, wodorotlenowych i niezdysocjo-
wanych cząsteczek wody*, a K - stałą dysocja¬
cji. Aby obliczyć stałą dysocjacji wody, nale¬
ży przypomnieć, że 1 mol cząsteczek wody ma
masę 18 g. Jeden litr (L) (1000 g) wody zawiera
zatem 1000 : 18 = 55,56 mol/L. Stężenie molo¬
we czystej wody wynosi więc 55,56 mol. Ponie¬
waż prawdopodobieństwo występowania wodoru
w formie jonowej wynosi 1,8 x 10-9, stężenie mo¬
lowe jonu H+ (lub jonów OH ) w wodzie oblicza
się, mnożąc prawdopodobieństwo 1,8 x 10-9 przez
stężenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik =
1,0x10-7 mol/L.
Teraz można wyliczyć wartość K dla wody:
JH+][0H"] _ [10-7] [10-7]
[H20] [55,56] “
= 0,018 x10'14 = 1,8 x10'16 mol/L
* Ściśle mówiąc, wyrażenia w nawiasach reprezentują
raczej aktywność molową niż stężenie molowe.
2. WODA I pH 11
Duże stężenie molowe wody (55,56) prawie nie
ulega zmianie w wyniku dysocjacji. Stąd wygod¬
nie jest rozpatrywać stężenie wody niezdysocjo-
wanej jako wartość stałą. Stała ta może być włą¬
czona do stałej dysocjacji K, co daje nową stałą
Kw, zwaną iloczynem jonowym wody. Zależność
między Kw i AT jest następująca:
= (K) [H20] = [H+] [0H~] =
=1,8 x 10'16 (mol/l) (55,56 mol/L) =
= 1,00 x 10'14 (mol/L)2
Stałą K wyraża się w molach na litr, a^w-w
mol2 na litr2. Z nazwy wynika, że iloczyn jonowy
Kw jest liczbowo równy iloczynowi stężeń molo¬
wych jonów H+i OH :
*w = [H+] [0H~]
W temperaturze 25°C Kw = (l O-7)2 = 10“14 (mol/L)2.
W temperaturach poniżej 25°C wartość Kw jest
mniejsza, powyżej zaś 25°C większa niż 10-14.
W temperaturze ciała ludzkiego (37°C) stężenie
H+ w wodzie jest nieco większe niż 10-7 mol/L.
W ramach ustalonych granic wpływu temperatury
wartość /fw = 10“14 (mol/L)2 dla wszystkich roz¬
tworów wodnych, nawet dla tych, które zawierają
kwasy lub zasady. W dalszej części rozdziału stała
ta będzie wykorzystywana do obliczania wartości
pH roztworów kwaśnych i zasadowych.
pH STANOWI UJEMNY LOGARYTM
STĘŻENIA JONÓW WODOROWYCH
Termin pH wprowadził w 1909 r. Sorensen, defi¬
niując pH jako ujemny logarytm stężenia jonów
wodorowych:
pH = -log [H+]
Definicja ta, aczkolwiek niezbyt ścisła*, jest
na ogół wystarczająca do celów biochemicznych.
Aby obliczyć pH roztworu, należy:
1) oznaczyć stężenie jonów wodorowych [H+],
2) obliczyć logarytm dziesiętny [H+].
pH jest ujemną wartością znalezioną w punkcie (2).
Na przykład dla czystej wody w temp. 25°C:
pH = -log [H+] = -log 10‘7 = -[-7] = 7,0
* pH = -log (aktywność Hf).
Ta wartość jest znana również jako power (jęz.
angielski), puissant (jęz. francuski), czy potennz
(jęz. niemiecki) wykładnika potęgi, stąd używa
się skrótu „p”.
Małe wartości pH odpowiadają dużym stęże¬
niom jonów H+, a duże - małym stężeniom H+.
Kwasy określa się dawcami (donorami) proto¬
nów, a zasady biorcami (akceptorami) protonów.
Wyróżnia się mocne kwasy (np. HC1, H2S04), cał¬
kowicie zdysocjowane nawet przy bardzo niskim
pH, oraz słabe kwasy, częściowo tylko dysocjują¬
ce w roztworach kwaśnych. Podobnie można wy¬
różnić mocne zasady (np. KOH, NaOH) i słabe
zasady (np. Ca(OH)2). Tylko mocne zasady są cał¬
kowicie zdysocjowane przy wysokich wartościach
pH. Większość związków organicznych w komór¬
kach to słabe kwasy. Wyjątek stanowią ufosfory-
lowane związki pośrednie, które zawierają silnie
kwasową grupę kwasu fosforowego.
Poniższe przykłady ilustrują sposób obliczania
pH roztworów kwaśnych i zasadowych:
Przykład L Jakie jest pH roztworu, w którym stę¬
żenie jonu wodorowego wynosi 3,2 x 10-4 mol/L?
pH = -log [H+]
= -log (3,2 x 10"4)
= -log (3,2)-log (KT4)
= -0,5+4
= 3,5
Przykład 2. Jakie jest pH roztworu, w któ¬
rym stężenie jonu wodorotlenowego wynosi
4,0 x 10’4mol/L?
Aby rozwiązać to zadanie, należy określić iloś¬
ciowo wartość pOH, które jest równe -log [OH-];
wartość tę można wyprowadzić z definicji Kw:
Kw = [H+] [0H~] = 10'14
zatem
log [H+] + log [OH'] = log 10'14
lub
pH + pOH = 14
A następnie:
[OH'] = 4,0 x 10'4
pOH = -log [0H“]
= -log (4,0x10'4)
= -log (4,0)-log (10'4)
= -0,60 + 4,0
= 3,4
12 2. WODA I pH
i teraz
pH = 14-pOH = 14-3,4 =10,6
Przykład 3. Jakie jest pH roztworu (a)
2,0 x 10~2 mol/L KOH, (b) 2,0 x 10"6 mol/L
KOH? W roztworach tych jony OH- pochodzą z
dwóch źródeł: KOH i wody. Ponieważ pH określa
całkowite stężenie jonów [H +] (a pOH - całkowite
[OH-]), należy obydwa źródła brać pod uwagę.
W pierwszym przypadku (a) udział wody w cał¬
kowitej puli [OH ] jest nieistotny, czego nie moż¬
na powiedzieć o drugim przypadku (b):
Stężenie
i* [mol/l]
(a)
(b)
Molowość KOH
2,0 x 10-2
2,0 x 10-6
[OH ] z KOH
2,0 x 10-2
2,0 x 10-6
[OH*] z wody
5 x 10~13
5 x 10^
Całość [OH ]
2,000 x 10-2
2,005 x 10^
* Ścisłe obliczenia powinny uwzględniać fakt, że dodanie mocnej
zasady powoduje cofanie dysocjacji cząsteczek wody. Dlatego
nawet w przypadku (b) udział jonów 0H“ pochodzących z dyso¬
cjacji wody jest mniejszy niż wynikałoby to z oszacowań, przed¬
stawionych w tabeli |przyp. tłum.].
Jeśli podejmie się decyzję o znaczeniu udziału
wody, pH można wyliczyć jak powyżej.
W przedstawionych przykładach przyjęto za¬
łożenie, że mocna zasada KOH jest w pełni zdy-
socjowana, a stężenie molowe jonów OH - równa
się stężeniu molowemu KOH. Założenie to jest
słuszne dla względnie rozcieńczonych roztwo¬
rów mocnych zasad i kwasów, lecz nie dotyczy
słabych zasad i kwasów. Ze względu na fakt, że te
słabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dy¬
socjują w roztworach, należy przed obliczeniem
całkowitego [H+] (lub całkowitego [OH-]) oraz
pH obliczyć stężenie H+ (lub stężenia OH ) z
danego stężenia molowego kwasu (lub zasady),
wykorzystując stałą dysocjacji.
aminowe lub utworzone w wyniku drugiego stop¬
nia dysocjacji kwasu fosforowego - występuje
we wszystkich białkach i kwasach nukleinowych,
w większości koenzymów oraz metabolitów po¬
średnich. Aby zrozumieć wpływ wewnątrzkomór¬
kowego pH na budowę i aktywność biochemiczną
tych związków, należy poznać sposób dysocjacji
grup funkcyjnych słabo kwaśnych i słabo zasado¬
wych. W laboratoriach badawczych i klinicznych
rozdział i identyfikacja tych związków opiera
się na znajomości przebiegu dysocjacji ich grup
funkcyjnych.
Uprotonowaną formę (HA lub RNH3 nazywa
się kwasem, a pozbawioną protonu (A lub RNH2)
- sprzężoną z nim zasadą. Podobnie można
określić zasadę (np. A" lub RNH2) i sprzężony
z nią kwas (np. HA lub RNH3) (łac. coniungere
- połączyć razem).
Przedstawicieli słabych kwasów (lewa strona),
sprzężone z nimi zasady (środek) i wartości pKa
(prawa strona) przedstawiono poniżej:
R—CH2—C00H R—CH2—C00" p/Ca = 4-5
R—CH2—NHJ R—CH2—NH2 p/Ca = 9-10
H2C03 HCO3 pKa = 6,4
H2P04- HPO42- p/Ca = 7,2
Względną moc słabych kwasów i zasad wyra¬
ża się ilościowo przez ich stałe dysocjacji, które
obrazują ich tendencje do jonizacji. Poniżej podano
wyrażenia na stałą dysocjacji (Ka) dla dwóch przed¬
stawicieli słabych kwasów: R-COOH i R-NH3
R—C00H 5=* RC00" + H+
K _ [R-C00-] [H+]
a [R—C00H]
R—NH3 5=* R-NH2 + H+
K = [R-NH2] [H+]
a [R—NHj]
Grupy funkcyjne, które oddziałuje
jak stabe kwasy, maje istotne
znaczenie fizjologiczne
Wiele związków organicznych w żywych ko¬
mórkach ma grupy funkcyjne typowe dla słabych
kwasów lub słabych zasad. Jedna lub więcej grup
funkcyjnych - głównie grupy karboksylowe,
Ponieważ wartości Ka dla słabych kwasów są
liczbami o wykładniku ujemnym, wygodniej jest
wyrażać Ka jako pKa, gdzie:
p/Ca = -log /Ca
Należy odnotować, że pKa odnosi się do Ka tak,
jak pH do stężenia H+. Mocniejsze kwasy wyka¬
zują niższe wartości pKa.
2. WODA I pH 13
Wartość p/Ca jest stosowana do wyrażania
względnej mocy kwasów i zasad. Z każdym
słabym kwasem jest sprzężona mocna zasada,
natomiast z mocną zasadą jest sprzężony słaby
kwas. Względna moc zasad jest wyrażana jako
p/Ca sprzężonych z nimi kwasów. Dla związków
poliprotonowych, zawierających więcej niż jeden
oddysocjowujący proton, pA^ dla każdego stopnia
dysocjacji opatruje się indeksem dolnym w kolej¬
ności rosnącej kwasowości. Dla dysocjacji typu
R — NHj5=*R — NH2 + H+
pKa stanowi takie pH, przy jakim stężenie kwasu
R-NH3 równa się stężeniu zasady R—NH2.
Z powyższych równań, odnoszących Ka do [H+]
i do stężenia niezdysocjowanego kwasu i sprzężo¬
nej z nim zasady, wynika, że jeśli
Zachowanie sie słabych kwasów
i buforów opisuje równanie
Hendersona-Hasselbalcha
Wartość pH roztworu zawierającego słaby kwas
jest zależna od stałej dysocjacji tego kwasu, jak
przedstawiono powyżej dla słabo kwaśnej wody.
Zależność tę opisuje, w przystępnej formie, rów¬
nanie Hendersona-Hasselbalcha, wyprowadzo¬
ne poniżej.
Słaby kwas HA dysocjuje w następujący spo¬
sób:
HA 5=± H+ + A"
Stała dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wy¬
nosi:
, [H+] [Al
[R—C00‘] = R—COOH
lub jeśli
[R—NH2] = [R—NH3]
to
Ka=[H+]
Można to wyrazić słowami: jeśli forma zasocjo-
wana (uprotonowana) i zdysocjowana (sprzężona
zasada) występują w równych stężeniach, to stę¬
żenie jonów wodorowych [H+] jest liczbowo rów¬
ne stałej dysocjacji Ka.
Jeśli obie strony powyższego równania zloga-
rytmuje się i następnie pomnoży przez -1, to
Ka=[H+]
-log/Ca =-log [H+]
Z definicji -log Ka opisuje się jako pA^a, a -log
[H+] jako pH. W związku z tym można ostatnie
równanie zapisać:
p/Ca = pH
tj. p^a grupy kwasowej jest takim pH, w którym
stężenia postaci uprotonowanej i nieuproto-
nowanej są równe. Wartość pKa kwasu moż¬
na oznaczyć doświadczalnie przez dodanie 0,5
równoważnika* zasady na równoważnik kwasu.
Powstałe w ten sposób końcowe pH będzie od¬
powiadać pA^a kwasu.
* Według układu SI pojęcie równoważnika che¬
micznego nie jest używane, jednak w tym tłumaczeniu
określenie to świadomie utrzymujemy [przyp. red. nauk.
tłum.].
Po pomnożeniu na krzyż:
[H+] [A'] = Ka [HA]
Po podzieleniu obu stron przez [A- ]
,H*1 - AT m*!
Po zlogarytmowaniu obu stron:
log [H+] = log(*M)
= log Ki + log ^
Po pomnożeniu przez -1
-log [H+] =-log/Ca - log
[HA]
[Al
Po podstawieniu zamiast -log [H+] i -log Ka
odpowiednio pH i pA^ otrzymuje się
pH = p/Ca-log|^y
Z kolei usuwa się znak minus, odwracając ostat¬
ni człon równania:
pH-p*-+i08^
Ta ostatnia forma równania, opisywana jako
równanie Hendersona-Hasselbalcha, służy do
14 2. WODA I pH
ilościowego charakteryzowania dysocjacji kwa-
sowo-zasadowej, np:
1. Kiedy kwas jest zobojętniony dokładnie
w połowie, tj. [A-] = [HA]. W tych warunkach
1A"1 1
ph = p/ca + log = p k + log- = p/Ca + 0
IHA] 1
Zatem w przypadku zobojętnienia w połowie
pH = p Ka.
2. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 100:1
pH = p/C, + log ^
pH = p/Ca + log 100/1 = p/Ca +2
3. Kiedy stosunek [A ]/[HA] wynosi 1:10
pH = p/Ca + log ~= p/Ca + H)
Jeśli równanie zastosuje się dla różnych stosun¬
ków [A~]/[HA] w zakresie 103— 10-3 i przedstawi
na wykresie wyliczone wartości pH, to otrzymany
wynik opisuje krzywą miareczkowania słabego
kwasu (ryc. 2.4).
Ryc. 2.4. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA. Czarna kropka
wskazuje p/Ca o wartości 5,0.
Roztwory słabych kwasów
i ich soli buforują PH
Roztwory słabych kwasów i sprzężonych z nimi
zasad (lub słabych zasad i sprzężonych z nimi
kwasów) wykazują zdolność buforowania, tj.
utrzymywania swojego pH na stałym poziomie.
Buforowanie jest potrzebne, ponieważ wiele re¬
akcji metabolicznych przebiega z uwalnianiem
lub pobieraniem protonów. Metabolizm tlenowy
dostarcza C02 - bezwodnika kwasu węglowego,
który przy braku buforowania powoduje ci꿬
kie kwasice. Utrzymanie stałego pH obejmuje
buforowanie przez fosforany, wodorowęglany
i białka, które pobierają lub oddają protony, unie¬
możliwiając zmianę pH. W doświadczeniach
przeprowadzonych z wykorzystaniem ekstraktów
tkankowych czy enzymów stała wartość pH jest
utrzymywana przez dodawanie takich buforów,
jak MES (kwas [2-/V-morfolino]etanosulfonowy,
pKa 6,1), nieorganiczny ortofosforan (pKa2 7,2),
HEPES (kwas N-hydroksypiperazyno-jV-etano-
sulfonowy, pKa 6,8) czy Tris (tris[hydroksyme
tylo]aminometan, pKa 8,3). Wybierając bufor,
uwzględnia się wartość pKa zależnie od pH, przy
jakim buforowanie jest wskazane.
Buforowanie można monitorować przez mia¬
reczkowanie słabego kwasu lub zasady przy uży¬
ciu pehametru (ryc. 2-4). Można również obli¬
czyć przesunięcie pH, które następuje w wyniku
dodawania kwasu lub zasady do zbuforowanego
roztworu. W przedstawionym przykładzie zbu-
forowany roztwór (mieszanina słabego kwasu
i sprzężonej z nim zasady, pKa = 5,0) wykazu¬
je początkowo jedną z czterech wartości pH.
Można obliczyć przesunięcie pH, jakie nastąpi,
jeśli zostanie dodana 0,1 mmola KOH na 1 mi-
lirównoważnik kwasu w roztworze (o stężeniu
1 mol/L).
Początkowe pH
5,00
5,37
5,60
5,86
[A-] początkowe
0,50
0,70
0,80
0,88
[HA] początkowe
0,50
0,30
0,20
0,12
[A~]/[HA] początkowe
1,00
2,33
4,00
7,33
Dodanie 0,1 mmol KOH
powoduje
[A-] końcowe
0,60
0,80
0,90
0,98
[HA] końcowe
0,40
0,20
0,10
0,02
[A~]/[HA] końcowe
1,50
4,00
9,00
49,0
log[A-]/[HA] końcowe
0,176
0,602
0,95
1,69
Końcowe pH
5,18
5,60
5,95
6,69
ApH
0,18
0,60
0,95
1,69
Należy zauważyć, że zmiana pH po dodaniu
1 mmola jonów OH zależy od początkowego pH.
Przy wartościach pH zbliżonych do pA^a roztwory
2. WODA I pH 15
buforowe utrzymują pH skuteczniej. Roztwór sła¬
bego kwasu i sprzężonej z nim zasady buforuje
najefektywniej w zakresie pH odpowiadającym
p£a±l,0.
Na rycinie 2-4 przedstawiono także ładunek
elektryczny 1 cząsteczki kwasu jako funkcję pH.
Ładunek 0,5 nie oznacza, że pojedyncza cząstecz¬
ka jest obdarzona ładunkiem ułamkowym, lecz
wyraża prawdopodobieństwo, z jakim cząsteczka
ma ładunek jednostkowy w danym czasie. Roz¬
ważanie ładunku elektrycznego makrocząsteczek
jako funkcji pH stanowi podstawę technik roz¬
działu, takich jak chromatografia jonowymienna
i elektroforeza.
Moc kwasów zależy od struktury
cząsteczkowej
Wiele kwasów o znaczeniu biologicznym zawiera
więcej niż jedną grupę dysocjującą. Obecność są¬
siadującego ujemnego ładunku hamuje uwalnia¬
nie protonu z pobliskiej grupy, podnosząc jej pKa.
Zjawisko to jest wyraźne, jeśli porównuje się war¬
tości pKa trzech dysocjujących grup kwasu fosfo-
Tabela 2.2. Względna moc wybranych kwasów o znaczeniu
biologicznym. W tabeli przedstawiono wartości p/Ca (-log stałej
dysocjacji) wybranych jedno-, dwu- i trójzasadowych kwasów
Kwasy jednozasadowe
Mrówkowy
P/Ca
3,75
Mlekowy
P*a
3,86
Octowy
pKa
4,76
Jon amonowy
PK,
9,25
Kwasy dwuzasadowe
Węglowy
p/Cai
P*a2
6,37
10,25
Bursztynowy
Ptfat
pKa2
4,21
5,64
Glutarowy
P^a1
P^a2
4,34
5,41
Kwasy trójzasadowe
P^a1
2,15
Fosforowy
P^a2
6,82
P Ki3
12,38
P*a1
3,08
Cytrynowy
pKa2
4,74
P*a3
5,40
rowego i kwasu cytrynowego (tab. 2-2). Wpływ
sąsiadującego ładunku zmniejsza się ze wzrostem
odległości. Wartość pATa2 kwasu bursztynowego,
który zawiera dwie grupy metylenowe między
jego grupami karboksylowymi, wynosi 5,6, a pK&
kwasu glutarowego - z dodatkową grupą metyle¬
nową-wynosi 5,4.
Wartości pję, zależa od właściwości
środowiska
Na wartość pKa określonej grupy funkcyjnej
w sposób istotny wpływa także środowisko.
Może ono albo podwyższać, albo obniżać pATa,
w zależności od tego, czy niezdysocjowany
kwas i sprzężona z nim zasada są obdarzo¬
ne ładunkiem. Wpływ stałej dielektrycznej na
pKa można zaobserwować po dodaniu etanolu
do wody. Wartość pKa kwasu karboksylowego
wzrasta, natomiast dla aminy maleje, ponie¬
waż etanol zmniejsza zdolność wody do roz¬
puszczania naładowanych grup. Wartości pKa
dysocjujących grup we wnętrzu białek w dużym
stopniu zależą od ich otaczającego środowiska,
w tym obecności lub braku wody.
STRESZCZENIE
• Dzięki wiązaniom wodorowym woda tworzy
skupienia cząsteczek własnych lub połączenia
z innymi donorami lub akceptorami atomów
wodoru. Wiązania wodorowe odpowiadają za
napięcie powierzchniowe, lepkość, stan ciekły
wody w temperaturze pokojowej i jej zdolność
do rozpuszczania.
• Związki, które zawierają O, N lub S mogą słu¬
żyć jako donory bądź akceptory wiązań wodo¬
rowych.
• Makrocząsteczki wymieniają powierzchniowe
wiązania wodorowe na wiązania wodorowe
z wodą.
• Entropia decyduje, że makrocząsteczki eksponu¬
ją obszary polarne do powierzchni kontaktują¬
cych się z wodą, a ukrywają regiony niepolame.
• Mostki solne, oddziaływania hydrofobowe i siły
van der Waalsa uczestniczą w utrzymaniu struk¬
tury molekularnej.
•PH stanowi ujemny logarytm stężenia [H+].
Niskie pH mają roztwory kwasowe, a wysokie
- zasadowe.
16 2. WODA I pH
• Moc słabych kwasów przedstawia się jako
wartość pKa - ujemny logarytm stałej dyso-
cjacji kwasu. Mocne kwasy wykazują niskie
wartości pKa, a słabe kwasy - wysokie.
• Bufory chronią przed zmianami pH, kiedy
w roztworze przybywa lub ubywa protonów.
Największa zdolność buforowania występuje
w zakresie pH odpowiadającym pKa±\. Fizjo¬
logiczne bufory to wodorowęglan, ortofosfo-
ran i białka.
PIŚMIENNICTWO
Reese KM: Whence came the symbol pH. Chem & Eng
News 2004;82:64.
Segel IM: Biochemical Calculations. Wiley, 1968.
Stillinger FH: Water revisited. Science 1980;209:451.
Suresh SJ, Naik VM: Hydrogen bond thermodynamic
properties of water from dielectric constant data.
J Chem Phys 2000; 113:9727.
Wiggins PM: Role of water in some biological proces-
ses. Microbiol Rev 1990;54:432.
CZĘSC I
Budowa oraz funkcje
białek i enzymów
Aminokwasy i peptydy
Peter J. Kennelly, PhD; \/ictor lV. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Oprócz dostarczania monomerycznych jednostek,
z których są syntetyzowane długie łańcuchy poli-
peptydowe białek, L-a-aminokwasy i ich pochod¬
ne uczestniczą w tak różnych funkcjach komór¬
kowych, jak przewodzenie impulsów nerwowych
czy biosynteza porfiryn, puryn, pirymidyn oraz
mocznika. Krótkie polikondensaty aminokwa¬
sów, zwane peptydarni, odgrywają ważną rolę
w układzie neuroendokrynnym jako hormony,
czynniki uwalniające hormony, neuromodulatory
czy neuroprzekaźniki (ang. neurotransmitters).
Mimo że białka zawierają tylko L-a-aminokwasy,
mikroorganizmy wytwarzają także takie peptydy,
w których skład wchodzą zarówno D-, jak i L-a-
-aminokwasy. Do peptydów mających znaczenie
terapeutyczne należą antybiotyki bacytracyna
i gramicydyna A oraz związek przeciwnowotwo-
rowy - bleomycyna. Niektóre peptydy mikroor¬
ganizmów są toksyczne. Peptydy cyjanobakterii
- mikrocystyna i nodularyna - w większych daw¬
kach powodują śmierć, natomiast niewielkie daw¬
ki wywołują powstawanie nowotworów wątroby.
Człowiek, i każdy wyżej uorganizowany orga¬
nizm zwierzęcy, jest zdolny syntetyzować jedynie
10 z 20 L-a-aminokwasów, w ilościach wystarcza¬
jących dla podtrzymania wzrostu dzieci lub utrzy¬
mania zdrowia osób dorosłych. Dieta człowieka
musi zatem zawierać odpowiednie ilości tych waż¬
nych pod względem żywieniowym aminokwasów.
WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW
Kod genetyczny określa
20 L-a-aminokwasów
Spośród 300 występujących w przyrodzie ami¬
nokwasów 20 stanowi monomeryczne jednost¬
ki białek. Chociaż trzyliterowy kod genetyczny
mógłby pomieścić więcej niż 20 aminokwasów,
jego degeneracja sprowadza dostępne kodony do
20 podstawowych L-a-aminokwasów, podanych
w tab. 3-1. Podzielono je w zależności od polar-
ności ich grupy R. W zapisie reszt aminokwaso-
wych w peptydach można stosować dwie formy
skrótów - jedno- i trzyliterową dla każdego ami¬
nokwasu (tab. 3-1). Niektóre białka zawierają do¬
datkowe aminokwasy, które są wynikiem mody¬
fikacji aminokwasów już obecnych w peptydzie.
Przykłady obejmują zamianę reszt proliny i lizyny
na reszty 4-hydroksyproliny i 5-hydroksylizyny
oraz peptydyloglutaminianu na y-karboksygluta-
minian, a także metylację, formylację, acetylację,
18 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Tabela 3-1. L-a-Aminokwasy występujące w białkach
Nazwa
Symbol
Wzór strukturalny
p/fi
P*2
P*3
Aminokwasy z alifatycznymi łańcuchami bocznymi
o-COOH
a-NH3
Grupa R
Glicyna
Gly [G]
H —CH ~COO
I
NHj
2,4
9,8
Alanina
Ala [A]
CH3 —CH — COO-
I
nhJ
2,4
9,9
Walina
Val [V]
h3cn
^CH —CH —COO-'
h3c I
nhJ
2,2
9,7
Leucyna
Leu [L]
h3c
\ _ .
CH — CH? —CH — COO“
/ I +
h3c nhJ
2,3
9,7
Izoleucyna
Ile [I]
CH3 CH2
^CH-CH —COO-
CH^ I +
nh3
2,3
9,8
Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy hydroksylowe (OH)
Seryna
Ser[S]
ch2—ch —coo
2,2
9,2
Około 13
I I
OH NH3
Treonina
Thr [T]
CH3-CH —CH —COO“
2,1
9,1
Około 13
OH NHj
Tyrozyna
Tyr[Y]
patrz niżej
Aminokwasy z tańcuchem bocznym zawierającym atomy siarki
Cysteina
Cys [C]
ch2-
-CH — COO-
1,9
10,8
8,3
I
SH
nh3
Metionina
Met [M]
ch2 — ch2-
1
- CH —COO-
|
2,1
9,3
1
s — ch3
nh3
Aminokwasy z tańcuchem bocznym zawierającym grupy kwaśne lub ich amidy
Kwas
asparaginowy
Asp [D]
—OOC — CH2 —CH — COO~
NHj
2,0
9,9
3,9
Asparagina
Asn [N]
H2N — c— CH2 — CH — COO-
II i +
o NH3
2,1
8,8
Kwas
glutaminowy
Glu [E]
“ooc — ch2— ch2—CH — coo-
I,
NHj
2,1
9,5
4,1
Glutamina
Gin [Q]
h2n— c— ch2— ch2—CH — coo-
II I
0 nh3
2,2
9,1
3. AMINOKWASY I PEPTYDY 19
cd. tab. 3-1
Nazwa
Symbol
Wzór strukturalny
pAft
P*2
P*3
Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy zasadowe
a-COOH
a-NH3+
Grupa R
Arginina
Arg [R]
h- n-ch2-ch2-ch2-ch — coó
1,8
9,0
12,5
1 + 1 .
c = nh2 nhJ
nh2
Lizyna
Lys [K]
ch2 - ch2 - CH2 - CH2 -t- ch—C0(T
1 1 +
nhJ NH3
2,2
9,2
10,8
Histydyna
His [H]
I I ch2 - ch - cocr
1,8
9,3
6,0
1 .
HN\^N NH3
Aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny
Histydyna
His [H]
patrz wyżej
Fenyloalanina
Phe [F]
^ CH; - CH — C00~
NH3ł
2,2
9,2
Tyrozyna
Tyr[Y]
HO CH; - CH - C00~
nhJ
2,2
9,1
10,1
Tryptofan
Trp [W]
n- ch2 - ch - coo-
LX7 '<*
1
H
2,4
9,4
Iminokwasy
Prolina
Pro [P]
^N^^COO-
Hj.
2,0
10,6
prenylację i fosforylację niektórych reszt amino-
kwasowych. Modyfikacje te poszerzają biologicz¬
ną różnorodność białek, zmieniając ich rozpusz¬
czalność, stabilność i oddziaływania z innymi
białkami.
Selenocysteina, 21. L-a-aminokwas?
SelenocySteina jest L-a-aminokwasem wykrywa¬
nym w niektórych białkach. Jej nazwa wskazuje,
że atom selenu zastępuje siarkę w jej strukturalnym
analogu - cysteinie. Wartość pselenocysteiny,
5,2, jest o 3 jednostki mniejsza niż dla cysteiny.
Z uwagi na fakt, że selenocysteina jest wbudo¬
wywana do polipeptydów podczas translacji, jest
ona powszechnie nazywana „21. aminokwasem”.
W przeciwieństwie jednak do pozostałych 20
aminokwasów kodowanych genetycznie, seleno¬
cysteina nie jest określona przez trzyliterowy ko-
don (patrz rozdz. 27).
W białkach występują tylko
L-a-aminokwasy
Atom węgla a wszystkich a-aminokwasów,
z wyjątkiem glicyny, jest chiralny (atom węgla
połączony z czterema różnymi podstawnika¬
mi). Chociaż niektóre aminokwasy występujące
w białkach są prawoskrętne, a niektóre lewo-
skrętne, wszystkie mają konfigurację aldehydu
L-glicerynowego, a zatem klasyfikuje się je jako
L-a-aminokwasy.
20 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Kilka wolnych L-a-aminokwasów odgrywa waż¬
ną rolę w procesach metabolicznych. Przykła¬
dem są omityna, cytrulina i argininobursztynian,
które uczestniczą w syntezie mocznika, tyrozyna
biorąca udział w tworzeniu hormonów tarczycy
i glutaminian uczestniczący w biosyntezie neuro-
transmiterów. Do D-aminokwasów występujących
w przyrodzie należą D-seryna i D-asparaginian,
które znajdują się w tkance mózgowej, D-alanina
i D-glutaminian - w ścianach komórkowych bak¬
terii Gram-dodatnich, oraz D-aminokwasy - w nie¬
których peptydach (peptydy takie nie występują
u ssaków) i pewne antybiotyki.
Cząsteczki aminokwasów mogą
wykazywać dodatni, ujemny
bądź zerowy ładunek
Naładowane i nienaładowane formy zdolnych do
jonizacji słabo kwaśnych grup —COOH i NH3
występują w roztworach w stanie równowagi re¬
akcji dysocjacji kwasowo-zasadowej:
R—COOH *=± R—C00- + H+
R—NH3 5=± R—NH2 + H+
Oba związki - R—COOH i R—NH3 - są sła¬
bymi kwasami, lecz R—COOH jest mocniejszym
kwasem niż NH3. W fizjologicznym pH (pH 7,4)
grupy karboksylowe występują prawie wyłącznie
jako R—COCT, a grupy aminowe głównie jako
R—NH3. Na rycinie 3-1 przedstawiono wpływ
pH na stan zjonizowania kwasu asparaginowego.
Cząsteczki, które zawierają jednakowe liczby zjo-
nizowanych grup o przeciwnym ładunku, a zatem
nie są obdarzone wypadkowym ładunkiem, nazy¬
wa się jonami obojnaczymi. Wolne aminokwasy
w krwi i w większości tkanek powinny być zatem
przedstawione jak we wzorze A, poniżej.
o o
A B
Struktura B nie może występować w roztwo¬
rze wodnym, ponieważ przy dostatecznie niskim
pH, przy jakim dochodzi do protonowania grupy
karboksylowej, grupa aminowa będzie występo¬
wać także w formie uprotonowanej. Podobnie,
przy pH dostatecznie wysokim, aby grupa ami¬
nowa występowała w formie nienaładowanej,
grupa karboksylowa będzie występować jako
R—COO . Wzór B stosuje się jednak często
w równaniach, w których rozważanie dysocjacji
kwasowo-zasadowej nie jest potrzebne.
Wartości vKa wyrażaia moc słabych
kwasów
Moc słabych kwasów wyraża się przez ich stałe
dysocjacji pA>. Dla cząsteczek z kilkoma oddy-
socjowującymi protonami wartość pKa dla każ¬
dej kwasowej grupy oznacza się, zastępując „a”
w indeksie dolnym cyfrą (p. tab. 3-1). Grupa imi-
dazolowa histydyny i grupa guanidynowa argini-
ny występują jako hybrydy rezonansowe z dodat¬
nim ładunkiem rozłożonym między dwa atomy
azotu (histydyna) lub wszystkie trzy atomy azotu
(arginina) (ryc. 3-2).
Wypadkowy ładunek aminokwasu - algebra¬
iczna suma wszystkich występujących dodatnio
i ujemnie naładowanych grup - zależy od warto-
V-0H
y NH3
IMH
P*1 = 2,09
(a-COOH) )— NHj
70-
'0
W mocnym kwasie pH ok. 3;
(pH poniżej 1); wypadkowy ładunek = 0
wypadkowy ładunek = +1
pH ok. 6-8;
wypadkowy ładunek = -1
W mocnej zasadzie
(pH powyżej 11);
wypadkowy ładunek = -2
Ryc. 3-1. Dysocjacja kwasowo-zasadowa kwasu asparaginowego.
3. AMINOKWASY I PEPTYDY 21
R R
/ /
H H
R
1
R
1
R
1
1
NH
1
NH
1
©NH
1
^ 1 ©
► II
c — nh2
II
c= nh2
I
c- nh2
©nh2
nh2
nh2
ffyc. 3-2. Rezonansowe hybrydy uprotonowanych form grup R
histydyny i argininy.
ści pKa jego grup funkcyjnych i od pH otaczają¬
cego środowiska. Zmiana ładunku aminokwasów
i ich pochodnych przez zmianę pH ułatwia fi¬
zyczny rozdział aminokwasów, peptydów i białek
(p. rozdz. 4).
W punkcie izoelektrycznym (pl)
cząsteczka aminokwasu nie jest
obdarzona ładunkiem
Forma izoelektryczna cząsteczki zawiera jed¬
nakowe liczby dodatnich i ujemnych ładunków,
a zatem jest elektrycznie obojętna. Punkt izo-
elektryczny (pi) jest to wartość pH równa średniej
arytmetycznej wartości pKa form znajdujących
się po obydwu stronach formy izoelektrycznej.
W przypadku aminokwasu, np. alaniny, zawiera¬
jącego tylko dwie grupy zjonizowane nie ma nie¬
jasności w wyliczeniu pi. Pierwsza wartość pKa
(R—COOH) wynosi 2,35, a druga pKa (R—NH3)
9,69. W ten sposób punkt izoelektryczny alaniny
wynosi:
■ _ p/Ci + pK2 __ 2,35 -i- 9,69 _ g ^
P 2 2
Dla kwasów wielofunkcyjnych pi także jest
wartością pH równą średniej arytmetycznej war¬
tości pKa form po obu stronach formy izoelek¬
trycznej (jonu obojnaczego). Na przykład pi kwa¬
su asparaginowego wynosi:
■ _ pK] + pK2 _ 2,09 + 3,96 _ « n9
Dla lizyny pi wylicza się ze wzoru:
| _ P^2 + P^3
P 2
Podobne rozważania stosuje się do wszystkich
kwasów poliprotonowych (np. białek), niezależ¬
nie od liczby obecnych grup zdysocjowanych.
W laboratorium klinicznym znajomość wartości
pi jest niezbędna do wyboru warunków rozdzia¬
łów elektrycznych. Na przykład elektroforeza
w pH 7,0 pozwoli rozdzielić dwie cząsteczki
o wartościach pi 6,0 i 8,0, ponieważ w pH 7,0 czą¬
steczka z pi = 6,0 będzie mieć ładunek ujemny,
a ta z pi = 8,0 - ładunek dodatni. Podobne roz¬
ważania można stosować dla zrozumienia zasad
chromatograficznych rozdziałów na złożach jono¬
wych, takich jak DEAE-celuloza (p. rozdz. 4).
Wartości pIQ zależa od otoczenia
Otoczenie dysocjującej grupy wpływa na jej pKa.
Wartości pKa grup R wolnych aminokwasów
w roztworze wodnym (p. tab. 3-1) dostarczają tyl¬
ko przybliżonych wskazówek co do pKa tych sa¬
mych aminokwasów, kiedy występują w białkach.
Środowisko polarne faworyzuje naładowaną for¬
mę (R—COO~ lub R—NH3), a środowisko niepo-
lame - nienaładowaną (R—COOH lub R—NH2).
W ten sposób niepolame środowisko podnosi war¬
tość pKa grupy karboksylowej (czyniąc ją słabszym
kwasem), ale obniża pKa grupy —NH3 (czyniąc ją
mocniejszym kwasem). Obecność przylegających
naładowanych grup może sprzyjać lub przeciw¬
działać wpływom rozpuszczalnika. pKa grupy
funkcyjnej będzie zatem zależeć od jej lokalizacji
w cząsteczce danego białka. Różnice w pKa mogą
wynosić nawet pełne jednostki pH (p. tab. 3-2).
Tabela 3-2. Typowy zakres wartości pK dla zjonizowanych grup
w białkach
Grupa dysocjująca
Zakres $K
a-Karboksylowa
3,5-4,0
Nie a-karboksylowa Asp czy Glu
4,0-4,8
Imidazolowa
6,5-7,4
—SH Cys
8,5-9,0
—OH Tyr
9,5-10,5
d-Aminowa
8,0-9,0
e-Aminowa Lys
9,8-10,4
Guanidynowa Arg
-12,0
22 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Wartości pktóre odbiegają od „wartości typo¬
wych” niekiedy aż o 3 jednostki pH, są charak¬
terystyczne dla centrów aktywnych enzymów.
Krańcowy przykład dotyczy kwasu asparagino¬
wego ukrytego w cząsteczce tioredoksyny, dla
którego wartość pKa wynosi ponad 9, a zatem róż¬
nica przekracza 6 jednostek pH!
Rozpuszczalność aminokwasów
odzwierciedla ich charakter jonowy
Naładowane grupy funkcyjne aminokwasów
gwarantują, że aminokwasy rozpuszczają się
z łatwością w rozpuszczalnikach polarnych, ta¬
kich jak woda i etanol, lecz nie rozpuszczają się
w rozpuszczalnikach niepolamych, takich jak
benzen, heksan czy eter.
Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego,
a zatem są bezbarwne. Tyrozyna, fenyloalanina,
a w szczególności tryptofan absorbuj ąjednak świat¬
ło nadfioletowe (250-290 nm). A zatem to głównie
tryptofan warunkuje zdolność większości białek do
absorpcji światła o długości fali 280 nm.
Grupy R przy atomie węgla a określają
właściwości aminokwasów
Ponieważ glicyna, najmniejsza z aminokwasów,
może „wpasować” się w miejsca niedostępne
dla innych aminokwasów, więc często występuje
w obszarach, gdzie peptydy ulegają silnemu zwi¬
nięciu. Hydrofobowe grupy R alaniny, waliny,
leucyny i izoleucyny oraz aromatyczne grupy R
fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu występują
głównie wewnątrz białek cytozolowych. Nałado¬
wane grupy R aminokwasów zasadowych i kwaso¬
wych stabilizują specyficzne konformacje białek
poprzez oddziaływania jonowe, tzw. mostki solne.
Wiązania te uczestniczą w układach „przekazywa¬
nia ładunku” (ang. „charge relay”) podczas katali¬
zy enzymatycznej i transportu elektronów w łań¬
cuchu oddechowym. Histydyna odgrywa wyjąt¬
kową rolę podczas katalizy enzymatycznej. War¬
tość pKa grupy imidazolowej pozwala jej działać
w obojętnym pH jako katalizator zasadowy lub
kwasowy. Pierwszorzędowa grupa alkoholowa
seryny i pierwszorzędowa grupa tiolowa (—SH)
cysteiny są doskonałymi czynnikami nukleofilo-
wymi i pełnią taką funkcję podczas katalizy en¬
zymatycznej. Drugorzędowa grupa alkoholowa
treoniny, choć jest dobrym czynnikiem nukleo-
filowym, nie pełni jednak analogicznej funkcji
katalitycznej. Grupy —OH seryny, tyrozyny i tre¬
oniny także uczestniczą w regulacji aktywności
enzymów, których działanie katalityczne zależy
od stanu ufosforylowania tych aminokwasów.
GRUPY FUNKCYJNE AMINOKWASÓW
WARUNKUJĄ ICH REAKCJE CHEMICZNE
Każda grupa funkcyjna aminokwasu ma zdolność
uczestniczenia we wszystkich charakterystycz¬
nych dla niej reakcjach chemicznych. Dla grup
karboksylowych reakcje te obejmują tworzenie
estrów, amidów i bezwodników kwasowych, dla
grupy aminowej - acylację, amidację i estryfika-
cję, a dla grup —SH i —OH - oksydację i estry-
fikację. Najważniejszą reakcją aminokwasów jest
tworzenie wiązania peptydowego (obszar zaciem¬
niony).
Alanylo- cysteinylo- walina
Sekwencja aminokwasowa określa
strukturą pierwszorzędowa
Liczba i kolejność wszystkich reszt aminokwaso-
wych w peptydzie określa jego strukturę pierw-
szorzędową. Jednostki aminokwasów występujące
w peptydach nazywa się resztami aminokwaso-
wymi i podaje ich nazwy, zamieniając końcówkę
nazwy wolnego aminokwasu -yna {-ina) na -yl
(np. alany/, asparty/, tyrozyl). Nadając nazwy pep-
tydom, traktuje się je jako pochodne C-końcowej
reszty aminokwasowej. Na przykład Lys-Leu-
-Tyr-Gln nosi nazwę liz^/o-leucy/o-tyroz^/o-gluta-
mina. Końcówka -ina glutaminy wskazuje, że a-
-karboksylowa grupa tego aminokwasu nie jest za¬
angażowana w tworzenie wiązania peptydowego.
Wzory peptydów można
przedstawić w prosty sposób
Przedrostki takie, jak tri- i okta- oznaczają pep¬
tydy zbudowane, odpowiednio, z trzech i ośmiu
3. AMINOKWASY I PEPTYDY 23
reszt aminokwasowych, a nie te z trzema czy
ośmioma wiązaniami peptydowymi. Umownie
peptydy zapisuje się w taki sposób, że ich wolna
grupa aminowa znajduje się po lewej stronie. W ce¬
lu przedstawienia struktury peptydu, najpierw ry¬
suje się jego główny łańcuch - szkielet - jako zyg¬
zak. Następnie dodaje się kolejno atomy łańcucha
głównego, które pojawiają się w powtarzającej
się sekwencji: atom azotu grupy —NH, atom
węgla a, atom węgla grupy karbonylowej. Potem
dopisuje się atomy wodoru do każdego atomu
węgla a i do każdego atomu azotu tworzącego
wiązanie peptydowe oraz atom tlenu grupy karbo¬
nylowej. Na końcu dodaje się właściwe grupy R
(obszar zaciemniony) do każdego atomu węgla a.
J C Ca N C
W V V
tydy wytwarzane przez grzyby, bakterie i niższe
zwierzęta mogą zawierać niebiałkowe amino¬
kwasy. Antybiotyki tyrocydyna i gramicydyna S
są cyklicznymi peptydami, które zawierają D-fe-
nyloalaninę i omitynę. Siedmiopeptydowe opiaty
- dermorfina i deltoforyna, występujące w skórze
południowoamerykańskich żab drzewnych, za¬
wierają D-tyrozynę i D-alaninę.
CHo *
I
ch2 H
I I
-CH\ /N'
c
ch2
I
H — C —NH3
I
o h3c h
II \/
HoN
H
N C00"
• \ /
^CH2
OH
Trzyliterowe skróty połączone prostymi kres¬
kami przedstawiają jasno strukturę pierwszorzę-
dową peptydu. Kreski te pomija się w skrótach
jednoliterowych.
Glu-Ala-Lys-Gly-Tyr-Ala
E A K G Y A
Niektóre peptydy zawierają nietypowe
aminokwasy
U ssaków hormony peptydowe zwykle zawiera¬
ją tylko a-aminokwasy (takie, które występują
w białkach) połączone standardowymi wiązania¬
mi peptydowymi. Niektóre peptydy mogą jednak
zawierać niebiałkowe aminokwasy, ich pochodne,
czy aminokwasy połączone nietypowym wiąza¬
niem peptydowym. Na przykład A-końcowy kwas
glutaminowy glutationu, uczestniczącego w fał¬
dowaniu białek i w metabolizmie ksenobiotyków
(p. rozdz. 52), wiąże się z cysteiną wiązaniem
nie-a-peptydowym (ryc. 3-3). A-Końcowa reszta
kwasu glutaminowego - hormonu uwalniającego
tyreotropinę (TRH) - ulega cyklizacji do reszty
kwasu piroglutaminowego, a grupa karboksylowa
C-końcowej reszty proliny ulega amidacji. Pep-
Ryc. 3-3. Glutation (y-glutamylocysteinyloglicyna). Glu i Cys łą¬
czy nie-a-peptydowe wiązanie.
Peptydy sa polielektrolitami
Wiązanie peptydowe nie ma ładunku w żadnym
środowisku odpowiadającym fizjologicznemu
pH. Powstawaniu peptydów z aminokwasów
towarzyszy utrata jednego ładunku dodatniego
i jednego ujemnego na jedno tworzone wiązanie
peptydowe. Peptydy w fizjologicznym pH są jed¬
nak obdarzone ładunkiem elektrycznym dzięki
ładunkom ich końcowych grup - karboksylowej
i aminowej, oraz kwaśnych i zasadowych grup R,
jeżeli takowe występują. Podobnie jak w przy¬
padku aminokwasów wypadkowy ładunek (netto)
peptydu zależy od pH otaczającego go środowi¬
ska i od wartości pAa jego dysocjujących grup.
Wiazania peptydowe maja częściowo
charakter wiazania podwójnego
Chociaż we wzorach strukturalnych peptydów
występuje pojedyncze wiązanie między atomami
węgla grupy karbonylowej i azotu grupy N—H,
w rzeczywistości to wiązanie ma częściowo cha¬
rakter podwójnego wiązania:
o 0"
II I
H H
24 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Brak tutaj swobody rotacji wokół wiązania,
które łączy atom węgla grupy karbonylowej
i atom azotu wiązania peptydowego. Wskutek
tego wszystkie cztery atomy (kolorowe) przed¬
stawione na ryc. 3-4 są koplaname. Wymuszone
usztywnienie wiązania peptydowego ma poważ¬
ny wpływ na uporządkowanie struktur wyższego
rzędu białek. Kółka ze strzałkami (ryc. 3-4) ozna¬
czają wiązania pozwalające na swobodną rotację
pozostałych wiązań szkieletu polipeptydowego.
Ryc. 3-4. Wymiary w pełni rozciągniętego łańcucha polipepty¬
dowego. Cztery zielone atomy są koplanarne. Niezacienione są:
atom węgla a, atom wodoru przy tym atomie węgla i grupa a-R
określonego aminokwasu. Rotacja swobodna zachodzi wokół
wiązań łączących atom węgla a z atomem azotu grupy N—H
i atomem węgla grupy karbonylowej (zielone grube strzałki).
Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy stanowi więc strukturę
półsztywną, w której 2/3 atomów jego szkieletu jest utrzymy¬
wanych w stałych wzajemnych powiązaniach płaszczyzno¬
wych. Odległość między przyległymi atomami węgla a wynosi
0,36 nm. Podano również odległości międzyatomowe i kąty
między wiązaniami, które nie są równoważne. (Przerysowano
i reprodukowano za zgodą z: L Pauling, L-P Corey, HR Branson:
Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide
Chain. Proc Natl Acad Sci USA 1951; 37: 205).
Konformacje peptydów sa wymuszane
przez siły niekowalencyjne
Fałdowanie łańcucha peptydowego prawdopo¬
dobnie przebiega jednocześnie z jego biosyntezą
(p. rozdz. 38). Fizjologicznie aktywna konfor¬
macja peptydu odzwierciedla łączny udział sek¬
wencji aminokwasowej, zawady przestrzennej
i oddziaływań niekowalencyjnych (np. wiązania
wodorowe, oddziaływania hydrofobowe) między
resztami aminokwasowymi. Na ogół konformacje
zawierają prawoskrętne a-helisy i struktury P-ar-
kuszy (p. rozdz. 5).
ANALIZA SKŁADU AMIN0KWAS0WEG0
MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
W celu określenia jakościowego i ilościowego
składu aminokwasowego w próbce materiału
biologicznego, w pierwszej kolejności należy
przeprowadzić hydrolizę wiązań peptydowych, łą¬
czących aminokwasy, działając gorącym HC1. Po¬
wstałą mieszaninę wolnych aminokwasów traktu¬
je się następnie 6-aminochinolino-A^-hydroksybur-
sztynyloimidokarbaminianem, reagującym z ich
grupami a-aminowymi. W wyniku reakcji tworzą
się fluorescencyjne pochodne, które następnie roz¬
dziela się i identyfikuje za pomocą wysokociśnie¬
niowej chromatografii cieczowej (p. rozdz. 4).
Do wykrywania aminokwasów jest także po¬
wszechnie stosowana ninhydryna; tworzy ona
purpurowe produkty z a-aminokwasami, a żółte
związki addycyjne - z grupami iminowymi prób¬
ny i hydroksyproliny.
STRESZCZENIE
• W przyrodzie występują zarówno D-aminokwa-
sy, jak i aminokwasy z grupą nie-a-aminową,
lecz w białkach występują wyłącznie L-a-ami-
nokwasy.
• Wszystkie aminokwasy mają przynajmniej
dwie słabo kwaśne grupy funkcyjne, R-NHj
i R-COOH. Wiele aminokwasów zawiera po¬
nadto słabo kwaśne grupy funkcyjne, takie jak:
—OH, —SH, guanidynowa czy imidazolowa.
• Wartości pKa wszystkich grup funkcyjnych ami¬
nokwasów decydują o ich wypadkowym ładun¬
ku (netto) przy danym pH. Punkt izoelektrycz-
ny - pi - stanowi pH, przy jakim aminokwas
nie wykazuje żadnego ładunku i nie porusza się
w polu elektrycznym.
• Najważniejszą reakcją biochemiczną amino¬
kwasów jest tworzenie wiązania peptydowego.
• Grupy R aminokwasów określają ich specyficz¬
ne funkcje biochemiczne. Właściwości grup R
stały się podstawą klasyfikacji aminokwasów
na zasadowe, kwaśne, aromatyczne, alifatyczne
czy zawierające siarkę.
• O nazwie peptydów decyduje liczba występują¬
cych w nich aminokwasów oraz fakt, że są one
pochodnymi C-końcowych reszt aminokwa-
sowych. Strukturę pierwszorzędową peptydu
3. AMINOKWASY I PEPTYDY 25
stanowi jego sekwencja aminokwasowa, rozpo¬
czynająca się od N-końcowej reszty aminokwa-
sowej.
• Charakter częściowo podwójnego wiązania łą¬
czącego atom węgla grupy karbonylowej i atom
azotu grupy N—H powoduje koplanamość
czterech atomów wiązania peptydowego i ogra¬
nicza liczbę możliwych konformacji peptydu.
PIŚMIENNICTWO
Doolittle RF: Reconstructing history with amino acid
seąuences. Protein Sci 1992; 1:191.
Gladyschev VN, HatfieldDL: Selenocysteine-containing
proteins in mammals. J Biomed Sci 1999;6:151.
Kreil G: D-Amino acids in animal peptides. Annu Rev
Biochem 1997;66:337.
Nokihara K, Gerhardt J: Development of an improved
automated gas-chromatographic chiral analysis sy¬
stem: application to non-natural amino acids and na-
tural protein hydrolysates. Chirality 2001; 13:431.
Sanger F: Seąuences, seąuences, and seąuences. Annu
Rev Biochem 1988;57:1.
Stadtman TC: Selenocysteine. Annu Rev Biochem 1996;
65:83.
Wilson NA et al: Aspartic acid 26 in reduced Escheri-
chia coli thioredoxin has a pKa greater than 9. Bio-
chemistry 1995;34:8931.
Białka: określanie
struktury pierwszorzędowej
Peter J. Kennelly, PhD; I/ictor W. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Białka są pod względem fizycznym i funkcjonal¬
nym złożonymi makrocząsteczkami, które pełnią
wiele nadzwyczaj ważnych funkcji. Wewnętrzna
sieć białek tworząca cytoszkielet (rozdz. 48) za¬
pewnia komórce kształt oraz spójność fizyczną.
Filamenty aktyny i miozyny tworzą aparat kurcz¬
liwy mięśni (rozdz. 48). Hemoglobina transportu¬
je tlen (rozdz. 6), natomiast krążące przeciwciała
wyszukują obcych „napastników” (rozdz. 49).
Z kolei enzymy katalizują reakcje, które wytwa¬
rzają energię, syntetyzują i degradują biomole-
kuły, replikują i transkrybują geny, przetwarzają
mRNA itp. (rozdz. 7). Receptory umożliwiają ko¬
mórkom reakcję i odpowiedź na różne hormony
oraz inne czynniki środowiskowe (rozdz. 41 i 42).
Białka ulegają wielu fizycznym i chemicznym
przemianom, które odzwierciedlają cykl życio¬
wy organizmu. Typowe białko powstaje w pro¬
cesie translacji (rozdz. 37), dojrzewa w procesach
potranslacyjnych, takich jak częściowa proteoliza
(rozdz. 9 i 37), oscyluje między stanem aktywnym
i spoczynkowym poprzez oddziaływania z czynni¬
kami regulacyjnymi (rozdz. 9), starzeje się wskutek
utleniania, deamidacji itp. (rozdz. 51) i wreszcie
ginie rozkładane do swoich składników budul¬
cowych, tj. aminokwasów (rozdz. 29). Ważnym
celem medycyny molekularnej jest rozpoznanie
białek i tych procesów w cyklu ich życia, których
obecność, brak bądź upośledzenie jest związane
z określonym stanem fizjologicznym lub choroba¬
mi (ryc. 4-1). Sekwencja reszt aminokwasowych
białka stanowi zarówno molekularny „odcisk pal-
tv# *' fu>łrsx.'hny utetttyfikstoji* jstk i mfimtM-
która może być wykorzystana do klonowania
\m\ (\ub aauąwA V-.- V * \ u
genu (lub genów) kodujących to białko.
BIAŁKA I PEPTYDY MUSZA ZOSTAĆ
OCZYSZCZONE PRZED ANALIZA
Białka poddawane szczegółowej analizie w celu
określenia ich fizycznych i czynnościowych
właściwości muszą się charakteryzować wyso¬
kim stopniem czystości. Komórki zawierają ty¬
siące różnych białek, w ilościach różniących się
w bardzo dużym zakresie, dlatego wyizolowanie
określonego białka w ilości wystarczającej do
analizy jest ogromnym wyzwaniem, wymagają¬
cym stosowania wielu różnych technik. Klasycz¬
ne metody oczyszczania wykorzystują różnice
we względnej rozpuszczalności poszczególnych
białek przy różnych wartościach pH (strącanie
izoelektryczne), polamości (strącanie acetonem
lub etanolem) czy stężenia soli (wysalanie siar¬
czanem amonu). Rozdział chromatograficzny
opiera się na podziale cząsteczek białek między
dwie fazy, ruchomą oraz stacjonarną. Fazą stacjo¬
narną, czyli tzw. złożem, w przypadku rozdziału
aminokwasów lub cukrów może być pasek bibuły
filtracyjnej (chromatografia bibułowa) bądź cien¬
ka warstwa celulozy, krzemionki lub tlenku glinu
(chromatografia cienkowarstwowa, ang. thin lay-
er chromatography, TLC).
Chromatografia kolumnowa
Chromatografia kolumnowa białek wykorzystuje
jako fazę stacjonarną upakowane w kolumnę małe
kuliste ziarna zmodyfikowanej celulozy, akryla-
midu lub krzemionki, której powierzchnia została
pokryta chemicznymi grupami funkcyjnymi. Zło-
ż.ł fazy stacjonarnej oddziałują z białkami dzięki
ich ładunkowi, hydrofobowości i zdolności do
>\ \ tUOWMu
wiązania ligandów. Mieszanina białek jest nakła-
4. BIAŁKA: OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ 27
Val C_J
2. Zwijanie
Gin
Phe
Asp
Met
. Synteza
T,P Gly Phe His
Pro Lys Ala
Val
Gin
Phe
Asp
Met
7. „Starzenie”
(tj. utlenianie,
deamidacja,
denaturacja)
( \
3. Przetwarzanie
Ol
SH O
. SH O .
1 ł
. o]
\
2H+ 2e"
1
Met-Asp-Phe-Gln-Val
T
Kataliza
Produkty Substraty
,S o
4. Modyfikacje
potranslacyjne
(np. acyiacja
kwasami
ttuszczowymi)
Ub
Ub
8. Ubikwitynacja
s' O
o
*
O
6. Aktywacja
5. Translokacja
O
Ryc. 4-1. Schemat cyklu życiowego hipotetycznego białka. (1) Jego cykl życia zaczyna się od syntezy na rybosomie łańcucha poli-
peptydowego, którego sekwencja dyktowana jest przez mRNA. (2) W miarę postępowania syntezy polipeptyd zaczyna się zwijać (tj.
fałdować) do swojej natywnej konformacji (kolor jasny). (3) Zwijaniu mogą towarzyszyć procesy modyfikacji, takie jak proteolityczne
odcięcie A/-końcowej sekwencji sygnałowej lub tworzenie wiązań disiarczkowych (S—S). (4) Następne modyfikacje kowalencyjne
mogą prowadzić do np. przyłączenia cząsteczki kwasu tłuszczowego w celu przemieszczenia (5) modyfikowanego peptydu do błony
komórkowej. (6) Wiązanie efektorów allosterycznych (ciemny okrąg) może powodować przyjęcie konformacji katalitycznie aktywnej.
(7) Z upływem czasu białka ulegają niszczeniu pod wpływem ataku chemicznego, deamidacji lub denaturacji i mogą być oznakowane
(8) przez kowalencyjne przyłączenie cząsteczek ubikwityny (Ub). (9) Ubikwitynowane białko jest następnie degradowane do swoich
składowych aminokwasów, które mogą być wykorzystane do syntezy nowych białek.
dana na kolumnę, która następnie jest przemywa¬
na ciekłą fazą ruchomą. Wypłukiwana z kolumny
faza ruchoma, czyli eluat, jest zbierana w małych
porcjach (ryc. 4-2).
Rozdział chromatograficzny
Rozdział na kolumnie chromatograficznej zależy
od względnego powinowactwa różnych białek do
danej fazy stacjonarnej oraz fazy ruchomej. Aso¬
cjacja między każdym białkiem a złożem kolum¬
ny jest słaba i nietrwała. Białka, które oddziałują
silniej z fazą nieruchomą są zatrzymywane na ko¬
lumnie dłużej. Czas, przez jaki dane białko utrzy¬
muje się w fazie stacjonarnej, jest funkcją składu
zarówno złoża, jak i fazy ciekłej. Optymalnego
rozdziału analizowanych białek można zatem do¬
konać, dobierając starannie skład obu faz.
Filtracja żelowa
Chromatografia pozwalająca na rozdział cząste¬
czek na podstawie ich rozmiaru (ang. size exclu-
sion chromatography), znana także pod nazwami
sączenia molekularnego (ang. molecular sieving)
lub filtracji żelowej (ang. gel filtration), rozdzie¬
la białka w oparciu o ich promienie Stokesa, tj.
efektywne promienie kul, za jakie można uznać
cząsteczki białka migrujące w roztworze. Promień
Stokesa jest funkcją masy cząsteczkowej oraz
kształtu cząsteczki. Przemieszczające się wydłu¬
żone białko zajmuje większą objętość niż białko
o tej samej masie, lecz o kształcie sferycznym.
W filtracji żelowej jako złoże wykorzystuje się
kuliste porowate ziarna (ryc. 4-3), których pory
stanowią analogię do zatoczek wzdłuż brzegu
rzeki. Gdy obiekty poruszające się z nurtem rzeki
wejdą do zatoczek, są zatrzymywane dopóty, do¬
póki z powrotem nie zdryfują do głównego nurtu.
Podobnie białka o promieniach Stokesa zbyt du-
28 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
c
Ryc. 4-2. Schemat prostego układu do
chromatografii cieczowej. R - zbiornik
fazy ciekłej przedostającej się na kolum¬
nę dzięki sile grawitacji lub za pomocą
pompy, C - kolumna ze szkła lub two¬
rzywa sztucznego zawierająca złoże,
F - kolektor frakcji służący do zbierania
poszczególnych porcji (frakcji) wypłu¬
kiwanej fazy ciekłej, czyli eluatu.
żych, aby wejść w pory (białka „odrzucone”, ang.
excluded proteins), pozostają w głównym stru¬
mieniu fazy ciekłej i są wypłukiwane wcześniej
niż białka, które mogą się zatrzymać w porach
(białka „wchłonięte”, ang. included proteins).
W ten sposób białka są wypłukiwane podczas fil¬
tracji żelowej w kolejności malejących promieni
Stokesa.
Chromatografia adsorpcyjna
W przypadku chromatografii adsorpcyjnej
mieszanina białek jest nakładana na kolumnę
w warunkach umożliwiających tak ścisłą aso¬
cjację analizowanego białka ze złożem, że jego
współczynnik podziału między fazę stacjonarną
i ruchomą osiąga bardzo dużą wartość, natomiast
niezaadsorbowane cząsteczki są wypłukiwane
i odrzucane. Związane białka są następnie stop¬
niowo uwalniane wskutek rozrywania sił, które
stabilizują kompleksy białka z fazą stacjonar¬
ną, co odbywa się najczęściej dzięki stworzeniu
gradientu rosnącego stężenia soli. Skład fazy cie¬
kłej jest stopniowo zmieniany, tak że cząsteczki
są uwalniane wybiórczo, w porządku zależnym
od ich powinowactwa do złoża.
Chromatografia jonowymienna
W chromatografii jonowymiennej białka oddzia¬
łują ze złożem na skutek interakcji ładunków.
Białka obdarzone całkowitym ładunkiem dodat¬
nim, przy danym pH, przylegają do złoża z ujem¬
nie naładowanymi grupami funkcyjnymi, takimi
jak grupy karboksylowe lub siarczanowe (wy¬
mieniacze kationów). Podobnie, białka o ładunku
ujemnym przylegają do ziaren złoża z dodatnio
naładowanymi grupami funkcyjnymi, takimi jak
4. BIAŁKA: OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ 29
Ryc. 4-3. Filtracja żelowa. A - mieszanina dużych (oznaczonych jako romby) oraz małych (okręgi)
cząsteczek jest nakładana na kolumnę do filtracji żelowej: B - podczas wnikania do kolumny małe
cząsteczki wchodzą w pory złoża, a duże cząsteczki je omijają; C - gdy faza ruchoma spływa w dół
kolumny, duże cząsteczki, które ominęły złoże spływają razem z nią, podczas gdy cząsteczki małe, które
tymczasowo ulokowały się w porach osłoniętych od głównego nurtu, pozostają za nimi daleko w tyle
i są wypłukiwane na końcu.
aminy trzecio- lub czwartorzędowe (wymieniacze
anionów). Białka będące polianionami współ¬
zawodniczą z anionami jedno wartościowymi
o miejsca wiązania ze złożem, stąd określenie
„wymiana jonowa”. Na przykład białka wiążą
się z dietyloaminoetylocelulozą (DEAE-celulozą)
poprzez zastępowanie konkurencyjnych jonów
(zazwyczaj CE lub CH3COO ), które zobojętniają
uprotonowane aminy. Związane białka są następ¬
nie selektywnie uwalniane w wyniku stopniowe¬
go zwiększania stężenia jonów jednowartościo-
wych, znajdujących się w fazie ciekłej. Białka są
wypłukiwane w odwrotnej kolejności, w stosunku
do siły ich oddziaływań z fazą stacjonarną.
Ponieważ całkowity ładunek białka zależy od
pH (por. rozdz. 3), stopniowe wymywanie kolej¬
nych białek można przeprowadzić, zmieniając pH
fazy ciekłej. Białko może być zatem poddawane
kolejnym cyklom chromatografii jonowymiennej
w rozmaitych pH i przy różnej sile jonowej.
Chromatografia oddziaływań
hydrofobowych
W chromatografii oddziaływań hydrofobowych
do rozdzielania białek wykorzystuje się ich różną
tendencję do asocjacji z fazą stacjonarną pokrytą
grupami hydrofobowymi (np. fenylo-Sefaroza,
oktylo-Sefaroza). Białka, które eksponują swoje
powierzchnie hydrofobowe, przylegają do złoża
dzięki oddziaływaniom hydrofobowym, które są
wzmacniane przez ruchomą fazę ciekłą o wyso¬
kiej sile jonowej. Białka niewiążące się z podło¬
żem są wymywane w pierwszej kolejności. Na¬
stępnie stopniowo obniża się stężenie soli w fazie
ruchomej. Jeśli oddziaływania między białkiem
i fazą stacjonarną są szczególnie silne, do osła¬
bienia oddziaływań można zastosować dodatek
etanolu lub glicerolu do fazy ruchomej.
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa opiera się na wy¬
sokiej specyficzności oddziaływań białek z ich
Ugandami. Enzymy można oczyszczać za pomo¬
cą chromatografii powinowactwa, z wykorzysta¬
niem unieruchomionych substratów, produktów,
koenzymów lub inhibitorów. Teoretycznie, tylko
te białka, które oddziałują z unieruchomionym li-
gandem wiążą się ze złożem. Związane białka są
następnie wypłukiwane albo w wyniku współza¬
wodnictwa o Ugand znajdujący się w roztworze,
albo - mniej selektywnie - poprzez niszczenie
oddziaływań białko-ligand za pomocą moczni-
30 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
ka, chlorowodorku guanidyny, niskiego pH lub
wysokiego stężenia soli. Złoża fazy stacjonarnej
dostępne w handlu zawierają Ugandy, takie jak
NAD+ lub analogi ATP. Wśród najbardziej wy¬
dajnych i powszechnie stosowanych złóż powino¬
wactwa znajdują się złoża stosowane do oczysz¬
czania odpowiednio zmodyfikowanych białek
rekombinowanych. Do takich złóż należy żywica
zawierająca jony Ni2+, wiążąca białka zawierające
przyłączoną „metkę” polihistydynową* oraz zło¬
że glutationowe, wiążące białko rekombinowane
połączone z S-transferazą glutationową.
Peptydy są oczyszczane za pomocą
wysokociśnieniowej chromatografii
cieczowej w odwróconym układzie faz
Złoża fazy stacjonarnej używane w tradycyjnych
kolumnach chromatograficznych mają charakter
materiałów gąbczastych, których zdolności kom-
presyjne ograniczają szybkość przepływu fazy
ruchomej. W wysokociśnieniowej chromatografii
cieczowej (ang. High Pressure Liquid Chromato-
graphy, HPLC) jako fazę stacjonarną wykorzystu¬
je się nieściśliwą krzemionkę lub mikroziarenka
tlenku glinu przy ciśnieniu rzędu do kilku tysięcy
psi [ang. pound per square inch, funt na cal kwa¬
dratowy, tj. kilkunastu MPa -przyp. tłum.].
Nieściśliwe złoża umożliwiają osiągnięcie za¬
równo szybszego przepływu, jak i lepszej roz¬
dzielczości. Za pomocą HPLC można rozdzielić
złożone mieszaniny lipidów lub peptydów, któ¬
rych właściwości różnią się tylko nieznacznie.
W HPLC w odwróconym układzie faz** wy¬
korzystuje się hydrofobowe złoże zawierające
alifatyczne łańcuchy o długości od 3 do 18 ato¬
mów węgla. Mieszaniny peptydów są wymywane
w oparciu o gradient stężenia rozpuszczalnika or¬
ganicznego mieszalnego z wodą, jak np. acetoni-
trylu lub metanolu.
* Tak zwana „żywica niklowa” wiąże białka za¬
wierające sekwencję sześciu reszt histydynowych, tj.
metkę „His-tag”, umieszczonych albo na A-końcu, albo
C-końcu rekombinowanego białka, otrzymywanego po¬
przez ekspresję z plazmidu zawierającego sekwencję
DNA białka z dołączoną dodatkowo sekwencją dla met¬
ki „His-tag” [przyp. tłum.].
** „Odwrócony układ faz” oznacza obecność fazy
stacjonarnej mniej polarnej niż ruchoma faza ciekła, tj.
eluent [przyp. tłum.].
Czystość białka jest określana za pomocą
elektroforezy w żelu poliakrylamidowym
Najczęściej stosowaną metodą określania czysto¬
ści preparatu białka jest elektroforeza w żelu po¬
liakrylamidowym (ang. polyacrylamide gel elec-
trophoresis, PAGE), często prowadzona w obec¬
ności anionowego detergentu, dodecylosiarczanu
sodu (ang. sodium dodecyl sulphate, SDS) i wów¬
czas nazywana SDS-PAGE. Rozdział elektrofo-
retyczny opiera się na różnicach szybkości po¬
ruszania się naładowanych biomolekuł w polu
elektrycznym. Do elektroforezy SDS-PAGE wy¬
korzystuje się akrylamid, który ulega polimeryza¬
cji oraz sieciowaniu, tworząc porowaty żel. Z ko¬
lei SDS wywołuje denaturację białek oraz wiąże
się z nimi w proporcji: jedna cząsteczka SDS na
dwa wiązania peptydowe. Jeśli elektroforeza typu
SDS-PAGE jest prowadzona w obecności 2-mer-
kaptoetanolu lub ditiotreitolu (DTT), następuje
redukcja i rozerwanie mostków disiarczkowych
(ryc. 4-4), co pozwala na rozpad białek oligome-
rycznych na składowe polipeptydy. Sumaryczny
ładunek pochodzący od dużej liczby anionowych
cząsteczek SDS o ładunku -1, opłaszczających
\
NH /
Ryc. 4-4. Rozszczepienie łańcuchów polipeptydowych połączo¬
nych wiązaniami disiarczkowymi (pole zaciemnione) za pomocą
czynników utleniających (kwas nadmrówkowy; strona lewa) bądź
redukujących (2-merkaptoetanol; strona prawa), prowadzące do
utworzenia dwóch peptydów - odpowiednio - z resztą kwasu cy¬
sternowego lub resztą cysteinylową.
4. BIAŁKA: OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ 31
S E C H D
111 Np
73 hP „
Ryc. 4-5. Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE do obserwacji
sukcesywnego oczyszczania białka. Żel został zabarwiony błęki¬
tem Commassie. Pokazano białkowy wzorzec masy (S), surowy
ekstrakt komórkowy (E), frakcję cytozolową (C), supernatant
po odwirowaniu przy wysokiej liczbie obrotów (H) oraz frakcję
oczyszczoną za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu
DEAE-Sefarozy (D). Oczyszczone białko charakteryzuje się masą
cząsteczkową ok. 45 kDa.
polipetyd, dominuje nad udziałem w całkowi¬
tym ładunku, który niosą ze sobą grupy funkcyj¬
ne reszt aminokwasowych. Stosunek ładunku do
masy jest w przypadku każdego kompleksu poli-
peptydu z SDS w przybliżeniu jednakowy, wobec
tego szybkość migracji jest zdeterminowana przez
opór fizyczny, jaki napotyka każdy polipeptyd,
wędrując wzdłuż żelu poliakrylamidowego. Sko¬
ro większe kompleksy napotykają większy opór,
zatem polipetydy można rozdzielić na podstawie
ich masy cząsteczkowej. Poszczególne polipepty-
dy zatrzymane na żelu poliakrylamidowym uwi¬
dacznia się za pomocą barwników, jak np. błękitu
Coomassie (ryc. 4-5).
Ogniskowanie izoelektryczne
Amfoteryczne bufory jonowe, zwane amfolitami,
dodane do żelu poliakrylamidowego i poddane
działaniu pola elektrycznego, powodują wytwo¬
rzenie gradientu pH w żelu. Nałożone na taki żel
białka migrują do chwili, kiedy znajdą się w miej¬
scu o pH równym wartości punktu izoelektrycz-
nego (pi), tj. pH, przy jakim całkowity ładunek
białka jest równy zeru. Ogniskowanie izoelek¬
tryczne (ang. isoelectric focusing, IEF), stoso¬
wane razem z elektroforezą SDS-PAGE, stanowi
podstawę elektroforezy dwukierunkowej, która
rozdziela peptydy w oparciu o ich punkty izo¬
elektryczne w jednym kierunku oraz na podsta¬
wie ich mas cząsteczkowych w drugim kierunku
(ryc. 4-6). Elektroforeza dwukierunkowa stanowi
szczególnie odpowiednią metodę rozdziału złożo¬
nych mieszanin białek.
pH = 3
pH = 10
IEF >-
Ryc. 4-6. Elektroforeza dwukierunkowa łącząca og¬
niskowanie izoelektryczne z elektroforezą SDS-PAGE.
Żel został wybarwiony błękitem Commassie. Surowy
ekstrakt bakteryjny poddano najpierw ogniskowaniu
izoelektrycznemu (IEF) w zakresie gradientu pH 3-10.
Żel IEF umieszczono następnie poziomo nad standar¬
dowym żelem zawierającym SDS, po czym przepro¬
wadzono rozdział białek za pomocą elektroforezy SDS-
-PAGE. Można zauważyć znaczną poprawę rozdziel¬
czości rozdziału różnych polipeptydów w porównaniu
ze zwykłym żelem SDS-PAGE (ryc. 4-5).
32 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
SANGER JAKO PIERWSZY OKREŚLIŁ
SEKWENCJE POLIPEPTYDU
Dojrzała insulina składa się z połączonych ze
sobą wiązaniami disiarczkowymi łańcucha A, za¬
wierającego 21 reszt aminokwasowych, oraz łań¬
cucha B, zawierającego 30 reszt aminokwaso¬
wych. Frederick Sanger poddał redukcji wiązanie
disiarczkowe łączące oba polipeptydy, rozdzielił
następnie łańcuchy A i B oraz za pomocą trypsy-
ny, chymotrypsyny i pepsyny przeprowadził ich
proteolizę do krótkich peptydów. Zostały one
wyizolowane i poddane działaniu kwasu w celu
hydrolizy części wiązań peptydowych i wytwo¬
rzenia jeszcze krótszych fragmentów, złożonych
z 2 lub 3 reszt aminokwasowych. Każdy z nich
został poddany reakcji z l-fluoro-2,4-dinitro-
benzenem (odczynnikiem Sangera), reagującym
z grupami a-aminowymi reszt A-końcowych, co
pozwoliło na określenie składu każdego peptydu.
Mimo że grupy e-aminowe reszt lizyny również
reagują z odczynnikiem Sangera, A-końcowe
reszty lizyny także można było zidentyfikować na
podstawie ich reakcji z dwiema cząsteczkami tego
odczynnika. Analiza sekwencji i rekonstrukcja na
ich podstawie sekwencji dłuższych fragmentów
peptydowych pozwoliła Sangerowi określić peł¬
ną sekwencję insuliny, za co w 1958 r. otrzymał
Nagrodę Nobla.
REAKCJA EDMANA UMOŻLIWIA
SEKWENCJONOWANIE
PEPTYDÓW I BIAŁEK
Pehr Edman jako pierwszy zastosował fenylo-
izotiocyjanian (odczynnik Edmana) do selek¬
tywnego znakowania reszt amino-końcowych
polipeptydu. W przeciwieństwie do odczynnika
Sangera, pochodna fenylotiohydantoinowa (PTH)
może zostać usunięta w łagodnych warunkach,
odsłaniając przy tym nową resztę amino-końcową
(ryc. 4-7). Kolejne cykle reakcji z odczynnikiem
Edmana mogą być zastosowane do sekwencjono-
wania wielu reszt aminokwasowych pojedynczej
próbki polipetydu. Metodą Edmana można łatwo
zidentyfikować pierwsze 20-30 reszt aminokwa¬
sowych od A-końca, jednak większość polipepty-
dów zawiera kilkaset aminokwasów. Przed sek-
wencjonowaniem metodą Edmana polipeptydy
muszą być zatem najpierw pocięte na mniejsze
fragmenty. Hydroliza niektórych wiązań może
być konieczna również w celu pozbycia się mo¬
dyfikacji potranslacyjnych, które blokują grupy
a-aminowe i uniemożliwiają reakcję z odczyn¬
nikiem Edmana. Zwykle niezbędne jest wytwo¬
rzenie kilku peptydów za pomocą różnych metod
fragmentacji. Wynika to zarówno ze zmienno-
Fenyloizotiocyjanian (odczynnik Edmana)
i peptyd
Pochodna fenylotiohydantoinowa
Fenylotiohydantoina i peptyd krótszy
o jedną resztę aminokwasową
Ryc. 4-7. Reakcja Edmana. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza
AZ-końcową resztę peptydu w pochodną fenylotiohydantoinową.
Po dodaniu kwasu w rozpuszczalnikach niehydroksylowych
uwalnia się pochodna fenylotiohydantoinowa aminokwasu, którą
z kolei identyfikuje się na podstawie jej ruchliwości chromatogra¬
ficznej; peptyd staje się krótszy o jedną resztę aminokwasową.
Proces jest następnie powtarzany.
4. BIAŁKA: OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ 33
ści występowania różnych miejsc podatnych na
określoną metodę trawienia enzymatycznego lub
chemicznego, jak i potrzeby uzyskania zestawu
peptydów o częściowo pokrywających się sek¬
wencjach, tak aby na ich podstawie można było
zrekonstruować całą sekwencję peptydu. Otrzy¬
mane w wyniku trawienia peptydy są oczyszcza¬
ne techniką HPLC w odwróconym układzie faz
i poddawane sekwencjonowaniu.
BIOLOGIA MOLEKULARNA
ZREWOLUCJONIZOWAŁA OKREŚLANIE
STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ
Znajomość sekwencji DNA pozwala określić
strukturę pierwszorzędową polipeptydów. Do
sekwencjonowania DNA wystarczą jedynie
śladowe ilości DNA i można z nich bez trudu
otrzymać sekwencje setek nukleotydów. W celu
sklonowania oraz zsekwencjonowania DNA ko¬
dującego określone białko, najpierw należy ziden¬
tyfikować właściwy klon, tj. sprawdzić specjalny¬
mi metodami chociaż fragment jego sekwencji.
Stąd wywodzi się mieszana metoda sekwencj o-
nowania. Do częściowego określenia sekwencji
aminokwasowej badanego białka wykorzystuje
się metodę Edmana, a następnie zaprojektowane
startery oligonukleotydowe, komplementarne ze
znalezionymi fragmentami sekwencji polipepty-
dowej, używa się do identyfikacji klonów DNA
lub namnożenia odpowiednich genów za pomocą
łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase
Chain Reaction, PCR) (rozdz. 39). Po otrzymaniu
właściwego klonu DNA można określić jego peł¬
ną sekwencję, a kod genetyczny pozwala wysnuć
wnioski o pierwszorzędowej strukturze kodowa¬
nego polipeptydu.
Metoda mieszana zwiększa szybkość i wy¬
dajność analiz struktur pierwszorzędowych oraz
liczbę białek, które można zsekwencjonować.
Umożliwia również unikanie przeszkód, takich
jak obecność grup blokujących aminowy koniec
polipeptydu lub brak peptydów o pokrywających
się częściowo sekwencjach. Metoda ta wymaga
określenia za pomocą analizy Edmana jedynie
kilku segmentów struktury pierwszorzędowej.
Sekwencjonowanie DNA ukazuje kolejność,
w jakiej aminokwasy są dodawane do łańcucha
polipeptydowego powstającego na rybosomie.
Nie daje ono jednak informacji o modyfikacjach
potranslacyjnych, takich jak proteoliza, mety-
lacja, glikozylacja, fosforylacja, hydroksylacja
reszt prolinowych i lizynowych oraz tworzenie
wiązań disiarczkowych, czyli o procesach, które
towarzyszą dojrzewaniu białek. Chociaż sekwen¬
cjonowanie metodą Edmana umożliwia wykrycie
obecności większości zmian potranslacyjnych, to
jednak ograniczenia techniczne często uniemożli¬
wiają identyfikację specyficznych modyfikacji.
SPEKTROMETRIA MAS WYKRYWA
MODYFIKACJE KOWALENCYJNE
Z racji wysokiej czułości, szybkości i uniwersal¬
ności spektrometria mas (MS) zastąpiła metodę
Edmana, stając się podstawową metodą określa¬
nia sekwencji peptydów i białek. Modyfikacje
potranslacyjne białek, zachodzące wskutek do¬
dania lub usunięcia reszt cukrowych, grup fosfo¬
ranowych, hydroksylowych lub innych, dodają
lub ujmują określoną, i łatwo identyfikowalną,
różnicę w masie cząsteczki (tab. 4-1). Spektro¬
metria mas, która rozróżnia cząsteczki wyłącznie
na podstawie ich masy, może w ten sposób wy¬
kryć subtelne zmiany fizyczne białek zachodzące
w ciągu życia komórki czy organizmu. W spek¬
trometrii mas próbka znajdująca się w próżni jest
przeprowadzana w stan pary w warunkach umoż¬
liwiających jej uprotonowanie, wskutek czego
cząsteczki uzyskują ładunek dodatni. Powstające
kationy są wprawiane w ruch za pomocą pola
elektrycznego, przechodzą następnie przez obszar
pola magnetycznego, które odchyla tor ich ruchu
Tabela 4-1. Przyrosty masy cząsteczkowej odpowiadające róż¬
nym modyfikacjom potranslacyjnym
Modyfikacja
Wzrost masy (Da)
Fosforylacja
80
Hydroksylacja
16
Metylacja
14
Acetylacja
42
Mirystylacja
210
Palmitoilacja
238
Glikozylacja
162
34 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
0 odpowiedni kąt w stosunku do pierwotnego lotu
1 skupia je na detektorze (ryc. 4-8). Natężenie pola
magnetycznego potrzebne do odchylenia ścieżki
lotu każdego jonu, tak aby trafił on w detektor,
jest mierzone i rejestrowane jako wartość prądu
przyłożonego do elektromagnesu. W przypadku
jonów o identycznych ładunkach natężenie to jest
proporcjonalne do ich mas. Przy użyciu aparatu
typu spektrometr czasu przelotu [ang. time-of-
-flight, TOF - przyp. tłum.] przyłożone na krótko
pole elektryczne przyspiesza jony w kierunku de¬
tektora, który rejestruje wartości czasu, w jakim
każdy jon przybył do detektora. W przypadku czą¬
steczek o identycznych ładunkach prędkości, do
jakich zostają one przyspieszone, a zatem i czasy
potrzebne do osiągnięcia detektora, są odwrotnie
proporcjonalne do ich mas.
Ryc. 4-8. Podstawowe elementy prostego spektrometru mas.
Mieszanina cząsteczek jest odparowywana do stanu zjonizowa-
nego w komorze próbki, S. Cząsteczki te są następnie przyspie¬
szane w dót toru lotu za pomocą pola elektrycznego przyłożonego
do siatki akceleratora, A. Regulowany elektromagnes, E. wytwa¬
rza pole magnetyczne odchylające kierunek lotu poszczególnych
jonów, aż do momentu, gdy uderzą w detektor, D. Im większa jest
masa jonu, tym silniejsze pole magnetyczne jest potrzebne do
jego zogniskowania na detektorze.
Konwencjonalne spektrometry mas są stoso¬
wane zazwyczaj do określania mas cząsteczek
o wartościach co najwyżej 1000 Da, natomiast
spektrometry czasu przelotu umożliwiają analizę
białek o bardzo dużych masach cząsteczkowych.
Analiza peptydów i białek za pomocą spektrome¬
trii mas była początkowo utrudniona ze względu
na problemy związane z przeprowadzaniem czą¬
steczek organicznych w stan lotny, jednak desorp¬
cja laserowa wspomagana matrycą (ang. matrix
assisted laser desorption ionization, MALDI)
oraz dyspersja elektrosprejowa (tj. nanosprejowa)
[electrospray ionization, ESI, elektrorozpylanie
- przyp. tłum.] pozwalają na określenie mas tak¬
że bardzo dużych polipeptydów (>100 kDa), i to
z niezwykłą dokładnością (± 1 Da). W przypad¬
ku zastosowania elektrorozpylania peptydy wy¬
mywane z kolumny HPLC z odwróconą fazą są
wprowadzane bezpośrednio do spektrometru mas
w celu natychmiastowego określenia ich mas.
Peptydy wewnątrz spektrometru ulegają fragmen-
tacji wskutek zderzeń z obojętnymi atomami helu
(dysocjacja indukowana kolizyjnie), po czym są
oznaczane masy poszczególnych fragmentów.
Wiązania peptydowe są znacznie mniej trwałe
niż wiązania węgiel-węgiel, dlatego fragmenty
występujące najliczniej różnią się między sobą
o jednostki masy równoważne jednemu lub dwóm
aminokwasom. Ze względu na unikatową masę
cząsteczkową wszystkich aminokwasów, z wy¬
jątkiem leucyny i izoleucyny, sekwencja amino-
kwasowa peptydu może zostać zrekonstruowana
na podstawie mas jego fragmentów.
Tandemowa spektrometria mas
Tandemowa spektrometria mas wykorzystuje
dwa połączone ze sobą spektrometry i umożli¬
wia analizę złożonych mieszanin peptydów bez
potrzeby ich rozdzielania. Pierwszy spektro¬
metr rozdziela poszczególne peptydy w oparciu
0 różnice mas. W wyniku regulacji natężenia
pola magnetycznego pierwszego magnesu, po¬
jedynczy peptyd może być skierowany do dru¬
giego spektrometru, gdzie ulega on fragmentacji
1 gdzie następnie są oznaczane masy poszczegól¬
nych fragmentów.
Tandemowa spektrometria mas
może służyć do analizy zaburzeń
metabolicznych
Tandemowa spektrometria mas może być sto¬
sowana do badań przesiewowych próbek krwi
noworodków na obecność aminokwasów, kwa¬
sów tłuszczowych i innych metabolitów oraz do
określenia ich stężeń. Zaburzenia poziomu stężeń
metabolitów mogą służyć jako wskaźniki diagno¬
styczne wielu chorób genetycznych, takich jak fe-
nyloketonuria, encefalopatia etylomalonowa czy
kwasica glutarowa typu 1.
4. BIAŁKA: OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ 35
GENOMIKA UMOŻLIWIA IDENTYFIKACJĘ
BIAŁEK NA PODSTAWIE OKREŚLENIA
KRÓTKICH SEKWENCJI
Analiza struktury pierwszorzędowej została zre¬
wolucjonizowana przez genomikę, zastosowanie
automatycznych metod sekwencjonowania oli-
gonukleotydów oraz komputerowe przeszukiwa¬
nie baz danych i analizy pełnego zestawu genów
organizmu. Od 1995 roku, kiedy określono peł¬
ną sekwencję genomu Haemophilus influenzae,
rozszyfrowano genomy setek organizmów. Jeśli
sekwencja genomu jest znana, określenie struk¬
tur pierwszorzędowych białek kodowanych przez
DNA jest znacząco uproszczone. Właściwie, dru¬
ga część tego zadania została już wykonana. To, co
jeszcze pozostaje do zrobienia, to uzyskać wystar¬
czającą ilość informacji, które pozwolą na odnale¬
zienie oraz identyfikację w genomowych bazach
danych dostępnych przez internet otwartej ramki
odczytu (ORF)* kodującej białko. W niektórych
przypadkach segment o długości zaledwie czte¬
rech lub pięciu aminokwasów może wystarczyć
do zidentyfikowania poprawnej ramki odczytu.
Algorytm wspomagany komputerowo ułatwia
identyfikację genów kodujących dane białko. Na
przykład podczas oznaczania mas peptydów mie¬
szanina produktów trawienia peptydów jest wpro¬
wadzana do spektrometru mas, gdzie są oznacza¬
ne ich masy cząsteczkowe. Następnie, z pomocą
komputera, poszukuje się otwartej ramki odczytu,
dla której przewidywany produkt białkowy, gdy¬
by został strawiony**, dawałby mieszaninę pepty¬
dów o masach pasujących do mas oznaczonych na
podstawie spektrometrii mas.
* ORF, ang. open reading frame - otwarta ramka od¬
czytu oznacza sekwencję DNA podlegającą transkrypcji
i potem translacji na białko. Ze względu na trójnukleo-
tydową budowę kodonów oraz różne odmiany kodonów
„START”, czytanie ramki odczytu podczas transkrypcji
może być przesunięte, tj. może się zacząć od dowolnego
z trzech nukleotydów, prowadząc albo do właściwego
produktu, albo do alternatywnego białka czy też braku
produktu [przyp. tłum.].
** W spektrometrii mas do trawienia peptydów stosuje
się najczęściej trypsynę, rozrywającą wiązania peptydo-
we po stronie karboksylowej reszt lizyny lub argininy
\przyp. tłum.].
PROTEOMIKAI PROTEOM
Celem proteomiki jest identyfikacja
kompletnych zestawów białek
wytwarzanych przez komórkę
w różnych warunkach
Sekwencja genomu ludzkiego jest wprawdzie
znana, lecz obraz dostarczany przez samą geno¬
mikę jest niestety statyczny i niekompletny. Ce¬
lem proteomiki jest identyfikacja całego zestawu
białek, które są wytwarzane przez komórkę w róż¬
nych warunkach. W zależności od stanu „włącze¬
nia” lub „wyłączenia” określonych genów, białka
są syntezowane w odpowiednich typach komórek,
w specyficznym okresie wzrostu lub różnicowa¬
nia oraz pod wpływem odpowiedzi na bodźce
zewnętrzne. Na przykład komórki mięśniowe
wytwarzają wiele białek, które nie są produkowa¬
ne przez komórki nerwowe, a typy podjednostek
tworzących tetramer hemoglobiny ulegają zmia¬
nom przed i po urodzeniu. Wiele białek podczas
dojrzewania podlega modyfikacjom potranslacyj-
nym do kompetentnych czynnościowo form lub
też w celu regulacji ich właściwości. Znajomość
genomu ludzkiego stanowi zatem tylko początko¬
wą fazę opisu organizmu od strony molekularnej
oraz pierwszy krok w stronę zrozumienia dyna¬
miki takich procesów, jak wzrost, starzenie się lub
choroba. Jeśli w organizmie ludzkim występują
tysiące typów komórek, a każda z nich zawiera
tysiące białek, to ustalenie kompletnego prote-
omu, tj. zestawu wszystkich białek wytwarzanych
przez pojedynczą komórkę w określonych warun¬
kach, jest zadaniem trudnym do zrealizowania.
Elektroforeza dwukierunkowa oraz
mikromacierze genowe sa wykorzystywane
do badania ekspresji białek
Jednym z celów proteomiki jest identyfikacja
białek, których poziom ekspresji koreluje z obra¬
zem klinicznym. Zakłada się, że białka, których
pojawienie się lub zniknięcie jest związane ze
specyficznymi warunkami fizjologicznymi, mogą
umożliwić ocenę podstawowych przyczyn lub
mechanizmów określonych stanów fizjologicz¬
nych. Charakterystyka proteomu dla każdego
typu komórki wymaga ostatecznie precyzyjnego
wyizolowania i zidentyfikowania poszczególnych
36 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
białek. W celu przyspieszenia procesu przygo¬
towania próbek oraz dużych dwukierunkowych
żeli, stosowanych do rozdziału białek komórko¬
wych, współczesne metody są znacznie zautoma¬
tyzowane. Poszczególne peptydy są ekstrahowa¬
ne i analizowane za pomocą sekwencjonowania
metodą Edmana lub spektrometrii mas. Podczas
gdy na zwykłym żelu może zostać rozdzielonych
jedynie ok. 1000 białek, elektroforeza dwukierun¬
kowa pozwala na identyfikację znacznie większej
ich liczby.
Metodą alternatywną, i uzupełniającą, dla elek¬
troforezy dwukierunkowej jest zastosowanie mi-
kromacierzy genowych, określanych czasami
mianem „czipów DNA” (ang. DNA chips), które
pozwalają na ilościową ocenę ekspresji mRNA ko¬
dujących dane białka. Mimo że zmiana poziomu
ekspresji mRNA niekoniecznie musi odzwiercied¬
lać proporcjonalne zmiany poziomu odpowiadają¬
cego białka, to jednak macierze genowe są bardziej
czułe niż żele dwukierunkowe i dlatego nadają się
do analizy większej ilości produktów genów.
Bioinformatyka pomaga w ustalaniu
funkcji białek
Funkcje ogromnej ilości białek kodowanych
przez genom ludzki nie są obecnie znane. Rozwój
technik macierzy białkowych, stosowanych do
bezpośredniego testowania potencjalnych funkcji
białek na skalę masową, pozostaje nadal w fazie
początkowej. Postępy w bioinformatyce pozwala¬
ją jednak na porównywanie sekwencji aminokwa-
sowych, co naprowadza na trop potencjalnych
właściwości, ról fizjologicznych i mechanizmów
działania białek. Algorytmy bioinformatyczne
opierają się na spostrzeżeniu, że przyroda dąży do
angażowania wariantów motywów strukturalnych
do pełnienia podobnych funkcji w kilku białkach
(np. domena Rossmanna wiążąca nukleotydy,
umożliwiająca także wiązanie NAD(P)H, sek¬
wencje sygnałowe kierujące do jądra, domeny
„rąk EF” wiążące jony Ca2+). Domeny te są za¬
zwyczaj wykrywane w strukturze pierwszorzędo-
wej na podstawie obecności poszczególnych reszt
aminokwasowych znajdujących się w kluczowych
pozycjach. Właściwości i role fizjologiczne nowo
odkrytych białek mogą być zatem przewidywane
na podstawie porównania ich sekwencji ze struk¬
turą pierwszorzędową białek już znanych.
STRESZCZENIE
• Długie polikondensaty aminokwasów, czyli po-
lipeptydy, tworzą podstawowe jednostki struk¬
turalne białek, a z kolei struktura białek dostar¬
cza informacji o pełnionej przez nie funkcji.
• Białka podczas swojego życia podlegają zmia¬
nom potranslacyjnym, które wpływają na ich
funkcje i określają ich losy.
• Metoda Edmana została w dużej mierze zastą¬
piona przez spektrometrię mas, czułe i wszech¬
stronne „narzędzie” do określania struktury
pierwszorzędowej, identyfikacji modyfikacji
potranslacyjnych oraz wykrywania zaburzeń
metabolicznych.
• Klonowanie DNA oraz biologia molekular¬
na w połączeniu z chemią białek zapewniają
wszechstronne podejście do problemu sekwen¬
cj ono wania, znacząco zwiększając szybkość
i skuteczność określenia struktury pierwszorzę¬
dowej białek.
• Genomika, analiza pełnej sekwencji oligonu-
kleotydowej całego materiału genetycznego or¬
ganizmu, zapewnia dalsze udoskonalenie tych
analiz.
• Algorytmy komputerowe wspomagają identyfi¬
kację otwartych ramek odczytu kodujących dane
białko, wykorzystując do tego celu częściowo
określone sekwencje oraz profile mas peptydów
otrzymane ze spektrometrii mas, umożliwiające
przeszukiwanie baz danych sekwencji.
• Podejmowane są próby określenia sekwencji
białek i funkcji wszystkich białek wytwarza¬
nych przez żywą komórkę, tj. określenia prote-
omu.
• Głównym celem tych badań jest identyfikacja
białek i ich modyfikacji potranslacyjnych, któ¬
rych pojawianie się lub znikanie koreluje ze sta¬
nami i procesami fizjologicznymi, starzeniem
lub specyficznymi chorobami.
PIŚMIENNICTWO
Austin CP: The impact of the completed human genome
seąuence on the development of novel therapeutics
for human disease. Annu Rev Med 2004;55:1.
Cutler P: Protein arrays: the current state-of-the-art. Pro-
teomics 2003;3:3.
Deutscher MP (editor): Guide to Protein Purification.
Methods Enzymol 1990; 182 (cały wolumin).
4. BIAŁKA: OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ 37
Geveart K, Vandekerckhove J: Protein Identification me-
thods in proteomics. Electrophoresis 2000; 21:1145.
Khan J et al.: DNA microarray technology: the anticipa-
ted impact on the study of human disease. Biochim
BiophysActa 1999; 1423 :M 17.
Patnaik SK, Blumenfeld 00: Use of on-line tools and
databases for routine seąuence analysis. Anal Bio-
chern 2001 ;289:1.
Rinaldo P, Tortorelli S, Matem D: Recent developments
and new applications of tandem mass spectrometry
in newboms screening. Curr Opin Pediatrics 2004;
16:427.
Rodland KD: Proteomics and cancer diagnosis: the po-
tential of mass spectrometry. Clin Biochem 2004;
37:579.
Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expres-
sion pattems with a complementary DNA microar¬
ray. Science 1995;270:467.
Semsarian C, Seidman CE: Molecular medicine in the
2 lst century. Intern Med J 2001;31:53.
Tempie LK et al.: Essays on science and society: defi-
ning disease in the genomics era. Science 2001;
293:807.
Wilkins MR et al.: High-throughput mass spectrometric
discovery of protein post-translational modifica-
tions. J Mol Biol 1999;289:645.
Woodage T, Broder S: The human genome and com-
parative genomics: understanding human evolu-
tion, biology and medicine. J Gastroenterol 2003;
15:68.
Białka: struktura wyższych rzędów
Peter J. Kennelly, PhD; 1fictor W. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
W przyrodzie funkcja jest ściśle uzależniona od
struktury. Aby nowo zsyntezowany polipeptyd
dojrzał do czynnego biologicznie białka, zdol¬
nego do katalizowania reakcji metabolicznych,
uczestniczenia w ruchu komórek, tworzenia
wielkocząsteczkowych „prętów” i „kabli”, które
zapewniają strukturalną integralność włosów, ko¬
ści, ścięgien i zębów, musi utworzyć specyficzny,
trójwymiarowy układ, znany pod nazwą konfor¬
macji. Podczas dojrzewania białko podlega mo¬
dyfikacjom potranslacyjnym, w wyniku których
są wprowadzane nowe grupy chemiczne lub też są
usuwane zbyteczne segmenty peptydowe. Jest za¬
tem oczywiste, że wady genetyczne lub niedobo¬
ry żywieniowe, które hamują dojrzewanie białek,
wywierają szkodliwy wpływ na zdrowie. Przykła¬
dami tych pierwszych są: choroba Creutzfeldta-
-Jakoba, scrapie, choroba Alzheimera, gąbczaste
zwyrodnienie mózgu u bydła („choroba szalo¬
nych krów”). Szkorbut jest z kolei następstwem
niedoborów pokarmowych, które upośledzają
dojrzewanie białek.
KONFORMACJA A KONFIGURACJA
Pojęcia konfiguracji i konformacji są często my¬
lone. Konfiguracja określa geometryczne po¬
wiązania między danymi zbiorami atomów, np.
tymi, które pozwalają odróżnić formy l- i D-ami-
nokwasów. Wzajemne przekształcenie się obu
form konfiguracyjnych wymaga rozerwania wią¬
zań kowalencyjnych oraz ich powtórnego utwo¬
rzenia. Konformacja odnosi się do przestrzen¬
nego układu wszystkich atomów w cząsteczce.
Wzajemna przemiana między konformerami
zachodzi bez rozrywania wiązań kowalencyj¬
nych, z zachowaniem konfiguracji, i zazwyczaj
odbywa się poprzez rotacje wokół wiązań poje¬
dynczych.
BIAŁKA BYŁY POCZĄTKOWO
KLASYFIKOWANE ZE WZGLĘDU
NA ICH OGÓLNE WŁAŚCIWOŚCI
Związek między strukturą i funkcją białek był
początkowo rozpatrywany przez klasyfikowanie
ich pod względem właściwości, takich jak roz¬
puszczalność, kształt lub obecność grup niebiał-
kowych. Na przykład białka, które można wyeks¬
trahować z komórek za pomocą wodnego roztwo¬
ru o fizjologicznej sile jonowej i fizjologicznym
pH są określane jako rozpuszczalne. Ekstrakcja
integralnych białek błonowych wymaga z ko¬
lei rozpuszczenia błon w roztworze detergentu.
Białka globularne są zwartymi, prawie kulistymi
cząsteczkami, które wykazują stosunek osiowy
(stosunek ich najdłuższego wymiaru do wymiaru
najkrótszego) nieprzekraczający 3. Większość en¬
zymów stanowi właśnie białka globularne. Wiele
białek strukturalnych natomiast przyjmuje bardzo
rozciągnięte konformacje. Są to białka fibryłarne
(włókienkowe), które wykazują stosunek osiowy
ok. 10 lub większy.
Lipoproteiny zawierają kowalencyjnie związa¬
ne lipidy, a głikoproteiny - cukrowce. Mioglobi-
na, hemoglobina, cytochromy i wiele innych me-
taloprotein zawiera silnie związane jony metali.
Bardziej precyzyjne sposoby klasyfikacji białek
opierają się na podobieństwie, inaczej homologii,
w sekwencji aminokwasowej i strukturze trój wy-
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 39
miarowej. Jednak w użyciu pozostaje wiele termi¬
nów z wcześniejszej klasyfikacji.
BIAŁKA SA BUDOWANE W OPARCIU
0 ZASADY MODULARNOŚCI
Białka pełnią złożone, fizyczne i katalityczne,
funkcje poprzez umiejscowienie specyficznych
grup chemicznych w ściśle określonym poło¬
żeniu przestrzennym. Szkielet polipeptydowy
zawierający te grupy musi przyjąć konforma¬
cję, która jest funkcjonalnie sprawna i fizycznie
trwała. Na pierwszy rzut oka biosynteza polipep-
tydów, obejmująca dziesiątki tysięcy pojedyn¬
czych atomów, wydawać się może wyjątkowym
wyzwaniem. Kiedy weźmie się pod uwagę, że
typowy polipeptyd może przyjąć >1050 różnych
konformacji, zwinięcie w konformację specy¬
ficzną dla jego biologicznych funkcji wydaje się
jeszcze trudniejsze. Jak przedstawiono w rozdz.
3 i 4, synteza szkieletu polipeptydowego białka
angażuje mały zestaw wspólnych bloków bu¬
dulcowych, tj. aminokwasów połączonych za
pośrednictwem jednakowych wiązań, tj. wiązań
peptydowych. Modułowa ścieżka syntezy, pro¬
wadzona krok po kroku, upraszcza fałdowanie
[ang. folding, inaczej „zwijanie,, -przyp. tłum.]
1 przetwarzanie nowo zsyntezowanego polipep-
tydu na dojrzałe białko.
CZTERY POZIOMY ORGANIZACJI
STRUKTURY BIAŁEK
Modułowa natura syntezy i zwijania łańcuchów
peptydowych białek przekłada się na koncepcję
czterech poziomów ich struktury. Są nimi: struk¬
tura pierwszorzędowa, tj. sekwencja amino¬
kwasów w łańcuchu polipeptydowym, struktura
drugorzędową, tj. sposób zwinięcia krótkich (od
3 do 30 reszt aminokwasowych) stykających się
segmentów polipeptydowych w geometrycznie
uporządkowaną jednostkę, struktura trzecio¬
rzędowa, tj. sposób ułożenia jednostek mających
strukturę drugorzędową w większe funkcjonalnie
segmenty, takie jak dojrzały polipeptyd lub jego
składowe domeny, i wreszcie struktura czwarto¬
rzędowa, tj. liczba i typy jednostek polipeptydo¬
wych budujących białko oligomeryczne oraz ich
przestrzenne ułożenie.
STRUKTURA DRUGORZĘDOWĄ
Wiązania peptydowe ograniczają możliwe
konformacje drugorzedowe
Swobodna rotacja jest możliwa jedynie wokół
dwóch z trzech wiązań tworzących szkielet po¬
lipeptydowy: wiązania łączącego atom węgla a
(Ca) z atomem węgla grupy karbonylowej (C0)
oraz wiązania między atomem węgla Ca i atomem
azotu (p. ryc. 3-4). Częściowo podwójny charak¬
ter wiązania peptydowego, które łączy atom wę¬
gla C0 z atomem azotu grupy N—H, uniemożli¬
wia rotację. Kąt charakteryzujący rotację wokół
wiązania N—Ca jest określany jako kąt phi (O),
a kąt określający rotację wokół wiązania C0—Ca
to kąt psi (VF)*. Ze względu na przeszkody ste-
ryczne większość kombinacji kątów phi i psi jest
-90 0 90
o
Ryc. 5-1. Diagram Ramachandrana przedstawiający kąty O (phi)
i \j/ (psi) dla głównego łańcucha ok. 1000 nieglicynowych reszt
aminokwasowych w ośmiu białkach, których struktury zostały
ustalone przy wysokiej rozdzielczości. Kropki reprezentują dozwo¬
lone kombinacje, a puste przestrzenie - zabronione kombinacje
kątów phi-psi. (Reprodukowano za zgodą z: Richardson JS: The
anatomy and taxonomy of protein structures. Adv Protein Chem
1981; 34:167 © 1981 Przedrukowano za zgodą z Elsevier).
* Kąty phi i psi to kąty torsyjne. Jeśli przyjąć ozna¬
czenia C0—N—Ca—C0'—N', to kąt phi będzie kątem
między wiązaniami C0—N i Ca—C0\ patrząc wzdłuż
wiązania N—Ca, natomiast kąt psi będzie kątem między
wiązaniami N—Ca i C0'—N\ patrząc wzdłuż wiązania
Ca—C0' [przyp. tłum.].
40 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
zabronionych dla aminokwasów innych niż gli¬
cyna (ryc. 5-1). W przypadku proliny przestrzeń
konformacyjna jest nawet jeszcze bardziej ogra¬
niczona ze względu na brak swobodnej rotacji
wokół wiązania N—Ca.
Obszary uporządkowanej struktury drugorzędo-
wej powstają wtedy, kiedy serie reszt aminokwa-
sowych przyjmują podobne wartości kątów phi
i psi. Długie segmenty polipeptydowe (np. pętle)
mogą wykazywać różnorodne wartości tych ką¬
tów. Wartości kątów definiujące dwa najbardziej
powszechne typy struktury drugorzędowej, tj.
helisę a i strukturę p [zwaną często arkuszem p,
beta-kartką, harmonijką p, pofałdowaną kartką
- przyp. tłum.], są usytuowane po lewej stronie,
odpowiednio w dolnym i górnym kwadrancie dia¬
gramu Ramachandrana (p. ryc. 5-1).
Helisa a
Szkielet polipeptydowy helisy a jest skręcony
wokół każdego atomu węgla a o taki sam kąt phi,
tj. o ok. -57°, oraz kąt psi, tj. o ok. -47°. Na pełny
obrót helisy przypada średnio 3,6 reszty amino-
kwasowej, a odcinek, jaki przypada na jej jeden
pełny obrót (tj. jej skok) wynosi 0,54 nm (ryc. 5-2).
Grupy R każdej reszty aminokwasowej w helisie
a wystają na jej zewnętrzną stronę (ryc. 5-3). Biał¬
ka zawierają jedynie L-aminokwasy, które tworzą
bardziej trwałą prawoskrętną helisę a; występują
w nich zatem jedynie helisy a prawoskrętne. He¬
lisy a są przedstawiane na schematach struktury
białek w formie cylindrów.
Stabilność helisy a wynika przede wszystkim
z obecności wiązań wodorowych tworzonych mię¬
dzy atomem tlenu grupy karbonylowej wiązania
peptydowego oraz atomem wodoru grupy N—H
wiązania peptydowego, czwartej z kolei reszty ami¬
nokwasowej, (ryc. 5-4). Zdolność tworzenia mak¬
symalnej liczby wiązań wodorowych, wspomagana
oddziaływaniami van der Waalsa występującymi
w rdzeniu tej ściśle upakowanej struktury, warun¬
kuje siłę napędową tworzenia helisy a. Ponieważ
peptydowemu atomowi azotu proliny brakuje wią¬
żącego się z nim atomu wodoru, współtworzącego
wiązanie wodorowe, prolina może być trwale ulo¬
kowana jedynie w pierwszym zwrocie helisy a. Jej
obecność w dowolnym innym miejscu powoduje
zagięcia. Zagięcia helisy a często wywołuje rów¬
nież glicyna ze względu na swój mały rozmiar.
Ryc. 5-2. Ułożenie atomów głównego łańcucha w polipeptydzie
wokół osi helisy a.
Ryc. 5-3. Przekrój poprzeczny helisy a. Łańcuchy boczne (R)
wystają na zewnątrz helisy. Promienie van der Waalsa są większe
niż pokazane na rycinie, dlatego wewnątrz helisy nie ma prawie
wolnej przestrzeni. (Nieznacznie zmodyfikowano i reprodukowa¬
no za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 3, Freeman, 1995 ©
1995 WH Freeman and Company).
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 41
Ryc. 5-4. Wiązania wodorowe (kropki) utworzone między ato¬
mami O i H stabilizują polipeptyd w konformacji a-helikalnej.
(Przedrukowano za zgodą z: Haggis GH i wsp.: Introduction to
Molecular Biology, Wiley, 1964. Przedrukowano za zgodą Pear-
son Education Limited).
Wiele helis a zawiera przeważnie hydrofobo¬
we grupy R po jednej stronie osi helisy, a grupy
hydrofilowe - po drugiej stronie. Amfipatyczne
helisy są dobrze przystosowane do tworzenia sty¬
ku między polarnymi i niepolamymi regionami,
tak jak między hydrofobowym wnętrzem białka
i jego środowiskiem wodnym. Zgrupowania am-
fipatycznych helis mogą tworzyć kanały lub pory,
umożliwiające różnym specyficznym cząstecz¬
kom przechodzenie przez hydrofobowe błony
komórkowe.
Struktura p
Po helisie a drugą poznaną (stąd nazwa „beta”)
regularną konformacją występującą w białkach
jest struktura p. Reszty aminokwasowe struktury
p, oglądane wzdłuż krawędzi, tworzą harmonijkę,
czyli pofałdowaną kartkę, na której grupy R sąsia¬
dujących reszt są skierowane w przeciwne strony.
Odmiennie niż w przypadku stłoczonego szkieletu
helisy a, szkielet peptydowy struktury P jest silnie
rozciągnięty. Ale podobnie jak w przypadku helisy
a, struktury p zawdzięczają swoją trwałość głów¬
nie wiązaniom wodorowym między atomami tlenu
grup karbonylowych oraz atomami wodoru grup
N—H wiązań peptydowych. W przeciwieństwie
jednak do helisy a, wiązania te tworzą się między
sąsiednimi segmentami struktury p (ryc. 5-5).
Oddziałujące ze sobą struktury p mogą być
ułożone na dwa sposoby: albo tworzą równole¬
głą kartkę p, w której sąsiadujące segmenty łań-
Ryc. 5-5. Rozmieszczenie przestrzenne i kąty wiązań mostków
wodorowych w antyrównoległych i równoległych strukturach
harmonijkowych. Strzałki wskazują kierunek każdego łańcucha
polipeptydowego. Atomy azotu grup N—H są przedstawione
w postaci czarnych kółek, a wiązania wodorowe - liniami prze¬
rywanymi. Dla przejrzystości rysunku pominięto grupy R i atomy
wodoru. Góra: Antyrównoległa struktura p. Pary wiązań wodo¬
rowych są na przemian raz blisko siebie, raz znacznie oddalone
i zorientowane w przybliżeniu prostopadle do szkieletu polipepty¬
dowego. Dół: Równoległa struktura p. Mostki wodorowe są roz¬
mieszczone równomiernie, lecz skośnie, w różnych kierunkach.
42 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
cuchów polipeptydowych biegną w tych samych
kierunkach, patrząc od grupy aminowej do grupy
karboksylowej, albo tworzą strukturę antyrów-
Ryc. 5-6. Przykłady struktury trzeciorzędowej białek.
Góra: Izomeraza fosfotrioz. Zauważalna elegancja i symetria na¬
przemiennego ułożenia struktur (3 i helis a. (Dzięki uprzejmości
J Richardsona). Dół: Dwudomenowa struktura podjednostki
homodimerycznego bakteryjnego enzymu klasy II, reduktazy
HMG-CoA. Jak to pokazano za pomocą ponumerowanych reszt,
pojedynczy polipeptyd zaczyna się w dużej domenie, wchodzi do
domeny małej i kończy się w domenie dużej. (Dzięki uprzejmości
C Lawrence’a, V Rodwella i C Stauffachera, Purdue University).
noległą, w której podążają one w przeciwnych
kierunkach (p. ryc. 5-5). Każda z tych konfor¬
macji umożliwia tworzenie maksymalnej liczby
wiązań wodorowych między segmentami lub
pasmami pofałdowanej kartki. Większość arku¬
szy p nie jest idealnie płaska, lecz lekko skręcona
w prawą stronę. Zespoły tych skręconych pasm
tworzą rdzeń wielu białek globulamych (ryc. 5-6).
Struktury p są przedstawiane na rycinach jako
strzałki, których grot wskazuje kierunek od końca
aminowego do karboksylowego w łańcuchu poli-
peptydowym.
Pętle i zagięcia
W przybliżeniu połowa reszt aminokwasowych
w „typowym” białku globulamym występuje
w helisach a i strukturach p, a połowa - w pętlach,
zwrotach, skrętach, zagięciach i w innych struktu¬
rach konformacyjnych. Skręty i zagięcia odnoszą
się do krótkich segmentów aminokwasowych,
które łączą dwie jednostki o strukturze drugorzę-
dowej, np. dwa sąsiednie pasma antyrównoległej
struktury p. Skręt p obejmuje cztery reszty amino-
kwasowe, z których pierwsza jest połączona wią¬
zaniem wodorowym z czwartą z kolei, co skutku¬
je ostrym zwrotem o 180° (ryc. 5-7). W skrętach p
występują często prolina i glicyna.
i /.
n — r
Cam~
-H
\
CH20H
H
Ryc. 5-7. Skręt p łączący dwa segmenty antyrównoległej struk¬
tury p. Linia kropkowana oznacza wiązanie wodorowe między
pierwszą i czwartą resztą czteroaminokwasowego segmentu
Ala-Gly-Asp-Ser.
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 43
Pętle stanowią regiony zawierające więcej reszt
aminokwasowych niż jest to konieczne do połą¬
czenia przyległych fragmentów struktury drugo-
rzędowej. Mimo że przyjmują one nieregularne
konformacje, pełnią przeważnie kluczowe funkcje
biologiczne. W przypadku wielu enzymów pętle,
które łączą domeny odpowiedzialne za wiązanie
substratu często zawierają reszty aminokwasowe
uczestniczące w katalizie. Motywy helisa-pętla-
-helisa stanowią elementy wiążące się z oligonu-
kleotydami w białkach oddziałujących z DNA,
jak w przypadku represorów i czynników tran-
skrypcyjnych. Motywy strukturalne typu helisa-
-pętla-helisa, będące formą przejściową między
strukturą drugorzędową i trzeciorzędową, są okre¬
ślane niejednokrotnie jako struktury naddrugo-
rzędowe. Liczne pętle i zagięcia występujące na
powierzchni białek, a więc wyeksponowane do
rozpuszczalnika, stanowią łatwo dostępne miej¬
sca, czyli epitopy, rozpoznawane i wiążące się
z przeciwciałami.
Chociaż pętle nie wykazują regularności struk¬
turalnej, ich specyficzna konformacja jest utrzy¬
mywana poprzez wiązania wodorowe, oddziały¬
wania jonowe oraz hydrofobowe z innymi regio¬
nami białka. Nie wszystkie jednak fragmenty bia¬
łek muszą mieć uporządkowaną strukturę. Białka
mogą zawierać „nieuporządkowane” regiony
o znacznej elastyczności konformacyjnej, często
w obrębie krańcowych sekwencji aminowych lub
karboksylowych. W wielu przypadkach regiony
nieuporządkowane przyjmują uporządkowaną
konformację dopiero po związaniu się z ligandem.
Ta strukturalna elastyczność umożliwia takim po-
lipeptydowym segmentom funkcjonowanie jako
„przełączniki” kontrolowane wiązaniem ligandu,
który wpływa na strukturę i funkcję białka.
Struktura trzecio- i czwartorzędowa
Pojęcie „struktura trzeciorzędowa” odwołuje się
do całej trójwymiarowej konformacji polipep-
tydu. Określa ona, jak drugorzędowe elementy
struktury - helisy, pofałdowane kartki, zagięcia,
skręty i pętle - układają się w przestrzeni trójwy¬
miarowej, tworząc domeny, i jak te domeny są
ułożone względem siebie. Domena stanowi frag¬
ment struktury białka wystarczający do pełnie¬
nia określonej funkcji chemicznej lub fizycznej,
takiej jak wiązanie substratu lub innego ligandu.
Inne domeny mogą zakotwiczać białko w błonie
komórkowej lub oddziaływać z cząsteczką regu¬
latorową, co moduluje jej funkcje. Małe polipep-
tydy, jak izomeraza fosfotrioz (p. ryc. 5-6) lub
mioglobina (rozdz. 6), mogą zawierać pojedynczą
domenę, a na przykład kinazy białkowe składają
się z dwóch domen. Katalizują one przeniesienie
grupy fosforanowej z ATP na peptyd lub białko.
Fragment aminokońcowy polipeptydu, zasobny
w struktury p, wiąże się z cząsteczką ATP, pod¬
czas gdy domena końca karboksylowego, wzbo¬
gacona w helisy a, wiąże substrat peptydowy lub
białkowy (ryc. 5-8). Grupy, które katalizują prze¬
niesienie fosforanu znajdują się w pętli usytuowa¬
nej na styku dwóch domen.
W niektórych przypadkach białka tworzą się
z większej liczby polipeptydów lub protomerów.
Ryc. 5-8. Struktura domen. Kinazy białkowe zawierają dwie
domeny. Na górze, domena aminokońcowa wiąże ATR donor
grupy fosforanowej (kolor jaśniejszy). Na dole, domena końca
karboksylowego wiąże syntetyczny substrat peptydowy (kolor
ciemniejszy).
44 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Struktura czwartorzędowa określa skład polipep-
tydowy oligomerycznego białka i przestrzenne
ułożenie jego podjednostek lub protomerów.
Białka monomeryczne są zbudowane z po¬
jedynczego łańcucha polipeptydowego. Białka
dimeryczne zawierają dwa łańcuchy. Homo-
dimery obejmują dwie kopie tego samego łań¬
cucha peptydowego, natomiast heterodimery
- różne łańcuchy polipeptydowe. W celu rozróż¬
nienia odmiennych podjednostek heterooligome-
rycznego białka oznacza się je literami greckimi
(a, p, y itd.), a cyframi umieszczanymi w dolnym
indeksie - liczbę podjednostek danego typu. Na
przykład a4 oznacza białko homotetrameryczne,
a a2P2y - białko zawierające pięć podjednostek
trzech różnych typów.
Ponieważ nawet małe białka zawierają wie¬
le tysięcy atomów, prezentacja struktury białka,
która uwzględnia położenie każdego atomu, na
ogół nie jest łatwa do interpretacji*. Dlatego do
opisywania kluczowych cech struktury trzecio-
i czwartorzędowej białka są stosowane uprosz¬
czone diagramy. Na diagramach tasiemkowych
(wstęgowych) (p. ryc. 5-6 i 5-8) jest nakreślona
konformacja szkieletu polipeptydowego, w któ¬
rym cylindry i strzałki wskazują, odpowiednio,
regiony a i p. Na jeszcze prostszym schemacie
ślad szkieletu polipeptydowego jest przedstawia¬
ny w postaci linii łamanej, łączącej atomy węgla
a. Takie schematyczne przedstawienie struktury
często obejmuje również łańcuchy boczne wy¬
branych aminokwasów, podkreślających specy¬
ficzne związki między strukturą i funkcją białka.
STRUKTURĘ TRZECIO-
I CZWARTORZĘDOWA STARILIZUJE
WIELE CZYNNIKÓW
Struktury białkowe wyższego rzędu są stabili¬
zowane przede wszystkim - a często wyłącznie
- przez wiązania niekowalencyjne. Do najważ¬
niejszych należą oddziaływania hydrofobowe,
które kierują łańcuchy boczne hydrofobowych
* Do oglądania trójwymiarowej struktury białka służą
też programy komputerowe odczytujące współrzędne
atomów zapisane np. w formacie danych pdb, dostęp¬
ne dla białek o znanej strukturze deponowanej w World
Wide Protein Data Bank (wwPDB) poprzez internetowe
bazy danych, np. www.rcsb.org/pdb [przyp. tłum.].
aminokwasów do wnętrza białka, osłaniając je
od środowiska wodnego. Do innych znaczących
oddziaływań zalicza się wiązania wodorowe oraz
mostki solne (ang. salt bridge) między zjonizowa-
nymi grupami karboksylowymi kwasów asparagi¬
nowego i glutaminowego oraz przeciwnie nałado¬
wanymi łańcuchami bocznymi uprotonowanych
reszt lizyny, argininy i histydyny. Oddziaływania
te, jeśli występują indywidualnie, są względnie
słabe w stosunku do typowych wiązań kowalen-1
cyjnych, o energii 300-500 kJ/mol, jednak dzia¬
łając wspólnie, nadają dużą trwałość konforma¬
cjom biologicznie czynnych białek. Nasuwa się tu
porównanie do popularnego zapięcia na „rzepy”,
które wykorzystuje skumulowaną siłę oddziały¬
wań wielu plastikowych pętelek i haczyków.
Niektóre białka zawierają również wiązania!
dwusiarczkowe** (S—S), łączące grupy doło¬
we (sulfhydrylowe) reszt cysteinowych. Ich
tworzenie opiera się na utlenieniu grup sulfhy-1
drylowych i wymaga czynników utleniających.
Mostki dwusiarczkowe wewnątrz łańcucha po¬
lipeptydowego dodatkowo umacniają zwiniętą
konformację, natomiast wiązania disulfidowe*** ;
między różnymi łańcuchami peptydowymi sta-l
bilizują strukturę czwartorzędową niektórych1
białek oligomerycznych. 1
TRÓJWYMIAROWA STRUKTURA
JEST OKREŚLANA ZA POMOCĄ
KRYSTALOGRAFII RENTGENOWSKIEJ I
LUB SPEKTROSKOPII NMR
Krystalografia rentgenowska
Podążając za wyjaśnieniem trójwymiarowej
struktury mioglobiny przez Johna Kendrew
w 1960 r., krystalografia rentgenowska pozwoliła
ujawnić strukturę tysięcy białek oraz wielu wiru¬
sów. W celu rozszyfrowania struktury za pomocą
krystalografii rentgenowskiej białko wytrąca się
z roztworu o składzie, umożliwiającym tworzenie
dobrze uporządkowanych kryształów. Należy też
ustalić odpowiednie warunki, wykonując próby
** Stosuje się też wymiennie terminy: wiązanie
disiarczkowe lub wiązanie disulfidowe [przyp. tłum.].
*** W tym rozdziale jest używany termin „disulfido¬
we” jako preferowany przez tłumacza niniejszego roz¬
działu [przyp. red.].
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 45
krystalizacji z kilkumikrolitrowymi objętościami
roztworu białka i różnymi kombinacjami zmien¬
nych parametrów (temperatury, pH, obecności soli
lub składników organicznych, np. glikolu poliety¬
lenowego); dzięki temu można określić optymalne
warunki tworzenia się kryształów*. Kryształy za¬
mocowane w kapilarach kwarcowych są najpierw
napromieniowywane monochromatyczną wiązką
promieni X o długości fali ok. 0,15 nm w celu po¬
twierdzenia, że mają one naturę białkową, a nie
pochodzą od soli obecnych w buforze. Następnie
kryształy białek są zamrażane w ciekłym azocie,
w celu zebrania kompletu danych o wysokiej roz¬
dzielczości.
Wzory dyfrakcyjne tworzone wskutek ugięcia
promieni rentgenowskich na atomach znajdują¬
cych się na ich drodze rejestruje się na kliszy fo¬
tograficznej lub w postaci cyfrowej, jako koliste
wzory plamek o różnej intensywności. Zawartą
w nich informację rozszyfrowuje się za pomocą
procedury matematycznej, określanej jako trans¬
formacja (synteza) Fouriera, która analizuje funk¬
cje falowe. Amplitudy funkcji falowych korelują
z intensywnością plamek, ale ponieważ ugięte
fale nie są zgodne w fazie, związek pomiędzy
ich fazami trzeba wyznaczyć osobno. Tradycyjne
podejście do rozwiązania „problemu fazowego”
wykorzystuje tzw. podstawienie izomorficzne.
Przed napromieniowaniem kryształu wprowadza
się do niego atom wykazujący odmienny wzór dy¬
frakcyjny, lecz lokujący się w znanych pozycjach
struktury pierwszorzędowej białka. Najczęściej
w izomorficznym podstawieniu atomami ciężki¬
mi wykorzystuje się atomy rtęci lub uranu, wią¬
żące się z resztami cysteiny. Alternatywna metoda
opiera się na nadekspresji zakodowanego w plaz¬
midzie rekombinowanego białka, w którym selen
ma zastąpić atomy siarki metioniny. Do ekspresji
tego białka stosuje się hodowlę bakterii auksotro-
ficznych względem metioniny i niezdolnych do
jej biosyntezy na pożywce, w której metionina
została zastąpiona selenometioniną. Najnowsze
procedury opierają się na wykorzystaniu stale ros-
* W praktyce testuje się setki różnych parametrów.
Dostępne są zestawy gotowych roztworów o zmien¬
nym składzie, zakresie pH, obecności czynników strą¬
cających, odpowiednich buforów itd., a ich nakraplanie
w mikrolitrowych objętościach w wielu laboratoriach
odbywa się automatycznie z pomocą robotów przezna¬
czonych specjalnie do tego celu [przyp. tłum.].
nącej liczby opublikowanych struktur trzeciorzę¬
dowych. Jeśli nieznana struktura jest podobna do
jednej z rozwiązanych, wirtualne podstawienie
molekularne wykonane na istniejącym modelu
pozwala uniknąć techniki rzeczywistego podsta¬
wienia atomami ciężkimi i stanowi często stoso¬
waną metodę określenia faz otrzymanych danych.
Ostatecznie, wyniki analizy Fouriera i określone
wartości faz funkcji falowych tworzą profil gęsto¬
ści elektronowej, czyli trójwymiarową mapę uka¬
zującą wzajemne połączenia i położenia atomów.
Krystalografia rentgenowska wg Laue’a
Zdolność niektórych wykrystalizowanych enzy¬
mów do katalizowania reakcji chemicznych suge¬
ruje, że ich struktury określone za pomocą kry¬
stalografii rzeczywiście odzwierciedlają struktury
obecne w roztworze. Klasyczna krystalografia do¬
starcza w zasadzie statycznych obrazów struktury
białka, które może ulegać przecież wielu znaczą¬
cym zmianom strukturalnym, takim jak te, które
towarzyszą katalizie enzymatycznej. Alternatyw¬
na metodologia, określana jako polichromatyczna
mikrodyfrakcja, tj. krystalografia Laue’a**, wy¬
korzystuje dyfrakcję polichromatycznych promie¬
ni X na wielu kryształach. Podejście to pozwala
uniknąć czasochłonnego procesu obrotu krysz¬
tału napromieniowywanego wiązką promieni X,
umożliwiając zastosowanie wyjątkowo krótkich
czasów ekspozycji.
Detekcja ruchów reszt aminokwasowych lub
domen cząsteczki enzymu podczas katalizy opie¬
ra się na wykorzystaniu kryształów zawierających
nieaktywny, tj. „uwięziony”, analog substratu,
który przekształca się w substrat dopiero po na¬
świetleniu błyskiem światła widzialnego. Dane
zebrane w czasie rzędu kilku nanosekund mogą
być następnie analizowane pod kątem ujawnienia
zmian strukturalnych, które zachodzą podczas
procesu katalizy.
Spektroskopia jądrowego rezonansu
magnetycznego
Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycz¬
nego (ang. Nuclear Magnetic Resonanse, NMR)
stanowi potężne narzędzie uzupełniające krysta-
** Od nazwiska: Max von Laue [przyp. tłum.].
46 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
lografię rentgenowską. Mierzy ona absorbancję
energii elektromagnetycznej fal o częstotliwości
radiowej, pochłanianych przez niektóre jądra ato¬
mowe. Do „aktywnych w NMR” izotopów pier¬
wiastków o znaczeniu biologicznym należą łH,
l3C, l5N i31P. Częstotliwość wyrażana za pomocą
tzw. przesunięcia chemicznego, przy którym dane
jądro absorbuje energię, jest funkcją zarówno
struktury grupy funkcyjnej, w której znajduje się
absorbujące jądro, jak i sąsiedztwa innych jąder
aktywnych w NMR. Dwuwymiarowa spektrosko¬
pia NMR pozwala z kolei na rekonstrukcję trój¬
wymiarowej struktury białka poprzez określenie
otoczenia chemicznego tych jąder atomowych.
Spektroskopia NMR umożliwia badanie białek
w roztworach wodnych bez potrzeby ich krysta¬
lizacji, dając sposobność obserwacji zmian kon-
formacyjnych, które zachodzą podczas wiązania
ligandów lub podczas procesu katalizy. Współczes¬
na technologia ogranicza jednak stosowalność tej
metody do analizy względnie małych białek, o ma¬
sie cząsteczkowej nieprzekraczającej 30 kDa.
Modelowanie molekularne
Coraz częściej dopełnieniem empirycznych me¬
tod określania struktury trójwymiarowej białek
jest wykorzystanie technologii komputerowych
do modelowania molekularnego. W przypadku
białek o znanej strukturze trójwymiarowej, pro¬
gramy dynamiki molekularnej mogą być wyko¬
rzystane do symulacji dynamiki konformacyjnej
białka oraz sposobu, w jaki zmiany temperatury,
pH, siły jonowej lub podstawienia niektórych
aminokwasów wpływają na ruchy białek. Pro¬
gramy umożliwiające dokowanie molekularne*
symulują z kolei oddziaływanie białka z substra-
tem, inhibitorem lub innym ligandem. Wirtualne
poszukiwanie cząsteczek o znaczeniu biomedycz¬
nym, które z dużym prawdopodobieństwem mogą
oddziaływać z kluczowymi strukturami w ob¬
rębie białka, coraz częściej wykorzystuje się do
wspomagania badań nad poszukiwaniem nowych
leków. W modelowaniu opartym na homologii
znana trójwymiarowa struktura białka jest wy¬
korzystywana jako wzorzec do budowy modelu
* Ang. docking, tj. wirtualne umieszczenie badanej
cząsteczki, podczas modelowania, wewnątrz określonej
struktury białka lub enzymu, np. centrum aktywnego lub
domeny wiążącej substrat [przyp. tłum.].
prawdopodobnej struktury białka spokrewnione¬
go. Można mieć nadzieję, że w przyszłości zosta¬
ną opracowane programy komputerowe do prze¬
widywania trójwymiarowej struktury białek na
podstawie ich sekwencji aminokwasowej.
FAŁDOWANIE BIAŁEK
Białka są cząsteczkami charakteryzującymi się
dynamiką konformacyjną. Ich łańcuchy poli-
peptydowe mogą się fałdować i rozfałdowywać
w czasie rzędu milisekund i robią to setki bądź
tysiące razy podczas swojego życia. W jaki spo¬
sób ten zdumiewający proces fałdowania jest re¬
alizowany?
Zwijanie się białka do struktury natywnej wcale
nie polega na dokładnym przeszukiwaniu wszyst¬
kich możliwych konformacji. Białka zdenatu-
rowane nie są tylko przypadkowymi kłębkami
i nawet w stanie zdenaturowanym są uprzywile¬
jowane miejsca kontaktu typowe dla struktury na¬
tywnej oraz zostają zachowane regiony struktury
występujące w natywnej konformacji. Rybosomy
mogą uczestniczyć w początkowym okresie fał¬
dowania, ale już nie w następnych etapach ani po
translokacji do organelli komórkowych. Wyjąt¬
kowo wysokie stężenie białek w komórce może
również wpływać na kinetykę procesu zwijania
ich łańcuchów polipeptydowych. Poniżej przedy¬
skutowano wpływ czynników, które mogą wspo¬
magać pierwotne i powtórne zwijanie łańcuchów
białkowych oraz przedstawiono współczesne kon¬
cepcje mechanizmów, zaproponowane w oparciu
o eksperymenty prowadzone głównie in vitro od
ponad 40 lat.
Natywna konformacja białka jest
uprzywilejowana termodynamicznie
Liczba różnych kombinacji kątów phi i psi, okre¬
ślająca potencjalne konformacje nawet względ¬
nie małego polipeptydu, o masie cząsteczkowej
15 kDa, jest niewyobrażalnie wielka. Przez roz¬
legły labirynt tak wielu możliwych konformacji
białka są prowadzone za pomocą reguł termody¬
namiki. Biologicznie istotną, tj. natywną, konfor¬
macją białka zazwyczaj jest ta najbardziej uprzy¬
wilejowana pod względem energetycznym, dlate¬
go informacja o natywnej konformacji powinna
być zawarta już w jego sekwencji aminokwa-
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 47
sowej. Jeśliby jednak oczekiwać na osiągnięcie
przez polipeptyd natywnej konformacji poprzez
losowe przeszukiwanie wszystkich możliwych,
na ukończenie tego procesu trzeba by poczekać
wiele bilionów lat. Jasno wynika z tego, że zwija¬
nie białek w komórce zachodzi w sposób bardziej
uporządkowany i ukierunkowany.
Zwijanie przebiega modułowo
Zwijanie białek zachodzi zwykle stopniowo.
W pierwszym etapie, kiedy nowo zsyntezowany
polipeptyd wyłania się z rybosomu, krótkie seg¬
menty fałdują się w jednostki struktury drugo-
rzędowej, które tworzą lokalne regiony struktury
uporządkowanej. Zwijanie ogranicza się teraz do
wyboru odpowiedniego ułożenia tej względnie
małej liczby elementów o strukturze drugorzędo-
wej. W drugim etapie siły, które kierują regiony
hydrofobowe do wnętrza cząsteczki białka, od¬
dzielając je od rozpuszczalnika, wprowadzają
częściowo zwinięty polipeptyd w fazę „roztopio¬
nej kuli” (ang. molten globule). W tym stadium
moduły struktury drugorzędowej wzajemnie się
przemieszczają, przybliżając się coraz bardziej
do dojrzałej konformacji białka. Proces ten, choć
uporządkowany, nie jest sztywno ustalony. Istnie¬
je znaczna różnorodność tych dróg oraz kolejności
układania poszczególnych elementów struktury
drugorzędowej. Ogólnie każdy element struktu¬
ry drugorzędowej lub naddrugorzędowej ułatwia
odpowiednie zwijanie, kierując ten proces w stro¬
nę konformacji natywnej i unikając w ten sposób
bezproduktywnej alternatywy. W przypadku bia¬
łek oligomerycznych poszczególne protomery
dążą do zwinięcia się, zanim zasocjują z innymi
podjednostkami.
Białka pomocnicze wspomagają zwijanie
W odpowiednich warunkach in vitro wiele białek
może samoczynnie powrócić do natywnej kon¬
formacji, po uprzedniej denaturacji wywołanej
kwasem lub zasadą, czynnikiem chaotropowym
lub detergentem. W przeciwieństwie jednak do
procesu zwijania in vivo, powtórne fałdowanie
w warunkach laboratoryjnych zachodzi znacznie
wolniej. Co więcej, wiele białek nie jest zdol¬
nych do powtórnego zwinięcia się in vitro i często
tworzą nierozpuszczalne agregaty, nieuporząd¬
kowane kompleksy, niezwinięte lub częściowo
pofałdowane polipeptydy, utrzymywane razem
dzięki oddziaływaniom hydrofobowym. Agrega¬
ty reprezentują bezproduktywną „ślepą uliczkę”
w procesie fałdowania. Komórki wykorzystują
białka pomocnicze w celu przyspieszenia proce¬
su zwijania oraz odpowiedniego kierowania nim
w stronę jego pomyślnego zakończenia.
Białka opiekuńcze (czaperony)
Białka opiekuńcze, inaczej czaperonowe (ang.
chaperons), uczestniczą w zwijaniu łańcuchów
polipeptydowych ponad połowy wszystkich bia¬
łek ssaków. Rodzina białek szoku termicznego
Hsp70 (ang. Heat shock protein, o masie cząstecz¬
kowej 70 kDa) wiąże krótkie sekwencje hydro¬
fobowych aminokwasów nowo zsyntezowanego
polipeptydu, osłaniając je od rozpuszczalnika.
Czaperony zapobiegają agregacji, zapewniając
w ten sposób możliwość utworzenia elementów
0 odpowiedniej strukturze drugorzędowej oraz
ich późniejsze scalenie w fazie roztopionej kuli.
Sekwencje i struktura rodziny białek czaperono-
wych HspóO, czasami określanych czaperoni-
nami, różnią się zarówno od białek Hsp70, jak
1 od jego homologów. Białko HspóO funkcjonuje
podczas późniejszych etapów procesu zwijania,
często jednak razem z Hsp70. Wewnętrzna jama
czaperonu HspóO, o kształcie orzecha, zapewnia
środowisko ochronne zapobiegające agregacji,
w którym polipetyd może się fałdować, aż do
chwili, kiedy wszystkie regiony hydrofobowe
zanurzą się we wnętrzu cząsteczki, co wyklucza
agregację.
Izomeraza dwusiarczkowa białek
Wiązania disulfidowe między polipeptydami oraz
w ich obrębie stabilizują strukturę trzecio- i czwar¬
torzędową. Tworzenie wiązań disulfidowych jest
jednak niespecyficzne. W warunkach utleniają¬
cych dana reszta cysteiny może tworzyć to wiąza¬
nie z grupą —SH dowolnej innej dostępnej reszty
cysteinowej. Poprzez katalityczne przyspieszenie
wymiany dwusiarczku, tj. rozerwania wiązania
S—S i jego ponownego utworzenia z inną resztą
cysteiny, izomeraza dwusiarczkowa białek uła¬
twia tworzenie wiązań disulfidowych, stabilizują¬
cych natywną konformację cząsteczki białka.
48 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Izomeraza cis,trans-m\mm
Wszystkie wiązania peptydowe X-Pro, gdzie X
oznacza dowolną resztę aminokwasową, są synte¬
zowane w konfiguracji trans, jednak ok. 6% wią¬
zań X-Pro w dojrzałych białkach ma konfigurację
cis. Konfiguracja cis szczególnie często występu¬
je w skrętach p. Izomeryzacja formy trans do cis
jest katalizowana przez izomerazę cis,trans-proli-
nową(ryc. 5-9).
Hyc. 5-9. Izomeryzacja prolilowego wiązania peptydowego N-a,
z konfiguracji cis do trans względem szkieletu polipeptydowego.
Fałdowanie jest procesem dynamicznym
Białka są cząteczkami konformacyjnie dynamicz¬
nymi, co oznacza, że ich łańcuchy polipeptydowe
mogą się zwijać i rozwijać setki lub tysiące razy
podczas swojego życia. W jaki sposób raz rozfał-
dowane białka mogą się powtórnie zwinąć i po¬
wrócić do swojej aktywnej konformacji? Przede
wszystkim rozwijanie białek wewnątrz komórki
rzadko kiedy prowadzi do całkowicie nieuporząd¬
kowanej konformacji łańcucha polipeptydowe¬
go. Tak więc rozwinięte białka utrzymują liczne
miejsca kontaktowe i regiony struktury drugorzę-
dowej, ułatwiające proces ponownego zwijania.
Następnie białka czaperonowe, poprzez rozwinię¬
cie regionów hydrofobowych i zapewnienie im
kolejnej szansy na właściwe pofałdowanie, mogą
„uratować” rozwinięte białka, które zostały ter¬
modynamicznie uwięzione i wadliwie zwinięte.
Ponadto glutation może redukować nieodpowied¬
nie wiązania disulfidowe, utworzone pod wpły¬
wem wystawienia białka na czynniki utleniające,
takie jak 02, nadtlenek wodoru lub ponadtlenki
(rozdz. 51).
ZABURZENIA KONFORMACJI BIAŁEK
MOGĄ MIEĆ KONSEKWENCJE
PATOLOGICZNE
Priony
Zakaźne encefalopatię gąbczaste, czyli choroby
prionowe, są śmiertelnymi chorobami neurozwy-
rodnieniowymi, które charakteryzują się zmiana¬
mi gąbczastymi, glejakami astrocytamymi, a także
utratą neuronów spowodowaną odkładaniem się
nierozpuszczalnych agregatów białkowych w ko¬
mórkach układu nerwowego. Do chorób priono-
wych zalicza się chorobę Creutzfeldta-Jakoba
występującą u ludzi, scrapie u owiec oraz zwy¬
rodnienie gąbczaste u bydła („choroba szalonych
krów”). Odmiana choroby Creutzfeldta-Jakoba
(ang. variant Creutzfeldt-Jakob Disease, vCJD),
która dotyka młodszych pacjentów, jest związa¬
na z wczesnymi objawami psychiatrycznymi oraz
zaburzeniami zachowania. Choroby prionowe
mogą się ujawniać jako choroby zakaźne, gene¬
tyczne lub sporadyczne. Długo jednak nie można
było zidentyfikować genów bakteryjnych lub wi¬
rusowych kodujących białka prionowe, stąd źród¬
ło i mechanizm zakażenia chorób prionowych po¬
zostawały w sferze domysłów. Obecnie wiadomo,
że choroby prionowe to zaburzenia konformacji
białek, przenoszone wskutek zmian konformacji
pewnego endogennego białka komórki, co prowa¬
dzi do zmiany jego niektórych fizycznych właści¬
wości. Cząsteczka PrP (ang. Prion-related Prote¬
in), czyli ludzkie białko spokrewnione z prionami,
jest glikoproteiną kodowaną na krótkim ramieniu
chromosomu 20. W zdrowym organizmie jest to
białko monomeryczne, bogate w helisy a. Pato¬
logiczne białka prionowe służą jako matryce dla
przemiany konformacyjnej prawidłowego białka
PrP, określanego jako PrPc, do białka patologicz¬
nego, PrPsc (PrP scrapie). Cząsteczka PrPsc obfi¬
tuje z kolei w struktury p, z łańcuchami bocznymi
wielu hydrofobowych aminokwasów skierowa¬
nymi w stronę rozpuszczalnika. Wskutek tego
cząsteczki PrPsc silnie ze sobą asocjują, tworząc
nierozpuszczalne agregaty, odporne na działanie
proteaz. Jedna cząsteczka patologicznego białka
prionowego, lub białka spokrewnionego z prio¬
nami, może służyć jako matryca dla przemiany
konformacyjnej wielu prawidłowych cząsteczek
białka PrPc, przekształcanych w odmiany pato¬
logiczne. Wskutek tego choroby prionowe mogą
być przenoszone przez samo białko bez udziału
DNA lub RNA.
Choroba Alzheimera
Powtórne pofałdowanie lub nieprawidłowe
zwinięcie łańcucha polipeptydowego pewnego
endogennego białka tkanki ludzkiego mózgu,
tj. (3-amyloidu, stanowi wiodącą cechę choroby
Alzheimera. Chociaż główna przyczyna cho¬
roby pozostaje niewyjaśniona, towarzyszą jej
charakterystyczne płytki starcze oraz włókniste
wtręty, tj. sploty neurofibrylame [ang. neurofi-
brillary tangle, NFT-przyp. tłum.\, występujące
w neuronach. Zawierają one agregaty p-amyloi-
du, polipeptydu o masie cząsteczkowej 4,3 kDa,
wytwarzanego w wyniku proteolizy większego
białka, znanego jako białko prekursorowe amy-
loidu. Poziom p-amyloidu podnosi się u pacjen¬
tów z chorobą Alzheimera, a białko to podlega
przemianom konformacyjnym z rozpuszczalnej
postaci zasobnej w helisy a do formy wzboga¬
conej w struktury p i skłonnej do samoczynnej
agregacji. Za mediatora tych zmian konforma-
cyjnych uważa się apolipoproteinę E*.
Beta-Talasemie
Talasemie są spowodowane przez defekty gene¬
tyczne upośledzające syntezę jednej z polipep-
tydowych podjednostek hemoglobiny (rozdz. 6).
Podczas nasilonej syntezy hemoglobiny towa¬
rzyszącej dojrzewaniu erytrocytów, specyficz¬
ny czaperon, określany jako białko stabilizujące
hemoglobinę a (ang. a-hemoglobin stabilizing
protein, AHSP), wiąże się z wolną podjednostką
a hemoglobiny, oczekującą na włączenie do te-
trameru Hb. Przy braku tego czaperonu, wolne
podjednostki a-hemoglobiny ulegają agregacji,
a wynikająca stąd precypitacja wywiera efekt cy-
totoksyczny na rozwijający się erytrocyt. Badania
z zastosowaniem genetycznie zmodyfikowanych
myszy sugerują udział białka AHSP w modulowa¬
niu ostrości przebiegu p-talasemii u człowieka.
* Apolipoproteina E, białko ApoE, bierze udział
w transporcie cholesterolu i pełni funkcje ochronne, a ze
zwiększonym ryzykiem choroby Alzheimera jest zwią¬
zana obecność jednej izoformy, tj. białka ApoE4, uwa¬
runkowanej genotypem APOE4 [przyp. tłum.].
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 49
KOLAGEN ILUSTRUJE
ROLĘ MODYFIKACJI
POTRANSLACYJNYCH
W DOJRZEWANIU BIAŁEK
Dojrzewaniu białek do ich końcowej struktury
towarzyszy często rozrywanie i/lub tworzenie
wiązań kowalencyjnych, tj. modyfikacje po-
translacyjne. Wiele polipeptydów jest począt¬
kowo syntezowanych jako większe prekursory,
określane mianem proprotein. Ich dodatkowe
segmenty polipeptydowe służą często jako sek¬
wencje sygnałowe, kierujące białko do okre¬
ślonej organelli komórkowej, lub też ułatwiają
jego przejście przez błonę komórkową. Niektóre
segmenty polipeptydowe gwarantują, że poten¬
cjalnie toksyczna aktywność danego białka, np.
proteazy, jak trypsyna lub chymotrypsyna, pozo¬
staje zablokowana aż do momentu, gdy białka te
osiągną swoje docelowe miejsce. Po spełnieniu
przejściowej funkcji ochronnej, zbędne regiony
peptydowe są usuwane w wyniku selektywnej
proteolizy. Oprócz tego mogą zachodzić inne
modyfikacje kowalencyjne, w wyniku których
do białka są dodawane nowe grupy chemiczne.
Dojrzewanie kolagenu obejmuje oba typy tych
procesów.
Kolagen jest białkiem wlókienkowym
(fibrylarnym)
Kolagen jest najpowszechniej występującym biał¬
kiem spośród białek włókienkowych, które stano¬
wi ponad 25% masy białek w organizmie ludz¬
kim. Inne ważne białka fibrylame to keratyna oraz
miozyna. Białka te stanowią podstawowe źródło
wytrzymałości strukturalnej komórki (tj. cy-
toszkieletu) oraz tkanek. Skóra zawdzięcza swo¬
ją wytrzymałość i elastyczność przeplatającej się
sieci kolagenu i włókien keratynowych, a struk¬
tura kości i zębów jest podtrzymywana przez sieć
włókien kolagenowych, położonych podobnie jak
pręty stalowe w zbrojonym betonie. Kolagen wy¬
stępuje również w tkance łącznej, tj. więzadłach
oraz ścięgnach. Wysoka wytrzymałość włókien
kolagenowych na rozciąganie wymaga obecności
wydłużonych cząsteczek białek o powtarzającej
się sekwencji aminokwasowej i regularnej struk¬
turze drugorzędowej.
50 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Kolagen tworzy unikatowe potrójne helisy
Tropokolagen składa się z trzech łańcuchów po-
lipeptydowych, zawierających po ok. 1000 ami¬
nokwasów, zwiniętych razem w unikatową kon¬
formację - potrójną helisę kolagenu (ryc. 5-10).
Dojrzałe włókno kolagenowe formuje wydłużo¬
ny pręt o stosunku osiowym równym ok. 200.
Trzy lewoskrętne helisy polipeptydowe owija¬
ją się wzajemnie w prawą stronę, aby utworzyć
potrójną helisę kolagenu. Przeciwne skręcenia
całej superhelisy i jej składników polipeptydo-
wych powodują, że jest ona bardzo odporna na
rozwijanie, podobnie jak liny stalowe stosowane
w wiszących mostach. Na jeden obrót potrójnej
helisy kolagenu przypada 3,3 reszty aminokwa-
sowej, a skok helisy przypadający na jedną resz¬
tę jest blisko dwukrotnie większy niż w helisie
a. Grupy R każdego łańcucha polipeptydowego
potrójnej helisy są upakowane tak ściśle, że aby
możliwe było ich dopasowanie, jedną z reszt musi
być glicyna. Właśnie dlatego co trzecią resztą jest
ten aminokwas. Lekkie wygięcie potrójnej helisy
umożliwia odpowiednie usytuowanie kluczowych
reszt glicyny wzdłuż całej jej długości. Kolagen
obfituje również w prolinę i hydroksyprolinę,
w formie powtarzających się sekwencji Gly-X-Y
(p. ryc. 5-10), w których Y oznacza prolinę lub
hydroksyprolinę.
Sekwencja
aminokwasowa
-Gly - X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-
drugorzędowa
Potrójna
helisa
Ryc. 5-10. Pierwszorzędowa, drugorzędowa i trzeciorzędowa
struktura kolagenu (Y - reszta proliny lub hydroksyproliny).
Potrójne helisy kolagenowe są utrzymywa¬
ne przez wiązania wodorowe między resztami
w różnych łańcuchach polipeptydowych. W mię-
dzyłańcuchowych wiązaniach wodorowych biorą
również udział grupy hydroksylowe reszt hydrok¬
syproliny. Dodatkową stabilność zapewniają ko¬
walencyjne wiązania formowane między zmody¬
fikowanymi resztami lizyny, zarówno w obrębie
jednego łańcucha, jak i między różnymi łańcucha¬
mi polipeptydowymi.
Kolagen jest syntezowany jako większy
prekursor
Kolagen jest pierwotnie syntezowany jako więk¬
szy prekursorowy polipeptyd, tj. prokolagen.
Liczne reszty profilowe i lizylowe prokolagenu
są następnie hydroksylowane przez hydroksyla-
zę prolinową i lizynową [dokładniej: oksygenazę
hydroksylującą proliny i lizyny - przyp. tłum.],
enzymy wymagające kwasu askorbinowego (wi¬
taminy C, p. rozdz. 27 i 44). Reszty hydroksypro-
lilowe i hydroksylizylowe zapewniają dodatkową
zdolność tworzenia wiązań wodorowych, które i
stabilizują dojrzałe białko. Ponadto transferaza (
glukozylowa i galaktozylowa dołączają reszty
glukozy lub galaktozy do grup hydroksylowych <
określonych reszt hydroksylizyny.
Środkowa część prekursorowego polipeptydu
łączy się następnie z innymi jego cząsteczka- 1
mi, tworząc charakterystyczną potrójną helisę.
Procesowi temu towarzyszy usunięcie globular-
nego amino- i karboksykońcowego fragmentu
prekursorowego polipeptydu wskutek selektyw¬
nej proteolizy. Określone reszty lizyny są także
modyfikowane przez oksydazę lizynową, białko
związane z jonami miedzi, które przekształca
grupy e-aminowe do aldehydowych. Te aldehy¬
dowe grupy mogą ulegać albo kondensacji aldo-
lowej, tworząc wiązania podwójne C=C, albo
kondensacji do zasad Schiffa (imin) w wyniku
reakcji z grupami e-aminowymi niezmodyfiko-
wanych reszt lizyny, które następnie ulegają re¬
dukcji do pojedynczych wiązań C—N. Wiązania
kowalencyjne łączą poprzecznie poszczególne
polipeptydy i nadają włóknom kolagenu wyjąt¬
kową wytrzymałość i sztywność.
Niedobory pokarmowe oraz defekty
genetyczne mogą upośledzać
dojrzewanie kolagenu
Złożony ciąg wydarzeń w procesie dojrzewania
kolagenu stanowi przykład ilustrujący konse¬
kwencje biologiczne niekompletnej dojrzałości
polipeptydu. Najlepiej znanym defektem syntezy
kolagenu jest szkorbut [gnilec -przyp. tłum.], spo-
5. BIAŁKA: STRUKTURA WYŻSZYCH RZĘDÓW 51
wodowany niedoborami pokarmowymi witaminy
C, niezbędnej do aktywności hydroksylaz proliny
i lizyny. Wynikający z nich brak odpowiedniej
liczby reszt hydroksyprolilowych i hydroksylizy-
lowych zaburza trwałość konformacyjną włókien
kolagenowych, co prowadzi do krwawień z dzią¬
seł, puchnięcia stawów, upośledzenia gojenia ran,
a nawet śmierci. Zespół Menkego, charakteryzu¬
jący się silnie poskręcanymi włosami i opóźnie¬
niem wzrostu, odzwierciedla niedobory pokarmo¬
we miedzi niezbędnej do aktywności oksydazy
lizynowej, która katalizuje kluczowy etap two¬
rzenia kowalencyjnych połączeń wzmacniających
włókna kolagenowe.
Zaburzenia genetyczne syntezy kolagenu obej¬
mują kilka postaci wrodzonej łamliwości kości
(iosteogenesis imperfecta), charakteryzującej się
ich znaczną kruchością. W zespole Ehlers-Dan-
losa, tj. grupie zaburzeń tkanki łącznej, która
obejmuje upośledzenie spójności struktur pod¬
trzymujących, defekt genów kodujących a kola¬
gen-1, jY-peptydazę prokolagenu lub hydroksyla-
zę lizynową, skutkuje upośledzeniem ruchomości
stawów lub nieprawidłowościami skóry (p. też
rozdz. 47).
STRESZCZENIE
• Białka mogą być klasyfikowane na podstawie
ich rozpuszczalności, kształtu cząsteczki, funk¬
cji biologicznej lub obecności grup prostetycz-
nych, takich jak hem.
• Pierwszorzędowa struktura łańcucha polipepty-
dowego określa jego sekwencję aminokwasową
kodowaną przez geny. Struktura drugorzędowa
wynika z pofałdowania polipeptydu w motywy
strukturalne utrzymywane wiązaniami wodo¬
rowymi, takie jak helisa a, struktura p, skręty
P i pętle. Kombinacja tych motywów tworzy
strukturę naddrugorzędową.
• Struktura trzeciorzędowa określa związki mię¬
dzy domenami struktury drugorzędowej. Struk¬
tura czwartorzędowa białek składających się
z dwóch lub większej liczby łańcuchów polipep-
tydowych (białka oligomeryczne) dotyczy relacji
przestrzennych między tymi łańcuchami.
• Struktury pierwszorzędowe są stabilizowa¬
ne przez kowalencyjne wiązania peptydowe.
Struktury wyższego rzędu są utrzymywane
przez słabe oddziaływania - liczne wiązania
wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne (jo¬
nowe) oraz asocjacje hydrofobowych grup R.
• Kąt phi (O) w peptydzie to kąt torsyjny wokół
wiązania Ca—N, natomiast kąt psi (¥) to kąt
wokół wiązania Ca—CG. Większość kombina¬
cji kątów phi-psi jest niedozwolona ze względu
na zawady przestrzenne. Kąty phi-psi, charak¬
teryzujące helisę a oraz strukturę p, znajdują
się - odpowiednio - w dolnej lub górnej lewej
ćwiartce diagramu Ramachandrana.
• Fałdowanie białek jest procesem słabo pozna¬
nym. W ogólnym zarysie, krótkie segmenty
nowo zsyntezowanego polipeptydu zwijają się
w jednostki struktury drugorzędowej. Siły, któ¬
re utrzymują regiony hydrofobowe z dala od
rozpuszczalnika, przekształcają częściowo zwi¬
nięty polipeptyd w „roztopioną kulę”, w której
moduły struktury drugorzędowej przemieszcza¬
ją się tak, aby powstała natywna konformacja
białka.
• Do białek, które pomagają w fałdowaniu łań¬
cucha polipeptydowego należą dwusiarczkowe
izomerazy białkowe, izomerazy cis,trans-proli-
nowe oraz białka opiekuńcze (czaperony), które
uczestniczą w procesie fałdowania ponad poło¬
wy białek u ssaków. Czaperony chronią nowo
zsyntezowane polipeptydy przed kontaktem
z rozpuszczalnikiem i zapewniają odpowied¬
nie środowisko elementom struktury drugorzę¬
dowej, które wyłaniają się, a następnie scalają
w „roztopionej kuli”.
• Techniki stosowane do badania wyższych po¬
ziomów struktury białka obejmują m.in. kry¬
stalografię rentgenowską, spektroskopię NMR,
ultrawirowanie analityczne, filtrację żelową
i elektroforezę żelową.
• Kolagen jest przykładem ścisłego powiązania
między strukturą białek i ich funkcją biologicz¬
ną. Choroby związane z dojrzewaniem kolage¬
nu obejmują zespół Ehlers-Danlosa oraz szkor¬
but, wynikający z niedoboru witaminy C.
• Priony - cząstki białkowe nieposiadające
kwasów nukleinowych - powodują zakaźne,
śmiertelne encefalopatię gąbczaste, jak choro¬
ba Creutzfeldta-Jakoba, scrapie oraz gąbczaste
zwyrodnienie mózgu u bydła. Choroby priono-
we wiążą się ze zmianą struktury drugo- i trze¬
ciorzędowej naturalnie występującego białka,
PrPc. Gdy białko PrPc oddziałuje ze swojąpato-
52 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
logiczną izoformą PrPsc, jego konformacja jest
modyfikowana z postaci zasobnej w struktury
a-helikalne do struktury p, charakterystycznej
dla PrPsc.
PIŚMIENNICTWO
Branden C, Tooze J: Introduction to Protein Structure.
Garland, 1991.
Burkhard P, Stetefeld J, Strelkov SV: Coiled coils:
A highly versatile protein folding motif. Trends
Celi Biol 2001; 11:82.
Collinge J: Prion diseases of humans and animals: Their
causes and molecular basis. Annu Rev Neurosci
2001; 24:519.
Frydman J: Folding of newly translated proteins in vivo:
The role of molecular chaperones. Annu Rev Bio-
chem 2001; 70:603.
Gothel SF, Marahiel MA: Peptidyl-prolyl cis-trans iso-
merases, a superfamily of ubiąuitous folding cata-
lysts. Celi Mol Life Sci 1999; 55:423.
Hajdu J et al: Analyzing protein function in four dimen-
sions. Nat Struct Biol 2000; 7:1006.
Hardy J: Toward Alzheimer therapies based on genetic
knowledge. Annu Rev Med 2004; 55:15.
Ho BK, Thomas A, Brasseur R: Revisiting the Ramach-
andran plot: Hard-sphere repulsion, electrostatics,
and H-bonding in the a-helix. Protein Sci 2003;
12:2508.
Ice GE et al: Polychromatic x-ray microdiffraction stu-
dies of mesoscale structure and dynamics. J Syn-
chrotron Rad 2005; 12:155.
Irani DN, Johnson RT: Diagnosis and prevention of
bovine spongiform encephalopathy and variant
Creutzfeldt-Jakob disease. Annu Rev Med 2003;
54:305.
Jorgensen WL: The many roles of computation in drug
discovery. Science 2004; 303:1813.
Kong Y et al: Loss of alpha-hemoglobin-stabilizing pro¬
tein impairs erythropoiesis and exacerbates beta-
-thalassemia. J Clin Invest 2004; 114:1457.
Myers JK, Oas TG: Mechanism of fast protein folding.
Annu Rev Biochem 2002; 71:783.
Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, the key enzymes
of collagen biosynthesis. Matrix Biol 2003; 22:15.
Radord S: Protein folding: Progress madę and promises
ahead. Trends Biochem Sci 2000; 25:611.
Sadana A, Vo-Dinh T: Biomedical implications of pro¬
tein folding and misfolding. Biotechnol Appl Bio¬
chem 2001; 33:7.
Segrest MP et al: The amphipathic alpha-helix: A mul-
tifunctional structural motif in plasma lipoproteins.
Adv Protein Chem 1995; 45:1.
Stoddard BL et al: Milisecond Laue structures of an en-
zyme-product complex using photocaged substrate
analogs. Nat Struct Biol 1998; 5:891.
Young JC, Moarefi 1, Hartl FU: Hsp90: A specialized
but essential protein-folding tool. J Celi Biol 2001;
154:267.
Białka: mioglobina i hemoglobina
Peter J. Kennelly, PhD; 1/ictor W. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Białka hemowe - mioglobina i hemoglobina - po¬
średniczą w dostarczaniu tlenu, który jest niezbęd¬
ny do metabolizmu zachodzącego w warunkach
tlenowych. Funkcją mioglobiny - monomerycz-
nego białka mięśni czerwonych jest magazyno¬
wanie tlenu jako rezerwy wykorzystywanej w wa¬
runkach jego niedoboru. Hemoglobina z kolei jest
tetramerycznym białkiem erytrocytów, przeno¬
szącym 02 do tkanek i C02 oraz protony do płuc.
Fizjologiczną funkcję hemoprotein - hemoglobi¬
ny i oksydazy cytochromowej - uniemożliwiają,
odpowiednio, tlenek węgla i cyjanek, stanowiąc
tym samym śmiertelne zagrożenie. Mioglobina
i podjednostki hemoglobiny mają podobną struk¬
turę drugo- i trzeciorzędową, jednak tetrame-
ryczna struktura hemoglobiny pozwala na łatwe
oddziaływanie, co jest kluczowe dla jej funkcji.
Na przykład 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG), sta¬
bilizując strukturę czwartorzędową deoksyhemo-
globiny, sprzyja uwalnianiu 02. Badania mioglo¬
biny i hemoglobiny ujawniły istnienie zależności
między strukturą i funkcją białka oraz umożliwiły
poznanie molekularnych podstaw chorób uwarun¬
kowanych genetycznie, takich jak niedokrwistość
(anemia) sierpowatokrwinkowa i talasemie.
ZDOLNOŚĆ MAGAZYNOWANIA
I TRANSPORTU TLENU WIĄŻE SIE
Z OBECNOŚCIĄ HEMU I ŻELAZA
NA DRUGIM STOPNIU UTLENIENIA
Mioglobina i hemoglobina zawierają hem - cy¬
kliczny tetrapirol, w którym cztery pierścienie
pirolowe są połączone mostkami a-metinowymi.
Płaski układ sprzężonych wiązań podwójnych wa¬
runkuje pochłanianie światła widzialnego, nadając
cząsteczce czerwone zabarwienie. Podstawnikami
w pozycjach p pierścieni pirolowych hemu są gru¬
py metylowe (M), winylowe (V) i propionianowe
(Pr), ułożone w następującej kolejności: M, V, M,
V, M, Pr, Pr, M (ryc. 6-1). W centrum tego układu
znajduje się atom żelaza na drugim stopniu utle¬
nienia - Fe(II). Innymi białkami, w których grupą
prostetyczną jest tetrapirol zasocjowany z meta¬
lem, są cytochromy (Fe i Cu) oraz chlorofil (Mg)
(p. rozdz. 31). Funkcja biologiczna cytochromów
jako przenośników elektronów wynika z utlenie-
Ryc. 6-1. Hem. Pierścienie pirolowe, atomy węgla mostków me-
tinowych i atom żelaza(ll) leżą praktycznie w jednej płaszczyźnie.
Piąte i szóste wiązanie koordynacyjne Fe(ll) jest usytuowane
prostopadle do płaszczyzny cząsteczki hemu (znajduje się nad
i pod tą płaszczyzną). Na uwagę zasługuje rodzaj podstawników
przy atomach węgla p pierścieni pirolowych, centralnie położony
atom żelaza oraz polarne łańcuchy boczne, które są zwrócone na
zewnątrz cząsteczki mioglobiny.
54 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
nia i redukcji Fe i Cu. W przypadku natomiast
mioglobiny i hemoglobiny utlenienie Fe(ll) do
Fe(III) wiąże się z utratą aktywności biologicznej
przez te białka.
Mioglobina jest bogata w helisy a
Zmagazynowany w mioglobinie mięśni czerwo¬
nych tlen jest uwalniany w warunkach jego nie¬
doboru (np. w przypadku intensywnych ćwiczeń
fizycznych) i wykorzystywany w mitochondriach
mięśni do aerobowej syntezy ATP (p. rozdz. 13).
Zbudowany ze 153 reszt aminokwasowych łań¬
cuch polipeptydowy mioglobiny (masa cząstecz¬
kowa 17 kDa) jest silnie upakowaną cząsteczką
o wymiarach 4,5 * 3,5 x 2,5 nm (ryc. 6-2). Cechą
Ryc. 6-2. Model cząsteczki mioglobiny, opracowany na podsta¬
wie analizy rentgenograficznej. W modelu zaznaczono wyłącznie
atomy węgla a. Regiony a-helikalne są oznaczone literami od
A do H. (Na podstawie: Dickerson RE, w: The Proteins, wyd. 2,
t. 2, Neurath H. [red.], Academic Press, 1964, reprodukcja za
zgodą Elsevier).
szczególną tego białka jest występowanie aż 75%
łańcucha w formie ośmiu prawoskrętnych, zbu¬
dowanych z 7-20 reszt aminokwasowych helis a;
oznacza się je literami od A do H, zaczynając od
końca aminowego. Typowo dla białek globular-
nych powierzchnia mioglobiny jest polarna, nato¬
miast wnętrze cząsteczki zawiera, oprócz dwóch
reszt, reszty niepolame, jak Leu, Val, Phe i Met.
Tymi dwoma hydrofilowymi resztami wewnętrz¬
nymi są His E7 i His F8, czyli siódma i ósma resz¬
ta aminokwasowa w helisach E i F, które znajdu¬
ją się w pobliżu żelaza hemowego i biorą udział
w wiązaniu tlenu.
Reszty histydyny F8 i E7 odgrywają
wyjątkową rolę w wiązaniu tlenu
przez mioglobine
W mioglobinie grupa hemowa znajduje się w za¬
głębieniu między helisami E i F (p. ryc. 6-2). Po¬
larne, propionianowe łańcuchy boczne hemu są
skierowane na zewnątrz cząsteczki mioglobiny,
a jego pozostała część znajduje się w niepolar-
nym wnętrzu białka. Atom żelaza(II) piątym
wiązaniem koordynacyjnym wiąże się z atomem
azotu pierścienia imidazolowego His F8, okre¬
ślanej mianem histydyny proksymalnej. Po
drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do
His F8 znajduje się His E7, określana jako histy-
dyna dystalna.
Atom żelaza przesuwa sie w kierunku
płaszczyzny hemu po związaniu tlenu
W mioglobinie pozbawionej tlenu atom żelaza(II) '
jest wysunięty o 0,03 nm (0,3 A) poza płaszczyznę i
hemu w kierunku His F8. Powoduje to nieznacz¬
ne „ściągnięcie” hemu. W przypadku utlenowanej
mioglobiny, w której cząsteczka tlenu zajmuje szó¬
stą pozycję koordynacyjną, atom żelaza jest wysu¬
nięty poza płaszczyznę hemu o 0,01 nm (0,1 A).
Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy więc ruch
atomu żelaza, a w konsekwencji i His F8 oraz reszt
kowalencyjnie połączonych z His F8.
Apomioglobina stanowi zawadę
przestrzenną dla żelaza hemowego
W utlenowanej mioglobinie wiązanie między
atomem tlenu i żelaza jest prostopadłe do płasz¬
czyzny hemu. Drugi atom tlenu natomiast two¬
rzy z pierwszym wiązanie ustawione pod kątem
121° względem płaszczyzny hemu i jest odsunię¬
ty od dystalnej reszty histydyny (ryc. 6-3). Około
25 000 razy silniej niż tlen z wyizolowanym he¬
mem wiąże się tlenek węgla (CO). Chociaż CO
znajduje się w atmosferze w ilościach śladowych,
a podczas prawidłowego katabolizmu hemu po-
6. BIAŁKA: MIOGLOBINAI HEMOGLOBINA 55
Ryc. 6-3. Wiązanie tlenu i tlenku węgla z atomem żelaza hemu
w hemoglobinie. Histydyna dystalna E7 stanowi przestrzenną za¬
wadę dla wiązania CO pod preferowanym w stosunku do płasz¬
czyzny hemu kątem (180°).
wstają jedynie niewielkie jego ilości, nasuwa się
pytanie: jak to się dzieje, że 02, a nie CO zajmuje
szóste miejsce koordynacyjne atomu żelaza(Il)
hemu mioglobiny? Przyczyną jest przestrzenna
zawada, jaką stanowi otoczenie hemu w mioglo-
binie. Preferowane ułożenie CO przyłączonego
do żelaza hemowego jest dla wszystkich trzech
atomów (Fe, C, O) prostopadłe w stosunku do
płaszczyzny hemu. Podczas gdy taka orienta¬
cja jest możliwa w przypadku wyizolowanego
hemu, w mioglobinie i hemoglobinie histydyna
dystalna stanowi przestrzenną zawadę dla wią¬
zania CO pod tym kątem. Powoduje to, że CO
wiąże się w mniej korzystnej konfiguracji, co
zmniejsza siłę wiązania hem-CO ok. 200 razy
w stosunku do wiązania hem-02 (p. ryc. 6-3)
w warunkach normalnie występującego nadmia¬
ru 02 względem CO. Pomimo to w warunkach
fizjologicznych ok. 1% mioglobiny występuje
w połączeniu z tlenkiem węgla.
KRZYWE DYSOCJACJI UTLENOWANEJ
MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY
OBRAZUJĄ ICH ODMIENNE FUNKCJE
FIZJOLOGICZNE
Dlaczego mioglobina jest białkiem magazynu¬
jącym, a nie transportującym tlen? Zależność
między stężeniem, lub ciśnieniem cząstkowym
02 (p02), i ilością związanego tlenu obrazuje
krzywa wiązania tlenu (ryc. 6-4). W przypad¬
ku mioglobiny krzywa ta ma kształt hiperboli.
Ryc. 6-4. Krzywe wiązania tlenu przez hemoglobinę i mioglobinę.
Ciśnienie cząstkowe tlenu we krwi tętniczej wynosi ok. 100 mm
Hg; we krwi żylnej ok. 40 mm Hg; w naczyniach włosowatych
pracujących mięśni ok. 20 mm Hg; minimum niezbędne dla funk¬
cji oksydazy cytochromowej to ok. 5 mm Hg. Połączenie łańcu¬
chów polipeptydowych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina)
pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedynczymi łańcu¬
chami, wydajności dostarczania tlenu. (Zmodyfikowano i repro¬
dukowano za zgodą z: Serwer CR i wsp. [red.]: The Molecular
and Metabolic Bases of Inherited Disease, wyd. 7, McGraw-Hill,
1995).
Dlatego też mioglobina skutecznie wiąże 02
przy p02 naczyń włosowatych płuc, wynoszącym
13,33 kPa (100 mm Hg). Ponieważ jednak mio¬
globina oddaje tylko niewielką ilość związanego
02 przy p02 typowym dla pracujących mięśni
(2,66 kPa, 20 mm Hg) czy innych tkanek (5,33
kPa, 40 mm Hg), nie może ona służyć jako efek¬
tywny przenośnik 02. Dopiero w warunkach
niedoboru tlenu, jaki towarzyszy dużej aktywno¬
ści fizycznej, kiedy p02 w mięśniach spada do
0,66 kPa (5 mm Hg), mioglobina uwalnia zwią¬
zany tlen, który w mitochondriach jest wyko¬
rzystywany do biosyntezy ATP, umożliwiającej
kontynuowanie pracy mięśni.
KONSEKWENCJA CZWARTORZĘDOWEJ
STRUKTURY HEMOGLOBINY SA JEJ
WŁAŚCIWOŚCI ALLOSTERYCZNE
Właściwości poszczególnych typów hemoglobin
wynikają z ich struktury czwartorzędowej, jak
również z drugo- i trzeciorzędowej. Czwartorzę¬
dowa struktura hemoglobiny jest odpowiedzial¬
na za nowe, dodatkowe w stosunku do mioglobi-
56 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
ny, właściwości, które warunkują jej wyjątkową
funkcję biologiczną. Właściwości allosteryczne
(gr. allos - inna, steros - przestrzeń) hemoglobi¬
ny są ponadto podstawą do zrozumienia struk¬
tury i funkcji innych białek allosterycznych (p.
rozdz. 18).
Hemoglobina jest tetramerem
Hemoglobina jest tetramerem składającym się
z par dwóch typów łańcuchów polipeptydowych,
czyli podjednostek określanych literami alfabe¬
tu greckiego. Główne typy hemoglobiny mają
następujący skład tetrameru: a2p2 (HbA; pod¬
stawowa hemoglobina prawidłowa człowieka
dorosłego), a2y2 (HbF; hemoglobina płodowa),
a2S2 (HbS; hemoglobina sierpowatych krwinek
czerwonych) i a252 (HbA2; hemoglobina prawid¬
łowa człowieka dorosłego, stanowiąca niewielki
odsetek Hb całkowitej). Strukturę pierwszorzę-
dową łańcuchów P, y i 5 hemoglobin ludzkich
charakteryzuje duża zachowawczość (konserwa-
tywność) ewolucyjna.
Mioglobina i podjednostki p hemoglobiny
maja praktycznie identyczne struktury
drugorzędowe i trzeciorzędowe
Pomimo różnic w rodzaju i liczbie reszt amino-
kwasowych, mioglobina i łańcuchy polipeptydowe
P HbA wykazują praktycznie takie same struktury
drugorzędową i trzeciorzędową. Podobieństwo to
dotyczy umiejscowienia hemu i ośmiu odcinków
helikalnych, jak również obecności aminokwasów
o podobnych właściwościach i równoznacznych
pozycjach w strukturze pierwszorzędowej. Łań¬
cuch a, chociaż zawiera siedem, a nie osiem od¬
cinków helikalnych, również wykazuje znaczne
podobieństwo z mioglobiną.
Utlenowanie hemoglobiny indukuje
zmiany konformacji apoproteiny
Hemoglobina wiąże cztery cząsteczki 02, jedną
na jeden hem. Przyłączenie 02 przez jeden z he-
mów ułatwia wiązanie kolejnych cząsteczek 02
przez pozostałe grupy hemowe (p. ryc. 6-4). To
kooperatywne wiązanie tlenu z hemoglobiną
jest właściwością pozwalającą na wiązanie mak¬
symalnej ilości 02 w płucach i uwalnianie mak¬
symalnej ilości 02 w tkankach. Oddziaływania
kooperatywne, będące wyłącznie cechą białek
multimerycznych, są szczególnie istotne dla życia
w warunkach tlenowych.
Miarę powinowactwa różnych
hemoglobin do tlenu jest wartość P50
Wartość P50 odpowiada ciśnieniu cząstkowemu
tlenu, przy jakim nasycenie hemoglobiny tlenem
wynosi 50%. Jest ona różna dla różnych orga¬
nizmów, ale zawsze większa od wartości p02
w tkankach. Na przykład wartość P50 dla HbA
wynosi 3,46 kPa (26 mm Hg), podczas gdy dla
HbF 2,66 kPa (20 mm Hg). Ta różnica umoż¬
liwia HbF pobieranie tlenu od HbA w obrębie
łożyska. Po porodzie HbF przestaje właściwie
spełniać swoją funkcję, ponieważ jej duże powi¬
nowactwo do 02 utrudnia jego oddysocjowywa-
nie w tkankach.
Skład podjednostkowy tetrameru hemoglobiny
zmienia się podczas rozwoju osobniczego. Naj¬
wcześniej jest syntetyzowany tetramer ^2s2 (odpo¬
wiadający hemoglobinie zarodkowej). Pod koniec
pierwszego trymestru ciąży podjednostki £ i e
zostają zastąpione przez podjednostki a i y, two¬
rzące hemoglobinę płodową HbF (a2y2). Chociaż
synteza podjednostki p wchodzącej w skład HbA
(a2p2) rozpoczyna się w trzecim trymestrze ciąży,
całkowicie zastępuje ona łańcuch y dopiero kilka
tygodni po porodzie (ryc. 6-5).
50 h
3 6 Poród 3 6 j
Ciąża [miesiące] Wiek [miesiące] i
Ryc. 6-5. Synteza łańcuchów hemoglobiny w rozwoju osobni¬
czym człowieka. (Reprodukowano za zgodą z Ganong WF: Re-
view of Medical Physiology, wyd. 20, McGraw-Hill, 2001).
Utlenowaniu hemoglobiny towarzysza
duże zmiany konformacji białka
6. BIAŁKA: MIOGLOBINAI HEMOGLOBINA 57
Podczas wiązania pierwszej cząsteczki 02 do de-
oksyHb atom żelaza(II), leżący ok. 0,06 nm poza
płaszczyzną hemu w nieutlenowanej hemoglobi¬
nie, wsuwa się w płaszczyznę tetrapirolu, pocią¬
gając za sobą histydynę proksymalną (F8) i połą¬
czone z nią reszty aminokwasowe (ryc. 6-6). Po¬
woduje to rozerwanie mostków solnych między
Histydyna F8
CH
HC^
f N
Odpychanie
przestrzenne /
f (Fe
. Raszczyzna
1 hemu
+O2
\
C — N
// W
HC^ ^CH
XN
Ryc. 6-7. W czasie przejścia hemoglobiny z formy T w formę R
jedna para podjednostek (a^) obraca się o 15° w stosunku do
drugiej pary (an/pi). Ponieważ oś obrotu jest niewspótśrodkowa,
również para przesuwa się nieco w kierunku osi. Na diagra¬
mie para ai/ft, utrzymująca się w stałej pozycji, jest jasna, a para
a2/P2 dokonująca obrotu i przesunięcia jest zacieniona.
wymagają rozerwania mniejszej liczby mostków
solnych (ryc. 6-8). Symbole T i R są również uży¬
wane dla określenia struktury enzymów alloste-
rycznych, o odpowiednio małym lub dużym po¬
winowactwie do substratu.
Po uwolnieniu 02 w tkankach hemoglobina
transportuje C02 i protony do płuc
Ryc. 6-6. Podczas utlenowania atom żelaza(ll) wsuwa się w płasz¬
czyznę hemu. Razem z atomem żelaza przemieszcza się reszta
histydyny F8 i związane z nią reszty aminokwasowe. (Zmodyfiko¬
wane i reprodukowane za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 4,
Freeman, 1995. Copyright © 1995 WH Freeman and Company).
Oprócz transportowania tlenu z płuc do tka¬
nek, hemoglobina bierze udział w przenoszeniu
C02, ubocznego produktu metabolizmu tlenowe¬
go, i protonów z tkanek do płuc. Ditlenek węgla
wchodzi w reakcję z końcowymi grupami ami¬
nowymi podjednostek hemoglobiny, tworząc
karbaminian.
H 0
I II
C02 + Hb—NH3+ ^ 2H++ Hb—N—C—0"
końcami karboksylowymi wszystkich czterech
podjednostek hemoglobiny. W konsekwencji jed¬
na para podjednostek a/p obraca się w stosunku
do drugiej pary o 15° (ryc. 6-7). Głębokie zmiany
w drugo-, trzecio- i czwartorzędowej strukturze
białka towarzyszą zatem indukowanemu przez
02 przejściu hemoglobiny z formy T (ang. taut
- naprężona), o małym powinowactwie do tlenu,
w formę R (ang. relaxed - rozluźniona), o dużym
powinowactwie do tlenu. Zmiany te w znaczący
sposób zwiększają powinowactwo do 02 pozo¬
stałych nieutlenowanych grup hemowych, gdyż
Tworzeniu karbaminianu towarzyszy zamia¬
na ładunku grup N-końcowych z dodatniego na
ujemny, co umożliwia tworzenie mostków sol¬
nych pomiędzy łańcuchami a i p.
Hemoglobina wiąże ok. 15% C02 transporto¬
wanego przez krew. Większość pozostałego C02
jest przenoszona w formie wodorowęglanu, po¬
wstającego w erytrocytach w wyniku uwodnienia
C02 do kwasu węglowego (H2C03) w reakcji ka¬
talizowanej przez anhydrazę węglanową. Przy pH
charakterystycznym dla krwi żylnej H2C03 dyso¬
cjuje do jonu wodorowęglanowego i protonu.
58 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Forma T
Forma R
Ryc. 6-8. Prawdopodobieństwo przejścia struktury T w R zwiększa się wraz z utlenowaniem każdego hemu
tetramerycznej hemoglobiny. Przekształcenie to nie następuje z chwilą przyłączenia określonej liczby cząste¬
czek tlenu, lecz dokonuje się wraz z utlenowaniem kolejnych grup hemowych. Stopniowe przyłączanie tlenu
powoduje pękanie (linie proste) i osłabianie (linie wężykowate) mostków solnych łączących podjednostki
w formie T. Przejście między tymi dwoma formami pozostaje pod wpływem różnych czynników, takich jak:
protony, ditlenek węgla, chlorki, BPG: im większe stężenie tych czynników, tym więcej tlenu musi zostać zwią¬
zane, aby zapoczątkować przekształcenie. Schemat nie zawiera całkowicie utlenowanej cząsteczki w formie
T oraz całkowicie nieutlenowanej cząsteczki w formie R, ponieważ są one zbyt nietrwałe, aby istnieć w zna¬
czącej liczbie. (Zmodyfikowane i reprodukowane za zgodą z: Perutz MF: Hemoglobin structure and respiratory
transport, Sci. Am. [Dec], 1978;239:92).
ANHYDRAZA
WĘGLANOWA
C02 + H20
(Samorzutnie)
H2C03 ^
HCOś + H+
Kwas
węglowy
Wydychanie
2C02 + 2H20
\ ANHYDRAZA
^ WĘGLANOWA
2H2C03
Odłączeniu dwóch cząsteczek 02 towarzyszy
wiązanie protonu przez deoksyhemoglobinę, co
stanowi jeden z istotnych mechanizmów odpo¬
wiedzialnych za zdolność buforującą krwi. Nieco
niższe pH tkanek i karbaminacja stabilizują więc
formę T, zwiększając tym samym efektywność
uwalniania 02. W płucach natomiast zachodzi zja¬
wisko odwrotne. Przyłączenie tlenu do deoksyhe-
moglobiny powoduje uwolnienie protonów, które
łącząc się z wodorowęglanem, tworzą kwas wę¬
glowy. Dehydratacja H2C03, katalizowana przez
anhydrażę węglanową, dostarcza C02, który jest
usuwany w procesie oddychania. Wiązanie tlenu
zwiększa zatem wydalanie C02 z powietrzem
wydechowym (ryc. 6-9). To odwracalne zjawisko
wiązania protonu i 02 nosi nazwę efektu Bohra.
Efekt Bohra jest uwarunkowany kooperatywnoś-
cią interakcji hemów w tetramerycznej hemo¬
globinie. Efektu Bohra nie obserwuje się w przy¬
padku monomerycznej mioglobiny.
Hb • 402
TKANKI
V*- 402
L— 2H+ + 2HC0J
402'
PŁUCA
Hb • 2H'
(bufor)
2H2C03
\ DEHYDRATAZA
U WĘGLANOWA
2C02+ 2H20
Cykl Krebsa —
Ryc. 6-9. Efekt Bohra. Powstający w tkankach ditlenek węgla
łączy się z wodą, tworząc kwas węglowy, który dysocjuje do
protonu i jonu wodorowęglanowego. Nieutlenowana hemoglobi¬
na wiąże protony i transportuje je do płuc. W płucach, w wyniku
przyłączania tlenu, następuje uwalnianie protonów, które łącząc
się z jonem wodorowęglanowym, tworzą kwas węglowy, prze¬
kształcany przez anhydrazę węglanową do ditlenku węgla usu¬
wanego w procesie oddychania.
6. BIAŁKA: MIOGLOBINAI HEMOGLOBINA 59
Rozrywanie mostków solnych
podczas przytaczania 02
dostarcza protonów
Protony odpowiedzialne za efekt Bohra powsta¬
ją w wyniku rozrywania mostków solnych pod¬
czas przyłączania 02 do formy T hemoglobiny.
Konwersja hemoglobiny w utlenowaną formę R
powoduje rozerwanie mostków solnych angażu¬
jących His 146 w łańcuchach p. Oddysocjowane
protony z His 146 przekształcają wodorowęglan
w kwas węglowy (p. ryc. 6-9). Podczas uwalnia¬
nia 02 jest odtwarzana struktura T i występują¬
ce w niej mostki solne. Ta zmiana konformacji
zwiększa pKa His 146 w łańcuchu P, która wiąże
protony. Tak więc, zwiększenie stężenia protonów
umożliwiających odtworzenie mostków solnych
sprzyja uwalnianiu 02 z utlenowanej (forma R)
hemoglobiny, a wzrost p02 powoduje odłączanie
protonów.
2,3-Bisfosfoglicerynian (BPG) stabilizuje
strukturę T hemoglobiny
W warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwięk¬
sza się synteza 2,3-bisfosfoglicerynianu (BPG)
w erytrocytach. Związek ten tworzy się z 1,3-bis-
fosfoglicerynianu będącego metabolitem pośred¬
nim glikolizy.
BPG wiąże się z hemoglobiną w stosunku jedna
cząsteczka BPG na jedną tetrameryczną cząstecz¬
kę hemoglobiny, a miejscem wiązania jest prze¬
strzeń między czterema podjednostkami, znaj¬
dująca się w centrum cząsteczki hemoglobiny.
Rozmiar tej wnęki jest odpowiedni dla BPG tylko
w przypadku formy T, tj. wtedy, kiedy przestrzeń
między helisami H łańcuchów p jest wystarcza¬
jąco duża. BPG przyłącza się za pośrednictwem
mostków solnych, tworzonych przy udziale
Ryc. 6-10. Sposób wiązania się 2,3-bisfosfoglicerynianu z nie-
utlenowaną hemoglobiną człowieka. BPG oddziałuje z trzema
dodatnio naładowanymi grupami każdego z łańcuchów p. (Na
podstawie Arnone A: X-ray diffraction study of binding 2,3-dipho-
sphoglycerate to human deoxyhemoglobin. Naturę 1972;237:146.
Reprodukcja za zgodą. Copyright © 1972. Zaadaptowano za zgo¬
dą Macmillan Publisher Ltd.).
A-końcowych grup aminowych Val NA1, jak
również Lys EF6 oraz His H21 łańcuchów p (ryc.
6-10). BPG stabilizuje więc nieutlenowaną (for¬
mę T) hemoglobiny, tworząc dodatkowe wiązania
jonowe, które muszą ulec zerwaniu przed przej¬
ściem hemoglobiny w formę R.
Wiązanie BPG z hemoglobiną płodową jest
znacznie słabsze niż z hemoglobiną człowieka do¬
rosłego, ponieważ resztą H21 w łańcuchu y HbF
jest nie His, lecz Ser, która nie tworzy mostków
solnych z BPG. BPG ma więc mniejszy wpływ na
stabilizację formy T w przypadku HbF, co powo¬
duje jej większe, w porównaniu z HbA, powino¬
wactwo do tlenu.
Adaptacja do dużych wysokości
Przebywaniu człowieka na dużych wysokościach
towarzyszą takie zmiany fizjologiczne, jak wzrost
liczby erytrocytów, wzrost stężenia hemoglobiny
i BPG. Wzrost stężenia BPG powoduje zmniej¬
szenie powinowactwa HbA do 02 (obniżenie
wartości P50) i w konsekwencji wzrost zdolności
hemoglobiny do uwalniania 02 w tkankach.
60 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
ROZPOZNANO KILKASET WARIANTÓW
STRUKTURALNYCH HEMOGLOBINY
Mutacje genów kodujących łańcuchy a lub p
mogą wpływać na biologiczną funkcję hemo¬
globiny. Niemniej jednak, prawie wszystkie z po¬
nad 900 znanych mutantów hemoglobiny ludzkiej,
w większości łagodnych i rzadko występujących,
nie powoduje objawów klinicznych. Stan, w któ¬
rym w wyniku mutacji następuje zaburzenie funk¬
cji biologicznej hemoglobiny określa się mianem
hemoglobinopatii. Informacje i linki dotyczące
hemoglobiny człowieka i jej wariantów można
znaleźć pod adresem URL http://globin.cse.psu.
edu/ (Globin Gene Server). Poniżej przedstawiono
wybrane przykłady.
Methemoglobina i hemoglobina M
W przypadku methemoglobinemii żelazo hemowe
występuje na stopniu utlenienia +III, co uniemoż¬
liwia wiązanie i transport 02. W warunkach pra¬
widłowych za redukcję Fe(III) methemoglobiny
do Fe(II) jest odpowiedzialna reduktaza methe-
moglobinowa. Występowanie methemoglobiny
może być efektem ubocznym utlenienia Fe(II)
do Fe(III) przez takie czynniki, jak sulfonamidy,
lub konsekwencją dziedziczenia hemoglobiny M,
czy obniżonej aktywności reduktazy methemo¬
globino wej.
W hemoglobinie M reszta histydyny F8 (His
F8) jest zastąpiona resztą tyrozyny. Prowadzi to
do stabilizacji Fe(III) na skutek tworzenia przez
niego trwałego połączenia z anionem fenolano-
wym tyrozyny. W przypadku wariantów hemo¬
globin M dotyczących łańcuchów a obserwuje się
przesunięcie równowagi przejścia R-T w kierun¬
ku formy T, zmniejszenie powinowactwa do tlenu
i zniesienie efektu Bohra. W przypadku natomiast
wariantów dotyczących łańcuchów p efekt Bohra
jest zachowany, ponieważ nie ulega zakłóceniu
przejście R-T.
Mutacje, które sprzyjają tworzeniu się formy R
charakteryzują się zwiększeniem powinowactwa
do tlenu (np. hemoglobina Chesapeake). Dostar¬
czanie wskutek tego zbyt małej ilości tlenu do
tkanek powoduje hipoksję, która prowadzi do po-
licytemii, czyli zwiększenia liczby erytrocytów.
Hemoglobina S
Hemoglobina S powstaje w wyniku zastąpienia
Glu 6 w łańcuchu p przez Val. Zastąpienie polar¬
nej reszty kwasu glutaminowego niepolamą resz¬
tą waliny powoduje powstanie na powierzchni
łańcucha p „lepkich miejsc”; występują one za¬
równo w utlenowanej, jak i nieutlenowanej HbS.
Z kolei na powierzchni nieutlenowanej formy R
HbA i HbS występują miejsca komplementarne
do „lepkich miejsc”. Powoduje to, że przy niskim
Utlenowana A Nieutlenowana A Utlenowana S Nieutlenowana S
Nieutlenowana A Nieutlenowana S
Ryc. 6-11. Schemat przedstawiający „lepkie miejsca” (A) w hemoglobinie S i ich „receptory" (a) w nieutlenowanej he¬
moglobinie A i S. Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje łączenie się nieutlenowanej hemoglobiny S
w polimery. Wydłużanie polimerów przerywa nieutlenowana hemoglobina A niezawierająca „lepkich miejsc". (Zmodyfiko¬
wane i reprodukowane za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 4, red. Freeman, 1995. Copyright © 1995 WH Freeman
and Company).
6. BIAŁKA: MIOGLOBINAI HEMOGLOBINA 61
p02 nieutlenowana HbS polimeryzuje w długie
włókna, które się wytrącają. Chociaż nieutleno¬
wana HbA zawiera miejsca komplementarne do
„lepkich miejsc”, to jednak jej przyłączenie do
HbS uniemożliwia dalsze wydłużanie polime¬
rów na skutek braku na jej powierzchni „lepkich
miejsc” sprzyjających dalszemu wiązaniu się
cząsteczek Hb (ryc. 6-11). Tworzące się włókna
0 strukturze helikalnej zniekształcają erytrocyty,
które przybierają wówczas kształt sierpowaty,
1 są odpowiedzialne za ich zwiększoną podatność
na liżę w zatokach śledzionowych, jak również
za inne objawy kliniczne. Niskie p02 (pobyt na
dużych wysokościach) pogłębia tendencję do po¬
limeryzacji. W leczeniu anemii sierpowatokrwin-
kowej znajduje zastosowanie indukcja ekspresji
hemoglobiny płodowej, prowadząca do zahamo¬
wania polimeryzacji HbS, transplantacja komórek
macierzystych, a w przyszłości terapia genowa.
ZNACZENIE KLINICZNE
Mioglobinuria
Uwolniona w wyniku rozległego uszkodzenia
mięśni poprzecznie prążkowanych (zespół zmiaż¬
dżenia) mioglobina pojawia się w moczu, nada¬
jąc mu zabarwienie ciemnoczerwone. Obecność
mioglobiny w osoczu można stwierdzić również
w przypadku uszkodzenia mięśnia sercowego,
chociaż wtedy większe znaczenie diagnostyczne
mają enzymy surowicy (p. rozdz. 7).
Niedokrwistości (anemie)
Główną przyczyną niedokrwistości, czyli zmniej¬
szenia liczby krwinek czerwonych lub stężenia
hemoglobiny we krwi, jest zaburzenie syntezy
hemoglobiny (np. w przypadku niedoboru żela¬
za; p. rozdz. 49) lub zaburzenie erytropoezy (np.
w przypadku niedoboru kwasu foliowego lub wi¬
taminy B12; p. rozdz. 44). Podstawą rozpoznania
jest oznaczenie poziomu hemoglobiny.
Talasemie
Przyczyną talasemii są zaburzenia genetyczne
prowadzące do niedoboru lub całkowitego bra¬
ku łańcucha a lub p hemoglobiny. Spośród roz¬
poznanych ponad 750 różnych mutacji genów
kodujących podjednostki hemoglobiny trzy są
najbardziej typowe. Dotyczą one łańcucha a (ta¬
lasemie a) lub łańcucha p (talasemie p). Symbol
umieszczany w indeksie górnym oznaczenia typu
łańcucha wskazuje, że podjednostka w ogóle nie
występuje (a° lub P°), lub że jej synteza jest obni¬
żona (a+ lub p+). Oprócz przeszczepu szpiku le¬
czenie ma charakter objawowy.
Pewne mutanty hemoglobiny są powszechne
w wielu populacjach, przy czym pacjenci mogą
dziedziczyć więcej niż jedną mutację. Wskutek
tego choroby związane z hemoglobiną mogą da¬
wać złożony obraz kliniczny. Wykorzystanie ana¬
lizy DNA w ich diagnozowaniu przedstawiono
w rozdz. 39.
Hemoglobina glikowana (HbA1c)
Pod wpływem glukozy wnikającej do erytrocytów
hemoglobina ulega nieenzymatycznej glikacji [co
należy odróżnić od glikozylacji -przyp. tłum.] na
grupach aminowych aminokwasów A^-końcowych
oraz s-aminowych lizyny. Stężenie glikowanej
pochodnej hemoglobiny, stanowiącej w warun¬
kach prawidłowych ok. 5%, jest proporcjonalne
do stężenia glukozy we krwi. Ponieważ przeciętny
okres połowicznego rozpadu erytrocytów wynosi
60 dni, poziom glikowanej hemoglobiny (HbAlc)
odzwierciedla średnie stężenie glukozy we krwi
w ciągu 6-8 tygodni. Pomiar HbAlc pozwala więc
na ocenę skuteczności leczenia cukrzycy.
STRESZCZENIE
• Mioglobina jest monomerem, a hemoglobina
tetrametrem składającym się z dwóch typów
podjednostek (a2p2 w HbA). Mioglobina i pod¬
jednostki hemoglobiny, mimo różnic w struk¬
turze pierwszorzędowej, wykazują praktycznie
identyczne struktury drugo- i trzeciorzędowe.
• Hem to zasadniczo płaski, nieco „ściągnięty”,
cykliczny tetrapirol z centralnie położonym
atomem Fe(II), który jest połączony z czterema
atomami azotu pierścieni pirolowych, resztą
histydyny F8 oraz w oksyMb i oksyHb także
z 02.
• Krzywa wiązania 02 dla mioglobiny jest hiper-
boliczna, natomiast dla hemoglobiny - sigmoi-
dalna, na skutek kooperatywności oddziaływa¬
nia w tetramerze. Kooperatywność warunkuje
62 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
maksymalną efektywność wiązania 02 przy p02
płuc oraz uwalniania 02 przy p02 tkanek.
• Miarą powinowactwa różnych hemoglobin do
tlenu jest wielkość P50, odpowiadająca p02,
przy jakim nasycenie ich 02 wynosi 50%. He¬
moglobiny ulegają saturacji przy ciśnieniu
cząstkowym 02 w odpowiednim dla nich ukła¬
dzie oddechowym, np. w płucach czy łożysku.
• Podczas procesu utlenowania hemoglobiny
atom żelaza(ll), reszta histydyny F8 i połączo¬
ne z nią reszty aminokwasowe przemieszczają
się w kierunku płaszczyzny hemu. Utlenowanie
jest więc związane z rozerwaniem mostków
solnych, co powoduje rozluźnienie struktury
czwartorzędowej i ułatwia wiązanie 02.
• DeoksyHb jest stabilizowana przez 2,3-bisfo-
sforoglicerynian (BPG), który zajmując central¬
ną przestrzeń między czterema podjednostkami,
tworzy mostki solne z łańcuchami p. Podczas
utlenowania przestrzeń ta ulega zmniejszeniu
w wyniku zbliżenia podjednostek tetrameru,
powodując uwalnianie BPG i w konsekwencji
rozluźnienie struktury czwartorzędowej.
• Funkcją Hb jest również transport C02 i proto¬
nów z tkanek do płuc. Uwolnieniu 02 z oksyHb
w tkankach towarzyszy przyłączenie protonów
na skutek zmniejszenia wartości pKa reszt hi¬
stydyny.
• W hemoglobinie krwinek sierpowatych (HbS)
Val zastępuje Glu pó HbA. Powoduje to powsta¬
wanie „lepkich miejsc”, mających swoje miejsca
komplementarne w deoksyłłb (nieobecne w ok¬
syHb). Przy niskim ciśnieniu 02 deoksyHbS po¬
limeryzuje, tworząc włókna, które deformują
erytrocyty do kształtu sierpowatego.
• Talasemie a i p są niedokrwistościami, których
przyczyną jest upośledzenie syntezy łańcuchów
a lub p HbA.
PIŚMIENNICTWO
Bettati S et al: Allosteric mechanism of haemoglobin:
Rupture of salt-bridges raises the oxygen affinity of
the T-structure. J Mol Biol 1998;281:581.
Frauenfelder H, McMahon BH, Fenimore PW: Myo-
globin: The hydrogen atom of biology and
a paradigm of complexity. Proc Natl Acad Sci USA
2003; 100:8615.
Hardison RC et al: Databases of human hemoglobin va-
riants and other resources at the globin gene server.
Hemoglobin 2001 ;25:183.
Lukin JA, Ho C: The structure-function relationship of
hemoglobin in solution at atomie resolution. Chem
Rev 2004; 104:1219.
Ordway GA, Garry DJ: Myoglobin: An essential he-
moprotein in striated muscle. J Exp Biol 2004;
207:3441.
Persons DA: Update on gene therapy for hemoglobin di-
sorders. Curr Opin Mol Ther 2003;5:508.
Schrier SL, Angelucci E: New strategies in the treatment
of the thalassemias. Annu Rev Med 2005;56:157.
Steinberg MH, Brugnara C: Pathophysiological-based
approaches to treatment of sickle-ceil disease. Annu
Rev Med 2003;54:89.
Weatherall DJ et al: The hemoglobinopathies. Chapter
181 in The Metabolic and Molecuiar Bases of In-
herited Disease, 8 th ed. Serwer CR et al (editors).
McGraw-Hill, 2000.
Enzymy: mechanizm działania
Peter J. Kennelly, PhD; 1/ictor \N. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Enzymy są biologicznymi makromolekularni,
katalizującymi reakcje chemiczne, bez których
-jak wiadomo - życie nie byłoby możliwe. Pełny
i zrównoważony zestaw enzymów w organizmie
jest niezbędny w procesach przemian składni¬
ków pokarmu, zachodzących w celu dostarczenia
energii i chemicznych jednostek budulcowych,
wbudowywania tych „cegiełek” w białka, DNA,
błony, komórki i tkanki, nadania energii komór¬
kom mającym zdolność poruszania się, a także
w celu umożliwienia funkcjonowania nerwów
i skurczu mięśni. Z wyjątkiem cząsteczek RNA
mających funkcję katalityczną, tzw. rybozymów,
enzymy są białkami. Niedobory ilości lub aktyw¬
ności katalitycznej kluczowych enzymów mogą
wynikać z defektów genetycznych, niedoboru
pożywienia lub zatrucia toksynami. Wadliwe en¬
zymy mogą powstać w wyniku mutacji genetycz¬
nych lub infekcji przez wirusowe lub bakteryjne
patogeny (np. Yibrio cholerae). Lekarze analizują
zaburzenia aktywności enzymatycznej, wykorzy¬
stując czynniki farmakologiczne do zahamowa¬
nia specyficznych enzymów, i udoskonalają me¬
todę terapii genowej, aby zaradzić niedoborowi
ilości i funkcji enzymu.
ENZYMY SA EFEKTYWNYMI I WYSOCE
SPECYFICZNYMI KATALIZATORAMI
Enzymy, które katalizują przekształcenie jedne¬
go lub większej liczby związków (substratów)
w jeden lub kilka różnych związków (produk¬
tów) zwiększają szybkość reakcji, w porówna¬
niu z odpowiednią reakcją niekatalizowaną, co
najmniej 106 razy. Jak wszystkie katalizatory, tak
i enzymy nie zużywają się ani trwale nie zmienia¬
ją w wyniku udziału w reakcji.
Enzymy są katalizatorami nie tylko wysoce
efektywnymi, ale także niezwykle selektywnymi.
W przeciwieństwie do większości katalizatorów
wykorzystywanych w syntezach chemicznych,
enzymy są specyficzne w stosunku zarówno do
typu katalizowanej reakcji, jak i do pojedyncze¬
go substratu lub niewielkiego zestawu podobnych
substratów. Enzymy są także katalizatorami ste-
reospecyficznymi i zazwyczaj katalizują reakcje
tylko jednego stereoizomeru danego związku, np.
D-, ale nie L-cukru, czy L-, ale nie D-aminokwasu.
Ponieważ enzymy wiążą substraty przynajmniej
w „trzech punktach przyłączenia”, mogą nawet
przekształcać niechiralne substraty w chiralne
produkty. Rycina 7-1 ilustruje, dlaczego enzym
katalizujący redukcję niechiralnego substratu
pirogronianu tworzy raczej L-mleczan, niż mie-
Ryc. 7-1. Planarny model „trójpunktowego przyłączania” sub¬
stratu do miejsca aktywnego enzymu. Chociaż atomy 1 i 4 są
identyczne, przyłączenie atomów 2 i 3 do ich komplementarnych
miejsc na enzymie powoduje, że tylko atom 1 może tworzyć
wiązanie. W ten sposób raz przyłączone do enzymu pozornie
identyczne atomy mogą być odróżnialne, co pozwala na stereo-
specyficzną chemiczną zmianę.
64 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
szaninę racemiczną d- i L-mleczanu. Wysoka spe¬
cyficzność enzymów nadaje żyjącym komórkom
zdolność równoczesnego prowadzenia i niezależ¬
nej kontroli szerokiego spektrum procesów che¬
micznych.
ENZYMY SA KLASYFIKOWANE WEDŁUG
TYPU REAKCJI
Powszechnie używane nazwy większości enzy¬
mów zakończone końcówką -aza opisują typ ka¬
talizowanej reakcji. Na przykład dehydrogenaz
usuwają atomy wodoru, proteaz hydrolizują
białka, a izomerazy katalizujązmianę konfiguracji.
Nazwę mogą poprzedzać określenia wskazujące
substrat (oksydaza ksantynowa), źródło enzymu
(rybonukleaza trzustkowa), jego regulację (lipaza
wrażliwa na hormon) lub cechę jego mechanizmu
działania (proteaza cysternowa). W razie potrzeby
są dodawane cyfrowo-literowe opisy, aby ziden¬
tyfikować liczne formy enzymu (np. RNA poli-
meraza III, kinaza białkowa Cft).
Aby uniknąć niejasności, Międzynarodowa
Unia Biochemiczna (IUB) opracowała jedno¬
znaczny system nazewnictwa enzymów, w któ¬
rym każdy enzym ma unikatową nazwę, numer
kodu określający typ katalizowanej reakcji i jej
substraty. Enzymy są podzielone na sześć klas:
l.Oksydoreduktazy (katalizują reakcje utlenia¬
nia i redukcji).
2. Transferazy (katalizują przenoszenie takich
jednostek, jak reszty glikozylowe, grupy mety¬
lowe czy fosforanowe).
3. HydroIazy (katalizują hydrolityczne rozszcze¬
pienie wiązań C—C, C—O, C—N i innych).
4. Liazy (katalizują rozszczepienie wiązań C—C,
C—O, C—N i innych przez eliminacją atomu
i pozostawienie podwójnego wiązania).
5.Izomerazy (katalizują geometryczne lub struk¬
turalne zmiany w obrębie cząsteczki).
6. Ligazy (katalizują wiązanie się dwóch cząste¬
czek połączone z hydrolizą ATP).
Mimo że system zaproponowany przez IUB jest
przejrzysty i jednoznaczny, nazwy są długie i dość
niewygodne; często więc używa się tradycyjnych
- chociaż czasami dwuznacznych - nazw. Przy¬
kład heksokinazy ilustruje zarówno jasność sy¬
stemu IUB, jak i jego złożoność. Systematyczna
nazwa heksokinazy, wg systemu IUB, to ATP:
D-heksozo-6-fosfotransferaza E.C. 2.7.1.1. Na¬
zwa ta identyfikuje heksokinazę jako enzym klasy
2 (transferazy), podklasy 7 (przeniesienie grupy
fosforanowej), podpodklasy 1 (grupa alkoholo¬
wa jest akceptorem reszty fosforanowej), a człon
„heksozo-6” wskazuje, że fosforylacji ulega gru¬
pa alkoholowa przy atomie węgla 6 heksozy. Nie¬
mniej jednak kontynuujemy nazywanie tego en¬
zymu po prostu heksokinazą.
GRUPY PROSTETYCZNE, KOFAKTORY
I KOENZYMY ODGRYWAJĄ WAŻNE ROLE
W KATALIZIE
Wiele enzymów zawiera małe niebiałkowe czą¬
steczki i jony metali, które bezpośrednio uczest¬
niczą w przyłączaniu substratu lub katalizie. Na¬
zwano je grupami prostetycznymi, kofaktora-
mi i koenzymami; rozszerzają one możliwości
katalityczne enzymu, wynikające z własności
reszt aminokwasowych występujących w jego
łańcuchach peptydowych.
Grupy prostetyczne su trwałym
elementem struktury enzymu
Grupy prostetyczne odznaczają się stabilnością
wbudowania w strukturę białka za pośrednictwem
wiązań kowalencyjnych lub niekowalencyjnych.
Przykłady obejmują fosforan pirydoksalu*, mo-
nonukleotyd flawinowy (FMN)*, dinukleotyd
flawino-adeninowy (FAD)*, difosforan darniny*,
biotynę i jony metali Co, Cu, Mg, Mn i Zn. Metale
są najbardziej powszechnymi grupami prostetycz¬
nymi**. W przybliżeniu jedna trzecia wszystkich
enzymów zawiera silnie przyłączone jony meta¬
li; takie enzymy są nazywane metaloenzymami.
Jony metalu, które uczestniczą w reakcjach re-
doks, zazwyczaj wchodzą w skład grup proste-
tycznych, takich jak hem (rozdz. 6) lub centrum
żelazo-siarkowe (rozdz. 12). Metale mogą także
ułatwiać przyłączanie i orientację substratów,
tworzenie wiązań kowalencyjnych z produktami
pośrednimi reakcji (Co2+ w koenzymie B12) lub
* Według niektórych autorów związki te należą ra¬
czej do koenzymów \przyp. tłum.].
** Często atom metalu pełni rolę aktywatora, a nie
grupy prostetycznej [przyp. tłum.].
7. ENZYMY: MECHANIZM DZIAŁANIA 65
współdziałać z substratami, aby uczynić je bar¬
dziej elektrofilowymi (ubogimi w elektrony) lub
nukleofilowymi (bogatymi w elektrony).
Kofaktory asocjuja odwracalnie
z enzymami lub substratami
Kofaktory pełnią funkcje podobne do funkcji grup
prostetycznych, z tym że przyłączają się w sposób
przejściowy albo do enzymu, albo do substratu,
np. do ATP. W przeciwieństwie do stabilnie zaso-
cjowanych grup prostetycznych, kofaktory muszą
być więc obecne w środowisku otaczającym en¬
zym, aby zaszła kataliza. Najbardziej powszech¬
nymi kofaktorami także są jony metalu. Enzymy,
które wymagają jonu metalu jako kofaktora są na¬
zywane enzymami aktywowanymi przez metal,
aby odróżnić je od metaloenzymów, dla których
jony metalu służą jako grupy prostetyczne.
Koenzymy służą jako wahadłowce
(transportery) substratów
Koenzymy odgrywają rolę odnawiających się
wahadłowców - inaczej czynników przenoszą¬
cych grupy funkcyjne - które transportują wiele
substratów z miejsca ich tworzenia do miejsca
ich wykorzystania. Asocjacja z koenzymem tak¬
że stabilizuje substraty, takie jak atomy wodoru
lub jony wodorkowe, które są niestabilne w wod¬
nym środowisku komórki. Do innych ugrupowań
chemicznych transportowanych przez koenzymy
zaliczają się: grupy metylowe (folian), grupy acy-
lowe (koenzym A) i oligosacharydy (dolichol).
Wiele koenzymów, koiaktorów i grup
prostetycznych to pochodne witamin
z grupy B
Rozpuszczalne w wodzie witaminy B stanowią
ważne komponenty wielu koenzymów. Szereg ko¬
enzymów zawiera ponadto reszty adeniny, rybozy
i resztę fosforanową AMP lub ADP (ryc. 7-2).
Nikotynamid jest komponentem koenzymów re¬
akcji biologicznego utleniania i redukcji - NAD+
i NADP+, a ryboflawina jest składnikiem koenzy¬
mów FMN i FAD. Kwas pantotenowy jest kom¬
ponentem przenośnika grup acylowych - koenzy¬
mu A. Tiamina w formie difosforanu uczestniczy
w dekarboksylacji ketokwasów, a kwas foliowy
i kobamid uczestnicząjako koenzymy w metabo¬
lizmie ugrupowań jedno węglowych.
o
HO OH
0 = P — 0"
Ryc. 7-2. Struktura NAD+1 NADP+. W NAD+ R = H. w NADP+
R = PO!'.
KATALIZA ZACHODZI W MIEJSCU
AKTYWNYM
Największa specyficzność substratowa i wysoka i
sprawność katalityczna enzymów odzwierciedla i
występowanie środowiska, które jest znakomicie 5
dostosowane do pojedynczej reakcji. To środowi- •
sko, określane jako miejsce aktywne, najczęściej i
przyjmuje formę szczeliny lub kieszeni. Aktyw- •
ne miejsca multimerycznych enzymów często sq [
zlokalizowane w regionie między podjednostka- •
mi i zawierają reszty z więcej niż jednego mono- •
meru. Trójwymiarowe aktywne miejsce zarównc >
chroni substraty przed rozpuszczalnikiem, jak :
i ułatwia katalizę. Substraty przyłączają się dc >
aktywnego miejsca w regionie komplementarnym i
do części substratu, która nie będzie podlegała i
zmianie chemicznej podczas przebiegu reakcji, .
To jednocześnie odpowiednio ustawia, w stosun- -
ku do funkcjonalnych grup łańcuchów bocznych i
aminokwasów, te części substratu, które będą \
66 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
podlegały zmianie. Aktywne miejsce także przy¬
łącza i orientuje kofaktory lub grupy prostetycz-
ne. Wiele reszt aminokwasowych pochodzących
z różnych części łańcucha polipeptydowego (ryc.
7-3) sprawia, że miejsce aktywne jest dość duże
i trójwymiarowe.
Arg 145
Glu 72
I
H
Ryc. 7-3. Dwuwymiarowy schemat połączenia dipeptydowego
substratu - glicylo-tyrozyny w obrębie aktywnego miejsca kar-
boksypeptydazy A.
ENZYMY KORZYSTAJĄ Z ROZMAITYCH
MECHANIZMÓW, ABY UŁATWIĆ KATALIZĘ
W celu znacznego przyspieszenia reakcji che¬
micznych, enzymy wykorzystują różne kombina¬
cje czterech głównych mechanizmów.
Kataliza przez sąsiedztwo
Aby cząsteczki przereagowały, muszą się znajdo¬
wać w odległości wystarczającej do utworzenia
wiązania. Jeśli ich stężenie będzie największe,
będą się one dużo częściej ze sobą spotyka¬
ły i większa będzie szybkość ich reakcji. Kiedy
enzym przyłącza cząsteczki substratu w swoim
miejscu aktywnym, powstaje region, w którym
lokalne stężenie substratu jest wysokie. Takie
otoczenie ponadto orientuje cząsteczki substratu
przestrzennie w pozycji dla nich najodpowied¬
niejszej do oddziaływania, dzięki czemu szybkość
reakcji zwiększa się przynajmniej tysiąckrotnie.
Kataliza kwasowo-zasadowa
Zdolne do jonizacji grupy funkcyjne łańcuchów
bocznych aminokwasów i (jeśli są obecne) gru¬
py prostetyczne biorą udział w katalizie, działając
jako kwasy lub jako zasady. Kataliza kwasowo-
-zasadowa może być albo specyficzna, albo ogól¬
na. W katalizie „specyficznej” biorą udział tylko
protony (H30+) lub tylko jony OH . W katalizie
specyficznej kwasowej lub specyficznej zasa¬
dowej szybkość reakcji jest wrażliwa na zmiany
stężenia protonów, ale nie zależy od stężenia in¬
nych kwasów (donorów protonu) lub zasad (ak¬
ceptorów protonu), występujących w roztworze
lub w miejscu aktywnym. Reakcje, których szyb¬
kości są wrażliwe na wszystkie obecne kwasy lub
zasady podlegają katalizie ogólnej kwasowej lub
zasadowej.
Kataliza przez odkształcenie cząsteczki
substratu
Enzymy, które katalizują reakcje lityczne, obej¬
mujące rozerwanie wiązania kowalencyjnego,
zazwyczaj przyłączają substraty w konformacji
niezbyt dogodnej dla wiązania, które będzie pod¬
legało rozerwaniu. Utworzone w wyniku tego ob¬
szary naprężenia zniekształcają docelowe wiąza¬
nie, osłabiając je i czyniąc bardziej podatnym na
rozerwanie.
Kataliza kowalencyjna
Proces katalizy kowalencyjnej obejmuje two¬
rzenie wiązania kowalencyjnego między enzy¬
mem i co najmniej jednym substratem. Zmodyfi¬
kowany enzym staje się wtedy reaktantem, czyli
substratem reakcji. Kataliza kowalencyjna wpro¬
wadza nowy szlak reakcji, którego energia akty¬
wacji jest niższa - i dzięki temu szlak jest szybszy
- niż szlaku reakcji w homogennym roztworze.
Chemiczna modyfikacja enzymu jest przejścio¬
wa. Po zakończeniu reakcji enzym powraca do
swego oryginalnego, niezmodyfikowanego sta¬
nu. Jego rola pozostaje zatem katalityczna. Ka¬
taliza kowalencyjna jest szczególnie powszechna
wśród enzymów, które katalizują reakcje przeno¬
szenia grup. W katalizie kowalencyjnej najczꜬ
ciej biorą udział reszty aminokwasowe cysteiny
i seryny, rzadziej histydyny. Kataliza kowalen-
7. ENZYMY: MECHANIZM DZIAŁANIA 67
Pyr
Ala Pyr KG Glu
Ryc. 7-4. Mechanizm „ping-pong" transaminacji. E-CHO i E-CH2NH2 oznaczają, odpowiednio, kompleksy enzym-fosforan pirydoksalu
i enzym-pirydoksamina (Ala - alanina, Pyr - pirogronian, KG - a-ketoglutaran; Glu - glutaminian).
cyjna zazwyczaj wykorzystuje mechanizm „ping-
-pong”, czyli taki, w którym pierwszy substrat
jest przyłączany i jego produkt uwalniany przed
przyłączeniem drugiego substratu (ryc. 7-4).
SUBSTRATY INDUKUJĄ
KONFORMACYJNE ZMIANY
W ENZYMACH
W końcu XIX wieku Emil Fischer porównał wy¬
soce specyficzne dopasowanie między enzyma¬
mi i ich substratami do zamka i klucza. Chociaż
„model klucza i zamka” tłumaczy znakomitą
specyficzność interakcji enzym-substrat, to jed¬
nak zakładana sztywność miejsca aktywnego en¬
zymu uniemożliwia dynamiczne zmiany, które
towarzyszą katalizie. Wolny od tego ogranicze-
Ryc. 7-5. Dwuwymiarowy schemat modelu Koshlanda induko¬
wanego dopasowania aktywnego miejsca liazy. Przyłączenie
substratu A-B indukuje konformacyjne zmiany w enzymie, które
odpowiednio ustawiają reszty katalityczne, uczestniczące w ka¬
talizie, i naprężają wiązanie między A i B, ułatwiając jego roze¬
rwanie.
nia jest zaproponowany przez Daniela Koshlan¬
da model indukowanego dopasowania, który
zakłada, że zbliżenie substratów do enzymu in¬
dukuje zmianę konformacyjną, co można porów¬
nać do umieszczenia ręki (substrat) w rękawicz¬
ce (enzym) (ryc. 7-5). W efekcie enzym indukuje
wzajemne zmiany w substratach, wykorzystując
energię przyłączenia na ułatwienie transformacji
substratów w produkty. Model indukowanego
dopasowania został wielokrotnie potwierdzony
w biofizycznych badaniach ruchu enzymu pod¬
czas przyłączania substratu.
PROTEAZA HIV DZIAŁA WG
MECHANIZMU KATALIZY
KWASOWO-ZASADOWEJ
Enzymy z rodziny proteaz asparaginianowych,
która obejmuje enzym trawienny pepsynę, lizoso-
malne katepsyny i proteazę produkowaną przez
wirus ludzkiego zespołu nabytego upośledzenia
odporności (HIV), mają wspólny mechanizm
katalizy. W katalizie biorą udział dwie zacho¬
wawcze (konserwatywne) reszty asparaginiano-
we, które działają jako katalizatory kwas-zasada.
W pierwszym etapie reakcji reszta asparaginia-
nowa, działająca jako ogólna zasada (Asp X, ryc.
7-6), pobiera proton z cząsteczki wody, generując
bardziej nukleofilowy jon OH . Ten nowo po¬
wstały nukleofil atakuje elektrofilowy atom węgla
grupy karbonylowej wiązania peptydowego sta¬
nowiącego cel hydrolizy, w wyniku czego tworzy
się tetraedryczny pośredni stan przejściowy.
Druga reszta kwasu asparaginowego (Asp Y, ryc.
7-6) ułatwia wtedy dekompozycję tego tetrae-
drycznego intermediatu przez dodanie protonu do
grupy aminowej, utworzonej wskutek rozerwania
wiązania peptydowego. Dwie różne reszty kwasu
aparaginowego miejsca aktywnego mogą działać
jednocześnie jako zasada lub jako kwas, ponie¬
waż ich najbliższe otoczenie faworyzuje jonizację
jednego, ale nie drugiego.
68 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
O
0^>
4
0 O —H
v/
ch2
AspY
’°>V
ch2
AspX
0eN
N —C —R
/\ I
OH
© h )
©
1 .0
V
|
0, 0
V
|
1
ch2
i
ch2
AspY 1
I
Asp X
ł
R\
N — H
/
H
0
II
+ C - R
/
HO
0. 0©
V
1
H
V
1
1
ch2
ch2
I
AspY
I
AspX
H O
I II
R, — N — C — R,
© 0^ /O
I
Asp 102
©
fi.
©
R, — N -r C — R,
0
Ov o —
Hh
0\
Y
K
\
Ser 195
Asp 102
His 57
n
R, — NH2
©
|
o
/h~
o
— H — N XN
K
°\
Ser 195
Asp 102
H \
\ C — R,
® ox o&ii-^YOK^
N-/ Ser 195
Asp 102 His 57
©
^ o—c —r2
f] ri
0\ O^H-^-N7 N — H 0\
Y K -
Asp 102 His 57
Ryc. 7-6. Mechanizm katalizy z udziałem proteazy asparaginia-
nowej - proteazy HIV. Zakrzywione strzałki wskazują kierunki
przepływu elektronu. © Reszta asparaginianu X działa jako za¬
sada, aby zaktywować cząsteczkę wody, usuwając proton. ©
Zaktywowana cząsteczka wody atakuje wiązanie peptydowe,
tworząc przejściowy tetraedryczny intermediat. © Reszta kwa¬
su asparaginowego Y działa jako kwas, aby ułatwić rozerwanie
tetraedrycznego intermediatu i uwolnić rozszczepione produkty
przez dodanie protonu do nowo tworzącej się grupy aminowej.
Przejście protonu z Asp X na Asp Y przywraca proteazę do jej
stanu wyjściowego.
HOOC — R2
® Ov O— N^N H — 0^
Y \=( Y,*
Asp 102 His 57
Ryc. 7-7. Kataliza z udziałem chymotrypsyny. © System prze¬
kazu ładunku usuwa proton z Ser 195, czyniąc ją bardziej nu-
kleofilową. © Aktywowana Ser 195 atakuje wiązanie peptydowe,
tworząc przejściowy tetraedryczny intermediat. © Uwolnienie
peptydu z końca aminowego jest ułatwione dzięki dodaniu proto¬
nu do nowo tworzącej się grupy aminowej przez His 57 systemu
przekazu ładunku; w rezultacie powstaje intermediat acyl-Ser
195. © His 57 i Asp 102 współdziałają w aktywacji cząsteczki
wody, która atakuje acyl-Ser 195, tworząc drugi tetraedryczny
intermediat. © System przekazu ładunku przenosi proton na Ser
195, co ułatwia rozerwanie tetraedrycznego intermediatu w celu
uwolnienia peptydu z końca karboksylowego ©.
7. ENZYMY: MECHANIZM DZIAŁANIA 69
CHYMOTRYPSYNAIFRUKTOZO-
•2,6-BISFOSFATAZA DZIAŁAJĄ WG
MECHANIZMU KATALIZY KOWALENCYJNEJ
Chymotrypsyna
Wprawdzie kataliza z udziałem proteaz asparagi-
nianowych jest związana z bezpośrednim hydro-
litycznym atakiem wody na wiązanie peptydowe,
jednak kataliza z udziałem proteazy serynowej
- chymotrypsyny wymaga najpierw utworzenia
intermediatu - acyloenzymu. Wysoce reaktywna
reszta sery nowa, Ser 195, uczestniczy w „sieci
przekazu ładunku” z resztami histydyny 57 i aspa-
raginianu 102. Reszty te, odległe od siebie w struk¬
turze pierwszorzędowej, w miejscu aktywnym
znajdują się jedna od drugiej w odległości rów¬
nej wiązaniu. Ułożone w kolejności Asp 102-His
57-Ser 195 stanowią „sieć przekazu ładunku”,
która działa jako „wahadłowiec protonowy”.
Przyłączenie substratu zapoczątkowuje przesu¬
nięcia protonu, a w rzeczywistości transfer proto¬
nu grupy hydroksylowej Ser 195 na Asp 102 (ryc.
7-7). Dzięki zwiększonej w ten sposób nukleofilo-
wości atomu tlenu reszty seryny, jego atak na atom
węgla grupy karbonylowej wiązania peptydowe-
go substratu jest ułatwiony; tworzy się zatem po¬
średni kowalencyjny addukt acyl-enzym. Proton
z Asp 102 przechodzi poprzez His 57 na grupę
aminową, która uwalnia się, gdy zostaje rozerwane
wiązanie peptydowe. Część pierwotnego peptydu
z wolną grupą aminową opuszcza wtedy miejsce
aktywne i jest zastępowana cząsteczką wody.
„Sieć przekazu ładunku” znów aktywuje czą¬
steczkę wody, usuwając proton poprzez His 57 do
Asp 102. Powstający jon wodorotlenkowy atakuje
acyloenzym, a odwrócony „wahadłowiec” proto¬
nowy przywraca proton na Ser 195, odtwarzając
w ten sposób stan wyjściowy. Tak więc, mimo że
chymotrypsyna ulega modyfikacji w procesie ka¬
talizy, to jednak powraca do wyjściowej struktury
po zakończeniu reakcji. Trypsyna i elastaza dzia¬
łają wg podobnego mechanizmu katalitycznego,
ale reszty aminokwasowe Ser-His-Asp stanowią¬
ce ich „protonowy wahadłowiec” są inne.
Fruktozo-2,6-bisfosfataza
Fruktozo-2,6-bisfosfataza - regulatorowy enzym
glukoneogenezy (rozdz. 20) katalizuje hydroli-
tyczne uwolnienie fosforanu z atomu węgla-2
fruktozo-2,6-bisfosforanu. Rycina 7-8 ilustruje
rolę siedmiu reszt miejsca aktywnego. Kataliza
angażuje „katalityczną triadę”, złożoną z jednej
reszty glutaminianu i dwóch reszt histydyny, oraz
kowalencyjny intermediat - fosfohistydynę.
Ryc. 7-8. Kataliza z udziałem fruktozo-2,6-bisfosfatazy. (1) Lys
356 i Arg 257, 307 i 352 stabilizują poczwórny ujemny ładunek
substratu przez oddziaływanie ładunek-ładunek. Glu 327 stabili¬
zuje dodatni ładunek na His 392. (2) Nukleofilowa His 392 ata¬
kuje wiązanie C-2-grupa fosforanowa i przenosi ją na His 258,
tworząc ufosforylowany enzym. Fruktozo-6-fosforan opuszcza
enzym. (3) Nukleofilowy atak cząsteczki wody prawdopodobnie
wspomagany przez Glu 327, działający jako zasada, powoduje
tworzenie nieorganicznego fosforanu. (4) Nieorganiczny ortofo-
sforan jest uwalniany z Arg 257 i Arg 307.
RESZTY MIEJSC KATALITYCZNYCH
SA WYSOCE KONSERWATYWNE
Białka zaliczane pod względem ewolucyjnym do
wspólnej rodziny enzymów, takich jak proteazy
asparaginianowe lub serynowe, działają na różne
substraty wg podobnego mechanizmu katalizy.
Rodziny enzymów powstają na skutek duplikacji
genów, co tworzy drugą kopię genu, która koduje
pojedynczy enzym. Białka kodowane przez dwa
70 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
geny mogą ewoluować niezależnie, aby rozpo¬
znawać różne substraty; przykładem są chymo-
trypsyna, która rozszczepia wiązania peptydowe
od strony grupy karboksylowej aminokwasów
z dużymi hydrofobowymi resztami bocznymi,
i trypsyna, która rozrywa wiązania peptydowe
od strony grupy karboksylowej aminokwasów
zasadowych. Na podstawie obecności specy¬
ficznych reszt aminokwasowych w tej samej po¬
zycji w strukturze każdego przedstawiciela rodzi¬
ny można wywnioskować o wspólnym przodku
enzymów. Reszty te są określane resztami kon¬
serwatywnymi. Białka, które mają dużą liczbę
konserwatywnych reszt aminokwasowych są
wobec siebie homologiczne. Tabela 7-1 ilustruje
konserwatyzm w strukturze pierwszorzędowej
dwóch komponentów sieci przekazu ładunku dla
kilku proteaz serynowych. Wśród najbardziej
konserwatywnych reszt są te, które uczestniczą
bezpośrednio w katalizie.
IZOENZYMY STANOWIĄ ODMIENNE
FORMY ENZYMU, KTÓRE KATALIZUJĄ
TĘ SAMA REAKCJĘ CHEMICZNA
Organizmy wyższe często wytwarzają wiele fi¬
zycznie odmiennych form danego enzymu, z któ¬
rych każda katalizuje taką samą reakcję. Podob¬
nie jak przedstawiciele innych rodzin białek, te
białkowe katalizatory, czyli izoenzymy, powstają
w wyniku duplikacji genów. Izoenzymy mogą
wykazywać subtelne różnice we właściwościach,
takich jak wrażliwość na poszczególne czynniki
regulatorowe (rozdz. 9) lub powinowactwo do
substratów (np. heksokinaza lub glukokinaza),
co adaptuje je do specyficznych tkanek lub wa¬
runków. Pewne izoenzymy mogą także ułatwiać
przeżycie organizmu, dostarczając rezerwowych
kopii podstawowego enzymu.
AKTYWNOŚĆ KATALITYCZNA ENZYMÓW
UMOŻLIWIA ICH DETEKCJĘ
Występowanie enzymów w komórkach w sto¬
sunkowo małych ilościach sprawia, że stwierdze¬
nie ich obecności i określenie stężenia jest dość
skomplikowane. Niemniej, zdolność do szybkiego
przekształcenia tysięcy cząsteczek specyficznego
substratu do produktów daje każdemu enzymo¬
wi sposobność do ujawnienia swojej obecności.
Analiza katalitycznej aktywności enzymów jest
często wykorzystywana w badaniach naukowych
i klinicznych. W odpowiednich warunkach (patrz
rozdz. 8) szybkość reakcji katalitycznej, która jest
monitorowana, jest proporcjonalna do ilości obec¬
nego enzymu, co pozwala wnioskować na temat
jego stężenia.
Enzymologia pojedynczej cząsteczki
Czułość tradycyjnych metod analizy enzymów
jest ograniczona, dlatego trzeba użyć dużej gru¬
py lub zespołu cząsteczek enzymu, aby otrzymać
mierzalną ilość produktu. Uzyskane dane od¬
zwierciedlają zatem średnią zdolność katalityczną
pojedynczych cząsteczek. Ostatnie postępy w na-
notechnologii umożliwiły obserwację, zazwyczaj
za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, katalizy
odbywającej się z udziałem pojedynczych cząste¬
czek enzymu i substratu. Dzięki temu, naukowcy
mogą obecnie mierzyć szybkość pojedynczych
przypadków katalizy i czasami poszczególnych
etapów katalizy, wykorzystując proces zwany en-
zymologią pojedynczej cząsteczki (ryc. 7-9).
Tabela 7-1. Sekwencje aminokwasów w sąsiedztwie miejsc katalitycznych kilku proteaz wolu. Przedstawiono regiony miejsca katali¬
tycznego po stronie reszty serylowej (S) i histydylowej (H)
Enzym
Sekwencja aminokwasów wokót seryny ©
Sekwencja aminokwasów
wokót histydyny®
Trypsyna
D
S
C
Q
D G
©
G
G
P
V
V
C
S
G
K
V
V
s
A A ® C Y K
s
G
Chymotrypsyna A
S
S
C
M
G D
©
G
G
P
L
V
C
K
K
N
V
V
T
A A © G G V
T
T
Chymotrypsyna B
S
S
C
M
G D
©
G
G
P
L
V
C
Q
K
N
V
V
T
A A © C G V
T
T
Trombina
D
A
C
E
G D
©
G
G
P
F
V
M
K
S
P
V
L
T
A A © C L L
Y
P
7. ENZYMY: MECHANIZM DZIAŁANIA 71
12 3 4
Ryc. 7-9. Bezpośrednia obserwacja wyników przecięcia DNA kata¬
lizowanego przez restrykcyjną endonukleazę. Cząsteczki DNA unie¬
ruchomione na kulkach (szare) są umieszczone w przepływającym
buforze (cienkie strzałki), co powoduje przyjęcie przez nie rozciąg¬
niętej konformacji. Cięcie przy jednym z miejsc restrykcyjnych
(oznakowane kolorem zielonym) przez endonukleazy prowadzi do
skrócenia cząsteczki DNA, co można zaobserwować bezpośrednio
w mikroskopie, ponieważ zasady nukleotydów w DNA fluoryzują.
Chociaż endonukleaza (bez kółka) nie fluoryzuje i dlatego jest nie¬
widoczna, stopniowe skracanie cząsteczki DNA (1—>4) ujawnia,
że endonukleaza przyłącza się do wolnego końca cząsteczki DNA
i posuwa się wzdłuż niego od miejsca do miejsca.
Wykrycie leku wymaga analiz
enzymatycznych właściwych dla „wysoko-
wydajnych badań przesiewowych”
(ang. high-throughput screening)
Enzymy są jedną z głównych klas biomolekuł,
które stanowią cząsteczki docelowe w proce¬
sie opracowywania leków i innych czynników
terapeutycznych. Na przykład wiele antybio¬
tyków hamuje enzymy, które są unikatowe dla
bakteryjnych patogenów. Wynalezienie nowych
leków jest bardzo ułatwione, kiedy duża liczba
potencjalnych farmaceutyków może być podda¬
na szybkiej i zautomatyzowanej analizie w pro¬
cesie określanym jako wysokowydajne badania
przesiewowe (ang. high-throughput screening).
Jest on idealny dla dokonania przeglądu wielu
produktów chemii kombinatorycznej, jedno¬
czesnej syntezy dużych bibliotek komponentów
chemicznych, które zawierają wszystkie możliwe
kombinacje zestawu chemicznych prekursorów.
Analizy enzymatyczne, w których są wytwarzane
produkty chromogenne lub fluoryzujące, są ideal¬
ne dla badań przesiewowych, ponieważ optyczne
detektory są tak skonstruowane, że umożliwiają
szybką analizę wielu próbek.
Testy immunoenzymatyczne
Czułe analizy enzymatyczne mogą być wykorzy¬
stane do detekcji białek, które nie mają aktyw¬
ności katalitycznej. Testy immunoenzymatycz¬
ne (ang. enzyme-linked-immunosorbent-assay,
ELISA) wykorzystują przeciwciała kowalencyj¬
nie przyłączone do „reporterowego enzymu”,
takiego jak alkaliczna fosfataza lub peroksydaza
chrzanu, których produkty są łatwe do wykrycia,
zazwyczaj z wykorzystaniem absorpcji światła
lub fluorescencji. W celu badania surowicy lub
innych próbek biologicznych są one umieszcza¬
ne w plastikowych płytkach mikrotitracyjnych,
gdzie białka przylegają do powierzchni plastiku
i w ten sposób są unieruchamiane. Pozostające
powierzchnie absorpcyjne ściany są wówczas
„blokowane” przez dodanie nieantygenowego
białka, takiego jak albumina surowicy wołu.
Następnie jest podawany roztwór przeciwciała
kowalencyjnie przyłączonego do reporterowego
enzymu. Przeciwciała przyłączają się do unieru¬
chomionego antygenu i same są unieruchamiane.
Nadmiar wolnych cząsteczek przeciwciała jest
wówczas odmywany. Obecność i ilość przyłą¬
czonego przeciwciała określa się przez dodanie
substratu dla reporterowego enzymu.
Dehydrogenazy zależne od NAD(P)+
sa analizowane spektrofotometrycznie
Fizykochemiczne właściwości substratów reakcji
katalizowanej enzymatycznie warunkują sposoby
badania aktywności enzymatycznej. W analizie
spektrofotometrycznej wykorzystuje się zdol¬
ność substratu lub produktu do absorpcji światła.
Zredukowane koenzymy NADH i NADPH, zapi¬
sywane jako NAD(P)H, absorbują światło o dłu¬
gości fali 340 nm, w przeciwieństwie do ich utle¬
nionych form NAD(P)+ (ryc. 7-10). Gdy NAD(P)+
ulega redukcji, absorbancja światła o długości fali
340 nm wzrasta proporcjonalnie do ilości wytwo¬
rzonego NAD(P)H i z szybkością od niego zależ¬
ną. Odwrotnie, w obecności dehydrogenazy, która
katalizuje utlenianie NAD(P)H, obserwuje się
zmniejszoną absorbancję światła o długości fali
72 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Ryc. 7-10. Widma absorpcji NAD+ i NADH. Gęstość optyczna
(absorbancja) dotyczy roztworu o stężeniu 44 mg/L, znajdujące¬
go się w kuwecie o grubości 1 cm. NADP+ i NADPH mają widma
analogiczne, odpowiednio, do widm NAD+ i NADH.
340 nm. W każdym przypadku szybkość zmiany
absorbancji przy 340 nm będzie proporcjonalna
do ilości enzymu.
Analiza wielu enzymów jest sprzężona
z reakcja katalizowana przez
dehydrogenazę
Badania enzymów, których reakcjom nie towa¬
rzyszą zmiany w absorbancji lub fluorescencji są
zazwyczaj bardzo trudne. W pewnych przypad¬
kach produkt lub pozostały substrat mogą być
przekształcane w łatwiej wykrywalny związek.
W innych przypadkach produkt reakcji przed po¬
miarem może być oddzielony od substratu, który
nie przereagował. Alternatywną strategią jest zna¬
lezienie syntetycznego substratu, którego produkt
absorbuje światło lub fluoryzuje. Na przykład
fosforan /^-nitrofenolu jest sztucznym substratem
dla pewnych fosfataz i dla chymotrypsyny, który
nie absorbuje światła widzialnego. Niemniej jed¬
nak po hydrolizie anion /7-nitrofenolanowy absor¬
buje światło o długości fali 419 nm.
Inną dość powszechną metodą jest analiza
„sprzężona” (ryc. 7-11). Zazwyczaj dehydroge¬
naza, której substratem jest produkt badanego en¬
zymu, jest dodawana w katalitycznym nadmiarze.
| HEKS0KINAZA~|
Glukoza
r
ATR Mg2+
ADR Mg2+
Glukozo-6-fosforan
DEHYDROGENAZA
GLUK0Z0-6-F0SF0RAN0WA
r
NADP+
NADPH + H+
6-Fosfoglukonolakton
Ryc. 7-11. Oznaczanie aktywności heksokinazy metodą „sprzę¬
żoną”. Tworzenie glukozo-6-fosforanu przez heksokinazę jest
połączone z utlenieniem produktu przez dehydrogenazę glukozo-
-6-fosforanową w obecności dodanego enzymu i NADP+. Jeśli
dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa występuje w nadmiarze,
szybkość tworzenia NADPH, która może być mierzona przy dłu¬
gości fali 340 nm, jest określona szybkością tworzenia glukozo-
-6-fosforanu przez heksokinazę.
Szybkość pojawiania się i zanikania NAD(P)H
zależy wówczas od szybkości reakcji enzyma¬
tycznej, z którą jest sprzężona reakcja katalizowa¬
na przez dehydrogenazę.
ANALIZA PEWNYCH ENZYMÓW
POMAGA W DIAGNOZOWANIU
Spośród tysięcy różnych enzymów występujących
w ciele człowieka, te które pełnią funkcje nie¬
zbędne dla życia komórki są obecne we wszyst¬
kich tkankach organizmu. Inne enzymy lub izo-
enzymy ulegają ekspresji tylko w specyficznych
typach komórek, w pewnych okresach rozwoju
lub w odpowiedzi na specyficzne fizjologiczne
lub patofizjologiczne zmiany. Analiza obecności
oraz dystrybucji enzymów i izoenzymów - któ¬
rych ekspresja jest normalnie tkankowo-, czaso¬
wo- lub warunkowospecyficzna - często pomaga
w diagnozowaniu.
Niefunkcjonalne enzymy osocza ułatwiają
diagnozowanie i rokowania
Pewne enzymy, proenzymy i ich substraty są cały
czas obecne w krążeniu zdrowych ludzi i pełnią
we krwi funkcje fizjologiczne. Przykładami tych
funkcjonalnych enzymów osocza są lipaza lipo-
protein, pseudocholinoesteraza oraz proenzymy
7. ENZYMY: MECHANIZM DZIAŁANIA 73
krzepnięcia krwi i fibrynolizy (rozdz. 50). Więk¬
szość tych enzymów jest syntetyzowana i wydzie¬
lana przez wątrobę.
Osocze zawiera także wiele innych enzymów,
które pełnią nieznane fizjologiczne funkcje we
krwi. Te najwyraźniej niefunkcjonalne enzymy
osocza pochodzą ze zwykłego prawidłowego
rozpadu erytrocytów, leukocytów i innych komó¬
rek. Uszkodzenie tkanki lub nekroza, wynikające
z uszkodzenia ciała lub choroby, są zazwyczaj po¬
łączone ze wzrostem poziomu wielu niefunkcjo¬
nalnych enzymów osocza. W tabeli 7-2 przedsta¬
wiono listę enzymów wykorzystywanych w diag¬
nostyce enzymatycznej.
Tabela 7-2. Giówne enzymy osocza wykorzystywane w diagno¬
styce klinicznej
Enzym osocza
Główne zastosowanie
diagnostyczne
Aminotransferazy
Aminotransferaza
asparaginianowa
(AST lub SGOT)
Aminotransferaza alaninowa
(ALT lub SGPT)
Zawal serca
Wirusowe zapalenie wątroby
Amylaza
Ostre zapalenie trzustki
Ceruloplazmina
Zwyrodnienie
wątrobowo-soczewkowate
(choroba Wilsona)
Fosfokinaza kreatynowa
Choroby mięśni i zawal serca
Transpeptydaza y-glutamylowa
Różne choroby wątroby
Dehydrogenaza mleczanowa
(izoenzymy)
Zawal serca
Lipaza
Ostre zapalenie trzustki
Fosfataza kwasowa
Rak gruczołu krokowego
z przerzutami
Fosfataza zasadowa
(izoenzymy)
Różne choroby kości, choroby
wątroby z utrudnionym
odpływem żółci
Uwaga: Wiele enzymów nie jest specyficznych dla podanych
chorób.
Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej
sa wykorzystywane do wykrywania
zawałów serca
Dehydrogenaza L-mleczanowa jest enzymem te-
tramerycznym, którego cztery podjednostki wy¬
stępują w dwóch izoformach, określonych sym¬
bolami H (serce) i M (mięśnie). Podjednostki
mogą się łączyć, w sposób pokazany niżej, w celu
wytworzenia aktywnych izoenzymów dehydroge¬
nazy L-mleczanowej.
Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej Podjednostki
11 HHHH
12 HHHM
13 HHMM
14 HMMM
15 MMMM
Podjednostki H i M są kodowane przez odmien¬
ne geny, których ekspresja jest różnie regulowana
w różnych tkankach. Ponieważ w sercu ekspresji
ulega prawie wyłącznie podjednostka H, izoen-
zym Ij dominuje w tej tkance. Z kolei, izoenzym
I5 dominuje w wątrobie. W stanie prawidłowym
w osoczu występują niewielkie ilości dehydroge¬
nazy mleczanowej. Po zawale mięśnia sercowego
lub w chorobie wątroby uszkodzone tkanki uwal¬
niają charakterystyczne izoenzymy dehydrogena¬
zy mleczanowej do krwi. Wynikający z tego pod¬
wyższony poziom izoenzymów b lub I5 jest wy¬
krywany przez badanie aktywności katalitycznej
oddzielonych elektroforetycznie różnych oligo¬
merów dehydrogenazy mleczanowej (ryc. 7-12).
ENZYMY UŁATWIAJĄ ROZPOZNANIE
CHORÓB GENETYCZNYCH
Chociaż od dawna wiadomo, że wiele chorób
człowieka jest wynikiem zmian w DNA, „na¬
rzędzia” do wykrywania mutacji genetycznych
dopiero ostatnio stały się powszechnie dostępne.
Techniki te opierają się na wykorzystaniu efek¬
tywności katalitycznej i specyficzności katalizy
enzymatycznej. Na przykład łańcuchowa reak¬
cja polimerazy (ang. polymerase chain reaction,
PCR) polega na zastosowaniu enzymów w roli
katalitycznych amplifikatorów i pozwala zanali¬
zować DNA obecny w próbach biologicznych, co
ma duże znaczenie m.in. w medycynie sądowej.
W technice PCR termostabilna polimeraza DNA,
kierowana przez odpowiednie startery oligonu-
kleotydowe, produkuje tysiące kopii próbki DNA,
której początkowo było zbyt mało, aby mogła być
wykryta bezpośrednio.
74 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Ryc. 7-12. Prawidłowy i patologiczny skład izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w surowicy człowieka. Izoenzymy LDH
surowicy były rozdzielone elektroforetycznie i wizualizowane z wykorzystaniem sprzężonej reakcji, której schemat znajduje się z lewej
strony ryciny (NBT - błękit nitrotetrazoliowy; PMS - metylosiarczan fenazyny). Po prawej stronie ryciny pokazano barwiony elektrofo-
regram. Wykres A - surowica od pacjenta z zawałem serca, B - prawidłowa surowica i C - surowica od pacjenta z chorobą wątroby.
Cyframi arabskimi określono specyficzne izoenzymy LDH.
Wykrycie polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych (ang. restriction fragments length
polymorphism, RFLP) ułatwiło w fazie prenatal¬
nej wykrycie zaburzeń dziedzicznych, takich jak
niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, beta-ta-
lasemia, fenyloketonuria noworodków, choroba
Huntingtona. Detekcja RFLP obejmuje cięcie
dwuniciowego DNA przez endonukleazy restryk¬
cyjne, które mogą wykrywać subtelne zmiany
w DNA dotyczące ich miejsc rozpoznawania.
W rozdziale 39 zamieszczono więcej szczegółów
na temat użycia PCR i enzymów restrykcyjnych
w diagnostyce.
REKOMBINACJA DNA JEST WAŻNYM
NARZĘDZIEM W BADANIU ENZYMÓW
Technika rekombinacji DNA okazała się ważnym
narzędziem w badaniu enzymów. Do badania
struktury i funkcji sąpotrzebne enzymy o wysokim
stopniu oczyszczenia. Wyizolowanie pojedyncze¬
go enzymu, zwłaszcza jeśli występuje w niskim
stężeniu, z tysięcy białek zawartych w komórce
może być niezwykle trudne. Jeżeli gen dla danego
enzymu został sklonowany, jest możliwe wytwo¬
rzenie dużej ilości białka w Escherichia coli lub
drożdżach. Niemniej, nie wszystkie białka zwie¬
rzęce mogą ulegać ekspresji w formie aktywnej
w komórkach bakteryjnych, ani też drobnoustroje
nie mogą przeprowadzać pewnych wymaganych
procesów potranslacyjnych. Z tego powodu gen
może ulegać ekspresji w systemach kultur komó¬
rek zwierzęcych wykorzystujących bakulowirus
jako wektor ekspresyjny do transformacji kultur
komórek owadów. Więcej szczegółów dotyczą¬
cych technik rekombinacji DNA można znaleźć
w rozdz. 39.
Rekombinowane białka fuzyjne
są oczyszczane za pomocą
chromatografii powinowactwa
Technika rekombinacji DNA może być także
wykorzystana do modyfikowania białek, które
w nowej postaci mogą być łatwo oczyszczane
metodą chromatografii powinowactwa. Gen bę¬
dący obiektem zainteresowania jest przyłączany
do oligonukleotydowej sekwencji, która koduje
karboksy- lub aminokońcowe wydłużenie kodo¬
wanego białka. Utworzone zmodyfikowane biał¬
ko, zwane białkiem fuzyjnym, zawiera domenę
7. ENZYMY: MECHANIZM DZIAŁANIA 75
dostosowaną do oddziaływania ze specyficznym
nośnikiem stosowanym w chromatografii powi¬
nowactwa. Jednym z częstych podejść metodycz¬
nych jest przyłączenie oligonukleotydu, który
koduje sześć reszt histydyny. Ulegające ekspresji
białko z tą „metką histydynową” przyłącza się
do chromatograficznego nośnika, który zawiera
unieruchomione dwuwartościowe jony meta¬
lu, np. Ni2+. Podobnie, wiążąca substrat domena
S-transferazy glutationowej (GST) może służyć
jako „metka GST”. Na rycinie 7-13 pokazano
schemat oczyszczania białka fuzyjnego z metką
GST z wykorzystaniem nośnika powinowactwa
zawierającego przyłączony glutation. Białka fu-
zyjne także często kodują miejsce ulegające roz¬
szczepieniu przez wysokospecyficzną proteazę,
taką jak trombina, w regionie, który łączy dwie
części białka. To pozwala usunąć dodaną domenę
fuzyjną po oczyszczeniu metodą chromatografii
powinowactwa.
p| GST TTKj
Enzym
Nałożenie na kolumnę
do chromatografii powinowactwa
zawierającą glutation GSH
1 GSH j GST Jt£
Ryc. 7-13. Wykorzystanie fuzyjnych białek z S-transferazą glu-
tationową (GST) do oczyszczania rekombinowanych enzymów
(GSH - glutation).
Ukierunkowana mutageneza pozwala
zrozumieć mechanizm katalizy
Po wykazaniu ekspresji białka ze sklonowanego
genu, jest możliwe zastosowanie ukierunkowa¬
nej mutagenezy do zmiany specyficznych ami¬
nokwasów poprzez modyfikację ich kodonów.
Metoda ta, użyta w połączeniu z analizami ki¬
netyki reakcji i krystalografią rentgenograficzną,
ułatwia rozpoznanie specyficznej roli reszt ami-
nokwasowych w przyłączaniu substratu i katali¬
zie. Na przykład hipoteza, że pojedynczy amino¬
kwas działa jako kwas, może zostać potwierdzona
przez zastąpienie go aminokwasem niezdolnym
do oddania protonu.
STRESZCZENIE
• Enzymy są wysokoefektywnymi i niezwykle
specyficznymi katalizatorami.
• Organiczne i nieorganiczne grupy prostetyczne,
kofaktory i koenzymy odgrywają ważne role
w katalizie. Koenzymy, z których wiele jest po¬
chodnymi witamin z grupy B, służą jako „wa¬
hadłowce” przenoszące substraty.
• Mechanizmy katalizy z udziałem enzymów
obejmują: wprowadzenie naprężenia, zbliżenie
reagentów, katalizę kwasowo-zasadową i kata¬
lizę kowalencyjną.
• Reszty aminokwasowe, które uczestniczą w ka¬
talizie, są konserwatywne w obrębie danej kla¬
sy enzymów.
• Substraty i enzymy wzajemnie indukują zmia¬
ny konformacyjne, które ułatwiają rozpoznanie
substratu i katalizę.
• Aktywność katalityczna enzymów ujawnia ich
obecność, ułatwia ich wykrycie i jest podstawą
testów immunoenzymatycznych.
• Wiele enzymów można analizować spektrofo-
tometrycznie, łącząc je z dehydrogenazą zależ¬
ną od NAD(P)+.
• Chemia kombinatoryczna daje możliwość two¬
rzenia obszernych bibliotek potencjalnych ak¬
tywatorów i inhibitorów enzymów, które mogą
być testowane przez „high-throughput screen-
ing”.
• Badanie enzymów osocza ułatwia diagnozę
i rokowania. Na przykład w zawale mięśnia ser¬
cowego poziom izoenzymu Ij dehydrogenazy
mleczanowej w osoczu krwi jest podwyższony.
76 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
• Endonukleazy restrykcyjne ułatwiają diagnozę
chorób genetycznych, ujawniając polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych.
• Wykorzystanie ukierunkowanej mutagenezy do
zmiany reszt, ważnych w katalizie lub przyłą¬
czaniu substratu, umożliwia poznanie mechani¬
zmów działania enzymu.
• Rekombinowane białka fuzyjne, takie jak za¬
kończone ciągiem reszt histydynowych lub
połączone z GST enzymy, mogą być łatwo
oczyszczane techniką chromatografii powino¬
wactwa.
PIŚMIENNICTWO
Brik A, Wong C-H: HIV-1 protease: Mechanism and
drug discovery. Org Biomol Chem 2003; 1:5.
Conyers GB et al: Metal reąuirements of a diadenosi-
ne pyrophosphatase from Bartonella bacilliformis.
Magnetic resonance and kinetic studies of the role
of Mn2+. Biochemistry 2000;39:2347.
Fersht A: Structure and Mechanism in Protein Science:
A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding.
Freeman, 1999.
Frank RAW, et al: A molecular switch and proton wire
synchronize the active sites in thiamine enzymes.
Science 2004;306:872.
Geysen HM, Schoenen F, Wagner D, Wagner R: Com-
binatorial compound libraries for drug discove-
ry: An ongoing challenge. Naturę Rev Drug Disc
2003;2:222.
Goddard J-P, Reymond J-L: Enzyme assays for
high-throughput screening. Curr Opin Biotech
2004; 15:314.
Hedstrom L: Serine protease mechanism and specificity.
Chem Rev 2002; 102:4501.
Ishijima A, Yanagida T: Single molecule nanobioscien-
ce. Trends Biochem Sci 2001;26:438.
Schafer B, Gemeinhardt H, Greulich KO: Direct mic-
roscopic observation of the time course of single-
molecule DNA restriction reactions. Agnew Chem
Int Ed 2001;40:4663.
Silverman RB: The Organie Chemistry of Enzyme-Cata-
lyzed Reactions. Academic Press, 2002.
Suckling CJ: Enzyme Chemistry. Chapman & Hall, 1990.
Sundaresan V, Abrol R: Towards a generał model for
protein-substrate stereoselectivity. Protein Sci
2002; 11:1330.
Todd AE, Orengo CA, Thomton JM: Plasticity of
enzyme active sites. Trends Biochem Sci 2002;
27:419.
Walsh CT: Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman,
1979.
Enzymy: kinetyka
Peter J. Kennelly, PhD; 1Hctor W. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Kinetyka enzymatyczna jest działem bioche¬
mii zajmującym się ilościowymi pomiarami
szybkości reakcji katalizowanych przez enzymy
i systematycznym badaniem czynników, które
wpływają na te szybkości. Kompletny, zrówno¬
ważony zestaw aktywności enzymatycznych jest
szczególnie ważny dla utrzymania homeostazy.
Znajomość kinetyki enzymatycznej jest zatem
niezbędna do zrozumienia, jak stresy fizjologicz¬
ne, takie jak anoksja, metaboliczna kwasica i za-
sadowica, toksyny i czynniki farmakologiczne,
wpływają na tę równowagę. Analiza kinetyczna
może dostarczyć danych na temat liczby i kolej¬
ności poszczególnych etapów przemiany, w jakiej
enzymy przekształcają substraty do produktów.
Wspólnie z ukierunkowaną mutagenezą i innymi
technikami, które umożliwiają badanie struktury
białka, analiza kinetyczna może wyjaśnić szcze¬
góły mechanizmu katalitycznego działania dane¬
go enzymu. Udział enzymów niemal we wszyst¬
kich procesach fizjologicznych czyni je celem dla
leków, które pozwalają całkowicie wyleczyć lub
dają znaczącą poprawę w trakcie choroby czło¬
wieka. Zastosowanie kinetyki enzymatycznej sta¬
nowi główną drogę, dzięki której naukowcy roz¬
poznają i charakteryzują czynniki terapeutyczne,
selektywnie hamujące szybkość specyficznych,
katalizowanych enzymatycznie procesów. Kine¬
tyka enzymatyczna odgrywa więc podstawową
rolę w opracowywaniu nowych leków, w farma-
kodynamice porównawczej i określaniu sposobu
działania leków.
REAKCJE CHEMICZNE OPISUJE SIE ZA
POMOCĄ RÓWNAŃ ZBILANSOWANYCH
Zbilansowane równanie chemiczne określa
kolejno wyjściowe związki chemiczne (substra¬
ty) i nowe związki chemiczne (produkty) two¬
rzące się w danej reakcji chemicznej, wszystkie
w prawidłowych proporcjach, czyli w ilościach
stechiometrycznych. Na przykład równanie zbi¬
lansowane (1) opisuje reakcję jednej cząsteczki
substratu A i jednej cząsteczki substratu B, w wy¬
niku której tworzy się jedna cząsteczka produktu
P i jedna cząsteczka produktu Q:
A + B^P + Q (1)
Podwójne strzałki oznaczają odwracalność, istot¬
ną cechę wszystkich reakcji chemicznych. Jeśli
zatem w reakcji (1) A i B mogą tworzyć P i Q,
to P i Q mogą także tworzyć A i B. Określenie da¬
nego związku jako „substrat” lub jako „produkt”
jest dlatego nieco arbitralne, skoro produkty reak¬
cji napisanej w jednym kierunku sąsubstratami dla
reakcji odwrotnej. Termin „produkty” jest jednak
często używany na określenie reagentów, których
tworzenie jest termodynamicznie uprzywilejowa¬
ne. Reakcje, w których czynniki termodynamicz¬
ne sprzyjają tworzeniu produktów, wskazywa¬
nych strzałką, często są zapisywane z pojedynczą
strzałką, tak jakby były „nieodwracalne”:
A + B -> P + Q (2)
Jednokierunkowe strzałki są także stosowane
w opisie reakcji w żywych komórkach, gdzie pro¬
dukty reakcji (2) są bezpośrednio wykorzystane
w następnej reakcji katalizowanej enzymatycznie.
78 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Szybkie usuwanie produktu P lub Q skutecznie
zapobiega przebiegowi reakcji odwrotnej, czy¬
niąc równanie (2) funkcjonalnie nieodwracal¬
nym w warunkach fizjologicznych.
ZMIANA ENTALPII SWOBODNEJ
OKREŚLA KIERUNEK I STAN
RÓWNOWAGI REAKCJI CHEMICZNYCH
Zmiana entalpii swobodnej (zwanej także energią
swobodną Gibbsa), AG, opisuje zarówno kieru¬
nek, w jakim będzie przebiegała reakcja che¬
miczna, jak i stężenie substratów oraz produktów,
które będą występowały w stanie równowagi. AG
dla reakcji chemicznej jest równa różnicy między
sumą entalpii swobodnych tworzenia produktów
reakcji AGP i sumą entalpii swobodnych tworze¬
nia substratów AGS. AG° określa zmianę entalpii
swobodnej, jaka towarzyszy przejściu substratów
i produktów od stanu standardowego, tj. stężeń
jednomolowych, do stanu równowagi. Bardziej
użyteczna dla biochemii jest wartość AG°', która
definiuje AG° w standardowym stanie 10 7 M pro¬
tonów, pH 7,0 (rozdz. 11). Jeżeli entalpia swobod¬
na tworzenia produktów jest mniejsza od entalpii
swobodnej tworzenia substratów, znak AG° i AG°'
będzie ujemny, wskazując, że reakcja tak opisana
przebiega w kierunku od strony lewej do prawej.
Takie reakcje są nazywane spontanicznymi (sa¬
morzutnymi). Znak i wielkość zmiany entalpii
swobodnej określa, jak daleko będzie zachodziła
reakcja. Równanie:
(6)
aG° = -RT In K* n
(3)
[P] [Q]
[A] [B]
a dla reakcji (5):
AG° może być obliczona z równania (3), jeżeli stę¬
żenia substratów i produktów w stanie równowagi
są znane. Jeżeli AG° ma wartość ujemną, Kęą będzie
większa od jedności i stężenie produktów w stanie
równowagi będzie wyższe niż stężenie substra¬
tów. Jeżeli AG° ma wartość dodatnią, Keą będzie
mniejsza od jedności i uprzywilejowane będzie
tworzenie substratów. Należy wziąć pod uwagę,
że skoro AG° jest funkcją jedynie początkowych
i końcowych stanów reagujących związków, więc
może dostarczać informacji tylko o kierunku i sta¬
nie równowagi reakcji. AG° jest niezależna od me¬
chanizmu reakcji i dlatego nie dostarcza żadnych
informacji dotyczących szybkości reakcji. W kon¬
sekwencji - i jak wyjaśniono dalej - reakcja może
mieć dużą ujemną wartość AG° lub AG°', a mimo
to może zachodzić z niezauważalną szybkością.
SZYBKOŚCI REAKCJI SA UWARUNKOWANE
ENERGIA ICH AKTYWACJI
Reakcje przebiegają poprzez stany
przejściowe
Koncepcja stanu przejściowego ma istotne zna¬
czenie w rozumieniu chemicznych i termodyna¬
micznych podstaw katalizy. Równanie (7) opisuje
reakcję wypierania, w której grupa E zastępuje
grupę L związaną początkowo z R.
E + R—L ^ E—R + L
(7)
ilustruje zależność między stałą równowagi Kcą
i AG°, gdzie R jest stałą gazową, 8,31 J/(molK),
a T jest temperaturą absolutną w stopniach Kel¬
wina. Keą równa się iloczynowi stężeń produktów
reakcji (podniesionych do potęg o wykładnikach
równych współczynnikom stechiometrycznym)
podzielonemu przez iloczyn stężeń substratów
(również podniesionych do odpowiednich potęg).
Dla reakcji A + B P + Q:
(4)
(5)
W połowie przebiegu reakcji wiązanie między R
i L zostaje osłabione, ale nie jest jeszcze całko¬
wicie rozrywane, a nowe wiązanie między E i R
jeszcze w pełni się nie formuje. Ten przejściowy
produkt - który nie jest ani wolnym substratem,
ani produktem - jest określany stanem przejścio¬
wym lub kompleksem aktywnym, E**-R**-L.
Przerywane linie reprezentują „cząstkowe” wią¬
zania, które się tworzą i rozrywają.
Można uznać, że na reakcję (7) składają się
dwie „reakcje połówkowe”, z których pierwsza
odpowiada tworzeniu (F), a druga - późniejsze¬
mu rozpadowi (D) kompleksu aktywnego. Jak
wszystkim reakcjom, tak i każdej reakcji połów¬
kowej towarzyszą charakterystyczne zmiany en¬
talpii swobodnej AGF i AGD:
A +A ;=* P
8. ENZYMY: KINETYKA 79
E + R—L «=± E — R — L AGF (8)
E-R-L «=± E—R + L aGd (9)
E + R—L ^=± E—R + L AG = AGF + AG0 (10)
Wartość AG reakcji sumarycznej (7) stanowi
sumę AGF i AGD. Podobnie jak w przypadku każ¬
dego równania z dwoma członami nie jest możli¬
we wywnioskowanie na podstawie AG ani znaku,
ani wartości AGF lub AGD.
Wiele reakcji przebiega przez różnorakie stany
przejściowe, każdy związany z określoną zmianą
entalpii swobodnej. W reakcjach tych całkowita
zmiana AG stanowi sumę wszystkich zmian ental¬
pii swobodnej związanych z tworzeniem i rozpa¬
dem wszystkich stanów przejściowych. Dlatego
nie jest możliwe wywnioskowanie, na podsta¬
wie całkowitej zmiany AG, liczby lub typu sta¬
nów przejściowych, poprzez które przebiega
reakcja. Inaczej mówiąc, ogólna termodynamika
nie mówi nic o kinetyce.
Energię aktywacji określa sie
za pomocą AGf
Bez względu na znak i wielkość AG, znak AGF dla
przeważającej większości reakcji chemicznych
jest dodatni. Tworzenie kompleksu aktywnego
wymaga zatem pokonania barier energetycznych.
Z tego powodu AGF jest często nazywana ener¬
gią aktywacji, Eact, czyli energią potrzebną na
pokonanie danej bariery energetycznej. Łatwość
- a więc i częstość - z jaką ta bariera jest poko¬
nywana zależy od Eact. Parametrami określający¬
mi szybkość przebiegu reakcji są zatem wartości
AGF powstawania stanów przejściowych, poprzez
które przebiega reakcja. Dla prostej reakcji, gdzie
oc oznacza „proporcjonalnie do”
szybkość oc e-Eac^(RT) (11)
Energia aktywacji dla reakcji przebiegającej w od¬
wrotnym kierunku jest równa -AGD.
NA SZYBKOŚĆ REAKCJI WPŁYWA
WIELE CZYNNIKÓW
Teoria kinetyczna - zwana także teorią zderzeń
- stwierdza, że aby dwie cząsteczki przereagowa-
ły, muszą (1) zbliżyć się do siebie na odległość
odpowiadającą długości tworzącego się wiązania,
czyli muszą się „zderzyć”, i (2) muszą mieć wy¬
starczającą energię kinetyczną, aby przekroczyć
barierę energetyczną i osiągnąć stan przejściowy.
Wynika stąd, że wszystko co zwiększa częstość
lub energię zderzeń substratów będzie zwiększało
szybkość reakcji, w której one uczestniczą.
Temperatura
Podwyższenie temperatury zwiększa energię ki¬
netyczną cząsteczek. Jak pokazano na rycinie 8-1,
całkowita liczba cząsteczek, których energia ki¬
netyczna jest większa niż bariera energetyczna
Eact (pionowy słupek) tworzenia produktów jest
tym większa, im wyższa jest temperatura; na ryc.
8-1 wykres A odpowiada temperaturze niskiej,
wykres B - pośredniej, a wykres C - wysokiej.
Bariera energetyczna
Energia kinetyczna
Ryc. 8-1. Bariera energetyczna dla reakcji chemicznych.
Wzrost energii kinetycznej cząsteczek powoduje
przyspieszenie ich ruchu i w ten sposób częstości
ich zderzeń. Dużo częstsze, a przy tym o większej
energii i efektywniejsze zderzenia wpływają na
wzrost szybkości reakcji.
Stężenie substratu
Częstość, z jakącząsteczki się zderzają, jest wprost
proporcjonalna do ich stężenia. Częstość zderzeń
dwóch różnych cząsteczek A i B podwoi się, jeżeli
podwoi się stężenie albo A, albo B. Jeżeli podwoi
się stężenie zarówno A, jak i B, prawdopodobień¬
stwo zderzenia wzrośnie czterokrotnie.
W przebiegającej w stałej temperaturze reakcji
chemicznej, w której bierze udział jedna cząstecz¬
ka A i jedna cząsteczka B:
A + B -» P (12)
liczba cząsteczek, które mają wystarczającą ener¬
gię kinetyczną, aby przekroczyć barierę energii ak-
80 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
tywacji będzie stała. Liczba zderzeń zachodzących
z energią wystarczającą do utworzenia produktu P
będzie zatem wprost proporcjonalna do liczby zde¬
rzeń między A i B, a zatem i do ich stężenia molo¬
wego (oznaczanego nawiasem kwadratowym):
szybkość oc [A] [B] (13)
Podobnie dla reakcji:
A + 2B -> P (14)
którą można zapisać jako:
A + B + B -> P (15)
odpowiednim wyrażeniem na szybkość jest
szybkość oc [A] [B] [B] (16)
lub
szybkość oc [A] [B]2 (17)
Dla przypadku ogólnego, gdy n cząsteczek A rea¬
guje z m cząsteczek B
nA + tf?B->P (18)
wyrażenie na szybkość reakcji ma postać:
szybkość oc [A]ff[Br (19)
Zastępując znak proporcjonalności znakiem rów¬
ności i wprowadzając współczynnik proporcjo¬
nalności, czyli tzw. stałą szybkości k charakte¬
rystyczną dla danej reakcji, otrzymuje się równa¬
nia (20) i (21), w których indeksy dolne 1 i -1
oznaczają reakcje przebiegające, odpowiednio, do
przodu i w kierunku odwrotnym.
szybkośći = ^ [A]'7[B]m (20)
szybkość_i = Li [P] (21)
oznacza iloraz stałych szybkości
reakcji
Chociaż wszystkie reakcje chemiczne są w pew¬
nym stopniu odwracalne, w stanie równowagi
ogólne stężenia substratów i produktów pozostają
stałe. W stanie równowagi szybkość przekształ¬
cania substratów do produktów jest więc rów¬
na szybkości, z jaką produkty są przekształcane
w substraty:
szybkość! = szybkość^ (22)
zatem
ki [Ar[Bf = k-! [P] (23)
ki
k-i
[P]
[Af[Bf
(24)
Iloraz kj i k_i nazwano stałą równowagi K
Należy zapamiętać następujące ważne właściwo¬
ści układu w stanie równowagi:
(1) Stała równowagi stanowi iloraz stałych szyb¬
kości reakcji (a nie szybkości reakcji).
(2) W stanie równowagi szybkości reakcji (a nie
stałe szybkości) w obie strony są równe.
(3) Równowaga jest stanem dynamicznym. Cho¬
ciaż nie następuje żadna zmiana netto w stę¬
żeniu substratów lub produktów, pojedyncze
cząsteczki substratów i produktów podlegają
stałemu, wzajemnemu przekształcaniu.
(4) Wartość liczbowa stałej równowagi Keą może
być obliczona albo ze stężeń substratów i pro¬
duktów w stanie równowagi, albo ze stosunku
KINETYKA KATALIZY ENZYMATYCZNEJ
Enzymy zmniejszają barierę energii
aktywacji reakcji
Wszystkie enzymy przyspieszają reakcje, przy¬
czyniając się do tworzenia kompleksów aktyw¬
nych o obniżonej wartości AGF. Sposób, w jaki to
robią, jest jednak bardzo różny. Jeśli mechanizm
lub kolejność etapów chemicznych zachodzących
w miejscu aktywnym cząsteczki enzymu są wy¬
raźnie takie same jak dla tej samej reakcji przebie¬
gającej bez udziału katalizatora, to środowisko
miejsca aktywnego obniża AGF, stabilizując stan
przejściowy. Jak podano w rozdz. 7, stabilizacja
może obejmować: (1) grupy kwasowo-zasadowe
ustawione w sposób sprzyjający przeniesieniu
protonów do lub z kompleksu aktywnego, (2)
właściwe ułożenie naładowanych grup lub jonów
metalu, co stabilizuje powstałe ładunki, (3) wy¬
muszenie przestrzennego odkształcenia substra¬
tów, tak aby ich geometria stała się podobna do
geometrii kompleksu aktywnego. Proteaza HIV
(p. ryc. 7-6) jest przykładem enzymu, który kata¬
lizuje, obniżając energię aktywacji przez stabili¬
zowanie stanu przejściowego.
Kataliza enzymatyczna przebiega według uni¬
katowego mechanizmu, jeśli kompleks aktywny
tworzy kowalencyjne wiązanie z enzymem (kata¬
liza kowalencyjna). Mechanizm katalitycznego
8. ENZYMY: KINETYKA 81
działania proteazy seiynowej chymotrypsyny (p.
ryc. 7-7) ilustruje, jak enzym wykorzystuje kata¬
lizę kowalencyjną do uczestniczenia w unikato¬
wym ciągu reakcji.
ENZYMY NIE MAJA WPŁYWU NA /(.„
Enzymy przyspieszają reakcję przez obniżenie
energii aktywacji AGj. Wprawdzie enzymy mogą
podlegać przejściowej modyfikacji w procesie
katalizy, to jednak na końcu reakcji pojawiają
się one niezmienione. Obecność enzymu zatem
nie ma żadnego wpływu na AG° sumarycznej
reakcji, która jest funkcją tylko początkowego
i końcowego stanu reagentów. Równanie (25) po¬
kazuje zależność między stałą równowagi reakcji
i standardową zmianą entalpii swobodnej dla tej
reakcji:
aG° = -RT In /Ceq
(25)
Jeżeli uwzględni się obecność enzymu
w obliczeniach stałej równowagi reakcji:
(Enz)
A + B + Enz P + Q + Enz
(26)
To wyrażenie na stałą równowagi:
[P][Q][Enz]
°a [A] [B][Enz]
(27)
przyjmie postać taką samą jak dla reakcji przebie¬
gającej bez udziału enzymu:
„ [P][Q]
* [A] [B]
(28)
wiązań niekowalencyjnych, utrzymujących prze¬
strzenną strukturę enzymu. Łańcuch polipepty-
dowy zostaje wtedy rozfaldowany, czyli zdena-
turowany, czemu towarzyszy utrata aktywności
katalitycznej. Zakres temperatury, w jakim enzym
utrzymuje stabilną, odpowiednią pod względem
katalitycznym konformację, zależy od (a zazwy¬
czaj umiarkowanie ją przekracza) normalnej tem¬
peratury komórki, w której występuje. Enzymy
człowieka na ogól wykazują stabilność w tempe¬
raturze do 45-55°C. Enzymy termofilnych mikro¬
organizmów, które występują w wulkanicznych
gorących źródłach lub podmorskich gorących ob¬
szarach, mogą być stabilne w temperaturze nawet
wyższej niż 100°C.
Czynnik Q10, czyli współczynnik temperatu¬
rowy, charakteryzuje stopień wzrostu szybkości
procesu biologicznego przy wzroście temperatury
o 10°C. W temperaturach, w których enzymy są
stabilne, szybkość większości procesów biolo¬
gicznych zazwyczaj podwaja się przy wzroście
temperatury o 10°C (Ql0 = 2). Zdolność zmiany
szybkości reakcji katalizowanych enzymatycznie,
które towarzyszą wzrostowi lub obniżeniu tem¬
peratury ciała, stanowią ważną cechę przystoso¬
wawczą „zimnokrwistych” organizmów, takich
jak jaszczurki lub ryby, których temperatura cia¬
ła zależy od środowiska zewnętrznego. Dla ssa¬
ków i innych stałocieplnych organizmów zmiany
w szybkości reakcji enzymatycznych spowodo¬
wane zmianami temperatury mają fizjologiczne
znaczenie tylko w takich warunkach, jak gorączka
lub hipotermia.
Enzymy nie mają więc wpływu na wartość Kcą.
NA SZYBKOŚĆ REAKCJI
KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE
WPŁYWA WIELE CZYNNIKÓW
Temperatura
Podwyższenie temperatury zwiększa szybkość
reakcji zarówno niekatalizowanych, jak i kata¬
lizowanych enzymatycznie, powodując wzrost
energii kinetycznej i częstości zderzeń reagują¬
cych cząsteczek. Energia cieplna może jednak
zwiększać również energię kinetyczną enzymu
do stanu, w którym zostaje przekroczona barie¬
ra energetyczna wystarczająca do rozerwania
Stężenie jonów wodorowych
Szybkość prawie wszystkich katalizowanych en¬
zymatycznie reakcji w dużej mierze zależy od stę¬
żenia jonów wodorowych. Większość wewnątrz¬
komórkowych enzymów wykazuje optymalną
aktywność w pH 5-9. Zależność aktywności od
stężenia jonów wodorowych (ryc. 8-2) odzwier¬
ciedla równowagę między denaturacją enzymu
w wysokim i niskim pH i wpływa na ładunek enzy¬
mu, substratów lub obu elementów. W przypadku
enzymów, których mechanizm działania obejmuje
katalizę kwasowo-zasadową, biorące w niej udział
reszty aminokwasowe muszą być w odpowiednim
stanie uwodornienia, aby reakcja mogła zachodzić.
Przyłączenie i rozpoznanie cząsteczek substratów
82 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
x
Ryc. 8-2. Wpływ pH na aktywność enzymu. Należy rozważyć
na przykład ujemnie naładowany enzym (EH"), który przyłącza
dodatnio naładowany substrat (SH+). Pokazana jest proporcja
(%) SH+ (\\\) i EH“ [III] jako funkcja pH. Tylko w obszarze za-
kreskowanym krzyżykami zarówno enzym, jak i substrat niosą
odpowiedni ładunek.
z dysocjującymi grupami zazwyczaj obejmuje
także tworzenie mostków solnych z enzymem.
Najpowszechniejszymi naładowanymi grupami są
ujemnie naładowane grupy karboksylowe i dodat¬
nio naładowane grupy pro tonowanych amin. Zysk
lub utrata naładowanych grup będzie wpływała na
przyłączenie substratu i w ten sposób będzie opóź¬
niała lub uniemożliwiała katalizę.
BADANIA REAKCJI KATALIZOWANYCH
ENZYMATYCZNIE ZWYKLE OPIERAJĄ
SIĘ NA POMIARZE SZYBKOŚCI
POCZĄTKOWEJ
W większości badań szybkości reakcji katalizo¬
wanych enzymatycznie pomiary wykonuje się dla
względnie krótkich odcinków czasu, co w przybli¬
żeniu odpowiada warunkom szybkości począt¬
kowej. W takim czasie akumulują się zaledwie
śladowe ilości produktu, dlatego szybkość reakcji
odwrotnej może być pomijana. Szybkość począt¬
kowa (v.) reakcji jest więc w zasadzie szybkością
reakcji w rozpatrywanym kierunku. W analizach
aktywności enzymatycznej prawie zawsze stosu¬
je się duży (103— 107) molowy nadmiar substratu
w stosunku do enzymu. W tych warunkach Vj jest
proporcjonalna do stężenia enzymu. Mierzenie
szybkości początkowej pozwala zatem ocenić
ilość enzymu zawartego w próbce biologicznej.
STĘŻENIE SUBSTRATU WPŁYWA
NA SZYBKOŚĆ REAKCJI
W dalszym opisie przyjęto, że reakcje enzyma¬
tyczne przebiegają z udziałem jednego substratu
i jednego produktu. Ponieważ większość enzy¬
mów ma więcej niż jeden substrat, zasady omó¬
wione poniżej dotyczą także enzymów z wieloma
substratami.
Jeżeli stężenie substratu dla typowego enzymu
wzrasta, to Vj wzrasta dopóty, dopóki nie osiąg¬
nie maksymalnej wartości Vmax (ryc. 8-3). Dal¬
sze zwiększanie stężenia substratu nie powoduje
wzrostu Vj; mówi się, że enzym jest „nasycony”
substratem. Należy odnotować, że krzywa obra¬
zująca zależność aktywności od stężenia substra¬
tu jest hiperbolą (ryc. 8-3). W danym momencie
tylko cząsteczki substratu, które są połączone
z enzymem w kompleks ES mogą być prze¬
kształcane w produkt. Stała równowagi reakcji
tworzenia kompleksu enzym-substrat nie jest
nieskończenie duża, dlatego jeśli nawet substrat
występuje w nadmiarze (punkty A i B na ryc.
8-4), tylko część enzymu może tworzyć kompleks
ES. W punktach A lub B zwiększenie lub obni¬
żenie [S] będzie zatem zwiększało lub obniżało
liczbę kompleksów ES i odpowiednio zmieniało
wartość Vj. W punkcie C (ryc. 8-4) w zasadzie
cały enzym występuje jako kompleks ES. Skoro
nie ma wolnego enzymu, który mógłby tworzyć
ES, dalsze zwiększenie [S] nie może wpłynąć na
przyspieszenie reakcji. W warunkach nasycenia
Vi zależy jedynie od szybkości - i w ten sposób
jest przez nią limitowana - z jaką produkt oddy-
socjowuje od enzymu, aby enzym mógł się łączyć
z nadmiarem substratu.
Ryc. 8-3. Wpływ stężenia substratu na początkową szybkość
reakcji katalizowanej enzymatycznie.
8. ENZYMY: KINETYKA 83
Ryc. 8-4. Obładowanie enzymu substratem przy małym (A), dużym (C) i równym (B) stężeniu substratu. Punkty A, B i C odpowiadają
punktom z ryc. 8-3.
RÓWNANIA MICHAELISA-MENTEN
IHILLA WYRAŻAJA WPŁYW STĘŻENIA
SUBSTRATU
Równanie Michaelisa-Menten
Równanie Michaelisa-Menten (29) wyraża mate¬
matyczną zależność między początkową szybko¬
ścią reakcji Vj i stężeniami substratu [S], przedsta¬
wioną graficznie na ryc. 8-3.
Stała Michaelisa Km odpowiada stężeniu sub¬
stratu, przy jakim V* stanowi połowę szybkości
maksymalnej (Vmax/2) osiągalnej przy danym
stężeniu enzymu. Stała Km zatem ma wymiar stę¬
żenia substratu. Zależność szybkości początkowej
reakcji od [S] i Km można określić, analizując rów¬
nanie Michaelisa-Menten dla trzech przypadków.
(1) Jeśli [S] jest znacznie mniejsze niż Km
(punkt A na ryc. 8-3 i 8-4), wyrażenie Km + [S] jest
prawie równe Km. Zastąpienie wyrażenia Km + [S]
stałąKm redukuje równanie (29) do postaci:
Vmax[Sl
v __mąxl_J_
Km+[S]
(30)
gdzie ~ oznacza „prawie równe”. Skoro zarówno
Vmax, jak i Km są stałymi, ich stosunek jest stały.
Innymi słowy, jeśli [S] jest znacznie mniejsze od
Km to Vj jest równa k[S]. Początkowa szybkość
reakcji jest zatem wprost proporcjonalna do [S].
(2) Jeśli [S] jest znacznie większe niż Km (punkt
C na ryc. 8-3 i 8-4), wyrażenie Km + [S] jest prawie
równe [S]. Zastąpienie wyrażenia Km + [S] wiel¬
kością [S] redukuje równanie (29) do postaci:
v rs] vmax[S] w
v = maxL J v = max * v
' *m + [ S] ' [S]
(31)
Jeśli więc [S] jest znacznie większe niż Km, to
szybkość reakcji jest maksymalna (Vmax) i nie ma
na nią wpływu dalszy wzrost stężenia substratu.
(3) Jeśli [S] = Km (punkt B na ryc. 8-3 i 8-4), to:
v _ vmax[S] _ vmax[S] _ vmax
' /fm + [S] 2[S] 2 <32)
Z równania (32) wynika, że jeśli [S] jest rów¬
ne Km, to szybkość początkowa stanowi połowę
szybkości maksymalnej. Równanie (32) pokazu¬
je, że Km odpowiada - i może to być potwierdzone
doświadczalnie - stężeniu substratu, przy jakim
szybkość początkowa stanowi połowę szybkości
maksymalnej.
Liniowe przekształcenie równania
Michaelisa-Menten jest wykorzystywane
do określenia Km i Vmax
Bezpośredni pomiar wartości liczbowej Vmax i ob¬
liczenie Km często wymaga stosowania bardzo
stężonych roztworów substratu, aby uzyskać stan
nasycenia, co w praktyce jest dość niewygod¬
ne. Dzięki liniowemu przekształceniu równania
Michaelisa-Menten można ominąć tę trudność,
84 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
ekstrapolując wartości Vmax i Km z wyników po¬
miarów początkowej szybkości, otrzymanych dla
niższych niż w stanie nasycenia stężeń substratu.
Wychodzi się z równania (29):
VnJS]
V'- Km + [S] (29)
odwraca się go:
1 _ Km+ [S]
v, VmJS] <33)
przekształca:
1 _ Km [S]
v, yjs] vmJ,[S] (34>
i upraszcza:
1 _(Km\ 1 1
V, lvJ[S]+V™ (35)
Równanie (35) jest równaniem linii prostej,
y = ar + b, gdzie y= \/v/i x = 1/[S]. Wykres 1/Vj
w funkcji 1/[S] jest linią prostą, która przecina
oś y w punkcie 1/Vmax i której nachylenie jest
równe KmfVmax. Taki wykres jest nazywany wy¬
kresem podwójnych odwrotności lub wykre¬
sem Lineweavera-Burka (ryc. 8-5). Przyjmując,
że y w równaniu (36) jest równe zeru i obliczając
x, znajdujemy, że oś x jest przecięta w punkcie
-\/Km
-b -1
0 = ax + b; zatem x = — = —— (36)
3 K m
Wartość Km jest zatem najłatwiej wyznaczana
z przecięcia osi x po stronie ujemnej.
Ryc. 8-5. Wykres podwójnych odwrotności albo wykres Linewe-
avera-Burka, czyli zależność 1/Vj od 1/[S], wykorzystywana do
określenia Km i Vmax.
Km może w przybliżeniu oznaczać siata
wiazania
Powinowactwo enzymu do substratu jest równe
odwrotności stałej dysocjacji Kd kompleksu en-
zym-substrat ES.
K
E+S ES
k-i
(37)
„ k i
(38)
Inaczej mówiąc, mniejsza tendencja kompleksu
enzym-substrat do dysocjacji wskazuje na więk¬
sze powinowactwo enzymu do substratu. Wpraw¬
dzie stała Michaelisa Km często jest bliska stałej
dysocjacji Kd, nie oznacza to jednak, że tak jest
w każdym przypadku. Dla typowej reakcji katali¬
zowanej enzymatycznie:
ki k2
E+S ^ ES —► E + P (39)
k-i
wartość [S], odpowiadająca Vj = Vmax/2, wynosi:
ki "f* k2
[S] = - 1 , = Km (40)
ki
Jeśli k_j » k2, to:
k.1 + k2*k.1 (41)
1 k,
[S]wlT = /Cd (42)
A zatem \/Km w przybliżeniu odpowiada \/Kd je¬
dynie w warunkach, w których asocjacja i dyso-
cjacja kompleksu ES jest szybka w porównaniu
z kolejnym etapem (tworzenia produktu) ograni¬
czającym szybkość w katalizie. Dla wielu reakcji
katalizowanych enzymatycznie, dla których war¬
tość wyrażenia k_j + k2 nie jest bliska wartości
k_1? wyrażenie \/Km nie odpowiada w pełni wy¬
rażeniu \/Kd.
Równanie Hilla opisuje zachowanie
enzymów, które wykazują kooperatywne
przyłączanie substratów
Mimo że większość enzymów wykazuje prostą
kinetykę nasycenia, przedstawioną na ryc. 8-3
i odpowiednio opisaną równaniem Michaelisa-
-Menten, pewne enzymy przyłączają substraty
8. ENZYMY: KINETYKA 85
w sposób kooperatywny, analogiczny do przy¬
łączania tlenu przez hemoglobinę (rozdz. 6).
Zachowanie kooperatywne jest wyłączną cechą
enzymów multimerycznych, które wiążą substrat
w więcej niż jednym miejscu cząsteczki.
Dla enzymów, które wykazują dodatnią ko-
operatywność w przyłączaniu substratu, kształt
krzywej zależności Vj od [S] jest sigmoidalny (ryc.
8-6). Ani wykres równania Michaelisa-Menten,
ani jego przekształcenie - wykres podwójnych
odwrotności - nie mogą być wykorzystane do
określenia kooperatywnej kinetyki nasycenia.
Dlatego enzymolodzy wykorzystują graficzną
prezentację równania Hilla, oryginalnie pocho¬
dzącą z opisanego kooperatywnego przyłączania
02 przez hemoglobinę. Równanie (43) przedsta¬
wia równanie Hilla w formie liniowej, gdzie k'
jest stałą złożoną.
log (Vi/(Vmax- Vj)) = n log[S] - log k' (43)
Z równania wynika, że jeśli [S] jest małe w po¬
równaniu z k', to początkowa szybkość reakcji
rośnie z n-tą potęgą [S].
flyc. 8-6. Sigmoidalny wykres kinetyki nasycenia substratem.
Wykres log v/(Vmax - Vj) w funkcji log[S] jest
linią prostą (ryc. 8-7), gdzie nachylenie linii n
odpowiada współczynnikowi Hilla; jest to pa¬
rametr empiryczny, którego wartość jest funkcją
liczby, rodzaju i siły oddziaływania wielu miejsc
wiążących substrat z enzymem. Jeśli n = 1, to
wszystkie miejsca wiązania funkcjonują nieza¬
leżnie i wszystko odbywa się w myśl prostej ki¬
netyki Michaelisa-Menten. Jeżeli n jest większe
Ryc. 8-7. Graficzne przedstawienie liniowej formy równania Hil¬
la jest wykorzystywane do oceny S50, czyli stężenia substratu,
które daje połowę szybkości maksymalnej, i stopnia koopera-
tywności n.
od 1, mówi się, że enzym wykazuje dodatnią ko-
operatywność. Przyłączenie substratu do jednego
miejsca wzmacnia wtedy podatność pozostałych
miejsc na przyłączenie dodatkowego substratu.
Wyższa wartość n to wyższy stopień kooperatyw-
ności i bardziej sigmoidalny wykres Vj w funkcji
[S]. Linia prostopadła narysowana od punktu 0 na
osi y (ryc. 8-7) przecina oś x w punkcie oznaczo¬
nym jako S50, odpowiadającym stężeniu substra¬
tu, które daje połowę szybkości maksymalnej. S50
jest zatem analogiczne do P50 dla tlenu przyłączo¬
nego do hemoglobiny (rozdz. 6).
ANALIZA KINETYCZNA ROZRÓŻNIA
HAMOWANIE KOMPETYCYJNE
I NIEKOMPETYCYJNE
Inhibitory aktywności katalitycznej enzymów
mogą być zarówno lekami, jak i narzędziami ba¬
dawczymi do analizy mechanizmu działania enzy¬
mów. Inhibitory mogą być podzielone na podsta¬
wie miejsca ich działania na enzym lub też według
tego, czy chemicznie modyfikują enzym albo czy
mają wpływ na parametry kinetyczne. Pod wzglę¬
dem kinetyki rozróżnia się dwie klasy inhibitorów
zależnie od tego, czy hamowanie ustępuje, czy nie
w wyniku zwiększenia stężenia substratu.
Inhibitory kompetycyjne zwykle
są podobne do substratów
Efekty działania inhibitorów kompetycyjnych
można osłabić, podwyższając stężenie substratu.
86 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Najczęściej w hamowaniu kompetycyjnym inhi¬
bitor (I) przyłącza się do części miejsca aktyw¬
nego enzymu wiążącej substrat i blokuje dostęp
dla substratu. Struktury większości klasycznych
inhibitorów kompetycyjnych przypominają struk¬
tury substratu i dlatego są określane analogami
substratu. Hamowanie działania enzymu - dehy¬
drogenazy bursztynianowej przez malonian jest
przykładem kompetycyjnego hamowania przez
analog substratu. Dehydrogenaza bursztynianowa
katalizuje usunięcie po jednym atomie wodoru
z każdego z dwóch atomów węgla grup metyleno¬
wych bursztynianu (ryc. 8-8). Zarówno burszty-
nian, jak i jego strukturalny analog - malonian
(-OOC—CH2—COO ) może przyłączać się do
DEHYDROGENAZA
BURSZTYNIANOWA
H — C — COO"
II
"00C — C — H
H
Bursztynian F
Ryc. 8-8. Reakcja dehydrogenazy bursztynianowej.
miejsca aktywnego dehydrogenazy bursztyniano¬
wej, tworząc - odpowiednio - kompleks ES lub
EL Skoro jednak malonian zawiera tylko jedną
grupę metylenową, nie może podlegać odwodor-
nieniu. Tworzenie i dysocjacja kompleksu El jest
procesem dynamicznym opisanym jako:
ki
Enzl Enz + I (44)
k-i
dla którego stała równowagi Kx wynosi:
[Enz] [I] _ kl
[Enzl] k.-,
(45)
Ściśle mówiąc, działanie inhibitora kompety-
cyjnego polega na zmniejszeniu liczby wolnych
cząsteczek enzymu zdolnych do przyłączenia
substratu, tj. do tworzenia ES, a zatem i do
tworzenia produktu:
^ E-l
EC
v E-S (46)
I
E + P
Inhibitor kompetycyjny i substrat wywierają od¬
wrotny wpływ na stężenie kompleksów El i ES.
Skoro przyłączenie substratu usuwa wolne czą¬
steczki enzymu mogące się połączyć z inhibito¬
rem, zwiększenie [S] obniża stężenie kompleksu
El i zwiększa szybkość reakcji. Stężenie substratu
odpowiednie do całkowitego zniesienia hamowa¬
nia zależy od stężenia obecnego inhibitora, jego
powinowactwa do enzymu Kx oraz wartości Km
enzymu dla danego substratu.
Wykresy podwójnych odwrotności
ułatwiają oceno inhibitorów
Wykresy podwójnych odwrotności odróżniają
kompetycyjne i niekompetycyjne inhibitory i uła¬
twiają określenie stałych hamowania. Wartość V(
jest określana dla różnych stężeń substratu za¬
równo przy udziale, jak i bez udziału inhibitora.
W klasycznym hamowaniu kompetycyjnym linie
proste łączące punkty doświadczalne spotykają
się na osi y (ryc. 8-9). Ponieważ punkt przecięcia
z osią_y ma wartość odpowiadającą 1/Vmax, wy¬
kres ten wskazuje, że kiedy 1/[S] zbliża się do
0, staje się niezależna od obecności inhibi¬
tora. Należy jednak wziąć pod uwagę, że punkt
[S]
Ryc. 8-9. Wykres Lineweavera-Burka dla hamowania kompety¬
cyjnego. Należy zauważyć całkowite zniesienie hamowania przy
dużym [S] (tj. małym 1/[S]).
przecięcia z osiąjc zmienia się wraz ze stężeniem
inhibitora - i że skoro \/K'm jest mniejsza niż
l/ATm, K'm („pozorna” Km) staje się większa w mia¬
rę wzrostu stężenia inhibitora. Inhibitor kom¬
petycyjny nie ma zatem wpływu na Vmax, ale
zwiększa K'm, czyli pozorną Km dla substratu.
8. ENZYMY: KINETYKA 87
Dla prostego hamowania kompetycyjnego punkt
przecięcia z osiąx jest określony równaniem:
x
-A
Km
(47)
Jeśli Km została określona bez udziału inhibito¬
ra, Ki może być obliczona z równania (47). Warto¬
ści Kx są wykorzystywane do porównania różnych
inhibitorów tego samego enzymu. Im niższa war¬
tość Kx, tym bardziej efektywny inhibitor. Na przy¬
kład wartość Ki statyny, która działa jako inhibitor
kompetycyjny reduktazy HMG-CoA (rozdz. 26),
jest kilka rzędów wielkości mniejsza niż wartość
Km dla substratu HMG-CoA.
Proste niekompetycyjne inhibitory
obniżają Vmax, ale nie mają wpływu na ACn
W hamowaniu niekompetycyjnym przyłączenie
inhibitora nie ma wpływu na przyłączenie sub¬
stratu. Dlatego jest możliwe tworzenie komplek¬
sów zarówno typu El, jak i EIS. Mimo że kom¬
pleks enzym-inhibitor może ciągle przyłączać
substrat, jego zdolność przekształcania substratu
w produkt, wyrażana wartością Vmax, jest mniej¬
sza. Niekompetycyjne inhibitory przyłączają się
do enzymów w miejscach odmiennych od miejsc
przyłączania substratu i zasadniczo nie wykazują
żadnego (lub małe) podobieństwa do substratu.
W prostym niekompetycyjnym hamowaniu E
i El mają identyczne powinowactwa do substra¬
tu i kompleks EIS tworzy produkt z bardzo małą,
pomijalną szybkością (ryc. 8-10). Bardziej złożo-
[S]
ftyc. 8-10. Wykres Lineweavera-Burka dla prostego hamowania
niekompetycyjnego.
ne niekompetycyjne hamowanie zachodzi wtedy,
kiedy przyłączenie inhibitora ma wpływ na po¬
zorne powinowactwo enzymu do substratu; odpo¬
wiada temu przecięcie linii albo w trzeciej, albo
w czwartej ćwiartce wykresu podwójnych od¬
wrotności (nie pokazano). Chociaż pewne inhibi¬
tory wykazują cechy hamowania kompetycyjnego
i niekompetycyjnego, ocena tych inhibitorów wy¬
kracza poza zakres tego rozdziału.
Nieodwracalne inhibitory
- „trucizny” enzymów
W przytoczonych przykładach inhibitory tworzą
dysocjujący, dynamiczny kompleks z enzymem.
Całkowicie aktywny enzym może być zatem ła¬
two odzyskany przez usunięcie inhibitora z ota¬
czającego środowiska. Wiele innych inhibitorów
działa jednak nieodwracalnie, chemicznie mody¬
fikując enzym. Modyfikacje te zazwyczaj obejmu¬
ją tworzenie lub rozkład wiązań kowalencyjnych
z resztami aminokwasowymi odpowiadającymi
za przyłączanie substratu, katalizę lub utrzyma¬
nie funkcjonalnej konformacji enzymu. Skoro te
kowalencyjne zmiany są względnie stabilne, en¬
zym, który został „zatruty” przez nieodwracalny
inhibitor, np. atom metalu ciężkiego lub związek
acylujący, pozostaje zahamowany nawet po usu¬
nięciu z otaczającego środowiska pozostałych
cząsteczek inhibitora.
W WIĘKSZOŚCI KATALIZOWANYCH
ENZYMATYCZNIE REAKCJI
BIORĄ UDZIAŁ CO NAJMNIEJ
DWASUBSTRATY
Wprawdzie wiele enzymów ma pojedynczy sub¬
strat, ale jest także wiele takich, które mają dwa
- a czasami więcej niż dwa - substraty i produkty.
Omówione wcześniej podstawowe zasady doty¬
czące jednosubstratowych enzymów mają zasto¬
sowanie także do enzymów wielosubstratowych.
Opis matematyczny wielosubstratowych reak¬
cji jest jednak bardzo skomplikowany. Szcze¬
gółowa analiza kinetyki wielosubstratowych
reakcji przekracza jednak zakres tego rozdzia¬
łu; dalej opisano jedynie dwusubstratowe reak¬
cje z dwoma produktami (określane reakcjami
„Bi-Bi”).
88 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Reakcje sekwencyjnego (pojedynczego)
wypierania
W reakcjach sekwencyjnych oba substraty mu¬
szą się połączyć z enzymem, aby utworzyć potrój¬
ny kompleks, zanim rozpocznie się kataliza (ryc.
8-11, góra). Reakcje sekwencyjne są czasami
nazywane reakcjami pojedynczego wypierania,
ponieważ grupa ulegająca przeniesieniu zazwy¬
czaj przechodzi bezpośrednio, w jednym etapie,
z jednego substratu na inny. Reakcje sekwencyjne
Bi-Bi muszą być następnie odróżnione na podsta¬
wie tego, czy dwa substraty są dodawane w spo¬
sób przypadkowy, czy uporządkowany. W re¬
akcjach przypadkowego wiązania albo substrat A,
albo substrat B może się łączyć z enzymem jako
pierwszy, tworząc kompleksy EA lub EB (ryc.
8-11, środek). W reakcjach uporządkowanych
A musi najpierw się połączyć z E, zanim B po¬
łączy się z kompleksem EA. Jednym z wyjaśnień
uporządkowanego mechanizmu jest to, że doda¬
nie A indukuje konformacyjną zmianę w enzymie,
która ustawia reszty aminokwasowe tak, że roz¬
poznają i przyłączają B.
AB P Q
J l t t
E EA EAB-EPO EQ E
AB P Q
BA Q P
A P B Q
_J t l t
E EA-FP F FB-EQ E
Ryc. 8-11. Schemat trzech klas mechanizmów Bi-Bi. Poziome
linie oznaczają enzym. Strzałki wskazują dołączenie substratów
i odłączenie produktów. Góra: uporządkowana reakcja Bi-Bi, cha¬
rakterystyczna dla wielu oksydoreduktaz zależnych od NAD(P)H.
Środek: przypadkowa reakcja Bi-Bi, charakterystyczna dla wielu
kinaz i niektórych dehydrogenaz. Dół: reakcja „ping-pong", cha¬
rakterystyczna dla aminotransferaz i proteaz serynowych.
Reakcje „ping-pong” |
Termin „ping-pong” określa mechanizmy, w któ- i
rych jeden produkt, lub kilka produktów, uwal- 1
nia się od enzymu, zanim zostaną przyłączone »
wszystkie substraty. Reakcje „ping-pong” obej- f
mują kowalencyjną katalizę i przejściową, zmo- 1
dyfikowaną formę enzymu (p. ryc. 7-4). Reakcje
„ping-pong” Bi-Bi są reakcjami podwójnego wy¬
pierania. Grupa ulegająca przemianie jest prze¬
noszona z substratu A przez enzym, aby mogła ,
utworzyć produkt P i zmodyfikowaną formę en- i
zymu (F). Następnie grupa jest przenoszona z F |
na drugi substrat B i tworzy produkt Q oraz zrege¬
nerowany E, co stanowi drugie podstawienie (ryc.
8-11, dół).
Większość reakcji Bi-Bi stosuje się 1
do kinetyki Michaelisa-Menten
Większość reakcji Bi-Bi stosuje się do nieco bar¬
dziej złożonej formy kinetyki Michaelisa-Men- j
ten, w której Vmax oznacza szybkość reakcji w wa- I
runkach, kiedy oba substraty występują w stanie j
nasycenia. Każdy substrat ma swoją własną '
charakterystyczną Km - wartość odpowiadającą |
stężeniu, przy jakim szybkość reakcji stanowi po¬
łowę maksymalnej szybkości, jeśli drugi substrat ’
występuje w stanie nasycenia. Tak jak dla reak¬
cji z pojedynczym substratem, wykres podwój¬
nych odwrotności może być użyty do określenia
Vmax i Km. Wartość Vj jest mierzona jako funkcja
stężenia jednego substratu (zmienny substrat),
podczas gdy stężenie innego substratu (stały sub¬
strat) jest utrzymane na stałym poziomie. Jeżeli
linie otrzymane dla wielu stałych stężeń drugiego
substratu są wykreślone na tym samym rysunku,
jest możliwe rozróżnienie między mechanizmem
„ping-pong”, który daje wzór linii równoległych,
a mechanizmem sekwencyjnym, który daje wzór
linii przecinających się (ryc. 8-12).
Badania hamowania reakcji przez produkt są
wykorzystywane do uzupełnienia analizy kinetyki
i odróżnienia uporządkowanych i przypadkowych
reakcji Bi-Bi. Na przykład w przypadkowej reak¬
cji Bi-Bi każdy produkt będzie kompetycyjnym
inhibitorem bez względu na to, który substrat jest
mianowany zmiennym substratem. Dla mecha¬
nizmu ciągłego (ryc. 8-11, góra) tylko produkt
Q będzie dawał wzór wskazujący na hamowanie
8. ENZYMY: KINETYKA 89
Wzrost
[S2]
V
Ryc. 8-12. Wykres Lineweavera-Burka dla dwusub-
stratowej reakcji „ping-pong”. Wzrost stężenia jed¬
nego substratu (Si), gdy stężenie innego substratu
(S2) jest utrzymywane na stałym poziomie, zmienia
punkty przecięcia linii prostych z osiami x i y, ale nie
nachylenia linii.
kompetycyjne, gdy A jest zmiennym substratem,
jednak tylko produkt P będzie tworzył ten wzór
z B jako zmiennym substratem. Inne połączenie
inhibitorowego produktu i zmiennego substratu
będą tworzyły formy złożonego niekompetycyj-
nego hamowania.
POZNANIE KINETYKI ENZYMÓW,
MECHANIZMU DZIAŁANIA
I HAMOWANIA POMAGA
W PROJEKTOWANIU NOWYCH LEKÓW
Wiele leków działa jako
Inhibitory enzymów
Celem farmakologii jest identyfikacja czynników,
które mogą:
1) zabijać lub osłabiać wzrost, inwazyjność lub
rozwój inwazyjnych patogenów;
2) stymulować endogenne mechanizmy obronne;
3) zatrzymać lub hamować zaburzone procesy
molekularne, wywołane przez genetyczne,
środowiskowe lub biologiczne czynniki z mi¬
nimalnymi zaburzeniami normalnych funkcji
komórkowych gospodarza.
Na podstawie ich zróżnicowanej roli fizjolo¬
gicznej i wysokiej selektywności substratowej,
enzymy stanowią naturalne cele dla rozwoju
czynników farmakologicznych, które są zarówno
skuteczne, jak i specyficzne. Na przykład statyna
zmniejsza syntezę cholesterolu przez zahamowa¬
nie reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo-ko-
enzymu A (rozdz. 26), a emtricitabina i tenofovir
(fumaran dizoproksylu) blokują replikację wirusa
HIV (ang. human immunodeficiency virus) przez
zahamowanie wirusowej odwrotnej transkryptazy
(rozdz. 34). Farmakologiczne leczenie nadciś¬
nienia często polega na zastosowaniu inhibitora
enzymu przekształcającego angiotensynę, co po¬
woduje obniżenie poziomu zwężającej naczynia
angiotensyny II (rozdz. 42).
Kinetyka enzymatyczna określa
odpowiednie warunki badań
przesiewowych
Kinetyka enzymatyczna odgrywa kluczową rolę
w odkrywaniu leków. Poznanie kinetyki określo¬
nego enzymu jest przede wszystkim potrzebne do
wyboru odpowiednich warunków badania umoż¬
liwiającego wykrycie obecności inhibitora. Na
przykład stężenie substratu musi być tak dobrane,
aby powstawała dostateczna ilość produktu, wy¬
starczająca do łatwej detekcji aktywności enzy¬
matycznej. Kinetyka enzymatyczna daje ponadto
możliwość obliczania i porównywania aktywno¬
ści różnych inhibitorów oraz rozpoznania sposobu
ich działania. Szczególnie pożądane są inhibitory
niekompetycyjne, ponieważ w przeciwieństwie
do inhibitorów kompetycyjnych, efekty ich dzia¬
łania nigdy nie mogą być całkowicie zniesione
przez zwiększenie stężenia substratu.
90 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Wiele leków jest metabolizowanych in vivo
Zaprojektowanie nowego leku często obejmuje
więcej niż kinetyczną ocenę oddziaływania inhi¬
bitorów z docelowym enzymem. Leki mogą dzia¬
łać na enzymy organizmu pacjenta lub organizmu
patogennego, a przy tym same ulegają przemianie
w procesie metabolizmu leków. Na przykład pe¬
nicylina i inne (3-laktamowe antybiotyki blokują
syntezę ściany komórkowej u bakterii przez nie¬
odwracalne „zatrucie” enzymu alanyloalaninowej
karboksypeptydazy - transpeptydazy. Niemniej
wiele bakterii wytwarza P-laktamazę, która hy-
drolizuje krytyczny (3-laktam. Jedną ze strategii
przezwyciężenia powstającej odporności na anty¬
biotyk jest jednoczesne podanie inhibitora (3-lak-
tamazy i (3-laktamowego antybiotyku.
Metaboliczna transformacja jest także niezbędna
do przekształcenia nieaktywnego prekursora leku,
czyli proleku, do jego biologicznie aktywnej for¬
my (rozdz. 52). Kwas 2'-deoksy-5-fluorourydylo¬
wy - potencjalny inhibitor syntazy tymidyłanowej,
ważnego celu chemoterapii raka, jest produkowa¬
ny z 5-fluorouracylu poprzez serię enzymatycz¬
nych przekształceń, katalizowanych przez fosfo-
rybozylotransferazę i enzymy szlaku regeneracji
deoksyrybonukleozydu (rozdz. 33). Tak więc sku¬
teczne projektowanie i ukierunkowywanie prole-
ków wymaga znajomości kinetyki i mechanizmów
działania enzymów odpowiedzialnych za prze¬
kształcenie ich w biologicznie aktywne formy.
STRESZCZENIE
• Badanie kinetyki enzymatycznej - czynników,
które wpływają na szybkość katalizowanych
enzymatycznie reakcji - ujawnia poszczególne
etapy, w których enzymy przekształcają sub-
straty do produktów.
• Wartość AG, czyli całkowita zmiana entalpii
swobodnej reakcji, jest niezależna od mechani¬
zmu reakcji i nie dostarcza żadnych informacji
dotyczących szybkości reakcji.
• Enzymy nie mają wpływu na Kcą. Wartość Keą
- ilorazu stałych szybkości reakcji może być ob¬
liczona na podstawie stężeń substratów i produk¬
tów w stanie równowagi lub jako iloraz kj/k _j.
• Reakcje przebiegają poprzez stany przejściowe,
w których AGF stanowi energię aktywacji. Tem¬
peratura, stężenie jonów wodorowych, stężenie
enzymu, stężenie substratu i inhibitory mają
wpływ na szybkość katalizowanych enzyma¬
tycznie reakcji.
• Pomiar szybkości reakcji katalizowanej en¬
zymatycznie zazwyczaj przeprowadza się dla
warunków odpowiadających szybkości począt¬
kowej, dla której zasadniczo nieobecność pro¬
duktu wyklucza reakcję odwrotną.
• Liniowa forma równania Michaelisa-Menten
ułatwia określenie Km i Vmax.
• Liniowa forma równania Hilla jest wykorzy¬
stywana do oceny kinetyki kooperatywnego
przyłączania substratu, w którym uczestniczą
pewne multimeryczne enzymy. Nachylenie
krzywej n, czyli współczynnik Hilla, charakte¬
ryzuje liczbę, naturę i siłę oddziaływań miejsc
przyłączających substrat. Wartość n większa
niż 1 wskazuje na dodatnią kooperację.
• Efekty działania inhibitorów kompetycyjnych,
które zwykle są podobne do substratów, są
znoszone przez zwiększenie stężenia substratu.
Niekompetycyjne inhibitory obniżają Vmax, ale
nie mają wpływu na Km.
• Substraty mogą wchodzić w reakcję w kolejno¬
ści przypadkowej (albo substrat A, albo B może
najpierw łączyć się z enzymem) lub w kolejno¬
ści uporządkowanej (substrat A musi się przyłą¬
czyć przed substratem B).
• W reakcjach „ping-pong” jeden produkt lub
kilka produktów odłącza się od enzymu zanim
zostaną dodane wszystkie substraty.
• Kinetyka enzymatyczna ułatwia identyfikację
i charakterystykę leków, które selektywnie ha¬
mują specyficzne enzymy. Kinetyka enzyma¬
tyczna odgrywa zatem podstawową rolę w pro¬
jektowaniu leku, w porównawczej farmakody-
namice i określaniu sposobu działania leków.
PIŚMIENNICTWO
Fersht A: Struć turę and Mechanism in Protein Science:
A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding.
Freeman, 1999.
Fraser CM, Rappuoli R: Application of microbial ge¬
nomie science to advanced therapeutics. Annu Rev
Med 2005;56:459.
Schultz AR: Enzyme Kinetics: From Diastase to Multi-
-enzyme Systems. Cambridge Univ Press, 1994.
Segel IH: Enzyme Kinetics. Wiley Interscience, 1975.
Wlodawer A: Rational approach to AIDS drug de¬
sign through structural biology. Annu Rev Med
2002;53:595.
Enzymy: regulacja aktywności
Peter J. Kennelly, PhD; \Hctor W. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Podstawy regulacji metabolizmu sformułował
w XIX w. fizjolog Claude Bernard. Zaobserwował
on, że organizmy mają zdolność precyzyjnego do¬
stosowania się do zmian zachodzących w środowi¬
sku zewnętrznym i wewnętrznym. Owa zdolność
zwierząt do utrzymania stałości środowiska we¬
wnętrznego, mimo zmian zachodzących w śro¬
dowisku zewnętrznym, została określona przez
Waltera Cannona jako homeostaza. Obecnie wia¬
domo, że organizmy potrafią w sposób zrównowa¬
żony i skoordynowany regulować szybkość reakcji
metabolicznych w odpowiedzi na zmiany w środo¬
wisku zewnętrznym i wewnętrznym. Zaburzenia
tej regulacji, będące wynikiem działania czynni¬
ków patogennych czy mutacji, są odpowiedzialne
za wiele chorób, w tym choroby nowotworowej,
cukrzycy, mukowiscydozy czy choroby Alzheime¬
ra. Na przykład wiele wirusów onkogennych kodu¬
je swoiste dla reszt tyrozyny kinazy białek, które
kontrolują procesy odpowiedzialne za ekspresję
genów zaangażowanych w inicjację i progresję
nowotworu. Toksyna Fibńo cholerne, bakterii bę¬
dącej przyczyną cholery, zaburza przekaźnictwo
w komórkach nabłonkowych jelita w wyniku
ADP-rybozylacji białek wiążących GTP (białka
G), uczestniczących w transdukcji sygnału z re¬
ceptorów błonowych do wewnątrzkomórkowych
przekaźników - cyklazy adenylanowej. Modyfika¬
cja ta prowadzi do permanentnej aktywacji cykla¬
zy, co powoduje wydzielanie wody do światła jelita
i w konsekwencji biegunkę oraz odwodnienie. Yer-
sinia pestis, będąca przyczyną dżumy, wytwarza
swoistą fosfatazę fos foty rozynową, która usuwa
reszty fosforanowe z głównych białek cytoszkie-
letu. Dysfunkcje w systemie odpowiedzialnym za
degradację nieprawidłowych lub uszkodzonych
białek wydają się odgrywać rolę w chorobach neu-
rodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera
czy choroba Parkinsona. Znajomość czynników
kontrolujących szybkości reakcji enzymatycznych
jest niezbędna do zrozumienia molekularnych pod¬
staw schorzenia. W niniejszym rozdziale opisano,
na wybranych przykładach, mechanizmy regulacji
procesów metabolicznych. Inne przykłady przed¬
stawiono w następnych rozdziałach.
REGULACJA PRZEPŁYWU METABOLITÓW
MOŻE BYĆ AKTYWNA LUB BIERNA
Enzymy działające z maksymalną szybkością nie
mają możliwości reagowania na wzrost stężenia
substratu, a jedynie na nagły spadek jego stężenia.
Dlatego też w przypadku większości enzymów
wewnątrzkomórkowe stężenie ich substratów od¬
powiada w przybliżeniu wartości Km. Dzięki temu
zmiany stężenia substratu wywołują odpowied¬
nie zmiany przepływu metabolitów (ryc. 9-1). Ta
zdolność dostosowania się enzymów do stężenia
Ryc. 9-1. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od zmiany
stężenia substratu, przy stężeniu substratu odpowiadającym war¬
tości Km (AI/a) oraz znacznie przekraczającym wartość Km (Al/B).
92 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
substratu stanowi istotny, lecz bierny, sposób ko¬
ordynacji przepływu metabolitów. Chociaż jest
on niezbędny dla homeostazy w niedzielących
się komórkach, to jednak nie pozwala w pełni na
podążanie za różnorodnymi zmianami w środowi¬
sku. W dalszej części rozdziału przedstawiono ak¬
tywne mechanizmy regulacji działania enzymów
w odpowiedzi na sygnały wewnątrz- i zewnątrz-
komórkowe.
Przepływ metabolitów jest zazwyczaj
jednokierunkowy
W żywych komórkach, mimo krótkotrwałych
zmian stężenia metabolitów i poziomu enzymów,
średnie stężenie metabolitów pozostaje względnie
stałe (ryc. 9-2). Niemal wszystkie reakcje che¬
miczne są do pewnego stopnia odwracalne, jednak
w żywych komórkach produkty jednych reakcji
stanowią substraty dla innych, enzymatycznych
reakcji; w ten sposób metabolity są skutecznie
Ryc. 9-2. Schemat homeostazy komórkowej. Przepływ metaboli¬
tów jest jednokierunkowy.
usuwane, a wiele potencjalnie odwracalnych re¬
akcji przebiega w rzeczywistości jednokierunko¬
wo. Temu sprzężeniu reakcji metabolicznych to¬
warzyszy zmiana energii swobodnej [poprawnie:
entalpii swobodnej - przyp. tłum.], gwarantująca
przepływ metabolitów w jednym kierunku (p.
rozdz. 11). Jednokierunkowy przepływ związków
w szlakach metabolicznych, na ogół z dużą utratą
entalpii swobodnej, przypomina przepływ wody
w rurze wodociągowej, której końce znajdują się
na różnych poziomach. Wygięcia rury lub węzły
mogą symulować poszczególne, katalizowane
przez enzymy, etapy o niewielkich dodatnich lub
ujemnych zmianach entalpii swobodnej. Przepływ
wody przez rurę będzie jednokierunkowy dzięki
różnicy poziomów, która odpowiada sumarycznej
zmianie entalpii swobodnej w szlaku metabolicz¬
nym (ryc. 9-3).
Ryc. 9-3. Analogia hydrostatyczna szlaku metabolicznego z etapem
kontrolującym (A) oraz etapem o wartości AG bliskiej zeru (B).
KOMPARTMENTACJA ZAPEWNIA
SPRAWNOŚĆ METABOLICZNA
I UPRASZCZA REGULACJE
W organizmach eukariotycznych szlaki anabolicz¬
ne i kataboliczne, wykorzystujące wspólne metabo¬
lity, przebiegają w określonych przedziałach (kom-
partmentach) komórkowych. Na przykład enzymy
degradujące białka i polisacharydy znajdują się
wewnątrz organelli, zwanych lizosomami. Z kolei
biosynteza kwasów tłuszczowych zachodzi w cy-
tozolu, natomiast utlenianie kwasów tłuszczowych
odbywa się w mitochondriach (p. rozdz. 22 i 23).
Fizyczne rozdzielenie procesów może być posu¬
nięte jeszcze dalej. Niektóre szlaki metaboliczne
zachodzą wyłącznie w wyspecjalizowanych typach
komórek. I przeciwnie, obecność jednego lub kilku
unikatowych intermediatów - specyficznych me¬
tabolitów pośrednich - pozwala na współistnienie
przeciwstawnych szlaków, nawet w przypadku bra¬
ku barier fizycznych. Na przykład glikoliza i glu-
koneogeneza, mimo wielu wspólnych metabolitów
i enzymów, są procesami energetycznie uprzywile¬
jowanymi. Nie byłoby to możliwe, gdyby wszyst¬
kie reakcje były takie same, gdyż wówczas tylko
jeden ze szlaków mógłby być termodynamicznie
korzystny. Jeśli bowiem jeden szlak jest korzystny
energetycznie, to szlak stanowiący jego dokładne
9. ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI 93
odwrócenie musiałby mieć zmianę entalpii swo¬
bodnej AG taką samą pod względem wartości bez¬
względnej, lecz o przeciwnym znaku. Jednoczesna
spontaniczność obu przemian wynika z zamiany
jednej czy kilku reakcji na inne, termodynamicznie
korzystne, zachodzące w przeciwnych kierunkach.
Na przykład enzym glikolizy - fosfofruktokinaza
(p. rozdz. 18) jest w glukoneogenezie zastąpiona
fruktozo-1,6-bisfosfatazą (p. rozdz. 20). Zdolność
enzymów do rozróżniania dwóch bardzo podob¬
nych pod względem strukturalnym koenzymów
NAD+ i NADP+ również prowadzi do pewnego
rodzaju kompartmentacji, gdyż umożliwia oddzie¬
lenie elektronów przeznaczonych do generowania
ATP od tych przeznaczonych do redukcji w wielu
szlakach biosyntezy.
Cały szlak metaboliczny może być
kontrolowany przez jeden enzym
katalizujący kluczowa reakcje
Wprawdzie przepływ metabolitów w szlakach
metabolicznych zależy od reakcji katalizowa¬
nych przez liczne enzymy, lecz aktywna kontrola
zapewniająca homeostazę zależy od niewielkiej
liczby enzymów. Regulacja jest najskuteczniejsza,
jeśli dotyczy enzymu, którego ilość lub spraw¬
ność katalityczna jest mniejsza w stosunku do
pozostałych etapów danego szlaku. Zmniejszenie
sprawności katalitycznej lub ograniczenie ilości
enzymu katalizującego to „wąskie gardło”, czy¬
li etap kontrolujący, powodujące zmniejszenie
przepływu metabolitów w całym szlaku. I prze¬
ciwnie, wzrost ilości lub zdolności katalitycznej
enzymu powoduje zwiększenie przepływu meta¬
bolitów w całym szlaku. Na przykład karboksyla-
za acetylo-CoA katalizuje syntezę malonylo-CoA
w pierwszej reakcji biosyntezy kwasów tłusz¬
czowych (p. rozdz. 23). Jeśli zostanie zahamo¬
wana synteza malonylo-CoA, wszystkie kolejne
etapy biosyntezy kwasów tłuszczowych zostaną
zatrzymane ze względu na brak substratów. Tak
więc enzymy, które katalizują etapy kontrolują¬
ce, decydują w sposób naturalny o przepływie
metabolitów. Stanowią więc one potencjalny cel
dla działania wielu leków. Na przykład zahamo¬
wanie za pomocą statyn reduktazy 3-hydroksy-3-
-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA), katalizującej
reakcję kluczową w cholesterogenezie, zmniejsza
syntezę cholesterolu.
REGULACJA ILOŚCI ENZYMU
Efektywność reakcji kontrolującej szlak metabo¬
liczny zależy od liczby cząsteczek enzymu i ich
sprawności katalitycznej. Oznacza to, że zarówno
zmiany ilości, jak i aktywności katalitycznej en¬
zymu wpływają na efektywność reakcji kontrolu¬
jącej.
Białka sa ustawicznie syntetyzowane
i degradowane
Mierząc szybkość wbudowywania aminokwa¬
sów znakowanych izotopem azotu 15N do białek
oraz szybkość ich uwalniania z białek, Schoen-
heimer wykazał, że w organizmie białka są w sta¬
nie „równowagi dynamicznej”, wynikającej z ich
ciągłej syntezy i degradacji - procesu określa¬
nego mianem obrotu metabolicznego. Stężenie
niektórych enzymów i innych białek pozostaje na
względnie stałym, konstytutywnym poziomie,
lecz stężenie wielu innych enzymów zależy od
różnych czynników fizjologicznych, hormonal¬
nych czy też składników pokarmowych.
Bezwzględna ilość danego enzymu odzwier¬
ciedla różnicę między szybkością jego syntezy
oraz szybkością jego degradacji. W komórkach
ludzkich zmiany poziomu enzymu mogą być
wynikiem zmiany wartości stałych szybkości
wszystkich procesów składających się na jego
syntezę (ks) lub degradację (°), czy też obu war¬
tości jednocześnie.
Enzym
Aminokwasy
Kontrola syntezy enzymów
Synteza określonych enzymów zależy od obecno¬
ści induktorów, którymi mogą być substraty lub
związki podobne pod względem struktury do sub¬
stratów. Na przykład bakteria Escherichia coli,
wykorzystująca jako źródło węgla glukozę, kata-
bolizuje laktozę tylko po dodaniu p-galaktozydu,
będącego induktorem inicjującym syntezę P-ga-
laktozydazy i permeazy galaktozydowej (p. ryc.
38-3). Enzymami ulegającymi indukcji u czło¬
wieka są 2,3-dioksygenaza tryptofanowa (piro-
94 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
laza tryptofanowa), dehydrogenaza treoninowa,
aminotransferaza tyrozyna: a-ketoglutaran, enzy¬
my cyklu mocznikowego, reduktaza HMG-CoA
i cytochrom P450. Z kolei nadmiar metabolitu
może zahamować syntezę swoistego enzymu po¬
przez represję. Indukcja oraz represja przebiegają
przy udziale elementów cis, tj. specyficznych sek¬
wencji DNA zlokalizowanych po stronie 5' genu
kodującego dany enzym oraz białek regulatoro¬
wych działających w układzie trans. Molekular¬
ne mechanizmy indukcji i represji przedstawiono
w rozdz. 38. Synteza enzymów może być również
stymulowana w wyniku wiązania hormonów i in¬
nych cząsteczek sygnałowych do specyficznych
receptorów komórkowych. Informacja dotycząca
kontroli syntezy białek w odpowiedzi na działanie
hormonów jest zawarta w rozdz. 42.
Kontrola degradacji enzymów
U zwierząt wiele białek jest degradowanych
w proteasomach w szlaku zależnym od ubikwi-
tyny, za którego rozszyfrowanie Aaron Ciecha-
nover, Aram Hershko i Irwin Roose otrzymali
Nagrodę Nobla. Proteasom 26S jest zbudowany
z ponad 30 podjednostek polipeptydowych two¬
rzących wydrążony w środku cylinder. Centra
aktywne proteolitycznych podjednostek są skie¬
rowane do wnętrza cylindra, co zapobiega nie¬
kontrolowanej degradacji białek komórkowych.
Białka przeznaczone do degradacji w proteaso¬
mach są „znakowane” poprzez ubikwitylację,
czyli kowalencyjne przyłączenie jednej lub kilku
cząsteczek ubikwityny. Ubikwityna jest małym,
zbudowanym z ok. 76 reszt aminokwasowych,
wysoce konserwatywnym pod względem ewolu¬
cyjnym białkiem. Ubikwitylacja jest realizowana
przez dużą rodzinę enzymów, określanych jako
ligazy E3, które katalizują przyłączanie ubikwi¬
tyny do grup aminowych reszt lizyny w łańcuchu
polipeptydu.
Zależna od ubikwityny proteoliza jest odpo¬
wiedzialna za podlegającą regulacji degradację
określonych białek komórkowych, na przykład
cyklin, w odpowiedzi na specyficzne wewnątrz-
i zewnątrzkomórkowe sygnały oraz usuwanie bia¬
łek nieprawidłowych czy uszkodzonych. Wszech¬
stronność i selektywność układu ubikwityna-pro-
teasom wynika z różnorodności wewnątrzkomór¬
kowych ligaz E3 i ich zdolności rozpoznawania
określonych konformacji i stanów fizycznych do¬
celowego białka. Selektywnej degradacji w pro¬
teasomach w szlaku zależnym od ubikwityny
ulegają białka, których fizyczna integralność lub
funkcjonalna kompetencja zostały zakłócone
w wyniku braku lub uszkodzenia grupy proste-
tycznej, utlenienia cysteiny czy histydyny lub de-
aminacji asparaginy czy glutaminy. „Znakowanie”
białek przeznaczonych do degradacji może być
również regulowane przez kowalencyjne modyfi¬
kacje, takie jak fosforylacja, wiązanie substratu lub
efektorów allosterycznych, połączenie z memb¬
ranami, oligonukleotydarni czy innymi białkami.
Wyniki licznych badań wskazują, że zaburzenia
w funkcjonowaniu układu ubikwityna-proteasom
są odpowiedzialne za gromadzenie nieprawidło¬
wych struktur białkowych, charakterystycznych
dla wielu chorób neurodegeneracyjnych.
AKTYWNOŚĆ KATALITYCZNA MOŻE BYĆ
REGULOWANA W RÓŻNY SPOSÓB
Indukcja syntezy białka u człowieka jest złożo¬
nym, wieloetapowym procesem, i dlatego zna¬
czące zmiany ilości enzymu wymagają określo¬
nego czasu, nawet wielu godzin. Z kolei zmiany
sprawności katalitycznej enzymu indukowane
przez odwracalne wiązanie ligandów (regulacja
allosteryczna) lub modyfikacje kowalencyjne
zachodzą w ciągu kilku sekund. Na ogół zmiany
poziomu białka następują wtedy, kiedy zmiana
adaptacyjna jest długotrwała, natomiast zmiany
sprawności katalitycznej dają szybkie, krótko¬
trwałe zmiany przepływu metabolitów.
AKTYWNOŚĆ OKREŚLONYCH ENZYMÓW
REGULUJĄ EFEKTORY ALLOSTERYCZNE
Hamowanie aktywności enzymu szlaku biosyn¬
tezy przez końcowy produkt tego szlaku nosi
nazwę hamowania przez sprzężenie zwrotne.
W biosyntezie związku D ze związku A, ka¬
talizowanej przez enzymy Enzh Enz2 i Enz3,
Enz, Enz2 Enz3
A —► B —► C —► D
duże stężenie związku D zwykle hamuje prze¬
mianę A w B. Nie następuje tu proste „cofanie
się” związków pośrednich, lecz związek D wiąże
9. ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI 95
Enzj, hamując jego aktywność. Związek D łączy
się zwykle w miejscu allosterycznym, różnym od
miejsca katalitycznego enzymu. Inhibitory zwrot¬
ne są więc efektorami allosterycznymi, które na
ogół nie wykazują podobieństwa strukturalnego
do substratów hamowanego enzymu. W podanym
przykładzie inhibitor zwrotny D działa więc jako
ujemny efektor allosteryczny Enz,.
W rozgałęzionym szlaku biosyntezy początko¬
we metabolity są wykorzystywane do biosyntezy
kilku końcowych metabolitów. Hamowanie przez
sprzężenie zwrotne w hipotetycznym rozgałęzio¬
nym szlaku biosyntezy przedstawiono na ryc. 9-4,
na której wygięte strzałki wskazują miejsca ha¬
mowania określonych enzymów przez ich inhibi¬
tory zwrotne. Przekształcenia S3 —► A, S4 —► B,
S4 —► C i S5 —►—► D stanowią liniowe ciągi reakcji,
które są hamowane na zasadzie sprzężenia zwrot¬
nego przez ich końcowe produkty. Konkretnym
przykładem tego zjawiska jest biosynteza nukleo-
tydów (p. rozdz. 33).
Ryc. 9-4. Hamowanie przez sprzężenie zwrotne w rozgałęzionym
szlaku biosyntezy. Si—S5 są związkami pośrednimi w biosyntezie
ostatecznych produktów A-D. Proste strzałki oznaczają enzymy
katalizujące określone przemiany. Wygięte strzałki wskazują hi¬
potetyczne miejsca hamowania przez swoiste produkty końcowe
w wyniku sprzężenia zwrotnego.
Kinetyka hamowania przez sprzężenie zwrotne
może mieć charakter kompetycyjny, niekompety-
cyjny lub mieszany. Inhibitory zwrotne, którymi
często są małe cząsteczki budujące związki wiel¬
kocząsteczkowe (np. aminokwasy dla białek, nu-
kleotydy dla kwasów nukleinowych), najczęściej
hamują pierwszy etap w danym szlaku biosyntezy.
Najlepiej poznanym przykładem jest hamowanie
bakteryjnej karbamoilotransferazy asparaginiano-
wej przez CTP (p. dalej i rozdz. 33).
Różnorodność mechanizmów hamowania przez
sprzężenie zwrotne w rozgałęzionych szlakach
metabolicznych stanowi dodatkowy poziom regu-
Ryc. 9-5. Regulacja rozgałęzionego szlaku biosyntezy w wyniku
hamowania przez sprzężenie zwrotne. Oprócz podstawowych
pętli sprzężenia zwrotnego (zaznaczonych wygiętymi strzałkami
przerywanymi) istnieje wiele dodatkowych pętli (zaznaczonych
wygiętymi strzałkami ciągłymi), regulujących enzymy wspólne
dla biosyntezy wielu produktów końcowych.
lacji. Na przykład, jak pokazano na ryc. 9-5, jeśli
produkt B występuje w nadmiarze, to zmniej¬
sza się zapotrzebowanie na substrat S2. Jednak
S2 jest niezbędny również dla syntezy A, C i D,
co by oznaczało, że B mógłby wstrzymać synte¬
zę wszystkich czterech produktów końcowych.
Aby uniknąć takiego niepożądanego efektu,
każdy produkt końcowy może ostatecznie tylko
częściowo zahamować aktywność katalitycz¬
ną enzymu. Hamujący wpływ dwóch lub kilku
produktów końcowych może być sumą skut¬
ków wywołanych przez każdy z tych produktów
z osobna (kumulatywne hamowanie przez sprzę¬
żenie zwrotne) lub też przewyższać sumaryczny
efekt (kooperatywne hamowanie przez sprzęże¬
nie zwrotne).
Najlepiej poznanym
enzymem allosterycznym jest
karbamoilotransferaza asparaginianowa
Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATC-
aza, ang. Aspartate Transcarbamoylase) katalizuje
pierwszą reakcję w szlaku biosyntezy pirymidyn
(p. ryc. 33-7). Enzym ten jest regulowany na zasa¬
dzie sprzężenia zwrotnego przez trifosforan cyty-
dyny (CTP) i trifosforan adenozyny (ATP). CTP,
będący produktem końcowym szlaku biosyntezy
pirymidyn, hamuje enzym, natomiast ATP go ak¬
tywuje. Wysoki poziom ATP może jednak znieść
hamujący efekt CTP, umożliwiając syntezę nu-
kleotydów pirymidynowych w obecności pod¬
wyższonej ilości nukleotydów purynowych.
96 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Miejsca allosteryczne i katalityczne sa
przestrzennie odmienne
Brak strukturalnego podobieństwa między inhibi¬
torem zwrotnym a substratem dla enzymu, którego
aktywność podlega regulacji sugeruje, że efektory
nie są izosteryczne, lecz allosteryczne (zajmują
inną przestrzeń) z substratem. Hipotezę o miej¬
scach allosterycznych, odmiennych fizycznie od
miejsca katalitycznego, postawił Jacąues Monod.
Enzymy, których aktywność miejsca katalityczne¬
go może być regulowana przez efektory alloste¬
ryczne, znajdujące się w miejscu allosterycznym,
określa się jako enzymy allosteryczne. Hipotezę
tę potwierdzają wyniki badań, przeprowadzone
m.in. za pomocą krystalografii rentgenowskiej
i mutagenezy ukierunkowanej, wykazujące ist¬
nienie odrębnych miejsc aktywnych i alloste¬
rycznych w przypadku różnorodnych enzymów.
Na przykład ATCaza E. coli jest dodekamerem
zawierającym sześć podjednostek katalitycznych
oraz sześć podjednostek regulatorowych, które
wiążą trifosforany nukleozydów modulujących
aktywność enzymu. Na ogół przyłączenie regula¬
tora allosterycznego indukuje w enzymie zmiany
konformacyjne obejmujące miejsce katalityczne.
Zmiany te mogą wpływać na sprawność katali¬
tyczną enzymu (enzymy serii V), powinowactwo
enzymu do substratu (enzymy serii K) lub też na
obie właściwości.
W wyniku oddziaływań allosterycznych
zmienia się wartość Km lub Vmax
Odnoszenie określeń „kompetycyjny” lub „nie-
kompetycyjny” do substratu w kinetyce hamo¬
wania allosterycznego może wprowadzić w błąd.
Słuszniejszy wydaje się podział enzymów podle¬
gających regulacji na dwie grupy, tj. enzymy serii
K i enzymy serii V. W przypadku enzymów allo¬
sterycznych serii K kinetyka nasycenia substratem
jest kompetycyjna w sensie zwiększenia wartości
Km i braku wpływu na wartość Vmax. W przypadku
natomiast enzymów allosterycznych serii V efek-
tor allosteryczny zmniejsza wartość Vmax bez wi¬
docznego wpływu na wartość Km. Zmiany warto¬
ści Km i Vmax wynikają prawdopodobnie ze zmian
konformacyjnych w miejscu katalitycznym, wy¬
wołanych związaniem efektora w miejscu allo¬
sterycznym. Dla enzymów allosterycznych serii
K skutkiem zmian konformacyjnych może być
osłabienie wiązań między substratem i resztami
aminokwasowymi w miejscu wiążącym substrat.
Z kolei dla enzymów allosterycznych serii V pier¬
wotnym skutkiem może być zmiana orientacji
przestrzennej lub ładunku reszt katalitycznych,
prowadząca do zmniejszenia wartości Vmax. Zmia¬
ny konformacyjne mogą mieć również wpływ za¬
równo na wartość Km, jak i Vmax.
REGULACJA NA ZASADZIE SPRZĘŻENIA
ZWROTNEGO NIE JEST SYNONIMEM
HAMOWANIA PRZEZ SPRZĘŻENIE
ZWROTNE
Zarówno w komórkach ssaków, jak i bakterii pro¬
dukty końcowe, działając na zasadzie „sprzężenia
zwrotnego”, kontrolują swoją syntezę. W wielu
przypadkach mechanizm tego zjawiska polega
na hamowaniu enzymu katalizującego począt¬
kowe etapy biosyntezy. Należy jednak odróżnić
regulację na zasadzie sprzężenia zwrotnego,
stanowiącąjedynie określenie fenomenologiczne,
od hamowania przez sprzężenie zwrotne, sta¬
nowiącego mechanizm regulacji aktywności en¬
zymów. Na przykład cholesterol zawarty w die¬
cie ogranicza syntezę cholesterolu w wątrobie.
Ta regulacja na zasadzie sprzężenia zwrotnego
nie polega jednak na hamowaniu przez sprzęże¬
nie zwrotne. Enzymem podlegającym regulacji
w cholesterogenezie jest reduktaza HMG-CoA.
Nie jest ona jednak hamowana przez cholesterol,
lecz cholesterol lub jego metabolit hamują ekspre¬
sję genu kodującego reduktazę HMG-CoA (repre¬
sja enzymu) (p. rozdz. 26).
WIELE HORMONÓW DZIAŁA
ZA POŚREDNICTWEM
WTÓRNYCH PRZEKAŹNIKÓW
Impulsy nerwowe, oraz wiązanie hormonów do re¬
ceptorów powierzchniowych komórki, wywołują
zmiany szybkości reakcji enzymatycznych w ko¬
mórkach docelowych poprzez indukowanie uwol¬
nienia lub syntezy wyspecjalizowanych efekto-
rów allosterycznych, nazywanych przekaźnikami
wtórnymi albo przekaźnikami drugiego rzędu.
Przekaźnikiem pierwotnym (pierwszego rzędu)
9. ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI 97
jest hormon lub impuls nerwowy. Jednym z lepiej
poznanych przekaźników drugorzędowych jest
3',5'-cAMP, syntetyzowany z ATP w obecności
cyklazy adenylanowej pod wpływem epinefryny
(adrenaliny). Innym przykładem przekaźnika dru¬
giego rzędu są jony Ca2+ znajdujące się wewnątrz
retikulum endoplazmatycznego większości ko¬
mórek. Depolaryzacja błony plazmatycznej pod
wpływem impulsu nerwowego otwiera kanały
błonowe, umożliwiając wypływ jonów wapnio¬
wych do cytoplazmy, gdzie wiążą się i aktywują
enzymy zaangażowane w regulację skurczu i mo¬
bilizację zmagazynowanej w glikogenie glukozy.
Glukoza jest źródłem energii niezbędnej do skur¬
czu mięśni. Jeszcze innymi wtórnymi przekaźnika¬
mi są3',5'-cGMP i polifosfoinozytole, powstające
w wyniku hydrolizy fosfolipidów inozytolowych
przez fosfolipazy regulowane przez hormony.
REGULATOROWE MODYFIKACJE
KOWALENCYJNE MOGĄ MIEĆ CHARAKTER
ODWRACALNY LUB NIEODWRACALNY
W komórkach ssaków dwoma podstawowymi mo¬
dyfikacjami kowalencyjnymi są swoista, ograni¬
czona proteoliza i fosforylacja. Ponieważ komórki
nie mają możliwości odtwarzania zhydrolizowa-
nego wiązania peptydowego i powtórnej syntezy
białka ulegającego hydrolizie, pierwsza z modyfi¬
kacji jest uznawana za nieodwracalną. Z kolei fo¬
sforylacja reprezentuje modyfikację odwracalną.
Fosforylacja reszt seryny, treoniny czy tyrozyny
w białkach, katalizowana przez kinazy białek, jest
korzystna pod względem termodynamicznym.
Równie korzystne jest hydrolityczne usunięcie
grup fosforanowych przez enzymy określane
jako fosfatazy białek. Aktywność kinaz i fosfataz
białek podlega własnej regulacji, w przeciwnym
bowiem razie ich działanie byłoby nieefektywne
zarówno z termodynamicznego, jak i biologiczne¬
go punktu widzenia.
PROTEAZY MOGĄ RYĆ WYDZIELANE
W POSTACI NIEAKTYWNYCH
PROENZYMÓW
Wiele białek jest syntetyzowanych w postaci nie¬
aktywnych prekursorów, określanych jako pro-
bialka. Jeśli białka te są enzymami, ich probiałka
są nazywane proenzymami lub zymogenami.
Przekształcenie probiałek w aktywne białka na¬
stępuje w wyniku jedno- lub kilkustopniowej
swoistej proteolizy, w wyniku której tworzą się
dojrzałe białka o charakterystycznej aktywno¬
ści, na przykład o aktywności enzymatycznej.
Do białek syntetyzowanych w formie probiałek
należą insulina (probiałko: proinsulina), enzymy
trawienne - pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna
(odpowiednie probiałka: pepsynogen, trypsyno-
gen i chymotrypsynogen), czynniki krzepnięcia
krwi i fibrynolizy (p. rozdz. 50) oraz białko tkanki
łącznej - kolagen (probiałko: prokolagen).
Proenzymy umożliwiają szybkie
uruchomienie aktywnych form w razie
zapotrzebowania fizjologicznego
Synteza i sekrecja proteaz w formie nieaktywnych
prekursorów chroni tkanki, w których są one wy¬
twarzane (np. trzustkę) przed samotrawieniem,
takim jakie może zachodzić w przypadku zapa¬
lenia trzustki. Niektóre procesy fizjologiczne, np.
trawienie, nie są ciągłe, chociaż na ogół regularne
i możliwe do przewidzenia. Inne natomiast, jak
krzepnięcie krwi, fibrynoliza i regeneracja tkanek
zachodzą tylko w przypadku zadziałania określo¬
nych czynników fizjologicznych lub patologicz¬
nych. Aby zachować homeostazę, procesy krzep¬
nięcia krwi i fibrynolizy muszą być skoordynowa¬
ne w czasie. Wydzielanie enzymów działających
okresowo w formie nieaktywnej gwarantuje ich
szybkie uruchomienie w chwili zapotrzebowania
na nie. Synteza niezbędnych w danym momencie
białek czy ich sekrecja mogłaby bowiem prze¬
biegać niewystarczająco szybko w stosunku do
potrzeb organizmu uwarunkowanych czynnikami
patofizjologicznymi, np. utratą krwi (p. rozdz. 50).
Aktywacja chymotrypsynogenu wymaga
swoistej proteolizy
Przekształcenie probiałka w aktywny enzym po¬
lega na jedno- lub kilkustopniowej, selektywnie
ograniczonej proteolizie, której produkty - pep-
tydy mogą być rozdzielone lub mogą pozostać
razem w ostatecznym białku. Najczęściej proces
ten prowadzi do zmian konformacyjnych, których
konsekwencją jest utworzenie miejsca katalitycz-
98 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
13 14 15 (16
1 13/14 15 16
I A~
146 / / 149
14-15 147-148
r~i
1 13 16
146 149
ZJ c
Ryc. 9-6. Tworzenie miejsca katalitycznego chymotrypsyny, zawierającego układ trzech aminokwasów,
triadę katalityczną Asp 102—His 57—Ser 195, warunkuje selektywna proteoliza i w konsekwencji zmia¬
ny konformacyjne. Stopniowa, ograniczona proteoliza prowadzi do przekształcenia prochymotrypsyny
(pro-CT) w chymotrypsynę n (jt-CT) i ostatecznie w pełni aktywną chymotrypsynę a (a-CT), w której trzy
łańcuchy peptydowe są połączone wiązaniami disiarczkowymi.
nego enzymu. Swoista, ograniczona proteoliza
prochymotrypsyny (chymotrypsynogenu) umoż¬
liwia utworzenie centrum katalitycznego, którego
trzy reszty aminokwasowe, tzw. triada katalitycz¬
na Ser-His-Asp, uczestniczą w przekazywaniu
protonu. Mimo że w a-chymotrypsynie His 57
i Asp 102 znajdują się w łańcuchu B, a Ser 195
w łańcuchu C (ryc. 9-6), to jednak w wyniku ich
zbliżenia tworzy się miejsce katalityczne zdolne
do oddziaływania z substratem.
U SSAKÓW ODWRACALNE MODYFIKACJE
KOWALENCYJNE REGULUJĄ KLUCZOWE
ENZYMY
Białka komórek ssaków podlegają różnorodnym
modyfikacjom kowalencyjnym. Niektóre z nich,
takie jak prenylacja, glikozylacja, hydroksyla-
cja czy acylacja kwasami tłuszczowymi, warun¬
kują określone właściwości strukturalne nowo
syntetyzowanych białek. Modyfikacje te mają
zasadniczo charakter stały. Spośród modyfikacji
kowalencyjnych zaangażowanych w regulację
funkcji białek (np. metylacja, adenylacja) naj¬
bardziej powszechna jest fosforylacja-defosfo-
rylacja. Fosforylację białek katalizują enzymy
zwane kinazami białek. Przenoszą one y-fosfo-
ranową grupę ATP na reszty hydroksylowe sery-
ny, treoniny lub tyrozyny, wskutek czego tworzą
się odpowiednio, O-fosfoseryny, O-fosfotreoni-
ny lub O-fosfotyrozyny (ryc. 9-7). Docelowymi
aminokwasami niektórych kinaz są reszty histy-
dyny, lizyny, argininy i kwasu asparaginowego.
Niezmodyfikowana forma białka może być rege- I
nerowana w wyniku hydrolitycznej reakcji kata- |
lizowanej przez fosfatazy białek. '
Typowa komórka ssaków zawiera tysiące ,
ufosforylowanych białek oraz kilkaset kinaz
i fosfataz odpowiedzialnych za ich fosforylację
ATP ADP
Ryc. 9-7. Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji
kowalencyjnej polegającej na fosforylacji i defosforylacji reszty
seryny.
9. ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI 99
i defosforylację. Łatwość, z jaką komórki mogą
przekształcać enzymy z formy defosforylowa-
nej w fosforylowaną i odwrotnie sprawia, że
fosforylacja-defosforylacja jest najczęstszym
mechanizmem regulacji. Pozwala ona na zmia¬
nę właściwości funkcjonalnych określonego
enzymu tylko w sytuacji fizjologicznego zapo¬
trzebowania. Następnie enzym może być pono¬
wnie przekształcany w nieaktywną formę, goto¬
wą do odpowiedzi na kolejny sygnał. Drugim
powodem, dla którego fosforylacja-defosfory¬
lacja jest tak powszechna, jest sama natura che¬
miczna grupy fosforanowej. Każda modyfikacja
enzymu prowadząca do zmiany jego właściwości
funkcjonalnych musi wywierać wpływ na konfi¬
gurację trzeciorzędową. Zarówno ładunek grup
fosforanowych związanych z białkiem, zwykle 2
- w fizjologicznym pH, jak i ich tendencja do
tworzenia wiązań z resztami argininy, warunkują
ich skuteczność jako czynników modyfikujących
strukturę i funkcję białek. Zasadniczo fosfory¬
lacja dotyczy aminokwasów odległych od miejs¬
ca katalitycznego i powoduje zmiany konforma-
cyjne wpływające na sprawność katalityczną lub
inne właściwości enzymu.
Modyfikacje kowalencyjne regulują
przepływ metabolitów
Pod wieloma względami miejsca fosforylacji
lub innych modyfikacji kowalencyjnych mogą
być uznawane za formę miejsc allosterycznych.
W tym przypadku jednak „ligand allosteryczny”
wiąże się kowalencyjnie z białkiem. Zarówno
fosforylacja-defosforylacja, jak i hamowanie
przez sprzężenie zwrotne regulują w sposób
krótkotrwały i odwracalny przepływ metaboli¬
tów w odpowiedzi na sygnały fizjologiczne, nie
wywołując zmian w ekspresji genów. Obydwa
procesy obejmują enzymy początkowych etapów
szlaków metabolicznych, często biosyntezy, oraz
działają poprzez zmiany w miejscu allosterycz-
nym, a nie katalitycznym. Hamowanie przez
sprzężenie zwrotne dotyczy jednak pojedyncze¬
go białka i nie podlega regulacji hormonalnej
ani nerwowej. Regulacja aktywności enzymów
ssaków w wyniku fosforylacji i defosforylacji
obejmuje wiele białek oraz ATP, a ponadto jest
bezpośrednio kontrolowana przez układ hormo¬
nalny i nerwowy.
FOSFORYLACJA BIAŁEK JEST
NIEZWYKLE WSZECHSTRONNA
Fosforylacja-defosforylacja białek jest wysoce
specyficznym procesem. Nie wszystkie białka
ulegają tej modyfikacji, a spośród wielu grup hy¬
droksylowych dostępnych na powierzchni białka
tylko pojedyncze lub nieliczne są modyfikowa¬
ne. Chociaż podstawową właściwością ulegającą
zmianie jest sprawność katalityczna, fosforylacja
może również modulować wewnątrzkomórkową
lokalizację, podatność na proteolizę i regulację
przez ligandy allosteryczne. W przypadku jednych
białek fosforylacja może zwiększać sprawność
katalityczną, przekształcając je w formę aktywną,
a w przypadku innych białek może prowadzić do
powstania ich nieaktywnych form (tab. 9-1).
Tabela 9-1. Przykłady enzymów, których aktywność katalityczna
ulega zmianie przez kowalencyjną fosforylację-defosforylację
Enzym
Aktywność1
mata
duża
Karboksylaza acetylo-CoA
EP
E
Syntaza glikogenowa
EP
E
Dehydrogenaza pirogronianowa
EP
E
Reduktaza HMG-CoA
EP
E
Fosforylaza glikogenowa
E
EP
Liaza cytrynianowa
E
EP
Kinaza fosforylazy b
E
EP
Kinaza reduktazy HMG-CoA
E
EP
1E - forma defosforylowana; EP - forma ufosforylowana
Wiele białek może być fosforylowanych w róż¬
nych miejscach lub może być regulowanych za¬
równo przez fosforylację-defosforylację, jak
i wiązanie allosterycznych ligandów. Z kolei
fosforylacja i de fosforylacja każdego miejsca
może być katalizowana przez różne kinazy i fo¬
sfatazy. Liczne kinazy i większość fosfataz mo¬
dyfikuje więcej niż jedno białko, a same ulegają
przekształceniu z formy aktywnej w nieaktywną
i odwrotnie, w wyniku wiązania przekaźników
wtórnych lub kowalencyjnej modyfikacji typu
fosforylacja-defosforylacja.
Zależności między kinazami i fosfatazami, funk¬
cjonalnymi efektami fosforylacji w różnych miej¬
scach czy miejscami fosforylacji i miejscami allo-
sterycznymi stanowią podstawę systemu regulacji
pozwalającego na właściwą, skoordynowaną od-
100 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
powiedź komórkową na złożone sygnały środowi¬
skowe. Ten wyrafinowany system regulacji spra¬
wia, że różne sygnały środowiskowe są odbierane
przez różne enzymy. Jeśli na przykład enzym
jest fosforylowany w określonym miejscu przez
więcej niż jedną kinazę, to jego przekształcenie
z formy aktywnej katalitycznie w nieaktywną, lub
odwrotnie, następuje w odpowiedzi na różne syg¬
nały. Kinazy mogą być aktywowane przez sygna¬
ły różne od tych, które aktywują fosfatazy. Efekt
funkcjonalny, zazwyczaj aktywność katalityczną,
odzwierciedla stan fosforylacji. Z kolei fosforyla¬
cja i jej poziom są determinowane przez względ¬
ną aktywność kinaz i fosfataz, odzwierciedlającą
obecność i natężenie sygnałów środowiskowych.
Zdolność wielu kinaz i fosfataz do modyfikacji
więcej niż jednego białka umożliwia skoordyno¬
waną regulację złożonych procesów metabolicz¬
nych w odpowiedzi na sygnał środowiskowy. Na
przykład reduktaza hydroksymetyloglutarylo-
-CoA (HMG-CoA) i karboksylaza acetylo-CoA,
kluczowe enzymy w regulacji biosyntezy - odpo¬
wiednio - cholesterolu i kwasów tłuszczowych, są
fosforylowane i inaktywowane przez kinazę bia¬
łek aktywowaną przez AMP. Aktywacja tej kinazy
w wyniku fosforylacji przez jeszcze inną kinazę,
lub w odpowiedzi na związanie allosterycznego
aktywatora 5'-AMP, prowadzi do zahamowania
obu szlaków syntezy lipidów z acetylo-CoA.
Enzymy docelowe oraz enzymy odpowiedzial¬
ne za ich modyfikacje nie funkcjonują jednak jako
proste „włączniki” i „wyłączniki”, działające nie¬
zależnie od siebie. Tworzą one skomplikowany
system, nieodzowny do utrzymania homeostazy
w komórkach, gdzie zachodzą złożone proce¬
sy metaboliczne, których regulacja umożliwia
dostosowanie się do różnorodnych czynników
środowiskowych.
Najlepiej poznanym przykładem tego złożone¬
go systemu regulacji jest cykl komórkowy kon¬
trolujący podziały komórek eukariotycznych.
Wyjściu ze stanu spoczynkowego, G0, towarzyszy
uruchomienie procesu podziału komórki, który
przebiega przez fazy określone jako Gu S, G2
Światło UV, promieniowanie jonizujące itp.
Kinaza ATM
(nieaktywna)
DNA
( m )
l
0
| | | | | j DNA (uszkodzony)
Kinaza ATM
(aktywna, zdysocjowana)
Kinazy CHK1/2
(aktywne)
r
fP "TON
iMj
Fosfataza Cdc25
(nieaktywna)
f
Kompleks cyklina-Cdk
(nieaktywny)
Ryc. 9-8. Uproszczony mechanizm punktu kontfolrt^ąyjS^S w cyklu komórkowym Eukaryota. Replikacja
genomu następuje w fazie S, a rozdział podwojonego materiału genetycznego i podział komórki - w fazie M.
Fazy te przedziela faza Gi - wzrostu, charal^zgiafe się powiększeniem rozmiaru komórki i nagromadze¬
niem prekursorów niezbędnych dla dużych rą^róćząsYedzęk ti/orzących się w fazie S i M.
9. ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI 101
i M(ryc. 9-8). System monitorujący prawidłowy
przebieg cyklu komórkowego stanowią punkty
kontrolne, dzięki którym uruchomienie kolejnej
fazy jest możliwe jedynie po zakończeniu fazy
poprzedniej. Na rycinie 9-8 w uproszczony spo¬
sób przedstawiono funkcjonowanie punktu kon¬
trolnego inicjacji replikacji DNA, określanej jako
faza S. Obecność podwójnych pęknięć w DNA
i w konsekwencji zmiany konformacji chroma-
tyny powodują aktywację związanej z genomem
kinazy białek, określanej jako ATM. Zaktywowa-
ny dimer ATM dysocjuje, a powstały monomer
inicjuje kaskadę reakcji fosforylacja-defosforyla-
cja przez kinazy białek CHK1 i CHK2, fosfatazę
Cdc25 i ostatecznie kompleks cyklina-kinaza bia¬
łek zależna od cykliny Cdk. Aktywacja kompleksu
Cdk-cyklina hamuje przejście z fazy G\ do fazy S,
uniemożliwiając replikację uszkodzonego DNA.
Nieskuteczność tego punktu kontrolnego może
być przyczyną pojawienia się mutacji w DNA
i w konsekwencji rozwijania się nowotworu lub
innej choroby. Każdy etap tej kaskady stanowi dla
systemu kontrolującego dodatkowy wskaźnik sta¬
tusu komórki, zanim wejdzie ona w fazę S.
STRESZCZENIE
• Homeostazę, czyli utrzymanie względnej sta¬
łości środowiska wewnątrz komórki i całego
organizmu, mimo znaczących zmian zachodzą¬
cych w środowisku zewnętrznym gwarantują
odpowiednie zmiany szybkości reakcji bioche¬
micznych w odpowiedzi na zapotrzebowanie
fizjologiczne.
• Substraty dla większości enzymów występują
zwykle w stężeniu odpowiadającym w przy¬
bliżeniu wartości Km. Pozwala to na bierną
regulację szybkości tworzenia produktu w od¬
powiedzi na zmiany poziomu poszczególnych
metabolitów.
• Aktywna regulacja przepływu metabolitów
obejmuje zmiany ilości albo aktywności kata¬
litycznej, lub obu parametrów jednocześnie,
enzymu katalizującego etap kontrolujący szlak
metaboliczny.
• Swoista proteoliza katalitycznie nieaktywnych
proenzymów inicjuje zmiany konformacyjne,
których efektem jest utworzenie miejsca katali¬
tycznego. Wydzielanie tych enzymów w postaci
nieaktywnych prekursorów umożliwia szybkie
uruchomienie aktywnych form w odpowiedzi na
uszkodzenie czy zapotrzebowanie fizjologiczne
i stanowi zabezpieczenie tkanek, w których są
one wytwarzane (np. autotrawienie przez pro-
teazy).
• Wiązanie metabolitów lub przekaźników wtór¬
nych do innych miejsc niż miejsce katalityczne
prowadzi do zmian konformacyjnych enzymu,
których efektem są zmiany wartości Vmax lub
Km.
• Specyficzna fosforylacja reszt seryny, treoniny
czy tyrozyny w białkach przez kinazy białek
i defosforylacja przez fosfatazy białek stano¬
wi mechanizm regulacji aktywności wielu en¬
zymów u człowieka. Kinazy i fosfatazy białek
uczestniczą w kaskadach reakcji będących od¬
powiedzią na sygnał przekazany przez hormon
lub przekaźnik drugiego rzędu i stanowią system
regulatorowy, który umożliwia przetwarzanie
złożonej informacji ze środowiska na właściwą
i wszechstronną odpowiedź komórkową.
PIŚMIENNICTWO
Bray D: Protein molecules as computational elements in
living cells. Naturę 1995;376:307.
Ciechanover A, Schwartz AL: The ubiąuitin system:
Pathogenesis of human diseases and drug targeting.
Biochim Biophys Acta 2004; 1695:3.
Graves DJ, Martin BL, Wang JH: Co- and Post-trans-
lational Modification of Proteins: Chemical Prin-
ciples and Biological Effects. Oxford Univ Press,
1994.
Johnson LN, Lewis RJ: Structural basis for control by
phosphorylation. Chem Rev 2001; 101:2209.
Pilkis SJ et al: 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-
-bisphosphatase: A metabolic signaling enzyme.
Annu Rev Biochem 1995;64:799.
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2000.
Sitaramayya A (editor): Introduction to Cellular Signal
Transduction. Birkhauser, 1999.
Stadtman ER, Chock PB (editors): Current Topics in
Cellular Regulation. Academic Press, 1969 to the
present.
Stieglitz K et al: Monitoring the transition from the T to
the R State in E. coli aspartate transcarbamoylase
by x-ray crystallography: Crystal structures of the
E50A mutant enzyme in four distinct allosteric Sta¬
tes. J Mol Biol 2004;341:853.
Weber G (editor): Advances in Enzyme Regulation. Per-
gamon Press, 1963 to the present.
Bioinformatyka
i biologia obliczeniowa
Peter J. Kennelly, PhD; I/ictor 1/1/ Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Pierwszy naukowy model patogenezy, zapropono¬
wany przez Louisa Pasteura, był z założenia dwu¬
stanowy: pojawienie się każdej choroby zależało
od jednego, określonego czynnika. Malaria była
wywoływana przez amebę Plazmodium falcipa-
rum, gruźlica - przez bakterię Mycobacterinm
tuberculosis, anemia sierpowata - przez mutację
w genie kodującym jedną z podjednostek hemo¬
globiny, choroba Heine-Medina - przez poliowi-
rusa, a szkorbut - przez niedobór kwasu askorbi¬
nowego. Przy takim założeniu, strategia leczenia
lub zapobiegania chorobom mogła zostać sprowa¬
dzona do śledzenia czynników uznanych za wy¬
wołujące daną chorobę, a po ich określeniu - do
zastosowania konkretnych środków w celu ich
wyeliminowania, zneutralizowania skutków ich
działania lub uniemożliwiających przenoszenie
czynnika powodującego chorobę. Takie podej¬
ście jest już od dawna z powodzeniem wykorzy¬
stywane zarówno do zrozumienia mechanizmów
powstawania chorób, jak i do ustalania strategii
leczenia chorób zakaźnych i uwarunkowanych
czynnikami genetycznymi. Okazało się jednak,
że wiele chorób - z chorobami nowotworowymi,
chorobami serca, cukrzycą typu II i chorobą Alz¬
heimera włącznie - jest wywoływanych przez
wiele czynników działających jednocześnie. Po¬
jawienie się i rozwój wymienionych chorób jest
raczej wynikiem wzajemnych, złożonych oddzia¬
ływań różnych czynników, zarówno takich, jak in¬
dywidualna aktywność genów osobnika, stosowa¬
na dieta i prowadzony styl życia, jak i szeroko po¬
jętego wpływu czynników środowiskowych, w tym
obecności toksyn, wirusów i bakterii, niż skutkiem
działania jednego lub kilku specyficznych czynni¬
ków uznanych za warunek konieczny i wystarcza¬
jący do wystąpienia danego schorzenia.
Wyzwania, jakie stanowią schorzenia wywoły¬
wane przez jednoczesne oddziaływanie różnych
czynników, wymagają znacznego poszerzenia
i pogłębienia naszej wiedzy dotyczącej żywych
organizmów, z uwzględnieniem stopnia ich skom¬
plikowania oraz złożoności. Należy jak najszyb¬
ciej zidentyfikować wiele nieznanych dotychczas
białek zakodowanych w genomie człowieka i ge¬
nomach innych organizmów mających wpływ na
zdrowie człowieka, a następnie ustalić zależności
między nimi oraz wpływ czynników dietetycz¬
nych, genetycznych i środowiskowych. Przetwo¬
rzenie ogromu informacji w celu wszechstronnego
i wyczerpującego zrozumienia molekularnych
mechanizmów leżących u podstaw działania ży¬
wych organizmów, jak również to, w jaki sposób
zakłócenia tych mechanizmów mogą prowadzić do
pojawienia się choroby lub dysfunkcji, zdecydo¬
wanie przekracza ludzkie możliwości oceny i ana¬
lizy. Z tego powodu badacze zajmujący się tema¬
tyką biomedyczną zainteresowali się możliwością
zastosowania zaawansowanych technik oblicze¬
niowych w celu gromadzenia i wykorzystywania
informacji biologicznych na skalę masową.
CZYM JEST BIOINFORMATYKA
I BIOLOGIA OBLICZENIOWA?
Bioinformatyka korzysta z potężnych, stwo¬
rzonych przez zastosowanie komputerów moż¬
liwości składowania i przechowywania danych
w celu opracowywania narzędzi służących do
gromadzenia, zestawiania i analizy danych bio¬
logicznych na szeroką skalę. Wiele zasobów bio-
10. BIOINFORMATYKAI BIOLOGIA OBLICZENIOWA 103
informatycznych (p. niżej) jest dostępnych przez
Internet, dzięki czemu są łatwo osiągalne i mogą
być wykorzystane na całym świecie. Głównym
celem typowego projektu bioinformatyczne-
go jest zintegrowanie wszystkich dostępnych
i dotyczących określonego tematu informacji w
jednym miejscu, zwanym biblioteką lub bazą
danych. Dane są przechowywane w ujednolico¬
nej formie, umożliwiającej ich obróbkę i analizę
przy użyciu algorytmów komputerowych.
Rozmiary i funkcjonalność bioinformatycznych
baz danych mogą się znacznie różnić w zależności
od ich zakresu i przeznaczenia. Na przykład baza
danych PubMed zawiera cytowania i odwołania
do wszystkich artykułów związanych z medycyną
i naukami biologicznymi. Liczba czasopism śle¬
dzonych przez bazę danych PubMed jest liczona
w setkach, przy czym w każdym czasopiśmie zwy¬
kle jest publikowane od kilkuset do kilku tysięcy
artykułów rocznie. Jako inny przykład można
wymienić stronę „The Cytochrome P450 Home¬
page” (http://dmelson.utmem.edu/Cytochrome
P450.html), zawierającą informacje dotyczą¬
ce około 2000 enzymów z rodziny cytochromu
P450, które są zaangażowane w metabolizm wie¬
lu leków i innych ksenobiotyków (p. rozdz. 52).
Budowanie obszernej i przyjaznej dla użytkow¬
nika bazy danych niesie ze sobą wiele wyzwań.
Po pierwsze, informacje biomedyczne są dostar¬
czane w bardzo zróżnicowanej formie. Na przy¬
kład informacja kodująca w genomie, mimo swo¬
jej obszemości, jest skonstruowana z prostych,
liniowych sekwencji czterech podstawowych
zasad. Chociaż liczba reszt aminokwasowych
definiujących podstawową strukturę białka jest
znacznie mniejsza niż liczba par zasad w geno¬
mie, to jednak rentgenowski opis struktury białek
wymaga, aby lokalizacja każdego wchodzącego
w jego skład atomu była określona w przestrzeni
trójwymiarowej. W badaniach biomedycznych do
opisu cech badanego obiektu może być zastoso¬
wany różnorodny zakres kryteriów: wzrost, waga,
wiek, płeć, BMI (ang. Body Mass Index), stoso¬
wana dieta i sposób odżywiania, narodowość, hi¬
storia przebytych chorób, zawód, zażywane leki,
picie alkoholu lub palenie tytoniu, ciśnienie krwi,
nawyki, stan cywilny, grupa krwi, poziom chole¬
sterolu w surowicy itp.
Dodatkowo, niezależnie od sposobu, w jaki
użytkownicy mogą chcieć przeszukiwać lub anali¬
zować informacje zawarte w bazie, już samo opra¬
cowanie algorytmów będących w stanie poradzić
sobie z takimi zmiennymi może być niezwykłym
wyzwaniem. Na przykład nawet proste zadanie
wyszukania w bazie danych genu każdorazowo
wymaga wzięcia pod uwagę tak różnych kryte¬
riów, jak nazwa genu, nazwa białka kodowanego
przez dany gen, biologiczna funkcja produktu
genu, sekwencja nukleotydowa genu, sekwencja
aminokwasów w białku kodowanym przez dany
gen, nazwa organizmu, w którym ten gen wystę¬
puje lub nazwisko badacza, który pracuje nad tym
genem. Oprócz tego badacze zamierzający wy¬
jaśnić, czy klimat wpływa na zależność między
polimorfizmem genetycznym i długowiecznością
mogą potrzebować do porównań danych z wielu
różnych baz.
Podstawowym celem biologii obliczeniowej
jest opracowanie algorytmów komputerowych,
które umożliwią naukowcom skonstruowanie
modeli naśladujących nieznane dotychczas bio¬
logiczne molekuły i procesy w oparciu o prawa
fizyki, chemii i biologii. Podczas gdy główne cele
i zainteresowania bioinformatyki ogniskują się
wokół zbierania i wykorzystywania istniejących
danych, biologia obliczeniowa jest w istocie eks¬
perymentalna i odkrywcza. Głównym celem ba¬
daczy zajmujących się biologią obliczeniową jest
wykorzystanie wiedzy o strukturze i sekwencji
już zbadanych białek do stworzenia algorytmów
komputerowych pozwalających na przewidy¬
wanie struktury trójwymiarowej i potencjalnych
funkcji nowych białek na podstawie ich struktury
pierwszorzędowej. Przy komputerowo wspoma¬
ganym projektowaniu leków używa się trójwy¬
miarowej struktury białek jako wzorca, na podsta¬
wie którego dokonuje się wyboru potencjalnych
ligandów. Naukowcy zajmujący się biologią ob¬
liczeniową opracowują również algorytmy, które
w skali globalnej lub systemowej opisują pełny
zakres aktywności metabolicznej w komórce na
poziomie określonych szlaków biochemicznych.
Takie wirtualne komórki mogą być następnie wy¬
korzystane do przewidywania efektów działania
toksyn, patogenów lub farmakologicznie czyn¬
nych związków chemicznych wpływających na
procesy zachodzące w komórkach. Wygląda na to,
że dzięki możliwości wykonywania wyszukanych
eksperymentów Jn silico” [,,w krzemie”, czyli
w procesorze komputera - przyp. tłum.] biologia
104 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
obliczeniowa umożliwi znaczne przyspieszenie
tempa badań biomedycznych i opracowania no¬
wych sposobów leczenia chorób u ludzi.
PROJEKT ANALIZY GENOMU CZŁOWIEKA
Osiągnięcie założeń projektu analizy genomu
człowieka (ang. human genome project) jest uko¬
ronowaniem więcej niż sześciu dekad monumen¬
talnych osiągnięć w biologii molekularnej, gene¬
tyce i biochemii. Poniżej wymieniono kilkanaście
zdarzeń uznawanych za kamienie milowe, które
doprowadziły do oznaczenia całej sekwencji
ludzkiego genomu.
1944 - DNA zostaje uznany za czynnik przeka¬
zujący cechy dziedziczne
1953 - Koncepcja podwójnej helisy DNA
1966 - Rozszyfrowanie kodu genetycznego
1972 - Opracowanie technologii rekombinacji
DNA
1977 - Możliwość sekwencjonowania DNA
1983 - Lokalizacja genu odpowiedzialnego za
chorobę Huntingtona
1985 - Wynalezienie łańcuchowej reakcji poli-
merazy (PCR)
1986 - Zautomatyzowane sekwencjonowanie
DNA
1986 - Identyfikacja genu odpowiedzialnego za
dystrofię mięśniową Duchenne’a
1989 - Identyfikacja genu odpowiedzialnego za
mukowiscydozę
1990 - Rozpoczęcie w USA prac nad projektem
„Human Genome”
1994 - Ukończenie prac nad mapą genetyczną
człowieka
1996 - Przypisanie genów do określonych loci
na chromosomach
1999 - Zapoczątkowanie badań nad polimor¬
fizmem pojedynczego nukleotydu (SNP)
1999 - Skompletowanie pełnej sekwencji 22.
ludzkiego chromosomu
2000 - Ukończenie „wstępnego szkicu” ludz¬
kiego genomu
2003 - Ustalenie kompletnej sekwencji ludz¬
kiego genomu.
Jednocześnie z wyżej wymienionymi osiąg¬
nięciami wykonywano sekwencjonowanie geno¬
mów setek innych organizmów, włączając w to:
Haemophilus influenzae (1995), drożdże (1996),
Escherichia coli (1997), Caenorhabditis elegans
(1998), Mycobacterium tuberculosis (1998), ryż
(2000), Listeria monocytogenes (2001), wstępny
zarys genomów myszy i szczura (2002) oraz ko- j
ronawirusa SARS (2003). Za sekwencjonowanie I
ludzkiego genomu były odpowiedzialne dwa ze- (
społy. Konsorcjum sekwencjonowania genomu j
ludzkiego (ang. The Human Genome Seąuencing i
Consortium) zastosowało metodę hierarchiczne¬
go przeszukiwania na ślepo. Cały genom został
podzielony na odcinki o długości w przybliżę- *
niu 100-200 kz, które następnie wbudowywano
w sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC, ang.
Bacterial Artificial Chromosome). Sztuczne chro¬
mosomy bakteryjne były z kolei przypisywane do
poszczególnych chromosomów człowieka przez
poszukiwanie sekwencji markerowych, określa¬
nych jako miejsca znaczone sekwencjami STS
(ang. Seąuence-Tagged Sites). Są to krótkie, uni¬
katowe sekwencje o znanych miejscach lokaliza¬
cji (loci) w genomie, dla których dostępne są dane
otrzymane techniką PCR. Następnie klony BAC
były dzielone na małe fragmenty (technika „shot-
gunning”), sekwencjonowane, a później łączone
w kompletną sekwencję przy użyciu algorytmu
komputerowego, używanego do identyfikacji
pasujących do siebie sekwencji i odróżnienia na¬
kładających się fragmentów. Zespół Celera nato¬
miast stosował metodę „shotgun” dla całego ge¬
nomu. Uzyskane w wyniku procedury „shotgun”
fragmenty były umieszczane na matrycach, będą¬
cych zbiorami tzw. contigs (duży fragment DNA
zawierający nakładające się sekwencje) we właś¬
ciwej kolejności, ale niekoniecznie połączonych
w jedną, ciągłą sekwencję. Właściwe pozycje na
matrycach określano przez wykorzystanie miejsc
znaczonych sekwencjami (STS). Sekwenatory
o wysokiej wydajności, potężne programy kom¬
puterowe i element współzawodnictwa - wszyst¬
ko to przyczyniło się do osiągnięcia przez obie
grupy błyskawicznych postępów i spowodowało
szybkie ukończenie prac nad projektem „Human
Genome”. Dokładniejszy opis postępowania obu
grup można znaleźć na www.genomenewsne-
twork.org/articles/ 06_00/sequence_primer.shtml.
REWOLUCJA W GENOMICE
Wczesne dekady XXI wieku będą świadkami re¬
wolucji w genomice, jako że lekarze i nauko w-
10. BIOINFORMATYKAI BIOLOGIA OBLICZENIOWA 105
cy wykorzystują informacje genetyczne ukryte
w projekcie „Humań Genome” i w genomach
organizmów, które zasiedlają, odżywiają i infeku¬
ją Homo sapiens. W tej nowej erze zadanie iden¬
tyfikowania genów odpowiedzialnych za ludzkie
choroby genetyczne zostało w znacznym stop¬
niu uproszczone dzięki udostępnieniu poprzez
Internet szczegółowych informacji genetycz¬
nych oraz przez możliwość uzyskania i analizy
DNA z wykorzystaniem szybkich, wysokoczułych
technik badawczych, takich jak PCR i zautomaty¬
zowane sekwencjonowanie DNA. Uwzględnianie
całych sekwencji genomów jest uznawane przez
bioinformatyków i biologów obliczeniowych za
niezbędne przy szacowaniu czynników odpowia¬
dających za podatność na choroby, starzenie się
oraz przy analizie innych zagadnień związanych
ze zdrowiem.
Jest oczywiste, że nawet subtelna, pozornie
mało znacząca różnica genetyczna może być bar¬
dzo istotna. Mimo że na przykład geny człowieka
i szympansa są w 98,8% identyczne, naczelne inne
niż człowiek nie są podatne na AIDS czy malarię.
Głównym więc celem genomiki porównawczej
powinno być skupienie działań właśnie na róż¬
nicach warunkujących podatność. Dodatkowym,
użytecznym modelem ssaka jest mysz, którego
zaletą jest dostępność oraz łatwość eksperymen¬
towania. Filogenetycznie i fenotypowo człowiek
jest bliższy naczelnym, jednak 90% genów myszy
ma swoje odpowiedniki w genomie człowieka.
Ponadto myszy charakteryzuje krótki czas życia
pokolenia i podatność na modyfikacje genetyczne
przy użyciu technologii transgenicznych (inżynie¬
ria genetyczna).
WYZWANIA DLA MEDYCYNY
Potencjał i wyzwania dla badań związanych z ge-
nomiką zostały zaprezentowane z godną podziwu
przejrzystością w znakomitym artykule zatytuło¬
wanym „A vision for the futurę of genomics re-
search. A blueprint for the genomie era”. (Wizja
przyszłości badań genomowych. Plan dla ery ge-
nomowej) {Naturę 2003;422:835), opublikowa¬
nym przez F. S. Collinsa i współpracowników,
w którym określono zadania, jakie pojawią się
wraz z postępem rewolucji genomowej dla leka¬
rzy, naukowców i twórców regulacji prawnych.
Wprawdzie rewolucja ta ma ogólne, społeczne
implikacje, lecz w rozdziale tym skupiono się
przede wszystkim na wyzwaniach dla medycyny
i biologii, przedstawionych w wyżej cytowanym
artykule, czyli:
• Opracowaniu skutecznych strategii rozszy¬
frowania roli genów w zachorowaniu i reakcji
- odpowiedzi na leki.
• Zidentyfikowaniu różnych genów, odpowie¬
dzialnych za utrzymanie dobrego zdrowia i za
odporność na choroby.
• Opracowaniu metod przewidywania podatno¬
ści na choroby i odpowiedzi na podanie leków,
opartych na danych dotyczących genomu, spo¬
sobów wczesnego wykrywania schorzeń i na¬
szkicowanie molekularnej taksonomii stanów
choroby.
• Wykorzystaniu nowych informacji o genach
i szlakach metabolicznych do opracowania bar¬
dziej efektywnego, terapeutycznego podejścia
do choroby.
• Określeniu, w jakim stopniu informacja o obcią¬
żeniu genetycznym powinna być uwzględniana
w danych klinicznych i w jaki sposób powin¬
na ona wpływać na zalecenia oraz zachowania
prozdrowotne.
Aktualne i przyszłe postępy w pojmowaniu
genomu wraz z funkcjami jego zakodowanych
elementów znacznie przyspieszą postęp medy¬
cyny i nauk biologicznych. Najbliższym celem
jest kompilacja „encyklopedii”, która będzie za¬
wierać dane o wszystkich białkach kodowanych
przez ludzki genom. Długofalowe wyzwanie
dla nauki to wyjaśnienie sposobu, w jaki współ¬
działają białka wypełniając funkcje fizjologiczne,
oraz zrozumienie mechanizmów zmian genomu,
jak również przewidywanie nowych funkcji bia¬
łek. Mimo że sekwencje DNA ludzkiego genomu
są dobrze znane, ich architektura funkcjonalna
jest niezmiernie złożona i w większości niezde¬
finiowana. Należy pamiętać, że tylko 1-2% sek¬
wencji ludzkiego DNA jest przeznaczone na prze¬
chowywanie zapisu sekwencji aminokwasowych
kodujących ok. 30 000 białek. Dodatkowe 1-2%
pozostałego, niekodującego DNA jest jednak pod¬
dawane aktywnej selekcji i wydaje się niezbędne.
Pomijając małe segmenty DNA, które odgrywają
rolę genów lub czynników regulujących kontrolę
ekspresji i replikacji genów, funkcje zdecydowa¬
nej większości genomu ludzkiego pozostają nadal
do odkrycia.
106 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
Ciągłe, przyrostowe gromadzenie sekwencji
genomowych różnorodnych organizmów jest klu¬
czowe dla zrozumienia funkcjonalnej roli ludz¬
kiego genomu. Możliwość porównywania i prze¬
ciwstawiania sekwencji genomowych różnych
organizmów będzie pomocne w zidentyfikowaniu
niesklasyfikowanych do tej pory genów i produk¬
tów genów. Wykorzystanie potężnych narzędzi
0 stale rosnącej mocy obliczeniowej pozwoli na¬
ukowcom na odtworzenie procesu powstawania
ludzkiego genomu, a przez to umożliwi zrozumie¬
nie jego architektury funkcjonalnej.
Postępująca rewolucja genomowa stawia spo¬
łeczeństwo przed problemami niezwiązanymi
bezpośrednio ze zdrowiem człowieka. Pierwszy¬
mi zwiastunami tych problemów mogą być bu¬
dzące kontrowersje doniesienia o zmodyfikowa¬
nej genetycznie żywności, klonowaniu zwierząt
1 wykorzystaniu komórek macierzystych ludzkich
embrionów w badaniach naukowych. Wybiega¬
jące w przyszłość spojrzenie na rolę molekular¬
nego i genetycznego wpływu na ludzkie cechy
i zachowania, jak również na zdrowie fizyczne lub
pojawienie się choroby wymaga opracowania no¬
wych, narodowych i międzynarodowych regulacji
w zakresie prawa, medycyny, rolnictwa itp.
WYZWANIA DLA BIOLOGII
Wpływ na medycynę jest tylko jednym z aspek¬
tów rewolucji genomowej. Sekwencje genomu
różnorodnych organizmów są rozstrzygające jeśli
chodzi o zrozumienie funkcjonalnej roli wszyst¬
kich genomów. Postępy w bioinformatyce, bio¬
logii obliczeniowej, genomice porównawczej
i nowoczesnej biochemii, dysponującej technika¬
mi o dużej wydajności, przyczyniły się do rozwo¬
ju i rozszerzenia zakresu dostępnych biologom
narzędzi do prowadzenia badań i analizy zdro¬
wia na nieosiągalnym uprzednio, molekularnym
poziomie. Osiągnięcia biochemii umożliwiają
obecnie jednoczesne badanie wzorców ekspresji
tysięcy mRNA i kodowanych przez nie białek
z wykorzystaniem mikromacierzy i technik pro-
teomiki. Obejmujący wszystkie trzy domeny filo¬
genetyczne, Archea, Bacteria i Eukarya, stały in¬
ternetowy dostęp do sekwencji genomowych orga¬
nizmów wraz z dostępem do silnych algorytmów
umożliwiających manipulowanie i transformację
danych otrzymanych z tych sekwencji, zawsze
miały istotny wpływ na biologię i biochemię. Jak
już wspomniano przy opisie ludzkiego genomu,
porównywanie sekwencji genomu gatunków zróż¬
nicowanych w procesie ewolucji stanowi potężne
narzędzie umożliwiające zidentyfikowanie istot¬
nych, ważnych funkcjonalnie elementów geno¬
mowych we wszystkich formach życia. Badania
molekularnych aspektów biochemii porównaw¬
czej stanowią wydajne, nowoczesne spojrzenie
na zróżnicowane procesy metaboliczne. Wczesne
zastosowania bioinformatyki polegały na użyciu
wygenerowanych komputerowo wielokrotnych
dopasowań aminokwasowych sekwencji białek
w celu zidentyfikowania konserwatywnych reszt
aminokwasowych, mających kluczowe znaczenie
funkcjonalne i strukturalne (p. tab. 7-1), jak rów¬
nież w celu wyjaśnienia katalitycznych, regulato¬
rowych i innych możliwości nowych białek oraz
produktów genu (p. rozdz. 42).
W cytowanym wcześniej artykule przedstawio¬
no następujące wyzwania dla biologii:
• Wyczerpująco zidentyfikować strukturalne
i funkcjonalne komponenty zakodowane w or¬
ganizmach zróżnicowanych biologicznie.
• Wyjaśnić organizację sieci genetycznych
i ścieżek białkowych oraz ustalić, w jaki sposób
wpływają one na fenotypy komórek i organi¬
zmów.
• Opracować szczegóły pozwalające na zrozu¬
mienie dziedziczenia zmian w genomie.
• Zrozumieć zmienność ewolucyjną między ga¬
tunkami oraz mechanizmy leżące u jej podstaw.
• Opracować regulacje prawne, które ułatwią
właściwe, szeroko pojęte wykorzystanie geno-
miki zarówno w badaniach, jak i normach kli¬
nicznych.
BIOINFORMATYKAI ZASOBY GEN0M0WE
Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu
(SNP)
Chociaż sekwencje genomu dwóch dowolnych
różnych osobników są identyczne w 99,9%, to
jednak ludzkie DNA zawiera ok. 10 milionów
miejsc, w których DNA osobników różni się tyl¬
ko jednym nukleotydem. Miejsca te, nazywane
są Polimorfizmem Pojedynczego Nukleotydu,
SNPs (ang. Single Nucleotide Polymorphisms).
Jednym ze sposobów wykrywania SNP jest po-
10. BIOINFORMATYKAI BIOLOGIA OBLICZENIOWA 107
dejście transgenomowe z zastosowaniem techni¬
ki denaturującej wysokosprawnej chromatografii
cieczowej (ang. Denaturing High Performance
Liąuid Chromatography - DHPLC lub WAVE/
DHPLC - ang. Transgenomic Wave Denaturing
High Performance Liąuid Chromatography), bę¬
dące odmianą techniki HPLC, która umożliwia
wykrycie zmiany w pojedynczej, określonej parze
zasad między skądinąd identycznymi fragmenta¬
mi DNA o długości 750 pz.
Jeśli zbiory SNPs zlokalizowane w tym samym
chromosomie są dziedziczone razem w bloku,
wzorzec SNP w każdym z bloków jest nazywany
haplotypem (ang. haplotype). Przez porównywa¬
nie rozkładu haplotypów w grupach osobników,
u których występuje (lub nie występuje) okre¬
ślona choroba lub odpowiedź biorcy, naukowcy
zajmujący się naukami biomedycznymi mogą zi¬
dentyfikować SNPs związane ze specyficzną ce¬
chą fenotypową. Proces ten może być ułatwiony
poprzez zwrócenie szczególnej uwagi na tzw. Tag
SNPs, który jest wystarczającym do zapewnienia
unikatowego podpisu dla określonego haplotypu
podzbiorem SNPs w określonym bloku. Szczegó¬
łowe badania każdego regionu powinny umożliwić
wykrycie zmienności w genach, które występują
w określonej chorobie lub odpowiedzi na lek. Iden¬
tyfikacja takich genów powinna doprowadzić do
wcześniejszej diagnostyki i należy mieć nadzieję,
że udoskonali zarówno zapobieganie chorobom, jak
i procedury leczenia chorych. Wiedza o indywidu¬
alnym profilu genetycznym mogłaby być również
użyta jako wskazówka przy doborze bezpiecznych
i skutecznych leków lub szczepionek; tymi zagad¬
nieniami zajmuje się farniakogenomika.
Jako podstawowe instytucje odpowiedzialne za
badania w dziedzinie ludzkiego zdrowia w Sta¬
nach Zjednoczonych, Narodowe Instytuty Zdro¬
wia, za pośrednictwem Narodowego Centrum
Informacji Biotechnologicznych NCBI (ang.
National Center for Biotechnology Information),
umożliwiają poprzez portal Entrez (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi) darmowy
i ciągły dostęp do bogatego zbioru molekular¬
nych, genomowych, strukturalnych i opartych na
informacjach literaturowych baz danych oraz do
algorytmów umożliwiających ich analizę. Głów¬
na tematyka Entrez dotyczy przede wszystkim
biomedycyny, jednak zasoby tego źródła są cenne
także dla badaczy zajmujących się molekularnymi
aspektami biologii i biochemii. Poniżej podano
wybrane, przykładowe zasoby tego rodzaju.
Projekt ENCODE
Identyfikacja wszystkich funkcjonalnych elemen¬
tów genomu znacznie poszerzy nasze zrozumienie
procesów molekularnych leżących u podstaw roz¬
woju ludzkiego gatunku, jego zdrowia i chorób.
Aby osiągnąć ten cel, pod koniec 2003 r. National
Humań Genome Research Institute (NHGRI) za¬
inicjowało projekt ENCODE (ang. Encyklopedia
Of DNA Elements), w którym dzięki staraniom
otwartego konsorcjum połączono metody i po¬
dejście obliczeniowe oraz badania laboratoryjne,
aby w pełni rozpoznać każdy funkcjonalny ele¬
ment w ludzkim genomie. Badacze konsorcjum,
0 zróżnicowanym przygotowaniu i specjalistycz¬
nej wiedzy, współpracowali nad rozwinięciem
1 oceną przydatności nowych, wysoko wydajnych
technik, technologii i strategii, ukierunkowanych
na słabe punkty w identyfikowaniu elementów
funkcjonalnych.
W wersji pilotażowej ENCODE będzie
uwzględniał ok. 1% (30 Mz) genomu ludzkiego do
prowadzenia skrupulatnych analiz eksperymen¬
talnych i obliczeniowych. Przed konsorcjum stoi
wiele wyzwań. Ponadto, ze względu na ogromny
rozmiar ludzkiego genomu i jego w większości
zaszyfrowany charakter, naukowcy muszą uporać
się ze zróżnicowaniem funkcjonalnym genomu
charakteryzującym różne typy komórek i pozio¬
my rozwoju. Wobec dużej złożoności próbek jest
oczywiste, że nie ma jednej metody eksperymen¬
talnej i jednego typu komórki, które mogłyby
w zadowalającym stopniu zapewnić pełny prze¬
krój wzajemnych, wewnętrznych powiązań mię¬
dzy sekwencją genomu, architekturą i funkcją.
BLAST
BLAST (ang. Basic Local Alignment Search
Tool) oraz inne algorytmy porównywania i do¬
pasowywania sekwencji umożliwiają śledzenie
pochodzenia sekwencji, wspierając tym wysiłki
biologów molekularnych zmierzających od sa¬
mego początku do określenia, czy obserwowany
wzorzec podobieństwa między białkami pełnią¬
cymi wspólne funkcje metaboliczne wskazuje
na wspólne pochodzenie. Głównym, ewolucjoni-
108 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
stycznym pytaniem było: czy istnieje podobień¬
stwo wskazujące na: (a) pochodzenie od wspólne¬
go prabiałka (ewolucja rozbieżna) lub (b) nieza¬
leżny dobór wspólnych mechanizmów łączących
pewne specyficzne potrzeby komórki (ewolucja
zbieżna), czego można by oczekiwać, jeśli jeden
określony wzorzec podobieństwa występuje zde¬
cydowanie częściej niż inne. Porównując sekwen¬
cje w celu oznaczenia minimalnej liczby zmian
nukleotydów, niezbędnej do wzajemnej zamiany
przypuszczalnych izoform białka, można określić,
czy podobieństwa i różnice wykazane w odniesie¬
niu do wzorca wskazują na postępujące zmiany
w odniesieniu do punktu startowego.
BLAST rozwinął się w rodzinę programów
zoptymalizowanych pod kątem specyficznych po¬
trzeb i zbiorów danych, blastp umożliwia zadanie
zapytania złożonego z sekwencji aminokwasowej
do bazy sekwencji białkowych, blastn - zadanie
zapytania złożonego z sekwencji nukleotydów
do bazy sekwencji nukleotydów, blastx - zada¬
nie zapytania złożonego z sekwencji nukleotydów
tłumaczonej z uwzględnieniem wszystkich ramek
odczytu do bazy sekwencji białkowych, w celu
wyszukania wszystkich potencjalnych produk¬
tów translacji, tblastn - zadanie zapytania zło¬
żonego z sekwencji białkowych do tłumaczonej
dynamicznie z uwzględnieniem wszystkich sześ¬
ciu ramek odczytu bazy sekwencji nukleotydów,
a tblastx - zadanie zapytania złożonego z translacji
sześcioramkowej sekwencji nukleotydów do bazy
sześcioramkowych translacji sekwencji nukleoty¬
dów. W przeciwieństwie do wielu programów do¬
pasowujących sekwencje w oparciu o dopasowanie
globalne, algorytmy BLAST uwzględniają regiony
lokalnego dopasowania. Pozwala to na wykrywa¬
nie zależności między sekwencjami wykazujący¬
mi izolowane regiony podobieństwa, zapewniając
szybkość i zwiększoną czułość przy wykrywaniu
odległych relacji między sekwencjami. Dane wej¬
ściowe lub sekwencja „zapytania” jest dzielona na
„słowa” (domyślny rozmiar to 11 dla nukleotydów,
3 dla aminokwasów). Takie „słowo” trafia do bazy
i po znalezieniu pasującej sekwencji kontynuowa¬
ne są poszukiwania w obie strony.
Entrez Gene
W Entrez Gene znajdują się różnorodne informa¬
cje o poszczególnych ludzkich genach. Obejmują
one sekwencje genomu oraz sekwencje zawartych
w nim genów wraz z genami sąsiednimi, strukturą
genów (granice intron-ekson), sekwencję mRNA
wytwarzanego przez dany gen i wszystkie fenoty¬
py odzwierciedlające daną mutację. Entrez Gene
umożliwia również, o ile jest to znane, wyświet¬
lenie funkcji zakodowanych białek oraz wpływ
znanego SNP na kodowany region.
Projekt HapMap
Projekt HapMap realizują wspólnie naukowcy ze
Stanów Zjednoczonych, Kanady, Chin, Japonii,
Nigerii i Wielkiej Brytanii w celu zidentyfikowa¬
nia genów związanych z chorobami ludzkimi oraz
z różnymi odpowiedziami na stosowane farma¬
ceutyki. Wynik ich pracy, jakim jest mapa haplo-
typów (HapMap - ang. haplotype map) genomu
ludzkiego ma być potężnym źródłem, które po¬
może określić czynniki genetyczne odpowiedzial¬
ne za zróżnicowaną wrażliwość ludzi na czynniki
środowiskowe, różną podatność na infekcje oraz
różne reakcje (pozytywne lub negatywne) na leki
i szczepionki.
CDD
Podobnie jak w niektórych wyrazach, które po¬
wstały z połączenia pojedynczych sylab wystę¬
pujących w innych wyrazach, np. superhighway
(superszybko), krystalografia, mainspring (głów¬
na siła napędowa [dosł.: główna sprężyna -przyp.
tłum.]), tak i w wielu białkach występują powta¬
rzalne obszary - domeny, z których każda ma
konkretną funkcję i ewolucyjne pochodzenie.
Naukowcy zajmujący się biologią obliczeniową
klasyfikują takie konserwatywne domeny (ang.
ęonserved domains, CDs) w oparciu o powta¬
rzalne sekwencje wzorców lub motywy. Te nie¬
zmienione motywy mogą być identyfikowane
i definiowane przez porównywanie i zestawienie
sekwencji wielu białek, uważanych za mające
wspólną domenę w procesie zwanym procesem
wielokrotnego dopasowania sekwencji (ryc. 10.1).
Baza domen konserwatywnych, czyli CDD (ang.
£onserved Domain Database), dostępna dzięki
National Centre for Biotechnology Information,
zawiera bibliotekę wielokrotnie dopasowanych
sekwencji zarówno dla pojedynczych domen, jak
i dla białek o pełnej długości łańcucha.
10. BIOINFORMATYKAI BIOLOGIA OBLICZENIOWA 109
CDART
Narzędzie odzyskiwania konserwatywnej archi¬
tektury domen (CDART - ang. Conserved Do-
main Architecture Retrieval Tool) wykorzystuje
definicje i annotacje domen z bazy danych CDD
w celu wyszukania białek o zbliżonej architek¬
turze domen na podstawie sekwencji domeny
konserwatywnej, która sugeruje wspólną funk¬
cję i wspólne pochodzenie ewolucyjne. CDART
wykorzystuje RPS-BLAST (ang. Reverse-Posi-
tion-Specific BLAST) - szybki algorytm, który
pozwala na określenie podobieństwa w ważnych
pod względem ewolucyjnym etapach dzięki uży¬
ciu szczegółowego profilu domen, a nie porówna¬
nia sekwencji aminokwas za aminokwasem. Ar¬
chitektura domeny jest wówczas wykorzystywana
do przeszukania CDD w celu znalezienia białka
z podobną organizacją domeny. Ze względu na
to, że CDART bazuje na profilach domen i an-
notacjach dotyczących domen funkcjonalnych,
narzędzie to działa szybko i dostarcza wielu in¬
formacji. Profile domen zawierają annotacje funk¬
cjonalne i są powiązane z dostępnymi, trójwymia-
Język Słowo Dopasowanie
Angielski PHYSIOLOGICAL
Francuski PHYSI0L0GIQUE
Niemiecki PHYSIOLOGISCH
Duński FYSIOLOGISCH
Hiszpański FYSIOLOGICO
Polski FIZJOLOGICZNY
PHYSIOLOGI-C AL
PHYSIOLOGI- UE
PHYSIOLOGI-SCH
-YSIOLOGI-SC H
-YSI0L0GI-C0
- OLOGI-CZNY
/tyc. 10-1. Schemat wielokrotnego dopasowania sekwencji.
Języki podlegają ewolucji w sposób naśladujący geny i białka.
Przykładowym słowem jest słowo odpowiadające angielskiemu
„physiological” w kilku językach romańskich*. Dopasowanie
pokazuje zachowane części słowa. Część identyczna z angiel¬
skim słowem jest napisana ciemnym kolorem, podobieństwa
lingwistyczne - jasnym. Algorytm wielokrotnego dopasowania
sekwencji umożliwia zidentyfikowanie konserwatywnych liter
kodujących nukleotyd i aminokwasy w DNA, RNA i analogicznie
-polipeptydów.
* Wszystkie wymienione języki należą do rodziny
języków indoeuropejskich. Języki romańskie to pod-
rodzina języków indoeuropejskich, do których należą:
hiszpański, francuski. Języki duński i niemiecki należą
do podrodziny języków germańskich, angielski do pod-
rodziny języków celtyckich, a polski - do słowiańskich
\przyp. tłum.].
rowymi strukturami. Kryteria poszukiwania mogą
być później ponownie określane z uwzględnie¬
niem taksonomii lub przez wyselekcjonowanie
domen, które są przedmiotem zainteresowania.
Baza Danych Modelowania
Molekularnego oraz Cn3D
Trójwymiarowe struktury złożone z co najmniej
28 000 białek i polinukleotydów są przechowy¬
wane w Bazie Danych Modelowania Moleku¬
larnego (ang. Molecular Mpdeling DataBase,
MMDB). Plik dla każdej struktury jest połączony
z odpowiednimi cytowaniami bibliograficznymi,
klasyfikacją taksonomiczną i informacjami o mo¬
lekułach mających zbliżoną sekwencję i strukturę
w innych bazach NCBI. Struktury mogą być od¬
szukane za pomocą słowa kluczowego, np. nazwy
enzymu, sekwencji aminokwasów lub sekwencji
nukleotydów. Następnie struktury można oglądać,
obracać i manipulować nimi przy użyciu darmo¬
wego programu Cn3D, dostępnego przez Internet,
pozwalającego na oglądanie trójwymiarowych
struktur dostępnych w Entrez. Cn3D wyświetla
jednocześnie strukturę, sekwencję i dopasowanie,
i dodatkowo jest wyposażony w potężne mechani¬
zmy umożliwiające annotacje i edycję dopasowań.
VAST
Algorytm komputerowy VAST (ang. Vector Alig-
nment Search Tool, narzędzie poszukiwania dopa¬
sowań wektorowych) pozwala na wyszukanie bia¬
łek o podobnej strukturze, na podstawie wyspecy¬
fikowanego przez użytkownika zbioru współrzęd¬
nych struktury określonego białka w przestrzeni
trójwymiarowej. Jeśli znalezione, podobne struk¬
turalnie białka znajdują się już w dostępnej przez
Entrez bazie MMDB, VAST jest wykorzystywany
do identyfikacji podobnych strukturalnie białek,
których w bazie jeszcze nie ma.
WNIOSEK
Szybko rozwijające się dziedziny nauki - bioin-
formatyka i biologia obliczeniowa - są wielką na¬
dzieją dla medycyny i biologii. Część związanych
z nimi oczekiwań jest już obecnie sprecyzowana,
inne tylko zarysowane, a o niektórych nie ma na¬
wet wyobrażenia. Pojawiają się wręcz wątpliwo-
110 CZĘŚĆ I: BUDOWA ORAZ FUNKCJE BIAŁEK I ENZYMÓW
ści, czy wpływ tych nauk na praktykę medyczną
w XXI wieku będzie taki sam, czy może większy,
niż wpływ odkrycia bakteryjnej patogenezy cho¬
rób w wieku XIX.
STRESZCZENIE
• W bioinformatyce komputery są wykorzysty¬
wane do gromadzenia, organizowania i analizo¬
wania danych biomedycznych.
• Biologia obliczeniowa wykorzystuje algorytmy
komputerowe do przeprowadzania „wirtual¬
nych eksperymentów”.
• Możliwości komputerów w zakresie przechowy¬
wania i przetwarzania danych umożliwiają bada¬
czom analizę ogromnych zbiorów danych, takich
jak sekwencje genomu i struktury białek.
• Zdolność do przeprowadzania złożonych po¬
równań wielu zbiorów danych czyni z bioin-
formatyki ważne narzędzie do identyfikowania
domen białkowych i rozszyfrowania przyczyn
chorób wieloczynnikowych.
• BLAST jest wykorzystywany do porównywa¬
nia krótkich sekwencji białek i aminokwasów.
• Entrez Gene i HapMap są używane do identyfi¬
kowania polimorfizmu pojedynczego nukleoty-
du, warunkującego wystąpienie patologii.
• CDART, MMDB i VAST są stosowane do
analizy architektury domen i trójwymiarowej
struktury białek.
PIŚMIENNICTWO
Altschul, SF et al: Basic local alignment search tool. J
Mol Biol 1990;215:403.
Butcher SC, Berg EL, Kunkel EJ: Systems biology in
drug discovery. Naturę Biotechnol 2004;22:1253.
Carroll SB: Genetics and the making of Homo sapiens.
Naturę 2003;422:849.
Collins FS et al: A vision for the futurę of genomics
research. A blueprint for the genomie era. Naturę
2003;422:835.
Debes JD, Urrutia R: Bioinformatics tools to understand
human diseases. Surgery 2004; 135:57.
Doolittle RF: Similar amino acid seąuences: Chance or
common ancestry? Science 1981 ;214:149.
Kim JH: Bioinformatics and genomie medicine. Genet
Med 2002;4:62S.
Koonin EV, Galperin MY: Seąuence—Evolution—Fun-
ction. Computational Approaches to Comparati\e
Genomics. Kluwer Academic Publishers, 2003.
Slepchencko BM et al: Quantitative celi biology with
the Yirtual Celi. Trends Celi Biol 2003; 13:570.
CZĘSC II
Bioenergetyka i metabolizm
węglowodanów oraz lipidów
F Bioenergetyka: rola ATP
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Bioenergetyka, czyli termodynamika biochemicz¬
na, zajmuje się badaniem zmian energetycznych
towarzyszących reakcjom biochemicznym. Ukła¬
dy biologiczne są zasadniczo izotermiczne i wy¬
korzystują energię chemiczną do napędzania pro¬
cesów życiowych. Znajomość sposobu, w jaki or¬
ganizm czerpie energię z pożywienia, jest podstawą
zrozumienia zasad prawidłowego odżywiania i me¬
tabolizmu. Jeżeli dostępne rezerwy energetyczne
ulegają wyczerpaniu, następuje śmierć głodowa.
Pewne formy niedożywienia prowadzą do zaburze¬
nia równowagi energetycznej i wyniszczenia (ma-
rasmus). Szybkość uwalniania energii, mierzona
szybkością metabolizmu, jest regulowana przez
hormony tarczycy, której niedoczynność wywołuje
zaburzenia metaboliczne. Wynikiem nadmiernego
magazynowania nadwyżek energetycznych jest
otyłość - jedna z najbardziej powszechnych cho¬
rób społeczeństw zachodnich.
ENTALPIA SWOBODNA JEST ENERGIA
^ UŻYTECZNA UKŁADU
Zmiana entalpii swobodnej, zwanej również
energią swobodną Gibbsa (AG), stanowi tę część
zmiany energii całkowitej (ściślej entalpii) ukła¬
du, która może być wykorzystana do wykonania
pracy; oznacza to, że jest ona energią użyteczną,
znaną w układach chemicznych jako potencjał
chemiczny.
Układy biologiczne podlegają
podstawowym prawom termodynamiki
Pierwsza zasada termodynamiki podaje, że ener¬
gia całkowita układu i jego otoczenia pozostaje
stała. Jest to również treść prawa zachowania
energii. Głosi ono, że w układzie izolowanym
żadna zmiana nie powoduje ani straty, ani zysku
energii. W obrębie tego izolowanego układu ener¬
gia może jednak zostać przekazana z jednej części
układu do drugiej lub może być przekształcona
w inną formę energii. Na przykład w układach
biochemicznych energia chemiczna może być
przekształcona w energię cieplną, elektryczną lub
mechaniczną.
Druga zasada termodynamiki podaje, że jeśli
proces zachodzi samorzutnie, to entropia cał¬
kowita układu i jego otoczenia musi wzrastać.
Entropia jest miarą nieuporządkowania (bezładu
molekularnego) układu. Przybiera ona wartości
maksymalne z chwilą osiągnięcia przez układ
równowagi. W warunkach stałej temperatury
112 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
i stałego ciśnienia zależność między zmianą ental¬
pii swobodnej (AG) układu reagującego i zmianą
entropii (AS) ujmuje następujące równanie, które
łączy dwie zasady termodynamiki:
aG = aH - TaS
gdzie AH oznacza zmianę entalpii (ciepło), a T
- temperaturę bezwzględną.
W warunkach reakcji biochemicznych AH rów¬
na się w przybliżeniu całkowitej zmianie energii
wewnętrznej (AE) reakcji, powyższą zależność
można zatem wyrazić następująco:
aG ~ aE - TaS = aF*
Jeżeli AG ma znak ujemny, to reakcja zachodzi
samorzutnie z utratą entalpii swobodnej, tzn. jest
egzoergiczna. Jeśli wartość AG jest duża, to reak¬
cja zachodzi właściwie aż do końca i jest zasadni¬
czo nieodwracalna. Jeżeli natomiast AG ma war¬
tość dodatnią, to reakcja zachodzi tylko wówczas,
gdy energia (entalpia swobodna) może zostać po¬
brana z zewnątrz, tzn. reakcja jest endoergiczna.
Jeśli ponadto wartość AG jest duża, to układ jest
stabilny i charakteryzuje się brakiem lub tylko
niewielką skłonnością do reagowania. Jeżeli AG
równa się zeru, to układ jest w stanie równowagi
i nie zachodzi w nim żadna wypadkowa zmiana.
Symbol AG0 oznacza standardową zmianę ental¬
pii swobodnej układu i odnosi się do stanu standar¬
dowego, w którym stężenie reagentów wynosi
1,0 mol/1. Dla reakcji biochemicznych przyję¬
to umownie, że warunki standardowe to stan
o pH 7,0. Standardową zmianę entalpii swobod¬
nej w tym „stanie standardowym” (tzn. w pH 7,0)
oznacza się jako AG°'.
Standardową zmianę entalpii swobodnej można
obliczyć, znając stałą równowagi K'cą:
AG°' = - RT In KIq
gdzie R jest stałą gazową, a T oznacza temperaturę
bezwzględną (rozdz. 8). Należy zwrócić uwagę,
że faktyczna wartość AG może być większa lub
mniejsza od wartości AG0' w zależności od stę¬
żeń różnych reagentów, w tym rozpuszczalnika,
jonów i białek.
* Gdzie F oznacza energię swobodną (w ścisłym zna¬
czeniu) \przyp. tłum.].
W układach biochemicznych enzym tylko przy¬
spiesza dojście do stanu równowagi; w stanie |
równowagi nigdy nie zmienia końcowych stężeń |
wolnych reagentów. (
PROCESY ENDOERGICZNE SA
SPRZĘŻONE Z PROCESAMI
EGZOERGICZNYMI
Procesy życiowe - np. reakcje syntezy, skurcz 1
mięśni, przewodnictwo nerwowe, aktywny
transport - czerpią energię dzięki chemicznemu
połączeniu, lub sprzężeniu, z reakcjami oksy¬
dacyjnymi. W najprostszej formie ten typ sprzę- j
żenią można przedstawić tak, jak to pokazano na
ryc. 11-1. Przemiana metabolitu A w metabolit B
zachodzi z uwolnieniem entalpii swobodnej i jest 1
sprzężona z inną reakcją, która wymaga ental¬
pii swobodnej do przekształcenia metabolitu C
w metabolit D. Ponieważ część entalpii swobod¬
nej uwalnianej w reakcji degradacji jest przeka- ’
zywana reakcji syntezy w innej postaci niż cie¬
pło, nie należy w przypadku tych reakcji używać
terminów chemicznych reakcja egzotermiczna
i reakcja endotermiczna. Zamiast nich używa się ■
określeń egzoergiczna lub endoergiczna, aby
wskazać, że procesom towarzyszy, odpowiednio,
strata lub zysk entalpii swobodnej, niezależnie od
formy energii biorącej udział w tych procesach.
W praktyce procesy endoergiczne nie mogą za¬
chodzić samodzielnie, lecz muszą być składni- ,
Ryc. 11-1. Sprzężenie reakcji egzoergicznej z endoergiczną.
11. BIOENERGETYKA: ROLAATP 113
kiem sprzężonego układu egzoergiczno-endoer-
gicznego, w którym wypadkowa zmiana netto jest
egzoergiczna. Reakcje egzoergiczne określa się
mianem katabolizmu (degradacja lub utlenianie
cząsteczek „paliwa”), a reakcje syntezy, które roz¬
budowują cząsteczki, określa się jako anabolizm.
Połączenie procesów katabolicznych i anabolicz¬
nych nazywa się ogólnie metabolizmem.
Jeśli reakcja przedstawiona na ryc. 11-1 prze¬
biega z lewa na prawo, to całemu procesowi musi
towarzyszyć utrata entalpii swobodnej w postaci
ciepła. Jeden z możliwych mechanizmów sprzę¬
żenia mógłby polegać na uczestnictwie w obu
reakcjach wspólnego niezbędnego związku po¬
średniego (1):
A + C->I->B + D
W ten sposób są sprzężone niektóre reakcje
egzoergiczne i endoergiczne w układach bio¬
logicznych. Należy sobie uświadomić, że ten typ
układu ma wbudowany mechanizm biologicznej
kontroli szybkości procesów oksydacyjnych, po¬
nieważ istnienie wspólnego niezbędnego związ¬
ku pośredniego powoduje, że szybkość zużycia
produktu szlaku syntezy (D) warunkuje z kolei,
poprzez jego działanie masowe, szybkość, z jaką
A ulega utlenieniu. Te wzajemne powiązania sta¬
nowią podstawę koncepcji kontroli oddechowej
- procesu, który chroni organizm przed niekon¬
trolowanym procesem spalania. Potwierdzeniem
koncepcji sprzężeniowej są reakcje odwodomie-
nia, sprzężone za pośrednictwem przenośnika
międzyenzymowego z reakcjami uwodornienia
(ryc. 11-2).
Ryc. 11-2. Sprzężenie reakcji odwodornienia i uwodornienia za
pośrednictwem przenośnika.
Alternatywną metodą sprzęgania procesów eg-
zoergicznych z procesami endoergicznymi jest
synteza wysokoenergetycznego związku w reak¬
cji egzoergicznej i włączenie tego nowego związ¬
ku w reakcję endoergiczną. W ten sposób nastę¬
puje przeniesienie entalpii swobodnej z procesu
egzoergicznego do endoergicznego (ryc. 11-3).
Biologiczną zaletą tego mechanizmu jest to, że
~(D, w przeciwieństwie do I z poprzedniego
układu, nie musi być strukturalną pochodną A,
B, C lub D. W ten sposób związek © może słu¬
żyć jako przekaźnik energii pochodzącej z wielu
reakcji egzoergicznych na równie dużą liczbę
reakcji lub procesów endoergicznych, takich jak
biosynteza, skurcz mięśni, przewodnictwo nerwo¬
we czy transport aktywny. W żywych komórkach
najważniejszym wysokoenergetycznym związ¬
kiem pośrednim lub związkiem przenośnikowym
(oznaczonym ~© na ryc. 11-3) jest adenozyno-
trifosforan (ATP).
Ryc. 11-3. Przeniesienie entalpii swobodnej z reakcji egzoergicz¬
nej do endoergicznej za pośrednictwem wysokoenergetycznego
metabolitu pośredniego -©.
WYSOKOENERGETYCZNE FOSFORANY
ODGRYWAJĄ KLUCZOWA ROLE
W PRZEJMOWANIU I PRZENOSZENIU
ENERGII
Wszystkie organizmy, aby podtrzymywać procesy
życiowe, muszą pobierać energię (entalpię swo¬
bodną) ze swojego środowiska. Organizmy auto-
troficzne sprzęgają swój metabolizm z pewnymi
procesami egzoergicznymi zachodzącymi w ich
otoczeniu, np. rośliny zielone wykorzystują ener¬
gię słoneczną, a niektóre bakterie autotroficzne
wykorzystują reakcję utleniania Fe2+—>Fe3+. Or¬
ganizmy heterotroficzne uzyskują entalpię swo-
114 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
bodną, sprzęgając swój metabolizm z degradacją
złożonych cząsteczek organicznych występują¬
cych w środowisku, w którym żyją. We wszyst¬
kich tych procesach główną rolę w przenoszeniu
entalpii swobodnej z procesów egzoergicznych
do procesów endoergicznych odgrywa ATP (ryc.
11-3). ATP jest nukleozydotrifosforanem zawiera¬
jącym adeninę, rybozę i trzy grupy fosforanowe.
W reakcjach zachodzących w komórce bierze on
udział w postaci kompleksu z Mg2+ (ryc. 11-4).
Ryc. 11-4. Adenozynotrifosforan (ATP) w formie kompleksu
magnezowego. Podobny kompleks z Mg2+ tworzy ADR
Znaczenie fosforanów w metabolizmie pośred¬
nim stało się jasne wraz z poznaniem chemiczne¬
go mechanizmu glikolizy oraz roli ATP, adenozy-
nodifosforanu (ADP) i fosforanu nieorganicznego
(Pi) w tym procesie (rozdz. 18).
Pośrednia wartość entalpii swobodnej
hydrolizy ATP ma istotne znaczenie
bioenergetyczne
Standardową entalpię swobodną hydrolizy nie¬
których biochemicznie ważnych fosforanów
przedstawiono w tab. 11 -1. Na podstawie wartości
AG°' hydrolizy (mierzonej w temperaturze 37°C)
można porównać skłonność każdej z grup fosfo¬
ranowych do przejścia na odpowiedni akceptor.
Jak widać w tabeli, wartość entalpii swobodnej
hydrolizy końcowego fosforanu ATP dzieli wy¬
mienione związki na dwie grupy. Jedną grupę
stanowią fosforany niskoenergetyczne, reprezen¬
towane przez estry fosforanowe uczestniczące
w glikolizie, których wartość AG°' hydrolizy jest
mniejsza niż dla ATP, a drugą grupę - fosforany
wysokoenergetyczne, których wartość AG°' jest
równa lub większa niż dla ATP. „Członkowie”
tej ostatniej grupy, obejmującej ATP i ADP, są
zwykle bezwodnikami (np. 1-fosforan w 1,3-bis-
fosfoglicerynianie), enolofosforanami (np. fos-
foenolopirogronian) lub fosfoguanidynami (np.
fosfokreatyna, fosfoarginina). Środkowa pozycja
ATP „gwarantuje” ważną rolę w przenoszeniu
energii. Duża zmiana entalpii swobodnej hydro¬
lizy ATP jest skutkiem zniesienia odpychania
między sąsiadującymi ujemnie naładowanymi
atomami tlenu i stabilizacji produktów reakcji,
zwłaszcza fosforanu, jako hybryd rezonanso¬
wych. Inne „związki wysokoenergetyczne” waż¬
ne biologicznie to estry tiolowe koenzymu A (np,
acetylo-CoA), białko przenoszące reszty acylowe
kwasów tłuszczowych (ang. acyl carrier protein;
ACP), estry aminokwasów uczestniczące w syn¬
tezie białek, S-adenozylometionina (aktywny me¬
tyl), UDP-Glc (urydynodifosfoglukoza) i PRPP
(5-fosforybozylo-1 -pirofosforan).
Tabela 11-1. Standardowa entalpia swobodna (AG°') hydrolizy
niektórych biochemicznie ważnych fosforanów organicznych1,2
Związek
AG°'
kJ/mol
kcal/mol
Fosfoenolopirogronian
-61,9
-14,8
Karbamoilofosforan
-51,4
-12,3
1,3-Bisfosfoglicerynian
(do 3-fosfoglicerynian)
-49,3
-11,8
Fosfokreatyna
-43,1
-10,3
atp->amp+pp,
-32,2
-7,7
ATP -> ADP + P,
-30,5
-7,3
Glukozo-1-fosforan
-20,9
-5,0
Pirofosforan
-19,2
-4,6
Fruktozo-6-fosforan
-15,9
-3,8
Glukozo-6-fosforan
-13,8
-3,3
Glicerolo-3-fosforan
-9,2
-2,2
1 Pj - ortofosforan nieorganiczny; PP, - pirofosforan.
2 Wartości dla ATP i większości pozostałych związków na podsta¬
wie danych Jencks (1976); wartości dla PPj wg Frey i Arabshah
(1995). Różnice między danymi różnych autorów wynikają z róż¬
nicy warunków, w jakich przeprowadzano pomiary.
Fosforany wysokoenergetyczne oznacza
si ę jako
W celu zaznaczenia obecności wysokoenerge¬
tycznej grupy fosforanowej, Lipmann wprowa¬
dził symbol ~ P /. Symbol ten wskazuje, że dołą¬
czona do tego wiązania grupa po przeniesieniu
11. BIOENERGETYKA: ROLAATP 115
na odpowiedni akceptor przekaże większą część
entalpii swobodnej. Z tego powodu niektórzy pre¬
ferują określenie potencjał przenoszenia grupy
zamiast „wiązanie wysokoenergetyczne”. ATP
zawiera więc dwie wysokoenergetyczne gru¬
py fosforanowe, a ADP jedną; fosforan w AMP
(adenozynomonofosforanie) jest typu niskoener-
getycznego, ponieważ jest połączony zwykłym
wiązaniem estrowym (ryc. 11-5).
0" 0" 0"
I I J
Adenozyno — 0 — P — 0 ^ P — 0 Oj P — 0
II II II
0 0 0
lub Adenozyno —
Adenozynotrifosforan (ATP)
0" 0"
I I
Adenozyno — 0 — P — O^P - 0
II II
0 0
lub Adenozyno —
Adenozynodifosforan (ADP)
0"
I
Adenozyno — 0 — P — 0
II
0
lub Adenozyno — (?)
Adenozynomonofosforan (AMP)
ffyc. 11-5. Struktura ATR ADP I AMP ukazująca położenie i liczbę
fosforanów wysokoenergetycznych (~(pi).
FOSFORANY WYSOKOENERGETYCZNE
FUNKCJONUJĄ JAKO „WALUTA
ENERGETYCZNA” KOMÓRKI
ATP może być donorem fosforanu wysokoener¬
getycznego w reakcjach tworzenia związków
znajdujących się poniżej ATP w tab. 11-1. Z tego
samego powodu w obecności odpowiednich en¬
zymów ADP może być akceptorem fosforanu wy¬
sokoenergetycznego od związków znajdujących
się powyżej ATP w tabeli; w reakcji tej powstaje
ATP. W praktyce cykl ATP/ADP łączy procesy
generujące ~(P) z procesami zużywającymi ~(P)
(ryc. 11-6). W ten sposób ATP jest stale zużywa¬
ny i odtwarzany. Proces ten przebiega w bardzo
szybkim tempie, ponieważ ogólna pula ATP/ADP
jest niezmiernie mała i wystarcza do utrzymania
aktywnych tkanek tylko przez parę sekund.
Fosfoenolopirogronian 1,3-Bisfosfoglicerynian
Ryc. 11-6. Rola cyklu ATP/ADP w przenoszeniu fosforanu wyso¬
koenergetycznego.
Zasadniczym źródłem ~(P) są trzy procesy,
składające się na przekazywanie energii, czyli jej
zachowanie:
1. Fosforylacja oksydacyjna. Fosforylacja ok¬
sydacyjna jest najważniejszym, pod wzglę¬
dem ilościowym, źródłem ~(P> w organizmach
tlenowych. Entalpia swobodna, napędzająca
ten proces, pochodzi z zachodzących w mito-
chondrialnym łańcuchu oddechowym procesów
utleniania, wykorzystujących tlen cząsteczko¬
wy (rozdz. 12).
2. Glikoliza. W wyniku przemiany w mleczan
jednego mola glukozy uzyskuje się netto dwa
~/P\ tworzone w dwóch reakcjach katalizo¬
wanych, odpowiednio, przez kinazę fosfoglice-
rynianową i kinazę pirogronianową (ryc. 18-2).
3. Cykl kwasu cytrynowego. Bezpośrednio w cy¬
klu powstaje jeden ~ Q w etapie katalizowanym
przez syntetazę sukcynylo-CoA (nazywanej
zwyczajowo syntetazą bursztynylo-CoA) (ryc.
17-3).
Fosfageny stanowią zapasową formę fosfo¬
ranów wysokoenergetycznych. Należy do nich
fosfokreatyna, występująca w mięśniach krę-
116 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
gowców, sercu, spermatocytach i w mózgu, oraz
fosfoarginina, występująca w mięśniach bezkrę¬
gowców. W warunkach fizjologicznych fosfageny
pozwalają utrzymać stężenie ATP w mięśniach,
w sytuacji gdy ATP jest szybko zużywany, służąc
jako źródło energii dla skurczu mięśni. Odwrot¬
nie, w sytuacji gdy ATP jest pod dostatkiem i pro¬
porcja ATP/ADP jest duża, zwiększa się stężenie
fosfagenów służących jako zapas fosforanów wy¬
sokoenergetycznych (ryc. 11-7).
hydroliza końcowego wiązania fosforanowego
w ATP:
(2) ATP -> ADP + Pi (AG°' = -30,5 kJ/mol)
Jeśli reakcje (1) i (2) są sprzężone w reakcji
katalizowanej przez heksokinazę, fosforylacja
glukozy przebiega bez trudu w bardzo egzoer-
gicznej reakcji, która w warunkach fizjologicz¬
nych jest daleka od równowagi i z tego powodu
praktycznie nieodwracalna. Wiele reakcji „akty¬
wacji” zachodzi właśnie w ten sposób.
_ H
KINAZA
KREA7YN0WA
h2\
Kinaza adenylanowa (miokinaza)
C =
/
h3c — n
NH -
/ \
h3c
C = NH
/
— N
przekształca nukleotydy adeninowe
I
ch2
ADP ATP
I
ch2
Enzym ten znajduje się w większości komórek.
I
C00'
Fosfokreatyna
(AG° = -12,6 kJ/mol)
I
C00'
Kreatyna
Katalizuje on następującą reakcję:
KINAZA
Ryc. 11-7. Przenoszenie wysokoenergetycznego fosforanu mię¬
dzy ATP i kreatyną.
Jeśli ATP działa jako donor fosforanu i tworzy
się związek charakteryzujący się mniejszą ental¬
pią swobodną hydrolizy (tab. 11-1), grupa fosfo¬
ranowa zawsze przekształca się w grupę nisko-
energetyczną, np.
KINAZA
GLICEROLOWA
Glicerol + Adenozyno — ►
Glicerol — (F) + Adenozyno —
ATP pozwala sprzęgnąć reakcje
termodynamicznie niekorzystne
z reakcjami termodynamicznie
uprzywilejowanymi
Fosforylacja glukozy do glukozo-6-fosforanu
(ryc. 18-2) - pierwsza reakcja szlaku glikolizy jest
bardzo endoergiczna i nie może przebiegać samo¬
dzielnie w warunkach fizjologicznych.
(1) Glukoza + Pj -»Glukozo-6-fosforan + H20
(AG°' = +13,8 kJ/mol)
Reakcja ta spełnia trzy zadania:
1. Umożliwia wykorzystanie wysokoenerge¬
tycznego fosforanu z ADP do syntezy ATP.
2. Umożliwia refosforylację AMP powstałego
z ATP w różnych reakcjach aktywacji.
3. Umożliwia zwiększenie stężenia AMP, gdy ATP
ulega wyczerpaniu. AMP działa jako sygnał
metaboliczny (allosteryczny) do zwiększenia
szybkości reakcji katabolicznych, które z kolei
prowadzą do tworzenia większych ilości ATP
(rozdz. 20).
Gdy z ATP tworzy się AMP, powstaje
pirofosforan nieorganiczny (PP|)
ATP może również zostać bezpośrednio zhydro-
lizowany do AMP, uwalniając PPj(p. tab. 11-1).
Następuje to np. w reakcji aktywacji długołańcu-
chowych kwasów tłuszczowych (rozdz. 22):
SYNTETAZA
ACYLO-CoA
ATP + CoA • SH + R • COOH
AMP + PPj + R • CO — SCoA
Aby reakcja mogła zajść, musi zostać sprzężona
z inną - bardziej egzoergiczną - reakcją, taką jak
Reakcji towarzyszy utrata entalpii swobodnej
w postaci ciepła, co gwarantuje przebieg reakcji
11. BIOENERGETYKA: ROLA ATP 117
aktywacji w prawo. Jest ona wspomagana do¬
datkowo przez hydrolityczne rozszczepienie PPj
(AG0' = -19,2 kJ/mol), katalizowane przez piro-
fosfatazę. Należy zwrócić uwagę, że w wyniku
reakcji aktywacji zachodzącej z utworzeniem pi-
rofosforanu dochodzi do utraty dwóch ~®, a nie
jednego, jak w przypadku reakcji z utworzeniem
ADP i P(:
| P1R0F0SFATAZA
PPi + H20 >- 2 Pj
Kombinacja powyższych reakcji umożliwia
obieg fosforanu i wzajemną przemianę nukleoty-
dów adenino wych (ryc. 11-8).
PIROFOSFATAZA
r ^
Hyc. 11-8. Cykle fosforanowe i przemiana wzajemna nukleoty-
dów adeninowych.
W przenoszeniu fosforanu
wysokoenergetycznego uczestniczą
również inne trifosfonukleozydy
Przy udziale kinazy difosfonukleozydowej mogą
być syntetyzowane UTP, GTP i CTP z odpowied¬
nich difosforanów, np.:
KINAZA
DIF0SF0-
NUKLE0ZYD0WA
ATP + UDP M >- ADP + UTP
(urydynotrifosforan)
Wszystkie te trifosforany uczestniczą w re¬
akcjach fosforylacji w komórce. Podobnie spe¬
cyficzne kinazy monofosfonukleozydowe katali¬
zują reakcje tworzenia difosfonukleozydów z od¬
powiednich monofosforanów:
SWOISTA KINAZA
M0N0F0SF0-
NUKLEOZYDOWA
ATP + Nukleozydo — (T)
ADP + Nukleozydo — (p)~(p)
Taką wyspecjalizowaną kinazą monofosforano-
wą jest kinaza adenylanowa.
STRESZCZENIE
• Układy biologiczne wykorzystują energię che¬
miczną do napędzania procesów życiowych.
• Reakcje egzoergiczne zachodzą samorzutnie,
z utratą entalpii swobodnej (AG ma wartość
ujemną). Reakcje endoergiczne wymagają do¬
starczenia entalpii swobodnej (AG ma wartość
dodatnią) i zachodzą tylko wówczas, gdy są
sprzężone z procesami egzoergicznymi.
• ATP funkcjonuje w komórce jako „waluta
energetyczna”, przenosząca entalpię swobod¬
ną ze związków o wysokim potencjale ener¬
getycznym do związków o niskim potencjale
energetycznym.
PIŚMIENNICTWO
De Meis L: The concept of energy-rich phosphate com-
pounds: Water, transport ATPases, and entropy
energy. Arch Biochem Biophys 1993;306:287.
Frey PA, Arabshahi A: Standard free energy change for
the hydrolysis of the alpha, beta-phosphoanhydride
bridge in ATP. Biochemistry 1995;34:11307.
Harold FM: The Vital Force: A Siudy of Bioenergetics.
Freeman, 1986.
Harris DA: Bioenergetics at a Glance: An Illustrated In-
troduction. Blackwell Publishing, 1995.
Jencks WP: Free energies of hydrolysis and decarboxy-
lation. In: Handbook of Biochemistry and Molecu-
lar Biology, vol 1. Physical and Chemical Data.
Fasman GD (editor). CRC Press, 1976.
Klotz IM: Introduction to Biomolecular Energetics.
Academic Press, 1986.
Nicholls D, Ferguson F: Bioenergetics. Elsevier, 2003.
Utlenianie biologiczne
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Pod względem chemicznym utlenianie definiuje
się jako proces usuwania elektronów, natomiast
redukcję - jako proces przyłączania elektronów.
Wynika z tego, że utlenieniu zawsze towarzyszy
redukcja biorcy (akceptora) elektronów. Ta reguła
utlenienia-redukcji obowiązuje również w ukła¬
dach biologicznych i stanowi podstawę zrozumie¬
nia natury procesu utleniania biologicznego. Na¬
leży podkreślić, że wiele procesów biologicznych
może zachodzić bez udziału tlenu cząsteczkowego,
np. reakcje odwodomienia. Życie wyższych gatun¬
ków zwierząt jest jednak bezwzględnie zależne od
obecności tlenu. Głównym procesem, w którym
jest zużywany tlen jest oddychanie tkankowe;
można je określić jako proces, w wyniku którego
komórka uzyskuje energię w postaci ATP z kont¬
rolowanej reakcji tworzenia wody z wodoru i tlenu.
Tlen cząsteczkowy jest ponadto wbudowywany
do różnych substratów przez enzymy określane
mianem oksygenaz; wiele leków, chemicznych
zanieczyszczeń środowiska i chemicznych karcy-
nogenów (ksenobiotyków) jest metabolizowanych
przy udziale tego typu enzymów, określanych jako
układ cytochromu P-450. Podawanie tlenu cho¬
rym z niewydolnością oddechową lub krążeniową
może uratować im życie.
ZMIANY ENTALPII SWOBODNEJ MOGĄ
BYĆ WYRAŻONE JAKO POTENCJAŁ
REDOKS
W reakcjach obejmujących utlenianie i redukcję
zmiana entalpii swobodnej jest proporcjonalna
do skłonności reagentów do oddawania lub po¬
bierania elektronów. Stąd też, oprócz wyrażania
zmian entalpii swobodnej jako AG°' (rozdz. 11),
możliwe jest ich liczbowe wyrażenie za pomocą
potencjału oksydoredukcyjnego lub potencja¬
łu redoks układu (Eó). Zazwyczaj porównuje się
potencjał oksydoredukcyjny układu (Eó) z po¬
tencjałem elektrody wodorowej, którego wartość
w pH 0 określa się jako 0,0 woltów. W przypad¬
ku jednak układów biologicznych przyjęło się
wyrażanie potencjału oksydoredukcyjnego (Eó)
w pH 7,0, w którym to pH potencjał elektrody
wodorowej wynosi -0,42 wolta. W tabeli 12-1
podano wartości potencjałów oksydoredukcyj-
nych niektórych biologicznych układów oksydo-
redukcyjnych, ważnych zwłaszcza w biochemii
ssaków. Na podstawie przedstawionych w tabeli
wartości można przewidzieć kierunek przepływu
elektronów z jednej pary oksydoredukcyjnej do
drugiej.
Tabela 12-1. Potencjały oksydoredukcyjne niektórych układów
oksydoredukcyjnych o specjalnym znaczeniu dla ssaków
Układ
E o [wolt]
H+/H2
-0,42
NAD7NADH
-0,32
Liponian/dihydroliponian
-0,29
Acetooctan/3-hydroksymaślan
-0,27
Pirogronian/mleczan
-0,19
Szczawiooctan/jabłczan
-0,17
Fumaran/bursztynian
+0,03
Cytochrom b\ Fe3+/Fe2+
+0,08
Ubichinon/ubichinol
+0,10
Cytochrom c; Fe3+/Fe2+
+0,22
Cytochrom a; Fe3+/Fe2+
+0,29
Tlen/woda
+0,82
12. UTLENIANIE BIOLOGICZNE 119
Enzymy uczestniczące w utlenianiu i redukcji
określono mianem oksydoreduktaz i podzielono
je na cztery grupy: oksydazy, dehydrogenazy,
peroksydazy i oksygenazy.
OKSYDAZY WYKORZYSTUJĄ TLEN
JAKO AKCEPTOR WODORU
Oksydazy katalizują oderwanie wodoru z substra-
tu w reakcji, w której tlen jest biorcą wodoru*.
Produktem reakcji jest woda lub nadtlenek wodo¬
ru (ryc. 12-1).
Ryc. 12-1. Utlenianie metabolitów katalizowane przez oksydazę (A)
tworzącą H20, (B) tworzącą H202.
Niektóre oksydazy zawierają miedź
Oksydaza cytochromowa jest rozpowszechnioną
w wielu tkankach hemoproteiną, zawierającąjako
grupę prostetyczną typowy hem, występujący
w mioglobinie, hemoglobinie i innych cytochro-
mach (rozdz. 6). Jest ona końcowym przenośni¬
kiem elektronów w mitochondrialnym łańcuchu
oddechowym, a zatem jest odpowiedzialna za
reakcję przenoszenia elektronów, pochodzących
z utleniania cząsteczek substratów katalizowane¬
go przez dehydrogenazy, na ich końcowy akcep¬
tor - tlen. Oksydaza traci aktywność w obecności
tlenku węgla, cyjanku lub siarkowodoru. Enzym
ten nazywano również „cytochromem a”. Obec¬
nie wiadomo, że cytochrom a i cytochrom a3 two¬
rzą kompleks białkowy; nadano mu nazwę cyto¬
chrom aa3. Zawiera on dwie cząsteczki hemu,
z których każda posiada atom Fe, występujący
podczas utleniania i redukcji w formie Fe3+ lub
Fe2+. Kompleks ten zawiera ponadto dwa atomy
Cu, po jednym na jednostkę hemową.
* Nazwa „oksydaza” jest czasami używana na ogólne
określenie wszystkich enzymów, które katalizują reak¬
cje wymagające udziału tlenu cząsteczkowego.
Inne oksydazy sa flawoproteinami
Enzymy flawoproteinowe zawierająmononukleo-
tyd flawinowy (FMN) lub dinukleotyd flawino-
adeninowy (FAD) jako grupy prostetyczne. FMN
i FAD są wytwarzane w organizmie z witaminy
- ryboflawiny (rozdz. 44). FMN i FAD są zwykle
mocno - ale nie kowalencyjnie - związane z od¬
powiednimi apoenzymami. Metaloflawoproteiny
zawierają atomy jednego lub kilku metali, które
są niezbędne do działania enzymu. Do tej grupy
oksydaz zalicza się m.in. oksydazę L-aminokwa-
sową, współdziałający z FMN enzym występują¬
cy w nerkach, katalizujący deaminację oksyda¬
cyjną naturalnie występujących L-aminokwasów,
oksydazę ksantynową, zawierającą molibden
i odgrywającą ważną rolę w przemianie zasad pu-
rynowych w kwas moczowy (rozdz. 28), mającą
szczególne znaczenie u zwierząt urykotelicznych,
dehydrogenazę aldehydową występującą w wą¬
trobie ssaków, zawierającą w swojej cząsteczce
FAD związany z enzymem oraz molibden i żelazo
niehemowe - jej substratami są aldehydy i związ¬
ki A-heterocykliczne. Mechanizm reakcji oksy-
doredukcyjnych katalizowanych przez te enzymy
jest skomplikowany. Sugeruje się, że reakcja za¬
chodzi w dwóch etapach, jak to przedstawiono na
ryc. 12-2).
DEHYDROGENAZY NIE MOGĄ UŻYWAĆ
TLENU JAKO AKCEPTORA WODORÓW
Ta grupa obejmuje dużą liczbę enzymów. Spełnia¬
ją one dwie zasadnicze funkcje:
1. Przenoszą atomy wodoru z jednego substratu
na drugi w sprzężonej reakcji oksydoredukcyjnej
(ryc. 12-3). Dehydrogenazy są swoiste dla swo¬
ich substratów, ale często używają tego samego
koenzymu lub przenośnika wodorów, np. NAD+.
Ponieważ reakcje są odwracalne, więc jest moż¬
liwe swobodne przenoszenie równoważników
redukujących wewnątrz komórki. Ten typ reakcji,
w której jeden substrat utlenia się kosztem dru¬
giego, jest przydatny zwłaszcza w przypadku bra¬
ku tlenu, umożliwia bowiem przebieg procesów
oksydoredukcyjnych na przykład podczas anaero-
bowej fazy glikolizy (ryc. 18-2).
2. Jako składniki łańcucha oddechowego
uczestniczą w transporcie elektronów z substratu
do atomu tlenu (ryc. 13-3).
120 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
(H+ + e") (H+ + e")
Ryc. 12-2. Oksydoredukcja pierścienia izoalloksazynowego w nukleotydach flawinowych poprzez pośredniki se-
michinonowe (wolne rodniki).
Ryc. 12-3. Utlenianie metabolitów katalizowane przez sprzężone
dehydrogenazy.
Wiele dehydrogenaz jest zależnych
od koenzymów nikotynoamidowych
Ta kategoria enzymów obejmuje liczną grupę de¬
hydrogenaz, których koenzymem jest dinukleotyd
nikotynoamido-adeninowy (NAD4) lub fosfo¬
ran dinukleotydu nikotynoamido-adeninowe-
go (NADP*). Niektóre dehydrogenazy mogą wy¬
korzystywać zarówno NAD*, jak i NADP*. NAD*
i NADP* są wytwarzane w organizmie z witaminy
- niacyny (rozdz. 44). Koenzymy te ulegają re¬
dukcji pod wpływem swoistego substratu dehyd¬
rogenazy i reoksydacji z udziałem właściwego
akceptora elektronów (ryc. 12-4). Mogą one swo¬
bodnie i odwracalnie dysocjować od odpowied¬
nich apoenzymów.
Na ogół zależne od NAD* dehydrogenazy kata¬
lizują reakcje oksydoredukcji w oksydacyjnych
szlakach metabolizmu, np. w glikolizie, cyklu
kwasu cytrynowego czy mitochondrialnym łań¬
cuchu oddechowym. Z kolei dehydrogenazy za¬
leżne od NADP* są charakterystyczne dla syntez
redukcyjnych, np. pozamitochondrialnej syn¬
tezy kwasów tłuszczowych i syntezy steroidów.
NADP* jest również koenzymem dehydrogenaz
szlaku pentozofosforanowego.
Inne dehydrogenazy sa zależne od (lawin
Grupy flawinowe związane z tymi dehyd¬
rogenazami są podobne do FMN i FAD występu¬
jących w oksydazach. Zasadniczo są one ściślej
związane ze swoimi apoenzymami niż koenzymy
nikotynoamidowe. Większość dehydrogenaz fla¬
winowych bierze udział w przenoszeniu elektro¬
nów w (lub do) łańcuchu oddechowym (rozdz.
13). Dehydrogenaza NADH jest składnikiem
łańcucha oddechowego, działającym jako prze¬
nośnik elektronów między NADH i składnikami
0 bardziej dodatnim potencjale redoks (ryc. 13-3).
Inne dehydrogenazy, takie jak dehydrogenaza
bursztynianowa, dehydrogenaza acylo-CoA
1 mitochondrialna dehydrogenaza glicerolo-
-3-fosforanowa przenoszą równoważniki redu¬
kujące bezpośrednio z substratu do łańcucha od¬
dechowego (ryc. 13-5). Inną rolą dehydrogenaz
zależnych od flawin jest udział w odwodomieniu
(dehydrogenaza dihydroliponoilowa) zreduko¬
wanego liponianu, związku pośredniego w ok¬
sydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu i a-ke-
toglutaranu (ryc. 13-5 i 18-5). Flawoproteina
przenosząca elektrony jest przenośnikiem elek¬
tronów pośredniczącym między dehydrogenazą
acylo-CoA i łańcuchem oddechowym (ryc. 13-5).
Również niektóre cytochromy mogą być
traktowane jako dehydrogenazy
Cytochromy są hemoproteinami zawierającymi
atom żelaza, w których podczas oksydoredukcji
występuje on naprzemiennie w postaci jonów Fe3*
lub Fe2*. Z wyjątkiem oksydazy cytochromowej
(opisanej wcześniej) cytochromy są klasyfikowa¬
ne także jako dehydrogenazy. W łańcuchu odde¬
chowym cytochromy działają jako przenośniki
12. UTLENIANIE BIOLOGICZNE 121
Ryc. 12-4. Mechanizm utleniania i re¬
dukcji koenzymów nikotynoamidowych.
Nikotynamid jest redukowany stereospe-
cyficznie w pozycji 4 przez substrat AH2.
Jeden z atomów wodoru zostaje ode¬
rwany od substratu jako anion wodor¬
kowy H" (jądro wodoru z 2 elektronami)
i przeniesiony na atom węgla w pozycji 4
nikotynamidu, gdzie może zostać przyłą¬
czony w położeniu A lub B, w zależności
od swoistości dehydrogenazy katali¬
zującej tę reakcję. Drugi atom wodoru
z pary atomów wodoru oderwanych od
substratu pozostaje w środowisku jako
wolny jon wodorowy.
DEHYDROGENAZA
SWOISTA DLA A
DEHYDROGENAZA
SWOISTA DLAB
R
R
NAD+ + AH2 ► NADH + H+ + A
elektronów między flawoproteinami i oksydazą
cytochromową (ryc. 13-5). W łańcuchu oddecho¬
wym występuje kilka różnych cytochromów, mia¬
nowicie cytochromy b,cuc, a i #3 (oksydaza cy-
tochromowa). Cytochromy znajdują się również
poza łańcuchem oddechowym, np. w siateczce
śródplazmatycznej (cytochromy P-450 i b5), oraz
w komórkach roślinnych, bakteriach i drożdżach.
HYDROPEROKSYDAZY UŻYWAJĄ JAKO
SUBSTRATÓW NADTLENKU WODORU
LUB NADTLENKÓW ORGANICZNYCH
Do tej kategorii zalicza się dwa typy enzymów:
peroksydazy i katalazę. Oba typy występują
zarówno u zwierząt, jak i u roślin. Peroksydazy
chronią organizm przed szkodliwymi nadtlenka¬
mi. Nagromadzenie się nadtlenków może sprzy¬
jać tworzeniu się wolnych rodników, które z kolei
mogą uszkadzać błony i przyczyniać się do po¬
wstawania nowotworów oraz miażdżycy (rozdz.
15 i 44).
Peroksydazy redukują nadtlenki przy
udziale rozmaitych donorów elektronów
Peroksydazy znajdują się w mleku, leukocytach,
płytkach krwi i różnych tkankach metabolizują¬
cych ikozanoidy (rozdz. 23). Grupą prostetyczną
peroksydaz jest protohem, który - przeciwnie niż
w większości hemoprotein - jest luźno związa¬
ny z apoproteiną. W reakcji katalizowanej przez
peroksydazę nadtlenek wodoru jest redukowany
kosztem różnych związków, np. askorbinianu,
hydrochinonów i zredukowanego cytochromu c,
które działają jako dawcy elektronów. Choć reak¬
cja katalizowana przez peroksydazę jest złożona,
to jej ogólny zapis można przedstawić następują¬
co:
| PEROKSYDAZA |
H202 + AH2 >- 2H20 + A
W erytrocytach i innych tkankach peroksy-
daza glutationowa, zawierająca atom selenu
jako grupę prostetyczną, katalizuje w obecności
zredukowanego glutationu rozkład H202 i nad¬
tlenków lipidów, zapobiegając w ten sposób utle¬
nianiu lipidów błonowych i hemoglobiny przez
nadtlenki (rozdz. 21).
Katalaza wykorzystuje nadtlenek wodoru
zarówno jako donor, jak i akceptor
elektronów
Katalaza jest hemoproteiną zawierającą cztery gru¬
py hemowe. Wykazuje ona aktywność peroksyda-
zową oraz dodatkowo może katalizować reakcję,
w której jedna cząsteczka H202 jest substratem
oddającym elektrony, a druga cząsteczka H202 jest
utleniaczem, czyli akceptorem elektronów.
122 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
| KATALAZA |
2H202 ► 2H20 + 02
W warunkach in vivo katalaza wykazuje zwy¬
kle aktywność peroksydazową. Aktywność
katalazy stwierdzono we krwi, szpiku, błonach
śluzowych, nerkach i wątrobie. Przyjmuje się,
że rozkłada ona nadtlenek wodoru tworzony
w reakcjach z udziałem oksydaz. W komórkach
wątroby oraz wielu innych narządów wykazano
obecność peroksysomów, które charakteryzują
się znaczną aktywnością oksydaz i katalazy. Tak
więc enzymy produkujące H202 są zgrupowane
z enzymem rozkładającym nadtlenek wodoru.
Układy mitochondrialny i mikrosomalny trans¬
portujące elektrony tak samo jak oksydaza ksan-
tynowa muszą być jednak uwzględnione jako
dodatkowe źródło H202.
OKSYGENAZY KATALIZUJĄ
BEZPOŚREDNIE PRZENIESIENIE
I WBUDOWANIE TLENU
DO CZĄSTECZKI SUBSTRATU
Oksygenazy uczestniczą w syntezie lub degrada¬
cji wielu różnych typów metabolitów. Enzymy te
katalizują reakcje wbudowywania tlenu do czą¬
steczki substratu. Reakcja przebiega dwuetapo¬
wo: 1) wbudowanie tlenu do centrum katalitycz¬
nego enzymu i 2) reakcja redukcji lub przeniesie¬
nia związanego z enzymem tlenu do substratu.
Oksygenazy można podzielić na dwie podgrupy,
omówione niżej.
Dioksygenazy przytaczają do substratu
oba atomy cząsteczki tlenu
Podstawowa reakcja przebiega wg następującego
równania:
A + 02 -> A02
Do tej podgrupy enzymów należą enzymy wątro¬
bowe, zawierające żelazo, np. dioksygenaza ho-
mogentyzynowa (oksydaza) i dioksygenaza 3-
-hydroksyantranilowa (oksydaza), oraz enzymy
wykorzystujące hem, np. dioksygenaza L-trypto-
fanowa (pirolaza tryptofanowa) (rozdz. 29).
Monooksygenazy (oksydazy o mieszanej
funkcji, hydroksylazy) wbudowują
tylko jeden atom tlenu cząsteczkowego
do substratu
Drugi atom tlenu ulega redukcji do wody, co wy¬
maga udziału dodatkowego donora elektronów
lub kosubstratu (Z).
A-H + 02 + ZH2 -> A-OH + H20 + Z
Cytochromy P-450 sa monooksygenazami
uczestniczącymi w detoksykacji
wielu leków oraz w hydroksylacjach
steroidów
Cytochromy P-450 stanowią wielką i ważną
rodzinę monooksygenaz zawierających hem.
Znanych jest obecnie ponad 1000 enzymów na¬
leżących do tej rodziny. Zarówno NADTł, jak
i NADPH dostarczają równoważników redu¬
kujących do redukcji cytochromów P-450 (ryc.
12-5), które z kolei są utleniane przez substra-
ty w wieloetapowym procesie enzymatycznym,
określanym jako cykl hydroksylacyjny (ryc.
12-6). W mikrosomach wątrobowych cytochro¬
my P-450 występują razem z cytochromem b5
i odgrywają ważną rolę w procesach detoksyka¬
cji. Wśród leków metabolizowanych przez ten
układ enzymatyczny znajdują się: benzopiren,
aminopiryna, anilina, morfina i benzofetamina.
Hydroksylacja zwiększa ich rozpuszczalność
w wodzie i ułatwia wydalanie. Wiele leków, np.
fenobarbital, może indukować syntezę enzymów
mikrosomalnych i cytochromu P-450.
Mitochondrialne układy cytochromu P-450 wy-
stępują w tkankach steroidogenicznych, takich jak
kora nadnerczy, jądra, jajniki, łożysko. Biorą one
udział w biosyntezie hormonów steroidowych
z cholesterolu (hydroksylacja przy atomach C22
i C20 w procesie odszczepienia łańcucha bocznego
oraz hydroksylacja w pozycjach 11P i 18). Poza
tym, nerkowe układy katalizujące la- i 24-hy-
droksylację 25-hydroksycholekalcyferolu w pro¬
cesie metabolizmu witaminy D oraz 7a-hydroksy-
laza cholesterolowa i 27-hydroksylaza sterolowa
uczestniczące w biosyntezie kwasów żółciowych
w wątrobie (rozdz. 26) także są zaliczane do en¬
zymów P-450.
12. UTLENIANIE BIOLOGICZNE 123
Aminooksydaza itp.
NADH ►
NADPH ►
Flawoproteina2
Flawoproteina3
Flawoproteina!
CN"
Desaturaza stearoilo-CoA
- Hydroksylacja
Peroksydacja lipidów
Oksygenaza hemu
Ryc. 12-5. Mikrosomalny łańcuch przenoszący elektrony. Zaznaczono miejsce hamowania przez
cyjanek (CN").
DYSMUTAZA PONADTLENKOWA
CHRONI ORGANIZMY TLENOWE
PRZED TOKSYCZNOŚCIĄ TLENU
Przeniesienie jednego elektronu na 02 sprawia, że
tworzy się potencjalnie szkodliwy wolny aniono-
rodnik ponadtlenkowy (02T). Działanie ponad-
tlenku w tkankach jest wzmacniane w wyniku re¬
akcji łańcuchowej wolnych rodników (rozdz. 15).
Łatwość, z jaką ponadtlenek może powstawać
w tkankach, i występowanie u organizmów tle¬
nowych (ale nie u beztlenowców bezwzględnych)
dysmutazy ponadtlenkowej, wskazuje, że tok¬
syczność tlenu wynika z jego przemiany w po¬
nadtlenek.
Ponadtlenek powstaje wówczas, gdy zredu¬
kowane flawiny - znajdujące się np. w oksydazie
ksantynowej - ulegają jednoelektronowej reok-
sydacji przez tlen cząsteczkowy:
Enzym-Flawina-H2 + 02 -> Enzym-Flawina-H + 02T H+
Ponadtlenek może redukować cytochrom c:
02t + Cyt c (Fe3+) -> 02 + Cyt c (Fe2+)
lub może być usuwany przez dysmutazę ponad-
tlenkową:
DYSMUTAZA
PONADTLENKOWA
02- + 02- + 2H+ >- H202 + 02
Substrat A-H
Ryc. 12-6. Mikrosomalny cykl hydroksylacyjny. Przedstawiony uktad jest typowy dla hydroksylaz steroidowych kory nad¬
nerczy. Mikrosomalny system hydroksylacyjny w wątrobie nie wymaga udziału białka żelazosiarkowego (Fe2S2). Zaznaczono
miejsce hamowania przez tlenek węgla (CO).
124 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
W reakcji tej ponadtlenek działa zarówno
jako utleniacz, jak i reduktor. Tak więc funkcja
dysmutazy ponadtlenkowej polega na ochronie
organizmów aerobowych (tlenowych) przed cy-
totoksycznym działaniem ponadtlenku. Enzym
występuje we wszystkich ważniejszych tkankach
aerobowych w mitochondriach i cytozolu. Choć
przeniesienie zwierząt do atmosfery składającej
się w 100% z tlenu powoduje adaptacyjne zwięk¬
szenie ilości dysmutazy ponadtlenkowej, zwłasz¬
cza w płucach, to jednak przedłużony pobyt w tej
atmosferze prowadzi do uszkodzenia płuc, a na¬
wet śmierci. Przeciwutleniacze, np. a-tokoferol
(witamina E), działają również jako „zmiatacze”
wolnych rodników i ograniczają toksyczność tle¬
nu (rozdz. 44).
STRESZCZENIE
• W układach biologicznych, podobnie jak w che¬
micznych, utlenieniu (utracie elektronów) za¬
wsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów.
• Oksydoreduktazy spełniają różne funkcje
w metabolizmie: oksydazy i dehydrogena¬
zy odgrywają zasadniczą rolę w oddychaniu
tkankowym, hydroperoksydazy chronią orga¬
nizm przed uszkodzeniem przez wolne rodniki,
a oksygenazy pośredniczą w hydroksylacji le¬
ków i steroidów.
• Toksyczność tlenu może być spowodowana
przez wolne rodniki ponadtlenkowe. Tkanki są
chronione przed ponadtlenkami przez specjalny
enzym - dysmutazę ponadtlenkową.
PIŚMIENNICTWO
Babcock GT, Wikstrom M: Oxygen activation and the
conservation of energy in celi respiration. Naturę
1992;356:301.
Coon MJ: Cytochrome P450: Nature’s most versatile
biological catalyst. Annu Rev Pharmacol Toxicol
2005;4:1.
Harris DA: Bioenergetics at a Glance: An IllustratedIn-
troduction. Blackwell Publishing, 1995.
Nicholls D, Ferguson F: Bioenergetics. Elsevier, 2003.
Raha S, Robinson BH: Mitochondria, oxygen free
radicals, disease and aging. Trends Biochem Sci
2000;25:502.
Tyler DD: The Mitochondrion in Health and Disease.
VCH Publishers, 1992.
Łańcuch oddechowy
i fosforylacja oksydacyjna
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Organizmy tlenowe przechwytują znacznie więk¬
szą część dostępnej entalpii swobodnej substra¬
tów oddechowych niż organizmy beztlenowe.
Mitochondrium trafnie określono mianem „si¬
łowni” komórki, ponieważ wewnątrz tej organelli
następuje wychwytywanie większości energii
pochodzącej z tkankowych procesów utleniania.
Mitochondrialny proces wytwarzania wysoko¬
energetycznego związku (ATP) sprzężony z oddy¬
chaniem nosi nazwę fosforylacji oksydacyjnej.
Niektóre leki (np. amobarbital) i trucizny (np.
cyjanek, tlenek węgla) hamują łańcuch oddecho¬
wy, zwykle ze śmiertelnym skutkiem. Opisano
kilka wad dziedzicznych dotyczących składni¬
ków mitochondrialnego łańcucha oddechowego
i fosforylacji oksydacyjnej. Wady te ujawniają się
w postaci miopatii, encefalopatii, a często kwa¬
sicy mleczan owej.
SPECYFICZNE ENZYMY SPEŁNIAJĄ
FUNKCJE ZNACZNIKÓW PRZEDZIAŁÓW
SUBMITOCHONDRIALNYCH
Mitochondria mają błonę zewnętrzną prze¬
puszczalną dla większości metabolitów, błonę
wewnętrzną wybiórczo przepuszczalną oraz ma¬
cierz wewnątrz mitochondrium (ryc. 13 -1). W bło¬
nie zewnętrznej występuje kilka enzymów, m.in.
syntetaza acylo-CoA i acylotransferaza fosfogli-
cerolowa. W przestrzeni międzybłonowej znaj¬
dują się kinaza adenyłanowa oraz kinaza kreaty-
nowa. W błonie wewnętrznej jest nagromadzony
fosfolipid - kardiolipina razem z enzymami łań¬
cucha oddechowego, syntazą ATP i przenośnika¬
mi (translokatorami) błonowymi.
ŁAŃCUCH ODDECHOWY UTLENIA
RÓWNOWAŻNIKI REDUKUJĄCE I DZIAŁA
JAKO POMPA PROTONOWA
Większość energii uwolnionej podczas utleniania
węglowodanów, kwasów tłuszczowych i amino¬
kwasów jest dostępna wewnątrz mitochondriów
jako równoważniki redukujące (—H lub elek¬
trony) (ryc. 13-2). Enzymy cyklu kwasu cytry¬
nowego i p-oksydacji (rozdz. 22 i 17) są zawarte
w mitochondrium, razem z łańcuchem oddecho¬
wym, który zbiera i transportuje równoważniki
redukujące, kierując je do ich ostatecznej reakcji
z tlenem, w której powstaje woda. Mitochondria
zawierają również układ enzymatyczny do oksy¬
dacyjnej fosforylacji - procesu, dzięki któremu
uwolniona entalpia swobodna jest gromadzona
w postaci wysokoenergetycznego wiązania fosfo¬
ranowego.
Składniki łańcucha oddechowego
występują w czterech dużych
kompleksach białkowych osadzonych
w wewnętrznej błonie mitochondrialnej
Elektrony przepływają przez łańcuch oddechowy
dzięki różnicy potencjałów redoks, jaka istnieje
między układem NAD7NADH i02/2H20 (wyno¬
si ona 1,1 V) (tab. 12-1). Przepływ odbywa się za
pośrednictwem trzech dużych kompleksów biał¬
kowych: oksydoreduktazy NADH-CoQ (kom¬
pleks I), gdzie elektrony są przenoszone z NADH
na koenzym Q (CoQ, ubichinon); oksydoreduk¬
tazy CoQ-cytochrom c (kompleks III), która
przekazuje elektrony na cytochrom c oraz oksy¬
dazy cytochromu c (kompleks IV), która kończy
łańcuch, przekazując elektrony na 02i powodując
126 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 73-7. Struktura błon mito-
chondrialnych. Należy zwrócić
uwagę, że błona wewnętrzna
zawiera wiele grzebieni.
jego redukcję do H20 (ryc. 13-3). Niektóre sub-
straty z bardziej dodatnim potencjałem redoks niż
NAD7NADH (np. bursztynian) przenoszą elek¬
trony na CoQ poprzez reduktazę bursztynian-
-CoQ (kompleks II), a nie poprzez kompleks I.
Cztery kompleksy są osadzone w wewnętrznej
błonie mitochondrialnej, ale CoQ i cytochrom c
są ruchliwe. CoQ przemieszcza się szybko w bło¬
nie, a cytochrom c jest białkiem rozpuszczalnym.
Przepływ elektronów przez kompleksy I, III i IV
powoduje pompowanie protonów z macierzy
przez wewnętrzną błonę mitochondrialnądo prze¬
strzeni między błonowej (ryc. 13-7).
Flawoproteiny i białka żelazowo-siarkowe
(Fe-S) sa składnikami kompleksów
łańcucha oddechowego
Flawoproteiny (rozdz. 22) są ważnymi składni¬
kami kompleksu I i II. Utleniony nukleotyd fla-
winowy (FMN lub FAD) może być zredukowany
w reakcjach wymagających przeniesienia dwóch
POKARM
Tłuszcze
Węglowodany
Białka
Ryc. 13-2. Rola mitochondrialnego łańcucha oddechowego w przekształceniu energii chemicznej pożywienia w ATR Utlenianiu więk¬
szości składników pokarmu towarzyszy wytwarzanie równoważników redukujących (2H), które są zbierane przez łańcuch oddechowy
w celu ich utlenienia i sprzężonego z tym wytwarzania ATR
13. ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA 127
Bursztynian Fumaran
Kompleks I:
oksydoreduktaza
NADH-CoQ
Kompleks III:
oksydoreduktaza
CoQ-cytc
Kompleks IV:
oksydaza cytc
Ryc. 13-3. Przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy. Q - koenzym Q lub ubichinon, cyt - cytochrom.
elektronów (powstaje FMNH2 lub FADH2), ale
może także przyjąć jeden elektron, tworząc se-
michinon (ryc. 12-2). Białka żelazowo-siarkowe
(białka zawierające żelazo niehemowe, Fe-S)
są składnikami kompleksów I, II i III. Mogą one
zawierać jeden, dwa lub cztery atomy Fe, po¬
łączone z atomami nieorganicznej siarki i/lub
z białkiem za pośrednictwem grupy —SH cy¬
steiny (ryc. 13-4). Fe-S uczestniczą w reakcjach
jednoelektronowego przeniesienia, w których
jeden atom Fe ulega reakcji utlenienia-redukcji,
tworząc albo Fe2\ albo Fe3+.
CoO przyjmuje elektrony z kompleksu I
i kompleksu II
Kompleks I, czyli oksydoreduktaza NADH-CoQ
jest dużym kompleksem białkowym w kształcie
litery L, katalizującym przeniesienie elektronów
z NADH na CoQ, co jest sprzężone z przeniesie¬
niem czterech H+ przez błonę:
NADH + C0Q + 5H macierz ~*
~* NAD + C0QH2 + 4H prZestrzeń międzyblonowa
Elektrony początkowo są przenoszone z NADH
na FMN, a potem na wiele centrów żelazowo-
-siarkowych i ostatecznie do CoQ (ryc. 13-5).
W kompleksie II (reduktaza bursztynian-CoQ)
w czasie przemiany bursztynianu do fumaranu
w cyklu kwasu cytrynowego (ryc. 17-3) najpierw
powstaje FADH2, z którego następnie elektrony
są przekazywane za pośrednictwem kilku cen¬
trów żelazowo-siarkowych na CoQ (ryc. 13-5).
Glicerolo-3-fosforan (tworzony w czasie rozpadu
triacylogliceroli lub w czasie glikolizy, ryc. 18-2)
i acylo-CoA także przekazują elektrony na CoQ
w innych szlakach wymagających udziału flawo-
protein (ryc. 13-5).
Cykl CoQ sprzęga przeniesienie
elektronów z transportem protonów
w kompleksie III
Elektrony z QH2 są przekazywane do cytochromu
c przez kompleks III (oksydoreduktaza CoQ-cy-
tochrom c):
QH2 + 2Cyt Cutieniony "I" 2H macierz “*
“* CoQ + 2Cyt Redukowany “I" 4H przestrzeń międzyblonowa
Proces ten wymaga udziału cytochromów Cj, bL
i bu oraz Rieske Fe-S (nietypowego białka Fe-
-S, w którym jeden atom żelaza centrum 2Fe-
-2S jest połączony z dwoma resztami histydy-
ny, a nie grupami —SH cysteiny) (ryc. 13-5)
i został nazwany cyklem CoQ (ryc. 13-6). CoQ
może występować w trzech formach: utlenionej
128 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
\ X
Cys Cys
xsX
Fe
X
X
Cys
X
\
Cys
\
Pr
\
Cys
\
S
\
Fe
/
S
/
Cys
/
Pr
Pr
/
Cys
/
/
\
\
Cys
\
Ryc. 13-4. Białko żelazowo-siarkowe (Fe-S). (A) Najprostszy model Fe-S z jednym atomem Fe związanym przez cztery reszty cysteiny.
(B) Centrum 2Fe-2S. (C) Centrum 4Fe-4S. S - siarka nieorganiczna, Pr - apoproteina, Cys - cysteina.
jako chinon, zredukowanej jako chinol albo jako
semichinon (ryc. 13-6). Semichinon powstaje
przejściowo podczas cyklu, jeden obrót cyklu
kończy się utlenieniem 2QH2 do CoQ i uwolnie¬
niem 4H+ do przestrzeni międzybłonowej, a re¬
dukcja jednego CoQ do QH2 powoduje pobra¬
nie 2H+z macierzy (ryc. 13-6). Należy zwrócić
uwagę, że CoQ przenosi dwa elektrony, a każdy
z cytochromów tylko jeden, więc utlenienie jed¬
nego QH2 w cyklu CoQ jest połączone z reduk¬
cją dwóch cząsteczek cytochromu c.
Tlen cząsteczkowy jest redukowany
do wody przez kompleks IV
Utlenieniu zredukowanego cytochromu c przez
kompleks IV (oksydaza cytochromu c) towarzy¬
szy redukcja 02 do dwóch cząsteczek wody:
4Cyt Czredukowany + 02 + 8H macierz-*
—* 4Cyt Cieniony "i" 2H20 ~I”4H przestrzeń międzyblonowa
Przeniesienie czterech elektronów z cytochro¬
mu c na 02 wymaga obecności dwóch ugrupo¬
wań hemowych - a i tf3 oraz jonów miedzi (ryc.
13-5). Elektrony są najpierw przekazywane na
centrum Cu (CuA), które zawiera 2 atomy Cu po¬
łączone z dwoma białkowymi grupami —SH cy¬
steiny (podobnie jak Fe-S), a potem kolejno do
hemu a, hemu a3 i drugiego centrum Cu - CuB,
które jest połączone z hemem a3 Ostatecznym
akceptorem elektronów jest 02. Z ośmiu jonów
H+ usuniętych z macierzy, cztery są używane do
tworzenia dwóch cząsteczek wody, a pozostałe
cztery są przepompowywane do przestrzeni mię¬
dzybłonowej przez kompleks IV. Cząsteczka 02
pozostaje mocno związana z kompleksem IV do
momentu, aż zostanie całkowicie zredukowana,
co zmniejsza uwalnianie potencjalnie szkodli¬
wych intermediatów, takich jak aniony ponad-
tlenkowe lub nadtlenek, które powstają, gdy 02
przyjmuje, odpowiednio, jeden lub dwa elektro¬
ny (rozdz. 12).
Glicerolo-3-fosforan
13. ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA 129
- cytochrom.
130 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
OH
o
OH
CH30
CH30
CH3
CH,
I
[CH2CH = CCH2]nH
OH
QH2: forma zredukowana (chinol)
Q: forma całkowicie utleniona (chinon)
Q : forma semichinonowa (wolny rodnik)
Przestrzeń
międzybtonowa
Mitochondrialna
błona
wewnętrzna
Macierz
mitochondrialna
Cyt c
Cyt Ci
Ryc. 13-6. Cykl CoQ. Podczas utleniania CoQH2 do CoQ jeden elektron zostaje przekazany do cyt c za pośrednictwem Rieske Fe-S
i cyt c1t a drugi do CoQ poprzez cyt óL i bH, w wyniku czego tworzy się semichinon, i uwalniają się powstałe jony 2H+ do przestrzeni
międzyblonowej. Podobny proces zachodzi z drugą cząsteczką CoQH2, ale w tym przypadku drugi elektron jest przekazywany do
semichinonu, który po pobraniu 2H+ z macierzy tworzy CoQH2. Fe-S - białko żelazowo-siarkowe, Q - koenzym Q lub ubichinon, cyt
- cytochrom.
TRANSPORT ELEKTRONÓW PRZEZ
ŁAŃCUCH ODDECHOWY POWODUJE
WYTWORZENIE GRADIENTU
PROTONOWEGO, KTÓRY NAPĘDZA
SYNTEZĘ ATP
Przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy
generuje ATP w procesie fosforylacji oksydacyj¬
nej. Teoria chemiosmotyczna, zaproponowana
przez Petera Mitchella w 1961 r., zakłada, że te
dwa procesy są sprzężone przez gradient proto¬
nowy, wytworzony w poprzek wewnętrznej błony
mitochondrialnej. Siła protomotoryczna wyni¬
kająca z różnicy potencjału elektrochemicznego
(ujemny po stronie macierzy) kieruje mechani¬
zmem syntezy ATP. Kompleksy 1, 111 i IV speł¬
niają funkcję pomp protonowych. Ponieważ we¬
wnętrzna błona mitochondrialna zasadniczo jest
nieprzepuszczalna dla jonów, zwłaszcza dla pro-
tOHÓW, gromadzą się one w przestrzeni między-
błonowej, tworząc siłę protomotoryczną, zgodnie
z teorią chemiosmotyczną.
Błonowa syntaza ATP odgrywa rolę
rotacyjnego silnika do wytwarzania ATP
Siła protomotoryczna jest wykorzystywana przez
zlokalizowaną w błonie syntazę ATP, która
w obecności P* + ADP wytwarza ATP. Syntaza ATP
jest osadzona w wewnętrznej błonie razem z kom¬
pleksami łańcucha oddechowego (ryc. 13-7). Kil¬
kanaście podjednostek białkowych tworzy struk¬
turę podobną do kuli nałożonej na pionową oś
kompleksu (ang. axle). Kompleks ten, określany
jako F| (ang. factor 1), jest skierowany w stronę
macierzy mitochondrialnej i zawiera mechanizm
fosforylacji (ryc. 13-8). Kompleks F| jest połączo¬
ny z błonowym kompleksem białkowym, określa¬
nym jako F0(o - litera oznaczająca oligomycynę),
który zatopiony w błonie tworzy kanał protono¬
wy. Przepływ protonów przez F0 powoduje jego
rotację, co napędza syntezę ATP w kompleksie F,
(ryc. 13-7 i 13-8). Zachodzi to zgodnie z mecha¬
nizmem zmiany wiązania, według którego kon¬
formacja podjednostek [3 w kompleksie F, zmie¬
nia się w czasie obrotu osi z konformacji mocno
13. ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA 131
Przestrzeń
międzybłonowa
Mitochondrialna
błona
wewnętrzna
Macierz
mitochondrialna
Bursztynian Fumaran
Ryc. 13-7. Chemiosmotyczna teoria fosforylacji oksydacyjnej. Kompleksy I, III i IV funkcjonują jako pompy protonowe wytwarzające
w poprzek błony gradient protonów (ładunek ujemny po stronie macierzy). Siła protomotoryczna, gdy zachodzi powrotny przepływ
protonów do macierzy, napędza syntezę ATP katalizowaną przez syntazę ATP (p. ryc. 13-8). Związki rozprzęgające zwiększają przepusz¬
czalność błony dla jonów, umożliwiając przepływ H+ przez błonę bez udziału syntazy ATP Obniżając w ten sposób gradient protonów,
rozprzęgają transport elektronów w łańcuchu oddechowym od procesów syntezy ATP Q - koenzym Q lub ubichinon, cyt - cytochrom.
Ryc. 13-8. Mechanizm wytwarzania ATP
przez syntazę ATP. W skład kompleksu
enzymatycznego wchodzi subkompleks
Fo, który ma postać krążka złożonego
z białkowych podjednostek „C”. Do niego
jest przyłączona podjednostka y w kształ¬
cie „nachylonej osi”. Przepływ protonów
przez podjednostki „C” powoduje, że
krążek obraca się wraz z podjednostką y.
Podjednostka y jest dopasowana do sub-
kompleksu F1t składającego się z trzech
podjednostek a i trzech podjednostek p,
które przylegają do błony i nie obracają
się. Kolejne podjednostki p pobierają ADP
i Pi do produkcji ATR który zostanie uwol¬
niony, gdy obracająca się podjednostka y
spowoduje obrót podjednostki p i zmianę
jej konformacji. W ten sposób powstają
trzy cząsteczki ATP przy każdym obrocie
Fi. Aby nie zaciemniać ryciny, nie przed¬
stawiono wszystkich znanych podjedno¬
stek - np. „oś” zawiera również podjed-
nostkę e.
Wewnętrzna
błona
mitochondrialna
132 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
wiążącej ATP na konformację uwalniającą ATP
i wiążącą ADP oraz P4. Dzięki temu może zostać
utworzona następna cząsteczka ATP. Z obliczeń
wynika, że na każdą cząsteczkę NADH ulegającą
utlenieniu kompleks I i III przenosi po cztery pro¬
tony, a kompleks IV tylko dwa.
ŁAŃCUCH ODDECHOWY DOSTARCZA
WIĘKSZOŚĆ ENERGII WYCHWYTYWANEJ
PODCZAS KATABOLIZMU
ADP przechwytuje, w postaci wysokoenergetycz¬
nych fosforanów, znaczną część entalpii swo¬
bodnej uwalnianej w procesach katabolicznych.
Powstające ATP jest nazywane walutą komórki,
ponieważ przekazuje entalpię swobodną do pro¬
cesów, które wymagają jej zużycia (ryc. 11-6).
W procesie glikolizy z 1 mola glukozy powstają
netto dwa mole wysokoenergetycznych grup fo¬
sforanowych (tab. 18-1). Kolejne dwa mole wyso¬
koenergetycznego fosforanu na 1 mol glukozy po¬
wstają w cyklu kwasu cytrynowego podczas prze¬
miany sukcynylo-CoA w bursztynian. Wszystkie
te fosforylacje zachodzą na poziomie substratu.
Kiedy substraty (np. NADH) są utleniane przez
kompleksy I, III i IV w łańcuchu oddechowym,
powstaje 2,5 mola ATP na 0,5 mola zużytego 02;
zatem P : O = 2,5 (ryc. 13-7). Kiedy natomiast
substrat (np. bursztynian lub glicerolo-3-fosforan)
jest utleniany kolejno przez kompleksy II, III i IV,
powstaje tylko 1,5 mola ATP; zatem P : O = 1,5.
Reakcje te są nazywane fosforylacjami oksyda¬
cyjnymi na poziomie łańcucha oddechowego.
Na podstawie tych wartości można oszacować, że
prawie 90% wysokoenergetycznych fosforanów
powstających w wyniku całkowitego spalenia
1 mola glukozy uzyskuje się w procesie fosfory¬
lacji oksydacyjnej sprzężonej z łańcuchem odde¬
chowym (tab. 18-1).
Kontrola oddechowa zapewnia ciagte
dostarczanie ATP
W mitochondriach szybkość oddychania może
być regulowana poprzez dostępność ADP. Jest
to możliwe, ponieważ utlenianie i fosforylacja
są ze sobą ściśle sprzężone, tzn. utlenianie w łań¬
cuchu oddechowym nie może zachodzić bez to¬
warzyszącej temu procesowi fosforylacji ADP.
W tabeli 13-1 przedstawiono pięć stanów meta¬
bolicznych kontrolujących szybkość oddychania
w mitochondriach. Większość komórek w stanie
spoczynkowym znajduje się w stanie 4, a oddy¬
chanie jest regulowane poprzez dostępność ADP.
W czasie wykonywania pracy następuje przemia¬
na ATP w ADP, co powoduje wzrost szybkości
oddychania i w rezultacie prowadzi do uzupełnie¬
nia zapasu ATP. W pewnych warunkach stężenie
fosforanu nieorganicznego może także wpływać
na szybkość funkcjonowania łańcucha oddecho¬
wego. Jeśli szybkość oddychania wzrasta (np.
podczas wysiłku fizycznego), komórka osiąga 3.
lub 5. stan metaboliczny; w tym czasie wydajność
łańcucha oddechowego osiąga stan wysycenia
albo Pq2 spada do wartości niższych niż wartość
A^m dla hemu a3. Możliwe jest również, że trans¬
porter ADP/ATP, który ułatwia wchodzenie cyto-
zolowego ADP do mitochondrium i wychodzenie
ATP, staje się czynnikiem ograniczającym szyb¬
kość fosforylacji oksydacyjnej.
Tabela 13-1. Stany kontroli oddechowej
Czynniki ograniczające szybkość oddychania
Stan 1
Dostępność ADP i substratu
Stan 2
Dostępność tylko substratu
Stan 3
Wydajność samego łańcucha oddechowego,
gdy wszystkie substraty i składniki występują
w stężeniach nasyconych
Stan 4
Dostępność tylko ADP %
Stan 5
Dostępność tylko tlenu
Procesy utleniania biologicznego, w których
entalpia swobodna spalania składników pokar¬
mowych staje się dostępna i może być groma¬
dzona, przebiegają raczej stopniowo, są wydajne
i podlegają kontroli, w odróżnieniu od procesów
niebiologicznych przebiegających wybuchowo,
nie wydaj nie i w sposób niekontrolowany. Pozo¬
stała entalpia swobodna, która nie jest gromadzo¬
na w postaci wysokoenergetycznego fosforanu,
uwalnia się jako ciepło. Nie oznacza to, że energia
została „stracona”, ponieważ dzięki temu proceso¬
wi układ oddechowy jako całość jest wystarczają¬
co egzoergiczny, aby być w stanie nierównowagi
i umożliwić tym samym ciągły, jednokierunkowy
przepływ elektronów i stałe zaopatrywanie w ATP.
Przyczynia się to także do utrzymania odpowied¬
niej temperatury ciała.
13. ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA 133
ŁAŃCUCH ODDECHOWY MOŻE BYĆ
HAMOWANY PRZEZ WIELE TRUCIZN
Sporo informacji dotyczących łańcucha odde¬
chowego uzyskano po zastosowaniu inhibitorów,
i odwrotnie, badania dotyczące działania łańcu¬
cha oddechowego dostarczyły wiedzy o mechani¬
zmach działania wielu trucizn (ryc. 13-9). Związ¬
ki te mogą być podzielone na inhibitory łańcucha
oddechowego, inhibitory fosforylacji oksydacyj¬
nej i związki rozprzęgające fosforylację oksyda¬
cyjną.
Barbiturany, takie jak amobarbital, hamują
transport elektronów przez kompleks I, blokując
przeniesienie ich z Fe-S na CoQ. In vivo dosta¬
teczna dawka wywołuje skutki śmiertelne. Anty-
mycyna A i dimerkaprol hamują łańcuch odde¬
chowy na poziomie kompleksu III. Klasyczne tru¬
cizny, takie jak H2S, tlenek węgla albo cyjanek,
hamują kompleks IV i mogą całkowicie zatrzy¬
mać oddychanie. Malonian jest kompetycyjnym
inhibitorem kompleksu II.
Atraktylozyd hamuje oksydacyjną fos fory lację
przez hamowanie przenośnika nukleotydów ade-
ninowych, odpowiedzialnego za transport ADP
do mitochondrium i wychodzenie ATP do cytozo-
lu(ryc. 13-10).
Związki rozprzęgające rozdzielają oddycha¬
nie w łańcuchu oddechowym i proces fosforylacji
(ryc. 13-7). In vivo związki te są toksyczne i powo¬
dują, że przebieg oddychania jest niekontrolowa¬
ny, ponieważ szybkość tego procesu przestaje być
ograniczana przez stężenie ADP i Pj. Najczęściej
używanym związkiem rozprzęgającym jest 2,4-
-dinitrofenol, ale inne związki działają w podob¬
ny sposób. Termogenina (białko rozprzęgające)
jest fizjologicznym związkiem rozprzęgającym,
który występuje w brunatnej tkance tłuszczowej.
Funkcją termogeniny jest utrzymanie ciepła ciała,
szczególnie u noworodków i zwierząt ulegają¬
cych hibernacji (rozdz. 25). Antybiotyk oligomy-
cyna całkowicie blokuje utlenianie i fosforylację,
hamując przepływ protonów przez syntazę ATP
(ryc. 13-9).
TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA
POZWALA WYJAŚNIĆ KONTROLE
ODDECHOWA I DZIAŁANIE ZWIĄZKÓW
ROZPRZEGAJACYCH
Różnica potencjału elektrochemicznego w poprzek
błony, wytworzona w wyniku przeniesienia proto¬
nów, hamuje transport kolejnych równoważników
Bursztynian -
Kompleks I
Kompleks II
FAD
Fe-S
NADH
FMN, Fe-S
4
Związki rozprzęgające
Oligomycyna
Pierycydyna A
Amobarbital
Rotenon
Karboksyna
TTFA
BAL
Antymycyna A
Kompleks III I
Cyt b, Fe-S, Cyt c-j n— Cyt c
O
H2S
CO
CN”
Kompleks IV |
Cyt a
Cyta3
Cu
Cu
i Związki rozprzęgające i
^ Oligomycyna
/?yc. 13-9. Proponowane miejsca hamowania (©) łańcucha oddechowego przez niektóre leki, substancje chemiczne i antybiotyki. Za¬
znaczono „miejsce sprzęgające", które - tworząc gradient protonowy - wspierają fosforylację. BAL (dimerkaprol); TTFA jest czynnikiem
chelatującym Fe. Kompleks I - oksydoreduktaza NADH: ubichinon; kompleks II - oksydoreduktaza bursztynian : ubichinon; kompleks
III - oksydoreduktaza ubichinon: utleniony cytochrom c; kompleks IV - oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c: tlen. Inne skróty
jak na ryc. 13-5.
134 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
redukujących przez łańcuch oddechowy, chyba że
zostanie rozładowana przez zwrotną translokację
protonów przez błonę z pomocą syntazy ATP. Ta
z kolei zależy od dostępności ADP i Pj.
Związki rozprzęgające (np. dinitrofenol) mają
właściwości amfipatyczne (rozdz. 15) i zwiększa¬
ją przepuszczalność lipidowej wewnętrznej błony
mitochondrialnej dla protonów, obniżając w ten
sposób potencjał elektrochemiczny i wywołu¬
jąc „krótkie spięcie” w syntazie ATP (ryc. 13-7).
W rezultacie, utlenianie może przebiegać bez fo¬
sforylacji.
Wewnętrzna
NA ZEWNĄTRZ błona WEWNĄTRZ
mitochondrialna
Ryc. 13-10. Układy przenośnikowe w błonie mitochondrialnej.
1 - przenośnik fosforanowy, 2 - sprzężony transport (sym-
port) pirogronianu, 3 - przenośnik anionów dikarboksylowych,
4 - przenośnik anionów trikarboksylowych, 5 - przenośnik
a-ketoglutaranowy, 6 - przenośnik nukleotydów adeninowych.
Zaznaczono miejsca hamowania (©) przez /V-etylomaleimid, hy-
droksycynamonian i atraktylozyd. W błonie znajdują się również
(nie pokazano) przenośniki: glutaminianowo-asparaginianowy
(ryc. 13-13), glutaminowy, ornitynowy, aminokwasów obojęt¬
nych i karnitynowy (ryc. 22-1).
WZGLĘDNA NIEPRZEPUSZCZALNOŚĆ
WEWNĘTRZNEJ BŁONY
MITOCHONDRIALNEJ NARZUCA
POTRZEBĘ ISTNIENIA
PRZENOŚNIKÓW-WYMIENIACZY
Systemy dyfuzji wymiennej, obejmujące biał¬
ka transportujące, znajdują się w błonie i mają
za zadanie wzajemną wymianę przeciwprądo-
wą anionów z OH oraz kationów z H+. Każdy
z tych systemów jest niezbędny do zachowania
równowagi elektrycznej i osmotycznej podczas
pobierania i uwalniania zjonizowanych meta¬
bolitów. Wewnętrzna błona mitochondrialna swo¬
bodnie przepuszcza elektrycznie obojętne małe
cząsteczki, takie jak tlen, woda, C02 i NH3 oraz
kwasy monokarboksylowe, takie jak kwas 3-hy-
droksymasłowy, acetooctowy i octowy. Długo-
łańcuchowe kwasy tłuszczowe są przenoszone
do mitochondriów jako pochodne kamityny (ryc.
22-1), a specjalny przenośnik w wewnętrznej bło¬
nie mitochondrialnej umożliwia sprzężony trans¬
port pirogronianu z H+ (symport), co jest równo¬
znaczne z zużyciem transbłonowego gradientu
protonów (ryc. 13-10). Aniony dikarboksylowe
i trikarboksylowe oraz aminokwasy wymagają
swoistych przenośników lub systemów transpor¬
tujących ułatwiających ich transport przez błonę.
Kwasy monokarboksylowe przenikają przez bło¬
nę łatwiej w formie niezdysocjowanej i bardziej
lipofilowej.
Transport anionów di- i trikarboksylowych jest
ściśle związany z przenoszeniem fosforanu nieor¬
ganicznego. Ten ostatni łatwo przechodzi przez
błonę jako jon H2P04 wymieniając się z OH .
Pobranie jabłczanu przez przenośnik anionów
dikarboksylowych wymaga wymiany fosfora¬
nu nieorganicznego po przeciwnej stronie błony.
Pobranie cytrynianu, izocytrynianu lub c/s-ako-
nitanu przez przenośnik anionów trikarboksylo¬
wych wymaga wymiany z jabłczanem. Transport
a-ketoglutaranu również zachodzi na zasadzie
wymiany z jabłczanem. Przenośnik nukleotydów
adeninowych umożliwia wymianę ATP z ADP,
ale nie z AMP. Pozwala on wyjść cząsteczce
ATP z mitochondrium do pozamitochondrialnych
miejsc zużywających energię oraz zapewnia po¬
wrót ADP do wnętrza mitochondrium, gdzie służy
do syntezy ATP (ryc. 13-11). Ponieważ w procesie
13. ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA 135
przenoszenia z macierzy mitochondrialnej zostają
usunięte cztery ładunki ujemne na trzy pobrane,
transbłonowy elektrochemiczny gradient proto¬
nów faworyzuje eksport ATP. Na+ może wymie¬
niać się z H+, do czego jest wykorzystywany gra¬
dient protonów. Uważa się, że aktywny transport
Ca2+ do mitochondriów zachodzi z przemieszcze¬
niem jednego ładunku (uniport), prawdopodobnie
na zasadzie antyportu Ca2+/H+. Uwalnianie wap¬
nia z mitochondriów jest ułatwione dzięki wymia¬
nie z Na+.
Wewnętrzna
NA ZEWNĄTRZ błona WEWNĄTRZ
mitochondrialna
F1 1
^^ 1 SYNTAZA ATP
y / 7 n
ATP4-
J
\
DP3'
t A
ó)
* n+
Ryc. 13-11. Współdziałanie przenośnika fosforanowego (1)
z przenośnikiem nukleotydów adeninowych (2) podczas synte¬
zy ATR Przedstawiony sprzężony transport (symport) H7P, jest
odpowiednikiem przeciwtransportu (antyport) P,/0H~.
Jonofory ułatwiają swoistym kationom
transport przez błonę
Jonofory sąlipofilowymi cząsteczkami zdolnymi
do kompleksowania swoistych kationów i uła¬
twiania ich transportu przez błony biologiczne;
przykładem jest walinomycyna, umożliwiająca
przenikanie K+ przez błonę mitochondrialną.
Klasyczne związki rozprzęgające, takie jak dini-
trofenol, są w rzeczywistości jonoforami proto¬
nowymi.
Transhydrogenaza transportująca H+ jest
źródłem wewnatrzmitochondrialnego
NADPH
Znajdująca się w wewnętrznej błonie mitochon¬
drialnej, zależna od energii, transhydrogenaza
sprzęga przemieszczenie protonów ze środowiska
zewnętrznego do wnętrza mitochondrium z prze¬
niesieniem wodoru z wewnątrzmitochondrialnego
NADH na NADP+, tworząc NADPH niezbędne
dla enzymów wewnątrzmitochondrialnych, takich
jak dehydrogenaza glutaminianowa i hydroksyla-
zy uczestniczące w syntezie steroidów.
Utlenianie pozamitochondrialnego
NADH odbywa się za pośrednictwem
„wahadłowców” substratowych*
Wewnętrzna błona mitochondrialna nie jest prze¬
puszczalna dla NADH, który jest stale wytwarza¬
ny w cytozolu przez dehydrogenazę gliceraldehy-
do-3-fosforanową- enzym szlaku glikolitycznego
(ryc. 18-2). W warunkach tlenowych pozamito-
chondrialny NADH nie gromadzi się jednak, gdyż
ulega przypuszczalnie utlenieniu w mitochondrial-
nym łańcuchu oddechowym. Przeniesienie
równoważników redukujących przez błonę mi¬
tochondrialną wymaga udziału par substratów,
sprzężonych odpowiednimi dehydrogenazami po
obu stronach błony mitochondrialnej. Na rycinie
13-12 przedstawiono mechanizm przenoszenia
przy udziale „wahadłowca” glicerołofosfora-
nowego. Ponieważ enzym mitochondrialny jest
sprzężony z łańcuchem oddechowym za pośred¬
nictwem flawoproteiny, a nie NAD+, zostanie
wytworzone tylko 1,5, a nie 2,5 mola ATP na 0,5
mola zużytego 02. Chociaż obecność tego ukła¬
du wahadłowego wykazano w niektórych tkan¬
kach (np. w mózgu, w mięśniu białym), to jednak
w innych narządach (np. w mięśniu sercowym)
stwierdza się niedobór mitochondrialnej dehydro¬
genazy glicerolo-3-fosforanowej. Dlatego uważa
się, że bardziej uniwersalny jest „wahadłowiec”
jabłczanowo-asparaginianowy (układ wahad¬
łowy jabłczan : asparaginian) przedstawiony
na ryc. 13-13. Złożoność tego układu wynika
z nieprzepuszczalności wewnętrznej błony mito-
* Inne nazwy to „promy” lub „czółenka” (włókienni¬
cze) [przyp. tłum.].
136 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
CYTOZOL
BŁONA
ZEWNĘTRZNA
MITOCHONDRIUM
BŁONA
WEWNĘTRZNA
FADH2
ł
Łańcuch oddechowy
Ryc. 13-12. „Wahadłowiec” glicerolofosforanowy transportujący równoważniki redukujące z cytozolu do mitochondrium.
chondrialnej dla szczawiooctanu. Szczawiooc-
tan, kosztem glutaminianu, musi najpierw ulec
transaminacji do asparaginianu, z którego po jego
przejściu przez błonę mitochondrialną zostanie
w cytozolu odtworzony szczawiooctan.
Transport jonów w mitochondriach
jest procesem zależnym od energii
Mitochondria utrzymują lub gromadzą kationy,
takie jak K+, Na+, Ca2+ i Mg2+ oraz Pj. Przyjmu¬
je się, że wymianę kationów napędza pierwotna
pompa protonowa.
„Wahadłowiec” fosfokreatynowy ułatwia
transport wysokoenergetycznych
fosforanów z mitochondriów
„Wahadłowiec” fosfokreatynowy (ryc. 13-14)
działa jako dynamiczny system transportu fos¬
foranu wysokoenergetycznego z mitochondriów
w aktywnych tkankach, np. mięśniu sercowym
lub mięśniach szkieletowych. Fosfokreatyna pełni
w tym systemie funkcję buforu energetycznego.
Izoenzymy kinazy kreatynowej (CKm) znajdują
się w mitochondrialnej przestrzeni międzybło-
nowej. Katalizują one reakcję przeniesienia na
CYTOZOL BŁONA MITOCHONDRIUM
Ryc. 13-13. „Wahadłowiec” jabłczanowo-asparaginianowy przenoszący równoważniki redukujące z cytozolu do mitochondrium.
© - przenośnik a-ketoglutaranowy; ® - przenośnik glutaminianowo-asparaginianowy (przenoszący z glutaminianem proton, sym-
port).
13. ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA 137
Procesy wymagające
Ryc. 13-14. „Czółenko” fosfokreatynowe mięśnia sercowego
i szkieletowego. Umożliwia ono szybki transport wysokoener¬
getycznego fosforanu z macierzy mitochondrialnej do cytozolu.
(CKa - kinaza kreatynowa ułatwiająca przebieg procesów wyma¬
gających znacznych ilości ATR takich jak np. skurcz mięśniowy;
CKc - kinaza kreatynowa utrzymująca równowagę między krea-
tyną i fosfokreatyną a ATP/ADP; CKg - kinaza kreatynowa sprzę¬
gająca glikolizę z syntezą fosfokreatyny; CKm - mitochondrialna
kinaza kreatynowa uczestnicząca w produkcji fosfokreatyny
z ATP tworzonego w procesie fosforylacji oksydacyjnej; P - por
białkowy w zewnętrznej błonie mitochondrialnej).
kreatynę fosforanu wysokoenergetycznego z ATP
opuszczającego przenośnik nukleotydów adeni-
nowych. Powstała w tej reakcji fosfokreatyna jest
następnie transportowana przez pory białkowe
w zewnętrznej błonie mitochondrialnej do cyto¬
zolu, gdzie może być użyta do tworzenia pozami-
tochondrialnego ATP.
ASPEKTY KLINICZNE
Niedobory lub brak większości oksydoreduk-
taz łańcucha oddechowego są przyczyną śmier¬
telnej miopatii mitochondrialnej niemowląt
i dysfunkcji nerek. MELAS (mitochondrialna
encefalopatia, kwasica mleczanowa i udar) jest
dziedzicznym zespołem chorobowym, które¬
go przyczyną jest niedobór oksydo-reduktazy
NADH:ubichinon (kompleks I) lub oksydazy cy-
tochromowej (kompleks IV). Jest to jedna z wie¬
lu chorób, których przyczyną są mutacje w mito-
chondrialnym DNA. Przypuszcza się, że z tego
typu mutacjami związane są choroba Alzheimera
i cukrzyca. Wiele leków i trucizn biologicznych
wywiera swój efekt przez hamowanie fosforylacji
oksydacyjnej.
STRESZCZENIE
• Praktycznie cała entalpia swobodna uwalniana
podczas utleniania węglowodanów, tłuszczów
i białek jest gromadzona w mitochondriach w po¬
staci równoważników redukujących (—H lub
e“). Są one kierowane do łańcucha oddechowe¬
go, w którym wędrują zgodnie z rosnącym po¬
tencjałem oksydo-redukcyjnym przenośników
do końcowego akceptora, tj. tlenu. W reakcji
z tlenem powstaje woda.
• Przenośniki redoks sązgrupowane w wewnętrznej
błonie mitochondrialnej w cztery kompleksy
łańcucha oddechowego. Trzy z czterech kom¬
pleksów, zużywając energię uwalnianą podczas
transportu elektronów, przepompowują protony
na zewnątrz błony mitochondrialnej. W wyniku
działania pomp protonowych powstaje transbło-
nowa różnica potencjału elektrochemicznego.
• Syntaza ATP umocowana w błonie działa jak
motor rotacyjny, zużywając potencjał energe¬
tyczny gradientu protonowego lub siłę proto-
motoryczną do syntezy ATP z ADP i P{ . W ten
sposób utlenianie jest ściśle sprzężone z fosfo¬
ry lacją, aby sprostać potrzebom energetycznym
komórki.
• Ponieważ wewnętrzna błona mitochondrialna
jest nieprzepuszczalna dla protonów i innych
jonów, w błonie znajdują się swoiste przenoś-
niki-wymieniacze, które umożliwiają przejście
jonom, takim jak OH , ATP4-, ADP3-, i meta¬
bolitom bez rozładowania transbłonowego gra¬
dientu elektrochemicznego.
• Wiele znanych trucizn, np. cyjanki, zatrzymuje
oddychanie przez hamowanie łańcucha odde¬
chowego.
138 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
PIŚMIENNICTWO
Winkle PC et al.: P/O ratios of mitochondria oxidati-
ve phosphorylation. Biochem Biophys Acta 2005;
1706:1.
Mitchell P: Keilin’s respiratory chain concept and its che-
miosmotic conseąuences. Science 1979;206:1148.
Schultz BE, Chan SI: Structures and proton-pumping
strategies of mitochondrial respiratory enzymes.
Annu Rev Biophys Biomol Struct 2001 ;30:23.
Smeitink J et al: The genetics and pathology of oxi-
dative phosphorylation. Nat Rev Genet 2001;
2:342.
Tyler DD: The Mitochondrion in Health and Disease.
VCH Publishers, 1992.
Wallace DC: Mitochondrial DNA in aging and disease.
SciAm 1997;277:22.
Yoshida M et al: ATP synthase - a marvelous ro-
tary engine of the celi. Nat Rev Mol Celi Biol
2001;2:669.
Węglowodany
o znaczeniu fizjologicznym
I
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Węglowodany (cukry) są bardzo rozpowszech¬
nione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Od¬
grywają one rolę zarówno strukturalną, jak
i metaboliczną. W roślinach glukoza jest syn¬
tetyzowana z ditlenku węgla i wody w procesie
fotosyntezy i przechowywana w postaci skrobi
lub ulega przekształceniu w celulozę (błonnik)
ścian komórek roślinnych. Zwierzęta mogą syn¬
tetyzować węglowodany z aminokwasów, ale
większa część węglowodanów zwierzęcych jest
pochodzenia roślinnego. Glukoza jest najważ¬
niejszym węglowodanem, ponieważ większość
węglowodanów zawartych w pokarmach jest
wchłaniana do krwiobiegu jako glukoza lub jest
w nią przekształcana w wątrobie, a w organizmie
z glukozy mogą powstać wszystkie inne cukry.
Glukoza jest bogatym źródłem energii w tkan¬
kach ssaków (z wyjątkiem przeżuwaczy) i uni¬
wersalnym „paliwem” dla płodu. Jest ona prze¬
kształcana w inne cukry, odgrywające swoiste
role, np. glikogen stanowiący materiał zapaso¬
wy, rybozę i deoksyrybozę wchodzące w skład
kwasów nukleinowych, galaktozę występującą
w laktozie mleka, w pewnych lipidach złożonych
oraz w połączeniu z białkami w glikoproteinach
i proteoglikanach. Do chorób związanych z za¬
burzeniami przemiany węglowodanów zalicza
się cukrzycę, galaktozemię, zaburzenia spich-
rzania glikogenu i nietolerancję laktozy.
WĘGLOWODANY SA ALDEHYDOWYMI LUB
KETONOWYMI POCHODNYMI ALKOHOLI
POLIHYDROKSYLOWYCH
Węglowodany klasyfikuje się następująco:
1. Monosacharydy są to węglowodany, któ¬
re nie ulegają hydrolizie do cukrów prostszych.
Na podstawie liczby atomów węgla można je
podzielić na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy
i heptozy, a zależnie od obecności grupy alde¬
hydowej lub ketonowej na aldozy i ketozy. Przy¬
kłady monosacharydów podano w tab. 14-1.
Tabela 14-1. Klasyfikacja ważniejszych cukrów
Cukry
Aldozy
Ketozy
Triozy (C3H603)
Gliceroza
(aldehyd glicerynowy)
Dihydroksyaceton
Tetrozy (C4HB04)
Erytroza
Erytruloza
Pentozy (C5H10O5)
Ryboza
Rybuloza
Heksozy (C6H|206)
Glukoza
Fruktoza
Heptozy (C?H,407)
-
Sedoheptuloza
Obok aldehydów i ketonów, w żywności wy¬
stępują alkohole polihydroksylowe (alkohole
cukrowe, poliole), w których grupa aldehydowa
lub ketonowa została zredukowana do grupy al¬
koholowej. Poliole, wytwarzane przez redukcję
monosacharydów, są składnikami produktów
bezcukrowych i dietetycznych, używanych przez
diabetyków lub osoby chcące zredukować masę
ciała.
2. Disacharydy są produktami kondensacji
dwóch jednostek monosacharydowych. Przykła¬
dami są maltoza i sacharoza.
140 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
3. Oligosacharydy są produktami kondensacji
2-10 jednostek monosacharydowych. Większość
z nich nie jest trawiona przez enzymy ludzkie.
4. Polisacharydy są produktami kondensacji
ponad 10 cząsteczek monosacharydów; przy¬
kładami są skrobie i dekstryny, które mogą być
polikondensatami liniowymi lub rozgałęzionymi.
Niekiedy polisacharydy dzieli się na heksozany
lub pentozany, w zależności od składników mo¬
nosacharydowych. Oprócz skrobi i dekstryn, żyw¬
ność zawiera wiele innych polisacharydów, które
określa się zwykle jako polisacharydy nieskrobio-
we. Przykładem są błonnik (polimer glukozowy),
występujący w ścianach komórek roślinnych,
oraz inulina (polimer fruktozowy) - węglowodan
zapasowy w niektórych roślinach; polisacharydy
te nie są trawione przez enzymy ludzkie.
POD WZGLĘDEM BIOMEDYCZNYM
NAJWAŻNIEJSZYM MONOSACHARYDEM
JEST GLUKOZA
Struktura glukozy może być
przedstawiona trzema sposobami
O ile wzór strukturalny glukozy w formie pro¬
stego łańcucha (aldoheksoza, ryc. 14-1 A) po¬
zwala zrozumieć niektóre właściwości glukozy,
0 tyle struktura cykliczna (hemiacetal powstały
w reakcji grupy aldehydowej z grupą hydroksy¬
lową) -jako termodynamicznie uprzywilejowana
- warunkuje jej pozostałe właściwości. Cyklicz¬
na struktura glukozy może być przedstawiona
w postaci płaskiego pierścienia narysowanego
perspektywicznie, jak to zaproponował Haworth
(ryc. 14-1B). Cząsteczka jest tu widoczna z boku
1 z góry płaszczyzny pierścienia. Zgodnie z kon¬
wencją, wiązania najbliższe względem oglądają¬
cego są pogrubione, a grupy hydroksylowe znaj¬
dują się powyżej lub poniżej płaszczyzny pier¬
ścienia. Sześcioczłonowy pierścień, zawierający
jeden atom tlenu, w rzeczywistości istnieje w for¬
mie krzesełkowej (ryc. 14-1C).
Cukry występują w formie
różnych izomerów
Glukoza, zawierająca cztery asymetryczne atomy
węgla, ma 16 izomerów. Ważniejsze rodzaje izo¬
merów glukozy to:
A 0
II
1C -H
I
H - 2C - OH
I
HO - 3C - H
I
H - 4C - OH
I
H - 5C - OH
I
6CH20H
6
Ryc. 14-1. D-Glukoza. A - forma łańcuchowa,
B - a-D-glukoza; wzór rzutowy Hawortha,
C - a-D-glukoza; konformacja krzesełkowa.
1. Izomery konfiguracyjne d i l. Określenie
izomeru jako formy d lub jej lustrzanego odbicia
jako formy l jest uwarunkowane przestrzennym
podobieństwem do macierzystego związku ro¬
dziny węglowodanów, trój węglowego cukru
- aldehydu glicerynowego (glicerozy). Formy l
i d tego cukru, wraz z odpowiadającymi im izo¬
merami glukozy, przedstawiono na ryc. 14-2.
Ustawienie grup —H i —OH wokół atomu wę¬
gla przylegającego do końcowego atomu węgla
pierwszorzędowego alkoholu (tj. piątego atomu
węgla w glukozie) warunkuje przynależność cu¬
kru do szeregu d lub l. Jeżeli grupa —OH przy
tym atomie węgla (atomie odniesienia) znajduje
się po jego prawej stronie (jak to przedstawiono
na ryc. 14-2), to cukier należy do szeregu d, a je¬
śli grupa —OH znajduje się po stronie lewej, to
cukier należy do szeregu l. Większość monosa¬
charydów występujących u ssaków ma konfigu¬
rację d, a enzymy warunkujące ich metabolizm
są swoiste dla tej konfiguracji.
14. WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 141
0
0
II
II
1C — H
|
C —H
i
HO - 2C -H
|
I
H — C — OH
i
3CH2OH
I
ch2oh
Aldehyd L-glicerynowy
Aldehyd D-glicerynowy
(L-Gliceroza)
(D-Gliceroza)
Piran Furan
Ryc. 14-2. D- i L-lzomery aldehydu glicerynowego i glukozy.
Obecność asymetrycznych atomów węgla na¬
daje cząsteczce aktywność optyczną. Jeśli stru¬
mień światła spolaryzowanego przechodzi przez
roztwór izomeru optycznego, to płaszczyzna
polaryzacji przechodzącego światła może zo¬
stać skręcona w prawo - prawoskrętność (+), lub
w lewo - lewoskrętność (-). Związek może być
oznaczony d(-), d(+), l(-) lub l(+). Na przykład
występującą w naturze formą fruktozy jest izomer
d(—). Rotacja optyczna obserwowana w roztwo¬
rach glukozy jest prawoskrętna; z tego powodu
w praktyce klinicznej niekiedy używa się nazwy
dekstroza zamiast glukoza.
2. Piranozowe i furanozowe formy pierścienio¬
we. Struktury pierścieniowe monosacharydów są
podobne do struktury pierścienia piranu (pierścień
sześcioczłonowy) lub furanu (pierścień pięcioczło-
nowy) (ryc. 14-3 i 14-4). W przypadku znajdującej
się w roztworze glukozy ponad 99% jej cząsteczek
znajduje się w postaci piranozowej.
3. Anomery alfa i beta. Struktura pierścienio¬
wa aldozy jest hemiacetalowa, ponieważ została
utworzona w wyniku reakcji grupy aldehydowej
z grupą alkoholową. Podobnie pierścieniowa
struktura ketozy jest hemiketalowa. Krystalicz¬
na glukoza jest a-D-glukopiranozą. W roztwo¬
rze struktura cykliczna zostaje zachowana, ale
następuje izomeryzacja przy pierwszym atomie
a-D-Fruktofuranoza p-D-Fruktofuranoza
Ryc. 14-4. Postacie piranozowa i furanozowa fruktozy.
węgla - karbonylowym lub anomerycznym ato¬
mie węgla. W wyniku tego powstaje mieszanina
a-glukopiranozy (38%) i (3-glukopiranozy (62%).
Mniej niż 0,3% jest reprezentowane przez anome¬
ry a i p glukofuranozy.
4. Epimery. Izomery różniące się konfiguracją
grup —OH i —H przy atomach węgla 2, 3 lub
4 glukozy są nazywane jej epimerami. Najważ¬
niejszymi pod względem biologicznym epimera-
142 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
hoch2
-0
hoch2
-0
hoch2
— 0
ho/h
\H
H /w
\h
w/w
\h
h\oh
H/oh
oh\oh
H/oH
0h\ OH
hoToh
H
OH
H
■f2
OH
H
2
H
a-D-Galaktoza
a-D-Glukoza
a-o-Mannoza ffyc. 14-5. Epimeryzacja glukozy.
mi glukozy są mannoza i galaktoza, powstające
w wyniku epimeryzacji, odpowiednio, przy ato¬
mie węgla 2 i 4 (ryc. 14-5).
5. Izomery aldoza-ketoza. Fruktoza ma ten
sam wzór cząsteczkowy co glukoza, lecz róż¬
ni się od niej wzorem strukturalnym. Fruktoza
zawiera potencjalną grupę ketonową w pozycji
2 (ryc. 14-4 i 14-7), natomiast glukoza zawiera
potencjalną grupę aldehydową w pozycji 1 (ryc.
14-2 i 14-6).
Wiele monosacharydów to związki ważne
pod względem fizjologicznym
Pochodne trioz, tetroz, pentoz i cukru siedmiowę-
glowego (sedoheptulozy) powstają jako metaboli¬
ty pośrednie w trakcie degradacji glukozy w pro¬
cesie glikolizy i w szlaku pentozofosforanowym.
Pentozy są istotnym składnikiem nukleotydów,
kwasów nukleinowych i wielu koenzymów (tab.
14-2). Z heksoz najważniejsze znaczenie fizjolo¬
giczne mają: glukoza, galaktoza, fruktoza i man¬
noza (tab. 14-3). Na rycinie 14-6 przedstawiono
strukturę ważnych pod względem biochemicznym
aldoz, a na ryc. 14-7 - strukturę ważnych ketoz.
Istotną rolę odgrywają karboksylowe pochodne
glukozy, takie jak D-glukuronian (uczestniczący
w tworzeniu glukuronidów i glikozoaminoglika-
nów) i jego pochodne metaboliczne: L-iduronian
(składnik glikozoaminoglikanów) (ryc. 14-8)
i L-gulonian (metabolit szlaku kwasu uronowe-
go; ryc. 21-4).
CHO
CHO
CHO
CHO
CHO
I
H-C-OH
CHO
I
HO-C-H
CHO
I
H-C-OH
CHO
1
CHO
I
HO-C-H
H-C-OH
HO-C-H
I
H-C-OH
HO-C-H
HO-C-H
HO-C-H
H-C-OH
HO-C-H
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
HO-C-H
I
H-C-OH
I
H-C-OH
I
H - C - OH
I
I
I
I
I
1
CH20H
D-Gliceroza
H-C-OH
I
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
ch2oh
CH20H
CH20H
CH20H
CH20H
CH20H
CH20H
CH20H
(D-gliceraldehyd) D-Erytroza o-Liksoza D-Ksyloza
Ryc. 14-6. Przykłady aldoz o znaczeniu fizjologicznym.
D-Arabinoza
D-Ryboza
D-Galaktoza
D-Mannoza
D-Glukoza
ch2oh
CH20H
CH20H
CH20H
C = 0
C = 0
I
HO-C-H
i = o
Ć=0
HO-C-H
H-C-OH
ch2oh
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
ę = o
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
ch2oh
CH20H
CH20H
CH20H
CH20H
Dihydroksyaceton
D-Ksyluloza
D-Rybuloza
D-Fruktoza
D-Sedoheptuloza
Ryc. 14-7. Przykłady ketoz o znaczeniu fizjologicznym.
14. WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 143
Tabela 14-2. Pentozy o znaczeniu fizjologicznym
Cukier
Występowanie
Znaczenie biochemiczne i kliniczne
D-Ryboza
Kwasy nukleinowe i metabolit pośredni
Składnik strukturalny kwasów nukleinowych i koenzymów,
np. ATR NAD(P)+, oraz koenzymów flawinowych
D-Rybuloza
Powstaje w procesach metabolicznych
Metabolit pośredni w szlaku pentozofosforanowym
D-Arabinoza
Gumy roślinne
Składnik glikoprotein
D-Ksyloza
Gumy roślinne, proteoglikany, glikozoaminoglikany
Składnik glikoprotein
L-Ksyluloza
Metabolit pośredni
Pojawia się w moczu w przypadku pentozurii wrodzonej
Tabela 14-3. Znaczenie fizjologiczne heksoz
Cukier
Występowanie
Znaczenie biochemiczne
Znaczenie kliniczne
D-Glukoza
Soki owocowe, hydrolizat skrobi,
sacharozy, maltozy lub laktozy
Główne paliwo dla tkanek; „cukier krwi”
Pojawia się w moczu (glukozuria) w wy¬
niku zwiększenia stężenia glukozy we krwi
(hiperglikemia) w przypadku cukrzycy
D-Fruktoza
Soki owocowe, miód, hydrolizat
sacharozy i inuliny, enzymatycz¬
na izomeryzacja glukozy
Metabolizuje bezpośrednio lub po prze¬
kształceniu w glukozę
Dziedziczna nietolerancja fruktozy prowa¬
dzi do akumulacji fruktozy i hipoglikemii
D-Galaktoza
Hydrolizat laktozy
Ulega przekształceniu w glukozę; syn¬
tetyzowana w gruczole sutkowym jest
substratem do syntezy laktozy mleka.
Składnik glikolipidów i glikoprotein
Wrodzona galaktozemia w wyniku niewy-
dajnego metabolizmu galaktozy prowadzi
do zaćmy
D-Mannoza
Hydrolizat mannozanowych gum
roślinnych
Składnik glikoprotein
CPO" H
Ryc. 14-8. a-D-Glukuronian (z lewej) i p-L-iduronian (z prawej).
Cukry tworzą glikozydy w reakcji z innymi
związkami lub miedzy sobą
Glikozydy są to związki powstające w wyniku
kondensacji monosacharydu i drugiego związku,
którym może być - lecz nie musi (w przypadku
aglikonu) - inny monosacharyd, za pośredni¬
ctwem grupy hydroksylowej monosacharydu,
znajdującej się przy anomerycznym atomie wę¬
gla. Jeżeli drugą grupą jest grupa hydroksylowa,
to powstające wiązanie O-glikozydowe stanowi
połączenie acetalowe, ponieważ jest ono wyni¬
kiem reakcji między hemiacetalową grupą (utwo¬
rzoną z aldehydu i grupy —OH) i inną grupą
—OH. Jeżeli częścią hemiacetalową jest gluko¬
za, to utworzony związek jest glukozydem; a je¬
śli jest nią galaktoza - galaktozydem itd. Jeżeli
drugą grupą jest amina, powstaje wiązanie A-gli-
kozydowe, np. między adeniną i rybozą w takich
nukleotydach, jak ATP (ryc. 11-4).
Glikozydy występują powszechnie w przyro¬
dzie. Aglikonem może być metanol, glicerol, ste¬
rol, fenol lub zasada, np. adenina. Wszystkie gli¬
kozydy, które mają duże znaczenie w medycynie
ze względu na ich działanie na mięsień sercowy
(glikozydy nasercowe) zawierają, jako składnik
aglikonowy, steroidy. Należą do nich glikozydy
naparstnicy i strofantusa, takie jak ouabaina, bę¬
dąca inhibitorem Na+/K+-ATPazy błon komórko¬
wych. Glikozydami są niektóre antybiotyki, np.
streptomycyna.
144 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Deoksycukrom brak jednego atomu tlenu
W deoksy cukrach grupę hydroksylową przyłączo¬
ną do pierścienia zastąpił atom wodoru. Przykła¬
dem jest deoksyryboza (ryc. 14-9), występująca
w kwasach nukleinowych (DNA). Deoksycukrem
jest również L-fukoza (ryc. 14-1$) - składnik gli-
koprotein oraz 2-deoksyglukoza - znany inhibitor
metabolizmu glukozy.
logicznie disacharydami są maltoza, sacharoza
i laktoza (tab. 14-4). W wyniku hydrolizy sacha¬
rozy powstaje mieszanina zwana „cukrem inwer¬
towanym”, gdyż powstająca w czasie hydrolizy
silnie lewoskrętna fruktoza powoduje zmianę
znaku (inwersję) skręcalności optycznej pierwot¬
nie prawoskrętnej sacharozy.
Maltoza
Aminocukry (heksozoaminy)
sa składnikami glikoprotein,
gangliozydów i glikozoaminoglikanów
Przykładami aminocukrów są D-glukozoamina,
będąca składnikiem kwasu hialuronowego (ryc.
14-10), D-galaktozoamina (chondrozoamina),
będąca składnikiem chondroityny i D-mannozo-
amina. Niektóre antybiotyki (np. erytromycyna)
zawierają w swojej cząsteczce aminocukry, odpo¬
wiedzialne za aktywność antybakteryjną.
Laktoza
Ryc. 14-10. Glukozoamina (2-amino-D-glukopiranoza; anomera).
Galaktozoamina jest 2-amino-D-galaktopiranozą. Zarówno glu¬
kozoamina, jak i galaktozoamina występują jako /V-acetylowe
pochodne w większości węglowodanów złożonych, np. w gliko-
proteinach.
Maltoza, sacharoza i laktoza
sa ważnymi disacharydami
Disacharydy są cukrami złożonymi z dwóch
reszt monosacharydowych, połączonych wiąza¬
niem glikozydowym (ryc. 14-11). Ważnymi fizjo-
0-p-D-Galaktopiranozylo-(1 4)-p-o-glukopiranoza
Ryc. 14-11. Struktura ważnych disacharydów. Przedrostek a i P
odnosi się do konfiguracji przy anomerycznym atomie węgla
(*). Jeżeli anomeryczny atom węgla drugiej reszty uczestniczy
w tworzeniu wiązania glikozydowego, jak w sacharozie, to taką
resztę glikozydową nazywa się furanozydem lub piranozydem.
Disacharyd niemający wolnej potencjalnej grupy aldehydowej
lub ketonowej przy anomerycznym atomie węgla nie wykazuje
właściwości redukujących. Konfiguracja reszty p-fruktofuranozy
w sacharozie jest wynikiem obrotu cząsteczki P-fruktofuranozy
(przedstawionej na ryc. 14-4) o 180 stopni i jej odwrócenia. Mal¬
toza i laktoza są cukrami redukującymi; na rycinie zostały przed¬
stawione, odpowiednio, w formach a i p.
14. WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 145
Tabela 14-4. Disacharydy o znaczeniu fizjologicznym
Cukier
Skład
Źródło
Znaczenie kliniczne
Izomaltoza
0-a-D-glukopiranozylo-(1-*6)-a-D-glukopiranoza
Enzymatyczna hydroliza
skrobi (amylopektyny)
Maltoza
0-a-D-glukopiranozylo-(1-*4)-a-D-glukopiranoza
Enzymatyczna hydroliza
skrobi (amylaza); kiełkują¬
ce ziarna zbóż i słód
Laktoza
0-p-D-galaktopiranozylo-(1-*4)-p-D-glukopiranoza
Mleko (oraz wiele prepara¬
tów farmaceutycznych)
Brak laktozy (alactasia) prowadzi do nie¬
tolerancji laktozy - efektem są biegunki
i wzdęcia. Laktoza może pojawiać się
w moczu podczas ciąży
Laktuloza
O-a-D-galaktopiranozylo-
(1 ->4)-p-D-fruktofuranoza
Niewielkie ilości w gorą¬
cym mleku. Produkt syn¬
tetyczny
Niehydrolizowana przez enzymy jelitowe,
ale ulega fermentacji przy udziale bakterii
jelitowych. Używana jako łagodny osmo-
tyczny środek przeczyszczający
Sacharoza
0-a-D-glukopiranozylo-(1-+2)-p-D-fruktofuranozyd
Cukier trzcinowy i z bu¬
raków cukrowych, sorgo,
niektóre owoce i warzywa
Przy niedoborze sacharazy dochodzi
do nietolerancji sacharozy - zaburzenie
wchłaniania prowadzi do biegunek i wzdęć
Trehaloza
0-a-D-glukopiranozylo-(1 -4 )-a-D-glukopiranozyd
Drożdże i grzyby; główny
cukier hemolimfy owadów
POLISACHARYDY PEŁNIA FUNKCJE
ZAPASOWE I STRUKTURALNE
Do polisacharydów zalicza się omówione niżej
węglowodany o dużym znaczeniu fizjologicz¬
nym:
Skrobia jest homopolimerem glukozowym,
tworzącym a-glukozydowy łańcuch zwany glu-
kozanem lub glukanem. Skrobia jest najważniej¬
szym źródłem węglowodanów w pożywieniu
i znajduje się w kaszach, ziemniakach, roślinach
strączkowych i innych warzywach. Dwoma głów¬
nymi składnikami skrobi są: amyloza (15-20%),
tworząca nierozgałęzioną strukturę helikoidalną,
oraz amylopektyna (80-85%), tworząca łań¬
cuchy rozgałęzione. W tej ostatniej do łańcucha
głównego są przyłączone wiązaniem 1—>6 łań¬
cuchy boczne; jedno odgałęzienie przypada na
24-30 reszt glukozowych połączonych wiązania¬
mi 1—>4 (ryc. 14-12).
Ryc. 14-12. Struktura skrobi. A - Amyloza o strukturze helikalnego zwoju, B - amylopektyna z rozgałęzieniami przyłączonymi wiąza¬
niami 1 6.
146 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Szybkość, z jaką amylaza będzie hydrolizo-
wać skrobię znajdującą się w pokarmie, zależy
od struktury skrobi, stopnia jej krystalizacji lub
hydratacji i jej dostępności (znajdująca się w nie¬
naruszonych komórkach roślinnych nie ulega tra¬
wieniu). Miarą przyswajalności skrobi zawartej
w produkcie jest tzw. indeks glikemiczny. Obli¬
cza się go, dzieląc stężenie glukozy we krwi po
przeprowadzeniu testu żywnościowego z udzia¬
łem skrobi, przez poziom glukozy uzyskany po
spożyciu równoważnej ilości glukozy.
Glikogen (ryc. 14-13) jest zapasowym poli¬
sacharydem organizmów zwierzęcych. Często na¬
zywa się go skrobią zwierzęcą. Ma strukturę bar¬
dziej rozgałęzioną niż amylopektyna, gdyż jedno
odgałęzienie przyłączone do łańcucha głównego
wiązaniem a(l—>6)-glikozydowym przypada na
12-14 reszt a-D-glukopiranozowych połączonych
wiązaniami a(l—>4)-glikozydowymi. Inulina jest
polisacharydem fruktozowym (jest więc fruktoza-
nem) występującym w bulwach i korzeniach dalii,
karczochów i mniszka lekarskiego. Ten zapasowy
cukier jest łatwo rozpuszczalny w wodzie i bywa
używany w badaniach fizjologicznych do określe¬
nia szybkości filtracji w kłębuszkach nerkowych.
Nie jest hydrolizowany przez enzymy jelitowe.
Dekstryny są substancjami powstającymi pod¬
czas częściowej hydrolizy skrobi. Błonnik (ce¬
luloza) jest głównym składnikiem podporowym
roślin. Jest nierozpuszczalny. Tworzy długie, pro¬
ste łańcuchy, zbudowane z jednostek P-D-gluko-
piranozowych, połączonych wiązaniami p(l—>4),
wzmocnione międzyłańcuchowymi wiązaniami
wodorowymi. Błonnik nie jest trawiony w prze¬
wodzie pokarmowym wielu ssaków z powodu
braku hydrolazy działającej na wiązania p(l—>4).
Jest ważnym składnikiem „objętościowym” poży¬
wienia. W żołądku przeżuwaczy i innych trawo-
żemych występują mikroorganizmy zdolne rozbić
wiązanie p, co pozwala wykorzystać błonnik jako
znaczące źródło energetyczne. Ten bakteryjny
proces może również zachodzić w ograniczonym
zakresie w jelicie grubym człowieka. Chityna jest
polisacharydem strukturalnym w pancerzach sko¬
rupiaków i owadów, występuje również w grzy¬
bach. Struktura chityny składa się z jednostek
N-acetylo-D-glukozoaminy, połączonych wiąza¬
niami p(l—>4)-glikozydowymi (ryc. 14-14).
Ryc. 14-13. Cząsteczka glikogenu. A - Struktura ogólna, B - powiększona struktura w punkcie rozgałęzienia. Cząsteczka, którą można
zobaczyć w mikroskopie elektronowym, ma kształt kuli o średnicy ok. 21 nm. Jej masa cząsteczkowa wynosi 107 Da. Cząsteczka sktada
się z łańcuchów polisacharydowych, z których każdy zawiera ok. 13 reszt glukozowych. Rozgałęzione i nierozgałęzione łańcuchy są
ułożone w dwanaście współśrodkowych warstw (na rycinie przedstawiono tylko cztery). Łańcuchy rozgałęzione (z których każdy ma
dwa rozgałęzienia) znajdują się w wewnętrznych warstwach cząsteczki, a łańcuchy nierozgałęzione - w zewnętrznych. (G - glikogenina,
cząsteczka inicjująca syntezę glikogenu).
14. WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 147
Chityna
Kwas hialuronowy
4-Siarczan chondroityny
(Uwaga: występuje również 6-siarczan)
Heparyna
Usiarczanowana Usiarczanowany
glukozoamina kwas iduronowy
Ryc. 14-14. Struktura niektórych polisacharydów złożonych
i glikozoaminoglikanów.
Glikozoaminoglikany (mukopolisacharydy) są
zbudowane z łańcuchów polisacharydów złożo¬
nych, zawierających aminocukry i kwasy uro-
nowe. Po przyłączeniu tych łańcuchów cukro¬
wych do cząsteczki białka powstaje składnik
zwany proteoglikanem. Proteoglikany tworzą
substancję podstawową tkanki łącznej. Znaczna
liczba grup —OH i ładunków ujemnych, które
przez odpychanie utrzymują w cząsteczce łań¬
cuchy węglowodanowe osobno, powoduje, że
glikozoaminoglikany mają właściwość zatrzy¬
mywania znacznej ilości wody oraz pęcznienia
i dzięki temu nadają właściwości amortyzujące
lub poślizgowe innym strukturom. Przykładem są
kwas hialuronowy, siarczan chondroityny i he¬
paryna (ryc. 14-14).
Tabela 14-5. Węglowodany występujące w glikoproteinach
Heksozy
Mannoza (Man), Galaktoza (Gal)
Acetyloheksozoaminy
/V-Acetyloglukozoamina (GIcNAc),
/V-Acetylogalaktozoamina (GalNAc)
Pentozy
Arabinoza (Ara), Ksyloza (Xyl)
Metylopentozy
L-Fukoza (Fuc; p. ryc. 14-15)
Kwasy sjalowe
/V-Acylopochodne kwasu neuramino-
wego; dominującym kwasem sjalo-
wym jest kwas /Wacetyloneuramino-
wy (NeuAc, p. ryc. 14-16)
Glikoproteiny (oraz pokrewne im mukopro-
teiny) są to białka zawierające rozgałęzione lub
nierozgałęzione łańcuchy polisacharydowe (tab.
14-5, ryc. 14-15); znajdują się one między inny¬
mi w błonach komórkowych, w wydzielinie błon
śluzowych i osoczu krwi* (rozdz. 40 i 46). Kwasy
H
— 0
H /
/ ch3
\H
Ho\
VH
HOy
fOH
OH
H
Ryc. 14-15. p-L-Fukoza (6-deoksy-p-L-galaktoza).
* Glikoproteinami jest większość białek osocza, z wy¬
jątkiem albuminy \przyp. tłum.].
148 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
sjalowe sąjV- lub O-acylowymi pochodnymi kwa¬
su neuraminowego (ryc. 14-16). Kwas neurami-
nowy jest 9-węglowym cukrem, którego strukturę
można wyprowadzić, łącząc mannozoaminę (epi-
mer glukozoaminy) z pirogronianem. Kwasy sja¬
lowe są składnikami zarówno glikoprotein, jak
i gangliozydów (glikolipidów).
H
Ryc. 14-16. Struktura kwasu A/-acetyloneuraminowego (kwasu
sjalowego). Ac = CH3—CO—.
WĘGLOWODANY ZNAJDUJĄ SIĘ
W BŁONACH KOMÓRKOWYCH
IW LIPOPROTEINACH
Analiza składników błon komórkowych ssaków
wykazuje, że ok. 5% stanowią węglowodany, któ¬
re znajdują się w glikoproteinach i glikolipidach.
Ich obecność na zewnętrznej powierzchni bło¬
ny plazmatycznej (glikokaliks) wykazano przy
użyciu lektyn roślinnych, aglutynin białkowych,
które wiążą się swoiście z pewnymi resztami gli-
kozylowymi, np. konkanawalina A jest swoista
w stosunku do reszt a-glukozylowych i a-manno-
zylowych. Glikoforyna jest główną, integralną
glikoproteiną błony ludzkich erytrocytów. Zbudo¬
wana ze 130 reszt aminokwasowych, tkwi w bło¬
nie lipidowej, przy czym łańcuch peptydowy jest
eksponowany po obu stronach błony. Reszty cu¬
krowe są przyłączone tylko do części A-końcowej
cząsteczki glikoforyny, znajdującej się na ze¬
wnętrznej powierzchni błony. Składniki cukrowe
występują również w apoproteinie B, należącej do
lipoprotein osocza.
STRESZCZENIE
• Węglowodany są ważnymi składnikami pokar¬
mów zwierząt oraz tkanek zwierzęcych. Klasy¬
fikuje się je na podstawie typu i liczby reszt mo-
nosacharydowych tworzących ich cząsteczkę.
• Glukoza jest najważniejszym cukrem w bio¬
chemii ssaków. Wynika to z faktu, że niemal
wszystkie węglowodany zawarte w pokarmach
są przekształcane w glukozę, zanim ulegną dal¬
szemu metabolizmowi.
• Cukry tworzą znaczną liczbę stereoizomerów,
ponieważ zawierają wiele asymetrycznych ato¬
mów węgla.
• Monosacharydami o dużym znaczeniu fizjolo¬
gicznym są glukoza - „cukier krwi” oraz rybo-
za, będąca istotnym składnikiem nukleotydów
i kwasów nukleinowych.
• Ważne pod względem fizjologicznym disacha-
rydy to: maltoza (a-D-glukopiranozylo-( 1 —>4)-
-D-glukopiranoza) - metabolit pośredni trawie¬
nia skrobi, sacharoza (P-D-fruktofuranozylo-a-
-D-glukopiranozyd) - ważny składnik pokar¬
mów zawierający fruktozę, laktoza (P-D-galak-
topiranozylo-( 1 —»4)-D-glukopiranoza) - wystę¬
pująca w mleku.
• Skrobia występująca w roślinach i glikogen
występujący u zwierząt są zapasowymi polisa¬
charydami zbudowanymi z cząsteczek glukozy.
Skrobia jest zasadniczym źródłem energii uzy¬
skiwanym z diety.
• Węglowodany złożone zawierają w swojej
cząsteczce pochodne cukrów, np. aminocukry,
kwasy uronowe, kwasy sjalowe. Należą tu pro-
teoglikany i glikozoaminoglikany, stanowiące
strukturalne elementy tkanek, oraz glikoprote-
iny, będące białkami z przyłączonymi łańcu¬
chami oligosacharydowymi, występujące mię¬
dzy innymi w błonach komórkowych i osoczu
krwi.
PIŚMIENNICTWO
Boons J-G: Carbohydrate Chemistry. Blacke Academic
and Professional, 1998.
Davis BG, Fairbanks AJ: Carbohydrate Chemistry, Ox-
ford University Press, 2002.
Ernst B, Hart GW, Sinay P: Carbohydrate in Chemistry
and Biology. Wiley-VCH, 2000.
Lindhorst TK, Thisbe K: Essential of Carbohydrate
Chemistry and Biochemistry. Wiley, 2003.
Lipidy o znaczeniu fizjologicznym
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Lipidy są heterogenną grupą związków, które są
spokrewnione raczej dzięki właściwościom fi¬
zycznym niż chemicznym, obejmującą tłuszcze,
oleje, steroidy, woski i ich pochodne. Mają one
dwie wspólne cechy, którymi są (1) nierozpusz-
czalność w wodzie oraz (2) rozpuszczalność
w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak
eter i chloroform. Lipidy są ważnymi składnikami
pokarmów nie tylko ze względu na ich dużą war¬
tość energetyczną, lecz także dlatego, że w tłusz¬
czach zawartych w naturalnych pokarmach znaj¬
dują się witaminy rozpuszczalne w tłuszczach
oraz niezbędne kwasy tłuszczowe. W organizmie
tłuszcze są odkładane w tkance tłuszczowej.
Tłuszcze tkanki podskórnej oraz gromadzące się
wokół niektórych narządów służą jako izolatory
termiczne. Lipidy niepolame działają jako izola¬
tory elektryczne, pozwalając na szybkie rozprzes¬
trzenianie się fal depolaryzacyjnych wzdłuż mieli-
nowych włókien nerwowych. Połączenia tłuszczu
z białkiem (lipoproteiny) są ważnymi składnikami
komórkowymi, które występują zarówno w bło¬
nie komórkowej, jak i mitochondriach, a także
służą jako środki transportu lipidów w osoczu
krwi. Znajomość biochemii lipidów jest koniecz¬
na do zrozumienia wielu ważnych zagadnień bio¬
medycznych, np. otyłości, cukrzycy, miażdżycy,
oraz roli różnych wielonienasyconych kwasów
tłuszczowych w odżywianiu i utrzymaniu dobre¬
go stanu zdrowia.
LIPIDY DZIELI SIĘ NA PROSTE I ZŁOŻONE
1. Lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych
z różnymi alkoholami.
a. Tłuszcze właściwe: estry kwasów tłuszczo¬
wych z glicerolem. Tłuszcze występujące
w stanie płynnym nazywa się olejami.
b. Woski: estry kwasów tłuszczowych z dłu-
gołańcuchowymi alkoholami monohydro-
ksylowymi.
2. Lipidy złożone: estry kwasów tłuszczowych
zawierające, oprócz alkoholu i kwasów tłusz¬
czowych, jeszcze inne grupy.
a. Fosfolipidy: lipidy zawierające, oprócz kwa¬
sów tłuszczowych i glicerolu, resztę kwasu
fosforowego. Często zawierają one zasadę
azotową i inne podstawniki, np. w glice-
rolofosfolipidach alkoholem jest glicerol,
a w sfingofosfolipidach - sfingozyna.
b. Glikolipidy (glikosfingolipidy): lipidy za¬
wierające kwas tłuszczowy, sfingozynę i cu¬
kry.
c. Inne lipidy złożone: np. sulfolipidy i ami-
nolipidy. W tej grupie można umieścić rów¬
nież lipoproteiny.
3. Prekursory i pochodne lipidów: należą do
nich kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, inne
alkohole, aldehydy tłuszczowe, ciała ketonowe
(rozdz. 22), węglowodory, witaminy rozpusz¬
czalne w tłuszczach i niektóre hormony.
Ze względu na brak ładunku w cząsteczkach
acyloglicerole (glicerydy), cholesterol i estry
cholesterolu określa się mianem lipidów obojęt¬
nych.
KWASY TŁUSZCZOWE SA ALIFATYCZNYMI
KWASAMI KARBOKSYLOWYMI
Kwasy tłuszczowe występują w naturalnych tłusz¬
czach i olejach głównie w formie zestryfikowanej,
ale w surowicy krwi występują i są transportowane
w formie niezestryfikowanej - jako wolne kwa¬
sy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe występujące
w tłuszczach naturalnych są zwykle pochodnymi
nierozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych
i zawierają parzystą liczbę atomów węgla. Ich
150 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
łańcuch może być nasycony (brak wiązań po¬
dwójnych) lub nienasycony (zawiera co najmniej
jedno wiązanie podwójne).
Nazwy kwasów tłuszczowych tworzy się
od nazw odpowiednich węglowodorów
Według najczęściej używanej nomenklatury, na¬
zwę systematyczną kwasu tłuszczowego tworzy
się od nazwy węglowodoru o tej samej liczbie
atomów węgla, dodając do niej końcówkę -owy
(nomenklatura genewska). A zatem nazwa kwasu
nasyconego kończy się na -anowy, np. oktanowy,
a kwasu nienasyconego z wiązaniami podwój¬
nymi - na -enowy, np. oktadekenowy (kwas ole¬
inowy).
Numerację atomów węgla rozpoczyna się od
atomu węgla grupy karboksylowej (atom węgla
nr 1). Atomy węgla przylegające do atomu węgla
grupy karboksylowej (nr 2,3 i 4) są, odpowiednio,
określane jako atomy węgla a, P i y. Atom węgla
w grupie metylowej znajdującej się na końcu łań¬
cucha nazywa się atomem węgla co lub n.
W użyciu jest kilka sposobów wskazywania
liczby i położenia wiązań podwójnych (ryc. 15-1);
np. A9 oznacza wiązanie podwójne między atoma¬
mi węgla 9 i 10 kwasu tłuszczowego; co9 wskazuje
wiązanie podwójne przy atomie węgla 9, licząc od
atomu węgla co. U zwierząt, dodatkowe wiązania
podwójne są wprowadzane tylko między istnieją¬
cym wiązaniem podwójnym (np. co9, coó lub co3)
a grupą karboksylową, czego wynikiem są 3 serie
kwasów tłuszczowych, znane odpowiednio jako
rodziny co9, coó i co3.
18:1 ;9 lub A918:1
18 10 9 1
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
lub
co9,C18:1 lub n-9,18:1
<o23456789 10 18
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH=CH(CH2)7COOH
n 17 10 9 1
Ryc. 15-1. Kwas oleinowy, n - 9 (n minus 9) jest odpowiedni¬
kiem co9.
Nasycone kwasy tłuszczowe nie
zawierała wiazań podwójnych
Nasycone kwasy tłuszczowe można uważać za
pochodne kwasu octowego (CH3—COOH), któ¬
ry jest pierwszym związkiem szeregu powstałego
w wyniku kolejnego wstawiania grupy —CH2—
między końcową grupę —CH3 a grupę —COOH.
W tabeli 15-1 przedstawiono przykłady takich
kwasów. Inne wyższe kwasy tłuszczowe z tego
szeregu występują przeważnie w woskach. Wy¬
odrębniono również kilka kwasów tłuszczowych
o łańcuchu rozgałęzionym zarówno z materiału
roślinnego, jak i zwierzęcego.
Tabela 15-1. Nasycone kwasy tłuszczowe
Nazwa
zwyczajowa
kwasu
Liczba
atomów
węgla
Występowanie
Octowy
2
Główny produkt końcowy
fermentacji węglowodanów
u przeżuwaczy
Masłowy
4
W pewnych tłuszczach w małych
ilościach (zwłaszcza w maśle).
Końcowy produkt fermentacji
węglowodanów u przeżuwaczy1
Walerianowy
5
Kapronowy
6
Laurynowy
12
Spermacet, cynamon, nasiona
palmy, olej kokosowy, owoc
wawrzynu, masło
Mirystynowy
14
Gałka muszkatołowa, nasiona
palmy, olej kokosowy, mirt, masło
Palmitynowy
16
Powszechnie występują
we wszystkich tłuszczach
zwierzęcych i roślinnych
Stearynowy
18
1 Również wytwarzany w kątnicy trawożernych i w mniejszym
stopniu w okrężnicy człowieka.
Nienasycone kwasy tłuszczowe zawierała
co najmniej jedno wiązanie podwójne
Nienasycone kwasy tłuszczowe (tab. 15-2) można
podzielić na następujące podgrupy:
1. Kwasy jednonienasycone (monoetenoidy,
kwasy monoenowe) zawierające jedno wiąza¬
nie podwójne.
2. Kwasy wielonienasycone (polietenoidy, kwa¬
sy polienowe) zawierające co najmniej dwa
wiązania podwójne.
15. LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 151
3. Ikozanoidy (synonim eikozanoidy). Grupa
związków, pochodnych ikoza (C2o) polieno-
wych kwasów tłuszczowych, obejmująca pro-
stanoidy, leukotrieny (LT) oraz lipoksyny
(LX). Do prostanoidów zalicza się prostaglan-
dyny (PG), prostacykliny (PGI) i trombok-
sany (TX).
Prostaglandyny występują praktycznie we
wszystkich tkankach ssaków i działają w nich
jako miejscowe hormony; wykazują aktywności
o dużym znaczeniu fizjologicznym i farmakolo¬
gicznym. In vivo są one syntetyzowane z wielonie-
nasyconych kwasów tłuszczowych C2o (ikozano-
wych), np. kwasu arachidonowego. Pierwszy etap
biosyntezy polega na cyklizacji środkowej części
łańcucha i utworzeniu pierścienia cyklopentano-
wego (ryc. 15-2). Pokrewny szereg związków, tj.
tromboksany, zawierają pierścień cyklopentano-
wy przedzielony atomem tlenu (pierścień oksa-
nowy) (ryc. 15-3). Trzy różne ikozanowe kwasy
tłuszczowe dają początek trzem grupom ikozano-
o
OH
Ryc. 15-2. Prostaglandyna E2 (PGE2).
Tabela 15-2. Nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w pokarmach i mające znaczenie fizjologiczne
Liczba atomów C
oraz liczba i pozycja
wiązań podwójnych
Szereg
Nazwa
zwyczajowa
Nazwa systematyczna
Występowanie
Kwasy monoenowe (z 1 podwójnym wiązaniem)
16:1 ;9
co7
Palmitooleinowy
c/s-9-Heksadekenowy
Niemal we wszystkich tłuszczach
18:1 ;9
co9
Oleinowy
c/s-9-Oktadekenowy
Prawdopodobnie najbardziej roz¬
powszechniony kwas tłuszczowy
w tłuszczach naturalnych
18:1:9
co9
Elaidynowy
fra/7S-9-Oktadekenowy
Tłuszcze przeżuwaczy i utwardzane
Kwasy dienowe (z 2 podwójnymi wiązaniami)
18:2:9,12
co6
Linolowy
all-c/s-9,12-Oktadekadienowy
Oleje: kukurydziany, arachidowy,
bawełniany, sojowy i wiele innych
olejów roślinnych
Kwasy trienowe (z 3 podwójnymi wiązaniami)
18:3:6,9,12
co6
y-Linolenowy
all-c/s-6,9,12-Oktadekatrienowy
Niektóre rośliny, np. olej z wiesiołka.
Niewielkie ilości w tłuszczach zwie¬
rzęcych
18:3:9,12,15
co3
a-Linolenowy
all-c/s-9,12,15-Oktadekatrienowy
Często występuje z kwasem linolo¬
wym, zwłaszcza w oleju lnianym
Kwasy tetraenowe (z 4 podwójnymi wiązaniami)
20:4:5,8,11,14
0)6
Arachidonowy
all-c/s-5,8,11,14-lkozatetraenowy
Występuje w tłuszczach zwierzę¬
cych; ważny składnik fosfolipidów
zwierzęcych
Kwasy pentaenowe (z 5 podwójnymi wiązaniami)
20:5:5,8,11,14,17
0)3
Timnodonowy
all-c/s-5,8,11,14,17-lkozapentenowy
Istotny składnik olejów rybich, np.
tranu dorszowego, olejów z makreli,
ryb śledziowatych i łososi
Kwasy heksaenowe (z 6 podwójnymi wiązaniami)
22:6:4,7,10,13,16,19
co3
Cerwonowy
all-c/s-4,7,10,13,16,19-Dokozaheksenowy
Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu
152 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
OH
Ryc. 15-3. Tromboksan A2 (TXA2).
idów, z charakterystyczną liczbą wiązań podwój¬
nych w łańcuchach bocznych, np. PGi, PG2, PG3.
Różne grupy podstawników przyłączone do pier¬
ścieni są przyczyną istnienia szeregu prostaglan-
dyn i tromboksanów, oznakowanych A, B itd.,
np. typ „E” prostaglandyn (jak w PGE2) ma gru¬
pę ketonową w pozycji 9, natomiast typ „F” ma
w tej pozycji grupę hydroksylową. Leukotrieny
i lipoksyny stanowią trzecią grupę pochodnych
ikozanoidów, które powstają w szlaku lipooksy-
genazy (ryc. 15-4). Charakteryzują się one obec¬
nością, odpowiednio, trzech lub czterech sprzężo¬
nych wiązań podwójnych. Leukotrieny wywołują
skurcz oskrzeli, działają jak mocne czynniki pro-
zapalne i odgrywają pewną rolę w astmie.
Ryc. 15-4. Leukotrien A4 (LTA4).
Większość występujących w naturze
nienasyconych kwasów tłuszczowych
zawiera podwójne wiązanie cis
Łańcuchy węglowe nasyconych kwasów tłu¬
szczowych, rozciągnięte w niskich temperaturach,
przyjmują postać zygzaka. W wyższych tempera¬
turach niektóre wiązania ulegają rotacji, co powo¬
duje skrócenie łańcucha; to wyjaśnia, dlaczego
błony biologiczne stają się cieńsze w miarę wzro¬
stu temperatury. Typ izomeru geometrycznego,
w jakim występują nienasycone kwasy tłuszczo¬
we, zależy od ustawienia atomów lub grup wo¬
kół osi wiązań podwójnych, które uniemożliwiają
rotację. Jeśli łańcuchy węglowe znajdują się po
tej samej stronie wiązania, to wiązanie ma kon¬
figurację cis, jak np. w kwasie oleinowym; jeśli
po przeciwnych stronach - konfigurację trans, jak
np. w kwasie elaidynowym, będącym izomerem
trans kwasu oleinowego (ryc. 15-5). Prawie wszyst¬
kie występujące w przyrodzie długołańcuchowe
nienasycone kwasy tłuszczowe mają konfigurację
cis: łańcuchy węglowodorowe cząsteczek są „zgię¬
te” w miejscu podwójnego wiązania o 120°. Kwas
oleinowy ma więc kształt litery L, natomiast kwas
elaidynowy pozostaje „wyprostowany”. Zwiększe¬
nie liczby wiązań podwójnych cis w kwasach tłusz¬
czowych pozwala na różnorodność konfiguracji
przestrzennych cząsteczki, np. kwas arachidonowy
z czterema wiązaniami podwójnymi cis może mieć
kształt „supła” lub litery „U”. To ma istotne znacze¬
nie dla molekularnego upakowania w błonie i dla
ułożenia przestrzennego kwasów tłuszczowych
w bardziej złożonych cząsteczkach, takich jak
fosfolipidy. Obecność podwójnych wiązań trans
będzie zmieniać te przestrzenne współzależności.
W niektórych pokarmach występują kwasy tłusz¬
czowe o konfiguracji trans, ale większość z nich
powstaje jako produkt uboczny podczas wysyca¬
nia kwasów tłuszczowych w procesie uwodor¬
nienia, czyli „utwardzania” naturalnych olejów
w zakładach produkujących margarynę. Dodatko¬
wa niewielka część kwasów tłuszczowych trans
pochodzi ze spożywanych tłuszczów przeżuwa¬
czy, u których powstają one w żwaczu w wyniku
działania mikroorganizmów.
18
Ryc. 15-5. Izomery geometryczne kwasu tłuszczowego A9,18:1
(kwasy oleinowy i elaidynowy).
15. LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 153
Fizyczne oraz fizjologiczne właściwości
kwasów tłuszczowych sa uwarunkowane
długością i stopniem nienasycenia
ich łańcucha
Temperatura topnienia kwasów tłuszczowych
0 parzystej liczbie atomów węgla wzrasta z dłu¬
gością łańcucha i obniża się w miarę wzrostu
stopnia nienasycenia. Triacyloglicerol, zawie-
rający tylko nasycone kwasy tłuszczowe o 12
atomach węgla lub dłuższe, występuje w stanie
stałym w temperaturze ciała, natomiast jeżeli za¬
wiera wszystkie trzy reszty kwasów tłuszczowych
18:2, jest w stanie płynnym do temperatury 0°C.
W rzeczywistości naturalne acyloglicerole zawie¬
rają mieszaninę kwasów tłuszczowych dobraną
zgodnie z funkcją lipidu. Lipidy błon, które muszą
być płynne w zakresie temperatury środowiska, są
bardziej nienasycone niż lipidy zapasowe. Lipidy
tkanek narażonych na schłodzenie, np. u zwierząt
podczas snu zimowego lub w kończynach zwie¬
rząt, są w większym stopniu nienasycone.
TRIACYLOGLICEROLE (TRIGLICERYDY)*
TO GŁÓWNA FORMA ZAPASOWA
KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
Triacyloglicerole (ryc. 15-6) są estrami trihydrok-
sylowego alkoholu - glicerolu z kwasami tłusz¬
czowymi. W tkankach występują również mono-
1 diacyloglicerole, w których jeden lub dwa kwasy
tłuszczowe są zestryfikowane glicerolem. Mają
one szczególne znaczenie w syntezie i hydrolizie
triacylogliceroli.
o
II
1CH2—0 —C —R!
2I
0-CH 0
I II
3ch2- o - c - r3
Ryc. 15-6. Triacyloglicerol.
* Monoglicerydy, diglicerydy i triglicerydy, zgodnie
z obecną standardową terminologią Międzynarodowej
Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) oraz Mię¬
dzynarodowej Unii Biochemicznej (IUB), określa się,
odpowiednio, jako monoacyloglicerole, diacyloglicerole
i triacyloglicerole. Jednakże stara terminologia jest po¬
wszechnie używana, zwłaszcza w medycynie klinicznej.
Atomy węgla 1 i 3 w cząsteczce glicerolu
nie sa identyczne
Aby jednoznacznie ponumerować atomy węgla
glicerolu, stosuje się system -sn (stereochemiczne
numerowanie). Należy podkreślić, że atomy wę¬
gla 1 i 3 cząsteczki glicerolu nie są identyczne,
jeżeli ogląda się trójwymiarowy model cząstecz¬
ki (przedstawiony wzorem projekcyjnym na ryc.
15-7). Enzymy bez trudu rozpoznają je i są prawie
zawsze specyficzne względem jednego lub dru¬
giego atomu węgla, np. glicerol jest zawsze fosfo¬
ry lowany przez glicerokinazę na sn-3, dając glice-
rolo-3-fosforan, a nigdy glicerolo-1 -fosforan.
o
II
31 ii
H2C - 0 - C - R3
Ryc. 15-7. Triacylo-sn-glicerol.
FOSFOLIPIDY SA GŁÓWNYM
SKŁADNIKIEM LIPIDOWYM BŁON
Fosfolipidy można uznać za pochodne kwasu fo-
sfatydowego (ryc. 15-8), w którym fosforan jest
zestryfikowany z grupą —OH odpowiedniego al¬
koholu. Kwas fosfatydowy jest głównym związ¬
kiem pośrednim w syntezie triacylogliceroli oraz
fosfoacylogliceroli, ale w tkankach występuje
w niewielkich ilościach.
Fosfatydylocholiny (lecytyny) występuje
w błonach komórkowych
Fosfoacyloglicerole zawierające cholinę (ryc. 15-8)
są przeważającymi ilościowo lipidami błon ko¬
mórkowych i stanowią dużą część zasobów cho¬
liny w organizmie. Cholina odgrywa ważną rolę
w przewodnictwie nerwowym jako acetylocho¬
lina oraz jako zapas labilnych grup metylowych.
Dipalmitoilolecytyna jest bardzo aktywnym
związkiem powierzchniowo czynnym, istotnym
składnikiem surfaktantu zmniejszającego napię¬
cie powierzchniowe i zapobiegającego sklejaniu
154 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
o
II
o 1ch2 — o — c —
II 2I
R2 — C — O — CH O
I II
3ch2 — o — P — O'
O"
Kwas fosfadytowy
+ /CH3
a - o - ch2 — ch2 - n - ch3
ch3
V )
V
Cholina
+
— o — ch2 — ch2nh3
V _ J
V
Etanoloamina
NHa+
I
c - O - CH2 - CH - COO"
Seryna
OH
OH
M
— o/h
A
H\
H
D
h\h
\| 6
OH >
5|/
'oh
OH
H
Mioinozytol
0~
I
ch2 — o — P — o — ch2 o
I II I II
C - OH O O H — C — O — C — R3
I II I
ch2 r4 — c — o — ch2
Fosfatydyloglicerol
Ryc. 15-8. Kwas fosfatydowy i jego pochodne. Jeżeli atom
O" (na szarym tle) w kwasie fosfatydowym zastąpi się po¬
danymi na rycinie podstawnikami, to otrzyma się odpowied¬
nio: (A) 3-fosfatydylocholinę, (B) 3-fosfatydyloetanoloami-
nę, (C) 3-fosfatydyloserynę, (D) 3-fosfatydyloinozytol i (E)
kardiolipinę (difosfatydyloglicerol).
się błon pęcherzyków płucnych. Brak surfaktantu
w płucach wcześniaków jest przyczyną zespołu
błon szklistych. Większość fosfolipidów zawiera
nasyconą grupę acylową w położeniu sn-1, a gru¬
pę nienasyconą w położeniu sn-2 glicerolu.
Fosfatydyloetanoloamina (kefalina) i fosfa-
tydyloseryna (występująca w większości tkanek)
różnią się od fosfatydylocholiny tylko tym, że za¬
miast choliny mają, odpowiednio, etanoloaminę
lub serynę (ryc. 15-8).
Fosfatydyloinozytol jest prekursorem
wtórnych przekaźników sygnałów
W fosfatydyloinozytolu występuje stereoizomer
inozytolu - mioinozytol (ryc. 15-8). 4,5-Bisfosfo-
ran fosfatydyloinozytolu jest ważnym składni¬
kiem fosfolipidów błon komórkowych; po pobu¬
dzeniu komórki przez właściwy hormon jest on
hydrolizowany do diacyloglicerołu i trisfosfora-
nu inozytolu, a każda z tych pochodnych cząste¬
czek działa jako wewnątrzkomórkowa cząsteczka
sygnałowa lub wtórny przekaźnik.
Kardiolipina jest ważnym lipidem
błon mitochondrialnych
Kwas fosfatydowy jest prekursorem fosfatydy-
loglicerolu, który z kolei ulega przekształceniu
w kardiolipinę (ryc. 15-8).
Lizofosfolipidy są związkami pośrednimi
w metabolizmie fosfoacylogliceroli
Lizofosfolipidy są to fosfoacyloglicerole zawiera¬
jące w swojej cząsteczce tylko jedną resztę acy¬
lową, np. lizofosfatydylocholina (lizolecytyna),
która uczestniczy w metabolizmie i przekształ¬
caniu fosfolipidów (ryc. 15-9). Lizofosfolipidy
o
1 II
1CH2 - 0 — C —
HO - CH 0 -rH
i ii +/CHa
3ch2 — o — p - o — ch2 — ch2 — n — ch3
i- Xch3
Cholina
Ryc. 15-9. Lizolecytyna (lizofosfatydylocholina).
15. LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 155
znajdują się również w utlenionych lipoproteinach
i mają swój udział w rozwoju miażdżycy.
Plazmalogeny występują w mózgu
i mięśniach
Związki te stanowią co najmniej 10% fosfolipi¬
dów mózgu i mięśni. Struktura plazmalogenów
przypomina strukturę fosfatydyloetanoloaminy,
z tym że występuje w niej wiązanie eterowe przy
atomie węgla sn-1 zamiast wiązania estrowego.
Zazwyczaj grupą alkilową jest nienasycony al¬
kohol (ryc. 15-10). W niektórych przypadkach
etanoloamina może być zastąpiona choliną, se-
ryną lub inozytolem.
0 1CH2 - 0 — CH = CH -
u 2r
R2 - C - 0 - CH 0
I II
3ch2 - o - p — o - ch2 ~ ch2 - NHj
Etanoloamina
Ryc. 15-10. Plazmalogen.
Sfingomieliny występują
w układzie nerwowym
Sfingomieliny wykryto w dużych ilościach
w mózgu i tkance nerwowej. W wyniku hydro¬
lizy sfingomielin powstaje kwas tłuszczowy,
kwas fosforowy, cholina i złożony aminoalkohol
— sfingozyna (ryc. 15-11). W lipidach tych nie
występuje glicerol. Związek złożony ze sfingozy-
ny i kwasu tłuszczowego nazywa się ceramidem;
struktura tego typu występuje również w gliko-
sfingolipidach (p. dalej).
GLIKOLIPIDY (GLIKOSFINGOLIPIDY)
SA WAŻNYM SKŁADNIKIEM TKANKI
NERWOWEJ I BŁON KOMÓRKOWYCH
Glikolipidy występują powszechnie w każdej
tkance organizmu, zwłaszcza w tkance nerwowej,
np. w mózgu. Znajdują się głównie w zewnętrznej
warstwie błony plazmatycznej, tworząc sachary-
dy powierzchni komórki.
Głównymi glikolipidami zwierzęcymi są gli-
kosfingolipidy. Zawierają one ceramid i jedną lub
kilka cząsteczek cukru. Galaktozyloceramid jest
Ceramid
Sfingozyna
A
OH 0
I H II
CH3 - (CH2)12 — CH = CH — CH - CH - N - C - R
CH2 Kwas tłuszczowy
I
f o
Kwas fosforowy < |
l o = P - 0"
1 +
0 ~ CH2 - CH2 - N(CH3)3
v —V '
Cholina
Ryc. 15-11. Sfingomielina.
głównym glikosfingolipidem mózgu i innych tka¬
nek nerwowych, ale we względnie małych iloś¬
ciach występuje on wszędzie. Zawiera on sporo
charakterystycznych kwasów tłuszczowych C24,
np. kwasu cerebronowego. Galaktozyloceramid
(ryc. 15-12) może zostać przekształcony w sulfo-
galaktozyloceramid (sulfatyd), który występuje
obficie w mielinie. Glukozyloceramid jest pro¬
stym glikosfingolipidem, dominującym w tkan¬
kach pozanerwowych, ale w małych ilościach
znajduje się również w mózgu. Bardziej złożony¬
mi glikosfingolipidami są gangliozydy - pochod¬
ne glukozyloceramidu, zawierające dodatkowo
co najmniej jedną resztę kwasu sjalowego. Kwas
A-acetyloneuraminowy (NeuAc; rozdz. 14) jest
podstawowym kwasem sjalowym występującym
w tkankach ludzkich. Gangliozydy występują
w dużych stężeniach również w tkance nerwowej.
Wydaje się, że pełnią one funkcje receptorowe lub
inne. Najprostszym gangliozydem występującym
w tkankach jest GM3, który zawiera ceramid, jedną
cząsteczkę glukozy, jedną cząsteczkę galaktozy
i jedną cząsteczkę NeuAc. W użytym tu skróto¬
wym zapisie gangliozydu G oznacza gangliozyd,
M - resztę monosjalową, a cyfra arabska wskazu¬
je kolejność położenia na chromatogramach cien¬
kowarstwowych. Na rycinie 15-13 przedstawiono
strukturę GMi - bardziej złożonego gangliozydu
będącego pochodną GM3- GM1 jest związkiem in¬
teresującym pod względem biologicznym, jako że
jest on znanym receptorem dla toksyny cholery
w jelicie cienkim człowieka. Inne gangliozydy
mogą zawierać w swojej cząsteczce od jednej do
pięciu reszt sjalowych, tworzących, odpowiednio,
di-, trisjalogangliozydy itd.
156 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 15-12. Struktura galaktozyloceramidu
(galaktocerebrozyd, R = H) i sulfogalaktozy-
loceramidu (dawniej sulfatyd, R = S042").
CH(OH) - (CH2)21 - CH3
Kwas ttuszczowy
np. kwas cerebronowy
Ceramid — Glukoza — Galaktoza — W-Acetylo- — Galaktoza
(Acylo- I galaktozoamina
sfingozyna) NeuAc
lub
Cer — Gic — Gal — GalNAc — Gal
I
NeuAc
Ryc. 15-13. Gangliozyd GM1, monosjalogangliozyd, receptor tok¬
syny cholery w jelicie człowieka.
zenowy, chyba że zaznaczono inaczej. We wzorze
zaznacza się wszystkie wiązania podwójne. Bocz¬
ne grupy metylowe przedstawia się w postaci wią¬
zań pojedynczych. Występują one typowo w po¬
zycji 10 i 13 (stanowiąc 18. i 19. atom węgla).
W pozycji 17 występuje zwykle łańcuch boczny
(jak w cząsteczce cholesterolu). Jeżeli związek
zawiera jedną lub kilka grup hydroksylowych,
a żadnej grupy karbonylowej lub karboksylowej,
to jest sterolem i jego nazwa ma końcówkę -ol.
STEROIDY PEŁNIA WIELE WAŻNYCH
FUNKCJI FIZJOLOGICZNYCH
Cholesterol jest prawdopodobnie najbardziej
znanym steroidem ze względu na jego udział
w rozwoju miażdżycy oraz chorobach serca. Od¬
grywa on bardzo ważną rolę biochemiczną, po¬
nieważ jest prekursorem wielu równie ważnych
steroidów, takich jak kwasy żółciowe, hormony
kory nadnerczy, hormony płciowe, witaminy D,
glikozydy nasercowe, sitosterole w świecie roślin
i niektóre alkaloidy.
Wszystkie steroidy mają podobny rdzeń cyk¬
liczny, przypominający fenantren (pierścienie A,
B i C), do którego jest dołączony pierścień cy-
klopentanu (D). Atomy węgla w rdzeniu steroi¬
dowym są numerowane tak jak pokazano na ryc.
15-14. Analizując wzory strukturalne steroidów,
należy zwrócić uwagę, że prosty pierścień sześ¬
ciokątny oznacza całkowicie nasycony pierścień
6-węglowy, którego wszystkie wartościowości są
wysycone wodorem, tzn. nie jest to pierścień ben¬
18
16
15
4 6
Ryc. 15-14. Szkielet (rdzeń) steroidowy.
Ze względu na asymetrie cząsteczki
steroid może występować w postaci
wielu stereoizomerów
Każdy z pierścieni sześciowęglowych rdzenia ste¬
roidowego może przybierać formę trójwymiaro¬
wej konformacji „krzesłowej” lub „łódkowej”
(ryc. 15-15). W steroidach naturalnych wszystkie
pierścienie występują właściwie w formie krze¬
słowej, która jest bardziej stabilną konformacją.
Poszczególne pierścienie mogą się znajdować
względem siebie w konformacji cis lub trans
15. LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 157
\^
Konformacja „krzesłowa" Konformacja „łódkowa"
Ryc. 15-15. Konformacje stereoizomerów cykloheksanu.
(ryc. 15-16). W naturalnych steroidach połączenie
pierścieni A i B może mieć konformację cis lub
trans, a połączenie pierścieni B i C - konformację
trans, tak jak i połączenie pierścieni C i D. Wią¬
zania utrzymujące podstawniki nad płaszczyzną
pierścieni (wiązania P) przedstawia się linią cią¬
głą, natomiast wiązania łączące grupy znajdujące
się pod płaszczyzną pierścieni (wiązania a) linią
przerywaną. W steroidzie 5a pierścień A przyj¬
muje zawsze konformację trans względem pier¬
ścienia B, natomiast w steroidzie 5P - zawsze cis.
Grupy metylowe przyłączone do atomów węgla
C-10 i C-13 są niezmiennie w konfiguracji p.
Cholesterol jest ważnym
składnikiem wielu tkanek
Cholesterol (ryc. 15-17) występuje we wszyst¬
kich komórkach organizmu, zwłaszcza w tkance
nerwowej. Jest jednym z ważniejszych składni¬
ków błon plazmatycznych i lipoprotein surowicy
krwi. Występuje zwykle jako ester cholesterolu,
w którym grupa hydroksylowa w pozycji 3 cho¬
lesterolu jest zestryfikowana długołańcuchowym
kwasem tłuszczowym. Cholesterol jest powszech¬
ny w tkankach zwierzęcych, lecz nie występuje
w roślinach i bakteriach.
Ryc. 15-17. Cholesterol, 3-hydroksy-5,6-cholesten.
Ergosterol jest prekursorem witaminy D
Ergosterol występuje w roślinach i drożdżach
i jest ważnym prekursorem witaminy D (ryc.
15-18). Naświetlanie promieniami nadfioletowy¬
mi powoduje otwarcie pierścienia B, w wyniku
czego związek nabywa właściwości przeciwkrzy-
wiczych.
Prekursorem poliprenoidów
i cholesterolu jest ten sam związek
Poliprenoidy, chociaż nie są steroidami, są z nimi
spokrewnione, ponieważ są syntetyzowane, po-
Ryc. 15-16. Stereochemia ste¬
roidów: A - konfiguracja trans
między wszystkimi sąsiadującymi
pierścieniami; B - konfiguracja cis
między pierścieniami A i B.
158 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
-CH = C-CH= CH-
Ryc. 15-19. Jednostka izoprenowa.
dobnie jak cholesterol (p. ryc. 26-3), z 5-węglo-
wej jednostki izoprenowej (ryc. 15-19). Należy do
nich ubichinon (rozdz. 13) - składnik mitochon-
drialnego łańcucha oddechowego oraz długo-
łańcuchowy alkohol dolichol (ryc. 15-20), który
uczestniczy w syntezie glikoprotein, przenosząc
L- — 16
Ryc. 15-20. Dolichol - alkohol C95.
reszty oligosacharydowe na reszty asparaginowe
łańcucha polipeptydowego (rozdz. 46). Grupa ro¬
ślinnych izoprenoidów obejmuje kauczuk, kam¬
forę, rozpuszczalne w tłuszczach witaminy A, D,
E i K oraz P-karoten (prowitaminę A).
PEROKSYDACJA LIPIDÓW JEST
ŹRÓDŁEM WOLNYCH RODNIKÓW
Peroksydacja (autooksydacja) lipidów nara¬
żonych na działanie tlenu jest przyczyną nie tyl¬
ko psucia się żywności (jełczenie), lecz także
uszkodzenia tkanek in v/vo, co z kolei może być
przyczyną odczynów zapalnych, nowotworów,
miażdżycy, starzenia się. Szkodliwe działania
są inicjowane przez wolne rodniki (ROO\ RO*,
OH*), powstające podczas tworzenia nadtlenków
kwasów tłuszczowych, zawierających wiązania
podwójne oddzielone grupą metylenową, a więc
takie jak te, które znajdują się w naturalnych wie-
lonienasyconych kwasach tłuszczowych (ryc.
15-21). Peroksydacja lipidów jest reakcją łań¬
cuchową, zapewniającą ciągłą dostawę wolnych
rodników, które inicjują następne reakcje peroksy-
dacji. Pełny proces można zapisać następująco:
1. Inicjacja:
R00H + metal(")+ -> ROO’ + metal(°-1,+ + H+
X* + RH -> R- + XH
2. Rozprzestrzenianie (rozwijanie łańcucha re¬
akcji):
R + 02 ~* R00
R00' + RH -> R00H + Rł itd.
3. Zakończenie:
R00' + R00’ -> R00R + 02
R00' + R* -> R00R
R' + R*-> RR
Ponieważ molekularnym prekursorem dla ini¬
cjacji procesu jest zazwyczaj wodoronadtlenek
ROOH, peroksydacja lipidów jest reakcją łańcu¬
chową, z potencjalnymi skutkami niszczycielski¬
mi. W celu kontroli i ograniczenia peroksydacji
lipidów zarówno ludzie, jak i natura używają
antyoksydantów. Propylogalusan, butylowany
hydroksyanizol (BHA) i butylowany hydroksyto-
RH R. R. ROO
_ . . nuuuiuiiauMCMGh
Aldehyd malonowy Endonadtlenek Rq0H
Ryc. 15-21. Peroksydacja lipidów. Reakcję inicjują istniejące wolne rodniki (Xł), światło lub jony metali. Aldehyd malonowy powstaje
tylko z kwasów tłuszczowych mających co najmniej 3 wiązania podwójne. Miarą peroksydacji lipidów jest ilość powstającego aldehydu
malonowego oraz etanu lub pentanu, powstających, odpowiednio, z dwóch końcowych atomów węgla kwasów tłuszczowych co3 lub
z końcowych pięciu atomów węgla kwasów tłuszczowych co6.
15. LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 159
luen (BHT) są przeciwutleniaczami stosowanymi
jako dodatki (środki konserwujące) do żywności.
Naturalnie występującymi przeciwutleniaczami
są witamina E (tokoferol), która jest rozpuszczal¬
na w lipidach, oraz moczan i witamina C, które
są rozpuszczalne w wodzie. p-Karoten wykazuje
właściwości przeciwutleniacza przy małym p02.
Przeciwutleniacze dzieli się na dwie klasy: 1)
przeciwutleniacze (antyoksydanty) zapobiegające,
które zmniejszają szybkość inicjacji peroksydacji,
i 2) przeciwutleniacze przerywające reakcję łań¬
cuchową, które utrudniają rozprzestrzenianie się
peroksydacji. Przeciwutleniacze zapobiegające
obejmują katalazę i inne peroksydazy, np. perok-
sydazę glutationową, które reagują z ROOH; se¬
len, który jest istotnym składnikiem peroksydazy
glutationowej, oraz związki chelatujące jony me¬
tali, takie jak EDTA (etylenodiaminotetraoctan)
i DTPA (dietylenotriaminopentaoctan). In vivo
głównymi przeciwutleniaczami przerywającymi
proces łańcuchowy są: dysmutaza ponadtlenko-
wa wychwytująca w fazie wodnej wolne rodniki
ponadtlenkowe (027), moczan oraz witamina E,
wychwytujące w fazie lipidowej rodniki ROO*
(ryc. 44-6).
Peroksydacja jest katalizowana in vivo również
przez związki hemowe i przez lipoksygenazy,
znajdujące się w płytkach krwi i leukocytach. Do
produktów autooksydacji lub enzymatycznej ok¬
sydacji o dużym znaczeniu fizjologicznym zalicza
się oksysterole (pochodne cholesterolu) i izopro-
stany (prostanoidy).
Faza wodna
QQQQQQ
„Otef, czyli faza niepolama
|
000000
Faza wodna
PODWÓJNA WARSTWA LIPIDOWA
B
LIPID AMFIPATYCZNY
A
=^3}
Grupy polarne,
czyli hydrofilowe
Grupy niepolarne,
czyli hydrofobowe
Faza wodna
D
E
LIPOSOM
(WIELOWARSTWOWY)
F
Ryc. 15-22. Powstawanie błon lipidowych, miceli, emulsji i liposomów z lipidów amfipatycznych, np. fosfolipidów.
160 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
AMFIPATYCZNE LIPIDY
SAMOORIENTUJACE SIĘ
NA GRANICY OLEJ: WODA
Tworzą one błony, micele,
liposomy i emulsje
Lipidy są na ogół nierozpuszczalne w wodzie,
gdyż przeważają w ich cząsteczkach grupy niepo-
lame (węglowodory). Kwasy tłuszczowe, fosfoli¬
pidy, sfingolipidy, kwasy żółciowe, a także - choć
w mniejszym stopniu - cholesterol, zawierają jed¬
nak grupy polarne, dlatego część cząsteczki jest
hydrofobowa, czyli nierozpuszczalna w wodzie,
a inna część jest hydrofilowa, czyli rozpuszczalna
w wodzie. Tego rodzaju cząsteczki określa się jako
amfipatyczne (ryc. 15-22). Ustawiają się one na
granicy faz woda : olej w ten sposób, że ich grupy
polarne znajdują się w fazie wodnej, a niepolar-
ne - w fazie olejowej. Podwójna warstwa takich
polarnych lipidów jest podstawową strukturą błon
biologicznych (rozdz. 40). Lipidy polarne znajdu¬
jące się w środowisku wodnym w stężeniu kry¬
tycznym tworzą micele. Liposomy można otrzy¬
mać, działając ultradźwiękami na amfipatyczne
lipidy w środowisku wodnym. Liposomy są utwo¬
rzone z podwójnej warstwy lipidowej, otaczają¬
cej część środowiska wodnego. Przyłączanie się
soli kwasów żółciowych do miceli i liposomów
i tworzenie miceli mieszanych z produktami tra¬
wienia tłuszczu ułatwia wchłanianie lipidów z je¬
lita. Liposomy są potencjalnie użyteczne klinicz¬
nie - zwłaszcza jeśli połączy się je ze swoistymi
tkankowo przeciwciałami - jako przenośniki le¬
ków w krwiobiegu, gdyż trafiają precyzyjnie do
odpowiednich narządów, np. w leczeniu nowo¬
tworów. Poza tym, mogą być użyteczne w tera¬
pii genowej, np. do wprowadzania odpowiednich
genów do komórek naczyń krwionośnych, oraz
w leczeniu miejscowym jako nośniki dostarczają¬
ce poprzez skórę (transdermalnie) leki lub kosme¬
tyki. Emulsje składają się z cząsteczek dużo więk¬
szych i powstają zwykle z lipidów niepolamych
znajdujących się w środowisku wodnym. Są one
stabilizowane przez środki emulgujące, takie jak
lipidy polarne (np. lecytyna), które tworzą war¬
stwę powierzchniową oddzielającą główną masę
fazy niepolamej od fazy wodnej (ryc. 15-22).
STRESZCZENIE
• Wspólną cechą lipidów jest ich względna nie-
rozpuszczalność w wodzie (hydrofobowość),
a rozpuszczalność w rozpuszczalnikach niepo¬
lamych. Lipidy mające dodatkowo jedną lub
kilka grup polarnych (lipidy amfipatyczne) są
szczególnie przydatne w strukturze błon na gra¬
nicy faz lipid/woda.
• Fizjologicznie ważnymi lipidami są kwasy
tłuszczowe i ich estry oraz cholesterol i inne
steroidy.
• Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe mogą być
nasycone i nienasycone, w zależności od liczby
wiązań podwójnych. Ich płynność maleje wraz
z długością łańcucha, a zwiększa się ze wzro¬
stem stopnia nienasycenia.
• Ikozanoidy - pochodne 20-węglowych wielo-
nienasyconych kwasów tłuszczowych, stanowią
ważną grupę fizjologicznie i farmakologicznie
aktywnych związków, znanych jako prostaglan-
dyny, tromboksany, leukotrieny i lipoksyny.
• Najbardziej znaczącymi lipidami pod wzglę¬
dem ilościowym są estry glicerolu, reprezen¬
towane przez triacyloglicerol („tłuszcz”) waż¬
ny jako istotny składnik lipoprotein oraz jako
forma zapasowa lipidów w tkance tłuszczo¬
wej. Fosfoacyloglicerole są amfipatycznymi
lipidami spełniającymi wiele ważnych funkcji,
np. jako zasadnicze składniki błon i zewnętrz¬
nej warstwy lipoprotein, jako surfaktant płuc,
jako prekursory wtórnych przekaźników syg¬
nałów oraz jako znaczące składniki tkanki ner¬
wowej.
• Glikolipidy są również istotnym składnikiem
tkanki nerwowej (mózgu) i zewnętrznej war¬
stwy błony komórkowej, gdzie współpracują
z sacharydami powierzchni komórki.
• Cholesterol, jako amfipatyczny lipid, jest waż¬
nym składnikiem błon. Jest on macierzystą
cząsteczką, z której powstają w organizmie
wszystkie inne steroidy, m.in. hormony, takie
jak kortykoidy nadnerczowe i hormony płcio¬
we, witaminy D oraz kwasy żółciowe.
• Peroksydacja lipidów zawierających wielo-
nienasycone kwasy tłuszczowe powoduje po¬
wstawanie wolnych rodników, które mogą
uszkadzać tkanki i być przyczyną chorób.
15. LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM 161
PIŚMIENNICTWO
Benzie IFF: Lipid peroxidation: a review of causes, con-
seąuences, measurement and dietary influences. Int
J Food Sci Nutr 1996:47:233.
Christie WW: Lipid Analysis, 3td ed. The Oily Press, 2003.
Dowhan W, Bodanov H: Functional roles of lipids in
membranes. In: Biochemistry of Lipids, Lipopro-
teins and Membranes, 4th ed. Vance DE, Vance JE
(editors). Elsevier, 2002.
Gurr MI: Lipids in Nutrition and Health: A Reappraisal.
The Oily Press, 1999.
Gurr MI, Harwood JL, Frayn K: Lipid Biochemistry,
Blackwell Publishing, 2002.
Przemiany metaboliczne i zaopatrzenie
w „paliwo” metaboliczne
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Metabolizm jest terminem opisującym przemia¬
ny składników chemicznych w organizmie, szla¬
ki poszczególnych cząsteczek, współzależności
między nimi oraz mechanizmy, które regulują
przepływ metabolitów w szlakach. Szlaki meta¬
boliczne dzieli się na trzy kategorie: (1) szlaki
anaboliczne, prowadzące do syntezy większych
i bardziej złożonych związków chemicznych
z mniejszych prekursorów, np. synteza białka
z aminokwasów lub synteza zapasów triacylo-
gliceroli i glikogenu. Szlaki anaboliczne są en-
dotermiczne. (2) Szlaki kataboliczne, w których
następuje rozpad większych cząsteczek; zwykle
są to procesy oksydacyjne, przebiegają w sposób
egzotermiczny, prowadzą do powstania równo¬
ważników redukujących i ATP (głównie w łań¬
cuchu oddechowym). (3) Szlaki amfiboliczne,
biegnące na „skrzyżowaniu dróg” metabolicz¬
nych; działają jako łącznik między szlakami
anabolicznymi i katabolicznymi, np. cykl kwasu
cytrynowego.
Znajomość prawidłowego metabolizmu jest
istotnym warunkiem zrozumienia wielu stanów
chorobowych. Prawidłowy metabolizm obejmuje
adaptacje do okresów głodu, wysiłku, ciąży i lak¬
tacji. Zaburzenia metabolizmu mogą być wyni¬
kiem niedoborów żywieniowych, braku enzymu,
nieprawidłowego wydzielania hormonów lub
działania narkotyków albo toksyn.
Dorosły człowiek, ważący 70 kg, wymaga
dziennie ok. 10-12 MJ (2400-2900 kcal) po¬
chodzących z „paliwa” metabolicznego; większe
zwierzęta potrzebują mniej energii na kilogram
masy ciała, mniejsze - więcej. Również dzieci
i zwierzęta w okresie wzrostu mają proporcjonal¬
nie większe zapotrzebowanie energetyczne, aby
mógł być zapewniony zwiększony nakład energe¬
tyczny niezbędny do wzrostu. U człowieka to za¬
potrzebowanie pokrywa rozpad węglowodanów
(40-60%), lipidów (głównie triacylogliceroli,
30-40%) oraz białek (10-15%) i ewentualnie tak¬
że utlenianie alkoholu. Skład mieszaniny utlenia¬
nych węglowodanów, lipidów i białek zależy od
tego, czy człowiek jest w stanie głodu, czy sytości
(stanie resorpcyjnym czy poresorpcyjnym), oraz
od intensywności wysiłku fizycznego.
Zapotrzebowanie na „paliwo” metaboliczne jest
względnie stałe w ciągu dnia, ponieważ średnia ak¬
tywność fizyczna zwiększa szybkość metabolizmu
tylko o 40-50% powyżej poziomu podstawowego.
Większość ludzi zaspokaja swoje dzienne zapo¬
trzebowanie na to „paliwo” (związki energetyczne)
w dwóch lub trzech posiłkach. Z tego względu mu¬
szą być tworzone rezerwy węglowodanów (gliko-
gen w wątrobie i mięśniach) i lipidów (triacylogli-
cerole w tkance tłuszczowej) zużywane w okresach
przerw pomiędzy posiłkami.
Jeśli pobieranie paliwa metabolicznego jest
większe niż wydatek energetyczny, nadmiar „pa¬
liwa” jest odkładany, głównie w postaci triacy¬
logliceroli, w tkance tłuszczowej, co prowadzi do
rozwoju otyłości i związanego z nią ryzyka cho¬
rób. Inaczej się dzieje, jeśli spożycie substancji
energetycznych jest mniejsze niż wydatek energe¬
tyczny; wtedy zapasy węglowodanów i tłuszczu
są nieznaczne, a aminokwasy powstające z roz¬
padu białek są zużywane raczej do wytwarzania
energii niż do odtworzenia białka. Prowadzi to do
wychudzenia i wyniszczenia organizmu, a w re¬
zultacie do śmierci.
W stanie resorpcyjnym, po posiłku, zapasy wę¬
glowodanów są obfite, a metabolicznym „pali-
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 163
wem” dla większości tkanek jest glukoza. W sta¬
nie poresorpcyjnym glukoza musi być oszczę¬
dzana na potrzeby centralnego układu nerwo¬
wego (zależy on głównie od glukozy) i erytro¬
cytów (zależą całkowicie od glukozy). Dlatego
tkanki, które mają taką możliwość, zużywają
inne substancje energetyczne niż glukoza, np.
mięśnie i wątroba utleniają kwasy tłuszczowe,
a wątroba syntetyzuje z kwasów tłuszczowych
związki ketonowe, które mogą być eksportowa¬
ne do mięśni i innych tkanek. Jeśli zapasy gli-
kogenu zmniejszają się, aminokwasy powstające
z przemiany białek służą jako substraty w glu-
koneogenezie.
Tworzenie i wykorzystywanie zapasów triacy-
logliceroli i glikogenu oraz rodzaj tkanek, które
pobierają i utylizują glukozę, są w dużej mierze
kontrolowane przez hormony, tj. insulinę i glu-
kagon. W cukrzycy dochodzi albo do zaburzenia
syntezy i sekrecji insuliny (cukrzyca młodzieńcza
lub cukrzyca typu I), albo do upośledzenia wraż¬
liwości tkanek na działanie insuliny (cukrzyca
dorosłych lub cukrzyca typu II), co prowadzi do
ciężkich zaburzeń metabolicznych. U bydła wy¬
muszanie obfitej laktacji może prowadzić do ke-
tonemii, jak to się również zdarza w przypadku
ciąży mnogiej u owiec.
SZLAKI PRZETWARZANIA GŁÓWNYCH
PRODUKTÓW TRAWIENIA
Podstawowy typ metabolizmu w tkankach jest
warunkowany rodzajem diety, przy czym zawsze
sprowadza się on do przetwarzania produktów
trawienia węglowodanów, lipidów i białek pocho¬
dzących z pokarmu. Są to głównie (odpowiednio):
glukoza, kwasy tłuszczowe i glicerol oraz amino¬
kwasy. U przeżuwaczy (i w mniejszym stopniu
u innych zwierząt roślinożernych) błonnik po¬
chodzący z diety ulega fermentacji prowadzonej
przez organizmy symbiotyczne, w wyniku czego
powstają krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe
(octowy, propionowy, masłowy), a metabolizm
tych zwierząt jest przystosowany do zużywa¬
nia tych kwasów jako zasadniczych substratów.
Wszystkie produkty trawienia są metabolizowane
do wspólnego produktu - acetylo-CoA, który
ulega następnie utlenieniu w cyklu kwasu cytry¬
nowego (ryc. 16-1).
2C02
Ryc. 16-1. Schemat katabolizmu węglowodanów, białek i tłusz¬
czów pokarmowych. Szlaki kataboliczne tych związków prowa¬
dzą do wytworzenia acetylo-CoA, który następnie jest utleniany
w cyklu kwasu cytrynowego. Końcowym efektem tych przemian
jest wytworzenie ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej.
Metabolizm węglowodanów dotyczy
głównie glukozy
Glukoza jest głównym substratem energetycznym
większości tkanek (ryc. 16-2). Jest metabolizowa¬
na do pirogronianu w procesie glikolizy. Tkanki,
które zużywają tlen (aerobowe) metabolizują piro-
gronian do acetylo-CoA. Ten z kolei może wejść
do cyklu kwasu cytrynowego i ulec całkowitemu
utlenieniu do C02 i H20, połączonego z tworze¬
niem ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej
(ryc. 13-2). Glikoliza może również zachodzić
w warunkach beztlenowych (anaerobowych), ale
wtedy końcowym produktem jest mleczan.
Glukoza i jej metabolity biorą także udział
w innych procesach, takich jak: (1) synteza za¬
pasowego wielocukru - glikogenu w mięśniach
szkieletowych i wątrobie; (2) szlak fosfopento-
zowy, alternatywny dla glikolizy, dostarcza rów¬
noważników redukujących (NADPH) do syntezy
kwasów tłuszczowych oraz jest źródłem rybozy
do syntezy nukleotydów i kwasów nukleinowych;
164 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Pokarmy
I
Ryc. 16-2. Ogólny schemat metabolizmu węglowodanów i jego
główne produkty końcowe. Na schemacie nie uwzględniono glu-
koneogenezy.
(3) tworzenie glicerolowej części triacyloglicero-
li z fosfotrioz; (4) dostarczanie szkieletów węglo¬
wych przez pirogronian i związki pośrednie cyklu
kwasu cytrynowego do syntezy aminokwasów,
tworzenie kwasów tłuszczowych i cholesterolu
(a także wszystkich steroidów syntetyzowanych
w organizmie) z ich prekursora - acetylo-CoA.
Glukoneogeneza jest procesem wytwarzania glu¬
kozy z prekursorów niecukrowych, np. mleczanu,
aminokwasów lub glicerolu.
Metabolizm lipidów dotyczy głównie
kwasów tłuszczowych i cholesterolu
Źródłem długołańcuchowych kwasów tłuszczo¬
wych są albo lipidy z diety, albo synteza de novo
z acetylo-CoA pochodzącego z węglowodanów
lub aminokwasów (ryc. 16-3). Kwasy tłuszczowe
mogą zostać utlenione do acetylo-CoA (P-oksy-
dacja) lub ulec estryfikacji do acylogliceroli, któ¬
re w postaci triacyloglicerolu (tłuszczu) stanowią
główną rezerwę energetyczną organizmu. Ace-
tylo-CoA, powstający w P-oksydacji, ma bardzo
duże znaczenie, a mianowicie:
(1) tak jak acetylo-CoA pochodzący z glikolizy,
ulega on całkowitemu utlenieniu do C02
i H20 w cyklu kwasu cytrynowego;
(2) jest prekursorem cholesterolu oraz innych
steroidów;
(3) w wątrobie powstają z niego ciała ketonowe
(acetooctan i p-hydroksymaślan), które są
ważnym „paliwem” energetycznym w sytu¬
acji przedłużającego się głodowania.
Ryc. 16-3. Ogólny schemat metabolizmu kwasów tłuszczowych
i jego główne produkty końcowe. Ciała ketonowe to: acetooctan,
3-hydroksymaślan i aceton.
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 165
Metabolizm większości aminokwasów
wymaga transaminacji
Aminokwasy są niezbędne do syntezy białka (ryc.
16-4). Niektóre z nich muszą być dostarczane
z dietą (aminokwasy niezbędne, inaczej egzo¬
genne), ponieważ nie mogą być syntetyzowane
w organizmie. Pozostałe, czyli aminokwasy en¬
dogenne, również są dostarczane z pokarmem,
ale mogą być także wytwarzane w organizmie ze
związków pośrednich w procesie transaminacji,
wykorzystującym azot aminowy z innych amino¬
kwasów. Po deaminacji aminokwasów nadmiar
azotu aminowego jest usuwany jako mocznik,
a szkielety węglowe powstające w wyniku trans¬
aminacji są: (1) utleniane do C02 w cyklu kwasu
cytrynowego, (2) zużywane do syntezy glukozy
(glukoneogeneza) lub (3) ulegają przemianie do
ciał ketonowych.
Niektóre aminokwasy są także prekursorami in¬
nych ważnych związków: np. puryn, pirymidyn,
hormonów, takich jak adrenalina i tyroksyna, oraz
neuroprzekaźników.
SZLAKI METABOLICZNE MOGĄ BYĆ
BADANE NA RÓŻNYCH POZIOMACH
ZORGANIZOWANIA
Oprócz badania przemian na poziomie całego
organizmu, można analizować przebieg szlaków
metabolicznych i ich współzależność na niższych
poziomach zorganizowania, a mianowicie: (1) na
poziomie tkanki i narządu - określa się rodzaje
substratów wchodzących do tkanek i narządów
oraz metabolitów opuszczających tkanki i narzą¬
dy; (2) na poziomie subkomórkowym - każda
struktura subkomórkowa (np. mitochondrium)
lub przedział komórkowy (np. cytozol) pełni swo¬
iste funkcje, stanowiące część subkomórkowych
szlaków metabolicznych.
Poziom tkanki i narządu: krążenie krwi
integruje metabolizm
Aminokwasy powstające w procesie trawienia
białek pokarmowych oraz glukoza powstająca
Ryc. 16-4. Ogólny schemat przemiany aminokwasów i jej główne produkty końcowe.
166 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
w wyniku trawienia węglowodanów są wchłania¬
ne z jelita do krwi żyły wrotnej wątroby. Wą¬
troba odgrywa rolę w regulacji stężenia we krwi
rozpuszczalnych w wodzie metabolitów (ryc.
16-5). W przypadku glukozy odbywa się to przez
wychwytywanie nadmiaru glukozy i przekształca¬
nie jej w glikogen (glikogenogeneza) lub w kwa¬
sy tłuszczowe (lipogeneza). Między posiłkami,
w celu uzupełnienia stężenia glukozy we krwi,
wątroba uwalnia jąze zmagazynowanego glikoge-
nu (glikogenoliza) lub, wraz z nerką, przekształca
metabolity niecukrowe, takie jak mleczan, glice¬
rol i aminokwasy w glukozę (glukoneogeneza).
Utrzymanie właściwego stężenia glukozy we krwi
jest konieczne ze względu na pewne tkanki, dla
których jest ona głównym (mózg) albo jedynym
(erytrocyty) źródłem energii. Do zadań wątroby
należy również synteza głównych białek osocza
krwi (np. albuminy) oraz deaminacja amino¬
kwasów występujących w nadmiarze i związane
z tym tworzenie mocznika, który jest transporto¬
wany do nerek i wydalany.
Mięśnie szkieletowe zużywają glukozę jako
„paliwa” w przemianach zarówno tlenowych, two¬
rząc C02, jak i beztlenowych, tworząc mleczan.
Magazynują glikogen jako „paliwo” do wykorzy¬
stania w skurczu mięśni i syntetyzują białka miꜬ
niowe z aminokwasów osocza. Mięśnie stanowią
ok. 50% masy ciała, reprezentują więc znaczny
zapas białek, który może być wykorzystany do za¬
opatrzenia osocza w aminokwasy, użytkowane do
glukoneogenezy podczas głodowania.
Lipidy diety (ryc. 16-6), reprezentowane głów¬
nie przez triacyloglicerole, są hydrolizowane
w żołądku do monoacylogliceroli i kwasów tłusz¬
czowych, a następnie w śluzówce jelita zachodzi
resynteza lipidów. Po połączeniu z białkiem są
wydzielane w formie lipoprotein, znanych jako
chylomikrony, początkowo do układu limfatycz-
nego, a następnie do krwiobiegu. Chylomikrony
zawierają również inne składniki odżywcze roz¬
puszczalne w lipidach. W przeciwieństwie do glu¬
kozy i aminokwasów, triacyloglicerole zawarte
w chylomikronach nie są pochłaniane bezpośred-
Ryc. 16-5. Transport i los głównych substratów i metabolitów węglowodanowych i aminokwasowych. Uwaga: w mięśniu wolna gluko¬
za występuje w niewielkich stężeniach, ponieważ po wniknięciu do komórki ulega natychmiast fosforylacji.
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 167
Ryc. 16-6. Transport i losy głównych substratów i metabolitów lipidowych. WKT - wolne kwasy tłuszczowe, LPL - lipaza lipoproteino-
wa, MG - monoacyloglicerol, TG - triacyloglicerol, VLDL - lipoproteiny o bardzo małej gęstości.
nio przez wątrobę. Są one najpierw metabolizo¬
wane przez tkanki, zawierające lipazę lipopro-
teinową, która hydrolizuje triacyloglicerole, co
prowadzi do uwalniania kwasów tłuszczowych.
Kwasy te są następnie wbudowywane do lipidów
tkankowych lub wykorzystywane jako źródło
energii. Remnanty chylomikronów (chylomikro-
ny resztkowe) są wychwytywane przez wątrobę.
Innym ważnym źródłem długołańcuchowych
kwasów tłuszczowych jest synteza (lipogeneza)
z węglowodanów, głównie w tkance tłuszczowej
i wątrobie.
Triacyloglicerole tkanki tłuszczowej stanowią
zasadniczą rezerwę energetyczną w organizmie.
W następstwie ich hydrolizy (lipolizy) wol¬
ne kwasy tłuszczowe i glicerol są uwalniane do
krwiobiegu. Glicerol jest substratem dla gluko-
neogenezy. Kwasy tłuszczowe, transportowane
jako połączone z albuminą, są pobierane przez
większość tkanek (ale nie przez mózg i erytro¬
cyty) i albo estryfikowane do acylogliceroli, albo
utleniane jako źródło energetyczne. W wątrobie
triacyloglicerole powstałe w procesie lipogene-
zy, wolne kwasy tłuszczowe oraz chylomikrony
resztkowe (ryc. 25-3) są wydzielane do krwiobie¬
gu w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości
(VLDL). Triacyloglicerole te ulegają podobnym
przemianom jak chylomikrony. Częściowe utle¬
nianie wolnych kwasów tłuszczowych w wątrobie
prowadzi do tworzenia ciał ketonowych (ketoge-
neza). Ciała ketonowe są transportowane do tka¬
nek pozawątrobowych, gdzie są wykorzystywane
jako źródło energii w okresie długotrwałego postu
lub głodowania.
168 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Poziom subkomórkowy: glikoliza
przebiega w cytozolu, a cykl kwasu
cytrynowego w mitochondriach
Kompartmentacja szlaków metabolicznych w od¬
dzielnych przedziałach subkomórkowych lub or¬
ganellach pozwala na integrację i regulację
metabolizmu. Nie wszystkie szlaki są tak samo
ważne we wszystkich komórkach. Na rycinie
16-7 przedstawiono umiejscowienie szlaków
metabolicznych komórki miąższu wątroby.
Wyraźna jest centralna rola mitochondrium,
Ryc. 16-7. Wewnątrzkomórkowe umiejscowienie i integracja głównych szlaków metabolicznych w komórce miąższu wątroby
AA - przemiana jednego lub więcej aminokwasów egzogennych. AA <-► - przemiana jednego lub więcej aminokwasów endogennych.
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 169
ponieważ w nim skupia się metabolizm węglo¬
wodanów, lipidów i aminokwasów. Mieszczą się
w nim m.in. enzymy cyklu kwasu cytrynowego,
p-oksydacji kwasów tłuszczowych i ketogenezy
oraz łańcucha oddechowego z syntazą ATP.
Glikoliza, szlak pentozofosforanowy oraz syn¬
teza kwasów tłuszczowych zachodzą w cytozolu.
W glukoneogenezie substraty, takie jak mleczan
i pirogronian, które powstają w cytozolu, muszą
wejść do mitochondrium, aby ulec przemianie
w szczawiooctan, będący substratem dla syntezy
glukozy.
Błony siateczki śródplazmatycznej zawierają
system enzymatyczny, katalizujący syntezę tri-
acylogliceroli, oraz rybosomy, odpowiedzialne
za syntezę białek.
PRZEPŁYW METABOLITÓW
W SZLAKACH METABOLICZNYCH
MUSI BYĆ REGULOWANY
W SPOSÓB ZHARMONIZOWANY
Regulacja całkowitego przepływu metabolitów
w szlaku metabolicznym ma duże znaczenie dla
zapewnienia odpowiedniej podaży głównych
produktów tego szlaku. Regulacja sprowadza się
często do kontroli jednej lub kilku kluczowych
reakcji w szlaku, katalizowanych przez enzymy
regulacyjne. Najważniejsze w kontroli całkowi¬
tej szybkości szlaku metabolicznego są czynniki
fizykochemiczne, kontrolujące szybkość reakcji
katalizowanej przez enzym, np. stężenie substratu
(rozdz. 9).
Potencjalnymi punktami kontroli
są reakcje nierównowagowe
W reakcji, która osiągnęła stan równowagi szyb¬
kości reakcji w obydwu kierunkach są jednakowe
i dlatego nie obserwuje się żadnego przepływu
netto w jakimkolwiek kierunku.
A^B5=±C^D
In vivo, w stanie stacjonarnym, przepływ net¬
to będzie zachodził od strony lewej do prawej
w przypadku ciągłego dostarczania substratu
A i ciągłego usuwania produktu D. Zazwyczaj
w szlaku metabolicznym jedna albo kilka reak¬
cji przebiega nierównowagowo. W reakcjach
tych reagenty występują w stężeniach znacznie
różniących się od tych w stanie równowagi.
W wyniku dążenia do osiągnięcia stanu równo¬
wagi powstają duże straty entalpii swobodnej, co
powoduje, że tego typu reakcja jest zasadniczo
nieodwracalna.
Ciepło
a^bAc^d
Taki szlak wykazuje zarówno przepływ, jak i kie¬
runek. Enzymy katalizujące reakcje w warunkach
braku równowagi występują zwykle w mniejszych
stężeniach i podlegają różnorodnym mechani¬
zmom kontroli. Należy podkreślić, że większość
reakcji w szlakach metabolicznych nie da się za¬
klasyfikować wprost do kategorii reakcji równo¬
wagowych lub nierównowagowych i należałoby
je umieścić gdzieś pomiędzy nimi.
Reakcją powodująca przepływ jest
pierwsza reakcja w szlaku, która jest
wysycona substratem
Można ją zidentyfikować jako reakcję nierówno¬
wagową, w której Km enzymu jest znacznie mniej¬
sza od fizjologicznego stężenia substratu. Przykła¬
dem takiej reakcji jest pierwsza reakcja w gliko¬
lizie katalizowana przez heksokinazę (ryc. 18-2),
ponieważ jej Km dla glukozy (wynosząca 0,05
mmol/L) jest znacznie mniejsza od fizjologiczne¬
go stężenia glukozy we krwi (5 mmol/L).
MECHANIZMY ALLOSTERYCZNE
I HORMONALNE MAJA DUŻE ZNACZENIE
W METABOLICZNEJ KONTROLI REAKCJI
ENZYMATYCZNYCH
Na rycinie 16-8 przedstawiono hipotetyczny szlak
metaboliczny, w którym reakcje A B i 0->D są
w stanie równowagi, a B—>C jest reakcją w stanie
dalekim od równowagi. Przepływ w tym szlaku
może być regulowany dostępnością substratu A
dostarczanego z krwi, co z kolei zależy od spo¬
życia odpowiedniego pokarmu lub od pewnych
kluczowych reakcji, które wytwarzają i uwalniają
substraty do krwi. Przykładem tego są dwie reak¬
cje -jedna katalizowana przez fosforylazę gliko-
genu w wątrobie (ryc. 19-1), druga przez lipazę
170 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Nieaktywny
enzym!
©
Ca2+/kalmodulina ■
©
©
©
Aktywny
[Enzym,]
Jądrowa biosynteza
mRNA
Indukcja Represja
Ryc. 16-8. Mechanimy kontroli reakcji enzymatycznych. Liczby w kotkach wskazują możliwe miej¬
sca działania hormonów. © - zmiany przepuszczalności błony; © - przemiana postaci nieaktywnej
w postać aktywną enzymu, zazwyczaj zachodząca przy udziale reakcji fosforylacji/defosforylacji;
© - zmiana szybkości translacji mRNA na poziomie rybosomu; © - indukcja biosyntezy mRNA;
© - represja biosyntezy mRNA. 0 i © są szybkim sposobem regulacji aktywności enzymów, nato¬
miast © - ® - wolniejszym.
wrażliwą na hormony w tkance tłuszczowej (ryc.
25-8). Duże znaczenie ma również zdolność sub-
stratu A do przenikania przez błonę komórkową.
Przepływ może być również warunkowany szyb¬
kością usuwania końcowego produktu D i dostęp¬
nością kosubstratu lub kofaktorów oznaczonych
na rycinie jako X i Y. Enzymy katalizujące reakcje
nierównowagowe często są białkami allosterycz-
nymi, podlegającymi kontroli w odpowiedzi na
potrzeby komórki przez efektory allosteryczne
szybko działające poprzez sprzężenie zwrotne
albo poprzez sprzężenie do przodu (rozdz. 9). Czę¬
sto końcowy produkt szlaku biosyntezy hamuje
aktywność enzymu katalizującego pierwszą reak¬
cję tego szlaku. Inne mechanizmy kontroli zależą
od działania hormonów reagujących na potrzeby
całego organizmu; mogą one następować szybko
- poprzez zmianę aktywności enzymu lub powo¬
li - poprzez zmianę szybkości syntezy enzymu
(rozdz. 42).
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 171
„PALIWA” METABOLICZNE
SAPRZETWARZALNE
Nadwyżka węglowodanów ponad ilość wyma¬
ganą do bezpośredniego metabolizmu wytwa¬
rzającego energię i tworzenia zapasów glikogenu
w mięśniach oraz wątrobie może zostać zużyta
do syntezy kwasów tłuszczowych, a więc tri-
acylogliceroli w tkance tłuszczowej oraz wątro¬
bie (skąd są transportowane w postaci lipopro-
tein o bardzo małej gęstości). Znaczenie lipo-
genezy u ludzi jest niejasne; w krajach Zachodu
tłuszcz zawarty w diecie stanowi 35-45% jej
wartości energetycznej, podczas gdy w krajach
mniej rozwiniętych, gdzie węglowodany mogą
stanowić 60-75% wartości energetycznej diety,
całkowite spożycie pokarmów jest tak niskie, że
nadwyżka dla lipogenezy jest niewielka. Duże
spożycie tłuszczu hamuje lipogenezę w tkance
tłuszczowej i wątrobie.
Kwasy tłuszczowe (i tworzone z nich ciała ke¬
tonowe) nie mogą być użyte do syntezy glukozy.
Reakcja powstawania acetylo-CoA, katalizowana
przez dehydrogenazę pirogronianową, jest reakcją
nieodwracalną. Na każdą jednostkę dwu węglową
z acetylo-CoA, która wchodzi do cyklu kwasu cy¬
trynowego, są tracone dwa atomy węgla w posta¬
ci ditlenku węgla, zanim szczawiooctan zostanie
odtworzony. Oznacza to, że acetylo-CoA (a także
każdy substrat, który ulega przemianie do acetylo-
-CoA) nie może być wykorzystany do glukoneo-
genezy. Kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie
atomów węgla (stosunkowo rzadkie) dostarczają
propionylo-CoA, który jest produktem ostatniego
cyklu P-oksydacji i który może być użyty jako
substrat dla glukoneogenezy, podobnie jak glice¬
rol uwolniony w wyniku lipolizy triacyloglicerolu
zmagazynowanego w tkance tłuszczowej.
Większość nadwyżki aminokwasów ponad
potrzeby syntezy białek (pochodzących z po¬
karmu lub przemian białek tkankowych) dostar¬
cza pirogronianu lub cztero- i pięciowęglowych
związków pośrednich dla cyklu kwasu cytryno¬
wego. Pirogronian może być karboksylowany do
szczawiooctanu, który jest głównym substratem
glukoneogenezy, a inne związki pośrednie cyklu
kwasu cytrynowego także powodują w rezulta¬
cie wzrost poziomu szczawiooctanu, dostępnego
później dla glukoneogenezy. Aminokwasy te zo¬
stały nazwane aminokwasami glukogennymi.
Utlenianie dwóch aminokwasów (lizyny i leucy-
ny) prowadzi jedynie do powstania acetylo-CoA,
dlatego też nie mogą być one wykorzystane do
glukoneogenezy. Cztery inne (fenyloalanina,
tyrozyna, tryptofan i izoleucyna) przyczyniają
się do powstania zarówno szczawiooctanu, jak
i związków pośrednich cyklu kwasu cytryno¬
wego, które mogą być wykorzystane do gluko¬
neogenezy. Te aminokwasy, z których powstaje
acetylo-CoA są zaliczane do aminokwasów ke-
togennych, ponieważ w przedłużającym się
okresie niedoboru pokarmu lub w głodzie sporo
acetylo-CoA jest zużywane do syntezy ciał keto¬
nowych w wątrobie.
PODAŻ „PALIWA” METABOLICZNEGO
JEST ZAGWARANTOWANA
ZARÓWNO W STANIE SYTOŚCI,
JAK TEŻ W STANIE GŁODU
Glukoza jest stale potrzebna
dla centralnego układu
nerwowego i erytrocytów
Brak mitochondriów w erytrocytach powoduje,
że są one całkowicie zależne od (beztlenowej)
glikolizy i szlaku fosfopentozowego. Mózg może
metabolizować ciała ketonowe, co zaspokaja
ok. 20% jego zapotrzebowania energetycznego,
reszta musi być zapewniona przez glukozę. Prze¬
miany metaboliczne, które występują na czczo
i w okresie głodu są konsekwencją konieczności
utrzymania poziomu glukozy i ograniczenia re¬
zerw glikogenu w wątrobie oraz mięśniach, po
to, aby glukoza była stale dostarczana do mózgu
i czerwonych krwinek, oraz konieczności zabez¬
pieczenia dostaw alternatywnych substancji ener¬
getycznych dla innych tkanek. Podczas ciąży płód
wymaga znacznych ilości glukozy, podobnie jak
synteza laktozy podczas laktacji (ryc. 16-9).
W stanie resorpcyjnym (sytości)
sa odkładane rezerwy paliwa
metabolicznego
Przez kilka godzin po posiłku, kiedy produkty
trawienia są wchłaniane, obserwuje się znaczny
napływ substancji energetycznych. W tych wa¬
runkach glukoza jest głównym utlenianym „pali-
172 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 16-9. Metaboliczne powiązania tkanki tłuszczowej, wątroby i narządów pozawątrobowych. W narządzie takim jak
serce „paliwa” metaboliczne są spalane w następującej kolejności: ciała ketonowe > kwasy tłuszczowe > glukoza.
(LPL - lipaza lipoproteinowa, WKT - wolne kwasy tłuszczowe, VLDL - lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości).
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 173
Tabela 16-1. Zysk energetyczny, zużycie tlenu oraz produkcja dwutlenku węgla podczas utleniania substratów energetycznych
Zysk energetyczny
zużycie 02
produkcja
RQ (produkcja
Energia
(kJ/g)
d/g)
C02(l/g)
C02/zużycie02)
(kJ/l 02)
Węglowodany
16
0,829
0,829
1,00
20
Białka
17
0,966
0,782
0,81
20
Huszcz
37
2,016
1,427
0,71
20
Alkohol
29
1,429
0,966
0,66
20
wem” w większości tkanek. Obserwuje się wtedy
wzrost współczynnika oddechowego (stosunek
wytworzonego ditlenku węgla do zużytego tlenu)
zok. 0,8 na czczo do około 1 (tab. 16-1).
Pobieranie glukozy przez mięśnie i tkankę tłusz¬
czową jest kontrolowane przez insulinę, która
jest wydzielana przez komórki wysepek (3 trzust¬
ki w odpowiedzi na zwiększone stężenie glukozy
w żyle wrotnej. Na czczo w tkance tłuszczowej
i mięśniach przenośnik glukozowy (GLUT-4)
znajduje się w wewnątrzkomórkowych pęche¬
rzykach. W odpowiedzi na wydzielanie insuliny
następuje migracja pęcherzyków do powierzchni
komórki, gdzie ulegają fuzji z błoną komórko¬
wą, eksponując aktywny przenośnik glukozy. Te
wrażliwe na insulinę tkanki pobierają glukozę
z krwiobiegu jedynie w obecności hormonu. Na
czczo, gdy spada poziom wydzielania insuliny,
receptory są znowu transportowane do wnętrza
komórki, a w związku z tym jest obniżone pobie¬
ranie glukozy z krwi.
Wychwyt glukozy przez wątrobę jest nieza¬
leżny od insuliny, ale w wątrobie występuje izo-
enzym heksokinazy (glukokinaza) o wysokim
Km. Jeśli stężenie pobieranej glukozy w wątrobie
wzrasta, zwiększa się również szybkość syntezy
glukozo-6-fosforanu. Prowadzi to do nadmiaru
glukozo-6-fosforanu w stosunku do potrzeb me¬
tabolizmu dostarczającego energię i w wyniku
tego glukoza jest zużywana głównie do syntezy
glikogenu. Zarówno w wątrobie, jak i w miꜬ
niach szkieletowych insulina działa stymulująco
na syntazę glikogenową i hamująco na fosforyla-
zę glikogenową. Dodatkowa ilość glukozy wcho¬
dzącej do wątroby może być również wykorzysta¬
na do lipogenezy, a dalej do syntezy triacylogli-
ceroli. W tkance tłuszczowej insulina stymuluje
wychwytywanie glukozy, jej przemianę w kwasy
tłuszczowe i ich estryfikację do triacylogliceroli,
a hamuje wewnątrzkomórkową lipolizę i uwalnia¬
nie wolnych kwasów tłuszczowych.
Produkty trawienia tłuszczów przedostają
się do krwiobiegu w postaci chylomikronów
- największych lipoprotein osocza, wyjątko¬
wo zasobnych w triacyloglicerole (rozdz. 25).
W tkance tłuszczowej i mięśniach szkieletowych
jest syntetyzowana zewnątrzkomórkowa lipa¬
za lipoproteinowa, która ulega aktywacji w od¬
powiedzi na insulinę. W wyniku działania tego
enzymu powstają wolne kwasy tłuszczowe, któ¬
re są pobierane przez te tkanki i zużywane do
syntezy triacylogliceroli, oraz glicerol, który jest
wychwytywany przez wątrobę i zużywany albo
do glukoneogenezy, albo do syntezy glikogenu
lub do lipogenezy. Kwasy tłuszczowe pozosta¬
jące w krwiobiegu są pobierane przez wątrobę
i reestryfikowane. Chylomikrony resztkowe po¬
zbawione lipidów są wyłapywane przez wątro¬
bę, a reszta zawartych w nich triacylogliceroli,
razem z wytworzonym w wątrobie triacyloglice-
rolem, jest eksportowana w postaci lipoprotein
o bardzo małej gęstości.
W normalnych warunkach szybkość katabo¬
lizmu białek tkankowych jest mniej więcej stała
w ciągu dnia. Kacheksja (wyniszczenie) orga¬
nizmu, towarzysząca zaawansowanej chorobie
nowotworowej lub innym chorobom, charaktery¬
zuje się zwiększoną szybkością katabolizmu bia¬
łek. Na czczo występuje stan netto katabolizmu
białek, a po posiłku - stan netto syntezy białka,
kiedy szybkość syntezy wzrasta o 20-25%. Przy¬
spieszona synteza białka w odpowiedzi na więk¬
szą dostępność aminokwasów i związków ener¬
getycznych jest ponownie wynikiem działania
insuliny. Synteza białka jest „kosztownym” pod
względem energetycznym procesem; może zużyć
do 20% energii spoczynkowej po posiłku, ale tyl¬
ko 9% w stanie poresorpcyjnym.
174 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Metaboliczne rezerwy energetyczne
sa wykorzystywane w stanie
poresorpcyjnym
W stanie poresorpcyjnym następuje niewielki spa¬
dek poziomu glukozy w osoczu, a jeśli stan ten
przedłuża się w sytuacji głodowania - kolejny
mały spadek. W stanie resorpcyjnym wzrasta po¬
ziom wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu,
w okresie głodu wzrost ten postępuje. Znacznie
wzrasta także stężenie ciał ketonowych (acetoocta-
nu i p-hydroksymaślanu) (tab. 16-2, ryc. 16-10).
Tabela 16-2. Stężenie „paliw” metabolicznych (mmol/L) w suro¬
wicy krwi w stanie resorpcyjnym i na czczo
Posiłek
40 godzin
głodu
7 dni
głodu
Glukoza
5,5
3,6
3,5
Wolne kwasy tłuszczowe
0,30
1,15
1,19
Ciała ketonowe
nieistotne
2,9
4,5
W stanie poresorpcyjnym, kiedy stężenie glu¬
kozy w żyle wrotnej maleje, sekrecja insuliny też
maleje, a mięśnie szkieletowe i tkanka tłuszczo¬
wa pobierają mniej glukozy. Komórki a trzustki
zwiększają wydzielanie glukagonu, który hamu¬
je syntazę glikogenową oraz aktywuje fosforylazę
glikogenową w wątrobie. Powstający glukozo-6-
-fosforan jest hydrolizowany przez glukozo-6-fo-
sfatazę, a glukoza jest uwalniana do krwiobiegu
i może być wykorzystana przez mózg oraz ery¬
trocyty.
Mięśniowy glikogen nie może się bezpośred¬
nio przyczyniać do wzrostu poziomu glukozy we
krwi, ponieważ w komórkach mięśniowych nie
ma glukozo-6-fosfatazy, a głównym zadaniem
mięśniowego glikogenu jest dostarczanie glu-
kozo-6-fosforanu dla przemian energetycznych
w mięśniu. Acetylo-CoA, wytwarzany w czasie
utleniania kwasów tłuszczowych w mięśniu, ha¬
muje dehydrogenazę pirogronianową, co prowa¬
dzi do nagromadzania się pirogronianu. Większa
część tego pirogronianu ulega transaminacji do
alaniny, kosztem aminokwasów powstających
z rozpadu „labilnych” zapasów białek syntetyzo¬
wanych w okresie po spożyciu posiłku. Alanina
oraz ketokwasy powstające w wyniku transami-
Ryc. 16-10. Względne zmiany parametrów metabolicznych pod¬
czas głodówki.
nacji są eksportowane z mięśnia, wychwytywa¬
ne przez wątrobę, gdzie alanina ulega ponownej
transaminacji do pirogronianu. Aminokwasy
powstające w tej reakcji są transportowane z po¬
wrotem do mięśnia, gdzie stanowią źródło grupy
aminowej do tworzenia większej ilości alaniny.
W wątrobie natomiast pirogronian jest głównym
substratem dla glukoneogenezy.
Obniżenie poziomu insuliny i wzrost poziomu
glukagonu powoduje w tkance tłuszczowej zaha¬
mowanie lipogenezy, inaktywację lipazy lipopro-
teinowej oraz aktywację lipazy wewnątrzkomór¬
kowej, zależnej od hormonów (rozdz. 25). Prowa¬
dzi to do uwolnienia z tkanki tłuszczowej zwięk¬
szonej ilości glicerolu, który jest substratem dla
glukoneogenezy w wątrobie, i wolnych kwasów
tłuszczowych, które są zużywane przez wątrobę,
serce i mięśnie szkieletowe jako preferowany sub-
strat energetyczny. W ten sposób oszczędzana jest
glukoza.
Mimo że w stanie resorpcyjnym mięśnie prefe¬
rencyjnie pobierają i metabolizują wolne kwasy
tłuszczowe, nie mogą samą (3-oksydacją zaspo¬
koić całego swojego zapotrzebowania energe-
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 175
tycznego. W odróżnieniu od mięśni, wątroba ma
większą zdolność P-oksydacji, niż wymaga tego
jej własne zapotrzebowanie energetyczne. Jeśli
okres głodu przedłuża się, wytwarza ona w nad¬
miarze acetylo-CoA, a ten jest wykorzystywany
do syntezy ciał ketonowych (rozdz. 22), które są
głównym „paliwem” metabolicznym dla mięśni
szkieletowych i mięśnia sercowego oraz mogą
zaspokajać część zapotrzebowania energetyczne¬
go mózgu. W przypadku przedłużającego się gło¬
dowania udział glukozy w całym metabolizmie
dostarczającym energię dla organizmu może być
mniejszy niż 10%.
Gdyby nie było innego źródła glukozy, wątro¬
bowy i mięśniowy glikogen zostałby zużyty po 18
godzinach niedoboru pokarmu. Jeśli głodowanie
przedłuża się, zwiększona ilość aminokwasów
uwalnianych w wyniku katabolizmu białek jest
wykorzystywana w wątrobie i nerkach w procesie
glukoneogenezy (tab. 16-3).
Tabela 16-3. Podsumowanie głównych cech metabolicznych najważniejszych narządów
Narząd
Główne szlaki
Główne substraty
Główne eksportowane
produkty
Specjalistyczne enzymy
Wątroba
Glikoliza, glukoneogeneza,
P-oksydacja, cykl kwasu
cytrynowego, ketogeneza,
metabolizm lipoprotein,
metabolizm leków, synteza
soli kwasów żółciowych,
mocznika, kwasu
moczowego, cholesterolu,
białek osocza
Wolne kwasy tłuszczowe,
glukoza (po posiłku),
mleczan, glicerol,
fruktoza, aminokwasy,
alkohol
Glukoza, triacyloglicerol
w VLDL, ciała ketonowe,
mocznik, kwas
moczowy, sole kwasów
żółciowych, cholesterol,
białka osocza
Glukokinaza,
glukozo-6-fosfataza, kinaza
glicerolowa, karboksykinaza
fosfoenolopirogronianowa,
fruktokinaza, arginaza,
syntaza HMG-CoA, liaza
HMG-CoA, dehydrogenaza
alkoholowa
Mózg
Glikoliza, metabolizm
aminokwasów, synteza
neuroprzekaźników
Glukoza, aminokwasy,
ciała ketonowe
w przedłużającym się
głodzie
Mleczan, końcowe
produkty metabolizmu
neuroprzekaźników
Enzymy syntezy
i katabolizmu
neuroprzekaźników
Serce
P-Oksydacja, cykl kwasu
cytrynowego
Ciała ketonowe, wolne
kwasy tłuszczowe,
mleczan, triacyloglicerol
z chylomikronów i VLDL,
częściowo glukoza
Lipaza lipoproteinowa,
bardzo aktywny łańcuch
przenoszenia elektronów
Tkanka
tłuszczowa
Lipogeneza, estryfikacja
kwasów tłuszczowych,
lipoliza (w głodzie)
Glukoza, triacyloglicerol
z chylomikronów i VLDL
Wolne kwasy
tłuszczowe, glicerol
Lipaza lipoproteinowa,
lipaza zależna od
hormonów, enzymy szlaku
pentozofosforanowego
Mięsień szybko
kurczący się
Glikoliza
Glukoza, glikogen
Mleczan, (alanina
i ketokwasy w okresie
głodu)
~
Mięsień wolno
kurczący się
P-Oksydacja, cykl kwasu
cytrynowego
Ciała ketonowe,
chylomikrony
i triacyloglicerol w VLDL
■
Lipaza lipoproteinowa,
bardzo aktywny łańcuch
oddechowy
Nerki
Glukoneogeneza
Wolne kwasy tłuszczowe,
mleczan, glicerol, glukoza
Glukoza
Kinaza glicerolowa,
karboksykinaza
fosfoenolopirogronianowa
Erytrocyty
Glikoliza beztlenowa, szlak
pentozofosforanowy
Glukoza
Mleczan
Hemoglobina,
enzymy szlaku
pentozofosforanowego
VLDL - lipoproteina o bardzo malej gęstości.
176 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
ASPEKTY KLINICZNE
W przedłużającym się głodzie, jeśli rezerwy
tkanki tłuszczowej są wyczerpane, następuje
znaczny wzrost szybkości netto katabolizmu
białek, w celu dostarczania aminokwasów nie
tylko jako substratów dla glukoneogenezy, ale
także jako „paliwa” energetycznego dla wszyst¬
kich tkanek. Śmierć następuje wtedy, kiedy istot¬
ne białka tkankowe ulegają rozkładowi i nie są
zastępowane"nowymi. Wyniszczenie (kacheksja)
organizmu jest wynikiem uwalniania cytokin
w odpowiedzi na nowotwory i na wiele innych
stanów patologicznych. U takich pacjentów,
oprócz wzrostu szybkości metabolizmu, ob¬
serwuje się wzrost tempa rozpadu białek tkan¬
kowych. W rezultacie są oni w stanie zaawan¬
sowanego głodu, co jak już powiedziano, może
prowadzić do śmierci.
Wysokie zapotrzebowanie na glukozę u płodu
oraz synteza laktozy w czasie laktacji może pro¬
wadzić do ketonemii. U ludzi może być to łagod¬
na ketonemia z hipoglikemią. U bydła w czasie
laktacji i u owiec w ciąży mnogiej obserwuje się
znaczną ketonemię i głęboką hipoglikemię.
U pacjentów ze słabo kontrolowaną cukrzycą
typu 1 może się pojawiać hipoglikemią. Częścio¬
wo jest ona wynikiem braku insuliny niezbędnej
do wychwytywania i utylizacji glukozy, a czꜬ
ciowo tego, że przy braku insuliny w wątrobie
zachodzi zwiększona glukoneogeneza z ami¬
nokwasów. W tym samym czasie brak insuli¬
ny prowadzi do zwiększenia lipolizy w tkance
tłuszczowej, a powstające w tym procesie wolne
kwasy tłuszczowe są substratami dla ketogenezy
w wątrobie.
Wykorzystanie ciał ketonowych przez mięśnie
(i inne narządy) może być zakłócone z powodu
braku szczawiooctanu (we wszystkich tkankach
metabolizm glukozy jest potrzebny do utrzyma¬
nia odpowiedniej ilości szczawiooctanu niezbęd¬
nego dla przebiegu cyklu kwasu cytrynowego).
W niekontrolowanej cukrzycy ketonemia może
być na tyle głęboka, że powoduje znaczną kwa¬
sicę (ketokwasicę), ponieważ acetooctan i [3-hy-
droksymaślan są względnie mocnymi kwasami.
Śpiączka jest wynikiem zarówno kwasicy, jak
i znacznie zwiększonej osmolamości płynów po-
zakomórkowych (co jest głównie spowodowane
hipoglikemią).
STRESZCZENIE
• Produkty trawienia zapewniają tkankom ele¬
menty budulcowe do biosyntezy złożonych
cząsteczek oraz substraty energetyczne do zasi¬
lania procesów życiowych.
• Prawie wszystkie produkty trawienia węglowo¬
danów, tłuszczów i białek są metabolizowane do
wspólnego metabolitu - acetylo-CoA, zanim zosta¬
ną utlenione do C02 w cyklu kwasu cytrynowego.
• Acetylo-CoA jest również substratem dla synte¬
zy długołańcuchowych kwasów tłuszczowych
i steroidów, łącznie z cholesterolem i ciałami
ketonowymi.
• Glukoza dostarcza szkieletu węglowego dla gli¬
cerolu w triacyloglicerolach i dla aminokwasów
endogennych.
• Wszystkie rozpuszczalne w wodzie produkty
trawienia są transportowane żyłą wrotną bezpo¬
średnio do wątroby. Wątroba reguluje stężenie
glukozy i aminokwasów we krwi.
• Szlaki metaboliczne zachodzą w różnych prze¬
działach subkomórkowych. Glikoliza, gluko¬
neogeneza, glikogenogeneza, glikogenoliza,
szlak pentozofosforanowy oraz lipogeneza
zachodzą w cytozolu. Mitochondria zawierają
enzymy cyklu kwasu cytrynowego, [3-oksydacji
kwasów tłuszczowych oraz łańcuch oddechowy
i syntazę ATP. Błony siateczki śródplazmatycz-
nej zawierają enzymy dla wielu procesów, m.in.
syntezy triacyloglicerolu i metabolizmu leków.
• Szlaki metaboliczne są regulowane szybkimi
mechanizmami wpływającymi na aktywność już
istniejących enzymów, np. allosteryczna i kowa¬
lencyjna modyfikacja (często w odpowiedzi na
działanie hormonów) oraz powolne mechanizmy
działające na poziomie syntezy enzymów.
• Nadwyżka węglowodanów i aminokwasów po¬
chodzących z diety może być wykorzystana do
syntezy kwasów tłuszczowych, a te z kolei do
syntezy triacylogliceroli.
• Na czczo lub podczas głodu glukoza musi być
dostarczana do mózgu i krwinek czerwonych;
we wczesnym okresie niedoboru pokarmu
jest dostarczana z zapasów glikogenu. W celu
oszczędzania glukozy, mięśnie i inne tkanki nie
pobierają glukozy, kiedy wydzielanie insuliny
jest małe. Tkanki te wykorzystują kwasy tłusz¬
czowe (a później ciała ketonowe) jako prefero¬
wane źródło energii.
16. PRZEMIANY METABOLICZNE I ZAOPATRZENIE W „PALIWO” METABOLICZNE 177
Tkanka tłuszczowa uwalnia wolne kwasy tłusz¬
czowe w okresie głodu. Jeśli okres niedoboru
pokarmu przedłuża się, w wątrobie są synte¬
tyzowane związki ketonowe, które stanowią
główne źródło energii dla mięśni.
Większość aminokwasów, pochodzących z die¬
ty lub z przemiany białek tkankowych, może
być wykorzystana w glukoneogenezie, podob¬
nie jak glicerol pochodzący z rozpadu triacy-
logliceroli.
Ani kwasy tłuszczowe pochodzące z diety lub
lipolizy zachodzącej w tkance tłuszczowej, ani
ciała ketonowe tworzone z kwasów tłuszczo¬
wych w stanie głodu nie mogą być substratami
dla glukoneogenezy.
PIŚMIENNICTWO
Bender DA: Introduction to Nutrition and Metabolism,
3rd ed. Taylor & Francis, London, 2002.
Brosnan JT: Comments on the metabolic needs for glu-
cose and the role of gluconeogenesis. European
Journal of Clinical Nutrition 1999;53:Suppl 1,
S107-S111.
Feli D: Understanding the Control of Metabolism. Port-
land Press, 1997.
Frayn KN: Integration of substrate flow in vivo: some
insights into metabolic control. Clinical Nutrition
1997;16:277-282.
Frayn KN: Metabolic Regulation: A Humań Perspec-
tive, 2nd ed. Blackwell Science, 2003.
Zierler K: Whole body metabolism of glucose. Ameri¬
can Journal ofPsychology 1999;276:E409-E426.
Cykl kwasu cytrynowego:
katabolizm acetylo-CoA
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa, cykl kwa¬
sów trikarboksylowych) jest ciągiem reakcji za¬
chodzących w mitochondriach, w wyniku których
reszty acetylowe acetylo-CoA ulegają utlenieniu,
a koenzymy redukcji. Utlenieniu tych ostatnich
w łańcuchu oddechowym towarzyszy produkcja
ATP.
Cykl kwasu cytrynowego stanowi wspólny
szlak końcowy utleniania węglowodanów, lipi¬
dów i białek. Wynika to z faktu, że glukoza, kwa¬
sy tłuszczowe oraz większość aminokwasów są
metabolizowane do acetylo-CoA lub związków
pośrednich cyklu. Cykl odgrywa również istotną
rolę w glukoneogenezie, lipogenezie i metabo¬
lizmie aminokwasów. Aczkolwiek wiele z tych
procesów zachodzi w większości tkanek, jedy¬
nym narządem, w którym wszystkie te procesy
zachodzą w znaczącym stopniu jest wątroba. Stąd
też właśnie w tym narządzie uwidaczniają się
głębokie zaburzenia wówczas, gdy znaczna licz¬
ba komórek wątrobowych zostaje uszkodzonych
lub zastąpionych tkanką łączną, jak to się dzie¬
je w ostrym zapaleniu lub marskości wątroby.
Opisano kilka defektów genetycznych dotyczą¬
cych enzymów cyklu kwasu cytrynowego, któ¬
rym towarzyszy wiele objawów neurologicznych
wynikających ze znacznego ograniczenia produk¬
cji ATP w ośrodkowym układzie nerwowym.
CYKL KWASU CYTRYNOWEGO
DOSTARCZA SUBSTRATÓW DLA
ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO
Cykl zostaje zapoczątkowany połączeniem czą¬
steczki acetylo-CoA z 4-węglowym dikarboksy-
lowym kwasem szczawiooctowym, czego wy¬
nikiem jest powstanie 6-węglowego kwasu tri-
karboksylowego - cytrynianu. Następuje po tym
ciąg reakcji, w czasie których uwalniają się dwie
cząsteczki C02 i odtwarza się szczawiooctan (ryc.
17-1). Szczawiooctan spełnia tu właściwie funk¬
cję katalityczną, ponieważ tylko niewielkie jego
ilości wystarczają, aby została ułatwiona przemia¬
na znacznej liczby jednostek acetylowych w C02.
Cykl kwasu cytrynowego jest integralną czę¬
ścią procesu, w wyniku którego przeważająca
część entalpii swobodnej, uwalnianej podczas
utleniania substratów, staje się dostępna. W wy¬
niku utleniania acetylo-CoA rozmaite koenzymy
są redukowane, a następnie utleniane w łańcuchu
oddechowym, czemu towarzyszy synteza ATP
(fosforylacja oksydacyjna, ryc. 17-2; p. również
Acetylo-CoA
(C2)
(C4) (C6)
Ryc. 17-1. Cykl kwasu cytrynowego. Katalityczna rola szczawio-
octanu.
17. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO: KATABOLIZM ACETYLO-CoA 179
Węglowodany
Białka
Lipidy
Acetylo-CoA
(C2)
Fp Flawoproteina
Cyt Cytochrom
Fosforan wysokoenergetyczny
Ryc. 17-2. Cykl kwasu cytrynowego: główny szlak katabolizmu
acetylo-CoA w organizmach aerobowych. Acetylo-CoA - produkt
katabolizmu węglowodanów, białek i lipidów, wchodzi do cyklu
wraz z H20, ulegając utlenieniu do C02 z jednoczesnym uwolnie¬
niem równoważników redukujących (2H). Późniejsze utlenienie
2H w łańcuchu oddechowym jest sprzężone z fosforylacją ADP
do ATR Każdy obrót cyklu generuje 11 ~® przez fosforylację ok¬
sydacyjną oraz 1 ~® przez fosforylację substratową (konwersję
sykcynylo-CoA do bursztynianu).
rozdz. 13). Ten aerobowy proces wymaga tlenu
jako ostatecznego utleniacza zredukowanych koen¬
zymów. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego znaj¬
dują się w macierzy (matriks) mitochondrialnej
w formie wolnej albo są przyłączone do wewnętrz¬
nej błony mitochondrialnej i grzebieni błonowych,
gdzie są umiejscowione również enzymy łańcucha
oddechowego.
REAKCJE CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO
UWALNIAJĄ RÓWNOWAŻNIKI
REDUKUJĄCE IC02
Inicjująca cykl reakcja między acetylo-CoA
a szczawiooctanem, w której powstaje cytrynian,
jest katalizowana przez syntazę cytrynianową.
Tworzy ona wiązanie węgiel-węgiel między ato¬
mem węgla grupy metylowej acetylo-CoA i ato¬
mem węgla grupy karbonylowej szczawiooctanu
(ryc. 17-3). Produktem reakcji jest cytrynylo-
-CoA, w którym wiązanie tioestrowe ulega hy¬
drolizie (reakcja egzotermiczna), w wyniku czego
uwalnia się cytrynian i CoASH.
Cytrynian jest przekształcany w izocytry-
nian (reakcja izomeryzacji) z udziałem enzymu
akonitazy (hydrataza akonitanowa). Reakcja
ta zachodzi w dwóch etapach: dehydratacja do
c/s-akonitanu, pozostającego w połączeniu z en¬
zymem, i rehydratacja do izocytrynianu. Chociaż
cytrynian jest cząsteczką symetryczną, akonita-
za reaguje z nim w sposób asymetryczny, tak że
dwa atomy węgla, które są uwalniane jako C02
w kolejnych reakcjach cyklu nie są tymi, które
pochodzą z acetylo-CoA. Asymetryczny przebieg
tego procesu jest wynikiem utworzenia kanału
(ang. channeling), umożliwiającego przeniesienie
produktu syntazy cytrynianowej bezpośrednio do
centrum katalitycznego akonitazy bez wchodzenia
do środowiska wodnego. To zapewnia integrację
działania cyklu kwasu cytrynowego i pozwala na
dostarczanie cytrynianu jako źródła acetylo-CoA
do syntezy kwasów tłuszczowych w cytozolu. Flu-
orooctan jest toksyczny, ponieważ w formie flu-
oroacetylo-CoA kondensuje ze szczawiooctanem,
tworząc fluorocytrynian. Ten ostatni hamuje akoni-
tazę, powodując nagromadzanie się cytrynianu.
Izocytrynian przy udziale dehydrogenazy
izocytrynianowej ulega odwodomieniu, w wy¬
niku czego tworzy się początkowo szczawiobur-
180 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
CHo— CO ^S— CoA
c/s-Akonitan
Ryc. 17-3. Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa). Utlenianie NADH i FADH2 w łańcuchu oddechowym umożliwia syntezę ATP w proce¬
sie fosforylacji oksydacyjnej. W celu łatwiejszego śledzenia losów acetylo-CoA w cyklu atomy węgla grupy acetylowej oznakowano na
atomie węgla grupy karboksylowej znakiem [*] i na atomie węgla grupy metylowej znakiem [•]. W jednym obrocie zostają uwolnione
2 atomy węgla w postaci C02. W pierwszym obrocie cyklu te uwolnione atomy nie pochodzą z acetylo-CoA, który bezpośrednio wszedł
do cyklu, ale z tej części cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawiooctanu. Po pierwszym obrocie cyklu, odtworzony szcza-
wiooctan jest już jednak znakowany, stąd też w następnym obrocie cyklu uwolnieniu ulega znakowany C02. Ponieważ bursztynian jest
związkiem symetrycznym, a dehydrogenaza bursztynianowa nie rozróżnia 2 grup karboksylowych, na tym etapie następuje „przypad¬
kowe” znakowanie, w wyniku czego wszystkie 4 atomy węgla szczawiooctanu okazują się być znakowane po jednym obrocie cyklu.
W wyniku glukoneogenezy część atomów węgla znakowanego szczawiooctanu może się znaleźć w glukozie i glikogenie (p. ryc. 20-1).
Na rycinie zaznaczono miejsca hamowania (©) przez fluorocytrynian, malonian i arsenian(lll) (arsenin).
17. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO: KATABOLIZM ACETYLO-CoA 181
sztynian, który pozostaje związany z enzymem
i ulega dekarboksylacji do a-ketoglutaranu. De¬
karboksylacja wymaga obecności jonów Mg2+
lub Mn2+. Znane są trzy izoenzymy dehydroge¬
nazy izocytrynianowej. Jeden z nich, zależny od
NAD+, występuje tylko w mitochondriach. Dwa
pozostałe używają NADP+ i występują zarówno
w mitochondrium, jak i cytozolu. Utlenianie izo-
cytrynianu związane z łańcuchem oddechowym
odbywa się całkowicie przy udziale enzymu za¬
leżnego od NAD+.
a-Ketoglutaran ulega oksydacyjnej dekarbok¬
sylacji w reakcji katalizowanej przez kompleks
wieloenzymatyczny podobny do kompleksu bio¬
rącego udział w oksydacyjnej dekarboksylacji
pirogronianu (ryc. 18-5). Reakcja katalizowana
przez kompleks dehydrogenazy a-ketoglutara-
nowej wymaga obecności tych samych kofakto-
rów co kompleks dehydrogenazy pirogroniano-
wej, tj. difosfotiaminy, liponianu, NAD+, FAD
i Co A, a produktem reakcji jest sukcynylo-CoA
(synonim: bursztynylo-CoA). Równowaga tej re¬
akcji jest znacznie przesunięta w kierunku two¬
rzenia sukcynylo-CoA, dlatego reakcję tę trzeba
uznać za fizjologicznie jednokierunkową. Tak jak
w przypadku utleniania pirogronianu (rozdz. 18)
reakcja jest hamowana przez arsenian(III) (arse-
nin), który powoduje nagromadzanie się substratu
- a-ketoglutaranu.
Sukcynylo-CoA zostaje przekształcony w bur-
sztynian przy udziale syntetazy sukcynylo-CoA
(tiokinazy bursztynianowej). W cyklu kwasu cy¬
trynowego jest to jedyny przykład fosforylacji na
poziomie substratu. Tkanki, w których zachodzi
glukoneogeneza (wątroba i nerki) zawierają dwa
izoenzymy syntetazy sukcynylo-CoA, z których
jeden wykazuje specyficzność względem GDP,
a drugi względem ADP. Powstający GTP jest zu¬
żywany w procesie dekarboksylacji szczawioocta-
nu do fosfoenolopirogronianu w glukoneogenezie
oraz stanowi regulacyjny łącznik między aktyw¬
nością cyklu kwasu cytrynowego i wycofaniem
się szczawiooctanu do glukoneogenezy. Tkanki,
w których nie zachodzi glukoneogeneza zawiera-
jąjedynie izoenzym wykorzystujący ADP.
W tkankach pozawątrobowych, gdy metaboli¬
zowane są związki ketonowe, zachodzi alterna¬
tywna reakcja katalizowana przez transferazę
CoA sukcynylo-CoA:acetooctan (tioforazę).
W reakcji tej, w wyniku przeniesienia CoA z suk-
cynylo-CoA na acetooctan, powstaje acetoacety-
lo-CoA (rozdz. 22).
W dalszych przemianach bursztynianu, prowa¬
dzących do regeneracji szczawiooctanu, zacho¬
dzi ta sama sekwencja reakcji chemicznych jak
w p-oksydacji kwasów tłuszczowych: odwodor-
nienie, w celu utworzenia podwójnego wiązania
węgiel-węgiel, przyłączenie cząsteczki wody po¬
trzebnej do powstania grupy hydroksylowej oraz
kolejne odwodomienie, prowadzące do powstania
grupy okso szczawiooctanu.
Pierwsza reakcja odwodomienia, prowadząca
do powstania fumaranu, jest katalizowana przez
dehydrogenazę bursztynianową, która jest
związana z wewnętrzną powierzchnią wewnętrz¬
nej błony mitochondrialnej. Enzym ten zawiera
FAD oraz białko żelazowo-siarkowe (Fe-S) i bez¬
pośrednio redukuje ubichinon w łańcuchu przeno¬
szącym elektrony. Fumaraza (hydrataza fuma-
ranowa) katalizuje reakcję przyłączenia cząstecz¬
ki wody do podwójnego wiązania w fumaranie,
w wyniku czego powstaje jabłczan. Jabłczan
ulega przekształceniu przez dehydrogenazę jabł-
czanową w szczawiooctan w reakcji wymagającej
NAD+. Choć w stanie równowagi tej reakcji prze¬
waża tworzenie jabłczanu, to jednak w komórce
zachodzi ona w kierunku tworzenia szczawiooc¬
tanu, ponieważ jest on ciągle usuwany (w reakcji
tworzenia cytrynianu, w procesie glukoneogenezy
lub ulega transaminacji do asparaginianu), a po¬
nadto ciągle jest utleniany NADH.
PODCZAS KAŻDEGO OBROTU CYKLU
KWASU CYTRYNOWEGO POWSTAJE
DWANAŚCIE CZĄSTECZEK ATP
W wyniku kolejnych reakcji utleniania katalizo¬
wanych przez dehydrogenazy cyklu kwasu cytry¬
nowego powstają trzy cząsteczki NADH i jedna
FADH2 na każdą cząsteczkę acetylo-CoA kata-
bolizowaną w jednym obrocie cyklu. Te reduku¬
jące równoważniki są przenoszone do łańcucha
oddechowego (p. ryc. 13-3), w którym ponowne
utlenienie każdej cząsteczki NADH generuje ok.
3 cząsteczek ATP, a utlenianie FADH2- ok. 2 czą¬
steczek ATP. Dodatkowo 1 cząsteczkę ATP (lub
GTP) uzyskuje się na etapie fosforylacji substra¬
towej katalizowanej przez syntetazę sukcynylo-
-CoA.
182 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
WITAMINY ODGRYWAJĄ KLUCZOWA
ROLE W CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO
Cztery witaminy z grupy B mają duże znaczenie
w cyklu kwasu cytrynowego, a tym samym w pro¬
cesach metabolicznych generujących energię: (1)
ryboflawina w formie dinukleotydu flawinoade-
ninowego (FAD) - kofaktor dehydrogenazy bur-
sztynianowej; (2) niacyna w formie dinukleotydu
nikotynoamidoadeninowego (NAD) - akceptor
elektronów dla dehydrogenazy izocytrynianowej,
kompleksu dehydrogenazy a-ketoglutaranowej
i dehydrogenazy jabłczanowej; (3) tiamina (wi¬
tamina B^, jako difosfotiamina - koenzym pro¬
cesu dekarboksylacji w reakcji dehydrogenazy
a-ketoglutaranowej; (4) kwas pantotenowy jako
składnik koenzymu A - kofaktor związany z „ak¬
tywnymi” resztami kwasów karboksylowych, ta¬
kich jak acetylo-CoA i sukcynylo-CoA.
CYKL KWASU CYTRYNOWEGO MA
KLUCZOWE ZNACZENIE W METABOLIZMIE
Cykl kwasu cytrynowego jest nie tylko szlakiem
utleniania jednostek dwuwęglowych, lecz także
główną drogą przetwarzania metabolitów powsta¬
jących w reakcjach transaminacji i deaminacji
aminokwasów oraz szlakiem dostarczającym
substratów dla syntezy aminokwasów w proce¬
sie transaminacji, glukoneogenezy oraz syntezy
kwasów tłuszczowych. Cykl kwasu cytryno¬
wego jest procesem amfibolicznym (ryc. 17-4),
ponieważ odgrywa rolę zarówno w procesach
oksydacyjnych, jak i w syntezie.
Hydroksyprolina
Seryna
Cysteina
Treonina
Glicyna
Mleczan
| AMINOTRANSFERAZA
Tryptofan ► Alanina ► Pirogronian ► Acetylo-CoA
Ryc. 17-4. Cykl kwasu cytrynowego w transaminacji i glukoneogenezie. Grubsze strzałki wskazują główny
szlak glukoneogenezy.
17. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO: KATABOLIZM ACETYLO-CoA 183
Cykl kwasu cytrynowego jest elementem
glukoneogenezy, transaminacji
i deaminacji
Wszystkie metabolity cyklu są potencjalnie gluko-
genne, ponieważ mogą powodować wzrost pozio¬
mu szczawiooctanu, a tym samym wzrost produkcji
glukozy (w wątrobie i nerkach, czyli w organach,
w których zachodzi glukoneogeneza; p. rozdz. 20).
Kluczowym enzymem umożliwiającym przejście
metabolitów z cyklu do glukoneogenezy jest kar-
boksykinaza fosfoenolopirogronianowa. Enzym
ten katalizuje reakcję dekarboksylacji szczawio¬
octanu do fosfoenolopirogronianu, z udziałem
GTPjako dawcy fosforanu (p. ryc. 20-1).
Wprowadzenie metabolitów do cyklu następuje
w wyniku kilku reakcji. Jedną z najważniejszych
reakcji anaplerotycznych jest tworzenie szcza¬
wiooctanu w wyniku karboksylacji pirogronianu
katalizowanej przez karboksylazę pirogronia-
nową. Reakcja ta ma duże znaczenie dla utrzyma¬
nia odpowiedniego stężenia szczawiooctanu w re¬
akcji kondensacji z acetylo-CoA. Jeśli gromadzi
się acetylo-CoA, to działa on jako aktywator allo-
steryczny karboksylazy pirogronianowej, zapew¬
niając w ten sposób dopływ szczawiooctanu. Mle¬
czan - ważny substrat glukoneogenezy, wchodzi
do cyklu w wyniku utlenienia do pirogronianu,
a następnie do szczawiooctanu.
W reakcjach katalizowanych przez amino-
transferazy (transaminazy) powstaje pirogronian
z alaniny, szczawiooctan z asparaginianu i a-ke-
toglutaran z glutaminianu. Ponieważ te reakcje są
odwracalne, cykl służy także jako źródło szkiele¬
tów węglowych do syntezy tych aminokwasów.
Inne aminokwasy wspierają glukoneogenezę,
ponieważ ich szkielety węglowe przyczyniają się
do powstania intermediatów cyklu kwasu cytry¬
nowego. Przykładami są: alanina, cysteina, glicy¬
na, hydroksyprolina, seryna, treonina oraz trypto-
fan, czyli aminokwasy, które ulegają przemianie
do pirogronianu; arginina, histydyna, glutamina
i prolina, które przechodzą w a-ketoglutaran;
izoleucyna, metionina i walina, które tworzą suk-
cynylo-CoA; tyrozyna i fenyloalanina, z których
powstaje fumaran (ryc. 17-4).
Dla przeżuwaczy, u których głównym „pali¬
wem” metabolicznym są krótkołańcuchowe kwa¬
sy tłuszczowe tworzące się w czasie fermentacji
bakteryjnej, szczególne znaczenie ma przemiana
propionianu (głównego glikogennego produktu
fermentacji w żwaczu) do sukcynylo-CoA w szla¬
ku metylomalonylo-CoA (p. ryc. 20-2).
Cykl kwasu cytrynowego jest elementem
syntezy kwasów tłuszczowych
Acetylo-CoA, utworzony z pirogronianu w wyni¬
ku działania dehydrogenazy pirogronianowej, jest
podstawowym substratem dla syntezy długołań-
cuchowych kwasów tłuszczowych u nieprzeżu-
waczy (ryc. 17-5). (U przeżuwaczy acetylo-CoA
powstaje bezpośrednio z octanu). Ponieważ de¬
hydrogenaza pirogronianowa jest enzymem mi-
tochondrialnym, a synteza kwasów tłuszczowych
jest szlakiem zachodzącym w cytozolu, acetylo-
-CoA musi zostać przetransportowany przez nie¬
przepuszczalną dla niego błonę mitochondrialną.
Następuje to przez utworzenie z acetylo-CoA cy¬
trynianu, jego przeniesienie z mitochondrium do
cytozolu i w końcu utworzenie tam acetylo-CoA
wskutek rozszczepienia cytrynianu w reakcji ka¬
talizowanej przez liazę ATP:cytrynianową. Cy¬
trynian może być transportowany poza mitochon¬
drium w sytuacji, gdy akonitaza jest wysycona
substratem, a cytrynian nie może być bezpośred¬
nio kierowany z syntazy cytrynianowej do ako-
nitazy. Dzięki temu cytrynian jest zużywany do
Kwasy
Pirogronian Glukoza tłuszczowe
Ryc. 17-5. Udział cyklu kwasu cytrynowego w procesie syntezy
kwasów tłuszczowych z glukozy (p. też ryc. 23-5).
184 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
syntezy kwasów tłuszczowych tylko wtedy, kiedy
jego ilość jest wystarczająca do nieprzerwanej ak¬
tywności cyklu kwasu cytrynowego.
Regulacja cyklu kwasu cytrynowego
zależy głównie od podaży utlenionych
kofaktorów
W większości tkanek, w których główną funkcją
cyklu kwasu cytrynowego jest dostarczenie energii,
kontrola oddechowa za pośrednictwem łańcucha
oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej reguluje
aktywność cyklu kwasu cytrynowego (rozdz. 13).
Tak więc, aktywność cyklu bezpośrednio zależy
od zasobów NAD*, które z kolei - ze względu na
mocne sprzężenie utleniania z fosforylacją - zale¬
żą od dostępności ADP, a ostatecznie od szybkości
zużywania się ATP podczas chemicznej i fizycznej
pracy. Dodatkowo regulowane są poszczególne en¬
zymy cyklu. Najbardziej prawdopodobnymi miej¬
scami regulacji są nieodwracalne reakcje katalizo¬
wane przez dehydrogenazę pirogronianową, synta-
zę cytrynianową, dehydrogenazę izocytrynianową
oraz dehydrogenazę a-ketoglutaranową. Wymie¬
nione dehydrogenazy są aktywowane przez jony
Ca2*, których poziom i sekrecja wzrastają podczas
skurczu mięśnia, kiedy zwiększa się zapotrzebowa¬
nie na energię. W tkance takiej jak mózg, która jest
zależna w znacznym stopniu od węglowodanów
dostarczających acetylo-CoA, kontrola cyklu kwa¬
su cytrynowego może zachodzić na etapie dehy¬
drogenazy pirogronianowej. Wiele enzymów wy¬
kazuje wrażliwość na stan energetyczny, który jest
określony ilorazem [ATP]/[ADP] oraz [NADH]/
/[NAD+]. I tak, syntaza cytrynianowa jest hamo¬
wana allosterycznie przez ATP i długołańcuchowe
acylo-CoA. Allosteryczna aktywacja przez ADP
mitochondrialnej, zależnej od NAD* dehydroge¬
nazy izocytrynianowej jest znoszona przez ATP
i NADH. Kompleks dehydrogenazy a-ketoglu-
taranowej jest regulowany w ten sam sposób, co
kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (p. ryc.
18-6). Dehydrogenaza bursztynianowa jest hamo¬
wana przez szczawiooctan, a dostępność szcza-
wiooctanu kontrolowana przez dehydrogenazę
jabłczanową zależy od ilorazu [NADH]/[NAD*].
Ponieważ w przypadku syntazy cytrynianowej
wartość Km dla szczawiooctanu jest tego samego
rzędu co jego stężenie wewnątrzmitochondrialne,
więc wydaje się, że stężenie tego związku może
mieć znaczenie dla regulacji szybkości produkcji
cytrynianu. Dotychczas nie rozstrzygnięto, który
z mechanizmów występuje w warunkach in vivo.
PODSUMOWANIE
• Cykl kwasu cytrynowego j est końcowym szlakiem
utleniania węglowodanów, lipidów oraz białek.
Ich wspólny metabolit końcowy - acetylo-CoA
reaguje ze szczawiooctanem, tworząc cytrynian.
W serii reakcji odwodomienia i dekarboksylacji
cytrynian jest degradowany, co powoduje reduk¬
cję koenzymów i uwolnienie dwóch cząsteczek
C02 oraz regenerację szczawiooctanu.
• Zredukowane koenzymy są utleniane w łańcuchu
oddechowym sprzężonym z tworzeniem ATP.
Cykl kwasu cytrynowego jest więc głównym
procesem tworzenia ATP i zachodzi w macierzy
mitochondrialnej sąsiadującej z enzymami łań¬
cucha oddechowego i oksydacyjnej fosforylacji.
• Cykl kwasu cytrynowego jest procesem amfibo-
licznym, ponieważ oprócz tego, że bierze udział
w utlenianiu, dostarcza węglowych szkieletów
dla glukoneogenezy, syntezy kwasów tłuszczo¬
wych i przemian aminokwasów.
PIŚMIENNICTWO
Baldwin JE, Krebs HA: The evolution of metabolic cy-
cles. Naturę 1981;291:381.
Bowtell JL, Bruce M: Glutaminę: an anaplerotic precur-
sor. Nutrition 2002; 18:222.
De Meirleir L: Defects of pyruvate metabolism and
the Krebs cycle. Journal of Childhood Neurology
2002; Supl 3:3S26.
Gibała MJ, Young ME: Anaplerosis of the citric acid
cycle: role in energy metabolism of heart and
skeletal muscle. Acta Physiologica Scandinavica
2000; 168:657.
Kay J, Weitzman PDJ (editors): Krebs ’ Citric Acid Cycle
- Half a Century and Still Turning. Biochemical
Society, London, 1987.
Komberg H: Krebs and his trinity of cycles. Naturę Re-
views of Molecular Celi Biology 2000; 1:225.
Owen OE, Kalhan SC: The key role of anaplerosis and
cataplerosis for citric acid cycle function. Journal
of Biological Chemistry 2002;277:30409.
Rustin P, Bourgeron T: Inbom errors of the Krebs cycle:
Agroup of unusual mitochondrial diseases in humans.
Biochimica et Biophysica Acta 1997; 1361:187.
Sumegi B, Sherry AD: Is there tight channelling in the
tricarboxylic acid cycle metabolon? Biochemical
Society Transactions 1991; 19:1002.
Glikoliza i utlenianie pirogronianu
I
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Wszystkie tkanki wymagają pewnej minimalnej
podaży glukozy, lecz dla mózgu te wymagania
są szczególnie istotne. Glikoliza jest głównym
szlakiem metabolizmu glukozy i przebiega w cy-
tozolu wszystkich komórek. Jest to wyjątkowy
szlak, ponieważ może on przebiegać zarówno
w warunkach tlenowych (aerobowych), jak i bez¬
tlenowych (anaerobowych), w zależności od do¬
stępności tlenu i łańcucha transportu elektronów.
Erytrocyty, które nie zawierają mitochondriów, są
całkowicie zależne od glukozy, będącej ich jedy¬
nym źródłem energii i metabolizują ją w procesie
beztlenowej glikolizy. W procesie całkowitego
utlenienia glukozy, a więc utlenienia także koń¬
cowego produktu glikolizy - pirogronianu, musi
jednak brać udział zarówno tlen, jak i zespół en¬
zymów mitochondrialnych, takich jak kompleks
dehydrogenazy pirogronianowej, enzymy cyklu
kwasu cytrynowego oraz łańcuch oddechowy.
Glikoliza jest nie tylko podstawowym szlakiem
metabolizmu glukozy, lecz także stanowi główny
szlak metabolizmu fruktozy, galaktozy i innych
węglowodanów pochodzących z diety. Zdolność
glikolizy do dostarczania ATP w przypadku braku
tlenu jest szczególnie ważna, ponieważ dzięki niej
mięśnie szkieletowe funkcjonują sprawnie, kiedy
poziom tlenu jest niewystarczający; to pozwala
tkankom przetrwać epizod beztlenowy. Mięsień
sercowy natomiast, przystosowany do warun¬
ków tlenowych, charakteryzuje się względnie
małą aktywnością glikolityczną i słabą zdolnością
przetrwania w warunkach niedotlenienia. W cho¬
robach, w których stwierdzono brak aktywności
enzymów glikolizy (np. kinazy pirogronianowej),
zasadniczym ich objawem jest niedokrwistość
hemolityczna lub - jeśli defekt dotyczy mięśni
szkieletowych (niedobór aktywności fosfofruk-
tokinazy) - uczucie zmęczenia. W szybko rosną¬
cych komórkach nowotworowych glikoliza prze¬
biega z dużą szybkością; w jej wyniku powstają
znaczne ilości pirogronianu, który ulega redukcji
do eksportowanego później mleczanu. Prowa¬
dzi to do miejscowego zakwaszenia środowiska
w guzie, co z kolei może mieć następstwa w te¬
rapii pewnych typów nowotworów. W wątrobie
mleczan jest wykorzystywany w zużywającym
energię procesie glukoneogenezy, który jest odpo¬
wiedzialny za hipermetabolizm, obserwowany
w przypadku wyniszczenia nowotworowego or¬
ganizmu. Kwasica mleczanowa wynika z wielu
przyczyn, m.in. z powodu obniżonej aktywności
dehydrogenazy pirogronianowej.
GLIKOLIZA MOŻE PRZEBIEGAĆ
W WARUNKACH BEZTLENOWYCH
Już we wczesnym okresie badań nad glikolizą
zauważono, że proces fermentacji w drożdżach
jest podobny do rozpadu glikogenu w mięśniach.
Stwierdzono, że gdy mięsień kurczy się w środo¬
wisku beztlenowym, tzn. takim, z którego usunięto
tlen, zanika glikogen, a pojawia się mleczan. Je¬
śli tlen jest dostępny, czyli jeśli istnieją ponownie
warunki tlenowe, mleczan zanika. W przypadku
skurczu w warunkach tlenowych głównym pro¬
duktem glikolizy jest pirogronian, który jest dalej
utleniany do C02 i H20 (ryc. 18-1). Jeżeli tlen jest
dostępny tylko przez krótki okres, to mitochon-
drialna reoksydacja NADH powstałego podczas
glikolizy jest ograniczona. W tych warunkach
NADH jest utleniany w reakcji redukcji pirogro¬
nianu do mleczanu, co umożliwia dalszy przebieg
glikolizy (ryc. 18-1). Dzięki temu glikoliza może
186 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Glukoza Glikogen
C6 (C6)n
Heksozofosforan
C6
i
Triozofosforan Triozofosforan
C3 C3
Ryc. 18-1. Uproszczony schemat glikolizy. © - zablokowane
w warunkach beztlenowych lub przy braku mitochondriów,
zawierających główne enzymy oddechowe, np. tak jak w erytro¬
cytach.
zachodzić w warunkach beztlenowych, lecz ma to
swoją cenę - z jednego mola utlenianej glukozy
powstaje mniejsza ilość ATP. W konsekwencji,
aby wytworzyć tę samą ilość energii, więcej glu¬
kozy musi ulec glikolizie w warunkach beztle¬
nowych niż w warunkach tlenowych. U drożdży
i innych mikroorganizmów pirogronian tworzony
podczas beztlenowej glikolizy nie jest redukowa¬
ny do mleczanu, ale ulega dekarboksylacji i re¬
dukcji do etanolu.
REAKCJE GLIKOLIZY TO GŁÓWNY SZLAK
ZUŻYCIA GLUKOZY
Ogólne równanie glikolizy z glukozy do mlecza¬
nu jest następujące:
glukoza + 2ADP + 2Pj -> 2 mleczan + 2ATP + 2H20
Wszystkie enzymy glikolizy (ryc. 18-2) znajdują
się w cytozolu. Glukoza wchodzi do szlaku gliko-
litycznego i ulega fosforylacji do glukozo-6-fosfo-
ranu przy udziale enzymu heksokinazy, używając
ATP jako dawcy fosforanu. W warunkach fizjolo¬
gicznych fosforylacja glukozy do glukozo-6-fosfo-
ranu może być uważana za reakcję nieodwracalną.
Heksokinaza jest hamowana allosterycznie przez
produkt reakcji - glukozo-6-fosforan.
W tkankach innych niż wątroba (i komórki P
trzustki) dostępność glukozy dla procesu glikoli¬
zy (lub syntezy glikogenu w mięśniu albo lipo-
genezy w tkance tłuszczowej) jest regulowana
poprzez transport do komórki, który z kolei jest
regulowany przez insulinę. Heksokinaza ma wy¬
sokie powinowactwo (mała wartość Km) do glu¬
kozy, a w wątrobie jest wy sycona w normalnych
warunkach, a więc działa na stałym poziomie, do¬
starczając glukozo-6-fosforanu w miarę potrzeb
komórki. Komórki wątroby zawierają także izo-
enzym heksokinazy - glukokinazę, której war¬
tość Km jest dużo wyższa niż normalne wewnątrz¬
komórkowe stężenie glukozy. Funkcją glukokina-
zy w wątrobie jest usuwanie glukozy z krwi po
spożyciu posiłku, wskutek czego nadwyżka glu-
kozo-6-fosforanu służy do syntezy glikogenu lub
lipogenezy.
Glukozo-6-fosforan jest ważnym związkiem
łączącym wiele szlaków metabolicznych: gliko¬
lizę, glukoneogenezę, szlak pentozofosforanowy,
glikogenogenezę oraz glikogenolizę. W glikoli¬
zie jest on przekształcany w fruktozo-6-fosforan
wskutek izomeryzacji aldozowo-ketozowej przy
udziale izomerazy fosfoheksozowej. Po tej re¬
akcji następuje druga fosforylacja, katalizowana
przez fosfofruktokinazę (fosfofruktokinazę 1),
w wyniku której powstaje fruktozo-1,6-bisfo-
sforan. Reakcja katalizowana przez fosfofruk¬
tokinazę może być uważana za nieodwracalną
w warunkach fizjologicznych. Fosfofruktokinaza
jest enzymem indukowanym i regulowanym allo¬
sterycznie, którego aktywność odgrywa kluczową
rolę w regulacji szybkości glikolizy. Fruktozo-
-1,6-bisfosforan jest rozszczepiany przez aldolazę
(aldolazę fruktozo-1,6-bisfosforanową) na dwie
fosfotriozy - gliceraldehydo-3-fosforan i dihy-
droksyacetonofosforan. Gliceraldehydo-3-fosfo¬
ran i dihydroksyacetonofosforan przekształcają
się wzajemnie jeden w drugi w reakcji katalizo¬
wanej przez izomerazę fosfotriozową.
Następny etap glikolizy to utlenianie gliceral¬
dehydo-3-fosforanu do 1,3-bisfosfoglicerynianu.
Enzym katalizujący utlenianie - dehydrogenaza
18. GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU 187
Glikogen
\
Glukozo-1-fosforan
(Enol) Pirogronian (Keton) Pirogronian L(+)-Mleczan
/?yc. 18-2. Szlak glikolizy. ® - PO3", P( - HOPO3", © - hamowanie. * Atomy węgla 1-3 fruktozobisfosforanu tworzą hydroksyaceto-
nofosforan, natomiast atomy węgla 4-6 tworzą gliceraldehydo-3-fosforan. Przedrostek „bis-” (jak w fruktozobisfosforanie) wskazuje,
że grupy fosforanowe są odseparowane, natomiast określenie difosforan, np. w difosforanie adenozyny, wskazuje, że są bezpośrednio
ze sobą połączone.
188 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
gliceraIdehydo-3-fosforanowa - jest zależny od
NAD*. Jego struktura składa się z czterech iden¬
tycznych polipeptydów (monomerów) tworzą¬
cych tetramer. Każdy polipeptyd zawiera cztery
grupy —SH, pochodzące z reszt cysteiny łańcu¬
cha polipeptydowego. Jedna z grup —SH znaj¬
duje się w centrum katalitycznym enzymu (ryc.
18-3). Początkowo substrat łączy się z tą grupą,
tworząc tiohemiacetal, który w wyniku utlenienia
ulega przekształceniu w tioester; wodór oderwa¬
ny w czasie utleniania jest przenoszony na NAD*.
Tioester ulega następnie fosforolizie przy udzia¬
le nieorganicznego fosforanu (Ps), tworzy się
1,3-bisfosfoglicerynian, a grupa —SH jest od¬
twarzana. W następnej reakcji, katalizowanej
przez kinazę fosfoglicerynianową, fosforan jest
przenoszony z 1,3-bisfosfoglicerynianu na ADP,
w wyniku czego powstaje ATP (fosforylacja sub¬
stratowa) i 3-fosfoglicerynianu.
Ponieważ z jednej cząsteczki glukozy ulegającej
glikolizie powstają dwie cząsteczki fosfotrioz, na
tym etapie wytwarzają się również dwie cząstecz¬
ki ATP na jedną cząsteczkę glukozy. Toksyczność
arsenianu jest wynikiem jego współzawodnictwa
w powyższych reakcjach z nieorganicznym fosfo¬
ranem (Pj), a powstający l-arseno-3-fosfoglicery-
nian spontanicznie ulega hydrolizie do 3-fosfo¬
glicerynianu bez tworzenia ATP. 3-Fosfoglice-
rynian ulega izomeryzacji do 2-fosfoglicerynia-
nu przy udziale mutazy fosfoglicerynianowej.
Prawdopodobnie 2,3-bisfosfoglicerynian (difo-
sfoglicerynian, DPG) jest związkiem pośrednim
w tej reakcji.
Następny etap glikolizy jest katalizowany przez
enolazę, powodującą dehydratację i utworzenie
fosfoenolopirogronianu. Enolaza jest hamowana
przez fluorki; ta właściwość może być wykorzy¬
stana w sytuacji, w której zachodzi potrzeba za-
Wysokoenergetyczny produkt pośredni
Ryc. 18-3. Mechanizm utleniania gliceraldehydo-3-fosforanu. Enz - dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fo-
sforanowa. Enzym jest hamowany przez jodooctan wiążący się z grupą —SH. W ten sposób jodooctan
może hamować glikolizę. NADH tworzony przez enzym nie jest tak mocno związany z enzymem jak NAD+.
W rezultacie NADH łatwo wymienia się z inną cząsteczką NAD+.
18. GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU 189
hamowania glikolizy, np. w próbce krwi w celu
oznaczenia w niej stężenia glukozy. Aktywność
enzymu zależy także od obecności Mg2+ lub Mn2+.
Fosforan z fosfoenolopirogronianu jest przeno¬
szony na ADP przez enzym kinazę pirogronia-
nową, co daje na tym etapie dwie cząsteczki ATP
na cząsteczkę utlenianej glukozy.
Od tego momentu stan redoks tkanki determi¬
nuje, który z dwóch możliwych szlaków metabo¬
licznych zajdzie. W warunkach anaerobowych
(beztlenowych) niemożliwa jest reoksydacja
NADH w łańcuchu oddechowym przez przenie¬
sienie równoważników redukcyjnych na tlen. Pi-
rogronian ulega redukcji przez NADH do mlecza¬
nu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę
mleczanową. Znane są różne, specyficzne tkan¬
kowo izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej,
które mają znaczenie kliniczne (rozdz. 7). Reok¬
sydacja NADH w reakcji powstawania mleczanu
umożliwia przebieg glikolizy w warunkach braku
tlenu przez odtworzenie NAD+ dla następnego
cyklu reakcji katalizowanej przez dehydrogena¬
zę gliceraldehydo-3-fosforanową. W warunkach
aerobowych (tlenowych) natomiast pirogronian
jest pobierany przez mitochondria i po oksyda¬
cyjnej dekarboksylacji do acetylo-CoA zostaje
utleniony do C02 w cyklu kwasu cytrynowego.
Powstałe w glikolizie równoważniki redukujące
są przenoszone z NADH do wnętrza mitochon-
driów, przy udziale jednego lub dwóch systemów
transportujących („wahadłowców”), opisanych
w rozdz. 13.
Tkanki funkcjonujące w warunkach
niedotlenienia wytwarzają mleczan
Dotyczy to mięśni szkieletowych, zwłaszcza włó¬
kien białych, gdzie szybkość wykonywanej pracy,
a z nią potrzeba tworzenia ATP, może przewyższać
szybkość, z jaką tlen może być pobierany i wyko¬
rzystany (ryc. 18-2). Glikoliza w erytrocytach za¬
wsze kończy się utworzeniem mleczanu, z powo¬
du braku w tych komórkach mitochondriów, które
zawierają system enzymatyczny utleniający piro¬
gronian. Inne tkanki, które również czerpią swoją
energię głównie z glikolizy i wytwarzają mleczan
to: mózg, jelito, rdzeń nerki, siatkówka i skóra.
Wątroba, kora nerek i serce zwykle pobierają mle¬
czan i utleniają go, ale w warunkach niedotlenie¬
nia narządy te mogą wytwarzać mleczan.
GLIKOLIZA JEST REGULOWANA NA
TRZECH ETAPACH OBEJMUJĄCYCH
REAKCJE „NIEODWRACALNE”
Choć większość reakcji glikolitycznych jest od¬
wracalna, to jednak trzy z nich są wyraźnie eg-
zoergiczne i z tego powodu muszą być uważane
za reakcje fizjologicznie nieodwracalne. Są to
reakcje katalizowane przez heksokinazę (i glu-
kokinazę), fosfofruktokinazę i kinazę pirogro-
nianową. Reakcje te stanowią zasadnicze miej¬
sca regulacji glikolizy. Fosfofruktokinaza jest
silnie hamowana przez ATP w jego normalnych,
wewnątrzkomórkowych stężeniach. Jak opisa¬
no w rozdz. 20, to hamowanie może być szybko
zniesione przez 5'-AMP (tworzony, gdy zaczyna
się gromadzić ADP), dając sygnał, że potrzebny
jest wzrost szybkości glikolizy. Komórki, które
mają zdolność przeprowadzania glukoneogene-
zy (odwrócenie szlaku glikolizy) zawierają inne
enzymy, które katalizują reakcje przebiegające
w odwrotnym kierunku do tych nieodwracalnych
etapów, to jest: glukozo-6-fosfatazę, fruktozo-1,6-
bisfosfatazę oraz enzymy przeprowadzające reak¬
cje odwrotne do kinazy pirogronianowej: karbok-
sylazę pirogronianową i karboksykinazę fosfoe-
nolopirogronianową. Fruktoza po fosforylacji do
fruktozo-1-fosforanu wchodzi do szlaku glikoli¬
zy, omijając główne miejsca regulacyjne. Prowa¬
dzi to do powstania większej ilości pirogronianu
(i acetylo-CoA), niż jest potrzebne do tworzenia
ATP. W wątrobie i tkance tłuszczowej powoduje
to nasilenie lipogenezy, a duże spożycie fruktozy
może być czynnikiem rozwoju otyłości.
W glikolizie zachodzącej w erytrocytach
może być ominięta pierwsza reakcja
tworzenia ATP
W erytrocytach reakcja katalizowana przez ki¬
nazę fosfoglicerynianową może być w pewnym
stopniu zastąpiona reakcją mutazy bisfosfoglice-
rynianowej, która katalizuje przekształcenie 1,3-
-bisfosfoglicerynianu do 2,3-bisfosfoglicerynia-
nu. Ten ostatni ulega hydrolizie do 3-fosfoglice-
rynianu i Pi w reakcji katalizowanej przez fosfa¬
tazę 2,3-bisfosfoglicerynianową (ryc. 18-4). Ten
alternatywny szlak nie daje zysku energetycznego
w postaci ATP. Może on być jednak korzystny dla
190 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
H — C = O -« Glukoza
I
H - C - OH
CH2 -o-@
Gliceraldehydo-3-fosforan
3-Fosfoglicerynian
L ► Pirogronian
Ryc. 18-4. Szlak 2,3-bisfosfoglicerynianowy w erytrocytach.
erytrocytów, ponieważ dostarcza 2,3-bisfosfogli-
cerynianu, który wiąże się z hemoglobiną, powo¬
dując zmniejszenie jej powinowactwa do tlenu.
W ten sposób tlen jest łatwiej dostępny dla tkanek
(p. rozdz. 6).
UTLENIANIE PIR0GR0NIANU DO
ACETYLO-CoA JEST NIEODWRACALNYM
PROCESEM ŁĄCZĄCYM GLIKOLIZĘ
Z CYKLEM KWASU CYTRYNOWEGO
Pirogronian, powstający w cytozolu, jest trans¬
portowany do mitochondrium przez przenośnik
pirogronowy (symporter protonowy) (p. ryc. 13-
-10). Wewnątrz mitochondrium ulega oksydacyj¬
nej dekarboksylacji do acetylo-CoA przy udziale
wieloenzymowego kompleksu przylegającego do
wewnętrznej błony mitochondrialnej. Ten kom¬
pleks dehydrogenazy pirogronianowej jest ana¬
logiczny do kompleksu dehydrogenazy a-keto-
glutaranowej z cyklu kwasu cytrynowego (p. ryc.
17-3). Pirogronian, przy udziale dehydrogenazy
pirogronianowej będącej składnikiem komplek¬
su wieloenzymowego, ulega dekarboksylacji do
hydroksyetylowej pochodnej pierścienia tiazo-
lowego difosfotiaminy związanej z enzymem.
Pochodna ta reaguje z kolei z utlenionym lipono-
amidem - grupą prostetyczną acetylotransferazy
dihydroliponoamidowej, tworząc acetylolipono-
amid (ryc. 18-5). W przypadku niedoboru darni¬
ny, która jest witaminą Bt (rozdz. 44), metabolizm
glukozy ulega zaburzeniu, czego głównym obja¬
wem jest kwasica mleczanowa i pirogronianowa
(potencjalnie zagrażająca życiu). Acetylolipono-
amid reaguje z koenzymem A, tworząc acetylo-
-CoA i zredukowany liponoamid. Gdy ten ostatni
zostanie ponownie utleniony przez flawoproteinę
(zawierającą FAD) w obecności dehydrogenazy
dihydroliponoamidowej, cykl reakcji jest zakoń¬
czony. Ostatecznie zredukowana flawoproteina
jest utleniana przez NAD+, który z kolei przenosi
równoważniki redukujące do łańcucha oddecho¬
wego:
pirogronian + NAD* + CoA
-► Acetylo-CoA + NADH + H+ + C02
Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej
składa się z szeregu łańcuchów polipeptydowych
należących do trzech enzymów składowych,
a metabolity pośrednie nie dysocjują swobodnie,
lecz pozostają przyłączone do enzymów. Taka or¬
ganizacja kompleksu enzymatycznego, w którym
substraty są przekazywane z jednego enzymu na
następny, powoduje zwiększenie szybkości reak¬
cji i uniemożliwia przebieg reakcji ubocznych,
a w konsekwencji zwiększa ogólną wydajność
procesu.
Dehydrogenaza pirogronianowa jest
regulowana przez hamowanie produktami
końcowymi oraz przez modyfikacje
kowalencyjne
Dehydrogenaza pirogronianowa jest hamowana
przez produkty katalizowanej przez siebie reak¬
cji, acetylo-CoA i NADH (ryc. 18-6). Jest ona
18. GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU 191
o
Ryc. 18-5. Dekarboksylacja oksydacyjna pirogronianu przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej. Kwas liponowy jest połączony
wiązaniem amidowym z resztą lizyny acetylotransferazy. Reszta lizyny tworzy długie, ruchome ramię, umożliwiające kolejne obroty
grupy prostetycznej (tzn. kwasu liponowego) między centrami katalitycznymi każdego z enzymów kompleksu. NAD+ - dinukleotyd
nikotynoamido-adeninowy, FAD - dinukleotyd flawino-adeninowy, TDP - difosfotiamina.
również regulowana przez fosforylację trzech
reszt serynowych w dehydrogenazie pirogronia¬
nowej, katalizowaną przez kinazę, co prowadzi
do zmniejszenia aktywności, oraz przez defo-
sforylację przy udziale fosfatazy, co z kolei pro¬
wadzi do zwiększenia aktywności dehydrogena¬
zy. Kinaza ulega aktywacji, jeśli rosną wartości
stosunków [ATP]/[ADP], [acetylo-CoA]/[CoA]
oraz [NADH]/[NAD+]. Dehydrogenaza pirogro-
nianowa - a zatem i glikoliza - jest hamowana
zarówno wtedy, kiedy jest dostępna odpowiednia
ilość ATP (lub zredukowanych koenzymów nie¬
zbędnych do jego tworzenia), jak i wtedy, kiedy
utleniane są kwasy tłuszczowe. W okresie głodu,
kiedy wzrasta stężenie wolnych kwasów tłusz¬
czowych, następuje zmniejszenie ilości aktywnej
formy enzymu, co powoduje oszczędzanie węglo¬
wodanów. W tkance tłuszczowej, gdzie glukoza
dostarcza acetylo-CoA do lipogenezy, enzym jest
aktywowany w odpowiedzi na insulinę.
192 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Insulina
(w tkance tłuszczowej)
Ryc. 18-6. Regulacja dehydrogenazy pirogronianowej (PDH). Strzałki faliste dotyczą efektów allosterycznych. A - regulacja przez
hamowanie produktami końcowymi, B - regulacja przez wzajemną przemianę postaci aktywnej i nieaktywnej enzymu.
Utlenianie 1 mola glukozy dostarcza
38 moli ATP w warunkach tlenowych,
ale tylko 2 mole ATP przy braku tlenu
Jeśli 1 mol glukozy zostanie spalony w kalory-
metrze do C02 i wody, to uwolni się ok. 2870 kJ
ciepła. Jeśli utlenianie zachodzi w tkankach, utle¬
nieniu każdej cząsteczki glukozy do C02 i wody
towarzyszy wytworzenie ok. 38 cząsteczek ATP.
In vivo wartość AG reakcji katalizowanej przez
syntazę ATP wynosi ok. 51,6 kJ/mol. Wynika
z tego, że ilość energii wykorzystanej do synte¬
zy ATP, a pochodzącej z całkowitego utlenienia
1 mola glukozy, wynosi 1961 kJ, co stanowi ok.
68% energii spalania. Większość ATP tworzy
się podczas fosforylacji oksydacyjnej w wyniku
reoksydacji zredukowanych koenzymów w łańcu¬
chu oddechowym. Pozostały ATP jest wytwarza¬
ny przez fosforylację substratową (tab. 18-1).
ASPEKTY KLINICZNE
Zahamowanie utleniania pirogronianu
prowadzi do kwasicy mleczanowej
Arsenian(III) oraz jony rtęci reagują z grupami
—SH kwasu liponowego i hamują aktywność
dehydrogenazy pirogronianowej, co - podobnie
jak niedobór tiaminy w diecie - powoduje na¬
gromadzanie się pirogronianu. U alkoholików
18. GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU 193
Tabela 18-1. Wytwarzanie ATP podczas katabolizmu glukozy
Szlak przemian
Reakcja, którą katalizuje
Sposób wytwarzania ATP
ATP na mol
glukozy
Glikoliza
Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa
Utlenianie 2 NADH w łańcuchu oddechowym
6*
Kinaza fosfoglicerynianowa
Fosforylacja substratowa
2
Kinaza pirogronianowa
Fosforylacja substratowa
2
Zużycie ATP w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę
10
-2
Zysk
8
Dekarboksylacja
oksydacyjna
Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej
Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym
6
Cykl kwasu
Dehrydrogenaza izocytrynianowa
Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym
6
cytrynowego
Kompleks dehydrogenazy a-ketoglutaranowej
Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym
6
Syntetaza sukcynylo-CoA (tiokinaza bursztynianowa)
Fosforylacja substratowa
2
Dehydrogenaza bursztynianowa
Utlenienie 2 FADH2 w łańcuchu oddechowym
4
Dehydrogenaza jabtczanowa
Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym
6
Zysk
30
Ogólny bilans w warunkach tlenowych
38
Ogólny bilans w warunkach beztlenowych
2
* Przyjęto, że NADH powstający w glikolizie przekazuje atomy wodoru do wnętrza mitochondriów przy udziale „wahadłowca” jabtcza-
nowo-asparaginianowego (patrz ryc. 13-13). Przy udziale „wahadłowca” glicerolofosforanowego powstałyby tylko 2 mole ATP na
1 mol NADH. Należy zwrócić uwagę, że zużywanie glikogenu zamiast glukozy w procesie glikolizy beztlenowej w mięśniach jest znacz¬
nie korzystniejsze ponieważ produktem fosforylazy glikogenowej jest glukozo-1 -fosforan (ryc. 19-1), który ulega przemianie do gluko-
zo-6-fosforanu. Zostaje zatem oszczędzony ATR który byłby zużyty
z dwóch do trzech cząsteczek ATP na cząsteczkę glukozy.
zwykle występuje niedobór tiaminy (zarówno
z powodu ubogiej diety, jak i dlatego, że alkohol
hamuje absorpcję tiaminy), co potencjalnie może
prowadzić do kończącej się zwykle śmiercią kwa¬
sicy pirogronianowej i mleczanowej. U pacjentów
z dziedzicznym niedoborem dehydrogenazy pi¬
rogronianowej, która może być wynikiem braku
jednego lub kilku składników kompleksu dehy¬
drogenazy pirogronianowej, również występuje
kwasica mleczanowa, zwłaszcza w przypadku
nadmiernej podaży glukozy. Ponieważ glukoza
stanowi główne źródło energii dla mózgu, ten de¬
fekt metaboliczny objawia się zaburzeniami neu¬
rologicznymi.
Dziedziczny niedobór aldolazy A lub niedobór
kinazy pirogronianowej w erytrocytach wywo¬
łuje niedokrwistość hemolityczną. Niedobór
fosfofruktokinazy mięśniowej objawia się małą
wydolnością wysiłkową pacjentów, zwłaszcza
na diecie bogatej w węglowodany. Dostarczenie
reakcji katalizowanej przez heksokinazę. Zysk netto zwiększa się
lipidów jako alternatywnego źródła energii, np.
podczas głodu, kiedy wzrasta stężenie wolnych
kwasów tłuszczowych i związków ketonowych
we krwi, poprawia zdolność wysiłkową.
STRESZCZENIE
• Glikoliza jest szlakiem metabolicznym zacho¬
dzącym w cytozolu wszystkich komórek ssa¬
ków. W procesie tym glukoza (lub glikogen)
zostaje przekształcona w pirogronian lub mle¬
czan.
• Glikoliza może przebiegać w warunkach bez¬
tlenowych dzięki sprzężeniu dwóch reakcji,
z których jedna - redukcja pirogronianu do
mleczanu - odtwarza utlenioną formę NAD+
potrzebną w reakcji katalizowanej przez dehy¬
drogenazę gliceraldehydo-3 -fosforanową.
• Mleczan jest końcowym produktem glikolizy
zachodzącej w warunkach beztlenowych (np.
194 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
w pracującym mięśniu) lub zachodzącej w ko¬
mórkach niezdolnych do utleniania pirogronia-
nu (np. w erytocytach).
• Glikoliza jest regulowana przez trzy enzymy
katalizujące reakcje nieodwracalne: hekso-
kinazę, fosfofruktokinazę i kinazę pirogronia-
nową.
• W erytrocytach pierwsza reakcja fosforylacji
substratowej w glikolizie może zostać ominięta.
Pozwala to na wytworzenie 2,3-bisfosfoglicery-
nianu, który ma istotny udział w zmniejszaniu
powinowactwa hemoglobiny do 02.
• Pirogronian jest utleniany do acetylo-CoA przez
wieloenzymowy kompleks dehydrogenazy pi-
rogronianowej, który wymaga udziału difosfo-
tiaminy, będącej pochodną witaminy Bi.
• Brak możliwości metabolizowania pirogronia-
nu prowadzi często do kwasicy mleczanowej.
PIŚMIENNICTWO
Behal RH, Buxton DB, Robertson JG, Olson MS:
Regulation of the pyruvate dehydrogenase mul-
tienzyme complex. Annual Review of Nutrition
1993; 13:497.
Boiteux A, Hess B: Design of glycolysis. Philosophical
Transaction of the Royal Society of London Series
B 1981 ;293:5.
Fothergill-Gilmore LA: The evolution of the glyco-
lytic pathway. Trends in Biochemical Sciences
1986; 11:47.
Gladden LB: Lactate metabolism: A new paradigm
for the third millenium. Journal of Physiology
2004;558:5.
Hers HG, Hue L: Gluconeogenesis and related aspects
of glycolysis. Annual Review of Biochemistry
1983;52:617.
Kim J-W, Dang CV: Multifaceted roles of glycolytic
enzymes. Trends in Biochemical Sciences 2005;
30:142.
Robergs RA, Ghiasvand F, Parker D: Biochemistry of
exercise-induced metabolic acidosis. American
Journal of Physiology 2004;287:R502.
Wang YM, Eys J: Nutritional significance of fructose
and sugar alcohols. Annual Review of Nutrition
1981; 1:437.
Wasserman DH: Regulation of glucose fluxes during
exercise in the postabsorptive State. Annual Review
of Physiology 1995;57:191.
( Metabolizm glikogenu
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Glikogen jest główną formą magazynowania
węglowodanów u zwierząt, odpowiadającą skro¬
bi u roślin; jest on rozgałęzionym polimerem a-
-D-glukozy (p. ryc. 14-13). Występuje głównie
w wątrobie i mięśniach; chociaż stężenie glikoge¬
nu w wątrobie jest większe aniżeli w mięśniach,
to jednak ze względu na dużą masę mięśni w ca¬
łym organizmie, całkowita zawartość glikogenu
w mięśniach stanowi około trzech czwartych jego
zawartości w organizmie człowieka (tab. 19-1).
Tabela 19-1. Magazynowanie węglowodanów w organizmie
człowieka o masie 70 kg
Odsetek
masy
tkanki
Masa
tkanki
Całkowita
zawartość
w organizmie
Glikogen wątroby
5,0
1,8 kg
90 g
Glikogen mięśni
0,7
35 kg
245 g
Zewnątrzkomór-
kowa glukoza
0,1
10 L
10 g
Glikogen mięśniowy stanowi łatwo dostępne
źródło glukozy dla glikolizy w samym mięśniu.
Funkcją glikogenu wątroby jest magazynowanie
i eksportowanie glukozy w celu utrzymania stę¬
żenia glukozy we krwi między posiłkami. Po
12-18 godzinach głodzenia, zawartość glikogenu
w wątrobie niemal całkowicie ulega wyczerpaniu.
Mimo że glikogen mięśni nie dostarcza bezpośred¬
nio wolnej glukozy (ponieważ w mięśniach brak
jest glukozo-6-fosfatazy), to jednak pirogronian
wytwarzany w mięśniu w procesie glikolizy może
ulegać transaminacji do alaniny, która jest ekspor¬
towana z mięśni i zużywana do glukoneogenezy
w wątrobie. Choroby spichrzania glikogenu są
grupą dziedzicznych zaburzeń, charakteryzują¬
cych się niedostateczną mobilizacją glikogenu lub
odkładaniem nieprawidłowych form glikogenu,
co prowadzi do osłabienia mięśni; następstwem
niektórych chorób spichrzania glikogenu może
być przedwczesne zejście śmiertelne.
Dzięki silnie rozgałęzionej strukturze glikoge¬
nu glikogenoliza może zachodzić jednocześnie
w wielu miejscach cząsteczki, co pozwala na szyb¬
kie uwalnianie glukozo-1-fosforanu niezbędnego
do aktywności mięśnia. Sportowcy wyczynowi
potrzebują powolniejszego, dłużej podtrzymywa¬
nego uwalniania glukozo-1-fosforanu. Tworzenie
punktów rozgałęzienia w glikogenie jest wolniej¬
sze aniżeli dodawanie jednostek glukozowych
do łańcuchów liniowych. Niektórzy sportowcy
wyczynowi stosują więc następujący zabieg: do¬
prowadzają do wyczerpania się ładunku węglo¬
wodanowego mięśni przez intensywne ćwiczenie,
kiedy to zawartość glikogenu w mięśniach jest
niewielka, a następnie przyjmują wysokowęglo-
wodanowy posiłek. Powoduje to szybką syntezę
glikogenu z mniejszą liczbą punktów rozgałęzień
łańcuchów aniżeli normalnie.
GLIKOGENOGENEZA ZACHODZI GŁÓWNIE
W MIĘŚNIACH I WĄTROBIE
W szlaku biosyntezy glikogenu
bierze udział specjalny aktywny
nukleotyd glukozy
Podobnie jak w glikolizie, w glikogenogenezie
glukoza jest fosforylowana do glukozo-6-fosfo-
ranu w reakcji katalizowanej przez heksokinazę
w mięśniach, a przez glukokinazę - w wątrobie
(ryc. 19-1). Glukozo-6-fosforan jest izomeryzo-
wany do glukozo-1-fosforanu przez fosfogluko-
mutazę. Enzym ten sam zostaje ufosforylowany,
a jego grupa fosforanowa bierze udział w od-
196 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
wracalnej reakcji, w której intermediatem jest
glukozo-1,6-bisfosforan. Następnie glukozo-1 -
-fosforan reaguje z urydynotrifosforanem (UTP),
aby wytworzyć aktywny nukleotyd urydynodifo-
sfoglukozę (UDPGlc) i pirofosforan (ryc. 19-2),
w reakcji katalizowanej przez pirofosforylazę
UDPGlc. Równowaga tej reakcji przesuwa się
w stronę tworzenia UDPGlc, ponieważ obecna
w komórce nieorganiczna pirofosfataza katali¬
zuje hydrolizę pirofosforanu do dwóch cząsteczek
fosforanu (ortofosforanu), usuwając w ten sposób
jeden z produktów reakcji.
Syntaza glikogenowa katalizuje reakcję two¬
rzenia wiązania glikozydowego między atomem
Cj aktywnej glukozy UDPGlc a atomem C4 koń¬
cowej reszty glukozowej glikogenu, uwalniając
urydynodifosforan (UDP). Do zainicjowania tej
reakcji potrzebna jest cząsteczka glikogenu, czyli
„prajmer glikogenowy”. Sam prajmer glikoge¬
nowy może być z kolei utworzony na prajmerze
Glikogen
(jednostki glukozylowe 1->4 i 1-»6)
Glukoza
Ryc. 19-1. Szlak glikogenogenezy i glikogenolizy w wątrobie. © - pobudzenie; 0 - hamowanie. Insulina obniża stężenie cAMP
jedynie wówczas, gdy było ono uprzednio zwiększone działaniem glukagonu lub adrenaliny, tzn. jest antagonistą ich działania. Glukagon
jest aktywny w sercu, ale nie w mięśniu szkieletowym. W miejscu oznaczonym gwiazdką *: transferaza glukanowa i enzym usuwający
rozgałęzienia są prawdopodobnie dwiema oddzielnymi aktywnościami tego samego enzymu.
19. METABOLIZM GLIKOGENU 197
Ryc. 19-2. Urydynodifosfoglukoza (UDPGIc).
białkowym, zwanym glikogenina. Glikogenina
jest białkiem o masie cząsteczkowej 37 kDa, które
zostaje glukozylowane przez UDPGIc na swoistej
reszcie tyrozyny. Następne reszty glukozy zostają
połączone pozycjami 1—>4, tworząc krótki łań¬
cuch, na który działa syntaza glikogenowa.
W mięśniu szkieletowym glikogenina pozostaje
związana w centrum cząsteczki glikogenu (p. ryc.
14-13); w wątrobie liczba cząsteczek glikogenu
jest większa aniżeli liczba cząsteczek glikogeniny.
Częścią mechanizmu rozgałęziania
jest odłączanie istniejących już
łańcuchów glikogenu
Dodawanie reszty glukozy do istniejącego już
łańcucha glikogenowego, czyli do primera, na¬
stępuje na nieredukującym zewnętrznym końcu
cząsteczki, tak że „gałęzie” glikogenu wydłużają
się wraz z sukcesywnym powstawaniem wiązań
1—>4 (ryc. 19-3). Gdy łańcuch zostanie prze¬
dłużony do co najmniej 11 reszt glukozowych,
wówczas enzym rozgałęziający (ang. branching
enzyme) przenosi część łańcucha 1—>4 (długoś¬
ci co najmniej 6 reszt glukozowych) na sąsiedni
łańcuch, tworząc wiązanie 1—>6 i ustanawiając
w ten sposób punkt rozgałęzienia w cząsteczce.
Gałęzie wydłużają się wskutek dodawania jed¬
nostek 1—>4 glukozowych i następuje tworzenie
dalszych rozgałęzień.
GLIKOGENOLIZA NIE JEST
ODWRÓCENIEM GLIKOGENOGENEZY,
LECZ JEST ODRĘBNYM SZLAKIEM
REAKCJI
Fosforylaza glikogenowa katalizuje reakcję, któ¬
ra jest etapem determinującym szybkość glikoge-
nolizy. Reakcja ta to fosforolityczne rozerwanie
(fosforoliza, w odróżnieniu od hydrolizy) wiązań
1—>4 w glikogenie z wytworzeniem glukozo-1-
-fosforanu (ryc. 19-4). W ten sposób z najbardziej
zewnętrznych łańcuchów cząsteczki glikogenu
są usuwane reszty glukozylowe dopóty, dopóki
nie pozostaną po cztery reszty glukozy po każdej
stronie rozgałęzienia 1—>6 (ryc. 19-4). Inny en¬
zym (a-Il—>4]—►a-Jl—>4] transferaza glukano-
wa) przenosi jednostkę trisacharydową z jednej
gałęzi na inną, odsłaniając punkty rozgałęzienia
Ryc. 19-3. Biosynteza glikogenu. Mechanizm rozgałęzienia został wyjaśniony przez dodawanie glukozy znakowanej izotopem 14C do
diety zwierzęcia doświadczalnego i badanie glikogenu w odpowiednich odstępach czasu.
198 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
W
FOSFORYLAZA I TRANSFERAZA ENZYM
1 GLUKANOWA USUWAJĄCY
ROZGAŁĘZIENIA
1 Reszty glukozy połączone
—1
Reszty glukozy połączone
0-0 J
wiązaniami glukozydowymi 1
*+o
Reszty glukozy połączone
wiązaniami glukozydowymi 1 ->6
Ryc. 19-4. Etapy glikogenolizy.
1—*6. Hydroliza wiązań 1—>6 wymaga działa¬
nia enzymu usuwającego rozgałęzienia (ang.
debranching enzyme); transferaza glukanowa
i enzym usuwający rozgałęzienia są prawdopo¬
dobnie dwiema aktywnościami enzymatycznymi
tej samej cząsteczki białka. Po zhydrolizowaniu
wiązania 1—>6 może nadal działać fosforylaza
glikogenowa. Połączone działanie fosforylazy
i innych wymienionych enzymów prowadzi do
całkowitego rozłożenia glikogenu. Reakcja ka¬
talizowana przez fosfoglukomutazę jest odwra¬
calna, wobec czego z glukozo-1-fosforanu może
być wytwarzany glukozo-6-fosforan. W wątrobie
Ryc. 19-5. Kwas 3',5'-adenylowy (cykliczny AMP; cAMP).
(i w nerce), ale nie w mięśniach, występuje swo¬
isty enzym glukozo-6-fosfataza, która katalizuje
hydrolizę glukozo-6-fosforanu, uwalniając wolną
glukozę. Wolna glukoza może przenikać z komó¬
rek do krwi. Jest to końcowy etap glikogenolizy
wątrobowej, której wynikiem jest zwiększenie
stężenia glukozy we krwi.
CYKLICZNY AMP INTEGRUJE
REGULACJĘ GLIKOGENOLIZY
IGLIKOGENOGENEZY
Główne enzymy kontrolujące metabolizm gliko¬
genu - fosforylaza glikogenowa i syntaza gliko¬
genu - są regulowane zarówno przez mechanizmy
allosteryczne, jak i przez modyfikacje kowalen¬
cyjne. Te ostatnie polegają na odwracalnej fosfo¬
rylacji i defosforylacji białka enzymu w odpowie¬
dzi na działanie hormonu (rozdz. 9).
Cykliczny AMP (cAMP) (ryc. 19-5) tworzy
się z ATP przy udziale cyklazy adenylanowej
na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej
i działa jako wewnątrzkomórkowy pośrednik,
czyli przekaźnik drugorzędowy, w odpowiedzi
na hormony, takie jak adrenalina, noradrenali¬
na i glukagon. cAMP jest hydrolizowany przez
fosfodiesterazę, wskutek czego kończy się dzia¬
łanie hormonu. W wątrobie pod wpływem insuli¬
ny zwiększa się aktywność fosfodiesterazy.
Kontrola fosforylazy glikogenowej
jest różna w wątrobie i w mięśniu
W wątrobie rolą glikogenu jest dostarczanie
wolnej glukozy w celu podtrzymania stężenia
glukozy we krwi; w mięśniu glikogen spełnia
rolę źródła glukozo-6-fosforanu dla glikoli¬
zy nasilającej się w odpowiedzi na wzrost za¬
potrzebowania na ATP przy skurczu mięśnia.
W obydwu tkankach fosforylaza jest aktywo¬
wana w wyniku fosforylacji katalizowanej
przez kinazę fosforylazy (dzięki czemu powsta¬
je fosforylaza a), natomiast jest inaktywowana
w procesie defosforylacji katalizowanej przez
fosfatazę fosfoproteinową (dzięki czemu po¬
wstaje fosforylaza b), w odpowiedzi na działa¬
nie hormonu lub innych sygnałów.
Aktywna fosforylaza a w obydwóch tkankach
jest allosterycznie hamowana przez ATP i gluko-
19. METABOLIZM GLIKOGENU 199
zo-6-fosforan; w wątrobie, ale nie w mięśniach,
glukoza jest także jej inhibitorem. Mięśniowa
fosforylaza różni się tym od wątrobowej formy
tego enzymu, że zawiera miejsce wiążące 5'-
-AMP, który działa jako allosteryczny aktywa¬
tor (nieaktywnej) zdefosforylowanej formy b
enzymu. 5'-AMP działa jako silny sygnał stanu
energetycznego komórki mięśniowej; jest on
wytwarzany, gdy stężenie ADP zaczyna wzra¬
stać (wskazując na potrzebę wzmożenia metabo¬
lizmu w celu uzyskania wzrostu stężenia ATP)
jako wynik reakcji katalizowanej przez kinazę
adenylanową:
2 x ADP ATP + 5'-AMR
CAMP AKTYWUJE FOSFORYLAZĘ __
Kinaza fosforylazy jest aktywowana w odpowie¬
dzi na działanie cAMP (ryc. 19-6). Wzrost stęże¬
nia cAMP aktywuje zależną od cAMP kinazę
białek, która katalizuje fosforylację przez ATP
nieaktywnej kinazy b fosforylazy do aktywnej
kinazy a fosforylazy, która z kolei fosforyluje
fosforylazę b do fosforylazy a. W wątrobie cAMP
tworzy się w odpowiedzi na działanie glukagonu,
który jest wydzielany, kiedy stężenie glukozy we
krwi maleje; mięsień jest niewrażliwy na działa¬
nie glukagonu. W mięśniach sygnałem do nasi¬
lenia syntezy cAMP jest działanie noradrenaliny,
która jest wydzielana w odpowiedzi na przestrach
lub przerażenie, kiedy zachodzi potrzeba pod¬
wyższonej glikogenolizy w celu umożliwienia
szybkiej aktywności mięśni.
Ca2+ synchronizuje aktywację fosforylazy
ze skurczem mięśnia
Szybkość glikogenolizy w mięśniu zwiększa
się kilkasetkrotnie bezpośrednio po rozpoczęciu
skurczu mięśnia. Ten sam sygnał (wzrost we¬
wnątrzkomórkowego stężenia jonu Ca2+) jest od¬
powiedzialny za rozpoczęcie zarówno skurczu,
jaki glikogenolizy. Mięśniowa kinaza fosforyla¬
zy, która aktywuje fosforylazę glikogenową, jest
tetramerem złożonym z czterech różnych pod-
jednostek: a, p, y i 5. Podjednostki a i p zawie¬
rają reszty seryny, które są fosforylowane przez
zależną od cAMP kinazę białek. Podjednostka 5
jest identyczna z białkiem wiążącym Ca2+ - kal-
moduliną (rozdz. 42) - i wiąże cztery jony Ca2f.
Związanie Ca2+ aktywuje miejsce katalityczne
podjednostki y nawet wówczas, gdy enzym jest
w stanie zdefosforylowanym b; forma ufosfory-
lowana a jest w pełni aktywna jedynie w obec¬
ności Ca2+.
Glikogenoliza w wątrobie może być
niezależna od cAMP
W wątrobie zachodzi niezależna od cAMP ak¬
tywacja glikogenolizy w odpowiedzi na stymu¬
lację receptorów a,-adrenergicznych przez ad¬
renalinę i noradrenalinę. Niezbędne do tego jest
przemieszczenie się jonów Ca2+z mitochondriów
do cytozolu, a następnie stymulacja kinazy fo¬
sforylazy wrażliwej na działanie kompleksu
Ca2+-kalmodulina. Niezależna od cAMP gliko¬
genoliza jest wywoływana również przez wazo-
presynę, oksytocynę i angiotensynę II, działające
za pośrednictwem wapnia albo bisfosforanu fo-
sfatydyloinozytolu (ryc. 42-10).
Inaktywacja fosforylazy następuje
pod wpływem fosfatazy-1 białek
Zarówno fosforylaza a, jak i kinaza a fosforylazy
są defosforylowane i inaktywowane przez fosfa-
tazę-1 białek. Fosfataza-1 białek jest hamowana
przez białko zwane inhibitorem-1, które jest ak¬
tywne jedynie wówczas, gdy zostanie ufosfory-
lowane pod wpływem zależnej od cAMP kinazy
białek. W ten sposób cAMP kontroluje zarówno
aktywację, jak i inaktywację fosforylazy (ryc.
19-6).
Insulina wzmacnia to działanie przez hamo¬
wanie aktywacji fosforylazy b. Dokonuje tego
pośrednio, przez zwiększenie pobierania glukozy,
co prowadzi do zwiększenia stężenia glukozo-6-
-fosforanu. Glukozo-6-fosforan jest silnym inhi¬
bitorem kinazy fosforylazy.
Aktywności syntazy i fosforylazy
glikogenowej sa regulowane wspólnie,
lecz z odwrotnym efektem
Podobnie jak fosforylaza, syntaza glikogenowa
występuje zarówno w postaci ufosforylowanej,
jak i nieufosforylowanej; jednak efekt fosforylacji
obu enzymów jest odwrotny (ryc. 19-7). Aktywna
syntaza a glikogenowa jest zdefosforylowana,
Nieaktywna Aktywna
cyklaza cyklaza
adenylanowa adenylanowa
200 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
19. METABOLIZM GLIKOGENU 201
Adrenalina
p-receptor
©
Nieaktywna
cyklaza _
adenylanowa
Aktywna
cyklaza
adenylanowa
ATP
©
CAMP
| FOSFODIESTERAZA |
► 5'-AMP
Glikogen(n+1)
Glikogen(n)
+ UDPG
tyc. 19-7. Kontrola syntazy glikogenowej w mięśniu (n = liczba reszt glukozowych; GSK = kinaza syntazy glikogenowej; G6P =
glukozo-6-f osf oran).
natomiast nieaktywna syntaza b glikogenowa
jest ufosforylowana.
Na syntazę glikogenową działa sześć różnych
kinaz białek. Dwie z nich są zależne od kom¬
pleksu Ca2+-kalmodulina (jedna z nich jest ki-
naząfosforylazy). Druga z kinaz jest zależną od
cAMP kinazą białek, umożliwiającą hormonalne
działanie za pośrednictwem cAMP, które hamuje
syntezę glikogenu i jednocześnie aktywuje gli-
kogenolizę. Insulina także wzmaga glikogeno-
genezę w mięśniu, w tym samym czasie, kiedy
hamuje glikogenolizę, zwiększając stężenie glu-
kozo-6-fosforanu, stymulującego defosforylację
i aktywację syntazy glikogenowej. Defosfory-
lacja syntazy b glikogenowej jest katalizowana
przez fosfatazę-1 białek, która jest pod kontrolą
zależnej od cAMP kinazy białek.
REGULACJA METABOLIZMU GLIKOGENU
JEST EFEKTYWNA DZIĘKI RÓWNOWADZE
MIEDZY AKTYWNOŚCIAMI SYNTAZY
GLIKOGENOWEJ I F0SF0RYLAZY
W tym samym czasie, kiedy fosforylaza zostaje
zaktywowana w wyniku wzrostu stężenia cAMP
(przez kinazę fosforylazy), syntaza glikogeno¬
wa jest zmieniana w nieaktywną formę; obydwa
efekty występują pod wpływem zależnej od
cAMP kinazy białek (ryc. 19-8). A zatem efek-
202 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Adrenalina | FOSFODIESTERAZA
Ryc. 19-8. Skoordynowana kontrola glikogenolizy i glikogenogenezy przez kinazy białek zależne od cAMR Reakcje, które prowadzą do
glikogenolizy w rezultacie zwiększenia stężenia cAMR zaznaczono grubymi strzałkami, a te, które są hamowane przez aktywację fos-
fatazy-1 białek - przerywanymi strzałkami. Dzieje się odwrotnie, gdy stężenie cAMP zmniejsza się w wyniku działania fosfodiesterazy,
co prowadzi do glikogenogenezy.
tem hamowania glikogenolizy jest nasilenie gli¬
kogenogenezy, a hamowanie glikogenogenezy
następuje równocześnie z nasileniem glikogeno¬
lizy. Należy także zwrócić uwagę, że defosfory-
lacje fosforylazy a, kinazy fosforylazy i syntazy b
glikogenowej są katalizowane przez ten sam en¬
zym o dużym zakresie swoistości - fosfatazę-1
białek. Z kolei, fosfataza-1 białek jest hamowana
przez zależną od cAMP kinazę białek za pośred¬
nictwem inhibitora-1. Wobec tego jednocześnie
glikogenoliza może zostać zakończona, a gliko-
genogeneza - nasilona (i vice versa), ponieważ
obydwa procesy są uwarunkowane aktywnością
kinazy białek zależnej od cAMP. Zarówno kinaza
fosforylazy, jak i syntaza glikogenowa mogą być
odwracalnie fosforylowane w więcej aniżeli jed¬
nym miejscu przez oddzielne kinazy i fosfatazy.
Te wtórne fosforylacje modyfikują wrażliwość
pierwotnych miejsc na fosforylację i defosfory-
lację (wielomiejscowa fosforylacja). Pozwa¬
la to insulinie, w wyniku zwiększenia stężenia
glukozo-6-fosforanu, wywierać skutki odwrot¬
ne do wywoływanych przez cAMP (p. ryc. 19-6
i 19-7).
19. METABOLIZM GLIKOGENU 203
Tabela 19-2. Choroby spichrzania glikogenu
Typ
Nazwa
Niedobór enzymu
Istota zaburzenia klinicznego
0
-
Syntaza glikogenowa
Hipoglikemia; hiperketonemia; wczesna śmierć
I
Choroba von Gierkego
Niedobór glukozo-6-fosfatazy
Nagromadzenie glikogenu w wątrobie i w komórkach
kanalików nerkowych; hipoglikemia; hiperlaktacidemia;
ketonemia; hiperlipidemia
II
Choroba Pompego
Niedobór lizosomalnej
a-(1—►4)-
i a-(1—>6)-glukozydazy
(kwaśnej maltazy)
Nagromadzenie glikogenu w lizosomach; w odmianie
młodzieńczej hipotonia mięśni, śmierć z powodu
niedomogi serca w wieku ok. 2 lat; w odmianie
dorosłych dystrofia mięśni
III
Dekstrynoza graniczna
Choroba Forbesa lub
choroba Corich
Brak enzymu usuwającego
rozgałęzienia
Hipoglikemia głodowa; hepatomegalia w dzieciństwie;
gromadzenie charakterystycznych rozgałęzionych
polisacharydów
IV
Amylopektynoza
Choroba Andersena
Brak enzymu
rozgałęziającego
Hepatomegalia; nagromadzanie polisacharydu
z niewieloma punktami rozgałęzienia; śmierć z powodu
niedomogi wątroby lub serca w pierwszym roku życia
V
Niedobór miofosforylazy
Syndrom McArdle’a
Brak fosforylazy
glikogenowej w mięśniach
Zmniejszona zdolność do wysiłku fizycznego; mięśnie
zawierają zbyt dużo glikogenu (2,5-4%);
po wysiłku bardzo mało kwasu mlekowego we krwi
VI
Choroba Hersa
Niedobór fosforylazy
glikogenowej w wątrobie
Hepatomegalia; nagromadzenie glikogenu w wątrobie;
łagodna hipoglikemia; ogólnie dobre rokowanie
VII
Choroba Tarui
Niedobór fosfofruktokinazy-1
w mięśniach i erytrocytach
Zmniejszona zdolność do wysiłku fizycznego; mięśnie
zawierają zbyt dużo glikogenu (2,5-4%); po wysiłku
bardzo mało kwasu mlekowego we krwi; możliwość
niedokrwistości hemolitycznej
VIII
Niedobór kinazy fosforylazy
w wątrobie
Hepatomegalia; nagromadzenie glikogenu w wątrobie;
łagodna hipoglikemia; ogólnie dobre rokowanie
IX
Niedobór kinazy fosforylazy
w wątrobie i w mięśniach
Hepatomegalia; nagromadzenie glikogenu w wątrobie
i w mięśniach; łagodna hipoglikemia; ogólnie dobre
rokowanie
X
Niedobór zależnej od cAMP
kinazy białek
Hepatomegalia; nagromadzenie glikogenu w wątrobie
ASPEKTY KLINICZNE
Choroby związane z zaburzeniami
spichrzania glikogenu sa dziedziczne
Określenie „choroba spichrzania glikogenu” jest
ogólną nazwą grupy dziedzicznych zaburzeń,
charakteryzujących się odkładaniem nietypo¬
wego glikogenu lub nietypowej ilości glikogenu
w tkankach, albo też niemożnością uaktywnienia
(mobilizacji) glikogenu. Najważniejsze glikoge-
nozy zestawiono w tab. 19-2.
STRESZCZENIE
• Glikogen stanowi najważniejszą formę magazy¬
nowania węglowodanów w organizmie ssaków,
obecną głównie w wątrobie i w mięśniach.
• W wątrobie najważniejszą funkcją glikogenu
jest dostarczanie glukozy do tkanek poza wątro¬
bowych. W mięśniach glikogen stanowi przede
wszystkim gotowe źródło paliwa metaboliczne¬
go dla nich.
• Glikogen jest syntetyzowany z glukozy w szlaku
glikogenogenezy. Jest rozkładany w odrębnym
204 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
szlaku glikogenolizy. Glikogenoliza prowadzi
do wytwarzania glukozy w wątrobie, a mlecza¬
nu w mięśniach dzięki, odpowiednio, obecności
lub nieobecności glukozo-6-fosfatazy.
• Cykliczny AMP integruje regulację glikogenoli¬
zy i glikogenogenezy w sposób przeciwrówno-
legle skoordynowany, jednocześnie aktywując
fosforylazę glikogenową i hamując syntazę gli¬
kogenową. Insulina działa odwrotnie, hamując
glikogenolizę i stymulując glikogenogenezę.
• Dziedzicznie uwarunkowane niedobory swoi¬
stych enzymów metabolizmu glikogenu zarów¬
no w wątrobie, jak i w mięśniach są przyczyną
chorób spichrzania glikogenu.
PIŚMIENNICTWO
Bollen M, Keppens S, Stalmans W: Specific features
of glycogen metabolism in the liver. Biochemical
Journal 1998;336:19.
Ferrer JC, Favre C, Gomis RR, Femandez-Novell JM,
Garcia-Rocha M, de la Iglesia N, Cid E, Guinovart
JJ: Control of glycogen deposition. FEBS Letters
2003;546:127.
McGarry JD, Kuwajima M, Newgard CB, Foster DW,
Katz J: From dietary glucose to liver glycogen:
The fuli circle round. Annual Review of Nutrition
1987;7:51.
Melendez-Hevia E, Waddell TG, Shelton ED: Opti-
mization of molecular design in the evolution of
metabolism: The glycogen molecule. Biochemical
Journal 1993;295:477.
Radziuk J, Pye S: Hepatic glucose uptake, gluconeo-
genesis and the regulation of glycogen synthe-
sis. Diabetes and Metabolism Research Reviews
2001; 17(4):250.
Roach PJ: Glycogen and its metabolism. Current Mo¬
lecular Medicine 2002;2(2): 101.
Shearer J, Graham TE: New perspectives on the stor-
age and organization of muscle glycogen. Canadian
Journal of Applied Physiology 2002;27:179.
Wolfsdorf JI, Holm IA: Glycogen storage diseases. Phe-
notypic, genetic, and biochemical characteristics,
and therapy. Endocrinology and Metabolism Cli-
nics ofNorth America 1999;28:801.
Glukoneogeneza i kontrola
stężenia glukozy we krwi
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Glukoneogeneza jest procesem przekształcania
związków niewęglowodanowych w glukozę lub
glikogen. Głównymi substratami glukoneogenezy
są aminokwasy glikogenne oraz mleczan, glicerol
ipropionian. Wątroba i nerki są głównymi narzą¬
dami, w których zachodzi glukoneogeneza.
Glukoneogeneza zaspokaja zapotrzebowanie
organizmu na glukozę wówczas, gdy podaż węglo¬
wodanów z pokarmem jest niewystarczająca lub
brakuje rezerw glikogenu. Ciągłe dostarczanie glu¬
kozy jest niezbędne zwłaszcza dla układu nerwo¬
wego i erytrocytów. Zaburzenie glukoneogenezy
ma zwykle negatywne skutki. Hipoglikemia powo¬
duje zaburzenia czynności mózgu, które mogą pro¬
wadzić do śpiączki i zejścia śmiertelnego. Glukoza
jest także ważna dla utrzymania odpowiedniego
poziomu związków pośrednich cyklu kwasu cytry¬
nowego nawet wówczas, gdy kwasy tłuszczowe są
głównym źródłem acetylo-CoA w tkankach. Ponad¬
to glukoneogeneza usuwa mleczan, produkowany
przez mięśnie i erytrocyty, oraz glicerol wytwarza¬
ny w tkance tłuszczowej. U przeżuwaczy głównym
substratem dla glukoneogenezy jest propionian,
który powstaje z węglowodanów w żwaczu.
GLUKONEOGENEZA OBEJMUJE
REAKCJE GLIKOLIZY, CYKLU KWASU
CYTRYNOWEGO ORAZ NIEKTÓRE
REAKCJE SPECJALNE
Bariery termodynamiczne zapobiegają
prostemu odwróceniu glikolizy
Trzy nierównowagowe reakcje w glikolizie (rozdz.
18), katalizowane przez heksokinazę, fosfofrukto-
kinazę i kinazę pirogronianową, zapobiegają pro¬
stemu odwróceniu ciągu reakcji glikolizy, który
prowadziłby do syntezy glukozy (ryc. 20-1). Te
reakcje są omijane w następujący sposób.
A. PlROGRONIAN I F0SF0EN0L0PIR0GR0NIAN
Odwrócenie reakcji katalizowanej przez kinazę
pirogronianową w glikolizie odbywa się dzięki
dwóm reakcjom endotermicznym. Mitochon-
drialna karboksylaza pirogronianową katali¬
zuje karboksylację pirogronianu do szczawio-
octanu w reakcji wymagającej ATP do swego
przebiegu, a koenzymem w tej reakcji jest jedna
z witamin B - biotyna. Biotyna wiąże C02z wo¬
dorowęglanu, przechodząc w karboksybiotynę,
z której C02 jest przenoszony na pirogronian
(p. ryc. 44-17). Drugi enzym, karboksykinaza
fosfoenolopirogronianowa, katalizuje dekar-
boksylację i fosforylację szczawiooctanu do fo-
sfoenolopirogronianu, używając GTP jako dono¬
ra grupy fosforanowej. W wątrobie i nerkach tio-
kinaza bursztynianowa w cyklu kwasu cytryno¬
wego (rozdz. 17) produkuje GTP (a nie ATP, jak
w innych tkankach); ten GTP jest wykorzysty¬
wany do reakcji karboksykinazy fosfoenolopiro-
gronianowej, dzięki czemu tworzy się połączenie
między aktywnością cyklu kwasu cytrynowego
a glukoneogenezą. Zapobiega to nadmiernemu
usuwaniu szczawiooctanu dla glukoneogenezy,
które mogłoby ujemnie wpływać na aktywność
cyklu kwasu cytrynowego.
B. Fruktozo-1,6-bisfosforan i fruktozo-6-fosforan
Przekształcenie fruktozo-1,6-bisfosforanu we
fruktozo-6-fosforan, niezbędne do odwrócenia
glikolizy, jest katalizowane przez fruktozo-1,6-
-bisfosfatazę. Jej obecność w tkance warunkuje
zdolność tkanki do syntetyzowania glukozy (i gli¬
kogenu) nie tylko z pirogronianu, ale także z fosfo-
Glukoza
Ryc. 20-1. Główne szlaki oraz regulacje glukoneogenezy i glikolizy w wątrobie. Punkty wejścia glikogennych aminokwasów po ich
transaminacji są zaznaczone strzałkami wychodzącymi z kółek (p. także ryc. 17-4). Kluczowe enzymy glukoneogenezy są obwiedzione
podwójną ramką. ATP niezbędny do glukoneogenezy powstaje w procesie utleniania kwasów tłuszczowych. Propionian ma ilościowe
znaczenie jedynie u przeżuwaczy. Wężykowatymi strzałkami zaznaczono efekty allosteryczne, a strzałkami z przerywaną linią - kowa¬
lencyjną modyfikację wskutek odwracalnej fosforylacji. Duże stężenia alaniny działają jak „sygnał do glukoneogenezy”, hamując glikolizę
na etapie kinazy pirogronianowej.
20. GLUKONEOGENEZAI KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI 207
trioz. Enzym ten występuje w wątrobie, nerkach
i mięśniu szkieletowym, ale prawdopodobnie nie
występuje w sercu i mięśniach gładkich.
C. Glukozo-6-fosforan i glukoza
Przekształcenie glukozo-6-fosforanu w glukozę
jest katalizowane przez gIukozo-6-fosfatazę. Wy¬
stępuje ona w wątrobie i nerkach, ale nie ma jej
w mięśniach i tkance tłuszczowej. Obecność jej
pozwala danej tkance oddawać glukozę do krwi.
D. GLUKOZO-1-FOSFORAN I GLIKOGEN
Rozpad glikogenu do glukozo-1-fosforanu jest
katalizowany przez fosforylazę. Biosynteza gli¬
kogenu odbywa się całkiem odmiennym szla¬
kiem - przez utworzenie urydynodifosfoglukozy
z udziałem syntazy glikogenowej (p. ryc. 19-1).
Zależność między glukoneogenezą a szlakiem
glikolitycznym przedstawiono na ryc. 20-1. Ami¬
nokwasy glikogenne, po transaminacji lub de-
aminacji, albo tworzą pirogronian, albo stają się
metabolitami cyklu kwasu cytrynowego. Wobec
tego reakcje opisane wyżej mogą być odpowie¬
dzialne za przekształcenie zarówno mleczanu, jak
i aminokwasów glikogennych w glukozę lub gli-
kogen.
Propionian jest głównym prekursorem glukozy
u przeżuwaczy. Po estryfikacji z Co A, propionylo-
-CoA jest karboksylowany do D-metylomalonylo-
-CoA w reakcji katalizowanej przez karboksyla-
zę propionylo-CoA - enzym zależny od biotyny
(ryc. 20-2). Racemaza metylomalonylo-CoA
katalizuje przekształcenie D-metylomalonylo-
-CoA w L-metylomalonylo-CoA, który następnie
ulega izomeryzacji do bursztynylo-CoA w reakcji
katalizowanej przez mutazę metylomalonylo-
-CoA. U nieprzeżuwaczy, łącznie z człowiekiem,
propionian powstaje w wyniku p-oksydacji kwa¬
sów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów
węgla, które występują w tłuszczach przeżuwaczy
(rozdz. 22); propionian powstaje również w reak¬
cji utleniania izoleucyny oraz bocznego łańcucha
cholesterolu, stanowi jednak stosunkowo niewiel¬
ki odsetek substratów glukoneogenezy. Mutaza
metylomalonylo-CoA jest enzymem zależnym od
witaminy B12 i w przypadku niedoboru tej wita¬
miny kwas metylomalonowy jest wydalany z mo¬
czem (acyduria metylomalonowa).
Glicerol jest uwalniany z tkanki tłuszczowej
w wyniku lipolizy triacylogliceroli w stanie syto¬
ści. Może on być użyty do ponownej estryfikacji
wolnych kwasów tłuszczowych do triacyloglice¬
roli w tkance tłuszczowej lub w wątrobie, albo
może być substratem dla glukoneogenezy w wą¬
trobie. W stanie głodu glicerol uwalniany podczas
lipolizy triacylogliceroli tkanki tłuszczowej jest
zużywany wyłącznie jako substrat glukoneogene¬
zy w wątrobie i w nerkach.
cocr
Propionian
/^Mg
SYNTETAZA
C02 + H20
KARBOKSYLAZA
ACYLO-CoA
CHo »
i 3 V
PROPIONYLO-CoA
Mg^\"
ATP AMP + PPj
CH2
I
CO - S - CoA
Propionylo-CoA
tynT\
f Biotyna
ATP ADP + R
CH3
H - C - C00'
I
CO - S - CoA
D*Metylo-
malonylo-CoA
RACEMAZA
METYLOMALONYLO-CoA
Produkty pośrednie
C00‘
1
ch2
i -
MUTAZA
METYLOMALONYLO-CoA
cyklu
kwasu cytrynowego
ch2
I
Koenzym B1Z
CO - S - CoA
Sukcynylo-CoA
CH3
-00C -C-H
I
CO - S - CoA
L-Metylo-
malonylo-CoA
Ryc. 20-2. Metabolizm propionianu.
208 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
GLIKOLIZA I GLUKONEOGENEZA
PRZEBIEGAJĄ TYM SAMYM SZLAKIEM,
ALE W ODWROTNYCH KIERUNKACH,
DLATEGO MUSZA BYĆ KONTROLOWANE
WSPÓLNIE, ALE W SPOSÓB ODWROTNY
Zmiany w dostępności substratów są odpowie¬
dzialne za większość zmian w metabolizmie
albo bezpośrednio, albo pośrednio, wpływając
na zmianę wydzielania hormonów. W regulacji
aktywności enzymów uczestniczących w me¬
tabolizmie węglowodanów biorą udział trzy
mechanizmy: (1) zmiana szybkości syntezy en¬
zymów, (2) kowalencyjna modyfikacja enzymu
przez odwracalną fosforylację, (3) efekty allo-
steryczne.
Indukcja i represja kluczowych enzymów
wymaga kilku godzin
Zmiany aktywności enzymów w wątrobie, które
zachodzą w zmiennych warunkach metabolicz¬
nych, wymieniono w tab. 20-1. Enzymy te katali¬
zują reakcje, które nie są w stanie równowagi (są
nieodwracalne w warunkach fizjologicznych).
Efekty są na ogół wzmacniane, gdyż aktywność
enzymów katalizujących reakcje w przeciwnym
kierunku zmienia się odwrotnie (p. ryc. 20-1).
Enzymy biorące udział w procesach zużywa¬
nia glukozy (czyli te uczestniczące w glikolizie
i lipogenezie) stają się bardziej aktywne przy
nadmiernym napływie glukozy, a w tych warun¬
kach enzymy glukoneogenezy wykazują małą
aktywność. Insulina, wydzielana w odpowiedzi
na podwyższone stężenie glukozy we krwi, na¬
sila syntezę kluczowych enzymów glikolizy.
Działa ona również antagonistycznie w stosunku
do efektu glukokortykoidów i stymulowanego
przez glukagon cAMP, które indukują syntezę
kluczowych enzymów glukoneogenezy.
Kowalencyjna modyfikacja
przez odwracalna fosforylację jest szybka
Glukagon i adrenalina - hormony, które odpo¬
wiadają za obniżenie stężenia glukozy we krwi
- hamują glikolizę i stymulują glukoneogenezę
w wątrobie, zwiększając stężenie cAMP. To z ko¬
lei powoduje aktywację zależnej od cAMP kina¬
zy białek, prowadząc do fosforylacji i aktywacji
kinazy pirogronianowej. Obydwa te hormony
wpływają również na stężenie fruktozo-2,6-bisfo-
sforanu i wobec tego na glikolizę i glukoneogene¬
zę w sposób wyjaśniony poniżej.
Allosteryczna modyfikacja
jest natychmiastowa
W procesie glukoneogenezy synteza szczawio-
octanu z pirogronianu i wodorowęglanu, która
jest katalizowana przez karboksylazę pirogro-
nianową, wymaga obecności acetylo-CoA jako
aktywatora allosterycznego. Dodanie acetylo-
-CoA powoduje zmianę trzeciorzędowej struktury
białka enzymatycznego, zmniejszając wartość Km
dla wodorowęglanu. To oznacza, że gdy powstaje
acetylo-CoA z pirogronianu, dzięki aktywności
karboksylazy pirogronianowej, zapewnia on nie¬
jako automatycznie dostarczanie szczawiooctanu,
a zatem i możliwość swojego dalszego utlenia¬
nia w cyklu kwasu cytrynowego. Aktywacja
karboksylazy pirogronianowej, i jednoczesne ha¬
mowanie dehydrogenazy pirogronianowej przez
acetylo-CoA powstający z utleniania kwasów
tłuszczowych, pomaga wyjaśnić oszczędzający
wpływ utleniania kwasów tłuszczowych na utle¬
nianie pirogronianu i pobudzenie glukoneogenezy
wątrobowej. Odwrotny stosunek między aktyw-
nościami dehydrogenazy pirogronianowej i kar¬
boksylazy pirogronianowej zmienia metaboliczne
losy pirogronianu wówczas, gdy tkanka przecho¬
dzi z utleniania węglowodanów przez glikolizę na
glukoneogenezę; taka zmiana następuje podczas
przechodzenia stanu poresorpcyjnego w stan gło¬
du (p. ryc. 20-1). Główną rolą utleniania kwasów
tłuszczowych w pobudzaniu glukoneogenezy jest
dostarczanie ATP potrzebnego dla przebiegu glu¬
koneogenezy.
Fosfofruktokinaza (fosfofruktokinaza-1) zaj¬
muje kluczową pozycję w regulowaniu glikolizy
i jest także obiektem kontroli zwrotnej. Jest ona
hamowana przez cytrynian i przez normalne we¬
wnątrzkomórkowe stężenia ATP, a jest aktywo¬
wana przez 5'-AMP, który działa jako wskaźnik
stanu energetycznego komórki. Obecność kinazy
adenylanowej w wątrobie i wielu innych tkan¬
kach pozwala na szybkie osiągnięcie równowagi
reakcji:
2ADP;=±ATP + 5'AMR
20. GLUKONEOGENEZAI KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI 209
Tabela 20-1. Enzymy regulacyjne i adaptacyjne związane z metabolizmem węglowodanów
Aktywność
przy
karmieniu wę¬
glowodanami
przy
głodzeniu
i w cukrzycy
Induktor
Represor
Aktywator
Inhibitor
Glikogenoliza, glikoliza i utlenianie pirogronianu
Syntaza glikogenu
t
1
Insulina,
glukozo-6-
-fosforan
Glukagon
Heksokinaza
Glukozo-6-
-fosforan
Glukokinaza
t
1
Insulina
Glukagon
Fosf of r u kto ki n aza-1
T
1
Insulina
Glukagon
5'AMR fruktozo-
-6-fosforan,
fruktozo-2,6-
-bisfosforan
Cytrynian, ATR
glukagon
Kinaza pirogronianowa
t
1
Insulina, fruktoza
Glukagon
Fruktozo-1,6-
-bisfosforan,
insulina
ATR alanina,
glukagon,
noradrenalina
Dehydrogenaza
pirogronianowa
T
1
CoA, NAD+,
insulina, ADR
pirogronian
Acetylo-CoA,
NADH, ATP
(kwasy
tłuszczowe, ciała
ketonowe)
Glukoneogeneza
Karboksylaza
pirogronianowa
1
T
Glukokortykoidy
glukagon,
adrenalina
Insulina
Acetylo-CoA
ADP
Karboksykinaza
fosfoenolopiro-
gronianowa
i
t
Glukokortykoidy,
glukagon,
adrenalina
Insulina
Glukagon?
Glukozo-6-fosfataza
i
T
Glukokortykoidy,
glukagon,
adrenalina
Insulina
Wobec tego, gdy ATP jest zużywany do proce¬
sów wymagających energii, czego skutkiem jest
wytwarzanie ADP, stężenie AMP ([AMP]) wzra¬
sta. Stosunkowo mały spadek [ATP] powoduje kil¬
kakrotnie większy wzrost [AMP], tak więc [AMP]
działa jako metaboliczny wzmacniacz małej zmia¬
ny w [ATP]; jest zatem czułym wskaźnikiem stanu
energetycznego komórki. Aktywność fosfofrukto-
kinazy-1 jest więc regulowana w odpowiedzi na
stan energetyczny komórki, aby kontrolować ilość
węglowodanów podlegających glikolizie przed
ich wejściem w cykl kwasu cytrynowego. Jedno¬
cześnie AMP aktywuje fosforylazę, wzmagając
glikogenolizę. Konsekwencją hamowania aktyw¬
ności fosfofruktokinazy-1 jest nagromadzanie
glukozo-6-fosforanu, który z kolei hamuje dalsze
pobieranie glukozy w tkankach pozawątrobowych
poprzez hamowanie heksokinazy.
210 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Fruktozo-2,6-bisfosforan
odgrywa szczególna rolo
w regulacji glikolizy i glukoneogenezy
w wątrobie
Najbardziej skutecznym pozytywnym efekto-
rem allosterycznym fosfofruktokinazy-1, a in¬
hibitorem fruktozo-1,6-bisfosfatazy w wątrobie,
jest fruktozo-2,6-bisfosforan. Przeciwdziała on
hamowaniu fosfofruktokinazy-1 przez ATP i po-
Glukoza
i Glikogen
11
11
Pirogronian
Ryc. 20-3. Kontrola glikolizy i glukoneogenezy w wątrobie przez
fruktozo-2,6-bisfosforan i bifunkcyjny enzym PFK-2/F-2,6-Pazę
(6-fosfofrukto-2-kinazę/fruktozo-2,6-bisfosfatazę). PFK-1 - fo-
sfofruktokinaza-1 (6-fosfofrukto-1-kinaza); F-1,6-Paza - fruk-
tozo-1,6-bisfosfataza. Strzatki wężykowate oznaczają efekty
allosteryczne.
woduje zwiększanie jej powinowactwa do fruk-
tozo-6-fosforanu. Hamuje fruktozo-1,6-bisfosfa-
tazę przez zwiększenie wartości Km dla fruktozo-
-1,6-bisfosforanu. Jego stężenie jest regulowa¬
ne zarówno przez substraty (allosterycznie), jak
i hormonalnie (modyfikacja kowalencyjna) (ryc.
20-3).
Fruktozo-2,6-bisfosforan powstaje przez fo¬
sfory lację fruktozo-6-fosforanu, katalizowaną
przez fosfofruktokinazę-2. To samo białko en¬
zymatyczne jest również odpowiedzialne za roz¬
pad tego związku, ponieważ ma także aktywność
fruktozo-2,6-bisfosfatazy. Ten dwufunkcyjny
enzym jest pod allosteryczną kontrolą fruktozo-
-6-fosforanu, którego zwiększone stężenie po¬
budza kinazę oraz hamuje fosfatazę. Wobec tego
przy nadmiarze glukozy zwiększa się stężenie
fruktozo-2,6-bisfosforanu, pobudzając glikolizę
przez aktywację fosfofruktokinazy-1 oraz hamo¬
wanie fruktozo-1,6-bisfosfatazy. W stanie gło¬
dzenia glukagon stymuluje wytwarzanie cAMP,
aktywując zależną od cAMP kinazę białek,
która z kolei poprzez fosfory lację inaktywuje
fosfofruktokinazę-2 oraz aktywuje fruktozo-2,6-
-bisfosfatazę. W ten sposób zostaje wzmożona
glukoneogeneza poprzez zmniejszenie stężenia
fruktozo-2,6-bisfosforanu, co inaktywuje fosfo-
fruktokinazę-1 oraz znosi hamowanie fruktozo-
- 1,6-bisfosfatazy.
Cykle substratowe (daremne)
pozwalała na subtelne dostrajanie
i szybka odpowiedź
Punkty kontroli w glikolizie i w metabolizmie gli-
kogenu obejmują cykle fosforylacji i defosfory-
lacji katalizowane przez: glukokinazę i glukozo-
-6-fosfatazę; fosfofruktokinazę-1 i fruktozo-1,6-
-bisfosfatazę; kinazę pirogronianową, karboksy-
lazę pirogronianową i karboksykinazę fosfoeno-
lopirogronianową oraz syntazę glikogenu i fosfo-
rylazę. Wydawałoby się oczywiste, że te przeciw¬
stawne (działające w przeciwnych kierunkach)
enzymy są w taki sposób regulowane, że kiedy
te zaangażowane w glikolizę są aktywne, wtedy
te zaangażowane w glukoneogenezę są nieak¬
tywne. W przeciwnym razie istniałaby cykliczna
przemiana ufosforylowanych metabolitów po¬
średnich w nieufosforylowane, z hydrolizą ATP
jako efektem wypadkowym. W mięśniu zarówno
20. GLUKONEOGENEZAI KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI 211
fosfofruktokinaza, jak i fruktozo-1,6-bisfosfataza
wykazują jednak pewną aktywność jednocześnie,
tak że rzeczywiście zachodzi niewielka (darem¬
na) cykliczna przemiana substratu. To pozwala
na bardzo szybki wzrost intensywności glikoli¬
zy niezbędny dla skurczu mięśnia. W spoczynku
poziom aktywności fosfofruktokinazy jest oko¬
ło dziesięciokrotnie wyższy aniżeli fruktozo-1,6-
-bisfosfatazy; w przygotowaniu do skurczu miꜬ
nia aktywność obydwóch enzymów wzrasta,
przy czym fruktozo-1,6-bisfosfatazy dziesię¬
ciokrotnie bardziej aniżeli fosfofruktokinazy,
utrzymując tę samą wypadkową (netto) szybkość
glikolizy. Z chwilą rozpoczęcia skurczu mięśnio¬
wego aktywność fosfofruktokinazy nadal wzra¬
sta, a fruktozo-1,6-bisfosfatazy zmniejsza się,
powodując wzrost wypadkowej szybkości gli¬
kolizy (i wobec tego również tworzenia ATP) aż
tysiąckrotnie.
STĘŻENIE GLUKOZY WE KRWI
JEST PRECYZYJNIE REGULOWANE
W WĄSKICH GRANICACH
W stanie poabsorpcyjnym stężenie glukozy we
krwi u ludzi i u wielu ssaków jest utrzymywane
w granicach 4,5-5,5 mmol/L. Po spożyciu pokar¬
mu węglowodanowego może ono się zwiększać
do 6,5-7,2 mmol/L. W czasie głodzenia stężenie
glukozy może się zmniejszać do 3,3-3,9 mmol/L.
Gwałtowne zmniejszenie stężenia glukozy we
krwi (np. w odpowiedzi na nadmierną dawkę
insuliny) powoduje drgawki, ze względu na bez¬
pośrednią zależność funkcjonowania mózgu od
dostarczania glukozy. Jednak nawet znacznie
mniejsze stężenia mogą być tolerowane, jeżeli
hipoglikemia rozwija się dostatecznie wolno, aby
mogła nastąpić adaptacja. Stężenie glukozy we
krwi ptaków jest znacznie wyższe (14,0 mmol/L),
a u przeżuwaczy znacznie niższe (2,2 mmol/L
u owiec, a 3,3 mmol/L u bydła). Przypuszcza się,
że ta niższa norma stężenia wiąże się z tym, że
u przeżuwaczy właściwie wszystkie węglowoda¬
ny pokarmu ulegają fermentacji do kwasów tłusz¬
czowych o krótkim łańcuchu węglowym, które
w dużej mierze zastępują glukozę jako główne
metaboliczne źródło energii tkanek w stanie po¬
absorpcyjnym.
GLUKOZA ZAWARTA WE KRWI
POCHODZI Z POKARMÓW,
Z GLUKONEOGENEZYI GLIKOGENOUZY
W wyniku trawienia węglowodanów zawartych
w pokarmach powstają glukoza, galaktoza i fruk¬
toza, które są transportowane do wątroby poprzez
żyłę wrotną. Galaktoza i fruktoza są w wątrobie
łatwo przetwarzane w glukozę (rozdz. 21).
Glukoza jest wytwarzana z dwóch grup związ¬
ków, które ulegają glukoneogenezie (p. ryc. 17-4
i 20-1): (1) związków, które podlegają bezpośred¬
niemu przetworzeniu w glukozę, włączając w to
większość aminokwasów i propionian, oraz
(2) związków, które są produktami metabolizmu
glukozy w tkankach. Tak więc mleczan, wytwa¬
rzany podczas glikolizy w mięśniu szkieletowym
i w erytrocytach, jest transportowany do wątroby
i nerek, gdzie jest przetwarzany ponownie w glu¬
kozę, która - dostając się poprzez krążenie krwi do
różnych tkanek - może być znów wykorzystana
do utleniania. Proces ten jest znany jako cykl Cori
albo cykl kwasu mlekowego (ryc. 20-4).
W stanie głodzenia następuje wydzielanie ala¬
niny z mięśni szkieletowych w ilościach znacz¬
nie przekraczających ilość tego aminokwasu
w białkach mięśnia, które w tym czasie ulegają
katabolizmowi. Alanina jest bowiem wytwarza¬
na także w wyniku transaminacji pirogronianu
produkowanego w reakcji glikolizy z glikogenu
mięśniowego i jest transportowana do wątroby,
gdzie po ponownej transaminacji powstaje z niej
znów pirogronian, który staje się substratem dla
glukoneogenezy. Jest to cykl glukozowo-alani-
nowy (p. ryc. 20-4), który jest pośrednim spo¬
sobem użycia glikogenu mięśni do utrzymania
stężenia glukozy we krwi w okresie głodzenia.
ATP niezbędny do wątrobowej syntezy glukozy
z pirogronianu pochodzi z reakcji utleniania kwa¬
sów tłuszczowych.
Glukoza jest również wytwarzana z glikogenu
wątroby w procesie glikogenolizy (rozdz. 19).
Stężenie glukozy we krwi reguluje
mechanizmy metaboliczne i hormonalne
Stałe stężenie glukozy we krwi jest jednym z naj¬
precyzyjniej regulowanych spośród wszystkich
mechanizmów homeostatycznych, przy czym
ważną rolę odgrywają zarówno wątroba, jak
212 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
KREW
i tkanki pozawątrobowe, a także wiele hormo¬
nów. Glukoza łatwo przenika przez błony komór¬
ki wątrobowej (za pośrednictwem transportera
GLUT 2), natomiast stosunkowo trudno prze¬
nika przez komórki tkanek pozawątrobowych
(z wyjątkiem komórek P wysepek trzustko¬
wych), a transportery glukozy w tych tkankach
są regulowane przez insulinę. W efekcie, pobie¬
ranie glukozy z krążącej krwi jest etapem ograni¬
czającym szybkość zużywania tego cukru przez
tkanki pozawątrobowe. Rolę różnych białek,
będących transporterami glukozy, znajdujących
się w błonach komórkowych, przedstawiono
w tab. 20-2.
Glukokinaza odgrywa ważna rolę
w regulowaniu stężenia glukozy
we krwi po posiłku
Wartość Km heksokinazy jest mała dla glukozy.
W wątrobie heksokinaza jest wy sycona substra-
tem i działa z jednakową szybkością w każdych
Tabela 20-2. Główne transportery glukozy
Umiejscowienie tkankowe
Funkcje
Transportery ułatwiające dwukierunkowe przenikanie
GLUT 1
Mózg, nerki, jelito grube, łożysko, erytrocyty
Pobieranie glukozy
GLUT 2
Wątroba, komórki p trzustki, jelito cienkie, nerki
Szybkie pobieranie i uwalnianie glukozy
GLUT 3
Mózg, nerki, łożysko
Pobieranie glukozy
GLUT 4
Mięsień sercowy i szkieletowy, tkanka tłuszczowa
Pobieranie glukozy stymulowane insuliną
GLUT 5
Jelito cienkie
Absorpcja glukozy
Transporter jednokierunkowy zależny od sodu
SGLT1
Jelito cienkie i nerki
Aktywne pobieranie glukozy wbrew gradientowi stężeń
20. GLUKONEOGENEZAI KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI 213
warunkach. Wartość Km glukokinazy dla glukozy
jest znacznie wyższa (mniejsze powinowactwo),
tak że jej aktywność zwiększa się ze wzrostem stę¬
żenia glukozy w żyle wrotnej (ryc. 20-5). Sprzyja
to pobieraniu dużych ilości glukozy do wątroby
po posiłku węglowodanowym. Glukokinaza nie
występuje w wątrobie przeżuwaczy, u których
niewiele glukozy wchodzi do krążenia wrotnego
z jelita.
Przy normalnym stężeniu glukozy we krwi krą¬
żenia dużego (4,5-5,5 mmol/L) wątroba jest produ¬
centem netto glukozy. Jeśli jednak stężenie gluko¬
zy we krwi wzrasta, wydzielanie jej ustaje, a nawet
glukoza zaczyna być pobierana przez wątrobę.
Insulina odgrywa główna rolę
w regulowaniu stężenia glukozy we krwi
Dodatkowym czynnikiem obok wpływu hiper-
glikemii na wzrost przenikania glukozy z krwi
do wątroby jest hormon insulina, która odgrywa
główną rolę w regulowaniu stężenia glukozy we
krwi. Insulina jest wytwarzana przez komórki p
wysepek Langerhansa trzustki w odpowiedzi na
hiperglikemię. Przez komórki p wysepek trzust¬
kowych glukoza łatwo przenika za pośrednictwem
transportera GLUT 2 i jest fosforylowana przy
udziale glukokinazy. Wzrost stężenia glukozy
we krwi zwiększa zatem jej przepływ przez gli¬
kolizę i cykl kwasu cytrynowego, co nasila wy¬
twarzanie ATP. Zwiększenie stężenia ATP blo¬
kuje wrażliwe na ATP kanały dla jonów potasu,
powodując depolaryzację błony komórkowej, co
z kolei powoduje zwiększenie napływu Ca2+ przez
wrażliwe na napięcie kanały dla jonów wapnio¬
wych, pobudzając egzocytozę insuliny. Stężenie
insuliny we krwi zmienia się więc równolegle ze
zmianami stężenia glukozy. Innymi substancja¬
mi powodującymi uwalnianie insuliny z trzustki
są: aminokwasy, wolne kwasy tłuszczowe, ciała
ketonowe, glukagon, sekretyna oraz leki będące
pochodnymi sulfonylomocznika - tolbutamid
i glyburid. Leki te są stosowane jako substancje
pobudzające wydzielanie insuliny w cukrzycy
typu 2 (non-insulin dependent diabetes mellitus,
ang. NIDDM); działają one przez hamowanie
wrażliwych na ATP kanałów K+. Adrenalina i no¬
radrenalina blokują uwalnianie insuliny. Insulina
zmniejsza stężenie glukozy we krwi, wzmagając
transport glukozy do tkanki tłuszczowej i mięśni
Ryc. 20-5. Zmiany aktywności enzymów fosforylujących glu¬
kozę, heksokinazy i glukokinazy, w zależności od zwiększają¬
cego się stężenia glukozy we krwi. Km heksokinazy dla glukozy
wynosi 0,05 mmol/L, a analogiczna wartość dla glukokinazy
-10 mmol/L.
za pośrednictwem transporterów (GLUT 4) prze¬
noszonych z wnętrza komórki do błony komórko¬
wej. Chociaż insulina nie wpływa bezpośrednio na
pobieranie glukozy do wątroby, to jednak wzma¬
ga ona długoterminowe pobieranie, działając na
enzymy kontrolujące glikolizę, glikogenogenezę
i glukoneogenezę (rozdz. 19 i tab. 20-1).
Glukagon przeciwdziała efektom insuliny
Glukagon jest hormonem wytwarzanym przez ko¬
mórki a wysepek Langerhansa trzustki. Jego wy¬
dzielanie jest pobudzane przez hipoglikemię. Sty¬
muluje on glikogenolizę w wątrobie, aktywując
fosforylazę. W odróżnieniu od adrenaliny, gluka¬
gon nie wywiera wpływu na fosforylazę mięśnio¬
wą. Glukagon wzmaga również glukoneogenezę
z aminokwasów i mleczanu. We wszystkich tych
procesach glukagon działa poprzez stymulację
powstawania cAMP (tab. 20-1). Zarówno wątro¬
bowa glikogenoliza, jak i glukoneogeneza mają
udział w hiperglikemizującym efekcie glukago-
nu, który jest przeciwny do efektów działania in¬
suliny. Większość endogennego glukagonu (oraz
insuliny) jest usuwana z krążenia przez wątrobę.
Inne hormony wpływające
na stężenie glukozy we krwi
Przedni płat przysadki wydziela hormony, któ¬
re zwiększają stężenie glukozy we krwi, a więc
214 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Tabela 20-3. Odpowiedzi tkanek na insulinę i glukagon
Wątroba
Tkanka tłuszczowa
Mięśnie
Wzmożone przez Insulinę
Synteza kwasów
ttuszczowych,
Synteza glikogenu,
Synteza biatka
Pobieranie glukozy,
Synteza kwasów
ttuszczowych
Pobieranie glukozy,
Synteza glikogenu,
Synteza biatka
Obniżone przez insulinę
Ketogeneza,
Glukoneogeneza
Lipoliza
Wzmożone przez glukagon
Glikogenoliza,
Glukoneogeneza,
Ketogeneza
Lipoliza
działają antagonistycznie w stosunku do insuliny.
Są to: hormon wzrostu, hormon kortykotropowy
(ACTH) i zapewne inne czynniki „diabetogenne”.
Wydzielanie hormonu wzrostu jest pobudzane
przez hipoglikemię. Hormon wzrostu zmniejsza
pobieranie glukozy przez niektóre tkanki, np.
mięśnie. Niektóre z tych działań mogą być po¬
średnie, wiadomo bowiem, że hormon wzrostu
mobilizuje z tkanki tłuszczowej wolne kwasy
tłuszczowe, które same zmniejszają zużycie glu¬
kozy. Glikokortykosteroidy (11-oksosteroidy) wy¬
dzielane przez korę nadnerczy są syntetyzowane
także w nieregulowany sposób w tkance tłuszczo¬
wej. Działają one na podwyższenie glukoneoge-
nezy w wyniku wzmożonego katabolizmu ami¬
nokwasów w wątrobie, spowodowanego indukcją
aminotransferaz (i innych enzymów, takich jak
dioksygenaza tryptofanu) oraz kluczowych enzy¬
mów glukoneogenezy. Ponadto glikokortykoste¬
roidy hamują zużywanie glukozy w tkankach po¬
za wątrobowych. We wszystkich tych działaniach
glikokortykosteroidy działają w sposób antagoni-
styczny do insuliny. Liczne cytokiny, wydzielane
przez makrofagi infiltrujące tkankę tłuszczową,
także działają antagonistycznie w stosunku do in¬
suliny. Łącznie z glikokortykosteroidami wydzie¬
lanymi przez tkankę tłuszczową są one odpowie¬
dzialne za oporność na insulinę, która występuje
powszechnie u ludzi otyłych.
Adrenalina (epinefryna) jest wydzielana przez
rdzeń nadnercza w wyniku działania bodźców
stresowych (strach, podniecenie, krwotok, nie¬
dotlenienie, hipoglikemia itp.) i wzmaga gliko-
genolizę w wątrobie i mięśniach, pobudzając fo-
sforylazę poprzez wytwarzanie cAMP. Efektem
glikogenolizy w mięśniu jest wzmożona glikoli¬
za, natomiast w wątrobie - uwalnianie glukozy do
krwiobiegu.
INNE ASPEKTY KLINICZNE
Glukozuria występuje wtedy, gdy zostaje
przekroczony próg nerkowy dla glukozy
Gdy stężenie glukozy we krwi wzrasta do sto¬
sunkowo wysokich poziomów, również nerka
wywiera regulujący wpływ na glikemię. Gluko¬
za jest nieustannie przesączana w kłębuszkach
nerkowych, ale zwykle powraca w całości do
krwi za pośrednictwem reabsorpcyjnego układu
kanalików nerkowych, dzięki aktywnemu trans¬
portowi. Wydolność układu kanalikowego dla
zwrotnego wchłaniania glukozy jest ograniczona
do około 350 mg/min, a przy hiperglikemii (jak
to się zdarza w słabo kontrolowanej cukrzycy),
filtrat kłębuszkowy może zawierać więcej gluko¬
zy, aniżeli jest możliwe do wchłonięcia w kanali¬
kach, i wówczas występuje glukozuria. Glukozu¬
ria występuje wówczas, gdy stężenie glukozy we
krwi żylnej przekracza 9,5-10,0 mmol/L; jest to
nazywane progiem nerkowym dla glukozy.
Hipoglikemia może występować u kobiet
w czasie ciąży i u noworodków
W czasie ciąży wzrasta spożycie glukozy przez
płód i istnieje ryzyko powstania hipoglikemii
u matki, a być może również u płodu, zwłaszcza
jeśli następują długie przerwy między posiłka¬
mi albo w nocy. Co więcej, wcześniaki i dzie-
20. GLUKONEOGENEZAI KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI 215
ci o małej masie urodzeniowej ciała są bardziej
wrażliwe na wystąpienie hipoglikemii, gdyż
mają mało tkanki tłuszczowej mogącej w okresie
przejściowym - od zależności płodowej do życia
w stanie niezależnym - dostarczyć alternatyw¬
nego paliwa energetycznego, takiego jak wolne
kwasy tłuszczowe lub ciała ketonowe. W tym
okresie enzymy glukoneogenezy mogą jeszcze
nie być dojrzałe w sensie funkcjonalnym, a pro¬
ces ten jest zależny od dostarczania energii przez
wolne kwasy tłuszczowe. Także glicerol, który
normalnie byłby uwalniany z tkanki tłuszczowej,
nie jest dostępny w wystarczającej ilości dla glu¬
koneogenezy.
Zdolność organizmu do zużywania
glukozy można określić, mierząc
tolerancję glukozy
Wskaźnikiem tolerancji glukozy jest przebieg
krzywej zmian stężenia glukozy we krwi w cza¬
sie po podaniu próbnej ilości glukozy (zwykle
1 g/kg masy ciała) (ryc. 20-6). Cukrzyca typu 1
(czyli cukrzyca insulinozależna; ang. insulin-de-
pendent diabetes mellitus, IDDM) charakteryzuje
się obniżoną tolerancją glukozy, spowodowaną
zmniejszonym wydzielaniem insuliny w wyniku
postępującego zniszczenia komórek P wysepek
trzustkowych. Tolerancja glukozy jest także upo¬
śledzona w typie 2 cukrzycy (ang. non insulin-
dependent diabetes mellitus, NIDDM) w wyniku
upośledzonej czułości tkanek na działanie insu¬
liny. Oporność na insulinę związana z otyłością
(a zwłaszcza z otyłością brzuszną) prowadzą¬
cą do rozwoju hiperlipidemii, następnie miaż¬
dżycy i choroby wieńcowej serca, jak również
ujawnionej cukrzycy, jest znana jako syndrom
metaboliczny. Nieprawidłowa tolerancja gluko¬
zy występuje także przy uszkodzeniu wątroby,
w niektórych infekcjach i w odpowiedzi na nie¬
które leki, a także w przypadku nadczynności
przysadki lub kory nadnerczy, ze względu na an¬
tagonizm hormonów wydzielanych przez te gru¬
czoły w stosunku do działania insuliny.
Podanie insuliny (podczas leczenia cukrzy¬
cy) obniża stężenie glukozy we krwi i powoduje
wzrost jej zużycia oraz wzrost magazynowania
w postaci glikogenu w wątrobie i mięśniach. Nad¬
miar insuliny może spowodować hipoglikemię,
w wyniku której mogą wystąpić drgawki, a nawet
śmierć, jeżeli nie zostanie szybko podana gluko¬
za. Podwyższoną tolerancję glukozy obserwuje
się w niedomodze przysadki lub kory nadnerczy,
co można przypisać mniej antagonistycznemu
w stosunku do insuliny działaniu hormonów nor¬
malnie wydzielanych przez te gruczoły.
Koszt energetyczny glukoneogenezy
wyjaśnia, dlaczego diety o bardzo małej
zawartości węglowodanów sprzyjają
ubytkowi wagi
Diety o bardzo małej zawartości węglowodanów,
dostarczające co najwyżej 20 g cukrów dziennie
(w porównaniu z zalecanym spożyciem 100-120 g
dziennie), natomiast dopuszczające nieograniczo¬
ną konsumpcję tłuszczu i białka, bywają polecane
jako skuteczne w obniżeniu masy ciała, chociaż
jest to sprzeczne z rozsądnymi dietami zdrowot¬
nymi. Ponieważ istnieje ciągłe zapotrzebowanie
na glukozę, dochodzi do znacznego wzmożenia
glukoneogenezy z aminokwasów, a związany
z tym duży koszt zużycia ATP musi być pokryty
przez utlenianie kwasów tłuszczowych.
Ryc. 20-6. Test tolerancji glukozy. Krzywe stężenia glukozy we
krwi osoby zdrowej i u chorego na cukrzycę po doustnym poda¬
niu 1 g glukozy/kg masy ciała. Należy zwrócić uwagę na począt¬
kowo duże zwiększenie stężenia glukozy u chorego na cukrzycę.
Kryterium normalności stanowi powrót stężenia glukozy do po¬
czątkowej wartości po 2 godzinach.
216 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
STRESZCZENIE
• Glukoneogeneza jest mechanizmem przetwa¬
rzania niewęglowodanowych związków w glu¬
kozę lub glikogen. Zaopatruje ona organizm
w glukozę, gdy węglowodany z diety nie są do¬
stępne. Ważnymi dla tego procesu substratami
są: aminokwasy, mleczan, glicerol i propionian.
• Szlak glukoneogenezy, zachodzący w wątrobie
i nerkach, obejmuje te reakcje glikolizy, które
są odwracalne, oraz cztery dodatkowe reakcje,
które stanowią obejście nieodwracalnych reak¬
cji glikolizy niebędących w stanie równowagi.
• Ponieważ glikoliza i glukoneogeneza przebie¬
gają tym samym szlakiem, lecz w przeciwnych
kierunkach, także ich aktywności muszą być re¬
gulowane przeciwbieżnie.
• Wątroba reguluje stężenie glukozy we krwi po
posiłku, ponieważ zawiera enzym glukokinazę
o dużej wartości Km, która ułatwia zwiększone
zużycie glukozy przez wątrobę.
• Wydzielanie insuliny następuje jako bezpo¬
średnia odpowiedź na hiperglikemię. Insulina
pobudza wątrobę do magazynowania glukozy
w formie glikogenu i ułatwia pobieranie gluko¬
zy przez tkanki pozawątrobowe.
• Glukagon jest wydzielany w odpowiedzi na hi-
poglikemię i stymuluje zarówno glikogenolizę,
jak i glukoneogenezę w wątrobie, powodując
uwalnianie glukozy do krwi.
PIŚMIENNICTWO
Brosnan JT: Comments on metabolic needs for glucose
and the role of gluconeogenesis. European Journal
ofClinical Nutrition 1999;53 Suppl 1:S107.
Klover PJ, Mooney RA: Hepatocytes: Critical for glu¬
cose homeostasis. International Journal of Bio-
chemistry and Celi Biology 2004;36:753.
Nordlie RC, Foster JD, Lange AJ: Regulation of glucose
production by the liver. Annual Review of Nutrition
1999; 19:379.
Pilkis SJ, Claus TH: Hepatic gluconeogenesis/glycoly-
sis: Regulation and structure/function relationships
of substrate cycle enzymes. Annual Review of Nu¬
trition. 1991 ;11:465.
Pilkis SJ, Granner DK: Molecular physiology of the reg¬
ulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis.
Annual Review of Physiology. 1991 ;54:885.
Postic C, Shiota M, Magnuson MA: Cell-specific roles
of glucokinase in glucose homeostasis. Recent
Progress in Hormone Research 2001;56:195.
Schuit FC, Huypens P, Heimberg H, Pipeleers DG: Glu¬
cose sensing in pancreatic beta-cells: A model for
the study of other glucose-regulated cells in gut,
pancreas, and hypothalamus. Diabetes 2001 ;50:1.
f Szlak pentozofosforanowy
> oraz inne szlaki przemiany heksoz
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Szlak pentozofosforanowy stanowi alternatyw¬
ną drogę dla metabolizmu glukozy. Nie powstaje
w nim ATP, lecz w jego wyniku: 1) jest wytwa¬
rzany NADPH niezbędny do redukcyjnej syntezy
kwasów tłuszczowych i steroidów oraz 2) są do¬
starczane reszty rybozy do biosyntezy nukleoty-
dów i kwasów nukleinowych. Glukoza, fruktoza
i galaktoza są ilościowo najważniejszymi hekso-
zami wchłanianymi z przewodu pokarmowego.
Pochodzą one, odpowiednio, ze skrobi, sacharozy
i laktozy zawartych w pokarmie. Fruktoza i ga¬
laktoza mogą być zamienione w glukozę głównie
w wątrobie.
Genetycznie uwarunkowany niedobór dehy¬
drogenazy glukozo-6-fosforanowej, pierwszego
enzymu szlaku pentozofosforanowego, jest główną
przyczyną hemolizy czerwonych krwinek wystę¬
pującej w anemii hemolitycznej, dotykającej ok.
100 milionów osób na świecie. Kwas glukurono-
wy jest syntetyzowany z glukozy w szlaku kwasu
uronowego, o ilościowo mniejszym znaczeniu,
ale o bardzo dużym znaczeniu w procesie wydala¬
nia metabolitów i obcych organizmowi związków
chemicznych (ksenobiotyków) w postaci gluku-
ronidów. Zaburzenie funkcjonowania tego szlaku
prowadzi do samoistnej pentozurii. Całkowity
brak jednego szczególnego enzymu tego szlaku
(oksydazy L-gulonolaktonowej) u naczelnych i nie¬
których innych zwierząt wyjaśnia, dlaczego kwas
askorbinowy (witamina C) jest niezbędnym skład¬
nikiem diety dla człowieka, ale nie dla większości
innych ssaków. Niedobory enzymów uczestniczą¬
cych w metabolizmie fruktozy i galaktozy prowa¬
dzą do takich chorób metabolicznych, jak samoist¬
na fruktozuria i galaktozemie.
W SZLAKU PENT0Z0F0SF0RAN0WYM
JEST WYTWARZANY NADPH
I RYB0Z0F0SF0RAN
Szlak pentozofosforanowy (spięcie heksozo-
monofosforanowe, ang. hexose monophosphate
shunt) jest bardziej złożonym szlakiem niż gli¬
koliza (ryc. 21-1). Z trzech cząsteczek glukozo-
-6-fosforanu wytwarzają się w jego wyniku trzy
cząsteczki C02 i trzy reszty pięciowęglowego cu¬
kru. Te ostatnie zostają tak przetworzone, że re¬
generują się z nich dwie cząsteczki glukozo-6-fo-
sforanu i powstaje jedna cząsteczka pośredniego
metabolitu glikolizy - gliceraldehydo-3-fosfora-
nu. Ponieważ z dwóch cząsteczek gliceraldehy-
do-3-fosforanu może się zregenerować glukozo-
-6-fosforan, szlak pentozofosforanowy może być
drogą kompletnego utlenienia glukozy.
REAKCJE SZLAKU
PENTOZOFOSFORANOWEGO
ZACHODZĄ W CYTOZOLU
Enzymy szlaku pentozofosforanowego, podobnie
jak i glikolizy, znajdują się w cytozolu. Utlenia¬
nie, podobnie jak w glikolizie, zachodzi przez od-
wodorowanie, z tym że odmiennie aniżeli w gli¬
kolizie akceptorem wodorów jest NADP+, a nie
NAD+. Sekwencję reakcji szlaku można podzielić
na dwie fazy: nieodwracalną fazę oksydacyjną
i odwracalną fazę nieoksydacyjną. W pierwszej
fazie glukozo-6-fosforan ulega odwodorowaniu
i dekarboksylacji, przechodząc w pentozę, rybu-
lozo-5-fosforan. W drugiej fazie rybulozo-5-fo-
sforan jest przekształcany z powrotem do gluko-
zo-6-fosforanu w wyniku ciągu reakcji, w których
218 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Glukozo-6-fosforan
Glukozo-6-fosforan
Glukozo-6-fosforan
C6
DEHYDROGENAZA
GLUKOZO-6-FOSFORANOWA
r
NADP+ + H20
NADPH + H+
C£
r
NADP+ + H20
NADPH + H+
^6
r
NADP+ + H20
NADPH + H+
6-Fosfoglukonian
^6
DEHYDROGENAZA
6-FOSFO-
GLUKONIANOWA
r
NADP+
NADPH + H'
C02
6-Fosfoglukonian
Ce
r
NADP+
NADPH + H'
C02
6-Fosfoglukonian
^6
r
NADP+
NADPH + H+
C02
Rybulozo-5-fosforan
C5 /K
Rybulozo-5-fosforan
C5 Ą\
Rybulozo-5-fosforan
C5 /T\
3-EPIMERAZA |
| KETOIZOMERAZA [
| 3-EPIMERAZA~|
Ksylulozo-5-fosforan
C5 /K
Gliceraldehydo-3-fosforan
C.
IZOMERAZA
FOSFOHEKSOZOWA
Fruktozo-6-fosforan
Cfi
Gliceraldehydo-3-fosforan
IZOMERAZA
FOSFOHEKSOZOWA
IZOMERAZA
FOSFOTRIOZOWA
1/2 Fruktozo-1,6-bisfosforanu
Cr
FRUKTOZO-1,6-
-BISFOSFATAZA
1/2 Fruktozo-6-fosforanu
Cfi
IZOMERAZA
FOSFOHEKSOZOWA
Glukozo-6-fosforan
Cr
Glukozo-6-fosforan
Cg
1/2 Glukozo-6-fosforanu
Cr
Ryc. 21-1. Schemat szlaku pentozofosforanowego i jego połączeń ze szlakiem glikolizy. Pełen szlak, jak to pokazano, składa się z trzech
wzajemnie połączonych cykli, w których glukozo-6-fosforan jest zarówno substratem, jak i produktem końcowym. Reakcje powyżej
przerywanej linii są nieodwracalne, poniżej tej linii są samorzutnie odwracalne, z wyjątkiem reakcji katalizowanej przez fruktozo-1,6-
-bisfosfatazę.
21. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ 219
głównymi enzymami są transketolaza i transal-
dolaza (p. ryc. 21-1).
Włazie oksydacyjnej powstaje NADPH
Odwodorowanie glukozo-6-fosforanu do 6-fo-
sfoglukonianu zachodzi w reakcji utworzenia
6-fosfoglukonolaktonu, katalizowanej przez de¬
hydrogenazę glukozo-6-fosforanową - enzym
zależny od NADP+ (ryc. 21-1 i 21-2). Hydrolizę
powstałego 6-fosfoglukonolaktonu katalizuje
hydrolaza glukonolaktonowa. Drugi etap oksy¬
dacyjny jest katalizowany przez dehydrogenazę
6-fosfoglukonianową, która także potrzebuje
NADP+jako akceptora wodorów. Dalej następu¬
je dekarboksylacja z wytworzeniem ketopentozy
- rybulozo-5-fosforanu.
W nieoksydacyjnej fazie tworzą się
prekursory rybozy
Rybulozo-5-fosforan jest substratem dla dwóch
różnych enzymów. 3-Epimeraza rybulozo-5-fo-
sforanowa zmienia konfigurację wokół C3, two¬
rząc epimer - ksylulozo-5-fosforan, będący także
ketopentozą. Ketoizomeraza rybozo-5-fosfora-
nowa zamienia rybulozo-5-fosforan w odpowied¬
nią aldozę - rybozo-5-fosforan, który jest źród¬
łem rybozy potrzebnej w syntezie nukleotydów
i kwasów nukleinowych. Transketolaza przenosi
dwuwęglową jednostkę, zawierającą atomy wę¬
gla 1 i 2 ketozy, na atom węgla grupy aldehydo¬
wej aldozy. Powoduje ona zatem zamianę ketozy
w aldozę, uboższą o dwa atomy węgla, i równo¬
cześnie zamienia aldozę w ketozę, bogatszą o dwa
atomy węgla. Reakcja ta wymaga obecności Mg2+
i difosforanu darniny (witaminy B,) jako koen¬
zymu. Przenoszona jednostka dwuwęglową jest
prawdopodobnie glikoloaldehydem związanym
z difosforanem tiaminy. Tak więc transketolaza
katalizuje przeniesienie jednostki dwu węglowej
z ksylulozo-5-fosforanu na rybozo-5-fosforan,
tworząc siedmiowęglową ketozę (sedoheptulozo-
-7-fosforan) oraz aldozę (gliceraldehydo-3-fosfo-
ran). Te dwa produkty wchodzą następnie w inną
reakcję, znaną jako transaldolacja. Transaldo-
laza katalizuje przeniesienie trój węglowej jed¬
nostki dihydroksyacetonu (atomów węgla 1-3)
z ketozy - sedoheptulozo-7-fosforanu na aldozę
-gliceraldehydo-3-fosforan, aby utworzyć ketozę
- fruktozo-6-fosforan oraz czterowęglową aldo¬
zę - erytrozo-4-fosforan. Następnie zachodzi
dalsza reakcja, znów z udziałem transketolazy,
w której ksylulozo-5-fosforan służy jako dawca
glikoloaldehydu. W tym przypadku utworzony
uprzednio erytrozo-4-fosforan jest akceptorem,
a produktami są fruktozo-6-fosforan i gliceralde¬
hydo-3-fosforan.
Aby glukoza uległa całkowitemu utlenieniu do
C02 w szlaku pentozofosforanowym, niezbędna
jest obecność w tkance enzymów przekształcają¬
cych gliceraldehydo-3-fosforan w glukozo-6-fo-
sforan. Są to enzymy szlaku glikolizy, działające
w odwrotnym kierunku, i dodatkowo enzym glu-
koneogenezy - fruktozo-l,6-bisfosfataza. Jeżeli
tego enzymu nie ma w tkance, gliceraldehydo-3-
-fosforan podąża normalnym szlakiem glikolizy
do pirogronianu.
Dwa główne szlaki katabolizmu glukozy
mają ze sobą niewiele wspólnego
Chociaż glukozo-6-fosforan jest wspólnym me¬
tabolitem dla obydwóch szlaków, to jednak szlak
pentozofosforanowy jest znacząco odmienny od
glikolizy. Utlenienie w szlaku pentozofosfora¬
nowym następuje z użyciem raczej NADP+ niż
NAD+, a C02, który w ogóle nie jest produktem
glikolizy, jest charakterystycznym produktem
szlaku pentozofosforanowego. ATP nie powstaje
w szlaku pentozofosforanowym, natomiast jego
generacja jest zasadniczą funkcją glikolizy.
Równoważniki redukcyjne powstają
w tych tkankach, które sa
wyspecjalizowane w syntezach
redukujących
Szlak pentozofosforanowy jest aktywny w wątro¬
bie, tkance tłuszczowej, korze nadnerczy, tarczycy,
erytrocytach, jądrach i gruczole sutkowym w okre¬
sie laktacji. Jego aktywność jest mała w gruczole
sutkowym oprócz okresu laktacji i w mięśniach
szkieletowych. Te tkanki, w których ten szlak jest
aktywny, zużywają NADPH w syntezach redu¬
kujących, np. do syntezy kwasów tłuszczowych,
steroidów, aminokwasów szlakiem dehydrogena¬
zy glutaminianowej i zredukowanego glutationu.
Synteza dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej
i dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej może być
220 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
HO-C-H
H
C-OH
I
HO-C-H
I
H-C-OH
I
H-C
NADP+ NADPH + H+
v m92+ a
\lub Ca^/
0
II
C
1
H-C-OH
I
HO-C-H
CH2-0—®
0-D-Glukozo-6-fosforan
CHOH
II
C-OH
I
H-C-OH
I
H-C-OH
CH2-0-®_
Forma endiolowa
H20
. Mg2+, Mn2'
lub Ca2'*'
COO~
I
H-C-OH
DEHYDROGENAZA
I 0
H-C-OH I
HYDROLAZA
GLUK0Z0-6-F0SF0RAN0WA
H-C 1
GLUKONOLAKTONOWA
HO
H-C
CH2 - O -®
6-Fosfoglukonolakton
C-H
OH
H-C-OH
ch2 — o —®
6-Fosfoglukonian
NADP+
DEHYDROGENAZA
6-F0SF0GLUK0NIAN0WA
^Mg2+, Mn**,
l lub Ca2+
NADP+ + H+
IZOMERAZA RYBOZO-
-5-FOSFORANOWA
6CH?OH
°C = 0
\
HO-C-H
I
H-C-OH
I ^
ch2 — o —®
Ksylulozo-5-fosforan
H-C
CH2OH
C = O
-OH
H-C-OH
I
CH2 - O -
Rybul
■©
COO"
I
H-C-OH
I
C = 0
I
H-C-OH
I
H-C-OH
ch2 — o — ®_
3-Keto-6-fosfoglukonian
Erytrozo-4-fosforan
V
Tiamino-®2
Mg2+
H — C =0
I
H-C-OH
I ^
ch2 — o —®
Gliceraldehydo-3-fosforan
°C =0
I
HO-C-H
H-C-OH
I
H-C-OH
I _
ch2 — o—®
Fruktozo-6-fosforan
Ryc. 21-2. Szlak pentozofosforanowy (P —P02~; PRPP - 5-fosforybozylo-1 -pirofosforan).
21. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ 221
indukowana przez insulinę w stanie sytości, gdy
wzrasta lipogeneza.
Ryboza może być syntetyzowana
właściwie we wszystkich tkankach
Tylko niewielkie ilości rybozy występują
w krwiobiegu, wobec tego tkanki muszą wytwa¬
rzać rybozę potrzebną do syntetyzowania nukleo-
tydów i kwasów nukleinowych w szlaku pentozo-
fosforanowym (p. ryc. 21-2). Do syntetyzowania
rybozo-5-fosforanu nie jest potrzebny pełny szlak
pentozofosforanowy. W tkance mięśniowej ak¬
tywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej
i dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej są nie¬
wielkie, jednak mięśnie - jak większość innych
tkanek - są zdolne do syntetyzowania rybozo-5 -
-fosforanu przez odwrócenie nieoksydacyjnej
fazy szlaku pentozofosforanowego, wykorzystu¬
jąc fruktozo-6-fosforan.
SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY
IPEROKSYDAZA GLUTATIONOWA
CHRONIĄ ERYTROCYTY PRZED HEMOLIZA
Szlak pentozofosforanowy w erytrocytach do¬
starcza NADPH do reakcji redukcji utlenionego
glutationu, katalizowanej przez reduktazę glu¬
tationową - enzym będący flawoproteiną zawie¬
rającą FAD. Z kolei zredukowany glutation usu¬
wa z erytrocytów H202 w reakcji katalizowanej
przez peroksydazę glutationową - enzym za¬
wierający w centrum aktywnym selenowy ana¬
log cysteiny (selenocysteinę) (ryc. 21-3). Reak¬
cja ta jest ważna, ponieważ nagromadzenie H202
może skrócić czas życia erytrocytu, powodując
uszkodzenie błony komórkowej prowadzące do
hemolizy.
GLUKURONIAN, PREKURSOR
PROTEOGLIKANÓWI SPRZĘGNIĘTYCH
GLUKURONIDÓW, JEST PRODUKTEM
SZLAKU KWASU UR0N0WEG0
W wątrobie szlak kwasu uronowego katalizuje
przekształcenie glukozy w kwas glukuronowy,
kwas askorbinowy (z wyjątkiem organizmu czło¬
wieka i innych gatunków, dla których askorbinian
jest witaminą) oraz w pentozy (ryc. 21-4). Jest
on także alternatywną drogą utleniania glukozy,
ale nie prowadzi do wytwarzania ATR W szlaku
kwasu uronowego glukozo-6-fosforan jest prze¬
kształcany w glukozo-1-fosforan, który następnie
reaguje z urydynotrifosforanem (UTP), tworząc
urydynodifosfoglukozę (UDPGlc) w reakcji ka¬
talizowanej przez pirofosforylazę UDPGlc, tak
jak to się dzieje w syntezie glikogenu (rozdz. 19).
UDPGlc zostaje utleniona przy atomie węgla 6
pod wpływem zależnej od NAD+ dehydrogenazy
UDPGlc w dwuetapowej reakcji, w wyniku czego
powstaje UDP-glukuronian.
UDP-glukuronian jest „aktywną” formą gluku-
ronianu, która może być wbudowywana do pro-
teoglikanów lub która może wchodzić w reakcje
z hormonami steroidowymi, bilirubiną i wielo¬
ma lekami, wydalanymi z żółcią lub moczem
w stanie sprzężonym z kwasem glukuronowym
(p. ryc. 31-13).
W zależnej od NADPH reakcji glukuronian jest
redukowany do L-gulonianu - bezpośredniego
prekursora askorbinian u u tych zwierząt, któ¬
re mają zdolność syntetyzowania tej witaminy.
Ryc. 21-3. Rola szlaku pentozofosforanowego w reakcji katalizowanej przez peroksydazę glutationową erytrocytów
(G-S-S-G - glutation utleniony; G-SH - glutation zredukowany; Se - enzym zawierający selen).
7^
222 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
OH
H-C
I '
H-C-OH
I
HO-C-H
I
H-C-OH
I
a-D-Glukozo-
-6-fosforan
CHoOH
I
C = O
I
H-C-OH
I
HO-C-H
I
*CH2OH
L-Ksyluloza
BLOK
W PENTOZURII
*CH2OH
I
H-C-OH
I
HO-C-H
I
H-C-OH
I
ch2oh
Ksylitol
H-C-O—©
H-C-OH I
I
HO-C-H I
I O
H-C-OH I
I
H-C 1
I
ch2oh
Glukozo-1-fosforan
HO-C-H
I
C = O
I
H-C-OH
I
HO-C-H
I
*ch2oh
3-Keło-L-gulonian
Aldehyd glikolowy
l
D-Ksylulozo-1 -fosforan
BLOK U NACZELNYCH
I ŚWINKI MORSKIEJ
JIUMUldMU
f
2-Keto-i-gulonolakton
*ch2oh
c = o
I
HO — C — H D-Ksyluloza
I
H-C-OH
I
CH?OH
Mg'
ADP
D-Ksylulozo-5-fosforan
H-C-
HO-
*CH2OH
L-Askorbinian
BLOK U CZŁOWIEKA
[2H]
J
HO-C-H
I
*ch2oh
L-Dehydroaskorbinian
Szlak pentozofosforanowy
Ryc. 21-4. Szlak kwasu uronowego (* pokazuje losy atomu węgla 1 glukozy; P —PO^-).
21. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ 223
U człowieka i innych naczelnych, jak również
u świnek morskich, nietoperzy oraz niektórych
ptaków i ryb, kwas askorbinowy nie może być
syntetyzowany ze względu na brak enzymu - ok¬
sydazy L-gulonolaktonowej. L-Gulonian jest utle¬
niany do 3-keto-L-gulonianu, który jest następnie
dekarboksylowany do L-ksylulozy. L-Ksyluloza
zostaje zamieniona w jej izomer d w reakcji re¬
dukcji zależnej od NADPH i dalej do ksylitolu,
a następnie utleniona do D-ksylulozy w reakcji za¬
leżnej od NAD\ Po przekształceniu w D-ksylulo-
zo-5-fosforan jest ona metabolizowana w szlaku
pentozofosforanowym.
SPOŻYCIE DUŻYCH ILOŚCI FRUKTOZY
MA GŁĘBOKIE KONSEKWENCJE
METABOLICZNE
Spożywanie żywności o dużej zawartości sacha¬
rozy albo picie soków z dużą zawartością fruktozy
(HFS) - cukrów używanych w produkcji wysoko
przetworzonych pokarmów i napojów - prowadzi
do dużego napływu fruktozy (i glukozy) do żyły
wrotnej wątroby.
Fruktoza ulega glikolizie w wątrobie znacznie
szybciej aniżeli glukoza. Jest to spowodowane
tym, że omija ona etap w metabolizmie gluko¬
zy katalizowany przez fosfofruktokinazę (ryc.
21-5), który jest etapem regulacyjnym. To po¬
zwala na „zalanie” przez fruktozę szlaków me¬
tabolicznych w wątrobie i taką ich stymulację,
że następuje wzmożona synteza kwasów tłusz¬
czowych, estryfikacja kwasów tłuszczowych
i wzmożone wydzielanie VLDL. To z kolei może
zwiększać stężenie triacylogliceroli w surowicy
krwi i zwiększać stężenie cholesterolu LDL.
W wątrobie, nerkach i jelicie występuje swoista
kinaza - fruktokinaza, która katalizuje fosfory-
lację fruktozy do fruktozo-1-fosforanu. Enzym
ten nie działa na glukozę i - w odróżnieniu od
glukokinazy - jego aktywność nie ulega zmianie
pod wpływem głodzenia albo insuliny; to wy¬
jaśnia, dlaczego fruktoza znika z krwi chorych
na cukrzycę z normalną szybkością. Fruktozo-
-1-fosforan jest rozkładany do D-gliceraldehydu
i dihydroksyacetonofosforanu przez aldolazę B
- enzym znajdujący się w wątrobie; enzym ten
uczestniczy również w glikolizie wątrobowej,
rozkładając fruktozo-1,6-bisfosforan. D-Glicer-
aldehyd wchodzi w ciąg reakcji glikolizy drogą
fosforylacji do gliceraldehydo-3-fosforanu, ka¬
talizowaną przez triozokinazę. Te dwa triozofo-
sforany, dihydroksyacetonofosforan i gliceralde-
hydo-3-fosforan, mogą być rozłożone w wyniku
glikolizy albo mogą się stać substratami dla al-
dolazy i wziąć udział w glukoneogenezie, co jest
losem większej części fruktozy metabolizowanej
w wątrobie.
W pozawątrobowych tkankach heksokinaza ka¬
talizuje fosforylację większości heksoz, łącznie
z fruktozą, ale glukoza hamuje fosforylację fruk¬
tozy, ponieważ glukoza jest lepszym substratem
dla heksokinazy aniżeli fruktoza. Tym niemniej,
pewna ilość fruktozy może być metabolizowana
w tkance tłuszczowej i mięśniach. Wolna fruk¬
toza znajduje się w płynie nasiennym, a także
w krążeniu płodowym u kopytnych i u wielory¬
bów. Reduktaza aldozowa występuje w łożysku
owcy i jest odpowiedzialna za wydzielanie sorbi-
tolu do krwi płodowej. Dehydrogenaza sorbitolo-
wa znajdująca się w wątrobie, także w wątrobie
płodowej, jest odpowiedzialna za przekształcenie
sorbitolu we fruktozę. Ten szlak metaboliczny jest
również odpowiedzialny za obecność fruktozy
w płynie nasiennym.
GALAKTOZA JEST POTRZEBNA
DO SYNTEZY LAKTOZY, GLIKOLIPIDÓW,
PROTEOGLIKANÓWI GLIKOPROTEIN
Galaktoza powstaje w następstwie jelitowej hy¬
drolizy disacharydu laktozy - cukru występują¬
cego w mleku. W wątrobie galaktoza jest łatwo
przemieniana w glukozę. Galaktokinaza katali¬
zuje fosforylację galaktozy z użyciem ATP jako
dawcy fosforanu (ryc. 21-6). Produkt tej reakcji,
galaktozo-1-fosforan, reaguje z urydynodifosfo-
glukozą (UDPGlc), wytwarzając urydynodifosfo-
galaktozę (UDPGal) i glukozo-1-fosforan w re¬
akcji katalizowanej przez urydylilotransferazę
1-fosfogalaktozową. Następnie zamiana UDPGal
w UDPGlc jest katalizowana przez 4-epimerazę
UDPGal. Reakcja ta przebiega poprzez utlenie¬
nie, a następnie redukcję przy atomie węgla 4,
z udziałem NAD+ jako koenzymu. Powstała
UDPGlc jest następnie wbudowywana do gliko-
genu (rozdz. 19).
Ponieważ reakcja epimerazy jest swobodnie
odwracalna, a glukoza może być przemieniana
w galaktozę, zatem galaktoza nie jest niezbęd-
224 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Glikogen
Glukozo-6-fosforan
IZOMERAZA
FOSFOHEKSOZOWA
REDUKTAZA
ALDOZOWA
GLUKOZO-6-FOSFATAZA
NADPH
+ H+
NADP+
DEHYDROGENAZA
SORBITOLOWA
Fruktozo-6-fosforan
FRUKTOZO-1,6-
-BISFOSFATAZA
| HEKSOKINAZA~|
ATP
NAD+
r
NADH
+ H+
- Pokarmy
FOSFOFRUKTOKINAZA |
BLOK PRZY SAMOISTNEJ
FRUKTOZURII
Fruktozo-1,6-bisfosforan
Fruktozo-1 -fosforan
t
Pirogronian
Synteza kwasów tłuszczowych
Ryc. 21-5. Metabolizm fruktozy. Aldolaza A znajduje się we wszystkich tkankach, natomiast aldolaza B jest formą tego enzymu
dominującą w wątrobie (* nie znaleziono w wątrobie).
nym składnikiem pokarmów. Galaktoza jest po¬
trzebna w organizmach nie tylko do tworzenia
laktozy, lecz także jako składnik glikolipidów
(cerebrozydów), proteoglikanów i glikoprotein.
Podczas syntezy laktozy w gruczole sutkowym
UDPGal łączy się z glukozą, tworząc laktozę
w reakcji katalizowanej przez syntazę laktozo¬
wą (p. ryc. 21-6).
Glukoza jest prekursorem wszystkich
aminocukrów (heksozoamin)
Aminocukry są ważnymi składnikami gliko¬
protein (rozdz. 46), niektórych glikosfingoli-
pidów (np. gangliozydów; rozdz. 15) oraz gliko-
zoaminoglikanów (rozdz. 47). Głównymi ami-
nocukrami są glukozoamina, galaktozoamina
21. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWYORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ 225
I
J
BLOK
Galaktozo- W GALAKTOZEMII
-1-fosforan
SYNTAZA GLIKOGENOWA
Glikogen
Glukozo-1 -fosforan
URYDYLILOTRANSFERAZA
V \
4-EPIMERAZA
1-F0SF0-
WM NAD+
URYDYNODIFOSFO-
GALAKTOZOWA
T 7
GALAKTOZOWA
FOSFOGLUKOMUTAZA
GLUKOZO-
-6-FOSFATAZA
Glukozo-6-fosforan
NAD+
Mg!+ I
J
PIROFOSFORYLAZA
UDPGIc
FOSFOGLUKOMUTAZA
r
Glukozo-1-fosforan
Ryc. 21-6. Szlaki przemiany: (A) galaktozy do glukozy w wątrobie oraz (B) glukozy do laktozy w gruczole sutkowym w okresie
laktacji.
i mannozoamina (wszystkie sąheksozoaminami)
oraz związek dziewięciowęglowy - kwas sialo-
wy. Kwasem siałowym występującym głównie
w tkankach człowieka jest kwas A-acetyloneura-
minowy (NeuAc). Zależności metaboliczne mię¬
dzy aminocukrami przedstawiono na ryc. 21-7.
ASPEKTY KLINICZNE
Zaburzenie szlaku pentozofosforanowego
prowadzi do hemolizy erytrocytów
Defekty genetyczne dehydrogenazy glukozo-
-6-fosforanowej, których konsekwencją jest za¬
burzenie wytwarzania NADPH, są powszechne
wśród mieszkańców krajów śródziemnomorskich
i Karaibów. Defekt objawia się jako hemoliza
krwinek czerwonych (anemia hemolityczna),
gdy wrażliwy osobnik zostanie poddany działa¬
niu utleniaczy, takich jak przeciwmalaryczny lek
primachina, kwas acetylosalicylowy, albo gdy
spożyje ziarna bobu (Vicia faba lub fava - stąd
nazwa choroby fawizm). Peroksydaza glutatio-
nowa jest naturalnym przeciwutleniaczem wy¬
stępującym w wielu tkankach, zależnym od do¬
starczania NADPH, który w erytrocytach może
być wytwarzany jedynie w szlaku pentozofosfo-
ranowym. Enzym ten katalizuje redukcję orga¬
nicznych nadtlenków i H202, co stanowi część
ochrony lipidów organizmu przed peroksydacją
(p. ryc. 15-21). Pomiar aktywności transketo-
lazy wewnątrz erytrocytów i jej aktywacji przez
difosforan tiaminy jest stosowany w celu okre¬
ślenia stopnia niedoboru tiaminy (rozdz. 44).
226 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
ATP ADP
V }
Glukoza ^ ► Glukozo-6-fosforan
likogen
i-1-fosforan
I
Glikogen
Glukozo
Fruktozo-6-fosforan
Glukozoamino-
-1-fosforan
~ UDP-
-Glukozoamina*
Glikozoaminoglikany
(np. heparyna)
| EPIMERAZA |
A/-Acetylo-
mannozoamino-
-6-fosforan
UTP
PPj
UDP-
-/V-acetyloglukozoamina*
Fosfoenolopirogronian
NAD'
| EPIMERAZA l
Glikozoaminoglikany
(kwas hialuronowy,
glikoproteiny)
9-Fosforan kwasu
A/-acetylo-
neuraminowego
Kwas sialowy,
gangliozydy,
glikoproteiny
UDP-
-/V-acetylogalaktozoamina*
Glikozoaminoglikany
(chondroityny),
glikoproteiny
/wwwww^>- Ujemny
Q (inhibujący)
efekt allosteryczny
Ryc. 21-7. Zestawienie wzajemnych powiązań w metabolizmie aminocukrów (* analogiczna do UDPGIc). Inne nukleotydy purynowe
i pirymidynowe mogą być podobnie związane z cukrami lub aminocukrami. Przykładami są tymidynodifosfo(TDP)-glukozoamina oraz
TDP-N-acetyloglukozoamina.
Przyczyną przerwania szlaku kwasu
uronowego bywają defekty
enzymatyczne i niektóre leki
W rzadkiej chorobie dziedzicznej, samoistnej
pentozurii, w moczu pojawiają się znaczne ilości
L-ksylulozy, ponieważ u tych chorych nie wystę¬
puje enzym niezbędny do redukcji L-ksylulozy
do ksylitolu. Szybkość, z jaką glukoza wchodzi
w szlak kwasu uronowego, mogą zwiększać róż¬
ne leki. Na przykład barbital lub chlorobutanol
podany szczurom powoduje znaczny wzrost
przekształcania glukozy w glukuronian, L-gu-
lonian i askorbinian. Aminopiryna i antypiryna
wzmagają wydalanie L-ksylulozy u osób z pen-
tozurią.
21. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ 227
Przeładowanie wątroby fruktoza
może wzmagać hipertriacylo-
glicerolemię, hipercholesterolemię
i hiperurykemie
W wątrobie fruktoza wzmaga syntezę triacylogli-
ceroli i wydzielanie VLDL, prowadząc do hiper-
triacyloglicerolemii i wzrostu cholesterolu LDL,
które można uważać za czynniki miażdżycotwór-
cze (aterogenne) (rozdz. 26). Ponadto nagłe ob¬
ładowanie wątroby fruktozą, które może nastąpić
przy wlewach dożylnych lub przy bardzo dużym
spożyciu fruktozy, powoduje związanie nieorga¬
nicznego fosforanu w postaci fruktozo-1-fosfo¬
ranu i zmniejszenie syntezy ATP. W wyniku tego
następuje mniejsze hamowanie syntezy puryn de
novo przez ATP, a wzrasta tworzenie kwasu mo¬
czowego, powodując hiperurykemię, która jest
przyczyną dny moczanowej (rozdz. 33).
Zaburzenia metabolizmu fruktozy
są przyczyna chorób
Brak fruktokinazy w wątrobie powoduje samo¬
istną fruktozurię, a brak wątrobowej aldolazy B,
której substratem jest fruktozo-1-fosforan, prowa¬
dzi do dziedzicznej nietolerancji fruktozy (ryc.
21-5). Diety ubogie we fruktozę, sorbitol i sacha¬
rozę są zbawienne w obydwu tych stanach. Jedną
z konsekwencji wrodzonej nietolerancji fruktozy,
a także innego stanu wynikającego z niedobo¬
ru fruktozo-l,6-bisfosfatazy, jest prowokowana
przez fruktozę hipoglikemia, powstająca mimo
dużych rezerw glikogenu. Dzieje się tak, gdyż
nagromadzenie fruktozo-1-fosforanu i fruktozo-
-1,6-bisfosforanu hamuje aktywność wątrobowej
fosforylazy za pośrednictwem mechanizmów al-
losterycznych. Związanie nieorganicznego fosfo¬
ranu prowadzi również do ubytku ATP i hiperu-
rykemii.
Fruktoza i sorbitol w soczewce oka
Si) związane z występowaniem
zaćmy cukrzycowej
Zarówno fruktoza, jak i sorbitol znajdują się w so¬
czewce oka ludzkiego; ich stężenie w przypad¬
ku cukrzycy wzrasta, zatem mogą one uczestni¬
czyć w patogenezie zaćmy cukrzycowej. Szlak
sorbitolowy (poliolowy), który nie występuje
w wątrobie, jest odpowiedzialny za powstawa¬
nie fruktozy z glukozy (p. ryc. 21-5) i jego ak¬
tywność wzrasta, gdy stężenie glukozy podnosi
się w tych tkankach, które nie są wrażliwe na
insulinę, czyli w soczewce oka, nerwach ob¬
wodowych i kłębuszkach nerkowych. Glukoza
ulega redukcji w obecności NADPH, który to
proces jest katalizowany przez reduktazę al-
dozową; potem następuje utlenienie sorbitolu
do fruktozy w obecności NAD+i dehydrogena¬
zy sorbitolowej (dehydrogenazy poliolowej).
Sorbitol nie dyfunduje przez błony komórkowe
i wobec tego gromadzi się, powodując szok
osmotyczny. Jednocześnie zmniejsza się stę¬
żenie mioinozytolu. Nagromadzeniu się sorbi¬
tolu, ubytkowi mioinozytolu i wystąpieniu za¬
ćmy cukrzycowej można zapobiec u zwierząt
doświadczalnych chorych na cukrzycę, podając
im inhibitory reduktazy aldozowej; jednak do tej
pory nie ma dowodów na to, że inhibitory te są
skuteczne w zapobieganiu zaćmy lub neuropatii
cukrzycowej u ludzi.
Niedobory enzymatyczne
szlaku przemian galaktozy
powodują galaktozemie
Niezdolność metabolizowania galaktozy wystę¬
puje przy galaktozemiach, które mogą być spo¬
wodowane wrodzonymi niedoborami galaktoki-
nazy, urydylilotransferazy lub 4-epimerazy (ryc.
21-6A), ale najlepiej poznany jest niedobór ury¬
dylilotransferazy. Galaktoza jest substratem dla
reduktazy aldozowej; powstaje z niej galaktitol,
który może się gromadzić w soczewce oka, powo¬
dując zaćmę. Ogólny stan osoby z galaktozemią
jest znacznie cięższy, jeżeli przyczyną schorze¬
nia jest niedobór urydylilotransferazy, ponieważ
wówczas gromadzi się galaktozo-1-fosforan
i w wątrobie dochodzi do niedoboru nieorganicz¬
nego fosforanu. W końcu następuje niedomoga
wątroby i zaburzenia umysłowe. W sytuacji nie¬
doboru urydylilotransferazy epimeraza występuje
w dostatecznych ilościach, tak że w organizmach
chorych z tą formą galaktozemii UDPGal może
się wytwarzać z glukozy. To wyjaśnia, dlaczego
jest możliwy normalny wzrost i rozwój dzieci do¬
tkniętych tym schorzeniem mimo stosowania die¬
ty pozbawionej galaktozy w celu kontrolowania
objawów choroby.
228 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
STRESZCZENIE
• Szlak pentozofosforanowy, który zachodzi
w cytozolu, może być drogą całkowitego utle¬
niania glukozy, w wyniku którego powstaje
NADPH i C02, ale nieATP.
• Szlak ten ma swoją fazę oksydacyjną, która
jest nieodwracalna i w której jest wytwarzany
NADPH, oraz fazę nieoksydacyjną, która jest
odwracalna i dostarcza prekursorów rybozy dla
syntezy nukleotydów. Kompletny szlak pentozo¬
fosforanowy występuje tylko w tych tkankach,
które mają zapotrzebowanie na NADPH do syn¬
tez redukujących, np. dla lipogenezy lub stero-
idogenezy; faza nieoksydacyjna występuje we
wszystkich komórkach potrzebujących rybozy.
• W erytrocytach główną funkcją szlaku pentozo-
fosforanowego jest dostarczanie NADPH w celu
utrzymania glutationu w stanie zredukowanym
jako substratu dla peroksydazy glutationowej.
• Szlak kwasu uronowego jest źródłem kwasu
glukuronowego, niezbędnego do sprzęgania
z nim wielu endogennych i egzogennych sub¬
stancji przed ich wydaleniem w postaci gluku-
ronidów z moczem i żółcią.
• Fruktoza omija główny etap regulacyjny w gli¬
kolizie, katalizowany przez fosfofruktokinazę,
i stymuluje syntezę kwasów tłuszczowych oraz
wydzielanie triacylogliceroli przez wątrobę.
• Galaktoza jest syntetyzowana z glukozy w gru¬
czole sutkowym w okresie laktacji i w innych
tkankach, gdzie jest potrzebna do syntezy gli¬
kolipidów, proteoglikanów i glikoprotein.
PIŚMIENNICTWO
Ali M, Rellos P, Cox TM: Hereditary fructose intoler-
ance. Journal of Medical Genetics 1998;35:353.
Bron AJ, Sparrow J, Brown NA, Harding JJ, Blakytny
R: The lens in diabetes. Eye 1993;7:260.
Dunlop M: Aldose reductase and the role of the polyol
pathway in diabetic nephropathy. Kidney Interna¬
tional 2000;77:S3.
Horecker BL: The pentose phosphate pathway. Journal
of Biological Chemistry 2002;277:47965.
Mayes PA: Intermediary metabolism of fructose. Ameri¬
can Journal of Clinical Nutrition 1993;58:754.
Mehta A, Mason PJ, Vulliamy TI: Glucose 6-phosphate
dehydrogenase deficiency. Balliere’s Clinical Hae-
matology 2000; 13:21.
OMIM, On-line Mendelian Inheritance in Man, a reference
work for all genetic diseases. Retrieved at http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMlM
Van den Berghe G: Inbom errors of fructose metabolism.
Annual Review of Nutrition 1994; 14:41.
Utlenianie kwasów tłuszczowych:
ketogeneza
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Chociaż kwasy tłuszczowe są zarówno utle¬
niane do acetylo-CoA, jak i syntetyzowane
z acetylo-CoA, to jednak utlenianie kwasów
tłuszczowych nie jest prostym odwróceniem ich
biosyntezy, lecz zupełnie odmiennym proce¬
sem, zachodzącym w innym przedziale (kom-
partmencie) komórki. Oddzielenie utleniania
kwasów tłuszczowych w mitochondriach od
biosyntezy zachodzącej w cytozolu pozwala na
odrębną kontrolę każdego z tych procesów i do¬
stosowanie ich do potrzeb tkanki. W każdym
kroku utleniania kwasu tłuszczowego uczest¬
niczy pochodna acylo-CoA i każdy krok jest
katalizowany przez oddzielne enzymy, używa¬
jące NAD+ i FAD jako koenzymów; w efekcie
powstaje ATP. Jest to proces aerobowy, wyma¬
gający obecności tlenu.
Nasilenie utleniania kwasów tłuszczowych
jest charakterystyczne dla stanów głodzenia
i cukrzycy (diabetes mellitus) i prowadzi do wy¬
twarzania ciał ketonowych przez wątrobę (keto-
nemia). Ciała ketonowe mają charakter kwaśny
i jeśli są wytwarzane w nadmiarze przez długi
okres, jak np. w cukrzycy, mogą być przyczyną
kwasicy ketonowej, która - nieleczona - może
być fatalna w skutkach. Ponieważ glukoneoge-
neza jest zależna od utleniania kwasów tłusz¬
czowych, zaburzenie utleniania kwasów tłusz¬
czowych prowadzi do hipoglikemii. Zdarza się
to w różnych stanach niedoboru karnityny lub
niedoboru ważnych enzymów utleniania kwa¬
sów tłuszczowych, np. palmitoilotransferazy
karnitynowej, a także z powodu zahamowania
utleniania kwasów tłuszczowych pod wpływem
trucizn, np. hipoglicyny.
UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
ZACHODZI W MITOCHONDRIACH
Kwasy tłuszczowe sa transportowane
przez krew jako wolne kwasy
tłuszczowe (WKT)
Określenie „wolne kwasy tłuszczowe” (WKT,
ang. FFA - free fatty acids) odnosi się do kwa¬
sów tłuszczowych, które występują w stanie nie-
zestryfikowanym. Alternatywnymi skrótami ich
nazwy są UFA (ang. unesterified fatty acids) lub
NEFA (ang. nonesterified fatty acids). W osoczu
krwi WKT o dłuższych łańcuchach węglowych
są związane z albuminą, a w komórce są przy¬
łączone do białka wiążącego kwasy tłuszczowe.
W rzeczywistości więc kwasy te nigdy nie wy¬
stępują w stanie „wolnym”. Kwasy tłuszczowe
o krótszych łańcuchach węglowych są lepiej roz¬
puszczalne w wodzie i występują w postaci nie-
zjonizowanych kwasów lub anionu kwasu tłusz¬
czowego.
Kwasy tłuszczowe sa aktywowane,
zanim ulegną przemianom
katabolicznym
Kwasy tłuszczowe muszą najpierw zostać prze¬
kształcone w aktywny produkt pośredni (inter-
mediat), zanim będą mogły ulec katabolizmowi.
Jest to jedyny etap w całym procesie rozkładu
kwasów tłuszczowych, który wymaga energii
ATP. W obecności ATP i koenzymu A enzym
syntetaza acylo-CoA (tiokinaza) katalizuje
przemianę kwasu tłuszczowego (lub wolnego
kwasu tłuszczowego) do „aktywnego kwasu
230 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 22-1. Rola karnityny w transporcie długołańcuchowych
kwasów tłuszczowych przez wewnętrzną błonę mitochondrial¬
ną. Długołańcuchowy acylo-CoA nie może przenikać przez we¬
wnętrzną błonę mitochondrialną, ale produkt jego metabolizmu
- acylokarnityna - może.
tłuszczowego”, czyli acylo-CoA, czemu towa¬
rzyszy wydatek energii odpowiadający rozerwa¬
niu jednego wiązania wysokoenergetycznego
ATP utworzeniem AMP i PP. (ryc. 22-1). PP.
jest następnie hydrolizowany w reakcji katali¬
zowanej przez pirofosfatazę nieorganiczną,
z rozerwaniem kolejnego wysokoenergetycz¬
nego wiązania fosforanowego; w ten sposób
jest zapewnione, że cała przemiana przebiegnie
do końca w kierunku utworzenia acylo-CoA.
Syntetazy acylo-CoA występują w siateczce
śródplazmatycznej, w peroksysomach, wewnątrz
mitochondriów i na zewnętrznej błonie mito-
chondrialnej.
Dtugotańcuchowe kwasy tłuszczowe
przenikają wewnętrzna błonę
mitochondrialną jako pochodne karnityny
Kamityna (p-hydroksy-y-trimetyloaminomaślan)
występuje powszechnie, a szczególnie obficie
w mięśniach. Cząsteczki acylo-CoA (lub WKT)
nie przenikają przez wewnętrzną błonę mito¬
chondrialną. Jednak enzym palmitoilotransfe-
raza karnitynowa I, obecna w zewnętrznej bło¬
nie mitochondrialnej, katalizuje przekształcenie
długołańcuchowych acylo-CoA w acylokami-
tynę, która może przenikać przez wewnętrzną
błonę mitochondrialną i umożliwiać kwasom
tłuszczowym dostęp do enzymatycznego układu
p-oksydacji (p. ryc. 22-1). Translokaza karni-
tynoacylokarnitynowa działa jako wymienny
przenośnik karnityny w wewnętrznej błonie mi¬
tochondrialnej. Transport cząsteczki acylokami-
tyny do wnętrza mitochondrium jest skojarzony
z transportem jednej cząsteczki karnityny na
zewnątrz. Acylokarnityna po wniknięciu do mi¬
tochondrium reaguje z CoA; reakcja ta jest kata¬
lizowana przez palmitoilotransferazę karnity-
nową II, która znajduje się na wewnętrznej po¬
wierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej.
W ten sposób acylo-CoA zostaje odtworzony
i zostaje uwolniona kamityna.
p-OKSYDACJA KWASÓW
TŁUSZCZOWYCH POLEGA
NA KOLEJNYM ODCZEPIANIU
I UWALNIANIU ACETYLO-CoA
W reakcji p-oksydacji (ryc. 22-2) od cząsteczek
acylo-CoA, począwszy od końca karbonylowe-
go, są odczepiane reszty dwuwęglowe. Łańcuch
jest rozrywany między atomami węgla a (C-2)
i P (C-3), stąd nazwa p-oksydacja. Powstające
jednostki dwuwęglowe to cząsteczki acetylo-
-CoA; tak więc z jednej cząsteczki palmitoilo-
-CoA powstaje osiem cząsteczek acetylo-CoA.
Cykliczna sekwencja reakcji
prowadzi do powstania FADH2 i NADH
Kilka enzymów, znanych pod ogólną nazwą
„oksydaza kwasów tłuszczowych”, znajduje się
w macierzy mitochondrialnej w pobliżu łańcucha
22. UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA 231
wwvw\
CO r\j S — CoA
www\
pl CO S —CoA
!
| CH3 - CO S — CoA
1 Acetylo-CoA
Kolejne usuwanie jednostek dwuwęglowych
3CH3 -CO S — CoA
Acetylo-CoA
Ryc. 22-2. Ogólny schemat p-oksydacji kwasów tłuszczowych.
oddechowego, umiejscowionego w wewnętrznej
błonie mitochondrialnej. Katalizują one utlenianie
acylo-CoA do acetylo-CoA i układ ten jest skoja¬
rzony z fosforylacją ADP do ATP (ryc. 22-3).
Pierwszym krokiem jest oderwanie dwóch ato¬
mów wodoru od atomów węgla 2 (a) i 3 (P), katali¬
zowane przez dehydrogenazę acylo-CoA, której
koenzymem jest FAD. Wynikiem tego jest utwo¬
rzenie A2-/ratfs-enoilo-CoA i FADH2. Reoksyda-
cja FADH2 wymaga pośrednictwa innej flawo-
proteiny, nazywanej flawoproteiną przenoszącą
elektrony (rozdz. 12). Następnie jest przyłączana
cząsteczka wody w celu wy sycenia podwójnego
wiązania i wytworzenia 3-hydroksyacylo-CoA,
co jest katalizowane przez hydratazę A2-enoilo-
-CoA. Pochodna 3-hydroksylowa ulega dalszemu
Ryc. 22-3. p-Oksydacja kwasów tłuszczowych. Długołańcuchowy
acylo-CoA przechodzi cyklicznie przez reakcje 2-5, a w każdym
cyklu jest odszczepiany acetylo-CoA pod wpływem tiolazy
(reakcja 5). Gdy pozostanie reszta acylowa o długości jedynie
4 atomów węgla, wówczas w reakcji 5 powstają 2 cząsteczki
acetylo-CoA.
©
R — CH2— CH2— C — 0”
Kwas tłuszczowy
CoA — SH ^ ^ ATP
n Mg2*
AMD 4-
R-CH2-CH2-CroS-CoA
Acylo-CoA
(zewnętrzna)
strona cytoplazmatyczna
WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA
© TRANSPORTER MRMTWOWY
(wewnętrzna)
strona mitochondrialna
©
R-CH2-CH2-CroS-CoA
► Acylo-CoA
FAD
©
©
r
^ fadh2
0 Łańcuch
II oddechowy
2^®
H20
R-CH = CH-C^S-CoA
A2-fra/7$-EnoHo-CoA
HYDRATAZA
A2-ENOILO-CoA
r
h2o
OH
31 2 II
R-CH-CH2-CroS-CoA
L(+)-3-Hydroksy-
acylo-CoA
DEHYDROGENAZA
l(+)-3-HYDR0KSY-
r
NADH + H+
q 1 q Łańcuch
U , „ oddechowy
R-Cj-zCH2-C^S-CoA
3-Ketoacylo-CoA
CoA — SH
3n^®
H20
©
| TIOLAZA |
r
-R-C^S-CoA +CH3~COw»S~CoA
Acylo-CoA Acetylo-CoA
232 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
odwodorowaniu przy atomie węgla 3, katalizo¬
wanemu przez dehydrogenazę L(+)-3-hydroksy-
acyło-CoA, w wyniku czego powstaje odpo¬
wiedni 3-ketoacylo-CoA. W tej reakcji NAD\
a nie FAD, jest koenzymem uczestniczącym
w odwodorowaniu. W końcu, 3-ketoacylo-CoA
jest rozrywany w pozycji 2,3 przez tiolazę (tio-
lazę 3-ketoacylo-CoA) i powstaje acetylo-CoA
i acylo-CoA, zawierający o dwa atomy węgla
mniej niż pierwotna cząsteczka acylo-CoA. Utwo¬
rzona cząsteczka acylo-CoA ponownie wchodzi
w szlak oksydacyjny, począwszy od reakcji 2
(p. ryc. 22-3). W ten sposób długi łańcuch kwasu
tłuszczowego może całkowicie zostać rozłożony
na acetylo-CoA (jednostki dwuwęglowe). Ponie¬
waż acetylo-CoA może zostać utleniony do C02
i wody w cyklu kwasu cytrynowego (który także
jest umiejscowiony w mitochondriach), następuje
całkowite utlenienie kwasów tłuszczowych.
W wyniku utleniania kwasu tłuszczowego
0 nieparzystej liczbie atomów węgla
powstają cząsteczki acetylo-CoA
1 jedna cząsteczką propionylo-CoA
Kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie ato¬
mów węgla są utleniane w szlaku p-oksydacji,
z utworzeniem acetylo-CoA, dopóty, dopóki nie
pozostanie trójwęglowa reszta propionylo-CoA.
Związek ten jest przekształcany w bursztynylo-
CoA - metabolit będący związkiem pośrednim
cyklu kwasu cytrynowego (p. ryc. 20-2). Wobec
tego, reszta propionylowa z kwasów tłuszczo¬
wych o nieparzystej liczbie atomów węgła jest
jedynym glukogennym fragmentem kwasów
tłuszczowych.
Utlenianie kwasów tłuszczowych
powoduje powstawanie
wielu cząsteczek ATP
Transport elektronów w łańcuchu oddechowym
z FADH2 i NADH prowadzi do utworzenia czte¬
rech wysokoenergetycznych wiązań fosforano¬
wych (rozdz. 13) z każdą z pierwszych siedmiu
cząsteczek acetylo-CoA, utworzonych w wyniku
P-oksydacji palmitynianu, czyli (7*4 = 28). W su¬
mie powstaje 8 moli acetylo-CoA, z których każ¬
dy może dostarczyć 10 moli ATP wskutek utle¬
nienia w cyklu kwasu cytrynowego, co czyni
w sumie 8 • 10 = 80 moli ATP. Zatem łącznie
uzyskuje się: 28 + 80 = 108 moli ATP. Dwa mole
należy odjąć na początkową aktywację kwa¬
su tłuszczowego, wobec czego zysk netto wy¬
nosi 106 moli ATP na 1 mol palmitynianu albo
106 • 51,6* = 5470 kJ. To stanowi 68% entalpii
swobodnej spalania kwasu palmitynowego.
W peroksysomach ulegają utlenieniu
kwasy tłuszczowe o bardzo długim
łańcuchu
Zmodyfikowana forma p-oksydacji zachodzi
w peroksysomach, a prowadzi do wytwarzania
acetylo-CoA i H202 (na etapie dehydrogenazy
związanej z flawoproteiną). Nadtlenek wodoru
jest rozkładany przez katalazę. Wobec tego to
odwodorowanie w peroksysomach nie jest zwią¬
zane bezpośrednio z fosforylacją i wytwarzaniem
ATP. Proces ten ułatwia jednak utlenianie kwasów
tłuszczowych o bardzo długim łańcuchu węglo¬
wym (np. C20, C22). Enzymy w tym uczestniczą¬
ce są indukowane przez dietę bogatą w tłuszcze,
a u niektórych gatunków przez leki hipolipemicz-
ne, takie jak klofibrat.
Enzymy w peroksysomach nie działają na kwa¬
sy tłuszczowe o krótszym łańcuchu; P-oksydacja
kończy się na oktanoilo-CoA. Grupy oktanoilowe
i acetylowe są potem dalej utleniane w mitochon¬
driach. Inną rolą p-oksydacji w peroksysomach
jest skracanie bocznego łańcucha cholesterolu
w syntezie kwasów żółciowych (rozdz. 26). Per-
oksysomy biorą także udział w syntezie gliceroli-
pidów eterowych (rozdz. 24), cholesterolu i doli-
choli (p. ryc. 26-2).
UTLENIANIE NIENASYCONYCH
KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
PRZEBIEGA ZMODYFIKOWANYM
SZLAKIEM p-OKSYDACJI
Nienasycone kwasy tłuszczowe połączone wiąza¬
niem estrowym z CoA są rozkładane przez enzy¬
my uczestniczące normalnie w p-oksydacji, aż do
etapu A3-ds-acylo-CoA albo A4-c/s-acylo-CoA,
zależnie od pozycji podwójnego wiązania (ryc.
* AG dla reakcji ATP, jak to wyjaśniono w rozdziale 18.
22. UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA 233
ffyc. 22-4. Kolejność reakcji zachodzących podczas utleniania
nienasyconych kwasów tłuszczowych, np. kwasu linolowego.
Kwasy tłuszczowe a4-c/s lub kwasy tłuszczowe tworzące
A4-c/s-enoilo-CoA wchodzą do szlaku w zaznaczonym miejscu.
NADPH dla etapu reduktazy dienoilo-CoA jest dostarczany przez
enzymy wewnątrzmitochondrialne, takie jak dehydrogenaza glu¬
taminianowi dehydrogenaza izocytrynianowa i transhydroge-
naza NAD(P)H.
AAT=1^=W^C"S_ C0A
3 cykle
p-oksydacji
3 Acetylo-CoA
cis „ cis „ //
\6 > .3 C Oj S — CoA
A/\^vv
22-4). Pierwszy z tych związków jest izomeryzo-
wany (izomeraza Ay-cis —* A2-f/Yi/i.s-enoilo-CoA)
do związku odpowiadającego etapowi A 1-trans-
-enoilo-CoA w szlaku P-oksydacji, aby ulec na¬
stępnie hydratacji i utlenieniu. Każdy ze związków
będących A4-c/s-acylo-CoA, pozostający w szlaku
tak jak w przypadku kwasu linolenowego, lub też
wchodzący do szlaku w tym punkcie po przekształ¬
ceniu katalizowanym przez dehydrogenazę acylo-
-CoA do A2-/ratts-A4-c/s-dienoilo-CoA, jest meta¬
bolizowany dalej, jak pokazano na ryc. 22-4.
KETOGENEZA ZACHODZI WÓWCZAS,
GDY INTENSYWNOŚĆ UTLENIANIA
KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
W WĄTROBIE JEST DUŻA
W warunkach metabolicznych związanych z dużą
szybkością utleniania kwasów tłuszczowych,
wątroba wytwarza znaczne ilości acetooctanu
i D(-)-3-hydroksy maślanu (P-hydroksymaślanu).
Acetooctan ulega ciągłej, samoistnej dekarboksy-
lacji do acetonu. Te trzy substancje są znane pod
wspólną nazwą ciała ketonowe (nazywane także
ciałami acetonowymi lub [błędnie*] „ketonami”)
(ryc. 22-5). Acetooctan i 3-hydroksymaślan są
wzajemnie w siebie przekształcane pod wpły¬
wem mitochondrialnego enzymu dehydrogenazy
D(-)-3-hydroksymaślanowej. Równowaga tej
reakcji jest kontrolowana mitochondrialnym sto-
A3-c/s-A6-c/s-Dienoilo-CoA
IZOMERAZA
a3 cis (albo frafls)-»A2-fra/is-ENOILO-CoA
/V^\A£\
# C Oj S — CoA
0
A2-//3ns-A6-c/s-Dienoilo-CoA
(Etap p-oksydacji odpowiadający A2-fra/7S-enoilo-CoA)
1 cykl
p-oksydacji
Acetylo-CoA
C Oj S — CoA
' II
0
A2-//3ns-A4-c/s-Dienoilo-CoA •<
DEHYDROGENAZA
ACYLO-CoA
A -c/s-Enoilo-CoA
H+ + NADPH
NADP+
REDUKTAZA
A2-tfa/?s-A4-c/s-DIENOILO-CoA
aaaL
0
//
C s — CoA
A3-f/3/łS-Enoilo-CoA
IZOMERAZA
A3-c/s-(albofra/is)-+A2-fra/is-ENOILO-CoA
AAAĄ/
v
* Termin „ketony” nie powinien być używany, ponieważ
3-hydroksymaślan nie jest ketonem, a ponadto w krwi
znajdują się ketony, które nie są ciałami ketonowymi, np.
pirogronian, fruktoza.
Tak samo błędne jest używanie terminu „związki ketono¬
we” na określenie ciał ketonowych [przyp. tłum.].
A2-f/3/?s-Enoilo-CoA
4 cykle
p-oksydacji
5 Acetylo-CoA
234 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
o
II
ch3 — c — ch3
Ryc. 22-5. Wzajemne zależności ciał ketonowych. Dehydrogenaza
D(-)-3-hydroksymaślanowa jest enzymem mitochondrialnym.
sunkiem [NAD+] do [NADH], tj. stanem redok-
sowym. Stężenie całkowite ciał ketonowych we
krwi dobrze odżywionych ssaków nie przekracza
zwykle 0,2 mmol/L. Jest ono nieco większe u prze¬
żuwaczy wskutek tworzenia się w ścianie żwacza
3-hydroksymaślanu z kwasu masłowego (produk¬
tu fermentacji w żwaczu). Wątroba in vivo wyda¬
je się być jedynym narządem u nieprzeżuwaczy
wydzielającym znaczne ilości ciał ketonowych do
krwi. Pozostałe narządy zużywają ciała ketonowe
jako substraty oddechowe. Przepływ ciał ketono¬
wych z wątroby do tkanek poza wątrobowych jest
wynikiem aktywnej wątrobowej syntezy z bardzo
małym zużyciem ich w tym narządzie. Odwrotna
sytuacja występuje w tkankach pozawątrobowych
(ryc. 22-6).
3-Hydroksy-3-metyloglularylo-CoA
(HMG-Coń) jest związkiem pośrednim
w szlaku ketogenezy
Enzymy odpowiedzialne za powstawanie ciał ke¬
tonowych są związane głównie z mitochondriami.
Dwie cząsteczki acetylo-CoA wytwarzane pod¬
czas p-oksydacji kondensują ze sobą w wyniku
odwrócenia reakcji katalizowanej przez tiolazę,
tworząc acetoacetylo-CoA.
Acetoacetylo-CoA, który jest materiałem
wyjściowym dla ketogenezy, powstaje również
Ryc. 22-6. Powstawanie, zużywanie i wydalanie ciał ketonowych (główny szlak zaznaczono strzałkami ciągłymi).
22. UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA 235
WKT
CH3- CH — *CH2 — *COO”
o(-)-3-Hydroksymaślan
Ryc. 22-7. Szlak ketogenezy w wątrobie (WKT - wolne kwasy tłuszczowe).
z końcowych czterech atomów węgla kwasu
tłuszczowego w czasie P-oksydacji (ryc. 22-7).
W wyniku kondensacji acetoacetylo-CoA z jesz¬
cze jedną cząsteczką acetylo-CoA, katalizowa¬
nej przez syntazę 3-hydroksy-3-metylogluta-
ryło-CoA, powstaje 3-hydroksy-3-metylogluta-
rylo-CoA (HMG-CoA). Następnie enzym liaza
3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA katalizuje
odszczepienie acetylo-CoA od cząsteczki HMG-
-CoA, pozostawiając wolny acetooctan. Atomy
węgla oderwane jako acetylo-CoA pochodzą
z pierwotnej cząsteczki acetoacetylo-CoA. Oby¬
dwa wymienione enzymy muszą być obecne
w mitochondriach, aby ketogeneza mogła za¬
chodzić. Jest to możliwe jedynie w wątrobie
i nabłonku żołądka żwacza. Ciałem ketonowym
ilościowo dominującym we krwi i moczu w stanie
ketonemii jest D(-)-3-hydroksymaślan.
Ciała ketonowe służą
jako materiał energetyczny
dla tkanek pozawatrobowych
Chociaż wątroba jest wyposażona w aktywny me¬
chanizm enzymatyczny potrzebny do wytwarzania
acetooctanu z acetoacetylo-CoA, to raz powstały
236 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 22-8. Transport ciat ketonowych z wątroby i szlaki metaboliczne ich zużywania oraz utlenienia w tkankach pozawątrobowych
(OAA-szczawiooctan).
acetooctan nie może być bezpośrednio reaktywo¬
wany w wątrobie, z wyjątkiem reakcji w cytozolu
komórki wątrobowej, gdzie jest on prekursorem
w syntezie cholesterolu - szlaku metabolicznym
0 znacznie mniejszej aktywności. Sprawia to, że
w wątrobie więcej powstaje acetooctanu, niż jest
zużywane.
W tkankach pozawątrobowych aktywacja ace¬
tooctanu do acetoacetylo-CoA przebiega z udzia¬
łem bursztynylo-CoA i enzymu transferazy
CoA, bursztynylo-CoA : szczawiooctan. Aceto¬
octan reaguje z bursztynylo-CoA, a CoA zostaje
przeniesiony z wytworzeniem acetoacetylo-CoA
1 wolnego bursztynianu (ryc. 22-8). Acetoacetylo-
-CoA wytworzony w tej reakcji jest rozkładany do
acetylo-CoA z udziałem tiolazy i utleniany w cy¬
klu kwasu cytrynowego. Jeżeli stężenie ciał keto¬
nowych we krwi wzrasta, ich utlenianie również
się zwiększa, aż do osiągnięcia stężenia we krwi
wynoszącego ok. 12 mmol/L, przy którym nastę¬
puje wysycenie układów utleniających. W tym
stanie znaczna ilość pobieranego tlenu jest zuży¬
wana do utleniania ciał ketonowych.
W większości przypadków ketonemia jest spo¬
wodowana raczej zwiększonym wytwarzaniem
ciał ketonowych w wątrobie, a nie ich zmniej¬
szoną utylizacją przez tkanki pozawątrobowe.
Podczas gdy acetooctan i D(-)-3-hydroksymaślan
są łatwo utleniane przez tkanki pozawątrobowe,
utlenianie acetonu in vivo zachodzi z trudnością
i jest on w dużej mierze wydychany z powietrzem
przez płuca.
W ketonemii o umiarkowanym nasileniu utra¬
ta ciał ketonowych z moczem wynosi tylko kil¬
ka procent całkowitego wytwarzania i utylizacji
ciał ketonowych. Ponieważ dla ciał ketonowych
istnieją efekty podobne do progu nerkowego
(chociaż nie jest to prawdziwy próg nerkowy),
które wykazują różnice międzygatunkowe i mię-
dzyosobnicze, preferencyjną metodą oceniania
ciężkości schorzenia powinny być pomiary keto¬
nemii, a nie ketonurii.
22. UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA 237
KETOGENEZA JEST REGULOWANA
NA TRZECH GŁÓWNYCH ETAPACH
1. Ketonemia nie wystąpi in v/vo, jeżeli nie ma
zwiększonego stężenia krążących wolnych kwa¬
sów tłuszczowych pochodzących z lipolizy tri-
acylogliceroli w tkance tłuszczowej. Wolne kwa¬
sy tłuszczowe w wątrobie są prekursorami ciał
ketonowych. Wątroba zarówno w stanie sytości,
jak i w okresie głodzenia jest zdolna do wychwy¬
cenia ok. 30% wolnych kwasów tłuszczowych
przepływających przez nią, a więc przy dużym
stężeniu WKT we krwi ich napływ do wątroby
jest znaczny. Dlatego czynniki regulujące mobi¬
lizację wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki
tłuszczowej są ważne dla kontrolowania keto-
genezy (ryc. 22-9 i 25-8).
2. Kwasy tłuszczowe zaraz po wniknięciu do
wątroby są albo utleniane do C02 lub ciał ke¬
tonowych, albo estryfikowane do triacylogli-
ceroli i fosfolipidów. Wejście wolnych kwasów
tłuszczowych w szlak utleniania jest regulowane
aktywnością palmitoilotransferazy karnity-
nowej I (CPT-I); nieutlenione kwasy tłuszczo¬
we pobrane przez wątrobę, ulegają estryfikacji.
Aktywność CPT-I w stanie sytości jest mała, co
prowadzi do zmniejszenia utleniania kwasów
tłuszczowych, natomiast w stanie głodzenia ak¬
tywność CPT-I jest duża, wskutek czego utlenia¬
nie jest zwiększone. Malonylo-CoA, pierwszy
związek pośredni w biosyntezie kwasów tłusz¬
czowych (ryc. 23-1), powstający w reakcji ka¬
talizowanej przez karboksylazę acetylo-CoA,
jest w stanie sytości silnym inhibitorem CPT-I
(ryc. 22-10). W tych warunkach wolne kwasy
tłuszczowe wnikają do komórek wątrobowych
w bardzo małej ilości, niemal wszystkie są estry¬
fikowane do acylogliceroli i transportowane
z wątroby w postaci lipoprotein o bardzo małej
gęstości (VLDL). Jeśli jednak stężenie wolnych
kwasów tłuszczowych wzrasta w stanie głodze¬
nia, karboksylaza acetylo-CoA zostaje zahamo¬
wana bezpośrednio przez acylo-CoA i stężenie
malonylo-CoA się zmniejsza, odblokowując ha¬
mowanie CPT-I i pozwalając na to, aby więcej
acylo-CoA ulegało p-oksydacji. Procesy te nasi-
lają się, jeśli zmniejsza się stosunek [insulina]/
/[glukagon]. Tak więc nasilenie p-oksydacji
wolnych kwasów tłuszczowych jest kontrolowa-
Triacyloglicerol
TKANKA TŁUSZCZOWA
KREW
o
Lipoliza
WKT
WKT
WĄTROBA
Przejście
CPT-I
p-Oksydacja
Acylo-CoA
(^j \ Estryfikacja
Acyloglicerole
Acetylo-CoA
Ketogeneza
Ryc. 22-9. Regulacja ketogenezy. © - (D oznacza trzy kluczowe
etapy metabolizmu wolnych kwasów tłuszczowych (WKT), które
determinują wielkość ketogenezy (CPT-I - palmitoilotransferaza
karnitynowa I).
ne przez „furtkę” do mitochondriów, utworzoną
przez CPT-I, a nieutleniony nadmiar wolnych
kwasów tłuszczowych jest estryfikowany.
3. Z kolei acetylo-CoA powstały w wyniku
p-oksydacji albo zostaje utleniony w cyklu kwasu
cytrynowego, albo wchodzi w szlak ketogenezy,
tworząc ciała ketonowe. Gdy stężenie wolnych
kwasów tłuszczowych w surowicy się zwiększa,
wówczas proporcjonalnie więcej kwasów tłusz¬
czowych zostaje przekształconych w ciała keto¬
nowe, a mniej ulega utlenieniu do C02 w cyklu
kwasu cytrynowego. Proporcja acetylo-CoA na¬
pływającego do szlaku ketogenezy i do szlaku
utleniania do C02 jest tak regulowana, że całko¬
wita entalpia swobodna gromadzona w postaci
ATP w wyniku utleniania kwasów tłuszczowych
pozostaje stała, gdy stężenie WKT w surowicy się
zmienia. Łatwiej to zrozumieć, jeśli się policzy,
238 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
| Ketogeneza
Ciata ketonowe
Ryc. 22-10. Regulacja utleniania długotańcuchowych kwasów tłuszczowych w wątrobie (WKT - wol¬
ne kwasy tłuszczowe; VLDL - lipoproteiny o bardzo małej gęstości). Dodatnie (+) i ujemne (-) efekty
regulacyjne zaznaczono przerywanymi strzałkami, a przepływ substratów - strzałkami ciągłymi.
że całkowitemu utlenieniu 1 mola palmitynianu
towarzyszy utworzenie netto 106 moli ATP, jeśli
proces ten zachodzi szlakiem p-oksydacji i utwo¬
rzenia C02 w cyklu kwasu cytrynowego (patrz
wyżej), natomiast powstaje tylko 26 moli ATP,
jeżeli końcowym produktem przemiany palmi¬
tynianu jest acetooctan. Ilość powstającego ATP
zmniejsza się nawet do 21 moli, jeśli końcowym
produktem jest 3-hydroksymaślan. Tak więc keto¬
geneza może być uważana za mechanizm, który
pozwala wątrobie utleniać coraz większe ilości
kwasów tłuszczowych w warunkach ograniczenia
współistniejącym układem ściśle skojarzonego sy¬
stemu oksydacyjnych fosforylacji.
Teoretycznie, zmniejszenie stężenia szcza-
wiooctanu, zwłaszcza wewnątrz mitochondriów,
mogłoby upośledzać zdolność cyklu kwasu cy¬
trynowego do utleniania acetylo-CoA, kierując
utlenianie kwasów tłuszczowych ku ketogenezie.
Taki przypadek może nastąpić, ponieważ propor¬
cja [NADH]/[NAD+] wzrasta, jeśli p-oksydacja
przebiega intensywniej. Wpływa to bowiem na
równowagę między szczawiooctanem i jabłcza-
nem, zmniejszając stężenie szczawiooctanu. Jed¬
nak karboksylaza pirogronianowa, która katali¬
zuje przemianę pirogronianu w szczawiooctan,
jest aktywowana przez acetylo-CoA. Wobec tego,
gdy pojawiają się znaczne ilości acetylo-CoA,
powinny powstawać wystarczające ilości szcza-
wiooctanu, aby mógł się rozpocząć cykl kwasu
cytrynowego dzięki kondensacji szczawiooctanu
z acetylo-CoA.
22. UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA 239
ASPEKTY KLINICZNE
Upośledzone utlenianie kwasów
tłuszczowych jest przyczyna chorób
często związanych z hipoglikemia
Niedobór karnityny może występować zwłasz¬
cza u noworodków, a szczególnie u wcześniaków,
co jest spowodowane niewystarczającą biosynte¬
zą tego związku lub jego utratą przez nerki. Ubyt¬
ki mogą także następować przy hemodializie. To
sugeruje, że u niektórych osobników istnieje ko¬
nieczność pokarmowego uzupełniania karnityny
w diecie, tak jak to jest w przypadku witamin. Ob¬
jawami niedoboru jest m.in. hipoglikemia, będąca
następstwem upośledzonego utleniania kwasów
tłuszczowych, a także nagromadzenie tłuszczu
i osłabienie mięśni. Leczenie polega na doustnym
podawaniu karnityny.
Wrodzony niedobór CPT-I dotyczy jedynie
wątroby, a jego wynikiem jest ograniczenie utle¬
niania kwasów tłuszczowych i ketogenezy oraz
hipoglikemia. Niedobór CPT-II obejmuje pier¬
wotnie mięśnie szkieletowe, a w ciężkich przy¬
padkach także wątrobę. Leki będące pochodny¬
mi sulfonylomocznika (gliburyt i tolbutamid),
stosowane w leczeniu cukrzycy drugiego typu,
ograniczają utlenianie kwasów tłuszczowych
poprzez hamowanie CPT-I, redukując hipergli-
kemię.
Wrodzone niedobory enzymów p-oksydacji
i ketogenezy także prowadzą do hipoglikemii, lecz
bez ketonemii, śpiączki i stłuszczenia wątroby.
Znane są niedobory dehydrogenazy 3-hydroksy-
acylo-CoA dla kwasów długo- i krótkołańcucho-
wych (niedobór enzymu dla długołańcuchowych
kwasów może być przyczyną ostrego stłuszcze¬
nia wątroby w czasie ciąży). Niedobór tiolazy
3-ketoacyIo-CoA i liazy HMG-CoA może upo¬
śledzać rozkład leucyny i innych aminokwasów
ketogennych (rozdz. 29).
Jamajska choroba wymiotna występuje po
spożyciu niedojrzałych owoców tamtejszego
drzewa (akee tree), które zawierają toksynę hi-
poglicynę. Inaktywuje ona dehydrogenazę dla
krótko- i średniołańcuchowych acylo-CoA, co
powoduje zahamowanie p-oksydacji i hipogli-
kemię. Acyduria dwukarboksylowa charak¬
teryzuje się wydalaniem co-dikarboksylowych
kwasów o długości łańcucha węglowego C6-CI0,
hipoglikemią bez ketonemii; jej przyczyną jest
brak mitochondrialnej dehydrogenazy acyło-
-CoA, swoistej dla substratów o średniej dłu¬
gości łańcucha. Choroba Refsuma jest rzad¬
kim schorzeniem neurologicznym wynikającym
z zaburzeń metabolicznych, polegających na
nagromadzaniu się kwasu fitanowego znajdu¬
jącego się w wyrobach mleczarskich, tłuszczu
i mięsie przeżuwaczy. Uważa się, że kwas fitano-
wy zaburza funkcję błon, prenylację białek i eks¬
presję genów. Zespół Zellwegera (mózgowo-
-wątrobowo-nerkowy) występuje u osobników
z rzadkim, dziedzicznym brakiem peroksysomów
we wszystkich tkankach. Gromadzą się wówczas
w mózgu wielonienasycone kwasy tłuszczowe,
o długości łańcucha C26-C38. Choroba objawia
się ciężkimi zaburzeniami neurologicznymi,
większość pacjentów umiera w pierwszym roku
życia.
Kwasica ketonowa jest wynikiem
przewlekłej ketonemii
Większe niż normalnie ilości ciał ketonowych we
krwi nazywa się ketonemią (hiperketonemią),
a w moczu - ketonurią (oba przypadki nazywa
się wspólnie także „ketozami”, co jednak może
być mylone z jedną z form strukturalnych cukru:
aldoza i ketoza -przyp. tłum.). Podstawowa po¬
stać ketonemii występuje w głodzeniu i obejmu¬
je utratę dostępnych węglowodanów, połączoną
z mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych.
Ten stan pogłębia się, przyjmując postać patolo¬
giczną w cukrzycy (diabetes mellitus) typu 2,
która to forma tej choroby jest coraz bardziej
powszechna w krajach Zachodu; zdarza się
on również w ciążowym zatruciu u owiec,
a także u bydła w okresie laktacji. Niepatolo-
giczne formy ketonemii występują w warunkach
karmienia dietą o wysokiej zawartości tłuszczu
oraz po intensywnym wysiłku w stanie poab-
sorpcyjnym.
Kwasy acetylooctowy i 3-hydroksymasłowy
są umiarkowanie silnymi kwasami i w stanach
normalnych są buforowane, jeżeli znajdą się we
krwi lub w innych tkankach. Jednak ciągłe ich
wydzielanie w większych ilościach stopniowo
wyczerpuje rezerwę alkaliczną, powodując kwa¬
sicę ketonową. Może to być bardzo niekorzystne
w przypadku niekontrolowanej cukrzycy.
240 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
STRESZCZENIE
• W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych
w mitochondriach powstają duże ilości ATP
w procesie zwanym p-oksydacją, w którym
następuje odrywanie kolejnych jednostek ace-
tylo-CoA od łańcuchów acylowych. Utworzony
acetylo-CoA jest utleniany w cyklu kwasu cy¬
trynowego, co prowadzi do powstawania więk¬
szych ilości ATP.
• Ciała ketonowe (acetylooctan, 3-hydroksyma-
ślan i aceton) są wytwarzane w mitochondriach
wątroby, jeśli utlenianie kwasów tłuszczowych
odbywa się ze znaczną intensywnością. W szla¬
ku ketogenezy zachodzi synteza i rozpad 3-hy-
droksy-3-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA)
z udziałem dwóch głównych enzymów ketoge¬
nezy: syntazy HMG-CoA i liazy HMG-CoA.
• Ciała ketonowe są ważnym „paliwem” energe¬
tycznym w tkankach pozawątrobowych.
• Ketogeneza jest regulowana na trzech klu¬
czowych etapach: (1) kontroli pozyskiwania
wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłusz¬
czowej, (2) aktywności palmitoilotransferazy
kamitynowej I w wątrobie, która determinuje
proporcję dopływających kwasów tłuszczo¬
wych przeznaczonych do utleniania, a nie do
estryfikacji, (3) rozdziału acetylo-CoA między
szlak ketogenezy i cykl kwasu cytrynowego.
• Choroby związane z upośledzeniem utleniania
kwasów tłuszczowych prowadzą do hipoglike-
mii, nacieczenia tłuszczowego narządów we¬
wnętrznych i do hiperketonemii.
• Ketonemia bywa łagodna w przypadku głodze¬
nia, natomiast bardzo nasilona w przypadku
cukrzycy i u przeżuwaczy.
PIŚMIENNICTWO
Eaton S, Bartlett K, Pourfarzam M: Mammalian mito-
chondrial P-oxidation. Biochem J 1996;320:345.
Fukao T, Lopaschuk GD, Mitchell GA: Pathways and
control of ketone body metabolism: on the fringe
of lipid metabolism. Prostaglandins Leukot Essent
Fatty Acids 2004;70:243.
Gurr MI, Harwood JL, Frayn K: Lipid Biochemistry,
Blackwell Publishing, 2002.
Reddy JK, Mannaerts GP: Peroxisomal lipid metabo¬
lism. Annu Rev Nutr 1994; 14:343.
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8,h ed. McGraw-Hill,
2001.
Wood PA: Defects in mitochondrial beta-oxidation of
fatty acids. Curr Opin Lipidol 1999; 10:107.
[Biosynteza kwasów tłuszczowych
i ikozanoidów
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Kwasy tłuszczowe są syntetyzowane przez poza-
mitochondrialny układ, który jest odpowiedzial¬
ny za całkowitą syntezę palmitynianiu z acetylo-
-CoA w cytozolu. U większości ssaków glukoza
jest początkowym substratem dla lipogenezy, ale
u przeżuwaczy jest nim octan, główne molekular¬
ne „paliwo” wytwarzane z produktów dostarcza¬
nych z dietą. Choroby szlaku lipogenezy u ludzi
nie są znane, jednak w typie 1 cukrzycy (zależnej
od insuliny) zdarza się zahamowanie tego szlaku
metabolicznego, a zmiany jego aktywności wpły¬
wają na rodzaj i stopień otyłości.
Nienasycone kwasy tłuszczowe w fosfolipidach
błony komórkowej są ważnym czynnikiem utrzy¬
mującym płynność błony. Duża wartość stosunku
wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i nasy¬
conych kwasów tłuszczowych (stosunek P: S) w die¬
cie jest uważany za element skutecznie zapobiegają¬
cy chorobie wieńcowej serca. Tkanki zwierząt mają
ograniczoną zdolność wytwarzania nienasyconych
kwasów tłuszczowych, dlatego zwierzęta muszą
pobierać z dietą niektóre wielonienasycone kwa¬
sy tłuszczowe pochodzące z roślin. Te egzogenne
kwasy tłuszczowe są zużywane do tworzenia iko-
zanowych (C20) kwasów tłuszczowych, z których
powstają ikozanoidy, tj. prostaglandyny, trom-
boksany, leukotrieny i lipoksyny. Prostaglandyny
pośredniczą w procesach zapalenia, bólu, a także
w indukcji snu, uczestniczą również w regulacji
krzepnięcia krwi i reprodukcji. Niesteroidowe
leki przeciwzapalne, takie jak kwas acetylosalicy¬
lowy (aspiryna), działają przez hamowanie synte¬
zy prostaglandyn. Leukotrieny mają właściwości
związków kurczących mięśnie, a także uczestniczą
w reakcjach chemotaktycznych, są więc ważne
w procesach alergicznych i zapalnych.
GŁÓWNY SZLAK SYNTEZY
DE N0V0 KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
(LIPOGENEZA) ZACHODZI W CYTOZOLU
Synteza kwasów tłuszczowych zachodzi w wielu
tkankach, łącznie z wątrobą, nerkami, mózgiem,
płucami, gruczołem sutkowym i tkanką tłuszczo¬
wą. Do jej przebiegu są potrzebne takie ko faktory,
jak NADPH, ATP, Mn2+, biotyna oraz HC03 (jako
źródło C02). Acetylo-CoA jest bezpośrednim
substratem, a palmitynian jest produktem koń¬
cowym.
Wytworzenie malonylo-CoA jest
początkowym i kontrolującym etapem
syntezy kwasów tłuszczowych
W początkowej reakcji syntezy kwasów tłusz¬
czowych do karboksylacji acetylo-CoA do ma-
lonylo-CoA w obecności ATP i karboksylazy
acetylo-CoA jest potrzebny wodorowęglan jako
źródło C02. Z kolei do działania karboksylazy
acetylo-CoA jest niezbędna biotyna (ryc. 23-1).
Enzym ten jest białkiem wieloenzymowym, za¬
wierającym zmienną liczbę identycznych podjed-
nostek; w każdej są zawarte: biotyna, karboksy-
laza biotyny, białko nośnikowe karboksybiotyny
i transkarboksylaza, jak również allosteryczne
miejsce regulatorowe. Reakcja zachodzi w dwóch
etapach: (1) karboksylacja biotyny z udziałem
ATP oraz (2) przeniesienie karboksylu na acetylo-
-CoA z wytworzeniem malonylo-CoA.
242 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
CH3 — CO S — CoA ■
Acetylo-CoA
“OOC — CH2 — CO Oj S — CoA
Malonylo-CoA
Enz —bioty na — COO
Enz— biotyna
Ryc. 23-1. Biosynteza malonylo-CoA (Enz - karboksylaza acetylo-CoA).
Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego
jest polipeptydem zawierającym siedem
aktywności enzymatycznych
U bakterii i roślin poszczególne enzymy układu
syntazy kwasu tłuszczowego istnieją oddziel¬
nie, a reszty acylowe występują w połączeniu
z białkiem, nazywanym białkiem przenoszą¬
cym acyl (ACP - acyl carrier protein). U droż¬
dży, ssaków i ptaków układ syntazy jest wieloen-
zymowym kompleksem polipeptydowym, który
zawiera ACP przejmujące rolę CoA. Zawiera
on witaminę - kwas pantotenowy w formie
4'-fosfopanteteiny (p. ryc. 44-18). Połączenie
SH podjednostek , SH
4'-Fosfo- Cys
Ryc. 23-2. Wieloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego. Kompleks jest dimerem o dwóch identycznych monomerach poli-
peptydowych 1 i 2, każdy z nich składający się z siedmiu aktywności enzymatycznych oraz białka przenoszącego acyl (ACP). (Cys—SH
- tiol cysteiny). Grupa —SH 4'-fosfopanteteiny jednego z monomerów jest w bliskim sąsiedztwie grupy —SH cysteinylowej reszty
syntazy ketoacylowej drugiego monomeru, co wskazuje na ułożenie „głową do ogona" dwóch monomerów wobec siebie. Chociaż
każdy z monomerów zawiera wszystkie cząstkowe aktywności całego ciągu reakcji, rzeczywista funkcjonalna jednostka składa się
z połowy jednego z monomerów, która współdziała z komplementarną połową drugiego monomeru. W ten sposób dwa łańcuchy
acylowe są wytwarzane jednocześnie.
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 243
Ryc. 23-3. Biosynteza dtugotańcuchowych kwasów tłuszczowych. Przedstawiono szczegółowo, w jaki sposób dodawanie reszty ma-
lonylowej powoduje, że łańcuch acylowy wydłuża się o dwa atomy węgla. (Cys - reszta cysteiny; Pan - 4'-fosfopanteteina). Bloki
pokazane na ciemniejszym tle zawierają początkowo jednostkę C2, pochodzącą z acetylo-CoA (jak zilustrowano), a następnie jednostkę
C„ utworzoną w reakcji 5.
244 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
wszystkich enzymów określonego szlaku meta¬
bolicznego w jedną wieloenzymową, funkcjo¬
nalną jednostkę jest korzystne, gdyż daje efekt
kompartmentacji procesu wewnątrz komórki bez
stwarzania barier przepuszczalności, przy czym
synteza wszystkich enzymów kompleksu jest
skoordynowana, ponieważ są one zakodowane
w jednym genie.
U ssaków kompleks syntazy kwasu tłuszczowe¬
go jest dimerem, składającym się z dwóch iden¬
tycznych monomerów, z których każdy wykazuje
wszystkie siedem aktywności enzymatycznych
syntazy kwasu tłuszczowego, pochodzących od
składowych kompleksu wieloenzymowego zgro¬
madzonych na jednym łańcuchu polipeptydo-
wym (ryc. 23-2). Najpierw cząsteczka inicjująca
- acetylo-CoA łączy się z grupą —SH cysteiny,
co jest katalizowane przez transacylazę acetylo-
wą (ryc. 23-3, reakcja la). Malonylo-CoA łączy
się z sąsiednią grupą —SH na 4'-fosfopanteteinie
złączonej z ACP drugiego monomeru i w reakcji
katalizowanej przez transacylazę malonylową
(reakcja lb) tworzy połączenie acetylo(acylo-)
malonyloenzym. Acetylowa grupa atakuje grupę
metylenową reszty malonylowej w reakcji katali¬
zowanej przez syntazę 3-ketoacylową i uwalnia
C02, tworząc 3-ketoacyloenzym (acetoacetyloen-
zym). Powoduje to, że zostaje uwolniona grupa
—SH cysteiny, związana dotychczas przez grupę
acetylową. Dekarboksylacja pozwala na zajście re¬
akcji do końca dzięki temu, że działa jako siła po¬
ciągająca całą sekwencję reakcji. Powstała grupa
3-ketoacylowa zostaje zredukowana, odwodniona
i ponownie zredukowana, dzięki czemu tworzy
się odpowiedni nasycony acylo-S-enzym. Nowa
cząsteczka malonylo-CoA łączy się z grupą—SH
4'-fosfopanteteiny, wypierając nasyconą resztę
acylowąna wolną grupę —SH cysteiny. Powyższa
sekwencja reakcji powtarza się jeszcze sześć razy,
za każdym razem włącza się nowa reszta malony-
lowa, aż do czasu powstania reszty 16-węglowej
(palmitoilowej). Jest ona uwalniana z kompleksu
enzymatycznego z udziałem siódmego enzy¬
mu znajdującego się w kompleksie - tioestera-
zy (deacylazy). Wolny palmitynian musi zostać
zaktywowany do acylo-CoA, zanim będzie mógł
wejść do jakiegokolwiek innego szlaku metabo¬
licznego. Zazwyczaj jego losem jest estryfikacja
do acylogliceroli, przedłużenie łańcucha lub desa-
turacja, albo estryfikacja z cholesterolem. W gru¬
czole sutkowym występuje oddzielna tioesteraza
swoista dla reszt acylowych Cg, C10 lub CI2, które
następnie znajdują się w tłuszczach mleka.
Równanie sumaryczne całkowitej syntezy pal-
mitynianu z acetylo-CoA i malonylo-CoA przed¬
stawia się następująco:
CH3C0—S—CoA + 7H00C—CH2—CO—S—CoA +
+ 14NADPH + 14H+—► CH3(CH2)14C00H + 7C02 +
+ 6H20 + 8C0A—SH + 14NADP+
Z acetylo-CoA, użytego jako cząsteczki ini¬
cjującej, tworzą się atomy węgla 15. i 16. pal-
mitynianu. Dodawanie wszystkich następnych
jednostek dwuwęglowych odbywa się przez
uprzednie tworzenie malonylo-CoA. Propiony-
I0-C0A działa jako jednostka inicjująca synte¬
zę długołańcuchowych kwasów tłuszczowych,
złożonych z nieparzystej liczby atomów węgla,
występujących zwłaszcza w tłuszczu i mleku
przeżuwaczy.
Głównym źródłem NADPH dla lipogenezy
jest szlak pentozofosforanowy
NADPH jest zaangażowany, jako donor równo¬
ważników redukcyjnych, w redukcję zarówno
3-ketopochodnych, jak i 2,3-nienasyconych acy¬
lowych pochodnych (ryc. 23-3, reakcje 3 i 5).
Oksydacyjne reakcje szlaku pentozofosforano-
wego (p. rozdz. 21) są głównym źródłem ato¬
mów wodoru niezbędnych do redukcyjnej syn¬
tezy kwasów tłuszczowych. Należy zaznaczyć,
że w tkankach wyspecjalizowanych w aktywnej
lipogenezie, tj. wątrobie, tkance tłuszczowej
i gruczole sutkowym w okresie laktacji, również
występuje aktywny szlak fosfopentozowy. Co
więcej, obydwa te szlaki zachodzą w cytozolu
komórki, tak że nie istnieją przeszkody (takie
jak np. błony) w przenoszeniu NADPH. Innymi
źródłami NADPH są: reakcja przekształcająca
jabłczan w pirogronian, katalizowana przez „en¬
zym jabłczanowy” (dehydrogenazę jabłczano-
wą dekarboksylującą) (ryc. 23-4), oraz reakcja
katalizowana przez pozamitochondrialną dehy¬
drogenazę izocytrynianową (ta ostatnia reak¬
cja prawdopodobnie nie jest istotnym źródłem
NADPH dla lipogenezy, z wyjątkiem zwierząt
przeżuwających).
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 245
Acetylo-CoA jest główną „cegiełką”
budującą kwasy tłuszczowe
Acetylo-CoA jest wytwarzany z węglowodanów
w wyniku utleniania pirogronianu wewnątrz mi-
tochondriów. Nie przenika on jednak swobodnie
do pozamitochondrialnego cytozolu, zasadniczego
miejsca syntezy kwasów tłuszczowych. Cytrynian,
utworzony wskutek kondensacji acetylo-CoA ze
szczawiooctanem w cyklu kwasu cytrynowego za¬
chodzącym we wnętrzu mitochondriów, jest prze¬
noszony do pozamitochondrialnej części komórki
przez transporter trikarboksylanów (kwasów tri-
karboksylowych). Tam ulega on rozbiciu do acety-
lo-CoA i szczawiooctanu w reakcji katalizowanej
przez liazę ATP-cytrynianową, której aktywność
wzrasta w stanie sytości. Powstający acetylo-CoA
może teraz brać udział w tworzeniu malonylo-CoA
i syntezie palmitynianu (ryc. 23-4). Szczawiooctan
z kolei może przejść w jabłczan w reakcji katali¬
zowanej przez zależną od NADH dehydrogenazę
jabłczanową, po czym może nastąpić generacja
NADPH pod wpływem enzymu jabłczanowego.
Powstały NADPH staje się dostępny dla lipoge-
nezy, a pirogronian może być użyty do regeneracji
acetylo-CoApo przetransportowaniu do mitochon-
drium. Ten szlak jest sposobem przenoszenia rów¬
noważników redukcyjnych z pozamitochondrial¬
nego NADH na NADP. Alternatywnym szklakiem
dlajabłczanu jest jego przeniesienie do mitochon-
drium, gdzie może on ponownie utworzyć szcza¬
wiooctan. Należy zwrócić uwagę, że przenośnik
cytrynianu (trikarboksylanów) w błonie mitochon-
drialnej wymaga jabłczanu do wymiany z cytry¬
nianem (p. ryc. 13-10). U przeżuwaczy występuje
bardzo niewiele liazy ATP-cytrynianowej i enzy¬
mu jabłczanowego, prawdopodobnie dlatego, że
u tych gatunków octan (pochodzący z żołądka
żwacza i aktywowany do acetylo-CoA w prze¬
strzeni pozamitochondrialnej) jest głównym źród¬
łem acetylo-CoA.
Elongacja łańcuchów kwasów
tłuszczowych zachodzi w siateczce
śródplazmatycznej
W tym szlaku metabolicznym (elongacyjny układ
mikrosomalny) zostają wydłużone nasycone i nie¬
nasycone pochodne acylo-CoA kwasów tłuszczo¬
wych (począwszy od C10) o dwa atomy węgla, do
czego jest potrzebny malonylo-CoA jako donor
acetylu i NADPH jako czynnik redukujący, co jest
katalizowane przez mikrosomalny układ enzymów
nazywany elongazą kwasu tłuszczowego (ryc.
23-5). Elongacja stearoilo-CoA w mózgu wzrasta
szybko w okresie mielinizacji, aby dostarczyć kwa¬
sy tłuszczowe C22 i C24 dla syntezy sfingolipidów.
STAN ODŻYWIENIA REGULUJE
LIPOGENEZĘ
Wiele zwierząt magazynuje nadmiar węglowo¬
danów w postaci tłuszczu, aby przetrwać okresy
niedoboru kalorycznego, takie jak głód, hiberna¬
cja, oraz aby zagwarantować sobie dostarczenie
użytecznej energii pomiędzy posiłkami, co doty¬
czy zwierząt - także człowieka - spożywających
pokarm w formie oddzielonych w czasie posiłków.
Lipogeneza przemienia w tłuszcz nadmiar glukozy
i takich intermediatów, jak pirogronian, mleczan
i acetylo-CoA, co stanowi anaboliczną fazę cyklu
żywieniowego. Stan odżywienia organizmu jest
głównym czynnikiem regulującym szybkość lipo-
genezy. I tak, szybkość ta jest większa u dobrze
odżywionego zwierzęcia, którego dieta zawiera
dużo węglowodanów. Zmniejsza się w warunkach
ograniczonego dostarczania pokarmu energetycz¬
nego, diety bogatotłuszczowej lub gdy występuje
niedobór insuliny, jak to jest w przypadku cukrzy¬
cy. Stany te charakteryzują się zwiększonym stę¬
żeniem wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu
krwi, a wykazano odwrotną zależność między wą¬
trobową lipogenezą i stężeniem wolnych kwasów
tłuszczowych w osoczu. Lipogeneza wzrasta, gdy
spożywa się sacharozę zamiast glukozy, ponieważ
fruktoza omija punkt kontrolny w glikolizie, sta¬
nowiony przez fosfofruktokinazę, i zasila szlak
lipogenezy (p. ryc. 21-5).
LIPOGENEZA JEST REGULOWANA PRZEZ
MECHANIZMY KRÓTKOTERMINOWE
I DŁUGOTERMINOWE
Synteza długołańcuchowych kwasów tłuszczo¬
wych jest kontrolowana w trybie krótkotermino¬
wym przez allosteryczne i kowalencyjne mody¬
fikacje enzymów, a w trybie długoterminowym
- przez zmiany ekspresji genów warunkujących
syntezę enzymów.
246 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Palmitynian
Ryc. 23-4. Dostarczanie acetylo-CoA i NADPH dla lipogenezy. (PPP - szlak pentozofosforanowy, T - przenośnik trikarboksylanów,
K - przenośnik a-ketoglutaranu, P - przenośnik pirogronianu).
Karboksylaza acetylo-CoA
jest najważniejszym enzymem
w regulacji lipogenezy
Karboksylaza acetylo-CoA jest enzymem alloste-
rycznym i jest aktywowana przez cytrynian, któ¬
rego stężenie wzrasta w stanie dobrego odżywienia
i jest wskaźnikiem obfitego dostarczania acetylo-
-CoA. Cytrynian przemienia enzym z jego nieak¬
tywnej formy dimerycznej w aktywną postać poli-
meryczną o masie cząsteczkowej wielu milionów
daltonów. Inaktywacja następuje przez fosforyla-
cję enzymu i sprzyjają jej cząsteczki acylo-CoA
o długim łańcuchu węglowym, co jest przykładem
hamowania zwrotnego przez produkt reakcji. Ozna¬
cza to, że jeśli gromadzi się acylo-CoA - wskutek
zbyt powolnej estryfikacji albo ze względu na pod¬
wyższoną lipolizę lub napływ wolnych kwasów
tłuszczowych do tkanki - automatycznie zmniej¬
sza się synteza nowych kwasów tłuszczowych.
Mitochondrialny transporter trikarboksylanów
również jest hamowany przez acylo-CoA, co za¬
pobiega aktywacji enzymu przez cytrynian wypły¬
wający z mitochondriów do cytozolu.
Karboksylaza acetylo-CoA jest regulowana
również przez hormony, takie jak glukagon, ad¬
renalina i insulina, poprzez zmianę jej stanu ufo-
sforylowania (szczegóły na ryc. 23-6).
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 247
Dehydrogenaza pirogronianowa jest także
regulowana przez acylo-CoA
°CH2—°C rV S— CoA + *CH2 — C '"V' S — CoA
‘COOH
Acylo-CoA
SYNTAZA
3-KETOACYLO-CoA
Malonylo-CoA
CoA • SH + *C02
O O
II II
R —°CHo —°C —"CHo —*C r\J S — CoA
Acylo-CoA hamuje aktywność dehydrogenazy
pirogronianowej, hamując wymienny trans¬
porter ATP-ADP wewnętrznej błony mito-
chondrialnej. Powoduje to wzrost wartości we-
wnątrzmitochondrialnego ilorazu [ATP]/[ADP]
i w konsekwencji przekształcenie aktywnej
postaci dehydrogenazy pirogronianowej w nie¬
aktywną (p. ryc. 18-6). W ten sposób jest re¬
gulowana możliwość udziału acetylo-CoA
w procesie lipogenezy. Ponadto utlenianie acy-
lo-CoA, wynikające ze zwiększonego stężenia
3-Ketoacylo-CoA
REDUKTAZA
3-KETOACYLO-CoA
r
NADPH + H+
0
R — CH2 — CH — CH2 - C ^ S - CoA
3-Hydroksyacylo-CoA
HYDRATAZA
H20
0
R —°CH2 —°CH =*CH -CO/S - CoA
2,3-Nienasycony acylo-CoA
REDUKTAZA
2,3-NIENASYCONYCH
ACYLO-CoA
r
NADPH + H+
NADP+
0
R —°CH2 “°CH2-*CH2 - C Our S - CoA
Acylo-CoA
Ryc. 23-5. Mikrosomalny układ elongazy dla przedłużania
łańcucha kwasu tłuszczowego. NADH jest także używany
w reakcjach katalizowanych przez reduktazy, ale NADPH jest
preferowany.
Ryc. 23-6. Regulacja karboksylazy acetylo-CoA przez fosforyla-
cję/defosforylację. Enzym zostaje inaktywowany w reakcji fosfo¬
rylacji z udziałem kinazy białek aktywowanej przez AMP (AMPK),
która z kolei jest fosforylowana i aktywowana przez kinazę ak¬
tywowanej przez inną kinazę (AMPKK). Glukagon (i adrenalina)
zwiększają stężenie cAMP i wobec tego aktywują ten ostatni en¬
zym za pośrednictwem zależnej od cAMP kinazy białek. Uważa
się, że enzym kinaza kinazy jest także aktywowana przez acylo-
CoA. Insulina aktywuje karboksylazę acetylo-CoA prawdopodob¬
nie poprzez „białko aktywatorowe” oraz kinazę białek stymulowa¬
ną przez insulinę.
248 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
wolnych kwasów tłuszczowych, może wpłynąć
na wzrost wartości ilorazów [acetylo-CoA]/
/[CoA] i [NADH]/[NAD ] w mitochondriach,
co spowoduje zmniejszenie aktywności dehy¬
drogenazy pirogronianowej.
Insulina reguluje lipogenezę także
poprzez inne mechanizmy
Insulina stymuluje lipogenezę poprzez kilka
innych mechanizmów, jak również przez zwięk¬
szenie aktywności karboksylazy acetylo-CoA.
Hormon zwiększa transport glukozy do komórki
(np. w tkance tłuszczowej), zwiększając dostęp¬
ność zarówno pirogronianu dla syntezy kwasów
tłuszczowych, jak i glicerolo-3-fosforanu dla
estryfikacji nowo utworzonych kwasów tłusz¬
czowych. Powoduje też przekształcenie nieak¬
tywnej formy dehydrogenazy pirogronianowej
w formę aktywną, lecz w tkance tłuszczowej,
a nie w wątrobie. Insulina - dzięki zdolności ob¬
niżania poziomu wewnątrzkomórkowego cAMP
- hamuje lipolizę w tkance tłuszczowej, a przez
to zmniejsza stężenie wolnych kwasów tłusz¬
czowych w osoczu, w tym również acylo-CoA
o długim łańcuchu węglowym, który jest zna¬
nym inhibitorem lipogenezy.
NIEKTÓRE WIELONIENASYCONE
KWASY TŁUSZCZOWE NIE MOGĄ BYĆ
SYNTETYZOWANE PRZEZ SSAKI, SA
WIĘC NIEZBĘDNYMI SKŁADNIKAMI
POKARMU
Niektóre długołańcuchowe nienasycone kwasy
tłuszczowe o metabolicznym znaczeniu u ssa¬
ków pokazano na ryc. 23-7. Inne polienowe kwa¬
sy tłuszczowe C20, C22 i C24 mogą powstawać
przez elongację z kwasów oleinowego, linolo¬
wego i a-linolenowego. Kwasy palmitooleinowy
i oleinowy nie należą do kwasów niezbędnych
w diecie, ponieważ tkanki mogą wprowadzać po¬
dwójne wiązanie w pozycji A9 nasyconego kwasu
AA/WWV\
16 9 COOH
Kwas palmitooleinowy (oj 7,16:1, A9)
/wvuwv\
18 9 COOH
Kwas oleinowy (o) 9,18:1, A9)
MHAA/W”
18
*Kwas linolowy (o) 6,18:2, A9,12)
Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego A A. A. AAAA
i karboksylaza acetylo-CoA 8 5 12 9 C00H
są enzymami adaptacyjnymi *Kwas “**»«»«»* im, a9'215)
Organizm dostosowuje wymienione w tytule enzy¬
my do swoich fizjologicznych potrzeb, zwiększając
ich całkowitą ilość w stanie sytości i zmniejszając
w stanie głodu, w przypadku spożywania dużych
ilości tłuszczu oraz w cukrzycy. Insulina jest waż¬
nym hormonem powodującym ekspresję genu
i indukcję biosyntezy enzymu, natomiast glukagon
(poprzez cAMP) przeciwdziała temu. Spożywanie
tłuszczów zawierających wielonienasycone kwasy
tłuszczowe reguluje w sposób skoordynowany ha¬
mowanie ekspresji kluczowych enzymów glikolizy
i glukoneogenezy. Potrzeba kilku dni, aby działa¬
nie tych długoterminowych mechanizmów kontroli
lipogenezy w pełni się rozwinęło i spowodowało
wzrost bezpośredniego efektu działania wolnych
kwasów tłuszczowych i hormonów, takich jak in¬
sulina i glukagon.
/w=v=v=v=w
20
*Kwas arachidonowy (oj 6,20:4, a5,8,11,14)
20 17 14 11 8 5 COOH
Kwas ikozapentaenowy (oj 3,20:5, a5,8*11,14,17)
Ryc. 23-7. Budowa niektórych nienasyconych kwasów tłuszczo¬
wych. Chociaż atomy węgla są numerowane konwencjonalnie,
tzn. od atomu węgla karboksylowego, liczby poprzedzone grecką
literą co (np. co7 w kwasie palmitooleinowym) oznaczają pozycję
liczoną od przeciwnego końca (końcowej grupy metylowej) czą¬
steczki. Informacja podana w nawiasach wskazuje, że np. kwas
a-linolenowy ma podwójne wiązania począwszy od C3, licząc od
końca metylowego, ma 18 atomów węgla i 3 podwójne wiązania
oraz że te wiązania są umiejscowione przy 9., 12. i 15. atomie
węgla, licząc od końca karboksylowego. Gwiazdka (*) oznacza,
że dany związek jest egzogennym kwasem tłuszczowym.
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 249
r
Cyt b5
Oo + NADH + H+
Oleilo-CoA
Ryc. 23-8. Mikrosomalna A9 desaturaza.
tłuszczowego. Kwasy linolowy i a-linolenowy są
jedynymi kwasami tłuszczowymi, o których wia¬
domo, że są niezbędnymi składnikami pożywie¬
nia dla wielu gatunków zwierząt, łącznie z czło¬
wiekiem, i dlatego nazywa się je egzogennymi
kwasami tłuszczowymi. U większości ssaków
kwas arachidonowy może być tworzony z kwa¬
su linolowego (ryc. 23-10). Podwójne wiązania
mogą być wprowadzane w pozycjach A4, A5, A6
oraz A9 (p. rozdz. 15) u większości zwierząt, ale
nigdy w pozycje dalsze niż A9. W przeciwieństwie
do tego, rośliny są zdolne do syntetyzowania eg¬
zogennych kwasów tłuszczowych przez wprowa¬
dzanie podwójnych wiązań w pozycje A12 i A15.
JEDNONIENASYCONE KWASY
TŁUSZCZOWE SA SYNTETYZOWANE
PRZEZ UKŁAD A9 DESATURAZY
Uważa się, że wiele tkanek, łącznie z wątrobą,
jest odpowiedzialnych za tworzenie jednonie-
nasyconych kwasów tłuszczowych z odpowied¬
nich kwasów nasyconych. Pierwsze podwójne
wiązanie jest wprowadzane do nasyconego kwa¬
su tłuszczowego prawie zawsze w pozycji A9.
Układ enzymatyczny A9 desaturaza (ryc. 23-8)
w siateczce śródplazmatycznej katalizuje prze¬
kształcenie palmitoilo-CoA w palmitooleilo-CoA
albo przekształcenie stearoilo-CoA w oleilo-CoA.
Do reakcji jest niezbędny tlen oraz NADH lub
NADPH. Enzymy uczestniczące w tej reakcji
wydają się podobne do układu monooksygenazy
zawierającego cytochrom b5 (rozdz. 12).
W SYNTEZIE WIELONIENASYCONYCH
KWASÓW TŁUSZCZOWYCH UCZESTNICZĄ
UKŁADY ENZYMATYCZNE DESATURAZY
IELONGAZY
Dodatkowe wiązania podwójne, wprowadzane
do istniejących już jednonienasyconych kwasów
tłuszczowych, zawsze są oddzielone od siebie
grupą metylenową (wyjątkiem są bakterie). Po¬
nieważ u zwierząt występuje A9 desaturaza, są one
zdolne do kompletnego syntetyzowania rodziny
co9 (kwasu oleinowego) nienasyconych kwasów
tłuszczowych dzięki połączeniu elongacji i de-
saturacji (ryc. 23-9). Jak jednak wspomniano,
kwasy linolowy (coó) lub a-linolenowy (co3), nie¬
zbędne dla syntezy innych wielonienasyconych
kwasów tłuszczowych należących do rodziny coó
i co3, muszą być dostarczone z dietą. Linolan może
być przekształcony w arachidonian z udziałem
y-linolenianu w szlaku pokazanym na ryc. 23-10.
Rodzina
©9
24:1
22:1
Rodzina
©6
Rodzina
co3
2
Kwas oleinowy ► 18:2
18:1 4
a-linolenowy
18:3
20:2 —
20:3 ■
X
1 4
-U- 22:3 22:4
Nagromadza się przy niedoborze
egzogennych kwasów tłuszczowych
20:3 —
20:4
22:5
20:3 —
20:4
22:4
22:5
Ryc. 23-9. Biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodzin ©9, co6 i co3. Każdy etap jest katali¬
zowany przez mikrosomalny układ przedłużania łańcucha (elongazę) lub układ desaturazy: 1 - elongaza, 2 - A6
desaturaza, 3 - A5 desaturaza, 4 - A4 desaturaza, [(-) - inhibicja].
250 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
MHA/YW'
Linoleilo-CoA (A9,1z-oktadekadienoilo-CoA)
02 + NADH + H+
2H20 + NAD+
DESATURAZA
y-Linolenoilo-CoA (A6912-oktadekatrienoilo-CoA)
C2
(Malonylo-CoA,
NADPH)
MIKROSOMALNY UKŁAD
PRZEDŁUŻAJĄCY ŁAŃCUCH
(ELONGAZA)
A/\T=V=vHa/V\
o
Dihomo-Y*linolenoilo-CoA (A8,11,14-ikozatrienoilo-CoA)
02 + NADH + H'
2H20 + NAD'
A5
DESATURAZA
0
AA^=V=V=V=WC
Arachidonoilo-CoA (A5,8,11,14-ikozatetraenoilo-CoA)
Ryc. 23-10. Przemiana kwasu linolowego do arachidonowego.
U kotów nie zachodzi ta przemiana, gdyż nie mają one A6 desa-
turazy, muszą więc otrzymywać arachidonian z pokarmem.
Zapotrzebowanie żywieniowe na arachidonian
nie musi więc być zaspokojone, jeżeli w diecie
znajdzie się odpowiednia ilość linolanu. Układ
desaturacji i elongacji łańcucha węglowego jest
znacznie upośledzony w stanie głodu, jako odpo¬
wiedź na podanie glukagonu i adrenaliny, a także
przy braku insuliny, jak to jest w przypadku cuk¬
rzycy typu 1.
OBJAWY NIEDOBORU WYSTĘPUJĄ
WÓWCZAS, GDY BRAK JEST
W DIECIE EGZOGENNYCH KWASÓW
TŁUSZCZOWYCH (EFA)
Szczury karmione oczyszczoną dietą bezlipido-
wą, do której dodano witaminy A i D, wykazują
zmniejszone tempo wzrostu i upośledzoną repro¬
dukcję, które to objawy można leczyć, dodając do
karmy kwas linolowy, a-linolenowy i arachido-
nowy. Kwasy te znajdują się w dużych ilościach
w olejach roślinnych (tabela 15-2), a w małych
- w tuszach zwierzęcych. Egzogenne kwasy tłusz¬
czowe są potrzebne dla wytwarzania prostaglan-
dyn, tromboksanów, leukotrienów i lipoksyn (patrz
dalej), lecz spełniają również różne inne funkcje,
które mniej dokładnie zostały określone. Występu¬
ją one w lipidach strukturalnych komórki, często
w pozycji 2. fosfolipidów, i są odpowiedzialne za
strukturalną integralność błony mitochondrialnej.
Kwas arachidonowy występuje w błonach i sta¬
nowi 5-15% kwasów tłuszczowych w fosfolipi¬
dach. Kwas dokozaheksaenowy (DHA; co3,22:6),
który jest syntetyzowany z kwasu a-linolenowego
lub otrzymywany wprost z tłuszczu ryb, występuje
w dużych stężeniach w siatkówce, korze mózgu,
jądrach i spermie. DHA jest szczególnie potrzeb¬
ny dla rozwoju mózgu i siatkówki, a jest dostar¬
czany za pośrednictwem łożyska i z mlekiem.
Istnieją doniesienia, że pacjenci cierpiący na
retinitis pigmentosa wykazują niskie stężenie
DHA we krwi. Przy niedoborze egzogennych
kwasów tłuszczowych nieegzogenne polienowe
kwasy tłuszczowe rodziny co9, zwłaszcza kwas
A5-8’ n-ikozatrienowy (co9, 20:3) (p. ryc. 23-9) za¬
stępują egzogenne kwasy tłuszczowe w fosfolipi¬
dach, innych złożonych lipidach i błonach. Ozna¬
czanie proporcji trieny: tetraeny w lipidach osocza
krwi może służyć do diagnozowania stopnia nie¬
doboru egzogennych kwasów tłuszczowych.
Nienasycone kwasy tłuszczowe
o konfiguracji trans uczestniczą
w różnych zaburzeniach
Niewielkie ilości frww-nienasyconych kwasów
tłuszczowych znajdują się w tłuszczu przeżu¬
waczy (np. tłuszcz masła zawiera ich 2-7%) na
skutek działania mikroorganizmów w żołądku
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 251
żwaczu, ale głównym źródłem tych związków
w pokarmie człowieka są częściowo uwodo-
rowane oleje roślinne (np. margaryna). Kwasy
tłuszczowe trans zachowują się kompetycyjnie
w stosunku do egzogennych kwasów tłuszczo¬
wych i mogą one pogłębiać niedobór egzogen¬
nych kwasów tłuszczowych. Co więcej, są one
strukturalnie podobne do nasyconych kwasów
tłuszczowych (rozdz. 15) i wywierają porówny¬
walne efekty w pogłębianiu hipercholesterolemii
i miażdżycy naczyń (rozdz. 26).
IKOZANOIDY POWSTAJĄ
Z WIELONIENASYCONYCH KWASÓW
TŁUSZCZOWYCH C20
Arachidonian i niektóre inne wielonienasycone
kwasy tłuszczowe C20 są źródłem ikozanoidów
- czynnych fizjologicznie i farmakologicznie
związków, znanych jako prostaglandyny (PG),
tromboksany (TX), leukotrieny (LT) i lipok-
syny (LX) (rozdz. 15). Pod względem działania
Pokarm
Fosfolipid błonowy
GRUPA 3
Ikozatetraenoan
| +2C
Oktadekatetraenoan
Prostanoidy
P6D3
t
Pokarm
ffyc. 23-11. Trzy grupy ikozanoidów i ich biosyntetyczne pochodzenie (PG - prostaglandyna, PGI - prostacyklina, TX - tromboksan,
LT - leukotrien, LX - lipoksyna, © - szlak cyklooksygenazy, ® - szlak lipoksygenazy). Indeks we frakcji dolnej oznacza ogólną liczbę
podwójnych wiązań w cząsteczce i serię, do której ten związek należy.
252 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
fizjologicznego uważa się je za hormony, lokalnie
działające za pośrednictwem receptorów związa¬
nych z białkiem G w celu ujawnienia ich bioche¬
micznych efektów.
Znane są trzy grupy ikozanoidów, które są syn¬
tetyzowane z kwasów ikozanowych C20, pocho¬
dzących od egzogennych kwasów tłuszczowych
linolanu i a-linolenianu albo bezpośrednio od
zawartych w diecie arachidonianu i ikozapenta-
enonianu (ryc. 23-11). Arachidonian, który może
być otrzymywany z pokarmem, ale zwykle po¬
chodzi z pozycji 2. fosfolipidów w błonie komór¬
kowej, uwalniany pod wpływem fosfolipazy A2
(p. ryc. 24-6), jest substratem w syntezie prosta-
glandyn serii PG2 i prostanoidów TX2w szlaku
cyklooksygenazy albo serii LT4, LX4 w szlaku li-
pooksygenazy; obydwa szlaki konkurują ze sobą
o substrat - arachidonian (ryc. 23-11).
SZLAK CYKLOOKSYGENAZY JEST
ODPOWIEDZIALNY ZA SYNTEZĘ
PROSTANOIDÓW
Biosynteza prostanoidów (ryc. 23-12), podczas
której zużywane są dwie cząsteczki 02, jest ka¬
talizowana przez cyklooksygenazę (COX) (nazy¬
waną także syntazą prostaglandyny H); enzym
ten wykazuje dwie odrębne aktywności - cyklo¬
oksygenazy i peroksydazy.
COX występuje w postaci dwóch izoenzymów
- COX-l i COX-2. Produkt reakcji, który jest
endoperoksydem (PGH), ulega przemianie do
prostaglandyn D i E, jak również do trombok-
sanu (TXA2) i prostacykliny (PGI2). Każdy typ
komórki produkuje tylko jeden typ prostanoidu.
Aspiryna (kwas acetylosalicylowy), niestero-
idowy lek przeciwzapalny (NSAID), hamuje
Arachidonian
PGF2a PGD2 TXB2
Ryc. 23-12. Przemiana kwasu arachidonowego do prostaglandyn i tromboksanów serii 2 (PG - prostaglandyna, TX - tromboksan, PGI
- prostacyklina, HHT - hydroksyheptadekatrienoan). (Obydwie aktywności oznaczone gwiazdką (*) są związane z jednym enzymem
- syntazą H prostaglandyny). Podobne przemiany zachodzą z udziałem prostaglandyn i tromboksanów serii 1 i 3.
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 253
COX-l i COX-2. Inne niesteroidowe leki prze¬
ciwzapalne, łącznie z indometacyną i ibupro-
fenem, zwykle hamują cyklooksygenazy przez
kompetycję o arachidonian. Ponieważ inhibicja
COX-l powoduje podrażnienie żołądka, często
związane z przyjmowaniem niesteroidowych le¬
ków przeciwzapalnych, opracowywane są nowe
leki, które by selektywnie hamowały COX-2.
Transkrypcja COX-2, ale nie COX-l, jest całko¬
wicie hamowana przez przeciwzapalne korty-
kosteroidy.
Egzogenne kwasy tłuszczowe
nie wywołują wszystkich swoich efektów
fizjologicznych poprzez
syntezo prostaglandyn
Rola egzogennych kwasów tłuszczowych w two¬
rzeniu błon nie ma związku z powstawaniem pro¬
staglandyn. Prostaglandyny nie usuwają objawów
niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych,
a objawy niedoboru nie są wywoływane przez za¬
hamowanie syntetazy prostaglandyn.
Cyklooksygenaza jest „enzymem
samobójczym”
„Wyłączenie” działania prostaglandyny następuje
dzięki szczególnej właściwości cyklooksygenazy
- samokatalizującej się destrukcji; to oznacza, że
jest to „enzym samobójczy”. Ponadto inaktywacja
prostaglandyn przez dehydrogenazę 15-hydro-
ksyprostaglandynową jest szybka. Blokowanie
działania tego enzymu przez sulfasalazynę lub
indometacynę może przedłużyć okres półtrwania
prostaglandyn w organizmie.
LEUKOTRIENYILIPOKSYNY
SĄ WYTWARZANE W SZLAKU
LIPOKSYGENAZY
Leukotrieny stanowią rodzinę sprzężonych trie¬
rów, wytwarzanych z kwasów ikozanowych
w leukocytach, komórkach mastocytoma, płyt¬
kach krwi i makrofagach, w szlaku lipoksyge-
nazy, w odpowiedzi na bodźce immunologiczne
i nieimmunologiczne. Trzy różne lipoksygenazy
(dioksygenazy) katalizują przyłączenie tlenu
w pozycjach 5, 12 i 15 kwasu arachidonowego,
powodując powstawanie hydroperoksydów
(HPETE). Tylko 5-lipoksygenaza wytwarza
leukotrieny (szczegóły na ryc. 23-13). Lipok-
syny stanowią rodzinę sprzężonych tetraenów,
także powstających w leukocytach. Tworzą się
one w wyniku połączonego działania więcej niż
jednej lipoksygenazy (ryc. 23-13).
ASPEKTY KLINICZNE
Wśród objawów niedoboru
egzogennych kwasów tłuszczowych
u ludzi sa zmiany skórne oraz
upośledzenie transportu lipidów
U dorosłych spożywających przeciętną dietę
nie opisywano objawów niedoborów egzogen¬
nych kwasów tłuszczowych. Dzieci otrzymują¬
ce pożywienie ubogie w tłuszcze oraz pacjenci
utrzymywani przez długi czas wyłącznie na ży¬
wieniu dożylnym, ubogim w egzogenne kwa¬
sy tłuszczowe, wykazują objawy niedoboru,
którym można zapobiec przez podawanie eg¬
zogennego kwasu tłuszczowego w ilości odpo¬
wiadającej 1-2% całkowitego zapotrzebowania
energetycznego.
Nieprawidłowy metabolizm
egzogennych kwasów tłuszczowych
występuję w wielu chorobach
Nieprawidłowy metabolizm egzogennych
kwasów tłuszczowych, który może być zwią¬
zany z niedoborem pokarmowym, stwierdza¬
no u chorych z torbielowatym zwłóknieniem
trzustki, w acroderma enteropathica, zespole
wątrobowo-nerkowym, zespole Sjógrena-Lars-
sona, wieloukładowym zwyrodnieniu nerwów,
chorobie Crohna, marskości wątroby, alko¬
holizmie oraz zespole Reye’a. Podwyższone
stężenie polienowych kwasów tłuszczowych
o bardzo długich łańcuchach węglowych stwier¬
dzono w mózgu chorych z zespołem Zellwegera
(rozdz. 22). Spożywanie pokarmów o wysokim
stosunku P : S (wielonienasycone : nasycone
kwasy tłuszczowe) zmniejsza stężenie chole¬
sterolu w surowicy krwi i jest uważane za sku¬
teczne w ograniczaniu ryzyka rozwoju choroby
wieńcowej serca.
254 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 23-13. Przemiana kwasu arachidonowego do leukotrienów i lipoksyn serii 4 szlakiem lipoksygenazy. Niektóre podobne prze- '
miany zachodzą w seriach 3 i 5 leukotrienów (HPETE - hydroperoksyikozatetraenoan, HETE - hydroksyikozatetraenoan, © - pero- 1
ksydaza, © - hydrolaza epoksydu leukotrienu A4, © - S-transferaza glutationowa, © - y-glutamylotranspeptydaza, © - dipeptydaza i
cysteinyloglicynowa). I
Prostanoidy sq substancjami o dużej
aktywności biologicznej
Tromboksany są syntetyzowane w płytkach
krwi, a uwolnione z nich - powodują skurcz na¬
czyń i agregację płytek. Synteza ich jest swoiście
hamowana przez małe dawki kwasu acetylosali¬
cylowego. Prostacykliny (PGI2) są wytwarzane ]
przez ściany naczyń krwionośnych i są silny¬
mi inhibitorami agregacji płytek. Tromboksany
i prostacykliny są więc antagonistami. PG3 i TX3
wytwarzane z kwasu ikozapentaenowego (EPA)
hamują uwalnianie arachidonianu z fosfolipidów
oraz tworzenie PG2 i TX2. PGI3 jest tak silnym
23. BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH IIKOZANOIDÓW 255
czynnikiem przeciwdziałającym agregacji płytek
jak PGI2, ale TXA3 słabiej stymuluje agregację
aniżeli TXA2, zmieniając równowagę aktywności
i sprzyjając dłuższemu czasowi krzepnięcia. Już nie¬
wielka ilość prostaglandyn w osoczu, bo 1 ng/mL,
powoduje skurcz mięśni gładkich u zwierząt.
Wśród potencjalnych terapeutycznych zastoso¬
wań prostanoidów są: zapobieganie zapłodnieniu,
sprowokowanie porodu przy donoszonej ciąży,
przerwanie ciąży, zapobieganie wrzodom żołąd¬
ka lub złagodzenie bólów przy wrzodach żołądka,
kontrola stanu zapalnego i ciśnienia krwi, a także
złagodzenie objawów astmy oskrzelowej i obrzę¬
ków błony śluzowej nosa. Ponadto PGD2 jest
silną substancją nasenną. Prostaglandyny powo¬
dują wzrost stężenia cAMP w płytkach, tarczycy,
ciałku żółtym, kościach płodu, przednim płacie
przysadki mózgowej i płucach, ale obniżenie stę¬
żenia cAMP w komórkach kanalików nerkowych
i tkanki tłuszczowej (rozdz. 25).
Leukotrieny i lipoksyny sq silnymi
regulatorami wielu procesów
chorobowych
Wolno reagująca substancja anafilaksji (SRS-A)
£ jest mieszaniną leukotrienów C4, D4 i E4. Miesza¬
nina tych leukotrienów jest silnym czynnikiem
kurczącym mięśniówkę oskrzeli. Substancje te ra¬
zem z leukotrienem B4 zwiększają przepuszczal¬
ność naczyń krwionośnych oraz wywołuj ąchemo-
taksję i aktywację leukocytów, są więc ważnymi
regulatorami w wielu procesach chorobowych,
przebiegających ze stanami zapalnymi i reakcja-
1 mi nadwrażliwości, takimi jak astma oskrzelowa.
Leukotrieny są aktywne w stosunku do naczyń,
a obecność 5-lipoksygenazy stwierdzono w ścia¬
nach naczyń tętniczych. Dane doświadczalne po¬
twierdzają przeciwzapalne działanie lipoksyn na
’ naczynia i ich immunoregulacyjną funkcję, np.
| jako przeciwregulatorowych składników (chalo-
I nów) odpowiedzi immunologicznej,
i
i STRESZCZENIE
• Synteza kwasów tłuszczowych o długim łańcu¬
chu węglowym (lipogeneza) jest katalizowana
| przez dwa układy enzymatyczne: karboksylazę
acetylo-CoA i syntazę kwasu tłuszczowego.
• Ten szlak metaboliczny zamienia acetylo-CoA
w palmitynian, a potrzebuje do swojego prze¬
biegu NADPH, ATP, Mn2+, biotynę, kwas pan¬
totenowy i HC03 jako kofaktorów.
• Karboksylaza acetylo-CoA zamienia acetylo-
-CoA w malonylo-CoA i wówczas syntaza kwa¬
su tłuszczowego, kompleks wieloenzymowy
zbudowany z jednego łańcucha peptydowego,
z siedmioma oddzielnymi aktywnościami en¬
zymatycznymi, katalizuje utworzenie palmity-
nianu z jednej cząsteczki acetylo-CoA i siedmiu
cząsteczek malonylo-CoA.
• Lipogeneza jest regulowana na etapie karbok-
sylazy acetylo-CoA przez allosteryczne mo¬
dyfikatory, przez fosforylację/defosforylację
oraz przez indukcję i represję syntezy enzy¬
mów. Enzym karboksylaza acetylo-CoA jest
allosterycznie aktywowany przez cytrynian,
a deaktywowany przez długołańcuchowy acy-
lo-CoA. Defosforylacja (np. przez insulinę)
wzmaga jego aktywność, a fosforylacja (np.
przez glukagon lub adrenalinę) działa nań ha¬
mująco.
• Biosynteza nienasyconych długołańcuchowych
kwasów tłuszczowych przebiega z udziałem
układów enzymatycznych desaturazy i elon-
gazy, które - odpowiednio - wprowadzają po¬
dwójne wiązania i przedłużają istniejący łań¬
cuch acylowy.
• U zwierząt wyższych występują desaturazy A4,
A5, A6 oraz A9, ale nie może zachodzić proces
wstawiania nowych podwójnych wiązań w po¬
zycje łańcucha kwasu tłuszczowego wyższe niż
9. Dlatego egzogenne kwasy tłuszczowe: kwas
linolowy (coó) i kwas a-linolenowy (co3) muszą
być dostarczane z dietą.
• Ikozanoidy pochodzą z (ikozanowych) kwasów
tłuszczowych C20, syntetyzowanych z egzogen¬
nych kwasów tłuszczowych, i stanowią ważną
grupę związków czynnych fizjologicznie i far¬
makologicznie, zawierających prostaglandyny,
tromboksany, leukotrieny i lipoksyny.
PIŚMIENNICTWO
Cook HW, McMaster CR: Fatty acid desaturation and
chain elongation in eukaryotes. In: Biochemistry of
Lipids, Lipoproteins and Membranes. Vance DE,
Vance JE (editors). Elsevier, 2002.
Fischer S: Dietary polyunsaturated fatty acids and ei-
cosanoid formation in humans. Adv Lipid Res
1989;23:169.
256 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Fitzpatrick FA: Cyclooxygenase enzymes: regulation
and function. Curr Pharm Des 2004; 10:577.
Kim KH: Regulation of mammalian acetyl-coenzyme A
carboxylase. Annu Rev Nutr 1997; 17:77.
McMahon B et al: Lipoxins: revelations on resolution.
Trends Pharmacol Sci 1001 ;22:391.
Rangan VS, Smith S: Fatty acid synthesis in eukaryo-
tes. In: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and
Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Else-
vier, 2002.
Sith S, Witkowski A, Joshi AK: Structural and functio-
nal organisation of the animal fatty acid synthase.
Próg Lipid Res 2003;42:289.
Smith WL, Murphy RC: The eicosanoids: cyclooxyge-
nase, lipoxygenase, and epoxygenase pathways. In:
Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membra¬
nes. Vance DE, Vance JE (editors). Elsevier, 2002.
Wijendran V, Hayes KC: Dietary n-6 and n-3 fatty acid
balance and cardiovascular health. Annu Rev Nutr
2004;24:597.
Metabolizm acylogliceroli
i sfingolipidów
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Acyloglicerole stanowią większość lipidów
w organizmie. Triacyloglicerole są głównymi
lipidami tłuszczu zapasowego i tłuszczu pokar¬
mów; ich rola w transporcie i magazynowaniu
lipidów oraz w patogenezie różnych chorób,
takich jak otyłość, cukrzyca i hiperlipoproteine-
mia, została opisana w następnych rozdziałach.
Amfipatyczna natura fosfolipidów i sfingolipi¬
dów czyni je najodpowiedniejszymi składnika¬
mi lipidów błon komórkowych. Fosfolipidy bio¬
rą również udział w metabolizmie wielu innych
lipidów. Niektóre fosfolipidy spełniają wyspe¬
cjalizowane funkcje, np. dipalmitoilolecytyna
jest głównym składnikiem surfaktantu płucne¬
go, którego brak jest w zespole niewydolności
oddechowej noworodków. Fosfatydyloinozytole
działają w błonie komórkowej jako prekursory
hormonalnego przekaźnika drugorzędowe-
go, a czynnik aktywujący płytki jest alkilo-
fosfolipidem. Glikosfingolipidy zawierające
sfingozynę, reszty cukrowe i kwas tłuszczowy
znajdują się na zewnętrznej powierzchni błony
komórkowej, a ich łańcuchy oligosacharydowe
wystające na zewnątrz tworzą część „glikoka-
liksu” powierzchni komórki i odgrywają rolę
(1) w przyleganiu komórek i rozpoznawaniu ko¬
mórek; (2) jako receptory toksyn bakteryjnych
(np. toksyny przecinkowca cholery); (3) jako
substancje grup krwi ABO. Opisano około tuzina
chorób spichrzania glikolipidów (np. choroba
Gauchera, choroba Taya-Sachsa), każda z nich
spowodowana genetycznym defektem enzymów
uczestniczących w szlaku degradacji glikolipi¬
dów w lizosomach.
KATABOLIZM TRIACYLOGLICEROLI
ROZPOCZYNA HYDROLIZA
Triacyloglicerole muszą zostać zhydrolizowane
przez lipazę do ich składników kwasów tłusz¬
czowych i glicerolu, zanim będzie mógł nastąpić
dalszy katabolizm. W większości hydroliza ta (li-
poliza) zachodzi w tkance tłuszczowej, z uwolnie¬
niem wolnych kwasów tłuszczowych do osocza
krwi, gdzie znajdują się one w postaci związanej
z albuminą. Potem następuje pobieranie wolnych
kwasów tłuszczowych przez tkanki (również takie,
jak wątroba, serce, nerki, mięśnie, płuca, gonady
męskie i tkanka tłuszczowa, w mniejszym stopniu
przez mózg), gdzie są one utleniane lub ponownie
estryfikowane. Stopień wykorzystania glicerolu
zależy od tego, czy dana tkanka zawiera kinazę
glicerolową, której najwięcej występuje w wątro¬
bie, nerkach, jelicie, brunatnej tkance tłuszczowej
i gruczole sutkowym w okresie laktacji.
Glicerolo-3-fosforan m ► Dihydroksyacetonofosforan
I I 1
Fosfatydan Plazmalogeny PAF
Diacyloglicerol Kardiolipina Fosfatydyloinozytol
Fosfatydylocholina Triacyloglicerol 4,5-Bisfosforan
fosfatydyloetanoloamina fosfatydyloinozytolu
Ryc. 24-1. Ogólny schemat biosyntezy acylogliceroli (PAF
- czynnik aktywujący płytki).
258 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
OH
H2C
HO-C
I
h2c
Glicerol
OH
H2C-
o-c-
i
DEHYDROGENAZA
GLICEROLO*
-3-FOSFORANOWA
Acylo-CoA (głównie nasycony)
ACYLOTRANSFERAZA
GLICEROLO-
-3-FOSFORANOWA
H2C-OH
- C = 0 —
H2C-0-®
CoA
r C-O-C-
II 1
O H2C-
h2c — O—C—I
HO-CH
I
H2C-0-®
1-Acyloglicerolo-
-3-fosforan
(lizofosfatydan)
Ryc. 24-2. Biosynteza triacyloglicerolu i fosfolipidów (© - szlak monoacyloglicerolowy, © - szlak
glicerolofosforanowy). Fosfatydyloetanoloamina może być wytworzona z etanoloaminy szlakiem
metabolicznym podobnym do szlaku powstawania fosfatydylocholiny z choliny.
r2-c-
8
o-c-
I ^
H2C —O—®—Inozytol -(J
4,5-Bislosloran loslatydyloinozylolu
24. METABOLIZM ACYLOGLICEROLIISFINGOLIPIDÓW 259
TRIACYLOGLICEROLEI FOSFOGLICEROLE
POWSTAJĄ W WYNIKU ACYLACJI
TRIOZOFOSFORANÓW
Główne szlaki biosyntezy triacyloglicerolu i fo-
sfoglicerolu przedstawiono schematycznie na ryc.
24-1. Ważne związki, takie jak triacyloglicerole,
fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina, fo-
sfatydyloinozytol i kardiolipina, składnik błony
mitochondrialnej, są tworzone z 3-fosfoglicerolu.
Znaczące miejsca rozgałęzienia tego szlaku na-
stępująna etapach fosfatydanu i diacyloglicerolu.
Z fosfodihydroksyacetonu pochodzą fosfoglicero-
le zawierające eterowe wiązanie (—C—O—C—),
z których najlepiej znane są plazmalogeny i czyn¬
nik aktywujący płytki (PAF). 3-Fosfoglicerol i fo-
sfodihydroksyaceton są intermediatami w gliko¬
lizie, stanowiąc bardzo ważne połączenie między
metabolizmami węglowodanów i lipidów.
Fosfatydan jest wspólnym prekursorem
w biosyntezie triacylogliceroli, wielu
fostogliceroli i kardiolipiity
Zarówno kwasy tłuszczowe, jak i glicerol mu¬
szą zostać zaktywowane przez ATP, zanim będą
mogły być wbudowane do acylogliceroli. Kina-
za glicerolowa katalizuje aktywację glicerolu do
sw-glicerolo-3-fosforanu. Jeżeli enzym ten jest
nieaktywny lub jego aktywność jest mała, jak
w mięśniach lub w tkance tłuszczowej, większość
glicerolo-3-fosforanu tworzy się z fosfodihydrok¬
syacetonu w reakcji katalizowanej przez dehy¬
drogenazę glicerolo-3-fosforanową (ryc. 24-2).
A. Biosynteza triacylogliceroli
Dwie cząsteczki acylo-CoA, utworzone w wyni¬
ku aktywacji kwasów tłuszczowych pod wpły¬
wem syntetazy acylo-CoA (rozdz. 22), łączą się
z glicerolo-3-fosforanem, tworząc fosfatydan
(fosfo-l,2-diacyloglicerol). Zachodzi to w dwóch
etapach, katalizowanych przez acylotransferazę
glicerolo-3-fosforanową, a następnie przez acy¬
lotransferazę l-acyloglicerolo-3-fosforanową.
Fosfatydan zostaje przekształcony przez fosfohy-
drolazę fosfatydanową i przez acylotransferazę
diacyloglicerolową (DGAT) do 1,2-diacylogli-
cerolu, a następnie do triacyloglicerolu. DGAT
katalizuje jedyny etap przemiany, swoisty dla
syntezy triacyloglicerolu, i ten etap uważa się za
ograniczający szybkość w większości warunków.
W śluzówce jelita acylotransferaza monoacy-
loglicerolowa przemienia monoacyloglicerol
do 1,2-diacyloglicerolu w szlaku monoacylogli-
cerolowym. Największą aktywność enzymy te
wykazują w siateczce śródplazmatycznej, a nie¬
wielką w mitochondriach. Fosfohydrolaza fo-
sfatydanowa znajduje się głównie w cytozolu,
ale forma aktywna tego enzymu związana jest
z błoną.
W biosyntezie fosfatydylocholiny i fosfatydylo-
etanoloaminy (ryc. 24-2) cholina lub etanoloami-
na muszą najpierw zostać zaktywowane w reakcji
fosforylacji z udziałem ATP, a następnie połą¬
czenia z CTP. Powstała CDP-cholina lub CDP-
-etanoloamina reaguje z 1,2-diacyloglicerolem
i tworzy, odpowiednio, fosfatydylocholinę lub
fosfatydyloetanoloaminę. Fosfatydyloseryna po¬
wstaje z fosfatydyloetanoloaminy bezpośrednio
w reakcji z seryną(ryc. 24-2). Z fosfatydyloseryny
może zostać odtworzona fosfatydyloetanoloami¬
na w reakcji dekarboksylacji. Alternatywny szlak
w wątrobie umożliwia utworzenie fosfatydylo¬
choliny bezpośrednio z fosfatydyloetanoloaminy
w wyniku stopniowej metylacji reszty etanoloami-
nowej. Mimo istnienia źródeł powstawania choli¬
ny, jest ona uważana za niezbędny składnik poży¬
wienia wielu gatunków ssaków, oprócz ludzi.
Ryc. 24-3. Biosynteza kardiolipiny.
260 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Regulacja biosyntezy triacyloglicerolu, fosfaty-
dylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy jest kie¬
rowana dostępnością wolnych kwasów tłusz¬
czowych. Te z nich, które unikną utlenienia, są
preferencyjnie przekształcane do fosfolipidów,
a gdy to zapotrzebowanie zostanie zaspokojone,
są zużywane do syntezy triacylogliceroli.
Fosfolipidem występującym w mitochondriach
jest kardiolipina (difosfatydyloglicerol; p. ryc.
15-8). Powstaje ona z fosfatydyloglicerolu, który
z kolei jest syntetyzowany z CDP-diacylogli-
cerolu (ryc. 24-2) i 3-fosfoglicerolu, zgodnie ze
schematem przedstawionym na ryc. 24-3. Kardio¬
lipina, znajdująca się w wewnętrznej błonie mito-
chondrialnej, spełnia kluczową rolę w strukturze
i funkcji mitochondriów, a także uważa się, że
uczestniczy w programowanej śmierci komórki
(apoptozie).
B. Biosynteza gucerolofosfolipidów eterowych
Szlak ten przebiega w peroksysomach. Prekur¬
sorem części glicerolowej glicerolofosfolipidów
eterowych jest fosfodihydroksyaceton (ryc. 24-4).
Ten związek łączy się z acylo-CoA, tworząc
l-acylo-3-fosfodihydroksyaceton. Wiązanie ete¬
rowe tworzy się w następnej reakcji, w której
h2coh
I
o = c
Acylo-CoA
A.
0 R2-(CH2)2-OH
H2C —0 —C —RA H2C-0-(CH2)2-R2 V 1
A ^ 0 = ć
H2Ć — 0—© I SYNTAZA | \ H2Ć-0-®
- 0 = C
NADP+
H2C-0-(CH2)2-R2
HO-C-H
REDUKTAZA | H2Ć -0-®
Dihydroksyacetono-
fosforan
1 -Acylodihydroksy-
acetonofosforan
1 -Alkilodihydroksy-
acetonofosforan
1 -Alkiloglicerolo-3-fosloran
Acylo-CoA
r
o H2C — 0 —(CH2)3 — r2
r3—c — o—c—h
h2c — o —®—ch2 — ch2 - nh2
1 -Alkilo-2-acyloglicerolo-
-3-fosfoetanoloamina
CMP CDP-etanoloamina
_w
H20
F0SF0ETAN0L0-
-AMIN0TRANSFERA2A
CDP-ETANOLOAMINA:
ALKILOACYLOGUCEROL
o H2C — 0 — (CH2)2
r3-c-o-c-h —
I r
H,C - OH I
V
-R2 k J 0 H2C-0%-(CH2)2-R2
R3-C-0-Ć-H
F0SF0HYDR0LAZA | H2Ć-0-®
NADPH, 02(
Cyt 65
1 -Alkilo-2-acyloglicerol
l DESATURAZA |
FOSFOCHOLINOTRANSFERAZA
CDP-CHOLINA:
ALKILOACYLOGUCEROL
0 H2C-0-CH =CH -r2
R3-C-O-Ć-H
H2C — 0 —® — (CH2)2 -nh2
1 -Alkenylo-2-acyloglicerolo-
-3-fosfoetanoloamina,
plazmalogen
1 -Alkilo-2-acyloglicerolo-
•3-fosforan
Alkilodiacyloglicerole
CMP
o H.C-O-W.-R, H;0 Rj_COOH
R3-C-0-C-H v A h2c — 0 —(CH2)2 — r2
h2c-o-®
I
Cholina
1 -Alkilo-2-acyloglicerolo-
-3-fosfocholina
-H0-C-H
I
| F0SF0LIPA2A A; | H2C-O-0
Acetylo-CoA
0 H2C-0-(CH2)2-R
II |
H3C-C-O-C-H
H2C —0—®
I
Cholina
1-Alkilo-2-acetyloglicerolo-3-fosfocholina
PAF
1 -Alkilo-2-lizoglicerolo-
-3-fosfocholina
| ACETYLOTRANSFERAZA
Ryc. 24-4. Biosynteza lipidów eterowych, obejmujących plazmalogeny i czynnik aktywujący płytki (PAF). W szlaku syntezy PAF de
novo acetylo-CoA jest wbudowywany na etapie oznaczonym gwiazdką (*), unika tym samym dwóch ostatnich etapów pokazanych na
tej rycinie.
24. METABOLIZM ACYLOGLICEROLII SFINGOLIPIDÓW 261
powstaje l-alkilo-3-fosfodihydroksyaceton, prze¬
kształcany z kolei w l-alkilo-3-fosfoglicerol. Po
dalszej acylacji w pozycji 2, powstający 1-alkilo-
-2-acylo-3-fosfoglicerol (analogiczny do fosfaty-
danu z ryc. 24-2), jest hydrolizowany do wolnej
pochodnej glicerolu. Plazmalogeny, które stano¬
wią wiele spośród fosfolipidów w mitochondriach,
tworzą się w wyniku desaturacji analogicznej
pochodnej 3-fosfoetanoloaminowej (ryc. 24-4).
Czynnik aktywujący płytki (PAF) (l-alkilo-2-
-acetylo-s«-glicerolo-3-fosfocholina) jest syntety¬
zowany z odpowiedniej pochodnej fosfocholiny.
Jest on wytwarzany przez wiele komórek krwi
i innych tkanek i powoduje agregację płytek
w stężeniach bardzo niskich: 10 11 mol/L. Ma
on także zdolność obniżania ciśnienia krwi oraz
sprzyja powstawaniu owrzodzeń żołądka, jest
również zaangażowany w różnorodne odpowiedzi
biologiczne, takie jak procesy zapalne, chemotak-
sję i fosforylację białek.
Fosfolipazy umożliwiają
degradację oraz przemodelowanie
glicerolofosfolipidów
Chociaż fosfolipidy są aktywnie degradowane,
każda część składowa ich cząsteczki ulega ob¬
rotowi (rozpadowi i resyntezie; ang. tumover)
z odmienną szybkością, np. czas obrotu grupy fo¬
sforanowej jest inny niż grupy 1-acylowej. Jest to
spowodowane obecnością enzymów, które umoż¬
liwiają częściową degradację oraz następującą po
niej resyntezę (ryc. 24-5). Fosfolipaza A2 kata¬
lizuje hydrolizę glicerolofosfolipidu do wolnego
kwasu tłuszczowego i lizofosfolipidu, który może
z kolei zostać ponownie acylowany przez acylo-
-CoA w obecności acylotransferazy.
W alternatywnym szlaku lizofosfolipid (np.
lizolecytyna) może być atakowany przez lizofo-
sfolipazę, usuwającą pozostałą grupę 1-acylową
i pozostawiającą glicerol połączony fosfodiestro-
wo z odpowiednią zasadą. Ten ostatni związek
może być rozkładany przez odpowiednią hydro-
lazę z uwolnieniem glicerolo-3-fosforanu i zasa¬
dy. Fosfolipazy Ar A2, B, C i D atakują wiązania
wskazane na ryc. 24-6. Fosfolipaza A2 znajduje
się w płynie trzustkowym i jadzie węża, jak rów¬
nież w komórkach różnych typów; fosfolipaza C
jest jedną z głównych toksyn wydzielanych przez
o
o H2C — 0 — C — R.
II 2|
H2C - OH
I
HO - C - H
I ^
H2C -0-©-Cholina
Glicerolofosfocholina
H20
HYDROLAZA GLICERYLO-
F0SF0CH0UN0WA
H2C - OH
I
HO - C - H + Cholina
I ^
H2C - 0 -®
s/?-Gllcerolo-3-fosforan
Ryc. 24-5. Metabolizm fosfatydylocholiny (lecytyny).
Ryc. 24-6. Miejsca hydrolitycznego działania fosfolipaz na sub-
stratfosfolipidowy.
262 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
CH3 — (CH2)14 — c — S — CoA “OOC — ch — ch2 — oh
Palmitoilo-CoA Seryna
3-Ketosfinganina
REDUKTAZA
3-KETOSFINGANINOWA
- NADPH + H+
NADP+
NADP
CH3—(CH2)12— ch2 — CH2 — CH — CH — CH2 — OH
OH NH3+
Dihydrosfingozyna (sfinganina)
R — CO — S — CoA
Acylo-CoA N
CoA—SH ^
/WACYLOTRANSFERAZA
DIHYDROSFINGOZYNOWA
CH3— (CH2)12 - CH2 - CH2 - CH - CH - CH2 - OH
I I
OH NH — CO — R
Dihydroceramid
DESATURAZA
DIHYDROCERAMIDOWA
CH3 — (CH2)12 — CH = CH - CH - CH — CH2 — OH
I I
OH NH — CO — R
Ceramid
Ryc. 24-7. Biosynteza ceramidu.
bakterie, a o fosfolipazie D wiadomo, że uczestni¬
czy w przekazywaniu sygnałów u ssaków.
Lizolecytyna (lizofosfatydylocholina) może
powstawać w alternatywnym szlaku, z udzia¬
łem acylotransferazy lecytyna : cholesterol
(LCAT). Enzym ten, występujący w osoczu, ka¬
talizuje przeniesienie reszty kwasu tłuszczowego
z pozycji 2 lecytyny na cholesterol, wytwarzając
ester cholesterolowy. Uważa się, że enzym ten
jest odpowiedzialny za dużą ilość estrów chole¬
sterolowych w lipoproteinach osocza. Długołań-
cuchowe nasycone kwasy tłuszczowe znajdują się
przeważnie w pozycji 1 fosfolipidów, a wielonie-
nasycone kwasy (np. prekursory prostaglandyn)
są wbudowywane częściej w pozycję 2. Wbu¬
dowywanie kwasów tłuszczowych do lecytyny
obejmuje pełną syntezę fosfolipidu, transacylację
między estrami cholesterolowymi i lizolecytyną
oraz bezpośrednią acylację lizolecytyny z acylo-
-CoA. Wobec tego jest możliwa ciągła wymiana
kwasów tłuszczowych, zwłaszcza wprowadzanie
egzogennych kwasów tłuszczowych do cząste¬
czek fosfolipidów.
WSZYSTKIE SFINGOLIPIDY
POWSTAJĄ Z CERAMIDU
Ceramid jest syntetyzowany w siateczce śródpla-
zmatycznej z aminokwasu seryny, jak to pokaza¬
no na ryc. 24-7. Ceramid jest ważną cząsteczką
sygnałową (przekaźnikiem drugorzędowym)
w regulacji różnych szlaków, łącznie z programo¬
waną śmiercią komórki (apoptozą), cyklem ko¬
mórkowym oraz różnicowaniem komórki i proce¬
sem starzenia.
Sfingomieliny (p. ryc. 15-11) są fosfolipidami,
które powstają wtedy, kiedy ceramid reaguje z fo-
sfatydylocholiną i powstaje sfingomielina oraz
diacyloglicerol (ryc. 24-8A). Zachodzi to głów¬
nie w aparacie Golgiego, a w mniejszym stopniu
w błonie plazmatycznej.
A
Ceramid
Sfingomielina
Fosfatydylocholina Diacyloglicerol
V 4 Galaktozyloceramid V
^ ^—► (cerebrozyd)
Sulfogalakto-
zyloceramid
(sulfatyd)
Ryc. 24-8. Biosynteza sfingomieliny (A) oraz ga-
laktozyloceramidu i jego siarczanowej pochodnej
(B) (PAPS - „aktywny siarczan” 5'-fosfosiarczan
3'-fosfoadenozyny).
24. METABOLIZM ACYLOGLICEROLIISFINGOLIPIDÓW 263
Glikosfingoiipidy stanowią połączenie
ceramidu z jedną lub wieloma
resztami cukrowymi
Najprostszymi glikosfingolipidami (cerebrozy-
dami) są galaktozyloceramidy (GalCer) i glu-
kozyloceramidy (GIcCer). GalCer jest głów¬
nym lipidem mieliny, a GIcCer jest głównym
glikosfingolipidem tkanek pozanerwowych oraz
prekursorem większości bardziej złożonych gli-
kosfingolipidów. GalCer (ryc. 24-8B) powstaje
w reakcji między ceramidem i UDPGal (wytwa¬
rzanym przez epimeryzację z UDPGlc - ryc. 21 -6).
Sulfogalaktozyloceramid i inne sulfolipidy, ta¬
kie jak sulfo(galakto)glicerololipidy i siarczany
steroidów są wytwarzane w wyniku kolejnych
reakcji z udziałem 5'-fosfosiarczanu 3'-fosfoade-
nozyny (PAPS; „aktywny siarczan”). Gangliozy-
dy są syntetyzowane z ceramidu przez stopniowe
dodawanie aktywowanych cukrów (np. UDPGlc
i UDPGal) oraz kwasu sialowego, zazwyczaj
kwasu jY-acetyloneuraminowego (ryc. 24-9).
W ten sposób może być wytwarzana ogromna
liczba gangliozydów o coraz większej masie czą¬
steczkowej. Większość enzymów przenoszących
cukry z nukleotydocukrów (glukozylotransfera-
zy) występuje w aparacie Golgiego.
Glikosfingoiipidy są składnikami zewnętrznej
warstwy błony plazmatycznej i odgrywają ważną
rolę w przyleganiu komórek i rozpoznawaniu
komórek. Niektóre są antygenami, np. substan¬
cjami grupowymi krwi ABO. Pewne gangliozydy
działają jako receptory dla toksyn bakteryjnych
(np. dla toksyny cholery, która potem aktywuje
cyklazę adenylanową).
ASPEKTY KLINICZNE
Niedobór surfaktantu płucnego
jest przyczyną zespołu
niewydolności oddechowej
Surfaktant płucny składa się głównie z lipidu
oraz niewielkiej ilości białek i węglowodanów;
zapobiega on zapadaniu się pęcherzyków płuc¬
nych. Fosfolipid dipalmitoilofosfatydylocholina
zmniejsza napięcie powierzchniowe na granicy
faz powietrza i płynu, i dzięki temu wydatek ener¬
getyczny związany z oddychaniem jest znacznie
mniejszy. Inne składniki lipidowe i białkowe sur¬
faktantu także są ważne w wypełnianiu tej funkcji.
Niedobór surfaktantu płucnego w płucach, wy¬
stępujący u wielu niedonoszonych noworodków,
jest przyczyną zespołu dziecięcej niewydolności
oddechowej (IRDS). Podawanie naturalnego lub
sztucznego surfaktantu ma w tych przypadkach
korzystne działanie terapeutyczne.
Glukozylo-
ceramid
(Cer-GIc)
NeuAc
(GM3)
UDP-A/-acetylo-
galaktozoamina
Wyższe gangliozydy
(disialo- i trisialo-
gangliozydy)
UDP UDPGal
Cer-GIc-Gal-GalNAc-Gal
I
NeuAc
Cer-GIc-Gal-GalNAc
I
NeuAc
(G„,)
(Gm!)
Ryc. 24-9. Biosynteza gangliozydów (NeuAc - kwas W-acetyloneuraminowy).
264 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Fosfolipidy i sfingoiipidy mm
udział w patogenezie stwardnienia
rozsianego i lipidoz
Pewne choroby charakteryzują się obecnością
nieprawidłowych ilości tych lipidów w tkankach,
często w układzie nerwowym. Można je podzielić
na dwie grupy: (1) rzeczywiste choroby demieli-
nizacyjne oraz (2) sfingolipidozy.
W stwardnieniu rozsianym, które jest choro¬
bą demielinizacyjną, występuje ubytek zarówno
fosfolipidów (szczególnie plazmalogenu etano-
loaminowego), jak i sfingolipidów z substancji
białej. Wobec tego skład lipidowy substancji bia¬
łej przypomina skład substancji szarej. W płynie
mózgowo-rdzeniowym stężenie fosfolipidów jest
zwiększone.
Sfingolipidozy (choroby spichrzania lipidów)
stanowią grupę dziedzicznych chorób, spowodo¬
wanych genetycznym defektem katabolizmu li¬
pidów zawierających sfingozynę. Choroby te są
częścią większej grupy zaburzeń lizosomalnych
i wykazują kilka stałych cech: (1) Złożone lipi¬
dy zawierające ceramid nagromadzają się w ko¬
mórkach, szczególnie neuronów, co powoduje
zwyrodnienie nerwów i skrócenie okresu życia.
(2) Szybkość syntezy nagromadzanych lipidów
jest normalna. (3) Defekt enzymatyczny dotyczy
lizosomalnego szlaku degradacji sfingolipidów.
(4) Stopień niedoboru aktywności enzymu, któ¬
rego defekt dotyczy, jest podobny we wszystkich
tkankach. Nie ma skutecznego leczenia wielu
tych chorób, chociaż pewien sukces osiągnięto
postępowaniem polegającym na zastępowaniu
enzymu i przeszczepianiu szpiku kostnego, m.in.
w terapii chorób Gauchera i Fabry’ego. Innymi
obiecującymi sposobami są: terapia polegająca na
wyeliminowaniu substratu, co prowadzi do zaha¬
mowania syntezy sfingolipidów, oraz chemiczna
terapia z zastosowaniem białek opiekuńczych.
Terapia genowa zaburzeń lizosomalnych znajdu¬
je się obecnie w fazie badań. Niektóre przykłady
ważniejszych chorób spichrzania lipidów podano
w tabeli 24-1.
Wieloraki niedobór sulfataz powoduje nagro¬
madzanie sulfogalaktozyloceramidu, siarczanów
steroidowych i proteoglikanów dzięki złożonemu
niedoborowi arylosulfataz A, B i C oraz sulfatazy
steroidowej.
Tabela 24-1. Przykłady sfingolipidoz
Choroba
Niedobór enzymu
Nagromadzany lipid
Objawy kliniczne
Choroba Taya-Sachsa
Heksozoaminidaza A
Cer—Gic—Gal(NeuAc)-i-GalNAc
GM2Gangliozyd
Niedorozwój umysłowy, ślepota, osłabienie
mięśni
Choroba Fabry’ego
a-Galaktozydaza
Cer—Gic—Gal—i—Gal
Globotriaozyloceramid
Wykwity skórne, niewydolność nerek (pełne
objawy tylko u mężczyzn; gen recesywny
związany z chromosomem X)
Leukodystrofia
metachromatyczna
Arylosulfataza A
Cer—Gal—i—OSO3
3-Sulfogalaktozyloceramid
Niedorozwój umysłowy, u dorosłych
zaburzenia psychiczne, demielinizacja
Choroba Krabbego
P-Galaktozydaza
Cer-^Gal
Galaktozyloceramid
Niedorozwój umysłowy, niemal zupełny brak
mieliny
Choroba Gauchera
P-Glukozydaza
Cer-^GIc
Glukozyloceramid
Powiększona wątroba i śledziona, ubytki
osteolityczne kości długich, niedorozwój
umysłowy u dzieci
Choroba
Niemanna-Picka
Sfingomielinaza
Cer-j-P-cholina
Sfingomielina
Powiększona wątroba i śledziona,
niedorozwój umysłowy, zgon we
wczesnym okresie życia
Choroba Farbera
Ceramidaza
Acyl-^Sfingozyna
Ceramid
Chrypka, zapalenie skóry, deformacja
kośćca, niedorozwój umysłowy, zgon we
wczesnym okresie życia
24. METABOLIZM ACYLOGLICEROLIISFINGOLIPIDÓW 265
STRESZCZENIE
• Triacyloglicerole są głównymi lipidami zapaso¬
wymi magazynującymi energię, a fosfoglicero-
le, sfingomielina i glikosfingolipidy mają właś¬
ciwości amfipatyczne i spełniają strukturalne
funkcje w błonach komórkowych, jak również
inne wyspecjalizowane zadania.
• Triacyloglicerole i niektóre fosfoglicerole są syn¬
tetyzowane metodą stopniowej acylacji 3-fosfo-
glicerolu. Na etapie fosfatydanu szlak rozgałęzia
się na szlak tworzenia fosfolipidów inozytolu
i kardiolipiny oraz szlak powstawania cholinofo-
sfolipidów i etanoloaminofosfolipidów.
• Plazmalogeny i czynnik aktywujący płytki
(PAF) są fosfolipidami eterowymi, syntetyzo¬
wanymi z fosfodihydroksyacetonu.
• Sfingolipidy powstają z ceramidu (Ar-acylo-
sfingozyny). Sfingomielina występuje w bło¬
nach organelli komórkowych zaangażowanych
w procesy wydzielania (np. aparat Golgiego).
Najprostsze glikosfingolipidy stanowią połą¬
czenie ceramidu z resztą cukrową (np. GalCer
w mielinie). Gangliozydy są bardziej złożony¬
mi glikosfingolipidami, zawierającymi więcej
reszt cukrowych oraz kwas sialowy. Występują
w zewnętrznej warstwie błony komórkowej,
gdzie wchodzą w skład glikokaliksu i są ważne
jako antygeny i receptory komórki.
• Fosfolipidy i sfingolipidy uczestniczą w pato¬
genezie wielu procesów chorobowych, łącznie
z dziecięcym zespołem niewydolności oddecho¬
wej (brak surfaktantu płucnego), stwardnieniem
rozsianym (demielinizacja) oraz sfingolipidoza-
mi (niemożność rozkładania sfingolipidów w li-
zosomach spowodowana wrodzonymi defekta¬
mi enzymów hydrolizujących).
PIŚMIENNICTWO
McPhail LC: Glycerolipid in signal transduction. In:
Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membra-
nes, 4th ed. Vance DE, Vance JE (Eds.). Elsevier,
2002.
Merrill AH, Sandhooff K: Sphingolipids: metabolism
and celi signaling. In: Biochemistry of Lipids, Lipo¬
proteins and Membranes, 4th ed. Vance DE, Vance
JE (Eds.). Elsevier, 2002.
Meyer KC, Zimmerman JJ: Infiammation and surfactant.
Paediatric Respiratory Reviews 2002;3:308.
Proscott SM et al: Platelet-activating factor and related
lipid mediators. Annu Rev Biochem 2000;69:419.
Ruvolo PP: Intracellular signal transduction pathways
activated by ceramide and its metabolites. Pharma-
col Res 2003;47:383.
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001.
Vance DE: Phospholipid biosynthesis in eukaryotes. In:
Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membra¬
nes, 4th ed. Vance DE, Vance JE (Eds.). Elsevier,
2002.
van Echten G, Sandhoff K: Gangloside metabolism. En-
zymology, topology, and regulation. J Biol Chem
1993;268:5341.
Transport i magazynowanie
lipidów
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Tłuszcz wchłonięty z pokarmów oraz lipidy syn¬
tetyzowane w wątrobie i tkance tłuszczowej mu¬
szą być transportowane między różnymi tkanka¬
mi i narządami, aby mogły być tam przetwarzane
i magazynowane. Ponieważ lipidy są nierozpusz¬
czalne w wodzie, problem ich przenoszenia w śro¬
dowisku wodnym osocza krwi został rozwiązany
dzięki asocjacji niepolamych lipidów (triacylo-
glicerole i estry cholesterolu) z amfipatycznymi
lipidami (fosfolipidy i cholesterol) oraz białkami
i tworzeniu mieszających się z wodą lipoprotein.
U istot wszystkożemych, takich jak człowiek,
nadmiar dostarczonej z pożywieniem energii zo¬
staje zmagazynowany w fazie anabolicznej cyklu
pokarmowego; po niej następuje okres ujemnego
bilansu energetycznego, w czasie którego orga¬
nizm czerpie potrzebną energię ze swoich zapasów
węglowodanowych i tłuszczowych. Lipoproteiny
pośredniczą między tymi cyklami, transportując
z jelita lipidy w postaci chylomikronów i z wątro¬
by w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości
(VLDL) do większości tkanek, gdzie są utleniane,
oraz do tkanki tłuszczowej, gdzie są magazyno¬
wane. Z tkanki tłuszczowej tłuszcz jest pobierany
jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT), które do¬
stając się do krwi, łączą się z albuminą surowi¬
cy. Zaburzenia przemiany lipoprotein wywołują
różne hipolipoproteinemie lub hiperłipoprotei-
nemie. Najbardziej powszechne z nich występują
w cukrzycy, kiedy niedobór insuliny powoduje
nadmierne wykorzystanie WKT oraz zmniejszo¬
ne zużycie chylomikronów i VLDL, prowadzące
do hipertriacyłoglicerołemii. Większość innych
stanów patologicznych dotyczących transportu
lipidów jest uwarunkowana genetycznie i może
wywoływać hipercholesterołemię oraz przed¬
wczesną miażdżycę. Otyłość - zwłaszcza oty¬
łość brzuszna - jest czynnikiem ryzyka większej
śmiertelności, nadciśnienia, cukrzycy typu 2,
hiperlipidemii, hiperglikemii i różnych zaburzeń
hormonalnych.
LIPIDY SA TRANSPORTOWANE
W OSOCZU JAKO LIPOPROTEINY
W lipoproteinach występują cztery
główne klasy lipidów
Lipidy osocza składają się z triacylogłicerołi
(16%), fosfolipidów (30%), cholesterolu (14%)
i estrów cholesterolowych (36%) oraz z o wiele
mniejszej frakcji niezestryfikowanych wolnych
kwasów tłuszczowych (4%). Ta ostatnia frakcja,
wołne kwasy tłuszczowe (WKT), jest najbardziej
metabolicznie aktywna spośród lipidów osocza.
Rozróżnia się cztery główne grupy
lipoprotein osocza
Ponieważ tłuszcz wykazuje mniejszą gęstość niż
woda, gęstość lipoproteiny zmniejsza się, jeśli
proporcja lipidu do białka wzrasta (tab. 25-1). Wy¬
różniono cztery główne grupy lipoprotein osocza,
ważne pod względem fizjologicznym i diagno¬
stycznym; są to: (1) chylomikrony, pochodzące
z procesu wchłaniania triacyloglicerolu i innych
lipidów w jelitach; (2) lipoproteiny o bardzo
małej gęstości (VLDL albo pre-P-lipoprotei-
ny), tworzone w wątrobie w celu przenoszenia
triacyloglicerolu; (3) lipoproteiny o małej gęsto¬
ści (LDL albo P-lipoproteiny), związane z końco¬
wym etapem metabolizmu VLDL; (4) lipopro-
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 267
Tabela 25-1. Skład lipoprotein w osoczu krwi człowieka
Lipoproteina
Źródto
Średnica
[nm]
Gęstość
[fl/mL]
Skład
Główne
składniki
lipidowe
Apolipo¬
proteiny
Białko
[%]
Lipid
[%]
Chylomikrony
Jelito
90-1000
<0,95
1-2
98-99
Triacyloglicerol
A-l, A-ll, AIV\B-48
Resztkowe
chylomikrony
Chylomikrony
45-150
<1,006
6-8
92-94
Triacyloglicerol
fosfolipidy,
cholesterol
B-48
VLDL
Wątroba (jelito)
30-90
0,95-1,006
7-10
90-93
Triacyloglicerol
B-100, C-l, C-ll,
C-III
IDL
VLDL
25-35
1,006-1,019
11
89
Triacyloglicerol
cholesterol
B-100, E
LDL
VLDL
20-25
1,019-1,063
21
79
Cholesterol
B-100
HDL
HDI^
Wątroba,
jelito, VLDL,
chylomikrony
20-25
1,019-1,063
32
68
Fosfolipidy,
cholesterol
A-l, A-ll, AIV, C-l,
C-ll, C-III, D2, E
hdl2
10-20
1,063-1,125
33
67
HDL3
5-10
1,125-1,210
57
43
pre-p-HDL3
<5
>1,210
A-l
Albumina/wolne
kwasy tłuszczowe
Tkanka
tłuszczowa
>1,281
99
1
Wolne kwasy
tłuszczowe
Skróty: HDL - lipoproteiny o bardzo dużej gęstości; IDL - lipoproteiny o pośredniej gęstości; LDL - lipoproteiny o małej gęstości.
1 Wydzielana z chylomikronami, ale przenoszona do HDL.
2 Związana z subfrakcjami HDL2 i HDL3.
3 Część mniejszej frakcji, znanej jako lipoproteina o bardzo dużej gęstości (VHDL).
teiny o dużej gęstości (HDL albo a-lipoprote-
iny), uczestniczące w transporcie cholesterolu,
a także w metabolizmie VLDL i chylomikronów.
Triacyloglicerol jest dominującym lipidem w chy-
lomikronach i VLDL, natomiast cholesterol i fo¬
sfolipidy są dominującymi lipidami w LDL i HDL
(p. tab. 25-1). Lipoproteiny mogą być rozdzielane
według ich właściwości elektroforetycznych na
a-, p- i pre-P-lipoproteiny.
Lipoproteiny se zbudowane
z niepolarnego rdzenia i pojedynczej
warstwy powierzchniowej
amfipatycznych fosfolipidów
Niepolarny rdzeń lipidowy składa się głównie
z triacyloglicerolu i estrów cholesterolowych;
jest on otoczony pojedynczą warstwą amfipa¬
tycznych fosfolipidów i cząsteczek cholesterolu
(ryc. 25-1). Są one tak zorientowane, że polarne
grupy są skierowane na zewnątrz, do środowiska
wodnego, podobnie jak w błonie komórkowej
(rozdz. 15). Część białkowa lipoproteiny, znana
jako apolipoproteina albo apoproteina, stano¬
wi blisko 70% masy niektórych HDL, a tylko 1%
chylomikronów. Niektóre apolipoproteiny są inte¬
gralną częścią cząstki i nie mogą być z niej usu¬
nięte, natomiast pozostałe mogą być swobodnie
przenoszone do innych lipoprotein.
Rozmieszczenie apolipoprotein jest
charakterystyczne dla danej lipoproteiny
W każdej lipoproteinie występuje jedna lub kilka
apolipoprotein (białek lub polipeptydów). Głów¬
ne apolipoproteiny HDL (a-lipoproteina) są ozna¬
czane literą A (tab. 25-1). Główną apolipopro-
268 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
teiną LDL (p-lipoproteina) jest apolipoproteina
B (B-100), która znajduje się również w VLDL.
Chylomikrony zawierają okrojoną formę apoB
(B-48), która jest syntetyzowana w jelicie, gdy
tymczasem B-100 jest syntetyzowana w wątrobie.
ApoB-100 jest jednym z najdłuższych znanych
jednołańcuchowych polipeptydów - zawiera 4536
reszt aminokwasowych i ma masę cząsteczkową
550 kDa. ApoB-48 (48% B-100) jest tworzona na
tym samym mRNA co apoB-100 po wprowadze¬
niu sygnału „stop” przez enzym redagujący RN A.
ApoC-I, C-II i C-III są mniejszymi polipeptydami
(masa cząsteczkowa 7-9 kDa), swobodnie przeno¬
szonymi między kilkoma różnymi lipoproteinami.
ApoE znajduje się w VLDL, HDL, chylomikro-
nach i resztkowych chylomikronach (ang. chylo-
micron remnants); stanowi ona 5-10% wszystkich
apolipoprotein VLDL u zdrowych osób.
Apolipoproteiny spełniają wiele funkcji: (1)
mogą tworzyć część struktury lipoproteiny, np.
apoB; (2) są kofaktorami enzymu, np. C-II dla li¬
pazy lipoproteinowej, A-I dla acylotransferazy le¬
cytyna : cholesterol, albo są inhibitorami enzymu,
np. apoA-II i apoC-III dla lipazy lipoproteinowej,
apoC-I dla białka przenoszącego estry choleste¬
rolowe; (3) działają jako ligandy podczas oddzia¬
ływania z receptorami lipoproteiny w tkankach,
np. apoB-100 i apoE dla receptora LDL, apoE
dla białka pokrewnego receptorowi LDL (LRP),
które zidentyfikowano jako receptor resztkowych
chylomikronów, oraz apoA-I dla receptora HDL.
Funkcje apoA-IV i apoD nie zostały jeszcze jas¬
no zdefiniowane, chociaż uważa się, że apoD jest
ważnym czynnikiem w zaburzeniach neurodege-
neracyjnych.
WOLNE KWASY TŁUSZCZOWE SA
METABOLIZOWANE BARDZO SZYBKO
Wolne kwasy tłuszczowe (WKT, FFA, niezestryfi-
kowane kwasy tłuszczowe) dostają się do osocza
wskutek lipolizy triacylogliceroli w tkance tłusz¬
czowej albo w wyniku działania lipazy lipoprotei¬
nowej podczas pobierania triacylogliceroli do tka¬
nek. Występują w połączeniu z albuminą, bardzo
efektywnym solubilizatorem, w stężeniach 0,1-2,0
peq/mL osocza. Stężenia są małe w stanie dobre¬
go odżywienia i zwiększają się do 0,7-0,8 peq/mL
w stanie głodowania. W niewyrównanej cukrzycy
stężenia te mogą wzrosnąć do 2 peq/mL.
Peryferyjna apoproteina
(np. apoC)
Ryc. 25-1. Uogólniona struktura lipoproteiny. Należy zwrócić
uwagę na podobieństwa do struktury błony plazmatycznej. Nie¬
wielką ilość estrów cholesterolu i triacyloglicerolu można znaleźć
w warstwie powierzchniowej, a bardzo mato wolnego choleste¬
rolu - w rdzeniu cząstki.
Wolne kwasy tłuszczowe są usuwane z krwi
bardzo szybko i ulegają utlenieniu (realizując 25-
-50% zapotrzebowania energetycznego w stanie
głodowania) albo są estryfikowane do triacylogli¬
ceroli w tkankach. Podczas głodowania zestryfi-
kowane lipidy z krążenia lub z tkanek są również
utleniane, zwłaszcza w komórkach mięśnia serco¬
wego i szkieletowego, gdzie mogą się znajdować
znaczne zapasy lipidów.
Pobieranie przez tkanki wolnych kwasów tłusz¬
czowych jest bezpośrednio uzależnione od stę¬
żenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu,
które z kolei jest determinowane przez szybkość
lipolizy w tkance tłuszczowej. Po dysocjacji
kompleksu kwas tłuszczowy-albumina w bło¬
nie plazmatycznej, kwasy tłuszczowe wiążą się
do błonowego białka transportującego kwas
tłuszczowy, które działa jako przezbłonowy ko-
transporter z Na+. Po wniknięciu do cytozolu
wolne kwasy tłuszczowe są wiązane przez biał¬
ka wiążące kwas tłuszczowy. Uważa się, że rola
tych białek w transporcie wewnątrzkomórkowym
jest podobna do tej, jaką spełnia albumina w ze-
wnątrzkomórkowym transporcie długołańcucho-
wych kwasów tłuszczowych.
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 269
TRIACYLOGLICEROL JEST
TRANSPORTOWANY Z JELITA
WCHYLOMIKRONACH,
A Z WĄTROBY W LIPOPROTEINACH
0 BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI
Z nazwy chylomikronów wynika, że znajdu¬
ją się one w chłonce, czyli limfie (łac.: chylus),
lecz powstają jedynie w układzie limfatycznym
odprowadzającym chłonkę z jelita. Są one od¬
powiedzialne za transport do układu krążenia
wszystkich lipidów zawartych w pokarmach. Nie¬
wielkie ilości VLDL znajdują się także w chłonce,
jednak większość zawartego w osoczu VLDL po¬
chodzi z wątroby. Jego cząsteczki transportują
triacyloglicerole z wątroby do tkanek pozawą-
trobowych.
Mechanizmy tworzenia chylomikronów przez
komórki jelita i tworzenia VLDL przez wątrobo¬
we komórki parenchymalne (ryc. 25-2) są bardzo
podobne; może to wynikać z tego, że - oprócz
gruczołu sutkowego - jelito i wątroba są jedy¬
nymi tkankami, z których lipid jest wydzielany
w formie złożonych cząstek. Świeżo wydzielone
chylomikrony i VLDL zawierają tylko niewielką
ilość apolipoprotein C i E, a pełny ich komplet zy¬
skują z HDL w krążeniu (ryc. 25-3 i 25-4). ApoB
jest istotna dla utworzenia chylomikronu i VLDL.
W abetalipoproteinemii (rzadkie schorzenie) li-
poproteiny zawierające apoB nie są wytwarzane
1 wówczas w jelicie oraz wątrobie gromadzą się
krople lipidowe.
Bardziej szczegółowy opis czynników kontro¬
lujących wydzielanie VLDL z wątroby podano
niżej.
CHYLOMIKRONY ILIPOPROTEINY
0 BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI
SA SZYBKO KATABOLIZOWANE
Oczyszczanie krwi z chylomikronów jest szyb¬
kie; okres ich połowicznego zaniku u człowieka
wynosi mniej niż 1 godzina. Większe cząstki są
katabolizowane szybciej aniżeli mniejsze. Kwasy
tłuszczowe pochodzące z triacyloglicerolu chylo¬
mikronów są dostarczane głównie do tkanki tłusz¬
czowej, serca i mięśni (80%), podczas gdy około
20% dochodzi do wątroby. Jednakże wątroba nie
metabolizuje natywnych chylomikronów ani
VLDL w znacznym stopniu; wobec tego meta¬
bolizm kwasów tłuszczowych jest tam raczej dru¬
gorzędny w stosunku do ich metabolizmu w tkan¬
kach pozawątrobowych.
Triacyloglicerole chylomikronów
i VLDL sa hydrolizowane
przez lipazę lipoproteinowa
Lipaza lipoproteinowa występuje w ścianach
włosowatych naczyń krwionośnych, zakotwi¬
czona do śródbłonka przez ujemnie naładowany
łańcuch proteoglikanowy siarczanu heparanu.
Stwierdzono jej obecność w sercu, tkance tłusz¬
czowej, śledzionie, płucach, rdzeniu nerki, aorcie,
przeponie i gruczole sutkowym w okresie laktacji,
chociaż nie jest ona aktywna w dojrzałej wątrobie.
Normalnie nie stwierdza się jej we krwi, jednak
po wstrzyknięciu heparyny lipaza lipoproteino¬
wa zostaje uwolniona z jej połączenia z siarcza¬
nem heparanu do krążenia. Lipaza wątrobowa
jest związana z powierzchnią zatokową komórek
wątrobowych i jest uwalniana przez heparynę.
Enzym ten nie reaguje łatwo z chylomikronami
albo VLDL, bierze jednak udział w metabolizmie
resztkowych chylomikronów i HDL.
Fosfolipidy oraz apoC-II są niezbędne jako
kofaktory aktywności lipazy lipoproteinowej,
natomiast apoA-II i apoC-III są jej inhibitorami.
Hydroliza następuje wówczas, gdy lipoproteiny
są przyczepione do enzymu na śródbłonku. Tria-
cyloglicerol zostaje hydrolizowany stopniowo
- najpierw do diacyloglicerolu, następnie do mo-
noacyloglicerolu i w końcu do wolnych kwasów
tłuszczowych i glicerolu. Pewna ilość uwolnio¬
nych kwasów tłuszczowych wraca do krążenia
przyłączona do albumin, ale większość jest trans¬
portowana do tkanki (p. ryc. 25-3 i 25-4). Lipaza
lipoproteinowa w sercu ma duże powinowactwo
(niska wartość Km) do triacyloglicerolu; powino¬
wactwo enzymu tkanki tłuszczowej jest dziesię¬
ciokrotnie mniejsze. Dzięki temu kwasy tłuszczo¬
we z triacyloglicerolu mogą być przekazywane
z tkanki tłuszczowej do serca w stanie głodo¬
wania, kiedy stężenie triacyloglicerolu w osoczu
spada. Podobne przekierowanie następuje do gru¬
czołu sutkowego w okresie laktacji, co pozwala
na pobieranie kwasów tłuszczowych z triacylo¬
glicerolu lipoprotein do syntezy tłuszczu mleka.
270 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Światło jelita
Włosowate naczynie Naczynie limfatyczne prowadzące
krwionośne do przewodu piersiowego
Ryc. 25-2. Tworzenie i wydzielanie: (A) chylomikronów przez komórkę jelita oraz (B) lipoprotein o bardzo malej gęstości przez komórkę
wątrobową (RER - szorstka siateczka śródplazmatyczna; SER - gładka siateczka śródplazmatyczna; G - aparat Golgiego; N - jądro;
C - chylomikrony; VLDL - lipoproteiny o bardzo małej gęstości; E - śródbłonek; SD - przestrzeń okolozatokowa Dissego zawierająca
osocze krwi). Apoproteina B syntetyzowana w RER jest dołączana do lipoproteiny w SER - głównym miejscu syntezy triacyloglicerolu.
Po dodaniu reszt węglowodanowych w G cząstki są uwalniane z komórki w procesie odwróconej pinocytozy. Chylomikrony przechodzą
do układu limfatycznego. VLDL są wydzielane do przestrzeni Dissego, a potem do zatok wątrobowych przez okienka w śródbłonku
naczyniowym.
Receptor VLDL odgrywa istotną rolę w dostar¬
czaniu kwasów tłuszczowych z triacyloglicerolu
VLDL do adipocytów, dzięki wiązaniu VLDL
w pobliżu lipazy lipoproteinowej i umożliwieniu
kontaktu z tym enzymem. W tkance tłuszczowej
insulina pobudza syntezę lipazy lipoproteinowej
w adipocytach i ułatwia translokację tego enzy¬
mu do luminamej powierzchni śródbłonka naczyń
włosowatych.
Działanie lipazy lipoproteinowej
powoduje powstawanie lipoprotein
resztkowych (ang. remnant lipoproteins)
Wynikiem działania lipazy lipoproteinowej jest
utrata z chylomikronów ok. 90% triacyloglicerolu
i utrata apoC (która powraca do HDL), lecz nie
apoE, która łączy się z powstającymi teraz cząst¬
kami chylomikronów resztkowych. Cząstki te
mają o połowę mniejszą średnicę niż macierzyste
chylomikrony, a na skutek utraty triacyloglicerolu
stają się relatywnie bogatsze w cholesterol i estry
cholesterolu (p. ryc. 25-3). Podobne zmiany za¬
chodzą w stosunku do VLDL, które zmieniają się
w resztkowe VLDL, określane jako IDL (ang. in-
termediate density lipoprotein, czyli lipoproteina
0 pośredniej gęstości) (p. ryc. 25-4).
Wątroba jest odpowiedzialna za
wychwytywanie lipoprotein resztkowych
Chylomikrony resztkowe są wychwytywane przez
wątrobę za pośrednictwem receptorów w procesie
endocytozy, a zawarte w nich estry cholesterolu
1 triacyloglicerole są hydrolizowane i metabolizo¬
wane. W pobieraniu pośredniczy apoE (ryc. 25-3),
z udziałem dwóch zależnych od apoE receptorów,
receptor LDL (apoB-100, E) oraz LRP (ang.
LDL receptor-related lipoprotein, białko po¬
krewne receptorowi LDL). Lipaza wątrobowa
spełnia podwójną rolę: (1) działa jako ligand, uła¬
twiając pobieranie chylomikronów resztkowych
oraz (2) katalizuje hydrolizę triacyloglicerolu
i fosfolipidu.
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 271
TG z pokarmu
Ryc. 25-3. Metaboliczne losy chylomikronów (A - apolipoproteina A; B-48 - apolipoproteina B-48; (c) - apolipoproteina C; E - apoli-
poproteina E; HDL - lipoproteina o dużej gęstości; TG - triacyloglicerol; C - cholesterol i ester cholesterolu; P - fosfolipid; HL - lipaza
wątrobowa; LRP - białko pokrewne receptorowi LDL). Pokazano jedynie główne lipidy.
Po zmetabolizowaniu do IDL, VLDL może być
pobrany przez wątrobę bezpośrednio za pośredni¬
ctwem receptora LDL (apoB-100, E) albo może
być przekształcony w LDL. Tylko jedna cząstecz¬
ka apoB-100 znajduje się w każdej cząsteczce
tych lipoprotein, i ta cząsteczka jest zachowywa¬
na podczas opisanych przekształceń. Wobec tego
każda cząsteczka LDL pochodzi z pojedynczej
cząsteczki VLDL (p. ryc. 25-4). U ludzi stosun¬
kowo duża część IDL przechodzi w LDL, co jest
przyczyną większych stężeń LDL u ludzi w po¬
równaniu z wieloma innymi ssakami.
LDL JEST METABOLIZOWANA ZA
POŚREDNICTWEM RECEPTORA LDL
W wątrobie i wielu tkankach pozawątrobowych
występuje receptor LDL (apoB-100, E). Jest
on tak oznaczany, ponieważ jest swoisty dla
apoB-100, ale nie dla B-48, któremu brakuje
domeny końca karboksylowego B-100, zawiera¬
jącej ligand dla receptora LDL wiążącego także
lipoproteiny bogate w apoE. Ten receptor jest
defektywny w rodzinnej hipercholesterolemii.
Około 30% LDL jest rozkładane w tkankach
pozawątrobowych, a 70% w wątrobie. Stwier¬
dzono dodatnią zależność między zapadalnością
na miażdżycę naczyń wieńcowych i stężeniem
w osoczu cholesterolu LDL. Dalsza dyskusja
0 regulacji receptora LDL - patrz rozdz. 26.
HOL UCZESTNICZY W METABOLIZMIE
ZARÓWNO TRIACYLOGLICEROLU
LIPOPROTEIN, JAK I CHOLESTEROLU
HDL jest syntetyzowane i wydzielane zarówno
w wątrobie, jak i w jelicie (ryc. 25-5). Z kolei
apoC i apoE są syntetyzowane tylko w wątrobie
1 są przenoszone z wątrobowych HDL na jelito¬
we HDL, gdy te ostatnie dostaną się do osocza.
HDL pełni też ważną funkcję jako magazyn apoC
i apoE potrzebnych w metabolizmie chylomikro¬
nów i VLDL. Nowo wytworzone HDL składają
się z dyskoidalnej dwuwarstwy fosfolipidów za¬
wierającej apoA i wolny cholesterol. Lipoprote¬
iny te są podobne do cząstek znajdujących się
272 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 25-4. Metaboliczne losy lipoprotein o bardzo malej gęstości (VLDL) i wytwarzanie lipoprotein o malej gęstości (LDL) (A - apoli-
poproteina A; B-100 - apolipoproteina B-100; (c) - apolipoproteina C; E - apolipoproteina E; HDL - lipoproteina o dużej gęstości: T6
- triacyloglicerol; IDL - lipoproteina o pośredniej gęstości; C - cholesterol i estry cholesterolu; P - fosfolipid). Pokazano jedynie lipidy
przeważające ilościowo. Możliwe, że niektóre IDL są także metabolizowane z udziałem LRR
w osoczu pacjentów z niedoborem enzymu acy-
lotransferazy lecytyna : cholesterol (LCAT),
a także w osoczu pacjentów z żółtaczką zasto¬
ino wą. LCAT oraz jej aktywator apoA-I wiążą
się z dyskoidalnymi cząstkami, a powierzchnio¬
wy fosfolipid i wolny cholesterol zostają prze¬
kształcone w estry cholesterolowe i lizolecytynę
(rozdz. 24). Niepolame estry cholesterolu prze¬
mieszczają się do hydrofobowego wnętrza dwu-
warstwy, podczas gdy lizolecytyna jest przeno¬
szona na albuminę osocza. Wobec tego powstaje
niepolamy rdzeń, tworząc sferyczną pseudomi-
celamą HDL pokrytą błoną polarnych lipidów
i apolipoprotein. To pomaga w usuwaniu nad¬
miaru niezestryfikowanego cholesterolu z lipo¬
protein i z tkanek (patrz niżej). Stwierdzono, że
receptor oczyszczający (ang. scavenger recep¬
tor) klasy B (SR-B1) jest receptorem HDL o po¬
dwójnej roli w metabolizmie HDL. W wątrobie
i tkankach steroidogenicznych wiąże on HDL za
pośrednictwem apoA-I, a ester cholesterolu jest
selektywnie dostarczany do komórek, chociaż
sama cząstka, łącznie z apoA-I, nie przenika do
komórki. W innych tkankach SR-B1 pośredni¬
czy w przejmowaniu cholesterolu z komórki na
HDL, która następnie transportuje go do wątroby
w celu wydalenia z żółcią (w postaci cholestero¬
lu albo kwasów żółciowych) w procesie znanym
jako odwrócony transport cholesterolu (p. ryc.
25-5). HDL3, tworzona z dyskoidalnego HDL
pod wpływem LCAT, przejmuje cholesterol
z tkanek za pośrednictwem SR-B1, który następ¬
nie jest estryfikowany w reakcji katalizowanej
przez LCAT, wskutek czego cząstka HDL3 staje
się większa i jest teraz cząstką HDL2 o mniejszej
gęstości. HDL3 jest odtwarzana albo w wyniku
selektywnego dostarczenia estrów cholesterolu
do wątroby przy udziale SR-B1, albo wskutek
hydrolizy fosfolipidu i triacyloglicerolu HDL2
pod wpływem lipazy wątrobowej. Ta wzajem¬
na przemiana w siebie HDL2 i HDL3 jest nazy¬
wana cyklem HDL (p. ryc. 25-5). W procesach
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 273
Ryc. 25-5. Metabolizm lipoprotein o dużej gęstości (HDL) w odwróconym transporcie cholesterolu (LCAT - acylotransferaza lecytyna
: cholesterol; C - cholesterol; CE - estry cholesterolu; PL - fosfolipid; A-l - apolipoproteina A-l; SR-B1 - receptor oczyszczający B1;
ABCA1 - kasetowy receptor A1 wiążący ATP). Prep-HDL, HDL2, HDL3 - patrz tab. 25-1. Nadmiar składników powierzchniowych, po¬
zostałych po działaniu lipazy lipoproteinowej na chylomikrony i VLDL, są innym źródłem prep-HDL. Aktywność lipazy wątrobowej jest
podnoszona przez androgeny, a obniżana przez estrogeny, co może być przyczyną wyższego stężenia HDL2 u kobiet.
tych jest odszczepiana wolna apoA-I, która po
asocjacji z minimalną ilością fosfolipidu i cho¬
lesterolem tworzy prep-HDL. Nadmiar apoA-I
jest rozkładany w nerce. W drugim ważnym me¬
chanizmie odwróconego transportu cholesterolu
uczestniczy kasetowy transporter Al wiążący
ATP (ABCA1). ABCA1 należy do rodziny bia¬
łek transportujących, które łączą hydrolizę ATP
z wiązaniem substratu, co pozwala na przetrans¬
portowanie go przez błonę. ABC Al preferencyj¬
nie przenosi cholesterol z komórek na ubogie
w lipidy cząstki, takie jak prep-HDL lub apoA-I,
które wówczas są przekształcane w HDL3 drogą
poprzez dyskoidalny HDL (p. ryc. 25-5). Prep-
-HDL jest najbardziej wydajną formą HDL, po¬
wodującą wypływ cholesterolu z tkanek.
Stężenia HDL zmieniają się odwrotnie propor¬
cjonalnie do stężeń triacylogliceroli w osoczu,
a wprost proporcjonalnie do aktywności lipa¬
zy lipoproteinowej. Może to być spowodowane
nadmiarem składników powierzchniowych, np.
fosfolipidu i apoA-I, uwalnianych podczas hy¬
drolizy chylomikronów i VLDL, a uczestniczą¬
cych w tworzeniu prep-HDL i dyskoidalnych
HDL. Stężenia HDL2 są w odwrotnej relacji do
zapadalności na miażdżycę naczyń wieńco¬
wych, być może dlatego, że odzwierciedlają one
wydajność odwróconego transportu cholestero¬
lu. HDLC (HDLj) stwierdzono we krwi zwierząt
z hipercholesterolemią wywołaną odpowiednią
dietą. Lipoproteina ta jest bogata w cholesterol,
a jej jedyną apolipoproteiną jest apoE. Wydaje
się, że wszystkie lipoproteiny osocza są wzajem¬
nie od siebie zależne i uczestniczą w jednym lub
wielu cyklach metabolicznych, które składają się
na proces transportu lipidów osocza.
274 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
WĄTROBĄ ODGRYWA GŁÓWNA ROLĘ
W TRANSPORCIE I METABOLIZMIE
LIPIDÓW
Wątroba pełni następujące, ważne funkcje
w przemianie lipidów: (1) ułatwia trawienie
i wchłanianie lipidów, produkując żółć, która
zawiera cholesterol i kwasy żółciowe syntetyzo¬
wane w wątrobie de novo albo z wchłoniętego
cholesterolu (rozdz. 26); (2) aktywnie syntety¬
zuje i utlenia kwasy tłuszczowe (rozdz. 22 i 23),
a także syntetyzuje triacyloglicerole i fosfolipidy
(rozdz. 24); (3) zmienia kwasy tłuszczowe w ciała
ketonowe (ketogeneza) (rozdz. 22); (4) integruje
syntezę i metabolizm lipoprotein osocza (niniej¬
szy rozdział).
Wydzielanie VLDL w wątrobie zależy od
diety i stanu hormonalnego
Procesy komórkowe uczestniczące w tworzeniu
i wydzielaniu VLDL opisano wyżej (p. ryc. 25-2)
i przedstawiono na ryc. 25-6. Synteza triacylo-
gliceroli w wątrobie stanowi bezpośredni bodziec
do tworzenia i wydzielania VLDL. Kwasy tłusz¬
czowe, z których są syntetyzowane triacyloglice¬
role w wątrobie mogą pochodzić z dwóch źródeł:
(1) syntezy w wątrobie z acetylo-CoA pochodzą¬
cego głównie z węglowodanów (zapewne nie
bardzo istotne u ludzi) oraz (2) pobierania wol¬
nych kwasów tłuszczowych z krążenia. Pierwsze
źródło dominuje w stanie dobrego odżywienia,
kiedy synteza kwasów tłuszczowych jest znacz¬
na, a stężenie wolnych kwasów tłuszczowych
w osoczu małe. Ponieważ normalnie w tych wa¬
runkach triacyloglicerole nie gromadzą się w wą¬
trobie, należy sądzić, że są odtransportowywane
z wątroby w postaci VLDL z taką samą szybko¬
ścią, z jaką są syntetyzowane, przy czym synteza
apoB-100 nie jest czynnikiem ograniczającym
szybkość. Wolne kwasy tłuszczowe pochodzące
z krążenia są głównym źródłem w okresie głodo¬
wania, spożywania diety bogatej w tłuszcz albo
w cukrzycy, gdy lipogeneza jest w wątrobie za¬
hamowana. Do czynników pobudzających w wą¬
trobie zarówno syntezę triacylogliceroli, jak
i wydzielanie VLDL zalicza się: (1) stan sytości;
(2) dietę bogatą w węglowodany (zwłaszcza w sa¬
charozę lub fruktozę), która powoduje przyspie¬
szenie lipogenezy i estryfikacji kwasów tłuszczo¬
wych; (3) wysokie stężenia krążących wolnych
kwasów tłuszczowych; (4) spożywanie etanolu;
(5) wysokie stężenia insuliny, a niskie stężenia
glukagonu, które pobudzają syntezę kwasów
tłuszczowych i ich estryfikację, a hamują ich utle¬
nianie (p. ryc. 25-6).
ASPEKTY KLINICZNE
Brak równowagi między szybkością
tworzenia triacyloglicerolu i jego
wydzielania powoduje stiuszczenie
wątroby
Lipidy - głównie w postaci triacyloglicerolu
- mogą się gromadzić z rozmaitych powodów
w wątrobie (ryc. 25-6). Znaczne nagromadzenie
lipidów jest uważane za stan patologiczny. Jeśli
nagromadzanie lipidów staje się przewlekłe, do¬
chodzi do zmian zwłóknieniowych, przechodzą¬
cych w marskość i następuje upośledzenie czyn¬
ności wątroby.
Stwierdzono dwa główne rodzaje stłuszczenia
wątroby. Pierwszy jest związany ze zwiększonym
stężeniem wolnych kwasów tłuszczowych oso¬
cza, wynikającym ze zwiększonego pobierania
tłuszczu z tkanki tłuszczowej lub z szybszej hy¬
drolizy triacylogliceroli lipoprotein pod wpływem
lipazy lipoproteinowej w tkankach pozawątrobo-
wych. Wytwarzanie VLDL nie nadąża za zwięk¬
szonym napływem wolnych kwasów tłuszczowych
i ich estryfikacją, co prowadzi do nagromadzania
się triacylogliceroli i stłuszczenia wątroby. Tak się
dzieje podczas głodowania lub spożywania po¬
karmów o dużej zawartości tłuszczu. Ponadto
może być upośledzona (np. w czasie głodowania)
zdolność wydzielania VLDL. W niewyrównanej
cukrzycy, zatruciu ciążowym u owiec i w keto-
nemii bydła nacieczenie tłuszczowe jest na tyle
ciężkie, że powoduje widoczną bladość (tłuszczo¬
wy wygląd) i powiększenie wątroby, a często tak¬
że jej dysfunkcję.
Drugi typ stłuszczenia wątroby jest zwykle
wynikiem metabolicznego zablokowania wy¬
twarzania lipoprotein osocza, wskutek czego
triacyloglicerole gromadzą się w wątrobie. Teo¬
retycznie to upośledzenie może być spowodowa¬
ne: (1) zablokowaniem syntezy apolipoprotein;
(2) zablokowaniem tworzenia lipoprotein z lipidu
i apolipoproteiny; (3) ograniczeniem dostarczania
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 275
KREW
VLDL
L
Świeżo wytworzona
VLDL
ApoC
ApoE
HDL
Ryc. 25-6. Synteza lipoprotein o bardzo malej gęstości (VLDL) w wątrobie oraz prawdopodobne miejsca działania czynników powodu¬
jących akumulację triacyloglicerolu i stluszczenie wątroby (EFA - egzogenne kwasy tłuszczowe; WKT - wolne kwasy tłuszczowe; HDL
- lipoproteina o dużej gęstości; M - mikrosomalne białko transportujące triacyloglicerol; Apo - apolipoproteina). Pokazane tutaj szlaki
tworzą podstawę zjawisk przedstawionych na ryc. 25-2. Główna pula triacyloglicerolu (tego, którego nazwa jest w ramce) nie znajduje
się na bezpośrednim szlaku syntezy VLDL z acylo-CoA. Wobec tego wolne kwasy tłuszczowe, insulina i glukagon wywierają bezpośred¬
ni wpływ na wydzielanie VLDL, gdyż ich efekty dotyczą bezpośrednio małej prekursorowej puli triacyloglicerolu (na rycinie przy nazwie
jest gwiazdka). W stanie dobrego odżywienia apoB-100 jest syntetyzowana w nadmiarze w stosunku do ilości potrzebnej do wydzielania
VLDL i ten nadmiar jest rozkładany w wątrobie. Podczas biosyntezy apoB-100 transport lipidu przez mikrosomalne białko transferowe
umożliwia lipidowi połączenie z tworzonym łańcuchem polipeptydowym. Po uwolnieniu z rybosomów cząstki te ulegają fuzji z większą
ilością lipidów z gładkiej siateczki śródplazmatycznej, tworząc świeżo wytworzoną VLDL.
276 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
fosfolipidów, które znajdują się w lipoproteinach;
(4) niewydolnością samego mechanizmu wydzie¬
lania.
Jednym z typów stłuszczenia wątroby, który
był wielokrotnie badany u szczurów, jest stłusz-
czenie spowodowane niedoborem choliny; z tego
względu cholina została nazwana czynnikiem
lipotropowym. Substancje chemiczne, takie jak:
antybiotyk puromycyna, etionina (kwas a-amino-
y-sulfhydromasłowy), tetrachlorek węgla, chloro¬
form, fosfor, ołów i arsenian powodują stłuszcze-
nie wątroby i znaczne obniżenie stężenia VLDL
u szczurów. Cholina nie chroni organizmu przed
tymi czynnikami, ale prawdopodobnie pomaga
szybciej dojść do zdrowia. Tetrachlorek węgla
przypuszczalnie ułatwia powstawanie wolnych
rodników, powodujących peroksydację lipidów.
Niejaką ochroną przed tym może być dieta wzbo¬
gacona w witaminę E, która ma działanie anty-
oksydacyjne. Uważa się, że działanie etioniny po¬
lega na zmniejszeniu dostępności ATP, co wynika
z tego, że etionina - zastępując metioninę w S-
-adenozylometioninie - wychwytuje dostępną
adeninę i zapobiega syntezie ATP. Kwas orotowy
także powoduje stłuszczenie wątroby; uważa się,
że zaburza on glikozylację lipoprotein, hamując
ich uwalnianie; może on także upośledzać pobie¬
ranie triacyloglicerolu do cząstek lipoproteiny.
Niedobór witaminy E wzmaga martwicę wątroby
w przebiegu stłuszczenia wywołanego niedobo¬
rem choliny. Dodatek witaminy E lub selenu dzia¬
ła ochronnie, ograniczając peroksydację lipidów.
W stanie niedoboru białka, niedobory egzogennych
kwasów tłuszczowych i witamin (np. kwasu linolo¬
wego, pirydoksyny i kwasu pantotenowego) mogą
spowodować tłuszczowe nacieczenie wątroby.
Etanol także powoduje stłuszczenie
wątroby
Alkoholizm prowadzi do nagromadzenia tłusz¬
czu w wątrobie, do hiperlipidemii i ewentualnie
do marskości. Stłuszczenie wątroby jest następ¬
stwem działania dwóch mechanizmów - upo¬
śledzonego utleniania kwasów tłuszczowych
i wzmożonej lipogenezy, co - jak się uważa
- jest rezultatem zmian potencjału redoksowego
[NADH]/[NAD+] w wątrobie, a także interferen¬
cji z działaniem czynników transkrypcyjnych re¬
gulujących ekspresję enzymów uczestniczących
w szlakach przemiany lipidów i cukrów. Utlenia¬
nie etanolu z udziałem dehydrogenazy alkoholo¬
wej prowadzi do nadmiernej produkcji NADH.
DEHYDROGENAZA
ALKOHOLOWA
CH3 — CH2 — OH y*—^ ► CH3—CHO
NAD+ NADH + H+
Etanol Aldehyd octowy
Wytworzony NADH współzawodniczy o łań¬
cuch oddechowy z równoważnikami redukcyj¬
nymi pochodzącymi z innych substratów, łącznie
z kwasami tłuszczowymi, hamując utlenianie
kwasów tłuszczowych i wzmagając ich estryfika-
cję z utworzeniem triacylogliceroli, co w rezul¬
tacie doprowadza do stłuszczenia wątroby. Eta¬
nol jest utleniany do aldehydu octowego, który
następnie jest utleniany, w reakcji katalizowanej
przez dehydrogenazę aldehydową, do kwasu
octowego i NADH. Wzrost wartości proporcji
[NADH]/[NAD+] powoduje podwyższenie pro¬
porcji [mleczan]/[pirogronian], czego rezultatem
jest hiperlaktacidemia, która utrudnia wydala¬
nie kwasu moczowego, pogłębiając dolegliwości
chorych na dnę moczanową.
Pewna część spożytego etanolu jest metaboli¬
zowana szlakiem zależnego od cytochromu P450
mikrosomalnego układu utleniającego etanol
(MEOS) z udziałem NADPH i 02. Aktywność
tego układu jest wzmożona przy chronicznym
alkoholizmie i to może być przyczyną szybszego
usuwania etanolu z krwi u takich osobników. Eta¬
nol hamuje także metabolizm niektórych leków,
np. barbituranów, współzawodnicząc o enzymy
zależne od cytochromu P450.
Etanol CH3— CHO + NADP+ + 2H20
Aldehyd octowy
U niektórych Azjatów i rdzennych mieszkań¬
ców Ameryki spożycie etanolu wywołuje od¬
wrotną reakcję na aldehyd octowy (uczucie lęku),
co jest spowodowane genetycznym defektem mi-
tochondrialnej dehydrogenazy aldehydowej.
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 277
TKANKA TŁUSZCZOWA JEST GŁÓWNYM
MAGAZYNEM TRIACYLOGLICEROLI
W ORGANIZMIE
Zapasy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej
ulegają ciągłej lipolizie (hydrolizie) i powtórnej
estryfikacji (ryc. 25-7). Te dwa procesy przebie¬
gają zupełnie odmiennymi szlakami metabo¬
licznymi, obejmującymi inne pośrednie związki
i inne enzymy. To pozwala na oddzielne regu¬
lowanie procesów estryfikacji lub lipolizy przez
wiele czynników pokarmowych, metabolicznych
i hormonalnych. Wypadkowa tych dwóch proce¬
sów determinuje wielkość puli wolnych kwasów
tłuszczowych w tkance tłuszczowej, która z kolei
określa poziom wolnych kwasów tłuszczowych
krążących w osoczu. Ponieważ ta ostatnia wiel¬
kość ma głęboki wpływ na metabolizm innych
tkanek, szczególnie wątroby i mięśni, rola czyn¬
ników działających w tkance tłuszczowej, które
regulują wypływ wolnych kwasów tłuszczowych,
sięga poza tę tkankę.
Dostępność glicerolo-3-fosforanu
reguluje estryfikacje; lipoliza
jest kontrolowana przez lipazę
wrażliwa na hormon
Triacyloglicerol jest syntetyzowany z acylo-CoA
i glicerolo-3-fosforanu (p. ryc. 24-2). Ponieważ
enzym kinaza glicerolowa nie ulega ekspre¬
sji w tkance tłuszczowej, glicerol nie może być
wykorzystany jako źródło glicerolo-3-fosforanu;
źródłem tym musi być glukoza poddawana gliko¬
lizie.
Triacyloglicerol ulega hydrolizie z udziałem en¬
zymu - lipazy wrażliwej na hormon, w wyniku
czego powstają wolne kwasy tłuszczowe i glice¬
rol. Lipaza ta jest inna niż lipaza lipoproteinowa,
która katalizuje reakcję hydrolizy triacyloglicero-
lu lipoproteiny przed jego pobraniem do tkanki
pozawątrobowej (patrz wyżej). Ponieważ glicerol
nie może być wykorzystany, przechodzi do krwi,
skąd jest pobierany i następnie metabolizowany
przez takie tkanki, jak wątroba i nerka, które za¬
wierają aktywną kinazę glicerolową. Wolne kwa¬
sy tłuszczowe utworzone wskutek lipolizy mogą
zostać przekształcone w tkance tłuszczowej do
acylo-CoA w reakcji katalizowanej przez synteta-
• Insulina
TKANKA TŁUSZCZOWA! Glukozo-6-fosforan
Ryc. 25-7. Metabolizm triacylogliceroli! w tkance tłuszczowej.
Lipaza wrażliwa na hormon jest aktywowana przez ACTH, TSH,
glukagon, adrenalinę, noradrenalinę i wazopresynę, a hamowana
przez insulinę, prostaglandynę E, oraz kwas nikotynowy. Szcze¬
góły tworzenia glicerolo-3-fosforanu ze związków pośrednich gli¬
kolizy pokazano na ryc. 24-2 (PPP - szlak pentozofosforanowy;
FFA - wolne kwasy tłuszczowe; VLDL - lipoproteina o bardzo
małej gęstości).
zę acylo-CoA i mogą ulec ponownej estryfikacji
z glicerolo-3-fosforanem, tworząc triacyloglice¬
rol. Tak więc w tkance tłuszczowej stale odby¬
wa się cykl lipolizy i reestryfikacji. Jeśli jednak
szybkość reestryfikacji nie jest na tyle duża, aby
zrównać się z szybkością lipolizy, wolne kwa-
278 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
sy tłuszczowe nagromadzają się i dyfundują do
osocza, gdzie wiążą się z albuminą i tym samym
stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w oso¬
czu staje się większe.
Zwiększony metabolizm glukozy
zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów
tłuszczowych
Gdy zużycie glukozy przez tkankę tłuszczową
ulega zwiększeniu, zmniejsza się wypływ z niej
wolnych kwasów tłuszczowych. Mimo to utrzy¬
muje się uwalnianie glicerolu. Może to oznaczać,
że hamujący wpływ glukozy na uwalnianie wol¬
nych kwasów tłuszczowych nie wynika z osłabie¬
nia lipolizy, a raczej z dostarczania glicerolo-3-
-fosforanu, co nasila estryfikację wolnych kwa¬
sów tłuszczowych. Glukoza w tkance tłuszczowej
może wchodzić w wiele szlaków metabolicznych,
łącznie z utlenianiem do C02 w cyklu kwasu cy¬
trynowego, utlenianiem w szlaku pentozofosfo-
ranowym, przekształceniem w długołańcuchowe
kwasy tłuszczowe i tworzeniem acyloglicerolu
z glicerolo-3-fosforanu (p. ryc. 25-7). Gdy zuży¬
cie glukozy jest duże, większa część pobranej glu¬
kozy jest utleniana do C02, a także przekształcana
do kwasów tłuszczowych. Jeśli jednak całkowite
zużycie glukozy zmniejsza się, więcej glukozy
jest kierowane do tworzenia glicerolo-3-fosfo-
ranu, ulegającego następnie estryfikacji z acylo-
-CoA, co pozwala minimalizować wypływ wol¬
nych kwasów tłuszczowych.
HORMONY REGULUJĄ
MORILIZACJĘ TŁUSZCZU
Insulina hamuje wypływ
wolnych kwasów tłuszczowych
Na szybkość uwalniania wolnych kwasów tłusz¬
czowych z tkanki tłuszczowej działa wiele hor¬
monów, które wpływają albo na szybkość estry¬
fikacji, albo na szybkość lipolizy. Insulina hamuje
uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkan¬
ki tłuszczowej, czego następstwem jest zmniej¬
szenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych
w osoczu. Wzmaga ona lipogenezę i syntezę
acyloglicerolu oraz nasila utlenianie glukozy do
C02 w szlaku pentozofosforanowym. Działania
te, zależne od obecności glukozy, w dużej mie¬
rze można wyjaśnić pobudzającym wpływem
insuliny na pobieranie glukozy przez komórki
tkanki tłuszczowej za pośrednictwem transpor¬
tera GLUT 4. Insulina wzmaga także aktywność
dehydrogenazy pirogronianowej, karboksylazy
acetylo-CoA i acylotransferazy glicerolo-3-fosfo¬
ranowej, wzmacniając przez to skutki wynikające
ze wzmożonego pobierania glukozy, zwiększają¬
ce wytwarzanie kwasów tłuszczowych i syntezę
acyloglicerolu. Te trzy enzymy są regulowane
w skoordynowany sposób przez mechanizmy fo-
sforylacji-defosforylacji.
Zasadniczym działaniem insuliny w tkance
tłuszczowej jest hamowanie aktywności lipazy
wrażliwej na hormon, wskutek czego zmniejsza
się nie tylko uwalnianie wolnych kwasów tłusz¬
czowych, ale także glicerolu. Tkanka tłuszczowa
jest o wiele bardziej wrażliwa na działanie insu¬
liny aniżeli wiele innych tkanek, co oznacza, że
tkanka tłuszczowa jest ważnym miejscem działa¬
nia insuliny in vivo.
Wiele hormonów ma zdolność
pobudzania lipolizy
Wiele hormonów przyspiesza uwalnianie wol¬
nych kwasów tłuszczowych i zwiększa stężenie
wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu dzięki
temu, że zwiększają szybkość lipolizy zapasów
triacylogliceroli (ryc. 25-8). Wśród tych hor¬
monów znajdują się adrenalina, noradrenalina,
glukagon, kortykotropina (ACTH; ang. adreno-
corticotropic hormone), a- oraz P-melanotrofina
(MSH; ang. melanocyte stimulating hormone),
tyreotrofina (TSH; ang. thyroid-stimulating hor¬
mone), hormon wzrostu (GH, ang. growth hormo¬
ne) i wazopresyna. Część z nich aktywuje lipazę
wrażliwą na hormon. Aby osiągnąć optymalny
skutek, większość z tych procesów lipolitycznych
potrzebuje obecności glikokortykoidów i hor¬
monów tarczycy. Hormony te same nie wzma¬
gają lipolizy w sposób znaczący, lecz ułatwiają
działanie innych lipolitycznych czynników we-
wnątrzwydzielniczych.
Te hormony, które szybko pobudzają lipoli-
zę, np. katecholaminy, czynią to, aktywując cy-
klazę adenylanową - enzym który przekształca
ATP w cAMP. Mechanizm jest analogiczny do
mechanizmu odpowiedzialnego za stymulację
glikogenolizy (rozdz. 19). cAMP, pobudzając
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 279
Adrenalina, / ACTH, \ , Insulina, prostaglandyna E1t
noradrenalina \ TSH, ) * kwas nikotynowy
\ \ glukagon / /
Ryc. 25-8. Kontrola lipolizy w tkance tłuszczowej (TSH - tyreotropina; WKT - wolne kwasy tłuszczowe). Uwagę zwraca kaskadowa
sekwencja reakcji, wymuszająca zwielokrotnienie efektu na każdym etapie. Bodziec lipolityczny jest „wyłączany” przez: usunięcie pobu¬
dzającego hormonu; działanie fosfatazy lipazy; hamowanie lipazy i cyklazy adenylanowej pod wpływem dużych stężeń WKT; hamowanie
cyklazy adenylanowej przez adenozynę; usunięcie cAMP w reakcji katalizowanej przez fosfodiesterazę. ACTH, TSH i glukagon raczej nie
mogą aktywować cyklazy adenylanowej in vivo, gdyż wymagane do tego stężenia hormonu in vitro są znacznie większe niż stwierdzane
w krążeniu. Pozytywne (+) i negatywne (-) skutki regulacyjne zaznaczono liniami przerywanymi, a przepływ substratów - ciągłymi.
kinazę białek zależną od cAMP, aktywuje lipa¬
zę wrażliwą na hormon. Procesy, które rozkładają
lub chronią cAMP, wpływają zatem na lipolizę.
cAMP jest rozkładany do 5'-AMP przez enzym
fosfodiesterazę cyklicznego 3',5'-nukleotydu.
Enzym ten jest hamowany przez metyloksanty-
ny, takie jak kofeina i teofilina. Insulina działa
antagonistycznie w stosunku do hormonów lipo-
litycznych. Uważa się, że lipoliza jest bardziej
wrażliwa na zmiany stężenia insuliny aniżeli pro¬
ces zużywania glukozy i estryfikacja. Antylipo-
lityczne działanie insuliny, kwasu nikotynowego
i prostaglandyny Ej może polegać na hamowaniu
syntezy cAMP w miejscu cyklazy adenylanowej
działającej za pośrednictwem białka Gr Insulina
stymuluje także fosfodiesterazę i fosfatazę lipazy,
co inaktywuje lipazę wrażliwą na hormon. Wpływ
hormonu wzrostu na lipolizę zależy od syntezy
białek biorących udział w tworzeniu cAMP. Gliko-
kortykoidy pobudzają lipolizę, syntetyzując nowe
białko lipazy szlakiem niezależnym od cAMP, co
może być hamowane przez insulinę, a także przez
promowanie transkrypcji genów zaangażowanych
w sygnałową kaskadę cAMP. Odkrycia te poma¬
gają wyjaśnić rolę gruczołowej części przysadki
mózgowej i kory nadnerczy w pobudzaniu mo¬
bilizacji tłuszczu. Tkanka tłuszczowa wydziela
hormon leptynę, która reguluje homeostazę ener¬
gii. Chociaż początkowo sądzono, że chroni ona
przed otyłością, obecne dane wskazują, że główną
rolą leptyny jest sygnalizowanie wystarczalności
zasobów energetycznych, a nie nadmiaru mate¬
riału wykorzystywanego do wytwarzania energii
w organizmie.
280 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Współczulny układ nerwowy, uwalniając nor¬
adrenalinę w tkance tłuszczowej, odgrywa cen¬
tralną rolę w mobilizacji wolnych kwasów tłusz¬
czowych. Wzmożona lipoliza, wywoływana przez
wiele opisanych tu czynników, może zostać ogra¬
niczona lub całkowicie zniesiona przez odnerwie-
nie tkanki tłuszczowej lub blokadę odpowiednich
węzłów nerwowych.
Wykształciły się rozmaite
mechanizmy subtelnie regulujące
metabolizm tkanki tłuszczowej
U człowieka tkanka tłuszczowa nie jest ważnym
miejscem lipogenezy. Świadczą o tym obserwa¬
cje, że znaczniki wprowadzone do glukozy lub
pirogronianu nie wbudowują się w znaczącej
ilości do długołańcuchowych kwasów tłuszczo¬
wych. Ponadto zależna od ATP liaza cytryniano-
wa - kluczowy enzym lipogenezy - nie występuje
w tkance tłuszczowej, a inne enzymy lipogenicz-
ne, np. glukozo-6-fosfataza i enzym jabłczanowy,
nie ulegają zmianom adaptacyjnym. Przypuszcza¬
no natomiast, że u człowieka występuje „zespół
nadmiaru węglowodanów” spowodowany wyjąt¬
kowo małą zdolnością ludzkiego organizmu do
usuwania nadmiaru węglowodanów wg mecha¬
nizmu lipogenezy. U ptaków lipogeneza zachodzi
tylko w wątrobie i jest tam szczególnie istotna,
ponieważ dostarcza lipidów potrzebnych do sty¬
mulowanego estrogenami tworzenia jaj. Ludzka
tkanka tłuszczowa nie jest wrażliwa na działa¬
nie większości hormonów lipolitycznych oprócz
amin katecholowych.
Biorąc pod uwagę silne zaburzenia metabolizmu
w cukrzycy (spowodowane w dużej mierze zwięk¬
szonym uwalnianiem wolnych kwasów tłuszczo¬
wych z ich magazynów) oraz fakt, że podanie insu¬
liny znacznie łagodzi te zaburzenia, można wysnuć
wniosek, że insulina odgrywa podstawową rolę
w regulacji metabolizmu tkanki tłuszczowej.
BRUNATNA TKANKA TŁUSZCZOWA
POBUDZA TERMOGENEZĘ
Brunatna tkanka tłuszczowa uczestniczy w meta¬
bolizmie głównie wtedy, kiedy musi być wytwa¬
rzane ciepło. Tkanka jest zatem bardzo aktywna
metabolicznie u niektórych gatunków zwierząt
w okresie budzenia się ze snu zimowego, u zwierząt
WEWNĘTRZNA
STRONA BŁONA STRONA
Ryc. 25-9. Termogeneza w brunatnej tkance tłuszczowej. Dzię¬
ki aktywności łańcucha oddechowego wytwarzane jest ciepło
i jednocześnie są transportowane protony (rozdz. 13). Gdy te
protony wracają do przedziału (kompartmentu) wewnątrzmito-
chondrialnego za pośrednictwem termogeniny, następuje dyssy¬
pacja ciepła zamiast wytwarzania ATR które zachodzi wówczas,
gdy protony powracają za pośrednictwem ^ - syntazy ATR Jeżeli
brunatna tkanka tłuszczowa nie jest pobudzana, to przejście H+
przez termogeninę jest hamowane przez nukleotydy purynowe.
Pod wpływem noradrenaliny hamowanie to zostaje zniesione,
gdyż są wytwarzane wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i acylo-CoA.
Należy zwrócić uwagę na podwójną rolę acylo-CoA - ułatwia
działanie termogeniny i dostarcza równoważników redukcyjnych
dla łańcucha oddechowego. Zaznaczone są pozytywne (+) i ne¬
gatywne (-) skutki regulacyjne.
25. TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW 281
narażonych na zimno (termogeneza bezdrżeniowa)
oraz u noworodków. Nie jest to najważniejsza tkan¬
ka u ludzi, występuje jednak u zdrowych osób i jest
u nich odpowiedzialna za „termogenezę induko¬
waną dietą”. Godne uwagi jest to, że ilość brunat¬
nej tkanki tłuszczowej jest mniejsza lub w ogóle
jej brak u osób otyłych. Brunatną tkankę tłuszczo¬
wą charakteryzuje dobrze rozwinięte ukrwienie,
duża zawartość mitochondriów i cytochromów, ale
mała aktywność syntazy ATP. Metabolicznie prze¬
waża utlenianie glukozy i kwasów tłuszczowych.
Noradrenalina, uwalniana z zakończeń nerwów
współczulnych odgrywa ważną rolę jako czynnik
stymulujący lipolizę w brunatnej tkance tłuszczo¬
wej oraz zwiększający syntezę lipazy lipoprotei-
nowej, co umożliwia większe zużycie bogatych
w triacyloglicerole lipoprotein z krążenia. Utlenia¬
nie i fosforylacja nie są skojarzone w mitochon-
driach tej tkanki. Fosforylacje przebiegają na po¬
ziomie substratu, np. w reakcji katalizowanej przez
tiokinazę bursztynianowąoraz w glikolizie. W pro¬
cesie utleniania wytwarza się więc dużo ciepła,
lecz tylko niewielka część entalpii swobodnej
zostaje związana w postaci ATP. Termogeniczne
białko rozkojarzające - termogenina - działa jako
przenośnik protonów, powodując dyssypację poten¬
cjału elektrochemicznego istniejącego w poprzek
błony mitochondrialnej (ryc. 25-9).
STRESZCZENIE
• Niepolame lipidy są nierozpuszczalne w wo¬
dzie, dlatego zanim zostaną przetransportowane
między tkankami w wodnym środowisku oso¬
cza krwi, muszą się połączyć z amfipatycznymi
lipidami i białkami w mieszające się z wodą
lipoproteiny.
• Rozpoznano cztery główne grupy lipoprotein.
Chylomikrony transportują strawione i wchło¬
nięte lipidy. Lipoproteiny o bardzo małej gę¬
stości (VLDL) transportują triacyloglicerole
z wątroby. Lipoproteiny o małej gęstości (LDL)
dostarczają cholesterol do tkanek. Lipoprotei¬
ny o dużej gęstości (HDL) usuwają cholesterol
z tkanek i zwracają go do wątroby w celu wyda¬
lenia w procesie znanym jako odwrócony trans¬
port cholesterolu.
• Chylomikrony i VLDL są metabolizowane
w procesie hydrolizy ich triacylogliceroli, a lipo¬
proteiny resztkowe pozostają w krążeniu i są po¬
bierane przez wątrobę. Niektóre z tych resztko¬
wych lipoprotein (IDL), które powstały z VLDL,
przechodzą w LDL, pobierane przez wątrobę
i inne tkanki za pośrednictwem receptora LDL.
• Apolipoproteiny stanowią białkowy składnik
lipoprotein. Działają one jako aktywatory enzy¬
mu (np. apoC-II i apoA-I) lub jako Ugandy dla
receptorów komórkowych (np. apoA-I, apoE
i apoB-100).
• Triacyloglicerole są głównymi lipidami zapaso¬
wymi, magazynowanymi w tkance tłuszczowej.
W przypadku mobilizacji tłuszczu uwalniane
są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. Wolne
kwasy tłuszczowe są ważnym źródłem „paliwa
energetycznego”.
• Brunatna tkanka tłuszczowa jest miejscem „ter-
mogenezy bezdrżeniowej”. Tkanka ta występu¬
je u hibernujących zwierząt i u noworodków,
a także w małej ilości u dorosłych ludzi. Termo¬
geneza jest wynikiem obecności białka rozkoja-
rzającego - termogeniny w wewnętrznej błonie
mitochondrialnej.
PIŚMIENNICTWO
Eaton S et al: Multiple biochemical effects in the patho-
genesis of fatty liver. Eur J Clin Invest 1997;
27:719.
Goldberg IJ, Merkel M: Lipoprotein lipase: physiology,
biochemistry and molecular biology. Front Biosci
2001;6:D388.
Holm C et al: Molecular mechanisms regulating hormo-
ne sensitive lipase and lipolysis. Annu Rev Nutr
2000;20:365.
Kershaw EE, Flier JS: Adipose tissue as an endocrine
organ. J Clin Endocrinol Metab 2004;89:2548.
Lardy H, Shrago E: Biochemical aspects of obesity.
Annu Rev Biochem 1990;59:689.
Redgrave TG: Chylomicron metabolism. Biochem Soc
Trans 2004;32:79.
Rye K-A et al: Overview of plasma lipid transport. In:
Plasma Lipids and Their Role in Disease. Barter
PJ, Rye K-A (editors). Harwood Academic Pub-
lishers, 1999.
Sell H, Deshaies Y, Richard D: The brown adipocyte:
update on its metabolic role. Int J Biochem Celi
Biol. 2004;36:2098.
Shelness GS, Sellers JA: Very-low-density lipopro¬
tein assembly and secretion. Curr Opin Lipidol
2001;12:151.
Various authors: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins
and Membranes, 4th ed. Vance DE, Vance JE (edi¬
tors). Elsevier, 2002.
Synteza, transport
i wydalanie cholesterolu
Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Cholesterol występuje w tkankach i osoczu albo
w postaci wolnej, albo połączony z długołańcu-
chowym kwasem tłuszczowym w ester choleste¬
rolowy. W osoczu obydwie formy są transporto¬
wane w lipoproteinach (rozdz. 25). Cholesterol
jest lipidem amfipatycznym i jako taki jest waż¬
nym składnikiem strukturalnym błon i zewnętrz¬
nej warstwy lipoprotein. Jest syntetyzowany
w wielu tkankach z acetylo-CoA i jest prekurso¬
rem wszystkich innych steroidów w organizmie,
łącznie z kortykosteroidami, hormonami płcio¬
wymi, kwasami żółciowymi i witaminą D. Jako
typowy produkt metabolizmu zwierząt, występuje
w pokarmach pochodzenia zwierzęcego, takich
jak żółtko jaja, mięso, wątroba i mózg. Lipopro-
teina o małej gęstości, występująca w osoczu
(LDL), jest czynnikiem pobierającym i przeno¬
szącym cholesterol oraz estry cholesterolowe do
wielu tkanek. Wolny cholesterol jest usuwany
z tkanek przy udziale osoczowych lipoprotein
o dużej gęstości (HDL) i przenoszony do wątroby
w procesie znanym jako odwrócony transport
cholesterolu (rozdz. 25), a w wątrobie jest elimi¬
nowany z organizmu albo w formie niezmienio¬
nej, albo po przekształceniu w kwasy żółciowe.
Cholesterol jest głównym składnikiem kamie¬
ni żółciowych. Jednak jego główne znaczenie
w procesach patologicznych jest takie, że stanowi
on czynnik powstawania miażdżycy ważnych ży¬
ciowo tętnic, powodując choroby naczyń mózgo¬
wych, wieńcowych i obwodowych.
MNIEJ WIĘCEJ TYLE SAMO
CHOLESTEROLU POCHODZI
Z DIETY IZ BIOSYNTEZY
Nieco więcej niż połowa cholesterolu organizmu
człowieka powstaje w wyniku syntezy (ok. 700
mg/24 godz.), a pozostała ilość jest dostarczana
w przeciętnej diecie. Około 10% cholesterolu
syntetyzowanego w całym organizmie pochodzi
z wątroby, następne 10% - z jelit. Praktycznie
wszystkie tkanki zawierające komórki jądrzaste
mają zdolność syntetyzowania cholesterolu, co
odbywa się w siateczce śródplazmatycznej i cy-
tozolu.
Źródłem wszystkich atomów węgla
cholesterolu jest acetylo-CoA
Biosynteza cholesterolu odbywa się w pięciu eta¬
pach. (1) Synteza mewalonianu z acetylo-CoA (p.
ryc. 26-1). (2) Utworzenie jednostki izoprenoido-
wej z mewalonianu wskutek utraty C02 (p. ryc.
26-2). (3) Kondensacja sześciu jednostek izopre-
noidowych z utworzeniem skwalenu. (4) Cykliza-
cja skwalenu do macierzystego steroidu - lano-
sterolu. (5) Utworzenie cholesterolu z lanosterolu
(p. ryc. 26-3).
Etap 1. Biosynteza mewalonianu. HMG-CoA
(3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA) powstaje
w łańcuchu reakcji zachodzących w mitochon-
driach podczas syntezy ciał ketonowych (p. ryc.
22-7). Ponieważ synteza cholesterolu jest proce¬
sem pozamitochondrialnym, zatem te dwa szlaki
26. SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU 283
są odrębne. Początkowo dwie cząsteczki acetylo-
-CoA kondensują ze sobą, tworząc acetoacetylo-
-CoA w reakcji katalizowanej przez cytozolową
tiolazę. Acetoacetylo-CoA kondensuje z kolejną
cząsteczką acetylo-CoA w reakcji katalizowanej
przez syntazę HMG-CoA, tworząc HMG-CoA,
który jest redukowany do mewalonianu przez
NADPH w reakcji katalizowanej przez redukta-
zę HMG-CoA. Jest to główny etap regulacyjny
w szlaku syntezy cholesterolu i jest miejscem
działania klasy najbardziej skutecznych leków
obniżających stężenie cholesterolu - inhibitorów
reduktazy HMG-CoA (statyn) (rycina 26-1).
Etap 2. Utworzenie jednostek izoprenoido-
wych. Mewalonian zostaje kolejno ufosforylo-
wany przez trzy kinazy z udziałem ATP (rycina
26-2), a po dekarboksylacji zostaje utworzona
aktywna jednostka izoprenoidowa - izopenteny-
lodifosforan.
Etap 3. Sześć jednostek izoprenoidowych
tworzy skwalen. Izopentenylodifosforan ulega
izomeryzacji wskutek przesunięcia podwójne¬
go wiązania i tworzy difosforan dimetyloallilu,
a po kondensacji z inną cząsteczką izopentenylo-
difosforanu powstaje dziesięciowęglowy difosfo¬
ran geranylu (rycina 26-2). Dalsza kondensacja
z izopentenylodifosforanem prowadzi do utwo¬
rzenia difosforanu farnezylu. Dwie cząsteczki
difosforanu farnezylu kondensują ze sobą końca¬
mi di fosforanowymi i wreszcie powstaje skwalen.
Początkowo zostaje wyeliminowana jedna czą¬
steczka nieorganicznego pirofosforanu i powsta¬
je difosforan preskwalenu, który ulega redukcji
w wyniku działania NADPH i po wyeliminowa¬
niu drugiej cząsteczki pirofosforanu przechodzi
w skwalen.
Etap 4. Utworzenie lanosterolu. Skwalen
może ulec pofałdowaniu w strukturę przypomi¬
nającą pierścień steroidowy (ryc. 26-3). Zanim
nastąpi zamknięcie pierścienia, skwalen zosta¬
je przekształcony w 2,3-epoksyd skwalenu pod
wpływem działania oksydazy o mieszanej funk¬
cji w siateczce śródplazmatycznej - epoksydazy
skwalenowej. Gdy następuje cyklizacja katali¬
zowana przez enzym cyklaza oksydoskwalen :
lanosterol, grupy metylowe zostają przeniesione
zC14 na C13 oraz z C8 na C14.
Etap 5. Utworzenie cholesterolu. Cholesterol
powstaje z lanosterolu w błonach siateczki śród¬
plazmatycznej; proces obejmuje zmiany w pier-
o
CH3-C^S-CoA
2 Acetylo-CoA
^ CoA-SH
C— CH2 — C f\j S — CoA
q Acetoacetylo-CoA q
SYNTAZA HMG-CoA |
CHo — C S — CoA
Acetylo-CoA
CoA—SH
0
'00C — CH2 — C — CHo — C r\j S — CoA
3-Hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA)
Kwas żółciowy, cholesterol
|0 2NADPH + 2H+
REDUKTAZA HMG-CoA
t©
I©
Mewalonian
r
Statyny, np. mewastatyna
lowastatyna itd.
2NADP+ + CoA- SH
"00C - CHo - C - CHo - CHo - OH
OH
Mewalonian
Ryc. 26-1. Biosynteza mewalonianu. Synteza reduktazy HMG-
-CoA jest hamowana przez atorwastatynę, prawastatynę i sim-
wastatynę. Otwarte i wypełnione kółka oznaczają los każdego
z atomów węgla reszty acetylowej w cząsteczce acetylo-CoA.
ścieniu steroidowym oraz łańcuchu bocznym
(ryc. 26-3). Grupy metylowe przy atomach C14
i C4 zostają usunięte, w wyniku czego powstaje
14-demetylo-lanosterol, a potem zymosterol. Po¬
dwójne wiązanie między C8-C9 zostaje następnie
w dwóch etapach przeniesione między C5-C6
i powstaje desmosterol. W końcu, po redukcji po¬
dwójnego wiązania w łańcuchu bocznym powsta¬
je cholesterol. Dokładna kolejność, w jakiej rzeczy¬
wiście zachodzą opisane reakcje, nie jest znana.
Difosforan farnezylu jest związkiem
wyjściowym do biosyntezy dolicholu
i ubichinonu
Poliizoprenoidy dolichol (p. ryc. 15-20 i rozdz.
46) oraz ubichinon (p. ryc. 13-5) są syntetyzo-
284 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
'OOC C CH,
\/\/^
KINAZA
MEWALONIANOWA
CH3 OH
< /
"OOC C CHo
\/\/< ~
ch2 ch2 o-(p)
5-Fosłoran mewalonianu
KINAZA
FOSFOMEWALONIANOWA
r.
Mg2H
ATP
ADP
"OOC
ch3 o-(p)
c ch2
\/\/^ ~ ~
ch2 ch2 o-(p)~(p)
ADP ATP
KINAZA
DIFOSFOMEWALONIANOWA
CH3 OH
"OOC C
\/ \
®~®
3-Fosfo-5-difosforan mewalonianu
5-Difosforan mewalonianu
Ryc. 26-2. Biosynteza skwalenu, ubichinonu, dolicholu i innych pochodnych poliizoprenowych (HMG - reszta 3-hydroksy-3-metylo-
glutarylowa; x - cytokinina). Reszta farnezylowa jest obecna w cząsteczce hemu a oksydazy cytochromowej. Atom węgla znaczo¬
ny gwiazdką * staje się atomem C„ lub C12 w skwalenie. Syntetaza skwalenowa jest enzymem mikrosomalnym; wszystkie inne enzymy
zaznaczone na schemacie są rozpuszczalnymi białkami cytozolowymi, niektóre znajdują się w peroksysomach.
26. SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU 285
Ryc. 26-3. Biosynteza cholesterolu. Ponumerowane pozycje oznaczają atomy węgla pierścienia steroidowego, a otwarte i wypełnione
kółka wskazują losy każdego z atomów węgla acetylowej reszty acetylo-CoA. * odniesienie do oznakowania skwalenu na ryc. 26-2.
286 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
wane z difosforanu famezylu przez kolejne dołą¬
czanie reszt izopentenylodifosforanu, przy czym
w dolicholu jest ich 16, a w ubichinonie - 3-7.
Niektóre białka wiążące GTP w błonie komórko¬
wej są prenylowane resztami famezylu lub gera-
nylogeranylu (20 atomów węgla). Sądzi się, że
prenylacja białek ułatwia kotwiczenie białek do
błon lipidowych, a może także być zaangażowana
w oddziaływania białko-białko i w przemieszcza¬
nie się białek związanych z błonami.
SYNTEZA CHOLESTEROLU JEST
KONTROLOWANA PRZEZ REGULACJĘ
REDUKTAZY HMG-Coń
Regulacja biosyntezy cholesterolu odbywa się na
początku szlaku jego syntezy, na etapie reduktazy
HMG-CoA. Zmniejszonej syntezie cholesterolu
u głodzonych zwierząt towarzyszy zmniejszenie
aktywności tego enzymu. Jednak tylko synteza
w wątrobie jest hamowana wskutek dopływu cho¬
lesterolu z dietą. Hamowanie reduktazy HMG-
-CoA w wątrobie następuje pod wpływem dzia¬
łania mewalonianu, bezpośredniego produktu
w szlaku syntezy cholesterolu, oraz cholesterolu,
głównego końcowego produktu tego szlaku. Cho¬
lesterol i jego metabolity powodują represję tran¬
skrypcji reduktazy HMG-CoA poprzez aktywację
czynnika transkrypcyjnego, nazywanego biał¬
kiem wiążącym sterolowy element regulacyjny
(ang. sterol regulatory element-binding pro¬
tein, SREBP). Istnieje dość liczna rodzina białek
SREBP, które regulują transkrypcję wielu genów
odpowiedzialnych za pobieranie i metabolizm
cholesterolu oraz innych lipidów w komórkach.
Stwierdzono około dobową zmienność zarówno
syntezy cholesterolu, jak i aktywności reduktazy
HMG-CoA. Oprócz działania mechanizmów re¬
gulujących szybkość syntezy białka, aktywność
tej reduktazy jest także modulowana w szybszy
sposób - przez modyfikację potranslacyjną (ryc.
26-4). Insulina lub hormony tarczycy pobudzają
aktywność reduktazy HMG-CoA, natomiast glu-
kagon lub glikokortykoidy - hamują. Aktywność
jest odwracalnie modyfikowana przez mechani¬
zmy fosforylacji-defosforylacji, przy czym nie¬
które z nich mogą być zależne od cAMP i dlate¬
go mogą bezpośrednio odpowiadać na działanie
glukagonu. Próby obniżenia stężenia cholesterolu
w osoczu u ludzi poprzez dietę dają zmienne wy¬
niki. Ogólnie, zmniejszenie zawartości choleste¬
rolu w diecie o 100 mg powoduje obniżenie stę¬
żenia w surowicy o ok. 0,13 mmol/L.
WIELE CZYNNIKÓW WPŁYWA
NA RÓWNOWAGĘ CHOLESTEROLU
W TKANKACH
W tkankach równowaga cholesterolu jest regu¬
lowana w sposób przedstawiony na ryc. 26-5.
Wzrost ilości cholesterolu w komórce jest spowo¬
dowany: pobieraniem lipoprotein zawierających
cholesterol za pośrednictwem receptorów, np.
receptora LDL lub receptora oczyszczającego;
pobieraniem wolnego cholesterolu z bogatych
w cholesterol lipoprotein do błony komórkowej;
syntezą cholesterolu; a także hydrolizą estrów
cholesterolowych pod wpływem hydrolazy estru
cholesterolowego. Zmniejszenie zawartości cho¬
lesterolu w komórce jest wynikiem: wypływu
cholesterolu z błony do HDL za pośrednictwem
ABCA-1 lub SR-B1 (rozdz. 25), estryfikacji cho¬
lesterolu przez ACAT (acylotransferazę acylo-
-CoA: cholesterol) oraz zużywania cholesterolu
do syntezy innych steroidów, takich jak hormony,
lub do syntezy kwasów żółciowych w wątrobie.
Receptor LDL podlega intensywnej
kontroli (regulacji)
Receptory LDL (apoB-100, E) znajdują się na
powierzchni komórki we wgłębieniach, które są
opłaszczone od strony cytozolowej przez białko
zwane klatryną. Glikoproteinowy receptor jest
białkiem przezbłonowym, a jego region wiążący
B-100 znajduje się na końcu aminowym wysta¬
jącym na zewnątrz komórki. Po związaniu się
z receptorem LDL jest pobierany w całości wg
mechanizmu endocytozy. Apoproteina i estry cho¬
lesterolowe są hydrolizowane w lizosomach, po
czym cholesterol przenika do wnętrza komórki.
Receptory powracają na powierzchnię komórki.
Napływ cholesterolu hamuje transkrypcję genów
kodujących syntazę - reduktazę HMG-CoA i in¬
nych enzymów biorących udział w syntezie chole¬
sterolu, jak również hamuje powstawanie samego
receptora LDL drogą SREBP, tym samym zmniej¬
sza w skoordynowany sposób syntezę cholestero-
26. SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU 287
Glukagon
©i
i
Y
<-- cAMP
©
Ryc. 26-4. Możliwe mechanizmy regulacji syntezy cholesterolu przez reduktazę HMG-CoA. Insulina odgrywa dominującą rolę w porów¬
naniu z glukagonem. * Patrz ryc. 19-6.
lu i jego pobieranie. Następuje ponadto stymu¬
lacja aktywności ACAT, co pobudza estryfikację
cholesterolu. W ten sposób aktywność receptora
LDL na powierzchni komórki jest regulowana
w zależności od zapotrzebowania komórki na
cholesterol niezbędny do syntezy błon, hormo¬
nów steroidowych albo kwasów żółciowych
(p. ryc. 26-5).
CHOLESTEROL JEST TRANSPORTOWANY
MIĘDZY TKANKAMI W LIPOPROTEINACH
OSOCZA
Normalny poziom stężenia ogólnego cholesterolu
w osoczu u ludzi powinien wynosić ok. 5,2 mmol/
L, przy czym większość cholesterolu powinna być
w postaci zestryfikowanej. Cholesterol jest trans¬
portowany w osoczu w lipoproteinach (ryc. 26-6),
a u człowieka największa jego ilość znajduje się
w LDL. Cholesterol spożyty z pokarmem całko¬
wicie miesza się z cholesterolem osocza w ciągu
kilku dni, a z cholesterolem tkanek - w ciągu kilku
tygodni. Estry cholesterolu w diecie zostają zhy-
drolizowane do cholesterolu, który w takiej posta¬
ci jest wchłaniany przez ścianę jelita razem z nie-
zestryfikowanym cholesterolem i innymi lipidami.
Następnie razem z cholesterolem syntetyzowanym
w jelitach jest wbudowywany do chylomikronów.
Blisko 80-90% wchłoniętego cholesterolu zosta¬
je zestryfikowane długołańcuchowymi kwasami
tłuszczowymi w błonie śluzowej jelita. Dziewięć¬
dziesiąt pięć procent cholesterolu chylomikronów
jest dostarczane do wątroby w postaci chylomi¬
kronów resztkowych, a większość cholesterolu
wydzielanego przez wątrobę za pośrednictwem
VLDL pozostaje w tej strukturze podczas prze¬
kształcania w IDL i ostatecznie w LDL, które są
pobierane przez receptor LDL do wątroby i do in¬
nych tkanek pozawątrobowych (rozdz. 25).
288 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
BŁONA KOMÓRKOWA
Ryc. 26-5. Czynniki wpływające na równowagę cholesterolu w komórce. Odwrócony transport cholesterolu może się odbywać za
pośrednictwem białka transportującego ABCA 1 (z prep-HDL jako akceptorem zewnętrznym) albo SR-B1 (z HDL3 jako akceptorem
zewnętrznym). (C - cholesterol; CE - estry cholesterolowe; PL - fosfolipid; ACAT - acylotransferaza acylo-CoA.cholesterol; LCAT
- acylotransferaza lecytyna:cholesterol; A-l - apolipoproteina A-l; LDL - lipoproteina o małej gęstości; VLDL - lipoproteina o bardzo
małej gęstości). LDL i HDL nie są pokazane w odpowiedniej skali.
LCAT osocza jest odpowiedzialna za
powstawanie niemal wszystkich estrów
cholesterolowych osocza u ludzi
Aktywność LCAT jest związana z HDL zawiera¬
jącą apoA-I. Po estryfikacji cholesterolu w HDL
powstaje gradient jego stężenia, co „ściąga” cho¬
lesterol z tkanek i innych lipoprotein (p. ryc. 26-5
i 25-6), umożliwiając w ten sposób funkcjonowa¬
nie HDL w odwróconym transporcie choleste¬
rolu (p. ryc. 25-5).
Białko przenoszące ester cholesterolowy
ułatwia przenoszenie estrów
cholesterolowych z HDL do innych
lipoprotein
Białko to, związane z HDL, znajduje się w oso¬
czu ludzi i wielu innych gatunków. Ułatwia ono
przeniesienie estrów cholesterolowych z HDL
do VLDL, IDL i LDL w wymianie na triacylo-
glicerol, znosząc hamowanie zwrotne produktem
aktywności LCAT w HDL. U ludzi wiele estrów
cholesterolowych utworzonych wskutek działania
LCAT trafia do wątroby poprzez VLDL, lipoprote-
iny resztkowe (IDL) lub LDL (ryc. 26-6). Wzboga¬
cona w triacyloglicerol HDL2 dostarcza swój cho¬
lesterol do wątroby w cyklu HDL (p. ryc. 25-5).
CHOLESTEROL JEST WYDALANY
Z ORGANIZMU Z ŻÓŁCIĄ
W POSTACI NIEZMIENIONEJ
ALBO JAKO KWASY ŻÓŁCIOWE
(SOLE KWASÓW ŻÓŁCIOWYCH)
Około 1 g cholesterolu dziennie jest eliminowane
z organizmu. Blisko połowa jest wydalana w kale
26. SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU 289
KRĄŻENIE JELITOWO-WĄTROBOWE
Ryc. 26-6. Transport cholesterolu między tkankami u człowieka. (C - wolny cholesterol; CE - ester cholesterolowy; TG - triacylo-
glicerol; VLDL - lipoproteina o bardzo malej gęstości; IDL - lipoproteina o pośredniej gęstości; LDL - lipoproteina o małej gęstości;
HDL - lipoproteina o dużej gęstości; ACAT - acylotransferaza acylo-CoA:cholesterol; LCAT - acylotransferaza lecytyna:cholesterol;
A-l - apoproteina A-l; CETP - białko przenoszące ester cholesterolowy; LPL - lipaza lipoproteinowa; HL - lipaza wątrobowa; LRP
- białko pokrewne receptorowi LDL).
po przekształceniu w kwasy żółciowe. Reszta jest
wydalana w postaci niezmienionej, jako choleste¬
rol. Koprostanol jest głównym sterolem w kale;
jest on wytwarzany z cholesterolu przez bakterie
w dolnych odcinkach jelita.
Kwasy żółciowe sa wytwarzane
z cholesterolu
Pierwotne kwasy żółciowe są syntetyzowane
w wątrobie z cholesterolu. Są to kwas cholowy
(występujący w największej ilości) i kwas che-
nodeoksycholowy (ryc. 26-7). Pierwszym, i za¬
razem głównym, etapem regulacyjnym w biosyn¬
tezie kwasów żółciowych jest 7a-hydroksylacja
cholesterolu - reakcja katalizowana przez mikro-
somalny enzym 7a-hydroksylazę cholesterolu.
Jest to typowa monooksygenaza, potrzebująca do
swojego działania tlenu, NADPH i cytochromu
P450. Następne etapy hydroksylacji są katalizo¬
wane również przez monooksygenazy. Szlak bio¬
syntezy kwasów żółciowych rozdziela się już na
290 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
Ryc. 26-7. Biosynteza i degradacja kwasów żółciowych. Inny szlak w mitochondriach obejmuje hydroksylację cholesterolu z udziałem
enzymu - 27-hydroksylazy sterolowej. * Katalizowane przez enzymy bakteryjne.
początku na dwie drogi; jedna prowadzi do cholo-
ilo-CoA, charakteryzującego się dodatkową grupą
a-OH w pozycji 12, a druga - do chenodeoksy-
choloilo-CoA (ryc. 26-7). Inny szlak, odbywający
się w mitochondriach, obejmuje 27-hydroksyla-
cję cholesterolu jako pierwszy krok, jest katali¬
zowany przez 27-hydroksylazę sterolową i jest
odpowiedzialny za syntezę znacznej części pier¬
wotnych kwasów żółciowych. Pierwotne kwasy
żółciowe (p. ryc. 26-7) dostają się do żółci w for¬
mie połączeń z glicyną lub tauryną. Akt połącze¬
nia następuje w peroksysomach. U ludzi stosunek
połączeń z glicyną do połączeń z tauryną wynosi
3 : 1. W żółci, która ma odczyn zasadowy, kwa-
26. SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU 291
sy żółciowe i ich połączenia występują w postaci
soli, stąd nazwa „sole kwasów żółciowych”. Pew¬
na część kwasów żółciowych w jelicie jest pod¬
dawana działaniu bakterii jelitowych. Następuje
odłączenie przyłączonych uprzednio aminokwa¬
sów (dekoniugacja) oraz 7a-dehydroksylacja,
w wyniku czego tworzą się wtórne kwasy żółcio¬
we - kwas deoksycholowy i kwas litocholowy.
Większość kwasów żółciowych
powraca do wątroby w krążeniu
jelitowo-watrobowym
Produkty trawienia tłuszczu, łącznie z choleste¬
rolem, są wchłaniane w początkowym odcinku
(100 cm) jelita cienkiego, natomiast pierwotne
i wtórne kwasy żółciowe wchłaniają się niemal
wyłącznie w jelicie krętym, a 98-99% wydzie¬
lonych do jelita kwasów żółciowych powraca do
wątroby poprzez żyłę wrotną. Jest to znane jako
krążenie jelitowo-wątrobowe (p. ryc. 26-6). Jed¬
nak kwas litocholowy, jako nierozpuszczalny, jest
ponownie wchłaniany tylko w nieznacznym stop¬
niu. Jedynie mała frakcja soli kwasów żółciowych
nie zostaje wchłonięta i jest wydalana z kałem.
Tym niemniej, jest to główna droga eliminacji
cholesterolu. Każdego dnia niewielka pula kwa¬
sów żółciowych (3-5 g) krąży przez jelito sześć
do dziesięciu razy, a ilość kwasu żółciowego rów¬
noważna tej utraconej z kałem jest syntetyzowana
z cholesterolu, co pozwala na utrzymywanie sta¬
łej puli kwasów żółciowych. Dzieje się tak dzięki
działaniu układu kontroli zwrotnej.
Synteza kwasów żółciowych
jest kontrolowana na etapie
7a-hydroksylazy
Głównym etapem ograniczającym szybkość bio¬
syntezy kwasów żółciowych jest reakcja kata¬
lizowana przez 7a-hydroksylazę cholesterolu
(p. ryc. 26-7). Aktywność tego enzymu jest kon¬
trolowana zwrotnie z udziałem jądrowego recep¬
tora wiążącego kwas żółciowy: farnezoidowy X
receptor (FXR). Jeśli pula kwasów żółciowych
w krążeniu jelitowo-wątrobowym wzrasta, FXR
zostaje zaktywowany i transkrypcja genu 7a-hy-
droksylazy cholesterolu jest hamowana. Kwas
chenodeoksycholowy jest szczególnie ważny
w aktywacji FXR. 7a-Hydroksylaza cholesterolu
jest aktywowana również przez cholesterol po¬
chodzenia endogennego i pokarmowego, a regu¬
luje ją insulina, glukagon, glikokortykoidy i hor¬
mony tarczycy.
ASPEKTY KLINICZNE
Stężenie cholesterolu w surowicy
jest skorelowane z występowaniem
miażdżycy tętnic i choroby
niedokrwiennej serca
Podwyższone poziomy cholesterolu osocza uwa¬
ża się za główny czynnik sprzyjający miażdżycy
naczyń. Dziś wiadomo, że drugim, niezależnym
czynnikiem ryzyka są triacyloglicerole. Miaż¬
dżyca charakteryzuje się odkładaniem w ścianie
tętnic złogów cholesterolu i estrów cholestero¬
lowych z lipoprotein osocza. W chorobach, któ¬
rym towarzyszy utrzymywanie się podwyższo¬
nego stężenia we krwi VLDL, IDL, resztkowych
chylomikronów lub LDL (np. cukrzycy, nerczy-
cy lipidowej, niedoczynności tarczycy i innym
stanom hiperlipidemii), rozpoznaje się przed¬
wczesną miażdżycę lub znaczne jej nasilenie.
Między stężeniami HDL (HDL2) a zapadalnością
na niedokrwienną chorobę serca występuje jed¬
nak odwrotna zależność, dzięki czemu proporcja
LDL : HDL może być dobrym wskaźnikiem
prognostycznym. Jest to zgodne z funkcją HDL
w odwróconym transporcie cholesterolu. Po¬
datność na zapadalność na miażdżycę naczyń
u różnych gatunków jest bardzo różna, a czło¬
wiek jest jednym z nielicznych gatunków, u któ¬
rych ta choroba może być wywołana dietą o wy¬
sokiej zawartości cholesterolu.
Dieta może mieć ogromny
wpływ na obniżanie stężenia
cholesterolu w surowicy
Największy wpływ na determinowanie poziomu
stężenia cholesterolu w surowicy danego osob¬
nika mają czynniki dziedziczne, jednak ogromne
znaczenie mają również warunki środowiskowe,
a spośród nich czynnikiem obniżającym w spo¬
sób istotny stężenie cholesterolu w surowicy krwi
odpowiednia dieta, w której nasycone kwasy
tłuszczowe zostały zastąpione kwasami jedno-
i wielonienasyconymi. Oleje roślinne, takie jak
292 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
olej kukurydziany i olej słonecznikowy, zawieriją
dużo wielonienasyconych kwasów tłuszczowych,
natomiast oliwa z oliwek zawiera więcej jedno-
nienasyconych kwasów tłuszczowych. W skła¬
dzie tłuszczu masła, tłuszczu wołowego i tłuszczu
palmowego duży udział mają nasycone kwasy
tłuszczowe. Na wzrost stężenia lipidów we krwi,
zwłaszcza triacylogliceroli, największy wpływ spo¬
śród węglowodanów mają sacharoza i fruktoza.
Mechanizmy obniżania stężenia cholesterolu
przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe wciąż
nie są jeszcze w pełni poznane. Wiadomo jednak,
że jednym z nich może być silniejsze regulacyj¬
ne pobudzanie receptorów LDL przez wielonie¬
nasycone i jednonienasycone kwasy tłuszczowe,
aniżeli przez nasycone kwasy tłuszczowe, co
powoduje wzrost szybkości katabolizmu LDL
- głównych lipoprotein sprzyjających miażdży¬
cy. W dodatku nasycone kwasy tłuszczowe po¬
wodują powstawanie mniejszych cząstek VLDL,
które zawierają stosunkowo więcej cholesterolu
i są zużywane przez tkanki pozawątrobowe wol¬
niej aniżeli większe cząstki; czynniki te mogą
być uważane za sprzyjające powstawaniu miaż¬
dżycy.
Styl życia wpływa na stężenie
cholesterolu w surowicy
Inne czynniki uważane za sprzyjające powstawa¬
niu choroby niedokrwiennej serca to: nadciśnie¬
nie tętnicze, palenie tytoniu, płeć męska, otyłość
(zwłaszcza otyłość brzuszna), brak ruchu oraz pi¬
cie miękkiej wody a nie twardej. Czynniki zwią¬
zane z podwyższeniem stężenia WKT w osoczu,
z następującym potem wzmożonym wydzielaniem
triacylogliceroli i cholesterolu w postaci VLDL
do krążenia, obejmują stres emocjonalny i picie
kawy. Kobiety w wieku przedmenopauzalnym są
prawdopodobnie chronione przed wpływem tych
szkodliwych czynników przez dobroczynnie dzia¬
łające estrogeny. Stwierdzono pewien związek
między umiarkowanym spożywaniem alkoholu
i mniejszą zapadalnością na chorobę niedo¬
krwienną serca. Może to być spowodowane wzro¬
stem stężeń HDL wynikającym z podwyższonej
syntezy apoA-1 i ze zmianami aktywności białka
przenoszącego estry cholesterolowe. Donoszono
również o dobroczynnym działaniu czerwonego
wina, być może ze względu na zawarte w nim
antyoksydanty. Regularne ćwiczenia fizyczne
obniżają LDL osocza, a podnoszą HDL; stężenia
triacylogliceroli zostają także obniżone, najpraw¬
dopodobniej ze względu na podwyższoną wrażli¬
wość na insulinę, która wzmaga ekspresję lipazy
lipoproteinowej.
Jeśli zawodzi zmiana diety, steżenie
cholesterolu i triacylogliceroli
w surowicy mogą obniżyć leki
hipolipemizujace
W obniżaniu stężenia cholesterolu osocza i zapo¬
bieganiu chorobie niedokrwiennej serca okazała
się bardzo skuteczna rodzina leków znanych jako
statyny. Statyny działają jako inhibitory redukta-
zy HMG-CoA i związki pobudzające aktywność
receptora LDL. Obecnie stosuje się m.in. nastę¬
pujące preparaty: atorvastatin, simvastatin, flu-
\astatin i pravastatin [nazwy angielskie -przyp.
tłum.]. Innymi używanymi lekami sąfibraty, takie
jak clofibrate i gemfibrozil [nazwy angielskie
- przyp. tłum.] oraz kwas nikotynowy, których
działanie polega na zmniejszaniu stężenia triacy¬
logliceroli osocza przez obniżanie wydzielania
z wątroby VLDL zawierających triacyloglicerole
i cholesterol. Ostatnio wprowadzono nowy lek
pod nazwą ezetimibe, który obniża stężenie cho¬
lesterolu w krwi przez hamowanie wchłaniania
cholesterolu z jelita. Należy on do większej gru¬
py pokrewnych związków będących inhibitorami
wchłaniania cholesterolu z jelita.
Pierwotne zaburzenia lipoprotein
osocza (dyslipoproteinemie)
sa dziedziczne
Dziedziczne zaburzenia metabolizmu lipoprotein
są przyczyną pierwotnych stanów hipo- lub hi-
perlipoproteinemii (tab. 26-1). W wielu choro¬
bach, np. w cukrzycy, niedoczynności tarczycy,
chorobie nerek (zespół nerczycowy) i miażdżycy
występują wtórne nieprawidłowości w lipoprotei-
nach osocza, które są niemal takie same jak w sta¬
nach wrodzonych. Praktycznie wszystkie z tych
pierwotnych stanów są spowodowane uszkodze¬
niem na etapie tworzenia lipoprotein, ich trans¬
portu lub rozkładu (p. ryc. 25-4, 26-5 i 26-6). Nie
wszystkie te zaburzenia są szkodliwe.
26. SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU 293
Tabela 26-1. Pierwotne zaburzenia lipoprotein osocza (dyslipoproteinemie)
Nazwa
Defekt
Uwagi
Hipolipoproteinemie
Abetalipoproteinemia
Nie powstają chylomikrony, VLDL ani
LDL ze względu na nieprawidłowość
napełniania apoB lipidami
Rzadkie; stężenie acylogliceroli we krwi niskie;
jelito i wątroba nagromadzają acyloglicerole.
Zaburzenia wchłaniania jelitowego. Wczesny
zgon, któremu można zapobiec przez podawanie
dużych dawek witamin rozpuszczalnych
w tłuszczu, zwłaszcza witaminy E
Rodzinny niedobór a-lipoproteiny
Choroba Tangier
Choroba rybiego oka
Niedobory apoA-l
We wszystkich przypadkach występują
małe stężenia HDL lub też HDL w ogóle
nie występuje
Tendencja do hipertriacyloglicerolemii jako wynik
nieobecności apoC-ll powodującej nieaktywność
LPL. Niskie poziomy LDL. Miażdżyca w starszym
wieku
Hiperlipoproteinemie
Rodzinny niedobór lipazy
lipoproteinowej (typ 1)
Hipertriacyloglicerolemia spowodowana
niedoborem LPL, nietypowa LPL lub
niedobór C-ll powodujący nieaktywność
LPL
Powolne oczyszczanie krwi z chylomikronów
i VLDL, niskie stężenia LDL i HDL. Nie ma
podwyższonego ryzyka choroby wieńcowej
Rodzinna hipercholesterolemia
(typ Ma)
Nieprawidłowy receptor LDL lub mutacja
w regionie liganda apoB-100
Podwyższony poziom LDL i hipercholesterolemia,
w rezultacie miażdżyca i choroba wieńcowa
Rodzinna hiperlipoproteinemia
typu III (choroba szerokiego
pasma p, choroba
usuwania resztkowych
chylomikronów, rodzinna
dysbetalipoproteinemia)
Niedostateczne oczyszczanie krwi
z resztkowych chylomikronów
przez wątrobę spowodowane
nieprawidłowościami apoE. Chorzy
wykazują brak izoform E3 i E4, mają tylko
E2, który nie reaguje z receptorem E1
Wzrost stężenia resztkowych chylomikronów
i VLDL, o gęstości <1,019 (p-VLDL). Powoduje
hipercholesterolemię, powstawanie kępek żółtych
(żóttaków) i miażdżycę
Rodzinna hipertriacyloglicerolemia
(typ IV)
Nadprodukcja VLDL często połączona
z nietolerancją glukozy i hiperinsulinemią
Stężenia cholesterolu zwiększają się ze
wzrostem VLDL. Stężenia LDL i HDL często są
poniżej normy. Ten typ obrazu lipoprotein jest
zwykle związany z chorobą wieńcową serca,
typem 2 cukrzycy, otyłością, alkoholizmem
i z podawaniem hormonów progestagennych
Rodzinna hiperalfalipoproteinemia
Zwiększone stężenie HDL
Rzadki stan, zapewne sprzyjający zdrowiu
i długowieczności
Niedobór lipazy wątrobowej
Niedobór tego enzymu prowadzi do
nagromadzania się dużych, bogatych
w triacyloglicerole HDL i resztkowych
VLDL
U pacjentów powstają kępki żółte (żóttaki),
występuje choroba niedokrwienna serca
Rodzinny niedobór
acylotransferazy lecytyna:
cholesterol (LCAT)
Brak LCAT prowadzi do blokowania
odwróconego transportu cholesterolu.
Resztkowe HDL jako dyskoidalne
twory są niezdolne do pobierania
i estryfikowania cholesterolu
Stężenia estrów cholesterolowych i lizolecytyny
w osoczu są niskie. Obecna jest nietypowa
frakcja LDL, lipoproteina X, występująca również
u pacjentów z cholestazą. VLDL jest nietypowa
(p-VLDL)
Rodzinny nadmiar lipoproteiny (a)
Lp (a) składa się z jednej cząstki LDL
połączonej 1 molem apo(a). Apo(a)
wykazuje strukturalne homologie
z plazminogenem
Przedwczesna choroba niedokrwienna serca
spowodowana miażdżycą oraz zakrzepica
wywołana hamowaniem fibrynolizy
11stnieje związek między występowaniem u pacjentów allelu apoE4 a zapadalnością na chorobę Alzheimera. Zapewne apoE4 wiąże się
chętniej do p-amyloidu znajdującego się w płytkach zwyrodnieniowych układu nerwowego.
294 CZĘŚĆ II: BIOENERGETYKA I METABOLIZM WĘGLOWODANÓW ORAZ LIPIDÓW
STRESZCZENIE
• Cholesterol jest prekursorem wszystkich innych
steroidów w organizmie, np. kortykosteroidów,
hormonów płciowych, kwasów żółciowych
i witamin D. Spełnia on także ważną funkcję
strukturalną w błonach i w zewnętrznej war¬
stwie lipoprotein.
• Cholesterol jest syntetyzowany w organizmie
wyłącznie z acetylo-CoA. Trzy cząsteczki ace-
tylo-CoA tworzą mewalonian w wyniku ważnej
dla całego szlaku reakcji katalizowanej przez re-
duktazę HMG-CoA. Następnie jest wytwarzana
pięciowęglowa jednostka izoprenoidowa i sześć
tych jednostek kondensuje, tworząc skwalen.
Skwalen ulega cyklizacji, tworząc macierzysty
steroid lanosterol, który po utracie trzech grup
metylowych przechodzi w cholesterol.
• Synteza cholesterolu w wątrobie jest częścio¬
wo regulowana dopływem cholesterolu z die¬
tą. W tkankach równowaga cholesterolu jest
utrzymywana dzięki oddziaływaniom między
czynnikami warunkującymi wzrost stężenia
cholesterolu (np. synteza, pobieranie chole¬
sterolu poprzez receptor LDL lub receptory
oczyszczające) i czynnikami sprzyjającymi
utracie cholesterolu (np. synteza steroidów,
tworzenie estrów cholesterolowych, wydala¬
nie). Aktywność receptora LDL regulują pozio¬
my cholesterolu w komórce. W odwróconym
transporcie cholesterolu HDL pobiera choleste¬
rol z tkanek, a LCAT go estryfikuje i odkłada
w rdzeniu cząsteczki. Ester cholesterolu w HDL
jest pobierany przez wątrobę albo bezpośred¬
nio, albo po przeniesieniu do VLDL, IDL lub
LDL za pośrednictwem białka przenoszącego
ester cholesterolowy.
• Nadmiar cholesterolu jest wydalany z wątroby
z żółcią jako cholesterol lub jako sole kwasów
żółciowych. Znaczna ilość soli kwasów żół¬
ciowych jest wchłaniana do krążenia wrotnego
i oddawana do wątroby jako część krążenia je-
litowo-wątrobowego.
• Podwyższone stężenia cholesterolu obecnego
w VLDL, IDL lub LDL są związane z powsta¬
waniem miażdżycy naczyń, natomiast wysokie
stężenia HDL działają ochronnie.
• Wrodzone zaburzenia metabolizmu lipoprote¬
in prowadzą do pierwotnych stanów hipo- lub
hiperlipoproteinemii. Choroby takie, jak cuk¬
rzyca, niedoczynność tarczycy, choroba nerek
i miażdżyca wykazują wtórne nieprawidłowo¬
ści w lipoproteinach osocza, które są podobne
do niektórych pierwotnych nieprawidłowości.
PIŚMIENNICTWO
Chiang JL: Regulation of bile acid synthesis: pathways,
nuclear receptors and mechanisms. J Hepatol
2004;40:539.
Illingworth DR: Management of hypercholesterolemia.
Med. Clin North Am 2000;84:23.
Ness GC, Chambers CM: Feedback and hormonal regu¬
lation of hepatic 3-hydroxy-3-methylglutaryl coen-
zyme A reductase: the concept of cholesterol buffer-
ing capacity. Proc Soc Exp Biol Med 2000;224:8.
Parks DJ et al: Bile acids: natural ligands for a nuclear
orphan receptor. Science 1999;284:1365.
Russell DW: Cholesterol biosynthesis and metabolism.
Cardiovascular Drugs Therap 1992;6:103.
Spady DK, Woollett LA, Dietschy JM: Regulation of
plasma LDL cholesterol levels by dietary choles¬
terol and fatty acids. Annu Rev Nutr 1993; 13:355.
Tali A: Plasma lipid transfer proteins. Annu Rev Bio-
chem 1995;64:235.
Various authors: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins
and Membranes, 4th ed. Vance DE, Vance JE (edi-
tors). Elsevier, 2002.
Various authors: The cholesterol facts. A summary
of the evidence relating dietary fats, serum cho¬
lesterol, and coronary heart disease. Circulation
1990;81:1721.
Zhang FL, Casey PJ: Protein prenylation: Molecular
mechanisms and functional conseąuences. Annu
Rev Biochem 1996;65:241.
CZĘSC III
Metabolizm białek i aminokwasów
\ Biosynteza aminokwasów,
\ które nie muszą być dostarczane
i w pożywieniu
1Hctor l/l/. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Wszystkie 20 aminokwasów, które wchodzą
w skład białek, jest ważnych dla zdrowia. Sta¬
ny niedoboru aminokwasów, względnie rzadkie
w świecie zachodnim, są endemiczne w pewnych
regionach Afryki Wschodniej. Tam dieta opiera
się głównie na zbożach, które są ubogimi źródłami
aminokwasów, takich jak tryptofan i lizyna. Cho¬
roby wynikające z takiej diety to m.in. kwashior-
kor, który powstaje, gdy dziecko przechodzi na
dietę skrobiową ubogą w białko, i wyniszczenie
(marasmus), który jest następstwem niedoborów
zarówno energetycznych, jak i specyficznych
aminokwasów w pożywieniu.
Z ogólnej liczby 20 aminokwasów ludzie mogą
syntetyzować 12 z amfibolicznych związków
pośrednich glikolizy i cyklu kwasu cytrynowe¬
go (tab. 27-1). Te 12 aminokwasów nie jest by¬
najmniej „nieistotnych”, chociaż nie muszą być
dostarczane w pożywieniu. Wszystkie 20 ami¬
nokwasów jest pod względem biologicznym nie¬
zbędnych. Spośród 12 aminokwasów, które nie
muszą być dostarczane w pożywieniu, 9 powstaje
z amfibolicznych związków pośrednich i 3 (cyste¬
ina, tyrozyna i hydroksylizyna) z aminokwasów,
które muszą być dostarczone w pożywieniu. Roz¬
poznanie 12 aminokwasów, które ludzie mogą
Tabela 27-1. Zapotrzebowanie na aminokwasy u człowieka
Aminokwasy,
które muszą być
dostarczone w pożywieniu
Aminokwasy,
które nie muszą być
dostarczone w pożywieniu
Arginina1
Alanina
Histydyna
Asparagina
Izoleucyna
Asparaginian
Leucyna
Cysteina
Lizyna
Glutaminian
Metionina
Glutamina
Fenyloalanina
Glicyna
Treonina
Hydroksyprolina2
Tryptofan
Hydroksylizyna2
Walina
Prolina
Seryna
Tyrozyna
1 Częściowo niezbędny w pożywieniu. Syntetyzowany z niedo¬
stateczną szybkością, aby podtrzymać rozwój dzieci.
2 Niekonieczny do syntezy biatka, ale tworzący się podczas
zmian potranslacyjnych kolagenu.
296 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
syntetyzować, opierało się głównie na wynikach
badań stosowania diety, w której oczyszczone
aminokwasy zastępowały białko. W tym rozdzia¬
le omówiono tylko biosyntezę 12 aminokwasów,
które są syntetyzowane w ludzkich tkankach, nie
omówiono natomiast pozostałych 8, które są syn¬
tetyzowane przez rośliny, niższe eukarionty lub
prokarionty.
AMINOKWASY, KTÓRE NIE MUSZA
BYĆ DOSTARCZANE W POŻYWIENIU,
MAJA KRÓTKIE SZLAKI BIOSYNTEZY
Dehydrogenaza glutaminianowa, syntetaza glu¬
taminowa i aminotransferazy odgrywają kluczo¬
wą rolę w biosyntezie aminokwasów. Wynikiem
wspólnego działania tych trzech enzymów jest
przekształcenie jonu amonowego w azot a-ami-
nowy różnych aminokwasów.
Glutaminian i glutamina. Redukcyjne ami-
nowanie a-ketoglutaranu jest katalizowane przez
dehydrogenazę glutaminianową (ryc. 27-1). Ami-
nowanie glutaminianu do glutaminy jest katalizo¬
wane przez syntetazę glutaminową (ryc. 27-2).
o NHj
NAD(P)H + H+ NAD(P)+
Ryc. 27-1. Reakcja dehydrogenazy glutaminianowej.
nh3+ nh3+
Mg-ATP Mg-ADP + P,
Alanina. Alanina powstaje w wyniku transami-
nacji pirogronianu (ryc. 27-3).
Ryc. 27-3. Tworzenie alaniny w reakcji transaminacji pirogro¬
nianu. Donorem grupy aminowej może być glutaminian lub
asparaginian. Innym produktem jest a-ketoglutaran lub szcza-
wiooctan.
Asparaginian i asparagina. Asparaginian two¬
rzy się w wyniku transaminacji szczawiooctanu.
Przekształcenie asparaginianu w asparaginę jest
katalizowane przez syntetazę asparaginową (ryc.
27-4), która przypomina syntetazę glutaminową
(ryc. 27-2), z tym że w tym przypadku glutamina,
a nie jon amonowy, dostarcza azotu. Bakteryjna
syntetaza asparaginowa może także wykorzysty¬
wać jon amonowy. Hydroliza PPjdo przez piro-
fosfatazę sprawia, że reakcja jest bardzo uprzywi¬
lejowana energetycznie.
Mg-ATP Mg-AMP + PPj
Ryc. 27-4. Reakcja syntetazy asparaginowej. Należy zwrócić
uwagę na podobieństwa i różnice tej reakcji i reakcji syntetazy
glutaminowej (ryc. 27-2).
Seryna. Utlenianie grupy a-hydroksylowej
związku pośredniego glikolizy 3-fosfoglicerynia-
nu przekształca go w ketokwas, którego transami-
nacja i defosforylacja prowadzą do seryny (ryc.
27-5).
Ryc. 27-2. Reakcja syntetazy glutaminowej.
27. BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW, KTÓRE NIE MUSZĄ BYĆ DOSTARCZANE W POŻYWIENIU 297
OH
rV°'
NADH
0
■ rV
O
O
1
©
O
1
©
0
3-Fosfo-D-glicerynian
Fosfohydroksy-
pirogronian
a-AA
^ a-KA
nh3+
nh3+
Pi h2o
a;
HO 0
®-0
0
L-Seryna
Fosfo-L-seryna
Ryc. 27-5. Biosynteza seryny (a-AA - a-aminokwasy, a-KA
-a-ketokwasy).
Glicyna. Aminotransferazy glicynowe mogą
katalizować syntezę glicyny z glioksalanu i glu¬
taminianu lub alaniny. W przeciwieństwie do
większości aminotransferaz, te silnie uprzywile¬
jowują syntezę glicyny. Dodatkowymi ważnymi
ch3
i 3
2H CH3
A 1
1
h3c — n+ — ch3
»» h3c — n+ —
I
Cholina 1
Aldehyd betainy 11
OH
0
NAD+
Metyleno-
H4-Folian -H4-folian
HO 0 o
Seryna Glicyna
Ryc. 27-7. Reakcja hydroksymetylotransferazy serynowej. Reak¬
cja jest łatwo odwracalna (H4-folian - tetrahydrofolian).
szlakami tworzenia glicyny u ssaków jest jej bio¬
synteza z choliny (ryc. 27-6) lub z seryny (ryc.
27-7).
Prolina. Prolina tworzy się z glutaminianu
wskutek odwrócenia reakcji katabolizmu proliny
(ryc. 27-8).
o o
L-Glutaminian L-Glutamylo-
y-semialdehyd
H20
0 o
L-Prolina A2-Pirolidyno-
-5-karboksylan
Ryc. 27-8. Biosynteza proliny z glutaminianu przez odwrócenie
reakcji katabolizmu proliny.
Cysteina. Cysteina, której obecność w poży¬
wieniu nie jest konieczna, tworzy się z metioniny,
która jest niezbędna w pożywieniu. Po przekształ¬
ceniu metioniny w homocysteinę (p. ryc. 29-18)
homocysteina i seryna tworzą cystationinę, której
hydroliza dostarcza cysteiny i homoseryny (ryc.
27-9).
Ryc. 27-6. Powstawanie glicyny z choliny.
298 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
HO O
+ L-Seryna
u M+ c — U
O
l-Homoseryna
Ryc. 27-9. Przekształcenie homocysteiny i seryny w homose-
rynę i cysteinę. Siarka cysteiny pochodzi z metioniny, szkielet
węglowy z seryny.
NADP+ NADPH + H+
Tetrahydro- Dihydro-
biopteryna biopteryna
CH2 - CH - COO" CH2 - CH - COO'
NHj II \ NH,+
L-Fenyloalanina L-Tyrozyna
Tyrozyna. Hydroksylaza fenyloalaninowa
przekształca fenyloalaninę w tyrozynę (ryc. 27-
10). Tyrozyna nie jest potrzebna w pożywieniu
pod warunkiem, że dieta zawiera odpowiednią
ilość niezbędnej fenyloalaniny. Skoro reakcja ka¬
talizowana przez hydroksylazę fenyloalaninową
jest nieodwracalna, występująca w pożywieniu
tyrozyna nie może zastępować fenyloalaniny.
Reakcja katalizowana przez oksygenazę o mie¬
szanej funkcji polega na wbudowaniu jednego
atomu tlenu do fenyloalaniny i redukcji drugiego
atomu tlenu do cząsteczki wody. Moc redukcyjna,
dostarczana jako tetrahydrobiopteryna, pochodzi
ostatecznie z NADPH.
Hydroksyprolina i hydroksylizyna. Hydrok-
syprolina i hydroksylizyna występują głównie
w kolagenie. Ponieważ nie występuje tRNA dla
hydroksylowanego aminokwasu, zatem ani hy¬
droksyprolina, ani hydroksylizyna zawarte w po¬
karmie nie są wbudowywane do białka. Oba ami¬
nokwasy są całkowicie degradowane (p. rozdz.
29). Hydroksyprolina i hydroksylizyna powsta¬
ją z proliny i lizyny, ale tylko po wbudowaniu
tych aminokwasów do peptydów. Hydroksyla-
cja wbudowanych do peptydu reszt prolilowych
i lizylowych jest katalizowana przez hydroksy¬
lazę prolilową i hydroksylazę lizylową różnych
tkanek, m.in. skóry i mięśni szkieletowych, oraz
ziaminujących ran (ryc. 27-11). Hydroksylazy są
oksygenazami o mieszanej funkcji, które wyma¬
gają substratu, obecności tlenu cząsteczkowego,
askorbinianu, Fe2+ i a-ketoglutaranu. Na każdy
mol hydroksylowanej proliny lub lizyny jeden
mol a-ketoglutaranu ulega dekarboksylacji do
bursztynianu. Jeden atom tlenu cząsteczkowego
wbudowuje się w prolinę lub lizynę, drugi w bur-
h2n
H
N
i-Ketoglutaran [18OJ-Bursztynian
HNn
H
CH — CH -CHo
i i
OH OH
Tetrahydrobiopteryna
/S/N/' Pro >/S/\
Pro \/S/\
Ryc. 27-10. Reakcja hydroksylazy fenyloalaninowej. Biorą udział
dwa różne enzymy. Enzym II katalizuje redukcję dihydrobiopteryny
przez NADPH a enzym I - redukcję 02 do H20 oraz fenyloalaniny
do tyrozyny. Reakcja ta wiąże się z zaburzeniami metabolizmu
fenyloalaniny, omawianymi w rozdz. 29.
Ryc. 27-11. Reakcja hydroksylazy prolilowej. Substratem jest
peptyd bogaty w prolinę. Podczas reakcji tlen cząsteczkowy
wbudowuje się zarówno do bursztynianu, jak i do proliny. Hy¬
droksylaza lizylową katalizuje analogiczną reakcję.
27. BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW, KTÓRE NIE MUSZĄ BYĆ DOSTARCZANE W POŻYWIENIU 299
sztynian (ryc. 27-11). Brak witaminy C niezbęd¬
nej dla tych hydroksylaz wywołuje szkorbut.
Walina, leucyna i izoleucyna. Chociaż leucy-
na, walina i izoleucyna są aminokwasami, które
muszą być dostarczane w pokarmie, aminotran-
sferazy występujące w tkankach odwracalnie
przekształcają wszystkie trzy aminokwasy i odpo¬
wiadające im a-ketokwasy. Dlatego a-ketokwasy
mogą zastępować w pożywieniu odpowiadające
im aminokwasy.
Selenocysteina - 21. aminokwas. Mimo że
jej obecność w białkach nie jest powszechna,
selenocysteina występuje w miejscach aktyw¬
nych różnych enzymów człowieka, które kata¬
lizują reakcje redoks. Przykładami takich enzy¬
mów są reduktaza tioredoksynowa, peroksydaza
glutationowa i dejodynaza, która przekształca
tyroksynę w trijodotyroninę. Wszędzie tam,
gdzie selenocysteina występuje, uczestniczy ona
w aktywności katalitycznej tych enzymów i za¬
stąpienie selenocysteiny cysteiną może powodo¬
wać znaczne obniżenie aktywności katalitycznej.
Zaburzenia w ludzkich selenoproteinach skut¬
kowały nowotworzeniem i arteriosklerozą oraz
kardiomiopatią, związaną z niedoborem selenu
(choroba Keshan).
Biosynteza selenocysteiny wymaga L-cyste¬
iny, selenianu(VI) (Se042 ), ATP, specyficznego
tRNA i wielu enzymów. L-Seryna dostarcza sele-
nocysteinie szkieletu węglowego. Selenofosforan
utworzony z ATP i selenianu (ryc. 27-12) służy
jako donor selenu. W przeciwieństwie do hydrok-
syproliny lub hydroksylizyny, selenocysteina po¬
wstaje kotranslacyjnie podczas wbudowywania
jej do peptydów. Antykodon UGA unikatowego
tRNA, nazwanego tRNASec, normalnie sygnalizu-
H
I
H - Se - CH2 - C - C00"
NH3+
0
II
Se + ATP ► AMP + P, + H — Se — P — 0'
I
cr
Ryc. 27-12. Selenocysteina (góra) i reakcja katalizowana przez
syntetazę selenofosforanową (dóf).
je STOP. Zdolność aparatu syntetyzującego biał¬
ko rozróżniania specyficznego dla selenocysteiny
kodonu UGA wynika z obecności elementu inser-
cyjnego o strukturze pień-pętla (ang. stem-loop)
w nieulegającym translacji regionie mRNA.
Selenocysteinylo-tRNASec zostaje najpierw ob¬
ładowany seryną przez ligazę, która prowadzi
aminoacylację tRNASer. Następnie zastąpienie
tlenu seryny przez selen prowadzi do utworzenia
selenofosforanu w reakcji katalizowanej przez
syntazę selenofosforanową (ryc. 27-12). W kolej¬
nych katalizowanych enzymatycznie reakcjach
następuje przekształcenie cysteinylo-tRNAScc do
aminoakrylo-tRNASec i w końcu do selenocyste-
inylo-tRNA. W obecności specyficznego czyn¬
nika elongacji, który rozpoznaje selenocysteiny-
lo-tRNASec, selenocysteina może zostać wbudo¬
wana do białek.
STRESZCZENIE
• Wszystkie kręgowce mogą wytwarzać pewne
aminokwasy z amfibolicznych związków po¬
średnich lub z innych aminokwasów pożywie¬
nia. Związki pośrednie i aminokwasy, z których
one powstają, to a-ketoglutaran (Glu, Gin, Pro,
Hyp), szczawiooctan (Asp, Asn) i 3-fosfoglice-
rynian (Ser, Gly).
• Cysteina, tyrozyna i hydroksylizyna powstają
z aminokwasów, które muszą być dostarczone
w pożywieniu. W biosyntezie cysteiny szkiele¬
tu węglowego dostarcza seryna, a siarki - ho-
mocysteina. Hydroksylaza fenyloalaninowa
przekształca fenyloalaninę w tyrozynę.
• Ani zawarta w pokarmie hydroksyprolina, ani
hydroksylizyna nie są wbudowywane do bia¬
łek, ponieważ żaden kodon lub tRNA nie na¬
rzuca ich wbudowywania do peptydów.
• Występujące w peptydzie hydroksyprolina
i hydroksylizyna powstają w wyniku hydro-
ksylacji proliny lub lizyny w reakcjach katali¬
zowanych przez oksydazy o mieszanej funkcji,
które jako kofaktora wymagają witaminy C.
Szkorbut jest następstwem zaburzenia hydro¬
ksylami spowodowanego niedoborem witami¬
ny C.
• Selenocysteina, ważny aminokwas miejsca ak¬
tywnego w wielu enzymach ssaków, powsta¬
je w wyniku kotranslacyjnego wbudowania
z uprzednio zmodyfikowanego tRNA.
300 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
PIŚMIENNICTWO
Beckett GJ, Arthur JR: Selenium and endocrine Systems.
J Endocrinol 2005; 184:455.
Brown KM, Arthur JR: Selenium, selenoproteins
and human health: a review. Public Health Nutr
2001;4:593.
Kohrl J et al: Selenium in biology: facts and medical
perspectives. Biol Chem 2000;381:849.
Nordberg J et al: Mammalian thioredoxin reductase is
irreversibly inhibited by dinitrohalobenzenes by
alkylation of both the redox active selenocysteine
and its neighboring cysteinę residue. J Biol Chem
1998;273:10835.
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001.
Katabolizm białek i azotu
l aminokwasów
Victor \N. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
W rozdziale tym opisano sposób, w jaki azot ami¬
nokwasów jest przekształcany w mocznik, a także
przedstawiono rzadkie choroby, które towarzyszą
zaburzeniom w biosyntezie mocznika. U zdrowych
dorosłych osób ilość azotu spożytego odpowiada
ilości azotu wydalonego. Dodatni bilans azotowy,
tj. nadmiar przyjętego azotu w stosunku do wy¬
dalonego, towarzyszy wzrostowi i ciąży. Ujemny
bilans azotowy, w którym ilość azotu wydalonego
przewyższa ilość azotu spożytego, może występo¬
wać po operacjach, w zaawansowanym raku oraz
w kwashiorkorze i wyniszczeniu (marasmus).
Ponieważ amoniak pochodzący głównie z a-
-aminowego azotu aminokwasów jest wysoce
toksyczny, tkanki przekształcają go w grupę ami¬
dową nietoksycznej glutaminy. Następnie dea-
minacja glutaminy w wątrobie uwalnia amoniak,
który jest przekształcany w nietoksyczny mocz¬
nik. Jeżeli funkcja wątroby jest upośledzona, jak
w marskości lub zapaleniu wątroby, podwyższo¬
ny poziom amoniaku we krwi wywołuje objawy
kliniczne. Każdy enzym cyklu mocznikowego
dostarcza przykładów zaburzeń metabolicznych
i ich fizjologicznych konsekwencji, a sam cykl
służy jako molekularny model do badania zabu¬
rzeń metabolicznych u człowieka.
OBRÓT BIAŁKA WYSTĘPUJE
U WSZYTKICH FORM ŻYCIA
Ciągła degradacja i synteza białek komórkowych
zachodzi we wszystkich żywych organizmach.
Codziennie u człowieka następuje wymiana
1-2% całkowitego białka organizmu, głównie biał¬
ka mięśni. Bardzo szybka degradacja białka wy¬
stępuje w tkankach podlegających strukturalnym
przekształceniom, np. w tkance macicy podczas
ciąży, tkance ogona kijanki podczas metamorfozy
lub w mięśniu szkieletowym podczas głodowania.
Z uwolnionych aminokwasów prawie 75% zostaje
ponownie wykorzystanych, natomiast z nadmia¬
ru azotu tworzy się mocznik. Ponieważ nadmiar
aminokwasów nie jest magazynowany, te, które
natychmiast nie zostały wbudowane do nowego
białka, są szybko degradowane do amfibolicznych
związków pośrednich.
BIAŁKA SA DEGRADOWANE
DO AMINOKWASÓW
PRZEZ PROTEAZYIPEPTYDAZY
Podatność białka na degradację jest wyrażona
okresem jego połowicznego rozpadu (/1/2), czyli
czasem, w jakim jego stężenie zmniejsza się do
połowy wartości początkowej. Okres połowicz¬
nego rozpadu białek wątroby waha się od mniej
niż 30 minut do ponad 150 godzin. Wartości tm
typowych enzymów metabolizmu podstawowe¬
go (ang. housekeeping enzymes) wynoszą powy¬
żej 100 godzin. W przeciwieństwie do nich wiele
kluczowych enzymów regulatorowych wykazuje
wartość tm 0,5-2 godzin. Sekwencje PEST, czyli
regiony bogate w prolinę (P), glutaminian (E),
serynę (S) i treoninę (T), „wyznaczają” pewne
białka do szybkiej degradacji. Wewnątrzkomór¬
kowe proteazy hydrolizują wewnętrzne wiązanie
peptydowe. Powstałe peptydy są wówczas degra¬
dowane do aminokwasów przez endopeptydazy,
które rozrywają wewnętrzne wiązania, oraz przez
aminopeptydazy i karboksypeptydazy, które
usuwają kolejno aminokwasy, odpowiednio, od
końców aminowych i karboksylowych. Degra-
302 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
1.
2.
3.
O
II
UB-C-0- + E1-SH + ATP'
O
II
UB—C—S—E-j + E2—SH ■
UB-C—s—Eo + HoN—e— Białko -
O
II
AMP + PPj + UB—C—S—E,
O
II
E,—SH + UB—C—S—E2
O H
II I
E2—SH + UB— C—N—e—Białko
Ryc. 28-1. Reakcje cząstkowe w przyłączeniu ubikwityny (UB) do białka.
1. Końcowa grupa karboksylowa COOH ubikwityny tworzy wiązanie tioestrowe
z grupą -SH enzymu E, w reakcji napędzanej przekształceniem ATP w AMP
i PP,; dalsza hydroliza PP4 przez pirofosfatazę zapewnia, że reakcja 1 będzie
przebiegała łatwo we wskazanym kierunku. 2. Reakcja wymiany tioestru prze¬
nosi zaktywowaną ubikwitynę na enzym E2.3. Enzym E3 katalizuje przeniesienie
ubikwityny na e-aminowe grupy lizyny docelowego białka.
dacja krążących we krwi peptydów, takich jak
hormony, następuje po utracie cząsteczki kwasu
sjalowego z nieredukujących końców ich oligo-
sacharydowych łańcuchów. Pozbawione kwasu
sjalowego glikoproteiny zostają intemalizowane
przez asjaloglikoproteinowe receptory komórki
wątroby i degradowane przez lizosomalne pro-
teazy, zwane katepsynami.
Pozakomórkowe oraz związane z błoną i długo
żyjące wewnątrzkomórkowe białka są degrado¬
wane w lizosomach w procesach niezależnych od
ATP. Degradacja nieprawidłowych i innych krót¬
ko żyjących białek natomiast zachodzi w cytozo-
lu i wymaga ATP oraz „wszędobylskiego” białka
- ubikwityny. Ubikwityna, która swą nazwę za¬
wdzięcza obecności we wszystkich komórkach eu¬
kariotycznych, jest małocząsteczkowym białkiem
(8,5 kDa), które „wyznacza” wiele wewnątrzko¬
mórkowych białek do degradacji. Pierwszorzę-
dowa struktura ubikwityny jest bardzo konserwa¬
tywna. Tylko 3 z 76 reszt aminokwasowych różni
ubikwitynę drożdżową od ludzkiej. Do białka
„skazanego” na degradację zostaje przyłączonych
kilka cząsteczek ubikwityny za pomocą niepepty-
dowych wiązań, które tworzą się między końcem
karboksylowym ubikwityny i grupami 8-amino-
wymi reszt lizyny w białku (ryc. 28-1). Decyzja
o modyfikacji białka przez ubikwitynę zależy od
rodzaju aminokwasu na jego A-końcu. Reakcja
z ubikwityną jest utrudniana przez A-końcową
Met lub Ser, a ułatwiana przez Asp i Arg. Degra¬
dacja białka zachodzi w multikatalitycznym kom¬
pleksie proteaz, znanym jako proteasom.
ZWIERZĘTA PRZEKSZTAŁCAJĄ AZOT
GRUPY a-AMINOWEJ W RÓŻNE
PRODUKTY KOŃCOWE
Zwierzęta wydalają nadmiar azotu jako amoniak,
kwas moczowy lub mocznik. Środowisko wodne
ryb kostnoszkieletowych, które są amonioteliczne
(wydalają amoniak), zmusza je do stałego usuwa¬
nia wody, co ułatwia wydalanie bardzo toksyczne¬
go amoniaku. Ptaki, które muszą zachować wodę
i utrzymać małą masę ciała, są urykoteliczne i wy¬
dalają kwas moczowy jako półstałe guano. Liczne
zwierzęta lądowe i ludzie należą do organizmów
ureotelicznych i wydalają nietoksyczny, rozpusz¬
czalny w wodzie mocznik. Duże stężenie mocznika
we krwi osób z chorobami nerek jest konsekwen¬
cją, a nie przyczyną upośledzonej funkcji nerek.
BIOSYNTEZA MOCZNIKA
Biosynteza mocznika zachodzi w czterech eta¬
pach: (1) transaminacja, (2) oksydacyjna deami-
nacja glutaminianu, (3) transport amoniaku i (4)
reakcje cyklu mocznikowego (ryc. 28-2).
Podczas transaminacji azot grup
a-aminowych przechodzi
na a-ketoglutaran,
tworząc glutaminian
Transaminacja obejmuje wzajemne przemiany
pary a-aminokwasów i a-ketokwasów (ryc. 28-3).
28. KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW 303
a-Aminokwas a-Ketokwas
I transamin/oT
a-Ketoglutaran L-Glutaminian
Mocznik
Ryc. 28-2. Ogólny przepływ azotu w katabolizmie aminokwa¬
sów.
NHt
0
I 3
II
okc/0-
R1/CvsC/
H .
i 11
0 \
/ 0
o o
Ryc. 28-3. Transaminacja. Reakcja jest łatwo odwracalna, ze
stałą równowagi równą ok. 1.
Większość aminokwasów podlega transaminacji,
z wyjątkiem lizyny, treoniny, proliny i hydroksy-
proliny. Transaminacja jest łatwo odwracalna, za¬
tem aminotransferazy biorą udział także w biosyn¬
tezie aminokwasów. Fosforan pirydoksalu (PLP)
jako koenzym jest obecny w miejscu katalitycz¬
nym aminotransferaz i wielu innych enzymów,
których substratami są aminokwasy. PLP, forma
witaminy B6, tworzy połączony z enzymem zwią¬
zek pośredni typu zasady Schiffa, który może być
przekształcany w różny sposób. Podczas transami¬
nacji przyłączony PLP służy jako przenośnik grup
aminowych. W wyniku przekształcenia tworzy się
a-ketokwas i enzym połączony z fosforanem piry-
doksaminy, który następnie tworzy zasadę Schiffa
z drugim ketokwasem. Po usunięciu azotu grupy
aminowej w procesie transaminacji pozostający
„szkielet” węglowy jest degradowany w szla¬
kach omówionych w rozdz. 29. Aminotransferaza
alanina-pirogronian (aminotransferaza alanino-
wa) i aminotransferaza glutaminian-a-ketogluta-
ran (aminotransferaza glutaminianowa) katalizu¬
ją przeniesienie grup aminowych na pirogronian
(tworząc alaninę) lub na a-ketoglutaran (tworząc
glutaminian) (ryc. 28-4). Każda aminotransferaza
jest swoista dla jednej pary substratów, a nieswo¬
ista dla innej. Ponieważ alanina jest substratem
także dla aminotransferazy glutaminianowej,
cały azot aminowy z aminokwasów, które ulegają
transaminacji może być gromadzony w glutami¬
nianie. Jest to ważne, ponieważ L-glutaminian jest
jedynym aminokwasem, który w tkankach ssaków
ulega deaminacji oksydacyjnej ze znaczną szyb¬
kością. Tworzenie amoniaku z grup a-aminowych
przebiega więc głównie poprzez azot a-aminowy
L-glutaminianu.
Pirogronian a-Aminokwas
L-Alanina a-Ketokwas
a-Ketoglutaran a-Aminokwas
L-Glutaminian a-Ketokwas
Ryc. 28-4. Aminotransferaza alaninowa (góra) i aminotransfera¬
za glutaminianowa (dóf).
Transaminacja nie jest ograniczona do grup
a-aminowych. 5-Aminowa grupa omityny - ale
nie 6-aminowa grupa lizyny - łatwo ulega trans¬
aminacji. W pewnych stanach chorobowych stę¬
żenie aminotransferaz w surowicy jest zwiększo¬
ne (p. tab. 7-2).
DEHYDROGENAZA l-GLUTAMINIANOWA
ODGRYWA KLUCZOWA ROLĘ
W METABOLIZMIE AZOTU
Przeniesienie azotu aminowego na a-ketoglutaran
prowadzi do utworzenia L-glutaminianu. Uwolnie¬
nie tego azotu jako amoniaku jest wtedy katalizo¬
wane przez wątrobową dehydrogenazę L-glutami-
nianową (GDH), która może wykorzystywać albo
NAD+, albo NADPf (ryc. 28-5). Przekształcenie
a-aminowego azotu w amoniak w wyniku wspól¬
nego działania aminotransferazy glutaminianowej
304 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
NAD(P)+ NAD(P)H + H+
L-Glutaminian a-Ketoglutaran
Ryc. 28-5. Reakcja katalizowana przez dehydrogenazę L-gluta-
minianową. NAD(P)+ oznacza, że kosubstratem może być albo
NAD+, albo NADP+. Reakcja jest odwracalna, ale stała równowa¬
gi uprzywilejowuje tworzenie glutaminianu.
i GDH jest często nazywane „transdeaminacją”.
Aktywność GDH wątroby jest allosterycznie ha¬
mowana przez ATP, GTP i NADH, a aktywowana
przez ADP Reakcja katalizowana przez GDH jest
łatwo odwracalna i zachodzi także w biosyntezie
aminokwasu (p. ryc. 27-1).
Oksydazy aminokwasowe także usuwają
azot w postaci amoniaku
Chociaż ich rola fizjologiczna nie została okre¬
ślona, wiadomo, że oksydazy L-aminokwasów
wątroby i nerek przekształcają aminokwasy do
a-iminokwasu, który dalej przechodzi w a-keto-
kwas, czemu towarzyszy uwolnienie jonu amono¬
wego (ryc. 28-6). Zredukowana flawina enzymu
jest ponownie utleniana przez tlen cząsteczkowy
i tworzy nadtlenek wodoru (H202), który jest roz¬
kładany do 02 i H20 przez katalazę.
Zatrucie amoniakiem jest groźne dla życia
Amoniak tworzony przez bakterie jelitowe
i wchłaniany do krwi żyły wrotnej oraz amoniak
wytwarzany w tkankach jest szybko usuwany
z krążenia przez wątrobę i przekształcany w mocz¬
nik. We krwi obwodowej występują zatem tylko
jego śladowe ilości (10-20 pg/dL). Jest to ważne,
ponieważ amoniak jest toksyczny dla centralnego
systemu nerwowego. Krew wrotna może ominąć
wątrobę, przez co stężenie amoniaku we krwi krą¬
żenia ogólnego może się zwiększyć do poziomu
toksycznego. Następuje to w przypadku poważne¬
go upośledzenia funkcji wątroby lub rozwinięcia
krążenia obocznego między żyłą wrotną i żyła¬
mi krążenia ogólnego w marskości wątroby. Do
objawów zatrucia amoniakiem należą drgawki,
bełkotliwa mowa, upośledzenie ostrości widze¬
nia, śpiączka i ostatecznie zgon. Amoniak może
być toksyczny dla mózgu, po części dlatego, że
reaguje z a-ketoglutaranem, tworząc glutaminian.
Rezultatem obniżenia poziomu a-ketoglutaranu
jest zaburzenie funkcji cyklu kwasu trikarboksy-
lowego (TCA) w neuronach.
Syntetaza glutaminowa przekształca
amoniak w glutaminę
Tworzenie glutaminy jest katalizowane przez
mitochondrialną syntetazę glutaminową (ryc.
28-7). Ponieważ synteza wiązania amidowego
R
NH3+
i
c.
H
C
0“
OKSYDAZA
AMIN0KWAS0WA
0
a-Aminokwas
Flawina Flawina-Ho
0.
)
NHo
II
0 J
a-lminokwas
^ H20
0
a-Ketokwas
Ryc. 28-6. Deaminacja oksydacyjna katalizowana przez oksydazę
L-aminokwasową (oksydoreduktaza L-a-aminokwas: 02). a-lmi¬
nokwas w nawiasie nie jest trwałym produktem pośrednim.
L-Glutaminian
Mg-ATP NHJ
Mg-ADP
+ Pi
V;
i
L-Glutamina
Ryc. 28-7. Reakcja katalizowana przez syntetazę glutaminową
silnie uprzywilejowuje syntezę glutaminy.
jest połączona z hydrolizą ATP do ADP i Pi? re¬
akcja silnie uprzywilejowuje syntezę glutaminy.
Jedną z głównych funkcji glutaminy jest „prze¬
chowanie” amoniaku w formie nietoksycznej.
Glutaminaza i asparaginaza powodują
deaminację glutaminy i asparaginy
Hydrolityczne uwolnienie azotu amidowego glu¬
taminy w formie amoniaku, katalizowane przez
glutaminazę (ryc. 28-8), silnie sprzyja tworze¬
niu glutaminianu. Połączone działanie syntetazy
glutaminowej i glutaminazy katalizuje wzajemną
przemianę wolnego jonu amonowego i glutaminy.
Analogiczna reakcja jest katalizowana przez l-
-asparaginazę.
mt
i
H,N^ . CH,^ ,CH ^ /O"
2 2VCH,X
II
II
0
0
L-Glutamina
h2o ^
1 GLUTAMINAZA |
NHT
i J
O
\
o
/
- o
\o
O
/
o
\
o
/
p
II
0
II
0
L-Glutaminian
Ryc. 28-8. Reakcja katalizowana przez glutaminazę zachodzi
w zasadzie nieodwracalnie w kierunku tworzenia glutaminianu
i NH*. Należy zwrócić uwagę, że usuwany jest azot amidowy,
a nie azot a-aminowy.
Tworzenie i wydalanie amoniaku
utrzymuje równowagę
kwasowo-zasadowa
Wydalanie do moczu amoniaku wytwarzanego
przez komórki kanalików nerkowych ułatwia
zatrzymywanie kationów i regulację równowa¬
gi kwasowo-zasadowej. Wytwarzanie amoniaku
z wewnątrzkomórkowej puli aminokwasów ne¬
rek, szczególnie glutaminy, zwiększa się w meta¬
bolicznej kwasicy, a zmniejsza w metabolicznej
alkalozie.
28. KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW 305
MOCZNIK JEST GŁÓWNYM KOŃCOWYM
PRODUKTEM KATABOLIZMU
AZOTU U LUDZI
Biosynteza 1 mola mocznika wymaga 3 moli
ATP i 1 mola jonu amonowego oraz azotu
a-aminowego asparaginianu. Poszczególne reak¬
cje tej biosyntezy, oznaczone na ryc. 28-9 cyframi
od 1 do 5, są katalizowane przez pięć enzymów.
Z sześciu aminokwasów uczestniczących w syn¬
tezie mocznika A-acetyloglutaminian działa jedy¬
nie jako aktywator enzymu. Pozostałe służą jako
nośniki atomów, z których ostatecznie powstaje
mocznik. U ssaków główną funkcją metaboliczną
ornityny, cytruliny i argininobursztynianu jest
biosynteza mocznika. Jest to proces cykliczny.
Ponieważ omityna wykorzystana w reakcji 2 jest
regenerowana w reakcji 5, nie ma żadnych strat
ani zysków ornityny, cytruliny i argininoburszty¬
nianu lub argininy. Zużywa się jedynie jon amo¬
nowy, C02, ATP i asparaginian. Niektóre reakcje
biosyntezy mocznika zachodzą w macierzy (ma-
triks) mitochondrium, natomiast inne - w cytozo-
lu (ryc. 28-9).
Syntetaza karbamoilofosforanowa I
inicjuje biosyntezę mocznika
Reakcja kondensacji C02, amoniaku i ATP, pro¬
wadząca do utworzenia karbamoilofosforanu,
jest katalizowana przez mitochondrialną synte-
tazę karbamoilofosforanową I (reakcja 1, ryc.
28-9). Cytozolowa forma tego enzymu - syn¬
tetaza karbamoilofosforanowa II wykorzystu¬
je raczej glutaminę niż amoniak jako donor
azotu i odgrywa rolę w biosyntezie pirymidyn
(p. rozdz. 33). Syntetaza karbamoilofosfora¬
nowa 1 - enzym ograniczający szybkość cyklu
mocznikowego - jest aktywna tylko w obecności
swojego allosterycznego aktywatora - A^-acety-
loglutaminianu, który zwiększa powinowactwo
syntetazy do ATP. Tworzenie karbamoilofosfora¬
nu wymaga 2 moli ATP, z których jeden służy
jako donor fosforanu. Przekształcenie drugiego
mola ATP do AMP i difosforanu, połączone z hy¬
drolizą difosforanu do ortofosforanu, dostarcza
energii do syntezy wiązania amidowego i mie¬
szanego bezwodnikowego wiązania karbamoilo¬
fosforanu. Połączone działanie GDH i syntetazy
karbamoilofosforanowej I przemieszcza azot do
306 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
CHo
I
COO"
L-Asparaginian
Ryc. 28-9. Reakcje i produkty pośrednie biosyntezy mocznika. Grupy zawierające azot, które biorą udziat w tworzeniu mocznika,
zaciemniono. Reakcje (p> i (T) zachodzą w matriks mitochondriów wątroby, a reakcje (T), ff), (jf^ - w cytozolu wątroby. C02 (jako
wodorowęglan), jon amonowy, ornityna i cytrulina przechodzą do/z matriks mitochondrialnej przy udziale swoistych (patrz ciemne
kropki) przenośników obecnych w wewnętrznej btonie mitochondriów wątroby.
karbamoilofosforanu - związku o wysokim po¬
tencjale transferu grupy. Reakcja przebiega eta¬
powo. W reakcji wodorowęglanu z ATP tworzy
się karboksyfosforan i ADR Następnie amoniak
zastępuje resztę fosforanową, tworząc karbami-
nian i ortofosforan. Fosforylacja karbaminianu
przez drugą cząsteczkę ATP prowadzi do utwo¬
rzenia karbamoilofosforanu.
Karbamoilofosforan z ornityna
tworzą cytrulinę
Transkarbamoilaza L-ornitynowa katalizuje
przeniesienie reszty karbamoilowej karbamoilofo¬
sforanu na omitynę, w wyniku czego powstaje cy¬
trulina i ortofosforan (reakcja 2, ryc. 28-9). Reakcja
ta zachodzi w matriks mitochondrium, natomiast
28. KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW 307
tworzenie omityny i następnie metabolizm cytruli-
ny przebiega w cytozolu. Wejście omityny do mito-
chondriów przez wewnętrzną błonę mitochondrial-
ną umożliwiają układy transportu (ryc. 28-9).
Cytrulina z asparaginianem tworzą
argininobursztynian
Syntetaza argininobursztynianowa katalizuje
reakcję łączenia asparaginianu z cytruliną za po¬
średnictwem gmpy aminowej asparaginianu (re¬
akcja 3, ryc. 28-9) i dostarcza drugiego atomu
I azotu mocznika. Reakcja wymaga ATP i obejmuje
tworzenie związku pośredniego cytrulilo-AMP.
Po zastąpieniu AMP asparaginianem tworzy się
cytrulina.
Rozszczepienie argininobursztynianu
prowadzi do utworzenia argininy
i fumaranu
i Rozszczepienie argininobursztynianu, katalizo¬
wane przez argininobursztynazę, prowadzi do
zatrzymania azotu w argininie i uwolnienia szkie¬
letu asparaginianu w formie fumaranu (reakcja 4,
' ryc. 28-9). W wyniku przyłączenia się cząsteczki
I wody do fumaranu tworzy się L-jabłczan, a na-
| stępnie wskutek zależnego od NADf utlenienia
| jabłczanu - szczawiooctan. Te dwie reakcje są
analogiczne do reakcji cyklu kwasu cytrynowe¬
go (p. ryc. 17-3), ale są katalizowane przez cy-
I tozolową fumarazę i dehydrogenazę jabłczanową.
I Transaminacja szczawiooctanu przy udziale ami-
[ notransferazy glutaminianowej powoduje odtwo¬
rzenie asparaginianu. Szkielet węglowy asparagi-
nian-fumaran działa jako przenośnik azotu gluta¬
minianu na prekursor mocznika.
Rozszczepienie argininy powoduje
uwolnienie mocznika i odtworzenie
| omityny
Hydrolityczne rozszczepienie gmpy guanidyno-
wej argininy, katalizowane przez występującą
w wątrobie arginazę, powoduje uwolnienie
1 mocznika (reakcja 5, ryc. 28-9). Inny produkt -
omityna powraca do mitochondriów wątroby do
następnej rundy cyklu mocznikowego. Omityna
I i lizyna są silnymi inhibitorami arginazy, kompe-
tycyjnymi z argininą. Arginina służy także jako
prekursor bardzo aktywnego związku powodu¬
jącego rozkurcz mięśnia - tlenku azotu (NO)
w reakcji zależnej od jonów Ca2+ i katalizowanej
przez syntazę NO (p. ryc. 48-15).
Syntetaza karbamoiiofosforanowa I
jest enzymem nadającym tempo
cyklowi mocznikowemu
Aktywność syntetazy karbamoilofosforanowej I
zależy od A-acetyloglutaminianu, którego stę¬
żenie w stanie stacjonarnym jest uwarunkowane
szybkością jego syntezy z acetylo-CoA i gluta¬
minianu oraz szybkością hydrolizy do octanu
i glutaminianu. Reakcje te są katalizowane,
odpowiednio, przez syntazę A-acetyloglutami-
nianową i hydrolazę A-acetyloglutaminianową.
Zasadnicze zmiany w diecie mogą zwiększać
stężenie poszczególnych enzymów cyklu mocz¬
nikowego nawet 10-20-krotnie. Na przykład
podczas głodowania stężenie enzymów zwięk¬
sza się prawdopodobnie dlatego, że muszą one
podołać zwiększonemu wytwarzaniu amoniaku,
które towarzyszy zwiększonej degradacji białka.
ZABURZENIA METABOLICZNE
CYKLU MOCZNIKOWEGO
Stosunkowo rzadkie, ale groźne, zaburzenia me¬
taboliczne związane z biosyntezą mocznika ilu¬
strują główne reguły chorób metabolicznych:
1. Podobne lub identyczne objawy kliniczne
i symptomy mogą charakteryzować dowolną
liczbę różnych molekularnych defektów w da¬
nym enzymie.
2. Racjonalna terapia musi być oparta na zrozu¬
mieniu istotnych reakcji biochemicznych, ka¬
talizowanych enzymatycznie, zarówno u osob¬
ników zdrowych, jak i chorych.
3. Identyfikacja związków pośrednich i produk¬
tów pomocniczych, które akumulują się przed
blokiem metabolicznym, stanowi podstawę dla
metabolicznych testów przesiewowych i może
wskazywać reakcję, która jest hamowana.
4. Precyzyjna diagnoza wymaga ilościowego
oznaczenia aktywności enzymu, co do którego
jest podejrzenie, że wykazuje defekt.
5. W końcu gen, który koduje zmutowany enzym
jest klonowany i jego sekwencja DNA jest po-
308 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
równywana z sekwencją genu typu dzikiego,
aby zidentyfikować specyficzne mutacje, które
powodują chorobę.
Ponieważ cykl mocznikowy przekształca
toksyczny amoniak w nietoksyczny mocznik,
wszystkie zaburzenia syntezy mocznika powo¬
dują zatrucie amoniakiem. Najcięższe zatrucia
występują w przypadkach, w których blok me¬
taboliczny dotyczy reakcji 1 lub 2 (ryc. 28-9),
ponieważ w wyniku syntezy cytruliny występuje
pewnego stopnia kowalencyjne wiązanie amo¬
niaku z węglem. Klinicznymi objawami, wspól¬
nymi dla wszystkich zaburzeń cyklu moczniko¬
wego, są: wymioty, niechęć do pokarmów boga-
tobiałkowych, ataksja przerywana, nerwowość,
senność i opóźniony rozwój umysłowy.
Objawy kliniczne i leczenie wszystkich pięciu
omówionych dalej zaburzeń są podobne. Znacz¬
ną poprawę przynosi spożywanie pokarmów
0 małej zawartości białka, co może w dużym
stopniu zapobiec uszkodzeniu mózgu. Aby unik¬
nąć gwałtownego zwiększenia stężenia amonia¬
ku we krwi, pożywienie należy rozłożyć na kilka
mniejszych posiłków.
ZABURZENIA METABOLICZNE
SA ZWIĄZANE Z KAŻDA REAKCJA
CYKLU MOCZNIKOWEGO
Opisano defekty każdego enzymu cyklu mocz¬
nikowego. Wiele mutacji zostało zmapowanych
1 zidentyfikowano specyficzne defekty w kodo¬
wanych enzymach.
Syntaza /V-acelyloglutaminianu
A-acetyloglutaminian jest ważny dla aktywności
syntetazy karbamoilofosforanowej I (p. reakcja 1,
ryc. 28-9). Gen NAGS koduje syntazę A-acety-
loglutaminianową która katalizuje kondensację
acetylo-CoA z glutaminianem. Defekty w genie
NAGS powodują ostrą hiperamonemię, która
w tym specyficznym przypadku może być niwelo¬
wana podawaniem A-acetyloglutaminianu.
Syntetaza karbamoilofosforanowa I
Defekty w enzymie - syntetazie karbamoilofosfo¬
ranowej I (reakcja 1, ryc. 28-9) są odpowiedzial¬
ne za względnie rzadką (oszacowana częstość
1:62 000) chorobę metaboliczną, zwaną „hiper-
amonemiątypu 1”.
Przenośnik ornityny
Syndrom hiperornitynemii, hiperamonemii i ho-
mocytrulinurii (syndrom HHH) jest wynikiem
mutacji genu ORNT1, który koduje przenośnik
ornityny w błonie mitochondrialnej. Niemoż¬
ność importu cytozolowej ornityny do matriks
mitochondriów powoduje zahamowanie cyklu
mocznikowego z następującą po tym hiperamo-
nemią i towarzyszącą jej akumulacją cytozolo¬
wej ornityny, co kończy się hiperomitynemią.
W przypadku braku jego normalnego akceptora
- ornityny, mitochondrialny karbamoilofosfo-
ran prowadzi karbamoilację lizyny do homocy-
truliny, co powoduje homocytrulinurię.
Transkarbamoilaza ornitynowa
Związane z chromosomem X zaburzenie określa¬
ne „hiperamonemią typu 2” odzwierciedla wadę
w transkarbamoilazie omitynowej (reakcja 2,
ryc. 28-9). Matki także wykazują hiperamone¬
mię i niechęć do pokarmów bogatobiałkowych.
Stężenie glutaminy we krwi, płynie mózgowo-
-rdzeniowym i moczu jest zwiększone prawdo¬
podobnie na skutek wzmożonej biosyntezy glu¬
taminy pod wpływem podwyższonego stężenia
amoniaku w tkankach.
Syntetaza argininobursztynianowa
Oprócz pacjentów z brakiem wykrywalnej ak¬
tywności syntetazy argininobursztynianowej (re¬
akcja 3, ryc. 28-9), donoszono także o chorych,
u których stwierdzano 25-krotnie podwyższoną
wartość Km dla cytruliny. Te przykłady ilustrują
pierwszą wymienioną wcześniej regułę. W cytru-
linemii poziom cytruliny jest podwyższony w su¬
rowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym, czemu
towarzyszy wydalanie 1-2 g cytruliny na dobę.
Argininobursztynaza (liaza
argininobursztynianowa)
Acyduria argininobursztynianowa, której towa¬
rzyszy podwyższone stężenie argininoburszty-
28. KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW 309
nianu we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym
i moczu jest związana z łamliwością rosnących
w kępkach włosów (trichorrhexis nodosa). Znane
są wczesne i późne typy choroby. Wada metabo¬
liczna dotyczy argininobursztynazy (liazy argini-
nobursztynianu; reakcja 4, ryc. 28-9). Diagnoza
przez pomiar aktywności argininobursztynazy
erytrocytów może być przeprowadzona w maci¬
cy na krwi pępowinowej lub komórkach z płynu
owodniowego.
Arginaza
Hiperarginemiajest autosomalnąrecesywnąwadą
w genie arginazy (reakcja 5, ryc. 28-9). W prze¬
ciwieństwie do innych zaburzeń cyklu moczni¬
kowego, pierwsze symptomy hiperarginemii nie
pojawiają się przed 2.-4. rż. Stężenie argininy jest
podwyższone we krwi i płynie mózgowo-rdzenio¬
wym. Skład aminokwasów w moczu, który przy¬
pomina lizynocystynurię, może odzwierciedlać
współzawodnictwo argininy z lizyną i cysteiną
w reabsorpcji w kanaliku nerkowym.
Analiza krwi noworodków za pomocą
tandemowej spektrometrii mas może
wykryć choroby metaboliczne
Choroby metaboliczne spowodowane brakiem
lub osłabieniem funkcji enzymów metabolicz¬
nych mogą prowadzić do wyniszczenia. Wczes¬
ne wprowadzenie odpowiedniej diety może jed¬
nak w wielu przypadkach złagodzić, skądinąd
nieuniknione, poważne skutki. Najważniejsze
jest więc wczesne wykrycie takich metabolicz¬
nych chorób. Od chwili wdrożenia w 1960 roku
w Stanach Zjednoczonych programów prze¬
siewowych nowo narodzonych dzieci, obecnie
takie badania przeprowadza się we wszystkich
stanach Ameryki Północnej, chociaż w zróż¬
nicowanym zakresie. Bardzo skuteczna i czu¬
ła technika tandemowej spektrometrii mas
(p. rozdział 4) umożliwia przesiewową analizę
pod kątem wykrycia ponad dwudziestu czterech
chorób metabolicznych, do czego potrzebna jest
zaledwie jedna kropla krwi noworodka. Można
oczekiwać, że wkrótce we wszystkich stanach
USA będzie stosowana ta technika do badań
przesiewowych nowo narodzonych dzieci w celu
wykrywania takich chorób metabolicznych, jak
organiczna kwasica, aminoacydemia, zaburzenia
utleniania kwasów tłuszczowych i wady w enzy¬
mach cyklu mocznikowego.
Terapia genowa rokuje
nadzieje na usuwanie zaburzeń
biosyntezy mocznika
Terapia genowa, mająca na celu korygowanie wad
w enzymach cyklu mocznikowego, jest przed¬
miotem intensywnych badań. Wstępne obiecujące
wyniki otrzymano na przykład na modelach zwie¬
rzęcych, wykorzystując adenowirus jako wektor
w leczeniu cytrulinemii.
STRESZCZENIE
• Codziennie 1-2% białek organizmu ludzkie¬
go ulega degradacji z szybkością, która jest
bardzo różna dla różnych białek i w różnych
stanach fizjologicznych. Kluczowe enzymy re¬
gulatorowe często mają krótki okres połowicz¬
nego rozpadu.
• Białka są degradowane w szlaku zależnym lub
niezależnym od ATP. Ubikwityna „wyznacza”
wiele wewnątrzkomórkowych białek do de¬
gradacji. Powierzchniowe receptory komórek
wątroby przyłączają i intemalizują asjalogli-
koproteiny przeznaczone do degradacji w lizo-
somach.
• Amoniak jest wysoce toksyczny. Ryby wyda¬
lają NH3 bezpośrednio, ptaki przekształcają
NH3 w kwas moczowy. Wyższe kręgowce prze¬
kształcają NH3 w mocznik.
• Transaminacja kieruje azot a-aminokwasowy
do glutaminianu. Dehydrogenaza glutaminia-
nowa (GDH) odgrywa kluczową rolę w meta¬
bolizmie azotu.
• Syntetaza glutaminowa przekształca NH3
w nietoksyczną glutaminę. Glutaminaza uwal¬
nia NH3, który zostaje wykorzystany do syntezy
mocznika.
• NH3, C02 i azot aminowy asparaginianu dostar¬
czają atomów wchodzących w skład mocznika.
• Synteza mocznika w wątrobie odbywa się
częściowo w matriks mitochondrium i czꜬ
ciowo w cytozolu. Wrodzone zaburzenia me¬
tabolizmu są związane z każdą reakcją cyklu
mocznikowego.
310 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
• Zmiany stężenia enzymów i allosteryczna
regulacja syntetazy karbamoilofosforanowej
przez jV-acetyloglutaminian regulują biosynte¬
zę mocznika.
• Choroby metaboliczne mogą być związane
z wadami każdego z enzymów cyklu moczni¬
kowego, a także wadami błonowego przenośni¬
ka omityny i syntazy N-acetyloglutaminianu.
• Tandemowa spektrometria mas jest najlepszą
techniką badań przesiewowych nowo narodzo¬
nych dzieci w przypadku ponad dwudziestu
czterech chorób metabolicznych.
PIŚMIENNICTWO
Brooks P et al: Subcellular localization of proteasomes
and their regulatory complexes in mammalian cells.
Biochem J 2000;346:155.
Caldovic L et al: Late onset A-acetylglutamate synthase
deficiency caused by hypomorphic alleles. Hum
Mutat 2005;25:293.
Crombez EA, Cederbaum SD: Hyperargininemia due to
liver arginase deficiency. Mol Genet Metab 2005;
84:243.
Elpeleg O et al: A-acetylglutamate synthase deficiency
and the treatment of hyperammonemic encepha-
lopathy. Ann Neurol 2002;52:845.
Gyato K et al: Metabolic and neuropsychological phe-
notype in women heterozygous for omithine trans-
carbamylase deficiency. Ann Neurol 2004;55:80.
Haberle J et al: Mild citrullinemia in caucasians is an
allelic variant of argininosuccinate synthetase de¬
ficiency (citrullinemia type 1). Mol Gener Metab
2003;80:302.
Iyer R et al: The human arginases and arginase deficien¬
cy. J Inherit Metab Dis 1998;21:86.
Pickart CM: Mechanisms underlying ubiąuitination.
Annu Rev Biochem 2001 ;70:503.
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001.
i Katabolizm szkieletów
węglowych aminokwasów
I/icłor ]N. Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Tematem tego rozdziału są przekształcenia szkie¬
letów węglowych pospolitych L-aminokwasów
w amfiboliczne produkty pośrednie (intermedia-
ty) oraz choroby metaboliczne lub „wrodzone
wady metaboliczne” kojarzone z tymi procesami.
Zaburzenia te pozostawione bez leczenia mogą
prowadzić do nieodwracalnych uszkodzeń mózgu
i przedwczesnej śmierci. Dlatego też powinny być
wykryte w fazie prenatalnej lub wczesnej postna-
talnej oraz odpowiednio wcześnie leczone. Wiele
enzymów można wykryć w hodowlach komórek
z płynu owodniowego pobranego przez nakłucie
owodni (amniocentezę)*, co ułatwia prenatalną
diagnozę.
Prawie we wszystkich Stanach (w USA) są
przeprowadzane badania przesiewowe dotyczące
blisko 30 chorób metabolicznych. Obejmują one,
choć nie ograniczają się tylko do nich, choroby
wynikające z wad w katabolizmie aminokwasów.
Testy wykrywające w kilku kroplach krwi nowo¬
rodka katabolity, które sugerują defekty metabo¬
liczne, opierają się na tandemowej spektrometrii
mas. Leczenie polega przede wszystkim na stoso¬
waniu diety ubogiej w aminokwasy, których ka¬
tabolizm jest upośledzony. Wiele zmian w struk¬
turze pierwszorzędowej enzymów nie powoduje
efektów ubocznych, inne natomiast modyfikują
strukturę trzeciorzędową miejsc katalitycznych
lub regulatorowych, obniżają wydajność katali¬
tyczną (zmniejszają Vmax lub zwiększają stałą Km)
albo zmieniają powinowactwo do allosterycznych
* Badanie inwazyjne obarczone ryzykiem poronienia
(wymienianym jako główne) o częstości 1:200-1:400
\przyp. tłum.].
regulatorów aktywności. Różnorodne mutacje
mogą zatem warunkować te same cechy kliniczne
oraz wywoływać takie same objawy.
KATABOLIZM AMINOKWASÓW
ZAZWYCZAJ INICJUJE TRANSAMINACJA
Usunięcie azotu a-aminowego w reakcji trans-
aminacji (p. ryc. 28-3) stanowi pierwszą reakcję
kataboliczną aminokwasów, z wyjątkiem proli-
ny, hydroksyproliny, treoniny i lizyny. Pozostały
szkielet węglowodorowy jest następnie rozrywa¬
ny na amfiboliczne produkty pośrednie, co poka¬
zano na ryc. 29-1.
Asparagina, asparaginian, glutamina i gluta¬
minian. Wszystkie cztery atomy węgla asparaginy
i asparaginianu tworzą szczawiooctan (ryc. 29-2,
góra). Analogiczne reakcje przekształcają gluta¬
minę i glutaminian w a-ketoglutaran (ryc. 29-2,
dół). Ze względu na to, że enzymy [transaminujące
- przyp. tłum.] pełnią również funkcje anabolicz¬
ne, nie występują defekty metaboliczne związane
z degradacją tych czterech aminokwasów.
Prolina. Prolina nie uczestniczy w transamina-
cji, dlatego azot tego iminokwasu cały czas jest
zachowywany w trakcie utleniania do dehydro-
proliny, otwierania pierścienia do y-semialdehydu
glutaminowego oraz oksydacji do glutaminianu,
a jest usuwany tylko podczas transaminacji glu¬
taminianu do a-ketoglutaranu (ryc. 29-3, góra).
Blok metaboliczny w hiperprolinemii typu I
dotyczy dehydrogenazy prolinowej. Nie istnie¬
je jednak związane z nim upośledzenie kataboli¬
zmu hydroksyproliny. Blok metaboliczny w hi¬
perprolinemii typu II dotyczy dehydrogenazy
Y-semialdehydu glutaminowego [poprawnie:
312 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Ryc. 29-1. Amfiboliczne produkty pośrednie powstające ze szkieletów węglowych aminokwasów.
<
l nh2
ch2
h2o nh4+
O — o
^ /w
°, °
I
1
] — c — nh2
| ASPARAGINAZA |
H-C-NH3+
I
COO"
1
C00"
L-Asparagina
L-Asparaginian
PYR ALA c^u
1^0“
C = O
I
COO"
Szczawiooctan
AMINOTRANSFERAZA
(Transaminaza)
/O
cC
l nh2
ch2
h2o nh;
w
— o — o
^ /W
o o
ch2
ch2
I
c — nh3+
1 GLUTAMINAZA |
I
H-C - NH3
i
I
C00‘
1
C00"
PYR ALA
AMINOTRANSFERAZA
(Transaminaza)
ch2
I
c = O
I
COO"
L-Glutamina L-Glutaminian a-Ketoglutaran
Ryc. 29-2. Katabolizm L-asparaginy (góra) i L-glutaminy (dót) do amfibolicznych związków pośrednich
(PYR - pirogronian; ALA - L-alanina). Zaciemnienie grup funkcyjnych na tej rycinie i następnych
uwydatnia części cząsteczek ulegające przemianie chemicznej.
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 313
H
H H
/
O
L-Prolina
DEHYDROGENAZA
PROLINOWA
©
O O
y-Semialdehyd-L-glutaminowy
DEHYDROGENAZA
SEMIALDEHYDO-l-GLUTAMINOWA
©
i-Glutaminian
t
a-Ketoglutaran
NH,+
H
H2Nv /Nx /CH2x /Chx /0-
° CH, CH, C
II
O
L-Arginina
H20-
©
nh3+
I
/ CH2 /CH O’
ch2 ch? c
I II
NH,+ o
L-Ornityna
a-KG ->v
Glu ^
y-Semialdehyd-L-glutaminowy
Ryc. 29-3. Góra: Katabolizm proliny. Cyfry w kółkach zaznaczają
miejsca wad metabolicznych w typie I © i typie II © hiperproli-
nemii.
Dół: Katabolizm argininy. y-Semialdehyd glutaminianu tworzy
a-ketoglutaran, jak pokazano wyżej; © - miejsce wady metabo¬
licznej w hiperargininemii.
314 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
HN^NH
T, Jh, W
H
'H
L-Histydyna
AMONIAKOLIAZA
HISTYDYNOWA
(HiSTYDAZA)
m NH
H
HYDRATAZA
UROKANIANOWA
(Urokanaza)
HN^^NH
■0S /CH2v.
C CH,^0
4-lmidazolono-5-propionan
H,0
IMIDAZOLONOPROPIONAZA
(Hydrolaza imidazolonopropionianu)
HN NH,
o o
W-Formiminoglutaminian (Figlu)
H4-folian
FORMIMINOTRANSFERAZA
GLUTAMINIANOWA
/V5-Formimino- A
-H4-folian
L-Glutaminian
ł
a-Ketoglutaran
Ryc. 29-4. Katabolizm L-histydyny do a-ketoglutaranu (H4-folian
- tetrahydrofolian). Reakcja katalizowana przez amoniakoliazę hi-
stydynową [inaczej: histydazę - nazwa niezalecana; przyp. tłum.]
jest prawdopodobnie miejscem występowania wady metabolicz¬
nej w histydynemii.
dehydrogenazy semialdehydo-L-glutaminowej -
przyp. tłum.], która także funkcjonuje w katabo¬
lizmie hydroksyproliny. Wpływa ona na kata¬
bolizm zarówno proliny, jak i hydroksyproliny,
powodując wydzielanie A^pirolino-S-hydroksy-
-5-karboksylanu (p. ryc. 29-11).
Arginina i ornityna. Arginina jest przekształ¬
cana w omitynę, następnie w y-semialdehyd glu¬
taminowy, który dostarcza a-ketoglutaranu, tak
jak w przypadku proliny (ryc. 29-3, dół). Mutacje
5-aminotransferazy omitynowej powodują wzrost
stężenia omityny w osoczu i moczu oraz pro¬
wadzą do atrofii zakrętowej siatkówki. Lecze¬
nie polega na ograniczeniu zawartości argininy
w pożywieniu. W zespole hiperornitynemii-hi-
peramonemii wadliwy antyport ornitynowo-
-cytrulinowy (p. ryc. 28-9) upośledza transport
do mitochondriów omityny, wykorzystywanej do
syntezy mocznika.
Histydyna. Katabolizm histydyny przebiega
poprzez urokanian, 4-imidazolono-5-propionian
oraz A-formiminoglutaminian (Figlu). Przeniesie¬
nie grupy formiminowej na tetrahydrofolian pro¬
wadzi do utworzenia glutaminianu, a następnie
a-ketoglutaranu (ryc. 29-4). W stanie niedobo¬
ru kwasu foliowego przeniesienie to jest upośle¬
dzone, natomiast wydziela się Figlu. Wydalanie
Figlu, następujące po podaniu histydyny, może
być zatem wykorzystane do wykrycia niedoboru
kwasu foliowego. Łagodne anomalie katabolizmu
histydyny obejmują histydynemię i acydurię
urokanianową, które są związane z zaburzeniem
funkcji histydazy [poprawnie: amoniakoliazy hi-
stydynowej -przyp. tłum.].
PIR0GR0NIAN POWSTAJE Z SZEŚCIU
CZĄSTECZEK AMINOKWASÓW
W skład pirogronianu wchodzą wszystkie atomy
węgla glicyny, seryny, alaniny i cysteiny oraz dwa
atomy węgla treoniny; z pirogronianu powstaje
następnie acetylo-CoA.
Glicyna. Kompleks syntazy glicynowej mito¬
chondriów wątroby rozszczepia glicynę na C02
i NH4 oraz tworzy A5,Al0-metylenotetrahydrofo-
lian (ryc. 29-5). Glicynuria wynika z upośledzo¬
nego wchłaniania zwrotnego glicyny w kanalikach
nerkowych. Pierwotna hiperoksaluria polega na
braku zdolności do katabolizmu glioksylanu two¬
rzonego w wyniku deaminacji glicyny. W następ¬
stwie tego utlenianie glioksylanu do szczawianu
prowadzi do kamicy moczowej, wapnicy nerek
(nephrocalcinosis) oraz przedwczesnej śmierci
z powodu niewydolności nerek lub nadciśnienia.
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 315
CH2 O" + NAD+
C
II
O
Glicyna
H4-folian
^ A/5,A/10-CH2-CH4-folian
C02 + NH4+ + NADH + H+
Ryc. 29-5. Odwracalne rozszczepienie glicyny przez mitochon-
drialny kompleks syntazy glicynowej.
Sery na. Po konwersji do glicyny katalizowa¬
nej przez hydroksymetylotransferazę serynową
(ryc. 29-6) katabolizm seryny zbiega się z kata¬
bolizmem glicyny.
Metyleno-
H4-folian -H4-folian
I II II
HO 0 0
i-Seryna Glicyna
Ryc. 29-6. Wzajemne przekształcenie seryny i glicyny kata¬
lizowane przez hydroksymetylotransferazę (H4-folian - tetra-
hydrofolian).
Alanina. Transaminacja alaniny prowadzi do
pirogronianu. Prawdopodobnie z przyczyn wymie¬
nionych przy katabolizmie glutaminianu i aspa-
raginianu nie występują zaburzenia katabolizmu
alaniny.
Cysteina. Najpierw cystyna ulega redukcji do
cysteiny pod wpływem reduktazy cystynowej
(ryc. 29-7). Cysteina jest następnie przekształca¬
na w pirogronian w dwóch różnych szlakach (ryc.
29-8). W metabolizmie cysteiny może wystąpić
wiele nieprawidłowości. Na przykład w cystyno-
lizynurii (cystynurii) - zaburzeniu nerkowego
wchłaniania zwrotnego cystyny, lizyny, argini-
ny oraz omityny - aminokwasy te są wydalane.
Oprócz tego, że w cystynurii tworzą się cysty-
nowe kamienie nerkowe, wada ta jest anomalią
h2c
I
s
0
s
II
1
Cx
/CH2
NH3+ L-Cystyna
REDUKTAZA
CYSTYNOWA
^ NADH + H+
^ NAD+
2
NH3+
II
o
L-Cysteina
Ryc. 29-7. Reakcja katalizowana przez reduktazę cystynową.
łagodną. Mieszany disiarczek L-cysteiny z L-ho-
mocysteiną (ryc. 29-9), wydzielany u pacjentów
z cystynurią, jest lepiej rozpuszczalny niż cystyna
i ogranicza tworzenie kamieni cystynowych. Inna
wada metaboliczna to homocystynuria wrażliwa
lub niewrażliwa na witaminę B6. Wadliwy trans¬
port cystyny, uzależniony od nośnika, jest przy¬
czyną cystynozy (choroby spichrzeniowej cy¬
styny), polegającej na odkładaniu się kryształów
cystyny w tkankach, obciążonej ryzykiem wczes¬
nej śmiertelności spowodowanej ostrą niewydol¬
nością nerek. Mimo danych epidemiologicznych
wskazujących na związek między poziomem
homocysteiny w osoczu i chorobami sercowo-na-
czyniowymi kontrowersyjne pozostaje twierdze¬
nie, że homocysteina stanowi ich przyczynowy
czynnik ryzyka.
Treonina. Treonina ulega rozszczepieniu do
aldehydu octowego oraz glicyny. Po utlenieniu
aldehydu octowego do octanu powstaje acetylo-
-CoA (ryc. 29-10). Katabolizm glicyny został już
wcześniej omówiony.
4-Hydroksyprołina. W procesie kataboli¬
zmu 4-hydroksy-L-proliny tworzą się kolejno:
L-A^pirolino-S-hydroksy-S-karboksylan, y-semi-
aldehyd-y-hydroksy-L-glutaminowy, erytro-y-hy-
droksy-L-glutaminian oraz a-keto-y-hydroksy-
316 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
„(T
Cysteina H2C C
I II
HS O
DIOKSYGENAZA
CYSTEINOWA
[OJ
ch2 — s - s — ch2
I I
H — C - NH3+ CH2
I I
COO' H — C — NH3+
I
COO"
(Cysteina) (Homocysteina)
Ryc. 29-9. Mieszany dwusiarczek cysteiny i homocysteiny.
nh3+
Cysteinosulfonian
"02S O
AMINOTRANSFERAZA
(Transaminaza)
a-Ketokwas
a-Aminokwas
O
Sulfinylopirogronian
HX C
i u
~02S o
| DESULFINAZA [
Pirogronian
CYSTEINA
AMINOTRANSFERAZA
(Transaminaza)
a-KA
a-AA
3-Merkaptomleczan
Ryc. 29-8. Katabolizm L-cysteiny poprzez cysteinosulfinian
(góra) i 3-merkaptopirogronian (dót).
glutaran. Rozszczepienie aldolowe dostarcza na¬
stępnie glioksylanu i pirogronianu (ryc. 29-11).
Wada dehydrogenazy 4-hydroksyprolinowej
jest przyczyną łagodnej hiperhydroksyproline-
mii. Upośledzenie związanego z nią katabolizmu
proliny nie występuje.
ACETYLO-CoA POWSTAJE Z DWUNASTU
CZĄSTECZEK AMINOKWASÓW
Tyrozyna. Na rycinie 29-12 przedstawiono
schemat przemiany tyrozyny do amfibolicznych
produktów pośrednich. Podczas przekształcenia
p-hydroksyfenylopirogronianu w homogentyzy-
nian czynnikiem redukującym jest askorbinian,
dlatego u pacjentów cierpiących na szkorbut
wydzielają się niecałkowicie utlenione produk¬
ty katabolizmu tyrozyny. W następnych etapach
procesu powstaje maleiloacetooctan, fumarylo-
acetooctan, fumaran, acetooctan i ostatecznie
acetylo-CoA.
Prawdopodobnie zaburzenie metabolizmu w ty-
rozynemii typu I (tyrozynozie) dotyczy hydro-
lazy fumaryloacetooctanowej [poprawnie: fu-
maryloacetoacetazy - przyp. tłum.] (reakcja 4 na
ryc. 29-12). Terapia polega na stosowaniu diety ze
zmniejszoną zawartością tyrozyny i fenyloalani-
ny. Nieleczona ostra oraz przewlekła tyrozynoza
prowadzi do śmierci z powodu niewydolności wą¬
troby. Alternatywne metabolity tyrozyny są rów¬
nież wydzielane w tyrozynemii typu II (zespół
Richner-Hanharta), defekcie aminotransferazy
tyrozynowej (reakcja 1 na ryc. 29-12) oraz w ty¬
rozynemii noworodków spowodowanej osłabio¬
ną aktywnością hydroksylazy /?-hydroksyfenylo-
pirogronianu [poprawnie: dioksygenazy 4-hydro-
ksyfenylopirogronianowej -przyp. tłum.] (reakcja
2 na ryc. 29-12). Leczenie polega na stosowaniu
diety niskobiałkowej.
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 317
Alkaptonuria po raz pierwszy została rozpo¬
znana i opisana w XVI wieku; jej dokładne scha¬
rakteryzowanie w 1859 r. stało się dla Garroda
podstawą do opracowania klasycznych koncepcji
o wrodzonych wadach metabolicznych. Wada ta
polega na braku oksydazy [poprawnie: 1,2-diok-
sygenazy - przyp. tłum.] homogentyzynianowej
(reakcja 3 na ryc. 29-12). Objawia się tym, że
mocz na skutek kontaktu z powietrzem ciemnie¬
je, ponieważ utlenia się wydzielany homogenty-
zynian. W późnych stadiach choroby występuje
zapalenie stawów oraz pigmentacja tkanki łącz¬
nej (ochronoza), spowodowana utlenianiem ho-
mogentyzynianu do octanu benzochinonooctanu,
który polimeryzuje i wiąże się z tkanką łączną.
Fenyloalanina. Fenyloalanina jest najpierw
przekształcana w tyrozynę (p. ryc. 27-10); na¬
stępne reakcje dotyczą już tyrozyny (ryc. 29-12).
Hiperfenyloalaninemia powstaje na skutek de¬
fektów w samej hydroksylazie fenyloalaninowej
[poprawnie: 4-monooksygenazie - przyp. tłum.]
(typ I - klasyczna fenyloketonuria, czyli PKU),
w reduktazie dihydrobiopterynowej (typy II i III)
lub wad w biosyntezie dihydrobiopteryny (typy
IV i V) (p. ryc. 27-10). Wydzielane są alternatyw¬
ne katabolity (p. ryc. 29-13). Analiza próbek DNA
ułatwia diagnozę prenatalną wad hydroksylazy
fenyloalaninowej i reduktazy dihydrobiopteryno¬
wej. Stosując dietę ubogą w fenyloalaninę, można
zapobiec upośledzeniu umysłowemu, charaktery¬
stycznemu dla PKU (częstość 1:10 000 urodzeń).
Podwyższony poziom fenyloalaniny w krwi może
nie być wykrywalny aż do 3-4 dni po urodzeniu.
Fałszywie dodatnie wyniki u wcześniaków mogą
odzwierciedlać opóźnione dojrzewanie enzymów
katabolizmu fenyloalaniny. Starsze, i mniej wia¬
rygodne badania przesiewowe, opierają się na
zastosowaniu FeCl3 do wykrywania fenylopiro-
gronianu w moczu. Przeprowadzanie tego typu
testów u noworodków jest obowiązkowe w wie¬
lu krajach [także w Polsce - przyp. tłum.], z tym
że w Stanach Zjednoczonych wykonuje się testy
oparte na tandemowej spektrometrii mas.
Lizyna. Pierwszych sześć reakcji kataboli¬
zmu L-lizyny w wątrobie człowieka prowadzi do
utworzenia krotonylo-CoA, który jest następnie
degradowany do acetylo-CoA i C02 w wyniku
katabolizmu kwasów tłuszczowych. Numery w kół¬
kach pojawiające się w dalszej części tekstu odno¬
szą się do odpowiednich reakcji na ryc. 29-14.
h3c ^ - V \ / 0"
I II
OH 0
L-Treonina
ALD0LAZA
TRE0NIN0WA
Glicyna
H3C x
CH
II
0
Aldehyd octowy
H?0-
DEHYDROGENAZA
ALDEHYDOWA
NAD+
H,C
II
0
Octan
NADH + H
0"
CoASH \
TI0KINAZA
OCTANOWA
Mg-ATP
Mg-ADP
H3C . S ~ CoA
II
0
Acetylo-CoA
Ryc. 29-10. Przemiana treoniny w glicynę i acetylo-CoA.
W reakcjach © i © zasada Schiffa, utworzona
z a-ketoglutaranu oraz grupy e-aminowej lizyny,
zostaje przekształcona do 8-semialdehydu kwasu
L-a-aminoadypinowego. Obie reakcje są katali¬
zowane przez jeden dwufunkcyjny enzym - syn-
tazę semialdehydu aminoadypinowego (zwaną
także lizynową reduktazą 2-oksoglutaranową
- dehydrogenazą sacharopinową). Po redukcji
8-semialdehydu kwasu L-a-aminoadypinowego
do L-a-aminoadypinianu (reakcja ®) następuje
dekarboksylacja glutarylo-CoA do krotonylo-
-CoA (reakcja ©). Następne reakcje dotyczą kata¬
bolizmu a-nienasyconych kwasów tłuszczowych
z nieparzystą liczbą atomów węgla.
318 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
o"
o
4-Hydroksy-L-prolina
2H
©
DEHYDROGENAZA
HYDROKSYPROLINOWA
nh+
\ OH I
O'
O
i-A1-Pirolino-3-hydroksy-5-karboksylan
H20
Reakcja
NIEENZYMATYCZNA
OH
NH3+
i 3
/CH\
HC CH2
\
o -
/
: o
\
o
O O
y-Semialdehyd-L-hydroksy-y-glutaminowy
NAD+ H20
.rf®[
DEHYDROGENAZA
NADH
OH NH3+
I I
"0. . CH . CH QT
C CHo C
O O
Erytro-y-hydroksy-i-glutaminian
"O
a-KA
AMIN0TRANSFERAZA
a-AA ^
(Transaminaza)
OH
0
I
II
o
\
o
:r
*
o
o
/
o
\
o
II
II
0
0
a-Keto-y-hydroksyglutaran
■°-c-CH
O
Glioksylan
H3C C
O
Pirogronian
Ryc. 29-11. Związki pośrednie w katabolizmie L-hydroksyproliny
(a-KA - a-ketokwas; a-AA - a-aminokwas). Cyfry w kółkach
oznaczają miejsca występowania wad metabolicznych w 0 hi-
perhydroksyprolinemii i ® hiperprolinemii typu II.
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 319
Ryc. 29-12. Związki pośrednie w katabolizmie tyrozyny. Atomy węgla są ponumerowane, aby móc prześledzić ich losy (a-KG - a-ketoglutaran; Glu - glutaminian; PLP - fosforan pirydok-
salu). Cyfry w kółkach oznaczają miejsca występowania wad metabolicznych w: © tyrozynemii typu II, © tyrozynemii noworodków, © alkaptonurii, © tyrozynemii typu I lub tyrozynozie.
320 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Fenylopirogronian
Glutamina
Fenyloacetyloglutamina |
conh2
Ryc. 29-13. Alternatywne szlaki katabolizmu fenyloalaniny w fe-
nyloketonurii. Reakcje te zachodzą również w zdrowej tkance
wątroby, ale mają mniejsze znaczenie.
Zaburzenia metabolizmu związane z reakcjami
szlaku katabolicznego lizyny obejmują hiperlizy-
nemie. Hiperlizynemia może wynikać z osłabie¬
nia aktywności © lub defektu © dwufunkcyjnego
enzymu - syntazy semialdehydu aminoadypino-
wego. Hiperlizynemii towarzyszy podwyższony
poziom sacharopiny we krwi jedynie wówczas,
gdy przyczyną jest osłabienie aktywności (D.
Zaburzenie metaboliczne występujące na etapie
reakcji © objawia się wrodzoną chorobą metabo¬
liczną związaną z degeneracją prążkowia i kory
mózgowej; charakteryzuje się ono podwyższonym
stężeniem kwasu glutarowego i jego metabolitów,
tj. kwasu glutakonowego oraz kwasu 3-hydroksy-
glutarowego. Prawdziwym wyzwaniem w lecze¬
niu tych metabolicznych wad jest ograniczenie
podaży L-lizyny w diecie i niedoprowadzenie przy
tym do niedożywienia.
Tryptofan. Tryptofan jest rozkładany do am-
fibolicznych produktów pośrednich w szlaku ki-
nureninowo-antranilanowym (ryc. 29-15). Dzia¬
łanie oksygenazy tryptofanowej (pirolazy tryp-
tofanowej) [poprawnie: 2,3-dioksygenaza trypto-
fanowa - przyp. tłum.] powoduje otwarcie pier¬
ścienia indolowego i wbudowanie dwóch atomów
tlenu cząsteczkowego, w wyniku czego powstaje
A/-formylokinurenina. Enzym ten jest metalopro-
teiną żelazoporfirynową, indukowaną przez kor-
tykosteroidy kory nadnerczy oraz przez tryptofan,
a hamowaną zwrotnie przez pochodne kwasu
nikotynowego, w tym NADPH. Hydrolityczne
usunięcie grupy formylowej z A/-formylokinure-
niny, katalizowane przez formylazę [poprawnie:
formamidazę - przyp. tłum.] kinureninową, pro¬
wadzi do wytworzenia kinureniny. Kinureninaza
wymaga fosforanu pirydoksalu, stąd wydzielanie
ksanturenianu (ryc. 29-16) w odpowiedzi na ob¬
ciążenie tryptofanem ma znaczenie diagnostyczne
w rozpoznaniu niedoboru witaminy B6. Choroba
Hartnupa wynika z upośledzenia jelitowego
i nerkowego transportu tryptofanu oraz innych
obojętnych aminokwasów. Wydzielają się po¬
chodne indolowe niewchłoniętego tryptofanu, po¬
wstające pod wpływem bakterii jelitowych. Wada
ta ogranicza dostępność tryptofanu do biosyntezy
niacyny i odpowiada za objawy podobne do pe¬
lagry.
Metionina. Metionina reaguje z ATP, tworząc
S-adenozylometioninę - „aktywną metioninę”
(ryc. 29-17). W następnych reakcjach powstaje
propionylo-CoA (ryc. 29-18) i ostatecznie bur-
sztynylo-CoA (p. ryc. 20-2).
POCZĄTKOWE REAKCJE
SA WSPÓLNE DLA WSZYSTKICH
TRZECH AMINOKWASÓW
0 ROZGAŁĘZIONYCH ŁAŃCUCHACH
Reakcje 1-3 na ryc. 29-19 są analogiczne do reak¬
cji zachodzących w katabolizmie kwasów tłusz¬
czowych. W następstwie transaminacji wszystkie
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 321
L-Uzyna
a-KG
O
NADH + H+
NAD+
Sacharopina
ó-Semialdehyd
i-a-aminoadypinowy
nh3+ nh3+
H2Cn /CH2 CHn (T
ch2 n ch2 c
II
o
o o
II II
/C\ /CH*\ /C\
"o ch2 nch o-
I
NH2+ 0 NH3+
I I 3
H2C \ /h ot
ch/ nch2 c
II
o
o nh3+
II I
HC , CH2v CH. yO~
'CH/ NCh/ Nc'
II
o
O NH,+
II I
-n/ c\ / CH2 \ /CHSP/0
Krotonylo-CoA
O
II
o/ C N CH?
o
II
c o
ch2/ Nc/
II
o
o o
II II
-/c\ /CH*\ /c\
o ch2 ch2 S~CoA
o o
II II
- /CN /CH* / C \
O CH2 CH S~CoA
Ryc. 29-14. Reakcje i związki pośrednie w katabolizmie L-lizyny (a-KG - a-ketoglutaran; Glu - L-glutaminian). Po
lewej stronie podano reakcje, a po prawej - struktury związków pośrednich. Przedstawione reakcje i wady metabo¬
liczne związane z katabolizmem lizyny omówiono w tekście.
trzy a-ketokwasy ulegaj ądekarboksylacj i oksyda¬
cyjnej, katalizowanej przez mitochondrialną de¬
hydrogenazę a-ketokwasów o rozgałęzionych
łańcuchach. Ten multimeryczny kompleks en¬
zymów, tj. dekarboksylazy a-ketokwasów, trans-
acylazy i dehydrogenazy dihydrolipoilowej bar¬
dzo przypomina dehydrogenazę pirogronianową
(p. ryc. 18-5). Jego regulacja również przebiega
analogicznie do regulacji dehydrogenazy pirogro-
nianowej i polega m.in. na inaktywacji wskutek
fosforylacji oraz reaktywacji w wyniku defosfo-
rylacji (p. ryc. 18-6).
Reakcja 3 jest analogiczna do dehydrogenacji
tioestrów tłuszczowych acylo-CoA (p. ryc. 22-3).
W acydemii izowalerianianowej spożycie pro¬
duktów bogatych w białko podwyższa stężenie
izowalerianianu - produktu deacylacji izowale-
rylo-CoA. Na rycinach 29-20,29-21,29-22 poka¬
zano kolejne reakcje charakterystyczne dla szkie¬
letu każdego z tych aminokwasów.
322 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Ryc. 29-15. Katabolizm tryptofanu (PLP - fosforan pirydoksalu).
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 323
Ksanturenian
Ryc. 29-16. Schemat powstawania kwasu ksanturenowego przy
niedoborze witaminy B6. Przekształcenie metabolitu tryptofanu,
3-hydroksykinureniny, w 3-hydroksyantranilan jest upośledzone
(p. ryc. 29-15). Znaczna jej część dostarcza zatem ksanturenianu.
ZABURZENIA METABOLICZNE
KATABOLIZMU AMINOKWASÓW
0 ROZGAŁĘZIONYCH ŁAŃCUCHACH
Jak wskazuje nazwa, zapach moczu w chorobie
„moczu o zapachu syropu klonowego” (ketonu-
rii rozgałęzionych łańcuchów) przypomina za¬
pach syropu klonowego lub przypalonego cukru.
Defekt biochemiczny dotyczy kompleksu dekar-
boksylazy a-ketokwasów (reakcja 2 na ryc. 29-19).
Osocze oraz mocz wykazują podwyższony poziom
leucyny, izoleucyny, waliny, a-ketokwasów i a-hy-
droksykwasów (zredukowanych a-ketokwasów).
Mechanizm działania toksycznego nie jest znany.
Wczesna diagnoza, szczególnie przed upływem
pierwszego tygodnia od urodzenia, opiera się na
analizie enzymatycznej. Szybkie zastąpienie białek
w diecie mieszanką aminokwasów niezawierającą
leucyny, izoleucyny i waliny zapobiega uszkodze¬
niu mózgu i przedwczesnej śmierci.
Mutacje komponentów reduktazy dihydroli-
ponianowej upośledzają dekarboksylację a-keto¬
kwasów o rozgałęzionych łańcuchach, pirogro-
nianu oraz a-ketoglutaranu. W nawracającej ke-
tonurii łańcuchów rozgałęzionych dekarboksy-
laza a-ketokwasów zachowuje pewną aktywność,
a objawy występują w późniejszym okresie życia.
Wadliwym enzymem w acydemii izowaleria-
nianowej jest dehydrogenaza izowalerylo-CoA
(reakcja 3 na ryc. 29-19). Po spożyciu nadmiaru
białka następują wymioty, kwasica oraz śpiączka.
Nagromadzony izowalerylo-CoA jest hydrolizo-
wany do izowalerianianu i wydalany.
STRESZCZENIE
• Nadmiar aminokwasów jest katabolizowany do
amfibolicznych produktów pośrednich, wyko¬
rzystywanych jako źródła energii lub do bio¬
syntezy węglowodanów i lipidów.
C00"
I
+H,N — C — H
ch2
s
I
ch3
L-Metionina
C00“
I
+h3n -c-h
ch2
(?>KpXp)
h2o P, + PP,
I
CH?
J
ch2 a
l
ADENOZYLOTRANSFERAZA
ch3
0
^Rybozay
w
HO OH
v Ryboza y
l-METIONINOWA
W
HO OH
ATP
S-Adenozylo-L-metionina
(„aktywna metionina”)
Ryc. 29-17. Schemat powstawania S-adenozylometioniny. ~CH3 oznacza grupę o wysokim potencjale
transferowym „aktywnej metioniny".
324 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
nh3+
I
HoC . . ch2 . . CH . cr
3 ^ ^
ATP
^ Pi + PPi
S-Adenozylo-i-metionina
Akceptor
CH3-akceptor
S-Adenozylo-L-homocysteina
HoO
Adenozyna
nh3+
I
. CH? ^ . CH ^ ^ 0-
pH L-Homocysteina
/C\ /CH2
"O CH
I
nh3+
L-Seryna
P-SYNTAZA
CYSTATIONOWA
*CH2
. CH N
0
s-
ch2
sc
II
I
II
cv
. /CH2
0
CH ^
|
Cystatonina
nh3+
O SH
II I
/C\ /CH2
"O CH
I
NH3+
L-Cysteina
H3<^ /Cs /O-
CH, C
nh:
NAOH + H+
H3C^
CH2 S ~ CoA
Propionylo-CoA
Ryc. 29-18. Przemiana metioniny w propionylo-CoA.
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 325
Metakrylilo-CoA Tyglilo-CoA Acetooctan Acetylo-CoA
Ryc. 29-19. Pierwsze trzy analogiczne reakcje w katabolizmie leucyny, waliny i izoleucyny. Zwraca też uwagę analogia Ryc. 29-20. Katabolizm p-metylokrotonylo-CoA pocho-
reakcji® i (D do reakcji katabolizmu kwasów tłuszczowych (p. ryc. 22-3). Analogia do katabolizmu kwasów tłuszczowych dzącego z L-leucyny. Gwiazdką (*) oznaczono atomy
występuje także w katabolizmie innych związków (patrz następne ryciny). węgla pochodzące z C02.
326 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
H,C C S ~ CoA
CH3
Tyglilo-CoA
r
0 -H O
1 /H II
H,C ' ^ CH ^ ^ S ~ CoA
CH,
a-Metyloacetoacetylo-CoA
(S) rCoASH
' S ~ CoA + CH2 S ~ CoA
I
CH,
Acetylo-CoA
Propionylo-CoA
H2C /C\
x C S~CoA
I
CH,
Metakrylilo-CoA
H,0
®J^
' HO 0
H2C\ /C\
CH S~CoA
I
CH3
p-Hydroksyizobutyrylo-CoA
alf"'"
w CoASH
HO 0
I II
H.C
2 ^ CH ^ ^ 0"
I
CH3
p-Hydroksyizomaślan
■ NAD+
. NADH + H+
0 0
II II
HC. . c
^ CH ^ x 0“
I
CH3
Semialdehyd metylomalonowy
a-Metylo-p-hydroksybutyrylo-CoA
CoASH
a-AA
/r\ ¥- NAD+ X
/®
^ [2H]
®A *
* ^ NADH + H+
\^«-KA
0
0
nh3+ 0
0
0
II
II
1 II
II
H3C ^ CH '
II
^ S ~ CoA
c
C
H,C C
^ CH x
I
^ i ^ S — CoA
*
^ CH ^ v 0"
1
3 |
ch3
ch3
ch3
Metylomalonylo-CoA
p-Aminoizomaślan
CH2
H,C S — CoA
Bursztynylo-CoA
Ryc. 29-21. Dalszy katabolizm tyglilo-CoA powstałego
z L-izoleucyny.
Ryc. 29-22. Dalszy katabolizm metyloakrylilo-CoA utworzonego
z L-waliny (p. ryc. 29-19). (a-KA - a-ketokwas; a-AA - a-ami-
nokwas).
29. KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW 327
• Transaminacja jest najbardziej powszechną
reakcją zapoczątkowującą katabolizm amino¬
kwasów. Następne reakcje usuwają ewentualne
dodatkowe atomy azotu oraz uzdatniają szkielet
węglowodorowy do konwersji w szczawiooc-
tan, a-ketoglutaran, pirogronian i acetylo-CoA.
• Choroby metaboliczne związane z kataboli¬
zmem glicyny obejmują glicynurię oraz pier¬
wotną hiperoksalurię.
• Cysteina jest przekształcana do pirogronianu
w dwóch różnych szlakach. Zaburzenia meta¬
boliczne katabolizmu cysteiny obejmują cysty-
no-lizynurię, chorobę spichrzeniową cystyny
oraz homocystynurie.
• Po rozszczepieniu treoniny przez aldolazę treo-
ninowąna glicynę i aldehyd octowy katabolizm
treoniny zbiega się z katabolizmem glicyny.
• Po transaminacji szkielet węglowy tyrozyny
jest rozrywany do fumaranu i acetooctanu.
Choroby metaboliczne związane z kataboliz¬
mem tyrozyny obejmują tyrozynozę, zespół
Richner-Hanharta, tyrozynemię neonatalną
oraz alkaptonurię.
• Zaburzenia metaboliczne katabolizmu fenylo-
alaniny obejmują fenyloketonurię (PKU) i inne
hiperfenyloalaninemie.
• Żaden z atomów azotu lizyny nie podlega trans¬
aminacji. Choroby metaboliczne katabolizmu
lizyny obejmują okresowe i utrwalone formy
hiperlizynemii-amonemii.
• Katabolizm leucyny, waliny i izoleucyny wy¬
kazuje wiele analogii do katabolizmu kwasów
tłuszczowych. Zaburzenia metaboliczne kata¬
bolizmu aminokwasów o rozgałęzionych łań¬
cuchach obejmują hiperwalinemię, chorobę
„moczu o zapachu syropu klonowego”, nawra¬
cającą ketonurię łańcuchów rozgałęzionych,
acydemię izowalerianową oraz acydurię mety-
lomalonową.
PIŚMIENNICTWO
Blacher J, Safar ME: Homocysteine, folie acid, B vita-
mins and cardiovascular risk. J Nutr Health Aging
2001;5:196.
Bliksrud YT et al: Tyrosinemia type I, de novo mutation
in liver tissue suppressing an inbom splicing defect.
J Mol Med 2005;83:406.
Cooper AJL: Biochemistry of the sulfur-containing amino
acids. Annu Rev Biochem 1983;52:187.
Gerstner B et al: Glutaric acid and its metabolites cau-
se apoptosis in immature oligodendrocytes: a novel
mechanism of white matter degeneration in glu-
taryl-CoA dehydrogenase deficiency. Pediatr Res
2005;57;771.
Gjetting T et al: A phenylalanine hydroxylase amino acid
polymorphism with implications for molecular diag-
nostics. Mol Genet Metab 2001;73:280.
Harris RA et al.: Molecular cloning of the branched-chain
a-ketoacid dehydrogenase kinase and the CoA-de-
pendent methylmalonate semialdehyde dehydroge¬
nase. Adv Enzyme Reguł 1993;33:255.
Heldt K et al: Diagnosis of mapie syrup urine disease by
newbom screening allows early intervention wit-
hout extraneous detoxification. Mol Genet Metab
2005;84:313.
Muller E, Kolker S: Reduction of łysinę intake while avo-
iding malnutrition: major goals and major problems
in dietary treatment of glutaryl-CoA dehydrogenase
deficiency. J Inherit Metab Dis 2004;27:903.
Sacksteder KA et al: Identification of the alhpa-amino-
adipic semialdehyde synthase gene wich is defec-
tive in familial hyperlysinemia. Am J Hum Genet
2000;66:1736.
Serwer CR: Garrod’s foresight; our hindsight. J Inherit
Metab Dis 2001;24:93.
Serwer CR et al (editors): The Mełabolic and Molecular
Bases oflnheritedDisease, 8th ed. McGraw-Hill, 2001.
Waters PJ, Serwer CR, Pamiak MA: Homomeric and
heteromeric interactions between wild-type and mu¬
tant phenylalanine hydroxylase subunits: evaluation
of two-hybrid approaches for functional analysis of
mutations causing hyperphenylalaninemia. Mol Ge¬
net Metab 2001;73:230.
Przemiana aminokwasów
w wyspecjalizowane produkty
1/ictor W. Fiodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Do ważnych produktów pochodzących z ami¬
nokwasów, opisanych w innych rozdziałach, za¬
liczają się: hem, puryny, pirymidyny, hormony,
neuroprzekaźniki (neurotransmitery) i peptydy
aktywne biologicznie. Także wiele białek zawie¬
ra aminokwasy, które uległy potranslacyjnym
modyfikacjom, aby mogły spełniać specyficzne
funkcje w organizmie. Reszty aminokwasowe
w tych białkach są prekursorami reszt zmodyfiko¬
wanych. Jako przykład tego typu przemian można
podać karboksylację glutaminianu do y-karbo-
ksyglutaminianu, który uczestniczy w wiązaniu
jonów Ca2+, hydroksylację proliny, umożliwiają¬
cą włączenie się jej do potrójnej helisy kolagenu,
oraz powstawanie hydroksylizyny, której kolejne
modyfikacje i tworzenie wiązań krzyżowych sta¬
bilizują dojrzewające włókna kolagenu. Małe pep¬
tydy lub cząsteczki peptydopodobne, niesyntezo-
wane na rybosomach, pełnią specyficzne funkcje
w komórce. Do neuroprzekaźników pochodzą¬
cych z aminokwasów zalicza się y-aminomaślan,
5-hydroksytryptaminę (serotoninę), dopaminę,
noradrenalinę (norepinefrynę) i adrenalinę (epine-
frynę). Na metabolizm tych neuroprzekaźników
wpływa wiele leków stosowanych w leczeniu
schorzeń neurologicznych i psychiatrycznych.
Glicyna
Wiele metabolitów i farmaceutyków jest wydala¬
nych w postaci rozpuszczalnych w wodzie sprzę¬
żonych połączeń (koniugatów) glicynowych, np.
kwas glikocholowy (rozdz. 26) i kwas hipurowy,
powstający z dodawanego do żywności benzoe¬
sanu (ryc. 30-1). Także wiele leków, metabolitów
leków i innych związków z grupami karboksylo¬
wymi pojawia się w moczu w formie koniugatów
z glicyną. Glicyna jest wbudowywana do kre-
atyny (p. ryc. 30-8), atomy azotu i węgla a gli¬
cyny są włączane do pierścieni pirolowych, przy
czym atom węgla a jest również wbudowywany
do mostków metinowych hemu (rozdz. 31), a od
całej cząsteczki glicyny pochodzą atomy C4 i C5
oraz atom N7 puryn (p. ryc. 33-1).
a-Alanina
a-Alanina tworzy razem z glicyną główną frakcję
wolnych aminokwasów w osoczu.
p-Alanina
P-Alanina - metabolit cysteiny (p. ryc. 33-9)
- występuje w koenzymie A (p. ryc. 44-18) oraz
w postaci dipeptydów P-alanylowych głównie
w kamozynie (p. poniżej). W tkankach ssaków
P-alanina powstaje z cytozyny (p. ryc. 33-9),
kamozyny i anseryny (ryc. 30-2). Transamina-
cja P-alaniny dostarcza semialdehydu malono-
wego. Podwyższony poziom P-alaniny, tauryny
i P-aminoizomaślanu w płynach ustrojowych oraz
w tkankach stwierdza się w hiper-P-alaninemii
- rzadkim zaburzeniu metabolicznym.
Dipeptydy p-alanylowe
Dipeptydy P-alanylowe - kamozyna i anseryna
(A-metylokamozyna) (p. ryc. 30-2) - aktywu¬
ją ATP-azę miozynową, chelatują jony miedzi
oraz zwiększają pobór miedzi. P-Alaninoimida-
zol buforuje pH mięśni szkieletowych kurczą¬
cych się w warunkach beztlenowych. Biosynteza
30. PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY 329
kamozyny jest katalizowana przez syntetazę kar-
nozynową w dwuetapowej reakcji, która obejmu¬
je najpierw powstawanie p-alanylo-AMP związa¬
nego z enzymem i następnie przeniesienie reszty
P-alaniny na L-histydynę.
ATP + p-alanina p-alanylo-AMP + ??i
p-alanylo-AMP + L-histydyna karnozyna + AMP
Seryna
Seryna uczestniczy w biosyntezie sfingozyny
(rozdz. 24), puryn i pirymidyn; z jej cząsteczki
pochodzą atomy węgla C2 i C8 puryn oraz grupa
metylowa tyminy (rozdz. 33).
Fosforylowana seryna, treonina i tyrozyna
Hydrolizę kamozyny do P-alaniny i L-histydyny
katalizuje kamozynaza. Dziedziczne zaburzenie
związane z niedoborem kamozynazy określa się
jako kamozynurię.
Homokamozyna (p. ryc. 30-2), występująca
w mózgu człowieka w większym stężeniu niż
karnozyna, jest syntezowana w tkance mózgo¬
wej w reakcji katalizowanej przez syntetazę kar-
nozyny. Kamozynaza występująca w osoczu nie
hydrolizuje homokamozyny. Homokamozynoza,
rzadka wada genetyczna, objawia się postępują¬
cą spastyczną paraplegią i opóźnieniem rozwoju
umysłowego.
Fosforylacja i defosforylacja reszt serylowej, treo-
nylowej i tyrozylowej reguluje aktywność niektó¬
rych enzymów uczestniczących w metabolizmie
SH
A
NHo
\=l:
N-(CH3)3
I
CH . . 0"
o
Ergotioneina
. NH,+
NHo
\=L,
Benzoesan
ATP
AMP + PPj
CoASH
0
0
Karnozyna
^ + /CH3
n c
H
ch/
NH
I
CH
V
II
0
ch2^
nh3+
(T
Benzoilo-CoA
Anseryna
CoASH
Glicyna
Hipuran
Hyc. 30-1. Biosynteza hipuranu. Analogicznym reakcjom ulega
wiele leków o charakterze kwasowym i katabolitów.
'nh3+
NH
/CH ^ /0-
CH, C
N'' 'NH,+
W.
o
Homokamozyna
Ryc. 30-2. Związki spokrewnione z histydyną. Zaciemnione
prostokąty obejmują sktadniki pochodzące z histydyny. Grupa SH
ergotioneiny pochodzi z cysteiny.
330 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
lipidów i węglowodanów oraz wpływa na Właści¬
wości białek, które biorą udział w przekaźnictwie
(transdukcji) sygnału.
Metionina
S-Adenozylometionina - podstawowe źródło
grup metylowych w organizmie - dostarcza rów¬
nież swojego szkieletu węglowego do biosyntezy
części 3-diaminopropanowej poliamin, sperminy
i spermidyny (p. ryc. 30-4).
Cysteina
L-Cysteina jest prekursorem części tioetanoloami-
nowej koenzymu A oraz tauryny, która sprzęga się
z kwasami żółciowymi, dając np. kwas taurocho-
lowy (rozdz. 26).
Histydyna
Dekarboksylacja histydyny do histaminy odbywa
się z udziałem dekarboksylazy L-aminokwasów
aromatycznych, która jest enzymem o różnorod¬
nej specyficzności i katalizuje również dekarbok-
sylację DOPA, 5-hydroksytryptofanu, fenyloala-
niny, tyrozyny i tryptofanu. Hamujące aktywność
dekarboksylazy a-metyloaminokwasy znajdują
zastosowanie jako środki obniżające ciśnienie.
Do związków histydynowych występujących
w organizmie ludzkim zalicza się ergotioneinę,
kamozynę i anserynę, pochodzącą z pożywienia
(p. ryc. 30-2). Bardzo niski poziom 3-metylohi-
stydyny w moczu jest charakterystyczny dla cho¬
roby Wilsona.
Ornityna i arginina
Arginina stanowi donor grupy formamidynowej
w syntezie kreatyny (p. ryc. 30-8) oraz poprzez
omitynę dla putrescyny, sperminy i spermidyny
(ryc. 30-3). Arginina jest również prekursorem
wewnątrzkomórkowej cząsteczki sygnałowej
- tlenku azotu, która pełni funkcję neuroprzekaź-
nika, czynnika rozkurczającego mięśnie gładkie
oraz wazodylatatora. Synteza NO, katalizowana
przez syntazę tlenku azotu, obejmuje zależną od
NADPH reakcję L-argininy z tlenem cząstecz¬
kowym i dostarcza L-cytruliny oraz NO (p. ryc.
48-15).
y-Semialdehyd
glutaminowy
PUTRESCYNA,
SPERMIDYNA,
SPERMINA
| GLUTAMINIAN
Ryc. 30-3. Metabolizm argininy, ornityny i proliny. W tkankach ssaków zachodzą wszystkie reakcje za¬
znaczone strzałkami ciągłymi. Synteza putrescyny i sperminy przebiega zarówno u ssaków, jak i u bak¬
terii. Fosforan argininy w mięśniach bezkręgowców działa jako fosfagen, podobnie jak fosforan kreatyny
w mięśniach ssaków.
30. PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY 331
OH OH
Dekarboksylowana
S-adenozylometionina
kN
u
J
OH OH
Metylotioadenozyna
SYNTAZA
SPERMIDYNOWA
+H,N ,
Dekarboksylowana
S-adenozylometionina
Metylotioadenozyna
Spermidyna
SYNTAZA
SPERMINOWA
X
+H3N
H
hN
N
h2
NH,+
Spermina
Hyc. 30-4. Związki pośrednie i enzymy uczestniczące w biosyntezie spermidyny i
skrótowej, aby nie zaciemniać całości procesu.
sperminy. Grupy metylenowe zapisano w postaci
332 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Poliaminy
Poliaminy - spermidyna i spermina - pełnią
swoje funkcje podczas komórkowej proliferacji
i wzrostu, będąc czynnikami wzrostu komórek
ssaków w hodowli oraz stabilizując nienaruszone
komórki, organelle subkomórkowe i błony. Daw¬
ki farmakologiczne poliamin działają hipoter-
micznie i hipotensyjnie. Poliaminy są obdarzone
wielokrotnym ładunkiem dodatnim, łatwo więc
asocjująz DNA i RNA. Na rycinie 30-4 przedsta¬
wiono biosyntezę poliamin, a na ryc. 30-5 - ich
katabolizm.
Tryptofan
W wyniku hydroksylacji tryptofanu do 5-hy-
droksytryptofanu katalizowanej przez wątrobową
hydroksylazę [poprawnie: 3-monooksygenazę -
przyp. tłum.] tyrozynową i następnie dekarboksy-
lacji powstaje serotonina (5-hydroksytryptamina),
która jest czynnikiem powodującym silny skurcz
naczyń oraz stymulującym skurcz mięśni gład¬
kich. Katabolizm serotoniny rozpoczyna się od
jej oksydacyjnej deaminacji do 3-octanu 5-hy-
droksyindolu, katalizowanej przez oksydazę mo-
noaminową (MAO) [poprawnie: oksydazę amino¬
wą - przyp. tłum.] (ryc. 30-6). Pobudzenie psy¬
chiczne, które następuje po przyjęciu iproniazydu
wynika z jego zdolności do wydłużania działania
serotoniny poprzez hamowanie oksydazy amino¬
wej. W przypadku rakowiaka (argentaffinoma)
komórki guza wytwarzają nadmiernie serotoninę.
W moczu pacjentów z rakowiakiem występują
metabolity - glukuronid A-acetyloserotoniny i ko-
niugat glicynowy octanu 5-hydroksyindolu. Sero¬
tonina oraz 5-metoksytryptamina są metabolizo¬
wane do odpowiednich kwasów przez oksydazę
aminową. W wyniku A-acetylacji serotoniny i na¬
stępnie (9-metylacji w szyszynce powstaje mela¬
tonina. Krążąca z krwią melatonina jest pobiera¬
na przez wszystkie komórki, także przez mózg,
i jest szybko metabolizowana najpierw w reakcji
hydroksylacji, a następnie sprzęgania z siarcza¬
nem lub kwasem glukuronowym.
Nerki i wątroba ssaków oraz bakterie kałowe
człowieka przekształcają tryptofan do tryptami-
ny, a następnie do 3-octanu indolu. Podstawowe
katabolity tryptofanu znajdujące się w moczu to:
octan 5-hydroksyindolu oraz 3-octan indolu.
H2
Spermina
OKSYDAZA
POLI AMINOWA
A
nh:
Aldehyd fł-aminopropionowy
Spermidyna
OKSYDAZA
P0LIAMIN0WA
A
Aldehyd p-aminopropionowy
Putrescyna
l
t
NHj + C02
Ryc. 30-5. Katabolizm poliamin. Aby ułatwić przedstawienie pro¬
cesu, struktury podano w formie skrótowej.
Tyrozyna
Tyrozyna jest przekształcana w komórkach ner¬
wowych w adrenalinę i noradrenalinę (ryc. 30-7).
Produkt pośredni - cząsteczka DOPA - stanowi
również produkt pośredni w procesie wytwarzania
melaniny. Hydroksylacj a tyrozyny w melanocy-
tach odbywa się pod wpływem innych enzymów.
Dekarboksylaza DOPA - enzym zależny od
fosforanu pirydoksalu - bierze udział w powsta¬
waniu dopaminy. Hydroksy lacj a dopaminy, kata¬
lizowana przez p-oksydazę dopaminy, prowadzi
wtedy do utworzenia noradrenaliny. W rdzeniu
nadnerczy A-metylotransferaza fenyloetanolo-
aminowa wykorzystuje S-adenozylometioninę do
30. PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY 333
N
H
/NH3t
CH
5-Hydroksytryptofan
HO
ch2 . NH3+
ch2
NH X
w postaci 5-hydroksyindolu
sprzężonej
HO
r-
-CH2 ^ XH,
/Y-Acetyloserotonina
°2
[nhJ]
3-Octan
5-metoksyindolu
r-
3-Octan
5-metoksyindolu
/V
- CH2 v /N /CH3
ch2 c
II
o
Wydalany
w postaci
sprzężonej
Melatonina
/V-acetylo-5-metoksyserotonina
Wydalany
w postaci
sprzężonej
Ryc. 30-6. Biosynteza i metabolizm serotoniny i melatoniny ([NH4+] - produkt transaminacji; MAO - oksydaza aminowa, inaczej:
oksydaza monoaminowa - nazwa niezalecana; ~CH3 - z S-adenozylometioniny).
334 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
HO,
NHt
L-Tyrozyna
3-MONOOKSYGENAZA
(Hydroksylaza)
TYROZYNOWA
OH
r
H4 • biopteryna
H2 • biopteryna
HO,
NHj
Dopa
O
metylacji aminy pierwszorzędowej - noradrenali¬
ny - wytwarzając adrenalinę (p. ryc. 30-7). Tyro¬
zyna jest także prekursorem trijodotyroniny oraz
tyroksyny (rozdz. 41).
Kreatynina
Kreatynina jest wytwarzana w mięśniach z fo¬
sforanu kreatyny w wyniku nieodwracalnej, nie-
enzymatycznej dehydratacji (odwodnienia) i od-
szczepienia fosforanu (ryc. 30-8). Ilość wydalanej
w ciągu doby w moczu kreatyniny jest proporcjo¬
nalna do masy mięśniowej. W biosyntezie kreaty¬
ny uczestniczą glicyna, arginina i metionina. Koń¬
cowym etapem syntezy kreatyny jest metylacja
octanu guanidyny przez S-adenozylometioninę.
DEKARBOKSYLAZA
DOPA
OH
PLP
CH2
Dopamina
J3-0KSYDAZA
DOPAMINOWA
'nh:
°2
Cu2+
Witamina C
ch2 v
nh;
Norepinefryna
(Noradrenalina)
/V-METYLOTRANSFERAZA
FENYLOETANOLO-
AMINOWA
^ S-Adenozylometionina
S-Adenozylohomocysteina
/CH2^ / ch3
CH N
I H2+
OH
Epinefryna
(Adrenalina)
Ryc. 30-7. Przemiana tyrozyny w epinefrynę (adrenalinę)
i norepinefrynę (noradrenalinę) w komórkach nerwowych
nadnerczy (PLP - fosforan pirydoksalu).
y-Aminomaślan
y-Aminomaślan (ang. y-aminobutyric acid,
GABA) spełnia w tkance mózgowej funkcję neu-
roprzekaźnika hamującego, działającego poprzez
zmianę transbłonowej różnicy potencjałów. Wy¬
twarzany jest w wyniku dekarboksylacji L-gluta-
minianu - reakcji katalizowanej przez dekarbok-
sylazę L-glutaminianu (inaczej: glutaminianową)
(ryc. 30-9). Transaminacja y-aminomaślanu pro¬
wadzi do semialdehydu bursztynowego (p. ryc.
30-9), który następnie może ulegać redukcji do
y-hydroksymaślanu w reakcji katalizowanej przez
dehydrogenazę kwasu L-mlekowego lub utlenie¬
niu do bursztynianu i następnie w cyklu kwasu cy¬
trynowego do C02 i H20. Rzadkie genetyczne za¬
burzenie metabolizmu GABA obejmuje wadliwą
aminotransferazę GABA - enzym, który uczestni¬
czy w katabolizmie GABA, następującym po jego
uwolnieniu posynaptycznym w tkance mózgo¬
wej. Defekty dehydrogenazy semialdehydu bur¬
sztynowego (p. ryc. 30-9) są odpowiedzialne za
inne, rzadko występujące zaburzenie katabolizmu
y-aminomaślanu, charakteryzowane jako acydu-
ria 4-hydroksymaślanowa.
STRESZCZENIE
• Aminokwasy, oprócz tego że są głównymi
składnikami białek i peptydów, biorą udział
w wielu procesach biosyntezy.
• Glicyna uczestniczy w biosyntezie hemu, pu-
ryn i kreatyny oraz ulega sprzęganiu z kwasami
30. PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY 335
nh2
+ /
h2n=c
NH
CH2
ch2
ch2
I
H - C - NH3
COO"
L-Arginina
(Nerki)
TRANSAMIDYNAZA
ARGININO-GLICYNOWA
hH3N - CH2 - COO
Glicyna
H //
N — C
ch3
Kreatynina
Reakcja
nieenzymatyczna
w mięśniu
Pi + H20
Ryc. 30-8. Biosynteza i metabolizm kreatyny oraz kreatyniny.
+ /
nh2
HN- CH2 - COO"
Ornityna Gtikocyjamina
(guanidynooctan)
Wątroba
S-Adenozylo-
metionina
S-Adenozylo-
homocysteina
METYLOTRANSFERAZA
GUANIDYNOOCTANOWA
NH-(p)
/ W
HN = C
\
N - CH2 - COO"
I
CH3
Fosforan kreatyny
COO“
Semialdehyd bursztynowy
Bursztynian
Ryc. 30-9. Metabolizm y-aminomaślanu (a-KA - a-ketokwasy; a-AA - a-aminokwasy; PLP - fosforan pirydoksalu).
336 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
żółciowymi oraz z metabolitami wielu leków
wydalanych z moczem.
• Seryna odgrywa ważną rolę w biosyntezie fo¬
sfolipidów i sfingozyny oraz dostarcza atomy
węgla C2 i C8 puryn oraz grupę metylową ty-
miny.
• S-adenozylometionina - donor grup mety¬
lowych w wielu procesach biochemicznych
- uczestniczy również bezpośrednio w biosyn¬
tezie sperminy i spermidyny.
• Z glutaminianu powstaje neuroprzekaźnik -
y-aminomaślan (GABA).
• Część tioetanoloaminowa koenzymu A oraz
tauryna kwasu taurocholowego pochodzą z cy¬
steiny.
• W procesie dekarboksylacji histydyny powstaje
histamina. Histydyna razem z p-alaniną tworzy
kilka dipeptydów.
• Arginina stanowi donor grupy formamidyno-
wej w biosyntezie kreatyny, uczestniczy też
w biosyntezie poliamin i dostarcza azotu tlen¬
kowi azotu (NO).
• Do ważnych metabolitów tryptofanu należą se-
rotonina i melatonina.
• Z tyrozyny powstaje zarówno adrenalina, jak
i noradrenalina; jodowanie tyrozyny prowadzi
do wytworzenia hormonów tarczycy.
PIŚMIENNICTWO
Lindemose S, Nielsen PE, Mollegaard NE: Polyamines
preferentially interact with bent adenine tracts in
double-stranded DNA. Nucleic Acids Res 2005;
33:1790.
Moinard C, Cynober L, de Bandt JP: Polyamines: meta-
bolism and implication in human diseases. ClinNutr
2005;24:184.
Pearl PL, Gibson KM: Clinical aspects of the disorders
of GABA metabolism in children. Curr Opin Neurol
2004;17:107.
Pearl PL et al: Succinic semialdehyde dehydrogenase de-
ficiency in children and adults. Ann Neurol 2003; 54
Suppl 6:S73.
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001.
Porfiryny
Robert K. Murray, MD, PhD
i barwniki żółciowe
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
W rozdziale tym omówiono biochemię porfiryn
i barwników żółciowych. Te dwa zagadnienia są
ze sobą ściśle powiązane, ponieważ hem jest syn¬
tetyzowany z porfiryn i żelaza, a produktami jego
degradacji są barwniki żółciowe i żelazo.
Znajomość biochemii porfiryn i hemu stanowi
podstawę do zrozumienia różnorodnych funkcji
hemoprotein w organizmie (p. niżej). Porfirię
należą do dosyć rzadkich chorób spowodowanych
zaburzeniami w biosyntezie porfiryn. Znacznie
bardziej powszechne, z klinicznego punktu wi¬
dzenia, są żółtaczki wynikające z podwyższonego
stężenia bilirubiny w osoczu. Ten wzrost stężenia
bilirubiny, będący wynikiem zwiększonego wy¬
twarzania lub niewydolności wydalania bilirubiny,
jest obserwowany w przypadku licznych chorób
- od niedokrwistości hemolitycznych przez wiru¬
sowe zapalenie wątroby do nowotworów trzustki.
METALOPORFIRYNYIHEMOPROTEINY SA
ZWIĄZKAMI WAŻNYMI W PRZYRODZIE
HC CH
II II
HC. ^ CH
H
Pirol
C — CH
II N
I
HC-C
C =
li \
/
IV NH
HN II
I' /
\
HC-C
C =
II N
HC - C ^
I
C =CH
Y I III
I P
C
C
H
H
Porfiryna
(C20H14N4)
Ryc. 31-1. Porfiryna. Pierścienie oznaczono cyframi rzymskimi I,
II, III, IV, a pozycje podstawników w pierścieniach pirolowych cy¬
frami arabskimi 1,2,3,4,5,6,7,8. Mostki metinowe (—HC=)
określono jako a, (5, y, 5. Numeracja według Hansa Fischera.
Porfiryny są związkami cyklicznymi, zbudowa¬
nymi z czterech pierścieni pirolowych połączo¬
nych mostkami metinowymi (—HC=; ryc. 31-1).
Charakterystyczną właściwością porfiryn jest
tworzenie kompleksów z jonami metali, które
łączą się z atomami azotu pierścieni pirolowych.
Przykładami są żelazoporfiryny, takie jak hem
hemoglobiny, oraz porfiryna zawierająca mag¬
nez, tj. chlorofil - barwnik roślin zielonych biorą¬
cy udział w fotosyntezie.
Białka zawierające hem (hemoproteiny) po¬
wszechnie występują w przyrodzie, odgrywając
istotną rolę w procesach biologicznych. W tabeli
31-1 przedstawiono niektóre hemoproteiny ludzi
i zwierząt.
Tabela 31-1. Przykładowe hemoproteiny ludzi i zwierząt1
Białko
Funkcja
Hemoglobina
Transport tlenu we krwi
Mioglobina
Magazynowanie tlenu w mięśniach
Cytochrom c
Współudział w transporcie
elektronów w łańcuchu
oddechowym
Cytochrom P450
Hydroksylacja ksenobiotyków
Katalaza
Rozkład nadtlenku wodoru
2,3-Dioksygenaza
tryptofanowa
Utlenianie tryptofanu
1 Białka te i ich funkcje zostały przedstawione w różnych rozdzia¬
łach podręcznika.
338 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Naturalne porfiryny zawierała łańcuchy
boczne związane ze szkieletem porfiny
Porfiryny występujące w przyrodzie są związ¬
kami, w których osiem atomów wodoru, ozna¬
czonych na ryc. 31-1, jest podstawionych róż¬
nymi łańcuchami bocznymi. W celu prostego
przedstawienia tych podstawień Fischer zapro¬
ponował uproszczony wzór, w którym mostki
metinowe są pominięte, a w każdym pierścieniu
pirolu, oznaczonym cyfrą rzymską, ponumero¬
wano pozycje łańcuchów bocznych jak na ryc.
31-2. Na rycinach 31-2-31-4 przedstawiono
uproszczone wzory różnych porfiryn.
Ułożenie łańcuchów kwasu octowego (A)
i propionowego (P) w uroporfirynie, pokazanej
na ryc. 31-2, jest asymetryczne (w pierścieniu IV
12 A P
I
3
/
I
A
IV
II
IV
II
III
4
F
)
III
P
6 5 PA
Ryc. 31-2. Uroporfiryna III. A (octan) = —CH2C00H; P (propio-
nian) = —CH2CH2COOH. Zwraca uwagę asymetria podstawni¬
ków w pierścieniu IV (p. tekst).
kolejność ułożenia podstawników A i P jest od¬
wrócona). Porfiryny z tym typem asymetrii pod¬
stawników są określone jako porfiryny typu III.
Porfiryny z całkowicie symetrycznym ułożeniem
podstawników są określane jako porfiryny typu I.
W przyrodzie występują tylko porfiryny typu I
i III (ryc. 31-3), przy czym porfiryny typu III są
bardziej rozpowszechnione - i są ważne, ponie¬
waż obejmują hem.
Hem i jego bezpośredni prekursor - protoporfi-
ryna IX (ryc. 31-4) są porfirynami typu III (czyli
grupy metylowe są rozmieszczone asymetrycznie,
jak w koproporfirynie typu III). Jednakże zalicza
się je czasami do szeregu IX, gdyż były oznaczo¬
ne jako dziewiąte w serii izomerów postulowa¬
nych przez Hansa Fischera, pioniera w dziedzinie
badań chemii porfiryn.
HEM JEST SYNTETYZOWANY
Z BURSZTYNYLO-CoA I GLICYNY
Syntezę porfiryn w żywych komórkach zbada¬
no na przykładzie hemu. Dwoma związkami
wyjściowymi są: bursztynylo-CoA, pochodzący
z cyklu kwasu cytrynowego zachodzącego w mi-
tochondriach, i glicyna. Niezbędny jest również
fosforan pirydoksalu, który „aktywuje” glicynę.
Produktem reakcji kondensacji bursztynylo-CoA
A P
A P
P A
A P
Uroporfiryny wykryto po raz
pierwszy w moczu, ale nie jest to
jedyne miejsce ich występowania
P A
P A
Uroporfiryna I
Uroporfiryna III
M P
M P
3
M M
M
M P P P
P M
P M
Koproporfiryna I
Koproporfiryna III
Koproporfiryny po raz pierwszy
wyizolowano z katu, ale znajdują się
one także w moczu
Ryc. 31-3. Uroporfiryny i koproporfiryny. A (octan); P (propionian); M (metyl) = — CH3.
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 339
M
M V
M M
P V
Fe2+
V
| FERROCHELATAZA [
M M
Fe (II)
P V
P M
M
Protoporfiryna III (IX)
(macierzysta porfiryna dla hemu)
Hem
(grupa prostetyczna hemoglobiny)
Ryc. 31-4. Przyłączenie żelaza do protoporfiryny z utworzeniem hemu; M - metyl; P - propionian;
V-winyl = —CH=CH2.
i glicyny jest kwas a-amino-p-ketoadypinowy,
który natychmiast ulega dekarboksylacji do kwasu
5-aminolewulinowego (ALA) (ryc. 31-5). Reak¬
cje te katalizuje syntaza ALA, która jest enzymem
kontrolującym biosyntezę porfiryn w wątrobie
ssaków. Synteza ALA zachodzi w mitochon-
driach. W cytozolu, przy udziale dehydratazy
ALA, kondensują dwie cząsteczki ALA, tworząc
porfobilinogen (PBG) i dwie cząsteczki wody
(ryc. 31-5). Dehydrataza ALA jest enzymem za¬
wierającym cynk, a hamowana jest przez ołów, co
może nastąpić w przypadku zatrucia ołowiem.
Kondensacja czterech cząsteczek PBG prowa¬
dzi do utworzenia cyklicznego tetrapirolu, tj. por-
firyny (ryc. 31-6). Te cztery cząsteczki najpierw
kondensują liniowo, tworząc łańcuchowy tetra-
pirol - hydroksymetylenobilan (HMB). Reakcję
katalizuje syntaza uroporfirynogenowa I, znana
również jako deaminaza PBG lub syntaza HMB.
HMB ulega samorzutnej cyklizacji do uroporfi-
Sukcynylo-CoA
(„aktywny"
bursztynian)
Glicyna
/" COOH
I
ch2
I
J ch2
C =0
r + 1
'S — CoA I
I
!H 1
_| 1
H-C —NH2
COOH
COOH
I
SYNTAZA
ch2
SYNTAZA
ALA
I
ch2
ALA
CoA • SH
I
C02
C =0
I
H-C — NH2
Fosforan I
pirydoksalu COOH
COOH
I
C =0
I
H-C — NH2
H
a-Amino-/?-ketoadypian
(5-Aminolewulinian (ALA)
COOH
|
COOH
|
ch2
ch2
ch2
u
— I
o)=c
,c =fo"
~hVc -h
2 V
NH
2H20
J-
DEHYDRATAZA
ALA
COOH
I
COOH CH2
I I
ch2 ch2
I I
c c
II II
/c\ /CH
ch2 n
I H
nh2
2 cząsteczki
<$-aminolewulinianu
Porfobilinogen
(prekursor pirolu)
Ryc. 31-5. Biosynteza porfobilinogenu. Syntaza ALA znajduje się w mitochondriach, a dehydrataza ALA - w cytozolu.
340 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
f HOO
i w
COOH '
I
ch2
CH,
H2C
I
nh2
4 cząsteczki
porfobilinogenu
Hydroksymetylenobilan
(łańcuchowy tetrapirol)
— (J H2 C —
A P
Uroporfirynogen
typu i
Uroporfirynogen
typu III
Ryc. 31-6. Przekształcenie porfobilinogenu w uroporfirynogeny.
Syntaza uroporfirynogenowa I znana jest również jako deaminaza
porfobilinogenowa (PBG) lub syntaza hydroksymetylenobilanowa
(HMB).
rynogenu I (lewa strona ryc. 31-6) lub jest prze¬
kształcany w uroporfirynogen III pod wpływem
syntazy uroporfirynogenowej III (prawa strona
ryc. 31-6). W warunkach fizjologicznych powsta¬
je prawie wyłącznie izomer uroporfirynogenu
typu III, ale w niektórych porfiriach (omawianych
poniżej) tworzą się również izomery porfirynoge-
nów typu I.
W uroporfirynogenach pierścienie pirolowe są
połączone mostkami metylenowymi (—CH2—),
które nie tworzą układu sprzężonych wiązań po¬
dwójnych. Dlatego też związki te (jak wszystkie
porfirynogeny) są bezbarwne. Porfirynogeny ła¬
two utleniają się do odpowiednich porfiryn. Re¬
akcje utleniania katalizuje światło oraz już utwo¬
rzone porfiryny.
Uroporfirynogen III przekształca się w kopro-
porfirynogen III w wyniku dekarboksylacji łańcu¬
chów kwasu octowego (A) do grup metylowych
(M). Reakcję katalizuje dekarboksylaza uro¬
porfirynogenowa, która przekształca również
uroporfirynogen I w koproporfirynogen I (ryc.
31-7). Koproporfirynogen III wnika do mitochon-
driów, gdzie powstaje protoporfirynogen III,
a następnie protoporfiryna III. Przemiana ta
zachodzi w kilku etapach. Znajdująca się w mi-
tochondriach oksydaza koproporfirynogenowa
katalizuje dekarboksylację i utlenianie dwóch
łańcuchów kwasu propionowego z utworzeniem
protoporfirynogenu. Substratem dla tego enzy¬
mu jest wyłącznie koproporfirynogen typu III, co
mogłoby tłumaczyć nieobecność protoporfiryny
typu I w przyrodzie. Utlenianie protoporfirynoge¬
nu do protoporfiryny katalizuje inny enzym mito-
chondrialny - oksydaza protoporfirynogenowa.
Warunkiem przekształcenia w wątrobie ssaków
koproporfirynogenu w protoporfirynę jest obec¬
ność tlenu cząsteczkowego.
Powstawanie hemu polega na
wbudowaniu się żelaza do protoporfiryny
Końcowy etap syntezy hemu polega na wbudowa¬
niu się żelaza(II) do protoporfiryny w reakcji ka¬
talizowanej przez enzym mitochondrialny - fer-
rochelatazę (syntazę hemową) (p. ryc. 31-4).
Wszystkie etapy biosyntezy pochodnych por¬
firyny z PBG przedstawiono na ryc. 31-8. Ostat¬
nie trzy enzymy w szlaku biosyntezy porfiryn
oraz syntaza ALA występują w mitochondriach,
a pozostałe - w cytozolu. Z kolei pierwsze cztery
enzymy zidentyfikowano zarówno w komórkach
erytroidalnych, jak i nieerytroidalnych. Biosynte¬
za hemu zachodzi w większości komórek ssaków,
z wyjątkiem dojrzałych erytrocytów, które nie
zawierają mitochondriów. Około 85% hemu jest
jednak syntetyzowane w prekursorowych komór¬
kach erytroidalnych w szpiku kostnym, a więk¬
szość pozostałej ilości hemu - w hepatocytach.
Opisane wyżej porfirynogeny są bezbarwne i,
w porównaniu z odpowiadającymi im barwnymi
porfirynami, zawierają sześć dodatkowych ato¬
mów wodoru. Te zredukowane porfiryny (por¬
firynogeny), a nie odpowiadające im porfiryny, są
związkami pośrednimi w biosyntezie protoporfi-
ryn i hemu.
CYTOZOL
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 341
Uroporfirynogen III
Koproporfirynogen III
Ryc. 31-7. Dekarboksylacja uroporfirynogenów do koproporfirynogenów w cytozolu; A - octan, M - metyl, P - propionian.
Porfobilinogen
SYNTAZA
UROPORFIRYNOGENOWAI
<
Uroporfiryna
III
Koproporfiryna
III
Hydroksymetylenobilan
6H
Światto
Światto
OKSYDAZA
KOPROPORFIRYNOGENOWA
Uroporfiryna
I
Koproporfiryna
I
Protoporfirynogen III
OKSYDAZA
PROTOPORFIRYNOGENOWA
Lub światto in vitro
6H
Protoporfiryna III
FERROCHELATAZA
Fe2+
Hem
Ryc. 31-8. Etapy biosyntezy pochodnych porfiryny z porfobilinogenu. Syntaza uroporfirynogenowa I jest również określana jako
deaminaza porfobilinogenowa lub syntaza hydroksymetylenobilanowa.
342 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Kluczowym enzymem regulującym
biosyntezę hemu w wątrobie
jest syntaza ALA
Syntaza ALA występuje w dwóch izoformach
- wątrobowej (ALAS1) i erytroidalnej (ALAS2).
Reakcją kontrolującą syntezę hemu w wątrobie
jest reakcja katalizowana przez ALAS1 (p. ryc.
31-5). Uważa się, że hem, przypuszczalnie za po¬
średnictwem cząsteczki aporepresora, działa jako
ujemny regulator syntezy ALAS1. Mechanizm
represji i derepresji przedstawiono schematycznie
na ryc. 31-9. Szybkość syntezy ALAS1 znacznie
się zwiększa przy braku hemu, a maleje, jeśli hem
występuje. ALAS1 wątroby ssaków charaktery¬
zuje szybki obrót metaboliczny (okres półtrwa-
nia wynosi ok. 1 godz.), właściwy dla enzymów
katalizujących reakcje ograniczające tempo prze¬
mian. Ponadto hem wpływa na biosyntezę enzy¬
mu w etapie translacji i na przeniesienie enzymu
z cytozolu do mitochondrium.
Poziom ALAS1 znacznie się zwiększa pod
wpływem wielu leków. Większość z nich jest me¬
tabolizowana w wątrobie przy udziale swoistej
hemoproteiny - cytochromu P-450 (p. rozdz.
52). Metabolizm ich pociąga za sobą zwiększo¬
ne wykorzystanie hemu przez cytochrom P-450,
powodując zmniejszenie wewnątrzkomórkowe¬
go stężenia hemu, co z kolei wpływa na podwyż¬
szenie poziomu (indukcję) ALAS1 i przyspiesze¬
nie syntezy hemu, zgodnie z zapotrzebowaniem
komórki.
Indukcja ALAS1 w wątrobie pod wpływem le¬
ków zależy od wielu czynników, np. podanie glu¬
kozy lub hematyny (utleniona forma hemu) zapo¬
biega obniżeniu poziomu tego enzymu.
Znaczenie niektórych z tych mechanizmów
regulacyjnych omówiono w części poświęconej
chorobom sklasyfikowanym jako porfirię.
Regulacja erytroidalnej izoformy ALAS
(ALAS2) różni się od regulacji izoformy ALAS 1.
Na przykład nie jest ona indukowana przez leki
wpływające na ALAS 1, jak również nie jest ona
regulowana przez hem na zasadzie sprzężenia
zwrotnego.
PORFIRYNY SA BARWNE I FLUORYZUJĄ
Porfirynogeny są bezbarwne, natomiast por-
firyny są barwne. W badaniach porfiryn i ich
pochodnych duże znaczenie mają charaktery¬
styczne widma absorpcji zarówno w świetle
widzialnym, jak i nadfioletowym. Przykładem
może być widmo absorpcji roztworu porfiryny
w 5-proc. kwasie solnym (ryc. 31-10). Należy
zauważyć ostre pasmo odpowiadające silnemu
pochłanianiu przy długości fali ok. 400 nm, cha¬
rakterystyczne dla pierścienia porfirynowego,
niezależne od rodzaju łańcuchów bocznych por¬
firyn. Pasmo to jest określane pasmem Soreta,
od nazwiska jego odkrywcy, francuskiego fizyka
Charlesa Soreta.
Porfiryny rozpuszczone w mocnych kwasach
nieorganicznych lub rozpuszczalnikach orga¬
nicznych i naświetlone światłem UV silnie flu¬
oryzują na czerwono. Fluorescencja ta jest na
tyle charakterystyczna, że często jest wykorzy¬
stywana do wykrywania małych ilości wolnych
porfiryn. Absorpcja i fluorescencja porfiryn są
spowodowane obecnością wiązań podwójnych
między pierścieniami pirolu, których nie ma
w porfirynogenach.
Interesującym wykorzystaniem właściwo¬
ści fotodynamicznych porfiryn jest fototerapia
nowotworowa, możliwa do stosowania w przy¬
padku niektórych nowotworów. Komórki nowo¬
tworowe często gromadzą więcej porfiryn niż
komórki prawidłowe. W związku z tym chorym
z określonym typem nowotworu podaje się he-
matoporfiryny lub związki pokrewne [fotouczu-
lacz -przyp. tłum.], a następnie zmianę nowotwo¬
rową naświetla się światłem lasera argonowego.
Przejście porfiryn w stan wzbudzenia wywołuje
efekt cytotoksyczny.
Porfiryny i ich prekursory
wykrywa się za pomocą
spektrofotometrii
Koproporfiryny i uroporfiryny są ważne z kli¬
nicznego punktu widzenia, gdyż są wydalane
w zwiększonych ilościach w przypadku porfi-
rii. Występujące w moczu i kale związki można
rozdzielić za pomocą ekstrakcji odpowiednią
mieszaniną rozpuszczalników, a następnie ziden¬
tyfikować i oznaczyć ilościowo metodami spek¬
trofotometry czny mi .
Stosując odpowiednie testy kolorymetrycz¬
ne, można również oznaczyć w moczu ALA
i PBG.
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 343
Hemoproteiny
Białka —*^
Hem * Aporepresor
T
8. FERROCHELATAZA j
^J\ i
Protoporfiryna III .
1
7. OKSYDAZA I
PROTOPORFIRYNOGENOWA I
|
I
Protoporfirynogen III |
6. OKSYDAZA
KOPROPORFIRYNOGENOWA
Koproporfirynogen III
5. DEKARBOKSYLAZA
UROPORFIRYNOGENOWA
Uroporfirynogen III
4. SYNTAZA
UROPORFIRYNOGENOWA III
Hydroksymetylenobilan
3. SYNTAZA
UROPORFIRYNOGENOWA I
Porfobilinogen
2. DEHYDRATAZA
ALA
ALA
1. SYNTAZA
ALA
J
Sukcynylo-CoA + Glicyna
Ryc. 31-9. Metabolity pośrednie, enzymy i regulacja syntezy hemu. Numeracja en¬
zymów zgodna z numeracją w tab. 31-2. Enzymy 1, 6, 7 i 8 występują w mito-
chondriach, a pozostałe - w cytozolu. Mutacje enzymu 1 powodują niedokrwistość
syderoblastyczną związaną z chromosomem X. Mutacje enzymów 2-8 powodują
porfirię, przy czym wykryto tylko kilka przypadków niedoboru enzymu 2. Regulacja
biosyntezy hemu w wątrobie odbywa się na poziomie syntazy ALA (ALAS1) wg me¬
chanizmu sprzężenia zwrotnego (represja-derepresja), przy udziale hipotetycznego
aporepresora hemu. Linie przerywane oznaczają ujemną (0) regulację przez repre¬
sję. Enzym 3 jest również określany jako deaminaza porfobilinogenowa lub syntaza
hydroksymetylenobilanowa.
344 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
Długość fali (nm)
Ryc. 31-10. Widmo absorpcji hematoporfiryny (0,01-proc. roz¬
twór w 5-proc. HCI).
PORFIRIĘ SA CHOROBAMI GENETYCZNYMI,
ZWIĄZANYMI Z METABOLIZMEM HEMU
Porfirię należą do grupy chorób wrodzonych
lub nabytych, związanych z zaburzeniami bio¬
syntezy hemu. Chociaż nie występują one po¬
wszechnie, należy o nich pamiętać, szczególnie
w pewnych okolicznościach (np. w diagnostyce
różnicowej „ostrego brzucha” lub różnorodnych
zaburzeń o charakterze neuropsychiatrycznym),
aby uniknąć niewłaściwego postępowania z cho¬
rymi. Przypuszcza się, że król Jerzy III chorował
na porfirię mieszaną, która mogła być przyczyną
jego okresowego odizolowywania się na zamku
Windsor i pewnych jego poglądów dotyczących
amerykańskich kolonistów. Także nadwrażli¬
wość skóry na światło (skłaniająca raczej do
aktywności nocnej) i ciężkie zniekształcenia,
występujące u niektórych ofiar wrodzonej porfi-
rii erytropoetycznej, sugerują, że osoby te mogły
być pierwowzorami legendarnych wilkołaków,
chociaż nie zostało to udowodnione.
Biochemia tkwi u podstaw przyczyn,
rozpoznawania i leczenia porfirii
Biorąc pod uwagę zmniejszenie aktywności każ¬
dego z enzymów oznaczonych na ryc. 31-9 cy¬
frami 3-8 (p. też tab. 31-2), wyróżnia się sześć
głównych typów porfirii. Oznaczenie aktywności
jednego lub kilku z tych enzymów w odpowied¬
nim materiale (np. erytrocytach) jest podstawą
diagnostyki porfirii. Mała aktywność enzymu 1
(ALAS2) prowadzi do anemii, a nie do porfirii
(p. tab. 31-2). Zmniejszenie aktywności enzymu 2
(dehydrataza ALA) jest zjawiskiem obserwowa¬
nym bardzo rzadko, definiowanym jako porfiria
z niedoborem dehydratazy ALA.
Porfirię dziedziczy się autosomalnie domi¬
nuj ąco, z wyjątkiem wrodzonej porfirii erytropoe¬
tycznej, którą dziedziczy się w sposób recesywny.
Identyfikowanie nieprawidłowości w genach od¬
powiedzialnych za biosyntezę enzymów biorą¬
cych udział w biosyntezie hemu pozwala na pre¬
natalną diagnostykę porfirii.
Podobnie jak w przypadku większości chorób
wrodzonych, kliniczne objawy porfirii są wyni¬
kiem nagromadzenia się metabolitów poprzedza¬
jących blok enzymatyczny lub braku metabolitów
występujących za blokiem enzymatycznym.
Jeśli wada metaboliczna dotyczy początko¬
wych etapów biosyntezy hemu, tj. poprzedzają¬
cych tworzenie porfirynogenów (np. enzymu 3
na ryc. 31-9, porfiria ostra przerywana), nastę¬
puje nagromadzenie się ALA i PBG w tkankach
i płynach ustrojowych (ryc. 31-11). Objawami
klinicznymi są bóle brzucha i zaburzenia neuro-
psychiczne. Biochemiczne podłoże tych objawów
nie jest określone; prawdopodobnie jest związane
ze wzrostem poziomu ALA lub PBG czy niedo¬
borem hemu.
Blok enzymatyczny występujący w później¬
szych etapach szlaku powoduje nagromadzenie
się porfirynogenów, pokazanych na ryc. 31-9
i 31-11. Produkty ich utlenienia, czyli odpowied¬
nie porfiryny, powodują nadwrażliwość skóry na
światło widzialne o długości fali ok. 400 nm. Por¬
firyny eksponowane na światło o tej długości fali
przechodzą w stan wzbudzenia i reagują z tlenem
cząsteczkowym, wytwarzając wolnorodnikowe
formy tlenu, które uszkadzają lizosomy i inne
organelle komórkowe. Uwolnione enzymy powo¬
dują zmiany w skórze, aż do powstawania blizn.
Podstawą klasyfikacji porfirii może być ro¬
dzaj tkanki lub komórki, w których występują
nieprawidłowości metaboliczne. Są to przede
wszystkim tkanki i komórki szczególnie aktywne
w syntezie hemu, takie jak szpik kostny, syntety¬
zujący znaczne ilości hemoglobiny w ciągu doby,
oraz wątroba aktywnie syntetyzująca cytochrom
P-450. Zgodnie z tą klasyfikacją, wyróżnia się
głównie porfirię erytropoetyczne i wątrobowe.
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 345
Tabela 31-2. Główne objawy porfirii1
Wada enzymatyczna2
Typ, klasa i numer MIM
Główne objawy kliniczne
Wyniki testów laboratoryjnych
1. Syntaza ALA
Związana z chromosomem X
Niedokrwistość
Zmniejszenie liczby erytrocytów
(forma erytroidalna)
niedokrwistość syderobla¬
styczna3 (erytropoetyczna)
(MIM 301 300)
i hemoglobiny
2. Dehydrataza ALA
Niedobór dehydratazy ALA
Bóle brzucha, zaburzenia
Wzrost ALA i koproporfiryny III
(wątrobowa) (MIM 125 270)
neuropsychiczne
w moczu
3. Syntaza
Porfirią ostra przerywana
Bóle brzucha, zaburzenia
Wzrost ALA i PBG w moczu
uroporfirynogenowa I4
(wątrobowa) (MIM 176 000)
neuropsychiczne
4. Syntaza
Wrodzona porfirią (erytropoetycz¬
Brak nadwrażliwości skóry na
Wzrost uroporfiryny I w moczu,
uroporfirynogenowa III
na) (MIM 263 700)
światło
kale i krwinkach czerwonych
5. Dekarboksylaza
Porfirią skórna późna (wątrobowa)
Nadwrażliwość skóry
Wzrost uroporfiryny I w moczu
uroporfirynogenowa
(MIM 176 100)
na światło
6. Oksydaza
Koproporfiria wrodzona
Nadwrażliwość skóry
Wzrost ALA, PBG i koproporfi¬
koproporfirynogenowa
(wątrobowa) (MIM 121 300)
na światło, bóle brzucha,
zaburzenia neuropsychiczne
ryny III w moczu oraz kopro¬
porfiryny III w kale
7. Oksydaza
Porfirią mieszana (wątrobowa)
Nadwrażliwość skóry
Wzrost ALA, PBG i kopro¬
protoporfirynogenowa
(MIM 176 200)
na światło, bóle brzucha,
zaburzenia neuropsychiczne
porfiryny III w moczu oraz
protoporfiryny IX w kale
8. Ferrochelataza
Protoporfiria (erytropoetyczna)
Nadwrażliwość skóry
Wzrost protoporfiryny IX w kale
(MIM 177 000)
na światło
i erytrocytach
ALA - kwas 5-aminolewulinowy; PBG - porfobilinogen.
1 Tabela zawiera wyniki badań biochemicznych typowych dla stanów porfirii w fazie aktywnej. W okresie utajenia wyniki niektórych
oznaczeń mogą być prawidłowe. Przypadki 3,5 i 8 są przeważającymi typami porfirii, podczas gdy przypadek 2 pojawia się rzadko.
2 Numeracja enzymów odpowiada numeracji na ryc. 31-9.
3 Związana z chromosomem X niedokrwistość syderoblastyczna nie jest porfirią, ale włączona została ze względu na syntazę ALA.
4 Enzym ten jest również określany jako deaminaza PBG lub syntaza hydroksymetylenobilanu.
Ryc. 31-11. Biochemiczne podłoże głównych objawów klinicz¬
nych porfirii.
Typy porfirii należące do każdej z tych klas przed¬
stawiono w tab. 31-2. Na podstawie objawów kli¬
nicznych porfirię mogą być także klasyfikowane
jako ostre lub skórne. Przyczyny ujawniania się
w przypadku określonej porfirii zaburzeń me¬
tabolicznych, głównie w jednym typie tkanek,
nie są do końca wyjaśnione. Przypuszcza się, że
wynika to z różnej aktywności enzymów uczest¬
niczących w syntezie hemu w różnych tkankach
i komórkach, odpowiedzialnych za różne stężenie
metabolitów (np. ALA, PBG, swoistych porfiryn
lub brak hemu).
Jak już wspomniano, ALAS1 jest kluczowym
enzymem kontrolującym szlak biosyntezy hemu
w wątrobie. Wiele leków (np. barbiturany, gri-
zeofulwina) indukuje ten enzym. W większości
przypadków jest to związane z indukcją cytochro-
mu P-450 (p. rozdz. 52), a zwiększone zapotrze¬
bowanie na hem powoduje derepresję (indukcję)
346 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
ALAS1. U chorych z porfirią zwiększenie aktyw¬
ności ALAS1 prowadzi do zwiększenia stężenia
potencjalnie szkodliwych prekursorów hemu,
poprzedzających blok metaboliczny. Przyjmowa¬
nie leków, które indukują cytochrom P-450 (tzw.
induktory mikrosomalne), może więc wywołać
napad porfirii.
Podstawą rozpoznania swoistej postaci porfi¬
rii są: wywiad dotyczący samego chorego i wy¬
wiad rodzinny, badania przedmiotowe chorego
i odpowiednie testy laboratoryjne. Główne dane
dotyczące sześciu postaci porfirii przedstawiono
w tab. 31-2.
Duże stężenie ołowiu również może wpływać
na metabolizm hemu, ponieważ ołów wiąże się
z grupami SH takich enzymów, jak ferrochelataza
lub dehydrataza ALA. Powoduje to zwiększenie
zawartości protoporfiryny w erytrocytach oraz za¬
wartości ALA i koproporfiryny w moczu.
Należy mieć nadzieję, że w przyszłości będzie
możliwe leczenie porfirii na poziomie genu. Jak
na razie leczenie ma charakter objawowy. Chorzy
powinni unikać leków, które aktywują cytochrom
P-450. Przyjmowanie dużych ilości pokarmu
bogatego w węglowodany (obciążenie glukozą)
lub podawanie hematyny (wodorotlenek hemu)
może powodować represję ALAS1, a tym samym
zmniejszać tworzenie się szkodliwych prekur¬
sorów hemu. Chorym z wrażliwością skóry na
światło korzystnie jest podawać P-karoten; zwią¬
zek ten zmniejsza wytwarzanie wolnych rodników
i zmniejsza tym samym nadwrażliwość skóry na
światło. Pomocne mogą być również ekrany sło¬
neczne eliminujące zakres światła widzialnego.
PRODUKTEM KATABOLIZMU HEMU
JEST BILIRUBINA
U dorosłego człowieka w stanie fizjologicznym
w ciągu 1 godz. rozpada się (1—2)* 108 erytro¬
cytów. W ciągu dnia osoba o masie ciała 70 kg
metabolizuje ok. 6 g hemoglobiny. Część białko¬
wa - globina - rozpada się na składowe amino¬
kwasy, które mogą być ponownie wykorzystane,
a żelazo hemowe jest włączane w ogólną pulę
żelaza w organizmie, również w celu ponownego
wykorzystania. Pozbawiona żelaza część porfiry-
nowa hemu jest rozkładana głównie w komórkach
siateczkowo-śródbłonkowych wątroby, śledziony
i szpiku kostnego.
Katabolizm hemu, pochodzącego ze wszystkich
hemoprotein, zachodzi we frakcji mikrosomalnej
komórek przy udziale złożonego układu enzyma¬
tycznego, określanego mianem oksygenazy he¬
nrowej. Działanie oksygenazy hemowej poprzedza
zwykle utlenienie żelaza(II) w hemie do formy
Fe(III) z utworzeniem heminy. Oksygenaza hemo-
wa jest aktywowana pod wpływem substratu. Jak
przedstawiono na ryc. 31-12, w obecności NAD-
PH hemina ulega redukcji, po czym - również przy
udziale NADPH - do wiązania a-metinowego mię¬
dzy I i II pierścieniem pirolowym porfiryny przy¬
łącza się tlen, a żelazo(II) jest ponownie utleniane
do żelaza(III). W konsekwencji, w obecności tlenu
uwalnia się jon Fe3+ i odłącza się tlenek węgla,
a w wyniku rozerwania pierścienia tetrapirolowego
powstaje równomolowa ilość biliwerdyny.
U ptaków i płazów zielona biliwerdyna IX jest
wydalana, a u ssaków reduktaza biliwerdynowa
redukuje mostek metinowy między pierścieniami
pirolowymi III i IV do grupy metylenowej i tworzy
się bilirubina - żółty barwnik (p. ryc. 31-12).
Ocenia się, że 1 g hemoglobiny dostarcza 59,9
pmol (35 mg) bilirubiny. Dobowe wytwarzanie
bilirubiny u człowieka wynosi 427,5-598,5 pmol
(250-350 mg), przy czym pochodzi ona głównie
z rozpadu hemoglobiny oraz innych białek henro¬
wych, takich jak cytochrom P-450, lub powstaje
w wyniku nieefektywnej erytropoezy.
Chemiczne przekształcenie się hemu do biliru¬
biny przez komórki siateczkowo-śródbłonkowe
można obserwować in vivo na przykładzie krwia¬
ka, w którym purpurowa barwa hemu przechodzi
stopniowo w żółte zabarwienie bilirubiny.
Bilirubina powstająca w tkankach jest trans¬
portowana do wątroby w formie połączenia
z albuminą osocza. Dalszy metabolizm bilirubi¬
ny zachodzi głównie w wątrobie. Można w nim
wyróżnić trzy etapy: 1) wychwytywanie bilirubi¬
ny przez komórki miąższowe wątroby, 2) sprzę¬
ganie bilirubiny z glukuronianem w siateczce
śródplazmatycznej i 3) wydzielanie sprzężonej
bilirubiny do żółci. Każdy z tych procesów będzie
rozpatrywany oddzielnie.
BILIRUBINA JEST WYCHWYTYWANA
PRZEZ WĄTROBĘ
Bilirubina słabo rozpuszcza się w wodzie. Jej
rozpuszczalność w osoczu jest większa dzięki
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 347
Ryc. 31-12. Schemat mikrosomalnego układu oksygenazy hemowej (zmodyfikowany z Schmid R, McDonough AF w: The Porphyris,
Dolphin D [red.]. Academic Press, 1978. Copyright © 1978. Przedruk za zgodą Elsevier).
niekowalencyjnemu połączeniu z albuminą. Każ¬
da cząsteczka albuminy ma jedno miejsce o du¬
żym i jedno miejsce o małym powinowactwie do
bilirubiny. W 1000 ml osocza ok. 427,5 pmol
(250 mg) bilirubiny wiąże się silnie z albuminą
w miejscu jej dużego powinowactwa do bilirubi¬
ny. Nadmiar bilirubiny wiąże się słabo i tym sa¬
mym łatwo ulega odłączeniu i dyfuzji do tkanek.
348 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
o o
II II
"00C(CH20)4C — o — C C — O — C(CH20)4C0(T
h2c ch2
Ryc. 31-13. Struktura diglukuronidu bilirubiny (bilirubina sprzę¬
żona, bezpośrednia). Kwas glukuronowy tączy się wiązaniem
estrowym z dwiema resztami kwasu propionowego bilirubiny,
tworząc acyloglukuronid.
Niektóre związki, takie jak antybiotyki i inne leki,
współzawodniczą z bilirubiną o miejsce o dużym
powinowactwie w albuminie. Związki te mogą za¬
tem wypierać bilirubinę z połączenia z albuminą,
dzięki czemu odgrywają ważną rolę kliniczną.
W wątrobie bilirubina odłącza się od albuminy
i przy udziale nieswoistego układu transportują¬
cego przechodzi przez powierzchnię naczyniową
(biegun naczyniowy) hepatocytu do wnętrza ko¬
mórki. Ten układ transportu ułatwionego (dy¬
fuzji ułatwionej) charakteryzuje się dużą wydaj¬
nością i nawet w warunkach patologicznych nie
ogranicza szybkości przemian bilirubiny.
Ponieważ układ transportu ułatwionego umożli¬
wia utrzymanie równowagi bilirubiny po obu stro¬
nach powierzchni naczyniowej hepatocytu, bilans
wychwytywania bilirubiny zależy od jej usuwania
w dalszych etapach szlaku metabolicznego.
W hepatocytach, zanim nastąpi etap sprzęga¬
nia, bilirubina wiąże się z określonymi białkami
cytozolowymi, dzięki czemu jest utrzymywana
w formie rozpuszczalnej. Do białek tych należą
ligandyna (białko z rodziny S-transferaz glutatio-
nowych) oraz białko Y. Wiązanie się bilirubiny
z białkami w hepatocytach zapobiega również wy¬
pływowi bilirubiny z hepatocytu do krwiobiegu.
W wątrobie bilirubina ulega sprzęganiu
z kwasem glukuronowym
Niepolarna bilirubina mogłaby pozostawać w ko¬
mórce (np. w połączeniu z lipidami), gdyby nie ^
ulegała przekształceniu w formę rozpuszczalną
w wodzie. W hepatocytach bilirubina - przyłącza- i
jąc kwas glukuronowy - przekształca się do formy (
polarnej, wydzielanej do żółci. W procesie tym, ,
określanym mianem sprzęgania, mogą uczestni¬
czyć również inne polarne cząsteczki (np. siarcza- J
ny). Podobnemu przekształceniu ulega wiele hor- !
monów steroidowych i leków (p. rozdz. 52). ^
Sprzęganie bilirubiny jest katalizowane przez
specyficzną glukuronozylotransferazę. Enzym
ten, przenoszący resztę kwasu glukuronowego
z UDP-glukuronianu na bilirubinę i dlatego okre¬
ślany jako UDP-glukuronozylotransferaza biliru-
binowa (UGT bilirubinowa), znajduje się głównie
w siateczce śródplazmatycznej, a donorem glu-
kuronianu jest UDP-glukuronid. Produktem po¬
średnim jest monoglukuronid bilirubiny, który jest
przekształcany w diglukuronid (ryc. 31-13 i 31-14).
U ssaków większość bilirubiny wydziela się do
żółci w postaci diglukuronidu, jednak w sytuacjach
patologicznych sprzężona bilirubina, pojawiają¬
ca się w osoczu ludzi (np. w przypadku żółtaczki
DEHYDROGENAZA
UDPglukozowa
UDP-glukoza -v~ ► KwasUDP-glukuronowy
2NAD+ 2NADH + 2H+
Kwas UDP-glukuronowy
+
Bilirubina
UDP-GLUKURONOZYLO¬
TRANSFERAZA
Kwas UDP-glukuronowy
+
Monoglukuronid bilirubiny
UDP-GLUKURONOZYLO-
TRANSFERAZA
Monoglukuronid bilirubiny
+
UDP
Diglukuronid bilirubiny
UDP
Ryc. 31-14. Sprzężenie bilirubiny z kwasem gluku¬
ronowym. Donor glukuronianu, kwas UDP-gluku-
ronowy, tworzy się z UDP-glukozy. UDP-glukuro-
nozylotransferaza jest również określana jako UGT
bilirubinowa.
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 349
mechanicznej), ma postać głównie monogluku-
ronidu. Aktywność UGT bilirubinowej może być
indukowana przez wiele leków, np. fenobarbital.
Dokładniejszą charakterystykę układu sprzęgania
bilirubiny przedstawiono w części poświęconej
wrodzonym zaburzeniom sprzęgania bilirubiny.
Bilirubina jest wydzielana do żółci
Wydzielanie sprzężonej bilirubiny do żółci prze¬
biega wbrew gradientowi stężeń na zasadzie trans¬
portu aktywnego, który prawdopodobnie spełnia
funkcję regulującą dla całego metabolizmu bi¬
lirubiny w wątrobie. Uczestniczy w nim białko
MPR-2 (ang. multidrug resistance-like protein 2),
określane również jako MOAT (ang. multispecific
organie anion transporter). Występuje ono w błonie
plazmatycznej strefy wydzielniczej (biegun kanali¬
kowy, powierzchnia szczytowa) hepatocytu i usu¬
wa aniony organiczne. Białko to należy do rodziny
białek transportujących ABC, tj. zawierających ka¬
setę wiążącą ATP. Transport sprzężonej bilirubiny
do żółci jest indukowany przez te same leki, któ¬
re indukują proces sprzęgania bilirubiny. Układy
sprzęgania i wydzielania bilirubiny stanowią więc
skoordynowanąjednostkę funkcjonalną.
Na rycinie 31-15 przedstawiono trzy główne
etapy transferu bilirubiny z krwi do żółci. Jak za¬
znaczono, zaburzenia na określonych poziomach,
wywoływane przez różne czynniki, powodują
żółtaczki (p. poniżej).
Sprzężona bilirubina jest redukowana
do urobilinogenu przez bakterie jelitowe
W miarę jak sprzężona bilirubina dociera do jelita
krętego i jelita grubego, swoiste enzymy bakte¬
ryjne (P-glukuronidazy) usuwają kwas glukuro-
nowy, a flora bakteryjna kału redukuje barwnik
do bezbarwnych związków tetrapirolowych,
zwanych urobilinogenami. W jelicie krętym
oraz w jelicie grubym pewna część urobilinoge-
nów wchłania się i ponownie wydziela z wątroby,
stanowiąc krążenie jelitowo-wątrobowe barw¬
ników żółciowych. W warunkach nieprawidło¬
wych, zwłaszcza przy wytwarzaniu nadmiernej
ilości barwników żółciowych lub w przypadku
choroby wątroby upośledzającej krążenie jelito¬
wo-wątrobowe, następuje wydalanie urobilino¬
genu również z moczem.
Ryc. 31-15. Trzy główne etapy (wychwytywanie, sprzęganie
i wydzielanie) transferu bilirubiny z krwi do żółci. W wychwy¬
tywaniu bilirubiny przez hepatocyty biorą udział takie białka
hepatocytarne, jak ligandyna (należąca do enzymów z rodziny
S-transferaz glutationowych) i białko Y, które - wiążąc bilirubinę
- zapobiegają jej wypływowi z komórki do krwiobiegu. Jak zazna¬
czono, zaburzenia tego procesu powodują żółtaczki.
W stanie fizjologicznym większość bezbarw¬
nych urobilinogenów, utworzonych w okrężnicy
pod wpływem flory bakteryjnej kału, utlenia się
do urobilin (związków barwnych) i wydala z ka¬
łem. Utlenianie pozostałych urobilinogenów po¬
woduje ciemnienie kału na powietrzu.
HIPERBILIRUBINEMIA WYWOŁUJE
ŻÓŁTACZKĘ
Stan podwyższonego stężenia bilirubiny we krwi,
czyli większego niż 17,1 pmol/L (1 mg/dL), na¬
zywa się hiperbilirubinemią. Hiperbilirubinemia
może być wynikiem wytwarzania większej ilości
bilirubiny, niż wydziela zdrowa wątroba, lub też
skutkiem niezdolności uszkodzonej wątroby do
wydzielania bilirubiny powstającej w ilościach
prawidłowych. Przyczyną hiperbilirubinemii, jeśli
nie stwierdza się uszkodzenia wątroby, może być
również zaczopowanie przewodów żółciowych
350 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
wątroby, uniemożliwiające wydalanie żółci. We
wszystkich tych przypadkach bilirubina gromadzi
się we krwi i po przekroczeniu pewnego stężenia
(34,2-42,75 pmol/L; 2-2,5 mg/dL) dyfunduje do
tkanek, powodując ich zażółcenie. Zjawisko to
określa się mianem żółtaczki.
Oznaczenie stężenia bilirubiny w surowicy
ma ogromne znaczenie w badaniach klinicznych
żółtaczek. Van den Bergh jako pierwszy wpro¬
wadził metodę ilościowego oznaczania bilirubi¬
ny w surowicy, wykorzystując test Ehrlicha do
oznaczania bilirubiny w moczu. Test Ehrlicha po¬
lega na reakcji diazowanego kwasu sulfanilowego
(odczynnik diazowy Ehrlicha) i bilirubiny, w wy¬
niku której powstaje czerwonopurpurowy zwią¬
zek azowy. W oryginalnej metodzie Ehrlicha do
rozpuszczenia zarówno bilirubiny, jak i odczyn¬
nika diazowego wykorzystywano metanol. Przy¬
padkowe pominięcie przez Van den Bergha meta¬
nolu podczas oznaczania barwników żółciowych
w żółci doprowadziło do odkrycia, że reakcja
barwna zachodzi „bezpośrednio”. Postać bilirubi¬
ny reagującą w nieobecności metanolu określono
jako „bezpośrednią”. Następnie stwierdzono,
że taka sama reakcja zachodzi także w surowi¬
cy chorych na żółtaczkę mechaniczną. Niemniej
dodawanie metanolu było nadal konieczne przy
oznaczaniu bilirubiny w surowicy osób zdrowych
oraz bilirubiny występującej w zwiększonej ilości
w surowicy chorych na żółtaczkę hemolityczną,
u których nie stwierdzono niedrożności przewo¬
dów żółciowych. Postać bilirubiny, którą można
było oznaczyć tylko po dodaniu metanolu, okre¬
ślono jako „pośrednią”.
Obecnie wiadomo, że bilirubina pośred¬
nia jest bilirubiną „wolną” (niesprzężoną),
która przechodzi do hepatocytów z komórek
siateczkowo-śródbłonkowych, gdzie powsta¬
je w wyniku rozpadu układu porfirynowego
hemu. Ponieważ ta bilirubina nie rozpuszcza
się w wodzie, reakcja z odczynnikiem diazo-
wym wymaga obecności metanolu. W wątrobie
bilirubina wolna łączy się z kwasem glukuro-
nowym i w postaci sprzężonej, głównie jako di-
glukuronid bilirubiny, jest wydzielana do żółci.
Bilirubina sprzężona, jako rozpuszczalna w wo¬
dzie, reaguje bezpośrednio z odczynnikiem dia-
zowym, a więc „bilirubina bezpośrednia” Van
den Bergha odpowiada bilirubinie sprzężonej
(glukuronidowi bilirubiny).
W zależności od typu bilirubiny występującej
w osoczu, tj. bilirubiny niesprzężonej lub biliru¬
biny sprzężonej, hiperbilirubinemie można skla¬
syfikować odpowiednio jako hiperbilirubinemię
retencyjną, spowodowaną nadmiernym wytwa¬
rzaniem bilirubiny, oraz hiperbilirubinemię
zwrotną (zastoinową), w której następuje wtórne
wchłanianie się barwnika do krwi, spowodowane
niedrożnością przewodów żółciowych. Rozdział
i analizę ilościową niesprzężonej i sprzężonej bi¬
lirubiny można przeprowadzić za pomocą wyso¬
kociśnieniowej chromatografii cieczowej.
Ze względu na hydrofobowość tylko biliru¬
bina niesprzężoną może przenikać przez barierę
krew-mózg do ośrodkowego układu nerwowego;
a zatem encefalopatia spowodowana hiperbiliru-
binemią (kernicterus) może wystąpić wyłącznie
w przypadku retencji bilirubiny, czyli niesprzę¬
żonej hiperbilirubinemii. Ze względu na swoją
rozpuszczalność w wodzie tylko sprzężona biliru¬
bina może pojawić się w moczu. Zgodnie z tym,
żółtaczka z obecnością barwników żółciowych
w moczu (choluria = obecność barwników żół¬
ciowych w moczu) występuje tylko w przypadku
hiperbilirubinemii sprzężonej (zwrotnej), a żół¬
taczka bez barwników żółciowych w moczu -
w przypadku nadmiaru bilirubiny niesprzężonej.
Hiperbilirubinemia niesprzężoną może
być wynikiem różnych chorób
A. Niedokrwistość hemolityczną
Częstą przyczyną podwyższonego poziomu bili¬
rubiny niesprzężonej są niedokrwistości hemo-
lityczne. Ze względu jednak na dużą wydajność
metabolizowania bilirubiny w wątrobie, nawet
w przypadku znacznej hemolizy, hiperbilirubi¬
nemia niesprzężoną jest zazwyczaj niewielka:
< 68,4 pmol/L (< 4 mg/dL).
B. „ŻÓŁTACZKA FIZJOLOGICZNA” NOWORODKÓW
Ten przejściowy stan jest najczęściej spowodo¬
wany hiperbilirubinemią niesprzężoną. Jest ona
wynikiem nadmiernej hemolizy u noworodków
i niedojrzałości układu wątrobowego do wy¬
chwytywania, sprzęgania i wydzielania bilirubi¬
ny. Zmniejszona jest nie tylko aktywność UGT
bilirubinowej, ale przypuszczalnie również bio¬
synteza substratu dla tego enzymu, czyli kwasu
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 351
UDP-glukuronowego. Ze względu na fakt, że
podwyższony poziom bilirubiny wynika z bili-
rubinemii niesprzężonej, bilirubina może przeni¬
kać przez barierę krew-mózg, jeśli jej zawartość
w osoczu będzie większa od ilości, jaką może
związać albumina (340-428 pmol/L; 20-25 mg/
/dL). Następstwem toksycznego działania bilirubi¬
ny jest kernicterus - żółtaczka jąder podstawnych
mózgu, powodująca upośledzenie umysłowe.
Skuteczne jest podawanie fenobarbitalu ze wzglę¬
du na jego zdolność indukowania układu metabo¬
lizującego bilirubinę niesprzężoną. Ponadto foto¬
terapia światłem niebieskim pobudza wydzielanie
przez wątrobę bilirubiny niesprzężonej w wyniku
przekształcenia pewnej ilości bilirubiny w inne
pochodne wydalane w żółci, takie jak fragmenty
maleimidowe i izomery geometryczne.
C. Zespół Criglera-Najjara, typ I;
WRODZONA ŻÓŁTACZKA NIEHEMOLITYCZNA
Zespół Criglera-Najjara typu I jest rzadkim za¬
burzeniem, dziedziczonym jako cecha recesywna
autosomalna. Charakteryzuje się ciężką żółtaczką
wrodzoną(stężenie bilirubiny w surowicy przewyż¬
sza zwykle 340 pmol/L; 20 mg/dL) uwarunkowaną
mutacjami w genie kodującym UGT bilirubinową
w wątrobie. Choroba zwykle kończy się zgonem
w ciągu pierwszych 15 miesięcy życia. Dzieci
z tym zespołem są poddawane fototerapii (zmniej¬
sza ona stężenie bilirubiny w osoczu). Fenobarbi-
tal nie wpływa na tworzenie glukuronidów biliru¬
biny u chorych z zespołem Criglera-Najjara typu I.
Metodą leczenia może być przeszczep wątroby.
Ludzka UGT bilirubinową jest kodowana przez
gen UGT zlokalizowany na chromosomie 2.
Sprzęganie różnych substratów z kwasem gluku-
ronowym wymaga obecności wielu glukuronozy-
lotransferaz. W genie UGT występuje 13 (A 1-13)
form eksonu pierwszego, transkrybowanych
z własnych promotorów. Cztery pierwsze są pseu-
dogenami, a pozostałe kodują 9 izoform glukuro-
nozylotransferazy różniących się aktywnością. Za
sprzęganie z bilirubiną jest odpowiedzialny ekson
Al, który z eksonami 2-5 koduje UGT bilirubino¬
wą. W efekcie składania jednego z eksonów A2-13
z eksonami 2-5 powstają inne transferazy.
D. Zespół Criglera-Najjara, typ II
Ta rzadka choroba również jest uwarunkowana
mutacjami w genie kodującym UGT bilirubino¬
wą. Mutacje te nie powodują jednak całkowitej
inaktywacji enzymu, dzięki czemu choroba ta
ma znacznie łagodniejszy przebieg niż w typie
I. Stężenie bilirubiny w surowicy nie przekracza
zazwyczaj 340 pmol/L (20 mg/dL). Chorzy z tym
zespołem dobrze reagują na duże dawki fenobar¬
bitalu.
E. Zespół Gilberta
Ta dość powszechna choroba również jest uwa¬
runkowana mutacjami w genie kodującym UGT
bilirubinową. Dotyka ona częściej mężczyzn.
Z uwagi na zachowanie ok. 30% aktywności en¬
zymu, ta postać jest całkowicie nieszkodliwa.
F. Hiperbilirubinemia toksyczna
Hiperbilirubinemia niesprzężoną może być
wynikiem zaburzenia czynności wątroby, wy¬
wołanego przez takie czynniki, jak chloroform,
arsfenamina, tetrachlorek węgla, acetaminofen,
wirus zapalenia wątroby, marskość lub zatrucie
grzybami z rodzaju Amanita.
Choroba ta jest skutkiem uszkodzenia komórek
miąższowych wątroby i w konsekwencji zaburze¬
nia procesu sprzęgania.
Hiperbilirubinermia sprzężona
wynika najczęściej z niedrożności
przewodów żółciowych
A. Niedrożność przewodów żółciowych
Najbardziej powszechną przyczyną hiperbiliru-
binemii sprzężonej jest zablokowanie przewo¬
dów żółciowych wątroby lub przewodu żółcio¬
wego wspólnego przez kamienie lub rak głowy
trzustki, powodujące zaburzenia wydalania diglu-
kuronidu bilirubiny. Konsekwencją tego zaburze¬
nia jest wchłanianie zwrotne do żył wątrobowych
oraz naczyń chłonnych i pojawienie się bilirubiny
sprzężonej w krwi i moczu (żółtaczka z barwnika¬
mi żółciowymi w moczu).
Mianem żółtaczki cholestatycznej określa się
wszystkie postacie pozawątrobowych żółtaczek
mechanicznych. Termin ten obejmuje również
żółtaczki spowodowane ograniczeniem drożno¬
ści śródwątrobowych przewodzików żółciowych
przez obrzęknięte i uszkodzone hepatocyty (taka
sytuacja może wystąpić np. w wirusowym zapa¬
leniu wątroby).
352 CZĘŚĆ III: METABOLIZM BIAŁEK I AMINOKWASÓW
B. Zespół Dubina-Johnsona
To łagodne zaburzenie, dziedziczone jako cecha
autosomalna recesywna, objawia się hiperbili-
rubinemią sprzężoną i może wystąpić zarówno
w dzieciństwie, jak i u dorosłego człowieka. Hi-
perbilirubinemia jest wynikiem mutacji w genie
kodującym MRP-2 (p. wyżej) - białka pośredni¬
czącego w wydzielaniu sprzężonej bilirubiny do
żółci. Hepatocyty środkowego obszaru zrazika
zawierają czarny pigment, który może być po¬
chodną epinefryny (adrenaliny).
C. Zespół Rotora
Zespół Rotora jest rzadko pojawiającym się, ła¬
godnym zaburzeniem, charakteryzującym się
przewlekłą hiperbilirubinemią sprzężoną i prawid¬
łową strukturą histologiczną wątroby. Przyczyna
tej choroby nie jest dotychczas rozpoznana.
Bilirubina sprzężona może się wiazać
kowalencyjnie z albumina
W wyniku utrzymywania się dużego stężenia bili¬
rubiny sprzężonej w osoczu pewna jej forma może
się wiązać kowalencyjnie z albuminą (biliru¬
bina 5). Kowalencyjne wiązanie się z albuminą
sprawia, że okres półtrwania tej postaci bilirubi¬
ny w osoczu jest dłuższy w porównaniu z typową
bilirubiną sprzężoną. Powolne usuwanie z krwio-
biegu bilirubiny prawdopodobnie jest przyczyną
utrzymywania się żółtaczki w okresie rekonwa¬
lescencji mimo normalizacji stężenia pozostałej
bilirubiny sprzężonej.
Występowanie urobilinogenu i bilirubiny
w moczu jest wskaźnikiem klinicznym
Zazwyczaj w moczu znajdują się jedynie śladowe
ilości urobilinogenu. W przypadku całkowitego
zaczopowania przewodu żółciowego wspól¬
nego nie stwierdza się w ogóle urobilinogenu
w moczu, ponieważ bilirubina, z której powstaje,
nie przedostaje się do jelita, gdzie mogłaby być
przekształcana w urobilinogen. W takim przypad¬
ku obecność w moczu bilirubiny sprzężonej, przy
braku urobilinogenu, wskazuje na żółtaczkę me¬
chaniczną śródwątrobową lub pozawątrobową.
W żółtaczce będącej wtórnym efektem hemo-
lizy zwiększone wytwarzanie bilirubiny prowadzi
do wytwarzania większej ilości urobilinogenu,
który pojawia się w moczu w dużych ilościach.
Tabela 31-3. Wyniki analizy biochemicznej pacjentów zdrowych oraz chorych na różne rodzaje żółtaczek
Stan zdrowia
Bilirubina w surowicy
Urobiiinogen w moczu
Bilirubina w moczu
Urobiiinogen w kale
Prawidłowy
Bezpośrednia:
1,7-6,8 ąmol/L
(0,1—0,4 mg/dL)
Pośrednia:
3,4-12 pmol/L
(0,2-0,7 mg/dL)
0-6,75 |imol/24 h
(0-4 mg/24 h)
Brak
67,48-472,4 ąmol/24 h
(40-280 mg/24 h)
Niedokrwistość
hemolityczna
Podwyższone stężenie
pośredniej
Podwyższone stężenie
Brak
Podwyższona zawartość
Zapalenie wątroby
Podwyższone stężenie
bezpośredniej
i pośredniej
Obniżone stężenie
w przypadku
ograniczenia drożności
przewodów żółciowych
Obecna w przypadku
ograniczenia
drożności przewodów
żółciowych
Obniżona zawartość
Żółtaczka
mechaniczna1
Podwyższone stężenie
bezpośredniej
Brak
Obecna
Ilości śladowe lub brak
1 Najczęściej występującą przyczyną żółtaczki mechanicznej (pozawątrobowej) jest rak głowy trzustki oraz kamienie w przewodzie
żółciowym wspólnym. Obecność bilirubiny w moczu jest określana czasem jako choluria - dlatego zapalenie wątroby i niedrożność
przewodu żółciowego wspólnego powodują żółtaczki z obecnością barwników żółciowych w moczu (żółtaczka choluryczna), a nie¬
dokrwistości hemolityczne żółtaczki bez barwników żółciowych w moczu (żółtaczka acholuryczna). Wyniki badań biochemicznych
chorych z zapaleniem wątroby są zróżnicowane i zależą od stopnia uszkodzenia komórek parenchymalnych i ograniczenia drożności
przewodów żółciowych. W przypadku zapalenia wątroby stwierdza się zwykle w surowicy znaczne zwiększenie aktywności ALT i AST,
natomiast w przypadku cholestazy wątrobowej - zwiększenie aktywności fosfatazy alkalicznej.
31. PORFIRYNYI BARWNIKI ŻÓŁCIOWE 353
W moczu chorego na żółtaczkę hemolityczną bi¬
lirubina zazwyczaj nie występuje (niesprzężona
bilirubina nie przenika bowiem do moczu). Zwięk¬
szenie wydalania urobilinogenu i brak bilirubiny
w moczu sugerują więc występowanie żółtaczki
hemolitycznej. Wzmożony, z jakichkolwiek przy¬
czyn, proces niszczenia krwinek również powo¬
duje wzrost stężenia urobilinogenu w moczu.
W tabeli 31-3 zamieszczono wyniki analizy
biochemicznej chorych z różnymi rodzajami żół¬
taczek: niedokrwistością hemolityczną (przyczyna
przedwątrobowa), zapaleniem wątroby (przyczyna
wątrobowa) i niedrożnością przewodu żółciowego
wspólnego (przyczyna pozawątrobowa). W diag¬
nostyce różnicowej żółtaczek przedwątrobowych,
wątrobowych i pozawątrobowych istotne znaczenie
mają również badania krwi (ocena prawdopodo¬
bieństwa niedokrwistości hemolitycznej i czasu pro-
trombinowego) i surowicy (np. elektroforeza białek;
aktywność ALT, ASP i fosfatazy alkalicznej).
STRESZCZENIE
• Hemoproteiny, np. hemoglobina lub cytochro-
my, zawierają hem. Hem jest żelazoporfiryną
(Fe(II)-protoporfiryna IX), w której cztery pier¬
ścienie pirolowe są połączone ze sobą mostka¬
mi metinowymi. Osiem łańcuchów bocznych
w czterech pierścieniach pirolowych hemu jest
ułożonych w specyficznej kolejności.
• Biosynteza hemu, obejmująca osiem etapów,
przebiega w mitochondriach i cytozolu. Rozpo¬
czyna ją tworzenie 8-aminolewulinianu (ALA)
z bursztynylo-CoA i glicyny w reakcji katali¬
zowanej przez syntazę ALA, będącą enzymem
regulującym ten szlak metaboliczny.
• Genetycznie uwarunkowane zaburzenia siedmiu
z ośmiu enzymów uczestniczących w biosynte¬
zie hemu są przyczyną dziedzicznych porfirii.
Nieprawidłowości metaboliczne, objawiające
się jako porfirię, dotyczą głównie erytrocytów
i wątroby. Podstawowymi objawami jest nad¬
wrażliwość skóry na światło i zaburzenia neuro-
psychiczne. Przyjmowanie niektórych związków
(np. ołowiu) również może wywołać porfirię.
W diagnozowaniu porfirii pomocne jest oznacza¬
nie porfiryn i ich prekursorów w krwi i moczu.
• Katabolizm hemu inicjuje oksygenaza hemowa,
a produktem jej działania jest łańcuchowy tetra-
pirol.
• Bilirubina powstaje w wyniku redukcji bili-
werdyny, będącej jednym z najwcześniejszych
katabolitów. Transportowana jest ona w połą¬
czeniu z albuminą z tkanek do wątroby, gdzie
jest wychwytywana przez hepatocyty. Żelazo
hemowe i aminokwasy, powstałe w wyniku
degradacji globiny, są włączane w ogólną pulę
metabolitów i mogą być ponownie wykorzy¬
stane.
• W wątrobie, w wyniku przyłączenia dwóch
cząsteczek glukuronianu, bilirubina jest prze¬
kształcana w formę rozpuszczalną w wodzie,
a następnie wydzielana do żółci. W jelitach, pod
wpływem enzymów flory bakteryjnej, bilirubina
jest przekształcana do urobilinogenu i urobiliny,
które są wydalane z moczem i kałem.
• Zwiększone stężenie bilirubiny we krwi po¬
woduje żółtaczki. Przyczyny żółtaczek można
sklasyfikować jako przedwątrobowe (np. niedo¬
krwistość hemolityczną), wątrobowe (np. zapa¬
lenie wątroby) i pozawątrobowe (niedrożność
przewodu żółciowego wspólnego). W diagno¬
zowaniu żółtaczek bardzo pomocne jest ozna¬
czenie bilirubiny całkowitej i niesprzężonej
w osoczu, urobilinogenu i bilirubiny w moczu,
a także analiza niektórych enzymów osocza
oraz próbek stolca.
PIŚMIENNICTWO
Anderson KE et al: Disorders of heme biosynthesis:
X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias.
In: The Metabolic and Molecular Bases of Inher-
ited Disease, 8th ed. Serwer CR et al (editors).
McGraw-Hill, 2001.
Chowdhury JR et al: Hereditary jaundice and disorders
of bilirubin metabolism. In: The Metabolic and Mo¬
lecular Bases of Inheńted Disease, 8th ed. Serwer
CR et al (editors). McGraw-Hill, 2001.
Desnick RJ: The porphyrias. In: Harrisons Principles
oflnternal Medicine, 16th ed. Kasper DL et al (edi¬
tors). McGraw-Hill, 2005.
Nuttall KL, Klee GG: Analytes of hemoglobin metabo-
lism-porphyrins, iron and bilirubin. In: Tietz Fun-
damentals of Clinical Chemistry, 5th ed. Burtis CA,
Ashwood ER (editors). Saunders, 2001.
Pratt DS, Kapłan MM: Jaundice. In: Harrisons Prin¬
ciples of Internal Medicine, 16th ed. Kasper DL et
al (editors). McGraw-Hill, 2005.
Wolkoff AW: The hyperbilirubinemias. In: Harrison s
Principles of Internal Medicine, 16th ed. Kasper
DL et al (editors). McGraw-Hill, 2005.
CZĘSC IV
Budowa, funkcje i replikacja
makrocząsteczek informacyjnych
Nukleotydy
l/ictor 1/1/ Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Nukleotydy - jednostki monomeryczne, czyli ce¬
giełki, z których sązbudowane kwasy nukleinowe
- pełnią oprócz tego różnorodne funkcje. Wcho¬
dzą w skład wielu koenzymów, służą jako donory
grup fosforytowych (np. ATP lub GTP), cukrów
(np. cukrów z UDP lub GDP), lipidów (np. CDP-
acyloglicerol). Do nukleotydów regulatorowych
zaliczają się przekaźniki drugorzędowe cAMP
i cGMP; ADP, którego stężenie reguluje szyb¬
kość mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej;
ATP, AMP i CTP, biorące udział w allosterycznej
regulacji aktywności enzymatycznej. Syntetycz¬
ne analogi puryn i pirymidyn, zawierające halo¬
geny, tiole lub dodatkowe atomy azotu, są stoso¬
wane w chemioterapii nowotworów i AIDS oraz
w celu immunosupresji podczas transplantacji
narządów.
PURYNY, PIRYMIDYNY, NUKLEOZYDY
I NUKLEOTYDY
Puryny i pirymidyny są związkami heterocy¬
klicznymi, zawierającymi azot. Są to związki
pierścieniowe (cykliczne), które oprócz atomów
węgla zawierają także inne atomy (heteroato¬
my). Warto zauważyć, że-mniejsza cząsteczka
pirymidyny ma dłuższą nazwę, natomiast więk¬
sza puryna - krótszą oraz że kierunek numeracji
atomów w pirymidynie jest zgodny z ruchem
wskazówek zegara, natomiast w purynie - prze¬
ciwny (ryc. 32-1).
H
I c
H
I „
'6
C^
7
Nv
^ 8
■4
o 5
3N CH
I II
CH
I II
3
/
n9
HCn. / CH
1
H
Puryna
Pirymidyna
Ryc. 32-1. Puryna i pirymidyna. Numeracja atomów jest zgodna
z konwencją międzynarodową.
Planarny charakter pierścieni puryn i pirymi¬
dyn ułatwia ich „warstwowe” ułożenie i bliskie
oddziaływania, które stabilizują dwuniciową he¬
lisę DNA (rozdz. 34). Grupy okso- i amino- puryn
i pirymidyn cechuje tautomeria typu keto-enol
i amino-imina (ryc. 32-2), jednak w warunkach
fizjologicznych uprzywilejowane jest występo¬
wanie form amino- oraz okso-.
32. NUKLEOTYDY 355
Ryc. 32-2. Tautomeria grup funkcyjnych okso- i amino- puryn
i pirymidyn.
Nukleozydy i nukleotydy
Nukleozydy są pochodnymi puryn i pirymidyn; za¬
wierają cząsteczkę cukru związaną z atomem azotu
heteropierścienia, nazywanego heterocykliczną„za-
sadą”, przy czym może on nie wykazywać znaczą¬
cych właściwości zasadowych. Cyfry ze znaczkiem
prim (np. 2’ lub 3') odróżniają atomy w cząsteczce
cukru od atomów w cząsteczce heterocyklicznej
zasady. W rybonukleozydach cukrem jest D-rybo-
za, natomiast w deoksyrybonukleotydach jest nim
2-deoksy-D-ryboza. Cząsteczka cukru jest połączo¬
na z heterocykliczną zasadą wiązaniem p-7V-gli-
kozydowym, prawie zawsze z atomem N-l piry¬
midyny lub N-9 puryny (ryc. 32-3).
Mononukleotydy są to nukleozydy z grupą fo¬
sforytową zestryfikowaną do grupy hydroksylowej
cukru. Nukleotydy 3'- oraz 5'- są nukleozydami
z grupą fosforytową przy grupie hydroksylowej
w pozycji 3 - lub 5 - cząsteczki cukru. Ponieważ
większość nukleotydów jest typu 5'-, więc przed¬
rostek „5'-” jest zwykle pomijany. UMP i dAMP
przedstawiają zatem nukleotydy z grupą fosforylo-
Ryc. 32-3. Rybonukleozydy przedstawione jako konformery syn.
5'-Monofosforan adenozyny (AMP)
Y
5'-Difosforan adenozyny (ADP)
J
V.
Y
5'-Trifosforan adenozyny (ATP)
J
Ryc. 32-4. ATR difosforan (ADP) i monofosforan (AMP).
Ryc. 32-5. Konformery syn i anty adenozyny różnią się orientacją
względem wiązania A/-glikozydowego.
wą przy atomie C-5 pentozy. Dodatkowe grupy fo¬
sforanowe, połączone z grupą fosforanową mono-
nukleotydu za pomocą wiązań bezwodnikowych,
tworzą difosforany i trifosforany nukleozydów
(ryc. 32-4).
356 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Zawada przestrzenna ze strony heterocyklicz¬
nej zasady ogranicza rotację wokół wiązania
P-A-glikozydowego nukleozydów i nukleotydów.
Oba istnieją zatem w konformacji syn albo anty
(ryc. 32-5).
Jakkolwiek w przyrodzie występują obie
konformacje, to jednak przeważa forma anty.
W tabeli 32-1 pokazano najważniejsze zasady,
nukleozydy oraz nukleotydy purynowe i pirymi¬
dynowe.
Niezależnie od tego, czy dotyczy to nukleozy¬
dów czy nukleotydów, do oznaczania zasad uży¬
wa się jednoliterowych skrótów: A - adenina, G -
guanina, C - cytozyna, T - tymina i U - uracyl.
Przedrostek „d” (deoksy) wskazuje, że cukrem
jest 2'-deoksy-D-ryboza (np. dGTP) (ryc. 32-6).
Tabela 32-1. Zasady purynowe, rybonukleozydy I rybonukleotydy
Puryna lub pirymidyna
nh2
Oc>
x
o
N
h2n^n
I.
X
nh2
N '
X
o
I
dX
.ch3
X = H
X = Ryboza
Adenina
Adenozyna
Guanina
Guanozyna
Cytozyna
Cytydyna
Uracyl
Urydyna
Tymina
Tymidyna
X = Fosforan rybozy
Monofosforan adenozyny (adenozynomonofosforan, AMP)
Monofosforan guanozyny (guanozynomonofosforan, GMP)
Monofosforan cytydyny (cytydynomonofosforan, CMP)
Monofosforan urydyny (urydynomonofosforan, UMP)
Monofosforan tymidyny (tymidynomonofosforan, TMP)
32. NUKLEOTYDY 357
Ryc. 32-6. Kwas adenilowy (AMP) i 2’-deoksyadenilowy (dAMP) oraz kwas urydylowy (UMP) i tymidylowy (TMP).
Kwasy nukleinowe także zawierają
dodatkowe zasady heterocykliczne
W kwasach nukleinowych (DNA i RNA) wystę¬
pują niewielkie ilości dodatkowych puryn i piry-
midyn. Przykładem jest 5-metylocytozyna DNA
bakterii oraz człowieka, 5-hydroksymetylocyto-
zyna występująca w kwasach nukleinowych bak¬
terii i wirusów oraz A-metylowane adenina oraz
guanina obecne w mRNA ssaków (ryc. 32-7)
- zasady mające znaczenie w rozpoznawaniu oli-
gonukleotydów i w regulacji okresu półtrwania
kwasów rybonukleinowych.
W komórkach występują w stanie wolnym
nukleotydy: hipoksantyna, ksantyna i kwas mo¬
czowy (p. ryc. 33-8), które są pośrednikami
w katabolizmie adeniny i guanidyny (rozdz. 33).
Metylowane heterocykliczne zasady występujące
u roślin obejmują: pochodne ksantyny, kofeinę
w kawie, teofilinę w herbacie oraz teobrominę
w kakao (ryc. 32-8).
ch3
nh2
nh2
N
N
H
H
5-Metylocytozyna
5-Hydroksymetylocytozyna
Dimetyloaminoadenina 7-Metyloguanina
Ryc. 32-7. Struktura czterech rzadko występujących w przyro¬
dzie pirymidyn oraz puryn.
Ryc. 32-8. Kofeina (trimetyloksantyna). Budowa dimetyloksantyn
- teobrominy i teofiliny - jest podobna, z tym że nie zawierają one
ugrupowania metylowego w pozycjach, odpowiednio, N-1 i N-7.
Potranslacyjna modyfikacja utworzonych po-
linukleotydów może spowodować pojawienie
się dodatkowych zasad, takich jak pseudourydy-
na, w której cząsteczka D-rybozy jest związana
z atomem C-5 uracylu wiązaniem typu węgiel-
-węgiel zamiast wiązaniem P-A-glikozydowym.
Mononukleotyd - kwas pseudourydylowy (y)
powstaje w wyniku potranskrypcyjnego prze¬
grupowania kwasu urydylowego w powstałym
uprzednio tRNA. Podobnie TMP (monofosforan
tymidyny) zawiera rybozę zamiast deoksyrybozy
i powstaje, gdy UMP w utworzonym uprzednio
tRNA jest metylowany przez S-adenozylometio-
ninę.
358 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Nukleotydy pełnią różnorodne
funkcje fizjologiczne
Nukleotydy biorą udział w różnorodnych proce¬
sach fizjologicznych, takich jak synteza białek
i kwasów nukleinowych, kaskady regulatorowe
i transdukcja sygnałów wewnątrz- i międzyko¬
mórkowych.
Trifosforany nukleozydów zawierają
grupy wysokoenergetyczne
Bezwodniki kwasowe, w odróżnieniu od estrów
fosforanowych, mają grupy o wysokim potencja¬
le transferu. Wartość AG° hydrolizy obu końco¬
wych reszt fosforanowych (p i y) wszystkich tri-
fosforanów nukleozydów wynosi ok. -30 kJ/mol
(-7 kcal/mol). Wysoki potencjał transferu trifo-
sforanów nukleozydów purynowych i pirymi¬
dynowych umożliwia im udział jako czynników
transferu grup w wielu reakcjach (najczęściej
reszta y-fosforanowa). W reakcjach tych rozerwa¬
nie wiązania typu bezwodnika kwasowego jest
sprzężone z procesem wysoce endoergicznym,
takim jak synteza wiązań kowalencyjnych. Do¬
brym przykładem jest polimeryzacja głównych
trifosforanów nukleozydów w biosyntezie kwasu
nukleinowego.
ix:>
-o — p = o
-o
L
Y H2N ^
N 1
0
0
0
1
/ \
Ryc. 32-9. cAMP (3',5'-cykliczny AMP) oraz cGMP
Oprócz odgrywania roli prekursorów kwasów
nukleinowych, ATP, GTP, UTP, CTP i ich po¬
chodne pełnią specyficzne funkcje fizjologiczne,
opisane w innych rozdziałach.
A oto kilka przykładów: ATP pełni funkcję
głównego przekaźnika energii w procesach bio¬
logicznych; cAMP jest przekaźnikiem drugo-
rzędowym (ryc. 32-9); 3'-fosforano-5'-fosfosiar-
czan adenozyny (ryc. 32-10) jest donorem grup
siarczanowych dla proteoglikanów (rozdz. 47)
i siarczanowych koniugatów leków oraz S-adeno-
zylometionina - donorem grupy metylowej (ryc.
32-11).
Adenina — Ryboza — (?) — 0 — SO3
Ryc. 32-10. 3'-Fosforano-5'-fosfosiarczan adenozyny.
nh2
HO OH
Metionina Adenozyna
Ryc. 32-11. S-Adenozylometionina.
GTP służy jako allosteryczny regulator i źród¬
ło energii w syntezie białek. Cykliczny GMP
(p. ryc. 32-9) jest przekaźnikiem drugorzędowym
w odpowiedzi na tlenek azotu (NO) podczas re¬
laksacji mięśnia gładkiego (rozdz. 48). Pochodne
UDP-cukier uczestniczą w epimeryzacji cukrów
i w biosyntezie glikogenu, dwucukrów (disacha-
rydów) glukozylowych i oligosacharydów wy¬
stępujących w glikoproteinach i proteoglikanach
(rozdz. 46 i 47). UDP-kwas glukuronowy tworzy
koniugaty bilirubiny w moczu (rozdz. 31), jak
również koniugaty wielu leków, np. aspiryny.
CTP bierze udział w biosyntezie fosfoglicerydów,
sfingomielin i innych podstawionych sfingozyn
(rozdz. 24). Nukleotydy i cząsteczki podobne
do nukleotydów purynowych oraz pirymidyno¬
wych są również fragmentami wielu koenzymów
(tab. 32-2).
32. NUKLEOTYDY 359
Tabela 32-2. Koenzymy i związki pokrewne będące pochodnymi
monofosforanu adenozyny (adenozynomonofosforanu)
D-Ryboza
Adenina
Koenzym
R
R'
R"
n
Aktywna metionina
Metionina3
H
H
0
Adenylany aminokwasów
Aminokwas
H
H
1
Aktywny siarczan
sor
H
por
1
^'-Cykliczny AMP
H
por
1
NAD3
b
H
H
2
NADP3
•
por
H
2
FAD
•
H
H
2
CoASH
b
H
por
2
4 Zastępuje grupę fosforanową.
b R jest pochodną witaminy B.
Nukleotydy sa kwasami
o licznych funkcjach
Nukleozydy albo wolne zasady purynowe lub
pirymidynowe w warunkach fizjologicznych nie
są obdarzone ładunkiem. Z kolei wartości p
pierwszorzędowych reszt fosforanowych (ok.
1,0) oraz drugorzędowych reszt fosforanowych
nukleotydów (ok. 6,2) zapewniają ujemny ładu¬
nek nukleotydów w fizjologicznym pH. Nukleo¬
tydy mogą jednak działać albo jako donory, albo
jako akceptory protonu, jeśli wartość pH zmienia
się o co najmniej dwie jednostki w stosunku do
punktu zobojętnienia.
Nukleotydy absorbują światło
ultrafioletowe
Wiązania podwójne sprzężone w heterocyklicz¬
nych zasadach purynowych i pirymidynowych
powodują, że nukleozydy, nukleotydy i polinu-
kleotydy absorbują światło ultrafioletowe. Muta¬
genny efekt światła ultrafioletowego wynika z po¬
chłaniania go przez nukleotydy obecne w DNA,
czemu towarzyszą przemiany chemiczne. Wpraw¬
dzie widma są zależne od pH, jednak w pH = 7,0
wszystkie zwykłe nukleotydy absorbują światło
0 długości fali ok. 260 nm. Dlatego też stężenie
nukleotydów i kwasów nukleinowych często wy¬
raża się w jednostkach gęstości optycznej (OD)
przy 260 nm.
SYNTETYCZNE ANALOGI NUKLEOTYDÓW
SA STOSOWANE W CHEMIOTERAPII
Syntetyczne analogi puryn i pirymidyn, ich nu¬
kleozydy i nukleotydy znalazły liczne zastosowa¬
nia w medycynie klinicznej i badaniach medycz¬
nych. Podanie analogu, w którym pierścień hetero¬
cykliczny lub cząsteczka cukru zostały zmienione,
indukuje działanie toksyczne, gdy analog zostaje
wbudowany w swoiste składniki komórkowe.
Toksycznym skutkiem tego jest zahamowanie
przez lek swoistych enzymów niezbędnych do
biosyntezy kwasów nukleinowych lub wbudowa¬
nie metabolitu takiego leku w kwasy nukleinowe,
gdzie wpływa on na parowanie zasad - proces nie¬
zbędny do prawidłowego przenoszenia informa¬
cji. Onkolodzy stosują 5-fluoro- lub 5-jodouracyl,
3-deoksyurydynę, 6-tioguaninę i 6-merkaptopury-
nę, 5- lub 6-azaurydynę, 5- lub 6-azacytydynę i 8-
-azaguaninę (ryc. 32-12), które wbudowują się do
DNA przed podziałem komórki. Allopurinol - ana¬
log purynowy stosowany w leczeniu hiperurykemii
1 skazy moczanowej hamuje biosyntezę puryn de
novo oraz aktywność oksydazy ksantynowej. Nu-
kleozyd cytarabina jest stosowany w chemioterapii
nowotworów. Azatioprynę, która jest katabolizo-
wana do 6-merkaptopuryny, stosuje się w czasie
transplantacji narządów w celu stłumienia proce¬
sów immunologicznego odrzucania przeszczepu.
Analogi trifostoranów nukleozydów
nieulegajace hydrolizie sa narzędziami
badawczymi
Syntetyczne, nieulegające hydrolizie analogi tri-
fosforanów nukleozydów są cennymi narzędzia¬
mi w badaniach medycznych (ryc. 32-13). Tego
typu analogi nukleotydów pozwalają naukowcom
360 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
6-Merkaptopuryna 6-Tioguanina Allopurinol
Ryc. 32-12. Niektóre syntetyczne analogi pirymidyn oraz puryn.
zbadać, czy do skutecznego działania di- lub trifo-
sforanów nukleozydów wymagana jest hydroliza
albo czy działają one poprzez zajmowanie swoi¬
stych miejsc wiązania nukleotydów w enzymach
lub białkach regulatorowych.
POLINUKLEOTYDY
Pojedynczo zestryfikowany 5'-fosforan nukleo-
tydu może wytwarzać wiązanie estrowe z drugą
alkoholową grupą funkcyjną (—OH), tworząc
fosfodiester. Najczęściej ta druga grupa —OH,
w tym przypadku 3'-OH, znajduje się w cząsteczce
pentozy drugiego nukleotydu. Powstaje zatem di-
nukleotyd, w którym reszty cukrowe są związane
wiązaniem fosfodiestrowym 3'—>5' i tworzą szkie¬
let polinukleotydów, takich jak RNA czy DNA.
Tworzenie dinukleotydu można przedstawić
jako eliminację cząsteczki wody towarzyszącą
łączeniu się pary monomerów. W warunkach bio¬
logicznych proces ten nie zachodzi w taki sposób,
ponieważ z powodów termodynamicznych uprzy¬
wilejowana jest reakcja odwrotna, tzn. hydroliza
wiązania fosfodiestrowego. Dzięki jednak dużej
barierze energetycznej (bardzo korzystna wartość
000
II II II
Pu/Py — R — 0 — P —0 —P —0 — P — 0"
1 I I
0" 0_ 0_
Macierzysty trifosforan nukleozydu
0 0 0
II II II
Pu/Py —R —0 —P —0 —P — CHo —P —0"
I I I
0" 0" 0~
Pochodna p.y-metylenowa
0 0 0
II II H ||
Pu/Py -R -0 -P -0 -P — N-P — 0"
I I I
0" 0" 0"
Pochodna p.y-iminowa
Ryc. 32-13. Syntetyczne pochodne trifosforanów nukleozy¬
dów niezdolne do hydrolitycznego oddzielenia końcowej reszty
fosforanowej. (Pu/Py - zasada purynowa lub pirymidynowa,
R - ryboza lub deoksyryboza). Pokazano macierzysty (ulegający
hydrolizie) trifosforan nukleozydu {góra) i nieulegające hydrolizie
pochodne: p-metylenową (środek) oraz y-iminową (dóf).
AG) hydroliza jest procesem bardzo powolnym,
jeżeli nie jest katalizowana przez enzymy zwane
32. NUKLEOTYDY 361
fosfodiesterazami. Dlatego też DNA może prze¬
trwać przez długi czas i można go wykryć nawet
w skamieniałościach. RN A jest znacznie mniej sta¬
bilny niż DNA, ponieważ grupa 2'-hydroksylowa
(nieobecna w DNA) podczas hydrolizy wiązania
diestrowego 3'—► 5' zachowuje się jak nukleofil.
Polinukleotydy sq cząsteczkami
polarnymi
Wiązania fosfodiestrowe łączą atomy węgla 3' oraz
5' sąsiadujących monomerów. Każdy koniec poli¬
meru nukleotydów jest więc określony. Mówi się
zatem o „końcu 5'” i „końcu 3'” polinukleotydów.
Na przykład koniec 5' może zawierać wolną grupę
hydroksylową 5' lub może być fosforylowany.
Polinukleotydy maja strukturę
pierwszorzedowa
Podstawowa sekwencja struktury pierwszo-
rzędowej polinukleotydów może być przedsta¬
wiona w sposób pokazany poniżej. Na schemacie
tym P lub p oznacza wiązanie fosfodiestrowe, za¬
sady są symbolizowane przez pojedyncze litery,
a pentozy są przedstawione jako linie pionowe.
A T C A
Jeśli wszystkie wiązania fosfodiestrowe są typu
5'—> 3', można zastosować uproszczony zapis:
pGpGpApTpCpA
Zapis taki informuje, że reszta hydroksylowa 5'
jest fosforylowana, a grupa hydroksylowa 3' nie
jest podstawiona.
W jeszcze bardziej syntetycznym przedstawie¬
niu polinukleotydu, pokazującym tylko sekwen¬
cje zasad, koniec 5' umownie pisze się po stronie
lewej, a koniec 3' - po stronie prawej; grup fosfo¬
ranowych nie zaznacza się:
GGATCA
STRESZCZENIE
• W warunkach fizjologicznych przeważają tau-
tomery amino- i okso- puryn oraz pirymidyn
i ich pochodnych.
• Kwasy nukleinowe zawierają, oprócz A, G, C,
T i U, śladowe ilości 5-metylocytozyny, 5-hy-
droksymetylocytozyny, pseudourydyny (¥) lub
A-metylowanych zasad.
• Większość nukleozydów zawiera D-rybozę lub
2-deoksy-D-rybozę połączoną z atomem N-l
pirymidyny lub atomem N-9 puryny za pomocą
wiązania P-glikozydowego w dominującej kon¬
formacji syn.
• W terminologii mononukleotydów cyfra ze zna¬
kiem oznacza miejsce reszty fosforanowej
w cząsteczce cukru (np. 3-AMP, 5'-GMP). Do¬
datkowe reszty fosforanowe związane z pierwszą
resztą za pomocą wiązań bezwodnikowych wy¬
stępują w di- oraz trifosforanach nukleozydów.
• Trifosforany nukleozydów cechuje wysoki poten¬
cjał transferu grup i uczestniczą one w syntezach
z tworzeniem wiązań kowalencyjnych. Cyklicz¬
ne fosfodiestry cAMP oraz cGMP służą jako we¬
wnątrzkomórkowe przekaźniki drugorzędowe.
• Mononukleotydy sprzężone wiązaniem fosfo-
diestrowym 3'—>5' tworzą polinukleotydy - ma¬
krocząsteczki o charakterze polarnym, określo¬
nym przez końce 3' oraz 5'. W zapisie pTpGpTp
lub TGCATCA koniec 5' jest po stronie lewej,
a wszystkie wiązania fosfodiestrowe są typu
3'-*5'.
• Wiele syntetycznych analogów zasad purynowych
i pirymidynowych oraz ich pochodne są stosowa¬
ne w chemioterapii jako leki przeciwnowotworo-
we. Działają ona albo przez hamowanie enzymów
biorących udział w biosyntezie nukleotydów, albo
przez wbudowanie się do DNA lub RNA.
PIŚMIENNICTWO
Adams RLP, Knowler JT, Leader DP: The Biochemistry of
the Nucleic Acids, 1 lth ed. Chapman & Hall, 1992.
Blackbum GM, Gait MJ: Nucleic Acids in Chemistry &
Biology. IRL Press, 1990.
Bugg CE, Carson WM, Montgomery JA: Drugs by de¬
sign. Sci Am 1992; 269:92.
Pacher P, Nivorozhkin A, Szabo C: Therapeutic effects
of xanthine oxidase inhibitors: renaissance half a
century after the discovery of allopurinol. Pharma-
col Rev 2006; 58:87.
Metabolizm nukleotydów
purynowych i pirymidynowych
lfictor 1/1i Rodwell, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Biosyntezy purynowych i pirymidynowych
oksy- i deoksyrybonukleotydów (NTP i dNTP)
są precyzyjnie regulowane i koordynowane
przez sprzężenie zwrotne (ang. feedback), któ¬
re zapewnia wytwarzanie tych związków w od¬
powiednich ilościach i w odpowiednim czasie,
w zależności od zmieniającego się zapotrzebo¬
wania fizjologicznego (np. podział komórkowy).
Choroby człowieka, których podłożem jest za¬
burzony metabolizm purynowy, to m.in.: skaza
moczanowa, zespół Lesch-Nyhana, niedobór
deaminazy adenozynowej i fosforylazy nukle-
ozydów purynowych. Choroby związane z bio¬
syntezą pirymidyn są rzadsze; zalicza się do nich
acyduria orotanowa.
PURYNYI PIRYMIDYNY SA POD
WZGLĘDEM ŻYWIENIOWYM NIEISTOTNE
Ludzie i większość innych kręgowców mogą
syntetyzować z amfibolicznych związków po¬
średnich wystarczające ilości nukleotydów pu¬
rynowych i pirymidynowych. Chociaż ludzie
spożywają z dietą kwasy nukleinowe i nukleo-
tydy, to jednak ich wchłanianie i wykorzystanie
nie jest niezbędne do życia. Kwasy nukleinowe
ze spożytych nukleoprotein są w przewodzie
pokarmowym rozkładane do mononukleotydów
przy udziale rybonukleaz, deoksyrybonukle-
az i polinukleotydaz. Nukleotydazy i fosfatazy
hydrolizują mononukleotydy do nukleozydów,
które albo są wchłaniane, albo dalej rozkładane
przez fosforylazy jelitowe do zasad purynowych
i pirymidynowych. Zasady purynowe są utlenia¬
ne do kwasu moczowego, który może być wchła¬
niany i następnie wydalany z moczem. Podczas
gdy puryny i pirymidyny pobrane z pożywie¬
niem wcale lub prawie wcale nie wbudowują się
w tkankowe kwasy nukleinowe, to podane po-
zajelitowo wbudowują się; na przykład wstrzyk¬
nięta [3H]tymidyna wbudowuje się do nowo syn¬
tetyzowanego DNA. Wbudowywanie to stanowi
podstawę techniki umożliwiającej mierzenie
szybkości syntezy DNA in vivo i in vitro.
BIOSYNTEZA NUKLEOTYDÓW
PURYNOWYCH
Biosynteza nukleotydów purynowych i pirymidy¬
nowych in vivo przebiega z kontrolowaną szybko¬
ścią, stosownie do potrzeb fizjologicznych. Ponie¬
waż zapotrzebowanie na trifosforany nukleotydo-
we może się zmieniać, np. w czasie wzrostu lub
regeneracji tkanek i w komórkach gotowych do
podziału, szybkość biosyntezy puryn i pirymidyn
zależy od mechanizmów wewnątrzkomórkowych,
które określają i skutecznie regulują wielkość puli
tych pośrednich w biosyntezie kwasów nuklei¬
nowych cząsteczek. Wiedza dotycząca szlaków
biosyntezy nukleotydów i regulacji jej u ludzi po¬
chodzi z badań tych samych procesów u ptaków
i u Escheńchia coli.
Podawanie gołębiom znakowanych izotopem
prekursorów pozwoliło na ustalenie źródła każde¬
go atomu w zasadzie purynowej (ryc. 33-1) i zapo¬
czątkowało badania nad reakcjami i cząsteczkami
pośrednimi w biosyntezie puryn.
Trzy procesy składają się na biosyntezę nukleo¬
tydów purynowych; podano je w kolejności ma¬
lejącego znaczenia: 1) synteza z amfibolicznych
33. METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH 363
Ryc. 33-1. Pochodzenie atomów azotu i węgla w pierścieniu pu-
rynowym. Atomy 4,5 i 7 (zacienione) pochodzą z glicyny.
cząsteczek pośrednich (synteza de novo), 2) fo-
sforybozylacja puryn i 3) fosforylacja nukleozy-
dów purynowych.
M0N0F0SF0RAN INOZYNY (IMP)
POWSTAJE Z AMFIBOLICZNYCH
ZWIĄZKÓW POŚREDNICH
Na rycinie 33-2 przedstawiono związki pośrednie
oraz 11 katalizowanych przez enzymy reakcji,
w których a-D-rybozo-5-fosforan zostaje prze¬
kształcony do monofosforanu inozyny (IMP).
Ten metaboliczny szlak rozdziela się następ¬
nie na dwie ścieżki: jedna prowadzi od IMP do
AMP, druga od IMP do GMP. Następujące dalej
przeniesienie (transfer) reszty fosforanowej ATP
przekształca AMP i GMP, odpowiednio, do ADP
i GDP. Cząsteczka GDP jest potem zmieniana do
GTP przy użyciu innej cząsteczki ATP. Konwer¬
sja ADP do ATP zachodzi głównie w wyniku fo¬
sforylacji oksydacyjnej (p. rozdz. 13).
W biosyntezie nukleotydów
purynowych biorą udział
wielofunkcyjne katalizatory
U prokariotów każda reakcja pokazana na ryc.
33-2 jest katalizowana przez różne polipeptydy,
natomiast u eukariotów, wskutek fuzji genów,
powstały pojedyncze polipeptydy pełniące wie¬
lorakie funkcje katalityczne. W biosyntezie pu¬
ryn reakcje ®, ® i ®, reakcje ® i ® oraz ®
i ® katalizują, odpowiednio, trzy wielofunkcyj¬
ne katalizatory.
Leki przeciwfolianowe i analogi
glutaminy blokują biosyntezo
nukleotydu purynowego
Wprowadzone w reakcjach © i © (ryc. 33-2)
dwa atomy węgla pochodzą z pochodnych tetra-
hydrofolianu. U ludzi niedobór puryn występuje
rzadko i jest wywołany głównie niedoborem kwa¬
su foliowego. Zahamowanie tworzenia związków
tetrahydrofolianowych może zatem blokować
syntezę puryn. Związki blokujące oraz reakcje,
które one hamują, wykorzystywane w chemiote¬
rapii, obejmują: azaserynę (reakcja ®, ryc. 33-2),
diazanorleucynę (reakcja ®, ryc. 33-2), 6-mer-
kaptopurynę (reakcje ® i (14), ryc. 33-3) oraz
kwas mykofenolowy (reakcja ®, ryc. 33-3).
W REAKCJACH REZERWOWYCH
(„SALVAGE”) PURYNYI ICH
NUKLEOZYDY PRZEKSZTAŁCAJĄ SIĘ
DO MONONUKLEOTYDÓW
Konwersja puryn, rybonukleozydów puryn i de-
oksyrybonukleozydów puryn do mononukleoty-
dów obejmuje tzw. reakcje rezerwowe (reutyli-
zacji; ang. „salvage reactions”), które wymagają
znacznie mniej energii niż synteza de novo. Iloś¬
ciowo najważniejszym mechanizmem jest fo-
sforybozylacja wolnej puryny (Pu) przez PRPP
(struktura II, ryc. 33-2) z wytworzeniem 5'-mo-
nonukleotydu purynowego (Pu-RP).
Pu + PR-PP->PRP + PPj
Fosforybozylacja puryn zależna od PRPP jest
katalizowana przez fosforybozylotransferazę
adeninową (zmieniającą adeninę do AMP) oraz
fosforybozylotransferazę ksantynowo-guaninową
(zmieniającą hipoksantynę lub guaninę do IMP
lub GMP) (ryc. 33-4).
Drugi mechanizm reutylizacji („salvage”) obej¬
muje bezpośrednią fosforylację rybonukleozydu
purynowego (PuR) przez ATP:
PuR + ATP-» PuR-P + ADP
Kinaza adenozynowa katalizuje fosforylację ade¬
nozyny do AMP lub deoksyadenozyny do dAMP.
Z kolei- kinaza deoksycytydynowa katalizuje fo¬
sforylację deoksycytydyny i 2'-deoksyguanozyny
364 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
R.5-® H R-5-® | CYKLOHYDROLAZAIMP | R_5_®
oimidazolokarboksamido- Formimidoimidazolokarboksyamido- Monofosforan inozyny (IMP)
rybozylo-5-fosforan rybozylo-5-fosforan (XII)
33. METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCHI PIRYMIDYNOWYCH 365
W
'OOC-C-C-COO'
H2 i ..
NHt
'OOC-C-C-COO'
h2 i
NH
R-5-®
Monofosforan inozyny
(IMP)
Adenylobursztynian
(AMPS)
~ ooc—c= c — coo ~
J ®
GTP, Mg‘T
R-5-®
LIAZA ADENYLO-
BURSZTYNIANOWA
SYNTAZAADENYLO-
BURSZTYNIANOWA
(XMP)
Ryc. 33-3. Przekształcenie IMP do AMP i GMP
(GMP)
w
R-5-®
Monofosforan adenozyny
(AMP)
do dCMP i dGMP. Wątroba ssaków, stanowiąca
główne miejsce biosyntezy nukleotydów pury-
nowych, dostarcza puryn i ich nukleozydów do
reakcji rezerwowych oraz zużywania tych związ¬
ków przez tkanki, które nie mają zdolności do ich
biosyntezy. Na przykład w tkance mózgowej czło¬
wieka stężenie amidotransferazy PRPP jest małe
i dlatego zależy ona częściowo od egzogennych
puryn. Erytrocyty i leukocyty wielojądrzaste nie
mogą syntetyzować 5-fosforybozyloaminy (struk¬
tura III, ryc. 33-2) i dlatego zużywają egzogenne
puryny do wytworzenia nukleotydów.
AMP i GMP regulują amidotransferazę
glutamylową PRPP przez sprzężenie
zwrotne
Ponieważ w biosyntezie IMP z amfibolicznych
związków pośrednich zużywana jest glicyna,
glutamina, pochodne tetrahydrofolianu, asparagi-
nian i ATP, niezbędna jest regulacja biosyntezy
puryn. Głównym czynnikiem warunkującym
szybkość biosyntezy puryn de novo jest stęże¬
nie PRPP; parametr ten charakteryzuje względ¬
ną szybkość biosyntezy, zużywania i rozkładu
PRPP. Szybkość biosyntezy PRPP zależy od
dostępności rybozo-5-fosforanu i od aktywności
syntazy PRPP - enzymu wrażliwego zarówno na
stężenie fosforanu, jak i rybonukleotydów pury-
nowych, które działają jako jego allosteryczne
regulatory.
AMP i GMP regulują swoje powstawanie
z IMP przez sprzężenie zwrotne
Konwersję IMP do GMP i AMP regulują dwa
mechanizmy. AMP poprzez sprzężenie zwrotne
reguluje syntazę adenylobursztynianową, a GMP
poprzez sprzężenie zwrotne hamuje dehydrogena¬
zę IMP (reakcje ^1?) i (li) na ryc. 33-3). Co więcej,
konwersja IMP do adenylobursztynianu w szla¬
ku biosyntezy AMP wymaga GTP, a konwersja
ksantynianu (XMP) do GMP wymaga ATP. W ten
sposób krzyżowa regulacja między drogami me-
366 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
tabolizmu IMP służy zmniejszeniu biosyntezy
jednego nukleotydu purynowego, jeśli występuje
niedobór innego nukleotydu. AMP i GMP hamują
także fosforybozylotransferazę hipoksantynowo-
-guanozynową (która bierze udział w przemia¬
nie hipoksantyny i guaniny do IMP i GMP; ryc.
33-4). GMP poprzez sprzężenie zwrotne hamuje
amidotransferazę glutamylową PRPP (reakcja
®, ryc. 33-2).
PRPP PP:
I*
‘>A_2
©—o-
Adenina
F0SF0RYB0ZYL0-
TRANSFERAZA
ADENINOWA
OH OH
AMP
0 0
IMP
0 0
Ryc. 33-4. Fosforybozylacja adeniny, hipoksantyny i guaniny do
AMR IMP i GMP
REDUKCJA NDP PROWADZI
DO UTWORZENIA UNDP
Redukcja przy atomie węgla 2' difosforanów rybo-
nukleozydów purynowych i pirymidynowych, ka¬
talizowana przez kompleks reduktazy rybonuk-
leotydowej (ryc. 33-5), prowadzi do utworzenia
Difosforan
2'-deoksyrybonukleozydu
NADP+
NADPH + H+
Ryc. 33-5. Redukcja difosforanów rybonukleozydów do difosfo¬
ranów 2'-deoksyrybonukleozydów.
difosforanów deoksyrybonukleozydów (dNDP).
Kompleks enzymów jest aktywny tylko wówczas,
gdy komórki syntetyzują DNA w procesie przy¬
gotowania do podziału komórkowego. Redukcja
wymaga tioredoksyny (kofaktora białkowego),
reduktazy tioredoksyny (flawoproteina) oraz
NADPH. Bezpośrednim czynnikiem redukującym
NDP jest zredukowana tioredoksyna, wytworzona
w reakcji katalizowanej przez reduktazę NADPH:
tioredoksyna (ryc. 33-5). Redukcja difosforanów
rybonukleozydowych (NDP) do difosforanów
deoksyrybonukleozydowych (dNDP) podlega zło¬
żonej regulacji (ryc. 33-6), dzięki czemu następu-
j e zrównoważone wytwarzanie deoksyrybonukleo-
tydów do syntezy DNA.
BIOSYNTEZA NUKLEOTYDÓW
PIRYMIDYNOWYCH
Na rycinie 33-7 przedstawiono produkty pośred¬
nie i enzymy w biosyntezie nukleotydów pirymi¬
dynowych.
Biosynteza pirymidyny rozpoczyna się od syn¬
tezy karbamoilofosforanu z glutaminy, ATP i C02.
Reakcja ta jest katalizowana przez cytoplazma-
33. METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH 367
tyczną syntazę karbamoilofosforanową II, enzym
różny od mitochondrialnej syntazy karbamoilo-
fosforanowej I, działającej w syntezie mocznika
(p. ryc. 28-9). Dzięki kompartmentacji zagwaran¬
towane są niezależne pule fosforanu.
PRPP, biorący udział w początkowych etapach
biosyntezy nukleotydów purynowych (p. ryc.
33-2), bierze udział w późniejszych etapach bio¬
syntezy pirymidyn.
Wielofunkcyjne białka katalizują
początkowe reakcje biosyntezy
pirymidyn
Pięć spośród sześciu enzymów aktywnych w bio¬
syntezie pirymidyn występuje w postaci wielo¬
funkcyjnych polipeptydów. Jeden z tych polipep-
tydów katalizuje pierwsze trzy reakcje (ryc. 33-7),
zapewniając wydajne przekazywanie karbamoilo-
fosforanu do biosyntezy pirymidyn. Drugi dwu-
funkcjonalny enzym katalizuje reakcje @ i rf).
REUTYLIZACJA RYBO-
IDEOKSYRYBONUKLEOZYDÓW
URACYLU ICYTOZYNY
Komórki ssaków zużywają niewielką ilość wol¬
nych pirymidyn. W reakcjach reutylizacji („sal-
vage”) następuje konwersja dwóch rybonukleo-
zydów pirymidynowych (urydyna i cytydyna)
i dwóch deoksyrybonukleozydów (tymidyna i de-
oksycytydyna) do odpowiednich nukleotydów.
Fosforylację difosforanów 2'-deoksycytydyny, 2'-
-deoksyguanozyny i 2'-deoksyadenozyny do od¬
powiednich trifosforanów nukleozydu katalizują
zależne od ATP fosfotransferazy (kinazy). Ponad¬
to, rybozylotransferaza orotanowa (reakcja (5),
ryc. 33-7) - enzym uczestniczący w biosyntezie
nukleotydów pirymidynowych, umożliwia rekcję
typu „salvage” kwasu orotowego, w wyniku któ¬
rej powstaje monofosforan orotydyny (OMP).
Metotreksat blokuje reakcje
dihydrofolianu
Reakcja 12 na rycinie 33-7 jest jedyną reakcją nu-
kleotydu pirymidynowego, która wymaga obec¬
ności pochodnej tetrahydrofolianu. Grupa me¬
tylenowa A5^V,0-metylenotetrahydrofolianu jest
Ryc. 33-6. Regulacja redukcji rybonukleotydów purynowych
i pirymidynowych do odpowiednich 2'-deoksyrybonukleotydów.
Linie ciągłe oznaczają ciąg reakcji chemicznych, a linie przery¬
wane - ujemne (©) lub dodatnie (©) sprzężenie zwrotne.
redukowana do metylowej, która jest przenoszo¬
na, a tetrahydrofolian jest utleniany do dihydro¬
folianu. Aby zaszła dalsza biosynteza, dihydro-
folian musi zostać zredukowany z powrotem do
tetrahydrofolianu w reakcji katalizowanej przez
reduktazę dihydrofolianową. W następstwie tego
dzielące się komórki, które są zmuszone genero¬
wać TMP i dihydrofolian, są bardzo wrażliwe na
inhibitory reduktazy dihydrofolianowej, takie jak
metotreksat - lek używany często w leczeniu no¬
wotworów.
Niektóre analogi pirymidyn
sa substratami enzymów biosyntezy
nukleotydu pirymidynowego
Fosforybozylotransferaza orotanowa (reakcja .5 ,
ryc. 33-7) katalizuje konwersję leku allopurinolu
[4-hydroksypirazolopirymidyna - przyp. tłum.]
(ryc. 32-12) do nukleotydu, w którym rybozylo-
fosforan jest dołączony do atomu N-l pierścienia
pirymidynowego allopurinolu. Przeciwnowotwo-
rowy lek 5-fluorouracyl (p. ryc. 32-12) także jest
fosforybozylowany przez fosforybozylotransfera-
zę orotanową.
368 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
CO 9 + Glutamina + ATP
©
SYNTAZA
KARBAMOILO-
-FOSFORANOWA
+H3N3 "O-C.
J2 +
O 1 /-V 1.
o-® +H3N'
Fosforan
karbamoilu
(CAP)
© ^
Kwas
asparaginowy
KARBAMOILO-
0
TRANSFERAZA
łl
DIHYDRO-
ASPARAGINIANOWA
"0 "Cv^
HoNq 4 5 ?H2
OROTAZA
Kwas karbamoilo-
asparaginowy
(CAA)
© 'Y
NAD+-
DEHYDROGENAZA
DIHYDROOROTANOWA
NADH + H+-
Kwas
dihydroorotowy
(DHOA)
©
O
R-5-®
UMP
PP, PRPP
DEKARBOKSYLAZA
O^^N^^COO'
FOSFORYBOZYLO-
OROTYDYNO-
R-5-®
TRANSFERAZA
-5-F0SF0RAN0WA
OROTANOWA
o
Kwas orotowy
(OA)
ATP
ADP
y
©
UDP
ATP
ADP
V
©
NADPH + H+ NADP+
V © J
REDUKTAZA
RYBONUKLEOTYDOWA
UTP
dUDP (difosforan deoksyurydyny)
dUMP
SYNTAZA
TYMIDYLANOWA
N5, A/0 -metylenotetrahydrofolian
- Dihydrofolian
O
dR-5-®
TMP
Ryc. 33-7. Szlak biosyntezy nukleotydów pirymidynowych.
33. METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCHI PIRYMIDYNOWYCH 369
REGULACJA BIOSYNTEZY NUKLEOTYDU
PIRYMIDYNOWEGO
Ekspresja genu i aktywność enzymu
sa regulowane
Aktywność pierwszych dwóch enzymów biosyn¬
tezy nukleotydu pirymidynowego jest regulowana
allosterycznie. Syntetaza II karbamoilofosforano-
wa (reakcja (T), ryc. 33-7) jest hamowana przez
UTP i nukleotydy purynowe, lecz aktywowana
przez PRPP. Transkarbamoilaza asparaginianowa
(reakcja (2), ryc. 33-7) jest hamowana przez CTP,
a aktywowana przez ATP. Z kolei pierwsze trzy
i ostatnie dwa enzymy szlaku biosyntezy są regu¬
lowane na poziomie genetycznym przez skoordy¬
nowaną represję i derepresję.
Biosyntezy nukleotydu
purynowego i pirymidynowego
są procesami regulowanymi
w sposób skoordynowany
Biosynteza pirymidyny biegnie równolegle, mol
do mola, z biosyntezą puryny, co sugeruje ist¬
nienie skoordynowane regulacji. Biosyntezę nu¬
kleotydu purynowego i pirymidynowego w wielu
miejscach charakteryzuje krzyżowa regulacja.
Reakcja katabolizowana przez syntazę PRPP
(reakcja (D, ryc. 33-2), w wyniku której powsta¬
je prekursor niezbędny dla obu procesów, jest
hamowana sprzężeniem zwrotnym przez nukleo¬
tydy purynowe i pirymidynowe, aktywowana zaś
przez PRPP.
ORGANIZM LUDZKI KATABOLIZUJE
PURYNY DO KWASU MOCZOWEGO
W organizmie człowieka odbywa się konwersja
adenozyny i guanozyny do kwasu moczowego
(ryc. 33-8).
Ryc. 33-8. Wytwarzanie kwasu moczowego z nukleozydów pu-
rynowych przez zasady purynowe - hipoksantynę, ksantynę
i guaninę. Deoksyrybonukleozydy purynowe są rozkładane w tym
samym szlaku metabolicznym i przez te same enzymy, które znaj¬
dują się w błonie śluzowej przewodu pokarmowego ssaków.
W
h2c
/°\
OH OH
Adenozyna
Ho0~
DEAMINAZA
ADENOZYNOWA
W
\|
H W
H] fu
OH OH
Inozyna
k
1 llx>
H H
H] p)
OH OH
Guanozyna
r
Rybozo-1-fosforan
i O T r x>
^N/^NH h2n^n^-nh
Hipoksantyna
h2o + 02
OKSYDAZA
KSANTYNOWA
NH m
Kwas moczowy
370 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Adenozyna najpierw ulega deaminacji do ino¬
zyny dzięki deaminazie adenozynowej. U ssaków,
oprócz wyższych naczelnych, enzym urykaza
rozkłada kwas moczowy do dobrze rozpuszczal¬
nej w wodzie alantoiny. Końcowym produktem
katabolizmu puryn u człowieka jest jednak kwas
moczowy, ponieważ u człowieka nie występuje
urykaza.
DNA MOCZANOWA JEST
METABOLICZNYM ZABURZENIEM
KATABOLIZMU PURYNOWEGO
Rozmaite defekty genetyczne syntazy PRPP
(reakcja CD, ryc. 33-2) objawiają się klinicznie
w postaci skazy (dny) moczanowej. Każdy z tych
defektów, np. większa wartość Vmax, zwiększone
powinowactwo do rybozo-5-fosforanu lub opor¬
ność na hamowanie przez sprzężenie zwrotne,
prowadzi do nadprodukcji i nadmiernego wyda¬
lania katabolitów puryn. Jeśli poziom moczanu
w surowicy przekroczy limit rozpuszczalności,
w tkankach miękkich i stawach dochodzi do kry¬
stalizacji moczanu sodu, prowadzącej do reakcji
zapalnej, zwanej dnawym zapaleniem stawów.
W większości jednak wypadków przyczyną ska¬
zy moczanowej są zaburzenia w usuwaniu kwasu
moczowego przez nerki.
INNE ZABURZENIA KATABOLIZMU
PURYNOWEGO
Stany niedoboru puryn występują u ludzi rzadko,
natomiast są znane liczne genetyczne zaburzenia
katabolizmu puryn. Hiperurykemię można różni¬
cować na podstawie badania, czy ilość wydalanych
przez chorego moczanów mieści się w granicach
normy, czy ją przekracza. Niektóre hiperurykemie
są przejawem swoistych defektów enzymatycz¬
nych, inne zaś są zjawiskiem wtórnym w takich
chorobach, jak rak lub łuszczyca, w których prze¬
miana tkankowa ulega zwiększeniu.
ZespólLescha-Nyhana
Zespół Lescha-Nyhana, polegający na hiper-
urykemii z często towarzyszącą kamicą mo¬
czanową i dziwacznym zespołem samookale-
czania, jest spowodowany brakiem aktywności
fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-
-guaninowej - enzymu występującego w reak¬
cjach rezerwowych puryn (ryc. 33-4). Towarzy¬
szące temu zwiększenie stężenia wewnątrzko¬
mórkowego PRPP, który nie jest zużywany w re¬
akcji rezerwowej puryn, powoduje nadmierne
wytwarzanie puryn. Mniej szkodliwe mutacje,
które ograniczają aktywność enzymatyczną lub
ją likwidują, są wynikiem delecji, mutacji ram¬
ki odczytu, zmiany zasad i błędnego składania
(ang. splicing) RNA.
Choroba von Gierkego
Nadmierne wytwarzanie puryn i hiperurykemia
w chorobie von Gierkego (niedobór glukozo-6-
-fosfatazy) występuje jako proces wtórny, wyni¬
kający ze wzmożonej generacji rybozo-5-fosfora¬
nu, prekursora PRPP. Dodatkowo towarzysząca
temu kwasica mleczanowa podnosi próg nerkowy
dla moczanów i następnie zwiększa całkowitą
pulę moczanów w organizmie.
Hipourykemia
Hipourykemia i zwiększone wydalanie hipo-
ksantyny i ksantyny towarzyszą niedoborowi ok¬
sydazy ksantynowej (p. ryc. 33-8), wywołanemu
albo defektem genetycznym, albo silnym uszko¬
dzeniem wątroby. W ciężkim zespole niedoboru
oksydazy ksantynowej u chorych może występo¬
wać ksantynuria i kamica ksantynowa.
Deficyt deaminazy adenozynowej
i fosforylazy nukleozydu
purynowego
Deficytowi deaminazy adenozynowej (p. ryc.
33-8) towarzyszy ciężki, złożony deficyt immu¬
nologiczny, w którym zarówno limfocyty po¬
chodzące z grasicy (komórki T), jak i limfocyty
pochodzące ze szpiku kostnego (komórki B) są
nieliczne i niefunkcjonalne. Deficytowi fosfory¬
lazy nukleozydu purynowego towarzyszy ci꿬
ki deficyt limfocytów pochodzących z grasicy,
z pozornie normalną funkcją komórek B. Dys¬
funkcja immunologiczna wydaje się pochodzić
z nagromadzenia dGTP i dATP, które allosterycz-
nie hamują reduktazę rybonukleotydową i przez
to pozbawiają komórki prekursorów DNA.
33. METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH 371
W WYNIKU KATABOLIZMU PIRYMIDYN
POWSTAJĄ METABOLITY
ROZPUSZCZALNE W WODZIE
W odróżnieniu od słabo rozpuszczalnych produk¬
tów katabolizmu puryn końcowe produkty kata¬
bolizmu pirymidyn, takie jak C02, NH3, p-alanina
i P-aminoizomaślan (ryc. 33-9), są dobrze roz¬
puszczalne w wodzie.
Wydalanie p-aminoizomaślanu zwiększa się
w białaczce i po silnej ekspozycji na promie¬
niowanie rentgenowskie wskutek wzmożonego
rozpadu DNA. Około 25% Chińczyków i Japoń¬
czyków stale wydala duże ilości p-aminoizoma-
ślanu. Podobnie jak zwierzęta, człowiek ma
prawdopodobnie zdolność transaminacji p-ami¬
noizomaślanu do semialdehydu metylomalono-
wego, który następnie tworzy sukcynylo-CoA
(p. ryc. 20-2).
Pseudourydyna jest wydalana w stanie
niezmienionym
Ponieważ żaden ludzki enzym nie katalizuje hy¬
drolizy lub fosforolizy pseudourydyny, ten nie¬
zwykły nukleozyd, występujący tylko w tRNA,
a pierwotnie wykryty w ludzkim moczu, jest wy¬
dalany w postaci niezmienionej z moczem zdro¬
wych osobników.
NADMIERNEMU WYWARZANIU
KATABOLITÓW PIRYMIDYNOWYCH
RZADKO TOWARZYSZA ZNACZĄCE
ANOMALIE KLINICZNE
Ponieważ końcowe produkty metabolizmu pirymi¬
dyn są dobrze rozpuszczalne w wodzie, nadmierne
wytwarzanie pirymidyn wywołuje tylko niewiele
widocznych klinicznie zaburzeń. W hiperurykemii
związanej ze znacznie zwiększonym wytwarzaniem
PRPP następuje nadmierne wytwarzanie nukleo-
tydów pirymidynowych i zwiększone wydalanie
p-alaniny. Ponieważ A5,A10-metylenotetrahydrofo-
lian jest potrzebny do biosyntezy tymidylanów,
toteż zaburzenia metabolizmu folianów i witaminy
B,2 prowadzą do niedoborów TMP.
NH2
X
N
H
Cytozyna
1/202 ^
H «
Dihydrouracyl Dihydrotymina
H20
r
h2o
h2n CHo
\ /CH,
H,N C 3
►h I
2* |
.C* /CH2
p-Ureidopropionian
(AMcarbamoilo-p-alanina)
H
p-Ureidoizomaślan
(Af-karbamoilo-
-P-aminoizomaślan)
h3n+—ch2 — ch2 — COO"
p- Alanina
H3N + — CH2 — CH — COO"
i
ch3
p-Aminoizomaślan
Ryc. 33-9. Katabolizm pirymidyn.
372 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Orotoacyduria
Orotoacyduria (acyduria orotowa), która towa¬
rzyszy zespołowi Reye’a, prawdopodobnie jest
zjawiskiem wtórnym i wynika z niezdolności sil¬
nie uszkodzonych mitochondriów do zużywania
karbamoilofosforanu, z którego zatem powstaje
w cytoplazmie w nadmiarze kwas orotowy. Przy¬
czyną orotoacydurii typu I jest deficyt zarówno
fosforybozylotransferazy orotanowej, jak i dekar-
boksylazy orotydyłanowej (reakcje ® i (6), ryc.
33-7); przyczyną rzadszej orotoacydurii typu II
- tylko deficyt dekarboksylazy orotydylanowej
(reakcja (6), ryc. 33-7).
Deficyt enzymów w cyklu
mocznikowym prowadzi
do wydalania prekursorów
pirymidynowych
Wzmożone wydalanie kwasu orotowego, uracylu
i urydyny towarzyszy niedoborowi wątrobowej
omitynotranskarbamoilazy mitochondrialnej (re¬
akcja ®, ryc. 28-9). Niewykorzystany do końca
substrat, karbamoilofosforan, pojawia się w cyto¬
plazmie, gdzie stymuluje biosyntezę nukleotydu
pirymidynowego. W wyniku tego po zjedzeniu
produktu o wysokiej zawartości azotu pojawia się
lekka orotoacyduria.
Leki mogą przyśpieszać orotoacydurie
Analog puryny - allopurinol (p. ryc. 35-12), sub¬
strat fosforybozylotransferazy orotanowej (reakcja
®, ryc. 33-7), współzawodniczy o fosforybozyla-
cję z naturalnym substratem - kwasem orotowym.
W dodatku powstający produkt nukleotydowy
hamuje dekarboksylazę orotydy łanową (reakcja
®, ryc. 33-7), powodując orotoacydurię i oro-
tidynurię. 6-Azaurydyna, ulegając konwersji do
6-azaurydylanu, kompetycyjnie hamuje dekarbo¬
ksylazę orotydylanu (reakcja ®, ryc. 33-7), co
znacznie zwiększa wydalanie kwasu orotowego
i orotydyny.
STRESZCZENIE
• Kwasy nukleinowe zawarte w pożywieniu są
rozkładane w przewodzie pokarmowym do
puryn i pirymidyn. Nowe puryny i pirymidy¬
ny tworzą się z amfibolicznych produktów po¬
średnich, nie są zatem niezbędne w pożywieniu
człowieka; deficyt puryn jest u ludzi zjawiskiem
rzadkim.
• Biosynteza macierzystego nukleotydu puryny
- monofosforanu inozyny (IMP) obejmuje dłu¬
gi ciąg reakcji, w których jest wymagany udział
pochodnych folianowych i glutaminy. Leki
przeciwfolianowe i analogi glutaminy hamują
zatem biosyntezę puryn.
• Utlenianie i aminacja IMP prowadzą do utwo¬
rzenia AMP i GMP, a następnie przeniesienie
reszt fosforanowych z ATP - do utworzenia
ADP i GDP. Dalsze przeniesienie reszt fosfora¬
nowych z ATP na GDP daje GTP. ADP ponow¬
nie ulega konwersji do ATP w szlaku fosforyla¬
cji oksydacyjnej. Redukcja NDP daje difosfora-
ny deoksyrybonukleotydu (dNDP).
• Biosynteza nukleotydów purynowych w wąt¬
robie jest precyzyjnie regulowana przez wiel¬
kość puli fosforybozylopirofosforanu (PRPP)
i przez sprzężenie zwrotne między glutamylo-
amidotransferazą PRPP oraz AMP i GMP.
• Skoordynowana regulacja biosyntezy nukleoty¬
dów purynowych i pirymidynowych zapewnia
ich stężenie w proporcjach odpowiednich do
biosyntezy kwasów nukleinowych i innych po¬
trzeb metabolicznych.
• Organizm ludzki katabolizuje puryny do kwasu
moczowego (pKa 5,8), który w zależności od pH
moczu występuje w postaci stosunkowo słabo
rozpuszczalnego kwasu (w niskim pH) lub jako
lepiej rozpuszczalna sól - moczan sodu (w pH
bliskim obojętnemu). Kryształki moczanów są
elementem diagnostycznym w dnie moczano¬
wej - zaburzeniu metabolicznym katabolizmu
puryn. Inne zaburzenia katabolizmu puryn
obejmują zespół Lescha-Nyhana, chorobę von
Gierkego i hipourykemię.
• Produkty katabolizmu pirymidyn są dobrze roz¬
puszczalne w wodzie, toteż nadmierne wytwa¬
rzanie katabolitów pirymidynowych nie wiąże
się z klinicznie ważnymi zaburzeniami. Wyda¬
lanie prekursorów pirymidyn może jednak na¬
stępować w wyniku niedoboru transkarbamoi-
lazy omitynowej, enzymu cyklu moczowego,
ponieważ nagromadzony karbamoilofosforan
staje się dostępny dla biosyntezy pirymidyn.
33. METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH 373
PIŚMIENNICTWO
Brooks EM et al: Molecular description of three macro-
deletions and an Alu-Alu recombination-mediated
duplication in the HPRT gene in four patients with
Lesch-Nyhan disease. Mutat Res 2001 ;476:43.
Chow EL et al: Reassessing Reye syndrome. Arch Pe-
diatr Adolesc Med 2003; 157:1241.
Christopherson R, Lyons SD, Wilson PK: Inhibitors
of de novo nucleotide biosynthesis as drugs. Acc
Chem Res 2002;35:961.
Curro R, Voit EO, Cascante M: Analysis of abnorma-
lities in purine metabolism leading to gout and to
neurological dysfunctions in man. Biochem J 1998;
329:477.
Kamal MA, Christopherson RI: Accumulation of 5-
-phosphoribosyl-l-pyrophosphate in human CCRF-
-CEM leukemia cells treated with antifolates. Int J
Biochem Celi Biol 2004;36:957.
Lipkowitz MS et al: Functional reconstitution, membra¬
nę targeting, genomie structure, and chromosomal
localization of a human urate transporter. J Clin In-
vest 2001; 107:1103.
Martinez J et al: Human genetic disorders, a phylogene-
tic perspective. J Mol Biol 2001 ;308:587.
Moyer RA, John DS: Acute gout precipitated by total
parenteral nutrition. J Rheumatol 2003;30:849.
Neychev VK, Mitev VI: The biochemical basis of the
neurobehavioral abnormalities in the Lesch-Ny¬
han syndrome: a hypothesis. Med Hypotheses
2004;63:131.
Olsen DB et al: A 7-deaza-adenosine analog is a potent
and selective inhibitor of hepatitis C virus replica-
tion with excellent pharmacokinetic properties. An-
timicrob Agents Chemother 2004;48:3944.
Scriver CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Jnheńted Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001.
Wu VC et al: Renal hypouricemia is an ominous sign
in patients with severe acute respiratory syndrome.
Am J Kidney Dis 2005;45:88.
Struktura i funkcja kwasów
nukleinowych
P. Anthony Weil, PhD; Daryl K. Granner, MD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Odkrycie, że informacja genetyczna jest za¬
kodowana wzdłuż cząsteczki polimeru, złożonej
z czterech rodzajów jednostek monomery cz-
nych, jest wielkim osiągnięciem naukowym
ubiegłego stulecia. Ta polimeryczna cząstecz¬
ka - kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) jest
chemiczną podstawą dziedziczności. Składa
się ona z genów - podstawowych jednostek in¬
formacji genetycznej. Geny kontrolują syntezę
różnych typów RNA, większość z nich bierze
udział w biosyntezie białek. Geny nie działają
autonomicznie; ich replikacja i funkcja są kon¬
trolowane przez różnorodne produkty genowe,
często przy współudziale składników różnych
szlaków transdukcji sygnałów. Wiedza o struk¬
turze i funkcji kwasów nukleinowych jest pod¬
stawą zrozumienia genetyki i wielu aspektów
patofizjologii, a także poznania genetycznego
podłoża różnych chorób.
DNA ZAWIERA INFORMACJĘ
GENETYCZNA
Dowód na to, że DNA zawiera informację gene¬
tyczną, jako pierwsi wykazali w 1944 r. w serii do¬
świadczeń Avery, MacLeod i McCarty. Zaobser¬
wowali oni, że genetyczna determinacja otoczki
swoistych pneumokoków może być przeniesiona
do innych pneumokoków o wyraźnie odmiennym
typie otoczki przez wprowadzenie oczyszczonego
DNA. Autorzy ci określili czynnik, który doko¬
nuje tej zmiany, jako „czynnik transformujący”
(później wykazano, że był to DNA). W później¬
szym okresie ten typ manipulacji genetycznej
stał się powszechny. Podobne doświadczenia
wykonano ostatnio, używając drożdży, hodowli
komórek ssaków i zarodków owadów oraz gry¬
zoni jako biorców, a klonowanego DNA - jako
dawcy informacji genetycznej.
DNA składa się z czterech
deoksynukleotydów
Chemiczną naturę jednostek deoksynukleo-
tydowych DNA-deoksyadeny łanu, deoksygua-
nylanu, deoksycytydylanu i tymidylanu - opi¬
sano w rozdz. 32. Te monomeryczne jednostki
DNA są utrzymywane w postaci polimeru przez
mostki 3',5'-fosfodiestrowe, dzięki czemu two¬
rzą pojedyncze pasmo (nić), przedstawione na
ryc. 34-1.
Treścią informacji DNA (kodem genetycz¬
nym) jest sekwencja, w jakiej te monomery - de-
oksyrybonukleotydy purynowe i pirymidynowe
- są uporządkowane. Cząsteczka polimeru DNA,
jak wspomniano, jest polarna; na jednym końcu
ma grupę 5'-hydroksylową lub fosforanową, a na
drugim - grupę 3'-fosforanową lub hydroksylo¬
wą. Znaczenie tej polamości zostanie wyjaśnione
w dalszej części rozdziału. Ponieważ informacja
genetyczna jest zawarta w kolejno ułożonych
jednostkach monomerycznych cząsteczki poli¬
meru, musi istnieć mechanizm reprodukowania
lub replikowania tej swoistej informacji, o bar¬
dzo dużym stopniu wierności. Wymóg ten, razem
z danymi uzyskanymi w badaniach dyfrakcji
promieni rentgenowskich przez cząsteczkę DNA,
a także spostrzeżenia Chargaffa, że w cząstecz¬
kach DNA stężenie nukleotydów deoksyadeno-
zynowych (A) jest równe stężeniu nukleotydów
tymidynowych (T) (A = T), a stężenie nukleo¬
tydów deoksyguanozynowych (G) jest równe
34. STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 375
o
Ryc. 34-1. Segment jednej nici cząsteczki DNA, w której zasady purynowe i pirymidynowe: adenina (A), tymina (T), cytozyna (C)
i guanina (G) są połączone przez fosfodiestrowe wiązania (szkielet) między resztami 2'-deoksyrybozylowymi, związanymi z zasa¬
dami wiązaniem /V-glikozydowym. Warto zauważyć, że szkielet wiązań fosfodiestrowych wykazuje polarność (tj. ukierunkowanie).
Polarność jest zwykle podawana w orientacji 5-3' (tzn. pGpCpTpA, gdzie: G, C, T i A symbolizują cztery zasady, a (P) - wiążące je
reszty fosforanowe).
stężeniu nukleotydów deoksycytydynowych (C)
(G = C), pozwoliły zaproponować we wczesnych
latach pięćdziesiątych ubiegłego stulecia model
dwuniciowej cząsteczki DNA. Propozycję taką
przedstawili Watson, Crick i Wilkins. Model ten
przedstawiono na ryc. 34-2. Obie nici prawo-
skrętnej, dwuniciowej cząsteczki są utrzymane
przez wiązania wodorowe między zasadami
purynowymi i pirymidynowymi odpowiada¬
jących sobie cząsteczek liniowych oraz przez
oddziaływania van der Waalsa i hydrofobowe
między sąsiadującymi parami zasad. Wytwo¬
rzenie par między nukleotydami purynowymi
i pirymidynowymi na przeciwległych niciach jest
bardzo swoiste i zależy od wiązań wodorowych
między A i T oraz między G i C (ryc. 34-2).
Ta powszechna forma DNA jest nazywana
formą prawoskrętną, ponieważ patrząc wzdłuż
podwójnej helisy widać, że reszty zasad tworzą
spiralę skręconą zgodnie z ruchem wskazówek
zegara (w prawo). W dwuniciowej cząsteczce
ograniczenia wynikające z rotacji wokół wiązania
fosfodiestrowego, uprzywilejowania konfiguracji
anty wiązania glikozydowego (p. ryc. 32-5) oraz
dominacji tautomerów (p. ryc. 32-2) czterech
zasad (A, G, T i C) pozwalają na sparowanie A
wyłącznie z T, a G wyłącznie z C, jak to przedsta¬
wiono na ryc. 34-3.
Takie ograniczenie w parowaniu zasad wyjaś¬
nia wcześniejszą obserwację, że w dwuniciowej
cząsteczce DNA liczba cząsteczek A jest równa
liczbie T, a liczba G równa liczbie C. Dwa pas¬
ma w dwuniciowej cząsteczce, każde polarne,
są przeciwległe; jedno pasmo biegnie w kie¬
runku od 5' do 3', a drugie w kierunku od 3' do
5'. Można to porównać do dwóch równoległych
376 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Ryc. 34-2. Schemat modelu Watsona-Cricka dwuniciowej struk¬
tury formy B DNA. Strzałka pozioma pokazuje szerokość (śred¬
nicę) podwójnej helisy (2,0 nm), a strzałka pionowa - długość
jednego pełnego zwoju helisy (3,4 nm). Na jeden zwój B-DNA
przypada 10 par zasad (pz), a więc 0,34 nm na jedną parę. Cen¬
tralna oś podwójnej helisy jest pokazana jako pionowa linia. Krót¬
kie strzałki wskazują polarność przeciwległych nici (A - adenina;
C - cytozyna; G - guanina; T - tymina; P - fosforan; S - cukier
[deoksyryboza]). Wiązania wodorowe między zasadami A i T
oraz G i C są zaznaczone jako krótkie kolorowe linie poziome.
ulic, z których każda jest jednokierunkowa, ale
ruch na nich biegnie w odwrotnych kierunkach.
W cząsteczkach DNA informacja genetyczna
mieści się w sekwencji nukleotydów jednej nici,
nazywanej nicią matrycową (niekodującą), ko¬
piowaną w czasie syntezy RNA; przeciwległa do
niej nić jest nicią kodującą, ponieważ odpowiada
ona sekwencji transkryptu RNA (z tym że zawiera
uracyl zamiast tyminy, p. ryc. 34-8), który z kolei
koduje białko.
Dwie nici, w których naprzeciwległe zasa¬
dy łączą się wiązaniami wodorowymi, oplata¬
ją podwójną helisą oś centralną. Dwuniciowy
DNA istnieje przynajmniej w sześciu formach
(A-E i Z). Forma B (B-DNA) zwykle występuje
w warunkach fizjologicznych (małe stężenie soli,
duży stopień uwodnienia). Pojedynczy skręt for¬
my B DNA wokół osi cząsteczki zawiera 10 par
zasad. Długość jednego skrętu formy B DNA wy¬
nosi 3,4 nm. Szerokość (średnica helisy) formy B
dwuniciowego DNA wynosi 2 nm.
Na rycinie 34-3 przedstawiono, jak trzy wiąza¬
nia wodorowe utrzymują nukleotyd deoksygua-
nozynowy z nukleotydem deoksycytydynowym,
podczas gdy druga para, A-T, jest połączona
dwoma wiązaniami wodorowymi. Wiązanie G-C
jest więc mocniejsze o ok. 50%. Regiony DNA
o dużej liczbie wiązań G-C są bardziej odpor¬
ne na denaturację, czyli „topnienie”, niż regiony
o dużej liczbie wiązań A-T.
Denaturacja (topnienie) DNA jest
wykorzystywana do analizy jego struktury
Dwuniciowa struktura DNA może zostać rozdzie¬
lona w roztworze w podwyższonej temperaturze
lub przy zmniejszonym stężeniu soli. W procesie
tym nie tylko dwie nici zasad odrywają się od
siebie, lecz także same zasady zmieniają wzajem¬
ne położenie, będąc stale jeszcze związane, jako
H
Ryc. 34-3. Wzajemne parowanie między deoksyadenozyną i ty¬
midyną obejmuje wytworzenie dwóch wiązań wodorowych. Trzy
takie wiązania tworzą się między deoksycytydyną i deoksyguano-
zyną. Linie przerywane symbolizują wiązania wodorowe.
34. STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 377
polimer, szkieletem wiązań fosfodiestrowych.
Takiej denaturacji cząsteczki DNA towarzyszy
wzrost absorbancji zasad purynowych i pirymidy¬
nowych; zjawisko to określa się jako efekt hiper-
chromowy denaturacji. Dwuniciowa cząsteczka
DNA, dzięki efektowi typu „stacking” (oddzia¬
ływania między sąsiadującymi parami zasad) i
dzięki wiązaniom wodorowym między zasadami,
tworzy sztywne twory pałeczko we; w roztworze
ma dużą lepkość, która zmniejsza się wskutek de¬
naturacji.
Podczas denaturacji nici danej cząsteczki DNA
oddzielają się od siebie w pewnym zakresie tem¬
peratury. Punkt środkowy tego zakresu nazywa
się temperaturą topnienia (Tm). Wartość Tm
zależy od składu zasad DNA i od stężenia soli
w roztworze. Cząsteczki DNA o dużej liczbie par
G-C, które mają trzy wiązania wodorowe, topią
się w wyższej temperaturze niż cząsteczki DNA
o dużej liczbie par A-T, które mają dwa wiąza¬
nia wodorowe. Dziesięciokrotne zwiększenie
stężenia jednowartościowych kationów powodu¬
je zwiększenie wartości Tm o 16,6°C. Formamid,
który jest często używany w doświadczeniach
z rekombinowanym DNA, destabilizuje wiązania
wodorowe między zasadami i przez to zmniejsza
wartość Tm. Pozwala to na oddzielenie nici DNA
albo hybryd DNA-RNA w znacznie niższej tem¬
peraturze i minimalizuje pęknięcia nici, które na-
stępują w wysokich temperaturach.
Renaturacja DNA wymaga
dopasowania par zasad
Oddzielone nici DNA ulegają renaturacji albo też
reasocjują, jeśli zostaną osiągnięte właściwe wa¬
runki fizjologicznej temperatury i stężenia soli.
Zjawisko to nosi nazwę hybrydyzacji. Szybkość
reasocjacji zależy od stężenia komplementarnych
nici. Reasocjacja dwóch komplementarnych nici
DNA chromosomu po replikacji DNA jest fi¬
zjologicznym przykładem zjawiska renaturacji
(patrz niżej). W danej temperaturze i przy danym
stężeniu soli konkretna nić kwasu nukleinowego
będzie ulegać asocjacji wyłącznie z nicią komple¬
mentarną. W odpowiednich warunkach będą tak¬
że powstawać cząsteczki hybrydowe. Na przykład
DNA utworzy hybrydę z komplementarnym DNA
(cDNA) lub z pokrewnym RNA informacyjnym
(mRNA; patrz niżej). Kombinacja technik elek¬
troforezy żelowej, umożliwiających oddzielanie
hybrydowych cząsteczek różniących się wielkoś¬
cią, z radioaktywnymi lub fluorescencyjnymi me¬
todami znakowania cząsteczek, pozwalającymi
z kolei otrzymać wykrywalny sygnał, leży u pod¬
staw technik Southern (DNA/cDNA) oraz Nort¬
hern (RNA/DNA) blotting. Tego rodzaju proce¬
dury umożliwiają niezwykle specyficzną i bardzo
czułą identyfikację hybryd w mieszaninach DNA
lub RNA (p. rozdz. 39).
Cząsteczką DNA ma rowki
Szczegółowe badanie modelu cząsteczki DNA,
przedstawionego na ryc. 34-2, ujawnia rowek
większy i rowek mniejszy, które przebiegają
wzdłuż cząsteczki równolegle do szkieletu fosfo-
diestrowego. Białka mogą swoiście oddziaływać
w obrębie tych rowków z eksponowanymi atoma¬
mi nukleotydów (zwykle poprzez wiązania wodo¬
rowe) i dzięki temu rozpoznawać swoiste sekwen¬
cje nukleotydowe oraz wiązać się z nimi, bez roz¬
rywania sparowanych zasad w dwuniciowej czą¬
steczce DNA. Jak to omówiono w rozdz. 36 i 38,
dzięki takim oddziaływaniom białka regulatorowe
mogą kontrolować ekspresję swoistych genów.
DNA istnieje w postaciach
zrelaksowanej i silnie skręconej
W niektórych organizmach, takich jak bakterie,
bakteriofagi i wielu wirusach zwierzęcych za¬
wierających DNA, oraz organellach, takich jak
mitochondria (p. ryc. 35-8), końce cząsteczek
DNA wiążą się, tworząc zamkniętą (nieposiada-
jącą końca) kolistą cząsteczkę. To oczywiście nie
zaburza polamości cząsteczek, eliminuje jednak
wolne grupy hydroksylowe i fosforylowe w po¬
łożeniach 3' i 5'. Zamknięte cząsteczki koliste
istnieją w postaci zrelaksowanej (rozluźnionej)
i w postaci bardzo skręconej. Nadmierne skręce¬
nia występują wówczas, gdy zamknięta, kolista
cząsteczka jest skręcona wokół własnej osi lub
też gdy ulega skręceniu liniowa cząsteczka dwu-
niciowego DNA, której końce są zakotwiczone.
Proces ten, wymagający energii, powoduje wy¬
stąpienie napięć w cząsteczce; im większa liczba
„superskrętów”, tym większe napięcie, czyli tor-
sja (przetestuj to na gumowej taśmie). Ujemne
superzwoje tworzą się wówczas, gdy cząsteczka
378 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
prawoskrętnej, dwuniciowej helisy, występująca
w B-DNA, jest skręcona w kierunku przeciw¬
nym do ruchu wskazówek zegara. Taki DNA
nazywa się DNA rozwiniętym. Energia potrzeb¬
na do uzyskania tego stanu jest w pewnym sen¬
sie zmagazynowana w superskrętach. Przejście
zatem do innej postaci, które wymaga energii,
jest ułatwione przez rozkręcenie. Jednym z ta¬
kich przejść jest oddzielenie nici, co jest nie¬
zbędne do replikacji DNA i transkrypcji. DNA
w postaci superskrętów jest zatem preferowaną
postacią w układach biologicznych. Enzymy,
które katalizują topologiczne zmiany DNA, są
nazywane topoizomerazami. Topoizomerazy
mogą wprowadzać rozluźnienie albo superskręty
w cząsteczce DNA. Najlepiej scharakteryzowa¬
ną topoizomerazą jest giraza bakteryjna, która
wprowadza ujemne superskręty w DNA, czer¬
piąc energię z ATP. Homologi tego enzymu wy¬
stępują we wszystkich organizmach i są ważnym
celem chemioterapii nowotworów.
DNA SŁUŻY JAKO MATRYCA
DO REPLIKACJI I TRANSKRYPCJI
Informacja genetyczna zmagazynowana w sek¬
wencji nukleotydowej DNA służy dwóm celom:
jest ona źródłem informacji dla syntezy wszyst¬
kich cząsteczek białkowych komórki i organizmu
oraz dostarcza informacji dziedziczonej przez
komórki potomne i potomstwo. Warunkiem speł¬
niania obu funkcji jest występowanie DNA w roli
matrycy - w pierwszym przypadku do transkryp¬
cji informacji na RN A, a w drugim do replikacji
informacji dla dwóch siostrzanych cząsteczek
DNA.
Komplementamość dwuniciowego modelu
DNA Watsona i Cricka wyraźnie wskazuje, że
replikacja DNA zachodzi w sposób półkonser-
watywny. Gdy obie nici macierzystej, dwuni¬
ciowej cząsteczki DNA oddzielają się w czasie
replikacji od siebie, wówczas każda z nich służy
jako matryca, na której syntetyzuje się nowa nić
komplementarna (ryc. 34-4). Dwie wytworzo¬
ne na nowo siostrzane, dwuniciowe cząsteczki
DNA, każda zawierająca jedną nić (komplemen¬
tarną, a nie identyczną) z macierzystej dwuni¬
ciowej cząsteczki DNA, są następnie sortowane
między dwie komórki potomne (ryc. 34-5). Każda
STARE STARE
5’ 3'
Ryc. 34-4. Dwuniciowa struktura DNA i funkcja matrycowa każ¬
dej starej nici, na której jest syntetyzowane nowe komplementar¬
ne pasmo (zaciemnione).
z komórek potomnych zawiera cząsteczki DNA
z informacją identyczną z tą, jaką miała cząs¬
teczka macierzysta.
RNA RÓŻNI SIĘ OD DNA POD WZGLĘDEM
WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNYCH
Kwas rybonukleinowy (RNA) jest polimerem
złożonym z rybonukleotydów purynowych i pi¬
rymidynowych, połączonych wiązaniami 3',5'-fo-
sfodiestrowymi, takimi jakie występują w DNA
(ryc. 34-6). RNA, chociaż ma wiele wspólnych
cech z DNA, wykazuje też swoiste różnice:
34. STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 379
Oryginalna
cząsteczka macierzysta
Pierwsze pokolenie
cząsteczek siostrzanych
Drugie pokolenie
cząsteczek siostrzanych
Ryc. 34-5. Replikacja DNA jest półkonserwatywna. W czasie cy¬
klu replikacji każda z dwóch nici DNA służy jako matryca nowego,
komplementarnego pasma.
1. W RN A cząsteczką cukru, z którą są związane
fosforany oraz zasady purynowe i pirymidynowe,
jest ryboza, a nie 2-deoksyryboza jak w DNA.
2. Składniki pirymidynowe w RNA różnią się
od tych, które występują w DNA. RNA zawiera
rybonukleotydy adeniny, guaniny i cytozyny, lecz
nie zawiera tyminy, z wyjątkiem rzadkiego przy¬
padku wymienionego poniżej. Zamiast tyminy
RNA zawiera rybonukleotyd uracylu.
3. RNA występuje jako pojedyncza nić, na¬
tomiast DNA - jako dwuniciowa helikalna czą¬
steczka. W pewnych jednak sekwencjach, zawie¬
rających komplementarne zasady o odwrotnej
polamości, pojedyncza nić RNA, jak to przed¬
stawiono na ryc. 34-7, jest zdolna do zawinięcia
się na sobie samej, upodabniając się do spinki do
włosów oraz zyskując w ten sposób cechy struk¬
tury dwuniciowej.
4. Ponieważ cząsteczka RNA jest pojedynczą
nicią komplementarną tylko do jednej z dwóch
nici genu, ilość guaniny nie musi się równać ilości
cytozyny, ani ilość adeniny nie musi się równać
ilości uracylu.
5. RNA może być hydrolizowany w środo¬
wisku zasadowym do cyklicznych 2',3'-diestrów
mononukleotydów - związków, które nie po¬
wstają w wyniku działania na DNA alkaliami,
ponieważ DNA nie ma grup 2'-hydroksylowych.
Labilność RNA w stosunku do środowiska zasa¬
dowego jest użyteczna zarówno w diagnostyce,
jak i w analizie.
Informacja w pojedynczej nici RNA jest za¬
warta w sekwencji nukleotydów purynowych
i pirymidynowych („struktura pierwszorzędo-
wa”) w obrębie tego polimeru. Sekwencja ta jest
komplementarna do matrycowej nici DNA genu,
z którego była przepisana. Ze względu na tę kom-
plementamość, cząsteczka RNA może się swoi¬
ście wiązać według reguły parowania zasad do jej
matrycowej nici DNA; nie będzie się ona wiązała
(„hybrydyzowała”) z drugą (kodującą) nicią DNA
tego genu. Sekwencja cząsteczki RNA (z wyjąt¬
kiem U, które zastępuje T) jest taka sama jak ko¬
dującej nici genu (ryc. 34-8).
Prawie wszystkie rodzaje RNA sa w jakiś
sposób związane z synteza białka
Cząsteczki cytoplazmatycznego RNA, które słu¬
żą jako matryce do biosyntezy białek (tj. te, które
przenoszą informacje z DNA do ośrodków syn¬
tetyzujących białko) są nazwane informacyjnym
RNA lub krótko mRNA (ang. messenger RNA).
Wiele innych cząsteczek cytoplazmatycznego
RNA (rybosomalny RNA; rRNA) odgrywa¬
ją rolę strukturalną, tj. biorą udział w tworzeniu
rybosomów (system organelli do syntezy białek)
albo służą jako cząsteczki łącznikowe (transfero¬
wy, lub transportujący, RNA; tRNA) do translacji
informacyjnego RNA na swoistą sekwencję spoli-
meryzowanych aminokwasów.
Niektóre cząsteczki RNA mają wewnętrzną
aktywność katalityczną. Aktywność tych tzw.
rybozymów często wiąże się z cięciem kwasu
nukleinowego. Jako przykład może służyć dzia¬
łanie RNA w katalizie procesu składania pierwot¬
nego transkryptu genu w „dojrzały” informacyjny
RNA.
380 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Ryc. 34-6. Segment cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA), w której zasady purynowe i pirymidynowe - adenina (A), uracyl |
(U), cytozyna (C) i guanina (G) są utrzymywane razem przez wiązania fosfodiestrowe między resztami rybozylowymi związanymi
z zasadami wiązaniami A/-g I i kozy d owym i. Warto zauważyć, że polimer wykazuje polarność oznaczoną przez reszty fosforanowe
związane w pozycji 3' i 5'.
Znaczna część RNA, syntetyzowanego na ma¬
trycy DNA w komórkach eukariotycznych, w tym
również w komórkach ssaków, jest degradowana
w obrębie jądra i nigdy nie służy jako jednostka
strukturalna lub informacyjna w cytoplazmie ko¬
mórkowej.
We wszystkich komórkach eukariotycznych
występują małocząsteczkowe jądrowe RNA
(ang. smali nuclear RNA, snRNA), które nie są
bezpośrednio związane z procesem biosyntezy
białek, odgrywają jednak rolę w przekształcaniu
(ang. processing) RNA i budowie komórki. Te
stosunkowo małe cząsteczki zawierają 90-300
nukleotydów (tab. 34-1).
Materiałem genetycznym niektórych wirusów
zwierzęcych i roślinnych jest RNA, a nie DNA.
Choć RNA niektórych wirusów nigdy nie przepi¬
suje swojej informacji na cząsteczki DNA, to jed¬
nak wiele RNA wirusów zwierzęcych - zwłasz-
Tabela 34-1. Niektóre rodzaje malocząsteczkowych, trwałych
RNA, występujących w komórkach ssaków
Nazwa
Długość
(liczba
nukleotydów)
Liczba
cząsteczek
w komórce
Umiejscowienie
U1
165
1 x 106
Nukleoplazma/
hnRNA
U2
188
5 x 105
Nukleoplazma
U3
216
3 x 105
Jąderko
U4
139
1 x 105
Nukleoplazma
U5
118
2 x 105
Nukleoplazma
U6
106
3 x 105
Ziarnistości
perichromatyczne
4,5S
95
3 x 105
Jądro i cytoplazma
7SK
280
5 x 105
Jądro i cytoplazma
34. STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 381
Ryc. 34-7. Schemat drugorzędowej struktury cząsteczki jedno-
niciowego RNA, w której wytworzyła się todyżka i pętla (struktu¬
ra spinki do włosów) wskutek wewnątrzcząsteczkowego paro¬
wania zasad (kolorowe poziome linie między zasadami). Należy
zauważyć, że w mRNA wiązania wodorowe tworzy A z U.
cza retrowirusów (np. wirusa HIV) - jest prze¬
pisywanych przez zależną od RNA polimerazę
DNA, tj. tzw. odwrotną transkryptazę, na DNA;
w wyniku tego powstaje dwuniciowa kopia DNA
genomu RNA. W wielu przypadkach powstający
przepisany dwuniciowy DNA jest wbudowywany
w genom gospodarza i następnie służy jako ma¬
tryca do ekspresji genów, z której także mogą być
przepisane genomy RNA wirusów.
RNA tworzy kilka unikatowych struktur
We wszystkich organizmach prokariotycznych
i eukariotycznych występują trzy główne klasy
RNA: informacyjny RNA (mRNA), transferowy
RNA (tRNA) i rybosomalny RNA (rRNA). Każdy
z tych RNA różni się od innych wielkością, funk¬
cją i ogólną stabilnością.
A. Informacyjny RNA (mRNA)
Ta klasa RNA jest najbardziej niejednorodna
pod względem rozmiaru i stabilności. Wszystkie
cząsteczki tej klasy funkcjonują jako przenośni¬
ki informacji z genu do ośrodków syntezujących
białko. Każda z nich służy jako matryca, na której
polimeryzują aminokwasy w swoistej sekwencji,
tworząc swoistą cząsteczkę białkową jako końco¬
wy produkt genu (ryc. 34-9).
Informacyjny RNA, zwłaszcza u eukariotów,
ma wyjątkowe właściwości chemiczne. Do koń¬
ca 5' cząsteczki mRNA jest dołączona „czapecz¬
ka” („kapturek”, ang. cap), złożona z trifosforanu
7-metyloguanozyny, który jest przyłączony do
przyległego do jego grupy 5'-hydroksylowej T-0-
-metylorybonukleozydu za pośrednictwem trzech
reszt fosforanowych (ryc. 34-10).
Cząsteczki mRNA często zawierają we¬
wnętrzne 6-metyloadenylany i inne metylowane
nukleotydy 2'-0-rybozy. „Czapeczka” odgrywa
rolę w rozpoznawaniu mRNA przez mechanizm
translacyjny, a prawdopodobnie także pomaga
w stabilizowaniu mRNA poprzez zablokowanie
ataku 5'-egzonukleaz. „Maszyneria” syntetyzu¬
jąca białko rozpoczyna translację mRNA od
końca 5', czyli od końca otulonego „czapeczką”
metylowanych nukleotydów. Do drugiego końca
większości mRNA, czyli końca 3'-hydroksylowe-
Nici DNA:
Kodująca ^ 5' -T G 6 A A T T G T G A G C G G A T A A C A A T T T C A C A C A G G A A A C A G C T A T G A C C A T G - 3'
Matrycowa— 3' —A CCTTAACACTCGCCTA TTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCGATACTGGTAC — 5'
Transkrypt
RNA
5'pAUUGUGAGCGGAUAACAAUUUCACACAGGAAACAGCUAUGACCAUG 3'
Ryc. 34-8. Współzależności między sekwencjami transkryptu RNA i jego genu, w którym pokazano nici kodujące i niekodujące
(matrycowe) oraz ich polarność. Transkrypt RNA o polarności od 5' do 3' jest komplementarny do nici matrycowej o polarności
od 3' do 5'. Należy zauważyć, że sekwencja w transkrypcje RNA i jego polarność jest taka sama jak nici kodującej, z wyjątkiem U
w transkrypcje zastępującym T w genie.
382 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
DNA
mRNA
5'
3'
5'
5'
Rybosom
Ukończona
cząsteczka
białka
Ryc. 34-9. Ekspresja informacji gene¬
tycznej DNA w formie transkryptu mRNA.
Ten ostatni zostaje następnie przepisany
(translacja) przez rybosomy na cząstecz¬
kę swoistego białka.
go jest dołączony polimer zbudowany z 200-250
nukleotydów adenylowych. Swoista funkcja tego
„ogona” poli(A) na 3'-hydroksylowym końcu
cząsteczek mRNA nie jest w pełni poznana, ale
wydaje się, że utrzymuje on stabilność swoistych
mRNA wewnątrz komórki, chroniąc je przed ata¬
kiem 3'-egzonukleaz. Niektóre cząsteczki mRNA,
w tym mRNA niektórych histonów, nie zawierają
poli(A). Ogon poli(A) może tworzyć wiązania, na
zasadzie parowania zasad, z polimerami oligode-
oksytymidyny, związanej ze stałym podłożem, np.
celulozą. Dzięki temu może on być wykorzystany
do oddzielenia cząsteczek mRNA od innych ro¬
dzajów RN A, w tym również cząsteczek mRNA
pozbawionych ogona. Zarówno czapeczka, jak
i ogon mRNA są po transkrypcji dodawane przez
enzymy działające bez pośrednictwa matrycy.
Cząsteczki mRNA cytoplazmy komórek ssa¬
ków, w tym komórek ludzkich, nie są bezpo¬
średnio syntetyzowane na matrycy DNA, lecz
tworzą się w wyniku przekształceń prekursoro-
wej cząsteczki przed wejściem do cytoplazmy.
W jądrach komórek ssaków bezpośrednie pro¬
dukty transkrypcji genów stanowią więc czwartą
klasę cząsteczek RNA. Jądrowe cząsteczki RNA
są bardzo niejednorodne (heterogeniczne) pod
względem wielkości, a przy tym są dość duże.
Cząsteczki jądrowego heterogennego RNA
(hnRNA) mają masę cząsteczkową większą niż
107, natomiast masa cząsteczkowa mRNA jest na
ogół mniejsza niż 2 x 106. Jak to przedstawiono
w rozdz. 36, cząsteczki hnRNA ulegają prze¬
mianie do cząsteczek mRNA, które następnie
wnikają do cytoplazmy i służą jako matryce do
syntezy białek.
B. RNA TRANSFEROWY (tRNA)
Cząsteczki tRNA składają się z 74-95 nukleoty¬
dów. Tworzą się one w jądrze z cząsteczki prekurso-
rowej w wyniku różnych procesów (p. rozdz. 36).
tRNA służąjako cząsteczki łącznikowe w procesie
translacji informacji zawartej w sekwencji nukleo¬
tydów mRNA na swoiste aminokwasy w białku.
W każdej komórce występuje przynajmniej 20 ro¬
dzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej jeden
(a często kilka) odpowiada każdemu z 20 amino¬
kwasów potrzebnych do biosyntezy białka. Cho¬
ciaż każda swoista cząsteczka tRNA różni się od
innych sekwencją nukleotydową to jednak czą¬
steczki tRNA, jako klasa, mają wiele cech wspól¬
nych. Struktura pierwszorzędowa, tj. sekwencja
nukleotydową, wszystkich cząsteczek tRNA po¬
zwala na ich sfałdowanie, a wewnątrzcząsteczko-
wa komplementamość zasad umożliwia utworze¬
nie drugorzędowej struktury, która jest podobna do
liścia koniczyny (ryc. 34-11).
Wszystkie cząsteczki tRNA zawierają cztery
główne ramiona. Ramię akceptorowe składa się
z łodyżki utworzonej ze sparowanych zasad, która
kończy się sekwencją CpCpA0H. Te trzy nukleoty-
dy są dodawane po transkrypcji przez specyficzny
enzym - transferazę nukleotydylową. Aminokwasy
wiążą się wiązaniem estrowym do grupy 3'-hy¬
droksylowej reszty adenozylowej ramienia akcep¬
torowego dzięki swoim grupom karboksylowym
(p. ryc. 37-1). Ramiona D, T\|/C i ramiona do¬
datkowe wyznaczają specyficzność tRNA. Proka-
riotyczne tRNA są trwałe, natomiast ich odpowied¬
niki eukariotyczne - nieco mniej. Odwrotnie jest
z mRNA, który jest nietrwały u prokariotów, ale na
ogół trwały w organizmach eukariotycznych.
34. STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 383
Ryc. 34-10. Struktura „czapeczki" dołączonej do końca 5' większości cząsteczek eukariotycznego informacyjnego RNA. Trifosforan
7-metyloguanozyny (czarny) jest związany z końcem 5' mRNA (pokazany w kolorze), który zwykle zawiera również nukleotyd purynowy
zmetylowany w pozycji 2 rybozy (nukleotyd 2'-0-metylopuryny). Modyfikacje takie (czapeczka i metylacja) dokonują się po przepisaniu
DNA na mRNA.
C. Rybosomalny RNA (rRNA)
Rybosom jest cytoplazmatyczną strukturą nukleo-
proteinową, która bierze udział w mechanizmie syn¬
tezy białek na matrycach mRNA. Podczas translacji
na rybosomach cząsteczki mRNA i tRNA współ¬
działają ze sobą, umożliwiając syntezę swoistych
cząsteczek białka na podstawie informacji przepi¬
sanej uprzednio z genu. W trakcie syntezy białka
z cząsteczką mRNA oddziałuje wiele rybosomów, co
powoduje tworzenie struktur zwanych polisomami.
384 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Ryc. 34-11. Typowy acylo-tRNA, w którym aminokwas (aa) jest
związany 3'-końcową sekwencją CCA. Oznaczono antykodon
oraz ramiona TyC i dihydrouracylowe (D), jak również pozycję
wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych między parami
zasad. (Wg Watson JD, Molecular Biology of the Gene, 3rd ed.
Copyright © 1976,1970,1965, by W.A. Benjamin, Inc., Menlo
Park, California).
Składniki rybosomu u ssaków, mającego masę
cząsteczkową ok. 4,2 x 106 i szybkość sedymen¬
tacyjną 80S (S - jednostki Svedberga) przedsta¬
wiono w tab. 34-2.
Rybosom ssaków zawiera dwie główne pod-
jednostki nukleoproteinowe: większą o masie
cząsteczkowej 2,8 x 106 (60S) i mniejszą o ma¬
sie cząsteczkowej 1,4 * 106 (40S). Podjednostka
60S zawiera cząsteczki: 5S rybosomalnego RN A
(rRNA), 5,8S rRNA i 28S rRNA. Znajduje się
tam także ponad 50 swoistych polipeptydów.
Mniejsza podjednostka, czyli podjednostka 40S,
zawiera pojedynczą cząsteczkę 18S rRNA oraz
ok. 30 łańcuchów polipeptydowych. Wszystkie
cząsteczki rybosomalnego RN A, za wyjątkiem
5S rRNA, pochodzą z przekształcenia w jąderku
jednej, prekursorowej cząsteczki 45S RNA (p.
rozdz. 36). Cząsteczka 5S rRNA ma swoją własną
strukturę prekursorową, która jest przepisywana
niezależnie. Cząsteczki wysoko zmetylowanego
RNA są upakowane w jądrze wraz ze swoistymi
białkami rybosomowymi. W cytoplazmie rybo¬
somy są dość trwałe i mogą uczestniczyć w wielu
cyklach translacyjnych. Funkcje pełnione w rybo¬
somach przez cząsteczki rybosomalnego RNA nie
do końca zostały poznane, lecz są one niezbędne
do uformowania struktury rybosomu i zdają się
odgrywać kluczową rolę w wiązaniu mRNA do
rybosomów oraz translacji. Wyniki ostatnich ba¬
dań sugerują, że jakiś składnik rRNA wykazuje
aktywność transferazy peptydylowej, a zatem jest
enzymem (rybozymem).
D. Małocząsteczkowe RNA
W komórkach eukariotycznych znajdują się duże
ilości ewolucyjnie zachowanych, trwałych, ma-
łocząsteczkowych RNA. Większość tych cząste¬
czek istnieje w postaci rybonukleoprotein i są one
rozmieszczone w jądrze, cytoplazmie albo w obu
tych przedziałach komórkowych. Liczą one od
Tabela 34-2. Części składowe rybosomów1 ssaków
Składnik
Masa
cząsteczkowa
Białko
RNA
Liczba
Masa
Wielkość
Masa
Liczba zasad
Podjednostka 40S
1,4 x 106
33
7x105
18S
7 x 105
1900
Podjednostka 60S
2,8 x 106
50
1 x106
5S
35 000
120
5,8S
45 000
160
28S
1,6 x106
4700
1 Podjednostki rybosomowe są określone na podstawie ich szybkości sedymentacji i wyrażone za pomocą jednostek Svedberga (40S lub
60S). W tabeli podano całkowitą masę cząsteczkową każdej z nich. Pokazano również: liczbę unikatowych białek i ich całkowitą masę
cząsteczkową, składowe RNA każdej podjednostki, ich wielkość (w jednostkach Svedberga), masę cząsteczkową oraz liczbę zasad.
34. STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 385
90 do 300 nukleotydów, ich samych zaś jest od
100 000 do 1000 000 kopii.
1. Małe jądrowe RNA(snRNA). snRNA, pod¬
zbiór małocząsteczkowych RNA, są ściśle zwią¬
zane z przetwarzaniem mRNA i regulacją genów.
Spośród wielu snRNA, z usuwaniem intronów
i przekształcaniem hnRNA w mRNA są związane
Ul, U2, U4, U5 i U6 (p. rozdz. 36).
U7 snRNA bierze udział w tworzeniu pra¬
widłowego końca 3' histonowego mRNA (który
nie zawiera „ogona” poli(A)). 7SK RNA przyłą¬
cza się do wielu białek, tworząc kompleks rybo-
nukleoproteinowy, modulujący elongację mRNA
przez polimerazę RNA II (p. rozdz. 36).
2. Mikro RNA (miRNA) oraz małe interferu-
jące RNA (siRNA). Te dwie klasy RNA są częścią
podzbioru małocząsteczkowych RNA; odgrywają
one ważną rolę w regulacji genów. Obecnie wia¬
domo, że wszystkie znane miRNA oraz siRNA
hamują ekspresję genów poprzez zmniejszenie
wytwarzania specyficznych białek, jakkolwiek czy¬
nią to według odrębnych mechanizmów. miRNA
osiągają przeważnie długość 21-25 nukleotydów
i powstają w wyniku nukleolitycznego przetwa¬
rzania produktów oddzielnych genów/jednostek
transkrypcyjnych (p. ryc. 36-5). Prekursory miRNA
są jednoniciowe, jednak odznaczają się rozbudo¬
waną strukturą drugorzędową. Prekursory te liczą
od 500 do 1000 nukleotydów. Małocząsteczkowe
dojrzałe miRNA hybrydyzując, tworzą niedo¬
skonałe dupleksy RNA-RNA ze specyficznymi
docelowymi mRNA w obrębie nieulegających
translacji regionów 3r (3'UTR, p. ryc. 38-19).
Prowadzi to do zahamowania translacji; me¬
chanizm tego zjawiska nie jest znany. Do chwi¬
li obecnej opisano setki różnych miRNA u ludzi.
Z kolei siRNA powstają w wyniku nukleolitycz¬
nego, specyficznego przecięcia większych, dwu-
niciowych cząsteczek RNA, w wyniku czego
powstają niewielkie produkty o długości 21-25
nukleotydów. Takie krótkie siRNA zwykle two¬
rzą doskonałe hybrydy RNA-RNA. Docelowe,
komplementarne sekwencje mogą się znajdować
w dowolnym miejscu mRNA. Tworzenie duplek¬
sów RNA-RNA przez siRNA i mRNA prowadzi
w rezultacie do ograniczenia wytwarzania określo¬
nych białek, ponieważ kompleksy siRNA-mRNA
ulegają degradacji według specjalnych mechani¬
zmów nukleolitycznych; część lub cała degrada¬
cja odbywa się w określonych organellach, zwa¬
nych ciałkami P. Należy podkreślić, że zarówno
miRNA, jak i siRNA stworzyły wspaniałe możli¬
wości jeśli chodzi o nowe substancje nadające
się do terapii chorób. Technika wykorzystująca
siRNA jest często używana w laboratoriach do
obniżania poziomu lub znoszenia ekspresji okre¬
ślonych białek (powtórzmy: metodą degradacji
mRNA kierowanej przez homologiczny siRNA).
Jest to niezwykle użyteczna oraz skuteczna al¬
ternatywa dla technologii wykorzystujących tzw.
gene knockout (rozdz. 39).
KWASY NUKLEINOWE SA TRAWIONE
PRZEZ SPECYFICZNE NUKLEAZY
Od wielu lat znane są enzymy zdolne do degra¬
dacji kwasów nukleinowych. Te tzw. nukleazy
można sklasyfikować na kilka sposobów. Nu¬
kleazy wykazujące specyficzność w stosunku do
kwasu deoksyrybonukleinowego są nazywane
deoksyrybonukleazami; z kolei te, które w spo¬
sób specyficzny hydrolizują RNA są nazywane
rybonukleazami. W obu kategoriach mieszczą
się enzymy zdolne do przecinania wewnętrznych
wiązań fosfodiestrowych, co prowadzi do po¬
wstawania albo końców 3'-hydroksylowych i 5'-
-fosforylowych, albo końców 5'-hydroksylowych
i 3'-fosforytowych. Takie enzymy noszą nazwę
endonukleaz. Niektóre z nich mają zdolność hy-
drolizowania obu nici cząsteczki dwupasmowej,
podczas gdy inne są zdolne tylko do przecinania
pojedynczych nici kwasów nukleinowych. Nie¬
które nukleazy są w stanie hydrolizować wyłącz¬
nie niesparowane nici pojedyncze, natomiast inne
- pojedyncze nici biorące udział w tworzeniu
cząsteczki dwuniciowej. Istnieją też klasy endo¬
nukleaz rozpoznających specyficzne sekwencje
w obrębie DNA; większość z nich to endonu-
kleazy restrykcyjne; w ostatnich latach stały się
ważnym narzędziem w genetyce molekularnej
i naukach medycznych. Lista niektórych endonu¬
kleaz jest przedstawiona w tab. 39-2.
Niektóre nukleazy mogą hydrolizować nukleotyd
tylko wówczas, gdy znajduje się on na końcu czą¬
steczki; są to tzw. egzonukleazy. Enzymy te dzia¬
łają wyłącznie jednokierunkowo (3'—>5' lub 5'—>
3'). U bakterii egzonukleaza 3'—>5' jest integralną
częścią mechanizmu replikacji DNA i służy do edy¬
cji - inaczej sprawdzania poprawności parowania
zasad - ostatniego dodanego deoksynukleotydu.
386 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
STRESZCZENIE
• DNA składa się z 4 zasad: A, G, C i T, które
są utrzymywane w linijnym porządku przez
wiązania fosfodiestrowe między pozycją 3' i 5'
przyległych cząsteczek deoksyrybozy.
• DNA jest zorganizowany w dwie nici, dzięki
sparowaniu zasad: A z T oraz G z C na kom¬
plementarnych niciach. Tworzą one podwójną
helisę wokół centralnej osi.
• 3 x 109 par zasad DNA człowieka jest zorga¬
nizowanych w postaci haploidalnego komple¬
mentu 23 chromosomów. Unikalność osobnicza
wynika z konkretnej sekwencji tych 3 miliar¬
dów nukleotydów.
• Jedną z funkcji DNA jest zapewnienie matrycy
dla własnej replikacji jako sposobu utrzymania
genotypu. Inną funkcją DNA jest zapewnienie
matrycy dla transkrypcji ok. 300 000 genów,
które kodują różnorodne cząsteczki RNA.
• W odróżnieniu od DNA, RNA istnieje w po¬
staci wielu różnorodnych cząsteczek jednoni-
ciowych, z których większość jest związana,
pośrednio lub bezpośrednio, z procesami synte¬
zy białka. Liniowy układ nukleotydów w RNA
tworzą A, G, C i U, a cząsteczką cukrową jest
ryboza.
• Główne typy RNA to: informacyjny RNA
(mRNA), rybosomalny RNA (rRNA), trans¬
portujący RNA (tRNA) oraz małocząsteczko-
we jądrowe RNA (siRNA i miRNA). Niektóre
cząsteczki RNA działają jako katalizatory (ry-
bozymy).
PIŚMIENNICTWO
Green R, Noller HF: Ribosomes and translation. Annu
Rev Biochem 1997;66:689.
Guthrie C, Patterson B: Spliceosomal snRNAs. Ann Rev
Genet 1988;22:387.
Hunt T: DNA Makes RNA Makes Protein. Elsevier,
1983.
Moore M: From birth to death: the complex lives of eu-
karyotic mRNAs. Science 2005;309:1514.
Watson JD, Crick FHC: Molecular structure of nucleic
acids. Naturę 1953;171:737.
Watson JD: The Double Helix. Atheneum, 1968.
Watson JD et al: Molecular Biology of the Gene, 5,h ed.
Benjamin-Cummings, 2000.
Zamore PD, Haley B: Ribo-gnome: the big world of
smali RNAs. Science 2005;309:1519.
Organizacja, replikacja
I i naprawa DNA
P. Anthony Weil, PhD; DaryIK. Granner, MD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE*
Informacja genetyczna DNA chromosomu może
być przekazywana w wyniku wiernej replika¬
cji (DNA) lub też może podlegać wymianie w
wielu procesach, takich jak „Crossing over”, re¬
kombinacja i konwersja. Procesy te warunkują
sposoby adaptacji i różnicowania organizmu,
ale jeśli przebiegają nieprawidłowo, mogą także
prowadzić do powstania procesu chorobowego.
Do syntezy i naprawy DNA, procesów postępu¬
jących według reguły parowania zasad Watsona
i Cricka, potrzebne są liczne enzymy. Mutacje są
wynikiem zmian w sekwencji zasad DNA; mogą
one nastąpić w wyniku nieprawidłowo przebie¬
gających procesów replikacji, przemieszczenia
lub naprawy DNA i występują z częstością 1 na
każdych 106 podziałów komórkowych. W wy¬
niku mutacji, które zachodzą w kodujących lub
regulatorowych regionach DNA, powstaje nie¬
prawidłowy produkt genu. Mutacja w obrębie
komórki rozrodczej będzie przeniesiona na po¬
tomstwo (tzw. pionowe przeniesienie choroby
dziedzicznej). Wiele czynników, w tym wirusy,
związki chemiczne, promieniowanie ultrafiole¬
towe i promieniowanie jonizujące, zwiększają
szybkość mutacji. Mutacje dotyczą komórek so¬
matycznych i są przenoszone na następne gene¬
racje komórek w obrębie organizmu. Wiadomo,
że wiele chorób i prawdopodobnie większość
nowotworów złośliwych powstaje wskutek po¬
ziomego przeniesienia mutacji.
CHROMATYNA JEST MATERIAŁEM
CHROMOSOMALNYM Z JADER
KOMÓREK ORGANIZMÓW
EUKARIOTYCZNYCH
Chromatyna składa się z bardzo długich, dwuni-
ciowych cząsteczek DNA, i z prawie takiej samej
wagowo ilości małych zasadowych białek, zwa¬
nych histonami, jak również z nieco mniejszej
ilości białek niehistonowych (większość z nich
są to białka kwaśne i większe niż histony) i ma¬
łej ilości RNA. Białka niehistonowe to enzymy
biorące udział w replikacji DNA, takie jak topo-
izomerazy DNA. Należą do nich również białka
biorące udział w transkrypcji, takie jak kompleks
polimerazy RNA. Podwójna helisa DNA w każ¬
dym z chromosomów ma długość tysiąc razy
większą niż średnica jądra komórkowego. Jedną
z funkcji cząsteczek składających się na chroma-
tynę, zwłaszcza histonów, jest kondensacja DNA.
Obserwacja chromatyny pod mikroskopem elek¬
tronowym ujawniła zbite, kuliste cząstki, nazwa¬
ne nukleosomami, które mają ok. 10 nm śred¬
nicy i są powiązane pasmami DNA (ryc. 35-1).
Nukleosomy są złożone z DNA owiniętego wokół
skupiska cząsteczek histonów.
* Tak dalece, jak jest to możliwe, dyskusja w tym rozdziale oraz w rozdz. 36, 37 i 38 będzie się odnosiła do ssaków,
które należą oczywiście do wyższych organizmów eukariotycznych. W pewnych przypadkach konieczne będzie od¬
niesienie do spostrzeżeń poczynionych na organizmach prokariotycznych, takich jak bakterie i wirusy; będą to jednak
informacje, które mogą być ekstrapolowane na organizmy ssaków.
388 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Histony są najliczniejszymi białkami
chromatyny
Histony stanowią niewielką rodzinę blisko spo¬
krewnionych zasadowych białek. Spośród nich
najsłabiej związane z chromatyną (p. ryc. 35-1)
są histony HI i dlatego są one łatwo usuwane roz¬
tworem soli, w wyniku czego chromatyna staje się
rozpuszczalna.
Jednostką organizacyjną rozpuszczalnej chro¬
matyny jest nukleosom. Wyizolowany rdzeń
nukleosomów zawiera 4 klasy histonów: H2A,
H2B, H3 i H4. Struktura wszystkich czterech
histonów - H2A, H2B, H3 i H4, tzw. histonów
rdzeniowych tworzących nukleosom - zostaje
w znacznym stopniu zachowana (utrzymana)
wśród gatunków. Wysoki wskaźnik zachowania
struktury nasuwa wniosek, że czynność histo¬
nów jest identyczna we wszystkich komórkach
eukariotycznych i że cała cząsteczka (histonu)
uczestniczy w wypełnianiu swoistej funkcji.
Koniec C cząsteczek histonów w 2/3 ma zwy¬
kły skład aminokwasowy, natomiast V3 końca N
ma większość aminokwasów zasadowych. Wy¬
mienione cztery histony rdzenia nukleosomu
podlegają sześciu rodzajom kowalencyjnych
modyfikacji: acetylacji, metylacji, fosforylacji,
ADP-rybozylacji, monoubikwitylacji i sumoila-
cji. Modyfikacje histonów zapewne odgrywają
jakąś, mało jeszcze poznaną, rolę w strukturze
chromatyny i w jej czynności, jak to pokazano
w tab. 35-1.
Tabela 35-1. Możliwe role zmodyfikowanych histonów
1. Acetylacja histonów H3 i H4 jest związana z aktywacją lub
deaktywacją transkrypcji genów (rozdz. 36).
2. Acetylacja histonów rdzeniowych jest związana ze składa¬
niem chromosomów podczas replikacji DNA.
3. Fosforylacja histonu H1 jest związana z kondensacją chromo¬
somów podczas cyklu replikacji.
4. ADP-rybozylacja histonów jest związana z naprawą DNA.
5. Metylacja histonów jest skorelowana z aktywowaniem i re¬
presją transkrypcji genów.
6. Monoubikwitylacja jest związana z aktywacją genu, represją
i heterochromatycznym wyciszaniem genów.
7. Sumoilacja histonów (SUMO; ang. smali ubiquitin-related
modifier, mały modyfikator związany z ubikwityną) prowadzi
do represji transkrypcji.
Ryc. 35-1. Zdjęcie z mikroskopu elektronowego, pokazujące
nukleosomy (białe, kuliste twory) przyczepione do nici kwa¬
su nukleinowego (DNA) (cienka szara linia); patrz ryc. 35-2.
(Reprodukowane za zgodą z: Shao Z. Probing nanometer stru-
ctures with atomie force microscopy. News Physiol Sci, 1999,
Aug.,14:142-149. Courtesy of Professor Zhifeng Shao, Uni-
versity of Virginia.)
Histony oddziaływają wzajemnie w bardzo
swoisty sposób. H3 i H4, tworzą tetramer, za¬
wierający po dwie cząsteczki każdego z nich
(H3/H4)2, natomiast H2A i H2B tworzą dimery
(H2A-H2B). W warunkach fizjologicznych takie
oligomery histonowe łączą się w oktamer histo-
nowy o składzie (H3/H4)2-(H2A-H2B)2.
Nukleosom zawiera histon i DNA
Gdy oktamer histonowy zostanie zmieszany
z oczyszczonym dwuniciowym DNA, wówczas
obserwuje się taki sam wzór dyfrakcji promieni
X, jaki daje świeżo wyizolowana chromatyna.
Badania pod mikroskopem elektronowym po¬
twierdzają obecność zrekonstruowanych nukleo¬
somów. Odtworzenie nukleosomów na bazie DNA
oraz histonów H2A, H2B, H3 i H4 nie zależy od
tego, czy te różne składniki pochodzą z tych sa¬
mych komórek lub organizmów. Do odtworzenia
rdzenia nukleosomu nie są potrzebne ani histon
H1, ani białka niehistonowe.
W nukleosomie DNA jest nawinięty, jako lewo-
skrętna helisa, na powierzchni podobnego do dys¬
ku oktameru histonów (ryc. 35-2). Histony rdzenia
nukleosomu oddziaływają z DNA na wewnętrznej
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 389
powierzchni superzwoju, bez wystawania na ze¬
wnątrz, chociaż końce aminowe wszystkich hi-
stonów prawdopodobnie wystają z tej struktury
i mogą podlegać kowalencyjnym modyfikacjom
o znaczeniu regulacyjnym (p. tab. 35-1).
Sam tetramer (H3/H4)2 narzuca DNA właś¬
ciwości podobne do tych, jakie ma cały nuk-
leosom; tetramer odgrywa dzięki temu główną
rolę w tworzeniu nukleosomu.
Ryc. 35-2. Model struktury nukleosomu, w którym DNA jest
owinięty wokół powierzchni spłaszczonego cylindra białkowe¬
go (oktamer histonowy), składającego się z dwóch cząsteczek
każdego z histonów H2A, H2B, H3, H4. DNA o długości 146 par
zasad, stanowiący 1,75 superhelikalnego zwoju, stale styka się
z oktamerem histonowym. Chroni to DNA przed trawieniem nu-
kleazą. Pozycja histonu H1, jeśli jest on obecny, jest pokazana
za pomocą kreskowanego zarysu widocznego na dole ryciny.
Dodanie dwóch dimerów H2A-H2B stabilizuje
pierwotną cząsteczkę i wiąże silnie dwa dodat¬
kowe półskręty helisy DNA, uprzednio jedynie
luźno związane z tetramerem (H3/H4)2. Zatem
1,75 superhelikalnego zwoju DNA owija się wo¬
kół powierzchni oktameru histonowego, chroniąc
146 par zasad DNA i tworząc rdzeń nukleosomu
(p. ryc. 35-2). Cząstki rdzenia są oddzielone linke-
rem DNA o długości ok. 30 par zasad. Większość
DNA znajduje się w tego typu powtórzonych
strukturach, co pod mikroskopem elektronowym
widoczne jest jako „nici z nanizanymi paciorka¬
mi” (p. ryc. 35-1).
W powstawaniu nukleosomów pośredniczą nie¬
które czynniki tworzenia chromatyny, wspoma¬
gane przez białka opiekuńcze histonów, tj. grupę
białek wykazujących wysokie powinowactwo do
histonów. W trakcie tworzenia nukleosomów hi-
stony zostają uwolnione od białek opiekuńczych.
Nukleosomy wykazują preferencję do pewnych re¬
gionów na specyficznych cząsteczkach DNA, ale
podstawa takiego nieprzypadkowego rozmiesz¬
czenia nukleosomów, zwanego fazowaniem, nie
jest znana. Prawdopodobnie jest to związane ze
względną fizyczną giętkością pewnych sekwen¬
cji nukleotydowych, które są zdolne do przyjęcia
formy załamanej (ang. kinking) w obrębie super-
helisy, jak również z obecnością innych czynni¬
ków związanych z DNA, które ograniczają liczbę
miejsc lokalizacji nukleosomów.
Dalsze, wyższego rzędu upakowanie nukleoso¬
mów w jądrach jest prawdopodobnie zależne od
oddziaływania histonów HI z przyległymi nu-
kleosomami.
STRUKTURY WYŻSZEGO RZĘDU
ZAPEWNIAJĄ UPAKOWANIE
CHROMATYNY
Badanie chromatyny pod mikroskopem elektro¬
nowym wykazuje, że oprócz struktury samych
nukleosomów, ma ona dwie struktury wyższe¬
go rzędu: włókienko chromatynowe o grubości
10 nm i włókno o grubości 30 nm. Dyskopodobna
struktura nukleosomu ma średnicę 10 nm i wyso¬
kość 5 nm. Włókienko grubości 10 nm składa
się z nukleosomów ułożonych w taki sposób, że
ich brzegi są nieco od siebie oddzielone (30 par
zasad DNA), a ich płaskie powierzchnie leżą
równolegle do osi włókienka (ryc. 35-3). Włó¬
kienko grubości 10 nm jest prawdopodobnie
dodatkowo skręcone (6-7 nukleosomów na jeden
skręt) i tworzy włókno chromatynowe o grubo¬
ści 30 nm (p. ryc. 35-3).
Każdy zwój superhelisy jest względnie pła¬
ski, a powierzchnie nukleosomów następujących
po sobie skrętów są prawie równoległe. Histony
HI prawdopodobnie stabilizują włókno grubo¬
ści 30 nm, ale ich pozycja i pozycja przerywnika
DNA o różnej długości nie zostały jeszcze zdefi¬
niowane. Możliwe, że nukleosomy tworzą różne
upakowane struktury. Aby wytworzyć chromo¬
som mitotyczny, włókno grubości 30 nm musi
ulec dalszemu upakowaniu, tak aby jego długość
zmniejszyła się 100 razy (p. niżej).
W chromosomach interfazowych nici chro¬
matyny są zorganizowane w pętle lub domeny,
Pętle
po kondensacji
700 nm
Pętle
nieskondensowane
Rusztowanie
jądrowe
T
30 nm
i
T
10 nm
i
2 nm
jL
Ryc. 35-3. Stopień upakowania DNA w chromosomach metafazowych {góra) i dupleksowym DNA (dóf). Chromosomowy DNA jest
upakowany i zorganizowany na kilku poziomach (p. tab. 35-2). Każda faza kondensacji lub kompaktacji oraz organizacji (od dotu do
góry) zmniejsza ogólną dostępność DNA w stopniu takim, że sekwencje DNA w metafazowych chromosomach są prawie zupełnie
nieczynne transkrypcyjnie. W sumie, niniejsze pięć poziomów kompaktacji DNA powoduje skrócenie DNA prawie 104 razy, licząc od
jednego do drugiego końca cząsteczki. Całkowita kondensacja i dekondensacja liniowego DNA w chromosomach w trakcie normalnego
replikacyjnego cyklu komórkowego zachodzi w przeciągu kilku godzin (p. ryc. 35-20).
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 391
o długości 30000-100000 par zasad, zakot¬
wiczone w jądrze, w strukturze szkieletowej (lub
rusztowaniu podporowym). W obrębie tych do¬
men niektóre sekwencje DNA mogą być umiejs¬
cowione w sposób nieprzypadkowy. Sugeruje
się, że każda wypętlona domena chromatyny
odpowiada oddzielnej funkcji genetycznej, gdyż
zawiera zarówno kodujące, jak i niekodujące re¬
giony genu lub genów. Opisana struktura jądrowa
ma prawdopodobnie charakter dynamiczny i od¬
grywa ważną rolę w regulacji genów.
NIEKTÓRE REGIONY CHROMATYNY SA
„AKTYWNE”, A INNE „NIEAKTYWNE”
Ogólnie, wszystkie komórki każdego organizmu
wielokomórkowego zawierają tę samą infor¬
mację genetyczną w postaci takich samych
sekwencji DNA. Różnice między typami ko¬
mórek w obrębie jednego organizmu mogą być
zatem wytłumaczone zróżnicowaną ekspresją
wspólnej informacji genetycznej. Wykazano,
że chromatyna zawierająca geny aktywne (tj.
chromatyna aktywna transkrypcyjnie) różni
się pod wieloma względami od tej z regionów
nieaktywnych. Struktura nukleosomowa ak¬
tywnej chromatyny jest zmieniona lub, w bar¬
dzo aktywnych regionach, nie występuje. DNA
w aktywnej chromatynie zawiera obszerne re¬
giony (długości ok. 100 000 par zasad), które są
wrażliwe na trawienie nukleazą, takąjak DNa-
za 1. Enzym ten dokonuje jednoniciowych cięć
we wszystkich odcinkach DNA, nie wykazując
specyficzności sekwencyjnej i trawiąc niechro-
nione białkiem DNA do składowych deoksyry-
bonukleotydów. Wrażliwość aktywnie transkry-
bowanych regionów chromatyny na DNazę I
odzwierciedla raczej tylko potencjalną zdolność
transkrypcji niż samą transkrypcję, a w wielu sy¬
stemach jest skorelowana ze względnym brakiem
5-metylodeoksycytydyny w DNA oraz z poszcze¬
gólnymi kowalencyjnymi modyfikacjami histo-
nów (fosforylacja, acetylacja itp.; p. tab. 35-1).
W obrębie dużych regionów aktywnej chro¬
matyny występują krótkie odcinki (długości
100-300 nukleotydów), które wykazują nawet
większą (10 razy) wrażliwość na DNazę I. Takie
nadwrażliwe miejsca prawdopodobnie są skut¬
kiem konformacji strukturalnej, ułatwiającej do¬
stępność nukleazy do DNA. Regiony te zwykle
znajdują się bezpośrednio przed aktywnym ge¬
nem i struktura nukleosomalna tych regionów
zostaje przerwana w wyniku związania białek
niehistonowych - czynników transkrypcyjnych
(p. rozdz. 36 i 38). Wydaje się, że jeśli gen jest
zdolny do transkrypcji, w jego chromatynie musi
występować nadwrażliwe na DNazę miejsce
w regionie bezpośrednio poprzedzającym gen.
W powstawaniu miejsc nadwrażliwych biorą
udział białka uczestniczące w transkrypcji oraz
białka zaangażowane w utrzymaniu dostępu do
matrycowego pasma DNA. Miejsca nadwraż¬
liwe często stanowią pierwszą wskazówkę od¬
nośnie do obecności i umiejscowienia elementu
kontrolującego transkrypcję.
Chromatyna nieaktywna transkrypcyjnie jest
w interfazie gęsto upakowana, co można stwier¬
dzić przy użyciu mikroskopu elektronowego.
Taką chromatynę nazywa się heterochromaty-
ną. Chromatyna aktywna transkrypcyjnie wybar-
wia się jako substancja mniej gęsta; określa się ją
jako euchromatynę. Euchromatyna replikuje się
w cyklu komórkowym ssaków zwykle wcześniej
niż heterochromatyna (p. niżej).
Rozróżnia się dwa typy heterochromatyny:
konstytutywną i fakultatywną. Heterochroma¬
tyna konstytutywna zawsze jest upakowana,
a więc jest nieaktywna. Heterochromatynę kon¬
stytutywną znajduje się w regionach w pobliżu
centromeru i w końcach chromosomów (w te-
lomerach). Heterochromatyna fakultatywna
niekiedy jest skondensowana, a niekiedy jest
aktywnie przepisywana, a więc nieskondenso-
wana i mająca wygląd euchromatyny. U ssa¬
ków jeden z dwóch żeńskich chromosomów X
jest prawie całkowicie nieaktywny transkryp¬
cyjnie i jest chromosomem heterochromatycz-
nym. Heterochromatyczny chromosom X ulega
jednak w okresie gametogenezy dekondensacji
i staje się aktywny transkrypcyjnie we wczesnej
embriogenezie; jest to więc heterochromatyna
fakultatywna.
Niektóre komórki owadów, np. Chironomus,
zawierają chromosomy olbrzymie, które uległy
replikacji w 10 cyklach, ale siostrzane chromaty-
dy nie oddzieliły się. Kopie DNA leżą jedna obok
drugiej w precyzyjnym układzie i w rezultacie two¬
rzą chromosom prążkowany, zawierający regiony
chromatyny skondensowanej i jasne prążki chro-
392 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
matyny bardziej rozproszonej. Transkrypcyjnie
aktywne regiony tych politenicznych chromoso¬
mów, o silnie rozluźnionej budowie, tworzą
„pufy” zawierające enzymy odpowiedzialne za
transkrypcję; są to miejsca, gdzie przebiega syn¬
teza RNA (ryc. 35-4).
DNA JEST ZORGANIZOWANY
W POSTACI CHROMOSOMÓW
Chromosomy ssaków wykazują w metafazie po¬
dwójną symetrię z identycznymi, siostrzanymi
chromatydami, połączonymi w centromerze,
którego względne położenie jest charakterystycz¬
ną cechą danego chromosomu (ryc. 35-5). Centro-
mer jest regionem bogatym w pary adenina-tymi-
na (A-T); ma długość 102 (drożdże) do 106 (ssaki)
par zasad. Wiąże on, z dużym powinowactwem,
wiele białek. Kompleks ten, zwany kinetocho-
rem, stanowi miejsce zakotwiczenia wrzeciona
mitotycznego. Jest więc strukturą ważną w proce¬
sie segregacji chromosomów podczas mitozy.
Końce każdego chromosomu zawierają struktu¬
ry zwane telomerami. Składają się one z krótkich,
powtarzających się sekwencji bogatych w pary
T-G. U człowieka telomery zawierają zróżnicowa¬
ną liczbę powtórzeń sekwencji 5'-TTAGGG-3',
które mogą obejmować wiele tysięcy par zasad.
Telomeraza - kompleks składający się z wielu
podjednostek, zawierający RNA i spokrewniony
z zależnymi od RNA wirusowymi polimerazami
DNA (odwrotnymi transkryptazami) - jest en¬
zymem odpowiedzialnym za syntezę telomerów,
a zatem za podtrzymanie długości telomerów. Po¬
nieważ skracanie telomerów jest odpowiedzialne
za transformację nowotworową i starzenie, telo¬
meraza stała się obiecującym celem chemioterapii
i badań nad opracowaniem nowych leków. Każda
chromatyda siostrzana zawiera jedną dwuniciową
cząsteczkę DNA. W trakcie interfazy upakowanie
cząsteczki DNA jest mniej zbite niż w skondenso¬
wanym chromosomie w trakcie metafazy. Chro¬
mosom metafazowy jest prawie zupełnie nieak¬
tywny transkrypcyjnie.
Ludzki genom haploidalny składa się z 3,5 *
x 109 par zasad i ok. 1,7 * 107 nukleosomów. Każ¬
da z 23 chromatyd w ludzkim genomie haploidal-
nym zawiera więc średnio 1,5 * 108 nukleotydów
w jednej dwuniciowej cząsteczce DNA. Długość
Ryc. 35-4. Zdjęcia pokazujące silną korelację aktywności poli-
merazy RNA klasy II i syntezy mRNA. U larwy Chironomus ten-
tans wiele genów, oznaczonych A, B (góra) i 5C, ale nie geny
w locus BR3 (5C, BR3, dóf)t aktywuje się pod wpływem szoku
cieplnego (39°C, 30 min). (A): Rozmieszczenie polimerazy RNA
klasy II w izolowanym chromosomie IV ślinianki (strzałki). Enzym
uwidoczniono immunofluorescencyjnie, stosując przeciwciało
przeciw polimerazie. Swoiste prążki w chromosomie IV oznaczono
symbolami 5C i BR3; pufy pokazuje strzałka. (B): Autoradiogram
chromosomu IV po inkubacji z 3H-urydyną w celu wyznakowania
RNA. Należy zwrócić uwagę na zgodność obrazu immunofluo-
rescencji z obecnością radioaktywnego RNA (czarne punkty).
Odcinek skali = 7 ąm. (Reprodukowano za zgodą z: Sass H.:
RNA polymerase B in polytene chromosomes: Celi 1982; 28:274.
Copyright © 1982. Przedrukowano za zgodą Elsevier).
każdej cząsteczki DNA musi być zredukowana
ok. 8000 razy, aby mogła się wytworzyć struktura
skondensowanego chromosomu metafazowego!
W chromosomach metafazowych włókna chro-
matynowe grubości 30 nm są także sfałdowane
w upętlone domeny, których proksymalne końce
są zakotwiczone w niehistonowym, białkowym
rusztowaniu w jądrze (p. ryc. 35-3). Stopień upa¬
kowania każdej struktury DNA przedstawiono
w tab. 35-2.
Upakowanie nukleoprotein w obrębie chro¬
matyd nie jest przypadkowe, o czym świadczy
charakterystyczny wzór po wybarwieniu chro-
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 393
Chromatyda siostrzana Nr 2
Chromatyda siostrzana Nr 1
Ryc. 35-5. Dwie siostrzane chromatydy ludzkiego chromosomu 12.
Pokazane jest położenie bogatego w A+T regionu centromerycznego,
łączącego siostrzane chromatydy, jak również dwa z czterech telome-
rów znajdujących się na samych końcach chromatyd przyłączonych
jedna do drugiej w centromerze.
mosomów swoistymi barwnikami, takimi jak
kwinakryna lub barwnik Giemsy (ryc. 35-6).
Wzór wybarwiania (prążkowania) całego zesta¬
wu chromosomów u różnych osobników w obrę¬
bie jednego gatunku jest w dużym stopniu powta¬
rzalny, niemniej różni się znacznie od wzoru u in¬
nych, nawet blisko spokrewnionych, gatunków.
Upakowanie nukleoprotein w chromosomach
wyższych organizmów eukariotycznych musi być
w jakiś sposób zależne od gatunkowo swoistych
cech cząsteczek DNA.
Połączenie specjalnych technik barwienia
z mikroskopią dużej rozdzielczości pozwoliło ge-
Tabela 35-2. Stopień upakowania każdej struktury DNA
Postać w chromatynie
Stopień
upakowania
„Naga” dwunlclowa helisa DNA
-1,0
Włókienko nukleosomowe grubości 10 nm
7-10
Włókno chromatynowe grubości 30 nm
40-60
zawierające superhelikalne nukleosomy
Skondensowane pętle chromosomów
8000
metafazowych
netykom na dość precyzyjne zmapowanie tysię¬
cy genów w określonych regionach chromoso¬
mów myszy i człowieka. Dzięki wyjaśnieniu
w ostatnim okresie sekwencji ludzkiego i mysie¬
go genomu stało się jasne, że wiele z tych metod
wizualnego mapowania cechowała wyjątkowa
dokładność.
Regiony kodujące często są przerywane
sekwencjami wtrąconymi
Kodujące regiony DNA, których transkrypty
ostatecznie pojawiają się w cytoplazmie jako
pojedyncze cząsteczki mRNA, są zwykle po¬
przerywane w genomie dużymi sekwencjami
wtrąconymi niekodującego DNA. Wskutek tego
pierwotne transkrypty DNA - hnRNA (nazwane
tak, ponieważ ten typ RNA jest silnie heterogen-
ny pod względem długości oraz zlokalizowany
głównie w jądrze) zawierają niekodujące sekwen¬
cje RNA, które muszą być usunięte w takim pro¬
cesie, w którym jednocześnie następuje wzajemne
połączenie odpowiednich segmentów kodujących
z wytworzeniem dojrzałego mRNA. Większość
sekwencji kodujących pojedynczy mRNA jest po-
394 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
I
6
n iii
13 14 15
•I NI
19 20
21
Ryc. 35-6. Ludzki kariotyp (tj. człowieka z normalnym zestawem chromosomów: 46,XY), w którym chro¬
mosomy wybarwiono barwnikiem wg metody Giemsy i ułożono według zaleceń Konwencji Paryskiej. (Dzię¬
ki uprzejmości H. Ławce i F. Conte).
przerywana w genomie (a zatem i w pierwotnym
transkrypcie) przynajmniej przez jeden, a w nie¬
których przypadkach aż przez 50 niekodujących
sekwencji wtrąconych (introny). W większości
przypadków introny są znacznie dłuższe niż przy¬
ległe regiony kodujące (eksony). Obróbkę pier¬
wotnego transkryptu, która obejmuje wycięcie
intronów i połączenie przyległych eksonów, opi¬
sano szczegółowo w rozdz. 36.
Funkcja sekwencji wtrąconych, czyli intronów,
nie jest jasna. Mogą one służyć do rozdzielenia
funkcjonalnych domen (eksonów) informacji
zakodowanej w sposób umożliwiający szybszy
przebieg rekombinacji genetycznych niż wów¬
czas, gdy wszystkie regiony kodujące dla danej
funkcji genetycznej byłyby w postaci ciągłej.
Takie zwiększone tempo rearanżacji genetycznej
funkcjonalnych domen może prowadzić do szyb¬
kiej ewolucji funkcji biologicznych. Wzajemne
powiązania między chromosomalnym DNA, ze¬
społami genów na chromosomie, strukturą ek-
son-intron w genach i mRNA jako końcowym
produktem genów przedstawiono na ryc. 35-7.
WIĘKSZOŚĆ GENOMU SSAKÓW
WYSTĘPUJĘ W NADMIARZE
INIE JEST TRANSKRYBOWANA
Genom haploidalny każdej komórki ludzkiej skła¬
da się z 3,5 x 109 par zasad DNA podzielonych na
23 chromosomy. Cały genom haploidalny składa
się z DNA wystarczającego na zakodowanie ok.
1,5 miliona par genów. Jednakże badania nad tem¬
pem mutacji i złożonością genomów organizmów
wyższych dobitnie sugerują, że u ludzi występuje
tylko ok. 100 000 rodzajów podstawowych bia¬
łek kodowanych przez ok. 1% ludzkiego genomu,
który stanowi eksonowe DNA. Nasuwa to wnio¬
sek, że większość DNA nie jest DNA kodującym,
czyli zawarta w nim informacja nie jest nigdy tłu¬
maczona na sekwencję aminokwasów cząsteczki
białkowej. Z pewnością pewien nadmiar sekwencji
DNA służy do regulacji ekspresji genów w czasie
rozwoju, różnicowania i adaptacji do środowiska,
czy to służąc jako miejsca wiążące dla białek re¬
gulatorowych, czy też kodując regulatorowe RNA
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 395
Chromosom
(1-2) x 103 genów
Grupa genów
(—20 genów)
Gen
Transkrypt pierwotny
(
) 1,5 x108pz
J
V
r
ri f i
m ■■ iii
|
Uli II 1,5 * 106pz
J
V
r
-v////////A ■
1 L
i
ii
I I I
■— 2*104pz
i
i ■
1 L
1
_i
LJJ
1 8 x 103 nt
mRNA 2 x 103 nt
Ryc. 35-7. Współzależności między chromosomalnym DNA i mRNA. DNA ludzkiej komórki haploidalnej zawiera 3 x 109
par zasad (pz) i jest rozdzielony pomiędzy 23 chromosomy. Geny w tych chromosomach występują w grupach. Średnia
długość genu może wynosić 20 000 pz, włączając w to region regulatorowy (pole zakreskowane), który lokalizuje się
zwykle na końcu 5' genu. Na rycinie region regulatorowy przylega do punktu inicjacji transkrypcji (strzałka). Większość
genów eukariotycznych zawiera na przemian eksony i introny. W tym przykładzie występuje dziewięć eksonów (pola
kolorowe) i osiem intronów (pola białe). Introny są usuwane z pierwotnego transkryptu w procesie obróbki pierwotnego
transkryptu, a eksony są kolejno łączone ze sobą (składane) w mRNA (nt — nukleotydy).
(tzn. miRNA). Część nadmiaru stanowią sekwen¬
cje wtrącone (introny, ok. 24% ludzkiego genomu),
które rozdzielają kodujące regiony genu, ale więk¬
szość nadmiaru sekwencji składa się z wielu rodzin
sekwencji powtarzających się, którym nie przypi¬
suje się jeszcze jasno określonych funkcji. Podsu¬
mowanie najbardziej uderzających cech ludzkiego
genomu znajduje się w rozdz. 39.
DNA eukariotycznego genomu może być po¬
dzielony na różne „klasy sekwencji”. Są to: sek¬
wencje unikatowe, czyli niepowtarzalne sek¬
wencje DNA, i sekwencje DNA powtarzalne.
W genomie haploidalnym unikatowe sekwencje
DNA zawierają zwykle pojedyncze kopie genów
kodujących białka. Liczba kopii sekwencji powta¬
rzających się w genomie haploidalnym może wy¬
nosić od 2 do 107 na pojedynczą komórkę.
Ponad połowę DNA w organizmach
eukariotycznych stanowię sekwencje
unikatowe, czyli niepowtarzalne
Dane szacunkowe (jak również rozmieszczenie
powtarzalnych sekwencji DNA) pochodzą z ba¬
dań przeprowadzonych różnymi technikami hy¬
brydyzacji DNA-RNA, a ostatnio techniką bezpo¬
średniego sekwencjonowania. Podobne techniki
są stosowane do określenia liczby aktywnych
genów w populacji unikatowych sekwencji DNA.
W drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) - niż¬
szym organizmie eukariotycznym występuje
ekspresja ok. 2/3 z 6200 genów. W typowych
tkankach wyższych organizmów eukariotycz¬
nych (np. wątroba i nerka ssaków) ekspresji ule¬
ga 10 000-15 000 genów. Oczywiście, w każdej
tkance ulegają ekspresji różne kombinacje genów,
ale sposób, w jaki ten proces zachodzi, jest jedną
z nierozwiązanych kwestii w biologii.
W ludzkim DNA przynajmniej 30%
genomu składa się z sekwencji
powtarzalnych
Powtarzające się sekwencje DNA mogą być
ogólnie sklasyfikowane jako umiarkowanie czę¬
sto powtarzające się i często się powtarzające.
Często powtarzające się sekwencje składają się
z odcinków o długości 5-500 par zasad, powtó-
396 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
rzonych wiele razy jedna po drugiej. Sekwencje
te są zwykle zgrupowane w centromerach i te-
lomerach chromosomu i występują w ok. 1-10
milionach kopii w genomie haploidalnym. Sek¬
wencje te są transkrypcyjnie nieaktywne i mogą
odgrywać w chromosomie rolę strukturalną (p.
rozdz. 39).
Umiarkowanie często powtarzalne sekwencje,
których występuje w genomie mniej niż 106 ko¬
pii na 1 genom haploidalny, nie są zgrupowane,
lecz rozproszone wśród sekwencji unikatowych.
W wielu przypadkach te długie sekwencje roz¬
proszone są transkrybowane przez polimerazę
RNAII i zawierają „czapeczki metylacyjne”, nie¬
odróżnialne od tych zawartych w mRNA.
W zależności od ich długości, umiarkowanie
często powtarzalne sekwencje są sklasyfikowa¬
ne jako długie rozproszone sekwencje powta¬
rzalne (LINĘ, ang. long interspersed repeat se-
ąuences) albo krótkie rozproszone sekwencje
powtarzalne (SINE, ang. short interspersed re¬
peat seąuences). Oba typy sekwencji wydają się
retropozonami, tj. takimi sekwencjami, które
powstały w wyniku przemieszczenia z jednego
miejsca do drugiego (transpozycja) i które
utworzyły się za pośrednictwem RNA wskutek
działania odwrotnej transkryptazy, przepisującej
matrycę RNA na DNA. Genom ssaków zawie¬
ra 20 000-50 000 kopii sekwencji typu LINĘ,
0 długości 6-7 kz. Stanowią one rodziny powta¬
rzających się elementów, gatunkowo swoistych.
Sekwencje typu SINE są krótsze (70-300 pz)
1 w genomie występują w liczbie ponad 100 000
kopii. Jednym z rodzajów sekwencji typu SINE
w genomie ludzkim jest rodzina Alu, która wy¬
stępuje w liczbie 500 000 kopii na genom ha¬
ploidalny i stanowi co najmniej 5-6% ludzkiego
genomu. Składowe rodziny Alu człowieka i ich
spokrewnione analogi u innych zwierząt są prze¬
pisywane jako integralne komponenty hnRNA
lub jako odrębne cząsteczki RNA, zawierające
dobrze poznane 4,5S RNA i 7S RNA. Jednostki
należące do tych szczególnych rodzin są w wyso¬
kim stopniu zachowywane w obrębie gatunków,
jak również wśród gatunków ssaków. Składni¬
ki krótkich sekwencji powtarzalnych, łącznie
z rodziną Alu, mogą być elementami przemiesz¬
czającymi się, zdolnymi do „przeskakiwania”
z różnych miejsc do innych w obrębie genomu
(p. dalej). Może to mieć katastrofalne konse¬
kwencje, jak to pokazuje przykład insercji sek¬
wencji Alu w genie, który wskutek takiej mutacji
powoduje nerwiakowłókniakowatość (chorobę
Recklinghausena).
Powtarzalne sekwencje mikrosatelitarne
Każdy rodzaj sekwencji powtarzalnych istnieje
albo w formie rozproszonej, albo w formie zgru¬
powanych tandemów. Sekwencje takie składają
się z 2-5 pz, powtórzonych do 50 razy. Sekwen¬
cje mikrosatelitarne najczęściej są znajdywa¬
ne jako powtórzenia dwunukleotydowe AC na
jednej nici i TG na nici przeciwnej, ale istnieją
także w wielu innych formach, takich jak CG,
AT i CA. Powtórzenia sekwencji AC wystę¬
pują w genomie w ok. 50000-100000 miejsc.
W każdym miejscu liczba tych powtórzeń na
dwóch chromosomach może się różnić, co pro¬
wadzi do heterozygotyczności w odniesieniu do
liczby kopii poszczególnych mikrosatelitamych
sekwencji u danego osobnika. Jest to cecha
dziedziczna. Dzięki mnogości tych sekwencji
i łatwemu ich wykrywaniu za pomocą polimera-
zowej reakcji łańcuchowej (PCR) (p. rozdz. 39),
powtórzenia sekwencji typu AC są bardzo uży¬
teczne w sporządzaniu map genetycznych sprzę¬
żeń. Większości genów towarzyszy jeden lub
większa liczba markerów mikrosatelitamych;
dzięki temu może być oznaczone względne poło¬
żenie genów na chromosomie i związek danego
genu z chorobą. Stosując technikę PCR, można
szybko zbadać dużą liczbę członków rodziny
w celu oznaczenia polimorfizmu mikrosateli-
tarnego. Skojarzenie z genem swoistego poli¬
morfizmu u dotkniętych chorobą członków ro¬
dziny oraz brak takiego skojarzenia u zdrowych
członków rodziny może być pierwszą wskazów¬
ką co do genetycznego podłoża choroby.
Wzrost liczby sekwencji trinukleotydowych
(niestabilność sekwencji mikrosatelitamych) mo¬
że być przyczyną choroby. Niestabilność sekwen¬
cji powtarzalnych typu p(CGG)n jest związana
z zespołem łamliwego chromosomu X. Inne po¬
wtórzenia trinukleotydowe, które ulegają dyna¬
micznej mutacji (zwykle zwiększa się ich liczba),
są związane z pląsawicą Huntingtona (CAG),
dystrofią miotoniczną (CTG), atrofią mięśnio¬
wą rdzeniowo-opuszkową (CAG) i chorobą
Kennedyego (CAG).
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 397
JEDEN PROCENT KOMÓRKOWEGO DNA
ZNAJDUJE SIE W MITOCHONDRIACH
Większość peptydów w mitochondriach (ok. 54
z 67) jest kodowanych przez geny znajdujące się
w jądrze. Reszta jest kodowana przez geny znaj¬
dujące się w DNA mitochondrialnym (mtDNA).
Tabela 35-3. Niektóre główne cechy budowy i funkcje ludzkiego
mitochondrialnego DNA1
• Kolisty, dwuniciowy, składa się z ciężkiej (H) i lekkiej (L) nici
• Zawiera 16 569 par zasad
• Koduje 13 podjednostek białkowych łańcucha oddechowego
(z ogólnej liczby ok. 67)
Siedem podjednostek dehydrogenazy NADH (kompleks I)
Cytochrom b kompleksu III
Trzy podjednostki oksydazy cytochromowej (kompleks IV)
Dwie podjednostki syntazy ATP
• Koduje duży (16s) i mały (12s) mt rybosomalny RNA
• Koduje 22 cząsteczki mt tRNA
• Kod genetyczny różni się nieco od standardowego
UGA (standardowy kodon stop) czytany jest jako Trp
AGA i AGG (standardowe kodony dla Arg) czytane są jako
kodony stop
• Zawiera bardzo niewiele sekwencji nieulegających translacji
• Wysoka częstość mutacji (pięć do dziesięciu razy wyższa niż
dla DNA jądrowego)
• Badania porównawcze sekwencji mtDNA dostarczają dowo¬
dów na temat początków ewolucji naczelnych oraz innych
gatunków
1 Zaadaptowane z Harding AE: Neurological disease and mitochon-
drial genes, Trends Neurol Sci 1991 ;14:132. Copyright © 1991.
Przedrukowane za zgodą Elsevier.
Mitochondria u człowieka zawierają od dwóch
do dziesięciu kopii małej, kolistej dwuniciowej
cząsteczki DNA, stanowiącej ok. 1% całkowitej
ilości DNA w komórce. mtDNA koduje mtRNA
rybosomalny i transferowy dla 13 białek, odgry¬
wających kluczową rolę w łańcuchu oddecho¬
wym. Zlinearyzowaną mapę strukturalną ludz¬
kich genów mitochondrialnych pokazano na ryc.
35-8. Niektóre cechy mtDNA przedstawiono
w tab. 35-3.
Ważną cechą ludzkiego DNA mitochondrialne¬
go jest to, że jest on dziedziczony, w sposób nie-
mendlowski, po matce, jako że wszystkie mito¬
chondria trafiają do powstającej zygoty z komórki
jajowej. Chora matka może zatem teoretycznie
przekazać chorobę, mającą początek w mutacjach
mtDNA, całemu swemu potomstwu, ale tylko cór¬
ki będą przekazywać daną cechę. W niektórych
jednak przypadkach w trakcie oogenezy zachodzą
delecje w mtDNA, a zatem nie są przekazywane
przez matkę. Okazało się, że podłożem wielu cho¬
rób są mutacje mtDNA. Zaliczają się do nich róż¬
ne miopatie, schorzenia neurologiczne i niektóre
przypadki cukrzycy.
MATERIAŁ GENETYCZNY MOŻE
PODLEGAĆ ZMIANOM IREARANŻACJI
Zmiany sekwencji zasad purynowych i piry¬
midynowych w genie, spowodowane zamianą
- ubytkiem lub insercją-jednej lub kilku zasad,
103 par zasad
24 6 8 10 12 14 16
Ryc. 35-8. Mapy ludzkich genów mitochondrialnych. Mapy przedstawiają ciężką (górną) nić i lekką (dolną) nić zlinearyzowanego mi¬
tochondrialnego (mt) DNA, ukazując geny podjednostek oksydoreduktazy NADH-koenzym Q (od ND1 do ND6), oksydazy cytochromu
c (od C01 do C03), cytochromu b (CYT B) i syntazy ATP (ATPaza 8 i 6) oraz 12S i 16S rybosomalnych mt rRNA. Transferowe RNA
są oznaczone jako małe otwarte prostokąty. Strzałkami zaznaczono początek replikacji ciężkiej nici (OH) i lekkiej nici (OL), a także pro¬
motorów inicjacji transkrypcji ciężkiej nici (PH1 i PH2) oraz lekkiej nici (PL). (Reprodukowano za zgodą Moraes CT i in: Mitochondrial
DNA deletions in progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome. N Engl J Med 1989; 320:1293. Copyright © 1989.
Massachusetts Medical Society. Ali rights reserved.)
398 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
mogą być przyczyną tworzenia się zmienionego
produktu genu. Taka zmiana powoduje mutację,
której skutki omówiono w rozdz. 37.
Rekombinacja chromosomalna
jest jednym ze sposobów rearanżacji
materiału genetycznego
Informacja genetyczna może być wymieniana
pomiędzy podobnymi albo homologicznymi
chromosomami. Wymiana, czyli rekombinacja,
zachodzi w komórkach ssaków przede wszyst¬
kim w czasie mej ozy i wymaga równoległego
ustawienia homologicznych chromosomów, co
prawie zawsze odbywa się bardzo precyzyjnie.
Ryc. 35-9. Proces rekombinacji (crossing-over) między homo¬
logicznymi chromosomami, prowadzący do powstania rekombi-
nantów chromosomowych (p. również ryc. 35-12).
Na rycinie 35-9 pokazano, jak przebiega proces
crossing-over.
Wynikiem tego procesu jest równa i wzajemna
wymiana informacji genetycznej między homo¬
logicznymi chromosomami. Jeśli homologiczne
chromosomy mają różne allele tych samych ge¬
nów, crossing-over może spowodować zauwa¬
żalne i dziedziczne różnice w sprzężeniu genów.
W rzadkich przypadkach, gdy ułożenie homolo¬
gicznych chromosomów nie jest dokładne, cros-
sing-over (lub rekombinacja) powoduje nierów¬
nomierną wymianę informacji. Jeden z chromoso¬
mów może otrzymać mniej materiału genetyczne¬
go, a zatem może mieć delecje, podczas gdy drugi
chromosom może otrzymać więcej materiału
genetycznego w wyniku dołączenia materiału lub
jego podwojenia (ryc. 35-9). Nierównomierny
crossing-over występuje u ludzi, na co wskazuje
obecność hemoglobin typu Lepore lub anty-Lepo-
re (ryc. 35-10).
Im dalej leżą od siebie dwie sekwencje na jed¬
nym chromosomie, tym większe prawdopodo¬
bieństwo zajścia procesu crossing-over. Jest to
podstawą metod mapowania genetycznego. Nie¬
równy crossing-over oddziałuje na tandemową
organizację powtarzających się sekwencji DNA,
czy będą to np. spokrewnione geny globiny, jak na
ryc. 35-10, czy liczniejsze powtarzające się sek¬
wencje DNA. Nierównomierny crossing-over, po¬
wstający w wyniku „poślizgu”, powoduje zwięk¬
szenie lub zmniejszenie liczby kopii rodziny po¬
wtarzających się sekwencji i może mieć udział
w ekspansji i utrwalaniu wariantów w obrębie
tego uporządkowanego obszaru.
Niektóre wirusy mogą ulegać integracji
z chromosomami
Niektóre wirusy bakteryjne (bakteriofagi) są
zdolne do rekombinacji z DNA bakteryjnego
gospodarza w taki sposób, że informacja gene¬
tyczna bakteriofaga zostaje wbudowana liniowo
do genetycznej informacji gospodarza. Ta in¬
tegracja, która jest formą rekombinacji, zachodzi
według mechanizmu pokazanego schematycznie
na ryc. 35-11.
Struktura kolistego genomu bakteriofaga zo¬
staje przerwana, podobnie jak struktura cząstecz¬
ki DNA gospodarza; odpowiednie końce zostają
ponownie spojone z zachowaniem polamości.
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 399
Ryc. 35-10. Proces nierównomiernej
rekombinacji w regionie genomu ssa¬
ków zawierającym geny strukturalne dla
hemoglobiny oraz powstawanie produk¬
tów rekombinacji 8-p Lepore i p-8 anty-
-Lepore. Przykłady pokazują miejsca re¬
gionów, w których zaszła rekombinacja
pomiędzy resztami aminokwasowymi.
(Reprodukowane za zgodą z: Clegg JB,
Weatherall DJ: p° Thalassemia: time for
a reappraisal? Lancet 1974; 2: 133.
Copyright© 1974. Reprodukowane za
pozwoleniem Elsevier).
Gy Ay 8 p6 p
Gy Ay 5p
Lepore
W celu uproszczenia, DNA bakteriofaga scalające
się z cząsteczką bakteryjnego DNA (często będą¬
cego również zamkniętą formą kolistą) pokazano
w postaci rozprostowanej („liniowej”). Miejsce,
w którym genom bakteriofaga integruje, czyli
rekombinuje, z genomem bakteryjnym jest wy¬
bierane według jednego z dwóch mechanizmów.
Jeśli bakteriofag zawiera sekwencje DNA homo¬
logiczne z sekwencjami cząsteczki DNA gospo¬
darza, to może zajść rekombinacja analogiczna
do tej, jaka zachodzi między homologicznymi
B
C B A
-I— ' I I I I
1 2
Ryc. 35-11. Integracja kolistego genomu wirusa (zawierającego
geny A, B i C) z cząsteczką DNA gospodarza (zawierającą geny
1 i 2) i późniejsze ułożenie genów.
chromosomami. Jednakże niektóre bakteriofagi
syntetyzują białka, które wiążą swoiste miejsca
w chromosomach bakteryjnych z niehomolo-
gicznymi miejscami określonej cząsteczki DNA
bakteriofaga. Integracja taka zachodzi w określo¬
nym miejscu i nazywa się integracją „miejscowo
swoistą”.
Wiele wirusów zwierzęcych, zwłaszcza wiru¬
sy onkogenne, mogą się albo bezpośrednio, albo
- w przypadku wirusów RNA, takich jak HIV
powodujący AIDS - przez transkrypty DNA (po¬
wstające w wyniku działania wirusowej zależnej
od RNA polimerazy DNA lub odwrotnej trans-
kryptazy) integrować z chromosomami komórek
ssaków. Integracja DNA wirusów zwierzęcych
z genomem zwierzęcym na ogół nie jest „miej¬
scowo swoista”, cechują ją jednak pewne prefe¬
rencje.
Transpozycja może być
przyczyna powstawania
„przekształconych genów”
W komórkach eukariotycznych małe elementy
DNA, które na pewno nie są wirusami, mają
zdolność do transpozycji, czyli opuszczania
i wbudowywania się do genomu gospodarza
w taki sposób, że funkcja sąsiadujących sekwen¬
cji DNA zostaje naruszona. Te ruchome (mobil¬
ne) elementy, czasami nazywane „skaczącym
DNA”, mogą nieść za sobą flankujące odcinki
DNA i dzięki temu mogą znacznie wpływać na
procesy ewolucji. Jak już wcześniej wspomnia¬
no, rodzina Alu umiarkowanie często powta¬
rzanych sekwencji DNA ma charakterystyczne
400 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
cechy strukturalne, podobne do końcowych
odcinków retrowirusów, które u tych ostatnich
są odpowiedzialne za „wchodzenie” do genomu
i opuszczanie genomu ssaków.
Bezpośrednim dowodem na transpozycję in¬
nych małych elementów DNA w genomie czło¬
wieka było odkrycie „przekształconych genów”
dla cząsteczek immunoglobuliny, a-globiny
i wielu innych. Te przekształcone geny skła¬
dają się z sekwencji DNA identycznych lub
prawie identycznych z tymi, jakie znajdują się
w informacyjnym RNA, kodującym produkt od¬
powiedniego genu. W takich sekwencjach DNA
nietranskrybowany region 5', region kodujący
bez intronu oraz sekwencja (poli)A na końcu
3' sąsiadują ze sobą. Takie szczególne ułoże¬
nie sekwencji DNA musiało powstać przez od¬
wrotną transkrypcję przekształconej cząsteczki
informacyjnego RNA, z której zostały usunięte
regiony intronowe i został dodany szlak (poli)A.
Jedynym rozpoznanym mechanizmem, według
którego mogła się odbywać integracja odwrot¬
nego transkryptu do genomu, jest transpozycja.
Istotnie, takie „przekształcone geny” zawierają
krótkie końcowe powtarzane sekwencje przy
każdym ze swych końców, podobnie jak sekwen¬
cje, które uległy transpozycji u niższych organi¬
zmów. Przy braku transkrypcji i genetycznej se¬
lekcji funkcji, niektóre z tych przekształconych
genów zostały w trakcie ewolucji przypadkowo
zmienione w taki sposób, że obecnie mają non¬
sensowne kodony, które uniemożliwiają ekspre¬
sję tych genów (p. rozdz. 37). Geny takie określa
się nazwą „pseudogeny”.
Konwersja genu powoduje rearanżacje
Oprócz nierównego crossing-over i transpozycji,
istnieje trzeci mechanizm, który może wpływać
na szybkie zmiany w materiale genetycznym. Po¬
dobne do siebie sekwencje na homologicznych
lub niehomologicznych chromosomach mogą
przypadkowo wytwarzać między sobą sparowa¬
ne struktury dwuniciowe i eliminować wszystkie
sekwencje niesparowane. Proces ten może pro¬
wadzić do przypadkowego utrwalenia jednego
lub drugiego wariantu w rodzinie powtarzalnych
sekwencji i przez to powodować, że powtórzenia
rodzin sekwencji DNA staną się jednolite. Ten
ostatni proces jest nazywany konwersją genu.
Wymiana chromatyd siostrzanych
U diploidalnych organizmów eukariotycznych
(takich jak ludzie) komórki, które przeszły przez
fazę S, zawierają tetraploidalną ilość DNA. Wy¬
stępuje ona w postaci siostrzanych chromatyd
w każdej parze chromosomów (p. ryc. 35-6).
Każda z tych siostrzanych chromatyd zawie¬
ra identyczną informację genetyczną, ponieważ
każda z nich jest produktem semikonserwatyw-
nej replikacji pierwotnej macierzystej cząsteczki
DNA tego chromosomu. Między tymi genetycz¬
nie identycznymi siostrzanymi chromatydami za¬
chodzi crossing-over. Oczywiście takie wymiany
chromatyd siostrzanych (ryc. 35-12) nie mają
konsekwencji genetycznych tak długo, jak długo
wymiana jest wynikiem równego crossing-over.
Ryc. 35-12. Wymiany siostrzanych chromatyd między ludzkimi
chromosomami. Wymiany wykryto barwieniem, metodą Giem-
sy, chromosomów komórek, które miaty dwa cykle replikacji
w obecności bromodeoksyurydyny. Strzałki pokazują niektóre
regiony wymian. (Dzięki uprzejmości S. Wolff i J. Bodycote).
Rearanżacja genów immunoglobulin
W komórkach ssaków w czasie prawidłowego
rozwoju lub różnicowania zachodzą pewne inte¬
resujące rearanżacje genów. Na przykład u my-
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 401
szy geny VL i CL dla pojedynczej cząsteczki im-
munoglobuliny (p. rozdz. 38) są w germinalnej
linii DNA oddalone od siebie. W DNA komórek
zróżnicowanych, wytwarzających immunoglo-
bulinę (komórki plazmatyczne), te same geny VL
i CL fizycznie zbliżyły się do siebie w obrębie
genomu i utworzyły jednostkę transkrypcyjną.
Jednak nawet wówczas taka rearanżacja DNA
w czasie różnicowania nie spowodowała ułoże¬
nia genów VL i CL w ciągu w cząsteczce DNA.
Zamiast tego w cząsteczce DNA są zawarte roz¬
proszone, czyli wtrącone, sekwencje o długości
ok. 1200 par zasad, w miejscu lub sąsiedztwie
połączenia regionów V i C. Te wtrącone sekwen¬
cje zostają przepisane na RNA wraz z genami
VL i CL, a sekwencje wtrącone zostają usunięte
z RNA w czasie jego przekształceń w obrębie ją¬
dra (p. rozdz. 36 i 38).
SYNTEZA I REPLIKACJA DNA
SA ŚCIŚLE KONTROLOWANE
Podstawowym zadaniem replikacji DNA jest
dostarczenie potomstwu informacji genetycznej
zawartej w cząsteczce macierzystej. Replikacja
DNA musi więc być kompletna i na tyle wierna,
aby utrzymać stabilność genetyczną w obrębie
organizmów i gatunków. Proces replikacji DNA
jest złożony i obejmuje wiele funkcji komór¬
kowych oraz wiele procesów weryfikacyjnych,
gwarantujących wierność replikacji. W replikacji
/ chromosomu E. coli bierze udział ok. 30 białek;
u organizmów eukariotycznych proces ten jest
bardziej złożony. Pierwszych obserwacji enzy-
mologicznej replikacji DNA u E. coli dokonał
Arthur Komberg, który opisał występowanie
w tym organizmie enzymu, nazywanego obecnie
polimerazą DNA I. Enzym ten wykazuje wie¬
le aktywności katalitycznych, złożoną strukturę
i powinowactwo do trifosforanów 4-deoksyrybo-
nukleozydów adeniny, guaniny, cytozyny i tymi-
ny. Reakcja polimeryzacji, katalizowana u E. co¬
li przez polimerazę DNA I, była pierwowzorem
reakcji wszystkich polimeraz DNA zarówno
u organizmów prokariotycznych, jak i eukario¬
tycznych, choć obecnie wiadomo, że główna rola
tej polimerazy polega na ukończeniu replikacji
nici opóźnionej.
We wszystkich komórkach replikacja może
się odbywać tylko na matrycy jednoniciowego
DNA (ssDNA). Przede wszystkim musi istnieć
mechanizm ustalania miejsca inicjacji replika¬
cji i rozwijania dwuniciowego DNA (dsDNA)
w określonym rejonie. Następnie musi się utwo¬
rzyć kompleks replikacyjny. Po ukończeniu re¬
plikacji w danym rejonie nić macierzysta i nowo
powstała nić siostrzana muszą odtworzyć dsDNA.
W komórkach eukariotycznych konieczny jest
jeszcze dodatkowy etap. Dwuniciowy DNA musi
precyzyjnie odtworzyć strukturę chromatyny,
łącznie z nukleosomami, które istniały, zanim
rozpoczęła się replikacja.
Tabela 35-4. Fazy replikacji DNA w komórkach eukariotycznych
1. Identyfikacja miejsca początku replikacji
2. Rozplecenie (denaturacja) dsDNA w celu utworzenia matrycy
ssDNA
3. Utworzenie widełek replikacyjnych
4. Inicjacja syntezy DNA i elongacja
5. Utworzenie „banieczek” replikacyjnych i ligacja zsyntetyzo-
wanych segmentów DNA
6. Odtworzenie struktury chromatynowej
Choć proces ten zachodzący w komórkach
eukariotycznych nie został dobrze poznany, to
jednak proces w komórkach prokariotów został
dobrze opisany i sądzi się, że ogólne zasady są
takie same dla obu rodzajów komórek. Podsta¬
wowe etapy replikacji przedstawiono w tab. 35-4
i pokazane na ryc. 35-13; zostały też kolejno omó¬
wione poniżej. W procesie tym bierze udział wie¬
le białek, w większości wykazujących aktywność
enzymatyczną (tab. 35-5).
Początek replikacji
W miejscu rozpoczęcia replikacji (ori, ang.
origin of replication) następuje asocjacja białek
wiążących swoiste sekwencje dsDNA z sekwen¬
cjami DNA typu powtórzeń prostych (ang. direct
repeats). U bakteriofaga X region ori>- wiąże
białko O do czterech przyległych miejsc. Z kolei
u E. coli sekwencja oriC wiąże białko dnaA.
W obu przypadkach tworzy się kompleks zło¬
żony ze 150-250 pz DNA i multimerów białka
wiążącego DNA. Prowadzi to do miejscowej
402 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
* „ = Powstający DNA
[ I = Helikaza
A = Primaza
... = SSB
Ryc. 35-13. Fazy replikacji DNA. Na tej rycinie pokazano replikację DNA w komórce E. coli, ale podstawowe fazy replikacji są
podobne w komórkach eukariotycznych. Swoiste oddziaływanie białka (białko 0) z miejscem rozpoczęcia replikacji (ori) powoduje
miejscowe rozplecenie DNA w przyległym obszarze bogatym w A+T. W tym obszarze DNA zachowuje konformację jednoniciową
(ssDNA) dzięki białkom wiążącym pojedyncze nici (SSB). Umożliwia to wielu białkom, takim jak helikaza, primaza i polimeraza DNA,
związanie i zapoczątkowanie syntezy DNA. Widełki replikacyjne przesuwają się w miarę jak zachodzi ciągła synteza DNA (strzałka
długa) na nici wiodącej. Na nici opóźnionej (strzałki krótkie) synteza zachodzi w sposób nieciągły. Powstający DNA jest zawsze
syntetyzowany w kierunku od 5' do 3', ponieważ polimerazy DNA mogą dodawać nukleotyd tylko na końcu 3' nici DNA.
Tabela 35-5. Klasy białek biorących udział w replikacji
Biatko
Funkcja
Polimerazy DNA
Polimeryzacja deoksynukleotydów
Helikazy
Rozplatanie DNA
Topoizomerazy
Usuwanie dodatnich superskrętów powstałych w trakcie rozplatania przez helikazę
Primaza DNA
Inicjowanie syntezy starterów RNA
Białka wiążące jednoniciowy DNA
Zapobieganie przedwczesnej renaturacji dsDNA
Ligaza DNA
Uzupełnianie jednoniciowych ubytków pomiędzy powstającym łańcuchem i fragmentami
Okazaki na nici opóźnionej
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 403
denaturacji i rozplecenia (rozwinięcie) dwunicio-
wej helisy przyległego regionu DNA bogatego
w A+T. Podobne funkcjonalnie autonomicznie
replikujące się sekwencje (ang. ARS) zosta¬
ły stwierdzone w komórkach drożdży. Każda
z sekwencji ARS zawiera w pewnym sensie zde-
generowaną sekwencję 11 pz, zwaną elementem
replikacyjnym miejsca inicjacji (ORE, ang. ori-
gin replication element). Sekwencja ORE wiąże
się z kompleksem białkowym, analogicznym do
białka dnaA u E. coli, zwanym kompleksem roz¬
poznającym miejsce inicjacji (ORC, ang. origin
recognition complex). Homologi ORC znaleziono
u wszystkich badanych organizmów eukariotycz¬
nych. Sekwencje ORE sąsiadują z bogatą w A+T
sekwencją 80 pz, która łatwo ulega rozplataniu.
Jest to tzw. element rozplatający DNA (DUE,
ang. DNA unwinding element). DUE jest miej¬
scem rozpoczęcia replikacji u drożdży.
Sekwencje zgodne, podobne pod względem
struktury i funkcji do sekwencji ori lub ARS, nie
zostały w komórkach ssaków precyzyjnie określo¬
ne, choć poznano wiele białek, które biorą udział
w rozpoznawaniu i funkcjonowaniu ori; białka te
wydają się całkiem podobne do swoich odpowied¬
ników u drożdży, zarówno pod względem sekwen¬
cji aminokwasowej, jak i pełnionej funkcji.
Rozplatanie DNA
Oddziaływanie białek z sekwencjami ori określa
miejsce rozpoczęcia replikacji i tworzy krótki
rejon ssDNA niezbędny do zainicjowania synte¬
zy nici DNA. Proces ten wymaga oddziaływania
białko-białko i białko-DNA. Krytycznym eta¬
pem jest udział helikazy DNA, umożliwiający
stopniowe rozplatanie DNA. W niezakażonych
bakteriach E. coli funkcję tę pełni kompleks he¬
likazy dnaB i białka dnaC. Białka wiążące jed-
noniciowy DNA (SSB, od ang. single-stranded
DNA-binding proteins) stabilizują ten kompleks.
W bakteriach E. coli zakażonych fagiem X biał¬
ko P faga wiąże się z dnaB i kompleks P/dnaB
wiąże się z oriA, dzięki oddziaływaniu z białkiem
O. Helikaza dnaB nie jest helikazą aktywną, jeśli
występuje w kompleksie P/dnaB/O. Kooperujące
ze sobą trzy białka szoku cieplnego E. coli (dnaK,
dnaJ i GrpE) usuwają białko P i aktywują helika-
zę dnaB. Przy współdziałaniu z SSB prowadzi to
do rozwinięcia DNA i aktywnej replikacji. W ten
sposób replikacja faga X zostaje dokonana kosz¬
tem replikacji komórki-gospodarza E. coli.
Powstawanie widełek replikacyjnych
Widełki replikacyjne powstają w miejscu, gdzie
zbiegają się cztery komponenty procesu replika¬
cji DNA, zachodzące w następującej kolejności:
1) helikaza DNA rozplata krótki segment macie¬
rzystego dwuniciowego DNA; 2) primaza zapo¬
czątkowuje biosyntezę cząsteczki RNA, która jest
niezbędna do rozpoczęcia (ang. priming) biosyn¬
tezy DNA; 3) polimeraza DNA zapoczątkowuje
biosyntezę nowej siostrzanej nici; 4) białka SSB
wiążą się z ssDNA i zapobiegają przedwczesnej
renaturacji ssDNA do dsDNA. Omawiane kom¬
ponenty pokazano na ryc. 35-13.
Holoenzym polimerazy III (u E. coli jest to pro¬
dukt genu dnaE) wiąże się z matrycą DNA jako
część wielobiałkowego kompleksu, który składa
się z różnych czynników pomocniczych polimera¬
zy ((3, y, 8,8' oraz i). Polimerazy DNA syntetyzują
jedynie DNA w kierunku od 5' do 3' i tylko jedna
z różnych typów polimeraz bierze udział w repli¬
kacji w rejonie widełek. Ponieważ nici DNA są
antyrównoległe (spolaryzowane w przeciwstaw¬
nych kierunkach, p. rozdz. 34), polimeraza działa
asymetrycznie. Na nici wiodącej DNA jest syn¬
tetyzowany w sposób ciągły. Na nici opóźnionej
(wstecznej) DNA jest syntetyzowany w posta¬
ci krótkich (1-5 tysięcy zasad; patrz ryc. 35-16)
fragmentów, zwanych fragmentami Okazaki.
W każdych widełkach replikacyjnych musi zo¬
stać kolejno zsyntetyzowanych wiele fragmentów
Okazaki (do 250). Aby ten proces mógł nastąpić,
helikaza działa na nici opóźnionej, by rozwinąć
dsDNA w kierunku od 5' do 3'. Aby zapewnić
primazie odpowiedni dostęp do matrycy, helikaza
łączy się z nią. Pozwala to na wytworzenie prime-
ru RNA na nici opóźnionej i potem rozpoczęcie
replikacji DNA przez polimerazę. Jest to ważna
sekwencja reakcji, ponieważ polimerazy nie mo¬
głyby zainicjować syntezy DNA de novo. Ruchli¬
wy kompleks złożony z helikazy i primazy nazwa¬
no primosomem. Gdy synteza fragmentu Okazaki
jest ukończona i polimeraza odszczepiona, synte¬
tyzuje się nowy primer. Ta sama cząsteczka poli¬
merazy pozostaje zasocjowana z widełkami repli-
kacyjnymi, aby następnie wziąć udział w syntezie
kolejnego fragmentu Okazaki.
404 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Kompleks polimerazy DNA
W replikacji DNA bierze udział wiele różnych
polimeraz. Mają one następujące wspólne włas¬
ności: (1) wydłużanie łańcucha, (2) procesyw-
ność, (3) sprawdzanie poprawności replikacji.
Wydłużanie łańcucha jest wyrażane szybkością
(w nukleotydach na sekundę), z jaką zacho¬
dzi polimeryzacja. Procesywność określa licz¬
ba nukleotydów dodawanych do powstającego
łańcucha przed odłączeniem się polimerazy od
matrycy. Funkcja sprawdzania poprawności re¬
plikacji identyfikuje błędy kopiowania i je na¬
prawia. U bakterii E. coli polimeraza III (poi III)
działa w widełkach replikacyjnych. Katalizuje
ona wydłużanie łańcucha najszybciej spośród
wszystkich polimeraz i jest z nich najbardziej
procesywna. Jest zdolna w trakcie jednego cyklu
spolimeryzować na nici wiodącej łańcuch DNA
zawierający 0,5 miliona zasad. Pol III jest dużym
(masa cząsteczkowa >1 MDa) kompleksem biał¬
kowym zawierającym 10 podjednostek (E. coli).
Dwie identyczne podjednostki P polimerazy III
otaczają matrycę DNA, tworząc przesuwający
się „zacisk”, co tłumaczy stabilność kompleksu
i wysoką procesywność wykazywaną przez ten
enzym.
Polimeraza II (poi II) jest głównie zaanga¬
żowana w sprawdzanie poprawności replikacji
i w naprawę DNA. Polimeraza I (poi I) uzupeł¬
nia syntezę łańcucha pomiędzy fragmentami
Okazaki na nici opóźnionej. Komórki eukario¬
tyczne mają swoje odpowiedniki każdego z tych
enzymów, a ponadto zawierają enzymy dodat¬
kowe. Funkcje polimeraz DNA u prokariotów
i eukariotów przedstawiono w tab. 35-6.
Tabela 35-6. Zestawienie porównawcze funkcji polimeraz
eukariotycznych i prokariotycznych
E. coli
Ssaki
Funkcje
1
a
Uzupełnianie przerw i synteza nici
opóźnionej
II
e
Sprawdzanie poprawności syntezy
DNA i naprawa DNA
p
Naprawa DNA
Y
Synteza mitochondrialnego DNA
III
5
Procesywne, synteza nici wiodącej
W komórkach ssaków polimeraza może spo¬
limeryzować ok. 100 nukleotydów na sekundę;
szybkość ta jest co najmniej 10-krotnie mniejsza
od szybkości polimeryzacji deoksynukleotydów
przez kompleks bakteryjnej polimerazy DNA.
Zmniejszona szybkość biosyntezy w komórkach
eukariotycznych może wynikać z obecności nu-
kleosomów. Nie jest wiadomo, jak kompleks re-
plikacyjny radzi sobie z nukleosomami.
Inicjacja i elongacja syntezy DNA
Synteza DNA (ryc. 35-14) zostaje zapoczątkowa¬
na (ang. priming) przez krótkie fragmenty RNA
(primery) o długości 10-200 nukleotydów. Proces
inicjacji syntezy obejmuje atak nukleofilowy gru¬
py 3'-hydroksylowej primera RNA na a-fosforan
pierwszego wchodzącego trifosforanu deoksynu-
kleozydu (N na ryc. 35-14) i odszczepienie piro-
fosforanu.
Grupa 3'-hydroksylowa nowo przyłączonego
monofosforanu deoksyrybonukleozydu jest przy¬
gotowana do ataku nukleofilowego na resztę
a-fosforanową następnego (N + 1 na ryc. 35-14)
wchodzącego trifosforanu deoksyrybonukleozy¬
du, z odszczepieniem pirofosforanu. Oczywiście
wybór odpowiedniego deoksyrybonukleotydu,
którego końcowa grupa 3'-hydroksylowa będzie
atakowana, zależy od odpowiedniego parowania
z siostrzaną nicią cząsteczki DNA, stosownie do
reguły zaproponowanej przez Watsona i Cricka
(ryc. 35-15).
Kiedy cząsteczka monofosforanu deoksyrybo¬
nukleozydu adeniny znajduje się w odpowiednim
miejscu na matrycy, do rosnącej nowej nici włą¬
cza się trifosforan tymidyny, a jego reszta a-fo-
sforanowa jest atakowana przez grupę 3'-hydro¬
ksylową monofosforanu deoksyrybonukleozydu
świeżo dodanego do polimeru. W tym stopnio¬
wym procesie nić matrycowa „dyktuje”, która
cząsteczka trifosforanu deoksyrybonukleozydu
jest komplementarna i dzięki wiązaniom wodoro¬
wym utrzymuje go w miejscu, podczas gdy grupa
3'-hydroksylowa rosnącej nici atakuje i powoduje
inkorporację nowego nukleotydu do polimeru. Te
fragmenty DNA, które zostają dołączone do czą¬
steczki inicjującego RNA, zostały wykryte przez
Okazaki i nazywane są obecnie fragmentami
Okazaki (ryc. 35-16). U ssaków, jeśli powsta¬
nie wiele fragmentów Okazaki, kompleks replika-
Ryc. 35-14. Inicjacja syntezy DNA na primerze RNA i następujące po tym dołączenie drugiego trifosforanu deoksyrybonukleozydu.
406 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
cyjny zaczyna usuwać primery RNA i uzupełniać
ubytki powstałe wskutek ich usunięcia przy udzia¬
le odpowiednich deoksynukleotydów, dobieranych
na zasadzie parowania zasad, a następnie rozpoczy¬
na się łączenie fragmentów nowo zsyntetyzowa-
nych DNA przez enzymy zwane ligazami DNA.
DNA matrycowy
Proces replikacji jest polarny
Jak już wspomniano, cząsteczki DNA są dwuni-
ciowe, przy czym te dwie nici są antyrównoległe,
tj. biegną w przeciwnych kierunkach. Replikacja
DNA u prokariotów i eukariotów zachodzi jedno-
5'
5'
Primer
RNA
Nowo zsyntetyzowana
nić DNA
10 pz
100 pz
Fragmenty Okazaki
h*H
Ryc. 35-16. Nieciągła polimeryzacja deoksyrybonukleotydów na nici opóźnionej: pokazano tworzenie fragmentów Oka¬
zaki podczas syntezy opóźnionej nici DNA. Fragmenty Okazaki u eukariotów liczą 100-250 nukleotydów, u prokariotów
zaś 1000-2000 pz.
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 407
cześnie na obu niciach. Jednak żaden organizm nie
wytwarza enzymu zdolnego polimeryzować DNA
w kierunku od 3' do 5'. Z tego powodu obie świe¬
żo zreplikowane nici DNA nie mogą się wydłużać
jednocześnie w tym samym kierunku. Niemniej,
w replikacji obu nici uczestniczy ten sam enzym
i w tym samym czasie. Pojedynczy enzym repliku¬
je jednąnić („nić wiodącą”) w sposób ciągły w kie¬
runku od 5' do 3', tj. zgodnym z głównym kierun¬
kiem replikacji. Ten sam enzym prowadzi replika-
cję siostrzanej nici („nici opóźnionej”), polimeryzu¬
jąc w sposób nieciągły nukleotydy w krótkich od¬
cinkach o długości 150-250 nukleotydów, również
w kierunku od 5' do 3'; jednocześnie jednak synteza
biegnie w kierunku tylnego końca poprzedzającego
primera RNA, a nie w kierunku niezreplikowanej
części cząsteczki. Taki proces połowicznej, niecią¬
głej biosyntezy DNA jest pokazany schematycznie
na ryc. 35-13 oraz 35-16.
W genomie jądrowym ssaków większość prime-
rów RNA jest usuwana w trakcie procesu replika¬
cji, podczas gdy w replikacji mitochondrialnego
genomu małe odcinki RNA pozostają jako integral¬
na część zamkniętych kołowych struktur DNA.
Tworzenie baniek replikacyjnych
W kolistym, bakteryjnym chromosomie (zawiera¬
jącym ok. 6><106 par zasad) replikacja postępuje
od pojedynczego ori (miejsca rozpoczęcia repli¬
kacji). Proces ten trwa ok. 30 min, co odpowiada
szybkości 3 x 105 par zasad na minutę. Z kolei cały
genom ssaków replikuje się w ciągu 9 godz. -
okres potrzebny do utworzenia w replikującej ko¬
mórce tetraploidalnego genomu z genomu diploi-
dalnego. Jeśliby genom ssaków (3x 109 par zasad)
replikował się z taką szybkością jak u bakterii (tj.
3x 105 pz/min) z jednego tylko miejsca inicjacji, to
proces ten zająłby ponad 150 godz.! Organizmy
wyższe radzą sobie z tym problemem w dwojaki
sposób. Po pierwsze, replikacja przebiega wzdłuż
chromosomu w obu kierunkach. Po drugie, repli¬
kacja przebiega z wielu miejsc inicjacji w każdym
chromosomie (u człowieka ok. 100 takich jedno¬
stek replikacyjnych). W takim procesie replikacji
tworzą się „bańki replikacyjne” (ryc. 35-17).
Różnorodne miejsca, w których rozpoczyna się
proces replikacji DNA u eukariotów zostały sła¬
bo określone, z wyjątkiem niektórych wirusów
zwierzęcych i drożdży. Wiadomo, że inicjacja jest
regulowana zarówno w przestrzeni, jak i w czasie,
ponieważ zgrupowania przyległych miejsc rozpo¬
czynają replikację w sposób zsynchronizowany.
Inicjacja replikacji DNA w miejscu replikatoro-
wym/ori zależy od różnorakich cech struktury
chromatyny, które dopiero zaczynają być rozpo¬
znawane. Stwierdzono jednak, że występuje wię¬
cej replikatorów i nadmiar ORC w stosunku do
potrzeb replikacji genomu ssaków w czasie przy¬
padającym na typową fazę S cyklu. Muszą zatem
działać mechanizmy kontroli nadmiaru replikato¬
rów związanych z ORC. Zrozumienie tego proce¬
su jest wielkim wyzwaniem.
W czasie replikacji DNA jego dwie nici muszą
być od siebie oddzielone, aby każda z nich mogła
służyć jako matryca wiążąca wiązaniami wodo¬
rowymi swoich nukleotydów wprowadzane tri fo¬
sforany deoksynukleozydów. Oddzielenie dwuni-
ciowej helisy DNA odbywa się przy współudziale
cząsteczek białka SSB, które stabilizują strukturę
Początek replikacji
replikacji
Ryc. 35-17. Powstawanie „baniek replikacyjnych” w procesie syntezy DNA. Przedstawiono reakcje w obu kierunkach i prawdopodobne
pozycje białek rozwijających w widełkach replikacyjnych.
408 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
jednoniciową w miarę przesuwania się widełek
replikacyjnych. Białka stabilizujące przyłączają
się stechiometrycznie do pojedynczych nici, nie
zaburzając przy tym zdolności nukleotydów do
pełnienia ich funkcji matrycowych (p. ryc. 35-
-13). Oprócz rozdzielenia dwóch nici podwójnej
helisy musi zajść proces rozplecenia cząsteczki
(raz na każde 10 par nukleotydów). Biorąc pod
uwagę czas potrzebny na replikację DNA, proces
rozplatania musi zachodzić stopniowo. W czą¬
steczkach DNA wszystkich organizmów wystę¬
puje wiele rozproszonych obrotowych widełek
(„swivels”). Działanie takich widełek zapewniają
swoiste enzymy, które „tną” jedną z nici roz¬
kręcającej się podwójnej helisy, co umożliwia
postępowanie procesu rozkręcania helisy. Nacię¬
cia te są ponownie szybko spajane bez nakładu
energii, ponieważ jednocześnie tworzy się wyso¬
koenergetyczne wiązanie kowalencyjne między
naciętym szkieletem fosfodiestrowym i enzymem
wykazującym aktywność cięcia i spajania nici
(ang. nicking-resealing enzyme). Enzymy takie
zostały nazwane topoizomerazami DNA. Proces
naprawiania nici przedstawiono schematycznie na
Krok 1 Topoizomeraza DNA klasy I = E
Bj®-e
Ligaza DNA = E
E + ATP 2= e-0-(rHą)
(AMP-enzym)
Nacięcie pojedynczej nici
0* 3' przez enzym (E)
H
=1®-E
- q* ' Tworzenie wiązania
wysokoenergetycznego
5'
Bi)
Istniejące nacięcie jednej nici
0 3'
H
■ehJHrKą)
BiJ)y<£Ha>“©
Zho
0—®-®
(AMP)
Naprawione nacięcie
Naprawione nacięcie
Ryc. 35-18. Dwa typy reakcji naprawiania nacięć w DNA. Ciąg reakcji po stronie lewej jest katalizowany przez
topoizomerazę DNA klasy I, po stronie prawej zaś przez ligazę DNA; P = fosforan, R = ryboza, A = adeni¬
na. (Nieco zmodyfikowane i reprodukowane za zgodą Lehninger A.L.: Biochemistry, 2nd ed. Worth, 1975.
Copyright © 1975 by Worth Publishers. Reprodukowano za zgodą WH Freeman and Company).
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 409
ryc. 35-18 i porównano z zależnym od ATP pro¬
cesem spajania, który zachodzi przy udziale ligaz
DNA.
Topoizomerazy są ponadto zdolne do rozkręca¬
nia superskręconego DNA. Superskręcony DNA
jest wyższego rzędu strukturą kolistych cząsteczek
DNA, zwiniętych wokół rdzenia, jak to pokazano
na ryc. 35-19.
Ryc. 35-19. Superzwoje DNA. Lewoskrętny toroidalny (so-
lenoidalny) superzwój (na lewo) i forma odwrócona - pra-
woskrętny, wewnętrznie zwinięty superzwój powstający po
usunięciu cylindrycznego rdzenia. Takie przekształcenie jest
analogiczne do tego, jakie zachodzi po rozerwaniu nukleoso-
mów w wyniku ekstrakcji histonów z chromatyny stężonymi
roztworami soli.
Jeden z gatunków wirusów zwierzęcych (retro-
wirusów) wytwarza enzymy zdolne do syntezy
jednoniciowej, a następnie dwuniciowej cząstecz¬
ki DNA z jednoniciowej matrycy RNA. Taka za¬
leżna od RNA polimeraza DNA, czyli „odwrotna
transkryptaza”, syntetyzuje najpierw hybrydo¬
wą cząsteczkę DNA-RNA, wykorzystując genom
RNA jako matrycę. Swoisty, kodowany przez wi¬
rus, enzym RNaza H degraduje nić RNA, a pozo¬
stała nić DNA służy z kolei jako matryca do utwo¬
rzenia dwuniciowej cząsteczki DNA zawierającej
informację zakodowaną pierwotnie w genomie
RNA zwierzęcego wirusa.
Odtwarzanie struktury chromatyny
Istnieją dowody na to, że organizacja jądra i struk¬
tura chromatyny determinują regulację i inicjację
biosyntezy DNA. Jak już wspomniano, szybkość
polimeryzacji nukleotydów w komórkach eukario¬
tycznych, które zawierają chromatynę i nukleo-
somy, jest dziesięciokrotnie mniejsza niż w ko¬
mórkach prokariotycznych, w których występuje
„nagi” DNA. Wiadomo też, że po replikacji musi
zostać odtworzona struktura chromatyny. Zrep-
likowany DNA jest szybko organizowany w nu-
kleosomy, a już obecne lub zgromadzone na nowo
oktamery histonów rozmieszczają się na każdym
ramieniu widełek replikacyjnych.
Biosynteza DNA zachodzi w czasie
fazy S cyklu komórkowego
W komórkach zwierzęcych, także w ludzkich, re¬
plikacja DNA genomu odbywa się tylko w okre¬
ślonym czasie życia komórki. Czas ten jest nazy¬
wany okresem syntezy albo fazą S. Jest on zwykle
oddzielony od fazy mitotycznej fazami, w których
nie zachodzi synteza DNA, określane jako prze¬
rwa 1 (ang. Gapl-Gl) i przerwa 2 (ang. Gap2-
-G2). Jedna z nich występuje przed fazą S (Gl),
a druga po niej (G2) (ryc. 35-20).
Komórka przygotowuje się do syntezy DNA
w fazie Gl, a do mitozy w fazie G2. Komórki
regulują biosyntezę swego DNA, „pozwalając”
procesowi przebiegać tylko w określonym czasie
i głównie w komórkach przygotowujących się do
podziału w procesie mitozy.
Wydaje się, że wszystkie komórki eukariotycz¬
ne zawierają produkty genów, tj. białka, które
nadzorują przejście z jednej fazy cyklu komór¬
kowego do drugiej. Stężenie białek z rodziny
cyklin zwiększa się lub zmniejsza w czasie cyklu
komórkowego - od tego wywodzi się ich nazwa.
Cykliny aktywują w odpowiednim czasie róż¬
ne zależne od cyklin kinazy białkowe (CDK,
ang. cyclin-dependent protein kinases), które fos-
forylują substraty niezbędne do przebiegu cyklu
komórkowego (ryc. 35-21). Na przykład stężenie
cykliny D zwiększa się w późnym okresie fazy G1,
co umożliwia kontynuowanie cyklu poza punkt
410 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Wykrycie nieprawidłowego
wrzeciona
1
niekompletnej
replikacji
startowy (u drożdży) lub poza punkt restrykcyj¬
ny (u ssaków). Są to punkty (miejsca), poza
którymi komórki nieodwracalnie wkraczają
w fazę S, czyli w fazę biosyntezy DNA.
Cykliny D aktywują CDK4 i CDK6. Te dwie
kinazy są także syntetyzowane w fazie G1 w ko¬
mórkach, w których zachodzą aktywne podziały.
Cykliny D oraz CDK4 i CDK6 są białkami jądro¬
wymi, które gromadzą się jako kompleks w późnej
fazie Gl. Kompleks wykazuje aktywność kinazy,
Ryc. 35-20. Cykl komórkowy w komórkach ssaków
i punkty kontrolne cyklu. Integralność DNA, chromoso¬
mów i ich segregacji jest stale monitorowana w trakcie
cyklu komórkowego. Jeśli uszkodzenie DNA zostanie
wykryte w fazie G1 lub G2 cyklu, jeśli genom zosta¬
nie niecałkowicie zreplikowany lub jeśli mechanizm
prawidłowej segregacji chromosomów jest zaburzony
(tzn. wrzeciono zostało uszkodzone), to komórki nie są
w stanie przebrnąć przez fazę cyklu, w której został wy¬
kryty defekt. Niekiedy, jeśli uszkodzenie nie może zostać
naprawione, komórki ulegają apoptozie (programowa¬
nej śmierci komórki).
swoistą dla seryny i treoniny. Jednym z substra¬
tów dla tej kinazy jest białko Rb (od retinoblasto-
ma). Białko Rb jest regulatorem cyklu komórko¬
wego, ponieważ wiąże ono i inaktywuje czynnik
transkrypcyjny (E2F), niezbędny do transkrypcji
pewnych genów (genów histonów, białek repli¬
kacji DNA itd.) i do przejścia z fazy Gl do fazy
S. Fosforylacja białka Rb przez kinazy CDK4 lub
CDK6 powoduje zniesienie represji transkrypcji
E2F, w której pośredniczy Rb, w wyniku czego
CDK2-cyklina A
CDK2-cyklina E
Ryc. 35-21. Graficzne przedstawienie punktów w cyklu
komórkowym ssaków, w których są aktywowane poka¬
zane cykliny i zależne od cyklin kinazy. Grubość różnych
pokolorowanych linii odzwierciedla poziom aktywności.
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 411
zachodzi aktywacja genów i następuje progresja
cyklu komórkowego.
W różnych procesach cyklu komórkowego
uczestniczą inne cykliny i kinazy CDK (tab. 35-
-7). Cyklina E i kinaza CDK2 tworzą kompleks
w późnej fazie G1. Cyklina E jest następnie szyb¬
ko degradowana, a uwolniona CDK2 tworzy
kompleks z cykliną A. Ta sekwencja zdarzeń jest
niezbędna do inicjacji biosyntezy DNA w fazie
S. Kompleks cykliny B i kinazy CDK1 ogranicza
szybkość przejścia G2/M w komórkach eukario¬
tycznych.
Tabela 35-7. Cykliny i zależne od cyklin kinazy uczestniczące
w cyklu komórkowym
Cyklina
Kinaza
Funkcja
D
CDK4,
Przejście poza punkt restrykcyjny
CDK6
na granicy G1/S
E, A
CDK2
Inicjacja biosyntezy DNA we wczesnej
fazie S
B
CDK1
Przejście z fazy G2 do M
Wiele wirusów wywołujących nowotwory (on-
kowirusy) i geny indukujące nowotwory (onko-
geny) mają zdolność zmiany lub likwidowania
ograniczeń, które zwykle kontrolują przejście ko¬
mórki ssaków z fazy G1 do fazy S. Na podstawie
poprzednich rozważań można przypuszczać, że
nadmierne wytwarzanie cykliny lub wytwarzanie
jej w nieodpowiednim czasie może prowadzić
do nieprawidłowych lub nieograniczonych po¬
działów komórkowych. W tym kontekście warto
zwrócić uwagę na to, że onkogen bel, związany
zchłoniakiem wywodzącym się z komórek B,
jest genem kodującym cyklinę Dl. Podobnie on-
koproteiny (białka transformujące), wytwarzane
przez wiele wirusów DNA, obierają za cel in-
aktywacji represor transkrypcji Rb, indukując
w ten sposób niewłaściwe podziały komórek.
W czasie fazy S w komórkach ssaków wystę¬
pują większe ilości polimerazy DNA niż w fazach
cyklu komórkowego, w których nie zachodzi syn¬
teza. Ponadto enzymy, które są odpowiedzialne za
wytworzenie substratów do biosyntezy DNA, tj.
trifosforanów deoksyrybonukleozydów, zwięk¬
szają także swoją aktywność, która zmniejsza się
po fazie biosyntezy dopóty, dopóki znów nie po¬
jawi się sygnał do wznowienia biosyntezy DNA.
W czasie fazy S jądrowy DNA jest replikowa¬
ny w całości raz i tylko raz. Wydaje się, że raz
zreplikowana chromatyna jest tak „naznaczona”,
że jej dalsza replikacja jest niemożliwa do czasu,
aż przejdzie ona ponownie przez okres mitozy.
Mechanizm molekularny tego zjawiska nie został,
jak dotąd, wyjaśniony.
Zwykle dana para chromosomów replikuje
jednocześnie i w określonej części fazy S w każ¬
dym cyklu replikacyjnym. W obrębie chromo¬
somu zgrupowania jednostek replikacyjnych są
replikowane w sposób skoordynowany. Natura
sygnałów, które regulują biosyntezę DNA na
tych poziomach, nie jest znana, ale regulacja
wydaje się wewnętrzną właściwością każdego
chromosomu.
Uszkodzony DNA jest naprawiany
enzymatycznie
Utrzymanie integralności informacji w cząs¬
teczkach DNA jest problemem niezwykle waż¬
nym dla życia każdego organizmu oraz wszyst¬
kich gatunków. Można więc wyciągnąć wniosek,
że gatunki, które przeżyły, wytworzyły w proce¬
sie ewolucji mechanizmy naprawiania uszkodzeń
DNA, powstałych w wyniku błędów replikacyj¬
nych lub wpływu szkodliwych czynników środo¬
wiskowych.
W rozdziale 34 wyjaśniono, że za wierność repli¬
kacji jest odpowiedzialne głównie swoiste parowa¬
nie zasad nukleotydów. Odpowiednie parowanie
zależy od obecności uprzywilejowanych postaci
tautomerycznych nukleotydów purynowych i pi¬
rymidynowych, ale równowaga, w której jeden
tautomer jest bardziej stabilny niż inny, wynosi
tylko 104 lub 105 na korzyść tautomeru o większej
stabilności. Chociaż nie jest to wystarczające do
zagwarantowania wierności replikacji, faworyzo¬
wanie wybranych tautomerów, a zatem odpowied¬
nie parowanie zasad, może być zapewnione przez
dwukrotne monitorowanie procesu parowania
zasad. Takie podwójne monitorowanie występuje
zarówno w komórkach bakterii, jak i ssaków: po
raz pierwszy w trakcie włączania trifosforanów
deoksyrybonukleozydów, a później przez pono¬
wną kontrolę i wymagający energii mechanizm,
usuwający wszystkie nieprawidłowe zasady, które
mogą się pojawić w nowo wytworzonej nici. Ten
podwójny monitoring zapobiega powstawaniu błę-
412 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
dów nieodpowiedniego parowania zasad z powodu
obecności niefaworyzowanych tautomerów z częs¬
tością większą niż raz na każde 108-1010 par zasad
zsyntezowanego DNA. U bakterii E. coli odpo¬
wiedzialna za taki mechanizm monitorowania jest
aktywność egzonukleazowa 3'—>5' jednej z pod-
jednostek kompleksu polimerazy III oraz cząstecz¬
ki polimerazy I. Analogiczne polimerazy DNA
ssaków (5 oraz a) prawdopodobnie nie wykazują
takich korekcyjnych właściwości nukleazowych;
funkcję naprawczą sprawują inne enzymy.
Nawet jeśli istnieje bardzo skuteczny system
naprawy, błędy replikacyjne prowadzą do aku¬
mulacji mutacji. Człowiek ma 1014 komórek ją-
drzastych, w których w każdym genomie wystę¬
puje 3* 109 pz. Jeśli w okresie całego życia zacho¬
dzi ok. 1016 podziałów komórkowych i jeśli 10'10
mutacji na każdą parę zasad, na każdy podział ko¬
mórkowy, unika naprawy, to liczba mutacji może
dojść do jednej mutacji na każde 106 pz w geno¬
mie. Na szczęście większość z tych mutacji zaj¬
dzie prawdopodobnie w tych sekwencjach DNA,
które nie kodują białek lub nie będą wpływały
na funkcje kodowanych białek, a zatem nie będą
miały żadnych następstw. W dodatku samorzutnie
i chemicznie indukowane uszkodzenia DNA mu¬
szą być naprawiane.
Uszkodzenia DNA wywołane przez czynniki śro¬
dowiskowe, fizyczne i chemiczne mogą być skla¬
syfikowane na 4 grupy (tab. 35-8). Nieprawidłowe
rejony DNA, pojawiające się wskutek błędów
w kopiowaniu lub wskutek uszkodzenia DNA, są
zastępowane prawidłowymi rejonami wg czterech
mechanizmów: 1) naprawę źle sparowanych zasad
(ang. mismatch repair), 2) naprawę przez wycięcie
zasad, 3) naprawę przez wycięcie nukleotydów
Tabela 35-8. Rodzaje uszkodzeń DNA
I. Zmiana jednej zasady
A. Depurynacja
B. Deaminacja cytozyny do uracylu
C. Deaminacja adeniny do hipoksantyny
D. Alkilacja zasady
E. Insercja lub delecja nukleotydu
F. Wbudowanie analogu zasady
II. Zmiana dwóch zasad
A. Powstanie (pirymidynowego) dimeru tymina-tymina
indukowane promieniowaniem ultrafioletowym
B. Sieciowanie dwufunkcyjnym czynnikiem alkilującym
III. Pęknięcie łańcucha
A. Promienie jonizujące
B. Rozpad wiązań fosfodiestrowych pod wpływem promie¬
niowania
C. Powstawanie wolnych rodników utleniających
IV. Wiązania poprzeczne
A. Między zasadami tej samej nici lub nici przeciwległych
B. Między DNA i cząsteczkami białka (np. histony)
oraz 4) naprawę dwuniciowych pęknięć (tab. 35-
-9). Mechanizmy te wykorzystują nadmiar infor¬
macji, która jest nieodłączną cechą dwuniciowej,
helikalnej struktury DNA. Rejon uszkodzony
w jednej nici może zostać przywrócony do swej
formy pierwotnej na podstawie komplementarnej
informacji, zachowanej w nici nieuszkodzonej.
Naprawa niesparowanych zasad
(mismatch repair)
Naprawa typu „mismatch” koryguje błędy pow¬
stałe w trakcie kopiowania DNA. Na przykład
zamiast nukleotydu C może zostać wbudowany
nukleotyd T, gdy w naprzeciwległej nici znaj¬
duje się A, albo też polimeraza może ześlizgnąć
Tabela 35-9. Mechanizmy naprawy DNA
Mechanizm
Problem
Rozwiązanie
Naprawa niesparowanych
zasad (typu „mismatch”)
Błędy kopiowania (pojedyncza zasada lub pętle
2-5 niesparowanych zasad)
Przecięcie nici oznaczone miejscem metylacji,
strawienie egzonukleazą i zastąpienie
Naprawa przez wycięcie
zasady
Samorzutne, chemiczne lub popromienne
uszkodzenia pojedynczej zasady
Usunięcie zasady przy udziale A/-glikozylazy,
usunięcie cząsteczki cukru pozbawionego zasady,
zastąpienie
Naprawa przez wycięcie
nukleotydu
Samorzutne, chemiczne lub popromienne
uszkodzenie segmentu DNA
Usunięcie oligomeru o długości ok. 30
nukleotydów i zastąpienie
Naprawa uszkodzenia
dwuniciowego
Promieniowanie jonizujące, chemioterapia,
wolne rodniki
Koniugacja, rozwinięcie, ułożenie, ligacja
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 413
się lub zaciąć i wprowadzić 2-5 dodatkowych,
niesparowanych zasad. Swoiste białka przeszuku¬
ją nowo syntetyzowany DNA, używając zmetylo-
wanej adeniny w sekwencji GATC jako miejsce
odniesienia (ryc. 35-22).
3'
ch3
ch3
-L-
5'
5'
-X 3'
PRZECIĘCIE POJEDYNCZEJ NICI
PRZEZ ENDONUKLEAZĘ GATC
ch3
3'
ch3
_L_
5'
5'
-X 3'
USUNIĘCIE USZKODZENIA
PRZEZ EGZONUKLEAZĘ
CH3
5'
3'
NAPRAWIENIE USZKODZENIA
PRZEZ POLIMERAZĘ
3'
ch3
_I_
ch3
_I_
5'
ch3
I
SPOJENIE
PRZEZ LIGAZĘ
5'
3'
Ryc. 35-22. Naprawa DNA typu „mismatch”. Mechanizm ten
naprawia pojedyncze niesparowanie zasad, np. wstawienie C
zamiast T naprzeciw A, albo krótkich regionów niesparowanych.
Region uszkodzony rozpoznaje endonukleaza, która następnie
przecina pojedynczą nić w przyległej do tego regionu zmetylo-
wanej sekwencji GATC. Uszkodzony fragment DNA jest usuwany,
zastępowany nową sekwencją i ponownie spajany ligazą.
Nić matrycowa jest zmetylowana, natomiast
nić nowo zsyntezowana - nie. Różnica ta pozwala
enzymom naprawczym zidentyfikować nić, która
zawiera błędny nukleotyd wymagający zastąpie¬
nia. Jeśli zostanie znaleziona niesparowana zasada
lub mała pętla, endonukleaza GATC przecina nić
zawierającą mutację w miejscu odpowiadającym
GATC. Następnie egzonukleaza trawi tę nić od
sekwencji GATC poza mutację, usuwając w ten
sposób wadliwą sekwencję DNA. Proces ten
może zachodzić z obu końców, jeśli uszkodzenie
ograniczone jest przez dwa miejsca GATC. Uby¬
tek jest następnie wypełniany przez prawidłowe
enzymy komórkowe, stosownie do reguły paro¬
wania zasad. U bakterii E. coli do rozpoznania
mutacji i przecięcia nici DNA są potrzebne trzy
białka (MutS, MutC i MutH). Inne enzymy ko¬
mórkowe, łącznie z ligazą, polimerazą i białkami
SSB usuwają i wypełniają uszkodzoną nić. Pro¬
ces ten jest nieco bardziej złożony w komórkach
ssaków, ponieważ w pierwszym etapie naprawy
bierze udział sześć białek.
Z błędną naprawą niesparowanych zasad ma
związek dziedziczny rak jelita grubego, powsta¬
jący nie na tle polipowatości (HNPCC, od ang.
hereditary nonpolyposis colon cancer); jest to
jeden z najczęściej występujących raków dzie¬
dzicznych. Badania genetyczne wykazywały, że
u niektórych rodzin HNPCC ma związek z pew¬
nym regionem chromosomu 2. Umiejscowiony
tam gen, oznaczony hMSH2, okazał się ludzkim
analogiem białka MutS E. coli, które bierze udział
w procesie naprawczym typu „mismatch” (patrz
wyżej). Mutacje genu hMSH2 odpowiadają za
50-60% przypadków HNPCC. Inny gen, hMLHl,
jest związany z większością innych przypadków
raka jelita grubego. Gen hMLHl jest ludzkim
analogiem bakteryjnego genu MutL, biorącego
udział w naprawie typu „mismatch”. W jaki spo¬
sób wadliwa naprawa typu „mismatch” powoduje
raka jelita grubego? Geny ludzkie zostały zloka¬
lizowane w wyniku wykrycia niestabilności sek¬
wencji mikrosatelitamych. Mówiąc inaczej, sek¬
wencje mikrosatelitame w komórkach rakowych
mają inną długość niż sekwencje w komórkach
prawidłowych danego osobnika. Wydaje się, że
dotknięte komórki wytwarzają zmutowane formy
enzymu naprawczego typu „mismatch” (hMSH2
lub hMLHl), niezdolne do usuwania małych pętli
w niesparowanym DNA, w wyniku czego sek¬
wencje mikrosatelitame zwiększają swoją dłu¬
gość. To z kolei musi wpływać na ekspresję lub
funkcję białka krytycznego dla nadzorowania cy¬
klu komórkowego w komórkach jelita grubego.
Naprawa przez wycięcie zasady
Depurynacja DNA, przebiegająca spontanicznie
dzięki termolabilności wiązania A-glikozydo-
wego puryn, zachodzi z szybkością 5000-10000
414 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
zasad na komórkę na dobę w temp. 37°C. Miej¬
sca depurynowane są rozpoznawane przez swoi¬
ste enzymy i zastępowane odpowiednimi puryna-
mi bezpośrednio, bez przerywania wiązań fos-
fodiestrowych.
Występujące w DNA zasady: cytozyna, adeni¬
na i guanina spontanicznie tworzą, odpowiednio,
uracyl, hipoksantynę lub ksantynę. Ponieważ
te ostatnie nie występują w DNA w warunkach
prawidłowych, nie jest zaskoczeniem, że swoiste
W-glikozylazy mogą rozpoznawać te nieprawid¬
łowe zasady i usuwać je z DNA.
3' 5'
ATCGGCTCATCCGAT
I I I I I I I I I I I I I I I
5, TAGCCGAGTAGGCTA
Energia cieplna
ATCGGCTUATCCGAT
I I I I I I I I I I I I I I I
TAGCCGAGTAGGCTA
U ' | GLIKOZYLAZA URACYLOWA DNA |
ATCGGCTCATCCGAT
I I I I I I I I I I I I I I I
TAGCCGAGTAGGCTA
| NUKLEAZY |
A T C G G C T C C G A T
I I I I I I I I I I I I
TAGCCGAGTAGGCTA
| POLIMERAZA DNA + LIGAZA DNA |
ATCGGCTCATCCGAT
I I I I I I I I I I I I I I I
TAGCCGAGTAGGCTA
Ryc. 35-23. Naprawa DNA przez wycięcie zasady. Enzym glikozy-
laza uracylowa DNA usuwa uracyl powstały podczas spontanicz¬
nej deaminacji cytozyny w DNA. Endonukleaza przecina wiązanie
fosfodiestrowe w pobliżu miejsca uszkodzenia; następnie, po
usunięciu przez endonukleazę kilku zasad, ubytek zostaje uzupeł¬
niony dzięki działaniu polimerazy naprawczej i nić jest ponownie
spajana przez ligazę. (DziękLuprzejmości B. Albertsa).
Usunięcie zasady stanowi oznakowanie miejsca
wadliwego i pozwala endonukleazie apuryno-
wej lub apirymidynowej na wycięcie cząsteczki
cukru pozbawionego zasady. Odpowiednia zasa¬
da zostaje następnie zastąpiona dzięki działaniu
naprawczej polimerazy DNA, a ligaza przywra¬
ca DNA do jego pierwotnego stanu (ryc. 35-23).
Opisana seria zdarzeń nosi nazwę naprawy przez
wycięcie zasady. Dzięki podobnym łańcuchom
zdarzeń, obejmujących wstępnie rozpoznanie
uszkodzenia, z DNA mogą być usuwane zasady al-
kilowane oraz analogi zasad i może być przywra¬
cany pierwotny „zapis” informacji w cząsteczce
DNA. Mechanizm ten jest odpowiedni do zastąpie¬
nia pojedynczej zasady, ale nie jest skuteczny
w zastępowaniu uszkodzonych rejonów DNA.
Naprawa przez wycięcie nukleotydu
Mechanizm taki jest stosowany do zastępowa¬
nia uszkodzonych rejonów DNA o długości do
30 zasad. Najczęściej przyczyną takich uszko¬
dzeń DNA jest światło ultrafioletowe (UV),
które indukuje tworzenie się cyklobutanowych
dimerów pirymidyna-pirymidyna, oraz palenie
tytoniu, w wyniku którego tworzą się addukty
benzo[a]pirenu z guaniną. Promienie jonizują¬
ce, leki stosowane w chemioterapii nowotworów
i różne związki chemiczne występujące w środo¬
wisku powodują modyfikację zasad, pęknięcia
nici DNA, sieciowanie między naprzeciwległe
położonymi zasadami lub między DNA i biał¬
kiem oraz wiele innych uszkodzeń; są one na¬
prawiane w procesie nazwanym naprawą przez
wycięcie nukleotydu (ryc. 35-24).
Jest to złożony proces, w którym bierze udział
więcej produktów genowych niż w obu omówio¬
nych wyżej procesach naprawczych; zasadniczo
obejmuje on hydrolizę dwóch wiązań fosfo-
diestrowych w nici zawierającej uszkodzenia.
W procesie tym bierze udział swoista nukleaza
wycinająca (eksinukleaza), u bakterii E. coli
składająca się z przynajmniej trzech podjedno-
stek, u człowieka zaś z 16 polipeptydów. W ko¬
mórkach eukariotycznych enzymy tną pomiędzy
trzecim a piątym wiązaniem fosfodiestrowym po
stronie 3' od uszkodzenia, zaś od strony 5' cięcie
następuje gdzieś pomiędzy dwudziestym pierw¬
szym a dwudziestym piątym wiązaniem. Wycię¬
ty zostaje zatem fragment DNA o długości 27-
-29 nukleotydów. Usunięty uszkodzony odcinek
nici zostaje zastąpiony, z zachowaniem dokład¬
nego parowania zasad, dzięki aktywności jesz¬
cze innej polimerazy (u ludzi polimerazy 5/e),
a końce wstawki zostają połączone z istniejącą
nicią przez ligazę DNA.
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 415
3' 5'
5' XXXX 3'
ROZPOZNANIE IROZPLECENIE
WYCIĘCIE OLIGONUKLEOTYDU PRZEZ
PRZECIĘCIE NICI W DWÓCH MIEJSCACH
3' — 5'
5> —xxxx- 3>
[ DEGRADACJA ZMUTOWANEGO DNA |
| PONOWNA SYNTEZA ILIGACJA |
3' 5'
5'- 3'
Ryc. 35-24. Naprawa przez wycięcie nukleotydu. Mechanizm ten
umożliwia naprawę większych uszkodzeń DNA; na ogól bierze
w nim udział większa liczba białek niż w naprawie typu „mis-
match” albo naprawie przez wycięcie zasady. Po rozpoznaniu
uszkodzenia (oznaczonego XXXX) i rozpleceniu fragmentu DNA,
w którym znajduje się uszkodzenie, swoista nukleaza wycinająca
(eksinukleaza) przecina uszkodzone pasmo przed i za miejscem
uszkodzenia. Powstały ubytek jest następnie uzupełniany przy
udziale swoistej polimerazy (u ludzi polimeraza 5/e) i ponownie
spajany ligazą.
Skóra pergaminowata barwnikowa (jceroder-
ma pigmentosum) jest autosomalną, recesywną
chorobą genetyczną. Kliniczne objawy obejmują
znaczną wrażliwość na światło słoneczne (pro¬
mieniowanie ultrafioletowe), co przyczynia się
do powstawania mnogich nowotworów skóry
i przedwczesnej śmierci. Ryzyko rozwoju raka
skóry w tej chorobie jest 1000-2000 razy więk¬
sze. Wrodzona wada wiąże się z naprawą uszko¬
dzonego DNA, zwłaszcza dimerów ty miny. Ko¬
mórki osób chorych na xeroderma pigmentosum,
wykazują w hodowli in vitro małą aktywność pro¬
cesów naprawy DNA przez wycięcie nukleotydu.
Analiza oparta na hybrydyzacji komórek pozwo¬
liła zidentyfikować siedem grup komplementacji
genetycznej oraz poznać siedem produktów geno¬
wych (od XPA do XPG) xeroderma pigmentosum.
Dwa z nich (XPA i XPC) są związane z rozpo¬
znawaniem i wycinaniem. XPB i XPD są helika-
zami oraz, co interesujące, stanowią podjednostki
czynnika transkrypcyjnego TFIIH (p. rozdz. 36).
Naprawa pęknięć dwuniciowych
Naprawa pęknięć dwuniciowych jest częścią fi¬
zjologicznego procesu rearanżacji genu immuno-
globuliny. Jest również ważnym mechanizmem
naprawy uszkodzeń DNA powstałych w wyniku
działania promieniowania jonizującego lub gene¬
racji wolnych rodników utleniających. Niektóre
substancje chemioterapeutyczne niszczą komórki,
powodując powstawanie podwójnych pęknięć lub
zapobiegając ich naprawie.
W niehomologicznym złączeniu dwuniciowe-
go pęknięcia biorą początkowo udział dwa biał¬
ka. Jedno z nich, białko Ku, jest heterodimerem
złożonym z podjednostek o masie cząsteczkowej
70 kDa i 86 kDa i przyłącza się do wolnych koń¬
ców DNA. Wykazuje ono utajoną, zależną od
ATP, aktywność helikazy. Związany z DNA he-
terodimer Ku werbuje unikalną, zależną od DNA
kinazę białkową (DNA-PK). Kinaza ta zawiera
miejsce wiążące wolne końce DNA oraz miejsce
wiążące dwuniciowy DNA. Umożliwia to zbli¬
żenie dwóch rozdzielonych końców. Kompleks
o budowie: wolny koniec DNA-Ku-DNA-PK ak¬
tywuje kinazę. DNA-PK w odpowiedzi fosforyluje
Ku i drugą cząsteczkę DNA-PK na przeciwległej
nici, w położeniu trans. Następnie DNA-PK od¬
łącza się od DNA oraz Ku, co powoduje aktywa¬
cję helikazy Ku. W efekcie następuje rozplecenie
końców obu fragmentów DNA. Następuje sparo¬
wanie zasad rozplecionych końców zbliżonych
fragmentów, zaś zbędne „ogony” nukleotydowe
zostają usunięte przez egzonukleazę. Przerwy są
uzupełniane i spajane ligazą DNA. Mechanizm
naprawy pokazano na ryc. 35-25.
Niektóre enzymy naprawcze
pełnia wiele funkcji
Nieco zaskakujące jest poczynione niedawno
spostrzeżenie, że białka naprawiające DNA mogą
służyć także innym celom. Na przykład niektóre
enzymy naprawcze okazały się również kompo¬
nentami dużego kompleksu TFIIH, który odgry¬
wa główną rolę w transkrypcji genów (rozdz.
36). Inny komponent kompleksu TFIIH bierze
udział w regulacji cyklu komórkowego. Dzięki
zatem wykorzystywaniu wspólnych białek w ko¬
mórkach mogą być sprzężone trzy podstawowe
procesy. Istnieją również mocne dowody na to,
416 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
/A i11111 miny/
Ku oraz DNA-PK ulegają związaniu 1
Integralność DNA i chromosomów
w cyklu komórkowym jest monitorowana
/A
w/
Zbliżenie
Rozplecenie
Ustawienie i sparowanie zasad
Ligacja
/Am
/Au
1 | | | |>
AU
W/
W/
?/
Ryc. 35-25. Naprawa pęknięć podwójnoniciowych w DNA.
Dwa białka: Ku i zależna od DNA kinaza białkowa (DNA-PK) łą¬
czą się w celu zbliżenia dwóch odcinków DNA oraz rozplecenia
ich końców. W tak zbliżonych odcinkach następuje parowanie
zasad, a zbyteczne końcówki zostają usunięte, prawdopodob¬
nie przez endo- lub egzonukleazę stowarzyszoną z DNA-PK.
Przerwy zostają wypełnione, a ciągłość DNA przywrócona
dzięki działaniu ligazy.
że niektóre enzymy naprawcze biorą udział w fi¬
zjologicznych procesach przegrupowania (re-
aranżacji) genów.
Chorych, których dotyka zespół ataksja-tele-
angiektazja (autosomalna, recesywna choroba,
powodująca ataksję móżdżkową i nowotwory
układu chłonno-siateczkowego), cechuje wzmo¬
żona podatność na uszkodzenia wywołane pro¬
mieniowaniem rentgenowskim. Z kolei chorzy
z niedokrwistością Fanconiego (autosomalna
recesywna niedokrwistość) wykazują zwiększoną
zapadalność na nowotwory i niestabilność chro¬
mosomową. Prawdopodobnie wiąże się to z wad¬
liwą naprawą uszkodzeń polegających na tworze¬
niu wiązań poprzecznych (tzw. usieciowaniem).
Opisanym wyżej zespołom klinicznym towa¬
rzyszy zwiększona zapadalność na nowotwory.
Prawdopodobnie w przyszłości zostaną odkryte
jeszcze inne choroby dotykające człowieka, wy¬
nikające z zaburzeń zdolności naprawy DNA.
Zważywszy na znaczenie prawidłowego funkcjo¬
nowania DNA i chromosomów dla przeżycia, nie
jest dziwne, że w komórkach eukariotycznych
rozwinęły się złożone mechanizmy nadzoru nad
integralnością materiału genetycznego. Jak szcze¬
gółowo opisano wyżej, powstało wiele złożo¬
nych systemów enzymatycznych, które naprawia¬
ją uszkodzony DNA na poziomie sekwencji nu-
kleotydowych. Nadzór i naprawianie uszkodzeń
DNA odbywa się również na poziomie chromo¬
somowym. Jak to pokazano na ryc. 35-20, inte¬
gralność DNA oraz chromosomów jest podczas
cyklu komórkowego nieprzerwanie monitorowa¬
na. Cztery charakterystyczne miejsca, w których
funkcjonuje taki nadzór, nazwano punktami kon¬
trolnymi. Jeśli w tych miejscach zostaną wykryte
problemy, to cykl zostaje wstrzymany do czasu
naprawy uszkodzenia. Mechanizmy molekularne
leżące u podstaw wykrywania uszkodzeń DNA
w fazach G1 oraz G2 są lepiej poznane niż te do¬
tyczące faz S oraz M.
Białko supresorowe p53 (masa cząsteczkowa
53 kDa) odgrywa kluczową rolę w punktach kon¬
troli zarówno Gl, jak i G2. Jest ono czynnikiem
transkrypcyjnym wiążącym DNA, jednym z ro¬
dziny spokrewnionych białek. W normalnych wa¬
runkach jest bardzo nietrwałe, ale w odpowiedzi
na uszkodzenie DNA w jakiś sposób ulega stabi¬
lizacji, być może dzięki bezpośrednim oddziały¬
waniom p53-DNA. Podwyższony poziom p53 ak¬
tywuje transkrypcję całego zespołu genów, które
wspólnie opóźniają przebieg całego cyklu w ko¬
mórce. Jedno z indukowanych białek, p21c,p, jest
silnym inhibitorem CDK-cykliny (CKI), zdolnym
do skutecznego hamowania działania wszystkich
CDK. Oczywiście takie hamowanie wstrzymuje
postęp cyklu komórkowego (p. ryc. 35-19 i 35-
-20). Jeżeli uszkodzenie DNA jest zbyt trudne do
naprawienia, to komórka ulega apoptozie (pro¬
gramowanej śmierci komórkowej) zależnej od
p53. W takim przypadku p53 aktywuje zbiór ge¬
nów, które z kolei indukują apoptozę. Komórki,
które nie mają funkcjonalnego p53 nie są w stanie
ulec apoptozie w odpowiedzi na wysokie dawki
promieniowania lub czynniki chemioterapeutycz-
ne działające na DNA. Nic więc dziwnego, że
p53 jest jednym z najczęściej zmutowanych ge-
35. ORGANIZACJA, REPLIKACJA I NAPRAWA DNA 417
nów w nowotworach u człowieka. Z perspektywy
pozyskania nowych możliwości w terapiach prze-
ciwnowotworowych, wyniki dalszych badań nad
mechanizmami kontroli przebiegu cyklu komór¬
kowego zapewne okażą się bezcenne.
STRESZCZENIE
• W komórkach eukariotycznych DNA jest zwią¬
zany z różnymi białkami, dzięki czemu powsta¬
je struktura zwana chromatyną.
• Większość DNA jest związana z białkami hi-
stonowymi w postaci struktur zwanych nukleo-
somami. Nukleosomy składają się z oktameru
histonów i 150 pz DNA.
• Histony podlegają rozległym modyfikacjom
o charakterze kowalencyjnym, które mają waż¬
ne konsekwencje dla procesów regulacji.
• Nukleosomy i utworzone z nich struktury wyż¬
szego rzędu służą do kondensowania DNA.
• DNA w regionach aktywnych transkrypcyjnie
jest wrażliwy na atak nukleaz; niektóre regio¬
ny są szczególnie wrażliwe. Te nadwrażliwe
regiony często zawierają miejsca kontroli tran¬
skrypcji.
• Transkrypcyjnie aktywny DNA (geny) jest czę¬
sto zgrupowany w poszczególnych regionach
każdego chromosomu. W obrębie tych regionów
geny mogą być oddzielone sekwencjami nieak¬
tywnego DNA, który pozostaje w strukturach
nukleosomalnych. Jednostka transkrypcji, czyli
ta część genu, która jest kopiowana przez poli-
merazę RNA, składa się z kodujących regionów
DNA (eksony) porozdzielanych przez sekwen¬
cje wtrącone niekodującego DNA (introny).
• Po transkrypcji, w czasie składania RNA, intro¬
ny zostają usunięte, a eksony łączą się w doj¬
rzały mRNA, który następnie pojawia się w cy-
toplazmie.
• DNA każdego chromosomu jest dokładnie
replikowany, stosownie do reguł parowania za¬
sad, w czasie fazy S cyklu komórkowego.
• Obie nici podwójnej helisy replikują się
jednocześnie, ale różny jest mechanizm ich re¬
plikacji. Kompleks białkowy zawierający poli-
merazę DNA replikuje nić wiodącą w sposób
ciągły w kierunku od 5' do 3'. Nić opóźniona
jest replikowana w sposób nieciągły w posta¬
ci krótkich odcinków o długości 150-250 nu-
kleotydów w kierunku od 3' do 5'.
• Replikacja DNA przebiega w wielu miejscach
każdego chromosomu, zwanych „banieczkami
replikacyjnymi”. Cały proces replikacji w typo¬
wej komórce zajmuje ok. 9 godz.
• Różnorodne mechanizmy z udziałem różnych
enzymów dokonują napraw uszkodzonego
DNA, np. po ekspozycji na mutageny chemicz¬
ne albo promieniowanie ultrafioletowe.
PIŚMIENNICTWO
DePamphilis ML: Origins of DNA replication in meta-
zoan chromosomes. J Biol Chem 1993;268:1.
Gilbert DM: In search of the holy replicator. Naturę Rev
Mol Celi Biol 2004;5:848.
Hartwell LH, Kastan MB: Celi cycle control and cancer.
Science 1994;266:1821.
Jenuwein T, Allis CD: Translating the histone codę.
Science 2001; 293:1074.
Lander ES et al: Initial seąuencing and analysis of the
human genome. Naturę 2001;409:860.
Luger L et al: Crystal structure of the nucleosome core
particie at 2.8 A resolution. Naturę 1997;398:251.
Marians KJ: Prokaryotic DNA replication. Annu Rev
Biochem 1992;61:673.
Michelson RJ, Weinart T: Closing the gaps among
a web of DNA repair disorders. Bioessays J 2002;
22:966.
Misteli T: Spatial positioning: a new dimension in geno¬
me function. Celi 2004; 119:153.
Moll UM, Ersrer S, Zaika A: p53, p63 and p73 - solos,
alliances and feuds among family members. Bio-
chim Biophys Acta 2001; 1552:47.
Mouse Genome Seąuencing Consortium: Initial se¬
ąuencing and comparative analysis of the mouse
genome. Naturę 2002;420:520.
Narlikar GJ et al: Cooperation between complexes that
regulate chromatin structure and transcription. Celi
2002;108:475.
Sancar A, Lindsey-Boltz LA, Unsal-Kacmaz K, Linn S:
Molecular mechanisms of mammalian DNA repair
and the DNA damage checkpoint. Ann Rev Bio¬
chem 2004;73:39.
Sullivan et al: Determining centromere identity: cyc-
lical stories and forking paths. Nat Rev Genet
2001;2:584.
van Holde K, Zlatanova J: Chromatin higher order: cha-
sing a mirage? J Biol Chem 1995;270:8373.
Venter JC et al: The seąuence of the human genome.
Science 2002;291:1304.
Wallace DC: Mitochondrial DNA in aging and disease.
SciAm 1997 Aug; 277:40.
Wood RD: Nucleotide excision repair in mammalian
cells. J Biol Chem 1997;272:23465.
Synteza, przekształcanie
i metabolizm RNA
P. Anthony Weil, PhD; DarylK. Granner, MD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Synteza cząsteczki RNA z DNA jest bardzo zło¬
żonym procesem, w którym bierze udział jeden
z enzymów z grupy polimeraz RNA oraz wiele
współdziałających z nimi białek. Podstawowe
etapy syntezy pierwotnego transkryptu to inicja¬
cja, elongacja i terminacja. Najlepiej znany jest
etap inicjacji. Rozpoznano wiele regionów DNA
(na ogół przed miejscem inicjacji) oraz czynni¬
ki białkowe, które wiążą się do tych sekwencji
i regulują inicjację transkrypcji. Niektóre RNA,
a zwłaszcza mRNA, cechują się bardzo różnymi
okresami trwania w komórce. Poznanie podsta¬
wowych zasad syntezy i metabolizmu mRNA
jest ważne, ponieważ modulacja tego procesu
powoduje zmiany szybkości biosyntezy białek,
a w następstwie - różnorodne zmiany zarówno
metaboliczne, jak i fenotypowe. Jest to sposób,
w jaki wszystkie organizmy adaptują się do zmian
w środowisku, a także w jaki powstają i utrzymu¬
ją się zróżnicowane struktury oraz są spełniane
różne funkcje w komórce wyższych organizmów
wielokomórkowych. W komórkach ssaków więk¬
szość RNA jest syntetyzowana jako cząsteczki
prekursorowe, które ulegają przekształceniom
w dojrzały, aktywny RNA. Błędy lub zmiany
w syntezie, przekształcaniu i składaniu transkryp-
tów (ang. splicing) mRNA są przyczyną chorób.
ISTNIEJĄ CZTERY GŁÓWNE KLASY RNA
Wszystkie komórki eukariotyczne zawierają
cztery główne klasy RNA: rybosomalny RNA
(rRNA), informacyjny RNA (mRNA), transfero¬
wy RNA (tRNA) jak również mały jądrowy RNA
i mikroRNA (snRNA i miRNA). Pierwsze trzy
biorą udział w syntezie białek, natomiast małe
RNA uczestniczą w składaniu transkryptów (ang.
splicing) i regulacji genów. Jak pokazano w tab.
36-1, klasy RNA cechuje różnorodność, różnice
w stabilności oraz zawartości w komórkach.
Tabela 36-1. Klasy eukariotycznego RNA
RNA
Typy
Udziat
w ogólnej
ilości RNA
w komórce
Stabilność
Rybosomalny
(rRNA)
28S.18S,
5,8S, 5S
80%
Bardzo stabilny
Informacyjny
(mRNA)
ok. 105
rodzajów
2-5%
Niestabilny do
bardzo stabilny
Transferowy
(tRNA)
ok. 60
rodzajów
ok. 15%
Bardzo stabilny
Mały jądrowy
(snRNA)
ok. 30
rodzajów
<1%
Bardzo stabilny
Mikro (miRNA)
setki-tysiące
<1%
Stabilny
RNA JEST SYNTETYZOWANY NA MATRYCY
DNA PRZY UDZIALE POLIMERAZY RNA
Procesy syntezy DNA oraz RNA są do siebie
podobne, ponieważ: (1) występują w nich te same
podstawowe etapy inicjacji, elongacji i terminacji
z polamością od 5' do 3'; (2) biorą w nich udział
duże kompleksy inicjujące, zbudowane z wielu
elementów; oraz (3) podlegają regułom Watsona-
-Cricka parowania zasad. Występują między
tymi procesami także różnice, a mianowicie: (1)
w syntezie RNA uczestniczą rybonukleotydy,
a nie deoksyrybonukleotydy; (2) w RNA, T zo¬
staje zastąpiona przez U jako zasada komplemen-
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 419
tama do A; (3) w syntezie RNA nie bierze udziału
primer; (4) w trakcie replikacji DNA musi zostać
skopiowany cały genom, natomiast na RNA jest
transkrybowana (kopiowana) tylko jego część; (5)
w czasie transkrypcji RNA nie jest sprawdzana
poprawność odczytu.
Syntezę RNA (transkrypcji) na matrycy DNA
najlepiej scharakteryzowano w przypadku organi¬
zmów prokariotycznych. Mimo że w komórkach
ssaków synteza RNA i przekształcanie transkryp-
tów RNA są odmienne niż w organizmach proka¬
riotycznych, proces syntezy RNA, jako taki, jest
całkiem podobny w tych dwóch klasach organi¬
zmów. Dlatego opis syntezy RNA przebiegającej
w organizmach prokariotycznych może się także
odnosić do organizmów eukariotycznych, mimo
że enzymy biorące udział w tych procesach i syg¬
nały regulatorowe są różne.
Transkrypcji ulega matrycowa nić DNA
Sekwencja rybonukleotydów w cząsteczce RNA
jest komplementarna do sekwencji deoksyrybo¬
nukleotydów jednej z nici dwuniciowej cząstecz¬
ki DNA (p. ryc. 34-8). Nić DNA, która ulega
transkrypcji na cząsteczkę RNA, nazywa się ni¬
cią matrycową. Drugą nić DNA często określa
się jako nić kodującą dany gen. Została ona tak
nazwana, ponieważ - mimo że zawiera T zamiast
U - odpowiada dokładnie sekwencji pierwotne¬
go transkryptu, w którym jest zawarty kod dla
białka - produktu danego genu. W przypadku
dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej licz¬
ne geny, nić matrycowa dla poszczególnych ge¬
nów niekoniecznie jest tą samą nicią podwójnej
helisy DNA (ryc. 36-1). Dana nić dwuniciowej
cząsteczki DNA może więc służyć jako nić ma¬
trycowa dla niektórych genów i jako nić kodują-
Gen A Gen B Gen C Gen D
Ryc. 36-1. Na rycinie tej pokazano, że geny mogą być transkry-
bowane z obu nici DNA. Strzałki wskazują kierunek transkrypcji
(polarność). Należy zwrócić uwagę, że nić matrycowa jest zawsze
odczytywana w kierunku 3'-*5'. Nić przeciwległa jest nazywana
nicią kodującą, ponieważ jest identyczna (z wyjątkiem zamiany T
na U) z transkryptem mRNA (pierwotny transkrypt w komórkach
eukariotycznych), który koduje białkowy produkt genu.
ca dla innych genów. Należy zwrócić uwagę, że
sekwencja nukleotydów transkryptu DNA będzie
taka sama (z wyjątkiem U, która zastępuje T) jak
w nici kodującej. Informacja na nici matrycowej
jest odczytywana w kierunku od 3' do 5'.
Zależna od DNA polimeraza RNA
rozpoczyna transkrypcje w szczególnym
miejscu - promotorze
Zależna od DNA polimeraza RNA jest enzymem
odpowiedzialnym za polimeryzację rybonukleo¬
tydów o sekwencji komplementarnej do nici ma¬
trycowej genu (p. ryc. 36-2 i 36-3).
Transkrypt RNA
Ryc. 36-2. Polimeraza RNA (RNAP) katalizuje polimeryzację ry¬
bonukleotydów prowadzącą do powstania RNA, którego sekwen¬
cja jest komplementarna do nici matrycowej genu. Transkrypt
RNA ma tę samą polarność (od 5' do 3') co kodująca nić DNA,
ale zawiera U zamiast T. RNAP z E. coli składa się z kompleksu
rdzeniowego, zawierającego dwie podjednostki a i dwie podjed-
nostki p (p i P'). Holoenzym zawiera podjednostkę o związaną
z rdzeniem a2PP'. Podjednostki co nie pokazano. „Bańka” tran-
skrypcyjna obejmuje obszar ok. 20 nukleotydów stopionego
(zdenaturowanego) DNA, a cały kompleks pokrywa 30-75 pz,
w zależności od konformacji RNAP
Enzym przyłącza się do charakterystycznego
miejsca - promotora - na nici matrycowej. Roz¬
poczyna się następnie synteza RNA w punkcie
startu i proces postępuje, aż zostaną osiągnięte
sekwencje terminacyjne (ryc. 36-3).
Jednostka transkrypcji jest to region DNA za¬
wierający sygnały inicjacji, elongacji i terminacji.
Produkt RNA, który jest syntetyzowany w kie¬
runku od 5' do 3', jest nazywany transkryptem
pierwotnym. Szybkość transkrypcji jest różna dla
poszczególnych genów, przy czym może być bar¬
dzo duża. Na rycinie 36-4 przedstawiono zdjęcie
uzyskane za pomocą mikroskopu elektronowego,
ilustrujące przebieg transkrypcji.
420 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
(1) Wiązanie z matrycą
Ryc. 36-3. Cykl transkrypcyjny u bakterii. Transkrypcję RNA
bakteryjnego przedstawiono w czterech etapach: (1) Wiązanie
z matrycą. Polimeraza RNA (RNAP) wiąże się z DNA i lokalizuje
promotor (P), denaturując obie nici DNA i tworząc kompleks pre-
inicjacyjny (PIC). (2) Inicjacja łańcucha. Holoenzym RNAP (rdzeń
+ jeden z wielu czynników o) katalizuje przyłączenie pierwszego
nukleotydu (zwykle ATP lub GTP) do drugiego trifosforanu rybo-
nukleozydu i tworzy się dinukleotyd. (3) Uwolnienie promotora.
RNAP ulega zmianom konformacyjnym, gdy długość łańcucha
RNA osiągnie 10-20 nukleotydów, i odsuwa się od promotora
w dół jednostki transkrypcyjnej. (4) Elongacja łańcucha. Kolejne
reszty nukleotydowe są dołączane do końca 3'-OH powstającej
cząsteczki RNA. (5) Terminacja łańcucha i uwolnienie enzymu.
Ukończona nić RNA i RNAP są uwalniane z matrycy. Regeneruje
się holoenzym RNAR który odnajduje promotor, i cykl rozpoczyna
się od nowa.
W organizmach prokariotycznych transkrypt
pierwotny może reprezentować produkt kodo¬
wany przez kilka przyległych do siebie genów;
w komórkach ssaków jest to zwykle produkt poje¬
dynczego genu. Końce 5' pierwotnego transkryp-
tu RNA i dojrzałego cytoplazmatycznego RNA
są identyczne. Miejsce startu transkrypcji od¬
powiada więc nukleotydowi końca 5' mRNA.
Punkt ten jest oznaczony jako pozycja +1 i w ten
sam sposób jest oznaczony odpowiedni nukleo-
tyd na DNA. Numeracja staje się coraz większa,
w miarę jak sekwencja biegnie „w dół” („poni¬
żej”) (ang. downstream)* genu (na prawo) od
punktu startu. Konwencja ta ułatwia lokalizację
danego regionu, np. granic między intronem i ek-
sonem. Nukleotyd w sekwencji promotora, przy¬
legły do miejsca inicjacji transkrypcji, oznacza
się jako -1, a ujemna numeracja zwiększa się
w miarę oddalania się „w górę” („powyżej”) (ang.
* Czyli „z nurtem, z prądem” (analogia do nurtu rzeki)
[przyp. red.]
upstream)** genu (na lewo) od miejsca inicjacji.
Pozwala to na umowne określanie lokalizacji
elementów regulatorowych w promotorze.
Pierwotne transkrypty, generowane za pomocą
polimerazy RNA klasy II - jednej z trzech cha¬
rakterystycznych dla eukariotów zależnych od J
DNA jądrowych polimeraz RNA, są szybko opa¬
trywane („nakrywane”) trifosforanem 7-metylo- ^
guanozylu (p. ryc. 34-10), tworzącym kompleks ^
- „czapeczkę”, która utrzymuje się i ostatecznie
pojawia na końcu 5' dojrzałego cytoplazmatycz- i
Ryc. 36-4. Fotografia otrzymana przy użyciu mikroskopu elek¬
tronowego, pokazująca liczne kopie genów rybosomalnego RNA
u płazów w trakcie transkrypcji. Powiększenie ok. 6000 razy. Na¬
leży zauważyć, że długość transkryptów zwiększa się w miarę
jak cząsteczki polimerazy RNA przesuwają się wzdłuż poszcze¬
gólnych genów rybosomalnego RNA; miejsca startu transkrypcji
oznaczono czarnymi kółkami, a miejsca terminacji transkrypcji -
pustymi kółkami. Niewidoczna na zdjęciu polimeraza RNA I (RNA
Pol I) znajduje się w rzeczywistości u podstawy powstających
transkryptów rRNA. Do bliższego, proksymalnego regionu prze¬
pisywanego genu są zatem przyłączone krótkie transkrypty, na¬
tomiast z dystalnym końcem genu są związane znacznie dłuższe
transkrypty. Strzałki pokazują kierunek (od 5' do 3') transkrypcji.
(Reprodukowano za zgodą: Miller OL Jr., Beatty BR: Portrait of
a gene. J Celi Physiol 1969;74 [Suppl. 1]:225. Przedrukowano za
zgodą Wiley-Liss, Inc, a subsidiary of John Wiley & Sons, Inc.)
** Czyli „pod prąd” [przyp. red]
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 421
nego mRNA. Takie „czapeczki metylacyjne” są
niezbędne do przekształceń pierwotnego tran-
skryptu do mRNA, translacji mRNA i ochrony
mRNA przed atakiem egzonukleaz.
Zależna od DNA bakteryjna polimeraza
RNA składa się z podjednostek
Zależna od DNA polimeraza RNA (RNAP)
u bakterii Escherichia coli występuje jako kom¬
pleks o masie ok. 400 kDa, złożony z podjedno¬
stek; dwie z nich są identyczne (podjednostki a),
a dwie są podobne pod względem wielkości, ale
nie są identyczne (podjednostki p i p'). Oprócz
tego kompleks zawiera podjednostkę co. Uważa
się, że podjednostka p pełni funkcję katalityczną
(p. ryc. 36-2). RNAP zawiera także dwa atomy
cynku. Rdzeń polimerazy RNA asocjuje ze swo¬
istym czynnikiem białkowym (czynnikiem sigma
[o]), który pomaga enzymowi mocniej łączyć się
ze swoistą sekwencją deoksyrybonukleotydową
regionu promotora (ryc. 36-5), co prowadzi do
tworzenia kompleksu preinicjacyjnego (PIC).
Czynniki a odgrywają podwójną rolę w roz¬
poznawaniu promotora; związanie czynnika a
z rdzeniem polimerazy RNA zmniejsza jej powi¬
nowactwo do niepromotorowego DNA i jedno¬
cześnie zwiększa powinowactwo holoenzymu do
DNA promotorowego. Bakterie zawierają wiele
czynników a, z których każdy działa jako białko
regulatorowe, modyfikujące swoistość rozpozna¬
wania promotora przez polimerazę RNA. Poja¬
wianie się różnych czynników a jest skorelowane
w czasie z różnymi programami ekspresji genów
w systemach prokariotycznych, takimi jak sporu-
lacja, wzrost w obecności ubogich źródeł odży¬
wiania i reakcja na szok cieplny.
Komórki ssaków zawierają wiele
zależnych od DNA polimeraz RNA
Właściwości polimeraz ssaków przedstawiono
w tab. 36-2. Każda z tych zależnych od DNA po¬
limeraz RNA jest odpowiedzialna za transkrypcję
różnych klas genów.
Masa cząsteczkowa polimeraz RNA dla trzech
głównych klas eukariotycznego RNA zawiera
się w zakresie 500-600 kDa. Enzymy te mają
znacznie bardziej złożoną budowę niż bakteryjne
polimerazy RNA. Wszystkie zawierają dwie duże
-JEDNOSTKA TRANSKRYPCYJNA-
Nić kodująca 5'-
Nić matrycowa 3'-
Region przepisywany
-35
region
. Sekwencje Sekwencje
flankujące 5' flankujące 3'
Ryc. 36-5. Promotory bakteryjne, takie jak pokazany na tej rycinie promotor E. coli, mają dwa
wspólne regiony wysoce zachowawczych sekwencji nukleotydowych. Regiony te są umiej¬
scowione 35 i 10 pz „w górę” (w kierunku 5' nici kodującej) od miejsca startu transkrypcji,
oznaczonego symbolem +1. Wszystkie nukleotydy przed miejscem („w górę” od miejsca) star¬
tu transkrypcji oznacza się umownie liczbami ujemnymi i nazywa sekwencjami flankującymi
5'. Także elementy sekwencji regulatorowych DNA (kaseta TATA itp.) są podawane umownie
w kierunku od 5' do 3' i jako obecne na nici kodującej. Jednak te elementy występują tylko na
dwuniciowym DNA. Należy zwrócić uwagę, że transkrypt utworzony z tej jednostki transkryp-
cyjnej ma taką samą polarność, inaczej „sens” (tzn. orientację 5'->3'), jak nić kodująca. Ele¬
menty terminacji w pozycji cis znajdują się na końcu jednostki transkrypcyjnej (szczegóły p. ryc.
36-6). Sekwencje znajdujące się za miejscem („w dół” miejsca), w którym następuje terminacja
transkrypcji są nazywane zgodnie z konwencją sekwencjami flankującymi 3'.
422 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
podjednostki i wiele mniejszych - w przypadku
polimerazy RNA klasy III aż 14. Eukariotyczne
polimerazy RNA wykazują duże podobieństwo
sekwencji aminokwasów do prokariotycznych
polimeraz RNA. Jak wykazano ostatnio, homo-
logia ta sięga poziomu struktur przestrzennych.
Funkcje każdej z podjednostek nie są jeszcze po¬
znane. Niektóre podjednostki mogą mieć funkcje
regulatorowe, służące polimerazie do rozpozna¬
wania swoistych sekwencji, takich jak promoto-
rowe i sygnały terminacyjne.
Tabela 36-2. Nazwy i właściwości zależnych od DNA polimeraz
RNA ssaków
Klasa
polimerazy
RNA
Wrażliwość na
a-amanitynę
Główne produkty
1
Niewrażliwa
rRNA
II
Bardzo wrażliwa
mRNA, miRNA
III
Średnio wrażliwa
tRNA/5S rRNA, snRNA
Peptydowa toksyna z grzyba Amcmita phalloi-
des, a-amanityna, jest swoistym inhibitorem euka¬
riotycznej nukleoplazmatycznej, zależnej od DNA
polimerazy RNA (polimeraza RNA klasy II); tok¬
syna ta stała się cennym narzędziem badawczym
(p. tab. 36-2). a-Amanityna blokuje podczas tran¬
skrypcji translokację polimerazy RNA.
SYNTEZA RNA JEST PROCESEM
CYKLICZNYM I OBEJMUJE INICJACJE,
ELONGACJĘ ORAZ TERMINACJĘ
Proces biosyntezy RNA u bakterii - pokazany na
ryc. 36-3 - obejmuje najpierw przyłączenie czą¬
steczki holopolimerazy RNA do matrycy w miej¬
scu promotorowym, w wyniku czego powstaje
kompleks preinicjacyjny (PIC). Po związaniu
następuje zmiana konformacji RNAP, a następnie
pierwszy nukleotyd (zwykle purynowy) wiąże
się z miejscem inicjacji podjednostki p enzymu.
RNAP katalizuje tworzenie wiązania fosfodies-
trowego, a powstający łańcuch RNA pozostaje
związany w miejscu polimeryzacji na podjednost-
ce P RNAP. (Nasuwa się analogia do miejsc A i P
na rybosomie; p. ryc. 37-9).
Dalej zostaje zainicjowane tworzenie czą¬
steczki RNA przy jej końcu 5', przy czym elon-
gacja cząsteczki RNA biegnie cyklicznie, anty-
równolegle do jej matrycy, w kierunku od 5' do
3'. Enzym polimeryzuje rybonukleotydy w swoi¬
stej sekwencji, dyktowanej przez nić matrycową
i reguły parowania zasad, podane przez Watsona
i Cricka. W trakcie polimeryzacji uwalnia się pi-
rofosforan. Pirofosforan (PPŚ) jest szybko degra¬
dowany przez wszechobecne pirofosfatazy do
dwóch moli nieorganicznego fosforanu (Pj), co
powoduje nieodwracalność całej reakcji syntezy.
Zarówno u prokariotów, jak i eukariotów rybo-
nukleotyd purynowy zwykle jako pierwszy ulega
polimeryzacji w cząsteczce RNA. Podobnie jak
u eukariotów, trifosforan końca 5' tego pierw¬
szego nukleotydu zostaje w prokariotycznym
mRNA zachowany. Po zakończeniu polimery¬
zacji 10-20 nukleotydów RNAP podlega drugiej
zmianie konformacyjnej, prowadzącej do uwol¬
nienia promotora. Po tej transformacji RNAP
fizycznie oddala się od promotora, przepisując
jednostkę transkrypcji, co prowadzi do następnej
fazy procesu, tj. elongacji.
W miarę jak kompleks elongacyjny, zawie¬
rający rdzeń polimerazy RNA, przemieszcza
się wzdłuż cząsteczki DNA, musi następować
rozwijanie helisy DNA, tak aby zostały udo¬
stępnione miejsca do odpowiedniego parowania
zasad z nukleotydami nici matrycowej. „Bańka”
transkrypcyjna (rozwijającego się DNA) ma sta¬
łą wielkość w trakcie transkrypcji; szacuje się
ją na ok. 20 par zasad na cząsteczkę polimera¬
zy. Wydaje się więc, że wielkość rozwiniętego
regionu DNA jest dyktowana przez polimerazę
i jest niezależna od sekwencji DNA w obrębie
kompleksu. Sugeruje to, że polimeraza RNA
wykazuje aktywność typu rozwijającego (ang.
unwindase), która otwiera helisę DNA. To,
że podwójna helisa musi ulec rozwinięciu i że
w trakcie transkrypcji nici oddzielają się od sie¬
bie przynajmniej przejściowo, nasuwa wniosek,
że w komórkach eukariotycznych struktura nu-
kleosomów zostaje naruszona. Topoizomera-
za zarówno wyprzedza RNAP, jak i postępuje
w ślad za nią, zapobiegając powstawaniu kom¬
pleksów superhelikalnych.
Terminacja syntezy cząsteczki RNA jest
uwarunkowana sekwencją na nici matrycowej
cząsteczki DNA; taka sygnalna sekwencja jest
rozpoznawana przez białko terminacji, nazwane
czynnikiem rho [p]. Czynnik rho jest zależną od
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 423
ATP helikazą, stymulowaną przez RNA, która
rozrywa powstający kompleks DNA-RNA. Po
ukończeniu biosyntezy cząsteczki RNA, enzym
oddziela się od matrycy DNA i prawdopodob¬
nie dysocjuje do wolnego enzymu i wolnego
czynnika p. W obecności innego czynnika p en¬
zym rozpoznaje promotor i synteza nowej czą¬
steczki RNA zaczyna się ponownie. W komór¬
kach eukariotycznych terminacja jest określona
mniej precyzyjnie. Wydaje się ona w jakiś sposób
dotyczyć zarówno inicjacji, jak i dodania ogona
3' poliA mRNA oraz może wiązać się z destabili¬
zacją kompleksu RNA-DNA w rejonie par zasad
A-U. Tę samą nić matrycową genu może przepi¬
sywać jednocześnie więcej niż jedna cząsteczka
polimerazy RNA, ale proces ten przebiega fazo¬
wo i jest przestrzennie oddzielony w taki sposób,
że w każdym momencie każda cząsteczka polime¬
razy przepisuje inną część sekwencji DNA (p. ryc.
36-1 i 36-4).
WIERNOŚĆ I CZĘSTOTLIWOŚĆ
TRANSKRYPCJI SA KONTROLOWANE
PRZEZ BIAŁKA ZWIĄZANE Z PEWNYMI
SEKWENCJAMI DNA
Analiza sekwencyjna DNA określonych genów
umożliwiła rozpoznanie wielu sekwencji waż¬
nych dla przebiegu procesu transkrypcji genów.
Na podstawie wyników badań dużej liczby genów
bakteryjnych było możliwe utworzenie konsensu-
sowych modeli sekwencji sygnalnych inicjacji
i terminacji.
Pytanie: „w jaki sposób RNAP znajduje właś¬
ciwe miejsce dla inicjacji transkrypcji?” nie jest
trywialne, jeżeli weźmie się pod uwagę złożoność
genomu. E. coli zawiera ok. 2x 103 miejsc inicjacji
transkrypcji w ok. 4x106 par zasad swego DNA.
Sytuacja jest jeszcze bardziej złożona u człowie¬
ka, gdzie ok. 105 miejsc inicjacji transkrypcji
jest rozproszonych wśród 3x109 par zasad DNA.
RNAP, mimo że może się wiązać z wieloma regio¬
nami DNA, przeszukuje sekwencje DNA z szyb¬
kością ok. 103 pz/s, aż do momentu, gdy rozpozna
pewne swoiste regiony w DNA, z którymi wią¬
że się ze zwiększonym powinowactwem. Re¬
gion taki jest nazywany promotorem; związanie
RNAP z promotorem zapewnia dokładną inicja¬
cję transkrypcji. Rozpoznawanie i użytkowanie
promotora podlega regulacji zarówno u bakterii,
jak i u człowieka.
Promotory bakteryjne
są względnie proste
Promotory bakteryjne mają długość ok. 40 nu-
kleotydów (40 par zasad, czyli cztery zwoje
podwójnej helisy DNA); jest to region wystar¬
czająco mały, aby mógł zostać pokryty przez
cząsteczkę holopolimerazy RNA bakterii E. coli.
W tym obszarze promotora znajdują się dwie
krótkie, zachowawcze sekwencje. Około 35 par
zasad przed miejscem („w górę” od miejsca)
startu transkrypcji znajduje się sekwencja ośmiu
par nukleotydów, 5'-TGTTGACA-3', do której
przyłącza się RNAP, tworząc tzw. kompleks za¬
mknięty. Bliżej miejsca startu transkrypcji, bo
ok. 10 nukleotydów przed nim („w górę” od nie¬
go), znajduje się bogata w AT sekwencja sześciu
par nukleotydów (5'-TATAAT-3'). Te zachowaw¬
cze sekwencje zawarte w promotorze pokazano
schematycznie na ryc. 36-5. Wspomniana druga
sekwencja ma niską temperaturę topnienia, po¬
nieważ brak w niej par nukleotydów GC. Wsku¬
tek tego sekwencja (kaseta) TATA ułatwia dy-
socjację nici kodującej od niekodującej i w ten
sposób polimeraza RNA związana z regionem
promotorowym może uzyskać dostęp do leżącej
bezpośrednio za sekwencją nukleotydową nici
kodującej. Połączenie polimerazy RNA i pro¬
motora po zajściu tego procesu nosi nazwę kom¬
pleksu otwartego. DNA innych bakterii ma nie¬
co odmienne sekwencje konsensusowe w swoich
promotorach, ale na ogół występują w promo¬
torze dwa elementy, wykazujące tendencję do
zajmowania tej samej pozycji względem miej¬
sca startu transkrypcji. We wszystkich przypad¬
kach sekwencje między kasetami są różne; nadal
jednak odgrywają decydującą rolę oddzielającą
i umożliwiają rozpoznawanie przez holopoli-
merazę RNA sekwencji -35 i -10. W komórce
bakteryjnej różne zestawy genów są często re¬
gulowane w sposób skoordynowany. Jednym
z ważniejszych sposobów zapewnienia takiej
koordynacji jest dzielenie przez wspólnie regu¬
lowane geny unikatowych sekwencji promotoro-
wych -35 oraz -10. Te unikatowe promotory są
rozpoznawane przez różne czynniki o związane
z rdzeniem polimerazy RNA.
424 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Kierunek transkrypcji
Nić kodująca 5'
Nić matrycowa 3'
TTTTTTTT
AAAAAAAA
3'
5'
DNA
Nić kodująca 5'
Nić matrycowa 3'
rtTnrrr
5'
AAAAAAAA
U UUUUUU-3'
U
A U
G C
C G
C G
C G
G C
C G TranskryptRNA
O
3'
5'
DNA
Ryc. 36-6. Dominujący bakteryjny sygnał terminacji transkrypcji zawiera odwróconą sekwencję powtórzoną (dwa pola objęte ramką)
podzieloną łącznikiem, po której następuje ciąg par AT (góra ryciny). Po transkrypcji na RNA, odwrócona sekwencja powtarzana może
generować w transkrypcje RNA strukturę drugorzędową (dwuniciową), jak to pokazano w dolnej części ryciny. Tworzenie takiej struk¬
tury typu „spinka do włosów” powoduje, że polimeraza RNA zatrzymuje się; czynnik terminacji p oddziałuje następnie z zatrzymaną
polimerazą i w jakiś sposób indukuje terminację łańcucha.
U E. coli zależne od czynnika rho transkryp-
cyjne sygnały terminacji również mają wyraźne
sekwencje konsensusowe, jak to przedstawiono na
ryc. 36-6. Zachowawcza sekwencja zgodna (kon-
sensusowa, ang. consensus), która ma długość 40
par nukleotydów, zawiera przerwaną, odwróconą
sekwencję powtórzoną, po której następuje kilka
par zasad AT. W miarę jak transkrypcja postępuje
wzdłuż takiej przerwanej, odwróconej sekwen¬
cji, powstający transkrypt może wytworzyć we-
wnątrzcząsteczkową strukturę typu „spinka do
włosów”, jak to przedstawiono na ryc. 36-6.
Transkrypcja biegnie dalej do regionu AT na
końcu genu i tam, dzięki kończącemu transkryp¬
cję czynnikowi białkowemu rho (p), polimeraza
RNA zatrzymuje się i dysocjuje od matrycy DNA,
uwalniając wytworzony transkrypt.
W komórkach eukariotów sygnały
transkrypcyjne są bardziej złożone
Wiadomo już, że sygnalne sekwencje DNA,
które kontrolują transkrypcję w komórkach eu¬
kariotycznych, są różne. Dwa typy sekwencji
sygnalnych znajdują się w pobliżu promotora
(sekwencje proksymalne). Jeden z nich określa
w cząsteczce DNA miejsce, gdzie transkrypcja
ma się rozpocząć, drugi wpływa na mechanizm
kontrolujący jak często proces ten ma zachodzić.
Na przykład w genie kinazy tymidynowej wiru¬
sa opryszczki Herpes simplex, który do ekspresji
genów posługuje się czynnikami transkrypcyj-
nymi pochodzącymi od gospodarza (którym jest
komórka ssaka), znajduje się unikatowe miejsce
startu transkrypcji; start transkrypcji dokładnie
z tego miejsca zależy od sekwencji leżącej 32 nu-
kleotydy przed miejscem („w górę” od miejsca)
startu (tzn. w miejscu -32) (ryc. 36-7). Region
ten zawiera sekwencję TATA A A AG i wykazuje
znaczną homologię z czynnościowo spokrewnio¬
ną sekwencją TATA, która u prokariotów znajduje
się ok. 10 par zasad przed punktem („w górę” od
punktu) startu mRNA. Mutacja lub inaktywacja
sekwencji TATA znacznie zmniejsza transkrypcję
tego genu (jak również innych genów) zawiera¬
jącego taki zgodny (konsensusowy) element cis
(p. ryc. 36-7 oraz 36-8). Większość genów ssa¬
ków ma sekwencję TATA zlokalizowaną zwykle
25-30 nukleotydów przed miejscem startu tran¬
skrypcji. Sekwencją zgodną dla niej jest sekwen¬
cja TATA A A, chociaż stwierdzono tu ogromną
różnorodność. Sekwencja TATA łączy się z biał¬
kiem wiążącym TATA (TBP, ang. TATAbinding
protein), o masie 34 kDa, które z kolei wiąże inne
białka, zwane czynnikami asocjującymi z TBP
(TAF, ang. TBP-associated factors). Powstanie
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 425
kompleksu TBP i TAF, zwanego również czynni- Niewielka liczba genów nie zawiera sekwencji
kiem TFIID Jest pierwszym etapem tworzenia się TATA. W takich przypadkach polimeraza RNA
kompleksu transkrypcyjnego na promotorze. klasy II kieruje się do promotora dzięki dwu do-
Ryc. 36-7. Elementy sygnalne transkrypcji i regulatorowe czynniki białkowe wiążące DNA w genie kinazy tymidynowej (tk). Zależna
od DNA polimeraza RNA klasy II (nie pokazano) wiąże się z regionem kasety TATA (który wiąże czynnik transkrypcyjny TFIID), tworząc
kompleks preinicjacyjny, zdolny do inicjowania transkrypcji od jednego określonego nukleotydu (+1). Częstość tego zdarzenia zwięk¬
sza się wówczas, gdy na lewo od początku genu znajdują się elementy cis (ramki GC i CAAT). Te elementy sygnalne wiążą czynniki
transkrypcyjne trans, w tym wypadku Sp1 i CTF (zwane także C/EBR NF1, NFY). Elementy cis mogą funkcjonować w potożeniu nieza¬
leżnym od orientacji (strzałki).
h—
Ekspresja regulowana
Sekwencje
- regulatorowe -
dystalne (dalsze)
Ekspresja podstawowa
Sekwencje
_ proksymalne
(bliższe) względem
promotora
Ryc. 36-8. Diagram pokazujący transkrypcyjne regiony kontrolne hipotetycznego eukariotycznego genu klasy II, przepisywanego przez
polimerazę RNA klasy II. W takim genie można wydzielić regiony strukturalny oraz regulatorowy, a miejsce graniczne tych regionów
stanowi miejsce startu transkrypcji (strzałka; +1). Region kodujący zawiera sekwencję DNA, która jest transkrybowana na mRNA,
ulegający ostatecznie translacji na białko. Region regulatorowy składa się z elementów należących do dwóch klas. Jedna klasa zapewnia
podstawową ekspresję genu. Elementy te zwykle zawierają dwie składowe. Składnik proksymalny, zwykle kaseta (ramka) TATA, Inr lub
DPE, kierują polimerazę II RNA na odpowiednie miejsce (co zapewnia wierność transkrypcji). W promotorach niezawierających TATA to
pokrywający miejsce inicjacji (+1) element inicjatorowy Inr może kierować do tego miejsca polimerazę. Drugi składnik, elementy po¬
łożone przed startem, określa częstość inicjacji. Spośród tych elementów najlepiej została poznana kaseta CAAT, ale występują też inne
(wiązane przez białka transaktywujące Sp1, NF1, AP1 itp.), które mogą być wykorzystane w różnych genach. Ogólnie, za regulowaną
ekspresję jest odpowiedzialna druga klasa elementów regulatorowych cis. Klasa ta zawiera elementy, które wzmacniają (ang. enhan-
cers) lub wyciszają (ang. silencers) ekspresję oraz elementy, które pośredniczą w reakcji na różne sygnały, jak hormony, szok cieplny,
metale i związki chemiczne. Swoiste sekwencje tego typu zapewniają również swoistość ekspresji tkankowej. Działanie wszystkich tych
elementów, w zależności od orientacji, pokazują strzałki wewnątrz ramek. Na przykład element proksymalny (sekwencja TATA) musi
mieć orientację od 5' do 3'. Elementy położone przed elementami proksymalnymi najlepiej funkcjonują w orientacji od 5' do 3', ale
niektóre z nich mogą mieć orientację odwróconą (odwróconą polarność). Niektóre elementy nie są uplasowane na stałe w stosunku
do miejsca startu transkrypcji. Niektóre elementy odpowiedzialne za regulowaną ekspresję mogą w rzeczywistości być rozproszone
pomiędzy elementami uplasowanymi przed genem albo też mogą się znajdować za miejscem startu transkrypcji.
426 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
datkowym elementom cis - sekwencji inicja-
torowej (Inr) oraz tzw. dolnemu elementowi
promotorowemu (DPE), przez co podstawowa
transkrypcja zaczyna się od odpowiedniego miej¬
sca. Element Inr obejmuje punkt startu (od -3 do
+5) i składa się z sekwencji zgodnej TCA„,G/T
T T/C, która jest ze swojej natury podobna do
sekwencji inicjacji (A+1 oznacza pierwszy tran-
skrybowany nukleotyd). Do białek, które wiążą
się z Inr, aby kierować wiązaniem polimerazy II,
należy kompleks TFIID. Promotory, które mają
zarówno sekwencje TATA, jak i Inr są silniejsze
od tych, które mają tylko jeden z tych elementów.
DPE zawiera sekwencję zgodną A/GGA/TCGTG
i jest zlokalizowany ok. 25 pz za miejscem startu
+ 1. Podobnie jak Inr, sekwencje DPE są wiązane
przez podjednostki TAF tworzące TFIID. Analiza
ponad 200 genów eukariotycznych wykazuje, że
mniej więcej 30% zawiera sekwencję TATA oraz
Inr, 25% - Inr oraz DPE, 15% - wszystkie trzy
elementy, a ok. 30% - tylko Inr.
Leżące przed miejscem startu sekwencje,
w większej od niego odległości, określają, jak czę¬
sto zdarzenie transkrypcyjne ma zachodzić. Muta¬
cje w tych regionach zmniejszają częstość startu
transkrypcji 10-20 razy. Takie elementy DNA na¬
zywają się kasetami (ramkami) GC i CAAT, po¬
nieważ występują w nich tego rodzaju sekwencje.
Jak przedstawiono na ryc. 36-7, każda z tych kaset
wiąże unikatowe białko: Spl w przypadku ramki
GC i CTF (albo C/EPB, NF1, NFY) w przypadku
ramki CAAT; obydwie wiążą się dzięki swoistym
domenom wiążącym DNA (DBD). Częstość ini¬
cjacji transkrypcji jest następstwem oddziaływań
między białkami i DNA oraz złożonych oddziały¬
wań między poszczególnymi domenami czynni¬
ków transkrypcyjnych (różniącymi się od domen
DBD - tzw. domen aktywujących AD) tych białek
i resztą mechanizmu transkrypcyjnego (polimera-
za RNA klasy II i czynniki zasadowe TFIIA, B, D,
E, F) (patrz niżej oraz ryc. 36-9 i 36-10). Oddzia¬
ływania białko-DNA w sekwencji TATA, obej¬
mujące polimerazę RNA klasy II i inne składowe
podstawowego mechanizmu transkrypcyjnego,
zapewniają wierność inicjacji.
Podsumowując, promotor oraz proksymalne
w stosunku do promotora m-sprzężone elementy
umiejscowione przed miejscem startu transkryp¬
cji decydują o wierności i częstotliwości inicjacji
transkrypcji genu. Szczególnie sztywne wymogi,
zarówno co do umiejscowienia, jak i orientacji,
dotyczącą sekwencji TATA. Zmiana jednej pary
zasad w jakimkolwiek z takich elementów cis po¬
woduje w efekcie dramatyczne skutki, zmniejsza¬
jąc powinowactwo przyłączających się pokrew¬
nych czynników trans (TFIID/TBP, Spl, CTF
i inne). Usytuowanie tych elementów względem
miejsca startu transkrypcji także może mieć klu¬
czowe znaczenie. Jest to szczególnie prawdziwe
w odniesieniu do sekwencji TATA, Inr oraz DPE.
Ryc. 36-9. Podstawowy kompleks transkrypcyjny w komórce eukariotycznej. Utworzenie podstawowego kompleksu transkrypcyjnego
rozpoczyna się od związania się TFIID z sekwencją TATA. Kieruje to procesem (opartym na oddziaływaniach białko-DNA i białko-białko)
dalszego gromadzenia się wielu innych składników. Cały kompleks pokrywa obszar DNA od pozycji -30 do +30 względem miejsca
inicjacji (+1, oznaczone zgiętą strzałką). Struktury polimerazy RNA klasy II oraz TBP związanego z promotorem TATA w obecności
TFIIB lub TFIIA zostały zbadane (za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego) na poziomie atomowym, z rozdzielczością
0,3 nm (3 A). Z kolei struktury kompleksów TFIID i TFIIH zostały określone za pomocą mikroskopii elektronowej, z rozdzielczością 3 nm
(30 A). Dzięki takim technikom struktura molekularna mechanizmu transkrypcyjnego zaczyna być jasna. Wiele z uzyskanych informacji
strukturalnych pozostaje w zgodzie z przedstawianymi tu modelami.
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 427
Szybkość
transkrypcji
Ryc. 36-10. Dwa modele formowania aktywnych kompleksów transkrypcyjnych oraz schemat wyjaśniający jak aktywatory i koaktywa-
tory mogą wzmacniać transkrypcję. Pokazano (duży owal) wszystkie składniki podstawowego kompleksu transkrypcyjnego przed¬
stawionego na ryc. 36-9 (tzn. RNAP II i TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF i TFIIH. (A) Podstawowy kompleks transkrypcyjny jest formowany
na promotorze po związaniu się podjednostki TBP czynnika TFIID z sekwencją TATA. Wiele koaktywatorów TAF pozostaje zasocjo-
wanych z TBR W niniejszym przykładzie aktywator transkrypcji CTF jest pokazany jako związany z sekwencją CAAT, tworzący kompleks
w kształcie pętli w wyniku oddziaływań z TAF związanym z TBR (B) Model rekrutacji. Aktywator transkrypcji CTF wiąże się z sekwencją
TATA i oddziałuje z koaktywatorem (w tym wypadku TAF). Pozwala to na asocjację z uprzednio powstałym podstawowym kompleksem
transkrypcyjnym - TBR W ten sposób TBP może się połączyć z sekwencją TATA, zaś powstały kompleks staje się w pełni aktywny.
Trzecia klasa elementów sekwencji ma zdol¬
ność do zwiększania lub zmniejszania szybko¬
ści inicjacji transkrypcji genów eukariotycz¬
nych. Elementy te są nazywane, w zależności
od skutku jaki wywołują, elementami wzmac¬
niającymi (enhancers) lub tłumiącymi (si-
lencers) transkrypcję. Elementy te znaleziono
w różnych miejscach, zarówno przed, jak i za
miejscem startu transkrypcji, a nawet w obrębie
pewnych przepisywanych genów. W odróżnie¬
niu od elementów leżących proksymalnie oraz
przed promotorem, sekwencje wzmacniające
i tłumiące mogą wywierać wpływ także wów¬
czas, gdy są w odległości setek lub tysięcy
zasad od jednostek transkrypcyjnych znajdują¬
cych się na tym samym chromosomie. Zaska¬
kujące jest, że sekwencje wzmacniające i tłu¬
miące są aktywne niezależnie od ich orientacji
(polamości). Opisano dosłownie setki takich
elementów. W niektórych przypadkach wymo¬
gi co do wiązania się takich sekwencji są ściśle
ograniczone; w innych dopuszczalna jest znacz¬
na zmienność. Niektóre sekwencje wiążą się
jedynie z pojedynczym białkiem, choć więk¬
szość może przyłączać ich więcej. Podobnie,
pojedyncze białko może wiązać się z więcej niż
jednym elementem.
Elementy odpowiedzi hormonalnej (dla ste¬
roidów, T3, kwasu retinowego, peptydów itp.)
działają jako sekwencje wzmacniające lub tłu¬
miące, albo w sprzężeniu z nimi (p. rozdz. 42).
Inne procesy wzmacniające lub tłumiące ekspre¬
sję genu, np. reakcje na wstrząs cieplny, metale
ciężkie (Cd2+ i Zn2+) i niektóre toksyczne związki
chemiczne (np. dioksyna), działają za pośred¬
nictwem swoistych elementów regulatorowych.
Tkankowo swoista ekspresja genów (np. genu
albuminy w wątrobie czy genu hemoglobiny
w retikulocytach) zachodzi także dzięki swoi¬
stym sekwencjom DNA.
428 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Terminacja transkrypcji jest regulowana
specyficznymi sygnałami
Sygnały terminacji transkrypcji dla eukario¬
tycznej polimerazy RNA klasy II są słabo pozna¬
ne. Wydaje się jednak, że znajdują się one za (na
prawo) sekwencją kodujących genów eukario¬
tycznych, i daleko od niej. Na przykład sygnał dla
terminacji transkrypcji mysiej P-globiny występu¬
je w wielu miejscach odległych 1000-2000 zasad
od lokalizacji, w której ostatecznie zostanie doda¬
na sekwencja (ogon) poli(A). Niewiele o termi¬
nacji wiadomo, podobnie jak o tym, czy w oma¬
wianym procesie biorą udział swoiste czynniki
terminacji analogiczne do bakteryjnego czynnika
rho (p). Wiadomo jednak, że koniec 3' mRNAjest
syntetyzowany w okresie potranskrypcyjnym, że
w jakiś sposób ma to związek ze zdarzeniami (lub
strukturami) występującymi w miejscu inicja¬
cji lub podczas inicjacji, że zależy od specjalnej
struktury w jednej z podjednostek polimerazy
RNA klasy 11 (CTD; patrz niżej) i że synteza ta
wydaje się przebiegać dwuetapowo. Po przesu¬
nięciu się polimerazy RNA klasy II przez region
jednostki transkrypcyjnej kodujący fragment tran-
skryptu na końcu 3' endonukleaza RNA przecina
pierwotny transkrypt w miejscu leżącym ok. 15
zasad w kierunku 3' od sekwencji konsensuso-
wej AAUAAA, która jest sygnałem do przecięcia
transkryptów eukariotycznych. Nowo utworzony
koniec 3' jest na zakończenie poliadenylowany
w nukleoplazmie, jak to opisano poniżej.
EUKARIOTYCZNY KOMPLEKS
TRANSKRYPCYJNY
Dokładną i dającą się regulować transkrypcję ge¬
nów eukariotycznych zapewnia złożony aparat,
obejmujący aż 50 unikatowych białek. Informację
zawartą w nici matrycowej DNA przepisują na
RNA polimerazy RNA (poi I, poi 11 oraz poi III,
przepisujące, odpowiednio, geny klasy I, II i III).
Polimerazy te muszą rozpoznawać swoiste miej¬
sca promotora, aby móc zainicjować transkrypcję
od odpowiedniego nukleotydu. W przeciwieństwie
jednak do sytuacji u prokariotów, eukariotyczne
polimerazy RNA nie są w stanie same rozróżnić
sekwencji promotorowych od innych regionów
DNA; zatem inne swoiste białka, zwane ogólnymi
czynnikami transkrypcyjnymi (GTF), ułatwia¬
ją wiązanie się tych enzymów i tworzenie kom¬
pleksu preinicjacyjnego (PIC). Taka kombinacja
składników może katalizować podstawową lub
nieregulowaną transkrypcję in vitro. Inny zestaw
białek - koaktywatorów - pomaga regulować
szybkość inicjacji transkrypcji poprzez oddzia¬
ływanie z aktywatorami transkrypcji, które wią¬
żą się z wcześniej położonymi elementami DNA
(patrz niżej).
Tworzenie podstawowego kompleksu
transkrypcyjnego
U bakterii kompleks złożony z czynnika a i po¬
limerazy wiąże się wybiórczo z DNA promotora
bakteryjnego, tworząc PIC. Sytuacja jest bar¬
dziej złożona w przypadku genów eukariotycz¬
nych. Jako przykład można podać transkrypcję
genów klasy II, czyli tych, które są przepisywane
na mRNA przez polimerazę II. Dla genów kla¬
sy 11 funkcję czynnika a przejmują różne biał¬
ka. Transkrypcja podstawowa, oprócz poi II,
wymaga kilku czynników (GTF), zwanych:
TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF i TFIIH.
Czynniki te pobudzają transkrypcję przy udzia¬
le polimerazy RNA klasy II praktycznie we
wszystkich genach. Niektóre z czynników GTF
składają się z licznych podjednostek. Spośród
tych czynników jedynie TFIID, który wiąże się
z sekwencją TATA, jest zdolny do wiązania się
ze swoistymi sekwencjami DNA. Jak to opisa¬
no niżej, czynnik TFIID składa się z białka wią¬
żącego sekwencję TATA (TBP) i 14 czynników
towarzyszących TBP, tzw. czynników TAF (ang.
TBP-associated factors).
TBP wiąże się z sekwencją TATA w obrębie
rowka mniejszego DNA (większość czynników
transkrypcyjnych wiąże się w rowku większym)
i powoduje skręcenie, mniej więcej o 100 stopni,
helisy DNA. Uważa się, że zdarzenie to ułatwia
oddziaływanie czynników związanych z TBP
z innymi składnikami kompleksu inicjującego
transkrypcję, a być może z czynnikami związany¬
mi z elementami położonymi wcześniej. Wpraw¬
dzie TBP został zdefiniowany jako komponent
promotorów genów klasy II, jednak dzięki jego
powiązaniu ze specyficznymi dla polimeraz gru¬
pami czynników TAF jest on także ważnym skład¬
nikiem kompleksów inicjujących klasy I oraz III,
nawet jeśli nie zawierają one sekwencji TATA.
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 429
Wiązanie TBP znakuje określony promotor
transkrypcji; jest to jedyny etap w procesie for¬
mowania całkowicie zależny od nacechowanego
wysokim powinowactwem swoistego oddziały¬
wania białko-DNA. Spośród szeregu kolejnych
zdarzeń pierwsze jest wiązanie czynnika TF1IA,
potem TFIIB do kompleksu TFIlD-promotor.
W wyniku tego powstaje trwały trójskładniko¬
wy kompleks, którego lokalizacja w miejscu ini¬
cjacji transkrypcji staje się bardziej precyzyjna,
a wiązanie mocniejsze. Taki kompleks przyciąga
następnie, i wiąże z promotorem, kompleks poi
II-TFIIF. Pod względem budowy i funkcji TF1IF
jest podobny do bakteryjnego czynnika o i jest on
niezbędny do dostarczania poi II do promotora.
Ostatnim krokiem w tworzeniu kompleksu PIC
jest dodanie TFIIE i TFIIH. Wydaje się, że do
kompleksu poi II-TFIIF dołącza TFIIE, następnie
zaś jest rekrutowany TFIIH. Każdy z tych etapów
zwiększa rozmiar kompleksu; w końcu pokrywa
on ok. 60 pz (od -30 do +30 w stosunku do nukleo-
tydu +1, od którego rozpoczyna się transkrypcja)
(p. ryc. 36-9). Kompleks PIC tworzy wtedy całość
i jest zdolny inicjować, od prawidłowego nukleo-
tydu, podstawowy proces transkrypcji. W genach,
które nie mają sekwencji TATA, są potrzebne te
same czynniki, łącznie z białkiem TBP. W takich
przypadkach precyzyjne ustawienie kompleksu
do inicjacji transkrypcji zapewniają Inr lub DPE
(p. ryc. 36-8).
Polimeraza II jest aktywowana dzięki
fosforylacji
Eukariotyczna polimeraza II składa się z 12 pod-
jednostek. Dwie największe, po ok. 200 kDa, są
homologami podjednostek bakteryjnych p i p'.
Oprócz zwiększonej liczby podjednostek* eu¬
kariotyczna polimeraza II różni się od swoje¬
go prokariotycznego odpowiednika tym, że na
końcu C największej podjednostki zawiera serię
siedmioelementowych powtórzeń, zawierających
sekwencję zgodną Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser.
Taka karboksykońcowa domena powtórzeń
(CTD) liczy u drożdży 26 powtarzających się
jednostek, zaś w komórkach eukariotów jest ich
52. CTD jest zarówno substratem dla wielu ki¬
naz, włącznie z kinazową składową TFIIH, jak
i miejscem wiążącym dla różnorodnych białek.
Wykazano, że CTD oddziałuje z enzymami prze¬
kształcającymi RNA; tego typu asocjacja może
mieć związek z poliadenylacją RNA. Wiązanie
się różnych czynników z CTD polimerazy RNA
klasy II (i z innymi składowymi podstawowego
mechanizmu transkrypcyjnego) w jakiś sposób
łączy inicjację z powstawaniem końca 3' mRNA.
Pol II zostaje aktywowana z chwilą fosforyla¬
cji reszt serynowych i treoninowych, z kolei jej
aktywność zostaje zmniejszona, gdy CTD ulega
defosforylacji. Fosforylacja CTD jest decydująca
dla uwalniania promotora, elongacji, terminacji,
a nawet dla należytego przekształcania mRNA.
Pol II pozbawiona „ogona” CTD jest niezdolna do
aktywowania transkrypcji; podkreśla to znaczenie
tej domeny.
Pol II łączy się z innymi białkami o nazwie Med
lub białka mediatorowe, w wyniku czego powstaje
kompleks holoenzymatyczny; kompleks ten może
powstawać na promotorze lub w roztworze, przed
utworzeniem się PIC. U drożdży z CTD łączy się
co najmniej 25 produktów genów. Białka Med
są niezbędne do należytej regulacji transkrypcji
z udziałem poi II, jakkolwiek ich dokładna rola
w tym procesie nie została, jak dotąd, określona.
W komórkach człowieka stwierdzono obecność
pokrewnych białek, zawierających jeszcze bar¬
dziej złożone postacie polimerazy RNA klasy II
(>30 białek, Medl-Med 31).
Rola aktywatorów i koaktywatorów
transkrypcji
Początkowo sądzono, że TFIID jest pojedynczym
białkiem. Jednak liczne przesłanki doprowadziły
do ważnego odkrycia, że TFIID jest w rzeczy¬
wistości kompleksem składającym się z TBP
i 14 czynników TAF. Pierwszym dowodem, że
TFIID jest bardziej złożony, była obserwacja, że
TBP wiąże się z segmentem DNA leżącym 10 pz
bezpośrednio przed sekwencją TATA, natomiast
natywny holo-TFIID pokrywa region 35 pz lub
większy (p. ryc. 36-9). Drugim dowodem było to,
że TBP ma masę cząsteczkową 20—40 kDa, nato¬
miast kompleks TFIID - ok. 1000 kDa. Najważ¬
niejszym dowodem jest fakt, że TBP podtrzymuje
transkrypcję podstawową, lecz nie podtrzymuje
transkrypcji nasilonej w wyniku działania nie¬
których aktywatorów, np. Spl związanym z sek¬
wencją (kasetą) GC, natomiast TFIID utrzymuje
zarówno transkrypcję podstawową, jak i wzmo-
430 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
żoną dzięki działaniu takich czynników, jak: Spl,
Octl, API, CTF, ATF (tab. 36-3). Czynniki TAF
są niezbędne do transkrypcji nasilanej działaniem
aktywatorów. Obecnie nie jest jeszcze jasne, czy
istnieje jedna, czy kilka postaci TFIID, które
mogą się nieco różnić zestawem czynników TAF.
Możliwe, że różne kombinacje czynników TAF
z TBP - albo z jednym z wielu ostatnio odkrytych
czynników podobnych do TBP (ang. TBP-like
factors, TLF) - wiążą się z różnymi promotora¬
mi, co może tłumaczyć selektywną aktywację,
stwierdzoną ostatnio dla różnych promotorów,
oraz różną „moc” niektórych promotorów. Czyn¬
niki TAF, jako niezbędne dla aktywności akty¬
watorów, często są nazywane koaktywatorami.
Rozróżnia się trzy klasy czynników transkrypcyj-
nych, biorących udział w regulacji genów klasy II:
czynniki podstawowe, koaktywatory i aktywato-
ry-represory (tab. 36-4). Kwestią o podstawowym
znaczeniu jest sposób, w jaki omawiane klasy bia¬
łek współdziałają, decydując o miejscu i częstości
transkrypcji.
Tabela 36-3. Niektóre kontrolne elementy transkrypcji, ich se¬
kwencje konsensusowe (zgodne) i czynniki, które wiążą się
z nimi, a które są znajdywane w genach ssaków, przepisywanych
przez polimerazę RNA klasy II
Element
Sekwencja zgodna
Czynnik
Sekwencja TATA
TATAAA
TBP/TFIID
Sekwencja CAAT
CCAATC
C/EBP*, NF-Y*
Sekwencja GC
GGGCGG
Sp1*
CAACTGAC
MyoD
T/CGGA/CN5GCCAA
NF1*
Oktamer Ig
ATGCAAAT
0ct1,2,4,6*
AP1
TGAG/CTC/AA
Jun, Fos, ATF*
Element odpowiedzi
na surowicę
GATGCCCATA
SRF
Element reakcji na
szok cieplny
(NGAAN)3
HSF
Pełna lista obejmowałaby dziesiątki przykładów. Gwiazdka ozna¬
cza, że dana rodzina składa się z różnych członków.
Tabela 36-4. Trzy klasy czynników transkrypcji genów klasy
drugiej
Mechanizm ogólny
Swoiste komponenty
Komponenty podstawowe
TBP, TFIIA, B, E, F i H
Koaktywatory
TAFs (TBP+TAFs) = TFIID; Meds
Aktywatory
SP1, ATF, CTF, AP1 itd. ,
Dwa modele formowania kompleksu
prelnicjacyjnego
Opisany wyżej model tworzenia kompleksu PIC
opiera się na stopniowym dodawaniu, w warun¬
kach in vitro, oczyszczonych składników układu.
Podstawową cechą tego modelu jest składanie
kompleksu na matrycy DNA. Na tej podstawie
uważa się, że aktywatory transkrypcji, które za¬
wierają autonomiczne domeny wiążące i akty¬
wujące DNA (p. rozdz. 38) działają na zasadzie
pobudzania formowania lub funkcjonowania
kompleksu PIC. Koaktywatory TAF są uważane
za czynniki pomostowe, umożliwiające komu¬
nikowanie się między aktywatorami leżącymi
przed białkami stowarzyszonymi z poi II lub też
wieloma innymi składowymi TFIID. Model ten,
zakładający etapowy charakter składania PIC
- promowanego przez różne oddziaływania mię¬
dzy aktywatorami, koaktywatorami i składowymi
PIC - pokazano na ryc. 36-10 A. Potwierdzają go
obserwacje, że wiele z tych białek rzeczywiście
wiąże się ze sobą w warunkach in vitro.
Niedawno zebrane dowody sugerują, że moż¬
liwy jest jeszcze inny mechanizm tworzenia PIC
i regulacji transkrypcji. Po pierwsze, w ekstrak¬
tach komórkowych są znajdywane duże, wstępnie
poskładane, kompleksy czynników GTF oraz poi
II. Kompleks taki może się wiązać z promotorem
jednoetapowo. Po drugie, szybkość transkrypcji
osiągana, gdy aktywatory są dodawane do holo-
enzymu poi II w granicznych stężeniach, może
być uzyskana również przez zwiększanie stężenia
holoenzymu poi II pod nieobecność aktywatorów.
Wynika stąd, że same aktywatory nie są niezbędne
do tworzenia PIC. Takie spostrzeżenia doprowa¬
dziły do sformułowania hipotezy „rekrutacji”,
którą sprawdzono doświadczalnie. Mówiąc pro¬
sto, rolą aktywatorów i koaktywatorów być może
jest jedynie werbowanie do promotora uprzednio
powstałego kompleksu holoenzym-GTF. Wymóg
obecności domeny aktywującej można spełnić
dzięki technikom rekombinacji DNA, poprzez
przyłączenie do wiążącej DNA domeny (DBD)
aktywatora albo komponentu TFIID, albo też ho¬
loenzymu poi II. Podobne zakotwiczenie, dzięki
komponentowi DBD aktywatora, prowadzi do
otrzymania funkcjonalnej transkrypcyjnie struk¬
tury; dalsze wymogi wobec domeny aktywującej
aktywatora są zbędne. W modelu tym rolą domen
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 431
aktywujących oraz TAF jest tworzenie struktury,
która kieruje powstały kompleks holoenzym-GTF
do promotora; nie uczestniczą one w formowaniu
kompleksu PIC (p. ryc. 36-10 B). Wydajność pro¬
cesu rekrutacji określa tu bezpośrednio szybkość
transkrypcji z udziałem danego promotora.
Hormony - i inne efektory służące do przekazu
informacji związanej ze środowiskiem pozako-
mórkowym - modulują ekspresję genów, wpływa¬
jąc na formowanie i aktywność kompleksów ak¬
tywatorów i koaktywatorów oraz na powstawanie
następnie kompleksu PIC z udziałem promotora
docelowych genów (p. rozdz. 42). Dzięki licznym
komponentom biorącym udział w tych zjawiskach
możliwe są wielorakie kombinacje, a zatem duży
zakres aktywności transkrypcyjnej danego genu.
Należy zaznaczyć, że oba modele powstawania
PIC - etapowy i rekrutacji - nie wykluczają się
wzajemnie. Można sobie wyobrazić różne, jesz¬
cze bardziej skomplikowane scenariusze oddzia¬
ływania na gen, przywołujące elementy obu omó¬
wionych modeli.
CZĄSTECZKI RNA ZWYKLE SA
PRZEKSZTAŁCANE ZANIM STANA SIĘ
AKTYWNE
W organizmach prokariotycznych pierwotne tran-
skrypty genów kodujących mRNA są używane
jako matryce do translacji nawet przed ukończe¬
niem transkrypcji. Dzieje się tak prawdopodobnie
dlatego, że miejsce transkrypcji nie jest ograniczo¬
ne do obszaru jądra, jak w organizmach eukario¬
tycznych. Zatem w komórkach prokariotycznych
transkrypcja i translacja są ze sobą sprzężone.
Ryc. 36-11. Uwarunkowana przez polimerazę RNA klasy II transkrypcja genu na mRNA jest sprzężona kotranskrypcyjnie
z przekształcaniem i transportem RNA. Pokazano polimerazę II aktywnie przepisującą gen kodujący mRNA (elongacja od
dotu do góry ryciny). Czynniki przekształcania RNA (np. SR/czynniki splicingu zawierające motyw RNP, jak również czyn¬
niki poliadenylacji i terminacji) oddziałują z domeną CTD polimerazy II, podczas gdy czynniki pakujące mRNA, takie jak
kompleks TH0/TREX, zostają rekrutowane do powstającego transkryptu mRNA albo dzięki bezpośrednim oddziaływaniom
polimerazy II, jak pokazano, albo dzięki oddziaływaniom z SR/czynnikami splicingu obecnymi na powstających mRNA.
Uważa się, że w obu wypadkach powstające łańcuchy mRNA są szybciej i dokładniej przetwarzane, dzięki szybkiej rek¬
rutacji wielu z tych czynników do powstającego łańcucha (prekursora) mRNA. W ślad za odpowiednim przetworzeniem
mRNA dojrzały mRNA jest dostarczany do porów jądrowych, które licznie występują w błonie jądrowej; po przetranspor¬
towaniu przez pory, cząsteczki mRNA mogą łączyć się z rybosomami i ulegać translacji, tworząc białko. (Zaadaptowane
z Jensen et al. (2005). Molecular Celi, 11:1129-1138.).
432 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
W konsekwencji prokariotyczny mRNA podle¬
ga niewielkim modyfikacjom i przekształceniom
przed rozpoczęciem swojej czynności w procesie
biosyntezy białek. Odpowiednia regulacja niektó¬
rych genów (np. operonu Trp) opiera się na sprzę¬
żeniu transkrypcji i translacji. Prokariotyczne czą¬
steczki rRNA i tRNA są przepisywane w postaci
jednostek znacznie dłuższych niż ich cząsteczka
końcowa. W rzeczywistości, liczne jednostki
transkrypcyjne tRNA zawierają więcej niż jedną
cząsteczkę. W organizmach prokariotycznych do
wytworzenia dojrzałych czynnościowo cząste¬
czek niezbędne jest zatem przekształcenie prekur-
sorowych cząsteczek rRNA i tRNA.
Prawie wszystkie eukariotyczne pierwotne tran-
skrypty RNA podlegają dużym przekształceniom
od momentu ich zsyntetyzowania do rozpoczęcia
swojej ostatecznej funkcji; przekształceniom pod¬
legają zarówno mRNA, jak i cząsteczki struktu¬
ralne, takie jak rRNA, 5S RNA, tRNA, lub też
mechanizm obróbki RNA i snRNA. Proces prze¬
kształcenia zachodzi głównie w jądrze. Proces
ten obejmuje nukleolityczne cięcie na mniejsze
cząsteczki oraz sprzężone reakcje nukleolitycz¬
ne i reakcje ligacji (splicing eksonów). Tym
niemniej, procesy transkrypcji, przekształcania
RNA, a nawet transportu RNA z jądra są silnie
skoordynowane. Uważa się, że to transkrypcyj¬
ne koaktywatory o nazwie SAGA u drożdży, a P/
/CAF w komórkach ludzkich, są odpowiedzialne
za łączenie aktywacji transkrypcji z przekształca¬
niem RNA, co odbywa się poprzez rekrutację in¬
nego kompleksu, nazwanego TREX, który bierze
udział w elongacji, zjawisku splicingu i ekspor¬
tu jądrowego. TREX (ang. transcription-export)
jest prawdopodobnie molekularnym łącznikiem
pomiędzy kompleksami elongacyjnymi, mecha¬
nizmem splicingu RNA i eksportu jądrowego
(p. ryc. 36-11). Sprzężenie to prawdopodobnie
radykalnie zwiększa wierność i szybkość prze¬
mieszczania się RNA do cytoplazmy, gdzie odby¬
wa się translacja.
Ekson 1
Ekson 2
Koniec 5'
czapeczki
-//" An Koniec 3' transkryptu
pierwotnego
Czapeczka — s
t
Czapeczka ■
^ O
^G—OH ^— A-G
i
VAA„
VAA„
Nacięcie nukleofilowe
przy końcu 5' intronu
Tworzenie struktury
lassa
Czapeczka -
’C
VAA„
Czapeczka — s;
-/A*n
Nacięcie przy końcu
3' intronu
Ligacja końca 3' eksonu 1
do końca 5' eksonu 2
Enzymatyczne strawienie
intronu
Ryc. 36-12. Przekształcanie pierwotnego transkryptu (hnRNA) w mRNA. W tym hipotetycznym tran¬
skrypcje lewy koniec intronu jest przecięty (j), a intron tworzy pętlę (lasso) między swoim końcem 5'
oraz A w pobliżu końca 3' w obrębie sekwencji zgodnej UACUAAC. Sekwencja ta jest nazywana miejs¬
cem rozgałęzienia; znajdująca się najbliżej końca 3' A tworzy z G wiązanie 5'—21. Następuje wówczas
nacięcie końca 3' (prawego) intronu (U). Powoduje to uwolnienie pętli, która zostaje strawiona enzy¬
matycznie, a ekson 1 ulega połączeniu z eksonem 2 poprzez reszty G.
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 433
(\Au - UAAGU -
, Sekwencje zgodne
* \
■ UACUAAC 28-37 nukleotydów C AG
C
5' Ekson I
1 AG
•4
Ryc. 36-13. Sekwencje zgodne w miejscu połączenia. Na rycinie pokazano sekwencję 5' (dawca albo sekwencja
lewa) i sekwencję 3' (biorca lub sekwencja prawa). Pokazano także sekwencję zgodną (konsensusową) drożdży
(UACUAAC) w miejscu rozgałęzienia. W komórkach ssaków sekwencja konsensus ma układ PyNPyPyPuAPy, gdzie
Py jest pirymidyną, Pu jest puryną, a N może być dowolnym nukleotydem. Miejsce rozgałęzienia jest zlokalizowane
20-40 nukleotydów przed miejscem 3' (Copyright © 2005. Przedrukowano za zgodą Elsevier).
Wiadomo jednak, że w komórkach ssaków aż
50-70% jądrowego RNA nie znajduje się w cy-
toplazmatycznym mRNA. Ten jądrowy ubytek
RNA jest dużo większy niżby to wynikało jedynie
z utraty samych sekwencji wtrąconych (p. niżej).
Dokładna rola pozornego nadmiaru transkryptów
w jądrze komórek ssaków nie jest znana, jakkol¬
wiek niedawne odkrycie miRNA może wyjaśnić
znaczącą część tej nadmiernej transkrypcji.
Kodujące części (eksony)
większości genów eukariotycznych
sq przedzielone intronami
Pomiędzy kodującymi aminokwasy częściami
wielu genów (eksonami) są rozproszone długie
sekwencje DNA, które nie niosą informacji ge¬
netycznej ostatecznie przetłumaczonej na sek¬
wencję aminokwasów w cząsteczce białkowej
(p. rozdz. 35). Sekwencje te w istocie rzeczy
przerywają regiony kodujące genów struktural¬
nych. Takie wtrącone sekwencje (introny) znaj¬
dują się w większości genów, ale nie u wszyst¬
kich wyższych organizmów eukariotycznych.
Pierwotne transkrypty genów strukturalnych
zawierają mRNA komplementarny do sekwencji
wtrąconych. Sekwencje intronowe w RNA zostają
jednak wycięte z transkryptu, a eksony transkryp-
tu są w jądrze odpowiednio składane i łączone
(ligacja), zanim powstająca cząsteczka mRNA
pojawi się w cytoplazmie, gdzie będzie służyła
do translacji (ryc. 36-12 i 36-13). Jedną z prób
wyjaśnienia takiej budowy genów jest przypusz¬
czenie, że eksony, które często kodują domenę
aktywną białka, przedstawiają wygodny sposób
„tasowania” informacji genetycznej. Pozwala to
organizmom na szybkie sprawdzanie rezultatów
łączenia ze sobą różnych funkcjonalnych domen
białkowych.
Introny sę usuwane, a eksony podlegają
splicingowi (spajaniu)
Mechanizmy usuwania intronów z pierwotnego
transkryptu w jądrze, mechanizmy spajania ekso-
nów, w wyniku czego tworzy się „dojrzała” czą¬
steczka mRNA oraz mechanizmy transportu czą¬
steczki mRNA do cytoplazmy są obecnie w fazie
wyjaśniania. Poznano już cztery różne mechani¬
zmy reakcji spajania; ten najczęściej występujący
w komórkach eukariotycznych zostanie tu przed¬
stawiony. Chociaż sekwencje nukleotydów w in-
tronach różnych eukariotycznych transkryptów,
a nawet te w obrębie pojedynczego transkryptu,
są dość różnorodne, to jednak występują umiar¬
kowanie zachowawcze sekwencje w każdym
z dwóch połączeń ekson-intron (miejsce spojenia)
i w miejscu rozgałęzienia, które znajdująsię 20-40
nukleotydów przed miejscem spojenia 3' (p. sek¬
wencje zgodne na ryc. 36-13). W przekształceniu
pierwotnego transkryptu na mRNA bierze udział
swoista wieloelementowa struktura zwana splico-
somem. Splicosomy składają się z pierwotnego
transkryptu, pięciu małocząsteczkowych RNA
(Ul, U2, U5, U4 i U6) i ponad 60 białek, z któ¬
rych wiele zawiera zachowawcze motywy „RNP”
oraz „SR”. Razem tworzą one małocząsteczko-
wy kompleks rybonukleoproteinowy (snRNP),
czasem nazywany „snurp”. Splicosom (penta-
-snRNP) powstaje prawdopodobnie przed rozpo¬
częciem oddziaływań z prekursorowym mRNA.
Uważa się, że struktury typu „snurp” odpowiadają
za odpowiednie ułożenie odcinków RNA w reak¬
cjach splicingu. Reakcja spojenia rozpoczyna się
od nacięcia spojenia końca 5' eksonu (dawca lub
lewa strona) i intronu (p. ryc. 36-12). Zachodzi
to dzięki atakowi nukleofilowemu reszty adeny-
lowej w sekwencji punktu rozgałęzienia, leżącej
przed końcem 3' tego intronu. Wolny koniec 5'
434 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
sekwencji intronowej tworzy wówczas pętlę albo
strukturę lassa, która jest połączona wiązaniem
5'—2' z reaktywnym nukleotydem A w miejscu
rozgałęzienia o sekwencji PyNPyPyPuAPy (p. ryc.
36-13). Reszta adenylowa znajduje się zazwyczaj
28-37 nukleotydów przed końcem 3' intronu, któ¬
ry zostaje usunięty. Miejsce rozgałęzienia określa
miejsce zespolenia 3'. Drugie przecięcie następuje
w miejscu połączenia intronu z końcem 3' eksonu
(dawca lub strona prawa). W tej drugiej reakcji,
0 charakterze transestryfikacji, grupa hydroksy¬
lowa w pozycji 3' przed eksonem atakuje resztę
fosforanową w pozycji 5' leżącej przed granicą
ekson-intron, a struktura lassa zawierająca intron
oddziela się i zostaje zhydrolizowana. Końce 5'
1 3' eksonów są następnie spajane i tworzą ciągłą
sekwencję.
W procesie formowania różnych struktur i czą¬
steczek pośrednich niezbędne są snRNA i towa¬
rzyszące białka. Najpierw cząsteczka U1 w struk¬
turze snRNP wiąże się według reguły parowania
zasad z końcem 5' granicy ekson-intron. Następ¬
nie cząsteczka U2 kompleksu snRNP wiąże się,
według tej samej reguły, z miejscem rozgałęzie¬
nia. Eksponuje to mającą nukleofilowy charakter
resztę A. Z kolei U5/U4/U6 zawarte w kompleksie
snRNP pośredniczą w zależnym od ATP, pośred-
niczonym przez białko procesie rozwijania, w wy¬
niku którego następuje rozerwanie sparowanego
kompleksu U4-U6 i uwolnienie U4. U6 staje się
wtedy zdolny do oddziaływania najpierw z U2,
a następnie z Ul. Oddziaływania te powodują
zbliżenie miejsca 5' splicingu, punktu rozgałęzie¬
nia z reaktywną resztą A oraz miejsca splicingu 3'.
Ułożenie to jest wspomagane przez U5. W wyni¬
ku tego procesu tworzy się także struktura pętli
(lassa). Oba końce zostają przecięte prawdo¬
podobnie przez U2-U6 w obrębie kompleksu
snRNP. U6 jest z pewnością czynnikiem niezbęd¬
nym, na co wskazuje przykład drożdży pozba¬
wionych tego snRNA; są one niezdolne do życia.
Należy zwrócić uwagę, że RNA służy tu jako
czynnik katalityczny. Taka sekwencja zdarzeń
jest następnie powtarzana w genach, które zawie¬
rają liczne introny. W tych przypadkach przebieg
procesu jest charakterystyczny dla każdego genu,
a introny niekoniecznie są usuwane w kolejności:
pierwszy, potem drugi, potem trzeci itd.
Wydaje się, że wzajemne relacje między hnRNA
i odpowiadającym mu dojrzałym mRNA w ko¬
mórkach eukariotycznych zostały już wyjaśnione.
Cząsteczki hnRNA są pierwotnymi transkryptami
oraz produktami wczesnych przekształceń; po do¬
daniu czapeczek i sekwencji poli(A) oraz usunię¬
ciu części odpowiadającej intronom, cząsteczki te
są transportowane do cytoplazmy jako dojrzałe
cząsteczki mRNA.
Alternatywny splicing zapewnia
różnorodność mRNA
Przekształcanie cząsteczek hnRNA jest zja¬
wiskiem umożliwiającym regulację ekspresji
genów. Alternatywne wzorce składania RNA są
wynikiem działania tkankowo specyficznych me¬
chanizmów adaptacyjnych oraz mechanizmów
kontroli rozwoju embrionalnego. Jak już wspo¬
mniano, sekwencja zdarzeń w zjawiskach splicin¬
gu ekson-intron ma, dla danego genu, charakter
hierarchiczny. W trakcie splicingu tworzą się
bardzo złożone struktury RNA, przy czym bie¬
rze w tym udział wiele cząsteczek snRNA oraz
białek, co stwarza wiele możliwości zmian w ko¬
lejności wspomnianej sekwencji zdarzeń, a także
generowania różnorakich rodzajów mRNA. Wy¬
korzystywanie alternatywnych miejsc terminacji,
Prekursorowy mRNA
m—s—tu- AAUAA — AAUAA — (A)n
Selektywne spajanie (splicing)
AAUAA — AAUAA — (A)n
Alternatywne miejsce donorowe 5'
jmatywne miejsce akceptorowe 3'
AAUAA — AAUAA — (A)n
AAUAA — AAUAA — (A)n
Alternatywne miejsce poliadenylacji
AAUAA — (A)n
Ryc. 36-14. Alternatywne mechanizmy przekształcania prekur-
sorowych mRNA. Do takiego sposobu przekształcania mRNA
zalicza się selektywne włączanie lub wykluczanie eksonów,
wykorzystanie alternatywnych miejsc donorowych 5' oraz ak¬
ceptorowych 3', a także różnych miejsc poliadenylacji.
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 435
przecinania i poliadenylacji również gwarantuje
różnorodność cząsteczek mRNA. Przykłady
takich zachodzących w naturze procesów zostały
przedstawione schematycznie na ryc. 36-14.
Błędny splicing może wywoływać choroby.
Przynajmniej jedna postać P-talasemii - choroby,
w której gen P-globiny jest silnie wytłumiony, po¬
jawia się w wyniku zmiany nukleotydów w miejscu
połączenia ekson-intron, co wyklucza usunięcie
intronu i prowadzi do zmniejszonej syntezy łańcu¬
cha P lub ją wyklucza. Jest to konsekwencja prze¬
rwania normalnej ramki odczytu w mRNA. Oczy¬
wiście nieprawidłowość w tym podstawowym
procesie jakim jest splicing, zmniejsza dokładność,
jaką musi mieć proces składania RNA-RNA.
Wykorzystanie alternatywnego
promotora jest forma regulacji
Do swoistej dla tkanek regulacji ekspresji ge¬
nów mogą być wykorzystane elementy kontrolne
promotora lub alternatywne promotory. Gen glu-
kokinazy (GK) składa się z dziesięciu eksonów
przerwanych dziewięcioma intronami. Sekwencje
eksonów 2-10 w wątrobie i komórkach B trzustki
- głównych tkankach, w których następuje eks¬
presja odpowiadającego białka - są identyczne.
Ekspresja genu GAjest regulowana w tych tkan¬
kach w odmienny sposób, a mianowicie za pomo¬
cą dwu różnych promotorów. Promotor wątrobo¬
wy i ekson 1L znajdują się w pobliżu eksonów
2-10; 1L ulega ligacji bezpośrednio z eksonem 2.
W odróżnieniu od tego, promotor w komórkach B
trzustki występuje ok. 30 kpz wcześniej. W tym
przypadku granica 3' eksonu IB ulega ligacji
z granicą 5' eksonu 2. Promotor wątrobowy i ek¬
son 1L zostają wykluczone i następnie usunięte
w trakcie splicingu (p. ryc. 36-15). Dzięki istnie¬
niu wielu różnorodnych promotorów możliwe są
swoiste (dla komórek oraz tkanek) wzorce ekspre¬
sji poszczególnego genu (mRNA).
Rybosomalny RNA (rRNA) i większość
cząsteczek tRNA są syntetyzowane
w postaci dużych cząsteczek
prekursorowych
W komórkach ssaków trzy cząsteczki rRNA są
przepisywane jako części pojedynczej, dużej czą¬
steczki prekursorowej. Cząsteczka prekursoro-
wa jest następnie przekształcana w jąderku,
w wyniku czego powstają składowe RNA podjed-
nostek rybosomów znajdujących się w cytopla-
zmie. Geny rRNA znajdują się w jąderkach ko¬
mórek ssaków. W każdej komórce są setki kopii
tych genów. Tak duża liczba genów jest potrzebna
do biosyntezy dostatecznej liczby kopii każdego
rodzaju rRNA, niezbędnych do utworzenia 107
rybosomów uczestniczących w każdym cyklu
replikacyjnym komórki. Pojedyncza cząsteczka
mRNA może być skopiowana na 105 cząsteczek
białka, co jest olbrzymim zwielokrotnieniem, na¬
tomiast rRNA jest produktem końcowym. Brak
takiego zwielokrotnienia powoduje, że wymaga¬
na jest duża liczba genów dla rRNA oraz duża
szybkość ich transkrypcji, zsynchronizowana za¬
zwyczaj z szybkością wzrostu komórki. Podobnie
cząsteczki tRNA, które są również często synte¬
tyzowane w postaci prekursorowej, zawierają do¬
datkowe sekwencje po stronach 5' i 3' sekwencji
dojrzałego tRNA. Niewielka liczba cząsteczek
tRNA może nawet zawierać introny.
Wątroba —| |-
1B
(-30 kpz)
Komórka B/przysadka
Ryc. 36-15. Wykorzystanie alternatywnego promotora w genach glukokinazy wątrobowej i glukokinazy z komórek B trzustki. Różnicowa
regulacja ekspresji genu glukokinazy (GK) jest zapewniona dzięki wykorzystaniu swoistych dla tkanek promotorów. Promotor genu GK
w komórkach B oraz ekson 1B znajdują się ok. 30 kpz przed promotorem wątrobowym i eksonem 1L. Każdy z promotorów ma unikato¬
wą strukturę i jest odmiennie regulowany. Eksony 2-10 są w obu genach identyczne; także białka GK kodowane przez mRNA wątroby
i komórki B trzustki mają identyczne właściwości kinetyczne.
436 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
RNAMOGA ULEGAĆ ZNACZNYM
MODYFIKACJOM
Zasadniczo wszystkie cząsteczki RNA zostają
kowalencyjnie zmodyfikowane po zakończeniu
transkrypcji. Wiadomo, że przynajmniej część
tych modyfikacji ma charakter regulacyjny.
Informacyjny RNA (mRNA) jest
modyfikowany na końcach 5' i 3'
Jak już wspomniano, cząsteczki mRNA ssa¬
ków mają na końcu 5' strukturę (zawierającą
7-metyloguanozynę) zwaną czapeczką; ponadto
większość z nich zawiera na końcu 3' sekwen¬
cję (ogon) poli(A). Czapeczka zostaje dodana
do końca 5' dopiero co przepisanego prekurso¬
ra mRNA przed transportem cząsteczki mRNA
z jądra do cytoplazmy. Czapeczka jest niezbęd¬
na do efektywnego zapoczątkowania translacji
transkryptu oraz do ochrony końca 5' mRNA
przed atakiem ze strony egzonukleaz 5'—>3'.
Wtórna metylacja cząsteczek mRNA w obrębie
grup 2'-hydroksylowych i atomu N6 reszt adeny-
lowych następuje po pojawieniu się cząsteczki
mRNA w cytoplazmie.
Ogony poli(A) zostają dodane do końca 3'
cząsteczek mRNA w trakcie potranskrypcyjnego
etapu przekształcania. mRNA zostaje najpierw
przecięty w odległości ok. 20 nukleotydów za
sekwencją rozpoznawczą AAUAA. Inny enzym -
polimeraza poli(A) - dodaje ogon poli(A) mogący
zawierać do 200 reszt A. Rola sekwencji poli(A)
polega prawdopodobnie na osłonie końca 3' RNA
przed atakiem egzonukleazy, działającej w kie¬
runku 3'—>5'. Występowanie lub brak sekwencji
poli(A) nie przesądza o tym, że prekursorowa
cząsteczka obecna w jądrze pojawi się w cytopla¬
zmie, ponieważ nie wszystkie cząsteczki hnRNA
zawierające sekwencję poli(A) wchodzą w skład
cytoplazmatycznego mRNA ani też nie wszyst¬
kie cytoplazmatyczne cząsteczki mRNA zawie¬
rają sekwencję poli(A) (dobrym przykładem są
mRNA histonów). W komórkach ssaków enzy¬
my cytoplazmatyczne mogą dodawać i usuwać
reszty adenylowe z sekwencji poli(A); procesy te
są związane ze zmianą stabilności mRNA i jego
zdolności do translacji.
Wielkość niektórych cząsteczek cytoplazma¬
tycznego mRNA, nawet po usunięciu sekwencji
poli(A), znacznie przekracza, często 2-3 razy,
wielkość wymaganą do kodowania swoistego
białka, dla którego stanowią one matrycę. Do¬
datkowe nukleotydy występują w regionach
nieulegających translacji (niekodujących) za¬
równo po stronie 5', jak i 3' regionu kodujące¬
go; najdłuższe sekwencje nieulegające translacji
znajdują się zwykle przy końcu 3'. Właściwa rola
sekwencji 5' UTR oraz 3' UTR nie jest znana, ale
uważa się, że biorą one udział w przekształcaniu
RNA, transporcie, degradacji i translacji; każda
z tych reakcji może stanowić dodatkową kontrolę
ekspresji genów.
Edycja (redagowanie) RNA wprowadza
zmiany w mRNA po transkrypcji
Przyjmuje się za pewnik, że dla danego genu
i produktu genu istnieje liniowa zależność po¬
między sekwencją kodującą w DNA, sekwencją
mRNA i sekwencją białka (p. ryc. 35-7). Zmiany
w sekwencji DNA powinny zatem znaleźć od¬
bicie w zmianach sekwencji RNA, a następnie
- w zależności od używania kodonów - w sek¬
wencji białka. Od tych założeń istnieją jednak
odstępstwa, dobrze obecnie udokumentowane.
Informacja kodująca może być zmieniona na po¬
ziomie mRNA poprzez redagowanie RNA (ang.
RNA editing). W takich przypadkach kodująca
sekwencja mRNA różni się od odpowiadającej
jej sekwencji DNA. Jako przykład może służyć
gen apolipoproteiny B (apoB) i jego mRNA. Po¬
jedynczy gen apoB jest przepisywany w wątrobie
na mRNA, który kieruje syntezą białka apoB 100,
o masie cząsteczkowej 100 kDa. Ten sam gen
w jelitach kieruje syntezą pierwotnego tran¬
skryptu; jednak deaminaza cytydyny przekształ¬
ca w jednym określonym miejscu mRNA kodon
CAA na UAA. Zamiast kodować glutaminę, ko¬
don ten staje się sygnałem terminacji i powstaje
białko apoB48, o masie cząsteczkowej 48 kDa.
Oba białka pełnią różne funkcje w obu narządach.
Inne przykłady obejmują zamianę glutaminy na
argininę w receptorze glutaminianu oraz wiele
zmian w mitochondrialnych mRNA świdrowca
(Trypanosoma), gdzie zwykle następuje dodanie
lub delecja urydyny. Dokładny zakres edytowania
RNA nadal nie jest znany; obecnie szacuje się,
że mniej niż 0,01% mRNA podlega tego rodzaju
zmianom.
36. SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA 437
RNA transportujący (tRNA)
jest w znacznym stopniu
przekształcany i modyfikowany
Cząsteczki tRNA, jak to opisano w rozdz. 34 i 37,
służą jako adaptory w translacji mRNA na sek¬
wencje aminokwasowe białek. Cząsteczki tRNA
podlegają wielu modyfikacjom zasad A, U, G i C,
polegającym na metylacji, redukcji, deaminacji
i przekształcaniu wiązań glikozydowych. Dalsze
modyfikacje cząsteczek tRNA obejmują alkilację
nukleotydów oraz przyczepianie do końca 3' cha¬
rakterystycznej sekwencji terminalnej CpCpA0H
przy udziale enzymu - transferazy nukleotydo-
wej. Grupa 3'OH rybozy w A jest miejscem przy¬
łączenia swoistego aminokwasu, który ma wejść
w reakcję polimeryzacji podczas syntezy białka.
Metylacja prekursorów tRNA u ssaków zacho¬
dzi prawdopodobnie w jądrze, natomiast odcię¬
cie i dołączenie sekwencji CpCpA0H odbywa się
w cytoplazmie, ponieważ końcówki te ulegają
szybszemu metabolizmowi niż same cząsteczki
tRNA. W cytoplazmie komórek ssaków wystę¬
pują enzymy niezbędne do dołączenia aminokwa¬
sów do reszt CpCpA0H (p. rozdz. 37).
RNA MOŻE DZIAŁAĆ
JAKO KATALIZATOR
Oprócz katalitycznego działania snRNA w pro¬
cesie formowania mRNA, RNA spełnia jeszcze
inne funkcje katalityczne. Cząsteczkami RNA,
które wykazują aktywność katalityczną, są ry-
bozymy. Katalizują one reakcje transestryfikacji,
w większości mające związek z metabolizmem
RNA (składanie i endorybonukleaza). Ostatnio
zauważono, że komponent rybosomalnego RNA
może hydrol izować ester aminoacylowy i w ten
sposób odgrywać ważną rolę w funkcjonowaniu
wiązania peptydowego (transferaza peptydylo-
wa, p. rozdz. 37). Obserwacje te, dokonane na
organellach roślin, drożdży, wirusów i komórek
wyższych eukariotów, pozwalają przypuszczać,
że RNA działa jako enzym. Odkrycia te zrewo¬
lucjonizowały naszą wiedzę o działaniu enzymu
i początkach życia.
STRESZCZENIE
• RNA jest syntetyzowany na matrycy DNA
przez enzym polimerazę RNA.
• U ssaków istnieją trzy typy zależnych od DNA
jądrowych polimeraz RNA: polimerazy RNA
klasy I, II oraz III. Enzymy te kontrolują tran¬
skrypcję rRNA, mRNA i małocząsteczkowych
RNA (tRNA/5S rRNA, snRNA).
• Polimerazy RNA oddziałują z unikatowymi
ds-aktywnymi rejonami genów, zwanymi pro¬
motorami, w celu utworzenia kompleksów pre-
inicjacyjnych (PIC), zdolnych do inicjowania
transkrypcji. U eukariotów tworzenie PIC uła¬
twia wiele ogólnych czynników transkrypcyj-
nych (GTF), TFIIA, B, D, E. F oraz H.
• Kompleks PIC u eukariotów może się tworzyć
albo krokowo - dzięki sekwencyjnym, uporząd¬
kowanym oddziaływaniom czynników GTF
i polimerazy RNA z promotorami, albo jedno-
etapowo - dzięki rozpoznawaniu promotora
przez powstały wcześniej kompleks holopoli-
merazy RNA z GTF.
• Proces transkrypcji może być podzielony na
inicjację, elongację i terminację. Wszystkie
etapy zależą od charakterystycznych ds-aktyw-
nych elementów w DNA i mogą być dodatkowo
modulowane różnymi trans-aktywnymi czynni¬
kami białkowymi.
• Większość eukariotycznego RNA jest syntety¬
zowana w postaci prekursorowej i zawiera nad¬
miar sekwencji, który jest usuwany przed po¬
wstaniem dojrzałego, funkcjonalnego mRNA.
• Synteza eukariotycznego mRNA daje w wyniku
prekursorowy pre-mRNA, zawierający znaczne
ilości zbytecznego RNA (intronów); nadmiar ten
musi być precyzyjnie usunięty w trakcie procesu
splicingu, tak aby mógł powstać funkcjonalny,
nadający się do translacji mRNA, zawierający
eksonowe sekwencje kodujące i niekodujące.
• Wszystkie etapy - począwszy od zmian w ma¬
trycy DNA, sekwencji i dostępności w chro-
matynie, a skończywszy na stabilizacji RNA
- podlegają modulacji; są zatem potencjalnymi
miejscami kontrolnymi dla regulacji genów eu¬
kariotycznych.
438 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
PIŚMIENNICTWO
Bourbon H-M et al: A unified nomenclature for protein
subunits of mediator complexes linking transcrip-
tional regulators to RNA polymerase II. Mol Celi
2004;14:553.
Busby S, Ebrighr RH: Promoter structure, promoter re-
cognition, and transcription activation in prokaryo-
tes. Celi 1994;79:743.
Cramer P, Bushnell DA, Komberg R: Structural basis of
transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom
resolution. Science 2001; 292:1863.
Fedor MJ: Ribozymes. Curr Biol 1998;8:R441.
Gott JM, Emeson RB: Functions and mechanisms of
RNA editing. Ann Rev Genet 2000;34:499.
Hirose Y, Manley JL: RNA polymerase II andthe integra-
tion of nuclear events. Genes Dev 2000; 14:1415.
Keaveney M, Struhl K: Activator-mediated recruitment
of the RNA polymerase machinery is the predomi-
nant mechanism for transcriptional activation in
yeast. Mol Celi 1998; 1:917.
Komblihtt AR et al: Multiple links between transcription
and splicing. RNA 2004; 10:1489.
Lemon B, Tjian R: Orchestrated response: a symphony
of transcription factors for gene control. Genes Dev
2000; 14:2551.
Maniatis T, Reed R: An extensive network of cou-
pling among gene expression machines. Naturę
2002;416:499.
Orphanides G, Reinberg D: A unified theory of gene ex-
pression. Celi 2002; 108:439.
Reed R, Cheng H: TREX, SR proteins and export of
mRNA. Curr Opin Celi Biol 2005; 17:269.
Shatkin AJ, Manley JL: The ends of the affair: capping
and polyadenylation. Nat Struct Biol 2000;7:838.
Sims RJ, Belotserkovskaya R, Reinberg D: Elongation
by RNA polymerase II: the short and long of it.
Gene Dev 2004; 18:2437.
Stevens SW et al: Composition and functional charac-
terization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.
Mol Celi 2002;9:31.
Tucker M, Parker R: Mechanisms and control of mRNA
decapping .in Saccharomyces cerevisiae. Ann Rev
Biochem 2000;69:571.
Woychik NA, Hampsey M: The RNA polymerase II
machinery: structure illuminates fimction. Celi
2002; 108:453.
i
Synteza białek i kod genetyczny
Daryl K. Granner, MD; R Anthony Weil, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Nukleotydy występujące w DNA są oznaczane
skrótowo literami: A, G, T i C. Z liter tych skła¬
dają się z kolei trójliterowe symboliczne wyrazy
kodowe, zwane kodonami, których zbiór two¬
rzy kod genetyczny. Rozumienie syntezy białek
i wytłumaczenie mutacji było niemożliwe, dopóki
natura kodu genetycznego pozostawała niewyjaś¬
niona. Kod genetyczny daje możliwość wytłuma¬
czenia, w jaki sposób wadliwe białka mogą wy¬
woływać choroby genetyczne; jest on podstawą
ich diagnostyki, a w pewnych przypadkach rów¬
nież leczenia. Ze zdolnością wirusów do przery¬
wania syntezy białek gospodarza jest związana
patofizjologia wielu zakażeń wirusowych. Wiele
środków przeciwbakteryjnych jest skutecznych
dlatego, że wybiórczo przerywają syntezę białek
w dokonującej inwazji komórce bakteryjnej, nie
wpływając na syntezę białka w komórkach euka-
riotów.
INFORMACJA GENETYCZNA
PRZEPŁYWA Z DNA DO RNA
IDO BIAŁEK
Informacja genetyczna zawarta w sekwencji
nukleotydów DNA jest przepisywana w jądrze
komórkowym na określoną sekwencję nukleoty¬
dów w cząsteczce RNA. Sekwencja nukleotydów
w transkrypcie RNA jest komplementarna do sek¬
wencji nukleotydów w kodującej nici DNA odpo¬
wiedniego genu, stosownie do reguły parowania
zasad. W kierowaniu syntezą białek bierze udział
wiele różnych klas RNA.
U prokariotów istnieje liniowa współzależ¬
ność pomiędzy genem a informacyjnym RNA
(mRNA) przepisywanym z tego genu i pro¬
duktem polipeptydowym. Sytuacja ta jest bar¬
dziej skomplikowana w komórkach wyższych
organizmów eukariotycznych, w których pier¬
wotny transkrypt jest znacznie dłuższy niż doj¬
rzały mRNA. Duże cząsteczki prekursorowych
mRNA zawierają regiony kodujące (eksony),
które będą tworzyły dojrzały mRNA, oraz długie
sekwencje wtrącone (introny), rozdzielające ek¬
sony. Cząsteczka mRNA podlega w jądrze prze¬
kształceniom, podczas których introny - często
stanowiące większą część mRNA niż eksony
- zostają usunięte. Eksony są w tym procesie łą¬
czone i tworzą dojrzały mRNA, który jest trans¬
portowany do cytoplazmy, gdzie ulega translacji
na białko.
Komórka musi zawierać niezbędne mechanizmy
dokładnego i wydajnego tłumaczenia informacji
zawartej w nukleotydowej sekwencji mRNA na
sekwencję aminokwasów odpowiadającą określo¬
nemu białku. Wyjaśnienie i zrozumienie tego pro¬
cesu, zwanego translacją, stało się możliwe po
złamaniu kodu genetycznego. Już na wczesnym
etapie badań było wiadomo, że cząsteczki mRNA
jako takie nie wykazują powinowactwa do ami¬
nokwasów, a zatem translacja informacji zawartej
w sekwencji nukleotydów mRNA na sekwencję
aminokwasów w białku wymaga pośrednictwa
jakiejś cząsteczki adaptacyjnej. Taka cząstecz¬
ka adaptacyjna musi rozpoznawać sekwencję
nukleotydową oraz swoisty aminokwas. Za po¬
średnictwem cząsteczki adaptacyjnej komórka
jest w stanie wprowadzać określony aminokwas
w odpowiednią pozycję sekwencji białkowej,
dyktowaną sekwencją nukleotydów swoistego
mRNA. W rzeczywistości, grupy funkcyjne ami¬
nokwasów nie wchodzą w bezpośredni kontakt
z matrycą mRNA.
440 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
SEKWENCJA NUKLEOTYDÓW
CZĄSTECZKI mRNA ZAWIERA
SERIĘ KOCONÓW OKREŚLAJĄCYCH
SEKWENCJĘ AMINOKWASÓW
W KODOWANYM RIAŁKU
Do syntezy kompletu białek w komórce potrzeba
20 różnych aminokwasów, dlatego musi istnieć
przynajmniej 20 oddzielnych kodonów, które ra¬
zem tworzą kod genetyczny. Ponieważ w mRNA
występują tylko cztery różne nukleotydy, więc
każdy kodon musi oczywiście być tworzony
przez więcej niż jeden (purynowy bądź pirymi¬
dynowy) nukleotyd. Kodony, z których każdy
składałby się z dwóch nukleotydów, dałyby tyl¬
ko 16 (42) swoistych kodonów, natomiast kodony
trójnukleotydowe mogą tworzyć 64 (43) swoiste
kodony.
Tabela 37-1. Kod genetyczny (przypisanie kodonów w informa¬
cyjnym RNA)1
Pierwszy
Drugi nukleotyd
Trzeci
nukleotyd
U
C
A
G
nukleotyd
Phe
Ser
Tyr
Cys
U
U
Phe
Ser
Tyr
Cys
C
Leu
Ser
Term
Term2
A
Leu
Ser
Term
Trp
G
Leu
Pro
His
Arg
U
p
Leu
Pro
His
Arg
C
u
Leu
Pro
Gin
Arg
A
Leu
Pro
Gin
Arg
G
Ile
Thr
Asn
Ser
U
A
Ile
Thr
Asn
Ser
C
M
Ile2
Thr
Lys
Arg2
A
Met
Thr
Lys
Arg2
G
Val
Ala
Asp
Gly
U
G
Val
Ala
Asp
Gly
C
Val
Ala
Glu
Gly
A
Val
Ala
Glu
Gly
G
1 Określenia „pierwszy”, „drugi” i „trzeci” nukleotyd odnoszą się
do pozycji poszczególnych nukleotydów w kodonie trójkowym.
U - nukleotyd urydyny, C - nukleotyd cytydyny, A - nukleotyd
adeniny, G - nukleotyd guaniny, Met - kodon inicjujący (rozpo¬
czynający) łańcuch peptydowy, Term - kodon kończący łańcuch.
Triplet (AUG) kodujący Met służy w komórkach ssaków jako ko¬
don inicjujący; koduje on również wewnętrzne metioniny białka.
(Skróty aminokwasów objaśniono w rozdz. 3).
2 W mitochondriach ssaków AUA koduje Met, zaś UGA - Trp;
kodony AGA i AGG służą jako sygnały kończące łańcuch.
Obecnie już wiadomo, że każdy z kodonów
odpowiada sekwencji trójnukleotydowej, czyli że
kod jest trójkowy (p. tab. 37-1). Rozszyfrowa¬
nie kodu genetycznego w dużej mierze zależało
od chemicznego zsyntezowania polimerów nu-
kleotydowych, a zwłaszcza tripletów nukleoty-
dowych. Syntetyczne triplety nukleotydowe tego
rodzaju posłużyły do zaprogramowanej syntezy
białek, umożliwiając badaczom złamanie kodu
genetycznego.
KOD GENETYCZNY JEST
ZDEGENEROWANY, JEDNOZNACZNY,
NIENAKŁADAJACY SIĘ,
BEZPRZESTANKOWYI UNIWERSALNY
Trzy spośród 64 kodonów nie kodują określonego
aminokwasu; nazwano je kodonami nonsensow¬
nymi. Przynajmniej dwa z tych nonsensownych
kodonów są używane przez komórkę jako sygna¬
ły terminacji. Określają one, gdzie polikondensa-
cja aminokwasów w cząsteczkę białkową ma się
zatrzymać. Pozostałych 61 kodonów koduje 20
aminokwasów (p. tab. 37-1). Kod genetyczny jest
zatem „zdegenerowany”, tj. temu samemu ami¬
nokwasowi musi odpowiadać większa liczba ko¬
donów. Niektóre aminokwasy są kodowane przez
kilka kodonów, np. serynę koduje sześć różnych
kodonów. Innym aminokwasom, takim jak metio¬
nina i tryptofan, odpowiada pojedynczy kodon.
Przy określaniu swoistego aminokwasu, jaki ma
być wbudowany do cząsteczki białkowej, trzeci
nukleotyd kodonu jest na ogół mniej ważny niż
pozostałe dwa i głównie to zjawisko odpowiada
za degenerację kodu. Jednakże dla każdego kon¬
kretnego kodonu jest określony tylko pojedynczy
aminokwas; z rzadkimi wyjątkami kod genetycz¬
ny jest jednoznaczny, tj. dany swoisty kodon jest
przypisany pojedynczemu aminokwasowi. Waż¬
ne jest rozróżnianie pojęć braku jednoznacz¬
ności i zdegenerowania kodu.
Jednoznaczny, ale zdegenerowany kod może
być objaśniony na poziomie molekularnym. Roz¬
poznanie swoistych kodonów w mRNA przez
adaptacyjne cząsteczki tRNA zależy od ich re¬
gionu antykodonowego i reguł swoistego pa¬
rowania zasad. Każda cząsteczka tRNA zawiera
swoistą sekwencję komplementarną do kodonu;
nazywa się ją antykodonem. Dla danego kodonu
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 441
w mRNA tylko jeden rodzaj cząsteczek tRNA ma
odpowiadający antykodon. Ponieważ każda czą¬
steczka tRNA może być obarczona tylko jednym
swoistym aminokwasem, dlatego każdy kodon
określa tylko jeden aminokwas. Niektóre czą¬
steczki tRNA mogą jednak używać antykodonu
do rozpoznawania więcej niż jednego kodonu.
Z nielicznymi wyjątkami, dany swoisty kodon
będzie wprowadzał tylko jeden swoisty amino¬
kwas, chociaż dany swoisty aminokwas może
być rozpoznany przez więcej niż jeden kodon.
Jak to zostanie wyjaśnione dalej, odczytywaniu
kodu genetycznego w trakcie syntezy białek nie
towarzyszy jakiekolwiek nakładanie się kodonów.
Kod genetyczny jest więc kodem nienakłada-
jącym się. Co więcej, od chwili rozpoczęcia od¬
czytywania konkretnego kodonu nie pojawiają
się między nimi znaki przestankowe i przekaz
informacji następuje z ciągłej sekwencji tripletów
nukleotydowych, aż do chwili, kiedy zostanie na¬
potkany kodon nonsensowny.
Dotychczas sądzono, że kod genetyczny jest
uniwersalny. Obecnie okazuje się, że grupa czą¬
steczek tRNA w mitochondriach, zawierających
oddzielny i różniący się od cytoplazmatycznego
mechanizm translacyjny, u niższych i wyższych
eukariotów (z człowiekiem włącznie) odczytu¬
je cztery kodony w sposób inny niż cząsteczki
tRNA w cytoplazmie, nawet tych samych komó¬
rek. Jak pokazano w tab. 37-1, w mitochondriach
ssaczych kodon AUA jest odczytywany jako Met,
a UGA koduje Trp. W dodatku w mitochondriach
kodony AGA i AGG są odczytywane raczej jako
kodony stop, czyli kodony kończące łańcuch, niż
jako kodujące Arg. W wyniku tego mitochondria
do odczytu kodu genetycznego potrzebują tylko
22 różnych cząsteczek tRNA, podczas gdy cyto-
plazmatyczny system translacji ma pełny zestaw
31 rodzajów tRNA. Oprócz tego wyjątku kod ge¬
netyczny jest uniwersalny. Częstość, z jaką jest
używany kodon każdego aminokwasu, różni się
znacznie między gatunkami i w obrębie różnych
tkanek osobnika tego samego gatunku. Poziom
specyficznych tRNA z zasady odzwierciedla
odchylenia w częstości używania kodonów. Tak
więc szczególnie często używany kodon jest roz¬
poznawany przez równie silnie reprezentowany
tRNA dla tego kodonu. Zestawienia częstości
używania kodonów stają się coraz dokładniej¬
sze, w miarę jak coraz więcej genów jest sekwen-
cjonowanych. Ma to duże znaczenie, ponieważ
badacze próbują odtworzyć strukturę mRNA na
podstawie dedukcji sekwencji aminokwasów
w części białka. Ma to na celu uzyskanie, metodą
syntezy, sondy oligonukleotydowej niezbędnej
do rozpoczęcia procesu klonowania rekombina-
cyjnego DNA. Główne cechy kodu genetycznego
podano w tab. 37-2.
Tabela 37-2. Cechy kodu genetycznego
• Zdegenerowany
• Jednoznaczny
• Nienakladający się
• Bez znaków przestankowych
• Uniwersalny
DLA KAŻDEGO Z 20 AMINOKWASÓW
ISTNIEJE PRZYNAJMNIEJ JEDEN
RODZAJ TRANSFEROWEGO RNA (tRNA)
Cząsteczki tRNA mają zadziwiająco podobne
funkcje i trójwymiarowe struktury. Funkcja łącz¬
nikowa cząsteczek rRNA wymaga obarczenia
każdego swoistego tRNA jego swoistym amino¬
kwasem. Ponieważ kwasy nukleinowe nie wyka¬
zują powinowactwa do określonych grup funkcyj¬
nych aminokwasów, toteż rozpoznania swoistej
cząsteczki tRNA i określonego aminokwasu musi
dokonać zdolna do tego cząsteczka białka. Dla
tych swoistych funkcji rozpoznawczych i dla
właściwego dołączania 20 aminokwasów do
określonych cząsteczek tRNA potrzeba przynaj¬
mniej 20 swoistych enzymów. Proces rozpozna¬
nia i dołączenia aminokwasu (proces obarczenia
tRNA) przebiega dwuetapowo przy udziale jed¬
nego enzymu swoistego dla każdego z 20 amino¬
kwasów. Enzymy te są nazywane syntetazami
aminoacylo-tRNA. Tworzą one aktywny kom¬
pleks pośredni aminoacylo-AMP-enzym, który
przedstawiono na ryc. 37-1. Swoisty kompleks
aminoacylo-AMP-enzym rozpoznaje następnie
swoisty tRNA, do którego dołącza resztę amino-
acylową w pozycji 3'-hydroksylowej końcowej
adenozyny. Reakcje dołączenia aminokwasów są
obarczone błędem mniejszym niż 10^, są więc
niezwykle dokładne. Aminokwas pozostaje przy¬
łączony do swoistego tRNA wiązaniem estrowym
do czasu, aż w trakcie tworzenia polipeptydowego
442 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
ATP PPj
AMP + Enz
HOOC - HC - R
I
H,N
■ Enz • Adenozyna — O— P — O— C— CH
I
OH
NH
Aminokwas (aa)
Enzym (Enz)
SYNTETAZA
AMINOACYLO-tRNA
Enz*AMP-aa
(aktywowany aminokwas)
Kompleks
aminoacylo-AMP-enzym
tRNA tRNA-aa
Aminoacylo-tRNA
Ryc. 37-1. Schemat tworzenia aminoacylo-tRNA. Dwuetapowa reakcja przy udziale enzymu syntetazy aminoacylo-
-tRNA prowadzi do utworzenia aminoacylo-tRNA. Pierwsza reakcja obejmuje utworzenie kompleksu AMP-amino-
kwas-enzym. Taki zaktywowany aminokwas jest następnie przenoszony na odpowiednią cząsteczkę tRNA. AMP i en¬
zym zostają uwolnione i enzym może być ponownie użyty w reakcji. Reakcje dołączenia aminokwasów są obarczone
błędem mniejszym niż 10~^, są więc niezwykle dokładne.
prekursora cząsteczki białkowej zostanie użyty do
poi i kondensacji w określonej pozycji.
Na tym etapie rozważań stają się ważne regio¬
ny cząsteczki tRNA opisane w rozdz. 34 (p. ryc.
34-11). W procesie przyłączania się aminoacylo-
-tRNA do powierzchni rybosomu w miejscu syn¬
tezy białka bierze udział ramię rybotymidyna-
-pseudourydyna-cytydyna (Tij/C). Ramię D jest
jednym z miejsc istotnych dla właściwego rozpo¬
znania danego rodzaju tRNA przez właściwą mu
syntetazę aminoacylo-tRNA. Ramię akceptoro¬
we, znajdujące się przy końcu 3'-hydroksyloade-
no-zylowym, jest miejscem dołączenia swoistego
aminokwasu.
Region antykodonowy składa się z siedmiu nu-
kleotydów i jest rozpoznawany przez trój literowy
kodon w mRNA (ryc. 37-2). Sekwencja ta, odczy¬
tywana w pętli antykodonowej w kierunku od 3'
do 5', składa się z: dowolnej zasady, zmodyfiko¬
wanej puryny, XYZ, pirymidyny oraz pirymidy-
ny-5'. Należy zauważyć, że kierunek odczytu an-
tykodonu to od 3' do 5', natomiast kod genetyczny
podany w tab. 37-1 jest odczytywany w kierunku
od 5' do 3', a to dlatego, że kodon mRNA i pętla an-
tykodonu w tRNA są pod względem komplemen-
tamości antyrównoległe, tak jak przy wszystkich
innych oddziaływaniach międzycząsteczkowych
między nićmi kwasów nukleinowych.
Degeneracja kodu genetycznego odnosi się
głównie do ostatniego nukleotydu w triplecie ko-
donowym, co sugeruje, że parowanie zasad między
tym ostatnim nukleotydem i odpowiadającym mu
nukleotydem w antykodonie nie jest precyzyjne.
Jak już wspomniano, zjawisko to wyjaśnia hipo¬
teza tolerancji; w tym swoistym miejscu parowa¬
nia nukleotydu do nukleotydu kodon i antykodon
są w stanie „rozchwiania”. Na przykład dwa ko-
dony dla argininy: AGA i AGG mogą się wiązać
z tym samym antykodonem mającym uracyl na
swoim końcu 5' (UCU). Podobnie trzy kodony dla
glicyny: GGU, GGC i GGA mogą tworzyć pary
u • u • u
a . a . a Antykodon
Ryc. 37-2. Schemat rozpoznania kodonu przez antykodon.
Jednym z kodonów dla fenyloalaniny jest UUU. tRNA obar¬
czony fenyloalaniną (Phe) ma komplementarną sekwencję
AAA, która na zasadzie parowania zasad tworzy z kodonem
kompleks. Region antykodonowy składa się zwykle z siedmio-
nukleotydowej sekwencji (w kolejności od 3' do 5'): nukleotyd
zmienny (N), zmodyfikowana puryna (Pu*), X, Y, Z (tu: A«A»A)
i dwie pirymidyny (Py).
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 443
zasad z jednym antykodonem (CCI). „I” jest nu-
kleotydem inozyny, jednej ze szczególnych zasad
pojawiających się w cząsteczkach tRNA.
MUTACJE POWSTAJĄ WÓWCZAS,
GDY W SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ
ZACHODZĄ ZMIANY
Chociaż początkowa zmiana może nie wystąpić
w nici kodującej dwuniciowej cząsteczki DNA
danego genu, to jednak po replikacji siostrzane
cząsteczki DNA, zawierające mutacje w nici ko¬
dującej, będą się segregować i pojawią się w po¬
pulacji organizmów.
Niektóre mutacje zachodzą w wyniku
podstawienia (substytucji) zasad
Mutacje polegające na zamianie jednej zasady
(mutacje punktowe) mogą być typu tranzycji
lub transwersji. W pierwszym przypadku jedna
pirymidyna zostaje zamieniona na inną pirymidy¬
nę lub jedna puryna zostaje zamieniona na inną
purynę. Transwersja to zamiana puryny na jedną
z dwóch pirymidyn albo zamiana pirymidyny na
jedną z dwóch puryn, jak to przedstawiono na ryc.
37-3.
Jeśli sekwencja nukleotydowa genu zawiera¬
jąca mutację ulega transkrypcji na cząsteczkę
RNA, to w cząsteczce RNA w miejscu odpowia¬
dającym tej mutacji pojawi się komplementarna
zasada.
Zamiana jednej zasady w cząsteczkach mRNA
może powodować różne skutki, jeżeli cząsteczki
ulegną translacji na białko:
1. Może nie pojawić się żaden wykrywalny
skutek, ponieważ kod jest zdegenerowany; takie
mutacje często nazywa się mutacjami cichymi.
Będzie to tym bardziej prawdopodobne, jeśli
zmieniona w cząsteczce mRNA zasada jest trze¬
cim nukleotydem kodonu. Zgodnie z hipotezą
tolerancji, translacja kodonu jest mało wrażliwa
na zmianę w pozycji trzeciej.
2. Efekt mutacji typu zmiana sensu (ang. mis-
sense effect) wystąpi wówczas, gdy w odpowiednie
miejsce w cząsteczce białka zostanie wbudowany
zupełnie inny aminokwas. Taki błędnie dobra¬
ny aminokwas, w zależności od umiejscowienia
w określonym białku, może być akceptowalny,
częściowo akceptowalny lub nieakceptowalny
w odniesieniu do funkcji takiej cząsteczki białko¬
wej. Ze szczegółowej analizy kodu genetycznego
można wyciągnąć wniosek, że większość zmian
tylko jednej zasady prowadzi do zastąpienia jed¬
nego aminokwasu przez inny aminokwas, mający
raczej podobne grupy funkcyjne. Jest to bardzo
skuteczny mechanizm zapobiegania drastycznym
zmianom w fizycznych właściwościach cząstecz¬
ki białkowej. Jeśli skutek mutacji typu zmiany
sensu jest akceptowalny, to powstająca cząsteczka
białkowa może nie być odróżnialna od cząsteczki
normalnej. Jeśli zachodzi błąd nieakceptowalny,
cząsteczka białkowa nie będzie zdolna sprawo¬
wać przypisanej jej funkcji.
3. Może pojawić się kodon nonsensowny,
powodujący przedwczesną terminację procesu
wbudowywania aminokwasów do łańcucha pep-
tydowego, w wyniku czego zostaje wytworzony
tylko fragment zamierzonej cząsteczki białkowej.
Istnieje duże prawdopodobieństwo, że przed¬
wcześnie ukończona cząsteczka białka lub frag¬
ment peptydu nie będą spełniały przypisanej im
funkcji.
Cząsteczka hemoglobiny jest przykładem
ilustrującym skutki zmiany jednej zasady
w genie strukturalnym
Niektóre mutacje nie powodują widocznego
skutku. System genów kodujący hemoglobinę
jest jednym z najlepiej poznanych u ludzi. Brak
skutku wynikającego ze zmiany tylko jednej
zasady może być wykazany jedynie przez sek-
wencjonowanie nukleotydów w cząsteczkach
mRNA lub w genach strukturalnych. Sekwen-
cjonowanie dużej liczby cząsteczek mRNA he¬
moglobiny wykazało, że kodon waliny w pozycji
67 łańcucha (3 hemoglobiny nie jest identyczny
u wszystkich osób mających normalny łańcuch
Tranzycje Transwersje
Ryc. 37-3. Schemat mutacji typu tranzycji i transwersji.
444 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
P hemoglobiny. Hemoglobina typu Milwaukee
ma w pozycji 67 kwas glutaminowy, zaś he¬
moglobina typu Bristol ma w tej pozycji kwas
asparaginowy. Aby wyjaśnić zmiany aminokwa¬
su zmianami jednego nukleotydu w kodonie dla
aminokwasu 67, należy wnioskować, że mRNA
kodujący hemoglobinę typu Bristol zawierał ko-
don GUU lub GUC, zanim wystąpiła zmiana do
GAU lub GAC, tj. kodonów dla kwasu asparagi¬
nowego. Z kolei mRNA kodujący hemoglobinę
typu Milwaukee powinien mieć w pozycji 67 ko-
don GUA lub GUG, aby zmiana w pojedynczym
nukleotydzie mogła spowodować pojawienie się
kodonów kwasu glutaminowego GAA lub GAG.
Hemoglobina typu Sydney, która zawiera alani¬
nę w pozycji 67, mogła powstać przez zmianę
tylko jednego nukleotydu w którymkolwiek z
czterech kodonów waliny (GUU, GUC, GUA
lub GUG), co dało kodony alaniny, czyli odpo¬
wiednio: GCU, GCC, GCA lub GCG.
Podstawienie (substytucja) aminokwasów
powoduje mutacje typu zmiana sensu
A. Akceptowalne mutacje typu zmiana sensu
Przykładowa akceptowalna mutacja typu zmia¬
na sensu (ryc. 37-4, góra) w strukturalnym ge¬
nie łańcucha p hemoglobiny może być wykryta
dzięki obecności hemoglobiny o odmiennych
własnościach elektroforetycznych w erytrocy¬
tach z pozoru zdrowego osobnika.
Hemoglobinę typu Hikari znaleziono w orga¬
nizmach członków przynajmniej dwóch rodzin
Japończyków. Hemoglobina ta zawiera aspara-
ginę, która zastąpiła lizynę w pozycji 61 łańcu¬
cha p. Odpowiadająca temu transwersja mogła
polegać na zamianie AAA lub AAG na AAU lub
AAC. Zastąpienie swoistej lizyny asparaginą
pozornie nie zmienia normalnej funkcji łańcu¬
cha P u tych osobników.
Akceptowalna mutacja
typu zmiana sensu
Częściowo akceptowalna
mutacja typu
zmiana sensu
Nieakceptowalna mutacja
typu zmiana sensu
Cząsteczka białka
Hb A, łańcuch p
Hb Hikari, łańcuch p
Hb A, łańcuch p
Hb M (Boston), łańcuch c
Kodony
61 Lizyna
Asparagina
AAA albo AAG
IXI
AAU albo AAC
GAA albo GAG
GUA albo GUG
58 Histydyna
Tyrozyna
CAU albo CAC
UAU albo UAC
Ryc. 37-4. Przykłady trzech rodzajów mutacji typu zmiana sensu, w wyniku których powstają patologiczne łańcuchy
hemoglobiny. Wskazano zmiany w aminokwasach i możliwe zmiany w odpowiadających im kodonach. Hemoglobi¬
na typu Hikari z mutacją łańcucha p ma pozornie prawidłowe właściwości fizjologiczne, ale jest zmieniona pod względem
ruchliwości ele ktrof o rety czn ej. Hemoglobina S ma mutację w łańcuchu p i zachowuje częściową funkcję: hemo¬
globina S wiąże tlen, ale w postaci odtlenowanej ulega wytrąceniu. Hemoglobina M typu Boston zawiera mutację
w łańcuchu a, umożliwiającą utlenianie jonu żelaza(ll) hemu do jonu żelaza(lll), przez co hemoglobina nie jest
w stanie w ogóle wiązać tlenu.
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 445
B. Częściowo akceptowalne mutacje typu zmiana
sensu
Najlepszym przykładem częściowo akceptowal¬
nej mutacji typu zmiana sensu (ryc. 37-4, środek)
jest hemoglobina S (występująca w niedokrwisto¬
ści sierpowatej), w której normalnie występujący
aminokwas w pozycji 6 łańcucha p - kwas gluta¬
minowy - został zastąpiony waliną. Odpowiada¬
łaby temu zmiana jednego nukleotydu w kodonie
kwasu glutaminowego GAA lub GAG na GUA lub
GUG w kodonach waliny. Oczywiście te mutacje
typu zmiana sensu zaburzają normalne funkcje
i prowadzą do niedokrwistości sierpowatej, jeżeli
zmutowany gen występuje w stanie homozygo-
tycznym. Zmiana kwasu glutaminowego na wah¬
nę może być rozpatrywana jako częściowo akcep¬
towalna, ponieważ hemoglobina S może wiązać
i oddawać tlen, chociaż proces ten nie przebiega
normalnie.
C. Nieakceptowalne mutacje typu zmiana sensu
Nieakceptowalna mutacja typu zmiana sensu
(ryc. 37-4, dół) w genie hemoglobiny powoduje
powstanie niefunkcjonalnej cząsteczki hemoglo¬
biny. Na przykład mutacje występujące w he¬
moglobinie M sprawiają, że generowane są czą¬
steczki, które umożliwiają utlenienie żelaza Fe2+
reszty hemowej do Fe3+, w wyniku czego powsta¬
je methemoglobina, która nie może transportować
tlenu (p. rozdz. 6).
Mutacje typu przesuniecie ramki
odczytu powstają w wyniku delecji
lub insercji nukleotydów w DNA,
powodujących zmianę sekwencji
nukleotydów w cząsteczkach mRNA
W wyniku delecji tylko jednego nukleotydu
w kodującej nici genu powstaje zmieniona ram¬
ka odczytu w mRNA. „Maszyneria” translacji
mRNA nie rozpoznaje braku zasady, ponieważ
w trakcie odczytywania kodonów nie ma zna¬
ków przestankowych. W wyniku tego dochodzi
do głębokiej zmiany w sekwencji spolimery-
zowanych aminokwasów, jak to przedstawiono
w przykładzie 1 na ryc. 37-5. Zmieniona ramka
odczytu daje w rezultacie zniekształconą trans¬
lację mRNA w kierunku dystalnym od miejsca
delecji nukleotydu. Nie tylko zostaje zniekształ¬
cona sekwencja aminokwasów w kierunku dy¬
stalnym od tej delecji; odczytywanie informa¬
cji może również ujawnić nonsensowny kodon
i w ten sposób może dojść do syntezy zniekształ¬
conego i przedwcześnie ukończonego polipepty-
du na jego końcu karboksylowym (przykład 3,
ryc. 37-5).
Jeśli delecji w genie ulegną trzy nukleotydy
albo wielokrotność trzech, to odpowiadający
informacyjny RNA da w wyniku translacji biał¬
ko, w którym brak będzie odpowiedniej liczby
aminokwasów (przykład 2, ryc. 37-5). Ponie¬
waż ramkę odczytu stanowi triplet, faza odczytu
nie zostanie zmieniona dla tych kodonów, któ¬
re leżą dystalnie od miejsca delecji. Jeśli jed¬
nak delecja jednego lub dwóch nukleotydów
zachodzi tuż przed albo w obrębie normalne¬
go kodonu terminacji (kodonu nonsensowne¬
go), to może dojść do zaburzeń w odczytywa¬
niu sygnału normalnej terminacji. Taka delecja
może prowadzić do odczytywania poza sygnał
terminacji aż do momentu, kiedy znajdzie się
następny kodon nonsensowny (przykład 1, ryc.
37-5). Doskonały przykład takiego zjawiska
został opisany w dyskusji poświęconej hemoglo-
binopatiom.
Insercje w genie jednego, dwóch lub niewie-
lokrotności trzech nukleotydów dają w wyniku
mRNA, w którym ramka odczytu jest zmieniona
w czasie translacji i występuje taki sam skutek,
jak w przypadku delecji. Może to być zniekształ¬
cona w części dystalnej sekwencja aminokwa-
sowa lub powstanie kodonu nonsensownego
w miejscu insercji lub w części dystalnej, albo
też niemożność rozpoznawania (i w związku
z tym ominięcie) sygnału terminacyjnego. Jeśli
po delecji w genie nastąpi insercja (lub odwrot¬
nie), to zostanie przywrócona prawidłowa ramka
odczytu (przykład 4, ryc. 37-5). Przy translacji
odpowiedniego mRNA uzyska się zniekształconą
sekwencję aminokwasową między insercją a de-
lecją. W obszarze za przywróconą ramką odczy¬
tu sekwencja aminokwasów będzie prawidłowa.
Można sobie wyobrazić, że różne kombinacje
delecji, insercji lub delecji i insercji spowodują
powstanie białka, którego część będzie niepra¬
widłowa, ale ta część będzie otoczona normalną
sekwencją aminokwasów. Takie zjawiska zosta¬
ły w przekonujący sposób wykazane w wielu
schorzeniach.
446 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Mutacje supresorowe redukują
niektóre skutki mutacji typu zmiana
sensu, mutacji nonsensownych i typu
przesuniecie ramki odczytu
Powyższa dyskusja na temat wynikłych z mutacji
genów zmian zachodzących w produktach biał¬
kowych zakłada obecność prawidłowych cząste¬
czek tRNA. W organizmach prokariotycznych
i niższych organizmach eukariotycznych odkry¬
to jednak cząsteczki tRNA, które funkcjonują
nieprawidłowo i które same są wynikiem muta¬
cji. Niektóre z tych nieprawidłowych cząsteczek
tRNA są zdolne do wiązania i odczytywania
zmienionych kodonów, co prowadzi do supresji
skutków mutacji w odległych genach struktural¬
nych. Te supresorowe cząsteczki tRNA, zwykle
powstałe w wyniku zmian w ich regionach anty-
kodonowych, są zdolne do supresji mutacji typu
zmiana sensu, mutacji nonsensownych i mutacji
wynikających z przesunięcia ramki odczytu. Po¬
nieważ jednak cząsteczki supresorowego tRNA
Stan i -7
fizjologiczny I Typ dziki
mRNA 5'... UAG UUUG AUG GCC UCU UGC AAA GGC UAU AGU AGU UAG... 3'
Polipeptyd Met Ala Ser Cys Lys Gly Tyr Ser Ser STOP
Przykład 1 |Delecja(-1) |
mRNA 5'... UAG
Polipeptyd
Przykład 2 | Delecja (-3) |
mRNA 5'... UAG
Polipeptyd
UUUG AUG GCC CUU GCA AAG GCU AUA GUA GUU AG... 3'
Met Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Val Ser
Sekwencja zniekształcona
GGC UAU AGU AGU UAG- 3'
Met Ala Ser Lys Gly Tyr Ser Ser STOP
Przykład 3 | Insercja (+1) |
mRNA 5'... UAG
Polipeptyd
Przykład 4
Insercja (+1)
Delecja (-1)
mRNA 5'... UAG
Polipeptyd
UUUG
AUG GCC CUC UUG CAA AGG CUA
Met Ala Leu Leu Gin Arg Leu
V _
Y
Sekwencja zniekształcona
UAG
STOP
J
UAG UUAG... 3'
UUUG
Met Ala Ser Leu Gin Arg Tyr Ser Ser
V V '
Sekwencja zniekształcona
UAG...
STOP
31
Ryc. 37-5. Wpływ delecji i insercji w genie na sekwencję nukleotydów w transkrypcje mRNA i na sekwencję aminokwasów w łańcuchu
polipeptydowym uzyskanym z mRNA. Strzałki pokazują miejsca delecji i insercji, a liczby w owalach odpowiadają liczbie usuniętych lub
włączonych reszt nukleotydowych. Kolorem zaznaczono aminokwasy w prawidłowym ułożeniu.
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 447
nie są zdolne do odróżniania kodonu prawidło¬
wego od kodonu powstałego w wyniku mutacji
genu, ich obecność w komórce prowadzi zwy¬
kle do zmniejszenia jej żywotności. Na przykład
cząsteczki tRNA tłumiące mutacje nonsensowne
mogą powodować supresję prawidłowych syg¬
nałów terminacji. Umożliwia to kontynuowa¬
nie translacji („nadczy tanie”), mimo obecności
kodonu „stop”, w niepożądanych przypadkach.
Ponadto, wywołujące przesunięcia ramki odczy¬
tu cząsteczki supresorowego tRNA, które mogą
odczytywać kodon prawidłowy oraz składową
część kodonu przyległego, również powodują
przesunięcie ramki odczytu, gdy nie jest to po¬
żądane. Cząsteczki supresorowego tRNA mogą
istnieć w komórkach ssaków dzięki zachodzące¬
mu w nich zjawisku „nadczytania” (ang. read-
-through) transkrypcyjnego.
PODOBNIE JAK TRANSKRYPCJA,
SYNTEZA BIAŁKA SKŁADA SIĘ
Z TRZECH FAZ: INICJACJI, ELONGACJI
I TERMINACJI
W rozdziale 36 opisano ogólne cechy struktural¬
ne rybosomów i proces ich składania. Te po-
nadcząsteczkowe twory stanowią mechanizm
(„maszynerię”), dzięki któremu sekwencja nu-
kleotydów mRNA jest tłumaczona na sekwencję
aminokwasów określonego białka. Translacja
mRNA zaczyna się blisko jego końca 5' od two¬
rzenia odpowiadającego końca aminowego czą¬
steczki białkowej. Informacja jest czytana w kie¬
runku od 5' do 3' i kończy się utworzeniem końca
karboksylowego białka. Ponownie pojawia się
tutaj pojęcie polarności. Jak to opisano w rozdz.
36, transkrypcja genu na odpowiedni mRNA
albo jego prekursor prowadzi najpierw do utwo¬
rzenia końca 5' cząsteczki RNA. U prokariotów
pozwala to na rozpoczęcie translacji mRNA,
zanim zostanie ukończona transkrypcja genu.
W organizmach eukariotycznych proces tran¬
skrypcji zachodzi w jądrze komórkowym,
a translacja mRNA - w cytoplazmie. Wyklucza
to jednoczesną transkrypcję i translację w or¬
ganizmach eukariotycznych i umożliwia pro¬
ces przekształcania, niezbędny do wytworzenia
dojrzałego mRNA z pierwotnego transkryptu
- hnRNA.
W inicjacji uczestniczy wiele
kompleksów białek z RNA
Inicjacja syntezy białka wymaga wybrania przez ry-
bosom cząsteczki mRNA do translacji (ryc. 37-6).
Tuż po związaniu się mRNA z rybosomem, ten
ostatni odnajduje właściwą ramkę odczytu na
mRNA i rozpoczyna się translacja. W procesie
tym uczestniczy tRNA, rRNA, mRNA i przynaj¬
mniej 10 eukariotycznych czynników inicjujących
(elF), spośród których część zawiera kilka (3-8)
podjednostek. W procesie tym biorą udział także
GTP, ATP i aminokwasy. Inicjacja może być po¬
dzielona na cztery etapy: 1) dysocjacja rybosomu
na podjednostki 40S i 60S, 2) związanie trójskład¬
nikowego kompleksu, tworzonego przez met-
-tRNA', GTP i eIF-2 z rybosomem 40S, co daje
kompleks preinicjacyjny, 3) związanie mRNA
z kompleksem preinicjacyjnym 40S i powstanie
kompleksu inicjacyjnego 43S; 4) złączenie kom¬
pleksu inicjacyjnego 43S z podjednostką ryboso-
malną 60S, co daje kompleks inicjacyjny 80S.
A. Dysocjacja rybosomalna
Do nowo zdysocjowanej podjednostki 40S przy¬
łączają się dwa czynniki inicjacyjne: eIF-3 oraz
eIF-1 A. Opóźnia to jej reasocjację z podjednostką
60S oraz umożliwia innym czynnikom inicjują¬
cym translację zasocjowanie się z podjednostką
40S.
B. Tworzenie kompleksu preinicjacyjnego 43S
Pierwsza faza tego procesu obejmuje związanie
GTP przez eIF-2. Taki binarny kompleks wiąże
się następnie z met-tRNA', tj. typem tRNA wiążą¬
cym się swoiście z kodonem inicjacyjnym AUG.
(Dla metioniny istnieją dwa tRNA. Jeden określa
metioninę dla kodonu inicjującego, drugi - me¬
tioniny leżące w środku. Oba zawierają unikalne
sekwencje nukleotydowe). Powstały trójskładni¬
kowy kompleks wiąże się z rybosomalną podjed¬
nostką 40S, w wyniku czego tworzy się kompleks
preinicjacyjny 43S, który jest stabilizowany dzię¬
ki związaniu się z eIF-3 i elF-lA.
Jednym z elementów kontroli syntezy białka
w komórce eukariotycznej jest eIF-2. Czynnik
eIF-2 składa się z podjednostek a, p i y. eIF-2a
jest fosforylowany (na serynie 51) przez co
najmniej cztery różne kinazy białkowe (HCR,
PKR, PERK oraz GCN2), które są aktywowane,
448 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
gdy komórka podlega stresowi i gdy wydatek
energetyczny potrzebny do syntezy białka był¬
by szkodliwy dla komórki. Warunki takie stwa¬
rza głód aminokwasowy i glukozowy, infekcja
wirusowa, niepoprawnie sfałdowane białka,
pozbawienie surowicy, hiperosmolalność oraz
szok termiczny. Pod tym względem szczególnie
interesująca jest PKR. Kinaza ta jest aktywo¬
wana przez wirusy i zapewnia gospodarzowi
mechanizm obronny, polegający na zmniejsze¬
niu syntezy białka, co uniemożliwia replikację
wirusa. Fosforylowany eIF-2a wiąże się mocno
oraz inaktywuje białko eIF-2(3 biorące udział
w recyklingu GTP-GDP. Zapobiega to tworze¬
niu kompleksu preinicjacyjnego 43S i blokuje
syntezę białka.
C. Tworzenie kompleksu inicjacyjnego 43S
Większość cząsteczek mRNA w komórkach eu¬
kariotycznych ma na końcu 5' „czapeczkę mety-
lacyjną”, co opisano w rozdz. 36. Taka czapeczka
metyloguanozylotrifosforanowa ułatwia związa¬
nie się mRNA z preinicjacyjnym kompleksem
43S. Wiążący czapeczkę kompleks białkowy eIF-4F
(4F), który składa się z eIF-4E i kompleksu elF-
-4G (4G)-eIF-4A (4A), wiąże się z czapeczką
za pośrednictwem białka 4E. Następnie eIF-4A
(4A) i eIF-4B (4B) łączą się i znoszą złożoną
drugorzędową strukturę na końcu 5' cząsteczki
mRNA, dzięki aktywności odpowiedniej ATPa-
zy i zależnej od ATP helikazy. Asocjacja mRNA
z preinicjacyjnym kompleksem 43S, prowadzą¬
ca do utworzenia kompleksu inicjacyjnego 48S,
wymaga hydrolizy ATP. eIF-3 jest kluczowym
białkiem, ponieważ wiąże się z dużym powino¬
wactwem z komponentem 4G składowej 4F i łą¬
czy ten kompleks z rybosomalną podjednostką
40S. Po asocjacji preinicjacyjnego kompleksu
43 S z czapeczką mRNA, drugorzędową struktura
końca 5' mRNA zostaje zniesiona („stopiona”),
a kompleks przeszukuje mRNA, aby odnaleźć od¬
powiedni kodon inicjacyjny. Na ogół jest to AUG
zlokalizowany najbliżej końca 5', ale precyzyjne
określenie kodonu inicjacyjnego zachodzi przy
udziale tzw. sekwencji Kozaka, otaczającej AUG
i wykazującej zgodność:
-3 -1 +4
I I
GCCA / GCCAUGG
Najbardziej preferowana jest obecność puryny
w pozycjach -3 i +4 w stosunku do AUG.
D. Rola ogona poli(A) w inicjacji
Doświadczenia biochemiczne i genetyczne na
drożdżach wykazały, że ogon poli(A) oraz wią¬
żące go białko Pablp są niezbędne do efektyw¬
nego rozpoczęcia syntezy białka. Dalsze badania
pokazały, że ogon poli(A) pobudza rekrutowanie
podjednostki rybosomowej 40S do mRNA w wy¬
niku złożonych oddziaływań. Pablp, związany
z ogonem poli(A), oddziałuje z eIF-4G, który
z kolei wiąże się z eIF-4E, ten zaś pozostaje zwią¬
zany z czapeczką. Możliwe, że powstaje struktura
kolista i że dzięki temu rybosomowa podjednost-
ka 40S może dotrzeć do końca 5' mRNA. Ułatwia
to wyjaśnienie, w jaki sposób struktury czapeczki
i ogona poli(A) wywierają synergistyczny wpływ
na syntezę białka. Wydaje się, że podobny mecha¬
nizm działa w komórkach ssaków.
E. Utworzenie kompleksu inicjacyjnego 80S
Związanie podjednostki rybosomalnej 60S
z kompleksem inicjacyjnym 48S obejmuje hydro¬
lizę GTP związanego z eIF-2 za pośrednictwem
eIF-5. Reakcja ta powoduje uwolnienie czynni¬
ków inicjacyjnych związanych z kompleksem
inicjacyjnym 48S (czynniki te podlegają potem
recyrkulacji) i szybką asocjację podjednostek 40S
i 60S z wytworzeniem rybosomu 80S. W tym mo¬
mencie met-tRNA' znajduje się w miejscu P ry¬
bosomu i układ jest gotowy do rozpoczęcia cyklu
elongacji.
Regulacja elF-4E kontroluje szybkość
inicjacji
Kompleks eIF-4F (4F) jest bardzo ważny w kon¬
trolowaniu szybkości translacji. Jak już wspo¬
mniano, 4F składa się z eIF-4E (4E), który jest
połączony ze strukturą czapeczki m7G przy koń¬
cu 5' mRNA, oraz z 4G, który służy jako białko
rusztowania. 4G, oprócz wiązania się z 4E, wiąże
się z eIF-3, który łączy kompleks z podjednost¬
ką rybosomową 40S. 4G wiąże także 4A i 4B,
kompleks ATPazy-helikazy, pomagający rozpleść
RNA (ryc. 37-7).
4E jest odpowiedzialny za rozpoznawanie struk¬
tury czapeczki mRNA; wiązanie z czapeczką jest
elementem ograniczającym szybkość translacji.
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 449
2. Tworzenie trójskładnikowego 3. Tworzenie kompleksu
kompleksu inicjacyjnego 80S
1. Aktywacja mRNA
©
Ryc. 37-6. Schemat inicjacji biosyntezy białka na matrycy mRNA, zawierającego na końcu 5' czapeczkę (Czapeczka) i sekwencję poliA
na końcu 3' [(A)J. Proces przebiega w trzech etapach: (1) aktywacja mRNA; (2) utworzenie trójskładnikowego kompleksu składające¬
go się z met-tRNA, czynnika inicjującego elF-2 oraz z GTP; (3) skanowanie kompleksu 43S w celu zlokalizowania kodonu startowego
AUG, tworzenie kompleksu inicjacyjnego 48S; (4) utworzenie aktywnego kompleksu inicjacyjnego 80S (szczegóły w tekście). GTP - •;
GDP- o. Różne czynniki inicjujące pokazano w postaci skrótowej, jako.kółka lub kwadraciki, np. elF-3 ((D), elF-4F 0EI). 4F jest kom¬
pleksem składającym się z 4E i 4A związanych z 4G (patrz ryc. 37-7). Kompleks preinicjacyjny 43S składa się z konstelacji czynników
białkowych i podjednostki rybosomowej 40S. Po połączeniu się z mRNA powstaje kompleks preinicjacyjny 48S.
450 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Proces ten podlega regulacji na dwóch poziomach.
Insulina i wzrostowe czynniki mitogenne powo¬
dują fosforylację 4E na serynie 209 (lub treoninie
210). Ufo sfory lowany 4E wiąże się z czapecz¬
ką znacznie chętniej niż forma nieufosforylowa-
na, zwiększając w ten sposób szybkość inicjacji.
W reakcji fosforylacji prawdopodobnie uczestni¬
czy składowa szlaku kinazy MAP (p. ryc. 42-8).
Aktywność 4E jest regulowana w inny sposób,
także związany z fosforylacją. Rodzinę białek,
które wiążą i inaktywują 4E odkryto niedawno.
Białka te to 4E-BP1 (BPI znane też jako PHAS-
-1) oraz blisko spokrewnione 4E-BP2 i 4E-BP3.
BPI wiąże się z dużym powinowactwem z 4E.
Asocjacja [4E]#[BP1] zapobiega wiązaniu 4G
SpecAa AUG " <A>"
Ryc. 37-7. Aktywacja elF-4E przez insulinę i tworzenie wiążącego
czapeczkę kompleksu elF-4F. Kompleks 4F-czapeczka cząsteczki
mRNA pokazano tak samo jak na ryc. 37-6. Kompleks 4F składa
się z elF-4E (4E), elF-4A i elF-4G. 4E jest nieaktywny, jeśli jest
związany z jednym z członków rodziny białek wiążących (4E-BP).
Insulina i czynniki mitogenne (np. IGF-1, PDGF, interleukina-2
i angiotensyna II) aktywują serynową kinazę białkową w szlaku
mTOR, w wyniku czego 4E-BP ulega fosforylacji. Fosforylowany
4E-BP oddysocjowuje od 4E, dzięki czemu 4E jest zdolny do
utworzenia kompleksu z 4F i związania się z czapeczką metylacyj-
ną. Te wzrostowe peptydy także fosforylują sam 4E przez aktywo¬
wanie komponentu szlaku kinazy MAR Ufosforylowany 4E łączy się
z czapeczką znacznie łatwiej niż postać nieufosforylowana.
przez 4E (co daje 4F). Ponieważ oddziaływanie
to ma podstawowe znaczenie dla wiązania się 4F
z podjednostką rybosomową 40S i prawidłowym
usytuowaniem na mRNA z czapeczką, toteż BP-1
skutecznie hamuje inicjację translacji.
Działanie insuliny i innych czynników wzro¬
stowych powoduje w efekcie fosforylację BP-1
w pięciu unikatowych miejscach. W wyniku fos¬
forylacji BP-1 oddysocjowuje od 4E, co unie¬
możliwia mu ponowne związanie się, zanim
krytyczne miejsca nie ulegną defosforylacji. Od¬
powiadająca za to kinaza białkowa nie została
dotychczas zidentyfikowana, ale wydaje się, że
jest to kinaza inna niż fosfory luj ąca 4E. Kinaza
biorąca w tym udział jest związana ze szlakiem
mTOR (ang. mammalian target of rapamycin),
lub być może z samym mTOR. Powyższe skutki
aktywowania 4E częściowo tłumaczą, w jaki spo¬
sób insulina jest w stanie powodować znaczący
potranskrypcyjny wzrost syntezy białka w wątro¬
bie, tkance tłuszczowej i mięśniach.
Elongacja również jest procesem
wieloetapowym
Elongacja jest cyklicznym procesem zachodzącym
na rybosomach, podczas którego do powstające¬
go łańcucha peptydowego przyłącza się kolejno
jeden aminokwas (ryc. 37-8). Sekwencja pepty-
du jest określona kolejnością ułożenia kodonów
w mRNA. Elongacja składa się z kilku etapów,
katalizowanych przez białka zwane czynnikami
elongacji (EFs). Etapy te obejmują: 1) wiązanie
się aminoacylo-tRNA z miejscem A, 2) tworzenie
się wiązania peptydowego i 3) translokację.
A. Wiązanie się aminoacylo-tRNA z miejscem A
W kompletnym rybosomie 80S, powstałym
w czasie procesu inicjacji, miejsce A jest wol¬
ne. Wiązanie odpowiedniego aminoacylo-tRNA
w miejscu A wymaga rozpoznania odpowiedniego
kodonu. Czynnik elongacyjny EF1A powodu¬
je utworzenie się trójskładnikowego kompleksu
z GTP i aminoacylo-tRNA (p. ryc. 37-8). Kom¬
pleks ten pozwala aminoacylo-tRNA na zaję¬
cie miejsca A, czemu towarzyszy uwolnienie
EF1A*GDP oraz fosforanu. Hydroliza GTP jest
katalizowana przez aktywne miejsce na rybo¬
somie. Jak pokazano na ryc. 37-8, EF1A-GDP
wchodzi ponownie do cyklu, tworząc EF1A-GTP
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 451
przy udziale innych rozpuszczalnych czynników
białkowych oraz GTP.
B. Tworzenie się wiązania peptydowego
Grupa a-aminowa nowego aminoacylo-tRNA
w miejscu A dokonuje ataku nukleofilowego na
estryfikowaną grupę karboksylową peptydylo-
-tRNA, zajmującego miejsce P (miejsce peptydy-
lowe albo polipeptydowe). Przy inicjacji miejsce
to jest zajmowane przez aminoacylo-tRNA met'.
Reakcja ta jest katalizowana przez peptydylo-
transferazę, będącą komponentem 28S RNA
podjednostki rybosomowej 60S. Jest to inny przy¬
kład aktywności rybozymu i wskazuje on na waż¬
ną, uprzednio nieznaną, bezpośrednią rolę RNA
w biosyntezie białka (tab. 37-3). Ponieważ ami¬
nokwas aminoacylo-tRNA jest już „aktywowany”,
reakcja ta nie wymaga dodatkowego źródła ener¬
gii. W wyniku tej reakcji rosnący łańcuch pepty-
dowy zostaje dołączony do tRNA w miejscu A.
Tabela 37-3. Dowody na to, że rRNA jest peptydylotransferazą
Rybosomy mogą utworzyć wiązania peptydowe nawet
wówczas, gdy białka zostaną usunięte lub są inaktywowane.
Niektóre fragmenty sekwencji rRNA są u wszystkich gatun¬
ków wysoce zachowawcze.
Takie zachowawcze regiony znajdują się na powierzchni
cząsteczki RNA.
RNA może mieć właściwości katalityczne.
Mutacje, w wyniku których powstaje oporność na antybiotyki
na poziomie syntezy białka, częściej występują w rRNA niż
w białkowych komponentach rybosomów.
Szczegółowy mechanizm działania sugerują wyniki analizy
krystalograficznej dużej podjednostki rRNA związanej z tRNA.
C. Tran slo kac ja
Deacylowany tRNA zostaje przyłączony za po¬
mocą antykodonu do miejsca P na jednym końcu,
zaś na drugim końcu - za pomocą otwartego ogo¬
na CCA do miejsca wyjścia (E), znajdującego się
na dużej podjednostce rybosomu (część środkowa
ryc. 37-8). W tym momencie czynnik elongacji 2
Ryc. 37-8. Schemat procesu elongacji peptydu w trakcie syntezy
białka. Małe kółka, oznaczone n-1, n, n+1 itd., oznaczają resz¬
ty aminokwasowe w nowo powstającej cząsteczce białka. EF1A
i EF2 przedstawiają, odpowiednio, czynniki elongacyjne 1 i 2.
Miejsca peptydylo-tRNA, aminoacylo-tRNA i wyjścia są oznaczo¬
ne na rybosomie jako miejsca, odpowiednio, R A i E.
452 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
(EF2) wiąże się z peptydylo-tRNA i przemieszcza
go z miejsca A do miejsca P. Z kolei deacylowany
tRNA znajduje się w miejscu E, z którego opusz¬
cza rybosom. Kompleks EF2-GTP zostaje zhydro-
lizowany do EF2-GDP i fosforanu, przesuwając
mRNA o jeden kodon i pozostawiając miejsce A
dostępne dla kolejnego trójskładnikowego kom¬
pleksu aminokwasowego tRNA z EF1A i GTP,
a zatem dla następnego cyklu elongacji.
Obciążenie cząsteczki tRNA resztą aminoacy-
lową wymaga hydrolizy ATP do AMP, równoważ¬
nej z hydrolizą dwóch ATP do dwóch ADP i fo¬
sforanów. Wejście aminoacylo-tRNA w miejsce
A powoduje hydrolizę jednej cząsteczki GTP do
GDP. Translokacja nowo utworzonego peptydylo-
-tRNA z miejsca A do miejsca P za pośredni¬
ctwem eEF2 podobnie powoduje hydrolizę GTP
do GDP i fosforanu. Zapotrzebowanie energetycz¬
ne na utworzenie jednego wiązania peptydowego
jest równoważne energii uzyskanej z hydrolizy
dwóch cząsteczek ATP do ADP i dwóch cząste¬
czek GTP do GDP, czyli hydrolizy czterech boga-
toenergetycznych wiązań fosforowych. Rybosom
eukariotyczny może wbudowywać aminokwasy
z szybkością do sześciu cząsteczek na sekundę,
zaś rybosomy prokariotyczne wbudowują do 18
aminokwasów na sekundę. Proces biosyntezy
peptydu, zachodzący więc z bardzo dużą szybko¬
ścią i dokładnością, trwa aż do momentu osiąg¬
nięcia kodonu terminacyjnego.
Terminacja zachodzi wówczas,
gdy zostanie rozpoznany
kodon stop
W porównaniu z inicjacją i elongacją, terminacja
jest stosunkowo prostym procesem (ryc. 37-9).
Po wielu cyklach elongacji, w wyniku których
następuje polimeryzacja swoistych aminokwasów
w cząsteczkę białka, pojawia się w miejscu A ko¬
don stop (kodon nonsensowny terminacji) (UUA,
UAG, UGA) cząsteczki mRNA. W warunkach
prawidłowych nie istnieje tRNA zawierający an-
tykodon zdolny do rozpoznania takiego sygnału
terminacji. Czynnik uwalniający RF1 rozpo¬
znaje, że kodon stop znajduje się w miejscu A
(ryc. 37-9). Czynnik RF1 zostaje związany przez
kompleks, składający się z czynnika uwalniają¬
cego RF3 i GTP. Kompleks ten, wraz z transfe-
razą peptydylową, powoduje hydrolizę wiązania
między peptydem i tRNA zajmującym miejsce P.
Zamiast aminokwasu zostaje więc dodana czą¬
steczka wody. W wyniku hydrolizy z miejsca P
uwalnia się białko i tRNA. W następstwie hy¬
drolizy i uwolnienia białka oraz tRNA rybosom
80S dysocjuje do podjednostek 40S i 60S, które
ponownie wchodzą do cyklu. Czynniki uwalniają¬
ce są zatem białkami, które hydrolizują wiązanie
peptydylo-tRNA w momencie, kiedy nonsensow¬
ny kodon zajmuje miejsce A. mRNA zostaje na¬
stępnie uwolniony z rybosomu, który dysocjuje
do podjednostek 40S i 60S, i kolejny cykl syntezy
może być powtórzony.
Polisomy są skupiskami rybosomów
W procesie translacji tej samej cząsteczki mRNA
może brać udział jednocześnie wiele rybosomów.
Ponieważ rybosomy mają stosunkowo duży wy¬
miar, toteż wiążą się z mRNA w odstępach nie
mniejszych niż 35 nukleotydów. Duża liczba
rybosomów, związanych z tą samą cząsteczką
mRNA, tworzy polirybosom albo „polisom”.
Przy braku ograniczeń liczba rybosomów związa¬
nych z mRNA (a zatem wielkość polirybosomów)
jest wprost proporcjonalna do długości cząsteczki
mRNA. Masa cząsteczki mRNA jest oczywiście
całkiem mała w porównaniu z masą nawet poje¬
dynczego rybosomu.
Polirybosomy aktywnie syntetyzujące biał¬
ka mogą w cytoplazmie komórki istnieć jako
wolne ziarnistości albo mogą być przyczepione
do błoniastych struktur cytoplazmatycznych,
określanych jako siateczka śródplazmatyczna.
Doczepienie ziarnistości polirybosomowych do
siateczki śródplazmatycznej jest odpowiedzialne
za jej „szorstki” wygląd, co łatwo zaobserwo¬
wać w mikroskopie elektronowym. Białka syn¬
tetyzowane na polirybosomach przyczepionych
do siateczki są wydzielane do wnętrza cystern
pomiędzy listkami szorstkiej siateczki śródpla¬
zmatycznej, a następnie eksportowane dalej.
Niektóre z produktów białkowych szorstkiej sia¬
teczki śródplazmatycznej, w celu ewentualnego
dalszego ich eksportu, są upakowywane w obrę¬
bie aparatu Golgiego jako cząsteczki zymogenu
(p. rozdz. 45). Polirybosomy, które znajdują się
w cytozolu w stanie wolnym, są odpowiedzialne
za syntezę białek wypełniających funkcje we¬
wnątrzkomórkowe.
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 453
Kodon
terminacji
(stop)
Ryc. 37-9. Schemat procesu terminacji syntezy białka. Miejsca peptydylo-tRNA i aminoacylo-tRNA są oznaczone, odpowiednio, jako
miejsca P i A. Kodon terminacji (stop) jest zaznaczony za pomocą trzech pionowych kresek. Czynnik uwalniający RF1 zostaje związany
z kodonem stop. Z kolei z RF1 asocjuje czynnik uwalniający RF3 z przyłączonym GTR Hydroliza kompleksu peptydylo-tRNA jest ozna¬
czona jako wejście H20. Symbole N i C oznaczają, odpowiednio, aminokwasy na końcu aminowym i karboksylowym powstającego
łańcucha polipeptydowego i ilustrują polarność syntezy białka.
454 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
„Maszyneria” syntezy biatek może
reagować na zagrożenia środowiskowe
Ferryty na, białko wiążące żelazo, zapobiega
toksycznemu stężeniu jonów żelaza(II) (Fe2+)
w komórkach. Syntezę ferrytyny pobudza żelazo,
powodując uwolnienie cytoplazmatycznego biał¬
ka związanego ze swoistym regionem sekwencji
nieulegających translacji przy końcu 5' mRNA
ferrytyny. Przerwanie interakcji białko-mRNA
aktywuje ferryty no wy mRNA i powoduje jego
translację. Taki mechanizm zapewnia szybką
kontrolę syntezy białka, które usuwa potencjalnie
toksyczne jony Fe2+.
Wirusy kooptują w komórce gospodarza
„maszynerie” syntezy biatek
„Maszyneria” syntezy białka może być także mo¬
dyfikowana przez procesy szkodliwe dla komór¬
ki. Wirusy replikują, wykorzystując procesy
zachodzące w komórkach gospodarza, łącznie
z syntezą białka. Niektóre wirusowe mRNA (np.
wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego)
ulegają translacji znacznie wydajniej niż czą¬
steczki mRNA komórki gospodarza. Inne, np.
reowirus i wirus opryszczkowego zapalenia jamy
ustnej, replikują w sposób nadmierny i ich mRNA
współzawodniczą z cząsteczkami mRNA komór¬
ki gospodarza o ograniczoną liczbę czynników
translacji. Inne wirusy hamują syntezę białek ko¬
mórki gospodarza, uniemożliwiając wytworzenie
połączeń mRNA z rybosomem 40S.
Wirus polio i inne pikomawirusy uzyskują
przewagę selekcyjną dzięki zakłócaniu na swo¬
ją korzyść działania kompleksu 4F. mRNA tych
wirusów nie zawiera struktury czapeczki, umoż¬
liwiającej kierowanie wiązaniem podjednostki
rybosomowej 40S (patrz wyżej). Zamiast tego
jednostka rybosomowa 40S wchodzi w kontakt
z miejscem IRES (ang. intemal ribosomal entry
site) w reakcji wymagającej obecności 4G, a nie
4E. Wirus uzyskuje przewagę selekcyjną, ponie¬
waż zawiera proteazę, która atakuje 4G i usuwa
z jej końca aminowego miejsce wiążące 4E. W ta¬
kiej sytuacji nie może tworzyć się kompleks 4E-
-4G (czyli 4F), tak że podjednostka rybosomowa
40S nie może zostać skierowana do opatrzonego
czapeczką mRNA. Translacja w komórce gospo¬
darza zostaje w ten sposób zniesiona. Fragment
Czapeczka AUG
Proteaza
wirusa polio
r Nil
Czapeczka AUG
T' ^
— IRES AUG
Ryc. 37-10. Pikomawirusy niszczą kompleks 4F. Kompleks
4E-4G (4F) kieruje podjednostkę rybosomową 40S do typowego,
opatrzonego czapeczką mRNA (patrz tekst). Do skierowywania
podjednostki 40S do miejsca IRES wirusowych mRNA wystarcza
sam 4G. W celu uzyskania przewagi selekcyjnej pewne wirusy
(np. wirus polio) wykorzystują proteazę odcinającą 4E od końca
aminowego 4G. Skrócony w ten sposób 4G może skierowywać
podjednostkę rybosomową 40S do mRNA zawierających IRES,
ale nie do mRNA opatrzonych czapeczką. Szerokość strzałek po¬
kazuje szybkość inicjacji translacji z kodonu AUG w podanych
przykładach.
4G może kierować wiązaniem podjednostki ry¬
bosomowej 40S z mRNA, zawierającymi IRES,
tak więc translacja wirusowego mRNA jest bar¬
dzo wydajna (ryc. 37-10). Wirusy te przyczy¬
niają się także do defosforylacji BPI (PHAS-1),
zmniejszając w ten sposób translację zależną od
czapeczki (4E).
MODYFIKACJA POTRANSLACYJNA MA
WPŁYW NA AKTYWNOŚĆ WIELU BIAŁEK
Niektóre wirusy zwierzęce, m.in. wirus HIV, wi¬
rus polio i wirus zapalenia wątroby typu A, synte¬
tyzują długie, policistronowe białka na jednej dłu¬
giej cząsteczce mRNA. Cząsteczki takich białek
są następnie przecinane w określonych miejscach,
w wyniku czego powstaje wiele swoistych białek,
niezbędnych do spełniania funkcji wirusowych.
W komórkach zwierzęcych wiele białek jest syn¬
tetyzowanych na matrycy mRNA jako cząsteczka
prekursorowa, która następnie musi być zmodyfi¬
kowana tak, aby powstało aktywne białko. Przy¬
kładem i prototypem jest insulina, białko o ma-
37. SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY 455
lej masie, mające dwa łańcuchy polipeptydowe
z międzycząsteczkowymi i wewnątrzcząsteczko-
wymi mostkami disiarczkowymi. Cząsteczka in¬
suliny jest syntetyzowana jako jednołańcuchowy
prekursor, czyli prohormon, który fałduje się,
umożliwiając powstanie mostków disiarczko-
wych. Następnie swoista proteaza wycina seg¬
ment, który łączy oba łańcuchy, tworząc funkcjo¬
nalną cząsteczkę insuliny (p. ryc. 41-12).
Wiele innych peptydów jest syntetyzowanych
jako proproteiny, które - zanim osiągną aktyw¬
ność biologiczną - muszą ulec modyfikacji. Mo¬
dyfikacje potranslacyjne obejmują usunięcie reszt
aminokwasowych z końca aminowego, co zacho¬
dzi przy udziale swoistych aminopeptydaz. Kola¬
gen - białko występujące u wyższych eukariotów
w wielkich ilościach w przestrzeniach pozako-
mórkowych jest syntetyzowany jako prokolagen.
Trzy cząsteczki polipeptydu prokolagenu, często
0 innej sekwencji, układają się w specyficzny spo¬
sób, zależny od obecności określonych peptydów
na końcu aminowym. Następnie swoiste enzymy
przeprowadzają hydroksylację i oksydację swo¬
istych reszt aminokwasowych w obrębie cząste¬
czek prokolagenu, w celu utworzenia zwiększa¬
jących stabilność wiązań poprzecznych. Peptydy
na końcu aminowym cząsteczki zostają odcięte
1 w ten sposób powstaje produkt końcowy - trwa¬
ła, nierozpuszczalna cząsteczka kolagenu. Znane
są również inne potranslacyjne modyfikacje bia¬
łek. Na przykład częste są modyfikacje polegające
na acetylacji, fosforylacji, metylacji, ubikwityny-
lacji oraz glikozylacji.
WIELE ANTYBIOTYKÓW DZIAŁA
SKUTECZNIE, PONIEWAŻ HAMUJE
WYBIÓRCZO SYNTEZĘ BIAŁKA
BAKTERYJNEGO
Rybosomy bakterii i rybosomy w mitochondriach
komórek wyższych organizmów eukariotycznych
różnią się od rybosomów opisanych w rozdz. 34.
Rybosom bakteryjny jest mniejszy (70S, a nie
80S) i ma inny, nieco uproszczony zestaw czą¬
steczek RNA i białek. Te różnice wykorzystano
do celów klinicznych, ponieważ wiele skutecznie
działających antybiotyków oddziałuje swoiście
z białkami prokariotycznych rybosomów, hamując
syntezę białek. W wyniku takiego oddziaływania
następuje zahamowanie wzrostu lub śmierć bak¬
terii. Większość najbardziej skutecznych antybio¬
tyków tej klasy (np. tetracykliny, linkomycyna,
erytromycyna i chloramfenikol) nie oddziałuje ze
swoistymi białkami eukariotycznych cząsteczek
rybosomalnych i przez to nie są one toksyczne dla
eukariotów. Tetracyklina zapobiega wiązaniu się
aminoacylo-tRNA z miejscem A. Chloramfenikol
oraz antybiotyki makrolidowe działają poprzez
przyłączanie się do 23S rRNA, co jest interesu¬
jące z perspektywy docenionej obecnie roli rRNA
w tworzeniu wiązania peptydowego dzięki aktyw¬
ności peptydylotransferazowej. Należy zauważyć,
że duże podobieństwo między rybosomami pro-
kariotów i rybosomami mitochondrialnymi może
wywoływać komplikacje przy stosowaniu niektó¬
rych antybiotyków.
N(CH3)2
Ryc. 37-11. Porównanie struktury antybiotyku puromycyny
(góra) i 3'-końcowej części tyrozynylo-tRNA (dól).
456 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Inne antybiotyki hamują biosyntezę białka
na wszystkich rybosomach (puromycyna) albo
tylko na rybosomach komórek eukariotycznych
(cykloheksymid). Puromycyna, której strukturę
przedstawiono na ryc. 37-11, jest strukturalnym
analogiem tyrozynylo-tRNA. Puromycyna jest
wbudowywana, poprzez miejsce A na rybosomie,
do karboksylowego końca peptydu, ale proces ten
powoduje przedwczesne uwolnienie polipepty-
du. Puromycyna, jako analog tyrozynylo-tRNA,
skutecznie hamuje syntezę białka zarówno u pro-
kariotów, jak i u eukariotów. Cykloheksymid ha¬
muje u eukariotów peptydylotransferazę w pod-
jednostce rybosomowej 60S, prawdopodobnie
dzięki wiązaniu się z rRNA.
Toksyna błonicy, tj. egzotoksyna wytwarza¬
na przez pałeczki Corynebacterium diphteriae
zainfekowane swoistym fagiem lizogenicznym,
katalizuje w komórkach ssaków ADP-rybozylację
czynnika EF-2 na unikalnym diftamidzie ami-
nokwasowym. Rybozylacja ta inaktywuje EF-2,
hamując swoiście syntezę białka w komórkach
ssaków. Wiele zwierząt (np. myszy) wykazuje
oporność na toksynę błoniczą. Oporność ta wy¬
nika z niezdolności toksyny błoniczej do przeni¬
kania przez błonę komórkową, a nie z niewraż-
liwości mysiego EF-2 na katalizowaną toksyną
błoniczą ADP-rybozylację przez NAD.
Rycyna, krańcowo toksyczna cząsteczka wy¬
izolowana z rącznika pospolitego, inaktywuje 28S
rRNA przez umożliwienie cięcia A-glikolityczne-
go lub usunięcia pojedynczej cząsteczki adeniny.
Wiele z tych związków, a zwłaszcza puromy¬
cyna i cykloheksymid, są klinicznie nieużyteczne,
mają jednak duże znaczenie przy wyjaśnianiu roli
syntezy białka w regulacji procesów metabolicz¬
nych, zwłaszcza hormonalnej indukcji enzymów.
STRESZCZENIE
• Przepływ informacji genetycznej jest następu¬
jący: DNA —► RNA—► białko.
• Informacja genetyczna w regionie struktural¬
nym genu jest przepisywana na cząsteczkę
RN A tak, że sekwencja tej ostatniej jest kom¬
plementarna do nici matrycowej DNA.
• W procesie syntezy białka bierze udział kil¬
ka różnych typów RNA, m.in. rybosomalny
(rRNA), transportujący RNA (tRNA) oraz in¬
formacyjny (mRNA).
• Informacja genetyczna w mRNA występuje
w postaci tandemowego układu kodonów, z któ¬
rych każdy ma długość trzech nukleotydów.
• mRNA jest odczytywany w sposób ciągły od
kodonu startowego (AUG) do kodonu termina-
cyjnego (UAA, UAG, UGA).
• Otwarta ramka odczytu mRNA to ciąg precy¬
zyjnie określających sekwencję aminokwasową
kodonów, z których każdy odpowiada pewne¬
mu aminokwasowi.
• Synteza białka, podobnie jak synteza DNA
i RNA, przebiega z zachowaniem polamości od
5' do 3' i może być podzielona na trzy procesy:
inicjację, elongację i terminację. Mutanty białek
powstają wówczas, gdy w wyniku podstawienia
pojedynczej zasady pojawią się kodony okre¬
ślające inny aminokwas w danej pozycji; jeśli
powstanie kodon stop, w wyniku czego uzyska
się skróconą cząsteczkę białkową, albo gdy zo¬
stanie dodana lub usunięta zasada zmieniająca
ramkę odczytu w taki sposób, że odczytywane
są inne kodony.
• Różne związki chemiczne, łącznie z wieloma
antybiotykami, hamują syntezę białka poprzez
wpływanie na jeden lub kilka etapów procesów
opisanych wyżej.
PIŚMIENNICTWO
Crick F et al: The genetic codę. Naturę 1961; 192:227.
Green R, Noller HF: Ribosomes and translation. Annu
Rev Biochem 1997;66:679.
Kapp LD, Lorsch JR: The molecular mechanics of euka-
ryotic translation. Ann Rev Biochem 2004;73:657.
Kozak M: Structural features in eukaryotic mRNAs that
modulate the initiation of translation. J Biol Chem
1991 ;266:1986.
Lawrence JC, Abraham RT: PHAS/4E-BPs as regulators
of mRNA translation and celi proliferation. Trends
Biochem Sci 1997;22:345.
Sachs AB, Buratowski S: Common themes in translatio-
nal and transcriptional regulation. Trends Biochem
Sci 1997;22:189.
Sachs AB, Samów P, Hentze MW: Starting at the
beginning, middle and end: translation initiation in
eukaryotes. Celi 1997;98:831.
Steitz TA, Moore PB: RNA, the first macromolecular
catalyst: the ribosome is a ribozyme. Trends Bio¬
chem Sci 2003;28:411.
Weatherall DJ et al: The hemoglobinopathies. In:
The Metabolic and Molecular Bases of Inheri-
ted Disease, 8th ed. Serwer CR et al. (editors).
McGraw-Hill, 2001.
[
Regulacja ekspresji
DarylK. Granner, MD; P. Anthony Weil, PhD
genu
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Organizmy przystosowują się do zmian środowi¬
skowych poprzez zmianę ekspresji genów. Proces
zmian ekspresji genów zbadano szczegółowo;
często polega on na modulacji transkrypcji ge¬
nów. Ostatecznie kontrola transkrypcji jest wyni¬
kiem zmian w oddziaływaniach swoistych białek
regulatorowych z różnymi regionami DNA kon¬
trolowanego genu. Takie oddziaływanie białek
może mieć pozytywny lub negatywny wpływ na
transkrypcję. Kontrola transkrypcji może powo¬
dować specyficzną dla tkanek ekspresję genów;
wpływ na regulację transkrypcji mają hormony,
metale ciężkie i związki chemiczne. Oprócz kon¬
troli poziomu transkrypcji, ekspresję genów mogą
także modulować takie procesy, jak: wzmacnia-
nie/wyciszanie, rearanżacja genów, modyfikacje
potranskrypcyjne i stabilizacja RNA. Wiele me¬
chanizmów kontroli ekspresji genu bierze udział
w odpowiedzi na hormony i czynniki terapeutycz¬
ne. Zrozumienie zatem tych procesów przyczynia
się do opracowywania związków, które zmieniają
mechanizmy patofizjologiczne lub hamują czyn¬
ność albo też zatrzymują wzrost organizmów cho¬
robotwórczych.
REGULOWANA EKSPRESJA GENÓW JEST
NIEZBĘDNA DO PROCESU ROZWOJU,
RÓŻNICOWANIA I ADAPTACJI
Informacje genetyczne, występujące w każdej
komórce somatycznej organizmów wielokomór¬
kowych, są praktycznie identyczne. Wyjątek sta¬
nowią nieliczne rodzaje komórek, które mają am¬
plifikowane lub przegrupowane geny, aby mogły
wykonywać swoiste funkcje. Ekspresja informacji
genetycznej musi być regulowana w czasie onto-
genezy oraz różnicowania organizmu i jego skła¬
dowych komórek. Aby organizm mógł adaptować
się do środowiska i magazynować energię oraz
substraty odżywcze, ekspresja informacji gene¬
tycznej musi być wrażliwa również na sygnały ze¬
wnętrzne i reagować tylko wówczas, gdy zachodzi
potrzeba. W miarę ewolucji organizmów pojawia¬
ły się coraz to bardziej skomplikowane mechani¬
zmy regulacyjne, które umożliwiały organizmowi
i jego komórkom reakcje gwarantujące przeżycie
w złożonym środowisku. Komórki ssaków mają
ok. 1000 razy więcej informacji genetycznej niż
bakteria Escherichia coli. Znaczna część tej do¬
datkowej informacji genetycznej prawdopodob¬
nie służy regulacji ekspresji genów w czasie róż¬
nicowania tkanek oraz procesów biologicznych
w organizmie wielokomórkowym, a także zapew¬
nieniu, że organizm jest w stanie odpowiedzieć na
złożone bodźce środowiskowe.
Tabela 38-1. Wptyw regulacji pozytywnej i negatywnej na eks¬
presję genów
Stopień ekspresji genu
Regulacja
Regulacja
negatywna
pozytywna
Regulator obecny
Zmniejszenie
Zwiększenie
Brak regulatora
Zwiększenie
Zmniejszenie
W uproszczeniu, istnieją dwa typy regulacji
genu: regulacja pozytywna i regulacja negatywna
(tab. 38-1). Jeśli ekspresja informacji genetycznej
ilościowo się zwiększa dzięki obecności swoi¬
stego elementu regulatorowego, to mówi się, że
regulacja jest pozytywna; jeśli ekspresja infor¬
macji genetycznej zmniejsza się pod wpływem
458 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
swoistego elementu regulatorowego, to regulacja
jest negatywna. Czynnik lub cząsteczka, które
pośredniczą w regulacji negatywnej, jest regu¬
latorem negatywnym (represorem), a czynnik
pośredniczący w regulacji pozytywnej jest regu¬
latorem pozytywnym (aktywatorem). Jednakże
podwójna regulacja negatywna może działać
jako regulacja pozytywna. Czynnik, który hamuje
funkcję regulatora negatywnego, jest więc regu¬
latorem pozytywnym. Wiele regulowanych sy¬
stemów, które działają jak systemy indukowane,
Ryc. 38-1. Schematyczne przedstawienie stopnia ekspresji genu
jako odpowiedź na swoiste sygnały regulatorowe, takie jak np.
hormon.
jest w rzeczywistości systemami ulegającymi
derepresji na poziomie molekularnym. (Opis
tych zjawisk podano w rozdz. 9).
SYSTEMY BIOLOGICZNE WYKAZUJĄ TRZY
TYPY PRZEJŚCIOWYCH ODPOWIEDZI NA
SYGNAŁ REGULACYJNY
Na rycinie 38-1 schematycznie przedstawiono
stopień ekspresji genu jako czasową funkcję od¬
powiedzi na sygnał indukujący. Reakcja typu A
charakteryzuje się wzmożoną ekspresją genu,
która zależy od stałej obecności sygnału induku¬
jącego. Gdy sygnał indukujący zostaje usunięty,
wówczas stopień ekspresji genu maleje do warto¬
ści podstawowej, lecz ekspresja znów się zwięk¬
sza, jako reakcja na ponowne pojawienie się swo¬
istego sygnału. Ten typ reakcji często obserwuje
się u prokariotów w odpowiedzi na nagłe zmiany
wewnątrzkomórkowego stężenia składnika od¬
żywczego. Istnieje on również u wielu organi¬
zmów wyższych po ekspozycji na takie czynniki
indukujące, jak hormony steroidowe, składniki
odżywcze i czynniki wzrostowe (p. rozdz. 42).
Reakcja typu B przedstawia przejściowo
wzmożony stopień ekspresji genu, nawet przy sta¬
le trwającym sygnale regulatorowym. Gdy ustaje
sygnał regulatorowy i komórka powraca do stanu
prawidłowego, wówczas może wystąpić druga
przejściowa reakcja na następny sygnał regulato¬
rowy. Zjawisko odpowiedź-odwrażliwienie-po-
wrót wrażliwości cechuje mechanizmy działania
wielu środków farmakologicznych, ale jest także
cechą wielu procesów zachodzących w warun¬
kach naturalnych. Ten typ reakcji występuje czę¬
sto w procesie rozwoju organizmu, gdy produkt
określonego genu jest potrzebny tylko przejścio¬
wo mimo trwałej obecności sygnału.
Reakcja typu C na sygnał regulatorowy cha¬
rakteryzuje się zwiększonym stopniem ekspresji
genu, który utrzymuje się przez czas nieokre¬
ślony, nawet po zakończeniu sygnału. W takim
systemie sygnał regulatorowy działa jak mecha¬
nizm spustowy - raz zainicjowana w komórce
ekspresja genu może być zakończona nawet
w komórkach potomnych; jest to zatem zmiana
nieodwracalna i dziedziczna. Ten typ reakcji wy¬
stępuje zwykle w czasie różnicowania się tkanki
lub narządu.
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 459
Organizmy prokariotyczne stanowią
model badań ekspresji genów
w komórkach ssaków
Szczegółowa analiza regulacji ekspresji genów
w komórkach prokariotycznych pomogła sformu¬
łować zasadę, że przepływ informacji następuje
od genu poprzez mRNA do cząsteczki swoistego
białka. Wiedza o molekularnych mechanizmach
regulacji ograniczała się do niedawna do pro-
kariotów i niższych eukariotów. Wynikało to
z możliwości przeprowadzenia zaawansowanej
analizy genetycznej jedynie u tych prymitywnych
organizmów. W ostatnich latach różnorodne tech¬
niki biologii molekularnej, w oparciu o zasady
ustalone we wcześniejszych badaniach, umożli¬
wiły niezwykły postęp w analizie ekspresji genu
u organizmów wyższych, w tym ssaków. Wstępne
rozważania w tym rozdziale będą się koncentro¬
wały na systemach prokariotycznych. Nie będą tu
omawiane imponujące badania genetyczne, lecz
problem, który może być nazwany fizjologią eks¬
presji genu. Jednak prawie wszystkie wnioski do¬
tyczące tej fizjologii płyną z badań genetycznych
i zostały potwierdzone w badaniach z dziedziny
genetyki molekularnej i biochemii.
Niektóre cechy ekspresji genów
u prokariotów sa unikatowe
Zanim zostanie wyjaśniona fizjologia ekspresji
genu, należy zdefiniować niektóre specjalistyczne
terminy z zakresu genetyki i regulacji, dotyczące
systemów prokariotycznych. Geny uczestniczące
w jakimś szlaku metabolicznym u prokariotów
często występują w ustawieniu liniowym zwa¬
nym operonem, np. operon lac. Operon może
być regulowany za pomocą pojedynczego pro¬
motora lub regionu regulatorowego. Cistron jest
najmniejszą jednostką ekspresji genetycznej. Jak
to opisano w rozdz. 9, niektóre enzymy i inne
cząsteczki białkowe składają się z co najmniej
dwóch różnych podjednostek. Koncepcja „jeden
gen-jeden enzym” nie jest więc w pełni zasadna.
Cistron jest jednostką genetyczną kodującą struk¬
turę podjednostki cząsteczki białkowej, działając
jako najmniejsza jednostka ekspresji genetycznej.
Koncepcja jednego genu-jednego enzymu może
być obecnie rozważana bardziej precyzyjnie jako
koncepcja jeden cistron-jedna podjednostka.
Pojedynczy mRNA kodujący więcej niż jedno
ulegające osobnej translacji białko nosi nazwę
policistronowego mRNA. Na przykład mRNA
policistronowego operonu lac ulega translacji na
trzy osobne białka (patrz poniżej). Operony i poli-
cistronowy mRNA są powszechne u bakterii, lecz
nie u prokariotów.
Gen indukowany to taki gen, którego ekspresja
ulega zwiększeniu w odpowiedzi na induktor lub
aktywator, swoiście pozytywny sygnał regulato¬
rowy. Zazwyczaj indukowalne geny mają względ¬
nie małą podstawową szybkość transkrypcji.
W przeciwieństwie do nich, geny z dużą podsta¬
wową szybkością transkrypcji są często obiektem
regulacji typu obniżającego ze strony represorów.
Ekspresja niektórych genów jest konstytuty¬
wna, co oznacza, że jej szybkość jest stała i nie
podlega regulacji. Są to tzw. geny konstytutyw¬
ne (ang. housekeeping gene). Niektóre produkty
genów indukowalnych zaczynają być w wyniku
mutacji syntetyzowane w sposób konstytutywny.
Mutacja powodująca konstytutywną ekspresję
genu, który uprzednio był genem regulowanym,
nazywa się mutacją konstytutywną.
Analiza metabolizmu laktozy u E. coli
przyczyniła się do sformułowania
hipotezy operonu
W 1961 r. Franęois Jacob i Jacąues Monod opisali
w klasycznej rozprawie model operonu. Ich hipo¬
teza w dużej mierze opierała się na obserwacjach
regulacji metabolizmu laktozy przez bakterie
jelitowe E. coli. Mechanizm molekularny, odpo¬
wiedzialny za regulację genów biorących udział
w metabolizmie laktozy, należy obecnie do najle¬
piej poznanych mechanizmów regulacyjnych we
wszystkich organizmach. p-Galaktozydaza hydro-
lizuje p-galaktozyd laktozę do galaktozy i gluko¬
zy. Gen strukturalny p-galaktozydazy (gen lac Z)
występuje łącznie z genem odpowiedzialnym za
przenikanie galaktozy do komórki (lacY) i z ge¬
nem transacetylazy tiogalaktozydowej {lacA).
Geny strukturalne dla tych trzech enzymów, wraz
z promotorem lac i operatorem lac (region regula¬
torowy) są fizycznie połączone i stanowią operon
lac, przedstawiony na ryc. 38-2. Takie genetycz¬
ne uszeregowanie genów strukturalnych i ich ge¬
nów regulatorowych zapewnia skoordynowaną
ekspresję trzech enzymów uczestniczących
460 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Miejsce Operator
Operon lac
Ryc. 38-2. Wzajemne położenie genów strukturalnych i regula¬
torowych operonu lac. lad koduje p-galaktozydazę, lacY - per-
meazę, a lacA - transacetylazę tiogalaktozydową. lad koduje
białko represora operonu lac.
w metabolizmie laktozy. Każdy z tych sprzężo¬
nych genów jest przepisywany na dużą cząsteczkę
mRNA, która zawiera liczne i niezależne kodony
startu translacji (AUG) i zatrzymania translacji
(UAA) dla każdego cistronu. Każde zatem biał¬
ko ulega translacji osobno; białka te nie powstają
z jednego dużego białka prekursorowego. Taki
typ cząsteczki mRNA nazywa się policistrono-
wym mRNA. Policistronowe mRNA występują
głównie w organizmach prokariotycznych.
Obecnie przyjmuje się, że gen zawiera, oprócz
regionu kodującego transkrypt, sekwencje regu¬
latorowe. Jakkolwiek istnieje wiele historycznie
uzasadnionych wyjątków, nazwa genu jest zwykle
zapisywana pismem pochyłym i małymi literami,
natomiast kodowane przezeń białko jest zapisy¬
wane w postaci skrótowej pismem prostym, przy
czym pierwsza litera jest wielka. Na przykład gen
lacl koduje białko represorowe Lacl. Gdy bakte¬
rie E. coli zostaną eksponowane na laktozę lub
swoisty analog laktozy w odpowiednich warun¬
kach (np. wysokie stężenie laktozy, brak lub ni¬
skie stężenie glukozy), wówczas ekspresja aktyw¬
ności p-galaktozydazy, permeazy galaktozydowej
i transacetylazy tiogalaktozydowej zwiększa się
100-1000 razy. Jest to reakcja typu A, przedsta¬
wiona na ryc. 38-1. Kinetyka indukcji jest szyb¬
ka: mRNA specyficzne dla genów lac są w pełni
indukowane w ciągu 5-6 min po dodaniu laktozy
do kultur hodowlanych. Poziom białka p-galak¬
tozydazy osiąga maksimum w ciągu 10 min.
W warunkach pełnej indukcji w komórce może
się znajdować nawet 5000 cząsteczek p-galakto¬
zydazy, tzn. tysiąc razy więcej niż wynosi poziom
podstawowy, nieindukowany. Po usunięciu syg¬
nału, tj. induktora, synteza tych trzech enzymów
ulega spowolnieniu.
Jeśli bakterie E. coli są eksponowane zarówno
na laktozę, jak i na glukozę, jako źródła węgla,
to najpierw metabolizują glukozę, a następnie
chwilowo ograniczają wzrost do czasu, aż geny
operonu lac zostaną indukowane i umożliwią me¬
tabolizm laktozy. Chociaż laktoza jest obecna od
początku fazy wzrostowej bakterii, komórka nie
indukuje enzymów niezbędnych do katabolizmu
laktozy, zanim nie wyczerpie się glukoza. Zjawi¬
sko to początkowo przypisywano represji opero¬
nu laktozowego przez pewne katabolity glukozy;
stąd zjawisko to nazwano represją kataboliczną.
Obecnie wiadomo, że „represja kataboliczna”
w rzeczywistości zachodzi za pośrednictwem
białka aktywatora katabolicznego CAP (ang.
catabolite gene activator protein) przy udziale
cyklicznego AMP (cAMP) (p. ryc. 17-5). Białko
to niekiedy nazywa się białkiem regulatorowym
cAMP (CRP). Ekspresja wielu układów induko-
walnych enzymów lub operonów u E. coli i in¬
nych prokariotów jest wrażliwa na represję kata¬
boliczną, co będzie opisane poniżej.
Fizjologia indukcji operonu lac jest dobrze
poznana na poziomie molekularnym (ryc. 38-3).
Ekspresja normalnego genu lacl operonu lac jest
konstytutywna; jest to ekspresja na stałym pozio¬
mie, w wyniku której tworzą się podjednostki re¬
presora lac. Cząsteczka represora lac składa się
z czterech identycznych podjednostek o m.cz. 38
kDa. Cząsteczka Lacl białka represorowego - pro¬
dukt genu lacl - ma duże powinowactwo (Kd ok.
10 13 mol/L) do locus operatora. Locus operatora
jest to region dwuniciowego DNA, o długości 27
par zasad, mający podwójną symetrię rotacyjną
oraz odwrócony palindrom (strzałki obok kropko¬
wanej osi) w regionie obejmującym 21 par zasad,
jak to przedstawiono poniżej:
5' AATTGTGAGCGGATAACAATT
3' TTA ACACTCGCCTATTGTTAA
Wydaje się, że z operatorem przez cały czas
wiążą się tylko dwie podjednostki represora;
w obrębie regionu o długości 21 par zasad prawie
każda zasada każdej pary uczestniczy w procesie
rozpoznawania i wiązania represora Lacl. Wiąza¬
nie następuje głównie w rowku większym bez
rozerwania dwuniciowej, opartej na parowaniu
zasad, struktury DNA operatora. Locus operato¬
ra jest położony między miejscem promotora,
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 461
(tetramer)
B
Obecny induktor,
brak glukozy
CAP-cAMP
Ryc. 38-3. Mechanizm represji i derepresji operonu lac. Gdy brak jest induktora lub jest on wspólobecny z glukozą (A), produkty genu
lad, które są syntetyzowane konstytutywnie, tworzą tetrameryczną cząsteczkę represora, która wiąże się z locus operatora i zapobiega
wydajnemu inicjowaniu transkrypcji przez polimerazę RNA z locus promotora, uniemożliwiając w konsekwencji transkrypcję struktural¬
nych genów /acZ, lacY oraz lacA. Gdy induktor jest obecny (B), wówczas konstytutywnie działający gen lad wytwarza tetrameryczne
cząsteczki represora, które są konformacyjnie modyfikowane przez induktor i przez to nie mogą wiązać się z locus operatora (powi¬
nowactwo wiązania zmniejszone >1000-krotnie). W obecności cAMP i wiążącego go biatka (CAP) polimeraza RNA może przepisać
strukturalne geny lacZ, lacY i lacA, zaś policistronowa cząsteczka mRNA może ulec translacji na odpowiadające im cząsteczki biatka
P-galaktozydazy, permeazy i acetylazy; umożliwia to katabolizm laktozy.
w którym wiąże się zależna od DNA polimeraza
RNA w momencie rozpoczynania transkrypcji,
a miejscem inicjacji transkrypcji genu lacZ, czyli
strukturalnego genu p-galaktozydazy (ryc. 38-2).
Po przyłączeniu się do locus operatora cząstecz¬
ka represora uniemożliwia transkrypcję locus
operatora, jak również dystalnych strukturalnych
genów lacZ, lacY i lacA. Cząsteczka represora
LacI działa więc tu jako regulator negatywny;
w jej obecności (i przy braku induktora, p. niżej)
ekspresja genów lacZ, lacY i lacA jest uniemoż¬
liwiona. W każdej komórce na jeden operator
przypada zwykle od 20 do 40 cząsteczek tetrame-
rowego represora; jest to stężenie wystarczające
w ponad 95% do wiązania w dowolnej chwili
jednego operatora lac w komórce bakteryjnej.
Umożliwia to niską (ale nie zerową) transkryp¬
cję podstawową operonu lac pod nieobecność
sygnałów indukujących.
Analog laktozy, który jest zdolny indukować
operon lac, ale jednocześnie sam nie służy jako
substrat dla p-galaktozydazy, stanowi przykład
induktora poronnego. Jest nim np. izopropylo-
tiogalaktozyd (IPTG). Dodanie laktozy lub induk¬
tora poronnego (takiego jak IPTG) do bakterii,
rosnących na słabo użytkowanym źródle węgla
(np. takim jak bursztynian), powoduje szybką in¬
dukcję enzymów operonu lac. Małe ilości induk¬
tora poronnego lub laktozy są zdolne do wniknię¬
cia do komórki nawet pod nieobecność permeazy.
462 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Zarówno te cząsteczki represora LacI, które są
związane z loci operatora, jak również te, które
występują w stanie wolnym w cytozolu, mają
duże powinowactwo do induktora. Związanie in-
duktora z cząsteczką represora połączoną z opera¬
torem powoduje zmiany konformacyjne w struk¬
turze represora i prowadzi do jego dysocjacji od
DNA, ponieważ jego powinowactwo do operatora
jest teraz 103 razy mniejsze (A^d ok. 10 9 mol/L)
niż powinowactwo LacI pod nieobecność IPTG.
Jeśli zależna od DNA polimeraza RNA była już
wcześniej dołączona do kodującej nici w miej¬
scu promotorowym, to rozpocznie się transkryp¬
cja. Polimeraza generuje policistronowy RNA,
którego koniec 5' jest komplementarny do nici
matrycowego operatora. W ten sposób induktor
wywołuje derepresję operonu lac i pozwala
na transkrypcję strukturalnych genów p-galakto-
zydazy, permeazy galaktozydowej i transacety-
lazy tiogalaktozydowej. Translacja policistrono-
wego mRNA może zachodzić nawet wtedy, kiedy
transkrypcja nie jest jeszcze zakończona. Dere-
presja operonu lac pozwala komórce na syntezę
enzymów niezbędnych do katabolizmu laktozy
jako źródła energii. Indukowana przez IPTG eks¬
presja plazmidów (zawierających promotor ope¬
ratora lac połączony z różnorakimi konstrukcja¬
mi inżynierii genetycznej) jest dziś powszechnie
wykorzystywana do ekspresji rekombinowanych
białek ssaczych w bakterii E. coli.
Aby polimeraza RNA mogła skutecznie utwo¬
rzyć PIC w miejscu promotorowym, musi być
również obecne białko aktywatora katabolicz-
nego (CAP), z którym jest związany cAMP. Od¬
powiedni niezależny mechanizm pozwala na gro¬
madzenie cAMP przez bakterię tylko wówczas,
gdy jest ona pozbawiona źródła węgla. W obec¬
ności glukozy lub glicerolu, w stężeniach zapew¬
niających wzrost bakterii, nie będzie dostatecznej
ilości cAMP do związania się z białkiem CAP, po¬
nieważ glukoza hamuje cyklazę adenylanową, tj.
enzym przekształcający ATP do cAMP (p. rozdz.
41). W obecności glukozy lub glicerolu brak jest
więc białka CAP wysyconego cAMP. Zależna
od DNA polimeraza RNA nie może zainicjować
transkrypcji operonu lac. W obecności komplek¬
su CAP-cAMP, który wiąże się do DNA przed
miejscem promotorowym, transkrypcja może
zachodzić (p. ryc. 38-3). Badania wskazują, że
region CAP wchodzi w kontakt z podjednostką a
polimerazy RNA i ułatwia wiązanie się enzymu
z promotorem. Regulator CAP-cAMP działa więc
jako regulator pozytywny, ponieważ jego obec¬
ność jest wymagana do ekspresji genu. Operon
lac podlega więc kontroli przez dwa różne, modu¬
lowane Ugandami czynniki trans wiążące DNA:
jeden działający pozytywnie (kompleks cAMP-
-CRP) i drugi działający negatywnie (represor
LacI). Aktywność operonu lac jest największa
wtedy, gdy poziom glukozy jest niski (wysokie
stężenie cAMP wraz z aktywacją CAP) i gdy jest
obecna laktoza (LacI nie może wiązać się z ope¬
ratorem).
Jeśli gen lacl jest zmutowany w taki sposób, że
jego produkt - represor LacI - nie jest zdolny do
związania się z DNA operatora, to w organizmie
zajdzie konstytutywna ekspresja operatora lac.
Odwrotnie, jeśli w organizmie nastąpi mutacja
genu lacl uniemożliwiająca związanie induktora
z represorem, organizm pozostanie w stanie re¬
presji nawet w obecności cząsteczki induktora,
ponieważ induktor nie może związać represora
w locus operatora w celu derepresji operonu. Ana¬
logicznie, bakterie wytwarzające w locus operato¬
ra takie mutacje, które nie pozwalają na związanie
przez sekwencje operatora normalnej cząsteczki
represorowej, będą wykazywały konstytutywną
ekspresję genów operonu lac. Mechanizmy po¬
zytywnej i negatywnej regulacji porównywalne
z opisanymi dla systemu lac zaobserwowano
w komórkach eukariotycznych (patrz niżej).
Przełącznik genetyczny u bakteriofaga
lambda stanowi wzorzec
dla oddziaływań białko-DNA
w komórkach eukariotycznych
Podobnie jak niektóre wirusy u eukariotów (np.
wirus opryszczki zwykłej i wirus HIV), niektóre
wirusy bakteryjne znajdują się w stanie uśpienia
w chromosomie bakteryjnym lub mogą się repli¬
kować w bakterii i doprowadzać do lizy i śmierci
bakteryjnego gospodarza. Niektóre bakterie E. coli
wytwarzają taki łagodny („temperate”) wirus
- bakteriofag X. Podczas zakażenia wrażliwych
E. coli fagiem X, ten ostatni wstrzykuje do komór¬
ki bakteryjnej liniowy, dwuniciowy genom DNA
o długości 45 000 par zasad (ryc. 38-4). W zależ¬
ności od stanu odżywienia komórki bakteryjnej,
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 463
Ryc. 38-4. Zakażenie bakterii E. coli fagiem lambda zaczyna
się wówczas, gdy cząsteczka wirusa przyczepia się do swo¬
istych receptorów komórki bakteryjnej (1) i wstrzykuje swój
DNA (pogrubiona linia) do komórki (2,3). Zakażenie może biec
dalej dwoma szlakami, w zależności od tego, które z dwóch
zestawów genów wirusa zostają uaktywnione. Szlak lizogenicz-
ny prowadzi do integracji wirusowego DNA z chromosomem
bakteryjnym (4, 5), gdzie wirusowy DNA ulega biernej replikacji
wraz z podziałem komórki bakteryjnej. Uśpiony wirus jest nazy¬
wany profagiem, a komórka, która go wytwarza - lizogenem.
W alternatywnym szlaku zakażenia litycznego wirusowy DNA
replikuje samodzielnie (6) i steruje syntezą białek wirusowych
(7). Wytwarza się ok. 100 nowych cząsteczek wirusowych.
Namnażające się wirusy doprowadzają do lizy lub rozsadzenia
komórki (8). Profag może zostać „indukowany” takim czynni¬
kiem, jak promieniowanie ultrafioletowe (9). Czynnik indukujący
jest przełącznikiem, który uaktywnia inny zespół genów. Wiru¬
sowy DNA wypętla się z chromosomu (10) i replikuje; wirus
wchodzi na drogę lityczną. (Reprodukowano za zgodą z: Ptas-
hne M, Johnson AD, Pabo CO: A genetic switch in a bacterial
virus. Sci Am [Nov] 1982; 247:128).
wirusowy DNA albo integruje się z genomem
gospodarza (szlak lizogeniczny) i pozostaje tam
w stanie uśpienia do czasu aktywacji (p. niżej),
albo też zaczyna się replikować do czasu wytwo¬
rzenia ok. 100 kopii kompletnego, opakowanego
w białko wirusa, który w tym momencie powodu¬
je liżę swego gospodarza (szlak lityczny). Nowo
utworzone cząsteczki wirusa mogą następnie za¬
każać inne wrażliwe bakterie.
Wirus X po integracji z genomem gospoda¬
rza pozostaje w stanie uśpienia dopóty, dopóki
lizogeniczny bakteryjny gospodarz nie zostanie
eksponowany na czynniki uszkadzające DNA.
W odpowiedzi na taki uszkadzający bodziec
uśpiony bakteriofag zostaje „indukowany” i geny
jego własnego genomu, niezbędne do wycięcia go
z chromosomu gospodarza, do replikacji jego
DNA, do syntezy białek otoczki i enzymów li¬
tycznych, zaczynają być przepisywane i następnie
ulegają translacji. To zdarzenie działa jak spust lub
reakcja typu C (p. ryc. 38-1); jeśli bakteriofag X
raz zaangażuje się w proces indukcji, to nie ma po¬
wrotu do stanu wyjściowego, zanim komórka nie
ulegnie lizie, a zreplikowany bakteriofag nie zo¬
stanie uwolniony. Przełączenie ze stanu uśpienia,
czyli ze stanu profaga, do zakażenia litycznego
zostało dobrze poznane od strony genetycznej
i molekularnej, i będzie tu szczegółowo opisane.
Zjawisko przełączenia w bakteriofagu X zacho¬
dzi w obrębie jego dwuniciowej cząsteczki DNA
o długości 80 par zasad, określanej jako „prawy
operator” (0R) (ryc. 38-5 A). Prawy operator jest
ograniczony z lewej strony przez gen strukturalny
represora X, tj. białka cl, a z prawej strony - przez
gen strukturalny kodujący białko regulatorowe
Cro. Gdy bakteriofag X jest w stanie profaga, tzn.
w stanie zintegrowanym z genomem gospodarza,
jedynym genem wirusa X, który ulega ekspresji
jest gen represorowy cl. Gdy bakteriofag znajdu¬
je się w stanie wzrostu litycznego, wówczas gen
represorowy nie ulega ekspresji, za to w stanie
ekspresji znajduje się gen cro oraz wiele innych
genów wirusa X. Kiedy więc gen represorowy
jest włączony, wtedy gen cro jest wyłączony,
a kiedy gen cro jest włączony, wtedy gen repre¬
sorowy jest wyłączony. Jak widać, te dwa geny
regulują wzajemnie swoją ekspresję i ostatecznie
decydują o wyborze litycznego lub lizogeniczne-
go wzrostu bakteriofaga X. Decyzja o transkryp¬
cji genu represorowego lub transkrypcji genu
464 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
A
B
C
ł"f mmmmm
Ryc. 38-5. Prawy operator (0R) pokazany jest w tej serii rycin z uwidocznieniem coraz większych szczegółów.
Operator jest regionem wirusowego DNA o długości ok. 80 par zasad (A). Po jego lewej stronie leży gen kodujący
represor lambda (cl), po jego prawej stronie znajduje się gen (ero) kodujący białko regulatorowe Cro. W powięk¬
szonym regionie operatora (B) uwidaczniają się jego trzy podregiony 0R1, Or2 i Or3, z których każdy ma długość
17 pz. Są to miejsca sygnałowe, do których może się wiązać zarówno represor, jak i białko Cro. Miejsca sygnałowe
nachodzą dwa promotory, tj. sekwencje zasad, do których wiąże się polimeraza RNA w celu przepisania genu na
mRNA (linie faliste), ulegający następnie translacji na białko. Fragment (C) ryciny przedstawia w powiększeniu
miejsce 0R1 wraz z sekwencją zasad. Należy zauważyć, że w regionie 0R chromosomu X obie nici DNA służą jako
matryca do transkrypcji (p. rozdz. 36). (Reprodukowano za zgodą z: Ptashne M, Johnson AD, Pabo CO: A genetic
switch in a bacterial virus. Sci Am [Nov] 1982; 247:128).
cro jest wzorcowym przykładem przełączania
molekularnego.
Prawy region operatorowy 0R faga X, o dłu¬
gości 80 pz, może być podzielony na trzy cis-ak¬
tywne, równomiernie rozłożone elementy DNA,
składające się z 17 par zasad, będących miejscami
wiążącymi dla jednego z dwóch białek regulato¬
rowych bakteriofaga X. Te trzy połączone tande¬
mowo (posobnie, jeden za drugim) elementy mają
podobną, ale nie identyczną sekwencję DNA (ryc.
38-5B). Każdy z tych trzech elementów, 0R1, Or2
i Or3, usytuowanych wzajemnie w konfiguracji
cis, może wiązać białko represorowe cl lub biał¬
ko Cro. Względne powinowactwa cl oraz Cro do
każdego z tych elementów są jednak różne, co ma
podstawowe znaczenie dla należytego funkcjono¬
wania litycznego lub lizogenicznego „przełączni¬
ka molekularnego” faga X. Region DNA między
genami cro i genami represora zawiera także dwie
sekwencje promotorowe, które kierują swoistą
orientacją wiązania polimerazy RNA wówczas,
gdy polimeraza rozpoczyna transkrypcję przyle¬
głych genów. Jeden promotor zawiaduje polime-
razą RNA tak, aby przepisywała w kierunku na
prawo, a więc przepisywała gen cro i inne geny
dystalne, podczas gdy drugi promotor zawiaduje
transkrypcją genu represorowego w kierunku
na lewo (p. ryc. 38-5B).
Produkt genu represorowego jest dwudomeno-
wym białkiem represorowym, składającym się
z 236 reszt aminokwasowych, i mającym masę
27 kDa. Domena końca aminowego wiąże się
z DNA operatora, a domena końca karboksylo¬
wego pobudza związanie się jednego białka re¬
presorowego z drugim białkiem, w wyniku czego
powstaje dimer. Cząsteczki represorowe w posta¬
ci dimeru wiążą się z DNA operatora znacznie
silniej niż postać monomeryczna (ryc. 38-6A-C).
Produkt genu cro - białko Cro, złożone z 66
reszt aminokwasowych, ma pojedynczą domenę,
ale także wiąże się z DNA operatora znacznie sil¬
niej jako dimer (ryc. 38-6D). Pojedyncza domena
białka Cro pośredniczy zarówno w wiązaniu ope¬
ratora, jak i w dimeryzacji.
W bakterii lizogenicznej, tj. zawierającej profa-
ga X, dimer represora X wiąże się preferencyjnie
z Or1 i w czasie tego procesu, poprzez działanie
kooperatywne, wzmacnia (ok. 10 razy) wiązanie
się innego dimeru represora do Or2 (ryc. 38-7).
Powinowactwo represora do regionu Or3 jest
najmniejsze spośród powinowactwa do wszyst¬
kich trzech podregionów operatora. Związanie
represora z 0R1 ma dwa główne skutki. Zajęcie
podregionu 0R1 przez represor blokuje wiązanie
się polimerazy RNA z prawostronnym promo¬
torem, co zapobiega ekspresji genu cro. Ponadto,
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 465
A
D
Ryc. 38-6. Schematy struktur molekularnych cl (represor X pokazany w A, B i C) oraz białka Cro (D). Białko represo-
ra X jest łańcuchem polipeptydowym złożonym z 236 reszt aminokwasowych. Łańcuch ulega sfałdowaniu na dwie
podstruktury o kształcie hantli (ciężarków gimnastycznych): domenę w końcu aminowym (NH2) i domenę w końcu
karboksylowym (COOH). Obie domeny są połączone fragmentem łańcucha polipeptydowego wrażliwego na przecięcie
proteazami (dwie strzałki na ryc. A). Cząsteczki pojedynczego represora (monomery) mają tendencję do asocjowania
i tworzenia formy dimerycznej (B); dimer może dysocjować, dając ponownie monomery. Forma dimeryczna jest utrzy¬
mywana głównie dzięki kontaktowi domen końców karboksylowych (elementy wy kropkowane). Dimery represora wiążą
się z miejscami sygnałowymi w regionie operatora (i mogą od nich oddysocjowywać); największe ich powinowactwo
jest do miejsca 0R1 (C). Kontakt z DNA jest możliwy dzięki domenie aminoterminalnej cząsteczki represora (elementy
wykropkowane). Białko Cro (D) ma pojedynczą domenę odpowiadającą za dimeryzację i inne miejsca promujące wiąza¬
nie dimerów z operatorem, zwłaszcza z Or3. (Reprodukowano za zgodą z: Ptashne M, Johnson AD, Pabo CO: A genetic
switch in a bacterial virus. Sci Am [Nov] 1982; 247:128).
jak już wspomniano, dimer represora związany
z 0R1 wzmacnia wiązanie dimeru represora z Or2.
Związanie represora z Or2 wywiera ważny dodat¬
kowy skutek w postaci wzmocnienia wiązania
się polimerazy RNA z lewostronnym promoto¬
rem, który nakłada się z podregionem Or2 i przez
to wzmaga transkrypcję, a następnie ekspresję
genu represorowego. To wzmocnienie transkryp¬
cji wynika przypuszczalnie z bezpośrednich od¬
działywań białko-białko między polimerazą RNA
związaną z promotorem i represorem związanym
z Or2. Represor X jest więc zarówno negatywnym
regulatorem zapobiegającym transkrypcji genu
cro, jak i pozytywnym regulatorem wzmacniają¬
cym transkrypcję swego własnego, represorowe¬
go genu. Takie podwójne działanie represora jest
odpowiedzialne za stabilny stan uśpionego bakte¬
riofaga X\ represor nie tylko zapobiega ekspresji
genów niezbędnych do lizy, lecz także pobudza
swą własną ekspresję, aby móc stabilizować ten
stan zróżnicowania. Gdy stężenie białka represora
staje się bardzo duże, wówczas nadmiar represo¬
ra może się wiązać z Or3 i przez to zmniejszać
transkrypcję genu represorowego z promotora le¬
wostronnego do czasu, aż stężenie represora się
zmniejszy i represor oddysocjuje od Or3.
Biorąc pod uwagę stabilność i represyjność
stanu lizogenicznego, można się zastanawiać,
w jaki sposób w ogóle zostaje uruchomiony cykl
lityczny. Gdy sygnał uszkadzający DNA, taki jak
promieniowanie ultrafioletowe, zaatakuje lizoge-
niczną bakterię-gospodarza, zaczynają być wy¬
twarzane jednoniciowe fragmenty DNA, które
aktywują swoistą proteazę kodowaną przez gen
bakteryjny, nazywany genem recA (p. ryc. 38-7).
Aktywowana proteaza recA hydrolizuje tę część
białka represorowego, która wiąże domenę czą¬
steczki przy końcu aminowym z domeną przy
końcu karboksylowym (p. ryc. 38-6 A). Takie
przecięcie domen represora powoduje dysocjację
dimerów represora, co z kolei wywołuje dyso¬
cjację cząsteczek represora z Or2, a w końcu
z 0R1. Można przewidzieć skutki usunięcia repre¬
sora z 0R1 i z Or2. Polimeraza RNA natychmiast
uzyskuje dostęp do prawostronnego promotora
i rozpoczyna transkrypcję genu cro, a wzmac¬
niające działanie represora w podregionie Or2 na
transkrypcję w kierunku lewostronnym zostaje
zniesione (ryc. 38-7).
Nowo zsyntezowane białko Cro wiąże się z re¬
gionem operatora jako dimer, ale kolejność jego
preferencji jest odwrotna niż w przypadku białka
466 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Indukcja (1)
0„3 Or2 Oh1
NT^W \V\\ % W W \N
recA
Promotor represora
Promieniowanie ultrafioletowe
0r3 0r2 0R1
\~ \V\\ \V\\ W W W W W
v vv\yvfr\v
\/\/\/—►-
o
m
Wczesny wzrost lityczny
Promotor represora Promotor era
°r3 °r2 °r1 7 Polimeraza RNA
/
mnn
J
Ryc. 38-7. Konfiguracja przełącznika w czterech etapach cyklu życiowego bakteriofaga X. Droga lizogeniczna (w której wirus pozostaje
w stanie uśpionym jako profag) zostaje wybrana wówczas, gdy dimer represora wiąże się z 0R1, przez co zwiększa prawdopodobień¬
stwo natychmiastowego wypełnienia miejsca 0R2 przez inny dimer. U profaga (góra) dimery represora związane z 0R1 i 0R2 zapobiegają
związaniu się polimerazy RNA z prawostronnym promotorem i blokują syntezę białka Cro (kontrola negatywna). Cząsteczki represora
wzmacniają także wiązanie polimerazy z lewostronnym promotorem (kontrola pozytywna), w wyniku czego gen represorowy ulega
transkrypcji na RNA (linia falista) i powstaje więcej cząsteczek represora, co utrzymuje stan lizogeniczny. Indukcja profaga następuje
po aktywacji proteazy recA przez promieniowanie ultrafioletowe, która hydrolizuje monomery represora. Zostaje dzięki temu przesunięta
równowaga między wolnymi monomerami, wolnymi dimerami i dimerami związanymi, a dimery opuszczają miejsca operatora. Poli¬
meraza RNA nie ma warunków do wiązania się z lewostronnym promotorem, w wyniku czego represor nie jest dłużej syntetyzowany.
W miarę postępu indukcji wszystkie loci operatora zostają opróżnione z cząsteczek represora, dzięki czemu polimeraza może się wiązać
z prawostronnym promotorem i zaczyna być syntetyzowane białko Cro. W czasie wczesnego wzrostu litycznego pojedynczy dimer Cro
wiąże się z Or3 (zacieniowane kółka) - miejscem, do którego białko Cro ma największe powinowactwo. Polimeraza RNA nie może teraz
się wiązać z lewostronnym promotorem, ale pozostaje dostępny promotor prawy. Polimeraza kontynuuje wiązanie się z prawostronnym
promotorem i gen cro oraz inne wczesne geny lityczne ulegają transkrypcji. Następuje wzrost lityczny. (Reprodukowano za zgodą z:
Ptashne M, Johnson AD, Pabo CO: A genetic switch in a bacterial virus. Sci Am [Nov] 1982; 247:128).
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 467
represorowego (ryc. 38-7). Białko Cro wiąże
się najsilniej z Or3, ale nie ma to sprzyjającego
znaczenia dla wiązania się białka Cro z Or2. Przy
zwiększających się stężeniach białko Cro będzie
wiązało się do Or2 i ostatecznie do 0R1.
Zajęcie podregionu Or3 przez białko Cro na¬
tychmiast wyłącza transkrypcję z lewostronnego
promotora, a zatem zapobiega dalszej ekspresji
genu represorowego. W ten sposób przełącznik
molekularny zostaje całkowicie ustawiony na
drogę lityczną. Gen cro jest teraz w stanie ekspre¬
sji, a gen represorowy jest całkowicie wyłączony.
Sytuacja ta jest nieodwracalna i ekspresja innych
genów X zachodzi jako część cyklu litycznego.
Gdy stężenie represora Cro osiągnie dużą war¬
tość, wówczas białko Cro zajmie także podregion
0R1, przez co spowoduje wyłączenie własnego
genu; proces ten ma kluczowe znaczenie dla koń¬
cowych etapów cyklu litycznego.
Trójwymiarową strukturę białka Cro i białka
represorowego poznano dzięki badaniom z zasto¬
sowaniem krystalografii rentgenowskiej; zapropo¬
nowano też i przetestowano modele wiązania tych
białek oraz skutki opisanych wyżej zdarzeń gene¬
tycznych i molekularnych. Obydwa białka wiążą
się z DNA za pomocą motywu helisa-skręt-helisa.
System ten do tej pory najlepiej wyjaśnia zagad¬
nienia molekularne związane z regulacją genu.
Szczegółowa analiza represora lambda dopro¬
wadziła do narodzin ważnej koncepcji, a miano¬
wicie, że białka regulujące transkrypcję zawie¬
rają wiele ważnych domen funkcjonalnych. Na
przykład represor lambda wiąże DNA z wysokim
powinowactwem. Monomery represora tworzą
dimery, dimery oddziałują ze sobą, a represor od¬
działuje z polimerazą RNA. Obszar oddziaływań
białko-DNA oraz trzy obszary oddziaływań biał-
ko-białko obejmują odrębne domeny cząsteczki
represora. Dalej (p. ryc. 38-17) zostanie wyjaśnio¬
ne, że jest to jedna ze wspólnych cech cząsteczek
regulujących transkrypcję.
PROCES REGULACJI TANSKRYPCJI
GENÓW U EUKARIOTÓW WYKAZUJE
SZCZEGÓLNE CECHY
Większość DNA w komórkach prokariotycznych
występuje w postaci genów stanowiących matryce,
które mogą być stale przepisywane. W komórkach
ssaczych sytuacja jest całkiem odmienna. Tutaj
stosunkowo mała część całkowitego DNA wy¬
stępuje pod postacią genów i przyległych do nich
regionów regulatorowych. Nieznana jest funkcja
nadmiaru DNA. Ponadto, jak opisano w rozdz.
35, DNA w komórkach eukariotycznych jest
mocno upakowany i tworzy z białkami kompleks
zwany chromatyną. Ważną częścią tego komplek¬
su są histony; obydwa składniki tworzą struktury
zwane nukleosomami (p. rozdz. 35) i odgrywają
znaczącą rolę w mechanizmach regulacji genów,
co zostało opisane w dalszej części rozdziału.
Remodeling chromatyny jest
ważnym aspektem ekspresji
genów u eukariotów
Struktura chromatyny zapewnia dodatkowy
poziom kontroli transkrypcji genów. W rozdz. 35
omówiono, że istnieją duże regiony chromatyny,
które są nieaktywne transkrypcyjnie, natomiast
inne regiony są aktywne lub potencjalnie aktyw¬
ne. Oprócz nielicznych wyjątków, każda komórka
zawiera taki sam zestaw genów (komórki wy¬
twarzające przeciwciała są godnym uwagi wyjąt¬
kiem). Rozwój wyspecjalizowanych narządów,
tkanek i komórek oraz ich funkcji w organizmie
zależy od zróżnicowanej ekspresji genów.
Taka zróżnicowana ekspresja jest możliwa
dzięki dostępności dla transkrypcji odmiennych
regionów chromatyny w komórkach pochodzą¬
cych z różnych tkanek. Na przykład DNA zawie¬
rający zespół genów P-globiny występuje w reti-
kulocycie w „aktywnej” chromatynie, natomiast
w komórce mięśniowej jest on w chromatynie
„nieaktywnej”. Mechanizmy, które determinują
„aktywność” chromatyny nie są znane. Z pew¬
nością barierą utrudniającą przyłączanie się czyn¬
ników transkrypcyjnych do swoistych regionów
DNA jest obecność nukleosomów i kompleksów
histonów z DNA (p. rozdz. 35). Dynamika po¬
wstawania i rozpadu struktur nukleosomowych
jest zatem ważnym aspektem regulacji genów
u eukariotów.
Ważnym czynnikiem określającym aktywność
genów jest acetylacja i deacetylacja histonów.
Niespodziewane odkrycie, że aktywność ace-
tylazy histonowej wiąże się z czynnikami TAF
i koaktywatorami hormonalnej regulacji tran¬
skrypcji genów (p. rozdz. 42) przyczyniło się do
468 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
sformułowania nowej koncepcji regulacji genów.
Wiadomo, że acetylacja zachodzi w resztach li-
zynowych końców aminokwasowych cząsteczek
histonu. Modyfikacja ta zmniejsza ładunek do¬
datni tych końców, zmniejszając w ten sposób
powinowactwo histonu do obdarzonego ujem¬
nym ładunkiem DNA. Zgodnie z tym, acetyla¬
cja histonów może prowadzić do rozpadu struk¬
tury nukleosomów i ułatwiać dostęp czynników
transkrypcyjnych do pokrewnych im elementów
regulatorowych w DNA. Wcześniej już stwier¬
dzono, że skutkowałoby to wzmocnieniem wią¬
zania elementów podstawowego mechanizmu
transkrypcyjnego z promotorem. Deacetylacja
histonów dałaby efekt przeciwny. Z rozmaitymi
składnikami aparatu transkrypcyjnego związane
są różne białka wykazujące swoistą aktywność
acetylazy i deacetylazy. Swoistość tych zjawisk,
jak również różnorakich mechanizmów działania
jest obecnie przedmiotem badań; kilka konkret¬
nych przykładów podano w rozdz. 42.
Udowodniono, że metylacja reszty deoksy-
cytydynowej (w obrębie sekwencji 5'-mCpG-
-3') w DNA może powodować poważne zmiany
w chromatynie, wykluczające jej aktywną tran¬
skrypcję; opisano to w rozdz. 35. Na przykład
w wątrobie myszy mogą ulegać ekspresji tylko
niemetylowane geny rybosomalne; są także do¬
wody, że wiele wirusów zwierzęcych nie ulega
transkrypcji, jeśli ich DNA jest zmetylowany.
Nasilona demetylacja reszt deoksycytydynowych
w swoistym regionie genu aminotransferazy tyro-
zynowej, w odpowiedzi na hormony glukokorty-
koidowe, jest wiązana ze zwiększeniem szybkości
transkrypcji tego genu. Nie jest jednak możliwe
uogólnienie poglądu, że metylowany DNA nie
jest aktywny transkrypcyjnie i że cała nieaktyw¬
na chromatyna jest zmetylowana albo że aktywny
DNA nie jest metylowany.
Wiązanie swoistych czynników transkrypcyj¬
nych do pokrewnych im elementów w DNA może
powodować rozpad struktury nukleosomu. Wiele
genów eukariotycznych zawiera wiele elementów
DNA wiążących białko. Seryjne przyłączanie do
nich czynników transkrypcyjnych - w sposób
kombinatoryczny - może albo bezpośrednio po¬
wodować rozpad struktury nukleosomu, albo za¬
pobiegać jej odtworzeniu. Może też, dzięki oddzia¬
ływaniom białko-białko, prowadzić do rekrutacji
koaktywujących kompleksów wielobiałkowych,
zdolnych z kolei kowalencyjnie modyfikować lub
remodelować nukleosomy. Reakcje te wywołu¬
ją zmiany strukturalne na poziomie chromatyny,
które ostatecznie zwiększają dostępność DNA
dla innych czynników oraz dla mechanizmu tran¬
skrypcyjnego.
Eukariotyczny DNA, który znajduje się w „ak¬
tywnym” regionie chromatyny, może być prze¬
pisywany. Podobnie jak w komórkach prokario-
tycznych, promotor narzuca miejsce, w którym
polimeraza RNA rozpocznie transkrypcję, ale pro¬
motor ten często nie może być zdefiniowany jako
obszar zawierający kasetę -35 i -10, zwłaszcza
w komórkach ssaków (p. rozdz. 36). W komór¬
kach eukariotycznych czynniki typu trans na
ogół pochodzą z innych chromosomów (a więc
działają w układzie trans), natomiast w przy¬
padku komórek prokariotycznych zawierających
pojedynczy chromosom problem się nieco kom¬
plikuje. Dodatkowy stopień złożoności wnoszą
elementy/czynniki, które wzmagają lub wyciszają
transkrypcję, które określają swoistą tkankowo
ekspresję i które modulują działanie wielu czą¬
steczek efektorowych. Niedawno dokonane od¬
krycia sugerują ponadto, że aktywacja i represja
genów może następować przy zmianie podprze-
działu (kompartmentu) jądrowego (sublokalizacji
jądrowej) przez poszczególne geny.
Niektóre elementy DNA wzmacniają
lub wyciszają transkrypcje genów
eukariotycznych
Gromadzone są dowody, że oprócz prostych
zmian w chromatynie, wpływających na aktyw¬
ność transkrypcyjną, w obrębie DNA znajdują się
elementy, które ułatwiają lub wzmacniają inicja¬
cję transkrypcji w obszarze promotora. Na przy¬
kład w DNA wirusa 40 (SV40) małpy występuje
region położony ok. 200 pz przed promotorem
genów wczesnych; region ten, złożony z dwóch
identycznych, ułożonych tandemowo (posobnie)
sekwencji o długości 72 pz, może silnie wzmagać
transkrypcję genów in vivo. Każdy z tych ele¬
mentów o długości 72 pz może być podzielony
na kilka mniejszych; tak więc niektóre elementy
wzmacniające transkrypcję mają bardzo złożoną
budowę. Elementy wzmacniające transkrypcję
(enhancery) różnią się od promotora pod dwoma
znaczącymi względami. Mogą one wywierać po-
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 469
zytywny wpływ na transkrypcję nawet wówczas,
gdy pozostają oddzielone od promotora tysią¬
cami par zasad; ponadto działają w obu kierun¬
kach, gdy znajdują się zarówno przed (5'), jak
Sekwencja wzmacniająca Promotor
(enhancer)
Gen strukturalny
p-globina
p-globina
?
p-globina
p-globina
Ryc. 38-8. Schemat objaśniający działanie sekwencji wzmacnia¬
jących transkrypcję (enhancerów) i innych elementów regulacyj¬
nych działających w układzie cis. W modelu tym gen chimerycz¬
ny, stworzony za pomocą technik rekombinacji DNA (rozdz. 39),
składa się z genu reporterowego, tj. strukturalnego genu, który
koduje łatwe do oznaczenia białko, promotora, który zapewnia
inicjację transkrypcji, oraz domniemanego elementu regulatoro¬
wego. We wszystkich przypadkach wysoki poziom transkrypcji
w pokazanych układach chimerycznych zależy od obecności
sekwencji wzmacniających, pobudzających ekspresję ponad
stukrotnie w stosunku do poziomu podstawowego transkrypcji
(tj. transkrypcji tych samych genów chimerycznych, ale połą¬
czonych tylko z promotorami). Przykłady A i B ilustrują fakt, że
sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. SV40) działają w obu
orientacjach i na promotor heterologiczny. Przykład C pokazuje,
że element regulatorowy metalotioneiny (mt), indukujący pod
wpływem kadmu lub cynku transkrypcję endogennego genu mt
i syntezę białka wiążącego metal, może działać za pośrednictwem
promotora kinazy tymidynowej (tk) w procesie wzmocnienia tran¬
skrypcji genu ludzkiego hormonu wzrostu (hGH). Produkty inży¬
nierii genetycznej wprowadzono do przedjądrza męskiego jedno¬
komórkowych embrionów myszy, które umieszczano w macicy
matki zastępczej i uzyskiwano zwierzęta transgeniczne. Wśród
potomstwa uzyskanego w tych warunkach było takie, które na
podanie jonów cynku w wodzie do picia reagowało zwiększeniem
stężenia hormonu wzrostu w wątrobie. W tym przypadku na duże
stężenie hormonu wzrostu zwierzęta transgeniczne reagowały
podwojeniem wzrostu w porównaniu ze swoim normalnym ro¬
dzeństwem w miocie. Przykład D pokazuje, że element reakcji
na glikokortykoidy (GRE) będzie działał przez promotor homolo¬
giczny (gen PEPCK) lub heterologiczny (tego nie pokazano; np.
promotor tk, promotor SV40, promotor p-globiny itd.).
i za (3') promotorem. Sekwencje wzmacniające
mają charakter niespecyficzny; mogą one pobu¬
dzać każdy promotor, który znajdzie się w ich
sąsiedztwie. Mogą też pobudzać więcej niż jeden
promotor. Element wzmacniający wirusa SV40
może np. wywierać wpływ na transkrypcję genu
p-globiny, zwiększając 200-krotnie transkrypcję
tego genu w komórkach zawierających w obrę¬
bie tego samego plazmidu zarówno sekwencję
wzmacniającą, jak i gen p-globiny (p. niżej oraz
ryc. 38-8). Element wzmacniający transkrypcję
prawdopodobnie nie wytwarza produktów, które
z kolei działałyby na promotor, ponieważ jest on
aktywny tylko wówczas, gdy znajduje się w ob¬
rębie tej samej cząsteczki DNA, w której jest
promotor (czyli gdy znajduje się w położeniu cis
względem promotora). Za efekt ten są odpowie¬
dzialne białka wiążące sekwencje wzmacniające.
Dokładne mechanizmy, według których działają
takie aktywatory transkrypcji, są przedmiotem
wielu dyskusji. Wykazano ponad wszelką wąt¬
pliwość, że czynniki typu trans wiążące sekwen¬
cje wzmacniające oddziałują z wieloma innymi
białkami uczestniczącymi w transkrypcji. W ta¬
kich oddziaływaniach biorą udział koaktywato-
ry modyfikujące chromatynę, jak również po¬
szczególne składniki podstawowej „maszynerii”
transkrypcyjnej polimerazy RNA II. Ostatecznie
zjawiska wiązania czynników trans z sekwen¬
cjami wzmacniającymi DNA nasilają wiązanie
się podstawowej „maszynerii” transkrypcyjnej
z promotorem. Sekwencje wzmacniające i towa¬
rzyszące im białka wiążące nadają często tym re¬
gionom, w których się znajdują, nadwrażliwość
na nukleazę (p. rozdz 35). Podsumowanie właś¬
ciwości sekwencji wzmacniających przedstawio¬
no w tab. 38-2.
Tabela 38-2. Podsumowanie właściwości sekwencji wzmacnia¬
jących transkrypcję (enhancerów)
• Działają wówczas, gdy znajdują się w dużej odległości od
promotora.
• Działają wówczas, gdy znajdują się przed lub za promotorem.
• Działają w obu orientacjach.
• Działają na promotory homologiczne lub heterologiczne.
• Działają przez związanie jednego lub kilku białek.
• Ułatwiają wiązanie się podstawowego kompleksu transkryp-
cyjnego z promotorem.
470 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Jeden z najlepiej poznanych systemów wzmac¬
niających u ssaków dotyczy genu p-interferonu.
Gen ten zostaje indukowany z chwilą zakażenia
komórki przez wirusa. Jednym z zadań zainfeko¬
wanej komórki jest udzielenie odpowiedzi immu¬
nologicznej, nawet jeśli nie w celu samoratowa-
nia, to po to, aby uchronić resztę organizmu przed
infekcją wirusową. Wytwarzanie interferonu jest
jednym z mechanizmów umożliwiających osiąg¬
nięcie tego celu. Białka należące do tej rodziny
są wydzielane przez zainfekowane komórki. Od¬
działują one z komórkami sąsiadującymi w celu
zahamowania na różne sposoby replikacji wiru¬
sa i ograniczenia w ten sposób rozmiaru infek¬
cji. Sprawujący kontrolę nad indukcją tego genu
element wzmacniający, znajdujący się pomiędzy
nukleotydami -110 a -45 genu p-interferonu, zo¬
stał już dobrze scharakteryzowany. Wzmacniacz
składa się z grupy czterech odrębnych elementów
cis, spośród których każdy łączy się z odmiennym
czynnikiem typu trans. Jeden z elementów cis
łączy się z działającym w układzie trans czynni¬
kiem NFkB, drugi - z czynnikiem trans należą¬
cym do rodziny IRF (białek regulujących interfe¬
ron), a trzeci - z heterodimerycznym czynnikiem
trans ATF-2/c-Jun, zawierającym motyw suwaka
leucynowego. Czwartym czynnikiem jest wszech¬
obecny czynnik transkrypcyjny znany jako HMG
I(Y). Związanie się za pomocą bogatych w sek¬
wencje A+T zdegenerowanych miejsc wiążących
umożliwia HMG I(Y) indukowanie znaczące¬
go zgięcia w DNA. Istnieją cztery takie miejsca
wiążące HMG I(Y) umiejscowione w enhance-
rze. Miejsca te, wraz z trzema wspomnianymi
czynnikami typu trans, odgrywają kluczową rolę
w tworzeniu enhanceosomu, indukując serię klu-
czowo umiejscowionych zgięć DNA. W rezulta¬
cie HMG I(Y) kooperatywnie indukuje tworzenie
unikatowej, stereospecyficznej, trójwymiarowej
struktury, w obrębie której wszystkie cztery czyn¬
niki są aktywne, gdy sygnały infekcji wirusowej
są odbierane przez komórkę. Struktura utworzo¬
na w wyniku kooperatywnego składania tych
czterech czynników jest nazywana enhanceo-
somem p-interferonu (p. ryc. 38-9), nazwanym
tak z powodu jego oczywistego podobieństwa
do nukleosomu, który także jest unikatową, trój¬
wymiarową strukturą upakowującą DNA wokół
rdzenia białkowego (p. ryc. 35-1 i 35-2). Raz
utworzony enhanceosom powoduje duży wzrost
transkrypcji p-interferonu w razie infekcji wiru¬
sowej. Zajęcie przez białko liniowo ustawionych
miejsc elementów typu cis nie indukuje per se
transkrypcji genu p-interferonu; raczej indukuje
ją tworzenie samego enhanceosomu, które dostar¬
cza odpowiednich miejsc do rekrutacji koaktywa-
torów; skutkuje to wzmożonym powstawaniem
kompleksów PIC w promotorze w konfiguracji
cis, jak i aktywacją transkrypcji.
Stwierdzono także obecność elementów działa¬
jących w układzie cis, które zmniejszają lub wy¬
ciszają ekspresję swoistych genów. Zostały zba¬
dane tylko nieliczne takie elementy; uogólnienia
co do mechanizmu ich działania nie są możliwe,
jakkolwiek uważa się, że do aktywacji genu na
poziomie chromatyny są potrzebne kowalencyjne
modyfikacje histonów i innych białek przez (re¬
krutowane represorami) złożone z wielu podjed-
nostek korepresory.
Swoista tkankowo ekspresja może
być wynikiem działania sekwencji
wzmacniających lub wyciszających
Obecnie znanych jest wiele genów, które za¬
wierają elementy wzmacniające, występujące
w różnych miejscach w stosunku do regionów
kodujących. Oprócz tego, że elementy wzmac¬
niające wzmagają transkrypcję genów, niektóre
z nich mają zdolność wzmacniania transkrypcji
w sposób swoisty dla danej tkanki. Na przykład
element wzmacniający związany z genami immu-
noglobuliny i umiejscowiony między regionem
J i C wzmaga ekspresję tych genów w sposób wy¬
biórczy w komórkach limfoidalnych. W komór¬
kach trzustkowych myszy, którym do pojedynczej
komórki embrionalnej wprowadzono mikrochi-
rurgicznie specjalnie spreparowane konstrukty
genowe, enhancery związane z genami enzymów
trzustkowych są zdolne do wzmacniania tran¬
skrypcji nawet niespokrewnionych, ale fizycznie
sprzężonych genów w sposób swoisty, podobnie
jak elementy wzmacniające wirusa SV40, zdolne
do niespecyficznej aktywacji różnorakich genów
połączonych w układzie cis. Wykorzystanie takie¬
go zwierzęcia transgenicznego okazało się bar¬
dzo użyteczne w badaniach nad swoistą tkankowo
ekspresją genów. Na przykład, gdy DNA zawie¬
rający element wzmacniający (należący do genu
insulinowego), swoisty dla komórek B trzustko-
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 471
^PRD,r^g> PRDI-lir^PRDM HHMa^HRDI L HMif
HMGI-Y
ATF-2
cJun
C nf-kB
IRF(IRF3/7)
Ryc. 38-9. Powstawanie i prawdopodobna struktura enhanceosomu two¬
rzonego na sekwencji wzmacniającej (enhancerze) genu ludzkiego p-inter-
feronu. U góry schemat rozkładu licznych elementów typu cis (HMG, PRDIV,
PRDI-III, PRDII, NRDI), tworzących wzmacniacz genu p-interferonu. W indu¬
kowaniu genu p-interferonu (ponad stukrotnym) po wirusowym zakażeniu
komórek ludzkich pośredniczy cały integralny enhancer. Elementy cis tego
modularnego wzmacniacza są miejscami wiążącymi czynniki trans: HMG
l(Y), cJun-ATF-2, IRF3, IRF7 i NF-kB. Czynniki oddziałują z tymi elementami
DNA w obligatoryjny, uporządkowany i wysoce kooperatywny sposób, jak
zaznaczono strzałką. Najpierw związanie czterech cząsteczek białka HMG l(Y)
powoduje silne zgięcia w DNA wzmacniacza tak, że ten cały - liczący 70—80
par zasad - region będzie cechował się teraz silną krzywizną. Krzywizna ta
jest niezbędna do wysoce kooperatywnego przyłączania innych czynników
trans, umożliwiając związanym z DNA czynnikom na (mające duże znacze¬
nie) bezpośrednie oddziaływania białko-białko. Oddziaływania te zarówno
przyczyniają się do tworzenia i stabilności enhanceosomu, jak i stwarzają
unikatową, trójwymiarową powierzchnię służącą do rekrutowania czynników
modyfikujących chromatynę (np. Swi/Snf i P/CAF) oraz elementów mechani¬
zmu transkrypcyjnego (polimeraza RNAII i czynniki GTF). Jakkolwiek cztery
spośród tych pięciu elementów cis (PRDIV, PRDI-III, PRDII i NRDI) mogą,
niezależnie jeden od drugiego, umiarkowanie stymulować (ok. dziesięcio¬
krotnie) transkrypcję genu reporterowego w stransfekowanych komórkach
(p. ryc. 38-10 i 38-12), to jednak do odpowiedniej (tj. ponad stukrotnej)
stymulacji transkrypcji w reakcji na zakażenie wirusowe ludzkiej komórki
wymaganych jest wszystkich pięć elementów cis i to w odpowiednim uło¬
żeniu. Zróżnicowanie to wskazuje na ścisłe wymogi wydajnej transaktywacji
dotyczące struktury enhanceosomu. Uważa się, że podobne enhanceosomy,
w których występują różnorakie czynniki c/s oraz trans, tworzą się na wielu
innych ludzkich genach.
472 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
wych, zligowano w wektorze z dużym antyge¬
nem T (onkogenem) wirusa polioma, to konstrukt
taki powodował u myszy transgenicznych rozwój
nowotworów wywodzących się z komórek B. No¬
wotwory nie rozwijały się w żadnej innej tkance.
Swoista tkankowo ekspresja genu może być za¬
tem indukowana za pośrednictwem elementów
wzmacniających lub elementów do nich podob¬
nych.
Promotor testowany
_J3'
ENHANCER-PROMOTOR v
GENU
Gen reporterowy
GEN REPORTEROWY:
BADANY ENHANCER-PROMOTOR
REGULUJĄCY TRANSKRYPCJĘ
GENU CAT
TRANSFEKCJA KOMÓREK
ZA POMOCĄ DNA STRĄCONEGO
FOSFORANEM WAPNIA
<S> ^ ćP,
Podzielenie hodowli
i ponowne wysianie
Kontrola
Hormony
ZBIÓR PO 24 GODZINACH
OZNACZENIE AKTYWNOŚCI CAT
Identyfikacja
elementów kontrolnych
Ryc. 38-10. Użycie genów reporterowych do określenia regulato¬
rowych elementów DNA. Fragment DNA badanego genu - w tym
przypadku ok. 2000 par zasad DNA od strony 5\ wraz z pokrew¬
nym promotorem - został włączony do wektora plazmidowego,
który zawiera odpowiedni gen reporterowy, w tym wypadku kodu¬
jący bakteryjny enzym aminotransferazę chloramfenikolu (CAT).
Innym powszechnie stosowanym genem reporterowym jest gen
dla enzymu lucyferazy (LUC). Komórki ssacze nie zawierają CAT
ani LUC, zatem wykrycie ich aktywności w ekstraktach komór¬
kowych oznacza, że komórki zostały skutecznie stransfekowane
plazmidem. Wzrost aktywności CAT ponad poziom podstawowy,
np. po dodaniu jednego lub kilku hormonów, oznacza, że region
DNA użyty jako insert zawiera aktywny element odpowiedzi na
hormon (HRE). Konstruowane mogą być inserty zawierające co¬
raz to krótsze fragmenty DNA, regiony z wewnętrznymi delecjami
lub regiony z mutacjami punktowymi. Dzięki takim insertom moż¬
na precyzyjnie określać elementy regulatorowe odpowiadające
na sygnały (p. ryc. 38-11 dotyczący mapowania delecji danych
elementów HRE).
Geny reporterowe są używane do
określania elementów wzmacniających
i innych elementów regulatorowych
Wykorzystując ligację regionów DNA - przypusz¬
czalnie zawierających sekwencje regulatorowe
- z różnymi genami reporterowymi (geny fuzyj-
ne lub geny chimeryczne) (p. ryc. 38-8, 38-10
i 38-11), można określić te regiony w sąsiedztwie
genów strukturalnych, które mają wpływ na ich
ekspresję. Fragmenty DNA, które są podejrzane
0 funkcje elementów regulatorowych, są przy¬
łączane do odpowiedniego genu reporterowego
1 wprowadzane do komórki gospodarza (ryc. 38-
-10). Podstawowa ekspresja genu reporterowego
będzie się zwiększała, jeśli fragment DNA zawie¬
ra sekwencję wzmacniającą. Dodanie do pożywki
hodowlanej hormonu lub metalu ciężkiego będzie
powodowało zwiększenie ekspresji genu repor¬
terowego, jeśli DNA zawiera element reagujący
na hormon lub jony metalu (ryc. 38-11). Miejsce
występowania elementu może być ustalone przez
konstruowanie coraz to krótszych fragmentów
DNA, z delecjami lub mutacjami punktowymi
(ryc. 38-11).
Strategia transfekcji komórek w hodowli lub
użycia zwierząt transgenicznych umożliwiła
identyfikację dziesiątków sekwencji o cechach
wzmacniających, wyciszających, elementów swo¬
istych tkankowo, elementów reagujących na hor¬
mony, jony metali ciężkich, związki chemiczne
itd. Aktywność genów w każdym momencie prze¬
jawia się jako oddziaływanie tych licznych ele¬
mentów DNA, funkcjonujących w układzie cis,
z odpowiadającymi im czynnikami typu trans.
Poznanie sposobu ich działania jest wyzwaniem
dla naukowców.
Kombinacje elementów DNA i związanych
z nimi białek zapewniają różnorodność
odpowiedzi
W odpowiedzi na proste bodźce środowiskowe,
geny prokariotyczne często są regulowane metodą
włączania-wyłączania. Niektóre z genów eukario¬
tycznych również są regulowane w taki sposób,
jednakże proces ten w większości przypadków,
zwłaszcza w komórkach ssaczych, jest znacznie
bardziej skomplikowany. Do pojedynczego genu
mogą docierać sygnały odpowiadające złożonym
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 473
bodźcom środowiskowym. Odpowiedź genu na te
sygnały może mieć różne cechy natury fizjologicz¬
nej. Po pierwsze, odpowiedź może mieć szeroki
zakres. Dzieje się tak wtedy, kiedy sumującym się
lub synergistycznym odpowiedziom dodatnim są
przeciwstawione efekty negatywne lub represyj¬
ne. W niektórych przypadkach dominująca może
być albo odpowiedź dodatnia, albo ujemna. Wy¬
magany jest także mechanizm, za pomocą które¬
go efektor, taki jak hormon, może aktywować
pewne geny w komórkach, jednocześnie hamując
inne, a na jeszcze inne w ogóle nie wpływając.
Sprzężenie wszystkich tych procesów z czynnika¬
mi swoistymi tkankowo umożliwia uzyskanie zna¬
czącego stopnia elastyczności. Tego rodzaju fizjo¬
logiczne zmienne wymagają oczywiście znacznie
bardziej skomplikowanego systemu regulacji niż
te, które są oparte na zasadzie włączania-wyłącza¬
nia. Szyk elementów DNA w promotorze określa,
wraz z czynnikami towarzyszącymi, jaka będzie
odpowiedź danego genu. Kilka prostych przykła¬
dów pokazano na ryc. 38-12.
Domeny transkrypcyjne sa określone
regionami kontroli locus i regionami
izolującymi
Wielka liczba genów w komórkach eukariotycz¬
nych i złożony układ czynników regulujących
transkrypcję stanowią problem organizacyjny.
Dlaczego w danej komórce jedne geny mogą
podlegać transkrypcji, a inne nie? Jeśli sekwen¬
cje wzmacniające mogą regulować geny i nie są
zależne od pozycji i orientacji, to jak mogą one
zapobiegać transkrypcji przypadkowej? CzꜬ
ciowo odpowiedzi na te pytania daje organiza¬
cja chromatyny w postaci jednostek funkcjonal¬
nych, które ograniczają wzorzec ekspresji genu.
Chromatyna tworzy bowiem specjalną strukturę
z macierzą jądrową, innymi elementami fizycz¬
nymi lub podprzedziałami jądrowymi. Niektóre
regiony są też kontrolowane przez złożone ele¬
menty DNA, zwane regionami kontrolnymi lo¬
cus (LCR, ang. locus control regions). LCR oraz
związane z nimi białka kontroluje ekspresję grupy
genów. Najlepiej poznany LCR reguluje ekspresję
rodziny genów globinowych na dużym obszarze
DNA. Innym mechanizmem regulacji jest obec¬
ność regionów izolujących (ang. insulators). Ta¬
kie elementy DNA, również związane z jednym
lub większą liczbą białek, zapobiegają działaniu
sekwencji wzmacniających na promotor po dru¬
giej stronie sekwencji izolujących i w innej dome¬
nie transkrypcyjnej.
W WIĄZANIU SIĘ BIAŁEK
REGULATOROWYCH Z DNA POŚREDNICZY
WIELE MOTYWÓW STRUKTURALNYCH
Aby kontrola transkrypcji była swoista, białka
regulatorowe muszą się wiązać z dużym powino¬
wactwem z odpowiednim regionem DNA. Wia¬
domo, że do wielu z tych swoistych oddziaływań
białko-DNA przyczyniają się trzy unikatowe
motywy strukturalne białek: helisa-skręt-helisa,
palec cynkowy i suwak leucynowy. Przykłady
białek zawierających te motywy przedstawiono
w tab. 38-3.
Tabela 38-3. Przykłady białek regulujących transkrypcję, zawie¬
rających różne motywy strukturalne wiążące DNA
Motyw wiążący
Organizm
Biatko regulatorowe
Helisa-skręt-helisa
E.coli
Represor lac
CAP
Fag
Represory kl, ero,
tryptofanowy i 434
Ssaki
Białka kasety homeotycznej
Pit-1, 0ct1, 0ct2
Palec cynkowy
E.coli
Białko genu 32
Drożdże
Gal4
Drosophila
Serendipity, Hunchback
Xenopus
TFIIIA
Ssaki
Rodzina receptorów
steroidowych, Sp1
Suwak leucynowy
Drożdże
GCN4
Ssaki
C/EBR fos, Jun, Fra-1,
białko wiążące CRE,
c-myc, n-myc, I-myc
Porównanie aktywności wiążącej białek, które
zawierają te motywy, prowadzi do sformułowania
wielu ważnych uogólnień. Oto one:
1. Wiązanie musi cechować silne powinowac¬
two do swoistego miejsca w DNA oraz słabe po¬
winowactwo do innych regionów DNA.
2. Bezpośrednio z DNA łączą się niewielkie
regiony białka; pozostała część białka, oprócz
tego, że zapewnia domeny transaktywujące, może
474 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
KONSTRUKTY GENÓW HORMONOZALEŻNA
REPORTEROWYCH ZAWIERAJĄCE INDUKCJA
RÓŻNEJ DŁUGOŚCI DNA OD KOŃCA 5' TRANSKRYPCJI
ABC
■ — ■■ • + + +
- - - • o + +
• o + +
• o o +
—• o o +
i -r-i i i i i i *
2000 1000 +1
Pozycja nukleotydu
Ryc. 38-12. Kombinacje elementów DNA i białek zapewniają
różnorodność odpowiedzi genetycznej. Gen A jest aktywowany
(grubość strzałki wskazuje wielkość aktywacji) kombinacją akty¬
watorów 1,2 i 3 (prawdopodobnie z koaktywatorami, jak pokaza¬
no na ryc. 36-10). Gen B zostaje aktywowany, w tym przypadku
skuteczniej, kombinacją czynników 1, 3 i 4; należy zauważyć,
że czynnik 4 w tym przykładzie nie wchodzi w kontakt z DNA
bezpośrednio. Aktywatory mogą utworzyć mostek, który łączy
podstawową „maszynerię” z promotorem, albo też DNA może się
wypętlać. W jednym i drugim przypadku ma to na celu nakie¬
rowanie podstawowej „maszynerii” transkrypcyjnej na promotor.
Gen C jest inaktywowany kombinacją czynników 1, 5 i 3. W tym
przypadku, jak widać na rycinie, czynnik 5 uniemożliwia czynni¬
kowi 2 związanie się z DNA, tak jak to ma miejsce w przypadku
genu A. Jeśli aktywator 1 pomaga w przyłączaniu się represora
5 i jeśli przyłączanie się aktywatora 1 wymaga obecności liganda
(zaczernione kółko), to ligand może aktywować w komórce jeden
gen (gen A) i hamować drugi (gen C).
Ryc. 38-11. Ustalenie pozycji elementów odpowiedzi na hor¬
mon (HRE) A, B i C za pomocą transfekcji z użyciem genu
reporterowego. Do komórek można wprowadzić (osobno)
cały szereg spokrewnionych genów reporterowych, skon¬
struowanych tak, jak to pokazano na ryc. 38-10. Analizując
(oznaczając aktywność CAT) zanik odpowiedzi na odpowied¬
ni hormon w miarę delecji końca 5', można zlokalizować
swoisty elementy reakcji na hormon.
uczestniczyć w dimeryzacji monomerów białka
wiążącego, może zapewniać powierzchnię kon¬
taktu do tworzenia heterodimerów, może zapew¬
niać jedno lub więcej miejsc wiążących ligand
lub może zapewnić powierzchnię do oddziaływań
z koaktywatorami lub korepresorami.
3. Oddziaływania białko-DNA są utrzymy¬
wane dzięki wiązaniom wodorowym i siłom van
der Waalsa.
4. Motywy, które znajdują się w tych białkach
są wyjątkowe; obecność ich w białku o nieznanej
funkcji może nasuwać przypuszczenie, że białko
to wiąże się z DNA.
5. Białka z motywami helisa-skręt-helisa lub
suwak leucynowy tworzą symetryczne dimery,
a odpowiadające im miejsca wiążące w DNA
są symetrycznymi palindromami. W przypadku
białek mających motyw palec cynkowy miejsce
wiążące powtarza się 2-9 razy. Cechy te pozwa¬
lają na kooperatywne oddziaływania miejsc wią¬
żących oraz zwiększają stopień i powinowactwo
wiązania.
Motyw helisa-skręt-helisa
(ang. helix-turn-helix)
Motyw helisa-skręt-helisa jest pierwszym mo¬
tywem, który opisano i który został najlepiej
zbadany. Na podstawie analizy trójwymiarowej
struktury regulatora transkrypcji X, białka Cro,
stwierdzono, że każdy z monomerów składa się
z trzech antyrównoległych struktur (harmonijek) p
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 475
i trzech helis a (ryc. 38-13). Dimer powstaje przez
połączenie się przeciwrównoległych struktur P3.
Helisy a3 tworzą powierzchnię rozpoznającą DNA,
a reszta cząsteczki prawdopodobnie stabilizuje
te struktury. Przeciętna średnica helisy a wynosi
1,2 nm, co odpowiada w przybliżeniu szerokości
większego rowka DNA w formie B. Domena każ¬
dego monomeru Cro, rozpoznająca DNA, oddzia¬
łuje z pięcioma parami zasad, a miejsca wiążące
dimer mają długość 3,4 nm, co pozwala na dopaso¬
wanie kolejnych półskrętów w rowku większym na
tej samej powierzchni (ryc. 38-13). Analizy rentge-
nograficzne represora cl faga A,, CAP (białkowego
receptora cAMP u E. coli), represora tryptofanu
oraz represora faga 434 wykazują również obec¬
ność tej dimerycznej struktury helisa-skręt-helisa,
występującej w eukariotycznych białkach wiążą¬
cych DNA (p. tab. 38-3).
Motyw „palec cynkowy”
(ang. zinc finger)
Drugim poznanym motywem wiążącym DNA jest
motyw „palec cynkowy”. Było wiadomo, że biał¬
ko TFIIIA, które jest regulatorem pozytywnym
transkrypcji genu 5S RNA, wymaga do swej ak¬
tywności jonów cynku. Analiza strukturalna i bio-
fizyczna wykazały, że każda cząsteczka TFIIIA
ma dziewięć jonów cynku w powtarzającym
się kompleksie koordynacyjnym, utworzonym
przez ściśle ułożone reszty cysteina-cysteina, po
których następuje sekwencja 12-13 reszt ami-
nokwasowych, a następnie para histydyna-histy-
dyna (ryc. 38-14). W niektórych przypadkach,
zwłaszcza rodziny steroidowych tarczycowych
receptorów jądrowych, dublet His-His jest zastą¬
piony przez drugą parę Cys-Cys. Białko zawiera-
Dwukrotna
oś symetrii
Ryc. 38-13. Schemat trójwymiarowej struktury białka Cro i jego wiązania z DNA za pośrednictwem motywu helisa-skręt-helisa. Mono¬
mer Cro składa się z trzech antyrównoległych struktur p (prp3) i trzech helis a (ara3). Motyw helisa-skręt-helisa powstaje wskutek
tego, że helisy a3 i a2 są utrzymane pod kątem 90° przez skręt czterech aminokwasów. Helisa a3 białka Cro stanowi powierzchnię
rozpoznającą DNA (zacieniowane). Dwa monomery asocjują poprzez antyrównoległe harmonijki p3f tworząc dimer, który ma dwukrotną
oś symetrii (po prawej). Dimer Cro wiąże się z DNA swoimi helisami Oj, z których każda kontaktuje się z ok. pięcioma parami zasad
na tej samej powierzchni rowka większego DNA. Odległość między dwoma analogicznymi punktami na dwóch helisach DNA wynosi
3,4 nm (34 A), co odpowiada odległości jednego kompletnego skrętu podwójnej helisy DNA. (Dzięki uprzejmości Dr. B Mathewsa).
476 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Palec cynkowy Cys-Cys Palec cynkowy Cys-His
Ryc. 38-14. „Palce cynkowe” (ang. zinc fingers) stanowią serię
powtarzających się domen (od dwóch do dziewięciu), z których
każda zawiera związany tetrahedrycznym wiązaniem koordyna¬
cyjnym atom cynku. W przypadku TFIIIA koordynację zapewnia
para reszt cysternowych (C) oddzielona 12-13 resztami ami-
nokwasowymi od pary reszt histydynowych (H). W „palcach
cynkowych” innych białek drugą parę także stanowią reszty cy¬
sternowe. „Palce cynkowe” wiążą się w rowku większym, przy
czym przylegle palce łączą 5 pz wzdłuż tej samej płaszczyzny
helisy DNA.
A
jące palec cynkowy przypuszczalnie leży na jed¬
nej płaszczyźnie helisy DNA, a kolejne palce są
ułożone naprzemiennie w obrębie jednego skrętu
w dużym rowku. Podobnie jak w przypadku do¬
meny rozpoznającej, w białku typu helisa-skręt-
-helisa każdy palec cynkowy białka TFIIIA łączy
ok. pięć par zasad DNA. Znaczenie tego motywu
dla funkcji hormonów steroidowych podkreśla
„eksperyment natury”. Pojedyncza mutacja ami¬
nokwasu w jednym z dwóch palców cynkowych
białka receptora kalcytriolu powoduje oporność
na działanie tego hormonu i pojawienie się kli¬
nicznego zespołu krzywicy.
Motyw suwak leucynowy
(ang. leucine zipper)
Szczegółowa analiza sekwencji 30 reszt ami¬
nokwasów w karboksylowym regionie końco¬
wym białka C/EBP, wiążącego nukleotydową
Ryc. 38-15. Motyw „suwaka leucynowego” (ang. leucine zipper). Rycina po stronie lewej (A) pokazuje analizę koła helikalnego karbo-
ksykońcowej części białka C/EBP wiążącego DNA. Sekwencja reszt aminokwasowych jest pokazana jako wiązanie „koniec do końca”
i biegnie w dół (pod płaszczyznę kartki papieru) wzdłuż osi helisy a. Koło helikalne składa się z siedmiu szprych, które odpowiadają
siedmiu resztom aminokwasowym obejmującym każdy z dwóch skrętów helisy a. Należy zauważyć, że reszty leucynowe (L) pojawiają
się w co siódmej pozycji. W innych białkach mających „suwaki leucynowe” występuje podobny układ helikalnego koła. Schematyczny
model domeny wiążącej DNA białka C/EBP pokazano po stronie prawej (B). Dwa identyczne łańcuchy polipeptydowe C/EBP są utrzymy¬
wane w formie dimeru przez domenę „suwak leucynowy” każdego z polipeptydów (oznaczonych na rycinie jako prostokąty z doczepio¬
nymi owalami). Struktura taka jest najwidoczniej niezbędna, aby utrzymywać domeny wiążące DNA każdego polipeptydu (zacieniowane
prostokąty) w odpowiedniej konformacji, potrzebnej do związania z DNA. (Dzięki uprzejmości S McKinghta).
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 477
sekwencję wzmacniającą w DNA (enhancer),
umożliwiła ujawnienie nowej struktury. Na ry¬
cinie 38-15 widać, że region tego białka tworzy
helisę a, w której reszty leucynowe zajmują cy¬
klicznie powtarzające się miejsca co siedem reszt
aminokwasowych. Takie ułożenie obejmuje osiem
helikalnych skrętów i cztery powtarzające się leu-
cyny. Podobne struktury znaleziono w wielu in¬
nych białkach związanych z regulacją transkrypcji
w komórkach ssaków i drożdży. Sądzi się, że mo¬
tyw ten umożliwia połączenie dwóch identycz¬
nych monomerów lub heterodimerów (np. Fos-
-Jun lub Jun-Jun) na wzór zamka błyskawicznego
i powstanie mocnego dimerycznego kompleksu
0 strukturze oplatających się helis (ang. coiled
coil) (ryc. 38-15). Tego typu oddziaływanie biał-
ko-białko może wzmacniać wiązanie oddzielnych
domen wiążących DNA z ich sekwencjami doce¬
lowymi (ryc. 38-15).
W WIĘKSZOŚCI BIAŁEK
REGULATOROWYCH DOMENY WIĄŻĄCE
DNA ORAZ DOMENY PEŁNIĄCE FUNKCJE
TRANSAKTYWUJACE SA ODRĘBNE
INIE ODDZIAŁUJĄ ZE SOBĄ
Przyłączenie się białka do DNA mogłoby zmienić
ogólną konformację DNA, co umożliwiłoby przy¬
łączonemu białku aktywowanie transkrypcji; obie
te funkcje mogłyby być również pełnione przez
odrębne i niezależne domeny. Doświadczenia
z wymianą domen wskazują na tę ostatnią moż¬
liwość.
W metabolizmie galaktozy u drożdży bierze
udział produkt genu GALL Gen ten jest dodat¬
nio regulowany przez białko GAL4, które wią¬
że się - dzięki znajdującej się na końcu amino¬
wym domenie - z położoną przed regulowanym
genem sekwencją aktywatorową (UAS) lub
wzmacniaczem. Jeśliby ten, mający zdolność
wiązania DNA, koniec białka GAL4 o długości
73 reszt aminokwasowych usunąć i zastąpić rów¬
nież wiążącą DNA domeną DBD białka LexA
z E. coli, to powstanie cząsteczka, która nie wiąże
się z sekwencją aktywatorową UAS genu GALI
1 która oczywiście nie aktywuje genu GALI (ryc.
38-16). Jeśli jednak operator lexA - sekwencja
DNA zwykle wiązana przez domenę DBD genu
lexA - zostanie wprowadzony do regionu promo¬
tora genu GAL, to białko hybrydowe przyłączy się
do tego promotora (w operatorze lexA) i uaktywni
transkrypcję GALL Ten powtórzony wielokrotnie
eksperyment przedstawia solidne dowody na to,
że region końca karboksylowego GAL4 powo¬
duje aktywację transkrypcji. Dane doświadczalne
wskazują także, że domena DBD i domena trans-
aktywująca są od siebie niezależne i nie oddzia¬
łują ze sobą. Hierarchia składania kompleksów
aktywujących transkrypcję genów obejmuje biał¬
ka wiążące DNA i transaktywujące; białka, które
tworzą kompleksy białko-białko mostkujące biał¬
ka wiążące DNA z białkami transaktywującymi
oraz białka tworzące kompleksy białko-białko ze
składnikami podstawowego aparatu transkrypcyj-
nego. W danym białku może zatem występować
wiele powierzchni lub domen spełniających od¬
dzielne funkcje (p. ryc. 38-17). W rozdziale 36
wspomniano, że podstawowym celem tworzenia
takich kompleksów jest ułatwienie umocowania
i/lub uaktywnienia podstawowego aparatu tran-
skrypcyjnego w związanym w konfiguracji cis
promotorze.
REGULACJA GENÓW
U PROKARIOTÓWIEUKARIOTÓW
RÓŻNI SIE POD WIELOMA
WAŻNYMI WZGLĘDAMI
Oprócz regulacji transkrypcji, komórki eukario¬
tyczne stosują w celu regulowania ekspresji genu
różne inne mechanizmy (p. tab. 38-4). W komór¬
kach eukariotycznych błona jądrowa fizycznie
rozdziela proces transkrypcji genu od procesu
translacji, ponieważ rybosomy znajdują się jedynie
w cytoplazmie. Proces ekspresji genów eukario¬
tycznych składa się ze znacznie większej liczby
etapów, zwłaszcza dotyczących przekształceń
RN A, niż proces ekspresji genów prokariotycz-
nych; w porównaniu z prokariotami etapy te
dostarczają dodatkowych miejsc działania czyn¬
ników regulujących. Etapy przekształcania RN A
w komórkach eukariotycznych, opisane szczegó¬
łowo w rozdz. 36, obejmują modyfikację końca 5'
pierwotnego transkryptu, dodanie łańcucha poli-
adenylowego do końca 3' transkryptów oraz wy¬
cięcie regionów intronowych, aby umożliwić po¬
łączenie eksonów w dojrzałą cząsteczkę mRNA.
Dotychczasowa analiza ekspresji genów eukario-
478 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
A UAS
LexA-GAL4
£
Aktywny
Nieaktywny
£
Operator
lexA
Aktywny
Ryc. 38-16. Doświadczenie z wymianą domen wykazujące niezależny charakter funkcji wiąza¬
nia białka z DNA i funkcji aktywacji transkrypcji. Promotor genu GAL1 zawiera położoną przed
nim sekwencję aktywującą (UAS), która wiąże regulatorowe białko GAL4 (A). Oddziaływa¬
nie to powoduje pobudzenie transkrypcji genu GAL1. Białko fuzyjne, w którym domena GAL4
przy końcu aminowym została usunięta i podstawiona regionem wiążącym DNA białka LexA
E. coli, nie stymuluje transkrypcji genu GAL1, ponieważ domena LexA nie może się związać
z UAS (B). Fuzyjne białko LexA-GAL4 nasila transkrypcję genu GAL1 wówczas, gdy do regionu
promotora GAL1 wstawi się sekwencję operatora lexA (C), zastępując w ten sposób sekwencję
UAS genu Gall.
Ryc. 38-17. Białka, które regulują transkrypcję zawierają wiele
domen. Pokazano hipotetyczny czynnik transkrypcyjny, mający
domenę wiążącą DNA (DBD) oddzieloną od domeny wiążącej
ligand (LBD), jak również od kilku domen aktywacyjnych (AD)
(1-4). Inne białka mogą nie zawierać DBD ani LBD, wszystkie
natomiast mogą mieć różną liczbę domen, za których pośred¬
nictwem łączą się z innymi białkami, w tym z koregulatorami
i składnikami podstawowego kompleksu transkrypcyjnego (p.
także rozdz. 41 i 42).
tycznych dostarczyła dowodów, że regulacja za¬
chodzi na poziomie transkrypcji, przekształceń
jądrowego RNA i stabilizacji mRNA. Wykaza¬
no także, że następuje amplifikacja i rearanżacja
genów, co ma wpływ na ekspresję genów.
Tabela 38-4. Ekspresja genów w komórkach eukariotycznych
jest regulowana transkrypcją i wieloma innymi sposobami na
poziomie RNA
• Amplifikacja genów
• Rearanżacja genów
• Edytowanie (redagowanie) RNA
• Alternatywny splicing mRNA
• Transport mRNA z jądra do cytoplazmy
• Regulacja trwałości mRNA
Dzięki pojawieniu się techniki rekombinacji
DNA (czyli inżynierii genetycznej), w ostatnich
latach nastąpił znaczny postęp w rozumieniu eks¬
presji genów eukariotycznych. Ponieważ jednak
większość organizmów eukariotycznych zawie¬
ra znacznie więcej informacji genetycznej niż
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 479
organizmy prokariotyczne, a manipulacja genami
u tych pierwszych jest ograniczona, molekularne
aspekty regulacji genów eukariotycznych są po¬
znane znacznie gorzej niż przykłady dyskutowane
uprzednio w tym rozdziale. W następnych pod¬
rozdziałach opisano krótko kilka różnych typów
regulacji genów eukariotycznych.
Geny eukariotyczne mogą być
amplifikowane podczas rozwoju
osobniczego i w reakcji na leki
W okresie wczesnego rozwoju organizmów
wielokomórkowych pojawia się gwałtowne za¬
potrzebowanie na swoiste cząsteczki, takie jak
rybosomalny RNA i informacyjny RNA do syn¬
tezy białek, z których tworzą się takie tkanki, jak
osłonka jajowa. Jednym ze sposobów, które mogą
wzmóc syntezę takich cząsteczek, jest zwiększe¬
nie liczby genów dostępnych do transkrypcji tych
cząsteczek. Wśród powtarzających sekwencji
DNA znajdują się setki kopii genów rybosomal-
nego RNA i tRNA. Geny te istnieją w postaci wie¬
lu kopii w materiale genetycznym gamet i w ten
sposób są przenoszone z pokolenia na pokolenie
w wielkiej liczbie kopii. W niektórych szczegól¬
nych organizmach, takich jak muszka owocowa
(Drosophila), w czasie oogenezy zachodzi am-
plifikacja niektórych już istniejących genów, np.
tych, które kodują białka chorionu (osłonki jajo¬
wej). Takie amplifikowane geny, które powstają
prawdopodobnie w procesie powtarzanej inicjacji
w czasie syntezy DNA, dostarczają wielu miejsc
do transkrypcji genów (ryc. 36-4 i 38-18).
Geny nieamplifikowane
s36 s38
Ryc. 38-18. Schemat amplifikacji genów s361 s38 białka chorio¬
nu. (Reprodukowano za zgodą z: Chisholm R: Gene amplification
during development. Trends Biochem Sci 1982; 7:161. Copyright
© 1982. Przedrukowano za zgodą Elsevier).
Sekwencje kodujące, odpowiedzialne za po¬
wstawanie swoistych cząsteczek białkowych, nie
występują u ssaków w jednym bloku (p. rozdz.
36). Jest to prawdziwe zwłaszcza w odniesieniu
do genów kodujących przeciwciała. Jak to opisano
szczegółowo w rozdz. 49, cząsteczki immunoglo-
buliny są złożone z dwóch typów łańcuchów po-
lipeptydowych: łańcucha ciężkiego (ok. 50 kDa)
i lekkiego (ok. 25 kDa). mRNA obu tych podjed-
nostek białkowych są kodowane przez sekwencje
DNA cechujące się dużą zmiennością. Zmiany
takie są integralną częścią systemu generowania
wymaganej różnorodności rozpoznawania anty¬
genów, będącej istotą należytego działania układu
odpornościowego.
mRNA ciężkiego i lekkiego łańcucha IgG są
kodowane przez wiele różnych segmentów po¬
wtarzających się jeden po drugim (tandemowo)
w linii zarodkowej. Na przykład łańcuch lekki
IgG składa się z domeny lub regionu zmiennego
(VL), łączącego (JL) oraz stałego (CL). Poszcze¬
gólne podzbiory łańcuchów lekkich IgG zawdzię¬
cza się istnieniu mniej więcej 300 tandemowo
powtarzających się segmentów kodujących VL,
pięciu tandemowo ułożonych sekwencji kodują¬
cych JL i około dziesięciu sekwencji kodujących
CL. Wszystkie te wielokrotne, odrębne regiony
kodujące występują w tym samym rejonie tego
samego chromosomu i każdy typ segmentu kodu¬
jącego (VL, JL oraz CL) jest powtarzany w obrębie
regionu powtarzającego tandemowo na zasadzie
głowa-ogon. Dzięki kombinacji rozlicznych seg¬
mentów VL, JL oraz CL komórka układu odpor¬
nościowego dysponuje dużym asortymentem
sekwencji, umożliwiających powstanie zarówno
elastyczności, jak i swoistości immunologicznej.
Jednakże jednostka transkrypcyjna danego łań¬
cucha lekkiego IgG, podobnie jak inne, „zwykłe”
ssacze jednostki transkrypcyjne, zawiera sekwen¬
cje kodujące tylko jedno białko. Zanim więc doj¬
dzie do ekspresji konkretnego łańcucha lekkiego
IgG, pojedyncze sekwencje kodujące VL, JL oraz
CL muszą ulec rekombinacji, aby móc utworzyć
pojedynczą, łączną jednostkę transkrypcyjną
i wykluczyć liczne nieużywane segmenty (tzn. ok.
300 pozostałych niewykorzystanych segmentów
VL, cztery pozostałe niewykorzystane segmenty
JL i dziewięć pozostałych segmentów CL). Delecja
niewykorzystanej części informacji genetycznej
odbywa się przy udziale wybiórczej rekombinacji
480 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
DNA, która usuwa niepożądany kodujący DNA,
a zachowuje potrzebne sekwencje kodujące: jed-
ną VL, jedną JL oraz jedną CL. (Sekwencje VL
ulegają dodatkowej mutagenezie punktowej, co
przyczynia się do jeszcze większej ich różnorod¬
ności - stąd nazwa). Zrekombinowane sekwencje
tworzą w ten sposób pojedynczą jednostkę tran-
skrypcyjną, nadającą się do przepisania z udzia¬
łem polimerazy RN AII. Jakkolwiek geny IgG są
przykładem jednej z najlepiej zbadanych, ukie¬
runkowanych rearanżacji DNA, prowadzących do
modulacji ekspresji genów, to w piśmiennictwie
można znaleźć opisy innych przypadków rearan¬
żacji regulatorowego DNA. Jak opisano poniżej,
wywołana lekami amplifikacja genów jest istotną
komplikacją w chemioterapii nowotworów.
W ostatnich latach stało się możliwe pobudza¬
nie amplifikacji określonych genów w komórkach
ssaczych hodowanych in vitro. W niektórych
przypadkach było możliwe zwiększenie o kilka
tysięcy liczby kopii określonych genów w wyni¬
ku ekspozycji komórek na coraz większe dawki
wybranych związków chemicznych. U chorych
na raka otrzymujących metotreksat obserwowano
w komórkach nowotworowych rozwój oporno¬
ści lekowej wskutek zwiększenia liczby genów
kodujących reduktazę dihydrofolianową, która
uczestniczy w metabolizmie metotreksatu. Podob¬
na amplifikacja genów zachodzi spontanicznie in
vivo, tj. pod nieobecność zewnętrznego czynnika
wybiórczego, a niezamierzone dodatkowe cykle
replikacji mogą zostać „zamrożone” w genomie
pod wpływem presji selekcyjnej odpowiednich
czynników wybiórczych.
Alternatywne przekształcanie RNA jest
innym mechanizmem kontroli ekspresji
Komórki eukariotyczne, oprócz tego że wpły¬
wają na wydajność użytkowania promotora,
wykorzystują do kontroli ekspresji genów al¬
ternatywne przekształcanie RNA. Wynika ono
z używania alternatywnych promotorów, miejsc
splicingu intron-ekson lub miejsc poliadenylacji.
Czasami powoduje to powstawanie w komórce
heterogennych transkryptów, ale znacznie czꜬ
ciej ten sam transkrypt pierwotny jest odmiennie
przekształcany w różnych tkankach. Kilka przy¬
kładów każdego z tych typów regulacji przedsta¬
wiono dalej.
Wykorzystanie alternatywnych miejsc startu
transkrypcji powoduje w rezultacie pojawienie
się różnych eksonów na końcach 5' cząsteczek
mRNA dla amylazy i lekkiego łańcucha miozyny
u myszy, dla glukokinazy u szczura i dehydro¬
genazy alkoholowej oraz aktyny u muszki Dro-
sophila. Wybór alternatywnego miejsca poli¬
adenylacji w pierwotnym transkrypcie ciężkiego
łańcucha immunoglobuliny p skutkuje powsta¬
niem cząsteczek mRNA długości 2700 (pm) albo
2400 zasad (ps). W wyniku tego w kodowanych
białkach pojawiają się odmienne regiony karbok-
syterminalne, przy czym białko pm pozostaje przy¬
łączone do błony komórkowej limfocytu B, a im-
munoglobulina ps jest wydzielana. Alternatywny
splicing i przekształcanie odpowiadają z kolei za
wytworzenie w siedmiu różnych rodzajach tkanek
siedmiu unikatowych mRNA dla a-tropomiozyny.
Nie wiadomo jednak, jak „zapadają decyzje” do¬
tyczące splicingu i przekształceń RNA, ani też
czy zdarzenia te mogą być regulowane.
Regulacja stabilności mRNA
zapewnia jeszcze jeden
mechanizm kontroli ekspresji
Mimo że większość cząsteczek mRNA w komór¬
kach ssaczych jest bardzo stabilna (okresy pół-
trwania mierzone w godzinach), niektóre z nich
mają bardzo szybki okres obrotu metabolicznego
(10-30 min). W pewnych przypadkach trwałość
mRNA podlega regulacji. Pociąga to za sobą po¬
ważne następstwa, ponieważ zwykle istnieje bez¬
pośredni związek między ilością mRNA i jego
translacją na odpowiednie białko. Zmiany trwało¬
ści określonego mRNA mogą więc mieć zasadni¬
czy wpływ na procesy biologiczne.
Informacyjne RNA występują w cytoplazmie
w postaci cząstek rybonukleoproteinowych (RNP).
Niektóre z tych białek chronią mRNA przed tra¬
wieniem przez nukleazy, podczas gdy inne mogą,
w pewnych warunkach, przyczyniać się do ataku
nukleaz. Uważa się, że mRNA są stabilizowane
lub destabilizowane dzięki oddziaływaniom takich
białek z różnorodnymi strukturami lub sekwencja¬
mi. Niektóre efektory, jak np. hormony, mogą re¬
gulować trwałość mRNA dzięki zwiększaniu lub
zmniejszaniu ilości takich białek.
Wydaje się, że końce cząsteczek mRNA
mają swój udział w zjawisku stabilizowania
38. REGULACJA EKSPRESJI GENU 481
mRNA (ryc. 38-19). Czapeczka na końcu 5'
eukariotycznego mRNA zapobiega atakowi 5'-
-egzonukleaz, ogon poli(A) zaś uniemożliwia
działanie 3'-egzonukleazom. Zakłada się, że
w cząsteczkach mRNA zawierających tego typu
struktury atak egzonukleaz i strawienie całej czą¬
steczki umożliwia pojedyncze cięcie endonukleo-
lityczne. Uważa się też, że początkowemu działa¬
niu endonukleolitycznemu zapobiegają lub mogą
się do niego przyczyniać inne struktury (sekwen¬
cje niekodujące) w nieulegającym translacji re¬
gionie 5' (5'NCS), jak również region kodujący
oraz region 3'NCS (ryc. 38-19). Przedstawionych
zostanie kilka przykładów ilustrujących to zjawi¬
sko.
Delecja 5'NCS powoduje wydłużenie (3-5 razy)
okresu półtrwania c-myc mRNA. Z kolei skró¬
cenie regionu kodującego mRNA histonowego
zwiększa jego okres półtrwania. Region kodujący
bierze pośrednio udział w pewnej formie autore¬
gulacji stabilności mRNA. Z chwilą opuszczania
rybosomu do pierwszych czterech aminokwasów
nowo zsyntezowanego łańcucha tubuliny przyłą¬
cza się wolna tubulina. Wydaje się to aktywować
związaną z rybosomem (RNP) RNazę, która w ta¬
kich warunkach trawi mRNA tubuliny. Struktury
leżące na końcu 3', włącznie z ogonem poli(A),
zwiększają lub zmniejszają stabilność swoistych
mRNA. Brak ogona poli(A) wiąże się z szybką
degradacją mRNA, a usunięcie poli(A) z pew¬
nych RNA skutkuje ich destabilizacją. Cząsteczki
histonowego mRNA nie mają ogona poli(A), jed¬
nak w pobliżu końca 3' mają sekwencje mogące
tworzyć strukturę łodyżki-pętli; prawdopodobnie
gwarantuje to oporność na atak egzonukleolitycz-
ny. mRNA histonu H4 jest na przykład degrado¬
wany w kierunku od 3' do 5', ale tylko po tym, jak
dojdzie do pojedynczego cięcia endonukleolitycz-
nego około dziewięciu nukleotydów od końca 3',
w regionie domniemanej struktury łodyżka-pętla.
Struktury łodyżka-pętla występujące w sekwencji
niekodującej 3' odgrywają również kluczową rolę
w regulacji, z udziałem żelaza, mRNA kodują¬
cego receptor transferynowy. Struktury łodyżka-
-pętla są również związane ze stabilnością mRNA
u bakterii, co sugeruje, że mechanizm ten jest po¬
wszechnie wykorzystywany.
Inne sekwencje na końcach 3' cząsteczek nie¬
których eukariotycznych mRNA prawdopodob¬
nie wpływają na destabilizację tych cząsteczek.
Obiektem szczególnego zainteresowania są regio¬
ny bogate w motyw AU, spośród których wiele
zawiera sekwencje AUUUA. Sekwencja ta poja¬
wia się w cząsteczkach mRNA o bardzo krótkich
okresach półtrwania, np. w niektórych mRNA ko¬
dujących białka onkogenne lub cytokiny. Znacze¬
nie tego regionu podkreślają wyniki doświadcze¬
nia, w którym sekwencja odpowiadająca 3'NCS
krótkożyjącego mRNA, kodującego czynnik sty¬
mulujący wzrost kolonii (CSF), zawierająca mo¬
tyw AUUUA, została dodana do końca 3' mRNA
P-globiny. Okres półtrwania tego hybrydowego
mRNA P-globiny zamiast się wydłużyć uległ
skróceniu, charakterystycznemu dla mRNA czyn¬
nika CSF. Również odkryte niedawno miRNA
(rozdz. 34) są wybierane przez cząsteczki mRNA
za cel degradacji. Wiele reakcji metabolizmu
mRNA odbywa się w swoistych strukturach cyto-
plazmatycznych, zwanych ciałkami P (ang. Pro¬
cessing bodies).
Czapeczka
Sekwencja kodująca
o
Ryc. 38-19. Struktura typowego eukariotycznego mRNA pokazująca elementy biorące
udział w regulacji stabilności mRNA. Oprócz regionu kodującego, typowy eukariotycz¬
ny mRNA ma na końcu 5' oraz 3' sekwencje niekodujące (5'NCS oraz 3'NCS). Wszyst¬
kie cząsteczki mają na końcu 5' czapeczkę, a większość z nich na końcu 3' ma również
sekwencję poliadenylową. Czapeczka 5' oraz ogon poli(A) na końcu 3' chronią mRNA
przed atakiem egzonukleaz. Uważa się, że w zjawisku stabilizacji mRNA odgrywają rolę
zarówno struktury łodyżka-pętla obecne w 5'NCS oraz 3'NCS, jak i cechy sekwencji
kodujących oraz regiony bogate w motywy AU w NCS końca 3'.
482 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Z powyższych przykładów wynika jasno, że
mechanizmów regulacji stabilności mRNA jest
wiele, tak jak jest wiele mechanizmów regulacji
syntezy mRNA. Skoordynowana regulacja tych
dwóch procesów daje komórce niezwykle zdol¬
ności adaptacyjne.
STRESZCZENIE
• Genetyczny skład prawie wszystkich komó¬
rek somatycznych organizmów wielokomór¬
kowych jest identyczny.
• Fenotyp (swoistość tkankowa lub komórkowa)
podyktowany jest różnicami ekspresji genów
w posiadanym zestawie genów.
• Zmiany w ekspresji genów pozwalają komórce
adaptować się do zmian środowiskowych.
• Ekspresja genów może być kontrolowana na
różnych poziomach poprzez zmiany w tran¬
skrypcji, przekształcaniu, lokalizacji, trwałości
lub sposobie użytkowania RNA przez komórkę.
Na ekspresję genów mają wpływ także amplifi-
kacje i rearanżacje.
• Mechanizmy kontroli transkrypcji działają na
poziomie oddziaływań białko-DNA oraz biał-
ko-białko. Oddziaływania te pokazują modu-
lamość domen białkowych oraz wysoki stopień
swoistości.
• W czynnikach transkrypcyjnych rozpoznano wie¬
le różniących się klas domen wiążących DNA.
• Modyfikacje chromatyny są ważnym czynni¬
kiem kontroli transkrypcji u eukariotów.
PIŚMIENNICTWO
Albright SR, Tjian R: T AFs revisited: morę data re-
veal new twists and confirm old ideas. Gene
2000;242:1.
Berger SL, Felsenfeld G: Chromatin goes global. Mol
Celi 2001;8:263.
Bird AP, Wolffe AP: Methylation-induced repression-
-belts, braces and chromatin. Celi 1999;99:451. ,
Busby S, Ebright RH: Promoter structure, promoter re- j
cognition, and transcription activation in prokaryo- i
tes. Celi 1994;79:743. |
Busby S, Ebright RH: Transcription activation by ca-
tabolite activator protein (CAP). J Mol Biol 1999; s
293:199. ,
Cowell IG: Repression versus activation in the eon- j
troi of gene transcription. Trends Biochem Sci
1994; 1:38. |
Ebright RH: RNA polymerase: structural similarities j
between bacterial RNA polymerase and eukaryotic {
RNA polymerase II. J Mol Biol 2000;304:687.
Fugman SD: RAGI and RAG2 in V(D)J recombination
and transposition. Immunol Res 2001 ;23:23.
Jacob F, Monod J: Genetic regulatory mechanisms in
protein synthesis. J Mol Biol 1961 ;3:318.
Lemon B, Tjian R: Orchestrated response: a symphony
of transcription factors for gene control. Genes Dev
2000; 14:2551.
Letchman DS: Transcription factor mutations and
disease. N Engl J Med 1996;334:28.
Merika M, Thanos D: Enhanceosomes. Curr Opin Genet
Dev 2001 ;11:205.
Naar AM, Lemon BD, Tjian R: Transcriptional co-
activator complexes. Annu Rev Biochem 2001;
70:475.
Narlikar GJ, Fan HY, Kingston RE: Cooperation be¬
tween complexes that regulate chromatin structure
and transcription. Celi 2002; 108:475.
Oltz EM: Regulation of antigen receptor gene assembly
in lymphocytes. Immunol Res 2001 ;23:121.
Ptashne M: A Genetic Switch, 2nd ed. Celi Press and
Blackwell Scientific Publications, 1992.
Roeder RG: Transcriptional regulation and the role of
diverse coactivators in animal cells. FEBS Lett
2005;579:909.
Stemer DE, Berger SL: Acetylation of histones and
transcription-related factors. Microbiol Mol Biol
Rev 2000;64:435.
Valencia-Sanchez ME, Liu J, Hannon GJ, Parker R:
Control of translation and mRNA degradation by
miRNAs and SiRNAs. Genes Dev 2006;20:515.
Wu R, Bahl CP, Narang SA: Lactose operator-repressor
interaction. Curr Top Celi Reguł 1978; 13:137.
■ Techniki: rekombinacji DNA,
F molekularno-genetyczne
■ oraz genomiczne
DarylK. Granner, MD; P. Anthony Weil, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE*
Rozwój techniki rekombinacji DNA, wysoko wy¬
dajnych badań przesiewowych wysokiej gęsto¬
ści, jak i innych metodologii molekulamo-gene-
tycznych zrewolucjonizował biologię i ma coraz
większy wpływ na medycynę kliniczną. Na pod¬
stawie analizy rodowodów i badania białek odpo¬
wiedzialnych za proces chorobowy zgromadzono
już dużą wiedzę o chorobach genetycznych czło¬
wieka, jednakże w wielu przypadkach, w których
określona wada genetyczna pozostaje nieznana,
żadna z tych metod nie może być zastosowana.
Nowe narzędzia genetyki molekularnej pokonują
te ograniczenia, czerpiąc informację bezpośred¬
nio z cząsteczki DNA. Manipulowanie sekwencją
DNA i konstruowanie cząsteczek fuzyjnych - tzw.
inżynieria genetyczna - czynią możliwymi bada¬
nia nad funkcjonowaniem określonego odcinka
DNA. Nowe narzędzia genetyki molekularnej
umożliwiają badaczom stawianie pytań dotyczą¬
cych sekwencji genomowych i manipulowanie
nimi, jak również pozwalają badać komórkowe
mRNA oraz profile białkowe na poziomie mole¬
kularnym.
Poznanie tych technik jest ważne z wielu
względów. 1. Daje możliwość racjonalnego po¬
dejścia do zrozumienia molekularnych podstaw
wielu chorób (np. rodzinna hipercholesterolemia,
niedokrwistość sierpowata, talasemie, mukowi-
scydoza, dystrofia mięśniowa). 2. Stosując tech¬
nikę rekombinacji DNA, można wytwarzać pod
* Patrz słowniczek pojęć na końcu tego rozdziału.
dostatkiem ludzkie białka dla potrzeb leczniczych
(np. insulina, hormon wzrostu, aktywator plazmi-
nogenu). 3. Można w ten sposób uzyskać białka
do szczepionek (np. zapalenia wątroby typu B)
i do testów diagnostycznych (np. test do wykry¬
wania AIDS). 4. Technika rekombinacji DNA jest
stosowana w diagnostyce już rozwiniętych cho¬
rób i w przewidywaniu ryzyka rozwoju określo¬
nej choroby. 5. Specjalne techniki doprowadziły
do nadzwyczajnego postępu w medycynie sądo¬
wej. 6. Może zostać opracowana terapia genowa
niedokrwistości sierpowatej, talasemii, niedoboru
deaminazy adenozynowej i innych chorób.
WYJAŚNIENIE PODSTAWOWYCH CECH
DNA DOPROWADZIŁO 00 ROZWOJU
TECHNIKI REKOMBINACJI DNA
DNA jest złożonym biopolimerem,
przyjmującym postać podwójnej helisy
Podstawowym elementem organizacji jest sek¬
wencja zasad purynowych (adeniny [A] lub gua-
niny [G]) oraz pirymidynowych (cytozyny [C] lub
tyminy [T]). Zasady te są dołączone do cząsteczki
cukru - deoksyrybozy w pozycji C-l', a zasady
są połączone razem wiązaniem fosfodiestrowym,
łączącym cząsteczki cukru w pozycjach 3' i 5'
(p. ryc. 34-1). Leżące naprzemiennie grupy deok¬
syrybozy i fosforanowe tworzą szkielet podwój¬
nej helisy (p. ryc. 34-2). Wiązania 3-5' określają
także orientację danej nici w cząsteczce DNA,
a ponieważ dwie nici biegną w przeciwnych kie¬
runkach, określa się je jako anty równoległe.
484 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Parowanie zasad jest podstawowym
pojęciem dotyczącym struktury i funkcji
DNA
Adenina i tymina, podobnie jak guanina i cytozy-
na, dzięki wiązaniom wodorowym zawsze wystę¬
pują parami (p. ryc. 34-3). Mówi się, że pary te
są komplementarne i że zawartość guaniny we
fragmencie dwuniciowego DNA jest zawsze rów¬
na zawartości cytozyny w tym fragmencie; rów¬
nież zawartości tyminy i adeniny są jednakowe.
Sparowanie zasad i oddziaływania hydrofobo¬
we między zasadami utrzymują razem dwie nici
DNA. Te wzajemne oddziaływania można osła¬
bić, ogrzewając DNA w celu denaturacji. Reguły
parowania zasad przewidują, że dwie komplemen¬
tarne nici DNA mogą po renaturacji ponownie się
łączyć dokładnie nukleotyd w nukleotyd; zjawi¬
sko to zachodzi wówczas, gdy roztwór jest po¬
woli schładzany do normalnej temperatury. Na
podstawie znajomości temperatury potrzebnej
do procesu denaturacji-renaturacji można nawet
oznaczyć stopień sparowania zasad (albo sparo¬
wania błędnego). Odcinki DNA o dużym stopniu
prawidłowego sparowania wymagają dostarcze¬
nia większej ilości energii (ciepła) w celu wywo¬
łania denaturacji, albo też mówiąc inaczej, ściśle
sparowany odcinek wytrzyma wyższą tempera¬
turę, zanim nici ulegną rozdzieleniu. Reakcja ta
jest wykorzystywana do sprawdzania, czy między
dwoma sekwencjami DNA istnieją znaczące róż¬
nice, i leży ona u podstaw pojęcia hybrydyzacji,
mającej fundamentalne znaczenie dla procesów
opisanych w dalszej części.
Każdy ludzki haploidalny genom zawiera ok.
3x109 par zasad (pz). Jeśli długość przeciętnego
genu wynosi 3x 103 pz (3 kilozasady [kz]), to cały
genom składałby się z 106 genów, zakładając, że
nie następuje nakładanie się genów i że transkryp¬
cja przebiega tylko w jednym kierunku. Sądzi się,
że genom człowieka składa się z mniej niż 105 ge¬
nów, a tylko 1-2% DNA koduje białka. Funkcja
pozostałych ok. 98% ludzkiego genomu nie zosta¬
ła jeszcze dokładnie określona.
Podwójna helisa DNA jest upakowana w ści¬
ślejszą strukturę za pomocą białek, głównie
białek zasadowych, zwanych histonami. Taka
kondensacja może odgrywać rolę regulatorową
i z pewnością służy praktycznym celom. Gdy¬
by DNA występujący w jądrze komórki został
rozciągnięty, jego długość wynosiłaby ok. jedne¬
go metra. Białka chromosomalne powodują, że ta
długa cząsteczka DNA upakowuje się w jądrze
do objętości kilku pm3.
DNA jest zorganizowany w postaci genów
Geny prokariotyczne zwykle składają się z małe¬
go regionu regulatorowego (100-500 pz) i duże¬
go segmentu kodującego białko (500-10000 pz).
Często kilka genów jest kontrolowanych przez
pojedynczą jednostkę regulatorową. Większość
genów ssaków ma bardziej złożoną strukturę,
w której regiony kodujące są poprzedzielane re¬
gionami niekodującymi; te ostatnie są usuwane
w trakcie przekształcania pierwotnego transkryp-
tu RNA w dojrzały informacyjny RNA (mRNA,
ang. messenger RNA). Regiony kodujące (czyli
regiony, które pojawiają się w dojrzałym RNA),
są nazywane eksonami, a regiony niekodujące,
które znajdują się między eksonami, nazywają się
intronami (ryc. 39-1). Introny są zawsze usuwane
z prekursorowych cząsteczek RNA, zanim prze¬
mieszczą się do cytoplazmy. Proces, w trakcie któ¬
rego introny są usuwane z prekursorowego RNA,
a eksony łączone ze sobą, nazywa się składaniem
RNA (splicing RNA). Nieprawidłowe prze¬
kształcanie pierwotnego transkryptu w dojrzały
mRNA może prowadzić do stanów chorobowych
u człowieka (p. niżej); podkreśla to znaczenie po-
transkrypcyjnego przekształcania RNA. Różnice
w wielkości i złożoności niektórych ludzkich ge¬
nów przedstawiono w tab. 39-1.
Choć różnica w wielkości wymienionych ge¬
nów jest 300-krotna, to wielkości mRNA różnią
się tylko 20-krotnie. Dzieje się tak, ponieważ
większość DNA w genach występuje w formie
intronów i introny te są zwykle dłuższe niż ek¬
sony. Regiony regulatorowe określonych ge¬
nów eukariotycznych są zwykle umiejscowione
w DNA flankującym miejsce inicjacji transkryp¬
cji od końca 5' (sekwencje flankujące 5r). Cza¬
sami takie sekwencje są znajdywane w obrębie
samego genu albo w regionie, który flankuje ko¬
niec 3' genu. W komórkach ssaków każdy gen
ma swój własny region regulatorowy. Liczne
geny eukariotyczne (oraz niektóre wirusy, które
replikują w komórkach ssaków) mają specjalne
regiony, zwane sekwencjami wzmacniającymi
(enhancers), które przyspieszają transkrypcję.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 485
DNA
JĄDRO
Region
regulatorowy
Region
podstawowy
promotora
CAAT |-f~ TATA
Miejsce startu Miejsce
transkrypcji dodania
5' Intron 3'
Region
niekodujący
Region
niekodujący
Transkrypcja
Pierwotny transkrypt RNA
Modyfikacja
końców 5'i 3'
Transkrypt zmodyfikowany
Przekształcony jądrowy mRNA
Czapeczka
1 Usunięcie intronów
i składanie eksonów
AAA---A
Ogon poli(A)
3'
CYTOPLAZMA
mRNA
Transport błonowy
AAA-A
Translacja
Białko
COOH
flyc. 39-7. Struktura jednostki transkrypcyjnej w organizmach eukariotycznych i szlak ekspresji eukariotycznego genu. Geny eukario¬
tyczne mają regiony strukturalne i regulatorowe. Region strukturalny składa się z DNA kodującego i niekodujących sekwencji DNA na
końcach 5' i 3'. Regiony kodujące dzielą się na dwie części: 1) eksony, które ostatecznie zostają zligowane i tworzą dojrzały mRNA oraz
2) introny, które są usuwane z pierwotnego transkryptu w trakcie jego przekształcenia. Region strukturalny jest ograniczony przy końcu
5' przez miejsce inicjacji transkrypcji, a przy końcu 3' - przez miejsce dodania poli(A) lub miejsce terminacji. Region promotora, który
zawiera swoiste sekwencje DNA oddziałujące z różnymi czynnikami białkowymi regulującymi transkrypcję, jest opisany szczegółowo
w rozdz. 36 i 38. Transkrypt pierwotny zawiera na swym końcu 5' specjalną strukturę - „czapeczkę", a na końcu 3' sekwencję (A)n.
Transkrypt ten jest przekształcany w celu usunięcia intronów, a dojrzały mRNA jest następnie transportowany do cytoplazmy, gdzie
ulega translacji na białko.
Niektóre geny mają także sekwencje DNA zwane
sekwencjami wyciszającymi (silencers), które
hamują transkrypcję. Geny ssaków najwyraźniej
są złożonymi, wieloskładnikowymi strukturami.
Geny są przepisywane na RNA
Przepływ informacji odbywa się na ogół od DNA
do mRNA i dalej do białka, tak jak to przedstawio¬
no na ryc. 39-1 i co opisano dokładniej w rozdz.
38. Jest to proces ściśle kontrolowany, obejmują¬
cy wiele złożonych etapów, z których każdy bez
wątpienia jest regulowany przez jeden lub kilka
enzymów albo innych czynników; nieprawidłowe
funkcjonowanie na jakimkolwiek z tych etapów
może wywołać stan chorobowy.
TECHNIKA REKOMBINACJI
DNA OBEJMUJE IZOLOWANIE
I MANIPULACJE DNA W CELU
UTWORZENIA CZĄSTECZEK
CHIMERYCZNYCH
Istotą technik inżynierii genetycznej jest izolowa¬
nie i manipulacja DNA. Obejmuje ona łączenie
(typu koniec do końca) sekwencji, czasem z bardzo
różnych źródeł, w celu uzyskania cząsteczek chi-
486 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Tabela 39-1. Zmienność wielkości oraz złożoności niektórych
ludzkich genów i mRNA1
Gen
Wielkość
genu (kz)
Liczba
intronów
Wielkość
mRNA
(kz)
P-Globina
1,5
2
0,6
Insulina
1,7
2
0,4
Receptor p-adrenergiczny
3
0
2,2
Albumina
25
14
2,1
Receptor LDL
45
17
5,5
Czynnik VIII
186
25
9,0
Tyreoglobulina
300
36
8,7
1 Wielkości są podane w kilozasadach (kz). Wielkość genów obej¬
muje sekwencje części proksymalnej promotora i regionu regula¬
torowego: są one zwykle takie same dla różnych genów. Wielkość
genów jest różna, od ok. 1500 pz do ponad 2x106 pz. Liczby in-
tronów i eksonów także są zmienne. Gen receptora p-adrenergicz-
nego jest bezintronowy, a gen tyreoglobuliny zawiera 36 intronów.
Na podstawie mniejszej różnicy w wielkości mRNA można wy¬
wnioskować, że introny stanowią większość sekwencji genu.
merycznych (np. cząsteczek zawierających za¬
równo ludzkie, jak i bakteryjne sekwencje DNA,
w sposób niezależny od organizacji sekwencji).
W procedurach inżynierii genetycznej stosuje się
wiele unikatowych metod oraz odczynników.
Enzymy restrykcyjne przecinają tańcuchy
DNA w określonych miejscach
Niektóre endonukleazy, czyli enzymy, które prze¬
cinają DNA w określonych sekwencjach w ob¬
rębie cząsteczki (w odróżnieniu od egzonukleaz,
które trawią cząsteczki DNA od końców), są pod¬
stawowymi narzędziami w inżynierii genetycz¬
nej. Enzymy te pierwotnie nazwano enzymami
restrykcyjnymi, ponieważ ich obecność w danej
bakterii ograniczała wzrost pewnych wirusów
bakteryjnych, zwanych bakteriofagami. Enzymy
restrykcyjne rozcinają DNA na krótkie kawałki
w miejscach określonych sekwencji, w odróż¬
nieniu do większości metod enzymatycznych,
chemicznych lub fizycznych, w wyniku których
DNA jest przecinane w miejscach dowolnych.
Te obronne enzymy (dotychczas wykryto ich kil¬
kaset) chronią DNA bakterii gospodarza przed
DNA obcych organizmów (głównie zakaźnych
fagów). Enzymy te występująjednak tylko w tych
komórkach, które mają enzym towarzyszący,
Tabela 39-2. Wybrane endonukleazy restrykcyjne i ich specy¬
ficzność1
Endonukleaza
Przecinane sekwencje
Pokazane miejsca
cięcia
Pochodzenie
bakteryjne
BamHI
1
GGATCC
CCTAGG
T
Bacillus amylo-
liquefaciens H
Bglll
1
AGATCT
TCTAGA
T
Bacillus glolbigii
EcoRI
4
GAATTC
CTTAAG
T
Escherichia coli
RY13
EcoRII
4
CCTGG
GGACC
T
Escherichia coli
R245
Hmdlll
4
AAGCTT
TTCGAA
T
Haemophilus
influenzae Rd
Hhal
4
GCGC
CGCG
T
Haemophilus
haemolyticus
Hpal
4
GTTAAC
CAATTG
T
Haemophilus
parainfluenzae
Mstll
4
CCTnAGG
GGAnTCC
T
Szczep
Microcoleus
Pstl
4
CTGCAG
GACGTC
T
Providencia
stuartii 164
Taql
4
TCGA
AGCT
T
Thermus
aguaticus YTI
1 A - adenina: C - cytozyna; G - guanina: T - tymina. Strzałki
pokazują miejsce przecięcia: w zależności od miejsca przecięcia
tworzą się albo tzw. lepkie końce (np. BamHI), albo tępe końce
(np. Hpal). Długość rozpoznawalnych sekwencji wynosi 4 pz
(Taql), 5 pz (Eco Rll), 6 pz (Eco Rl) lub 7 pz (Mst II) lub więcej.
Umowny zapis sekwencji: nić górna w kierunku od 5' do 3', nić
dolna od 3' do 5', czyli o odwrotnej polarności. Zwróć uwagę,
że większość rozpoznawanych sekwencji to sekwencje palindro-
mowe (tj. odczytywane są tak samo w odwrotnych kierunkach
na obu niciach). Reszty n oznaczają, że może występować tu
jakikolwiek nukleotyd.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 487
A. Lepkie, czyli nierówne końce
5' GGATCC 3' G G
I I I I I I I
3' CCTAGG — 5' — CCTAG
B. Tępe końce
5' GTTAAC — 3' — GTT
3' CAATTG 5' C A A
zdolny do metylowania DNA gospodarza, który
to proces zmienia DNA gospodarza w substrat
nieodpowiedni do trawienia enzymem restrykcyj¬
nym. Miejscowo swoiste metylazy DNA i enzy¬
my restrykcyjne występują zawsze w bakteriach
jako pary.
Nazwy enzymów restrykcyjnych pochodzą od
nazwy bakterii, z której zostały wyizolowane.
Na przykład EcoRI jest enzymem restrykcyjnym
z Escherichia coli, a BamHI pochodzi z Bacillus
amyloliąuefaciens (tab. 39-2). Pierwsze trzy lite¬
ry w nazwie enzymu restrykcyjnego składają się
z pierwszej litery nazwy rodzaju (E) i pierwszych
dwóch liter nazwy gatunku (co). Symbol ten może
T C C
I
G Ryc. 39-2. Wynik trawienia endonukleazą
restrykcyjną. Trawienie endonukleazą re¬
strykcyjną daje fragmenty DNA z końcami
* * c lepkimi (A) lub z końcami tępymi (B). Jest
III to ważna okoliczność przy opracowywaniu
T t G strategii klonowania.
być uzupełniony określeniem szczepu (R) i cyfrą
rzymską (I) w celu wskazania kolejności, w ja¬
kiej enzymy zostały odkryte (np. EcoRI, EcoRII).
Każdy enzym restrykcyjny rozpoznaje i przecina
w dwuniciowym DNA sekwencję o długości 4-7
pz. Takie przecięcia DNA dają w wyniku tępe
końce (Hpal) lub końce nakładające się, czyli
końce lepkie {BamHI), zależnie od mechanizmu
cięcia, jakim posługuje się enzym (ryc. 39-2).
Końce lepkie są szczególnie użyteczne w kon¬
struowaniu hybrydowych, czyli chimerycznych
cząsteczek DNA (p. niżej). Jeśli w obrębie danej
cząsteczki DNA nukleotydy są rozmieszczone
przypadkowo, można wyliczyć, jak często dany
Tabela 39-3. Enzymy stosowane w badaniach opartych na technice rekombinacji DNA1
Enzym
Reakcja
Podstawowe zastosowanie
Fosfataza alkaliczna
Defosforylacja końców 5' DNA i RNA
Usuwanie grup 5'-P04 przed znakowaniem kinazą;
także w celu uniknięcia samoligacji
Nukleaza BAL 31
Degradacja końców 3' i 5' DNA
Progresywne skracanie cząsteczek DNA
Ligaza DNA
Kataliza wiązania między cząsteczkami DNA
Łączenie cząsteczek DNA
Polimeraza DNA I
Synteza dwuniciowego DNA
z jednoniciowego DNA
Synteza dwuniciowego cDNA; nick translation;
tworzenie tępych końców z lepkich końców
DNazal
W odpowiednich warunkach wytwarzanie
jednoniciowych nacięć w DNA
Nick translation: mapowanie miejsc nadwrażliwych;
mapowanie oddziaływań biatko-DNA
Egzonukleaza III
Usuwanie nukleotydów od końców 3' DNA
Sekwencjonowanie DNA; mapowanie oddziaływań
DNA-białko
Egzonukleaza X
Usuwanie nukleotydów z końców 5' DNA
Sekwencjonowanie DNA
Kinaza polinukleotydowa
Przenoszenie końcowego fosforanu (pozycja y)
z ATP do grup 5'-0H DNA lub RNA
Znakowanie końców DNA lub RNA za pomocą 32P
Odwrotna transkryptaza
Syntetyzuje DNA na matrycy RNA
Synteza cDNA z mRNA; mapowanie końca 5' RNA
Nukleaza S1
Degraduje jednoniciowy DNA
Usuwanie struktur „spinka do włosów” w syntezie
cDNA; mapowanie RNA (zarówno końca 5', jak i 3')
Transferaza terminalna
Dodaje nukleotydy do końców 3' DNA
Dodawanie ogonów homopolimerowych
1 Adaptowano za zgodą z: Emery AEH: Str. 41 w: Introduction to Recombinant DNA. Wiley, 1984. Copyright © 1984 John Wiley & Sons
Limited. Reprodukowane za pozwoleniem.
488 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
enzym będzie przecinał całą cząsteczkę DNA.
Dla każdego miejsca w cząsteczce DNA są czte¬
ry możliwości (A, C, G lub T); zatem enzym re¬
strykcyjny, który rozpoznaje sekwencję o długoś¬
ci 4 pz, będzie przecinał DNA średnio co 256 pz
(44), natomiast inny enzym, który rozpoznaje
sekwencję o 6 pz, będzie przecinał co 4096 pz
(46). Dany fragment DNA ma charakterystyczny
liniowy układ miejsc cięcia różnych enzymów, co
pozwala na konstruowanie map restrykcyjnych.
Jeśli DNA jest trawiony przez dany enzym, to
końce wszystkich fragmentów DNA mają tę samą
sekwencję. Uzyskane fragmenty mogą być wy¬
izolowane w wyniku rozdziału elektroforetycz-
nego strawionego DNA w żelu agarozowym lub
poliakrylamidowym (przenoszenie fragmentów
DNA jest omówione dalej); trawienie jest podsta¬
wowym krokiem w procesie klonowania i jedną
z głównych procedur, w których znajdują zasto¬
sowanie enzymy restrykcyjne.
Wiele innych enzymów działających na DNA
i RNA tworzy ważną część repertorium technik re¬
kombinacji DNA. Odniesienia do wielu z nich znaj¬
dują się w tym i następnych rozdziałach (tab. 39-3).
W tworzeniu chimerycznych cząsteczek
DNA są stosowane enzymy restrykcyjne
i ligaza DNA
Technika łączenia (spajania lub ligacji) DNA
z wykorzystaniem lepkich końców jest łatwa,
ale często trzeba zastosować specjalne metody,
aby uniknąć problemów nieodłącznie z nią zwią¬
zanych. Lepkie końce wektora mogą się łączyć
ponownie same z sobą, z pominięciem wprowa¬
dzanych fragmentów DNA. Również fragmenty
DNA mogą się łączyć za pośrednictwem lepkich
końców, dając w ten sposób tandemowe, hetero-
genne inserty. Ponadto lepkie końce mogą być
niemożliwe do wytworzenia albo mogą występo¬
wać w nieodpowiednim położeniu. Aby uniknąć
tych problemów, stosuje się enzym wytwarzają¬
cy tępe końce, do których następnie dodaje się
nowe końcówki, stosując inny enzym - terminal¬
ną transferazę. Jeżeli do końców 3' wektora doda
się poli d(G), a poli d(C) do końców 3' obcego
(wprowadzanego) DNA, to obie cząsteczki mogą
się połączyć tylko ze sobą i w ten sposób prob¬
lemy zostają ominięte. Taka procedura nazywana
jest dodawaniem ogonów homopolimerowych.
W niektórych przypadkach do tępych końców
DNA przyłącza się syntetyczne oligonukleotydo-
we łączniki (linkery), zawierające sekwencję dla
odpowiedniego enzymu restrykcyjnego. Bezpo¬
średnie związanie tępych końców uzyskuje się za
pomocą enzymu - ligazy DNA bakteriofaga T4.
Technika ta, chociaż trudniejsza niż wiązanie koń¬
ców lepkich, jest o tyle lepsza, że można dzięki
niej łączyć dowolne pary końców. Wadą jej zaś
jest brak kontroli nad orientacją insertu lub nad
liczbą połączonych cząsteczek, a także trudności
w odzyskaniu insertu.
Klonowanie to namnażanie DNA
Klon jest to duża populacja identycznych cząste¬
czek, bakterii lub komórek, które pochodzą od
wspólnego przodka. Klonowanie molekularne
pozwala na wyprodukowanie dużej liczby iden¬
tycznych cząsteczek DNA, które następnie mogą
być charakteryzowane albo użyte do innych ce¬
lów. Technika ta opiera się na możliwości wy¬
twarzania chimerycznych, czyli hybrydowych
cząsteczek DNA w wektorach (przenośnikach)
do klonowania, którymi zwykle są plazmidy
bakteryjne, fagi albo kosmidy, ulegające replika¬
cji w komórce gospodarza pod kontrolą swoich
własnych systemów. W ten sposób chimeryczny
DNA jest namnażany (amplifikowany). Ogólną
procedurę przygotowania wektorów służących do
klonowania przedstawiono na ryc. 39-3.
Bakteryjne plazmidy są to małe, koliste czą¬
steczki dwuniciowego DNA, których natural¬
ną funkcją jest nadawanie komórce gospodarza
oporności na antybiotyki. Plazmidy mają wiele
właściwości, które są niezwykle użyteczne do
konstrukcji wektorów służących do klonowa¬
nia. Występują one w postaci pojedynczych lub
licznych kopii i replikują niezależnie od bakte¬
ryjnego DNA. Znane są kompletne sekwencje
DNA licznych plazmidów; dzięki temu można
precyzyjnie wybrać miejsca cięcia enzymami re¬
strykcyjnymi; miejsca te służą do wprowadzania
obcego DNA. Plazmidy są mniejsze niż chromo¬
som gospodarza (bakterii) i dzięki temu można je
łatwo oddzielić od bakteryjnego DNA, a żądany
fragment DNA bez trudu odzyskać poprzez prze¬
cięcie plazmidu enzymem swoistym dla miejsca
restrykcyjnego, w które pierwotnie włączono
obcy odcinek DNA.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 489
Kolisty plazmidowy DNA Liniowy plazmidowy DNA
z lepkimi końcami
Cząsteczka plazmidowego DNA zawierająca insert ludzkiego DNA
(cząsteczka zrekombinowanego DNA)
T T A A
Fragmenty ludzkiego DNA przecięte
tą samą endonukleazą restrykcyjną
i zawierające te same lepkie końce
Ryc. 39-3. Użycie nukleaz restrykcyjnych w celu uzyskania nowych, rekombinowanych, czyli chimerycznych cząsteczek DNA. Pla¬
zmidowy DNA, po ponownym wprowadzeniu do komórki bakteryjnej (w procesie zwanym transformacją), replikuje się nie tylko sam,
ale replikuje również fizycznie wbudowany insert DNA. Ponieważ ponowne połączenie lepkich końców - jak to pokazano - regeneruje
tę samą sekwencję DNA, rozpoznawaną przez pierwotnie użyty enzym restrykcyjny, sklonowany insert DNA może być ponownie pre¬
cyzyjnie wycięty z kolistego plazmidowego rekombinanta tą samą endonukleazą. Jeśli jako źródła DNA ludzkiego użyje się mieszaniny
wszystkich fragmentów DNA, uzyskanych przez trawienie całego ludzkiego DNA pojedynczą nukleazą restrykcyjną, to można uzyskać
miliony różnych typów cząsteczek zrekombinowanego DNA, a każdy z typów będzie czysty (jednorodny) w swoim bakteryjnym klonie.
(Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Cohen SN: The manipulation of genes. Sci Am [July] 1975;233:25. Copyright © The
Estate of Bunji Tagawa).
Fagi zawierają zwykle cząsteczki liniowego
DNA, do których w wielu miejscach restrykcyj¬
nych może zostać wbudowany obcy DNA. Chime¬
ryczny DNA otrzymuje się po przejściu faga przez
cykl lityczny i po uzyskaniu dojrzałych, zakaź¬
nych cząsteczek fagowych. Wyższość wektorów
fagowych polega na tym, że do plazmidów można
wbudowywać fragmenty DNA o długości 6-10 kz,
zaś do fagów - fragmenty o długości 10-20 kz;
ograniczenie to jest narzucone przez ilość DNA,
która może zostać upakowana w główce faga.
Jeszcze dłuższe fragmenty DNA mogą być
klonowane w kosmidach, które łączą najlepsze
cechy plazmidów i fagów. Kosmidy są to plazmi¬
dy, które mają sekwencje DNA, tzw. miejsca cos,
niezbędne do upakowania X DNA w cząsteczce
faga. Wektory te namnażają się w bakteriach
w postaci plazmidów, ale ponieważ usunięto
z nich większą część niepotrzebnego DNA, do
główki cząsteczki może być upakowane wię¬
cej chimerycznego DNA. Wcale nierzadkie są
kosmidy, które przenoszą inserty chimeryczne¬
go DNA o długości 35-50 kz. Jeszcze większe
fragmenty DNA mogą być wprowadzane do
sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC),
sztucznych chromosomów drożdżowych (YAC)
lub też wektorów opartych na bakteriofagu PI
z E.coli (PAC). Wektory te włączają oraz na¬
mnażają inserty o długości przekraczającej nawet
kilkaset kilozasad i w znacznym stopniu zastą¬
piły wektory plazmidowe, fagowe i kosmidowe
w niektórych zastosowaniach klonowania i ma¬
powania genów. Zestawienie porównawcze tych
wektorów podano w tab. 39-4.
490 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Tabela 39-4. Pojemności wektorów powszechnie używanych
do klonowania
Wektor
Wielkość insertu DNA (kz)
Plazmid pBR322
0,01-10
X Charon 4A
10-20
Kosmidy
35-50
BAC, P1
50-250
YAC
500-3000
Ponieważ wprowadzenie obcego DNA do wek¬
tora może przeszkadzać w jego funkcjonowaniu,
należy przy klonowaniu mieć wzgląd na utrzy¬
manie podstawowych funkcji wektora. Ta sama
koncepcja jest jednak wykorzystywana także
w technice selekcyjnej. Na przykład popularny
wektor plazmidowy pBR322 ma geny oporności
zarówno dla tetracykliny (tet), jak i dla ampi¬
cyliny (amp). Jako miejsce insercji dla fragmen¬
tu obcego DNA zwykle wybiera się pojedyncze
miejsce dla enzymu restrykcyjnego Pstl w obrębie
genu oporności na ampicylinę. Oprócz uzyskania
lepkich końców (tab. 39-2 i ryc. 39-2), wbudowa¬
ny w to miejsce obcy DNA przerywa sekwencję
genu oporności na ampicylinę i sprawia, że bakte¬
ria przenosząca taki plazmid staje się wrażliwa na
ampicylinę (ryc. 39-4). Rodzicielski plazmid, któ¬
ry nadaje bakteriom oporność na dwa antybiotyki,
może więc być łatwo oddzielony od chimeryczne¬
go plazmidu, który jest oporny jedynie na tetracy¬
klinę. Wektory YAC wykazują zdolność selekcji,
replikacji i segregacji, działając zarówno w bakte¬
riach, jak i komórkach drożdży, mogą zatem być
namnażane w obu tych typach organizmów.
Oprócz wektorów opisanych w tab. 39-4,
które są przeznaczone głównie do namnażania
w komórkach bakteryjnych, zostały także stwo¬
rzone wektory do namnażania insertów geno¬
wych (cDNA) oraz ekspresji białek w komórkach
ssaków. Wszystkie te wektory skonstruowano
w oparciu o różne eukariotyczne wirusy, których
genomy zawierają DNA i RNA. Godnym uwagi
przykładem takich wektorów wirusowych są te,
przy których konstruowaniu wykorzystano genom
Gen oporności Gen oporności
Ryc. 39-4. Metoda przesiewu rekombinantów w celu potwierdzenia insercji fragmentów DNA. Do plazmidu pBR322 wbudowano w uni¬
katowe miejsce Pstl fragment obcego DNA. Przerwało to gen kodujący białko nadające bakterii gospodarza oporność na ampicylinę.
W wyniku tego plazmid chimeryczny nie jest w stanie przeżyć po wysianiu bakterii na pożywkę zawierającą ten antybiotyk. W celu
odróżnienia klonów plazmidowych, które zawierają insert może być zatem brana pod uwagę zróżnicowana wrażliwość na tetracyklinę
i ampicylinę. Na podobnym schemacie postępowania oparte jest tworzenie (z zachowaniem prawidłowej ramki odczytu) fuzyjnego
konstruktu plazmidu z insertem DNA, kodującym peptydowy fragment uzupełniający nieaktywny, skrócony fragment enzymu p-galak-
tozydazy. Prowadzi to, po wysianiu bakterii na płytki z agarem zawierającym hydrolizowany przez p-galaktozyd barwnik, do pojawienia
się białych i niebieskich kolonii. Kolonie bakterii zawierających p-galaktozydazę są niebieskie; kolonie takie zawierają więc plazmid, do
którego udało się wstawić insert DNA.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 491
adenowirusów (DNA) lub retrowirusów (RNA).
Jakkolwiek są one nieco ograniczone, jeśli cho¬
dzi o rozmiar sekwencji DNA, które mogą być
doń wprowadzone, wirusowe wektory służące do
klonowania w komórkach ssaków nadrabiają ten
mankament dzięki zdolności zakażania wielu róż¬
nych typów komórek. To właśnie sprawia, że tego
typu wektory są używane do doświadczeń nad te¬
rapią genową.
Biblioteka stanowi zbiór
zrekombinowanych klonów
Zastosowanie kombinacji enzymów restrykcyj¬
nych i różnych wektorów do klonowania pozwala
na upakowanie w wektorze całego genomu dane¬
go organizmu. Zbiór takich różnych zrekombino¬
wanych klonów nazywa się biblioteką. Biblioteka
genomowa jest przygotowywana z całkowitego
DNA linii komórkowej lub tkanki. Z kolei biblio¬
teka cDNA zawiera kopie komplementarnego
cDNA, odpowiadające populacji mRNA w danej
tkance. Biblioteki genomowe często uzyskuje
się dzięki częściowemu trawieniu całkowitego
DNA enzymami restrykcyjnymi, które tną DNA
z dużą częstością (np. Taql przecinający sekwen¬
cje o długości czterech zasad). Zamysłem jest tu¬
taj uzyskanie raczej dużych fragmentów, tak aby
większość genów pozostała w stanie nienaruszo¬
nym. Do skompletowania takich bibliotek najlep¬
sze są wektory B AC, YAC i P1, ponieważ można
w nie wbudować bardzo duże fragmenty DNA, co
daje większe prawdopodobieństwo udanego wy¬
izolowania nienaruszonego genu w pojedynczym
fragmencie DNA.
Wektor, w którym białko jest syntetyzowane
przez gen wprowadzony techniką rekombinacji
DNA, nazywa się wektorem ekspresyjnym. Takie
wektory są obecnie powszechnie stosowane w celu
wykrycia swoistych cząsteczek cDNA w bibliote¬
kach i do wytwarzania białek technikami inżynierii
genetycznej. Wektory te są tak konstruowane, aby
zawierały bardzo aktywne promotory indukowane
oraz będące we właściwej fazie kodony inicjujące
translację, a także sygnały terminacji transkrypcji
i translacji, i jeśli zachodzi potrzeba, odpowiednie
sygnały do przekształceń białka. W niektóre wek¬
tory ekspresyjne są wbudowywane nawet geny
inhibitorów proteazy, aby w ten sposób uzyskać
większe ilości końcowego produktu.
Do przeszukiwania bibliotek
w celu wykrycia określonych genów
lub cząsteczek cDNA są stosowane
specjalne sondy
Jako „sondy” do poszukiwania w bibliotekach
określonych genów lub cząsteczek cDNA lub do
ilościowego określania DNA lub RNA rozdzielo¬
nych podczas elektroforezy w żelach są stosowa¬
ne różnorakie cząsteczki. Są to na ogół fragmenty
DNA lub RNA znakowane przy użyciu nukleoty-
du zawierającego 32P lub, jak to się obecnie czyni
coraz częściej, wyznakowanego fluorescencyjnie.
Należy zaznaczyć, że żadna z tych modyfikacji
nie ma wpływu na zdolność znakowanych sond
do hybrydyzowania. Aby sonda była użyteczna
i skuteczna, musi rozpoznawać komplementarną
sekwencję. Do przeszukania biblioteki cDNA,
w celu znalezienia długich fragmentów cDNA,
lub biblioteki genomowej, w celu znalezienia
sekwencji komplementarnej kodującego regionu
genu, mogą zostać użyte sondy cDNA syntetyzo¬
wane na swoistych mRNA jako matrycach. Popu¬
larną techniką wyszukiwania określonych genów
jest wybranie krótkiej sekwencji aminokwasowej
i, na podstawie zestawienia kodonów dla tej sek¬
wencji (p. rozdz. 37), sporządzenie sondy oligo-
nukleotydowej, która wykryje odpowiadający
fragment DNA w bibliotece genomowej. Jeśli sek¬
wencje sondy komplementarnej dokładnie pasują
do sekwencji poszukiwanych, to sondy o długości
15-20 nukleotydów będą z nimi hybrydyzowały.
Do wykrywania fragmentów DNA przy użyciu
techniki hybrydyzacji typu Southern i do ilościo¬
wego wykrywania RNA techniką typu northem
są stosowane sondy cDNA. Jako sondy mogą być
także użyte swoiste przeciwciała, pod warunkiem
że wektor syntetyzuje cząsteczki białka, które są
przez te przeciwciała rozpoznawane.
Techniki hybrydyzacji pozwalają
na uwidacznianie swoistych
fragmentów DNA i RNA
Uwidocznienie swoistych fragmentów DNA
i RNA spośród wielu tysięcy cząsteczek „zanie¬
czyszczających” wymaga użycia wielu technik,
które popularnie określa się ogólnym terminem
„biot transfer”, dotyczącym przenoszenia sub¬
stancji z wykorzystaniem zjawisk kapilarnych. Na
492 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Technika Southerna Technika northern Technika western
l
| Przeciwciało*
Dodanie
sondy
Autoradiogram
Ryc. 39-5. Techniki transferu (blottingu) i hybrydyzacji kwasów
nukleinowych i białek. W technice Southerna wyizolowany z linii
komórkowej lub tkanki DNA trawi się jednym lub wieloma enzy¬
mami restrykcyjnymi. Mieszaninę inkubacyjną nanosi się do stu¬
dzienek w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym i eksponuje
na działanie pola elektrycznego prądu stałego. Dzięki ładunkowi
ujemnemu DNA wędruje w kierunku katody (+); małe fragmen¬
ty wędrują najszybciej. Po odpowiednim czasie DNA denaturuje
się łagodną alkalizacją. Następnie, opracowaną przez Southerna
techniką transferu opartego na wykorzystaniu sił kapilarnych
(ang. biot transfer), DNA zostaje przeniesiony na kawałek folii
nitrocelulozowej lub nylonowej w taki sposób, aby zachować
dokładny układ (replikę) prążków na żelu. Następnie folię pod¬
daje się wygrzewaniu, w wyniku czego DNA wiąże się z nią, po
czym folia zostaje eksponowana na działanie znakowanej sondy
cDNA, która hybrydyzuje z komplementarnymi fragmentami DNA
związanego z folią. Po dokładnym przemyciu folii wykonuje się
autoradiografię, w wyniku której na kliszy rentgenowskiej ujaw¬
niają się swoiste prążki odpowiadające fragmentom DNA, które
rozpoznały sekwencje cDNA sondy. Koncepcja leżąca u podstaw
techniki przenoszenia RNA, czyli metody northern, jest podob¬
na. Przed przeniesieniem RNA jest poddawany elektroforezie.
Technika przeniesienia wymaga nieco innego postępowania niż
przeniesienie DNA, aby przede wszystkim pozostawić nietknięte
cząsteczki RNA; ogólnie metoda ta jest nieco trudniejsza. Prze¬
noszenie białek, czyli technika western, polega na elektroforezie
i przeniesieniu białek na folię nitrocelulozową, a następnie użyciu,
jako sondy, swoistego przeciwciała lub innych sond molekular¬
nych. (Gwiazdki oznaczają radioaktywne lub fluorescencyjne
znakowanie). W przypadku transferu southwestern (patrz tekst),
białko przeniesione metodą western eksponuje się następnie
na wyznakowany kwas nukleinowy; powstają kompleksy białek
z kwasami nukleinowymi, które wykrywa się za pomocą auto-
radiografii.
rycinie 39-5 przedstawiono procedury blottingu
metodą Southerna (wykrywanie DNA), metodą
northern (wykrywanie RNA), a także pokrewnej
metody western (wykrywanie białka). (Pierw¬
sza technika uzyskała nazwę od nazwiska bada¬
cza, który ją opracował, a inne nazwy wzięły się
z przekornego żargonu laboratoryjnego i zostały
zaakceptowane). Metody te są użyteczne w ozna¬
czaniu liczby kopii genu w danej tkance albo okre¬
ślaniu, czy w danym genie nastąpiły duże zmiany
strukturalne (delecja, insercja czy rearanżacja).
W pewnych przypadkach, jeśli została zmienio¬
na swoista zasada, w wyniku czego zmieniło się
miejsce restrykcyjne, metody te mogą wykryć
mutację punktową. Techniki transferu i hybry¬
dyzacji typu northern i western są stosowane do
określenia wielkości i ilości swoistych cząsteczek
RNA lub białek. Czwarta technika hybrydyzacyj-
na, southwestern, służy do badania oddziaływań
białko-DNA. Rozdzielone elektroforetycznie biał¬
ka zostają w niej poddane renaturacji, a następnie
analizie oddziaływań ze swoistą, wyznakowaną
sondą DNA.
Hybrydyzacja kolonii lub hybrydyzacja płyt¬
kowa jest metodą stosowaną do rozpoznawania
i oczyszczania swoistych klonów. Płytki agarowe
z koloniami wyhodowanych bakterii pokrywa się
folią nitrocelulozową. Komórki każdej kolonii
przylepiają się do folii i zostają, wskutek podgrza¬
nia, utrwalone na niej na stałe; jednoczesne po¬
działanie roztworem NaOH doprowadza do lizy
komórek i denaturacji DNA oraz pozwala na jego
hybrydyzację z sondą. Po dodaniu radioaktywnej
sondy na folię, hybrydowy kompleks jest prze¬
mywany i lokalizowany metodą autoradiografii.
Po zidentyfikowaniu na autoradiogramie plamki
odpowiadającej kolonii, tę ostatnią można wyod¬
rębnić z płytki. Podobna strategia jest stosowana
do identyfikacji fragmentów DNA w bibliote¬
kach fagowych. Kolejne etapy tej procedury dają
w wyniku wyizolowany klon (kolonie bakteryjne)
lub kolonię pochodzącą od indywidualnego faga.
Wszystkie metody hybrydyzacji, omawia¬
ne w tej części, zależą od swoistych, opisanych
wcześniej właściwości parowania zasad kom¬
plementarnych nici kwasów nukleinowych. Do¬
kładne sparowanie łatwo daje hybrydę odporną
na wysoką temperaturę w trakcie reakcji hybry-
dyzowania i przemywania. Kompleksy takie two¬
rzą się również w przypadku małych stężeń soli.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 493
Parowanie zasad, przebiegające z mniejszą do¬
kładnością, nie toleruje takich wymagających
warunków, tj. podwyższonej temperatury i ma¬
łych stężeń soli; w takim przypadku hybrydyzacja
albo nie zachodzi, albo hybrydy zostają rozerwane
w czasie przemywania. Zmiana warunków hybry¬
dyzacji i przemywania może być wykorzystana
do wykrywania rodzin genów wykazujących pe¬
wien stopień homologii. Takie podejście pozwala
również na między gatunkowe porównania danego
genu. Opracowane zostały warunki hybrydyzacji
umożliwiające wykrywanie nawet pojedynczych
niedopasowań w parze zasad między sondą i sek¬
wencją docelową.
Do oznaczania sekwencji DNA
wykorzystuje się techniki ręczne
i automatyczne
Odcinki cząsteczek określonego DNA, uzyskane
techniką rekombinacji DNA, mogą być analizo¬
wane pod kątem ich sekwencji nukleotydowej.
Metoda ta wymaga dysponowania dużą liczbą
identycznych cząsteczek DNA. Spełnienie tego
wymogu jest możliwe, jeśli sklonuje się dany
fragment jedną z wyżej opisanych technik. En¬
zymatyczna metoda ręczna (metoda Sangera)
sekwencjonowania DNA wykorzystuje swoiste
dideoksynukleotydy, które kończą syntezę nici
DNA w miejscu swoistego nukleotydu w trakcie
syntezy nici na oczyszczonej matrycy kwasu nu¬
kleinowego. Reakcje są tak dobrane, że uzyskuje
się populację fragmentów DNA reprezentujących
zatrzymanie syntezy na każdym nukleotydzie.
Wprowadzając radioaktywny znacznik w miejsce
znajdujące się naprzeciwko miejsca terminacji,
można uzyskać oddzielne fragmenty, segrego¬
wane pod względem wielkości, za pomocą elek¬
troforezy w żelu poliakrylamidowym. Wykonuje
się następnie autoradiogram, na którym każdy
z fragmentów tworzy pasmo. Pasma te, czytane
po kolei, dają sekwencję DNA (p. ryc. 39-6). Inna
metoda ręczna (Maxama i Gilberta) polega na
wykorzystaniu do przecinania DNA w miejscu
Reakcje z udziałem radioznakowanych:
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
Zasada kończąca
Sekwencja nici oryginalnej:
-A-G-T - C- T - T- G- G- A- G- C- T-3'
Ryc. 39-6. Sekwencjonowanie DNA metodą opracowaną przez Sangera. Drabinkowy układ prążków na żelu od dołu do góry przedsta¬
wia stopniowo wydłużający się fragment oryginalnej nici DNA. Wiedząc, która ze swoistych reakcji dideoksynukleotydowych została
wykonana w celu uzyskania mieszaniny fragmentów, można oznaczyć sekwencję nukleotydów od końca nieznakowanego w kierunku
końca znakowanego (*) na podstawie „odczytywania” żelu w kierunku do góry. Sekwencjonowanie automatyczne opiera się na „odczy¬
tywaniu" deoksynukleotydów zmodyfikowanych chemicznie. Reguły parowania zasad wg Watsona-Cricka (A-T, G-C) dyktują sekwencję
drugiej (komplementarnej) nici. (Gwiazdki oznaczają miejsce znakowania izotopem radioaktywnym).
494 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
określonych nukleotydów metod chemicznych.
W procedurach zautomatyzowanego sekwen-
cjonowania DNA stosowane są techniki, które
nie wymagają używania radioizotopów. Zwykle
stosuje się zautomatyzowaną metodę, wykorzy¬
stującą cztery różne znaczniki fluorescencyjne,
reprezentujące kolejne nukleotydy. Emitują one
specyficzne promieniowanie po pobudzeniu wiąz¬
ką lasera, które można analizować komputerowo.
Synteza oligonukleotydów jest obecnie
metoda rutynowa
Zautomatyzowana synteza chemiczna umiarkowa¬
nie długich (ok. 100 nukleotydów) oligonukleoty¬
dów o ściśle określonej sekwencji jest dzisiaj ru¬
tynową metodą laboratoryjną. Każdy cykl syntezy
zajmuje kilka minut, tak że cała cząsteczka może
być wytworzona przez syntetyzowanie względnie
krótkich odcinków, które następnie można zligo-
wać. Takie oligonukleotydy są obecnie niezbędne
do sekwencjonowania DNA, przeszukiwania bi¬
bliotek, badania wiązań DNA-białko, określania
przesunięć w mobilności DNA, polimerazowej
reakcji łańcuchowej (p. niżej), ukierunkowanej
mutagenezy, syntezy sztucznych genów i licznych
innych zastosowań.
Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR)
pozwala na amplifikację sekwencji DNA
Polimerazowa reakcja łańcuchowa jest metodą
służącą do namnażania (amplifikacji) określonych
docelowych sekwencji DNA. PCR pozwala na
czułe, wybiórcze i niezwykle szybkie namnożenie
pożądanej sekwencji DNA. Swoistość tej reakcji
wynika z użycia dwóch primerów oligonukleoty-
dowych, które hybrydyzujądo komplementarnych
sekwencji położonych na przeciwległych niciach
DNA i flankujących interesującą nas sekwencję
docelową (ryc. 39-7). Próbka DNA jest najpierw
podgrzewana, aby rozdzielić obie nici, następnie
sekwencje primerów wiążą się z DNA i każda
z nici jest kopiowana przez polimerazę DNA,
począwszy od miejsca primera. Każda z dwóch
nici DNA służy jako matryca do syntezy nowego
DNA, począwszy od obu primerów. Powtarzane
cykle denaturacji cieplnej, łączenia primerów do
ich sekwencji komplementarnych i wydłużania
sekwencji primerów przez polimerazę DNA dają
ostatecznie wykładnicze namnożenie odcinków
DNA o określonej długości. Na początku stoso¬
wania reakcji PCR używano polimerazy DNA
z E. coli\ polimeraza ta była niszczona przez każ¬
dy cykl denaturacji cieplnej. Zastąpienie jej ter-
mostabilnąpolimerazą DNA z Thermus aąuaticus
- organizmu, który żyje i replikuje się w temp.
70-80°C, pozwoliło ominąć problem wrażliwości
enzymu na temperaturę i zautomatyzować metodę
PCR, ponieważ reakcja prowadzona przy użyciu
tej polimerazy może przebiegać w temp. 70°C.
Pozwoliło to także zwiększyć swoistość i wydaj¬
ność namnożonego DNA.
Można uzyskać zamplifikowane sekwencje
DNA krótkie (np. 50-100 pz) oraz długie (10 kz).
Dwadzieścia cykli w reakcji PCR daje amplifika¬
cję rzędu 106, a trzydzieści cykli - rzędu 109. Re¬
akcja PCR pozwala na amplifikację i analizę DNA
z pojedynczej komórki, cebulki włosowej lub
plemnika. Oczywiste stają się zatem zastosowania
reakcji PCR w medycynie sądowej. Metoda PCR
jest także stosowana do: 1) wykrywania czynni¬
ków zakaźnych, zwłaszcza latentnych wirusów,
2) prenatalnej diagnostyki genetycznej, 3) wy¬
krywania polimorfizmu alleli, 4) precyzyjnego
typowania tkanek do transplantacji, 5) badań nad
ewolucją, z wykorzystaniem archeologicznych
próbek DNA oraz 6) analiz RNA po skopiowaniu
RNA i ilościowym pomiarze mRNA metodą tzw.
RT-PCR (tj. kopii cDNA uzyskanych z mRNA
dzięki zastosowaniu odwrotnej transkryptazy re¬
tro wirusowej). Techniki PCR są także często wy¬
korzystywane w badaniach z zakresu nauk pod¬
stawowych; z pewnością pojawi się wiele innych
możliwości zastosowania tej metody.
PRAKTYCZNYCH ZASTOSOWAŃ TECHNIKI
REKOMBINACJI DNA JEST WIELE
Wyizolowanie określonego genu z całego genomu
wymaga takiej techniki, która umożliwia rozróż¬
nianie jednej części na milion. Rozpoznanie ob¬
szaru regulatorowego, który może mieć długość
tylko 10 pz, wymaga czułości rozróżniania wyno¬
szącej jedna część na 3X108; taka choroba, jak nie¬
dokrwistość sierpowata, spowodowana mutacją
pojedynczej zasady, wymaga z kolei czułości rzę¬
du jedna część na 3x109. Technika rekombinacji
DNA jest całkowicie wystarczająca, aby sprostać
takim wymogom.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 495
^ V V Sekwencja docelowa V V V
START WV < 11111 |TT -vW
A/W
< \''''lT]~ -vW
vw—^"""^— \a/\a
TTummiii mu
. -vW
T
cykli^A^niiriiiiiiiiiiiiiiiiiiiiip^ v\AA
VVV piiiijiiiiiiiiiiiiiniiiiiiiiiir^^
I
WV —-nraraWW
L2 VsA^inmi1- c=n
~*~fnn-nrl
VW—
-WSA
rmrnpmj ~\AAA
.aa PrrrrrrlTrTTl Tl lilii 11 ] [JLU-LLL|
pcnmp 1111111111U U Frn-i-rrl ^^a
WNy_ limdlllllllllllllllllllllffllt^^
I
wv
<" 11111111" -vw
WV— 1 .. i
I—I ™
wv^-
~ j 1111 n~j
- "Mirnirl
"*irnnrl
I
-vw
-WNA
-.1 luiIiIT
IititiiIt
- 101111 \
lu lilii"
IhiiiiIt
l_|iiiiii| ^/w
_|i 11111|
^ 111111 j
_| i i i i i i |
^TTTn j sAAA
_j I I I I I I I
_l I I I I I I I -vw
IIIIIIMIIM|AA/a
Mapowanie genów pozwala na
zlokalizowanie genów w określonych
chromosomach
Zlokalizowanie określonych genów umożliwia
zatem sporządzenie mapy ludzkiego genomu.
Dzięki temu uzyskuje się wiele informacji uży¬
tecznych przy określaniu chorób występujących
u człowieka. Wykorzystuje się przy tym dwie
techniki: hybrydyzację komórek somatycznych
oraz hybrydyzację in situ. Hybrydyzacja in situ
jest prostszą i bardziej bezpośrednią procedurą,
w której radioaktywna sonda jest dodawana do
rozproszonych na powierzchni szkiełka mikrosko¬
powego chromosomów metafazowych. Dokładne
miejsce hybrydyzacji określa się, nakładając na
szkiełko emulsję fotograficzną i naświetlając ją,
a następnie porównując rozmieszczenie ziarnisto¬
ści obrazu z histologiczną identyfikacją chromo¬
somów. Techniką o bardzo dużej czułości, rów¬
nież używaną do tego celu, jest fluorescencyjna
hybrydyzacja in situ (FISH). Pozwala ona czę¬
sto na umiejscowienie genu w określonym prążku
lub regionie chromosomu. Niektóre z ludzkich
genów, zlokalizowane tymi metodami, przedsta¬
wiono w tab. 39-5.
W tabeli tej przedstawiono jedynie wybrane
próbki, ponieważ w wyniku dokonanego niedaw¬
no sekwencjonowania całego ludzkiego genomu
zmapowano już tysiące genów. Po zlokalizowaniu
defektu w określonym regionie DNA, mającym
charakterystykę genu (ryc. 39-1), można skon¬
struować gen syntetyczny i uzyskać jego ekspresję
w odpowiednim wektorze oraz określić jego funk¬
cję. Można też domniemany peptyd zsyntetyzo-
wać na podstawie układu otwartej ramki odczytu
w obrębie regionu kodującego. W celu zbada¬
nia, czy taki peptyd ulega ekspresji u zdrowych
Ryc. 39-7. Schemat polimerazowej reakcji łańcuchowej wyko¬
rzystywanej do amplifikacji określonych sekwencji genowych.
Dwuniciowy DNA jest podgrzewany w celu rozdzielenia na poje¬
dyncze nici. Nici te wiążą dwa określone primery, które są kom¬
plementarne do swoistych sekwencji na przeciwległych niciach
i które określają fragment przeznaczony do amplifikacji. Polime-
raza DNA wydłuża primery w obu kierunkach i syntetyzuje dwie
nici komplementarne do dwóch nici oryginalnych. Cykl ten jest
powtarzany wielokrotnie i daje ostatecznie zamplifikowany pro¬
dukt o określonej długości sekwencji. Należy zwrócić uwagę, że
oba primery występują w nadmiarze.
496 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Tabela 39-5. Umiejscowienie ludzkich genów w chromosomach1
Gen
Chromosom
Choroba
Insulina
11 p15
Prolaktyna
6p23-q12
Hormon wzrostu
17q21 -qter
Niedobór hormonu wzrostu
a-Globina
16p12-pter
a-Talasemia
p-Globina
11 p12
p-Talasemia, niedokrwistość sierpowata
Deaminaza adenozynowa
20q13-qter
Niedobór deaminazy adenozynowej
Hydroksylaza fenyloalaniny
12q24
Fenyloketonuria
Fosforybozylotransferaza
Xq26-q27
Zespół Lescha-Nyhana
hipoksantynowo-guaninowa
Segment G8 DNA
4p
Pląsawica Huntingtona
1 Tabela ta przedstawia chromosomalne umiejscowienie niektórych genów w chromosomach i choroby związa¬
ne z niedoborem lub nieprawidłowym wytwarzaniem produktów genowych. Implikowany chromosom wskazuje
pierwsza cyfra lub litera. Inne cyfry i litery odnoszą się do szczegółowej lokalizacji podanej w: McKusick, Victor A,
MD: Mendelian Inheritance in Man: Catalogs of AutosomalDominant, AutosomalRecessive, andX-linkedPhenoty-
pes. Copyright © 1983 Johns Hopkins University Press. Przedrukowane za pozwoleniem Johns Hopkins University
Press.
osobników i czy nie występuje u osobników
z określonym zespołem genetycznym, można
użyć przeciwciał skierowanych przeciwko takie¬
mu peptydowi.
Określone białka mogą być wytwarzane
do celów badawczych
i diagnostycznych
Praktyczny cel przyświecający badaniom, któ¬
re prowadzi się nad rekombinowanym DNA, to
uzyskanie materiału do zastosowań biomedycz¬
nych. Technika rekombinacji ma dwie niewątpli¬
we zalety: 1. Może zapewnić materiał w dużych
ilościach, niemożliwych do otrzymania zwykłymi
metodami oczyszczania (np. interferon, tkankowy
aktywator plazminogenu). 2. Może dostarczać
materiału ludzkiego (np. insuliny, hormonu wzro¬
stu). Korzyści w obu przypadkach są oczywiste.
Chociaż podstawowym celem jest dostarczenie
produktów, na ogół białek, wykorzystywanych
w lecznictwie (insulina) lub diagnostyce (test do
wykrywania AIDS) chorób ludzi i zwierząt, albo
też w celach prewencyjnych (szczepionka prze¬
ciwko wirusowi zapalenia wątroby B), to jednak
możliwe są także inne zastosowania, mające zna¬
czenie rynkowe, zwłaszcza w rolnictwie. Przykła¬
dem są próby uzyskania, dzięki inżynierii gene¬
tycznej, roślin, które są bardziej odporne na suszę
lub ekstremalne temperatury, wydajniej asymilują
azot lub które wytwarzają nasiona zawierające
komplet niezbędnych aminokwasów (ryż, pszeni¬
ca, kukurydza itp.).
Technika rekombinacji DNA ma
zastosowanie w analizie molekularnej
chorób
A. Naturalna zmienność genowa
Sekwencje DNA cechuje naturalna zmienność,
podobnie jak jest to w przypadku innych aspek¬
tów budowy organizmu. Zmienność w sekwencji
DNA, czyli polimorfizm, występuje z częstością
1 na każdych 500 nukleotydów, czyli ok. 107 razy
na genom. Nie ulega wątpliwości, że zmienność
polega na delecjach i insercjach DNA oraz pod¬
stawieniach pojedynczych zasad. U zdrowych lu¬
dzi zmiany te zachodzą zwykle w niekodujących
regionach DNA lub w miejscach, które nie wywo¬
łują zmian funkcji kodowanego białka. Ten dzie¬
dziczny polimorfizm struktury DNA może mieć
związek z niektórymi chorobami występującymi
u osób spokrewnionych i może być wykorzystany
w poszukiwaniach swoistego genu odpowiedzial¬
nego za chorobę, jak to opisano dalej. Polimor¬
fizm ma także różne zastosowania w medycynie
sądowej.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 497
€ Gv Ay 'PP
—H—<■—B □ □ □
I 1
10 kz
B-B
Hemoglobinopatia
P°-Talasemia
Hemoglobina Lepore
(Ay8p)°-Talasemia typu III
Ryc. 39-8. Schemat zespołu genów p-globiny i uszkodzeń w niektórych zaburzeniach genetycznych. Gen p-globiny znajduje
się w chromosomie 11 w ścisłym powiązaniu z dwoma genami y-globiny i genem 5-globiny. Rodzina genów p jest ułożona
w kolejności S^s-Gy-Ay-yp-S-p-S'. Locus e ulega ekspresji we wczesnym okresie płodowym (jako a2s2). Geny y ulegają
ekspresji w życiu płodowym, dając hemoglobinę płodową (HbF, a2y2). Hemoglobina osobników dorosłych składa się z HbA
(a2P2) lub HbA2 (a252). Gen Tp jest pseudogenem, który wykazuje homologię sekwencji z p, ale zawiera mutacje, które
zapobiegają jego ekspresji. Region kontrolujący locus (LCR), znajdujący się przed (koniec 5') genem s, kontroluje szybkość
transkrypcji całego zespołu genów p-globiny. Delecje (czarne paski) w obrębie locus p powodują powstanie p-talasemii (nie¬
dobór lub brak [P°] p-globiny). Delecja genów 5 oraz p jest przyczyną powstania hemoglobiny Lepore (w której zawarta jest
tylko hemoglobina a). Inwersja (Ay5p)° w tym regionie (najdłuższy pasek) niszczy funkcję genu i także powoduje talasemię
(typ III). Każdy z typów talasemii ma tendencję do występowania w pewnych populacjach, np. delecja (Ay5p)° i inwersja
pojawiają się u osób pochodzących z Indii. Delecji występujących w tym regionie chromosomu zmapowano znacznie więcej
i każda z nich powoduje pewien typ talasemii.
B. Zmienność genowa powodująca chorobę
Genetyka klasyczna uczy, że większość chorób
o podłożu genetycznym jest spowodowana muta¬
cjami punktowymi, w wyniku których dochodzi
do syntezy wadliwych białek. Podejście to jest
nadal prawdziwe, choć należy zaznaczyć, że cho¬
roba genetyczna może być także wynikiem dez¬
organizacji któregokolwiek etapu przemian opi¬
sanych w początkowych częściach tego rozdziału
Tabela 39-6. Zmiany strukturalne w genie P-globiny
Zmiana
Upośledzona funkcja
Choroba
Mutacje
Fałdowanie białka
Niedokrwistość
punktowe
sierpowata
Kontrola transkrypcji
p-Talasemia
Mutacja typu przesunięcia
ramki odczytu oraz
nonsensowna
P-Talasemia
Przekształcanie RNA
p-Talasemia
Delecja
Wytwarzanie mRNA
P°-Talasemia
Hemoglobina
Lepore
Rearanżacja
Wytwarzanie mRNA
P-Talasemia typ III
i pokazanych na ryc. 39-1. Zagadnienie to dobrze
ilustrują badania nad genem P-globiny. Gen ten
występuje w zespole genów w chromosomie 11
(ryc. 39-8); jego bardziej szczegółową budowę
przedstawiono na ryc. 39-9. Nieprawidłowe wy¬
twarzanie P-globiny skutkuje różnorakimi choro¬
bami; jest ono spowodowane wieloma różnymi
uszkodzeniami w obrębie genu P-globiny oraz
jego otoczeniu (tab. 39.6).
C. Mutacje punktowe
Klasycznym przykładem jest choroba zwana nie¬
dokrwistością sierpowatą, spowodowana muta¬
cją tylko jednej zasady spośród 3x109 zasad skła¬
dających się na cały genom; jest to substytucja T
przez A w DNA, która następnie powoduje zmia¬
nę A na U w mRNA, odpowiadającą szóstemu
kodonowi w genie P-globiny. Zmieniony kodon
określa inny aminokwas (wahnę zamiast kwasu
glutaminowego), co powoduje nieprawidłowości
strukturalne cząsteczki P-globiny. Inne mutacje
punktowe w obrębie genu P-globiny i jego oto¬
czeniu powodują zmniejszenie, a w niektórych
przypadkach zatrzymanie wytwarzania P-globi¬
ny; w wyniku tych mutacji powstaje P-talasemia.
498 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Talasemie charakteryzują się wadami syntezy
podjednostek hemoglobiny, a P-talasemia powsta¬
je wówczas, gdy P-globina nie jest wytwarzana
w dostatecznych ilościach. Na rycinie 39-9 przed¬
stawiono mutacje punktowe, które zaburzają
rozliczne procesy składające się na wytwarzanie
normalnego mRNA (a zatem normalnego białka)
i które są uwikłane w powstawanie p-talasemii.
D. Delecje, insercje i rearanzacje DNA
Badania nad bakteriami, wirusami, drożdżami
i muszką owocową wskazują, że fragmenty DNA
w obrębie genomu mogą przemieszczać się z jed¬
nego miejsca do drugiego. Delecja krytycznego
fragmentu DNA, rearanżacja DNA w obrębie
genu albo insercja fragmentu DNA do regionu ko¬
dującego lub regulatorowego mogą wywoływać
takie zmiany w ekspresji genu, które prowadzą do
choroby. Molekularna analiza P-talasemii dostar¬
cza wielu przykładów takich procesów, a zwłasz¬
cza delecji, które są przyczyną choroby (p. ryc.
39-8). Zespół genów globiny wydaje się szcze¬
gólnie podatny na tego typu uszkodzenie. Dele¬
cje w zespole genów a-globiny, umiejscowionym
w chromosomie 16, powodują powstanie a-ta-
lasemii. Wiele typów takich delecji ma podłoże
etniczne; na przykład Europejczycy zamieszkują¬
cy na północy Europy, Filipińczycy, rasa czarna
i ludzie pochodzenia śródziemnomorskiego mają
różne typy uszkodzeń, a wszystkie z nich powo¬
dują brak hemoglobiny A i a-talasemię.
Podobną analizę można przeprowadzić w przy¬
padku wielu innych schorzeń. Mutacje punktowe
są zwykle określane na podstawie sekwencjono-
wania danego genu, choć czasem, jeśli mutacja
niszczy albo stwarza nowe miejsce restrykcyjne,
do wykazania uszkodzenia może być zastosowa¬
na technika analizy fragmentów restrykcyjnych.
Delecje lub insercje DNA, większe niż 50 pz,
często są wykrywane techniką hybrydyzacji
Southema.
E. Analiza rodowodowa
Niedokrwistość sierpowata ponownie dostarcza
doskonałego przykładu, jak technika rekombina¬
cji DNA może być wykorzystana do badań nad
chorobami człowieka. Podstawienie T przez A
w nici matrycowej DNA genu P-globiny zmienia
sekwencję w regionie, który odpowiada szóstemu
kodonowi, z sekwencji
1
CCTGAGG nić kodująca
GGAC0CC nić matrycowa
na sekwencję
CCTGTGG nić kodująca
GGAC® CC nić matrycowa
oraz niszczy miejsce rozpoznania enzymu restryk¬
cyjnego MstU (CCTnAGG; oznaczone małą pio¬
nową strzałką; tab. 39-2). Inne miejsca dla Mstll,
znajdujące się w kierunku 5f oraz 3f od miejsca
omawianego (ryc. 39-10), nie są objęte mutacją,
a zatem będą przecinane. W rezultacie inkubacja
DNA od osobników zdrowych (AA), heterozygot
00 o o
U i i
I 1
• •
I
TT T I
AA A A
0 0
JU
O
Ryc. 39-9. Mutacje w genie p-globiny powodujące p-talasemię. Gen p-globiny pokazano w orientacji od 5' do 3'. Pola zakreskowane
ilustrują regiony 5' i 3' nieulegające translacji. Czytając w kierunku od 5' do 3', pola zacienione to eksony 1-3, a pola niezacienione to
introny 1 (Ę) oraz 2 (l2). Mutacje dotyczące kontroli transkrypcji (•) są umiejscowione w regionie DNA flankującym gen od końca 5'.
Podano przykłady rozpoznanych mutacji nonsensownych (A), mutacji dotyczących przekształceń RNA (O) i przecinania RNA (o).
W niektórych regionach znaleziono wiele mutacji. Oznaczono je klamrami.
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 499
A. Miejsca restrykcyjne Mstll wokót genu i w genie p-globiny
B. Analiza rodowodowa
[1
*
O
Wielkość
fragmentu
1,35 kz
1,15 kz
Wydedukowany fenotyp
Ryc. 39-10. Analiza rodowodowa dla niedokrwistości sierpowatej. Górny fragment ryciny (A) pokazuje
pierwszą część genu p-globiny i miejsce restrykcyjne Mstll w genie p-globiny prawidłowym (A) i w przy¬
padku niedokrwistości sierpowatej (S). U osób zdrowych trawienie DNA enzymem restrykcyjnym Mstll daje
fragmenty o długości 1,15 kz i 0,2 kz. Zamiana T na A, jaka zachodzi u chorych na niedokrwistość sier-
powatą, usuwa jedno z trzech miejsc restrykcyjnych wokół genu p-globiny, a zatem w wyniku trawienia
Mstll powstaje tylko pojedynczy fragment o długości 1,35 kz. Te różnice w długości fragmentów są łatwo
wykrywalne techniką Southerna. (Na powyższej rycinie fragment 0,2 kz byłby zlokalizowany poza żelem).
(B) Analiza rodowodu pokazuje trzy możliwości: AA = osoba zdrowa (kółka białe); AS = heterozygota (kółka
oraz kwadrat zielono-białe); SS = homozygota (zielony kwadrat). Podejście to pozwala na prenatalną diag¬
nozę niedokrwistości sierpowatej (kwadrat narysowany linią przerywaną). Patrz tekst.
(AS) i homozygot (SS) z enzymem restrykcyjnym
da trzy różne wzory prążków uzyskanych metodą
Southerna (p. ryc. 39-10). Przykład ten ilustruje,
jak można ustalić rodowód DNA, stosując zasady
omówione w tym rozdziale. Analiza rodowodu
jest wykorzystywana w odniesieniu do różnych
chorób genetycznych i jest najbardziej użyteczna
w przypadku chorób spowodowanych delecjami
i insercjami lub, rzadziej, zmian w miejscu re¬
strykcyjnym, jak to podano na przykładzie cyto¬
wanym w tej części. Analiza taka jest ułatwiona
dzięki zastosowaniu PCR, która może dostarczyć
dostatecznej ilości DNA do takiej analizy z zale¬
dwie kilku jądrzastych erytrocytów.
500 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
Nienaruszony DNA 5' 1 Gen X | 3'
Sonda
początkowa
Ryc. 39-11. Technika spaceru (kroczenia) po chromosomie. Zamiarem jest wyizolowanie genu X z dużego odcinka DNA. Dokładne
położenie tego genu nie jest znane, ale dostępna jest sonda (*—) komplementarna do fragmentu DNA (na rycinie pokazano sondę dla
końca 5'), jak również biblioteka zawierająca serię nakładających się fragmentów DNA. W celu uproszczenia pokazano tylko pięć takich
fragmentów. Początkowo sonda będzie hybrydyzowała tylko z klonami zawierającymi fragment 1, który można następnie wyizolować
i użyć jako sondę do wykrycia fragmentów 2. Tę procedurę powtarza się aż do hybrydyzacji fragmentu 4 z fragmentem 5, który zawiera
całą sekwencję genu X.
F. Diagnostyka prenatalna
Diagnostyka prenatalna jest możliwa wówczas,
gdy jest znana wada genetyczna i gdy dostępna jest
swoista sonda molekularna. Uzyskany z niewiel¬
kiej ilości (np. 10 mL) płynu owodniowego (albo
z biopsji kosmówki) DNA może być analizowany
metodą Southema. Płód mający wzór restrykcyjny
AA (p. ryc. 39-10) nie jest chory na niedokrwistość
sierpowatą, ani nie jest jej nosicielem. U płodu ma¬
jącego wzór SS rozwinie się niedokrwistość sier-
powata. Tego rodzaju sondy są obecnie dostępne
do analizy wielu schorzeń genetycznych.
G. Polimorfizm długości fragmentów
RESTRYKCYJNYCH (RFLP) I P0LIM0RFIZMY
POJEDYNCZEGO NUKLEOTYDU (SNP)
Przytaczane wyżej różnice w sekwencjach DNA
mogą wynikać ze zmienności miejsc restrykcyj¬
nych, w wyniku czego fragmenty restrykcyjne
mają różne długości. Analogicznie, przy użyciu
czułej metody jaką jest PCR mogą być wykrywa¬
ne polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP).
Odziedziczone różnice wzoru restrykcyjnego
(zmienność DNA dotycząca ponad 1% ogółu po¬
pulacji) są znane jako polimorfizm długości frag¬
mentów restrykcyjnych, czyli RFLP (ang. restric-
tion fragment length polymorphism). Obecnie są
sporządzane szczegółowe mapy polimorfizmów
RFLP i SNP występujących w genomie ludzkim.
Okazały się one przydatne w Projekcie Sekwen-
cjonowania Ludzkiego Genomu, a także mają
znaczący wkład w zrozumienie różnych schorzeń
mono- i poligenowych. RFLP powstają w wyni¬
ku zmian pojedynczej zasady (np. niedokrwistość
sierpowata) albo delecji lub insercji DNA w obrę¬
bie fragmentu restrykcyjnego (np. talasemie) i są
użytecznym narzędziem diagnostycznym. Poli¬
morfizm taki znaleziono w znanych genetycznych
loci, a także w obrębie sekwencji, których funkcja
pozostaje nieznana; tak więc polimorfizm RFLP
może prowadzić do zakłócenia funkcji genu lub
też może nie mieć żadnych konsekwencji biolo¬
gicznych.
Polimorfizmy RFLP i SNP są dziedziczne i se¬
gregują się w sposób mendlowski. Polimorfizm
RFLP (dotychczas poznano tysiące takich poli¬
morfizmów) jest wykorzystywany głównie przy
definiowaniu chorób dziedzicznych, w których
nie jest znany ubytek funkcji. SNP/RFLP mogą
być użyte do ustalenia grup sprzężeń, które na¬
stępnie, w procesie zwanym spacer po chromo¬
somie, mogą ostatecznie doprowadzić do okre¬
ślenia locus związanego z chorobą. W metodzie
spaceru po chromosomie (ryc. 39-11) fragment
przedstawiający jeden z końców długiego od¬
cinka DNA jest używany do izolowania innego
fragmentu, który pokrywa się z pierwszym, ale
wychodzi poza jego obręb. Kierunek tego wy¬
chodzenia jest określany w wyniku mapowania
restrykcyjnego i proces ten jest powtarzany dopó¬
ty, dopóki nie uzyska się sekwencji stanowiącej
przedmiot zainteresowania. Tego typu podejście
jest szczególnie odpowiednie w przypadku cho¬
rób sprzężonych z chromosomem X, ponieważ
ekspresji ulega tylko jeden allel. Stąd ok. 20%
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 501
wszystkich zdefiniowanych RFLP znajduje się
w obrębie chromosomu X i została już opraco¬
wana prawie kompletna mapa sprzężeń w tym
chromosomie. Stosując technikę RFLP, znale¬
ziono gen dystrofii mięśniowej typu Duchenne’a
sprzężony z chromosomem X. Stwierdzono też,
że wada w przypadku pląsawicy Huntingtona
jest zlokalizowana w końcowym regionie krót¬
kiego ramienia chromosomu 4, a wada wywołu¬
jąca torbielowatość nerek jest sprzężona z locus
a-globiny w chromosomie 16.
H. POLIMORFIZMY MIKROSATELITARNEGO DNA
W ludzkim genomie występują (p. rozdz. 35),
od ok. 50 000 do 100 000 razy, krótkie (2-6 pz),
dziedziczone i powtarzające się tandemowo (po-
sobnie, czyli jedna po drugiej) sekwencje DNA.
Ponieważ występują one częściej niż RFLP, toteż
- przy obecnie rutynowym stosowaniu czułych
metod opartych na PCR - zastępują one RFLP
jako loci markerowe w różnego rodzaju badaniach
polegających na przeszukiwaniu genomu.
I. RFLP i VNTR w medycynie sądowej
Pospolitym typem „insercji”, które powodują wy¬
stąpienie RFLP są sekwencje o zmiennej liczbie
tandemowych powtórzeń (VNTR). Sekwencje
VNTR są dziedziczone i w tym przypadku są one
użyteczne przy ustalaniu genetycznego związku
z chorobą w danej rodzinie lub grupie osób spo¬
krewnionych; mogą one być również unikatowe
dla poszczególnych osobników i dlatego mogą
służyć do molekularnej identyfikacji („finger-
print”) danego osobnika.
J. Terapia genowa
Choroby wywołane niedoborem jakiegoś pro¬
duktu genowego (tab. 39-5) mogą być zwalczane
terapią zastępczą. Strategia takiego leczenia po¬
lega na sklonowaniu genu (np. genu kodującego
deaminazę adenozyny) w wektorze, który może
być pobrany przez komórkę gospodarza i wpro¬
wadzony do genomu. Przydatne do tego celu są
komórki prekursorowe szpiku kostnego, ponie¬
waż komórki takie mogą zasiedlić szpik i tam
się namnażać. Wprowadzony gen może zacząć
kierować ekspresją swego białkowego produktu
i w ten sposób naprawiać ubytek w komórce go¬
spodarza.
K. Zwierzęta transgeniczne
Wprowadzony gen do komórki somatycznej
oczywiście nie może być przekazany potomstwu.
Opracowano inne metody zmian w linii komórek
rozrodczych, ale odpowiednie badania przepro¬
wadzono jedynie na zwierzętach doświadczal¬
nych. Pewien odsetek genów wstrzykniętych do
zapłodnionego jaja myszy może być wbudowany
do genomu i można go znaleźć zarówno w komór¬
kach somatycznych, jak i komórkach rozrodczych.
Uzyskano setki takich zwierząt transgenicznych
i okazały się one bardzo użyteczne w analizie
swoistych tkankowo czynników wpływających
na ekspresję genów oraz wpływu nadmiernego
wytwarzania produktów genowych (np. hormonu
wzrostu lub onkogenów), a także w poszukiwa¬
niu genów związanych z rozwojem osobniczym,
który to proces dotychczas było trudno badać.
Metodę transgeniczną zastosowano niedawno
w celu skorygowania wady genetycznej u my¬
szy. Do zapłodnionych jaj, uzyskanych od myszy
z genetycznym hipogonadyzmem, wstrzykiwano
DNA zawierający kodującą sekwencję prekursora
białkowego hormonu uwalniającego gonadotropi-
nę (GnRH). Gen ten ulegał ekspresji i podlegał
prawidłowej regulacji w podwzgórzu u pewnej
liczby otrzymanych myszy, a zwierzęta te były
pod wszystkimi względami zdrowe. Ich potom¬
stwo nie wykazywało niedoboru GnRH. Jest to
zatem dowód na somatyczną ekspresję transgenu
i na jego utrzymywanie się w komórkach rozrod¬
czych.
Celowane zakłócanie działania genu
lub jego eliminacja (ang. knockout)
Genomy zwierząt transgenicznych zawierają do¬
datkowo jedną lub kilka kopii genu, ale nie ma
sposobu, aby sprawdzić, gdzie gen ten został
umiejscowiony. Komplementarnym podejściem,
ale znacznie trudniejszym, jest wybiórcze usunię¬
cie genu z genomu. Zwierzęta z „wyrzuconym”
genem (zwykle myszy) uzyskuje się w wyniku
wywołania mutacji, która całkowicie zakłóca
funkcję tego genu. Jest on następnie wykorzy¬
stany do zastąpienia jednego z dwóch genów
w embrionalnej komórce macierzystej, dzięki cze¬
mu uzyskuje się heterozygotyczne zwierzę trans¬
geniczne. Należy się spodziewać, że skojarzę-
502 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
nie dwóch takich zwierząt doprowadzi, zgodnie
z prawami genetyki mendlowskiej, do uzyskania
potomstwa, z którego 25% będzie wykazywało
homozygotyczną mutację. Wyhodowano już set¬
ki odmian myszy pozbawionych wielu różnych
genów. Opracowano również techniki zakłócania
funkcji genów w określonych komórkach, tkan¬
kach lub narządach; są to tzw. nokauty warunkowe
i celowane. Można tego dokonywać, wykorzystu¬
jąc konkretne kombinacje promotor-wzmacniacz
kierujące ekspresją rekombinaz DNA lub siRNA,
inaktywujących ekspresję genów. Metody te są
użyteczne zwłaszcza wtedy, kiedy całkowite usu¬
nięcie danego genu w trakcie wczesnego rozwoju
wywołuje śmierć embrionu.
Badania profilu transkryptów RNA
oraz białek
Punktem kulminacyjnym rewolucyjnego postępu,
jaki dokonał się w ostatnich latach jest, jak do¬
tychczas, poznanie sekwencji nukleotydowych
całych genomów, w tym: pączkujących i roz-
szczepkowych drożdży, różnych bakterii, muszki
Ryc. 39-12. Zarys dwuhybrydowego systemu służącego do identyfikacji i charakteryzacji oddziaływań białko-białko. Pokazane zo¬
stały podstawowe składowe i sposób działania systemu dwuhybrydowego, pierwotnie opracowanego przez Fieldsa i Songa [Naturę
340:245246 (1989)] do badań na drożdżach. (1) Gen reporterowy, mogący albo być selekcyjnym markerem (tj. genem umożliwiającym
prototroficzny wzrost w selektywnych mediach), albo wytwarzać enzym, dla którego istnieje metoda kolorymetrycznego oznaczania
aktywności w koloniach, np. p-galaktozydazę); gen ten ulega ekspresji tylko wtedy, kiedy czynnik transkrypcyjny zwiąże się z położo¬
nym wyżej w układzie cis wzmacniaczem (ciemnoszary pasek). (2) Białko fuzyjne „Przynęta” (DBD-X), powstałe w wyniku ekspresji
chimerycznego genu kodującego modularną domenę wiążącą DNA (DBD; często pochodzącą z białka Ga14 drożdży lub z bakteryjnego
białka LexA, które wysoce swoiście i z dużym powinowactwem wiążą się z DNA) zespojoną, z zachowaniem prawidłowej ramki odczytu,
z badanym białkiem, w tym przypadku z białkiem X. W doświadczeniach dwuhybrydowych bada się, czy z białkiem X oddziałuje jakieś
inne białko. Badane białko X („Przynęta") może być w całości spojone z DBD; często jednak zostaje złączony tylko jego fragment,
ulegający ekspresji z zachowaniem ramki odczytu. (3) Białko fuzyjne „Ofiara” (Y-AD), będące połączeniem, z zachowaną ramką od¬
czytu, specyficznego białka Y oraz domeny aktywującej transkrypcję (AD; pochodzi ona często albo z białka VP16 wirusa opryszczki,
albo z drożdżowego białka Ga14). System dwuhybrydowy jest przydatny do badania oddziaływań białko-białko między białkami X i Y,
ponieważ pod nieobecność funkcjonalnego transaktywatora wiążącego się z sekwencją wzmacniającą (enhancerem) transkrypcja genu
reporterowego nie zachodzi. Transkrypcja jest zatem obserwowana tylko wtedy, kiedy występuje oddziaływanie białka X z białkiem Y,
w wyniku czego funkcjonalna domena AD styka się ze związaną w pozycji cis jednostką transkrypcyjną, aktywując w takim przypadku
transkrypcję genu reporterowego. W niniejszym scenariuszu samo białko DBD-X nie jest w stanie aktywować transkrypcji reportera,
ponieważ domena X spojona z DBD nie zawiera domeny aktywującej AD. Analogicznie, samo białko Y-AD też nie jest w stanie samo
aktywować transkrypcji genu reporterowego, ponieważ nie zawiera domeny wiążącej DBD, umożliwiającej kontakt białka Y-AD z sek¬
wencją wzmacniającą. Tylko wtedy, kiedy oba białka fuzyjne ulegają ekspresji w tej samej komórce i jeśli dzięki oddziaływaniom białko-
-białko (DBD-X-Y-AD) wiążą się ze wzmacniaczem, może zostać przywrócone działanie transaktywujące binarnego „białka"; w rezulta¬
cie następuje aktywacja transkrypcji genu reporterowego i synteza mRNA (zielona linia łącząca AD z genem reporterowym).
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 503
owocowej, nicienia Caenorhabditis elegans,
myszy, a przede wszystkim człowieka. Następne
genomy są sekwencjonowane w coraz szybszym
tempie. Dostępność całego tego zasobu informa¬
cji o sekwencjach DNA i postęp technologiczny
spowodowały, że powstało szereg rewolucyjnych
metodologii, w większości opartych na techni¬
kach tzw. mikromacierzy wysokiej gęstości.
Mamy dzisiaj możliwość nałożenia na podłoże
wielkości mikroskopowego szkiełka przedmioto¬
wego, czyli na powierzchnię kilku centymetrów
kwadratowych, dosłownie tysięcy określonych,
znanych i dających się zdefiniować sekwencji
DNA (obecnie coraz częściej są to syntetyczne
oligonukleotydy). Używając takich mikromacie¬
rzy DNA wraz z wysokoczułą detekcją hybry-
dyzujących z nimi fluorescencyjnie wyznakowa¬
nych „sond”, otrzymanych przy udziale badanego
mRNA, badacze mogą szybko i dokładnie okre¬
ślić profile ekspresji genów (np. zawartość okre¬
ślonego rodzaju mRNA w komórce) w próbkach
komórek i tkanek, których masa nie przekracza
jednego grama. W rezultacie informację z całe¬
go transkryptomu (kompletny zbiór wszystkich
mRNA w komórce) dla takiej komórki czy tkan¬
ki można łatwo otrzymać w ciągu zaledwie kilku
dni. Uzyskana za pośrednictwem transkryptomu
informacja pozwala przewidzieć, w oparciu o pro¬
fil obecnego w takich komórkach mRNA, zbiory
białek, które mogłyby ulegać ekspresji w okre¬
ślonej komórce, tkance lub narządzie, zarówno
w stanach patologicznych, jak i prawidłowych.
Dopełnieniem tej wysoko wydajnej metody pro¬
filowania transkryptów są narodziny w ostatnich
latach wysoko czułej i wysoko wydajnej spek¬
trometrii mas złożonych próbek białkowych.
Nowsze techniki spektrometrii mas pozwalają
zidentyfikować setki tysięcy białek w ekstraktach
otrzymanych z bardzo niewielkiej liczby komó¬
rek (< 1 g). Badacze otrzymują informację o tym,
które spośród wielu mRNA, wykrytych w trakcie
mikromacierzowego mapowania transkryptów,
faktycznie ulegają translacji na białko będące,
ogólnie rzecz biorąc, ostatecznym „dyktatorem”
fenotypu. Obmyślono również nowe genetyczne
sposoby identyfikacji oddziaływań białko-białko
oraz badania funkcji białek. Do oceny przyczynku
poszczególnych genów do różnorakich procesów
zachodzących w układach modelowych (drożdże,
robaki, muszki) i komórkach ssaków (ludzkich
oraz mysich) stosuje się, obejmującą systema¬
tycznie cały genom, technikę eliminacji ekspresji
genu za pomocą siRNA oraz przesiewowe bada¬
nia letalnych oddziaływań syntetycznych genów.
Dokonano zmapowania sieci oddziaływań białko-
-białko na poziomie genomu, wykorzystując wy¬
soko wydajne warianty testu oddziaływania mię¬
dzy dwoma hybrydami (ryc. 39-12). To proste,
a przy tym skuteczne „narzędzie” może być zasto¬
sowane w badaniach bakterii, drożdży lub orga¬
nizmów wielokomórkowych. Umożliwia ono wy¬
krywanie oddziaływań białko-białko w żywych
komórkach. Doświadczenia pokazały, że tą meto¬
dą można łatwo wykrywać oddziaływania białko-
białko, których stała powinowactwa Kd wynosi co
najmniej 1 pM. Niniejsze technologie razem two¬
rzą skuteczne „narzędzia”, którymi można anali¬
zować zawiłości biologii człowieka.
Techniki mikromacierzowe, wysoko wydajny
dwuhybrydowy genetyczny „knockdown” oraz
identyfikacja białek za pomocą spektrometrii mas
generują olbrzymie ilości informacji. Należyta ob¬
róbka danych oraz interpretacja zalewu informacji
generowanych w wyniku takich badań opiera się
na metodach statystycznych; nowa technologia,
w połączeniu z bogactwem informacji dotyczącej
sekwencji DNA, spowodowała rozwój bioinfor-
matyki i biologii systemów - nowych dyscyplin
ukierunkowanych na zarządzanie, analizę i inte¬
grację tego ogromu biologicznie ważnej informa¬
cji. Przyszłe dokonania na pograniczu bioinfor-
matyki, profilowania transkryptów i białek oraz
biologia systemów dokonają rewolucji w naszym
pojmowaniu fizjologii i medycyny.
STRESZCZENIE
• Do izolacji i charakteryzacji genów oraz iloś¬
ciowej oceny produktów genu można obecnie
wykorzystywać różnorakie, niezwykle czułe
techniki.
• W metodzie klonowania DNA określony odci¬
nek DNA jest usuwany ze swojego normalnego
otoczenia za pomocą reakcji PCR lub za pomocą
jednej z wielu endonukleaz restrykcyjnych. Od¬
cinek ten zostaje następnie wbudowany (zligo-
wany) do wektora, dzięki czemu może zostać na¬
mnożony i wytworzony w dowolnych ilościach.
• Sklonowany DNA może być wykorzystany,
w jednej z wielu odmian reakcji hybrydyzacji,
504 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
jako „sonda” służąca do wykrywania innych,
spokrewnionych lub sąsiadujących, fragmen¬
tów DNA; może on też zostać spożytkowany
do ilościowej oceny produktów funkcjonowa¬
nia genu, takich jak mRNA.
• Manipulacja fragmentem DNA w celu zmiany
jego struktury, tzw. inżynieria genetyczna, jest
kluczowym elementem procedur klonowania
(np. konstrukcji cząsteczek fuzyjnych); może
być ona również wykorzystana w badaniu funk¬
cji pewnych fragmentów DNA oraz w analizie
sposobów regulacji działania genów.
• Fuzyjne (chimeryczne) cząsteczki DNA wpro¬
wadza się do komórek w celu otrzymania trans-
fektantów lub do zapłodnionej komórki jajowej
w celu otrzymania zwierząt transgenicznych.
• Techniki oparte na użyciu sklonowanego DNA
są wykorzystywane do lokalizacji genów
w określonych regionach chromosomów, do
identyfikacji genów odpowiedzialnych za cho¬
roby, do badań regulacji wadliwych genów po¬
wodujących choroby oraz, coraz częściej, do
leczenia chorób o podłożu genetycznym.
SŁOWNICZEK
ARS - oddzielnie replikująca się sekwencja, początek
replikacji u drożdży.
Autoradiografia - wykrywanie radioaktywnych
cząsteczek (np. DNA, RN A lub białka) przez uwi¬
docznienie skutków ich działania na kliszy fotogra¬
ficznej.
Bakteriofag - wirus, który zakaża bakterię.
Biblioteka - zbiór sklonowanych fragmentów, repre¬
zentujących cały genom. Biblioteki mogą być albo
genomowe (są w nich reprezentowane zarówno in-
trony, jak i eksony oraz inne sekwencje DNA) lub
mogą być bibliotekami cDNA (w których są repre¬
zentowane jedynie eksony).
cDNA - cząsteczka jednoniciowego DNA, która jest
komplementarna do cząsteczki mRNA i jest na niej
syntetyzowana z udziałem odwrotnej transkryptazy.
Chimeryczna cząsteczka - cząsteczka (np. DNA,
RN A, białko) zawierająca sekwencje wyodrębnio¬
ne z dwu różnych gatunków.
Endonukleaza - enzym, który przecina wewnętrzne
wiązania w DNA lub RNA.
Ekson - sekwencja w genie, która jest reprezentowana
(ulega ekspresji) w cząsteczce mRNA.
Ekscynukleaza - nukleaza uczestnicząca w naprawie
DNA poprzez wymianę nukleotydów.
Egzonukleaza - enzym, który odcina nukleotydy
w DNA lub RNA od końca 3' lub 5'.
Fingerprinting - rodzaj procedury identyfikacyjnej,
opartej na użyciu RFLP lub DNA o powtarzających
się sekwencjach, ustalającej unikatowy wzór frag¬
mentów DNA danego osobnika.
Footprinting - wykazywanie przez DNA z przyłą¬
czonym białkiem odporności na trawienie DNaza-
mi. Sekwencjonowanie takiego DNA ujawnia chro¬
niony przez białko obszar (tzw. footprint).
Hybrydyzacja - swoista reasocjacja komplementar¬
nych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA,
DNA z RNA lub RNA z RNA).
Insert - dodatkowa sekwencja w DNA, na ogół wpro¬
wadzona technikami rekombinacji DNA.
Intron - sekwencja w genie, która jest przepisana
na RNA, ale wycięta i usunięta przed translacją
w trakcie przekształcania pierwotnego transkryptu.
Klon - duża liczba organizmów, komórek lub cząste¬
czek, które są identyczne z pojedynczym macierzy¬
stym organizmem, komórką lub cząsteczką.
Kosmid - plazmid, do którego włączono sekwencje
DNA bakteriofaga X, niezbędne dla upakowania
DNA (miejsca cos); pozwala to na upakowanie pla¬
zmidowego DNA in vitro.
Lepkie końce DNA - komplementarne pojedyncze
nici DNA, wystające na przeciwległych końcach
dwuniciowej cząsteczki DNA lub z końców różnych
dwuniciowych cząsteczek (p. także tępe końce).
Ligacja - katalizowane enzymatycznie łączenie, po¬
przez wiązania fosfodiestrowe, dwóch odcinków
DNA lub RNA; nadającymi się do tego enzymami
są ligazy DNA i RNA.
Lines (ang.) - długie rozproszone, powtarzające się
sekwencje.
miRNA - mikroRNA; rodzaj RNA, długości 21-25
nukleotydów, pochodzący z jednostek transkryp-
cyjnych polimerazy RNA klasy II, o długości
500-1500 pz; niedawno odkryte i uważane za od¬
grywające kluczowe role w regulacji genów.
Nick-translacja (ang. nick translation) - technika
znakowania DNA oparta na zdolności polimerazy
DNA z E. coli do degradowania naciętej nici DNA
oraz następczego resyntezowania tej nici; jeśli za¬
stosuje się radioaktywne trifosforany nukleozydów,
to nowo zsyntetyzowana nić zostanie wyznakowana
i będzie mogła być użyta jako sonda radioaktywna.
Northern biot - metoda przenoszenia RNA z żelu
agarozowego na folię nitrocelulozową na której
cząsteczki RNA mogą być wykryte odpowiednią
sondą.
Oligonukleotyd - krótka, zdefiniowana sekwencja
nukleotydów, połączonych typowym wiązaniem
fosfodiestrowym.
Odwrotna transkrypcja - synteza DNA na matrycy
RNA, katalizowana odwrotną transkryptazą.
Ori - miejsce rozpoczęcia replikacji DNA.
PAC - wysokowydajny wektor do klonowania (70-
95 kz), oparty na genomie bakteriofaga PI E. coli,
39. TECHNIKI: REKOMBINACJI DNA, MOLEKULARNO-GENETYCZNE ORAZ GENOMICZNE 505
który replikuje się w bakteriach jako element poza-
chromosomowy.
Palindrom - sekwencja dwunicowego DNA, która
jest taka sama, jeśli obie nici są czytane w przeciw¬
nych kierunkach.
Plazmid mała, pozachromosomalna, kolista czą¬
steczka DNA, która replikuje niezależnie od DNA
gospodarza.
Polimorfizm mikrosatelitarny - heterozygotyczność
jakiejś powtarzającej się sekwencji mikrosatelitar-
nej u danego osobnika.
Powtarzające się sekwencje mikrosatelitarne - roz¬
proszone lub występujące grupowo sekwencje po¬
wtarzające się; składają się z 2-5 pz powtarzanych
do 50 razy. Mogą występować w 50-100 tysiącach
miejsc genomu.
Primosom - mobilny kompleks helikazy i prymazy,
biorący udział w replikacji DNA.
Pseudogen - nieaktywny segment DNA powstały
wskutek mutacji aktywnego genu macierzystego.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) - enzyma¬
tyczna metoda wielokrotnego kopiowania (a więc
namnażania) dwu nici DNA tworzących sekwencję
określonego genu.
Rekombinacyjny DNA - DNA powstały w wyniku
przyłączenia (insercji) sekwencji deoksynukleoty-
dowych (które uprzednio nie były w nim obecne),
do istniejącej cząsteczki DNA, w wyniku reakcji
enzymatycznych lub chemicznych.
Restrykcyjny enzym endonukleaza, która przeci¬
na obie nici DNA w bardzo swoistych miejscach,
określonych sekwencją zasad.
RT-PCR - metoda ilościowego oznaczania mRNA,
oparta na kopiowaniu mRNA do cDNA przez od¬
wrotną transkryptazę; poprzedza to amplifikację
i oznaczenie ilościowe za pomocą PCR.
Sines (ang.) - krótkie, rozrzucone, powtarzające się
sekwencje.
siRNA - wyciszające cząsteczki RN A, długości
21-25 nukleotydów, powstające w wyniku wy¬
biórczej nukleolitycznej degradacji dwuniciowych
RNA pochodzenia komórkowego lub wirusowego.
Cząsteczki siRNA przyłączają się do różnych swo¬
istych miejsc w docelowych RNA, czego skutkiem
jest degradacja mRNA, a zatem eliminacja ekspre¬
sji genu.
Sonda - cząsteczka używana do wykrywania obecno¬
ści swoistego fragmentu DNA lub RNA, np. w ko¬
lonii bakteryjnej lub w trakcie analizy technikami
hybrydyzacyjnymi (blotting); zwykle sondami są
cząsteczki cDNA, syntetyczne oligodeoksynukleo-
tydy o określonej sekwencji i przeciwciała prze¬
ciwko swoistym białkom.
SNP - polimorfizm pojedynczych nukleotydów.
Odnosi się do występowania w odrębnych loci
chromosomów genetycznej wariacji sekwencji
pojedynczego nukleotydu. Pomiar różnic w SNP
pomiędzy allelami jest użyteczny w mapowaniu
genetycznym.
snRNA - małocząsteczkowy jądrowy RNA. Rodzina
tych RNA jest najlepiej znana ze swojej roli w prze¬
kształceniach mRNA.
Southern biot - metoda przenoszenia DNA z żelu
agarozowego na folię nitrocelulozową, na której
DNA może być wykryty przy użyciu odpowiedniej
sondy (np. komplementarnego DNA lub RNA).
Southwestern biot - metoda wykrywania oddziały¬
wań białko-DNA, polegająca na nałożeniu na użytą
do transferu folię (gdzie znajduje się zrenaturowa-
ne białko) wyznakowanej sondy DNA.
Spinka do włosów (ang. hairpin) - dwuniciowy od¬
cinek kwasu nukleinowego, powstały w wyniku
sparowania zasad między sąsiednimi, komplemen¬
tarnymi sekwencjami pojedynczej nici DNA lub
RNA.
Spliceosom - wielkocząsteczkowy kompleks, odpo¬
wiedzialny za splicing prekursorowego mRNA.
Spliceosom zawiera co najmniej pięć małych ją¬
drowych RNA (snRNA; Ul, U2, U4, U5 oraz U6)
oraz wiele białek.
Splicing (składanie RNA) - usuwanie intronów
z RNA z jednoczesnym łączeniem eksonów.
Sygnał - forma przekazu wybiórczej informacji, to¬
warzysząca np. wykrywaniu swoistych sekwencji
DNA lub RNA metodą autoradiografii lub inną
metodą znakowania. W celu uzyskania sygnału jest
zwykle stosowana hybrydyzacja ww. sekwencji
z komplementarnym, wyznakowanym np. radioak¬
tywnie lub fluorescencyjnie polinukleotydem (np.
technika Southema lub technika northem).
Tandem - liczne kopie tej samej sekwencji (np.
DNA), które leżą przylegle jedna do drugiej.
Terminalna transferaza - enzym, który dodaje nu-
kleotydy jednego typu (np. reszty deoksyadenonu-
kleotydylowe) do końca 3' nici DNA.
Tępe końce - dwie nici DNA mające końce zrównane
z sobą (p. lepkie końce).
Transkrypcja - odbywająca się na matrycy DNA
synteza kwasów nukleinowych; zwykle synteza
RNA na matrycy DNA.
Transkryptom - całościowy zbiór mRNA, które ule¬
gły ekspresji w danym organizmie.
Transgeniczny - termin odnoszący się do wpro¬
wadzenia obcego DNA do komórek rozrodczych
w wyniku wstrzyknięcia go do jądra komórki ja¬
jowej.
Translacja - synteza białka na matrycy mRNA.
Wektor - plazmid lub bakteriofag, do którego może
być wprowadzony obcy DNA w celu sklonowania.
Western biot - metoda przenoszenia białka na folię
nitrocelulozową, na której białko to może być wy¬
kryte odpowiednią sondą, np. przeciwciałem.
506 CZĘŚĆ IV: BUDOWA, FUNKCJE I REPLIKACJA MAKROCZĄSTECZEK INFORMACYJNYCH
PIŚMIENNICTWO
Friedman A, Perrimon N: Genome-wide high-through-
put screens in functional genomics. Curr Opin Gen
Dev 2004;14:470.
Lewin B: Genes F//Oxford Univ Press, 1999.
Martin JB, Gusella JF: Huntington’s disease: patho-
genesis and management. N Engl J Med 1986;
315:1267.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning:
A Laboratory Manuał. Cold Spring Harbor Labora-
tory Press, 1989.
Spector DL, Goldman RD, Leinwand LA: Cells: A Lab¬
oratory Manuał. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1998.
Watson JD et al: Recombinant DNA, 2nd ed. Scientific
American Books. Freeman, 1992.
Weatherall DJ: The New Genetics and Cłinicał Practice,
3rd ed. Oxford Univ Press, 1991.
CZĘSCV
Biochemia komunikacji zewnątrzkomórkowej
i wewnątrzkomórkowej
^ Błony: struktura i funkcja
Robert K. Murray, MD, PhD; DarylK. Granner, MD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Błony są bardzo lepkimi, plastycznymi struktu¬
rami. Błony plazmatyczne tworzą zamknięte
obszary wokół cytoplazmy komórkowej i od¬
dzielają jedną komórkę od drugiej, zapewniając
tym samym ich odrębność. Błony plazmatyczne
charakteryzują się wybiórczą (selektywną) prze¬
puszczalnością i działająjako bariery, dzięki któ¬
rym jest możliwe utrzymanie różnic w składzie
wnętrza komórki i jej zewnętrznego otoczenia.
Wybiórcza przepuszczalność jest uwarunkowana
głównie istnieniem kanałów oraz pomp dla jo¬
nów i substratów. Błona plazmatyczna wymienia
także składniki ze środowiskiem pozakomórko-
wym w procesach egzocytozy i endocytozy, spe¬
cjalne zaś przestrzenie w strukturze błony - złącza
szczelinowe - umożliwiają wymianę substancji
między przylegającymi komórkami. Ponadto bło¬
na plazmatyczna odgrywa kluczową rolę w od¬
działywaniach międzykomórkowych i sygnali¬
zacji przezbłonowej.
Błony oddzielają również wyspecjalizowane
przedziały - kompartmenty - wewnątrz komórki.
Takie wewnątrzkomórkowe błony otaczają wiele
morfologicznie odrębnych struktur (organelli),
np. mitochondria, siateczkę śródplazmatyczną,
siateczkę sarkoplazmatyczną, aparat Golgiego,
ziarnistości wydzielnicze, lizosomy i błonę jądro¬
wą. Błony zawierają enzymy, działająjako inte¬
gralne elementy sprzęgające proces pobudzenia
komórki z odpowiedzią komórkową oraz są miej¬
scami transdukcji energii, np. w procesach foto¬
syntezy i oksydacyjnej fosforylacji.
Zmiany w strukturze błon (spowodowane na
przykład niedokrwieniem) mogą wpływać na
równowagę wodną i przepływ jonów, a tym sa¬
mym na każdy proces zachodzący wewnątrz ko¬
mórki. Specyficzne niedobory lub zmiany okre¬
ślonych składników błon prowadzą do różnych
chorób (p. tab. 40-5). Krótko ujmując, normalne
funkcjonowanie komórki zależy od prawidłowe¬
go stanu błon.
UTRZYMYWANIE PRAWIDŁOWEGO
ŚRODOWISKA WEWNATRZ-
I P0ZAK0MÓRK0WEG0 JEST
PODSTAWOWYM WARUNKIEM ŻYCIA
Życie powstało w środowisku wodnym; w tym
też ośrodku rozpoczęły się reakcje enzymatyczne,
procesy komórkowe, subkomórkowe i inne. Sko¬
ro ssaki żyją w środowisku gazowym, to w jaki
508 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
sposób jest utrzymywane środowisko wodne? To
zadanie, dzięki zatrzymywaniu i kompartmenty-
zacji wody w organizmie, spełniają właśnie błony
komórkowe.
Woda w organizmie jest
kompartmentyzowana
Woda stanowi ok. 60% nietłuszczowej masy ciała
ludzkiego i jest rozmieszczona w dwóch dużych
obszarach (kompartmentach).
A. Płyn wewnątrzkomórkowy
(ang. intracellular fluid, ICF)
Płyn wewnątrzkomórkowy stanowi 2/3 całkowi¬
tej ilości wody w organizmie, która stwarza śro¬
dowisko dla: 1) wytwarzania, magazynowania
i wykorzystywania energii, 2) procesów samona-
prawczych, 3) replikacji i 4) wykonywania okre¬
ślonych funkcji.
B. Płyn pozakomórkowy
(ang. extracellular fluid, ECF)
Płyn pozakomórkowy stanowi ok. V3 ogólnoustro-
jowej ilości wody, rozdzielonej między osocze
krwi i kompartment śródmiąższowy. Płyn poza¬
komórkowy jest układem dostawczym. Dostarcza
do komórek składniki odżywcze (np. glukozę,
kwasy tłuszczowe, aminokwasy), tlen, różne jony
i pierwiastki śladowe oraz wiele związków regula¬
torowych (hormonów), które koordynują funkcje
znacznie oddalonych od siebie komórek, a usuwa
dwutlenek węgla, substancje odpadowe, składniki
toksyczne i produkty detoksykacji.
Sktad jonowy płynu wewnątrzkomórkowego
różni się znacznie od składu jonowego ptynu
pozakomórkowego
Jak pokazano w tabeli 40-1, środowisko we¬
wnętrzne komórki jest bogate w jony K+ i Mg2+,
a jego podstawowym anionem jest jon fosfora¬
nowy. Płyn pozakomórkowy charakteryzuje się
dużą zawartością jonów Naf i Ca2+, a jego podsta¬
wowym anionem jest Cl . Należy zwrócić uwagę,
że stężenie glukozy jest większe w płynie poza-
komórkowym niż wewnątrz komórki, natomiast
stężenie białek jest mniejsze. Skąd taka różnica?
Przypuszcza się, że pierwotne morze, w którym
powstało życie, było bogate w jony IC i Mg2+
i dlatego reakcje enzymatyczne oraz inne procesy
biologiczne zachodzą najlepiej w takim właśnie
środowisku - stąd wewnątrz komórek występuje
duże stężenie tych jonów. Komórki były narażo¬
ne na znaczną selekcję w okresie, kiedy morze
stopniowo zmieniało swój skład i stało się bogate
w jony Na+ i Ca2+. Aby wytworzyła się całkowicie
nowa „maszyneria” biochemiczna i fizjologicz¬
na, musiałyby nastąpić ogromne zmiany; zamiast
tego komórki wytworzyły bariery w postaci błon
z wbudowanymi w nie „pompami”, aby zachować
wewnętrzne mikrośrodowisko.
Tabela 40-1. Zestawienie średnich stężeń różnych substancji wy¬
stępujących na zewnątrz i wewnątrz komórek ssaków
Substancja
Płyn
pozakomórkowy
Płyn
wewnątrzkomórkowy
Na+
140 mmol/L
10 mmol/L
K+
4 mmol/L
140 mmol/L
Ca2+
(zjonizowany)
2,5 mmol/L
0,1 pmol/L
Mg2+
1,5 mmol/L
30 mmol/L
ci-
100 mmol/L
4 mmol/L
hco3
27 mmol/L
10 mmol/L
poj-
2 mmol/L
60 mmol/L
Glukoza
5,5 mmol/L
0-1 mmol/L
Białko
2 g/dL
16 g/dL
BŁONY SA ZŁOŻONYMI STRUKTURAMI,
ZBUDOWANYMI Z LIPIDÓW, BIAŁEK
I WĘGLOWODANÓW
Omawiane będą głównie błony występujące w ko¬
mórkach eukariotycznych, chociaż wiele z opisa¬
nych zagadnień dotyczy błon komórek prokario-
tycznych. Różne błony komórkowe mają różny
skład, co odzwierciedla stosunek białek do lipidów
(ryc. 40-1). Różnice te nie są zaskoczeniem, biorąc
pod uwagę bardzo zróżnicowane funkcje tych błon.
Błony są asymetrycznymi, zamkniętymi struktura¬
mi warstwowymi, z wyraźnymi powierzchniami
zewnętrznymi i wewnętrznymi. Te warstwowe
struktury są zespołami niekowalencyjnymi, sta¬
bilnymi termodynamicznie i aktywnymi metabo¬
licznie. W błonach są zlokalizowane liczne białka,
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 509
które pełnią specyficzne funkcje charakterystyczne
dla organelli, komórek czy też organizmu.
Stosunek biaiek do lipidów
Ryc. 40-1. Stosunek białek do lipidów w różnych błonach. Niemal
we wszystkich błonach białka występują w takich samych iloś¬
ciach jak lipidy lub większych. Wyjątkiem jest mielina - elektrycz¬
ny izolator występujący w wielu włóknach nerwowych.
Podstawowymi lipidami błon komórek ssaków
są fosfolipidy, glikosfingolipidy i cholesterol.
A. Fosfolipidy
Spośród dwóch głównych grup fosfolipidów
występujących w błonach fosfoglicerydy wy¬
stępują częściej. Składają się one ze szkieletu
glicerolowego, do którego są przyłączone dwa
kwasy tłuszczowe, tworzące wiązania estrowe,
oraz fosforylowany alkohol (ryc. 40-2). Czą¬
steczki kwasów tłuszczowych zawierają zwykle
parzystą liczbę atomów węgla - najczęściej 16
lub 18. Cząsteczki te nie są rozgałęzione i mogą
występować w postaci nasyconej lub nienasyco¬
nej. Najprostszym fosfoglicerydem jest kwas fo-
sfatydowy, który jest l,2-diacyloglicerolo-3-fo-
sforanem. Jest to podstawowy związek pośredni
w syntezie wszystkich innych fosfoglicerydów
(rozdz. 24). W innych fosfoglicerydach fosforan
w pozycji 3 jest estryfikowany alkoholem, np.
etanoloaminą, choliną, seryną, glicerolem lub
inozytolem (rozdz. 15).
Druga ważna grupa fosfolipidów to sfingomieli-
ny, które mają szkielet sfingozynowy, a nie glice-
rolowy. Kwas tłuszczowy jest przyłączony wiąza¬
niem amidowym do grupy aminowej sfingozyny,
tworząc ceramid. Pierwszorzędowa grupa hydrok¬
sylowa sfingozyny jest estryfikowana fosfocho-
liną. Sfingomieliny, jak wskazuje ich nazwa, są
głównymi składnikami osłonek mielinowych.
Kwasy tłuszczowe
0
U
R! — C —0—1CH2
J
Ro — C — 0 — 2CH 0"
N J I
o 3CHo —o — P — o—Rq
II
o
Glicerol Alkohol
Ryc. 40-2. Cząsteczka fosfoglicerydu, zawierająca kwasy tłusz¬
czowe (H, i R2), glicerol i fosforylowany alkohol. W kwasie fosfa-
tydowym R3 jest wodorem.
Ilość i skład kwasów tłuszczowych w fosfoli¬
pidach są zróżnicowane w różnych błonach ko¬
mórkowych.
B. Glikosfingolipidy
Glikosfingolipidy (GSL) są lipidami zawierają¬
cymi składnik węglowodanowy dołączony do
szkieletu ceramidowego. Należą do nich galak-
tozylo- i glukozyloceramidy (cerebrozydy) oraz
gangliozydy. Ich struktura jest opisana w rozdz.
15. Występują one głównie w błonach plazma-
tycznych komórek.
C. Sterole
Najczęściej występującym w błonach sterolem
jest cholesterol (rozdz. 15). Znajduje się on prze¬
de wszystkim w błonach plazmatycznych komó¬
rek zwierzęcych, może jednak występować także,
choć w mniejszych ilościach, w błonach mito-
chondrialnych, aparatu Golgiego i jądrowych.
Cholesterol oddziałuje z fosfolipidami błony,
kierując swą grupę hydroksylową w stronę fazy
wodnej, a pozostałą część cząsteczki w stronę
510 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
dwuwarstwy. Jego wpływ na płynność błon bę¬
dzie omawiany w dalszej części rozdziału.
Wszystkie opisane wyżej lipidy można rozdzie¬
lić metodą chromatografii kolumnowej, cienko¬
warstwowej lub gazowo-cieczowej, a ich struktu¬
ry można określić techniką spektrometrii mas.
Błona każdej komórki eukariotycznej ma nieco
odmienny skład lipidowy, chociaż fosfolipidy sta¬
nowią w niej główną grupę lipidów.
Lipidy błon są amfipatyczne
Wszystkie podstawowe lipidy występujące w bło¬
nach zawierają zarówno regiony hydrofobowe,
jak i hydrofilowe, i dlatego są nazywane amfipa-
tycznymi. Błony są zatem amfipatyczne. Jeśliby
hydrofobowe regiony zostały oddzielone od reszty
cząsteczki, lipidy byłyby nierozpuszczalne w wo¬
dzie, a rozpuszczalne w oleju. Odwrotnie, gdyby
hydrofilowe regiony zostały oddzielone od reszty
cząsteczki, lipidy byłyby nierozpuszczalne w ole¬
ju, a rozpuszczalne w wodzie. Amfipatyczny cha¬
rakter fosfolipidu przedstawiono schematycznie na
ryc. 40-3. Tak więc, polarne główki fosfolipidów
i grupa hydroksylowa cholesterolu są skierowane
w stronę środowiska wodnego; podobnie zachowu¬
ją się reszty węglowodanowe GSL (p. niżej).
s u s s
Ryc. 40-3. Schemat fosfolipidu lub innego lipidu bton. Polarna
główka jest hydrofilowa, a węglowodorowe ogony są hydrofobo¬
we lub lipofilowe. Kwasy tłuszczowe w ogonach są nasycone (S)
lub nienasycone (U). Pierwsze są zwykle przyłączone do glicerolu
przy C-1, a drugie przy C-2. Zauważalne zagięcie w ogonie niena¬
syconego kwasu tłuszczowego (U) jest ważne ze względu na jego
rolę w zwiększaniu płynności błony.
Nasycone kwasy tłuszczowe mają proste ogo¬
ny, natomiast nienasycone kwasy tłuszczowe,
które zwykle występują w błonach w konfiguracji
cis, tworzą ogony zagięte (p. ryc. 40-3). Im więcej
zagięć jest w ogonie, tym mniej ściśle upakowane
stają się błony i tym bardziej są one płynne.
Amfipatyczne są także cząsteczki detergentów;
są one ważne zarówno w biochemii, jak i w gospo¬
darstwie domowym. Ich struktura jest podobna do
struktury cząsteczek fosfolipidów. Niektóre deter¬
genty są powszechnie stosowane do rozpuszcza¬
nia białek błonowych jako pierwszego etapu ich
oczyszczania. Hydrofobowy koniec cząsteczki
detergentu wiąże się z hydrofobowymi regionami
białka, wypierając większość związanych z nimi
lipidów. Polarny koniec cząsteczki detergentu jest
wolny, wskutek czego białka są wprowadzane do
roztworu w postaci kompleksu białkowo-deter-
gentowego, który zwykle zawiera również lipidy
resztkowe.
Lipidy błon tworzą dwuwarstwy
Amfipatyczny charakter fosfolipidów sugeruje,
że dwa regiony ich cząsteczek mają niezgodne
rozpuszczalności; jednak w takich rozpuszczalni¬
kach jak woda fosfolipidy organizują się w twór,
który pod względem termodynamicznym speł¬
nia wymaganie rozpuszczalności obu regionów.
Takim właśnie tworem jest micela (ryc. 40-4).
Ryc. 40-4. Schemat miceli. Polarne główki znajdują się w wodzie,
natomiast hydrofobowe ogony węglowodorowe są otoczone in¬
nymi węglowodorami i dlatego są chronione przed wodą. Micele
są względnie małymi (w porównaniu z dwuwarstwą lipidową)
strukturami sferycznymi.
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 511
Hydrofobowe regiony miceli są osłonięte od
wody, natomiast hydrofilowe grupy polarne są
zanurzone w środowisku wodnym. Micele jednak
są zwykle małe (średnica ok. 200 nm) i dlatego
mają ograniczoną zdolność tworzenia błon.
Jak wykazali Gorter i Grendel w 1925 roku,
warstwa bimolekularna, lub inaczej dwuwar-
stwa lipidowa, może spełniać termodynamiczne
wymagania dla amfipatycznych cząsteczek w śro¬
dowisku wodnym. To dwuwarstwy, a nie micele,
są rzeczywistymi strukturami błon biologicznych.
Dwuwarstwa ma postać arkusza, w którym hy¬
drofobowe regiony fosfolipidów są chronione
przed środowiskiem wodnym, natomiast regiony
hydrofilowe są zanurzone w wodzie (ryc. 40-5).
Roztwór wodny
Ryc. 40-5. Schemat przekroju poprzecznego dwuwarstwy bło¬
ny utworzonej z cząsteczek fosfolipidów. Ogony nienasyconych
kwasów tłuszczowych są załamane, wskutek czego przestrzenie
między polarnymi główkami są większe i jest więcej miejsca do
przemieszczeń. Powoduje to zwiększenie płynności błony. (Ryci¬
na nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stry-
erL:Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981. Copyright© 1981 by
W.H. Freeman and Company).
2). Gdy cząsteczki lipidów zbliżają się do siebie
w dwuwarstwie, zwiększa się entropia cząsteczek
otaczającego rozpuszczalnika.
Powyższe rozważania nasuwają dwa pytania.
Po pierwsze, jak dużo cząsteczek biologicznie
aktywnych jest rozpuszczalnych w tłuszczach
i tym samym może łatwo wnikać do komórki?
Gazy, takie jak tlen, ditlenek węgla i azot, jako
małe cząsteczki oddziałujące w niewielkim stop¬
niu z rozpuszczalnikami, łatwo dyfundują przez
hydrofobowe regiony błony. Współczynniki prze¬
nikania niektórych jonów i wielu innych cząste¬
czek przez dwuwarstwę lipidową przedstawio¬
no na ryc. 40-6. Trzy elektrolity (Na4, K4 i Cl)
przenikają przez dwuwarstwę wolniej niż woda.
Ogólnie, współczynniki przenikania małych czą¬
steczek przez dwuwarstwę lipidową korelują z ich
rozpuszczalnością w rozpuszczalnikach niepolar-
nych. Na przykład, steroidy łatwiej niż elektrolity
przechodzą przez dwuwarstwę lipidową. Wysoka
wartość współczynnika przenikania samej wody
jest zadziwiająca, ale częściowo można to wyjaś¬
nić małą wielkością cząsteczek wody i względ¬
nym brakiem ładunku.
10'14
Tryptofan
Cl' Glukoza Mocznik,
Glicerol
Na+
I I I I I I I I I i i
10'12 10'10 10^ 10^ KT* 10'2
Współczynnik przenikalności (cm-s1)
Tylko końce lub brzegi dwuwarstwowego ar¬
kusza są eksponowane na niesprzyjające środo¬
wisko, lecz może to być wyeliminowane przez
załamanie arkusza w celu utworzenia zamknięte¬
go pęcherzyka bez brzegów. Dwuwarstwa może
rozciągać się na względnie duże odległości (np.
1 mm). Zamknięta dwuwarstwa warunkuje jedną
z najbardziej istotnych właściwości błon - dzięki
niej błona jest nieprzepuszczalna dla większości
rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek; w prze¬
ciwnym razie cząsteczki te nie rozpuściłyby się
w hydrofobowym wnętrzu dwuwarstwy.
Dwuwarstwy lipidowe powstają samorzutnie
pod wpływem efektu hydrofobowego (rozdz.
Ryc. 40-6. Współczynniki przenikania wody, niektórych jonów
i innych małych cząsteczek przez dwuwarstwę lipidową błon.
Cząsteczki, które szybko przechodzą przez błonę, mają wysoki
współczynnik przenikania. (Rycina nieznacznie zmodyfikowana
i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2,
Freeman, 1981. Copyright © 1981 by W.H. Freeman and Com¬
pany).
Drugie pytanie dotyczy cząsteczek, które nie
są rozpuszczalne w tłuszczach. W jaki sposób
są utrzymywane przezbłonowe gradienty stężeń
cząsteczek nierozpuszczalnych w tłuszczach?
Odpowiedź na to pytanie jest związana z wystę¬
powaniem w błonach białek, które także są czą¬
steczkami amfipatycznymi i mogą się wbudowy-
512 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
wać w odpowiednie regiony amfipatyczne dwu-
warstwy lipidowej. Białka tworzą kanały, którymi
przemieszczają się jony i małe cząsteczki, a także
służą jako przenośniki większych cząsteczek,
niemających innej możliwości przejścia przez
dwuwarstwę. Procesy te opisano niżej.
Białka błon sa związane
z dwuwarstwa lipidowa
Fosfolipidy błon działają jako rozpuszczalniki dla
białek błonowych, tworząc środowisko, w którym
białka te mogą pełnić swoje funkcje. Jak opisano
w rozdz. 5, a-helikalna struktura białek minimali¬
zuje hydrofitowy charakter wiązań peptydowych.
Tym samym białka mogą mieć charakter amfipa-
tyczny i tworzyć integralną część błony dzięki po¬
siadaniu hydrofitowych obszarów skierowanych
do wnętrza i na zewnątrz błony, przy czym są one
połączone przez hydrofobowe obszary przenika¬
jące hydrofobowe wnętrze dwuwarstwy. W isto¬
cie, te części białek błonowych, które przenikają
błony, mają znaczącą ilość hydrofobowych ami¬
nokwasów i niemal zawsze zawierają dużą ilość
struktur a-helikalnych lub pofałdowanych har¬
monijko wo struktur p. W wielu błonach fragment
a-helisy, liczący ok. 20 aminokwasów, przenika
dwuwarstwę.
Możliwe jest obliczenie, czy określona sek¬
wencja aminokwasów występująca w białku
odpowiada lokalizacji przezblonowej. Można
to zrobić na podstawie analizy tabelarycznych
wartości hydrofobowości każdego z dwudzie¬
stu aminokwasów i wartości energii swobodnej
transferu ich z wnętrza błony do wody. Ami¬
nokwasy hydrofobowe mają dodatnie wartości,
natomiast aminokwasy polarne - ujemne. Gra¬
ficzne przedstawienie wartości całkowitej ener¬
gii swobodnej dla transferu kolejnych sekwencji
dwudziestu aminokwasów w białku stanowi tzw.
wykres hydropatyczny. Wartości wyższe od 20
kcal • mol 1 odpowiadają, ale nie dowodzą, loka¬
lizacji przezbłonowej.
Inny aspekt oddziaływania lipidów i białek po¬
lega na tym, że niektóre białka są zakotwiczone
w jednej warstwie dwuwarstwy wskutek połącze¬
nia wiązaniami kowalencyjnymi z niektórymi
lipidami. Kwasami tłuszczowymi tworzącymi
takie połączenia ze specyficznymi białkami są np.
palmitynian i mirystynian. Wiele różnych białek
(p. rozdz. 46) jest związanych ze strukturami gli-
kofosfatydyloinozytolowymi (GPI).
Różne błony maje różny skład białkowy
Liczba różnych białek w błonie waha się od mniej
niż tuzin w siateczce sarkoplazmatycznej do ponad
100 w błonie plazmatycznej. Większość białek
błonowych może być rozdzielona metodą elektro¬
forezy w żelu poliakrylamidowym z siarczanem
dodecylu sodu (SDS-PAGE), która to metoda sta¬
nowiła przełom w badaniach białek. W przypadku
braku SDS niewiele białek błonowych pozostaje
rozpuszczalnych podczas elektroforezy. Białka są
głównymi cząsteczkami funkcjonalnymi błon
i obejmują enzymy, białka transportujące, biał¬
ka strukturalne, białka antygenowe (np. zgod¬
ności tkankowej) i receptory dla różnych cząste¬
czek. Ponieważ każda błona ma inny skład białek,
nie może istnieć takie pojęcie, jak typowa struktu¬
ra błon. Właściwości enzymatyczne kilku różnych
błon przedstawiono w tab. 40-2.
Tabela 40-2. Enzymatyczne markery różnych błon1
Btona
Enzym
Błona plazmatyczna
5' -Nukleotydaza
Cyklaza adenylanowa
Na+K+-ATPaza
Siateczka śródplazmatyczna
Glukozo-6-fosfataza
Aparat Golgiego
Cis
GIcNAc-transteraza I
Środkowy
Golgi mannozydaza II
Trans
Galaktozylotransferaza
TGN2
Sialilotransteraza
Wewnętrzna błona mitochondrialna
Syntaza ATP
1 Błony zawierają wiele białek. Niektóre z nich mają aktywność
enzymatyczną, niektóre występują wyłącznie w określonych bło¬
nach i dlatego mogą być użyte jako markery stopnia oczyszcze¬
nia tych błon.
2 T6N - siateczka trans-Mgl
Błony sa strukturami dynamicznymi
Błony i ich składniki są strukturami dynamicz¬
nymi. Lipidy i białka w błonach ulegają obro¬
towi metabolicznemu, takiemu jaki występuje
w innych kompartmentach komórki. Różne lipi¬
dy podlegają obrotowi metabolicznemu z różną
szybkością. Podobnie poszczególne rodzaje bia-
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 513
łek błonowych cechują się znacznym zróżnico¬
waniem szybkości obrotu metabolicznego. Błona
jako całość może się przekształcać szybciej niż
każdy z jej składników. To zagadnienie jest do¬
kładniej omówione w rozdziale poświęconym en-
docytozie.
Innym wskaźnikiem dynamiczności struktury
błon, jak wykazało wiele badań, jest dyfuzja bocz¬
na lipidów i niektórych białek w płaszczyźnie
błony. Dyfuzji bocznej nie wykazują białka zako¬
twiczone w strukturach wewnątrzkomórkowych,
takich jak mikrofilamenty. Przemieszczanie się na¬
tomiast lipidów w poprzek błony (ang. flip-flop)
jest niezmiernie powolne (p. niżej) i nie zostało
stwierdzone w przypadku jakiegokolwiek białka.
Błony sa strukturami asymetrycznymi
Asymetria błon wynika częściowo z nieregularne¬
go rozmieszczenia w nich białek. Asymetria typu
wewnętrzno-zewnętrznego jest ponadto spowo¬
dowana zewnętrzną lokalizacją węglowodanów
przyłączonych do białek błonowych. Dodatkowo,
specyficzne enzymy są usytuowane albo po stronie
zewnętrznej, albo wewnętrznej błon, jak np. w bło¬
nach mitochondrialnych i plazmatycznych.
W błonach występują również asymetrie re¬
gionalne. Niektóre z nich, np. te występujące na
kosmkowym biegunie komórek śluzówkowych,
są widoczne niemal jako obszary makroskopowe.
Inne, np. asymetrie w złączach szczelinowych,
w złączach zwartych i synapsach, zajmują znacz¬
nie mniejsze obszary błony i są to odpowiednio
mniejsze asymetrie lokalne.
Rozróżnia się również asymetrię wewnętrzno-
-zewnętrzną (poprzeczną) fosfolipidów. Fosfo¬
lipidy zawierające cholinę (fosfatydylocholina
i sfingomielina) występują przede wszystkim
w zewnętrznej warstwie molekularnej, natomiast
aminofosfolipidy (fosfatydyloseryna i fosfaty-
dyloetanoloamina) - w warstwie wewnętrznej.
Oczywiście, jeżeli taka asymetria w ogóle istnieje,
to ruchliwość poprzeczna (flip-flop) fosfolipidów
błonowych musi być ograniczona. Istotnie, fosfo¬
lipidy w syntetycznych dwu warstwach wykazują
się niezwykle małą szybkością w procesie flip-
-flop; okres półtrwania tej asymetrii może wyno¬
sić kilka tygodni.
Mechanizmy rządzące asymetrią lipidów nie
zostały dobrze poznane. Enzymy uczestniczą¬
ce w syntezie fosfolipidów są zlokalizowane na
cytoplazmatycznej stronie błon pęcherzyków
mikrosomalnych. Istnieją jednak translokazy
(flipazy), które przenoszą określone fosfolipi¬
dy (np. fosfatydylocholinę) z wewnętrznej war¬
stwy do zewnętrznej. Specyficzne białka, które
wiążą preferencyjnie określone fosfolipidy,
również występują w dwóch warstwach, uczest¬
nicząc w asymetrycznym rozmieszczeniu cząste¬
czek tych lipidów. Ponadto, białka biorące udział
w przemieszczaniu fosfolipidów (białka wymia¬
ny fosfołipidowej) rozpoznają specyficzne fosfo¬
lipidy i przenoszą je z jednej błony (np. z siateczki
śródplazmatycznej [ER]) do innej (np. mitochon-
drialnej i peroksysomalnej).
Asymetria dotyczy również GSL oraz głiko-
protein; reszty węglowodanowe tych cząsteczek
wystają na zewnątrz błony plazmatycznej i nie
występują w jej wnętrzu.
Błony zawierała białka integralne
i peryferyjne
Białka błonowe można podzielić na dwa typy:
integralne i peryferyjne (ryc. 40-7). Większość
białek błonowych to integralne składniki błon,
co oznacza, że oddziałują one z fosfolipidami
i wymagają użycia detergentów w celu ich roz¬
puszczenia. Ponadto, wnikają one w głąb dwu-
warstwy. Białka integralne są zwykle globular-
ne i amfipatyczne. Składają się z hydrofilowych
końców rozdzielonych regionem hydrofobowym,
który przenika hydrofobowe wnętrze dwuwar-
stwy. Im lepiej poznaje się strukturę integralnych
białek błonowych, tym bardziej oczywisty staje
się fakt, że niektóre z nich (np. cząsteczki trans¬
portujące, różne receptory i białka G) przenikają
dwuwarstwę wiele razy (p. ryc. 45-5). Białka in¬
tegralne również są asymetrycznie rozmieszczone
w dwuwarstwie błony. Tę asymetryczną orientację
w błonie uzyskują w czasie wbudowywania się do
dwuwarstwy lipidowej. Mechanizmy molekular¬
ne wbudowywania się białek do błon i sposób
ich rozmieszczenia w błonach zostały omówione
w rozdz. 45.
Białka peryferyjne nie oddziałują bezpo¬
średnio z hydrofobowym rdzeniem fosfolipidów
w dwuwarstwie i dlatego nie wymagają użycia
detergentów w celu ich uwolnienia. Są one sła¬
bo związane z hydrofitowymi obszarami spe-
514 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Ryc. 40-7. Model płynnej mozaiki opisujący strukturę błony. Błona składa się z dwucząsteczkowej warstwy lipidowej zawierającej
białka, które albo są wbudowane do niej, albo są związane z jej powierzchnią. Integralne białka błonowe są silnie zakotwiczone w war¬
stwie lipidowej. Niektóre z tych białek przenikają całkowicie dwuwarstwę, i w związku z tym zostały nazwane białkami przezbłonowymi,
natomiast inne białka są wbudowane w zewnętrzną lub wewnętrzną warstwę lipidowej dwuwarstwy. Białka luźno związane z zewnętrzną
lub wewnętrzną powierzchnią błony zostały nazwane białkami peryferyjnymi. Wiele z tych białek i wszystkie glikolipidy mają wystające
na zewnątrz łańcuchy oligosacharydowe. (Rycina reprodukowana za zgodą z: Junqueira LC, Carneiro J: Basic Histology: Text & Atlas,
wyd. 10, McGraw-Hill, 2003).
cyficznych białek integralnych oraz główkami
fosfolipidów i można je z nich uwolnić, działając
roztworami soli o wysokiej sile jonowej. Na przy¬
kład ankiryna, białko peryferyjne, jest związana
z integralnym białkiem pasma 3 („band 3”) błony
erytrocytamej. Spektryna, białko cytoszkieletu
erytrocytu, jest związana z ankiryną, przez co od¬
grywa ważną rolę w utrzymaniu jego dwuwklę-
słego kształtu.
SZTUCZNE BŁONY MOGĄ BYĆ UŻYTE
00 BADANIA FUNKCJI BŁON
Sztuczne systemy błonowe mogą być przygoto¬
wywane odpowiednimi metodami. Systemy te za¬
sadniczo składają się z co najmniej jednego rodza¬
ju fosfolipidów naturalnych lub syntetycznych;
mogą one być spreparowane (np. przez łagodną
sonifikację) w postaci sferycznych pęcherzyków,
w których lipidy tworzą dwuwarstwę. Takie pę¬
cherzyki, otoczone dwuwarstwą lipidową, nazy¬
wają się liposomami.
A oto niektóre z zalet stosowania sztucznych
systemów błonowych w badaniach funkcji błon.
1. Skład lipidów błonowych można zmieniać, co
pozwala na systematyczne badania wpływu zmien¬
nego składu lipidów na określone funkcje błon.
2. Do pęcherzyków można wbudowywać
oczyszczone białka błonowe łub enzymy w celu
wyjaśnienia, jakie czynniki (np. specyficzne lipi¬
dy lub pomocnicze białka) są wymagane do przy¬
wrócenia funkcji białek.
3. Środowisko tych systemów może być do¬
kładnie kontrolowane i systematycznie zmieniane
(np. stężenie jonów, ligandy).
4. Gdy sporządza się liposomy, można „napeł¬
nić” je określonymi substancjami, np. lekami
lub izolowanymi genami. Zainteresowanie wyko¬
rzystaniem liposomów do dystrybucji leków do
określonych tkanek jest bardzo duże i jeśli niektóre
składniki (np. przeciwciała przeciw określonym
cząsteczkom powierzchniowym komórki) mogłyby
być wbudowywane do liposomów w taki sposób,
że liposomy te trafiałyby do określonych tkanek
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 515
lub nowotworów, to efekt terapeutyczny mógłby
być znaczący. DNA zamknięty wewnątrz liposo-
mów staje się mniej wrażliwy na atak nukleaz; ta
cecha może być użyteczna w terapii genowej.
MODEL PŁYNNEJ MOZAIKI
JEST POWSZECHNIE UZNAWANYM
MODELEM STRUKTURY BŁON
Model płynnej mozaiki dotyczący struktury błon
został zaproponowany w 1972 r. przez Singera
i Nicolsona (p. ryc. 40-7). Model ten jest często
porównywany do gór lodowych (białka błonowe)
unoszących się w morzu przeważających ilościo¬
wo cząsteczek fosfolipidowych. Wcześniejszym
potwierdzeniem tego modelu była obserwacja, że
niektóre gatunkowo specyficzne białka integralne
(wykrywane technikami znakowania fluorescen¬
cyjnego) ulegają szybkiej i przypadkowej redys¬
trybucji w błonie plazmatycznej komórki, będącej
międzygatunkową hybrydą utworzoną w wyniku
sztucznej fuzji dwóch różnych komórek rodziciel¬
skich. Później wykazano, że fosfolipidy również
ulegają szybkiemu przemieszczaniu w płaszczyź¬
nie błony. Ta dyfuzja w płaszczyźnie błony, na¬
zwana dyfuzją boczną, może być bardzo szybka
w przypadku fosfolipidów; i rzeczywiście, jedna
cząsteczka fosfolipidu może w płaszczyźnie bło¬
ny przemieszczać się o kilka mikrometrów w cią¬
gu sekundy.
Zmiany fazowe, a tym samym płynność błon,
w dużym stopniu zależą od składu lipidowego
błony. W dwuwarstwie lipidowej łańcuchy hydro¬
fobowe kwasów tłuszczowych mogą być bardzo
wyrównane lub uporządkowane w celu zapew¬
nienia stosunkowo sztywnej struktury. Gdy tem¬
peratura wzrasta, hydrofobowe łańcuchy boczne
przechodzą ze stanu uporządkowanego (faza że-
lopodobna lub krystaliczna) w stan nieuporząd¬
kowany, stając się układem cieczopodobnym lub
płynnym. Temperatura, w jakiej struktura prze¬
chodzi z uporządkowanej w nieuporządkowaną
(tj. topi się), nosi nazwę temperatury przemiany
fazowej (Tm). Dłuższe i bardziej nasycone łań¬
cuchy kwasów tłuszczowych oddziałują silnie ze
sobą poprzez swoje dłuższe łańcuchy węglowo¬
dorowe i dlatego są odpowiedzialne za wyższe
wartości Tm, a to oznacza, że do wzrostu płyn¬
ności dwuwarstwy są wymagane wyższe tem¬
peratury. Ponadto, wiązania nienasycone, które
występują w konfiguracji cis, powodują upłynnia¬
nie dwuwarstwy przez zmniejszanie upakowania
łańcuchów bocznych bez osłabiania właściwości
hydrofobowych (p. ryc. 40-3). Fosfolipidy błon
komórkowych zwykle zawierają co najmniej je¬
den nienasycony kwas tłuszczowy z co najmniej
jednym wiązaniem podwójnym typu cis.
Cholesterol modyfikuje płynność błon. W tem¬
peraturach niższych od Tm zaburza oddziaływanie
węglowodorowych łańcuchów kwasów tłuszczo¬
wych, powodując wzrost płynności. W tempera¬
turach wyższych od Tm zmniejsza stopień nieupo¬
rządkowana, ponieważ jest bardziej sztywny niż
węglowodorowe łańcuchy kwasów tłuszczowych
i nie może poruszać się w błonie w takim samym
zakresie jak one, co prowadzi do zmniejszenia
płynności błony. Przy dużych wartościach pro¬
porcji cholesterol/fosfolipid temperatury przejścia
fazowego są niewyznaczalne.
Płynność błon w istotnym stopniu determinuje
ich funkcje. Jeżeli płynność wzrasta, zwiększa się
przepuszczalność błon dla wody i małych hydro-
filowych cząsteczek. Ze wzrostem płynności błon
zwiększa się także ruchliwość boczna białek inte¬
gralnych. Jeżeli aktywna część białka integralne¬
go odpowiedzialna za określoną funkcję znajduje
się wyłącznie w jego regionach hydrofilowych, to
zmiana płynności lipidów będzie prawdopodobnie
miała niewielki wpływ na aktywność tego białka;
jeżeli jednak białko to spełnia funkcje transpor¬
towe, a biorące udział w transporcie składniki
przenikają przez błonę, to zjawiska zachodzące
w fazie lipidowej mogą w istotny sposób zmie¬
niać szybkość transportu. Wyjątkowo dobrym
przykładem zmian funkcji wywołanych zmiana¬
mi płynności błony jest receptor insulinowy. Gdy
stężenie nienasyconych kwasów tłuszczowych
w błonie wzrasta (podczas hodowli komórkowej
na pożywce bogatej w takie cząsteczki), zwiększa
się również płynność błony. To zmienia receptor
do tego stopnia, że wiąże on więcej insuliny.
Rafty lipidowe, kaweole i ścisłe
złqcza są specyficznymi cechami
błon plazmatycznych
Błony plazmatyczne zawierają wyspecjalizowane
struktury, których niektóre szczegóły ich bioche¬
micznej natury zostały już poznane.
516 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJI WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Białka związane z GPI
?
Fosfolipid (PL)
Sfingomielina (SM)
Różne węglowodany
glikosfingolipidu (GSL)
lub białka związane z GPI
Ryc. 40-8. Schemat rafty lipidowej. Rafty lipidowe są nieco bardziej zagęszczone niż pozostała
część dwuwarstwy. Są one wzbogacone w sfingolipidy (np. sfingomielinę), glikosfingolipidy (np.
gangliozyd GM^, nasycone fosfolipidy i cholesterol. Zawierają także niektóre białka związane z GPI
(zewnętrzna warstwa) oraz acylowane i prenylowane białka (wewnętrzna warstwa). Białka zwią¬
zane z GPI omówiono w rozdz. 46. Acylacja i prenylacja to reakcje potranslacyjnej modyfikacji
niektórych białek błonowych.
STRONA ZEWNĘTRZNA
Ryc. 40-9. Schemat kaweoli. Kaweola jest wpukleniem błony pla-
zmatycznej. Białko kaweolina odgrywa ważną rolę w tworzeniu
kaweoli i występuje jako dimer. Każdy monomer jest zakotwiczo¬
ny w wewnętrznej warstwie błony plazmatycznej za pośredni¬
ctwem trzech cząsteczek palmitynianu (nie pokazano).
Rafty lipidowe (tratwy lipidowe) są dynamicz¬
nymi obszarami warstwy egzoplazmatycznej
dwuwarstwy lipidowej, wzbogaconymi w chole¬
sterol, sfingolipidy i niektóre białka (ryc. 40-8).
Uczestniczą one w przekazywaniu sygnałów i in¬
nych procesach. Uważa się, że nagromadzenie się
określonych składników systemów sygnalizacyj¬
nych blisko siebie może zwiększać skuteczność
ich funkcjonowania.
Kaweole mogą powstawać z raft lipidowych.
Wiele, jeśli nie wszystkie, zawierają białko kawe-
olinę-1, które może uczestniczyć w ich powsta¬
waniu z raft. Kaweole są widoczne pod mikrosko¬
pem elektronowym jako wpuklenia błony komór¬
kowej w kształcie butelki (ryc. 40-9). Białka wy-
stępujące w kaweolach obejmują różne składniki
systemów przekaźnictwa sygnału (np. receptor in¬
sulinowy i niektóre białka G), receptor folianowy
i endotelialną syntazę tlenku azotu (eNOS). Ka¬
weole i rafty lipidowe są przedmiotem intensyw¬
nych badań, a ich prawdopodobna rola w różnych
schorzeniach jest szybko rozpoznawana.
Innymi strukturami występującymi w błonach
powierzchniowych są ścisłe złącza. Są one czę¬
sto zlokalizowane poniżej apikalnej powierzchni
komórek nabłonkowych i zapobiegają dyfuzji
makrocząsteczek pomiędzy komórkami. Zbu¬
dowane są z różnych białek, takich jak okludy-
ny, różne klaudyny i cząsteczki adhezyjne złącz
szczelinowych.
Do innych wyspecjalizowanych struktur wy¬
stępujących w błonach powierzchniowych nale-
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 517
żądesmosomy, złącza adhezyjne i mikrokosmki;
ich chemiczna natura i funkcje nie zostały tutaj
omówione. Charakterystykę złącz szczelinowych
opisano niżej.
WYBIÓRCZOŚĆ (SELEKTYWNOŚĆ)
BŁON POZWALA NA UTRZYMANIE
WŁAŚCIWEGO SKŁADU I FUNKCJI
KOMÓREK
Jeżeli błona plazmatyczna jest względnie nieprze¬
puszczalna, to jak większość cząsteczek dostaje
się do komórki? Na czym polega wybiórczość
tego ruchu? Odpowiedzi na te pytania są ważne
dla zrozumienia, jak komórki dostosowują się
do stale zmieniającego się środowiska zewnętrz¬
nego. W organizmach wielokomórkowych musi
więc być możliwość komunikowania się między
sąsiadującymi i odległymi komórkami, aby złożo¬
ne procesy biologiczne mogły być w nich koordy¬
nowane. Sygnały takie docierają do komórek i są
przenoszone przez błony lub po wstają jako konse¬
kwencja pewnych oddziaływań z błoną. Niektóre
z głównych mechanizmów tych procesów przed¬
stawiono w tab. 40-3.
Tabela 40-3. Przenoszenie materiału i informacji przez błony
Przemieszczanie małych cząsteczek przez błony
Dyfuzja (bierna i ułatwiona)
Transport aktywny
Przemieszczanie dużych cząsteczek przez błony
Endocytoza
Egzocytoza
Przenoszenie sygnałów przez błony
Receptory powierzchniowe komórek
1. Transdukcja sygnału (np. glukagon -+ cAMP)
2. Internalizacja sygnału (sprzężona z endocytozą, np. re¬
ceptor LDL)
Przemieszczanie do wewnątrzkomórkowych receptorów
(hormony steroidowe; rodzaj dyfuzji)
Międzykomórkowy kontakt i komunikacja
Niektóre małe cząsteczki są biernie
przenoszone przez błony
Cząsteczki mogą biernie przenikać przez dwu-
warstwę, zgodnie z elektrochemicznym gradien¬
tem, w wyniku dyfuzji prostej lub dyfuzji uła¬
twionej. To spontaniczne przemieszczanie się,
aż do ustalenia się równowagi, jest przeciwstaw¬
ne transportowi aktywnemu, który wymaga
energii, gdyż ruch zachodzi w kierunku przeciw¬
nym do gradientu elektrochemicznego. Na ryci¬
nie 40-10 przedstawiono schemat tych mechani¬
zmów.
Jak już wspomniano, niektóre substancje roz¬
puszczone, np. gazy, mogą wnikać do komórki,
dyfundując przez błonę zgodnie z elektroche¬
micznym gradientem, co nie wymaga energii
metabolicznej. Prostą dyfuzję bierną substancji
rozpuszczonej przez błonę ograniczają: termicz¬
ne wzbudzenie tej cząsteczki, gradient stężenia
w poprzek błony i rozpuszczalność tej substancji
(współczynnik przenikania, p. ryc. 40-6) w hydro¬
fobowym wnętrzu dwuwarstwy błony. Rozpusz¬
czalność jest odwrotnie proporcjonalna do liczby
wiązań wodorowych, które muszą zostać roze¬
rwane, aby substancja rozpuszczona znajdująca
się w zewnętrznej fazie wodnej mogła się wbu¬
dować w hydrofobową dwu warstwę. Elektrolity,
jako słabo rozpuszczalne w lipidach, nie tworzą
wiązań wodorowych z wodą, lecz uzyskują otocz¬
kę hydratacyjną wskutek oddziaływania elek¬
trostatycznego. Wielkość tej otoczki jest wprost
proporcjonalna do gęstości ładunku elektrolitu.
Elektrolity o dużej gęstości ładunku mają większą
otoczkę hydratacyjną i przez to mniejszą szyb¬
kość dyfuzji. Na przykład Na+ma większą gęstość
ładunku niż K\ Uwodniony Na+jest zatem więk¬
szy niż uwodniony K+ i dlatego K+ przenika przez
błony łatwiej.
Czysta dyfuzja substancji zależy od nastę¬
pujących czynników: 1) gradientu jej stężeń
w poprzek błony; substancje rozpuszczone prze¬
mieszczają się w kierunku od stężenia dużego do
małego; 2) potencjału elektrycznego w poprzek
błony; substancje rozpuszczone przemieszcza¬
ją się w kierunku roztworu mającego przeciwny
ładunek; wnętrze komórki zwykle ma ładunek
ujemny; 3) współczynnika przepuszczalności da¬
nej substancji przez błonę; 4) gradientu ciśnienia
hydrostatycznego w poprzek błony; wzrost ciś¬
nienia powoduje wzrost szybkości dyfuzji i czę¬
stości zetknięć cząsteczki z błoną; 5) temperatury;
podwyższenie temperatury powoduje wzrost ru¬
chliwości cząsteczek, co zwiększa częstotliwość
zderzeń między nimi a błoną. Należy dodać, że
w błonach występuje wiele kanałów, które torują
wnikanie jonów do komórek.
518 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Transportowana
cząsteczka
Dwuwarstwa
lipidowa
Gradient
elektrochemiczny
V
••
T ransport bierny T ransport aktywny
Ryc. 40-10. Wiele małych nienaiadowanych cząsteczek przechodzi swobodnie przez dwuwarstwę lipido¬
wą. Cząsteczki naładowane, większe nienaładowane cząsteczki i niektóre małe nienaładowane cząsteczki
są przenoszone przez kanały lub pory lub przez specyficzne białka transportujące. Transport bierny nastę¬
puje zawsze zgodnie z gradientem elektrochemicznym aż do ustalenia się równowagi. Transport aktywny
następuje w kierunku przeciwnym do elektrochemicznego gradientu i wymaga nakładu energii, natomiast
transport bierny nie wymaga energii. (Rycina przedrukowana za zgodą z: Alberts B et al: Molecular Biology
ofthe Celi. Garland, 1983).
Kanały jonowe są białkami
przezbłonowymi, które umożliwiają
wybiórcze (selektywne) wnikanie
różnych jonów
Naturalne błony zawierają przezbłonowe kanały
- struktury przypominające pory, złożone z bia¬
łek tworzących wybiórcze kanały jonowe. Kana¬
ły przewodzenia kationowego mają średnicę ok.
5-8 nm. Przepuszczalność kanału zależy od wiel¬
kości jonu, stopnia jego hydratacji i od gęstości ła¬
dunku jonu. Wykazano istnienie swoistych kana¬
łów dla Na+, K\ Ca2+ i Cl; jeden z takich kanałów
przedstawiono na ryc. 40-11. Jest on zbudowany
z czterech podjednostek. Każda podjednostka jest
złożona z sześciu a-helikalnych przezbłonowych
domen. Końce aminowy (N) i karboksylowy (C)
są umiejscowione w cytoplazmie, a pętle wysta¬
ją na zewnątrz i do wnętrza komórki. Por wy¬
stępujący w kanale, przez który przenikają jony,
nie został przedstawiony. Stanowi on centrum
struktury (średnica ok. 5-8 nm) utworzone przez
odpowiednie zestawienie podjednostek. Kanały
jonowe charakteryzują się dużą wybiórczością
(selektywnością), pozwalającą na przechodzenie
często tylko jednego rodzaju jonu (Na+, Ca2+ itp.).
Odmian strukturalnych danego kanału jest wiele,
jednak ogólnie wszystkie kanały jonowe są zbu¬
dowane z przezbłonowych podjednostek, które
układają się obok siebie, tworząc centralny por
selektywnie przepuszczający jony.
Błony komórek nerwowych zawierają dobrze
zbadane kanały jonowe, które są odpowiedzialne
za wytwarzanie potencjałów czynnościowych.
Aktywność niektórych z tych kanałów jest kon¬
trolowana przez neuroprzekaźniki; dlatego też ak¬
tywność kanałów może być regulowana.
Kanały jonowe są otwarte okresowo. Oznacza
to, że są one „bramkowane”, czyli są otwierane lub
zamykane. W kanałach bramkowanych ligan-
dem specyficzna cząsteczka wiąże się z recepto¬
rem i w ten sposób otwiera kanał. Kanały bram¬
kowane napięciem otwierają się (lub zamykają)
w odpowiedzi na zmianę potencjału błonowego.
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 519
Ryc. 40-11. Schemat struktury kanału jonowego (kanał Na+ w mózgu szczura). Rzymskie cyfry oznaczają cztery podjednostki kanału,
a arabskie - a-helikalne domeny przezbłonowe każdej podjednostki. Por, przez który przenikają jony (Na+) nie został pokazany; po¬
wstaje on przez odpowiednie zestawienie różnych podjednostek. Nie pokazano również specyficznych obszarów podjednostek, które
biorą udział w otwieraniu i zamykaniu kanału. (Według WK Catterall, po zmodyfikowaniu i reprodukowaniu z: Hall ZW: An Introduction
toMolecularNeurobiology. Sinauer, 1992).
Niektóre właściwości kanałów jonowych
przedstawiono w tab. 40-4; inne aspekty związane
z kanałami jonowymi zostały omówione skróto¬
wo w rozdz. 48.
Tabela 40-4. Niektóre właściwości kanałów jonowych
• Składają się z przezbłonowych podjednostek białkowych.
• Większość jest wysoce selektywna dla jednego rodzaju jonu;
kilka jest nieselektywnych.
• Umożliwiają przemieszczanie przez błonę nieprzepuszczal¬
nych jonów z szybkościami zbliżonymi do szybkości dyfuzji.
• Umożliwiają przepływ jonów z szybkością 106-107/s.
• Ich aktywności są regulowane.
• Dzielą się na dwa rodzaje: bramkowane napięciem i bramko¬
wane ligandem.
• Ich budowa jest zazwyczaj zachowana w obrębie gatunku.
• Większość komórek ma różnorodne kanały: Na+, K+, Ca2+
iCf.
• Mutacje w genach je kodujących mogą być przyczyną specy¬
ficznych chorób1.
• Niektóre leki wpływają na ich aktywność.
1 Niektóre choroby spowodowane mutacjami kanałów jonowych
zostały skrótowo omówione w rozdz. 48.
SZCZEGÓŁOWE BADANIA KANAŁU K+
I KANAŁU BRAMKOWANEGO NAPIĘCIEM
UMOŻLIWIŁY POZNANIE ICH DZIAŁANIA
Aby zrozumieć działanie kanałów jonowych, nale¬
ży dokładnie scharakteryzować ich cztery główne
właściwości, a mianowicie: 1) ogólną ich struktu¬
rę; 2) sposób, w jaki przewodzą jony tak szybko;
3) wybiórczość (selektywność) i 4) podatność na
bramkowanie. W rozumieniu tych trudnych zagad¬
nień nastąpił w ostatnich latach znaczny postęp.
Szczególny postęp w wyjaśnieniu struktu¬
ry i funkcji kanału K+ (KvAP) występującego
u Streptomyces lividans nauka zawdzięcza Mac-
Kinnonowi i wsp. W badaniach zastosowali oni
różne techniki, takie jak ukierunkowana mutage-
neza i krystalografia rentgenowska. Kanał K4 jest
integralnym białkiem błonowym, zbudowanym
z czterech identycznych podjednostek, z których
każda zawiera dwa segmenty przezbłonowe, two¬
rzące strukturę przypominającą odwrócony wig¬
wam (ryc. 40-12). Część kanału, która odpowiada
za selektywność jonową (filtr selektywności) ma
520 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Ryc. 40-12. Schemat struktury kanału K+ (KvAP) u Streptomy-
ces Hvidans. Przedstawiony jest pojedynczy kanat K+ w dużej
wodnej jamie w środkowej części btony. Dwa helikalne regiony
białka kanałowego są skierowane swymi końcami karboksylowy¬
mi w stronę jonu K+. Ułożenie kanału wyznaczają atomy tlenu
karboksylowego. (Rycina zmodyfikowana za zgodą z: Doyle DA
et al. Science 1998; 280:69. Copyright © 1998 AAAS).
długość 1,2 nm (12 A) (jest to względnie mała
długość błony, więc K+ nie musi daleko prze¬
mieszczać się w błonie) i znajduje się na szerokim
końcu odwróconego wigwamu. Duża, wypełnio¬
na wodą jama i helikalne dipole, przedstawione
na ryc. 40-12, ułatwiają kationowi pokonanie
względnie dużej elektrostatycznej bariery ener¬
getycznej i tym samym umożliwia mu przejście
przez błonę. Filtr selektywności jest odpowied¬
nio ustawiony atomami tlenu karbonylowego
(co wynika z sekwencji TVGYG), dostarczając
w ten sposób wielu miejsc, z którymi mogą od¬
działywać jony K\ Jony te, ulegając dehydratacji
podczas wnikania do filtru o małej selektywności,
dopasowują się do niego, przyjmując właściwą
koordynację. Jon Na+ jest natomiast zbyt mały,
aby oddziaływać z atomami tlenu karbonylowego
w odpowiednim ustawieniu filtru i zostaje odrzu¬
cony. Gdy dwa jony K+ zbliżają się do siebie w fil¬
trze, odpychają się wzajemnie. To odpychanie jest
silniejsze niż oddziaływanie między K+ i otacza¬
jącymi cząsteczkami białka, dzięki czemu możli¬
we jest bardzo szybkie przechodzenie jonów K+
z dużą selektywnością.
Inne badania, dotyczące kanału jonowego
bramkowanego napięciem (HvAP) występują¬
cego u Aeropyrum pernix, ujawniły wiele cech
związanych z mechanizmami jego reagowania na
zmiany napięcia i bramkowania. Kanał ten jest
zbudowany z czterech podjednostek, z których
każda ma sześć przezbłonowych segmentów. Je¬
den z sześciu segmentów (S4 i część S3) jest czuj¬
nikiem napięcia. Zachowuje się on jak obdarzone
ładunkiem wiosło (ryc. 40-13), ponieważ może
poruszać się w wewnętrznej części błony, przeno¬
sząc cztery dodatnie ładunki (wynikające z obec¬
ności 4 reszt Arg w każdej podjednostce) z jednej
powierzchni błony na drugą, w odpowiedzi na
zmiany napięcia. W każdym kanale znajdują się
cztery takie czujniki napięcia, związane z bram¬
ką kanału. Część bramki kanału jest zbudowana
z helis S6 (po jednej z każdej podjednostki). Ru¬
chy tej części kanału, jako reakcja na zmiany na¬
pięcia, skutecznie zamykają kanał lub ponownie
go otwierają, umożliwiając w tej drugiej sytuacji
przepływ jonów.
Ryc. 40-13. Schemat kanału K+ u Aeoropyrum pernix bramko¬
wanego napięciem. Czujniki napięcia zachowują się jak wiosła,
które poruszają się w wewnętrznej części błony. Cztery czujni¬
ki napięcia (tylko dwa przedstawiono na rycinie) są związane
z bramką kanału. Każdy czujnik ma cztery dodatnie ładunki po¬
chodzące od reszt argininy. (Rycina zmodyfikowana za zgodą
z: Siqworth E Naturę 2003; 123:21. Copyright © 2003. Zaadap¬
towano za zezwoleniem Macmillan Publishers Ltd.).
Jonofory sa cząsteczkami działającymi
jak błonowe „czółenka” przerzucające
różne jony
Niektóre mikroorganizmy syntetyzują małe czą¬
steczki organiczne, jonofory, które spełniają
funkcję „czółenek” układów wahadłowych, które
przerzucają jony przez błonę. Jonofory te zawiera¬
ją centra hydrofilowe, które wiążą określone jony,
i są otoczone obwodowymi regionami hydrofobo¬
wymi; taka organizacja pozwala cząsteczkom na
skuteczne rozpuszczenie się w błonie i dyfuzję
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 521
w poprzek błony. Inne jonofory, np. dobrze zba¬
dany polipeptyd gramicydyna, tworzą kanały.
Mikrobiologiczne toksyny, takie jak toksyna
dyfterii, i aktywowane składniki dopełniacza su¬
rowicy mogą wytwarzać duże pory w błonach ko¬
mórkowych i w ten sposób umożliwiać przejście
makrocząsteczek bezpośrednio do środowiska
wewnętrznego.
Akwaporyny sa białkami, które tworzą
kanały wodne w niektórych błonach
W niektórych komórkach (np. czerwonych krwin¬
kach, komórkach kanalików zbiorczych nerki)
przenikanie wody na zasadzie dyfuzji prostej jest
wzmożone wskutek przemieszczania się jej przez
kanały wodne. Kanały te są zbudowane z tetrame-
rycznych białek przezbłonowych, zwanych akwa-
porynami. Zidentyfikowano 10 różnych akwapo-
ryn (od AP-1 do AP-10). Stwierdzono, że mutacje
w genie kodującym AP-2 są przyczyną jednego
z typów nerkopochodnej moczówki prostej.
BŁONY PLAZMATYCZNE UCZESTNICZĄ
W DYFUZJI UŁATWIONEJ, TRANSPORCIE
AKTYWNYM I INNYCH PROCESACH
Systemy transportowe można scharakteryzować
w sensie funkcjonalnym na podstawie liczby
przemieszczanych cząsteczek oraz kierunku prze¬
mieszczania (ryc. 40-14) lub też uwzględniając,
Ryc. 40-14. Schemat działania różnych rodzajów systemów
transportowych. Transportery mogą być klasyfikowane wg kie¬
runku przemieszczania cząsteczek lub też liczby przemieszcza¬
nych swoistych cząsteczek (jedna czy więcej). Uniport umożli¬
wia też przemieszczanie w przeciwnym kierunku, w zależności od
stężenia cząsteczki transportowanej wewnątrz i zewnątrz komór¬
ki. (Rycina przedrukowana za zgodą z: Alberts B et al: Molecular
Biologyofthe Celi. Garland, 1983).
czy odbywa się ono w kierunku uzyskania równo¬
wagi, czy odwrotnie. System uniportowy polega
na dwukierunkowym ruchu cząsteczek jednego
rodzaju. W systemach kotransportowych przeni¬
kanie jednej substancji rozpuszczonej zależy od
stechiometrycznego, jednoczesnego lub następ¬
czego, przeniesienia innej substancji rozpuszczo¬
nej. System symportowy polega na przenikaniu
dwóch substancji rozpuszczonych w tym samym
kierunku. Przykładem są transportery protonu-
-węglowodanu w bakteriach oraz transportery
Na+-węglowodanu (dla glukozy i niektórych in¬
nych węglowodanów), a także transportery Na+-
-aminokwasu w komórkach ssaków. Systemy
antyportowe są odpowiedzialne za ruch dwóch
cząsteczek w przeciwnych kierunkach (np. Na+ do
środka i Ca2+ na zewnątrz).
Cząsteczki, które nie mogą samorzutnie i swo¬
bodnie przenikać przez dwuwarstwę lipidową
błony, czynią to dzięki asocjacji z białkami trans¬
portującymi. Zjawisko to dotyczy dwóch proce¬
sów: dyfuzji ułatwionej i transportu aktywne¬
go, a także bardzo specyficznych systemów trans¬
portowych.
Dyfuzja ułatwiona i transport aktywny mają
wiele cech wspólnych. Przebiegają z udziałem
białek transportujących i wykazują swoistość
dla jonów, węglowodanów i aminokwasów.
Badania mutacji w komórkach bakteryjnych
i zwierzęcych (także takie, które dotyczą chorób
u ludzi) potwierdziły te przypuszczenia. Dyfuzja
ułatwiona i transport aktywny przypominają
reakcję substrat-enzym, z tym że nie wystę¬
pują oddziaływania walencyjne. Podobieństwa
są następujące: 1) substancja rozpuszczona ma
swoiste miejsce wiązania; 2) białko transportu¬
jące ulega wy syceniu, dlatego też można okre¬
ślić maksymalną szybkość transportu (Fmax; ryc.
40-15); 3) stała wiązania substancji rozpuszczo¬
nej wynosi Km i taka stała jest charakterystyczna
dla całego systemu (p. ryc. 40-15); 4) inhibito¬
ry kompetycyjne o podobnej strukturze blokują
transport.
Zasadnicze różnice są następujące: 1) dyfuzja
ułatwiona może być dwukierunkowa, natomiast
transport aktywny przebiega zwykle w jednym
kierunku; 2) transport aktywny zawsze zachodzi
w kierunku przeciwnym do gradientu elektrycz¬
nego lub chemicznego, dlatego wymaga dostar¬
czenia energii.
522 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Stężenie substancji rozpuszczonej
Ryc. 40-15. Porównanie kinetyki dyfuzji z udziałem transportera
(dyfuzji ułatwionej) z dyfuzją bierną. Szybkość przemieszczania
w tej ostatniej jest wprost proporcjonalna do stężenia substancji
rozpuszczonej, natomiast w przypadku udziału transportera pro¬
ces wykazuje cechy nasycenia. Stężenie substancji rozpuszczo¬
nej w połowie maksymalnej szybkości dyfuzji jest równe stałej
wiązania (Km) substancji rozpuszczonej przez transporter (l^
-szybkość maksymalna).
Dyfuzja ułatwiona
Niektóre substancje rozpuszczone dyfundują
przez błonę zgodnie z gradientem elektroche¬
micznym znacznie szybciej, niż można oczekiwać
na podstawie ich wielkości, ładunku lub wartości
współczynnika podziału. Ta ułatwiona dyfuzja
cechuje się odmiennymi właściwościami niż dy¬
fuzja prosta. Szybkość dyfuzji ułatwionej, która
stanowi system uniportowy, może osiągnąć stan
nasycenia; oznacza to, że liczba miejsc biorących
udział w dyfuzji określonej substancji rozpusz¬
czonej jest ograniczona. Wiele systemów dyfuzji
ułatwionej cechuje się stereospecyficznością, jed¬
nak - podobnie jak dyfuzja prosta - nie wymagają
one energii metabolicznej.
Proces dyfuzji ułatwionej można wytłumaczyć
na podstawie mechanizmu „ping-pong” (ryc.
40-16). Według tego modelu, białko transportują¬
ce może przyjmować dwie podstawowe konfor¬
macje. W stanie „pong” jest ono eksponowane na
duże stężenia substancji rozpuszczonej i cząstecz¬
ki tej substancji przyłączają się do specyficznych
miejsc w białku transportującym. Transport za¬
chodzi wtedy, kiedy wskutek zmiany konformacji
białko transportujące zwróci się w stronę mniej¬
szego stężenia substancji rozpuszczonej (stan
„ping”). Proces ten jest całkowicie odwracalny,
tak więc rzeczywisty przepływ w poprzek błony
zależy od gradientu stężenia. Szybkość, z jaką
substancja rozpuszczona wnika do komórki na
zasadzie dyfuzji ułatwionej zależy od następują¬
cych czynników: 1) gradientu stężenia w poprzek
błony; 2) ilości białka transportującego (jest to
kluczowy czynnik regulujący); 3) szybkości od¬
działywania między substancją rozpuszczoną
a białkiem transportującym; 4) szybkości zmiany
konformacyjnej obu stanów białka - białko zwią¬
zane z substancją rozpuszczoną i białko uwolnio¬
ne od substancji rozpuszczonej.
Dyfuzję ułatwioną regulują hormony, wpły¬
wając na zmianę liczby dostępnych białek trans¬
portujących. Insulina zwiększa transport glu¬
kozy w tkance tłuszczowej i mięśniach, mobili¬
zując białka transportujące pochodzące z zapa¬
sów wewnątrzkomórkowych. Insulina zwiększa
V7
Pong
Ryc. 40-16. Model „ping-pong” dyfuzji ułatwionej. Białko transportujące (elementy szare) w dwuwarstwie lipidowej asocjuje
z substancją rozpuszczoną w dużym stężeniu po jednej stronie błony. Wtedy następuje zmiana konformacji transportera (z „pong”
w „ping”) i substancja rozpuszczona zostaje uwolniona po stronie, w której panuje inny stan równowagi. Pusty przenośnik powraca do
swojej oryginalnej konformacji (z „ping” w „pong”), zamykając cykl przemian.
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 523
także transport aminokwasów w wątrobie i in¬
nych tkankach. Jednym z koordynujących działań
hormonów glikokortykoidowych jest nasilanie
transportu aminokwasów do wątroby, gdzie służą
one jako substraty dla procesu glukoneogenezy.
Hormon wzrostu zwiększa transport aminokwa¬
sów do wszystkich komórek, a estrogeny - do
tych, które znajdują się w macicy. Transport ami¬
nokwasów w komórkach zwierzęcych odbywa
się za pośrednictwem co najmniej pięciu różnych
układów. Każdy z nich jest swoisty dla grupy bli¬
sko spokrewnionych aminokwasów, a większość
z nich działa w systemie symportu z Na+ (p. ryc.
40-14).
Transport aktywny
Proces transportu aktywnego różni się od dyfu¬
zji tym, że cząsteczki są przenoszone niezgodnie
z zasadami równowagi termodynamicznej; dlate¬
go też wymaga on dostarczenia energii. Źródłem
tej energii może być hydroliza ATP, ruch elek¬
tronów lub światło. Utrzymywanie gradientów
elektrochemicznych w układach biologicznych
jest tak ważne, że pochłania ok. 30-40% całkowi¬
tej energii wydatkowanej w komórce.
Ryc. 40-17. Stechiometria pompy Na+K+-ATPaza. Pompa prze¬
nosi trzy jony Na+ z wnętrza komórki na zewnątrz i dwa jony K+
z zewnątrz do wnętrza komórki, co towarzyszy hydrolizie jednej
cząsteczki ATP do ADP pod wpływem ATPazy związanej z błoną.
Ouabaina i inne glikozydy nasercowe hamują tę pompę przez od¬
działywanie na zewnątrzkomórkową powierzchnię błony (dzięki
uprzejmości R Post).
Na ogół w komórkach utrzymuje się małe stę¬
żenie Na+ i duże stężenie K+ (p. tab. 40-1), przy
czym wewnątrz komórki panuje ujemny potencjał
elektryczny. Pompą, która utrzymuje te gradien¬
ty, jest ATPaza, która jest aktywowana przez Na+
i K+ (Na+K+-ATPaza; ryc. 40-17). ATPaza jest in¬
tegralnym białkiem błonowym i do uaktywnienia
wymaga fosfolipidów. Ma ona katalityczne cen¬
tra zarówno dla ATP, jak i dla Na', występujące
po cytoplazmatycznej stronie błony, natomiast
miejsce wiązania K+ znajduje się po zewnętrznej
stronie błony komórkowej. Ouabaina lub di-
gitoksyna hamują tę ATPazę przez wiązanie do
zewnątrzkomórkowej domeny. Inhibicja ATPazy
przez ouabainę może być antagonizowana przez
zewnątrzkomórkowy K+.
Przewodzenie bodźców
nerwowych zachodzi w górę
i w dół błony
Błona pokrywająca komórki nerwowe utrzymu¬
je różnicę napięcia (potencjału elektrycznego)
między wnętrzem a środowiskiem zewnętrznym
i cechuje się pobudliwością elektryczną. Jeśli
jest ona pobudzana bodźcem chemicznym za po¬
średnictwem swoistego synaptycznego receptora
błonowego (p. niżej omówienie przenoszenia syg¬
nałów biochemicznych), otwory w błonie otwie¬
rają się, umożliwiając szybkie wnikanie Na+ lub
Ca2+ (połączone lub niepołączone z wypływem
K+). Prowadzi to do szybkiego zaniku istniejące¬
go gradientu napięcia, dzięki czemu ten odcinek
błony ulega depolaryzacji. Jednak pompy jonowe
w błonie szybko odtwarzają ten gradient.
Jeśli duże powierzchnie błony ulegają w ten spo¬
sób depolaryzacji, zakłócenie elektrochemiczne
przemieszcza się wzdłuż błony, tak jak fala, ge¬
nerując impuls nerwowy. Osłonki mielinowe
utworzone przez komórki Schwanna, pokrywają¬
ce włókna nerwowe, tworzą elektryczny izolator;
otacza on większą część nerwu i znacznie przy¬
spiesza propagację fali (sygnału), umożliwiając
przenikanie jonów przez błonę tylko w miejscach
niepokrytych izolatorem. Osłona mielinowa jest
zbudowana z fosfolipidów, cholesterolu, białek
i GSL. Zawiera ona stosunkowo niewiele białek
i wydaje się, że to one utrzymują razem wiele
dwuwarstw błonowych tworzących hydrofobową
strukturę izolacyjną, nieprzepuszczalną dla jonów
i wody. Niektóre choroby, jak np. stwardnienie
rozsiane czy zespół Guillaina-Barrego, są skut¬
kiem demielinizacji i upośledzonego przewodze¬
nia impulsów nerwowych.
524 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJI WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Transport glukozy obejmuje kilka
mechanizmów
W tym rozdziale zostanie omówionych kilka me¬
chanizmów transportu glukozy. Aby mogła
ona być wykorzystana jako źródło energii, musi
wniknąć do komórki. W adipocytach i mięśniach
glukoza wnika do komórek za pośrednictwem
swoistego systemu transportowego, który jest
wspomagany przez insulinę. Zmiany w transpor¬
cie są przede wszystkim wynikiem zmian Fmax
(prawdopodobnie na skutek działania większej lub
mniejszej liczby aktywnych przenośników), ale
przyczyną mogą być także zmiany Km. Transport
glukozy obejmuje różne aspekty, które już zo¬
stały wcześniej opisane. Glukoza i Na+ wiążą się
w różnych miejscach na przenośniku glukozowym.
Na+ przenika do komórki zgodnie z jego gradientem
elektrochemicznym i pociąga za sobą glukozę (ryc.
40-18). Im większy zatem jest gradient Na+, tym
więcej glukozy wnika do komórki; jeśli natomiast
stężenie Na' w płynie pozakomórkowym jest małe,
SYMPORT Na+-GLUK0ZA ŚWIATŁO JELITA
Glukoza
PŁYN P0ZAK0MÓRK0WY
Ryc. 40-18. Przezkomórkowe przemieszczanie glukozy w ko¬
mórkach jelita. Glukoza przechodzi za Na+ przez luminalną błonę
komórek nabłonkowych. Gradient Na+, który jest siłą napędową
tego symportu, tworzy się wskutek wymiany Na+-K+, zachodzą¬
cej na błonie podstawnej, znajdującej się po stronie przestrzeni
pozakomórkowej, z udziałem Na+K+-ATPazy. Glukoza występu¬
jąca w dużych stężeniach wewnątrz komórki przemieszcza się
zgodnie z gradientem stężeń do płynu pozakomórkowego wg
mechanizmu dyfuzji ułatwionej (mechanizm uniportu) z udziałem
GLUT2 (transporter glukozowy). Symport Na+-glukoza przenosi
2 jony Na+ na każdą cząsteczkę glukozy.
dokomórkowy transport glukozy zostaje przerwa¬
ny. Aby utrzymać duży gradient Na\ symport Na+-
-glukoza jest zależny od gradientów generowanych
przez Na'K+-ATPazę, która utrzymuje małe stęże¬
nie Na+ wewnątrz komórki. Podobne mechanizmy
działają przy transporcie innych węglowodanów,
a także aminokwasów.
Przezkomórkowy transport węglowodanów
wymaga jeszcze jednego dodatkowego czynni¬
ka, którym jest uniport (p. ryc. 40-18). Pozwala
on glukozie zgromadzonej wewnątrz komórki
przemieszczać się przez inne błony w kierunku
nowej równowagi; zachodzi to np. w komórkach
jelita i obejmuje udział uniportera glukozowego
(GLUT2).
Powyższe informacje mają zastosowanie w od¬
niesieniu do leczenia poważnych przypadków
biegunki (takiej na przykład, jaka towarzyszy
cholerze). W tej chorobie przemieszczane mogą
być bardzo duże ilości płynów w postaci wodne¬
go kału, w bardzo krótkim czasie, co prowadzi do
odwodnienia i ewentualnie śmierci. Wprowadzo¬
na przez Światową Organizację Zdrowia (WHO)
terapia rehydratacji doustnej, mająca na celu
uzupełnienie wody, polega na podawaniu prze¬
de wszystkim NaCl i glukozy. Transport glukozy
i Na+ przez nabłonek jelitowy jest siłą napędową
(dzięki osmozie) przemieszczania się wody ze
światła jelita do komórek nabłonkowych, czego re¬
zultatem jest właśnie rehydratacja. Podawanie tyl¬
ko glukozy lub tylko NaCl nie byłoby skuteczne.
Komórki transportują przez błony
plazmatyczne niektóre makrocząsteczki
Proces polegający na pochłanianiu dużych czą¬
steczek przez komórki nazywa się endocytozą.
Niektóre z tych cząsteczek (np. polisacharydy,
białka i polinukleotydy), po zhydrolizowaniu we¬
wnątrz komórki, mogą być źródłem składników
odżywczych. Endocytozą stanowi mechanizm re¬
gulujący zawartość niektórych składników błon,
czego najlepszym dowodem są receptory hormo¬
nów. Proces ten pozwala na poznanie większej
liczby szczegółów dotyczących funkcjonowania
komórki. DNA jednego rodzaju komórki może
być użyty w procesie transfekcji innej komórki
i zmienić tym samym jej funkcję lub fenotyp.
W tego typu doświadczeniach często jest uży¬
wany specyficzny gen, co pozwala na unikatowy
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 525
sposób badania i analizowania procesów regulo¬
wanych przez niego. Transfekcja DNA zależy od
endocytozy; endocytoza jest odpowiedzialna za
wnikanie DNA do komórki. W takich doświad¬
czeniach powszechnie wykorzystuje się fosforan
wapnia, gdyż Ca24 pobudza endocytozę i wytrą¬
ca DNA, co ułatwia jego endocytozę. Komórki
mogą także uwalniać makrocząsteczki w procesie
egzocytozy. Zarówno endocytoza, jak i egzocyto-
za wymagają tworzenia się pęcherzyków z błoną
plazmatyczną lub z błony plazmatycznej.
A. Endocytoza
Wszystkie komórki eukariotyczne trawią, w spo¬
sób ciągły, część swoich błon plazmatycznych.
Pęcherzyki endocytame powstają wówczas, gdy
fragmenty błony plazmatycznej wpuklają się do
wewnątrz, zamykając w sobie niewielką obję¬
tość płynu zewnątrzkomórkowego wraz z jego
zawartością. Pęcherzyk taki odrywa się od błony,
kiedy połączone błony plazmatyczne zasklepią
szyjkę pęcherzyka w miejscu pierwotnego do¬
środkowego wpuklenia (ryc. 40-19). Pęcherzyk
zlewa się następnie z innymi strukturami błono¬
wymi, co wyjaśnia transport jego zawartości do
innych obszarów komórki lub nawet poza nią.
Większość pęcherzyków endocytamych zlewa się
z pierwotnymi lizosomami, tworząc lizosomy
wtórne, które zawierają enzymy hydrolityczne
i tym samym są strukturami wyspecjalizowanymi
w wewnątrzkomórkowym rozdysponowywaniu
produktów. Makrocząsteczki zawarte w pęcherzy¬
kach zostają trawione do aminokwasów, cukrów
prostych i nukleotydów, które z kolei dyfundują
poza pęcherzyki do cytoplazmy, gdzie mogą być
ponownie wykorzystane.
Endocytoza wymaga: 1) energii, zwykle pocho¬
dzącej z hydrolizy ATP; 2) obecności Ca2+ w pły¬
nie zewnątrzkomórkowym i 3) kurczliwych ele¬
mentów w komórce (prawdopodobnie układów
mikrofilamentowych) (rozdz. 48).
Rozróżnia się dwa zasadnicze typy endocytozy.
Fagocytoza zachodzi tylko w wyspecjalizowa¬
nych komórkach, takich jak makrofagi i granulo-
cyty. Polega ona na wchłanianiu dużych cząste¬
czek, takich jak wirusy, bakterie, komórki i resztki
komórek. Makrofagi są niezwykle aktywne w tym
procesie - w ciągu godziny mogą one wchłonąć
substancje stanowiące nawet 25% ich objętości.
Działając w ten sposób, makrofag może zużyć 3%
A B
CV
Ryc. 40-19. Dwa rodzaje endocytozy. Pęcherzyk endocytarny (V)
tworzy się w wyniku wpuklenia fragmentu błony plazmatycznej
w kierunku cytoplazmy. Endocytoza fazy płynnej (A) jest przypad¬
kowa i nieukierunkowana. Endocytoza, w której pośredniczy re¬
ceptor (B), jest wybiórcza (selektywna) i zachodzi w dołkach (CP)
pokrytych białkiem klatryną (postrzępiona otoczka). Wybiórczość
tę zapewniają receptory (czarne symbole) specyficzne dla wielu
cząsteczek. W tym ostatnim procesie powstają opłaszczone pę¬
cherzyki (CV).
swojej błony plazmatycznej w każdej minucie lub
całą swoją błonę w ciągu 30 min.
Pinocytoza zachodzi we wszystkich komórkach
i polega ona na pobieraniu przez komórkę płynów
wraz z ich składnikami. Tutaj także wyróżnia się
dwa typy procesu. Pinocytoza fazy płynnej jest
procesem nieselektywnym, w którym pobranie
substancji rozpuszczonej przez tworzenie małych
pęcherzyków jest wprost proporcjonalne do stę¬
żenia tej substancji w płynie pozakomórkowym
otaczającym komórkę. Powstawanie tych pę¬
cherzyków jest procesem niezwykle aktywnym.
Fibroblasty na przykład zużywają swoją błonę
plazmatyczną z szybkością równą ok. V3 szybko¬
ści charakterystycznej dla makrofagów. Proces
ten zachodzi szybciej niż wytwarzanie nowych
błon. Ponieważ w procesie pinocytozy całkowi¬
ta powierzchnia i objętość komórek niewiele się
zmieniają, błony muszą się odtwarzać w procesie
egzocytozy lub w wyniku recyklizacji tak szybko,
jak szybko są usuwane wskutek endocytozy.
526 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Drugi typ pinocytozy - pinocytoza absorpcyj¬
na - jest selektywnym procesem, zachodzącym
z udziałem receptora odpowiedzialnego przede
wszystkim za pobieranie makrocząsteczek, dla
których istnieje ograniczona liczba miejsc wiążą¬
cych na błonie plazmatycznej. Receptory te, ce¬
chujące się wysokim powinowactwem, pozwalają
na wybiórcze zatężanie ligandów pobranych z me¬
dium, minimalizując pobieranie płynów lub roz¬
puszczonych, niezwiązanych makrocząsteczek,
a także w znacznym stopniu zwiększają szybkość
wnikania specyficznych cząsteczek do komórki.
Pęcherzyki powstające podczas pinocytozy ab¬
sorpcyjnej powstają z wpukleń (dołków) błony,
które są pokryte od strony cytoplazmatycznej ma¬
teriałem filamentamym i dlatego zostały nazwane
dołkami opłaszczonymi. W wielu układach tym
filamentamym materiałem jest białko klatryna.
Ma ono strukturę trój członową (zwaną triskelion),
a każdy jej człon składa się z jednego łańcucha
lekkiego i jednego ciężkiego. Polimeryzację kla-
tryny w procesie tworzenia pęcherzyka nadzoru¬
ją cząstki montujące, złożone z czterech białek
adaptorowych. Białka te oddziałują z określony¬
mi sekwencjami aminokwasowymi receptorów,
nadając im selektywność wychwytu. W tworze¬
niu pęcherzyka ważną rolę odgrywa również lipid
PIP2. Ponadto białko dynamina, które zarówno
wiąże, jak i hydrolizuje GTP, jest niezbędne do
oderwania się opłaszczonego klatryną pęcherzyka
od powierzchni komórek.
Jako przykład można podać cząsteczkę lipopro-
teiny o małej gęstości (LDL) i jej receptor (rozdz.
25), które wnikają za pośrednictwem opłaszczo-
nych dołków zawierających receptory LDL. Te
endocytame pęcherzyki, zawierające LDL i jego
receptory, zlewają się w komórce z lizosomami.
Receptor uwalnia się i ponownie przemieszcza
na powierzchnię błony komórkowej, apoproteina
LDL ulega degradacji, a estry cholesterolowe są
metabolizowane. Synteza receptorów LDL jest
regulowana przez wtórne lub trzeciorzędne pro¬
dukty pinocytozy, np. produkty metaboliczne, ta¬
kie jak cholesterol, uwolnione w czasie degradacji
LDL. Defekty w budowie receptora LDL lub za¬
kłócenia w jego wnikaniu do komórki są ważne
z medycznego punktu widzenia i zostały omówio¬
ne w rozdz. 25.
Pinocytoza absorpcyjna glikoprotein ze-
wnątrzkomórkowych wymaga, aby miały one
specyficzne sygnały rozpoznawania węglowoda¬
nów, które są wiązane przez cząsteczki recepto¬
rów błonowych, odgrywających rolę analogicz¬
ną do tej, jaką odgrywa receptor LDL. Receptor
galaktozylowy na powierzchni hepatocytów jest
pomocny w pinocytozie absorpcyjnej asjalogli-
koprotein z układu krążenia (rozdz. 46). Kwaśne
hydrolazy pobierane wg mechanizmu pinocytozy
absorpcyjnej przez fibroblasty są rozpoznawane
za pośrednictwem występujących w nich reszt
mannozo-6-fosforanu. Prawdopodobnie reszta
mannozo-6-fosforanowa odgrywa także ważną
rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie kwaś¬
nych hydrolaz do lizosomów komórek, w których
są one syntetyzowane (rozdz. 46).
Proces endocytozy za pośrednictwem recepto¬
rów nie jest całkowicie wyjaśniony w przypad¬
ku wirusów, które wywołują takie choroby, jak
zapalenie wątroby (uszkadzają hepatocyty) czy
zapalenia istoty szarej rdzenia (poliomyelitis;
uszkadzają neurony motoryczne) i AIDS (wpływ
na komórki T). Toksyczność żelaza również jest
związana z nadmiernym jego pobieraniem przez
komórki w procesie endocytozy.
B. Egocytoza
Większość komórek uwalnia makrocząsteczki do
środowiska wg mechanizmu egzocytozy. Proces
ten występuje również w zjawisku remodelowa-
nia błony, kiedy składniki syntetyzowane w apa¬
racie Golgiego są przenoszone w pęcherzykach
do błony plazmatycznej. Sygnałem dla egzocy¬
tozy jest często hormon, który po związaniu się
z receptorem powierzchniowym komórki wywo¬
łuje miejscowe i przemijające zmiany w stężeniu
Ca2+. Jony wapnia z kolei uruchamiają egzocytozę.
Na rycinie 40-20 przedstawiono schematy porów¬
nawcze mechanizmów egzocytozy i endocytozy.
Losy cząsteczek uwalnianych w wyniku egzo¬
cytozy mogą być następujące: 1) cząsteczki mogą
się przyłączyć do powierzchni komórki i stać się
białkami peryferyjnymi, np. antygenami; 2) mogą
się stać częścią macierzy zewnątrzkomórkowej,
jak np. kolagen i glikozoaminoglikany; 3) mogą
się dostać do płynu zewnątrzkomórkowego i być
czynnikiem sygnałowym dla innych komórek. In¬
sulina, parathormon i katecholaminy występują
w formie ziarnistości i są poddawane obróbce
w komórkach w celu uwolnienia z niej pod wpły¬
wem odpowiedniej stymulacji.
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 527
Egzocytoza
Endocytoza
Ryc. 40-20. Schematy porównawcze mechanizmów endocytozy i egzocytozy. Egzocytoza wymaga
zetknięcia się dwóch wewnętrznych powierzchni (cytoplazmatyczna strona) jednowarstwowych, nato¬
miast endocytoza - dwóch zewnętrznych powierzchni jednowarstwowych.
Niektóre substancje sygnałowe
sq przenoszone przez błony
Specyficzne, biochemiczne substancje sygnało¬
we, takie jak neuroprzekaźniki, hormony i immu-
noglobuliny, wiążą się ze swoistymi receptorami
(białkami integralnymi), znajdującymi się na ze¬
wnętrznej stronie błony komórkowej, i przekazują
informacje poprzez tę błonę do cytoplazmy. Proces
ten, zwany sygnalizacją przezbłonową, wyma¬
ga wytworzenia wielu cząsteczek sygnałowych,
m.in. cyklicznych nukleotydów, jonów wapnia,
fosfoinozytydów i diacyloglicerolu. Mechanizm
ten omówiono szczegółowo w rozdz. 42.
Złącza szczelinowe umożliwiają
bezpośredni przepływ cząsteczek
z jednej komórki do drugiej
Złącza szczelinowe są to struktury pozwalające
na bezpośrednie przenoszenie małych cząsteczek
(do ok. 1,2 kDa) z jednej komórki do komórki
sąsiedniej. Zbudowane są one z białek, zwanych
koneksynami, które tworzą strukturę heksago¬
nalną zawierającą 12 cząsteczek takich białek.
Sześć cząsteczek koneksyny formuje koneksyno¬
wy półkanał, który łączy się z podobną struktu¬
rą sąsiedniej komórki, tworząc kompletny kanał
o nazwie konekson (ryc. 40-21). Jedno złącze
szczelinowe zawiera kilka koneksonów. W róż¬
nych tkankach występują różne koneksyny. Mu¬
tacje w genach kodujących koneksyny prowadzą
do licznych stanów patologicznych, np. zaburzeń
układu sercowo-naczyniowego, jednego z typów
głuchoty i sprzężonego z chromosomem X typu
choroby Charcot-Marie-Tooth (demielinizacyjne
schorzenie neurologiczne).
Ryc. 40-21. Schemat złącza szczelinowego. Jeden konekson
jest utworzony przez dwa półkoneksony. Każdy półkonekson jest
zbudowany z sześciu cząsteczek koneksyny. Małe rozpuszczone
substancje mogą dyfundować przez centralny kanał, co stanowi
bezpośredni mechanizm międzykomórkowego komunikowania.
MUTACJE BIAŁEK BŁONOWYCH
SA PRZYCZYNA CHORÓB
W świetle faktu, że błony występują w tak wielu
organellach i że uczestniczą w tak wielu proce¬
sach, nie jest zaskakujące, że mutacje pojawia¬
jące się w białkach błonowych mogą powodować
wiele chorób lub zaburzeń. Wśród białek błono¬
wych rozróżnia się białka: receptorowe, trans¬
portujące, kanałów jonowych i strukturalne.
528 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Przedstawiciele każdej z tych klas występują czę¬
sto w postaci glikozylowanej, dlatego też mutacje
wpływające na proces glikozylacji mogą zmieniać
ich funkcje. Przykłady chorób lub zaburzeń spo¬
wodowanych nieprawidłowościami w białkach
błonowych przedstawiono w tab. 40-5; obejmują
one głównie mutacje w białkach błony plazma-
tycznej, z których jedna wpływa na funkcję lizo-
somów (choroba komórek I). Ponad 30 genetycz-
Tabela 40-5. Niektóre choroby i stany patologiczne przypisywane
nieprawidłowościom w błonach1
Choroba
Nieprawidłowość
Chondrodystrofia
płodowa (MIM 100800)
Mutacje w genie kodującym
receptor 3 fibroblastowego
czynnika wzrostu
Rodzinna
hipercholesterolemia
(MIM 143890)
Mutacje w genie kodującym
receptor LDL
Zwłóknienie torbielowate
(MIM 219700)
Mutacje w genie kodującym białko
CFTR, będące transporterem CT
Wrodzony zespół
wydłużonego QT
(MIM 192500)
Mutacje w genach kodujących
kanały jonowe w sercu
Choroba Wilsona
(MIM 277900)
Mutacje w genie kodującym
miedziozależną ATPazę
Choroba komórek I
(MIM 252500)
Mutacje w genie kodującym
G1 cNAc-fosfotransferazę,
powodujące brak czynnika
sygnałowego w postaci Man-6-P
dla lizosomalnej lokalizacji
niektórych hydrolaz
Dziedziczna sferocytoza
(MIM 182900)
Mutacje w genach kodujących
spektrynę lub inne białka
strukturalne występujące
w błonie erytrocytów
Przerzuty nowotworowe
Uważa się, że ważne dla tego
procesu są nieprawidłowości
w łańcuchach oligosacharydowych
błonowych glikoprotein i glikolipidów
Napadowa
hemoglobinuria nocna
(MIM 311770)
Mutacje powodujące niedostateczne
przyłączanie kotwicy GPI do
niektórych białek błony erytrocytów
1 Nieprawidłowości te omówiono w innych rozdziałach. Tabela
obejmuje przykłady mutacji mających wpływ na receptory, syste¬
my transportujące, kanały jonowe, enzymy i białka strukturalne.
Umieszczono tu także przykłady zmienionej lub nieprawidłowej
glikozylacji glikoprotein. Większość uwarunkowań opisanych
w tabeli wpływa na błonę plazmatyczną.
nie uwarunkowanych chorób lub zaburzeń zosta¬
ło przypisanych mutacjom w różnych białkach
transportujących aminokwasy, węglowodany,
lipidy, moczan, aniony, kationy, wodę i witami¬
ny przez błonę plazmatyczną. Mutacje w genach
kodujących białka występujące w innych błonach
również mogą mieć szkodliwe konsekwencje. Na
przykład mutacje w genach kodujących białka
błony mitochondrialnej, uczestniczące w fosfo¬
rylacji oksydacyjnej, mogą wywołać zaburzenia
neurologiczne i inne (np. dziedziczna neuropatia
nerwu wzrokowego Lebera; ang. Leber’s here-
ditary optic neuropathy, LHON). Na białka bło¬
nowe mogą mieć także wpływ czynniki inne niż
mutacje. Powstawanie autoprzeciwciał przeciw
receptorowi acetylocholiny w mięśniach szkiele¬
towych wywołuje miastenię (myasthenia graviś).
Niedokrwienie może szybko wpływać na inte¬
gralność różnych kanałów jonowych w błonach.
Nieprawidłowości dotyczące innych składników
błony, oprócz białek, także mogą być szkodliwe.
W przypadku lipidów nadmiar cholesterolu (np.
w rodzinnej hipercholesterolemii), lizofosfolipidu
(np. po ukąszeniu przez niektóre węże, których jad
zawiera fosfolipazy) lub glikosfingolipidów (np.
w sfingolipidozie) może wpływać na funkcje
błon.
Zwłóknienie torbielowate jest
spowodowane mutacjami w genie
kodującym kanał chlorkowy
Zwłóknienie torbielowate (ang. cystic fibrosis,
CF) jest recesywną chorobą genetyczną, rozpo¬
wszechnioną wśród białej ludności Ameryki Pół¬
nocnej oraz niektórych obszarów północnej Eu¬
ropy. Choroba ta charakteryzuje się przewlekłymi
infekcjami bakteryjnymi dróg oddechowych i za¬
tok, zaburzeniami trawienia tłuszczów z powodu
egzokrynnej niedoczynności trzustki, niepłodnoś¬
cią u mężczyzn spowodowaną nieprawidłowym
rozwojem nasieniowodów, jak również podwyż¬
szonym stężeniem jonów chlorkowych w pocie
(> 60 mmol/L).
Punktem zwrotnym w badaniach nad tą chorobą
było zidentyfikowanie w 1989 r. genu dla CF na
chromosomie 7. Stwierdzono, że koduje on białko
zawierające 1480 aminokwasów, nazwane przez-
błonowym regulatorem związanym ze zwłóknie¬
niem torbielowatym (CFTR, ang. cystic fibrosis
40. BŁONY: STRUKTURA I FUNKCJA 529
transmembrane regulator), stanowiące kanał Cl
regulowany przez cykliczny AMP (ryc. 40-22).
Zaburzenia w przepuszczalności Cl przez błonę
prawdopodobnie są spowodowane zwiększoną
lepkością wielu wydzielin organizmu, chociaż
dokładne mechanizmy są nadal badane. Najpo¬
wszechniej występującą mutacją (ok. 70% u nie¬
których populacji kaukaskich) jest delecja trzech
zasad, prowadząca do utraty reszty fenyloalaniny
w pozycji 508 (AF508). Oprócz niej odkryto po¬
nad 1000 innych mutacji. Ich efektem może być:
1) zmniejszenie ilości białka CFTR; 2) w zależno¬
ści od mutacji, może ono być podatne na błędne
fałdowanie i zatrzymanie w ER lub aparacie Gol-
giego; 3) mutacje w domenach wiążących nukleo-
tydy mogą wpływać na zależną od ATP zdolność
kanału Cl do otwierania; 4) mutacje mogą także
spowalniać przepływ jonów przez kanał, zmniej¬
szając strumień Cl .
Najpoważniejszym, zagrażającym życiu powi¬
kłaniem są nawracające infekcje płuc, spowodo¬
wane nadmiernym wzrostem różnych czynników
patogennych w lepkich wydzielinach przewodu
oddechowego. Niedostateczne odżywianie wyni¬
kające z niewydolności trzustki pogarsza tę sytua¬
cję. Leczenie CF wymaga więc położenia nacisku
na stan odżywienia, aby skutecznie przeciwdziałać
i zwalczać infekcję oraz utrzymać zdrowie fizycz¬
ne i psychiczne. Postępy w genetyce molekularnej
Koniec
karboksylowy
flyc. 40-22. Schemat struktury białka CFTR (skala niezacho-
wana). Białko zawiera dwanaście segmentów przezbłonowych
(prawdopodobnie helikalnych), dwa zagięcia lub domeny wiążą¬
ce nukleotydy (NBF1 i NBF2) i jedną domenę regulatorową (R).
NBF1 i NBF2 prawdopodobnie wiążą ATP i sprzęgają jego hydroli¬
zę z transportem CF. Phe w pozycji 508, główne miejsce mutacji
w zwłóknieniu torbielowatym, występuje w NBF1.
wskazują na możliwość prowadzenia badań mu¬
tacji w okresie prenatalnym oraz testowania no¬
sicieli w rodzinach, w których jedno dziecko jest
chore. Zaawansowane są badania polegające na
wykorzystaniu terapii genowej w celu przywró¬
cenia aktywności CFTR. Udowodniono korzystne
efekty terapii aerozolowymi preparatami ludzkiej
DNazy, które trawią DNA mikroorganizmów
w przewodzie oddechowym.
STRESZCZENIE
• Błony są złożonymi strukturami, zbudowanymi
z lipidów, węglowodanów i białek.
• Podstawową strukturą wszystkich błon jest
dwuwarstwa lipidowa. Jest ona utworzona
przez dwie warstwy fosfolipidów, w których
hydrofitowe polarne główki są skierowane
w przeciwne strony i wystają do wodnego śro¬
dowiska zewnętrznej i wewnętrznej powierzch¬
ni błony, a hydrofobowe niepolame ogony tych
cząsteczek leżą naprzeciw siebie i są skierowa¬
ne do środka błony.
• Białka są strukturami dynamicznymi. Lipidy
i niektóre białka wykazują szybką dyfuzję bocz¬
ną. Ruchy flip-flop lipidów są bardzo wolne,
a w przypadku białek w ogóle nie występują.
• Model płynnej mozaiki stanowi użyteczny mo¬
del opisujący strukturę błon.
• Białka błonowe są klasyfikowane jako biał¬
ka integralne, jeśli są mocno zakotwiczone
w dwuwarstwie, lub białka peryferyjne, jeśli są
luźno związane z zewnętrzną lub wewnętrzną
powierzchnią błony.
• Około 20 różnych błon w komórkach ssaków
pełni ważne funkcje (np. są aktywne enzy¬
matycznie) i dzieli wnętrze komórki na ściśle
określone kompartmenty lub wyspecjalizowane
środowiska, pełniące specyficzne funkcje (np.
lizosomy).
• Niektóre cząsteczki dyfundują swobodnie przez
błony, lecz przemieszczanie innych jest ogra¬
niczone z powodu ich wielkości, ładunku lub
rozpuszczalności.
• Gradienty tych cząsteczek w poprzek różnych
błon są utrzymywane dzięki zróżnicowanym
- biernym i aktywnym - mechanizmom.
• Niektóre substancje rozpuszczone, np. glukoza,
wnikają do komórek wg mechanizmu dyfuzji
ułatwionej, zgodnie z gradientem stężeń - od
530 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
większego do mniejszego. W procesach tych
uczestniczą specyficzne cząsteczki lub trans¬
portery.
• Kanały jonowe bramkowane ligandem lub na¬
pięciem często uczestniczą w przemieszczaniu
cząsteczek naładowanych (Na\ K\ Ca2+ itp.)
przez błony.
• Duże cząsteczki mogą wnikać do komórek lub
opuszczać komórki w procesie endocytozy lub
egzocytozy. Mechanizmy te często wymagają
połączenia cząsteczki z receptorem, który za¬
pewnia specyficzność procesu.
• Receptory mogą być integralnymi składnikami
błon (zwłaszcza błony plazmatycznej). Oddzia¬
ływanie ligandu z jego receptorem nie musi być
związane z ich przemieszczaniem do komórki,
lecz może wywoływać powstawanie sygnału,
który wpływa na procesy wewnątrzkomórkowe
(sygnalizacja przezbłonowa).
• Mutacje, które wpływają na strukturę białek
błonowych (receptorów, kanałów jonowych,
enzymów i białek strukturalnych) mogą być
przyczyną chorób; przykładem jest zwłóknienie
torbielowate i rodzinna hipercholesterolemia.
PIŚMIENNICTWO
Alberts B et al: Molecular Biology of the Celi. 4th ed.
Garland Science, 2002.
Clapham DE: Symmetry, selectivity and the 2003 Nobel
Prize. Celi 2003; 115:641.
Holland IB et al: ABC Proteins: From Bacteria to Man.
Academic Press/Elsevier Science, 2003.
Le Roy C, Wrana JL: Clathrin- and non-clathrin-me-
diated endocytic regulation of celi signaling. Nat
Rev Mol Celi Biol 2005; 6:112.
Lodish H et al: Molecular Celi Biology. 5th ed. WH
Freeman & Co., 2004.
Longo N: Inherited defects of membranę transport. In:
Harrison s Principle of Internal Medicine. 16th ed.
Kasper DL et al (editors). McGraw-Hill, 2005.
Lucero HA, Robbins PW: Lipid rafts: protein asso-
ciation and the regulation of protein activity. Arch
Biochem Biophys 2004; 426:208.
Riordan JR: Assembly of functional CFTR chloride
channels. Annu Rev Physiol 2005; 67:701.
Singer SJ: Some early history of membranę molecular
biology. Annu Rev Physiol 2004; 66:1.
Vance DE, Vance JE: Biochemistry of Lipids, Lipopro-
teins and Membranes. 4th ed. Elsevier, 2002.
Yeagle PL: The structure of Biological Membranes. 2nd
ed. CRC Press, 2004.
Różnorodność morfologiczna
i czynnościowa układu
wewnątrzwydzielniczego
DarylK. Granner, MD
Skróty stosowane w tym rozdziale
ACTH hormon adrenokortykotropowy, korty -
kotropina
ANF przedsionkowy czynnik natriuretyczny
cAMP cykliczny adenozynomonofosforan
CBG globulina wiążąca kortykosteroidy
CG gonadotropina kosmówkowa
cGMP cykliczny guanozynomonofosforan
CLIP peptyd pośredniego płata przysadki,
podobny do kortykotropiny
DBH P-hydroksylaza dopaminowa
DHEA dehydroepiandrosteron
DIT dijodotyrozyna
DOC deoksykortykosteron
EGF naskórkowy czynnik wzrostowy
FSH folitropina
IGF-1 czynnik wzrostowy insulinopodobny 1
LH lutropina
LPH lipotropina
MIT monojodotyrozyna
MSH melanotropina, hormon pobudzający
melanocyty
OHSD dehydrogenaza hydroksysteroidowa
PNMT Af-metylotransferaza fenyloetanolo-
aminowa
POMC pro-opiomelanokortyna
SHBG globulina wiążąca hormony płciowe
StAR białko ostrej regulacji steroidogenezy
TBG globulina wiążąca tyroksynę
TEBG globulina wiążąca testosteron i estro¬
geny
TRH tyreoliberyna
TSH tyreotropina
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Życie organizmów wielokomórkowych zależy od
ich zdolności adaptacyjnej do stale zmieniającego
się środowiska. Do adaptacji niezbędne sąmiędzy-
komórkowe mechanizmy komunikacyjne. Należą
do nich: układ nerwowy i narządy wydzielania
wewnętrznego. Początkowo uważano, że to układ
nerwowy gwarantuje stały (nieulegający zmianie)
mechanizm komunikacyjny, a układ wewnątrz-
wydzielniczy wytwarza hormony, które stanowią
bardziej mobilne substancje sygnałowe. W rze¬
czywistości oba te układy komunikacyjne ściśle
ze sobą współdziałają. 1 tak na przykład regulacja
nerwowa układu wewnątrzwydzielniczego jest
istotna dla syntezy i sekrecji niektórych hormo¬
nów. Ponadto wiele neuroprzekaźników wykazu¬
je podobne szlaki syntezy, transportu i mechani¬
zmy działania jak klasyczne hormony. Wreszcie,
wiele hormonów jest wytwarzanych w układzie
nerwowym. Słowo „hormon” pochodzi z języka
greckiego i oznacza „zwiększenie aktywności”.
Według klasycznej definicji, hormonem nazywa
się substancję wytwarzaną w jednym narządzie
i przenoszoną za pośrednictwem krwi do innego
narządu, w którym działa. Ta definicja jest jed¬
nak zawężona, ponieważ hormony mogą działać
na komórki sąsiadujące (działanie parakrynne)
lub na komórki, w których zostały wytworzone
(działanie autokrynne), przy czym hormon wca¬
le nie opuszcza komórki, w której powstał. Wiele
hormonów, wykazujących swoiste mechanizmy
532 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
działania, biosyntezy, spichrzenia, sekrecji, trans¬
portu i przemiany, wywołuje odpowiednie reak¬
cje homeostatyczne. Ta rozmaitość biochemiczna
i czynnościowa hormonów jest przedmiotem ni¬
niejszego rozdziału.
KONCEPCJA KOMÓREK DOCELOWYCH
W organizmie człowieka występuje ok. 200 ty¬
pów zróżnicowanych komórek. Tylko niektóre
z nich wytwarzają hormony, natomiast niemal
wszystkie 75 triliony (trilion odpowiada biliar-
dowi europejskiemu) komórek to komórki doce¬
lowe dla ponad 50 poznanych hormonów. Kon¬
cepcja komórek docelowych jest użyteczna dla
określenia mechanizmu działania hormonu. Do
niedawna uważano, że hormony działają tylko
na komórki jednego rodzaju i wywołują w nich
unikalną - biochemiczną i fizjologiczną reakcję.
Obecnie wiadomo, że jeden hormon może działać
na kilka rodzajów komórek oraz że na jedną i tę
samą komórkę może działać więcej niż jeden hor¬
mon, wywołując liczne i różne reakcje w różnych
komórkach. Po wykryciu swoistych receptorów
na powierzchni i wewnątrz komórki definicja ko¬
mórki docelowej została rozszerzona. Według tej
nowej definicji, za komórkę docelową uważa się
każdą komórkę, której receptory wykazują zdol¬
ność wiązania hormonu (ligandu), niezależnie od
tego, czy reakcja wiązania hormonu z receptorem
wywołuje, czy też nie wywołuje określonej reak¬
cji biochemicznej lub fizjologicznej.
Reakcja komórek docelowych na działanie hor¬
monu zależy od wielu czynników. Spośród nich wy¬
różnia się dwie grupy: 1) czynniki, które wpływają
na stężenie hormonu w komórce docelowej (tab.
41-1) oraz 2) czynniki, które nasilają reakcje ko¬
mórki docelowej na określony hormon (tab. 41-2).
Tabela 41-1. Determinanty stężenia hormonu w komórce doce¬
lowej
• Nasilenie syntezy i sekrecji hormonu
• Odległość dzieląca komórkę docelową od źródła hormonu
(efekt rozcieńczenia)
• Stałe dysocjacji hormonu ze swoistymi białkami transportują¬
cymi osocza (o ile takie występują)
• Konwersja nieaktywnej lub względnie aktywnej postaci hormo¬
nu w postać w pełni aktywną
• Nasilenie klirensu hormonu przez inne tkanki lub nasilenie tra¬
wienia, przemiany lub wydalania hormonu
Tabela 41-2. Determinanty odpowiedzi komórki docelowej na
hormon
Liczba swoistych receptorów błonowych, cytoplazmatycznych
lub jądrowych, ich względna aktywność i stopień wysycenia
Przemiana hormonu (aktywacja lub inaktywacja) w komórce
docelowej
Obecność w komórce docelowej innych czynników niezbęd¬
nych do wywołania reakcji indukowanej hormonem
Zwiększenie lub zmniejszenie liczby receptorów powodowane
oddziaływaniem z ligandem
Poreceptorowe osłabienie reakcji na hormon (desensybiliza-
cja) indukowana m.in. zmniejszeniem liczby receptorów
RECEPTORY HORMONALNE
ODGRYWAJĄ WIODĄCĄ ROLĘ
Receptory precyzyjnie odróżniają
cząsteczki
Najważniejsze ogniwa hormonalnego układu ko¬
munikacyjnego pokazano na ryc. 41-1.
Stężenia hormonów w płynie pozakomórkowym
są zwykle bardzo małe i zawierają się w zakresie
od 10 15 do 10-9 mol/L. Są to stężenia znacznie
mniejsze od stężeń wielu strukturalnie podobnych
do hormonów cząsteczek (steroidów, aminokwa¬
sów, peptydów, białek) i innych substancji krążą¬
cych we krwi; stężenia tych ostatnich wynoszą od
10'5 do 10 3 mol/L. Dlatego też komórki docelo¬
we muszą nie tylko odróżnić hormony obecne we
krwi w małych stężeniach, lecz także rozpoznać je
wśród cząsteczek występujących w 106— 109 razy
większym stężeniu. Tak precyzyjne rozróżnianie
poszczególnych cząsteczek zapewniają struktury
komórkowe zwane receptorami. Hormony rozpo¬
czynają swoje działanie biologiczne od związania
się ze swoistym receptorem komórkowym. Każdy
skuteczny układ kontroli musi jednak obejmować
również mechanizmy hamujące efekty hormonal¬
ne. Zachodzą one zwykle w ten sposób, że efektor
odłącza się od receptora.
Pod pojęciem komórki docelowej należy ro¬
zumieć komórkę wykazującą zdolność wiązania
określonego hormonu za pośrednictwem swoiste¬
go receptora. Aby oddziaływania między hormo¬
nem i receptorem były fizjologicznie skuteczne,
muszą być spełnione następujące, ważne czynni¬
ki biochemiczne: 1) wiązanie hormonu powinno
mieć charakter swoisty, co oznacza, że wiązanie
hormonu może zostać wyparte przez swoistego
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 533
❖
¥
♦ ■
O
*
o
o
¥
*
❖
I
♦
o
Cząsteczki
> krążące w płynie
pozakomórkowym
—fi—
—
~is~
®
^
1
2
3
4
5
6
Receptor
■ hormonalny
Typ komórki
Ryc. 41-1. Swoistość i selektywność recep¬
torów hormonalnych. W ptynie pozakomór¬
kowym krąży wiele różnych cząsteczek, lecz
tylko kilka z nich jest rozpoznawanych przez
receptory hormonalne. Receptory te muszą
rozpoznawać właśnie te cząsteczki wśród
innych cząsteczek występujących w dużych
stężeniach. Na tej uproszczonej rycinie widać,
że niektóre komórki mogą nie mieć receptorów
(komórki typu 1), mogą zawierać tylko jeden
rodzaj receptora (komórki typu 2,5 i 6), mogą
mieć receptory dla kilku hormonów (komórki
typu 3) lub też zawierać receptor bez obecności
hormonu w sąsiedztwie (komórki typu 4).
agonistę lub może być blokowane przez swoiste¬
go antagonistę, 2) wiązanie musi być „wysycalne”
oraz 3) wiązanie hormonu przez receptor powinno
zachodzić w zakresie stężeń wywołujących ocze¬
kiwaną odpowiedź biologiczną.
W obrębie receptora występuję
zarówno domena rozpoznająca,
jak i sygnalizacyjna
Wszystkie receptory mają przynajmniej dwie do¬
meny czynnościowe. Domena rozpoznająca wią¬
że hormon, a domena sygnalizacyjna wytwarza
sygnał łączący proces rozpoznawania hormonu
z jakąś czynnością śródkomórkową.
Proces transdukcji sygnału odbywa się najczꜬ
ciej wg dwóch mechanizmów. Cząsteczki hormo¬
nu białkowego lub polipeptydowego, lub też amin
katecholowych, łącząc się z receptorami zloka¬
lizowanymi w błonie plazmatycznej, wyzwala¬
ją sygnał regulujący różne procesy w komórce,
najczęściej poprzez zmianę aktywności jakiegoś
enzymu.
W odróżnieniu od ww. hormonów, hormony
steroidowe, retinoidy i hormony tarczycy wiążą
się z receptorami śródkomórkowymi, a powstały
w ten sposób kompleks ligand-receptor sam jest
bezpośrednim sygnałem dla swoistych genów, re¬
gulującym szybkość ich transkrypcji.
Dotychczas zidentyfikowano domeny rozpo¬
znające i sygnalizacyjne w receptorach dla hormo¬
nów polipeptydowych i amin katecholowych. Re¬
ceptory steroidowe dla hormonów tarczycowych
i retinoidowe zawierają kilka domen czynnościo¬
wych: jedna z nich wiąże się z hormonem, druga
- ze swoistym obszarem łańcucha DNA, trzecia
- oddziałuje z innymi białkami koregulacyjnymi,
w wyniku czego następuje aktywacja (lub repre¬
sja) transkrypcji genowej, czwarta - specyficznie
wiąże się z jednym lub kilkoma białkami wpły¬
wającymi na śródkomórkowy transport receptora.
Podwójna funkcja receptora, tj. wiązanie hormo¬
nu i inicjowanie określonej czynności śródko-
mórkowej, leży u podstawy tzw. sprzężenia re-
ceptorowo-efektorowego (ang. receptor-effector
coupling), stanowiącego pierwszy etap wzmoc¬
nienia (amplifikacji) odpowiedzi hormonalnej.
Ta cecha odróżnia receptor komórki docelowej
od białek nośnikowych osocza, które wprawdzie
wiążą hormony, lecz nie indukują określonego
sygnału hormonalnego (p. tab. 41-6).
Receptory są białkami
Rozróżnia się wiele klas receptorów dla hor¬
monów peptydowych. Na przykład receptor
insulinowy jest heterotetramerem (a2P2), które¬
go podjednostki są połączone ze sobą wieloma
wiązaniami dwusiarczkowymi. Położona poza-
komórkowo podjednostka a łączy się z insuliną,
a sprzęgająca błonę podjednostka p przekazuje
sygnał za pośrednictwem domeny kinazy tyro¬
zyno wej tej jednostki zlokalizowanej w cyto-
plazmie. Podobną, ogólną strukturę wykazu¬
ją receptory dla insulinopodobnego czynnika
wzrostowego 1 (IGF-1) i naskórkowego czynni¬
ka wzrostowego (EGF). Receptory dla hormonu
wzrostu i prolaktyny również zawierają domeny
sprzęgające błonę plazmatyczną komórki doce¬
lowej, lecz nie hamują wewnętrznej aktywności
kinazy białek. Po przyłączeniu się ligandu do
tych receptorów następuje asocjacja i aktywacja
534 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
całkowicie odmiennego szlaku kinazy białek, tj.
szlaku JAK-Stat. Receptory hormonów polipep-
tydowych i amin katecholowych, które przeka¬
zują sygnał poprzez zmianę ilości powstającego
cAMP (z wykorzystaniem białek G) charakte¬
ryzują się obecnością 7 domen sprzęgających
błonę plazmatyczną. Aktywacja kinazy białek
oraz generacja cyklicznego AMP (cAMP - kwas
3',5'-adenylowy - p. ryc. 19-5) jest działaniem
„w dół” (ang. downstream action) tej klasy re¬
ceptorów (p. rozdz. 42). Porównanie kilku róż¬
nych receptorów steroidowych z receptorami dla
hormonów tarczycowych ujawniło występowa¬
nie znamiennej identyczności w sekwencji ami-
nokwasowej domen różnych regionów, szcze¬
gólnie domen wiążących się z DNA. To stało
się podstawą poglądu, że receptory typu stero-
idowo-tarczycowego tworzą dużą nadrodzinę
receptorów jądrowych. Dla wielu spokrewnio¬
nych „członków” tej rodziny nie są znane Ugan¬
dy, dlatego określono je receptorami sierocymi.
Nadrodzina receptorów jądrowych odgrywa klu¬
czową rolę w hormonalnej regulacji transkrypcji
genów, opisanej w rozdz. 42.
KLASYFIKACJA HORMONÓW MOŻE SIĘ
OPIERAĆ NA RÓŻNYCH KRYTERIACH
Hormony można sklasyfikować na podstawie ich
struktury chemicznej lub rozpuszczalności w róż¬
nych środowiskach, lokalizacji receptora hormo¬
nalnego lub rodzaju sygnału pośredniczącego
w działaniu hormonu w obrębie komórki. W ta¬
beli 41-3 przedstawiono klasyfikację hormonów
opartą na ostatnich dwóch kryteriach, a w tab. 41 -4
- ogólne cechy każdej z dwóch grup wymienio¬
nych w tab. 41-3.
Hormony grupy 1 mają właściwości lipofilowe.
Po wydzieleniu do krwi hormony zostają związa¬
ne przez białka transportujące, dzięki czemu nie
ma znaczenia ich rozpuszczalność i wydłuża się
ich okres półtrwania w osoczu krwi. Ilości hormo¬
nu wolnego i związanego zależą od pojemności
i stałej powinowactwa białka transportującego.
Aktywną postacią hormonu jest jego postać wolna
(niezwiązana); w tej postaci hormon łatwo przeni¬
ka przez lipofilowe błony plazmatyczne wszyst¬
kich komórek, wiążąc się po drodze ze swoim
receptorem w cytoplazmie lub jądrze komórki do¬
celowej. Uważa się, że kompleks ligand-receptor
jest śródkomórkowym przekaźnikiem w tej gru¬
pie hormonów.
Tabela 41-3. Klasyfikacja hormonów oparta na mechanizmie ich
działania
Grupa I. Hormony wiążące się z receptorami
śródkomórkowymi
Androgeny
Estrogeny
Glukokortykoidy
Hormony tarczycy (T3 i T4)
Kalcytriol [1,25(0H)2D3]
Kwas retinolowy
Mineralokortykoidy
Progestyny
Grupa II. Hormony wiążące się z receptorami powierzchni
komórki
A. Drugim przekaźnikiem jest cAMP
Hormon adrenokortykotropowy
(ACTH)
Angiotensyna II
Folitropina (FSH)
Glukagon
Gonadotropina kosmówkowa
ludzka (hCG)
Hormon antydiuretyczny (ADH)
Kalcytonina
Katecholaminy a-adrenergiczne
Katecholaminy p-adrenergiczne
Kortykoliberyna (CRH)
Lipotropina (LPH)
Lutropina (LH)
Melanotropina (MSH)
Parathormon
Somatostatyna
Tyreotropina (TSH)
B. Drugim przekaźnikiem jest cGMP
Przedsionkowy czynnik
natriuretyczny (ANF)
Tlenek azotu (NO)
C. Drugim przekaźnikiem są jony wapniowe
lub/i fosfatydyloinozytydy
Acetylocholina (receptor
Gonadoliberyna
muskarynowy)
Katecholaminy
Angiotensyna II
aradrenergiczne
Cholecystokinina
Oksytocyna
Czynnik wzrostowy pochodzenia
Substancja P
płytkowego (PDGF)
Tyreoliberyna (TRH)
Gastryna
Wazopresyna
D. Przekaźnikiem śródkomórkowym jest kinaza lub kaskada
fosfatazowa
Adiponektyna
Erytropoetyna
Czynnik wzrostowy fibroblastów
Hormon wzrostu (GH)
(FGF)
Insulina
Czynnik wzrostowy
Leptyna
insulinopodobny (IGF-I, IGF-II)
Prolaktyna
Czynnik wzrostowy naskórkowy
Somatomammotropina
(EGF)
Czynnik wzrostowy nerwu (NGF)
Czynnik wzrostowy pochodzenia
płytkowego (PDGF)
kosmówkowa (CS)
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 535
Druga duża grupa hormonów to hormony roz¬
puszczalne w wodzie, wiążące się z receptorami
błony plazmatycznej komórki docelowej. Hor¬
mony wiążące się z błoną plazmatyczną komórek
„komunikują się” ze śródkomórkowymi proce¬
sami metabolicznymi za pośrednictwem cząste¬
czek określanych jako przekaźniki drugorzę-
dowe (ang. second messenger; sam hormon jest
określany jako przekaźnik pierwszorzędowy). Te
ostatnie powstają w wyniku oddziaływania hor¬
monu z receptorem. Koncepcja przekaźnika dru-
gorzędowego powstała na podstawie obserwacji,
że epinefryna, wiążąc się z błoną plazmatyczną
pewnych komórek, zwiększa stężenie śródkomór-
kowego cAMP. W serii kolejnych doświadczeń
wykazano, że cAMP bierze udział w działaniu
biologicznym licznych hormonów. Hormony, dla
których udowodniono w sposób jednoznaczny
taki mechanizm działania, znajdują się w grupie
IIA tab. 41-3. Jak dotychczas tylko jeden hormon
- przedsionkowego hormonu natriuretycznego
(ANF) - ma swój przekaźnik drugorzędowy i jest
nim cGMP. Zapewne do tej grupy (grupa IIB
w tab. 41-3) dołączą i inne hormony. Okazało się,
że w przypadku wielu hormonów, dla których za
drugi przekaźnik uważano cAMP, w rzeczywisto¬
ści mają inny przekaźnik drugorzędowy, a miano¬
wicie jony wapnia i/lub metabolity złożonych fo-
sfoinozytydów. Hormony te znajdują się w grupie
IIC w tab. 41-3.
Tabela 41-4. Ogólne cechy poszczególnych klas hormonów
Cecha
Grupa I
Grupa II
Rodzaj hormonu
Hormony steroido¬
we, jodotyroniny,
kalcytriol, retinoidy
Hormony polipep-
tydowe, białkowe
lub glikoproteinowe,
aminy katecholowe
Charakter
rozpuszczalności
Lipofilowe
Hydrofilowe
Związane
z białkami
transportującymi
Tak
Nie
Okres póttrwania
w osoczu
Długi (od kilku
godzin do kilku dni)
Krótki (minuty)
Lokalizacja
receptora
Śródkomórkowa
W błonie
plazmatycznej
Charakter drugiego
przekaźnika
Kompleks
receptor-hormon
cAMP, cGMR Ca2+,
metabolity złożonych
fosfoinozytydów,
kaskady kinazowe
Przekaźnikiem śródkomórkowym dla grupy
IID jest kinaza białek lub kaskada fosfatazowa.
Dotychczas zidentyfikowano wiele takich śródko-
mórkowych przekaźników. Jeden hormon może
działać za pośrednictwem więcej niż jednej kaska¬
dy kinazowej. Kilka hormonów można zaliczyć
do więcej niż jednej grupy. Podana klasyfikacja
hormonów zapewne ulegnie zmianie w miarę po¬
jawiania się nowych informacji.
RÓŻNORODNOŚĆ DZIAŁANIA
I BUDOWY GRUCZOŁÓW
WYDZIELANIA WEWNĘTRZNEGO
Hormony są wytwarzane
przez różnorodne komórki
Hormony są wytwarzane w oddzielnych narzą¬
dach, spełniających swoiste, ściśle określone funk¬
cje. Do tych narządów należą: tarczyca (miejsce
syntezy trijodotyronin), nadnercza (miejsce syn¬
tezy glukokortykoidów i mineralokortykoidów)
i przysadka mózgowa (miejsca wytwarzania TSH,
FSH, LH, hormonu wzrostu, prolaktyny i ACTH).
Niektóre narządy wydzielania wewnętrznego
spełniają dwie funkcje ściśle ze sobą powiązane.
Na przykład jajniki wytwarzają nie tylko dojrzałe
oocyty, lecz także estradiol i progesteron, odgry¬
wające rolę w procesie reprodukcji. Jądra wytwa¬
rzają dojrzałe plemniki i testosteron. Hormony
są również wytwarzane przez swoiste komórki
występujące w innych narządach. Na przykład
peptyd podobny do glukagonu jest wytwarzany
przez określone komórki znajdujące się w jelicie
cienkim, kalcytonina - przez komórki C tarczycy,
a angiotensyna II - przez nerki. Synteza niektó¬
rych hormonów wymaga z kolei udziału komó¬
rek miąższowych kilku narządów (np. do syntezy
l,25(OH)2D3 potrzebne jest współdziałanie ko¬
mórek skóry, hepatocytów i nerek). Przykłady tej
różnorodności w sposobach wytwarzania hormo¬
nów, z których każdy spełnia specyficzne funkcje,
zostaną omówione poniżej.
Hormony charakteryzują się
różnorodnością budowy chemicznej
Hormony są syntetyzowane z „cegiełek” chemicz¬
nych znacznie różniących się między sobą. Wiele
z nich to pochodne cholesterolu. Do nich należą
536 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
glukokortykoidy, mineralokortykoidy, estrogeny,
progestyny i l,25(OH)2D3 (p. ryc. 41-2). W nie¬
których przypadkach hormon sterydowy jest pre¬
kursorem cząsteczki innego hormonu. I tak, pro¬
gesteron jest nie tylko hormonem w ścisłym
tego słowa znaczeniu, lecz również prekursorem
w syntezie glukokortykoidów, mineralokortyko-
idów, testosteronu i estrogenów. Testosteron jest
obligatoryjnym związkiem pośrednim w bio¬
syntezie estradiolu i dihydrotestosteronu (DHT).
Przykłady te opisane niżej bardziej szczegółowo,
dowodzą, że końcowy produkt zależy od rodzaju
komórek i od zestawu enzymów komórkowych,
z którymi styka się prekursor.
Tyrozyna jest aminokwasem wyjściowym
w syntezie amin katecholowych i hormonów tar¬
czycy (tyroksyny, T4, która jest tetrajodotyroniną,
i trijodotyroniny, T3; ryc. 41-2). T3 i T4 są unikal¬
nymi hormonami, wymagającymi obecności jodu
(I ), by stały się aktywne. Ponieważ występowa-
B.POCHODNE TYROZYNY
I I
-C
H
H
I
-C -NH,
I 2
H
Norepinefryna (noradrenalina)
HO
H
\ 0 H CH,
I I I 3
I —(' yc -C -NH
\=/ I I
H H
Epinefryna (adrenalina)
C. PEPTYDY 0 RÓŻNEJ WIELKOŚCI
(piro)
TRH-tyreoliberyna
D. GLIKOPROTEINY (TSH, FSH, LH)
zawierają taką samą podjednostkę a,
lecz swoiste (różniące się pomiędzy sobą) podjednostki p.
Ryc. 41-2 Chemiczne zróżnicowanie hormonów. (A) Pochodne cholesterolu. (B) Pochodne tyrozyny. (C) Peptydy o różnej wielkości.
(D) Glikoproteiny (TSH, FSH, LH) zawierające taką samą podjednostkę a, lecz swoiste (różniące się między sobą) podjednostki p.
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 537
nie jodu w wielu regionach Ziemi jest niewielkie,
ustrój wyrobił sobie sprawny mechanizm groma¬
dzenia i zatrzymywania tego pierwiastka.
Wiele hormonów jest polipeptydami lub gliko-
proteinami. Różnią się one znacznie wielkością.
I tak, tyreoliberyna jest tripeptydem, ACTH - po-
lipeptydem złożonym z 39 aminokwasów, parat-
hormon (PTH) - polipeptydem składającym się
z 84 aminokwasów i hormon wzrostu - zbudowa¬
ny ze 191 aminokwasów (p. ryc. 41-2). Insulina
jest heterodimerem składającym się z łańcucha
A (zawierającego 21 aminokwasów) i łańcucha
B (złożonego z 30 aminokwasów). Folitropina
(FSH), lutropina (LH), tyreotropina (TSH) i gona-
dotropina kosmówkowa (CG) są glikoproteinami
złożonymi z dwóch łańcuchów a i p (heterodime-
ry a i p). Wymienione 4 hormony zawierają jed¬
nakowy łańcuch a, natomiast różnią się strukturą
łańcucha p. Masa cząsteczkowa tych hormonów
waha się od 25 do 30 kDa i zależy od stopnia gli-
kozylacji oraz długości łańcucha p.
Szlaki syntezy i aktywacji poszczególnych
hormonów sa różne
Niektóre hormony są syntetyzowane w ostatecznej
postaci i natychmiast wydzielane do przestrzeni
pozakomórkowej. Do takich hormonów należą po¬
chodne cholesterolowe. Inne hormony, np. aminy
katecholowe, są również syntetyzowane w osta¬
tecznej postaci, lecz są magazynowane w komór¬
kach, w których były wytwarzane. Jeszcze inne
hormony są syntetyzowane w postaci prekursoro-
wej, następnie są przetwarzane i wydzielane pod
wpływem swoistego sygnału (do takich hormonów
należy insulina). Są wreszcie i takie hormony, któ¬
re są wydzielane w postaci prekursorowej i ulega¬
ją aktywacji dopiero w tkankach docelowych (do
takich hormonów należą T3 i DHT). Wszystkie te
szlaki syntezy i aktywacji hormonów są szczegóło¬
wo omówione w dalszej części rozdziału.
WIELE HORMONÓW JEST
POCHODNYMI CHOLESTEROLU
Steroidogeneza nadnerczowa
Steroidy nadnerczowe są wytwarzane z choleste¬
rolu. Większość cholesterolu pochodzi z osocza
krwi, a tylko niewielka ilość jest syntetyzowana
in situ z acetylo-CoA szlakiem mewaloniowym
i skwalenowym. Większość cholesterolu znaj¬
dującego się w nadnerczach występuje w posta¬
ci estryfikowanej i jest magazynowana w „kro¬
plach” tłuszczowych cytoplazmy. Pod wpływem
stymulacji nadnerczy przez ACTH, ulega aktywa¬
cji esteraza. W następstwie jej działania powstaje
wolny cholesterol, który zostaje przeniesiony do
mitochondriów, gdzie pod wpływem enzymu
rozszczepiającego łańcuch boczny i zawierają¬
cego cytochrom P-450 (enzym ten określa się
skrótem P-450scc) ulega przekształceniu do preg-
nenolonu. Proces odszczepienia łańcucha boczne¬
go rozpoczyna się od podwójnej hydroksylacji -
najpierw przy atomie węgla C-22, a następne przy
C-20, a dopiero potem dochodzi do odszczepie¬
nia 6-węglowego łańcucha, tj. izokaproaldehydu,
i utworzenia 21-węglowego steroidu (ryc. 41-3).
Do transportu cholesterolu do P-450scc, umiejsco¬
wionego na wewnętrznej ścianie mitochondrium,
potrzebne jest białko zależne od ACTH, stymu¬
lujące steroidogenezę (StAR) w nagłych sytua¬
cjach.
Wszystkie steroidy powstające u ssaków są wy¬
twarzane z cholesterolu via pregnenolon, w wyni¬
ku wielu reakcji zachodzących w mitochondriach
lub siateczce śródplazmatycznej komórek nad¬
nerczy. Istotną rolę w tych reakcjach odgrywają
hydroksylazy, wymagające obecności tlenu czą¬
steczkowego i NADPH. Ponadto w niektórych
etapach biosyntezy potrzebne są dehydrogenazy,
jedna izomeraza i liaza. Stwierdza się pewną swo¬
istość komórkową w steroidogenezie, np. 18-hy-
droksylaza oraz dehydrogenaza 18-hydroksyste-
roidowa, potrzebne w biosyntezie aldosteronu,
występują tylko w komórkach kłębkowych nad¬
nerczy, przez co synteza tego mineralokortykoidu
odbywa się tylko w tej warstwie nadnerczy.
Schemat szlaków syntezy trzech głównych klas
steroidowych nadnerczy przedstawiono na ryc.
41-4. W prostokątnych ramkach podano nazwę
enzymów, a szarymi polami zaznaczono zmianę
chemiczną, jaką dany enzym powoduje.
A. Synteza mineralokortykoidów
Synteza aldosteronu odbywa się szlakiem mi-
neralokortykoidowym w warstwie kłębkowatej
nadnerczy. Pregnenolon ulega przekształceniu
do progesteronu przy udziale dwóch enzymów
zlokalizowanych w siateczce śródplazmatycznej
538 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Odszczepienie bocznego łańcucha cholesterolu
Podstawowe struktury hormonów steroidowych
CH,OH
I
OH C = O
HO
HO
0‘
O'
170-Estradiol Testosteron Kortyzol Progesteron
Związki estranowe (C18) Związki androstanowe (C19) Związki pregnanowe (C21)
Ryc. 41-3. Odszczepienie łańcucha bocznego cholesterolu oraz zasadnicze cechy budowy hormonów steroidowych. Podstawowe
pierścienie sterolowe oznaczono literami A, B, C, D. Atomy węgla oznaczono liczbami od 1 do 21, począwszy od pierścienia A. Należy
zauważyć, że grupa estranowa zawiera 18 atomów węgla (C18) itd.
gładkiej, tj. dehydrogenazy 3p-hydroksysteroi-
dowej (3P-OHSD) i A5,4-izomerazy. Po hydrok-
sylacji progesteronu w pozycji C-21 powstaje
11-deoksykortykosteron (DOC), który jest aktyw¬
nym mineralokortykoidem (zatrzymującym sód).
W wyniku kolejnej hydroksylacji w pozycji C-l 1
powstaje korty kosteron, który wykazuje aktyw¬
ność glukokortykoidową i słabą aktywność mine-
ralokortykoidową (stanowiącą ok. 5% aktywności
aldosteronu). U niektórych gatunków zwierząt,
np. u gryzoni, korty kosteron jest najsilniejszym
glukokortykoidem. Hydroksylacja w pozycji
C-21 jest potrzebna do wystąpienia zarówno ak¬
tywności mineralo-, jak i glukokortykoidowej.
Większość steroidów z grupą hydroksylową
w pozycji C-l7 wykazuje większą aktywność
glukokortykoidową i mniejsze działanie minera-
lokortykoidowe. W siateczce śródplazmatycznej
gładkiej komórek warstwy kłębkowatej nadner¬
czy brak jest 17a-hydroksylazy, natomiast wystę¬
puje enzym mitochondrialny - 18-hydroksylaza.
W wyniku działania 18-hydroksylazy na kortyko-
steron powstaje 18-hydroksy korty kosteron, który
- po przekształceniu grupy alkoholowej w pozycji
C-l8 na aldehydową - tworzy aldosteron. To je¬
dyne w swoim rodzaju rozmieszczenie enzymów
oraz swoista regulacja czynności warstwy kłęb¬
kowatej przez jony K+ i angiotensynę II stały się
dla niektórych badaczy podstawą do postawienia
tezy, że w nadnerczach występują nie tylko dwa
odrębne gruczoły wydzielania wewnętrznego (tj.
kora i rdzeń nadnerczy), lecz także dwa odrębne
gruczoły w obrębie samej kory nadnerczy [jeden
produkujący mineralokortykoidy, a drugi - gluko-
kortykoidy -przyp. tłum.].
B. Synteza glukokortykoidów
Synteza kortyzolu wymaga trzech hydroksylaz,
występujących w warstwie pasmowatej i siatkowa¬
tej nadnerczy, działających kolejno w pozycjach:
C-l7, C-21 i C-ll. Hydroksylacja w pozycjach
C-l7 i C-21 zachodzi szybko, natomiast w pozycji
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 539
11P-HYDROKSYLAZA
CH,OH
Ryc. 41-4. Szlaki syntezy 3 głównych klas steroidów nadnerczowych: mineralokortykoidów, glukokor-
tykoidów i androgenów. Enzymy katalizujące umieszczono w prostokątnych ramkach, a modyfikacje
struktur zachodzące na każdym etapie zaznaczono szarymi polami. Należy zauważyć, że 17a-hydrok-
sylaza i 17,20-liaza są składowymi jednego enzymu oznaczonego jako P-450C17. (Rycina nieznacznie
zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Harding BWW: DeGroot LJ (red.): Endocrinology, tom 2,
Grune and Stratton, 1979).
540 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
C-ll dość wolno. Jeżeli najpiew wystąpi hydrok-
sylacja w pozycji C-21, następuje zahamowanie
17a-hydroksylazy, wskutek czego aktywacji ule¬
ga szlak mineralokortykoidowy (jest wytwarzany
kortykosteron lub aldosteron, zależnie od rodzaju
komórek nadnerczowych). 17a-Hydroksylaza wy¬
stępuje w siateczce śródplazmatycznej gładkiej
i działa albo na progesteron, albo - częściej - na
pregnenolon. 17a-hydroksyprogesteron, ulegając
hydroksylacji w pozycji C-21, tworzy 11-deoksy-
kortyzol, który po kolejnej hydroksylacji w pozycji
Cli tworzy kortyzol; jest to najsilniejszy natural¬
ny hormon glukokortykoidowy u człowieka. Po¬
nieważ 17a-hydroksylaza występuje w siateczce
śródplazmatycznej gładkiej, a 11 P-hydroksylaza
- w mitochondriach, zatem steroidogenezę cha¬
rakteryzuje powtarzający się transport substratów
steroidowych do i z mitochondriów.
C. Synteza androgenów
Najważniejszym androgenem lub prekursorem
androgenów powstających w korze nadnerczy
jest dehydroepiandrosteron (DHEA). Większość
17-hydroksypregnenolonu ulega dalszym prze¬
kształceniom w szlaku glukokortykoidowym,
a tylko mała jego ilość ulega działaniu 17,20-lia-
zy, odszczepiającej dwuwęglowy łańcuch boczny.
Aktywność liazowa jest związana z częścią tego
samego enzymu (P-450C17), który katalizuje 17a-
-hydroksylazę. Dlatego liaza jest białkiem o po¬
dwójnej funkcji. Aktywność liazowa enzymu
jest ważna zarówno w nadnerczach, jak i gona¬
dach, gdzie enzym działa wyłącznie na cząsteczki
zawierające grupę hydroksylową w pozycji 17a.
W razie braku jednej z hydrolaz i zahamowania
biosyntezy glukokortykoidów (patrz niżej - ze¬
spół nadnerczowo-płciowy) wytwarzanie andro¬
genów w nadnerczach znacznie się nasila. DHEA
jest tak naprawdę prohormonem, ponieważ
przekształca się w silniejszy androgen - andro-
stendion (DHEA jest słabym androgenem) pod
wpływem 3P-OHSD i AM-izomerazy. Małe ilości
androstendionu powstają również w nadnerczach
pod wpływem działania liazy na 17a-hydroksy-
progesteron. W wyniku redukcji androstendionu
w pozycji C-17 powstaje testosteron - najsilniej¬
szy androgen nadnerczowy. Małe ilości testostero¬
nu powstają właśnie w ten sposób w nadnerczach,
większość natomiast powstaje wskutek konwersji
w innych tkankach.
Steroidogeneza w jądrach
(gonadach męskich)
Androgeny gonady męskiej są wytwarzane przez
komórki Leydiga, występujące w tkance śród¬
miąższowej. Prekursorem steroidów gonadalnych
jest, podobnie jak steroidów nadnerczowych,
cholesterol. Etapem krytycznym, podobnie jak
w nadnerczach, jest transport cholesterolu przez
białko określane skrótem StAR (ang. steroidoge-
nic acute regulatory protein - białko ostrej regula¬
cji steroidowej) do wewnętrznej błony mitochon-
drialnej, gdzie następuje odszczepienie bocznego
łańcucha przez enzym P-450scc. Proces konwersji
cholesterolu do pregnenolonu jest taki sam zarów¬
no w nadnerczach, jak i w jądrach oraz jajnikach.
W dwóch ostatnich narządach proces ten jest po¬
budzany przez LH, a nie przez ACTH.
Konwersja pregnenolonu do testosteronu wyma¬
ga działania pięciu enzymów zawartych w trzech
białkach. Są nimi: 1) dehydrogenaza 3p-hydro-
ksysteroidowa (3P-OHSD) i A54-izomeraza, 2)
17a-hydroksylaza i 17,20-liaza oraz 3) dehydro¬
genaza 17p-hydroksysteroidowa (17p-OHSD).
Szlak biosyntezy testosteronu, określany jako
szlak progesteronowy (inaczej szlak A4), jest
przedstawiony po prawej stronie ryc. 41-5. Kon¬
wersja pregnenolonu do testosteronu może się
również odbyć szlakiem dehydroepiandrostero-
nowym (zwanym również szlakiem A5), przed¬
stawionym po lewej stronie ryc. 41-5. W jądrach
ludzkich szlak A5 jest szlakiem preferowanym.
Pięć wymienionych aktywności enzymatycz¬
nych jest zlokalizowanych we frakcji mikroso-
malnej jąder szczurzych. Stwierdza się bliskie
czynnościowe sprzężenie między aktywnościami
3P-OHSD i A5t4-izomerazy oraz między aktyw¬
nościami 17a-hydroksylazy i 17,20-liazy. Te pary
enzymów, z których każda zawiera się w jednym
białku, są pokazane na ryc. 41 -5 wg kolejności za¬
chodzących reakcji.
Dihydrotestosteron powstaje
z testosteronu w tkankach obwodowych
Przemiana testosteronu odbywa się dwoma szlaka¬
mi. W jednym z nich zachodzi oksydacja w pozy¬
cji 17, w drugim - redukcja podwójnego wiązania
pierścienia A oraz grupy ketonowej w pozycji 3.
Przemiana wg pierwszego szlaku zachodzi w licz-
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 541
Ryc. 41-5. Szlaki biosyntezy testo¬
steronu. Szlak po lewej stronie jest
określany jako szlak a5 lub szlak
dehydroepiandrosteronowy, a szlak
po stronie prawej - jako szlak a4
lub szlak progesteronowy. Gwiazdki
oznaczają, że aktywność 17a-hy-
droksylazy i 17,20-liazy jest zwią¬
zana z jednym białkiem P-450C17.
cn3
CK,
i 3
C = 0
I
c =
17cc-HYDR0KSYLAZA*
i
ł
17a-HYDR0KSYLAZA*
DEHYDROGENAZA
17p-HYDR0KSYSTER0ID0WA
DEHYDROGENAZA
17P-HYDR0KSYSTER0ID0WA
A5-Androstendiol
TESTOSTERON
542 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
nych tkankach, w tym i w wątrobie; produktami
końcowymi są 17-ketosteroidy, które są zwykle
nieaktywne lub mniej aktywne niż hormon ma¬
cierzysty. Przemiana wg drugiego szlaku jest
mniej skuteczna i zachodzi głównie w tkankach
docelowych; jest ona źródłem bardzo aktywnego
metabolitu - DHT.
Najważniejszym metabolitem testosteronu
jest DHT. W wielu tkankach, w tym w gruczole
krokowym, zewnętrznych narządach płciowych
Ryc. 41-6. Dihydrotestosteron powstaje z testosteronu w reakcji katalizowanej przez 5a-reduktazę.
Cholesterol Pregnenolon ► 17a-Hydroksypregnenolon ►- Dehydroepiandrosteron
t ł \
Progesteron ^ 17a-Hydroksyprogesteron ^ Androstendion
Ryc. 41-7. Biosynteza estrogenów. (Rycina nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Ganong WF: Review of Medical
Physiology, wyd. 20. Appleton and Lange, 2001).
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 543
i w niektórych obszarach skóry, DHT jest aktyw¬
ną postacią hormonu. Stężenie DHT u dorosłe¬
go mężczyzny stanowi V10 stężenia testosteronu.
W ciągu doby powstaje ok. 400 pg DHT i ok.
5 mg testosteronu, przy czym ok. 50-100 pg
DHT jest wydzielanych przez jądra, a pozostała
ilość jest wytwarzana przez tkanki obwodowe.
Reakcję konwersji testosteronu do DHT katalizu¬
je NADPH-zależna 5a-reduktaza (ryc. 41-6).
Testosteron może więc być uznany za prohor-
mon, ponieważ ulega przekształceniu do znacznie
silniej działającego związku (dihydrotestoste-
ronu); większość tej konwersji odbywa się poza
jądrami. Mały odsetek testosteronu ulega także
konwersji do estradiolu w wyniku aromatyzacji
pierścienia zachodzącej w tkankach obwodo¬
wych, szczególnie u mężczyzn.
Steroidogeneza jajnikowa
Estrogeny tworzą rodzinę hormonów syntety¬
zowanych w różnorodnych tkankach. Głów¬
nym estrogenem pochodzenia jajnikowego jest
17p-estradiol. U niektórych gatunków zwierząt
estrogenem wytwarzanym w licznych tkankach
w większych ilościach jest estron. W okresie cią¬
ży wydziela się więcej estriolu; jego źródłem jest
łożysko. Ogólny szlak biosyntezy estrogenów
oraz lokalizacja subkomórkowa enzymów uczest¬
niczących we wczesnych jej etapach są takie same
jak w przypadku androgenów. Cechy różniące
biosyntezę estrogenów od androgenów przedsta¬
wiono na ryc. 41-7.
Estrogeny powstają w reakcji aromatyzacji
androgenów. W tym złożonym procesie zacho¬
dzą trzy hydroksylacje z udziałem 02 i NADPH.
Przyjmuje się, że kompleks enzymatyczny, okre¬
ślany jako aromataza, zawiera P-450 monooksy-
genazę. Jeśli substratem dla tego kompleksu en¬
zymatycznego jest testosteron, to powstaje estra¬
diol, jeśli natomiast substratem jest androstendion
- tworzy się estron.
Określenie komórek wytwarzających poszcze¬
gólne steroidy jajnikowe było trudne. W ich
syntezie następuje transfer substratów między
dwiema komórkami. Komórki osłonki są źródłem
androstendionu i testosteronu. Steroidy te ulegają
następnie przekształceniu do, odpowiednio, estro-
nu i estradiolu. Proces ten katalizuje kompleks
aromatazowy, zawarty w komórkach ziarnistych.
Progesteron, który jest prekursorem dla wszyst¬
kich hormonów steroidowych, jest wytwarzany
i wydzielany przez komórki ciałka żółtego, i to
jako hormon ostateczny, ponieważ hormony te
nie zawierają enzymów potrzebnych do konwersji
progesteronu do innych hormonów steroidowych
(ryc. 41-8).
Octan
I
Progesteron
Ryc. 41-8. Biosynteza progesteronu w ciałku żółtym.
Dość duże ilości estrogenów powstają w tkan¬
kach obwodowych w reakcji aromatyzacji andro¬
genów. U mężczyzn aromatyzacja testosteronu
w tkankach obwodowych jest źródłem 80% wy¬
twarzanego u nich estradiolu (E2). U kobiet waż¬
nym substratem dla estrogenów sąandrogeny nad-
nerczowe. W okresie ciąży 50% wytworzonego E2
jest wynikiem aromatyzacji androgenów nadner-
czowych. Konwersja androstendionu w estron jest
z kolei głównym źródłem estrogenów u kobiet po
menopauzie. Aktywność aromatyzową stwierdza
się w komórkach tłuszczowych oraz w wątrobie,
skórze i innych tkankach. Wydaje się, że nadmier¬
na aktywność tego enzymu jest charakterystyczna
dla patogenezy zespołu estrogenizacji, występu¬
jącego u osób starych, oraz dla takich chorób, jak
544 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
marskość wątroby, nadczynność tarczycy i oty¬
łość. Należy się spodziewać, że inhibitory aro-
matazy znajdą zastosowanie w terapii raka piersi
i nowotworów innych kobiecych narządów roz¬
rodczych.
1,25(0H)2-D3 (kalcytriol) jest pochodna
cholesterolu
l,25(OH)2-D3 jest produktem serii reakcji enzy¬
matycznych, wymagających transportu cząsteczek
prekursorowych do kilku różnych tkanek. Jednym
z prekursorów jest witamina D, która w rzeczy¬
wistości nie jest witaminą, jednak w potocznej
mowie klinicznej ciągle się ją tak nazywa. Ak¬
tywna cząsteczka kalcytriolu jest transportowa¬
na do innych narządów, gdzie uczynnia procesy
biologiczne, podobnie jak robią to inne hormony
steroidowe.
A. Skóra
Małe ilości prekursora potrzebnego do syntezy
l,25(OH)2-D3 występują w pokarmach (tran rybi,
żółtko jaja), większość jednak jest wytwarzana
z 7-dehydrocholesterolu w komórkach Malpighie-
go skóry pod wpływem promieni ultrafioletowych
w nieenzymatycznej reakcji fotolizy. Stopień fo-
tolizy jest wprost proporcjonalny do intensywno¬
ści promieniowania ultrafioletowego i odwrotnie
proporcjonalny do stopnia pigmentacji skóry.
W miarę starzenia się organizmu zawartość 7-de¬
hydrocholesterolu w naskórku zmniejsza się, co
wydaje się przyczyną ujemnego bilansu wapnio¬
wego w starszym wieku.
Promienie słoneczne
7-Dehydrocholesterol ■
SKÓRA
WĄTROBA
Witamina D3
25-Hydroksylaza
Inne
metabolity
25-Hydroksycholekalciferol (25[0H]-D3)
1 a-Hydroksyiaza
)H)2-D3
1,24,25(0H),-D,
Ryc. 41-9. Powstawanie i hydroksylacja witaminy D3. Hyroksylacja w pozycji C25 zachodzi w wątrobie, a pozostałe reakcje w nerkach.
25,26(0H)2-D3 i 1,25,26(0H)3-D3 zapewne również są syntetyzowane. Pokazano również wzory chemiczne 7-dehydrocholesterolu,
witaminy D3 i 1,25(0H)2-D3. Rycina zmodyfikowana, reprodukowana za zgodą z: Ganong WF: Review of Medical Physiology, wyd. 20,
McGraw Hill, 2001.
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 545
B. Wątroba
Swoiste białko transportujące, określone jako
białko wiążące witaminę D (ang. vitamin D-
-binding protein), wiąże witaminę D3 oraz jej
metabolity i przenosi je ze skóry i jelit do wątro¬
by, gdzie ulegają hydroksylacji w pozycji C-25,
która to reakcja jest pierwszą w syntezie kalcy-
triolu. 25-Hydroksylacja odbywa się w siateczce
śródplazmatycznej. Do reakcji tej jest potrzebny
magnez, NADPH, tlen cząsteczkowy oraz bliżej
nieokreślony czynnik cytoplazmatyczny. W reak¬
cji uczestniczą dwa enzymy: reduktaza cytochro-
mu P-450, zależna od NADPH, oraz cytochrom
P-450. Reakcja ta nie podlega regulacji i zacho¬
dzi, w mniejszym nasileniu, również w nerkach
i jelicie cienkim. Następnie 250H-D3 dostaje się
do krążenia, gdzie jest głównym metabolitem wi¬
taminy występującym w osoczu. Po związaniu się
z białkiem wiążącym witaminę D, 250H-D3 jest
transportowany do nerek.
C. Nerki
250H-D3 jest słabym agonistą kalcytriolu. Aby
250H-D3 osiągnął pełną aktywność, niezbęd¬
na jest jego hydroksylacja przy atomie węgla
C-l. Zachodzi ona w mitochondriach komórek
proksymalnego kanalika krętego, przy udziale
trzyskładnikowej reakcji monooksygenazowej,
wymagającej obecności NADPH, Mg2+, tlenu
cząsteczkowego i przynajmniej trzech enzymów,
tj.: 1) nerkowej reduktazy ferredoksynowej (bę¬
dącej flawoproteiną), 2) nerkowej ferredoksyny
(będącej białkiem żelazo-siarkowym) oraz 3) cy-
tochromu P-450. Ten układ wytwarza l,25(OH)2-
-D3, który jest najbardziej aktywnym, naturalnym
metabolitem witaminy D.
AMINY KATECHOLOWEI HORMONY
TARCZYCY SA POCHODNYMI TYROZYNY
Aminy katecholowe sa wytwarzane
w ostatecznej postaci i magazynowane
w ziarnistościach wydzielniczych
Trzy aminy: dopamina, norepinefryna i epine-
fryna są syntetyzowane z tyrozyny w komórkach
chromochłonnych rdzenia nadnerczy. Głównym
produktem rdzenia nadnerczy jest epinefryna. Sta¬
nowi ona 80% wszystkich katecholamin rdzenia
i nie jest wytwarzana w innych tkankach. W od¬
różnieniu od epinefryny, większość norepinefryny
(ok. 80%) występuje w narządach unerwionych
przez nerwy sympatyczne i jest wytwarzana in
situ, pozostała ilość zaś (ok. 20%) pochodzi z za¬
kończeń nerwowych i dociera do komórek doce¬
lowych z krwią. Epinefryna i norepinefryna mogą
być wytwarzane i magazynowane przez różne
komórki rdzenia nadnerczy i innych tkanek chro¬
mochłonnych.
Konwersja tyrozyny przebiega w 4 etapach:
1) hydroksylacja pierścienia benzenowego, 2) de¬
karboksylacja łańcucha bocznego, 3) hydroksy¬
lacja łańcucha bocznego z utworzeniem norepi¬
nefryny i 4) N-metylacja z wytworzeniem epi¬
nefryny. Szlaki biosyntezy tych hormonów oraz
potrzebne do ich syntezy enzymy przedstawiono
na ryc. 41-10.
A. Hydroksylaza tyrozynowa jest enzymem
DECYDUJĄCYM 0 WYDAJNOŚCI BIOSYNTEZY AMIN
KATECH0L0WYCH ____
Tyrozyna jest bezpośrednim prekursorem amin
katecholowych, a hydroksylaza tyrozynowa
(4-monooksygenaza monofenolowa) jest enzy¬
mem krytycznym w biosyntezie tych związków,
decydującym o jej wydajności. Hydroksylaza ty¬
rozynowa występuje tylko w tkankach wytwarza¬
jących aminy katecholowe i to w postaci rozpusz¬
czonej lub związanej z ziamistościami. Działa ona
jako oksydoreduktaza z tetrahydropterydyną jako
koenzymem, przekształając L-tyrozynę do L-dihy-
droksyfenyloalaniny (lewodopa, L-dopa). Jako
enzym decydujący o wydajności biosyntezy amin
katecholowych, hydroksylaza tyrozynowa podle¬
ga różnym regulacjom. Najważniejszym mecha¬
nizmem tej regulacji jest hamowanie jej aktyw¬
ności przez same aminy katecholowe (hamowanie
poprzez sprzężenie zwrotne), które współzawod¬
niczą z hydroksylazą o koenzym pterydynowy.
Aminy katecholowe nie przenikają przez barierę
krew-mózg; oznacza to, że muszą być syntetyzo¬
wane na miejscu, tj. w samym mózgu. W określo¬
nych chorobach ośrodkowego układu nerwowego,
np. w chorobie Parkinsona, stwierdza się lokalne
upośledzenie syntezy dopaminy.
W odróżnieniu od dopaminy, L-dopa - będąca
prekursorem dopaminy - bardzo łatwo przenika
przez barierę krew-mózg, dzięki czemu jest waż¬
nym lekiem w terapii choroby Parkinsona.
546 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
o
HO
H H
I I
C — C — NHp
I I
H H
p-HYDROKSYLAZA
DOPAMINOWA
Ryc. 41-10. Biosynteza katecholamin. PNMT - A/-metylotransfe-
raza fenyloetanolaminowa.
B. Dekarboksylaza dopy występuje we wszystkich
TKANKACH
Ten rozpuszczony w cytoplazmie enzym potrze¬
buje obecności fosforanu pirydoksalu, aby w pro¬
cesie konwersji przekształcić L-dopę do 3,4-dihy-
droksyfenyloetyloaminy (dopaminy). Związki
strukturalnie podobne do L-dopy, np. a-metyldo-
pa, są kompetycyjnymi inhibitorami tej reakcji.
a-Metyldopa jest lekiem skutecznym w niektó¬
rych postaciach nadciśnienia tętniczego.
C. HyDROKSYLAZA DOPAMINOWA
(P“OKSYDAZA DOPAMINOWA, DBH) KATALIZUJE
KONWERSJĘ DOPAMINY DO NORADRENALINY
DBH jest monooksygenazą. Dawcą elektronów dla
tego enzymu jest askorbinian, a jego modulatorem
- fumaran. W centrum aktywnym tego enzymu
znajduje się miedź. DBH występuje prawdopodob¬
nie w specjalnej frakcji subkomórkowej komórek
rdzenia nadnerczy, tj. w ziamistościach wydzielni-
czych. Tak więc w tej śródkomórkowej strukturze
zachodzi konwersja dopaminy do noradrenaliny.
D. W-Metylotransferaza fenyloetanoloaminy
(PNMT) KATALIZUJE POWSTAWANIE ADRENALINY
(epinefryny)
Enzym ten katalizuje A-metylację noradrenaliny,
dzięki czemu powstaje adrenalina. Reakcja ta za¬
chodzi w komórkach rdzenia nadnerczy syntety¬
zujących ten hormon. Ponieważ PNMT jest enzy¬
mem rozpuszczalnym, przyjmuje się, że reakcja
konwersji noradrenaliny do adrenaliny zachodzi
w cytoplazmie. Syntezę PNMT indukują hormony
glukokortykoidowe, docierające z kory do rdzenia
nadnerczy śródnadnerczowym układem wrotnym.
Układ ten sprawia, że stężenia steroidów we krwi
rdzenia są 100 razy większe niż we krwi obwodo¬
wej. Wydaje się, że tak duże stężenie glukokor-
tykoidów w rdzeniu nadnerczy jest niezbędne do
indukcji PNMT.
Trijodotyronina (T3) i tyroksyna (TJ
ilustrują różnorodność syntezy hormonów
Powstawanie trijodotyroniny (T3) i tetrajodoty-
roniny (tyroksyny - T4) (p. ryc. 41-2) najlepiej
ilustruje różnorodność szlaków syntezy hormo¬
nów omawianych w tym rozdziale. Aby hormony
te były aktywne, niezbędna jest obecność pier¬
wiastka śladowego - jodu. Ich synteza zachodzi
w dużej cząsteczce prekursorowej tyreoglobuliny.
Powstałe hormony są następnie magazynowane
w koloidzie pęcherzyków tarczycowych. W koń¬
cu, w tkankach obwodowych, zachodzi konwersja
T4 do bardziej aktywnego biologicznie T3.
Hormony tarczycy odróżniają się od innych
hormonów unikalną cechą, tj. tym, że do ich ak¬
tywności biologicznej jest potrzebny pierwiastek
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 547
śladowy jod. Na większości obszarów Ziemi
jod występuje w niewielkich ilościach, wskutek
czego jego zawartość w środkach spożywczych
jest mała. Ten fakt tłumaczy, dlaczego rozwinął
się złożony mechanizm zatrzymywania tego waż¬
nego piewiastka śladowego w ustroju i przekształ¬
cania go w postać nadającą się do wbudowywania
do związków organicznych. Jednocześnie tarczy¬
ca musi syntetyzować tyroninę z tyrozyny, co od¬
bywa się w tyreoglobulinie (ryc. 41-11).
ŚWIATŁO PĘCHERZYKA TARCZYCOWEGO ZAWIERAJĄCE KOLOID
Ryc. 41-11. Schemat przemiany anionu jodkowego I' w pęcherzyku tarczycowym. Przedstawiono komórkę pęcherzyka tarczycowego
zwróconą do światła pęcherzyka (góra) oraz przestrzeń pozakomórkową (śródmiąższową) (dót). Aniony L wchodzą do komórki za
pośrednictwem pompy lub dyfuzji biernej (pokazane w lewym dolnym rogu). Synteza hormonów tarczycy zachodzi w świetle pęcherzy¬
ka; jest ona reakcją wieloetapową. W wielu jej etapach bierze udział peroksydaza. Uwolnienie hormonów tarczycy z tyreoglobuliny
zachodzi w wyniku hydrolizy w komórkach pęcherzykowych. Tgb - tyreoglobulina, MIT - monojodotyrozyna, DIT - dijodotyrozyna,
T3 - trijodotyronina, T4 - tetrajodotyronina. Gwiazdką oznaczono miejsca występowania dziedzicznych defektów enzymatycznych,
będących przyczyną wrodzonego wola towarzyszącego często niedoczynności tarczycy.
548 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Tyreoglobulina jest prekursorem T4 i T3. Jest
to duże białko jodowane i glikozylowane, o masie
cząsteczkowej 660 kDa, przy czym węglowodany
stanowią 8-10%, a jod 0,2-1% całej masy tyreo-
globuliny. Zawartość jodu w cząsteczce tyreo-
globuliny zależy od zawartości tego pierwiastka
w pożywieniu. Tyreoglobulina składa się z dwóch
dużych podjednostek. Zawiera ona 115 reszt ty¬
rozyno wy ch, z których każda jest potencjalnym
miejscem jodowania. Około 70% jodu cząsteczki
tyreoglobulinowej występuje w postaci nieaktyw¬
nych prekursorów, tj. monojodotyrozyny (MIT)
i dijodotyrozyny (DIT), a 30% w postaci reszt
jodotyroninowych, T4 i T3. Przy dostatecznej po¬
daży jodu stosunek T4 i T3 wynosi 7:1. W stanach
niedoboru jodu ta proporcja ulega zmniejszeniu,
podobnie jak stosunek DITiMIT. Tyreoglobulina,
złożona z ok. 5000 reszt aminokwasowych, gwa¬
rantuje konformację cząsteczki potrzebną przy
sprzęganiu reszt tyrozylowych i organifikacji
jodu, niezbędnej w syntezie hormonów tarczycy
złożonych z dwóch reszt aminokwasowych. Ty¬
reoglobulina jest syntetyzowana w części bazalnej
komórek pęcherzyków tarczycowych, skąd jest
transportowana do części luminalnej i magazyno¬
wana w pozakomórkowym koloidzie pęcherzyko¬
wym. W zdrowej tarczycy znajdują się zapasy T3
i T4 wystarczające na kilka tygodni. Po stymulacji
tarczycy przez TSH, w ciągu kilku minut koloid
ulega przemieszczeniu do komórek pęcherzyko¬
wych. Zjawisku temu towarzyszy wzmożona ak¬
tywność fagolizosomów. Różne kwaśne proteazy
i peptydazy rozkładają tyreoglobulinę do amino¬
kwasów i uwalniają z niej T4 i T3, które są wydala¬
ne z komórek pęcherzykowych na bazalnym bie¬
gunie (p. ryc. 41-11). Tyreoglobulina jest zatem
bardzo dużym prohormonem.
Przemiana jodków obejmuje kilka
odrębnych etapów
Gruczoł tarczowy wykazuje zdolność zwiększa¬
nia stężenia I wbrew znacznemu gradientowi
elektrochemicznemu. Zatężanie jest procesem
energochłonnym, sprzężonym z transportem tar¬
czycowym zależnym od Na\ K+ ATP-azy. Iloraz
stężenia jodku w tarczycy (T) i stężenia tego pier¬
wiastka we krwi (S) (iloraz T:S) jest miarą aktyw¬
ności transportera I . Aktywność tego transportera,
wyrażona ilorazem T:S, jest kontrolowana głów¬
nie przez TSH. Wartość ilorazu może wynosić od
500 - u zwierząt przewlekle stymulowanych TSH
do 5 (lub mniej) - u zwierząt pozbawionych przy¬
sadki (brak TSH). U ludzi prawidłowo się odży¬
wiających (normalna zawartość jodu w diecie)
iloraz T:S wynosi ok. 25:1.
Tarczyca jest jedyną tkanką wykazującą zdol¬
ność utleniania anionu 1 . Utlenianie jest niezbęd¬
nym etapem w procesie przekształcania 1 w jod
organiczny i biosyntezy hormonów tarczycy. Etap
ten wymaga obecności peroksydazy, zawierającej
hem, i występuje na luminalnej powierzchni ko¬
mórek pęcherzyków tarczycowych.
Peroksydaza tarczycowa jest białkiem tetrame-
rycznym, o masie cząsteczkowej 60 kDa. Do pro¬
cesu utlenienia enzym ten wymaga nadtlenku wo¬
doru (H202), który jest wytwarzany przez enzym
zależny od NADPH, przypominający reduktazę
cytochromu C. Utlenianie I , i co za tym idzie,
jego wbudowywanie do MIT i DIT, hamuje dzia¬
łanie wielu związków. Do najważniejszych z nich
należą leki będące pochodnymi tiomocznika. Są
one znane jako tzw. leki przeciwtarczycowe, po¬
nieważ działają hamująco na ten etap biosyntezy
hormonów tarczycy.
W postaci organicznej jod niełatwo opuszcza
tarczycę. Wolna tyrozyna może ulec jodowaniu,
lecz nie jest wbudowywana do białek, ponieważ
żaden tRNA nie rozpoznaje jodowanej tyrozyny.
Sprzęganie dwóch cząsteczek DIT w celu wy¬
tworzenia T4 lub jednej cząsteczki DIT z jedną
cząsteczką MIT w celu wytworzenia T3 zachodzi
w obrębie cząsteczki tyreoglobuliny. Ponieważ
nie znaleziono dotychczas oddzielnego enzymu
sprzęgającego, a proces ma charakter reakcji
utleniania, przyjmuje się, że reakcję tę katalizuje
tyreoperoksydaza, pobudzając tworzenie się wol¬
nych rodników jodotyrozynowych. Taką hipotezę
potwierdza m.in. to, że te same leki, które hamują
utlenianie I , hamują również proces sprzęgania.
Powstałe hormony tarczycy stanowią integralną
część tyreoglobuliny tak długo, jak długo ta ostat¬
nia nie ulega degradacji, opisanej wyżej.
Dejodynaza tarczycy usuwa I z nieaktyw¬
nych mono- i dijodotyronin. Proces ten dostarcza
znacznych ilości I do biosyntezy T3 i T4. Dejody¬
naza peryferyczna, występująca w narządach do¬
celowych, takich jak przysadka mózgowa, nerki,
wątroba, usuwa selektywnie I z pozycji 5 '-tyrok-
syny, w wyniku czego powstaje T3 (p. ryc. 41-2),
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 549
która jest znacznie aktywniejsza niż T4. A zatem
T4 uważa się za prohormon wykazujący pewną
aktywność wewnętrzną (ang. intrinsic activity).
Wiele hormonów powstaje z większych
prekursorów peptydowych
Tworzenie się kluczowych dla struktury insuli¬
ny mostków disiarczkowych sprawia, że insuli¬
na musi być najpierw syntetyzowana jako część
większej cząsteczki prekursorowej - proinsuliny.
Idea tego zjawiska jest podobna do zjawiska wy¬
stępującego w syntezie hormonów tarczycy, któ¬
re również powstają z cząsteczki prekursorowej
znacznie większej od ostatecznych hormonów.
Wiele innych hormonów jest syntetyzowanych na
bazie większych cząsteczek prekursorowych i to
nie ze względu na swoiste wymagania struktural¬
ne, lecz na mechanizmy kontroli syntezy aktywnej
postaci określonego hormonu. Przykładami takich
mechanizmów regulacji sekrecji są PTH i angio-
tensyna II. Innym interesującym przykładem jest
białko POMC [proopiomelanokortyna - przyp.
tłum.], z którego może powstać wiele różnych,
swoistych dla narządów hormonów. Przykłady te
są dokładniej omawiane w dalszej części niniej¬
szego rozdziału.
Insulina jest syntetyzowana jako
preprohormon, ulegający modyfikacji
strukturalnej w obrębię komórek beta
Insulina jest heterodimerem, składającym się
z łańcuchów A i B. W cząsteczce insuliny wy¬
stępują: jeden mostek śródłańcuchowy (łączący
A6 z Ali) i dwa mostki disiarczkowe między-
łańcuchowe (A7-B7 i A20-B19) (ryc. 41-12).
W laboratorium łatwo zsyntetyzowano oddziel¬
nie łańcuchy A i B, lecz próby biosyntezy całej
cząsteczki insuliny dały słabe wyniki. Przyczynę
tego poznano dopiero wtedy, kiedy wykryto, że
insulina powstaje z preprohormonu (o masie
Ryc. 41-12. Budowa ludzkiej proinsuliny. Insulina i peptyd C są ze sobą połączone w dwóch miejscach za pośrednictwem łączników
dipeptydowych. 0 zadziałaniu enzymu trypsynopodobnego (białe strzałki) i kilku kolejnych reakcji aktualizowanych przez enzymy kar-
boksypeptydazopodobne (zielone strzałki) powstają: heterodimeryczna cząsteczka (AB) insuliny oraz peptyd C.
550 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
cząsteczkowej około 11,5 kDa), który jest pro¬
totypem dla peptydów, powstających w wyniku
przekształcenia większych cząsteczek prekurso-
rowych. Hydrofobowa sekwencja sygnalna (pre)
lub liderowa (prowadząca) złożona z 23 reszt
aminokwasowych naprowadza cząsteczkę do cy¬
stern siateczki śródplazmatycznej, po czym ule¬
ga odszczepieniu. W wyniku tej reakcji powstaje
proinsulina, o masie cząsteczkowej 9 kDa, wyka¬
zująca zmiany konformacyjne niezbędne do wy¬
tworzenia właściwych mostków disiarczkowych.
Jak widać na ryc. 41-12, cząsteczka proinsuliny
zaczyna się od łańcucha B na A-końcu, połączone¬
go za pośrednictwem polipeptydu C z łańcuchem
A. Proinsulina ulega kilku procesom rozszczepie¬
nia, swoistym dla określonych pozycji łańcucha
polipeptydowego, w wyniku których powstają
równoważne ilości insuliny i peptydu C. Procesy
tego enzymatycznego rozszczepienia proinsuliny
przedstawiono na ryc. 41-12.
Parathormon (PTH) jest wydzielany
w postaci polipeptydu złożonego
z 84 reszt aminokwasowych
Bezpośrednim prekursorem PTH jest proPTH,
różniący się od natywnego hormonu obecnością
bardzo zasadowego heksapeptydu na A-końcu.
Znaczenie czynnościowe tego heksapeptydu jest
niejasne. Pierwotnym produktem transkrypcji
genu kodującego ten hormon jest preproPTH,
złożony ze 115 reszt aminokwasowych, będący
Ryc. 41-13. Struktura bydlęcego preproPTH. Strzałki wskazują miejsca działania enzymów rozszczepiających hormon w obrębie
przytarczyc (strzałki oznaczone cyframi 1-5) i w obrębie wątroby (strzałki oznaczone cyframi 4-5) po jego wydzieleniu do krwi. Do
fragmentu biologicznie aktywnego (PTH^J jest przyłączona sekwencja aminokwasów, niemająca wpływu na aktywność hormonu
i jego wiązanie z receptorem. (Rycina nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Habener JF: Recent advances in para-
thyroid hormone research. ClinBiochem 1981,14,223).
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 551
bezpośrednim prekursorem proPTH. PreproPTH
różni się od proPTH obecnością dodatkowego
łańcucha polipeptydowego na jV-końcu, złożone¬
go z 25 reszt aminokwasowych. Ten dodatkowy
polipeptyd ma charakter hydrofobowy, podobnie
jak sekwencje liderowe lub sygnalne innych bia¬
łek sekrecyjnych. Szczegółową sekwencję ami-
nokwasową preproPTH, proPTH i PTH przedsta¬
wiono na ryc. 41-13. N-Końcowy fragment, skła¬
dający się z 34 reszt aminokwasowych (PTH,_34),
wykazuje pełną aktywność biologiczną. Fragment
PTH25_34 jest odpowiedzialny głównie za wiąza¬
nie się z receptorem.
Biosynteza PTH i jego wydzielanie zależą od
stężenia Ca2+, przy czym mechanizm regulacji
jest bardzo złożony. Nagły spadek Ca2+ powodu¬
je znaczny wzrost mRNA kodującego PTH, po
czym nasila się synteza i wydzielanie PTH. Około
80-90% syntetyzowanego proPTH nie ulega prze¬
kształceniu do natywnego PTH,_84. Należy zatem
wnioskować, że większość powstałego proPTH
jest szybko rozkładana. Później wykryto, że de¬
gradacja proPTH zmniejsza się przy małych stęże¬
niach Ca2+, natomiast wzrasta, jeśli stężenia Ca2+
są duże. W zjawiskach tych pośredniczą recepto¬
ry Ca2+, zlokalizowane na powierzchni komórek
przytarczyczek. W następstwie proteolityczne¬
go działania powstają bardzo swoiste fragmen¬
ty cząsteczki PTH (p. ryc. 41-13). Stwierdzono
występowanie w przytarczycach licznych enzy¬
mów proteolitycznych, w tym również katepsyn
B i D. Katepsyna B rozkłada cząsteczkę PTH na
dwa fragmenty, tj. PTH,_36 i PTH37_84 Fragment
PTH37g4nie ulega dalszej degradacji, natomiast
fragment PTH,_36 ulega szybkiemu rozpadowi do
di- i tripeptydów.
Większość rozkładu proteolitycznego PTH
odbywa się w samych komórkach przy tarczyc.
W licznych badaniach wykazano jednak, że raz
wydzielony do krwi PTH ulega rozkładowi pro¬
teolitycznemu w wielu tkankach, szczególnie
w wątrobie, i to wg podobnego mechanizmu.
Angiotensyna II jest również
syntetyzowana z dużego prekursora
Układ reninowo-angiotensynowy uczestni¬
czy w regulacji ciśnienia tętniczego i przemiany
elektrolitowej (stymulując sekrecję aldosteronu).
Głównym hormonem w tych procesach jest angio¬
tensyna II, oktapeptyd powstający z angiotensy-
nogenu (ryc. 41-14). Synteza angiotensynogenu,
Angiotensynogen Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu (~400 dalszych aminokwasów)
t
1 RENINA |
Angiotensyna I Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu
t
ENZYM PRZEKSZTAŁCAJĄCY
ANGIOTENSYNĘI (KONWERTAZA)
ANGIOTENSYNA II Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe
t
Ryc. 41-14. Powstawanie i przemiana
angiotensyn. Krótkie strzałki wskazują
miejsca działania enzymów rozszcze¬
piających.
["aminopeptydaza "|
Angiotensyna III Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe
| ANGIOTENSYNAZY ~|
Produkty degradacji
552 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
będącego a2-globuliną, następuje w wątrobie. Jest
on substratem dla reniny - enzymu wytwarzane¬
go w komórkach tętniczki doprowadzającej
kłębuszka nerkowego (komórki przykłębuszko-
we). Lokalizacja tych komórek sprawia, że są one
szczególnie wrażliwe na zmiany ciśnienia tętni¬
czego. Wiele regulatorów fizjologicznych wpływa
na uwalnianie reniny za pośrednicwem barore-
ceptorów nerkowych. Komórki przykłębuszko-
we są również wrażliwe na zmiany stężenia Na+
i CL w płynie kanalikowym. Tak więc czynniki
powodujące obniżenie efektywnej objętości krwi
krążącej (odwodnienie, spadek ciśnienia tętni¬
czego, utrata płynów ustrojowych lub krwi) lub
obniżające stężenie NaCl w płynie kanalikowym
pobudzają uwalnianie reniny. Nerwy współczulne
nerek, ze swoimi zakończeniami w komórkach
przykłębuszkowych, pośredniczą w oddziaływa¬
niu ośrodkowego układu nerwowego lub pozycji
ciała na uwalnianie reniny. W mechanizmie tej
regulacji biorą udział receptory P-adrenergiczne.
Renina, działając na substrat - angiotensynogen,
uwalnia dekapeptyd, zwany angiotensyną I.
Enzym przekształcający angiotensynę (kon-
wertaza) jest glikoproteiną występującą w płu¬
cach, komórkach śródbłonkowych i osoczu krwi.
Katalizuje on odszczepienie dipeptydu od C-koń-
ca dekapeptydu angiotensyny I, w wyniku czego
powstaje oktapeptyd - angiotensyna II. Reakcja ta
nie wydaje się mieć charakteru reakcji regulowa¬
nej. Różne analogi nonapeptydowe angiotensy¬
ny I i inne związki są kompetycyjnymi inhibito¬
rami enzymu przekształcającego i są stosowane
w leczeniu nadciśnienia tętniczego reninoza-
leżnego. Związki te określa się jako inhibitory
konwertazy angiotensyny (ACEI).
Angiotensyna II podnosi ciśnienie tętnicze
krwi, działając kurcząco na tętniczki. Jest ona sil¬
ną substancją wazoaktywną. Hamuje uwalnianie
reniny z komórek przykłębuszkowych i jest sil¬
nym stymulatorem syntezy aldosteronu. Zmiany
te są przyczyną retencji sodu, wzrostu wolemii
i ciśnienia tętniczego.
U niektórych gatunków angiotensyna II ulega
przekształceniu do angiotensyny III, będącej
des-Asp^heptapeptydem, pobudzającym syntezę
aldosteronu równie silnie jak angiotensyna II (p.
ryc. 41-14). U człowieka stężenie angiotensyny II
w osoczu jest 4-krotnie wyższe niż angiotensyny
III, co sugeruje, że większość efektów biologicz¬
nych wywołuje oktapeptyd - angiotensyna II. Za¬
równo angiotensyna II, jak i angiotensyna III są
szybko rozkładane przez angiotensynazy.
Angiotensyna II wiąże się ze swoistym recep¬
torem komórek warstwy kłębkowatej nadnerczy.
Kompleks hormon-receptor nie aktywuje cyklazy
adenylanowej, co sugeruje, że cAMP nie pośred¬
niczy w działaniu hormonu na poziomie komór¬
kowym. Działanie angiotensyny II, polegające na
stymulacji konwersji cholesterolu do pregnenolo-
nu i kortykosteronu do 18-hydroksykortykoste-
ronu i aldosteronu, prawdopodobnie jest regulo¬
wane zmianą śródkomórkowego stężenia wapnia
i metabolitów fosfolipidowych, podobnie jak to
opisano w rozdz. 42.
Rodzina peptydów proopiomelanokortyny
(POMC) jest efektem złożonego procesu
przekształcania
Rodzina POMC składa się z peptydów działają¬
cych jako hormony (ACTH, LPH, MSH), neu-
roprzekaźniki lub neuromodulatory (endorfiny)
(ryc. 41-15). Prekursorem POMC jest cząsteczka
złożona z ok. 285 aminokwasów, ulegająca róż¬
nym procesom w różnych obszarach przysadki.
Ekspresja genu POMP odbywa się w przednim
i pośrednim płacie przysadki. Najbardziej stała
sekwencja u różnych gatunków znajduje się w N-
-końcowym fragmencie oraz w obszarze sekwen¬
cji ACTH i p-endorfin. Obecność POMC oraz
jego produktów wykryto również w kilku innych
tkankach kręgowców, np. w mózgu, łożysku,
przewodzie żołądkowo-jelitowym, przewodach
układu płciowego, płucach i limfocytach.
Proces przekształcania POMC w przednim pła¬
cie przysadki różni się od zachodzącego w płacie
pośrednim. Płat pośredni jest szczątkowy u do¬
rosłych ludzi, lecz jest aktywny u ludzkich pło¬
dów, kobiet ciężarnych w późnej fazie ciąży oraz
u wielu gatunków zwierząt. Proces przekształcania
POMC w tkankach obwodowych (w przewodzie
pokarmowym, łożysku, drogach płciowych m꿬
czyzn) jest podobny do występującego w płacie
pośrednim. Istnieją trzy główne grupy hormonów
pochodnych POMC. Pierwsza obejmuje ACTH,
z której może powstać a-MSH oraz peptyd kor-
tykotropinopodobny pośredniego płata przysadki
(CLIP). Druga grupa składa się z P-lipotropiny
(p-LPH), z której mogą powstać y-LPH, p-MSH
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 553
i (3-endorfiny, a z tych ostatnich - endorfiny a i y.
Do trzeciej grupy należy duży A-końcowy peptyd,
z którego powstaje y-MSH. Różnorodność produk¬
tów POMC wynika z występowania wielu ugru¬
powań, złożonych z dwóch aminokwasów zasado¬
wych, będących potencjalnymi miejscami działa¬
nia enzymów trypsynopodobnych. Przed każdym
z wymienionych peptydów znajdują się dipeptydy,
takie jak Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg lub Lys-Lys.
Po odszczepieniu segmentu prehormonalnego ko¬
lejne rozszczepienie następuje między segmentem
ACTH i P-LPH i to zarówno w płacie przednim, jak
i pośrednim przysadki mózgowej. W wyniku tego
przekształcenia powstaje na A-końcu fragment za¬
wierający ACTH oraz segment odpowiadający p-
-LPH (p. ryc. 41-15). Od fragmentu A-końco-
wego zostaje następnie odszczepiony segment
ACTHN39 i po tych przekształceniach POMC
w przednim płacie przysadki już nie zachodzą
żadne inne procesy rozszczepiające. W płacie
pośrednim ACTHN39 ulega dalszym przemianom,
w wyniku których powstaje a-MSH (zawierające
reszty aminokwasowe sekwencji 1-13) i CLIP
(złożony z sekwencji reszt aminokwasowych
18-39 ACTH). p-LPH ulega przekształceniu do y-
-LPH (złożony z sekwencji 42-101) i p-endorfiny
(złożona z sekwencji 104-134 P-LPH). p-MSH
(złożona z sekwencji 84-101) powstaje z y-LPH.
W poszczególnych tkankach wymienione pep-
tydy ulegają ponadto innym modyfikacjom, wpły¬
wającym na ich aktywność biologiczną. Modyfi¬
kacje te polegają na fosforylacji, acetylacji, gliko-
zylacji i amidacji produktów rozpadu POMC.
Mutacje receptora dla y-MSH są sprzężone
z wcześnie pojawiającą się i często występującą
postacią otyłości. Ta nieoczekiwana obserwacja
stała się przyczyną ponownego zainteresowania
się hormonami peptydowymi będącymi pochod¬
nymi POMC.
MIEJSCA MAGAZYNOWANIA
I WYDZIELANIE HORMONÓW
SA RÓŻNORODNE
Jak już wspomniano, hormony steroidowe
i 1,25(OH)2-D3 są syntetyzowane w swej ostatecz¬
nej postaci i w takiej też postaci są wydzielane.
Nie są one magazynowane w obrębie komórek,
w których powstają. Aminy katecholowe również
są syntetyzowane w postaci aktywnej, lecz są ma¬
gazynowane w ziamistościach komórek chromo-
chłonnych rdzenia nadnerczy. Do krwi są uwal¬
niane wg mechanizmu egzocytozy, w odpowiedzi
na określony bodziec nerwowy. W komórkach
chromochłonnych znajdują się zapasy katechola-
min wystarczające na pokrycie zapotrzebowania
ustroju na kilka godzin.
PTH jest również magazynowany w pęcherzy¬
kach magazynujących. Około 80-90% syntetyzo¬
wanego proPTH ulega rozpadowi, zanim dotrze do
ostatecznej struktury magazynującej, szczególnie
wtedy, kiedy stężenie Ca2+ w komórkach przytar-
czyc jest wysokie (patrz wyżej). Uwalnianie PTH
do krwi następuje wówczas, gdy stężenie Ca2+
w komórkach przytarczyc jest małe. Zapasy PTH
POMC (1-134)
ACTH (1-39)
p-LPH (42-134)
Ryc. 41‘15. Produkty rozpadu
proopiomelanokortyny (POMC),
MSH - hormon pobudzający
melanocyty, CLIP - peptyd kor-
tykotropinopodobny pośredniego
piata przysadki mózgowej, LPH
- lipotropina.
a-MSH
(1-13)
p-Endorfina
(104-134)
P-MSH
(84-101)
y-Endorfina
(104-118)
a-Endorfina
(104-117)
554 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
w przytarczycach wystarczają na pokrycie zapo¬
trzebowania na ten hormon przez kilka godzin.
Ludzka trzustka wydziela dziennie 40-50 jed¬
nostek insuliny, co stanowi 15-20% zapasów tego
hormonu w komórkach B trzustki, w stanach fizjo¬
logicznych. Insulina i peptyd C są wydzielane do
krwi w ilościach równoważnych (p. ryc. 41-12).
Bodźce, takie jak glukoza, pobudzają wydziela¬
nie insuliny, nasilając przekształcenie proinsuliny
w insulinę. Jest to istotna odpowiedź sekrecji in¬
suliny na bodziec wydzielniczy.
Tabela 41-5. Różnice między hormonami pod względem ich ma¬
gazynowania
Hormon
Ilość hormonu magazynowego
(zapasów)
Hormony steroidowe
i1,25(0H),-Da
Brak zapasów
Katecholaminy i PTH
Zapasy wystarczające na kilka godzin
Insulina
Zapasy wystarczające na kilka dni
VT4
Zapasy wystarczające na kilka tygodni
W koloidzie pęcherzyków tarczycowych znaj¬
dują się kilkutygodniowe zapasy T3 i T4 związane
z tyreoglobuliną. Hormony te mogą być uwalniane
pod wpływem TSH. Jest to przykład niezwykłego
prohormonu, który składa się z ok. 5000 amino¬
kwasów i musi być najpierw zsyntetyzowany, by
następnie, ulegając biodegradacji, mógł dostar¬
czyć zaledwie kilka cząsteczek aktywnych hormo¬
nów, tj. T3 i T4. W tabeli 41-5 zestawiono różnice
między hormonami pod względem ich magazyno¬
wania w narządach, w których powstają.
NIEKTÓRE HORMONY SA PRZENOSZONE
W OSOCZU ZA POŚREDNICTWEM
BIAŁEK TRANSPORTUJĄCYCH
Hormony klasy I są hydrofobowe, a zatem są
słabo rozpuszczalne w osoczu. Należą do nich
m.in. hormony steroidowe i hormony tarczycy.
Mają one w osoczu swoiste białka transportują¬
ce, spełniające kilka funkcji. Po pierwsze, dzięki
tym białkom rozwiązany jest problem nierozpusz-
czalności niektórych hormonów w osoczu, gdyż
na ich pośrednictwem hormony mogą dotrzeć do
komórek docelowych. Po drugie, białka te utrzy¬
mują we krwi pewną rezerwę hormonalną, która
w przypadku na przykład hormonów tarczycy
może być nawet dość znaczna. Hormony związa¬
ne przez białka transportujące nie podlegają prze¬
mianie, dlatego wydłuża się ich osoczowy okres
półtrwania (/1/2). Powinowactwo hormonu do jego
białka transportującego określa iloraz stężenia
hormonu związanego i stężania hormonu wol¬
nego (niezwiązanego). Jest to ważna wielkość,
bowiem tylko hormon wolny, niezwiązany z biał¬
kiem transportującym, jest biologicznie aktywny.
Najczęściej stężenie wolnego hormonu w osoczu
jest bardzo małe, gdyż wynosi od 10 15 do 10 9
mol/L. Należy pamiętać, aby odróżniać białka
transportujące od receptorów hormonalnych, bo¬
wiem obydwa białka wiążą się z hormonem, choć
wykazują bardzo różne cechy (tab. 41-6).
Tabela 41-6. Porównanie receptorów z białkami transportującymi
Cecha
Receptory
Białka transportujące
Stężenie
Bardzo małe (tysiące
receptorów na jedną
komórkę)
Bardzo duże (miliardy
cząsteczek na pL)
Powinowactwo
Duże
(pmol/L do nmol/L)
Matę
(Umol/L)
Swoistość
wiązania
Bardzo duża
Mała
Wysycalność
Występuje
Nie występuje
Odwracalność
wiązania
Występuje
Występuje
Transdukcja
sygnału
Występuje
Nie występuje
Hormony hydrofilowe, należące najczęściej do
klasy II hormonów i wykazujące strukturę pepty-
dową, są rozpuszczalne w osoczu i nie wymagają
białek transportujących. Hormony, takie jak in¬
sulina, hormon wzrostu, ACTH i TSH, krążą we
krwi w postaci wolnej (niezwiązane z białkami
transportującymi), biologicznie aktywnej i wy¬
kazują bardzo krótki osoczowy okres półtrwania.
Wyjątkiem od tej reguły jest IGF-1, który jest
transportowany przez białka należące do jednej
rodziny białek wiążących (m.in. hormony).
Hormony tarczycy sa transportowane
przez globulinę wiążącą te hormony
Omawiany mechanizm transportu hormonów
można scharakteryzować na przykładzie białek
41. RÓŻNORODNOŚĆ MORFOLOGICZNA I CZYNNOŚCIOWA UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO 555
wiążących hormony tarczycy. Więcej niż poło¬
wa, do 2/3, ogólnoustrojowego T4 i T3 znajduje
się poza tarczycą. Większość tych hormonów
jest związanych przez swoiste białko wiążące
- globulinę wiążącą tyroksynę (TBG, ang. thy-
roxine binding globulin). TBG, będąca glikopro-
teiną o masie cząsteczkowej 50 kDa, wykazuje
zdolność wiązania tych hormonów równą 20 pg
na 100 mL osocza. W warunkach prawidłowych
TBG wiąże niekowalencyjnie prawie całą ilość T4
i T3 występującą w osoczu, przy czym wykazuje
większe powinowactwo do T4 niż do T3 (tab. 41-7).
Tabela 41-7. Charakterystyka T4 i T3 występujących w osoczu
krwi
Całkowite
Stężenie wolnego hormonu
(niezwiązanego z biatkiem)
Okres
półtrwa¬
nia we
krwi,
dni
stężenie
hormonu
nmol/L (jug/dL)
udział
w stężeniu
całkowitym
ng/dL
mol/L
%
t4
103 (8)
0,03
2,24
3,0-10-11
6,5
T,
2,29 (0,15)
0,3
0,4
0,6-10-11
1,5
Okres półtrwania T4 w osoczu jest 4-krotnie dłuż¬
szy niż T3. Aktywność biologiczna zależy od stę¬
żenia wolnej (niezwiązanej z białkiem transpor¬
tującym) frakcji tych hormonów. Tak więc, mimo
znacznych różnic w stężeniach całkowitych stę¬
żenie wolnej frakcji T3 jest zbliżone do stężenia
wolnej frakcji T4. Jeżeli jeszcze dodać, że T3 jest
biologicznie bardziej aktywna niż T4, staje się
oczywiste, że większość efektów biologicznych
hormonów tarczycowych przypisuje się T3. TBG
nie wiąże żadnych innych hormonów.
Glukokortykoidy sa transportowane przez
globulinę więżącą kortykosteroidy
Hydrokortyzon (kortyzol) krąży we krwi w po¬
staci związanej z białkiem i wolnej. Głównym
białkiem osocza wiążącym ten hormon jest a-
-globulina, zwana transkortyną lub globuliną
wiążącą kortykosteroidy (CBG, ang. cortico-
steroid binding globulin). CBG jest syntetyzowa¬
na w wątrobie, podobnie jak globulina wiążąca
hormony tarczycy (TBG). Syntezę CBG, tak jak
TBG, nasilają estrogeny. CBG wiąże większość
kortyzolu osocza, jeśli stężenie tego hormonu
mieści się w granicach normy. Znacznie mniejsze
ilości kortyzolu są związane z albuminami. Róż¬
nice w powinowactwie hormonów do białek po¬
zwalają określić okres biologicznego półtrwania
różnych glukokortykoidów. Kortyzol wiąże się
mocno z CBG, jego okres półtrwania wynosi 1,5-
-2 godz. Kortykosteron wiąże się słabiej z CBG,
przez co jego okres półtrwania wynosi mniej niż
1 godz. (tab. 41-8). Stężenie kortyzolu niezwią-
zanego, a więc wolnego, stanowi ok. 8% stężenia
kortyzolu całkowitego w osoczu krwi. Kortyzol
niezwiązany stanowi biologicznie aktywną frak¬
cję tego hormonu. Wiązanie z CBG bynajmniej
nie jest ograniczone do glukokortykoidów. I tak,
deoksykortykosteron i progesteron wykazują wy¬
starczające powinowactwo do CBG, by konkuro¬
wać z kortyzolem o miejsce wiążące. Aldosteron,
najsilniejszy naturalny mineralokortykoid, nie
ma swoistych białek transportujących w osoczu.
Steroidy gonadalne wykazują bardzo słabą wią-
zalność z CBG (p. tab. 41-8).
Tabela 41-8. Przybliżone powinowactwo steroidów do białek
wiążących surowicy
Steroid
SHBG1
CBG1
Dihydrotestosteron
1
> 100
Testosteron
2
> 100
Estradiol
5
> 10
Estron
> 10
> 100
Progesteron
>100
-2
Kortyzol
> 100
-3
Kortykosteron
>100
-5
1 Powinowactwo wyrażone jako wartość Kó (nmol/L)
Steroidy gonadalne sa transportowane
przez globulinę więżąca hormony
płciowe
U większości ssaków, w tym i u człowieka,
w osoczu krwi występuje P-globulina wiążąca
testosteron, odznaczająca się swoistością, wyso¬
kim powinowactwem i ograniczoną pojemnością
(p. tab. 41-8). Białko to, zwykle określane jako
globulina wiążąca hormony płciowe (SHBG,
ang. sex-hormone-binding globulin) lub globu¬
lina wiążąca testosteron i estrogeny (TEBG,
ang. testosterone-estrogen-binding globulin),
jest wytwarzane w wątrobie. Jego synteza nasila
się pod wpływem estrogenów (u kobiet stężę-
556 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
nie SHBG w surowicy krwi jest 2-krotnie wyż¬
sze niż u mężczyzn) oraz u chorych na niektóre
schorzenia wątroby lub z nadczynnością tarczy¬
cy, natomiast ulega osłabieniu pod wpływem
androgenów, w miarę starzenia się organizmu
oraz w niedoczynności tarczycy. Wiele z wymie¬
nionych czynników wpływa również na wytwa¬
rzanie CBG i TBG. Ponieważ SHBG i albuminy
wiążą 97-99% krążącego we krwi testosteronu,
tylko niewielka frakcja tego hormonu występu¬
je w surowicy w postaci wolnej (biologicznie
aktywnej). Główna funkcja SHBG wydaje się
polegać na zmniejszaniu stężenia wolnego testo¬
steronu w surowicy krwi. Testosteron wykazuje
większe powinowactwo do SHBG niż estradiol
(p. tab. 41-8). Dlatego też zmiana stężenia SHBG
powoduje większe zmiany stężenia wolnego te¬
stosteronu niż wolnego estradiolu.
Estrogeny wiążą się z SHBG, progestyny zaś
z CBG. Estradiol wiąże się z SHBG 5-krotnie sła¬
biej niż testosteron lub DHT. W odróżnieniu od
wymienionych steroidów, progesteron i kortyzol
wykazują małe powinowactwo do tego białka
transportującego (p. tab. 41-8). Progesteron i kor¬
tyzol wykazują prawie takie samo powinowactwo
do CBG. Z kolei globulina wiążąca kortykoidy
(CBG) wykazuje małe powinowactwo do estra¬
diolu i jeszcze mniejsze do testosteronu, DHT lub
estronu.
Białka transportujące spełniają funkcję krążą¬
cego „rezerwuaru” dla wymienionych hormonów.
Ponieważ wykazują one dość dużą pojemność
wiązania, stanowią zapewne rodzaj buforu chro¬
niącego ustrój przed nagłymi zmianami stężenia
hormonów w osoczu krwi. Wielkość klirensu
metabolicznego wymienionych steroidów jest od¬
wrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa do
SHBG, zatem „klirensowanie” estronu jest szyb¬
sze niż estradiolu i „klirensowanie” estradiolu jest
szybsze niż testosteronu i DHT.
STRESZCZENIE
• Obecność swoistego receptora określa komórki
docelowe dla danego hormonu.
• Receptory są białkami wiążącymi swoiste
hormony i wyzwalają sygnał śródkomórkowy
(sprzężenie receptorowo-efektorowe).
• Niektóre hormony mają receptory śródkomór-
kowe (umiejscowione w obrębie komórki), inne
zaś wiążą się z receptorami zlokalizowanymi
w błonie plazmatycznej.
• Hormony są syntetyzowane z różnych cząste¬
czek prekursorowych, w tym z cholesterolu
i tyrozyny, oraz z aminokwasów wchodzących
w skład hormonów peptydowych i białkowych.
• Liczne procesy modyfikujące zmieniają aktyw¬
ność hormonów. Na przykład wiele hormonów
jest syntetyzowanych z większych cząsteczek
prekursorowych.
• Obecność kompletu enzymów w obrębie okre¬
ślonego typu komórki umożliwia syntezę swoi¬
stej klasy hormonów steroidowych.
• Większość hormonów rozpuszczalnych w tłusz¬
czach jest wiązanych przez dość swoiste białka
transportujące osocza.
PIŚMIENNICTWO
Bartalina L: Thyroid hormone-binding proteins: update
1994. Endocr Rev 1994; 13:140.
Beato M et al: Steroid hormone receptors: many actors
in search of a plot. Celi 1995;83:851.
Dai G, Carrasco L, Carrasco N: Cloning and characte-
rization of the thyroid iodide transporter. Naturę
1996;379:458.
DeLuca HR: The vitamin D story: a collaborative effort
of basie science and clinical medicine. FASEB J
1988;2:224.
Douglass J, Civelli O, Herbert E: Polyprotein gene ex-
pression: Generation of diversity of neuroendocrine
peptides. Annu Rev Biochem 1984;53:665.
Farooąi IS, 0’Rahilly S: Monogenic obesity in humans.
Ann Rev Med 2005;56:443.
Miller WL: Molecular biology of steroid hormone bio-
synthesis. Endocr Rev 1988; 9:295.
Nagatsu T: Genes for human catecholamine-synthesi-
zing enzymes. Neurosci Res 1991; 12:315.
Russell DW, Wilson JD: Steroid 5 alpha-reductase: two
genes/two enzymes. Annu Rev Biochem 1994;
63:25.
Russell J et al: Interaction between calcium and 1,25-
dihydroxy-vitamin D3 in the regulation of pre-
proparathyroid hormone and vitamin D receptor
mRNA in avian parathyroids. Endocrinology 1993;
132:2639.
Steiner DF et al: The new enzymology of precursor
Processing endoproteases. J Biol Chem 1992;
267:23435.
Działanie hormonów
i transdukcja sygnałów
DarylK. Granner, MD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Adaptacje homeostatyczne zachodzące w ustroju
jako reakcja na stale zmieniające się środowisko
w większości przypadków polegają na zmianach
ilości białek i ich aktywności. Hormony nale¬
żą do związków ułatwiających przebieg takich
zmian. Oddziaływanie hormonu z receptorem
wyzwala śródkomórkowy sygnał, który może
regulować aktywność określonego zespołu ge¬
nów, w wyniku czego następuje zmiana ilości
niektórych białek w komórce docelowej, albo też
wpływa na aktywność swoistych białek, spośród
których należy wymienić enzymy, białka trans¬
portujące lub białka kanałów błon komórko¬
wych. Sygnał może wpływać na przemieszcza¬
nie się białek w obrębie komórki lub na przebieg
takich procesów, jak synteza białek, wzrost ko¬
mórek, względna replikacja komórek, zapewne
poprzez oddziaływanie na ekspresję genów. Inne
cząsteczki sygnałowe, w tym cytokiny, interleu-
kiny, czynniki wzrostowe i metabolity działają
za pośrednictwem podobnych szlaków sygnali¬
zacyjnych. Nadmierna lub niedostateczna pro¬
dukcja hormonów lub cząsteczek regulacyjnych
albo nieodpowiednia synteza ich w stosunku do
aktualnego zapotrzebowania mogą być główną
przyczyną choroby. Zadaniem wielu substancji
farmakoterapeutycznych jest korygowanie nie¬
prawidłowo działających szlaków sygnalizacyj¬
nych. Zostały one dokładniej omówione w dal¬
szej części niniejszego rozdziału.
(^^Hormony grupy7^^)
Hormony grupy II
Rozpoznanie bodźca
Uwalnianie hormonów
Kompleks hormon-receptor Wiele różnych sygnałów Wytwarzanie sygnałów
SKOORDYNOWANA ODPOWIEDŹ NA BODZIEC
Ryc. 42-1. Udział hormonów w odpowiedzi na działanie bodźca. Bodziec oddziałujący na integralność ustroju wyzwala reakcję,
obejmującą m.in. uwalnianie co najmniej jednego hormonu. Hormony te wyzwalają sygnały na poziomie błon komórkowych lub
w obrębie komórek docelowych. Z kolei sygnały regulują różne procesy biologiczne, które razem stanowią koordynowaną odpowiedź
na bodziec lub stres. Porównaj ryc. 42-8 przedstawiającą przykład szlaku sygnalizacyjnego.
558 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
HORMONY PRZENOSZĄ SYGNAŁY
WPŁYWAJĄCE NA MECHANIZMY
HOMEOSTATYCZNE
Zasadnicze etapy koordynowanej reakcji na dany
bodziec przedstawiono na ryc. 42-1. Bodziec
może być wyzwaniem lub zagrożeniem dla całego
ustroju, dla określonego narządu lub dla integral¬
ności pojedynczej komórki ustroju. Rozpoznanie
bodźca stanowi pierwszy etap odpowiedzi adap¬
tacyjnej. Biorąc pod uwagę cały ustrój, w etapie
tym uczestniczy zwykle układ nerwowy oraz
poszczególne organy zmysłowe (wzrok, słuch,
zakończenia bólowe, smak, dotyk). Na poziomie
narządów lub komórek w proces rozpoznania
zaangażowane są czynniki fizykochemiczne, ta¬
kie jak pH, p02, temperatura, podaż substancji
odżywczych, metabolity toksyczne i molalność
(osmolalność). Jeśli rozpoznanie rodzaju bodźca
jest prawidłowe, następuje uwolnienie jednego
lub kilku hormonów, które będą dominowały
w regulacji odpowiedzi adaptacyjnej. Dla celów
dydaktycznych hormony podzielono na grupy,
które omówiono w rozdz. 41. Kryterium klasy¬
fikacji była lokalizacja w komórce swoistego
receptora oraz rodzaj sygnału wywołanego po
połączeniu się hormonu z receptorem. Hormo¬
ny grupy I wiążą się z receptorami śródkomór-
kowymi, a hormony grupy II - z receptorami
znajdującymi się w zewnętrznej warstwie błony
komórkowej komórek docelowych. Do grupy II
należą również cytokiny, interleukiny i czynniki
wzrostowe. Te ostatnie odgrywają kluczową rolę
w procesach adaptacyjnych związanych z ho¬
meostazą i są w pewnym sensie hormonami wy¬
twarzanymi przez swoiste komórki, gdyż wiążąc
się z receptorami błony plazmatycznej komórki,
aktywują szlaki sygnalizacyjne takie same jak
klasyczne hormony grupy II oraz wykazują dzia¬
łanie autokrynne, parakrynne i endokrynne.
Ryc. 42-2. Regulacja ekspresji przez hormony klasy I. Hormony steroidowe łatwo docie¬
rają do przestrzeni cytoplazmatycznej komórek docelowych. Hormony glukokortykoidowe
(czarne trójkąty) stykają się w cytoplazmie ze swoimi receptorami, które tam występują pod
postacią kompleksu zawierającego białko szoku termicznego 90 (hsp). Połączenie się ligandu
(hormonu) z tym kompleksem jest przyczyną odłączenia się hsp i wystąpienia zmiany kon-
formacyjnej receptora. Z kolei kompleks ligand-receptor przenika przez błonę jądrową i wiąże
się z DNA elementu odpowiedzi na glukokortykoidy (GRE), wykazującego dużą swoistość
i duże powinnowactwo. To z kolei uruchamia wiele koregulatorów transkrypcyjnych (trójkąty
ze znakiem + w ich obrębie), po czym rozpoczyna się wzmożony proces transkrypcyjny.
W odróżnieniu od glukokortykoidów, hormony tarczycy i kwas retinolowy (oznaczone czar¬
nymi kółkami) wnikają bezpośrednio do jądra komórkowego, gdzie ich swoisty receptor jest
już związany z odpowiednim elementem odpowiedzi hormonalnej pod postacią kompleksu
z represorem transkrypcyjnym (represory oznaczone ©). Kompleks ten, składający się
z takich cząsteczek, jak N-CoR lub SMRT (p. tab. 42-6), pozbawiony ligandu (hormonu),
aktywnie hamuje proces transkrypcji. Związanie ligandu powoduje odłączenie się tego repre-
sora od receptora, umożliwiając powstawanie kompleksu aktywującego transkrypcję genu.
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 559
WYTWARZANIE SYGNAŁÓW
Kompleks ligand-receptor jest sygnałem
dla hormonów grupy I
Lipofilowe cząsteczki hormonów grupy I przeni¬
kają przez błony plazmatyczne wszystkich komó¬
rek, lecz wiążą się tylko ze swoistymi receptorami
śródkomórkowymi o wysokim powinowactwie,
znajdującymi się w komórkach docelowych. Re¬
ceptory te mogą być umiejscowione w cytopla-
zmie lub jądrze komórek docelowych. Kompleks
hormon-receptor ulega najpierw aktywacji. Jak
widać na ryc. 42-2, aktywacja receptora może się
odbywać wg przynajmniej dwóch mechanizmów.
Na przykład glukokortykoidy dyfundują przez
błonę plazmatyczną i łączą się ze swoim recep¬
torem w cytoplazmie komórki docelowej. Po po¬
łączeniu się ligandu z receptorem odłącza się od
tego receptora białko szoku termicznego 90 (hsp
90). Ten etap jest niezbędny, aby receptor gluko-
kortykoidowy ulokował się w jądrze komórko¬
wym. Receptor ten zawiera poza tym sekwencje
wspomagające jego translokację z cytoplazmy
do jądra. Zaktywowany receptor wnika do jądra
i wiąże się ze swoistą sekwencją DNA, wykazują¬
cą duże powinowactwo (p. ryc. 42-2). Ten swoisty
fragment DNA jest określany jako element (lub
sekwencja) odpowiedzi hormonalnej (HRE,
ang. hormone response element). W omawianym
przykładzie chodzi o element odpowiedzi na glu¬
kokortykoidy (ang. glucocorticoid response ele¬
ment, GRE). W tabeli 42-1 zestawiono sekwencje
konsensusowe dla HRE niektórych hormonów.
Związany z DNA kompleks ligand-receptor sta¬
nowi miejsce wysokiego powinowactwa dla jed¬
nego lub kilku białek, zwanych koaktywatorami
przyspieszającymi transkrypcję odpowiednich
genów. W odróżnieniu od glukokortykoidów, nie¬
które hormony (np. hormony tarczycy i retinoidy)
dy fundują z płynu pozakomórkowego przez błonę
plazmatyczną bezpośrednio do jądra komórkowe¬
go. W tych przypadkach odpowiedni receptor jest
już przyłączony do odpowiedniego HRE (np. do
elementu odpowiedzi na hormon tarczycy - TRE,
ang. thyroid response element). Receptor związa¬
ny z DNA nie wykazuje jednak zdolności aktywo¬
wania transkrypcji, ponieważ znajduje się w kom¬
pleksie zawierającym korepresor. W rzeczywisto¬
ści kompleks receptor-korepresor stanowi aktyw¬
ny represor transkrypcji genu; połączenie ligandu
(hormonu) z takim receptorem powoduje odłącze¬
nie się korepresora (lub korepresorów). Dopiero
teraz receptor połączony z ligandem (hormonem)
jest zdolny do wiązania się z jednym lub wieloma
koaktywatorami o dużym powinowactwie, powo¬
dując aktywację transkrypcji genów. Porównanie
receptorów hormonalnych z innymi receptorami
jądrowymi i ich stosunek do koregulatorów jest
przedmiotem bardziej szczegółowej charaktery¬
styki w dalszej części rozdziału.
Dzięki selektywnej transkrypcji genów i syntezie
odpowiednich docelowych mRNA, ulegają zmia¬
nie ilość swoistych białek i procesy metaboliczne.
Tabela 42-1. Sekwencje DNA dla kilku HRE
Hormon/Efektor
HRE
Sekwencja DNA*
Glukokortykoidy
GRE
Progestyny
PRE
GGTACA nnn GTTCT
Mineralokortykoidy
MRE
<— —>
Androgeny
ARE
Estrogeny
ERE
AGGTCA TGA/TCCT
Hormony tarczycy
TRE
AGGTCA N3,4,5 AGGTCA
Kwas retinolowy
RARE
<— —>
Witamina D
VDRE
cAMP
CRE
TGACGTCA
* Litery oznaczają trifosforany nukleotydów. N oznacza, że w tym
położeniu może występować którykolwiek z czterech nukleoty¬
dów. Strzałki skierowane w przeciwnych kierunkach wskazują na
występowanie nieco niedoskonałej, odwróconej sekwencji palin-
dromowej w wielu HRE; w niektórych przypadkach te ostatnie
określa się jako „sekwencję połowicznie wiążącą” (ang. haft-bin-
ding sites), ponieważ każdy z nukleotydów wiąże jeden monomer
receptora. GRE, PRE, MRE i ARE wykazują taką samą sekwencję
zasad w nici DNA. Swoistość może być uwarunkowana śród-
komórkowym stężeniem ligandu lub receptora hormonalnego,
sekwencją DNA flankującą albo też innymi czynnikami. Druga
grupa HRE odnosi się do hormonów tarczycy, kwasu retinolowe-
go estrogenów i witaminy D. Te HRE są podobne do siebie; różnią
się orientacją i przestrzennym oddaleniem od siebie połówek pa-
lindromowych. Ta ostatnia cecha określa swoistość hormonalną.
VDRE (N = 3), TRE (N = 4) i RARE (N = 5) wiążą się raczej
z bezpośrednimi niż odwróconymi sekwencjami powtarzającymi
się (repeats). Należący do nadrodziny receptorów steroidowych
receptor retinolowy X (RXR) tworzy heterodimery z VDR, TR
i RARE i te stanowią tzw. czynniki działające trans. cAMP wpływa
na transkrypcję genów poprzez CRE.
560 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Wpływ każdego z hormonów jest bardzo swoisty.
Ogólnie można przyjąć, że hormony oddziałują na
mniej niż 1% genów, mRNA lub białek w komórce
docelowej, a czasami tylko kilka z nich ulega zmia¬
nie. Dość dobrze poznano działanie hormonów
steroidowych, hormonów tarczycy i retinoidów na
poziomie jądra komórkowego. Większość danych
sugeruje, że hormony oddziałują głównie na proces
transkrypcji, chociaż wiele z nich (również hormo¬
ny pozostałych grup omawianych w dalszej części
rozdziału) mogą działać na każdy z etapów „szlaku
informacyjnego”, przedstawionego na ryc. 42-3.
Opisano również możliwość bezpośredniego dzia¬
łania różnych steroidów w cytoplazmie i wpływ
tych hormonów na różne organelle subkomórkowe
oraz błony komórkowe.
‘"‘A
Degradacja
Degradacja
Aktywny
degradacja
Degradacja
nieaktywny
Ryc. 42-3. „Szlak informacyjny”. Sygnał informacyjny biegnie od
genu, pierwotnego transkryptu i mRNA do białka. Hormony mogą
oddziaływać na każdy z etapów szlaku informacyjnego i wpływać
na szybkość procesu, degradując lub modyfikując różne produkty.
nia) i zapoczątkowują aktywację szlaku informa¬
cyjnego, wiążąc się z receptorem zlokalizowanym
w błonie komórkowej (p. tab. 41-3 i 41-4). Me¬
chanizm działania tych hormonów można najle¬
piej opisać, charakteryzując generowany przez
nich śródkomórkowy sygnał. Sygnały te obej¬
mują m.in.:
• cAMP (cykliczny 3 ',5 '-adenozynomonofosforan
(p. ryc. 19-5), będący nukleotydem powstającym
z ATP pod wpływem cyklazy adenylanowej,
• cGMP, będący nukleotydem powstałym w wy¬
niku działania cyklazy guanyłanowej,
• Ca2+,
• fosfatydyloinozytydy.
Wiele z wymienionych przekaźników drugorzę-
dowych wpływa na transkrypcję genów w sposób
wyżej opisany. Oddziałują one jednak również na
wiele innych procesów biologicznych, pokaza¬
nych na ryc. 42-1.
Receptory sprzężone z białkami G
Wiele hormonów grupy II wiąże się z recepto¬
rami sprzęgającymi się ze swoimi efektorami za
pośrednictwem białek wiążących GTP. Zwykle
receptory te zawierają 7 hydrofobowych domen
spinających błonę komórkową. Pokazano to
na ryc. 42-4, gdzie 7 połączonych ze sobą „cy¬
lindrów” przenika przez dwuwarstwę lipidową
błony komórkowej. Receptory tej klasy, które
przekazują sygnał za pośrednictwem białek wią¬
żących nukleotydy guaninowe, są określane jako
receptory sprzężone z białkami G (ang. G pro¬
tein coupled receptors, GPCR). Dotychczas sklo-
nowano u różnych gatunków ssaków ponad 130
genów dla receptorów sprzężonych z białkami G.
Te ostatnie pośredniczą w wielu różnorodnych
reakcjach odpowiedzi hormonalnej.
HORMONY GRUPY II (PEPTYDOWE
IKATECHOLAMINY) ZAWIERAJĄ
RECEPTORY BŁONOWE
IŚRÓDKOMĆRKOWE SUBSTANCJE
PRZEKAŹNIKOWE
Wiele hormonów jest rozpuszczalnych w wodzie.
Nie mają one białek transportujących w osoczu
(dlatego odznaczają się krótkim okresem półtrwa-
cAMP jest śródkomórkowym sygnałem
dla wielu odpowiedzi hormonalnych
cAMP był pierwszym śródkomórkowym sygna¬
łem, jaki wykryto w komórkach ssaków. Genera¬
cja, degradacja i działanie cAMP obejmuje kilka
etapów.
A. Cyklaza adenylanowa
Różne hormony peptydowe mogą albo pobudzać
(s), albo hamować (i) produkcję cAMP w obec-
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 561
Brak hormonu: efektor nieaktywny Hormon związany (H): efektor aktywny
Ryc. 42-4. Składowe układu receptor hormonalny-białko G. Receptory sprzężone z efektorami za pośrednictwem białek G zawierają
zwykle siedem domen spinających błonę plazmatyczną. W przypadku braku hormonu (strona lewa) heterotrimer kompleksu białkowego
G (a p y) występuje w postaci nieaktywnej, tj. związanej z guanozynodifosforanem (GDP) i prawdopodobnie nie jest związany z recepto¬
rami. Kompleks ten jest zakotwiczony w błonie plazmatycznej za pośrednictwem prenylowanych grup podjednostki Py (linia falowana)
oraz prawdopodobnie myristoilowanych grup do podjednostek a. W chwili wiązania się hormonu (H) z receptorem prawdopodobnie
następuje zmiana konformacji receptora (nachylenie domen spinających) i aktywacja kompleksu białkowego G. Wynika to z wymiany
GDP na GTP na podjednostce a, po której podjednostka a odłącza się od kompleksu Py. Uwolniona podjednostka wiąże się z efektorem
(E) i go aktywuje. Efektorem może być cyklaza adenylanowa (a), kanały Ca2+, Na+ lub Cl" (as), kanał K+ (aj), fosfolipaza cp (aq) lub
cGMP fosfodiesteraza. Cząsteczka py może również działać bezpośrednio na efektor. (Rycina reprodukowana za zgodą Granner DK W:
Principles andpractice of endocrinology and metabolism, wyd. 2, red. Beker K.L., Lippincott, 1995).
ności cyklazy adenylanowej. Ta ostatnia jest ko¬
dowana przez co najmniej 9 różnych genów (tab.
42-2). Dwa równoległe układy, jeden pobudzają¬
cy (s) i jeden hamujący (i), są umiejscowione na
pojedynczej cząsteczce katalitycznej (C). Każdy
z nich składa się z receptora Rs lub oraz z kom¬
pleksu regulatorowego Gs i Gj. Białka regulatoro¬
we Gs i G, sątrimerami złożonymi z podjednostek
a, P i y. Ponieważ podjednostka a występująca
w Gs różni się od tej występującej w Gi5 oznaczo¬
no je odpowiednio jako as i aj. Są one kodowane
przez różne geny. Podjednostki y wiążą nukleo-
tydy guaninowe. Podjednostki p i y zawsze są ze
sobą połączone (Py) i prawdopodobnie działają
jako heterodimery. Połączenie się hormonu z Rs
lub Rj aktywuje białko G, co wyraża się wymianą
GDP przez GTP na podjednostce a oraz odszcze-
pieniem podjednostek Py od podjednostki a.
Podjednostka a ma wewnętrzną aktywność
GTP-azową. Jej aktywna postać a • GTP ulega
inaktywacji wskutek hydrolizy GTP do GDP;
trimeryczna postać kompleksu Gs (aPy) zostaje
następnie odtworzona i jest gotowa do rozpo¬
częcia nowego cyklu aktywacji. Toksyny chole¬
ry i krztuśca powodują ADP-rybozylację odpo¬
wiednio podjednostki as i aj_2, w wyniku czego
następuje inaktywacja GTP-azy, a podjednostka
as zachowuje swoją postać aktywną (tab. 42-3).
W przypadku podjednostki as modyfikacja ta nisz¬
czy wewnętrzną aktywność GTP-azową, przez co
podjednostka as nie może się ponownie połączyć
z Py i jest nieustannie aktywowana. ADP-rybozy-
lacja podjednostki aj.2 zapobiega odszczepieniu
Tabela 42-2. Podgrupy hormonów grupy HA
Hormony pobudzające
Hormony hamujące
cyklazę adenylanową (Hs)
cyklazę adenylanową (H{)
• ACTH
• Acetylocholina
• ADH (AVP)
• Substancje a2-adrenergiczne
• Substancje p2-adrenergiczne
• Angiotensyna II
• Kalcytonina
• Kortykoliberyna (CRH)
• FSH
• Glukagon
• hCG (ludzka gonadotropina
kosmówkowa)
• LH
• LPH
• MSW
• PTH
• TSH
• Somatostatyna
562 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
a{_2 od Py, w wyniku czego nie może powstać wol¬
na podjednostka a{,2. A zatem hamowana aktyw¬
ność podjednostki as w takich komórkach nie jest
hamowana.
Dzisiaj wiadomo, że istnieje duża rodzina bia¬
łek G i że stanowią one część nadrodziny GTP-az.
Uwzględniając homologię sekwencji reszt ami-
nokwasowych, rodzinę białek G można podzielić
na cztery podrodziny, przedstawione w tab. 42-3.
Zidentyfikowano geny dla 21 podjednostek a, 5
podjednostek P i 8 podjednostek y. Możliwość
różnych kombinacji ww. podjednostek powoduje
istnienie dużej liczby kompleksów apy i cyklaz.
Podjednostki a i kompleksy Py wykazują dzia¬
łania niezależne od tych na cyklazę adenylanową
(p. ryc. 42-2 i tab. 42-3). Niektóre postacie pod¬
jednostki cii pobudzają kanały K+, natomiast ha¬
mują kanały Ca2+, podczas gdy cząsteczki as wy¬
kazują działanie przeciwne. Białka należące do
rodziny Gq aktywują enzymy grupy C fosfolipazy.
Kompleksy Py uczestniczą w stymulacji kanałów
potasowych i aktywacji fosfolipazy C. Ponadto
białka G biorą udział w wielu ważnych proce¬
sach biologicznych, niezależnie od ich działania
endokrynnego. Godnym uwagi przykładem jest
ich udział w funkcjonowaniu narządu powonie¬
nia (yolf) i wzroku (cii). Niektóre przykłady z tej
dziedziny zawarto w tab. 42-3. GPCR uczestni¬
czą w patogenezie wielu chorób i są docelowymi
obiektami leków.
B. Kinaza białek
W komórkach prokariotycznych cAMP wiąże się
ze swoistym białkiem, określanym jako katabo-
liczne białko regulatorowe (CRP, ang. catabolite
regulatory protein). Białko to wiąże się bezpo¬
średnio z DNA i wpływa na ekspresję genów.
W komórkach eukariotycznych cAMP wiąże się
z kinazą białek A (PKA), będącą cząsteczką he-
terotetrameryczną, złożoną z dwóch podjednostek
regulatorowych (R) i dwóch podjednostek katali¬
tycznych (C).
Tabela 42-3. Klasy i funkcje wybranych białek G12
Klasa lub typ
Bodziec
Elektor
Skutek działania
Gs
ai
Glukagon,
T Cyklaza adenylanowa
Glukoneogeneza, lipoliza
p-Adrenergiki
T Kanały Ca2+, Ch, Na+
Glikogenoliza
a*
Odorant
T Cyklaza adenylanowa
Powonienie
Gi
^1-1.2,3
Acetylocholina
i Cyklaza adenylanowa
Zwolnienie akcji serca
a2-Adrenergiki
T Kanały K+
M2-Cholinergiki
i Kanały Ca2+
a0
Opioidy, endorfiny
t Kanały K+
Aktywność elektryczna neuronów
Ot
Światło
t cGMR fosfodiesteraza
Efekt optyczny, widzenie
Gq
MrCholinergiki
arAdrenergiki
t Fosfolipaza C-p,
T Skurcz mięśni
ai1
arAdrenergiki
T Fosfolipaza C-p2
T Ciśnienie tętnicze
Gl?
?
Kanały Cl'
?
1 Tabela modyfikowana i reprodukowana za zgodą Granner DK i wsp. W: Principles and Practice of Endocrinology and Metabolism. Wyd.
2, Becker KL (red.), Lippincott, 1995.
2 Podział białek G ssaków na cztery główne klasy lub rodziny (Gs, Git Gq i G12) opiera się na homologii sekwencji białek. W tabeli przed¬
stawiono wybiórczo niektórych członków poszczególnych klas oraz związane z nimi bodźce, efektory i dobrze zdefiniowane skutki
biologiczne. Zidentyfikowano 9 izoform cyklazy adenylanowej (izoformy l-IX). Wszystkie izoformy ulegają stymulacji przez as. Izoformy
cii hamuią typ V i VI, zaś do - izoformy I i V. Zidentyfikowano przynajmniej 16 różnych podjednostek a.
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 563
Reakcję wiązania cAMP przedstawia następu¬
jące równanie:
4cAMP + R2C2 ^±1 R2 • (4cAMP) + 2C
Kompleks R2C2 nie wykazuje aktywności en¬
zymatycznej, lecz po związaniu się R z cAMP R
odłącza się od C, przez co ulega aktywacji C (ryc.
42-5). Aktywna podjednostka C katalizuje prze¬
noszenie reszty y-fosforanowej z ATP na serynę
lub treoninę całego szeregu białek. Konsensuso-
wym miejscem fosforylacji jest zwykle sekwen¬
cja -Arg-Arg/Lys-X-Ser/Thr i -Arg-Lys-X-X-Ser,
przy czym w miejscu X może występować dowol¬
na reszta aminokwasowa.
Pierwotnie wyróżniano kinazy białek zależne
od cAMP i niezależne od cAMP. Problem ten stał
się znacznie bardziej złożony, kiedy wykazano,
że fosforylacja białek stanowi ważny mechanizm
regulatorowy. Dotychczas poznano wiele setek
różnych kinaz białek. Każda z nich jest unikatową
cząsteczką, wyróżniającą się zmiennością podjed-
nostek wchodzących w jej skład, masą cząstecz¬
kową, autofosforylacją, wartością Km dla ATP
i swoistością substratową.
C. Fosfoproteiny
Zakłada się, że działanie cAMP w komórkach
eukariotycznych polega na fosforylacji lub de-
fosforylacji białek. Kontrola efektów działania
cAMP, obejmujących tak różnorodne procesy,
jak steroidogeneza, wydzielanie, transport jonów,
przemiana węglowodanów i tłuszczów, aktywacja
enzymów, regulacja genów, wzrost komórek i ich
replikacja, mogłaby być zależna od swoistej ki¬
nazy białek, swoistej fosfatazy lub od swoistych
substratów fosforylacji. Substraty te są pomocne
w określaniu tkanek docelowych oraz stopnia od¬
powiedzi hormonalnej w danej komórce. Na przy¬
kład w działaniu cAMP na transkrypcję genów
pośredniczy białko określane jako białko wią¬
żące sekwencję HRE, powstałe pod wpływem
Aktywna
cyklaza
adenylanowa
Błona
komórkowa
ATP • Mg2'
Białko Fosfodiesteraza
Fosfataza
Efekty
fizjologiczne
Ryc. 42-5. Hormonalna regulacja procesów komórkowych zachodzących za
pośrednictwem kinazy białka zależnej od cAMP (PKA). PKA występuje w postaci
nieaktywnej jako R2C2 heterotetramer, składający się z dwóch podjednostek regulato¬
rowych i dwóch podjednostek katalitycznych. Powstały pod wpływem cyklazy adeny-
lanowej (pokazany na ryc. 42-4 jako postać aktywna) cAMP wiąże się z podjednostką
regulatorową PKA. Proces ten powoduje odłączenie się podjednostki regulatorowej od
podjednostki katalitycznej oraz aktywację tej ostatniej. Aktywne postacie podjednostek
katalitycznych katalizują fosforylację szeregu białek docelowych w miejscach, w których
występują seryna i treonina. Fosfatazy, odszczepiając fosforany wymienionych amino¬
kwasów, kończą proces fizjologicznej odpowiedzi hormonalnej. Proces ten może również
zakończyć fosfodiesteraza, przekształcając cAMP w 5'-AMP
564 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
cAMP (CREB, ang. cAMP response element bin-
ding protein). CREB, wiążąc się z niefosforylo-
wanym elementem CRE (ang. cAMP responsive
element) (p. tab. 42-1) jest słabym aktywatorem
transkrypcji. Po fosforylacji przez PKA CREB
wiąże się z koaktywatorem określanym jako biał¬
ko wiążące CREB (CBP/p300), w wyniku czego
staje się silniejszym aktywatorem transkrypcji
(patrz niżej).
D. Fosfodiesterazy
Działanie hormonów zwiększające śródkomórko-
we stężenie cAMP może zostać zakończone kil¬
koma sposobami, m.in. wskutek hydrolizy cAMP
katalizowanej przez fosfodiesterazy. Obecność
tych hydrolitycznych enzymów zapewnia szyb¬
ki obrót cząsteczki sygnałowej (tj. cAMP) i tym
samym szybkie zakończenie procesu biologicz¬
nego indukowanego bodźcem hormonalnym,
jak tylko ten ostatni przestaje działać. Poznano
przynajmniej 11 członków rodziny fosfodieste-
raz. Aktywność ich jest regulowana stężeniem
substratów dla tych enzymów, cAMP i cGMP,
hormonami i śródkomórkowymi przekaźnikami,
takimi jak Ca2+ (prawdopodobnie działającego za
pośrednictwem kalmoduliny). Inhibitory fosfo¬
diesterazy, spośród których najbardziej znane są
metylowane ksantyny (np. kofeina), zwiększają
stężenie śródkomórkowego cAMP, mogą zatem
wywołać efekty hormonopodobne lub wydłużyć
działanie hormonów.
E. Fosfatazy fosfoprotein
Jeśli uwzględni się znaczenie fosforylacji białek,
nie będzie zaskoczeniem ważna rola reakcji de-
fosforylacji tych ostatnich w mechanizmie regu¬
lacji aktywności enzymów (p. ryc. 42-5). Same
fosfatazy fosfoprotein podlegają regulacji przez
procesy fosforylacji i defosforylacji oraz przez
inne czynniki, takie jak oddziaływania między
białkami. W rzeczywistości swoistość fosfataz
fosfoseryno-fosfotreoninowych może być po¬
dyktowana odmiennością podjednostek regula¬
torowych, których wiązanie podlega regulacji
hormonalnej. Najlepiej zbadano rolę regulacji
defosforylacji białek w przemianie glikogenu
w mięśniach szkieletowych. Wyróżniono w tej
tkance dwa główne typy fosfataz fosfoseryno-fo¬
sfotreoninowych. Typ I preferencyjnie defosfory-
luje podjednostkę p kinazy fosforylazowej, typ II
zaś defosforyluje podjednostkę a. Typ I fosfatazy
uczestniczy w regulacji syntazy glikogenowej, fo¬
sfory lazy i kinazy fosforylazowej. Sama fosfataza
jest regulowana reakcją fosforylacji pewnych jej
podjednostek; reakcje te ulegają odwróceniu pod
wpływem działania jednej z fosfataz typu II. Po¬
nadto dwa ciepłoopome inhibitory białkowe regu¬
lują aktywność fosfatazy typu I. Inhibitor-1 jest
fosforylowany i aktywowany przez kinazy białek
zależne od cAMP, natomiast inhibitor-2 (który
wydaje się podjednostką nieaktywnej fosfatazy)
także ulega fosforylacji być może przez kina-
zę-3 syntazy glikogenowej. Fosfatazy atakujące
fosfotyrozynę odgrywają ważną rolę w transduk-
cji sygnałów (p. ryc. 42-8).
cGMP jest również śródkomórkowym
sygnałem
Cykliczny GMP powstaje z GTP pod wpływem
cyklazy guanylanowej, występującej w posta¬
ci rozpuszczalnej i związanej z błoną komórko¬
wą. Każdy z tych izozymów ma niepowtarzalne
własności fizjologiczne. Atriopeptyny, rodzina
peptydów wytwarzanych przez kardiomiocy-
ty przedsionków, wywołują natriurezę, diurezę
i rozszerzenie naczyń oraz hamują sekrecję aldo-
steronu. Peptydy te (np. przedsionkowy czynnik
natriuretyczny) wiążą się z cyklazą guanylanową
przyłączoną do błony plazmatycznej i ją aktywu¬
ją. W wyniku tej reakcji wzrasta stężenie cGMP,
w niektórych przypadkach aż 50-krotnie. Przy¬
puszcza się, że wymienione efekty atriopeptyn są
spowodowane zwiększeniem wytwarzania cGMP.
Inne dowody wskazują na udział cGMP w proce¬
sie wazodylatacji. Wiele związków, wśród których
znajdują się nitroprusydek, nitrogliceryna, tlenek
azotu, azotan (III) sodu i azydek sodu, powodu¬
ją rozkurcz miocytów naczyniowych i są bardzo
silnymi lekami rozszerzającymi naczynia krwio¬
nośne. Związki te zwiększają stężenie cGMP,
aktywując rozpuszczalną postać cyklazy guany¬
lanowej. Efekt ten nasilają i wydłużają w czasie
inhibitory fosfodiesterazy cGMP (przykładem
tego jest lek sildenafil — Viagra). Uwalniające
się większe ilości cGMP aktywują kinazę białek
zależną od cGMP, która z kolei katalizuje fosfory-
lację wielu białek miocytów naczyniowych. Przy¬
puszczalnie proces ten uczestniczy w relaksacji
miocytów i wazodylatacji.
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 565
Wiele hormonów działa
za pośrednictwem jonów wapnia
lub f osf aty dylo i n ożyto I i
Jon wapniowy jest ważnym regulatorem: 1) róż¬
nych procesów komórkowych, w tym procesu
skurczu mięśnia, 2) sprzężenia między bodźcem
sekrecyjnym a sekrecją, 3) układu krzepnięcia
krwi, 4) aktywności enzymów i pobudliwości
komórkowej. Jest on również śródkomórkowym
przekaźnikiem w mechanizmie działania hormo¬
nów.
A. Przemiana wapnia
Stężenie wapnia ogólnego w płynie pozakomór-
kowym wynosi ok. 2,5 mmol/L. Podlega ono
bardzo ścisłej regulacji, chociaż znaczne ilości
wapnia są związane przez organelle śródkomór-
kowe (mitochondria i retikulum endoplazmatycz-
ne). Stężenie śródkomórkowego wolnego jonu
wapniowego jest znacznie mniejsze i wynosi
0,05-10 pmol/L. Mimo występowania znacznego
gradientu między stężeniami wapnia poza- i śród¬
komórkowego i sprzyjającego przezbłonowego
gradientu elektrycznego, wnikanie Ca2+ do komó¬
rek jest utrudnione. Utrzymanie stałego (małego)
stężenia Ca2+ śródkomórkowego wymaga dużego
nakładu energii i ma istotne znaczenie, bowiem
długotrwały wzrost stężenia Ca2+ w komórce jest
dla niej bardzo toksyczny. Mechanizm wymiany
Na+/Ca2+, wykazujący dużą pojemność, lecz małe
powinowactwo, wypompowuje Ca2+ z komórki.
Istnieje również pompa wapniowo-protonowa
(zależna od ATP-azy), która wydala Ca2+ na zasa¬
dzie wymiany z jonami H+. Pompa ta charaktery¬
zuje się wysokim powinowactwem dla Ca2+, lecz
małą pojemnością, i służy najprawdopodobniej
subtelnej regulacji zmian stężenia w cytoplazmie.
Ponadto Ca2+-ATP-aza wypompowuje Ca2+ z cy-
tozolu do światła siateczki endoplazmatycznej.
Zmiana stężenia Ca2+ w cytoplazmie może się
odbywać trzema sposobami. 1. Niektóre hormo¬
ny (hormony klasy III C, p. tab. 41-3), po zwią¬
zaniu się z receptorami (które są kanałami Ca2+),
zwiększają przepuszczalność błony komórkowej
dla Ca2+ i tym samym zwiększają napływ Ca2+ do
komórki. 2. Hormony mogą również bezpośred¬
nio nasilać napływ Ca2+, oddziałując na napięcie
błony plazmatycznej. Depolaryzacja błony ot¬
wiera kanały wapniowe bramkowane napięciem,
co sprzyja napływowi Ca2+ do komórki. 3. Jony
wapnia mogą być też uwalniane (mobilizowa¬
ne) z siateczki endoplazmatycznej i ewentualnie
z puli mitochondrialnej.
Poznanie śródkomórkowych organelli wraż¬
liwych na działanie Ca2+ stanowiło ważny etap
w procesie poznawania mechanizmu oddziaływa¬
nia tych jonów z hormonami. Odkrycie regulato¬
ra aktywności fosfodiesterazy zależnego od Ca2+
było punktem wyjścia do zrozumienia śródko¬
mórkowego oddziaływania między Ca2+ i cAMP.
B. Kalmodulina
Kalmoduliną określa się białko regulatorowe za¬
leżne od Ca2+, o masie cząsteczkowej 17 kDa, ho¬
mologiczne pod względem struktury i czynności
z tropiną C, będącą białkiem mięśniowym. Kal¬
modulina ma cztery miejsca wiążące Ca2+, po któ¬
rych wysyceniu dochodzi do znacznej zmiany jej
konformacji, warunkującej zdolność kalmoduliny
do aktywowania enzymów i kanałów jonowych.
Idea oddziaływania Ca2+ z kalmoduliną (w wyni¬
ku którego zachodzi zmiana jej aktywności) jest
podobna do wiązania się cAMP z kinazą białek
A (PKA) i następnie jej aktywacji. Kalmodulina
może być jedną z licznych podjednostek wielu
kompleksów białkowych. Uczestniczą one w re¬
gulacji aktywności różnych kinaz i enzymów syn¬
tezy oraz rozkładu cyklicznych nukleotydów. Nie¬
pełną listę enzymów regulowanych bezpośrednio
lub pośrednio zmianami stężenia Ca2+ (prawdopo¬
dobnie za pośrednictwem kalmoduliny) przedsta¬
wiono w tab. 42-4.
Oprócz działania na enzymy i transport Ca2+,
kalmodulina reguluje aktywność wielu elemen¬
tów strukturalnych komórki. Spośród nich nale-
Tabela 42-4. Enzymy i białka regulowane przez Ca2+ lub kalmo-
dulinę
• Cyklaza adenylanowa
• Ca2+-Mg2+-ATPaza
• Kinaza białek zależna od Ca2+ i fosfolipidów
• Kinazy białek zależne od Ca2+
• Fosfodiesteraza cyklicznego nukleotydu
• Niektóre białka cytoszkieletu
• Kilka kanałów jonowych (np. kanały wapniowe typu l)
• Syntaza tlenku azotu
• Kinaza fosforylazy
• Fosfataza 2B fosfoproteinowa
• Niektóre receptory (np. receptor glutaminianowy typu NMDA)
566 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
ży wymienić kompleks aktyna-miozyna mięśni
gładkich (znajdujący się pod kontrolą P-adrener-
giczną) oraz różne procesy, w których biorą udział
mikrofilamenty w niekurczących się komórkach
(ruchliwość komórek, zmiany konformacyjne,
mitoza, uwalnianie ziarnistości i endocytoza).
C. Jony wapnia pośredniczą w działaniu hormonów
Za udziałem jonów wapnia w mechanizmie
działania hormonów przemawiają następujące
obserwacje: 1) działanie wielu hormonów ulega
osłabieniu w środowisku pozbawionym Ca2+ lub
w stanach niedoboru wapnia w komórce, 2) dzia¬
łanie hormonów można naśladować, używając
substancji zwiększających stężenie wapnia śród-
komórkowego, np. jonoforu wapnia A23187, 3)
działanie hormonów ma wpływ na przemiesz¬
czanie się Ca2+ w obrębie komórki. Dobrym
przykładem jest regulacja przemiany glikogenu
w wątrobie przez wazopresynę i katecholaminy
a-adrenergiczne. Pokazano to schematycznie na
ryc. 19-6 i 19-7.
Aktywność wielu enzymów o znaczeniu kry¬
tycznym dla pewnych szlaków metabolicznych
jest regulowana przez zmianę stężenia Ca2+ i/lub
fosforylację tych enzymów. Spośród takich enzy¬
mów należy wymienić m.in.: syntazę glikogeno¬
wą, kinazę pirogronianową, karboksylazę pirogro¬
nianową, dehydrogenazę glicerolo-6-fosforanową
oraz dehydrogenazę pirogronianową.
Ca2+
Ryc. 42-6. Oddziaływanie niektórych hormonów z receptorem powoduje aktywację fosfolipazy C. W procesie tym uczestniczy swoiste
białko G, które również może aktywować kanał wapniowy. W wyniku działania fosfolipazy C powstaje IP3, który uwalnia Ca2+ ze śród-
komórkowych magazynów, oraz diacyloglicerol (DAG), aktywujący kinazę białka C. W tym mechanizmie aktywowana kinaza białek C
katalizuje fosforylację swoistych substratów, które z kolei zmieniają procesy fizjologiczne. Również kompleks Ca2+-kalmodulina (CaM)
może aktywować swoiste kinazy. W wyniku tych działań substraty ulegają modyfikacjom, co z kolei zmienia reakcje fizjologiczne. (Dzięki
uprzejmości JH Exton).
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 567
R,
L
Ryc. 42-7. Fosfolipaza C rozkłada 4,5-difosforan
fosfatydyloinozytolu (PIP2) do diacyloglicerolu
11,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3). Ri jest za¬
zwyczaj stearynianem, a R2 - arachidonianem.
IP3 może ulec defosforylacji (do nieaktywnego
1,4-difosforanu inozytolu (l-1,4-P2) lub fosfory¬
lacji (do potencjalnie aktywnego 1,3,4,5-tetrafo-
sforanu inozytolu l-1,3,4,5-P4).
D. Przemiana fosfoinozytydu odgrywa rolę
W DZIAŁANIU HORMONÓW ZALEŻNYCH OD Ca2+
Musi istnieć sygnał zapewniający komunikację
między receptorem hormonalnym błony komór¬
kowej i śródkomórkowymi „magazynami” wap¬
nia. Ten warunek spełniają produkty przemiany
fosfoinozytydu. Receptory dla acetylocholiny,
hormonu antydiuretycznego i katecholamin a,-
-adrenergicznych, występujące na powierzchni
błony plazmatycznej, po połączeniu się ze swo¬
istymi Ugandami, zostają silnymi aktywatorami
fosfolipazy C. Proces wiązania się hormonu z re¬
ceptorem oraz aktywacja fosfolipazy C są ze sobą
sprzężone przez izoformy białka Gq (p. tab. 42-3
i ryc. 42-6). Fosfolipaza C katalizuje hydrolizę
4,5-difosforanu fosfatydyloinozytolu do trifosfo-
ranu inozytolu* i 1,2-diacyloglicerolu (ryc. 42-7).
Choć sam diacyloglicerol może aktywować ki-
nazę białek C (PKC), to jednak aktywność tego
enzymu zależy również od obecności wolnych
jonów wapnia. Trifosforan inozytolu, działając
na swoisty receptor śródkomórkowy, efektywnie
uwalnia wapń ze śródkomórkowych „magazy¬
nów”, takich jak siateczka endoplazmatyczna.
Tak więc hydroliza 4,5-difosforanu fosfatydylo¬
inozytolu jest przyczyną aktywacji kinazy białek C
i wzrostu stężenia Ca2+ w cytoplazmie. Jak widać
na ryc. 42-4, aktywny kompleks białka G może
również bezpośrednio oddziaływać na kanały
Ca2+. W następstwie wzrostu stężenia Ca2+ w cyto-
* Pełna nazwa tego związku to 1,4,5-trifosforan
inozytolu; często spotyka się też nazwę: trifosfoinozytol
[przyp. red.].
plazmie dochodzi do aktywacji kinaz i enzymów
zależnych od kompleksu Ca2+-kalmodulina.
Czynniki steroidogeniczne - ACTH i cAMP
w korze nadnerczy, angiotensyny II, K+, serotoni-
ny, ACTH i cAMP w warstwie kłębkowatej nad¬
nerczy, LH w jajnikach oraz LH i cAMP w ko¬
mórkach Leydiga gonady męskiej - odpowiadają
za wzrost ilości kwasu fosfatydowego, trifosfo-
inozytolu i polifosfoinozytydów (patrz rozdz. 15)
w poszczególnych tkankach docelowych. Można
by przytoczyć kilka innych przykładów.
Na rycinie 42-6 przedstawiono rolę Ca2+ i pro¬
duktów rozpadu polifosfoinozytydu w mechani¬
zmie działania hormonów. W tym mechanizmie
aktywna kinaza białek C katalizuje fosforylację
swoistych substratów, które następnie zmieniają
procesy fizjologiczne. Podobnie kompleks Ca2+-
kalmodulina może aktywować swoiste kinazy,
które z kolei modyfikują substraty, a zatem i reak¬
cje fizjologiczne.
Niektóre hormony działają za
pośrednictwem kaskady kinazy białek
Poszczególne kinazy białek, takie jak kinazy za¬
leżne od PKA, PKC i kompleksu Ca2+-kalmodu-
lina (CaM), poprzez stymulację fosforylacji reszt
serynowych i treoninowych odgrywają ważną
rolę w działaniu hormonów. Przełomem w tej
dziedzinie było odkrycie, że receptor dla EGF
wykazuje wewnętrzną aktywność kinazy tyro-
zynowej, która ulega aktywacji po przyłączeniu
się ligandu (EGF). Receptory dla insuliny i IGF-I
również wykazują wewnętrzną aktywność kinazy
568 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
tyrozynowej po przyłączeniu się wymienionych
ligandów. Wiele receptorów - zwykle te, które
wiążą ligandy uczestniczące w regulacji wzrostu,
różnicowania lub reakcji zapalnych - albo wyka¬
zują własną (wewnętrzną) aktywność kinazy tyro¬
zynowej, albo są sprzężone z białkami będącymi
kinazami tyrozynowymi. Inną cechą wyróżniającą
tę klasę hormonów jest to, że kinazy te fosforylują
preferencyjnie reszty tyrozynowe, chociaż ten ro¬
dzaj fosforylacji rzadko występuje w komórkach
ssaków (stanowi ona mniej niż 0,03% wszystkich
fosforylacji aminokwasów). Trzecią cechą tej kla¬
sy hormonów jest to, że interakcja ligandu z re¬
ceptorem, prowadząca do fosforylacji tyrozyny,
zapoczątkowuje kaskadę, w której może uczest¬
niczyć wiele kinaz białek, fosfatazy i inne białka
regulatorowe.
A. Insulina przekazuje sygnały za pośrednictwem
KILKU KASKAD KINAZOWYCH
Receptory dla insuliny, naskórkowego czynnika
wzrostu I dla IGF-I, wykazują własną (wewnętrz¬
ną) aktywność tyrozynowej kinazy białek, która
jest umiejscowiona w domenach cytoplazmatycz-
nych. Aktywność ta narasta (ulega stymulacji)
po związaniu się receptora ze swoim ligandem.
Następnie receptory te ulegają autofosforylacji
w miejscach reszt tyrozynowych, co uruchamia
serię „zdarzeń” przedstawionych schematycznie
na ryc. 42-8. Z kolei fosforylowany receptor insu¬
linowy fosfory luje reszty tyrozynowe substratów
receptora insulinowego (znane są przynajmniej
cztery takie cząsteczki, określane jako IRS 1-4).
Fosforylowane IRS wiążą się z domenami ho-
mologami Src2 dwóch (SH2) domen różnych bia¬
łek, które bezpośrednio uczestniczą w realizacji
efektów insulinowych. Jedno z tych białek - IP3-
-kinaza - przetwarza sygnał aktywacji receptora
insulinowego na efekty insulinowe w ten spo¬
sób, że aktywuje liczne cząsteczki, w tym kinazę
PDK1 (kinaza-1 zależna od fosfoinozytydów).
Enzym ten przenosi sygnał na wiele innych kinaz,
w tym na PKB (akt), SKG i PK (p. legenda do ryc.
42-8, w której znajduje się objaśnienie skrótów).
Alternatywny szlak „w dół” (ang. downstream)
od PKD1 obejmuje p70S6K i być może inne do¬
tychczas niezidentyfikowane kinazy. Drugi duży
szlak sygnalizacyjny obejmuje mTOR. Enzym
ten jest regulowany bezpośrednio przez amino¬
kwasy oraz insulinę i ma istotne znaczenie dla
aktywności p70S6K. Szlak ten zapewnia odróż¬
nienie sygnałów biegnących odgałęzieniem PKB
od sygnałów biegnących odgałęzieniem p70S6K
(odgałęzienia położone dystalnie wobec PKD1).
Szlaki te występują w procesie translokacji białek
oraz w regulacji aktywności enzymów i genów
(za pośrednictwem insuliny), biorących udział
w procesach metabolicznych (p. ryc. 42-8). Innym
białkiem zawierającym domeny SH2 jest GRB2,
które - wiążąc się z IRS-1 - przyczynia się do
fosforylacji szeregu białek, w której następstwie
dochodzi do aktywacji kaskady kinaz treonino-
wych i serynowych. Na rycinie 42-8 jest pokaza¬
ny szlak, ilustrujący mechanizm aktywacji kinazy
aktywowanej przez mitogen (kinazy MAP), uru¬
chomiony wskutek oddziaływania receptora insu¬
linowego z ww. białkami, a także są wymienione
efekty działania anabolicznej insuliny, indukowa¬
ne tym oddziaływaniem. Rola tych wielu dokują¬
cych białek, kinaz i fosfataz oczekuje na dokładne
wyjaśnienie.
B. Niektóre hormony i cytokiny działają
ZA POŚREDNICTWEM SZLAKU JAK/STAT
Aktywacja kinazy tyrozynowej może także za¬
początkować kaskadę fosforylacji i defosforyla-
cji, w którą jest zaangażowanych wiele innych
kinaz białek i fosfataz przeciwdziałających tym
pierwszym. Inicjacja tej kaskady odbywa się wg
dwóch mechanizmów. Niektóre hormony, takie
jak hormon wzrostu, prolaktyna, erytropoetyna
i cytokiny, zaczynają działanie, aktywując ki¬
nazę tyrozynową, która nie stanowi integralnej
części receptora hormonalnego. Interakcja hor¬
monu z własnym receptorem aktywuje cytopla-
zmatyczne kinazy tyrozynowe białek, takie jak
Tyk-2, JAKI lub JAK2. Kinazy te fosforylują
jedno lub kilka białek cytoplazmatycznych, które
z kolei łączą się z innymi „dokującymi” białka¬
mi za pośrednictwem domen SH2. Jedna z takich
interakcji prowadzi do aktywacji rodziny białek
cytoplazmatycznych, określanych jako białka
transdukcji sygnałów i aktywacji transkryp¬
cji (białka STAT). Fosforylowane białko STAT
ulega dimeryzacji i translokacji do jądra i zostaje
związane przez określoną sekwencję DNA, np.
przez RE dla interferonu (ang. serum response
element), po czym aktywuje transkrypcję. Proces
ten pokazano na ryc. 42-9. Inne zjawiska związa¬
ne z domenami SH2 mogą być przyczyną akty-
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 569
Ryc. 42-8. Szlaki sygnalizacyjne insuliny. Są one znakomitym przykładem paradygmatu: „rozpoznanie-»uwalnianie hormonu-»po-
wstawanie sygnału-»skutek biologiczny", przedstawionego na ryc. 42-1. Insulina jest uwalniana z komórek wyspowych pod wpływem
hiperglikemii. Związanie się insuliny ze swoistym receptorem komórki docelowej zlokalizowanym w błonie zapoczątkowuje kaskadę
zjawisk śródkomórkowych. Stymulacja wewnętrznej aktywności kinazy tyrozynowej receptora insulinowego jest początkiem procesu
powodującego wzrost fosforylacji reszt tyrozynowych (Y) do YP zarówno receptora, jak i cząsteczek jednego lub kilku substratorów
receptora insulinowego (IRS 1-4). Ten wzrost fosfotyrozyny pobudza aktywność wielu śródkomórkowych cząsteczek, takich jak GTP-
-azy, kinazy białek i kinazy lipidowe. Wszystkie te cząsteczki odgrywają pewną rolę w mechanizmie metabolicznego działania insuliny.
Na rycinie pokazano dwa najlepiej poznane szlaki. Po pierwsze, fosforylacja cząsteczki IRS (najpewniej IRS-2) powoduje dokowanie
i aktywację kinazy lipidowej - IP3-kinazy, która stymuluje generację nowych lipidów inozytolowych mogących służyć jako drugorzę-
dowe przekaźniki. Te z kolei aktywują PDK1, a następnie różnorodne cząsteczki sygnałowe występujące w dalszych etapach szlaku
sygnalizacyjnego. Do tych ostatnich należą m.in. kinaza białka B (PKB) SGK i aPKC. W alternatywnym szlaku występuje aktywacja
p70S6K i innych dotychczas niezidentyfikowanych kinaz. Po drugie, fosforylacja IRS (prawdopodobne IRS-1) jest przyczyną dokowa¬
nia GRB2/mSOS i aktywacji małej GTP-azy - p21 RAS - która zapoczątkowuje aktywację kaskady kinazowej białek aktywującej Raf-1,
MEK i izoform p42/p44 kinazy MAR Te białkowe kinazy są istotne w procesach proliferacji i różnicowania komórek różnego rodzaju.
Szlak mTOR stanowi alternatywną drogę aktywacji p70S6K i wydaje się uczestniczyć w powstawaniu sygnałów indukowanych pokar¬
mami oraz w mechanizmie działania insuliny. Jak widać na rycinie, każda z tych kaskad może wpływać na różne procesy fizjologiczne.
Wszystkie procesy fosforylacji są odwracalne dzięki działaniu swoistych fosfataz. Na przykład fosfataza lipidowa PTEN defosforyluje
produkt reakcji katalizowanej przez IP3-kinazę, wskutek czego dochodzi do zahamowania aktywności szlaku i wygaszenia sygnału.
W ramkach podano przykłady najważniejszych efektów biologicznych insuliny. Gwiazdka przy fosfodiesterazie oznacza, że insulina
wpływa pośrednio na aktywność wielu enzymów poprzez aktywację fosfodiesteraz i zmniejszenie śródkomórkowego stężenia cAMR
Objaśnienia symboli:
IGFBP - białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu, aPKC - atypowa kinaza białkowa C,
IRS 1-4 - izoformy 1-4 substratu receptora insulinowego, p70S6K - p70 rybosomalna S6 kinaza białkowa,
IP3-kinaza - kinaza trifosforanu fosfatydyIoinozytolu, mTOR - docelowy szlak działania rapamycyny u ssaków,
PTEN - fosfataza i homolog tensyny z delecją na chromosomie 10, GRB2 - białko 2 wiążące receptor dla czynnika wzrostu,
PKD1 - kinaza zależna od fosfoinozytydów, mSOS - chłopiec w wieku poniżej 7 lat,
PKB - kinaza białka B, MEK - kinaza kinazy MAP i kinaza ERK,
SGK - kinaza regulowana przez surowicę i glukokortykoidy, MAP-kinaza - kinaza białkowa aktywowana przez mitogeny
570 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJI WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
wacji kinazy IP3, szlaku kinazy MAP (przez SHC
lub GRB2) lub fosfolipazy C (PLCy), w której
bierze udział białko G. Aktywacji tej towarzyszy
wytwarzanie diacyloglicerolu i aktywacja kinazy
białkowej C. Łatwo zauważyć, że jest to rodzaj
„szybkiej wymiany zdań” (ang. „cross-talk”),
kiedy różne hormony aktywują różnorodne szlaki
transdukcji sygnału.
C. Szlak NF-kB jest regulowany
PRZEZ GLUKOKORTYKOIDY
Czynnik transkrypcyjny NF-kB jest heterodime-
rem, złożonym zwykle z dwóch podjednostek
określanych jako p50 i p65 (p. ryc. 42-10). Nor¬
malnie NF-kB jest zamaskowany w cytoplazmie,
w swej nieaktywnej pod względem transkrypcyj-
nym formie, przez inhibitory NF-kB, czyli przez
IkB. Bodźce pozakomórkowe, takie jak cytokiny
prozapalne, reaktywne rodniki tlenowe i mito-
geny, aktywują kompleks kinazy IkB, określony
jako IKK. Kompleks ten wykazuje strukturę he-
teroheksamerową, złożoną z podjednostek a, (3
i y. IKK fosforyluje IkB na dwóch resztach sery-
nowych, co przysposobią IkB do ubikwitynacji,
a następnie degradacji przez proteasom. Po degra¬
dacji IkB wolny NFK może teraz ulec translokacji
do jądra, gdzie wiąże się z wieloma promotorami
genowymi i aktywuje transkrypcję genów, zwłasz¬
cza tych zaangażowanych w odpowiedź zapalną.
Regulacja transkrypcji przez NF-kB odbywa się
za pośrednictwem różnorodnych koaktywatorów,
takich jak białko wiążące CREB (CBP) (patrz dal¬
sza część rozdziału).
Hormony glukokortykoidowe są użytecznymi
substancjami leczniczymi, stosowanymi w lecze¬
niu różnorodnych chorób zapalnych i immunolo¬
gicznych. Ich działanie przeciwzapalne i immu-
nomodulujące tłumaczy się częściowo zahamo¬
waniem NF-kB i jego skutków biologicznych.
Istnieją dowody na istnienie trzech mechanizmów
hamujących NF-kB przez glukokortykoidy: 1) glu-
kokortykoidy zwiększają mRNA IkB, co prowadzi
do wzrostu ilości białka IkB i bardziej skutecznej
sekwestracji NF-kB w cytoplazmie; 2) receptor
glukokortykoidowy konkuruje z NF-kB o wiązanie
z koaktywatorami; 3) receptor glukokortykoidowy
wiąże się bezpośrednio z podjednostkąp65 NF-kB
i hamuje jego aktywację (ryc. 42-10).
PLCy do jądra
IP3
GAP
Ryc. 42-9. Zapoczątkowanie transdukcji sygnału przez receptor związany z kinazami JAK. Receptory dla
prolaktyny, hormonu wzrostu, interferonów i cytokin nie mają własnej (wewnętrznej) aktywności kinazy ty-
rozynowej. Po związaniu się tych ligandów z receptorami te ostatnie ulegają dimeryzacji i asocjowane białko
(JAK1, JAK2 lub TYK) ulega fosforylacji. JAK«R będący aktywną kinazą, fosforyluje receptor w miejscach,
gdzie występują reszty tyrozynowe. Białka STAT łączą się z fosforylowanym receptorem, po czym same ule¬
gają fosforylacji przez JAK«P. STAT*P ulega dimeryzacji, a następnie przemieszczeniu do jądra, gdzie wiąże
się ze swoistym elementem DNA i reguluje transkrypcję. Reszty fosfotyrozynowe receptora także wiążą się
z szeregiem białek zawierających domeny SH2. W następstwie tego dochodzi do aktywacji szlaku kinazy
MAP (za pośrednictwem SHC lub GRB2), PLCy lub kinazy IP3.
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 571
Aktywatory NF-kB
Prozapalne cytokiny
Infekcje bakteryjne i wirusowe
Reaktywne rodniki tlenowe
Kompleks IKK
Ryc. 42-10. Regulacja szlaku NF-kB. NF-kB składa się z dwóch podjednostek - p50 i p65, regu¬
lujących transkrypcję wielu genów, jeżeli znajdują się w obrębie jądra komórkowego. Wnikanie
NF-kB do jądra hamuje IkB, który jest inhibitorem NF-kB. IkB, wiążąc się z miejscem lokalizacji
sygnału NF-kB w jądrze, maskuje go. To cytoplazmatyczne białko ulega fosforylacji przez okre¬
ślony kompleks IKK, który jest następnie aktywowany przez cytokiny, reaktywne rodniki tlenowe
i mitogeny. Fosforylowany IkB może ulec ubikwitinylacji i degradacji, tracąc swój wpływ na NF-kB.
Glukokortykoidy wpływają na wiele etapów tego procesu (patrz tekst).
HORMONY MOGĄ WPŁYWAĆ NA
SWOISTE EFEKTY BIOLOGICZNE,
MODYFIKUJĄC PROCES TRANSKRYPCJI
Sygnały wytwarzane w sposób wyżej opisany
muszą zostać „przetłumaczone” na działanie po¬
zwalające komórce efektywnie przygotować się
do podjęcia wyzwania (p. ryc. 42-1). Na większą
część procesu adaptacyjnego składają się zmiany
szybkości transkrypcji swoistych genów. Wie¬
le różnych obserwacji wpłynęło na wyrobienie
sobie aktualnego poglądu na mechanizm wpły¬
wu hormonów na transkrypcję. A oto niektóre
z nich: 1. Aktywnie przepisywane geny znajdują
się w obszarach „otwartej” chromatyny (pojęcie
to określa podatność na działanie DN-azy I), co
umożliwia dostępność czynników transkrypcyj-
nych do DNA. 2. Geny mają regiony (obszary)
regulatorowe, do których przyłączają się czynniki
transkrypcyjne, modulując częstotliwość inicjacji
transkrypcyjnych. 3. Jednym z tych czynników
transkrypcyjnych może być kompleks hormon-
-receptor. Sekwencję DNA, z którą wiąże się ten
kompleks, określa się jako „element” odpowiedzi
hormonalnej (ang. hormone response element,
HERE) (patrz przykłady HERE podane w tab.
42-1). 4. Inne sygnały wytwarzane przez hormo¬
ny mogą modyfikować lokację, ilość i aktywność
czynników transkrypcyjnych i przez to oddziały¬
wać na wiązanie się ich z elementem regulatoro¬
wym lub elementem odpowiedzi hormonalnej.
5. Wiele członków dużej nadrodziny receptorów
jądrowych współdziała z receptorami hormonal¬
nymi lub też działa w sposób podobny jak one.
6. Receptory jądrowe, reagując z inną, dużą
grupą cząsteczek koregulatorowych, zmieniają
transkrypcję swoistych genów.
Poznano już wiele elementów
odpowiedzi hormonalnej
Elementy odpowiedzi hormonalnej (HERE) są
podobne do elementów wzmacniających, ponie-
572 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJI WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
waż nie są one ściśle zależne od położenia i orien¬
tacji przestrzennej i na ogół występują o kilkaset
nukleotydów przed (5'-koniec) miejscem inicjacji
transkrypcji, lecz mogą być również zlokalizo¬
wane w obrębie fragmentu kodującego intronów.
Strukturę HERE określono metodą pokazaną
na ryc. 38-11. Sekwencje konsensusu pokazane
w tab. 42-1 uzyskano przy użyciu wielu genów
regulowanych przez dany hormon, używając pro¬
stych heterologicznych systemów reporterowych
(ryc. 38-10). Chociaż te proste HERE chętniej
wiążą kompleks hormon-receptor niż otaczające
DNA lub DNA pochodzące z odmiennego źródła
oraz przekazują odpowiedź hormonalną do genu
reporterowego, to jednak szybko zorientowano
się, że proces regulacji naturalnych genów musi
być znacznie bardziej złożony. Glukokortykoidy,
progestyny, mineralokortykoidy i androgeny wy¬
kazują znacznie odmienne efekty fizjologiczne.
Nasuwa się pytanie: jak można uzyskać swoistość
tych efektów poprzez regulację ekspresji genu dla
jednego i tego samego HERE (tab. 42-1)? Podobne
pytania skłoniły do przeprowadzenia doświadczeń,
których wyniki pozwoliły na opracowanie złożo¬
nego modelu regulacji transkrypcji. Na przykład
HERE musi się połączyć z innymi elementami
DNA (i połączonymi z nimi białkami wiążącymi),
by mógł funkcjonować optymalnie. Stwierdzenie
dużego podobieństwa sekwencji w receptorach
hormonów steroidowych, szczególnie w dome¬
nach wiążących DNA, było przyczyną odkrycia
nadrodziny receptorów jądrowych. Pozwalają
one, wraz z dużą liczbą białek koregulatoro-
wych, na różne oddziaływania DNA z białkami
i białek z białkami, zapewniając swoistość nie¬
zbędną do ścisłej kontroli fizjologicznej. Schemat
takiego układu przedstawiono na ryc. 42-11.
Istnieje duża rodzina białkowych
receptorów jądrowych
Nadrodzina receptora jądrowego składa się ze
zróżnicowanego zestawu czynników transkryp-
cyjnych, które zostały odkryte dzięki temu, że
wykazują podobną sekwencję DNA w domenach
wiążących. Rodzina ta, złożona z ponad 50 człon¬
ków, obejmuje receptory jądrowe hormonów,
omówione w poprzednim rozdziale, pewną liczbę
innych receptorów, dla których ligandy wykryto
dopiero po zidentyfikowaniu receptora, oraz licz¬
ne receptory domniemane lub sieroce, dla których
dotychczas nie wykryto ligandu.
Wymienione receptory jądrowe mają kilka
wspólnych cech strukturalnych (ryc. 42-12).
Wszystkie zawierają centralnie umiejscowioną
domenę wiążącą DNA (ang. DNA-binding do-
Ryc. 42-11. Jednostka transkrypcyjna odpowiedzi
hormonalnej. Składa się ona z fragmentów DNA
i związanych z nimi białek, oddziałujących z liczny¬
mi cząsteczkami pełniącymi funkcję koaktywatorów
lub korepresorów. Istotną składową tej jednostki jest
„element odpowiedzi hormonalnej”, który wiąże się
z kompleksem ligand (czarny trójkącik)-receptor (R).
Równie istotna jest obecność składowych dodat¬
kowego czynnika (AFEs - ang. accessory factor
elements), wiążących czynniki transkrypcyjne. Po¬
nad dwa tuziny tych dodatkowych czynników (AFs,
ang. accessory factors), które często są członkami
nadrodziny receptorów jądrowych, są wynikiem
działania hormonów na proces transkrypcji. Czyn¬
niki AF mogą oddziaływać wzajemnie ze sobą,
z receptorami jądrowymi związanymi z ligandami
lub z koregulatorami. Składowe te komunikują się
z podstawowym aparatem transkrypcyjnym za po¬
średnictwem kompleksu koregulatorowego, który
może zawierać jeden koaktywator p160 (lub wiele),
korepresor, białko związane z mediatorem lub koak¬
tywator rodziny CBP/p300 (p. tab. 42-6).
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 573
A/B
C
D
E
F
N —
AF-1
DBD
Domena
zawiasowa
LBD
| AF-2
GR, MR, PR
AR, ER
TR, RAR, VDR
PPARa, p.y
FXR, CAR, LXR,
PXR/SXR
COUP-TF, TR2, GEN8
HNF-4, TLX
Receptory:
Hormony klasy steroidowej
RXR jako partner
Sieroce
Wiązanie:
Homodimery
Heterodimery
Homodimery
Ligand:
Steroidy
9-Cis RA + (X)
?
Element DNA:
Powtórzenia
odwrócone
Powtórzenia proste
Powtórzenia proste
Ryc. 42-12. Nadrodzina receptorów jądrowych. Członków tej rodziny podzielono na sześć do¬
men strukturalnych (A-F). Domena A/B jest określana również symbolem AF-1 lub nazywana
regionem modulatorowym, ponieważ uczestniczy w aktywacji procesu transkrypcji. Domena C
składa się z sekwencji wiążącej DNA (DBD, ang. DNA-binding domain). Region D zawiera do¬
menę zawiasową, którą zapewnia elastyczność czynnościową pomiędzy DBD i domeną wiążącą
ligand (LBD, region E). Końcowa część regionu E zawiera AF-2, tj. domenę o dużym znaczeniu
w procesie transkrypcji. Mało zdefiniowany jest region F. Funkcje poszczególnych domen są
bliżej omawiane w tekście. Receptory mające znane już ligandy, np. hormony steroidowe, wią¬
żą się w postaci homodimerów z półobszarem (ang. half-sitę) powtórzeń odwróconych. Inne
receptory tworzą heterodimery RXR (receptor retinolowy) i wiążą się z elementami powtórzeń
prostych. Pomiędzy powtórzeniami mogą występować „przerwy” (spacje) nukleotydowe za¬
wierające 1-5 zasad (DR1-5). Inna klasa receptorów, dla których nieznane są jeszcze ligandy
(receptory sieroce), przyłączają się jako homodimery do powtórzeń prostych oraz czasami jako
monomery do pojedynczych półobszarów.
main, DBD), która pozwala na wiązanie, z dużym
powinowactwem, receptora z elementem odpo¬
wiedzi. W DBD występują dwa wiążące motywy
strukturalne palca cynkowego (p. ryc. 38-14),
które decydują o tym, czy powstają homodimery,
heterodimery (zwykle zawierające, jako partne¬
ra, receptor retinolowy X-RXR) lub monomery.
Docelowy element odpowiedzi składa się z jednej
lub dwóch sekwencji konsensusowych DNA, uło¬
żonych w postaci powtórzeń prostych lub odwró¬
conych. Rozłożenie przerw (spacji) między tymi
sekwencjami jest pomocne w określaniu swoisto¬
ści wiązania. I tak, spacjowanie odpowiednio co
trzy, cztery lub pięć zasad nukleotydowych po¬
zwala na dokładne określenie miejsca wiązania
receptora dla witaminy D, hormonów tarczycy
i kwasu retinolowego do tego samego elementu
odpowiedzi w regionie konsensusu (tab. 42-1).
W C-końcowej połówce receptora jest umiejsco¬
wiona domena wiążąca ligand (ang. ligand-bin-
ding domain, LBD). LBD wiąże się selektywnie
z hormonami lub metabolitami, przez co reakcja
na te ligandy ma charakter swoisty. LBD zawie¬
rają również domeny pośredniczące w wiązaniu
białek szoku termicznego, procesie dimeryzacji,
lokalizacji jądrowej i transaktywacji. Transak-
tywację ułatwia domena AF-2, która dostarcza
powierzchni potrzebnej do oddziaływania z koak-
tywatorami. Bardzo zmienny region zawiasowy
oddziela DBD od LBD. Region ten zapewnia ela¬
styczność receptora, umożliwiającą różne konfor¬
macje domeny wiążącej DNA. W końcu należy
wymienić również bardzo zmienny N-końcowy
region, zawierający inną domenę transaktywacji,
określaną jako AF-1. Ta słabiej poznana dome¬
na może wpływać na określone funkcje, wiążąc
się z różnymi białkami koregulatorowymi. Ten
region receptora, przy udziale różnych promoto¬
rów, alternatywnego „splicingu” i wielu różnych
miejsc inicjacji translacji umożliwia działanie
574 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
izoform, zawierających identyczne DBD i LBD,
lecz wywołujących odmienne efekty fizjologicz¬
ne; jest to spowodowane asocjacją rozmaitych
koregulatorów ze zmiennym A-końcowym frag¬
mentem domeny AF-1.
Tę dużą liczbę receptorów można podzielić na
grupy według różnych kryteriów. W niniejszym
rozdziale kryterium podziału był mechanizm
wiązania tych receptorów z poszczególnymi ele¬
mentami (sekwencjami) DNA (p. ryc. 42-12).
Klasyczne receptory dla glukokortykosteroidów
(GR), mineralokortykoidów (MR), estrogenów
(ER), androgenów (AR) i progestyn (PR) wiążą
się jako homodimery z sekwencjami powtórzeń
odwróconych (ang. inverted repeats). Inne recep¬
tory, takie jak receptory dla hormonów tarczycy
(TR), kwasu retinolowego (RAR), witaminy D
(VDR), oraz receptory wiążące różne ligandy
metaboliczne, takie jak PPARa, PPARp i PPARy,
FXR, LXR, PYR/SXR i CAR, wiążą się jako he-
terodimery (partnerem tych ostatnich jest receptor
retinolowy RXR) bezpośrednio z powtórzeniami
prostymi (p. ryc. 42-12 i tab. 42-5). Inna grupa -
receptory sieroce, dla których ligandy nie zostały
jeszcze poznane, wiążą się jako homodimery lub
monomery z sekwencjami powtórzeń prostych.
Jak to podano w tab. 42-5, odkrycie nadrodziny
receptorów jądrowych umożliwiło zrozumienie
mechanizmu regulacji ekspresji genów przez róż¬
ne ksenobiotyki i metabolity oraz metabolizmu
detoksykacji i wydalania fizjologicznych substan¬
cji i egzogennych związków, w tym również le¬
ków. Nie jest zaskoczeniem, że wiedza ta stała się
żyznym polem dla poszukiwań nowych sposobów
terapii.
W regulacji transkrypcji uczestniczy
również duża liczba koregulatorów
receptorów jądrowych
Przebudowa (remodeling) chromatyny, modyfika¬
cja czynnika transkrypcji przez enzymy wykazu¬
jące różną aktywność oraz komunikacja między
receptorami jądrowymi i podstawowym mecha¬
nizmem transkrypcyjnym odbywają się w wyni¬
ku oddziaływania typu białko-białko, w którym
Tabela 42-5. Receptory jądrowe i ich swoiste ligandy1
Receptor
Receptor partnerujący
Ligand
Efekt biologiczny
Receptory aktywowane prolife-
ratorem peroksysomów
PPARa
PARp
PPARy
RXR (DR1)
Kwasy tłuszczowe
Kwasy tłuszczowe
Kwasy tłuszczowe
Tiazolidinediony
Proliferacja peroksysomów
Przemiana tłuszczowa i węglowodanowa
Farnesoid X
FXR
RXR (DR4)
Farnesol kwasy żółciowe
Przemiana kwasów żółciowych
„Liver” X
LXR
RXR (DR4)
Oksysterol
Przemiana cholesterolu
Ksenobiotyk X
CAR
RXR (DR5)
Androstany
Fenobarbital
Ksenobiotyki
Ochrona przed niektórymi lekami, meta¬
bolitami toksycznymi i ksenobiotykami
PXR
RXR (DR3)
Pregnany
Ksenobiotyki
1 Wielu członków nadrodziny receptorów jądrowych odkryto metodą klonowania, a dopiero potem zidentyfikowano odpowiadające im
ligandy. Ligandy te nie są hormonami w klasycznym tego słowa znaczeniu, lecz tylko spełniają podobne funkcje w takim sensie, że ak¬
tywują swoistych „członków” nadrodziny receptorów jądrowych. Opisane tu receptory tworzą heterodimery z receptorem retinolowym
(RXR) i wykazują zmienne sekwencje nukleotydowe, oddzielające elementy wiązania będące pustymi sekwencjami powtarzającymi
się („powtórzeniami pustymi”) (DR1-5). Receptory te regulują rozmaite geny, takie jak geny kodujące cytochromy P-450 (CYP), cyto-
plazmatyczne białka wiążące oraz transportery „kaset” wiążących ATP (ABC), wpływające na metabolizm i chroniące komórkę przed
toksycznym działaniem leków.
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 575
uczestniczą cząsteczki koregulatorowe jednej lub
wielu klas. Liczba znanych już cząsteczek koregu-
latorowych przekracza 100, nie licząc różnic mię-
dzygatunkowych i wariantów „splicingowych”
(połączeniowych). Pierwszą taką cząsteczkę, któ¬
rą należałoby opisać jest białko wiążące CREB
(CBP, ang. CREB-binding protein). CBP wiąże
się za pośrednictwem aminokońcowej domeny
zfosforylowanąserynąwpozycji 137 CREB i po¬
średniczy w transaktywacji indukowanej cAMP.
Dlatego CBP jest określane jako koaktywator.
CBP i jego bliski „krewny”, białko p300, reagują
z licznymi cząsteczkami sygnałowymi, także z ta¬
kimi białkami, jak białko aktywatorowe-1 (AP-1),
przekaźniki sygnałów i aktywatory transkrypcji
(STATS), receptory jądrowe i CREB (ryc. 42-13).
CBP/p300 również wiąże się z białkami - koak-
tywatorami rodziny pl 60 opisanymi niżej, oraz
z wieloma innymi białkami, takimi jak wirusowy
czynnik transkrypcyjny Ela, kinaza białek P90"*
i helikaza A zależna od RNA. Należy wspomnieć,
że CBP/p300 wykazuje aktywność acetylo-
transferazy histonowej (HAT). Znaczenie tego
faktu opisano w dalszej części rozdziału. Niektóre
efekty działania CBP/p300 są między innymi wy¬
nikiem właśnie tej wewnętrznej aktywności enzy¬
matycznej oraz zdolności tego białka do wiązania
innych białek, co pokazano na ryc. 42-11. Inne
koregulatory mogą spełniać podobne funkcje.
Poznano też kilka innych rodzin cząsteczek ko-
aktywatorowych. Wszystkie one mają masę czą¬
steczkową ok. 160 kDa. Rodziny te oraz rodzina
pl60 obejmują takie koaktywatory, jak: 1) SRC-1
i NCoA-1, 2) GRIP 1, TIF2 i NCoA-2 oraz 3) p/
/CIP, ACTR, Albl, RAC3 i TRAM-1 (tab. 42-6).
Różne nazwy poszczególnych członków w obrębie
jednej podrodziny często odzwierciedlają różnice
gatunkowe lub warianty niewielkich różnic „spli-
cingu”. Członkowie różnych podrodzin wykazują
podobieństwo składu aminokwasowego w 35%.
Koaktywatory p 160 wykazują wiele wspólnych
cech: 1) wiążą się z receptorami jądrowymi jak
agoniści (wiązanie to jest zależne od domeny
transaktywacyjnej AF-2), 2) wykazują jednako¬
wy podstawowy motyw typu helisa-pętla-helisa
(bHLH) na N-końcu (p. rozdz. 38), 3) wykazują
słabą domenę transaktywacyjną na C-końcu i sil¬
niejszą na /V-końcu w obszarze potrzebnym dla
oddziaływania z CBP/pl60,4) zawierają przynaj¬
mniej 3 motywy w rodzaju LXXLL, niezbędne
przy oddziaływaniu typu białko-białko z innymi
koaktywatorami oraz 5) często wykazują aktyw¬
ność HAT. Szczególnie ciekawa jest rola HAT, bo¬
wiem mutacje domeny HAT unieczynniają wiele
Btona
plazmatyczna
Btona jądra
komórkowego
Ryc. 42-13. Wiele szlaków transdukcji sygnałów zbiega się (konwerguje) na kompleksie CBP/p300.
Ligandy wiążące się z receptorami błonowymi lub jądrowymi wyzwalają odpowiednie sygnały mogą¬
ce się spotkać na CBP/p300. Istnieje wiele różnych szlaków transdukcji sygnałów. EGF - naskórkowy
czynnik wzrostu, GH - hormon wzrostu, Prl - prolaktyna, TNF - czynnik martwicy nowotworów;
pozostałe skróty są objaśnione w tekście.
576 CZĘŚĆ V: BIOCHEMIA KOMUNIKACJI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
czynników transkrypcyjnych. Obecnie uważa
się, że HAT (która ma określone umiejscowienie
- p. ryc. 41-6) - acetylując histony - powoduje
przebudowę (remodeling) chromatyny i sprzyja
ukształtowaniu się środowiska korzystnego dla
transkrypcji. Doniesiono jednak o innych sub-
stratach białkowych ulegających acetylacji za
pośrednictwem HAT. Sugeruje się, że acetylacja
i deacetylacja odgrywają ważną kliniczną rolę
w ekspresji genów.
Rodzina korepresorów obejmuje małą liczbę bia¬
łek, w tym NCoR i SMRT. Działają one, przynaj¬
mniej częściowo, zgodnie ze schematem podanym
na ryc. 42-2. Inna rodzina obejmuje białka koregu-
latorowe grupy TRAP, DRIP i ARC (tab. 42-6). Te
tzw. białka powiązane z mediatorami mają masę
cząsteczkową od 80 do 240 kDa; przypuszcza się,
że uczestniczą one w naprowadzaniu kompleksu
jądrowego złożonego z receptora i koaktywatora
do RNA polimerazy II i innych komponentów pod¬
stawowego aparatu transkrypcyjnego.
Tabela 42-6. Niektóre białka koregulatorowe ssaków
I. Rodzina koaktywatorów o masie cząsteczkowej 300 kDa
A. CBP - Białko wiążące CREB
B. p300 - Białko o m.cz. 300 kDa
II. Rodzina koaktywatorów o masie cząsteczkowej 160 kDa
A. SRC-1 - Koaktywator 1 receptora steroidowego
NCoA-1 - Koaktywator 1 receptora jądrowego
B. TIF2 - Czynnik transkrypcyjny pośredniczący 2
GRIP1 - Białko oddziałujące z receptorem glukokortykoi-
dowym
NCoA-2 - Koaktywator 2 receptora jądowego
C. p/CIP - Białko 1 łączące się z kointegratorem p300/CBP
ACTR - Aktywator receptorów dla hormonów tarczycy
i kwasu retinolowego
AIB - Koaktywator wzmocniony w raku piersi
RAC3 - Koaktywator 3 łączący się z receptorem
TRAM-1 - Cząsteczka 1 aktywatora TR
III. Kopresory
A. NCoR - Korepresor receptora jądrowego
B. SMRT - Mediator wyciszający dla RXR i TR
IV. Białka powiązane z mediatorami
A. TRAPs - Białka łączące się z receptorem dla hormonów
tarczycy
B. DRIPs - Białka oddziałujące z receptorem dla wit. D
C. ARC - Kofaktor rekrutowany przez aktywator
Rola wymienionych koaktywatorów jest obec¬
nie przedmiotem intensywnych badań. Wiele
z tych białek wykazuje wewnętrzną (własną)
aktywność enzymatyczną. Jest to szczególnie
interesujące zważywszy na fakt, że acetylacja,
fosforylacja, metylacja, sumoilacja i ubikwityla-
cja - podobnie jak proteoliza i translokacja ko¬
mórkowa - mogą zmienić aktywność niektórych
z wymienionych koregulatorów i ich obiektów
docelowych.
Wydaje się, że pewna kombinacja koregulato¬
rów (i co za tym idzie - różne kombinacje akty¬
watorów i inhibitorów) jest odpowiedzialna za
występowanie swoistych, indukowanych ligan-
dem efektów z udziałem różnych receptorów. Po¬
nadto wpływ ten na określony promotor jest bar¬
dzo dynamiczny. Zdarza się nawet, że kompleks
złożony z aż 47 czynników transkrypcyjnych
może oddziaływać na pojedynczy gen.
STRESZCZENIE
• Hormony, cytokiny, interleukiny i czynniki
wzrostowe uruchamiają różnorodne mechani¬
zmy sygnałowe w celu ułatwienia przebiegu
komórkowych reakcji adaptacyjnych.
• Kompleks ligand-receptor jest inicjującym syg¬
nałem dla członków rodziny receptorów jądro¬
wych.
• Hormony klasy II, wiążące się z receptorami
błony komórkowej, wyzwalają rozmaite syg¬
nały śródkomórkowe. Spośród nich należy wy¬
mienić cAMP, cGMP, Ca2+, fosfatydyloinozyty-
dy i kaskady kinaz białek.
• Wiele efektów hormonalnych jest wynikiem
zmiany szybkości transkrypcji swoistych ge¬
nów.
• Białka nadrodziny receptorów jądrowych od¬
grywają kluczową rolę w regulacji transkrypcji
genów.
• Te receptory, dla których ligandami są hormo¬
ny, metabolity lub leki, wiążą się ze swoistymi
sekwencjami DNA w postaci homodimerów
lub heterodimerów (zawierających jako partne¬
ra RXR).
• Niektóre receptory - zwane receptorami siero¬
cymi, dla których nie są znane swoiste ligandy,
również wiążą się z DNA i wpływają na proces
transkrypcji.
• Inna duża grupa białek koregulatorowych in¬
dukuje przebudowę chromatyny, modyfikuje
innne czynniki transkrypcji i tworzy pomost
między receptorami jądrowymi i podstawowym
aparatem transkrypcyjnym.
42. DZIAŁANIE HORMONÓW ITRANSDUKCJA SYGNAŁÓW 577
PIŚMIENNICTWO
Arvanitakis L et al: Constitutively signaling G-protein-
-coupled receptors and human disease. Trends En-
docrinol Metab 1998;9:27.
Damell JE Jr, Kerr IM, Stark GR: Jak-STAT pathways
and transcriptional activation in response to IFNs
and other extracellular signaling proteins. Science
1994;264:1415.
Fantl WJ, Johnson DE, Williams LT: Signalling by re¬
ceptor tyrosine kinases. Annu Rev Biochem 1993;
62:453.
Hanoune J, Defer N: Regulation and role of adenylyl
cyclase isoforms. Annu Rev Pharmacol Toxicol
2001 ;41:145.
Jaken S: Protein kinase C isozymes and substrates. Curr
Opin Celi Biol 1996;8:168.
Lee C-H, Olson P, Evans RM: Mini-review: Lipid me-
tabolism, metabolic diseases and peroxisome pro-
liferators-activated receptor. Endocrinology 2003;
144:2201.
Lonard DM, 0’Malley BW: Expanding functional di-
versity of the coactivators. Trends Biochem Sci
2005;30:126.
Montminy M: Transcriptional regulation by cyclic AMP.
Annu Rev Biochem 1997;66:807.
Morris AJ, Malbon CC: Physiological regulation of
G protein-linked signaling. Physiol Rev 1999;
79:1373.
Perissi V, Rosenfield MG: Controlling nuclear recep¬
tors: the circular logie of cofactor cycles. Nat Rev
Mol Celi Biol 2005;6:542.
Walton KM, Dixon JE: Protein tyrosine phosphatases.
Annu Rev Biochem 1993;62:101.
CZĘSC VI
Wybrane zagadnienia
Żywienie, trawienie i wchłanianie
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD DSc.
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Oprócz wody dieta musi dostarczyć metabolicz¬
nego „paliwa” (głównie węglowodanów i tłusz¬
czów), białka (potrzebnego do wzrostu i tkanko¬
wego obrotu białkowego), włókna (do tworzenia
masy kałowej), składników mineralnych (zawie¬
rających pierwiastki spełniające swoiste funkcje
metaboliczne), witamin i egzogennych kwasów
tłuszczowych (związków organicznych potrzeb¬
nych w mniejszych ilościach do innych funkcji
metabolicznych i fizjologicznych). Polisachary¬
dy, triacyloglicerole i białka tworzą główną masę
pokarmową. Związki te, zanim zostaną wchło¬
nięte i przetworzone muszą ulec hydrolizie, od¬
powiednio, do monosacharydów, kwasów tłusz¬
czowych i aminokwasów. Składniki mineralne
i witaminy, przed wchłonięciem i zużytkowa¬
niem ich, muszą zostać uwolnione ze złożonej
masy pokarmowej.
Niedożywienie występuje na całym świecie;
prowadzi ono do upośledzenia wzrostu, zaburzeń
czynności układu immunologicznego oraz zmniej¬
szonej wydolności w pracy. W krajach rozwinię¬
tych spożywanie pokarmów jest z kolei nadmier¬
ne (szczególnie tłuszczów) i staje się przyczyną
otyłości oraz rozwoju chorób sercowo-naczynio-
wych, a także niektórych postaci nowotworów.
Niedobory witaminy A, żelaza i jodu, stanowią
w wielu krajach poważne problemy zdrowotne,
a niedobory innych witamin i składników mine¬
ralnych są głównymi przyczynami złego stanu
zdrowia. W krajach rozwiniętych niedobory ży¬
wieniowe występują rzadko, chociaż są grupy
ludzi, u których istnieje ryzyko niedożywienia.
Pobranie składników mineralnych i witamin, wy¬
starczające, aby uchronić się przed chorobą, może
się okazać niewystarczające, aby cieszyć się bar¬
dzo dobrym zdrowiem i długowiecznością.
Nadmierna sekrecja kwasu solnego u chorych
z infekcją Helicobacter pylon może być przyczy¬
ną wrzodów żołądka i dwunastnicy. Małe zmia¬
ny składu żółci mogą być przyczyną krystalizacji
cholesterolu i powstawania kamieni żółciowych.
Upośledzone wydzielanie soku trzustkowego
(charakterystyczne dla fibrosis cystica) może po¬
wodować niedożywienie i biegunki tłuszczowe.
Nietolerancja laktozy jest następstwem niedo¬
boru laktozy i przyczyną biegunek oraz zaburzeń
jelitowych. Wchłanianie się nierozłożonych pep-
tydów do krwi, zdolnych do zapoczątkowania po¬
wstawania przeciwciał, może być przyczyną wy¬
stąpienia reakcji nadwrażliwości i celiakii, czyli
nadwrażliwości na gluten.
43. ŻYWIENIE, TRAWIENIE I WCHŁANIANIE 579
TRAWIENIE I WCHŁANIANIE
WĘGLOWODANÓW
Trawienie węglowodanów polega na ich hydroli¬
zie prowadzącej do uwolnienia oligosacharydów,
a następnie mono- i disacharydów. Iloraz wzrostu
stężenia glukozy we krwi, występującego po po¬
daniu określonej dawki węglowodanów, i wzrostu
glikemii, występującego po podaniu równoważ¬
nej dawki glukozy, określa się jako wskaźnik gli-
kemiczny. Dla glukozy i galaktozy wskaźnik gli-
kemiczny wynosi 1. Podobny wskaźnik wykazuje
laktoza, maltoza, izomaltoza i trehaloza (bowiem
cukry te, ulegając hydrolizie, uwalniają mono-
sacharydy). Fruktoza i alkohole cukrowe wchła¬
niają się szybciej i wykazują indeks glikemiczny
mniejszy od jedności, podobnie jak sacharoza.
Wskaźnik glikemiczny skrobi waha się od ok. 1
do ok. 0; spowodowane jest to różną szybkością
hydrolizy. Dla polisacharydów nieskrobiowych
wskaźnik glikemiczny wynosi 0. Pokarmy o niż¬
szym wskaźniku glikemicznym uważa się za bar¬
dziej korzystne, wywołują one bowiem mniejsze
wahania w sekrecji insuliny.
Amylazy katalizują hydrolizę skrobi
Hydrolizę skrobi katalizują amylazy ślinowe
i trzustkowe, rozrywające wiązania a(l->4)-gli-
kozydowe. W następstwie ich działania powstają
dekstryny, a następnie mieszanina glukozy, malto¬
zy i izomaltozy (w wyniku zadziałania na miejsce
rozgałęzienia amylopektyn).
Disacharydazy sa enzymami rąbka
szczoteczkowego
Disacharydazy, takie jak maltaza, sacharozo-izo-
maltaza (jest to enzym dwufunkcyjny, katalizu¬
jący hydrolizę sacharozy i izomaltozy), laktaza
i trehalaza, występują w rąbku szczoteczkowym
nabłonka jelitowego, gdzie następuje wchłanianie
powstałych monosacharydów i innych składni¬
ków pokarmowych. U większości ludzi, z wyjąt¬
kiem mieszkańców północnej Europy, począwszy
od lat młodzieńczych zachodzi stopniowa utrata
laktazy, co prowadzi do wystąpienia nietoleran¬
cji laktozy w wieku dorosłym. U tych osób lakto¬
za powstaje w świetle jelit, gdzie stanowi substrat
dla fermentacji bakteryjnej, objawiającej się po¬
wstawaniem mleczanów i wystąpieniem biegunek
oraz wzdęć.
Wchłanianie monosacharydów w jelicie
cienkim odbywa sie wg dwóch odrębnych
mechanizmów
Glukoza i galaktoza ulegają wchłanianiu w proce¬
sie sodozależnym. Cukry te są przenoszone przez
to samo białko transportujące (SGLT 1) i wza¬
jemnie konkurują o wiązanie z nim w procesie
wchłaniania (ryc. 43-1). Inne monosacharydy ule¬
gają resorpcji wg mechanizmu dyfuzji za pośred¬
nictwem przenośnika. Ponieważ transport tych
ostatnich nie jest transportem aktywnym, fruktoza
i alkohole cukrowe ulegają wchłanianiu zgodnie
z gradientem stężeń. Przy umiarkowanie podwyż¬
szonej podaży takich cukrów niewielkie jego ilo-
Biatko
Ryc. 43-1. Transport glukozy, fruktozy i galaktozy przez nabłon¬
ki jelitowe. Transporter SGLT 1 jest sprzężony z pompą Na+-K+,
umożliwiającą transport glukozy i galaktozy w kierunku przeciw¬
nym do gradientu stężeń. Transporter GLUT 5 jest Na+-niezależny
i ułatwia transport fruktozy, glukozy i galaktozy zgodnie z gradien¬
tem stężeń. Wszystkie cukry opuszczają komórkę za pośredni¬
ctwem transportera GLUT 2.
580 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
ści pozostają w świetle jelita, stając się substratem
dla fermentacji bakteryjnej.
TRAWIENIE I WCHŁANIANIE TŁUSZCZÓW
Głównymi lipidami zawartymi w pokarmach są
triacyloglicerole i, w mniejszym stopniu, fosfoli¬
pidy. Są to cząsteczki hydrofobowe i muszą ulec
hydrolizie oraz rozbiciu na małe kropelki, zwane
micelami, zanim zostaną wchłonięte. Rozpusz¬
czalne w tłuszczach witaminy, czyli witaminy A,
D, E i K, oraz różnorodne lipidy (w tym chole¬
sterol) ulegają resorpcji pod postacią miceli lipi¬
dowych. Wchłanianie witamin rozpuszczalnych
w tłuszczach jest upośledzone, jeżeli spożywa się
dietę ubogotłuszczową.
Hydrolizę triacylogliceroli rozpoczyna lipaza
zawarta w ślinie i soku żołądkowym, która ata¬
kuje wiązanie sn-3-estrowe, tworząc 1,2-diacy-
loglicerol i wolny kwas tłuszczowy, wspomaga¬
jące proces emulsyfikacji. Lipaza trzustkowa jest
wydzielana do jelita cienkiego i do rozwinięcia
swego działania hydrolitycznego potrzebuje dru¬
giego białka trzustkowego, zwanego kolipazą.
Lipaza trzustkowa swoiście rozkłada wiązanie
estrowe triacylogliceroli w pozycji 1 i 3. W wy¬
niku tej reakcji powstają: 2-monoacyloglicerol
i wolne kwasy tłuszczowe, jako produkty koń¬
cowe trawienia triacylogliceroli w świetle jelita.
Monoacyloglicerole są słabymi substratami dla
procesu hydrolizy, w związku z tym mniej niż
25% spożytych triacylogliceroli ulega całkowi¬
tej hydrolizie do glicerolu i wolnych kwasów
tłuszczowych (ryc. 43-2). Sole kwasów żółcio¬
wych, powstałe w wątrobie i wydzielane z żółcią,
umożliwiają emulsyfikację produktów trawienia
tłuszczów, tworząc micele razem z fosfolipida¬
mi i cholesterolem zawartym w żółci. Ponieważ
micele są rozpuszczalne, ułatwiają transport pro¬
duktów trawienia tłuszczów i rozpuszczonych
w nich witamin przez wodne środowisko świat¬
ła jelita do rąbka szczoteczkowego, gdzie za¬
chodzi proces wchłaniania ich przez enterocyty
(nabłonek jelitowy). Sole kwasów żółciowych
dostają się do jelita cienkiego krętego, gdzie
większość ulega resorpcji; jest to tzw. krążenie
jelitowo-wątrobowe (rozdz. 26). W obrębie na¬
błonka jelitowego 1-monoacyloglicerole ulegają
rozkładowi do wolnych kwasów tłuszczowych
i glicerolu, a 2-monoacyloglicerole ulegają reacy-
lacji, tworząc triacyloglicerole. Ten ostatni proces
odbywa się szlakiem monoacyloglicerolowym.
Uwolniony do światła jelita w czasie hydrolizy
triacylogliceroli glicerol nie ulega reutylizacji,
lecz dostaje się do krążenia wrotnego. Glicerol
powstały w obrębie komórek nabłonka jelitowego
ulega reutylizacji w wyniku syntezy triacylogli¬
ceroli w normalnym szlaku kwasu fosfatydowego
(rozdz. 24). W obrębie komórek nabłonkowych
jelita długołańcuchowe kwasy tłuszczowe ulegają
estryfikacji, tworząc triacyloglicerole; te ostatnie,
wraz z innymi produktami trawienia tłuszczów, są
wydzielane do naczyń chłonnych w postaci miceli,
skąd dostają się przez przewód piersiowy do krwi
krążącej (rozdz. 25). Kwasy tłuszczowe krótko-
i średniołańcuchowe dostają się głównie do krąże¬
nia wrotnego w postaci nieestryfikowanej.
TRAWIENIE I WCHŁANIANIE BIAŁEK
Białka niezdenaturowane, czyli niepoddane dzia¬
łaniu wysokiej temperatury (gotowanie) lub kwa¬
su solnego, mają tylko kilka wiązań, na które
mogą działać enzymy proteolityczne.
Wiele grup enzymów katalizuje trawienie
białek
Istnieją dwie podstawowe grupy enzymów prote¬
olitycznych (proteazy) różniące się swoistością
wiązania peptydowego, które ulega rozerwaniu.
Endopeptydazy hydrolizują wiązania peptydowe
między swoistymi aminokwasami, występujące
w dowolnym miejscu cząsteczki. Są to enzymy
pierwszego ataku, rozkładające białka na dużą
liczbę mniejszych fragmentów. Do tych enzymów
należą pepsyna soku żołądkowego oraz trypsy-
na, chymotrypsyna i elastaza, wydzielane przez
trzustkę do światła jelita. Egzopeptydazy katali¬
zują przerwanie wiązania peptydowego znajdują¬
cego się na końcach łańcucha polipeptydowego.
Karboksypeptydazy, występujące w soku trzust¬
kowym, odłączają aminokwas znajdujący się na
karboksylowym końcu łańcucha polipeptydowe¬
go (aminokwas C-końcowy), aminopeptydazy
zaś (wytwarzane przez komórki nabłonka jeli¬
towego) - aminokwas N-końcowy. Dipeptydazy
rąbka szczoteczkowego katalizują hydrolizę di-
peptydów, które nie są substratami ani dla amino-
peptydaz, ani dla karboksypeptydaz.
Szlak monoacyloglicerolowy
43. ŻYWIENIE, TRAWIENIE I WCHŁANIANIE 581
1 ““ ***• »«“ »«"“ "<« a* zm**. «*** „!gW„, »a«t „„
582 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Proteazy wydzielane są jako nieaktywne zymo-
geny; centrum katalityczne enzymu jest zasłonięte
przez mały odcinek łańcucha peptydowego. Moż¬
na je odsłonić przez hydrolizę swoistego wiązania
peptydowego. Pepsynogen ulega aktywacji do
pepsyny pod wpływem kwasu solnego soku żo¬
łądkowego lub samej aktywnej pepsyny (autoka-
taliza). W jelicie cienkim trypsynogen - prekursor
trypsyny ulega aktywacji pod wpływem entero-
peptydazy, wydzielanej przez komórki nabłonko¬
we dwunastnicy. Z kolei powstała trypsyna może
aktywować chymotrypsynogen do chymotrypsy-
ny, proelastazę do elastazy, prokarboksypeptyda-
zę do karboksypeptydazy, proaminopeptydazę zaś
do aminopeptydazy.
Wolne aminokwasy i małe peptydy
ulegają resorpcji wg różnych
mechanizmów
Produktami końcowymi działania endopeptydaz
i egzopeptydaz jest mieszanina wolnych amino¬
kwasów, di- i tripeptydów oraz oligopeptydów;
wszystkie one ulegają resorpcji. Wchłanianie
wolnych aminokwasów przez nabłonek jelito¬
wy odbywa się wg mechanizmu Na+-zależnego
transportu aktywnego. Istnieje kilka różnych
transporterów aminokwasowych, swoistych dla
rodzaju łańcucha bocznego aminokwasu (łańcu¬
chy boczne duże lub małe, elektrycznie obojętne,
kwaśne lub zasadowe). Aminokwasy transporto¬
wane przez ten sam przenośnik konkurują ze sobą
zarówno o pierwszeństwo wchłaniania, jak i wy¬
chwytu przez tkanki. Dipeptydy i tripeptydy, po
dostaniu się do rąbka szczoteczkowego, ulegają
rozkładowi do wolnych aminokwasów, po czym
dostają się do krwi żyły wrotnej. Względnie duże
peptydy mogą ulec resorpcji w postaci niezmie¬
nionej szlakiem transcellulamym albo paracellu-
lamym. Wiele z tych peptydów jest dostatecznie
dużych, by indukować powstawanie przeciwciał,
co tłumaczy patomechanizm nadwrażliwości na
niektóre pokarmy.
TRAWIENIE I WCHŁANIANIE WITAMIN
ORAZ SKŁADNIKÓW MINERALNYCH
W procesie trawienia pokarmów są uwalniane
witaminy i składniki mineralne, lecz nie cała ich
ilość, bowiem dostępność witamin i składników
mineralnych zależy od rodzaju pokarmu, szcze¬
gólnie w odniesieniu do składników mineralnych.
Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach są wchła¬
niane w postaci miceli tłuszczowych, tworzących
się w procesie trawienia; witaminy rozpuszczalne
w wodzie i większość składników mineralnych
ulega absorpcji w jelicie cienkim. Te ostatnie są
wchłaniane wg mechanizmu transportu aktywne¬
go lub dyfuzji z udziałem przenośnika. W obrębie
enterocytów składniki mineralne ulegają zagęsz¬
czeniu, co umożliwia dostanie się ich do krwi
zgodnie z gradientem stężeń. Absorpcja witaminy
B12 wymaga obecności swoistego białka transpor¬
tującego, określanego jako czynnik wewnętrzny
(ang. intrinsic factor). Absorpcja wapnia zależy
od obecności witaminy D. Wchłanianie cynku
prawdopodobnie wymaga obecności ligandu wią¬
żącego cynk, wydzielanego przez egzokrynną
część trzustki.
[Należy podkreślić, że wchłanianie żelaza jest
ograniczone i zależne od wielu czynników, ta¬
kich jak hepcydyna, transferryna, ferrytyna i inne
-przyp. tłum.].
Wchłanianie wapnia zależy od witaminy D
Oprócz tego, że witamina D reguluje homeostazę
wapniową, jej obecność jest niezbędna w procesie
wchłaniania Ca2+ w jelitach. Syntezę śródkomór-
kowego białka wiążącego wapń - kalbindyny,
niezbędnego w procesie wchłaniania wapnia, in¬
dukuje witamina D. Witamina ta wpływa także
na przepuszczalność komórek śluzówki jelita dla
wapnia; proces ten zachodzi bardzo szybko i jest
niezależny od syntezy białek.
W świetle jelita kwas fitynowy (heksafosforan
inozytolu), zawarty w pokarmach zbożowych,
wiąże wapń, przez co utrudnia jego wchłanianie.
Inne składniki, jak np. cynk, również ulegają che-
lacji przez fitynian. Stanowi to istotny problem dla
ludzi spożywających duże ilości przaśnych pro¬
duktów, wyrabianych z pełnych ziaren pszenicy.
Drożdże zawierają enzym fitazę, defosforylującą
fitynian i go inaktywującą. Ograniczać wchła¬
nianie wapnia mogą również wysokie stężenia
kwasów tłuszczowych w świetle jelit, jako wynik
upośledzonego ich wchłaniania; kwasy tłuszczo¬
we tworzą bowiem nierozpuszczalne sole wapnia.
Również zwiększone spożycie kwasu szczawio-
43. ŻYWIENIE, TRAWIENIE I WCHŁANIANIE 583
wego może czasem być przyczyną niedoboru Ca2+
w ustroju, gdyż kwas ten tworzy z jonami wapnia
nierozpuszczalny szczawian wapnia.
Wchłanianie żelaza jest ograniczone
i dokładnie kontrolowane, zwiększa się
jednak pod wpływem witaminy C
i alkoholu
Chociaż niedobory żelaza są powszechnym pro¬
blemem społecznym, ok. 10% ludności jest ge¬
netycznie zagrożona rozwojem hemochromato-
zy. Dlatego też, w celu uniknięcia efektów nie¬
pożądanych spowodowanych nieenzymatyczną
generacją wolnych rodników przez jony żelaza,
wchłanianie Fe jest dokładnie regulowane. Nieor¬
ganiczne żelazo ulega akumulacji w komórkach
błony śluzowej jelita cienkiego i związaniu przez
białko śródkomórkowe, zwane ferrytyną. Po cał¬
kowitym wysyceniu ferrytyny żelazem, dalsze
wnikanie tego pierwiastka do komórki zostaje za¬
blokowane. Żelazo może opuścić komórkę tylko
wtedy, kiedy zwiąże go transferyna osocza krwi.
Po całkowitym wysyceniu transferyny żelazem
pozostałe jego ilości, zawarte w enterocytach, ule¬
gają wydaleniu wraz ze złuszczającym się nabłon¬
kiem jelitowym. Wskutek istnienia tej śluzówko-
wej bariery zaledwie ok. 10% żelaza zawartego
w pokarmach ulega absorpcji, w tym tylko 1-5%
pochodzi z pokarmów roślinnych (rozdz. 50).
Nieorganiczne żelazo ulega absorpcji w po¬
staci Fe2+ (forma redukowana), a zatem związ¬
ki o własnościach redukujących nasilają proces
wchłaniania. Spośród tych związków witami¬
na C najskuteczniej zwiększa wchłanianie że¬
laza. Przy spożywaniu 40-80 mg tej witaminy
dziennie zapotrzebowanie na nią jest pokryte
w nadmiarze. Spożycie 25-50 mg witaminy C
w czasie jednego posiłku zwiększa w dostatecz¬
nym stopniu wchłanianie żelaza, szczególnie u
osób leczonych solami żelaza z powodu niedo¬
krwistości syderopenicznej. Wchłanianie żelaza
zwiększają również alkohol i fruktoza. Żelazo
hemowe zawarte w mięsie wchłania się oddziel¬
nym szlakiem i jego biodostępność jest większa
niż żelaza nieorganicznego. Wchłanianie żelaza
zarówno hemowego, jak i nieorganicznego ulega
upośledzeniu przez wapń - wystarczy wypicie
szklanki mleka, by wchłanianie żelaza znacznie
się zmniejszyło.
BILANS ENERGETYCZNY:
PRZEKARMIENIE I NIEDOŻYWIENIE
Woda dostarczona organizmowi jest przede
wszystkim potrzebna do przemian energetycz¬
nych związanych z gospodarką tłuszczową, wę¬
glowodanową i aminokwasową (p. tab. 16-1).
Pobór pokarmów w ilościach przekraczających
zapotrzebowanie prowadzi do otyłości, natomiast
pobór pokarmów w ilościach mniejszych od za¬
potrzebowania - do wyczerpania, wyniszczenia,
uwiądu i może być przyczyną zespołu kwashior-
kor [niedobór energetyczno-białkowy - przyp.
tłum.]. Zarówno otyłość, jak i duże niedożywie¬
nie są przyczyną zwiększonej śmiertelności. Do
oceny stopnia otyłości używa się najczęściej tzw.
wskaźnika masy ciała (BMI), który określa się
ilorazem masy ciała (w kilogramach) i kwadratu
wzrostu (w metrach):
masa ciała [kg]
BMI =
wzrost2 [m2]
Wymagana wartość BMI zawiera się w zakresie
20-25.
Zapotrzebowanie na energię oblicza się,
mierząc wydatek energetyczny
Wydatek energetyczny można określić, mierząc
ilość ciepła wytwarzanego przez ustrój, najczꜬ
ciej jednak określa się go pośrednio, mierząc
wielkość konsumpcji tlenu. Normalnie zużycie
1 litra tlenu dostarcza 20 kJ energii, niezależnie
od tego, czy paliwem był metabolizm węglowo¬
danów, tłuszczów czy białek (p. tab. 16-1).
Pomiar ilorazu objętości wytworzonego dwu¬
tlenku węgla i objętości zużytego tlenu (jest to
tzw. współczynnik oddechowy - RQ) jest wskaź¬
nikiem składu mieszaniny utlenianego paliwa me¬
tabolicznego (p. tab. 16-1).
Nowocześniejsza technika umożliwia określe¬
nie wydatku energetycznego całego ciała w ciągu
1-2 tygodni przy użyciu podwójnie znakowanej
wody 2H2,80. 2H opuszcza ustrój tylko w posta¬
ci wody, natomiast ,802 - w postaci wody i dwu¬
tlenku węgla. Na podstawie różnicy w szybkości
utraty znakowanych związków można określić
całkowitą ilość wytworzonego C02, a następnie
zużycie tlenu i wydatek energetyczny.
584 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Podstawowa przemiana materii (BMR, ang.
basal metabolic ratę) jest to ilość energii wydat¬
kowanej na podtrzymanie podstawowych proce¬
sów fizjologicznych w warunkach standardowych
(osoba nie powinna spać, powinna przebywać
w ciepłym pomieszczeniu, a pomiary wydatku
energetycznego należy przeprowadzić 12 go¬
dzin po ostatnim posiłku). Wartość BMR zależy
od masy ciała, wieku i płci. Całkowity wydatek
energetyczny ustroju zależy od BMR, od ilości
energii wydanej na aktywność fizyczną oraz od
energii wydatkowanej na wytworzenie rezerw
w stanie sytości. Możliwe jest więc obliczenie
zapotrzebowania energetycznego każdego czło¬
wieka w oparciu o takie wskaźniki, jak masa
ciała, wiek, płeć i stopień aktywności fizycznej.
Masa ciała ma wpływ na wartość BMR, ponieważ
w ciele o większej masie znajduje się większa
ilość aktywnych tkanek. Zmniejszanie się war¬
tości BMR w miarę starzenia się organizmu, na¬
wet jeśli ogólna masa ciała nie ulega zmianie,
jest spowodowane zanikiem masy mięśniowej,
zastępowanej przez metabolicznie mniej aktyw¬
ną tkankę tłuszczową. Dlatego też wartość BMR
kobiet jest znacznie mniejsza niż mężczyzn, cia¬
ło kobiety bowiem zawiera więcej tkanki tłusz¬
czowej.
Wydatek energetyczny wzrasta
proporcjonalnie do wzrostu
aktywności fizycznej
Najlepiej wydatek energetyczny związany z aktyw¬
nością fizyczną wyrazić jako wielokrotność BMR.
I tak, siedzący tryb życia jest związany z wydat¬
kiem energetycznym równym 1,1-1,2xBMR.
Intensywny wysiłek fizyczny (chodzenie po scho¬
dach lub wspinanie się pod górę) może zwiększyć
wydatek energetyczny do 6-8 x BMR.
Dziesięć procent energii dostarczonej
z pokarmami zostaje zużyta
na tworzenie rezerw
Po spożyciu posiłków obserwuje się znaczny
wzrost termogenezy (termogeneza indukowana
posiłkiem). Mała część tego wydatku energetycz¬
nego jest związana z sekrecją enzymów trawien¬
nych, natomiast większa część - z syntezą rezerw
glikogenu, triacylogliceroli i białek.
Wyróżnia się dwie ekstremalne
postacie niedożywienia
Uwiąd (marasmus) może występować zarów¬
no u dzieci, jak i dorosłych, w grupach ludno¬
ści narażonej na uszkodzenia ciała (zranienia).
Kwashiorkor występuje tylko u dzieci i jedynie
w krajach słabo rozwiniętych. Cechą różnicującą
kwashiorkor jest obecność obrzęków (wzmożona
retencja płynów). Marasmus charakteryzuje się
krańcowym wycieńczeniem. Jest on wynikiem
długotrwałego ujemnego bilansu energetyczne¬
go. Wyczerpują się rezerwy tłuszczowe ustroju,
zanikają mięśnie, a w przypadkach krańcowych
dochodzi do utraty białka w mięśniu sercowym,
wątrobie i nerkach. Aminokwasy uwolnione
w następstwie katabolizmu białkowego służąjako
paliwo metaboliczne oraz są substratami gluko-
neogenezy, dostarczającej niezbędnej dla mózgu
i krwinek czerwonych glukozy (p. rozdz. 20).
Niedostateczna synteza białek (immunoglobulin)
jest przyczyną upośledzonej odporności humoral-
nej i wzrostu ryzyka zakażeń. Zaburzeniu ulega
również proliferacja nabłonka jelitowego, prowa¬
dząca do zmniejszenia powierzchni resorpcyjnej
jelit i - co za tym idzie - ograniczenia wchłania¬
nia składników odżywczych.
Chorzy z zaawansowana choroba
nowotworowa i chorzy na AIDS
wykazują cechy złego odżywienia
Chorzy z zaawansowaną chorobą nowotworo¬
wą, chorzy na AIDS (zakażeni wirusem HIV)
i chorzy na wiele przewlekłych chorób często są
niedożywieni i wykazują objawy kacheksji. Ba¬
daniem fizykalnym stwierdza się objawy uwiądu
(marasmus), lecz utrata białka u takich chorych
jest znacznie większa niż u chorych głodzonych.
Sekrecją cytokin indukowana infekcją lub no¬
wotworem jeszcze bardziej zwiększa katabolizm
białek tkankowych. Ta cecha odróżnia kacheksję
od uwiądu, w którym synteza białek jest mniej¬
sza, lecz ich katabolizm jest normalny. Chorzy ci
wykazują hipermetabolizm, czyli wzrost BMR.
Wiele nowotworów spala glukozę szlakiem bez¬
tlenowym, prowadzącym do powstawania mle¬
czanów. Mleczany te są zużywane do syntezy glu¬
kozy (w procesie zwanym glukoneogenezą) przez
wątrobę kosztem wydatku energetycznego równe-
43. ŻYWIENIE, TRAWIENIE I WCHŁANIANIE 585
go 6 ATP na każdy mol powstałej glukozy (p. ryc.
20-4). Ponadto dochodzi do silniejszej stymulacji
przez cytokiny syntezy białek rozsprzęgających
fosforylacja oksydacyjną, co prowadzi do wzro¬
stu termogenezy i wzrostu utleniania paliwa me¬
tabolicznego. Występuje daremny (bezskuteczny)
obrót lipidów, charakteryzujący się aktywacją
przez proteoglikan (wydzielany przez nowotwór)
lipazy wrażliwej na hormony. W wyniku tej ak¬
tywacji zostają uwolnione z tkanki tłuszczowej
kwasy tłuszczowe, które w wątrobie ulegają ener¬
gochłonnej reestryfikacji do triacylogliceroli i są
wydzielane do krwi jako VLDL.
Kwashiorkor występuje u dzieci
niedożywionych
Oprócz cech typowych dla marasmusa (zanik
mięśni, utrata nabłonka jelitowego, upośledzenie
reakcji odpornościowych) u dzieci chorych na
kwashiorkor występuje kilka dodatkowych obja¬
wów. Spośród nich należy na pierwszym miejscu
wymienić obrzęki, którym towarzyszy hipoprote-
inemia. Ponadto stwierdza się powiększenie wą¬
troby, spowodowane gromadzeniem się lipidów
w hepatocytach. Pierwotnie przypuszczano, że
przyczyną kwashiorkoru jest brak w diecie białka
przy mniej więcej prawidłowej wartości energe¬
tycznej diety. Analiza składu diet takich dzieci nie
potwierdziła słuszności tej hipotezy. Dzieci z ze¬
społem kwashiorkor są mniej zahamowane w roz¬
woju niż chore na marasmus i już w fazie leczenia
cofały się u nich obrzęki, kiedy nadal otrzymywa¬
ły dietę niskobiałkową.
Zwykle kluczowym czynnikiem wystąpienia
zespołu kwashiorkor jest infekcja. Przypuszcza
się, że u dzieci z kwashiorkor nakładają się dwa
elementy: niedobór składników odżywczych i nie¬
dobór substancji antyoksydacyjnych, takich jak
cynk, miedź, karoten, witamina C i E. Afekt
oddechowy (wybuch oddechowy) kwashiorkor
spowodowany infekcją prowadzi do wytworzenia
cytotoksycznych wolnych rodników tlenowych
i halogenowych, wytwarzanych przez pobudzo¬
ne makrofagi. Ten dodatkowy stres oksydacyjny
może stanowić dodatkowy czynnik wyzwalający
rozwój kwashiorkor.
ZAPOTRZEBOWANIE NA BIAŁKA
I AMINOKWASY
Zapotrzebowanie na białka może być
określone na podstawie wyznaczonego
bilansu azotowego
Stan odżywienia białkowego można określić, ba¬
dając pobranie i wydalenie związków azotowych
z ustroju. Chociaż kwasy nukleinowe też zawie¬
rają azot, to jednak białka zawarte w pokarmach
są głównym źródłem azotu; wyznaczenie ilości
azotu całkowitego jest zatem dobrym sposobem
ustalenia wielkości pobrania białka. Pobranie
białka można określić na podstawie następujące¬
go wzoru:
mg N x 6,25 = mg białka
opartego na założeniu, że azot stanowi 16% masy
większości białek. Azot jest wydalany przez
ustrój:
- głównie z moczem, w większości pod postacią
mocznika, a w mniejszej ilości pod postacią in¬
nych związków,
- z kałem, w postaci niestrawionych białek,
- przez skórę, w postaci białek zawartych w pocie
i złuszczonych komórek naskórkowych. [Cza¬
sem utrata białka przez skórę może być bardzo
duża (np. w oparzeniach) - przyp. tłum.].
Różnica między ilością związków azotowych
pobrana i wydalona jest określana jako bilans azo¬
towy ustroju. Można wyróżnić trzy rodzaje bilan¬
su azotowego. U zdrowych dorosłych osób bilans
azotowy jest wyrównany, kiedy ilość związków
azotowych pobrana jest równa ilości wydalonej
z ustroju, a zatem ogólna zawartość białka w ustro¬
ju nie ulega zmianie. U dzieci w okresie wzrostu,
kobiet w ciąży i ozdrowieńców (po utracie białka)
wydalanie związków azotowych jest mniejsze niż
ich pobranie, a zatem bilans azotowy jest dodat¬
ni; stwierdza się zatrzymanie azotu w ustroju pod
postacią białek. U osób po urazie lub z infekcją
pobranie azotu jest niedostateczne w stosunku do
zapotrzebowania i ustrój wydala więcej związ¬
ków azotowych, niż ich pobiera, a zatem bilans
azotowy staje się ujemny.
Nieustanny katabolizm białek w organizmie
sprawia, że potrzebuje on podaży białka z poży¬
wieniem nawet wtedy, kiedy już nie rośnie. Mimo
że część uwalnianych z rozpadających się białek
586 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
aminokwasów może być reutylizowana, to jednak
duża ich część jest wykorzystywana w procesie
glukoneogenezy zachodzącej w stanie głodzenia.
Badania nad równowagą azotową wykazały, że
przeciętne dzienne zapotrzebowanie na białko
u osób dorosłych wynosi 0,6 g/kg mc. (w indy¬
widualnych przypadkach może dochodzić do
0,75 g/kg mc.). Tak więc dobowe zapotrzebo¬
wane na białko u osób dorosłych wynosi 50 g.
W krajach rozwiniętych przeciętne dobowe po¬
branie białka wynosi 80-100 g i stanowi 14-15%
dobowego pobrania składników energetycznych.
Ponieważ u dzieci w okresie wzrostu zwiększa
się zawartość białek w ustroju, ich zapotrzebo¬
wanie na ten składnik odżywczy jest większe niż
u dorosłych. Bilans azotowy u dzieci powinien
być zatem dodatni. Nawet gdyby tak było, potrze¬
by są stosunkowo małe, zważywszy na zwiększo¬
ny u nich obrót białkowy. W niektórych krajach
pobranie białka nie pokrywa zapotrzebowania na
ten składnik odżywczy, co może się przełożyć na
zahamowanie wzrostu dzieci.
Urazy i infekcje są przyczyną utraty
białek przez ustrój
Jedną z odpowiedzi metabolicznych na duży uraz
(np. oparzenie, złamanie kości kończyn, zabieg
operacyjny) jest wzrost katabolizmu białkowego.
W takich przypadkach może dojść do utraty 6-7%
białka ogólnoustrojowego w ciągu 10 dni. Długo¬
trwałe przebywanie w łóżku może być przyczyną
znacznej utraty białek i zaniku mięśni. U takich
osób katabolizm białka jest normalny, lecz brak
jest bodźca ruchowego niezbędnego do syntezy
białek. Podczas rekonwalescencji następuje od¬
budowa utraconego białka i bilans azotowy jest
dodatni. Prawidłowa dieta zupełnie wystarcza, by
taka odbudowa zachodziła.
Zapotrzebowanie dotyczy nie tyle białek,
ile swoistych aminokwasów
Nie wszystkie białka mają taką samą wartość od¬
żywczą. Dlatego istnieje potrzeba zwiększonej
podaży pewnych białek, tj. tych zawierających
małą ilość aminokwasów egzogennych. Ustrój
wymaga podaży aminokwasów w określonej
proporcji, potrzebnej do syntezy białka. Wszyst¬
kie aminokwasy można podzielić na dwie grupy,
tj. aminokwasy egzogenne (niezbędne) i endo¬
genne (nie niezbędne). Istnieje 9 aminokwasów
niezbędnych, których ustrój nie potrafi syntety¬
zować; są nimi: histydyna, izoleucyna, leucyna,
lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryp-
tofan i walina. W przypadku braku lub niedoboru
jednego z nich, niezależnie od ilości spożytego
białka, niemożliwe jest utrzymanie wyrówna¬
nego bilansu azotowego, ponieważ nie ma do¬
statecznej ilości tego aminokwasu do syntezy
białka. Dwa aminokwasy, tj. cysteina i tyrozyna,
mogą być syntetyzowane przez człowieka, lecz
tylko w obecności egzogennych prekursorów,
tj. metioniny (potrzebnej w syntezie cysteiny)
i fenyloalaniny (potrzebnej do syntezy tyrozy¬
ny). Dlatego ilości pobranej cysteiny i tyrozyny
mają wpływ na wielkość zapotrzebowania na
metioninę i fenyloalaninę. Pozostałe 11 amino¬
kwasów uważa się za nie niezbędne, ponieważ
mogą one być syntetyzowane przez człowie¬
ka pod warunkiem dostatecznej podaży białek
w diecie. Mimo braku jednego z tych nie nie¬
zbędnych aminokwasów w diecie możliwe jest
utrzymywanie wyrównanego bilansu azotowe¬
go. Jednak za rzeczywiście nie niezbędne ami¬
nokwasy można uznać tylko trzy aminokwasy
- alaninę, asparaginian i glutaminian, ponieważ
są metabolitami pośrednimi (ang. intermediates)
(powstają, odpowiednio, z pirogronianu, szcza-
wiowooctanu i a-ketoglutarynianu). Pozostałe
aminokwasy tylko uważa się za nie niezbędne.
W pewnych jednak okolicznościach synteza tych
ostatnich przez ustrój może być niedostateczna
w stosunku do zapotrzebowania.
STRESZCZENIE
• Trawienie polega na hydrolizie składników
odżywczych i wytworzeniu mniejszych czą¬
steczek absorbowanych przez nabłonek żołąd¬
ka i jelit. Polisacharydy ulegają absorpcji jako
monosacharydy, triacyloglicerydy - jako mo-
noacyloglicerydy, kwasy tłuszczowe i glicerol,
białko zaś - w postaci aminokwasów.
• Zaburzenia trawienia mogą być spowodowane:
1) niedoborem enzymów, np. laktazy lub sacha-
razy;
2) zaburzeniem wchłaniania, np. glukozy lub
galaktozy wskutek uszkodzenia kotranspor-
tera sodowo-glukozowego (SGLT 1);
43. ŻYWIENIE, TRAWIENIE I WCHŁANIANIE 587
3) wchłanianiem niestrawionych polipeptydów,
prowadzącym do rozwoju reakcji immuno¬
logicznych (np. w celiakii);
4) wytrąceniem się cholesterolu z żółci (co
prowadzi do tworzenia się kamieni żółcio¬
wych).
Oprócz wody pokarmy muszą dostarczać paliwa
metabolicznego (węglowodanów i tłuszczów),
potrzebnego do wzrostu i aktywności fizycznej,
białka - niezbędnego do syntezy białek tkanko¬
wych, włókna - w celu utrzymania sprawno¬
ści motorycznej jelit, składników mineralnych
- potrzebnych do swoistych przemian meta¬
bolicznych, niektórych wielonienasyconych
kwasów tłuszczowych z rodziny n-3 i n-6, wita¬
min oraz związków organicznych potrzebnych
w małych ilościach do innych istotnych funkcji
ustrojowych.
Do syntezy białek potrzebnych jest 20 różnych
aminokwasów, wśród których 9 aminokwasów
jest niezbędnych. Zapotrzebowanie na białka
zależy od jego wartości biologicznej, wydatku
energetycznego i aktywności fizycznej.
• Niedożywienie może występować pod dwie¬
ma ekstremalnymi postaciami, tj. marasmusa
u dorosłych i dzieci oraz kwashiorkoru u dzieci.
Przekarmienie jest wynikiem nadmiernej poda¬
ży energii i może być przyczyną wielu stanów
chorobowych, takich jak otyłość, cukrzyca in-
sulinoniezależna, miażdżyca, nowotwory i nad¬
ciśnienie tętnicze.
PIŚMIENNICTWO
Bender DA, Bender AE: Nutrition: A Reference Hand-
book. Oxford University Press, 1997.
Fuller MF, Garllick PJ: Humań amino acid reąuire-
ments: can the controversy be resolved? Ann Rev
Nutr 1994; 14:217.
Geissler C, Powers HJ: Humań Nutrition. ll‘h edition,
Elsevier, 2005.
Institute of Medicine: Dietary Reference Intakes for
Energy, Carbohydrate, Fi ber, Fat, Fatty Acids,
Cholesterol, Protein, and Amino Acids (Macronu-
trients). National Academies Press, 2002.
Pencharz PB, Bali RO: Different approaches to define
individual amino acid reąuirements. Ann Rev Nutr
2003;23:101.
Mikroelementy odżywcze:
• witaminy i składniki mineralne
David A. Bender, PhD; Peter A. Mayes, PhD, DSc.
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Witaminy są grupą organicznych substancji od¬
żywczych, niezbędnych w małych ilościach do
różnorodnych funkcji biochemicznych. W zasa¬
dzie związki te nie są syntetyzowane przez ustrój
i dlatego muszą być dostarczane z pożywieniem.
Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach są
związkami hydrofobowymi, mogą zatem zostać
wchłonięte tylko wtedy, kiedy absorpcja tłusz¬
czów nie jest zaburzona. Podobnie jak tłuszcze
są one transportowane z lipoproteinami krwi lub
przyłączają się do swoistych białek wiążących.
Witaminy spełniają różnorodne funkcje: witamina
A uczestniczy w procesie widzenia i różnicowania
komórek, witamina D - w przemianie wapniowej
i fosforanowej oraz w różnicowaniu komórek,
witamina E jest antyoksydantem, witamina K zaś
bierze udział w procesie krzepnięcia krwi. Nie¬
dobory witamin spowodowane nieprawidłowym
odżywianiem, jak również wynikające z upośle¬
dzonego trawienia i wchłaniania tłuszczów (np.
wskutek zaburzeń wytwarzania i wydzielania żół¬
ci, manifestujących się wydalaniem stolców tłusz¬
czowych), mogą być przyczyną wielu objawów
chorobowych, takich jak upośledzone widzenie
nocne (kurza ślepota) i suchość spojówek (nie¬
dobór witaminy A), krzywica u dzieci i osteoma-
lacja u dorosłych (niedobór witaminy D), efekty
neurologiczne i niedokrwistość hemolityczna
u noworodków (niedobór witaminy E) oraz
krwawienia u noworodków (niedobór witaminy
K). Także przedawkowanie niektórych witamin,
np. witaminy A lub D, może być przyczyną wy¬
stąpienia objawów toksycznych. Witamina A, ka¬
roteny (wiele z nich jest prekursorami witaminy
A) i witamina E są antyoksydantami i zapewne
odgrywają pewną rolę w prewencji miażdżycy
i nowotworów.
Do witamin rozpuszczalnych w wodzie należą
witaminy grupy B oraz witamina C; najczęściej
odgrywają one rolę kofaktorów enzymatycznych.
Kwas foliowy spełnia funkcję donora jednostek
jednowęglowych. Niedobór tylko jednej witami¬
ny grupy B jest rzadko spotykany, ponieważ nie¬
prawidłowy skład diety jest najczęściej przyczyną
wielorakich stanów niedoboru. Niemniej jed¬
nak, niedobór jednej witaminy może być przyczy¬
ną wystąpienia charakterystycznych objawów kli¬
nicznych. I tak, niedobór tiaminy wywołuje cho¬
robę beri-beri, niedobór ryboflawiny - zapalenie
kącików ust i zapalenia języka, niedobór niacyny
- objawy pelagry, niedobór witaminy B12 - niedo¬
krwistość megaloblastyczną, acydurię metyloma-
lonową i niedokrwistość złośliwą, niedobór kwa¬
su foliowego - niedokrwistość megaloblastyczną,
a niedobór witaminy C - szkorbut.
Dieta prawidłowa powinna również dostar¬
czać nieorganicznych pierwiastków mineralnych,
potrzebnych do prawidłowego funkcjonowania
ustroju. W stanie ich niedoboru mogą wystąpić ta¬
kie objawy, jak niedokrwistość (niedobór żelaza),
wole i niedorozwój umysłowy (niedobór jodu).
Nadmiar tych składników również może być tok¬
syczny.
Określenie zapotrzebowania
na mikroelementy zależy od użytych
kryteriów i przyjętej normy
Dla każdego składnika odżywczego istnieje pe¬
wien zakres normy, poniżej której zawsze wystę¬
pują kliniczne objawy niedoborowe, powyżej
zaś - objawy toksyczności. Przestrzeganie nor-
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 589
my zapewnia dobre zdrowie i integralność meta¬
boliczną ustroju. Poszczególne osoby wykazują
zróżnicowanie zapotrzebowania na składniki
odżywcze, nawet jeśli uwzględni się wielkość
masy ciała i wydatek energetyczny. Różnice
międzyosobnicze mogą wynosić 25% wartości
średniej. Dlatego istnieje potrzeba ustalenia in¬
dywidualnego zapotrzebowania na dany skład¬
nik odżywczy. Zapotrzebowanie to powinno być
dostatecznie wysokie, aby uniknąć stanu niedo-
Tabela 44-1. Witaminy
boru, lecz nie na tyle, aby wywoływało objawy
toksyczności. Przyjmuje się, że zapotrzebo¬
wanie na określony składnik wykazuje rozkład
gausowski i równa się wartości średniej + dwu¬
krotna wartość odchylenia standardowego (SD).
W tym zakresie mieści się zapotrzebowanie 95%
ludności. Dlatego zakres normalnego zapotrze¬
bowania ustala się w obrębie wartości średniej
± 2 x SD i to spełnia lub przewyższa wymaga¬
nia 97,5% całej ludności.
Witamina
Funkcje
Skutki niedoboru
A
Retinol,
p-karoten
Składnik barwników wzrokowych siatkówki, regula¬
cja ekspresji genów i różnicowania komórek (p-ka¬
roten jest antyoksydantem)
Kurza ślepota, suchość spojówek;
keratynizacja skóry (nadmiar wit. A)
D
Kalcyferol
Utrzymywanie równowagi wapniowej, wzrost wchła¬
niania Ca2+ w jelitach i mobilizacja składników mi¬
neralnych w kościach, regulacja ekspresji genów
i różnicowania komórek
Krzywica (upośledzona mineralizacja kości,
Osteomalacja (demineralizacja kości)
E
Tokoferole
Tokotrienole
Antyoksydant, rola w procesach sygnałowych ko¬
mórek
Bardzo rzadko - poważne zaburzenia neu¬
rologiczne
K
Filochinon
Menachinony
Koenzym w syntezie y-karboksyglutaminianu dla en¬
zymów krzepnięcia krwi i macierzy kostnej
Zaburzenia krzepnięcia krwi, skazy krwo¬
toczne
Bi
Tiamina
Koenzym dehydrogenazy pirogronianowej i a-keto-
glutarynianowej oraz transketolazy - reguluje kanał
CL w przewodnictwie nerwów
Uszkodzenie nerwów obwodowych (beri-
-beri) lub ośrodkowego układu nerwowego
(zespół Wernickego-Korsakowa)
b2
Ryboflawina
Koenzym w reakcjach utleniania i redukcji, proste-
tyczny składnik flawoprotein
Uszkodzenie nabłonka kącików ust, warg
i języka, łojotokowe zapalenie skóry
Niacyna
Kwas
nikotynowy
Nikotynamid
Koenzym w reakcjach utleniania i redukcji, czynnoś¬
ciowa struktura NAD i NADR rola w regulacji wap¬
nia śródkomórkowego i w procesach sygnałowych
komórek
Pelagra - zapalenie skóry, wrażliwe na
światło, psychoza depresyjna
B6
Pirydoksyna
Pirydoksal
Pirydoksamina
Koenzym procesów transaminacji i dekarboksylacji
aminokwasów oraz fosforylacji glikogenowej, modu¬
lacja działania hormonów steroidowych
Zaburzenia gospodarki aminokwasowej,
drgawki
Kwas foliowy
Koenzym w reakcjach przenoszenia aktywnych grup
jednowęglowych
Niedokrwistość megaloblastyczna
Kobalamina
Koenzym w reakcjach przenoszenia aktywnych grup
jednowęglowych i w przemianie kwasu foliowego
Niedokrwistość złośliwa (niedokrwistość
megaloblastyczna + zwyrodnienie rdzenia
kręgowego)
Kwas pantotenowy
Czynna grupa CoA i białka przenoszącego grupy
acylowe: synteza i przemiana kwasów tłuszczo¬
wych
Uszkodzenie nerwów obwodowych (nutri-
tional melagia lub „zespół palących stóp”)
H
Biotyna
Koenzym w reakcjach karboksylacji, glukoneogene-
zy i syntezy kwasów tłuszczowych, rola w regulacji
cyklu komórkowego
Upośledzenie przemiany tłuszczowej
i węglowodanowej, zapalenie skóry
C
Kwas
askorbinowy
Koenzym w reakcjach hydroksylacji proliny i lizyny
zachodzących w syntezie kolagenu; antyoksydant,
nasila wchłanianie żelaza w jelitach
Gnilec - upośledzone gojenie się ran, utrata
cementu zębów, krawienia podskórne
590 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
WITAMINY STANOWIĄ ZRÓŻNICOWANA
GRUPĘ ZWIĄZKÓW SPEŁNIAJĄCYCH
RÓŻNORODNE FUNKCJE METABOLICZNE
Witaminą określa się związek organiczny wystę¬
pujący w małych ilościach w pożywieniu i nie¬
zbędny dla utrzymania prawidłowego metaboli¬
zmu ustroju. Niedobór określonej witaminy wy¬
wołuje swoiste stany chorobowe, którym można
zapobiec lub które można wyleczyć przez podanie
deficytowego związku (p. tab. 44-1). Podanej de¬
finicji „witaminy” nie spełnia witamina D, gdyż
powstaje w skórze po ekspozycji na promienie
słoneczne, oraz niacyna, która może powstać
z egzogennego aminokwasu - tryptofanu.
■ WITAMINY ROZPUSZCZALNE
W TŁUSZCZACH
DWIE GRUPY ZWIĄZKÓW WYKAZUJĄ
AKTYWNOŚĆ WITAMINY A
Retinoidy obejmują retinol, retinal i kwas reti-
nolowy (preformowana witamina A występująca
tylko w pokarmach pochodzenia zwierzęcego).
Karotenoidy występujące w roślinach składają
się z karotenów i ich pochodnych, wiele z nich
jest prekursorami witaminy A. W wyniku rozpadu
karotenoidów może powstać retinal, a następnie
retinol i kwas retinolowy (ryc. 44-1). Najliczniej¬
szą grupę karotenoidów, stanowią karoteny a, (3, y
oraz kryptoksantyna, które są prowitaminami wi¬
taminy A. Chociaż może się wydawać, że z jednej
cząsteczki (3-karotenu powstają dwie cząsteczki
retinolu, w rzeczywistości tak nie jest, bo 6 pg
(3-karotenu jest równoważne 1 pg preformowane-
go retinolu. Dlatego też całkowitą zawartość wita¬
miny A w pożywieniu wyraża się w równoważni¬
kach retinolowych. (3-Karoten i inne karotenoidy
prowitaminowe, po rozszczepieniu przez jelitową
dioksygenazę karotenową, tworzą retinal (alde¬
hyd retinalowy), który ulega redukcji do retinolu,
a następnie estryfikacji i wydzieleniu w chylomi-
kronach razem z estrami utworzonymi z retinolu
zawartego w pożywieniu. Aktywność dioksyge-
nazy karotenowej jelitowej jest mała, co sprawia,
że stosunkowo duże ilości spożytego (3-karotenu
pojawiają się w krążeniu w postaci niezmienionej.
Mimo że głównym miejscem ataku dioksygena-
zy retinolowej jest środkowe wiązanie łańcucha
izoprenowego, to jednak może również dojść
do asymetrycznego rozpadu cząsteczki karotenu
i wytworzenia 8'-, 10'- i 12'-apokarotenali, któ¬
re mogą zostać utlenione do kwasu retinolowego,
lecz nie mogą być źródłem retinolu i retinalu (al¬
dehydu retinolowego).
Witamina A uczestniczy w procesie
widzenia
W siatkówce oka retinal spełnia funkcję grupy
prostetycznej dla białek opsynowych wrażli¬
wych na światło, tworząc rodopsynę (w pręci-
Ryc. 44-1. p-Karoten i najważniejsze związki
wykazujące działanie witaminy A. Gwiazdka
wskazuje miejsce rozcięcia p-karotenu przez
dioksygenazę karotenową; w wyniku tej reakcji
powstaje retinal (aldehyd retinowy).
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 591
kach) i iodopsynę (w czopkach). Każda komórka
czopkowata zawiera tylko jeden typ opsyny i jest
wrażliwa tylko na jedną barwę. W nabłonku bar¬
wnikowym siatkówki całkowicie-f/Yws-retinol
(ang. all-/ratfs-retinol) ulega izomeracji do 11 -cis-
retinolu i następnie utlenieniu do 11 -czs-retinalu.
Ten ostatni, reagując z resztą lizyny opsyny, two¬
rzy holobiałko - rodopsynę. Jak widać na rycinie
44-2, absorpcja światła przez rodopsynę powodu¬
je izomerację postaci 11 -cis do całkowicie-Zrazw
oraz zmianę konformacyjną opsyny. W wyniku
^ch2oh
CH3 Calkowicie-frarts-retinol
CH,
CHoOH
11-c/s-Retinol
H,C. CH,
11-c/s-Retinal
CH3 h3C"
Hr=n
C=0
h2n^^J
u p pu w| >3 Reszta lizynowa J
H^C-CH^ ' w cząsteczce f
opsyny
CH3 h3C
HC=N
Rodopsyna (barwnik wzrokowy)
ŚWIATŁO | 1015s
H,C. ,CH: CH:1 CHl
^ CH3
Fotorodopsyna
« | 45 ps
| Batorodopsyna
.i. | 30 ns
£ Lumirodopsyna
2 | 75 jas
2 Metarodopsyna I
.i i 10 ms
p 1
m Metarodopsyna II •
{ minuty
Metarodopsyna III
C=0
5'GMP
Zamknięty kanał Na+
♦ fosfodiesteraza
Transducyna-GTP
Transducyna-GDP
A.
tego retinal odłącza się od białka, inicjując powsta¬
wanie impulsu nerwowego. Tworzenie się, w wy¬
niku wzbudzenia, formy rodopsyny - batorodopsy-
ny, trwa po zadziałaniu światła przez pikosekundy.
Kolejno następuje kilka zmian konformacyjnych,
prowadzących do powstania metarodopsyny II. Ta
ostatnia zapoczątkowuje kaskadę amplifikacyjną
z udziałem nukleotydów guaninowych i następnie
impuls nerwowy. Etapem końcowym jest hydroli¬
za, uwalniająca całkowicie-/raz?s-retinal i opsynę.
Kluczowe znaczenie dla zapoczątkowania „cyklu
wzrokowego” ma dostępność do 11 -czs-retina-
lu, tj. do witaminy A. Stany niedoboru witaminy
A charakteryzują się wydłużeniem czasu potrzeb¬
nego do adaptacji w ciemności oraz upośledzonym
widzeniem w słabym świetle.
Kwas retinolowy odgrywa rolę w regulacji
ekspresji genów i różnicowania tkanek
Witamina A odgrywa ważną rolę w regulacji pro¬
cesu różnicowania komórek i ich obrotu. Kwasy:
całkowicie-/raz?s-retinolowy i czs-retinolowy (p.
ryc. 44-1) regulują wzrost, rozwój i różnicowanie
tkanek; wykazują one różne działanie w różnych
tkankach. Podobnie jak hormony tarczycy, hor¬
mony steroidowe i witamina D, kwas retinolowy
wiąże się z receptorem jądrowym w tzw. sek¬
wencji odpowiedzi hormonalnej, gdzie reguluje
transkrypcję swoistych genów. Wyróżnia się dwie
rodziny jądrowych receptorów retinolowych:
jedna obejmuje receptory dla kwasu retinolowe-
go (RAR), wiążące kwas całkowicie-/razw-re-
tinolowy oraz kwas 9-czs-retinolowy, druga zaś
- receptory retinolowe X (RXR), wiążące kwas
9-czs-retinolowy. Receptory retinolowe X tworzą
również aktywne dimery z innymi hormonalnymi
receptorami jądrowymi.
Niedobór witaminy A stanowi
ważny problem zdrowia publicznego
o zasięgu światowym
Ryc. 44-2. Rola retinalu (aldehydu retinolowego) w cyklu wzro¬
kowym (ps - pikosekundy, ns - nanosekundy, \is - mikrose¬
kundy).
Niedobór witaminy A jest najważniejszą przy¬
czyną ślepoty, której można zapobiec. Pierwszy¬
mi objawami niedoboru jest utrata rozróżniania
koloru zielonego, a następnym zaburzenia adap¬
tacji do słabego oświetlenia oraz kurza ślepota
(upośledzone widzenie nocne). Dłużej trwają¬
cy niedobór jest przyczyną suchości spojówek
592 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
(.xerophtalmia), prowadzącej do keratynizacji
rogówki i ślepoty. Witamina A odgrywa również
rolę w różnicowaniu komórek układu immunolo¬
gicznego. Nawet łagodne niedobory są przyczyną
zwiększonej podatności na infekcje. Z kolei in¬
fekcja może być przyczyną ograniczenia syntezy
białka wiążącego retinol (jest to „ujemne” białko
ostrej fazy; ang. negative acute phase protein),
wskutek czego zmniejsza się stężenie krążącej we
krwi witaminy, pogłębiając istniejące upośledzo¬
ne reakcje immunologiczne.
Nadmiar witaminy A jest toksyczny
Ustrój wykazuje tylko ograniczoną możliwość
metabolizowania witaminy A, co może być przy¬
czyną wzrostu jej stężenia we krwi, przekraczają¬
cego zdolność jej wiązania przez nośnik białkowy
osocza. Wzrost ten dotyczy wolnej, niezwiązanej
z białkiem postaci witaminy, która działa toksycz¬
nie na tkanki. Objawami toksyczności witaminy
A są bóle głowy, nudności, ataksja i brak apety¬
tu. Wszystkim tym objawom towarzyszy wzrost
ciśnienia płynu mózgowo-rdzeniowego. Ponadto
stwierdza się hepatomegalię (histologicznie moż¬
na wykazać stłuszczenie hepatocytów), hiperlipe-
mię, zaburzenia homeostazy wapniowej (pogru¬
bienie długich kości, hiperkalcemia i zwapnienia
tkanek miękkich) i zmiany skórne (skóra sucha,
łuszcząca się, łysienie).
WITAMINA D JEST W RZECZYWISTOŚCI
HORMONEM
Witamina D nie jest witaminą w ścisłym tego
słowa znaczeniu, ponieważ może być syntetyzo¬
wana w skórze i w większości przypadków jest
to główne źródło tej witaminy. Tylko w razie
niedostatecznej ekspozycji skóry na promienie
słoneczne zachodzi potrzeba dostarczania tej wi¬
taminy z pożywieniem. Główną funkcją witaminy
D jest regulacja wchłaniania wapnia z przewodu
pokarmowego i regulacja homeostazy wapnia
w ustroju; większość tych działań odbywa się za
pośrednictwem receptorów jądrowych regulują¬
cych ekspresję genów. Problemem zdrowotnym
mieszkańców na obszarach dużych szerokości
geograficznych jest krzywica u dzieci i osteoma-
lacja u dorosłych, wynikające z niedostatecznej
ekspozycji na słońce.
Witamina D jest syntetyzowana w skórze
7-Dehydrocholesterol (jest to pośredni związek
w syntezie cholesterolu, gromadzącego się w skó¬
rze) ulega nieenzymatycznemu przekształceniu
do prewitaminy D pod wpływem światła ultra¬
fioletowego (ryc. 44-3). Ta ostatnia w ciągu go¬
dziny wchodzi w dalszą reakcję, w wyniku której
powstaje cholekalcyferol, ulegający wchłonięciu
do krążącej krwi. U ludzi żyjących w klimacie
umiarkowanym, największe stężenie witaminy D
w osoczu stwierdza się pod koniec lata, najniższe
zaś pod koniec zimy. Na szerokościach geogra¬
ficznych na północ lub południe od 40. równo¬
leżnika dostępność światła ultrafioletowego o od¬
powiedniej długości jest w porze zimowej bardzo
mała.
Witamina D ulega przemianie do
aktywnego metabolitu - kalcytriolu
w wątrobie i nerkach
Cholekalcyferol syntetyzowany w skórze lub do¬
starczony z pokarmem, ulega dwukrotnej hydro¬
ksylami, w wyniku której powstaje 1,25-dihydro-
ksywitamina D lub kalcytriol (ryc. 44-4). Ergo-
kalcyferol zawarty w pokarmach wzbogaconych
w ten steryd, ulega podobnym hydroksylacjom,
tworząc 1,25-dihydroksyergokalcyferol (ergokal-
cytriol). W wątrobie cholekalcyferol ulega hy¬
droksylami, tworząc 25-hydroksypochodną, zwa-
Ryc. 44-3. Synteza
witaminy D w skórze.
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 593
Ryc. 44-4. Przemiana witaminy D.
ną kalcydiolem (25-OH-D), która po dostaniu się
do krwi wiąże się z globuliną przyłączającą wi¬
taminę D. Kompleks 25-OH-D z globuliną wią¬
żącą jest główną postacią zapasową tej witaminy.
W nerkach kalcydiol ulega hydroksylacji w pozy¬
cji C-l, tworząc aktywny metabolit - 1,25-dihy-
droksywitaminę D (kalcytriol), lub hydroksylacji
w pozycji C-24, tworząc (prawdopodobnie nieak¬
tywny) metabolit 24,25-dihydroksywitaminę D
(24-hydroksykalcydiol).
Witamina D jest regulowana przez
gospodarkę wapniowa i odwrotnie
-homeostaza wapniowa jest zależna
od witaminy D
Główną funkcją witaminy D jest kontrola gospo¬
darki wapniowej. Z kolei przemiana witaminy D
jest regulowana przez czynniki wpływające na kal-
cemię i fosfatemię. Kalcytriol, za pośrednictwem
mechanizmu ujemnego sprzężenia zwrotnego,
hamuje własną syntezę, indukując 24-hydroksy-
lazę i zmniejszając aktywność 1-hydroksylazy
w nerkach. Zasadniczym zadaniem witaminy D
jest utrzymywanie prawidłowego stężenia wapnia
we krwi; realizuje to trzema sposobami: 1) zwięk¬
sza wchłanianie wapnia w jelitach, 2) zatrzymuje
wapń w kościach, 3) zmniejsza wydalanie wapnia
z moczem (stymulując wchłanianie zwrotne Ca2+
przez dystalne kanaliki nerkowe). Ponadto kal¬
cytriol uczestniczy w procesie sekrecji insuliny,
syntezie i sekrecji hormonu przytarczyc (PTH)
oraz hormonów tarczycy, w hamowaniu i sekrecji
interleukiny przez aktywowane limfocyty T i im-
munoglobulin przez aktywowane limfocyty B,
w różnicowaniu prekursorów monocytów i modu¬
lacji proliferacji komórek. W większości przypad¬
ków działa ona jak hormon steroidowy, wiążąc się
z receptorami jądrowymi i stymulując ekspresję
genów, chociaż wykazuje również szybkie efek¬
ty na transportery wapnia w błonie śluzowej je¬
lit. Dalsze szczegóły dotyczące roli kalcytriolu
w homeostazie wapniowej zostały przedstawione
w rozdz. 47.
Niedobór witaminy D wpływa na stan
zdrowia dzieci i dorosłych
W krzywicy spowodowanej niedoborem witami¬
ny D kości dzieci wykazują niedostateczną mine¬
ralizację, która wynika z małej absorpcji wapnia
w jelitach. Podobne zmiany kostne występują
w wieku młodzieńczym w fazie wzrostu. U osób
dorosłych osteomalacja jest wynikiem deminera-
lizacji kości, szczególnie u kobiet, mało ekspono¬
wanych na działanie słońca lub po kilku ciążach.
Chociaż witamina D odgrywa ważną rolę w zapo¬
bieganiu i leczeniu osteomalacji u dorosłych, to
594 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
jednak mało jest danych na temat jej skuteczności
w leczeniu osteoporozy.
Nadmiar witaminy D jest toksyczny
Niektóre niemowlęta są wrażliwe na dawki wita¬
miny D nawet tak niskie, jak 50 pg/d, co objawia
się występowaniem hiperkalcemii. Może ona być
przyczyną wazokonstrykcji, nadciśnienia tętni¬
czego i kalcynozy, tj. zwapnienia tkanek mięk¬
kich. Nadmierna podaż witaminy D w pożywie¬
niu może być przyczyną wystąpienia toksycznych
objawów, lecz nadmierna ekspozycja skóry na
promienie słoneczne nie prowadzi do hiperwita-
minozy D, ponieważ skóra wykazuje ograniczo¬
ną zdolność syntezy prekursora witaminy D, tj.
7-dehydrocholekalcyferolu. Poza tym w wyniku
długotrwałej ekspozycji na działanie promieni
słonecznych są syntetyzowane nieaktywne meta¬
bolity witaminy D.
WITAMINA E NIE WYKAZUJE ŚCIŚLE
OKREŚLONEJ FUNKCJI METABOLICZNEJ
Dotychczas nie udało się określić ściśle swoistej
funkcji witaminy E. Odgrywa ona rolę antyoksy-
dantu rozpuszczalnego w lipidach błon komór¬
kowych; podobne jednak działanie mogą wyka¬
zywać syntetyczne antyoksydanty. Witamina E
ma znaczenie w podtrzymywaniu płynności błon
komórkowych. Ponadto odgrywa ona pewną rolę
(nie w pełni jeszcze ustaloną) w przekazywaniu
sygnałów do komórki. Witamina E jest gene-
rycznym deskryptorem dwóch rodzin związków,
tj. tokoferoli i tokotrienoli (ryc. 44-5). Każda
Ryc. 44-5. Witaminy grupy E (witamery witaminy E). W a-toko-
ferolu i tokotrienolu R1t R2 i R3 są grupami CH3. W p-witamerach
R2 jest atomem H, w y-witamerach R, jest atomem H, a w 8-wi-
tamerach R, i R2 jest atomem H.
z witamin wykazuje inną aktywność biologiczną.
Najbardziej aktywny jest D-a-tokoferol. Pobranie
witaminy E wyraża się zwykle w mg równoważ¬
nika D-a-tokoferolu. Syntetyczny DL-a-tokoferol
nie wykazuje takiej samej aktywności biologicz¬
nej jak związek naturalny.
Witamina E jest głównym antyoksydantem
rozpuszczalnym w lipidach błon
komórkowych i lipoproteinach osocza
Główną funkcją witaminy E jest przerywanie łań¬
cucha tworzenia wolnych rodników w błonach
komórkowych i lipoproteinach osocza. Zjawisko
to polega na reakcji witaminy E z rodnikami nad¬
tlenkowymi lipidów, utworzonymi przez peroksy-
dację wielonienasyconych kwasów tłuszczo¬
wych. Tokoferoksylowy produkt rodnikowy jest
względnie niereaktywny i w ostateczności tworzy
nierodnikowe związki. Zwykle tokoferoksylowy
rodnik ulega redukcji do tokoferolu; w reakcji tej
uczestniczy witamina C (ryc. 44-6). Powstały rod¬
nik monodehydroaskorbinianowy ulega reakcji,
w wyniku której powstaje askorbinian i dehydro-
askorbinian. Oba te związki nie są rodnikami.
Stabilność rodnika tokoferoksylowego oznacza,
że może on wnikać do komórek i propagować re¬
akcję łańcuchową. Dlatego też witamina E może
wykazywać, podobnie jak inne antyoksydanty,
również działanie prooksydacyjne, szczególnie
jeżeli występuje w dużych stężeniach. Ten fakt
tłumaczy, dlaczego mimo wykazania związku
między występowaniem dużych stężeń witaminy
E w osoczu i mniejszą zachorowalnością na miaż¬
dżycę, w badaniach klinicznych z zastosowaniem
wysokich dawek witaminy E uzyskano niezado¬
walające wyniki.
Niedobór witaminy E
W badaniach doświadczalnych niedobór wita¬
miny E wywołał resorpcję płodów i zanik jąder.
Nieznane są stany niedoboru witaminy E u lu¬
dzi, chociaż u chorych z zespołem upośledzone¬
go wchłaniania, z włóknieniem torbielowatym
(fibrosis cystiba) lub niektórymi przewlekłymi
chorobami wątroby mogą występować objawy
uszkodzenia nerwów i błon mięśniowych spo¬
wodowane niedoborem witaminy E. U takich
chorych stwierdza się upośledzone wchłanianie
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 595
Reakcja łańcuchowa
wolnych rodników
Ponadtlenek PUFA-OH
Ryc. 44-6. Interakcje i synergizm między układami antyoksydantowymi, działającymi w fazie lipidowej (błony komórek) i w fazie wod¬
nej (cytozol). R* - wolny rodnik, PUFA-OO* - wolny rodnik peroksylowy wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, występujących
w fosfolipidach błonowych, PUFA-OOH - wodoroperoksypochodne wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w fosfolipidach bło¬
nowych, uwalniane do cytozolu przez fosfolipazę A2, PUFA-OH - hydroksypochodne wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, TocOH
-witamina E (a-tokoferol), TocO* - wolny rodnik a-tokoferolowy, Se - selen, GSH - postać zredukowana glutationu, GS-SG - postać
utleniona glutationu, która ulega redukcji pod wpływem reduktazy glutationowej w obecności NADPH, PUFA-H - wielonienasycone
kwasy tłuszczowe.
(witamina E wchłania się wraz z tłuszczami)
i transport witaminy E. Niedobór witaminy E
może być przyczyną przedwczesnych porodów
i niedokrwistości hemolitycznej, spowodowanej
łamliwością błon erytrocytamych wynikającą
zperoksydacji lipidów.
WITAMINA K JEST POTRZEBNA DO
SYNTEZY BIAŁKOWYCH CZYNNIKÓW
KRZEPNIĘCIA KRWI
Wykrycie witaminy K było wynikiem badań nad
przyczyną skazy krwotocznej u bydła karmione¬
go słodką koniczyną i kurcząt karmionych dietą
beztłuszczową. U kurcząt niedoborowym składni¬
kiem okazała się witamina K, u bydła zaś - diku-
maroł, antagonista witaminy K. Leki-antagoniści
witaminy K stosowane są w leczeniu chorych wy¬
kazujących duże ryzyko wykrzepiania krwi; tym
antagonistą najczęściej jest warfaryna.
Aktywność biologiczną witaminy K wykazują
trzy związki (ryc. 44-7): filochinon (występuje
w zielonych jarzynach), menachinony (synte¬
tyzowane przez bakterie jelitowe, a różniące się
między sobą długością łańcucha bocznego), i me-
nadiol (lub menadion) oraz dioctan menadiolu (są
to związki syntetyczne, które mogą ulec przemia¬
nie do filochinonu). Menachinony są absorbowane
tylko w części, lecz nie jest jasne, w jakim stopniu
są one biologicznie aktywne. Jest bowiem moż¬
liwe wywołanie objawów niedoboru witaminy K
przez podawanie tylko diety ubogiej w filochinon,
nie hamując czynności bakterii jelitowych.
596 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
o
Menadiol I
C=0
I
CH3
Dioctan menadiolu
Ryc. 44-7. Grupa witamin K. Menadiol (lub menadion) i dioctan
menadiolu są związkami syntetycznymi, ulegającymi przekształ¬
ceniu do menachinonu w wątrobie.
Witamina K jest koenzymem karboksylacji
glutaminianu w posyntetycznej
modyfikacji białek wiążących wapń
Witamina K jest kofaktorem karboksylacji reszt
glutaminianowych w procesie posyntetycznej
modyfikacji białek, w wyniku tej reakcji powstaje
niezwykły aminokwas - y-karboksyglutaminian
(Gla) (ryc. 44-8). Początkowo postać hydrochi¬
nonowa witaminy K ulega utlenieniu do postaci
epoksydowej, która aktywuje resztę glutaminia-
nową w białku substratowym do karboanionu. Ten
ostatni reaguje nieenzymatycznie z ditlenkiem wę¬
gla, tworząc y-karboksyglutaminian. Epoksydowa
postać witaminy K ulega redukcji do postaci chi-
nonowej (reakcję tę katalizuje reduktaza wrażliwa
na warfarynę), która z kolei ulega redukcji do ak¬
tywnej hydrochinonowej postaci witaminy K (re¬
akcję tę katalizuje wyżej wspomniana reduktaza
wrażliwa na warfarynę lub reduktaza chinonowa
niewrażliwa na warfarynę). W obecności warfa-
ryny epoksydowa postać witaminy K nie może
zostać zredukowana, lecz ulega akumulacji i wy¬
daleniu. Przy dostatecznej podaży w pożywieniu
chinonowej postaci witaminy K może ona ulec re¬
dukcji do aktywnej postaci hydrochinonowej pod
wpływem reduktazy niewrażliwej na warfarynę;
w ten sposób proces karboksylacji może się dalej
odbywać w warunkach stechiometrycznej utyliza¬
cji witaminy K i wydalania epoksydowej postaci
tej witaminy. Duża dawka witaminy K jest antido¬
tum na przedawkowanie warfaryny.
Protrombina i wiele innych białek układu krzep¬
nięcia (czynniki VII, IX i X, białka C i S) zawie¬
rają po 4-6 reszt y-karboksyglutaminianowych.
y-Karboksyglutaminian, chelatując jony wapnia,
umożliwia wiązanie białek krzepnięcia krwi do
błon. W stanach niedoboru witaminy K lub bra¬
ku warfaryny, do krwi dostaje się nieprawidłowy
prekursor protrombiny (preprotrombina zawiera¬
jąca mało reszt y-karboksyglutaminianowych lub
niezawierająca żadnej reszty) i niezdolny do che-
latowania jonów wapnia.
Witamina K jest również ważna w syntezie
białek kości wiążących jony Ca2+
Leczenie kobiet ciężarnych warfaryną może być
przyczyną rozwoju anomalii kostnych u płodu
(„płodowy zespół warfarynowy”). W kościach
występują dwa białka zawierające y-karboksy-
glutaminian: są to osteokalcyna i białko Gla ma¬
cierzy kostnej. Osteokalcyna zawiera również hy-
droksyprolinę, dlatego jej synteza zależy zarówno
od witaminy K, jak i C. Ponadto synteza osteokal-
cyny jest indukowana przez witaminę D. Dlatego
też uwalnianie osteokalcyny do krwi jest wskaźni¬
kiem stanu witaminy D w organizmie.
■ WITAMINY ROZPUSZCZALNE
W WODZIE
WITAMINA B, (TIAMINA) ODGRYWA
KLUCZOWA ROLĘ W PRZEMIANIE
WĘGLOWODANOWEJ
Tiamina odgrywa kluczową rolę w przemianach
energetycznych, w szczególności w przemianie
węglowodanów (ryc. 44-9). Difosforan tiaminy
jest koenzymem trzech kompleksów wieloenzy-
matycznych, katalizujących reakcje dekarboksyla-
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 597
■OOC— CH —COO'
I
CH
2
O
Reszta karboksyglutaminianowa
nieenzymatycznie
Postać hydrochinonowa witaminy K
Postać disiarczkowa
HINONOWEJI
MINYK |
owa J
cfr
o
Postać chinonowa witaminy K
Postać epoksydowa witaminy K
Postać sulthydrylowa
Postać disiarczkowa
Ryc. 44-8. Rola witaminy K w syntezie kar-
boksyglutaminianu.
cji: dehydrogenazy pirogronianowej (w przemia¬
nie węglowodanowej - rozdz. 17), dehydrogenazy
a-ketoglutarowej (w cyklu kwasu cytrynowego -
rozdz. 17) i dehydrogenazy ketokwasów o rozga¬
łęzionym łańcuchu (w przemianie leucyny, izoleu-
cyny i waliny - rozdz. 29). W każdym przypadku
difosforan tiaminy dostarcza reaktywnego atomu
węgla do pierścienia tiazolowego, tworzącego kar-
boanion, który ulega następnie przemieszczeniu
na grupę karbonylową, np. pirogronianu. Powstały
w ten sposób związek ulega następnie dekarbo-
ksylacji z wydzieleniem C02. Difosforan tiaminy
jest również koenzymem transketolazy w szlaku
pentozofosforanowym (rozdz. 21).
Trifosforan tiaminy uczestniczy w przewodni¬
ctwie impulsów nerwowych. Fosforylując kanał
chlorkowy w błonie nerwów, jednocześnie go
aktywuje.
Niedobór tiaminy wpływa na układ
nerwowy i serce
Niedobór tiaminy jest przyczyną wystąpienia
trzech zespołów chorobowych: choroby beri-
-beri, psychozy Korsakowa i kwasicy mlecza-
nowej. Choroba beri-beri charakteryzuje się za¬
paleniem nerwów obwodowych, któremu mogą
towarzyszyć niewydolność serca i obrzęki.
Tiamina
0
0
H3C
II
||
v^/ch2
— ch2 —o —p—0
— P — 0"
— N "f
1
0'
1
0'
V?
eH
Difosforan tiaminy
Karboanion
Ryc. 44-9. Tiamina, difosforan tiaminy i postać karboanionowa.
598 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
W złośliwej postaci (postaci piorunującej) beri-
-beri (shoshin beriberi) dominują objawy nie¬
wydolności serca i zaburzenia metaboliczne, nie
występują jednak objawy zapalenia nerwów. En¬
cefalopatia Wernickego z psychozą Korsakowa
występuje najczęściej u ludzi nadużywających
alkoholu i narkomanów. Rola difosforanu tiaminy
w działaniu dehydrogenazy pirogronianowej jest
ważna, bowiem niedobór tiaminy jest przyczyną
upośledzonej konwersji pirogronianu do acylo-
-CoA. U chorych spożywających dietę wysoko-
węglowodanową niedobór tiaminy może być
przyczyną wzrostu stężenia we krwi mleczanu
i pirogronianu i w konsekwencji wystąpienia
kwasicy mleczanów ej, groźnej dla życia.
Zawartość tiaminy w ustroju można
ocenić przez oznaczenie aktywności
transketoiazy erytrocytów
Przyjętym wskaźnikiem zawartości tiaminy w or¬
ganizmie jest aktywność transketoiazy, oznaczana
w hemolizatach krwinek czerwonych po aktywa¬
cji apo-enzymu (apo-transketolazy) przez dodanie
difosforanu tiaminy.
WITAMINA B2 (RYBOFLAWINA)
ODGRYWA KLUCZOWA ROLE
W PRZEMIANACH ENERGETYCZNYCH
Ryboflawina jest źródłem reaktywnych struktur
koenzymów, tj. mononukleotydu flawinowe-
go (FMN) i dinukleotydu flawinowego (FAD)
(ryc. 44-10). FMN powstaje w reakcji fosforyla¬
cji ryboflawiny z udziałem ATP, natomiast FAD
jest produktem dalszej reakcji z ATP, w której
cząsteczka AMP zostaje przeniesiona na FMN.
Głównymi środkami spożywczymi zawierający¬
mi ryboflawinę są mleko i produkty mleczne. Ze
względu na intensywnie żółty kolor ryboflawina
jest powszechnie stosowana jako dodatek do żyw¬
ności (ang. food additive).
Koenzymy (lawinowe
są nośnikami elektronów
w reakcjach utleniania-redukcji
Dotyczy to łańcucha oddechowego mitochondriów,
kluczowych enzymów utleniania (oksydacji) kwa¬
sów tłuszczowych i aminokwasów oraz cyklu kwa¬
su cytrynowego. W procesie ponownego utleniania
(reoksydacji) zredukowanej postaci fiawiny przez
oksygenazy lub oksydazy o mieszanej funkcji po¬
wstaje rodnik flawinowy i wodorotlenek fiawiny,
związane z tworzeniem związków pośrednich,
takich jak rodniki ponadtlenkowy i nadtlenkowy
oraz nadtlenek wodoru. Dlatego oksydazy fiawi-
nowe mają znaczący udział w patogenezie ogólno-
ustrojowego stresu oksydacyjnego.
Niedobór ryboflawiny występuję często,
lecz nie jest przyczyną śmierci
Chociaż ryboflawina jest kluczową substancją
przemiany lipidowej i węglowodanowej, a jej nie¬
dobór występuje u mieszkańców wielu krajów, to
jednak nie jest on przyczyną stanów groźnych dla
h3c
h3c
OH OH OH
I I I
CH2—CH “ CH “ CH “ CH20H
*0
N
0
II
- CHo-O-P—0"
Ryboflawina
FMN
OH OH
I I
OH
I
CH2—CH — CH — CH — CH2
h3c
h3c
.0
-o-
0
II
P —0
I
0"
o
Ryc, 44-10. Rybofla¬
wina oraz koenzymy:
mononukleotyd flawi¬
nowy (FMN) oraz di-
nukleotyd flawinowy
(FAD).
FAD
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 599
życia. Można to zawdzięczać bardzo skutecznemu
mechanizmowi ochrony ryboflawiny w tkankach.
Niedobór ryboflawiny objawia się zapaleniem
kącików ust («cheilosis), złuszczaniem nabłonka,
zapaleniem języka oraz łojotokowym zapaleniem
skóry.
Zawartość ryboflawiny w ustroju można ocenić
na podstawie aktywności reduktazy glutationowej
erytrocytów, oznaczanej po dodaniu do nich (in
vitro) FAD.
NIACYNA NIE JEST WITAMINĄ
W ŚCISŁYM TEGO SŁOWA ZNACZENIU
Niacynę wykryto jako składnik odżywczy w ba¬
daniach nad pelagrą. Nie jest witaminą w ści¬
słym tego słowa znaczeniu, ponieważ może ona
powstać w organizmie człowieka z aminokwasu
egzogennego - tryptofanu. Dwa związki: kwas
nikotynowy i amid kwasu nikotynowego wyka¬
zują aktywność biologiczną niacyny. Aktywność
biologiczna tych związków jest związana z pier¬
ścieniem nikotynamidowym koenzymów NAD
i NADP, uczestniczących w reakcjach utleniania
i redukcji (ryc. 44-11). Około 60 mg tryptofa¬
nu jest równoważne 1 mg niacyny występującej
w pokarmach. Zawartość niacyny w pokarmach
wyraża się w następujący sposób:
mg równoważnika niacyny =
= mg pretormowanej niacyny +
+ Veo x mg tryptofanu
C00" ^s^conh2
Kwas nikotynowy Amid kwasu nikotynowego
OH OH
NAD
Ryc. 44-11. Niacyna (kwas nikotynowy i amid kwasu nikotyno¬
wego) oraz dinukleotyd nikotynamido-adeninowy (NAD). Gwiazd¬
ka oznacza miejsce fosforylacji w NADR
Ponieważ większość niacyny zawartej w pro¬
duktach zbożowych jest biologicznie niedostęp¬
na, można ją pominąć w obliczeniach.
NAD jest źródłem ADP-rybozy
NAD, oprócz tego, że jest koenzymem, jest źród¬
łem ADP-rybozy niezbędnej do ADP-rybozyla-
cji białek i poli-ADP-rybozylacji nukleoprotein
uczestniczących w mechanizmach naprawy
DNA.
Pelagra jest spowodowana niedoborem
tryptofanu i niacyny
Pelagra charakteryzuje się światłowrażliwym
zapaleniem skóry. W miarę postępu choroby
dołączają się demencja i czasami biegunki. Nie-
leczona pelagra kończy się śmiercią. Chociaż
etiologia pelagry jest dobrze poznana i suple-
mentacja pokarmów tryptofanem lub niacyną
może zapobiec chorobie, ważne znaczenie dla
jej rozwoju mają dodatkowe czynniki, takie jak
niedobór ryboflawiny lub witaminy B6, tj. wita¬
min niezbędnych do syntezy amidu kwasu niko¬
tynowego z tryptofanu. W przypadku epidemii
pelagry zachorowalność jest dwukrotnie większa
u kobiet niż u mężczyzn. Jest to najprawdopo¬
dobniej spowodowane hamowaniem przemiany
tryptofanu przez estrogeny.
Pelagra może wystąpić jako skutek
choroby pomimo dostatecznej podaży
tryptofanu i niacyny
Wiele chorób genetycznych spowodowanych nie¬
prawidłową przemianą tryptofanu może być przy¬
czyną pelagry, mimo podaży wystarczającej ilości
zarówno tryptofanu, jak i niacyny. Taką rzadko
spotykaną chorobą jest zespół Hartnupa, charak¬
teryzujący się upośledzonym transportem trypto¬
fanu przez błony komórkowe. W następstwie tego
defektu dochodzi do upośledzonego wchłania¬
nia tryptofanu przez jelita oraz do znacznej jego
utraty z moczem, spowodowanej upośledzoną re-
sorpcją tego aminokwasu przez cewki nerkowe.
W zespole rakowiaka zachodzi nadprodukcja
5-hydroksytryptaminy przez komórki chromo-
chłonne przerzutów nowotworowych (pierwotny
nowotwór może się znajdować w wątrobie). Ta
600 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
nadprodukcja może dotyczyć 60% ogólnoustro-
jowej przemiany tryptofanu, co sprawia, że nie
dochodzi do syntezy NAD.
Nadmiar niacyny jest toksyczny
ga uwolnieniu z mięśni, kiedy zapasy glikogenu
ulegają wyczerpaniu. Wówczas jest on dostępny,
zwłaszcza w wątrobie i nerkach, gdzie pokrywa
zwiększone zapotrzebowanie wynikające z nasi¬
lenia glukoneogenezy z aminokwasów.
Kwas nikotynowy podawany w dawkach 1-6 g/d
w terapii hiperlipemii może być przyczyną napa¬
dowego rozszerzenia naczyń krwionośnych i za¬
czerwienienia skóry (ang. flushing) oraz objawów
podrażnienia skóry. Ponadto zażywanie kwasu
nikotynowego lub amidu kwasu nikotynowego
w dawkach wyższych niż 500 mg/d może powo¬
dować uszkodzenie wątroby.
WITAMINA B6 JEST WAŻNYM OGNIWEM
W PRZEMIANIE AMINOKWASÓW
I GLIKOGENU ORAZ W DZIAŁANIU
HORMONÓW STEROIDOWYCH
Aktywność witaminy B6 wykazuje sześć związ¬
ków (ryc. 44-12): pirydoksyna, pirydoksal i pi-
rydoksamina oraz ich 5'-fosforany. Aktywnym
koenzymem jest 5'-fosforan pirydoksalu. Około
80% ogólnoustrojowej witaminy B6 to fosforan
pirydoksalu mięśni, przeważnie w połączeniu
z fosforylazą glikogenową. W stanach niedoboru
jest on niedostępny. W stanach wygłodzenia ule-
HOCHjInH
^CH,
Pirydoksyna
HC=0
H0CH2yV>H
Pirydoksal
N xCH3
Pirydoksamina
° ch2oh
°“fOCH2
.?QSFAm...\ °"
I KINAZA I
Fosforan pirydoksyny
\0KSYDAZA\
0_
I
0 = POCHo
HC=0
I
iMWl u = poch2
FOSFATAZA 1 0_ ^JL
N TH;
Fosforan pirydoksalu
AMINOTRANSFERAZA
I KINAZA
OKSYDAZA1
CHoNHo
I
■ 0 “P°CH2
FOSFATAZA 1 °~ ^rACH3
Fosforan pirydoksaminy
Ryc. 44-12. Przekształcenia zachodzące w strukturze poszcze¬
gólnych przedstawicieli witaminy B6.
Witamina B„ spełnia wiele funkcji
w przemianach metabolicznych
Fosforan pirydoksalu jest koenzymem wielu enzy¬
mów przemiany aminokwasowej, w szczególno¬
ści transaminacji i dekarboksylacji. Jest również
kofaktorem fosforylazy glikogenowej, dla której
grupa fosforanowa jest ważna pod względem ka¬
talitycznym. Ponadto witamina B6 ma znaczenie
w mechanizmie działania hormonów. Fosforan
pirydoksalu rozrywa wiązanie kompleksu hor-
mon-receptor z DNA, przerywając w ten sposób
działanie hormonów. W stanie niedoboru witami¬
ny B6 występuje zwiększona wrażliwość ustroju
na działanie małych stężeń estrogenów, androge-
nów, kortyzolu i witaminy D.
Niedobór witaminy B„
zdarza się rzadko
Chociaż kliniczne skutki niedoboru witaminy B6
zdarzają się rzadko, to jednak istnieją dowody, że
u znacznej części ludności poziom tej witaminy
w organizmie jest na granicy stanu normalnego.
Niewielkie niedobory objawiają się zaburzenia¬
mi przemiany tryptofanu i metioniny. Wzmożona
wrażliwość na działanie hormonów steroidowych
(występująca w niedoborze witaminy B6) może
stanowić ważne ogniwo w rozwoju hormonoza-
leżnego raka piersi, macicy i prostaty, zawartość
zaś tej witaminy B6 w ustroju może mieć wpływ
na rokowanie u takich chorych.
Zawartość witaminy B6 w ustroju
można ocenić na podstawie aktywności
aminotransferaz w krwinkach
czerwonych
Najczęściej stosowaną metodą określenia za¬
wartości witaminy B6 w ustroju jest oznacze¬
nie współczynnika aktywności aminotransferaz
w krwinkach czerwonych po uprzedniej akty¬
wacji tych enzymów egzogennym fosforanem
pirydoksalu.
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 601
Nadmiar witaminy B6 może być przyczyna
neuropatii sensorycznej
Stwierdzono występowanie neuropatii senso¬
rycznej u pacjentów zażywających pirydoksynę
w dawce 2-7 g/d z różnych przyczyn. Wiele do¬
wodów przemawia za skutecznością stosowania
witaminy B6 w leczeniu zespołu napięcia przed-
miesiączkowego. Po odstawieniu tak dużych
dawek witaminy B6 nadal obserwuje się pewne
objawy neurologiczne. Inne doniesienia sugerują,
że podawanie witaminy B6 w dawkach przewyż¬
szających 200 mg/d może być przyczyną wystą¬
pienia objawów neurotoksyczności.
WITAMINA B12 WYSTĘPUJE TYLKO
W POKARMACH POCHODZENIA
ZWIERZĘCEGO
Termin „witamina Bi2” jest wspólną nazwą dla
kobalamin, czyli korynoidów (związków za¬
wierających kobalt w pierścieniu korynowym)
wykazujących aktywność biologiczną witamin
(ryc. 44-13). Niektóre korynoidy, będące czyn¬
nikami wzrostowymi dla drobnoustrojów, nie
tylko że nie wykazują aktywności witaminy B12,
lecz mogą nawet być antymetabolitami tej wita¬
miny. Chociaż witamina Bi2 syntetyzowana jest
wyłącznie przez drobnoustroje, to jednak można
przyjąć, że głównym źródłem witaminy Bi2 dla
człowieka są pokarmy pochodzenia zwierzęcego,
gdyż rośliny nie wytwarzają tej witaminy [o ile
nie są zanieczyszczone drobnoustrojami - przyp.
tłum.]. Dowodzi to, że ściśli wegetarianie (wega-
nie) są grupą ryzyka rozwoju stanów niedoboru
witaminy B|2. Wprawdzie małe ilości witaminy
B12 wytwarzane przez bakterie znajdujące się na
powierzchni owoców mogą być wystarczające
dla pokrycia zapotrzebowania na tę witaminę, to
jednak są dostępne preparaty B|2 uzyskane drogą
fermentacj i bakteryj nej.
Wchłanianie witaminy B12 wymaga
obecności dwóch białek wiążących
Witamina B12 ulega wchłanianiu z przewodu pokar¬
mowego po związaniu z czynnikiem wewnętrz¬
nym, będącym małocząsteczkową glikoproteiną
wydzielaną przez komórki okładzinowe błony
śluzowej żołądka. Kwas solny soku żołądkowego
/
NH
/
h3c — c — 0
H
H0CH2
Hyc. 44-13. Witamina B12. Cztery miejsca koordynacji na central¬
nie położonym członie kobaltu są chelatowane przez atomy azo¬
tu pierścienia korynowego i jedno przez atom azotu nukleotydu
dimetylobenzimidazolowego. Szóste miejsce koordynacji może
być zajęte przez: CN" (cyjanokobalamina), OH” (hydroksykoba-
lamina), H20 (akwakobalamina), -CH3 (metylokobalamina) lub
5 '-deoksyadenozynę (adenozylokobalamina).
i pepsyna uwalniają witaminę B,2 z białek zawar¬
tych w pokarmach, udostępniając ją kobalofilinie,
tj. białku wiążącemu, wydzielanemu przez ślinian¬
ki. W dwunastnicy kobalofilina ulega hydrolizie,
a uwolniona witamina B12 zostaje związana przez
czynnik wewnętrzny. W razie niewydolności ze-
wnątrzwydzielniczej trzustki może wystąpić nie¬
dobór witaminy B|2, spowodowany wydalaniem
z kałem kompleksu kobalofiliny z tą witaminą.
Czynnik wewnętrzny wiąże tylko aktywne pochod¬
ne witaminy B12, nie wiąże natomiast nieczynnych
korynoidów. Absorpcja witaminy B,2 odbywa się
w dystalnej V3 części jelita cienkiego. Uczestniczą
w niej receptory wiążące się z kompleksem wita¬
mina B|2-czynnik wewnętrzny, lecz niewiążące ani
wolnej witaminy B|2 (niewiązanej), ani samego
czynnika wewnętrznego.
Trzy enzymy są zależne od witaminy B12
Enzymami zależnymi od witaminy BI2 są: mutaza
metylomalonylo-CoA, aminomutaza leucyno-
602 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ryc. 44-14. Homocysteina i „pułapka folianowa”. Niedobór
witaminy B12 jest przyczyną upośledzonej aktywności syntazy
metioninowej, prowadzącej do gromadzenia się homocysteiny
i wyłapywania folianu w postaci metylotetrahydrofolianu („pułap¬
ka folianowa”).
wa i syntaza metioninowa (ryc. 44-14). Mety-
lomalonylo-CoA jest substancją pośrednią (inter-
mediatem) katabolizmu waliny i produktem kar-
boksylacji propronylo-CoA, powstającego w na¬
stępstwie katabolizmu izoleucyny, cholesterolu
i, rzadko, kwasów tłuszczowych zawierających
nieparzystą liczbę atomów węgla lub bezpośred¬
nio z propronianu, ważnego produktu fermentacji
bakteryjnej w żwaczu. Podlega on w kolejności
przegrupowaniu do sukcynylo-CoA z udziałem
witaminy Bi2, katalizowanemu przez mutazę me-
tylomalonylo-CoA (ryc. 20-2). Aktywność tego
enzymu ulega znacznemu osłabieniu w stanach
niedoboru witaminy Bi2, co powoduje gromadze¬
nie się metylomalonylo-CoA i zwiększone wyda¬
lanie kwasu metylomalonowego z moczem. Ozna¬
czanie tego kwasu w moczu jest wskaźnikiem za¬
wartości witaminy Bi2 w ustroju człowieka.
Niedobór witaminy B12 jest przyczyną
niedokrwistości złośliwej
Niedokrwistość złośliwa powstaje wtedy, kiedy
na skutek niedoboru witaminy B|2 zostaje zabu¬
rzona przemiana kwasu foliowego i następnie ery-
tropoeza, w wyniku czego uwalniają się ze szpiku
kostnego do krwi niedojrzałe prekursory krwinek
czerwonych (niedokrwistość megaloblastyczna).
Najczęstszą przyczyną niedokrwistości złośliwej
jest upośledzone wchłanianie witaminy B,2 z prze¬
wodu pokarmowego. Może ono być spowodowa¬
ne niedoborem czynnika wewnętrznego (uwarun¬
kowanym immunologicznym uszkodzeniem ko¬
mórek okładzinowych żołądka przez przeciwciała
skierowane przeciw czynnikowi wewnętrznemu).
OH
N iT
0
coo-
H
h li
. CH2 — N y-C-N-
' 10 \=/ H
I
-CH
|
jl i
H2N"^r
5 j
^ l\T
CH2
I
H
Tetrahydrofolian (THF)
ch2
c=o
I
(Glu)n
HoN^rr^r
H
CH2— N —
5-Formylo-THF
HC=0
I
CH2 — N —
10-Formylo-THF
HC=NH
H2N
h2n^n
N'
H
:h2—|
,CH2-N-
5.10-Metyleno-THF
CH3
OH H
nXJych-n-
HN^N^tr 5-Mety|o-THF
2 H
J* 'I
h2n^n
irCH—i
,l\l .ch2 —N —
N'
H
Ryc. 44-15. Kwas tetrahydrofoliowy i jego pochod¬
ne z przyłączonymi grupami jednowęglowymi.
5,10-Metenylo-THF
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 603
W POŻYWIENIU WYSTĘPUJĄ LICZNE
POSTACIE FOLIANÓW
Aktywną postacią kwasu foliowego (który jest
pteroiloglutaminianem) jest tetrahydrofolian
(ryc. 44-15). Foliany zawarte w pożywieniu
mogą zawierać do 7 dodatkowych reszt gluta-
minianowych powiązanych wiązaniami y-pep-
tydowymi. Wszystkie przedstawione na ryc.
44-15 jednowęglowe pochodne folianu mogą
występować w pożywieniu. Wielkość wchłania¬
nia poszczególnych postaci folianów jest różna,
dlatego pobranie folianów wyraża się w równo¬
ważnikach folianowych. Stanowią one sumę mi-
krogramów folianów zawartych w pożywieniu
i wyrażenia 1,7 * pg kwasu foliowego użytego
do wzbogacenia pokarmów.
Tetrahydrofolian jest nośnikiem
aktywnych jednostek jednowęglowych
Tetrahydrofolian może być nośnikiem jednowę-
glowych grup przyłączonych do atomów N-5
(grupa formylowa, formiminowa lub metylowa),
N-10 (grupa formylowa) lub atomów mostkują¬
cych N-5-N-10 (grupa metylenowa lub metenylo-
wa). 5-Formylotetrahydrofolian jest bardziej sta¬
bilny niż folian i dlatego jest stosowany jako lek
(zwany kwasem foliowym); związek syntetyczny
(w postaci racemicznej) jest nazywany leukowo-
ryną. Głównym czynnikiem wprowadzającym
grupy jednowęglowe do podstawionych folianów
jest metylenotetrahydrofolian (ryc. 44-16), po¬
wstający w reakcji glicyny, seryny i choliny z te-
trahydrofolianem. Najważniejszym źródłem pod¬
stawionych folianów potrzebnych w reakcjach
biosyntetycznych jest seryna, a aktywność trans-
ferazy hydroksymetylowej seryny jest regulowana
stężeniem podstawionych folianów i dostępnością
folianu. Reakcja ma charakter odwracalny, dlate¬
go w wątrobie może powstać seryna z glicyny
będąca substratem procesu glukoneogenezy. Me-
tyleno-, metenylo- i 10-formylotetrahydrofoliany
mogą podlegać wzajemnej przemianie (konwer¬
sji). Jeżeli nie ma zapotrzebowania na podstawio¬
ne jednowęglowymi grupami foliany, następuje
utlenienie formylotetrahydrofolianu. W wyniku
tej reakcji powstaje ditlenek węgla i wolny folian,
dzięki czemu możliwe jest utrzymanie pewnej
puli ogólnoustrojowej tej witaminy.
Inhibitory przemiany folianów są
wykorzystywane w chemioterapii
nowotworów oraz jako leki
przeciwbakteryjne i przeciwmalaryczne
Metylacja monofosforanu deoksyurydyny
(dUMP) do monofosforanu tymidyny (TMP), ka¬
talizowana przez syntazę tymidylanową, stanowi
istotne ogniwo w syntezie DNA. Grupa jednowę-
glowa metylenotetrahydrofolianu ulega redukcji
z utworzeniem grupy metylowej. W reakcji tej
zostaje uwolniony dihydrofolian, który - ulega¬
jąc redukcji przez reduktazę dihydrofolianową
- tworzy tetrahydrofolian. Syntaza tymidylanowa
i reduktaza dihydrofolianową są szczególnie ak¬
tywne w tkankach wykazujących wysoki poziom
proliferacji komórek. M eto t reksa t, będący analo-
Histydyna
Źródła jednostek jednowęglowych
Seryna ^
Glicyna
Cholina ^
► Formimino-THF
Metyleno-THF
Metenylo-THF
Synteza z użyciem jednowęglowych jednostek
^ Seryna
Metylo-THF ► Metionina
TMP + dihydrofolian
DNA
Formylo-THF -
^ Formylometionina
► Puryny
"C02
Ryc. 44-16. Źródła i wykorzystanie jednowęglowych pochodnych folianów.
604 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
giem 10-metylotetrahydrofolianu, hamuje reduk-
tazę dihydrofolianową, dlatego jest wykorzysty¬
wany jako lek przeciwnowotworowy. Reduktazy
dihydrofolianowe niektórych bakterii i pasożytów
różnią się od enzymu ludzkiego. Inhibitory tych
enzymów są stosowane jako leki przeciwbakte-
ryjne (trimetoprim) lub przeciwmalaryczne (py-
rimetamina).
Niedobór witaminy B1Z jest przyczyna
czynnościowego niedoboru folianów
- „pułapka folianowa”
S-Adenozylometionina, działając jako donor
grupy metylowej, tworzy homocysteinę, która
może ulec ponownej metylacji przez metylote-
trafolian. Ta ostatnia reakcja jest katalizowana
przez syntazę metioninową, będącą enzymem
zależnym od witaminy B]2 (p. ryc. 44-14). Po¬
nieważ redukcja metylenotetrahydrofolianu do
metylotetrafolianu jest nieodwracalna, a głów¬
nym źródłem tetrahydrofolianów dla tkanek
jest metylotetrahydrofolian, rola syntazy me-
tioninowej jest kluczowa, gdyż stanowi ogniwo
czynnościowe między folianem i witaminą Bi2.
Upośledzenie syntazy metioninowej występują¬
cej w stanach niedoboru witaminy Bi2 jest przy¬
czyną gromadzenia się metylotetrahydrofolianu,
co jest określane jako „pułapka folianowa”. Jest
to zatem czynnościowy niedobór folianów w na¬
stępstwie niedoboru witaminy Bl2.
Niedobór folianów jest przyczyna
niedokrwistości megaloblastycznej
Niedobór kwasu foliowego lub niedobór witami¬
ny Bi2, będący przyczyną czynnościowego niedo¬
boru kwasu foliowego, powoduje upośledzenie
czynności komórek szybko się mnożących, po¬
nieważ wykazują one zwiększone zapotrzebo¬
wanie na tymidynę niezbędną w syntezie DNA.
Klinicznie niedobór ten dotyczy szpiku kostnego
i jest przyczyną rozwoju niedokrwistości mega¬
loblastycznej.
Suplementacja kwasu foliowego
zmniejsza ryzyko nieprawidłowego
rozwoju cewy nerwowej
i hiperhomocysteinemii, a także może
zmniejszyć częstość występowania
chorób układu sercowo-naczyniowego
oraz niektórych nowotworów
Stosując przed zapłodnieniem suplementację fo¬
lianów w ilości 400 pg/d, można znacznie zmniej¬
szyć ryzyko wystąpienia spina bifida i innych
defektów cewy nerwowej. Zwiększone stężenie
homocysteiny stanowi znaczne zagrożenie dla
rozwoju miażdżycy naczyń, zmian zakrzepo¬
wych i nadciśnienia tętniczego. Zmiany te są
spowodowane upośledzoną syntezą metylotetra¬
hydrofolianu przez reduktazę metylenotetrahy-
drofolianową, przez co rozwija się czynnościowy
niedobór folianu, prowadzący do upośledzenia
ponownej metylacji homocysteiny do metioniny.
Osoby wykazujące genetycznie uwarunkowaną
nietypową odmianę reduktazy metylenotetrahy-
drofolianowej nie są narażone na hiperhomocy-
steinemię, jeżeli pobierają względnie wysokie
dawki folianów. Nie jest jednak pewne, czy takie
leczenie ma wpływ na częstość występowania
chorób sercowo-naczyniowych.
Zostało też udowodnione, że mała zawartość
folianów w organizmie człowieka prowadzi do
upośledzenia metylacji „wysepek” CpG w nici
DNA, co jest czynnikiem sprzyjającym rozwo¬
jowi raka jelita grubego i innych nowotworów.
Wiele badań sugeruje, że wzbogacenie pokarmów
w kwas foliowy może zmniejszyć ryzyko rozwoju
nowotworów.
Wzbogacenie pokarmów
w kwas foliowy może być
zagrożeniem dla niektórych osób
Suplementacja kwasu foliowego może zmniej¬
szyć niedokrwistość megaloblastyczną, wywołaną
niedoborem witaminy B12, lecz może także przy¬
spieszyć rozwój nieodwracalnego uszkodzenia
nerwów (spowodowanego niedoborem witaminy
B12). Należy również pamiętać o antagonizmie
w działaniu leków przeciwpadaczkowych i kwasu
foliowego.
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 605
NIEZNANE SA STANY NIEDOBORU BIOTYNY
Na rycinie 44-17 przedstawiono strukturę che¬
miczną biotyny, biocytyny i karboksybiocytyny
(aktywny metabolit biocytyny). Biotyna wystę¬
puje w wielu produktach żywnościowych, po¬
dobnie jak biocytyna (e-aminobiotynylolizyna),
która uwalnia się w procesie proteolizy. Wytwa¬
rzana jest w nadmiarze przez florę bakteryjną jelit
(w ilościach przekraczających zapotrzebowanie).
Ryc. 44-17. Biotyna, biocytyna i karboksybiocytyna.
Stany niedoborów biotyny nie są znane, z wy¬
jątkiem przypadków chorych żywionych przez
wiele miesięcy drogą pozajelitową lub niewielkiej
liczby chorych spożywających nietypowo duże
ilości surowego białka jaj zawierającego awidynę,
tj. białka wiążącego biotynę, przez co staje się ona
niewchłanialna przez jelita.
Biotyna jest koenzymem enzymów
karboksylazowych
Biotyna uczestniczy w przenoszeniu C02 w nie¬
wielkiej liczbie reakcji karboksylacji (karboksyla-
zy: acetylo-CoA, pirogronianowa, propionylo-CoA
i metylokrotonylo-CoA). Syntetaza holokarboksy-
lazowa katalizuje przenoszenie biotyny na resztę
lizyny apo-enzymu, tworząc resztę biocytynową
holoenzymu. Reaktywną substancją pośrednią tej
przemiany jest 1 -A-karboksybiocytyna, utworzona
z wodorowęglanu w reakcji zależnej od ATR Gru¬
pa karboksylazy zostaje następnie przeniesiona na
substrat ulegający karboksylacji. Biotyna uczestni¬
czy również w regulacji cyklu komórkowego, bio-
stymulując kluczowe białka jądra komórkowego.
KWAS PANTOTENOWY, JAKO SKŁADNIK
CoA I BIAŁKA TRANSPORTUJĄCEGO ACP,
UCZESTNICZY W PRZENOSZENIU GRUP
ACYLOWYCH
Kwas pantotenowy odgrywa kluczową rolę
w przemianie grup acylowych jako panteteina
wchodząca w skład CoA oraz białka przenoszą¬
cego reszty acylowe (ACP, ang. acyl carrier pro¬
tein) (ryc. 44-18). Reszta panteteinowa powstaje
przez połączenie pantotenianu z cysteiną, będą-
c =o
l
CHOH
I
h3c - c -ch3
I
ch2oh
Kwas pantotenowy
o = c-nh-ch2-ch2-sh
ch2
ch2
NH
I
C =0
I
CHOH
I
H3c — c—CH3 o- 0"
CHp-0-P -o -p — 0 —CH2 0
Koenzym A (CoASH)
W
Ryc. 44-18. Kwas pantotenowy i CoA.
Gwiazdka oznacza miejsce acylacji przez
kwasy tłuszczowe.
~o-p=o
i
o-
606 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
cą donorem grupy prostetycznej —SH dla CoA
i ACP. CoA uczestniczy w reakcjach cyklu kwa¬
su cytrynowego (rozdz. 17), utlenienia kwasów
tłuszczowych (rozdz. 22), acetylacji i w syntezie
cholesterolu (rozdz. 26). ACP bierze udział w syn¬
tezie kwasów tłuszczowych (rozdz. 23). Kwas
pantotenowy występuje we wszystkich środkach
spożywczych. Nie udowodniono jednoznacznie
występowania stanów niedoboru kwasu pantote¬
nowego u człowieka. Taki niedobór stwierdzono
jedynie w badaniach swoistych stanów niedobo¬
rowych.
KWAS ASKORBINOWY JEST WITAMINA
TYLKO DLA NIEKTÓRYCH GATUNKÓW
Witamina C (ryc. 44-19) jest witaminą dla czło¬
wieka i innych naczelnych, świnki morskiej, nie¬
toperzy, osiadłych ptaków oraz większości ryb
i bezkręgowców. Inne zwierzęta syntetyzują wi¬
taminę C w szlaku kwasu uronowego przemiany
glukozowej (w szlaku tym witamina C jest po¬
średnim metabolitem) (rozdz. 21). U zwierząt, dla
których witamina C jest witaminą, występuje brak
oksydazy gulonolaktonowej. Aktywność witami¬
ny C wykazuje zarówno kwas askorbinowy, jak
i dehydroaskorbinowy.
Witamina C jest koenzymem
dla dwóch grup hydroksylaz
Witamina C jest bardzo ważna dla hydroksylaz
zawierających miedź oraz hydroksylaz zawiera¬
jących żelazo i powiązanych z przemianą kwasu
a-ketoglutarowego. Nasila też aktywność wielu in¬
nych enzymów in vitro, mimo że jest to nieswoiste
działanie osłabiające. Witamina C wykazuje także
wiele efektów nieenzymatycznych, wynikających
z posiadania przez nią własności redukujących oraz
zdolności zmiatania rodników tlenowych.
/^-Hydroksylaza dopaminowa jest enzymem
zawierającym miedź i uczestniczącym w syntezie
amin katecholowych, norepinefryny (noradrenali¬
ny) i epinefryny (adrenaliny). Związki te powstają
z tyrozyny w rdzeniu nadnerczy oraz w ośrodko¬
wym układzie nerwowym. W procesie hydroksy¬
lami Cu+ ulega utlenieniu do Cu2+. Redukcja Cu2+
z powrotem do Cu+ wymaga obecności askorbi-
nianu, który zostaje przekształcony do monode-
hydroaskorbinianu.
Wiele hormonów peptydowych zawiera na kar¬
boksylowym końcu cząsteczki grupę amidową,
pochodzącą z końcowej reszty glicynowej. Glicy¬
na ulega hydroksylacji przy atomie węgla a przez
zawierający miedź enzym - hydroksylazę pepty-
dyloglicynową, potrzebuje obecności askorbinia-
nu do redukcji Cu2+.
Wiele hydroksylaz zawierających żelazo i za¬
leżnych od witaminy C wykazuje jednakowy me¬
chanizm działania, w którym dekarboksylacja
substratu jest powiązana z dekarboksylacją kwa¬
su a-ketoglutarowego. Niektóre z tych enzymów
uczestniczą w modyfikacji białek prekursorowych.
Hydroksylaza prolinowa i lizynowa są potrzebne
w posyntetycznym przekształcaniu prokolagenu
do kolagenu. Ponadto hydroksylaza prolinowa jest
niezbędna do tworzenia osteokalcyny oraz skład¬
nika Clq dopełniacza. Hydroksylaza asparaginia-
nowa bierze udział w posyntetycznej modyfikacji
prekursora białka C, tj. proteazy zależnej od wi¬
taminy K, hydrolizującej aktywowany czynnik V
w kaskadzie krzepnięcia krwi. Hydroksylaza tri-
metylolizynowa i y-butyrobetainowa są potrzebne
w syntezie kamityny.
Niedobór witaminy C jest przyczyna
gnilca (szkorbutu)
Wśród objawów niedoboru witaminy C należy
wymienić zmiany skórne, kruchość naczyń wło-
Ryc. 44-19. Witamina C.
CH o
'£r
OH OH
Askorbinian
■ch „
Cr
0 OH
Monodehydroaskorbinian
(semidehydroaskorbinian)
CH20H
Dehydroaskorbinian
44. MIKROELEMENTY ODŻYWCZE: WITAMINY I SKŁADNIKI MINERALNE 607
sowatych, obrzęki dziąseł, utratę zębów i złama¬
nia kości. Wiele z tych objawów jest spowodowa¬
nych upośledzoną syntezą kolagenu.
Duże pobranie witaminy C
może być korzystne
Przy spożyciu ponad 100 mg witaminy C na dobę
zdolność jej metabolizowania przez ustrój jest
całkowicie wysycona i dalsze zwiększanie poda¬
ży powoduje wydalanie tej witaminy z moczem.
Oprócz wymienionych na początku funkcji wita¬
mina C ułatwia wchłanianie żelaza w przewodzie
pokarmowym, z tym że kwas askorbinowy musi
być obecny w świetle jelita. To wskazuje na ko¬
rzyści ze spożywania dużych ilości witaminy C.
Istnieje mało przekonujących dowodów na to, że
spożycie dużych dawek witaminy C chroni przed
przeziębieniem, chociaż może skrócić czas trwa¬
nia i nasilenia objawów choroby.
SKŁADNIKI MINERALNE SA POTRZEBNE
DO PRAWIDŁOWEGO PRZEBIEGU
PROCESÓW FIZJOLOGICZNYCH
ORAZ BIOCHEMICZNYCH
Wiele ważnych składników mineralnych (tab.
44-2) występuje w różnych produktach żywnoś¬
ciowych i osoby spożywające urozmaiconą dietę
nie są narażone na ich niedobory. Zapotrzebowa¬
nie dobowe na poszczególne składniki mineral¬
ne zawiera się w zakresie od gramów (dla sodu
i wapnia) przez miligramy (dla żelaza i cynku) do
mikrogramów (dla pierwiastków śladowych). Sta¬
ny niedoboru zdarzają się wtedy, kiedy żywność
pochodzi z regionów, w których gleba jest uboga
w składniki mineralne, np. w jod lub selen. Niedo¬
bór tych dwóch składników występuje w wielu re¬
gionach świata. Jeśli żywność pochodzi z różnych
regionów, niedobory składników mineralnych są
mniej prawdopodobne. Dużym problemem oka¬
zuje się jednak niedobór żelaza, ponieważ utrata
Fe z ustroju jest względnie duża (np. w czasie ob¬
fitych krwawień miesiączkowych), podaż zaś od¬
powiedniej jego ilości (wyrównujących jego utra¬
tę) jest trudna. Pokarmy pochodzące z obszarów,
w których gleba jest bogata w selen, mogą być
przyczyną wystąpienia objawów toksyczności,
a spożywanie diety bogatosodowej może sprzyjać
powstawaniu nadciśnienia tętniczego u podatnych
na tę chorobę osób.
Tabela 44-2. Klasyfikacja składników mineralnych oparta na
funkcji, jaką spełniają
Funkcja
Składnik mineralny
Funkcje strukturalne
Wapń, magnez, fosforany
Udział w funkcjach błon
komórkowych
Sód, potas
Tworzenie grup prostetycznych
enzymów
Kobalt, miedź, żelazo,
molibden, selen, cynk
Działanie regulacyjne lub udział
w działaniu hormonów
Wapń, chrom, jod, magnez,
mangan, sód, potas
Działanie nieokreślone, lecz
składnik niezbędny
Krzem, wanad, nikiel, cyna
Działanie występuje, lecz
składnik niesprecyzowany
Fluor, lit
Działanie toksyczne, jeśli
składnik dostarczany
w nadmiarze
Glin, arsen, antymon, bor,
brom, kadm, cez, german,
ołów, rtęć, srebro, stront
STRESZCZENIE
• Witaminy są organicznymi składnikami odżyw¬
czymi, wykazującymi ważne działanie metabo¬
liczne; potrzebne są w małych ilościach i muszą
być dostarczane w diecie, ponieważ ustrój nie
potrafi ich syntetyzować. Witaminy rozpusz¬
czalne w tłuszczach (A, D, E i K) są substan¬
cjami hydrofobowymi. Skuteczne wchłanianie
ich w przewodzie pokarmowym wymaga nie-
zaburzonej absorpcji tłuszczów, w przeciwnym
bowiem razie mogą powstać stany niedoboru
tych witamin.
• Witamina A (retinol) obecna w mięsie i prowita¬
mina (^-karoten) występująca w roślinach ule¬
gają przekształceniu do aldehydu retinolowego
(retinalu), uczestniczącego w procesie widze¬
nia, i do kwasu retinolowego, uczestniczącego
w regulacji ekspresji genów.
• Witamina D jest prohormonem steroidowym,
z którego powstaje kalcytriol. Kalcytriol regu¬
luje przemianę wapniową i fosforową. Niedo¬
bór witaminy D jest przyczyną krzywicy i os-
teomalacji.
• Witamina E (tokoferol) jest najważniejszym an-
tyoksydantem dla człowieka. Działa ona w war¬
stwie lipidowej błon komórkowych, chroniąc
je przed toksycznym wpływem wolnych rodni¬
ków.
608 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
• Witamina K jest kofaktorem karboksylazy;
działa na reszty glutaminianowe białek prekur-
sorowych czynników krzepnięcia i białek kości,
przez co umożliwia chelatowanie przez nie jo¬
nów wapnia.
• Rozpuszczalne w wodzie witaminy z grupy B są
kofaktorami enzymów. Tiamina jest kofaktorem
dekarboksylacji oksydacyjnej a-ketokwasów
i transketolazy w szlaku pentozofosforanowym.
Niacyna i ryboflawina są ważnymi kofaktorami
w reakcjach oksydoredukcyjnych i występują
w enzymach flawoproteinowych oraz w NAD
i NADP.
• Kwas pantotenowy jest składnikiem Co A i biał¬
ka transportującego reszty acylowe (ACP).
Odgrywa on rolę w reakcjach przemiany reszt
acylowych.
• Pirydoksyna w postaci fosforanu pirydoksalu
jest koenzymem kilku enzymów uczestniczą¬
cych w przemianie aminokwasów obejmują¬
cych aminotransferazy i fosforylazę glikoge¬
nową. Biotyna jest koenzymem kilku karbo-
ksylaz.
• Oprócz wielu różnych działań witamina B12
i kwas foliowy stanowią donory grup jedno-
węglowych, potrzebnych w syntezie DNA. Nie¬
dobór tych witamin jest przyczyną niedokrwi¬
stości megaloblastycznej.
• Witamina C jest witaminą rozpuszczalną w wo¬
dzie, utrzymującą witaminę E oraz liczne ko-
faktory z metalami w postaci zredukowanej.
• Dieta powinna dostarczać wszystkich składni¬
ków mineralnych niezbędnych do prawidłowe¬
go funkcjonowania organizmu. Przy niedosta¬
tecznej podaży mogą się rozwinąć stany niedo¬
borowe, natomiast nadmierna podaż może być
przyczyną wystąpienia objawów toksycznych.
PIŚMIENNICTWO
Bender DA, Bender AE: Nutrition: A Reference Hand-
book. Oxford University Press, 1997.
Bender DA: Nutritional Biochemistry of the Witamins,
2nd edition, Cambridge University Press, 2003.
Department of Health: Dietary Reference Values for
Food Energy and Nutrients for the United King-
dom. Her Majesty’s Stationery Office, 1991.
Department of Health: Folie Acid and the Prevention of
Disease. The Stationery Office, 2000.
FAO/WHO: Humań Witamin and Minerał Reąuirements:
Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation:
Bangkok, Thailand. Food and Nutrition Division of
the United Nations Food and Agriculture Organiza-
tion, 2000.
Geissler C, Powers HJ: Humań Nutrition, llth edition,
Elsevier, 2005.
Institute of Medicine: Dietary Reference Intakes for
Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitarnin D and
Fluoride. National Academy Press, 1997.
Institute of Medicine: Dietary Reference Values for
Thiamin, Riboflavin, Niacin, Witamin B# Folate,
Witamin BI2, Pantothenic Acid, Biotin and Cholinę.
National Academy Press, 2000.
Institute of Medicine: Dietary Reference Yalues for Wita¬
min C, Witamin E, Selenium and Carotenoids. Na¬
tional Academy Press, 2000.
Institute of Medicine: Dietary Reference Intakes for Wita¬
min A, Witamin K, Arsenie, Boroń, Chromium, Cop-
per, Iodine, Iron, Manganese, Molybdenum, Nickel,
Silicon, Vanadium and Zinc. National Academy
Press, 2001.
Wewnątrzkomórkowy transport
i sortowanie białek
i
l
Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Białka są transportowane z polirybosomów do
wielu różnych miejsc w komórce, aby mogły peł¬
nić swoje funkcje. Niektóre białka są przeznaczone
na komponenty dla specyficznych organelli, inne
do cytozolu lub są wydalane z komórki, a jeszcze
inne znajdą się w różnych błonach komórkowych.
Dlatego wewnątrzkomórkowy transport białek
jest zagadnieniem ważnym. Wiele badań wyka¬
zało, że aparat Golgiego odgrywa istotną rolę
w sortowaniu białek, dzięki czemu mogą one być
kierowane do miejsca docelowego. Odkryto, że
białka zawierają informację (sygnał lub sekwen¬
cję kodującą) naprowadzającą je na właściwe
miejsce przeznaczenia. Od kiedy liczba sygna¬
łów została określona, stało się jasne, że pewne
choroby powstają w wyniku mutacji mających
wpływ na te sygnały. W tym rozdziale omówiono
wewnątrzkomórkowy transport białek i ich sor¬
towanie oraz, w skrócie, niektóre zaburzenia po¬
wstające na skutek różnych nieprawidłowości.
WIELE BIAŁEK JEST NAPROWADZANYCH
DO ICH MIEJSC PRZEZNACZENIA
ZA POŚREDNICTWEM SEKWENCJI
SYGNAŁOWYCH
Szlaki biosyntezy białek w komórkach mogą być
rozpatrywane jako jeden wielki system sortują¬
cy. Wiele białek zawiera sygnały (zwykle, lecz
nie zawsze, są to specyficzne sekwencje amino¬
kwasów), które kierują je do miejsc przeznacze¬
nia, zapewniając w ten sposób umieszczenie ich
we właściwej błonie lub kompartmencie (prze¬
dziale) komórkowym; sygnały te są podstawowy¬
mi elementami systemu sortującego. Zwykle są
one rozpoznawane i oddziałują z dopełniającymi
je miejscami w białkach, które pełnią rolę recep¬
torów dla zawierających je białek.
Ważna decyzja dotycząca sortowania białek
zapada już na wczesnych etapach biosyntezy,
gdy specyficzne białka są syntetyzowane albo na
wolnych, albo na związanych z błoną polirybo-
somach. Powstają w ten sposób dwa układy sor¬
tujące: cytozolowy i szorstkiej siateczki śród-
plazmatycznej (RER, ang. rough endoplasmic
reticulum) (ryc. 45-1). Podział ten wynika z faktu,
że białka syntetyzowane na polirybosomach zwią¬
zanych z błonami zawierają peptyd sygnałowy,
który pośredniczy w ich wiązaniu do błony sia¬
teczki śródplazmatycznej. Dalsze szczegóły doty¬
czące peptydu sygnałowego opisano niżej. Białka
syntetyzowane na wolnych polirybosomach nie
zawierają tego szczególnego peptydu sygnałowe¬
go i są transportowane do cytozolu. Stąd są kie¬
rowane wprost do mitochondriów, jądra i perok-
sysomów za pośrednictwem swoistych sygnałów
lub pozostają w cytozolu, jeśli takiego sygnału nie
mają. Każde białko zawierające sekwencję napro¬
wadzającą, która jest potem usuwana, nosi nazwę
preproteiny. W niektórych przypadkach drugi
peptyd również jest usuwany i wówczas orygi¬
nalne białko jest nazywane preproproteiną (np.
preproalbumina, p. rozdz. 49).
Docelowym miejscem wielu białek syntety¬
zowanych i sortowanych w układzie szorstkiej
siateczki śródplazmatycznej (ryc. 45-2) są róż¬
ne błony (np. siateczka śródplazmatyczna, aparat
Golgiego, lizosomy i błona plazmatyczna); biał¬
ka te są również wydalane. Do białek tych zali¬
cza się także enzymy lizosomalne. Z tego wzglę¬
du białka takie mogą pozostawać w błonach lub
610 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Białka
Mitochondrialne
Jądrowe
Peroksysomalne
Cytoplazmatyczne
Błony ER
Błony aparatu Golgiego
Błony plazmatyczne
Wydzielnicze
Enzymy lizosomalne
Ryc. 45-1. Schemat dwóch dróg sortowania białek przez syntezę
na cytozolowych (1) i związanych z błonami polirybosomach (2).
Mitochondrialne białka są kodowane przez geny jądrowe. Sygna¬
ły użyte w dalszym sortowaniu większości z tych białek zamiesz¬
czono w tab. 45-4 (ER - siateczka śródplazmatyczna).
w świetle siateczki śródplazmatycznej, lub też
mogą uczestniczyć w głównym szlaku trans¬
portowym białek wewnątrzkomórkowych do
aparatu Golgiego. Dalsze, zależne od sygnałów
sortowanie określonych białek zachodzi w apa¬
racie Golgiego, co pozwala na ich dostarczenie
do lizosomów, błon aparatu Golgiego i innych
miejsc. Uważa się, że docelowymi miejscami
przeznaczenia białek nieniosących swoistych
sygnałów sortujących, które przechodzą jednak
przez aparat Golgiego, jest błona plazmatyczna
lub układ wydziełniczy.
Cała droga od siateczki śródplazmatycznej
przez aparat Golgiego do błony plazmatycznej
jest często nazywana drogą wydziełniczą lub
egzocytotyczną. Temu zagadnieniu zostanie po¬
święcone więcej uwagi. Większość białek, które
osiągają aparat Golgiego lub błonę plazmatyczną,
jest transportowana w specjalnych pęcherzykach
transportujących; krótki opis powstawania tych
ważnych cząstek zostanie podany niżej. Inne biał¬
ka przeznaczone do wydzielania są przenoszone
przez pęcherzyki wydzielnicze (sekrecyjne)
(p. ryc. 45-2). Występują one głównie w trzustce
i niektórych innych gruczołach. Tworzenie się ich
i opróżnianie jest regulowane i często nazywane
„sekrecją regulowaną”. Droga wydziełniczą
obejmująca transport z udziałem pęcherzyków
transportujących jest nazywana „sekrecją kon¬
stytutywną”.
Eksperymenty, które miały znaczący wpływ na
wyjaśnienie procesów opisywanych w tym roz¬
dziale obejmowały: (1) użycie mutantów droż¬
dży; (2) zastosowanie technik rekombinacyjnych
DNA (np. wywoływanie mutacji lub eliminacja
określonych sekwencji w białkach, lub wbudo¬
wywanie sekwencji do białek); (3) wytworzenie
układów in vitro (np. badanie translokacji w reti-
kulum endoplazmatycznym i mechanizmów two¬
rzenia się pęcherzyków).
Sortowanie białek należących do systemu cyto-
zolowego wspomnianego wyżej zostało opisane
w dalszej części i zaczyna się od sortowania bia¬
łek mitochondrialnych.
MIT0CH0NDRIA ZARÓWNO IMPORTUJĄ,
JAKI SYNTETYZUJĄ BIAŁKA
Mitochondrium zawiera wiele białek. Trzyna¬
ście białek (w większości składniki błon łań¬
cucha transportu elektronów) jest kodowanych
przez genom mitochondrialny i syntetyzo¬
wanych w tym organellum przez własny układ
biosyntezy białka. Jednak większość białek (co
najmniej kilkaset) jest kodowana przez geny
jądrowe i syntetyzowana poza mitochondriami
na polirybosomach cytozolowych, i musi być
przez mitochondria importowana. Szczególnie
użytecznym modelem do analizy mechanizmów
importowania tych białek okazały się komórki
drożdży, częściowo dlatego, że drożdże mają
zdolność wytwarzania różnorodnych mutan¬
tów, dzięki którym wyjaśniono wiele fundamen¬
talnych procesów wchodzących w skład tego
zjawiska. Największy postęp został osiągnięty
w badaniach nad białkami obecnymi w macie¬
rzy mitochondrialnej, takich jak podjednostki F,
ATPazy. Poniżej szczegółowo będzie omówiony
tylko szlak importu białek z macierzy.
Białka macierzy musząprzejść z cytozolowych
polirybosomów przez zewnętrzną i wewnętrzną
błonę mitochondrialną. Przejście przez te dwie
błony nazywa się transłokacją. Omawiane białka
mają końcową sekwencję liderową (presekwen-
cję) o długości ok. 20-50 reszt aminokwasowych,
która nie jest wysoce konserwatywna, lecz jest
amfipatyczna i zawiera wiele hydrofobowych
i dodatnio naładowanych reszt aminokwasowych
(np. Lys lub Arg). Presekwencja jest równoważna
białku sygnałowemu pośredniczącemu w przyłą¬
czaniu polirybosomów do błon i siateczki śród-
Polirybosomy
(1) Cytozolowe
(2) Szorstkie ER
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 611
Ryc. 45-2. Schemat systemu szorstkiej siateczki śródplazmatycznej białka sortującego. Nowo syntety¬
zowane białka są wprowadzane do błony lub do światła siateczki śródplazmatycznej z polirybosomów
związanych z błonami (małe czarne kółka umieszczone na cytozolowej powierzchni siateczki śródpla¬
zmatycznej). Białka, które są transportowane poza siateczkę śródplazmatyczną (zaznaczone jako ciągłe
czarne strzałki) pochodzą z przejściowych składników wolnych rybosomów. Takie białka mogą przenikać
przez różne subkompartmenty aparatu Golgiego, aż osiągną TGN, tj. miejsce wyjścia z aparatu Golgiego.
W TGN białka są segregowane i sortowane. Białka sekrecyjne są kumulowane w ziarnistościach wydziel-
niczych, z których są wyrzucane w sposób, jaki pokazano w górnym prawym rogu ryciny. Białka prze¬
znaczone dla błony plazmatycznej lub te, które są wydzielane w sposób konstytutywny, są kierowane do
powierzchni komórki w pęcherzykach transportujących w sposób, jaki pokazano w środkowej górnej czę¬
ści ryciny. Niektóre białka mogą osiągnąć powierzchnię komórek za pośrednictwem późnych i wczesnych
endosomów. Inne białka wchodzą do prelizosomów (późne endosomy) i są selektywnie przenoszone do
lizosomów. Szlak endocytozy zilustrowany w lewej górnej części ryciny omówiono w innym miejscu tego
rozdziału. Zawracanie białek z aparatu Golgiego do siateczki śródplazmatycznej nie jest przedstawione na
tym schemacie (CGN - przedział cis-Golgi; TGN - przedział trans-Golgi) (dzięki uprzejmości E Degen).
612 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
plazmatycznej (p. niżej), ale w tym wypadku
kieruje ona białko do macierzy mitochondrialnej;
jeśli sekwencja liderowa zostanie odcięta, białka
nie wejdą do macierzy.
Uważa się, że translokacja występuje potrans-
lacyjnie po uwolnieniu białek macierzy z cytozo-
lowych polirybosomów. Translokację bezwzględ¬
nie poprzedza oddziaływanie z wieloma białkami
cytozolowymi, które pełnią funkcję białek opie¬
kuńczych, czyli chaperonów (p. niżej) i czynni¬
ków kierujących transportem, zapewniając jego
prawidłowy przebieg.
W translokacji uczestniczą dwa odrębne
kompleksy translokacyjne, umiejscowione
w zewnętrznej i wewnętrznej błonie mitochon¬
drialnej, określane odpowiednio TOM (ang.
translocase-of-the outer membranę) i TIM (ang.
translocase-of-the inner membranę). Analiza
kompleksów translokacyjnych ujawniła ich bu¬
dowę złożoną z wielu białek, z których jedne
pełnią funkcję receptorów dla dostarczanych
białek, a inne są składnikami przezbłonowych
kanałów (np. Tom40), przez które białka muszą
się przedostawać. Za pośrednictwem komplek¬
sów translokacyjnych mogą wchodzić jedynie
białka w stanie niesfałdowanym, co jest moż¬
liwe dzięki zależnemu od ATP wiązaniu się
ich z kilkoma białkami chaperonowymi. Rola
białek chaperonowych w fałdowaniu białek bę¬
dzie omawiana w dalszej części tego rozdziału.
W mitochondriach białka te uczestniczą w trans¬
lokacji, sortowaniu, fałdowaniu, organizowa¬
niu i degradacji importowanych białek. Import
do mitochondriów zachodzi dzięki działającej
w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej
sile protonomotorycznej, tworzącej się wskutek
istnienia potencjału elektrycznego w poprzek
błony (strona wewnętrzna ma ładunek ujemny)
i gradientu pH (p. rozdz. 13). Transport dodat¬
nio naładowanej sekwencji liderowej przez błonę
jest ułatwiony dzięki ujemnemu ładunkowi ma¬
cierzy. Presekwencja jest cięta w macierzy przez
specyficzną, uczestniczącą w obróbce białek ma¬
cierzy peptydazę MPP (ang. matrix-processing
peptidase). Do całkowitego zakończenia procesu
importu jest niezbędny kontakt z innymi chape-
ronami obecnymi w macierzy. Oddziaływanie
z białkiem mt-Hsp70 (Hsp = ang. heat shock pro¬
tein, białko szoku termicznego) zapewnia właś¬
ciwy import do macierzy i zapobiega przypadko¬
wemu pofałdowaniu lub agregacji, a interakcja
z mt-Hsp60-Hspl0 zapewnia właściwe pofał¬
dowanie. Omawiane białka szoku termicznego
przypominają bakteryjne chaperoniny GroEL,
stanowiące podklasę chaperonów, które tworzą
złożone, klatkopodobne zgrupowania utworzone
z siedmioczłonowych struktur pierścieniowych.
Oddziaływanie importowanych białek z opisa¬
nymi wyżej chaperonami wymaga hydrolitycz-
nego rozkładu ATP.
Szczegóły dotyczące sposobu, w jaki prepro-
teiny są przemieszczane nie zostały do końca
wyjaśnione. Możliwe, że potencjał elektryczny
związany z wewnętrzną błoną mitochondrialną
wywołuje zmianę konformacyjną w przemiesz¬
czanej niepofałdowanej preproteinie, co pozwala
jej na przejście przez błonę. Ponadto fakt, że ma¬
cierz jest bardziej ujemna niż przestrzeń między-
błonowa może uczynić ją bardziej „atrakcyjną”
i spowodować, że dodatnio naładowany koniec
aminokwasowy preproteiny włączy się do ma¬
cierzy. Aby zjawisko translokacji mogło wystą¬
pić, potrzebny jest bliski kontakt obu stron błony
-wewnętrznej i zewnętrznej.
Dotychczas opisano główne szlaki transpor¬
tu białek do macierzy mitochondrialnej. Pewne
szczególne białka ulegają jednak wbudowaniu do
zewnętrznej błony mitochondrialnej, co uła¬
twia kompleks TOM. Inne białka zatrzymują się
w przestrzeni międzybłonowej, a jeszcze inne
są umieszczane w wewnętrznej błonie mito¬
chondrialnej. Jeszcze inne białka są kierowane do
macierzy, po czym wracają do błony wewnętrz¬
nej lub przestrzeni międzybłonowej. Wiele białek
zawiera dwie sekwencje sygnałowe - jedną do
wejścia do macierzy mitochondrialnej, a drugą
ułatwiającą kolejną relokację (np. do wewnętrz¬
nej błony). Niektóre białka mitochondrialne nie
zawierają presekwencji (np. cytochrom c, który
zlokalizowany jest w przestrzeni międzymembra-
nowej), a inne zawierają wewnętrzne presekwen-
cje. W sumie widać, że białka wykorzystują róż¬
norodne mechanizmy i szlaki w celu osiągnięcia
ostatecznego miejsca swego przeznaczenia w mi¬
tochondriach.
Ogólne cechy charakteryzujące import białek
do organelli, w tym do mitochondriów i niektó¬
rych innych organelli, które będą dalej omawiane,
zestawiono w tab. 45-1.
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 613
Tabela 45-1. Niektóre ogólne cechy importu białek do organelli1
Import białka do organelli zachodzi zwykle w trzech stadiach:
rozpoznawania, translokacji i dojrzewania.
Sekwencje naprowadzające, występujące w białku, są rozpo¬
znawane w cytoplazmie lub na powierzchni organellum.
W procesie translokacji białko występuje w postaci niesfałdowa-
nej, a stan ten jest utrzymywany w cytoplazmie przez chaperony.
Przemieszczanie białka przez błonę wymaga energii i chapero-
nów organellowych po stronie trans błony.
Cykle wiązania i uwalniania białka z chaperonów powodują
wciągnięcie łańcucha polipeptydowego przez błonę.
Inne białka znajdujące się w organellum katalizują proces fał¬
dowania białka i - przyłączając często kofaktory lub oligosa-
charydy - biorą udział w organizowaniu aktywnych monome¬
rów bądź oligomerów.
1 Dane pochodzą z: McNew JA, Goodman JM: The targeting and
assembly of peroxisomal proteins: some old rules do not apply.
Trends Biochem Sci 1998;21:54. Przedrukowano za zgodą El-
sevier.
W TRANSPORCIE MAKROCZĄSTECZEK
DO JADRA IZ JADRA UCZESTNICZĄ
IMPORTYNYIEKSPORTYNY
Oszacowano, że w aktywnej komórce eukario¬
tycznej między jądrem i cytoplazmą transpor¬
towanych jest ponad milion makrocząsteczek
w ciągu minuty. Do makrocząsteczek tych należą
histony, białka rybosomalne i podjednostki ry-
bosomalne, czynniki transkrypcyjne i cząstecz¬
ki mRNA. Transport ich jest dwukierunkowy
i odbywa się przez jądrowe kompleksy porowe
(NPCs, ang. nuclear porę complexes). Są to skom¬
plikowane struktury o masie około 30 razy więk¬
szej niż masa rybosomu, złożone z ok. 100 róż¬
nych białek. Średnica NPC wynosi ok. 9 nm, ale
może osiągać rozmiary większe, sięgające 28 nm.
Cząsteczki o masie cząsteczkowej mniejszej niż
40 kDa mogą przenikać przez pory NPC w wy¬
niku dyfuzji, ale cząsteczki większe przenikają
dzięki specyficznym mechanizmom translokacyj¬
nym. Mechanizmy te są obecnie przedmiotem in¬
tensywnych badań, aczkolwiek pewne ich ważne
właściwości zostały już ujawnione.
Tutaj zostanie głównie opisany import jądro¬
wy niektórych makrocząsteczek. Stwierdzono do
tej pory, że importowane białka (ang. cargo mo-
lecules, transportowane cząsteczki) mają sygnał
lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localiza-
tion signal). Przykładem takiego sygnału jest sek¬
wencja aminokwasowa (Pro)2-(Lys)4-Ala-Lys-Val,
zawierająca dużo zasadowych reszt lizyny. W za¬
leżności od posiadanej sekwencji NLS, transpor¬
towane cząsteczki oddziałują z rozpuszczalnym
białkiem należącym do rodziny białek cytopla-
zmatycznych, zwanych importynami, a powsta¬
ły kompleks lokuje się w NPC. Decydującą rolę
w regulacji oddziaływania utworzonego komplek¬
su z NPC i jego translokacji przez NPC odgrywają
inne białka, należące do rodziny Ran. Białka Ran
są małymi, monomerycznymi GTPazami jądro¬
wymi, które podobnie jak inne GTPazy istnieją
w formie związanej z GDP lub GTP. Białka Ran
są regulowane przez czynniki wymiany nukleoty-
dów guaninowych (GEFs, ang. guanine nucleotide
exchange factors; np. białko RCC1 u eukariotów),
które są zlokalizowane w jądrze, oraz przez białka
aktywujące guaninę (GAPs) dla celów aktywacji
Ran, obecne głównie w cytoplazmie. Forma Ran
związana z GTP występuje w jądrze, natomiast for¬
ma RanGDP - w cytoplazmie. Konformacja i ak¬
tywność cząsteczek Ran zmieniają się w zależności
od związania z nimi GDP lub GTP (w połączeniu
z GTP Ran jest aktywne; p. dyskusja o białkach G
w rozdz. 42). Asymetryczne rozmieszczenie Ran
związanego z nukleotydami GDP/GTP między
jądrem i cytoplazmą określa rolę Ran w transpor¬
cie jednokierunkowym kompleksów przez NPC.
Po uwolnieniu wewnątrz jądra transportowanych
cząsteczek, importyny wracają do cytoplazmy,
gdzie są ponownie wykorzystywane. Na rycinie
45-3 przedstawiono niektóre z podstawowych cech
omawianego procesu.
Inne małe monomeryczne GTPazy (np. ARF,
Rab, Ras i Rho) odgrywają ważną rolę w różno¬
rodnych procesach komórkowych, takich jak po¬
wstawanie i transport pęcherzyków (ARF i Rab;
p. niżej), w niektórych procesach związanych ze
wzrostem i różnicowaniem (Ras) oraz tworzeniem
aktynowego szkieletu komórkowego. Transport
białek przez błony siateczki śródplazmatycznej
zależy również od GTP i GDP (p. niżej).
W transporcie wielu makrocząsteczek z jądra
komórkowego biorą udział białka podobne do
importyn, zwane eksportynami. Przeznaczone
do eksportowania z jądra cząsteczki zawierają ją¬
drowe sygnały eksportujące (NESs, ang. nuclear
export signals). W transport ten są również zaan¬
gażowane białka Ran. Prawdopodobnie procesy
eksportu i importu mają wiele wspólnych cech.
614 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ryc. 45-3. Schemat prawdopodobnej roli białek Ran w imporcie cząsteczek obdarzonych ładunkiem i zawierających
sygnał NLS. (1) Kompleks transportujący powstaje, gdy receptor dla NLS (a, importyna) zwiąże cząsteczkę obdarzoną
ładunkiem przez NLS i czynnik dokujący (p). (2) Dokowanie następuje w miejscach nitkowatych, które wystają z NPC.
RanGDP dokuje się niezależnie. (3) Transfer do kanału translokacyjnego jest pobudzany, gdy RanGEF przekształca Ran-
-GDP w RanGTP (4) NPC przyspiesza translokację kompleksu transportującego. (5) RanGTP wraca do formy RanGDP
przy udziale zadokowanego RanGAP (6) RanGTP rozkłada kompleks transportujący, wiążąc się do miejsca wiązania
w obrębie p. (7) Cząsteczka obdarzona ładunkiem i niosąca NLS opuszcza receptor a, a RanGTP może oddysocjować
od p. (8) Czynniki a i p wracają do cytoplazmy.
Rycina wstawiona: Translokacja Ran jest zahamowana w cytoplazmie i uruchamiana w jądrze. RanGTP pobudza ukierun¬
kowaną przez NLS i NES translokację. Jednak cytoplazmatyczne Ran jest wzbogacone w RanGDP (wyłączone) przez ak¬
tywne RanGAR a pula jądrowa jest wzbogacona w RanGTP (włączone) przez aktywny GEF. Ran-BP1 pobudza przeciwne
aktywności tych dwóch czynników. Bezpośrednie połączenie puli cytoplazmatycznej z jądrową białka Ran następuje za
pośrednictwem NPC, ale mechanizmy transportujące nie są znane. P, - fosforan nieorganiczny; NLS - sygnał lokalizacji
jądrowej; NPC - jądrowy kompleks kanałowy (porowy); GEF - czynnik wymiany nukleotydów guaninowych; GAP - biał¬
ko aktywujące guaninę; NES - jądrowy sygnał eksportujący; BP - białko wiążące. (Rycina reprodukowana za zgodą z:
Goldfarb DS: Whose finger is on the switch? Science 1997;276:1814, Copyright © 1997 AAAS).
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 615
WIĘKSZOŚĆ PRZYPADKÓW ZESPOŁU
ZELLWEGERA JEST SPOWODOWANA
MUTACJAMI GENÓW KODUJĄCYCH
BIAŁKA UCZESTNICZĄCE W IMPORCIE
BIAŁEK PEROKSYSOMALNYCH
Peroksysom jest ważnym organellum biorącym
udział w metabolizmie wielu cząsteczek, takich
jak kwasy tłuszczowe i inne lipidy (np. plazma-
logeny, cholesterol, kwasy żółciowe), puryny,
aminokwasy i nadtlenek wodoru. Każdy perok¬
sysom jest ograniczony pojedynczą błoną i za¬
wiera ok. 50 enzymów; katalaza i oksydaza mo¬
czanowa są enzymami markerowymi tego orga¬
nellum. Białka peroksysomu są syntetyzowane
na polirybosomach cytozolowych i fałdowane
przed importem. Zbadano szlaki importu wie¬
lu peroksysomalnych białek i enzymów, z któ¬
rych niektóre są składnikami macierzy, a inne
składnikami błony. Odkryto co najmniej dwie
sekwencje kierujące białka macierzy per-
oksysomalnej (PTSs, ang. peroxisomal-matrix
targeting seąuences) do tego organellum. Jedna
z nich, PTS1, jest tripeptydem (np. Ser-Lys-Leu,
[SKL], choć stwierdzono zmienność w tej sek¬
wencji), zlokalizowanym przy końcu karboksy¬
lowym wielu białek macierzy, łącznie z katalazą.
Inna sekwencja, PTS2, składająca się z 26-36
reszt aminokwasowych, została wykryta w co
najmniej czterech białkach macierzy (np. tiola-
zie) i w odróżnieniu od PTS1 ulega odcięciu po
wniknięciu białek do macierzy. Białka zawiera¬
jące sekwencje PTS1 tworzą kompleksy z roz¬
puszczalnym białkiem receptorowym (PTS1R),
a białka zawierające sekwencje PTS2 - z recep¬
torem PTS2R. Powstające kompleksy oddziałują
następnie z receptorem błonowym Pexl4p. Biał¬
ka uczestniczące w dalszym transporcie białek do
macierzy są także obecne. Większość peroksyso¬
malnych białek błonowych nie zawiera jednak
żadnej z omówionych wyżej naprowadzających
sekwencji sygnałowych, ale prawdopodobnie za¬
wiera inne sekwencje. Układ importujący może
jednak pobierać nienaruszone oligomery (np.
tetramerycznąkatalazę). Import białek macierzy
wymaga obecności ATP, natomiast import białek
błonowych tego nie wymaga.
Zainteresowanie importem białek do peroksy-
somów znacznie wzrosło w związku z badaniami
nad zespołem Zellwegera. Zespół Zełłwegera
jest schorzeniem wrodzonym, charakteryzują¬
cym się głębokimi zaburzeniami neurologiczny¬
mi, w których następstwie dochodzi do śmierci
przed ukończeniem pierwszego roku życia. Licz¬
ba peroksysomów może być zmienna, od niemal
całkowicie prawidłowej do nawet ich braku
u niektórych pacjentów. Biochemiczne niepra¬
widłowości zespołu są związane z akumulacją
kwasów tłuszczowych o bardzo długim łańcu¬
chu, zaburzeniem syntezy kwasów żółciowych
i istotnym zmniejszeniem zawartości plazma-
logenów. Uważa się, że schorzenie to jest spo¬
wodowane występowaniem mutacji w genach
kodujących pewne białka, zwane peroksynami,
uczestniczące w różnych etapach biogenezy per¬
oksysomów (takich jak import białek opisanych
wyżej), lub w genach kodujących pewne enzymy
peroksysomalne. Ściśle powiązanymi z zespołem
Zellwegera jednostkami chorobowymi są adre-
noleukodystrofia noworodków i niemowlęca
postać choroby Refsuma. Oba schorzenia mają
cechy podobne do zespołu Zellwegera, lecz ten
ostatni jest najgroźniejszy (defekt wielu białek),
a choroba Refsuma jest najmniej niebezpieczna
(defekt jednego lub kilku białek). Tabela 45-2
zawiera wyjaśnienie podstaw tych oraz wielu in¬
nych chorób.
Tabela 45-2. Choroby spowodowane nieprawidłowościami per-
oksysomalnymi1
Numer MIM2
Zespół Zellwegera
214100
Adrenoleukodystrofia noworodków
202370
Niemowlęca postać choroby Refsuma
266510
Kwasica hiperpipekolinowa
239400
Proksymalna chondrodysplazja punktowa
215100
Adrenoleukodystrofia
300100
Rzekoma adrenoleukodystrofia noworodków
264470
Rzekomy zespół Zellwegera
261510
Hiperoksaluria typu 1
259900
Wrodzony brak katalazy (choroba Takahary)
115500
Niedobór oksydazy glutarylo-CoA
231690
1 Dane reprodukowane za zgodą z: Seashore MR, Wappner RS:
Genetics in Primary Care and Clinical Medicine. Appleton and
Lange, 1996.
2 MIM = Dziedziczenie Mendlowskie u ludzi (ang. Mendelian In-
heritance in Man). Każdy numer to odnośnik do literatury, w któ¬
rej można odnaleźć informację dotyczącą każdego z powyższych
schorzeń.
616 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
HIPOTEZA SYGNAŁOWA WYJAŚNIA,
W JAKI SPOSÓB POLIRYBOSOMY WIĄŻĄ
SIĘ Z SIATECZKA ŚRÓDPLAZMATYCZNA
Jak już wspomniano, układ szorstkiej siateczki
śródplazmatycznej jest jednym z dwóch układów
uczestniczących w syntezie i sortowaniu białek.
W układzie tym białka są syntetyzowane na poli-
rybosomach związanych z błoną i przed dalszym
sortowaniem są przemieszczane do światła szorst¬
kiej siateczki śródplazmatycznej (p. ryc. 45-2).
Hipotezę sygnałową zaproponowali Blobel
i Sabatini, częściowo w celu wyjaśnienia różnic
między polirybosomami wolnymi i związanymi
z błonami. Odkryli, że białka syntetyzowane na
polirybosomach związanych z błonami zawierają
na końcach aminowych wydłużenie peptydowe
(peptyd sygnałowy), które uczestniczy w ich
przyłączeniu do błon siateczki śródplazmatycz¬
nej. Jak zauważono wyżej, białka, których cała
synteza zachodzi na wolnych polirybosomach, nie
mająpeptydu sygnałowego. Ważną konsekwencją
tej hipotezy jest potwierdzony już fakt, że wszyst¬
kie rybosomy mają taką samą strukturę i że
różnice między związanymi z błoną i wolnymi
rybosomami wynikają wyłącznie z tego, że pierw¬
sze z nich zawierają białka mające peptydy sygna¬
łowe. Wiele dowodów potwierdziło tę pierwotną
hipotezę. Ponieważ wiele białek błonowych jest
syntetyzowanych na polirybosomach związanych
z błonami, hipoteza sygnałowa odgrywa istotną
rolę w koncepcji budowy błon. Niektóre cechy
peptydów sygnałowych podano w tab. 45-3.
Tabela 45-3. Niektóre właściwości peptydów sygnałowych
• Zwykle, ale nie zawsze, są zlokalizowane na końcu amino¬
wym.
• Zawierają 12-35 reszt aminokwasowych.
• Metionina jest zwykle końcem aminowym.
• Zawierają centralne skupisko hydrofobowych reszt aminokwa¬
sowych.
• Zawierają co najmniej jedną dodatnio naładowaną resztę ami-
nokwasową położoną blisko końca aminowego.
• Zwykle odszczepieniu ulega reszta Ala przy C-końcu przy
udziale peptydazy sygnałowej.
Na rycinie 45-4 przedstawiono główne etapy
transportu wydzielanych białek przez błony sia¬
teczki śródplazmatycznej. Uwzględnia ona włas¬
ności wynikające wprost z oryginalnej hipotezy
sygnałowej oraz z późniejszych prac. Informa¬
cyjny RNA (mRNA) dla takich białek koduje na
A-końcu peptyd sygnałowy (znany również jako
sekwencja liderowa, chwilowy sygnał insercyjny,
sekwencja sygnałowa lub presekwencja). W hi¬
potezie sygnałowej przyjęto, że białko jest wbu¬
dowywane do błony siateczki śródplazmatycznej
w tym samym czasie, kiedy jego mRNA uczest¬
niczy w procesie translacji na polirybosomach,
co jest nazywane insercją kotranslacyjną. Gdy
peptyd sygnałowy wyłania się z dużej podjed-
nostki rybosomalnej, jest on rozpoznawany przez
cząstkę rozpoznającą sygnał (SRP, ang. signal
recognition particie), która po polikondensacji ok.
70 aminokwasów (40 ukrytych w dużej podjed-
nostce rybosomów, a 30 eksponowanych) blokuje
dalszą translację. Ten blok jest nazywany zatrzy¬
maniem elongacji. Cząstka SRP zawiera 6 białek
połączonych z 7S RNA, który jest ściśle spokrew¬
niony z rodziną Alu często powtarzających się
sekwencji DNA (p. rozdz. 35). Wstrzymany przez
SRP blok nie jest uwolniony dopóty, dopóki kom¬
pleks SRP - peptyd sygnałowy - polirybosom, nie
zwiąże się z tzw. białkiem dokującym (SRP-R,
receptor dla SRP) na błonie siateczki śródpla¬
zmatycznej. W ten sposób SRP kieruje peptyd
sygnałowy do swego receptora SRP-R w błonie
siateczki śródplazmatycznej i zapobiega przed¬
wczesnemu fałdowaniu i wydalaniu syntetyzowa¬
nego białka do cytozolu.
Receptor dla SRP jest integralnym białkiem
błonowym zbudowanym z podjednostek a i p.
Podjednostka a wiąże GDP. Podjednostka P prze¬
nika błonę. Gdy kompleks SRP-peptyd sygnałowy
łączy się z receptorem, następuje wymiana GDP
na GTP. Ta postać receptora (związana z GTP)
ma duże powinowactwo do SRP i dlatego uwal¬
nia peptyd sygnałowy, który wiąże się z układem
translokacyjnym (translokon), również obecnym
w błonie siateczki śródplazmatycznej. Podjednost¬
ka a hydrolizuje następnie związany z nią GTP,
uwalniając GDP, w ten sposób zamyka cykl GTP-
-GDP. Jednokierunkowość tego cyklu pomaga
w przebiegu oddziaływania polirybosomu i jego
peptydu sygnałowego z błoną siateczki śródpla¬
zmatycznej w odpowiednim kierunku (naprzód).
Układ translokacyjny (translokon) składa się
z trzech białek błonowych (kompleks Secól),
tworzących kanał w błonie siateczki śródplazma¬
tycznej, przez który mogą przenikać nowo synte-
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 617
Ryc. 45-4. Schemat przebiegu transportu białek wydzielanych przez błony siateczki śródplazmatycznej wg hipotezy sygnałowej. Ry¬
bosomy syntetyzujące białko przemieszczają się wzdłuż informacyjnego RNA, ustalając sekwencję reszt aminokwasowych w białku
(informacyjny RNA oznaczony jest linią między 5' a 3'). Kodon AUG oznacza start informacji dla białka. Linia poprzecznie kreskowana,
występująca po AUG, reprezentuje kodony dla sekwencji sygnałowej. W miarę wydłużania się łańcucha białkowego poza dużą podjed-
nostkę rybosomalną, sekwencja sygnałowa jest eksponowana i wiązana z cząstką rozpoznającą sygnał (SRP). Translacja zostaje za¬
blokowana, dopóki kompleks nie zwiąże się z „białkiem dokującym”, określanym również jako SRP-R (oznaczonym czarnym słupkiem)
na błonie siateczki śródplazmatycznej. Jest tam także receptor (niezaczerniony słupek) dla samego rybosomu. Interakcja rybosomu
i powiększającego się łańcucha peptydowego z błoną siateczki śródplazmatycznej powoduje otwarcie kanału, przez który białko jest
transportowane do wewnętrznej przestrzeni siateczki śródplazmatycznej. W czasie transportu sygnałowa sekwencja większości białek
zostaje usunięta przez enzym zwany peptydazą sygnałową, zlokalizowaną na wewnętrznej powierzchni błony siateczki śródplazma¬
tycznej. Kompletne białko jest w końcu uwalniane przez rybosom, który następnie rozpada się na swoje dwie składowe, tj. małą i dużą
podjednostkę rybosomalną. Koniec białka znajduje się wewnątrz siateczki śródplazmatycznej. Więcej szczegółów w tekście. (Rycina
nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Marx JL: Newly madę proteins zip through the celi. Science 1980:207:164.
Copyright © 1980 by the American Association for the Advancement of Science).
tyzowane białka. Kanał ten jest otwarty tylko wte¬
dy, kiedy obecny jest peptyd sygnałowy, a zamy¬
kając się, zapobiega przechodzeniu białek przez
błony siateczki śródplazmatycznej. Przepusto¬
wość kanału została zmierzona doświadczalnie.
Wprowadzenie peptydu sygnałowego do kanału
przenoszącego w czasie, kiedy drugi koniec biał¬
ka jest jeszcze związany z rybosomami, jest nazy¬
wane „insercją kotranslacyjną”. Proces elonga-
cji pozostałej części tego białka prawdopodobnie
ułatwia przechodzenie powstałego białka przez
dwuwarstwę lipidową, gdy rybosomy pozostają
przyłączone do błony siateczki śródplazmatycz¬
nej. W taki sposób powstaje szorstka błona (po¬
kryta rybosomami) siateczki śródplazmatycznej.
Ważne jest, aby białko pozostawało niepofałdo-
wane przed wejściem do kanału przenoszącego,
w przeciwnym razie dostęp do kanału może nie
być możliwy. Rybosomy pozostają przyłączone
do siateczki śródplazmatycznej w czasie syntezy
białek zawierających peptyd sygnałowy, po za¬
kończeniu tego procesu są uwalniane i dysocjują
na charakterystyczne dla nich podjednostki. Pep¬
tyd sygnałowy jest hydrolizowany przez pepty-
dazę sygnałową, zlokalizowaną na luminalnej
stronie błony siateczki śródplazmatycznej (p. ryc.
45-4) i następnie jest szybko degradowany przez
proteazy.
Cytochrom P450 (p. rozdz. 52), stanowiący in¬
tegralne białko błony siateczki śródplazmatycznej,
nie przechodzi całkowicie przez błonę i pozostaje
w niej wraz ze swoim niezmienionym peptydem
sygnałowym. Jego przejściu przez błonę zapobie¬
ga sekwencja reszt aminokwasowych nazywana
sygnałem zatrzymania procesu translokacji
(ang. halt- lub stop-transfer signal).
Białka wydzielane i białka przeznaczone dla
błon odległych od siateczki śródplazmatycznej
całkowicie przenikają przez dwuwarstwę błon i są
wyrzucane do światła siateczki śródnlazmatycz-
618 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
nej. Łańcuchy N-glikanowe, jeśli występują, są
przyłączane (p. rozdz. 46) w czasie, kiedy białka
te przechodzą przez wewnętrzną część błony sia¬
teczki śródplazmatycznej; proces ten nazywany
jest „glikozylacją kotranslacyjną”. W wyniku
tego procesu białka pojawiają się w świetle apa¬
ratu Golgiego, gdzie zachodzą dalsze zmiany
w łańcuchach glikanowych (p. ryc. 46-9) poprze¬
dzające wewnątrzkomórkową dystrybucję lub
sekrecję białek. Istnieją przekonujące dowody, że
peptyd sygnałowy uczestniczy w procesie wbu¬
dowywania białka do błon siateczki śródpla¬
zmatycznej. Zmutowane białka ze zmienionymi
peptydami sygnałowymi, w których hydrofobowa
reszta aminokwasowa jest zastąpiona hydrofilową
resztą aminokwasową, nie są wbudowywane do
błon siateczki śródplazmatycznej. Białka niebło-
nowe natomiast (np. a-globina), do których przy¬
łączono peptydy sygnałowe metodą inżynierii ge¬
netycznej, mogą przechodzić do światła siateczki
śródplazmatycznej lub nawet być wydzielane.
Udowodniono też, że występujący w błonie
siateczki śródplazmatycznej transpozon uczestni¬
czy w transporcie wstecznym (retrogradowym)
różnych cząsteczek ze światła siateczki śródpla¬
zmatycznej do cytozolu. Takiemu transportowi
ulegają niepofałdowane lub błędnie pofałdowa¬
ne glikoproteiny, glikopeptydy i oligosachary-
dy. Niektóre z tych cząsteczek są degradowane
w proteasomach (p. niżej). Tak więc, transport
przez błonę siateczki śródplazmatycznej przebie¬
ga w obu kierunkach.
WBUDOWYWANIE BIAŁEK LUB ICH
PRZYŁĄCZANIE DO BŁON SIATECZKI
ŚRÓDPLAZMATYCZNEJ ODBYWA SIE
KILKOMA SPOSOBAMI
Sposoby wbudowywania białek do błon siateczki
śródplazmatycznej są następujące:
A. Insercja kotranslacyjną
Na rycinie 45-5 pokazano kilka sposobów roz¬
mieszczenia białek w błonie plazmatycznej. Nie¬
które białka (np. receptor LDL) po zewnętrznej
stronie błony mają swoje końce aminowe, inne
zaś (np. receptor asjaloglikoproteinowy) po tej
stronie mają końce karboksylowe. Aby wyjaśnić
takie rozmieszczenie, należy wziąć pod uwagę
początkowe etapy biosyntezy białek zachodzące
na błonie siateczki śródplazmatycznej. Receptor
LDL wnika do błony siateczki śródplazmatycznej
w taki sam sposób jak białko wydzielane (p. ryc.
45-4); przechodzi on częściowo przez błonę sia¬
teczki śródplazmatycznej, przy czym jego peptyd
sygnałowy ulega odcięciu, a koniec aminowy
wystaje do światła siateczki. Jest on jednak za¬
trzymywany w błonie, ponieważ zawiera wysoce
hydrofobowy segment, który stanowi sygnał za¬
trzymania procesu translokacji. Ta sekwencja
tworzy pojedynczy przezbłonowy segment białka
i jest jego domeną kotwiczącą. Mały obszar bło¬
ny siateczki śródplazmatycznej, w którym jest
zlokalizowany nowo zsyntetyzowany receptor
LDL, tworzy następnie komponent pęcherzyka
transportującego, prawdopodobnie pochodzący
z elementów przejściowych siateczki śródplazma¬
tycznej (p. ryc. 45-2). Jak opisano niżej w dysku¬
sji o asymetrii białek i lipidów podczas budowy
błon, umieszczenie receptora w błonie siateczki
śródplazmatycznej jest zagwarantowane dzięki
tworzeniu pęcherzyka, który ostatecznie zlewa się
z błoną plazmatyczną. Receptor asjaloglikopro¬
teinowy ma natomiast wewnętrzną sekwencję
insercyjną, która wbudowuje się w błonę, ale nie
jest odcinana. Działa ona jak kotwica, a karbo¬
ksylowy koniec receptora zostaje wypchnięty przez
błonę. Bardziej złożone rozmieszczenie transpor¬
terów (np. dla glukozy) można tłumaczyć tym, że
przezbłonowe a-helisy działają alternatywnie jako
nieodcięte sekwencje insercyjne lub jako sygnały
zatrzymujące proces translokacji. Każda para he-
likalnych segmentów jest wbudowana jako spinka
(ang. hairpin). Sekwencje, które określają strukturę
białka w błonie, są nazywane sekwencjami topo-
genicznymi. Jak wyjaśniono w podpisie pod ryc.
45-5, wymienione wyżej trzy białka są przykłada¬
mi białek przezbłonowych typu I, II i IV.
B. Synteza na wolnych polirybosomach
I NASTĘPUJĄCE PO NIEJ PRZYŁĄCZENIE DO BŁONY SIATECZKI
ŚRÓDPLAZMATYCZNEJ
Przykładem jest cytochrom b5, który spontanicz¬
nie wnika do błony śródplazmatycznej.
C. Zatrzymanie w świetle siateczki śródplazmatycznej
PRZEZ SWOISTE SEKWENCJE AMINOKWASOWE
Wiele białek ma sekwencję aminokwasową
KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) na końcu karboksylo-
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 619
N N
Receptor LDL
Ciężki łańcuch HLA-A
Hemaglutynina indukowana wirusem grypy
Ryc. 45-5. Różnorodność w sposobie wprowadzania białek do błon. Na schemacie pokazano wiele możliwych ułożeń,
w których segmenty białek w błonie przedstawiono jako a-helisy, a inne segmenty jako linie. Receptor LDL, który jed¬
nokrotnie przenika błonę i którego A/-koniec jest skierowany na zewnątrz, jest nazywany typem I białka przezbłonowego.
Receptor asjaloglikoproteinowy, który także jednokrotnie przenika błonę, ale jego karboksylowy koniec jest skierowany na
zewnątrz, jest nazywany typem II białka przezbłonowego. Cytochrom P450 (niepokazany) jest przykładem białka przez¬
błonowego typu III; jego usytuowanie jest podobne jak białek typu I, lecz nie zawiera odszczepianej sekwencji sygnałowej.
Różne przenośniki pokazane na rycinie (np. przenośnik glukozy) przechodzą przez błonę wielokrotnie i są nazywane
typem III białek przezbłonowych (ang. polytopic membranę proteins). (N - koniec aminowy; C - koniec karboksylowy).
(Rycina reprodukowana za zgodą z: Wickner WT, Lodish HF: Multiple mechanisms of protein insertion into and across
membranes. Science 1985;230:400. Copyright © 1985 by the American Association for the Advancement of Science).
wym. Z powodu takiej sekwencji białka zostaną
przyłączone do wewnętrznej części siateczki
śródplazmatycznej w dość luźny sposób. Jed¬
nym z takich białek jest chaperon BiP (p. niżej).
Białka zawierające sekwencję KDEL wędrują
najpierw do aparatu Golgiego, gdzie oddziałują ze
specyficznym dla KDEL białkiem receptorowym,
po czym wracają w pęcherzykach do siateczki
śródplazmatycznej i oddzielają się od receptora.
D. Wsteczny transport z aparatu Golgiego
Niektóre białka niezawierające sekwencji
KDEL, przeznaczone do budowy błon siateczki
śródplazmatycznej, przechodzą również do apa¬
ratu Golgiego, a następnie wracają za pomocą
pęcherzykowego transportu wstecznego do sia¬
teczki śródplazmatycznej, gdzie ulegają wbudo¬
waniu (p. niżej).
Powyższe przykłady pokazują, że istnieje kilka
sposobów wbudowywania białek do błon siatecz¬
ki śródplazmatycznej; prawdopodobnie podobnie
jest w przypadku innych błon (np. błon mitochon-
drialnych i błon plazmatycznych). Określono sek¬
wencje naprowadzające dla niektórych białek (np.
sekwencje KDEL). Problem biogenezy błon zo¬
stał omówiony w dalszej części tego rozdziału.
BIAŁKA PRZECHODZĄ PRZEZ
KOMÓRKOWE KOMPARTMENTY
DO OKREŚLONYCH BŁON
Schemat przedstawiający możliwy przepływ bia¬
łek błonowych szlakiem: siateczka śródplazma-
tyczna —> aparat Golgiego —► błona plazmatyczna
pokazano na ryc. 45-6. Poziome strzałki ozna¬
czają etapy transportu, które mogą być niezależ¬
ne od sygnałów docelowych, natomiast otwarte
pionowe strzałki pokazują etapy, które zależą od
specyficznych sygnałów. W ten sposób przepływ
620 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Lizosomy
O
Powierzchnia
komórki
O
Pęcherzyki
wydzielnicze
Ryc. 45-6. Przepływ białek błonowych z siateczki śródplazmatycznej na powierzch¬
nię komórki. Poziome strzałki oznaczają etapy, które zostały uznane za niezależne
od sygnałów i dlatego reprezentują one przepływ masowy. Otwarte pionowe strzałki
w obrębie kolejnych kwadratów wskazują retencję białek, które pozostają w błonach
zaznaczonych organelli. Otwarte pionowe strzałki poza kwadratami wskazują uwa¬
runkowany sygnałem transport do lizosomów i do zapasowych ziarnistości sekre-
cyjnych. (Rycina reprodukowana za zgodą z: Pfeffer SR, Rothman JE: Biosynthetic
protein transport and sorting by the endoplasmic reticulum and Golgi. Annu Rev
Biochem 1987;56:829. Copyright © by Annual Reviews, www.annualreviews.org.
Przedrukowano za zgodą)
określonych białek błonowych z siateczki śród¬
plazmatycznej do błon plazmatycznych (oznacza¬
ny jako przepływ masowy, gdyż jest on niese-
lektywny) zachodzi prawdopodobnie bez udziału
jakichkolwiek sekwencji naprowadzających, tj.
w sposób niekierowany. Wbudowywanie białek
rezydujących do błon siateczki śródplazmatycz¬
nej i aparatu Golgiego jest zależne od swoistych
sygnałów (np. KDEL lub sekwencje zatrzymania
procesu translokacji w siateczce śródplazmatycz¬
nej). Transport wielu enzymów do lizosomów
Tabela 45-4. Sekwencje lub związki, które kierują białka do okre¬
ślonych organelli
Sekwencja kierująca
lub związek
Docelowe organellum
Sekwencja peptydu sygnałowego
Błony siateczki
śródplazmatycznej
Sekwencja na końcu aminowym
KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)
Luminalna powierzchnia błon
siateczki śródplazmatycznej
Sekwencja na końcu aminowym
(20-80 reszt aminokwasowych)
Macierz mitochondrium
NLS (np. Pro2-Lys2-Ala-Lys-Val)
Jądro
PTS (np. Ser-Lys-Leu)
Peroksysom
Fosforan mannozy
Lizosom
NLS - sygnał lokalizacji jądrowej; PTS - sekwencja kierująca do
macierzy peroksysomów.
także zależy od sygnału Man 6-P (mannozo-6-
-fosforan) (p. rozdz. 46). Sygnał może również
umożliwiać wnikanie białek do ziarnistości se-
krecyjnych. W tabeli 45-4 zebrano informacje
o sekwencjach, które uczestniczą w naprowadza¬
niu różnych białek do ich miejsc przeznaczenia
w obrębie komórki.
CHAPERONYSA BIAŁKAMI
ZAPOBIEGAJĄCYMI BŁĘDNEMU
SFAŁDOWANIUI PRZYPADKOWYM
ODDZIAŁYWANIOM Z INNYMI BIAŁKAMI
Wyjście z siateczki śródplazmatycznej może być
etapem ograniczającym szybkość szlaku sekrecyj-
nego. Wykazano, że pewne białka odgrywają rolę
w organizowaniu się lub we właściwym fałdowa¬
niu innych białek, nie będąc ich składnikami. Biał¬
ka takie są nazywane chaperonami molekular¬
nymi. Niektóre właściwości tych białek wyszcze¬
gólniono w tab. 45-5, a nazwy niektórych z nich,
o szczególnym znaczeniu dla siateczki śródpla¬
zmatycznej, umieszczono w tab. 45-6. Zasadni¬
czo, stabilizują one niepofałdowane lub częściowo
pofałdowane stany pośrednie białek i zapobiegają
niewłaściwym oddziaływaniom, uniemożliwiając
powstawanie niefunkcjonalnych struktur. Więk¬
szość chaperonów wykazuje aktywność ATPazy
oraz wiąże ADP i ATP. Ta aktywność jest ważna
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 621
Tabela 45-5. Niektóre właściwości białek chaperonowych
Występują u bardzo wielu gatunków, od bakterii do człowieka.
Wiele z nich to tzw. białka szoku cieplnego (Hsp).
Niektóre są indukowane przez warunki, które powodują roz-
fałdowanie nowo syntetyzowanych białek (np. podwyższona
temperatura i różne związki chemiczne).
Wiążą się głównie do hydrofobowych obszarów rozładowa¬
nych lub zagregowanych białek.
Działają częściowo jako „kontrola jakości” lub „mechanizm
korekcyjny” dla błędnie pofałdowanych lub mających inne de¬
fekty białek.
Większość chaperonów cechuje się aktywnością ATPazy,
uczestniczącej z udziałem ATP lub ADP w oddziaływaniu biał-
ko-chaperon.
Występują w różnych kompartmentach komórkowych, takich
jak cytozol, mitochondria i światło siateczki śródplazmatycz-
nej.
w ich udziale w procesie fałdowania. Kompleks
ADP-chaperon często ma wysokie powinowactwo
do niepofałdowanych białek, które po związaniu
się z nim stymulują uwolnienie ADP i zastąpienie
go przez ATP. Kompleks ATP-chaperon z kolei
uwalnia segmenty białka, które zostały pofałdo¬
wane właściwie i tym samym cykl z udziałem
wiązania ADP i ATP powtarza się do chwili, kiedy
pofałdowane białko zostaje uwolnione.
Tabela 45-6. Niektóre chaperony i enzymy uczestniczące w fałdo¬
waniu, zlokalizowane w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej
• BiP (białko wiążące ciężki łańcuch immunoglobuliny)
| • GRP94 (białko glukozozależne)
• Kalneksyna
• Kalretikulina
• PDI (disiarczkowa izomeraza białek)
• PPI (cis-trans izomeraza peptydyloprolilowa)
Kilka przykładów chaperonów zostało poda¬
nych przy okazji omawiania sortowania białek
mitochondrialnych. Białko wiążące ciężki łań¬
cuch immunoglobuliny (BiP) jest zlokalizowa¬
ne w świetle siateczki śródplazmatycznej. Biał¬
ko to wiąże nieprawidłowo pofałdowane ciężkie
łańcuchy immunoglobulin i kilka innych białek
oraz zapobiega ich ucieczce z siateczki śródpla¬
zmatycznej, w której są one degradowane. Innym
ważnym chaperonem jest kalneksyna - białko
wiążące jony Ca2+ i zlokalizowane w błonie sia¬
teczki śródplazmatycznej. Białko to wiąże wiele
białek, m.in. antygeny głównego układu zgodno¬
ści tkankowej (MHC) i zróżnicowane białka suro¬
wicy. Jak przedstawiono w rozdz. 46, kalneksyna
wiąże monoglukozylowane glikoproteiny, które
powstają w czasie obróbki glikoprotein, zatrzy¬
mując je w siateczce śródplazmatycznej do cza¬
su, aż cząsteczka glikoproteiny nie pofałduje się
w sposób właściwy. Kalretikulina, która również
jest białkiem wiążącym jony Ca2+, ma właściwo¬
ści podobne jak kalneksyna; nie jest ona związa¬
na z błoną. Chaperony nie są jedynymi białkami
w świetle siateczki śródplazmatycznej odpowie¬
dzialnymi za właściwe fałdowanie się białek.
Dwa obecne tam enzymy również odgrywają ak¬
tywną rolę w fałdowaniu. Izomeraza disiarczko¬
wa białek (PDI) pobudza szybkie zmiany wiązań
disiarczkowych do czasu osiągnięcia właściwego
układu. Izomeraza peptydyloprolylowa (PPI)
przyspiesza fałdowanie białek zawierających pro-
linę, katalizując izomeryzację cis-trans wiązań
X-Pro, gdzie X oznacza resztę dowolnego amino¬
kwasu.
NAGROMADZENIE NIEWŁAŚCIWIE
SFAŁDOWANYCH BIAŁEK
W ENDOPLAZMATYCZNYM RETIKULUM
MOŻE WYWOŁYWAĆ ODPOWIEDŹ
NA ROZFAŁDOWANE BIAŁKA
Homeostaza w retikulum endoplazmatycznym
jest ważna dla normalnego funkcjonowania ko¬
mórek. Jeśli na fałdowanie białek w retikulum
endoplazmatycznym mają wpływ różne czyn¬
niki (np. odbiegające od normy poziomy jonów
wapnia, zmiany w stanie redoks, mutacje, różne
choroby), to retikulum endoplazmatyczne może
wyczuwać tę sytuację. Mechanizmy sygnało¬
we, które są aktywowane w retikulum endopla¬
zmatycznym mogą prowadzić do zwiększenia
pofałdowania białek (np. zwiększona synteza
chaperonów i białek uczestniczących w procesie
fałdowania). Uruchamiane są również inne pro¬
cesy zmierzające do przywrócenia homeostazy
komórkowej. Jeśli stan niewłaściwego fałdowa¬
nia białek utrzymuje się, uruchamiane są proce¬
sy prowadzące do śmierci komórki (apoptoza).
Całokształt tego procesu jest nazywany odpo¬
wiedzią na rozfałdowane białka (ang. unfolded
protein response). Jest to zagadnienie inne niż te
omawiane dalej.
622 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
ROZFAŁDOWANE BIAŁKA ULEGAJĄ
DEGRADACJI W RETIKULUM
ENDOPLAZMATYCZNYM
(ERAD, ANG. ENDOPLASMIC
RETICULUM-ASSOCIATED DEGRADATION)
Niewłaściwe pofałdowanie białek występuje
w wielu chorobach genetycznych (np. CFTR
w mukowiscydozie, p. rozdz. 39). Białka, które
ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu w retiku-
lum endoplazmatycznym są selektywnie trans¬
portowane z powrotem przez retikulum endopla-
zmatyczne, aby przedostać się do proteasomów
Peptydy
4,
7; Proteasom
t
Poliubikwityna
Ryc. 45-7. Schemat zdarzeń w procesie ERAD. Białko docelowe
(które może być nieprawidłowo lub prawidłowo pofałdowane)
jest wstecznie transportowane przez translokon do cytoplazmy,
gdzie ulega poliubikwitynacji. Następnie, wnika ono do proteaso-
mu, gdzie jest degradowane do małych peptydów, które opusz¬
czają proteasom; ich dalsze losy są różne. Uwolnione cząsteczki
ubikwityny są ponownie wykorzystywane.
do proteasomów. Przed wejściem do proteaso¬
mów większość z białek ulega ubikwitynacji i są
one eskortowane do proteasomów przez białka
wiążące ubikwitynę. Proces ten, określany skró¬
tem ERAD, jest opisany pod ryciną 45-7.
UBIKWITYNA JEST WAŻNA CZĄSTECZKĄ
W PROCESIE DEGRADACJI BIAŁEK
Degradacja białek u eukariotów odbywa się dwo¬
ma głównymi szlakami. Jeden wykorzystuje li-
zosomalne proteazy i nie wymaga ATP. Drugi
wykorzystuje ubikwitynę i jest zależny od ATP.
Odgrywa on główną rolę w degradacji białek i jest
w szczególny sposób związany z pozbyciem się
niewłaściwie pofałdowanych białek i enzymów re¬
gulatorowych, które mają krótkie okresy półtrwa-
nia. Badania nad ubikwityną rozwijają się bardzo
o
obecnych w cytozolu. Wsteczny transport przez
błony retikulum endoplazmatycznego zachodzi
prawdopodobnie przez translokon (kompleks Sec
61) już wcześniej opisany. Jest on wspomagany
przez ATPazy występujące w proteasomach, gdyż
struktury te znajdują się w bliskim sąsiedztwie re¬
tikulum endoplazmatycznego. Chaperony zlokali¬
zowane w świetle retikulum endoplazmatycznego
i w cytozolu naprowadzają źle sfałdowane białka
Ryc. 45-8. Sekwencja reakcji prowadzących do przyłączenia ubi¬
kwityny do białka docelowego. (Ub - ubikwityną; E1 - enzym
aktywujący; E2 - enzym przyłączający; E3 - ligaza; LYS—Pr
- białka docelowe). W reakcji katalizowanej przez E1 C-końcowa
grupa C00" ubikwityny wiąże się wiązaniem tioestrowym z grupą
SH enzymu E1. W reakcji katalizowanej przez E2 aktywowana
ubikwityną jest przenoszona na grupę SH enzymu E2. W reakcji
katalizowanej przez E3 ubikwityną jest przenoszona z E2 na grupę
e-aminową lizyny białka docelowego. Dodatkowe rundy ubikwity-
nacji wydłużają łańcuch poliubikwitynowy.
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 623
szybko. Wiadomo, że jest ona związana z regulacją
cyklu komórkowego (degradacja cyklin), naprawą
DNA, aktywacją NFkB (p. rozdz. 49), zanikiem
mięśni, infekcjami wirusowymi i wieloma innymi
ważnymi procesami fizjologicznymi i patologicz¬
nymi. Ubikwityna jest małym, wysoce konserwa¬
tywnym białkiem (76 reszt aminokwasowych),
które odgrywa kluczową rolę w znakowaniu
różnych białek w celu ich degradacji w proteaso-
mach. Mechanizm wiązania się ubikwityny z do¬
celowym białkiem (np. niewłaściwie sfałdowana
forma CFTR, białka związanego z pojawieniem
się mukowiscydozy; p. rozdz. 40) pokazano na
ryc. 45-8. Uczestniczą w nim trzy enzymy: enzym
aktywujący, enzym łączący i ligaza. Enzymów łą¬
czących jest bardzo wiele typów i co zaskakujące,
jest blisko 500 różnych ligaz wymagających spe¬
cyficznych substratów. Gdy cząsteczka ubikwityny
przyłączy się do białka, natychmiast przyłączają
się kolejne cząsteczki, wskutek czego tworzy się
poliubikwitynowe białko docelowe. Szacuje się, że
przynajmniej cztery cząsteczki ubikwityny muszą
być przyłączone do docelowego białka, aby zosta¬
ło ono poddane degradacji w proteasomie. Ubikwi¬
tyna może być odłączona od docelowego białka
przez enzymy deubikwitynujące, a uwolniona ubi¬
kwityna może być ponownie użyta.
UBIKWITYNOWANE BIAŁKA SA
DEGRADOWANE W PR0TEAS0MACH
Poliubikwitynowane białka docelowe wnikają do
proteasomów zlokalizowanych w cytozolu. Pro-
teasom cechuje się względnie dużą, cylindryczną
strukturą, składającą się z 28 podjednostek, które
tworzą cztery ułożone jeden na drugim pierścienie
zbudowane z 7 podjednostek. Stos ten ma pusty
rdzeń, który jest wyznaczony przez co najmniej
3 różne proteazy. Docelowe białka przechodzą
do rdzenia, aby ulec degradacji do małych pepty-
dów, które następnie opuszczają proteasom (p. ryc.
45-7). Substratami dla proteasomu są białka pofał¬
dowane zarówno prawidłowo, jak i nieprawidło¬
wo. Uwolnione cząsteczki ubikwityny są następnie
ponownie użyte. Proteasom odgrywa znaczącą
rolę w dostarczaniu małych peptydów, będących
produktami degradacji różnych wirusów i innych
molekuł, cząsteczkom głównego układu zgodności
tkankowej klasy pierwszej, co stanowi kluczowy
etap w oferowaniu antygenów limfocytom T.
PĘCHERZYKI TRANSPORTUJĄCE
MAJA KLUCZOWE ZNACZENIE
W WEWNĄTRZKOMÓRKOWYM
PRZEMIESZCZANIU SIE BIAŁEK
Większość białek syntetyzowanych na polirybo-
somach związanych z błonami, które są przezna¬
czone dla aparatu Golgiego lub błon plazmatycz-
nych, dociera do tych miejsc w pęcherzykach
transportujących. Dokładne mechanizmy, we¬
dług których białka syntetyzowane w szorstkiej
siateczce śródplazmatycznej są wbudowywane
do tych pęcherzyków nie są znane. Pęcherzyki,
które uczestniczą w transporcie z retikulum endo-
plazmatycznego do aparatu Golgiego i z aparatu
Golgiego do błon plazmatycznych są zwykle wol¬
ne od klatryny, w odróżnieniu od pęcherzyków
uczestniczących w endocytozie (p. informacje
0 receptorze LDL w rozdz. 25 i 26). Aby było jas¬
ne, w tej książce pęcherzyki niepokryte klatry-
ną będą nazywane pęcherzykami transportu¬
jącymi. Istnieją dowody, że białka przeznaczone
do budowy błon aparatu Golgiego mają swoiste
sekwencje sygnałowe, natomiast większość bia¬
łek przeznaczonych docelowo do budowy błon
plazmatycznych lub do sekrecji nie zawiera
swoistych sygnałów, ale i bez nich trafia do miej¬
sca przeznaczenia.
Aparat Golgiego uczestniczy
w glikozylacji i sortowaniu białek
Aparat Golgiego spełnia dwie istotne funk¬
cje w syntezie błon. Po pierwsze, uczestniczy
w przemianach łańcuchów oligosacharydo-
wych błon i innych połączonych wiązaniem
A-glikozydowym glikoprotein, a także zawie¬
ra enzymy uczestniczące w O-glikozylacji
(p. rozdz. 46). Po drugie, uczestniczy w sorto¬
waniu różnych białek przed ich dostarczeniem
do właściwych miejsc przeznaczenia wewnątrz
komórki. Wszystkie elementy aparatu Golgiego
uczestniczą w jego pierwszej funkcji, natomiast
obszary trans - przede wszystkim w drugiej
1 są bardzo bogate w pęcherzyki. Ze względu
na ich kluczowe znaczenie w transporcie białek,
w ostatnich latach przeprowadzono wiele badań
nad procesem tworzenia się pęcherzyków trans¬
portujących i ich dalszym losem.
624 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Model niepokrytych klatryną
pęcherzyków obejmuje udział SNARE
i innych czynników
Pęcherzyki odgrywająkluczowąrolę w wewnątrz¬
komórkowym transporcie wielu białek. Ostatnio
odnotowano duży postęp w poznawaniu proce¬
sów związanych z formowaniem się pęcherzyków
i transportem. Było to możliwe dzięki zastosowa¬
niu różnych metod badawczych, które obejmują
przygotowanie układu bezkomórkowego do zba¬
dania procesu powstawania pęcherzyków. Można
na przykład, wykorzystując technikę mikroskopii
elektronowej, śledzić pączkowanie pęcherzyków
z aparatu Golgiego, który był inkubowany z cy-
tozolem i ATP. Duże znaczenie ma także rozwój
metod genetycznych stosowanych do badań nad
pęcherzykami w drożdżach. Proces ten jest bar¬
dzo skomplikowany, jego opis wymaga uży¬
cia specjalistycznego nazewnictwa (tab. 45-7),
uczestniczy w nim wiele zróżnicowanych białek
cytozolowych i błonowych, GTP, ATP i czynni¬
ków pomocniczych.
Tabela 45-7. Czynniki uczestniczące w tworzeniu się pęcherzy¬
ków niepokrytych klatryną i w ich transporcie
• ARF: czynnik rybozylacji ADR GTPaza
• Koatomery: rodzina co najmniej siedmiu białek opuszczają¬
cych (a, p, y, 5, s, pf oraz ę). Różne pęcherzyki transportujące
mają różne składniki białek opuszczających
• SNAP: rozpuszczalny czynnik przyłączający NSF
• SNARE: receptor dla SNAP
• v-SNARE: „adresowy” SNARE pęcherzyka
• t-SNARE: docelowy receptor SNARE
• GTP-y-S: niehydrolizowalny analog GTR używany do testowa¬
nia udziału GTP
• NEM: A/-etylomaleimid, związek chemiczny alkilujący grupy
sulfhydrylowe
• NSF: czynnik fuzji wrażliwy na NEM, ATPaza
• Białka Rab: rodzina białek spokrewniona z białkami Ras, od¬
kryta w mózgu szczurów; są to GTPazy, które są aktywne, jeśli
są związane z GTP
• Sec1: należy do rodziny białek, które przyłączają się do recep¬
torów t-SNARE i są z nich wypierane przez białka Rab, umoż¬
liwiając w ten sposób przebieg interakcji między v-SNARE
i t-SNARE
Opierając się głównie na propozycjach Rothma-
na i wsp., uznano, że omówiony wcześniej trans¬
port pęcherzykowy zachodzi w ośmiu etapach
(ryc. 45-9). Głównym założeniem jest, że każdy
pęcherzyk transportujący zawiera unikatowy
marker adresowy, złożony z jednego lub większej
liczby białek v-SNARE, natomiast każda błona
docelowa zawiera jeden lub kilka komplemen¬
tarnych białek t-SNARE, z którymi oddziałują
specyficzne białka v-SNARE.
Etap L Opłaszczanie rozpoczyna się, kiedy
ARF ulega aktywacji przez wiązanie GTP,
który wymienia GDP. W wyniku tego kom¬
pleks GTP-ARF wiąże się z domniemanym
receptorem (pokazanym na ryc. 45-9 jako
pole zakreskowane) w błonie donorowej.
Etap 2. Związany z błoną ARF wybiera białka
opłaszczające, które tworzą otoczkę formu¬
jącego się pęcherzyka.
Etap 3. Formujący się pęcherzyk odszczepia
się, w czym uczestniczy acylo-CoA i prawdo¬
podobnie ATP w celu zakończenia tworzenia
się opłaszczonego pęcherzyka.
Etap 4. Zdemontowaniu płaszcza (co wy¬
maga dysocjacji AFR i warstwy otaczającej
powstający pęcherzyk) towarzyszy hydroliza
związanego GTP. Pozbycie się płaszcza jest
konieczne, aby mógł nastąpić proces fuzji.
Etap 5. Naprowadzenie pęcherzyka do miej¬
sca przeznaczenia odbywa się za pośredni¬
ctwem rodziny białek integralnych, nazywa¬
nych v-SNARE, które dają pęcherzykowi
swoiste oznakowanie (adres) podczas jego
formowania. v-SNARE tworzą pary z po¬
krewnymi t-SNARE w błonie docelowej przy
„cumowaniu” pęcherzyka.
Zakłada się, że etapy 4. i 5. są ze sobą ściśle
sprzężone oraz że etap 4. może nastąpić po eta¬
pie 5. i może obejmować szybką dysocjację ARF
i płaszcza tworzącego się pęcherzyka po procesie
„cumowania”.
Etap 6. Właściwy układ fuzji tworzy się na
sparowanym kompleksie SNARE; zawiera on
ATPazę (NSF - czynnik wrażliwy na NEM)
oraz białka SNAP (rozpuszczalny czynnik
przyłączający NSF). Białka SNAP wiążą się
z kompleksem SNARE (receptor dla SNAP),
umożliwiając związanie NSF.
Etap 7. Hydroliza ATP przez NSF jest istotna
dla procesu fuzji, który może być hamowany
przez NEM (N-etylomaleimid). Wymagana
jest tu obecność także pewnych innych białek
i Ca2+.
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 625
Ryc. 45-9. Model kolejnych etapów transportu pęcherzykowego. Cykl rozpoczyna się od etapu zaznaczo¬
nego w dolnym lewym rogu ryciny, gdzie dwie cząsteczki ARF są pokazane jako małe owale zawierające
GDR Etapy cyklu opisano w tekście. Większość stosowanych tutaj skrótów zostało wyjaśnionych w tab.
45-7. Rola białek Rab i Sec1 (p. tekst) w całym procesie nie została przedstawiona na rycinie. (CGN
- sieć cis aparatu Golgiego; BFA - brefeldyna A). (Rycina reprodukowana z: Rothman JE: Mechanisms of
intracellular protein transport. Naturę 1994;372:55) (dzięki uprzejmości E Degen).
Etap 8. Transport wsteczny zachodzi w celu
ponownego rozpoczęcia cyklu. Ten ostat¬
ni etap pozwala na odzyskanie określonych
białek lub ponowne użycie białek v-SNARE.
Etap ten jest hamowany przez nokodazol,
czynnik niszczący mikrotubule.
Brefeldyna A hamuje proces optaszczania
A oto rozszerzenie i wyjaśnienie zagadnień przed¬
stawionych w poprzednim punkcie.
(a) Aby uczestniczyć w etapie 1, ARF musi ulec
modyfikacji przez przyłączenie kwasu mirysty-
nowego (C|4:o) i wykorzystanie mirystoilo-CoA
jako donora reszty acylowej. Mirystylacja jest
jedną z wielu enzymatycznie katalizowanych mo¬
dyfikacji potranslacyjnych, polegających na przy¬
łączeniu określonych lipidów do specyficznych
reszt w białkach, co ułatwia wiązanie się białek do
cytozolowych powierzchni błon lub pęcherzyków.
Inne modyfikacje polegają na przyłączeniu pal-
mitynianu, farnezylu i geranylogeranylu; dwie
ostatnie cząsteczki są poliizoprenoidami zawiera¬
jącymi, odpowiednio, 15 i 20 atomów węgla.
(b) Wyróżniono co najmniej trzy rodzaje opłasz-
czonych pęcherzyków: COPI, COPII i zawiera¬
jące klatrynę; pierwsze dwa są tu określane jako
pęcherzyki transportujące. Na pewno zostanie
jeszcze odkrytych wiele innych typów pęcherzy¬
ków. Pęcherzyki COPI uczestniczą w dwukie¬
runkowym transporcie z siateczki śródplazma-
tycznej do aparatu Golgiego, a także w odwrot¬
nym kierunku, natomiast pęcherzyki COPII bio¬
rą udział głównie w transporcie z siateczki śród-
plazmatycznej do aparatu Golgiego. Pęcherzyki
zawierające klatrynę uczestniczą w transporcie,
odpowiednio, z sieci trans aparatu Golgiego do
prelizosomów i z błony plazmatycznej do endo-
somów. Proces selekcji cząsteczek transportowa¬
nych przez pęcherzyki zależy przede wszystkim
od funkcji białek znajdujących się w płaszczu pę¬
cherzyków. Cząsteczki przenoszone (ang. cargo
molecules) mogą oddziaływać z białkami płasz¬
cza bezpośrednio lub za pośrednictwem białek
626 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
przyłączonych do białek płaszcza, które stają się
potem integralnymi składnikami pęcherzyka.
(c) Występujący u grzybów metabolit brefeldy-
na A zapobiega wiązaniu się GTP do ARF w eta¬
pie 1, co hamuje cały proces opłaszczania. W jej
obecności aparat Golgiego wydaje się ulegać dez¬
integracji i tracić fragmenty, co być może się od¬
bywa wskutek hamowania wymieniacza nukleo-
tydu guaninowego uczestniczącego w etapie 1.
(d) GTP-y-S (niehydrolizowalny analog GTP,
często używany w badaniach nad rolą GTP w pro¬
cesach biochemicznych) hamuje odpadanie płasz¬
cza opłaszczonych pęcherzyków, wzmacniając
ich budowę.
(e) W kilku etapach wewnątrzkomórkowego
transportu białek, regulowanej sekrecji i endo-
cytozy bierze również udział rodzina białek po¬
dobnych do białek Ras, nazywana rodziną białek
Rab. Są to małe, monomeryczne GTPazy, które
przyłączają się do cytozolowej powierzchni błon
za pośrednictwem łańcuchów geranylogeranylo-
wych. Białka te przyłączają się w postaci zwią¬
zanej z GTP (nie pokazano ich na ryc. 45-9) do
pączkujących pęcherzyków. Inna rodzina białek
(Sec 1) wiąże z białkami receptorowymi t-SNARE,
znajdującymi się w błonie docelowej i zapobiega
oddziaływaniu z nimi i z komplementarnymi do
nich receptorami pęcherzykowymi v-SNARE.
Gdy pęcherzyk oddziałuje z jego błoną docelową,
białka Rab usuwają białka Secl i wówczas jest
możliwe oddziaływanie v-SNARE z t-SNARE.
Okazuje się, że białka z rodzin Rab i Secl regu¬
lują szybkość tworzenia się pęcherzyków w spo¬
sób przeciwstawny. W ogólnym procesie powsta¬
wania pęcherzyków białka Rab są porównywane
do przepustnicy, a białka Secl do tłumika.
(f) Badania, w których białka v-SNARE
i t-SNARE zostały wprowadzone do oddzielnych
pęcherzyków zawierających dwuwarstwę lipido¬
wą wykazały, że tworzą one kompleksy SNARE,
zwane SNAREpinami, łączące dwie błony (pę¬
cherzyki). W procesie powstania SNAREpinów
potrzebny jest udział SNAP i NSF, a tworzenie się
tych kompleksów natychmiast wywołuje sponta¬
niczną fuzję błon w temperaturze fizjologicznej,
co sugeruje, że są one najmniejszym układem nie¬
zbędnym do fuzji błon.
(g) Fuzja pęcherzyków synaptycznych z błoną
plazmatyczną neuronów obejmuje serię zdarzeń
podobnych do opisanych w punkcie (f). Niech na
przykład jednym białkiem v-SNARE będzie sy-
naptobrewina, a dwoma białkami t-SNARE będą
syntaksyna i SNAP 25 (białko związane z synap-
tosomem o masie cząsteczkowej 25 kDa). Tok¬
syna jadu kiełbasianego, botulina B, jest jedną
z najbardziej zabójczych toksyn i najpoważniej¬
szą przyczyną zatruć pokarmowych. Wykryto, że
jednym ze składników tej toksyny jest proteaza
zdolna do rozszczepienia jedynie synaptobrewiny,
przez co jest hamowane uwolnienie acetylocholi¬
ny w połączeniu nerwowo-mięśniowym, co z ko¬
lei może stać się przyczyną śmierci, jeżeli dawka
była odpowiednio duża.
(h) Chociaż ten model opisuje pęcherzyki nie-
pokryte klatryną, to jednak wydaje się praw¬
dopodobne, że wiele procesów opisanych wyżej
może dotyczyć, przynajmniej w założeniu, pęche¬
rzyków pokrytych klatryną.
BUDOWA BŁON JEST ZŁOŻONA
Rozróżnia się wiele rodzajów błon komórkowych,
z których każda ma swoje specyficzne właściwo¬
ści. Nie ma uniwersalnego modelu, który mógłby
reprezentować strukturę każdej z błon. Dotych¬
czas omówiono już sposób, w jaki różne białka
są wbudowywane do błon siateczki śródplazma-
tycznej, a także transport białek, w tym białek
błonowych wewnątrz pęcherzyków, do różnych
części komórki zlokalizowanych. Należy jednak
zwrócić jeszcze uwagę na pewne ogólne proble¬
my dotyczące budowy błon.
W czasie budowania się bion
zachowywana jest asymetria
zarówno białek, jak i lipidów
Pęcherzyki powstające z błon siateczki śródpla-
zmatycznej (ER) i aparatu Golgiego w sposób na¬
turalny lub wskutek odrywania podczas homoge¬
nizacji wykazują poprzeczną asymetrię zarówno
lipidów, jak i białek. Asymetria ta zostaje utrzyma¬
na w czasie fuzji pęcherzyków transportujących
z błoną plazmatyczną. Wnętrze pęcherzyków po
fuzji staje się zewnętrzną stroną błony plazma-
tycznej, a cytoplazmatyczna stroną pęcherzyka
pozostaje cytoplazmatyczną stroną błony (ryc.
45-10). Poprzeczna asymetria błonowa istnieje
w pęcherzykach ER, zanim zleją się one z błoną
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 627
plazmatyczną, dlatego też głównym problemem
tworzenia się błon jest sposób, w jaki integralne
białka są wbudowywane w dwuwarstwy lipidowe
siateczki śródplazmatycznej. Zagadnienie to zo¬
stało omówione na początku tego rozdziału.
Spośród wielu rodzajów lipidów w błonach
występują głównie fosfolipidy. Enzymy odpo-
Ryc. 45-10. Zlewanie się pęcherzyka z btoną plazmatyczną za¬
chowuje orientację każdego białka integralnego zakotwiczonego
w dwuwarstwie pęcherzyka. Początkowo A/-koniec białka jest
skierowany do wnętrza pęcherzyka. Po fuzji A/-koniec znajduje się
na zewnętrznej powierzchni btony plazmatycznej. To, że orientacja
białka nie została odwrócona wynika z faktu, że drugi koniec czą¬
steczki, C-koniec, jest zawsze zanurzony w cytoplazmie. Światło
pęcherzyka i przestrzeń pozakomórkowa są topologicznie równo¬
ważne względem opisanego przekształcenia. (Rycina przedruko¬
wana i zmodyfikowana za zgodą z: Lodish HF, Rothman JE: The
assembly of celi membranes. Sci Am [Jan] 1979;240:43).
wiedzialne za syntezę fosfolipidów znajdują się
na powierzchni cytoplazmatycznej cystern sia¬
teczki śródplazmatycznej. Ponieważ fosfolipidy
są syntetyzowane właśnie po tej stronie siateczki,
zatem wbudowują się one prawdopodobnie sa¬
morzutnie w termodynamicznie stabilne warstwy
dwucząsteczkowe, powodując rozrastanie się bło¬
ny i być może wywołując tym samym odłączenie
się od niej pęcherzyków lipidowych. Zakłada się,
że pęcherzyki te przemieszczają się do innych
miejsc, oddając swoje lipidy innym błonom; nie¬
wiele jednak wiadomo o tym zjawisku. Jak już
wspomniano, w komórce znajdują się białka cy-
tozolowe, które wychwytują fosfolipidy z jednej
błony i przenoszą je do innej (białka wymiany
fosfolipidowej); prawdopodobnie wpływają one
na swoisty skład lipidów w różnych błonach.
Lipidy i białka są poddawane przemianom
metabolicznym w różnym stopniu
w różnych błonach
Wykazano, że okresy półtrwania lipidów w bło¬
nach retikulum endoplazmatycznego wątroby
szczura są krótsze niż okresy półtrwania białek
zawartych w tych błonach, co oznacza, że proce¬
sy przemian lipidów i białek są od siebie nieza¬
leżne. Rzeczywiście okazało się, że różne lipidy
charakteryzują się różnymi okresami półtrwania,
a ponadto okresy półtrwania białek w tych bło¬
nach zawierają się w szerokim zakresie wartości.
Niektóre z białek cechuje krótki (rzędu godzin),
a inne długi (rzędu dni) okres półtrwania. A zatem
poszczególne lipidy i białka błony ER są niezależ¬
nie wbudowywane do błony. Podobnie dzieje się
w wielu innych błonach.
Biogeneza błon, jak wynika z powyższych roz¬
ważań, jest procesem złożonym, o którym trzeba
się jeszcze wiele nauczyć. Jednym z wyznaczni¬
ków tej złożoności jest liczba modyfikacji po-
translacyjnych, którym są poddawane białka
błonowe, zanim przyjmą one ostateczną postać.
Modyfikacje te obejmują proteolizę, glikozylację
i przyłączenia kotwicy glikofosfatydyloinozyto-
lowej (GPI), siarczanowania tyrozyny lub jed¬
nostek węglowodanowych, fosforylacji, acylacji
i prenylacji, a lista ta na pewno nie jest jeszcze
kompletna. Jednak istotny postęp został osiągnię¬
ty. W tabeli 45-8 podano główne cechy budowy
błon omówione wyżej.
628 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tabela 45-8. Główne cechy organizacji błon
• Lipidy i białka są wbudowywane do błon niezależnie od siebie.
• Poszczególne lipidy i białka błonowe są przekształcane w róż¬
nym stopniu i niezależnie.
• Sekwencje topogeniczne [np. sygnał (końca aminowego lub
wewnętrzny) i zatrzymania procesu translokacji] są ważne dla
określenia wbudowania i rozmieszczenia białek w błonach.
• Białka błonowe znajdujące się wewnątrz pęcherzyków trans¬
portujących odrywają się od siateczki śródplazmatycznej
i zmierzają do aparatu Golgiego; końcowe sortowanie wielu
białek błonowych zachodzi w sieci trans aparatu Golgiego.
• Swoiste sekwencje sortujące kierują białka do określonych
organelli, takich jak lizosomy, peroksysomy i mitochondria.
Różne zaburzenia sa wynikiem
mutacji w genach kodujących
białka biorące udział w transporcie
wewnątrzkomórkowym
Niektóre z tych zaburzeń przedstawiono w tabeli
45-9; większość z nich dotyczy funkcji lizoso-
malnych. Znane sąjeszcze inne mutacje wpływa¬
jące na wewnątrzkomórkowy transport białek, ale
nie zostały one tutaj opisane.
Tabela 45-9. Niektóre zaburzenia spowodowane mutacjami
w genach kodujących białka uczestniczące w transporcie we¬
wnątrzkomórkowym do błon1
Zaburzenie2
Białko transportujące
Zespół Chediak-Higashiego,
214500
Regulator transportu
lizosomalnego
Złożony niedobór czynników
krzepnięcia V i VIII, 227300
ERGIC53, pektyna wiążąca
mannozę, wieloskładnikowy
niedobór czynników
krzepnięcia (MCFD2)
Zespół Hermanskiego-Pudlaka,
203300
Kompleks adaptorowy AP-3
(podjednostka p3A)
Mukolipidoza typu II
(ang. l-cell disease), 252500
1 -Fosfotransferaza
A/-acetyloglukozaminowa
Zespół Lowego, zespół oczno-
-mózgowo-nerkowy, 309000
0CRL-1,5-fosfataza PIP2
1 Zmodyfikowane z Olkonnen VM, Ikonen E: Genetic defects of
intra-cellular-membrane transport. N Eng J Med 2000; 343:1095.
Szczegółowe warunki związane z chorobą nie są tu opisane, znaj¬
dują się w cytowanej publikacji. Mukolipidoza typu II jest opisana
w rozdz. 46. Większość wymienionych wyżej zaburzeń dotyczy
funkcji lizosomalnych; czytelnik powinien sprawdzić w podręcz¬
niku medycznym informacje dotyczące objawów klinicznych.
2 Liczba przy każdym zaburzeniu to numer według klasyfikacji
OMIM.
STRESZCZENIE
• Wiele białek jest kierowanych do miejsc ich
przeznaczenia przez sekwencje sygnałowe.
Ważne decyzje dotyczące ich sortowania są po¬
dejmowane wówczas, gdy białka są rozdzielane
między cytozol i błony związane z poliryboso-
mami, w zależności od istnienia peptydów syg¬
nałowych.
• Opisano szlaki dostawy białek do mitochon-
driów, jądra, peroksysomów i retikulum endo-
plazmatycznego.
• Wiele białek syntetyzowanych na błonach
związanych z polirybosomami przechodzi do
aparatu Golgiego i błon plazmatycznych w pę¬
cherzykach transportujących.
• W kompartmentach aparatu Golgiego zachodzi
wiele reakcji glikozylacji. Białka są następnie
sortowane w sieci trans aparatu Golgiego.
• Wydaje się, że większość białek przeznaczo¬
nych dla błon plazmatycznych i do wydzielenia
nie wymaga obecności specyficznych sygna¬
łów.
• Przedstawiono rolę białek chaperonowych
w fałdowaniu białek, jak również w odpowiedzi
na rozfałdowanie białka.
• Opisano degradację związaną z retikulum endo-
plazmatycznym, pokazano również kluczową
rolę ubikwityny w degradacji białek.
• Przedstawiono model opisujący pączkowanie
i przyłączanie się pęcherzyków transportują¬
cych do docelowej błony.
• Przedyskutowano budowę błon, pokazano, że
jest ona złożona. W czasie procesu budowy błon
zostaje zachowana asymetria lipidów i białek.
• Opisano wiele zaburzeń związanych z mutacja¬
mi w genach kodujących białka, uczestniczą¬
cych w różnych etapach ich transportu i sorto¬
wania.
PIŚMIENNICTWO
Alder NN, Johnson AE: Cotranslational membranę pro¬
tein biogenesis at the endoplasmic reticulum. J Biol
Chem 2004; 279:22787.
Dalbey RE, von Heijne G (editors): Protein Targeting,
Transport and Translocation. Academic Press,
2002.
Ellgaard L, Helenius A: Quality control in the endo¬
plasmic reticulum. Nat Rev Mol Celi Biol 2003;
4:181.
45. WEWNĄTRZKOMÓRKOWY TRANSPORT I SORTOWANIE BIAŁEK 629
Koehler CM: New developments in mitochondrial as-
sembly. Ann Rev Celi Dev Biol 2004;20:309.
Lee MCS et al: Bi-directional protein transport between
the ER and Golgi. Ann Rev Celi Dev Biol 2004;
20:87.
Lodish H et al: Molecular Celi Biology, 5th ed. WH
Freeman & Co., 2004.
Owen DJ, Collins BM, Evans PR: Adaptors for clathrin
coats: structure and fiinction. Ann Rev Celi Dev
Biol 2004;20:153.
Romisch K: Endoplasmic-reticulum-associated degra-
dation. Ann Rev Celi Dev Biol 2005;21:435.
Schroder M, Kaufman RJ: The mammalian unfolded
protein response. Ann Rev Biochem 2005;74:739.
Trombetta ES, Parodi AJ: Quality control and protein
folding in the secretory pathway. Ann Rev Celi Dev
Biol 2003; 19:649.
Van Meet G, Sprong H: Membranę lipids and vesicular
traffic. Curr Opin Celi Biol 2004; 16:373.
Vance DE, Vance J: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins
and Membranes, 4th ed. Elsevier, 2002.
Wiedemann N, Frazier AE, Pfanner N: The protein im¬
port machinery of mitochondria. J Biol Chem 2004;
279:14473.
Zaidiu SK et al: Intranuclear trafficking: organization
and assembly of regulatory machinery for com-
binatorial biological control. J Biol Chem 2004:
279:43363.
Glikoproteiny
Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Glikobiologia jest nauką o roli cukrowców
w stanach zdrowia i choroby. Cały składnik cu-
krowcowy niezależnie od tego, czy występuje
jako odrębna cząsteczka, czy jako składowa zło¬
żonej struktury w organizmie jest określany jako
glikom. Glikomika, podobnie jak genomika
i proteomika, jest nauką o glikomie, obejmującą
aspekty: genetyczny, fizjologiczny, patologiczny
i inne.
Glikoproteiny są jedną z głównych klas gliko-
mu. Są białkami zawierającymi łańcuchy oligo-
sacharydowe (glikany), kowalencyjnie połączone
ze szkieletem białkowym. Szacuje się, że ok. 50%
wszystkich białek organizmów eukariotycznych
zawiera przyłączone węglowodany, tak więc gli-
kozylacja (enzymatyczne wbudowanie węglowo¬
danów do białek) jest najczęstszą potranslacyjną
modyfikacją białek. Może zachodzić także nieen-
zymatyczne przyłączenie węglowodanów do bia¬
łek, które jest określane jako glikacja. Proces ten
ma poważne następstwa w stanach chorobowych
(np. w niewyrównanej cukrzycy). Glikoproteiny
są jedną klasą glikokoniugatów lub komplekso¬
wych węglowodanów. Oba terminy są używane
na określenie cząsteczek zawierających co naj¬
mniej jeden łańcuch węglowodanowy kowalen¬
cyjnie przyłączony do białka (tworzy glikoprote¬
iny lub proteoglikany) lub lipidu (tworzy glikoli¬
pidy). (Proteoglikany są omówione w rozdz. 47,
a glikolipidy w rozdz. 15).
Prawie wszystkie białka osocza ludzkiego,
z wyjątkiem albumin, są glikoproteinami. Wiele
białek błon komórkowych (rozdz. 40) zawiera
znaczne ilości węglowodanów. Także niektóre
substancje grupowe krwi są glikoproteinami,
podczas gdy inne są glikofosfolipidami. Niektóre
hormony (np. gonadotropina kosmówkowa) to
także glikoproteiny. Głównym problemem w no¬
wotworach to przerzuty. Powstają one wskutek
odrywania się komórek nowotworowych od tka¬
nek, z których pochodzą (np. piersi), i dostają się
z krwią do różnych narządów i tkanek ustroju (np.
mózgu), gdzie w warunkach niekontrolowanych
rozrastają się, wywołując katastrofalne następ¬
stwa dla organizmu. Onkolodzy sądzą, że do po¬
wstawania przerzutów przyczyniają się w znacz¬
nej części zmiany w strukturze glikokoniugatów
powierzchni komórek nowotworowych.
POWSZECHNIE WYSTĘPUJĄCYM
GLIK0PR0TEIN0M PRZYPISUJE SIE
WIELE FUNKCJI
Glikoproteiny występują w większości organi¬
zmów, od bakterii do człowieka.
Wiele wirusów także zawiera glikoproteiny;
niektóre z nich były intensywnie badane, częścio¬
wo dlatego, że często odgrywają kluczową rolę
w przyłączeniu się wirusa do komórek (np. wi¬
rusy HIV-1 i wirusy grypy A). Wiele białek speł¬
niających różne funkcje jest glikoproteinami (tab.
46-1); zawartość w nich węglowodanów wynosi
1-85% wagowych.
Przeprowadzono wiele badań, aby ustalić rolę
łańcuchów oligosacharydowych w pełnieniu
funkcji biologicznej przez glikoproteiny. W tabeli
46-2 podsumowano wyniki tych badań, niektóre
funkcje zostały jednoznacznie określone, a nie¬
które są ciągle przedmiotem badań.
46. GLIKOPROTEINY 631
Tabela 46-1. Niektóre funkcje pełnione przez glikoproteiny
Funkcja
Glikoproteiny
Cząsteczki strukturalne
Kolageny
Czynniki poślizgowe
i ochronne
Mucyny
Cząsteczki transportujące
Transferryna, ceruloplazmina
Udział w procesach
odpornościowych
Immunoglobuliny, antygeny układu
zgodności tkankowej
Hormony
Gonadotropina kosmówkowa,
hormon tyreotropowy (TSH)
Enzymy
Różne, np. fosfataza zasadowa
Udział w oddziaływaniach
komórek
Różne białka biorące udział
w oddziaływaniu komórka-
-komórka (np. plemnik-komórka
jajowa), wirus-komórka, bakteria-
-komórka i hormon-komórka
Ochrona przed
zamarznięciem
Niektóre białka osocza u ryb
żyjących w zimnych wodach
Oddziaływanie
z określonymi
węglowodanami
Lektyny, selektyny (lektyny
komórkowe), przeciwciała
Funkcja receptorowa
Różne białka biorące udział
w działaniu hormonów
Wpływ na pofałdowanie
struktury niektórych białek
Kalneksyna, kalretikulina
Regulacja rozwoju
Białko Notch i inne
Hemostaza (i tworzenie
zakrzepów)
Swoiste glikoproteiny zewnętrznej
błony płytek krwi
Tabela 46-2. Niektóre funkcje łańcuchów oligosacharydowych
glikoprotein1
• Modulują właściwości fizykochemiczne, np. rozpuszczalność,
lepkość, ładunek, strukturę przestrzenną, denaturację i miej¬
sca wiązania bakterii i wirusów.
• Ochraniają przed proteolizą zarówno zewnątrz-, jak i śródko-
mórkową.
• Wpływają na proteolityczną przemianę białek prekursorowych
do mniejszych cząsteczek.
• Wykazują aktywność biologiczną, np. ludzkiej gonadotropiny
kosmówkowej (hCG).
• Wpływają na proces wbudowywania do błon, wewnątrzko¬
mórkową migrację, przepuszczalność i wydzielanie.
• Wpływają na rozwój embrionalny i różnicowanie.
• Odpowiedzialne są w dużej części za umiejscowienie się prze¬
rzutów nowotworowych.
1 Zaadaptowano z: Schachter H: Biosynthetic Controls that deter-
mine the branching and heterogeneity of protein-bound oligosac-
charides; Biochem Celi Biol 1986;64:163.
ŁAŃCUCHY OLIGOSACHARYDOWE
ZAWIERAJĄ INFORMACJE BIOLOGICZNĄ
Między sacharydami może być tworzona ogrom¬
na liczba wiązań glikozydowych. Na przykład
trzy różne heksozy mogą się łączyć ze sobą, two¬
rząc ponad 1000 różnych trisacharydów. Konfigu¬
racja przestrzenna cukrów w łańcuchach oligosa¬
charydowych zmienia się w zależności od rodzaju
wiązań i możliwości oddziaływania z innymi ma¬
krocząsteczkami znajdującymi się w sąsiedztwie
oligosacharydów. Przyjmuje się ogólnie, że łań¬
cuchy oligosacharydowe kodują znaczną ilość in¬
formacji biologicznej, która zależy od składu cu¬
krowego, ich sekwencji i konfiguracji przestrzen¬
nej, np. reszty mannozo-6-fosforanu skierowują
nowo zsyntetyzowane enzymy lizosomalne do
wnętrza lizosomów (p. dalej). Wykorzystując za¬
wartą w cukrach informację biologiczną, oddzia¬
łują one w sposób swoisty z innymi cukrami albo
wolnymi, albo w glikokoniugatach i białkami (ta¬
kimi jak lektyny, patrz dalej) lub innymi cząstecz¬
kami zawierającymi cukrowce. Oddziaływania
te prowadzą do zmian aktywności komórkowej.
Tak więc, odcyfrowanie tzw. kodu cukrowcowego
pozwala na wyjaśnienie wszystkich oddziaływań,
w jakich uczestniczą cukry i cząsteczki zawiera¬
jące cukrowce, a także zmian zachowań komórek
wynikłych z tych oddziaływań. Nie będzie to ła¬
twe zadanie, zważywszy na różnorodność glika-
nów, jakie znajdują się w komórkach.
DOSTĘPNE SĄ TECHNIKI WYKRYWANIA,
OCZYSZCZANIA I STRUKTURALNEJ
ANALIZY GLIKOPROTEIN
Metody stosowane do wykrywania, oczyszczania
i analizy strukturalnej glikoprotein są zestawione
w tab. 46-3. Tradycyjne metody oczyszczania bia¬
łek i enzymów są także stosowane do oczyszcza¬
nia glikoprotein. Po oczyszczeniu glikoproteiny
zastosowanie spektroskopii mas i wysokoroz¬
dzielczej spektroskopii rezonansu magnetycz-
no-jądrowego pozwala określić budowę łańcu¬
chów glikanowych w glikoproteinach. Analiza
glikoprotein może być utrudniona, ponieważ wy-
stępująone często w postaci glikoform. Są to biał¬
ka o jednakowej sekwencji aminokwasowej, ale
odmiennym składzie oligosacharydowym. Cho¬
ciaż wiązania pomiędzy składnikami cukrowymi
632 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
w glikoproteinach nie są szczegółowo omawiane
w tym rozdziale, mają one podstawowe znaczenie
dla budowy i czynności tych cząsteczek.
Tabela 46-3. Niektóre ważne metody stosowane w badaniach
glikoprotein
Metoda
Zastosowanie
Barwienie odczynnikiem
Schiffa i kwasem jodowym
(VII) (nadjodowym)
Wykrywanie glikoprotein jako
różowego pasma w rozdziałach
elektroforetycznych
Inkubacja hodowanych in
vitro komórek z sacharyda-
mi znakowanymi izotopami
promieniotwórczymi
Prowadzi do wykrycia glikoprotein
jako radioaktywnego pasma po
rozdziale elektroforetycznym
Poddanie działaniu właści¬
wej endo- lub egzoglikozy-
dazy lub fosfolipazy
Wywołują zmianę ruchliwości
elektroforetycznej, co może pomóc
rozróżnić białka zawierające glikan
połączony wiązaniem N, wiąza¬
niem 0 lub wiązaniem GPI, a także
glikoproteiny zawierające dużą
ilość mannozy i złożone W-glikany
Chromatografia kolum¬
nowa z użyciem sefarozy
i lektyny
Używana do oczyszczania gliko¬
protein lub glikopeptydów, które
wiążą się z określoną lektyną
Hydroliza kwaśna
i następnie analiza składu
Określa rodzaj sacharydów za¬
wartych w glikoproteinach i ich
strukturę przestrzenną
Spektrometria mas
Dostarcza danych o masie czą¬
steczkowej, składzie, sekwencji
i czasami o rozgałęzieniu łańcu¬
chów glikanu
Spektroskopia rezonansu
magnetyczno-jądrowego
Określa poszczególne sacharydy,
ich sekwencję, wiązanie i anome-
ryczny charakter wiązań glikozy-
dowych
Analiza metylacyjna
- analiza wiązań
Określa wiązania między
sacharydami
Określenie sekwencji
aminokwasowej
lub sekwencji cDNA
Określa sekwencję aminokwasową
Imponujący postęp nastąpił w analizie che¬
micznej, gdyż stała się możliwa synteza złożo¬
nych glikanów, które mogą być użyte do badań
ich aktywności biologicznej i farmakologicznej.
Dodatkowo, opracowano metody wykorzystania
prostych organizmów, takich jak drożdże, do wy¬
twarzania ludzkich glikoprotein mających znacze¬
nie lecznicze (np. erytropoetyny), wydzielanych
do otaczającego je środowiska.
OSIEM CUKRÓW
DOMINUJE W LUDZKICH
GLIKOPROTEINACH
Chociaż znanych jest ok. 200 naturalnie wy¬
stępujących monosacharydów, to tylko osiem
powszechnie występuje w łańcuchach oligosa-
charydowych glikoprotein (tab. 46-4). Więk¬
szość tych cukrów omówiono w rozdz. 14. Kwas
A-acetyloneuraminowy (NeuAc) jest termi¬
nalnym cukrem łańcucha oligosacharydowego
i zwykle jest przyłączony do reszty galaktozy
(Gal) lub jV-acetylogalaktozoaminy (GalNAc).
Inne przedstawione w tabeli cukry można zna¬
leźć w bardziej wewnętrznych pozycjach. W gli¬
koproteinach często stwierdza się występowa¬
nie siarczanów, zwykle przyłączonych do Gal,
GalNAc lub GlcNAc.
Uważano, że cukry inne niż glukoza, zesta¬
wione w tab. 46-4, mogą być syntetyzowane
z glukozy w ilościach wystarczających dla po¬
trzeb organizmu. W ludzkich tkankach są en¬
zymy niezbędne do wytworzenia tych cukrów
z glukozy. Są jednak dowody, że inne cukry
mogą być w pewnych okolicznościach korzyst¬
ne, jeżeli występują w diecie. To stanowi podsta¬
wę do opracowania cukrowcowych suplemen¬
tów diety, zawierających albo cukry wymienione
w tab. 46-4 (z wyjątkiem glukozy), albo ich pre-
kursory. Skuteczność takich suplementów jest
obecnie przedmiotem badań.
CUKRY NUKLE0TYD0WE DZIAŁAJĄ
JAKO CUKRY DONOROWE W WIELU
REAKCJACH BIOSYNTEZY
Należy przede wszystkim zrozumieć, że w więk¬
szości reakcji biosyntezy nie bierze udziału
wolny cukier lub fosforylowany cukier, lecz
odpowiadający mu cukier nukleotydowy. Pierw¬
szym odkrytym cukrem nukleotydowym był
urydynodifosforan glukozy (UDP-Glc); jego
budowę przedstawiono na ryc. 19-2. Typowe
cukry nukleotydowe biorące udział w biosynte¬
zie glikoprotein są wymienione w tab. 46-4. Nie
wiadomo, dlaczego niektóre pochodzą z UDP,
a inne z guanozynotrifosforanu (GTP) lub cy-
tydynomonofosforanu (CMP). Nukleotydy te są
wykorzystywane w wielu, ale nie we wszystkich,
46. GLIKOPROTEINY 633
Tabela 46-4. Najważniejsze cukry występujące w ludzkich glikoproteinach. Struktury większości wymienionych cukrów są przedsta¬
wione w rozdz. 14
Cukier
Typ
Używany skrót
Nukleotydowy cukier
Uwagi
Galaktoza
Heksoza
Gal
UDP-Gal
Występuje w A/-wiązanych glikoproteinach, często
jako przedostatni sacharyd przyłączony do NeuAc
oraz w rdzeniu trisacharydowym proteoglikanów
Glukoza
Heksoza
Gic
UDP-GIc
Występuje podczas syntezy A/-wiązanych glikoprote¬
in, ale zwykle nieobecna w dojrzałych glikoproteinach.
Występuje w niektórych czynnikach krzepnięcia
Mannoza
Heksoza
Man
GDP-Man
Główny sacharyd A/-wiązanych glikoprotein
Kwas
N- acetylo-
neuraminowy
Kwas sialowy
(9 atomów
węgla)
NeuAc
CMP-NeuAc
Występuje często jako terminalny sacharyd w 0- i N-
-wiązanych glikoproteinach. Znane są także inne typy
kwasów sialowych, ale w organizmie ludzkim głównie
występuje NeuAc. Grupy acetylowe mogą występo¬
wać w 0- i A/-wiązanych glikoproteinach
Fukoza
Deoksyheksoza
Fuc
GDP-Fuc
Występuje na zewnątrz łańcuchów 0- i A/-wiązanych
glikoprotein, lub też może być wiązana do reszty GIc¬
NAc połączonej A/-glikozydowo z Asn. Może być także
wewnętrznie związana z grupą OH seryny (np. w t-PA
i niektórych czynnikach krzepnięcia)
N- acetylo-
galaktozoamina
Aminoheksoza
GalNAc
UDP-GalNAc
Występuje w 0- i A/-wiązanych glikoproteinach
N- acetylo-
glukozoamina
Aminoheksoza
GIcNAc
UDP-GIcNAc
Sacharyd jest połączony z atomem azotu Asn łańcu¬
cha polipeptydowego A/-wiązanych glikoprotein, ale
może również występować w innych pozycjach łań¬
cucha oligosacharydowego tych białek. Wiele białek
jądrowych zawiera GIcNAc przytwierdzony do grupy
OH seryny lub treoniny jako pojedynczy sacharyd
Ksyloza
Pentoza
Xyl
UDP-Xyl
Ksyloza jest połączona z grupą OH seryny w wielu
proteoglikanach. Następnie ksyloza łączy się z dwie¬
ma resztami Gal, tworząc trisacharyd łączony. Xyl
stwierdzono także w t-PA i niektórych czynnikach
krzepnięcia
reakcjach glikozylacji, zachodzących w procesie
biosyntezy glikoprotein (p. dalej). Hydrofobowe
wiązanie między grupami fosforanowymi i cu¬
krami jest typowym wiązaniem wysokoenerge¬
tycznym i ma wysoki potencjał przenoszenia
grup (rozdz. 11). Zaktywowane cukry mogą być
przenoszone do odpowiednich akceptorów pod
warunkiem, że są dostępne swoiste transferazy.
Cukry nukleotydowe są tworzone w cytopla-
zmie z odpowiednich nukleotydów trifosforano-
wych. Kwasy sialowe związane z CMP są wytwa¬
rzane w jądrze. Tworzenie urydynodifosforanu
galaktozy (UDP-Gal) przebiega w dwóch reak¬
cjach zachodzących w tkankach ssaków:
PIROFOSFORY-
LAZAUDP-
-GLUKOZOWA
UTP + Glukozo-1-fosforan ►
UDP-GIc + Pirofosforan
EPIMERAZA
UDP-GIc
UDP-GIc UDP-Gal
Ponieważ większość reakcji glikozylacji zacho¬
dzi wewnątrz aparatu Golgiego, systemy prze¬
kaźników (permeazy i systemy transportu) trans¬
portują cukry nukleotydowe przez błonę aparatu
Golgiego. Znane są układy transportujące UDP-
634 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
-Gal, GDP-Man i CMP-NeuAc do cystern aparatu
Golgiego. Działają one na zasadzie antyportu;
to oznacza, że dopływowi jednego cukru nukleo-
tydowego towarzyszy odpływ jednej cząsteczki
odpowiedniego nukleotydu (np. UMP, GMP lub
CMP), powstałego z cukru nukleotydowego. Me¬
chanizm ten zapewnia odpowiednie stężenie każ¬
dego cukru nukleotydowego wewnątrz aparatu
Golgiego. UMP powstaje z UDP-Gal w następu¬
jącej reakcji:
GALAKTOZYLO-
TRANSFERAZA
UDP-Gal + Białko ► Białko —Gal + UDP
NUKLEOZYDO-
TRANSFERAZA
UDP ► UMP + Pj
EGZOGLIKOZYDAZYI ENDOGLIKOZYDAZY
SA UŻYTECZNE W BADANIACH
GLIKOPROTEIN
Liczne glikozydazy o określonej specyfice oka¬
zały się użyteczne w badaniach glikoprotein pod
względem funkcjonalnym i strukturalnym (tab.
46-5). Enzymy te działają albo w zewnętrznej
(egzoglikozydazy), albo w wewnętrznej (endogli-
kozydazy) pozycji łańcucha oligosacharydowe-
go. Przykładami egzoglikozydaz są neuramini-
dazy i galaktozydazy; użyte po kolei powodują
Tabela 46-5. Niektóre glikozydazy używane do badań struktury
i funkcji glikoprotein1
Enzymy
Typ
Neuraminidaza
Egzoglikozydaza
Galaktozydaza
Egzoglikozydaza lub endoglikozydaza
Endoglikozydaza F
Endoglikozydaza
Endoglikozydaza H
Endoglikozydaza
1 Enzymy różnego pochodzenia są często specyficzne dla pew¬
nych typów wiązań glikozydowych, jak też dla ich anomerycznej
konfiguracji. Miejsca działania endoglikozydazy F i H pokazano
na ryc. 46-5. Endoglikozydaza F działa na wiązanie glikozydowe
łańcuchów oligosacharydowych typu zarówno wysokomannozo-
wego, jak i kompleksowego, natomiast endoglikozydaza H działa
tylko na typ pierwszy.
usunięcie końcowej reszty NeuAc oraz przed¬
ostatniej reszty Gal z większości glikoprotein.
Endoglikozydazy F i H są przykładami drugiej
grupy enzymów; enzymy te rozrywają łańcuch
oligosacharydowy w określonych miejscach wy¬
stępowania reszt GlcNac, w pobliżu łańcucha
polipeptydowego (tzn. w wewnętrznych pozy¬
cjach; ryc. 46-5) i dlatego są użyteczne w bada¬
niach strukturalnych dużych łańcuchów oligosa¬
charydowych. Trawienie glikoprotein jedną lub
kilkoma z wymienionych glikozydaz wykorzy¬
stuje się do badań pewnych procesów biologicz¬
nych związanych z usunięciem specyficznych
cukrów.
RECEPTORY ASIALOGLIKOPROTEIN
U SSAKÓW BIORĄ UDZIAŁ
W OCZYSZCZANIU OSOCZA
Z NIEKTÓRYCH GLIKOPROTEIN
PRZEZ KOMÓRKI WĄTROBOWE
Doświadczenia przeprowadzone przez Ashwella
i wsp. we wczesnych latach siedemdziesiątych
ub.w. wykazały ważną rolę łańcuchów oligosa¬
charydowych w funkcji biologicznej glikopro¬
tein. Wstępnie badali oni wpływ usunięcia reszt
NeuAc w wyniku działania neuraminidazy in
vitro (tj. desializacji) na eliminację z krążące¬
go osocza ceruloplazminy (rozdz. 49) u króli¬
ków. Postępowanie to prowadzi do odsłonięcia
przedostatnich w łańcuchu reszt Gal, w warun¬
kach prawidłowych maskowanych przez koń¬
cowe reszty NeuAc. Poddana działaniu neura¬
minidazy, znakowana izotopem radioaktywnym
ceruloplazmina znika bardzo szybko z krążenia,
w przeciwieństwie do wolnej eliminacji biał¬
ka niepoddanego trawieniu neuraminidazą. Dal¬
sze prace wykazały występowanie w komórkach
wątrobowych ssaków receptorów asialogliko-
protein, które rozpoznają resztę galaktozową
w wielu desializowanych białkach osocza i pro¬
wadzą do ich endocytozy. Te prace jasno poka¬
zały, że pojedynczy cukier, taki jak galaktoza,
może pełnić przynajmniej jedną ważną biolo¬
gicznie funkcję (np. determinując czas przeby¬
wania w krwiobiegu) glikoprotein. To bardzo
mocno potwierdza koncepcję, zgodnie z którą
łańcuchy oligosacharydowe mogą zawierać in¬
formację biologiczną.
46. GLIKOPROTEINY 635
LEKTYNY MOGĄ SŁUŻYĆ
DO OCZYSZCZANIA I BADANIA
FUNKCJI GLIKOPROTEIN
Lektyny są białkami wiążącymi cukry, które mają
zdolność aglutynowania lub wytrącania glikoko-
niugatów. Wiele lektyn jest glikoproteinami. Im-
munoglobuliny, które oddziałują z cukrami, nie są
zaliczane do lektyn. Lektyny zawierają przynaj¬
mniej dwa miejsca wiążące cukry; białka z jed¬
nym miejscem wiążącym cukier nie mogą aglu-
tynować komórek lub wytrącać glikokoniugatów.
Swoistość lektyn zwykle określa się wskazując
cukry, które najlepiej hamują ich zdolność do po¬
wodowania aglutynacji lub precypitacji. Enzymy,
toksyny i białka transportowe mogą być zalicza¬
ne do lektyn, jeżeli mają kilka miejsc wiążących
węglowodany. Lektyny wykryto po raz pierwszy
w roślinach i drobnoustrojach, ale znanych jest te¬
raz wiele lektyn pochodzenia zwierzęcego. Recep¬
tor asialoglikoprotein ssaków, opisany wcześniej,
Tabela 46-6. Niektóre ważne lektyny
Lektyny
Przykłady lub omówienie
Lektyny roślin
strączkowych
Konkanawalina A, lektyna grochu
Aglutynina zawiązków
pszenicy
Powszechnie używana w badaniach
powierzchni komórek prawidłowych
i nowotworowych
Rycyna
Cytotoksyczna glikoproteina uzyski¬
wana z nasion rącznika pospolitego
Toksyny bakteryjne
Wrażliwa na ciepło enterotoksyna
z pałeczki okrężnicy i toksyny przecin¬
kowców cholery
Hemaglutynina wirusa
grypy
Odpowiedzialna za przyleganie do ko¬
mórek gospodarza i zlewanie się błon
Lektyny typu C
Cechuje je zależna od Ca2+ składowa
rozpoznająca węglowodany (CRD);
należy do nich: receptor asialoprotein
ssaków, selektyny i białko wiążące
mannozę
Lektyny typu S
Zwierzęce lektyny wiążące p-galakto-
zydy odgrywające rolę w oddziaływa¬
niach komórka-komórka i komórka-
-substancja pozakomórkowa
Lektyny typu P
Receptor Man-6-P
Lektyny typu 1
Należą do nadrodziny immunoglobu-
lin, np. sialoadhezyna odpowiedzialna
za przyleganie makrofagów do róż¬
nych komórek
jest ważnym przykładem lektyny pochodzenia
zwierzęcego. Niektóre ważne lektyny zestawiono
w tab. 46-6. Wiele współczesnych badań skupia
się na roli różnych lektyn zwierzęcych w mecha¬
nizmie działania glikoprotein; niektóre z nich są
omówione dalej (np. selektyny).
Wiele lektyn zostało oczyszczonych i są dostęp¬
ne w handlu; trzy lektyny roślinne, które są szeroko
używane w doświadczeniach, podano w tab. 46-7.
Lektyny mają wiele zastosowań; wykorzystuje się
je m.in. do oczyszczania określonych glikoprotein,
jako narzędzie do określania składu glikoprotein
powierzchni komórek, jako odczynniki pozwala¬
jące uzyskać zmutowane komórki z niedoborem
niektórych enzymów biorących udział w biosyn¬
tezie łańcuchów oligosacharydowych.
Tabela 46-7. Trzy lektyny i sacharydy, z którymi one oddziałują1
Lektyna
Stosowany skrót
Sacharyd
Konkanawalina A
ConA
Man i Gic
Lektyna sojowa
-
Gal i GalNAc
Aglutynina zawiązków
pszenicy
WGA
Gic i NeuAc
1 W większości przypadków lektyny wykazują specyficzność
w stosunku do anomerycznej konfiguracji wiązania glikozydowe-
go (a i p); nie jest to pokazane w tabeli.
WYRÓŻNIA SIE TRZY GŁÓWNE
KLASY GLIKOPROTEIN
Na podstawie rodzaju wiązania między łańcu¬
chem polipeptydowym i łańcuchem oligosacha-
rydowym glikoproteiny mogą być podzielone na
trzy klasy (ryc. 46-1): 1) zawierające wiązanie
O-glikozydowe (O-wiązane) łączące hydroksylo¬
wy koniec łańcucha seryny lub treoniny z takim
cukrem, jak A-acetylogalaktozoamina (GalNAc-
-Ser[Thr]); 2) zawierające wiązanie A-glikozydowe
(A-wiązane) łączące azot amidowy asparaginianu
i A-acetyloglukozoaminę (GlcNAc-Asn); 3) łączą¬
ce karboksylowy końcowy aminokwas białka przez
fosforyloetanoloaminę z oligosacharydem (glika-
nem) łącznikowym, który z kolei jest przyłączony
przez glukozoaminę do fosfatydyloinozytolu (PI).
Ostatnia z wymienionych klas jest określana jako
glikoproteidy zakotwiczone do glikozylofosfa-
tydyloinozytolu (GPI-zakotwiczone). Znane są
również inne mniej liczne klasy glikoprotein.
636 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
A CH2OH
I
H H-N
I
C = O
I
ch3
B CH2OH
Ryc. 46-1. A: wiązanie O (A/-acetylogalaktozoamina z seryną); B: wiązanie N (/V-acetyloglukozoamina z asparaginą); C: wiązanie gliko-
zylofosfatydyloinozytolu (GPI). Budowa GPI przedstawiona jako wiązanie acetylocholinesterazy z błoną komórkową ludzkich krwinek
czerwonych. Karboksykońcowy aminokwas - glicyna łączy się wiązaniem amidowym za pośrednictwem grupy COOH z grupą NH2
fosforyloetanoloaminy, która z kolei łączy się z resztą mannozy. Glikan rdzenia zawiera 3 reszty mannozy i 1 glukozoaminy. Glukozoami-
na jest połączona z inozytolem, który jest połączony z kwasem fosforowym. Na rycinie zaznaczono miejsce działania Pl-fosfolipazy C
(PI-PLC). Budowę glikanu rdzenia omówiono w tekście. GPI przedstawiony na rycinie zawiera dodatkowo kwas tłuszczowy przyłączony
do inozytolu, a także dodatkowo fosforyloetanoloaminę przyłączoną do środkowej z trzech reszt mannozy. Zmienność budowy GPI
dotyczy rodzaju karboksykońcowego aminokwasu, cząsteczek przyłączonych do reszt mannozowych i szczegółowej budowy części
lipidowej. (Przedrukowano za zgodą Copyright Clearance Centre, Inc.).
Liczba łańcuchów oligosacharydowych przy¬
łączonych do jednego łańcucha polipeptydowego
może wynosić od 1 do 30, a nawet więcej, a licz¬
ba reszt cukrowych tworzących jeden łańcuch
oligosacharydowy waha się od 2 lub 3 do bardzo
wielu. Niektóre białka zawierają więcej niż jeden
typ wiązania, przykładowo glikoforyny - ważne
glikoproteiny błony krwinek czerwonych (rozdz.
51) zawierają oligosacharydy przyłączone zarów¬
no 0-, jak i A-wiązaniem.
GLIKOPROTEINY ZAWIERAJĄ WIELE
RODZAJÓW WIĄZAŃ 0-GLIKOZYDOWYCH
Przynajmniej cztery podklasy wiązania O-gli-
kozydowego rozpoznano w ludzkich glikopro-
teinach:
1. Dominujące wiązanie GalNAc-Ser (Thr)
przedstawiono na ryc. 46-1. Dwa rodzaje oligosa-
charydów występujących w tej podklasie przed¬
stawiono na ryc. 46-2. Najczęściej reszta Gal lub
NeuAc jest przyłączona do GalNAc, ale stwierdza
się dużą zmienność składu i długości łańcuchów
oligosacharydowych. Ten typ wiązania występuje
w mucynach (p. niżej).
2. Proteoglikany zawierające trisacharyd Gal-
-Gal-Xyl-Ser (tzw. wiążący trisacharyd).
3. Kolageny zawierające wiązanie Gal-hy-
droksylizyna (Hyl) (podklasy 2 i 3 są omówione
w rozdz. 47).
4. Wiele białek jądrowych (np. niektóre czyn¬
niki transkrypcyjne) i białek cytozolowych za¬
wiera boczne łańcuchy zbudowane z pojedyncze¬
go GlcNAc, przyłączonego do reszty seryny lub
treoniny (GlcNAc-Ser[Thr|).
46. GLIKOPROTEINY 637
A
a 2,6
PolKIAn
’ bailMAC
B
p 1,3
PolMAn
i
NeuAc
2,3
- baiNAC
j«2
NeuAc
Ryc. 46-2. Struktury dwóch O-wiązanych oligosacharydów wy¬
stępujących w (A) mucynach ślinianek podszczękowych i (B)
fetuinie oraz sialoglikoproteinie błon ludzkich erytrocytów. (Ry¬
cina zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Lennarz WJ:
The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum
Press, 1980. Przedrukowano za uprzejmą zgodą Springer Scien¬
ce i Business Media).
Mucyny zawierają dużą liczbę
O-wiązanych oligosacharydów
oraz cechują się powtarzaniem się
sekwencji aminokwasowych
Mucyny są glikoproteinami charakteryzującymi
się dwiema głównymi cechami: 1) dużą zawartoś¬
cią oligosacharydów O-wiązanych (zawartość wę¬
glowodanów w mucynach wynosi ponad 50%),
2) występowaniem powtarzających się sekwencj i
aminokwasów (powtórzenia tandemowe) w środ¬
kowej części struktur polipeptydowych, do których
są przyłączone liczne łańcuchy O-glikanowe (ryc.
46-3). Sekwencje te obfitują w serynę, treoninę
i prolinę. Chociaż w mucynach dominują O-gli-
kany, często stwierdza się łańcuchy N-glikanowe.
Występują też mucyny wydzielnicze i mucyny
związane z błonami. Pierwsze z nich stwierdza
się w wydzielinach żołądkowo-jelitowych, ukła¬
du oddechowego i układu rozrodczego. Śluz za¬
wiera ok. 94% wody i 5% mucyn. Pozostała część
to mieszanina różnych cząsteczek komórkowych,
elektrolitów i komórki resztkowe. Mucyny wy¬
dzielnicze mają ogólnie budowę oligomeryczną,
a więc często mają bardzo dużą masę cząsteczko¬
wą. Oligomery są złożone z monomerów powią¬
zanych wiązaniami disiarczkowymi. Śluz cechuje
się dużą lepkością i często tworzy żel. Właści¬
wości te są wynikiem dużej zawartości mucyn.
Duża zawartość O-glikanów odpowiada za roz¬
gałęzioną budowę mucyn. Wyjaśnia to częściowo
przestrzenne oddziaływanie między ich częściami
GalNAc i oddziałującymi aminokwasami, co pro¬
wadzi do efektu usztywnienia łańcucha; tak więc
konformacja mucyn przypomina sztywny pręt.
W tworzeniu żelu biorą udział międzycząsteczko-
we, niekowalencyjne oddziaływania między cu¬
krami sąsiednich łańcuchów glikanowych. Duża
zawartość reszt NeuAc i siarczanów, stwierdzona
w wielu mucynach, zapewnia im ujemny ładunek.
Mucyny ułatwiają funkcję poślizgową i tworzą
ochronną barierę fizyczną na powierzchniach
nabłonkowych. Mucyny związane z błonami bio¬
rą udział w różnych oddziaływaniach komórka-
-komórka (np. opisane dalej selektyny). Gęstość
łańcuchów oligosacharydowych utrudnia dostęp
proteaz do ich osiowych polipeptydów, a więc
mucyny są często oporne na działanie proteaz.
Mucyny mają także tendencje do „maskowania”
niektórych antygenów powierzchniowych. Wiele
rodzajów komórek rakowych wytwarza mucyny;
prawdopodobnie mucyny mogą maskować nie¬
które antygeny powierzchniowe tych komórek
i w ten sposób chronić je przed działaniem ukła¬
du immunologicznego. Mucyny zawierają także
swoiste peptydy nowotworowe i epitopy węglo¬
wodanowe (epitopy są fragmentem antygenu roz¬
poznawanym przez przeciwciała i nazywanym
determinantem antygenowym). Niektóre z tych
epitopów mogą być używane do pobudzania od¬
powiedzi odpornościowej skierowanej przeciwko
komórkom nowotworowym.
(sekwencja tandemowa)
Ryc. 46-3. Schemat budowy mucyny. Przedstawiono łańcuchy
O-glikanowe przyłączone do środkowej części wydłużonego
łańcucha polipeptydowego i łańcuchy A/-glikanowe przyłączone
do części karboksykońcowej. Wąskie prostokąty przedstawiają
serie powtarzających się sekwencji aminokwasowych. Wie¬
le mucyn zawiera reszty cysteinowe, których grupy SH tworzą
międzyłańcuchowe wiązania, czego nie przedstawiono na rycinie
(Zmienione według Strons GJ, Dekker J: Mucin-type glikopro-
teins. Crit Rev Biochem Mol Biol 1992, 27, 57. Copyright ©
1992. Reprodukowano za zgodą Taylor & Francis Group, LLC,
http://www.taylorandfrancis.com.).
638 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Badano geny kodujące polipeptydy rdzenia
licznych mucyn. Sklonowano geny ludzkich mu-
cyn i ustalono ich sekwencję. Dotyczy to mucyn
wydzielanych przez trzustkę, jelito cienkie, drogi
oskrzelowo-krtaniowe, żołądek i ślinianki. Prace
te dostarczyły nowych danych o wspomnianych
peptydach (wielkość jednostki powtarzającej się,
miejsca potencjalnej A-glikozylacji itp.) i wskaza¬
ły na aspekty, które są istotne z punktu widzenia
genetyki. Niektóre ważne właściwości mucyn ze¬
stawiono w tab. 46-8.
Tabela 46-8. Niektóre właściwości mucyn
• Występują w wydzielinach przewodu pokarmowego, dróg od¬
dechowych i dróg rodnych oraz w błonach wielu komórek.
• Wykazują dużą zawartość łańcuchów O-glikanowych i zwykle
zawierają dużo NeuAc i siarczanów.
• Zawierają powtarzającą się sekwencję aminokwasową, bogatą
w reszty seryny, treoniny i proliny.
• Rozbudowana struktura wpływa na ich dużą lepkość i ela¬
styczność.
• Tworzą ochronną barierę na powierzchni wielu komórek,
uczestniczą w oddziaływaniach międzykomórkowych i ma¬
skują niektóre antygeny powierzchniowe.
Biosynteza O-wiązanych glikoprotein
wymaga udziału cukrów nukleotydowych
Polipeptydowe łańcuchy O-wiązanych i innych
glikoprotein są kodowane przez mRNA; ponie¬
waż większość glikoprotein to integralne biał¬
ka błonowe lub białka sekrecyjne, toteż ogólnie
można powiedzieć, że ulegają one translacji na
polirybosomach związanych z błonami (p. rozdz.
37). Istnieją setki różnych łańcuchów oligosacha-
rydowych Owiązanych. Te w glikoproteinach są
wytwarzane przez stopniowe dodawanie cukrów
pochodzących z cukrów nukleotydowych, ta¬
kich jak UDP-GalNAc, UDP-Gal i CMP-NeuAc.
Enzymy katalizujące ten typ reakcji sąglikozylo-
transferazami glikoproteinowymi, związanymi
z błonami. Ogólnie można powiedzieć, że synte¬
za jednego specyficznego typu wiązania wymaga
aktywności odpowiednio specyficznej transfera-
zy. Czynniki określające reszty seryny lub treoni¬
ny, które ulegają swoistej glikozylacji, nie zostały
ustalone, ale prawdopodobnie proces ten zależy
od struktury peptydu otaczającego reszty ulegają¬
ce glikozylacji. Enzymy katalizujące przyłączanie
łańcuchów O-wiązanych znajdują się w aparacie
Golgiego i są umiejscowione w kolejności zacho¬
dzących reakcji, tak że końcowe reakcje zachodzą
w części trans aparatu Golgiego. Główne cechy
biosyntezy O-wiązanych glikoprotein zestawiono
w tab. 46-9.
Tabela 46-9. Zestawienie głównych cech O-glikozylacji
Bierze w niej udział zespół związanych z błonami glikozylo-
transferaz glikoproteinowych, działających w określonej kolej¬
ności; każda glikozylotransferaza wykazuje swoistość katali¬
tyczną do określonego typu wiązania.
Większość enzymów biorących w niej udział jest umiejsco¬
wiona w różnych częściach aparatu Golgiego.
W każdej reakcji glikozylacji bierze udział właściwy cukier nu-
kleotydowy.
Nie biorą udziału oligosacharydo-P-P-dolichol i glikozydazy,
reakcje nie są hamowane przez tunikamycynę.
O-Glikozylacja zachodzi potranslacyjnie i dotyczy niektórych
reszt serynowych i treoninowych.
ff-WIĄZANE GLIKOPROTEINY ZAWIERAJĄ
WIĄZANIE Asn-GIcNAc
Ta klasa glikoprotein wyróżnia się występowa¬
niem wiązania Asn-GIcNAc (p. ryc. 46-1). Jest
ona główną klasą glikoprotein, dobrze zbadaną
dzięki łatwej dostępności do tkanek, w których
występuje (np. białka osocza). Należą do niej
zarówno glikoproteiny będące integralnymi
białkami błonowymi, jak też białkami krążą¬
cymi (osoczowymi). Główne różnice między
nimi, jak również poprzednimi klasami, oprócz
rodzaju aminokwasu, do którego są przyłączone
łańcuchy oligosacharydowe (głównie Asn za¬
miast Ser lub Thr), dotyczą ich biosyntezy.
Wyróżnia się trzy klasy itf-wiazanych
oligosacharydów: złożone, hybrydowe
i bogate w mannoze
Znane są trzy główne klasy 7V-wiązanych oli¬
gosacharydów: kompleksowe, hybrydowe i bo¬
gate w mannozę (ryc. 46-4). Częścią wspólną
w tej klasie jest pentasacharyd Man3GlcNAc2,
wyróżniony linią przerywaną na ryc. 46-4, jak
również na ryc. 46-5. Różnią się one między
sobą jedynie zewnętrznymi rozgałęzieniami.
Obecność wspólnego pentasacharydu dowo¬
dzi, że wszystkie trzy klasy mają wspólny ogól¬
ny mechanizm biosyntezy. Glikoproteiny typu
kompleksowego zwykle zawierają końcową
46. GLIKOPROTEINY 639
Kwas sialowy
a2,3 lub 2,6
Kwas sialowy
a2,3 lub 2,6
Ryc. 46-4. Budowa głównych typów asparaginowiązanych oligosacharydów. Wyróżniony obszar jest rdzeniem pentasacharydo-
wym, powszechnie występującym we wszystkich ^-wiązanych glikoproteinach. (Rycina reprodukowana za zgodą z: Komfeld R,
Komfeld S: Assembly of asparagine-linked oligosaccharides; Annu Rev Biochem 1985,54,631. Copyright © 1985 Annual Reviews,
www.annualreviews.org. Przedrukowano za zgodą).
resztę NeuAc oraz charakterystyczne reszty
Gal i GlcNAc, które często są disacharydem
Wacetylolaktozoaminowym. Powtarzający się
fragment N-acetylolaktozoaminy [Gaip 1 -
-3/4GlcNAc|31-3]n (poli-A-acetylolaktozoami-
noglikany) jest często stwierdzany w //-wiąza¬
nych łańcuchach glikanów. Do nich należą sub¬
stancje grupowe krwi I/i. Większość oligosacha¬
rydów typu kompleksowego zawiera dwa, trzy
lub cztery zewnętrzne rozgałęzienia (ryc. 46-4),
chociaż opisano także struktury zawierające pięć
rozgałęzień. Rozgałęzienia oligosacharydów są
często nazywane antenami i struktury takie okre¬
śla się jako bi-, tri-, tetra- i pentaantenowe.
Endoglikozydaza F
Man
a1,3
Endoglikozydaza H
Ryc. 46-5. Schematyczny diagram podstawowego rdzenia pen-
tasacharydowego wszystkich AZ-wiązanych oligosacharydów, do
którego mogą być przyłączone różne łańcuchy oligosacharydowe.
Wskazane są również miejsca działania endoglikozydaz F i H.
Liczba złożonych łańcuchów jest zdumiewają¬
ca, a przedstawiony na ryc. 46-4 to tylko jeden
z wielu. Inne łańcuchy kompleksowe mogą być
zakończone Gal lub Fuc. Łańcuchy oligosacha¬
rydowe bogate w mannozę zawierają dodatkowo
dwie do sześciu reszt Man przyłączonych do rdze¬
nia pentasacharydowego. Cząsteczki hybrydowe
mają cechy charakterystyczne dla obu klas.
W biosyntezie Owiązanych glikoprotein
uczestniczy oligosacharydo-P-P-dolichol
Leloir i wsp. opisali występowanie oligosacha-
rydu związanego z difosfodolicholem (oligosa-
charydo-P-P-Dol), który odgrywa główną rolę
w biosyntezie N-wiązanych glikoprotein. Ogól¬
ną strukturę łańcucha oligosacharydowego tego
związku można przedstawić następującym wzo¬
rem R—GlcNAc2Man9Glc3, gdzie R = P-P-Dol.
W pierwszym etapie biosyntezy cukry najpierw są
przyłączane do difosfodolicholu, a później łańcu¬
chy oligosacharydowe są przenoszone w całości
do odpowiednich reszt Asn, będących akceptora¬
mi apoglikoprotein podczas syntezy na polirybo-
somach związanych z błonami. Wszystkie N-gli-
640 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
kany mają wspólną pentasacharydową strukturę
rdzenia (p. ryc. 46-5).
Łańcuchy bogate w mannozę powstają przez
łączenie reszt Gic oraz dodatkowo usuwanie lub
też nie niektórych peryferyjnych reszt Man. Przy
tworzeniu łańcucha oligosacharydowego typu
złożonego reszty Gic i cztery reszty Man są usu¬
wane przez glikozydazy znajdujące się w siatecz¬
ce endoplazmatycznej i aparacie Golgiego. Cukry
charakterystyczne dla złożonych łańcuchów (Glc-
NAc, Gal, NeuAc) zostają wbudowane w wyni¬
ku działania poszczególnych glikozylotransferaz
znajdujących się w aparacie Golgiego. Zjawisko,
w wyniku którego łańcuchy glikanowe A-wiąza-
nych glikoprotein są najpierw częściowo usuwa¬
ne, a potem przebudowywane, określa się jako
proces przekształcania (obróbki) oligosachary-
dów. Łańcuchy hybry dowe powstają w procesie
częściowego przekształcenia oligosacharydów;
zawierają one zarówno łańcuchy typu komplek¬
sowego, jak i łańcuchy z Man.
Tak więc w biosyntezie A-wiązanych gliko¬
protein uczestniczy oligosacharydo-P-P-Dol, na¬
tomiast w biosyntezie O-wiązanych glikoprotein
nie uczestniczy.
W procesie tym można wyróżnić dwa etapy:
1) tworzenie i przeniesienie oligosacharydo-P-P-
-dolicholu, 2) obróbka łańcuchów oligosachary-
dowych.
A. Tworzenie i przeniesienie związków typu
OLIGOSACHARYD-P-P-DOUCHOL
Poliizoprenole występują zarówno w tkankach
eukariotycznych, jak i u bakterii. Biorą udział
w biosyntezie błon komórkowych bakterii, jak
również w biosyntezie A-wiązanych glikoprote¬
in i kotwiczących białek GPI. W tkankach euka¬
riotycznych do biosyntezy jest wykorzystywany
dolichol, związek należący do rodziny poliizo-
prenoli. Dolichol, oprócz gumy, jest najdłuższym
naturalnie występującym węglowodorem: składa
się on z 17-20 powtarzających się pojedynczych
podjednostek izoprenoidowych (ryc. 46-6).
Zanim dolichol zostanie użyty do biosyntezy
związku typu oligosacharyd-P-P-dolichol, musi
ulec fosforylacji do fosfodolicholu (Dol-P), któ¬
ry powstaje w reakcji dolicholu z ATP (nośnik
fosforanu), katalizowanej przez kinazę dolicho-
lową.
GlcNAc-pirofosforylodolichol (GlcNAc-P-P-
-Dol) jest głównym lipidem odgrywającym rolę
akceptora dla innych cukrów tworzących oli-
gosacharyd-P-P-Dol. Jest on syntetyzowany na
błonach szorstkiej siateczki śródplazmatycznej
z Dol-P i UDP-GlcNAc w reakcjach, z których
pierwsza jest następująca:
Dol-P + UDP-GlcNAc -+ Dol-P-P-GIcNAc + UMP
Kolejne reakcje przedstawione są na ryc. 46-7.
Dalsze etapy tworzenia się oligosacharydo-P-P-
-dolicholu przebiegają następująco:
1. Druga reszta GlcNAc zostaje przeniesiona na
pierwszą, przy czym UDP-GlcNAc jest jej
nośnikiem.
2. Następnie zostaje przyłączonych pięć reszt
Man, pochodzących z GDP-Man.
3. W końcu zostają przyłączone cztery kolejne
reszty Man, pochodzące z Dol-P-Man. Dol-P-
-Man powstaje w następującej reakcji:
Dol-P + GDP-Man -► Dol-P-Man + GDP
4. Biosyntezę oligosacharydu prekursorowego
kończy przeniesienie trzech reszt glukozy
z Dol-P-Glc. Dol-P-Glc powstaje w reakcji po¬
dobnej do wyżej przedstawionej z tą różnicą,
że Dol-P i UDP-Glc sąsubstratami.
Należy zwrócić uwagę, że pierwszych siedem
cukrów (dwie reszty GlcNAc i pięć reszt Man)
pochodzi z cukrów nukleotydowych, podczas gdy
ostatnich siedem cukrów (cztery reszty Man i trzy
reszty Gic) jest przenoszonych z cukrów dolicholo-
wych. Rezultatem powyższych reakcji jest związek
Ryc. 46-6. Struktura dolicholu. Fosforan
w fosforanie dolicholu jest połączony
z grupą hydroksylową po lewej stronie
cząsteczki. Fragment objęty klamrą jest
częścią izoprenu (n = 17-20 jednostek
izoprenoidowych).
ho — ch2 — ch2 — c — ch2
I
ch3
-- ch2 — CH = c — ch2 -- ch2 — ch = c — ch3
46. GLIKOPROTEINY 641
©
Tunikamycyna
GIcNAc — P —P —Doi
UDP-GIcNAc >
GIcNAc — GIcNAc — P — P — Doi
GDP-M *.
M — GIcNAc — GIcNAc — P — P — Doi
M—
M — M ^
M — (GlcNAc)2 — P — P — Doi
G —G —G —M —M—M
„ P —Doi
* M —P — Doi i G —P —Doi
(M)6 — (GlcNAc)2 — P — P — Doi
< P —Doi
* M — P —Doi
> — (GlcNAc)2 — P — P — Doi
(GDP-M)4 (GDP)4
Ryc. 46-7. Szlak biosyntezy oligosacharydo-P-P-dolicholu. Rodzaje powstałych specyficznych wiązań są pokazane na ryc. 46-8. Moż¬
na zauważyć, że zewnętrzne reszty mannozy pochodzą z GDP-mannozy, natomiast większość reszt mannozy i glukozy pochodzi z do-
licholo-P-mannozy i dolicholo-P-glukozy. UDP - urydynodifosforan; Doi - dolichol; P - fosforan; UMP - urydynomonofosforan; GDP
- guanozynodifosforan; M - mannoza; G - glukoza.
przedstawiony na ryc. 46-8. Jego wzór sumaryczny
można podać jako Dol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3.
Oligosacharydy związane z difosfodolicholem
są przenoszone w całości na nowo zsyntetyzowa-
ne białko związane z błoną szorstkiej siateczki
śródplazmatycznej, aby wytworzyć A-glikozydo-
we wiązanie z jedną lub kilkoma specyficznymi
resztami Asn łańcucha polipeptydowego, wywo¬
dzącego się z luminalnej powierzchni błon sia¬
teczki endoplazmatycznej. Reakcja jest katalizo¬
wana przez transferazę oligosacharydowo-biał-
kową, która jest enzymem związanym z błoną we¬
wnętrzną siateczki. Transferaza ta może rozpoznać
i przenieść każdą substancję o strukturze Dol-P-P-
-(GlcNAc)2-R i wykazuje preferencyjne powino¬
wactwo do struktury Dol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3.
Glikozylacja zachodzi na resztach Asn tripepty-
dowej sekwencji Asn-X-Ser/Thr, gdzie X jest do¬
wolnym aminokwasem, innym niż reszty proliny,
kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego.
Uprzywilejowanymi miejscami do glikozylacji jest
tripeptyd wykazujący konformację przestrzenną p.
Tylko ok. V3 reszt Asn ulega glikozylacji, co suge¬
ruje, że inne czynniki niż sekwencja tripeptydowa
Man
A\‘
kn ^
ort ,2 ort ,3 ort ,3 ort ,2 ort ,2 /a1*3
Gic ► Gic ► Gic ► Man ► Man ► Man
Ryc. 46-8. Struktura oligosacharydo-P-P-dolicholu. (Wzięte z Li E i wsp.: Structure of the lipid-linked oligosaccharide precursor of
the complex-type oligosaccharides of the vesicular stomatitis virus G protein. J Biol Chem 1978;253:7762. Reprodukowane za zgodą
uzyskaną za pośrednictwem Copyright Clearance Center, Inc.).
642 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
biorą udział w regulacji glikozylacji. Białkami
akceptorowymi są zarówno białka sekrecyjne, jak
i integracyjne błonowe. Białka cytoplazmy sto¬
sunkowo rzadko ulegają glikozylacji. Na rycinie
46-9 przedstawiono reakcję przeniesienia oraz
późniejszy proces glikozylacji N-wiązanych gli-
koprotein, jak również lokalizację tych ostatnich
w strukturach subkomórkowych. Drugim produk¬
tem reakcji katalizowanej przez transferazę oligo-
sacharydową jest dolicholo-P-P, który pod wpły¬
wem fosfatazy ulega konwersji do dolicholo-P.
Dolicholo-P może ponownie służyć jako akceptor
SZORSTKA SIATECZKA ŚRÓDPLAZMATYCZNA
Ryc. 46-9. Schemat szlaku biosyntezy oligosacharydów. Reakcje są katalizowane przez następujące en¬
zymy: 1 - oligosacharydotransferaza, 2 - a-glukozydaza I, 3 - a-glukozydaza II, 4 - a1,2-mannozydaza,
I. /V-acetyloglukozoaminylofosfotransferaza, II. /V-acetyloglukozoamino-1 -fosfodiestero-a-/V-acetylogluko-
zoaminidaza siateczki śródplazmatycznej, 5 - a-mannozydaza I aparatu Golgiego, 6 - /V-acetyloglukozo-
aminylotransferaza I, 7 - a-mannozydaza II aparatu Golgiego, 8 - /V-acetyloglukozoaminylotransferaza II,
9 - fukozylotransferaza, 10 - galaktozyIotransferaza, 11 - sialilotransferaza, ■ - /V-acetyloglukozoamina,
o - mannoza, a - glukoza, a - fukoza, • - galaktoza, ♦ - kwas sialowy. (Rycina reprodukowana za zgodą
z: Kornfeld R, Kornfeld S: Assembly of asparagine-linked oligosaccharides;/tay RevBiochem 1985;54:631.
Copyright © 1985 by Annual Reviews, www.annualreviews.org. Przedrukowano za zgodą).
46. GLIKOPROTEINY 643
w syntezie innej cząsteczki oligosacharydo-P-P-
-dolicholu.
B. Przekształcanie (obróbka) łańcuchów
OLIGOSACHARYDOWYCH
1. Wcześniejsza faza. Na rycinie 46-9 pokaza¬
ne są różne typy reakcji biorących udział w tym
procesie. Reakcję 1 katalizuje transferaza oligo-
sacharydowa (p. wyżej). W reakcji 2 i 3 kolejno
są usuwane: przez glukozydazę I końcowa reszta
Gic oraz przez glukozydazę II dwie reszty Gic.
W przypadku glikoprotein bogatych w mannozę
proces ten może być zatrzymany na tym etapie lub
też mogą dodatkowo zostać usunięte cztery reszty
Man. Łańcuchy typu kompleksowego tworzone
są w dalszych etapach, mianowicie cztery ze¬
wnętrzne reszty Man są usuwane w reakcjach 4 i 5
przez różne mannozydazy, a w reakcji 6, katalizo¬
wanej przez GlcNAc-transferazę I, reszta GlcNAc
jest dodawana do jednej Man. Działanie kolejne¬
go enzymu - mannozydazy (a-mannozydazy II
aparatu Golgiego) umożliwia przebieg reakcji 7,
w wyniku której dochodzi do redukcji reszt Man
w rdzeniu do 3 reszt (p. ryc. 46-5).
Na rycinie 46-9 reakcje I i II przedstawiają do¬
datkowy, ważny szlak metaboliczny przekształ¬
cania oligosacharydów. Przedstawiona jest tutaj
synteza jednostek oligosacharydowych enzymów
lizosomalnych, które po uzyskaniu specyficznego
markera są kierowane do lizosomów. W reakcji I
reszta GlcNAc-1-P jest przenoszona na grupę OH
przy atomie węgla 6 jednej lub kilku reszt Man
tych enzymów. Reakcja ta, przedstawiona niżej,
jest katalizowana przez GlcNAc-fosfotransferazę.
Nośnikiem GlcNAc jest UDP-GlcNAc, produk¬
tem zaś reakcji jest UMP.
GlcNAc-
-FOSFOTRANS-
FERAZA
UDP-GlcNAc + Man — Białko
GIcNAc-1 -P-6-Man - Białko + UMP
W reakcji II reszta GlcNAc jest usuwana pod
wpływem fosfodiesterazy, pozostają natomiast fo¬
sfory lowane reszty Man w pozycji 6 Man.
FOSFO-
DIESTERAZA
GlcNAc-1 -P-6-Man - Białko
P-6-Man — Białko + GlcNAc
Receptor dla Man-6-P zlokalizowany w apa¬
racie Golgiego wiąże resztę Man-6-P i kieruje ją
potem do lizosomów. Fibroblasty pochodzące od
pacjentów, u których stwierdza się chorobę wtrę¬
tów komórkowych (ang. I-cell disease) (p. niżej)
mają receptory dla fosfomannozowych oligosa¬
charydów, lecz wykazują duży niedobór GlcNAc-
-fosfotransferazy.
2. Późniejsza faza. Łańcuchy oligosachary-
dowe typu kompleksowego tworzą się dzięki
przyłączaniu dodatkowych cukrów do jednostek
oligosacharydowych powstałych w reakcji 7.
W reakcji 8 druga reszta GlcNAc jest dodawana
do zewnętrznej reszty Man innych rozgałęzień
biantenowej struktury pokazanej na ryc. 46-9; en¬
zymem katalizującym ten etap jest GlcNAc-trans-
feraza II. W reakcjach 9, 10 i 11 katalizowanych
przez fukozylo-, galaktozylo- i sialilotransferazy
kolejno są dodawane reszty Fuc, Gal i NeuAc.
Połączenie łańcuchów poli-A-acetylolaktozaminy
wymaga działania dodatkowych transferaz.
Głównymi miejscami glikozylacji
sa aparat Golgiego i siateczka
śródplazmatyczna
Głównymi miejscami, w których zachodzi proces
glikozylacji są siateczka śródplazmatyczna i apa¬
rat Golgiego, co pokazano na ryc. 46-9. Łączenie
się Dol-P-P-oligosacharydów odbywa się zarów¬
no na cytoplazmatycznych, jak i wewnętrznych
powierzchniach błon siateczki endoplazmatycz-
nej. Łańcuchy oligosacharydowe są przyłączone
w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej i jest
to zjawisko zarówno ko-, jak i potranslacyjne.
W siateczce śródplazmatycznej następuje również
odcinanie reszt Gic oraz niektórych peryferyjnych
reszt Man. Aparat Golgiego składa się ze specy¬
ficznych cystern, mianowicie: cis, środkowych
i trans, które mogą być rozdzielone za pomocą
odpowiedniego wirowania. Glikoproteiny powsta¬
łe w siateczce śródplazmatycznej są przenoszone
potem do cystern cis aparatu Golgiego. Wiele
różnych badań potwierdziło, że enzymy uczestni¬
czące w procesie syntezy glikoprotein wykazują
swoistą lokalizację w cysternach aparatu Golgie¬
go. Jak wynika z ryc. 46-9, a-mannozydaza I apa¬
ratu Golgiego (katalizująca reakcję 5) znajduje się
głównie w rejonie cis aparatu Golgiego, natomiast
GlcNAc-transferaza (katalizująca reakcję 6) wy-
644 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
stępuje w rejonie środkowym aparatu Golgiego.
Fukozylo-, galaktozylo- i sialilotransferazy (ka¬
talizujące reakcje 9, 10, 11) są obecne w rejonie
trans aparatu Golgiego.
Tabela 46-10. Zestawienie głównych cech AZ-glikozylacji
Oligosacharyd Glc3Man9(GlcNAc)2 jest przenoszony ze związ¬
ku oligosacharyd-P-P-dolichol w reakcji katalizowanej przez
transferazę oligosacharyd: białko, która jest hamowana przez
tunikamycynę.
Przenoszenie dotyczy określonych reszt asparaginianowych,
umiejscowionych w sekwencji Asn-X-Ser/Thr, przy czym X
może być resztą każdego aminokwasu z wyjątkiem Pro, Asp
lub Glu.
Przenoszenie zachodzi w trakcie translacji w siateczce śród-
plazmatycznej.
Oligosacharyd związany z białkiem ulega dalszym przemianom
przy udziale glukozydaz i mannozydaz; jeżeli nie są dołączone
dodatkowe sacharydy, dochodzi do wytworzenia łańcucha bo¬
gatego w mannozę.
Jeżeli przekształcenia zachodzą poniżej rdzenia pentasachary-
dowego (Man3[GlcNAc]2), wytworzone zostają złożone łańcu¬
chy powstałe w wyniku kolejnego dołączania monosachary-
dów (GIcNAc), odłączenia dwóch Man i stopniowego dodania
pojedynczych cukrów w reakcji katalizowanej przez swoiste
transferazy (np. transferazę GIcNAc, Gal, NeuAc), które wyko¬
rzystują w reakcji właściwe cukry nukleotydowe.
Główne cechy biosyntezy A-wiązanych gliko-
protein podano w tab. 46-10 i można je porównać
z uprzednio zestawionymi (tab. 46-9) O-wiązany-
mi glikoproteinami.
Niektóre glikanowe produkty pośrednie
powstające w trakcie Jtf-glikozylacji
pełnia swoiste funkcje
Ustalono lub są w trakcie badania następujące
swoiste funkcje łańcuchów A-glikanowych.
1. Nie budzi wątpliwości udział sygnału man-
nozo-6-P w ukierunkowaniu działania niektórych
enzymów lizosomalnych (p. dalej i omówienie
choroby wtrętów komórkowych).
2. Przypuszcza się, że długie łańcuchy A-glika-
nowe w nowo zsyntetyzowanych glikoproteinach
mogą współdziałać w utrzymaniu tych białek
w stanie rozpuszczonym w świetle siateczki śród-
plazmatycznej.
3. Wykazano, że jeden rodzaj łańcuchów A-gli-
kanowych jest odpowiedzialny za fałdowanie
się glikoprotein i zatrzymanie niektórych z nich
w świetle siateczki śródplazmatycznej. Kalnek-
syna jest białkiem obecnym w błonach siateczki
śródplazmatycznej i działa jako chaperon (rozdz.
45). Chaperon jest białkiem, które wiąże się z de
novo zsyntetyzowanym białkiem i wspomaga go
przy tworzeniu właściwego ufałdowania. Wyka¬
zano, że kalneksyna wiąże się swoiście do wie¬
lu glikoprotein (np. hemaglutyniny wirusa grypy
[HA]), które mają monoglikozylowaną budowę
rdzenia. Są to produkty reakcji 2, ukazanej na ryc.
46-9, z których została usunięta końcowa resz¬
ta glukozy, a pozostała tylko glukoza dołączona
w samym środku. Uwolnienie w pełni ukształto¬
wanej przestrzennie hemaglutyniny wirusa grypy
od kalneksyny wymaga enzymatycznego odłą¬
czenia ostatniej reszty glukozowej przez działa¬
nie a-glukozydazy II. W ten sposób kalneksyna
zatrzymuje niektóre częściowo pofałdowane (lub
błędnie pofałdowane) glikoproteiny; uwalniają
się one wtedy, kiedy zostaną właściwie ukształto¬
wane przestrzennie. Stanowi to istotną składową
systemu kontroli jakości działającego wewnątrz
siateczki endoplazmatycznej. Rozpuszczalne biał¬
ko kalretikulina wydaje się pełnić podobną rolę.
Glikozylację glikoprotein reguluje
kilka czynników
Wiadomo, że glikozylacja glikoprotein jest pro¬
cesem złożonym, w którym bierze udział wiele
enzymów. Szacuje się, że ok. 1% ludzkiego ge¬
nomu koduje białka uczestniczące w glikozylacji.
Innym wskaźnikiem złożoności tego zjawiska jest
więcej niż dziesięć GIcNAc transferaz biorących
udział w biosyntezie glikoprotein, przy czym ist¬
nieją przesłanki teoretyczne, że oprócz tych wy¬
krytych występuje też wiele innych. Znanych jest
wiele rodzajów innych glikozylotransferaz (np.
sialilotransferazy). Pierwsze etapy biosyntezy A-
-wiązanych glikoprotein (tzn. tworzenie i przeno¬
szenie oligosacharydów) są kontrolowane przez
następujące czynniki: 1) obecność odpowiednich
miejsc akceptorowych na białku, 2) odpowiednie
stężenie Dol-P w tkankach i 3) aktywność transfe¬
razy oligosacharydowej.
Niektóre czynniki biorące udział w regulacji
przekształcania łańcuchów oligosacharydo-
wych zestawiono w tab. 46-11. Dwa zagadnie¬
nia zasługują na dalsze omówienie. Po pierw¬
sze, zmienność gatunkowa enzymów metabo¬
lizujących odgrywa ważną rolę przy produkcji
46. GLIKOPROTEINY 645
Tabela 46-11. Niektóre czynniki wpływające na aktywność enzy¬
mów biorących udział w obróbce glikoprotein
Czynnik
Komentarz
Rodzaj komórki
Różne komórki zawierają różne pro¬
file enzymów
Poprzedzający enzym
Niektóre glikozylotransferazy działają
tylko na łańcuch oligosacharydowy
uprzednio poddany działaniu określo¬
nego innego enzymu1
Rozwój
Komórkowy profil enzymów może
zmieniać się podczas rozwoju, jeżeli
ich geny ulegają ekspresji lub ich
ekspresja jest zahamowana
Umiejscowienie
wewnątrzkomórkowe
Na przykład: jeżeli enzym jest prze¬
znaczony do insercji do błon siateczki
śródplazmatycznej (np. HMG-CoA re-
duktaza), może nigdy nie mieć kon¬
taktu z enzymami znajdującymi się
w aparacie Golgiego
Konformacja białka
Różnice w konformacji różnych
białek mogą ułatwiać lub utrudniać
dostęp enzymów do jednakowych
łańcuchów oligosacharydowych
Gatunek
Te same komórki (np. fibroblasty)
pochodzące od organizmów różnych
gatunków mogą się różnić profilem
enzymów uczestniczących w obrób¬
ce glikoprotein
Nowotwór
Komórki nowotworowe mogą się róż¬
nić składem enzymów uczestniczą¬
cych w obróbce glikoprotein od od¬
powiednich komórek prawidłowych
1 Na przykład: przed działaniem GIcNAc transferazy I niezbędne
jest działanie a-mannozydazy II zawartej w aparacie Golgiego.
glikoprotein dla celów leczniczych, uzyskiwa¬
nych za pomocą techniki rekombinacji DNA.
Na przykład rekombinowana erytropoetyna
(EPO) jest czasami podawana chorym na róż¬
ne rodzaje przewlekłej niedokrwistości w celu
pobudzenia erytropoezy. Okres półtrwania EPO
w osoczu zależy od jej glikozylacji, a niektóre
układy oligosacharydów skracają jej okres pół¬
trwania, co istotnie ogranicza jej skuteczność
leczniczą. Ważne jest więc, aby uzyskać EPO
z komórek, które zapewniają wbudowanie oli¬
gosacharydów warunkujących prawidłowy jej
okres półtrwania. Po drugie, duże zaintereso¬
wanie budzi analiza aktywności enzymów bio¬
rących udział w syntezie glikoprotein w komór¬
kach różnych rodzajów nowotworów. Stwier¬
dzono, że komórki nowotworowe często wytwa¬
rzają odmienne łańcuchy oligosacharydowe (np.
często łańcuchy o większej liczbie odgałęzień)
niż odpowiednie komórki niezmienione nowo-
tworowo. Może to być wynikiem występowania
w komórkach nowotworowych innego układu
glikozylotransferaz niż w komórkach zdrowych,
co wynika ze swoistej aktywacji lub represji
genów. Różnice w łańcuchach oligosacharydo-
wych mogą wpływać na oddziaływanie między
komórkami nowotworowymi i niezmienionymi
komórkami macierzystej tkanki, co jest istotne
dla tworzenia przerzutów. Jeżeli udałoby się
ustalić zależność między aktywnością okre¬
ślonych enzymów biorących udział w syntezie
glikoprotein i aktywnością metastatyczną ko¬
mórek nowotworowych, byłaby możliwa synteza
leków, które hamują te enzymy i wtórnie hamują
tworzenie przerzutów.
Wiele glikozylotransferaz zostało już sklono¬
wanych, a inne są w trakcie badań. Klonowanie
dostarczyło już wielu nowych danych zarówno
o budowie tych białek, jak i kodujących ich ge¬
nów. Poznawanie genów rzuca także światło na
mechanizmy kontroli ich transkrypcji, a elimina¬
cja genów jest stosowana w badaniach biologicz¬
nego znaczenia różnych glikozylotransferaz.
Tunikamycyna hamuje Af-glikozylację,
ale nie hamuje 0-glikozylacji
Znanych jest wiele związków, które hamują róż¬
ne etapy przekształcania glikoprotein. Przykłada¬
mi takich związków mogą być: tunikamycyna,
deoksynojirimycyna i swainsonina. W tabeli
46-12 przedstawiono działanie tych inhibitorów.
Związki te mogą być używane jako czynniki ha¬
mujące różne etapy biosyntezy glikoprotein, jak
również do badania skutków tego hamowania. Na
przykład, jeśli komórki są hodowane w obecno¬
ści tunikamycyny, to proces syntezy A-wiązanych
glikoprotein nie nastąpi. Działanie tych inhibito¬
rów w pewnych przypadkach wzmaga wrażliwość
białek na proteolizę. Okazało się, że hamowanie
glikozylacji przez różne inhibitory nie wpływa
w sposób stały na wydzielanie normalnie wydzie¬
lanych glikoprotein. Inhibitory obróbki glikopro¬
tein, łącznie z wymienionymi w tab. 46-12, nie
646 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
wpływają na syntezę O-glikozylowanych gliko-
protein. Wydłużenie O-glikozylowanych łańcu¬
chów może być chronione przez GalNAc-benzyl.
Związek ten współzawodniczy z naturalnymi gli-
koproteinami i w ten sposób chroni wzrost łańcu¬
cha przed GalNAc.
Tabela 46-12. Trzy inhibitory enzymów uczestniczących w pro¬
cesie glikozylacji glikoprotein i miejsca ich działania
Inhibitor
Miejsce działania
Tunikamycyna
Inhibitor enzymu katalizującego do¬
dawanie reszty GIcNAc do dolicho-
lo-P w pierwszym etapie biosyntezy
oligosacharydo-P-P-dolicholu
Deoksynojirimycyna
Inhibitor glikozydazy I i II
Swainsonina
Inhibitor mannozydazy II
NIEKTÓRE BIAŁKA SA ZAKOTWICZONE
W BŁONACH KOMÓRKOWYCH
ZA POMOCĄ STRUKTUR
GLIKOZYLOFOSFATYDYLOINOZYTOLOWYCH
Glikoproteiny związane z glikozylofosfatydylo-
inozytolem (GPI) stanowią trzecią z głównych
klas glikoprotein. Struktura GPI (czasami nazy¬
wana „lepką stopą”) bierze udział w wiązaniu
enzymu acetylocholinesterazy (esterazy acetylo-
cholinowej) do błon komórkowych krwinek czer¬
wonych, jak to przedstawiono na ryc. 46-1. Białka
związane z GPI są zakotwiczone w zewnętrznej
warstwie błony komórkowej przez kwasy tłusz¬
czowe fosfatydyloinozytolu (PI). PI jest połączo¬
ny za pośrednictwem części GlcNH2 z łańcuchem
glikanowym, który zawiera różne cukry (np. Man,
G1cNH2). Z kolei łańcuch oligosacharydowy jest
związany za pośrednictwem fosforyloetanolo-
aminy wiązaniem amidowym z karboksykońco-
wym aminokwasem przyłączonego białka. Rdzeń
większości GPI zawiera jedną cząsteczkę GlcNH2
i jedną cząsteczkę fosfatydyloinozytolu, zgodnie
z następującym schematem:
Etanoloamino-fosfo -* 6Mana1 -* 2Mana1->
-> 6Mana1 -* GIcNal -* 6-m/o-inozytolo-1-fosfolipid
Znaleziono dodatkowe składniki w wielu struk¬
turach GPI, na przykład struktura pokazana na
ryc. 46-1 zawiera dodatkową fosforyloetanolo-
aminę, przyłączoną do środkowej z trzech grup
Man w glikanie, i dodatkowy kwas tłuszczowy
przyłączony do GlcN. Czynnościowe znaczenie
tych różnic w budowie nie jest znane. Ten typ
wiązania został po raz pierwszy wykryty przy
użyciu bakteryjnej, swoistej dla PI fosfolipazy
C (PI-PLC), która uwalnia niektóre białka z błon
komórkowych w wyniku rozerwania wiązania za¬
znaczonego na ryc. 46-1. Przykłady białek, które
są umocowane wiązaniem tego typu, zestawiono
w tab. 46-13. Temu typowi wiązania przypisuje
się przynajmniej trzy możliwe funkcje:
1. Wiązanie GPI umożliwia większą ruchliwość
białka w błonie komórkowej w porównaniu z biał¬
kami zawierającymi fragmenty przezbłonowe. Nie
jest to zaskoczeniem, wiązanie GPI łączy bowiem
białko z zewnętrzną warstwą lipidową błony, więc
łatwiej ulega ono oderwaniu niż białka umocowa¬
ne do obu warstw błony komórkowej. Zwiększona
ruchliwość może być istotna dla szybkiej reakcji
białka na zadziałanie określonych bodźców.
2. Niektóre zakotwiczenia GPI mogą łączyć się
ze szlakiem przekazywania sygnału.
3. Wykazano, że struktury GPI mogą ukierun¬
kowywać niektóre białka do wierzchołkowych
części błony komórkowej komórek nabłonko¬
wych. Biosynteza struktur GPI jest złożona i za¬
czyna się w siateczce śródplazmatycznej. Struktu¬
ra kotwicząca GPI powstaje w serii niezależnych,
katalizowanych enzymatycznie reakcji, a następ¬
nie jest przenoszona do końca karboksylowego
białka akceptującego, czemu towarzyszy oderwa¬
nie uprzednio istniejącego karboksyterminalnego
peptydu hydrofobowego tego białka. Proces ten
jest czasami nazywany glipiacją. Nabyte zabu¬
rzenia wczesnych etapów biosyntezy struktury
GPI są przyczyną napadowej nocnej hemoglo-
binurii (p. dalej).
Tabela 46-13. Niektóre białka związane z GPI
• Acetylocholinoesteraza (błona komórkowa krwinek czerwo¬
nych
• Fosfataza zasadowa (jelitowa, łożyskowa)
• Czynnik przyspieszający zamieranie (błona komórkowa krwi¬
nek czerwonych)
• 5'-Nukleotydaza (limfocyty T, inne komórki)
• Antygen Thy-1 (mózg, limfocyty T)
• Różne glikoproteiny powierzchniowe (Trypanosoma brucei
- świdrowiec afrykański)
46. GLIKOPROTEINY 647
GLIKOPROTEINY BIORĄ
UDZIAŁ W WIELU PROCESACH
BIOLOGICZNYCH I CHOROBOWYCH
Jak przestawiono w tab. 46-1, glikoproteiny peł¬
nią wiele różnorodnych funkcji. Niektóre z nich
już opisano w tym rozdziale, inne (np. transport
cząsteczek, cząsteczki biorące udział w procesach
odpornościowych i hormony) są opisane w innych
częściach książki. Poniżej przedstawiono pokrót¬
ce udział glikoprotein w dwóch procesach: za¬
płodnieniu i zapaleniu. Dodatkowo zostaną przed¬
stawione liczne choroby rozwijające się w wyniku
nieprawidłowości w syntezie i rozkładzie gliko¬
protein.
Glikoproteiny odgrywają
ważna rolę w procesie zapłodnienia
Plemnik, aby dojść do błony komórki jajowej,
musi przeniknąć przez osłonę przejrzystą będącą
grubą, przezroczystą, bezkomórkową otoczką otu¬
lającą komórkę jajową. Osłona przejrzysta składa
się z trzech glikoprotein: ZP1-ZP3. Szczególne
zainteresowanie budzi ZP3 - O-wiązana gliko-
proteina, która pełni funkcję receptora dla plem¬
ników. Białko na powierzchni plemników, praw¬
dopodobnie transferaza galaktozylowa, oddzia¬
łuje swoiście z łańcuchami oligosacharydowymi
glikoproteiny ZP3. Przynajmniej u niektórych
gatunków (np. myszy) oddziaływanie to, polega¬
jące na przezbłonowym przekazywaniu sygnału,
wywołuje odpowiedź akrosomalną, w której
uwalniane są enzymy, takie jak proteazy i hialuro-
nidaza oraz inne składniki akrosomu plemników.
Uwolnienie enzymów pomaga plemnikowi prze¬
niknąć przez osłonę przejrzystą i dojść do błony
komórki jajowej. U chomików stwierdzono inną
glikoproteinę - PH-30, która odgrywa ważną rolę
w wiązaniu błony komórkowej plemnika do ko¬
mórki jajowej i następnie zlaniu się tych komórek.
Oddziaływania te umożliwiają plemnikom przeni¬
kanie do komórki jajowej, a więc i zapłodnienie.
Możliwe wydaje się zapobieganie zapłodnieniu
przez zaburzenie prawidłowej czynności gliko¬
protein ZP3 i PH-30 możliwymi w przyszłości
do wyprodukowania lekami lub przeciwciałami,
które będą spełniały funkcje środków antykon¬
cepcyjnych.
Selektyny odgrywała kluczowa rolę
w procesach zapalnych
i zasiedlaniu się limfocytów
Limfocyty odgrywają ważną rolę w wielu proce¬
sach zapalnych i odpornościowych. Pierwszym
etapem wielu zjawisk jest oddziaływanie krążących
krwinek białych z komórkami śródbłonka, poprze¬
dzające przechodzenie krwinek poza układ krąże¬
nia. Badania określające swoiste cząsteczki obecne
na powierzchni komórek i biorące udział w tych od¬
działywaniach wykazały, że krwinki białe i komór¬
ki śródbłonka zawierają na powierzchni swoiste
lektyny, zwane selektynami, biorące udział w przy¬
leganiu komórek. Charakterystykę trzech głównych
grup selektyn zamieszczono w tab. 46-14.
Tabela 46-14. Niektóre cząsteczki uczestniczące w oddziaływa¬
niu między krwinkami białymi i komórkami śródbłonkowymi1
Cząsteczka
Komórka
Ligandy
Selektyny
L-selektyna
PMN,
limfocyty
CD34, Gly-CAM-12, sialylo-Lewisx
i inne
P-selektyna
EC, płytki
Glikoproteinowy ligand P-selektyny-
-1 (PSGL-1) sialylo-Lewisx i inne
E-selektyna
EC
Sialylo-Lewisx i inne
Integryny
LFA-1
PMN,
limfocyty
ICAM-1, ICAM-2 (CD11 a/CD18)
Mac-1
PMN
ICAM-1 i inne (CD11b/CD18)
Nadrodzina immunoglobulin
ICAM-1
Limfocyty, EC
LFA-1, Mac-1
ICAM-2
Limfocyty, EC
LFA-1
PECAM-1
EC, PMN,
limfocyty
Różne płytki
1 Tabela zmodyfikowana i reprodukowana z: Albelda SM, Smith
CW, Ward PA: Adhesion molecules and inflammatory injury.
FASEB J 1994;8:504. Przedrukowano za zgodą uzyskaną za po¬
średnictwem Copyright Clearance Center, Inc.
2 Są to ligandy dla L-selektyny limfocytów, ligandy dla L-selektyny
granulocytów obojętnochłonnych nie zostały ustalone.
Skróty: PMN - leukocyty z jądrem wielopostaciowym; EC - ko¬
mórki śródbłonka; CD - antygeny błony komórek limfocytów T,
pozwalające klasyfikować je w podklasy; ICAM - cząsteczka ad¬
hezji międzykomórkowej; LFA-1 - antygen 1 związany z czynnoś¬
cią limfocytów; PECAM-1 - cząsteczka 1 adhezji płytek i komórek
śródbłonkowych.
648 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Selektyny są białkami zbudowanymi z pojedyn¬
czego łańcucha przezbłonowego, wiążącego jony
wapnia i zawierającego liczne domeny o różnej
funkcji (ryc. 46-10). Aminokońcowy fragment za¬
wiera domenę lektynową, która uczestniczy w swo¬
istym wiązaniu węglowodanów.
L-selektyna
Lektyna
Ryc. 46-10. Schemat budowy ludzkiej L-selektyny. Pozakomór-
kowa aminoterminalna część zawiera fragmenty homologiczne
do lektyn typu C i przyległy fragment przypominający naskórkowy
czynnik wzrostu. Za nimi znajduje się różna liczba fragmentów
przypominających czynniki regulujące dopełniacz (cyfry w kół¬
kach) i sekwencja przezbtonowa (czarny romb). Krótka sekwencja
cytoplazmatyczna (jasny prostokąt) kończy się grupą karboksylo¬
wą. Budowa P- i E-selektyn jest podobna, z tym że zawierają one
więcej fragmentów regulatorowych dla dopełniacza. Liczbę amino¬
kwasów w L-, P- i E-selektynach ustalono na podstawie określenia
sekwencji cDNA i wynosi ona, odpowiednio, 385, 789 i 589. (Ry¬
cina reprodukowana za zgodą z: Berilacqua MR Nelson RM: Selec-
tins J Clin lnvest 1993;91:370. Przedrukowano za zgodą uzyskaną
za pośrednictwem Copyright Clearance Center, Inc.).
Przyleganie granulocytów obojętnochłonnych
do komórek śródbłonka małych postwłosowa-
tych naczyń żylnych następuje w czterech eta¬
pach, przedstawionych na ryc. 46-11. Wstępny
etap poprzedza zwolnienie przepływu lub „to¬
czenie się” po ścianie śródbłonka granulocytów
obojętnochłonnych, w czym biorą udział selek¬
tyny: L - na powierzchni granulocytów i czą¬
steczki CD34 oraz GlyCAM-1 - na powierzchni
komórek śródbłonkowych. Oddziaływania te są
krótkotrwałe i wiązanie jest względnie słabe.
W tym etapie oddziaływania dochodzi jednak
do aktywacji granulocytów obojętnochłonnych
przez różne mediatory chemiczne (omówione
dalej), co prowadzi do zmiany kształtu granu¬
locytów i ścisłego przylegania tych komórek do
śródbłonka. W ścisłym przyleganiu granulocy¬
tów bierze udział zespół cząsteczek adhezyjnych,
a mianowicie LFA-1 i Mac-1, występujących na
granulocytach obojętnochłonnych, oraz ICAM-1
i ICAM-2, występujących na powierzchni komó¬
rek śródbłonka. LFA-1 i Mac-1 są integrynami
CD11/CD18 (p. rozdz. 51 - omówienie inte-
gryn), natomiast ICAM-1 i ICAM-2 należą do
nadrodziny immunoglobulin. Czwartym etapem
jest przemieszczenie się granulocytów obojęt¬
nochłonnych przez śródbłonek. Aby to zaszło,
granulocyty wysuwają wypustki rzekome (pseu-
dopodia) do połączeń między komórkami śród-
błonkowymi, następnie przeciskają się przez te
połączenia, przechodzą przez błonę podstawną
i dopiero wtedy mogą swobodnie przemieszczać
się w przestrzeni pozakomórkowej. W połącze¬
niach między komórkami śródbłonkowymi zna¬
leziono płytkowo-śródbłonkowe cząsteczki ad-
hezyjne 1 (PECAM-1), które mogą brać udział
w przemieszczaniu się granulocytów obojętno¬
chłonnych. Do cząsteczek biologicznie czynnych
biorących udział w aktywacji granulocytów obo¬
jętnochłonnych i komórek śródbłonkowych na¬
leżą: nowotworowy czynnik martwicy a, różne
Aktywacja
i silne
przyleganie
Przemie¬
szczanie się
Ryc. 46-11. Schemat oddziaływania granulocytów obojętno¬
chłonnych na komórki śródbłonka. A: Warunki podstawowe:
granulocyty obojętnochłonne nie przylegają do ściany śródbłon¬
ka. B: Pierwszym etapem jest zwolnienie przepływu i „toczenie
się” granulocytów obojętnochłonnych po ścianie śródbłon¬
ka drobnych naczyń żylnych, w czym uczestniczą selektyny.
C: W wyniku aktywacji granulocyty obojętnochłonne silnie przy¬
legają do powierzchni komórek śródbłonkowych, a także ulegają
spłaszczeniu. Wymaga to oddziaływania aktywowanej integryny
CD18 granulocytów obojętnochłonnych z ICAM-1 śródbłonka.
D: Granulocyty obojętnochłonne przemieszczają się przez szcze¬
linę między komórkami śródbłonkowymi do substancji między¬
komórkowej. Wymaga to udziału PECAM-1. W ostatnim etapie
zachodzi również chemotaksja. (Reprodukowano za zezwoleniem
z: Albelda SM, Smith CW, Ward PA: Adhesion molecules and
inflammatory injury. FASEB J 1994;8:504).
46. GLIKOPROTEINY 649
interleukiny, czynnik aktywujący płytki (PAF),
leukotrien B4 i niektóre fragmenty dopełniacza.
Związki te aktywują różne drogi wewnątrzko¬
mórkowego przenoszenia sygnału, co powoduje
zmiany strukturalne i czynnościowe komórek;
niektóre z tych związków wykazują działanie
chemotaktyczne. Jedną z ważnych zmian czyn¬
nościowych jest przemieszczenie selektyn na
powierzchnię komórek, w których czasami były
uprzednio magazynowane w ziarnistościach (np.
w komórkach śródbłonkowych i płytkowych).
Poznano dokładnie budowę chemiczną nie¬
których ligandów wiązanych przez selektyny.
Wszystkie 3 selektyny wiążąsialowane i fukozy-
lowane oligosacharydy, a szczególnie cząstecz¬
kę sialylo-Lewis* (ryc. 46-12), która to struktura
występuje w glikoproteinach i glikolipidach. Nie
ustalono, czy związek ten jest rzeczywiście ligan-
dem in vivo. W niektórych sytuacjach cząsteczki
zawierające siarczany (sulfatydy, p. rozdz. 15)
mogą być Ugandami. Znajomość podstaw tych
zjawisk jest przydatna w próbach wytworzenia
związków, które hamują oddziaływanie selektyn
z Ugandami i w ten sposób działają przeciwza¬
palnie. Próbuje się w tym celu podawać swoi¬
ste przeciwciała monoklonalne lub syntetyczne
analogi cząsteczki sialylo-Lewis\ które wiążą
się z selektynami. Komórki nowotworowe czę¬
sto mają na swej powierzchni cząsteczki sialylo-
-Lewisx lub innych selektyn. Przypuszcza się, że
odgrywają one rolę w rozprzestrzenianiu się no¬
wotworów i tworzeniu przerzutów.
NeuAca2 ► 3Gal(31 ► 4GlcNAc —
t a 1-3
Fuc
Ryc. 46-12. Schemat struktury cząsteczki sialylo-Lewis*.
Nieprawidłowości syntezy
glikoprotein leża u podstaw
niektórych chorób
W tabeli 46-15 zestawiono choroby, w których
ważną rolę odgrywają nieprawidłowości syntezy
glikoprotein. Jak już wspomniano, wiele komó¬
rek nowotworowych ma na powierzchni zmie¬
niony zestaw łańcuchów oligosacharydowych,
z których niektóre mogą brać udział w tworzeniu
przerzutów.
Tabela 46-15. Niektóre choroby wynikłe z zaburzeń w biosynte¬
zie glikoprotein lub z nimi związane
Choroba
Zaburzenia
Rozrost nowotworowy
Zwiększona liczba łańcuchów bocz¬
nych glikanów powierzchni komórek,
co może odgrywać istotną rolę w two¬
rzeniu przerzutów
Wrodzone zaburzenia
glikozylacji1
Patrz tab. 46-16
HEMPAS2
(MIM 224100)
Zaburzenie biosyntezy A/-glikanów
(np. przypuszczalny niedobór manno-
zydazy II) szczególnie dotyczący błony
komórkowej krwinek czerwonych
Niedobór adhezji
leukocytów, typ II
(MIM 266265)
Najpewniej spowodowany mutacją
transportera GDP fukozy, zlokalizowa¬
nego w aparacie Golgiego i będącego
przyczyną upośledzenia fukozylacji
Nocna napadowa
hemoglobinuria
(MIM 311770)
Nabyte zaburzenie biosyntezy GPI3,
czynnika przyspieszającego zamiera¬
nie (DAF) i CD59
Choroba wtrętów
komórkowych
(choroba komórek I)
(MIM 252500)
Niedobór fosfotransferazy GIcNAc po¬
wodujący zaburzoną adresację niektó¬
rych enzymów lizosomalnych
1 Numer MIM (Mendelian Inheritance in Man) dla CDGS typu I to
212065.
2 Dziedziczna erytroblastyczna wielojądrzastość z dodatnim wy¬
nikiem testu lizy erytrocytów w zakwaszonej surowicy (wrodzo¬
na niedokrwistość dyserytropoetyczna typu II). Jest to postać
względnie łagodnej niedokrwistości. Wskazuje ona, przynajmniej
częściowo, na występowanie w błonie komórkowej krwinek
czerwonych różnych glikoprotein z nieprawidłowymi łańcuchami
A/-glikanowymi, co upodatnia krwinki na liżę.
3 Glikozylofosfatydyloinozytol.
Wrodzone choroby uwarunkowane zabu¬
rzoną glikozylacją (ang. congenital disorders of
glycosylation, CDG) stanowią dużą grupę cho¬
rób, budzącą współcześnie duże zainteresowanie.
Główne cechy tych chorób zestawiono w tabeli
46-16.
Upośledzenie przylegania krwinek białych
II (ang. leukocyte adhesion deficiency II, LAD)
jest rzadką chorobą wywołaną prawdopodobnie
mutacją wpływającą na aktywność transporte¬
ra GDP-fukozy w aparacie Golgiego. Choroba
może być uważana za wrodzony defekt glikozy-
lacji. Brak zawierających fukozę ligandów dla
selektyn znacznie ogranicza toczenie się granu-
locytów obojętnochłonnych po ścianie śródbłon-
650 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
ka. Chorzy cierpią na powtarzające się, zagraża¬
jące życiu zakażenia bakteryjne oraz upośledze¬
nie umysłowe i psychomotoryczne. Wydaje się,
że pomocne jest doustne podawanie fukozy.
Tabela 46-16. Główne cechy wrodzonych chorób wynikłych
z nieprawidłowej glikozylacji
• Dziedziczą się jako cechy autosomalne recesywne.
• Dotyczą wielu układów, prawdopodobnie nie były rozpozna¬
wane w przeszłości.
• Najczęściej dotyczą ośrodkowego układu nerwowego, powo¬
dując opóźnienie psychoruchowe i inne zmiany.
• Typ I chorób jest wywołany mutacjami genów kodujących en¬
zymy (np. fosfomannomutazę-2 [PMM2], wywołującą CDG-
-la), biorące udział w syntezie oligosacharydów-P-P-dolichol.
• Typ II chorób jest wywołany mutacjami genów kodujących
enzymy (np. GIcNAc transferazę-2, wywołującą CDG-Ila), bio¬
rącymi udział w przekształceniach łańcuchów A/-glikanów.
• Zostało opisanych ok. 11 odrębnych chorób.
• Ogniskowanie izoelektryczne transferryny jest przydatnym
testem biochemicznym w ustaleniu rozpoznania tych chorób,
zmiany rdzenia łańcuchów oligosacharydowych tego białka
zmieniają wynik ogniskowania izoelektrycznego.
• Doustne podawanie mannozy jest stosowane w terapii CDG-
-la.
CDG - wrodzona choroba spowodowana nieprawidłową glikozy-
lacją (ang. congenital disorder of glycosylation).
Wrodzona wielojądrzastość erytroblastycz-
na z dodatnim testem lizy erytrocytów wywo¬
łanej kwaśnym środowiskiem (ang. hereditary
erythroblastic multinuclearity with a positive aci-
dified lysis test, HEMPAS) jest wrodzoną niedo¬
krwistością dyserytropoetyczną typu II - inną cho¬
robą wywołaną nieprawidłowym przekształceniem
A-glikanów. Uważa się, że w niektórych przypad¬
kach jest ona wynikiem braku a-mannozydazy II.
Napadowa nocna hemoglobinuria jest naby¬
tą łagodną niedokrwistością, cechującą się wy¬
stępowaniem hemoglobiny w moczu w wyniku
hemolizy erytrocytów, szczególnie podczas snu.
Hemoglobinuria podczas snu jest wynikiem lek¬
kiego wówczas zmniejszenia pH, co zwiększa
wrażliwość erytrocytów na liżę wywołaną przez
układ dopełniacza (rozdz. 49). Podstawową wadą
u chorych na napadową hemoglobinurię jest na¬
byta somatyczna mutacja genu PIG-A (kodu¬
jącego glikan fosfatydyloinozytolowy klasy A)
w niektórych komórkach hemopoetycznych. Pro¬
duktem tego genu jest prawdopodobnie enzym,
który łączy glukozoaminę z fosfatydyloinozyto-
lem w cząsteczce GPI (p. ryc. 46-1). Dochodzi
więc do niedoboru białek w błonie erytrocytów,
ponieważ uległy one „zakotwiczeniu” wskutek
wiązania z GPI. Szczególne zainteresowanie bu¬
dzą białka: czynnik przyspieszający zamieranie
(ang. decay accelerating factor, DAF) i białko
oznaczone jako CD59. W warunkach prawidło¬
wych oddziałują one z niektórymi składnikami
układu dopełniacza (rozdz. 49) i zapobiegają jego
hemolitycznemu działaniu. Przy ich niedoborze
układ dopełniacza może oddziaływać hemolitycz-
nie na erytrocyt. Napadowa nocna hemoglobinuria
może być rozpoznana względnie prosto, ponieważ
erytrocyty chorych znacznie łatwiej ulegają hemo-
lizie zawieszone w prawidłowej surowicy zakwa¬
szonej do pH 6,2 (próba Hama). W tych warunkach
ulega aktywacji układ dopełniacza, co jednak nie
wpływa na prawidłowe erytrocyty. Stosuje się róż¬
ne sposoby lecznicze (przetoczenia krwi, glikokor-
tykosteroidy, ewentualnie przeszczep szpiku kost¬
nego). Na rycinie 46-13 przedstawiono etiologię
napadowej nocnej hemoglobinurii.
Ryc. 46-13. Schemat powstawania napadowej nocnej hemoglo¬
binurii (MIM 311770).
Badania nad wrodzonymi dystrofiami miꜬ
niowymi (ang. congenital muscular dystrophy,
CMD) wykazały, że niektóre z nich (np. zespół
Walkera i Warburga, choroba „mięśnie-oko-mózg”,
wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy) są
wynikiem defektu syntezy glikanów w białku
a-dystroglikanie (a-DG). Białko to odsłania się na
powierzchni błony komórek mięśniowych i od¬
działuje z lamininą-2 (merozyną) znajdującą się
w błonie podstawnej (p. ryc. 48-12). Jeżeli glika-
46. GLIKOPROTEINY 651
ny a-DG nie są prawidłowo zbudowane (w wyni¬
ku mutacji genów kodujących niektóre glikozylo-
transferazy), dochodzi do upośledzenia oddziały¬
wania a-DG z lamininą, co następnie prowadzi do
rozwoju wrodzonej dystrofii mięśniowej.
Reumatoidalne zapalenie stawów wiąże się ze
zmianami glikozylacji cząsteczek krążącej immu-
noglobuliny G (IgG) (rozdz. 49), takimi jak brak
galaktozy w regionie Fc i zakończenie łańcucha
węglowodanowego na GlcNAc. Białko wiążące
mannozę (ang. mannose-binding protein, MBP,
nie mylić z receptorem G-P mannozy) jest C-
-lektyną wytwarzaną przez komórki wątrobowe
i wydzielaną do krążenia, która wiąże mannozę,
GlcNAc i niektóre inne cukry. Może więc wiązać
pozbawione galaktozy cząsteczki IgG. Proces ten
następnie aktywuje układ dopełniacza, uczestni¬
cząc w rozwoju przewlekłego zapalenia błony
maziowej stawów.
MBP także wiąże wymienione cukry, kiedy
znajdują się one na powierzchni bakterii, grzybów
i wirusów, przygotowując wymienione patogeny
do opsonizacji lub zniszczenia przez układ dopeł¬
niacza. Jest to przykład odporności nieswoistej,
zachodzącej bez udziału immunoglobulin. Niedo¬
bór MBP u wcześniaków będący wynikiem mu¬
tacji, sprawia, że występują u nich nawracające
zakażenia.
Choroba wtrętów komórkowych
(ang. l-cell disease) jest wynikiem
niemożności umieszczenia enzymów
lizosomalnych w lizosomach
Jak to już wcześniej wyjaśniono, Man-6-P jest
chemicznym markerem naprowadzającym enzy¬
my lizosomalne do lizosomów. Badania hodowli
fibroblastów pochodzących od pacjentów, u któ¬
rych rozpoznano chorobę wtrętów komórkowych
(ang. I-cell disease), wykazały istotną rolę tego
markera w tym procesie chorobowym. Choroba
wtrętów komórkowych jest rzadkim schorzeniem,
cechującym się ciężkim, postępującym niedoroz¬
wojem psychoruchowym i różnymi objawami fi¬
zykalnymi; zgon następuje często w pierwszej de¬
kadzie życia. Okazało się, że fibroblasty zmienione
chorobowo mają małe stężenie prawie wszystkich
enzymów lizosomalnych, a lizosomy gromadzą
duże ilości różnych nierozłożonych makrocząste¬
czek. Jednak w surowicy chorych stwierdza się
znacznie zwiększone stężenie tych enzymów, co
sugeruje, że enzymy lizosomalne są syntetyzowa¬
ne, ale nie mogą się dostać do wewnątrzkomórko¬
wych miejsc przeznaczenia. Dodanie do hodowli
fibroblastów pochodzących od chorych enzymów
lizosomalnych otrzymanych od zdrowych osób
wykazało, że komórki mają zdolność wychwyty¬
wania egzogennych enzymów lizosomalnych, co
dowodzi, że mają na swojej powierzchni recepto¬
ry dla enzymów lizosomalnych. Badania te suge¬
rują, że enzymy lizosomalne chorych z chorobą
wtrętów komórkowych najprawdopodobniej nie
mają markera rozpoznającego, przez co ulegają
wydzielaniu, a nie gromadzeniu w lizosomach.
Dalsze badania wykazały, że enzymy lizosomalne
osób zdrowych mają rozpoznawczy, opisany wy¬
żej marker Man-6-P, który oddziałuje ze swoistym
białkiem receptorowym wewnątrzkomórkowym.
Komórki chorych hodowane in vitro wykazują
niedobór aktywności fosfotransferazy GlcNAc
umiejscowionej w aparacie Golgiego cis, co tłu¬
maczy niemożność wbudowania markera Man-6-
-P do enzymów lizosomalnych. Obecnie wiado¬
mo, że są dwa białka receptorowe dla Man-6-P.
Jedno z nich ma dużą masę cząsteczkową (275
kDa), a drugie małą (46 kDa). Białka te są lekty-
nami oddziałującymi swoiście z Man-6-P. Białko
o dużej masie cząsteczkowej jest niezależne od
kationów i wiąże także IGF-II (jest więc nazywa¬
ne receptorem Man-6-P-IGF-II), natomiast drugie
białko receptorowe zależy od kationów i nie wią¬
że IGF-II. Uważa się, że oba białka receptorowe
uczestniczą w wewnątrzkomórkowym segrego¬
waniu enzymów lizosomalnych do pęcherzyków
powleczonych klatryną, co zachodzi w aparacie
Golgiego trans zaraz po przyłączeniu Man-6-P
w aparacie Golgiego cis. Pęcherzyki z enzymami
opuszczają następnie aparat Golgiego i zlewająsię
z obszarem prelizosomalnym. Dzięki małemu pH
w tym obszarze enzymy lizosomalne odrywają się
od ich receptorów, a następnie przemieszczają się
do lizosomów. Receptory są używane powtórnie,
ulegając recyrkulacji. Receptor o małej masie czą¬
steczkowej bierze również udział w endocytozie
zewnątrzkomórkowych enzymów lizosomalnych,
która stanowi mniej istotny szlak przemieszcza¬
nia enzymów. Nie wszystkie komórki używają
receptora Man-6-P do nakierunkowania enzymów
do lizosomów (np. komórki wątrobowe używają
innego, niepoznanego jeszcze szlaku); co więcej,
652 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
nie wszystkie enzymy lizosomalne są przemiesz¬
czane w ten sposób. Te badania biochemiczne nie
tylko wyjaśniły patogenezę opisywanej choroby,
lecz także przyczyniły się do poszerzenia wiedzy
na temat transportu nowo syntetyzowanych białek
do specyficznych organelli, w tym przypadku do
lizosomów. Na rycinie 46-14 przedstawiono przy¬
czyny choroby wtrętów komórkowych.
Ryc. 46-14. Patogeneza przyczyn choroby wtrętów komórko¬
wych (MIM 252500).
Polidystrofia rzekoma Hurler jest inną, gene¬
tycznie uwarunkowaną chorobą, ściśle związaną
z chorobą ciałek wtrętowych. Jest schorzeniem
łagodnym i wielu chorych może dożyć wieku
dorosłego. Badania sugerują, że fosfotransferaza
GlcNAc uczestnicząca w patogenezie choroby cia¬
łek wtrętowych ma różne domeny, w tym domenę
katalityczną oraz domenę swoiście rozpoznającą
i oddziałującą z enzymami lizosomalnymi. Przy¬
puszcza się, że u chorych na polidystrofię rzekomą
Hurler defekt dotyczy tej ostatniej domeny oraz że
zachowanie pewnej aktywności katalitycznej enzy¬
mu warunkuje łagodniejszy przebieg choroby.
Genetycznie uwarunkowany
niedobór hydrolaz lizosomalnych
glikoprotein powoduje choroby,
takie jak a-mannozydoza
Glikoproteiny, podobnie jak większość innych czą¬
steczek organizmu, ulegają przemianie, tj. zarówno
syntezie, jak i rozpadowi. W rozkładzie łańcuchów
oligosacharydowych glikoprotein uczestniczy
zespół hydrolaz lizosomalnych, w tym a-neura-
minidaza, P-galaktozydaza, P-heksozoaminidaza,
a- i P-mannozydazy, a-A-acetylogalaktozoami-
nidaza, a-fukozydaza, endo-|3-/V-acetyloglukozo-
aminidaza i aspartyloglukozoaminidaza. Miej¬
sce działania dwóch ostatnich z wymienionych
enzymów jest wykazane w opisie ryc. 46-5. Ge¬
netycznie uwarunkowane niedobory aktywności
tych enzymów mogą występować i prowadzić do
upośledzonego rozkładu glikoprotein. Nagroma¬
dzenie w tkankach nieprawidłowo rozkładanych
glikoprotein może być powodem wielu chorób.
Do najlepiej poznanych chorób z tej grupy należą:
mannozydoza, fukozydoza, sialidoza, asparty-
loglikozoaminuria i choroba Schindlera. Są one
wynikiem niedoboru odpowiednio: a-mannozy-
dazy, a-fukozydazy, a-neuraminidazy, asparty-
loglukozoaminidazy i A-acetylogalaktozoamini-
dazy. Choroby są względnie rzadkie i mają różne
objawy; niektóre z nich zestawiono w tab. 46-17.
Tabela 46-17. Główne cechy niektórych chorób wynikłych
z niedoboru hydrolaz glikoproteinowych (np. a-mannozydozy,
P-mannozydozy, fukozydozy, sialidozy, aspartyloglikozoaminurii
i choroby Schindlera)1
• Zwykle występuje upośledzenie umysłowe lub inne zaburzenia
neurologiczne oraz pogrubienie rysów twarzy lub powiększe¬
nie narządów wewnętrznych (lub obie te zmiany).
• Różne nasilenie choroby - od postaci łagodnej do szybko po¬
stępującej.
• Dziedziczą się w sposób autosomalny recesywny.
• Mogą występować częściej w pewnych grupach etnicznych
(np. aspartyloglikozoaminuria często występuje w Finlandii).
• Mikroskopowo stwierdza się wakuolizację komórek w niektó¬
rych chorobach.
• W moczu występują nieprawidłowe produkty rozpadu (np.
oligosacharydy, które się gromadzą z powodu niedoboru
enzymów) wykrywane za pomocą chromatografii cienkowar¬
stwowej i dające się określić za pomocą chromatografii gazo-
wo-cieczowej i spektrometrii mas.
• Ostateczne rozpoznanie opiera się na oznaczaniu aktywności
właściwego enzymu, zwykle używane są do tego krwinki bia¬
łe.
• Możliwa diagnostyka prenatalna polegająca na oznaczaniu od¬
powiednich enzymów.
• Obecnie nieznane jest skuteczne leczenie.
1 Numery MIM (Mendelian Inheritance in Man): a-mannozydoza
248500, p-mannozydoza 248510, fruktozydoza 230000, sialido¬
za 256550, aspartyloglikozoaminuria 208400, choroba Schindle¬
ra 104170.
46. GLIKOPROTEINY 653
Fakt, że wszyscy chorzy na te choroby mają ob¬
jawy wskazujące na uszkodzenie ośrodkowego
układu nerwowego, oznacza ważną rolę gliko-
protein w rozwoju i prawidłowej czynności tego
układu.
WIELE GLIKANÓW WIĄŻE
WIRUSY I BAKTERIE
Główną cechą glikanów wyjaśniającą ich funk¬
cje biologiczne jest zdolność swoistego wiązania
| różnych cząsteczek, takich jak białka lub inne gli-
| kany. Wyrazem tej właściwości jest zdolność wią-
I zania przez glikany niektórych wirusów i licznych
j bakterii.
Wirus grypy A wiąże się z receptorem wy¬
stępującym na powierzchni komórek, którego
cząsteczki zawierają NeuAc i są białkiem nazy¬
wanym hemaglutininą. Wirus zawiera także neu-
ramidazę, dzięki której nowo zsyntetyzowane
potomne wirusy mogą oderwać się od zakażonej
komórki. Jeżeli proces ten ulega zahamowaniu,
rozprzestrzenianie się jest znacząco zmniejszone.
Inhibitory tego enzymu (np. zanamivir, oseltami-
vir) stanowią obecnie leki stosowane u chorych
na grypę.
HIV-1 jest uważany przez większość badaczy
za przyczynę zespołu nabytego niedoboru odpor¬
ności (AIDS), przyczepia się do komórki przez
jedną z jej glikoprotein powierzchniowych (gp
1 120) i za pomocą innej glikoproteiny powierzch¬
niowej (gp 41) zlewa się z błoną komórki gospo¬
darza.
Helicobacter pylori jest uważany za główną
przyczynę owrzodzeń żołądka. Badania wykaza¬
ły, że bakteria ta wiąże się z co najmniej dwoma
różnymi glikanami występującymi na powierzchni
komórek nabłonkowych w żołądku (p. ryc. 46-15).
To pozwala bakteriom na trwałe umiejscowienie
się na komórkach wyścielających żołądek. Bakte¬
rie, wydzielając amoniak i inne związki, są uważa¬
ne za czynnik zapoczątkowujący owrzodzenie.
Podobnie bakterie wywołujące biegunkę przy-
, łączają się do powierzchni komórek jelita za po¬
średnictwem glikanów znajdujących się w gliko-
proteinach lub glikolipidach.
Podstawową przyczyną mukowiscydozy (ang.
cystic fibrosis, CF) są mutacje genu kodującego
1 CFTR (p. rozdz. 40). Głównym problemem tej
choroby są nawracające zakażenia płuc wywołane
przez bakterie takie, jak Pseudomonas aeruginosa.
U chorych dochodzi do względnego odwodnienia
wydzieliny drzewa oskrzelowego, w następstwie
zachodzących tam zmian składu elektrolitów wy¬
nikłych z mutacji CFTR. Bakterie, takie jak P
aeruginosa, przyłączają się do łańcuchów węglo¬
wodanowych mucyny, a odwodnione środowisko,
jakie występuje w oskrzelikach, sprzyja namnaża-
niu się bakterii.
Ryc. 46-15. Przyłączanie bakterii Helicobacter pylori do komó¬
rek nabłonka żołądka. Adhezyna - białko występujące w witce
H. pylori, oddziałuje z dwoma różnymi glikanami (budowa po¬
dana niżej) występującymi w glikoproteinach znajdujących się
na powierzchni żołądkowych komórek nabłonkowych. To stano¬
wi miejsce przyczepu bakterii, które następnie wydzielają takie
cząsteczki, jak amoniak, co zapoczątkowuje rozwój owrzodzenia
żołądka. (A) NeuAca2,3Galpl ,4-białko (neuraminylo-galakto-
za); (B) Fuca1,2Galp1,3GlcNAc-białko (substancja Lewis6) (wg
Murray RK: Glycoproteins: Crucial molecules in many diseases.
Glycoscience Nutrition 2003;4 (8):3).
GLIKOMIKA DOSTARCZA NOWYCH
PRZYKŁADÓW ZNACZENIA GLIKOPROTEIN
W PROCESACH BIOLOGICZNYCH
Ostatnie badania wykazały znaczenie glikoprote¬
in w różnych zjawiskach biologicznych. Poniżej
podano tylko trzy przykłady.
Glikoproteina Notch jest białkiem zawierają¬
cym fukozę przyłączoną wiązaniem O do reszt se-
ryny i treoniny. Białko to odgrywa kluczową rolę
w procesach rozwoju.
654 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Przetaczanie płytek krwi jest często istotne
w niektórych sytuacjach klinicznych. Niestety,
okres życia płytek w krążeniu po uprzednim po¬
braniu, oziębieniu i przetoczeniu jest skrócony.
Wykazano, że jest to wynikiem nagromadzenia
się na powierzchni płytek zespołu receptorów
dla czynnika von Willebranda, co prowadzi do
szybkiego usuwania z krążenia przetoczonych
płytek. Enzymatyczna glikozylacja oziębionych
płytek zapobiega nagromadzeniu się kompleksu
receptorowego i tym samym przedłuża okres ży¬
cia płytek.
Świnia jest zwierzęciem przydatnym jako źród¬
ło narządów (np. serce) do przeszczepu dla ludzi
(ksenotransplantacja). Niestety, występowanie
reszt galaktozy —► 1,3-galaktozy na powierzchni
komórek świni jest główną przeszkodą do wy¬
konywania ksenotransplantacji. Na powierzchni
komórek ludzkich nie ma takiego epitopu, od¬
powiedzią jest zatem wytwarzanie przeciwciał
przeciwko niemu. Prowadzone są próby z uży¬
ciem technik genetycznych wyhodowania świni
pozbawionej a-l,3-galaktozotransferazy, która
odpowiada za wytworzenie tego epitopu (tzw.
a-1,3-galaktozyltransferase knock out pigs).
Badania w zakresie glikomiki postępują zna¬
cząco szybko. W przeszłości badania hamowała
niedostępność technik pozwalających na określe¬
nie budowy glikanów. Obecnie są one już znane
(p. tab. 46-3). Rozwój nowych technik badaw¬
czych (np. techniki knock-out i knock-down
z zastosowaniem cząsteczek RNAi) w wielu dzie¬
dzinach omawianych badań pozwoli na odkrycie
wielu ważnych biologicznie oddziaływań zależ¬
nych od cukrów i wskaże cele dla działania leków
lub dla innych rodzajów terapii.
STRESZCZENIE
• Glikoproteiny są białkami powszechnie wystę¬
pującymi i pełniącymi różne funkcje. Zawierają
one jeden lub kilka łańcuchów oligosacharydo-
wych wbudowanych kowalencyjnie.
• Składowa węglowodanowa glikoprotein stano¬
wi 1-85% ich masy i może mieć budowę prostą
lub złożoną.
• Przynajmniej niektóre łańcuchy oligosachary-
dowe glikoprotein kodują informację biologicz¬
ną. Występowanie łańcuchów oligosacharydo-
wych jest niezwykle istotne dla rozpuszczal¬
ności i lepkości glikoprotein, chroni je przed
proteolizą i zapewnia aktywność biologiczną
glikoprotein.
• Budowę wielu łańcuchów oligosacharydowych
poznano dzięki chromatografii gaz-ciecz, spek¬
trometrii mas i wysokorozdzielczej spektrome¬
trii rezonansu magnetyczno-jądrowego.
• Glikozydazy hydrolizują swoiście wiązania
w łańcuchach oligosacharydowych i dzięki
temu mogą być używane do badania budowy
i czynności glikoprotein.
• Lektyny są białkami wiążącymi węglowodany,
odpowiedzialnymi za przyleganie komórek i za
wiele innych procesów biologicznych.
• Głównymi klasami glikoprotein są: 0-wiązane
(przez grupę OH seryny lub treoniny), A-wiąza-
ne (przez atom N grupy aminowej asparaginia-
nu) i wiązane przez glikozylofosfatydyloinozy-
tol (GPI).
• Mucyny są glikoproteinami O-wiązanymi, któ¬
re występują na powierzchni komórek nabłon¬
kowych dróg oddechowych, przewodu pokar¬
mowego i dróg rodnych.
• Siateczka endoplazmatyczna i aparat Golgiego
odgrywają główną rolę w reakcjach glikozylacji
występujących w biosyntezie glikoprotein.
• Oligosacharydy O-wiązanych glikoprotein są
syntetyzowane przez stopniowe dobudowywa-
nie cukrów dostarczanych przez nukleotydy cu¬
krowe w reakcjach katalizowanych przez swoi¬
ste glikozylotransferazy glikoproteinowe.
• W przeciwieństwie do powyższego, w biosyn¬
tezie A-związanych glikoprotein uczestniczą
swoiste oligosacharydy P-P-dolicholowe i róż¬
ne glikozydazy. W zależności od rodzaju gliko-
zydaz i białek prekursorowych wytwarzanych
w tkance, mogą one być syntetyzowane jako
złożone, hybrydowe lub bogate w mannozę oli¬
gosacharydy typu A-z wiązanego.
• Glikoproteiny biorą udział w wielu procesach
biologicznych. Wykazano na przykład ich klu¬
czową rolę w procesie zapłodnienia i zapale¬
nia.
• Wiele chorób łączy się z nieprawidłowościa¬
mi syntezy i rozpadu glikoprotein. Glikopro¬
teiny także biorą udział w rozwoju innych
chorób, w tym grypy, nabytego niedoboru od¬
porności (AIDS) i reumatoidalnego zapalenia
stawów.
• Rozwój nowych obszarów glikomiki prawdo-
46. GLIKOPROTEINY 655
podobnie dostarczy wielu nowych danych o roli
cukrowców w stanach zdrowia i choroby oraz
wskaże cele działania leków lub innych metod
terapeutycznych.
PIŚMIENNICTWO
Brockhausen 1, Kuhns W: Glycoproteins and Humań
Disease. Chapman & Hall, 1997.
Helenius A, Aebi M: Roles of N-linked glycans in the
endoplasmic reticulum. Ann Rev Biochem 2004;
73:1019.
Hoffmeister KM et al: Glycosylation restores survival of
chilled blood platelets. Science 2003;301:1531.
Komfeld R, Komfeld S: Assembly of asparagine-linked
oligosaccharides. Ann Rev Biochem 1985;54:631.
Lowe JB, Marth JD: A genetic approach to mammalian
glycan function. Ann Rev Biochem 2003;72:643.
Michele DE, Campbell KP: Dystrophin-glycoproteins
complex: post-translational processing and dystro-
glycan function. J Biol Chem 2003;278:15457.
Ramasamy R et al: Advanced glycation end products
and RAGĘ: a common thread in aging, diabetes,
neurodegeneration, and inflammation. Glycobiolo-
gy 2005; 15:16R.
Roseman S: Reflections on glycobiology. J Biol Chem
2001 ;276:41527.
Schachter H: The clinical relevance of glycobiology.
JClin Invest 2001; 108:1579.
Science 2001 ;21 (5512):2263. (This issue contains a spe-
cial section entitled Carbohydrates and Glycobio¬
logy. It contains articles on the synthesis, structural
determination, and functions of sugar-containing
molecules and the roles of glycosylation in the im-
mune system.)
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001. (Various chapters in this text give in-depth
coverage of topics such as I-cell disease and disor-
ders of glycoprotein degradation.)
Sharon N, Lis H: History of lectins: from hemaggluti-
nins to biological recognition molecules. Glycobio¬
logy 2004;14:53R.
Spiro RG: Protein glycosylation: naturę, distribution,
enzymatic formation, and disease implications of
glycopeptide bonds. Glycobiology 2002;12:43R.
Taylor ME, Drickamer K: Introduction to Glycobiology.
Oxford University Press, 2003.
Varki A et al (editors): Essentials of Glycobiology. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Winchester B: Lysosomal metabolism of glycoproteins.
Glycobiology 2005; 15:IR.
Substancja pozakomórkowa
Robert K. Murray, MD, PhD; Frederick W. Keeley PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Większość komórek ssaków jest umiejscowiona
w tkankach, gdzie są one otoczone przez złożo¬
ną substancję pozakomórkową, często określa¬
ną jako „tkanka łączna”. Substancja ta zawie¬
ra trzy główne grupy cząsteczek biologicznych:
1) białka strukturalne: kolagen, elastynę i fibryli-
nę; 2) niektóre białka swoiste, takie jak fibrylina,
fibronektyna i laminina; 3) proteoglikany, któ¬
rych budowę chemiczną opisano w dalszej części.
Substancja pozakomórkowa uczestniczy w wielu
procesach fizjologicznych i patologicznych, np.
odgrywa ważną rolę w rozwoju, stanach zapalnych
i rozprzestrzenianiu się komórek rakowych. Wy¬
kazano udział niektórych składników substancji
pozakomórkowej w reumatoidalnym zapaleniu
stawów oraz chorobie zwyrodnieniowej stawów.
Wiele chorób (np. wrodzona łamliwość kości - os-
teogenesis imperfecta i różne typy zespołu Ehler-
sa i Danlosa) jest wynikiem genetycznie uwarun¬
kowanych zaburzeń syntezy kolagenu. W grupie
chorób uwarunkowanych genetycznie, zwanych
mukopolisacharydozami, są zmienione określo¬
ne składniki proteoglikanów (glikozoaminoglika-
ny, GAG). Zmiany w substancji pozakomórkowej
zachodzą w procesie starzenia się. Niniejszy roz¬
dział przedstawia podstawy biochemii wymienio¬
nych trzech grup cząsteczek biologicznych i uka¬
zuje ich znaczenie biologiczno-medyczne. Krótko
opisano również najważniejsze cechy biochemicz¬
ne dwóch wyspecjalizowanych postaci substancji
pozakomórkowej: kości i chrząstki oraz omówiono
choroby, które ich dotyczą.
KOLAGEN JEST NAJBARDZIEJ
ROZPOWSZECHNIONYM BIAŁKIEM
ZWIERZĘCYM
Kolagen, główny składnik większości tkanek łącz¬
nych, stanowi ok. 25% wszystkich białek ssaków.
Tworzy on pozakomórkową strukturę „szkieleto¬
wą” u wszystkich zwierząt wielokomórkowych
i występuje praktycznie w każdej tkance zwierzę¬
cej. Z tkanek ludzkich wyodrębniono ponad 25
typów kolagenu, zbudowanych z ok. 30 różnych
łańcuchów polipeptydowych (kodowanych przez
taką samą liczbę genów kolagenowych). Cho¬
ciaż wiele z nich występuje w małych ilościach,
mogą one odgrywać ważną rolę w kształtowaniu
fizycznych właściwości tkanek. Dodatkowo licz¬
ne białka (np. składnik dopełniacza Clq, białka
surfaktantu płucnego SP-A i SP-D), które nie są
zaliczane do kolagenów, mają domeny przypomi¬
nające strukturalnie kolagen. Białka te określa się
czasami jako „niekolagenowe” kolageny.
W tabeli 47-1 zestawiono typy kolagenu wy¬
kryte w tkankach ludzkich; zastosowane nazew¬
nictwo określa typ kolagenu, a ich geny są wy¬
mienione w przypisie do tabeli.
Dziewiętnaście typów kolagenu wymienio¬
nych w tabeli można podzielić na różne klasy
głównie na podstawie struktury, jaką tworzą
(tab. 47-2). W tym rozdziale skoncentrowano
się przede wszystkim na kolagenach tworzących
włókna, tj. kolagenie typu I i II, czyli głównych
kolagenach skóry, kości i chrząstek. Inne typy
kolagenu są wspomniane w odpowiednich miej¬
scach tekstu.
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 657
Tabela 47-1. Typy kolagenu i ich geny1,2
Typ
Geny
Tkanki
1
C0L1A1, C0L1A2
Większość tkanek, w tym kość
II
C0L2A1
Chrząstka, ciałko szkliste oka
III
C0L3A1
Rozciągliwe tkanki łączne, takie jak
skóra, płuca, układ naczyniowy
IV
C0L4A1-C0L4A6
Błony podstawne
V
C0L5A1-C0L5A3
Drobny składnik towarzyszący
kolagenowi typu I
VI
C0L6A1-C0L6A3
Większość tkanek łącznych
VII
C0L7A1
Włókna kotwiczące
VIII
C0L8A1-C0L8A2
Śródbłonek, inne tkanki
IX
C0L9A1-C0L9A3
Tkanki zawierające kolagen typu II
X
COL10A1
Chrząstka hipertroficzna
XI
C0L11A1,
C0L11A2,
C0L2A1
Tkanki zawierające kolagen typu II
XII
C0L12A1
Tkanki zawierające kolagen typu I
XIII
C0L13A1
Wiele tkanek
XIV
C0L14A1
Tkanki zawierające kolagen typu I
XV
C0L15A1
Wiele tkanek
XVI
C0L16A1
Wiele tkanek
XVII
C0L17A1
Hemidesmosomy skóry
XVIII
C0L18A1
Wiele tkanek (np. wątroba, nerka)
XIX
C0L19A1
Komórki mięsaka z mięśni
poprzecznie prążkowanych
1 Tabela nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana z: Prockop
DJ, Kivirrikko KI: Collagens: Molecular biology, diseases, and po-
tentials for therapy. Annu Rev Biochem 1995;64:403. Copyright
© by Annual Reviews, www.annualreviews.org. Przedrukowano
za zgodą.
2 Typy kolagenu oznacza się cyframi rzymskimi. Wchodzące
w ich skład łańcuchy prokolagenowe, zwane łańcuchami proa,
oznacza się cyframi arabskimi i cyfrą rzymską w nawiasie. Przy¬
kładowo, prokolagen typu I jest połączeniem dwóch łańcuchów
proa 1(1) i jednego łańcucha proa 2(1). Tak więc jest on hete-
rotrymerem, natomiast prokolagen typu II jest homotrymerem
złożonym z trzech jednakowych łańcuchów proal (II). Geny ko¬
dujące kolagen są oznaczane zgodnie z typem kolagenu pisanym
cyfrą arabską, po której pisze się literę A i numer kolejny łańcu¬
cha proa, który koduje określony gen. Tak więc geny C0L1A1
i C0L1A2 kodują łańcuchy a1 i a2, odpowiednio w kolagenie
typu I.
Tabela 47-2. Klasyfikacja kolagenów według podstawowej struk¬
tury, którą tworzą1
Klasa
Typy kolagenu
Tworzące włókna
I, II, III, V, XI
Tworzące układ sieciowy
IV, VIII, X
Kolageny tworzące włókna z przerywaną
strukturą trójhelisową (FACIT)2
IX, XII, XIV, XVI, XIX
„Włókienka koralikowe”
VI
Włókna kotwiczące
VII
Domeny przezbłonowe
XIII, XVII
Inne3
XV, XVIII
1 Tabela z: Prockop DJ, Kivirrikko KI: Collagens: Molecular bio¬
logy, diseases, and potentials for therapy. Annu Rev Biochem
1995;64:403. Copyright © by Annual Reviews, www.annualre-
views.org. Przedrukowano za zgodą.
2 FACIT = fibril-associated collagens with interrupted triple he-
lices.
3 Kolageny typu XV, XVI, XVIII i XIX są niekiedy określane jako
multipleksyny \przyp. tłum.].
KOLAGEN TYPU IMA BUDOWĘ
POTRÓJNEJ HELISY I TWORZY WŁÓKNA
Wszystkie typy kolagenu mają strukturę potrój¬
nej helisy. W niektórych kolagenach cała czą¬
steczka ma budowę potrójnej helisy, natomiast
w innych helisa stanowi jedynie część cząstecz¬
ki. Dojrzały kolagen typu I zawiera ok. 1000
reszt aminokwasowych i w całości ma strukturę
potrójnej helisy. Każdy łańcuch polipeptydowy
(łańcuch a) jest skręcony w lewoskrętną helisę
o skręcie zbudowanym z trzech reszt aminokwa¬
sowych (ryc. 47-1). Trzy takie łańcuchy a skrę¬
cone w prawoskrętną superhelisę tworzą czą¬
steczkę przypominającą trójżyłową linę o średni¬
cy 1,4 nm i długości 300 nm. Uderzającą cechą
kolagenu jest występowanie reszt glicynylowych
na każdym co trzecim miejscu w helikalnej części
łańcuchów a. Wynika to z faktu, że glicyna jest
jedynym aminokwasem tak małym, aby zmieścić
się w ograniczonej przestrzeni w środkowej czę¬
ści rdzenia potrójnej helisy. Powtarzająca się sek¬
wencja (Gly-X-Y)n jest bezwzględnie wymagana
do utworzenia potrójnej helisy. Chociaż w pozy¬
cji X i Y może się znajdować każdy aminokwas,
ok. 100 reszt w pozycji X stanowi prolina i ok.
658 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
67 nm
Łańcuch
a-polipeptydowy
\yJ \yJ \F
Sekwencja
aminokwasowa
-Gly -X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-
Ryc. 47-1. Charakterystyczne cechy budowy kolagenu - od
struktury pierwszorzędowej do włókna. (Rycina nieznacznie
zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Eyre DR: Collagen:
molecular diversity in the body’s protein scaffold. Science 1980,
207,1315. Copyright © by the American Association for the Ad-
vancement of Science).
100 reszt w pozycji Y stanowi hydroksyprolina.
Prolina i hydroksyprolina decydują o sztywności
cząsteczki kolagenu. Hydroksyprolina jest utwo¬
rzona przez potranslacyjną hydroksylację reszt
prolinowych wbudowanych do łańcucha poli-
peptydowego. Proces ten jest katalizowany przez
hydroksylazę prolinową, której kofaktorami są
kwas askorbinowy (witamina C) i a-ketogluta-
ran. Lizyna umieszczona w pozycji Y może także
być potranslacyjnie hydroksylowana do hydro-
ksylizyny w wyniku działania hydroksylazy lizy-
nylowej - enzymu wymagającego podobnych ko-
faktorów. Niektóre reszty hydroksylizyny ulegają
dalszej modyfikacji przez przyłączenie galaktozy
lub galaktozyloglukozy połączonej wiązaniem
O-glikozydowym; glikozylacja taka zachodzi tyl¬
ko w kolagenie.
Typy kolagenu, które tworzą długie włókna
przypominające strukturą liny, ulegają agregacji,
układając się fragmentami o budowie trójhelikal-
nej bok do boku przy przesunięciu o l/4 długości
(ryc. 47-1, górna część). Układ ten odpowiada
za prążkowanie włókien tkanki łącznej. Włókna
kolagenowe ulegają dalszej stabilizacji w wyniku
tworzenia wiązań poprzecznych, zarówno we¬
wnątrz struktur trójhelikalnych, jak i między są¬
siednimi strukturami. Wiązania poprzeczne two¬
rzą się w wyniku działania oksydazy lizynylowej
- enzymu zależnego od miedzi, który oksydatyw-
nie deaminuje grupy s-aminowe w niektórych
resztach lizyny i hydroksylizyny, tworząc wcho¬
dzące w reakcję reszty aldehydowe. Reszty alde¬
hydowe ulegają kondensacji aldolowej z innymi
aldehydowymi pochodnymi lizyny i hydroksyli-
zyny lub tworzą zasady Schiffa z nieutlenionymi
grupami 8-aminowymi nieutlenionych reszt lizyny
i hydroksy lizyny. Reakcja ta po następnych prze¬
kształceniach prowadzi do stabilnych, kowalen-
tnych wiązań poprzecznych, które są ważne dla
wytrzymałości włókien na rozerwanie. Histydyna
może także brać udział w tworzeniu niektórych
wiązań poprzecznych.
Wiele typów kolagenu nie tworzy włókien
w tkankach (p. tab. 47-2). Cechują się one prze¬
rywaną strukturą trójhelikalną ze wstawkami bez
sekwencji Gly-X-Y. Fragmenty niehelikalne mają
budowę globulamą i są wbudowane między frag¬
menty helikalne.
Typ IV kolagenu jest najlepiej poznanym przy¬
kładem kolagenu o nieciągłej strukturze helikalnej,
ważnym składnikiem błon podstawnych, w któ¬
rych tworzy przypominający sito układ siatkowy.
Kolagen podlega rozległym modyfikacjom
potranslacyjnym
Nowo zsyntetyzowany kolagen, zanim stanie się
częścią dojrzałych, pozakomórkowych włókien
kolagenowych, ulega intensywnym modyfika¬
cjom potranslacyjnym (tab. 47-3). Podobnie jak
większość wydzielanych białek, kolagen jest syn¬
tetyzowany w postaci prekursorowej - preproko-
lagenu, który zawiera sekwencję sygnalną, kieru¬
jącą łańcuch polipeptydowy do zbiorników sia¬
teczki śródplazmatycznej. Po przemieszczeniu się
do siateczki śródplazmatycznej peptyd sygnałowy
ulega oderwaniu. W tym samym miejscu komór¬
ki następuje także hydroksylacja reszt prolino¬
wych i lizynowych oraz glikozylacja w cząstecz¬
ce prokolagenu. Cząsteczka prokolagenu zawie¬
ra peptydy ekstensyjne o masie cząsteczkowej
20-35 kDa, umieszczone na aminowym i kar-
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 659
Tabela 47-3. Kolejność i umiejscowienie etapów przekształcania
prekursorów kolagenu tworzących włókna
Etapy wewnątrzkomórkowe
1. Oderwanie peptydu sygnalnego.
2. Hydroksylacja reszt prolinowych umiejscowionych w pozycji
Y i niektórych reszt lizylowych umiejscowionych w pozycji Y;
glikozylacja niektórych reszt hydroksylizyny.
3. Tworzenie międzyłańcuchowych i wewnątrzłańcuchowych
wiązań S-S w peptydach końcowych.
4. Tworzenie potrójnej helisy.
Etapy pozakomórkowe
1. Oderwanie aminokońcowych i karboksykońcowych propepty-
dów.
2. Agregacja włókien kolagenowych z zachowaniem przesunię¬
cia o 1A długości.
3. Oksydacyjna deaminacja grup e-aminowych reszt lizylowych
i hydroksylizylowych do aldehydów.
4. Wytwarzanie śródłańcuchowych i międzyłańcuchowych wią¬
zań poprzecznych przez tworzenie zasad Schiffa i aldolowej
kondensacji ich produktów.
boksylowym końcu, których nie ma w dojrzałym
kolagenie. Obydwa peptydy ekstensyjne zawiera¬
ją reszty cysteinowe. W aminokońcowym pepty-
dzie znajdują się tylko wewnątrzłańcuchowe wią¬
zania disiarczkowe, natomiast w karboksykońco-
wym peptydzie znajdują się wewnątrzłańcuchowe
i międzyłańcuchowe mostki disiarczkowe. Two¬
rzenie wiązań disiarczkowych pomaga w ułoże¬
niu trzech łańcuchów polipeptydowych w struk¬
turę helikalną, a skręcanie zaczyna się od końca
karboksylowego. Utworzenie struktury helikalnej
kończy proces hydroksylacji reszt prolinowych
i lizynowych lub glikozylacji reszt hydroksylizy-
nowych. Nieenzymatyczne utworzenie struktury
trójhelikalnej kolagenu jest podstawową zasadą
biosyntezy kolagenu.
Po wydzieleniu cząsteczki poza obręb komór¬
ki, co następuje z udziałem aparatu Golgiego,
peptydy ekstensyjne ulegają oderwaniu w wyniku
działania enzymów określanych jako aminopro-
teinaza prokolagenowa i karboksypeptydaza
prokolagenowa. Rozpad tych propeptydów może
zachodzić w kryptach lub fałdach błony komór¬
kowej. Po usunięciu propeptydów, trójhelikalne
cząsteczki kolagenu, zawierające ok. 1000 reszt
aminokwasowych w łańcuchu, ulegają sponta¬
nicznej agregacji, prowadzącej do powstania
włókien kolagenowych. Dalsza stabilizacja jest
wynikiem wytworzenia wiązań poprzecznych
wewnątrzłańcuchowych i międzyłańcucho¬
wych, co następuje na skutek działania uprzednio
opisanej oksydazy lizynowej.
Te same komórki, które wytwarzają kolagen,
wydzielają także fibronektynę - glikoproteinę
0 dużej masie cząsteczkowej, występującą na
powierzchni komórek, w substancji pozakomór-
kowej i we krwi (p. dalej). Fibronektyna wiąże
agregujące włókna prokolagenowe i zmienia ki¬
netykę tworzenia włókien w substancji wokółko-
mórkowej. Fibronektynie i prokolagenowi towa¬
rzyszą w substancji wokółkomórkowej proteogli-
kany - siarczan heparanu i siarczan chondroityny
(p. dalej). Kolagen typu IX - występujący w ma¬
łych ilościach w chrząstce, zawiera przyłączone
łańcuchy proteoglikanowe. Oddziaływania takie
mogą uczestniczyć w regulacji tworzenia włókien
1 określać ich przestrzenną orientację w tkankach.
Raz utworzony kolagen jest względnie stabilny
metabolicznie. Jednak jego rozpad zwiększa się
podczas głodowania i w różnych stanach zapal¬
nych. Nadmierne wytwarzanie kolagenu wystę¬
puje w wielu stanach chorobowych, np. w mar¬
skości wątroby.
Wiele chorób dziedzicznych jest
wynikiem nieprawidłowej syntezy
kolagenu
Kolagen jest kodowany przez ok. 30 genów, a jego
szlak biosyntezy jest złożony i obejmuje przynaj¬
mniej 8 katalizowanych przez enzymy modyfika¬
cji potranslacyjnych. Nie jest więc zaskoczeniem,
że wiele chorób (tab. 47-4) jest spowodowanych
mutacjami genów kodujących kolagen lub ge¬
nów kodujących enzymy biorące udział w mo¬
dyfikacjach potranslacyjnych. Te choroby, które
dotyczą kości lub chrząstki są omówione w dal¬
szej części tego rozdziału.
Zespół Ehlersa-Danlosa stanowi grupę dzie¬
dzicznych chorób, których główną cechą klinicz¬
ną jest nadmierna rozciągliwość skóry, nieprawid¬
łowa podatność na urazy (wątłość) tkanek oraz
zwiększona ruchomość stawów. Obraz kliniczny
jest zmienny, co świadczy o różnorodności defek¬
tów genetycznych. Wyróżniono co najmniej dzie¬
sięć typów choroby, większość z nich odzwier¬
ciedla różne defekty biosyntezy kolagenu. Typ IV
zespołu Ehlersa-Danlosa jest najpoważniejszy,
660 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tabela 47-4. Choroby spowodowane mutacjami genów kolageno¬
wych lub niedostateczną aktywnością enzymów biorących udział
w modyfikacjach potranslacyjnych w biosyntezie kolagenu1
Gen lub enzym
Choroba2
C0L1A1,
C0L1A2
Wrodzona łamliwość kości3
(MIM 166200)
Osteoporoza4 (MIM 166710)
Zespół Ehlersa-Danlosa typu VII
dziedziczony autosomalnie
dominująco (MIM 190060)
C0L2A1
Ciężkie chondroplazje
Choroba zwyrodnieniowa stawów4
(MIM 120140)
C0L3A1
Zespół Ehlersa-Danlosa typu IV
(MIM 130050)
C0L4A3-C0L4A6
Zespół Alporta (zarówno postać
dziedzicząca się autosomalnie,
jak i sprzężona z płcią) (MIM 104200)
C0L7A1
Epidermoliza pęcherzowa, postać
dystroficzna (MIM 131750)
COL10A1
Chondrodysplazja przynasadowa
typu Schmida (MIM 156500)
Hydroksylaza lizylowa
Zespół Ehlersa-Danlosa typu VI
(MIM 225400)
A/-Proteinaza
prokolagenowa
Zespół Ehlersa-Danlosa typ VII
dziedziczony autosomalnie
recesywnie (MIM 225410)
Hydroksylaza lizylowa
Zespół Menkesa5 (MIM 309400)
1 Zaadaptowane z: Prockop DJ, Kivirrikko KI: Collagens: Mo-
lecular biology, diseases, and potentials for therapy. Annu Rev
Biochem 1995:64:403. Copyright © by Annual Reviews, www.
annualreviews.org. Przedrukowano za zgodą.
2 Związek patogenetyczny z genami kolagenu wykazano również
w kilku innych chorobach, niewymienionych w tabeli.
3 Poznano co najmniej cztery typy wrodzonej łamliwości ko¬
ści; większość mutacji we wszystkich typach dotyczy genów
C0L1A1\C0L1A2.
4 Obecnie uważa się, że dotyczy to tylko względnie małej liczby
chorych.
5 Wtórnie do niedoboru miedzi (rozdz. 49).
ponieważ u chorych rozwija się podatność na
samoistne pęknięcia tętnic lub jelit, co jest wyni¬
kiem nieprawidłowości kolagenu typu III. Chorzy
z typem VI zespołu Ehlersa-Danlosa, będącego
wynikiem niedoboru hydroksylazy lizynowej,
wykazują znacznie zwiększoną ruchomość sta¬
wów i mają skłonność do pęknięć w obrębie gałki
ocznej. Niedobór aminopeptydazy prokolageno-
wej prowadzi do tworzenia nieprawidłowo cien¬
kich, nieregularnych włókien kolagenowych, co
stanowi podstawę zespołu Ehlersa-Danlosa typu
VIIC, który klinicznie objawia się nadruchomoś-
cią stawów i miękkością skóry.
Zespół Alporta określa liczne dziedziczne cho¬
roby (zarówno dziedziczone w sprzężeniu z płcią,
jak i autosomalnie) dotyczące budowy włókien
kolagenu typu IV - głównego kolagenu tworzą¬
cego błony podstawne kłębuszków nerkowych
(p. omówienie lamininy w dalszej części). U cho¬
rych wykazano też mutacje w genach kodujących
kolagen typu IV. Objawem początkowym jest
krwiomocz, u chorych może się rozwijać niewy¬
dolność nerek. Obrazy w mikroskopie elektrono¬
wym ukazują nieprawidłowości w błonie pod-
stawnej i blaszce gęstej.
W epidermolizie pęcherzowej {epidermolysis
bullosa) skóra pęka i nawet w wyniku małych ura¬
zów tworzą się pęcherze. Postać dystroficzna jest
wynikiem mutacji genu COL7A1, co wpływa na
budowę kolagenu typu VII. Kolagen ten tworzy
delikatne włókna „kotwiczące” blaszkę podstaw-
ną do włókien kolagenowych w skórze właściwej.
W tej postaci choroby dochodzi do znacznego
niedoboru włókien kotwiczących, co prawdopo¬
dobnie odpowiada za tworzenie pęcherzy. Postać
prosta epidermolizy pęcherzowej jest inną od¬
mianą choroby związaną z mutacją genu keratyny
5 (rozdz. 48).
W szkorbucie (gnilcu) zmieniona jest struktura
kolagenu. Choroba jest wynikiem niedoboru kwa¬
su askorbinowego (rozdz. 44) i nie jest chorobą
dziedziczną. Głównymi objawami są krwawienia
z dziąseł, podskórne krwawienia i upośledzone
gojenie ran. Objawy te odzwierciedlają niedosta¬
teczną syntezę kolagenu z powodu niedoboru hy-
droksylaz prolinowej i lizynowej - oba te enzymy
wymagają kwasu askorbinowego jako kofaktora.
ELASTYNA NADAJE SPRĘŻYSTOŚĆ
PŁUCOM, NACZYNIOM KRWIONOŚNYM
IWIEZADŁOM
Elastyna jest białkiem tkanki łącznej, odpo¬
wiedzialnym za zdolność tkanek do rozciągania
i powrotu do uprzedniego kształtu. Nie jest tak
rozpowszechniona jak kolagen, ale występuje
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 661
w dużych ilościach w tkankach, które wymagają
takich właściwości fizycznych, a więc np. w płu¬
cach, dużych tętnicach i niektórych więzadłach
sprężystych. Mniejsze ilości elastyny znajdują
się także w skórze, chrząstce małżowiny usznej
i w innych tkankach. Wydaje się, że w przeci¬
wieństwie do kolagenu występuje tylko jeden ge¬
netyczny typ elastyny, chociaż mogą się ujawnić
pewne zmiany w wyniku zmienionego przekształ¬
cania hnRNA dla elastyny (rozdz. 36). Elastyna
jest syntetyzowana jako rozpuszczalny monomer
o masie cząsteczkowej 70 kDa, nazywany tropo-
elastyną. Niektóre reszty prolinowe w tropoela-
stynie ulegają hydroksylacji do hydroksyproliny
w wyniku działania hydroksylazy prolinowej, ale
hydroksylizyna i glikozylowana hydroksylizyna
nie występują. W przeciwieństwie do kolagenu,
tropoelastyna nie jest syntetyzowana w postaci
prekursorowej z peptydarni końcowymi. Co wię¬
cej, elastyna nie zawiera powtarzającej się sek¬
wencji Gly-X-Y, potrójnej helisy ani składników
węglowodanowych.
Po wydzieleniu poza obręb komórki niektóre
reszty lizynowe tropoelastyny ulegają oksyda-
tywnej deaminacji do aldehydów w wyniku dzia¬
łania oksydazy lizynowej. Te same enzymy biorą
udział w dojrzewaniu kolagenu. Jednak głównym
wiązaniem poprzecznym w elastynie są desmo-
zyny - wynik kondensacji trzech aldehydowych
pochodnych lizyny z niezmienioną resztą lizy¬
no wą. Powstaje w ten sposób czteroskładnikowe
wiązanie poprzeczne występujące tylko w elasty¬
nie. Utworzone wiązania poprzeczne w dojrzałej,
występującej pozakomórkowo elastynie nadająjej
znaczną nierozpuszczalność i stabilność oraz bar¬
dzo długi okres półtrwania. Elastyna zawiera róż¬
ne obszary „sprężynowe”, co sprawia, że białko
po rozciągnięciu powraca do stanu poprzedniego.
W tabeli 47-5 zamieszczono główne różnice
między kolagenem a elastyną.
Delecję genu elastyny (umiejscowionego
w chromosomie 7ql 1—23) wykryto u ok. 90% cho¬
rych z zespołem Williamsa - zaburzeniem rozwo¬
jowym dotyczącym tkanki łącznej i ośrodkowego
układu nerwowego. Mutacje, poprzez wpływ na
syntezę elastyny, prawdopodobnie są przyczyną
nadzastawkowego zwężenia tętnicy głównej
- często stwierdzanej zmiany w tej chorobie. Wiele
chorób skóry (np. twardzina) jest wynikiem gro¬
madzenia elastyny. Fragmentację lub przeciwnie
Tabela 47-5. Najważniejsze różnice między kolagenem i elastyną
Kolagen
Elastyna
1. Wiele różnych typów uwa¬
runkowanych genetycznie
Jeden typ genetyczny
2. Potrójna hel'sa
Brak budowy potrójnej helisy,
„sprężynowa” budowa
umożliwiająca odkształcenia
3. Powtarzająca się
sekwencja (6ly-X-Y)n
Brak powtarzającej się
sekwencji (6ly-X-Y)n
4. Występowanie
hydroksylizyny
Brak hydroksylizyny
5. Występowanie
w cząsteczce sacharydów
Brak sacharydów
w cząsteczce
6. Wewnątrzcząsteczkowe
aldolowe wiązania
poprzeczne
Wewnątrzcząsteczkowe
desmozynowe wiązania
poprzeczne
7. Występowanie peptydów
ekstensyjnych podczas
biosyntezy
Brak peptydów
ekstensyjnych
podczas biosyntezy
- zmniejszenie ilości elastyny stwierdza się w ta¬
kich chorobach, jak: rozedma płuc, rozciągliwość
skóry (cutis laxa) i starzenie się skóry.
ZESPÓŁ MARFANA JEST SPOWODOWANY
MUTACJA GENU FIBRYLINY - BIAŁKA
OBECNEGO W MIKROFIBRYLACH
Zespół Marfana jest dość często spotykaną dzie¬
dziczną chorobą tkanki łącznej. Dziedziczy się
w sposób autosomalny dominujący. Zespół do¬
tyczy oczu (np. powoduje przemieszczanie so¬
czewki - ectopia lentis), układu szkieletowego
(większość chorych to osoby o wysokim wzro¬
ście i długich palcach [arachnodaktylia] i stawach
o nadmiernej ruchomości) oraz układu sercowo-
-naczyniowego (np. osłabienie błony środkowej
tętnicy głównej prowadzące do rozszerzenia od¬
cinka wstępującego tętnicy głównej). Na zespół
ten prawdopodobnie chorował Abraham Lincoln.
Większość przypadków jest spowodowana muta¬
cją genu fibryliny (umiejscowionego na chromo¬
somie 15). U wielu chorych z zespołem Marfana
wykryto mutacje zmiany sensu (missense).
Fibrylina jest dużą glikoproteiną (masa czą¬
steczkowa ok. 350 kDa), strukturalnym składni¬
kiem mikrofibryl o średnicy 10-12 nm, występu-
662 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ryc. 47-2. Przypuszczalna kolejność rozwoju zmian zespołu
Marfana (MIM 154700) prowadzących do wystąpienia głównych
objawów.
jącym w wielu tkankach. Fibrylina jest wydzie¬
lana (w następstwie rozpadu proteolitycznego)
do substancji pozakomórkowej przez fibroblasty
i zostaje wbudowana do nierozpuszczalnych
mikrofibryl, które stanowią „rusztowanie” dla
odkładanej elastyny. Występowanie fibryliny
w tkankach można badać za pomocą metod im-
munohistochemicznych. U chorych z zespołem
Marfana na uwagę zasługuje występowanie fibry¬
liny we włóknach soczewki w pobliżu obwódki
rzęskowej, w okostnej i w połączeniu z włóknami
sprężystymi w tętnicy głównej (i w innych tęt¬
nicach). Umiejscowienie to szczególnie wyjaśnia
przemieszczenie soczewek, arachnodaktylię i ano¬
malie sercowo-naczyniowe stwierdzane u cho¬
rych z tym zespołem. Inne białka występują także
w tych mikrofibrylach i wydaje się, że nieprawid¬
łowości ich dotyczące mogą być przyczyną innych
chorób tkanki łącznej. Inny gen fibryliny znajduje
się na chromosomie 5. Mutacje tego genu łączą
się z wrodzoną przykurczową długopalczastością,
ale nie z zespołem Marfana. Przypuszczalną ko¬
lejność zaburzeń prowadzącą do zespołu Marfana
przedstawiono na ryc. 47-2.
FIBRONEKTYNA JEST WAŻNĄ
GLIK0PR0TEINĄ BIORĄCĄ UDZIAŁ
W PRZYLEGANIU I PRZEMIESZCZANIU
SIĘ KOMÓREK
Fibronektyna jest głównąglikoproteinąsubstancji
pozakomórkowej, występującą także w postaci
rozpuszczalnej w osoczu. Składa się z dwóch iden¬
tycznych podjednostek, każda o masie cząsteczko¬
wej ok. 230 kDa, połączonych dwoma wiązaniami
disiarczkowymi umiejscowionymi blisko ich koń¬
ców karboksylowych. Gen kodujący fibronektynę
jest bardzo duży, zawiera 50 eksonów. RNA wy¬
tworzony w wyniku transkrypcji jest poddawany
intensywnej obróbce i w tkankach stwierdzono aż
20 różnych jego odmian. Fibronektyna zawiera
trzy typy powtarzających się motywów (I, II i III),
które tworzą czynnościowe fragmenty cząstecz¬
ki (jest ich co najmniej siedem). Ich zadaniem jest
wiązanie heparyny (p. niżej) oraz włóknika, ko¬
lagenu, DNA i powierzchni komórek (ryc. 47-3).
Sekwencja aminokwasowa receptora fibronekty-
RGD
Składowa A
Składowa
Składowa A
Składowa B
Składowa B
Składowa B
wiążąca heparynę
Składowa A
wiążąca
■ DNA
wiążąca -
- wiążąca -
- wiążąca
- wiążąca
wiążąca wtóknik
kolagen
komórkę
heparynę
komórkę
wtóknik
Ryc. 47-3. Schemat strukturalno-czynnościowy fibronektyny. Przedstawiono 7 składowych
warunkujących czynności biologiczne; prezentują one 2 grupy składowych: wiążących hepa¬
rynę i komórki oraz wiążących wtóknik. Składowe zbudowane są z trzech motywów struktu¬
ralnych (I, II i III), nieprzedstawionych na rycinie. Podobnie nie ukazano na rycinie, że fibronek¬
tyna jest dimerem, którego części są połączone mostkami disiarczkowymi, umiejscowionymi
w pobliżu końców karboksylowych monomerów. Strzałką wskazano przypuszczalne umiejsco¬
wienie motywu RGD fibronektyny, która oddziałuje z receptorami integryn znajdującymi się na
powierzchni komórek. (Rycina przerysowana z: Yamada KM: Adhesive recognition sequences.
J Biol Chem 1991 ;266:12809. Przedrukowano za zgodą uzyskaną za pośrednictwem Copy¬
right Clearance Center, Inc.).
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 663
ny została określona; białko to należy do klasy in-
tegryn przezbłonowych (rozdz. 50). Integryny są
heterodimerami zawierającymi różne typy łańcu¬
chów polipeptydowych a i p. Fibronektyna zawie¬
ra sekwencję Arg-Gly-Asp (RGD), która wiąże
się z receptorem. Motyw RGD występuje w licz¬
nych białkach substancji pozakomórkowej, które
wiążą się z integrynami obecnymi na powierzchni
komórkowej. Syntetyczne peptydy zawierające
sekwencję RGD hamują wiązanie fibronektyny
do powierzchni komórek. Na rycinie 47-4 przed¬
stawiono oddziaływanie kolagenu, fibronektyny
i lamininy - głównych białek substancji pozako¬
mórkowej - z typową komórką (np. fibroblastem)
substancji pozakomórkowej.
Ryc. 47-4. Schemat oddziaływania komórki za pośrednictwem
różnych receptorów integrynowych dla kolagenu, fibronektyny
i lamininy w substancji pozakomórkowej (szczegółowe podjed-
nostki nie są przedstawione). (Rycina przerysowana z: Yamada
KM: Adhesive recognition sequences. J Biol Chem 1991;266:
12809. Przedrukowano za zgodą uzyskaną za pośrednictwem
Copyright Clearance Center, Inc.).
Receptor fibronektyny oddziałuje pośrednio
z mikrofilamentami aktyny (rozdz. 48) występu¬
jącymi w cytozolu (ryc. 47-5). Biorą w tym udział
liczne białka, zwane białkami przylegania (adhe-
zynami), takie jak talina, winkulina, actin-filament
capping protein („białko czapeczkowe”) i a-akty-
nina. Talina oddziałuje z receptorem i winkuliną,
które z kolei oddziałują z aktyną. Oddziaływa¬
nie fibronektyny z jej receptorem jest jednym ze
sposobów, w jaki zewnętrzne obszary komórki
komunikują się z jej wnętrzem, wpływając na
zachowanie się komórki. Przez oddziaływanie
z receptorem fibronektyna odgrywa istotną rolę
w adhezji komórek do substancji pozakomórko¬
wej. Bierze udział również w przemieszczaniu
się komórek, tworząc miejsca, z którymi wiążą się
— Kolagen
Ryc. 47-5. Schemat oddziaływania fibronektyny z integrynowym
receptorem fibronektyny, umiejscowionym na zewnętrznej błonie
komórek tkanki łącznej, oraz z różnymi białkami oddziałującymi
bezpośrednio lub pośrednio z mikrofilamentami aktyny w cytozo¬
lu. W celu uproszczenia, białka łączące ukazano wspólnie.
komórki, i w ten sposób toruje im drogę przez sub¬
stancję pozakomórkową. Ilość fibronektyny wokół
wielu przekształconych komórek jest znacznie
zmniejszona, co częściowo wyjaśnia ich niewłaści¬
we oddziaływanie z substancją pozakomórkową.
LAMININA JEST GŁÓWNYM BIAŁKOWYM
SKŁADNIKIEM KŁEBUSZKÓW
NERKOWYCH I INNYCH BŁON
PODSTAWNYCH
Błony podstawne są wyspecjalizowaną częścią
substancji pozakomórkowej, która otacza ko¬
mórki nabłonkowe i niektóre inne komórki (np.
komórki mięśniowe); niżej została omówiona
tylko błona podstawna kłębuszków nerkowych.
W strukturze tej błona podstawna oddziela war¬
stwy komórek (komórek śródbłonkowych i ko¬
mórek nabłonkowych), znajdujących się po prze¬
ciwnych stronach błony podstawnej. Wszystkie
te trzy warstwy tworzą błonę kłębuszkową.
664 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Pierwotnymi składnikami błony podstawnej są
trzy białka - laminina, entaktyna i kolagen typu
IV oraz GAG - heparyna lub siarczan hepa-
ranu. Składniki te są wytwarzane w przylegają¬
cych komórkach.
Laminina (masa cząsteczkowa ok. 850 kDa,
długość cząsteczki 70 nm) składa się z trzech
odrębnych, wydłużonych łańcuchów polipepty-
dowych (A, Bj i B2), połączonych w cząsteczkę
o kształcie wydłużonego krzyża. Ma ona miej¬
sca wiążące kolagen typu IV, heparynę i inte-
gryny powierzchni komórek. Kolagen łączy się
z lamininą (zamiast bezpośrednio z powierzch¬
nią komórek), która z kolei oddziałuje z inte-
grynami lub innymi białkami receptorowymi
dla lamininy, w ten sposób przyłączając błonę
podstawnądo komórek. Entaktyna, zwana rów¬
nież nidogenem, jest glikoproteiną zawierającą
motyw RGD. Wiąże się ona z lamininą i jest
głównym czynnikiem łączącym się z komórka¬
mi. Względnie gruba błona podstawna kłębusz-
ków nerkowych odgrywa ważną rolę w filtracji
kłębuszkowej, regulując przechodzenie dużych
cząsteczek (większość białek osoczowych) przez
kłębuszek do kanalików nerkowych. Błona kłę-
buszkowa pozwala małym cząsteczkom, takim
jak inulina (masa cząsteczkowa 5,2 kDa), prze¬
chodzić tak łatwo jak wodzie. Jednak tylko mała
ilość albuminy (masa cząsteczkowa 69 kDa)
- głównego białka osocza, przechodzi przez pra¬
widłowy kłębuszek. Wyjaśniają to dwa fakty:
1) otwory w błonie kłębuszkowej są wystarczają¬
co duże, aby cząsteczki o długości mniejszej niż
8 nm mogły przenikać, 2) albuminy są mniejsze
niż wymiary otworów, ale przed przenikaniem
chroni je ujemny ładunek obecnych w lamini-
nie siarczanów heparanu i niektórych kwaśnych
glikoprotein, zawierających kwasy sialowe. Ła¬
dunki ujemne odpychają albuminy i większość
białek osocza mających ujemny ładunek w wa¬
runkach pH krwi. Prawidłowa budowa kłębusz-
ka może być poważnie zaburzona w niektórych
rodzajach kłębuszkowego zapalenia nerek (np.
wywołanego przez przeciwciała przeciwko róż¬
nym składnikom błony kłębuszkowej). Zmienia
to otwory oraz liczbę i rozmieszczenie ujemnych
ładunków wymienionych wyżej makrocząste¬
czek. Prowadzi to do przechodzenia do moczu
względnie dużych ilości albumin (i wielu innych
białek osocza), co powoduje albuminurię.
PROTEOGLIKANY
I GLIKOZOAMINOGUKANY
Glikozoaminoglikany występujące
w proteoglikanach są zbudowane
z powtarzających się jednostek
disacharydowych
Proteoglikany są białkami złożonymi, zawierają¬
cymi kowalencyjnie przyłączone glikozoamino¬
glikany (GAG). Opisano i nazwano co najmniej
30 proteoglikanów - syndekan, betaglikan, sergli-
kan, perlekan, agrekan, wersikan, dekorin, bigli-
kan i fibromodulinę. Różnią się one między sobą
rozmieszczeniem w tkankach, budową rdzenia
białkowego, przyłączonymi glikozoaminoglika-
nami i funkcją biologiczną. Białka kowalencyjnie
wiążące GAG są nazywane rdzeniami białkowy¬
mi; wyizolowanie tych makrocząsteczek w formie
niezdegradowanej sprawia wiele trudności, ale
wprowadzenie nowoczesnej techniki inżynierii
genetycznej do badań nad proteoglikanami do¬
starcza coraz to ważniejszych informacji na temat
ich struktury. Ilość składnika cukrowego przypa¬
dająca na łańcuch polipeptydowy w proteoglika¬
nach jest znacznie większa niż w glikoproteinach,
sięga aż 95% ich całkowitej masy. Na rycinach
47-6 i 47-7 przedstawiono ogólną budowę jednego
określonego proteoglikanu - agrekan u, głównego
typu proteoglikanu chrząstki. Jest on bardzo dużą
cząsteczką (o masie cząsteczkowej ok. 2 MDa),
a jego struktura przypomina szczotkę do czyszcze¬
nia butelek. Zawiera on długie pasmo kwasu hialu-
ronowego (jednego z GAG), do którego białka łą¬
czące są umocowane w sposób niekowalencyjny.
Z kolei białka łączące wiążą się niekowalencyjnie
z rdzeniem białkowym, z którym łączą się łańcu¬
chy innych GAG (w tym przypadku siarczanu ke-
ratanu i siarczanu chondroityny). Więcej szczegó¬
łów na temat tej makrocząsteczki przedstawiono
przy omawianiu chrząstki (p. niżej).
Znanych jest co najmniej siedem rodzajów gli-
kozoaminoglikanów GAG: kwas hialuronowy,
siarczan chondroityny, siarczan keratanu I i II,
heparyna, siarczan heparanu i siarczan dermata-
nu. GAG są nierozgałęzionymi polisacharydami
złożonymi z powtarzających się jednostek dwu-
sacharydowych, w których jednym ze składników
jest zawsze aminocukier (stąd nazwa GAG),
tj. D-glukozoamina lub D-galaktozoamina, dru-
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 665
wych, w których dochodzi do przebudowy tkanki,
zachodzą jednoczesne zmiany w proteoglikanach.
Nic dziwnego, że związki te są przedmiotem co¬
raz większego zainteresowania.
Kwas
hialuronowy
Białka wiążące
Siarczan keratanu
Siarczan
chondroityny
Rdzeń białkowy
Podjednostki
Ryc. 47-6. Obraz z mikroskopu elektronowego agregatu proteo-
glikanu średniej wielkości, w którym podjednostka (monomer)
proteoglikanu i filamenty rdzenia są znacznie powiększone. (Ry¬
cina reprodukowana za zgodą z: Rosenberg L, Hellman W, Klein-
schmidt AK: Electron microscopic studies of proteoglycan ag-
gregates from bovine articular cartilage; J Biol Chem 1975;250:
1877. Przedrukowano za zgodą uzyskaną za pośrednictwem
Copyright Clearance Center, Inc.).
Ryc. 47-7. Schemat proteoglikanu agrekanu. (Rycina reproduko¬
wana za zgodą z: Lennarz WJ: The Biochemistry of Glycoprote-
ins and Proteoglycans, Plenum Press 1980. Przedrukowano za
uprzejmą zgodą Springer Science and Business Media).
gim zaś (wyjątkiem jest siarczan keratanu) kwas
uronowy, tj. kwas D-glukuronowy (GlcUA) lub
jego 5'-epimer, kwas L-iduronowy (IdUA). Z wy¬
jątkiem kwasu hialuronowego, wszystkie GAG
zawierają grupę siarczanową w postaci albo
O-estrowej, albo A-siarczanowej (jak w hepa¬
rynie i siarczanie heparanu). Kwas hialuronowy
jest także wyjątkiem, ze względu na brak jedno¬
znacznych dowodów na temat kowalencyjne¬
go połączenia z białkiem, co wynika z definicji
proteoglikanów. W przeszłości napotykano wiele
trudności związanych z wyodrębnieniem tych zło¬
żonych makrocząsteczek. Jednakże są one waż¬
nymi składnikami substancji podstawowej tkanki
łącznej, pełniącymi wiele istotnych biologicznych
funkcji; co więcej, w różnych stanach chorobo-
Biosynteza proteoglikanów obejmuje
przyłączenie giikozoaminoglikanów
do rdzenia białkowego, wydłużenie
i zakończenie łańcuchów
A. Przyłączenie do rdzenia białkowego
Znane są trzy typy wiązania między GAG i rdze¬
niem białkowym.
1. O-glikozydowe wiązanie między ksylozą
(Xyl) i seryną (Ser), które występuje tylko w pro¬
teoglikanach. Powstaje ono przez przeniesienie
reszty Xyl z UDP-ksylozy na Ser. Następnie dwie
reszty Gal są dodawane do reszty Xyl, tworząc
charakterystyczny trisacharyd Gal-Gal-Xyl-Ser.
Dalszy wzrost łańcuchów GAG zachodzi na koń¬
cowej reszcie Gal.
666 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
2. 0-glikozydowe wiązanie tworzone między
GalNAc i Ser (Thr), (ryc. 46-1 A) występują¬
ce w siarczanie keratanu II. Powstaje ono dzięki
przeniesieniu GalNAc na Ser (lub Thr), przy czym
UDP-GlcNAc jest dostarczycielem GalNAc.
3. A^-glikozydowe wiązanie między GlcNAc
(A-acetyloglukozoaminą) i azotem amidowym
Asn, które jest charakterystyczne dla ^-wiąza¬
nych glikoprotein (ryc. 46-IB). W syntezie tego
wiązania uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol.
Synteza rdzenia białkowego, jak też powsta¬
wanie niektórych wiązań, zachodzi w siateczce
śródplazmatycznej i tam wytwarzana jest przy¬
najmniej część wiązań. Większość późniejszych
etapów biosyntezy łańcucha GAG i ich modyfika¬
cje następują w aparacie Golgiego.
B. Wydłużanie łańcucha
Do syntezy łańcuchów GAG są wykorzystywa¬
ne odpowiednie cukry nukleotydowe i wysoce
specyficzne glikozylotransferazy, znajdujące się
w aparacie Golgiego. Obowiązuje nadal zasada
„jedno wiązanie - jeden enzym”, podobnie jak
dla pewnych typów wiązań występujących w gli-
koproteinach. Enzymy biorące udział w procesie
wydłużania łańcucha są zdolne do wiernej repro¬
dukcji złożonych GAG.
C. Zakończenie (terminacja) łańcuchowa
Jest ono wynikiem: 1) siarczanowania określo¬
nych pozycji pewnych cukrów, 2) wydłużenia
łańcuchów GAG daleko poza błonami, gdzie za¬
chodzi kataliza.
D. Dalsze modyfikacje
Po utworzeniu łańcuchów GAG zachodzą liczne
chemiczne modyfikacje polegające na wpro¬
wadzeniu grupy siarczanowej do określonej po¬
zycji GalNAc oraz na epimeryzacji reszt GlcUA
do IdUA. Proces siarczanowania, katalizowany
przez odpowiednie sulfotransferazy, przebiega
przy udziale 3 '-fosfoadenozyno-5 '-fosfosiarczanu
(PAPS, aktywny siarczan), będącego nośnikiem
grupy siarczanowej. Sulfotransferazy znajdujące
się w aparacie Golgiego są enzymami wysoce
specyficznymi, katalizującymi siarczanowanie
cukrów w różnych pozycjach (np. przy atomie
węgla w pozycji 2, 3, 4 i 6). Epimeryzację reszt
kwasu glukuronowego do iduronowego katalizują
epimerazy.
Poszczególne rodzaje
glikozoaminoglikanów wykazują
subtelne różnice w strukturze oraz
charakterystyczne rozmieszczenie
Siedem wymienionych wyżej GAG różni się mię¬
dzy sobą następującymi właściwościami: składem
aminocukrowym, występowaniem kwasu glu¬
kuronowego lub iduronowego, typem wiązania
między składnikami jednostek disacharydowych,
długością łańcucha, występowaniem lub nie grup
siarczanowych, składem aminokwasowym rdzeni
białkowych, typem wiązania między rdzeniem
białkowym i GAG, rozmieszczeniem w poszcze¬
gólnych tkankach i strukturach subkomórkowych
oraz funkcjami biologicznymi.
Poniżej omówiono krótko strukturę GAG (ryc.
47-8), ich połączenia z rdzeniem białkowym lub
innymi białkami oraz ich rozmieszczenie w tkan¬
kach. Charakterystyczne właściwości tych sied¬
miu GAG wymieniono w tab. 47-6.
A. Kwas hialuronowy
Kwas hialuronowy jest nierozgałęzionym łańcu¬
chem polisacharydowym, złożonym z powtarza¬
jących się jednostek disacharydowych, zawie¬
rających GlcUA i GlcNAc. Występuje on w ko¬
mórkach bakteryjnych, jak również powszechnie
w różnych tkankach zwierzęcych i ludzkich (np.
w płynie stawowym, ciałku szklistym oka i w luź¬
nej tkance łącznej).
B. Siarczany chondroityny (4-siarczan chondroityny
i 6-siarczan chondroityny)
Proteoglikany powstałe w wyniku 0-glikozydo-
wego wiązania Xyl-Ser-0- z siarczanem chon¬
droityny są głównymi składnikami chrząstki
(p. niżej). Jednostki disacharydowe siarczanu
chondroityny i kwasu hialuronowego są bardzo
podobne, zawierają GlcUA, z tąjednak różnicą, że
siarczan chondroityny zawiera GalNAc zamiast
GlcNAc. Ponadto reszta GalNAc jest podstawio¬
na w pozycji 4' lub 6' siarczanem. W przybliżeniu
1 grupa siarczanowa przypada na jednostkę disa-
charydową.
C. Siarczany keratanu I i 11
Jak przedstawiono na ryc. 47-8 składają się one
z powtarzających się jednostek disacharydowych
Gal-GlcNAc. Mogą one zawierać grupę siar-
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 667
czanową w pozycji 6 GlcNAc lub czasem Gal.
Typ I tego GAG występuje przede wszystkim
w rogówce, typ II, oprócz siarczanu chondroityny
i kwasu hialuronowego, w luźnej tkance łącznej,
Typy I i II różnią się sposobem wiązania z biał¬
kiem (ryc. 47-8).
Kwas hialuronowy p14» GIcUA p13» GlcNAc PM» GIcUA PU» GlcNAc p14»
Siarczany chondroityny P14» GIcUA P13» GalNAc P1'4» GIcUA PU» Gal PU» Gal p1'4» Xyl P > Ser
I
4- lub 6-Siarczan
Siarczany
keratanu I i II
GlcNAc —► Asn (Siarczan keratanu I)
GlcNAc Gal
GlcNAc -^►Gal
i 1
6-Siarczan 6-Siarczan " " GalNAc » Thr (Ser) (Siarczan keratanu II)
I
Gal-NeuAc
Heparyna
I siarczan
.1—►IdUA
heparanu
i
2-Siarczan
Siarczan
► MUA
dermatanu
1
2-Siarczan
6-Siarczan
GIcN GIcUA
I
S03 lub Ac
.... PI.4 .
Ryc. 47-8. Struktury proteoglikanów i glikozoaminoglikanów. GIcUA - kwas D-glukuronowy; IdUA - kwas L-iduronowy; GIcN - D-gluko-
zoamina; GaIN - D-galaktozamina; Ac - acetyl; Gal - galaktoza; Xyl - ksyloza; Ser - L-seryna; Thr - L-treonina; Asn - asparagina; Man
- mannoza; NeuAc - kwas /V-acetyloneuraminowy. Przedstawione wzory tych makrocząsteczek obrazują jedynie skład jakościowy, nie
odzwierciedlając w pełni ich struktury. Żadna z wymienionych struktur nie oddaje wiernie wszystkich możliwości podstawienia dodat¬
kowej grupy, np. w heparynie większość reszt kwasu iduronowego zawiera w pozycji 2 grupę siarczanową, natomiast w siarczanie
dermatanu tylko niektóre reszty tego kwasu są podstawione siarczanem. W siarczanie chondroityny, dermatanu, heparanu i heparynie
pokazano również charakterystyczny obszar wiążący GAG-i z rdzeniem białkowym (-Gal-Gal-Xyl-). (Rycina nieznacznie zmodyfikowana
i reprodukowana za zgodą z: Lennarz WJ: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980. Reprodukowano
za uprzejmą zgodą Springer Science and Business Media).
Tabela 47-6. Główne właściwości glikozoaminoglikanów
GAG
Cukry
Siarczan1
Wiązanie do białka
Występowanie
HA
GlcNAc, GIcUA
-
brak przekonujących dowodów
Płyn stawowy, ciałko szkliste,
luźna tkanka łączna
CS
GalNAc, GIcUA
GalNAc
Xyl-Ser; łączy się z HA przez
białka
Chrząstka, kość, rogówka
KSI
GlcNAc, Gal
GlcNAc, Gal
GIcNAc-Asn
Rogówka
KSII
GlcNAc, Gal
jak w KSI
GalNAc-Thr
Luźna tkanka łączna
Heparyna
GIcN, IdUA
GIcN, GIcN, IdUA
Ser
Mastocyty
Siarczan heparanu
GIcN, GIcUA
GIcN, GIcN
Xyl-Ser
Fibroblasty skóry, ściana aorty
Siarczan dermatanu
GalNAc, IdUA (GIcUA)
GalNAc, IdUA
Xyl-Ser
Powszechnie występujący
1 Siarczan jest przyłączony do podanych w tabeli sacharydów w różnych pozycjach (p. ryc. 47-7).
Należy zauważyć, że wszystkie glikozoaminoglikany (z wyjątkiem siarczanów keratanu) zawierają kwas uronowy (glikuronowy lub
iduronowy).
668 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
HNSO3 OSO3 HNSO3 OH HNSO3 OH HNAc
GIcN IdUA GIcN IdUA GIcN GIcUA GIcNAc
Ryc. 47-9. Struktura heparyny. Fragment polimeru przedstawia charakterystyczne strukturalne cechy typowej heparyny. Na tej rycinie
została przedstawiona wybrana sekwencja różnie podstawionych powtarzających się jednostek disacharydowych. Dodatkowo mogą
również występować w pozycji 3 niesiarczanowane bądź siarczanowane reszty glukozoaminy. (Rycina zmodyfikowana, przerysowana
za zgodą z: Lindahl U i wsp.: Structure and biosynthesis of heparin like polisaccharides: FedProc 1977:36:19).
D. Heparyna
Powtarzająca się jednostka disacharydowa jest
złożona z glukozoaminy (GIcN) i kwasu glukuro-
nowego lub iduronowego (ryc. 47-9). Większość
grup aminowych GIcN jest ^-siarczanowana,
a nieliczne acetylowane. Ponadto GIcN w pozycji
6 zawiera estrowo związaną grupę siarczanową.
W heparynie ok. 90% kwasu uronowego to
IdUA. W pierwszym etapie biosyntezy GAG
powstający łańcuch zawiera kwas glukuronowy,
ale w wyniku procesu epimeryzacji z udziałem
5-epimerazy 90% reszt GIcUA zostaje przekształ¬
conych do reszt IdUA po utworzeniu łańcucha
polisacharydowego. Cząsteczka białka proteogli-
kanu heparyny jest wyjątkowa, składa się bowiem
wyłącznie z reszt seryny i glicyny. Przeciętnie 2/3
reszt seryny jest połączonych z łańcuchem GAG,
tworząc proteoglikan o masie cząsteczkowej 5-15
kDa lub czasem większy. Heparyna występuje
w ziamistościach komórek tucznych, a także
w wątrobie, płucach i skórze.
E. Siarczan heparanu
Występuje jako proteoglikan zarówno na po¬
wierzchniach komórkowych, jak i pozakomór-
kowo. Zawiera on GIcN z mniej licznymi resz¬
tami A-siarczanowymi niż heparyna i w odróż¬
nieniu od heparyny głównym kwasem uronowym
jest GIcUA.
R Siarczan dermatanu
Powszechnie występuje w tkankach zwierzęcych.
Pod względem struktury jest podobny do siarcza¬
nów chondroityny, z tą jednak różnicą, że w miej¬
scu GIcUA związanego z GalNAc wiązaniem
P-1,3 znajduje się IdUA związany z GalNAc wią¬
zaniem a-1,3. Synteza IdUA odbywa się podob¬
nie jak w heparynie czy siarczanie heparanu, tj.
przez 5 '-epimeryzację GIcUA. Ponieważ proces
ten jest regulowany przez stopień siarczanowania,
w przypadku niecałkowitego siarczanowania siar¬
czan dermatanu składa się zarówno z disacharydu
IdUA-GalNAc, jak i GlcUA-GalNAc.
Niedobory enzymów degradujących
glikozoaminoglikany są przyczyna
mukopolisacharydoz
Zarówno egzo-, jak i cndoglikozydazy degradują
GAG. Podobnie jak i inne biomakrocząsteczki,
GAG podlegają procesom metabolicznym, za¬
równo syntezy, jak i degradacji. Ich okres pół-
trwania w tkankach dojrzałych jest stosunkowo
krótki, rzędu kilku dni do kilku tygodni.
W poznaniu szlaku rozkładu GAG, podobnie
jak glikoprotein (rozdz. 46) i glikosfingolipidów
(rozdz. 24) znacznie pomogło wykrycie niedo¬
borów określonych enzymów w przypadkach
wrodzonych zaburzeń metabolicznych. Jeżeli
dziedziczne zaburzenia dotyczą GAG, choroby te
nazywa się mukopolisacharydozami (tab. 47-7).
Rozkładu GAG dokonuje zespół hydrolaz li-
zosomalnych. Zalicza się do nich niektóre endo-
glikozydazy, różne egzoglikozydazy i sulfatazy,
zwykle działające po kolei, aby rozłożyć różne
GAG. Niektóre wymieniono w tab. 47-7.
Mukopolisacharydozy mają wspólny mecha¬
nizm powstawania. Przedstawiono go na ryc.
47-10. Dziedziczą się w sposób autosomalny
recesywny; najlepiej poznano zespoły Hurler
i Huntera. Są to zespoły rzadko występujące.
W niektórych przypadkach udaje się potwierdzić
dziedziczność wywiadem rodzinnym. Badania
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 669
Tabela 47-7. Defekty biochemiczne i testy diagnostyczne stosowane w mukopolisacharydozach i mukolipidozach oraz związane z nimi
zaburzenia1
Nazwa
Stosowane
skróty2
Enzymatyczny defekt3
Wykrywane metabolity
w moczu
Mukopolisacharydozy
Zespól Hurler (MIM 607014)
Zespól Scheiego (MIM 607016)
Zespól Hurler-Scheiego (MIM 607015)
MPS I
Niedobór a-L-iduronidazy
Siarczan dermatanu,
siarczan heparanu
Zespól Huntera (MIM 309900)
MPS II
Niedobór sulfatazy iduronianowej
Siarczan dermatanu,
siarczan heparanu
Zespól Sanfilippo A (MIM 252900)
MPS III A
Niedobór yV-sulfatazy HS (sulfamidazy)
Siarczan heparanu
Zespól SanfilippoB (MIM 252920)
MPS III B
Niedobór a-/V-acetyloglukozoaminidazy
Siarczan heparanu
Zespół Sanfilippo C (MIM 252930)
MPS III C
Niedobór acetylotransferazy
Siarczan heparanu
Zespół Sanfilippo D (MIM 252940)
MPS III D
Niedobór /V-acetyloglukozoamino-6-sulfatazy
Siarczan heparanu
Zespól Morąuio A (MIM 253000)
MPS IV
Niedobór /V-acetylogalaktozo-6-sulfatazy
Siarczan keratanu C6-S04
Zespół Morąuio B (MIM 253010)
MPS IFB
Niedobór p-galaktozydazy
Siarczan keratanu
Zespól Morteaux-Lamy (MIM 253200)
MPS VI
Niedobór /V-acetylogalaktozoamino-4-sulfatazy
(arylosulfatazy B)
Siarczan dermatanu
Zespół Sly’ego (MIM 253220)
MPS VII
Niedobór p-glukuronidazy
Siarczan dermatanu,
siarczan heparanu,
4-siarczan chondroityny,
6-siarczan chondroityny
Mukolipidozy
Sialidoza (MIM 256550)
MLI
Niedobór sialidazy (neuraminidazy)
Fragmenty glikoprotein
Choroba wtrętów komórkowych
(l-cell disease) (MIM 252500)
MLII
Niedobór /V-acetyloglukozoaminylofosfotransfe-
razy UDP-/V-acetyloglukozoaminoproteinowej
(kwaśne hydrolazy wykazują brak reszt
fosfomannozowych)
Fragmenty glikoprotein
Polidystrofia rzekomohurlerowska
(MIM 252600)
ML HI
Jak w ML II, ale niedobór jest całkowity
Fragmenty glikoprotein
1 Tabela zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: DiNatale R Neyfeld EF: The biochemical diagnosis of mucopolisaccharidoses,
mucolipidosis and related disorders. W: Perspectives in Inherited Metabolic diseases. Vol 2. Barra B i wsp. (red.): Editiones Ermes
Milan 1979.
2 Wiele wymienionych enzymów może być oznaczonych w fibroblastach, leukocytach, komórkach ptynu owodniowego lub surowicy.
Pacjenci z tymi chorobami wykazują różne objawy kliniczne, do których należą: zmętnienie rogówki, upośledzenie umysłowe, sztywność
stawów, zmiany w sercu, powiększenie wątroby i śledziony oraz niski wzrost. Występują one w zależności od choroby i jej nasilania.
3 Termin „MPS V” nie jest już używany. Nie potwierdzono występowania MPS VIII (przypuszczalnie niedoboru glukozoamino-6-sulfatazy,
MIM 253230). Opisano co najmniej jeden przypadek niedoboru hialuronidazy (MPS IX, MIM 601492).
laboratoryjne, które pomagają w rozpoznaniu,
to wykazanie w moczu zwiększonej zawartości
GAG oraz oznaczanie aktywności przypuszczal¬
nie zmutowanych enzymów w krwinkach białych,
fibroblastach, a czasami w surowicy. W wielu
przypadkach pobiera się wycinek tkanki i ozna¬
cza elektroforetycznie nagromadzone GAG. Co¬
raz powszechniejsze jest badanie DNA. Do badań
diagnostycznych prenatalnych można użyć komó¬
rek z płynu owodniowego lub bioptatu kosmówki.
Termin „mukolipidozy” wprowadzono do
określenia chorób, które łączą cechy mukopoli-
sacharydoz i sfingolipidoz (rozdz. 24). Trzy mu¬
kolipidozy zestawiono w tab. 47-7. W sialidozie
670 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ryc. 47-10. Uproszczony schemat przyczyn powstawania mu-
kopolisacharydoz, takich jak zespół Hurler (MIM 252800), który
dotyczy enzymu L-iduronidazy. Zaznaczone na rycinie nagroma¬
dzenie GAG w tkance może powodować powiększenie wątroby,
śledziony, zaburzenia wzrostu, zniekształcenia twarzy i upośle¬
dzenie umysłowe.
(mukolipidozie I, ML-I) w tkankach gromadzą
się różne oligosacharydy pochodzące z glikopro-
tein i niektóre gangliozydy. Chorobę komórek I
(ML-II) i polidystrofię „pseudo-Hurler” (ML-
-III) opisano w rozdz. 46. Termin „mukolipidozy”
zachowano, ponieważ jest on względnie często
używany przez klinicystów, ale nie jest on właś¬
ciwy dla dwóch ostatnich wymienionych chorób,
ponieważ mechanizm przyczynowy dotyczy mis-
lokacji określonych enzymów lizosomalnych.
Dziedziczne wady rozkładu łańcuchów oligosa-
charydowych w glikoproteinach (np. mannozydo-
zę, fukozydozę) opisano także w rozdz. 46. Więk¬
szość tych wad enzymatycznych cechuje zwięk¬
szone wydalanie różnych fragmentów glikoprote-
in w moczu oraz gromadzenie ich na skutek bloku
metabolicznego, jak w przypadku mukolipidoz.
Hialuronidaza jest jednym z ważnych enzy¬
mów uczestniczących w rozpadzie zarówno kwa¬
su hialuronowego, jak i siarczanu chondroityny.
Jest ona szeroko rozpowszechnioną endoglikozy-
dazą, rozszczepiającą wiązanie heksozoamidyno-
we. Działając na kwas hialuronowy, generuje ona
tetrasacharyd o strukturze (GlcUA-pi,3-GlcNAc-
pi,4)2, który może być dalej rozkładany przez
p-glikuronidazę i P-A-acetyloheksozoaminę. Do¬
tychczas opisano tylko jeden przypadek uwarun¬
kowanego genetycznie niedoboru tego enzymu.
Proteoglikany spełniają liczne funkcje
Jak już wspomniano, proteoglikany w znacz¬
nym stopniu są złożonymi makrocząsteczkami
występującymi we wszystkich tkankach organi¬
zmu, głównie w macierzy pozakomórkowej lub
w substancji podstawowej tkanki łącznej. Ponadto
niektóre z nich mogą się łączyć z innymi skład¬
nikami macierzy, np. z kolagenem lub elastyną,
co jest istotne dla utrzymania właściwej struktury
organizacji tkanki łącznej. Niektóre proteoglika¬
ny, np. dekoryna, mogą także przyłączyć się do
czynników wzrostu, takich jak TGF-p i w ten
sposób zmieniać wpływ tych czynników na ko¬
mórki. Ponadto niektóre proteoglikany oddziału¬
ją z pewnymi białkami adhezyjnymi, takimi jak
fibronektyna lub laminina (patrz wyżej). GAG
obecne w proteoglikanach są polianionami, dla¬
tego też wiążą polikationy i kationy, takie jak Na+
i K+. Dzięki tym ostatnim dochodzi do hydratacji
tkanki łącznej i nadania jej odpowiedniego na¬
pięcia. Przy stosunkowo małych stężeniach GAG
wykazują skłonności do żelowania. Ich długie
łańcuchy polisacharydowe oraz właściwości żelu¬
jące sprawiają, że działają one w pozakomórkowej
macierzy jak sito, uniemożliwiając przedostanie
się dużych makrocząsteczek, natomiast ułatwiają
przenikanie małym cząsteczkom. Ponadto, dzięki
swej rozciągniętej strukturze i występowaniu czę¬
sto w postaci wielkocząsteczkowych agregatów,
zajmują względnie dużą objętość macierzy w sto¬
sunku do innych białek.
A. Niektóre funkcje specyficznych GAG i(lub)
PROTEOGLIKANÓW
Kwas hialuronowy w szczególnie dużym stę¬
żeniu występuje w tkankach embrionalnych. Są¬
dzi się, że pełni on ważną funkcję w migracji
komórek podczas morfogenezy i w procesach
naprawczych. Jego zdolność do zatrzymywania
wody w pozakomórkowej macierzy sprawia, że ta
ostatnia ulega zwiotczeniu, co może mieć znacze¬
nie dla wymienionych procesów. Duże stężenie
kwasu hialuronowego i siarczanów chondroityny
w chrząstce zapewnia tej tkance utrzymanie właś¬
ciwej sprężystości i wytrzymałości (p. dalej).
Siarczan chondroityny występuje w miejscach
wapnienia w kościach śródchrzęstnych. Obecność
jego stwierdza się również w obrębie neuronów,
gdzie może tworzyć śródkomórkowy szkielet
umożliwiający utrzymanie stałego kształtu tych
komórek.
Zarówno siarczan keratanu I, jak i siarczan
dermatanu występują w rogówce. Umiejsco¬
wione są między włóknami kolagenowymi. Pod-
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 671
stawową ich funkcją jest zapewnienie rogówce
wysokiej przezroczystości. W przypadku uszko¬
dzenia powierzchni rogówki stwierdza się zmiany
w składzie proteoglikanów, które zanikają w przy¬
padku wygojenia się wymienionych uszkodzeń.
Siarczan dermatanu występujący w twardówce
jest odpowiedzialny za utrzymanie właściwego
kształtu gałek ocznych. Siarczan keratanu 1 wy¬
stępuje także w chrząstce.
Heparyna jest ważnym antykoagulantem. Łą¬
czy się ona z IX i XI czynnikiem krzepnięcia.
Najistotniejsze jest jednak jej oddziaływanie
z osoczową antytrombiną III (rozdz. 50). Hepa¬
ryna może również się wiązać specyficznie z li¬
pazą lipoproteinową występującą w naczyniach
włosowatych, przyczyniając się do uwalniania
tego enzymu do krwiobiegu.
Pewne proteoglikany (np. siarczan heparanu)
są wbudowane w błonę plazmatyczną komórek,
a ich rdzenie białkowe zapewniają tym błonom
odpowiednie naprężenie. Ponadto na powierzchni
komórki mogą one działać jak receptory i uczest¬
niczyć we wzroście komórek i oddziaływaniach
komórka-komórka. W hodowlach komórkowych
siarczan heparanu uczestniczy w procesie łącze-
Tabela 47-8. Niektóre funkcje GAG i(lub) proteoglikanów1
• Strukturalne składniki macierzy pozakomórkowej (EC).
• Specyficzne oddziaływania z kolagenem, elastyną, fibronekty-
ną, lamininą i innymi białkami macierzy.
• Jako polianionowe substancje wiążą polikationy i kationy.
• Uczestniczą w kształtowaniu charakterystycznego napięcia
różnych tkanek.
• Działają jak sita w macierzy pozakomórkowej.
• Ułatwiają migrację komórek (HA).
• Odgrywają istotną rolę w sprężystości i wytrzymałości
chrząstki (HA i CS).
• Zapewniają przezroczystość rogówce (KSI i DS).
• Strukturalna rola w twardówce (DS).
• Antykoagulacyjne właściwości (heparyna).
• Składniki plazmatycznych błon komórkowych, gdzie mogą
działać jak receptory i uczestniczyć w adhezji komórek i od¬
działywaniach komórka-komórka (np. HS).
• Determinują selektywność filtracji kłębuszkowej zależną od
ładunku (HS).
• Składniki pęcherzyków synaptycznych i innych pęcherzyków
(HS).
1 Stosowane skróty: HA - kwas hialuronowy; CS - siarczan chon-
droityny; KS I - siarczan keratanu I; DS - siarczan dermatanu;
HS-siarczan heparanu.
nia się komórek do substratów. Te proteoglikany
znaleziono również w błonach podstawnych kłę-
buszków nerkowych, razem z kolagenem typu IV
i lamininą (p. wyżej), gdzie determinują selektyw¬
ność filtracji kłębuszkowej cząsteczek zależną od
ładunku.
Proteoglikany stwierdzono również w we¬
wnątrzkomórkowych organellach, np. w jądrze
komórkowym. Ich funkcja w tej strukturze sub-
komórkowej nie została jednak wyjaśniona. Wy¬
kazano je również w ziamistościach spichrzenio-
wych lub wydzielniczych, np. w ziamistościach 1
chromochłonnych komórek rdzenia nadnerczy.
Przypuszczano, że proteoglikany odgrywają pew¬
ną rolę w uwalnianiu treści tych ziarnistości. Róż¬
ne funkcje GAG zestawiono w tab. 47-8.
B. Udział w patogenezie ważnych chorób i w procesie
STARZENIA
Kwas hialuronowy umożliwia migrację komórek
nowotworowych przez macierz pozakomórkową.
Komórki nowotworowe mogą pobudzać fibrobla-
sty do wzmożonej syntezy GAG, co być może jest
powodem ich łatwego rozprzestrzeniania się. Nie¬
które komórki nowotworowe zawierają stosun¬
kowo niewielkie ilości siarczanu heparanu, który
najczęściej występuje w postaci związanej z błoną
komórkową, co z kolei powoduje zanik zdolności
adhezyjnych tych komórek.
W skład śródbłonka (intimy) ściany tętnic
wchodzą: proteoglikany zawierające kwas hialu¬
ronowy, siarczan chondroityny, siarczan derma¬
tanu i siarczan heparanu. Z wymienionych pro¬
teoglikanów siarczan dermatanu wiąże osoczowe
lipoproteiny o małej gęstości. Co więcej, jest on
głównym GAG syntetyzowanym przez miocy-
ty naczyniowe. Ponieważ są to komórki, które
w procesie miażdżycowym bardzo łatwo proli-
ferują, uważa się, że siarczan dermatanu może
pełnić istotną funkcję w rozwoju blaszki miaż¬
dżycowej.
W różnych postaciach zapalenia stawów pro¬
teoglikany mogą działać jako autoantygeny,
uczestnicząc w patogenezie tych schorzeń. Wia¬
domo również, że z wiekiem zmniejsza się zawar¬
tość w chrząstce siarczanu chondroityny, natomiast
zwiększa się ilość siarczanu keratanu i kwasu hia-
luronowego. Zmiany te mogą się przyczyniać do
rozwoju zmian zwyrodnieniowych u ludzi sta¬
rych (osteoarthritis), podobnie jak zwiększenie
672 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
aktywności agrekanazy - enzymu, który rozkłada
agrekan. Obserwuje się także zmiany z upływem
lat zawartości niektórych GAG w skórze, co może
wyjaśnić jej charakterystyczne zmiany starcze.
Nowy fascynujący etap badań nad proteoglika-
nami rozpoczęły odkrycia wskazujące, że mutacje
pojedynczych proteoglikanów lub enzymów nie¬
zbędnych do ich syntezy zmieniają drogi prze¬
noszenia sygnału u Drosophila melanogaster
(muszki owocowej) i Caenarhabditis elegans (ni¬
cień), a tym samym ich rozwój. Wydaje się, że
podobne zjawisko zachodzi u myszy i ludzi.
KOŚĆ JEST TKANKA ŁĄCZNĄ BOGATA
W SKŁADNIKI MINERALNE
Kość zawiera zarówno składniki organiczne, jak
i nieorganiczne. Składniki organiczne to przede
wszystkim białka. Główne białka zestawiono
w tab. 47-9. Dominującym białkiem jest kolagen
typu I, stanowiący 90-95% wszystkich składni¬
ków organicznych. W małych ilościach występuje
także kolagen typu V, podobnie jak liczne białka
niekolagenowe, niektóre z nich swoiste dla kości.
Nieorganiczne, czyli mineralne składniki to głów¬
nie kryształy hydroksyapatytu (Ca10[PO4]6[OH]2)
oraz sód, magnez, węglany i fluorki. Około 99%
zawartego w organizmie wapnia znajduje się
w kośćcu (rozdz. 44). Hydroksyapatyt zapewnia
kości wytrzymałość i tzw. odbojność, co jest wy¬
magane ze względu na pełnioną przez nią funkcję
biologiczną.
Kość jest strukturą dynamiczną, która pod¬
lega stałej przebudowie polegającej na resorpcji
z następowym tworzeniem nowej tkanki kostnej.
Przebudowa ta umożliwia przystosowywanie się
kości do bodźców fizycznych (np. obciążenie
zwiększoną masą) i hormonalnych.
Głównymi rodzajami komórek biorących udział
w resorpcji i tworzeniu kości są osteoklasty i os-
teoblasty (ryc. 47-11). Pierwsze odpowiadają za
resorpcję, drugie wytwarzają nową tkankę kostną.
Osteocyty rozwijają się z osteoblastów. Wydaje
się, że biorą również udział w utrzymaniu macie¬
rzy kostnej, nie będą jednak omawiane.
Osteoklasty są komórkami wielojądrowymi,
wywodzącymi się z niezróżnicowanych komórek
pnia układu krwiotwórczego. Wykazują na api-
kalnej błonie rąbek szczoteczkowy, który odgry-
Tabela 47-9. Główne białka występujące w kości1
Białko
Omówienie
Kolageny
Kolagen typu 1
Stanowi około 90% wszystkich białek
kości, składa się z dwóch łańcuchów
a1 (I) i jednego łańcucha a2(l).
Kolagen typu V
Ten składnik występuje w małej ilości.
Białka niekolagenowe
Białka osocza
Mieszanina różnych białek osocza.
Proteoglikany2
CS-PGI (biglikan)
Zawiera dwa łańcuchy GAG, występuje
w innych tkankach.
CS-PGII (dekorin)
Zawiera jeden łańcuch GAG, występuje
w innych tkankach.
CS-PGIII
Swoisty dla kości.
Białko SPARC3 kości
(osteonektyna)
Nieswoiste dla kości.
Osteokalcyna (kostne
białko Gla)
Zawiera reszty y-karboksyglutamino-
we, które wiążą się z hydroksyapaty-
tem. Swoiste dla kości.
Osteopontyna
Nieswoiste dla kości glikozylowane
i fosforylowane białko.
Sialoproteina kostna
Swoiste dla kości intensywne gliko¬
zylowane białko zawierają siarczany
przyłączone do reszt tyrozynowych.
Białka morfogenetycz-
ne kości (BMPs, ang.
bonę morphogenetic
proteins)
Rodzina (osiem lub więcej) białek
wydzielniczych wykazujących różne
działanie na kość; mogą wywoływać
kostnienie ektotopowe.
Osteoprotegeryna
Hamuje rozwój osteoklastów.
1 Niekolagenowym białkom są przypisywane różne funkcje bio¬
logiczne, ale większość z nich nie została udowodniona, w tym
udział w mineralizacji kości. Nie wydaje się, aby niekolagenowe
białka nieswoiste dla kości odgrywały kluczową rolę w minerali¬
zacji. W kości znajdują się też liczne inne białka, w tym bogate
w tyrozynę kwaśne białka macierzy (ang. tyrosine-rich acidic ma-
trix protein, TRAMP), niektóre czynniki wzrostu (np. TGFP) i enzy¬
my biorące udział w syntezie kolagenu (np. oksydaza lizylowa).
2 CS-PG - proteoglikan - siarczan chondroityny; są one zbliżo¬
ne do proteoglikanów z siarczanem dermatanu występujących
w chrząstce (tab. 47-11).
3 SPARC - kwaśne wydzielnicze białko bogate w cysteinę (ang.
secreted protein acidic and rich in cysteinę).
wa kluczową rolę w resorpcji kości (ryc. 47-12).
ATP-aza przemieszczająca protony wyrzuca je
w obszar rąbka szczoteczkowego do przestrzeni
resorpcyjnej, której środowisko cechuje się ma-
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 673
Osteoklast Mezenchyma Nowo utworzona macierz kostna (osteoid)
Ryc. 47-11. Schemat głównych rodzajów komórek w kości błoniastej: Osteoblasty (jaśniejsze) wytwarzają
kolagen typu I, stanowiący substancję pozakomórkową, w której unieruchomione są komórki. Po spełnieniu
swej funkcji osteoblasty stopniowo ulegają przekształceniu w osteocyty. (Rycina reprodukowana za zgodą z:
Jungueira LC, Carneiro J: Basic Histology, Text & Atlas, wyd. 10, McGraw-Hill 2003).
łym pH, jak ukazano to na rycinie. Zmniejsza
to miejscowe pH do 4,0 lub mniej, zwiększając
w ten sposób rozpuszczalność hydroksyapatytu
i umożliwiając proces demineralizacji. Uwalniane
kwaśne proteazy lizosomalne trawią odsłonięte
w ten sposób białka pozakomórkowe kości. Os¬
teoblasty - jednojądrowe komórki wywodzące
się z prekursorów mezenchymalnych - wytwarza¬
ją większość białek występujących w kości (tab.
47-9), a także różne czynniki wzrostu i cytokiny.
Odpowiadają one za odkładanie nowej kości (os¬
teoid) i jej następową mineralizację. Osteoblasty
kontrolują mineralizację przez regulację prze¬
mieszczania się jonów wapnia i fosforanowych
przez ich błony komórkowe. Błony komórko¬
we zawierają fosfatazę alkaliczną, która bierze
udział w wytwarzaniu jonów fosforanowych z or¬
ganicznych fosforanów. Mechanizmy mineraliza¬
cji nie są w pełni poznane, ale znanych jest wiele
czynników wpływających na ten proces. Fosfa¬
taza alkaliczna uczestniczy w procesie minerali¬
zacji kości, ale jej udział nie jest wystarczający.
W miejscach mineralizacji znajdują się małe pę¬
cherzyki (pęcherzyki macierzy) zawierające wapń
i fosforany, ale ich rola nie jest jasna. Wydaje się,
że niezbędny jest też kolagen typu I, ponieważ
mineralizacja zachodzi najpierw w pustych prze¬
strzeniach pomiędzy cząsteczkami. Ostatnio zain¬
teresowanie skupia się na kwaśnych fosfoprotei-
nach, takich jak sialoproteina kostna, stanowiąca
jądro kondensacji. Białka te zawierają fragmenty
(np. pasma poliAsp i poliGlu), które wiążą wapń
i mogą stanowić „rusztowanie” dla mineralizacji.
Niektóre duże cząsteczki, takie jak proteoglikany
i glikoproteiny, także mogą hamować czynność
jąder kondensacji.
Szacuje się, że u przeciętnej zdrowej osoby do¬
rosłej ok. 4% masy kości zbitej ulega wymianie
w ciągu roku, podczas gdy w tym czasie ulega
przebudowie 20% kości beleczkowej.
Wiele czynników bierze udział w regulacji mi¬
neralizacji kości, lecz tylko kilka z nich jest tutaj
wymienionych. Niektóre pobudzają osteoblasty
(np. parathormon i 1,25-dihydroksycholekalcife-
rol), a inne je hamują (np. glikokortykosteroidy).
Parathormon i 1,25-dihydroksycholekalciferol tak¬
że pobudzają osteoklasty, natomiast hamują je kal¬
cytonina i estrogeny
674 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ryc. 47-12. Schemat ilustrujący różne aspekty roli osteoklastu w resorpcji kości. Enzymy lizosomalne
i jony wodorowe są uwalniane do mikrośrodowiska zamkniętej przestrzeni, utworzonej przez połączenie
macierzy kostnej obwodową strefą jasną osteoklastu. Zakwaszenie środowiska zamkniętej przestrzeni
ułatwia rozpuszczanie fosforanów wapniowych kości i stwarza optymalne pH dla działania hydrolaz lizo-
somalnych. Substancja pozakomórkowa kości jest w ten sposób usuwana, a produkty resorpcji kości są
wchłaniane do cytoplazmy osteoklastów, prawdopodobnie są tam dalej trawione i wydalane do naczyń
włosowatych. Równanie chemiczne przedstawione na rycinie odnosi się do opisanej w tekście reakcji
katalizowanej przez anhydrazę węglanową II (Rycina reprodukowana za zgodą z: Junąueira LC, Carneiro J:
Basic Histology, Text & Atlas, wyd. 10, McGraw-Hill 2003).
WIELE CHORÓB METABOLICZNYCH
I DZIEDZICZNYCH DOTYCZY KOŚCI
Kilka ważniejszych chorób metabolicznych i ge¬
netycznych dotyczących kości zestawiono w tab.
47-10.
Wrodzona łamliwość kości (osteogenesis
imperfecta) cechuje się nadmierną łamliwością
kości. Twardówki oczu są często nieprawidłowo
cienkie i przejrzyste i mogą wydawać się błękitne
na skutek zmniejszonej zawartości tkanki łącznej.
Wyróżniono cztery postacie tego zespołu (lek¬
ka, zaawansowana, ciężka i zmienna). Zaawan¬
sowana postać występująca u noworodków jest
najbardziej groźna. Chore noworodki mogą przy¬
chodzić na świat z wieloma złamaniami i umie¬
rać. Ponad 90% chorych na wrodzoną łamliwość
kości ma mutacje w genach COLI Al i COL1A2,
które kodują odpowiednio łańcuchy proal(I)
i proa2(I). Udokumentowano ponad 100 mutacji
w tych dwóch genach, w tym częściowe delecje
i duplikacje. Inne mutacje dotyczą splicingu RNA
i najczęściej polegają na zamianie glicyny na inny
aminokwas o większej cząsteczce. Ogólnie muta¬
cje te wywołują zmniejszoną ekspresję kolagenu
lub nieprawidłowe łańcuchy proa łączą się, two¬
rząc nieprawidłowe włókna osłabiające ogólną
budowę kości. Kiedy jeden nieprawidłowy łań¬
cuch łączy się z dwoma prawidłowymi, utworzo¬
ny kolagen cechuje się zaburzoną strukturą trze¬
ciorzędową, co powoduje enzymatyczny rozkład
wszystkich łańcuchów. Zjawisko to nazywa się
„samobójstwem prokoIagentT i jest przykładem
dominującej niekorzystnej mutacji zachodzącej
często wówczas, gdy białko składa się z wielu
różnych podjednostek.
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 675
Tabela 47-10. Niektóre metaboliczne i dziedziczne choroby doty¬
czące kości i chrząstki
Choroba
Komentarz
Karłowatość
Często jest skutkiem niedoboru
hormonu wzrostu, ale mogą
być też inne przyczyny.
Krzywica
Jest wynikiem niedoboru
witaminy D w dzieciństwie.
Osteomalacja
Jest wynikiem niedoboru
witaminy D u dorosłych.
Nadczynność
przytarczyc
Nadmiar parathormonu
powoduje resorpcję kości.
Wrodzona łamliwość kości
(osteogenesis imperfecta)
Wywołana różnymi mutacjami
genów COL1A1 \C0L1A2
wpływającymi na syntezę
i budowę kolagenu typu I.
Osteoporoza
Najczęściej występuje
osteoporoza pomenopauzalna,
a w innych przypadkach rozwija
się ona stopniowo i zależy od
wieku chorego; w małej liczbie
przypadków jest spowodowana
mutacjami genów COL1A1
i C0L1A2 i być może genu
receptora witaminy D (MIM
166710).
Choroba zwyrodnieniowa
stawów
W małej liczbie przypadków jest
wynikiem mutacji genów COL1A.
Niektóre
chondrodysplazje
Wywołane mutacjami genów
C0L2A1.
Zespół Pfeiffera1
(MIM 100600)
Mutacje genu kodującego
receptor czynnika wzrostu
fibroblastów 1 (FGFR1).
Zespół Jacksona-Weissa
(MIM 123150) oraz zespół
Crouzona (MIM 123500)1
Mutacja genu kodującego FGFR2.
Achondroplazja (MIM
100800) i śmiertelna
dysplazja (MIM 187600)2
Mutacje genu kodującego FGFR3.
1 Zespól Pfeiffera, zespól Jacksona-Weissa oraz zespól Crouzona
są zespołami przedwczesnego zarośnięcia szwów czaszkowych.
Termin „craniosynostosis” określa przedwczesne zrośnięcie się
szwów czaszki.
2 Tanatoforyczna (gr. tanatos - śmierć, pherein - przynosić)
dysplazja jest najczęstszą śmiertelną dysplazją szkieletową no¬
worodków, jej objawy są zbliżone do homozygotycznej achon-
droplazji.
Osteopetroza (choroba marmurowa kości, ko¬
ści marmurowe) cechuje się zwiększoną gęstoś¬
cią kości i jest spowodowana niezdolnością do
resorpcji kości. Jedna postać choroby występuje
razem z nerkową kwasicą kanalikową i zwapnie¬
niami mózgowia. Jest ona spowodowana mutacją
genu na chromosomie 8q22, kodującego anhydra-
zę (dehydratazę) węglanową II (CA II), jednego
z czterech izoenzymów anhydrazy węglanowej
występujących w ludzkich tkankach. Niżej przed¬
stawiono reakcję katalizowaną przez anhydrazę
węglanową:
C02 + H20~H2C03~H+ + HC03_
W biorących udział w resorpcji kości osteobla-
stach CA II prawdopodobnie dostarcza protonów
do zobojętnienia jonów OH pozostawianych
wewnątrz komórki podczas wydzielania jonów
H+ przez rąbek szczoteczkowy (p. wyżej). Przy
niedoborze aktywności CA II w osteoklastach
nie zachodzi więc resorpcja kości, co prowadzi
do osteopetrozy. Mechanizm tworzenia zwapnień
mózgowia nie jest jasny, natomiast nerkowa kwa¬
sica kanalikowa wynika z niedoboru aktywności
CA II w kanalikach nerkowych.
Osteoporoza jest uogólnionym, postępującym
zmniejszaniem się masy tkanki kostnej przypada¬
jącej na jednostkę objętości szkieletu, co powodu¬
je jego osłabienie. Stosunek części mineralnej do
organicznej pozostaje niezmieniony w pozostałej
kości. Złamania różnych kości, takich jak szyjka
kości udowej, zachodzą bardzo łatwo i stają się
problemem dla chorych i budżetu ochrony zdro¬
wia. Niektóre czynniki, takie jak estrogeny, inter-
leukina 1 i interleukina 6, prawdopodobnie są bez¬
pośrednio związane z patogenezą osteoporozy.
GŁÓWNYMI SKŁADNIKAMI CHRZĄSTKI
SA KOLAGEN TYPU III NIEKTÓRE
PROTEOGLIKANY
Główne białka chrząstki szklistej (głównego ro¬
dzaju chrząstki) są zestawione w tab. 47-11. Do¬
minującym białkiem jest kolagen typu II (ryc.
47-13), chociaż występują też w małych iloś¬
ciach liczne inne typy kolagenu. W uzupełnieniu
do tych składników chrząstka sprężysta zawiera
elastynę, a chrząstka włóknisto-sprężysta kolagen
typu I. Chrząstka zawiera liczne proteoglikany,
676 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tabela 47-11. Główne białka występujące w chrząstce
Białko
Omówienie
Kolageny
Kolagen typu II
Kolageny V, VI, IX, X, XI
Stanowi 90-98% całej zawartości kolagenu w chrząstce. Złożony z trzech łańcuchów a1 (II).
Kolagen typu IX łączy się wiązaniami poprzecznymi z kolagenem typu II. Kolagen typu XI może
współdziałać w kontrolowaniu średnicy włókien kolagenu typu II.
Białka niekolagenowe
Proteoglikany
Agrekan
Duże nieagregujące proteoglikany
DS-PGI (biglikan)1
DS-PGII (dekorin)
Chondronektyna
Anchorin CII
Główny proteoglikan chrząstki. Występuje w kilku typach chrząstki.
Podobny do CS-PGI występującego w kości.
Podobny do CS-PGII występującego w kości.
Może brać udział w przyłączeniu kolagenu typu II do powierzchni chrząstek.
Może brać udział w przyłączeniu kolagenu typu II do powierzchni chondrocytów.
1 Białka rdzenia proteoglikanów DS-PGI i DS-PGII są homologiczne do białek rdzenia proteoglikanów kości CS-PGI i CS-PGII (tab.
47-9). Możliwym wyjaśnieniem jest brak epimerazy w osteoklastach, który to enzym jest niezbędny do przemiany kwasu glukuronowego
w kwas iduronowy, występujący w siarczanie dermatanu.
które odgrywają ważną rolę w ściśliwości chrząst¬
ki. Agrekan (masa cząsteczkowa ok. 2 MDa) jest
głównym proteoglikanem. Jak widać na ryc. 47-14
ma on bardzo złożoną budowę. Składa się z kilku
GAG (kwas hialuronowy, siarczan chondroityny
i siarczan keratanu) oraz białka wiążącego i białka
rdzenia. Białko rdzenia zawiera trzy składowe: A,
B i C. Kwas hialuronowy wiąże się niekowalen-
cyjnie ze składową A białka rdzenia oraz z biał¬
kiem wiążącym, które stabilizuje połączenie kwa-
Ryc. 47-13. Schemat molekularnej struktury macierzy chrząstki. Białka łączące niekowalencyjnie wiążą
białko rdzenia (jaśniejsze) proteoglikanów do linijnych cząsteczek kwasu hialuronowego (ciemniejsze).
Boczne łańcuchy siarczanu chondroityny zawartego w proteoglikanach elektrostatycznie wiążą włókna
kolagenowe, tworząc usieciowaną macierz. Obszar zaznaczony owalem ukazany jest poniżej w powięk¬
szeniu. (Rycina reprodukowana za zgodą z: Junqueira LC, Carneiro J: Basic Histology, Text & Atlas,
wyd. 10, McGraw-Hill 2003).
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 677
Domena A Domena B
Domena C
Ryc. 47-14. Schemat budowy agrekanu z wolowej chrząstki nosowej. Pasmo kwasu hialuronowego po¬
kazano po stronie lewej. Białko rdzenia (masa cząsteczkowa ok. 210 kDa) ma trzy składowe. Składowa A,
znajdująca się na końcu aminowym, oddziałuje w przybliżeniu z pięcioma powtarzającymi się podjednost-
kami disacharydowymi kwasu hialuronowego. Białko wiążące oddziałuje zarówno z kwasem hialuronowym,
jak i składową A, stabilizując ich połączenie. Do składowej B przyłączone jest ok. 30 łańcuchów siarczanu
keratanu, połączonych za pomocą wiązania GalNAc-Ser. Składowa C zawiera ok. 100 łańcuchów siarczanu
chondroityny przyłączonych za pomocą wiązania Gal-Gal-Xyl-Ser oraz ok. 40 łańcuchów oligosacharydo-
wych przyłączonych wiązaniem 0-glikozydowym. Jeden lub więcej łańcuchów glikanów jest przyłączonych
wiązaniem /V-glikozydowym w pobliżu końca karboksylowego białka rdzenia. (Rycina reprodukowana za
zgodą z: Moras LA i wsp.: Biochemistry, wyd. 2. Neil Patterson Publishers, 1994. Przedrukowano za zgodą
Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, New Jersey).
su hialuronowego z białkiem rdzenia. Łańcuchy
siarczanu keratanu znajdują się w składowej B,
a łańcuchy siarczanu chondroityny - w składo¬
wej C; obydwa GAG są połączone kowalencyjnie
z białkiem rdzenia. Białko rdzenia zawiera także
łańcuchy oligosacharydowe połączone wiązaniem
O- lub A-glikozydowym.
Inne proteoglikany zawarte w chrząstce mają
prostszą budowę niż agrekan.
Chondronektyna odgrywa dużą rolę w przyłą¬
czeniu kolagenu typu II do chondrocytów.
Chrząstka jest tkanką pozbawioną naczyń
krwionośnych i otrzymuje większość składni¬
ków odżywczych z płynu stawowego. Wykazuje
ona powolną, ale stałą odnowę. Różne protea-
zy (np. kolagenazy i stromalizyna) wytwarzane
przez chondrocyty mogą rozkładać kolagen i inne
białko chrząstki. IL-1 i TNFa wydają się pobu¬
dzać wytwarzanie tych proteaz, natomiast TGFP
i IGF-1 ogólnie wykazują wpływ anaboliczny na
chrząstkę.
MOLEKULARNA PODSTAWĘ
CHONDRODYSPLAZJI STANOWIĄ
MUTACJE GENÓW KODUJĄCYCH
KOLAGEN TYPU III RECEPTORY
CZYNNIKÓW WZROSTU FIBROBLASTÓW
Chondrodysplazje stanowią niejednolitą grupę
dziedzicznych chorób dotyczących chrząstki. Ob¬
jawiają się karłowatością - krótkimi kończynami
i licznymi zniekształceniami kośćca. Wiele z nich
jest spowodowanych mutacjami genu COL2A1,
co prowadzi do nieprawidłowości kolagenu typu
II. Przykładem jest zespół Sticklera, objawiający
się zwyrodnieniem chrząstek stawowych i ciałka
szklistego oka.
Najlepiej znaną chondrodysplazją jest achon-
droplazja, najczęstsza przyczyna karłowatości.
Osoby chore mają krótkie kończyny, prawidłową
wielkość tułowia, dużą głowę i różne nieprawidło¬
wości szkieletowe. Choroba często jest dziedziczo-
678 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
na jako cecha autosomalna dominująca, ale wiele
przypadków jest następstwem nowych mutacji.
Podstawy molekularne achondroplazji przedsta¬
wiono na ryc. 47-15. Achondroplazja nie jest za-
Ryc. 47-15. Uproszczony schemat powstawania achondroplazji
(MIM 100800). W większości przypadków dotychczas bada¬
nych mutacja polegała na zamianie G na A w nukleotydzie 1138.
W kilku przypadkach wystąpiła transwersja G na C w tym sa¬
mym nukleotydzie. Nukleotyd ten jest szczególnym miejscem
mutacji. Obie mutacje powodują zastąpienie reszty Gly przez Arg
w przezbłonowej części receptora. W kilku przypadkach wykaza¬
no zmianę Gly na Cys w wyniku mutacji kodonu 375.
burzeniem budowy cząsteczki kolagenu, ale wyni¬
kiem swoistych mutacji genu kodującego recep¬
tor czynnika wzrostu fibroblastów 3 (FGFR3).
Czynniki wzrostu fibroblastów stanowią grupę
co najmniej 9 białek wpływających na wzrost
i różnicowanie się komórek pochodzenia mezen-
chymalnego i neuroektodermalnego. Ich receptory
są białkami przezbłonowymi i stanowią podgrupę
rodziny receptorów kinaz tyrozynowych. FGFR3
jest przedstawicielem tej grupy białek i pośredni¬
czy w działaniu FGF3 w chrząstce. W wielu zba¬
danych przypadkach achondroplazji stwierdzono
mutacje dotyczące nukleotydu 1138, będące wy¬
nikiem podstawienia reszty argininy przez glicynę
(w pozycji 380) w przezbłonowej części białka, co
czyni je nieczynnym biologicznie. Nie znaleziono
takiej mutacji u osób zdrowych. Jak podano w tab.
47-10, inne dysplazje szkieletowe (włączając nie¬
które zespoły przedwczesnego zarośnięcia szwów
czaszkowych) są także wynikiem mutacji genów
kodujących receptory dla FGF. Inny typ dyspla-
zji (dysplazja diastroficzna) jest spowodowany
mutacją układu przenoszącego siarczany. Dzięki
technice rekombinacji DNA rozpoczęła się więc
era rozpoznawania mechanizmów przyczynowych
dysplazji szkieletowych.
STRESZCZENIE
• Głównymi składnikami macierzy pozakomór-
kowej są białka strukturalne (kolagen, elastyna
i fibrylina), liczne białka „wyspecjalizowane”
(np. fibronektyna i laminina) i różne proteogli-
kany.
• Kolagen jest najczęściej występującym biał¬
kiem w świecie zwierząt. Wyodrębniono ok. 25
typów kolagenu. Wszystkie kolageny zawierają
większe lub mniejsze fragmenty potrójnej heli¬
sy i powtarzającą się strukturę (Gly-X-Y)n.
• Biosynteza kolagenu jest złożona i obejmuje
wiele modyfikacji potranslacyjnych, w tym hy-
droksylację proliny i lizyny.
• Do chorób, w których występują zaburzenia
syntezy kolagenu, należą: szkorbut, wrodzona
łamliwość kości, zespół Ehlersa-Danlosa (wiele
typów) i zespół Menkesa.
• Elastyna zapewnia rozciągliwość i powrót do
poprzedniego kształtu tkanek. Zawiera hydro-
ksyprolinę, ale nie zawiera hydroksylizyny, sek¬
wencji Gly-X-Y, nie ma struktury potrójnej heli¬
sy i węglowodanów. Zawiera natomiast wiązania
poprzeczne tworzone przez desmozynę i izode-
smozynę, które nie występują w kolagenie.
• Fibrylina znajduje się w mikrofibrylach towa¬
rzyszących elastynie. Mutacje genu kodującego
fibry linę wywołują zespół Marfana.
• Glikozoaminoglikany (GAG) są utworzone
z powtarzających się jednostek disacharydo-
wych, zawierających kwas uronowy (glukuro-
nowy lub iduronowy) lub heksozę (galaktozę)
oraz heksozoaminę (galaktozoaminę lub gluko-
zoaminę). Często występują w nich siarczany.
• Głównymi glikozoaminoglikanami są: kwas
hialuronowy, 4-siarczan chondroityny, 6-siar-
czan chondroityny, siarczany keratanu I i 11, he¬
paryna, siarczan heparanu i siarczan dermatanu.
GAG są syntetyzowane przez zespół swoistych
enzymów (glikozylotransferazy, epimerazy, sul-
fotransferazy itp.), a rozkładane sukcesywnie
przez hydrolazy lizosomalne. Uwarunkowany
genetycznie niedobór hydrolaz lizosomalnych
jest przyczyną mukopolisacharydoz (np. zespo¬
łu Hurler).
• GAG w tkankach występują w połączeniu z róż¬
nymi białkami (białka łączące i białka rdzenia),
tworząc proteoglikany. Są to bardzo duże czą¬
steczki pełniące liczne funkcje w tkankach.
47. SUBSTANCJA POZAKOMÓRKOWA 679
• Wiele składników macierzy pozakomórkowej
wiąże się z białkami powierzchni komórkowej
zwanymi integrynami. Stanowi to jeden ze szla¬
ków, którym przestrzeń pozakomórkowa komu¬
nikuje się z wnętrzem komórek.
• Kości i chrząstki są wyspecjalizowaną postacią
tkanki łącznej. Kolagen typu I i hydroksyapatyt
są głównymi składnikami kości. Kolagen typu
II i niektóre proteoglikany są głównym składni¬
kiem chrząstki.
• Molekularne przyczyny wielu chorób dzie¬
dzicznych kości (np. wrodzona łamliwość ko¬
ści) i chrząstki (np. chondrodystrofia) zostały
odkryte dzięki zastosowaniu techniki rekombi¬
nacji DNA.
PIŚMIENNICTWO
Brodsky B, Persikov AV: Molecular structure of the
collagen triple helix. Adv Prot Chem 2005;70:301.
Chen D, Zhao M, Mundy GR: Bonę morphogenetic pro-
teins. Growth Fact 2004;22:233.
Deftos LJ: Treatment of Paget’s disease - taming the
wild osteoclast. N Engl J Med 2005;353:872.
Farach-Carson MC, Hecht JT, Carson DD: Heparan sul-
fate proteoglycans: key players in cartilage biology.
Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2005; 15:29.
Hacker U, Nybakken L, Perrimon N: Heparan sulfate
proteoglycans: the sweet side of development. Nat
Rev Mol Celi Biol 2005;6:530.
Handel TM et al: Regulation of protein function by gly-
cosaminoglycans - as exemplified by chemokines.
Ann Rev Biochem 2005;74:385.
Iozzo RV: Basement membranę proteoglycans: from cel-
lar to ceiling. Nat Rev Mol Celi Biol 2005;6:645.
Prockop DJ, Ala-Kokko L: Inherited disorders of con-
nective tissue. In: Harrisons Principles oflnternal
Medicine, 16th ed. McGraw-Hill, 2005.
Sagę E: Regulation of interactions between cells and
extracellular matrix: a command performance on
several stages. J Clin Invest 2001; 107:781. (This
article introduces a series of six articles on cell-ma-
trix interaction. The topics covered are celi adhe-
sion and de-adhesion, thrombospondins, syndecan,
SPARC, osteopontin, and Ehlers-Danlos syndrome.
Ali of the articles can be accessed at http://www.
jci.org.)
Serwer CR et al (editors): The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease, 8th ed. McGraw-Hill,
2001. (This comprehensive four-volume text con-
tains chapters on disorders of collagen biosynthesis
and structure, Marfan syndrome, the mucopolysac-
charidoses, achondroplasia, Alport syndrome, and
craniosynostosis syndromes.)
Yoon JH, Halper J: Tendon proteoglycans: biochemistry
and function. J Musculoskelet Neuronal Interact
2005;5:350.
Mięsień i szkielet komórkowy
(cytoszkielet)
Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Białka odgrywają również ważną rolę w mecha¬
nizmach ruchu zarówno na poziomie narządo¬
wym (np. mięśnie szkieletowe, serce i przewód
pokarmowy), jak i komórkowym. W tym rozdzia¬
le przedstawiono rolę, jaką odgrywają w skurczu
mięśnia specyficzne białka i inne kluczowe czą¬
steczki (np. Ca2+). Opisano także krótko białka
szkieletu komórkowego.
Wiedza o molekularnych podstawach wielu
chorób dotyczących mięśni bardzo się w ostat¬
nich latach rozwinęła. Dużym krokiem naprzód
w poznawaniu molekularnych podstaw dystrofii
mięśniowej typu Duchenne’a było odkrycie, że
jest ona spowodowana mutacjami genu kodują¬
cego dystrofinę. Nastąpił również znaczny postęp
w poznaniu molekularnych podstaw hipertermii
złośliwej, poważnego powikłania występującego
u pacjentów poddawanych pewnego typu nar¬
kozie. Niewydolność serca jest bardzo często
występującym stanem patologicznym o różnych
przyczynach; jego racjonalne leczenie wymaga
znajomości biochemii mięśnia sercowego. Jed¬
ną z grup stanów chorobowych, jakie prowa¬
dzą do niewydolności serca są kardiomiopatie,
z których niektóre są uwarunkowane genetycznie.
Stwierdzono, że tlenek azotu (NO) jest głównym
regulatorem napięcia mięśni gładkich. Wiele le¬
ków rozkurczających naczynia, stosowanych do
leczenia niewydolności wieńcowej, takich jak
nitrogliceryna, działa przez pobudzenie syntezy
NO. Mięśnie, częściowo ze względu na swoją
masę, odgrywają dużą rolę w całkowitym meta¬
bolizmie ustroju.
MIĘSIEŃ PRZETWARZA ENERGIĘ
CHEMICZNA NA MECHANICZNA
Mięśnie należą do głównych przetworników bio¬
chemicznych (maszyn), które przetwarzają energię
potencjalną (chemiczną) na kinetyczną (mecha¬
niczną). Mięśnie - jednorodna, mająca największy
udział w ciele ludzkim tkanka - stanowią mniej niż
25% masy ciała przy urodzeniu, ponad 40% u mło¬
dych dorosłych i nieco mniej niż 30% w starości.
Zostaną tu omówione właściwości trzech typów
mięśni występujących u kręgowców: mięśnie
szkieletowe, mięsień sercowy i mięśnie gładkie.
Zarówno mięśnie szkieletowe, jak i mięsień ser¬
cowy są mięśniami poprzecznie prążkowanymi;
w mięśniach gładkich takie prążkowanie w obrazie
mikroskopowym nie występuje. Czynność mięśni
szkieletowych jest kontrolowana przez układ ner¬
wowy i zależy od naszej woli, natomiast czynność
mięśni gładkich od naszej woli nie zależy.
Sarkoplazma komórek mięśniowych
zawiera ATP, fosfokreatynę i enzymy
glikolityczne
Mięsień poprzecznie prążkowany składa się
z wielojądrzastych komórek (włókien) otoczonych
wrażliwą na bodźce elektryczne błoną - sarkole-
mą. Pojedyncze włókno (komórka) mięśniowe,
które może rozciągać się na całą długość mięśnia,
zawiera pęczki złożone z wielu równolegle ułożo¬
nych miofibryli, zanurzonych w wewnątrzkomór¬
kowym płynie - sarkoplazmie. Płyn ten zawiera
glikogen, związki wysokoenergetyczne, ATP i fo¬
sfokreatynę oraz enzymy glikolityczne.
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 681
Ryc. 48-1. Struktura mięśnia szkieletowego. Sarkomer obejmuje obszar położony między liniami Z. (Rycina wykona¬
na przez Sylwię Colard Keene, reprodukowana za zgodą z: Bloom W, Fawcett DW: A Textbook of Histology, Saunders,
1975).
Sarkomer jest czynnościowa jednostka
mięśnia
Ogólny obraz dowolnego mięśnia (szkieletowe¬
go) na poszczególnych poziomach jego organiza¬
cji pokazano na ryc. 48-1.
Obserwacja miofibryli pod mikroskopem elek¬
tronowym wykazuje naprzemienne występowa¬
nie ciemnych i jasnych prążków (prążków ani¬
zotropowych, co oznacza dwułomność w świetle
spolaryzowanym, i prążków izotropowych, tj.
niezmienianych przez światło spolaryzowane).
Prążki są oznaczane odpowiednio jako prążki
A i prążki I. Centralna część prążka A (prążek
lub strefa H) wykazuje mniejszą gęstość niż jego
pozostała część. Prążek I jest pośrodku przedzie¬
lony bardzo gęstym optycznie i wąskim prążkiem
(linią) Z (ryc. 48-2).
Mianem sarkomeru określa się obszar pomię¬
dzy dwoma liniami Z (p. ryc. 48-1 i 48-2). Sar-
komery są ułożone szeregowo wzdłuż długiej osi
miofibryli, a odległości między liniami Z wynoszą,
zależnie od stanu skurczu, od 1500 do 2300 nm.
Prążkowanie mięśni szkieletowych i mięśnia
sercowego wynika z wysokiego stopnia organi¬
zacji ich struktury. Większość komórek jest tak
ułożonych, że ich sarkomery tworzą równoległe
szeregi (p. ryc. 48-1).
Grube nitki zawierają miozynę; cienkie
nitki zawierają aktynę, tropomiozynę
i troponinę
Badanie poprzecznych przekrojów miofibryli przy
użyciu mikroskopu elektronowego wykazuje, że
każda z nich jest zbudowana z dwóch typów po¬
dłużnych nitek. Jeden z tych typów (grube nitki)
ograniczony do prążka A, zawiera głównie białko
miozynę. Nitki te mają średnicę ok. 16 nm i na
przekrojach poprzecznych tworzą układ heksago¬
nalny (p. ryc. 48-2, środek; prawy przekrój).
Nitki drugiego typu (o średnicy około 7 nm) leżą
w prążku I, ale rozciągają się również na prążek
A z wyjątkiem jego strefy H (p. ryc. 48-2). Cien¬
kie nitki zawierają białka aktynę, tropomiozynę
i troponinę (ryc. 48-3). W obrębie prążka A cień-
682 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
A. Rozkurczony
Strefa H
Linia Z
2300 nm
B. Skurczony
Filament —
cienki
Filament —
gruby
1500 nm
Średnica 6 nm
Średnica 16 nm
Ryc. 48-2. Ułożenie nitek białkowych w mięśniu poprzecznie prążkowanym. (A) Mięsień rozkurczony. Pokazano położe¬
nie prążków I, A i H w tym stanie. Cienkie nitki częściowo zachodzą za końce nitek grubych; nitki cienkie są zakotwiczone
w liniach Z (często nazywanych dyskami Z). W dolnej części ryciny 48-2A, pokazano groty strzałek wystające z nitek
miozyny (grubych) i skierowane w przeciwne strony. Cztery nitki aktyny (cienkie) zakotwiczone są w dwóch liniach Z za
pośrednictwem a-aktyniny. Środkowy obszar trzech nitek grubych, w którym nie ma grotów strzałek, jest nazywany prąż¬
kiem M (nieoznaczony). Pokazano przekroje poprzeczne przez prążki M, przez obszar, na którym nitki aktyny i miozyny
zachodzą za siebie, oraz obszar, na którym występują tylko nitki aktyny. (B) Mięsień skurczony. Nitki aktyny wślizgnęły
się głębiej pomiędzy nitki miozyny i zbliżyły się do siebie. Długości nitek miozyny (szerokość prążków A) i nitek aktyny
(odległość między prążkiem Z i brzegiem prążka H) nie zmieniły się. Długość sarkomeru zmniejszyła się jednak (z 2300
nm do 1500 nm), długości prążków H i I również się zmniejszyły na skutek większego zachodzenia na siebie nitek aktyny
i miozyny. Te morfologiczne obserwacje dostarczyły elementów do ślizgowego modelu skurczu mięśnia.
kie nitki są ułożone wokół nitek grubych, tworząc
wtórny układ heksagonalny. Każda z cienkich ni¬
tek leży symetrycznie między trzema grubymi (p.
ryc. 48-2, środek; przekrój poprzeczny), a każda
z grubych nitek jest otoczona symetrycznie przez
sześć cienkich.
Grube i cienkie nitki oddziałują na siebie za po¬
średnictwem poprzecznych mostków, które co 14
nm wystają z nitek grubych. Jak widać na ryc. 48-2,
mostki poprzeczne (narysowane jako „groty strza¬
łek” leżące na każdym z końców nitek miozyny, ale
niesięgające całkowicie do nitek cienkich) na dwóch
obwodowych odcinkach nitek miozyny są skierowa¬
ne przeciwnie. Oba bieguny grubych nitek oddziela
wolny od poprzecznych mostków odcinek o długoś¬
ci 150 nm (prążek M, nieoznaczony na rycinie).
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 683
Tropomiozyna Troponina
Ryc. 48-3. Schematyczne przedstawienie cienkiej nitki, pokazujące przestrzenne ułożenie jej trzech głównych komponentów biał¬
kowych: aktyny, troponiny i tropomiozyny. Górna część ryciny pokazuje pojedyncze cząsteczki aktyny G. Środkowa część pokazuje
monomery aktyny tworzące aktynę F. Pokazano również pojedyncze cząsteczki tropomiozyny (dwa zwinięte ze sobą pasma) i troponiny
(składające się z trzech podjednostek). Dolna część pokazuje kompletną cienką nitkę składającą się z aktyny F, tropomiozyny i trzech
podjednostek troponiny (TpC, Tpl, orazTpT).
Model ślizgowo-mostkowy jest podstawę,
na której opierają się współczesne
poglądy na skurcz mięśnia
Model ten został zaproponowany w 1950 r., nie¬
zależnie, przez Henry Huxleya i Andrew Huxleya
oraz ich współpracowników. Był on w dużym stop¬
niu oparty na dokładnych obserwacjach morfolo¬
gii spoczywającego, rozciąganego lub kurczącego
się mięśnia. Kiedy mięsień kurczy się, długość
grubych i cienkich nitek pozostaje niezmieniona,
natomiast strefa H i prążek I się zwężają (patrz
opis ryc. 48-2). Wynika z tego, że zachodzące na
siebie grube i cienkie nitki muszą ślizgać się po
sobie (przesuwać się w stosunku do siebie) w cza¬
sie skurczu. Poprzeczne mostki, które łączą grube
i cienkie nitki na pewnych etapach cyklu skurczo¬
wego, generują i podtrzymują napięcie. Napięcie
wytwarzane w czasie skurczu mięśnia jest propor¬
cjonalne do stopnia zachodzenia na siebie nitek
i liczby poprzecznych mostków. Główka każdego
poprzecznego mostka jest połączona z grubą nit¬
ką za pośrednictwem giętkiego, nitkowatego seg¬
mentu, który może się od niej odginać. Ten giętki
segment ułatwia kontakt główki z cienką nitką,
kiedy to jest potrzebne, a przy tym jego giętkość
jest wystarczająca, aby mostek mógł się zmieścić
w przestrzeni pomiędzy nitkami.
684 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
AKTYNA I MIOZYNA SA GŁÓWNYMI
BIAŁKAMI MIĘŚNIA
Mięsień składa się w prawie 75% z wody i w po¬
nad 20% z białek. Dwoma głównymi białkami
mięśnia są aktyna i miozyna.
Monomeryczna aktyna G (43 kDa; G - glo-
bulama) stanowi wagowo 25% białek mięśnia.
W fizjologicznym zakresie siły jonowej i w obec¬
ności magnezu aktyna G polimeryzuje niekowa-
lencyjnie, tworząc nierozpuszczalną, podwójnie
spiralną (pdwójną helisę) nitkę zwaną aktyną F
(p. ryc. 48-3). Nitka aktyny F ma średnicę 6-7 nm
i strukturę powtarzającą się co 35,5 nm.
Miozyny tworzą rodzinę białek, której co
najmniej 12 klas wykryto w ludzkim genomie.
W tym rozdziale opisano miozynę-II i jeżeli bę¬
dzie mowa o miozynie, to będzie chodziło o ten
właśnie jej rodzaj. Miozyna-I jest białkiem mono-
merycznym i wiąże się z błonami komórkowymi.
Może ona służyć jako, występujący w pewnych
miejscach, łącznik pomiędzy mikrofilamentami
i błoną komórkową.
Miozyna stanowi wagowo 55% białek mięśnia
i tworzy grube nitki. Jest ona asymetrycznym
heksamerem o masie cząsteczkowej ok. 460 kDa.
Miozyna ma nitkowate zakończenie zbudowane
z dwóch skręconych helis. Każda helisa ma na
jednym końcu kulistą (globulamą) główkę (ryc.
48-4). Heksamer składa się z jednej pary łańcu¬
chów ciężkich (H), każdy o masie cząsteczkowej
ok. 200 kDa, i z dwóch par łańcuchów lekkich (L),
każdy o masie cząsteczkowej ok. 20 kDa. Lekkie
łańcuchy różnią się między sobą. Jeden z nich
jest nazywany łańcuchem podstawowym, a drugi
regulatorowym. Miozyna mięśni szkieletowych
wiąże aktynę, tworząc kompleks aktomiozynowy
(aktyna-miozyna). Tworzenie tego kompleksu ak-
Ryc. 48-4. Diagram cząsteczki miozyny pokazujący dwie zwinięte a-helisy (część włókienkowata), główkę (G), lekkie łańcuchy (L),
i efekt proteolitycznego trawienia przez trypsynę i papainę. Główka zawiera miejsce wiążące aktynę i miejsce wiążące łańcuch L i jest
połączona z pozostałą częścią cząsteczki miozyny.
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 685
tywuje jego ATPazę. Ogólne ilości izoform mio¬
zyny są różne w różnych stanach anatomicznych,
fizjologicznych i patologicznych.
Struktura krystalograficzna aktyny i główek
miozyny została określona za pomocą krystalo¬
grafii rentgenowskiej; badania te zweryfikowały
wiele wcześniejszych wyników dotyczących ich
struktury oraz dostarczyły nowych.
Ograniczone trawienie miozyny
proteazami pomogto wyjaśnić
jej strukturę i funkcje
Trawienie miozyny trypsyną powoduje jej rozpad
na dwa fragmenty (meromiozyny). Lekka mero-
miozyna (LMM) składa się z zagregowanych,
nierozpuszczalnych, a-helikalnych nitek pocho¬
dzących z trzonu miozyny (p. ryc. 48-4). LMM
nie wykazuje aktywności ATPazy i nie wiąże się
z aktyną F.
Ciężka meromiozyna (HMM, o masie czą¬
steczkowej ok. 340 kDa) jest rozpuszczalnym
białkiem, zawierającym część nitkowatą i część
globulamą (p. ryc. 48-4). Wykazuje ona aktyw¬
ność ATPazy i wiąże się z aktyną F. Pod wpływem
trawienia papainą HMM rozpada się na dwie
podjednostki, S-l i S-2. Nitkowata podjednostka
S-2 nie wykazuje aktywności ATPazy i nie wiąże
się z aktyną F.
Podjednostka S-l (masa cząsteczkowa ok. 115
kDa) wykazuje aktywność ATPazową, wiąże lek¬
kie łańcuchy (L), a przy braku ATP wiąże się z ak¬
tyną, „dekorując” ją „grotami strzałek” (ryc. 48-5).
Ryc. 48-5. „Dekoracja" nitek aktyny fragmentami S-1 miozyny
tworzy „groty strzał” (dzięki uprzejmości JA Spudich).
Zarówno podjednostka S-l, jak i HMM wykazują
aktywność ATPazy, która nasila się 100-200 razy
na skutek wiązania się ich z aktyną F. Jak to będzie
przedyskutowane niżej, aktyna F znacznie zwięk¬
sza szybkość, z jakąATPaza miozyny uwalnia pro¬
dukty rozpadu ATP, ADP i ?{. Tak więc, chociaż
aktyna F nie wpływa na sam etap hydrolizy, to
jednak ułatwianie przez nią uwalniania produk¬
tów rozpadu ATP znacznie zwiększa szybkość tej
reakcji.
Zmiany konformacji główek miozyny
sa czynnikiem napędowym skurczu
W jaki sposób hydroliza ATP może wywoływać
makroskopowe przesunięcia? Skurcz polega za¬
sadniczo na cyklicznym przyłączaniu główek
podjednostek S-l miozyny do nitek aktyny F
i następnie odłączaniu. Można też powiedzieć,
że proces ten to na przemian tworzenie i zrywa¬
nie poprzecznych mostków. Połączenie aktyny
z miozyną pociąga za sobą zmiany konformacji,
szczególnie w główce podjednostki S-l, zależne
od tego, który z nukleotydów jest obecny (ADP
lub ATP). Te zmiany konformacyjne prowadzą
do powstania impulsu siły, która przesuwa nitki
aktyny względem nitek miozyny. Ostatecznym
źródłem tej siły jest energia pochodząca z hydro¬
lizy ATP do ADP i ?r Bezpośrednią przyczyną
powstania impulsu siłowego jest jednak zmiana
konformacji główki miozyny powstająca w mo¬
mencie oddzielenia od niej ADP.
Główne zjawiska biochemiczne zachodzące
w czasie jednego cyklu skurczowo-rozkurczo-
wego mięśnia mogą być ujęte w pięciu etapach,
przedstawionych na ryc. 48-6:
(1) W fazie rozkurczu mięśnia główki S-l
miozyny hydrolizują ATP do ADP i Pi5 jednak
produkty reakcji pozostają z nimi związane. Po¬
wstający w ten sposób kompleks ADP-Prmiozy-
na jest pobudzony, tj. znajduje się w stanie tzw.
konformacji wysokoenergetycznej.
(2) Kiedy mięsień zostaje pobudzony do skur¬
czu (w wyniku opisanych niżej zjawisk, w których
uczestniczą jony Ca2+, troponina, tropomiozyna
i aktyna), aktyna staje się dostępna dla miozyny,
której główki odnajdują ją i wiążą się z nią, two¬
rząc kompleks aktyna-miozyna-ADP-
(3) Utworzenie tego kompleksu ułatwia od¬
dzielenie Pj, co inicjuje impuls siłowy. Po oddzie-
686 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
—W-yy-
Nitka gruba
LMM
2 S-2 ^7vS-1
Ryc. 48-6. Hydroliza ATP napędza cykliczne łączenie i rozłączanie
aktyny i miozyny w pięciu reakcjach opisanych w tekście. (Zmo¬
dyfikowane z: Stayer L: Biochemistry, 2nd ed. Freeman, 1981.
Copyright by W Freeman and Company).
leniu Pj następuje uwolnienie ADP, któremu towa¬
rzyszą duże zmiany konformacji główek miozyny
w stosunku do jej trzonu (ryc. 48-7), przesuwające
nitkę aktyny o ok. 10 nm w kierunku środka sar-
komeru. Na tym polega impuls siłowy. Miozyna
znajduje się teraz w tzw. stanie niskoenergetycz-
nym, określanym jako aktomiozyna.
(4) Następna cząsteczka ATP przyłącza się do
główki S-1, tworząc kompleks aktyna-miozyna-ATP.
(5) Miozyna związana z ATP ma małe powi¬
nowactwo do aktyny, która zostaje wobec tego
uwolniona. Ten ostatni etap jest kluczowym ele¬
mentem rozkurczu i zależy od wiązania ATP przez
kompleks aktyna-miozyna.
Hydroliza ATP rozpoczyna następny cykl
(etap 1, ryc. 48-6), przywracając konformację
wysokoenergetyczną.
Tak więc hydroliza ATP zostaje użyta jako siła
napędowa cyklu, przy czym impuls siłowy wyni¬
ka ze zmiany konformacji główki S-l powstającej
w chwili oddzielenia od niej ADP. Obszary „za¬
wiasowe” miozyny (opisane w podpisie pod ryc.
48-7 jako giętkie miejsca na końcu każdej pod-
jednostki S-2) pozwalają na duży zakres ruchu
podjednostek S-l, jak również umożliwiają im
odnalezienie nitek aktyny.
Jeżeli poziom ATP w komórce zmniejsza się
(np. po śmierci), brak jest ATP, który mógłby się
związać z główką S-l (etap 4), aktyna nie dyso¬
cjuje, wobec czego rozkurcz (etap 5) nie zacho¬
dzi. Tak powstaje rigor mortis, tj. zesztywnienie
ciała po śmierci.
Nitka cienka
Ryc. 48-7. Obraz aktywnych mostków pomiędzy grubymi
i cienkimi nitkami. Diagram ten został zaadaptowany przez AF
Huxleya z HE Huxleya: Mechanizm skurczu mięśnia. Science
1969:164:1356. W tej ostatniej pracy zaproponowano, że siła za¬
angażowana w skurcz mięśnia wynika z tendencji główki miozyny
(S-1) do obrotu w stosunku do cienkiej nitki i jest przekazywana na
nitkę grubą przez fragment S-2 cząsteczki miozyny, działający jak
nierozciągliwe ogniwo. Elastyczne miejsca na każdym z końców
S-2 umożliwiają obrót S-1, jak również zmianę odstępu pomiędzy
nitkami. Rycina niniejsza jest oparta na propozycji HE Huxleya, lecz
uwzględnia również elementy elastyczne (sprężynki we fragmencie
S-2), jak również skokowo skracające się elementy (przedsta¬
wione tutaj jako miejsca oddziaływania między fragmentami S-1
1 cienką nitką), (patrz: Huxley AF, Simmons RM: Proposed mecha-
nism of force generation of striated muscle. Naturę [Lond] 1971;
233:533). Siła wiązania połączonych miejsc jest większa w pozycji
2 niż w pozycji 1 i większa w pozycji 3 niż w pozycji 2. Główka
miozyny może być odłączona z pozycji 3 przez cząsteczkę ATP;
jest to dominujący proces w toku skurczu. Jak podano w tekście,
główka miozyny zmienia swą pozycję z ok. 90° do ok. 45°. (S-1 -
główka miozyny: S-2 - fragment cząsteczki miozyny; LMM - lekka
meromiozyna) (patrz podpis pod ryciną 48-4). (Reprodukowano z:
Huxley AF: Muscular contraction. J Physiol 1974,243:1. Za uprzej¬
mym zezwoleniem autora i Journal of Physiology).
Obliczenia wykazały, że wydajność energetyczna
skurczu wynosi ok. 50%; wydajność energetyczna
silników spalinowych wynosi mniej niż 20%.
Kompleks tropomiozyny i troponiny
występujący w cienkich nitkach pełni
w mięśniu poprzecznie prążkowanym
kluczowe funkcje
W mięśniu poprzecznie prążkowanym występują
dwa inne białka, których masa jest mała, ale funk¬
cja bardzo ważna. Tropomiozyna jest nitkowatą
cząsteczką, składającą się z dwóch łańcuchów, a
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 687
i p. Przyłącza się ona do aktyny F w rowku pomię¬
dzy jej łańcuchami (p. ryc. 48-3). Tropomiozyna
występuje we wszystkich strukturach mięśniowych
i mięśniopodobnych. Kompleks troponinowy wy¬
stępuje tylko w mięśniach poprzecznie prążkowa¬
nych i składa się z trzech polipeptydów. Troponi-
na T (TpT) wiąże się z tropomiozyną i z dwoma
innymi składnikami troponiny. Troponina I (Tpl)
hamuje oddziaływanie aktyny F z miozyną oraz
wiąże się z pozostałymi składnikami troponiny. Tro¬
ponina C (TpC) jest polipeptydem wiążącym Ca2+,
pod względem strukturalnym i czynnościowym
podobnym do kalmoduliny, rozpowszechnionego
w przyrodzie białka wiążącego wapń. Cząstecz¬
ka każdego z tych białek ma masę cząsteczkową
17 kDa i wiąże 4 jony wapnia.
Ca2+ odgrywa kluczowa rolo
w regulacji skurczu mięśnia
Skurcz wszystkich rodzajów mięśni odbywa się
według opisanego wyżej mechanizmu ogólnego.
Mięśnie różnych organizmów lub zbudowane
z różnych komórek, pochodzących z różnych tka¬
nek, mogą mieć różne mechanizmy molekularne
odpowiedzialne za regulację skurczu i rozkurczu
mięśni. We wszystkich mięśniach Ca2+pełni funk¬
cję kluczowego regulatora. Rozróżnia się dwa
główne mechanizmy regulacji skurczu mięśnia:
skurcz oparty na aktynie i skurcz oparty na
miozynie. Ten pierwszy funkcjonuje w mięśniach
szkieletowych i w mięśniu sercowym, a drugi
- w mięśniach gładkich.
Regulacja oparta na aktynie występuję
w mięśniach poprzecznie prążkowanych
Regulacja skurczu oparta na aktynie występuje
w mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym
(mięśnie poprzecznie prążkowane) kręgowców.
W ogólnym mechanizmie opisanym wyżej (p.
ryc. 48-6) jedynym czynnikiem limitującym cykl
może być ATR Układ mięśnia szkieletowego jest
w czasie jego spoczynku zahamowany; to zaha¬
mowanie jest znoszone w celu aktywacji skurczu.
Inhibitorem mięśnia szkieletowego jest układ
troponiny związany z tropomiozyną cienkiej nitki
aktyny F (p. ryc. 48-3). W mięśniu poprzecznie
prążkowanym bez obecności układu troponina-
-tropomiozyna nie byłoby żadnej regulacji skur¬
czu. Jak to przedstawiono wyżej, tropomiozyna
leży w rowku pomiędzy łańcuchami aktyny F
i wiąże 3 części troponiny - TpT, Tpl i TpC. Tpl
zapobiega łączeniu się główek miozyny z miej¬
scami wiązania na aktynie F albo przez zmianę
konformacji aktyny F pod wpływem cząsteczek
tropomiozyny, albo przez proste przesunięcie tro-
pomiozyny do pozycji, w której blokuje ona bez¬
pośrednio miejsca wiązania główek na aktynie F.
Oba mechanizmy zapobiegają aktywacji ATPazy
miozyny, zachodzącej na skutek wiązania jej głó¬
wek z aktyną F. W ten sposób układ Tpl blokuje
etap 2 skurczu, przedstawiony na ryc. 48-6. Od¬
powiada to za stan rozkurczowego zahamowania
mięśnia poprzecznie prążkowanego.
Siateczka sarkoplazmatyczna reguluje
wewnątrzkomórkowy poziom Ca2+
w mięśniach szkieletowych
Stężenie Ca2+ w sarkoplazmie mięśnia w stanie
spoczynku wynosi od 10 8 do 10'7mol/L. Stan
spoczynku jest wynikiem wychwytu Ca2+ przez
siateczkę sarkoplazmatyczną, możliwego dzięki
działaniu układu aktywnego transportu, zwane¬
go Ca2+-ATPazą (ryc. 48-8). Inicjuje on rozkurcz.
Siateczka sarkoplazmatyczna jest siecią małych,
błoniastych pęcherzyków. Wewnątrz siatecz¬
ki sarkoplazmatycznej Ca2+ jest wiązany przez
specyficzne białko, zwane kalsekwestryną. Sar-
komer jest otoczony pobudliwymi błonami, sta¬
nowiącymi ściany kanalików poprzecznych (T)
ściśle związanych z siateczką sarkoplazmatyczną.
[Opis ten jest błędny z morfologicznego punktu
widzenia: siateczka nie jest siecią pęcherzyków,
lecz składa się z części kanalikowej, oplatającej
sarkomery, i części pęcherzykowej, pozostającej
w apozycji w stosunku do ścian kanalików po¬
przecznych T. Kanaliki T nie otaczają sarkome-
rów -przyp. tłum.].
Kiedy sarkolema zostaje pobudzona przez im¬
puls nerwowy, sygnał jest przewodzony przez
kanaliki T, co powoduje otwarcie kanałów wap¬
niowych siateczki sarkoplazmatycznej i gwał¬
towne uwolnienie jej wapnia do sarkoplazmy.
Stężenie Ca2+ w sarkoplazmie gwałtownie rośnie
do wartości 10-5 mol/L. Miejsca wiązania TpC zo¬
stają szybko zajęte przez Ca2+. TpC-4Ca2+ reagu¬
je z Tpl oraz TpT, zmieniając ich oddziaływanie
z tropomiozyną. Tropomiozyna usuwa się z miejsc
688 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
wiązania główek miozyny na aktynie lub zmienia
konformację aktyny F tak, że kompleks główka
miozyny-ADP-Pj (p. ryc. 48-6) może reagować
z aktyną F, zapoczątkowując cykl skurczowy.
Ryc. 48-8. Diagram zależności między sarkolemą (błoną plazma-
tyczną), kanalikiem T i dwoma pęcherzykami siateczki sarkopla-
zmatycznej mięśnia szkieletowego (skala niezachowana). Kanalik
T rozciąga się od sarkolemy w głąb komórki. Fala depolaryzacji
wzbudzona impulsem nerwowym jest przewodzona od sarkole¬
my wzdłuż kanalika T. Następnie jest ona przekazywana na kanał
wydzielający Ca2+ (receptor rianodynowy) wskutek oddziaływa¬
nia między nim a receptorem dihydropirydynowym (wolny kanał
Ca2+). Jak to pokazano na rycinie, znajdują się one bardzo blisko
siebie. Wydzielenie Ca2+ przez receptor rianodynowy do cytozolu
aktywuje skurcz. Następnie Ca2+ jest pompowany z powrotem
do pęcherzyków siateczki sarkoplazmatycznej przez Ca2+-ATPazę
(pompę Ca2+) i tam magazynowany, częściowo w postaci zwią¬
zanej z kalsekwestryną.
Kanały wapniowe siateczki sarkoplazmatycz¬
nej są również nazywane receptorami rianody-
nowymi (RYR). Znane są dwie izoformy tych
receptorów, RYR1 i RYR2 [w rzeczywistości są
trzy formy RYR: 1 - mięśnie szkieletowe, 2 -
mięsień sercowy i 3 - układ nerwowy - przyp.
tłum.]. Pierwszy z nich występuje w mięśniach
szkieletowych, a drugi w mięśniu sercowym
i w mózgu. Rianodyna jest alkaloidem pocho¬
dzenia roślinnego, który - wiążąc się swoiście
z receptorami RYR1 i RYR2 - zmienia ich aktyw¬
ność. Kanały Ca2+ siateczki sarkoplazmatycznej
są homotetramerami, zbudowanymi z czterech
podjednostek o masie 565 kDa każda. Na swoich
końcach karboksylowych zawierają one sekwen¬
cje przezbłonowe, które prawdopodobnie tworzą
kanał wapniowy. Pozostała część białka wystaje
do cytozolu, tworząc mostek w poprzek szczeliny
pomiędzy siateczką sarkoplazmatyczną a ścianą
kanalika T. In vitro kanał jest bramkowany li-
gandem, przy czym Ca2+ i ATP działają synergi-
stycznie. Nie jest jednak jasne, jak kanał działa in
vivo. Możliwa sekwencja zdarzeń prowadzących
do otwarcia kanału została przedstawiona na ryc.
48-9. Kanał leży bardzo blisko receptora dihy-
dropirydynowego (DHPR; bramkowany napię¬
ciem elektrycznym, powolny kanał wapniowy
typu K) ściany kanalika T (p. ryc. 48-8). W do¬
świadczeniach in vitro z użyciem chromatografii
kolumnowej wykazano, że składający się z 37
reszt aminokwasowych odcinek w RYR1 reaguje
z jedną specyficzną pętlą DHPR.
Depolaryzacja nerwu
Depolaryzacja mięśnia szkieletowego
Depolaryzacja błony kanalika poprzecznego
Przesunięcie ładunku wolnego kanału Ca2+
(DHPR) błony kanalika poprzecznego
Otwarcie kanału wydzielającego Ca2+ (RYR1)
Ryc. 48-9. Prawdopodobny łańcuch zdarzeń prowadzący do
otwarcia kanału wydzielającego Ca2+. Jak podano w tekście,
bramkowany potencjałem kanał Ca2+ i wydzielający Ca2+ kanał
(siateczki sarkoplazmatycznej) oddziałują na siebie wzajemnie za
pośrednictwem specyficznych obszarów w swych łańcuchach
polipeptydowych. DHPR - receptor dihydropirydynowy; RYR1
- receptor rianodynowy 1.
Rozkurcz występuje wtedy, kiedy stężenie Ca2+
w sarkoplazmie zmniejsza się do wartości mniejszej
niż 10 7 mol/L, na skutek ponownego wyłapywa¬
nia jonów przez Ca2+-ATPazę siateczki sarkopla¬
zmatycznej. W efekcie tego TpC-4Ca2+ traci swój
wapń. W wyniku oddziaływania z tropomiozyną
troponina hamuje dalsze oddziaływanie między
główkami miozyny i aktyną F. W obecności ATP
główki miozyny oddzielają się od aktyny F.
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 689
Jony Ca2+ kontrolują więc skurcz mięśnia we¬
dług allosterycznego mechanizmu, w którym biorą
udział TpC, Tpl, TpT, tropomiozyna i aktyna F.
Zmniejszenie stężenia ATP w sarkoplazmie
(np. na skutek intensywnego zużycia w cyklu
skurczowo-rozkurczowym lub osłabionej synte¬
zy, jaka może wystąpić w niedokrwieniu) wywo¬
łuje dwa główne efekty: (1) Ca2+-ATPaza (pom¬
pa wapniowa) siateczki sarkoplazmatycznej nie
może utrzymywać niskiego stężenia Ca2+ w sarko¬
plazmie. Ułatwione zatem zostaje oddziaływanie
główek miozyny z aktyną F. (2) Nie może nastą¬
pić zależne od ATP oddzielenie główek miozyny
od aktyny F, co powoduje wystąpienie stężenia
mięśni (rigor). Stan rigor mortis występujący po
śmierci jest stanem krańcowym.
Skurcz mięśnia jest wynikiem subtelnej, dy¬
namicznej równowagi między przyłączaniem
główek miozyny do aktyny F i ich odłączaniem,
podlegającej regulacji przez układ nerwowy.
W tabeli 48-1 przedstawiono pełną sekwencję
zdarzeń w czasie skurczu i rozkurczu mięśnia
szkieletowego.
Tabela 48-1. Kolejność zdarzeń w trakcie skurczu i rozkurczu
mięśnia szkieletowego1
Etapy skurczu
(1) Pobudzenie neuronu ruchowego
(2) Wydzielenie przekaźnika (acetylocholiny) na płytce moto-
rycznej
(3) Wiązanie acetylocholiny z receptorami nikotynowymi ace¬
tylocholiny
(4) Zwiększona przewodność dla Na+ i K+ w błonie płytki mo-
torycznej
(5) Powstanie potencjału płytkowego
(6) Powstanie potencjału czynnościowego we włóknach miꜬ
niowych
(7) Dokomórkowe rozprzestrzenianie się potencjału wzdłuż ka¬
nalików T
(8) Wydzielenie Ca2+ z pęcherzyków końcowych siateczki sar¬
koplazmatycznej i jego dyfuzja do grubych i cienkich nitek
(9) Wiązanie Ca2+ z troponiną C i odsłonięcie miejsc aktyny
wiążących miozynę
(10) Tworzenie poprzecznych połączeń pomiędzy aktyną i miozy¬
ną oraz ślizganie się cienkich nitek po grubych, co powoduje
skrócenie włókna
Etapy rozkurczu
(1) Ca2+ jest pompowany z powrotem do siateczki sarkopla¬
zmatycznej
(2) Uwolnienie Ca2+ z troponiny
(3) Zanik oddziaływania między aktyną i miozyną
1 Reprodukowane za pozwoleniem z Ganong WF: Review ofMedi-
cal Physiology, 21st ed. McGraw-Hill, 2003.
Mutacje genu kodującego kanały Ca2*
siateczki sarkoplazmatycznej są jedną
z przyczyn hipertermii złośliwej u ludzi
U niektórych genetycznie predysponowanych
pacjentów niektóre anestetyki (np. halotan) lub
depolaryżujące środki zwiotczające mięśnie (np.
sukcynylocholina) wywołują ciężkie schorzenie,
znane jako hipertermia złośliwa. Objawia się
ono przede wszystkim stężeniem mięśni szkie¬
letowych, hipermetabolizmem i bardzo dużą
ciepłotą ciała. Główną przyczyną jest wysokie
stężenie Ca2+ w cytozolu mięśni. Jeżeli hiper¬
termia złośliwa nie zostaje rozpoznana i natych¬
miast odpowiednio leczona, chorzy mogą umrzeć
nagle z powodu migotania komór serca, a jeśli je
przeżyją, mogą umrzeć później z powodu innych
ciężkich powikłań. Właściwym leczeniem jest
natychmiastowe wycofanie anestetyku i podanie
dożylne leku o nazwie dantrolen. Dantrolen jest
środkiem zwiotczającym mięśnie szkieletowe,
działającym na zasadzie hamowania wydzielania
Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej do cytozolu.
W ten sposób dantrolen zapobiega występujące¬
mu w hipertermii złośliwej wzrostowi stężenia
Ca2+ w cytozolu.
Hipertermia złośliwa występuje również
u świń. Podatne na niąhomozygoty tych zwierząt
reagują na stres prowadzącym do śmierci stanem
(świński syndrom stresowy) podobnym do tego,
jaki występuje u ludzi. Jeśli reakcja taka wystąpi
przed ubojem, mięso będzie znacznie gorszej ja¬
kości. Stany te mogą powodować znaczne straty
w przemyśle mięsa wieprzowego.
Stwierdzenie wysokiego stężenia Ca2+ w cy¬
tozolu komórek mięśni w hipertermii złośliwej
sugeruje, że stan ten może być spowodowany za¬
burzeniami czynności Ca2+-ATPazy lub kanałów
wapniowych siateczki sarkoplazmatycznej. Nie
zauważono żadnych nieprawidłowości enzymu,
jednak sekwencjonowanie cDNA dla kanałów
dostarczyło ciekawych informacji, szczególnie
w przypadku świń. Wszelkie do tej pory badane
cDNA pochodzące od świń ze złośliwą hiperter-
mią wykazują podstawienie T zamiast C w pozy¬
cji 1843, co powoduje podstawienie Cys zamiast
Arg615 w kanałach wapniowych siateczki. Ta mu¬
tacja zmienia funkcję kanałów w ten sposób, że
otwierają się one łatwiej i dłużej pozostają otwar¬
te; wypadkowym efektem jest masowe wydzie-
690 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
lanie Ca2+ do cytozolu, powodujące ostatecznie
trwały przykurcz mięśni.
Obraz jest bardziej złożony u ludzi, ponie¬
waż hipertermia złośliwa wykazuje genetyczną
heterogenność. U członków wielu rodzin, które
cierpią na hipertermię złośliwą nie wykazano ge¬
netycznego związku z genem RYR1. Niektórzy
ludzie podatni na hipertermię złośliwą wykazu¬
ją taką mutację, jaką znajduje się u świń. Inni
mogą mieć jednak mutacje punktowe w innych
miejscach genu RYRJ. W niektórych rodzinach
z hipertermią złośliwą wykryto mutacje zmie¬
niające DHPR. Na rycinie 48-10 przedstawiono
prawdopodobny łańcuch zjawisk w hipertermii
złośliwej. Główną nadzieją płynącą z tych ba¬
dań jest to, że kiedy zostaną wykryte dodatkowe
mutacje, będzie możliwe przeprowadzenie przy
użyciu odpowiednich sond DNA badań prze¬
siewowych wykrywających osoby, u których
występuje ryzyko hipertermii złośliwej w czasie
narkozy. Obecnie stosowane testy przesiewowe
(np. test kofeinowo-halotanowy in vitró) są mało
wiarygodne. Osoby z tego typu ryzykiem mo¬
głyby być poddawane innej narkozie, nienara-
żającej ich życia na niebezpieczeństwo. Powinno
być również możliwe wyeliminowanie hiperter¬
mii złośliwej z populacji świń przez prowadze¬
nie odpowiednich krzyżówek.
Ryc. 48-10. Uproszczony schemat przyczyn hipertermii złośliwej
(MIM 145600). Wykryto co najmniej 17 różnych mutacji punk¬
towych w genie RYR1. Niektóre z nich są związane z chorobą
central core (MIM 117000). Uważa się, że u co najmniej 50%
rodzin, których członkowie cierpią na hipertermię złośliwą wystę¬
pują nieprawidłowości w genie RYR1. U niektórych osób wykryto
również mutacje w genie kodującym DHPR; jest możliwe, że zo¬
staną również wykryte mutacje innych genów kodujących białka
zaangażowane w pewne elementy metabolizmu mięśniowego.
Innym stanem występującym w wyniku muta¬
cji w genie RYRJ jest central core disease [brak I
polskiego terminu - przyp. tłum.]. Jest to rzadka '
miopatia, pojawiająca się w niemowlęctwie, prze- 1
jawiająca się hipotonią i słabością mięśni proksy-
malnych. Badanie przy użyciu mikroskopu elek¬
tronowego wykazuje brak mitochondriów w cen¬
tralnych częściach wielu włókien mięśniowych
typu I (patrz niżej). Za te objawy morfologiczne
okazuje się być odpowiedzialne uszkodzenie mi¬
tochondriów przez wysokie wewnątrzkomórkowe
stężenie Ca2+> będące wynikiem nieprawidłowego
funkcjonowania RYRJ.
MUTACJE GENU KODUJĄCEGO
DYSTR0FINĘ POWODUJĄ DYSTR0FIĘ
MIĘŚNI TYPU DUCHENNE A
W strukturze i funkcjonowaniu mięśnia odgrywa
różnorodną rolę wiele dodatkowych białek. Nale¬
żą do nich tytyna (największe ze znanych białek),
nebulina, a-aktynina, desmina, dystrofina i kalcy-
neuryna. Niektóre właściwości tych białek przed¬
stawiono w tab. 48-2.
Tabela 48-2. Niektóre inne ważne białka mięśnia
Białko
Umiejscowienie
Komentarz lub funkcja
Tytyna
Rozciąga się od
linii Z do linii M
Największe białko w ustroju
Rola w rozkurczu mięśnia
Nebulina
Od linii Z wzdłuż
nitek aktyny
Może regulować tworzenie się
i długość nitek aktyny
a-Aktynina
Zakotwicza aktynę
w liniach Z
Stabilizuje nitki aktyny
Desmina
Ułożona wzdłuż
nitek aktyny
Połączona z błoną plazma-
tyczną (plazmalemą)
Dystrofina
Połączona
z plazmalemą
Brak w dystrofii mięśni typu
Duchenne’a. Mutacje jej genu
mogą również powodować
kardiomiopatię rozstrzeniową
Kalcyneu-
ryna
Cytozol
Fosfataza regulowana przez
kalmodulinę. Może odgrywać
dużą rolę w przeroście miꜬ
nia sercowego i w regulacji
liczby szybko i wolno kurczą¬
cych się włókien mięśniowych
Białko C
wiążące
miozynę
Ułożone poprzecz¬
nie w prążkach A
sarkomerów
Wiąże miozynę i tytynę
Odgrywa rolę w integracji
struktury sarkomeru
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 691
Szczególne zainteresowanie budzi dystrofina.
Stwierdzono, że mutacje genu kodującego dys-
trofinę powodują wystąpienie dystrofii mięśni
Ryc. 48-11. Podsumowanie przyczyn dystrofii mięśniowej
Duchenne’a (MIM 310200).
typu Duchenne’a lub łagodniejszej dystrofii typu
Beckera (ryc. 48-11). Przypisuje się im również
ważną rolę w niektórych przypadkach kardio-
miopatii rozstrzeniowej (patrz niżej). Gen kodu¬
jący dystrofinę jest największym ze znanych (ok.
2300 kz) i jest zlokalizowany na chromosomie
X, z czego wynika dziedziczenie dystrofii typu
Duchenne’a i Beckera po matce. Jak to pokaza¬
no na ryc. 48-12, dystrofina stanowi część duże¬
go kompleksu białek, połączonego i reagującego
z sarkolemą. Dystrofina łączy aktynowy szkielet
komórkowy z macierzą zewnątrzkomórkową, jak
również jest potrzebna do utworzenia połączeń
synaptycznych. Zaburzenia tych procesów na
skutek tworzenia nieprawidłowej dystrofiny jest
przypuszczalnie główną przyczyną dystrofii typu
Duchenne’a. Mutacje genów kodujących niektóre
komponenty kompleksu sarkoglikanu, pokaza-
Ryc. 48-12. Rozmieszczenie dystrofiny i innych białek w stosunku do sarkolemy komórek mięśniowych. Dystrofina jest częścią dużego
oligomerycznego kompleksu połączonego z kilkoma innymi kompleksami białkowymi. Kompleks dystroglikanu składa się z dystrogli-
kanu a, który łączy się z białkiem błony podstawnej, merozyną (zwaną także lamininą-2), i dystroglikanu p, który wiąże dystroglikan a
i dystrofinę. Syntropina wiąże się z karboksylowym końcem dystrofiny. Kompleks sarkoglikanu składa się z czterech białek przezbłono-
wych: sarkoglikanów a, p, y i 6. Funkcja kompleksu sarkoglikanu i istota oddziaływania w obrębie kompleksu oraz między nim i innymi
kompleksami nie jest jasna. Kompleks sarkoglikanu tworzy się wyłącznie w mięśniach poprzecznie prążkowanych. Podjednostki tego
kompleksu łączą się preferencyjnie ze sobą, co sugeruje, że może on funkcjonować jako osobna jednostka. Mutacje genów kodujących
dystrofinę powodują dystrofię mięśniową typu Duchenne’a i typu Beckera; wykazano, że mutacje genów kodujących różne sarkoglikany
są odpowiedzialne za dystrofię obręczową 604286). (Reprodukowano za zezwoleniem z: Duggan DJ et al.: Mutations in the sarcoglycan
genes in patients with myopathy. N Engl J Med 1997;336:618. Copyright © 1997 Massachusetts Medical Society. Ali rights reserved).
692 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
ne na ryc. 48-12, są odpowiedzialne za dystrofię
obręczową i niektóre inne postacie dystrofii miꜬ
niowej.
Stwierdzono, że mutacje genów kodujących
wiele glikotransferaz uczestniczących w syntezie
łańcuchów cukrowych a-dystroglikanu powodu¬
ją pewne typy wrodzonej dystrofii mięśni (patrz
rozdz. 46).
MIĘSIEŃ SERCOWY POD WIELOMA
WZGLĘDAMI PRZYPOMINA MIĘSIEŃ
SZKIELETOWY
Skurcz mięśnia sercowego przypomina w swoim
ogólnym obrazie skurcz mięśnia szkieletowego.
Mięsień sercowy jest poprzecznie prążkowany,
a jego skurcz opiera się na opisanym powyżej
układzie aktyna-miozyna-tropomiozyna-troponi-
na. W przeciwieństwie do mięśnia szkieletowego,
mięsień sercowy ma swój własny automatyzm,
a jego miocyty komunikują się ze sobą w układzie
syncycjalnym. System kanalików poprzecznych
T jest w mięśniu sercowym silniej rozwinięty, na¬
tomiast siateczka sarkoplazmatyczna - słabiej,
dlatego dostarcza ona mniej jonów Ca2+ potrzeb¬
nych do aktywacji skurczu. Skurcz mięśnia ser¬
cowego zależy wobec tego od Ca2+ zewnątrzko-
mórkowego; kiedy izolowany mięsień sercowy
zostaje pozbawiony Ca2+, jego skurcze zanikają
w czasie 1 min [skurcze zanikają natychmiast -
przyp. tłum.], podczas kiedy mięsień szkieletowy
może się kurczyć [przez długi czas -przyp. tłum.]
bez obecności zewnątrzkomórkowego Ca2+. Cy¬
kliczny AMP odgrywa większą rolę w mięśniu
sercowym niż w mięśniu szkieletowym. Modyfi¬
kuje on wewnątrzkomórkowe poziomy Ca2+ przez
aktywację kinaz białek; enzymy te fosforylują
różne białka transportujące w sarkolemie i sia¬
teczce sarkoplazmatycznej, jak również w regu¬
latorowym kompleksie troponina-tropomiozyna,
wpływając na wewnątrzkomórkowy poziom Ca2+
i reakcje nań. Istnieje pewna korelacja między
fosforylacją Tpl i zwiększoną pod wpływem ka-
techolamin siłą skurczu. Może to odpowiadać za
inotropowe efekty (zwiększanie kurczliwości)
związków p-adrenergicznych w sercu. Niektóre
różnice między mięśniem szkieletowym, serco¬
wym i mięśniami gładkimi zostały przedstawione
w tab. 48-3.
Tabela 48-3. Niektóre różnice między mięśniem szkieletowym, sercowym i gładkim
Mięsień szkieletowy
Mięsień sercowy
Mięsień gładki
1. Prążkowany
1. Prążkowany
1. Nieprążkowany
2. Nie stanowi syncycjum
2. Stanowi syncycjum
2. Nie stanowi syncycjum
3. Małe kanaliki T
3. Duże kanaliki T
3. Głównie rudymentarne (szczątkowe)
kanaliki T
4. Siateczka sarkoplazmatyczna dobrze
rozwinięta, a pompa wapniowa działa
szybko
4. Siateczka sarkoplazmatyczna obecna,
a pompa wapniowa działa względnie
szybko
4. Siateczka sarkoplazmatyczna często słabo
rozwinięta, a pompa wapniowa działa wolno
5. W plazmalemie brak jest wielu
receptorów dla hormonów
5. Plazmalema zawiera różnorodne
receptory (np. a- i p-adrenergiczne)
5. Plazmalema zawiera różnorodne receptory
(np. a- i p-adrenergiczne)
6. Skurcz jest inicjowany przez impuls
nerwowy
6. Posiada wewnętrzny automatyzm
6. Skurcz jest inicjowany przez impulsy
nerwowe, hormony itd.
7. Zewnątrzkomórkowy Ca2+ nie jest
ważny dla skurczu
7. Zewnątrzkomórkowy Ca2+ ważny dla
skurczu
7. Zewnątrzkomórkowy Ca2+ ważny dla
skurczu
8. Układ troponiny obecny
8. Układ troponiny obecny
8. Nie zawiera układu troponiny: wykorzystuje
regulatorową główkę miozyny
9. Kaldesmon nie jest zaangażowany
9. Kaldesmon nie jest zaangażowany
9. Kaldesmon jest ważnym białkiem
regulatorowym
10. Bardzo szybkie cykle mostków
10. Względnie szybkie cykle mostków
10. Powolne cykle mostków pozwalają na
długotrwały skurcz przy małym zużyciu ATP
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 693
Ca2+ wnika do miocytów serca przez kanały
Ca2+, a opuszcza je za pośrednictwem
wymiennika Na+-Ca2+ oraz Ca2+-ATPazy
Jak już wspomniano, zewnątrzkomórkowy Ca2+
odgrywa ważną rolę w skurczu mięśnia sercowego,
ale nie szkieletowego. Oznacza to, że Ca2+ wchodzi
do miocytów i opuszcza je w uporządkowany spo¬
sób. Zostaną bliżej omówione trzy białka przezbło-
nowe, odgrywające rolę w tych procesach.
A. Kanały Ca2*
Ca2+ wchodzi do miocytów przez kanały specy-
ficzne dla tego jonu. Głównie są to kanały typu L
(długi czas przepływu prądu, duża przewodność),
zwane również wolnymi [tej nazwy od dawna się
nie używa -przyp. tłum.]. Są one bramkowane po¬
tencjałem błonowym, otwierają się kiedy poten¬
cjał czynnościowy rozprzestrzenia się w komórce,
a zamykają w czasie repolaryzacji. Są one odpo¬
wiednikiem receptorów dihydropirydynowych
mięśni szkieletowych (p. ryc. 48-8). Wolne kana¬
ły wapniowe są regulowane przez kinazy białek
zależne od cAMP (pobudzające) i kinazy zależne
od cGMP (hamujące) i są blokowane przez tzw.
blokery kanałów wapniowych (np. werapamil).
W plazmalemie występują również szybkie (lub
T od ang. transient) kanały Ca2+, aczkolwiek gę¬
stość ich jest znacznie mniejsza; prawdopodobnie
mają one udział we wczesnej fazie wzrostu stęże¬
nia Ca2+ w mioplazmie.
Będący skutkiem aktywacji kanałów wapnio¬
wych wzrost stężenia tych jonów w mioplazmie
działa aktywująco na wydzielające Ca2+ kanały sia¬
teczki sarkoplazmatycznej. Zjawisko to nazywane
jest uwalnianiem wapnia przez wapń (ang. Ca2+-
-induced Ca2+ release - CICR). Szacuje się, że ok.
10% Ca2+ zaangażowanego w aktywację skurczu
dostaje się do cytozolu z płynu zewnątrzkomórko-
wego, a 90% - z siateczki sarkoplazmatycznej. Te
10% jest jednak bardzo ważne, ponieważ ważna
jest szybkość wzrostu stężenia Ca + w mioplazmie,
a wejście Ca2+ przez kanały wapniowe ma w tym
swój udział [zależnie od gatunku zwierzęcia spoza
komórki napływa od 10 do ok. 50% Ca2+ aktywują¬
cego skurcz -przyp. tłum.].
B. Wymiennik Ca2+-Na+
Jest on głównym mechanizmem wychodzenia
Ca2+ z miocytów. W stanie spoczynku pomaga on
utrzymać niski poziom wolnego Ca2+ w komórce,
wymieniając 1 Ca2+ na 3 Na\ Energia przesunięcia
Ca2+ wbrew gradientowi stężeń pochodzi z energii
dokomórkowej dyfuzji Na\ Wymiana ta ma udział
w rozkurczu, ale w czasie pobudzenia może za¬
chodzić także w odwrotnym kierunku. W wyniku
mechanizmu działania wymiennika Na+/Ca2+ jaki¬
kolwiek czynnik powodujący wzrost stężenia Na+
(Na*), powoduje też wtórnie wzrost stężenia Ca2+,
co pociąga za sobą wzrost siły skurczu. Określa¬
ne to jest jako dodatni efekt inotropowy. Jednym
z przykładów jest użycie glikozydów naparstni¬
cy w leczeniu niewydolności serca. Naparstnica
hamuje Na+,K+-ATPazę sarkolemy, zmniejszając
odkomórkowy transport Na\ co powoduje wzrost
Na*. To zaś wywołuje wzrost stężenia wewnątrzko¬
mórkowego Ca2+ na skutek hamowania wymiany
Na*/Ca2*. Zwiększenie Ca2* powoduje korzystne
w niewydolności serca zwiększenie siły skurczu.
C. Ca2ł-ATPflZA
Ta zlokalizowana w sarkolemie pompa wapniowa
również umożliwia wychodzenie Ca * z komórki,
jednak jej rola jest znacznie mniejsza niż wymien¬
nika Na*/Ca2*.
Należy pamiętać, że w większości komórek
występuje wiele kanałów jonowych (rozdz. 40)
dla Na+, K*, Ca2+ i in. Wiele z nich sklonowano
w ostatnich latach i określono ich układ w odpo¬
wiednich błonach (liczbę odcinków przezbłono-
wych, lokalizację miejsca przewodzącego jony
w białku itd.). Mogą one być sklasyfikowane
w sposób pokazany w tab. 48-4. W mięśniu ser¬
cowym występuje wiele kanałów jonowych, które
Tabela 48-4. Główne typy kanałów jonowych znajdujących się
w komórkach
Typ kanału
Komentarz
Bramkowane
zewnętrznym
ligandem
Otwierają się pod działaniem swoistej
pozakomórkowej cząsteczki,
np. acetylocholiny
Bramkowane
wewnętrznym
ligandem
Otwierają się lub zamykają pod działaniem
swoistej cząsteczki śródkomórkowej,
np. cyklicznego nukleotydu
Bramkowane
potencjałem
Otwierają się w odpowiedzi na zmianę
potencjału błonowego,
np. kanały Na+, K+ i Ca2+ w sercu
Bramkowane
mechanicznie
Otwierają się pod wpływem zmiany
mechanicznego nacisku
694 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
są również ważne w mięśniu szkieletowym. Wy¬
kazano, że mutacje genów kodujących kanały jo¬
nowe są odpowiedzialne za wiele dość rzadkich
stanów chorobowych dotykających mięsień ser¬
cowy. Te i inne choroby będące skutkiem mutacji
kanałów jonowych nazwano kanałopatiami; nie¬
które z nich wymieniono w tab. 48-5.
Tabela 48-5. Niektóre choroby (kanatopatie) powstające na sku¬
tek mutacji w genach kodujących polipeptydowe składniki kana¬
łów jonowych1
Choroba2
Zaangażowane kanały
i główne narządy
Central core disease
(MIM 117000)
Kanał Ca2+ siateczki
sarkoplazmatycznej (RYR1).
Mięsień szkieletowy
Fibrosis cystica
(MIM 219700)
CFTR (kanał Cl").
Płuca, trzustka
Okresowe porażenie hiperka-
lemiczne (MIM 170500)
Kanał sodowy.
Mięsień szkieletowy
Okresowe porażenie
hipokalemiczne
(MIM 114208)
Wolny kanał Ca2+ bramkowany
potencjałem (DHPR).
Mięsień szkieletowy
Hipertermia złośliwa
(MIM 180901)
Kanał wydzielający Ca2+
(RYR1). Mięsień szkieletowy
Wrodzona miotonia
(MIM 160800)
Kanał chlorowy.
Mięsień szkieletowy
1 Dane częściowo wzięte z: Ackerman MJ, Clapham DE: lon chan-
nels - basie science and clinical disease. N Engl J Med 1997;
336:1575.
2 Do innych kanałopatii należą: zespół długiego QT (MIM 192500);
aldosteronizm rzekomy (zespół Little, MIM 177200); uporczywa
hipoglikemia hiperinsulinowa niemowląt (MIM 601820); wro¬
dzona, recesywna kamica nerkowa typu II niemowląt związana
z chromosomem X (Zespół Denta, MIM 300009); recesywna
uogólniona miotonia (choroba Beckera, MIM 255700). Nazwa
„miotonia” oznacza wszelkie stany, w których mięsień nie roz¬
kurcza się po skurczu.
Wrodzone kardiomiopatie są
spowodowane zaburzeniami metabolizmu
energetycznego serca lub nietypowymi
białkami mięśnia sercowego
Pod pojęciem wrodzonej kardiomiopatii rozu¬
mie się jakiekolwiek morfologiczne lub czynnoś¬
ciowe zaburzenia mięśnia komorowego z przyczyn
dziedzicznych. Istnieją również niedziedziczne
formy kardiomiopatii, ale nie będą one tu opisy¬
wane. Jak pokazano w tab. 48-6, przyczyny wro-
Tabela 48-6. Biochemiczne przyczyny wrodzonych kardiomio-
patii1,2
Przyczyna
Dotknięte białka lub czynność
Wrodzone błędy w utlenianiu
kwasów tłuszczowych
Wchodzenie karnityny do komó¬
rek i mitochondriów. Niektóre
enzymy zaangażowane w utle¬
nianie kwasów tłuszczowych
Zaburzenia oksydatywnych
fosforylacji w mitochondriach
Białka kodowane przez geny
mitochondrialne. Białka kodo¬
wane przez geny jądrowe
Nieprawidłowe zmiany w biał¬
kach kurczliwych i struktural¬
nych mięśnia sercowego
Łańcuchy ciężkie miozyny (3,
troponina, tropomiozyna,
dystrofina
1 Na podstawie: Kelly DR Strauss AW: Inherited cardiomyopaties.
N Engl J Med 1994; 330:913.
2 Mutacje (np. mutacje punktowe lub w niektórych przypadkach
delecje) w genach (jądrowych lub mitochondrialnych) kodują¬
cych różne białka, enzymy lub cząsteczki tRNA są podstawowymi
przyczynami wrodzonych kardiomiopatii. Niektóre z tych chorób
są łagodne, natomiast inne są ciężkie i mogą być częścią zespo¬
łów chorobowych obejmujących inne tkanki.
dzonych kardiomiopatii można podzielić na dwie
kategorie: (1) zaburzenia sercowego metabolizmu
energetycznego, będące głównie odbiciem muta¬
cji genów kodujących enzymy lub białka biorące
udział w utlenianiu kwasów tłuszczowych (głów¬
ne źródło energii w mięśniu sercowym) i w oksy-
datywnej fosforylacji; (2) mutacje genów kodu¬
jących białka uczestniczące w skurczu mięśnia
sercowego, takie jak miozyna, tropomiozyna,
troponiny i wiążące miozynę sercowe białko C.
Mutacje w genach kodujących te ostatnie białka
powodują rodzinną kardiomiopatię przerostową
która zostanie omówiona poniżej.
Mutacje w genach kodujących ciężki
łańcuch sercowej p-miozyny sq jedna
z przyczyn rodzinnej kardiomiopatii
przerostowej
Rodzinna kardiomiopatia przerostowa jest jedną
z najczęstszych dziedzicznych chorób serca. Już
w młodym wieku chorzy wykazują przerost, czę¬
sto masywny, jednej lub obu komór, bez uchwyt¬
nej zewnątrzsercowej przyczyny, takiej jak np.
nadciśnienie tętnicze. W większości przypadków
schorzenie jest przekazywane w autosomalny, do¬
minujący sposób; reszta jest sporadyczna. Do nie-
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 695
dawna przyczyna była niejasna, lecz zmieniło się
to kiedy badania jednej z dotkniętej schorzeniem
rodzin wykazały, że są za nie odpowiedzialne
mutacje sensu (tj. podstawienie jednego z ami¬
nokwasów przez inny; ang. missense mutation)
w genie kodującym ciężki łańcuch miozyny p.
Następne badania wykryły pewną liczbę mutacji
sensu tego genu. Wszystkie z nich kodują reszty
bardzo konserwatywne. U niektórych osób wy¬
kryto inne mutacje, np. powstanie hybrydowego
genu ciężkiego łańcucha miozyny a/p. Jest to
częściowo odbiciem genetycznej heterogenno-
ści; mutacje pewnej liczby innych genów (np.
kodujących sercową aktynę, tropomiozynę, ser¬
cową troponinę I oraz T, podstawowe i regulato¬
rowe lekkie łańcuchy miozyny, sercowe białko C
wiążące miozynę, tytynę, oraz mitochondrialną
tRNA-glicynę i tRNA-izoleucynę) mogą również
powodować rodzinną kardiomiopatię przerosto¬
wą. W dodatku mutacje w różnych punktach genu
kodującego ciężki łańcuch miozyny p mogą wpły¬
wać na funkcjonowanie tego białka w mniejszym
lub większym stopniu. Te mutacje sensu są zgru¬
powane w główce i na granicy główka-pień ci꿬
kiego łańcucha miozyny. Według jednej z hipotez,
zmutowane polipeptydy („toksyczne polipepty-
dy”) powodują powstawanie nieprawidłowych
miofibryli, co prowadzi do kompensacyjnego
przerostu. Niektóre mutacje zmieniają ładunek
aminokwasu (np. podstawienie argininy zamiast
glutaminy), co przypuszczalnie bardziej wpływa
na konformację białka, zmieniając w ten sposób
jego funkcjonowanie. Pacjenci, u których wystę¬
pują te mutacje, żyją znacznie krócej niż osoby,
u których mutacje nie powodują zmiany ładunku
(aminokwasu). Tak więc może się okazać, że pre¬
cyzyjne określenie mutacji będących przyczyną
wrodzonej rodzinnej kardiomiopatii przerostowej
ma ważne znaczenie prognostyczne; odpowiednie
badanie można wykonać, przeprowadzając poli-
merazową reakcję łańcuchową z DNA genomu
otrzymanego z jednej próbki limfocytów krwi. Na
rycinie 48-13 przedstawiono uproszczony sche¬
mat ciągu przyczyn prowadzących do rodzinnej
kardiomiopatii przerostowej.
Inny typ kardiomiopatii nosi nazwę kardio¬
miopatii rozstrzeniowej. Uważa się, że jedną
z przyczyn tej choroby są mutacje genów kodują¬
cych dystrofinę, mięśniowe białko LIM (nazwane
tak, ponieważ zawiera domeny bogate w cystei-
Ryc. 48-13. Uproszczony schemat przyczyn rodzinnej kardio¬
miopatii przerostowej (MIM 192600) spowodowanej mutacjami
genu kodującego ciężki łańcuch miozyny p. Choroba ta może być
również spowodowana mutacjami genów kodujących inne białka
(patrz tekst).
nę, pierwotnie wykryte w trzech białkach: Lin-11,
Isl-1 i Mec-3) oraz białko wiążące czynnik cy¬
klicznej reakcji (CREB). Pierwsze dwa białka
pomagają w organizacji układów kurczliwych ko¬
mórek mięśnia sercowego, a CREB bierze udział
w regulacji pewnej liczby genów w tych komór¬
kach. Wciąż prowadzone badania nie tylko wyjaś¬
niają molekularne przyczyny kardiomiopatii, lecz
także wykrywają mutacje powodujące zaburzenia
rozwojowe serca (np. ubytki przegrodowe) i za¬
burzenia rytmu (np. na skutek mutacji zmieniają¬
cych funkcję kanałów jonowych).
Ca2* reguluje również skurcz
mięśni gładkich
Wszystkie mięśnie zawierają aktynę, miozynę
i tropomiozynę, ale tylko mięśnie poprzecznie
prążkowane kręgowców zawierają układ tro-
poniny. Tak więc mechanizm regulujący skurcz
musi się różnić w różnych układach kurczliwych.
Struktura molekularna mięśni gładkich jest
podobna jak w mięśniach poprzecznie prążko¬
wanych, z tym że sarkomery nie są tak uporząd¬
kowane, aby mogły tworzyć obraz poprzecznych
prążków. Mięśnie gładkie zawierają, podobnie jak
mięśnie szkieletowe, cząsteczki a-aktyniny i tro-
pomiozyny. Nie występuje w nich układ troponi-
ny, a ich lekkie łańcuchy miozyny różnią się od
lekkich łańcuchów mięśni poprzecznie prążkowa¬
nych. Regulacja skurczu mięśnia gładkiego opie¬
ra się na miozynie, w przeciwieństwie do mięśnia
696 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
poprzecznie prążkowanego, gdzie jest ona oparta
na aktynie. Jednakże, podobnie jak w mięśniach
poprzecznie prążkowanych, skurcz mięśni gład¬
kich jest regulowany przez Ca2+.
Skurcz mięśni gładkich jest inicjowany
przez fosforylacje lekkich łańcuchów
miozyny
Miozyna mięśnia gładkiego związana z aktyną
F, przy braku innych białek mięśniowych, takich
jak tropomiozyna, nie wykazuje zauważalnej ak¬
tywności ATPazowej. Ten brak aktywności ATPa-
zowej jest zupełnie inny od sytuacji w mięśniu
szkieletowym, gdzie miozyna i aktyna F wyka¬
zują dużą aktywność ATPazową. Mięsień gładki
zawiera lekkie łańcuchy, które zapobiegają wią¬
zaniu główek miozyny z aktyną F; muszą one naj¬
pierw ulec fosforylacji, co pozwoli na aktywację
ATPazy miozyny przez aktynę F. Osiągana wtedy
aktywność ATPazy jest ok. 10 razy mniejsza niż
w mięśniu szkieletowym. Fosforan na lekkich łań¬
cuchach główek miozyny może tworzyć chelaty
z Ca2+ związanym z kompleksem tropomiozyna-
-TpC-aktyna, co prowadzi do szybszego tworze¬
nia się mostków poprzecznych między główkami
miozyny i aktyną. Fosforylacja lekkich łańcuchów
rozpoczyna skurczowy cykl łączenia i rozłączania
mostków poprzecznych w mięśniu gładkim.
Kinaza lekkiego łańcucha miozyny
jest najpierw aktywowana
przez 4Ca2+-kalmodulinę, a dopiero
potem fosforyluje łańcuchy lekkie
Sarkoplazma mięśnia gładkiego zawiera zależ¬
ną od Ca kinazę lekkiego łańcucha. Aktywacja
przez Ca2+ zachodzi na skutek wiązania 4Ca2+-
-kalmoduliny z podjednostką kinazy (ryc. 48-14).
Kinaza lekkiego łańcucha aktywowana przez
4Ca2+-kalmodulinę fosforyluje lekkie łańcuchy,
co przeciwdziała hamowaniu przez nie oddziały¬
wania miozyny z aktyną F. Rozpoczyna się wtedy
cykl skurczowy.
W mięśniach gładkich występuje również inna,
niezależna od Ca2+, droga aktywacji skurczu. Za¬
angażowana jest w nią aktywowana przez różne
bodźce kinaza Rho. Enzym ten, fosforylując
fosfatazę lekkiego łańcucha miozyny, hamuje ją,
nasilając w ten sposób fosforylację łańcucha. Ki¬
naza Rho również bezpośrednio fosforyluje lekki
łańcuch miozyny. Oba te działania nasilają skurcz
mięśnia gładkiego (p. ryc. 48-14).
Ryc. 48-14. Regulacja skurczu mięśni gładkich przez Ca2+.
Miozyna pL jest ufosforylowanym lekkim łańcuchem miozyny;
miozyna L jest defosforylowanym lekkim łańcuchem (miozyny).
(Zaadaptowano z: Adelstein RS, Eisenberg R: Regulation and ki-
netics of actin-myosin ATP interaction. Annu Rev Biochem 1980;
49:921. Copyright © 1980 by Annual Reviews, reprodukowano
za zezwoleniem).
Mięsień gładki rozkurcza się, kiedy
stężenie Ca2+ staje się mniejsze
niż 10-7 mol/L
Rozkurcz mięśnia gładkiego następuje wtedy, kie¬
dy stężenie Ca2+ w sarkoplazmie staje się mniej¬
sze niż 10 7 mol/L. Wapń oddysocjowuje od kal-
moduliny, która z kolei oddysocjowuje od kinazy
lekkiego łańcucha, co powoduje jej inaktywację.
Żadne nowe fosforany nie są przyłączane do lek¬
kiego łańcucha p, a fosfataza lekkiego łańcucha,
będąc niezależna od wapnia i stale aktywna, usu¬
wa z niego już przyłączone fosforany. Defosfory-
lowany lekki łańcuch p hamuje wtedy wiązanie
główek miozyny z aktyną F i aktywność ATPazy.
Główka miozyny oddziela się od aktyny F w obec-
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 697
ności ATP i nie może się do niej ponownie przy¬
łączyć w obecności defosforylowanego lekkiego
łańcucha p; wobec tego następuje rozkurcz.
W tabeli 48-7 przedstawiono sposoby regula¬
cji oddziaływania aktyny z miozyną (aktywację
ATPazy miozyny) w mięśniach poprzecznie prąż¬
kowanych i gładkich.
Cykliczny AMP nie ma bezpośredniego wpły¬
wu na kinazę lekkich łańcuchów, ani jej bezpo¬
średnio nie aktywuje. Kinaza aktywowana przez
cAMP (rozdz. 44) może jednak fosforylować
kinazę lekkiego łańcucha (ale nie sam łańcuch).
Ufosforylowana kinaza lekkiego łańcucha wyka¬
zuje mniejsze powinowactwo do Ca2+-kalmoduli-
ny i wobec tego jest mniej podatna na aktywację.
Wzrost stężenia cAMP tłumi zatem odpowiedź
skurczową mięśnia gładkiego na wzrost stężenia
Ca2+ w sarkoplazmie. Ten molekularny mecha¬
nizm może tłumaczyć rozkurczający wpływ po¬
budzenia p-adrenergicznego na mięsień gładki.
Innym zależnym od Ca2+ białkiem, które od¬
grywa rolę w regulacji skurczu mięśnia gładkie¬
go jest kaldesmon (87 kDa). Białko to występuje
powszechnie w mięśniach gładkich, jak również
znajduje się w tkankach niemięśniowych. Przy
niskich stężeniach Ca2+ wiąże się ono z tropomio-
zyną i aktyną. Zapobiega to interakcji aktyny
z miozyną, utrzymując mięsień w stanie rozkur¬
czu. W przypadku wyższych stężeń Ca2+, Ca2+-
-kalmodulina wiąże kaldesmon, uwalniając go od
aktyny. Aktyna może wtedy wiązać się z miozyną,
a zatem może nastąpić skurcz. Kaldesmon może
być również fosforylowany i defosforylowany:
w postaci ufosforylowanej nie może się on wiązać
z aktyną i umożliwiać jej oddziaływanie z mio¬
zyną. Kaldesmon może również uczestniczyć
w tworzeniu się układów kurczliwych mięśni
gładkich. Wiele z jego działań wykazano in vitro,
lecz funkcje fizjologiczne nadal są przedmiotem
badań.
Jak pokazano w tab. 48-3, powolny obrót most¬
ków powoduje, że skurcz mięśni gładkich (np.
trzewnych i naczyniowych) jest powolny i dłu¬
gotrwały przy odpowiednio mniejszym zużyciu
ATP niż w mięśniu poprzecznie prążkowanym.
Zdolność mięśnia gładkiego do utrzymywania
napięcia przy ograniczonej szybkości skurczu jest
nazywana stanem zakleszczenia; jest to ważna
właściwość mięśnia gładkiego, a jej mechanizm
molekularny jest przedmiotem badań.
Tabela 48-7. Oddziaływanie aktyny i miozyny w mięśniach poprzecznie prążkowanych i mięśniach gładkich
Mięśnie poprzecznie prążkowane
Mięśnie gładkie
Białka nitek (filamentów) mięśnia
Aktyna
Miozyna
Tropomiozyna
Troponina (Tpl, TpT, TpC)
Aktyna
Miozyna1
Tropomiozyna
Spontaniczne oddziaływanie aktyny F
i samej miozyny (spontaniczna aktywacja
ATPazy miozyny przez aktynę F)
Tak
Nie
Inhibitor oddziaływania aktyna F-miozyna
(inhibitor zależnej od aktyny F aktywacji
ATPazy)
Układ troponiny (Tpl)
Nieufosforylowany lekki łańcuch miozyny
Aktywacja skurczu przez
Ca2+
Ca2+
Bezpośrednie działanie Ca2+
4Ca2+ wiąże się z TpC
4Ca2+ wiąże się z kalmoduliną
Działanie Ca2+ związanego z białkiem
TpC-4Ca2+ przeciwdziała hamowa¬
niu oddziaływania aktyny F z mio¬
zyną (pozwala na aktywację ATPazy
przez aktynę F)
4Ca2+-kalmodulina aktywuje kinazę lekkiego
łańcucha miozyny fosforylującą lekki łańcuch p.
Fosforylowany łańcuch p przestaje hamować
oddziaływanie aktyny F z miozyną (pozwala
na aktywację ATPazy przez miozynę)
Lekkie łańcuchy miozyny mięśni poprzecznie prążkowanych i gładkich różnią się od siebie.
698 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tlenek azotu rozkurcza mięśnie gładkie
naczyń krwionośnych oraz pełni inne
ważne funkcje biologiczne
Acetylocholina jest środkiem rozkurczającym
mięśnie gładkie naczyń. Nie działa ona jednak
bezpośrednio na komórki mięśniowe. Kluczowe
znaczenie miała obserwacja, że po usunięciu ko¬
mórek śródbłonka z komórek mięśni gładkich
acetylocholina nie działa rozszerzająco na naczy¬
nia. To odkrycie wskazuje, że środki rozszerzające
naczynia, takie jak acetylocholina, najpierw od¬
działują z receptorami komórek śródbłonka ma¬
łych naczyń. Receptory te są sprzężone z cyklem
fosfoinozytydowym (rozdz. 44), co prowadzi do
wyzwolenia Ca2+ pod działaniem trifosforanu ino-
Acetylocholina
Ryc. 48-15. Schemat powstawania w komórce śródbłonka tlenku
azotu (NO) z argininy w reakcji katalizowanej przez syntazę NO.
Oddziaływanie agonisty (np. acetylocholiny) z receptorem (R)
prawdopodobnie prowadzi do wewnątrzkomórkowego uwolnie¬
nia Ca2+ przez trifosforan inozytolu, wytwarzany w szlaku trifo¬
sforanu inozytolu, w wyniku czego zostaje aktywowana syntaza
NO. Następnie NO dyfunduje do przyległego mięśnia gładkiego,
w którym aktywuje cyklazę gwanylylową. Na skutek powstania
cGMP następuje aktywacja zależnych od cGMP kinaz białek,
w wyniku czego następuje rozkurcz. Środek rozkurczający naczy¬
nia, nitrogliceryna, również przenika do komórek mięśni gładkich,
gdzie w wyniku jej metabolizowania powstaje NO.
zytolu. Wzrost stężenia Ca2+ w cytoplazmie ko¬
mórek śródbłonka prowadzi do wydzielenia po¬
chodzącego ze śródbłonka czynnika rozkurcza¬
jącego (EDRF), który dyfunduje do pobliskiego
mięśnia gładkiego. Tam reaguje on z hemową
częścią rozpuszczalnej cyklazy gwanylylowej, co i
powoduje jej aktywację z następowym wzrostem
stężenia cGMP w komórce (ryc. 48-15). To z ko¬
lei pobudza aktywność niektórych zależnych od
cGMP kinaz białek, które prawdopodobnie fosfo¬
ry luj ą specyficzne białka mięśniowe, wywołując
rozkurcz; zjawiska te nie zostały jednak szczegó¬
łowo wyjaśnione. Ważny i powszechnie używany
w leczeniu niewydolności wieńcowej środek roz¬
kurczający naczynia wieńcowe, nitrogliceryna,
działa przez nasilanie wewnątrzkomórkowego
wydzielania EDRF, a tym samym cGMP.
Zaskakujące było stwierdzenie, że EDRF jest
gazem - tlenkiem azotu (NO). NO powstaje pod
wpływem enzymu - cytozolowej syntazy NO.
Śródbłonkowe i neuronalne formy syntazy NO są
aktywowane przez Ca2+ (tab. 48-8). Substratem
jest arginina, a produktami reakcji - cytrulina
i NO:
[ SYNTAZA NO |
arginina ►- cytrulina + NO
Syntaza NO katalizuje pięcioelektronowe utle¬
nienie aminowego atomu azotu argininy. L-Hy-
droksyarginina jest produktem pośrednim i pozo¬
staje ściśle związana z enzymem. Syntaza NO jest
bardzo złożonym enzymem, potrzebującym pię¬
ciu oksydoredukcyjnych kofaktorów: NADPH,
FAD, FMN, hemu i tetrahydrobiopteryny. NO
może się również tworzyć z azotanu(III), pocho¬
dzącego z takich środków rozkurczających naczy¬
nia, jak trinitrogliceryna. NO ma bardzo krótki
okres półtrwania (w przybliżeniu 3-4 s) w tkan¬
kach, ponieważ reaguje on z tlenem i nadtlen¬
kiem wodoru. Produktem reakcji z nadtlenkiem
jest peroksyazotan(III) (ONOO ), który rozkłada
się z utworzeniem bardzo reaktywnego rodnika
OH’. NO jest hamowany przez wiążącą go sil¬
nie hemoglobinę i inne białka hemowe. Obecnie
są dostępne syntetyczne inhibitory syntazy NO,
które mogą znacznie ograniczyć jego produkcję.
Podane zwierzętom i ludziom powodują skurcz
naczyń i znaczny wzrost ciśnienia krwi, co do-
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 699
Tabela 48-8. Nazwy syntaz NO i skutki usuwania (ang. knockout) ich genów u myszy1
Podtyp
Nazwa2
Komentarz
Skutki usuwania genów u myszy3
1
nNOS
Aktywność zależy od podwyższonego stężenia Ca2+.
Po raz pierwszy zidentyfikowana w neuronach.
Aktywowana przez kalmodulinę
Często występuje zwężenie odżwiernika, odporność na
udar naczyniowy, agresywność zachowań seksualnych
u samców
2
iNOS4
Niezależna od podwyższonego stężenia Ca2+.
Powszechna w makrofagach
Większa wrażliwość na pewne typy infekcji
3
eNOS
Zależna od podwyższonego stężenia Ca2+. Po raz
pierwszy wykryta w komórkach śródbłonka
Podwyższone ciśnienie tętnicze krwi
1 Zaadaptowane z: Snyder SH: No endothelial NO. Naturę 1995; 377:196.
2 n - neuronalna; i - indukowana; e - śródblonkowa.
3 Usuwania genów u myszy dokonano przez homologiczną rekombinację (rozdz. 42). Enzymy określono jako neuronalny, indukowany
(makrofagi) i śródbłonkowy, tj. od miejsc, w których zostały po raz pierwszy zidentyfikowane. Jednakże wszystkie trzy enzymy znaj¬
dują się i w innych miejscach, a enzym neuronalny jest również indukowany. Każdy z enzymów zostat sklonowany oraz określono ich
chromosomalną lokalizację u ludzi.
4 iNOS jest niezależna od Ca2+, ale bardzo mocno wiąże się z kalmoduliną.
wodzi, że NO ma duży udział w utrzymywaniu
prawidłowego ciśnienia in vivo. Innym ważnym
sercowo-naczyniowym efektem działania NO jest
hamowanie agregacji płytek krwi przez zwięk¬
szanie syntezy cGMP (rozdz. 50).
Tabela 48-9. Niektóre fizjologiczne i patologiczne funkcje tlenku
azotu (NO)
• Czynnik rozszerzający naczynia, ważny dla regulacji ciśnienia
tętniczego krwi
• Czynnik odpowiedzialny za erekcję; cytrynian sildenafilu (Via-
gra) działa przez hamowanie fosfodiesterazy cGMP
• Neuroprzekaźnik w mózgu i obwodowym układzie wegetatyw¬
nym
• Odgrywa rolę w długotrwałej potencjacji [nie wiadomo czego
- przyp. tłum.]
• Odgrywa rolę w neurotoksyczności
• Niskie poziomy NO są przyczyną skurczu odżwiernika w prze¬
rostowym zwężeniu odżwiernika u dzieci
• Może odgrywać rolę w rozkurczu mięśni szkieletowych
• Może stanowić część prymitywnego układu odpornościo¬
wego
• Hamuje przyleganie, aktywację i agregację płytek krwi
Odkrycie naczyniorozkurczowego działania
NO wzbudziło ogromne zainteresowanie bada¬
czy. Okazało się, że NO pełni wiele fizjologicz¬
nych funkcji we wszystkich tkankach ustroju (tab.
48-9). Stwierdzono, że są trzy główne izoformy
syntazy NO. Każda z nich została sklonowana,
określono też lokalizację ich genów w ludzkich
chromosomach. Ze wszystkimi trzema izoforma-
mi wykonano doświadczenia z usuwaniem (ang.
knockout) genów. Pomogły one upewnić się co do
niektórych postulowanych funkcji NO.
Podsumowując, badania przeprowadzone
w ostatnim dziesięcioleciu wykazały, że NO od¬
grywa ważną rolę w wielu fizjologicznych i pato¬
logicznych procesach.
ZAPASY ATP W MIĘŚNIU ODNAWIAJĄ
SIĘ WG WIELU MECHANIZMÓW
ATP niezbędny jako stałe źródło energii cyklu
skurczowo-rozkurczowego mięśnia może się two¬
rzyć: (1) w wyniku glikolizy z udziałem glukozy
z krwi lub glikogenu mięśni, (2) przez oksydatyw-
ne fosforylacje, (3) z fosfokreatyny i (4) z dwóch
cząsteczek ADP w reakcji katalizowanej przez
kinazę adenylylową (ryc. 48-16). Zapas ATP
w mięśniu szkieletowym wystarcza do zaopa¬
trzenia w energię czynności skurczowej trwającej
kilka sekund, dlatego ATP musi być stale odna¬
wiany jednym lub kilkoma wymienionymi spo¬
sobami, zależnie od warunków metabolicznych.
Jak to będzie przedstawione poniżej, w mięśniach
występują co najmniej dwa różne typy włókien.
Jedne z nich mają metabolizm głównie beztleno¬
wy, a drugie - głównie tlenowy. Nic więc dziwne¬
go, że wykorzystują one w różnym stopniu różne
źródła energii.
700 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Fosforan kreatyny
Ryc. 48-16. Liczne źródła ATP w mięśniu.
Mięsień szkieletowy zawiera dużo
glikogenu
Sarkoplazma mięśnia szkieletowego zawiera
duże zapasy glikogenu, który jest magazyno¬
wany w granulkach znajdujących się w pobliżu
prążków I. Wydzielenie glukozy z glikogenu za¬
leży od specyficznej fosforylazy mięśniowego
glikogenu (rozdz. 19), która może być aktywo¬
wana przez Ca2+, adrenalinę i AMP. Aby powstał
podlegający glikolizie 6-fosforan glukozy, fosfo-
rylaza b glikogenu musi zostać przekształcona
w procesie fosforylacji przez kinazę fosforylazo-
wą b w aktywną fosforylazę a (rozdz. 19). Ca2+
ułatwia aktywację kinazy fosforylazowej b, rów¬
nież w wyniku fosforylacji. W ten sposób Ca2+
inicjuje skurcz mięśnia oraz ułatwia produkcję
potrzebnej energii. Hormon adrenalina również
aktywuje glikogenolizę w mięśniach. AMP, po¬
wstający w czasie pracy mięśni z rozpadu ADP,
także aktywuje fosforylazę b z pominięciem jej
fosforylacji. Mięśniowa fosforylaza b glikogenu
jest nieaktywna w chorobie McArdle’a, jednej
z chorób, których przyczynąjest spichrzanie gli¬
kogenu (rozdz. 19).
W warunkach tlenowych mięsień
generuje ATP głównie w wyniku
oksydacyjnej fosforylacji
Synteza ATP w procesie oksydacyjnej fosforyla¬
cji wymaga dostawy tlenu. Mięśnie potrzebujące
dużych ilości tlenu w celu podtrzymania skurczu
(np. mięśnie utrzymujące postawę ciała) magazy-
nują go jako połączenie z hemem, składnikiem
mioglobiny (rozdz. 7). Dzięki hemowi mięśnie
zawierające dużo mioglobiny są czerwone, nato¬
miast mięśnie zawierające jej mało lub niezawie-
rające jej wcale są białe. Głównymi substratami
w tlenowym metabolizmie mięśnia są: glukoza
pochodząca z krwi lub endogennego glikogenu
oraz kwasy tłuszczowe pochodzące z triglicery-
dów tkanki tłuszczowej.
Fosforan kreatyny stanowi główna
rezerwe energii w mięśniu
Fosforan kreatyny zapobiega nagłemu wyczerpa¬
niu się zapasów ATP, dostarczając łatwo dostępny,
bogaty energetycznie fosforan, potrzebny do two¬
rzenia ATP z ADP. Fosforan kreatyny tworzy się
z ATP i kreatyny (p. ryc. 48-16) w okresach, kiedy
mięsień jest rozkurczony i zapotrzebowanie na
ATP nie jest tak wielkie. Enzymem katalizującym
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 701
fosforylację kreatyny jest kinaza kreatynowa
(CK). Jest to enzym, który - ze względu na jego
swoistość dla mięśni - może posłużyć do wykry¬
wania ich ostrych lub przewlekłych schorzeń.
MIĘSIEŃ SZKIELETOWY SKŁADA
SIĘ Z KURCZĄCYCH SIĘ POWOLI
(CZERWONYCH) I SZYBKO (BIAŁYCH)
WŁÓKIEN
W mięśniach szkieletowych wykryto różne typy
włókien. Jeden z podziałów klasyfikuje je jako
typ I (powolny skurcz), typ IIA (szybki skurcz,
metabolizm tlenowy) i typ IIB (skurcz szybki,
metabolizm oparty na glikolizie). W celu uprosz¬
czenia będą rozważane tylko dwa typy: typ
I (skurcz powolny, metabolizm tlenowy) i typ II
(skurcz szybki, metabolizm oparty na glikolizie)
(tab. 48-10).
Tabela 48-10. Charakterystyka włókien typu I i II mięśnia szkie¬
letowego
Właściwość
Typ 1 powolne
(skurcz)
Typ II szybkie
(skurcz)
Aktywność ATPazy miozyny
Niska
Wysoka
Zużycie energii
Niskie
Duże
Liczba mitochondriów
Liczne
Nieliczne
Kolor
Czerwony
Biały
Występowanie mioglobiny
Obecna
Nieobecna
Szybkość skurczu
Mała
Duża
Czas trwania skurczu
Długi
Krótki
Włókna typu I są czerwone, ponieważ zawie¬
rają mioglobinę i mitochondria; ich metabolizm
jest tlenowy i mogą one wykonywać względnie
długo podtrzymywane skurcze. Włókna typu II,
które nie mają mioglobiny i zawierają mało mito-
chondriów, są białe: czerpią one energię z beztle¬
nowej glikolizy, a ich skurcze są krótkotrwałe (na
skutek szybkiego męczenia). Stosunek ilościowy
tych dwóch typów włókien jest różny w różnych
mięśniach, zależnie od ich funkcji (czy mięsień
wykonuje, czy nie, długotrwałe skurcze, np.
w celu utrzymania postawy ciała). Wzajemny sto¬
sunek włókien ulega modyfikacji wskutek trenin¬
gu; np. ilość włókien typu I w pewnych mięśniach
nóg zwiększa się u sportowców trenujących bieg
maratoński, natomiast u sprinterów wzrasta ilość
włókien typu II.
Organizm sprintera korzysta, w celu
produkowania ATP, z fosfokreatyny
i beztlenowej glikolizy, natomiast
organizm maratończyka
- z oksydacyjnej fosforylacji
Wziąwszy pod uwagę opisane wyżej dwa typy
włókien mięśnia szkieletowego i ich różne źródła
energii, interesujące może się okazać porównanie
ich udziału w sprincie (bieg na 100 m) i w biegu
maratońskim (42,2 km; nieco więcej niż 26 mil)
(tab. 48-11).
Tabela 48-11. Typy włókien mięśniowych i głównych źródeł
energii wykorzystywanych przez sprintera i maratończyka
Sprinter (100 m)
Maratończyk
Wykorzystywane są głównie
włókna typu II (glikolityczne)
Wykorzystywane są głównie
włókna typu I (tlenowe)
W czasie pierwszych 4-5 s
głównym źródłem energii jest
fosfokreatyna
ATP jest głównym źródłem
energii w czasie całego biegu
Głównym źródłem energii
jest glukoza pochodząca
z mięśniowego glikogenu
i metabolizowana beztlenowo
Głównymi źródłami energii są
glukoza z krwi i wolne kwasy
tłuszczowe
Zapas mięśniowego glikogenu
szybko się zmniejsza
Zapas mięśniowego glikogenu
zmniejsza się powoli
Głównymi źródłami energii dla mięśni pod¬
czas sprintu są fosforan kreatyny (pierwsze 4-
-5 s), a następnie beztlenowa glikoliza z udzia¬
łem glikogenu mięśnia jako źródła glukozy. Dwo¬
ma czynnikami, od których zależy regulacja meta¬
bolizmu sąfosforylaza glikogenowa i PFK-1. Ta
pierwsza jest aktywowana przez Ca2+ (wydzielany
w czasie skurczu z siateczki sarkoplazmatycznej),
adrenalinę i AMP. PFK-1 jest aktywowana przez
AMP, ?i oraz NH3. W czasie sprintu intensywność
glikolizy może wzrosnąć aż 1000 razy, co świad¬
czy o małej wydajności tych procesów.
W przeciwieństwie do tego, w czasie biegu
maratońskiego głównym źródłem ATP jest me¬
tabolizm tlenowy. Podstawowymi substratami
energetycznymi są glukoza, pobierana z krwi,
oraz kwasy tłuszczowe, w większości pochodzące
z pobudzanej przez adrenalinę hydrolizy triglice-
rydów tkanki tłuszczowej. Stężenie glukozy we
krwi jest podtrzymywane przez rozkład glikogenu
702 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
wątroby. Glikogen mięśniowy jest również źród¬
łem glukozy, ale jest on rozkładany wolniej niż
w czasie sprintu. Obliczono, że glukoza we krwi,
glikogen w wątrobie, glikogen w mięśniach i tri-
acyloglicerol w tkance tłuszczowej mogą mięś-
Tabela 48-12. Główne właściwości biochemiczne mięśnia szkie¬
letowego związane z jego metabolizmem1
• Mięsień szkieletowy pracuje zarówno w warunkach tlenowych
(w spoczynku), jak i beztlenowych (np. podczas sprintu), wo¬
bec czego zachodzi, zależnie od warunków, zarówno glikoliza
tlenowa, jak i beztlenowa.
• Mięsień szkieletowy zawiera mioglobinę jako zbiornik tlenu.
• Mięsień szkieletowy jest zbudowany z różnych włókien przy¬
stosowanych do warunków beztlenowych (szybko kurczące
się włókna) lub tlenowych (wolno kurczące się włókna).
• Aktyna, miozyna, tropomiozyna, kompleks troponiny (TpT, Tpl,
TpC), ATP i Ca2+ są głównymi składnikami mięśnia odpowie¬
dzialnymi za jego skurcz.
• Ca2+-ATPaza, kanał wydzielający Ca2+ i kalsekwestryna są
białkami uczestniczącymi w różnych fazach metabolizmu
wapnia w mięśniu.
• Insulina działa na mięsień, zwiększając wychwyt glukozy.
• W stanie sytości większość glukozy jest zużywana do syntezy
glikogenu, odgrywającego rolę magazynu glukozy, która może
być użyta w czasie pracy mięśnia; „nasycanie” organizmu glu¬
kozą jest stosowane przez długodystansowców w celu zwięk¬
szenia zapasów glikogenu.
• Adrenalina pobudza glikogenolizę w mięśniu szkieletowym,
natomiast glukagon jest nieaktywny z powodu braku w miꜬ
niu jego receptorów.
• Mięsień szkieletowy nie może bezpośrednio wydzielać swojej
glukozy do krwi z powodu braku glukozo-6-fosfatazy.
• Mleczan produkowany podczas beztlenowego metabolizmu
w mięśniu szkieletowym jest przekazywany do wątroby, gdzie
może on być użyty do syntezy glukozy, która znowu trafia do
mięśni (cykl Cori).
• Mięsień szkieletowy zawiera fosfokreatynę, która stanowi źród¬
ło energii dla krótkotrwałych (kilkusekundowych) wysiłków.
• Wolne kwasy tłuszczowe w plazmie są głównym źródłem ener¬
gii, szczególnie w warunkach biegu maratońskiego i w czasie
długiego głodzenia.
• W czasie głodzenia mięsień szkieletowy może metabolizować
ciała ketonowe.
• Mięsień szkieletowy jest głównym miejscem metabolizmu
rozgałęzionych aminokwasów, które zostają użyte jako źródło
energii.
• Proteoliza mięśnia dostarcza w stanie głodzenia aminokwa¬
sów dla glukoneogenezy.
• Głównymi aminokwasami pochodzącymi z mięśni są alanina
(przeznaczona głównie dla glukoneogenezy w wątrobie i two¬
rząca część cyklu glukozo-alaninowego) i glutamina (kierowa¬
na głównie do jelit i nerek).
1W tabeli tej zebrano materiał z różnych rozdziałów tej książki.
niom dostarczyć energii wystarczającej na, odpo¬
wiednio, 4 min, 18 min, 70 min i ok. 4000 min
biegu maratońskiego. Szybkość utleniania kwa¬
sów tłuszczowych w mięśniu jest jednak mniejsza
niż glukozy, a zatem oba te substraty są głównymi
źródłami energii w biegu maratońskim.
Sportowcy stosują wiele metod opóźniania zmę¬
czenia mięśni i poprawy ich siły. Zaliczają się do
nich: spożywanie dużych ilości węglowodanów,
przyjmowanie węglanu sodu, doping za pomocą
krwi (przetaczanie krwinek czerwonych) oraz
spożywanie kreatyny i androstenedionu. Dysku¬
sja o racjonalności i skuteczności tych metod zo¬
stanie pominięta.
MIĘŚNIE SZKIELETOWE STANOWIĄ
GŁÓWNY MAGAZYN BIAŁKA USTROJU
U ludzi białka mięśni szkieletowych stanowią
główną, nietłuszczową rezerwę zmagazynowanej
energii. Tłumaczy to, szczególnie u dorosłych,
bardzo duże straty masy mięśniowej w wyniku
długotrwałego kalorycznego niedożywienia.
Badanie rozpadu białek tkankowych in vivo
jest trudne, gdyż aminokwasy pochodzące z we¬
wnątrzkomórkowego rozpadu białek mogą być
w znacznym stopniu użyte do budowy innych
białek w tejże komórce lub przetransportowane
do innych narządów, gdzie biorą udział w reak¬
cjach anabolicznych. Aktyna i miozyna są jednak
w reakcji potranslacyjnej metylowane do pepty-
dylo-3-metylohistydyny. W czasie wewnątrzko¬
mórkowego rozpadu aktyny i miozyny 3-mety-
lohistydyna jest wydzielana z mięśni i wydalana
z moczem. Wydalanie tego metylowanego amino¬
kwasu stanowi wiarygodny wskaźnik szybkości
rozpadu białek miofibrylamych u ludzi.
Różne postacie metabolizmu mięśniowego,
z których większość opisano w innych rozdzia¬
łach, zostały przedstawione w tab. 48-12.
CYT0SZKIELET PEŁNI WIELE
FUNKCJI KOMÓRKOWYCH
Komórki niemięśniowe również wykonują pracę
mechaniczną, która obejmuje samodzielne prze¬
mieszczanie, morfogenezę, podział, wewnątrz¬
komórkowy transport, endocytozę, egzocytozę
i zmianę kształtu komórki. Te komórkowe funk-
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 703
cje są pełnione przez rozległą sieć nitkowatych
struktur, stanowiących cytoszkielet. Cytoplazma
komórkowa nie jest, jak kiedyś uważano, worecz¬
kiem płynu. W zasadzie wszystkie komórki euka¬
riotyczne zawierają trzy typy nitkowatych struk¬
tur: diamenty aktyny (znane również jako mikro-
filamenty), mikrotubule i diamenty pośrednie.
Filamenty te można rozróżnić biochemicznie
i przy użyciu mikroskopu elektronowego.
Tabela 48-13. Niektóre właściwości mikrofilamentów i mikrotubul
Mikrofilamenty
Mikrotubule
Białka
Aktyna
Tubuliny a i p
Średnica
8-9 nm
25 nm
Funkcje
Struktura (komórki),
Struktura, ruchy
ruchy
spolaryzowane
Niektóre właściwości filamentów pośrednich opisano w tab. 48-14
Tabela 48-14. Rodzaje filamentów pośrednich i ich rozmieszcze¬
nie w komórkach eukariotycznych
Białka
Masa
cząsteczkowa
kDa
Rozmieszczenie
Keratyny
Typ 1 (kwaśne)
40-60
Komórki nabłonkowe,
Typ II (zasadowe)
50-70
włosy, paznokcie
Wimentynopodobne
Wimentyna
54
Różne komórki
Desmina
53
mezenchymalne
Mięśnie
Włókienkowate
50
Komórki gleju
kwaśne białko gleju
Peryferyna
66
Neurony
Neurofilamenty
Mała (L), średnia (M)
i duża (H)1
60-130
Neurony
Laminy
A.BiC
65-75
Błona jądrowa
10dnosi się do ich masy cząsteczkowej.
Niektóre właściwości tych trzech struktur poda¬
no w tab. 48-13 i 48-14.
Komórki niemięśniowe zawierają aktynę,
z której sa zbudowane mikrofilamenty
Aktyna G występuje w większości, jeśli nie we
wszystkich, komórek ustroju. Przy odpowiednich
stężeniach magnezu i chlorku potasu polimery¬
zuje ona spontanicznie, tworząc podwójną helisę
filamentów aktyny F, podobnych do występują¬
cych w mięśniach. W komórkach niemięśniowych
występują co najmniej dwa typy aktyny: aktyna p
i aktyna y. Oba typy mogą występować jednocześ¬
nie w danej komórce, a nawet może się zdarzyć,
że współpolimeryzują, tworząc jeden filament.
W cytoplazmie aktyna F tworzy mikrofilamenty
0 średnicy 7-9,5 nm, które często występują w po¬
staci wiązek tworzących nieregularną sieć. Wiązki
te najczęściej znajdują się tuż pod błoną plazma-
tyczną, dlatego są nazywane włóknami napięcio¬
wymi (ang. stress fibres). Włókna napięciowe zani¬
kają, gdy wzrasta ruchliwość komórki lub w czasie
złośliwej transformacji komórki pod wpływem
środków chemicznych lub onkogennych wirusów.
Chociaż filamenty aktyny nie są w komórkach
niemięśniowych rozmieszczone tak jak w miꜬ
niach, mogą one oddziaływać z miozyną, powo¬
dując ruchy komórki.
Mikrotubule zawierają tubuliny a i p
Mikrotubule, które są integralnymi składnikami
szkieletu komórkowego, składają się z rurek cyto-
plazmatycznych o średnicy 25 nm i często o bardzo
dużej długości. Mikrotubule są potrzebne do two¬
rzenia i funkcjonowania wrzecionka mitotyczne-
go, dlatego występują we wszystkich komórkach
eukariotycznych. Mają one również swój udział
w wewnątrzkomórkowych ruchach pęcherzyków
endo- i egzocytamych oraz stanowią podstawowe
elementy strukturalne rzęsek i dagelli. Mikrotubu¬
le są jednym z głównych komponentów aksonów
1 dendrytów, którym nadają strukturę i uczestniczą
w aksoplazmatycznym przepływie materiałów
wzdłuż tych neuronalnych wypustek.
Mikrotubule mają kształt cylindrów zbudowa¬
nych z 13 podłużnie ułożonych protofilamentów,
z których każdy składa się z dimerów tubulin a
i p. Są one bardzo podobnie zbudowanymi biał¬
kami o masie cząsteczkowej ok. 50 kDa. Dimery
tubuliny łączą się warstwowo w protofilamenty,
które ostatecznie tworzą mikrotubule. „Centrum
dowodzenia” dla mikrotubul, zlokalizowane wo¬
kół pary centrioli, zapoczątkowuje wzrost nowych
mikrotubuli. Trzeci rodzaj tubuliny, tubulina y,
odgrywa ważną rolę w ich tworzeniu. Również
GTP jest tu potrzebne. Różne białka związane
704 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
z mikrotubulami (białka związane z mikrotubu-
lami [MAPs], z których jednym jest białko tau)
odgrywają ważną rolę w ich tworzeniu i stabili¬
zowaniu. Mikrotubule są w stanie dynamicznej
destabilizacji, nieustannie się tworzą i rozpada¬
ją. Wykazują one biegunowość (końce ujemne
i dodatnie), co ma duże znaczenie w procesie ich
rozrastania się od centrioli i w ich zdolności do
ukierunkowania wewnątrzkomórkowego ruchu.
Na przykład w transporcie aksonalnym białko
kinezyna, o podobnej do miozyny aktywności
ATPazowej, wykorzystuje hydrolizę ATP do prze¬
suwania pęcherzyków wzdłuż aksonu w kierunku
dodatniego bieguna mikrotubuli. Przepływ mate¬
riałów w odwrotnym kierunku, do końca ujemne¬
go, jest wspomagany przez cytozolową dyneinę,
inne białko o aktywności ATPazowej. Podobnie
aksonemalne dyneiny dostarczają energii dla
ruchów rzęsek i flagelli. Inne białko, dynamina,
wykorzystujące GTP, jest zaangażowane w endo-
cytozę. Kinezyny, dyneiny, dynaminy i miozyny
bywają nazywane molekularnymi silnikami.
Brak dyneiny w rzęskach i flagellach powodu¬
je ich unieruchomienie, co prowadzi do męskiej
bezpłodności i przewlekłych zakażeń układu od¬
dechowego, znanych jako zespół Kartagenera.
Pewne leki wiążą się z mikrotubulami, zakłó¬
cając ich tworzenie się i rozpad. Należy do nich
kolchicyna (stosowana do leczenia ostrego dna-
wego zapalenia stawów), winblastyna (alkaloid
z rośliny Vinca, stosowany do leczenia niektórych
typów raka), paklitaksel (Taxol) (efektywny w le¬
czeniu raka jajników) i grizeofulwina (czynnik
przeciwgrzybiczy).
Filamenty pośrednie różnie się od
mikrofilamentów i mikrotubul
W komórkach występuje również układ filamen-
tów o podłużnej periodyczności 21 nm i średnicy
8-10 nm, czyli pośredniej między mikrofilamen-
tami (6 nm) i mikrotubulami (23 nm). Jak to po¬
kazano w tabeli 48-14, wyróżnia się cztery klasy
diamentów pośrednich. Wszystkie są wydłużo¬
nymi, włókienkowatymi cząsteczkami z centralną
domeną pałeczkowatą, główką na końcu amino¬
wym i ogonem na końcu karboksylowym. Tworzą
one strukturę podobną do liny, a dojrzałe filamenty
składają się z tetramerów połączonych tak, że two¬
rzą helisę. Są one ważnymi elementami struktural¬
nymi komórki, z których większość jest względnie
trwała, bowiem nie tworzy się i nie rozpada gwał¬
townie i nie zanika w czasie mitozy, jak to się dzie¬
je z aktyną i wielu filamentami mikrotubulamymi.
Wyjątkiem są laminy, które na skutek fosforylacji
rozpadają się w czasie mitozy i ponownie pojawia¬
ją po jej zakończeniu. Mutacje genów kodujących
laminę A powodują progerię, charakteryzującą się
przedwczesnym starzeniem i innymi zmianami.
Keratyny tworzą dużą rodzinę, w której wyróż¬
nia się ok. 30 „członków”. Jak pokazano w tabeli
48-13, są dwa główne typy keratyny; wszystkie
keratyny są heterodimerami utworzonymi z jed¬
nego przedstawiciela każdej z klas.
Wimentyny powszechnie występują w komór¬
kach mezodermalnych. Podobne do nich są des-
mina, kwaśne białko fibrylame gleju i peryferyna.
Wszyscy członkowie rodziny wimentyn mogą ze
sobą polikondensować. Filamenty pośrednie wy¬
stępują w dużej ilości w komórkach nerwowych;
neurofilamenty dzieli się, w zależności od ich
masy cząsteczkowej, na mało-, średnio- i wielko¬
cząsteczkowe.
Laminy tworzą siatkę pozostającą w apozy-
cji w stosunku do wewnętrznej błony jądrowej.
Rozkład filamentów pośrednich w normalnych
i anormalnych (np. rak) komórkach może być
badany przy użyciu technik immunofluorescen-
cyjnych, z zastosowaniem odpowiednich specy¬
ficznych przeciwciał. Przeciwciała te, swoiste dla
filamentów pośrednich, mogą również posłużyć
patomorfologowi w rozpoznaniu guzów złośli¬
wych. Nowotwory te mogą nadal zachowywać
typ filamentów pośrednich właściwy dla komó¬
rek, z których się wywodzą.
Wiele chorób skóry objawiających się po¬
wstawaniem pęcherzy zależy od mutacji genów
kodujących różne keratyny; trzy z tych chorób
to: epidermolysis bullosa simplex, hyperkerato-
sis epidermolytica i keratoderma palmoplanta-
ris epidermolytica. Tworzenie się pęcherzy jest
prawdopodobnie następstwem zmniejszonej
odporności różnych warstw skóry na działanie
czynników mechanicznych, na skutek niepra¬
widłowości w strukturze mikrofilamentów.
STRESZCZENIE
• Miofibryle mięśnia szkieletowego składają
się z grubych i cienkich nitek. Grube nitki
48. MIĘSIEŃ I SZKIELET KOMÓRKOWY 705
zawierają miozynę, a cienkie - aktynę, tropo-
miozynę i kompleks troponiny (troponiny T, 1,
oraz C).
Podstawą obecnej wiedzy o skurczu miꜬ
nia jest model ślizgowy, uwzględniający rolę
mostków poprzecznych. Istotą tego modelu
jest przekonanie, że zachodzące na siebie nitki
ślizgają się po sobie w czasie skurczu, a mostki
pomiędzy miozyną i aktyną generują i podtrzy¬
mują napięcie.
Hydroliza ATP napędza ruch miofilamentów.
ATP wiąże się z główkami miozyny i jest hy-
drolizowany do ADP i dzięki aktywności
ATPazowej kompleksu aktomiozyny.
Ca2+ odgrywa kluczową rolę w inicjowaniu
skurczu mięśnia przez wiązanie się z troponi-
ną C. W mięśniu szkieletowym siateczka sar-
koplazmatyczna reguluje dystrybucję Ca2+ do
sarkomerów, natomiast w mięśniu sercowym
i gładkim ważną rolę odgrywa napływ Ca2+
przez kanały wapniowe sarkolemy.
Wiele przypadków hipertermii złośliwej u ludzi
jest wynikiem mutacji genu kodującego białka
kanałów (siateczki sarkoplazmatycznej) wy¬
dzielających wapń.
Między mięśniami szkieletowym i sercowym
występuje wiele różnic; np. mięsień sercowy
ma na swojej powierzchni dużo receptorów.
Niektóre przypadki rodzinnej kardiomiopatii
przerostowej są wynikiem mutacji sensu w ge¬
nie kodującym ciężki łańcuch miozyny p. Wy¬
kryto również mutacje genów kodujących wiele
innych białek.
Mięsień gładki, w przeciwieństwie do mięśni
szkieletowych i mięśnia sercowego, nie zawiera
układu troponiny; skurcz jest w nim inicjowany
przez fosforylację lekkich łańcuchów miozyny.
Regulatorem skurczu mięśni gładkich jest tle¬
nek azotu; zablokowanie jego syntezy z argi-
niny wywołuje nagły wzrost ciśnienia krwi,
co wskazuje, że regulacja ciśnienia jest jedną
z jego funkcji.
Dystrofia typu Duchenne’a jest wynikiem mu¬
tacji kodującego białko dystrofinę genu zlokali¬
zowanego na chromosomie X.
W mięśniach ludzkich występują dwa główne
typy włókien: białe (beztlenowe) i czerwone
(tlenowe). Te pierwsze „pracują” podczas bie¬
gów sprintowych, a te drugie - przy długo¬
trwałej tlenowej pracy mięśni. W czasie sprintu
mięsień wykorzystuje jako źródło energii fo-
sfokreatynę i glikolizę; w czasie późniejszych
faz biegu maratońskiego duże znaczenie ma
utlenianie kwasów tłuszczowych.
• Komórki niemięśniowe wykonują różnego ro¬
dzaju pracę mechaniczną dzięki strukturom,
z których jest zbudowany ich szkielet. W skład
tych struktur wchodzą filamenty aktynowe
(mikrofilamenty), mikrotubule (składające się
przede wszystkim z tubuliny a i P) i filamenty
pośrednie. Te ostatnie są zbudowane z keratyny,
białka wimentynopodobnego, neurofilamentów
i laminy.
Piśmiennictwo
Bruckdorfer R: The basics about nitic oxide. Mol As-
pects med 2005;26:3.
De La Cruz EM, Ostap EM: Relating biochemistry and
function in the myosin superfamily. Curr Opin Celi
Biol 2004; 16:61.
Herrman H, Aebi U: Intermediate filaments: molecular
structure, assembly mechanism, and integration
into fimctionally distinct intracellular scaffolds.
Annu Rev Biochem 2004;73:749.
Lodish H et al (editors). Molecular Celi Biology, 5^ ed.
WH Freeman & Co., 2004. (Ten świetny tekst obej¬
muje silniki molekularne, skurcz mięśni, mikrofila¬
menty, mikrotubule i filamenty pośrednie).
Metthews KD, Moore SA: Multicore myopathy, central
core disease, malignant hyperthermia susceptibi-
lity, and RyRl mutations: one disease with many
faces? Arch Neurol 2004;61:106.
Murphy RT, Starling RC: Genetics and cardiomyopathy:
where are we now? Cleve Clin Med 2005; 72:465.
Nowak KJ, Davies KE: Duchenne muscular distrophy
and distrophin: pathogenesis and opportunities for
treatment. EMBO Rep 2004;5:872.
Palmer KJ, Watson P, Stephens DJ: The role of microtu-
bules in transport between endoplasmic reticulum
and Golgi apparatus in mammalian cells. Biochem
Soc Symp 2005;72:1.
Serwer CR et al (editors): The metabolism and Mole¬
cular Bases of Inherited Disease, 8,h ed, McGrow-
-Hill, 2001. (Ta 4-tomowa książka zawiera roz¬
działy poświęcone złośliwej hipertermii, kanało-
patiom, kardiomiopatii przerostowej, dystrofiom
mięśniowym i nieprawidłowościom filamentów
pośrednich).
Webb RC: Smooth muscle contraction and relaxation.
Adv Physiol Educ 2003;27:201.
Wahrens XHT, Lehnart SE, Marks AR: Intracellular cal-
cium release and cardiac disease. Annu Rev Physiol
2005;67:69.
Białka osocza i immunoglobuliny
Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Niezwykle istotna rola, jaką odgrywa krew
w utrzymaniu homeostazy, oraz łatwość, z jaką
krew może być pobierana do analiz sprawiły, że
badania jej składników nabrały szczególnego zna¬
czenia w rozwoju biochemii ogólnej i biochemii
klinicznej.
W niniejszym rozdziale opisano podstawowe
właściwości różnych białek osocza, w tym im-
munoglobulin (przeciwciał). Zmiany stężenia
białek osocza i immunoglobulin występują w wie¬
lu chorobach i mogą być oceniane na podstawie
rozdziału elektroforetycznego lub innymi meto¬
dami. We wcześniejszym rozdziale opisano, że
zmiany aktywności niektórych enzymów w oso¬
czu są brane pod uwagę przy rozpoznawaniu wie¬
lu stanów chorobowych.
KREW SPEŁNIA WIELE FUNKCJI
Funkcje krwi - z wyjątkiem swoistych dla ele¬
mentów komórkowych, takich jak transport tlenu
i odporność komórkowa - spełniają osocze i jego
składniki (tab. 49-1).
Osocze składa się z wody, elektrolitów, metabo¬
litów, składników pokarmowych, białek i hormo¬
nów. Zawartość wody i elektrolitów jest praktycz¬
nie taka sama jak we wszystkich płynach pozako-
mórkowych. Oznaczanie stężenia Na+, K+, Ca2+,
Cl i HC03 w surowicy oraz PaC02 i pH krwi jest
bardzo pomocne w procesie leczenia wielu chorych.
OSOCZE ZAWIERA BARDZO ZŁOŻONA
MIESZANINĘ BIAŁEK
Stężenie białka całkowitego w osoczu ludzkim
wynosi ok. 70-75 g/L (7,0-7,5 g/dL). Stanowi
ono główną część niezmiennych składników oso-
Tabela 49-1. Gtówne funkcje krwi
1. Oddychanie — transport tlenu z ptuc do tkanek oraz ditlenku
węgla z tkanek do ptuc.
2. Odżywianie — transport wchłoniętych substancji odżyw¬
czych.
3. Wydalanie — transport zbędnych metabolitów do nerek,
ptuc, skóry i jelit w celu ich usunięcia.
4. Utrzymywanie prawidłowej równowagi kwasowo-zasadowej
w organizmie.
5. Regulacja gospodarki wodnej przez wpływ na wymianę wod¬
ną między płynem tkankowym i jego pulą krążącą.
6. Regulacja temperatury ustrojowej poprzez dystrybucję ener¬
gii cieplnej w organizmie.
7. Obrona przed zakażeniem za pośrednictwem białych krwinek
i krążących przeciwciał.
8. Transport hormonów i regulacja metabolizmu.
9. Transport metabolitów.
10. Krzepnięcie.
cza. Białka osocza są bardzo złożoną mieszaniną
zawierającą nie tylko białka proste, lecz także zło¬
żone, takie jak glikoproteiny i wiele rodzajów li-
poprotein. Zastosowanie technik proteomicznych
pozwala na wyizolowanie i scharakteryzowanie
uprzednio nieznanych białek osocza; niektóre
z nich występują w bardzo małych ilościach (np.
wykrywane w płynie dializacyjnym lub w osoczu
chorych na raka) i to rozszerza proteom osocza.
W osoczu krwi człowieka znajduje się tysiące
przeciwciał, chociaż zawartość poszczególnych
ich rodzajów w warunkach prawidłowych jest
zwykle stosunkowo mała. Względne wielkości
i masy cząsteczkowe kilku spośród białek osocza
przedstawiono na ryc. 49-1.
Wydzielenia poszczególnych białek z mieszani¬
ny dokonuje się często za pomocą różnych roz¬
puszczalników i(lub) elektrolitów, wykorzystując
charakterystyczną rozpuszczalność poszczegól¬
nych białek. Na tej zasadzie bazują tzw. metody
wysalania, które znalazły zastosowanie w ozna-
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 707
Skala
10 nm Na+ Cf Glukoza
Albumina
69 000
Hemoglobina
64 500
prGlobulina
90 000
y-Globulina
156 000
arLipoproteina
200 000
prLipoproteina
1 300 000
Fibrynogen
340 000
się ciśnienie płynu śródmiąższowego wynoszące
1 mm Hg (0,13 kPa). Ciśnienie osmotyczne (on-
kotyczne) uwarunkowane białkami osocza wyno¬
si ok. 25 mm Hg (3,3 kPa). Wypadkowe ciśnienie
ok. 11 mm Hg (1,5 kPa) powoduje więc prze¬
mieszczenie płynów do przestrzeni śródmiąższo¬
wej. Ciśnienie hydrostatyczne w drobnych naczy¬
niach żylnych wynosi ok. 17 mm Hg (2,3 kPa),
a ciśnienia onkotyczne i śródmiąższowe są takie
jak poprzednio - wypadkowe ciśnienie ok. 9 mm
Hg (1,2 kPa) powoduje powrót wody do układu
krążenia. Opisane ciśnienia są często nazywane
siłami Starlinga. Gdy stężenie białka w osoczu
znacznie się zmniejsza (np. w ciężkim niedoży¬
wieniu białkowym), płyn nie jest wciągany z po¬
wrotem do łożyska naczyniowego, lecz gromadzi
się w przestrzeni pozanaczyniowej, co prowadzi
do powstania obrzęków. Spośród wielu przyczyn
tego stanu jedną jest niedobór białka.
Białka osocza badano bardzo dokładnie
Ryc. 49-1. Względne wielkości i masy cząsteczkowe białek krwi
(Oncley).
czaniu frakcji białkowych w laboratorium klinicz¬
nym. Stosując różne stężenia siarczanu sodu lub
siarczanu amonu, można rozdzielić białka osocza
na trzy główne grupy - fibrynogen, albuminy
i globuliny.
Powszechnie stosowaną metodą analizy białek
osocza jest elektroforeza. W różnych jej rodzajach
stosuje się odmienne nośniki. W laboratoriach kli¬
nicznych najczęściej jest stosowany octan celulozy,
który pozwala na rozdzielenie białek osocza na pięć
frakcji - albuminy, ar, a2-, P- i y-globuliny (ryc. 49-
-2). Wybarwione paski octanu celulozy (lub innego
nośnika) określa się jako elektroforogram. Stęże¬
nie każdej spośród pięciu frakcji można wygodnie
określić, posługując się densytometrem. Charakte¬
rystyczne zmiany zawartości jednej lub kilku tych
frakcji stwierdza się w wielu chorobach.
Ze względu na dość dużą łatwość pozyskiwania,
białka osocza zarówno ludzi, jak zwierząt były
dokładnie badane. Istotne informacje uzyskano na
temat biosyntezy, metabolizmu, struktury i funk¬
cji głównych białek osocza. Przedmiotem wielu
badań były również zmiany w ich stężeniu i meta¬
bolizmie w wielu stanach chorobowych. W ostat¬
nich latach sklonowano oraz zbadano struktury
genów dla wielu białek osocza.
Uzyskanie przeciwciał swoistych dla poszcze¬
gólnych białek osocza znacznie ułatwiło ich anali¬
zę, dzięki możliwościom precypitacji oraz wyizo¬
lowania czystych białek ze złożonej mieszaniny
występującej w tkankach lub w osoczu. Zastoso¬
wanie z kolei izotopów promieniotwórczych po¬
zwoliło poznać ich szlaki biosyntezy oraz szyb¬
kość metabolizmu w osoczu.
Na podstawie badań białek osocza można
przedstawić następujące uogólnienia:
A. Większość białek osocza syntetyzowana jest
W WĄTROBIE
Stężenie białka w osoczu jest istotne
dla rozmieszczenia płynu miedzy krwią
a tkankami
Ciśnienie hydrostatyczne w tętniczkach wyno¬
si ok. 37 mm Hg (4,9 kPa), a przeciwstawia mu
Stwierdzono to, badając zwierzęta po wykonanej
doświadczalnie hepatektomii oraz stosując per-
fundowane preparaty wyizolowanej wątroby, jej
skrawki, homogenaty lub systemy translacji i uży¬
wając mRNA ekstrahowanego z wątroby. y-Glo-
buliny syntetyzowane są przez komórki plazma-
708 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ryc. 49-2. Technika elektroforezy strefowej na octanie celulozy: A - matą ilość surowicy lub innego płynu nanosi się na pasek z oc¬
tanu celulozy, B - przeprowadzany jest rozdział elektroforetyczny białek zawartych w próbce w elektrolitowym środowisku buforu,
C - po zabarwieniu rozdzielone pasma białkowe uwidaczniają się w charakterystycznych dla nich miejscach, D - za pomocą pomiarów
densytometrycznych rozdział elektroforetyczny na octanie celulozy jest przekształcany do diagramu, na którym odpowiednie charakte¬
rystyczne „piki” symbolizują: albuminy, arglobuliny, a2-globuliny, (3-globuliny i y-globuliny. (Rycina reprodukowana za zgodą z: Parslow
TG (red.): Medical Immunology, wyd. 10, McGraw-Hill, 2001).
tyczne, a pewne białka osocza jeszcze w innych
miejscach, np. w komórkach śródbłonka.
B. Białka osocza sa syntetyzowane głównie przez
POURYBOSOMY ZWIĄZANE Z BŁONAMI
Przed wejściem do osocza przechodzą głównym
szlakiem wydzielniczym komórki, obejmującym
szorstką i gładką siateczkę śródplazmatyczną,
aparat Golgiego oraz pęcherzyki wydzielnicze.
Większość spośród białek osocza jest syntetyzo¬
wana jako prebiałka mające na N-końcu peptydy
sygnałowe (p. rozdz. 45). Podlegają one następnie
wielu modyfikacjom potranslacyjnym (proteoliza,
glikozylacja, fosforylacja itd.) podczas transportu
przez komórkę. Czas przemieszczenia z miejsca
syntezy do osocza wynosi od 30 min do wielu go¬
dzin, w zależności od rodzaju białka.
C. Prawie wszystkie białka osocza są glikoproteinami
Zawierają one łańcuchy oligosacharydowe połą¬
czone poprzez atomy N i(lub) O (p. rozdz. 46).
Wyjątkiem jest albumina, która nie zawiera reszt
cukrowych. Łańcuchy oligosacharydowe pełnią
wiele funkcji (p. tab. 46-2). Usunięcie końcowej
reszty kwasu sialowego z pewnych białek osocza
(np. ceruloplazminy) poprzez działanie neurami-
nidazy może znacznie skrócić ich okres półtrwa-
nia w osoczu (p. rozdz. 46).
D. Wiele białek osocza wykazuje polimorfizm
Polimorfizm jest cechą mendlowską lub mono-
genową, występującą w populacji w co najmniej
dwóch fenotypach, z częstością większą niż
1-2%. Substancje grupowe krwi układu AB0
(rozdz. 51) są najlepiej znanym przykładem po¬
limorfizmu u ludzi. Polimorfizm ludzkich białek
osocza stwierdza się np. w przypadku aranty-
trypsyny, haptoglobiny, transferryny, cerulopla¬
zminy i immunoglobulin. Formy polimorficzne
tych białek można rozdzielić różnymi metodami
(np. różnymi typami elektroforezy, ogniskowa¬
niem izoelektrycznym), w których każda forma
wykazuje charakterystyczną szybkość migracji.
Analiza polimorfizmu białek osocza jest przed¬
miotem badań genetycznych i antropologicz¬
nych, a w pewnych przypadkach (np. arantytry-
psyna, p. niżej) wzbudza także zainteresowanie
klinicystów.
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 709
Tabela 49-2. Niektóre funkcje białek osocza
Funkcja
Białka osocza
Antyproteazy
Antychymotrypsyna
arAntytrypsyna (arantyproteinaza)
a2-Makroglobulina
Antytrombina
Krzepnięcie krwi
Różne czynniki krzepnięcia, fibrynogen
Enzymy
Czynne we krwi, np. czynniki
krzepnięcia, cholinoesteraza
Uwolnione z komórek lub tkanek,
np. aminotransferazy
Hormony
Erytropoetyna1
Obrona
immunologiczna
Immunoglobuliny, białka układu
dopełniacza, p2-nriikroglobulina
Udział w reakcji
zapalnej
Białka fazy ostrej (np. białko C-reaktywne,
kwaśna arglikoproteina [orozomukoid])
Białka
nowotworowo-
-płodowe
arFetoproteina (AFP)
Białka
transportujące
lub wiążące
Albuminy (różne ligandy, w tym bilirubina,
wolne kwasy tłuszczowe, jony (Ca2+),
metale (np. Cu2+, Zn2+), methemoglobina,
steroidy, inne hormony i różne leki)
Ceruloplazmina (zawiera Cu2+, albumina
odgrywa prawdopodobnie ważniejszą
rolę w przenoszeniu Cu2+)
Globulina wiążąca kortykosteroidy
(transkortyna) (wiążąca kortyzol)
Haptoglobina
(wiąże hemoglobinę pozakrwinkową)
Lipoproteiny
(chylomikrony, VLDL, LDL, HDL)
Hemopeksyna (wiąże hem)
Białko wiążące retinol
Globuliny wiążące hormony płciowe
(wiążą testosteron, estradiol)
Globulina wiążąca hormony tarczycy
(wiąże tyroksynę i trijodotyroninę)
Transferryna (przenosi żelazo)
Transtyretyna (poprzednio: prealbumina);
wiąże tyroksynę i tworzy kompleks
z białkiem wiążącym retinol
1 We krwi krążą różne hormony, ale nie są one zwykle określa¬
ne jako białko osocza. Podobnie ferrytyna - występuje w osoczu
w małych ilościach, ale nie jest zwykle uważana za białko osocza.
E. Każde białko osocza ma charakterystyczny okres
PÓŁTRWANIA W UKŁADZIE KRĄŻENIA
Okres półtrwania białek osocza może być
oznaczony metodą znakowania wyizolowanego,
oczyszczonego białka za pomocą131! w warun¬
kach zapobiegających jego denaturacji. Izotop
ten łączy się kowalencyjnie z resztami tyrozyny
w cząsteczce białka. Niezwiązany 13 !I oddziela się
następnie od znakowanego białka i określa jego
aktywność właściwą (dpm/mg białka). Znaną
ilość aktywnego białka podaje się dorosłej osobie,
a następnie pobiera się próbki krwi w określonych
odstępach czasu i określa ich radioaktywność.
Uzyskane wartości wykreśla się jako funkcję cza¬
su i oznacza okres półtrwania (czas zmniejszenia
radioaktywności od wartości szczytowej do poło¬
wy tej wartości), po odliczeniu czasu koniecznego
do zrównoważenia (wymieszanie się) stężenia po¬
dawanego białka w krwi i przestrzeni pozanaczy-
niowej. Okresy półtrwania uzyskane dla albumin
i haptoglobin u zdrowych osób dorosłych wyno¬
szą odpowiednio 20 i 5 dni. W pewnych schorze¬
niach okres półtrwania białek może się znacznie
zmienić. Na przykład w chorobie Crohna doty¬
czącej układu pokarmowego znaczna ilość białek
osocza, głównie albumin, może być bezpowrot¬
nie tracona poprzez wydzielanie do światła jelita
przez zmienioną zapalnie błonę śluzową. Osoby
dotknięte tym schorzeniem wykazują gastro-
enteropatię z utratą białka, a okres półtrwania
podanej dożylnie jodowanej albuminy może się
skrócić do ok. 1 dnia.
F. Stężenie niektórych białek w osoczu zwiększa
SIĘ podczas ostrych stanów zapalnych lub wtórnie
W NASTĘPSTWIE PEWNYCH RODZAJÓW USZKODZEŃ TKANEK
Do białek tych, zwanych białkami ostrej fazy
(lub reaktantami), zalicza się: białko C-reaktyw-
ne (CRP, zwane tak ze względu na reaktywność
z polisacharydem C pneumokoków), arantytry-
psynę, haptoglobinę, kwaśną a,-glikoproteinę
oraz fibrynogen. Stężenie tych białek zwięk¬
sza się od 1,5 do ponad 1000 razy w przypadku
CRP. Stężenie to może być również zwiększone
podczas przewlekłych procesów zapalnych oraz
u chorych z nowotworami złośliwymi. Uważa
się, że białka te odgrywają rolę w odpowiedzi
organizmu na proces zapalny. Na przykład biał¬
ko C-reaktywne może aktywować drogę klasycz¬
ną dopełniacza, a a,-antytrypsyna zdolna jest
do neutralizacji pewnych proteaz uwalnianych
podczas ostrego stanu zapalnego. Interleukina 1
(IL-1), polipeptyd uwalniany z jednojądrowych
komórek fagocytujących, jest głównym, lecz nie
jedynym stymulatorem syntezy większości bia-
710 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
łek ostrej fazy przez hepatocyty. Inne cząsteczki,
m.in. IL-6, również uczestniczą w tym procesie i,
podobnie jak IL-1, wydają się działać na poziomie
transkrypcji genu.
Jądrowy czynnik kappa-B (NFKB) jest czyn¬
nikiem transkrypcyjnym, biorącym udział w po¬
budzaniu syntezy niektórych białek fazy ostrej.
Ten ważny czynnik uczestniczy także w ekspresji
wielu cytokin, chemokin, czynników wzrosto¬
wych i komórkowych białek adhezyjnych zaan¬
gażowanych w funkcje odpornościowe. W wa¬
runkach prawidłowych występuje w formie nie¬
aktywnej w cytozolu, ale jest aktywowany dzia¬
łaniem różnych cząsteczek (np. interleukiny-1),
wytwarzanych w takich procesach, jak zapalenie,
zakażenie i uszkodzenie popromienne.
W tabeli 49-2 zestawiono funkcje wielu białek
osocza. W następnych podrozdziałach podano pod¬
stawowe informacje dotyczące albumin, haptoglo-
biny, transferryny, ceruloplazminy, arantytrypsy-
ny, cb-makroglobuliny, immunoglobulin i układu
dopełniacza. Lipoproteiny omówiono w rozdz. 25.
Albumina jest głównym białkiem
ludzkiego osocza
Albumina - główne białko ludzkiego osocza
(34-^17 g/L) ma masę cząsteczkową ok. 69 kDa.
Stanowi ok. 60% wszystkich białek osocza. Oko¬
ło 40% albumin znajduje się w osoczu, pozostałe
60% w przestrzeni pozakomórkowej. Wątroba
wytwarza ok. 12 g albumin na dobę, co stanowi
ok. 25% całkowitej ilości białek syntetyzowanych
w tym narządzie, a połowę tych, które są wydzie¬
lane. Początkowo albumina jest syntetyzowana
jako preproproteina. Peptyd sygnałowy zosta¬
je usunięty podczas przemieszczenia do cystern
szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, a następ¬
nie zostaje odcięty heksapeptyd na A-końcu pod¬
czas dalszej wędrówki szlakiem wydzielniczym.
Synteza albumin zmniejsza się w różnych choro¬
bach, szczególnie tych, które dotyczą wątroby.
Osocze pacjentów z chorobami wątroby często
cechuje się zmniejszonym ilorazem stężenia albu¬
min do globulin (obniżony stosunek A : G). Syn¬
teza albumin zmniejsza się stosunkowo wcześnie
w warunkach nieprawidłowego odżywienia biał¬
kiem, m.in. w kwashiorkor.
Dojrzała albumina ludzka składa się z jednego
łańcucha polipeptydowego, zbudowanego z 585
reszt aminokwasowych, i zawiera siedemnaście
mostków disiarczkowych. Stosując proteazy,
można podzielić albuminę na trzy domeny, speł¬
niające odmienne funkcje. Albumina ma kształt
elipsoidalny, co oznacza, że nie zwiększa lepko¬
ści osocza w tak znacznym stopniu jak cząstecz¬
ki o wydłużonym kształcie, np. fibrynogen. Ze
względu na stosunkowo małą masę cząsteczkową j
(ok. 69 kDa) i duże stężenie albumina wydaje się
w 75-80% odpowiadać za ciśnienie onkotycz-
ne ludzkiego osocza. Badania elektroforetyczne
wykazały, że osocze niektórych osób nie zawie- I
ra albuminy, co określa się terminem analbumi- .
nemii. Jedną z przyczyn tego stanu jest mutacja |
zaburzająca proces wycinania i składania („spli- <
ring”). U osób z analbuminemią występują je¬
dynie niewielkie obrzęki, mimo iż albumina jest I
głównym czynnikiem decydującym o ciśnieniu
onkotycznym osocza. Uważa się, że zwiększenie
stężenia innych białek osocza kompensuje skutki
braku albumin.
Inną istotną cechą albumin jest ich zdolność do
wiązania różnych ligandów. Należą do nich wol¬
ne kwasy tłuszczowe (WKT), wapń, pewne hor¬
mony steroidowe, bilirubina oraz część tryptofanu
obecnego w osoczu. Ponadto albumina wydaje się
odgrywać dużą rolę w transporcie miedzi w orga¬
nizmie (p. niżej). Wiele leków, m.in. sulfonamidy,
penicylina G, dikumarol, kwas acetylosalicylowy,
związanych jest z albuminą; ma to istotne impli¬
kacje farmakologiczne.
Preparaty ludzkiej albuminy są stosowane w le¬
czeniu wstrząsu krwotocznego oraz oparzeń. Ta
metoda leczenia jest obecnie dokładnie analizo¬
wana, ponieważ ostatnie badania sugerują, że po¬
danie albumin chorym oparzonym może zwięk¬
szyć śmiertelność.
Haptoglobina wiąże pozakrwinkowa
hemoglobinę, zapobiegając
przedostawaniu się wolnej
hemoglobiny do nerek
Haptoglobina (Hp) jest osoczową glikoproteiną,
która wiąże pozakrwinkową hemoglobinę (Hb)
w zwarty niekowalencyjny kompleks (Hb-Hp).
Hp zawarta w 1 L może związać 400-1800 mg Hb.
Około 10% Hb degradowanej każdego dnia uwal¬
nia się do krążenia, stąd jest określana jako poza¬
krwinkowa. Pozostałe 90% występuje w starych,
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 711
uszkodzonych erytrocytach i jest katabolizowane
w komórkach układu histiocytamego. Masa czą¬
steczkowa Hb wynosi ok. 65 kDa, a najprostszej
formy polimorficznej Hp (Hp-1-1) u ludzi - ok.
90 kDa. Powstały kompleks Hb-Hp osiąga masę
cząsteczkową 155 kDa. Wolna Hb przechodzi
przez kłębuszki nerkowe i dostaje się do kanali¬
ków, gdzie ma skłonność do wytrącania się (może
to nastąpić w następstwie masywnego przetoczenia
krwi niezgodnej grupowo, z przekroczenia pojem¬
ności wiążącej Hp względem Hb) (p. ryc. 49-3).
Kompleks Hb-Hp jest zbyt duży, aby przenikać
przez kłębuszki nerkowe. Funkcja Hp prawdo¬
podobnie polega na zapobieganiu utracie wolnej
Hb przez nerki. Chroni ona cenne atomy żelaza,
obecne w Hb, przed utratą z organizmu.
A. Hb -> nerki -► Wydzielanie do moczu lub wytrącanie w świetle
(m.cz. 65 ooo) kanalików nerkowych; organizm traci żelazo
B. Hb + Hp -> Kompleks Hb : Hp Nerka
(m.cz. 65 000) (m.cz. 90 000) (m.cz. 155 000)
l
Rozkładany przez hepatocyty;
żelazo jest przechowywane
do ponownego użycia
Ryc. 49-3. Różne losy wolnej hemoglobiny (Hb) oraz kompleksu
Hb z haptoglobiną (Hp).
Ludzka Hp występuje w trzech formach poli-
morficznych, znanych jako Hp 1-1, Hp 2-1 i Hp
2-2. Hp 1 -1 wędruje w elektroforezie na żelu skro¬
biowym jako pojedyncze pasmo, natomiast Hp
2-1 i Hp 2-2 wykazują bardziej złożony profil
pasm. Dwa geny, oznaczane jako Hp1 i Hp2, kodują
te trzy fenotypy, przy czym Hp 2-1 jest fenotypem
heterozygotycznym. Sugeruje się, że polimorfizm
haptoglobiny może się łączyć ze skłonnością do
występowania wielu chorób zapalnych.
Stężenie Hp w osoczu ludzkim jest zmienne,
co ma znaczenie diagnostyczne. Małe stężenia
Hp stwierdza się u chorych z niedokrwistościa-
mi hemolitycznymi. Wyjaśnia to obserwację, że
okres półtrwania Hp wynosi ok. 5 dni, natomiast
w przypadku kompleksu Hb-Hp, szybko usuwa¬
nego z osocza przez hepatocyty, nie przekracza
90 min. Jeśli Hp jest związana z Hb, eliminacja
z osocza przebiega 80 razy szybciej niż zwykle.
Zgodnie z tym, stężenie Hp zmniejsza się szybko
w sytuacjach, gdy Hb jest stale uwalniana z ery¬
trocytów, co występuje w niedokrwistościach he-
molitycznych. Hp należy do białek ostrej fazy i jej
stężenie zwiększa się w wielu stanach zapalnych.
Pewne białka osocza wiążą hem, lecz nie Hb.
Hemopeksyna jest fh-globuliną, która wiąże wol¬
ny hem. Albumina łączy się z methemem (hem
żelazowy), tworząc methemalbuminę, a następnie
przekazuje methem hemopeksynie.
Wchłanianie żelaza w jelicie cienkim jest
precyzyjnie regulowane
Transferryna (Tf) jest białkiem osocza, które
odgrywa główną rolę w transporcie żelaza do każ¬
dego miejsca, w którym jest ono potrzebne. Przed
omówieniem tego zagadnienia, zostaną podsumo¬
wane niektóre aspekty metabolizmu żelaza.
Żelazo jest ważne dla organizmu człowieka, po¬
nieważ występuje w wielu hemoproteinach, takich
jak hemoglobina, mioglobina i cytochromy. Jest
przyjmowane z pokarmem jako żelazo hemowe lub
niehemowe (ryc. 49-4). Wykazano, że obie te formy
są przyswajane odrębnymi szlakami. Wchłanianie
żelaza zachodzi w bliższym odcinku dwunastnicy
i jest precyzyjnie regulowane, ponieważ nie ma fi¬
zjologicznej drogi wydalania żelaza z organizmu.
W warunkach prawidłowych ustrój chroni swoje
żelazo, tak że zdrowy mężczyzna wydala go tyl¬
ko około 1 mg/24 godz., co jest kompensowane
wchłanianiem. Dorosłe kobiety są bardziej podatne
ne niedobór żelaza, ponieważ tracą go więcej pod¬
czas krwawień miesiączkowych. Zawartość żelaza
w różnych przestrzeniach (kompartmentach) ustro¬
ju jest przedstawiona w tab. 49-3.
Enterocyty w bliższej części dwunastnicy są
odpowiedzialne za wchłanianie żelaza. Spożyte
żelazo w postaci jonów Fe3+ jest redukowane do
jonów Fe2+ przez ferrireduktazę występującą na
powierzchni enterocytów (ryc. 49-4). Witamina
C zawarta w pożywieniu ułatwia redukcję jonów
żelaza(III) do żelaza(II). Przemieszczenie jonów
przez szczytową część błony enterocytów zacho¬
dzi przy udziale transportera metali dwuwar-
tościowych (DMT1), którego czynność jest zwią¬
zana z przemieszczeniem się protonów. Białko to
nie jest swoiste dla żelaza i może przenosić różne
dwuwartościowe kationy.
Niedawno odkryty peptyd (złożony z 25 reszt
aminokwasowych, wytwarzany w wątrobie), o na¬
zwie hepcydyna, odgrywa ważną rolę w metaboli-
712 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Rąbek
szczoteczkowy
Ryc. 49-4. Schemat wchłaniania żelaza. Fe3+ ulega przekształceniu do Fe2+ przez reduktazę żelazo¬
wą i Fe2+ jest transportowane do enterocytu poprzez jego błonę luminalną za pomocą transportera
żelaza DMT1. Hem jest transportowany do enterocytu przez oddzielny transporter hemowy (HT)
i oksydaza hemowa (HO) uwalnia Fe2+ z hemu. Część wewnątrzkomórkowych jonów Fe2+ ulega
przekształceniu do Fe3+ i zostaje związana przez ferrytynę. Pozostałe jony Fe2+ wiąże transporter
części podstawnej (FP) błony komórkowej i przenosi do krwi. Pomaga w tym hefaestyna (HP).
W osoczu jony Fe3+ są związane z białkiem transportującym - transferryną (FT). (Reprodukowano
za zgodą z: Ganong WF: Review of Medical Physiology, wyd. 21, McGraw-Hill, 2003).
Tabela 49-3. Rozmieszczenie żelaza w organizmie dorosłego
mężczyzny o masie 70 kg mc.1
Transferryna
3-4 mg
Hemoglobina w erytrocytach
2500 mg
Mioglobina i różne enzymy
300 mg
Żelazo zapasowe (ferrytyna i hemosyderyna)
1000 mg
Wchłanianie
1 mg/d
Straty
1 mg/d
1 W przypadku organizmu dorosłej kobiety o zbliżonej ma¬
sie ciała ilości zmagazynowanego żelaza są ogólnie mniejsze
(np. 100-400 mg), natomiast straty większe (np. 1,5-2,0 mg/d).
zmie żelaza. Zmniejsza on wchłanianie jelitowe że¬
laza i jego transport przez łożysko, a także uwalnia¬
nie żelaza z makrofagów, prawdopodobnie na sku¬
tek oddziaływania z ferroportyną. Kiedy stężenie
żelaza w osoczu jest duże, synteza hepcydyny się
zwiększa. Zjawisko przeciwne zachodzi wówczas,
gdy stężenie żelaza w osoczu jest małe. Może to
odgrywać pewną rolę w hemochromatozie (p. da¬
lej), a także w niedokrwistości z niedoboru żelaza
w przewlekłych stanach zapalnych. Inne niedaw¬
no odkryte białko - hemojuwelina może działać
i przez modulację ekspresji hepcydyny.
Kiedy żelazo znajduje się we wnętrzu enterocy¬
tu, może być albo magazynowane jako ferrytyna,
albo transportowane przez podstawną część bło¬
ny komórkowej do osocza, gdzie jest przenoszo¬
ne przez transferrynę (p. niżej). Transport przez
część podstawną błony komórkowej enterocytu
zachodzi przy udziale innego białka - ferropor-
tyny. Białko to oddziałuje z zawierającym miedź
białkiem hefaestyną, podobnym do ceruloplazmi-
ny (p. niżej). Hefestyna jest uważana za ferooksy-
dazę, która jest ważna dla uwalniania jonów że¬
laza z komórek. Tak więc, jony Fe2+ są ponownie
przekształcane w Fe3+ i w tej formie przenoszone
w osoczu przez transferrynę.
Cały proces regulacji wchłaniania żelaza jest
złożony i nie do końca poznany. Wydaje się, że
kluczową rolę w tym zjawisku odgrywa hepcydy-
na. Regulacja zachodzi w enterocycie, gdzie dal¬
sze wchłanianie jest hamowane (prawdopodobnie
przez hepcydynę), jeżeli wystarczające ilości żela¬
za zostały przyjęte z pokarmem (tzw. regulacja die¬
tetyczna uzupełniona przez „blok śluzówkowy”).
Prawdopodobnie odpowiada ona na całościowe za¬
potrzebowanie na żelazo wynikające z erytropoezy
(regulacja erytroetyczna). Nadmierne wchłanianie
następuje w hemochromatozie (p. niżej).
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 713
Transferryna przemieszcza żelazo
do miejsc, w których jest ono
metabolizowane
Transferryna jest prglobuliną o masie cząstecz¬
kowej ok. 80 kDa. Jest to glikoproteina syntetyzo¬
wana przez wątrobę. Wykazano obecność ponad
dwudziestu polimorficznych form tego białka.
Transferryna odgrywa główną rolę w ustrojowej
gospodarce żelazem, ponieważ transportuje je
(2 mole Fe3+ na 1 mol transferryny) w układzie
krążenia do miejsc, w których jest ono potrzebne,
m.in. z jelita do szpiku i innych narządów.
Około 200 miliardów erytrocytów (= 20 mL
krwi) jest poddawane procesom katabolicznym
i uwalnia dziennie ok. 25 mg żelaza. Większość
tego żelaza jest transportowana przez transferrynę.
Na powierzchni wielu komórek występują re¬
ceptory dla transferryny (TfRl i TfR2). Transfer¬
ryna wiąże się z tymi receptorami i ulega interna¬
lizacji na zasadzie endocytozy sterowanej recep¬
torem (por. losy LDL, rozdz. 25). W kwaśnym pH
wewnątrz lizosomów następuje oddysocjowanie
żelaza od białka. W przeciwieństwie jednak do
białkowej części LDL, apotransferryna nie ulega
degradacji w obrębie lizosomów. Pozostaje ono
związane z receptorem, powraca do błony cyto-
plazmatycznej, oddziela się od receptora, przenika
następnie do osocza, pobiera kolejną porcję żelaza
i znów dostarcza je do potrzebujących komórek.
W warunkach prawidłowych żelazo wiąże się
do transferryny 10-20 razy dziennie.
Nieprawidłowości w glikozylacji transferryny
występują we wrodzonych zaburzeniach gli¬
kozylacji (rozdz. 46) i w przewlekłym naduży¬
waniu alkoholu. Wykrycie ich, na przykład za
pomocą ogniskowania izoelektrycznego, może
być pomocne w rozpoznawaniu tych stanów cho¬
robowych.
Niedokrwistość z niedoboru żelaza
występuję wyjątkowo często
Metabolizm żelaza jest szczególnie ważny u ko¬
biet ze względów wyżej przedstawionych. Rów¬
nież w ciąży należy uwzględnić zapotrzebowanie
rozwijającego się płodu na żelazo. U starszych
ludzi odżywiających się skromnie (herbata,
grzanki) także może dojść do niedoboru żelaza.
Niedokrwistość z niedoboru żelaza zależna od
niedostatecznego wchłaniania, nieprawidłowego
wykorzystania lub nadmiernej jego utraty jest
jednym z najczęściej spotykanych stanów choro¬
bowych obserwowanych w praktyce lekarskiej.
Stężenie transferryny w osoczu wynosi ok. 3,0
g/L (300 mg/dL). Ta ilość transferryny może wią¬
zać ok. 3 mg żelaza/L osocza, co określa się mia¬
nem całkowitej zdolności wiązania żelaza przez
osocze. W stanie prawidłowym jedynie V3 trans¬
ferryny jest wysycana żelazem. W niedokrwisto¬
ści z niedoboru żelaza białko jest w mniejszym
stopniu wysycone żelazem, natomiast w warun¬
kach spichrzania nadmiaru żelaza w organizmie
(np. hemochromatoza) znacznie przekracza V3.
Ferrytyna magazynuje żelazo
w komórkach
Ferrytyna jest kolejnym białkiem istotnym
z punktu widzenia metabolizmu żelaza. W wa¬
runkach prawidłowych gromadzi ono żelazo, któ¬
re może być z niego pobierane w razie potrzeby.
W przypadku nadmiaru żelaza (np. hemochroma¬
toza) ustrojowe zapasy żelaza znacznie się zwięk¬
szają i zdecydowanie więcej ferrytyny stwierdza
się w tkankach, głównie w wątrobie i śledzionie.
Ferrytyna zawiera ok. 23% żelaza oraz apofer-
rytynę (część białkowa niezawierająca żelaza)
i ma masę cząsteczkową ok. 440 kDa. Ferrytyna
zbudowana jest z dwudziestu czterech podjedno-
stek o masie cząsteczkowej 18,5 kDa, które ota¬
czają 3000-4000 atomów żelaza występujących
w postaci micelamej. Normalnie stężenie ferryty¬
ny w osoczu krwi jest małe; u chorych z nadmia¬
rem żelaza jest dużo większe; stężenie ferrytyny
w osoczu można w sposób wygodny oznaczyć
metodami radioimmunologicznymi. Parametr ten
może być dobrym wskaźnikiem stanu ustrojo¬
wych zapasów żelaza.
Synteza receptorów dla transferryny (TfR)
i ferrytyny jest wzajemnie uzależniona od za¬
wartości żelaza w komórce. Swoiste, nieulegające
translacji fragmenty cząsteczek mRNA, odpo¬
wiedzialne za syntezę obu receptorów (nazywane
składnikami reagującymi na żelazo), oddziały¬
wają z białkami cytozolowymi w komórce. Kiedy
zawartość żelaza jest zwiększona, komórka gro¬
madzi mRNA, aby syntetyzować ferrytynę, nato¬
miast mRNA dla TfR jest degradowany. Przeciw¬
nie, kiedy zawartość żelaza jest mała, stabilizacji
714 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
ulega mRNA dla TfR i dochodzi do zwiększonej
syntezy tego receptora, podczas gdy mRNA dla
ferrytyny jest magazynowany w postaci nieczyn¬
nej. Jest to ważnym przykładem kontroli ekspresji
białek na poziomie translacji.
Hemosyderyna jest cząsteczką słabo poznaną;
wydaje się, że może to być częściowo zdegrado¬
wana postać ferrytyny, wciąż zawierająca żelazo.
Można ją wykryć barwieniami histologicznymi
(np. błękitem pruskim) na obecność żelaza, a jej
występowanie dowodzi nadmiernego gromadze¬
nia żelaza.
Dziedziczna hemochromatoza jest
wynikiem mutacji genu HFE
Dziedziczna (pierwotna) hemochromatoza jest
autosomalną, recesywną chorobą, bardzo często
występującą w niektórych częściach świata (np.
w Szkocji, Irlandii, Ameryce Północnej). Cha¬
rakteryzuje się nadmiernym magazynowaniem
żelaza w tkankach. Całkowita zawartość żelaza,
która u zdrowych dorosłych wynosi 2,5-3,5 g,
u chorych na pierwotną hemochromatozę zwykle
przekracza 15 g. Nagromadzone żelazo uszka¬
dza narządy i tkanki, takie jak wątroba, wysep¬
ki trzustkowe i serce, prawdopodobnie częścio¬
wo jako wynik wytwarzania wolnych rodników
(rozdz. 51). Melanina i różne ilości żelaza groma¬
dzą się w skórze, powodując kamiennoszare jej
zabarwienie. Dokładna przyczyna gromadzenia
melaniny w skórze nie jest znana. Częste współ-
występowanie cukrzycy (z powodu uszkodzenia
wysepek trzustkowych) ze zmienionym zabarwie¬
niem skóry stało się podstawą terminu „brązowa
cukrzyca” (ang. diabetes bronze). W 1995 r. Fe¬
ler i wsp. wyizolowali gen, teraz określony jako
HFE, umiejscowiony na chromosomie 6 blisko
genów głównego kompleksu antygenów zgod¬
ności tkankowej. Koduje on białko zbliżone do
białka klasy I antygenów zgodności tkankowej.
Początkowo u chorych na dziedziczną hemochro¬
matozę odkryto dwie mutacje sensu („missense”).
Częściej występuje mutacja punktowa: zamiana
reszty cystyny w pozycji 282 na resztę tyrozy¬
ny (CY282Y) zaburzająca budowę białka. Inna
mutacja zamienia resztę histydyny w pozycji 63
na resztę asparaginy (H63D). Inne mutacje genu
HFE również mogą być przyczyną dziedzicznej
hemochromatozy. Prowadzenie genetycznych ba¬
dań przesiewowych jest przedmiotem oceny, ale
obecnie takie badania nie są zalecane. Poszukiwa¬
nie jednak mutacji genu HFE u chorych ze zwięk¬
szonym stężeniem żelaza może być przydatne.
Białko HFE występuje w komórkach krypt
w jelicie cienkim - miejscu wchłaniania żelaza.
Wykazano, że białko łączy się z p2-mikroglobu-
liną i to połączenie może być niezbędne dla sta¬
bilności przekształceń wewnątrzkomórkowych
oraz ekspresji białka na powierzchni komórek.
Kompleks oddziałuje z receptorem transferryny
(TfR). To jak dochodzi do magazynowania żela¬
za, kiedy HFE jest zmieniona w wyniku mutacji,
stanowi przedmiot badań. Uzyskano model po¬
tencjalnie przydatny do badania hemochromatozy
myszy pozbawionych genu kodującego HFE.
Na rycinie 49-5 przedstawiono schemat przy¬
puszczalnych zmian zachodzących u chorych na
dziedziczną hemochromatozę.
Ryc. 49-5. Schemat prawdopodobnych głównych mechanizmów
przyczynowych dziedzicznej hemochromatozy (MIM 235200).
Głównymi mutacjami są CY282Y i H6D (p. tekst). Wykryto rów¬
nież inne mutacje HFE.
Opisano wiele innych rodzajów hemochroma¬
tozy uwarunkowanych mutacjami genu kodują¬
cych hemojuwelinę, hepcydynę, receptor trans-
feryny-2 i ferroportynę (tab. 49-4).
Wtórna hemochromatoza może wystąpić po
powtarzanych przetaczaniach krwi (np. z powodu
niedokrwistości sierpowatej), nadmiernego po¬
boru żelaza (np. u członków afrykańskiego ple¬
mienia Bantu spożywających napoje alkoholowe
fermentowane w naczyniach z żelaza) lub z wielu
innych przyczyn.
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 715
Tabela 49-4. Typy hemochromatozy
Typ
Biatko uczestniczące
Dziedziczna hemochromatoza
HFE
Hemochromatoza młodzieńcza
Typ 2A
Typ 2B
Hemojuwelina
Hepcydyna
Hemochromatoza typu 3
(zależna od TfR2 dziedziczna
hemochromatoza)
Receptor transferryny-2
Hemochromatoza typu 4 (nadmierne
gromadzenie żelaza zależne od
ferroportyny)
Ferroportyna
Więcej informacji o tych chorobach można znaleźć w OMIM.
Jest również typ hemochromatozy noworodków, przyczyna nie¬
znana.
W tabeli 49-5 przedstawiono badania labora¬
toryjne przydatne w diagnostyce nieprawidłowo¬
ści w zakresie gospodarki żelazem, a w tab. 49-6
- wykaz białek uczestniczących w metabolizmie
żelaza.
Tabela 49-5. Testy laboratoryjne służące do oceny chorych
z zaburzeniami metabolizmu żelaza
• Liczba erytrocytów [hipochromicznych - przyp. tłum] i stęże¬
nie hemoglobiny.
• Określenie stężenia żelaza w osoczu, całkowitej zdolności wią¬
zania żelaza (TIBC) i odsetka wysycenia transferryny.
• Określenie stężenia ferrytyny w osoczu metodą radioimmuno-
logiczną.
• Barwienie wycinków tkankowych za pomocą błękitu pruskiego.
• Ocena ilości żelaza (pg/g) w bioptacie tkankowym.
Tabela 49-6. Niektóre białka biorące udział w przemianach że¬
laza
• Ceruloplazmina (aktywność ferrooksydazy)
• DMT1
• Ferrireduktaza (reduktaza I cytochromu b)
• Ferrytyna
• Ferroportyna
• Transporter hemu
• Hemojuwelina
• Hepcydyna
• Hefaestyna
• HFE
• Odpowiadające na żelazo białko wiążące pierwiastki
• Transferryna
• Receptory transferryny 1 i 2
Ceruloplazmina wiąże miedź;
jej małe stężenie w osoczu
jest przyczyna choroby Wilsona
Ceruloplazmina jest a2-globuliną o masie czą¬
steczkowej ok. 160 kDa. Ze względu na zawartość
miedzi jej zabarwienie jest niebieskie. Zawiera
90% miedzi zawartej w osoczu. Każda cząsteczka
ceruloplazminy wiąże sześć atomów miedzi bar¬
dzo mocno, co sprawia, że pierwiastek ten nie jest
łatwo wymienialny. Albumina przenosi pozostałe
10% miedzi osocza. Siła, z jaką albumina wiąże
miedź jest jednak mniejsza w porównaniu z siłą
wiązania przez ceruloplazminę. W konsekwencji
albumina łatwiej oddaje miedź tkankom niż ce¬
ruloplazmina i prawdopodobnie dlatego jest bar¬
dziej istotna w procesie transportu miedzi w orga¬
nizmie człowieka. Ceruloplazmina wykazuje po¬
nadto aktywność oksydazową, jednak znaczenie
tej cechy nie jest jasne, oprócz możliwego udziału
w utlenianiu jonów Fe2+ w transferrynie do Fe3+.
Stężenie ceruloplazminy w osoczu zmniejsza się
w chorobach wątroby. Małe jej stężenie występu¬
je szczególnie w chorobie Wilsona (zwyrodnie¬
nie wątrobowo-soczewkowe), odznaczającej się
nieprawidłowym metabolizmem miedzi. Aby
przejrzyście opisać tę chorobę, najpierw zostanie
przedstawiona przemiana miedzi oraz choroba
Menkesa - inna choroba związana z metaboli¬
zmem miedzi.
Miedź jest kofaktorem niektórych
enzymów
Miedź jest niezbędnym pierwiastkiem ślado¬
wym. Musi być podawana w diecie, ponieważ
metal ten jest kofaktorem różnych enzymów (tab.
49-7). Miedź przyjmuje i oddaje elektrony, bierze
też udział w reakcjach dysmutacji, hydroksylacji
i utleniania. Nadmiar miedzi może jednak powo¬
dować problemy, ponieważ miedź może utleniać
białka i lipidy, wiązać się do kwasów nukleino¬
wych i zwiększać wytwarzanie wolnych rodni¬
ków. Dlatego istotny jest mechanizm utrzymujący
ilość miedzi w organizmie w granicach wartości
prawidłowych. Organizm zdrowego, dorosłego
człowieka zawiera ok. 100 mg miedzi, zgroma¬
dzonej przede wszystkim w kościach, wątrobie,
nerkach i mięśniach. Dzienne pobranie miedzi
wynosi 2-4 mg, z czego 50% wchłania się w żo-
Więcej informacji o tych białkach można znaleźć w OMIM.
716 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tabela 49-7. Niektóre ważne enzymy zawierające miedź
• Oksydaza aminowa
• Zależna od miedzi dysmutaza ponadtlenkowa
• Oksydaza cytochromowa
• Tyrozynaza
łądku i górnej części jelita cienkiego, a pozostała
część jest wydalana z kałem. Miedź po wchłonię¬
ciu przenoszona jest do wątroby przez albuminy.
Zostaje ona wychwytywana przez komórki wątro¬
bowe i częściowo jest wydalana do żółci. Miedź
opuszcza wątrobę także w postaci związanej z ce-
ruloplazminą, która jest wytwarzana w tym na¬
rządzie.
Zawartość miedzi i niektórych innych
metali w tkankach jest częściowo
regulowana przez metalotioneiny
Metalotioneiny są grupą małych białek (o masie
cząsteczkowej ok. 6,5 kDa) występujących w cy-
tozolu komórek, szczególnie w wątrobie, nerkach
i jelicie. Odznaczają się dużą zawartością cystei¬
ny i mogą wiązać miedź, cynk, kadm i rtęć. Grupy
SH cysteiny biorą udział w wiązaniu metali. Po¬
danie w krótkim czasie (np. w iniekcji) miedzi lub
niektórych innych metali wywołuje (indukuje)
wzrost zawartości tych białek w tkankach, podob¬
nie jak podanie niektórych hormonów lub cyto-
kin. Białka te mogą brać udział w magazynowa¬
niu wymienionych metali w postaci nietoksycznej
i uczestniczą w ogólnym metabolizmie ustroju.
Wiązanie miedzi i jej składowanie zmniejsza ilość
tego pierwiastka uczestniczącego w wytwarzaniu
wolnych rodników.
Choroba Menkesa jest spowodowana
mutacjami genu odpowiedzialnego za
syntezo wiążącej miedź ATPazy typu P
Choroba Menkesa (choroba „skręconych” lub
„stalowych” włosów) jest zaburzeniem przemian
miedzi. Choroba jest sprzężona z chromosomem
X, dotyczy tylko niemowląt płci męskiej i obej¬
muje zmiany w układzie nerwowym, tkance łącz¬
nej i naczyniach, zwykle prowadzące do śmier¬
ci w okresie dziecięcym. W 1993 r. odkryto, że
przyczyną choroby Menkesa są mutacje genu
(gen ATP7A) kodującego ATPazę typu P wią¬
żącą miedź (białko ATP7A). Co ciekawe, enzym
wykazuje budowę podobną do niektórych białek
wiążących metale, występujących w drobnoustro¬
jach. Uważa się, że ta ATPaza odpowiada za bez¬
pośredni wypływ miedzi z komórek. Mutacyjna
zmiana ATPazy powoduje, że miedź nie jest pra¬
widłowo uwalniana z komórek jelit i innych tka¬
nek. Pomimo nagromadzenia nadmiaru miedzi
aktywność wielu zależnych od niej enzymów jest
upośledzona, prawdopodobnie na skutek zaburze¬
nia wbudowywania miedzi do białkowej części
enzymów. W warunkach prawidłowych w wątro¬
bie znajduje się niewiele omawianej ATPazy, co
tłumaczy brak zmian wątrobowych u pacjentów
z chorobą Menkesa. Sugeruje to, że wątroba może
zawierać inną ATPazę wiążącą miedź, która może
brać udział w powstawaniu choroby Wilsona.
Jak opisano niżej, przypuszczenie to okazało się
prawdziwe.
Choroba Wilsona także jest spowodowana
mutacja genu kodującego wiażaca miedź
ATPazę typu P
Choroba Wilsona jest wrodzonym stanem,
w którym miedź nie może być wydalana z żółcią,
przez co gromadzi się w organizmie, szczególnie
w wątrobie, mózgu, nerkach oraz erytrocytach.
Przyczyny choroby należy upatrywać w niezdol¬
ności organizmu do zachowania zerowego bilan¬
su gospodarki miedzi, prowadzącej do zatrucia
tym pierwiastkiem. Wzrost zawartości miedzi
w komórkach wątroby hamuje wiązanie się mie¬
dzi z apoceruloplazminą, co prowadzi do zmniej¬
szenia stężenia tego białka w osoczu. W miarę
gromadzenia się miedzi rozwija się niedokrwi¬
stość hemolityczna, przewlekłe schorzenie wą¬
troby (marskość, zapalenie) oraz zespół objawów
neurologicznych zależnych od gromadzenia się
miedzi w zwojach podstawy i innych ośrodkach
mózgu. Częstym objawem klinicznym jest pierś¬
cień Kaysera-Fleischera, przybierający barwę
zieloną lub złotą i występujący u podstawy ro¬
gówki, jako wyraz odkładania się miedzi w błonie
Descemeta. Podstawowe badania laboratoryjne
oceniające przemiany miedzi zestawiono w tab.
49-8. W przypadku podejrzenia choroby Wilsona
konieczna jest biopsja wątroby; wartość diagno¬
styczną ma zawartość miedzi w wątrobie przekra-
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 717
Tabela 49-8. Podstawowe testy laboratoryjne stosowane w ba¬
daniu zaburzeń przemiany miedzi1
Test
Zakres wartości prawidłowych
u dorostych
Stężenie miedzi w surowicy
10-22 pmol/L
Stężenie ceruloplazminy
200-600 mg/L
Wydalanie miedzi w moczu
< 1 pmol/24 godz.
Zawartość miedzi w wątrobie
20-50 pg/g suchej masy
1 Na podstawie: Gaw A i wsp.: Clinical Biochemistry. Churchill
Livingstone, 1995. Copyright © 1995 Elsevier Ltd. Reproduko¬
wano za zgodą Elsevier.
czająca 250 pg/g suchej masy przy jednoczesnym
zmniejszeniu się stężenia ceruloplazminy w oso¬
czu poniżej 200 mg/L.
Przyczyna choroby Wilsona została odkryta
w 1993 r. Po odkryciu genu powodującego cho¬
robę Menkesa wykazano różne mutacje genu
(ATP7B) kodującego podobną wiążącą miedź
ATPazę P, która odpowiada za chorobę Wilso¬
na. Szacuje się, że gen koduje białko zawierające
1411 reszt aminokwasowych o wysokiej homo-
logii z białkiem kodowanym przez gen choroby
Menkesa. W sposób nie w pełni wyjaśniony, nie¬
aktywna biologicznie ATPaza upośledza wydala¬
nie miedzi do żółci, ogranicza wbudowywanie się
miedzi do apoceruloplazminy, gromadzenie mie¬
dzi w wątrobie i następnie w innych narządach,
takich jak mózg.
Leczenie polega na stosowaniu diety niskomie-
dziowej i rozważnym podawaniu przez całe życie
D-penicylaminy, która chelatuje miedź i umożli¬
wia wydalenie jej z moczem, dzięki czemu orga¬
nizm pozbywa się nadmiaru tego pierwiastka.
Inną chorobą dotyczącą ceruloplazminy jest
aceruloplazminemia. Jest to uwarunkowana
genetycznie choroba, w której stężenie cerulo¬
plazminy jest bardzo małe, a w konsekwencji
występuje niedobór aktywności oksydazy żelazo¬
wej. To prowadzi do upośledzenia uwalniania że¬
laza z komórek, które gromadzi się w niektórych
komórkach mózgu, komórkach wątrobowych
i wysepkach trzustkowych. U chorych występują
poważne objawy neurologiczne i cukrzyca. Zasto¬
sowanie związków chelatujących lub przetacza¬
nie osocza względnie ceruloplazminy mogą być
skuteczne terapeutycznie.
Niedobór arantyproteinazy ((/,-anty-
trypsyny) jest związany z rozedmą płuc
i pewną postacią choroby wątroby
apAntyproteinaza, zwana dawniej arantytry-
psyną, jest białkiem o masie cząsteczkowej ok.
52 kDa, zbudowanym z pojedynczego łańcucha
liczącego 394 reszty aminokwasowe oraz 3 łań¬
cuchy oligosacharydowe. Stanowi główny skład¬
nik (> 90%) aj-globulin osocza. Syntetyzowana
jest w wątrobie i pełni funkcje najważniejszego
inhibitora proteaz serynowych (serpin lub Pi)
w osoczu człowieka. Hamuje aktywność trypsy-
ny, elastazy i pewnych proteaz poprzez tworzenie
z nimi kompleksów. Rozdział elektroforetyczny
pozwala na wyodrębnienie przynajmniej 75 po-
limorficznych jej postaci. Głównym genotypem
jest MM, odpowiadający fenotypowi PiM. Zain¬
teresowanie kliniczne arantytrypsyną dotyczy
dwóch aspektów. Niedobór tego białka odgrywa
rolę w pewnych przypadkach rozedmy płuc (ok.
5%). Dotyczy to głównie osobników z genoty¬
pem ZZ, wytwarzających PiZ, a także hetero-
zygot PiSZ, które wytwarzają mniej białka niż
PiMM i wydzielających to białko w znacznie
mniejszej ilości w porównaniu z PiM. W przy¬
padku niedoboru arantytrypsyny zwiększenie
liczby granulocytów w obrębie płuc (występują¬
ce np. w zapaleniu płuc) i wydzielanych przez nie
enzymów proteolitycznych nie napotyka bariery
antyproteazowej arantytrypsyny, prowadząc
tym samym do uszkodzenia tkanki płucnej, głów¬
nie przez takie proteazy, jak elastaza (ryc. 49-6).
Szczególne zainteresowanie wzbudza metionina
(reszta aminokwasowa w pozycji 358), uczest¬
nicząca w wiązaniu arantytrypsyny z proteaza-
mi. Palenie tytoniu sprawia, że aminokwas ten
zostaje utleniony do sulfotlenku metioniny, co
inaktywuje go i tym samym prowadzi do utraty
właściwości antyproteazowych arantytrypsyny.
Szczególne spustoszenie stwierdza się u pacjen¬
tów z fenotypem PiZZ, który odznacza się małym
stężeniem arantytrypsyny już w normalnych wa¬
runkach. Dalsze zmniejszanie aktywności cą-an-
tytrypsyny, będące następstwem palenia tytoniu,
powoduje wzmożoną destrukcję proteolityczną
tkanki płucnej, przyspieszając tym samym roz¬
wój rozedmy płuc. Dożylne podanie arantytry-
psyny może być pomocne w leczeniu pacjentów
z rozedmą płuc zależną od niedoboru arantytry-
718 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
A. Aktywna elastaza + arAT -* Kompleks nieaktywnej elastazy z a!-AT -* Brak proteolizy w płucach -► Brak uszkodzenia tkanek
B. Aktywna elastaza + i lub brak arAT -*■ Aktywna elastaza — Proteoliza w płucach -► Uszkodzenie tkanek
Ryc. 49-6. Schemat ilustrujący (A) prawidłową inaktywację elastyny przez arAT i (B) sytuację, w której ilość arAT
jest zmniejszona, co prowadzi do proteolizy wskutek działania elastazy z następczym uszkodzeniem tkanek.
psyny. Dzięki technikom inżynierii genetycznej
czynione sąpróby zastąpienia metioniny 358 przez
aminokwas niepodatny na utlenianie. Powstałe
„mutanty” arantytrypsyny mogłyby wykazywać
ochronne działanie przed proteazami przez znacz¬
nie dłuższy okres niż natywna arantytrypsyna.
Czynione są również próby opracowania terapii
genowej do leczenia tej choroby. Próbuje się za¬
stosować zmodyfikowany adenowirus (patogen
dla dróg oddechowych), do którego wbudowano
gen cii-antytrypsyny. Wirus ten wprowadza się
do dróg oddechowych (np. w postaci aerozolu),
mając nadzieję, że gen ulegnie ekspresji miejsco¬
wej w komórkach nabłonka dróg oddechowych.
Dotychczasowe doświadczenia na zwierzętach
dostarczyły zachęcających wyników.
Niedobór arantytrypsyny może być również
przyczyną jednego z typów marskości wątroby
(choroba wątroby z niedoboru arantytrypsyny).
W tej sytuacji cząsteczki arantytrypsyny typu
ZZ gromadzą się w cysternach siateczki śród-
plazmatycznej hepatocytów. Ostatnie badania
wykazały, że agregacja zachodzi w wyniku two¬
rzenia polimerów zmutowanej arantytrypsyny.
Polimery tworzą się wskutek silnego oddziały¬
wania pomiędzy swoistą pętlą z jednej cząstecz¬
ki i pofałdowaną strukturą P drugiej cząsteczki
(polimeryzacja: pętla-struktura pofałdowana).
Według nieznanego mechanizmu rozwija się za¬
palenie wątroby i w następstwie marskość (na¬
gromadzenie dużych ilości kolagenu, prowadzące
do zwłóknienia) wątroby. Możliwe jest, że poda¬
wanie syntetycznego peptydu przypominającego
sekwencją aminokwasową pętlę, może hamować
polimeryzację układu pętla-struktura pofałdowa¬
na. Choroby takie, jak niedobór arantytrypsyny,
w których nieprawidłowości komórkowe pierwot¬
nie wynikają z występowania agregatów niepra¬
widłowych form poszczególnych białek nazywa
się chorobami konformacyjnymi. Większość
chorób prawdopodobnie wynika z tworzenia się
niestabilnych form białek typu „kartka B”, które
z kolei prowadzą do wytwarzania agregatów. In¬
nymi przykładami chorób tej grupy są: choroba
Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Hun¬
tingtona.
Obecnie ciężką chorobę wątroby wynikłą z nie¬
doboru arantytrypsyny leczy się przeszczepem
wątroby. W przyszłości może być możliwe wpro¬
wadzenie genu prawidłowej arantytrypsyny do
komórek wątrobowych, ale to nie zatrzyma wytwa¬
rzania PiZ białka. Na rycinie 49-7 przedstawiono
schemat przyczynowy omawianej choroby.
Ryc. 49-7. Schemat przyczynowy rozwoju choroby wątroby
uwarunkowanej niedoborem arantytrypsyny. Mutacja pokazuje
przyczyny tworzenia PiZZ (MIM 107400). (arAAT - arantytry¬
psyna).
a2-Makroglobulina zobojętnia wiele
proteaz i przenosi pewne cytokiny
do tkanek docelowych
a2-Makroglobulina jest dużą glikoproteiną oso-
czową (masa cząsteczkowa 720 kDa) zbudowa¬
ną z czterech jednakowych podjednostek o ma¬
sie 180 kDa. a2-Makroglobulina stanowi 8-10%
wszystkich białek ludzkiego osocza. Około 10%
cynku zawartego w osoczu jest przenoszone
przez a2-makroglobulinę, pozostała część jest
transportowana przez albuminę. a2-Makroglobu-
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 719
lina jest wytwarzana przez różne rodzaje komó¬
rek, w tym monocyty, hepatocyty i astrocyty. Jest
ona głównym białkiem osoczowym, obejmuje
składniki dopełniacza C3 i C4. Białka te zawie¬
rają unikalne, wewnętrzne, cykliczne wiązanie
estrowe (utworzone pomiędzy cysteiną i resztą
glutaminową) i z tego względu są określane jako
rodzina osoczowych białek tiolowo-estrowych.
a2-Makroglobulina wiąże wiele proteinaz i dla¬
tego jest ważnym inhibitorem panproteinazo-
wym. Kompleksy: cb-makroglobulina-proteinazy
są szybko usuwane z osocza przez swoisty re¬
ceptor znajdujący się w wielu komórkach. Do¬
datkowo a2-makroglobulina wiąże wiele cytokin
(np. płytkowy czynnik wzrostu, transformujący
czynnik wzrostu - P itp.) i prawdopodobnie bie¬
rze udział w transporcie cytokin do określonych
tkanek lub komórek. Po wchłonięciu do komórki,
cytokiny mogą się odłączyć od a2-makroglobuli-
ny i następnie wywierać różne wpływy na wzrost
i czynność komórek. Wiązanie proteinaz i cytokin
przez a2-makroglobulinę odbywa się wg różnych
mechanizmów, które nie są tutaj omawiane.
Skrobiawica występuje w wyniku
odkładania fragmentów różnych
białek osoczowych w tkankach
Skrobiawica polega na gromadzeniu się różnych
nierozpuszczalnych białek fibrylamych pomię¬
dzy komórkami tkanek w stopniu, który wpływa
na czynność komórek. Włókienka zwykle stano¬
wią wytworzone proteolitycznie fragmenty róż¬
nych białek osoczowych, które są nierozgałęzio-
ne i mają strukturę pofałdowanej warstwy typu
p. Określenie „skrobiawica” jest mylące - po¬
czątkowo myślano, że włókienka są zbudowane
z substancji przypominającej skrobię. Wśród naj¬
częściej występujących białek prekursorowych
amyloidu są łańcuchy lekkie immunoglobulin
(p. niżej), amyloidogenne białko surowicy towa¬
rzyszące amyloidowi (glikoproteina osoczowa)
i transtyretyna (tab. 49-2). Białka prekursoro-
we w osoczu albo występują w większej ilości
(np. lekkie łańcuchy immunoglobulin u chorych
na szpiczaka mnogiego lub p2-mikroglobuli-
na u chorych przewlekle dializowanych), albo
mają zmienioną budowę w wyniku mutacji (np.
transtyretyna u chorych na rodzinną neuropatię
skrobiawiczą). Dokładne określenie czynników
decydujących o odkładaniu się w tkankach pro¬
duktów proteolizy wymaga dalszych badań. We
włókienkach amyloidu stwierdzono także inne
białka, takie jak kalcytonina i białka P amyloidu
(niepochodzące z białek osoczowych), występu¬
jące w chorobie Alzheimera; w sumie znalezio¬
no w amyloidzie 15 białek. Wszystkie włókienka
mają połączony z nimi składnik P, który wywo¬
dzi się z występującego w surowicy składnika P
amyloidu, białka osoczowego bardzo podobne¬
go do białka C reaktywnego. Skrawki tkankowe
zawierające włókienka amyloidu wybarwiają się
czerwienią Kongo i wykazują silne, dwułom-
ne zielone świecenie widoczne w mikroskopie
z użyciem światła spolaryzowanego. Odkłada¬
nie amyloidu występuje u pacjentów z różnymi
chorobami. Jeżeli jest to możliwe, należy leczyć
chorobę podstawową. Wiele małych ligandów
silnie wiąże się z włóknami amyloidu. Na przy¬
kład, jodynowana antracyklina wiąże się silnie
i specyficznie ze wszystkimi naturalnymi włók¬
nami amyloidu i sprzyja ich rozkładowi in vitro.
Możliwe, że takie związki okażą się użyteczne
w leczeniu skrobiawicy.
IMMUNOGLOBULINY OSOCZA
ODGRYWAJĄ WAŻNA ROLĘ
W MECHANIZMACH OBRONNYCH
ORGANIZMU
Układ immunologiczny organizmu składa się
z dwóch głównych składników: limfocytów B
i limfocytów T. Limfocyty B wywodzą się głów¬
nie z komórek szpiku kostnego u wyższych zwie¬
rząt lub z torebki Fabrycjusza u ptaków. Limfo¬
cyty te pochodzą z grasicy. Limfocyty B są od¬
powiedzialne za syntezę krążących przeciwciał,
zwanych immunoglobulinami. Limfocyty T są
zaangażowane w liczne reakcje immunologicz¬
ne typu komórkowego, takie jak odrzucanie
przeszczepu, reakcje nadwrażliwości lub obronne
przed komórkami nowotworowymi i wirusami.
W podrozdziale tym omówiono wyłącznie immu-
noglobuliny osocza, które powstają głównie w ko¬
mórkach plazmatycznych wyspecjalizowanej
linii komórkowej, wywodzącej się z limfocytów
B, które syntetyzują i wydzielają immunoglobuli-
ny do osocza w odpowiedzi na kontakt z różnymi
antygenami.
720 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Wszystkie immunoglobuliny zawierają
co najmniej dwa łańcuchy lekkie
i dwa łańcuchy ciężkie
Wszystkie cząsteczki immunoglobulin składają
się z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L)
o masie cząsteczkowej 23 kDa i dwóch identycz¬
nych łańcuchów ciężkich (H) o masie cząstecz¬
kowej 53-75 kDa połączonych w tetramer L2H2
przez mostki disiarczkowe. Budowę IgG przed¬
stawiono na ryc. 49-8; ma ona kształt Y, a na obu
końcach ramion Y jest wiązany antygen. W każ¬
dym z łańcuchów można wyróżnić swoiste do¬
meny, regiony o strukturalnym i funkcjonalnym
znaczeniu. Połowa łańcucha lekkiego (L) w kie¬
runku końca karboksylowego zwana jest regio¬
nem stałym (CL), natomiast połowa jV-końcowa
określana jest jako region zmienny (VL) łańcucha
lekkiego. Około V4 łańcucha ciężkiego fragmentu
C-końcowego odpowiada regionowi zmienne- {
mu (VH), a pozostałe 75% tego łańcucha określa !
się mianem regionów stałych (CH1, CH2, CH3)
łańcucha H. Część cząsteczki immunoglobuliny,
która wiąże swoisty antygen, jest utworzona przez
fragmenty A^-końcowe (regiony zmienne) obydwu
łańcuchów (H i L), tj. domeny VH i VL. Domeny
Ryc. 49-8. Struktura IgG. Każda cząsteczka składa się z dwóch łańcuchów lekkich (L) i dwóch ciężkich
(H). Każdy łańcuch lekki zawiera region zmienny (VL) i stały (CL). Każdy łańcuch ciężki składa się z re¬
gionu zmiennego (VH) i stałego, złożonego z 3 domen (CH1, CH2, CH3). Domena CH2 zawiera miejsce
wiązania dopełniacza, a domena CH3 - miejsce wiązania się z receptorami neutrofilów i makrofagów.
Miejsce wiązania antygenu zlokalizowane jest w nadzmiennym regionie łańcucha lekkiego i ciężkiego,
znajdującego się w regionie zmiennym (ryc. 49-9). Łańcuchy lekki i ciężki połączone są wiązaniami
disiarczkowymi. (Reprodukowano za zgodą z Parslow TG i wsp. (red.): Medical Immunology, wyd. 10,
McGraw-Hill, 2001).
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 721
łańcuchów peptydowych nie występują w formie
liniowej, lecz tworzą regiony globulame, z odpo¬
wiednią strukturą drugo- i trzeciorzędową, w celu
wiązania swoistych antygenów.
Jak przedstawiono na ryc. 49-8, trawienie czą¬
steczki immunoglobuliny papainą prowadzi do
powstania dwóch fragmentów wiążących anty¬
gen (Fab) i jednego fragmentu zdolnego do kry¬
stalizacji (Fc), który jest odpowiedzialny za inne
funkcje immunoglobuliny niż wiązanie antygenu.
Ponieważ IgG zawiera dwa fragmenty Fab, czą¬
steczka łączy się z dwoma cząsteczkami antyge¬
nu i jest określana jako diwalentna. Miejsce an¬
tygenu, które przyłącza przeciwciało, określone
jest jako determinanta antygenowa lub epitop.
Region zawiasowy zapewnia elastyczność czą¬
steczki i pozwala, aby ramiona Fab odchylały się
niezależnie od siebie, co umożliwia im wiązanie
antygenów o różnym oddaleniu od siebie (np. na
powierzchni bakterii). Fc i region zawiasowy od¬
różniają poszczególne klasy przeciwciał, ale ogól¬
ny schemat budowy każdej klasy jest podobny do
IgG przedstawionej na ryc. 49-8.
Wszystkie łańcuchy lekkie sa
albo typu kappa, albo lambda
Na podstawie różnic w strukturze regionów CL
łańcuchy lekkie dzieli się na typ kappa (k) oraz
lambda (k). Cząsteczka immunoglobuliny zawiera
dwa łańcuchy lekkie tego samego typu, nigdy ich
kombinację. U człowieka łańcuch typu k występu¬
je w cząsteczkach immunoglobulin częściej niż X.
Pięć typów łańcuchów ciężkich określa
przynależność immunoglobuliny
do określonej klasy
U człowieka stwierdza się pięć klas łańcuchów
ciężkich, wyróżniających się odmienną budową
regionów CH (tab. 49-9). Łańcuchy te, oznaczane
jako y, a, p, 8 i e, różnią się masą cząsteczkową,
która zawiera się w zakresie od 50 do 70 kDa.
Chociaż zwykle występują trzy domeny, łańcuchy
p i 8 mają ich po cztery. Rodzaj łańcucha ci꿬
kiego określa przynależność immunoglobuliny do
określonej klasy, a zatem i rodzaj pełnionej funk-
Tabela 49-9. Właściwości ludzkich immunoglobulin1
Właściwość
IgG
IgA
IgM
IgD
igE
Przybliżona zawartość wśród wszystkich
immunoglobulin surowicy (%)
75
15
9
0,2
0,004
Przybliżone stężenie w surowicy (mg/L)
10000
2000
1200
30
0,5
Współczynnik sedymentacji
7S
7S lub 11S2
19S
7S
8S
Masa cząsteczkowa (kDa)
150
170 lub 4002
900
180
190
Symbol łańcucha H
y
a
F
5
£
Wiązanie dopełniacza
+
-
+
-
-
Przenikanie przez łożysko
+
-
-
?
-
Udział w reakcji alergicznej
-
-
-
-
+
Występowanie w wydzielinach
-
+
-
-
-
Opsonizacja
+
-
_3
-
-
Receptor antygenowy na limfocytach B
-
-
+
?
-
Forma polimeryczna zawiera łańcuch J
-
+
+
-
-
1 Tabela reprodukowana za zezwoleniem z Levinson W, Jawetz E: Medical Microbiology and Immunology, 7th ed. McGraw-Hill,
2002.
2 Postać o współczynniku sedymentacji 11S występuje w wydzielinach (np. ślinie, mleku, łzach) i wydzielinach układu oddechowego,
pokarmowego i płciowego.
3 IgM bierze pośredni udział w opsonizacji, aktywując składnik C3b dopełniacza, który jest opsoniną.
722 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
cji. Rozróżnia się pięć klas immunoglobulin: IgG,
Ig A, IgM, IgD, IgE. Jak przedstawiono w tab.
49-10, w obrębie każdej z klas łańcuchów ci꿬
kich, na podstawie subtelnych różnic w strukturze
regionów CH, można wyróżnić podklasy.
Tabela 49-10. Główne funkcje immunoglobulin1
Immunoglo-
bulina
Główne funkcje
IgG
Główne przeciwciało wtórnej odpowiedzi humo-
ralnej. Bierze udział w opsonizacji bakterii, przez
co ułatwia ich fagocytozę. Wiąże dopełniacz,
przez co ułatwia zabijanie bakterii. Neutralizuje
toksyny bakteryjne i wirusy. Ma zdolność prze¬
chodzenia przez łożysko.
igA
Wydzielnicza IgA zapobiega przyleganiu bakterii
i wirusów do błon śluzowych. Nie wiąże dopeł¬
niacza.
IgM
Przeciwciało wytwarzane jako pierwotna odpo¬
wiedź na kontakt z antygenem. Wiąże dopełniacz.
Nie przechodzi przez łożysko. Tworzy receptor
antygenowy na powierzchni limfocytów B.
IgD
Funkcja nie jest znana. Występuje na powierzchni
wielu rodzajów limfocytów B oraz w surowicy.
igE
Pośredniczy w rozwoju reakcji bezpośredniej nad¬
wrażliwości, powodując uwalnianie mediatorów
z komórek tucznych i granulocytów zasadochton-
nych po ich kontakcie z alergenem (antygenem).
Bierze udział w reakcji obronnej przeciwko paso¬
żytom, powodując uwalnianie enzymów z granu¬
locytów kwasochłonnych. Nie wiąże dopełniacza.
Stanowi główny mechanizm obronny przed infe-
stacją robakami jelitowymi.
1 Reprodukowane za zezwoleniem z Levinson W, Jawetz E: Medi-
cal Microbiology and Immunology, 7th ed. McGraw-Hill, 2002.
Nie ma dwóch identycznych regionów
zmiennych
Regiony zmienne w cząsteczkach immunoglo¬
bulin składają się z domen VL i VH i cechują się
znaczną heterogennością. W rzeczywistości nie
stwierdzono dwóch identycznych pod względem
sekwencji aminokwasowej regionów zmiennych
w cząsteczkach immunoglobulin uzyskanych od
różnych osób. Analiza składu aminokwasowego
wykazała jednak, że regiony zmienne składają
się z fragmentów o względnie stałym składzie
i innych o dużej zmienności (ryc. 49-9). Łańcu-
Obszary
nadzmienne
łańcucha
Ryc. 49-9. Schematyczny model cząsteczki IgG, prezentujący
prawdopodobne położenie obszarów nadzmiennych w obrębie
łańcuchów ciężkich i lekkich. Obszary nadzmienne są miejscami
wiązania antygenów. Obszary te określone są jako CDRs (com-
plementarity - determining regions). (Rycina zmodyfikowana
i reprodukowana za zgodą z: Parslow TG (red.): Medical Immu¬
nology, wyd. 10, McGraw-Hill, 2001).
chy lekkie mają trzy nadzmienne regiony (w VL),
a łańcuchy ciężkie mają takie cztery regiony (w
VH). W obszarach nadzmiennych znajdują się
miejsca wiążące antygen (umiejscowione na koń¬
cach ramion Y, ryc. 49-8), co warunkuje wyjątko¬
wą swoistość przeciwciał. Z tego względu regio¬
ny nadzmienne są określane jako determinujące
komplementarność (CDR). 5-10 reszt amino-
kwasowych w każdym regionie nadzmiennym
tworzy miejsca wiążące antygen (CDR). Miejsca
CDR są zlokalizowane w małych pętlach frag¬
mentów zmiennych. Odcinki polipeptydowe ota¬
czające CDR pomiędzy regionami nadzmiennymi
są nazywane regionami szkieletowymi. Miej¬
sca CDR z domen VH i VL razem ukształtowane
przestrzennie tworzą pojedynczą powierzchnię
stanowiącą miejsce wiązania antygenu. Różne
układy miejsc CDR łańcuchów H i L są podstawą
wytwarzania przeciwciał o różnej swoistości, co
pozwala na istnienie ogromnej liczby różnorod¬
nych cząsteczek przeciwciał. Zjawisko to określa
się jako różnorodność kombinatoryjną. Duże
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 723
antygeny oddziaływają ze wszystkimi miejscami
CDR przeciwciał, natomiast małe ligandy mogą
się wiązać z tylko jednym lub kilkoma miejscami
CDR, tworzącymi „kieszonkę” lub „zagłębienie”
cząsteczki przeciwciała. Istotą oddziaływania an¬
tygenu i przeciwciała jest wzajemne dopasowa¬
nie powierzchni CDR i epitopu. W tych oddziały¬
waniach uczestniczą wiązania niekowalencyjne
(elektrostatyczne, siły van der Waalsa, wiązania
wodorowe i hydrofobowe).
Regiony stałe określają funkcje efektorowe
immunoglobulin swoiste dla klasy
Regiony stałe cząsteczek immunoglobulin, szcze¬
gólnie Ch2 i Ch3 (oraz CH4 w IgM i IgE), któ¬
re tworzą fragmenty Fc, odpowiadają za funkcje
efektorowe różnych cząsteczek immunoglobu¬
lin, swoiste dla poszczególnych klas (tab. 49-9,
część dolna), takich jak wiązanie dopełniacza lub
przenikanie przez łożysko.
Niektóre immunoglobuliny, jak IgG, występują
jedynie w podstawowej strukturze tetramerycz-
nej, natomiast inne, jak IgA lub IgM, mogą wy¬
stępować jako wyższe polimery złożone z dwóch,
trzech (IgA) lub pięciu (IgM) jednostek tetrame-
rycznych (ryc. 49-10).
W limfocycie B lub w komórce plazmatycznej
łańcuchy L i H są syntetyzowane jako oddzielne
cząsteczki i następnie łączone w cząsteczkę im¬
munoglobuliny, która wykazuje budowę gliko-
proteiny.
Ryc. 49-10. Uproszczony sche¬
mat przedstawiający polime-
ryczne ludzkie immunoglobu- c ( M
liny. Łańcuchy polipeptydowe ' foentamer)
są reprezentowane przez grube
linie; wiązania disiarczkowe
łączące różne łańcuchy poli¬
peptydowe są przedstawione
za pomocą cienkich linii. (Ry¬
cina reprodukowana za zgodą
z: Parslow TG i wsp. (red.):
Medical Immunology, wyd. 10,
McGraw-Hill, 2001).
724 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Oba typy łańcuchów - lekkie i ciężkie
- sa produktami wielu genów
Każdy łańcuch lekki jest wytworem co najmniej
trzech odrębnych genów strukturalnych: genu ko¬
dującego zmienny region (VL), genu dla regionu
łączącego (J) (niemającego związku z łańcuchem
J immunoglobulin A lub M) i genu dla regionu
stałego (CL). Każdy łańcuch ciężki jest produk¬
tem co najmniej czterech różnych genów: genu
dla regionu zmiennego (VH), genu dla regionu
nadzmiennego (D), genu dla regionu łączącego
(J) i genu regionu stałego (CH). W tym przypadku
nie ma zastosowania zasada: Jeden gen - jedno
białko”. Mechanizmy cząsteczkowe odpowie¬
dzialne za wytwarzanie pojedynczych łańcuchów
immunoglobulin kodowanych przez wiele genów
strukturalnych są omówione w rozdz. 35 i 38.
Różnorodność przeciwciał
zależy od rearanżacji genów
Każdy człowiek jest zdolny do wytwarzania
przeciwciał skierowanych przeciwko 1 miliono¬
wi różnych antygenów. Zdolność wytwarzania
tak ogromnej liczby różnych przeciwciał zależy
od wielu czynników, w tym występowania wie¬
lokrotnych segmentów genów (segmenty V, C, J
i D), ich rekombinacji (p. rozdz. 35 i 38), kom¬
binacji różnych łańcuchów L i H, dużej częstości
somatycznych mutacji genów kodujących immu-
noglobuliny i zmienności połączeniowej. Polega
ona na przyłączaniu lub odrywaniu przypadkowej
liczby nukleotydów, kiedy łączą się poszczególne
segmenty genów, przez co wprowadzają dodatko¬
we źródło różnorodności. Jest to przyczyną dodat¬
kowej zmienności. Wymienione czynniki zapew¬
niają możliwość dodania lub delecji ogromnej
liczby nukleotydów, kiedy pewne segmenty geno¬
we łączą się ze sobą i wprowadzają dodatkowy
czynnik zmienności.
Podczas odpowiedzi immunologicznej
dochodzi do zmiany klasy tworzonych
przeciwciał (ang. class switching
- przełączenie)
W większości przypadków odpowiedzi immuno¬
logicznej typu humoralnego dochodzi do tworze¬
nia przeciwciał o identycznej swoistości, lecz róż¬
niących się przynależnością do określonej klasy,
i zjawisko to następuje w ścisłym porządku chro¬
nologicznym w odpowiedzi na podanie immuno-
genu (immunizującego antygenu). Na przykład
w warunkach prawidłowych synteza przeciwciał
klasy IgM poprzedza syntezę cząsteczek klasy
IgG. Molekularny mechanizm zmiany klasy two¬
rzonych przeciwciał (ang. class switching) jest
intensywnie badany. Pojedynczy typ lekkiego łań¬
cucha może łączyć się ze swoistym antygenowo
łańcuchem p w swoistą cząsteczkę IgM. Następ¬
nie ten sam antygenowo swoisty łańcuch lekki łą¬
czy się z łańcuchem y o identycznym regionie VH,
tworząc cząsteczkę IgG o takiej samej specyficz¬
ności wobec antygenu jak początkowo wytwarza¬
na IgM. Ten sam łańcuch lekki może się również
łączyć z łańcuchem ciężkim a, zawierającym
identyczny region VH, aby utworzyć cząsteczkę
IgA cechującą się taką samą swoistością wobec
antygenu. Te trzy klasy (IgM, IgG i IgA) cząste¬
czek immunoglobulin przeciwko temu samemu
antygenowi mają identyczną domenę zmienną
zarówno w łańcuchu lekkim, jak i ciężkim. Mówi
się więc, że mają one wspólny idiotyp. Idiotypem
określa się determinantę antygenową utworzoną
przez określone reszty aminokwasowe w regionie
nadzmiennym. Różne klasy tych trzech immuno¬
globulin (zwane izotypami) są determinowane
przez regiony CH połączone z tym samym swo¬
istym antygenowo regionem VH.
Przyczyna chorób może być zarówno
nadmierna, jak i niedostateczna
synteza immunoglobulin
Zaburzenia w zakresie immunoglobulin obejmują
wzmożoną syntezę swoistych klas immunoglo¬
bulin lub nawet swoistych cząsteczek immuno¬
globulin, przy czym to ostatnie zjawisko zachodzi
w przypadku klonalnego rozrostu nowotworowe¬
go komórek plazmatycznych, określanego mia¬
nem szpiczaka. Szpiczak mnogi jest nowotwo¬
rem. Elektroforetyczny rozdział białek surowicy
krwi lub moczu ujawnia znaczne zwiększenie
stężenia jednej immunoglobuliny lub określonego
łańcucha (w tym przypadku białka Bence-Jonesa).
Zmniejszone wytwarzanie immunoglobulin może
dotyczyć jednej klasy (np. IgA lub IgG) lub może
być niedoborem immunoglobulin wszystkich klas
(IgA, IgD, IgE, IgG i IgM). Istotne upośledzenie
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 725
wytwarzania immunoglobulin określonej klasy
spowodowane defektem genetycznym może pro¬
wadzić do poważnego zmniejszenia odporności
ze względu na zaburzoną obronę przed drobno¬
ustrojami Jak to jest u chorych na agammaglobu-
linemię, w której IgG jest znacznie upośledzone.
Hybrydomy dostarczają stałego źródła
bardzo użytecznych przeciwciał
monoklonalnych
Wstrzyknięcie antygenu do organizmu zwierzęcia
powoduje wytwarzanie poliklonalnych przeciw¬
ciał przez mieszaninę komórek (limfocytów) B.
Przeciwciała poliklonalne są skierowane przeciw¬
ko różnym miejscom (epitopom lub determinan¬
tom) antygenu, a więc nie są monospecyficzne.
Można jednak metodą opracowaną przez Kohle¬
ra i Milsteina uzyskać duże ilości pojedynczych
przeciwciał monoklonalnych skierowanych prze¬
ciwko jednemu epitopowi.
Metoda polega na zlaniu komórek i wytworze¬
niu stałej linii komórkowej zwanej hybrydomą.
Najczęściej komórki B uzyskuje się ze śledziony
myszy (lub innego podatnego zwierzęcia), które¬
mu uprzednio podano antygen lub mieszaninę an¬
tygenów (np. obce komórki). Komórki B miesza
się z mysimi komórkami szpiczakowymi i pod¬
daje działaniu glikolu polietylenowego, który
powoduje zlanie się komórek. Zasady tworzenia
komórek hybrydomowych przedstawiono na ryc.
49-11. W tych warunkach tylko komórki hybrydo¬
my ulegają namnożeniu: komórki umieszcza się
w pożywce HAT (hipoksantyna, aminopteryna,
tymidyna) w takim rozcieńczeniu, aby na każdej
płytce znajdowała się przeciętnie jedna komórka.
W wyniku tego na każdej płytce będzie się mno¬
żyć klon komórek hybrydomy. Płyn hodowlany
jest zbierany i badany w celu wykrycia przeciw¬
ciał reagujących z oryginalnym antygenem lub
antygenami. Jeżeli immunogen był mieszaniną
wielu antygenów (np. preparaty błony komórko-
wej), pojedyncze płytki hodowlane zawierają klo¬
ny komórek hybrydomy wytwarzające monoklo-
nalne przeciwciała skierowane przeciwko jednej
swoistej determinancie antygenowej ze wstępnej
mieszaniny. Zbierając płyn z wielu płytek hodow¬
lanych, uzyskuje się zespół przeciwciał mono¬
klonalnych; wiele z nich jest skierowanych prze¬
ciwko pojedynczym składnikom immunogennej
Komórka
szpiczaka
O
Fuzja w obecności glikolu
polietylenowego
Hybrydomą
Wzrost w obecności pożywki z HAT
Hybrydomy mnożą się, komórki szpiczaka
i komórki 8 obumierają
Hybrydomą
Ryc. 49-11. Schemat wytwarzania komórek hybrydomą. Komór¬
ki szpiczaka stanowią linię stalą („nieśmiertelną”), nie wytwarzają
przeciwciał i są HGPRT" (przez co rezerwowy szlak purynogene-
zy jest nieskuteczny - rozdz. 33). Komórki B nie są linią stałą,
wytwarzają przeciwciała i są HGPRT. Glikol polietylenowy (PEG)
wywołuje zlanie się komórek. Powstałe komórki hybrydomą są li¬
nią stałą (po komórkach szpiczaka), wytwarzają przeciwciała i są
HGPRT (po komórkach B). Komórki B obumrą w pożywce, bo
nie są linią stałą. Komórki szpiczaka również obumrą w pożywce
w obecności HAT, ponieważ HAT hamuje syntezę puryn de novo
przez hamowanie wbudowywania tetrahydrofolianu (rozdział
33). Przeżyją komórki hybrydomą; będą rosły (bo są HGPRT)
i jeżeli są sklonowane - będą wytwarzać przeciwciała. (HAT =
= hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna; HGPRT = fosforybo-
zylotransferaza hipoksantyno-guaninowa).
mieszaniny. Komórki hybrydomy można zamro¬
zić, a następnie odmrozić, kiedy potrzebne jest
określone przeciwciało. Zapewnia to dostępność
przeciwciał przez długi czas. Komórki hybrydo¬
my mogą także rosnąć w jamie brzusznej myszy,
dostarczając dużej ilości przeciwciał.
Ze względu na swoistość przeciwciała mono-
klonalne stały się bardzo użytecznymi odczynni¬
kami stosowanymi w biologii i medycynie. Moż¬
na ich używać do ilościowego oznaczania wielu
pojedynczych białek (np. białek osocza), określać
charakter czynników zakaźnych (np. typ bakterii)
i określać typ komórek zarówno prawidłowych
(np. limfocytów), jak i zmienionych nowotworo-
wo (np. komórek białaczkowych). Dodatkowo są
one bezpośrednim czynnikiem terapeutycznym,
stosowanym przeciwko komórkom nowotwo¬
rowym. Stosuje się je także do przyspieszonego
usuwania z krążenia leków, jeśli występują one
w stężeniu toksycznym (np. digoksyna).
726 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Układ dopełniacza składa się
z około dwudziestu białek osocza
i bierze udział w lizie komórek,
w zapaleniu i innych procesach
Osocze zawiera ok. dwudziestu białek należących
do układu dopełniacza. Układ ten został wykry¬
ty po stwierdzeniu, że dodanie świeżej surowicy
zawierającej przeciwciała skierowane przeciwko
bakteriom powoduje ich liżę. W przeciwieństwie
do przeciwciał, czynnik ten ulega unieczynnieniu
po ogrzaniu do temperatury 56°C. Dalsze prace
pozwoliły określić białka tego układu i ujawniły
ich funkcje; większość tych białek sklonowano
i określono ich sekwencję aminokwasową. Głów¬
ne białka układu oznaczono C1-C9; C9 łączy się
z kompleksem C5-8, tworząc układ „atakujący”
błonę komórkową przez wytworzenie kanałów
powstałych na skutek rozpuszczenia lipidów bło¬
ny komórkowej. W ten sposób następuje osmo-
tyczna liza komórki.
Szczegóły tego układu są bardzo złożone, moż¬
na je znaleźć w podręcznikach immunologii.
Zasada podstawowa mówi, że w warunkach pra¬
widłowych nieczynny układ po zadziałaniu czyn¬
nika uruchamiającego ulega aktywacji w wyniku
proteolizy w określonej kolejności jednego lub
kilku białek układu. Prowadzi to do lizy komórek
i wytwarzania peptydów lub ich fragmentów, któ¬
re biorą udział w procesach zapalnych (chemotak-
sja, fagocytoza itp.). Układ pełni też inne funkcje,
np. usuwanie kompleksów antygen-przeciwciało
z krążenia. Uczynnienie układu dopełniacza roz¬
poczyna się jednym z dwóch szlaków, zwanych
szlakiem klasycznym i szlakiem alternatyw¬
nym. Pierwszy dotyczy oddziaływania Cl z kom¬
pleksami antygen-przeciwciało, a drugi - oddzia¬
ływania powierzchni komórek bakteryjnych lub
polisacharydów ze składnikiem nazwanym C3b.
Układ dopełniacza przypomina krzepnięcie
krwi (rozdz. 50), w którym dochodzi zarówno do
przekształcenia nieczynnych prekursorów w ak¬
tywne produkty działania proteaz, jak i kaskado¬
wego zwiększania aktywności.
STRESZCZENIE
• Osocze zawiera wiele białek pełniących różno¬
rodne funkcje. Większość z nich jest wytwarza¬
na w wątrobie i ulega glikozylacji.
• Głównym białkiem jest albumina, która nie
zawiera składowej węglowodanowej i jest naj¬
ważniejszym czynnikiem decydującym o we¬
wnątrznaczyniowym ciśnieniu onkotycznym.
Wiąże także wiele ligandów, takich jak leki i bi¬
lirubina.
• Haptoglobina wiąże pozakrwinkową hemoglo¬
binę, zapobiegając utracie hemoglobiny z mo¬
czem. W ten sposób umożliwia zachowanie
żelaza hemoglobiny do dalszego wykorzystania
w organizmie.
• Transferryna wiąże żelazo, przenosząc je do
miejsc, w których jest ono potrzebne. Ferry-
tyna bierze udział w wewnątrzkomórkowym
magazynowaniu żelaza. Niedokrwistość z nie¬
doboru żelaza jest często spotykaną chorobą.
Dziedziczna hemochromatoza jest wynikiem
mutacji genu HFE kodującego białka HFE,
które prawdopodobnie odgrywa ważną rolę we
wchłanianiu żelaza. Inne postacie hemochro-
matozy są uwarunkowane mutacjami: genów
kodujących hemojuwelinę, hepcydynę, receptor
transferryny-2 i ferroportynę.
• Ceruloplazmina zawiera dużą ilość miedzi, ale
albumina wydaje się ważniejsza jako białko
transportujące miedź. Obie choroby Wilso¬
na oraz Menkesa są wynikiem nieprawidłowej
przemiany miedzi i są wywołane mutacjami ge¬
nów kodujących wiążącą miedź ATP-azę typu P.
• arAntytrypsyna jest głównym inhibitorem pro¬
teaz serynowych osocza, hamującym szczegól¬
nie elastazę granulocytów obojętnochłonnych.
Dziedziczny niedobór tego białka jest przyczy¬
ną rozedmy płuc i może także prowadzić do
choroby wątroby.
• cb-Makroglobulina jest głównym białkiem oso¬
cza, które zobojętnia wiele proteaz i przenosi
niektóre cytokiny do określonych narządów.
• Immunoglobuliny odgrywają kluczową rolę
w mechanizmach obronnych organizmu, po¬
dobnie jak białka układu dopełniacza. Niektóre
istotne cechy tych białek zostały scharakteryzo¬
wane.
49. BIAŁKA OSOCZA IIMMUNOGLOBULINY 727
PIŚMIENNICTWO
Adamson JW: Iron deficiency and hypoproliferative
anemias, Chapter 90, p. 586. In: Kasper DL et al
(editors): Harrisem s Principles of Internal Medi¬
anę, 16th ed. McGraw-Hill, 2005.
Adamson JW, Longo DL: Anemia and polycythemia,
Chapter 52, p. 329. In: Kasper DL et al (editors):
Harrisons Principles of Internal Medicine, 16th
ed. McGraw-Hill, 2005.
Beutler E: “Pumping” iron: The proteins. Science 2004;
306:2051.
Fleming RE, Bacon BR: Orchestration of iron homeo-
stasis. N Engl J Med 2005;352:1741.
Janeway CA Jr et al: Immunobiology, 6th ed. Garland
Science Publishing, 2005.
Johnson AM et al: Proteins. In: Burtis CA, Ashwood EA
(editors): Tietz Fundamentals of Clinical Chemis-
try, 5th ed. Saunders, 2001.
Kelly JW: Attacking amyloid. N Engl J Med 2005;352:
722.
Levinson W, Jawetz E: Medical Microbiology and Im-
munology, 6th ed. Appleton & Lange, 2000.
Merlini G, Belloti V: Molecular mechanisms of amyloi-
dosis. N Engl J Med 2003;349:583.
Parslow TG et al (editors): Medical Immunology, lOth
ed. Appleton & Lange, 2001.
Pietrangelo A: Hereditary hemochromatosis: A new look
at an old disease. N Engl J Med 2004;350:2383.
Tali AR: C-reactive protein reassessed. N Engl J Med
2004;350:1450.
The SAFE Study Investigators: A comparison of albu¬
min and salinę for fluid resuscitation in the inten-
sive care unit. N Engl J Med 2004;350:2247.
■ Proces krzepnięcia krwi
. ,. i choroba zakrzepowa
Margaret L Rand, PhD; Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Rozdział zawiera opis podstawowych danych
0 białkach biorących udział w procesie krzepnię¬
cia i fibrynolizy. Przedstawiono również niektóre
ważne aspekty funkcji płytek krwi. Krwawienie
1 stany nadkrzepliwości są poważnym problemem
medycznym, a zakrzepy tętnic wieńcowych lub
mózgowych są główną przyczyną zgonów w wie¬
lu częściach świata. Racjonalne leczenie tych
stanów wymaga pełnego zrozumienia podstawo¬
wych mechanizmów krzepnięcia krwi, fibrynoli¬
zy i agregacji płytek krwi.
PROCES KRZEPNIĘCIA I TWORZENIE
ZAKRZEPÓW PRZEBIEGA W TRZECH
ETAPACH
Hemostaza jest procesem zatrzymywania krwa¬
wienia, które następuje po naruszeniu integral¬
ności ściany naczyniowej. Zakrzepica występuje
natomiast przy uszkodzeniu komórek śródbłon-
ka wyściełających naczynia (np. przy pęknięciu
blaszki miażdżycowej). Obejmuje ona powstawa¬
nie skrzepu i polega na współdziałaniu elementów
ściany naczyniowej, płytek krwi i białek osocza,
które powoduje zarówno krzepnięcie krwi, jak
i liżę powstałego skrzepu.
W zahamowaniu krwawienia pierwszym zja¬
wiskiem jest obkurczanie się uszkodzonego na¬
czynia, z jednoczesnym zmniejszeniem się prze¬
pływu krwi w odcinku dystalnym w stosunku do
miejsca uszkodzenia. Proces krzepnięcia zachodzi
w trzech etapach.
1. Formowanie luźnego, przejściowego czopu
płytkowego w miejscu uszkodzenia. Płytki
krwi przylegają do włókien kolagenu w miejscu
uszkodzenia ściany naczyniowej i podlegają ak¬
tywacji przez trombinę (mechanizm aktywacji
płytek krwi opisano poniżej), powstałą w ka¬
skadowej reakcji krzepnięcia w tym samym
miejscu lub przez ADP uwolniony z innych
zaktywowanych już płytek krwi. Podczas ak¬
tywacji płytki krwi zmieniają kształt i w obec¬
ności fibrynogenu ulegają agregacji z utworze¬
niem czopu hemostatycznego lub skrzepu.
2. Tworzenie sieci fibryny lub skrzepu, który za¬
trzymuje w swoim obrębie czop płytkowy (biały
skrzep) i(lub) erytrocyty (czerwony skrzep), for¬
mując ostatecznie bardziej trwałą skrzeplinę.
3. Częściowe lub całkowite rozpuszczenie skrze¬
pu przez plazminę.
Istnieją trzy rodzaje skrzepów
Wszystkie rodzaje skrzepów zawierają fibrynę,
ale w różnej proporcji.
1. Biały skrzep, złożony z płytek krwi i fibryny,
jest stosunkowo ubogi w erytrocyty. Powstaje
w miejscu uszkodzenia lub patologicznej zmiany
ściany naczyniowej, szczególnie w miejscach,
w których przepływ krwi jest szybki (tętnice).
2. Czerwony skrzep początkowo składa się
z erytrocytów i fibryny. Czerwony skrzep mor¬
fologicznie przypomina skrzeplinę powsta¬
łą w probówce i może formować się in vivo
w obszarach o zwolnionym przepływie krwi
lub z jej zastojem, ewentualnie ze współistnie¬
jącym uszkodzeniem naczyniowym, albo też
może on być formowany w miejscu zranienia
lub zmiany naczyniowej w połączeniu z two¬
rzącym się pierwotnie czopem płytkowym.
3. Trzecim rodzajem skrzepu są rozsiane złogi fi¬
bryny zlokalizowane w bardzo małych naczy¬
niach i naczyniach włosowatych.
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 729
W pierwszej kolejności zostanie przedstawiony
proces krzepnięcia prowadzący do powstania fi-
bryny, a następnie pewne aspekty udziału płytek
krwi i ściany naczyń krwionośnych w całościowo
ujętym procesie krzepnięcia. To oddzielenie czyn¬
ników krzepnięcia i płytek krwi jest sztuczne,
jako że jedne i drugie pełnią wzajemnie zależne
i bardzo zbliżone funkcje w procesie krzepnięcia;
takie podejście ułatwia jednak opis całości toczą¬
cych się procesów.
WYNIKIEM DZIAŁANIA SZLAKU
WEWNATRZP0CH0DNEG0
IZEWNATRZPOCHODNEGO
JEST POWSTANIE WŁÓKNIKA
Dwa szlaki prowadzą do uformowania czopu fi-
brynowego - zewnątrzpochodny i wewnątrzpo-
chodny. Szlaki te nie są niezależne, jak dawniej
sądzono, jednak w dalszej części tekstu będą oma¬
wiane oddzielnie, aby opis był przejrzysty.
Powstanie czopu fibrynowego w odpowiedzi
na uszkodzenie tkanki odbywa się szlakiem ze-
wnątrzpochodnym. Szlak wewnątrzpochodny
zostaje in vitro zainicjowany przez powierzchnię
naładowaną ujemnie, np. szkło. Obydwa szlaki
zbiegają się we wspólnym, końcowym etapie,
obejmującym aktywację protrombiny do trom-
biny i katalizowane przez powstały enzym roz¬
szczepienie fibrynogenu z utworzeniem czopu
fibrynowego. Szlaki zewnątrzpochodny i we¬
wnątrzpochodny, jak również wspólny etap koń¬
cowy, są skomplikowane i bierze w nich udział
wiele różnych białek (ryc. 50-1 i tab. 50-1).
Ogólnie, jak przedstawiono w tab. 50-2, białka
te mogą być zaklasyfikowane do pięciu grup: 1)
zymogenów, obejmujących serynowe proteazy,
które ulegają aktywacji podczas procesu krzep¬
nięcia; 2) kofaktorów; 3) fibrynogenu; 4) trans-
glutaminazy, która stabilizuje skrzep fibrynowy;
5) białek regulatorowych i innych.
Szlak wewnątrzpochodny prowadzi
do aktywacji czynnika X
Szlak wewnątrzpochodny (ryc. 50-1) obejmuje
czynniki XII, XI, IX, VIII i X, jak również pre-
kalikreinę, wielkocząsteczkowy kininogen, jony
wapnia i fosfolipidy płytek krwi. Ostatecznie do¬
prowadza on do powstania czynnika Xa (według
przyjętej konwencji zaktywowane czynniki krzep¬
nięcia oznacza się za pomocą przyrostka „a”).
Szlak ten rozpoczyna się „fazą kontaktu”,
w trakcie której prekalikreina, wielkocząsteczko¬
wy kininogen, czynniki XII i XI są eksponowane
na działanie ujemnie naładowanej powierzchni
aktywującej. Prawdopodobnie to właśnie kolagen,
znajdujący się na odsłoniętej powierzchni ścia¬
ny naczynia, odgrywa in vivo rolę wspomnianej
powierzchni aktywującej, podczas gdy szkło lub
kaolin w warunkach laboratoryjnych, in vitro, sty¬
mulują szlak wewnątrzpochodny. W chwili, gdy
czynniki uczestniczące w fazie kontaktu zostaną
zgromadzone na powierzchni aktywującej, czyn¬
nik XII ulega aktywacji do czynnika XIIa w reakcji
proteolizy katalizowanej przez kalikreinę. Powsta¬
ły pod wpływem kalikreiny czynnik XIIa działa
na prekalikreinę, uwalniając kolejne cząsteczki
kalikreiny i tworząc tym samym układ wzajemnej,
zwrotnej aktywacji. Utworzony czynnik XIIa akty¬
wuje czynnik XI do XIa oraz uwalnia bradykininę
(nonapeptyd o działaniu rozszerzającym naczynia
krwionośne) z wielkocząsteczkowego kininogenu.
Czynnik XIa w obecności jonów wapnia akty¬
wuje czynnik IX (masa cząsteczkowa 55 kDa,
będący zymogenem zawierającym zależne od
obecności witaminy K reszty y-karboksyglutami-
nianowe [Gla]; p. rozdz. 44) do proteazy seryno-
wej - czynnika IXa. Czynnik ten rozkłada wiązanie
między argininą i izoleucyną (Arg-Ile) w cząstecz¬
ce czynnika X (masa cząsteczkowa 56 kDa), two¬
rząc dwułańcuchową proteazę serynową - czynnik
Xa. Ostatnia reakcja wymaga do swego przebiegu
udziału zespołu składników, określanych łącznie
jako tenazowy kompleks aktywny, zlokalizowany
na powierzchni zaktywowanych płytek krwi i skła¬
dający się z jonów wapnia, czynników VIIIa, IXa
i X. Należy nadmienić, iż we wszystkich reakcjach,
w których biorą udział zymogeny zawierające resz¬
ty Gla na V-końcach cząsteczek (czynniki II, VII,
IX i X), reszty te są miejscami wiązania o dużym
powinowactwie dla jonów wapnia. Czynnik VIII
(masa cząsteczkowa 330 kDa) jest glikoproteiną
niebędącą prekursorem proteazy, lecz kofaktorem
służącym jako receptor dla czynników IXa i X na
powierzchni płytek krwi. Czynnik VIII jest aktywo¬
wany przez niewielkie ilości trombiny do czynnika
VIIIa, podlegającego następnie unieczynnieniu na
drodze dalszego rozszczepienia przez trombinę.
730 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Szlak wewnątrzpochodny
PK
HK
XII Xlla
Ryc. 50-1. Szlaki krzepnięcia krwi. Przedstawiono szlak wewnątrzpochodny i zewnątrzpo-
chodny. Etapy poniżej czynnika Xa stanowią wspólny szlak krzepnięcia krwi kończący się
wytworzeniem usieciowanego wtóknika. Nowe obserwacje (strzałki z kropek) wskazują, że
kompleks czynnika tkankowego i czynnika Vlla aktywuje nie tylko czynnik X (klasyczny szlak
zewnątrzpochodny), ale także czynnik IX szlaku wewnątrzpochodnego. Dodatkowo, trombina
i czynnik Xa oddziaływają zwrotnie na dwa miejsca (strzałki przerywane). PK - prekalikreina;
HK - wielkocząsteczkowy kininogen; PL - fosfolipidy. (Rycina reprodukowana za zgodą z:
Roberts HR, Lozier JN: New perspectives on the coagulation cascade. Hosp Prąci [Off Ed],
Jan. 1992:27:97).
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 731
Tabela 50-1. Numeryczny system nazewnictwa czynników
krzepnięcia krwi. Liczebniki wskazują kolejność, w jakiej czyn¬
niki osoczowe byty odkrywane i nie mają związku z kolejnością,
w jakiej one działają
Czynnik
Nazwa(y) zwyczajowa(e)
1
Fibrynogen ) Czynniki te są zwykle określane
II
Protrombina / nazwami zwyczajowymi
III
Czynnik tkankowy ) Nie są zwykle określane
IV
Jony wapnia / jako czynniki krzepnięcia
V
Proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator (Ac-)
globuliny
VII1
Prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny
(SPCA), kotromboplastyna
VIII
Czynnik antyhemofilowy A, globulina
antyhemofilowa (AHG)
IX
Czynnik antyhemofilowy B, czynnik Christmasa,
osoczowy składnik tromboplastyny
X
Czynnik Stuarta-Prowera
XI
Czynnik poprzedzający tromboplastynę osoczową
(PTA)
XII
Czynnik Hagemana
XIII
Czynnik stabilizujący fibrynę (FSF), fibrynoligaza
1 Czynnik VI nie istnieje.
Szlak zewnatrzpochodny również
prowadzi do uczynnienia czynnika X,
choć w odmienny sposób
Czynnik Xa zajmuje w układzie krzepnięcia
miejsce, gdzie zbiegają się oba szlaki; zewnątrz-
pochodny i wewnątrzpochodny (ryc. 50-1), roz¬
poczynając wspólny, końcowy etap krzepnięcia
krwi. Szlak zewnątrzpochodny obejmuje czyn¬
nik tkankowy, czynnik VII, X i jony wapniowe,
prowadząc do powstania czynnika Xa. Szlak ten
jest aktywowany w miejscu uszkodzenia tkanki
w chwili ekspresji czynnika tkankowego (ryc.
50-1) na powierzchni pobudzonych komórek
śródbłonka i monocytach. Czynnik tkankowy od¬
działuje z czynnikiem VII (masa cząsteczkowa 53
kDa), który jest krążącą w osoczu glikoproteiną
zawierającą reszty glutaminianowe, wytwarzaną
w wątrobie. Czynnik tkankowy działa jako kofak-
tor czynnika VIla, zwiększając jego aktywność
enzymatyczną prowadzącą do aktywacji czynnika
X. Współdziałanie czynnika tkankowego i czyn¬
nika VIIa jest nazywane zespołem czynnika
tkankowego. Czynnik VIla rozszczepia to samo
wiązanie między argininą i izoleucyną (Arg-Ile)
w cząsteczce czynnika X, które jest rozszczepia¬
ne przez kompleks aktywnych czynników szlaku
wewnątrzpochodnego. Aktywacja czynnika X
stanowi ważne sprzężenie szlaku wewnątrzpo¬
chodnego z zewnątrzpochodnym.
Tabela 50-2. Funkcje osoczowych czynników krzepnięcia
Zymogeny proteaz serynowych
Czynnik XII
Łączy się z powierzchniami o ładunku elektrosta¬
tycznym ujemnym w miejscu uszkodzenia ściany
naczyniowej; aktywowany przez wielkocząsteczko¬
wy kininogen i kalikreinę.
Czynnik XI
Aktywowany jest przez czynnik Xlla.
Czynnik IX
Aktywowany jest przez czynnik Xla w obecności
jonów wapnia.
Czynnik VII
Aktywowany przez trombinę w obecności jonów
wapnia.
Czynnik X
Uczynniany na powierzchni zaktywowanych pły¬
tek krwi przez kompleks czynników (jony wapnia,
czynniki Vllla i IXa), jak również przez czynnik Vlla
w obecności czynnika tkankowego i jonów wapnia.
Czynnik II
Uczynniany na powierzchni zaktywowanych płytek
krwi przez kompleks protrombinowy (jony wapnia,
czynnik Va i Xa) (czynniki II, VII, IX i X są zymogena-
mi zawierającymi reszty karboksyglutaminianowe).
Kofaktory
Czynnik VIII
Aktywowany przez trombinę, czynnik Vllla jest
kofaktorem w reakcji aktywacji czynnika X przez
czynnik IXa.
Czynnik V
Aktywowany przez trombinę; czynnik Va jest ko¬
faktorem w reakcji aktywacji protrombiny przez
czynnik Xa.
Czynnik
Białko na powierzchni pobudzonych komórek śród¬
tkankowy
błonka wymaga obecności fosfolipidu, by mogło
(czynnik III)
stać się kofaktorem dla czynnika VIII.
Fibrynogen
Czynnik I
Rozszczepiany przez trombinę z utworzeniem
| skrzepu fibrynowego.
Tiolowo-zależna transglutaminaza
Czynnik XIII
Aktywowany przez trombinę w obecności jonów
wapnia stabilizuje skrzep fibrynowy na zasadzie
tworzenia poprzecznych wiązań kowalencyjnych.
Białka regulatorowe i inne
Białko C
Aktywowane do białka Ca przez trombinę związaną
z trombomoduliną; następnie rozkłada czynnik Vllla
i Va.
Białko S
Jest kofaktorem dla białka C; obydwa białka zawie¬
rają reszty Gla (y-karboksyglutaminianowe).
Trombo-
Białko znajdujące się na powierzchni komórek
modulina
śródbłonka; wiąże trombinę, która następnie akty¬
wuje białko C.
732 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Ważnym oddziaływaniem między szlakiem
zewnątrzpochodnym i wewnątrzpochodnym
jest aktywacja czynnika IX szlaku wewnątrzpo-
chodnego przez kompleks czynnika tkankowego
i czynnika VIIa. Istotnie, tworzenie kompleksów
czynnika tkankowego i czynnika VIIa uważa
się za kluczowy etap procesu krzepnięcia krwi
in vivo. Fizjologiczne znaczenie wstępnych eta¬
pów wewnątrzpochodnego szlaku, w których
biorą udział czynnik XII, prekalikreina i wielko¬
cząsteczkowy kininogen jest kwestionowane, po¬
nieważ u chorych z wrodzonym niedoborem tych
czynników nie dochodzi do nadmiernych krwa¬
wień. Podobnie osoby z niedoborem czynnika XI
mogą nie mieć problemów z krwawieniami. Szlak
wewnątrzpochodny może odgrywać ważniejszą
rolę w fibrynolizie (p. niżej) niż w krzepnięciu,
ponieważ kalikreina, czynnik XIIa i czynnik Xla
rozszczepiają plazminogen, a kalikreina może ak¬
tywować jednołańcuchową urokinazę.
Inhibitor szlaku tkankowego czynnika (TFPI)
jest głównym fizjologicznym inhibitorem krzep¬
nięcia. Jest on białkiem krążącym we krwi w po¬
łączeniu z lipoproteiną. TFPI bezpośrednio hamuje
czynnik Xa przez wiązanie się z enzymem w po¬
bliżu jego centrum aktywnego. Kompleks: czynnik
Xa-TFP1 hamuje następnie kompleks utworzony
przez czynnik VIIa i czynnik tkankowy.
Czynnik Xa powoduje aktywacje
protrombiny do trombiny
Podczas końcowego, wspólnego etapu krzepnię¬
cia czynnik Xa, powstający zarówno na szlaku
wewnątrzpochodnym, jak i zewnątrzpochodnym,
aktywuje protrombinę (czynnik II) do trombiny
Ryc. 50-2. Schemat (bez zachowania propor¬
cji) wiązania czynników Va, Ca2+ i protrombi¬
ny z błoną aktywowanej płytki krwi. Miejsca
rozszczepienia cząsteczki protrombiny przez
czynniki Xa zaznaczono dwoma strzałkami.
Część cząsteczki protrombiny, z której na¬
stępnie powstaje trombina, oznaczono jako
pretrombina. Ca2+ łączą się z anionowymi fo¬
sfolipidami błony aktywowanych płytek krwi.
(czynnik Ha), która następnie przekształca fibry-
nogen w fibrynę (ryc. 50-1).
Aktywacja protrombiny, podobnie jak uczyn¬
nienie czynnika X, zachodzi na powierzchni bło¬
ny komórkowej i wymaga obecności kompleksu
protrombinazowego składającego się z płytko¬
wych, anionowych fosfolipidów, jonów wapnia,
czynnika Va, czynnika Xa i protrombiny. Połą¬
czenie protrombinazy i kompleksu tenazowego
następuje na powierzchni aktywowanych płytek
krwi, kiedy to dochodzi do ekspozycji aniono¬
wych (kwasowych) fosfolipidów - fosfatydylose-
ryny, która w warunkach spoczynkowych, w nie-
aktywowanych płytkach krwi, znajduje się na we¬
wnętrznej powierzchni błony plazmatycznej.
Czynnik V (masa cząsteczkowa 330 kDa), gli-
koproteina wykazująca podobieństwo do czyn¬
nika VIII i ceruloplazminy, jest syntetyzowany
w wątrobie, śledzionie i nerkach, i występuje
zarówno w płytkach krwi, jak i osoczu. Działa
on jako kofaktor w sposób podobny do czynni¬
ka VIII w kompleksie aktywnym. Po aktywacji
do czynnika Va, zachodzącej pod wpływem nie¬
wielkich ilości trombiny, wiąże się on ze specy¬
ficznymi receptorami błony komórkowej płytek
krwi (ryc. 50-2), tworząc kompleks z czynnikiem
Xa i protrombiną. Następnie czynnik ten podlega
inaktywacji wskutek dalszego działania trombiny,
tym samym zapewniając ograniczenie konwersji
protrombiny do trombiny. Protrombiną (masa
cząsteczkowa 72 kDa, ryc. 50-3) jest jednołańcu¬
chową glikoproteiną syntetyzowaną w wątrobie.
Fragment A-końcowy protrombiny (1 na ryc. 50-3)
zawiera dziesięć reszt y-karboksyglutaminiano-
wych (Gla), zaś zależne od seryny miejsce aktyw¬
ne tej proteazy (zaznaczone czarnym trójkątem)
Pretrombina
F-1.2
Ca2+ Ca2+
■ Ładunki ujemne,
z którymi wiążą się Ca2+
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 733
Glan
rn *
A l B |
ł
xa
~Y V"
F-1 • 2 Pretrombina
(przed rozszczepieniem przez czynnik Xa)
Trombina
(po rozszczepieniu przez czynnik Xa)
Ryc. 50-3. Schemat cząsteczki protrombiny (bez zachowania
proporcji). Fragment /V-końcowy znajduje się po lewej stronie;
obszar 1 zawiera wszystkie 10 reszt glutaminy. Zaznaczono
miejsca, w których cząsteczka jest rozszczepiana pod wpływem
czynnika Xa, jak również produkty jej degradacji. Pozycja katali¬
tycznie aktywnej seryny jest oznaczona trójkącikiem. Łańcuchy
A i B aktywnej trombiny (zacienione) są wzajemnie połączone za
pomocą mostków disiarczkowych.
umiejscowione jest na końcu C cząsteczki. Po
połączeniu z kompleksem czynników Va i Xa na
powierzchni płytki krwi, cząsteczka protrombiny
ulega rozszczepieniu w dwóch miejscach (ryc. 50-
-2) przez czynnik Xa, co prowadzi do utworzenia
aktywnej, dwułańcuchowej cząsteczki trombiny,
która jest następnie uwalniana z powierzchni płyt¬
ki. Łańcuchy A i B trombiny są ze sobą połączone
wiązaniem disiarczkowym.
Przekształcenie fibrynogenu do fibryny
jest katalizowane przez trombine
Fibrynogen (czynnik I, masa cząsteczkowa 340
kDa, ryc. 50-1 i 50-4 oraz tab. 50-1 i 50-2) jest
rozpuszczalną glikoproteiną osoczową, która
składa się z trzech różniących się między sobą
par łańcuchów polipeptydowych (Aa, Bp, y)2,
kowalencyjnie połączonych ze sobą wiązaniami
disiarczkowymi. Łańcuchy Bp i y zawierają przy¬
łączony do asparaginy kompleks oligosacharydo-
wy. Wszystkie trzy łańcuchy są syntetyzowane
w wątrobie; trzy odpowiedzialne za ich syntezę
geny strukturalne są zlokalizowane na tym sa¬
mym chromosomie, a ich ekspresja u ludzi podle¬
ga koordynacyjnej regulacji. Regiony A-końcowe
sześciu łańcuchów są utrzymywane w bliskim
wzajemnym sąsiedztwie przez pewną liczbę wią¬
zań disiarczkowych, natomiast regiony C-końco-
we są od siebie znacznie oddalone, wskutek czego
cząsteczka ma wydłużony i asymetryczny kształt
(ryc. 50-4). Odcinki A i B znajdujące się w regio¬
nach A-końcowych łańcuchów Aa i Bp, określa¬
ne odpowiednio jako fibrynopeptydy A (FPA)
i fibrynopeptydy B (FPB), mają nadmiar łańcu¬
chów ujemnych, co jest spowodowane obecnoś¬
cią reszt asparaginianowych i glutaminianowych,
jak również nietypowego O-siarczanu tyrozyny
w FPB. Wspomniane ładunki ujemne mają swój
wpływ na rozpuszczalność fibrynogenu w osoczu,
jak również zapobiegają agregacji jego cząsteczek
dzięki elektrostatycznemu odpychaniu.
Trombina (masa cząsteczkowa 34 kDa) jest
proteazą serynową, występującą w osoczu i hy¬
drol izującą cztery wiązania arginina-glicyna (Arg-
-Gly) zlokalizowane między fibrynopeptydami
oraz odcinkami a i p łańcuchów Aa i Bp fibryno¬
genu (ryc. 50-5A). Uwolnienie fibrynopeptydów
przez trombinę wyzwala monomery fibryny, ma¬
jące strukturę podjednostkową (a, P, y)2. Ponie¬
waż FPA i FPB zawierają, odpowiednio, tylko 16
i 14 reszt aminokwasowych, cząsteczka fibryny
zachowuje 98% reszt obecnych w fibrynogenie.
Usunięcie fibrynopeptydów odsłania miejsca wią¬
żące, które umożliwiają cząsteczkom monome¬
rów fibryny spontaniczną agregację w niestabil¬
ny kompleks tworzący z kolei nierozpuszczalny
skrzep fibry nowy. Uformowany, nierozpuszczal¬
ny polimer fibryny zatrzymuje w swoim obrębie
Łańcuch y
Ryc. 50-4. Schemat (bez zachowania propor¬
cji) cząsteczki fibrynogenu, eksponujące pary
łańcuchów Aa, Bp i y połączonych wiązaniami
disiarczkowymi. FPA - fibrynopeptyd A, FPB
- fibrynopeptyd B.
734 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
A Trombina
Fibrynopeptyd Łańcuch fibryny
(A lub B) (alubp)
Ryc. 50-5. Tworzenie się skrzepu fibry-
nowego: A - indukowane przez trombinę
rozszczepienie wiązań Arg-Gly (arginina-
-glicyna) łańcuchów Aa i Bp fibrynogenu
i powstanie fibrynopeptydów (lewostron¬
nie) oraz łańcuchów a i p monomerów
fibryny (prawostronnie). B - usieciowa-
nie cząsteczek fibryny przez aktywowany
czynnik XIII (czynnik Xllla).
Fibryna — CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — NH3+
Reszta lizyny
O
II
H2N — C — CH2 — CH2 — Fibryna
Reszta glutaminy
NH4+
j
Czynnik Xllla (transglutaminaza)
O
II
Fibryna — CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — NH — C — CH2 — CH2 — Fibryna
płytki krwi, erytrocyty i inne składniki, tworzące
białe lub czerwone skrzepy. Utworzony począt¬
kowy skrzep fibrynowy jest raczej słaby i utrzy¬
mywany w całości jedynie przez niekowalencyjne
połączenia monomerów fibryny.
Trombina, oprócz konwersji fibrynogenu do
fibryny, przekształca również czynnik XIII do
czynnika XIIIa. Czynnik ten jest bardzo swoistą
transglutaminazą, która łączy kowalencyjnie
cząsteczki fibryny na zasadzie tworzenia wiązań
peptydowych między grupami amidowymi i s-
-aminowymi reszt lizyny (ryc. 50-5B). W ten spo¬
sób powstaje bardziej stabilny skrzep fibrynowy
o zwiększonej odporności na proteolizę.
Stężenie krążącej trombiny wymaga
precyzyjnej kontroli wobec możliwości
powstawania zakrzepów
Po wytworzeniu aktywnej trombiny w procesie
krzepnięcia krwi lub tworzenia zakrzepów, jej
stężenie jest dokładnie regulowane, aby zapobiec
dalszemu tworzeniu fibryny lub aktywacji płytek
krwi. Cel ten osiągany jest w dwojaki sposób.
Trombina krąży w postaci nieaktywnego prekurso¬
ra protrombiny, która podlega uczynnieniu w wy¬
niku kaskady reakcji enzymatycznych, podczas
których nieaktywne zymogeny są przekształcane
do aktywnych enzymów, co w konsekwencji pro¬
wadzi do konwersji protrombiny w trombinę (ryc.
50-1). Na każdym etapie wspomnianej kaskady
mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego
zapewnia istnienie precyzyjnej równowagi mię¬
dzy aktywacją a hamowaniem. Stężenie czynnika
XII w osoczu wynosi ok. 30 pg/mL, fibrynogenu
- 3 mg/mL, natomiast stężenia innych czynników
kolejno działających w kaskadzie wykazują stały
wzrost, co jednoznacznie wskazuje na działanie
mechanizmu zwielokrotnienia w obrębie kaskady.
Drugi sposób kontroli aktywności trombiny pole¬
ga na unieczynnianiu wszelkich tworzących się jej
cząsteczek przez krążące inhibitory, z których
najważniejsza jest antytrombina III (p. niżej).
Heparyna zwiększa aktywność
antytrombiny - inhibitora trombiny
W warunkach fizjologicznych w osoczu występu¬
ją cztery naturalne inhibitory trombiny. Najważ¬
niejszym z nich jest antytrombina, której udział
w całkowitej aktywności antytrombinowej wyno¬
si 75%. Antytrombina może również hamować
aktywność czynników IXa, Xa, XIa, XIIa i VIIa,
o ile jest połączona z czynnikiem tkankowym.
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 735
a2-Makroglobulina ma największy udział w po¬
zostałej aktywności antytrombinowej osocza wraz
z kofaktorem heparyny II i arantytrypsyną
(a|-antyproteinazą), wykazującymi mniejszą ak¬
tywność hamującą w warunkach fizjologicznych.
Endogenna aktywność antytrombiny znacznie
zwiększa się w obecności kwaśnych proteoglika-
nów, takich jak heparyna (p. rozdz. 47). Wiążą
się one ze swoistymi miejscami kationowymi
w obrębie cząsteczki antytrombiny, indukując
zmianę jej konformacji i ułatwiając tym samym
jej wiązanie się z trombiną oraz innymi substra-
tami. Mechanizm ten leży u podstaw stosowania
heparyny w medycynie klinicznej w celu zahamo¬
wania krzepnięcia. Antykoagulacyjne działanie
heparyny może zostać zniesione przez działające
przeciwstawnie silnie kationowe polipeptydy, jak
protamina, która mocno wiąże się z heparyną
i osłabia jej łączenie się z antytrombiną. Hepary¬
ny o małej masie cząsteczkowej (małocząstecz-
kowe heparyny, LMWHs) znajdują coraz większe
zastosowanie kliniczne, a są to produkty enzyma¬
tycznego lub chemicznego rozkładu heparyny nie-
frakcjonowanej. Podaje się je podskórnie i mogą
być stosowane ambulatoryjnie. Mają większą do¬
stępność biologiczną niż heparyna niefrakcjono-
wana i ich stosowanie nie wymaga stałego nadzo¬
ru oraz przeprowadzania badań laboratoryjnych.
U osób z wrodzonymi niedoborami antytrombiny
występuje tendencja do częstego tworzenia się
rozległych zakrzepów, co potwierdza fizjologicz¬
ne znaczenie antytrombiny oraz wskazuje na fakt,
iż układ krzepnięcia u ludzi jest w warunkach fi¬
zjologicznych układem dynamicznym.
Trombiną bierze ponadto udział w regulacji
procesu krzepnięcia. Łączy się z trombomodu-
liną - glikoproteiną występującą na powierzchni
komórek śródbłonkowych. Kompleks ten aktywu¬
je białko C. Białko C, w połączeniu z białkiem S,
tworzy kofaktor określany jako aktywowane biał¬
ko C (APC), które rozkłada czynniki Va i VIIIa,
ograniczając ich udział w procesie krzepnięcia.
Dziedziczny niedobór białka C lub białka S może
być przyczyną powstawania poważnych zakrze¬
pów. Co więcej, u osób z czynnikiem V Leiden
(który ma resztę glutaminy w miejscu reszty ar-
gininy w pozycji 506) występuje zwiększone
ryzyko zakrzepów żylnych, ponieważ czynnik V
Leiden jest oporny na unieczynnianie przez APC.
Stan ten określa się jako oporność na APC.
Antykoagulanty kumarynowe hamuja
zależna od witaminy K karboksylację
czynników II, VII, IX i X
Antykoagulanty kumarynowe (np. warfaryna) są
lekami hamującymi zależną od witaminy K kar-
boksylację reszt glutaminianowych do y-karbok-
syglutaminianowych (p. rozdz. 44) w regionach
A-końcowych czynników II, VII, IX i X oraz
białek C i S. Białka te, powstające w wątrobie,
do spełnienia swej funkcji w procesie krzepnię¬
cia wymagają jonów wapnia. Pochodne kuma¬
ryny hamują redukcję pochodnych chinonowych
witaminy K do aktywnych jej form hydrochino¬
nowych (rozdz. 44). W tym przypadku podanie
witaminy K pozwala ominąć indukowaną kuma¬
ryną inhibicję i umożliwia powstanie czynników
zawierających reszty y-karboksyglutaminianowe.
Odwrócenie inhibicji kumarynowej przez witami¬
nę K trwa 12-14 h, podczas gdy wyeliminowanie
efektów działania heparyny przez protaminę jest
prawie natychmiastowe. Heparyna i warfaryna są
powszechnie stosowane do leczenia zakrzepicy
i stanów pozakrzepowych, takich jak zakrzepi-
ca żył głębokich i zatorowość płucna. Heparyna
podawana jest jako pierwsza, ponieważ działa od
razu, podczas gdy warfaryna wymaga kilku dni,
aby w pełni zadziałać. Działanie to należy do¬
kładnie monitorować, wykonując odpowiednie
badania krzepnięcia (p. niżej), ponieważ stwarza
zagrożenie krwotokiem.
Hemofilia A jest jednym z wielu
dziedzicznych zaburzeń krzepnięcia
U ludzi występuje wiele wrodzonych niedoborów
w obrębie układu krzepnięcia. Najbardziej rozpo¬
wszechniony jest niedobór czynnika VIII wywo¬
łujący hemofilię A. Choroba ta, dziedzicząca się
z chromosomem X, miała duże znaczenie w hi¬
storii rodów królewskich w Europie. Hemofilia
B jest spowodowana niedoborem czynnika IX
i wykazuje obraz kliniczny niemalże identyczny
z hemofilią A. Obydwa stany chorobowe można
jednak różnicować na podstawie swoistych te¬
stów laboratoryjnych.
Gen ludzkiego czynnika VIII, poddany klono¬
waniu, okazał się być jednym z największych do
tej pory poznanych, zawiera bowiem 186 kz i 26
eksonów. Wykryto wiele rozmaitych typów muta-
736 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
cji, przejawiających się zmniejszoną aktywnością
czynnika VIII. Obejmują one częściowe delecje
i punktowe mutacje typu missence, prowadzące
do przedwczesnego zakończenia tworzenia łań¬
cucha polipeptydowego. Obecnie możliwa jest
diagnostyka prenatalna, polegająca na ocenie
DNA z pobranych komórek kosmówki.
W ostatnich latach leczenie pacjentów z hemo¬
filią A obejmowało podawanie krioprecypitatów
(wzbogaconych w czynnik VIII), otrzymywanych
od indywidualnych dawców, lub liofilizowanych
koncentratów czynnika VIII, przygotowywanych
z puli osocza pochodzącego nawet od 5000 daw¬
ców. Obecnie można, dzięki technice rekom¬
binacji DNA, uzyskać preparat czynnika VIII.
Preparaty te nie są zanieczyszczone wirusami (np.
wirusami zapalenia wątroby A, B, C lub HIV-1)
występującymi w osoczu, ale na razie są bardzo
drogie; ich zastosowanie może wzrosnąć, jeżeli
obniży się ich cena.
Najczęściej spotykaną skazą krwotoczną jest
choroba von Willebranda, występująca u 1%
ludzi. Jest ona spowodowana niedoborem lub
defektem czynnika von Willebranda, będącego
wielką, multimeryczną glikoproteiną, wydzie¬
laną przez komórki śródbłonkowe do osocza,
gdzie stabilizuje czynnik VIII. Ponadto czynnik
von Willebranda zwiększa przyleganie płytek do
uszkodzonych miejsc naczyń (p. dalej).
Skrzepy fibrynowe sq rozpuszczane
przez plazmine
Jak już stwierdzono, prawidłowy układ krzepnię¬
cia jest w stanie dynamicznej równowagi, w której
skrzepy fibryny są stale tworzone i jednocześnie
rozpuszczane. Proces ten nazywa się fibrynolizą.
Plazmina - proteaza serynowa, odpowiedzialna
w głównej mierze za degradację fibryny i fibry-
nogenu, krąży w osoczu w formie nieaktywnego
zymogenu - plazminogenu (masa cząsteczkowa
90 kDa). Jeśli nawet niewielkie ilości plazminy
powstają we krwi krążącej, w warunkach fizjolo¬
gicznych podlegają one natychmiastowej inakty-
wacji przez szybko działający inhibitor plazminy
- a2-antyplazminę. Plazminogen łączy się zarów¬
no z fibrynogenem, jak i fibryną, i w ten sposób
zostaje włączony w skład skrzepu w trakcie jego
tworzenia się. Plazmina powstająca w czasie jej
związania z fibryną jest chroniona przed dzia¬
łaniem a2-antyplazminy i pozostaje aktywna.
W większości tkanek organizmu występują róż¬
nego rodzaju aktywatory plazminogenu, roz¬
szczepiając to samo wiązanie w cząsteczce pla¬
zminogenu - między argininą i wahną (Arg-Val)
i tworząc tym samym dwułańcuchową proteazę
serynową- plazminę (ryc. 50-6).
Aktywatory
plazminogenu
PLAZMINOGEN
LArg-Val -t
s —s—'
PLAZMINA
Ryc. 50-6. Aktywacja plazminogenu. To samo wiązanie Arg-Val
(arginina-walina) jest rozszczepiane przez wszystkie aktywatory
plazminogenu, z utworzeniem dwutańcuchowej cząsteczki plaz¬
miny. Trójkącik oznacza resztę serynową miejsca aktywnego.
Dwa łańcuchy plazminy są połączone ze sobą za pomocą mostka
disiarczkowego.
Tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA)
jest proteazą serynową, uwalnianą ze śródbłonka
naczyniowego do krążenia w warunkach uszko¬
dzenia tkanki lub stresu, a następnie - jeśli nie
zwiąże się z fibryną - podlega katalitycznej inak-
tywacji. Po połączeniu z fibryną t-PA rozszczepia
plazminogen w obrębie skrzepu z wytworzeniem
plazminy, która z kolei rozkłada fibrynę z uwalnia¬
niem rozpuszczalnych produktów jej degradacji,
co ostatecznie prowadzi do rozpuszczenia skrze¬
pu. Zarówno plazmina, jak i aktywator plazmino¬
genu, nie mogąc pozostać związane z produktami
degradacji fibryny, są uwalniane do osocza, gdzie
podlegają unieczynnieniu przez ich naturalne in¬
hibitory. Prourokinaza jest prekursorem kolejnego
aktywatora plazminogenu - urokinazy, która nie
ma tak dużej swoistości dla fibryny jak poprzed¬
ni aktywator. Urokinaza, pierwotnie wydzielona
z moczu, jest wytwarzana przez monocyty, ma-
krofagi, fibroblasty i komórki śródbłonkowe. Jej
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 737
Ryc. 50-7. Schemat ukazujący miejsca
działania streptokinazy, tkankowego akty¬
watora plazminogenu (t-PA), urokinazy, in¬
hibitora aktywatora plazminogenu i a2-an-
typlazminy (ostatnie dwa białka wykazują
działanie hamujące). Streptokinaza tworzy
kompleks z plazminogenem, który wyka¬
zuje aktywność proteolityczną; powoduje
to przejście plazminogenu w plazminę, co
zapoczątkowuje fibrynolizę.
0
Inhibitor t-PA
aktywatora
plazminogenu
Streptokinaza
+
Plazminogen ► Kompleks
streptokinazy i plazminogenu
—► Urokinaza
0
Plazmina a2-Antyplazmina
Fibryna ► Produkty degradacji fibryny
główną funkcją jest prawdopodobnie rozkład ma¬
cierzy pozakomórkowej. Na rycinie 50-7 ukazano
miejsca działania pięciu białek, które wpływają
na tworzenie się i działanie plazminy.
Rekombinowany t-PA i streptokinaza
służą jako leki przeciwzakrzepowe
Alteplaza (t-PA) uzyskana techniką rekombinacji
DNA jest używana w lecznictwie podobnie jak
i streptokinaza. Streptokinaza jest jednak mniej
wybiórcza niż t-PA, ponieważ aktywuje zarówno
plazminogen w osoczu (gdzie może on następnie
rozkładać krążący fibrynogen), jak również pla¬
zminogen związany ze skrzepem fibrynowym.
Ilość plazminy powstałej pod wpływem dawek
terapeutycznych streptokinazy może przekro¬
czyć zdolność neutralizacji przez krążącą a2-an-
typlazminę, powodując w konsekwencji rozkład
zarówno fibrynogenu, jak i fibryny, a ponadto
krwawienia, często obserwowane w trakcie tera¬
pii fibrynolitycznej. Coraz większe jest zaintere¬
sowanie wykorzystaniem terapeutycznym t-PA
otrzymanego metodą rekombinacji DNA, z racji
jego swoistości dla rozkładanej fibryny i możliwo¬
ści przywracania drożności tętnicom wieńcowym,
objętym uprzednio zakrzepem. Odpowiednio
wczesne podanie t-PA (ok. 6 godzin od powstania
zakrzepu) może znacznie obniżyć współczynnik
umieralności z powodu uszkodzenia mięśnia ser¬
cowego, co jest konsekwencją zakrzepicy wień¬
cowej. Streptokinaza jest powszechnie używana
w leczeniu zakrzepicy naczyń wieńcowych, ale
jej niekorzystną cechą jest antygenowość. t-PA
jest stosowany w leczeniu chorych na udar niedo¬
krwienny mózgu, zwężenie tętnic obwodowych
i zatorowość płucną.
W wielu stanach patologicznych, między in¬
nymi w chorobie nowotworowej i wstrząsie, ob¬
serwuje się zwiększenie stężenia aktywatorów
plazminogenu. Ponadto aktywność antyplazmi-
ny, na którą składają się arantytrypsyna i a2-an-
typlazmina, może być zaburzona w niektórych
stanach chorobowych, jak chociażby w marskości
wątroby. Ponieważ pewne substancje pochodzenia
bakteryjnego, np. streptokinaza, mają zdolność
aktywowania plazminogenu, więc mogą być one
odpowiedzialne za powstawanie rozległej skazy
krwotocznej, obserwowanej czasami u pacjentów
z uogólnionymi zakażeniami bakteryjnymi.
Aktywacja płytek krwi jest zwiazana ze
stymulacja szlaku polifosfoinozytydowego
Płytki krwi w warunkach prawidłowych krążą
jako nieaktywne twory o kształcie krążków. Pod¬
czas krzepnięcia lub tworzenia zakrzepów ulegają
one aktywacji i tworzą czop hemostatyczny lub
zakrzep. Płytki krwi podlegają kolejno trzem pro¬
cesom, zapewniającym ciągłość hemostazy: 1)
adhezji do odsłoniętych włókien kolagenu w ścia¬
nie naczyniowej; 2) uwolnieniu zawartości ich
ziarnistości oraz 3) agregacji.
Adhezja płytek krwi do kolagenu odbywa się
za pośrednictwem swoistych receptorów znajdu¬
jących się na powierzchni płytek, w tym komplek¬
sów glikoproteinowych GPIa-IIa (a^ integryna;
rozdz. 51), GPIb-IX-V i GPVI. W wiązaniu się
GPIb-IX-V z kolagenem pośredniczy czynnik
von Willebranda; oddziaływanie to jest szczegół-
738 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
nie ważne w adhezji płytek krwi do warstwy pod-
śródbłonkowej w warunkach oddziaływania „sił
strzygących” w małych naczyniach i częściowo
zwężonych tętniczkach.
Płytki krwi, przylegając do kolagenu, zmieniają
kształt i rozciągają się na śródbłonku. Uwalniają
wtedy zawartość ziarnistości (ziarnistości gęstych
i ziarnistości a). Proces wydzielania jest pobudza¬
ny także przez trombinę.
Trombina, utworzona w wyniku kaskady
krzepnięcia jest najsilniejszym aktywatorem pły¬
tek i zapoczątkowuje aktywację płytek, łącząc się
z receptorami PAR-1 (ang. protease activated re¬
ceptor-1), PAR-4 i GPIb-IX-V znajdującymi się
na powierzchni błony cytoplazmatycznej (ryc.
50-8A). Kolejne zjawiska prowadzące do aktywa¬
cji płytek krwi, zapoczątkowane przyłączeniem
trombiny do receptorów PAR-1 i PAR-4, są przy-
Znajdujący się pod śródbłonkiem
czynnik von Willebranda
Na zewnątrz
płytki krwi
Błona
•cytoplazma-
tyczna
Wewnątrz
płytki krwi
(A) Schemat aktywacji płytki krwi przez kolagen, trombinę, trom-
Sygnał zapoczątkowujący proces
Wewnątrz
Na zewnątrz
Fibrynogen
Na zewnątrz
Wewnątrz
Sygnał zapoczątkowujący proces
Błona
cytoplazma-
tyczna
Błona
cytoplazma-
tyczna
boksan A2 i ADP oraz hamowania aktywacji płytek przez prosta-
cyklinę. Od góry do dołu przedstawiono: zewnętrzne otoczenie
płytek, błonę cytoplazmatyczną i wnętrze płytek krwi. Zwięk¬
szenie stężenia jonów wapniowych wewnątrz płytek i aktywacji
kinazy białek C powoduje dalsze przekazywanie sygnału, prowa¬
dzące do zmiany kształtu płytek, uwalniania zawartości ziarnisto¬
ści i agregacji (AC - cyklaza adenylanowa; cAMP - cykliczny
AMP; DAG -1,2-diacylglicerol; GP - glikoproteina; IP - receptor
prostacykliny; IP3 - trifosforan 1,4,5-inozytolu; P2Y1( P2Yi2 - re¬
ceptory purynowe; PAR - receptor aktywowany przez proteazy;
PIP2 - bisfosforan 4,5-fosfatydyloinozytolu; PKC - kinaza bia¬
łek C; PL - fosfolipid; PLA2 - fosfolipaza A2; PLCp; PLCy - fosfo-
lipaza Cy; TP - receptor dla tromboksanu A2; Tx A2 - tromboksan
A2; VWF - czynnik von Willebranda). Nie pokazano na schemacie
białek G biorących udział w aktywacji płytek.
(B) Schemat agregacji płytek zachodzącej po przyłączeniu fibry-
nogenu do aktywowanych cząsteczek GPIIb-llla na przylegają¬
cych płytkach. Sygnały aktywujące ten proces pochodzące od
wszystkich czynników pobudzających agregację płytek powodują
przekształcenie spoczynkowej formy cząsteczki GPIIb-llla do for¬
my czynnej, która może przyłączać fibrynogen.
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 739
kładem sygnalizacji przezbłonowej, w trakcie
której chemiczny sygnał zawarty w przestrzeni
pozakomórkowej powoduje powstanie cząsteczek
efektorowych we wnętrzu komórki. Na przykład
trombina działa jako pozakomórkowy przekaźnik
chemiczny (stymulant lub agonista). Oddziały¬
wanie trombiny z jej receptorami połączonymi
z białkiem G pobudza aktywność wewnątrz¬
komórkowej fosfolipazy Cp. Enzym ten hydro-
lizuje fosfolipid znajdujący się w błonie cyto-
plazmatycznej - bisfosforan 4,5-fosfatydyloino-
zytolu (PIP2, polifosfoinozytol). W procesie tym
tworzą się dwie występujące wewnątrzkomórko¬
we cząsteczki - 1,2-diacylglicerol i trisfosforan
1,4,5-inozytolu.
Hydroliza PIP2 jest elementem mechanizmu
działania wielu hormonów i leków. Diacylglice-
rol pobudza kinazę białkową C, która fosforyluje
białko pleksytrynę (masa cząsteczkowa 47 kDa).
To powoduje agregację ziarnistości magazynu¬
jących i uwolnienie ich zawartości. Uwolnione
z ziarnistości ADP także może aktywować płyt¬
ki krwi, w wyniku czego dochodzi do agregacji
dalszych płytek. IP3 powoduje uwolnienie jonów
wapniowych z gęstego układu tubulamego (lub
resztek siateczki endoplazmatycznej z megaka-
riocytów). Jony wapniowe uwolnione do cytozolu
oddziałują z kalmoduliną i lekkimi łańcuchami
kinazy miozyny, co powoduje fosforylację lek¬
kich łańcuchów miozyny. Łańcuchy te następnie
współdziałają z aktyną i powodują przesunięcie
i zmiany kształtu płytki krwi.
Wywołana przez kolagen aktywacja płytkowej
fosfolipazy A2 przez zwiększone stężenie Ca2+
jest przyczyną uwolnienia kwasu arachidonowe-
go z płytkowych fosfolipidów i powstania trom-
boksanu A2 (rozdz. 23), który z kolei za pośred¬
nictwem receptora związanego z białkiem G może
dalej aktywować fosfolipazę C, ułatwiając agrega¬
cję płytek krwi. Uczynnione płytki krwi, poza for¬
mowaniem czopu płytkowego, są niezbędne, dzię¬
ki swoim fosfolipidom, do aktywacji czynników X
i II w kaskadzie krzepnięcia (p. ryc. 50-1).
Wszystkie czynniki powodujące agregację pły¬
tek krwi, w tym trombina, kolagen, ADP, czynnik
aktywujący płytki krwi, zmieniają powierzchnię
płytek krwi tak, że fibrynogen może oddziaływać
z kompleksem glikoproteinowym GPIIb-IIIa (in-
tegryna anb-p3) (rozdz. 51) znajdującym się na po¬
wierzchni pobudzonych płytek krwi (ryc. 50-8B).
W procesie tym cząsteczki fibrynogenu łączą ak¬
tywowane płytki krwi, tworząc agregaty. Niektóre
substancje, w tym adrenalina, serotonina i wazo-
presyna (ADH), działają synergicznie z innymi
czynnikami pobudzającymi agregację.
Komórki śródbtonka naczyń
krwionośnych syntetyzują prostacyklinę
oraz inne substancje wpływające na
krzepniecie krwi i tworzenie zakrzepów
Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych wno¬
szą istotny wkład do ogólnej regulacji krzepnię¬
cia krwi i powstawania zakrzepów. Jak opisano
w rozdz. 23, komórki te wytwarzają prosta¬
cyklinę (PGI2), która jest silnym inhibitorem
agregacji płytek i działania tromboksanu A2.
Prostacyklina działa na zasadzie pobudzania ak¬
tywności cyklazy adenylanowej na powierzchni
błon płytek krwi. Pojawiające się w następstwie
tego zwiększenie stężenia wewnątrzpłytkowe-
go cAMP przeciwdziała stymulowanemu przez
Tabela 50-3. Cząsteczki wytwarzane przez komórki śródbtonka
odgrywające rolę w regulacji krzepnięcia i fibrynolizy1
Cząsteczka
Działanie
ADP-aza
(ektoenzym)
Rozktada ADP (aktywator płytek)
do AMP + Pj.
Śródblonkowy czynnik
rozszerzający naczynia
(tlenek azotu)
Hamuje adhezję i aktywację płytek
przez zwiększenie zawartości
cyklicznego GMR
Siarczan heparanu
(glikozoaminoglikan)
Środek przeciwkrzepliwy; po połączeniu
z antytrombiną III hamuje trombinę.
Prostacyklina (PGI2,
prostaglandyna)
Hamuje agregację płytek krwi
poprzez zwiększenie zawartości
cyklicznego AMR
Trombomodulina
(glikoproteina)
Łączy się z białkiem C, które następnie
jest rozkładane przez trombinę do czyn¬
nego białka C; czynne białko C w połą¬
czeniu z białkiem S rozkłada czynniki Va
i Vllla, ograniczając ich działanie.
Tkankowy aktywator
plazminogenu (t-PA,
proteaza)
Przekształca nieaktywny plazminogen
w plazminę, która traci fibrynę; działanie
t-PA jest ograniczone przez inhibitor
aktywatora plazminogenu (PAI-1).
1 Adaptowane z: Wu KK: Endothelial cells in hemostasis, throm-
bosis and inflammation. Hosp Pract (Off Ed), 1992;27:145.
740 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
IP3 wzrostowi stężenia wewnątrzkomórkowych
jonów wapnia i tym samym hamuje aktywację
płytek krwi (p. ryc. 50-8). Komórki śródbłonka
spełniają też inne funkcje w regulacji powsta¬
wania skrzepu. Na przykład metabolizują ADP,
znosząc jego działanie agregujące płytki krwi.
Ponadto, wytwarzają one również siarczan hepa-
ranu, który wiąże niektóre czynniki krzepnięcia,
a także wytwarzają aktywatory plazminogenu,
które mogą wspomagać rozpuszczanie skrzepów.
W tabeli 50-3 zestawiono niektóre związki wy¬
twarzane przez komórki śródbłonka, wpływające
na tworzenie skrzepu i fibrynolizę. Czynnik re¬
laksujący pochodzenia śródbłonkowego (tlenek
azotu) omówiono w rozdz. 48.
Analiza mechanizmów inkorporacji aterogen-
nych lipoprotein, jak LDL, przez monocyty, ko¬
mórki śródbłonka i mięśniówki gładkiej tętnic,
wraz z precyzyjną oceną mechanizmów powsta¬
wania uszkodzeń wywoływanych przez lipopro-
teiny w obrębie tych komórek, są przedmiotem
intensywnych badań w celu wyjaśnienia mecha¬
nizmów powstawania miażdżycy (rozdz. 26).
Kwas acetylosalicylowy jest skutecznym
lekiem przeciwptytkowym
Wiele leków (przeciwpłytkowych) zmienia czyn¬
ność płytek krwi. Najważniejszy jest kwas ace¬
tylosalicylowy, który nieodwracalnie acyluje
i w ten sposób hamuje układ cyklooksygenazy
płytkowej (COX-l) uczestniczącej w wytwarza¬
niu tromboksanu A2 (rozdz. 15) - silnego czyn¬
nika agregującego płytki krwi i powodującego
skurcz naczyń. Płytki krwi są bardzo wrażliwe
na kwas acetylosalicylowy - tak mała dawka, jak
30 mg/dzień (tabletka aspiryny zawiera zwykle
325 mg) skutecznie blokuje syntezę tromboksa¬
nu A2. Hamuje także wytwarzanie prostacykliny
(PGI2, która przeciwdziała agregacji i skurczowi
naczyń) przez komórki śródbłonka, ale w przeci¬
wieństwie do płytek krwi komórki te odbudowują
cyklooksygenazę w ciągu kilku godzin. Wypadko¬
wą tych zjawisk jest więc przewaga prostacykliny
nad tromboksanem, co przeciwdziała agregacji
płytek krwi. Wskazaniami do leczenia kwasem
acetylosalicylowym jest dusznica bolesna, za¬
grażający zawał serca oraz zapobieganie udarowi
mózgu u chorych z napadami przejściowego nie¬
dokrwienia mózgu.
Inne leki przeciwpłytkowe to klopidogrel
- swoisty inhibitor receptora P2Y12 dla ADP oraz
antagoniści Uganda wiążący się z receptorem
GPIIb-IIIa (np. abciximab), które to leki zaburza¬
ją przyłączenie fibrynogenu i w ten sposób hamu¬
ją agregację płytek krwi.
Laboratoryjne testy oceny krzepnięcia
krwi, trombolizy i agregacji płytek krwi
Obecnie dostępnych jest wiele różnorodnych te¬
stów laboratoryjnych służących do oceny czterech
etapów hemostazy, opisanych wyżej. Obejmują
one oznaczanie liczby płytek krwi, czasu krwa¬
wienia, częściowego czasu tromboplastynowego
(aPTT lub PTT), czasu protrombinowego (PT),
czasu trombinowego, stężenia fibrynogenu, trwa¬
łości skrzepu fibrynowego oraz ilości produktów
rozpadu fibryny. Liczba płytek krwi odzwiercied¬
la ich zawartość we krwi, a czas krwawienia jest
ogólnym testem ich czynności. Częściowy czas
tromboplastynowy (aPTT) określa wewnątrzpo-
chodny szlak krzepnięcia, a czas protrombino-
wy - zewnątrzpochodny szlak krzepnięcia. Czas
protrombinowy służy do oceny skuteczności do¬
ustnych leków przeciwzakrzepowych, takich jak
warfaryna, a częściowy czas aktywowanej trom-
boplastyny - do oceny leczenia heparyną. Więcej
danych o tych testach można znaleźć w podręcz¬
nikach hematologii.
STRESZCZENIE
• Krzepnięcie krwi jest złożonym procesem,
w którym biorą udział czynniki krzepnięcia,
płytki krwi i ściana naczyń krwionośnych.
• Wiele czynników krzepnięcia to substraty pro-
teaz serynowych, które ulegają aktywacji pod¬
czas całego procesu.
• Istnieje wewnątrzpochodny i zewnątrzpochod¬
ny szlak uczynnienia krzepnięcia krwi; ten dru¬
gi zostaje zapoczątkowany przez czynniki tkan¬
kowe. Szlaki te zbiegają się przy czynniku Xa,
zapoczątkowując końcowy proces prowadzący
do katalizowanego przez trombinę przekształ¬
cenia fibrynogenu w fibrynę, której budowa
ulega wzmocnieniu przez wytworzenie wiązań
poprzecznych, co katalizuje czynnik XIII.
• Występują dziedziczne choroby związane
z czynnikami krzepnięcia, najczęściej spoty-
50. PROCES KRZEPNIĘCIA KRWI I CHOROBA ZAKRZEPOWA 741
kane dotyczą czynnika VIII (hemofilia A, czy¬
li krwawiączka A), czynnika IX (hemofilia B,
czyli krwawiączka B) i czynnika von Wille-
branda (choroba von Willebranda).
Spośród naturalnych inhibitorów krzepnięcia
najważniejsza jest antytrombina. Dziedziczny
niedobór tego białka może być przyczyną za¬
krzepów.
Aktywność czynników II, VII, IX i X oraz bia¬
łek C i S wymaga y-karboksylacji niektórych
reszt glutaminianowych, a proces ten zależy od
witaminy K i jest hamowany przez warfarynę
- lek przeciwkrzepliwy.
Fibryna ulega rozpuszczeniu przez plazminę.
Plazmina występuje w postaci nieczynnego pre¬
kursora - plazminogenu, który ulega aktywacji
pod wpływem tkankowego aktywatora plazmi¬
nogenu (t-PA). Zarówno t-PA, jak i streptokina-
za są powszechnie używane w leczeniu wczes¬
nych stadiów zakrzepów tętnic wieńcowych.
• Trombina i inne czynniki powodują uczynnie¬
nie płytek krwi - proces obejmujący różnorakie
biochemiczne i strukturalne zjawiska. Kluczo¬
wym etapem aktywacji płytek krwi jest pobu¬
dzenie fosfolipazy C i szlaku przemian polifo-
sfoinozytydów, ale inne procesy też biorą w tym
udział.
• Aspiryna jest ważnym lekiem przedwpłytko-
wym, hamującym wytwarzanie tromboksanu A2.
PIŚMIENNICTWO
Hoffman R et al (editors): Hematology: Basic Principles
and Practice, 4th ed. Elsevier Churchill Livings-
ton, 2005.
Israels LG, Israels ED: Mechanisms in Hematology, 3rd
ed. Core Health Sciences Inc, 2002. (Praca zawiera
wiele wspaniałych ilustracji mechanizmów podsta¬
wowych procesów hematologicznych).
Kasper DL et al (editors): Harrison s Principles of Inter-
nal Medicine, 16th ed. McGraw-Hill, 2005.
Erytrocyty i leukocyty
Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Komórki krwi są przedmiotem intensywnych ba¬
dań, ponieważ można je łatwo uzyskać, pełnią
liczne funkcje biologiczne i biorą udział w wielu
procesach chorobowych. Budowa i czynność he¬
moglobiny, porfirię, żółtaczka i aspekty gospo¬
darki żelazem zostały omówione w poprzednich
rozdziałach. Zmniejszenie liczby erytrocytów i za¬
wartej w nich hemoglobiny jest przyczyną niedo¬
krwistości (anemii) - ważnej i niejednolitej grupy
schorzeń, przy czym niektóre rodzaje niedokrwi¬
stości są często spotykane w praktyce klinicz¬
nej. Wiele układów grupowych krwi obecnych
w błonie erytrocytów i innych komórek krwi ma
szczególne znaczenie w przetaczaniu krwi i prze¬
szczepianiu tkanek. W tabeli 51-1 przedstawiono
przyczyny licznych, ważnych chorób dotyczących
erytrocytów; niektóre z nich są omówione w tym
rozdziale, a pozostałe w innych częściach książki.
Zapaleniem może być objęty każdy narząd. Gra-
nulocyty obojętnochłonne odgrywają główną rolę
w ostrym zapaleniu, a inne leukocyty, np. limfo¬
cyty, odgrywają rolę w zapaleniach przewlekłych.
Białaczki, określane jako złośliwe nowotwory
tkanek wytwarzających krew, mogą dotyczyć
komórek prekursorowych każdej głównej grupy
krwinek białych. Najczęściej spotykanymi ich ro¬
dzajami są ostre i przewlekłe białaczki szpikowe,
dotyczące komórek prekursorowych granulocy-
tów obojętnochłonnych, oraz ostre i przewlekłe
białaczki limfatyczne. Znajomość mechanizmów
cząsteczkowych biorących udział w powstawa¬
niu białaczek szybko się pogłębia, ale nie są one
przedmiotem niniejszego rozdziału.
Złożona chemioterapia oparta na stosowaniu
kombinacji różnych czynników chemioterapeu-
tycznych, z których każdy działa na jeden lub
wiele biochemicznych punktów uchwytu, jest
znacznie skuteczniejsza w leczeniu wielu typów
białaczek. Zrozumienie roli krwinek czerwonych
i białych w stanach zdrowia i choroby wymaga
wiedzy o wielu podstawowych aspektach ich me¬
tabolizmu.
ERYTROCYT CECHUJE SIĘ PROSTA
BUDOWA I FUNKCJA
Główne funkcje erytrocytów są względnie pro¬
ste i obejmują dostarczanie tlenu do tkanek i po¬
moc w wydalaniu ditlenku węgla oraz protonów
wytwarzanych w metabolizmie tkankowym. Mają
one znacznie prostszą strukturę niż większość
komórek ludzkiego organizmu, zbudowane są bo¬
wiem z błony komórkowej, która otacza roztwór
hemoglobiny (białko to stanowi 95% wszystkich
białek wewnątrzkomórkowych erytrocytu). Ery¬
trocyt nie ma takich organelli komórkowych,
jak mitochondria, lizosomy lub aparat Golgiego.
Ludzkie krwinki czerwone, podobnie jak erytro¬
cyty większości zwierząt, są pozbawione jądra
komórkowego. Nie są one jednak metabolicznie
obojętne. ATP jest syntetyzowany w procesie gli¬
kolizy i jest to ważny proces, który ułatwia krwin¬
ce utrzymanie kształtu dwuwklęsłego, a także
regulację transportu jonów (np. przy udziale
Na7K+-ATPazy i białek wymiany anionów; p.
dalej) oraz ułatwia transport wody z i do ko¬
mórki. Dwuwklęsły kształt zwiększa stosunek
powierzchni do objętości krwinki i w ten spo¬
sób sprzyja wymianie gazów. Erytrocyt zawiera
składniki cytoszkieletu (p. niżej), które odgrywają
ważną rolę w utrzymaniu jej kształtu.
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 743
Tabela 51-1. Zestawienie przyczyn wybranych ważnych chorób
związanych z erytrocytami
Choroba
Wyłączna lub główna przyczyna
Niedokrwistość
z niedoboru żelaza
Niedostateczna podaż lub nadmierna
utrata żelaza.
Methemoglobinemia
Nadmierna podaż utleniaczy (różne
związki chemiczne lub leki). Genetycznie
uwarunkowany niedobór układu zależnej
od NADH reduktazy methemoglobiny
(MIM 250800). Dziedziczna
methemoglobinemia (MIM 141800).
Niedokrwistość
sierpowatokrwinkowa
(MIM 141903)
Zmiana kodonu 6 odpowiedzialnego
za syntezę łańcucha p-hemoglobiny,
tj. zastąpienie trypletu GAG przez GTG,
co powoduje zastąpienie reszty waliny
resztą kwasu glutaminowego.
a-Talasemie
(MIM 141800)
Mutacje genów syntezy a-globiny,
głównie nierównomierne crossing-over
lub duże oderwanie, rzadziej mutacja
nonsensowna lub zmiany fazy odczytu.
p-Talasemie
(MIM 141900)
Rozliczne mutacje genu syntezy p-glo-
biny, w tym oderwania, nonsensowna
mutacja, zmiany fazy odczytu i zmiany
budowy genu (np. miejsce „splicingu”,
mutacje genu promotorowego).
Niedokrwistości megaloblastyczne
Niedobór
witaminy B12
Zmniejszone wchłanianie witaminy B12
wywołane niedoborem czynnika
wewnętrznego wydzielanego przez
komórki okładzinowe żołądka.
Niedobór kwasu
foliowego
Zmniejszona podaż, upośledzone
wchłanianie lub zwiększone
zapotrzebowanie (np. w ciąży).
Dziedziczna
sferocytoza1
(MIM 182900)
Niedobór ilościowy lub zaburzona
budowa a-spektryny lub p-spektryny,
ankiryny lub białek pasma 3 lub 4.1.
Niedobór dehydroge¬
nazy glukozo-6-
-fosforanowej1
(MIM 305900)
Różnorodne mutacje genu dla G6PD,
sprzężone z chromosomem X;
najczęściej mutacje punktowe.
Niedobór kinazy
pirogronianowej
(PK)1 (MIM 266200)
Prawdopodobnie różnorodne mutacje
genu odpowiadającego za syntezę
izoenzymu erytrocytarnego (R) PK.
Napadowa nocna
hemoglobinuria1
(MIM 311770)
Mutacje genu PIG-A wpływające na
syntezę białek kotwiczących GPI.
1 Ostatnie cztery wymienione w tabeli choroby są przyczyną
niedokrwistości hemolitycznej, podobnie jak inne wymienione
schorzenia. Większość z nich jest omówiona w innych rozdzia¬
łach. Numery MIM odnoszą się tylko do chorób uwarunkowanych
genetycznie.
Około dwóch milionów erytrocytów
dostaje się do krążenia w każdej
sekundzie
Czas życia prawidłowego erytrocytu wynosi 120
dni, co oznacza, że codziennie jest wymieniane
nieco mniej niż 1% ogólnej liczby krwinek (200
mld dziennie lub 2 min na sekundę). Pojawiające
się w krążeniu nowe erytrocyty zawierają jeszcze
rybosomy i składniki siateczki śródplazmatycznej.
Kwas rybonukleinowy (RNA) rybosomów można
wykryć za pomocą odpowiedniego barwienia (np.
błękitem krezolowym), a komórki go zawierające
określa się jako retikulocyty. W warunkach pra¬
widłowych stanowią one ok. 1% wszystkich ery¬
trocytów. Czas życia krwinek czerwonych może
ulec dramatycznemu skróceniu w różnych rodza¬
jach niedokrwistości hemolitycznych. Liczba
retikulocytów jest wtedy znacznie zwiększona,
ponieważ szpik próbuje wyrównać szybki rozpad
krwinek przez wzrost wydzielania nowych, mło¬
dych krwinek do krążenia.
Erytropoetyna reguluje
wytwarzanie erytrocytów
Ludzka erytropoetyna jest glikoproteiną zbu¬
dowaną ze 166 reszt aminokwasowych (masa
cząsteczkowa ok. 34 kDa). Jej stężenie w osoczu
oznacza się metodami radioimmunologiczny-
mi. Jest ona głównym czynnikiem regulującym
u człowieka tworzenie erytrocytów. Erytropoety¬
na jest wytwarzana głównie przez nerki i uwalnia¬
na, w odpowiedzi na niedobór tlenu, do strumie¬
nia krwi, którym dostaje się do szpiku kostnego.
Tam następuje oddziaływanie erytropoetyny z ko¬
mórkami prekursorowymi krwinek czerwonych
za pośrednictwem swoistego receptora. Receptor
ten jest białkiem przezbłonowym, zbudowanym
z dwóch podjednostek i wielu domen. Nie jest
kinazą tyrozynową, ale pobudza aktywność ki¬
naz biorących udział w wewnątrzkomórkowym
przekazywaniu sygnału. Erytropoetyna działa
na komórkę prekursorową krwinek czerwonych,
znaną jako jednostka erytroidalna rozrastająca
się (ang. burst forming unit - erythroid; BFU-E),
powodując jej proliferację i różnicowanie. Dodat¬
kowo, erytropoetyna działa na dalszy prekursor
erytrocytów, znany jako jednostka erytroidalna
tworząca kolonie (colony forming unit - erythro-
744 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Mulitpotencjalna
komórka pnia
Interleukiny Interleukiny
GM-CSF GM-CSF, Epo Komórki
CFU-GEMM ► BFU-E ► prekursorowe
(wczesny erytrocytu
lub późny)
Dojrzale
erytrocyty
Ryc. 51-1. Znacznie uproszczony schemat różnicowania się komórek pnia do erytrocytów. Różne interleuki¬
ny (IL), takie jak IL-3, IL-4, IL-9 i IL-11, biorą udział w poszczególnych etapach całego procesu. Do komórek
prekursorowych erytrocytu zalicza się: proerytroblasty, zasadowe, polichromatofilne i ortochromatofilne
erytroblasty i retikulocyty. Erytropoetyna (Epo) działa na zasadowe erytroblasty, ale nie na późniejsze stadia
komórek prekursorowych erytrocytu. CFU-GEMM - colony-forming unit whose cells give rise to granulo-
cytes, erythrocytes, macrophages and megakaryocytes; jednostka tworząca kolonie, z których powstają
granulocyty, erytrocyty, makrofagi i megakariocyty; BFU-E - burst forming unit-erythroid; GM-CSF - granu-
locyte-macrophage colony-stimulating factor; Epo - erytropoetyna.
id; CFU-E), także powodując jego proliferację
i różnicowanie się. Do tego działania erytropoe¬
tyna wymaga współdziałania z innymi czynnika¬
mi (np. interleukina-3 i insulinopodobny czynnik
wzrostu; ryc. 51-1).
Uzyskanie cDNA dla erytropoetyny umożli¬
wiło produkcję znacznych ilości tego hormonu
i wykorzystanie go do badań i celów leczniczych.
Uprzednio wyodrębniono jedynie bardzo małe
ilości tego białka z moczu. Głównym zastosowa¬
niem rekombinowanej erytropoetyny (rEpo)
jest leczenie niektórych rodzajów niedokrwisto¬
ści, takich jak niedokrwistość spowodowana nie¬
wydolnością nerek.
WIELE CZYNNIKÓW WZROSTU REGULUJE
WYTWARZANIE LEUKOCYTÓW
W ostatnich latach wykryto, poza erytropoetyną,
wiele hemopoetycznych czynników wzrostu.
Badania te rozszerzyły wiedzę o różnicowaniu się
komórek krwi, dostarczyły czynników, które mogą
być użyteczne w leczeniu i pomagają zrozumieć
nieprawidłowy wzrost komórek krwi (np. w bia¬
łaczkach). Podobnie jak erytropoetyna, większość
wyodrębnionych czynników jest glikoproteina-
mi. Są one bardzo aktywne in vivo oraz in vitro,
oddziałują z komórkami docelowymi poprzez
swoiste receptory błony komórkowej oraz układ
wewnątrzkomórkowego przenoszenia sygnału
receptorowego, zmieniając ekspresję genów. Do¬
celowe działanie na ekspresję genową powoduje
różnicowanie się komórek. Wiele z nich uzyskano
w wyniku klonowania, co pozwoliło na ich pro¬
dukcję w dość dużych ilościach. Dwa z tych czyn¬
ników są szczególnie interesujące: czynnik pobu¬
dzający tworzenie kolonii granulocytów (ang.
granulocyte colony-stimulating factor; G-CSF)
i czynnik pobudzający tworzenie kolonii gra-
nulocytowo-makrofagowych (ang. granulocyte-
-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF).
G-CSF jest względnie swoistym czynnikiem
działającym na granulocyty obojętnochłonne.
GM-CSF działa na różne komórki progenitorowe
i pobudza granulocyty obojętnochłonne, makro¬
fagi i granulocyty kwasochłonne. Zmniejszone
wytwarzanie granulocytów obojętnochłonnych
określa się jako neutropenię. Występuje ona
szczególnie często u pacjentów leczonych che-
mioterapeutykami lub u osób po przeszczepie
szpiku. U takich pacjentów mogą występować
niebezpieczne zakażenia. G-CSF podaje się takim
chorym w celu stymulacji wytwarzania granulo¬
cytów obojętnochłonnych.
ERYTROCYT MA WYJĄTKOWY, ALE
WZGLĘDNIE PROSTY METABOLIZM
W tabeli 51-2 przedstawiono różne aspekty me¬
tabolizmu erytrocytu, z których wiele omówio¬
no w innych rozdziałach.
Erytrocyt ma w błonie komórkowej układ
przenoszący glukozę
Stopień wnikania glukozy do erytrocytów jest
znacznie większy niż wynikałoby to z prostej dy¬
fuzji. Jest to raczej układ dyfuzji ułatwionej (p.
rozdz. 40). Swoiste białko biorące udział w tym
procesie jest nazywane przenośnikiem glukozy
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 745
Tabela 51-2. Zestawienie ważnych aspektów metabolizmu ery¬
trocytu
• Erytrocyt pozostaje w silnej zależności od glukozy jako źródła
energii; błona komórkowa erytrocytów zawiera białka transpor¬
tujące glukozę o dużym powinowactwie do glukozy.
• Glikoliza, w wyniku której powstają mleczany, jest źródłem po¬
wstawania ATR
• ATP nie powstaje w wyniku fosforylacji oksydacyjnej, ponieważ
erytrocyt nie ma mitochondriów.
• Erytrocyt ma zespół układów transportujących, co pozwala mu
utrzymywać równowagę wodno-elektrolitową.
• Wytwarzanie 2,3-bisfosfoglicerynianu w reakcjach ściśle zwią¬
zanych z glikolizą jest ważnym czynnikiem regulującym zdol¬
ność Hb do przenoszenia tlenu.
• W erytrocycie zachodzą przemiany cyklu pentozo-fosforano-
wego (ok. 5-10% ogólnej ilości wchłoniętej glukozy jest w ten
sposób metabolizowane), który wytwarza NADPH. Częstą cho¬
robą jest niedokrwistość hemolityczna wywołana niedoborem
aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej.
• W metabolizmie erytrocytu istotną rolę odgrywa zredukowany
glutation (GSH), częściowo przeciwdziałający aktywności po¬
tencjalnie toksycznych nadtlenków. Erytrocyt może wytwarzać
GSH przez redukfcję utlenionego glutationu (GSSG), przy czym
proces ten wymaga NADPH.
• Żelazo w Hb musi pozostawać w postaci żelaza(ll); jony
żelaza(lll) są redukowane do jonów żelaza(ll) w wyniku dzia¬
łania zależnego od NADH układu reduktazy methemoglobiny
zawierającego reduktazę cytochromu b5 i cytochrom b5.
• Wytwarzanie glikogenu, kwasów tłuszczowych, białek i kwa¬
sów nukleinowych nie zachodzi w erytrocycie, choć niektóre
lipidy (np. cholesterol) obecne w błonie komórkowej erytrocytu
mogą ulegać wymianie z analogicznymi lipidami osocza.
• Erytrocyt zawiera niektóre enzymy metabolizmu nukleotydów
(np. deaminazę adenozynową, nukleotydazę pirymidynową
i kinazę adenylanową); niedobór tych enzymów może być przy¬
czyną niektórych postaci niedokrwistości hemolitycznej.
• Kiedy erytrocyt kończy swoje życie, globina jest rozkładana do
aminokwasów, które są powtórnie zużywane przez organizm,
żelazo zostaje uwolnione z hemu i powtórnie zużytkowane,
a składowe czteropirolowe hemu ulegają przekształceniu w bi¬
lirubinę, która jest wydalana głównie przez jelita za pośredni¬
ctwem żółci.
(GLUT1) lub permeazą glukozową. Niektóre jej
właściwości zestawiono w tab. 51-3. Proces wni¬
kania glukozy do erytrocytów jest szczególnie
ważny, ponieważ stanowi główne źródło energii
dla tych komórek. Z tkanek ludzkich wyodręb¬
niono 12 odmiennych, chociaż zbliżonych do
siebie, rodzajów białek przenoszących glukozę.
W przeciwieństwie do przenośnika glukozy z ery¬
trocytów, niektóre z nich wykazują zależność od
insuliny (np. białka obecne w mięśniach i tkan¬
ce tłuszczowej). Zwłaszcza te ostatnie budzą
duże zainteresowanie, ponieważ upośledzenie
przemieszczania tych przenośników ze skupisk
wewnątrzkomórkowych do błony komórkowej
komórek mięśni szkieletowych może tłumaczyć
mechanizm oporności na insulinę, stwierdzany
u chorych z cukrzycą typu 2.
Tabela 51-3. Niektóre właściwości przenośnika glukozy zawarte¬
go w błonie komórkowej erytrocytów (GLUT1)
• Stanowi ok. 2% białek błony komórkowej erytrocytu.
• Cechuje się swoistością w stosunku do glukozy i D-heksoz
(L-heksozy nie są przenoszone).
• Przy fizjologicznym stężeniu glukozy we krwi (ok. 5 mmol/L)
przenośnik pracuje z wydajnością ok. 75% jego Vmax; może ule¬
gać wysyceniu i może być hamowany przez niektóre analogi
strukturalne glukozy.
• Dotychczas wyodrębniono przynajmniej 12 różnych przenośni¬
ków glukozy obecnych w tkankach ssaków; białko erytrocytów
jest jednym z nich.
• Białko to nie jest zależne od insuliny, w przeciwieństwie do
analogicznych przenośników występujących w mięśniach lub
tkance tłuszczowej.
• Ustalono pełny skład aminokwasowy (492 reszt aminokwaso-
wych) przenośnika.
• Przenośnik umieszczony w sztucznych liposomach ma zacho¬
waną zdolność przenoszenia glukozy.
• Szacuje się, że zawiera on 12 przezbłonowych fragmentów
o budowie helikalnej.
• Działanie przenośnika polega na wytwarzaniu bramkowanych
kanałów w błonie komórkowej, które umożliwiają przemiesz¬
czanie się glukozy; kanały zależą konformacyjnie od obecności
glukozy i mogą się szybko zmieniać (ok. 900 razy na sekundę).
W retikulocytach zachodzi synteza biatek
Dojrzały erytrocyt nie ma zdolności syntezy białek.
Czynne w tym procesie są natomiast retikulocy-
ty. Po dostaniu się do krążenia, tracą one organelle
wewnątrzkomórkowe (rybosomy, mitochondria
itp.) i w ciągu 24 godzin, stając się młodymi erytro¬
cytami, tracą zdolność do syntezy białek. Wyciąg
z retikulocytów królika (uzyskanych po podaniu
zwierzęciu fenylohydrazyny, która powoduje ci꿬
ką niedokrwistość hemolityczną, co prowadzi do
prawie całkowitego zastąpienia erytrocytów przez
retikulocyty), jest powszechnie używany jako
układ syntezy białek in vitro. Endogenny mRNA,
obecny w retikulocytach, zostaje rozłożony za po-
746 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
mocą nukleazy, której aktywność można później
zahamować przez dodanie jonów wapnia. Układ
ten następnie jest programowany przez dodanie
oczyszczonego mRNA lub wyciągu z całych komó¬
rek zawierającego mRNA, a radioaktywne białka
są syntetyzowane w obecności 35S-L-metioniny lub
innych aminokwasów znakowanych izotopami ra¬
dioaktywnymi. Wytwarzane w tym układzie białka
radioaktywne są rozdzielane za pomocą elektrofo¬
rezy SDS-PAGE i wykrywane autoradiograficznie.
Dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza
i glutation chronią erytrocyty przed
obciążeniem i uszkodzeniem tlenowym
W trakcie przemian zarówno w komórkach krwi,
jak i w większości innych tkanek powstaje wiele
silnych utleniaczy. Należą do nich anion ponad-
tlenkowy O*, nadtlenek wodoru (H202), rodni¬
ki nadtlenkowe (ROO*) i rodnik hydroksylowy
(OH*). Są one nazywane czynnymi postaciami
tlenu (ang. reactive oxygen species; ROS). Wol¬
ne rodniki to atomy lub grupy atomów posiada¬
jące niesparowane elektrony (p. rozdz. 15). OH*
jest cząsteczką szczególnie czynną, która może
reagować z białkami, kwasami nukleinowymi,
lipidami i innymi związkami, zmieniając ich bu¬
dowę i powodując uszkodzenie tkanek. Reakcje
wymienione w tab. 51-4 odgrywają istotną rolę
w wytwarzaniu utleniaczy i ich rozmieszczaniu.
Są one kolejno omówione poniżej.
Ponadtlenki (reakcja 1) są wytwarzane w ery¬
trocytach w wyniku autooksydacji hemoglobi¬
ny do methemoglobiny (ok. 3% Hb w ludzkich
erytrocytach ulega autooksydacji w ciągu doby).
W pozostałych tkankach są one wytwarzane w wy¬
niku działania takich enzymów, jak reduktaza
cytochromu P-450 i oksydaza ksantynowa. Gra-
nulocyty obojętnochlonne pobudzone wskutek
kontaktu z bakteriami ulegają eksplozji oddecho¬
wej (p. niżej) i wytwarzają ponadtlenki w reakcji
katalizowanej przez oksydazę NADPH (reakcja
2). Ponadtlenek samoistnie ulega przekształceniu
w H202 i 02, przy czym reakcja ta może zostać
bardzo przyspieszona w wyniku działania enzymu
dysmutazy ponadtlenkowej (reakcja 3). Nadtle¬
nek wodoru ulega dalszym przemianom. Enzym
katalaza, występujący w wielu rodzajach komó¬
rek, katalizuje rozpad nadtlenku wodoru do H20
i 02 (reakcja 4). Granulocyty obojętnochłonne za¬
wierają wyjątkowy enzym - mieloperoksydazę,
dzięki której z H202 i halogenków powstają kwa¬
sy halogenowe(l) (reakcja 5). To zagadnienie zo¬
stanie omówione dalej. Zawierający selen enzym
peroksydaza glutationowa (p. rozdz. 21) może
również działać na zredukowany glutation (GSH)
i H202, w wyniku czego powstaje utleniony glu¬
tation (GSSG) i H20 (reakcja 6). Wspomniany
enzym może wykorzystywać także nadtlenki jako
substraty. OH* i OH mogą powstawać w nieen-
zymatycznej reakcji z H202, katalizowanej przez
jony Fe2+ (reakcja Fentona, reakcja 7). 02 i H202
są substratami w katalizowanej przez żelazo re¬
akcji Habera i Weissa (reakcja 8), w wyniku
której również powstają OH* i OH . Ponadtlenek
może uwalniać jony żelaza(lll) z ferrytyny. Wy-
Tabela 51-4. Reakcje przyczyniające się do obciążenia tlenowego komórek krwi i tkanek
1. Powstawanie ponadtlenków (jako produktów ubocznych różnych reakcji)
02 + e —► 02
2. Reakcja z udziałem NADPH-oksydazy
202 4- NADPH -> 20i 4- NADP+H+
3. Reakcja z udziałem dysmutazy ponadtlenkowej
O2 4* O2 4- 2H+ —► H2O2 4- O2
4. Reakcja z udziałem katalazy
2H2O2-2H2O + O2
5. Reakcja z udziałem mieloperoksydazy
H2O2 4- X~ 4- H+ —► H0X 4- H20 (X“ = CI-, Br, SCN')
6. Reakcja z udziałem peroksydazy glutationowej (zależna od selenu)
2GSH 4- R-O-OH -> GSSG 4- H20 4- ROH
7. Reakcja Fentona
Fe2+ + H20 - Fe3+ 4- OH' 4- 0H~
8. Katalizowana przez żelazo reakcja Habera i Weissa
02t 4-H202 ->02 + 0H' + 0H-
9. Reakcja z udziałem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD)
G-6-P 4- NADP -> 6-fosfoglukonian 4- NADPH 4- H+
10. Reakcja z udziałem reduktazy glutationowej
GSSG 4- NADPH 4- H+ -> 2GSH 4- NADP
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 747
twarzanie OH* może być jednym z mechanizmów
uszkadzających tkanki w stanach nadmiaru żelaza
(np. w hemochromatozie, rozdz. 49).
Związki i reakcje chemiczne mogące uwalniać
toksyczne postacie tlenu są określane jako pro-
utlcniaczc, natomiast związki i reakcje chemicz¬
ne usuwające te postacie tlenu, „zmiatające” je,
zmniejszające ich tworzenie lub przeciwdziałają¬
ce ich działaniu - jako przeciwutleniacze (anty-
oksydanty). Zalicza się do nich takie związki che¬
miczne, jak NADPH, GSH, kwas askorbinowy
i witaminę E. W prawidłowej komórce występuje
równowaga między proutleniaczami i przeciwu-
tleniaczami, która może być zaburzona na korzyść
proutleniaczy, jeśli powstawanie toksycznych po¬
staci tlenu znacznie się zwiększy (np. po wpro¬
wadzeniu niektórych związków chemicznych lub
leków), lub jeśli zawartość przeciwutleniaczy
znacznie się zmniejszy (np. po unieczynnieniu
enzymów biorących udział w usuwaniu toksycz¬
nych postaci tlenu lub w warunkach zmniejszonej
zawartości wymienionych przeciwutleniaczy).
Stan taki nazywa się obciążeniem (stresem) tle¬
nowym i jeżeli jest on nasilony lub trwa dłużej,
może być przyczyną poważnych uszkodzeń ko¬
mórki.
ROS są obecnie uważane za ważny czynnik po¬
wodujący uszkodzenie komórek (np. w wyniku
podawania różnych trujących substancji chemicz¬
nych lub niedokrwienia), niekiedy prowadzący
do śmierci komórki. Pośrednim dowodem takie¬
go działania tlenu jest ochronne oddziaływanie
dysmutazy ponadtlenkowej lub katalazy zapo¬
biegające uszkodzeniu komórek w stanach wyżej
opisanych.
Niedobór dehydrogenazy
glukozo-6-fosforanowej jest częsta
w niektórych regionach świata i ważna
przyczyna niedokrwistości hemolitycznej
NADPH, który powstaje w cyklu pentozowo-
-fosforanowym (rozdz. 21) w reakcji katalizowa¬
nej przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową
(tab. 51-4, reakcja 9), enzym, którego synteza
dziedziczy się w sprzężeniu z chromosomem X,
odgrywa główną rolę w utrzymaniu równowagi
czynników redukujących w erytrocytach i innych
komórkach, takich jak hepatocyty. Ponieważ cykl
pentozowo-fosforanowy jest wyłącznym szlakiem
powstawania NADPH, erytrocyt jest bardzo po¬
datny na uszkodzenia wywołane przez utleniacze,
jeżeli dochodzi do upośledzenia tego cyklu (np.
w wyniku niedoboru enzymów). Jedną z funkcji
NADPH jest redukowanie GSSG do GSH. Reak¬
cja jest katalizowana przez reduktazę glutationo-
wą (reakcja 10).
Niedobór aktywności dehydrogenazy gluko-
zo-6-fosforanowej w wyniku mutacji jest bardzo
częsty w niektórych częściach świata (np. w Afry¬
ce równikowej, okolicach Morza Śródziemnego,
niektórych częściach Azji, u Murzynów w Ame¬
ryce Północnej). Jest on najczęściej spotykaną
enzymopatią, czyli chorobą spowodowaną przez
zmiany enzymów. Wykazano ponad 300 gene¬
tycznie uwarunkowanych odmian wspomnianego
enzymu. Obecność nieprawidłowych odmian de¬
hydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stwierdza
się co najmniej u 100 min osób. Powoduje to cho¬
robę określaną jako niedokrwistość hemolitycz-
na. Spożywanie bobu (Vicia faba) przez osoby
z niedoborem aktywnego enzymu powoduje wy¬
stąpienie napadów niedokrwistości hemolitycznej
(najprawdopodobniej dlatego, że bób zawiera
silne utleniacze). Ponadto liczne leki (np. prze-
ciwzimniczy lek primachina - Primaąuine) (tzw.
niedokrwistość hemolityczna uwarunkowana
primachiną) lub sulfonamidy oraz inne czyn¬
niki chemiczne (np. naftalen) mogą wywoływać
napady, ponieważ ich zażycie powoduje wytwa¬
rzanie H202 lub O*. W warunkach prawidłowych
H202 jest rozkładany przez katalazę i peroksydazę
glutationową (tab. 51-4, reakcje 4 i 6). Ostatnia
z tych reakcji prowadzi do powstania GSSG. GSH
jest regenerowany z GSSG w wyniku działania
enzymu reduktazy glutationowej, której działa¬
nie zależy od dostępności NADPH (reakcja 10).
Krwinki czerwone osób, u których występuje
niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-
-fosforanowej, nie mogą wytwarzać dostatecz¬
nych ilości NADPH do regeneracji GSH z GSSG.
To z kolei upośledza zdolność krwinek do unie-
czynniania H202 i rodników tlenowych. Związki
te mogą powodować utlenianie krytycznych grup
SH w białkach i prawdopodobnie powodować
peroksydację lipidów błony krwinki czerwonej,
co prowadzi do lizy krwinek. Utlenienie niektó¬
rych grup SH w hemoglobinie powoduje wytrą¬
canie się tego białka wewnątrz erytrocytów i two¬
rzenie się ciałek Heinza, które stwierdza się po
748 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
wybarwieniu na purpurowo za pomocą fioletu
krezylowego. Ciałka Heinza wskazują, że ery¬
trocyty znajdują się w stanie obciążenia (stresu)
tlenowego. Na rycinie 51-2 zestawiono łańcuch
przyczynowy zaburzeń występujących u chorych
na niedokrwistość hemolityczną wywołaną niedo¬
borem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej.
Ryc. 51-2. Zestawienie zjawisk prawdopodobnie powodujących
niedokrwistość hemolityczną w wyniku niedoboru aktywności
dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD) (MIM 305900).
Methemoglobina nie bierze udziału
w przenoszeniu tlenu
Jony żelaza(II) z hemoglobiny są podatne na utle¬
nienie przez ponadtlenki i inne utleniacze, w wy¬
niku czego powstaje methemoglobina, która nie
ma zdolności przenoszenia tlenu. W warunkach
prawidłowych tylko bardzo mała ilość methe¬
moglobiny znajduje się we krwi, ponieważ ery¬
trocyt ma skuteczny układ redukujący jony Fe3+
do Fe2+ (układ reduktazy NADH-cytochrom b5
methemoglobina). Układ ten składa się z NADH
(wytwarzanego w procesie glikolizy), flawopro-
teiny nazwanej reduktazą cytochromu b5 (zwanej
także reduktazą methemoglobiny) i cytochromu
b5. Jony Fe3+ methemoglobiny są redukowane do
Fe2+ w wyniku działania zredukowanego cyto¬
chromu b5:
Hb—Fe3+ + Cytb5red. - Hb-Fe2+ + Cytb5u«.
Zredukowany cytochrom b5 jest następnie re¬
generowany w wyniku działania reduktazy cyto¬
chromu b5:
Cytb5ufl. + NADH -+ Cytb5red. + NAD
Methemoglobinemia może być wrodzona
lub nabyta
Methemoglobinemię można podzielić na wro¬
dzoną i nabytą. Ta ostatnia jest spowodowa¬
na zażywaniem różnych leków lub związków
chemicznych. Żaden z rodzajów methemoglo-
binemii nie występuje często, ale lekarz powi¬
nien być świadomy możliwości pojawienia się
jej. Wrodzona methemoglobinemia zwykle jest
wynikiem niedoboru aktywności reduktazy
methemoglobinowej, co jest przekazywane jako
cecha autosomalna recesywna. Niektóre rodza¬
je nieprawidłowych hemoglobin (HbM) mogą
stanowić rzadką przyczynę methemoglobinemii.
W HbM mutacje prowadzą do zmian w składzie
reszt aminokwasowych biorących udział w łą¬
czeniu się z hemem, co zmienia powinowactwo
hemoglobiny do tlenu i ułatwia proces utleniania.
Zażycie określonych leków (np. sulfonamidów)
lub substancji chemicznych (np. aniliny) może
stanowić przyczynę nabytej methemoglobinemii.
Sinica (niebieskosine zabarwienie skóry i błon
śluzowych spowodowane zwiększeniem zawar¬
tości nieutlenowanej hemoglobiny we krwi tętni¬
czej lub w omawianym przypadku zwiększeniem
zawartości methemoglobiny we krwi) jest zwykle
dominującym objawem, przy czym jest ona wy¬
raźna, jeżeli ponad 10% hemoglobiny występuje
w postaci methemoglobiny. Rozpoznanie opie¬
ra się na spektroskopowym badaniu krwi, które
uwidacznia typowe widmo absorpcyjne methe¬
moglobiny. Dodatkowo, próbki krwi zawierającej
methemoglobinę nie mogą być w pełni utlenowa-
ne przez przepuszczany przez nie tlen, w przeci¬
wieństwie do nieutlenowanej prawidłowej krwi.
Obecność nieprawidłowej hemoglobiny można
wykazać za pomocą elektroforezy. W leczeniu
lekkich postaci methemoglobinemii wywołanych
niedoborem enzymu stosuje się błękit metyleno¬
wy lub kwas askorbinowy (czynniki redukują¬
ce). Ostra, masywna methemoglobinemia (wywo-
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 749
łana spożyciem związków chemicznych) powinna
być leczona błękitem metylenowym podawanym
dożylnie.
0 BŁONIE KOMÓRKOWEJ LUDZKICH
ERYTROCYTÓW WIADOMO WIĘCEJ
NIŻ 0 BŁONIE ZEWNĘTRZNEJ INNYCH
KOMÓREK ORGANIZMU CZŁOWIEKA
Do badania błony komórkowej erytrocytów sto¬
suje się różne metody biochemiczne. Należy do
nich rozdział białek błony za pomocą elektro¬
forezy SDS-PAGE z zastosowaniem swoistych
enzymów (proteinazy, glikozydazy i in.) w celu
zlokalizowania białek i glikoprotein w błonach,
a także różne techniki badania zawartości i roz¬
mieszczenia poszczególnych lipidów. Stosuje się
także techniki morfologiczne (np. mikroskopię
elektronową, mikroskopię elektronową mroże-
niowego przełomu struktur biologicznych - ang.
freeze-fracture electron microscopy) oraz inne
metody (np. użycie przeciwciał skierowanych
przeciwko określonym składnikom). Rozpad ery¬
trocytów w określonych warunkach prowadzi do
Tabela 51-5. Charakterystyka biochemiczna błony komórkowej
erytrocytów
• Błona jest dwuwarstwowa i składa się w 50% z lipidów i w 50%
z białek.
• Główną grupę lipidów stanowią fosfolipidy i cholesterol; główny¬
mi fosfolipidami są fosfatydylocholina (PC), fosfatydyloetanolo-
amina (PE) i fosfatydyloseryna (PS) oraz sfingomielina (Sph).
• Fosfolipidy zawierające cholinę: PC i Sph przeważają w ze¬
wnętrznej warstwie błony, a fosfolipidy zawierające aminokwa¬
sy (PE i PS) w wewnętrznej warstwie błony.
• Glikosfingolipidy (GSLs) (obojętne GSLs, gangliozydy i związki
złożone, w tym związki grupowe krwi ABO) stanowią 5-10%
wszystkich lipidów.
• Rozdział za pomocą SDS-PAGE elektroforezy wykazuje, że bło¬
na zawiera ok. 10 głównych białek i ponad 100 białek o mniej¬
szym znaczeniu.
• Główne białka błony (w tym spektryna, ankiryna, białko wymia¬
ny anionów, aktyna i białko 4.1) zostały intensywnie zbadane;
ustalono ich rozmieszczenie (integralne lub peryferyjne białko),
budowę oraz funkcję.
• Wiele spośród białek błony to glikoproteiny (np. glikoferyny)
zawierające łańcuchy oligosacharydowe związane za pomocą
O- i(lub) N-wiązania i umieszczone na zewnętrznej powierzchni
błony.
powstania cieni krwinek o naturalnym układzie
błony komórkowej. Zmiana warunków lizy po¬
woduje powstanie cieni krwinek, których cytozo-
lowa strona błony jest umieszczona na zewnątrz
(odwrócone cienie krwinek). Oba rodzaje cieni są
przydatne w analizie rozmieszczenia swoistych
białek i lipidów błony komórkowej. W ostatnich
latach otrzymano cDNA dla wielu białek błony,
co pozwoliło na określenie ich składu amino-
kwasowego i budowy. W sumie, znacznie więcej
wiadomo o błonie komórkowej erytrocytów niż
o jakiejkolwiek błonie innych komórek organi¬
zmu człowieka (tab. 51-5).
Za pomocą SDS-PAGE rozdziela sio białka
błony erytrocytów
Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE pozwala
na wyodrębnienie ok. 10 głównych białek wystę¬
pujących w błonie erytrocytów (ryc. 51-3). Wiele
Glikoforyny
l i
Barwienie błękitem
Coomassie
Barwienie
metodą PAS
Ryc. 51-3. Diagram ukazujący główne białka błony ludzkich
krwinek czerwonych po rozdziale za pomocą SDS-PAGE. Białka
wybarwiające się błękitem Coomassie przedstawiają dwa lewe
słupki, prawy słupek przedstawia białka wybarwiające się kwa¬
sem jodowym(VII) i odczynnikiem Schiffa. (Rycina reproduko¬
wana za zgodą z: Beck WS, Tepper Rl: Hemolytic anemias III:
membranę disorders. W: Beck WS (red.): Hematology. The MIT
Press 1991, wyd. 5).
750 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
z nich okazało się glikoproteinami. Białka okre¬
śla się zgodnie z szybkością migracji elektrofo-
retycznej, a najwolniej przesuwające się (a więc
białko o największej masie cząsteczkowej) zosta¬
ło nazwane białkiem pasma 1 lub spektryną. Wy¬
odrębniono wszystkie główne białka, większość
z nich została zidentyfikowana, a także lepiej po¬
znano ich czynności biologiczne (tab. 51-6). Usta¬
lono również skład aminokwasowy i sekwencję
wielu białek. Poza tym rozpoznano, które z białek
są integralnymi, a które peryferyjnymi białkami
błony komórkowej, które białka znajdują się na
zewnętrznej powierzchni, a które są umiejscowio¬
ne na powierzchni cytoplazmatycznej lub zajmują
całą szerokość błony (ryc. 51 -4). Za pomocą czu-
Tabela 51-6. Główne białka błony komórkowej erytrocytu1
Numer
pasma2
Białko
Białko
integralne (I)
lub
peryferyjne (P)
Przybliżona
masa
cząsteczkowa,
kDa
1
Spektryną (a)
P
240
2
Spektryną (p)
P
220
2,1
Ankiryna
P
210
2,2
Ankiryna
P
195
2,3
Ankiryna
P
175
2,6
Ankiryna
P
145
3
Białko wymiany
anionów
I
100
4,1
Nienazwane
P
80
5
Aktyna
P
43
6
Dehydrogenaza
gliceraldehydo-
-3-fosforanowa
P
35
7
Tropomiozyna
P
~29
8
Nienazwane
P
23
Glikoforyny A, B, C
I
31,23
28
1 Dane zaadaptowane z pracy: Lux SE, Becker PS: Disorders of
the red celi membranę skeleton: hereditary spherocytosis and
hereditary elliptocytosis. Rozdział 95 w: The Metabolic Basis of
Inherited Disease, Scriver CR i in. (red.), wyd. 6, McGraw-Hill,
1989.
2 Numer pasma odnosi się do szybkości migracji w elektroforezie
SDS-PAGE (p. ryc. 51-3). Glikoforyny są wykrywane za pomocą
barwienia metodą PAS (kwas jodowy(VII) - odczynnik Schiffa).
Wiele innych składników (np. 4.2 i 4.9) pominięto w tabeli. Na-
tywna spektryną ma budowę a2p2.
ODDZIAŁYWANIE ODDZIAŁYWANIE
SPEKTRYNY Z ANKIRYNĄ AKTYNY I SPEKTRYNY
I BIAŁKIEM 3 Z BIAŁKIEM 4,1
POŁĄCZENIE
CZĄSTECZEK
SPEKTRYNY
Ryc. 51-4. Diagram ukazujący oddziaływania białek cytoszkieletu
między sobą i z innymi integralnymi białkami błony erytrocytu.
(Rycina reprodukowana za zgodą z: Beck WS, Tepper Rl: Hemo-
lytic anemias III: membranę disorders. W: Beck WS (red.): Hema-
tology. The MIT Press 1991, wyd. 5).
łych metod barwienia lub dwukierunkowej elek¬
troforezy w błonie erytrocytów można zidentyfi¬
kować wiele mniej ważnych składników. Jednym
z tych składników jest opisane uprzednio białko
przenoszące glukozę.
Głównymi integralnymi biatkami
błony komórkowej są białka
wymiany anionów i glikoforyny
Białko wymiany anionów (pasmo 3) jest przez-
błonową glikoproteiną, której C-koniec znajduje
się na zewnętrznej powierzchni błony, a N-koniec
na powierzchni cytoplazmatycznej błony. Jest
ono przykładem wielokrotnie przezbłonowego
(ang. multipass) białka, które przenika całą gru¬
bość błony co najmniej 10 razy. Występuje ono
prawdopodobnie w postaci dimeru, który tworzy
kanał pozwalający na przemieszczenie i wymianę
chlorków na wodorowęglany. Ditlenek węgla wy¬
twarzany w tkankach wnika do erytrocytów w po¬
staci wodorowęglanów, które ulegają wymianie
na chlorki w płucach, gdzie ditlenek węgla jest
wydalany z powietrzem wydychanym. N-Koniec
białka wiąże wiele innych białek, w tym hemo¬
globinę, białka 4.1 i 4.2, ankirynę i wiele enzy¬
mów glikolitycznych. Wykazano, że oczyszczone
białko pasma 3, dodane do pęcherzyków lipido¬
wych in vitro, spełnia swoją funkcję transportową
w tym zrekonstruowanym układzie.
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 751
Glikoforyny A, B i C również są białkami
przezbłonowymi, ale rozciągają się między po¬
wierzchniami błony tylko raz (białka jednokrot¬
nie przezbłonowe, ang. single-pass). Główną
glikoforyną jest glikoforyna A; zbudowana jest
ze 131 reszt aminokwasowych i jest silnie gli-
kozylowana (ok. 60% całej masy cząsteczkowej
przypada na węglowodany). Jej A-koniec zawiera
16 łańcuchów oligosacharydowych (15 z nich to
O-glikany), które są wystawione na zewnątrz, po¬
nad powierzchnię erytrocytu. W tym białku jest
zawartych ok. 90% kwasów sialowych błony ery¬
trocytów. Odcinek śródbłonowy białka (23 reszty
aminokwasowe) ma strukturę helisy a. Odcinek
C-końcowy sięga cytoplazmy i wiąże białko 4.1,
które z kolei wiąże spektrynę. Polimorfizm oma¬
wianego białka leży u podstaw systemu grup krwi
MN (p. dalej). Glikoforyna A zawiera miejsca
wiążące wirusy grypy oraz zarodźce sierpowate
(Plasmodium falciparum) - pasożyty wywołujące
zimnicę. Co ciekawe, brak glikoforyny A nie wy¬
daje się zaburzać czynności erytrocytów.
Spektryna, ankiryna i inne peryferyjne
białka błony wspomagają utrzymanie
kształtu i elastyczności erytrocytu
Erytrocyt musi mieć zdolność do przeciskania się
przez wąskie obszary mikrokrążenia podczas nie¬
zliczonych przemieszczeń w całym organizmie;
szczególnie istotnym w tym aspekcie miejscem są
naczynia zatokowe śledziony. Aby erytrocyt mógł
łatwo i odwracalnie zmieniać swój kształt, jego
błona komórkowa musi być płynna i elastyczna;
musi także zachowywać kształt dwuwklęsły, po¬
nieważ to ułatwia wymianę gazową. Lipidy błony
komórkowej pozwalają na zachowanie płynności
błony. Do wewnętrznej strony błony komórkowej
erytrocytu są przyczepione liczne peryferyjne
białka cytoszkieletu (tab. 51-6), które odgrywają
ważną rolę w utrzymywaniu kształtu dwuwklęsłe-
go i elastyczności krwinki. Zostaną one poniżej
omówione.
Spektryna jest głównym białkiem cytoszkiele¬
tu. Składa się ona z dwóch polipeptydów: spek-
tryny 1 (czyli łańcucha a) i spektryny 2 (łańcucha
P). Łańcuchy te, mierzące ok. 100 nm długości, są
ułożone nierównolegle i są luźno ze sobą skręco¬
ne, tworząc dimer. Obydwa łańcuchy są zbudo¬
wane ze 106 reszt aminokwasowych skręconych
w postaci a-helisy i są połączone fragmentami
niehelisowymi. Dimer spektryny łączy się z in¬
nym dimerem spektryny, tworząc uporządkowany
liniowy tetramer. Ogólny kształt białka nadaje mu
elastyczność, co z kolei udziela się całej błonie
krwinki. W spektrynie zidentyfikowano co naj¬
mniej cztery miejsca wiążące: 1) dla wzajemnego
połączenia, 2) dla ankiryny (pasmo 2.1 itp.), 3) dla
aktyny (pasmo 5) i 4) dla białka 4.1.
Ankiryna jest białkiem o kształcie piramidy,
które wiąże spektrynę, z kolei ankiryna ściśle łą¬
czy się z pasmem 3, zabezpieczając w ten sposób
związanie spektryny z błoną komórkową. Anki¬
ryna jest wrażliwa na działanie proteolityczne, co
jest powodem powstawania pasm 2.2, 2.3 i 2.6,
które pochodzą z pasma 2.1.
Aktyna (pasmo 5) występuje w erytrocytach
w postaci krótkich, podwójnych helikalnych seg¬
mentów F-aktyny. Końcowy odcinek spektryny
wiąże się z aktyną. Aktyna wiąże się także z biał¬
kiem 4.1.
Białko 4.1 jest białkiem globulamym, ściśle
związanym z końcowym odcinkiem spektryny
w pobliżu miejsca, w którym spektryna wiąże
aktynę. Białko 4.1 jest więc częścią trzyskładni-
kowego zespołu: białko 4.1-spektryna-aktyna.
Białko 4.1 wiąże się również z integralnymi biał¬
kami: glikoforyną A i C, które tym sposobem są
także włączone do wspomnianego zespołu białek.
Co więcej, białko 4.1 może oddziaływać z niektó¬
rymi fosfolipidami błony i w ten sposób dochodzi
do połączenia dwuwarstwowej błony lipidowej
z cytoszkieletem.
Niektóre inne białka (4.9, adducyna, tropomiozy-
na) także wchodzą w skład struktur cytoszkieletu.
Zaburzenia ilości i struktury
spektryny sa przyczyna dziedzicznej
sferocytozy i eliptocytozy
Dziedziczna sferocytoza (HS) jest genetycznie
uwarunkowaną chorobą, przenoszoną jako cecha
autosomalna dominująca. Dotyczy ona ok. 1 na
5000 mieszkańców Ameryki Północnej. Choroba
charakteryzuje się występowaniem we krwi obwo¬
dowej sferocytów (kulistych krwinek czerwonych,
w których stosunek powierzchni do objętości jest
obniżony). Towarzyszy temu niedokrwistość he-
molityczna i powiększenie śledziony. Sferocyty
nie są tak podatne jak krwinki prawidłowe na od-
752 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
kształcenia i są niszczone w śledzionie, co znacz¬
nie skraca czas ich życia w krążeniu. Dziedziczna
sferocytoza może być wyleczona dzięki wycięciu
śledziony, ponieważ przy braku śledziony sfero-
cyty mogą dłużej pozostawać w krążeniu.
Sferocyty są znacznie bardziej podatne na roz¬
pad w warunkach obniżonego ciśnienia osmotycz-
nego (osmoliza) niż prawidłowe erytrocyty. Jest
to wykorzystywane w teście oporności osmo-
tycznej, w którym erytrocyty są poddawane in
vitro działaniu chlorku sodu w coraz mniejszym
stężeniu. Fizjologiczne stężenie chlorku sodu wy¬
nosi 0,85 g/dL (0,85%). Kiedy prawidłowe erytro¬
cyty poddaje się działaniu roztworu chlorku sodu
o stężeniu 0,50 g/dL (0,50%), tylko mała część
krwinek ulega hemolizie, podczas gdy to samo
stężenie chlorku sodu powoduje rozpad ok. 50%
sferocytów. Wyjaśnia się to faktem, że sferocyty
będące komórkami kulistymi nie mają możliwo¬
ści zwiększenia swej objętości przy wchłonięciu
pewnej ilości wody, toteż ulegają rozpadowi po
poddaniu ich działaniu lekko obniżonego ciśnie¬
nia osmotycznego.
Przyczyną dziedzicznej sferocytozy (ryc. 51-5)
jest niedobór ilościowy spektryny lub nieprawid¬
łowości jej budowy, co prowadzi do upośledzenia
zdolności wiązania z innymi białkami, z którymi
w warunkach prawidłowych oddziałuje. Prowa¬
dzi to do osłabienia błony i nadaje kulisty kształt
krwinkom. Nieprawidłowości dotyczące ankiry-
Ryc. 51-5. Zestawienie przyczyn wywołujących dziedziczną
sferocytozę (MIM 182900). Około 50% przypadków choroby
jest spowodowane nieprawidłowościami dotyczącymi ankiryny,
a 25% - nieprawidłowościami spektryny.
ny i białek pasma 3,4.1 i 4.2 są przyczyną niektó¬
rych postaci sferocytozy.
Dziedziczna eliptocytoza jest genetycznie
uwarunkowaną chorobą zbliżoną do dziedzicznej
sferocytozy, a różnicą jest eliptyczny, podobny do
dysku kształt erytrocytów, który można stwierdzić
pod mikroskopem. Przyczyną tej choroby jest
również nieprawidłowość spektryny, a w niektó¬
rych przypadkach stwierdza się zaburzenia pasma
4.1 lub glikoforyny C.
POZNANO BIOCHEMICZNE PODSTAWY
UKŁADU ABO GRUP KRWI
Poznano co najmniej 25 układów grupowych
krwi. Najlepiej znane z nich są układy ABO, Rh
(Rhesus) i MN. Określenie grupa krwi oznacza
system antygenów erytrocytów (substancji grupo¬
wych krwi) określony przez genetyczny loeus ze
zmienną liczbą alleli (np. antygeny A, B i 0 w ukła¬
dzie grupowym ABO). Określenie typ krwi (ang.
blood type) odnosi się do fenotypu antygenowego
zwykle rozpoznawanego przy użyciu właściwych
przeciwciał. Do przetaczania krwi niezbędne jest
poznanie podstaw układów grupowych ABO i Rh.
Zainteresowanie grupami krwi dotyczy zagadnień
biochemicznych, genetycznych, immunologicz¬
nych, antropologicznych, położniczych, patolo¬
gicznych i medyczno-sądowych. W niniejszym
opracowaniu zostały krótko omówione główne
cechy układu ABO i natura biochemiczna ukła¬
dów Rh i MN. Z biochemicznego punktu widze¬
nia istotne jest wyodrębnienie i określenie budo¬
wy substancji grupowych ABO, określenie dróg
ich biosyntezy i ustalenie charakteru produktów
genów A, B i 0.
Układ grupowy ABO ma kluczowe
znaczenie w przetaczaniu krwi
Układ ABO opisał po raz pierwszy Landsteiner
w 1900 r. podczas badania podstaw zgodności
i niezgodności przetaczanej krwi ludzkiej. Błony
erytrocytów większości ludzi zawierają substan¬
cje układu grup krwi grupy A, B, AB lub 0. Osoby
grupy krwi A mają w osoczu krwi przeciwcia¬
ła skierowane przeciwko grupie B, tak więc ich
osocze aglutynuje (zlepia) krwinki osób grupy
B lub AB. Osoby grupy krwi B mają w osoczu
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 753
krwi przeciwciała skierowane przeciwko A i one
aglutynują krwinki grupy A i AB. Osoby z grupą
krwi AB nie mają w osoczu ani przeciwciał anty-
-A, ani przeciwciał anty-B i są dlatego określane
jako uniwersalni biorcy. Osoby z grupą krwi 0
nie mają w erytrocytach ani substancji A, ani B
i dlatego są określane jako uniwersalni dawcy.
Wyjaśnienie tych zjawisk łączy się z faktem, że
organizm zwykle nie wytwarza przeciwciał prze¬
ciwko własnym składnikom, tak więc osoby z gru¬
pą krwi A nie wytwarzają przeciwciał przeciwko
substancji grupowej A, ale wytwarzają przeciw¬
ciała skierowane przeciwko obcym substancjom
grupowym krwi, tj. substancji B, prawdopodobnie
w wyniku podobieństwa strukturalnego tej sub¬
stancji do związków obecnych w niektórych mi¬
kroorganizmach, z którymi organizm człowieka
styka się we wczesnych okresach życia. Ponieważ
osoby z grupą krwi 0 nie mają w krwinkach ani
substancji A, ani B, mają w osoczu przeciwciała
przeciwko obu tym substancjom. Powyższy opis
jest uproszczony, ponieważ występują dwie pod¬
grupy w ramach grupy A, tj. A! i A2.
Geny odpowiedzialne za wytwarzanie substan¬
cji układu ABO są zlokalizowane w długim ramie¬
niu chromosomu 9. Wyróżniono trzy allele, dwa
z nich są równocenne (kodominujące) (A i B),
a pozostały jest recesywny (0). Daje to ostatecznie
cztery możliwe fenotypy: A, B, AB i 0.
Substancje grupowe sg glikosfingolipidami
i glikoproteinami mającymi wspólne
tańcuchy oligosacharydowe
Substancje ABO są złożonymi oligosacharyda¬
rni obecnymi w większości komórek organizmu
i występują w wielu wydzielinach. Oligosacha-
rydy, które determinują swoistą naturę substancji
ABO na powierzchni błon krwinek czerwonych,
występują przede wszystkim w postaci glikosfin-
golipidów, podczas gdy w płynach ustrojowych
te same oligosacharydy występują w postaci gli-
koprotein. Ich obecność w płynach ustrojowych
jest zdeterminowana przez gen oznaczony jako
Se (od angielskiego słowa secretor - wydzielacz),
który koduje swoistą transferazę fukozylową
(Fuc), występującą w narządach wydzielniczych,
takich jak gruczoły wydzielania zewnętrznego,
ale która nie jest czynna w erytrocytach. Osoby
o genotypie SeSe lub Sese wydzielają antygen
A lub B (względnie obydwa), natomiast osoby
o genotypie sese nie wydzielają substancji A lub
B, ale ich erytrocyty mają na swej powierzchni
antygeny A i B.
Substancja H jest biosyntetycznym
prekursorem zarówno substancji A,
jak i B
Substancje ABO zostały wyodrębnione, określono
też ich budowę. Na rycinie 51-6 przedstawiono
uproszczoną wersję (tylko niedające się zredu¬
kować fragmenty końcowe) substancji układu
ABO. Należy przede wszystkim zwrócić uwagę na
strukturę substancji H, ponieważ jest ona zarów¬
no prekursorem substancji A i B, jak i substancją
grupową krwi stwierdzaną u osób z grupą krwi 0.
Substancja H powstaje w wyniku działania trans-
ferazy fukozylowej, która katalizuje przyłącze¬
nie fukozy występującej na końcu łańcucha oli-
gosacharydowego do reszty galaktozy za pomocą
wiązania al,2 w następującej reakcji:
GDP-Fuc + Gal-p-R - Fuc-a1,2-Gal-p-R + GDP
Prekursor Substancja H
Wymienioną transferazę fukozylową kodu¬
je gen H. Allel h w locus H koduje nieaktywną
transferazę fukozylową, tak więc osoby z genoty¬
pem hh nie mogą wytwarzać substancji H. Osoby
z genotypem hh mają erytrocyty grupy 0, mimo że
mają enzymy niezbędne do wytwarzania substan¬
cji A lub B (p. niżej). Określa się je jako fenotyp
Bombay (Oh).
Gen A koduje transferazę GalNAc,
gen B - transferazę Gal,
a gen 0 - nieczynny produkt
W porównaniu z substancją H (ryc. 51 -6) substan¬
cja A zawiera dodatkowo GalNAc, a substancja
B zawiera Gal przyłączoną tak, jak pokazano na
rycinie. Przeciwciała przeciwko A są skierowa¬
ne przeciwko dodatkowej reszcie GalNAc, która
znajduje się w substancji A. Przeciwciała skie¬
rowane przeciwko B są skierowane przeciwko
dodatkowej reszcie Gal obecnej w substancji B.
Reszta cukrowcowa GalNAc jest immunodomi-
754 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Gal
Substancja B
Ryc. 51-6. Schemat budowy substancji grupowych krwi H, A i B. R jest długim łańcuchem oli-
gosacharydowym przyłączonym albo do ceramidu, jeśli substancje grupowe są glikosfingolipi-
dami, albo do łańcucha polipeptydowego białek poprzez resztę seryny, jeśli substancje grupowe
są glikoproteinami. Można zauważyć, że struktury substancji grupowych krwi są dwuantenowe,
tzn. mają 2 rozgałęzienia, które mogą się rozwidlać (czego nie pokazano) w punkcie połączenia
GIcNAc-R; na rycinie tej pokazano tylko jedną z możliwości tego rozwidlenia. Każda z substancji
H, A, B zawiera 2 odpowiednio krótkie łańcuchy oligosacharydowe, pokazane powyżej. Substan¬
cja AB zawiera jeden typ łańcucha A i jeden typ łańcucha B.
nującym cukrem (tj. jedynym determinującym
swoistość przeciwciał skierowanych przeciwko
substancjom grupowym krwi) dla grupy A, nato¬
miast Gal jest immunodominującym cukrem dla
substancji B. W świetle tych stwierdzeń struk¬
turalnych nie jest zaskakujące, że substancja
A może być syntetyzowana in vitro z substancji
0 w reakcji katalizowanej przez transferazę Gal-
NAc, dla której dawcą cukru jest UDP-GalNAc.
Podobnie substancja grupy krwi B może być wy¬
tworzona z substancji O w reakcji katalizowanej
przez transferazę Gal z użyciem UDP-Gal. Należy
więc przyjąć, że gen grupy krwi A koduje syntazę
transferazy GalNAc, która przyłącza resztę Gal-
NAc do substancji 0. Podobnie produktem genu
grupy krwi B jest transferaza Gal przyłączająca
Gal do substancji 0. Osoby z grupą krwi AB mają
obydwa enzymy i dwa łańcuchy oligosacharydo¬
we -jeden zakończony GalNAc, a drugi Gal (ryc.
51-6). Osoby z grupą krwi 0 wytwarzają jedynie
nieaktywne białko enzymatyczne, które można
wykryć za pomocą metod immunologicznych.
Ich substancją grupową krwi w układzie ABO jest
substancja H.
W 1990 r. ustalono, za pomocą kodowania
1 techniki określania sekwencji, różnice między
produktami glukozylotransferaz, tj. produktami
genów A, B i 0. Różnica 4 nukleotydów jest wy¬
starczająca, aby zróżnicować swoistość glukozy-
lotransferazy A i B. Allel 0 cechuje się jednak mu¬
tacją pojedynczej pary zasad, powodującą zmianę
fazy odczytu oraz produkcję białka pozbawione¬
go enzymatycznej aktywności transferazy.
NIEDOKRWISTOŚCI HEMOLITYCZNE
MOGĄ BYĆ WYWOŁANE PRZEZ CZYNNIKI
WYSTĘPUJĄCE NA ZEWNĄTRZ KOMÓRKI,
W BŁONIE KOMÓRKOWEJ
LUB WEWNĄTRZ ERYTROCYTU
Zewnątrzkomórkowe przyczyny niedokrwisto¬
ści hemolitycznych obejmują hipersplenizm, tj.
stan, w którym śledziona jest powiększona z róż¬
nych przyczyn i powoduje niszczenie erytrocy¬
tów. Przyczyny immunologiczne (np. reakcje
poprzetoczeniowe, obecność w osoczu ciepłych
lub zimnych przeciwciał, które powodują liżę ery¬
trocytów i nadwrażliwość na dopełniacz) również
zaliczają się do przyczyn zewnątrzkomórkowych,
tak jak trucizny uwalniane przez niektóre mikro¬
organizmy, np. bakterie z rodzaju Clostridium.
Niektóre węże mają w jadzie substancje powo¬
dujące liżę krwinek w wyniku działania na błonę
komórkową (np. przez aktywację fosfolipaz lub
proteinaz).
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 755
Przyczyny związane z błoną komórkową wy¬
nikają z nieprawidłowej budowy białek. Najważ¬
niejszą przyczyną jest dziedziczna sferocytoza
i dziedziczna eliptocytoza, głównie spowodowa¬
na przez nieprawidłowości spektryny (p. wyżej).
Przyczyny niedokrwistości hemolitycznych
związane z wnętrzem erytrocytu obejmują he-
moglobinopatie i enzymopatie. Najważniejszą
hemoglobinopatią jest niedokrwistość sierpowa-
ta. Najczęściej występującymi enzymopatiami
są nieprawidłowości cyklu pentozowo-fosfora-
nowego, szczególnie glikolizy. Przeważający
w populacjach niektórych części świata niedobór
dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stano¬
wi przyczynę niedokrwistości hemolitycznej (p.
wyżej). Niedobór kinazy pirogronianowej nie
jest częsty, ale jest drugim co do częstości wy¬
stępowania niedoborem enzymatycznym powo¬
dującym niedokrwistość hemolityczną z powodu
upośledzenia glikolizy. Wywołuje go zmniejszone
tworzenie ATP, co upośledza w różny sposób inte¬
gralność błony erytrocytów.
Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawa¬
niu niedokrwistości hemolitycznych zestawiono
w tab. 51-7.
Tabela 51-7. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu
niedokrwistości hemolitycznej
Badania ogólne
Oznaczenie stężenia we krwi nieskoniugowanej (pośredniej)
bilirubiny (podwyższone wskazuje na niedokrwistość).
Oznaczenie czasu życia krwinek mierzonego jako czas życia
podanych dożylnie autologicznych erytrocytów znakowa¬
nych51 Cr (skrócony).
Retikulocytoza.
Hemoglobinemia.
Oznaczenie stężenia haptoglobiny w osoczu (małe).
Badanie swoiste
Elektroforetyczne różnicowanie hemoglobiny (np. wykrycie
HbS).
Oznaczenie enzymów erytrocytów (np. niedobór G6PD lub
PK).
Zmniejszona oporność osmotyczna (np. we wrodzonej sfero-
cytozie).
Test Coombsa1.
Oznaczenie zimnych aglutynin.
1 Bezpośredni test Coombsa wykrywa przeciwciała na erytrocy¬
tach, natomiast pośredni test Coombsa wykrywa krążące prze¬
ciwciała skierowane przeciwko antygenom erytrocytów.
GRANULOCYTY 0B0JĘTN0CHŁ0NNE
ODZNACZAJĄ SIĘ AKTYWNYM
METABOLIZMEM I ZAWIERAJĄ WIELE
UNIKALNYCH ENZYMÓW I BIAŁEK
Główne cechy biochemiczne granulocytów obo-
jętnochlonnych zestawiono w tab. 51-8. Domi-
nującymi w nich zjawiskami są aktywna gliko¬
liza tlenowa, aktywne przemiany cyklu pentozo-
wo-fosforanowego, umiarkowana fosforylacja
oksydacyjna (z powodu względnie małej liczby
Tabela 51-8. Zestawienie głównych cech biochemicznych granu¬
locytów obojętnochłonnych
• Aktywna glikoliza.
• Aktywny cykl pentozowo-fosforanowy.
• Umiarkowana fosforylacja oksydacyjna.
• Liczne lizosomy bogate w enzymy degradujące.
• Występowanie wielu unikalnych enzymów (np. mieloperoksy-
daza i układ NADPH-oksydazy) oraz białek.
• Obecność integryn CD11/CD18 w błonie cytoplazmatycznej.
mitochondriów) oraz duża zawartość enzymów
lizosomalnych. Wiele z tych enzymów, zestawio¬
nych w tab. 51 -4, bierze udział także w tlenowym
metabolizmie granulocytów obojętnochłonnych
(p. niżej). W tabeli 51-9 zestawiono czynności
biologiczne niektórych białek, które są względnie
swoiste dla granulocytów obojętnochłonnych.
Granulocyty obojętnochtonne sq
głównymi obrońcami organizmu przed
zakażeniami bakteryjnymi
Granulocyty obojętnochłonne są ruchliwymi
komórkami żernymi, które odgrywają główną rolę
w stanach ostrych zapaleń. Wniknięcie bakterii do
tkanek wywołuje zespół zjawisk, które zbiorczo
określa się jako ostra odpowiedź zapalna. Nale¬
żą do nich: 1) zwiększenie przepuszczalności na¬
czyń, 2) wnikanie uczynnionych (aktywowanych)
granulocytów obojętnochłonnych do tkanek, 3)
aktywacja płytek krwi, 4) samoistne ustąpienie
tych zjawisk, jeżeli wnikające mikroorganizmy
zostaną pokonane.
Wiele czynników jest uwalnianych z komórek
i białek osocza podczas ostrego zapalenia, a czyn-
756 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tabela 51-9. Wybrane ważne enzymy i białka granulocytów obojętnochtonnych1
Enzym lub białko
Reakcja katalizowana lub czynność biologiczna
Komentarz
Mieloperoksydaza
(MPO)
H202 + X- (halogenek) + H+ H0X + H20,
gdzie X' = Cl', H0X = kwas chlorowy(l)
Odpowiedzialna za zielony kolor ropy. Dziedziczny niedobór
może być przyczyną nawracających zakażeń
NADPH-oksydaza
202 + NADPH 20i + NADP + H+
Główny składnik eksplozji oddechowej. Niedobór w przewle¬
kłej chorobie ziarniczej
Lizozym
Hydrolizuje wiązanie pomiędzy kwasem
/V-acetylomuramidowym i /V-acetylo-D-glukozaminą
znajdujące się w ścianie komórkowej bakterii
Występuje w dużych ilościach w makrofagach
Defenzyny
Zasadowe peptydy antybiotykowe zbudowane
z 29-30 reszt aminokwasowych
Zabijają bakterie przez uszkadzanie ich ściany komórkowej
Laktoferryna
Białko wiążące żelazo
Może hamować wzrost wielu bakterii przez wiązanie żelaza
oraz brać udział w regulacji proliferacji komórek szpikowych
CD11a/CD18,
CD11 b/CD18,
CD11C/CD182
Cząsteczki adhezyjne (należą do integryn)
Niedobór przyczyną upośledzonej adhezji leukocytów typu I
(MIM 116920)
Receptory dla Fc
fragmentów IgG
Wiąże fragmenty Fc immunoglobuliny IgG
Wiąże kompleksy antygen-przeciwciało do komórek szpiko¬
wych i limfoidalnych, nasila fagocytozę i inne formy reakcji
komórkowej
1 Ekspresja tych cząsteczek jest badana podczas różnych okresów różnicowania się prawidłowych granulocytów obojętnochłonnych
lub odpowiadających im komórek białaczkowych. W badaniach używane są współczesne techniki biologii molekularnej (np. pomiar
swoistego mRNA). Dla większości enzymów i białek wyodrębniono cDNA i określono jego sekwencję, i na tej podstawie ustalono
sekwencję reszt aminokwasowych białek, ustalono lokalizację genu w chromosomie, jego budowę i układ eksonów i intronów. Niektóre
ważne proteazy granulocytów obojętnochłonnych zestawiono w tab. 51-12.
2 CD-cluster of differentiation (antygen różnicowania). Jest to określenie ujednoliconego systemu nazewnictwa powierzchniowych mar¬
kerów leukocytów. Swoiste białka powierzchniowe (markery), które różnicują poszczególne linie lub stadia zróżnicowania leukocytów
i są rozpoznawane za pomocą grupy przeciwciał monoklonalnych, są zaliczane do antygenów różnicowania. Układ ten jest szczególnie
pomocny w klasyfikowaniu podtypów limfocytów. Wiele antygenów różnicowania bierze udział w oddziaływaniach komórka-komórka,
adhezji i przekazywaniu sygnałów przez błony komórkowe.
Tabela 51-10. Źródła wazoaktywnych cząsteczek biorących udział w ostrym zapaleniu
Komórki tuczne
Płytki krwi
Granulocyty obojętnochłonne
Białka osocza krwi
Czynnik aktywujący płytki (PAF)
C3a, C4a i C5a układu dopełniacza
Histamina
Serotonina
Ikozanoidy (różne prostaglandyny i leukotrieny)
Bradykinina i produkty rozpadu fibryny z układu
krzepnięcia
niki te sumarycznie powodują zwiększenie prze¬
puszczalności ściany naczyniowej, którego wyni¬
kiem jest obrzęk tkanek (tab. 51-10).
W stanach ostrego zapalenia granulocyty obo-
jętnochłonne pochodzą z krwi krążącej, skąd
przechodzą do tkanek, aby pomóc w elimino¬
waniu obcych mikroorganizmów. Granulocyty
obojętnochłonne są przyciągane do tkanek przez
czynniki chemotaktyczne, do których należą
fragmenty dopełniacza C5a, małe peptydy pocho¬
dzenia bakteryjnego (np. A-formylo-metionylo-
leucylo-fenyloalanina) i liczne leukotrieny. Aby
dotrzeć do tkanek, krążący we krwi granulocyt
obojętnochłonny musi przenikać przez ścianę
naczynia włosowatego. W tym celu granulocyty
układają się wzdłuż ścian naczynia (ulegają mar¬
ginalizacji), a następnie przylegają do komórek
śródbłonka naczyń włosowatych.
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 757
Integryny pośredniczą w przyleganiu
granulocytów obojętnochłonnych
do komórek śródbionka
Przyleganie granulocytów obojętnochionnych
do komórek śródbłonka wymaga udziału swoistych
białek adhezyjnych (integryn), znajdujących się na
powierzchni granulocytów, oraz swoistych białek
receptorowych na powierzchni komórek śródbłon¬
ka (p. także omówienie selektyn, rozdz. 46).
Integryny są nadrodziną białek powierzchnio¬
wych obecnych w różnorodnych komórkach. Bio¬
rą one udział w przyleganiu komórek do komórek
oraz komórek do składników substancji pozako-
mórkowej. Integryny są heterodimerami, zbu¬
dowanymi z połączonych niekowalencyjnie pod-
jednostek a i (3. Podjednostki zawierają zewnątrz-
komórkowe śródbłonowe i wewnątrzkomórkowe
segmenty. Zewnątrzkomórkowe segmenty
wiążą różne ligandy, takie jak białka substancji
pozakomórkowej i białka powierzchni innych
komórek. Ligandy te często zawierają sekwencje
Arg-Gly-Asp (R-G-D). Wewnątrzkomórkowe
segmenty wiążą się z różnymi składnikami cy-
toszkieletu, takimi jak aktyna lub winkulina. In¬
tegryny są białkami, które łączą składniki wystę¬
pujące na zewnątrz komórek ze składnikami
ich wnętrza, i dzięki temu pomagają integrować
odpowiedź komórki na zmieniające się warunki
otaczającego środowiska.
Początkowo wyróżniono trzy podrodziny inte¬
gryn. Integryny wchodzące w skład poszczegól¬
nych podrodzin różnią się podjednostkąa, a zawie¬
rają wspólną dla każdej podrodziny podjednostkę
p. Z czasem wyróżniono więcej niż trzy rodzaje
podjednostek p, co sprawiło, że klasyfikacja inte¬
gryn stała się bardziej złożona. Niektóre integry¬
ny swoiście związane z czynnością granulocytów
obojętnochłonnych zestawiono w tab. 51-11.
Niedobór podjednostki p2 (zwanej także CD 18)
w LFA-1 i dwóch pokrewnych integrynach:
Mac-1 (CDllbCD18) i pl50.95 (CDllcCD18)
stwierdzono w granulocytach obojętnochłonnych
i makrofagach: powoduje to typ 1 upośledzo¬
nego przylegania leukocytów, chorobę cha¬
rakteryzującą się nawracającymi zakażeniami
bakteryjnymi i grzybicami. Wśród różnych skut¬
ków wymienionego niedoboru, upośledzone jest
przyleganie białych krwinek do komórek śród¬
błonka, tak więc mniejsza liczba granulocytów
obojętnochłonnych może wnikać do tkanek, aby
zwalczać zakażenie.
Po przeniknięciu przez ścianę małych naczyń
granulocyty obojętnochłonne, migrując w kierun¬
ku największego stężenia czynników chemotak-
tycznych, napotykają wnikające bakterie i próbują
Tabela 51-11. Przykłady integryn, które odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu granulocytów obojętnochłonnych, innych leukocytów
oraz płytek krwi
Integryna
Komórka
Podjednostki
Ugand
Czynność
VLA-1 (CD49a)
Leukocyty,
inne komórki
di p,
Kolagen, laminina
Adhezja komórek do substancji
pozakomórkowej
VLA-5 (CD49e)
Leukocyty,
inne komórki
<*5 Pi
Fibronektyna
Adhezja komórek do substancji
pozakomórkowej
VLA-6 (CD49f)
Leukocyty,
inne komórki
06 Pi
Laminina
Adhezja komórek do substancji
pozakomórkowej
LFA-1 (CD11a)
Leukocyty
aLp2
ICAM-1
Adhezja krwinek białych
Glikoproteina llb/llla
Płytki krwi
a»b p3
ICAM-2, fibrynogen, fibronektyna,
czynnik von Willebranda
Adhezja i agregacja płytek krwi
LFA-1 - lymphocyte function-associated antigen 1 (antygen-1 związany z czynnością limfocytów); VLA - very late antigen (bardzo
późny antygen), CD - cluster of differentiation (antygen różnicowania); ICAM - intercellular adhesion molecule (międzykomórkowa czą¬
steczka przylegania). Niedobór LFA-1 i zbliżonych integryn stwierdzono u chorych z upośledzoną adhezją leukocytów (MIM 116290).
Niedobór zespołu glikoprotein llb/llla wykazano w trombastenii Glanzmanna (MIM 273800), chorobie cechującej się krwawieniami,
prawidłową liczbą płytek krwi, ale nieprawidłową kurczliwością skrzepu. Obserwacje te wskazują jak istotne jest poznanie adhezyjnych
białek powierzchni komórek w wyjaśnieniu przyczyn licznych chorób.
758 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
je zaatakować oraz zniszczyć. Granulocyty obo-
jętnochłonne muszą być w stanie aktywacji, aby
uruchomić ciąg procesów metabolicznych biorą¬
cych udział w fagocytozie i zabijaniu bakterii.
Aktywacja granulocytów
obojętnochtonnych jest podobna do
aktywacji płytek krwi i wymaga hydrolizy
bisfosforanu fosfatydyloinozytolu
Mechanizmy aktywacji płytek krwi są omówione
w rozdz. 50 (p. ryc. 50-8). Proces aktywacji obej¬
muje oddziaływanie bodźca (np. trombiny) na re¬
ceptor, aktywację białek G, pobudzenie aktywności
fosfolipazy C i uwalnianie trifosforanu inozytolu
i diacyloglicerydu z bisfosforanu fosfatydyloino¬
zytolu. Związki te, biorące udział w przenoszeniu
sygnału, powodują wzrost wewnątrzkomórkowego
Ca2+ i aktywację kinazy białek C. Dodatkowo ak¬
tywacja fosfolipazy A2 wytwarza kwas arachido-
nowy, który jest produktem wyjściowym dla wielu
biologicznie czynnych ikozanoidów.
Proces aktywacji granulocytów obojętno-
chłonnych jest wyraźnie podobny. Są one po¬
budzone przez bakterie, wiązanie czynników
chemotaktycznych lub kompleksy antygen-prze-
ciwciało za pośrednictwem swoistych receptorów.
Wytworzony w procesie aktywacji wzrost stęże¬
nia wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ wpływa
na wiele procesów zachodzących w granulocytach
obojętnochłonnych, takich jak łączenie się mikro-
tubul oraz układ aktyna-miozyna. Procesy te biorą
udział w wydzielaniu zawartości ziarnistości oraz
są odpowiedzialne za ruchliwość komórek, co
pozwala granulocytom obojętnochłonnym odszu¬
kiwać mikroorganizmy, które wtargnęły do ustro¬
ju. Aktywowane granulocyty obojętnochłonne są
w tym stanie gotowe, aby zniszczyć mikroorgani¬
zmy za pomocą reakcji, które obejmują wytwa¬
rzanie czynnych postaci tlenu.
Eksplozja oddechowa komórek
fagocytujacych zachodzi
przy udziale NADPH-oksydazy
i pomaga zabijać bakterie
Kiedy granulocyty obojętnochłonne lub inne ko¬
mórki fagocytujące wchłoną bakterie, wykazują
szybki wzrost zużycia tlenu, znany jako eksplozja
oddechowa. Zjawisko to odzwierciedla szybkie
zużywanie tlenu (następujące po 15-60 s) i wy¬
twarzanie dużych ilości czynnych pochodnych
tlenowych, takich jak 02, H202, OH* i OC1 (jon
chloranu(I)). Niektóre z tych produktów są poten¬
cjalnymi czynnikami bakteriobójczymi.
Łańcuch przenoszenia elektronów odpo¬
wiedzialny za eksplozję oddechową (nazywany
NADPH-oksydazą) składa się z kilku składni¬
ków. Jednym z nich jest cytochrom ó558 umiej¬
scowiony w błonie plazmatycznej. Jest on he-
terodimerem złożonym z dwóch polipeptydów
0 masie cząsteczkowej 91 kDa i 22 kDa. Po
aktywacji systemu (p. niżej) dwa polipeptydy
cytoplazmatyczne, o masie 47 kDa i 67 kDa, ule¬
gają przemieszczeniu oraz przyłączeniu do bło¬
ny plazmatycznej i tworzą z cytochromem 6558
oksydazę NADPH odpowiedzialną za eksplozję
oddechową. NADPH jest wytwarzany w cyklu
pentozowym, który ulega nasileniu podczas fa-
gocytozy. Reakcję katalizowaną przez NADPH-
-oksydazę, prowadzącą do wytwarzania anionu
ponadtlenkowego (przez redukcję tlenu jednym
elektronem), przedstawiono w tab. 51-4 (reakcja
2). NADPH jest wytwarzany w cyklu pentozo-
wo-fosforanowym, którego aktywność wzrasta
znacznie podczas fagocytozy.
W przedstawionej niżej reakcji następuje spon¬
taniczne wytwarzanie (w procesie spontanicznej
dysmutacji) nadtlenku wodoru z dwóch cząste¬
czek ponadtlenku:
02 + 02 + 2H+ —* H2O2 + O2
Jon ponadtlenkowy jest wydalany na zewnątrz
komórki lub do fagolizosomów, w których znaj¬
dują się wchłonięte bakterie. Zabijanie bakterii
w fagolizosomach zależy od jednoczesnego dzia¬
łania podwyższonego pH, jonu ponadtlenkowego
1 dalszych pochodnych tlenowych (H202, OH*
i HOC1, czyli kwas chlorowy(I), p. niżej) oraz
działania wielu bakteriobójczych peptydów (de-
fensyn) i innych białek (np. katepsyny G i kilku
białek kationowych) obecnych w komórkach fa-
gocytujących. Każdy ponadtlenek, który dostaje
się do cytozolu komórki fagocytującej, ulega prze¬
kształceniu w H202 w wyniku działania dysniuta-
zy ponadtlenkowej, która katalizuje tę samą re¬
akcję dysmutacji, jaka zachodzi spontanicznie, co
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 759
opisano wyżej. Z kolei H202 jest wykorzystywany
przez mieloperoksydazę (p. niżej) lub zużywany
w wyniku działania peroksydazy glutationowej
albo katalazy.
NADPH-oksydaza występuje w postaci nie¬
czynnej w spoczynkowych komórkach fagocytu-
jących i ulega aktywacji wskutek zetknięcia się
różnych ligandów (fragmenty C5a dopełniacza,
peptydy chemotaktyczne itp.) z receptorami bło¬
ny plazmatycznej. Zjawiska wynikłe z aktywacji
układu oksydazy są przedmiotem wielu badań,
nadal jednak nie zostały w pełni poznane. Są bar¬
dzo podobne do uprzednio opisanego procesu ak¬
tywacji granulocytów obojętnochłonnych, co nie
dziwi wobec faktu, że eksplozja oddechowa jest
integralną częścią procesu aktywacji. W zjawi¬
skach tych biorą udział białka G, aktywacja fosfo-
lipazy C i tworzenie inozytolo-l,4,5-trifosfo-
ranu (IP3). Ostatni z wymienionych związków
bierze udział w krótkotrwałym wzroście stężenia
Ca2+, który jest istotnym elementem wywoływania
eksplozji oddechowej. Wytwarzany jest również
diacyloglicerol, który powoduje przemieszczenie
kinazy białek C do błon plazmatycznych z cyto-
plazmy. Tam enzym ten katalizuje fosforylację
różnych białek, które są prawdopodobnie składni¬
kami układu oksydazy. Powyższy obraz jest bar¬
dziej złożony, na co wskazują dane o podwójnym
szlaku aktywacji obejmującym także przenosze¬
nie sygnału niezależnie od Ca2+.
Mutacje genów składników układu
NADPH-oksydazy powodują przewlekła
chorobo ziarnicza
Znaczenie układu NADPH-oksydazy zostało
wyjaśnione, kiedy zaobserwowano, że w przewle¬
kłej chorobie ziarniczej, rzadkim schorzeniu ce¬
chującym się nawracającymi zakażeniami i uogól¬
nionymi ziaminiakami (przewlekłymi zmianami
zapalnymi) skóry, płuc i węzłów chłonnych, eks¬
plozja oddechowa jest upośledzona. Ziaminiaki
są formą izolowania bakterii, które nie mogą być
zabite z powodu dziedzicznego niedoboru układu
NADPH-oksydazy. Choroba jest spowodowana
mutacją genów kodujących cztery polipeptydy
wchodzące w skład systemu NADPH-oksydazy.
Niektórzy chorzy reagują na leczenie y-interfe-
ronem, który zwiększa transkrypcję składnika,
o masie cząsteczkowej 91 kDa, systemu NADPH-
-oksydazy. Warunkiem jest występowanie u tych
chorych niedoboru tego składnika. Prawdopodob¬
ne przyczyny wywołujące przewlekłą chorobę
ziamiczą są przedstawione na ryc. 51-7.
Ryc. 51-7. Uproszczony schemat przedstawiający kolejność
zjawisk stanowiących przyczynę powstawania przewlekłej cho¬
roby ziarniniakowej (MIM 306400). Mutacje jakiegokolwiek genu
kodującego cztery składniki polipeptydowe układu NADPH-ok¬
sydazy (dwa polipeptydy są składnikami cytochromu b558 i dwa
pochodzą z cytoplazmy) mogą być przyczyną choroby. Polipep-
tyd o masie cząsteczkowej 91 kDa jest kodowany przez gen
umiejscowiony na chromosomie X, ok. 60% chorych dziedziczy
przewlekłą chorobę ziarniniakowatą w sposób sprzężony z płcią,
pozostałe przypadki choroby dziedziczą się w sposób autosomal-
ny recesywny.
Granulocyły obojętnochtonne
zawierają mieloperoksydazę,
która katalizuje wytwarzanie
utleniaczy zawierających chlor
Enzym mieloperoksydaza, obecny w dużych
ilościach w ziamistościach granulocytów obojęt¬
nochłonnych i odpowiedzialny za zielony kolor
ropy, działa na H202 i powoduje powstanie halo¬
genków kwasowych:
| mieloperoksydaza]
H202 + X- + H+ *- H0X + H20
(X" = er, Br', r lub SCN'; HOCI - kwas chlorowy(l))
H202 stanowiący substrat reakcji jest wytwa¬
rzany przez układ NADPH-oksydazy. Cl“ jest naj¬
częściej wykorzystywanym chlorowcem, ponie-
760 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
waż występuje w stosunkowo dużych stężeniach
w osoczu i płynach ustrojowych. HOCI, czyli
czynny składnik płynnych środków wybielają¬
cych stosowanych w gospodarstwie domowym,
jest silnym utleniaczem i jest silnie bakteriobój¬
czy. Kiedy zostaje podany do niezmienionych
tkanek, jego potencjalnie uszkadzające działanie
jest osłabione przede wszystkim przez łączenie
się z pierwszorzędowymi i drugorzędowymi ami¬
nami obecnymi w granulocytach obojętnochłon-
nych i tkankach, w wyniku czego powstają róż¬
ne produkty połączenia chloru z azotem (N-Cl).
Należą do nich chloraminy, które także, chociaż
słabiej niż uprzednio wymienione substancje,
działają bakteriobójczo (np. są stosowane do od¬
każania ran), nie powodując przy tym uszkodze¬
nia tkanek.
Proteinazy granulocytów
obojętnochłonnych mogą
powodować poważne uszkodzenia
tkanek, jeżeli ich działanie
nie jest kontrolowane
Granulocyty obojętnochłonne zawierają liczne
proteazy (tab. 51-12), które mają zdolność hy-
drolizowania elastyny, różnych typów kolagenu
i innych białek obecnych w substancji pozako-
mórkowej. Działanie takie, jeżeli nie jest ograni¬
czane, może powodować poważne uszkodzenia
tkanek. Większość tych proteaz to enzymy lizo-
somalne, występujące w prawidłowych granu¬
locytach obojętnochłonnych głównie w postaci
nieaktywnej. Małe ilości enzymów są uwalniane
do prawidłowych tkanek, ale ilość ta znacznie się
zwiększa w stanach zapalnych. Aktywność elasta-
zy i innych proteaz jest w stanach prawidłowych
ograniczana przez liczne antyproteazy (także ze¬
stawione w tab. 51-12), które występują w oso¬
czu krwi i pozakomórkowym płynie tkankowym.
Każda z antyproteaz może hamować proteazę lub
proteazy przez łączenie się z enzymem w nieko-
walencyjny kompleks. W rozdziale 49 wykazano,
że genetycznie uwarunkowany niedobór inhibi¬
tora arantyproteinazy (arantytrypsyny) po¬
woduje niekontrolowaną aktywność enzymatycz¬
ną elastazy, która niszczy tkankę płucną i w ten
sposób staje się przyczyną rozedmy tego narządu.
a2-lVlakroglobulina jest wielkocząsteczkowym
Tabela 51-12. Proteazy granulocytów obojętnochłonnych oraz
antyproteazy osocza krwi i tkanek1
Proteazy
Antyproteazy
Elastaza
drAntyproteaza (drantytrypsyna)
Kolagenaza
d2-Makroglobulina
Żelatynaza
Wydzielniczy inhibitor leukoproteaz
Katepsyna G
di-Antychymotrypsyna
Aktywator plazminogenu
lnhibitor-1 aktywatora plazminogenu
Tkankowy inhibitor metaloproteaz
1 Tabela zawiera wybrane ważne proteazy granulocytów obojętno-
chlonnych i niektóre białka, które hamują ich działanie. Większość
wymienionych proteaz występuje wewnątrz granulocytów obojęt¬
nochłonnych w postaci prekursorowej. Aktywator plazminogenu
nie jest proteazą, ale został zamieszczony, ponieważ aktywuje
plazminę, która jest proteazą. Wymienione proteazy mogą rozkła¬
dać wiele białek substancji pozakomórkowej, powodując w ten
sposób uszkodzenie tkanek. Sumaryczna równowaga proteaz
i antyproteaz może zostać zaburzona w wyniku zmienionej akty¬
wacji prekursorów proteaz lub inaktywacji antyproteaz. Ostatnie
z wymienionych zjawisk może zachodzić wskutek proteolitycz¬
nego rozkładu antyproteaz lub ich chemicznej modyfikacji, np.
palenie tytoniu powoduje utlenianie reszty metioninowej w pozycji
358 w arantyproteazie.
białkiem osocza krwi, które odgrywa istotną rolę
w ochronie organizmu przed nadmiarem proteaz.
Ma ona zdolność łączenia się z enzymami i w ten
sposób inaktywuje wiele proteaz (rozdz. 49).
Zwiększenie ilości utleniaczy zawierających
chlor, wytwarzanych w stanach zapalnych, zabu¬
rza równowagę proteazy-antyproteazy na korzyść
enzymów. Na przykład wiele proteaz wymie¬
nionych w tab. 51-12 jest aktywowanych przez
HOCI, podczas gdy liczne antyproteazy są przez
ten związek inaktywowane. Dodatkowo tkanko¬
wy inhibitor metaloproteaz i arantychymotry-
psyna mogą być hydrolizowane przez aktywną
elastazę, a arantyproteaza może być hydrolizo-
wana przez aktywną kolagenazę i żelatynazę.
W większości przypadków zostaje ustalona właś¬
ciwa równowaga proteaz i antyproteaz, chociaż
w takich stanach, jak niedobór arantyproteazy
lub nagromadzenia znacznej liczby granulocytów
obojętnochłonnych w tkankach z powodu niedo¬
statecznego ich odpływu, może dojść do znacz¬
nego uszkodzenia tkanek w wyniku działania
nieograniczanej aktywności proteaz.
51. ERYTROCYTY I LEUKOCYTY 761
TECHNIKA REKOMBINACJI DNA
MIAŁA WYRAŹNY WPŁYW
NA ROZWÓJ HEMATOLOGII
Technika rekombinacji DNA wywiera istotny
wpływ na wiele aspektów hematologii. Podstawy
etiologiczne talasemii i wiele zaburzeń krzep¬
nięcia (p. rozdz. 50) zostało w znacznym stopniu
wyjaśnionych za pomocą klonowania lub określa¬
nia sekwencji. Badania onkogenów i translokacji
chromosomalnych przyczyniły się do zrozumienia
mechanizmów białaczek. Jak wspomniano wy¬
żej, techniki klonowania dostarczyły leczniczych
ilości erytropoetyny i innych czynników wzro¬
stowych. Niedobór deaminazy adenozynowej,
który szczególnie dotyczy limfocytów, jest pierw¬
szą chorobą leczoną za pomocą terapii genowej.
Podobnie jak inne dziedziny biologii i medycyny,
hematologia ulega i będzie ulegać dalszemu roz¬
wojowi dzięki tym zadziwiającym technikom.
STRESZCZENIE
• Erytrocyt ma prostą budowę i proste funkcje.
Składa się przede wszystkim ze stężonego roz¬
tworu hemoglobiny otoczonego błoną komór¬
kową.
• Wytwarzanie erytrocytów jest regulowane
przez erytropoetynę, natomiast leukocytów
- przez inne czynniki wzrostowe (np. czynniki
pobudzające tworzenie kolonii granulocytów
oraz makrofagów).
• Erytrocyt zawiera wiele enzymów cytoplazma-
tycznych, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa,
katalaza, peroksydaza glutationowa, aby elimi¬
nować silne utleniacze powstające podczas jego
metabolizmu.
• Genetycznie uwarunkowany niedobór aktywno¬
ści dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, któ¬
ra warunkuje wytwarzanie NADPH, jest ważną
przyczyną niedokrwistości hemolitycznej.
• Methemoglobina nie ma zdolności przenoszenia
tlenu. Znane są zarówno dziedziczne, jak i naby¬
te przyczyny tej choroby. Istotne informacje uzy¬
skano o białkach i lipidach budujących błonę ko¬
mórkową erytrocytów. Liczne białka cytoszkie-
letu, takie jak spektryna, ankiryna i aktyna,
oddziałują ze swoistymi białkami integralnymi
błony i pomagają utrzymać krwince dwuwklęsły
kształt i podatność na odkształcenia.
• Niedobór spektryny powoduje dziedziczną
sferocytozę, jedną z istotnych przyczyn niedo¬
krwistości hemolitycznej.
• Substancje grupowe układu ABO są złożonymi
glikosfingolipidami występującymi w błonie
krwinek: immunodominującym cukrem sub¬
stancji A jest A-acetylogalaktozamina, a sub¬
stancji B - galaktoza.
• Granulocyty obojętnochłonne odgrywają głów¬
ną rolę w mechanizmach obronnych organizmu.
Integryny obecne na powierzchni komórek de¬
terminują swoiste oddziaływanie różnych ko¬
mórek i składników tkankowych.
• Leukocyty ulegają aktywacji w wyniku kon¬
taktu z bakteriami oraz działania innych bodź¬
ców. NADPH-oksydaza odgrywa główną rolę
w procesie aktywacji (eksplozja oddechowa).
Mutacje enzymów i związanych z nimi białek
są przyczyną przewlekłej choroby ziamiczej.
• Proteazy granulocytów obojętnochłonnych
mogą rozkładać wiele białek tkankowych; w wa¬
runkach prawidłowych są pod kontrolą licznej
grupy antyproteaz. Jednak mechanizm hamujący
może być zaburzony w wielu okolicznościach,
co prowadzi do rozległych uszkodzeń tkanek.
• Zastosowanie techniki rekombinacji DNA zre¬
wolucjonizowało badania w hematologii.
PIŚMIENNICTWO
ffrench-Constant C, Colognato H: Integrins: versatile in-
tegrators of extracellular signals. Trends Celi Biol
2004; 14:678.
Hoffman R et al (editors): Hematology: Basic Principles
and Practice, 4th ed. Elsevier Churchill Livings-
ton, 2005.
Israels LG, Israels ED: Mechanisms in Hematology, 3rd
ed. Core Health Sciences Inc, 2002.
Kasper DL et al (editors): Harrison s Principles of Inter¬
nat Medicine, 16th ed. McGraw-Hill, 2005.
Serwer CR et al (editors): The Molecular Bases oflnher-
ited Disease, 8th ed. McGraw-Hill, 2001.
Yonekawa K, Harlan JM: Targeting leukocyte integrins
in human diseases. J Leukoc Biol 2005;77:129.
Metabolizm ksenobiotyków
Robert K. Murray, MD, PhD
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Człowiek jest coraz bardziej narażony na dzia¬
łanie związków obcych, egzogennych (kseno¬
biotyków), takich jak leki, środki konserwujące
dodawane do żywności lub zanieczyszczenia
środowiska zewnętrznego itp. Ilustruje to naj¬
lepiej następujący cytat z Rachel Carson: „Fa¬
bryka życia została skonfrontowana z atakiem
chemicznym podobnym do inwazji z użyciem
nieznanej dotychczas broni lub ataku przez ja¬
skiniowców”. Poznanie mechanizmu działania
ksenobiotyków na poziomie komórkowym jest
niezbędne do skutecznego przeciwdziałania ata¬
kowi chemicznemu.
Znajomość przemiany ksenobiotyków stanowi
podstawę racjonalnej farmakologii i terapii, far¬
macji, toksykologii, leczenia nowotworów lub
uzależnień od leków. Cechą wspólną wszystkich
wymienionych dziedzin jest podawanie ksenobio¬
tyków lub ekspozycja człowieka na te substancje.
CZŁOWIEK STYKA SIĘ Z TYSIĄCAMI
KSENOBIOTYKÓW, KTÓRE MUSZA
ULEC PRZEMIANIE, ZANIM ZOSTANĄ
WYDALONE Z USTROJU
Ksenobiotyk (greckie słowo xenos oznacza
„obcy”) jest substancją obcą dla człowieka. Spo¬
śród głównych grup ksenobiotyków mających
znaczenie medyczne należy wymienić leki, karcy-
nogeny chemiczne i różne związki znajdujące się
w otaczającym nas środowisku (np. polichlorowa-
ne bifenyle - PCB, niektóre insektycydy itd.).
Znanych jest ponad 200000 związków che¬
micznych wytwarzanych w środowisku. Więk¬
szość z nich ulega przemianie (tj. przekształce¬
niom chemicznym) w ustroju człowieka, w tym
głównie w wątrobie. Rzadko ksenobiotyk jest
wydalany w postaci niezmienionej. W przemia¬
nie ksenobiotyków uczestniczy przynajmniej 30
różnych enzymów. W niniejszym rozdziale zo¬
staną omówione tylko wybrane grupy tych en¬
zymów.
Przemianę ksenobiotyków można podzielić na
dwie fazy.
W fazie pierwszej główną reakcją jest hydrok-
sylacja, katalizowana przez enzymy zaliczane
do monooksygenaz lub cytochromów P-450.
Hydroksylacja może być czasem przyczyną utra¬
ty właściwości leczniczych przez lek. Oprócz
hydroksylacji enzymy te katalizują zaskakująco
dużą liczbę innych reakcji chemicznych, np. reak¬
cję deaminacji, dehalogenacji, desulfuracji, epok-
sydacji, peroksydacji i redukcji. W fazie pierwszej
zachodzą również reakcje hydrolizy (katalizowa¬
ne przez esterazy) oraz niektóre reakcje niekatali-
zowane przez enzymy P-450.
W fazie drugiej związki hydroksylowane lub
zmienione w inny sposób w fazie pierwszej ule¬
gają przekształceniu przez swoiste enzymy do
różnych metabolitów polarnych w reakcji sprzę¬
gania z kwasem glukuronowym, siarkowym lub
octowym, glutationem lub pewnymi aminokwa¬
sami, albo też w wyniku metylacji.
Głównym celem obu faz przemiany ksenobio¬
tyków jest zwiększenie ich rozpuszczalności
w wodzie (czyli zwiększenie ich polarności),
dzięki czemu ułatwione jest wydalanie kseno¬
biotyków z ustroju. Bardzo silnie hydrofobowe
ksenobiotyki mogłyby przebywać w tkance tłusz¬
czowej nieograniczenie długo, gdyby nie zostały
przekształcone do postaci bardziej polarnych.
52. METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW 763
W określonych przypadkach, w wyniku reakcji
zachodzących w fazie pierwszej, niektóre kseno-
biotyki ulegają konwersji ze związków biologicz¬
nie nieaktywnych do biologicznie aktywnych.
W takich przypadkach pierwotny ksenobiotyk
jest określany jako prekursor lekowy, prolek, lub
prokarcynogen. W innych przypadkach, wsku¬
tek dodatkowych reakcji zachodzących w fazie
pierwszej (np. dalsze hydroksylacje), aktywne
związki ulegają przed procesem sprzęgania kon¬
wersji do postaci mniej aktywnych lub nieaktyw¬
nych. W jeszcze innych przypadkach w wyniku
samego procesu sprzęgania aktywne metabolity
fazy pierwszej ulegają przekształceniu do związ¬
ków mniej aktywnych lub nieaktywnych oraz
zostają wydalone z moczem lub żółcią. Tylko
w bardzo rzadkich przypadkach w wyniku pro¬
cesu sprzęgania aktywność ksenobiotyku może
wzrosnąć.
Pojęcie „detoksykacja” (odtruwanie) jest uży¬
wane czasem do określenia wielu reakcji przebie¬
gających podczas przemian ksenobiotyków. Nie
zawsze termin ten jest właściwy, ponieważ - jak
już wspomniano - w reakcjach, którym są podda¬
wane ksenobiotyki, mogą powstać związki biolo¬
giczne bardziej aktywne, a nawet toksyczne.
IZOFORMY CYTOCHROMU P-450
HYDROKSYLU JĄ WIELE
KSENOBIOTYKÓW W PIERWSZEJ
FAZIE ICH PRZEMIANY
Hydroksylacja jest główną reakcją zachodzącą
w fazie pierwszej. Jest ona katalizowana przez
enzymy określane jako monooksygenazy lub en¬
zymy grupy cytochromu P-450. Ludzki genom
zawiera kod dla przynajmniej 60 enzymów P-450.
Reakcję katalizowaną przez monooksygenazę
(enzym grupy cytochromu P-450) przedstawia
następujące równanie:
RH + 02 + NADPH + H+ -> R — OH + H20 + NADP
Symbol RH oznacza różne ksenobiotyki, np.
leki, karcynogeny, pestycydy, produkty przeróbki
ropy naftowej i zanieczyszczenia (np. mieszaninę
związków PCB). Substratami mogą być również
pewne związki endogenne, takie jak niektóre ste¬
roidy, ikozanoidy, kwasy tłuszczowe i retinoidy.
Substraty te są przeważnie lipofilowe. Po hydrok¬
sylami stają się bardziej hydrofilowe.
Cytochrom P-450 jest uważany za najbardziej
wszechstronny ze znanych biokatalizatorów.
Mechanizm reakcji katalizowany przez P-450
jest złożony. Został on w skrócie przedstawiony
na ryc. 12-6. Używając 1802, wykazano, że jeden
atom tlenu zostaje wbudowany do R—OH, drugi
zaś do wody. Dwojaki los tlenu w tej reakcji tłu¬
maczy, dlaczego uczestniczące w niej monooksy¬
genazy określano dawniej jako oksydazy o funk¬
cji mieszanej (ang. mixed function oxidases). Re¬
akcję katalizowaną przez cytochrom P-450 można
również przedstawić następującym równaniem:
Postać zredukowana Postać utleniona
cytochromu P-450 cytochromu P-450
rh + o2->r-oh + h2o
Nazwa cytochrom P-450 jest historycznie uza¬
sadniona - odkryto go, gdy preparaty mikroso-
mów poddanych chemicznej redukcji, a następnie
ekspozycji na działanie tlenku węgla, wykazały
maksymalną absorpcję światła o długości fali
450 nm. Enzym ten jest niezwykle ważny, wy¬
kazano bowiem, że ok. 50% leków zażywanych
przez chorych jest metabolizowanych przez en¬
zymy z grupy cytochromu P-450. Te same enzy¬
my działają na karcynogeny i zanieczyszczenia.
Głównymi cytochromami P-450 uczestniczący¬
mi w przemianie leków są cytochromy rodziny
CYP1, CYP2 i CYP3 (patrz dalej).
Izoformy cytochromu P-450
tworzą nadrodzinę enzymów
zawierających hem
Poniżej podano ważne cechy enzymów grupy cy¬
tochromu P-450.
1. Ze względu na dużą liczbę odkrytych izo-
form (ok. 150) należało wprowadzić nazewni¬
ctwo systematyczne zarówno dla izoform P-450,
jak i ich genów. Takie nazewnictwo jest obecnie
używane i opiera się na homologii strukturalnej.
Skrót CYP jet symbolem wyjściowym i oznacza
cytochrom P-450. Obok tego symbolu podaje
się liczbę arabską oznaczającą rodzinę: enzymy
P-450 zalicza się do tej samej rodziny, jeżeli za-
764 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
wierają 40% lub więcej identycznych sekwencji
aminokwasowych. Po liczbie arabskiej podaje się
dużą literę oznaczającą podrodzinę cytochromu
P-450 w razie występowania co najmniej dwóch
członków tej podrodziny. Enzymy P-450 należą
do tej samej podrodziny, jeżeli zawierają więcej
niż 55% identycznych sekwencji. Poszczególne
enzymy P-450 oznacza się następnie arbitralnie
liczbą arabską. Na przykład CYP1A1 oznacza
enzym P-450 należący do rodziny 1 i podrodziny
A; jest on pierwszym członkiem tej podrodziny.
System nazewnictwa genów kodujących enzymy
P-450 jest taki sam, z tym że skrót zapisuje się
pismem pochyłym (kursywą). Na przykład gen
kodujący enzym CYP1A1 oznacza się CYP1A1.
CYP3A jest najważniejszym cytochromem P-
-450 uczestniczącym w przemianie leków, jeże¬
li uwzględni się jego ilość w wątrobie i jelitach.
Enzym ten może działać na różnorodne leki pra¬
wie wszystkich klas. Również aktywność tego
enzymu jest nieprzewidywalna i może się ona
zmienić prawie 400-krotnie; może on wykazy¬
wać działanie hamujące lub indukujące, przez co
dawkowanie leku może stwarzać istotny problem
terapeutyczny.
2. Podobnie jak hemoglobina, enzymy tej grupy
są hemoproteinami.
3. Enzymy te występują u bardzo wielu gatun¬
ków istot żywych, w tym również w bakteriach.
4. Największe stężenie tych enzymów stwierdza
się w wątrobie i jelicie cienkim, lecz prawdopo¬
dobnie występują one we wszystkich tkankach.
W wątrobie, podobnie jak w wielu innych tkan¬
kach, enzymy te występują głównie w błonach
siateczki śródplazmatycznej gładkiej, która
stanowi część frakcji mikrosomalnej przy frak¬
cjonowaniu subkomórkowym tkanek. W mikro-
somach wątrobowych enzymy P-450 mogą sta¬
nowić aż 20% ogólnej ilości białka. Znajdują się
one w większości tkanek, chociaż w mniejszych
ilościach niż w wątrobie. W nadnerczach znaj¬
dują się w mitochondriach, a także w siateczce
śródplazmatycznej. Występujące w nadnerczach
różnorodne hydroksylazy odgrywają ważną rolę
w biosyntezie cholesterolu i steroidów. Mitochon-
drialny cytochrom P-450 różni się od występują¬
cego w siateczce śródplazmatycznej obecnością
reduktazy adrenodoksynowej, będącej flawo-
proteiną sprzężoną z NADPH i białkiem żelazo-
wo-siarkowym, pozbawionym hemu, zwanym
adrenodoksyną. Ponadto swoiste izoformy P-
-450, uczestniczące w biosyntezie steroidów, wy¬
kazują znacznie bardziej ograniczoną swoistość
substratową.
5. W siateczce śródplazmatycznej ludzkich he-
patocytów stwierdza się co najmniej 6 izoform
cytochromu P-450. Każda z tych izoform odzna¬
cza się dużymi zachodzącymi na siebie zakresami
swoistości substratowych; izoformy te działają
zarówno na ksenobiotyki, jak i na związki endo¬
genne. W ostatnich latach wyizolowano i szcze¬
gółowo zbadano geny kodujące izoformy P-450
(pochodzące zarówno od ludzi, jak i zwierząt, np.
szczura).
6. W reakcjach katalizowanych przez cytochro-
my P-450 uczestniczy NADPH, a nie NADH.
Enzym redukujący cytochrom P-450 i współdzia¬
łający z NADPH (lewa strona zapisanego wcześ¬
niej równania) jest określany jako reduktaza
NADPH-cytochrom P-450. Elektrony zostają
przeniesione z NADPH na reduktazę NADPH-cy¬
tochrom P-450, a następnie na cytochrom P-450.
To powoduje redukcyjną aktywację tlenu czą¬
steczkowego, przy czym jeden atom tlenu zostaje
wbudowany do substratu. Inne białko hemowe
występujące w siateczce śródplazmatycznej gład¬
kiej (rozdz. 12) - cytochrom bs - może uczestni¬
czyć w tej reakcji jako donor elektronów.
7. Składnikami układu cytochromu P-450 są
również lipidy, najczęściej fosfatydylocholina
- główny lipid błon siateczki śródplazmatycznej.
8. Syntezę większości rodzajów cytochromu
P-450 można indukować za pomocą określonych
związków. I tak, podawanie fenobarbitalu i wielu
innych leków przez zaledwie 4-5 dni powoduje
przerost siateczki śródplazmatycznej gładkiej
oraz 3^ł-krotny wzrost ilości cytochromu P-450.
Mechanizm indukcji został dogłębnie zbadany;
polega on przeważnie na wzroście transkrypcji
mRNA kodującego cytochrom P-450. W pew¬
nych jednak przypadkach indukcja jest związana
ze stabilizacją mRNA, stabilizacją enzymów lub
innymi mechanizmami (np. działaniem na proces
translacji).
Indukcja tego enzymu ma ważne następstwa
kliniczne, ponieważ stanowi jeden z mechani¬
zmów interakcji leków. Interakcja leków zacho¬
dzi wówczas, gdy efekty działania jednego leku
ulegają zmianie w wyniku uprzedniego lub jed-
52. METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW 765
noczesnego stosowania innego leku. Na przykład
chory zażywa dikumarol w celu zmniejszenia
krzepliwości krwi. Lek ten jest metabolizowany
przez CYP2C9. Następnie okazuje się, że cho¬
ry wymaga stosowania fenobarbitalu z powodu
pewnego rodzaju padaczki. Zgodnie z oczeki¬
waniami, po 5 dniach stosowania fenobarbita¬
lu stężenie CYP2C9 w hepatocytach wzrasta
3^4-krotnie, co oznacza, że dikumarol jest szyb¬
ciej metabolizowany oraz że zmniejsza się jego
działanie przeciwzakrzepowe. Aby więc uzyskać
właściwy efekt przeciwzakrzepowy, dawkę po¬
dawanego dikumarolu należy zwiększyć. Nowy
problem powstaje wtedy, kiedy chory przestaje
zażywać fenobarbital, lecz kontynuuje zażywanie
dikumarolu w zwiększonej dawce. U takiego cho¬
rego mogą wystąpić objawy skazy krwotocznej,
spowodowanej przedawkowaniem dikumarolu
i nagłym spadkiem stężenia CYP2C9 (inaktywu-
jącego ten lek).
Inny przykład indukcji enzymatycznej doty¬
czy enzymu CYP2E1, którego syntezę stymu¬
luje spożywanie etanolu. Ten fakt ma znaczenie
praktyczne, ponieważ ta izoforma cytochromu
P-450 metabolizuje niektóre często używane roz¬
puszczalniki i składniki dymu tytoniowego do
karcynogenów. Tak więc, zwiększona aktywność
CYP2E1 indukowana etanolem może zwiększyć
ryzyko wystąpienia nowotworów w razie ekspo¬
zycji na te substancje.
9. Pewne izoformy cytochromu P-450 (np.
CYP1A1) uczestniczą w przemianie wielopier¬
ścieniowych węglowodorów aromatycznych
(WWA) i spokrewnionych z nimi związków.
Z tego powodu enzymy te określa się jako hy-
droksylazę węglowodorów aromatycznych
(AHH, ang. aromatic hydrocarbon hydroxylases).
Są to ważne enzymy przemiany WWA i karcyno-
genezy wywołanej tymi związkami. Na przykład
w płucach enzym ten może uczestniczyć w kon¬
wersji nieaktywnych WWA (prokarcynogenów),
wdychanych z dymem papierosowym, do ak¬
tywnych karcynogenów (w wyniku hydroksylacji
WWA). W niektórych komórkach palaczy wy¬
stępują większe stężenia AHH niż w komórkach
osób niepalących. W kilku opracowaniach donie¬
siono o występowaniu wzmożonej aktywności
AHH w łożysku kobiet palących - płody tych ko¬
biet mogą być eksponowane na działanie zwięk¬
szonych ilości WWA (niektóre z tych związków
mogą być bardzo szkodliwe).
10. Niektóre cytochromy P-450 mają formy
polimorficzne (genetycznie uwarunkowane izo¬
formy) odznaczające się małą aktywnością kata¬
lityczną. Ta ważna obserwacja tłumaczy znaczne
zróżnicowanie reakcji poszczególnych chorych
na ten sam lek. Jeden cytochrom P-450, wyka¬
zujący polimorfizm w zakresie CYP2D6, uczest¬
niczy w przemianie debrizochiny (jest to lek
przeciwnadciśnieniowy; p. tab. 52-2) i sparteiny
(lek antyarytmiczny i oksytocynowy). Pewne
postacie polimorficzne CYP2D6 wykazują sła¬
bą aktywność metabolizującą, m.in. w stosunku
do wymienionych dwóch leków, co sprawia, że
mogą się one kumulować w ustroju i stać się
przyczyną wystąpienia objawów niepożądanych.
Inny interesujący polimorfizm dotyczy CYP2A6,
uczestniczącego w przemianie nikotyny do ko-
nityny. Rozpoznano trzy allele CYP2A6, jeden
dziki i dwa „zerowe”, pozbawione aktywności.
Doniesiono, że u osób, u których występują alle¬
le „zerowe”, przemiana nikotyny jest upośledzo¬
na, co najwidoczniej chroni je przed nałogiem
palenia (p. tab. 52-2). Takie osoby palą mniej,
najpewniej dlatego, że w ich krwi i mózgu stę¬
żenie nikotyny jest większe niż u osób z alle-
lem dzikim. Spekuluje się, że przez hamowanie
CYP2A6 będzie możliwe zapobieganie nałogo¬
wi palenia tytoniu lub leczenie go.
W tabeli 52-1 przedstawiono najważniejsze ce¬
chy enzymów grupy cytochromu P-450.
PROCESY SPRZĘGANIA
PRZYGOTOWUJĄ KSEN0BI0TYKI
00 WYDALANIA Z USTROJU
W DRUGIEJ FAZIE ICH PRZEMIANY
W reakcjach pierwszej fazy metabolizmu kseno-
biotyki ulegają zwykle konwersji do związków
bardziej polarnych w wyniku hydroksylacji. W re¬
akcjach fazy drugiej hydroksylowane pochodne
ulegają sprzęganiu z kwasem glukuronowym,
siarczanami lub glutationem. W wyniku tych re¬
akcji związki te stają się bardziej rozpuszczalne
w wodzie i mogą ewentualnie zostać wydalone
z moczem lub żółcią.
766 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Tabela 52-1. Niektóre właściwości enzymów grupy cytochromu
P-450
• Uczestniczą w I fazie przemiany wielu ksenobiotyków, w tym
50% leków zażywanych przez ludzi.
• Uczestniczą w przemianie wielu związków endogennych (np.
steroidów).
• Wszystkie są hemoproteinami.
• Charakteryzują się dużym zakresem swoistości substratowej;
w konsekwencji różne P-450 mogą katalizować powstawanie
tego samego produktu.
• Są bardzo wszechstronnymi katalizatorami katalizującymi ok.
60 rodzajów reakcji.
• Katalizują zwykle reakcje, w których jeden atom tlenu wbudo¬
wuje się do substratu, a drugi do wody.
• Powstające pod wpływem tych enzymów hydroksylowane
pochodne ksenobiotyków są bardziej hydrofilowe niż ich sub-
straty, co ułatwia wydalanie ich z ustroju.
• Chociaż największe ilości tych enzymów występują w wątro¬
bie, to nie brak ich również w innych narządach, takich jak
jelita, mózg i płuca.
• Występują w siateczce śródplazmatycznej gładkiej oraz w mi-
tochondriach (enzymy steroidogenezy).
• W niektórych przypadkach produkty działania tych enzymów
mają własności mutagenne i karcynogenne.
• Większość z tych enzymów ma masę cząsteczkową ok. 55
kDa.
• Są to enzymy ulegające indukcji pod wpływem wielu substan¬
cji, przez co stają się przyczyną interakcji lekowej.
• Wiele tych enzymów jest hamowanych przez leki, przez co
stają się inną przyczyną interakcji leków.
• Niektóre enzymy tej grupy wykazują polimorfizm, co może być
przyczyną nieprawidłowej przemiany leków.
• Aktywność tych enzymów może ulec zmianie w tkankach cho¬
robowo zmienionych (np. w marskości wątroby), co wpływa
na przemianę leków.
• Przez określenie profilu genowego kodującego P-450 u cho¬
rych (np. przez wykrycie polimorfizmów) rysuje się możli¬
wość indywidualizacji terapii lekowej.
Opis pięciu rodzajów reakcji
zachodzących w drugiej fazie przemiany
ksenobiotyków
A. Glukuronidacja
Proces glukuronidacji bilirubiny został przedsta¬
wiony w rozdz. 31. Reakcje glukuronidacji kse¬
nobiotyków są w zasadzie podobne do siebie.
Donorem reszty glukuronidowej jest kwas UDP-
-glukuronowy, a enzymami katalizującymi reak¬
cje glukuronidacji - transferazy glukuronozylowe
występujące zarówno w siateczce śródplazma¬
tycznej, jak i w cytoplazmie. Wiele związków,
takich jak 2-acetyloaminofluoren (karcynogen),
anilina, kwas benzoesowy, meprobamat, fenol
i wiele steroidów, jest wydalanych w postaci glu-
kuronidów. Reszta glukuronidowa może zostać
związana przez tlen, azot lub grupę siarkową
danego substratu. Glukuronidacja jest prawdopo¬
dobnie najczęściej spotykaną reakcją sprzęgania.
B. Sprzęganie z siarczanem (sulfatacja)
Niektóre alkohole, aminy aromatyczne i fenole
ulegają sprzęganiu z siarczanem. Donorem reszty
siarczanowej w tych i innych reakcjach sulfatacji
(np. sulfatacji steroidów, glikozaminoglikanów,
glikolipidów i glikoprotein) jest 3'-fosfoadenozy-
no-5'-fosfosiarczan (PAPS) (rozdz. 24), zwany
również „aktywnym siarczanem”.
C. Sprzęganie z glutationem
Glutation (y-glutamylocysteinyloglicyna) jest tri-
peptydem składającym się z kwasu glutaminowe¬
go, cysteiny i glicyny (p. ryc. 3-3). Powszechnie
używanym skrótem dla glutationu jest GSH, ze
względu na obecność grupy sulfhydrylowej cy¬
steiny, która jest aktywną grupą wymienionego
peptydu. Wiele potencjalnie toksycznych, elektro-
filowych ksenobiotyków (jak np. niektóre karcy-
nogeny) ulega sprzęganiu z nukleofilowym GSH
zgodnie z reakcją:
R + GSH -» R —S —G
gdzie R oznacza elektrofilowy ksenobiotyk. En¬
zymy katalizujące reakcję są określone jako
^-transferazy glutationowe. Występują one
w dużych stężeniach w cytozolu hepatocytów,
w mniejszych zaś - w innych tkankach. W tkan¬
kach człowieka stwierdza są różnorodne S-trans-
ferazy glutationowe. Odznaczają się one odmien¬
nymi swoistościami substratowymi i można je
rozdzielić metodą elektroforetyczną lub innymi
technikami. Gdyby potencjalnie toksyczny kse¬
nobiotyk nie uległ sprzężeniu z GSH, mógłby się
swobodnie połączyć wiązaniem kowalencyjnym
z DNA, RNA lub białkami komórkowymi i stać
się przyczyną poważnego uszkodzenia komórki.
GSH jest więc ważnym ogniwem mechanizmu
obronnego przed określonymi związkami tok¬
sycznymi, np. niektórymi lekami lub karcynoge-
nami. Jeżeli stężenie GSH w takich narządach,
jak wątroba się zmniejszy (np. u szczurów przez
52. METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW 767
podanie im pewnych związków wiążących GSH),
to narząd taki wykaże zwiększoną wrażliwość na
toksyczne działanie różnych związków chemicz¬
nych normalnie inaktywowanych przez GSH.
Koniugaty glutationowe ulegają jeszcze dalszym
przemianom, zanim zostaną wydalone z ustroju.
Dochodzi bowiem do odszczepienia przez swo¬
iste enzymy grup glutamylowej i glicynylowej
glutationu oraz połączenia grupy aminowej po¬
zostającej reszty cysteinylowej z grupą acetylo-
wą (donorem grupy acetylowej jest acetylo-CoA)
W wyniku tych reakcji powstaje kwas mer kap¬
turowy - koniugat L-acetylocysteiny, który jest
wydalany z moczem.
Glutation spełnia jeszcze inne ważne funkcje
w komórkach ludzkich, oprócz udziału w prze¬
mianie ksenobiotyków.
1. Uczestniczy w rozkładzie potencjalnie tok¬
sycznego nadtlenku wodoru. Reakcja ta jest
katalizowana przez peroksydazę glutationową
(rozdz. 21).
2. Jest ważnąśródkomórkową substancją redu¬
kującą, pozwalającą utrzymać grupy SH enzy¬
mów w postaci zredukowanej; funkcja ta zo¬
stała omówiona w rozdz. 21. Udział glutationu
w powstawaniu niedokrwistości hemolitycznej
spowodowanej niedoborem dehydrogenazy
glukozo-6-fosforanowej omówiono w rozdz.
21 i 51.
3. Uczestniczy jako substancja przenośnikowa
w przezbłonowym transporcie aminokwasów
w nerkach. Pierwsza reakcja tego cyklu jest na¬
stępująca:
Aminokwas + GSH -> y-Glutamylowa pochodna
aminokwasu + Cysteinyloglicyna
Reakcja ta pomaga w przezbłonowym transpor¬
cie pewnych aminokwasów. Aminokwas ulega
następnie odszczepieniu od kompleksu z GSH,
po czym zachodzi resynteza GSH z cysteinylogli-
cyny. Enzym, który katalizuje tę reakcję, nazywa
się y-glutamylotransferazą (GGT). Występuje
on w błonach plazmatycznych komórek kanali¬
kowych nefronów i przewodzików żółciowych
oraz w siateczce śródplazmatycznej hepatocytów.
Oznaczanie tego enzymu ma znaczenie diagno¬
styczne, jest on bowiem uwalniany z hepatocytów
do krwi w różnych chorobach wątroby i dróg żół¬
ciowych.
D. Inne reakcje
Spośród innych reakcji drugiej fazy przemiany
ksenobiotyków najważniejsze są reakcje acetyla-
cji i metyłacji.
1. Acetylacja. Reakcję acetylacji ilustruje rów¬
nanie:
X + Acetylo-CoA -> Acetylo-X + CoA
gdzie X oznacza ksenobiotyk. Podobnie jak w in¬
nych reakcjach acetylacji donorem aktywnego oc¬
tanu jest acetylo-CoA. Reakcje te są katalizowa¬
ne przez acetylotransferazy, występujące w cy-
toplazmie komórek różnych tkanek, a zwłaszcza
wątroby. Izoniazyd - lek stosowany do leczenia
gruźlicy - ulega acetylacji. Ponieważ istnieją po-
limorficzne postacie acetylotransferaz, wśród lu¬
dzi wyróżnia się osoby odznaczające się małą lub
dużą wydajnością procesu acetylacji. Osoby
o małej wydajności acetylacji odznaczają się ma¬
łym klirensem leków, np. izoniazydu, przez co są
one bardziej narażone na ich toksyczne działanie.
2. Metylacja. Kilka ksenobiotyków jest mety-
lowanych przez metylotransferazy. Donorem gru¬
py metylowej w tych reakcjach jest S-adenozylo-
metionina (ryc. 29-17).
NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW PRZEMIANY
KSENOBIOTYKÓW MAJA WPŁYW WIEK,
PŁEĆ I INNE CZYNNIKI
Na aktywność enzymów metabolizujących kseno-
botyki wpływają różne czynniki. Aktywność tych
enzymów jest różna u poszczególnych gatunków
zwierząt. Oznacza to, że toksyczność lub karcy-
nogenność określonego ksenobiotyku u jednego
gatunku wcale nie oznacza, że jest on równie tok¬
syczny lub rakotwórczy u drugiego gatunku. Wy¬
stępują też znaczne, genetycznie uwarunkowane
różnice w aktywności wymienionych enzymów
między osobnikami tego samego gatunku. Aktyw¬
ność niektórych enzymów przemiany ksenobioty¬
ków zależy ponadto od wieku i płci osobnika.
Stosowanie różnych ksenobiotyków, takich
jak fenobarbital, PCB lub niektóre węglowodo¬
ry, może powodować indukcję enzymów. Waż¬
na jest więc informacja o zażywaniu przez daną
osobę związków indukujących syntezę enzymów
przemiany ksenobiotyków. Informacja ta jest
768 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
istotna dla oceny efektów biochemicznych kseno-
biotyków.
Metabolity niektórych ksenobiotyków mogą ha¬
mować lub zwiększać aktywność enzymów meta¬
bolizujących te związki. Powyższe fakty tłumaczą
występowanie znacznych różnic gatunkowych
lub między osobnikami tego samego gatunku
w zakresie reakcji na ksenobiotyki oraz potrzebę
indywidualizacji dawkowania leków u chorych.
Różne stany chorobowe (np. marskość wątroby)
mogą zmienić aktywność enzymów metabolizu¬
jących ksenobiotyki, co sprawia, że zachodzi po¬
trzeba zmiany dawkowania niektórych leków.
REAKCJE NA KSENOBIOTYKI MOGĄ
MIEĆ CHARAKTER FARMAKOLOGICZNY,
TOKSYCZNY, IMMUNOLOGICZNY
I RAKOTWÓRCZY
W ustroju ksenobiotyki ulegają przemianie wg
reakcji przedstawionych wyżej. Jeżeli kseno-
biotyk jest lekiem, może on zostać aktywowany
w wyniku reakcji fazy pierwszej. Jeżeli zaś lek
był farmakologicznie aktywny bez uprzedniej
metabolizacji, aktywność jego może się zmniej¬
szyć lub całkowicie zaniknąć w następstwie re¬
akcji fazy pierwszej. Ocena efektów działania le¬
ków jest przedmiotem badań farmakologicznych;
w tym miejscu należy podkreślić, że mechanizmy
działania leków mają przede wszystkim charak¬
ter biochemiczny. W tabeli 52-2 przedstawiono
cztery reakcje na leki spowodowane genetycz¬
nie uwarunkowanymi różnicami w aktywności
enzymów i w strukturze białek u różnych ludzi.
Badaniami w tym zakresie zajmuje się farmako-
genetyka (patrz niżej).
Polimorfizm wpływający na przemianę leków
może dotyczyć każdego enzymu uczestniczącego
w jego przemianie (także cytochromu P-450), każ¬
dego przenośnika (transportera) lub receptora.
Niektóre ksenobiotyki są niezwykle toksyczne
nawet w małych stężeniach w płynach ustrojo¬
wych (np. cyjanki). Kilka ksenobiotyków, w tym
również leki, nie jest jednak toksycznych nawet
wtedy, kiedy są podawane w dużych ilościach.
Efekty toksyczne ksenobiotyków są niezwykle
różnorodne; zostaną omówione bardzo krótko
tylko trzy ogólne rodzaje toksyczności związane
z przemianą ksenobiotyków (ryc. 52-1).
Tabela 52-2. Kilka wybranych reakcji na leki spowodowanych
mutacjami lub polimorfizmem enzymów lub białek1
Zmieniony enzym lub
zmienione białko
Reakcje lub skutki
spowodowane występowaniem
zmienionych strukturalnie
enzymów lub białek
Mutacje enzymu G-6-PD
(dehydrogenazy
glukozo-6-fosforanowej)
(MIM 305900)
Niedokrwistość hemolityczna
występująca po zażyciu nie¬
których leków, np. primachiny
(lek przeciwmalaryczny)
Mutacje w obrębie kanału
wapniowego (receptor
rianodynowy) uwalniającego
Ca2+ w siateczce śródplaz-
matycznej (MIM 180901)
Hipertermia złośliwa występują¬
ca po zastosowaniu niektórych
anestetyków (np. halotanu)
Polimorficzne postacie
CYP2D6 (MIM 124030)
Spowolniony metabolizm nie¬
których leków, np. debrizochiny,
ulegającej akumulacji w ustroju
Polimorfizm CYP2A6
(MIM 122720)
Upośledzona przemiana nikotyny
chroniąca przed uzależnieniem
tytoniowym
1 Niedobór G-6-PD został omówiony w rozdz. 21 i 51, a hiper-
termia złośliwa w rozdz. 48. Znany jest przynajmniej jeden gen
inny niż gen kodujący receptor rianodynowy, uczestniczący w pa¬
togenezie niektórych przypadków hipertermii złośliwej. Obecnie
znanych jest wiele innych reakcji na leki spowodowanych poli¬
morfizmem lub mutacjami enzymów.
Pierwszy z nich to uszkodzenie komórek przez
ksenobiotyki (cytotoksyczność). Może ono być na
tyle ciężkie, że kończy się śmiercią komórek. Ist¬
nieje wiele mechanizmów, za pośrednictwem któ¬
rych ksenobiotyki uszkadzają komórki. Spośród
nich należy wymienić kowalencyjne wiązanie
się reaktywnych postaci ksenobiotyków, po¬
wstałych w wyniku ich przemiany, z makroczą¬
steczkami komórkowymi. Tymi ostatnimi mogą
być DNA, RNA i białka. Jeżeli tymi makroczą¬
steczkami są białka lub enzymy niezwykle ważne
dla funkcji komórki, decydujące o jej przeżyciu,
np. enzymy fosforylacji oksydacyjnej lub białka
regulujące przepuszczalność błony plazmatycz-
nej, to łatwo wytłumaczyć szybkie wystąpienie
objawów toksycznych spowodowanych kseno-
biotykiem.
Drugi efekt toksyczny wynika z tego, że reak¬
tywny ksenobiotyk - wiążąc się z białkami - może
zmienić ich strukturę i antygenowość. Mówi się
wówczas, że ksenobiotyk działa jako hapten.
52. METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW 769
Transferaza glutationowa
Ryc. 52-1. Uproszczony schemat metabolizmu ksenobiotyku, prowadzącego do toksycznego lub immunologicznego uszkodzenia ko¬
mórek lub też do powstania raka. W tych przypadkach konwersję ksenobiotyku do reaktywnego metabolitu katalizują enzymy grupy
cytochromu P-450, zaś przekształcenie reaktywnego metabolitu (np. epoksydu) do metabolitu nieaktywnego - transferaza glutationowa
albo hydrolaza epoksydowa.
Oznacza to, że sam ksenobiotyk, jako mała czą¬
steczka, nie stymuluje powstawania przeciwciał
(wiążących ten ksenobiotyk). Jeżeli jednak zo¬
stały wytworzone takie przeciwciała (dzięki po¬
łączeniu się ksenobiotyku z białkami), to wiążą
się one ze swoim antygenem. W wyniku różnych
mechanizmów immunologicznych zachodzących
między tymi przeciwciałami i ksenobiotykiem
związanym przez makrocząsteczki komórkowe
dochodzi do poważnych zaburzeń normalnych
procesów biochemicznych komórki.
Trzeci efekt to łączenie się chemicznych kar-
cynogenów, po ich aktywacji, z DNA. Uważa
się, że taka reakcja może mieć duże znacze¬
nie w karcynogenezie chemicznej. Niektóre
związki chemiczne (np. benzo[a]piren) wyma¬
gają aktywacji przez monooksygenazy siateczki
śródplazmatycznej, aby stać się substancjami
rakotwórczymi (o takich substancjach mówi się,
że są pośrednio działającymi karcynogenami).
Aktywność tych monooksygenaz i innych enzy¬
mów przemiany ksenobiotyków występujących
w siateczce śródplazmatycznej decydują o tym,
czy takie związki stają się karcynogenami, czy
też ulegają detoksykacji. Inne związki chemicz¬
ne (np. substancje alkilujące) mogą bezpośred¬
nio reagować z DNA, bez uprzedniej aktywacji
w obrębie komórki (są to karcynogeny bezpo¬
średnio działające).
Enzym określany jako hydrolaza epoksydowa
jest przedmiotem zainteresowania ze względu na
to, że może mieć działanie ochronne w stosunku
do niektórych karcynogenów. Produktami mono¬
oksygenaz działającymi na niektóre prokarcyno-
geny są epoksydy. Epoksydy są wysoce reaktyw¬
ne i dlatego wykazują działanie mutagenne i (lub)
karcynogenne. Hydrolaza epoksydowa, podobnie
jak cytochrom P-450, występuje w błonach sia¬
teczki śródplazmatycznej. Przekształca ona epok¬
sydy do znacznie mniej reaktywnych dihydrodioli.
Reakcję tę przedstawia następujące równanie:
u OH OH
Epoksyd Dihydrodiol
FARMAKOGENOMIKA PRZYCZYNI SIE
DO ROZWOJU NOWYCH I BARDZIEJ
BEZPIECZNYCH LEKÓW
Jak już wspomniano, farmakogenetyka zajmuje
się wpływem zmian genetycznych na efekt dzia¬
łania leków. Dzięki poznaniu genomu ludzkiego
rozwinęła się nowa dziedzina nauki - farmakoge-
nomika. Obejmuje ona nie tylko farmakogenety-
kę, lecz również znacznie szersze obszary wiedzy.
770 CZĘŚĆ VI: WYBRANE ZAGADNIENIA
Interpretacja informacji uzyskanych z genomiki,
proteomiki, bioinformatyki i innych dziedzin, ta¬
kich jak biochemia i toksykologia, zapewne po¬
zwoli na syntezę nowych i bezpiecznych leków.
Ponieważ poznano sekwencję wszystkich naszych
genów kodujących syntezę białek, możliwe stanie
się poznanie nowych celów ataku dla leków.
Ponadto postępy w ww. dziedzinach pozwolą na
określenie roli polimorfizmów (wyjaśnienie tego
pojęcia znajduje się w rozdz. 49) enzymów i bia¬
łek w przemianie, działaniu i toksyczności leków.
Przy użyciu techniki analiz mikromacierzowych
stanie się możliwe zidentyfikowanie polimorfi¬
zmów chorych podatnych na toksyczne działanie
leków przed ich stosowaniem. Obecnie są już
dostępne czipy genowe przydatne do diagnostyki
genotypów P-450 (np. genu CYP2D6 uczestni¬
czącego w przemianie wielu leków przeciwdepre-
syjnych, przedwpsychotycznych, beta-blokerów
i niektórych chemoterapeutyków). Na rycinie 52-
-2 przedstawiono niektóre metody opracowywa¬
nia (projektowania) nowych leków. Celem tych
metod jest wytwarzanie nowych leków o większej
skuteczności i większym bezpieczeństwie ich sto¬
sowania oraz optymalne dostosowanie do potrzeb
każdego chorego (na podstawie jego profilu po-
Chemia
kombinatoryczna
Wybór docelowych miejsc działania leku
(geny, RNA, biafka, glikokoniugaty itp.)
I
Model budowy leku i oddziaływanie leku
z cząsteczkami docelowymi, udoskonalany
następnie na podstawie testów
ł
Różnorodne testy {in vitro, in vivo)
\
Możliwe testy kliniczne
Ryc. 52-2. Uproszczony schemat przedstawiający różne podej¬
ścia do projektowania nowych leków.
limorfizmu i innych czynników). Szacuje się, że
w USA umiera rocznie około 100000 ludzi w na¬
stępstwie ubocznych działań leków. Należy mieć
nadzieję, że w wyniku nowych badań w dziedzi¬
nach wymienionych na ryc. 52-2 i w innych dzie¬
dzinach zostaną wykryte nowe metody lecznicze
i rozpocznie się era terapii personalistycznej (opty¬
malnie dopasowanej do potrzeb każdego chorego).
STRESZCZENIE
• Ksenobiotyki są związkami chemicznymi obcy¬
mi dla człowieka, np. lekami, środkami konser¬
wującymi lub zanieczyszczeniami środowisko¬
wymi. Dotychczas rozpoznano ponad 200000
takich związków.
• Ksenobiotyki ulegają przemianie w dwóch fa¬
zach. Najważniejszą reakcją fazy I jest reak¬
cja hydroksylacji, katalizowana przez różne
monooksygenazy, znane również jako enzymy
grupy cytochromu P-450. W fazie II hydroksy-
lowane związki ulegają koniugacji z hydrofito¬
wym związkiem, takim jak kwas glukuronowy,
siarczan lub glutation. W wyniku reakcji fazy
I i II substancje lipofilowe zostają przekształ¬
cone w związki rozpuszczalne w wodzie, łatwo
wydalane z ustroju.
• Enzymy grupy cytochromu P-450 katalizują re¬
akcje, w których jeden atom tlenu, pochodzący
z cząsteczki 02, wbudowuje się do substratu,
w wyniku czego powstaje związek hydroksylo-
wany. W tych złożonych reakcjach uczestniczą
NADP i reduktaza NADPH-cytochrom P-450.
• Wszystkie enzymy grupy cytochromu P-450 są
hemoproteinami, wykazującymi duży zakres
swoistości substratowej i działającymi na wiele
substratów egzo- i endogennych. Są one najbar¬
dziej wszechstronne ze wszystkich dotychczas
poznanych biokatalizatorów.
• W tkankach człowieka znaleziono ok. 60 ge¬
nów kodujących cytochrom P-450. Enzymy
grupy cytochromu P-450 występują najczęściej
w siateczce śródplazmatycznej. Najbogatsze
w te enzymy są hepatocyty.
• Wiele enzymów grupy cytochromu P-450 uda¬
je się indukować. Ten fakt ma duże znaczenie
praktyczne, np. w interakcji leków.
• Istnieje również mitochondrialny cytochrom P-
-450, uczestniczący w biosyntezie cholesterolu
i steroidów. Cytochrom ten działa w obecności
52. METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW 771
adrenodoksyny - białka niehemowego, siar-
kowo-żelazowego, niezbędnego w izoformach
mikrosomalnych. Enzymy grupy cytochromu
P-450, dzięki ich aktywnościom katalitycznym,
odgrywają zasadniczą rolę w reakcjach komó¬
rek na związki chemiczne oraz w chemicznej
kancerogenezie.
Reakcje fazy II są katalizowane przez takie en¬
zymy, jak transferazy glukuronozylowe, siar¬
czanowe i S-glutationowe. W reakcjach tych
donorami odpowiednich grup są: kwas UDP-
-glukuronowy, PAPS (donor aktywnego siar¬
czanu) i glutation.
Glutation odgrywa ważną rolę nie tylko w re¬
akcjach fazy II, ale także jako śródkomórkowa
substancja redukująca oraz w transporcie nie¬
których aminokwasów do komórek.
Ksenobiotyki mogą wywołać wiele efektów
biologicznych, w tym reakcji farmakologicz¬
nych, immunologicznych i toksycznych, oraz
mogą uczestniczyć w kancerogenezie.
Dzięki postępowi w zakresie sekwencjonowa-
nia ludzkiego genomu rozwinęła się nowa dzie¬
dzina - farmakogenomika, dzięki której będzie
możliwe opracowanie nowych, racjonalnie
zaprojektowanych i bezpiecznych leków oraz
zwiększenie ich dostępności.
PIŚMIENNICTWO
Austin CP: The impact of the completed human
genome seąuence on the development of novel
therapeutics for human disease. Annu Rev Med
2004;55:1.
Borst P, Elferink RO: Mammalian ABC transporters
in health and disease. Annu Rev Biochem 2002;
71:537.
Evans WE, McLeod HL: Pharmacogenomics - drug
disposition, drug targets, and side effects. N Engl J
Med 2003; 348:538.
Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature
Committee. http://www.imm.ki.se/CYPalleles/
Kalow W, Grant DM: Pharmacogenetics. In: The Meta-
bolic and Molecular Bases of Inheńted Disease, 8lh
ed. Serwer CR et al (editors). McGraw-Hill, 2001.
Katzung BG (editor): Basic & Clinical Pharmacology,
9th ed. McGraw-Hill, 2004.
Lee WM: Drug-induced hepatotoxicity. N Engl J Med
2003; 349:474.
Szuromi P et al: Revisiting drug discovery. Science
2004; 303:1795. (This is the introduction to a series
of articles on drug development in this particular
issue of Science.)
Weinshilboum R: Inheritance and drug response. N Engl
J Med 2003; 348:529.
Wilkinson GR: Drug metabolism and variability among
patients in drug response. N Engl J Med 2005;
350:2211.
Dodatek
WYBRANE STRONY INTERNETOWE
Poniżej podano strony internetowe, które mogą
być użyteczne dla Czytelników. Z tych stron
korzystali przy różnych okazjach autorzy książ¬
ki. Większość stron pochodzi z USA, lecz wiele
z nich zawiera linki do stron międzynarodowych
i baz danych (np. dotyczących białek lub kwa¬
sów nukleinowych) oraz czasopism dostępnych
on-line.
R. K. Murray będzie wdzięczny Czytelnikom,
którzy natrafiwszy na inne użyteczne źródła in¬
formacji, prześlą ich adresy pocztą elektroniczną
(murray6745@rogers.com). Umożliwi to umiesz¬
czenie tych adresów w przyszłych wydaniach
książki.
Czytelnicy powinni być świadomi, że adresy
mogą ulec zmianie lub całkowicie zniknąć ze
spisu.
■ DOSTĘP DO PIŚMIENNICTWA
BIOMEDYCZNEGO
High Wire Press
(zawiera obszerną listę różnych czasopism z zakresu
biologii, medycyny itd.; podaje również obszerną listę
czasopism bezpłatnie dostępnych on-line)
http://highwire.stanford.edu/
National Library of Medicine
(wolny dostęp do Medline przez PubMed.)
http://www.nlm.nih.gov/
STRONY INTERNETOWE ZAWIERAJĄCE
OGÓLNE ŹRÓDŁA
• The Biology Project (z Uniwersytetu Arizona)
(zawiera doskonałe informacje dotyczące enzymów,
błon komórkowych itd.)
http://www.biology.arizona.edu/default.html
• Harvard University Department of Molecular and Cel-
lular Biology Links
(zawiera liczne użyteczne linki)
http://mcb.harvard.edu/BioLinks.html
STRONY INTERNETOWE ZAWIERAJĄCE
SPECYFICZNE DANE
• American Heart Association
(zawiera dużo użytecznych informacji na temat ży¬
wienia, roli różnych biocząsteczek, np. cholesterolu
i lipoprotein w chorobach serca, oraz na temat waż¬
niejszych chorób sercowo-naczyniowych)
http://www.americanheart.org/
• Cancer Genome Anatomy Project (CGAP)
(jest to program interdyscyplinarny do konstrukcji
informacji i technologii potrzebnych do określenia
anatomii molekularnej komórek rakowych)
http://www.cgap.nci.nih.gov.
• Carbohydrate Chemistry and Glycobiology: AWeb tour
(zawiera linki do chemii organicznej, chemii węglo¬
wodanów i glikobiologii)
http://sciencemag.org/feature/data/carbohydrates. shl
• European Bioinformatics Institute
(jest kontynuacją bazy danych EMBL i SWISS-Prot,
jak również innych baz danych)
http://ebi.ac.uk/index.html
• GeneCards
(zawiera bazę danych dotyczących ludzkich ge¬
nów, ich produktów i udziału w patogenezie chorób,
z Weizmann Institute of Science)
http://www.genecards.org/
• GeneTests
(źródło informacji z genetyki medycznej, zawierające
zwięzłe informacje dotyczące chorób genetycznych)
http://www.geneclinics.org/
DODATEK 773
Genes and Disease
(kompendium obejmujące podstawy genetyczne wie¬
lu chorób)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/disease/
Howard Hughes Medical Institute
(stanowi wspaniały bieżący informator z zakresu ba¬
dań biochemicznych; jest zwięzłym archiwum postę¬
pów naukowych)
http://www.hhmi.org/
Humań Gene Mutation Database
(zawiera zestawienie mutacji ludzkich genów sporzą¬
dzone przez Institute of Medical Genetics w Cardiff,
Wales)
http://www.hgmd.cf.ac.uk/hgmdO.html
Humań Genome Project Information
(pochodzi z Programu Ludzkiego Genomu Amery¬
kańskiego Departamentu Energii; zawiera również
informacje o genomice i o genomie drobnoustrojów)
http://www.doegenomes.org/
Karolińska Institute: Diseases and Disoders
(zawiera rozległe linki do informacji o chorobach me¬
tabolicznych i spowodowanych żywieniem)
http://www.mic.ki.se/Diseases/C18.html
Lipids Online
(źródło informacji pochodzące z Baylor College of
Medicine, przeznaczone dla lekarzy zajmujących się
opieką zdrowotną lub zainteresowanych miażdżycą,
dyslipemiami lub przemianą lipidów)
http://lipidsonline.org/
MITOMAP
(baza danych dotyczących ludzkiego genomu mito-
chondrialnego)
http ://www.mitomap. org/
National Center for Biotechnology Information
(informacje o biologii molekularnej oraz wpływie
procesów molekularnych na zdrowie i rozwój chorób
u ludzi)
http://ncbi.nlm.nih.gov/
National Humań Genome Research Institute (zawiera
obszerne informacje o Projekcie Genomu Ludzkiego
i kolejnych badaniach w tym zakresie)
http://www. genome. go v/
National Institutes of Health
(zawiera linki do poszczególnych instytutów i ośrod¬
ków wchodzących w skład NIH i obejmuje duży za¬
kres badań biochemicznych)
http://www.nih.gov/
Office of Rare Diseases
(zawiera informacje o ponad 7000 rzadkich chorób oraz
o bieżących badaniach prowadzonych w tym zakresie)
http://rarediseases.info.nih.gov/
OMIM (Online Medelian Inheritance in Man)
(jest to wspaniałe, zwięzłe źródło wiadomości na te¬
mat ludzkich chorób uwarunkowanych genetycznie,
zainicjowane przez dr. Wiktora A. McKusicka, uwa¬
żanego przez wielu za ojca nowoczesnej genetyki
człowieka)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?
db=OMIM
Protein Data Bank
(jest to światowa składnica danych dotyczących ob¬
róbki i rozmieszczenia trójwymiarowych biologicz¬
nych makrocząsteczek)
http: //www. rcsb. org/pdb/
Society for Endocrinology
(ma na celu promocję edukacji i badań w dziedzinie
endokrynologii dla dobra społeczeństwa)
http://www.endocrinology.org/default.htm
Society for Neuroscience
(zawiera użyteczne informacje dotyczące różnych za¬
gadnień neurologicznych)
http://web.sfn.org
The Broad Institute
(jest kolaboracją MIT, Harwardu ze szpitalami afilio¬
wanymi oraz Instytutu Whitehead, utworzoną w celu
przeniesienia osiągnięć genomiki do medycyny)
http://www.broad.mit.edu/
The Institute for Genetic Research
(zawiera sekwencje genomów różnych bakterii i inne
informacje)
http://www.tigr.org/
The Protein Kinase Resource
(zawiera informacje o enzymach należących do rodzi¬
ny kinaz białkowych)
http://www.kinasenet.org/
The Signaling Gateway
(jest to zwięzłe źródło informacji dla badaczy zainte¬
resowanych transdukcją sygnałów)
http://www.signalling-gateway.org/
The Wellcome Trust Sanger Institute
(jest to ośrodek badania genomu utworzony w celu
wzbogacenia naszej wiedzy o genomach szczególnie
poprzez analizę produktów sekwencjonowania typu
„large-scale”)
http://www.sanger.ac.uk.
CZASOPISMA BIOCHEMICZNE
I PRACE PRZEGLĄDOWE
Poniżej podano listę niektórych czasopism bio¬
chemicznych i serii prac przeglądowych, jak
również niektórych czasopism biomedycznych
zawierających prace o tematyce biochemicznej.
Czasopisma biochemiczne i biologiczne zwykle
mają już swoją stronę internetową, na której czę¬
sto są podane użyteczne linki. Niektóre z nich są
dostępne bezpłatnie.
Posługując się wyszukiwarką, Czytelnik może
uzyskać bliższe informacje o stronach interneto¬
wych niżej podanych czasopism:
774 DODATEK
Annual Reviews of Biochemistry, Celi and Develop-
mental Biology, Genetics, Genomics and Humań Ge-
netics
Archives of Biochemistry and Biophysics (Arch Bio-
chem Biophys)
Biochemical and Biophysical Research Communica¬
tions (Biochem Biophys Res Commun)
Biochemical Journal (Biochem J)
Biochemistry (Biochemistry)
Biochemistry (Moscow) (Biochemistry [Mosc])
Biochimica et Biophysica Acta (Biochim Biophys Acta)
Biochimie (Biochimie)
European Journal of Biochemistry (Eur J Biochem)
Indian Journal of Biochemistry and Biophysics (Indian
J Biochem Biophys)
Journal of Biochemistry (Tokyo) (J Biochem [Tokyo])
Journal of Biological Chemistry (J Biol Chem)
Journal of Clinical Investigation (J Clin Invest)
Journal of Lipid Research (J Lipid Res)
Naturę (Naturę)
Naturę Genetics (Nat Genet)
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
(Proc Natl Acad Sci USA)
Science (Science)
Trends in Biochemical Sciences (Trends Biochem Sci)
Postępy Biochemii \przyp. red.]
Skorowidz
Abetalipoproteinemia 269
Absorbancja 71
Aceruloplazminemia 717
Acetoacetylo-CoA 234
Acetooctan 233
Acetylo-CoA 163, 171, 208, 232,
245,247
Acetyloliponoamid 190
Achondroplazja 677
Acydemia izowalerianianowa 321,
323
Acyduria argininobursztynianowa
308
- dwukarboksylowa 239
- metylomalonowa 207
- orotanowa 362, 372
- urokanianowa 314
Acylacja triozofosforanów 259
Acyloglicerole metabolizm 257
Acylokamityna 230
Acylotransferaza 1 -acyloglicerolo-
-3-fosforanowa 259
- diacyloglicerolowa (DGAT) 259
- glicerolo-3-fosforanowa 259
- lecytyna : cholesterol (LCAT)
262,272,288
- monoacyloglicerolowa 259
Adaptacja człowieka do dużych
wysokości 59
S-Adenozylometionina 330,336
Adenozyno-5'-monofosforan 199
Adenozynofosforan cykliczny
(cAMP) 198, 199, 201
Adenozynotrifosforan (ATP) 113
ADH patrz Hormon
antydiuretyczny
Adhezyny 663
Adrenalina 208, 214, 281,546
Adrenoleukodystrofia noworodków
615
Agrekan 664, 676
Aktyna 662, 684, 751
-F 703
-G 703
Aktyna, interakcja z miozyną 697
Aktywator plazminogenu
tkankowy 736
Akwaporyny 521
Alanina 211, 296, 315
a-Alanina 328
p-Alanina 328
p-Alaninoimidazol 328
Albumina 664, 715
Albuminuria 664
Aldehyd octowy 276
Aldolaza A, niedobór dziedziczny
193
- B 223
Aldosteron 537, 538
Alkaloza metaboliczna 305
Alkaptonuria 317
Alkoholizm chroniczny 276
- wpływ na wątrobę 276
Allopurinol 359, 367
Alteplaza 737
Amid kwasu nikotynowego 599
Aminocukry 144, 224
Aminofosfolipidy 513
p-Aminoizomaślan 371
Aminokwas(y) 17, 165
- glukogenne 171
- katabolizm 311
-ketogenne 171
- przemiana w wyspecjalizowane
produkty 328
- występujące w białkach 18
- zapotrzebowanie u człowieka 295
a-Aminokwas 19
y-Aminomaślan 334, 336
Aminomutaza leucynowa 601
Aminopeptydazy 580
Aminotransferazy 183
Aminy katecholowe 545
Amoniak, wydalanie 309
- zatrucie 304
AMP patrz
Adenozynomonofosforan
p-Amyloid 49
Amylopektyna 145
Amyloza 145
Anabolizm 113
Analbuminemia 710
Analogi glutaminy 363
- nukleotydów w chemioterapii
359
Androgeny, synteza 540
Androstendion 540
Anemia patrz Niedokrwistość
Angiotensyna I 552
-II 551,552
-III 552
Ankiryna 751
Anseryna 328
Antybiotyki 143,455
Anty koagulanty kumaryno we 735
Antykodon 440
AntymycynaA 133
Antyoksydanty 158, 747
arAntyproteinaza 717
Antytrombina 734
Aparat Golgiego 609, 623, 654
Apoferrytyna 713
Apolipoproteina(y) 267, 281
- E 49
Apomioglobina 54
Apoproteiny 267
Apoptoza 262,416
Arachidonian 251, 252
Arginaza 309
Arginina 307,314,330, 336
Argininobursztynian 305
Asparagina 296, 311
Asparaginaza 305
Asparaginian 296, 311
Aspartyloglikozoaminuria 652
Aspiryna patrz Kwas
acetylosalicylowy
Atraktylozyd 133
Atrofia mięśniowa rdzeniowo-
-opuszkowa 396
- zakrętowa siatkówki 314
Autooksydacja lipidów 158
776 SKOROWIDZ
Autoradiografia 504
Azatiopryna 359
Azot, wydalanie nadmiaru 302
Badanie(a) biochemiczne 4
- przesiewowe wysokowydajne 71
Bakteriofag 504
Barbiturany 133
Barwniki żółciowe 337
- - obecność w moczu 350
Białaczka 741
Białko(a) adaptorowe 526
- aktywatora katabolicznego
(CAP) 460,462
- aktywujące guaninę 613
- ApoE 49
- błon komórkowych 630
erytrocytu 750
- błonowe 527
- integralne 38, 513
- modyfikacje potranslacyjne 627
-peryferyjne 513
- - transportujące kwas tłuszczowy
268
- C 735
- CD 59 650
- chaperonowe patrz Białko
czaperonowe
- C-reaktywne 709
- czapeczkowe 662
- czaperonowe 47, 612
- dimeryczne 44
- dojrzewanie 49
- dokujące 616, 617
- fałdowanie 46,48, 51
- fazy syntezy 447
- fibrylame 38,49
- fosforylacja 99
- fuzyjne 74, 76
- globulame 38
- hemowe 53
-HFE714
- identyfikacja 35
-jednokrotnie przezbłonowe 751
- klasyfikacja 38, 51
- koregulatorowe 576
-Ku 415
- macierzy 610
- peroksysomalnej 615
- mięśni 690
- modelowanie molekularne 46
- modyfikacje potranslacyjne 38
- monomeryczne 44
- MPR-2 359
- niehistonowe 387
Białko(a), określanie czystości
preparatu 30
- - struktury pierwszorzędowej 26
- opiekuńcze 47
- osocza 630, 706
- - polimorfizm 708
- synteza w wątrobie 707
- ostrej fazy 709
ujemne 592
- p300 575
- pasma 1 750
- podatność na degradację 301
- POMC 549
- powiązane z mediatorami 576
- prekursorowe 719
- prionowe 48, 51
- PrPc 48,51
- przenoszące acyl (ACP) 242
- przylegania 663
-Ran 613, 614
- regulujące transkrypcję 473
- rozfałdowanie 621, 622
- rozprzęgające 133
- rozpuszczalne 38
- sekwencjonowanie 32
- sortowanie 609, 623
- stabilizujące hemoglobinę a
(AHSP) 49
- STAT 568
- struktura wyższych rzędów 39
- strukturalne 656
- supresorowe p53 416
- swoiste 656
- szoku termicznego 47
- tau 704
- transdukcji sygnałów
i aktywacji transkrypcji 568
- transport wewnątrzkomórkowy
609
- transportujące 554
- trawienie i wchłanianie 580
- wiążące ciężki łańcuch
immunoglobuliny 621
--CREB 564, 575
- - kwas tłuszczowy 268
- mannozę 651
- - sekwencję HRE 563
- - sterolowy element regulacyjny
(SREBP) 286
- witaminę D 545
- włókienkowe 49
- występujące w kości 672
- zawierające hem 338
- zwijanie 47
- żelazowo-siarkowe 127
Białko(a), 4.1 751
Biblioteka cDNA491, 504
- genomowa 491, 504
Biegunka 653
Bilans azotowy ustroju 301,585
Bilirubina 346, 353
- dobowe wytwarzanie
u człowieka 346
- postać pośrednia i bezpośrednia
350
- sprzęganie z kwasem
glukuronowym 348
- stężenie w osoczu 338
- wydzielanie do żółci 349
Biliwerdyna 346
Biochemia, definicja 1,4
- związek z medycyną 1,4
Biocytyna 605
Biocząsteczki amfipatyczne 8
Bioenergetyka 111
Bioinformatyka 102, 106
-bazy danych 107
Biologia obliczeniowa 103
Biomedycyna, realizowane
projekty 107
Biorcy uniwersalni 753
Biosynteza aminokwasów 296
- białka na matrycy mRNA 449
- cholesterolu, etapy 282, 285
- estrogenów 542
- fosfatydylocholiny 259
- fosfatydyloetanoloaminy 259
- fosfolipidów 258
- gangliozydów 263
- glicerolofosfolipidów eterowych
260
- hemu 340, 353
- kardiolipiny 259
- kwasów tłuszczowych 241
- - żółciowych 290
- kwasu deoksyrybonukleinowego
409
- mewalonianu 282
- mocznika 302,305
- nukleotydów purynowych
i pirymidynowych 362
- pirymidyny 366
- pochodnych poliizoprenowych 284
- prostanoidów 252
- proteoglikanów 665
- triacyloglicerolu 258, 259
Biotyna 241, 605
2,3-Bisfosfoglicerynian (BPG) 59
4,5-Bisfosforan
fosfatydyloinozytolu 154
SKOROWIDZ 777
Błąd metabolizmu wrodzone 2
Błona(y) komórkowe, budowa 626
--skład 508
- model płynnej mozaiki 515
- plazmatyczne 507
- - struktura 515
-podstawne 658, 663
- struktura i funkcja 507
-sztuczne 514
Błonnik 146
Botulina B 626
Brefeldyna A 625, 626
Buforowanie 14
Bufory 16
Bursztynylo-CoA 338
Celiakia 578
Celuloza 146
Centromer 392
Ceramid 155, 262
Cerebrozydy 263
Ceruloplazmina 715, 717
Chaperony patrz Czaperony
Chemia kombinatoryczna 75
Chemioterapia złożona 741
Chityna 146
Chloraminy 760
Chlorofil 53, 338
Chluria 350
Cholekalcyferol 592
Cholesterol 156, 157, 160, 164,
282, 509
- biosynteza 282, 285
- obniżanie stężenia 292
- transport między tkankami 287
- - odwrócony 272, 282, 288
- wydalanie z organizmu 288
Cholina, niedobór 276
Chondrodysplazje 677
Chondronektyna 677
Choroba(y) Alzheimera 49
- beri-beri 597
- Creutzfeldta-Jakoba 48, 51
-Crohna 253,709
- demielinizacyjne 264
- dotyczące kości metaboliczne
i dziedziczne 675
-genetyczna 415
- - glikogenu 195, 203
- - glikolipidów 257
--diagnostyka 73
- wskaźniki diagnostyczne 34
- Hartnupa 320
- Kennedyego 396
- Keshan 299
Choroba(y) konformacyjne 718
- - lipidów 264
- marmurkowa kości 675
- McArdle'a 700
-Menkesa 715, 716
- metaboliczne 311, 327
- wykrywanie 309, 310
- „mięśnie-oko-mózg” 650
- moczu o zapachu syropu
klonowego 323
- niedokrwienna serca 291
- patogeneza 102
- podłoże biochemiczne 3
- prionowe 48
- Refsuma 239
- - postać niemowlęca 615
- skóry 661, 704
- „skręconych (stalowych)”
włosów 715, 716
- spichrzania cystyny 315
- szalonych krów 48
- uwarunkowane zaburzoną
glikozylacją wrodzone 649
- von Gierkego 370
-wątroby 710
-Wilsona 715, 716
- wtrętów komórkowych 651
- wymiotna jamajska 239
- z chromosomem X 500
- ziamicza przewlekła 759
- związana z biosyntezą pirymidyn
362
- - erytrocytami 742
- nieprawidłowościami
w błonach 528
- - zaburzeniami w biosyntezie
glikoprotein 649
- zwyrodnieniowa stawów 656
Chromatografia adsorpcyjna 28
- bibułowa 26
- cieczowa 28
- cienkowarstwowa 26
-jonowymienna 28
- kolumnowa białek 26
- oddziaływań hydrofobowych 29
- powinowactwa 29, 74
- wysokociśnieniowa cieczowa
(HPLC)30
Chromatydy siostrzane 392
- - wymiana 400
Chromatyna aktywna
transkrypcyjnie 391
- nieaktywna transkrypcyjnie 391
- skład 387
-struktura 389,467
Chromosomy, budowa 392
- interfazowe 389
Chylomikrony 166, 266, 269, 281
- resztkowe 270
Chymotrypsyna 69
Ciała ketonowe 164, 167, 175,
229, 233, 235
Ciałka Heinza 747
Cistron 459
Ciśnienie hydrostatyczne 707
- osmotyczne 707
Crossing-over 398
Cukry 139, 148
- izomery 140
- nukleotydowe 632
Cukrzyca 163, 176,266, 280
- typu drugiego 239
- - pierwszego 215, 241
Cykl ATP/ADP 115
- CoQ 127
- Cori 211
- glukozowo-alaninowy 211
- Krebsa patrz Cykl kwasu
cytrynowego
- kwasów trikarboksylowych patrz
Cykl kwasu cytrynowego
- kwasu cytrynowego 163, 171,178
- mlekowego 211
- lipolizy i reestryfikacji w tkance
tłuszczowej 277
- mocznikowy zaburzenia
metaboliczne 307
- pentozowo-fosforanowy 747
Cyklaza adenylanowa 278, 560
Cykliny 409
Cykloheksymid 456
Cyklooksygenaza 252
Cynk 718
Cysteina 297, 315, 327, 330, 336
Cystynolizynuria 315
Cystynoza 315
Cystynuria 315
Cytochrom(y) 53, 120
-aa3 119
- P-450 118, 122, 342,617, 763
Cytoszkielet 680
- funkcje komórkowe 702
Cytrulina 305, 306
Cytrynian 179, 183
Czaperony 47,49, 612, 620
Czop fibrynowy 729
Czynnik(i) aktywujący płytki
(PAF) 257, 261,265
- hemotaktyczne 756
- kappa-B jądrowy 710
778 SKOROWIDZ
Czynnik(i) krzepnięcia I 733
- osoczowe 731,741
- - V 732
Leiden 735
--VII 735
- - VIII 729, 735
- - X 731, 732
- XI 729
-XII 729, 731,734
-XIII 734
- przyspieszający zamieranie 650
- wzrostu fibroblastów 678
- - hemopoetyczne 744
Dawcy uniwersalni 753
Deaminaza adenozynowa,
niedobór 362, 370, 761
Degradacja białek 302, 309
Dehydrogenaza aldehydowa 119,
276
- alkoholowa 276
- gliceraldehydo-3-fosforanowa
186
- glicerolo-3-fosforanowa 259
- glukozo-6-fosforanowa 219
- - niedobór 217, 747
- 15-hydroksyprostaglandynowa
253
- izocytrynianowa 244
- izowalerylo-CoA 323
jabłczanowa dekarboksylująca
244
- L-glutaminianowa 303
- mleczanowa 73
- - niedobór dziedziczny 193
- pirogronianowa 190
- - regulacja przez acylo-CoA 247
- prolinowa 311
- sorbitolowa 223
- zależne od flawin 120
NAD(P)+ 71
Dekarboksylaza
uroporfirynogenowa 340
Dekstryny 146
Deoksycukry 144
Deoksynojirimycyna 645
Deoksyrybonukleazy 385
Deoksyrybonukleotydy 355
Deoksyryboza 139, 143
Desaturacja 249
Desaturaza 249,255
Desmosterol 283
Desorpcja laserowa wspomagana
matrycą (MALDI) 34
Detergenty 510
Detoksykacja 763
1,2-Diacyloglicerol 259
Diagnostyka prenatalna 500
Diagram Ramachandrana 39,40, 51
Dieta, wpływ na obniżenie stężenia
cholesterolu 291
Difosfodolichol 639
Difosforan dimetyloallilu 283
- famezylu 283
- geranylu 283
- tiaminy 219, 597
Difosfotiamina 190
Digitoksyna 523
Dihydrotestosteron 540, 542
Dikumarol 595
Dimerkaprol 133
Dinitrofenol 133, 134
Dinukleotyd 360
- flawinowy 598
Dioksygenaza 122
Dipalmitoilofosfatydylocholina 263
Dipalmitoilolecytyna 153
Dipeptydy P-alanylowe 328
Disacharydazy 579
Disacharydy 139
Dna moczanowa 362, 370
Dolichol 158, 283,640
Dopamina 332, 546
Dyfuzja bierna 517
-boczna białek 513
- czysta 517
- prosta 517
-ułatwiona 517, 521
- - mechanizm „ping-pong” 522
Dynamina 526
Dyneina 704
Dysfunkcja nerek 137
Dyslipoproteinemia 293
Dysmutaza ponadtlenkowa 123,
746
Dysocjacja wody 10
Dyspersja elektrosprejowa (ESI)
34
Dystrofia mięśni typu Duchenne’a
690
- mięśniowa wrodzona 650
- miotoniczna 396
- typu Beckera 691
Dystrofina 691
Efekt Bohra 58, 60
Egocytoza 526
Egzonukleaza 385, 504
Egzopeptydazy 580
Eikozanoidy 151
Ekscynukleaza 504
Ekson 394,417,433,439, 504
Eksportyny 613
Ekspresja genu regulowana 459
Elastyna 660, 678
Elektrofile 9
Elektroforeza 707, 748
- dwukierunkowa 31
- w żelu poliakrylamidowym
(PAGE) 30
Elektrorozpylanie 34
Eliptocytoza dziedziczna 751
Elongacja 249
- łańcuchów kwasów
tłuszczowych 245
Elongaza kwasu tłuszczowego 245
Emulsje 160
Encefalopatia(e) gąbczaste zakaźne
48
- spowodowana hiperbilirubinemią
350
- Wemickego 598
Endocytoza 524, 525
Endoglikozydazy F i H 634
Endonukleaza(y) 385, 504
- apirymidynowa 414
- apurynowa 414
- restrykcyjne 385,486
Energia aktywacji 79
- swobodna Gibbsa 78, 111
Enhancery 468,484
Enolaza 188
Entaktyna 664
Entalpia swobodna 78, 111
Entropia 111
Enzym(y) 9
- aktywowane przez metal 65
- allosteryczne 96
- analiza aktywności katalitycznej
70
degradacja 94
- flawoproteinowe 119
- grupy cytochromu P-450 763,766
- jabłczanowy 244
- kinetyka 77
- klasyfikacja 64
- mechanizm działania 63
-naprawcze 415
- nazewnictwo 64
- osocza funkcjonalne 72
- - niefunkcjonalne 73
- P-450scc 537
- proteolityczne 580
- restrykcyjne 486,487, 505
-rozgałęziający 197
SKOROWIDZ 779
Enzym(y) synteza 93
- usuwający rozgałęzienia 198
- w diagnostyce chorób
genetycznych 73
--klinicznej 73, 75
- wątrobowe zawierające żelazo
122
- zależne od witaminy B!2 601
- związane z metabolizmem
węglowodanów 209
Enzymologia pojedynczej
cząsteczki 70
Epidermoliza pęcherzowa 660
3- Epimeraza rybulozo-5-
-fosforanowa 219
4- Epimeraza 223
Epinefryna 214, 545
Epoksydaza skwalenowa 283
Ergokalcyferol 592
Ergosterol 157
Erytrocyty, czas życia 743
- funkcje 741
Erytropoetyna 743
- rekombinowana 645, 744
Estradiol 543
Estrogeny 523
Estron 543
Estryfikacja triacylogliceroli
w tkance tłuszczowej 277
Etionina 276
Euchromatyna 391
Fagi 489
Fagocytoza 525
Fałdowanie białek 46, 48, 51
Farmakogenetyka 769
Farmakogenomika 107, 769
Fawizm 225
Fenotyp Bombay 753
Fenyloalanina 298, 317
Fenyloketonuria klasyczna 317
Ferroportyna 712
Ferrytyna 454, 583, 713
Fibraty 292
Fibronektyna 659, 662
Fibrylina 661
Fibryna 728, 741
Fibrynogen 733
Filamenty 704
Filtracja żelowa 27, 29
Fingerprinting 504
Fitaza 582
Fitochinon 595
Flawoproteina 126
- przenosząca elektrony 231
Fluorescencja porfiryn 342
Fluorooctan 179
5-Fluorouracyl 367
Foliany 603
- niedobór 604
Footprinting 504
Formy laza (formamidaza)
kinureinowa 320
Fosfageny 115
Fosfataza(y) białek 98, 199, 202
- fosfoprotein 564
Fosfatydan 259
Fosfatydylocholina, biosynteza 259
F osfatydy loetanoloamina,
biosynteza 259
Fosfatydyloinozytol 154, 257
Fosfatydyloseryna 259
Fosfoacyloglicerole 153
Fosfo-l,2-diacyloglicerol 259
Fosfodiester 360
Fosfodiesteraza 198, 564
Fosfodihydroksyaceton 260
Fosfoenolopirogronian 205
Fosfofruktokinaza 188, 189,208
-1 209
-2 210
- mięśniowa, niedobór 193
Fosfohydrolaza fosfatydanowa 259
Fosfolipaza Cp 739
- rodzaje 261
Fosfolipidy 149, 153, 269, 509,
512,513,627
- biosynteza 258
- znaczenie biomedyczne 257
Fosfoproteiny 563
- kwaśne 673
Fosforan(y) keratyny 700
- niskoenergetyczne 114
- pirydoksalu 600
-wysokoenergetyczne 114
Fosforybozylotransferaza
hipoksantynowo-guaninowa 370
Fosforylacja białek 99
- oksydacyjna 125
- wielomiejscowa 202
Fosforylaza glikogenowa 197
- glikogenowa, kontrola
w wątrobie i mięśniach 198
- nukleozydów purynowych,
niedobór 362, 370
Fosfotriozy 188
Fotoliza 544
Fototerapia nowotworowa 342
Fragment Okazaki 403, 404
Fruktokinaza 223
Fruktoza 189, 223, 228
- nietolerancja dziedziczna 227
- zaburzenia metabolizmu 227
Fruktozo-1,6-bisfosfataza 205, 219
Fruktozo-2,6-bisfosfataza 69, 210
Fruktozo-1,6-bisfosforan 205
Fruktozo-2,6-bisfosforan 210
Fruktozo-6-fosforan 205
Fruktozuria samoistna 217, 227
Fukozydoza 652
Fumaran 307
Fumaryloacetoacetaza 316
Galaktokinaza 223
Galaktoza 139, 223, 227, 228
Galaktozemia 217, 227
Galaktozoamina 224
Galaktozydazy 634, 654
Galaktozyloceramidy (GalCer)
155, 263
Gangliozydy 155, 263
Gastroenteropatia z utratą białek
709
Gen(y) celowane, zakłócanie
działania 501
- dziedziczenie 374
- ekspresja regulowana 457
- p-globiny 497
- indukowany 459
- konstytutywne 459
- mapowanie 495
- mitochondrialne 397
- przekształcone 400
- rearanżacje 400
- reporterowe 472
- wybiórcze, usunięcie
z genomu 501
Genom 104
- haploidalny 392, 394
- ludzki 4
Genomika35, 104
Giraza bakteryjna 378
Gliburyd 213, 239
Glicerol 207, 277
Glicerolofosfolipidy eterowe,
biosynteza 260
Glicyna 297, 314, 328,335,338
Glicynuria 314
Glikacja 630
Glikan, wiązanie wirusów
i bakterii 653
Glikobiologia 630
Glikoforyna 148, 636, 751
Glikogen 139, 146, 203,207
- biosynteza 195
780 SKOROWIDZ
Glikogen, zaburzenia spichrzania
203
- zapasy w mięśniu 700
- zawartość w mięśniach 195
Glikogenina 197
Glikogenozy 203
Glikokortykoidy 214, 536
- synteza 538
Glikolipidy 149, 155
Glikoliza 163, 187, 193, 208
Glikomika 630, 653, 654
Glikoproteina(y) 38,147, 630, 654
- bogate w mannozę 640, 643
- funkcje 631
- klasy 635
- Notch 653
- W-wiązane 638
Glikosfingolipidy 149, 155, 257,
263,509
Glikozoaminoglikany 147,656, 671
rodzaje 664, 678
Glikozydazy 634
Glikozydy nasercowe 143
Glikozylacja 643, 644
Glikozylacja kotranslacyjna 618
N-Glikozylazy 414
Globina 346
- wiążąca hormony płciowe 555
- - kortykosteroidy 555
- - testosteron i estrogeny 555
--tyroksynę 555
Glukagon 208,213,248
Glukokinaza 188
Glukoneogeneza 164, 166, 189,
205, 208
Glukoza 139, 148, 163, 171,207
- próg nerkowy 214
- stężenie we krwi 205, 211
- transport w komórkach 524
wychwyt przez wątrobę 173
- zaburzenia tolerancji 215
- zużycie przez tkankę tłuszczową
278
Glukozo-6-fosfataza 198, 207
- niedobór 370
Glukozo-6-fosforan 188, 195, 199,
207
Glukozoamina 224
Glukozuria 214
Glukozyloceramidy (GlcCer) 155,
263
Glukuronian 221
Glukuronidacja ksenobiotyków 766
Glukuronozylotransferaza 348
Glutamina 296, 311
Glutaminaza 305
Glutaminian 296, 311
y-Glutamylotransferaza 767
Głodzenie 239
Gnilec 50, 606, 660
Granulocyty obojętnochłonne 746,
755
- - aktywacja 758
Grupy krwi 752
- prostetyczne 64, 65
Guanozynomonofosforan
cykliczny 564
Haplotyp 107
Haptoglobina 710
Hefaestyna 712
Heksokinaza 188
Heksoza, przemiany 217
Helicobacter pylori 653
Helisa(y) amfipatyczna 41
- kolagenowe potrójne 50
-a 40
Hem 53,61,338, 340, 700
Hemochromatoza 583
-dziedziczna 714
-wtórna 714
Hemofilia 735
Hemoglobina(y) 53
- Chesapeake 60
- funkcja 56
- glikowana 61
- krwinek sierpowatych 62
- M 60
- nieprawidłowe 748
- S 60,445
- typu Hikari 444
- utlenowanie 55, 62
- warianty strukturalne 60
- właściwości allosteryczne 55
Hemoglobinopatie 60
Hemoglobinuria napadowa nocna
650
Hemojuwelina 712
Hemoliza erytrocytów 221,225
Hemopeksyna 711
Hemoproteidy 53
Hemoproteiny 338, 353
Hemosyderyna 714
Heparyna 147, 668,671
- małocząsteczkowa 735
Hepcydyna 711,712
Heterochromatyna fakultatywna
391
- konstytutywna 391
Heterodimery 44
Hialuronidaza 670
Hiper-p-alaninemia 328
Hiperamonemia typu 1 i 2 308
Hiperarginemia 309
Hiperbilirubinemia 349
- retencyjna 350
- sprzężona 351
-toksyczna 351
- zwrotna (zastoinowa) 350
Hipercholesterolemia 227,266, 528
Hiperfenyloalaninemia 317
Hiperhomocysteinemia 604
Hiperhydroksyprolinemia łagodna
316
Hiperlaktacidemia 276
Hiperlipoproteinemia 266,292,294
Hiperlizynemia 320
Hiperoksaluria pierwotna 314
Hiperprolinemia typu I i II 311
Hipertermia złośliwa 680, 689
Hipertriacyloglicerolemia 227, 266
Hiperurykemia 227, 370, 371
Hipoglicyna 229
Hipoglikemia 205
- u kobiet w ciąży i noworodków
214
Hipolipoproteinemia 266, 292
Hipourykemia 370
Histony 387
- acetylacja i deacetylacja 467
- rodzaje 388
Histydyna 314, 330
- proksymalna i dystalna 54
Histydynemia 314
HIV-1 653
Homeostaza 91, 101
Homocystynuria 315
Homodimery 44
Homokamozyna 329
Homokamozynoza 329
Hormon(y) antydiuretyczny 6
- budowa chemiczna 535
- definicja 531
- glikokortykoidowe 523
- klasyfikacja 534
- kortykotropowy (ACTH) 214
- pobudzanie lipolizy 278
- podział na grupy 558
- regulacja dyfuzji 522
- sterydowy 536
- tarczycy 278, 546
- wpływające na stężenie glukozy
we krwi 213
- wytwarzanie 535
- wzrostu 214, 523
SKOROWIDZ 781
Hybrydy RNA-RNA 385
Hybrydyzacja 377,491,504
- in situ 495
fluorescencyjna 495
- kolonii 492
- płytkowa 492
Hydroksylacja 763
Hydroksylaza(y) 298
- dopaminowa 546
- tyrozynowa 545
- znaczenie w organizmie 606
18-Hydroksylaza 538
7a-Hydroksylaza cholesterolu 289,
291
P-Hydroksylaza dopaminowa 606
Hydroksylizyna 298,299
3-Hydroksymaślan 233
Hydroksymetylenobilan 339
3- Hydroksy-3-metyloglutarylo-
-CoA (HMG-CoA) 234, 235
Hydroksyprolina 298, 299
4- Hydroksyprolina 315
P-Hydroksy-y-trimetyloaminomaślan
230
Hydrolaza fumaryloacetooctanowa
316
Hydroliza 9
Identyfikacja molekularna danego
osobnika 501
Idiotyp 724
Ikozanoidy 151, 160,241
Iloczyn jonowy wody 11
Immunoglobulina(y), klasy 721
- rola w mechanizmach obronnych
organizmu 719, 726
- struktura 720
Importyny 613
Impulsy nerwowe 523
- - przewodzenie zaburzone 523
Indeks glikemiczny 146
Induktory 93
Inhibitor(y) 199
- kompetycyjne 85
- konwertazy angiotensyny 552
- niekompetycyjne 87
Insercja kotranslacyjna 616, 618
Insert 504
Insulina 173, 188, 199,201,208,
248, 278, 279, 522, 537
- rola w regulowaniu stężenia
glukozy we krwi 213
Integryny 757
Interakcja leków 764
Intron 394,417,433,439, 504
Inulina 146, 664
Inżynieria genetyczna 483,485, 718
Izocytrynian 179
Izoenzymy 70
Izoleucyna 299
Izomeraza disiarczkowa białek 621
- peptydyloprolylowa 621
Izomery cukrów 140
Izopentenylodifosforan 282
Izotyp 724
Jod 547
- niedobór 548
Jodki 548
Jon(y) obojnacze 20
- ponadtlenkowy 758
- w płynach ustrojowych 508
- wapniowe 565, 566
Jonofory 135, 520
Kacheksja 173, 176,584
Kalbindyna 582
Kalcydiol 593
Kalcynoza 594
Kalcytriol 544, 593
Kalmodulina 199, 565,687
Kalneksyna 621
Kalretikulina 621
Kamienie nerkowe cystynowe 315
- żółciowe 282, 578
Kanał(y) jonowe 519
- - bramkowane ligandem 518, 533
napięciem 520
- K+ 519
Kanałopatie 694
Karbamoilofosforan 305, 306
Karbamoilotransferaza
asparaginianowa 95
Karboksykinaza
fosfoenolopirogronianowa 183,
205
Karboksylaza acetylo-CoA 246,255
- pirogronianowa mitochondrialna
205
- propionylo-CoA 207
Karboksypeptydazy 580
Kardiolipina 154, 260
- biosynteza 259
Kardiomiopatia(e) 680
- rodzinna przerostowa 694
- rozstrzeniowa 695
- wrodzona 694
Kamityna, niedobór 229, 239
Kamozyna 328
Kamozynaza 329
Karoten 590
P-Karoten 159
Karotenoidy 590
Katabolizm 113
-acetylo-CoA 178
- argininy 313
- L-asparaginy 312
- L-cysteiny 316
- L-glutaminy 312
- L-histydyny 314
- L-lizyny 317
- pirymidyn 371
- proliny 313
- puryn do kwasu moczowego 369
- serotoniny 332
- tryptofanu 322
- tyrozyny 319
Katalaza 121
Kataliza 65
- enzymatyczna 81
- kowalencyjna 66
- kwasowo-zasadowa 66, 67
- przez sąsiedztwo 66
Katepsyna B i D 551
Kaweole 516
Keratyna 704
Ketogeneza 229,233, 240
- regulacja 237
Ketokwasica 176
Ketonemia 236, 239, 240
- bydła 274
Ketonuria 239
- łańcuchów rozgałęzionych 323
Ketony 233, 239
Kinaza(y) adenylanowa 208
- białek 98
--A 562
- - zależna od cAMP 201
- białkowe zależne od cyklin 409
od DNA 415
- glicerolowa 257, 277
- lekkiego łańcucha miozyny 696
- Rho 696
Kinetyka enzymatyczna 77, 90
- - w odkrywaniu leków 89
Kinurenina 320
Klatryna 526
Klon 504
Klonowanie 761
- DNA 503
- molekularne 488
Kobalaminy 601
Kod genetyczny 17, 374,439
- - cechy 441
Kodon(y) 439
782 SKOROWIDZ
Kodon(y) nonsensowne 440, 443,
445
Koenzym(y) 64, 65
- nikotynoamidowe 120
Kofaktory 64, 65
Kofeina 357
Kolagen 49, 656
- modyfikacje potranslacyjne 658
- struktura 50
- typu I 657
--IV 658
--IX 659
- zaburzenia syntezy 50
Komórka(i) docelowa, definicja
532
- krwi 742
- nowotworowe 649
Kompleks(y) białkowe w błonie
mitochondrialnej 125
- Ca2+-kalmodulina 199, 201
- eIF-4F 448
- inicjacyjny 43S 448
--80S 448
- jądrowe porowe 613
- ligand-receptor 559
- preinicjacyjny 422,430,433,447
- reduktazy rybonukleotydowej
366
- rybonukleoproteinowy (snurp)
433
- siRNA-mRNA 385
- syntazy kwasu tłuszczowego 242
- tioesterazy 244
- transkrypcyjny 426,428
- - eukariotyczny 428
- translokacyjne 612
- troponinowy 687
Koneksyny 527
Konfiguracja 38
Konformacja 38
- natywna 46
Konkanawalina A 148
Konwersja genu 400
Koproporfiryny 342
Koprostanol 289
Kortyzol 540, 555
Korynoidy 601
Kosmid 489, 504
Krążenie jelitowo-wątrobowe 291,
580
- - barwników żółciowych 349
Kreatynina 334
Krew, funkcje 706
- grupy 752
- krzepnięcie 728
Krew, pH 6
- przetaczanie 752
- regulacja stężenia glukozy 211
Krwinki białe, upośledzenie
przylegania 649
Krystalografia rentgenowska 44
- - wg Laue’a 45
Krzepnięcie krwi 728
Krzywa wiązania tlenu 55, 61
Krzywica 593
Ksenobiotyk(i) 762
- cytotoksyczność 768
- reakcje zachodzące w fazie
przemiany 766
L-Ksyluloza 226
Kwas(y) A-acetyloneuraminowy
632
- acetylosalicylowy 252, 740
- arachidonowy 250
- askorbinowy 217, 606
- całkowicie-/r<ms-retinolowy 591
- chenodeoksycholowy 289
- cholowy 289
- deoksycholowy 291
- deoksyrybonukleinowy 374, 386,
417
--budowa 375
- - delecje 498
- - denaturacja 376
- - fragmenty Okazaki 403,404
- - insercje 498
- - mitochondrialny 397
- - model Watsona-Cricka 375
- - naprawa enzymatyczna 411,417
nici 408
pęknięć dwuniciowych 415
przez wycięcie nukleotydu
414
przez wycięcie zasady 413
typu „mismacht” 412
- - nić matrycowa i kodująca dany
gen 419
- odtwarzanie struktury
chromatyny 409
- - polamość 374
- - postać zrelaksowana i silnie
skręcona 377
- - powstawanie widełek
replikacyjnych 403
- - rearanżacje 498
- - regiony kodujące 393
- - rekombinacyjny 505
- - renaturacja 377
- - replikacje 401,402, 406,417
- - rozplatanie 403
Kwas(y) deoksyrybonukleinowy,
sekwencje niepowtarzane 395
powtarzane 395
powtarzane mikrosatelitame
396
powtarzane rozproszone
krótkie i długie 396
- - sekwencjonowanie 493
- - synteza 404
- - tworzenie baniek
replikacyjnych 407
- - upakowanie w chromosomach
390
--uszkodzenia 412
- dokozaheksaenowy 250
- fitynowy 582
- foliowy 588, 603, 608
- suplementacja 604
- fosfatydowy 153, 154, 509
- glukuronowy 217
- hialuronowy 147, 666, 670
- jednonasycone 291
- a-linolenowy 249, 250
- linolowy 249, 250
- litocholowy 291
- mocne 11
- moczowy 369, 372
- neuraminowy 148
- nikotynowy 292, 599
- nukleinowe 357, 362, 372, 385
- pantotenowy 242, 605
-retinolowy 590, 591
- rybonukleinowy 378, 386,418
- - informacyjny 379, 381,418,
436,439, 484
policistronowy 459,460
- - interferujące małe 385
- - jądrowe małe 385,418
heterogenny 382
małocząsteczkowy 505
- - klasy 418
- małocząsteczkowe 384
-mikro385,418, 504
- modyfikacje 436
- redagowanie 436
- - replikacja 379
- - rybosomalny 383,418,435
--struktury 381
- - synteza 418,422
- - transferowy 382,418,441
- transkrypcja 420
- - transportujący 437
-sjalowe 148, 155,225
- słabe 11
-tłuszczowe 149, 160, 164
SKOROWIDZ 783
Kwas(y) tłuszczowe, biosynteza 241
- - egzogenne 241, 249
brak w diecie 250
metabolizm nieprawidłowy
253
niedobór 253
- - ikozanowe 241
- - nasycone 150,510
--nienasycone 150, 151,510
budowa 248
--utlenianie 233
- - rozkład 229
- - /ratts-nienasycone 250
- - utlenianie 229, 237
- - wolne 149, 230
metabolizm 268
- - p-oksydacja 230
- wielonienasycone 291
- żółciowe pierwotne 289
-wtórne 291
Kwashiorkor 295, 583-585
Kwasica 6, 176
- ketonowa 229, 239
- metaboliczna 305
-mleczanowa 187, 192
Laktoza 144
- nietolerancja 578, 579
Laminina 663, 664
Laminy 704
Lanosterol 283
Lek(i) antagoniści witaminy K 595
- hipolipemizujące 292
- interakcje 764
- projektowanie 89, 770
- przeciwfolianowe 363
- przeciwpłytkowe 740
przeciwtarczycowe 548
- przeciwzakrzepowe 737
Lektyny 635
- roślinne 148
Leptyna 279
Leucyna 299
Leukotrien 152, 241, 251, 253, 255
Leukoworyna 603
Lewodopa 545
Liaza HMG-CoA 235
Ligacja 504
a-Linolenian 252
Linolan 249, 252
Lipaza lipoproteinowa 269, 277
- wątrobowa 269, 270
- wrażliwa na hormon 277, 278
Lipidy 160, 166
- amfipatyczne 510
Lipidy, eterowe, biosynteza 260
- gromadzenie w wątrobie 274
- klasy występujące
w lipoproteinach 266
- niepilame 281
- peroksydacja 158, 160
-proste 149
- transport i magazynowanie 266
- złożone 149
- znaczenie biomedyczne 149
Lipogeneza, regulacja szybkości
245,255
5-Lipoksygenaza 253
Lipoksyna 152, 251
Lipoliza triacylogliceroli 257, 277
Lipoproteiny 38
- budowa 267
- grupy 266, 281
- o małej gęstości 167, 173
- resztkowe 270
Liposomy 160
Lizofosfatydylocholina 154, 262
Lizofosfolipaza 261
Lizofosfolipidy 154
Lizolecytyna 154, 262
Lizosomy pierwotne i wtórne 525
Lizyna 317
Łamliwość kości wrodzona 51,
656, 674
- włosów rosnących w kępkach 309
Łańcuch oddechowy 125
- - hamowanie przez trucizny 133
- - niedobory oksydoreduktaz 137
a2-Makroglobulina 718, 726, 735
Malonian 133
Malonylo-CoA 241
Maltoza 144, 148
Mannozoamina 225
Mannozydoza 652
Mapowanie genów 495
Mapy genów mitochondrialnych 397
Marasmus 295, 584
Marker Man-6-P 651
Marskość wątroby 274, 276, 718
Mechanizm „ping-pong” 522
Medycyna prewencyjna 3
Melanina 714
Melatonina 332
Menachinony 595
Menadiol 595
Meromiozyna lekka i ciężka 685
Metabolizm 113
- acylogliceroli 257
Metabolizm błędy wrodzone 2
- ksenobiotyków 762
- sfingolipidów 257
- węglowodanów i lipidów 111
Metaloenzymy 64, 65
Metaloporfiryny 338
Metalotioneiny 716
Methemoglobina 60, 748, 761
Methemoglobinemia 60
- wrodzona i nabyta 748
Metionina 297, 320, 330
Metoda(y) Edmana sekwencjono-
wania peptydów i białek 32
- hybrydyzacji 492, 495
- Maxama i Gilberta 493
- projektowania leków 89, 770
- Sangera 493
- Southema 492
- southwestem 492, 505
- spaceru po chromosomie 500
- western 492
- - biot 505
Metotreksat 367, 603
A-Metylotransferaza
fenyloetanoloaminy 546
Mewalonian 283
Miastenia 528
Miażdżyca 156
- naczyń 291
- przedwczesna 266
- tętnic 282
Micele 160,510, 580
Miedź 715
- zaburzenia przemiany 716
Mieloperoksydaza 746, 759
Mięsień(śnie) model ślizgowo-
-mostkowy skurczu 683
- sercowy 692
- szkieletowe 166
- - stężenie Ca2+687
- - struktura 681
--typy włókien 701
- - właściwości biochemiczne
związane z metabolizmem 702
Mikrody frakcja polichromatyczna
45
Mikroelementy odżywcze 588
Mikromacierze genowe 35
Mineralokortykoidy, synteza 537
Mioglobina 53, 61
Mioglobinuria 61
Miopatia central core disease 690
- mitochondrialna niemowląt 137
Miozyna 684
- mięśnia gładkiego 696
784 SKOROWIDZ
Mirystylacja 625
Mitochondria 610
Mleczan 187, 193,211
- wytwarzanie przez tkanki 189
Mocznik 302, 305
Modelowanie molekularne białek
46
Modyfikacje potranslacyjne białek
38
Modyfikacje potranslacyjne
dojrzewania białek 49
Monofosforan inozyny 363, 372
Mononukleotyd(y) 355, 361
- flawinowy 598
Monooksygenaza 122
Monosacharydy 139, 148
Mostki solne 8,44
Mucyny 637, 654
Mukolipidozy 669
Mukopolisacharydozy 668
Mukopolisacharydy 147, 656
Mukoproteiny 147
Mukowiscydoza 653
Mutacja(e) białek błonowych 527,
530
- ciche 443
- genów 413
- - kodujących białka 628
kanał chlorkowy 528
- - dystrofinę 690
kolagen 659
kolagen typu II 677
- konstytutywna 459
- mtDNA 397
- punktowe 443,497
- supresorowe 446
- typu przesunięcia ramki odczytu
445
- - zmiana sensu 443
sensu akceptowalne 444
sensu akceptowalne
częściowo 445
sensu nieakceptowalne 445
Mutageneza ukierunkowana 75
Mutaza metylomalonylo-CoA 207,
601
NADPH 244
NADPH-oksydaza 759
Nadwrażliwość na gluten 578
Neuraminidazy 634
Neuropatia nerwu wzrokowego
dziedziczna Lebera 528
Neuroprzekaźniki pochodzące
z aminokwasów 328
Niacyna 590, 599
- nadmiar 600
Nick-translacja 504
Nidogen 664
Niedobór(ory) aldolazy A
dziedziczny 193
- dj-antyproteinazy 717
- biotyny 605
- czynnika krzepnięcia VII 735
- deaminazy adenozynowej 362,
370,761
- dehydrogenazy glukozo-6-
-fosforanowej 217, 747
- mleczanowej dziedziczny 193
- folianów 604
- fosfofruktokinazy mięśniowej
193
- fosforylazy nukleozydów
purynowych 362, 370
- glukozo-6-fosfatazy 370
- hydrolaz lizosomalnych
uwarunkowany genetycznie 652
-jodu 548
- kamityny 229,239
- kwasów tłuszczowych
egzogennych 250, 253
- oksydazy ksantynowej 370
- oksydoreduktaz łańcucha
oddechowego 123
- palmitoilotransferazy
kamitynowej 239
- pokarmowe 50
- ryboflawiny 598
- sulfataz wieloraki 264
- surfaktantu płucnego 257, 263
- tiaminy 225, 597
- w diecie 192
- tryptofanu i niacyny 599
-witamin 578, 588
- A 591
- B6 600
- B12 602,604
- - C 606
--D593
- E 594
- K 596
- żelaza 583, 713
- żywieniowe 38
Niedokrwistość 61, 741
- Fanconiego 416
- hemolityczna 187, 193, 217, 225,
350,711,747
- przyczyny 754
- - uwarunkowana primachiną 747
- sierpowata 497
Niedokrwistość sierpowata, analiza
rodowodowa 498
- sierpowatokrwinkowa 61
- z niedoboru żelaza 713
-złośliwa 601
Niedożywienie 578, 583, 584,587
Niedrożność przewodów
żółciowych 351
Nietolerancja fruktozy dziedziczna
227
- laktozy 578, 579
Niewydolność oddechowa 236,257
- serca 680
- trzustki zewnątrzwydzielnicza
601
Noradrenalina 199
Norepinefryna 545
Nukleazy 9
Nukleofile 9
Nukleosomy 387
- budowa 388
Nukleotydy 354
- absorpcja światła
ultrafioletowego 359
- pirymidynowe 362
- purynowe 362
Nukleozydy 355, 361
Odczynnik Edmana 32
- Sangera 32
Oddychanie tkankowe 118
Odtruwanie 763
Ogniskowanie izoelektryczne
(IEF) 31
p-Oksydacja 230,237
Oksydaza cytochromowa 119
- homogentyzynianowa brak 317
- koproporfirynogenowa 340
- ksantynowa 119
- - niedobór 370
- kwasów tłuszczowych 230
- L-aminokwasowa 119
- protoporfirynogenowa 340
Oksydoreduktazy 119
Oksygenaza 122
- hemowa 346
- tryptofanowa 320
Oligonukleotyd(y) 504
- synteza chemiczna 494
Oligosacharydy 140
Ołów, wpływ na metabolizm hemu
346
Onkogeny 2
Operon 459
Omityna 305, 306,314,330
SKOROWIDZ 785
Orotidynuria 372
Orotoacyduria 362, 372
Osłonka mielinowa 523
Osteoblasty 672, 673
Osteogenesis imperfecta 51, 656,
674
Osteokalcyna 606
Osteoklasty 672
Osteomalacja 593
Osteopetroza 675
Osteoporoza 675
Otyłość 162, 171,241,583
- brzuszna 266
Ouabaina 143, 523
Palindrom 505
Palmitoilotransferaza
kamitynowa I 230, 237, 239
--II 230, 239
- - niedobór 229
Palmitynian 244
Parathormon 550
Parowanie zasad 484
Pelagra 599
Pentozuria samoistna 217, 226
Peptyd(y) 17
- określanie składu 32
- sekwencjonowanie 32
- sygnałowe 609, 618, 710
- właściwości 616
Peroksydacja lipidów 158, 160
Peroksydaza 121
- glutationowa 746
- tarczycowa 548
Peroksyny 615
Peroksysomy 232, 615
- brak w tkankach dziedziczny 239
pH, definicja 11
-krwi 6
- roztworów obliczanie 11
Pinocytoza absorpcyjna 526
- fazy płynnej 525
Pirogronian 190, 194,205, 207, 315
Pirydoksal 600
Pirydoksamina 600
Pirydoksyna 600, 608
Pirymidyny 354
Plazmalogeny 155, 261, 265
Plazmidy 488, 505
Plazmina 736
Plazminogen 736
Pląsawica Huntingtona 396
Pleksytryna 739
Płyn pozakomórkowy 508
- - skład jonowy 508
Płyn wewnątrzkomórkowy 508
- - skład jonowy 508
Płytki krwi, przetaczanie 654
- starcze 49
Podstawienie izomorficzne 45
- molekularne 45
Poliaminy 332
Policytemia 60
Polimeraza 404
- II 429
- RN A zależna od DNA 419, 421
Polimorfizm białek osocza 708
- długości fragmentów
restrykcyjnych (RFLP) 74, 500
- kwasu deoksyrybonukleinowego
496, 501
- mikrosatelitamy 396, 505
- pojedynczego nukleotydu (SNP)
106, 500
Polinukleotydy 360, 361
Poliprenoidy 157
Polirybosomy 452
Polisacharydy 140, 145
Polisomy 383, 452
Ponadtlenki 746
Porfiria 338, 343
- erytropoetyczna wrodzona 344
- typy 344, 353
Porfirynogeny 340, 342
Porfiryny 337, 342
Potencjał oksydoredukcyjny 118
Prebiałka 708
Pregnenolon 537
Preproteina 609
Primachina 225, 747
Primosom 403, 505
Priony 48, 51
Probiałka 97
Proenzymy 97
Progesteron 543
Proinsulina ludzka 549
Prokarcynogen 763
Prokolagen 50
Prolek 90, 763
Prolina 297,311
Promień Stokesa 27
Proopiomelanokortyna 549, 552
Propionian 207
Proproteiny 49
Prostacyklina 254, 739
Prostaglandyna 151, 241, 251, 252
Prostanoidy, biosynteza 252
Protamina 735
Proteasom 94
Proteaza(y) 9, 580
Proteaza(y) asparaginianowe 67
- granulocytów obojętnochłonnych
760, 761
- HIV 67
- serynowe 69
Proteoglikany 147, 656, 671
- rodzaje 664
Proteom 35
Proteomika 35
Protoporfiryna III 340
-IX 338
Protoporfirynogen III 340
Protrombina 732
Proutleniacze 747
Próg nerkowy dla glukozy 214
Przeciwciała 706
- monoklonalne 725
Przeciwutleniacze 159, 747
Przekarmienie 583
Przekaźniki drugiego rzędu 96
Przemiana materii podstawowa 584
Przenośnik redoks 137
Przerzuty nowotworowe 630
Przeszczep wątroby 718
Przetaczanie krwi 752
Pseudodystrofia rzekoma Hurler
652
Pseudogeny 400, 505
Pseudourydyna 357, 371
Psychoza Korsakowa 598
Punkt izoelektryczny 21
Puromycyna 456
Puryny 354
Racemaza metylomalonylo-CoA
207
Rafty lipidowe 516
Rakowiak 332
Rdzeń lipidowy niepolamy 267
Reakcja(e) anaplerotyczne 183
- „Bi-Bi” 87
- chemiczne spontaniczne
(samorzutne) 78
- Edmana 32
-enzymatyczne 169
- Fentona 746
- Harbera i Weissa 746
- katalizowane enzymatyczne,
czynniki 81
- łańcuchowa polimerazy (PCR)
33, 73, 396, 494, 505
- „ping-pong” 88
- rezerwowe (reutylizacji) 363, 367
- sekwencyjnego (pojedynczego)
wypierania 88
786 SKOROWIDZ
Receptor(y) apoE 270
- asialoglikoprotein w komórkach
wątrobowych 634
- dihy drop iry dyno wy 688
- dla hormonów peptydowych 533
- SRP616
-- transferryny 713
- hormonalne 532
-jądrowe białkowe 572, 574
- typu steroidowo-tarczycowego
534
- LDL 271,286
- oczyszczający, klasy B 272
- rianodynowe 688
- sieroce 534
- sprzężone z białkami G 560
- VLDL 270
Reduktaza HMG-CoA 286
Region antykodonowy 440,442
Rekombinacja chromosomalna
398
- DNA w badaniu enzymów 74
Reoksydacja NADH 189
Reszty aminokwasowe 22
Retikulocyty 745
Retinal 590
Retinoidy 590
Retinol 590, 607
Rodniki wolne 746
Rodopsyna 590
Rozdział chromatograficzny 27
Równanie chemiczne
funkcjonalnie nieodwracalne 78
- - zbilansowane 77
- Hendersona-Hasselbalcha 13
- Hilla 84
- Michaelisa-Menten 83
Ryboflawina 598
Rybonukleazy 385
Rybonukleozydy 355
Rybosomy 383
Ryboza 139, 163,221
Rybozymy 379,437
Rybulozo-5-fosforan 219
Sacharoza 144
Samoasocjacja 8
„Samobójstwo prokolagenu” 674
Sarkolema 680
Sarkomer 681
Sarkoplazma 680
Sączenie molekularne 27
Scarpie 48, 51
Sekrecja regulowana
i konstytutywna 610
Sekwencja odpowiedzi
hormonalnej 559
- polipeptydu Sangera 32
Sekwencjonowanie metodą
Edmana 32
Selektyny 647
Selenocysteina 19, 299
Serotonina 332
Seryna 296,315,329,336
Sferocytoza dziedziczna 751
Sfingolipidozy 264, 265
Sfingolipidy 262,265
- metabolizm 257
Sfingomielina 155, 262, 509
Sfingozyna 155
Sialidoza 652, 669
Siarczan(y) chondroityny 147,666,
670
- dermatanu 668, 670
- heparanu 668, 671
- keratanu 666, 670
- steroidów 263
Siateczka śródplazmatyczna 609
Siły van der Waalsa 8,40
Skaza moczanowa patrz Dna
moczanowa
Składnik(i) mineralne, funkcje 607
- - trawienie i wchłanianie 582
Skóra pergaminowata barwnikowa
415
Skręt p 42
Skrobia 145, 148
- przyswajalność 146
Skrobiawica 719
Skrzep(y) fibrynowe 736
- rodzaje 728
Skwalen 283
Sole kwasów żółciowych 291
Sonda 505
Sorbitol 227
Sortowanie białek 609, 623
Spektrofotometria 342
Spektrometria mas 33
- - tandemowa 34, 309, 310
- - złożonych próbek białkowych
503
Spektroskopia mas 631
- rezonansu magnetyczno-
-jądrowego 45
wysokorozdzielcza 631
Spektryna 750, 752
Spermidyna 330, 332
Spermina 330, 332
Spliceosom 433, 505
Splicing 433,434
Splicing błędny 435
- RN A 484
Sploty neurofibrylame (NFT) 49
Sprzężenie receptorowo-
-efektorowe 533
Stała dielektryczna 6
-dysocjacji 12
--wody 10
- Michaelisa 83
- szybkości k 80
Stany przejściowe w reakcji
chemicznej 78
Statyny 283, 292
Steroidogeneza jajnikowa 543
- nadnerczowa 537
- w jądrach 540
Steroidy 156
- gonadalne 540,555
- nadnerczowe 537
Sterole 156, 509
Stłuszczenie wątroby 274, 276
- - ostre 239
Streptokinaza 737
Streptomycyna 143
Struktura p 41
Stwardnienie rozsiane 264, 523
Substancja(e) grupowa A i B 753
- - H 753
- AB0 753,761
- pozakomórkowa 656
Suchość spojówek 592
Sulfatazy, niedobór wieloraki 264
Sulfatyd 155
Sulfogalaktoglicerololipidy 263
Sulfogalaktozyloceramid 263
Suplementy cukrowcowe diety 632
Surfaktant 153
- płucny 257
- - niedobór 263
Swainsonina 645
Sygnał(y) jądrowe eksportujące 613
- lokalizacji jądrowej 613
- zatrzymania procesu translokacji
617,618
Syndrom HHH (hiperomitynemii,
hiperamonemii i homo-
cytrulinurii) 308
- metaboliczny 215
- świński stresowy 689
Syntaza A-acetyloglutaminianu 308
-ALA 342
-ATP130
- cytrynianowa 179
- glicynowa mitochondriów
wątroby 314
SKOROWIDZ 787
Syntaza glikogenowa 196, 199,207
- 3-ketoacylowa 244
- laktozowa 224
- metioninowa 602
- prostaglandyny H 252
- tlenku azotu 698
Syntetaza(y) acylo-CoA 229
- aminoacylo-tRNA 441
- argininobursztynianowa 307, 308
- karbamoilofosforanowa 305, 307,
308
Synteza kolagenu, defekty 50
Szczawiooctan 238
Szkorbut 50, 299, 606, 660
Szlak(i) amfiboliczne 162
-anaboliczne 162
- biosyntezy nukleotydów
pirymidynowych 368
- oligosacharydów 642
- - puryn 364
--testosteronu 541
- cyklooksygenazy 252
- dehydroepiandrosteronowy 540
- fosfopentozowy 163, 244
- glikogenogenezy w wątrobie 196
-glikolizy 186, 187
- JAK/STAT 568
- kataboliczne 162
- krzepnięcia krwi 730
- kwasu uronowego 217, 221,222,
228
przerwanie 226
- lipooksygenazy 252
-metaboliczne 165, 168
- monoacyloglicerolowy 259, 580
- NF-kB 570
- pentozofosforanowy 217, 220,
228,244
- - w erytrocytach 221
- progesteronowy 540
- przemian heksoz 217
- sorbitolowy 227, 557
- - insuliny 569
- syntezy steroidów
nadnerczowych 539
- uczynnienia krzepnięcia krwi
729,740
Szpiczak mnogi 724
Śmierć komórki programowana
262,416
Śpiączka 176
Talasemia 49, 61, 497
- a 62
Talasemia p 62,435
Talina 662
Technika(i) badania wyższych
poziomów struktury białka 45, 51
- „biot transfer” 491
- blottingu 492
- hybrydyzacji 491,492
- łączenia DNA z wykorzystaniem
lepkich końców 488
- mikromacierzy wysokiej gęstości
503
- PCR 33, 73
- rekombinacji DNA 74,483,485,
494, 736, 761
- zakłócania funkcji genów 502
Telomeraza 392
Telomery 392
Teoria chemiosmotyczna Mitchella
130, 133
- kinetyczna 79
- zderzeń 79
Terapia genowa 309, 501,718
Terminacja syntezy białka 452
Termodynamika biochemiczna 111
- zasady 111
Termogeneza indukowana dietą 281
--posiłkiem 584
- w tkance tłuszczowej brunatnej
280
Termogenina 133, 281
Test(y) Ehrlicha 350
- immunoenzymatyczne (ELISA)
71
- kolorymetryczne 342
- oporności osmotycznej 752
tolerancji glukozy 215
- wykrywania fenylopirogronianu
w moczu 317
Testosteron 543
Tetrahydrofolian 603
Tetrajodotyronina 546
Tiamina 596
- niedobór 225
- - w diecie 192
Tiokinaza 229
Tkanka łączna 656
- tłuszczowa brunatna 280
- metabolizm triacyloglicerolu
277
Tlenek azotu 680, 698
Tłuszcze, trawienie i wchłanianie
580
-właściwe 149
Tokoferol 159, 594, 607
Tokotrienol 594
Toksyczność tlenu 123, 124
Toksyna błonicy 456
-jadu kiełbasianego 626
Tolbutamid 213, 239
Tolerancja glukozy 215
Topoizomeraza DNA 378,408
Transacylaza acetylowa 244
- malonylowa 244
Transaldolacja 219
Transaldolaza 219
Transaminacja 165, 303, 309
Transdukcja sygnałów 557
Transferaza fukozylowa 753
- terminalna 505
Transferryna 711, 713, 726
Transketolaza 219
- pomiar 225
Transkortyna 555
Transkrypcja 505
- RNA, etapy 422,437
- - rola aktywatorów
i koaktywatorów 429
Transkrypt pierwotny 419
Transkryptaza odwrotna 381
Transkryptom 505
Translacja 439, 505
Translokacja 451,610
Translokaza
kamitynoacylokamitynowa 230
Transport aktywny w błonie
plazmatycznej 521,523
- białek wewnątrzkomórkowy 609
- cholesterolu odwrócony 272,282,
288
- glukozy 524
- pęcherzykowy 624
- wsteczny 618, 622, 625
- - z aparatu Golgiego 619
Transportery) glukozy 212
-kasetowyAl wiążącyATP
(ABCA 1)273
- trikarboksylanów
mitochondrialny 246
Tratwy lipidowe 516
Trawienie 578, 586
- białek 580
- składników mineralnych 582
- tłuszczów 580
- witamin 582
- zaburzone 586
Treonina 315, 329
Triacyloglicerol(e) 153, 160, 164,
167, 265,580
- synteza w wątrobie 274
- zapasy w tkance tłuszczowej 277
788 SKOROWIDZ
Triacyloglicerol(e) znaczenie
biomedyczne 257
Trifosforan tiaminy 597
Triglicerydy 153
Trijodotyronina 546
Triozofosforany acylacja 259
Triozokinaza 223
Trombina 733,735,738, 741
Tromboksan 151, 251, 254
-A 739
Trombomodulina 735
Tropoelastyna 661
Tropokolagen 59
Tropomiozyna 686
Troponina 687
Tryptofan 320, 332
Trzustka, niewydolność
zewnątrzwy dzielni cza 601
Tunikamycyna 645
Twardzina 661
Tyreoglobulina 548
Tyroksyna 546
Tyrozyna 298, 316, 329, 332, 336,
536, 545
Tyrozynemia noworodków 316
-typu I i II 316
Tyrozynoza 316
Ubichinon 158, 283
Ubikwityna 302, 309, 622
Ubikwitynacja (proces ERAD)
622, 623
UDP-Glukuronian 221
Układ dopełniacza 725
- grup krwi 752
- grupowy ABO 752
- reninowo-angiotensynowy 551
Urobilinogeny 349
Urokinaza 736
Uroporfiryna 339, 342
Uroporfirynogen 340
Urydylilotransferaza
1-fosfogalaktozowa 223
Urydynodifosfoglukoza (UDPGlc)
196
Utleniacze 746
Utlenianie biologiczne 118
- kwasów tłuszczowych 229, 237
nienasyconych 233
- pirogronianu do acetylo-CoA 190
Utlenowanie hemoglobiny 55, 62
Uwiąd 584
Wady genetyczne 38
- - diagnostyka 73
Wady metaboliczne wrodzone 311
Wahadłowce substratowe 135, 136
Walina 299
Walinomycyna 135
Wapń, wchłanianie 582
Warfaryna 596, 735
Wątroba, funkcje w przemianie
lipidów 274
-marskość 718, 247
- przeszczep 718
- stłuszczenie 274, 276
- - ostre 239
- zadania 166
Wchłanianie białek 580
- monosacharydów w jelicie
cienkim 579
- składników mineralnych 582
- tłuszczów 580
- wapnia 582
- węglowodanów 579
-witamin 582
- żelaza 582, 583
Wektor do klonowania 488, 504
- ekspresyjne 491
Węglowodany 139, 148
- trawienie i wchłanianie 579
Wiązanie disiarczkowe 44
- disulfidowe 44,47
- kowalencyjne 7
- niekowalencyjne 8
- peptydowe 22
- wodorowe 7, 15
Widma absorpcji porfiryn 342
Wielojądrzastość wrodzona
erytroblastyczna 650
Wimentyny 704
Winkulina 662
Wirus grypy A 653
- synteza białek 454
Witamina(y) 589
-A 588, 590, 607
- - nadmiar 592
--niedobór 591
- B 588, 608
-B, 596
—niedobór 190, 597
-B2 598
- - niedobór 598
-B6 600
--nadmiar 601
- - niedobór 600
- B12601, 608
- - niedobór 602, 604
-C 159,217,583, 606, 608
- - nadmiar 607
Witamina(y) C, niedobór 606
-D 582, 588, 592, 607
- - nadmiar 594
- - niedobór 593
- E 159, 276, 588, 594, 607
- - niedobór 594
- K 588, 595, 608, 735
- - niedobór 596
- rola w cyklu kwasu cytrynowego
182
- rozpuszczalne w tłuszczach 590
- - wodzie 596
- trawienie i wchłanianie 582
Woda dysocjacja 10
- właściwości fizyczne
i chemiczne 6, 508
Woski 149
Wrzód żołądka i dwunastnicy 578
Wskaźnik glikemiczny 579
- masy ciała 583
Współczynnik Hilla 85
- oddechowy 583
Wtręty włókniste 49
Wychudzenie 162
Wydatek energetyczny 584
--pomiar 583
Wykres Lineweavera-Burka 84, 86
- podwójnych odwrotności 84
Wyniszczenie organizmu 173, 176,
295
- nowotworowe 187
Xeroderma pigmentosum 415
Xerophtalmia 592
Zaburzenia biosyntezy porfiryn 338
- metabolizmu 162
- - puryn 362
- przemiany węglowodanów 139
- równowagi energetycznej 111
- spichrzania glikogenu 203
- syntezy kolagenu 50
Zaczopowanie przewodu
żółciowego całkowite 352
Zaćma cukrzycowa 227
Zakrzep 728, 735
Zakrzepica 735
Zapalenie 741
- stawów 671
- - reumatoidalne 651, 656
Zapotrzebowanie energetyczne
organizmu 162
Zasada(y) mocne 11
- Schiffa 303
- słabe 11
SKOROWIDZ 789
Zasadowica 6
Zatrucie amoniakiem 304
- ciążowe u owiec 274
- u bydła lub owiec 239
Zawał serca, wykrywanie
na podstawie stężenia
izoenzymów dehydrogenazy
mleczanowej 73
Zdrowie, definicja 3
Zespół AIDS 653
- Alporta 660
- ataksja-teleangiektazja 416
- błon szklistych 154
- Criglera-Najjara 351
- czynnika tkankowego 731
- Dubina-Johnsona 352
- Ehlersa-Danlosa 51, 656, 659
- Guillaina-Barrego 523
- Hartnupa 599
- hiperomitynemii-hiperamonemii
314
- Hurler 668
- Huntera 668
- Kartagenera 705
Zespół Lescha-Nyhana 362, 370
- łamliwego chromosomu X 396
- Marfana 661
-MELAS 137
- Menkego 51
- nadmiaru węglowodanów
u człowieka 280
- napięcia przedmiesiączkowego
601
- niewydolności oddechowej 263
u noworodków 257, 263
- płodowy warfarynowy 596
- rakowi aka 599
- Reye’a 372
- Richner-Hanharta 316
- Rotpra 351
- Sjógrena-Larssona 253
- Sticklera 677
- Walkera i Warburga 650
- Williamsa 661
- Zellwegera 239, 253, 615
Złącza szczelinowe 527
Złogi fibryny 728
Zmęczenie 187
Zwapnienie tkanek miękkich 594
Zwierzęta transgeniczne 501
Zwijanie białek 47
Zwłóknienie torbielowate 528
Zwyrodnienie gąbczaste u bydła
48,51
- nerwów wieloukładowe 253
Zymogeny 97, 582
Żelazo hemowe 346
- niedobory 583, 713
- wchłanianie 582, 583, 711
- zdolność wiązania przez osocze
całkowita 713
Żelazoporfiryny 338
Żółtaczka 338, 350
- bez lub z obecnością barwników
żółciowych w moczu 350
- cholestatyczna 351
- fizjologiczna noworodków 350
-jako wtórny efekt hemolizy 352
- niehemolityczna wrodzona 351
- przyczyny 353
Żywienie 578
BIOCH
HARPE
ilustrowana
Jest to tłumaczenie 27. wydania należącego
do najlepszych na świecie i najnowocześniejszych
podręczników biochemii dla studentów medycyny.
W zwięzłej, przystępnej i interesującej formie
przedstawiono w nim podstawy tej dziedziny nauki
uwzględniono też nąjnowsze, szczególnie ważne
dla medycyny osiągnięcia.
Nowości w obecnym wydaniu:
• Bioinformatyka i biologia komputerowa
• Metody projektowania nowych leków oparte na postępach
genomiki i proteomiki
• Spektrometria mas w diagnostyce chorób metabolicznych
• Wzbogacone kolorem ilustracje ułatwiające przyswojenie wiedzy
• Wykaz użytecznych stron internetowych o tematyce biochemicznej
• Wykaz czasopism dotyczących biochemii lub dziedzin pokrewnych
Książka adresowana przede wszystkim do studentów medycyny,
farmacji, biologii i kierunków pokrewnych.
\
www.pzwl.pl