/
Author: Белясова Н.А.
Tags: химия биология биохимия молекулярная биология биологические науки
Text
ВВЕДЕНИЕ
1. Краткий исторический очерк развития биохимии
и молекулярной биологии
Как самостоятельная наука биохимия сложилась к середине XIX ст., однако предпосылки для ее развития появились почти на век ранее. К их числу
можно отнести открытие Дж. Пристли (1770—1780 гг.) явления поглощения
кислорода животными и выделения растениями; выделение из природных
источников первых органических молекул — глицерина, яблочной, лимонной, молочной и мочевой кислот (Шееле, Руэль, 1770—1786 гг.); расшифровку состава белков как веществ, содержащих азот (Дальтон, 1803 гг.); выделение первой аминокислоты из сока спаржи (Asparagus) — аспарагина (Воклен,
1806 г.); вывод уравнения спиртового брожения (Гей-Люссак, 1810 г.); выделение при кислотной обработке мыла кристаллического препарата жирной
кислоты и открытие холестерина (Шеврёль, 1811, 1812 г.).
Наконец, Ф. Вёлер в 1828 г. синтезировал из неорганических веществ
первое органическое соединение — мочевину, нанеся тем самым сокрушительный удар по витализму. Многими это достижение считается основной
вехой в становлении биохимии как самостоятельной науки. В 1833 г. Пайен и
Персо очистили и изучили свойства первой ферментной молекулы —
амилазы пшеницы, постулировав центральную роль ферментов в биологии.
В 1854—1864 гг. Пастер доказал, что брожение является функцией живых
клеток (дрожжей) и привел решающие аргументы против гипотезы о самозарождении. В это же время, начиная с открытия Ф. Мишером ДНК (1869 г.),
зарождается химия нуклеиновых кислот.
К концу XIX ст. между Луи Пастером и Ю. Либихом разгорелся спор относительно природы брожения. Пастер отстаивал взгляд на брожение как на
явление, способное осуществиться лишь в клетках микроорганизмов, а Либих
придерживался иной точки зрения — касательно химической природы этого
процесса, в котором, однако, принимают участие вещества, подобные уже
известной в то время амилазе. Спор помогли разрешить братья Бухнеры, которые в 1897 г. показали, что брожение может осуществляться в бесклеточных дрожжевых экстрактах. Таким образом, стало понятно, что брожение —
химический процесс, способный происходить как в клетках, так и вне их, но
с участием ферментов —продуктов жизнедеятельности организмов. По словам историков: «…появление пузырьков газа в опыте Бухнеров означало рождение современной биохимии и энзимологии».
После этого открытия биохимия получила мощный толчок в развитии: в
1901—1902 гг. Эмиль Фишер показал, что белки представляют собой поли5
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
пептиды, и установил природу пептидной связи; в 1905 г. Кнооп открыл bокисление жирных кислот; в 1911 г. Функ выделил в кристаллическом виде
тиамин и предложил термин «витамин»; в 1913 г. Михаэлис и Ментен разработали теоретические основы кинетики ферментативных реакций; в 1926 г.
Самнер выделил в кристаллическом виде фермент уреазу и доказал, что он
является белком; в 1933 г. Кребс и Гензелейт открыли и изучили химизм
цикла мочевины, а Эмбден и Мейергоф выявили наиболее важные особенности процессов гликолиза и брожения. Даже этот небольшой перечень самых
важных достижений биохимии первой половины XX ст. показывает, что интерес ученых сместился в область расшифровки процессов, протекающих в
живой клетке.
В результате к середине XX ст. оказались изученными основные превращения веществ в клетках. Открыт фотосинтез (К.А. Тимирязев), цикл трикарбоновых кислот (Г. Кребс), процесс окислительного фосфорилирования,
закономерности превращения энергии в клетке.
В этот период биохимики все еще не могли ответить на один из главных
вопросов, волновавших человека: какое клеточное вещество является носителем наследственной информации. Лучше других макромолекул оказались
изученными белки, и было показано их удивительное многообразие. Логично
было предположить, что именно белковые молекулы, столь вариабельные в
своем составе, должны осуществлять функции вещества, кодирующего столь
же вариабельные свойства живых существ. Однако уже в 1928 г. в экспериментах Гриффита были получены первые сведения об участии в данном процессе нуклеиновых кислот. А в 1944 г. американские ученые Эвери, МакЛеод и Мак-Карти доказали, что веществом, ответственным за хранение и
передачу наследственной информации у клеточных организмов, является
ДНК.
Для исследования структуры нуклеиновых кислот были привлечены самые совершенные методы, имеющиеся в распоряжении исследователей из
разных областей науки. В частности, рентгеноструктурный анализ, основы
которого были разработаны в 1934 г. Берналом и Крауфутом, позволил приблизиться к изучению трехмерной структуры ДНК. В это время выделяется в
самостоятельную науку молекулярная биология. О ее зарождении впервые
упомянул Уоррен Уивер — руководитель отдела естественных наук Рокфеллеровского фонда. В своем отчете за 1938 г. он отметил, что «в тех пограничных областях, где физика и химия пересекаются с биологией, постепенно
возникает новый раздел науки — молекулярная биология, начинающая приоткрывать завесы над многими тайнами, окутывающими основные элементы
живой клетки».
Современная биохимия отличается внедрением в анализ веществ и процессов скоростных автоматизированных методов. В настоящее время автоматическому контролю подвластны аминокислотный анализ белка, количественное определение моно- и дисахаридов в биологических жидкостях, секвенирование нуклеиновых кислот, синтез пептидов и олигонуклеотидов, хроматографическое и гельфильтрационное разделение природных соединений
и др.
При завершении обзора достижений биохимической науки можно заклю6
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
чить, что биохимия изучает химический состав и строение живой материи, а
также химические процессы, протекающие в живых организмах.
Датой «рождения» молекулярной биологии считается 1953 г., когда физик
Фрэнсис Крик и биолог Джеймс Уотсон расшифровали структуру ДНК —
двойную спираль. Это замечательное открытие стало основой большинства
молекулярно-биологических исследований, а его предпосылками считаются
уже упоминавшиеся достижения «фаговой школы» (Эвери и соавт.) и физиков (Бернал, Крауфут). Кроме этого, перемещению интересов биохимиков в
область изучения нуклеиновых кислот способствовало постулирование в
1941 г. Дж. Бидлом и Э. Тейтумом принципа «один ген — один фермент»,
который они сформулировали при изучении биохимических мутаций у хлебной плесени Neurospora crassa.
Особенностью молекулярной биологии является исследование структуры
макромолекул и ее связи с функцией. Наиболее наглядно это продемонстрировано на ДНК. Однако молекулярная биология исследует и другие молекулы, в чем можно убедиться, познакомившись с основными достижениями
данной науки: расшифрована структура некоторых белков и установлена
взаимосвязь ее с функциями этих молекул (М. Перутц, Дж. Кендрью,
Ф. Сенгер, К. Анфинсен и др.); определена структура и выявлены механизмы
биологических функций нуклеиновых кислот и рибосом (Дж. Уотсон,
Ф. Крик, Т. Касперсон, Ж. Браше, С. Вейсс и др.); расшифрован генетический код (М. Ниренберг, Г. Корана, С. Очоа); разработан метод специфического расщепления ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз — основа
современной генетической инженерии (Х. Смит, В. Арбер, Д. Натанс); открыто явление обратной транскрипции (Г. Темин, Д. Балтимор, С.М. Гершензон);
открыты механизмы и определены этапы биосинтеза белковых молекул
(Ф. Жакоб, Ж. Моно, Ф. Крик) и нуклеиновых кислот (А. Корнберг, С. Очоа);
установлена структура вирусов и механизмов их репродукции, разработаны
методы генетической инженерии (П. Берг, В. Арбер, Х. Смит); разработаны
методы введения чужеродной ДНК в различные клетки с помощью векторов
(Г. Бойер, С. Коэн, Д. Хелинский); осуществлен синтез гена (Г. Корана);
предложена вирусогенетическая теория возникновения рака (Л.А. Зильбер);
установлена последовательность нуклеотидов в тРНК (А.А. Баев); разработан
метод секвенирования ДНК (А. Максам, У. Гилберт, Ф. Сенгер).
Таким образом, можно сформулировать определение молекулярной биологии как науки, изучающей функционирование живых организмов сквозь
призму химической структуры формирующих их молекул и атомов.
2. Объекты исследования биохимии и молекулярной биологии
Зачастую предметами исследования обеих наук служат одни и те же объекты, поэтому логично охарактеризовать их в общем составе.
1. Атомы. Средний диаметр — менее 0,4 нм. Наибольшее распространение в живой материи имеют атомы углерода, кислорода, азота и водорода.
Поведение малых молекул определяется свойствами тех атомов, которые их
формируют.
2. Малые молекулы. Величина — 0,5—1,0 нм. Особое значение для жи7
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
вых систем имеют малые молекулы следующих классов: аминокислоты, моносахариды, азотистые основания, неорганический фосфат, глицерин. Из этих
молекул, как из строительных блоков, формируются макромолекулы.
3. Гены. Это участки нуклеиновых кислот, определяющие структуру полипептидов, тРНК, рРНК, а также играющие роль в регуляции метаболизма.
Одна молекула ДНК (РНК) может содержать от нескольких единиц до нескольких тысяч генов. Размер генов определяется числом пар нуклеотидов и
может содержать их в количестве от нескольких десятков до десятков тысяч.
4. Макромолекулы. Имеют размер 3—300 нм. Наибольшее распространение и значение для организмов имеют белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Они участвуют в формировании вирусных частиц и клеточных органелл.
5. Органеллы — клеточные структуры, выполняющие специфические
функции. Характеризуются размером 20 нм—10 мкм. Наиболее крупные и
высокоорганизованные органеллы (имеются только в клетках эукариот) —
ядра, митохондрии, хлоропласты.
6. Вирусы — существа, имеющие неклеточное строение. Диаметр вирусных частиц составляет 20—300 нм. Не имеют собственного метаболизма,
облигатные ультрапаразиты, не способны к самовоспроизведению без содействия соответствующих клеточных систем.
7. Клетки — минимальные единицы жизни, способные к самовоспроизведению. Существуют двух типов — прокариотические и эукариотические.
Имеют размер 0,1—100 мкм.
8. Организмы: одно- и многоклеточные; про- и эукариотические. От размеров одной клетки до гигантских форм.
8
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Часть первая. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
И МЕХАНИЗМЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
Глава 1. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА КЛЕТКИ
Развитие представлений о ДНК как о веществе, в котором зашифрована
наследственная информация клетки, осуществлялось в истории биохимии на
протяжении примерно двадцати лет в ходе нескольких этапов. Причиной такого длительного спора между исследователями в отношении одного из главных вопросов естествознания послужила, с одной стороны, консервативность
взглядов на структуру нуклеиновых кислот как на «просто организованные
молекулы». При недостаточной их изученности полагалось, что ДНК и РНК
представляют собой полимеры, в которых многократно повторяются тетрануклеотиды. В то же время белковые молекулы стали исследоваться раньше
других клеточных макромолекул, и к 1928 г. в изучении их организации удалось достичь определенного прогресса: было известно, что в их составе присутствует, как минимум, 20 аминокислот, которые чередуются в произвольном порядке, определяя огромное количество вариантов строения полипептидов.
История становления постулата «ДНК — носитель наследственной информации» показательна с точки зрения изящества человеческой мысли, а
также проливает свет на многие закономерности процессов наследования
признаков организмами и достойна изучения.
1.1. Становление постулата «ДНК — носитель
генетической информации»
Первым прямым доказательством генетической роли ДНК послужили
эксперименты Ф. Гриффита (1928 г.) по трансформации пневмококков.
Гриффит работал с двумя типами штаммов Diplococcus pneumoniae: Sформами, образующими на агаризованных средах гладкие, блестящие (от
англ. smooth — гладкий) колонии, и R-формами, характеризующимися шероховатой (от англ. rough — шероховатый) поверхностью колоний. S-формы
были высоковирулентными для мышей и вызывали у них пневмонию. Однако
убитые нагреванием до 65° С, пневмококки S-формы не приводили к болезни
и гибели мышей. R-формы были низковирулентными и редко вызывали заболевание мышей.
Гриффит обнаружил, что если мышей заразить смесью живых R-форм и
убитых нагреванием (до 65° С) S-форм, то животные заболевают, а из их кро9
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ви можно выделить жизнеспособные S-формы пневмококков, причем того же
серотипа, что и убитые нагреванием S-формы. Это наблюдение позволило
Гриффиту сделать вывод о явлении «трансформации» в организме мыши
бактерий одного типа (R) в бактерии другого типа (S), а трансформирующим
фактором в этом случае должно было выступать вещество, определяющее
наследственные свойства и содержащееся в убитых нагреванием клетках.
Поскольку при используемой температуре (60—65 °С) белок подвергается
денатурации, Гриффит предположил, что трансформирующим фактором,
очевидно, является не белок, а ДНК.
Со времен экспериментов Гриффита данный метод переноса генетической
информации называется трансформацией. Позже стало известно, что характер клеточной поверхности пневмококков определяется двумя аллелями гена:
аллель S контролирует способность клетки формировать полисахаридную
капсулу, придающую гладкую поверхность колониям и защищающую пневмококков от иммунной системы мыши; если в клетке присутствует аллель R,
то капсула не образуется, и клетки легко распознаются и уничтожаются иммунной системой хозяина.
В свое время результаты экспериментов и выводы Гриффита, как выходящие за рамки традиционных представлений об этих процессах, не были
приняты научной общественностью. Понадобилось воспроизведение похожих
манипуляций in vitro, которое осуществили в 1944 г. американские исследователи Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти. Эти ученые трансформировали растущую культуру пневмококков R-типа выделенной из клеток S-штамма ДНК.
Оказалось, что некоторые бактерии приобретали способность синтезировать
полисахаридную капсулу и, соответственно, патогенность для мышей. При
этом единственным фактором, способным сообщить R-клеткам данное свойство, была очищенная ДНК. Кроме того, в данных экспериментах было выявлено, что на трансформацию не оказывают влияния протеолитические ферменты, и наоборот, обработка трансформирующего фактора нуклеазами приводила к предотвращению процесса трансформации. Наконец, из экспериментов следовало, что возникающие в результате трансформации бактерии Sтипа обладают способностью передавать приобретенное свойство (синтез
капсульных полисахаридов) дочерним клеткам. Полученные американскими
учеными доказательства роли ДНК в хранении и передаче наследственной
информации носили фундаментальный характер и вошли в историю, однако и
они не были оценены сразу по указанным выше причинам. Кроме того, изучение основ наследственности в 1944 г. только начиналось и еще не было
точно установлено, что бактерии обладают генами, во всех отношениях сходными с генами высших организмов.
Решающим доказательством в пользу генетической роли ДНК стали эксперименты, осуществленные Альфредом Херши и Маргарет Чейз в 1952 г.
Им удалось доказать, что носителем наследственной информации у бактериофага Т2 является ДНК. Суть экспериментов сводилась к следующему.
Одну культуру клеток кишечной палочки выращивали на среде, содержащей
радиоактивные изотопы фосфора (32Р), а другую — в присутствии изотопов
серы (35S), в результате чего эти изотопы включались в содержимое клеток.
Затем каждую из меченых бактериальных культур использовали для получе10
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ния лизата Т2. Получали разные лизаты меченных изотопами фагов: в одном
из них содержались частицы Т2, у которых 35S включался в состав белка
(капсида), а в другом – Т2 с 32Р в составе ДНК. Радиоактивные метки позволяли проследить пути белка и ДНК фага при его репродукции.
Литический цикл начинается с прикрепления фаговой частицы к клеточной поверхности, и через определенное время фаговая ДНК инъецируется в
клетку. Это подтверждалось результатами центрифугирования суспензий на
отмеченных стадиях: вначале вместе с бактериями осаждались и фаги (35S и
32
Р регистрировался в осадке). Однако через определенное время бульшая
часть меченного изотопом серы белка может быть отделена от клеток при
встряхивании суспензии, при этом бульшая часть меченной изотопом фосфора ДНК не отделяется от бактерий и обнаруживается в осадке. Это дает основание предполагать, что ДНК оказывается уже внутри клеток.
Удаление из культуры пустых фаговых оболочек («теней») не оказывает
влияния на дальнейшие события: бактерии лизируются, и из них выходит
фаговое потомство точно так же, как и в случае, если «тени» остаются на поверхности клеток. Оказалось, что удаление «теней» сопровождается удалением не менее 80 % 35S, а основная масса 32Р остается в клетках и в дальнейшем
(при репродукции фага) передается потомству. Таким образом, очевиден вывод, что именно ДНК, а не белок определяет процесс репродукции фага в
клетках.
Эксперимент Херши и Чейз послужил решающим доказательством генетической роли ДНК и привлек внимание к работам, выполненным на пневмококках несколькими годами ранее. Этому способствовало несколько причин:
к 1952 г. исследование структуры нуклеиновых кислот достигло больших успехов и было опровергнуто представление об этих молекулах как о консервативных; данный эксперимент был осуществлен на бактериофаге, относительно характера наследования признаков которого было хорошо известно, что он
аналогичен таковому для высших организмов; наконец, для фага Т2 было
продемонстрировано существование мутаций и так же, как у высших организмов, описана рекомбинация мутантных генов.
Дополнительным доказательством генетической роли ДНК явилось обнаружение инфекционных свойств у очищенного препарата ДНК вируса табачной мозаики.
1.2. Типы нуклеиновых кислот и их функции
Из двух типов нуклеиновых кислот — ДНК и РНК — дезоксирибонуклеиновая кислота выполняет роль вещества, в котором закодирована вся
основная наследственная информация клетки, и которое способно к самовоспроизведению, а рибонуклеиновые кислоты выполняют роль посредников
между ДНК и белком. Такие функции нуклеиновых кислот тесно связаны с
особенностями их индивидуальной структуры.
ДНК и РНК — это полимерные макромолекулы, мономерами которых
служат нуклеотиды. Каждый нуклеотид сформирован из трех частей —
моносахарида, остатка фосфорной кислоты и азотистого основания. Азотистое основание соединено с сахаром b-N-гликозидной связью (рис. 1.1).
11
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Сахар, входящий в состав нуклеотида (пентоза), может присутствовать в
одной из двух форм: b-D-рибозы и b-D-2-дезоксирибозы. Различие между
ними состоит в том, что гидроксил рибозы при 2ў-углеродном атоме пентозы
замещен в дезоксирибозе на атом водорода. Нуклеотиды, содержащие рибозу,
называются рибонуклеотидами и являются мономерами РНК, а нуклеотиды,
содержащие дезоксирибозу, носят название дезоксирибонуклеотиды и формируют ДНК.
Азотистые основания являются производными одного из двух соединений — пурина или пиримидина. В нуклеиновых кислотах преобладают два
пуриновых основания — аденин (А) и гуанин (G) и три пиримидиновых —
цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U). В рибонуклеотидах и соответственно в
РНК присутствуют основания А, G, С, U, а в дезоксирибонуклеотидах и в
ДНК — А, G, С, Т.
H
H
N
Азотистое
основание
(аденин)
O
O P O
O
Фосфат
N
N
H
H
N
N
5'
CH2
O
4'
Н
1'
3'
2'
OH
H
Н
Сахар
(дезоксирибоза)
Нуклеозид (дезоксиаденозин)
Нуклеотид (дезоксиаденозин-5'-фосфат)
Рис. 1.1. Структура нуклеозида и нуклеотида: цифрами обозначено положение атомов в остатке пентозы
Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов широко используется в биохимии и молекулярной биологии и представлена в табл. 1.1.
12
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Таблица 1.1. Номенклатура нуклеотидов и нуклеозидов
Основание
Нуклеозид
Нуклеотид
Аденозин
Аденилат, аденозинфосфат (АМР, ADP,
ATP)
Гуанозин
Гуанилат, гуанозинфосфат (GМР, GDP,
GTP)
Цитидин
Цитидилат, цитидинфосфат (СМР, CDP,
CTP)
Уридин
Уридилат, уридинфосфат (UМР, UDP, UTP)
NH2
Аденин
N
N
N
N
О
N
НN
Гуанин
H2N
N
N
NH2
Цитозин
N
О
N
О
НN
Урацил
О
N
О
НN
CH3
Дезокситимидин
Тимин
О
N
Дезокситимидилат,
дезокситимидинфосфат (dТМР, dTDP,
dTTP)
Длинные полинуклеотидные цепочки ДНК и РНК образуются при соединении нуклеотидов между собой с помощью фосфодиэфирных мостиков. Каждый фосфат соединяет гидроксил при 3ў-углеродном атоме пентозы одного
13
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
нуклеотида с ОН-группой при 5ў-углеродном атоме пентозы соседнего нуклеотида (рис. 1.2).
При кислотном гидролизе нуклеиновых кислот образуются отдельные
компоненты нуклеотидов, а при ферментативном гидролизе с помощью нуклеаз расщепляются определенные связи в составе фосфодиэфирного мостика
и при этом обнажаются 3ў- и 5ў-концы молекулы (рис. 1.2).
Рис. 1.2. Вторичная структура ДНК. Ферментативный гидролиз цепочки ДНК с
обнажением 3ў- и 5ў- свободных концов молекулы
Это дает основание считать цепочку нуклеиновой кислоты полярной, и появляется возможность определять направление чтения последовательности нуклеотидов в ней. Следует отметить, что большинство ферментов, участвующих
14
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
в синтезе и гидролизе нуклеиновых кислот, работают в направлении от 5ў- к
3ў-концу (5ў ® 3ў) цепочки нуклеиновой кислоты. Согласно принятому соглашению, последовательность нуклеотидов в цепочках нуклеиновых кислот
тоже читается в направлении 5ў ® 3ў (рис. 1.2).
Особенности строения ДНК. Согласно трехмерной модели, предложенной Уотсоном и Криком в 1953 г., молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, которые образуют правую спираль относительно одной и
той же оси. Направление цепей в молекуле взаимно противоположное, она
имеет почти постоянный диаметр и другие параметры, которые не зависят от
нуклеотидного состава, в отличие от белков, у которых последовательность
аминокислотных остатков определяет вторичную и третичную структуру молекулы.
Сахарофосфатный остов располагается по периферии спирали, а азотистые основания находятся внутри, и их плоскости перпендикулярны оси спирали. Между основаниями, расположенными друг напротив друга в противоположных цепях, формируются специфические водородные связи: аденин
всегда связывается с тимином, а гуанин с цитозином. Причем в АТ-паре основания соединены двумя водородными связями: одна из них образуется между амино- и кетогруппами, а другая — между двумя атомами азота пурина и
пиримидина соответственно. В GС-паре имеется три водородные связи: две
из них образуются между амино- и кето-группами соответствующих оснований, а третья — между атомом азота пиримидина и водородом (заместителем
у атома азота) пурина.
Таким образом, более объемные пурины всегда спариваются с пиримидинами, имеющими меньшие размеры. Это приводит к тому, что расстояния
между С1ў-атомами дезоксирибозы в двух цепях оказываются одинаковыми
для АТ- и GС-пар и равными 1,085 нм. Два указанных типа пар нуклеотидов,
АТ и GС, называют комплементарными парами. Образование пар между
двумя пуринами, двумя пиримидинами или некомплементарными основаниями (А+С или G+Т) стерически затруднено, поскольку при этом не могут
образовываться подходящие водородные связи и, следовательно, нарушается
геометрия спирали.
Геометрия двойной спирали такова, что соседние нуклеотиды в цепи находятся друг от друга на расстоянии 0,34 нм. На один виток спирали приходится 10 пар нуклеотидов, и шаг спирали равен 3,4 нм (10 ґ 0,34 нм). Диаметр двойной спирали равен примерно 2,0 нм. В связи с тем, что сахарофосфатный остов расположен дальше от оси спирали, чем азотистые основания, в
двойной спирали имеются желобки —большой и малый (рис. 1.3).
Молекула ДНК способна принимать различные конформации. Обнаружены А-, В- и Z-формы. В-ДНК — это обычная форма, в которой ДНК находится в клетке, в ней плоскости колец оснований перпендикулярны оси двойной
спирали. В А-форме ДНК плоскости пар оснований повернуты примерно на
20° от нормали к оси правой двойной спирали. Z-форма ДНК — это левая
спираль с 12 парами нуклеотидов на виток. Биологические функции А- и Zформ ДНК до конца не выяснены.
15
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 1.3. Схематическое изображение В-формы двойной спирали ДНК.
Видны большой и малый желобки. Указаны расстояние между ближайшими парами оснований и шаг спирали [М. Сингер, П. Берг, 1998]
Стабильность двойной спирали обусловлена водородными связями между
комплементарными нуклеотидами в антипараллельных цепях, стэкинг16
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
взаимодействием (межплоскостные вандерваальсовы контакты между атомами и перекрывание p-орбиталей атомов контактирующих оснований), а также
гидрофобными взаимодействиями. Последние выражаются в том, что неполярные азотистые основания обращены внутрь спирали и защищены от непосредственного контакта с полярным растворителем, и наоборот, заряженные
сахарафосфатные группы обращены наружу и контактируют с растворителем.
Поскольку две цепи ДНК связаны между собой только нековалентными
связями, молекула ДНК легко распадается на отдельные цепочки при нагревании или в щелочных растворах (денатурация). Однако при медленном
охлаждении (отжиг) цепи способны вновь ассоциировать, и между комплементарными основаниями восстанавливаются водородные связи (ренатурация). Эти свойства ДНК имеют большое значение для методологии генетической инженерии (глава 20).
Размер молекул ДНК выражают в числе пар нуклеотидов, при этом за
единицу принимается тысяча пар нуклеотидов (т. п. н.) или 1 килобаза (кб).
Молекулярная масса одной т. п. н. В-формы ДНК составляет ~ 6,6Ч105 Да, а
ее длина составляет 340 нм. Полный геном Е.coli (~ 4Ч106 п. н.) представлен
одной кольцевой молекулой ДНК (нуклеоид) и имеет длину 1,4 мм.
Особенности строения и функции РНК. Молекулы РНК представляют
собой полинуклеотиды, состоящие из одной цепи, включающей 70—10000
нуклеотидов (иногда и больше), представленные следующими типами: мРНК
(матричная или информационная), тРНК (транспортная), рРНК (рибосомная)
и только в клетках эукариот — гяРНК (гетерогенная ядерная), а также мяРНК
(малые ядерные). Перечисленные виды РНК выполняют специфические
функции, кроме того, в некоторых вирусных частицах РНК является носителем генетической информации.
Матричная РНК является транскриптом определенного фрагмента смысловой цепи ДНК и синтезируется в ходе транскрипции. мРНК — это программа (матрица), по которой строится полипептидная молекула. Каждые три
последовательно расположенных нуклеотида в мРНК выполняют функцию
кодона, определяя положение соответствующей аминокислоты в пептиде.
Таким образом, мРНК служит посредником между ДНК и белком.
Транспортная РНК также участвует в процессе синтеза белка. Ее функция
состоит в доставке аминокислот к месту синтеза и определении положения
аминокислоты в пептиде. Для этого в составе тРНК имеется специфический
триплет нуклеотидов, носящий название «антикодон», и вся молекула характеризуется уникальным строением. Структурное представление о молекуле
тРНК носит название «клеверный лист» (рис. 1.4).
Молекула тРНК — короткая и состоит из 74—90 нуклеотидов. Как и любая цепь нуклеиновой кислоты, она имеет 2 конца: фосфорилированный 5ўконец и 3ў-конец, на котором всегда присутствуют 3 нуклеотида —ССА и
концевая 3ўОН-группа. К 3ў-концу тРНК прикрепляется ами-
17
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 1.4. Структура тРНК [Э. Рис, М. Стернберг, 1988]
нокислота, и он называется акцепторным. В составе тРНК обнаружено несколько необычным образом модифицированных нуклеотидов, не встречающихся в других нуклеиновых кислотах.
Несмотря на то, что молекула тРНК одноцепочечная, в ней присутствуют
отдельные дуплексные участки, формирующие т. н. стебли или ветви, где между асимметричными участками цепи образуются Уотсон—Криковские пары
(рис. 1.4). Все известные тРНК формируют «клеверный лист» с четырьмя
стеблями (акцепторным, D, антикодоновым и Т). Стебли имеют форму правой двойной спирали, известной как А-форма ДНК. Петли тРНК представля18
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ют собой одноцепочечные участки. Некоторые тРНК имеют дополнительные
петли и/или стебли (например, вариабельная петля дрожжевой фенилаланиновой тРНК).
Узнавание молекулой тРНК соответствующего сайта в мРНК осуществляется с помощью антикодона, расположенного в антикодоновой петле
(рис. 1.4). При этом образуются водородные связи между основаниями кодона и антикодона, при условии, что формирующие их последовательности
комплементарны, а полинуклеотидные цепи антипараллельны (рис. 1.5).
Молекулы разных тРНК отличаются друг от друга последовательностью
нуклеотидов, однако их третичная структура очень сходна. Молекула имеет
такой характер укладки, что напоминает по форме букву Г. Акцепторный и Тстебли уложены в пространстве особым образом и образуют одну непрерывную спираль — «перекладину» буквы Г; антикодоновый и D-стебли образуют
«ножку». Правильная укладка молекул тРНК в пространстве имеет большое значение для их функционирования.
В количественном отношении в клетке преобладает рибосомная РНК, однако ее разнообразие по сравнению с другими типами РНК —наименьшее: на
долю рРНК приходится до 80 % массы клеточных РНК, и она представлена
тремя—четырьмя видами. В то же время, масса почти 100 видов тРНК составляет около 15 %, а доля нескольких тысяч различных мРНК — менее 5 %
массы клеточной РНК.
В клетках E.coli обнаружено 3 типа рРНК: 5 S, 16 S и 23 S, а в эукариотических клетках функционируют 18 S-, 5,8 S-, 28 S- и 5 S-рРНК. Эти виды
рРНК входят в состав рибосом и составляют примерно 65 % их массы. В составе рибосом рРНК плотно упакованы, способны складываться с образованием стеблей со спаренными основаниями, подобными таковым в тРНК.
Считается, что рРНК принимают участие в связывании рибосомы с тРНК.
Показано, в частности, что 5 S-рРНК взаимодействует с Т-плечом тРНК.
Кроме перечисленных типов РНК, у эукариот в ядрах обнаружены гетерогенные ядерные РНК и малые ядерные РНК. На долю гяРНК приходится менее 2 % от общего количества клеточной РНК. Эти молекулы способны к быстрым превращениям — для большинства из них время полужизни не превышает 10 мин. Одной из немногих выявленных функций гяРНК является ее
роль в качестве предшественника мРНК. мяРНК
Рис. 1.5. Взаимодействие кодона мРНК с антикодоном тРНК. Точками
обозначены водородные связи между комплементарными
нуклеотидами
ассоциированы с рядом белков и формируют так называемые малые ядер19
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ные рибонуклеопротеидные частицы (мяРНП), осуществляющие сплайсинг РНК (глава 3).
1.3. Структура и функции гена. Организация генов в хромосомах
Термин «ген» ввел датский ученый В. Иоганнсен в 1909 г., когда еще не
была известна его материальная природа. Пониманию структуры и функций
гена способствовали результаты экспериментов американских исследователей
Дж. Бидла и Э. Тейтума, которые изучали биохимическую роль различных
генов у гриба Neurospora crassa. Было установлено однозначное соответствие
между появлением генетической мутации, индуцированной рентгеновским
излучением, и исчезновением определенного фермента, необходимого для
данной биохимической стадии метаболизма. Исходя из этого, Бидл и Тейтум
сформулировали гипотезу «один ген — один фермент», которая означала, что
каждый ген направляет синтез одного фермента. В настоящее время эта гипотеза претерпела лишь одно изменение, связанное с тем, что структура некоторых белков, включающих более чем одну полипептидную цепь, кодируется
несколькими генами. При этом последовательность аминокислот в каждой
полипептидной цепи кодируется отдельным геном, цепи синтезируются отдельно и лишь затем соединяются в готовый продукт. Чаще гены, контролирующие синтез двух или нескольких полипептидных цепей, располагаются
рядом на хромосоме, но не всегда. Так, например, гены, определяющие
структуру a- и b-цепей гемоглобина, не сцеплены между собой. Таким образом, современная трактовка постулата Бидла и Тейтума звучит «один ген —
одна полипептидная цепь». Это открытие позволило вплотную подойти к
расшифровке механизмов реализации генетической информации.
В настоящее время ген понимают как структурную единицу наследственной информации, далее неделимую в функциональном отношении. Ген — это
участок молекулы ДНК (реже, только у некоторых вирусов —РНК), кодирующий структуру одной макромолекулы: полипептида, тРНК или рРНК. В
структуре генов прокариот, эукариот и вирусов, а также в организации этих
генов в хромосомах много общего, однако есть и существенные различия.
Нуклеоид прокариот содержит примерно 2—3 тыс. не перекрывающихся
генов. Среди них выделяют независимые гены и гены, организованные в
группы. Независимые гены называются так потому, что мРНК, считанная с
такого гена, всегда моноцистронная (под цистроном понимают последовательность нуклеотидов, кодирующую единую полипептидную цепь или стабильную РНК). В свою очередь, независимые гены у прокариот могут содержать регуляторные области (рис. 1.6, А), и в таком случае их транскрипция
подвержена регуляции; а могут и не содержать таковых. В последнем случае
они носят название конститутивных генов, поскольку их транскрипция
осуществляется непрерывно (конститутивно), независимо от ситуации в
клетке. Конститутивные гены кодируют структуру конститутивных белков.
В большинстве случаев, однако, единицы транскрипции прокариот являются полицистронными и содержат последовательности, кодирующие не
один, а несколько типов белков или РНК (рис. 1.6, Б и В). Как правило,
транскрипция кодирующих последовательностей в полицистронной единице
20
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
осуществляется согласованно, с участием общих 5ў- и 3ў-регуляторных элементов. При этом последовательности, кодирующие один или несколько полипептидов, транскрибируются с образованием зрелой мРНК, которая не претерпевает событий модификации перед трансляцией. Наоборот, последовательности, кодирующие разные типы РНК, специфически расщепляются в
ходе посттранскрипционного процессинга с образованием зрелых стабильных РНК-продуктов.
Таким образом, современное представление о прокариотическом гене
распространяется на следующие элементы: 1) единицы транскрипции, включающие последовательности, кодирующие зрелую РНК, либо полипептид, 5ўлидерную и 3ў-трейлерную последовательности, а также спейсерную ДНК;
2) 5ў-последовательности, необходимые для начала правильной транскрипции
(промотор) и 3ў-последовательности, нужные для правильного окончания
транскрипции (терминатор); 3) последовательности, регулирующие частоту
инициации транскрипции.
На рис. 1.6 показаны все перечисленные элементы, входящие в состав
разных прокариотических генов. Единица транскрипции представляет собой
участок ДНК между сайтами, в которых начинается и заканчивается транскрипция. Для белок-кодирующих генов характерно наличие в составе транскрипционной единицы определенного количества нуклеотидов, которые
предшествуют белок-кодирующей последовательности (5ў-лидер) или следующих за ней (3ў-трейлер). Эти элементы присутствуют в зрелых мРНК,
известно участие 5ў-лидерной последовательности в процессе регуляции
транскрипции.
Спейсерная ДНК представляет собой промежуточные последовательности, разделяющие кодирующие области, и она удаляется в ходе процессинга
первичных транскриптов. Последовательности, необходимые для правильного начала транскрипции, представляют собой, прежде всего, промотор, с которым связывается РНК-полимераза, и участки, влияющие на скорость инициации транскрипции (оператор, активатор). Нуклеотидные последовательности, ответственные за терминацию транскрипции, располагаются на 3ў-конце
гена.
В нуклеоиде гены почти непрерывно следуют один за другим по всей длине ДНК, а иногда (в очень редких случаях) даже перекрываются. Значительная часть прокариотических генов объединена в группы по функциональному
признаку. Например, гены путей биосинтеза аминокислот, путей катаболизма
углеводов у прокариот часто объединяются в опероны. В этом случае их экспрессия осуществляется согласованно.
Число генов в геномах эукариот обычно на порядок больше, чем у прокариот. Например, в геноме человека по разным оценкам насчитывается 40—
60Ч103 генов. Организация в эукариотических хромосомах и сама структура
генов характеризуются некоторыми отличительными особенностями. В первую очередь, у эукариот в процессе транскрипции принимает участие не один
тип РНК-полимеразы, как это имеет место в
21
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 1.6. Особенности строения прокариотических генов
22
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
прокариотических клетках, а несколько разных ферментов. Поэтому сами
единицы транскрипции и их регуляторные последовательности отличаются
большей сложностью и разнообразием структурных элементов. Во-вторых, в
составе эукариотических генов изобилуют мозаичные единицы транскрипции,
в которых чередуются кодирующие (экзоны) и некодирующие (интроны)
последовательности. Интроны чаще всего встречаются в генах, кодирующих
полипептиды и тРНК, и реже в рРНК-генах. Размеры, число и местоположение интронов у разных генов различны. В целом общая длина последовательностей интронов превышает суммарную длину экзонов в 2—10 раз и больше.
Интроны вырезаются из состава мРНК в процессе сплайсинга. Третья особенность эукариотических генов состоит в том, что все белок-кодирующие
мРНК у них – моноцистронные, не сгруппированные в опероны. Гены 5 SрРНК располагаются в хромосомах эукариот тандемно (следуя один за другим в количестве нескольких копий), но каждый ген транскрибируется со своего собственного промотора с образованием РНК, имеющей только одну последовательность 5 S-рРНК на молекулу. Напротив, остальные типы рРНК
образуют кластеры (группы тесно расположенных генов с общим промотором) и транскрибируются в виде полицистронной молекулы РНК, из которой
в ходе посттранскрипционного процессинга образуются зрелые молекулы
18 S-, 5,8 S- и 28 S-рРНК. Количество генов в геномах разных эукариот сильно отличается, приближаясь к 105.
Количество генов в вирусных геномах самое маленькое — обычно до десяти. Их особенностью является способность к перекрыванию в результате
использования нескольких рамок считывания генетического кода. При таком способе записи наследственной информации увеличивается емкость генетического материала, что необходимо вирусам из-за ограниченных размеров
капсидов, в которые может поместиться строго определенное количество нуклеиновых кислот.
1.4. Генетический код
Первые представления о том, каким образом в генах закодирована наследственная информация, изложил Ф. Крик в своей «гипотезе последовательности», согласно которой последовательность аминокислот в полипептидной цепи определяется последовательностью элементов в гене. Экспериментальные подтверждения данная гипотеза получила уже после расшифровки генетического кода в экспериментах Ч. Яновского. Чарльз Яновский в
1964 г. показал совпадение относительного положения индуцированных мутаций в гене trpA E.coli и аминокислотных замен в кодируемом этим геном
ферменте — триптофан-синтетазе. Таким образом, была доказана колинеарность структуры гена и кодируемого им полипептида.
Тем не менее молекулярные основы этой колинеарности были вовсе не
очевидны, поскольку все разнообразие аминокислот в полипептидах описывается значением 20, а разнообразие нуклеотидов в ДНК —значением 4. Таким образом, один нуклеотид никак не может кодировать одну аминокислоту
в пептиде.
Эксперименты Ф. Крика и его соавторов по исследованию мутаций у бак23
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
териофага Т4 кишечной палочки позволили прийти к заключению, что каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами, т. е. генетический код
триплетный. Этот вывод следовал из наблюдения, что мутации, сопровождающиеся вставками или выпадениями (делециями) одного либо двух нуклеотидов из генома Т4, приводили к образованию аномальных белков с нарушенной функцией. Наоборот, вставки или делеции трех нуклеотидов сопровождались часто незначительными изменениями в составе белков, в результате чего последние сохраняли активность. Крик и Бреннер заключили, что
генетический код считывается дискретными единицами по 3 нуклеотида. В
таком случае вставка (делеция) триплета нуклеотидов должна приводить к
добавлению (изъятию) всего одной аминокислоты из состава соответствующего полипептида. В ситуации, когда вставка (делеция) нуклеотидов совершается в количестве, не кратном трем, должен происходить сдвиг «рамки
считывания» и последовательность аминокислот в белке должна полностью
меняться.
Таким образом, генетический код — триплетный, т. е. положение каждой
аминокислоты в полипептиде задается последовательностью из трех нуклеотидов, которая носит название кодон. Поскольку число разных нуклеотидов в
ДНК равно четырем, то количество возможных вариантов триплетов нуклеотидов будет описываться количеством: 4 ґ 4 ґ 4 = 64. 61 из 64 триплетов
кодируют аминокислоты, причем каждый триплет — только одну аминокислоту, а три оставшихся кодона служат сигналами окончания (терминации)
трансляции (рис. 1.7). Эти кодоны называют стоп (stop)-кодонами или нонсенс-кодонами, поскольку они не определяют никакой аминокислоты. Помимо этого, два кодирующих триплета (чаще ATG — для Met, иногда
GTG — для Val) выполняют двойную функцию: кодируют аминокислоты метионин или валин и служат стартовыми кодонами, на которых начинается
процесс трансляции (рис. 1.7).
Ala — GCA, GCG, GCT, GCC;
Asp — GAT, GAC;
Arg — AGA, AGG, CGA, CGG, CGT, CGC;
Asn — AAT, AAC;
Gly — GGA, GGG, GGT, GGC;
Cys — TGT, TGC;
Ileu — ATA, ATT, ATC;
Glu — GAA, GAG;
Leu — TTA, TTG, CTA, CTG, CTT, CTC; Gln — CAA, CAG;
Pro — CCA, CCG, CCT, CCC;
His — CAT, CAC;
Ser — AGT, AGC, TCA, TCG, TCT, TCC; Lys — AAA, AAG;
Thr — ACA, ACG, ACT, ACC;
Met — ATG;
Val — GTA, GTG, GTT, GTC;
Phe — TTT, TTC;
Trp — TGG;
Tyr — TAT; TAC;
stop — TAA, TAG, TGA
Рис. 1.7. Структура генетического кода. Подчеркнуты кодоны,
выполняющие функции стартовых при трансляции. Выделены
стоп-кодоны, терминирующие процесс трансляции
Особенностью генетического кода является то, что в нем отсутствуют запятые, т. е. нет знаков, отделяющих один кодон от другого. При этом генети24
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ческий код не перекрывается в пределах одной рамки считывания, а рамка
считывания задается первым «читаемым» нуклеотидом (рис. 1.8). Максимальное количество рамок считывания в гене — 3, столько же, сколько и
«букв» в коде.
Для большинства клеточных организмов характерна реализация лишь одной рамки считывания, в то время как у некоторых вирусов их может быть
две или даже три.
Направление чтения закодированной записи осуществляется от 5ў-конца к
3ў-концу мРНК, являющейся транскриптом «+»-цепи ДНК, считанным с нее в
направлении 5ў ® 3ў. Первый с 5ў-конца кодон отвечает N-концевой аминокислоте полипептидной цепи. Следовательно, белки синтезируются от Nконца к С-концу (рис. 1.8).
Еще одним свойством генетического кода является его вырожденность.
Это означает, что одна аминокислота может кодироваться более чем одним
триплетом нуклеотидов. С другой стороны, код не является двусмысленным:
каждый кодон кодирует только одну аминокислоту. Такая закономерность
выражается в том, что если известна последовательность нуклеотидов в ДНК,
то с ее помощью легко узнать последовательность аминокислот в белке; наоборот, известную последовательность аминокислот нельзя однозначно перевести в нуклеотидную последовательность ДНК. Вырожденность генетического кода, как правило, приводит к тому, что у кодонов, определяющих одну
и ту же аминокислоту, реально распознаются только первые два нуклеотида, а
третий может не иметь значения.
Рис. 1.8. Рамки считывания генетического кода. Цифрой «1» обозначены первые нуклеотиды, задающие каждую из трех возможных рамок считывания.
Полипептид строится от N-конца (свободная аминогруппа) к С-концу (свободная карбоксильная группа). Сдвиг рамки считывания приводит к
изменению последовательности аминокислот в пептидной молекуле
Для объяснения этого феномена Крик предложил гипотезу «качания» (от
англ. wobble), которая впоследствии подтвердилась, и в настоящее время на25
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
зывается правилом неоднозначного соответствия. Согласно этому правилу,
соответствие третьего нуклеотида в кодоне мРНК первому нуклеотиду в антикодоне тРНК является нестрогим, поскольку часто первое положение в антикодоне тРНК занимает минорный нуклеотид, содержащий в качестве азотистого основания инозин. Инозин может образовывать водородные связи с
урацилом, цитозином или аденином, находящимися в кодоне в третьем положении. Существование такого механизма позволяет клетке иметь меньше 61
разной тРНК, поскольку многие тРНК способны узнавать до трех кодонов.
Генетический код универсален. Это свойство кода состоит в том, что любая молекула мРНК при трансляции в клетке любого организма приведет к
синтезу полипептида с одинаковой последовательностью аминокислот. Данное правило, однако, имеет исключения, которые касаются генетического
кода ДНК митохондрий. Большей частью и здесь используется основной «генетический словарь», но, например, в митохондриях млекопитающих кодон
UGA в мРНК «читается» как триптофан, и в пептид в соответствующее положение включается триптофан, в то время как в ядерной мРНК данный кодон
служит стоп-кодоном (рис. 1.7) и на нем заканчивается процесс трансляции.
Наоборот, в митохондриях млекопитающих триплеты нуклеотидов AGA и
AGG прочитываются как сигналы терминации, а в ядре они кодируют аминокислоту аргинин. В митохондриях других организмов могут встречаться иные
отклонения от универсального для ядерной ДНК генетического кода.
Структура триплетов нуклеотидов коррелирует с химическими свойствами кодируемых ими аминокислот. Так, все кодоны с уридилатом во втором
положении кодируют аминокислоты с гидрофобной боковой цепью: фенилаланин, лейцин, изолейцин, валин, метионин. Если исключить терминирующие кодоны, то наличие аденилата во втором положении определяет полярную или заряженную боковую цепь (тирозин, гистидин, глютамин, аспарагин,
лизин, глютаминовая и аспарагиновая кислоты). К тому же кодоны для большинства гидрофобных аминокислот различаются только одним нуклеотидом
(рис. 1.7). Аналогичная ситуация наблюдается и для кодонов серина и треонина (их боковые группы содержат гидроксил) или аланина и глицина (имеют
наименее сложно устроенные боковые группы). Таким образом, генетический
код устроен так, что при замене нуклеотидов даже в первой или второй позиции некоторых кодонов в полипептид включается структурно родственная
аминокислота, сводя тем самым к минимуму нарушения во вторичной структуре белка.
Расшифровка генетического кода осуществлена Ниренбергом и Кораной в
начале 60-х годов прошлого столетия. В ходе первых экспериментов в бесклеточную систему для синтеза белка, содержащую все необходимые компоненты, в качестве мРНК вносили искусственно синтезированные гомополинуклеотиды: полиуридилат, полицитидилат и др. Синтезированные в таких
условиях полипептиды подвергали аминокислотному анализу и установили,
что на мРНК, представляющей собой poly(U) (т. е. UUUUUU…), синтезируется полифенилаланин, на poly(С) — полипролин и т. д. Таким образом, можно
было заключить, что триплет нуклеотидов UUU кодирует аминокислоту фенилаланин, а ССС — пролин. Окончательную расшифровку всех 64 кодонов
удалось осуществить с использованием в бесклеточных системах трансляции
26
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
синтетических полирибонуклеотидов с известными повторяющимися последовательностями. Эти регулярные сополимеры удалось получить благодаря
комбинированию методов органического и ферментативного синтеза.
1.5. Репликация нуклеиновых кислот
Основной функцией ДНК является ее способность к самоудвоению (репликации). Репликация — очень точный механизм, практически не допускающий ошибок. В самой ДНК (у некоторых вирусов — в РНК) закодирована информация о структуре ферментов, осуществляющих удвоение нуклеиновых кислот, синтез новых нуклеотидов — строительную базу репликации,
исправление ошибок репликации, а также репарацию повреждений ДНК,
вызванных разными факторами. Наконец, сама структура ДНК, а именно
наличие двух цепей в ее составе, является условием, облегчающим процесс
копирования, поскольку в таком случае каждая из цепочек может выполнять
роль матрицы при синтезе новых молекул ДНК. Подобное предположение
высказали Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик еще в 1953 г., и оно получило
экспериментальное подтверждение. Такой механизм копирования ДНК, когда каждая из цепей выполняет функцию шаблона, а вновь синтезированные
молекулы являются гибридными (состоят из одной старой и одной новой цепей), называется полуконсервативным.
Кроме полуконсервативной, были предложены еще две модели репликации: консервативная и дисперсивная. Особенности этих моделей репликации ДНК состоят в следующем. Согласно дисперсивной модели, родительская спираль ДНК при удвоении разрывается на каждом полуобороте путем
множественной фрагментации, а синтез новых цепей происходит на фрагментах (рис. 1.9). По консервативной модели раскручивания спирали ДНК не
происходит вовсе, и она служит матрицей для двух новых цепей, в результате
чего родительская спираль целиком состоит из старого, а дочерняя — из нового материала. Доказательство реальности полуконсервативного механизма
репликации ДНК предоставили Месельсон и Сталь в 1958 г. в экспериментах
с ультрацентрифугированием меченой бактериальной ДНК.
Суть этих экспериментов состояла в следующем: ДНК E.coli метили радиоактивным изотопом 15N, а затем давали осуществиться одному раунду
репликации ДНК, выращивая клетки в течение ~ 50 мин на питательной среде, содержащей нормальный изотоп азота — 14N. Выделенную из клеток ДНК
подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности хлористого
цезия. При таком центрифугировании молекулы CsCl создают в пробирке
градиент плотности, и молекулы других веществ распределяются в этом градиенте в соответствии со своей плотностью. ДНК E.coli, выращенных на среде, содержащей 15N, имеет плотность 1,724 г/см3, тогда как ДНК клеток, выращенных на обычной среде с изотопом 14N, характеризуется плотностью
1,710 г/см3. Таким образом, смесь этих двух типов ДНК легко разделяется
при центрифугировании по плотности. Локализацию ДНК в пробирке с градиентом CsCl можно определить по поглощению ультрафиолетовых лучей
(ДНК поглощает излучение с длиной волны 260 нм). Таким образом, ДНК в
пробирке выявляется в виде «полос» — «легкая» у верхнего края пробирки,
27
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
«тяжелая» — ближе ко дну. В данном эксперименте в пробирке с градиентом
хлористого цезия образовалась всего одна, средняя по «тяжести» полоса, положение которой соответствовало гибридной ДНК, включающей оба изотопа
азота — 15N и 14N. Это обстоятельство исключало возможность реализации
только одной модели репликации ДНК —консервативной. Для выбора между
оставшимися двумя моделями репликации Месельсон и Сталь позволили бактериям, ДНК которых содержала оба изотопа, совершить еще одно деление
на среде с 14N. Затем их ДНК снова подвергли ультрацентрифугированию. На
этот раз в пробирке сформировалось две полосы ДНК — «легкая» и средняя
по «тяжести», что подтверждает справедливость полуконсервативного механизма репликации ДНК.
Рис. 1.9. Предполагаемые модели репликации дуплексной ДНК. Сплошными
линиями изображены исходные («тяжелые», содержащие 15N) цепи ДНК, а
прерывистыми линиями показаны полученные в результате репликации новые («легкие», содержащие 14N) цепочки ДНК
Итак, все изученные к настоящему времени способы репликации нуклеиновых кислот сводятся к полуконсервативному механизму, согласно которому
после каждого раунда репликации одна нить в каждой из двух дочерних молекул является родительской, т. е. консервативной, а другая —
синтезированной заново. Репликация одно- и двухцепочечных нуклеиновых
кислот, представляющих геномы разных организмов, осуществляется с соблюдением определенных закономерностей при реализации разных механиз28
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
мов, которые рассмотрены ниже. Общим для всех этих процессов является:
1) участие сложного комплекса ферментов, которые осуществляют репликацию; 2) наличие трех основных стадий процесса — инициации, элонгации и
терминации; 3) соблюдение принципа комплементарности при построении
новых цепей, при котором шаблоном (матрицей) служит родительская цепочка; 4) высокая точность процесса; 5) возможность исправления ошибок репликации в ходе корректорской правки.
Репликация двухцепочечных ДНК. Двухцепочечные ДНК формируют
геномы всех клеточных организмов — и прокариот и эукариот. Наилучшим
образом механизм репликации ДНК изучен по отношению к прокариотическим клеткам, в частности бактерий E.coli. В экспериментах с прокариотами
показано, что в условиях, ограничивающих синтез белка, репликация ДНК не
происходит, из чего можно сделать вывод, что этот процесс нуждается в участии белков. В настоящее время показано, что в процессе репликации ДНК
участвуют продукты более чем 10 генов. Это, в первую очередь, ДНКполимеразы, а также топоизомеразы, геликазы и лигазы. Появляется все
больше данных в пользу участия в процессе репликации ДНК высокоорганизованного мультиферментного комплекса —реплисомы, включающей
праймосомо-праймазный комплекс, геликазы, Pol III-холофермент и гиразы.
ДНК-полимеразы — это ключевые ферменты репликативного процесса,
которые собственно и осуществляют наращивание полинуклеотидных цепей,
используя принцип комплементарности. Наиболее полно изучены ДНКполимеразы кишечной палочки. В клетках этих бактерий обнаружено три
различных типа ДНК-полимераз (Pol-I, Pol-II и Pol-III), которые различаются
в первую очередь скоростью катализа и нуклеазной активностью. ДНКполимераза I (Pol-I) представляет собой одиночный полипептид, содержащий
порядка 1000 аминокислотных остатков. В клетке E.coli насчитывается около
400 молекул этого фермента. Pol-I обладает следующими активностями: полимеразной — присоединение комплементарных матричной цепи дезоксинуклеотидов к свободной 3ў-ОН-группе праймера в направлении от 5ў- к 3ўконцу (5ў ® 3ў) строящейся молекулы ДНК; экзонуклеазной — гидролиз фосфодиэфирных связей (отщепление нуклеотидов) в одной цепи ДНК или на
неспаренном конце дуплексной ДНК, начиная с 3ў-конца цепи (3ў ® 5ў) и 5ўконца цепи (5ў ® 3ў). Экзонуклеазные активности играют очень большую
роль в репликации и репарации хромосомной ДНК E.coli. 3ў ® 5ўэкзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи
(корректорская правка), а 5ў ® 3ў-экзонуклеазная активность используется
для удаления димеров пиримидинов и рибонуклеотидов фрагментов Оказаки.
ДНК-полимераза II (Pol-II) присутствует в клетках кишечной палочки в
значительно меньшем числе копий и осуществляет полимеразную активность
гораздо медленнее, чем Pol-I (составляет только 5% активности ДНКполимеразы I). В отличие от Pol-I этот фермент не обладает 5ў ® 3ўэкзонуклеазной активностью. Роль этой полимеразы в репликации до конца
29
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
не выяснена. Считается, что этот фермент не обязателен для репликации
ДНК, но может заменять отдельные функции Pol-I при ее повреждении.
ДНК-полимераза III (Pol-III) — основной фермент, ответственный за репликацию хромосомальной ДНК E.coli. В каждой клетке содержится только
10—20 молекул этого фермента, но работает он примерно в 60 раз быстрее
ДНК-полимеразы I. Кроме того, Pol-III обладает повышенным сродством к
матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. Для
данного фермента, так же как и для Pol-II, не присуща 5ў ® 3ў-экзонуклеазная
активность. Поэтому для репликации отстающей цепи необходимо участие
Pol-I, чтобы произошло удаление РНК-праймеров на 5ў-конце фрагментов
Оказаки.
В эукариотических клетках выявлено большее количество ДНКполимераз, но их функции изучены хуже.
Функция топоизомераз сводится к разрешению механических и топологических проблем в процессе раскручивания двойной спирали в репликативной вилке. Эти ферменты изменяют степень сверхспирализации и приводят
к образованию «шарнира», который создает условия для непрерывного движения репликативной вилки. В различных организмах идентифицированы
топоизомеразы двух основных типов: топоизомеразы типа I надрезают одну
из двух цепей, в результате чего концевой участок двойной спирали может
повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплементарные цепи, изменяют степень сверхспирализации, а затем соединяют
разорванные концы.
Геликазы осуществляют образование и продвижение вдоль спирали ДНК
репликативной вилки — участка молекулы с расплетенными цепями. Эти
ферменты используют для расплетения цепей энергию, высвобождающуюся
при гидролизе АТР. Для обеспечения более высокой скорости раскручивания
несколько геликаз действуют в комплексе с белками второго типа, которые
связываются с одноцепочечными участками молекулы и тем самым стабилизируют расплетенный дуплекс.
Наконец, ДНК-лигазы катализируют процессы воссоединения фрагментов
цепей ДНК, участвуя в образовании ковалентных связей (фосфодиэфирных
мостиков) между 5ў-P- и 3ў-ОН-группами соседних дезоксирибонуклеотидов.
Эти ферменты также используют энергию макроэргических связей, образующуюся при гидролизе АТР или GTP.
Механизм репликации двухцепочечной ДНК лучше всего исследован для
бактерий E.coli и будет рассмотрен на данном примере.
И н и ц и а ц и я р е п л и к а ц и и Д НК . Процесс репликации ДНК кишечной
палочки начинается в строго определенной точке, которая называется origin
(ori), или точкой начала репликации, и расположена на 85 мин. генетической
карты хромосомы этих бактерий. В ori репликации на ДНК действуют ферменты (топоизомеразы, геликазы), обусловливающие формирование репликативной вилки, в которой собственно и происходит копирование цепей. Для
репликации необходимо наличие: ДНК-матрицы в виде одноцепочечного участка ДНК, смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, реплисомы (ансамбля
ферментов, принимающих участие в репликации) и 3ў-ОН–группы нуклеино30
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
вой кислоты —затравки, к которой ДНК-полимераза должна присоединять
следующий нуклеотид. Дело в том, что ни одна из ДНК-полимераз не может
начинать процесс полимеризации нуклеотидов de novo. Эту функцию выполняют РНК-полимеразы, которые узнают ori репликации в репликативной
вилке и синтезируют коротенькие (10—60 рибонуклеотидов) последовательности — РНК-затравки (праймеры). При этом синтез затравок осуществляется в направлении от 5ў- к 3ў-концу, и в результате образуется свободный 3ўОН-конец, который может использовать ДНК-полимераза для продолжения
процесса полимеризации цепей на стадии элонгации репликации (рис. 1.10).
Э л он г а ц и я р е п л и к а ц и и Д НК . Синтез новых цепей ДНК осуществляется с соблюдением принципа комплементарности: каждый подбираемый в
растущую цепь нуклеотид должен быть комплементарен соответствующему
(расположенному напротив) нуклеотиду в исходной (матричной) цепи.
Поскольку все ДНК-полимеразы осуществляют процесс полимеризации
нуклеотидов только в одном направлении (5ў ® 3ў), а репликативная вилка
движется вдоль ДНК в обоих направлениях, непрерывно синтезироваться в
каждом из направлений может лишь одна нить, которую называют лидирующей. Вторая (противоположная) нить синтезируется короткими фрагментами (фрагменты Оказаки) и называется отстающей (рис. 1.10). Фрагменты
Оказаки у прокариот содержат порядка 1000 нуклеотидов, а у эукариот —
100—200 нуклеотидов.
Кроме полимеризации цепей, которую осуществляет в основном ДНКполимераза III, в процессе репликации ДНК происходят следующие события:
— вырезание РНК-затравок из лидирующей цепи и из каждого фрагмента
Оказаки. Эту функцию выполняет Pol-I с помощью своей 5ў ® 3ўэкзонуклеазной активности;
— заполнение “брешей”, оставшихся после вырезания РНК-затравок. Эту
работу также осуществляет ДНК-полимераза I, используя свободную 3ў-ОН–
группу соседнего фрагмента Оказаки;
— соединение фрагментов ДНК в отстающей цепи с помощью фермента
ДНК-лигазы: когда растущий 3ў-гидроксильный конец каждого фрагмента
Оказаки доходит до 5ў-дезоксинуклеотидного конца соседнего фрагмента,
вступает в действие ДНК-лигаза и образуется непрерывная отстающая цепь;
— исправление ошибок репликации — корректорская правка. Этот механизм характерен как для Pol-I, так и для Pol-III и основывается на их 3ў ® 5ўэкзонуклеазной активности. Известно, что ДНК-полимераза про-
31
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 1.10. Репликация у E.coli. Стрелками показано направление синтеза новых цепей ДНК. Незаштрихованные толстые линии — РНК-праймеры, начинающие синтез; сплошные жирные линии — фрагменты удлиняющихся цепей ДНК. Вертикальными линиями показаны водородные связи
между комплементарными нуклеотидами
веряет комплементарность подбираемого нуклеотида, контролируя размер
новой предполагаемой пары нуклеотидов в своем активном центре, и ее полимеразная активность включается лишь тогда, когда эта комплементарность
установлена. С другой стороны, каждый вновь встроенный нуклеотид также
проверяется на соответствие своей паре в активном центре фермента. Если
размер образовавшейся пары нуклеотидов не соответствует истинному (когда
основания противоположных нуклеотидов не комплементарны друг другу), с
помощью своей 3ў ® 5ў-экзонуклеазной активности фермент вырезает некомплементарный нуклеотид и ищет ему замену. Дополнительным механизмом,
уменьшающим ошибки репликации, служит репарация ДНК. В результате
частота ошибочного включения нуклеотидов в образующуюся при репликации цепь ДНК крайне низка (10-8—10-10).
Т е р м и н а ц и я р е п л и к а ц и и . При двунаправленной репликации кольцевого генома (как у кишечной палочки) репликативные вилки встречаются
на расстоянии 180° от точки репликации, и в этом месте репликация завершается. Кольцевые ДНК в месте встречи соединяются лигазой, при этом они
оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем происходит их разделение на отдельные геномы с помощью топоизомеразы типа II.
32
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Скорость репликации ДНК у бактерий E.coli составляет примерно
1500 пар нуклеотидов в секунду. Таким образом, полный геном кишечной
палочки (4Ч106 п. н.) реплицируется примерно за 40 мин. Однако клетки E.coli
делятся быстрее — каждые 20 мин, и это означает, что при прежней скорости
копирования увеличивается частота актов инициации в той же самой точке
начала репликации. Т. е. еще до завершения первого раунда репликации генома в сайте ori инициируется второй раунд репликации. Скорость движения
репликативной вилки в эукариотических клетках значительно меньше (10—
100 п. н. в секунду), но завершение репликации в разумное время обеспечивается одновременной инициацией во множестве точек. В результате хромосома дрозофилы, например, содержащая 6,5Ч107 п. н., реплицируется за несколько минут.
В целом закономерности репликации, выявленные для прокариот, характерны и для большинства эукариотических геномов. Отличия состоят, в первую очередь, в наличии у эукариот множества сайтов инициации репликации
на каждой хромосоме, иных, чем у прокариот, механизмах исправления ошибок репликации, а также в ферментативном оснащении процесса репликации.
Схематическое изображение процессов репликации циклических, формирующих геномы прокариот и плазмид, и линейных (эукариотических) геномов представлены на рис. 1.11.
В линейной ДНК раскручивание цепей осуществляется путем вращения
одной цепи вокруг другой. В кольцевой ДНК раскручивание и репликация
ведут к образованию структуры, напоминающей кольцо с внутренней петлей.
Ее называют тэта-петлей, поскольку по форме она похожа на греческую букву Q. Такие петли можно наблюдать на радиоавтографах реплицирующихся
бактериальных ДНК, что впервые осуществил Кэрнс для ДНК E.coli.
Приведенный механизм двунаправленной репликации ДНК является наиболее распространенным, но не единственным. ДНК фагов Р22, 186, Р2, а
также фагов Т4 и l на поздних стадиях литического цикла реплицируется по
однонаправленному механизму (тип катящегося кольца). В этом случае
двухцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в
уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца). Образовавшийся в результате надреза 5ў-конец цепи связывается с ферментом, осуществившим надрез. Синтез ДНК начинается с вытеснения 5ў-конца, связанного с
ферментом, в раствор, что позволяет ДНК-полимеразе присоединять нуклеотиды к 3ў-ОН-концу. Происходит полуконсервативная репликация, в ходе которой 5ў-конец разорванной цепи вытесняется в виде свободного хвоста и его
длина все увеличивается, а матрицей служит интактная замкнутая цепь. Эту
реплицирующуюся структуру (рис. 1.12) называют катящимся кольцом, так
как разматывание свободной одиночной цепи сопровождается вращением
двухцепочечной матрицы вокруг своей оси.
Если этот механизм используется для репликации двухцепочечной ДНК,
то 5ў-концевые хвосты служат матрицами для синтеза небольших фрагментов
ДНК, которые сразу же сшиваются вместе под действием ДНК-лигазы. В результате растущие хвосты вскоре после своего образования приобретают
двухцепочечную структуру. Элонгация хвостов
33
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 1.11. Типы двунаправленной репликации двухцепочечной ДНК. Сплошными линиями обозначены исходные цепи ДНК; пунктиром — вновь синтезирующиеся цепи
приводит иногда к тому, что их длина многократно превышает общую длину
исходной кольцевой молекулы. Такой способ репликации использует, например, фаг l. При упаковке ДНК в капсиды в специальных участках, называемых cos-сайтами и отстоящих друг от друга на длину вирусного генома, образуются надрезы, в результате чего длинные дуплексы многократно повторенной фаговой ДНК расчленяются на фрагменты, соответствующие по размерам зрелой ДНК, обнаруживаемой в вирионах бактериофага l.
Репликация по типу катящегося кольца характерна также для процесса
образования копии бактериальной хромосомы E.coli Hfr и фактора F+, передающихся при конъюгации в реципиентную клетку.
Репликация одноцепочечных ДНК. У фагов М13 или fХ174, чьи зрелые
геномы представлены одиночными кольцевыми ДНК, репликация осуществляется по механизму катящегося кольца (рис. 1.12). Это происходит
34
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 1.12. Репликация двухцепочечной ДНК по типу катящегося кольца.
Сплошной линией обозначены цепи исходной ДНК; пунктиром —вновь
синтезированные в ходе репликации цепочки. Позиция 1 —исходная
кольцевая ДНК; 2 — формирование надреза в одной из цепей с обнажением 3ў- и 5ў-концов; 3, 4 — репликация кольцевой цепи в репликативной вилке; 5 — начало репликации
5ў-хвоста; 6, 7 —продукты репликации
на поздних стадиях инфекционного процесса, после того, как инфицирующая
ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. В данном случае не
осуществляется репликация 5ў-концевых участков, в отличие от репликации
геномов фага l (рис. 1.12, поз. 5), поэтому продуктом репликации являются
длинные одиночные цепи ДНК, постоянно отделяющиеся от «катящегося рулона» Эти цепи надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых кольцевых форм, упаковываемых в капсиды.
Репликация РНК. Образование РНК-содержащих вирусов происходит
путем репликации их РНК, тогда как все клеточные РНК образуются в результате транскрипции ДНК. За исключением ретровирусов репликация РНК
в основном повторяет процесс репликации ДНК. Как и при репликации ДНК,
порядок расположения нуклеотидов определяется комплементарным копированием матрицы, в данном случае обязательно цепи РНК. Ферменты, осуществляющие этот процесс, называются РНК-зависимыми репликазами. РНК
бактериальных вирусов R17 и MS2, а также полиовирусов и вируса Синдбис,
инфицирующих животных, всегда обозначается знаком (+), поскольку последовательность их РНК-геномов идентична последовательности мРНК. Таким
35
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
образом, геном инфицирующего вируса может служить в качестве мРНК и
содержит информацию о синтезе некоторых, если не всех, вирусных белков.
Специфическая репликаза, кодируемая геномом вируса и образующаяся
вскоре после инфекции, связывается с одним или несколькими белками клетки-хозяина и инициирует процесс копирования (+)-цепи с ее 3ў-конца с образованием полной (-)-цепи, ассоциированной с (+)-цепью-матрицей. Затем та
же репликаза синтезирует множество копий (+)-цепи РНК, используя новосинтезированную (-)-цепь в качестве матрицы. Геномы некоторых вирусов
(вирус везикулярного стоматита, гриппа) представлены одной или несколькими (-)-цепями. В этом случае они служат матрицами для синтеза (+)-цепей,
которые играют роль мРНК и используются при синтезе дочерних (-)-цепей.
Отличительной особенностью репликации геномов ретровирусов является то, что после проникновения их РНК в клетку хозяина вирусный геном
подвергается обратной транскрипции. При этом сначала образуется дуплекс
РНК-ДНК, а затем — двухцепочечная ДНК. Фермент, катализирующий комплементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной
траскриптазой (ревертазой). Он содержится в ретровирусных частицах (вирионах) и активируется после попадания в клетку. Появляется все больше
данных о том, что обратная транскрипция происходит в самых разных эукариотических клетках, а обратная транскриптаза играет важную роль в процессах перестройки генома. Репликация двухцепочечной формы ретровирусной ДНК не начинается до тех пор, пока она не встроится в клеточную ДНК.
Механизм рекомбинационного встраивания пока полностью не установлен.
После интеграции ретровирусная ДНК реплицируется как часть клеточной
ДНК. РНК дочерних вирионов образуется в результате транскрипции интегрированных копий вирусной ДНК.
36
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 2. СОХРАНЕНИЕ ПОСТОЯНСТВА И ИЗМЕНЧИВОСТЬ
ГЕНОМОВ
Сохранение постоянства наследственной информации, с одной стороны, и
изменчивость геномов — с другой, представляют собой две противодействующие силы, между которыми происходит постоянное соперничество. Сама
организация ДНК, являющихся молекулами, в которых зашифрована генетическая информация всех клеточных организмов, способствует надежному
хранению этой информации, поскольку содержит две комплементарные цепочки. В случае каких-либо нарушений в одной из них вторая может служить
матрицей для исправления этих искажений, что действительно имеет место в
многочисленных репарационных процессах. Кроме того, двойная спираль
обусловливает возможность воспроизведения себе подобных молекул, и процессы репликации ДНК осуществляются с высокой точностью (глава 1). Наконец, многие (если не все) клетки имеют систему защиты от проникновения
в них чужеродной ДНК — это, в первую очередь, набор нуклеаз —
ферментов, способных деградировать нуклеиновые кислоты. Среди таких
нуклеаз особое значение имеют рестрикционные ферменты (рестриктазы).
Однако эволюция была бы не возможной, если бы отсутствовали процессы генетической изменчивости: несмотря на все усилия организмов сохранить
неизменным свой геном, он все же поддается изменениям. Основной вклад в
процесс изменчивости геномов вносят следующие процессы: мутагенез, генетический обмен и рекомбинационные события, а также деятельность мобильных генетических элементов.
Перечисленные процессы, направленные на сохранение постоянства и изменение наследственной информации, рассмотрены в данной теме.
2.1. Явление рестрикции—модификации ДНК
В систему рестрикции—модификации входят ферменты, относящиеся к
двум классам: одни из них модифицируют молекулы ДНК, находящиеся в
клетке, а другие расщепляют чужеродные молекулы ДНК (или свои, не модифицированные) в этих же сайтах.
Впервые явление рестрикции—модификации обнаружено С. Лурия в 50-х
гг. прошлого столетия в экспериментах по инфицированию бактерий E coli
бактериофагом l. Оказалось, что бактериофаги, размноженные на бактериях
одного штамма кишечной палочки, инфицировали клетки некоторых других
штаммов с низкой эффективностью. Наблюдалось и обратное явление: полученные в ходе этого низкопродуктивного литического цикла фаги инфицировали клетки исходного штамма также плохо. Было высказано предположение,
37
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
которое впоследствии подтвердилось, что фаговая ДНК подвергается в бактериях E. coli модификации, которая защищает ее от хозяйских ферментов рестрикции, но не от подобных ферментов в других штаммах.
В настоящее время известно, что модификацией, защищающей геном
клетки и некоторые инфицирующие фаговые ДНК, является штаммспецифичное метилирование определенных азотистых оснований в ДНК.
Причем ферментативное присоединение заместителей к азотистым основаниям происходит уже после включения соответствующих нуклеотидов в цепи
ДНК, начиная с этапа образования фрагментов Оказаки. Метилируются нуклеотиды, занимающие строго определенное положение в молекуле, а ферменты, осуществляющие эти реакции, относятся к единой системе рестрикции—модификации. Ферменты рестрикции, входящие в такую систему, узнают в ДНК те же последовательности нуклеотидов и осуществляют специфическое расщепление ДНК в этих (либо прилегающих) последовательностях, если они не модифицированы.
Структура сайтов рестрикции—модификации расшифрована для более
чем 200 рестрикционных ферментов.
Различают три типа эндонуклеаз рестрикции (I, II, III). Ферменты I и III
типов обладают как нуклеазной, так и метилирующей активностями. При
этом эндонуклеазы I типа узнают в ДНК определенную последовательность и
разрезают двухцепочечную ДНК на разном (не фиксированном) расстоянии
от сайтов узнавания. Эндонуклеазы типа III осуществляют двухцепочечные
разрезы ДНК на расстоянии ~25 п. н. от своих сайтов узнавания. Только эндонуклеазы типа II производят двухцепочечные разрезы ДНК по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо
на небольшом, но вполне определенном удалении от него. Ферменты этого
типа не обладают метилирующей активностью. Некоторые из эндонуклеаз II
типа узнают специфические группы из четырех нуклеотидов, другие —
гексануклеотидные последовательности, причем их общей особенностью является палиндромная структура (рис. 2.1). В этом случае одна и та же последовательность располагается в двух цепях в противоположных направлениях симметрично, относительно оси симметрии в середине палиндрома.
Рис. 2.1. Расщепление ДНК с помощью рестриктазы Eco R1 из
Escherichia coli RY13. Слева показана структура сайта рестрикции фермента Eco R1: пунктиром изображена ось симметрии палиндрома; вертикальными стрелками — ковалентные связи между нуклеотидами, которые
подвергаются расщеплению. Справа показаны фрагменты
ДНК, образованные в результате рестрикции
38
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Как показано на рис. 2.1, результатом действия многих рестриктаз на молекулы ДНК, является разрезание их «уступом» в немодифицированных сайтах. При таком способе расщепления двухцепочечных ДНК образуются
фрагменты, у которых имеется концевая избыточность, или так называемые
«липкие» концы. В составе «липких» концов, образованных под действием
одной рестриктазы, последовательности нуклеотидов комплементарны
(рис. 2.1). Указанные особенности функционирования рестриктаз II типа делают их незаменимыми инструментами в генетической инженерии: это молекулярные ножницы, с помощью которых in vitro осуществляется фрагментирование ДНК.
В настоящее время рестрикционные ферменты выделены из более чем
400 штаммов бактерий, и для большей их части определена структура сайтов рестрикции. Система рестрикции—модификации может рассматриваться как своеобразный барьер, охраняющий клетку от включения в нее чужеродного генетического материала. Возникновение мутантов, лишенных способности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для изменчивости у этих штаммов.
Недавно обнаружена способность некоторых конъюгативных плазмид и
фагов преодолевать барьеры рестрикции клеток-хозяев, куда они попадают
при конъюгации или инфекционном процессе. Это явление получило название антирестрикция. В геномах плазмид и фагов обнаружены гены ard, детерминирующие структуру белков-антирестриктаз. Эти белки ингибируют
ферменты, принадлежащие к системе рестрикции—модификации типа I.
2.2. Репарация ДНК
Несмотря на высокую точность работы ферментов, осуществляющих репликацию ДНК, а также на существование механизма корректорской правки,
при синтезе новых цепей ДНК все же происходят ошибки, связанные с включением в их состав некомплементарных нуклеотидов. Кроме того, молекулы
ДНК подвергаются в клетках воздействию разнообразных физических и химических факторов, нарушающих их структуру. К числу наиболее часто возникающих повреждений ДНК можно отнести следующие:
— разрыв (b-N)-гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой
(депуринизация), который чаще всего является следствием повышения температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10 000 актов
депуринизации;
— спонтанное дезаминирование остатков цитозина и аденина с образованием, соответственно, остатков урацила и гипоксантина (примерно
100 событий на геном в сутки);
— алкилирование азотистых оснований под действием химических веществ особого класса (алкилирующих агентов);
— интеркаляция (встраивание) некоторых соединений между соседними
парами нуклеотидов;
— образование ковалентных сшивок между цепями ДНК под действием
бифункциональных агентов;
39
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
— образование, возникающих при поглощении ультрафиолетового света
(УФ) циклобутановых димеров (рис. 2.2) между соседними пиримидинами в
цепи.
Большинство перечисленных повреждений нарушает процессы репликации и экспрессии генов, например, каждый тиминовый димер в ДНК E. coli
задерживает репликацию на 10 с. Кроме того, эти повреждения являются источником мутаций, если их исправление не осуществится до начала репликации ДНК.
Чаще всего подобные нарушения происходят лишь в одной из нитей ДНК,
при этом во второй нити напротив повреждения в большинстве случаев содержится «правильная» последовательность, которая может служить матрицей для исправления ошибок. Таким образом, двойная спираль ДНК, а также
то, что в ней закодирована информация о структуре репарационных ферментов, делает возможным уникальный механизм исправления ошибок —
репарацию, характерный только для одного класса молекул — ДНК.
Репарационных систем и механизмов, существующих у разных организмов, очень много, среди них есть такие, которые специфичны лишь для исправления повреждений одного рода, а есть и менее специфичные. Для удобства все известные к настоящему времени репарационные процессы можно
разделить на две категории: 1) те, что не требуют участия репликации и представляют собой непосредственное исправление нарушений в ДНК; 2) более
сложные процессы, в ходе которых происходит репарационная репликация.
Лучше всего репарационные механизмы изучены по отношению к исправлению повреждений, вызванных УФ-облучением, — пиримидиновых димеров
(рис. 2.2).
CH3
CH3
O
O
NH
NH
N
CH3
O
O
N
NH
O
O
CH3
NH
УФ
R
N
R
O
N
R
O
R
Рис. 2.2. Образование тиминовых димеров в одной из цепей ДНК включает формирование циклобутанового кольца (состоит из четырех углеродных атомов)
при взаимодействии атомов соседних пиримидиновых оснований
40
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Поскольку в наиболее известных процессах репарации последствий УФоблучения принимают участие зависимые от УФ-света ферменты, репарационные механизмы делят также на световую (способную осуществиться лишь
на видимом свету) и темновую (не требующую участия видимого света) репарацию.
К репарационным механизмам прямого исправления повреждений можно
отнести дезалкилирование остатков гуанина и мономеризацию циклобутановых димеров между соседними пиримидиновыми основаниями. Дезалкилирование метилгуаниновых остатков относится к темновой репарации и происходит при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и млекопитающих. О6-метилгуанин-ДНК-алкил-трансфераза катализирует перенос
алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента (рис. 2.3).
Расщепление димеров между пиримидиновыми нуклеотидами происходит
в процессе фотореактивации — восстановления структуры молекул ДНК,
поврежденных УФ-излучением в результате последующего воздействия видимого света (световая репарация). Известна неферментативная коротковолновая фотореактивация, которая заключается в мономеризации димеров при
действии ультрафиолетового излучения с длиной волны 240 нм, а также ферментативная фотореактивация. Последнюю обычно и подразумевают под
собственно фотореактивацией. Этот процесс требует участия видимого света
с длиной волны 300—600 нм и осуществляется под действием специфических
фотореактивирующих ферментов (дезоксирибопиримидинфотолиазы). Субстратом фотолиазы служат димеры пиримидиновых оснований, с которыми
она образует комплекс (с неповрежденной ДНК фермент не связывается).
Используя энергию поглощенного света, фермент разрушает димер без разрыва цепей ДНК (рис. 2.4).
O
-O
OCH3
-
P
O N
-O
N
-
P
О
O N
O
O
H 2C
O
N
O
N
H 2C
NH2
NH
N
N
O
+ Фермент- SH
+
O
H
O
H
-O P
O
-O P
O
NH2
Фермент -SH
CH3
O
O
Рис. 2.3. Дезалкилирование О6-метилгуаниновых остатков катализируется
специфической ДНК-алкилтрансферазой
41
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 2.4. Образование тиминовых димеров под действием УФ-света и их разрушение на свету при помощи фотореактивирующего фермента
Явление фотореактивации широко распространено в природе и обнаружено даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Фотореактивирующие ферменты найдены у некоторых высших растений и животных,
а также у всех изученных бактерий, за исключением Deinococcus radiodurans,
который, тем не менее, чрезвычайно устойчив к действию УФ-света: эти бактерии выдерживают дозы в 1000 раз более высокие, чем те, которые убивают
E. coli. При полном отсутствии способности к фотореактивации
D. radiodurans обладает мощной системой эксцизионной репарации.
Репарационные события, связанные с заменой искаженных участков, не
требуют участия видимого света и в них, кроме других ферментов, важную
роль играют нуклеазы двух типов: экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют расщепление ДНК, начиная с концов цепей, а эндонуклеазы атакуют цепи во внутренних частях, формируя в ДНК однонитевые разрывы.
Среди многообразия разных видов репарации, связанной с репаративным
синтезом ДНК, можно выделить два основных: эксцизионную и пострепликативную репарацию.
Эксцизионная репарация. Отличительной особенностью эксцизионной
репарации является удаление поврежденного участка ДНК. Этот вид репарации не столь специфичен в отношении повреждений ДНК, как фотореактивация, и с его помощью могут исправляться не только пиримидиновые димеры,
но и многие другие изменения структуры ДНК. Эксцизионная репарация
(рис. 2.5, А) представляет собой многоэтапный процесс и включает следующие события: 1) узнавание повреждения в ДНК, которое осуществляется специфическими эндонуклеазами, выполняющими и следующую стадию;
2) надрезание одной цепи ДНК вблизи повреждения — инцизия (осуществляют эндонуклеазы); 3) удаление группы нуклеотидов вместе с повреждением — эксцизия (осуществляют экзонуклеазы); 4) ресинтез ДНК —
заполнение образовавшейся бреши (ДНК-полимеразная активность);
5) восстановление непрерывности репарируемой цепи за счет образования
ковалентных связей сахарофосфатного остова молекулы.
42
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 2.5. Два типа темновой репарации: А — эксцизионная репарация, Б —
пострепликативная репарация. Светлые линии — исходные цепи ДНК; темные линии — цепи ДНК, синтезированные в ходе репарационных событий
Лучше всего механизм эксцизионной репарации изучен на примере темнового удаления пиримидиновых димеров из ДНК E. coli, облученных ультрафиолетом. В клетках кишечной палочки за данный процесс отвечают гены
uvrA-D (кодируют структуру ферментов, вырезающих участок цепи ДНК с
димером), а также polА (определяет структуру ДНК-полимеразы I, осуществляющую репартивный синтез ДНК). Особенностью такого способа эксцизионной репарации является образование одноцепочечных надрезов по обе стороны тиминового димера.
Некоторые организмы используют для репарации повреждений, в том
числе связанных с образованием тиминовых димеров, еще одну разновидность эксцизионной репарации, предусматривающую участие в процессе
особого фермента — N-гликозилазы. В данном случае первым репаративным
43
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
событием является расщепление гликозидной связи между поврежденным
основанием (например, одним из тиминов в димере, N-алкилированным пурином и др.) и дезоксирибозой. Таким образом, имеет место локальная апуринизация, или апиримидинизация; возникает так называемый АР-сайт,
узнаваемый АР-специфической эндонуклеазой, которая расщепляет фосфодиэфирную связь рядом с АР-сайтом. Затем брешь заполняется с помощью
обычного репаративного синтеза.
В бактериальных и эукариотических клетках обнаружен целый ряд различных N-гликозилаз. Например, урацил-ДНК-гликозилаза узнает неправильную пару dG/dU, возникшую в результате спонтанного дезаминирования
остатка дезоксицитозина из пары dG/dC. Дезаминирование цитозина может
привести при репликации к возникновению мутантной нуклеотидной пары
dA/dT, поскольку с точки зрения образования водородных связей урацил ведет себя аналогично тимину. Другой, широко распространенный фермент
подобного типа, представляет собой пиримидиновый димер-N-гликозилазу,
которая создает апиримидиновый сайт при репарации повреждений, связанных с образованием пиримидиновых димеров.
Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация,
выщепляются
ферментами
АР (апуриновые
и
апиримидиновые)эндонуклеазами. В клетках про- и эукариот имеется много разнообразных
АР-эндонуклеаз. Некоторые из них надрезают цепь с 3ў-стороны АР-сайта, а
другие расщепляют диэфирную связь с 5ў-стороны; в любом случае образуются 3ў-гидроксильный и 5ў-фосфорильный концы. Это позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны надреза вместе с повреждением.
Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у
про- и эукариотических организмов, в том числе у млекопитающих. Нарушения процессов эксцизионной репарации могут приводить к драматическим
последствиям. Так, у людей известно наследственное заболевание —
пигментная ксеродерма, основными симптомами которого является повышенная чувствительность к солнечному свету, приводящая к развитию рака
кожи. У этих больных обнаружены различные дефекты эксцизионной репарации.
Пострепликативная репарация. Этот тип репарации требует участия
продуктов генов, задействованных также в рекомбинационных событиях (recгены), и не осуществляется в клетках rec-мутантов, поэтому его называют
еще и рекомбинационной репарацией. Рекомбинционная пострепликативная
репарация основана на процессах репликации и рекомбинации поврежденной
ДНК, она наименее специфична из всех рассмотренных типов репарации,
поскольку в ней отсутствует этап узнавания повреждения. Это довольно быстрый способ восстановления нативной структуры ДНК в дочерних (вновь
синтезированных) цепях: показано, что репарация происходит уже в первые
минуты после облучения. Особенностью данного процесса является сохранение повреждения в исходных (материнских) цепочках (рис. 2.5, Б).
Наряду с быстрой существует и медленная пострепликативная репарация,
для которой требуется несколько часов. Ее производит система ферментов,
которая отсутствует в необлученных клетках и которую индуцирует облуче44
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ние. Этот механизм получил название SOS-репарации. Его удивительным
отличием является значительное увеличение частоты мутаций, несмотря на то
что ДНК и так уже повреждена. Это может являться следствием использования в качестве матрицы цепи ДНК, содержащей повреждения.
Пострепликативная репарация существует не только у бактерий, но и в
клетках эукариот, в том числе у млекопитающих.
2.3. Мутационный процесс
Если повреждения в молекулах ДНК, описанные в разделе 2.2, не успеют
репарироваться до начала репликации, они скорее всего будут закреплены в
ходе репликативного удвоения ДНК в виде мутаций. В общем виде мутации
можно определить как скачкообразные наследуемые изменения в генетическом материале организмов. Различают спонтанные (произошедшие без видимого вмешательства) мутации, частота которых обычно находится на уровне 10-6—10-8 на клетку, и индуцированные (возникающие в ответ на использование какого-либо мутагенного фактора) мутации. Частота возникновения
последних зависит от особенностей организма, типа и дозы мутагена, а также
условий обработки и может достигать 10-3 на клетку. Мутации можно считать
первоисточником генетической изменчивости организмов, и наряду с рекомбинационными процессами они являются мощным фактором эволюции.
Для характеристики всего многообразия мутационных изменений в системном порядке используют несколько принципов классификации мутаций:
1) по характеру изменения генома различают геномные мутации —
изменение числа хромосом; хромосомные перестройки — изменения структуры хромосом, приводящие к изменению числа и порядка расположения в
них генов; генные мутации — изменения последовательности нуклеотидов в
пределах одного гена (мутации в узком смысле слова);
2) по проявлению в гетерозиготе мутации делят на доминантные (проявляются в гетерозиготе) и рецессивные (проявляются только в гомозиготе);
3) по направлению действия мутации подразделяют на прямые (изменения исходного, или так называемого дикого типа) и обратные (реверсии),
которые представляют собой возврат к дикому типу;
4) по локализации в клетке выделяют ядерные мутации, которые осуществляются в хромосомах у эукариот и нуклеоидах у прокариот, и цитоплазматические, затрагивающие внеядерную наследственность;
5) по фенотипическому проявлению различают мутации летальные (приводящие к гибели), морфологические (изменения морфологии), биохимические (изменения обмена веществ), поведенческие (сдвиги в физиологии),
криптические (не имеющие видимого фенотипического эффекта), устойчивости или чувствительности к повреждающим агентам и др.
В свою очередь, генные мутации (они наиболее распространены) подразделяются на делеции (выпадения одного или нескольких нуклеотидов), транзиции (замены пуринов на пурины или пиримидинов на пиримидины),
трансверсии (замены пуринов на пиримидины и наоборот), дупликации
(удвоения группы нуклеотидов), амплификации (умножения групп нуклеотидов). Последние два типа более характерны для хромосомных перестроек, в
45
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
этом случае речь идет об удвоении или умножении числа отдельных генов
либо даже групп генов. Для хромосомных мутаций характерны также транспозиции (вставки участков хромосом в новые места), транслокации (обмен
участками между хромосомами), инверсии (изменения порядка расположения генов на хромосоме).
Следует отметить, что мутации могут приводить как к утрате функций,
так и к приобретению новых признаков, особенно в тех случаях, когда происходит слияние генов и они оказываются под контролем несвойственных им
регуляторных элементов.
2.4. Генетический обмен и рекомбинация
Не менее важный, чем мутации, вклад в изменчивость привносят способы
генетического обмена и следующие за ними рекомбинационные события. Генетический обмен характерен как для эукариот, так и для прокариот и может
осуществляться в ходе различных процессов. Для эукариотических организмов изучены половой и парасексуальный процессы: в ходе первого происходит слияние половых клеток с образованием диплоидной зиготы, которая в
большинстве случаев подвергается мейотическому делению, сопровождающемуся рекомбинацией между хромосомами. В парасуксуальном цикле
происходят объединение и последующая рекомбинация генов на основе событий, осуществляющихся в митозе без участия оплодотворения половым путем.
Обмен генетической информацией у прокариот происходит in vivo в ходе
конъюгации, трансдукции и трансформации, а в лабораторных условиях,
кроме того, при слиянии протопластов.
Конъюгация — процесс генетического обмена, требующий физического
контакта клеток. При этом перенос генов осуществляется из донорских бактерий (содержат конъюгативные плазмиды) в реципиентные клетки (бесплазмидные) по специальному каналу — конъюгативному мостику. Этот
процесс опосредуется генами, расположенными на плазмидах. Плазмиды
представляют собой суперспирализованные ковалентно-замкнутые кольцевые
молекулы ДНК небольшой величины (2—600 т. п. н.), способные к автономной репликации. Клетки, содержащие плазмиды, могут приобретать новые
признаки. Эти признаки используются для обозначения выявленных впервые
плазмид: F-плазмиды (факторы фертильности, или половые факторы), ответственные за донорские свойства бактерий; Col-плазмиды (факторы колициногенности) —опосредуют способность клеток синтезировать особый класс бактериоцинов — колицины; R-плазмиды (факторы резистентности) — обусловливают устойчивость бактерий к антибиотикам и др. Плазмиды характеризуются рядом общих и специфических свойств. К общим свойствам плазмид
можно отнести способность к автономной репликации, к конъюгативному
переносу, к интеграции в нуклеоид (эписомы), несовместимость (неспособность некоторых плазмид стабильно наследоваться одной и той же клеткой).
Специфические (индивидуальные) свойства характеризуют небольшие
группы плазмид и придают клеткам разные фенотипические свойства: устойчивость к антибиотикам, катионам, анионам, мутагенным факторам, бакте46
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
риоцинам, бактериофагам; способность деградировать ксенобиотики; синтез
антибиотиков, бактериоцинов, пигментов, инсектицидов, поверхностных антигенов, токсинов, ферментов; использование в качестве источников углерода
разных сахаров и аминокислот; индукцию опухолей у растений и др.
Трансдукция — способ генетического транспорта, при котором переносчиками генов выступают умеренные или вирулентные бактериофаги. Фрагменты бактериальных хромосом обычно включаются в состав фаговых частиц либо в ходе неправильного вырезания профагов из бактериального генома (характерно для умеренных вирусов), либо в ходе ошибочной упаковки в
головки бактериальной ДНК при сборке вирулентных фагов. Образующиеся
фаговые частицы носят название «дефектные», поскольку в большинстве случаев не способны обеспечить литический цикл. Однако они сохраняют способность адсорбироваться на клетках и инъецировать в них свою нуклеиновую кислоту, которая может вступать в события рекомбинации с клеточным
геномом.
Трансформация — способ генетического обмена, открытый Гриффитом,
при котором в клетки проникает свободная ДНК. Трансформирующая способность описана как для хромосомальных, так и для плазмидных ДНК. Процесс, в котором выделенная ДНК фагов поступает в бактериальные клетки и
обусловливает образование в них зрелых фаговых частиц, называется трансфекцией. В естественных условиях трансформация осуществляется с невысокой эффективностью за счет высвободившейся из спонтанно лизировавшихся
клеток ДНК. В лабораторных условиях частоту трансформации можно существенно повысить, увеличив концентрацию трансформирующей ДНК и переведя клетки в компетентное состояние (только в таком состоянии клетки
способны адсорбировать и поглощать ДНК). Еще легче трансформируются
протопласты, и этот прием — один из самых распространенных при введении
гибридных (полученных в экспериментах по генной инженерии) молекул
ДНК в клетки.
Слияние протопластов представляет собой искусственный метод объединения геномов. Он основан на способности плазматических мембран —
пограничных структур протопластов — к спонтанной агрегации с обобществлением всего содержимого двух или более протопластов. При этом между
геномами могут происходить сложные рекомбинационные события, сопровождающиеся возникновением разных вариантов организмов.
Процессы трансформации клеток и протопластов, а также слияние протопластов используют и для селекции некоторых эукариотических организмов:
дрожжей, мицелиальных грибов, растений.
Итак, перечисленные выше процессы приводят к поступлению в клетки
нового генетического материала, который может подвергаться у бактерий
рестрикции, если модифицирован неадкватно имеющейся в клетке системе
рестрикции—модификации, но может и успеть вступить во взаимодействие с
резидентными молекулами ДНК — рекомбинацию. Рекомбинация свойственна всем группам организмов, за исключением РНК-содержащих вирусов (у
них она не обнаружена). Это ферментативный процесс, и генетическая информация о синтезе ферментов, опосредующих рекомбинацию, есть во всех
клетках и у многих вирусов. Некоторые ферменты, играющие ключевую роль
47
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
при рекомбинации, участвуют также в процессах репликации и репарации
ДНК.
Различают три типа рекомбинации: общую (регулярную, гомологичную),
сайт-специфическую и незаконную (негомологичную, случайную). Основное отличие между этими типами заключается в протяженности сайтов гомологии, которые обусловливают взаимодействие молекул ДНК, приводящее к
перекомбинированию генов.
Общая рекомбинация. Это обмен участками между гомологичными
(идентичными) нуклеотидными последовательностями, или кроссинговер.
При данном типе рекомбинации происходит разрыв гомологичных цепей
ДНК с последующим реципрокным соединением их в новом сочетании
(рис. 2.6). Обмен производится одноцепочечными участками, причем имеющими одинаковую ориентацию. В процессе принимает участие большое количество разнообразных ферментов. В частности общая рекомбинация у
E. coli катализируется recA-белком (обеспечивает обмен одиночными цепями), recBCD-нуклеазой (осуществляет разрыв и расплетение цепочек), геликазами и белками, связывающимися с одноцепочечной ДНК (необходимы для
миграции креста Холлидея), а также ДНК-полимеразой РolI и ДНК-лигазой.
Гомологичная рекомбинация начинается с надрезания однонаправленных
цепей в гомологичных молекулах ДНК, после чего свободные концы одной
цепи спариваются со свободными концами другой цепочки, и формируется
структура Холлидея (по имени исследователя впервые предложившего ее).
Точка перекреста обменивающихся цепей перемещается вдоль рекомбинирующих молекул — миграция ветви (креста). При этом происходит размыкание водородных связей между комплементарными нуклеотидами внутри одной родительской молекулы ДНК и замыкание соответствующих связей между нуклеотидами цепей, принадлежащих разным молекулам ДНК. Структуры
Холлидея затем переходят в рекомбинантные двойные спирали (разрешаются) путем внесения разрывов и воссоединения цепей двумя альтернативными
способами. В первом способе разрезаются и воссоединяются перекрещивающиеся однонаправленные цепи, а в другом — неперекрещивающиеся однонаправленные цепочки. При миграции креста Холлидея осуществляется спаривание цепей, принадлежащих разным молекулам ДНК, т. е. образуются гетеродуплексы. В их составе могут содержаться некомплементарные нуклеотиды, которые удаляются так же, как при репарации ДНК, а шаблоном в данном случае может служить любая из цепей.
Существует альтернативный способ общей рекомбинации, в ходе которого происходит двухцепочечный разрыв в одной молекуле ДНК. В этом случае
на одном из этапов тоже формируется структура Холлидея, и происходит миграция ветви.
48
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 2.6. Этапы процесса рекомбинации между гомологичными молекулами ДНК: 1 — продукт разрезания и воссоединения перекрещивающихся
цепей; 2 — продукт разрезания и воссоединения неперекрещивающихся цепей
Сайт-специфическая рекомбинация. Этот способ рекомбинации не зависит от продуктов генов recA, B и D и происходит между специфическими
сегментами молекул ДНК, не имеющими протяженных областей гомологии.
Лучше всего этот тип рекомбинации изучен на примере интеграции фага l в
нуклеоид кишечной палочки и его обратного исключения. Рекомбинационные
события при этом происходят в коротких участках ДНК бактериофага и клетки — att-сайтах (от англ. attachment —прикрепление). В составе фаговой
ДНК присутствует attРОРў-сайт, а в составе бактериальной ДНК — attВОBўсайт, располагающийся между оперонами gal (отвечает за утилизацию галактозы) и bio (отвечает за биосинтез биотина). Нуклеотидные последовательности att-сайтов на фаговой и клеточной ДНК различаются, за исключением
участка «О» протяженностью 15 пар нуклеотидов, одинаковых для обоих сайтов. Эта последовательность, общая для рекомбинирующих геномов, служит
49
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
для образования «липких» концов за счет двух надрезов уступом (рис. 2.7).
Образование этих надрезов катализирует белок Int — продукт фагового
гена int.
ДНК фага l проникает в клетку в линейной форме и сразу замыкается в
кольцо благодаря существованию «липких» концов. Затем на фаговую и бактериальную ДНК воздействуют нуклеазы (белок Int), и образующиеся «липкие» концы в составе разных att-сайтов могут взаимодействовать, приводя к
интеграции профага в хромосому (рис. 2.8).
Рис. 2.7. Нуклеотидная последовательность участка «О», входящего в состав att-сайтов: стрелками показаны места надрезов уступом
Рис. 2.8. Интеграция ДНК фага l в хромосому E. coli
50
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
В результате сайт-специфической рекомбинации, сопровождающей процесс интеграции ДНК фага l в нуклеоид кишечной палочки, происходит образование новых (рекомбинантных) сайтов: ВОРў и РОВў (рис. 2.8).
Исключение профага l из хромосомы E. coli может происходить также в
результате сайт-специфической рекомбинации, и в этом процессе, кроме белка Int, играют роль фаговый белок Xis и клеточный белок HF. Следует отметить, что интеграция профага l может осуществляться и в другие сайты нуклеоида E. coli, однако это происходит с частотой примерно в 200 раз меньшей, чем интеграция между локусами gal и bio, и в таких случаях реализуются закономерности незаконной рекомбинации.
Незаконная рекомбинация. Примерами незаконной (негомологичной)
рекомбинации служат события транспозиции перемещающихся (мобильных)
элементов, для которых в геномах отсутствуют предпочтительные сайты интеграции. Полагают, что для этих событий не требуются участки гомологии
ДНК. К незаконной рекомбинации относят также процессы случайного
встраивания вирусной или плазмидной ДНК в клеточные геномы. Эти события наиболее часты для клеток животных.
2.5. Деятельность мобильных элементов
К мобильным элементам относят профаг mu, транспозоны, IS-элементы
(Insertion Sequences), которые представляют собой дискретные сегменты
ДНК, способные перемещаться внутри одного генома или между геномами,
находящимися в одной клетке. Все мобильные элементы содержат гены, опосредующие процесс транспозиции, а также специфические инвертированные повторы на концах, которые тоже принимают участие в перемещении.
IS-элементы — это линейные фрагменты ДНК размером 0,2—2 т. п. н.,
содержащие на концах инвертированные повторы (фланкированные повторами). Существует несколько типов IS-элементов, отличающихся между собой последовательностью нуклеотидов, длиной, величиной инвертированных
повторов (10—40 п. н.), частотой транспозиции (10-4—10-7 на поколение), а
также длиной дуплицированных повторов в ДНК-мишени (5—11 п. н.), которые образуются в процессе транспозиции. IS-элементы не содержат генов,
определяющих фенотипически различимые свойства, а лишь информацию,
необходимую для процесса транспозиции (структуру фермента транспозазы).
При транспозиции этих элементов в новый сайт исходный IS-элемент остается на прежнем месте, т. е. инсерция сопровождается точным синтезом второй
копии и не зависит от репликативных функций и рекомбинационного аппарата хозяина. Не требуется также никакой гомологии между IS-элементом и
сайтом-мишенью. В разных репликонах содержится различное количество
копий IS-элементов: например, нуклеоид E. coli содержит 4—19 копий IS1,
0—12 копий IS2, 1—2 копии IS4.
Транспозоны (Tn) — это созданные на основе IS-элементов (или их производных) сложные мобильные структуры, содержащие гены, определяющие
дополнительные (кроме транспозиции) функции. Все транспозоны фланкированы концевыми повторами. Часто ими являются известные IS-элементы,
51
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
например IS1, которые могут повторяться на концах транспозона в прямой
или обратной (рис. 2.9) ориентации.
На рис. 2.9 видно, что с двух сторон центральная область транспозона
(Km) фланкирована одинаковыми IS-элементами: IS-L (слева) и IS-R (справа),
расположенными в Tn5 в разной ориентации. При этом сами IS-элементы
также содержат инвертированные концевые повторы. Вся информация, необходимая для перемещения сложного транспозона, содержится в его ISэлементах: это та самая информация, которую используют сами IS-элементы
при транспозиции, — гены, кодирующие транспозазу.
Разные мобильные элементы отличаются друг от друга степенью специфичности при выборе сайтов интеграции в репликоны. При высокой специфичности транспозон использует один или несколько сайтов ДНК-мишени,
при низкой — множество предпочтительных либо практически любой сайт.
Вероятность транспозиции зависит от свойств мобильного элемента, в первую очередь от его длины: при увеличении транспозона на 1 т. п. н. частота
перемещения снижается в 2 раза. Частота транспозиции для одного и того же
мобильного элемента тоже может быть неодинаковой, и зависит она от характера донорного и реципиентного репликонов. Так, известны мутации, которые могут подавлять частоту транспозиции. Кроме того, на перемещение
мобильных элементов влияют факторы окружающей среды: температура,
УФ-облучение, химические агенты.
Механизм транспозиции. Для объяснения механизма транспозиции,
тонкости которого остаются невыясненными, предложено несколько моделей,
принадлежащих к двум группам: репликативные и консервативные. Более
понятной является репликативная (коинтегративная) модель. Согласно этой
модели, на первой стадии происходит слияние молекул донорной и реципиентной ДНК, сопровождающееся дупликацией в местах слияния двух репликонов (рис. 2.10).
Рис. 2.9. Структура транспозона Tn5: NK — ДНК репликона-мишени; D —
дуплицированные участки мишени; Km — гены устойчивости к канамицину.
Стрелками показаны направления концевых повторов в составе IS-элементов, а
также ориентация самих IS-элементов на концах транспозона
52
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
На второй стадии репликоны разделяются благодаря реципрокной рекомбинации между идентичными участками (res-сайтами) в коинтеграте
(рис. 2.10).
Для осуществления первой стадии необходима транспозаза и два инвертированных терминальных повтора. Считается, что транспозаза распознает
именно эти участки и специфически взаимодействует с ними. Для разделения
коинтеграта требуется другой продукт транспозоновых генов — резолваза,
которая осуществляет сайт-специфическую рекомбинацию в res-сайтах.
При транспозиции путем коинтеграции принимают участие не только гены, принадлежащие самому мобильному элементу, но и репликативные
функции клетки. Так, показано, что коинтеграты некоторых транспозонов
могут диссоциировать только в RecA+-клетках (где есть RecA-белок); иными
словами, разрешение этих коинтегратов осуществляется при участии системы
гомологичной рекомбинации.
Консервативная (простая, нерепликативная) модель транспозиции допускает выщепление (эксцизию) мобильного элемента из молекулы до-нора и
вставку (инсерцию) его в молекулу-реципиент, т. е. не осуществляется дупликация самого мобильного элемента. Но и в этом случае соблюдается главная
особенность процесса транспозиции: в сайте-мишени возникают дуплицированные повторы (рис. 2.11). Согласно консервативной модели, транспозаза
катализирует ступенчатые двухнитевые разрывы реципиентной ДНК, аналогичные тем, что образуют рестриктазы. Транспозазы могут, вероятно, осуществлять надрезы на концах транспозона и соединять их с концами разрывов в
ДНК-мишени. При этом фор-
Рис. 2.10. Механизм репликативной транспозиции: а — образование коинтеграта; в — реципрокная рекомбинация между res-сайтами; с —
разделение коинтеграта. Стрелками обозначены транспозоны
53
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 2.11. Образование дуплицированных повторов в ДНК-мишени при
транспозиции: стрелками обозначены сайты разрыва ковалентных связей
в ДНК — результат воздействия на репликон-мишень транспозазы
мируются однонитевые бреши, которые застраиваются репаративными системами клетки. В результате на концах мобильных элементов всегда создаются одинаковые короткие повторы участка ДНК-мишени (рис. 2.11). Некоторые мобильные элементы, например бактериофаг mu, могут участвовать в
обоих типах транспозиции: в интегративной и консервативной.
Вырезание транспозонов из ДНК чаще всего осуществляется в результате
гомологичной рекомбинации между копиями сайта-мишени.
Перемещения мобильных генетических элементов в пределах одного репликона могут приводить к образованию делеций и инверсий, а при межмолекулярной транспозиции могут возникать и другие мутации. Вообще, мобильные элементы индуцируют все виды хромосомных перестроек: слияние и
диссоциацию репликонов, транслокации, делеции, инверсии, дупликации.
Нередко встраивание мобильного элемента в регуляторный или кодирующий
участок приводит к снижению экспрессии соответствующего гена. В некоторых случаях — наоборот: промотор, расположенный внутри самого транспозона, индуцирует экспрессию соседнего гена, который ранее был молчащим.
Совместно с плазмидами и фагами мобильные элементы переносят гены между разными организмами и вносят весомый вклад в их изменчивость.
54
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 3. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ
Наследственная информация, записанная языком последовательности
нуклеотидов, у большинства организмов (кроме РНК-содержащих вирусов)
хранится в ДНК. Последовательность триплетов нуклеотидов в генах определяет последовательность аминокислот в полипептидах или рибонуклеотидов в
молекулах транспортных и рибосомальных РНК. Для того чтобы генетическая программа реализовалась (синтезировались нужные белки и РНК), требуется участие аппарата экспрессии генов. Под процессом экспрессии генов
понимают синтез матричных РНК и белков. При этом мРНК выступают в
роли посредников между ДНК и белком: синтез белка всегда осуществляется
на однонитевых мРНК (при участии рибосом), а сами мРНК всегда синтезируются на двухнитевых ДНК. Оба процесса относятся к числу матричных и
подлежат регуляции, которая существенным образом сказывается на уровне
клеточного метаболизма.
3.1. Транскрипция ДНК
Экспрессия всех генов начинается с транскрипции их нуклеотидной последовательности. Транскрипция — это процесс перевода информации, записанной на языке последовательности дезоксирибонуклеотидов в смысловой
цепи ДНК на язык последовательности рибонуклеотидов в мРНК. При этом
определенный участок одной из двух цепей ДНК (антисмысловой) используется как матрица для синтеза РНК путем комплементарного спаривания оснований.
Ферментами, катализирующими процесс транскрипции, служат ДНКзависимые РНК-полимеразы. Причем у прокариот, например, в клетках кишечной палочки обнаружен лишь один тип этого фермента, который синтезирует все три типа РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от них эукариоты
имеют три разные ДНК-зависимые РНК-полимеразы, каждая из которых ответственна за транскрипцию генов, кодирующих разные типы клеточных
РНК. Наилучшим образом процесс транскрипции, а также его ферментативное оснащение изучены у прокариот. Бактериальные РНК-полимеразы — это
сложные белки, состоящие из нескольких разных субъединиц. Наиболее изученный фермент — холофермент РНК-полимераза E. coli, который содержит
пять разных полипептидных субъединиц: две a-цепи, одну b- и одну bў-цепи,
s- и w-цепи. Альтернативная форма фермента, называемая кором или миниферментом, лишена s-субъединицы. Кор-фермент катализирует большинство реакций транскрипции ДНК в РНК, однако не может инициировать синтез РНК в нужном месте, поскольку не способен узнавать промоторные сай55
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ты. Точное связывание и инициация в промоторах происходят только после
добавления к кор-ферменту sd-субъединицы и образования холофермента.
Как и другие матричные процессы, транскрипция включает 3 стадии:
инициацию, элонгацию и терминацию.
Инициация транскрипции. Для этого процесса необходимы: холофермент, специальная последовательность нуклеотидов в ДНК (промотор) и набор нуклеозидтрифосфатов. Транскрипция инициируется при образовании
стабильного комплекса между холоферментом и специфической последовательностью, называемой промотором и располагающейся в начале всех
транскрипционных единиц. Промотор — это участок молекулы ДНК, состоящий примерно из 40 пар нуклеотидов и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. В нем различают две важные и достаточно консервативные по составу последовательности. Одна из них состоит
из шести или семи нуклеотидов (чаще ТАТААТ) и расположена на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида
(+1); этот сигнал обычно обозначают как -10-последовательность, или Прибнов-Бокс — в честь ее первооткрывателя. В данном сайте РНК-полимераза
связывается с ДНК. Вторая последовательность расположена на расстоянии
~ 35 нуклеоти-дов до сайта инициации и служит участком распознавания
промотора РНК-полимеразой (рис. 3.1).
Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное
расплетение двойной спирали ДНК и образуется открытый промоторный
комплекс. В нем происходит копирование последовательности нуклеотидов
смысловой, или (+)-цепи ДНК, имеющей направление 5ў ® 3ў. При этом синтез мРНК всегда начинается с нуклеотидов А или G. Вторая, антисмысловая
цепь ДНК, служит матрицей для синтеза цепочки РНК (рис. 3.2).
Транскрипция аналогична репликации в том смысле, что порядок присоединения рибонуклеотидов определяется комплементарным спариванием оснований (рис. 3.2). После формирования первых нескольких фосфодиэфирных связей (обычно 5—10) d-субъединица отделяется от инициирующего
комплекса, и дальнейшая транскрипция осуществляется с помощью корфермента.
Рис. 3.1. Структура промотора E. coli (объяснения в тексте)
56
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.2. Матричный принцип процесса транскрипции
Элонгация транскрипции. Растущая цепь РНК остается связанной с
ферментом и спаренной своим растущим концом с участком матричной цепи.
Остальная часть образовавшейся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК.
По мере продолжения транскрипции движущийся вдоль цепи ДНК корфермент действует подобно застежке «молния», расплетая двойную спираль,
которая замыкается позади фермента, и восстанавливается ее исходная дуплексная структура. «Раскрытая» ферментом область ДНК простирается всего
на несколько пар нуклеотидов (рис. 3.3).
Наращивание РНК идет в направлении от 5ў- к 3ў-концу вдоль матричной
(-) цепи, ориентированной в направлении 3ў ® 5ў, т. е. антипараллельно.
Транскрипция непрерывно продолжается до тех пор, пока фермент не достигнет сайта терминации транскрипции.
Терминация транскрипции. Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, называются транскрипционными терминаторами. Они содержат инвертированные повторы, благодаря чему 3ў-концы
РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины
(рис. 3.4).
Рис. 3.3. Транскрипция ДНК: в локальном участке «расплетенной» ДНК
работает кор-фермент, синтезируя цепь мРНК в направлении 5ўР ® 3ўОН
57
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.4. Пример шпильки в составе мРНК, на которой заканчивается
процесс транскрипции. В составе стебля шпильки присутствуют комплементарные нуклеотиды
Обнаружены два типа сигналов терминации — r-зависимый и rнезависимый терминаторы. r — это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТР до ADP и неорганического фосфата. В одной из моделей действие r-белка объясняется тем, что он
связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5ў ® 3ў к месту синтеза РНК; необходимая для его перемещения
энергия выделяется при гидролизе АТР. Если r-белок наталкивается на образующуюся в РНК шпильку, он останавливает полимеразу, которая могла бы
продолжить транскрипцию. Механизм r-независимой терминации изучен
хуже, в нем остается много неясного.
В большинстве случаев первичные транскрипты, образующиеся описанным выше способом, не являются зрелыми молекулами РНК, а требуют процесса созревания, который называется процессингом РНК. Процессинг сильно отличается для прокариотических и эукариотических РНК.
У прокариот первичные транскрипты, сформированные при транскрипции генов, кодирующих белки, функционируют в качестве мРНК без последующей модификации или процессинга. Причем трансляция мРНК часто начинается даже до завершения синтеза 3ў-конца транскрипта. Совсем иная ситуация наблюдается для молекул прокариотических рРНК и тРНК. В этом
случае кластеры рРНК- или тРНК-генов часто транскрибируются с образованием единой цепи РНК. Для формирования зрелых функциональных форм
должны произойти специфическое надрезание первичных РНК-транскриптов
и модификация. Эти молекулярные события и называют процессингом РНК
или посттранскрипционной модификацией. Начальное расщепление первичных транскриптов на фрагменты, содержащие либо тРНК, либо 16S-, 23S58
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
, или 5S-рРНК-последовательности, осуществляет эндонуклеаза РНК-аза Ш.
Ее мишенями служат короткие дуплексы РНК, образующиеся при внутримолекулярном спаривании оснований в последовательностях, фланкирующих
каждый из РНК-сегментов. Эти комплементарные последовательности формируют шпильки, в составе которых РНК-аза вносит разрывы, после чего
лишние последовательности спейсерных областей удаляются другими РНКазами. Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде про-тРНК, которая на
~ 20 % длиннее, чем зрелая. Лишние последовательности, расположенные у
5ў и 3ў-концов, удаляются рибонуклеазами Q и P. Кроме этого, для образования зрелой функциональной тРНК, по-видимому, должны произойти специфическая модификация оснований и присоединение одного, двух или всех
трех нуклеотидов 3ў-ССА-конца (акцепторная ветвь).
Созревание РНК у эукариот осуществляется гораздо сложнее. Во-первых,
у эукариот существует ядро, которое отделено от цитоплазмы ядерной мембраной. В ядре осуществляется образование первичных транскриптов, которые имеют бульшую длину, чем цитоплазматическая мРНК, участвующая в
трансляции. Следовательно, образованию зрелой мРНК у эукариот должно
предшествовать удаление интронов из последовательности гяРНКтранскрипта (этот процесс называется сплайсингом от англ. to splice —
сплетать, сращивать). После удаления последовательностей, соответствующих интронам, происходит соединение участков, которые транскрибированы
с экзонов. Сплайсинг катализируется комплексами белков с РНК (мяРНП),
которые, взаимодействуя с гяРНК, образуют сплайсому. Полагают, что каталитической активностью в сплайсоме обладает РНК-составляющая. Такие
РНК называют рибозимами. Место сплайсинга определяется в сплайсомах с
высокой точностью, поскольку ошибка даже в 1 нуклеотид может привести к
искажению структуры белка. Для точного узнавания в составе интронов есть
специфические последовательности — сигналы.
Кроме сплайсинга, мРНК у эукариот подвергается модификации: на 5ўконце синтезируется «кэп» (шапочка) — структура, представляющая собой
метилированный остаток гуанозинтрифосфата, который защищает РНК от
гидролиза 5ў-экзонуклеазами. На 3ў-конце про-мРНК синтезируется полиаденилатная последовательность длиной 150—200 нуклеотидов, которая называется «шлейф». Эти структуры принимают участие в регуляции экспрессии
эукариотических генов. Процессинг рРНК и тРНК у эукариот осуществляется
аналогично таковому у прокариот.
3.2. Регуляция генной экспрессии на уровне транскрипции
Каждая клетка целого организма или популяции содержит полный набор
генов, свойственный для данного вида (штамма). Однако в любой момент
времени в клетке функционируют (экспрессируются) не все гены, а лишь те, в
продуктах которых имеется потребность. Такое распределение «обязанностей» между генами возможно благодаря существованию механизмов регуляции генной экспрессии, которые функционируют на разных уровнях. С помощью этих механизмов клетка экономит свои ресурсы: в каждый конкретный момент она синтезирует определенный ограниченный набор веществ, а
59
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
не весь возможный их спектр и, кроме того, осуществляет координацию метаболических путей.
Среди нескольких уровней регуляции экспрессии генов наиболее существенной и часто используемой является регуляция синтеза ферментов, которая
осуществляется на уровне транскрипции. Суть такого типа регуляции сводится к ускорению или замедлению процессов транскрипции определенных генов, что в конечном итоге отражается на скорости синтеза их продуктов. Различают позитивную и негативную регуляцию транскрипции. Негативная регуляция предусматривает торможение инициации транскрипции за счет связывания с операторной областью белков-репрессоров; позитивная регуляция — наоборот, охватывает события «включения» транскрипции, которые
также обусловливаются присоединением к оператору специфических белков
(в данном случае их называют активаторами).
Наилучшим образом регуляция синтеза ферментов изучена у прокариот.
Их особенностью является организация генов, участвующих в одном метаболическом пути, в опероны. Это дает возможность прокариотам «включать» и
«выключать» транскрипцию группы генов (входящих в оперон) одновременно. Несколько разных типов регуляции инициации транскрипции (оперонной
регуляции) будет рассмотрено в данной теме на примерах двух оперонов
E. coli — лактозном, принадлежащем к группе катаболитных оперонов, и
триптофановом — анаболическом.
Регуляция инициации транскрипции у эукариот осуществляется гораздо
сложнее, чем у прокариот, но основные ее закономерности соблюдаются и в
этом случае.
Регуляция экспрессии лактозного оперона по типу индукции. Лактозный оперон E. coli содержит регуляторную область (промотор и
оператор) и три структурных гена: lacZ (кодирует структуру bгалактозидазы), lacY (определяет структуру b-галактозидпермеазы) и lacA
(структура b-галактозидтрансацетилазы) (рис. 3.5). Названные ферменты
обусловливают перенос в клетку дисахарида лактозы и расщепление ее на
глюкозу и галактозу. Транскрипция структурных генов лактозного оперона
осуществляется согласованно: гены lacZ, lacY и lacA транскрибируются в
одну полицистронную мРНК, которая транслируется с образованием почти
одинаковых количеств каждого из ферментных белков. Недалеко от лактозного оперона на хромосоме E. coli располагается ген I, кодирующий структуру белка-репрессора. Этот белок в свободном состоянии имеет сродство к
операторной области lac-оперона.
Когда клетки кишечной палочки выращиваются на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода, они содержат очень мало белков — продуктов структурных генов лактозного оперона: примерно по
10 молекул на клетку. В присутствии лактозы и других b-галактозидов концентрация этих белков возрастает до 10 000 и более молекул на клетку. В
этом случае лактоза (b-галактозиды) служит индуктором синтеза названных
ферментов, и это означает, что соответствующий оперон регулируется по типу
индукции, т. е. кодируемые им ферменты синтезируются только в присутствии индуктора.
60
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.5. Лактозный оперон E. coli (lac) и тесно сцепленный с ним ген
lac-репрессора (lac I): Р — промотор; О — оператор
Механизм индукции состоит в следующем. В отсутствие индуктора свободный белок-репрессор (тетрамерная молекула) прочно связывается с операторной областью lac-оперона (рис. 3.6). Поскольку промоторная и операторная последовательности перекрываются, связывание репрессора с оператором
становится помехой для присоединения РНК-полимеразы к промотору, что
приводит к блокированию транскрипции структурных генов. Однако присутствие в клетке лактозы или иного индуктора lac-оперона приводит к образованию комплекса индуктора с репрессором, который утрачивает сродство к
оператору и освобождает регуляторную область (рис. 3.6). Осуществляется
транскрипция структурных генов, и на сформированной мРНК синтезируются
соответствующие белки.
Таким образом, существование явления индукции позволяет клетке экономить свои ресурсы, поскольку обеспечивает транскрипцию индуцибельных
генов и синтез соответствующих ферментов не постоянно, а только при наличии индуктора в среде.
У бактерий E. coli получены мутации, которые выражаются в уменьшении или исчезновении сродства репрессора к оператору. У таких мутантов
наблюдается конститутивный синтез ферментов лактозного оперона, т. е.
его экспрессия наблюдается и в отсутствие индуктора.
Регуляция синтеза ферментов по типу индукции относится к негатив61
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.6. Репрессия lac-оперона гомотетрамерным lac-репрессором (вверху) и индукция lac-оперона после связывания с репрессором bгалактозидного индуктора (внизу)
ному контролю. Кроме этого, работа лактозного оперона и многих других
оперонов подвержена позитивной регуляции, которую можно рассмотреть на
примере катаболитной репрессии.
Регуляция работы лактозного оперона по типу катаболитной репрессии. Позитивная регуляция транскрипции лактозного оперона заключается в связывании активаторного комплекса со специфической последовательностью, расположенной в самом начале lac-промотора. Это приводит к
стимулированию процесса транскрипции lac-оперона, в результате чего скорость синтеза соответствующей мРНК увеличивается почти в 50 раз. Данный
феномен не имеет пока окончательного объяснения, однако существует несколько гипотез, описывающих процесс стимулирования транскрипции. Согласно наиболее общепринятой из них, активаторный комплекс связывается с
той частью промотора, которая непосредственно прилегает к сайту присоединения РНК-полимеразы (рис. 3.7) и усиливает сродство этого фермента к
62
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
промотору. Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание
активаторного комплекса с промотором предотвращает присоединение
РНК-полимеразы к расположенному поблизости слабому промотору и
увеличивает тем самым вероятность связывания фермента с «правильным» промоторным сайтом.
Функцию активатора транскрипции в данном случае выполняет комплекс
циклического АМР (сАМР) с белком-активатором катаболизма (САР, от
англ. catabolite activator protein). Этот комплекс выполняет аналогичные
функции и при регуляции экспрессии многих других катаболитных оперонов.
Свободный белок САР не способен связываться со специфической последовательностью в составе промотора и требует участия сАМР.
сАМР образуется из АТР (рис. 3.8) в ходе ферментативного превращения
в ответ на различные клеточные события и сигналы. Это вещество-посредник
принимает участие во многих процессах, и с его помощью осуществляется
регуляция различных граней клеточного метаболизма. Содержание сАМР в
клетке контролируется с помощью двух уравновешивающих друг друга процессов: синтеза при участии аденилатциклазы (рис. 3.8) и деградации под
действием фосфодиэстеразы. Глюкоза ускоряет распад сАМР и ингибирует
процесс его синтеза, т. е. в присутствии глюкозы наблюдается низкий, а в
отсутствие — высокий уровень сАМР в клетке.
Таким образом, содержание сАМР и, соответственно, активаторного комплекса сАМР-САР зависит от наличия в клетке глюкозы. У бактерий, растущих на глюкозе, концентрация этих веществ очень низкая, поэтому даже в
присутствии индукторов транскрипция лактозного и подобных ему оперонов
не осуществляется, и в клетке не синтезируются ферменты, принимающие
участие в катаболизме соответствующих сахаров (лактозы, арабинозы, галактозы и др.). Это явление и обозначают термином «катаболитная репрессия».
Регуляция работы триптофанового оперона по типу репрессии. Триптофановый оперон E. coli содержит в своем составе пять структурных генов (trpE, trpD, trpC, trpB, trpA), определяющих аминокислотные
Рис. 3.7. Нуклеотидные последовательности, принимающие участие в регуляции экспрессии лактозного оперона
63
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
NH2
NH2
N
O
-
O P O
CH2
N
O P O
O
N
CH2
N
N
N
O
O
Аденилатциклаза
O
-
N
N
+ PPi
O
OH OH
P
O
OH
O-
O
-
O P O
O-
cAMP
ATP
Рис. 3.8 Синтез циклического АМР (сАМР) из АТР
последовательности пяти ферментов, участвующих в превращении хоризмата
в триптофан. Кроме этого, в состав оперона входит лидерный сегмент trpL и
регуляторная область (перекрывающиеся последовательности промотора и
оператора), принимающие участие в регуляции транскрипции структурных
генов (рис. 3.9). В ином сайте нуклеоида кишечной палочки (на достаточном
удалении от trp-оперона) расположен ген trpR, кодирующий структуру белкарепрессора.
Структурные гены trp-оперона транскрибируются в виде полицистронной
мРНК длиной 7000 нуклеотидов. Синтез мРНК инициируется на промоторе,
последовательность которого перекрывается с оператором (рис. 3.9). Транскрипция контролируется взаимодействием с оператором белка-репрессора,
эффектором которого служит конечный продукт данного биосинтетического
пути — триптофан. Когда в клетке присутствует свободный триптофан, он
связывается с репрессором и оказывает аллостерическое воздействие на
структуру последнего, в результате чего репрессор приобретает способность
прочно связываться с оператором. В этом случае триптофан выполняет роль
корепрессора триптофанового оперона.
Связывание комплекса триптофан—репрессор с операторной областью
препятствует правильному взаимодействию РНК-полимеразы с промотором,
поскольку последовательности оператора и промотора перекрываются.
Транскрипция trp-оперона блокируется, и ферменты, участвующие в синтезе
триптофана, не образуются.
В отсутствие триптофана не происходит связывания свободного белкарепрессора с оператором, и транскрипция оперона не нарушается. В данном
случае происходит интенсивный синтез пяти ферментов, превра64
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.9. Триптофановый оперон E. coli (trp-оперон). Продукты структурных генов:
а1 — антранилатсинтаза,
компонент I;
а2 — антранилатсинтаза,
компонент II — фосфорибозилантранилаттрансфераза;
pr — фосфорибозилантранилатизомераза-индолглицеролфосфатсинтетаза;
t1 — триптофансинтетаза b; t2 — триптофансинтетаза a. Промежуточные метаболиты: PR —
фосфорибозил; CdRP — карбоксифениламинодезоксирибулозофосфат;
InGP — индолглицерофосфат; PRPP — фосфорибозилпирофосфат
щающих хоризмат в триптофан. Благодаря процессам регуляции содержание
этих ферментов в клетке E. coli может различаться до 700 раз в зависимости
от внутриклеточного уровня триптофана.
С помощью репрессии регулируется работа и других оперонов, в частности тех, которые участвуют в биосинтезе других аминокислот. Для некоторых
из этих оперонов характерен еще один способ регуляции —аттенуация.
Аттенуация экспрессии триптофанового оперона. Этот способ регуляции экспрессии trp-оперона связывает между собой два процесса: транскрипцию и трансляцию. В нем задействован регуляторный сегмент ДНК, расположенный перед структурным геном trpЕ. Этот так называемый лидерный
сегмент trpL содержит аттенуаторную последовательность длиной ~ 145 пар
нуклеотидов. При наличии свободного триптофана в клетке осуществляется
транскрипция аттенуаторной последовательности, после чего происходит ее
преждевременная
терминация
и
отделяется
trp-лидерная
мРНК
(145 нуклеотидов). При отсутствии триптофана преждевременной терминации не происходит и транскрибируется полноразмерная триптофановая
65
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
мРНК. Таким образом, в составе аттенуаторной последовательности содержится сигнал, регулирующий транскрипцию структурных генов.
Секвенс-анализ аттенуаторной последовательности позволил обнаружить в ее составе три необычных сегмента: один из них кодирует структуру
короткого полипептида, в состав которого входит 14 аминокислот, в том числе два расположенных рядом остатка триптофана; два других сегмента содержат инвертированные повторы, способные образовывать шпильки разной
структуры при спаривании комплементарных нуклеотидов. Одна из двух
шпилечных структур не препятствует процессу транскрипции, а вторая опосредует r-независимую преждевременную терминацию транскрипции. Какая
именно из двух шпилечных структур будет реализована, зависит от концентрации триптофана в клетке: при его отсутствии (или невысоком содержании)
не может полностью синтезироваться короткий пептид, содержащий два тандемных повтора данной аминокислоты, и это служит сигналом для формирования шпильки, не препятствующей транскрипции. При содержании триптофана в клетке на уровне от среднего до высокого происходит синтез короткого пептида, кодируемого аттенуаторной последовательностью, и в этом случае
рибосомы доходят до терминирующего кодона в лидерной мРНК, что обусловливает формирование шпилечной структуры, прерывающей дальнейший
процесс транскрипции. Таким образом, аттенуация преждевременной терминации транскрипции происходит при низком содержании или почти полном
отсутствии триптофана в клетке, и сигналом для этого служит особое положение рибосомы на лидерной мРНК.
Экспрессия триптофанового, а также некоторых других анаболических
оперонов (гистидинового, треонинового, изолейцинвалинового) достигает
максимума в отсутствие репрессии и при максимальной аттенуации терминации транскрипции.
3.3. Трансляция генетического кода
Трансляция — это процесс декодирования мРНК, в результате которого
информация с языка последовательности нуклеотидов в мРНК переводится
(транслируется) на язык последовательности аминокислот в полипептидной
молекуле. Декодирование мРНК осуществляется в направлении 5ў ® 3ў. В
процессе трансляции различают стадии:
1) активация аминокислот;
2) аминоацилирование тРНК;
3) собственно трансляция.
Активация аминокислот. Это процесс присоединения аминокислоты с
помощью своей карбоксильной группы к a-фосфату АТР с помощью специфической аминоацил-тРНК-синтетазы (рис. 3.10). Реакция сопровождается
высвобождением неорганического пирофосфата и образованием аминоациладенилата (АК-АМР). Аминоацил-аденилат обладает очень высокой реакционной
способностью и стабилизируется благодаря прочному связыванию с ферментом. Данный
процесс характеризуется высокой специфичностью: для каждой аминокислоты существует
собственный фермент (ферменты).
66
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
-
H
R
O
O
C C
NH3
-
O
+
O
-
+
O
-
O
аденин
P O P O P CH2
O
O
O
O
АТР
Аминокислота
H
H
OH OH
Аминоацил-тРНКсинтетаза
H О
Аминоацил-тРНКсинтетаза
O
аденин
R C C O P CH2
O
NH3
O
+ PPi
+
H
H
OH OH
Аминоацил-аденилат-ферментный комплекс
Рис. 3.10. Активация аминокислот в ходе трансляции
Аминоацилирование тРНК. Представляет собой перенос аминоацильной
группы от связанного с ферментом аминоацил-аденилата на 2ў- или 3ў-ОНгруппу концевой рибозы тРНК в акцепторной ветви (рис. 3.11).
Ключевой особенностью реакции, приводящей к аминоацилированию
тРНК, является специфичность участвующих в ней ферментов. Присоединение к тРНК каждой из 20 аминокислот, встречающихся в белках, катализируется определенной аминоацил-тРНК-синтетазой. Фермент должен отличить
одну аминокислоту от 19 других и перенести ее к одной или нескольким изоакцепторным тРНК из имеющихся примерно 75 других тРНК. При этом следует подчеркнуть высокое сходство в структуре многих аминокислот (лейцин,
валин и изолейцин; валин и треонин; аспарагиновая и глутаминовая кислоты;
и др.), а также удивительное сходство вторичной и третичной структур тРНК.
Поэтому даже очень высокой специфичности, присущей данным ферментам,
оказывается недостаточно, чтобы не допустить ошибок, и синтетазы могут
исправлять ошибки, происходящие при присоединении. Это имеет место при
гидролизе связи между аминокислотой и АМР в комплексе фермент—
аминоацил—аденилат. В таком случае формирование ошибочно аминоацилированной тРНК предотвращается. Напротив, механизм, с помощью которого
удалялось бы уже присоединенная к тРНК неправильная аминокислота, отсутствует. В таких случаях аминокислота зани67
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
OH
HO
2'
3'
Аминоацил-тРНКсинтетаза
+
O
CH2
Аденин
O
H О
аденин
R C C O P CH2
O
NH3
O
+
H
OH OH
тРНК
3'-конец акцепторной
ветви тРНК
+
Аминоацил-аденилат-ферментный комплекс
R
+
R
H3N CH
C O
H3N CH
C O
O
O
HO
OH
либо
2'
2'
3'
O
Аденин
H
O
CH2
Аденин
+ AMP
3'
CH2
тРНК
тРНК
Аминоацил-тРНК
Рис. 3.11. Образование аминоацил-тРНК
мает неправильную позицию в белке. Частота таких ошибок очень низка (например, в гемоглобине кролика 10-5).
Собственно трансляция. Процесс трансляции осуществляется на рибосомах — клеточных органеллах, представляющих собой сложный комплекс
из белков и молекул РНК. В течение всего процесса синтеза белка растущая
полипептидная цепь, мРНК и очередная аминоацил-тРНК остаются прикрепленными к рибосоме. У прокариот и эукариот рибосомы различаются по величине и составу (рис. 3.12). Коэффициент седиментации рибосом прокариот
составляет 70S (S — Сведберг, единица измерения скорости, с которой частица оседает при центрифугировании; 1S = 10-13 с), а у эукариот для рибосом,
обнаруживаемых в цитоплазме, он равен 80S.
Рибосомы при определенных условиях могут диссоциировать на большую
и малую субчастицы, а каждая субчастица, в свою очередь, на
68
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.12. Структура и состав рибосом прокариотических и
эукариотических клеток
составляющие молекулы белка и РНК (рис. 3.12). Все эти компоненты могут
снова ассоциировать с образованием функционально активной рибосомы,
если созданы соответствующие условия.
Электронно-микроскопические исследования 70S-рибосом показали, что
малая и большая субчастицы соприкасаются в нескольких точках, причем
между ними образуется бороздка, необходимая для размещения мРНК во
время трансляции. Для понимания процесса трансляции важны два основных
в функциональном отношении участка на 70S-рибосоме. Участок (сайт) А
служит для присоединения аминоацил-тРНК, а с сайтом Р связывается растущая пептидная цепь.
В процессе трансляции, кроме аминоацил-тРНК и рибосом, принимает
участие большое количество вспомогательных белков — факторов инициации, элонгации и терминации транскрипции.
69
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Суть процесса трансляции состоит в последовательном декодировании
мРНК в направлении 5ў ® 3ў с помощью аминоацилированных тРНК, в ходе
которого происходит последовательная конденсация аминокислотных остатков, начиная с амино-(N)-конца полипептидной цепи, в направлении к карбоксильному (С)-концу. Матричный принцип процесса соблюдается при узнавании комплементарных нуклеотидов в составе очередного кодона мРНК и
антикодона тРНК. Наиболее полно трансляция изучена у прокариот, и механизм этого процесса будет рассмотрен на примере трансляции у E. coli.
Инициация трансляции. Считывание мРНК начинается с кодона AUG,
который обозначает 5ў-конец кодирующей последовательности и детерминирует N-концевую (первую) аминокислоту синтезируемого полипептида. Для
инициации трансляции необходимо наличие 30S-субчастицы рибосомы, которая связывается в комплекс с белками — факторами инициации (IF1, IF2,
IF3), GTP и Fmet-тРНК. Такой полный комплекс связывается с 5ў-концом кодирующей последовательности мРНК вблизи кодона AUG. Очевидно, IF2
способен отличить Fmet-тРНК (формил-метионин-тРНК) от met-тРНК, которая связывается с кодонами AUG во внутренней части мРНК, но не может
начать трансляцию со стартового кодона AUG. Эта специфичность обеспечивается N-формильной группой, отсутствующей у met-тРНК.
Распознавание стартового кодона осуществляется следующим образом.
Связывание 30S-субчастицы с мРНК находится под строгим контролем нуклеотидной последовательности, расположенной примерно за 10 нуклеотидов
до 5ў-конца стартового кодона. Взаимодействию способствует комплементарное спаривание этой богатой пуринами последовательности с полипиримидиновым участком, находящимся в составе 16S-рРНК. Процесс инициации зависит от многих условностей в структуре взаимодействующих участков, в том
числе от вторичной структуры того участка молекулы мРНК, в котором находится стартовый кодон AUG. Это имеет значение для процессов регуляции
эффективности синтеза белка.
Итак, при инициации указанный комплекс связывается с Р-сайтом 30Sсубчастицы рибосомы, и первой аминокислотой в составе пептида будет формил-метионин. Далее следует присоединение 50S-субчастицы рибосомы и
формируется 70S-инициирующий комплекс (рис. 3.13). Источником энергии
для инициации синтеза белка служит расщепление GTP до GDP и Pi.
Элонгация трансляции. Для образования первой пептидной связи необходимо, чтобы аминоацил-тРНК, соответствующая следующему кодону, заняла А-участок рибосомы. Для этого аминоацил-тРНК должна сначала связать белок EF-Tu (один из факторов элонгации) и GTP. Образовавшийся
тройной комплекс (аминоацил-тРНК- [EF-Tu-GTP]) и доставляет аминоацилтРНК к А-участку. GTP в это время гидролизуется, и комплекс (EF-Tu-GDP)
отделяется от рибосомы. Когда оба участка, А и Р, заняты, пептидилтрансферазная активность 50S-субчастицы катализирует перенос группы Fmet с ее
тРНК на аминогруппу аминоацил-тРНК, находящуюся
в А-участке
(рис .3.14). В результате в А-участке оказывается дипептидил-тРНК, а в Р —
свободная тРНК (рис. 3.13).
Пептидилтрансферазная активность рибосом связана, по-видимому,
70
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 3.13. Трансляция
генетического
кода:
1 — образование
70Sинициирующего комплекса; 2 — связывание аминоацил-тРНК с участком А
рибосомы; 3 — формирование пептидной связи; 4 — транслокация рибосомы. В процессе элонгации повторяются стадии 2—4
не с белковой частью 50S-субъединицы, а с одним из РНК-компонентов —
рибозимов.
Для прочтения следующего кодона и удлинения полипептидной цепи еще
на одну аминокислоту вся серия реакций должна повториться. Однако прежде
чем это произойдет, свободная тРНК освобождает Р-участок, образовавшаяся
дипептидил-тРНК перемещается на него с А-участка (при этом не происходит
взаимодействия кодона с антикодоном), а рибосома продвигается скачкообразно (на 3 нуклеотида) в сторону 3ў-конца мРНК. Все эти процессы осуществляются с помощью фактора элонгации EF-G при GTР-зависимой транслокации рибосомы. В результате этих трех актов освобождается участок А и
экспонируется следующий кодон, что позволяет начаться следующему циклу
элонгации (рис. 3.13). Следует отметить, что при образовании каждой пептидной связи расходуется энергия, равная четырем энергетическим эквивалентам (если за один эквивалент принять энергию образования фосфатной связи):
два
71
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
O
O
Пептидная
связь
H
H C (CH2)2 S
C
O
NH2
CHR
C
O
O
тРНК
тРНК
Образование
пептидной
связи
OH
тРНК
Сайт А
O
NH
CHR
C
O
O
O
тРНК
Дипептидил-тРНК
Формил-метионил-тРНК Аминоацил-тРНК
Сайт Р
H C (CH2)2 S
C
CH3
CH3
NH
C
NH
H
C
Формильная
группа
Сайт Р
Сайт А
Рис. 3.14. Образование пептидной связи между первыми двумя аминокислотами на рибосомах
эквивалента АТР потребляются при аминоацилировании тРНК и два эквивалента GTР — в каждом цикле элонгации.
Терминация трансляции. Процесс последовательной трансляции кодонов, в конце концов, доходит до того момента, когда в А-участке оказывается
один из трех терминирующих кодонов — UAG, UAA или UGA. В природе не
существует таких тРНК, антикодоны которых соответствовали бы этим кодонам. Здесь вступают в действие факторы терминации — RF-1 и RF-2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от тРНК, тРНК — от
рибосомы, а 70S-рибосому — от мРНК.
После инициации трансляции 70S-рибосома удаляется от сайта инициации по мере считывания каждого последующего кодона. Когда расстояние от
рибосомы до сайта инициации достигнет величины 100—200 нуклеотидов, в
этом сайте может произойти новая инициация. Более того, как только вторая
рибосома пройдет такое же расстояние, может произойти третья инициация, и
т. д. Итак, одну и ту же белок-кодирующую последовательность мРНК могут
одновременно транслировать несколько рибосом. Подобные мультирибосомные трансляционные комплексы называются полирибосомами или полисомами.
Матричные РНК, состоящие из нескольких белок-кодирующих участков,
часто транслируются последовательно: когда рибосома доходит до термини72
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
рующего кодона в первой последовательности, она отделяется от мРНК и со
следующим инициирующим участком связывается новый комплекс. Иногда
этого не происходит, и транслирующая первую кодирующую последовательность рибосома, не отделяясь, перемещается вдоль мРНК, инициируя трансляцию в других сайтах.
В некоторых случаях трансляция первой кодирующей последовательности
может начаться и даже завершиться еще до окончания транскрипции остальных последовательностей, как, например, в случае lac- или trp-оперонов
E.coli.
Особенности трансляции у эукариот. Процесс трансляции эукариотической мРНК в основном аналогичен таковому для прокариот. Однако имеется ряд отличий. Во-первых, аппараты транскрипции и трансляции у эукариот
разобщены во времени и в пространстве, поскольку транскрипция осуществляется в ядре, а трансляция — в цитоплазме. Во-вторых, инициирующей
аминоацил-тРНК у эукариот служит не Fmet-тРНК, а специальная инициирующая met-тРНК. В-третьих, на 5ў- и 3ў-концах эукариотичеких мРНК имеются особые структуры — «кэпы» и «шлейфы», принимающие участие в
трансляции. Известно, что отдельные факторы инициации трансляции узнают
кэпированные области для связывания с мРНК и начала процесса трансляции.
3.4. Посттрансляционная модификация белков
Образующиеся в процессе трансляции полипептидные молекулы часто не
являются зрелыми, биологически активными формами белка. Для того чтобы
они приобрели функциональную активность, требуются различные изменения
в их составе и структуре, которые принято называть посттрансляционной модификацией. К наиболее распространенным событиям такого рода относятся:
расщепление и укорочение цепей; фосфорилирование, ацетилирование, гидроксилирование, карбоксилирование определенных аминокислотных остатков; соединение пептидов с полисахаридами или липидами; связывание с
простетическими группами и др.
Примером укорочения пептидных цепей служит отщепление N-концевого
формилметионина (или метионина), который включается во все полипептидные молекулы в процессе инициации трансляции. Это событие часто осуществляется еще на рибосомах, в начале трансляции.
Расщепление белков-предшественников часто происходит при сборке капсидов сложных бактериофагов (Т4, Р2, l, Т5), а также многих протеолитических белков, гормонов, нейропептидов млекопитающих. Например, инсулин
синтезируется при трансляции в виде препроинсулинового полипептида и
превращается в зрелый инсулин после расщепления цепи и удаления Nконцевого, а также внутреннего сегмента (глава 21).
Связывание пептидов с простетическими группами можно рассмотреть на
примере формирования функционально активного гемоглобина. Образованные в ходе трансляции a- и b-цепи гемоглобина объединяются вначале в
a2b2-структуру, а затем с боковыми группами аминокислот обеих субъединиц
связывается гем. Похожим образом происходит модификация пируваткарбок73
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
силазы — для приобретения этим ферментом активности с определенными
боковыми цепями его аминокислот должен ковалентно связаться биотин.
Модификация аминокислотных остатков — широко распространенное явление. Карбоксилирование специфических остатков глутаминовой кислоты в
белках, принимающих участие в свертываемости крови, обусловливают возможность связывания Са2+. Для образования коллагена должно произойти
гидроксилирование специфических пролиновых и лизиновых остатков. Фосфорилирование и дефосфорилирование определенных остатков серина, треонина и тирозина принимают участие в регуляции метаболизма.
У некоторых белков на N-конце имеется короткая (15—35 остатков) последовательность гидрофобных аминокислотных остатков, которые называют
«сигнальными последовательностями». Эти последовательности играют
важную роль в транспорте белков через мембраны: они узнаются сигналраспознающими частицами в составе мембран, которые опосредуют направленную транспортировку белков. В процессе переноса через мембрану сигнальная последовательность отщепляется сигнальной пептидазой. В результате белок приобретает функциональную активность, оказавшись в соответствующей органелле (например, лизосоме) или вне клетки. Часто процесс
транспорта белков через мембраны происходит уже в ходе трансляции с участием связанных с мембранами рибосом (у эукариот это чаще всего мембраны шероховатого эндоплазматического ретикулума). Такой процесс называют
котрансляционным транспортом.
Существование событий посттрансляционной модификации расширяет
возможности клеток в регуляции метаболизма. Изменения концентрации или
активности ферментов, участвующих в модификации белков, приводят к
снижению или увеличению концентрации последних, а следовательно, и к
изменению скорости соответствующих процессов.
74
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Часть вторая. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ
КОМПОНЕНТОВ
Глава 4. БИОМЕМБРАНЫ
К биомембранам относят плазматические мембраны клеток, ядерную
мембрану, мембраны эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи,
мембраны лизосом, пероксисом, митохондрий, хлоропластов, суперкапсиды
вирусов, а также некоторые специализированные мембраны отдельных организмов. Все они имеют классическую структуру — липидный бислой с вкраплениями белковых молекул, и можно говорить, что принципиально их организация не различается, что дает право рассматривать эти принадлежащие
разным организмам и органеллам мембраны в общей схеме.
Биомембраны выполняют такое количество разнообразных, неотъемлемых для живых существ функций, что можно считать их появление решающим этапом возникновения жизни. Основными функциями мембран являются следующие:
1) ограничивающая: биомембраны окружают все про- и эукариотические
клетки, обосабливая таким образом живое от неживого или отдельные клетки
в многоклеточном организме. Мембраны также ограничивают содержимое
отдельных органелл в эукариотических клетках, позволяя в каждой из них
осуществляться специфическим процессам;
2) барьерная: биомембраны представляют собой высокоизбирательный
барьер для большинства веществ, стремящихся попасть в клетку (органеллу)
или покинуть ее;
3) мембраны обусловливают индивидуальность клеточных поверхностей,
что особенно важно для многоклеточных животных организмов, лишенных
клеточных стенок: это позволяет клеткам взаимодействовать между собой,
формируя органы и ткани;
4) такие незаменимые для многих клеток процессы запасания энергии,
как окислительное и фотофосфорилирование, могут осуществляться только
на мембранах;
5) многие ферментативные реакции осуществляются только в мембранах,
и биомембраны воздействуют на активность многих ферментов;
6) генерация и перенос нервных импульсов возможны только на мембранах, биомембраны обладают рецепторной функцией. Работа высокоразвитых
органов чувств высших животных и человека основана на свойствах мембран;
7) многие жизненно важные для клетки функции требуют обязатель75
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ного участия мембран. Это, в первую очередь, синтез белка, репликация
ДНК, модификация и секреция белков, регуляция метаболизма, основанная
на гормональном ответе.
Биомембраны представляют собой природные пленки толщиной 5—7 нм,
состоящие в основном из липидов, которым принадлежит, в первую очередь,
структурная функция, и белков, определяющих разнообразие мембран и уникальность их свойств. Кроме того, в состав мембран входят углеводы, которые присутствуют там не в свободной форме, а в составе сложных соединений: гликолипидов и гликопротеинов. Для объяснения организации биомембран предложено несколько моделей, из которых общепринятой в настоящее время считается жидкостно-мозаичная модель С.Дж. Сингера и
Г.Л. Николсона, предложенная в 1971 г. Согласно этой модели, основой мембран служит текучий липидный бислой, в котором остатки жирных кислот
фосфолипидов находятся в жидкокристаллическом состоянии. В бислой погружены и встроены молекулы белков, также способные к движению. Со
времени своего появления модель Сингера и Николсона претерпела некоторые изменения и уточнения, но ее концептуальная основа осталась неизменной.
Для изучения структуры биомембран используются в основном методы
электронной микроскопии препаратов, приготовленных по типу замораживания—скалывания, и метод дифракции рентгеновских лучей.
4.1. Особенности организации мембранных липидов
В биомембранах присутствует несколько основных классов липидов:
фосфоглицеролипиды, фосфосфинголипиды, гликоглицеролипиды, гликосфинголипиды, стеролы. Разнообразие представителей этих классов огромно:
в любой конкретной мембране может содержаться до ста разных типов липидных молекул, что, очевидно, связано с разнообразием их функций. Однако основной функцией липидов в биомембранах служит структурная —
липиды формируют двухслойный матрикс, в котором находятся белковые
молекулы.
Фосфоглицеролипиды. Этот класс липидов в количественном отношении
преобладает в большинстве биологических мембран. Наибольшее распространение получили следующие фосфоглицеролипиды: фосфатидилхолин,
фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, дифосфатидилглицерол (кардиолипин). Основу молекул фосфоглицеролипидов представляет трехатомный
спирт глицерол. Две его гидроксильные группы этерифицированы двумя остатками жирных кислот, а третья — остатком фосфорной кислоты. Образованная в результате молекула представляет собой основной предшественник
всех фосфоглицеролипидов — фосфатидную кислоту (рис. 4.1).
В клетке присутствует небольшое количество фосфатидата, поскольку он является
ключевым промежуточным соединением для синтеза всех фосфоацилглицеролов. Последние образуются в ходе реакции этерификации фосфатной группы гидроксильной
группой одного из спиртов. На рис. 4.1 представлены структурные формулы наиболее
часто встречающихся в мембранах полярных спиртов, а также структура одного из
фосфоглицеролипидов — фосфатидилхолина (лецитина).
76
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2 CH
CH2
OH
OH
CH3
N CH3
CH3
+
O CH2 CH2
OH
Глицерол
Холин
O
CH2 CH
O
O
O C
C
R1
CH2
O
P
+
O CH2 CH2 NH3
O
Этаноламин
O
+
O
O CH2 CH
Фосфатидат
R2
Серин
O
CH2 CH
O
O
O C
C
CH2
O P
O
NH3
COO-
CH3
+
O CH2 CH2 N CH3
CH3
Полярная головка
O
CH2 CH2
Гидрофобный
хвост
CH3 CH3
Фосфатидилхолин
Рис. 4.1. Строение молекул фосфоглицеролипидов и их структурных компонентов. R1 и R2 — остатки углеводородных цепей жирных кислот
Жирные кислоты в составе фосфолипидов почти всегда содержат четное
число атомов углерода (от 14 до 24). Среди них наиболее распространены
следующие: пальмитиновая (16:0), пальмитолеиновая (16:1 D9), стеариновая
(18:0), олеиновая (18:1 D9), линолевая (18:2 D9,12), g-линоленовая
(18:3 D6,9,12), a-линоленовая (18:3 D9,12,15), арахиновая (20:0), арахидоновая (20:4 D5,8,11,14). В скобках указано число атомов углерода: число двойных связей, число атомов углерода (D) от карбоксильной группы до двойной
связи.
Фосфоглицеролипиды выполняют в мембранах структурную функцию.
Фосфатидилхолин служит основным компонентом мембран животных клеток, фосфатидилэтаноламин чаще встречается в мембранах бактерий. Это
сильно амфифильные молекулы, поскольку содержат в структуре две нерав77
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
нозначные по свойствам группировки: полярную гидрофильную головку и
неполярный гидрофобный хвост (рис. 4.1).
Фосфосфинголипиды. Это также сильно амфифильные молекулы. Они
образованы на основе аминоспирта сфингозина, который имеет длинную
негидролизуемую ненасыщенную углеводородную цепь (рис. 4.2). Первичным сфинголипидом, из которого образуются все классы неглицероловых
липидов, является церамид (рис. 4.2). Он формируется в результате присоединения жирной (чаще моноеновой) кислоты к центральной аминогруппе
сфингозина с образованием амидной связи.
Фосфосфинголипиды представляют собой церамиды, у которых оставшаяся спиртовая группа этерифицирована фосфатным производным (фосфорилхолином, фосфорилэтаноламином, фосфорилинозитолом, фосфорилглицеролом). Церамид, этерифицированный фосфорилхолином называется
сфингомиелином (рис. 4.2). Сфингомиелин преобладает в
OH
HO CH
CH
CH
CH2
NH2
+
O CH2 CH2 N(CH3)3
O
P
HC
CH3
HO CH
CH
CH
NH
HC
C
HO CH
CH
CH
NH
HC
OH
C
CH2
Полярная головка
O
CH2
CH2
O
CH2
O
O
Сфингозин
Гидрофобный
хвост
CH3
Церамид
CH3
CH3
Сфингомиелин
CH3
78
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.2. Структурные компоненты и строение молекул фосфосфинголипидов на примере сфингомиелина (церамид-1-фосфорилхолина)
мембранах животных клеток, выполняя там в основном структурную функцию.
Гликоглицеролипиды. Представляют собой полярные липиды, построенные на основе глицерола, у которого гидроксил у третьего атома углерода
участвует в образовании гликозидной связи с каким-либо углеводом. Роль
углеводных единиц чаще выполняют остатки галактозы или 6-сульфо-6дезокси-a-D-глюкопиранозил, при этом образуются, соответственно, моногалактозилдиацилглицерол и сульфолипид (рис. 4.3). Гидроксилы двух остальных атомов углерода в гликоглицеролипидах так же, как в фосфоглицеролипидах, этерифицированы жирными кислотами. Моногалактозилдиацилглицерол считается самым распространенным в природе полярным липидом, поскольку на его долю приходится до половины всех липидов тилакоидных
мембран хлоропластов. Гликоглицеролипиды выполняют в основном рецепторную функцию.
Гликосфинголипиды. Молекулы этих липидов построены на основе церамида, к концевой гидроксильной группе которого с помощью гликозидной
связи присоединяются моно- либо олигосахариды. Те гликосфинголипиды, у
которых углеводная часть представлена моносахаридами, носят название цереброзиды. Цереброзиды присутствуют в высоких концентрациях в мозге и
нервных тканях млекопитающих. В частности, галактоцереброзид (рис. 4.4)
является основным компонентом миелиновой оболочки нервного волокна.
Сфинголипиды, у которых углеводная часть представлена коротким кислотным, как правило, разветвленным олигосахаридом, называются ганглиозидами. Кислотность этого класса гликолипидов обусловлена присутствием в них в качестве ветвей углеводной цепи моносахарида нейраминовой
кислоты или ее N-ацетил-производного (рис. 4.4).
Гликосфинголипиды участвуют в регуляции клеточного метаболизма, в
частности играют роль в регуляции роста клеток. Кроме того, гликолипиды
данного класса можно считать молекулами-медиаторами: они выполняют
сигнальные функции, воспринимая и передавая сигналы. Гликосфинголипиды
мембран эритроцитов несут антигены группы крови.
SO3
HO
CH2OH
O O
CH2
OH
CHOCOR1
OH
CH2
O
Моногалактозилдиацилглицерол
CHOCOR1
OH
CH2OCOR2
HO
CH2OCOR2
O
OH
CH2
Сульфолипид (6-сульфо-6-дезокси-a-Dглюкопиранозилдиглицерид)
79
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.3. Структура некоторых гликоглицеролипидов. R1 и R2 —
углеводородные цепи жирных кислот
HO
CH2OH
HO
OO
CH
CH CH
CH
NH CH2
CH2
OH
21
Галактоцереброзид
(нервон)
22
H3C
CH2
20
OH
18
CH
CH3
12
11
19
CH3
3
10
A
4
17
13
14
D
16
27
CH3
CH
25
CH3
26
15
9
1
2
C
CH2
23
24
CH2
B
5
6
HO
8
7
Холестерол
O
H3C
C
NH CHOH O
CHOH
CH2OH
OH
OH
COO
H
N-Ацетилнейраминовая
(сиаловая) кислота
Рис. 4.4. Компоненты и структурные формулы некоторых липидов
Стеролы (стероидные спирты). Эти вещества относят к простым («неомыляемым») липидам, не содержащим жирных кислот. Все стеролы содержат b-гидроксильную группу при С-3, одну или несколько двойных связей в
кольце В и не содержат карбоксильные и карбонильные группы. Эти липиды
присутствуют во многих мембранах растений, животных и микроорганизмов,
выполняя различные функции: структурную, регуляторов текучести мембран,
предшественников витаминов и гормонов у растений и животных и др. Наиболее
распространенным стеролом мембран животных и многих бактерий является холестерол (рис. 4.4). Это слабо амфифильная молекула. Она включает жесткое
80
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
гидрофобное полициклическое ядро и полярную головку, представленную гидроксильной группой.
Жесткость полициклического кольца холестерола сообщает мембранам
специфические свойства, стабилизируя их текучесть. Холестерол у животных
и человека выполняет роль предшественника всех стероидных гормонов и
витамина D, является компонентом желчных кислот, облегчающих всасывание жирных кислот в кишечнике. В некоторых мембранах, например, эритроцитов млекопитающих он составляет 40—60% всех липидов. В клетках
растений, водорослей, мицелиальных грибов и дрожжей образуется множество родственных холестеролу соединений: эргостерол, b-ситостерол, стигмастерол и др.
4.2. Свойства полярных липидов и их агрегатов
Липиды, формирующие биомембраны, представляют собой амфифильные
соединения (рис. 4.1, 4.2). Эта особенность организации находит отражение в
их свойствах: в водном окружении молекулы полярных липидов спонтанно
агрегируют с образованием структур, у которых гидрофобные части молекул
упакованы внутрь и защищены гидрофильными головками, обращенными к
воде. Такие агрегаты могут иметь разную форму и структуру, которая зависит
от строения молекулы липида и от соотношения размеров полярной и неполярной ее частей.
Наиболее простые агрегаты амфифильных молекул называются мицеллами. Причем в зависимости от природы растворителя липиды могут образовывать либо мицеллы обычного типа, либо так называемые «обращенные»
мицеллы (рис. 4.5). В воде формируются обычные мицеллы, у которых гидрофобные углеводородные цепи изолированы от водного окружения гидрофильными полярными головками.
81
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.5. Липидные мицеллы в воде и неполярных растворителях
В неполярных растворителях (бензол, гексан и др.), содержащих следовые
количества воды, формируются обращенные мицеллы, у которых ориентация
липидных молекул противоположная (рис. 4.5). К мицеллообразующим липидам относятся соли высших жирных кислот и формы липидов, у которых
на молекулу приходится всего одна углеводородная цепь, а также многие детергенты. Липидные мицеллы могут иметь разную форму: сферическую
(рис. 4.5), цилиндрическую, эллипсоидную, дискообразную. Особой разновидностью липидных агрегатов являются бислои (бимолекулярные слои). Как
правило, эти структуры формируются липидами, не способными образовывать мицеллы, например фосфолипидами. Возможность организовываться в
бислои определяется, как и в случае мицелл, соотношением размеров полярной и неполярной частей молекулы.
Благодаря своей эластичности и гибкости бислои могут замыкаться сами
на себя с образованием ламеллярных пузырьков, которые называют липосомами (рис. 4.6).
Липосомы служат удобными модельными системами для изучения мембран, а также используются для доставки лекарственных препаратов в различные органы и ткани. Причем в этом случае появляется возможность изолировать лекарственный препарат от разрушающих его ферментов и адресно
доставить к очагу заболевания. Липосомы и мицеллы можно получить при
обработке ультрафиолетом или ультразвуком водных дисперсий полярных
липидов, например фосфатидилхолина.
Силами, стабилизирующими структуру липидного бислоя, являются: гидрофобные взаимодействия, водородные связи и ван-дер-ваальсовы силы.
Гидрофобные взаимодействия вносят наибольший вклад в процесс стабилизации бислоев: под действием этих сил система принимает такую
82
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.6. Структурное представление о липосомах и липидных бислоях
структурную организацию, при которой сводятся к минимуму контакты между неполярными участками липидных молекул и водой. Суммарное изменение свободной энергии при переносе неполярного вещества из неполярного
растворителя в воду термодинамически неблагоприятно из-за энтропийных
эффектов, связанных с нарушением структуры воды как растворителя. Можно сказать, что невыгодные взаимодействия между неполярным растворяемым веществом и водой — это и есть «гидро-фобные силы». Водородные
связи образуются между полярными головками некоторых липидов. Ван-дерваальсовы силы представляют собой короткодействующие слабые силы притяжения между соседними гидрофобными цепями.
Толщина липидных бислоев определяется длиной углеводородных цепей,
а также наличием в них двойных связей и заместителей, т. е. плотностью
упаковки гидрофобных хвостов. Обычно этот параметр варьирует в пределах
4—5 нм.
Липидный бислой представляет собой жидкую среду с низкой вязкостью
(консистенция растительного масла). В зависимости от температуры липидный бислой может находиться в двух основных состояниях —
кристаллическом (твердом или гелевом) и жидкокристаллическом (жидком).
Обычно этот переход осуществляется при температуре 15—40° С, но для каждого конкретного липида этот параметр строго определен и называется
температурой фазового перехода (tп). Температура фазового перехода зависит от строения углеводородных хвостов и полярных головок. Рис. 4.7 дает
схематическое представление о фазовом переходе липидов в бислоях. При
переходе мембран из жидкокристаллического состояния в фазу геля текучесть
уменьшается приблизительно на два порядка. Поддержание жидкокристаллического состояния очень важно для функционирования мембран, и клетки
обладают механизмами регулирования текучести мембран, которые основаны
на изменении состава липидов в бислоях. Особенно большое значение данный механизм имеет для пойкилотермных организмов, не способных поддерживать определенную температуру тела и зависящих от температуры окружающей среды.
Нагревание (tП)
Охлаждение
Жидкокристаллическое
состояние липидного бислоя
Гелевое, или «кристаллическое»
состояние липидного бислоя
Рис. 4.7. Фазовые переходы в состоянии липидного бислоя
83
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
4.3. Организация и функции мембранных белков
Липидам в составе мембран отводят, в первую очередь, структурные
свойства — они создают бислой, или матрикс, в котором размещаются активные компоненты мембраны — белки. Именно белки придают разнообразным мембранам уникальность и обеспечивают специфические свойства.
Многочисленные мембранные белки выполняют следующие основные функции: обусловливают перенос веществ через мембраны (транспортные функции), осуществляют катализ, обеспечивают процессы фото- и окислительного
фосфорилирования, репликацию ДНК, трансляцию и модификацию белков,
рецепцию сигналов и передачу нервного импульса и др.
Принято делить мембранные белки на 2 группы: интегральные (внутренние) и периферические (наружные). Критерием такого разделения служит степень прочности связывания белка с мембраной и, соответственно,
степень жесткости обработки, необходимой для извлечения белка из мембраны. Так, периферические белки могут высвобождаться в раствор уже при
промывке мембран буферными смесями с низкой ионной силой, низкими
значениями рН в присутствии хелатирующих веществ, например этилендиаминотетраацетата (ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Периферические белки выделяются из мембран при таких мягких условиях, поскольку связаны с головками липидов или с другими белками мембраны при помощи слабых электростатических взаимодействий, либо с помощью гидрофобных взаимодействий — с хвостами липидов. Наоборот, интегральные
белки представляют собой амфифильные молекулы, имеют на своей поверхности большие гидрофобные участки и располагаются внутри мембраны, поэтому для их извлечения требуется разрушить бислой. Для этих целей наиболее часто используют детергенты или органические растворители. Способы
прикрепления белков к мембране довольно разнообразны (рис. 4.8).
Транспортные белки. Липидный бислой является непроницаемым барьером для большинства водорастворимых молекул и ионов, и их перенос через
биомембраны зависит от деятельности транспортных белков. Можно выделить два основных типа этих белков: каналы (поры) и переносчики. Каналы
представляют собой туннели, пересекающие мембрану, в которых места связывания транспортируемых веществ доступны на обеих поверхностях мембраны одновременно. Каналы в процессе транспорта веществ не претерпевают каких-либо конформационных изменений, их конформация меняется
лишь при открывании и закрывании. Переносчики, наоборот, в процессе переноса веществ через мембрану изменяют свою конформацию. Причем в каждый конкретный момент времени место связывания переносимого вещества
в переносчике доступно только на одной поверхности мембраны.
Каналы, в свою очередь, можно разделить на две основные группы: потенциалзависимые и регулируемые химически. Примером потенциалзависимого канала является Na+-канал, его работа регулируется изменением напряжения электрического поля. Иными словами, эти каналы открываются и закрываются в ответ на изменение трансмембранного потен-
84
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.8. Различные способы прикрепления белков к мембране
циала. Химически регулируемые каналы открываются и закрываются в ответ
на связывание специфических химических агентов. Например, никотиновый
ацетилхолиновый рецептор при связывании с ним нейромедиатора переходит
в открытую конформацию и пропускает одновалентные катионы (подраздел 4.7 данной главы). Термины «пора» и «канал» обычно взаимозаменяемы,
но под порой чаще понимают неселективные структуры, различающие вещества главным образом по размеру и пропускающие все достаточно малые
молекулы. Под каналами чаще понимают ионные каналы. Скорость транспорта через открытый канал достигает 106—108 ионов в секунду.
Переносчики также можно разделить на 2 группы: пассивные и активные.
С помощью пассивных переносчиков через мембрану осуществляется транспорт одного типа веществ. Пассивные переносчики задействованы в облегченной диффузии и лишь увеличивают поток вещества, осуществляемый по
электрохимическому градиенту (например, перенос глюкозы через мембраны
эритроцитов). Активные переносчики транспортируют вещества через мем85
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
брану с затратами энергии. Эти транспортные белки накапливают вещества
на одной из сторон мембраны, перенося их против электрохимического градиента. Скорость транспорта с помощью переносчиков в очень сильной степени зависит от их типа и колеблется от 30 до 105 с-1. Часто для обозначения
отдельных переносчиков используют термины «пермеаза», «транслоказа»,
которые можно считать синонимами термина «переносчик».
Ферментные функции мембранных белков.
В клеточных мембранах функционирует большое количество разнообразных ферментов. Одни
из них локализуются в мембране, находя там подходящую среду для превращения гидрофобных соединений, другие благодаря участию мембран располагаются в них в строгой очередности, катализируя последовательные стадии
жизненно важных процессов, третьи нуждаются в содействии липидов для
стабилизации своей конформации и поддержания активности. В биомембранах обнаружены ферменты — представители всех известных классов. Они
могут пронизывать мембрану насквозь, присутствовать в ней в растворенной
форме или, являясь периферическими белками, связываться с мембранными
поверхностями в ответ на какой-либо сигнал. Можно выделить следующие
характерные типы мембранных ферментов:
1) трансмембранные ферменты, катализирующие сопряженные реакции
на противоположных сторонах мембраны. Эти ферменты имеют, как правило, несколько активных центров, размещающихся на противоположных сторонах мембраны. Типичными представителями таких ферментов являются
компоненты дыхательной цепи или фотосинтетические редокс-центры, катализирующие окислительно-восстановительные процессы, связанные с транспортом электронов и созданием ионных градиентов на мембране;
2) трансмембранные ферменты, участвующие в транспорте веществ.
Транспортные белки, сопрягающие перенос вещества с гидролизом АТР, например, обладают каталитической функцией;
3) ферменты, катализирующие превращение связанных с мембраной субстратов. Эти ферменты участвуют в метаболизме мембранных компонентов:
фосфолипидов, гликолипидов, стероидов и др.
4) ферменты, участвующие в превращениях водорастворимых субстратов.
С помощью мембран, чаще всего в прикрепленном к ним состоянии, ферменты могут концентрироваться в тех областях мембран, где содержание их субстратов наибольшее. Например, ферменты, гидролизующие белки и крахмал,
прикрепляются к мембранам микроворсинок кишечника, что способствует
увеличению скорости расщепления этих субстратов.
Белки цитоскелета. Цитоскелет представляет собой сложную сеть белковых волокон разного типа и присутствует только в эукариотических клетках. Цитоскелет обеспечивает механическую опору для плазматической мембраны, может определять форму клетки, а также местоположение органелл и
их перемещение при митозе. С участием цитоскелета осуществляются также
такие важные для клетки процессы, как эндо- и экзоцитоз, фагоцитоз, амебоидное движение. Таким образом, цитоскелет является динамическим каркасом клетки и определяет ее механику.
Цитоскелет формируется из волокон трех типов:
86
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
1) микрофиламенты (диаметр ~ 6 нм). Представляют собой нитевидные
органеллы — полимеры глобулярного белка актина и других связанных с ним
белков;
2) промежуточные филаменты (диаметр 8—10 нм). Сформированы кератинами и родственными им белками;
3) микротрубочки (диаметр ~ 23 нм) — длинные трубчатые структуры.
Состоят из глобулярного белка тубулина, субъединицы которого формируют
полый цилиндр. Длина микротрубочек может достигать нескольких микрометров в цитоплазме клеток и нескольких миллиметров в аксонах нервов.
Перечисленные структуры цитоскелета пронизывают клетку в разных направлениях и тесно связываются с мембраной, прикрепляясь к ней в некоторых точках. Эти участки мембраны играют важную роль в межклеточных
контактах, с их помощью клетки могут прикрепляться к субстрату. Они же
играют важную роль в трансмембранном распределении липидов и белков в
мембранах.
4.4. Характерные свойства биомембран
Несмотря на то, что мембраны существенно различаются по составу формирующих их компонентов, можно выделить и охарактеризовать несколько
особенностей в их организации и свойствах, которые дают возможность говорить об универсальности строения всех биомембран.
Текучесть мембраны. Это свойство обусловлено постоянным движением
мембранных компонентов. Мембраны представляют собой динамические
структуры, в которых и липиды, и белки совершают движения разных типов с
различной скоростью. Эти свойства характеризуют жидкокристаллическое
состояние мембраны. При переходе мембран в фазу геля ее текучесть уменьшается на два порядка и, как результат, организация и правильное функционирование компонентов мембраны (особенно белков) резко нарушаются. Поэтому организмы и стараются поддерживать мембраны в жидкокристаллическом состоянии.
Для компонентов мембраны характерны следующие типы движения:
1) вращательное движение (вокруг продольной оси) — наблюдается, в
первую очередь, для липидных молекул и совершается очень быстро, с частотой 109—1010 с-1. Вращательные движения характерны и для большинства
мембранных белков, но с гораздо меньшей скоростью, поскольку белки имеют больший размер и часто формируют агрегаты;
2) латеральное перемещение (в плоскости мембраны). Коэффициент латеральной диффузии липидов составляет 10-9—10-7 см2Чс-1, т. е. за 1 с фосфолипидная молекула совершает от 1000 до 100 000 скачков с размером шага,
равным ее диаметру (~ 1 нм). Для белков скорость латеральной диффузии
ограничена, что может быть обусловлено большим размером белковых молекул, их связью с другими белками или с цитоскелетом;
3) миграция молекул с одной стороны мембраны на другую (флип-флоп
перескок). Это наиболее медленный способ движения мембранных компонентов, его характерная скорость для фосфолипидов составляет несколько
суток. Причина такого медленного движения заключается в его энергетиче87
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ской невыгодности — липиду с полярной головкой требуется пересекать гидрофобную область бислоя. Однако флип-флоп перескок может ускоряться в
присутствии некоторых интегральных белков или при возмущениях в бислое,
а также в некоторых специализированных мембранах. Например, в мембране
эндоплазматического ретикулума клеток печени крысы эта скорость может
достигать нескольких минут. Предполагается, что увеличение скорости
трансмембранного перехода липидов связано с присутствием в мембране молекул, облегчающих перенос липидов через бислой.
Для белков в естественных мембранах флип-флоп перескок пока не обнаружен. Считается, что белки, находясь в плоскости бислоя, не меняют своей
топологической ориентации. Они встраиваются в мембрану в строго определенной ориентации (относительно обеих ее поверхностей) и остаются в таком положении в течение всего времени их жизни.
Асимметрия мембраны. Все природные мембраны асимметричны, что
обусловлено, в первую очередь, различиями в составе омывающих их сред.
Например, наружная поверхность плазматической мембраны контактирует с
окружающим водным раствором, а внутренняя ее поверхность — с клеточным содержимым. Кроме того, поверхности мембраны различаются по своей
кривизне: наружная поверхность является выпуклой, а внутренняя —
вогнутой. В результате и липидные, и белковые молекулы распределены между двумя слоями бислоя асимметрично. Например, гликолипиды всегда
встроены в наружную часть бислоя, так что их углеводная часть направлена
во внеклеточную среду. В мембранах эритроцитов фосфатидилхолин и сфингомиелин находятся преимущественно в наружной части бислоя, а фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин в основном во внутренней. Еще большую
асимметрию имеют в мембранах интегральные и периферические белки.
Одним из основных факторов, определяющих асимметрию мембран,
является взаимодействие липидов с цитоскелетом. Трансмембранная
асимметрия обусловливает чувствительность мембраны к изменениям
среды по обе ее стороны и чрезвычайно важна для функционирования
клетки.
Между внутренними мембранами эукариот происходит постоянное перераспределение липидных молекул — процесс межмембранного транспорта
липидов, который обеспечивается специфическими белками. Перенос фосфолипидов интенсивно осуществляется между митохондриальными мембранами, эндоплазматическим ретикулумом, плазматической мембраной, лизосомами и другими органеллами. Это явление позволяет клетке регулировать
скорость протекающих в мембранах процессов.
4.5. Транспорт веществ через мембраны
Жизнедеятельность клетки связана с постоянным обменом ее содержимого с окружающей средой. Точно так же и внутри клетки происходит перемещение веществ между органеллами или компартментами. Все эти события
связаны с преодолением основного барьера для веществ — мембраны, ограничивающей органеллу или саму клетку. При этом следует помнить, что
главная функция биомембран — избирательность транспорта для различных
88
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
веществ и ионов. Возможные способы транспорта через мембраны можно
разделить на 4 основных типа: пассивная диффузия, облегченная диффузия,
активный транспорт и цитозы.
Пассивная диффузия. Это процесс транспорта через мембраны веществ
из области с большей их концентрацией в область с меньшей концентрацией
(по химическому градиенту), в котором не принимают участия транспортные
белки и не затрачивается энергия. С помощью такого способа через мембрану
транспортируются малые незаряженные молекулы, например молекулы газов, некоторые анестезирующие вещества, а также вода. Чтобы пересечь бислой, молекула должна преодолеть поверхностное натяжение на границе мембраны, проникнуть в бислой, продиффундировать через него и выйти с противоположной стороны, вновь преодолев энергетический барьер на границе
раздела фаз. Этим и объясняется избирательная проницаемость липидного
бислоя для небольших молекул неэлектролитов. Удивительным является факт
весьма легкого и быстрого проникновения воды через мембраны: показано,
что молекуле воды требуется для пересечения бислоя всего 1 мкс. Для объяснения этого феномена в последнее время появляются основанные на некоторых экспериментальных данных предположения о том, что в мембранах все
же существуют какие-то белковые проводящие пути для воды, либо молекулы
воды пользуются локальными дефектами в структуре бислоев.
Перемещение одних только молекул воды через полупроницаемую мембрану можно рассматривать как частный вид диффузии — осмос. Под осмосом понимают переход молекул воды из области с высоким водным потенциалом и низкой концентрацией растворенного вещества в область с низким
водным потенциалом и высокой концентрацией растворенного вещества
(рис. 4.9). В этом случае молекулы воды будут переходить из гипотонического раствора в гипертонический до тех пор, пока не наступит равновесие
и оба раствора не станут изотоническими по отношению друг к другу.
Чтобы обозначить величину уменьшения водного потенциала, вызванного присутствием растворенных веществ, используют термин «осмотическое
давление». Под осмотическим давлением понимают давление, которое следует приложить к раствору, чтобы остановить осмотическое поступление воды в него через полупроницаемую мембрану. Повышение концентрации растворенного вещества увеличивает осмотическое давление и уменьшает водный потенциал раствора.
Перемещение воды через плазматические мембраны клеток в соответствии с законами осмоса создает организмам немалые проблемы, особенно для
водных обитателей. Поэтому осморегуляция (поддержание водного потенциала в клетке на постоянном уровне) является важной стороной функциональной деятельности большинства организмов, и на ее осуществление зачастую тратится значительная доля запасенной клеткой энергии.
89
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис 4.9. Движение молекул воды в соответствии с закономерностями осмоса. Раствор А содержит более высокую концентрацию глюкозы, чем раствор В, и является по отношению к нему гипертоническим. Соответственно раствор В по отношению к раствору А является гипотоническим. Результатом осмотического перемещения воды становится уравнивание концентраций и воды, и
глюкозы: растворы становятся изотоническими по отношению друг к другу
Скорость диффузии веществ через мембраны зависит от многих причин:
растворимости вещества в мембране, коэффициента диффузии в мембране, а
также разности концентрации вещества снаружи и внутри клетки (градиента
концентрации) (рис. 4.10).
Облегченная диффузия. Этот вид транспорта осуществляется с помощью
транспортных белков по электрохимическому градиенту (разность электрических потенциалов и концентраций веществ) без затрат энергии. Это селективный перенос веществ — вещество будет транспортировано через мембрану лишь в том случае, если для него в мембране имеется функционирующий транспортный белок. Поскольку в облегченной диффузии задействованы
белки, этот процесс, в отличие от пассивной диффузии, может достигать эффекта насыщения. Стадия насыщения (рис. 4.10) характеризует состояние,
когда все транспортные белки для данного вещества насыщены субстратом и
скорость транспорта этого вещества достигает максимума.
С помощью облегченной диффузии через мембрану транспортируются
многие вещества, в том числе гидрофильные молекулы: углеводы, аминокислоты, нуклеотиды, различные ионы и др. При этом скорость транспорта значительно превышает скорость пассивной диффузии (рис. 4.10). Принципиально возможны два пути переноса веществ и ионов через мембрану: с помощью переносчиков и каналов. Поскольку трансмембранное перемещение
белков в биомембранах не обнаружено, предложена модель, описывающая
работу переносчиков — механизм «пинг-понг». Согласно этому механизму,
транспорт веществ связан с конформационными изменениями в структуре
белка-переносчика, которые индуцируются связыванием транспортируемого
вещества (рис. 4.11).
90
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.10. Зависимость скорости процессов пассивной и облегченной диффузии от разности концентраций транспортируемого вещества
Рис. 4.11. Модель работы интегральных транспортных белков по типу
«пинг-понг»
Работу каналов можно рассмотреть на примере ацетилхолинового рецептора. Этот интегральный белок находится в основном в мембранах нервномышечных соединений скелетных мышц. Он состоит из пяти субъединиц четырех типов и открывается в ответ на связывание ацетилхолина (нейромедиатор). При взаимодействии с ацетилхолином канал открывается, что связано с изменением конформации субъединиц, и пропускает определенные
91
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ионы (Na+, K+, Ca++ и некоторые другие), остается в таком положении 1 мс, а
затем закрывается. Селективное перемещение катионов изменяет трансмембранный потенциал, в результате чего происходит электрическое возбуждение мышечной клетки, что приводит к сокращению мышцы. Изучение структуры ацетилхолинового рецептора показало, что пять белковых субъединиц
встроены в бислой определенным образом: они организованы вокруг центральной поры диаметром 3 нм, через которую и транспортируются катионы.
Непроницаемость канала для анионов и в три раза большую проницаемость
для катионов, чем для незаряженных молекул, можно объяснить электростатическими взаимодействиями, возникающими благодаря присутствию в воротах канала биполярных или отрицательно заряженных групп.
Особым типом транспорта веществ в ходе облегченной диффузии является использование ионофоров, действие которых изучено на искусственных
мембранах. Под ионофорами понимают низкомолекулярные вещества пептидной природы, избирательно транспортирующие через мембраны ионы.
Различают ионофоры-каналообразователи (грамици-дин А, амфотерицин В
и др.) и ионофоры-переносчики (валиномицин, энниатины, боверицин).
Валиномицин представляет собой антибиотик депсипептидной природы,
организованный по типу ионной «ловушки». В неполярных растворителях
конформация валиномицина напоминает собой браслет, внутренняя полость
которого точно подогнана под размеры ионов калия. Внешняя сфера валиномицина гидрофобна, в результате чего он способен перемещаться в липидном
бислое и транспортировать через него ионы.
Хорошо изученным примером ионофоров-каналообразователей служит
грамицидин А. Это антибиотик пептидной природы, состоящий из
15 аминокислот. Две молекулы грамицидина могут пронизывать мембрану в
виде двойной спирали или образуя димер «голова к голове». В таких конформациях молекулы грамицидина А формируют полый цилиндр, по которому могут перемещаться ионы металлов.
В биологических мембранах ионофорный тип транспорта до сих пор не
обнаружен.
Активный транспорт. Это сопряженный с потреблением энергии перенос молекул или ионов через мембрану против электрохимического градиента, в котором задействованы транспортные белки. Благодаря активному
транспорту в жизнеспособных клетках между двумя сторонами мембраны
поддерживается разность потенциалов, т. е. электрический заряд, при этом у
большинства изученных клеток внутреннее содержимое заряжено отрицательно по отношению к внешней среде.
Активный транспорт сопряжен со значительными затратами энергии: некоторые клетки тратят более трети всей запасенной энергии для создания
ионного градиента на мембране. Это необходимо для таких жизненно важных процессов, как осморегуляция, генерация и передача нервных импульсов,
перенос в клетки питательных веществ (сахаров, аминокислот и др.).
Разнообразные системы активного транспорта отличаются друг от друга,
в первую очередь тем, что служит для них источником энергии: АТР, ионный
градиент, фосфоенолпируват, видимый свет. Наиболее хорошо изученной
системой активного транспорта является натрий-калиевая (Na+/K+)-АТР-аза,
92
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
функционирующая в плазматических мембранах животных клеток. Этот интегральный белок состоит из двух субъединиц: бульшая представлена полипептидом, имеющим участки связывания для ионов натрия и АТР на цитоплазматической поверхности, а ионов калия — на наружной; меньшая субъединица является гликопротеином. Работа (Na+/K+)-АТР-азы заключается в
следующем: при гидролизе одной молекулы АТР из клетки выкачивается
3 иона Na+, а извне в клетку проводится 2 иона K+, т. е. выводится больше
положительных ионов, чем проводится внутрь клетки. Так на внутренней
стороне мембраны создается избыточный отрицательный заряд, и клетка становится электрогенной. В мембранах обычно присутствуют проводящие пути
для облегченной диффузии ионов натрия и калия по электрохимическому
градиенту, и этот транспорт, хотя и с малой скоростью, совершается. Однако
в жизнеспособной клетке не происходит уравнивания концентраций ионов,
создающих электрохимический градиент на мембране, благодаря постоянной
работе первичных активных переносчиков, таких, как (Na+/K+)-АТР-аза. Таким образом, ионные насосы, принимающие участие в первичном активном
транспорте, осуществляют перемещение заряда на мембране и создают на
ней электрохимический градиент, в котором заключена энергия.
Вторичные активные переносчики используют электрохимические градиенты в качестве движущей силы для транспорта растворимых веществ. Этот
процесс можно проследить на примере клеток эпителия кишечника. Образуемые в кишечнике при переваривании пищи строительные блоки (аминокислоты, глюкоза и др.) поступают в кровь при диффузии через мембраны кровеносных сосудов, и эта диффузия осуществляется в ходе симпорта (однонаправленного транспорта) с ионами натрия. Ионы натрия стремятся возвратиться в клетку согласно закономерностям облегченной диффузии и как бы
тянут с собой молекулы питательных веществ. В мембранах обнаружены специфические переносчики сахаров и разных аминокислот, которые функционируют в системе активного транспорта, накапливая в клетке эти вещества,
извлекая их даже из очень разбавленных растворов, т. е. против химического
градиента. Эти же транспортные системы могут участвовать и в облегченной
диффузии, если вещества транспортируются по химическому градиенту.
Кроме описанного выше примера симпорта питательных веществ вместе с
возвращающимися в клетку ионами натрия, существует и разнонаправленный
транспорт — антипорт. Например, белок полосы 3 эритроцитов осуществляет сопряженный транспорт Cl- и HCO3- в противоположных направлениях
через эритроцитарную мембрану.
У аэробных бактерий транспорт питательных веществ в клетку осуществляется в ходе симпорта не с ионами Na+, а с протонами. Наилучшим образом
охарактеризованным примером подобного переносчика служит лактозопермеаза кишечной палочки. Этот интегральный белок использует протонный
электрохимический градиент, созданный на мембране в результате окислительного фосфорилирования, для симпорта лактозы: с каждым возвращенным в клетку протоном переносится одна молекула лактозы.
Следует отметить, что АТР-азы представляют собой ферменты, катализирующие взаимообратимые реакции: при гидролизе АТР ионы транспортиру93
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ются против электрохимического градиента, а перенос ионов по электрохимическому градиенту через каналы АТР-азы может запускать синтез АТР.
Эндоцитоз и экзоцитоз. Эти способы переноса веществ через мембраны
связаны с образованием впячиваний (инвагинаций) мембраны и формированием особых мембранных везикул, обеспечивающих прохождение через
мембрану крупных макромолекул и частиц. При этом эндоцитоз обеспечивает
поглощение клеткой веществ, а экзоцитоз — выделение из клетки. Принято
делить цитозы еще на два типа: пиноцитоз и фагоцитоз. Пиноцитоз — это
механизм, с помощью которого через мембрану проводятся белки и другие
макромолекулы в жидкой фазе. Фагоцитоз представляет собой поглощение
клеткой крупных частиц, например бактерий, вирусов. Эти виды транспорта
характерны в основном для эукариотических клеток, причем у животных фагоцитоз осуществляют только специализированные клетки, такие, например,
как макрофаги. Для многих простейших, например амеб, фагоцитоз является
основным способом питания.
Важной особенностью цитозов является последовательное образование и
слияние везикул, в которых заключено транспортируемое вещество, причем
секретируемые и поглащаемые молекулы локализуются в везикулах и не
смешиваются с другими макромолекулами или органеллами клетки. С помощью не установленного пока механизма каждый пузырек сливается только со
специфическими мембранными структурами (рис. 4.12).
В основе цитозов лежит еще одно характерное свойство липидных слоев
биомембран — способность к агрегации, в результате чего мелкие везикулы
объединяются в более крупные или происходит объединение везикул с плазматической мембраной клетки. Такой механизм основан на универсальности
структуры биомембран, участвующих в формировании клеточных органелл и
протопластов. Аналогичное явление можно наблюдать в пенах, где мыльные
пузыри, также состоящие из амфифильных молекул (мыла — соли жирных
кислот), обладают тенденцией к объединению с образованием более крупных
структур. Способность мембран к агрегации лежит в основе такого широко
распространенного способа переноса генетической информации, как слияние
протопластов.
Скорость цитозов удивительно высокая. Показано, что клетки печени поглощают путем эндоцитоза за 1 ч количество жидкости, составляющее не
менее 20% их объема, и количество мембранного материала, по площади
превышающее в пять раз площадь их плазматической мембраны. Сходство
цитозов с другими способами транспорта веществ через биомембраны состоит в том, что переносимое вещество должно быть «узнано» мембранными
компонентами, иными словами, и в этом случае проявляется избирательная
проницаемость мембран для различных соединений.
94
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 4.12. Схематическое изображение цитозов. Стадии: 1–1 — от аппарата
Гольджи отшнуровывается секреторная везикула; 1–2 — везикула диффундирует к плазматической мембране и слипается с ней; 1–3 — слияние везикулы
с мембраной и выход содержимого везикулы в окружающую среду; 2–1 —
частица обволакивается мембраной; 2–2 — фагосома отшнуровывается от
мембраны; 2–3 — фагосома диффундирует к лизосоме;
2–4 — фагосома слипается с лизосомой и сливается с ней
4.6. Рецепторные функции мембран
Все клетки должны обладать системами, позволяющими определять состояние и изменения окружающей среды, чтобы адаптироваться к ним. Эти
системы представляют собой разнообразные рецепторные молекулы, которые
располагаются в поверхностных структурах, чаще всего — в плазматических
мембранах, реже — в клеточных стенках, причем у грамотрицательных бактерий — в наружной мембране. Функция рецепторных молекул и их ассоциа-
95
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ций состоит во взаимодействии с внеклеточными компонентами и инициировании специфического клеточного ответа.
Рецепторные молекулы в большинстве случаев представлены белками, но
эту роль могут выполнять и другие молекулы, например гликолипиды, гликопротеины или сфинголипиды. Так, показано, что ганглиозиды служат местом
связывания холерного и столбнячного токсинов, а также участвуют в регуляции процессов клеточного роста и дифференцировки.
Среди огромного разнообразия клеточных рецепторов можно выделить
несколько основных типов. В поверхностных структурах бактериальных,
дрожжевых, животных клеток присутствуют рецепторы, определяющие способность клеток распознавать друг друга, взаимодействовать, образуя скопления, а также связываться с нерастворимыми компонентами внеклеточного
матрикса. Примером рецепторов указанного типа служат белковые ворсинки,
обнаруженные у патогенных штаммов E. coli, которые вызывают инфекционные заболевания мочевых путей человека. Ворсинки крепятся в наружной
мембране и содержат на конце рецепторный белок — адгезин, способный
специфически связываться с дигалактозидсодержащими гликолипидами. Эти
липиды присутствуют на поверхности эпителиальных клеток, выстилающих
мочевые пути, где размножаются бактерии.
Другой класс рецепторов представлен молекулами, расположенными в
плазматических мембранах организмов и связывающими питательные вещества и метаболиты. Эти рецепторы участвуют в процессах эндо- и экзоцитоза,
определяя специфичность этих видов транспорта.
Более сложные рецепторные реакции сопровождаются связыванием рецептора с метаболитом, гормоном или нейромедиатором, передачей сигнала
внутрь клетки и следующим затем клеточным ответом. К подобному классу
рецепторов относятся, например, белки бактерий, ответственные за хемотаксис. В составе плазматической мембраны E. coli присутствует рецептор для
аспартата, который представляет собой трансмембранный белок. Этот белок
осуществляет связывание аспартата, что влечет за собой конформационное
изменение в той части молекулы, которая обращена в цитоплазму. Это изменение и служит сигналом, заставляющим опосредованным образом (через
фосфорилирование другого белкового компонента системы) вращаться жгутики. В результате клетка перемещается по градиенту концентрации аспартата, получая возможность использовать его в качестве питательного субстрата.
Клеточный ответ на сигнал, обусловленный рецепцией специфического вещества, может выражаться также в активации транскрипции отдельных генов. В
такую рецепторную систему входит белок-регулятор, находящийся, повидимому, в цитоплазме в растворимой форме. Считается, что рецепторы
каким-то образом модифицируют регуляторные белки, и затем последние
активируют транскрипцию.
Аналогичным образом происходит передача сигнала при связывании
лиганда (нейромедиатора или гормона) со специфическим рецептором на
наружной поверхности мембраны животной клетки. Это событие инициирует
конформационный переход в молекуле рецептора и следующий затем каскад
событий в клетке, который может включать открывание канала (никотиновый
ацетилхолиновый рецептор), фосфорилирование клеточных белков, сопрово96
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ждающееся изменением их активности, образование комплекса с G-белками.
В последнем случае G-белки активируются, высвобождаются из комплекса и
диффундируют к клеточным мишеням, вызывая специфический ответ. Одной
из наиболее распространенных мишеней G-белков является аденилатциклаза
(катализирует образование сАМР). Конформационное изменение этого фермента приводит к изменению внутриклеточной конценрации сАМР, который,
как известно (глава 3), служит вторым посредником, влияя на множество
внутриклеточных процессов.
Наконец, многие клетки имеют в составе мембран рецепторы, способные
в ответ на стимул (внешний сигнал) генерировать нервный импульс. Нервный
импульс, возникший в мембране специализированной рецепторной клетки
передается через синапсы по отросткам центростремительных нервных клеток к центральной нервной системе, а затем по отросткам центробежных
нервных клеток — к мышце или железе. В клетках скелетных мышц при этом
возбуждается ацетилхолиновый рецептор и возникает потенциал действия, а
через короткий промежуток времени (около 35 мс) происходит сокращение за
счет движения актина и миозина внутриклеточных миофибрилл.
Специализированные рецепторные клетки у высших животных и человека
могут формировать органы чувств. Работа этих органов основана на изменении электрических характеристик рецепторных клеток в ответ на специфический стимул, т. е. на свойстве клеток генерировать нервный импульс. Более
подробно эти процессы рассмотрены в главе 13 на примере функционирования органа зрения.
4.7. Генерация и проведение нервных импульсов
Благодаря непрерывной работе мембранных ионных насосов между внутренним содержимым невозбужденной клетки и внешней средой постоянно
поддерживается разность потенциалов. Этот параметр можно измерить введением электрода в крупные нервные клетки, диаметр которых у кальмаров,
например, может достигать 1 мм. Определяемая величина называется потенциалом покоя и достигает в невозбужденных клетках (-60) — (-70) мВ (минус указывает на то, что внутренняя поверхность мембраны электроотрицательна по отношению к внешней). Потенциал покоя характеризует состояние
динамического равновесия в перемещении ионов натрия и калия через мембрану.
При воздействии на мембрану в каком-либо локусе электрическим током
или другим раздражителем в этом месте открываются специфические натриевые каналы и ионы Na+ устремляются внутрь, нейтрализуя отрицательный
заряд на внутренней поверхности мембраны в данном локусе. Это явление
носит название «деполяризация». Если пороговая величина импульса, вызвавшего деполяризацию, достаточно велика (более 10 мВ), то в мембране
открываются натриевые каналы, работающие на потенциал действия. Потенциал действия представляет собой импульс, проходящий вдоль мембраны
нервной клетки и специфически изменяющий за доли секунды (в нервах млекопитающих приблизительно за 0,5 мс) мембранный потенциал. Особенно-
97
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
стями потенциала действия являются: высокая скорость распространения
вдоль мембраны нервной клетки — до 100 м/с и неизменная интенсивность.
Механизм передачи нервного импульса состоит в следующем. Повышение
проводимости мембраны в конкретном локусе для ионов натрия и деполяризация взаимно усиливают друг друга. В результате быстрого перемещения
ионов натрия на внутреннюю поверхность мембраны исходный потенциал (70 мВ) падает до нуля, а затем достигает значения (+20) — (+40) мВ. Таким
образом, в данном локусе мембраны создается область положительного заряда и в местной цепи возникает ток между этим активным участком и отрицательно заряженной областью, находящейся непосредственно перед ним. Отличительной особенностью мембран нервных клеток, очень быстро проводящих нервные импульсы, является наличие миелиновой оболочки, которая
выполняет роль изолятора. Благодаря этой оболочке плазматическая мембрана контактирует с содержащей Na+ внеклеточной жидкостью лишь в определенных точках — перехватах Ранвье, и деполяризация мембраны происходит
толь-ко в области этих перехватов. Так как нервная клетка покрыта изолятором — миелином, распространение области электрического тока до следующего перехвата осуществляется в основном через цитоплазму клетки. Дойдя
до очередного перехвата, ток снижает мембранный потенциал в этой области,
в ней происходит деполяризация и повышается проницаемость для ионов натрия, т. е. возникает потенциал действия. Так, в виде волны деполяризации
потенциал действия распространяется по мембране в одном направлении.
Восстановление поляризации происходит в результате выхода из аксона
ионов К+. Пока реполяризация не закончится, перехват не может возбудиться
снова, а к тому времени, когда перехват будет способен к ответу, импульс уже
уйдет по мембране слишком далеко, чтобы снова открыть в рассматриваемом
перехвате аксона натриевые каналы. По этой причине импульс распространяется по мембране нервной клетки только в одном направлении. Реполяризация заканчивается после того, как АТР-азы, задействованные в активном
транспорте ионов, восстановят нормальное соотношение концентраций Na+ и
К+ в перехвате.
Амплитуда потенциала действия постоянна для каждой нервной клетки и
не уменьшается по мере движения по мембране, так как изменение в каждой
точке мембраны происходит за счет локального запаса энергии в виде ионного градиента, хотя и запускается изменением в соседнем перехвате.
Передача нервного импульса между нейронами и от нейронов к мышечным клеткам происходит в нервных окончаниях (синапсах) с помощью сигнальных веществ — медиаторов. Одним из наиболее распространенных
нейромедиаторов (синтезируются нервными клетками) является ацетилхолин. Выделение ацетилхолина синаптическими мембранами служит сигналом
для генерирования нервного импульса в расположенной по соседству нервной
клетке. Осуществляется это с помощью ацетилхолиновых рецепторов, которые представляют собой трансмембранные комплексы из пяти субъединиц,
формирующие проницаемый для ионов Na+ и K+ каналы.
Участки для специфического присоединения ацетилхолина расположены
на внеклеточной части a-субъединицы рецептора и их связывание приводит к
формированию в центре комплекса трансмембранного канала, который от98
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
крывается на короткое время для прохождения ионов натрия и калия. Открывание и закрывание канала происходит в результате аллостерического изменения в заряженных участках полипептидных цепей рецептора. Перемещение
ионов через мембраны изменяет потенциал покоя нервной или мышечной
клетки, что стимулирует открывание потенциал-управляемых Na+-каналов, и
возникает потенциал действия.
Ацетилхолиновый рецептор может связывать различные лекарственные
вещества, например никотин, который в малых дозах активирует ацетилхолиновые рецепторы, а в больших — угнетает их. Кроме этого, многие нейротоксины змей способны взаимодействовать с ацетилхолиновым рецептором и
нарушать его функционирование. Известно также явление конкурентного ингибирования ацетилхолина при связывании с рецептором ядом кураре (растительный алкалоид), которым южно-американские индейцы пропитывали наконечники для стрел.
99
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 5. КЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ
Полисахариды представляют собой длинные полимерные цепочки, построенные из остатков моносахаридов, соединенных между собой гликозидными связями. Полисахариды присутствуют во всех клетках и выполняют в
них в основном структурную, рецепторную, защитную, функции, а также играют роль запасных (резервных) веществ.
В состав полисахаридов могут входить разнообразные моносахариды, но
наиболее часто встречается шестиуглеродный сахар (гексоза) D-глюкоза.
Гликозидная связь образуется при взаимодействии двух моносахаридов, в
ходе реакции дегидратации (рис. 5.1). В формировании этой эфирной связи
могут принимать участие разные атомы углерода моносахаридов и их заместители. Обозначение гликозидной связи включает: положение гидроксила
при первом атоме углерода (a или b), а также номер углеродного атома в молекуле второго остатка моносахарида. Например, связь a(1®4) сформирована между атомом кислорода при
6'
4'
6'
CH2OH
5'
O OH
b
OH
1'
HO
4'
+
HO
2'
3'
CH2OH
5'
O
a
OH
OH
1'
OH
2'
OH
3'
a -D-глюкоза
b -D -глюкоза
- H2O
6'
4'
HO
CH2OH
5'
O
b
OH
3'
2'
OH
6'
1'
O
4'
CH2OH
5'
O
a
OH
3'
6'
1'
4'
OH HO
2'
OH
b-D-Глюкозид
Содержит b (1 4)-гликозидную связь
CH2OH
5'
O
a
OH
3'
6'
1'
4'
CH2OH
5'
O OH
OH b 1'
O
2'
OH
3'
2'
OH
a -D-Глюкозид
Содержит a (1 4)-гликозидную связь
Рис. 5.1. Образование гликозидных связей
100
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
атоме углерода 1 в a-положении одного остатка моносахарида и углеродным
атомом в положении 4 другого остатка моносахарида (рис. 5.1).
Наиболее часто в природных полисахаридах встречаются гликозидные
связи типа a(1®4), a(1®6), b(1®4) и b(1®3).
5.1. Резервные полисахариды
Большинство резервных полисахаридов организмов представляют собой
гомополисахариды, в которых преобладают a(1®4)-гликозидные связи. Эти
вещества выполняют роль источников углерода и энергии для клеток в периоды голодания, поэтому их структура отвечает основному требованию —
доступности для гидролитических ферментов, расщепляющих их. Молекулы
преобладающих в живом мире резервных полисахаридов — крахмала и гликогена — представляют собой рыхлые, разветвленные структуры, доступные
для ферментативного расщепления в большом количестве участков.
Крахмал. Этот резервный гомополисахарид преобладает в клетках растений, микроводорослей, а также имеется у некоторых бактерий. Крахмал состоит
из
двух
компонентов:
a-амилозы
и
амилопектина.
a-Амилоза представляет собой полимер D-глюкозы, остатки которой соединены с помощью a(1®4)-гликозидных связей. При этом в молекуле появляется большая свобода вращения вокруг связей 1С—О и О—4С, и цепочка образует стабильную спираль с шестью остатками глюкозы на один виток. Молекулы йода по своим размерам очень точно подходят к центральной полости
этой спирали и образуют комплекс, обусловливающий приобретение темносиней окраски растворами a-амилозы при иодно-крахмальном тесте.
Амилопектин состоит из цепей poly(D-глюкозы) с a(1®4)-гликозидными
связями; от этих цепей отходят боковые ветви, присоединенные к основной
цепи a(1®6)-гликозидными связями. Ветви представляют собой короткие
цепочки a(1®4)-глюкозида и мешают основной цепи образовывать спираль.
Амилопектин имеет структуру «куста» и вместе с a-амилозой образует сложную сеть. Молекулы амилопектина содержат сотни тысяч остатков глюкозы — это одни из самых крупных природных молекул.
Гликоген. Этот гомополисахарид преобладает в клетках животных, грибов и некоторых бактерий. Его структура сильно напоминает структуру амилопектина, но у гликогена боковые ветви, присоединенные к основной цепи
связями a(1®6)-типа, расположены значительно чаще, чем у амилопектина
(рис. 5.2). У гликогена отсутствует спиральная структура. Поэтому в целом
молекулы гликогена еще более разветвлены и «открыты» действию ферментов.
Кроме охарактеризованных выше внутриклеточных резервных полисахаридов, некоторые организмы (в первую очередь, бактерии и дрожжи) образуют внеклеточные запасные вещества, которые формируют капсулы и слизи. В
большинстве случаев эти структуры состоят из полисахаридов. В качестве
примера можно привести капсульные полисахариды —декстраны, образуемые молочнокислыми бактериями Leuconostoc me-
101
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2OH
O
OH
CH2OH
O
CH2OH
O
OH
OH
O
O
O
OH
OH
OH
O
CH2
CH2OH
O
CH2OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
a(1 6)-гликозидная связь
O
O
OH
OH
OH
Рис. 5.2. Фрагмент молекулы гликогена
senteroides и некоторыми видами стрептококков. Декстраны представляют
собой полиглюканы, в которых преобладают a(1®6)-гликозидные связи.
Цепи декстранов могут быть линейными или разветвленными по положениям
4 или 3 (штаммоспецифичный признак).
Декстраны синтезируются бактериями в условиях высокого содержания
источников углерода (в первую очередь, сахарозы), а в период голодания могут расщепляться внеклеточными ферментами до глюкозы, которая поступает
в клетки и используется в качестве источника углерода и энергии. Показано,
что капсульные полисахариды могут защищать клетки от перепадов рН, действия токсичных факторов, от кратковременного высушивания. Некоторые
капсульные полисахариды (не обладающие антигенными свойствами) защищают патогенные микроорганизмы от фагоцитоза, повышая их вирулентность по отношению к животным и человеку, — явление, позволившее Гриффиту открыть трансформацию генетических признаков у пневмококков (глава 1).
Капсульные полисахариды находят применение в хозяйственной деятельности человека. В частности, декстраны используются для получения сефадексов — молекулярных сит. Их получают в ходе образования «сшивок» между линейными цепями декстранов с применением особых агентов. Степень
«сшивки» определяет размер пор и соответственно размер фракционируемых
молекул. Кроме этого, декстраны широко используются в качестве заменителей плазмы крови, в медицине для создания гидрофильного слоя на обожженных поверхностях (для поглощения жидких экссудатов). Среди других
капсульных полисахаридов, находящих применение в медицинской, пищевой
(в составе пудингов, кремов, мороженого), фармацевтической промышленности, получили распространение ксантаны, альгинат, пуллулан.
102
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
5.2. Структура клеточных стенок растений
Клеточные стенки растений обладают необычайной прочностью, и в процессе роста растения меняют свою структуру и состав. Основными компонентами клеточных стенок растений являются полисахариды, причем среди них
преобладает целлюлоза, которая в значительной мере определяет архитектуру
стенки.
Целлюлоза. Этот гомополисахарид является самым распространенным на
Земле углеводом (растения образуют в год до 1011 т целлюлозы). Мономерами целлюлозы служат остатки глюкозы, соединенные в длинные цепочки (до
10 000 остатков глюкозы в каждой) с помощью b(1®4)-гликозидных связей
(рис. 5.3). В такой молекуле отсутствует полная свобода вращения вокруг
1
С—О- и О—4С-связей, и полимер приобретает конформацию, благоприятную для образования межцепочечных водородных связей, в случае, когда
цепочки располагаются антипараллельно. В результате молекулы целлюлозы
объединяются в микрофибриллы толщиной примерно от 10 до 25 нм. Микрофибриллы перевиваются и образуют тонкие нити, которые, в свою очередь,
могут обматываться одна вокруг другой, как пряди в канате, формируя макрофибриллы. Каждая макрофибрилла имеет толщину около 0,5 мкм и может
достигать в длину 6—8 мкм. Прочность макрофибрилл сопоставима с прочностью равной по толщине стальной проволоки. Кроме того, отдельные участки микрофибрилл имеют упорядоченное строение и придают клеточной
стенке кристаллические свойства. Таким образом, можно отметить сложность
и высокую упорядоченность целлюлозы в составе клеточных стенок, что неслучайно: этот полимер выполняет защитную и опорную функции в растении.
В таком виде полисахариды недоступны действию собственных ферментов, и
целлюлоза не может использоваться растением в качестве резервного вещества. Лишь немногие организмы (некоторые бактерии, грибы, простейшие и
редкие животные) обладают ферментными системами, способными расщеплять целлюлозу.
Микро- и макрофибриллы целлюлозы в клеточной стенке растений погружены в матрикс, который также состоит в основном из полисахаридов и
меняет свою структуру в процессе роста растения. На начальных этапах развития матрикс состоит из пектиновых веществ, а в дальнейшем в нем появляются ксиланы и различные нейтральные полисахариды («гемицеллюлоза»). Пектиновые вещества представляют собой полимеры a-галактуроновой
кислоты, в которых некоторые водородные атомы замещены метильными
группами (-СН3) (рис. 5.3). Ксиланы представляют собой полимеры ксилозы
(рис. 5.3).
На более поздних этапах развития, когда происходит одревеснение клеточных стенок, в клетках откладывается лигнин — химически устойчивый
полимер, содержащий большое число ароматических колец. Кроме этого, в
составе клеточных стенок растений обнаруживаются небольшие количества
гликопротеинов, нерастворимых липидных полимеров различного строения и
восков.
Клеточные стенки некоторых растений содержат редкие полисахариды,
имеющие необычное строение. Например, в стенках и межклеточном
103
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2OH
O
O
OH
CH2OH
O
O
OH
OH
CH2OH
O
O
OH
OH
O
OH
Целлюлоза
COOH
O
O
OH
COOH
O
O
O
OH
OH
COOH
O
O
OH
OH
OH
Полигалактуроновая кислота
H
H
H
O
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
OH
Поликсилоза
Рис. 5.3. Структура фрагментов полисахаридов клеточных стенок растений. В пунктирные рамки заключены атомы водорода, которые
могут замещаться в пектинах на метильные группы
веществе морских красных водорослей содержится сложный гетерополисахарид агар, представляющий собой смесь сульфатированных полисахаридов —
агарозы и агаропектина. Агароза построена из чередующихся остатков Dгалактозы и 3,6-ангидро-L-лактозы, связанных попеременно b(1®4)- и
a(1®3)-связями. Агаропектин имеет более сложное строение: в его состав
входят D-галактоза, 3,6-ангидрогалактоза, уроновые кислоты и сульфат. Агар
используется в качестве наиболее распространенного уплотнителя для твердых сред, незаменимых в микробиологии, а также в пищевой промышленности для желирования продуктов. Следует отметить, что подавляющее большинство микроорганизмов не способно расщеплять агар, и это одно из главных его преимуществ перед другим уплотнителем питательных сред —
желатиной. Агароза находит широкое применение в биохимических исследованиях: она в водной среде образует гель с большими порами, размер которых определяется ее концентрацией. Агарозные гели используются для фрак104
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ционирования белков и нуклеиновых кислот, а также для иммобилизации
клеток.
5.3. Структура клеточных стенок прокариот
Большинство прокариот имеют на поверхности плазматической мембраны жесткую, многослойную клеточную стенку, которая выполняет функцию
механической защиты клетки, а также придает ей форму. Клеточная стенка
может быть отделена от мембраны периплазматическим пространством, в
котором находятся ферменты и белки, связывающие питательные вещества.
В отличие от плазматической мембраны, клеточная стенка проницаема для
солей и низкомолекулярных соединений. Основу клеточных стенок большинства прокариот составляет пептидогликан муреин. Однако состав и структура клеточных стенок двух самых представительных отделов прокариот
(Gracilicutes и Firmicutes) сильно различается, что положено в основу дифференциального метода окраски бактерий по Граму.
Клеточная стенка грамположительных бактерий. Практически целиком состоит из муреина. Этот гетерополимер содержит чередующиеся остатки N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, связанные между собой b(1®4)-гликозидными связями. Молекула муреина уникальна по
своему строению, поскольку содержит D-аминокислоты, диаминопимелиновую кислоту и g-пептидную связь (рис. 5.4).
Необычность строения муреина выражается, в первую очередь, в особенностях тетрапептида в составе N-ацетилмурамовой кислоты. Первую позицию
в нем занимает L-аланин, вторую — D-изоглутаминовая кислота (либо какаянибудь минорная аминокислота). Изоглутаминовая кислота формирует пептидную связь с L-лизином с помощью своей g-карCH2OH
O
O
OR
CH2OH
O
O
OH
O
NH
NH
C O
C O
CH3
CH3
Остаток N-ацетилмурамовой кислоты
H C CH3
Остаток
N-ацетилглюкозамина
C O
NH
L-Аla
D-isoGlu
L-Lys
D-Ala
R
105
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 5.4. Структура мономерного звена молекулы муреина
боксильной группы (g-пептидная связь), а не a-карбоксильной группы, как
обычно. Третью позицию в тетрапептиде занимает L-лизин, который имеет
боковую аминогруппу, хотя он может быть замещен на другие кислоты с боковой аминогруппой (диаминопимелиновую или диаминомасляную)
(рис. 5.5). Последнюю позицию в тетрапептиде всегда занимает D-аланин. DАминокислоты в составе муреина придают ему повышенную устойчивость к
протеолитическим ферментам.
Линейные цепи пептидогликана, в которых чередуются дисахаридпептидные звенья (рис. 5.4), составляют основу муреина. Его структуру усложняют
короткие пептиды, поперечно сшивающие полисахаридные цепи. Благодаря
множеству поперечных сшивок возникает одна огромная мешковидная макромолекула, которую называют муреиновым каркасом. Поперечные сшивки
чаще всего представлены пентаглициновыми пептидами (мостиками), но в их
состав могут входить и другие аминокислоты: L-аланин, L-треонин или Lсерин. При формировании сшивок карбоксильная группа одного концевого
остатка глицина в пентаглициновом мостике образует пептидную связь с боковой аминогруппой лизина в составе тетрапептида N-ацетилмурамовой кислоты какой-либо цепи, а свободная аминогруппа другого концевого остатка в
пентаглициновом мостике образует пептидную связь со свободной карбоксильной группой концевого остатка D-аланина в составе N-ацетилмурамовой
кислоты той же или другой муреиновой цепи (рис. 5.6). Таким образом, один
тетрапептид может участвовать в образовании сразу двух сшивок между цепями с помощью пентаглициновых мостиков.
Сформированная в результате сложная муреиновая сеть упрочняется тейхоевыми кислотами, которые покрывают слои пептидогликана или инкрустируют их. Тейхоевые кислоты представляют собой цепочки из молекул глицерола или пятиатомного спирта рибитола, связанные между
NH2
HOOC
HC
NH2
H2N
(CH2)3 CH
H2N
(CH2)2
CH
COOH
COOH
Диаминомасляная кислота
Диаминопимелиновая кислота
O
O P
OH
O
CH2
H
H
H
C
C
C
O
CH2 O P
OH OH OH
O
OH
Фрагмент тейхоевой кислоты
106
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 5.5. Структура отдельных компонентов клеточных стенок прокариот
NAM
(Gly)5
NAG
NAM
NAG
L-Ala
D-Glu
L-Ala
D-Glu
D-Ala
L-Lys
D-Ala
NAM
L-Lys
NAM
NAG
(Gly)5
L-Ala
NAG
(Gly)5
L-Ala
D-Glu
L-Lys
D-Ala
D-Glu
L-Lys
D-Ala
Рис. 5.6. Структура муреина: NAG — остаток N-ацетилглюкозамина в
линейной цепи пептидогликана; NAM — остаток N-ацетилмурамовой кислоты; (Gly)5 — пентаглициновый мостик, связывающий между собой
аминокислоты в составе тетрапептида N-ацетилмурамовой кислты
собой фосфодиэфирными мостиками (рис. 5.5). В одной молекуле тейхоевой
кислоты встречается около 30 остатков спиртовых молекул. В эту цепочку
могут быть включены остатки молекул аминокислот или сахаров. Гидроксильные группы спиртов в составе тейхоевых кислот используются для связывания пептидогликановых слоев друг с другом и делают муреиновый каркас более прочным.
Всего в составе клеточной стенки грамположительных бактерий насчитывается около 40 слоев муреина, и он составляет 30—70% сухой массы клеточной стенки. Стенка сохраняет прочность и форму клетки даже в том случае, когда клеточное содержимое ликвидируется, например растворяется кислотой.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий. У грамотрицательных бактерий клеточная стенка организована более сложно, чем у грамположительных. Ее основными отличительными особенностями являются следующие: муреиновая сеть однослойная и составляет только 5—10% сухой
массы клеточной стенки; в стенке отсутствуют тейхоевые кислоты; на поверхности пептидогликанового слоя есть богатая липидами наружная мембрана (рис. 5.7). По структуре муреин грамотрицательных бактерий отличается от такового грамположительных низким содержанием поперечных сшивок
и меньшим разнообразием диаминокислот.
107
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Наружная мембрана представляет собой толстый слой клеточной стенки и
состоит из липополисахаридов, фосфолипидов и белков. Принципиальная
структура этого слоя очень похожа на структуру плазматической мембраны.
Непосредственно над муреиновым слоем расположен слой фосфолипидов,
молекулы которых ориентированы своими гидрофильными головками к муреину, а гидрофобными «хвостами» — к слою липополисахаридов. Липополисахариды служат основными компонентами наружной мембраны и имеют
необычное строение. Их молекулы состоят из трех частей: липида А, ядра и
О-антигенов.
Липид А — «скелет» сложной молекулы — представляет собой дисахаридные звенья, образованные двумя остатками N-ацетилглюкозамина, связанными b-(1®4)-гликозидными связями, которые многократно повторяются
и соединяются между собой с помощью фосфодиэфирных мостиков. К остаткам N-ацетилглюкозамина присоединяются остатки жирных кислот, которые
совместно с фосфолипидами формируют липидный бислой. В двойной липидный бислой, образованный липополисахаридами и фосфолипидами, вкраплены молекулы белков. Они пронизывают бислой и представляют собой
трансмембранные транспортные белки, ответственные за перенос веществ
через наружную мембрану. Снаружи к липиду А присоединяются полисахаридные молекулы, которые можно разделить по длине на 2 части — ядро
(включает 8—10 остатков моносахаридов и почти у всех грамотрицательных
бактерий имеет одинаковую структуру) и О-антигены. Последние представляют собой вариабельную часть наружных полисахаридов и чаще всего образованы тетрасахаридными последовательностями, которые могут повторяться
в одной молекуле до 50 раз (рис. 5.7).
108
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 5.7. Структура клеточной стенки грамотрицательных бактерий
В отличие от ацильной части липида А, олигосахариды ядра и О-боковые
цепи высоко гидрофильны. Ряд сахаров в липополисахариде фосфорилирован, и молекула в целом имеет отрицательный заряд. Для поддержания стабильности липополисахаридного слоя в нем присутствуют в большом количестве ионы Са2+. О-боковые цепи находятся на самой поверхности клетки и
образуют так называемый «молекулярный ворс». Они служат рецепторами
для адсорбции многих бактериофагов, а также являются главными антигенными детерминантами клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Их
называют, кроме того, эндотоксинами, поскольку вирулентность бактериальных клеток для животных определяется наличием и типом О-боковых цепей. В экспериментах по введению лабораторным животным выделенных
клеточных стенок бактерий определенного вида происходит копирование
симптомов соответствующего заболевания, и у животных вырабатывается
иммунитет к бактериям — обладателям использованных клеточных стенок.
Наружная мембрана соединяется с муреиновой сетью с помощью липопротеинов, которые через диаминопимелиновую кислоту присоединяются к
муреину. При этом липофильные (гидрофобные) части липопротеинов погружены в липидный бислой и выполняют роль «якоря».
Ряд химических факторов может оказывать воздействие на клеточные
стенки прокариот, в частности такие широко распространенные агенты, как
фермент лизоцим и антибиотик пенициллин. Механизмы этих явлений будут
рассмотрены далее в соответствующих разделах. Общим для действия названных факторов и им подобных является то, что в гипертонических средах
оно приводит к образованию протопластов (полностью лишенных клеточной
стенки форм) или сферопластов (форм, частично лишенных клеточной стенки). Эти образования характеризуются осмотической хрупкостью (лизируются в гипотонических средах) и способны в подходящих условиях регенерировать клеточную стенку. Протопласты и сферопласты широко используются в
генной инженерии в экспериментах по их слиянию и трансформации с получением гибридных бактерий.
5.4. Структура клеточных стенок грибов
Полисахариды клеточных стенок грибов, в том числе дрожжей, представлены в основном гемицеллюлозами: глюканами, хитином и маннанами. Глюканы — продукты конденсации глюкозы с разным числом звеньев —
принадлежат в основном к b-1,4- и b-1,6-типу. Эти гомополисахариды формируют в клеточной стенке грибов микрофибриллярный скелет, подобный
тому, который создает целлюлоза в клеточных стенках растений.
Хитин представляет собой гомополисахарид, образованный цепями Nацетилглюкозамина, который также является структурной частью муреина
(рис. 5.4). Остатки N-ацетилглюкозамина в хитине связаны между собой с
помощью b(1®4)-гликозидных связей и формируют слоистую структуру,
подобную целлюлозе. Однако в хитине межцепочечные водородные связи
оказываются более прочными, поскольку в их образовании принимают участие N-ацетильные группы. Хитин служит также основным структурным по109
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
лисахаридом покровов тела насекомых.
Маннаны являются полимерами маннозы (рис. 5.8). В них от главной a1,6-цепи отходят короткие ветви (из 1—3 маннозных звена), присоединенные
через a(1®2)- и a(1®3)-гликозидные связи. Маннаны и глюканы — это основные полисахариды клеточных стенок дрожжей (составляют в них 60—
80% сухого вещества).
Кроме гемицеллюлоз, в состав клеточных стенок грибов входят белки
(6—13%), липиды (2—9%) и неорганические полифосфаты. Белки богаты
серусодержащими аминокислотами и присутствуют в виде комплексов с полисахаридами. Наиболее часто среди таких комплексов встречаются маннанопротеины. Кроме структурной функции, маннанопротеинам принадлежит
рецепторная: они воспринимают сигналы из внешней среды и участвуют в
осуществлении клеточных контактов. Структура маннанопротеинов определяет иммунологические свойства дрожжей.
Анализ наиболее распространенных клеточных полисахаридов, охарактеризованных в этой главе, позволяет заключить, что их структура и функции
тесно связаны: полисахариды с рыхлой, разветвленной, легко доступной
ферментам структурой выполняют в клетках резервную функцию. Наоборот,
полисахариды, призванные служить механической опорой и защитой для клеток, имеют сложную, компактную структуру, которая упрочняется при взаимодействии полисахаридов с веществами других классов: белками, липидами, тейхоевыми кислотами и др. В этих комплексах практически всегда присутствуют межмолекулярные связи, что делает клеточные стенки жесткими,
прочными, трудно доступными ферментативному расщеплению.
CH2
O
OH HO
O
HO
CH2
O
OH HO
HO
O
Рис. 5.8. Структура фрагмента главной маннановой цепи
110
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 6. БЕЛКИ. ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИИ
ФЕРМЕНТОВ
Белки представляют собой один из основных классов клеточных макромолекул, составляя, например, в микробной клетке до 50% сухого вещества.
Этим удивительным по разнообразию полимерам присущи одни из наиболее
важных и разносторонних клеточных функций.
Мономерными единицами белков служат аминокислоты. Природные
аминокислоты являются 2-аминокарбоновыми кислотами, или aаминокислотами. В их молекулах при атоме С-2 (Сa) имеются 4 различных
заместителя (рис. 6.1). Таким образом, все a-аминокислоты, кроме глицина,
имеют асимметрический (хиральный) a-углеродный атом (рис. 6.1) и существуют в виде двух энантиомеров — L- и D-аминокислот. В большинстве природных пептидов содержатся L-аминокислоты.
Аминокислоты различаются структурой боковых цепей и степенью их полярности. На рис. 6.2 изображено строение боковых групп 20-ти протеиногенных (положение которых в полипептидах кодируется генетическим кодом) аминокислот. Из них выраженными неполярными (гидрофобными)
свойствами характеризуются боковые группы аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, цистеина, фенилаланина. Заряженные боковые цепи
содержатся в составе кислых аминокислот (аспарагиновой, глутминовой) и
основных аминокислот (лизина, аргинина, гистидина).
Карбоксильная
группа
COO-
COO+
+
H3N
H3N
C
R
Аминогруппа
R
H
L-аминокислота
(реальное изображение)
Ca
Боковая
цепь
H
a-Углеродный
атом
Проекционная формула Фишера
Рис. 6.1. Особенности строения L-аминокислот
111
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Серосодержащие
Алифатические
CH2
CH2 H3C
H3C CH
H
CH3
C
H3C CH
CH3
CH3
Глицин Аланин Валин
(Gly, G) (Ala, A) (Val, V)
Лейцин
(Leu, L)
H
CH2
CH2
CH2
S
CH3
SH
CH3
Изолейцин
(Ile, I)
Цистеин Метионин
(Cys, C) (Met, M)
Ароматические
CH2
CH2
Нейтральные
CH2
CH2
H3C
N
H
C
H
OH
OH
Фенилаланин Тирозин Триптофан
(Tyr, Y)
(Trp, W)
(Phe, F)
CH2
CH2
CH2
CONH2
CONH2
OH
Треонин Аспарагин Глутамин Серин
(Thr, T)
(Asn, N)
(Gln, Q) (Ser, S)
Иминокислота
Основные
Кислые
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COOАспарагиновая
кислота
(Asp, D)
-
COO
Глутаминовая
кислота
(Glu, E)
HN
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH
CH
+
NH
CH2
C
+
C
H
NH3 H2N + NH2
Гистидин Лизин
Аргинин
(His, H) (Lys, K) (Arg, R)
COOCH
HN
CH2
H2C
CH2
Пролин
(Pro, P)
Рис. 6.2. Строение боковых цепей протеиногенных аминокислот
a-Аминокислоты в водных растворах при нейтральных рН существуют преимущественно в виде диполярных ионов (цвиттер-ионов), у которых аминогруппы
протонированы, а карбоксильные группы диссоциированы (рис. 6.1).
Остатки аминокислот в пептидах соединяются друг с другом пептидной
(карбоксамидной) связью, в формировании которой принимают участие aкарбоксильная группа одной и a-аминогруппа другой аминокислоты. В ходе
этой реакции выделяется вода (рис.6.3).
112
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
113
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Первичная структура белков характеризует их аминокислотную последовательность, которая определяет другие уровни организации этих полимеров — вторичную, третичную и четвертичную структуру. Под вторичной
структурой обычно подразумевают структуру участков полипептидной цепи
с упорядоченной конформацией, стабилизированной водородными связями
между СО- и NH-группами. Подобные участки называют элементами вторичной структуры и различают несколько их типов: правую a-спираль
(наиболее распространенный элемент), левую a-спираль, антипараллельный
и параллельный b-складчатый лист, b-петлю. В фибриллярных белках, которые обычно выполняют структурную функцию, регулярные вторичные структуры распространяются на достаточно протяженные фрагменты молекулы и
представлены чаще каким-либо одним типом. К тому же для этих белков характерно формирование ансамблей взаимодействующих между собой вторичных структур, что обусловливает особую прочность формируемых волокон. Например, коллаген — белок соединительной и костной тканей, сухожилий, хрящей — представляет собой правую тройную спираль, скрученную
из трех первичных левых спиралей.
В глобулярных белках (растворимые, с формой, близкой к сферической),
которые выполняют в клетках специфические функции, в том числе обладают
каталитической активностью, обычно присутствуют одновременно и aспирали, и b-складчатые листы. Кроме этого имеются участки с неупорядоченной структурой. В молекуле инсулина (см. разд. 21.3), например, на долю
участков, представленных a-спиралью, приходится 57%, b-складчатой структурой — 6%, b-петлей — 10%. Остальная часть молекулы (27%) не имеет
упорядоченной структуры.
Под третичной структурой понимают расположение в пространстве
атомов и формируемых ими элементов вторичной структуры полипептида,
иными словами, трехмерную функционально активную конформацию белка. Каждый белок характеризуется своей уникальной пространственной
структурой. Стабилизация конформации белковых молекул обеспечивается
водородными связями, дисульфидными мостиками, электростатическим
взаимодействием, комплексообразованием с ионами металлов, гидрофобными эффектами.
Многие белковые молекулы образуют симметрично построенные комплексы, стабилизированные за счет нековалентных взаимодействий. Взаимное расположение составных единиц комплексов (субъединиц) определяет
четвертичную структуру белка.
Обычно в белковых молекулах насчитывается несколько десятков аминокислотных остатков, однако встречаются полипептиды, содержащие сотни и
даже тысячи мономерных звеньев. При этом число типов мономерных единиц (различающихся своей боковой цепью аминокислот) в большинстве природных белков составляет 20. Поистине огромная вариабельность структуры
разных белков определяется последовательностью аминокислот, число различных вариантов которой описывается величиной 20n, где n — количество
аминокислотных остатков в белке. Последовательность аминокислот в полипептиде определена генетически. Белковая молекула может состоять из одной
или нескольких полипептидных цепей.
114
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Кроме простых белков, в состав которых входят только аминокислоты,
существуют сложные белки, которые могут содержать ионы металлов (металлопротеины), молекулы пигментов (хромопротеины), образовывать
комплексы с другими молекулами (липопротеины, нуклеопротеины, гликопротеины), ковалентно связывать неорганический фосфат (фосфопротеины).
Химические свойства белков обусловлены набором и соотношением аминокислот с гидрофильными и гидрофобными боковыми группами. К биологическим свойствам белков относятся, в первую очередь, каталитическая
(ферментативная), транспортная (транспортировка веществ в организме и
перенос их через биомембраны), структурная (в составе хромосом, цитоскелета, соединительных, мышечных, опорных тканей), регуляторная (способность регулировать скорость химических реакций в клетке и уровень метаболизма в целом организме) и рецепторная функции. Кроме этого, белкам
присущи защитные, запасные, токсические, сократительные и некоторые другие функции. Большинство перечисленных биологических свойств белков уже
охарактеризованы в предыдущих главах. Здесь внимание будет уделено биокаталитической активности белковых молекул.
6.1. Особенности структуры ферментных молекул
Ферменты (энзимы) представляют собой специфические высокоэффективные катализаторы химических реакций. Подавляющее большинство клеточных реакций осуществляется с участием ферментов, одна клетка может
содержать до 1000 различных ферментов. В настоящее время известны функции более двух тысяч ферментов, из которых несколько сотен изучены наиболее полно, для них определена аминокислотная последовательность и пространственная структура.
Ферментативный катализ ускоряет протекание химических реакций в
106—1016 раз! Будучи выделенными из клетки без повреждения нативной
структуры, ферменты сохраняют активность, что делает возможным их использование в бесклеточных реакциях.
Молекулы ферментов характеризуются различными молекулярными массами — от 10 000 до 1 000 000 дальтон (Да) и выше, однако большинство
ферментов представлено глобулярными белками с молекулярной массой в
несколько сотен тысяч дальтон, построенными из субъединиц (протомеров).
Упаковка субъединиц в мультимерном (состоящем из нескольких субъединиц) белке осуществляется благодаря взаимодействиям того же типа, что и
при образовании третичной структуры белка. Среди ферментов-мультимеров
преобладают димеры и тетрамеры, в меньшей мере распространены гексамеры и октамеры и очень редко встречаются тримеры и пентамеры.
Мультимерные ферментные белки могут содержать протомеры нескольких типов, различающихся некоторыми особенностями первичной и третичной структуры. От соотношения протомеров разного типа в мультимере зависят некоторые его химические и физические свойства, и такие различающиеся формы мультимерного фермента называют изоферментами (изозимами).
Например, лактатдегидрогеназа, катализирующая в мышцах обратимую ре115
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
акцию окисления молочной кислоты, состоит из четырех субъединиц двух
типов (Н и М) и представлена пятью изоферментами (НННН, НННМ,
ННММ, НМММ, ММММ). Эти изоферменты отличаются друг от друга активностью, молекулярной массой, электрофоретической подвижностью, локализацией в органах и тканях, а также чувствительностью к регуляторным
веществам. Существование изоферментов позволяет организму изменять их
соотношение и регулировать, таким образом, метаболическую активность.
Изучение структуры молекул ферментов позволило выявить ряд закономерностей в их организации. Полипептидная цепь, образующая белковую
глобулу, свернута довольно сложным образом. Одни участки этой цепи являются a-спиралями или же b-структурами, другие принимают нерегулярные,
но вполне определенные конформации. Эти структуры, тесно прилегая друг к
другу и чередуясь, упаковываются в блоки, обладающие функциональной
активностью. На поверхности белковой глобулы сосредоточены в основном
полярные группы и заряженные атомы, причем между противоположно заряженными группами (например, между боковыми цепями Glu- и Lys+) иногда
образуются ионные связи (солевые мостики). Внутренняя часть белковой глобулы представляет собой неполярную среду, гидрофобное ядро образовано
неполярными группами, входящими главным образом в состав алифатических и ароматических боковых цепей аланина, валина, изолейцина, лейцина,
метионина, фенилаланина и триптофана. Полярные радикалы аминокислот,
имеющие функциональное значение, ориентированы также внутрь глобулы,
при этом они ассоциированы друг с другом.
Важнейшей частью ферментной молекулы является активный центр, который обычно имеет форму щели или впадины в глобуле фермента. В активном центре происходит связывание субстрата и превращение его в продукт.
Активный центр почти всегда построен из небольшого количества аминокислотных остатков, которые, как правило, значительно удалены друг от друга в
полипептидной молекуле. В активном центре можно условно выделить два
участка: связывающий и каталитический.
Остатки аминокислот, образующие связывающий участок, обеспечивают
удержание субстрата в актином центре. Именно «архитектура» связывающего
участка активного центра фермента определяет его комплементарность
структуре субстрата, т. е. специфичность связывания фермента. Часто прикрепление субстрата осуществляется за счет взаимодействия с eаминогруппой радикала лизина, расположенного в субстратном участке. Эту
же роль может выполнять карбоксильная группа глутаминовой кислоты, а
также сульфгидрильная группа цистеина. Однако чаще формирование субстрат-ферментного комплекса происходит без образования ковалентных связей, за счет более слабых сил, таких, как водородные и электростатические
связи, гидрофобные и ван-дер-Ваальсовы взаимодействия.
В каталитический участок фермента входят остатки аминокислот, непосредственно участвующие в катализе. Их называют каталитическими группами, и они чаще всего представлены остатками серина, гистидина, триптофана, аргинина, цистеина, аспарагиновой и глутаминовой кислоты, тирозина.
Окончательное формирование каталитического участка у многих ферментов
может происходить в момент присоединения субстрата.
116
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Кроме активного центра, большинство ферментов содержат аллостерический центр. Этот участок молекулы предназначен для связывания с регуляторными веществами, в результате чего изменяется третичная структура
белка. Это искажение затрагивает и конфигурацию активного центра, что
сопровождается увеличением или снижением каталитической активности
фермента. Данное явление лежит в основе аллостерической регуляции активности ферментов.
Некоторые ферменты проявляют полифункциональность —способность
осуществлять несколько энзиматических активностей. Данное явление объясняется тем, что при формировании третичной структуры полипептидные цепи
подобных ферментов образуют несколько функционально и стерически обособленных глобулярных участков — доменов, каждый из которых характеризуется собственной каталитической активностью.
6.2. Специфичность ферментов
Одним из удивительных свойств ферментов является их высокая специфичность. Различают субстратную специфичность (способность связываться с
определенным субстратом или их группой) и специфичность действия, или
реакционную специфичность (способность катализировать реакции определенного типа).
Специфичность связывания субстрата у разных ферментов значительно
варьирует — некоторые ферменты могут катализировать реакцию с участием
только одного субстрата, тогда как другие — с несколькими химически родственными веществами. Например, формамидаза гидролизует только формамид, в то время как амидаза гидролизует любой алифатический амид. В
таком случае говорят соответственно об узкой и широкой специфичности
ферментов.
Ранее было принято объяснять субстратную специфичность ферментов
теорией замка и ключа: к ферменту (замку) подходит лишь свой субстрат
(ключ). Однако в настоящее время эта теория получила развитие в гипотезе
Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента, которая считается общепринятой. Согласно этой гипотезе, пространственное соответствие между структурами активного центра фермента и субстрата создается в момент их взаимодействия друг с другом. При этом в молекуле фермента индуцируются небольшие конформационные изменения, в результате
чего в каталитическом участке функционально активные группы ориентируются наиболее благоприятным для протекания соответствующей реакции образом. В субстрате также возникают конформационные превращения (говорят о возникновении напряжения в субстрате), что делает его более реакционноспособным. Данная гипотеза объясняет тот факт, что молекулы, очень
похожие по форме на истинный субстрат, могут связываться с ферментом, но
не превращаются в продукт, т. е. действуют как ингибиторы.
Субстратная специфичность ферментов настолько выражена, что большинство из них способно распознавать положение заместителей у аномерного
атома углерода, связывая и катализируя превращения лишь одной из групп
аномеров. Например, почечная оксидаза D-аминокислот катализирует окис117
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ление целого ряда D-аминокислот, но не действует на L-аминокислоты. Однако это правило не абсолютно, и существуют ферменты, катализирующие
превращения обоих энантиомеров. Так, субстратами глутаминсинтетазы из
мозга овцы служит как D-, так и L-глутаминовая кислота.
Специфичность действия ферментов также проявляется в высокой степени и характеризует способность ферментов катализировать однуединственную химическую реакцию или несколько реакций одного типа. Часто превращения субстрата могут идти по нескольким путям, и в ходе некатализируемой реакции либо при участии неорганического катализатора превращения органического вещества сопровождаются образованием множества
побочных продуктов. Этого не происходит при ферментативном катализе, и
продукт ферментативной реакции не содержит примесей.
Более того, некоторые ферменты обладают стереохимической специфичностью, т. е. способны различать в субстрате правую и левую стороны, а
также распознавать пространственное положение атомов. Например, ферменты, расщепляющие a- и b-метилглюкозиды, узнают эти пространственные
изомеры и характеризуются специфичностью по отношению к ним. Алкогольдегидрогеназа, катализирующая окисление этанола, распознает и отщепляет один из пары атомов в СН2-группе этанола, а именно тот, который находится в положении про-R относительно прохирального центра:
OH
H3C C
Hs
HR
Алкогольдегидрогеназа
O
+ [H]
H3C C
H
Этанол
Ацетальдегид
6.3. Механизм ферментативного катализа
Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать
следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс.
При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и молекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной
конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное
состояние, — высокоэнергетическая промежуточная структура, которая
энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важнейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабилизации переходного состояния —взаимодействия между аминокислотными
остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации.
Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного
состояния соответствует свободной энергии активации (DG#). Скорость реакции зависит от величины DG#: чем она меньше, тем больше скорость реакции, и наоборот. По сути DG# представляет собой «энергетический барьер»,
который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация
переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На
следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образовавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.
118
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности
ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реакции.
1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким
образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизости друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения).
2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фиксация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических
связей ориентация (эффект ориентации).
3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки
(существует на растворенных в воде веществах).
4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.
5. Стабилизация переходного состояния.
6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать кислотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофильный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит
к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).
Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гликозидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим представляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и
растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из
куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной полипептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных
мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгеноструктурный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов,
образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «щели» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести сахарных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F)
(рис. 6.4).
Glu-35
фермент
NAG
NAM
NAG
участок А
участок В
участок C
NAM
участок D
NAG
NAM
участок E
участок F
Asp-52
субстрат
Рис. 6.4. Расположение гексосахаридного звена муреина в активном центре молекулы лизоцима: NAG — остаток N-ацетилглюкозамина; NAM —
остаток N-ацетилмурамовой кислоты; заштрихованная часть
рисунка — область активного центра лизоцима
119
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Молекула муреина удерживается в активном центре лизоцима в основном
благодаря водородным связям и гидрофобным взаимодействиям. В непосредственной близости к месту гидролиза гликозидной связи расположены 2 аминокислотных остатка активного центра: глутаминовая кислота, занимающая
35-е положение в полипептиде, и аспарагиновая кислота — 52-е положение в
полипептиде (рис. 6.5).
Glu-35
C
O
O
NAM
H
O
O
O
O
1
O
O
O
C
участок D
NAG
4
участок Е
Asp-52
Glu-35
C
Покидает область
активного центра
O
O
NAM
O
O
O
O
O
O
участок D
H
+
C
участок Е
NAG
O
Asp-52
H 2O
Glu-35
C
O
O
H
NAM
O
O
H
O
O
O
участок D
Покидает область
активного центра
C
Asp-52
Рис. 6.5. Механизм гидролиза гликозидной связи в молекуле муреина с участием фермента лизоцима
120
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Боковые цепи этих остатков располагаются на противоположных поверхностях «щели» в непосредственной близости к атакуемой гликозидной связи — примерно на расстоянии 0,3 нм. Остаток глутамата находится в неполярном окружении и не ионизирован, а остаток аспартата — в полярном окружении, его карбоксильная группа депротонирована и участвует в качестве
акцептора водорода в сложной сети водородных связей.
Процесс гидролиза осуществляется следующим образом. Протонированная карбоксильная группа остатка Glu-35 предоставляет свой протон гликозидному атому кислорода, что приводит к разрыву связи между этим атомом
кислорода и С1-атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D
(стадия общего кислотного катализа). В результате образуется продукт,
включающий в себя сахарные кольца, находившиеся в
участках E и F, который может высвободиться из комплекса с ферментом.
Конформация сахарного кольца, расположенного в участке D, искажается,
принимая конформацию полукресла, в которой пять из шести атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Эта структура соответствует конформации переходного состояния. При этом С1-атом оказывается положительно заряженным и промежуточный продукт носит название карбоний-иона (карбкатиона). Свободная энергия переходного состояния
уменьшается за счет стабилизации карбоний-иона депротонированной карбоксильной группой остатка Asp-52 (рис. 6.5).
На следующем этапе в реакцию вступает молекула воды, которая замещает диффундирующий из области активного центра дисахаридный остаток.
Протон молекулы воды переходит к Glu-35, а гидроксильный ион (ОН-) к
атому С1 карбоний-иона (стадия общего основного катализа). В результате
второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реакции (конформация кресла) и уходит из области активного центра, а фермент
возвращается в исходное состояние и готов осуществить следующую реакцию
расщепления дисахарида (рис. 6.5).
6.4. Свойства ферментов
Характеризуя свойства ферментов, в первую очередь оперируют понятием «активность». Под активностью фермента понимают такое его количество,
которое катализирует превращение определенного количества субстрата в
единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (Е) и «катал» (кат). За
международную единицу активности фермента принято то его количество,
которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 мин в
стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моль субстрата за 1 с.
1 кат = 6Ч107 Е.
Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью,
которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность — это
число единиц активности фермента на 1 мг белка.
Активность ферментов в очень сильной степени зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН сре121
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ды. Повышение температуры в интервале 0—50° С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением
процессов формирования субстрат-ферментного комплекса и всех последующих событий катализа. Однако дальнейшее повышение температуры, как
правило, сопровождается увеличением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении
активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом — значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его
активность. Чаще для ферментов растительного происхождения температурный оптимум лежит в пределах 50—60° С, а животного — между 40 и 50° С.
Ферменты термофильных бактерий характеризуются очень высоким температурным оптимумом.
Зависимость активности ферментов от значений рН среды также имеет
сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды,
при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого
оптимума в одну либо другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента
(уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также
третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют
оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа).
Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (вещества, снижающие активность) и
активаторов (вещества, увеличивающие активность). Роль ингибиторов и
активаторов могут выполнять катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические
белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др. Эти вещества
могут попадать в клетку извне либо вырабатываться в ней. В последнем случае говорят о регуляции активности ферментов — неотъемлемом звене в общей регуляции метаболизма.
Воздействующие на активность ферментов вещества могут связываться с
активным и аллостерическим центрами фермента, а также вне этих центров.
Частные примеры подобных явлений будут рассмотрены в главах 7—19. Для
обобщения некоторых закономерностей ингибирования активности ферментов следует указать, что эти явления в большинстве случаев сводятся к двум
типам — обратимому и необратимому. В ходе обратимого ингибирования в
молекулу фермента не вносится каких-либо изменений после его диссоциации
с ингибитором. Примером служит действие аналогов субстрата, которые
могут связываться с активным центром фермента, препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом. Однако увеличение концентрации
субстрата приводит к «вытеснению» ингибитора из активного центра, и скорость катализируемой реакции восстанавливается (конкурентное ингибирование). Другой случай обратимого ингибирования представляет собой связывание ингибитора с простетической группой фермента, или апоферментом,
вне активного центра. Например, взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам остат122
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ков аминокислот фермента, белок-белковые взаимодействия или ковалентая
модификация фермента. Такое ингибирование активности называется неконкурентным.
Необратимое ингибирование в большинстве случаев основано на связывании так называемых «суицидных субстратов» с активными центрами
ферментов. При этом между субстратом и ферментом формируются ковалентные связи, которые расщепляются очень медленно и фермент долго не
способен выполнять свою функцию. Примером «суицидного субстрата» служит антибиотик пенициллин (глава 18, рис. 18.1).
Поскольку для ферментов характерна специфичность действия, их классифицируют по типу реакции, подвергающейся катализу. Согласно принятой
в настоящее время классификации, ферменты группируют в 6 классов:
1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные реакции).
2. Трансферазы (реакции переноса функциональных групп между субстратами).
3. Гидролазы (реакции гидролиза, акцептором переносимой группы является молекула воды).
4. Лиазы (реакции отщепления групп негидролитическим путем).
5. Изомеразы (реакции изомеризации).
6. Лигазы, или синтетазы (реакции синтеза за счет энергии расщепления
нуклеозидтрифосфатов, чаще АТР).
Номер соответствующего класса фермента закреплен в его кодовой нумерации (шифре). Шифр фермента состоит из четырех разделенных точками
чисел, обозначающих класс фермента, подкласс, подподкласс и порядковый
номер в подподклассе.
6.5. Регуляция активности ферментов
Регуляция ферментативной активности — не менее важный для успешного функционирования клетки процесс, чем регуляция экспрессии генов на
уровне транскрипции. Существование этих механизмов позволяет клеткам и
всему организму четко координировать осуществление многочисленных разветвленных метаболических реакций, обеспечивая наиболее высокий и экономный уровень обмена веществ, а также быструю приспособляемость к меняющимся условиям окружающей среды. При этом регуляция синтеза ферментов является более медленным механизмом, действующим в течение многих минут или даже часов, в то время как изменение ферментативной активности происходит мгновенно и действует в течение нескольких минут или
секунд. Регуляцию активности ферментов можно назвать «тонкой настройкой» клеточного метаболизма.
Регуляция ферментативной активности может осуществляться несколькими путями, среди которых наиболее распространены аллостерическая
регуляция и ковалентная модификация.
Аллостерической регуляции подвержены не все ферменты, а лишь те, которые имеют в составе молекулы аллостерический (от греч. аллос – другой и
стереос – тело, пространство) центр — участок, отличающийся от активного
центра, характеризующийся высоким сродством к регуляторным молекулам.
123
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Подобные ферменты называют аллостерическими. Их активность регулируется при участии низкомолекулярных веществ (эффекторов), общим свойством которых является способность к взаимодействию с аллостерическим центром, что приводит к искажению конформации белковой молекулы. Это искажение передается активному центру, в результате чего меняются активность фермента и скорость соответствующей реакции.
Эффекторы могут выполнять роль как ингибиторов активности ферментов, так и их активаторов. Примером ингибирования ферментативной активности может служить снижение активности первого фермента пути биосинтеза триптофана у E.coli — антранилатсинтетазы при избытке в клетке
триптофана. В данном случае триптофан, как конечный продукт названного
биосинтетического пути, служит игибитором активности ключевого фермента, что координирует скорость синтеза этой аминокислоты и позволяет клетке
экономить свои ресурсы. Ведь при избытке триптофана, например, когда он
присутствует в ростовой среде, клетке незачем расходовать строительные
блоки и энергию на его синтез, она может воспользоваться экзогенной аминокислотой. Действительно, экспериментально доказано, что в процессе роста
бактерии преимущественно используют добавленные к ростовой среде аминокислоты, пурины и пиримидины и что эти соединения оказывают ингибирующее действие на свой собственный синтез из молекул-предшественников.
Поскольку в приведенном случае триптофан является конечным продуктом
биосинтетического пути, скорость которого снижается при ингибировании ключевого фермента, такой тип регуляции носит название «ретроингибирование».
Увеличение активности аллостерического фермента при связывании с
эффектором (активатором) можно рассмотреть на примере аспартаттранскарбамоилазы (АТКазы), которая катализирует первую реакцию биосинтеза пиримидинов. Этот фермент активируется аденозинтрифосфатом (АТР) —
пуриновым нуклеотидом. Следует отметить, что одновременно АТКаза ингибируется одним из конечных продуктов названного биосинтетического пути — цитидинтрифосфатом (СТР), причем активатор и ингибитор связываются с одним и тем же аллостерическим центром. Таким образом, с помощью
регуляции активности одного фермента обеспечивается координация синтеза
пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.
Мутационное повреждение аллостерического центра может обусловить
утрату способности фермента связывать молекулы эффекторов и изменять в
ответ на это свою активность. Данное явление используется в селекции микроорганизмов для получения мутантов с десенсибилизированными ферментами. Такие микроорганизмы часто являются продуцентами биологически
активных веществ, и для их отбора используют аналоги метаболитов. Например, 5-метилтриптофан так же, как триптофан, способен ингибировать активность антранилатсинтетазы, но не заменяет триптофан в составе белка. Поэтому бактерии E.coli не способны формировать колонии на синтетической
среде с этим веществом. Однако известны мутанты E.coli, растущие на среде
с 5-метилтриптофаном. Эти бактерии содержат в клетках нечувствительную к
ретроингибированию (десенсибилизированную) антранилатсинтетазу и синтезируют триптофан в избыточных количествах, выделяя его во внешнюю
среду.
124
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Еще одним распространенным путем регуляции активности ферментов
служит ковалентная модификация — присоединение или отщепление от фермента небольшой химической группы. С помощью таких модификаций обычно либо полностью неактивная форма фермента становится активной, либо,
наоборот, полностью активный фермент инактивируется. К явлению ковалентной модификации относятся: ограниченный протеолиз (укорочение полипептидных цепей), фосфорилирование — дефосфорилирование, аденилирование — деаденилирование, ацетилирование — деацетилирование и др. Например, гликогенсинтетаза клеток млекопитающих, катализирующая превращение глюкозы в гликоген, инактивируется после ковалентного присоединения фосфатной группы к боковой цепи одного из сериновых остатков и
снова активируется при отщеплении фосфата. Другие примеры ковалентной
модификации ферментов описаны в главе 3.
Особый случай регуляции активности ферментов представляют собой белок-белковые взаимодействия, в которых роль ингибиторов ферментов выполняют особые белки. При таких взаимодействиях блокируется активный
центр фермента. Особое значение ингибирование с помощью белков имеет
для регуляции активности протеиназ, участвующих в посттрансляционной
модификации белков. Это способствует изменению скорости созревания многих важных для клетки белков, а следовательно, и интенсивности процессов,
в которых последние принимают участие.
125
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 7. КОФАКТОРЫ
В ряде случаев для осуществления катализа ферменты нуждаются в особых посредниках — кофакторах. Кофакторы представляют собой вещества
небелковой природы, которые функционируют на промежуточных стадиях
ферментативной реакции (или цикла реакций), но не расходуются в ходе катализа. В подавляющем большинстве случаев кофакторы регенерируются в
неизменном виде по завершении каталитического акта.
Разнообразные по химической природе кофакторы можно разделить на
две основные группы: коферменты (слабо связаны с ферментом и при катализе отделяются от него) и простетические группы (прочно связаны с ферментной молекулой).
Основные механизмы, согласно которым кофакторы принимают участие в
катализе, следующие:
— выполняют функцию переносчиков между ферментами. Взаимодействуя с одним ферментом, переносчик акцептирует часть субстрата, мигрирует
к другому ферменту и передает переносимую часть субстрату второго фермента, после чего высвобождается. Такой механизм типичен для большинства коферментов;
— выполняют роль «внутриферментного» переносчика, что характерно, в
первую очередь, для простетических групп. Простетическая группа присоединяет часть молекулы субстрата и переносит ее на второй субстрат, связанный
в активном центре того же фермента. В данном случае можно рассматривать
простетическую группу как часть каталитического участка фермента;
— изменяют конформацию ферментной молекулы, взаимодействуя с ней
вне активного центра, что может индуцировать переход активного центра в
каталитически активную конфигурацию;
— стабилизируют конформацию фермента, способствующую каталитически активному состоянию;
— выполняют функцию матрицы. Например, полимеразы нуклеиновых
кислот нуждаются в «программе» — матрице, по которой строится новая молекула;
— играют роль промежуточных соединений. Иногда фермент может использовать в реакции молекулу кофактора, образуя из нее продукт, но при
этом одновременно за счет субстрата образовать новую молекулу кофактора.
Среди известных в настоящее время ферментов примерно 40% способны
осуществить катализ только при посредстве кофакторов. Наибольшее распространение имеют кофакторы, осуществляющие перенос восстановительных
эквивалентов, фосфатных, ацильных и карбоксильных групп.
124
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
7.1. Переносчики восстановительных эквивалентов
Под восстановительными эквивалентами подразумевают обычно атомы
водорода, электроны или гидрид-ионы. Поскольку их перенос осуществляется
в ходе окислительно-восстановительных реакций, соответствующие переносчики называют окислительно-восстановительными кофакторами. Среди них
присутствуют как коферменты, так и простетические группы. Наибольшее
значение и распространение имеют никотинамидные (NAD и NADP) и флавиновые (FAD и FMN) кофакторы.
Никотинамидные переносчики восстановительных эквивалентов.
Известно порядка 270 ферментов, использующих никотинамидные окислительно-восстановительные коферменты в ходе катализа. Этими коферментами являются никотинамидадениндинуклеотид (НАД, или NAD) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ, или NADP). Структурные формулы
NAD и NADP представлены на рис. 7.1, и можно видеть, что два кофермента
очень сходны по строению.
NH2
N
N
В молекуле NAD+ : R = H
N
N
-
CH2
AMP
O
O
-O
O
P
-
O
P
O
O
HO
O
O
В молекуле NADP+ : R =
P
OR
O
C
-
NH2
O
Никотинамид
(витамин)
+
O
N
CH2
O
HO
OH
Рис. 7.1. Структура никотинамидных окислительновосстановительных коферментов
При физиологических значениях рН (7,0—7,5) кислотные группы
фосфатных остатков этих коферментов ионизированы и суммарный заряд
молекулы NAD в окисленном состоянии равен (-)1, а молекулы NADP —
125
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
(-)3. Тем не менее окисленные формы этих коферментов принято обозначать как NAD+ и NADP+, желая подчеркнуть присутствие избыточного
положительного заряда на атоме азота никотинамидного кольца.
Функциональной группой никотинамидных переносчиков восстановительных эквивалентов служит никотинамидное кольцо, входящее в состав
никотинамида — одной из форм витамина В5 (РР). При ферментативном
окислении субстрата с участием NAD+ (NADP+) никотинамидное кольцо восстанавливается в ходе присоединения гидрид-иона, который представляет
собой протон и два электрона (рис. 7.2). При этом дегидрирование субстрата
в большинстве случаев сопровождается отщеплением двух атомов водорода,
в ходе которого протон выделяется в окружающую среду.
Примером работы никотинамидных переносчиков восстановительных эквивалентов может служить окисление этанола в уксусный альдегид, катализируемое алкогольдегидрогеназой (рис. 7.3). Этот фермент осуществляет стереоспецифическое отщепление двух атомов водорода от молекулы этанола,
причем к NAD+ переносится водород, связанный с углеродом спиртовой
группы, а водород, присоединенный к кислороду гидроксила, высвобождается
в среду в виде протона.
Два пиримидиновых кофермента участвуют в разных окислительновосстановительных реакциях при различных окислительно-восстановительных потенциалах: NAD+ чаще выступает в роли окислительного
агента в катаболитных путях, а NADP+ восстанавливается до NADPH и выполняет функцию восстановителя в биосинтетических процессах.
Флавиновые переносчики восстановительных эквивалентов. Существует не менее 80 флавинсодержащих ферментов, которые в качестве простетической группы используют либо флавинадениндинуклеотид (ФАД, или
FAD), либо флавинмононуклеотид (ФМН, или FMN). Оба этих кофактора
построены на основе витамина рибофлавина (В2) (рис. 7.4).
H
HC
HC
C
+
H
H
C
CONH2
C
+ [H-]
CH
N
- [H-]
R
HC
C
HC
CONH2
CH
N
R
NAD+ (NADP+)
NADH (NADPH)
Рис. 7.2. Окисление—восстановление никотинамидного кольца
126
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
OH
H3C C
O
Алкогольдегидрогеназа
Hs
HR
+
H3C C
+
H
H
Ацетальдегид
Этанол
H
H
CONH2
CONH2
N+
N
+
NAD
NADH
Рис. 7.3. Восстановление никотинамидного кольца в процессе стереоспецифического дегидрирования этанола с участием алкогольдегидрогеназы
NH2
N
O
O
O
P
O
P
N
O
N
CH2
O
O
O
O
O
N
H
HO
C
H
HO
C
H
H
C
H
CH2
HO
-
H3C
H3C
N
N
O
NH
N
Витамин В 2 (рибофлавин)
C
O
O
CH2
HO
P
O
OH
HO
C
H
HO
C
H
HO
C
H
H
C
H
-
H3C
N
N
O
NH
H3C
N
O
Флавинадениндинуклеотид (FAD)
Флавинмононуклеотид (FMN)
Рис. 7.4. Структура флавиновых кофакторов: в пунктирную рамку заключена реакционноспособная часть — изоаллоксазиновая система
127
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
R
H
H3C
N
N
H3C
N
R
-
H3C
N
N
O
NH
H3C
+ 2 [H]
- 2[H]
N
NH
O
H
FAD (FMN)
O
O
FADH2 (FMNH2)
Рис 7.5. Окисление—восстановление флавиновых кофакторов
Реакционноспособной частью FAD и FMN служит изоаллоксазиновая
система, содержащая двойные сопряженные связи. Структура изоаллоксазиновой системы изменяется при восстановлении (рис. 7.5). Следует отметить,
что дегидрирование с участием флавиновых кофакторов также сопровождается отщеплением от субстрата двух атомов водорода, но в отличие от никотинамидных коферментов, акцептирующих гидрид-ион, флавиновые кофакторы
акцептируют оба атома водорода (рис. 7.5). Поэтому восстановленные формы
флавинадениндинуклеотида и флавинмононуклеотида обозначаются как
FADН2 и FMNН2, соответственно.
Флавиновые кофакторы являются более сильными окислителями, чем никотинамидные, а восстановленные формы никотинамидных коферментов
служат более сильными восстановителями, чем восстановленные флавины.
В качестве других переносчиков восстановительных эквивалентов известны цитохромы, хиноны, липоевая и аскорбиновая кислота, глутатион.
7.2. Переносчики фосфатных групп. Преобразование
энергии в клетке
Кофакторы — переносчики фосфатных групп являются обязательными
компонентами не менее 225 ферментов. Подавляющее большинство этих
ферментов специфично к аденозиндифосфату (ADP), и их называют киназами. Типичную киназную реакцию можно представить схематически:
x-Pi + ADP ® x + ATP,
(7.1)
где x-Pi — фосфорилированный субстрат, выполняющий роль донора неорганического фосфата (Pi); ADP — акцептор фосфатной группы; х —
дефосфорилированный донор; АТР — аденозинтрифосфат.
После этой реакции может осуществиться другая киназная (уравнение 7.2)
либо синтетазная (уравнение 7.3) реакция:
y + ATP ® y-Pi + ADP
(7.2)
y + z + ATP ® y-z + ADP + Pi
(7.3)
128
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Нетрудно заметить, что в реакциях типа 7.2 и 7.3 высвобождается ADP,
который снова может принимать участие в реакции типа 7.1, что и дает основание отнести аденозиндифосфат к кофакторам.
В реакции типа 7.1 формируется АТР — богатое энергией вещество, основной поставщик энергии в клеточных процессах. В реакции типа 7.2 АТР
выполняет роль донора фосфатной группы, а в реакции типа 7.3 —донора
энергии для взаимодействия вещества «y» с веществом «z». Но по сути АТР
служит сопрягающим агентом, позволяющим осуществиться реакциям 7.2 и
7.3 за счет распада вещества x-Pi (реакция 7.1).
Особенности структуры молекулы АТР. Аденозинтрифосфат имеет
своеобразное строение (рис. 7.6): при значениях рН, близких к 7, трифосфатный компонент несет около четырех отрицательных зарядов, которые находятся в непосредственной близости друг к другу и сильно взаимоотталкиваются. Электростатическое отталкивание между заряженными группами ослабляется при гидролизе АТР. Кроме того, АТР характеризуется меньшей
резонансной стабилизацией, чем продукт его гидролиза — ADP и Pi. Таким
образом, АТР является термодинамически неустойчивой молекулой и гидролизуется с образованием ADP или АМР. При этом расщепляются макроэргические связи (обозначаются знаком ~) и выделяется большое количество
энергии.
При гидролизе макроэргических связей АТР при рН 7 в стандартных условиях изменение свободной энергии составляет от –30 до –35 кДж/моль,
независимо от того, какая из ангидридных связей АТР при этом расщепляется. Эта энергия может быть расходована для запуска реакций, требующих
притока энергии, или для активации молекул (некоторые вещества способны
подвергаться превращениям только в активированном виде). При этом термодинамически невыгодная реакция может быть превращена в термодинамически выгодную путем сопряжения с гидролизом АТР.
Действующей формой АТР является комплекс с ионом Mg2+, кординационно связанным с a- и b-фосфатом.
NH2
N
N
O
N
N
CH2
H
H
O
P
O-
O
O
~P
O
O
~P
O-
-
O
O-
OH HO
H
O
H
При гидролизе этой
связи образуются:
АМР и РРi (пирофосфат)
При гидролизе этой
связи образуются:
ADP и Pi
Рис. 7.6. Структура молекулы АТР
129
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Строго говоря, АТР является непосредственно используемым донором
свободной энергии, а не формой ее запасания: обычно молекула АТР расходуется в течение 1 мин после образования. Известно, что человек в покое
расходует до 40 кг АТР за 24 ч, а во время интенсивной работы скорость использования АТР может достигать 0,5 кг/мин. Такие жизненно важные процессы, как движение, активный транспорт веществ через мембраны, биосинтез, поддержание температуры организма, осморегуляция, генерация и проведение нервных импульсов, свечение, мышечные сокращения, требуют непрерывной регенерации АТР. Как же образуется АТР?
Образование АТР. Аденозинтрифосфат — «основная энергетическая валюта клетки» — может образовываться в ходе нескольких процессов, сопровождающихся следующими механизмами.
1. Окислительное фосфорилирование, которое осуществляется в процессе дыхания (аэробного либо анаэробного) и требует обязательного участия
мембран. Движущей силой синтеза АТР служит энергия протонного градиента на мембране.
2. Фотофосфорилирование — механизм трансформирования световой
энергии в энергию макроэргических связей АТР, реализующийся при фотосинтезе. Также требует участия биомембран, поскольку и в этом случае движущей силой синтеза АТР выступает энергия протонного градиента на мембране.
3. Субстратное фосфорилирование. Здесь АТР синтезируется при расщеплении макроэргических связей некоторых метаболитов. Процесс не требует участия мембран и реализуется в катаболитных путях и в ходе некоторых типов брожения.
Во всех перечисленных процессах АТР образуется из АDP и неорганического фосфата. В свою очередь, АDP может образовываться из АТР и АМР,
чему способствуют взаимопревращения, катализируемые ферментом аденилаткиназой согласно следующему уравнению реакции:
АТР + АМР « АDP + АDP
(7.4)
Важно отметить, что по потенциалу переноса фосфатной группы АТР занимает промежуточное положение в ряду биологически важных фосфорилированных молекул, выполняя функцию и доноров, и акцепторов энергии в
обмене веществ. Это означает, что должны существовать соединения, характеризующиеся более высоким потенциалом переноса неорганического фосфата, чем АТР. Данные соединения (ацетилфосфат, креатинфосфат, фосфоенолпируват, 1,3-дифисфоглицерат, карбамоилфосфат и некоторые другие) также
содержат макроэргические связи и называются макроэргическими соединениями.
Основным признаком макроэргической связи является то, что при ее расщеплении или новообразовании изменение уровня свободной энергии составляет гораздо большую величину (в среднем 25—50 кДж/моль), чем при преобразовании нормальной связи (порядка 12,5 кДж/моль). Макроэргические
связи представлены в основном сложноэфирными связями, в том числе тиоэфирными, ангидридными (как в молекуле АТР) и фосфоамидными. Практически все известные макроэргические соединения содержат по месту локали130
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
зации данных связей атомы серы и фосфора. Аденозиндифосфат, как кофактор киназ, представляет собой подвижный переносчик фосфатной группы и
может быть отнесен к коферментам.
Некоторые ферменты используют в качестве переносчиков фосфатных
групп другие нуклеозиддифосфаты — GDP, UDP или CDP, однако такие реакции встречаются нечасто.
7.3. Переносчики карбоксильных групп
Реакции карбоксилирования—декарбоксилирования и транскарбоксилирования осуществляются с участием ферментов, многие из которых нуждаются в посредстве биотина. Биотин (витамин Н) служит простетической группой ферментов и связывается с их белковой частью ковалентно через eаминогруппу лизина (рис. 7.7). Гетероциклическая часть молекулы биотина
состоит из имидазольного (И) и тиофенового (Т) циклов, а боковая цепь
представлена остатком валериановой кислоты. Активной формой биотинакофактора служит N5-карбоксибиотин («актив-ный карбоксил»).
Биотинсодержащие ферменты принимают участие в процессах фиксации
углекислоты, биосинтеза липидов, аминокислот, углеводов, нуклеиновых кислот и других веществ. При этом роль биотина состоит в осуществлении сопряжения расщепления АТР с карбоксилированием: на первой стадии происходит присоединение бикарбоната (НСО3-) или СО2 к биотину с образованием
карбоксибиотина, для чего и необходим гидролиз АТР. На второй стадии
карбоксибиотин передает карбоксильную группу субстрату, выполняя роль
своеобразной «подвижной руки» в составе ферментного комплекса.
Известен только один биотинсодержащий фермент, который для катализа
не требует участия АТР — карбокситрансфераза пропионовокислых бактерий. Но и в этом случае роль переносчика карбоксильной группы играет биотин.
O
O
C
C
O
HO
N
HN
H2C
HC
NH
И
HC
CH
Т
S
NH
И
C
Остаток валериановой
кислоты
H2C
CH
Т
S
CH2
CH
CH2
CH2
CH2
фермент
O
CH
(CH2)4
C N ...лизин
O
H
C
OH
Биотин
« Активный
карбоксил »
Рис. 7.7. Структура биотина и «активного карбоксила»
7.3. Переносчики ацильных групп
131
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Незаменимым кофактором переноса ацильных остатков в клетках является коэнзим А (СоА), который еще называют коферментом А. Это соединение служит коферментом не менее 80 известных ацилпереносящих ферментов, принимающих участие в цикле трикарбоновых кислот, b-окислении
жирных кислот, брожении некоторых типов, обмене углеводов и во множестве других жизненно важных процессов.
В составе молекулы коэнзима А присутствует витамин В3 (пантотеновая
кислота) (рис. 7.8), составными частями которого являются пантоевая кислота и b-аланин. Реакционноспособной группой коэнзима А служит сульфгидрильная (SH-) группа, расположенная на конце длинной, относительно гибкой
цепи. По этой группе с помощью тиоэфирной связи и осуществляется присоединение ацильных остатков. Образующиеся в результате производные носят
название ацил-СоА.
Простейшим ацильным производным является ацетил-СоА (рис. 7.8). Это
соединение характеризуется высоким потенциалом переноса ацетильной
группы, что подтверждается большой отрицательной величиной изменения
свободной энергии (DGo) для реакции гидролиза ацетил-СоА:
NH2
O
R
C
O
S
CoA
H3C
Ацил-СоА
N
C
S
N
CoA
N
Ацетил-СоА
CH2
N
O
O
O
P
Остаток пантоевой
кислоты
Остаток тиоламина
-O
CH2
CH2
NH
CO
CH2
CH2
NH
CO
CH
C
OH
CH3
O
H
OH
O
P(OH)2
O
O
CH3
HS
H
H
O
P
Остаток аланина
O-
H
CH2
Остаток 3'-фосфоаденозин-5'-дифосфата
Остаток пантотеновой кислоты
(витамин В3)
)
Коэнзим А (3'-фосфо- ADP-пантоил- b-аланил-цистеамин
Рис. 7.8. Структура коэнзима А и его производных. В пунктирном контуре заключена активная сульфгидрильная группа
132
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Ацетил-СоА + Н2О « Ацетат + СоА + Н+
DGo = -31,4 кДж/моль
Коэнзим А является подвижным кофактором и в процессе переноса
ацильных остатков взаимодействует с разными ферментами. Кроме него, в
клетках присутствует другой распространенный кофактор, переносящий
ацильные остатки — фосфопантетеин (рис. 7.9). Фосфопантетеин ковалентно
(через остаток серина) связан с ацилпереносящим белком, принимающим
участие в биосинтезе жирных кислот. Таким образом, данный кофактор является простетической группой белков. Его функции аналогичны функциям
СоА.
Связанный фосфопантетеин обнаружен также в цитрат-расщепляющем
ферменте и в ферментах, участвующих в синтезе пептидных антибиотиков.
O
CH3
HS
CH2
CH2
NH
CO
CH2
CH2
NH
CO
CH
C
OH
CH3
CH2
O
P
OH
С помощью этой связи
фосфопантетеин присоединяется к ферменту
Фосфопантетеин
Рис. 7.9. Структура фосфопантетеина
133
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Часть третья. МЕТАБОЛИЗМ.
ПРОЦЕССЫ, ПРИВОДЯЩИЕ К ЗАПАСАНИЮ ЭНЕРГИИ
Глава 8. ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
Под метаболизмом обычно подразумевают обмен веществ и энергии,
происходящие в клетках. В этом высоко интегрированном процессе можно
различить две составляющие: катаболизм и анаболизм, которые тесно
взаимосвязаны и не осуществимы друг без друга. В ходе катаболитных реакций происходит расщепление более сложных и разнообразных веществ на
более простые (строительные блоки), число которых довольно ограничено.
В большинстве случаев эти процессы сопровождаются окислением веществ,
поэтому результатом таких реакций является образование восстановительных
эквивалентов. Кроме того, в процессе катаболизма выделяется свободная
энергия, которая может быть запасена в макроэргических связях АТР.
Реакции, относящиеся к анаболизму, имеют обратную направленность. В
них из строительных блоков синтезируются удивительные по разнообразию
сложные вещества, спектр которых специфичен для клеток разных организмов или органов (тканей) многоклеточного организма. Процессы биосинтеза
требуют притока энергии, а также восстановительных эквивалентов, поскольку синтезируемые сложные вещества, как правило, характеризуются меньшей
степенью окисленности, чем их предшественники. При этом происходит регенерация окисленных форм переносчиков восстановительных эквивалентов.
Часто выделяют еще одну (промежуточную) составляющую метаболизма — амфиболизм, под которым подразумевают реакции цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). В ходе амфиболизма осуществляются превращения, приводящие, с одной стороны, к полному окислению веществ до углекислоты и
воды, что сопровождается выделением энергии и образованием восстановительных эквивалентов, а с другой — к формированию промежуточных веществ, используемых в качестве субстратов при биосинтезе.
Таким образом, реакции катаболизма функционируют по принципу воронки, а реакции анаболизма — по принципу перевернутой воронки
(рис. 8.1). Но во времени и те, и другие могут быть не разделены, а осуществляться синхронно, чему немало способствует их разная локализация в эукариотических клетках.
Сложные органические вещества, используемые клетками в качестве питательных субстратов, чаще всего представлены полисахаридами, бел-
134
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 8.1. Взаимосвязь реакций катаболизма и анаболизма
ками и липидами. При их расщеплении формируются в основном гексозы и
пентозы, 20 типов аминокислот, несколько преобладающих жирных кислот и
глицерол. Эти молекулы сами могут использоваться в виде субстратов для
биосинтеза либо подвергаются дальнейшему расщеплению, связанному с высвобождением энергии. Большинство из них способно превращаться в пировиноградную кислоту и ацетил-СоА — ключевые промежуточные соединения, субстраты разного рода брожений и ЦТК.
Характеризуя представленную на рис. 8.1 схему, можно различить еще
две грани метаболизма: конструктивный и энергетический метаболизм.
Под конструктивным метаболизмом понимают взаимопревращения веществ,
связанные с разрушением и образованием химических связей, протекающие с
участием ферментов. Энергетический метаболизм —это взаимопревращения
энергии в клетке, осуществляющиеся в основном благодаря действию сопрягающих агентов, таких, как наиболее распространенный переносчик фосфатных групп — ADP (глава 7). Конструктивный и энергетический метаболизм
также тесно связаны друг с другом.
Важной особенностью метаболизма является его универсальность: у
большинства живых существ главные метаболические пути сходны, а закономерности запасания энергии при субстратном, окислительном и фотофосфорилировании — едины. В результате многообразные варианты превращения веществ у разных организмов можно свести к общей схеме. Общим так135
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
же является то, что метаболические превращения осуществляются с участием
ферментов, поэтапно (с образованием промежуточных продуктов —
метаболитов), в ходе обмена многоатомными группировками, а не поатомной сборки.
Метаболический процесс можно рассматривать как стройную систему
химических реакций, в которой существует строгое соподчинение, благодаря
наличию регулирующих механизмов. Именно сложная регуляция метаболизма, осуществляющаяся на нескольких уровнях, позволяет координировать
скорость процессов катаболизма и анаболизма, сопрягая ее с меняющимися
условиями окружающей среды.
136
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 9. КАТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ
Процессы расщепления сложных питательных веществ происходят в
клетках через ряд последовательных ферментативных реакций, которые
можно объединить в три стадии. На первой стадии полимерные молекулы
расщепляются до мономеров (глава 8). Мономеры (гексозы, пентозы, аминокислоты, жирные кислоты, глицерол) на второй стадии катаболизма превращаются в еще более простые и меньшие по размеру молекулы, среди которых
преобладают: пируват, ацетил-СоА, a-кетоглутарат, оксалоацетат, сукцинат,
фумарат. Наконец, на третьей стадии эти строительные блоки могут в аэробных клетках вступать в цикл трикарбоновых кислот, где происходит их окончательное окисление до СО2 и Н2О. На второй и третьей стадиях выделяется
свободная энергия, и формируются восстановительные эквиваленты. Последние могут поступать в дыхательную цепь, где на уровне окислительного фосфорилирования запасается большое количество энергии в форме макроэргических связей АТР.
В анаэробных условиях строительные блоки, сформировавшиеся на 2-й
стадии, могут подвергаться брожению различного типа. При этом образуются
продукты брожения (в основном органические кислоты, спирты, СО2), которые выводятся из клетки. Только в некоторых химических реакциях в ходе
брожения запасается энергия (используется механизм субстратного фосфорилирования).
В данной главе будут рассмотрены основные катаболические процессы,
приводящие к высвобождению большого количества свободной энергии: bокисление жирных кислот и катаболизм гексоз. Именно названные субстраты
обеспечивают клеткам наиболее высокий уровень метаболизма, являясь универсальными источниками энергии и углерода. Кроме этого, многие клетки
способны осуществлять окислительное расщепление аминокислот (данный
процесс будет рассмотрен в главе «Метаболизм азотсодержащих соединений»), а также использовать в качестве субстратов менее распространенные и
даже уникальные химические соединения.
9.1. Окисление жирных кислот
Биологическое окисление жирных кислот можно сопоставить со сгоранием углеводородов: как в одном, так и в другом случае наблюдается наибольший выход свободной энергии. При биологическом b-окислении углеводородной части жирных кислот образуются двууглеродные активированные
компоненты, доокисляющиеся в ЦТК, и большое количество восстановительных эквивалентов, которые приводят к синтезу АТР в дыхательной цепи.
137
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Большинство аэробных клеток способно к полному окислению жирных кислот до углекислого газа и воды.
Источником жирных кислот служат экзогенные или эндогенные липиды.
Последние чаще всего представлены триацилглицеридами, которые откладываются в клетках в качестве резервного источника энергии и углерода. Кроме
этого, клетки используют и полярные липиды мембран, метаболическое обновление которых происходит постоянно. Липиды расщепляются с помощью
специфических ферментов (липазы) до глицерола и свободных жирных кислот.
b-окисление жирных кислот. Этот основной процесс окисления жирных
кислот осуществляется у эукариот в митохондриях. Переносу жирных кислот
через мембраны митохондрий способствует карнитин (g-триметиламино-bоксибутират), который связывает молекулу жирной кислоты особым образом,
в результате чего положительный (на атоме азота) и отрицательный (на атоме
кислорода карбоксильной группы) заряды оказываются сближенными и нейтрализуют друг друга.
После транспорта в матрикс митохондрий жирные кислоты подвергаются
активации с помощью СоА в АТР-зависимой реакции, которую катализирует
ацетат-тиокиназа (рис. 9.1). Затем ацил-СоА-производное окисляется с участием ацил-дегидрогеназы. В клетке существует несколько разных ацилдегидрогеназ, специфичных к СоА-производным жирных кислот с разной
длиной углеводородной цепи. Все эти ферменты используют FAD в качестве
простетической группы. Образующийся в реакции FADH2 в составе ацилдегидрогеназы окисляется другим флавопротеидом, переносящим электроны
к дыхательной цепи в составе митохондриальной мембраны.
Продукт окисления — еноил-СоА гидратируется под действием еноилгидратазы с образованием b-гидроксиацил-СоА (рис. 9.1). Существуют еноил-СоА-гидратазы, специфичные к цис- и транс-формам еноил-СоАпроизводных жирных кислот. При этом транс-еноил-СоА гидратируется стереоспецифически в L-b-гидроксиацил-СоА, а цис-изомеры — в Dстереоизомеры -b-гидроксиацил-СоА-эфиров.
Последний этап реакций b-окисления жирных кислот представляет собой
дегидрирование L-b-гидроксиацил-СоА (рис. 9.1). Окислению подвергается
b-углеродный атом молекулы, поэтому и весь процесс носит название bокисления. Катализирует реакцию b-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназа, специфичная только к L-формам b-гидроксиацил-СоА. Этот фермент использует
в качестве кофермента NAD. Дегидрирование D-изомеров b-гидроксиацилСоА осуществляется после дополнительной стадии изомеризации их в L-bгидроксиацил-СоА (фермент b-гид-роксиацил-СоА-эпимераза). Продукт данного этапа реакций представляет собой b-кетоацил-СоА, легко расщепляющийся тиолазой на 2 производных: ацил-СоА, который короче исходного активированного субстрата на 2 углеродных атома, и ацетил-СоА —
двууглеродный компонент, отщепленный от жирнокислотной цепи (рис. 9.1).
Ацил-СоА-производное подвергается следующему циклу реакций bокисления, а ацетил-СоА может вступать в цикл трикарбоновых кислот для
дальнейшего окисления.
138
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
O
R CH2
CH2
Жирная кислота
O
+ ATP; + CoA
C
Ацетаттиокиназа
OH
R CH2
CH2 C S
Ацил-СоА
FAD
CoA + AMP + PPi
Ацил-СоАдегидрогеназа
Дегидрирование
FADH2
O
R CH
Последовательность
реакций bокисления
Гидратация
CH C S
Еноил-СоА
+ H2O
CoA
Еноилгидратаза
O
R CH
CH2
C
S
CoA
OH
b-Гидроксиацил-СоА
NAD+
b- ГидроксиацилДегидрирование
дегидрогеназа
O
NADH
R C S CoA
O
O
Ацил-СоА
+ СоА
CH2 C S CoA
R
C
+
b- КетоO
b- Кетоацил-СоА
тиолаза
CH3 C S CoA
Ацетил-СоА
Рис. 9.1. Процесс b-окисления жирных кислот. R-углеводородная часть молекулы жирной кислоты
Таким образом, каждый цикл b-окисления жирных кислот сопровождается отщеплением от субстрата двууглеродного фрагмента (ацетил-СоА) и двух
пар атомов водорода, восстанавливающих 1 молекулу NAD+ и одну молекулу
FAD. Процесс продолжается до полного расщепления жирнокислотной цепи.
Если жирная кислота состояла из нечетного числа атомов углерода, то bокисление завершается образованием пропионил-СоА, который в ходе нескольких реакций превращается в сукцинил-СоА и в таком виде может вступать в ЦТК.
Большинство жирных кислот, входящих в состав клеток животных, растений и микроорганизмов, содержит неразветвленные углеводородные цепи.
В то же время в липидах некоторых микроорганизмов и в восках растений
присутствуют жирные кислоты, чьи углеводородные радикалы имеют точки
139
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ветвления (обычно в виде метильных групп). Если ветвлений немного, и все
они приходятся на четные положения (у углеродных атомов 2, 4 и т. д.), то
процесс b-окисления происходит по обычной схеме с образованием ацетил- и
пропионил-СоА. Если же метильные группы расположены у нечетных атомов
углерода, процесс b-окисления блокируется на стадии гидратирования. Это
следует учитывать при производстве синтетических детергентов: чтобы обеспечить их быструю и полную биодеградацию в окружающей среде, надо к
массовому потреблению допускать лишь варианты с неразветвленными углеводородными цепями.
Окисление ненасыщенных жирных кислот. Этот процесс осуществляется с соблюдением всех закономерностей b-окисления. Однако большинство
природных ненасыщенных жирных кислот имеет двойные связи в таких местах углеводородной цепи, что последовательное удаление двууглеродных
фрагментов с карбоксильного конца дает ацил-СоА-производное, у которого
двойная связь находится в положении 3—4. К тому же двойные связи природных жирных кислот имеют цис-конфигурацию. Чтобы смогла осуществиться стадия дегидрирования с участием b-гидроксиацил-СоАдегидрогеназы, специфичной к L-формам b-гидроксиацил-СоА, необходима
дополнительная стадия ферментативной изомеризации, в ходе которой двойная связь в молекуле СоА-производного жирной кислоты перемещается из
положения 3—4 в положение 2—3 и изменяется конфигурация двойной связи
из цис- в транс-. Такой метаболит служит субстратом еноил-гидратазы, превращающей транс-еноил-СоА в L-b-гидроксиацил-СоА.
В тех случаях, когда перенос и изомеризация двойной связи оказываются
невозможными, такая связь восстанавливается при участии NADPH. Последующая деградация жирной кислоты происходит по обычному механизму bокисления.
Второстепенные пути окисления жирных кислот. b-Окисление представляет собой основной, но не единственный путь катаболизма жирных кислот. Так, в клетках растений обнаружен процесс a-окисления жирных кислот, содержащих в составе 15—18 атомов углерода. Этот путь включает
первичную атаку жирной кислоты пероксидазой в присутствии перекиси водорода, в результате чего карбоксильный углерод отщепляется в виде СО2, а
атом углерода в a-положении окисляется до альдегидной группы. Затем альдегид окисляется при участии дегидрогеназы в высшую жирную кислоту, и
процесс повторяется снова (рис. 9.2). Однако этот путь не может обеспечить
полного окисления. Он используется лишь для укорочения цепей жирных кислот, а также в качестве обходного пути, когда b-окисление оказывается заблокированным из-за присутствия боковых метильных групп. Процесс не
требует участия СоА и не сопровождается образованием АТР.
Некоторые жирные кислоты могут также подвергаться окислению по wуглеродному атому (w-окисление). В этом случае СН3- группа подвергается
гидроксилированию под действием монооксигеназы, в ходе которого возникает w-оксикислота, которая затем окисляется до дикарбоновой кислоты. Дикарбоновая кислота может укорачиваться с любого конца посредством реакций b-окисления.
140
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
O
R CH2
CH2
C
Жирная кислота
OH
O
+ 2H2O2
R CH2
Пероксидаза
жирных кислот
C
Альдегид
+ H2O
NADP+
+ CO2 + 3H2O
H
Альдегиддегидрогеназа
NADPH
O
R CH2
C
OH
Жирная кислота
(укорочена на один
атом углерода)
Рис. 9.2. Процесс a-окисления жирных кислот
Подобным образом в клетках микроорганизмов и некоторых тканей животных происходит расщепление насыщенных углеводородов. На первой стадии с участием молекулярного кислорода происходит гидроксилирование
молекулы с образованием спирта, который последовательно окисляется в
альдегид и карбоновую кислоту, активируется присоединением СоА и вступает в путь b-окисления.
9.2. Катаболизм углеводов
Основными источниками углерода и энергии, а значит, и пищевыми субстратами для большинства организмов (исключая растения) служат углеводы.
Среди них на планете в наибольшей мере распространены целлюлоза, ее производные и крахмал. Кроме этих полисахаридов, большое значение имеют
гликоген, инулин, хитин, ксиланы, пектиновые вещества и др. Большинство
перечисленных полисахаридов расщепляется при участии специфических
ферментов на моносахариды, среди которых преобладают гексозы и пентозы.
Зачастую расщепление поли- и олигосахаридов осуществляется при участии
ферментов фосфорилаз, и тогда образованные продукты оказываются фосфорилированными.
Особенностью сахаров является наличие при каждом атоме углерода атома кислорода, что делает возможным химическую атаку этих субстратов
практически в любой точке молекулы. Кроме того, моносахариды и в первую
очередь их фосфорилированные формы способны к изомеризации: карбонильные группы, атомы водорода могут легко перемещаться в соседнее положение или изменять свое пространственное положение в молекуле с помощью изомераз. Таким образом, появляется возможность перехода от любой
гексозы или пентозы к любой другой, изомерной ей. По этой причине, несмотря на многообразие и сложность процессов обмена углеводов, можно
141
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
выделить несколько типичных путей их превращения, в частности катаболизма, имеющих выраженные отличительные особенности. Такими путями
служат: гликолиз, пентозофосфатные пути и путь Энтнера—Дудорова.
К закономерностям катаболизма моносахаридов относится обязательная
начальная стадия активации свободных моноз, которая осуществляется в ходе
фосфорилирования. В результате образуются фосфорные эфиры моносахаридов, способные вступать в дальнейшие превращения.
Гликолиз. Этот способ катаболизма сахаров называют иначе фруктозо1,6-дифосфатным путем (по названию ключевого соединения) или путем Эмбдена—Мейергофа—Парнаса (по именам его исследователей).
Гликолиз считается наиболее универсальным и самым выгодным с энергетической точки зрения путем катаболизма гексоз. Процесс открыт в 1897 г.
братьями Бухнерами, и его название происходит от двух греческих корней:
glicos — сахар и lysis — растворять. В ходе гликолиза происходит не требующее участия молекулярного кислорода многоэтапное превращение гексоз
в пируват, что сопровождается образованием АТР и восстановительных эквивалентов.
Реакции гликолитического пути осуществляются в цитозоле. Все промежуточные соединения имеют фосфорилированную форму. Для запасания
энергии используется механизм субстратного фосфорилирования.
Превращение глюкозы в пируват (рис. 9.3) требует участия десяти ферментов и осуществляется в ходе следующих стадий: подготовка к разрыву
гексозной цепи, разрыв цепи и образование глицеральдегид-3-фосфата, первое и второе субстратное фосфорилирование.
Процесс начинается с фосфорилирования глюкозы (активация молекулы)
с участием АТР (донор фосфатной группы) и фермента гексокиназы. Образующийся глюкозо-6-фосфат в следующей реакции изомеризуется глюкозофосфатизомеразой во фруктозо-6-фосфат, который претерпевает второе фосфорилирование за счет АТР с образованием фруктозо-1,6-дифосфата.
Фруктозо-1,6-дифосфат является ключевым промежуточным продуктом
гликолитического пути: именно данное соединение отличает гликолиз от других путей катаболизма сахаров. Кроме того, на уровне этого вещества осуществляется регуляция скорости всего процесса гликолиза. Активность катализирующего данную реакцию фермента (фосфо-фруктокиназы) ингибируется
высокими концентрациями АТР, при этом снижается сродство фосфофруктокиназы к субстрату — фруктозо-6-фосфату. Кроме того, фосфофруктокиназа
ингибируется цитратом —ранним промежуточным продуктом цикла трикарбоновых кислот. Известна и активация фосфофруктокиназы: ее осуществляют
ADP и неорганический фосфат. Таким образом, фосфофруктокиназа наиболее
активна в условиях, когда в клетке мало АТР (много ADP) и недостает строительных блоков.
На следующем этапе гликолиза фруктозодифосфат расщепляется с участием фруктозодифосфатальдолазы на два триозофосфата: дигидроксиацетонфосфат и глицеральдегидтрифосфат. Эти продукты представляют собой
изомеры и легко переходят один в другой под действием триозофосфатизомеразы. Однако направление этой реакции сдвинуто в
142
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2OH
CH2O P
O
O
Глюкозофос фатизомераза
Гексокиназа
OH
P OH2C
CH2OH
O
HO
OH
OH
OH
HO
ATP
ADP
OH
Глюкоза
OH
HO
OH
Фруктозо-6-фосфат
OH
Глюкозо-6-фосфат
ATP
Триозофосфатизомераза
Фосфофруктокиназа
H
O
C
H
C
C
OH
H
P OH2C
O
Дигидроксиацетонфосфат
HO
OH
OH
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
OH
Глицеральдегид+
S ФЕРМЕНТ NAD
C
3-фосфатдегидрогеназа
C OH
O
~ ФЕРМЕНТ
S
C
H
CH2 O P
Субстрат-ферментный
комплекс
CH2O P
O
Фруктозодифос фатальдолаза
CH2OH
CH2 O P
Глицеральдегид3-фосфат
H
ADP
O P
CH2
+
OH
C
+
NAD
P
O
CH2
NADH
Pi
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
SH-ФЕРМЕНТ
O
H
Фосфоглице ратмутаза
O
C
OH
Фосфоглицераткиназа
C
C
OH
H
C
CH2 O P
3-Фосфоглицерат
CH2 O P
1,3-Дифосфоглицерат
O
O
H
ADP
ATP
~P
O
OH
C
OH
C
O
Енолаза
P
CH2OH
2-Фософглицерат
Н2О
O
C
OH
C
O
~
Пируваткиназа
P
СН 2
Фосфоенолпируват
ADP
ATP
C
OH
C
O
CH3
Пируват
Рис. 9.3. Гликолитический путь катаболизма гексоз. Зигзагообразными линиями обозначены макроэргические химические связи
сторону образования глицеральдегид-3-фосфата, поскольку он все время выводится из реакционной смеси, претерпевая дальнейшие превращения. Глицеральдегид-3-фосфат служит субстратом первого субстратного фосфорили143
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
рования.
В ходе оставшихся этапов гликолиза, в отличие от предыдущих, энергия
выделяется и запасается в форме АТР. Одной из подобных реакций является
окисление глицеральдегид-3-фосфата. Фермент, катализирующий данную
реакцию (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), использует в качестве
кофермента NAD и характеризуется содержанием большого количества
сульфгидрильных групп (SH-групп). Окисление начинается со связывания
глицеральдегид-3-фосфата с SH-группой фермента — формируется субстратферментный комплекс. Далее фермент катализирует перенос водорода с субстрата на NAD+ , и восстановленный кофермент отделяется. Реакция дегидрирования и служит окислительной реакцией, поставляющей энергию: возникает комплекс фермента с ацильным остатком (тиоэфир), богатый энергией.
Затем осуществляется фосфоролиз — перенос остатка глицеральдегид-3фосфата совместно с макроэргической связью на фосфорную кислоту, что
приводит к образованию 1,3-дифосфоглицериновой кислоты и исходной
формы фермента. 1,3-Дифосфоглицерат представляет собой смешанный ангидрид фосфорной и карбоновой кислот и имеет высокий потенциал переноса
фосфатной группы. Богатая энергией фосфатная группа переносится с 1,3дифосфоглицерата на ADP с участием фосфоглицераткиназы и образованием
продуктов: 3-фосфоглицерата и АТР. Так осуществляется первое субстратное
фосфорилирование в гликолизе.
Заключительный этап гликолиза — второе субстратное фосфорилирование — начинается со внутримолекулярной перестройки, в ходе которой 3фосфоглицерат изомеризуется в 2-фосфоглицерат (фермент фосфоглицератмутаза). 2-Фосфоглицерат дегидратируется в фосфоенолпируват при участии
енолазы. В результате этой реакции образуется соединение, характеризующееся высоким потенциалом переноса фосфатной группы, таким образом,
отщепление молекулы воды от 2-фосфоглицерата сопровождается перераспределением энергии внутри молекулы, и фосфатная связь у 2 атома углерода
превращается из низко- в высокоэнергетическую. Последняя реакция гликолиза катализируется пируваткиназой, и в ходе нее фосфатная группа переносится на молекулу ADP и образуется конечный продукт пути — пируват.
Гликолитическое расщепление одной молекулы глюкозы приводит к образованию 4 молекул АТР (по две на каждую молекулу глицеральдегид-3фосфата), из которых 2 расходуются на образование фруктозодифосфата. Таким образом, запасается всего 2 молекулы АТР. Кроме того, на одну молекулу глюкозы в этом процессе запасается 2 молекулы NADH (при окислении 2
молекул глицеральдегид-3-фосфата). Баланс гликолиза выглядит следующим
образом:
1 С6Н12О6 ® 2 С3Н4О3 + 2 АТР + 2NADH
Гликолитический процесс служит клетке для запасания энергии и восстановительных эквивалентов, а также является поставщиком «строительных
блоков» в виде трехуглеродного, частично окисленного соединения —
пировиноградной кислоты и некоторых промежуточных продуктов, в частности глицеральдегид-3-фосфата.
144
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Пентозофосфатные пути. Эти пути катаболизма сахаров довольно
разнообразны. В зависимости от условий и видовой принадлежности организма результатом данных процессов могут быть различные вещества. Осуществление реакций пентозофосфатных путей в обратном направлении используется клетками при фиксации СО2. Основной отличительной особенностью путей является образование в качестве промежуточных соединений пятиуглеродных сахаров, а также последовательное отщепление от 6углеродного фосфорилированного сахара по одному атому углерода, который
высвобождается в среду в виде СО2.
Пентозофосфатные пути (иначе, схема Варбурга—Диккенса—Хореккера,
гексозомонофосфатный шунт, фосфоглюконатный путь) реализуются организмами реже, чем гликолиз, и обнаруживаются чаще всего в клетках бактерий.
После традиционной реакции активации глюкозы в ходе фосфорилирования образованный глюкозо-6-фосфат подвергается дегидрированию. Данную
реакцию катализирует глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, а восстановительные
эквиваленты акцептирует ее кофермент — NADP+. Образуется 6фосфоглюконолактон (рис. 9.4). Данное соединение подвергается гидролизу
(раскрытие кольца) с участием глюконолактоназы, а образованная 6фосфоглюконовая кислота претерпевает второе дегидрирование (фосфоглюконатдегидрогеназа), после которого сразу же следует декарбоксилирование и
образуется рибулозо-5-фосфат. Рибулозо-5-фосфат изомеризуется в два пятиуглеродных сахара — ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат (рис. 9.4).
Следующий этап пентозофосфатных путей представляет собой многократные межмолекулярные перестройки и изомеризацию промежуточных
соединений, формирующихся из рибулозо-5-фосфата. Эти реакции направлены на образование 6-углеродного соединения (глюкозо-6-фосфата), которое
может снова подвергнуться окислению и декарбоксилированию. В результате
из 6 молекул рибулозо-5-фосфата получается 5 молекул глюкозо-6-фосфата
(рис. 9.5).
Система структурной перестройки сахаров включает два фермента —
транскетолазу и трансальдолазу, которые катализируют перенос двухуглеродных и трехуглеродных фрагментов, разрывая С—С-связи в двух положениях: по соседству с карбонильной (a) и у соседнего с карбонильной группой
углеродного атома (b) (на рис. 9.5 места, в которых связи подвергаются расщеплению, обозначены пунктирной линией).
При полном окислении глюкозы в пентозофосфатных путях молекула глицеральдегид-3-фосфата, образующаяся на конечном этапе, подвергается изомеризации с участием триозофосфатизомеразы в дигидроксиацетонфосфат, который
затем вступает в реакцию альдольной конденсации со второй молекулой глицеральдегид-3-фосфата, и образуется фруктозодифосфат. Данная реакция является
обратимой процессу расщепления фруктозодифосфата, которое имеет место в
гликолизе (рис. 9.3), а фермент фруктозодифосфатальдолаза катализирует и прямое, и обратное превращения. Молекула фруктозо-1,6-дифосфата дефосфорилируется с образованием фруктозо-6-фосфата (фермент фосфатаза), а он, в свою
очередь, изомеризуется в глюкозо-6-фосфат и возвращается к начальному этапу
дегидрирования.
145
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2O P
6
O
6
OH
OH
OH
OH
Глюкозо-6-фосфат
6-Фосфоглюконолактоназа
CH2O P
Глюкозо-6фосфатдегидрогеназа
O
O
OH
+ 6Н2О
+
6 NADP 6 NADPH OH
OH
6-Фосфоглюконолактон
O
HO
C
H
4 H
C
OH
6 NADPH
Эпимераза
CH2OH
CH2O P
Ксилулозо-5-фосфат
O
H
C
H
Изомераза
C OH
2 H
C
OH
H
C
OH
C
OH
6 HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
CH2O P
6-Фосфоглюконовая
кислота
+
6 NADP
CH2OH
C
COOH
H
C
O
6 H
C
OH
H
C
OH
6-Фосфоглюконатдегидрогеназа
+ 6 CO2
CH2O P
Рибулозо-5-фосфат
CH2O P
Рибозо-5-фосфат
Рис. 9.4. Образование и изомеризация рибулозо-5-фосфата в ходе пентозофосфатных путей. Поскольку из одной молекулы гексозы может образоваться 6 молекул СО2, для удобства подсчета баланса процесс
приведен на 6 молекул глюкозо-6-фосфата
Таким образом, на одну молекулу глюкозы при полном окислении в пентозофосфатных путях затрачивается 1 молекула АТР и образуется 6 молекул
СО2 и 12 молекул NADPH. Таким образом, основной задачей пентозофосфатных путей является обеспечение клетки NADPH, который используется в
процессах биосинтеза.
В ходе пентозофосфатных путей может и не происходить полного окисления глюкозы. В этом случае глицеральдегид-3-фосфат претерпевает иные
превращения, например подвергается реакциям субстратного фосфорилирования под действием ферментов гликолитического пути.
Большое значение пентозофосфатные пути имеют для биосинтетических
процессов: здесь образуются промежуточные соединения, играющие роль
146
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
предшественников многих веществ. В частности, эритрозо-4-фосфат используется бактериями и растениями для синтеза ароматических амиH
CH2OH
C
O
2 HO
C
H
H
C
OH
CH2OH
O
C
H
+
2
H
H
H
C OH Транскетолаза,
трансальдолаза
C OH
(ТК, ТА)
C OH
CH2O P
Рибозо-5-фосфат
Глицеральдегид-3-фосфат
В начало цикла,
на стадию
дегидрирования
2
C
H
OH
HO
Изомераза
2
O
C
H
C
OH +
H
C
H
H
C
OH
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
+
2
C
2H
C OH
ТК, ТА
2 HO
H
CH2O P
OH
O
H
C OH
H
C
CH2O P
O
C
O
C
H
C
OH
CH2O P
Ксилулозо-5-фосфат
OH
CH2O P
Эритрозо-4-фосфат
CH2OH
O
Глицеральдегид-3-фосфат
Изомераза,
альдолаза,
Изомераза
изомераза
2
OH
O
HO
H
CH2O P
Фруктозо-6-фосфат
HO
C
CH2O P
Фруктозо-6-фосфат
C
C
H
C
OH
CH2OH
H
H
ТК, ТА
CH2OH
OH
Глюкозо-6-фосфат
2
C
CH2O P
Седегептулозо-7-фосфат
CH2O P
O
HO
2
C OH +
CH2O P
CH2O P
Ксилулозо-5-фосфат
O
HO
C
2H
C
O
H
O
C
+
2
H
C OH
H
C
OH
CH2O P
Эритрозо-4-фосфат
CH2O P
O
OH
OH
OH
Глюкозо-6-фосфат
В начало цикла,
на стадию
дегидрирования
1
HO
OH
OH
OH
Глюкозо-6-фосфат
147
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 9.5. Превращения изомеров рибулозо-5-фосфата в ходе пентозофосфатных путей при полном окислении глюкозы (в расчете на 6 молекул
глюкозо-6-фосфата). Объяснения в тексте
нокислот. Рибозо-5-фосфат служит субстратом для синтеза азотистых оснований и некоторых аминокислот.
Путь Энтнера—Дудорова (2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный).
Этот процесс является еще одним способом катаболизма гексоз и представлен
в основном в клетках микроорганизмов. Особое значение данный путь имеет
для расщепления глюконата. Начальные стадии превращения глюкозо-6фосфата совпадают с таковыми для пентозофосфатных путей, вплоть до образования 6-фосфоглюконовой кислоты. Далее, однако, 6-фофоглюконат подвергается а не окислению, а реакции дегидратации, с участием фермента 6фосфоглюконат-дегидратазы. Образуется ключевое соединение данного пути — 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюко-нат. Стадия дегидратации осуществляется через образование промежуточного соединения (енола), который в результате таутомерного превращения переходит в 2-кето-3-дезокси-6фосфоглюконат (рис. 9.6).
Далее альдолаза катализирует расщепление ключевого соединения на пируват и глицеральдегид-3-фосфат. Последний может вступать в гликолитический путь и подвергаться дальнейшим превращениям.
148
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
COOH
CH2O P
O
Дегидрогеназа,
лактоназа
OH
OH
NADP+
HO
COOH
H
C
HO
C
OH Фосфоглюконатдегидрогеназа
H
H
C
OH
H
C
OH
NADPH
OH
Глюкозо-6-фосфат
C
OH
C
H
H
C
OH
H
C
OH
CH2O P
6-Фосфоглюконовая
кислота
Баланс
CH2O P
Енол
На 1 молекулу глюкозы:
COOH
2 молекулы пирувата
1 молекула NADPH,
1 молекула NADH,
1 молекула ATP
C
1
COOH
O
2C
O
H
3
H
O
H
4
OH
H
H
5
OH
CH3
Пируват
Альдолаза
C
COOH
C
O
CH3
Пируват
2ATP 2ADP
NADH NAD+ H
Гликолиз
C
OH
CH2O P
Глицеральдегид-3-фосфат
C
C
C
6
CH2O P
2-Кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат
Рис. 9.6. Путь Энтнера—Дудорова и сопряженные с ним процессы
Как следует из баланса пути Энтнера—Дудорова, этот процесс менее выгоден с энергетической точки зрения, чем гликолиз: на молекулу глюкозы
здесь запасается только 1 молекула АТР (из двух синтезированных одна тратится на фосфорилирование глюкозы).
Обзор основных катаболических путей позволяет увидеть, что расщепление «топливных» молекул при их неполном окислении сопровождается образованием двух основных метаболитов — пировиноградной кислоты и ацетилСоА. Данные вещества могут использоваться как в биосинтетических путях в
качестве «строительных блоков», так и подвергаться дальнейшим превращениям, обеспечивающим запасание клетками энергии. Поскольку в данном
разделе обсуждаются процессы, приводящие к запасанию энергии, следует
отметить, что судьба пирувата и ацетил-СоА зависит в первую очередь от
наличия молекулярного кислорода в клетке, а также от ее ферментативного
оснащения. Так, в клетках анаэробных микроорганизмов и тканей высших
организмов пируват и ацетил-СоА могут подвергаться различного рода брожениям, завершающим процессы катаболического расщепления субстратов.
В аэробных и факультативно-анаэробных клетках при наличии молекулярно149
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
го кислорода пируват может подвергаться процессу окислительного декарбоксилирования, и образующийся ацетил-СоА вступает в цикл трикарбоновых кислот, где осуществляется его полное окисление до СО2 и Н2О, а формирующиеся восстановительные эквиваленты поступают в дыхательную
цепь. Перечисленные процессы будут рассмотрены в следующих главах.
150
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 10. БРОЖЕНИЕ
Брожение со времен Пастера называют «Жизнью без воздуха». Этот тип
метаболизма возник на нашей планете одним из самых первых —еще в то
время, когда в атмосфере отсутствовал молекулярный кислород. Наиболее
древние обитатели Земли использовали этот самый примитивный и наименее
выгодный с энергетической точки зрения способ метаболизма для своей жизнедеятельности. В ходе эволюции возникли новые, более перспективные процессы запасания энергии, однако брожение по прежнему используется многими организмами, поскольку позволяет им осуществлять жизнедеятельность
в условиях отсутствия молекулярного кислорода.
Брожение происходит в клетках бактерий, дрожжей (для этих микроорганизмов брожение является преобладающим типом метаболизма), простейших, моллюсков, в некоторых тканях рыб и птиц, а также высших животных,
включая человека (мышцы, хрусталик и роговица глаза).
Известно большое разнообразие процессов брожения, которые отличаются друг от друга субстратами, продуктами, а также химическими превращениями. При этом можно различить несколько типов брожения, встречающихся наиболее часто: спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, муравьинокислое, маслянокислое, ацетоно-бутиловое. Свое название эти типы брожения
получили от доминирующих или характерных продуктов, которые образуются в результате определенной последовательности реакций. Нетрудно заметить, что среди продуктов преобладают органические кислоты и спирты. Субстратами для разных типов брожения служат также органические вещества — в большинстве случаев пируват, а также лактат, ацетил-СоА, некоторые
промежуточные метаболиты гликолитического пути, аминокислоты. Таким
образом, брожение можно определить как катаболический процесс, происходящий в условиях, не требующих участия молекулярного кислорода, в котором и донорами, и акцепторами электронов являются органические вещества.
Реакциям брожения всегда предшествуют предварительные этапы катаболизма субстратов: чаще гликолиз, реже — пентозофосфатные и фосфоглюконатный пути. Поэтому часто реакции собственно брожения рассматривают в
совокупности с предшествующими этапами, и в этом случае можно говорить
о запасании энергии в ходе таких процессов. Однако следует помнить, что
энергия в форме макроэргических связей АТР запасается в процессе субстратного фосфорилирования, как правило, еще до образования пирувата. В
процессах собственно брожения энергия запасается редко, и можно назвать
всего три реакции, в которых фосфорилируется ADP: образование масляной,
уксусной, а также ацетоуксусной кислот. В брожениях других типов дополнительного количества энергии не образуется, и их основной задачей является
150
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
регенерация окисленной формы переносчика восстановительных эквивалентов — NAD+. Это необходимо для бесперебойного осуществления реакций
гликолиза и других катаболических путей, в ходе которых, как известно, происходит расщепление субстратов, сопровождающееся их окислением, что
требует постоянного присутствия в клетке акцепторов восстановительных
эквивалентов — NAD+.
Рассмотрев более детально несколько типов брожения, можно убедиться в
том, что соблюдается эквивалентность между количеством молекул NADН,
образованных в ходе гликолиза, и числом молекул NAD+, сформировавшихся
в ходе собственно брожения (при условии, что в метаболизме не принимает
участие молекулярный кислород). Таким образом, в анаэробных условиях
использующие бродильный тип метаболизма клетки вынуждены тратить существенную часть двух-, трехуглеродных органических веществ для акцептирования водорода, выводя их затем из клетки. Этот крайне непроизводительный процесс приводит к тому, что в анаэробных условиях клетки перерабатывают огромные количества субстрата, чтобы извлечь нужное для жизнедеятельности количество энергии. Неслучайно у многих факультативноанаэробных микроорганизмов выработался механизм подавления процессов
брожения в аэробных условиях с переключением на дыхательный метаболизм. При дыхании из одной молекулы глюкозы клетка может извлечь максимально 38 молекул АТР, а при брожении — только 4 (в большинстве случаев всего 2).
10.1. Спиртовое брожение
Преобладающим продуктом спиртового брожения является этиловый
спирт. Этот тип брожения характерен для определенных видов дрожжей, бактерий, а также мицелиальных грибов. Известно 3 основных способа спиртового брожения, которые отличаются друг от друга тем, какой из трех катаболических путей расщепления глюкозы (и некоторых других сахаров) реализуется: гликолиз, пентозофосфатные пути либо путь Энтнера—Дудорова. Наиболее часто, как отмечалось выше, клетки используют гликолиз, и его конечный продукт — пируват чаще других служит субстратом спиртового брожения.
На рис. 10.1 представлены схемы двух способов спиртового брожения.
Первый способ предполагает катаболизм глюкозы по гликолитическому пути
(характерен для дрожжей и бактерий Sarcina ventriculi), а второй — по пентозофосфатному (гетероферментативные молочнокислые бактерии). Соответственно различаются участвующие в этих процессах ферменты и спектр продуктов. Третий способ спиртового брожения, который используют бактерии
Zymomonas mobilis, отличается тем, что глюкоза катаболизируется по пути
Энтнера—Дудорова. Образующийся пируват подвергается декарбоксилированию, как и в первом случае, и ступенчато восстанавливается в этанол.
Часть пирувата восстанавливается в молочную кислоту.
151
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
2ATP 2ADP
Гликолиз
Глюкоза
2 Пируват
Пируватдекарбоксилаза
4ADP 4ATP
2NAD
+
2NADH
2СО2
1
O
2 H3C
CH2OH
Этанол
2ATP 2ADP
2 H3C
Алкогольдегидрогеназа
C
H
Ацетальдегид
Пентозофосфатный путь
Глюкоза
Рибулозо-5-фосфат
СО2
NADP+
NADPH
NADP+
+
Фосфокетолаза
NADPH
H3C
CH2OH
Этанол
H3C
C
H
Ацетальдегид
O
C
O
O
H3C
Pi
C
H
OP
Ацетилфосфат
H
C OH
CH2O P
Глицеральдегид-3-фосфат
Стадии
гликолиза
2
2ADP
2ATP
O
C
OH
H C OH
CH3
Лактат
O
Лактатдегидрогеназа
NAD+
C
C
OH
O
NAD+
NADH
CH3
NADH Пируват
Рис. 10.1. Способы спиртового брожения: 1 — основанный на гликолитическом расщеплении глюкозы; 2 — основанный на пентозофосфатном пути. Показано только число образованных, но не затраченных молей АТР
На рис. 10.1 наглядно продемонстрировано, что количество затраченных в
ходе гликолиза и пентозофосфатного пути молекул NAD+ (NADP+) строго
соответствует количеству регенерированных в процессе спиртового брожения
молекул NAD+ (NADP+). При этом реакции субстратного фосфорилирования,
приводящие к синтезу АТР, имеют место только в катаболических путях до
152
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
образования пирувата. В реакциях собственно спиртового брожения, связанных с преобразованием пирувата в этанол или лактат, запасание энергии не
происходит.
Ход брожения очень сильно зависит от условий, в которых функционируют клетки. Кроме того, у некоторых микроорганизмов существуют отдельные
отклонения от приведенных выше классических схем спиртового брожения. В
результате спектр продуктов брожения может сильно различаться и включать
кроме этанола и лактата примеси: глицерол, ацетальдегид, другие альдегиды,
эфиры, кетоны, спирты, в том числе высшие органические кислоты и др.
10.2. Молочнокислое брожение
Данный тип брожения также широко распространен в природе и обнаружен у представителей разных царств живых существ: в первую очередь у
млекопитающих, у простейших, некоторых насекомых, бактерий семейства
Lactobacillaceae, в клетках некоторых тканей птиц и рыб.
Различают два основных типа молочнокислого брожения — гомо- и гетероферментативное. При гомоферментативном брожении до 90% состава конечных продуктов представлено молочной кислотой. Лишь небольшая часть
образованного в процессе гликолиза пирувата превращается в уксусную кислоту, этанол, ацетоин, а также СО2. Схема этого процесса представлена на
рис. 10.2. Обращает на себя внимание соотношение окисленных и восстановленных форм никотинамидных пере-носчиков: так же, как и в спиртовом
брожении, между ними сохраняется эквивалентность. Синтез АТР не осуществляется в реакциях собственно молочнокислого брожения, это происходит
еще до формирования пирувата, в гликолизе.
У микроорганизмов, осуществляющих гетероферментативное молочнокислое брожение (бактерии рода Lactobacillus, Leuconostoc mesenteroides),
отсутствуют ферменты гликолитического пути — альдолаза и триозофосфатизомераза. В клетках этих бактерий глюкоза катаболизируется с участием
пентозофосфатных путей, и субстратом брожения служит рибулозо-5-фосфат.
В этом случае реализуется 2-я схема брожения, представленная на рис. 10.1, а
среди продуктов брожения преобладают молочная кислота и этиловый спирт.
2ATP
Глюкоза
2ADP
Гликолиз
4ADP 4ATP
2NAD+
2NADH
2 Пируват
2 Лактат
Лактатдегидрогеназа
Рис. 10.2. Схема процесса гомоферментативного молочнокислого брожения
10.3. Реакции субстратного фосфорилирования
153
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Приведенные выше процессы наиболее распространенных типов брожения — спиртового и молочнокислого — позволяют выявить большое разнообразие способов и путей образования конечных продуктов.
(1)
1,3-Дифосфоглицерат
Фосфоглицераткиназа
3-Фосфоглицерат
ADP+Pi
ATP
Гликолиз
Пируваткиназа
(2)
Фосфоенолпируват
Пируват
ADP+Pi
(3)
ATP
ФосфотрансАцетатO
ацетилаза
киназа
H3C С O ~ P
H3C CO ~ SCoA
H3C COOH
Ацетил-СоА
Ацетат
Ацетилфосфат
Pi
CoA
ADP+Pi ATP
(4) Ацетоацетил-СоА
СоА-трансфераза
Pi
(5) H3C
(CH2)2 CO ~SCoA
Бутирил-СоА
Ацетоацетаткиназа
Ацетоацетат
Ацетоацетилфосфат
ADP+Pi
CoA
СоА-трансфераза
Pi
ATP
O
H3C
(CH2)2 С O ~ P
Бутирилфосфат
CoA
ADP+P i
Бутираткиназа
ATP
H3C (CH2)2 COO
Бутират
(6)
Сукцинаттиокиназа
OOC (CH2)2 CO ~SCoA
Сукцинил-СоА
GDP+Pi GTP
CoA
OOC
(CH2)2
COO
Сукцинат
Рис. 10.3. Реакции субстратного фосфорилирования
Как уже говорилось, существует еще не менее четырех основных типов
брожения. Важно отметить, что природа, спектр и относительные количества
154
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
конечных продуктов брожения того или иного типа зависят как от самого организма (его видовой принадлежности), так и от условий инкубирования (или
ситуации в клетке).
Таким образом, можно насчитать множество разнообразных химических
реакций, относящихся к собственно брожению либо к подготовительным стадиям (катаболические процессы расщепления углеводов). Но среди этого
множества лишь считанные реакции обеспечивают запасание энергии на
уровне субстратного фосфорилирования (рис. 10.3). При этом следует подчеркнуть, что две первые, из приведенных на рис. 10.3 реакций, осуществляются в процессе гликолиза, и только реакции 3—5 относятся к собственно
брожению. Синтез АТР при образовании ацетата, ацетоацетата и бутирата
(масляной кислоты) имеет место в маслянокислом и ацетоно-бутиловом брожении. Последняя, 6-я на рис. 10.3, реакция субстратного фосфорилирования
осуществляется в цикле трикарбоновых кислот.
155
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 11. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Продукты катаболизма углеводов, жирных кислот, аминокислот у большинства аэробных организмов (клеток) подвергаются полному окислению в
цикле трикарбоновых кислот (иначе — цикл лимонной кислоты, цикл Кребса). В этой системе замкнутых реакций образуются СО2, Н2О, запасается небольшое количество энергии на уровне субстратного фосфорилирования и
формируется большое количество восстановительных эквивалентов. Последние с помощью переносчиков попадают в дыхательную цепь и обусловливают там синтез АТР (окислительное фосфорилирование). Таким образом, основной задачей цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) является окончательное
окисление топливных молекул и улавливание восстановительных эквивалентов. Кроме этого, в ЦТК образуется ряд промежуточных продуктов, которые
используются в качестве субстратов для биосинтеза важных соединений
(аминокислот, порфиринов, глюкозы). Поэтому ЦТК рассматривают как
промежуточный или центральный тип метаболизма — амфиболизм (от греческого «амфи» — оба), связывающий между собой реакции катаболизма и
анаболизма.
Топливные молекулы вступают в ЦТК в виде активированного двууглеродного соединения — ацетил-СоА. В свою очередь, ацетил-СоА образуется
при окислении жирных кислот, расщеплении некоторых аминокислот и в ходе окислительного декарбоксилирования пирувата.
11.1. Окислительное декарбоксилирование пирувата
Как показано ранее (глава 9), основным продуктом катаболизма углеводов является пируват. Это трехуглеродное соединение образуется также при
окислении многих аминокислот. Для того чтобы пируват мог подвергнуться
дальнейшему окислению в ЦТК, он должен быть превращен в ацетил-СоА.
Этот весьма сложный процесс осуществляется с участием пируватдегидрогеназного комплекса, который включает три фермента и пять кофакторов.
Суммарное уравнение процесса окислительного декарбоксилирования пирувата выглядит довольно просто (рис. 11.1), однако механизм действия всех
компонентов пируватдегидрогеназного комплекса включает несколько стадий.
На первой стадии пируватдекарбоксилаза (называется также дегидрогеназой) с помощью своего кофактора — тиаминдифосфата катализирует декарбоксилирование пирувата с образованием оксиэтильного производного (—
СНОН—СН3), которое остается связанным с кофактором и ферментом. Затем
происходит перенос оксиэтильного остатка на молеку156
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H3C CO COOH + HSCoA
Пируват
Пируватдегидрогеназный
комплекс
NAD+
H3C CO ~ SCoA + СО2
Ацетил-СоА
NADH
Рис. 11.1. Суммарное уравнение процесса окислительного декарбоксилирования пирувата
лу липоевой кислоты, которая служит кофактором второго фермента комплекса — липоат-ацетилтрансферазы. Перенос завершается окислением
оксиэтильного остатка до ацетильной группы и частичным восстановлением
липоевой кислоты. На третьей стадии ацетильная группа переносится от липоевой кислоты на тиоловую группу коэнзима А, в результате чего ацетилСоА отделяется от комплекса и образуется полностью восстановленная форма
липоевой кислоты — дигидролипоевая кислота. Последняя стадия процесса
катализируется третьим ферментом —дигидролипоилдегидрогеназой, содержащей FAD в качестве простетической группы. Этот фермент катализирует окисление дигидролипоевой кислоты в липоевую с восстановлением FAD
до FADH2. Наконец, восстановительные эквиваленты от FADH2 передаются
на NAD+, который транспортирует их в дыхательную цепь.
Следует отметить, что в составе сформированного в процессе окислительного декарбоксилирования пирувата продукта — ацетил-СоА —появляется
макроэргическая связь (обозначена волнистой линией на рис. 11.1).
Активность пируватдегидрогеназного комплекса зависит от количества
АТР в клетке и регулируется с привлечением механизма ферментативной
модификации белка: АТР-зависимая протеинкиназа осуществляет фосфорилирование определенных аминокислотных остатков в пируватдекарбоксилазной субъединице, в результате чего фермент утрачивает активность. Обратное действие (восстановление активности пируватдекарбоксилазы) совершает
особая фосфатаза, которая дефосфорилирует белковую молекулу.
11.2. Химизм ЦТК
Реакции цикла трикарбоновых кислот осуществляются у эукариот в митохондриях — там же, где функционируют системы, поставляющие «топливо»
для ЦТК: b-окисление жирных кислот, окислительное декарбоксилирование
пирувата. Считается, что ферменты, принимающие участие в ЦТК, сгруппированы в особый каталитический комплекс, расположенный между внутренними мембранами митохондрий. Структура комплекса такова, что промежуточные продукты цикла последовательно переходят от одного фермента к
другому, не высвобождаясь в матрикс. В этом случае скорость процесса значительно увеличивается.
Все реакции ЦТК можно условно разделить на 4 стадии: 1) акцептирование ацетил-СоА и образование изоцитрата; 2) окислительное декарбоксилирование изоцитрата; 3) окислительное декарбоксилирование a-кетоглутарата;
157
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
4) регенерация акцептора ацетил-СоА.
Акцептором ацетил-СоА является оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота, ЩУК). Это четырехуглеродное соединение конденсируется с двухуглеродным компонентом ацетил-СоА при участии фермента цитратсинтетазы. Данная реакция альдольной конденсации протекает ступенчато, с образованием
промежуточного продукта — цитрил-СоА, гидролиз которого сдвигает направление реакции в сторону образования цитрата (рис. 11.2).
Чтобы могло осуществиться окислительное декарбоксилирование шестиуглеродного соединения, цитрат (лимонная кислота) должен изомеризоваться
в изоцитрат. Этот процесс катализируется аконитазой и представляет собой
реакцию дегидратации с последующей гидратацией.
Окислительное декарбоксилирование изоцитрата катализируется изоцитратдегидрогеназой, которая использует NAD в качестве кофермента. Изоцитрат окисляется в b-кетокислоту, оксалосукцинат, который быстро теряет карбоксил, будучи связанным с ферментом, и превращается в a-кетоглутарат
(рис. 11.3).
На третьей стадии (рис. 11.4) a-кетоглутарат также подвергается окислительному декарбоксилированию. Эту реакцию катализирует организованный
ансамбль ферментов — a-кетоглутарат-дегидрогеназный комплекс. Состав
ансамбля сходен с комплексом, катализирующим окислительное декарбоксилирование пирувата, и оба процесса имеют множество общих деталей. Продуктом реакции является четырехуглеродное активированное соединение —
сукцинил-СоА. Макроэргическая
O
O C
COO-
H2C COOОксалоацетат
O
+
H3C
Цитратсинтетаза
C ~ SCoA
H2C
HO
Ацетил-СоА
C ~ SCoA
C
COO-
H2C
COO-
Цитрил-СоА
+ Н2О
Цитратсинтетаза
H2C COOCOO- Аконитат- H2C COO- Аконитатдегидрогеназа
гидратаза
HO C COO- + HS-CoA
C COOН C COO+ Н2О
+ H+
H2C COOHO НС COOHC COOH2O
Изоцитрат
цис -Аконитат
Цитрат
H2C
Рис. 11.2. Первая стадия ЦТК: образование изоцитрата
связь сукцинильного тиоэфира расщепляется с участием сукцинаттиокиназы,
и это сопряжено с фосфорилированием GDP (у млекопитающих) или АТР (у
158
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
бактерий, высших растений). Образование высокоэнергетической связи GTP
или АТР при гидролизе сукцинил-СоА является единственным случаем субстратного фосфорилирования, который имеет место в ЦТК.
Образовавшийся на предыдущей стадии сукцинат (янтарная кислота) в
ходе нескольких реакций (окисление, гидратация, окисление) превращается в
оксалоацеат (рис. 11.5). Данная последовательность превращений представляет собой процесс b-окисления, который уже был рассмотрен по отношению
к жирным кислотам в главе 9. Реакции последней стадии ЦТК представляют
собой регенерирование оксалоацетата. Окисление сукцината катализирует
сукцинатдегидрогеназа. Этот фермент непосредственно связан с цепью переноса электронов, и в отличие от других ферментов ЦТК является интегральным белком внутренней мембраны митохондрий.
Продукт окисления сукцината — фумарат — гидратируется фумаразой.
Происходит стереоспецифическое присоединение водорода и гидроксила с
образованием L-малата (яблочной кислоты). Наконец, L-малат окисляется в
оксалоацетат малатдегидрогеназой.
Полностью циклическая система реакций ЦТК представлена на рис. 11.6.
Многие промежуточные вещества ЦТК служат предшественниками в биосинтетических реакциях. Например, оксалоацетат и a-кетоглутарат используются
в биосинтезе аминокислот. Оксалоацетат включается в процесс глюконеогенеза (образование глюкозы из неуглеH2C
COO-
НC
COOCOO-
HO НС
Изоцитрат
Изоцитратдегидрогеназа
NAD+
NADH
H2C
COO-
НC
COO-
Изоцитратдегидрогеназа
O C COOОксалосукцинат
COO-
H2C
CH2
СО2
O C COOa-Кетоглутарат
Рис. 11.3. Вторая стадия ЦТК: окислительное декарбоксилирование изоцитрата
H2C
COO-
a-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс
CH2
O C COO- NAD+ NADH CoA
a-Кетоглутарат
H2C
COO-
Сукцинаттиокиназа
H2C
COO-
CH2
H2C COOO C ~ SCoA GDP
CO2
GTP CoA Сукцинат
Сукцинил-СоА
Рис. 11.4. Третья стадия ЦТК: окислительное декарбоксилирование aкетоглутарата
159
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H2C
COO-
H2C COOСукцинат
FAD FADH2
COO-
H
Сукцинатдегидрогеназа
COO-
HO HC
C
Фумараза
C
+ Н 2О
H
OOC
Фумарат
H2C COOL-Малат
NAD +
Малатдегидрогеназа
NADH
O C
COO-
H2C COOОксалоацетат
Рис. 11.5. Заключительная стадия ЦТК: регенерирование оксалоацетата
Ацетил-СоА
Цитрат
цис-Аконитат
СоА
O
Оксалоацетат
-
H C COO
Глиоксилат
NADH
Изоцитратлиаза
+
Изоцитрат
Сукцинат
NAD+
NAD+
L-малат
NADH
Оксалосукцинат
СО2
Фумарат
FADH2
NADH NAD+
FAD
a-Кетоглутарат
СоА
Сукцинат
GTP
GDP
СО2
СоА
Сукцинил-СоА
Рис. 11.6. Цикл трикарбоновых кислот. Пунктирными линиями обозначены превращения глиоксилатного цикла
160
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
водных субстратов). Большинство углеродных атомов в порфиринах ведут
свое происхождение от сукцинил-СоА. Однако потребление промежуточных
продуктов ЦТК для целей биосинтеза обязательно должно сопровождаться их
восполнением, в противном случае цикл прервется. В норме между реакциями, за счет которых определенные промежуточные продукты удаляются из
цикла и, наоборот, поступают в цикл, существует состояние динамического
равновесия.
Восполняющие запас промежуточных продуктов ЦТК реакции носят название анаплеротических. Одной из основных анаплеротических реакций
клеток млекопитающих является карбоксилирование пирувата с образованием оксалоацетата. Катализирует это превращение аллостерический фермент — пируваткарбоксилаза. Его активатором служит субстрат ЦТК —
ацетил-СоА. В условиях накопления ацетил-СоА стимулируется активное
карбоксилирование пирувата и увеличивается количество оксалоацетата, который служит непосредственным акцептором ацетил-СоА.
В клетках бактерий и растений восполнение оксалоацетата осуществляет
другой фермент — фосфоенолпируват-карбоксилаза.
11.3. Баланс ЦТК
На рис. 11.6 показано, что каждый оборот цикла трикарбоновых кислот
сопровождается поступлением в него двух атомов углерода (в виде молекулы
ацетил-СоА) и выходом из него двух атомов углерода (в виде двух молекул
СО2). В молекуле СО2 достигается высшая степень окисленности углерода.
Окисление углерода сопровождается отщеплением от промежуточных
продуктов ЦТК четырех пар атомов водорода. Это сопровождается восстановлением 3 молекул NAD+ и 1 молекулы FAD, образуется 3 молекулы
NADH и 1 молекула FADH2. Регенерация окисленных форм переносчиков
восстановительных эквивалентов происходит в дыхательной цепи, где конечным акцептором электронов выступает молекулярный кислород. Поэтому
ЦТК функционирует только в аэробных условиях, несмотря на то что молекулярный кислород не принимает непосредственного участия в реакциях цикла.
Каждый оборот ЦТК обеспечивает запасание энергии на уровне субстратного
фосфорилирования: синтезируется одна молекула АТР (либо GTP).
Общая стехиометрия ЦТК:
Ацетил-СоА + 3NAD+ + FAD + ADP + Pi + 2H2O ®
® 2CO2 + 3NADH + FADH2 + ATP + 2H+ + CoA
11.4. Регуляция ЦТК
Скорость функционирования ЦТК регулируется на нескольких уровнях и
оказывается точно пригнанной к потребностям клетки. Основной реакцией,
лимитирующей интенсивность оборотов цикла, является окислительное декарбоксилирование изоцитрата. Изоцитратдегидрогеназа представляет собой
аллостерический белок, активируемый аденозиндифосфатом, который повы-
161
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
шает сродство фермента к субстратам. Ингибитором активности изоцитратдегидрогеназы служит NADH, который «вытесняет» из активного центра NAD+.
Другой фермент ЦТК — цитратсинтетаза — испытывает ингибирование
со стороны АТР: с увеличением содержания АТР в клетке снижается насыщение активного центра фермента ацетил-СоА и, как следствие, уменьшается
скорость образования цитрата.
Еще один фермент ЦТК — сукцинатдегидрогеназа изменяет свою активность в процессе аллостерической регуляции: активируется фосфатом и сукцинатом, а ингибируется оксалоацетатом. При накоплении в клетке ЩУК не
происходит окисление сукцината.
Наконец, активность a-кетоглутаратдегидрогеназы аллостерически ингибируется продуктами катализируемой этим ферментом реакции —сукцинилСоА и NADH.
Следует отметить, что у разных организмов могут существовать различные, в том числе не охарактеризованные здесь способы регуляции скорости
реакций ЦТК.
11.5. Другие пути окисления одно- и двухуглеродных
субстратов
Цикл трикарбоновых кислот осуществляется в клетках бактерий, грибов,
простейших, растений, животных и является одним из самых важных циклов
аэробных организмов. Однако у некоторых бактерий и растений существуют
другие пути окисления одно- и двухуглеродных молекул. Как правило, использование альтернативных путей бывает вызвано тем, что в качестве единственного источника углерода и энергии используется какой-либо неуглеводный субстрат. В таком случае клетки вынуждены искать возможность такого
способа окисления субстрата, который приводит к образованию промежуточных продуктов, способных превращаться в необходимые клетке метаболиты.
Примером подобной ситуации может служить функционирование глиоксилатного цикла в клетках семян высших растений. Когда основным запасным веществом семян служат триацилглицериды, остатки жирных кислот
которых превращаются при окислении в ацетил-СоА, клетки используют глиоксилатный цикл (рис. 11.6, 11.7). Особенность этого цикла состоит в том,
что изоцитрат не декарбоксилируется, как в ЦТК, а расщепляется под действием изоцитрат-лиазы на сукцинат (возвращается на этап b-окисления) и
глиоксилат (рис. 11.6).
Глиоксилат затем конденсируется с еще одной молекулой ацетил-СоА
(фермент малат-синтетаза) и превращается в L-малат. Это четырехуглеродное соединение может окисляться в оксалоацетат либо декарбоксилироваться
с образованием пирувата. И оксалоацетат, и пируват могут использоваться
клеткой в качестве предшественников биосинтеза многих нужных клетке веществ, в том числе глюкозы (рис. 11.7).
Этот процесс используют и бактерии, например E. coli, Pseudomonas, а
также некоторые простейшие в случаях, когда единственным источни-
162
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H C COO
Глиоксилат
"Яблочный
фермент"
Малатсинтетаза
O
+
Ацетил-СоА
Пируват + СО2
L-малат
NAD +
NADH
(NADP+) (NADPH)
СоА
NAD+
Малатдегидрогеназа
NADH
Оксалоацетат
Рис. 11.7. Реакции глиоксилатного цикла
ком углерода служит ацетат. У бактерий ЦТК и глиоксилатный цикл пространственно на разделены, а у эукариот часть ферментов, необходимых для
глиоксилатного пути, находится в особых органеллах —глиоксисомах. Глиоксисомы по структуре напоминают пероксисомы. Поскольку глиоксилатный
путь можно рассматривать как анаплеротические реакции (восполняют количество сукцината, малата, оксалоацетата), то его часто считают частью ЦТК
(рис. 11.6).
Некоторые бактерии существуют в условиях, когда единственным источником углерода являются такие двухуглеродные соединения, как гликолат,
глицин, оксалат. Все эти вещества могут превращаться в глиоксилат
(рис. 11.8), который, в свою очередь, окисляется до СО2 и Н2О в цикле дикарбоновых кислот. В этом цикле акцептором глиоксилата служит ацетилСоА, который регенерируется в системе реакций. Каждый оборот цикла сопровождается образованием двух молекул углекислоты и высвобождением
двух пар электронов, которые в составе двух молекул NADH поступают в
дыхательную цепь.
HO CH2 СОО
Гликолат
+
-2[H]
O
Переаминирование
H C COO
Глиоксилат
H3N CH2 СОО
Глицин
OOC СОО
Оксалат
Цикл дикарбоновых
кислот
2NAD+
Оксолил-СоА
+2[H]
2CO2
2NADH
163
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 11.8. Окисление двухуглеродных субстратов
Клетки многих микроорганизмов, а также некоторых растений и животных способны окислять и другие необычные субстраты, в том числе одноуглеродные (например, формиат), извлекая при этом энергию. В каждом случае
реализуется оригинальный метаболический путь, позволяющий использовать
отщепленные от субстрата электроны в дыхательной цепи для синтеза АТР.
164
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 12. ДЫХАНИЕ
Дыхание является одним из самых распространенных способов запасания
энергии, которым обладает большинство организмов: животные, растения,
простейшие, грибы, аэробные и почти все факультативно анаэробные бактерии. В процессе дыхания энергия запасается по механизму окислительного
фосфорилирования, донорами электронов могут выступать как органические, так и неорганические вещества, а акцепторами электронов служат только неорганические вещества. По сравнению с субстратным окислительное
фосфорилирование — гораздо более выгодный и эффективный механизм, в
эволюционном плане находящийся на более высокой ступени. Его отличительной особенностью является обязательное участие мембран, в которых в
строго определенной очередности расположены компоненты дыхательной
цепи. Движущей силой синтеза АТР служит энергия протонного градиента на
мембране. В свою очередь, протонный градиент создается в результате переноса электронов по компонентам дыхательной цепи в определенном направлении: от лучшего донора к лучшему акцептору.
Компоненты дыхательной цепи (электронтранспортная система) и катализирующий образование АТР фермент (АТР-синтаза) располагаются у
прокариот в плазматической мембране, а у эукариот — во внутренней мембране митохондрий. Именно в этих органеллах, как было показано ранее
(глава 9, 11), в ходе катаболических и амфиболических процессов формируется наибольшее количество восстановительных эквивалентов, которые с помощью никотинамидных и флавиновых переносчиков передаются в дыхательную цепь.
В дыхательной цепи осуществляются реакции, представляющие собой
биохимический аналог горения водорода. Их отличительной особенностью
является запасание значительной части выделяющейся энергии в виде макроэргических связей АТР, т. е. перевод свободной энергии в биологически доступную форму. И лишь небольшая доля выделяющейся при дыхании энергии
рассеивается в виде тепла.
Для понимания механизма окислительного фосфорилирования необходимо, прежде всего, охарактеризовать компоненты дыхательной цепи, закономерности их функционирования и расположения в мембране.
12.1. Характеристика компонентов дыхательной цепи
Компоненты дыхательной цепи представляют собой переносчики восстановительных эквивалентов, среди них присутствуют переносчики водорода и
переносчики электронов. Причем их расположение в мембране строго опре165
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
делено: переносчики водорода чередуются с переносчиками электронов, и
лучшие доноры электронов всегда предшествуют лучшим акцепторам.
Поскольку транспорт электронов и транспорт водорода являются сопряженными и эквивалентными процессами, дыхательную цепь можно рассматривать как цепь переноса электронов (электронтранспортную цепь). Ее основными компонентами служат флавопротеины, железосерные белки, хиноны и цитохромы.
Флавопротеины. Представляют собой ферменты, содержащие в качестве
простетических групп FMN или FAD. Эти переносчики восстановительных
эквивалентов охарактеризованы в главе 7. Следует подчеркнуть, что флавиновые кофакторы переносят водород и являются более сильными окислителями, чем NAD+.
Железосерные белки. Эти окислительно-восстановительные системы содержат атомы железа, связанные, с одной стороны, с серой аминокислотных
остатков цистеина, а с другой — с неорганической сульфидной серой. Железосерные центры (рис. 12.1) можно рассматривать как простетические группы
ферментов, имеющие, однако, структуру, отличную от гема. Поэтому железосерные белки называют еще белками с негемовым железом.
Число атомов железа и сульфидной серы в этих белках может различаться, но наиболее часто встречаются белки, содержащие 2Fe, 2S2- и 4Fe, 4S2-.
Железосерные белки переносят только электроны. В частности, 2Fe, 2S2—
центры транспортируют по одному электрону. При этом электроны не локализуются на атомах какого-то одного типа, а взаимодействуют и с ядрами
железа, и с ядрами серы, т. е. находятся в делокализованном состоянии.
Железосерные белки принимают участие в фиксации молекулярного азота
нитрогеназными системами, в восстановлении сульфитов и нитритов, в фотосинтезе, окислении алканов.
Хиноны. Это низкомолекулярные переносчики водорода, которые присутствуют во внутренней части липидного бислоя митохондриальных мембран в 10—15-кратном избытке по сравнению с другими компонентами электронтранспортной системы. Благодаря наличию неполярной гидрофобной
цепи молекулы хинонов свободно перемещаются в липидном бислое. Различают несколько семейств хинонов, среди которых наиболее распространены
убихиноны (в переводе с латинского —вездесущие хиноны), которые также
называют коферментами Q (СоQ). Количество изопреноидных звеньев в
молекуле хинона обозначают в виде подстрочного символа (Qn). Убихиноны
митохондрий млекопитающих содержат 10 изопреноидных звеньев (Q10), а
убихиноны бактерий — 6 (Q6). На рис. 12.1 представлена структура и стадии
окисления—восстановления убихинонов.
Среди других групп хинонов известны пластохиноны (содержатся в
мембранах хлоропластов, осуществляют транспорт водорода в фотосистемах), токоферолы (различные формы витамина Е с антиоксидантными
функциями), филлохиноны и менахиноны (семейство витаминов группы К,
участвуют в транспорте водорода у микобактерий, в свертываемости
166
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
HO
CH3
[
]3
пептидная
цепь
CH3
CH3
цистеин
цистеин
CH CH2
H3C
S
S
Fe
S
S
Fe
Fe2+
N
N
S
S
N
N
O
CH3
C
цистеин
цистеин
H
пептидная
цепь
Простетическая группа железосерного
белка типа (2Fe,2S2-)
CH2
CH2
CH2
CH2
COOH
COOH
Гем а
OH
O
CH3
H3CO
[
H3CO
]
CH3
H3CO
+ 2 [H]
- 2 [H]
[
H3CO
nH
]
nH
OH
O
Убигидрохинон (убихинол)
Убихинон
Рис. 12.1. Структура и особенности функционирования компонентов дыхательной цепи. В пунктирных рамках — сульфидная сера, способная отщепляться при подкислении в виде сероводорода
крови у млекопитающих). Дополнительные сведения об этих соединениях
содержатся в главе 17.
Цитохромы. Данные окислительно-восстановительные ферментные системы содержат в качестве простетической группы гем (рис. 12.1). Центральный атом железа в геме участвует в переносе электронов, изменяя свою валентность:
Гем-Fe2+ « Гем-Fe3+ + e
167
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Цитохромы являются переносчиками электронов, и некоторые из них (цитохромоксидаза) способны передавать электроны непосредственно на молекулярный кислород.
Различают множество цитохромов, выделенных из разных источников.
Их принято обозначать сочетанием буквенных и цифровых символов: буквы
обычно указывают на тип гема (например, a, b, c, o), а цифры — на значение
длины волны a-полосы в спектре поглощения (например, 552; 557,5; 450).
Для электронтранспортной системы особенно важно, что разные цитохромы
характеризуются различными окислительно-восстановительными потенциалами и расположены в мембране в определенной очередности по отношению
друг к другу. Только цитохром с, как полагают, находится в растворенном
состоянии на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны.
12.2. Окислительно-восстановительный
потенциал компонентов
Компоненты дыхательной цепи ведут себя как типичные окислительновосстановительные системы, переходя попеременно в процессе транспорта
электронов из восстановленного состояния в окисленное и наоборот. При
этом порядок расположения переносчиков в мембране обусловлен величиной
их окислительно-восстановительного потенциала (ОВП), который служит
мерой способности соединений или элементов отдавать электроны.
Подобно химическим элементам, функционирующие в клетках вещества
тоже можно расположить в ряд по величине их ОВП (Е0) при степени восстановления 1/2. Отрицательный окислительно-восстановитель-ный потенциал
свидетельствует о том, что данное вещество имеет меньшее сродство к электронам, чем молекулярный водород. Положительные значения Е0 характеризуют более высокое, чем у Н2, сродство к электронам у данного вещества.
Таким образом, сильный восстановитель, например NADH, обладает отрицательным Е0, а сильный окислитель (например, О2) — положительным Е0. В
биохимии пользуются величиной Е0`, приведенной к рН 7. Значения Е0` отдельных компонентов дыхательной цепи находятся в пределах от (-) 0,32 В
(для NAD+/NADH) до (+) 0,82 В (для О2-/1/2 О2). Соответственно никотинамидные переносчики начинают дыхательную цепь, т. е. располагаются в ее
начале, а молекулярный кислород завершает цепь, выполняя роль конечного
акцептора электронов.
Разность ОВП двух реагирующих веществ может служить мерой изменения свободной энергии в химической реакции, т. е. мерой полезной работы,
которую способна выполнить система. Сопоставление окислительновосстановительных потенциалов компонентов дыхательной цепи позволяет
обнаружить три этапа окисления, на которых высвобождается достаточное
для синтеза молекулы АТР количество энергии (не менее -0,15 В). В
табл. 12.1 представлены значения Е0` основных компонентов дыхательной
цепи, а также разность потенциалов (DЕ0) взаимодействующих систем.
Таблица 12.1. Окислительно-восстановительные потенциалы компонентов дыхательной цепи
168
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Компонент
Е0`, В
+
NAD /NADH
-0,32
FMN/FMNH2
-0,30
FeS/FeS(2e)
-0,25
Q/QH2
+0,02
Цитохром b (Fe3+/Fe2+)
3+
2+
+0,03
Цитохром c1 (Fe /Fe )
+0,22
Цитохром c (Fe3+/Fe2+)
+0,24
3+
2+
Цитохром a*a3 (Fe /Fe )
+0,25*, +0,39
O2-/1/2O2
+0,82
DЕ0, В
Образование АТР
-0,02
нет
-0,05
нет
-0,27
да
-0,01
нет
-0,19
да
-0,02
нет
-0,01
нет
-0,43
да
12.3. Механизм окислительного фосфорилирования
Вся система переносчиков в дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий включает примерно 70 различных полипептидов, организованных
в 4 ферментных комплекса: NADH—CoQ-редуктаза (комплекс I), CoQH2—
цитохром c-редуктаза (комплекс III), цитохромоксидаза (комплекс IY) и сукцинат—СоQ-редуктаза (комплекс II). Дыхательная цепь тесно примыкает к
АТР-синтазному комплексу, в котором осуществляется фосфорилирование
АDP. Для ответа на вопрос о том, каким образом транспорт электронов по
компонентам дыхательной цепи сопряжен с синтезом АТР, предложено несколько гипотез:
1) гипотеза химического сопряжения (Е. Слейтер, 1953 г.): перенос электронов вызывает серию химических реакций, в ходе которых образуется некий высокоэнергетический продукт. Расщепление этого продукта сопровождается высвобождением энергии, достаточной для синтеза молекулы АТР;
2) гипотеза конформационного сопряжения (П. Бойер, 1964 г.): транспорт
электронов вызывает конформационные изменения в белковых компонентах
в мембране, что связано с переходом их в высокоэнергетическую форму. Эти
изменения передаются АТР-синтазе, которая активируется и катализирует
синтез АТР;
3) хемиосмотическая гипотеза (предложена Питером Митчеллом в
1961 г.): перенос электронов сопровождается выводом протонов в межмембранное пространство митохондрий. Так на внутренней мембране создается
электрохимический градиент, который и запускает работу АТР-синтазы.
Иными словами, синтез АТР осуществляется за счет осмотической энергии
протонного градиента.
Из всех рассмотренных гипотез наиболее состоятельной и подтвержденной многими экспериментальными данными является гипотеза Митчелла.
Она, в частности, объясняет необходимость целостности мембраны для синтеза АТР. Однако и ее положения носят пока статус теории и далеки от совершенства, хотя признаны большинством исследователей и будут рассмотрены ниже.
169
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Каждый из комплексов дыхательной цепи включает по несколько редоксцентров, расположенных в мембране особым образом, формируя несколько
«петель». В каждой такой «петле» 2 атома водорода выносятся к наружной
поверхности внутренней мембраны митохондрий, где отдают 2 протона в
межмембранное пространство, а пара электронов транспортируется затем на
внутреннюю поверхность мембраны. На рис. 12.2 представлена упрощенная
схема функционирования переносчиков дыхательной цепи (комплексы I, III,
IY), работа которых описана ниже.
Межмембранное
пространство
Внутренняя мембрана
митохондрий
Матрикс
NADH
FMN
NAD+
FMNH 2
2Н+
FeS
(I)
FeS(2e)
2Н +
CoQ
CoQH2
2Н+
Редоксцентры
комплекса III
4Н +
Редоксцентры
комплекса IV
2Н+
Редоксцентры
комплекса IV
1/2 О2
H2O
Рис. 12.2. Упрощенная схема транспорта электронов по компонентам дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий
Комплекс I включает 25—30 субъединиц, FMN, 6—7 железосерных центров и носит название NADH-дегидрогеназа или NADH—CoQ-редуктаза.
170
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Этот комплекс окисляет NADH и восстанавливает хиноны (СоQ). Гидрид-ион
от NADH и протон из матрикса митохондрии передаются на FMN, который
восстанавливается до FMNH2. FMNH2 осуществляет перенос двух атомов водорода от внутренней поверхности мембраны к внешней. При этом два протона выводятся в межмембранное пространство, а два электрона акцептируются железосерными белками и по их редокс-центрам электроны мигрируют
к внутренней поверхности мембраны, где переносятся на хиноны. Но для восстановления хинонов требуются атомы водорода, а не электроны, поэтому
дополнительно 2 протона акцептируются из матрикса (рис. 12.2).
Далее вступает в действие комплекс III (CoQH2—цитохром c-редуктаза),
содержащий 11 субъединиц, 2 железосерных центра, 2 гема цитохрома b и
гем цитохрома с1. Работа этого комплекса приводит к окислению CoQH2 и
восстановлению цитохрома с. Перенос электронов осуществляется в следующей последовательности:
CoQH2 ® гем b ® FeS (III) ® гем с1 ® гем с
Процесс окисления CoQH2 также сопровождается выводом протонов в
межмембранное пространство (рис. 12.2).
Цитохром с окисляется комплексом IV (цитохромоксидаза), включающим
13 субъединиц, 2 атома меди, 2 гема а и 2 гема а3. Этот комплекс восстанавливает молекулярный кислород до воды. Электрон, отнятый от гема с, переносится на редокс-центр CuA цитохромоксидазы, который расположен ближе
всего к той поверхности фермента, которая обращена в межмембранное пространство. Перемещаясь далее вглубь мембраны, электрон переносится на
гем а, а затем на комплекс гем а3 — CuB, который и восстанавливает молекулярный кислород. При этом следует признать, что хотя цитохромы являются
переносчиками электронов, цитохромоксидаза имеет протон-проводящие каналы и, как полагают, может действовать как истинный протонный насос. На
один транспортируемый электрон переносится 2 протона, один из которых
участвует в восстановлении О2, а второй пересекает мембрану. Таким образом, на 2 транспортируемых по компонентам дыхательной цепи электрона
через канал цитохромоксидазы должно быть перенесено 4 протона
(рис. 12.2).
Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа или сукцинат-СоQ-редуктаза) переносит водород от сукцината, окисляемого в ЦТК, на хиноны без участия
NAD+. В этом случае реализуется на одну «петлю» меньше и в межмембранное пространство митохондрий выводится меньшее количество протонов.
Таким образом, на внутренней мембране митохондрий создается градиент
электрохимического потенциала Н+, который и является движущей силой
синтеза АТР.
Вопрос о том, каким образом энергия протонного градиента сопрягается с
синтезом АТР, пока остается открытым. Известно, что в интактных митохондриях только АТР-синтаза позволяет осуществить обратное (по электрохимическому градиенту) перемещение протонов в матрикс. Этот подчиняющийся
закономерностям облегченной диффузии поток протонов осуществляется через канал АТР-синтазы и каким-то образом сопряжен с фосфорилированием
АDP.
171
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
АТР-синтаза (называется также АТР-аза, поскольку в определенных условиях способна катализировать обратную реакцию: гидролиз АТР и создание протонного градиента на мембране) состоит из двух частей: пронизывающего мембрану протонного канала (F0) и «головки» (F1), выступающей в
матрикс в форме грибовидного выроста. Обе части АТР-синтазы состоят, в
свою очередь, из нескольких субъединиц и организованы в мембране особым
образом (рис. 12.3). Протонный канал и «ствол» головки примыкают друг к
другу, а каталитические центры фермента располагаются между тремя a- и
тремя b-субъединицами.
Синтез АТР осуществляется в три фазы в трех каталитических центрах.
Вначале АТР-синтаза связывает АDP и Рi, затем формируется фосфоангидридная связь между ними (образуется АТР) и, наконец, АТР высвобождается
в матрикс.
Предполагается, что энергия транспортируемых через канал F0 протонов
расходуется на поворот g-субъединицы, в результате чего изменяется конформация a- и b-субъединиц и их каталитические центры переходят в активное состояние. Существуют и другие гипотезы, объясняющие механизм синтеза АТР. Согласно одной из них, предложенной П. Митчеллом, фосфатная
группа (Рi) связывается в активном центре «головки» фермента в непосредственной близости к протонному каналу. Перенос протонов по каналу F0 под
действием градиента рН и мембранного потенциала сопровождается активацией неорганического фосфата, в результате чего от него отщепляется гидроксильная группа (образует с протоном молекулу воды). Оставшаяся часть
неорганического фосфата превращается в весьма реакционноспособную частицу, реагирующую с ADP, образуя АТР.
Рис. 12.3. Структура АТР-синтазы
Следует отметить, что протонный градиент на биомембранах может использоваться не только для синтеза АТР, но и для других целей: для транспорта через мембраны нуклеозиддифосфатов и нуклеозидтрифосфатов, для
172
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
вращения бактериальных жгутиков, для поддержания осмотического давления, для транспорта через мембраны веществ против градиента концентрации, для выработки тепла. Последний механизм имеет очень важное значение
для теплокровных животных, а также для некоторых растений, насекомых. У
многих животных обнаружена особая ткань, так называемый «бурый жир»,
содержащая большое количество митохондрий (в мембранах этих митохондрий присутствуют красноватые цитохромы). Особенностью таких специализированных митохондрий является использование свободной энергии протонного градиента не для синтеза АТР, а для обогрева организма: энергия
рассеивается в виде тепла.
12.4. Энергетический баланс
Ранее (табл. 12.1) показано, что в полной дыхательной цепи имеется 3
этапа окисления, на которых высвобождается достаточное для синтеза молекулы АТР количество энергии. Иными словами, при переносе двух электронов от NADH на молекулярный кислород только три электронных перехода
могут быть сопряжены с фосфорилированием ADP, т. е. может образоваться
максимум 3 молекулы АТР. Эту связь фосфорилирования с восстановлением
О2 принято обозначать коэффициентом (отношением) Р/О, который равняется
числу молекул АТР, образованных в расчете на один атом кислорода, использованного в процессе дыхания.
Субстраты, переносящие свои восстановительные эквивалентны на NAD+,
дают Р/О = 3, а для сукцината и других субстратов, переносящих электроны
на FAD, Р/О = 2 (в этом случае электроны включаются в цепь на уровне хинонов и проходят меньший путь по системе переносчиков). Зная энергетические коэффициенты можно подсчитать энергетический баланс окисления
глюкозы.
Общий энергетический баланс окисления глюкозы. Если глюкоза катаболизируется по гликолитическому пути, а образованный пируват через ЦТК
полностью окисляется до СО2 и Н2О, и при этом весь водород сжигается в
дыхательной цепи до воды, то на 1 молекулу использованной глюкозы образуется:
— в гликолизе — 2 молекулы NADH;
— при дегидрировании пирувата — (1 ґ 2) =2 молекулы NADH;
— в ЦТК — (3 ґ 2) =6 молекул NADH и (1 ґ 2) =2 молекулы
FADH2;
Итого: 10 молекул NADH и 2 молекулы FADH2.
Зная, что для NADH Р/О = 3, а для FADH2 Р/О = 2, можно вычислить количество молекул АТР, синтезированных при окислительном фосфорилировании: (10 ґ 3) +(2 ґ 2) = 34. К этому количеству следует добавить 2 молекулы АТР, запасенные на уровне субстратного фосфорилирования в гликолизе,
и 2 молекулы АТР, запасенные при окислении 2 молекул a-кетоглутарата в
ЦТК.
Таким образом, общий итог по количеству АТР, способного образоваться
при полном окислении глюкозы составляет 38 молекул. Реально эта цифра,
однако, несколько меньше и составляет 32—26 молекул АТР. Объясняется
173
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
данное обстоятельство тем, что транспорт метаболитов (в первую очередь,
АТР и ADP) через мембрану митохондрий сопровождается расходованием
энергии протонного градиента. Таким образом, не вся запасенная в протонном градиенте энергия будет направлена на синтез АТР.
Энергетический баланс брожения. Сопоставление энергетической ценности для клеток процессов дыхания и брожения позволяет заключить, что
дыхание гораздо более выгодный процесс. Простой расчет показывает, что в
ходе наиболее часто используемых типов брожения, таких, как спиртовое и
молочнокислое, на 1 молекулу глюкозы клетка может запасти только 2 молекулы АТР, поскольку даже запасенные в гликолизе 2 молекулы NADH окисляются до NAD+ при образовании этанола или лактата.
12.5. Особенности анаэробного дыхания
Как показано выше, окислительное фосфорилирование служит гораздо
более выгодным механизмом запасания энергии, чем субстратное фосфорилирование. Поэтому неудивительно, что в ходе эволюции возникла возможность реализации окислительного фосфорилирования в анаэробных условиях.
В этом случае конечным акцептором электронов выступает не молекулярный
кислород, а какие-либо окисленные либо частично окисленные соединения и
ионы: нитраты, сульфаты, карбонаты, фумарат, сера, возможно, ионы трехвалентного железа. Подобные процессы и называют анаэробным дыханием, желая подчеркнуть, что в них реализуется транспорт электронов по компонентам дыхательной цепи, но не принимает участия молекулярный кислород.
Чаще всего анаэробное дыхание осуществляется в клетках бактерий, хотя,
например, фумаратное дыхание (восстановление фумарата в электронтранспортной цепи) обнаружено в клетках факультативно-анаэробных червей
и даже млекопитающих. Фумаратное дыхание сравнивают с брожением, поскольку и донорами, и акцепторами электронов в этом процессе являются
органические вещества. Однако следует учитывать, что электроны, восстанавливающие фумарат, уже прошли часть пути по дыхательной цепи и обусловили создание протонного градиента на мембране. Поэтому становится
возможным окислительное фосфорилирование, и восстановление фумарата
следует относить к анаэробному дыханию.
Все клетки, способные к анаэробному дыханию, обладают дыхательной
цепью и, как правило, содержат цитохромы. В большинстве случаев неорганические акцепторы электронов включаются в дыхательную цепь на уровне
цитохромов b или c (из-за значений их окислительно-восстановительных потенциалов). Поэтому фосфорилирование в комплексе III, как правило, не
происходит и выход АТР меньше, чем при использовании О2.
Донорами электронов в анаэробном дыхании могут служить как орТаблица 12.2. Характеристика процессов анаэробного дыхания
Тип дыхания
Aкцепторы
электронов
Продукты
дыхания
Представители
174
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Нитратное
NO3-, NO2-,
N2O
NO2-, N2O,
N2
Сульфатное
SO42-
H2S
Серное
Карбонатное
S
CO2, HCO3-
H2S
CH3-COOH
Карбонатное
CO2, HCO3-
CH4
Фумаратное
Фумарат
Сукцинат
«Железное»
Fe+3
Fe+2
Бактерии-денитрификаторы
(Pseudomonas fluorescens,
Bacillus licheniformis,
Paracoccus denitrificans,
Thiobacillus denitrificans); E.coli,
Enterobacter
Бактерии-сульфатредукторы
(Desulfovibrio,
Desulfotomaculum,
Desulfococcus, Desulfosarcina,
Desulfobacter)
Desulfuromonas acetoxidans
Ацетогенные бактерии
(Clostridium aceticum,
Clostridium thermoaceticum,
Acetobacterium woodii)
Метанобразующие бактерии
(Methanobacterium,
Methanococcus, Methanosarcina,
Methanospirillum)
Сукциногенные бактерии, черви, клетки млекопитающих
Смешанные популяции почвенных бактерий
ганические, так и неорганические субстраты. В зависимости от используемого
акцептора электронов различают нитратное, сульфатное, серное, карбонатное, фумаратное, «железное» дыхание. В табл. 12.2 перечислены представители этих типов дыхания, а также образующиеся продукты.
Большинство представленных в табл. 12.2 бактерий играет огромную
роль в природе и хозяйственной деятельности человека, участвуя в круговороте азота и серы, определяя плодородие почв, формируя месторождения полезных ископаемых и метана. Нельзя не учитывать и негативную деятельность многих из перечисленных бактерий, связанную с накоплением нитритов в почве, анаэробной коррозией железа и др.
12.6. Использование неорганических доноров электронов
В клетках большинства организмов при дыхании донорами электронов
являются органические вещества, которые одновременно выполняют роль
источников углерода. Однако среди прокариот существуют группы почвенных и водных бактерий, способные использовать в качестве доноров электронов неорганические восстановленные вещества: элементарную серу, молекулярный водород, окись углерода, а также ионы аммония, нитрита, сульфита,
тиосульфата, сульфида, двухвалентного железа. Эти бактерии впервые обнаружил и описал С.Н. Виноградский, назвав способ их метаболизма «хемосинтезом». Данные бактерии по типу питания относят к группе хемолитоав175
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
тотрофов: в качестве источника энергии они используют энергию химических связей химических соединений, донором электронов служат неорганические вещества, а источником углерода — СО2.
У литотрофных бактерий количество цитохромов в дыхательной цепи
обычно в несколько раз превышает таковое у органотрофов. Связано это с
особенностями используемых доноров электронов, которые в большинстве
случаев характеризуются более положительными значениями Е0ў, чем у NAD,
т. е. не могут передавать свои электроны на NAD+. Включение электронов,
отщепляемых от большинства неорганических субстратов, в дыхательную
цепь осуществляется чаще всего на уровне флавина или цитохромов. Например, первичным акцептором электронов при окислении ионов Fe2+ является
цитохром с, а при окислении ионов NO2- — цитохром а. Поэтому у железобактерий и бактерий-нитрификаторов в электронтранспортной цепи функционируют лишь III-й и IV-й либо даже только IV-й комплексы. Соответственно, число событий фосфорилирования ADP уменьшается до двух или одного против трех, имеющих место у органотрофных бактерий при переносе
электронов на NAD+. Исключение представляют водородные бактерии: для
Н2 значение Е0ў = -0,42 В, и при окислении молекулярного водорода под действием О2 происходит перенос электронов через все три участка сопряжения,
что приводит к синтезу 3 молекул АТР.
Существование укороченной дыхательной цепи у большинства хемолитоавтотрофов является причиной неэффективного запасания энергии в ходе
дыхания, что вызывает необходимость перерабатывать огромные количества
субстрата. В результате эти бактерии очень медленно растут, например, промежутки между двумя делениями клетки у бактерий-нитрификаторов достигают 5—10 ч. Кроме этого, у данных бактерий возникает дефицит NADH в
клетках, поскольку большинство неорганических доноров электронов не в
состоянии восстанавливать NAD+. Чтобы справиться с этой проблемой, у хемолитотрофов выработался механизм обратного транспорта электронов по
компонентам дыхательной цепи. Такой обращенный поток электронов приводится в движение гидролизом АТР.
В табл. 12.3 охарактеризованы некоторые процессы использования неорганических доноров электронов. Следует отметить, что среди хемолитоавтотрофов встречаются как облигатные, так и факультативные литотрофы. Последние способны также к хемоорганогетеротрофному способу питания.
Окисление неорганических соединений может происходить как в аэробных (с участием О2), так и в анаэробных условиях, т. е. в процессе анаэробного дыхания (табл. 12.3).
Хемолитоавтотрофы способны фиксировать СО2, и большинство из них
использует для этой цели цикл Кальвина.
Таблица 12.3. Способы окисления неорганических доноров электронов
Донор электронов
+
NH4
NO2-
Продукт окисления
Конечный акцептор
электронов
NO2NO3-
O2
O2
Представители
Бактерии-нитрификаторы
176
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H2S, S, S2O32Fe
2+
Н2
SO42+
Fe3
Н2О
O2, иногда NO3O2
О2, NO3-, SO42-, S,
CO2, фумарат
Тионовые бактерии
Железобактерии
Водородные бактерии
177
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 13. УЛАВЛИВАНИЕ ЭНЕРГИИ СВЕТА БИОМОЛЕКУЛАМИ
Можно смело утверждать, что Жизнь на нашей планете обязана солнечному свету. Энергия света поглощается фотосинтезирующими организмами и
запасается в виде химических связей органических соединений, а остальные
обитатели Земли (возможно, лишь за исключением способных к хемосинтезу
бактерий) используют энергию этих связей для того, чтобы осуществить в
клетках окислительное или субстратное фосфорилирование.
Видимый свет представляет собой форму электромагнитного излучения с
длиной волны 400—700 нм, и его происхождение обусловлено сложными
процессами, происходящими на Солнце. Одним из результатов этих процессов является испускание энергии в виде квантов видимого света (фотонов),
которые достигают земной поверхности. Энергия фотонов обратно пропорциональна их длине волны, и наибольшей энергией характеризуются фотоны
с наименьшей длиной волны, соответствующей фиолетовому краю видимого
спектра.
Способность вещества поглощать свет зависит от его атомной структуры.
Когда фотон сталкивается с атомом или молекулой, способными поглощать
свет данной длины волны, энергия фотона поглощается одним из электронов
и атом или молекула переходят в более богатое энергией возбужденное состояние. Возбуждение длится 10-9—10-8 с, после чего молекула возвращается
в первоначальное состояние, которое называется основным и характеризуется меньшей энергией, чем возбужденное. При возврате в основное состояние
возбужденная молекула может терять свою энергию несколькими способами:
1) энергия может рассеиваться в виде тепла; 2) часть поглощенной энергии
может немедленно испускаться в виде света (флуоресценция) или после некоторой задержки (фосфоресценция). Испускаемый при флуоресценции и
фосфоресценции свет обычно характеризуется большей длиной волны и
меньшей энергией, чем свет, вызвавший возбуждение молекулы. Кроме этого
(3), поглощение света может вызывать фотохимические реакции, в которые
способны вступать возбужденные молекулы.
Фотохимические реакции представляют собой диссоциацию на ионы или
радикалы либо присоединение протонов, что может сопровождаться разрывом связей, реакции фотоприсоединения и фотоотщепления, а также изомеризации. Возбужденные молекулы способны превращаться в сильные окислители и восстановители и индуцировать соответствующие процессы по отношению к другим молекулам. Все перечисленные реакции с участием возбужденных светом молекул становятся возможными, поскольку с повышением энергии молекулы приобретают химические свойства, нехарактерные для их невозбужденных форм.
178
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Фотохимические реакции приобретают особую роль, когда затрагивают
жизненно важные для клетки структуры. Первостепенное значение в этом
отношении играют нуклеиновые кислоты, азотистые основания которых, как
известно, испытывают на себе фотодинамическое действие коротковолнового
света. В результате различного рода фотохимических превращений (в первую
очередь, образования пиримидиновых димеров) в составе ДНК появляется
большое количество изменений, которые, не будучи репарированными, закрепляются в виде мутаций (глава 2).
С другой стороны, фотохимические реакции чрезвычайно важны для таких явлений, как фотосинтез и фоторецепция. Среди биологических молекул
есть специализированные, способные в ответ на поглощение света обусловливать определенные процессы в клетках. Такими молекулами служат, в первую очередь, фотосинтетические пигменты, участвующие в запасании световой энергии в ходе фотосинтеза. В возбужденном состоянии молекулы хлорофилла способны инициировать фотоокисление молекул воды, что сопровождается транспортом возбужденных электронов по компонентам фотосистем.
Другой класс светочувствительных биомолекул представлен зрительными
фоторецепторами, которые в ответ на поглощение света генерируют нервный
импульс. Фотохимическая реакция, запускающая данный процесс, состоит в
изомеризации молекулы зрительного пигмента.
13.1. Фотосинтез
Фотосинтез представляет собой высокоэффективный процесс запасания
энергии видимого света и трансформирования ее в энергию химических связей биологических молекул. Осуществляется данный процесс в клетках растений, водорослей и фототрофных бактерий, причем у большинства перечисленных организмов фотосинтез сопровождается использованием в качестве
донора электронов воды и выделением молекулярного кислорода (уравнение 13.1). И только у аноксигенных бактерий, относящихся к классу Anoxyphotobacteria, вместо воды роль доноров электронов могут выполнять некоторые иные восстановленные соединения, например сероводород. При этом
не происходит образования О2 (уравнение 13.2).
CO2 + H2O ® (CH2O) + O2
(13.1)
CO2 + 2H2S ® (CH2O) + H2O + 2S
(13.2)
Данное наблюдение принадлежит Корнелису ван Нилю, который в 1931—
1933 гг., будучи еще студентом-дипломником, исследовал особенности фотосинтеза у разных бактерий и сделал смелое предположение, перевернувшее
взгляды исследователей на закономерности фотосинтеза. Исходя из выведенного им уравнения фотосинтеза для пурпурных серных бактерий (13.2),
К. ван Ниль предположил, что не углекислота, а вода разлагается при фотосинтезе у растений, образуя молекулярный кислород, и предложил общее
уравнение фотосинтеза (13.3):
CO2 + 2H2A ® (CH2O) + H2O + 2A
(13.3)
179
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
В последнем уравнении H2A представляет собой донор электронов, которым у оксигенных организмов служит вода, а у аноксигенных бактерий —
другие вещества (сероводород, молекулярный водород, изопропанол и др.).
При этом выделяется дегидрированный донор электронов (А) и происходит
восстановление углекислоты до органического соединения (СН2О). Эти превращения и составляют суть процесса фотосинтеза.
Интересно отметить, что вода является очень плохим донором электронов
и ни один из окислителей, которыми располагают живые организмы, не является достаточно мощным, чтобы отщепить от молекулы Н2О атомы водорода.
Это становится возможным лишь в результате фотохимических превращений
особых молекул хлорофиллов, которые становятся сильными окислительными агентами и приобретают способность окислять воду.
Процесс фотосинтеза требует обязательного участия мембран. У прокариот эту роль выполняют впячивания плазматической мембраны, а у эукариот — мембраны тилакоидов, расположенные в хлоропластах. Тилакоиды
находятся в строме хлоропластов, образуя стопки (граны). Внутреннее содержимое тилакоидов называют люменом.
В мембранах тилакоидов располагаются компоненты транспорта электронов, сгруппированные в 2 фотосистемы, и АТР-синтаза. Фотосистемы используются для переноса электронов и сопряженного с ним перевода протонов в люмен, в результате чего на тилакоидной мембране создается протонный градиент. Энергия протонного градиента запускает синтез АТР, подобно
тому, как это имеет место при окислительном фосфорилировании. Однако, в
отличие от дыхательной цепи, в фотосистемах электроны движутся от плохого донора (молекулы воды) к плохому акцептору (NADP+), т. е. в противоположном по сравнению с дыханием направлении. Соответственно и энергия
при таком направленном «вверх» потоке электронов должна затрачиваться.
Действительно, для восстановления NADP+ электроны должны дважды возбудиться светом.
Характеристика компонентов фотосистем. Компоненты фотосистем
представляют собой белковые комплексы, содержащие фоточувствительные
молекулы (пигменты) и переносчики восстановительных эквивалентов.
Пигменты представлены в основном хлорофиллами, каротиноидами и
фикобилинами. Основную роль в процессе фотосинтеза играет зеленый, содержащий ионы магния тетрапиррольный пигмент — хлоро-филл a
(рис. 13.1). Этот хромофор представляет собой магнийпорфирин и похож по
структуре на гем (железопорфирин). Однако у хлорофилла a имеются следующие основные отличия: с одним из пиррольных колец слито пятое, циклопентановое кольцо; одно из пиррольных колец частично восстановлено;
одна из кислотных боковых цепей представляет собой эфир фитола —
двадцатиуглеродного высокогидрофобного спирта. Остаток фитола придает
молекуле хлорофилла амфифильные свойства и служит «якорем», с помощью
которого хромофор может удерживаться в липидном бислое тилакоидной
мембраны. При этом гидрофиль-
180
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2
CH2
CH3
CH
CH2
CH2
H3C
CH3
C O
O
N
N
Mg
CH3
N
N
H
H3C
CH3
CH3
R
H
H
(C20H39OH)
O
O
Остаток спирта
фитола
CH3
C
O
CH3
CH3
H3C
Хлорофилл a
R
Рис. 13.1. Структура молекулы хлорофилла а
ная голова (магнийпорфирин) находится на поверхности мембраны, обращенной к водной фазе стромы, и расположена параллельно плоскости мембраны. Таким образом, достигается ориентация хлорофилла в хлоропластах,
способствующая наиболее эффективному улавливанию световой энергии.
Другие хлорофиллы зеленых растений (b, c, феофитин), а также хлорофиллы некоторых водорослей и бактерий (хлоробиум-хлорофилл, бактериохлорофиллы) отличаются от хлорофилла a структурой заместителей у пиррольных колец, отсутствием иона магния (феофитин), спектрами поглощения.
Существование в клетке хлорофиллов с разными спектрами поглощения позволяет увеличить диапазон улавливаемого излучения.
Каротиноиды и фикобилины служат вспомогательными пигментами. Они
еще больше увеличивают спектр поглощаемой организмом энергии, а кроме
того, защищают хлорофиллы от избытка света и от окисления кислородом,
который выделяется при фотосинтезе. Каротиноиды — это желтые, оранжевые, красные или коричневые пигменты, сильно поглощающие в фиолетовой
области спектра. В хлоропластах присутствуют две группы каротиноидов —
каротины (углеводороды, бульшую часть которых составляют тетратерпены, подробно рассматриваются в главе 17) и ксантофиллы (по химическому
181
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
строению сходны с каротинами, но содержат кислород). Фикобилины характерны для цианобактерий и хлоропластов красных водорослей.
Для более полного улавливания световой энергии пигменты в фотосистемах собраны с помощью белков в антенные комплексы. В каждом антенном комплексе насчитывается по несколько сотен молекул пигментов, и их
основная функция состоит в передаче поглощенной энергии хлорофиллу а.
Таким образом, можно сравнить антенный комплекс с воронкой, «загоняющей» энергию к хлорофиллу реакционного центра фотосистемы. Энергия
возбуждения (экситон) передается от молекулы к молекуле посредством электрического поля возбужденного электрона (очевидно, возбужденный электрон
в молекуле, поглотившей квант света, передает свою энергию близлежащей
молекуле таким образом, что в той тоже возбуждается электрон).
Транспортирующие электроны компоненты фотосистем представлены
комплексом цитохрома b/f (агрегат интегральных мембранных белков, содержащий два цитохрома: b563 и f), феофитином, мембраносвязанными пластохинонами (QA и QB), а также мобильными переносчиками, функции которых выполняют пластохинон QP, пластоцианин и ферредоксин. Пластохинон по структуре и функциям очень напоминает убихинон (рис. 12.1). Пластоцианин представляет собой белок с одним атомом меди, координационно
связанным с боковыми цепями аминокислот: при переносе электрона Cu находится попеременно в степени окисленности +1 и +2. Ферредоксин является
железосерным белком типа 4Fe, 4S2-, переносящим электроны. Цепь переносчиков замыкает фермент, транспортирующий электроны на NADP+.
Установлено, что фотосинтез требует участия двух фотосистем: II и I. Фотосистема II содержит в реакционном центре хлорофилл a, имеющий оптимум поглощения при 680 нм (Р680), а в реакционном центре фотосистемы I
(Р700) содержится хлорофилл a с оптимумом поглощения 700 нм.
Световые реакции фотосинтеза. Процесс фотосинтеза условно можно
разделить на 2 этапа: световые и темновые реакции. Световые реакции требуют участия видимого света и осуществляются в тилакоидных мембранах.
Их итогом является восстановление NADP+ и синтез АТР. Темновые реакции
могут осуществляться и в условиях отсутствия видимого света, в строме, и
под ними обычно подразумевают восстановление СО2 при участии АТР и
NADPH.
У растений фотосинтетический перенос электронов начинается с фотосистемы II. Энергия поглощенного света поступает от антенных комплексов к
хлорофиллу a реакционного центра Р680 и переводит один из его электронов в
возбужденное состояние. Возбужденный электрон сразу передается на расположенный рядом феофитин, а в молекуле хлорофилла появляется положительно заряженная «дырка» с очень высоким сродством к электрону, т. е.
возникает положительно заряженный радикал Р680. «Дырка» очень быстро
заполняется электроном, извлеченным из воды водорасщепляющим ферментом (Н2О ® 2Н+ + Ѕ О2 + 2к) при участии ионов марганца. Возбужденный
электрон мигрирует по цепи переносчиков (рис. 13.2) и достигает второй
«дырки» в Р700 фотосистемы I, которая, в свою очередь, образовалась при
переносе «горячего» электрона
182
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Возбужденный
в ФС I электрон
Е0' (B)
-1, 2
Возбужденный
в ФС II электрон
Пластохинон
-1,0
Феофитин
4Fe,4S2-
-0,8
Пластохиноны
QA и QB
-0, 6
-0,4
Ферредоксин
Пластохинон
QP
-0, 2
NADP+
NADPH
Цитохромы b/f
0
Пластоцианин
+0, 2
P700
+0,4
H2O
+0, 6
Антенный
комплекс
P680
2H + + 1/2 O2
+0,8
Свет
Антенный
комплекс
Свет
Рис. 13.2. Схема потоков электронов в фотосистемах тилакоидных мембран. Зигзагообразные стрелки символизируют фотохимическое возбуждение электронов и
переход их на более высокий энергетический уровень; обычные стрелки указывают путь электронов в нециклическом потоке; пунктирная
стрелка указывает путь электронов при их поступлении в циклический поток
на электронный акцептор (по-видимому, пластохинон). Здесь электрон возбуждается вторично и далее по переносчикам фотосистемы I передается на
183
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
NADP+ (рис. 13.2). Такое движение электронов по цепи переносчиков называется нециклическим потоком, или Z-схемой. Важной отличительной особенностью этого процесса является то, что электрон дважды возбуждается в
реакционных центрах двух фотосистем, и поэтому его энергии хватает для
восстановления NADP+. Реакцию образования NADPH катализирует ферредоксин-NADP-редуктаза, содержащая FAD в качестве простетической группы. Следует отметить, что для восстановления никотинамидных кофакторов
требуются гидрид-ионы: 2 электрона от двух молекул восстановленного ферредоксина конвергируют, а протон поступает из стромы.
Кроме образования NADPH, нециклический поток электронов обусловливает перенос протонов в люмен и создание на тилакоидной мембране электрохимического градиента. Это происходит на этапе переноса водорода от
восстановленного пластохинона QP на комплекс цитохромов b/f, которые, как
известно (глава 12), являются переносчиками электронов. Когда протоны,
согласно закономерностям облегченной диффузии, выходят из люмена в
строму, они используют каналы АТР-синтазы, и происходит синтез АТР.
Этот механизм запасания энергии носит название фотофосфорилирование,
и его принцип сходен с механизмом окислительного фосфорилирования.
Кроме описанного выше нециклического потока, в тилакоидных мембранах могут осуществляться циклические потоки электронов. В них электрон
возбуждается только единожды, в реакционном центре фотосистемы I, и не
происходит образования NADPH. Поток становится циклическим, когда электроны от ферредоксина передаются не на NADP+, а обратно, к пластохинону
QP (рис. 13.2, 13.3, пунктирные стрелки). Такое движение электронов обеспечивает клетку только АТР, но не NADPH. Циклический поток электронов
преобладает при низких концентрациях NADP+, что обусловлено накоплением в клетке NADPH.
На рис. 13.3 показано расположение компонентов фотосистем, их субстратов, а также продуктов. Можно видеть, что основные продукты световых
реакций фотосинтеза — NADPH и ATP — накапливаются в строме, т. е. там,
где они должны расходоваться в темновых реакциях.
Темновые реакции фотосинтеза. К темновым реакциям фотосинтеза
относят фиксацию, т. е. восстановление и включение в состав органических
соединений, СО2. У большинства фотосинтезирующих организмов этот процесс осуществляется в цикле Кальвина (цикл носит имя Мелвина Кальвина,
получившего за его открытие Нобелевскую премию).
Цикл Кальвина условно можно разделить на три этапа: 1) карбоксилирование рибулозодифосфата; 2) восстановление 3-фосфоглицерата до альдегида; 4) регенерация рибулозодифосфата — акцептора СО2.
Углекислота, восстанавливаемая в цикле Кальвина, поступает в строму
хлоропластов зеленых растений через устьица в листьях и зеленых стеблях, а
в клетки водорослей и цианобактерий — в растворенном виде. Ключевой реакцией восстановления СО2 является карбоксилирование рибулозодифосфата.
Данную реакцию катализирует необычный фермент — рибулозодифосфаткарбоксилаза/оксигеназа, обладающая двумя активностями: карбоксилазной
и оксигеназной (рис. 13.4).
184
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
185
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2 O
C
C
P
CH2 O
O
C
OH
+ СО2 HO
OH
CH2 O
C
OH
C
O
CH2 O
P
H2O
P
P
OH
COOH
COOH
C
OH
CH2 O
P
3-Фосфоглицерат
P
O
CH2 O
CH
+
CH OH
CH OH
CH2 O
C
P
Карбоксилазная активность
CH OH
CH OH
Оксигеназная активность
CH2 O P
Рибулозодифосфат
CH2 O
C
OH
C
OH
P
CH2 O
HO
O
+ О2
CH OH
CH2 O
C
OH
C
O
P
CH2 O
P
COOH
Фосфогликолат
COOH
CH OH
P
CH2 O
C
P
OH
CH2 O P
3-Фосфоглицерат
Рис. 13.4. Реакции превращения рибулозодифосфата, катализируемые рибулозодифосфат-карбоксилазой/оксигеназой
Оксигеназная активность реализуется в отсутствии СО2 и в присутствии
О2, а продукты этой реакции участвуют в фотодыхании. Рибулозодифосфаткарбоксилаза/оксигеназа очень медленно работает: скорость ее катализа в
сотни раз меньше, чем для большинства других ферментов. Поэтому в хлоропластах этот фермент может составлять до половины всего белка. Считается,
что это самый распространенный на Земле белок, преобладающий в количественном отношении над другими белками. На уровне данного фермента
осуществляется регуляция скорости цикла Кальвина.
Восстановление продуктов карбоксилазной реакции (2 молекул 3фосфоглицерата) происходит с участием фосфоглицераткиназы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Обратные реакции, катализируемые этими
ферментами, имеют место в гликолизе (рис. 9.3). В этом процессе затрачивается энергия АТР и восстановительные эквивалентны, поставляемые NADPH.
Регенерация рибулозодифосфата осуществляется в результате межмолекулярных перестроек с участием трансальдолаз и транскетолаз (принимают
также участие в пентозофосфатных путях, описаны в главе 9). В превращения
186
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
вступают 3 соединения: глицеральдегид-3-фосфат, образующийся из него в
ходе изомеризации дигидроксиацетонфосфат, а также фруктозо-1,6дифосфат, который образуется в реакции альдольной конденсации из двух
триозофосфатов (см. Гликолиз, глава 9).
В результате описанных превращений из 6 молекул СО2 в ходе 6 оборотов
цикла Кальвина синтезируется 1 молекула гексозы. При этом затрачивается
18 молекул АТР и 12 молекул NADPH (рис. 13.5). Таким образом, фиксация
углекислоты обходится клетке очень дорого: на включение лишь одной молекулы СО2 в органическое соединение расходуется 3 молекулы АТР и
2 молекулы NADPH.
Цикл Кальвина изображают замкнутым, однако, как и в ЦТК, многие его
промежуточные продукты используются в качестве предшественников для
биосинтеза клеточных соединений. Так, 3-фосфоглицерат мо- жет превращаться в пируват (реакции гликолиза); эритрозо-4-фосфат —
6 CO2
6
Рибулозодифосфат
12
3-Фосфоглицерат
12АТР
6ADP
12ADP
6ATP
Рибулозо-5-фосфат
6
12
1,3-Дифосфоглицерат
12NADPH
4Pi
12Pi
12NADP+
10
Глицеральдегид-3-фосфат
2
12
Глицеральдегид-3-фосфат
Глицеральдегид-3-фосфат
Глюконео генез
1 Глюкозо-6-фосфат
Pi
Общий баланс: 6CO2 + 18ATP + 12NADPH + 12H+
глюкозо-6-фосфат + 18ADP + 17Pi + 12NADP+
187
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 13.5. Цикл Кальвина
в ароматические аминокислоты; рибозо-5-фосфат — в нуклеотиды; гексозофосфаты — в полисахариды (последние три промежуточных соединения
формируются на стадии межмолекулярных перестроек). Так же, как и в других циклах, существуют анаплеротические реакции, не позволяющие циклу
прерываться.
Скорость цикла Кальвина строго регулируется, поскольку на фиксацию
СО2 не должно расходоваться чересчур много клеточной энергии. Основной
принцип регуляции цикла состоит в том, чтобы «подогнать» скорость фиксации СО2 к скорости световых реакций фотосинтеза, где образуются необходимые для фиксации АТР и NADPH. Поэтому, не смотря на то что цикл
Кальвина не требует непосредственного участия видимого света, наиболее
интенсивно он все же протекает в условиях освещения. Основной стадией,
лимитирующей скорость фиксации углекислоты, является карбоксилирование
рибулозодифосфата. Активность карбоксилазы значительно увеличивается
при освещении, чему способствуют следующие причины:
1) карбоксилаза аллостерически активируется фруктозо-6-фосфатом и ингибируется фруктозо-1,6-дифосфатом. В свою очередь, содержание этих продуктов контролирует фермент фруктозо-1,6-дифосфатаза, которая активируется светом и катализирует расщепление фруктозодифосфата;
2) еще одним аллостерическим активатором карбоксилазы является
NADPH, а его количество возрастает на свету при интенсивном нециклическом потоке электронов;
3) скорость рассматриваемой ферментативной реакции возрастает при повышении рН от 7 до 9. Фермент работает в строме, а ее защелачивание является следствием закисления люмена при создании протонного градиента на
тилакоидной мембране;
4) карбоксилаза активируется ионами марганца, которые высвобождаются
в строму при переносе протонов в люмен в процессе транспорта электронов.
Кроме этого, свет активирует еще один фермент цикла Кальвина —
глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, который, очевидно, меняет свою
специфичность (от NADH к NADPH) под действием света.
С4-путь фиксации СО2. Описанный выше процесс включения СО2 в состав 3-фосфоглицерата (результат карбоксилазной реакции рибулозодифосфат-карбоксилазы/оксигеназы) называется С3-путем, а растения, в которых
он осуществляется — С3-растениями. В то же время существует альтернативный С4-путь (цикл Хэтча—Слэка), отличающийся присутствием дополнительной начальной стадии — фиксации СО2 в составе четырехуглеродного
соединения (оксалоацетата). Эту реакцию катализирует фосфоенолпируваткарбоксилаза — фермент, работающий гораздо быстрее, чем рибулозодифосфат-карбоксилаза/оксигеназа. В результате у С4-растений углекислота включается в состав оксалоацетата намного эффективнее, чем у С3-растений в состав 3-фосфоглицерата. Однако С4-путь требует дополнительных стадий и
затрат энергии: на фиксацию одной молекулы СО2 здесь затрачивается 5 молекул АТР вместо 3 в С3-пути (рис. 13.6). Тем не менее, С4-растения (кукуруза, сахарный тростник, сорго, многие сорняки, произрастающие в умеренной
зоне и др.) растут го188
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Фосфоенолпиру ваткарбоксилаза
COOH
C
O
P
+
CO2 + H2O
COOH
C O
CH2
CH2
Фосфоенол пируват
COOH
Оксалоацетат
(через малат
или аспартат)
Пируват дикиназа
COOH
C
ATP + Pi
O
+
СО2
CH3
В цикл Кальвина
(карбоксилирование
рибулозодифосфата)
AMP + PPi
Рис. 13.6. Цикл Хэтча—Слэка (С4-путь фиксации СО2)
раздо быстрее, чем С3-растения (пшеница, рожь, овес, рис и др.). Причиной
такого несоответствия служит фотодыхание — расточительный процесс, характерный для всех С3-растений и практически отсутствующий у С4растений.
Фотодыхание. Этот процесс обязан существованию оксигеназной активности рибулозодифосфат-карбоксилазы/оксигеназы. Молекулярный кислород
конкурирует с СО2 за активный центр данного фермента, и часть рибулозодифосфата превращается в фосфогликолат (рис.13.4). Этого не происходит у
С4-растений, поскольку большинство их имеет своей родиной тропические
страны, где высокое испарение влаги заставило растения выработать механизм закрывания устьиц, через которые ткани вентилируются газами, в самые жаркие часы дня (при максимальном солнечном освещении). Чтобы такой механизм не привел к снижению скорости фиксации СО2, растения запасают углекислоту в составе малата или аспартата (образуются из оксалоацетата в цикле Хэтча—Слэка), а затем расходуют по мере надобности (реакции
декарбоксилирования). В этом случае концентрация СО2 в зеленых частях
растений всегда находится на высоком уровне и отсутствует конкуренция О2
за активный центр фермента, поскольку молекулярный кислород поступает в
клетки в ограниченных количествах при закрывании устьиц.
Субстратом фотодыхания служит гликолат, который образуется при дефосфорилировании фосфогликолата. При фотодыхании (в отличие от митохондриального дыхания, тоже характерного для растений в темноте) потребление О2 и выделение СО2 не связано с запасанием энергии, наоборот, здесь
189
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
расходуются восстановительные эквиваленты и ATP, а фиксированный в
цикле Кальвина углерод бесполезно теряется в виде СО2. Показано, что фотодыхание может приводить к реокислению и выделению до 50% углерода,
фиксированного в цикле Кальвина. До сих пор не разгадана целесообразность
этого столь неэкономного и ограничивающего эффективность роста растений
процесса.
Последовательность событий фотодыхания изображена на рис. 13.7.
Можно видеть, что отдельные стадии этого процесса осуществляются в разных органеллах. Итогом фотодыхания является образование одной
Рибулозодифосфат + О 2
Хлоропласт
Цикл
Кальвина
Фосфогликолат + 3-Фосфоглицерат
ADP
ATP
Pi
Гликолат
Глицерат
Глицерат
Гликолат
NAD+
NADH
+ О2
O
C H
Пероксисома
COOH
C
COOH
Глиоксилат
O
CH2OH
Гидроксипируват
+ NH3
Глицин
NH3
Серин
Митохондрия
Глицин + Глицин
ADP
1/2 O 2
ATP
CO2
Серин + NH 3
190
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 13.7. Фотодыхание
молекулы фосфоглицерата (3 атома «С») из двух молекул гликолата (4 атома
«С»), а участие кислорода приводит к окислению четвертого атома углерода в
углекислоту. По-видимому, назначение сложной последовательности превращений в фотодыхании состоит в том, чтобы вернуть в цикл хотя бы часть углерода из гликолата, который накапливается в избытке.
При фотодыхании происходит потеря одного атома углерода из каждых
четырех, причем следует учитывать, что на фиксацию этого атома углерода
уже затрачена энергия в цикле Кальвина. Кроме этого, при окислении глицина и дезаминировании серина выделяется аммиак, на включение которого в
состав аминокислот снова придется затрачивать энергию. В результате фотодыхание снижает потенциальную урожайность С3-растений на 30—40%.
13.2. Зрительное восприятие
Органы зрения представляют собой высокоразвитые рецепторы, в основе
функционирования которых лежат фотохимические реакции светочувствительных пигментов (фоторецепторов). Для улавливания наибольшего количества света фоторецепторами светочувствительные клетки глаза (палочки и
колбочки сетчатки) устроены особым образом: их внешние сегменты буквально «напичканы» специализированными мембранами, в которых и находятся рецепторные молекулы (рис. 13.8). Каждая такая клетка соединяется с
помощью посредника с аксонами зрительного нерва, в мембранах которых в
результате каскадных реакций в ответ на фотохимические превращения фоторецепторов возбуждаются нервные импульсы. Таким образом, свет различной длины волны, отражаемый объектами, расположенными на различном
расстоянии, воспринимается глазом и преобразуется в нервные импульсы. По
аксонам зрительного нерва эти импульсы поступают в особый отдел головного мозга (зрительную кору) и интерпретируются там, порождая изображение.
В палочках (высокочувствительные клетки сетчатки, отвечающие за
«черно-белое» зрение), в их внешнем, обращенном к окружающей среде сегменте, располагается порядка 500 параллельно уложенных дисков диаметром
~ 2 мкм (рис. 13.8). Каждый диск образован парой мембран, разделенных
узким пространством. Мембраны на 60% состоят из белка, основная часть
которого приходится на родопсин — светочувст-вительный хромопротеин.
Хромофором родопсина служит 11-цис-ретиналь, он через e-аминогруппу
остатка лизина связан с белковой частью — опсином (рис. 13.8). Родопсин
присутствует в мембранах дисков в виде трансмембранного белка.
При поглощении молекулой родопсина кванта света происходит изомеризация 11-цис-ретиналя в полностью транс-ретиналь (рис. 13.8). В результате
этой фотохимической реакции родопсин переходит в активную форму и стимулирует G-белок, циркулирующий в цитоплазме палочек. В свою очередь,
G-белок запускает каскад передачи сигнала, который и приводит к генерированию нервного импульса в мембранах нервных клеток.
191
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H3C
CH3
CH3
11
12
Свет
11-цис-ретиналь
H3C
CH3
C
Наружный
сегмент
O
H
hn
Мембранные
диски
H3C
CH3
CH3
CH3
11
H
C
O
12
CH3
ядро
Синапс
H3C
Полностью транс-ретиналь
CH3
CH3
11
12
Отростки
нервных
клеток
Связанная с белком
форма цис-ретиналя
CH3
H3C
HC
NH
Палочка сетчатки глаза
опсин
Рис. 13.8. Схематическое строение палочки. Родопсин. Изомеризация ретиналя из цис-формы в транс-форму
Транс-ретиналь характеризуется низким сродством к опсину, и спустя короткое время активированный родопсин диссоциирует на опсин и полностью
транс-ретиналь. Специальная ретиналь-изомераза катализирует превращение
транс-ретиналя в его цис-форму, после чего происходит самопроизвольная
ассоциация цис-ретиналя с опсином, обусловленная высоким сродством этих
структурных частей друг к другу, и снова образуется родопсин. Все перечисленные события циклически повторяются и известны под названием зрительный цикл (рис. 13.9).
192
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Для понимания механизма генерирования нервного импульса в ходе каскадных событий, вызванных изомеризацией ретиналя под действием
Родопсин*
(транс - ретиналь)
Стимуляция G - белка
hn
Родопсин
( 11-цис-ретиналь )
Активация GMP фосфодиэстеразы
Падение уровня cGMP
Транс - ретиналь + опсин
Закрывание катионных
каналов
Ретиналь изомераза
Гиперполяризация
мембраны палочки
Остановка выброса
нейромедиатора
11-цис-ретиналь
Генерация нервного
импульса в мембранах
нейронов
Рис. 13.9. Зрительный цикл и связанные со световой активацией родопсина
каскадные реакции, приводящие к генерации нервного импульса в мембранах
нейронов (родопсин* — активированная форма родопсина;
cGMP- циклический гуанозинмонофосфат)
света, следует учитывать некоторые особенности функционирования светочувствительных клеток. В мембране палочки находятся катионные насосы,
которые постоянно выкачивают ионы Na+ и Ca2+ из клетки, создавая на ней
ионный градиент. В темноте внутрь палочек постоянно течет поток ионов
натрия и кальция, которые пользуются cGMP-зависимыми каналами для возвращения в клетку согласно закономерностям облегченной диффузии. Эти
каналы остаются открытыми при связывании с ними циклического гуанозинмонофосфата (cGMP).
При освещении происходят следующие события. Активный родопсин, в
составе которого цис-ретиналь подвергнулся фотохимическому превращению
в полностью транс-ретиналь, связывается с G-белком. При этом в составе Gбелка GDP обменивается на GTP и белок диссоциирует на субъединицы, одна
из которых представляет собой активную GTP-a-субъединицу. Эта структура
активирует фермент сGMP-фосфодиэстеразу, которая катализирует гидролиз
193
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
циклического гуанозинмонофосфата. Уровень сGMP быстро понижается, что
приводит к перекрыванию катионных каналов. В результате концентрация
ионов Na+ и Ca2+ на внутренней поверхности мембраны палочки резко падает,
поскольку продолжают работать катионные насосы: происходит гиперполяризация клетки. Гиперполяризация замедляет высвобождение из палочек возбуждающего нейромедиатора (глутамата), и в ответ на это опосредованным
образом в аксонах зрительного нерва возникает потенциал действия (глава 4).
Активная GTP-a-субъединица G-белка существует очень непродолжительное время и инактивируется за счет гидролиза GTP. Образуется свободная a-субъединица, ассоциирующая с остальными субъединицами с образованием G-белка, способного снова перейти в активную форму за счет связывания с активным родопсином.
Бактериородопсин. Белок, похожий по структуре на родопсин глаза
(бактериородопсин), обнаружен в клетках некоторых архебактерий, где он
тоже используется для фоторецепции. Высокоспециализированная в физиологическом отношении группа галобактерий (Halobacterium, Halococcus, Natrococcus, Natrobacterium) содержит необычные пурпурные мембраны, окрашенные в ярко оранжевые — ярко красные тона за счет содержания в них
бактериородопсина. Эти бактерии уникальны тем, что способны за счет поглощения энергии света генерировать на мембране протонный градиент, который используется в качестве движущей силы при синтезе АТР. Другой отличительной особенностью галобактерий является способность развиваться в
концентрированных растворах солей (галофилия).
Бактериородопсин представляет собой интегральный белок пурпурной
мембраны, в которой он формирует полый цилиндр. Хромофором бактериородопсина служит ретиналь. В темноте ретиналь находится в полностью
транс-форме и его альдиминная группа (= N+H -) протонирована (рис. 13.8).
При освещении ретиналь перегруппировывается в 13-цис-форму, а альдиминная группа отдает протон, который через канал выводится на наружную
поверхность мембраны. Так на мембране создается протонный градиент. Закономерности синтеза АТР за счет энергии протонного градиента такие же,
как при окислительном фосфорилировании. Таким образом, бактериородопсин в пурпурных мембранах выполняет роль протонного насоса, приводимого
в действие светом.
Энергия, запасенная в ходе такого необычного способа «фотосинтеза»,
дополняет энергию, которую галобактерии запасают в ходе дыхания.
13.3. Биолюминесценция
Под биолюминесценцией понимают способность живых организмов испускать видимый свет. В основе данного явления лежит ферментативное
аэробное окисление веществ особого семейства, называемых люциферинами. Катализирующие этот процесс ферменты называют люциферазами.
Энергия, выделяющаяся в процессе окисления люциферинов, превращается в
энергию электронного возбуждения молекул, способных испускать ее в виде
фотонов. Свечение может иметь самые разные тона: от голубого до красного.
194
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
К биолюминесценции способны многие организмы: бактерии, грибы, простейшие, моллюски, насекомые (светляки), кишечнополостные животные,
ракообразные, рыбы и др. Люциферины этих организмов сильно различаются
по структуре и свойствам. Большинство из них испускают свет при окислении, взаимодействуя с О2. Однако некоторые люциферины, например такие,
как фотобелок медуз, активируются ионами кальция.
У светящихся бактерий роль люциферина выполняет FMNH2. При его
окислении в присутствии альдегида с длинной цепью (не менее 8 атомов углерода) происходит одновременное окисление альдегида в карбоновую кислоту и люциферина в FMN:
FMNH2 + O2 + R—CHO + люцифераза ®
® FMN + H2O + R—COOH + фотон
Эта реакция протекает, видимо, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида, а свечение характеризуется длиной волны ~490 нм.
Светящиеся организмы могут использовать явление биолюминесценции
для опознавания особей своего вида, приманки добычи, в качестве брачных
сигналов, отпугивания хищников и отвлечения их внимания, для «высвечивания» жертвы и т. д. Менее понятна роль биолюминесценции для низкоорганизованных организмов, например бактерий.
Существует точка зрения, согласно которой биолюминесценция возникла
на стадии перехода от анаэробных форм жизни к аэробным как защитная
реакция по отношению к мощному окислителю — молеку-лярному кислороду.
195
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Часть четвертая. МЕТАБОЛИЗМ.
ПРОЦЕССЫ, ТРЕБУЮЩИЕ ПРИТОКА ЭНЕРГИИ
Глава 14. ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА.
БИОСИНТЕЗ УГЛЕВОДОВ
Биосинтез клеточных веществ составляет одну из основных «затратных
статей» метаболизма: на эти нужды расходуется самая большая доля энергии,
запасенной в составе АТР, восстановительных эквивалентов и строительных
блоков. Биосинтетические реакции относят к анаболизму, особенности которого и взаимосвязь с другими гранями метаболизма описана в главе 8. К этой
информации стоит добавить еще несколько важных закономерностей биосинтетических процессов: 1) пути биосинтеза сложных клеточных соединений
часто осуществляются параллельно соответствующим путям катаболизма, в
которых формируются строительные блоки — предшественники биосинтеза.
Однако последовательности реакций в этих взаимообращенных путях никогда полностью не совпадают, так же как не совпадают наборы ферментов,
принимающих участие в этих процессах; 2) регуляция путей биосинтеза и
катаболитных процессов осуществляется независимо, на уровне разных ферментов; 3) вступление веществ в пути биосинтеза требует их активации, что
чаще всего осуществляется в ходе фосфорилирования при участии АТР;
4) процессы биосинтеза родственных по структуре и функциям соединений
часто представляют собой «разветвленные» пути, в которых продукт одной
серии реакций становится субстратом для синтеза других продуктов; 5) роль
предшественников в биосинтезе большинства клеточных веществ выполняет
ограниченное количество субстратов, которые образуются в ходе основных
катаболических и анаболических процессов и принадлежат к ключевым
промежуточным соединениям клетки.
Большинство перечисленных закономерностей биосинтеза можно обнаружить, например, при сравнении процессов гликолиза и глюконеогенеза.
Последний будет рассмотрен в данной главе.
14.1. Закономерности обмена и биосинтеза моносахаридов
Ключевым промежуточным соединением в обмене углеводов можно назвать глюкозо-6-фосфат. Это вещество может образовываться из экзогенной
глюкозы при ее фосфорилировании в процессе транспорта через мембраны
или сразу после этого. Кроме того, глюкозо-6-фосфат образуется в клетках
автотрофных организмов, способных к фиксации СО2, в процессе глюконео196
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
генеза из глицеральдегид-3-фосфата (рис. 13.5). Другими источниками глюкозо-6-фосфата являются: пируват (образуется в результате большинства катаболитных путей расщепления углеводов), некоторые промежуточные продукты ЦТК, углеродные скелеты гликогенных аминокислот, лактат (продукт
молочнокислого брожения), глицерол (образуется при расщеплении липидов).
Все эти вещества могут вовлекаться в процесс глюконеогенеза — синтеза
глюкозы из неуглеводных предшественников. Кроме этого, в клетках растений и многих микроорганизмов глюкоза может образовываться из ацетилСоА — продук-та расщепления жирных кислот. В этом случае используются
два специфических фермента глиоксилатного цикла, отсутствующие в клетках высших животных. Эти ферменты (изоцитрат-лиаза и малат-синтаза)
участвуют в превращении ацетил-СоА в сукцинат, который затем преобразуется в оксалоацетат (рис. 11.7) и вступает в процесс глюконеогенеза. Наконец, еще одним источником глюкозы, а значит, и глюкозо-6-фосфата являются резервные полисахариды.
Расходуется глюкозо-6-фосфат в клетках следующим образом. Во-первых,
он является субстратом разнообразных катаболических путей, в которых запасается энергия, образуются восстановительные эквиваленты и строительные блоки (глава 9). Во-вторых, глюкозо-6-фосфат способен изомеризоваться
в глюкозо-1-фосфат и служить субстратом для биосинтеза гликогена либо
иных запасных и структурных полисахаридов. Глюкозо-6-фосфат может дефосфорилироваться с образованием глюкозы, которая способна трансформироваться в клетках в другие моносахариды, например галактозу, маннозу,
фруктозу, глюкуроновую кислоту. Названные соединения принимают участие
в процессах образования сложных полисахаридов клеточных стенок или других структур.
Большинство перечисленных выше способов образования и расходования
моносахаридов уже охарактеризовано в предыдущих разделах. Здесь внимание будет уделено одному из центральных путей образования ключевого продукта углеводного обмена (глюкозо-6-фосфата) —глюконеогенезу.
Глюконеогенез. Этот процесс характерен для представителей всех царств
живых организмов, но наиболее важное значение имеет для клеток высших
животных. Дело в том, что эмбриональные ткани, мозг, семенники, эритроциты в качестве источника углерода способны использовать только Dглюкозу. Если в рационе недостает углеводов, в печени индуцируется распад
гликогена, но и этого источника может оказаться недостаточно (мозг человека в сутки потребляет более 120 г глюкозы). В таком случае глюкоза синтезируется в организме из неуглеводных предшественников в ходе глюконеогенеза. Наиболее активно глюконеогенез осуществляется у животных в клетках
печени и почек.
Реакции глюконеогенеза в большой степени тождественны обратным реакциям гликолиза, и многие из них катализируются теми же ферментами,
которые задействованы в гликолизе (риc. 14.1).
Итак, в гликолизе имеется три практически необратимые реакции, взамен
которых в глюконеогенезе существуют обходные пути. Первый обходной
путь представляет собой превращение пирувата в фосфоенол197
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
АТР
Глюкоза
Обходной
путь
Глюкозо-6-фосфат
Гликолиз
Фруктозо-6-фосфат
АТР
Обходной
путь
Фруктозо-1,6-дифосфат
Фруктозодифосфатальдолаза
Глицеральдегид-3-фосфат
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
+
Дигидроксиацетонфосфат
Триозофосфатизомераза
Глюконеогенез
Глюкозофосфатизомераза
1,3-Дифосфоглицерат
ADP
ФосфоглицеАТР раткиназа
3-Фосфоглицерат
Фосфоглицератмутаза
2-Фосфоглицерат
Енолаза
Фосфоенолпируват
ADP
Обходной
путь
Пируват
Рис. 14.1. Последовательность реакций гликолиза (пунктирные стрелки) и
глюконеогенеза (сплошные стрелки). Подписаны названия ферментов, общих
для двух путей. Стадии, по которым процессы различаются, обозначены в глюконеогенезе, как обходные пути
пируват. Для непосредственного перевода пирувата в фосфоенолпируват недостаточно энергии расщепления АТР, поэтому данная стадия осуществляется в ходе нескольких реакций. Вначале пируват, образующийся преимущест198
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
венно в цитоплазме (из лактата, аминокислот, в гликолизе), переводится в
митохондрии и там карбоксилируется в оксалоацетат (рис. 14.2). Катализирует реакцию пируваткарбоксилаза, использующая в качестве кофактора биотин. Эта анаплеротическая реакция и характеристика свойств фермента описаны в разделе 11.2.
Оксалоацетат в митохондриях восстанавливается в малат (митохондриальная малатдегидрогеназа), который с помощью специфических переносчиков транспортируется в цитоплазму. В цитоплазме малат вновь окисляется в
оксалоацетат (цитоплазматическая малатдегидрогеназа), который с помощью
GTP-зависимой фосфоенолпируваткарбоксилазы декарбоксилируется в фосфоенолпируват (РEP).
Второй обходной путь в глюконеогенезе представляет собой превращение
фруктозодифосфата во вруктозо-6-фосфат (рис. 14.2). В гликолизе фосфофруктокиназная реакция, сопровождающаяся гидролизом АТР, является необратимой.
В
глюконеогенезе
функционирует
другой
фермент —
фруктозодифосфатаза, которая катализирует практически необратимое отщепление фосфатной группы от первого атома углерода. Фруктозодифосфатаза, как и пируваткарбоксилаза, является аллостерическим ферментом. Его
активность ингибируется с помощью АМР и активируется при участии АТР.
Третий обходной путь — дефосфорилирование глюкозо-6-фосфата, не
может произойти с помощью прямого обращения гексокиназной реакции. Эту
реакцию катализирует глюкозо-6-фосфатаза, которая локализована на внутренней поверхности мембран гладкого эндоплазматического ретикулума
(ЭР). Поэтому для осуществления данной реакции глюкозо-6-фосфат транспортируется в ЭР, где дефосфорилируется в свободную глюкозу (рис. 14.2).
Следует отметить, что глюкозо-6-фосфатаза отсутствует в таких тканях, как
мышцы и мозг, поэтому они не могут поставлять в кровь свободную глюкозу.
Суммарное уравнение глюконеогенеза выглядит следующим образом:
2Пируват + 4АТР + 2GTP +2NADH + 2H+ + 4H2O ®
® Глюкоза + 2NAD+ + 4ADP + 2GDP + 6 Pi
Из приведенного баланса следует, что на образование одной молекулы
глюкозы в процессе глюконеогенеза расходуется шесть высокоэнергетических фосфатных связей, а также две молекулы NADH. Важно отметить, что
регуляция скорости синтеза глюкозы в этом пути осуществляется с помощью
ферментов, не принимающих участие в гликолизе. При этом глюконеогенез
наиболее интенсивно протекает в условиях повышенного содержания в клетке
топливных молекул, в частности ацетил-СоА, и достаточного количества
АТР.
Глицерол включается в путь глюконеогенеза через дигидроксиацетонфосфат, в который он превращается после фосфорилирования (с участием АТР) и
дегидрирования.
Аминокислоты поступают в путь через такие метаболиты, как пируват и
оксалоацетат, образующиеся в ходе перестроек их углеродных скелетов. Лактат перед вступлением в глюконеогенез должен окислиться до пирувата.
199
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Первый обходной путь:
COOCOO-
Пируваткарбоксилаза
Малатдегидрогеназа
C O
C O + СО2
CH3
COOH
CH2
ATP
CH2
COO-
ADP
Пируват
OH
C
NADH
COOМалат
NAD+
Оксалоацетат
Митохондрия
COO-
COOCO2
+
C
O
РЕР-карбоксикиназа
P
C O
COO-
Малатдегидрогеназа
H
CH2
Фосфоенолпируват
GTP
GDP
COO-
NADH
OH
C
CH2
CH2
NAD+
COOМалат
Оксалоацетат
Цитоплазма
Второй обходной путь:
P OCH2 O
CH2O P
HO
H
P OCH2 O
Фруктозо-1,6дифосфатаза
OH
H
Pi
OH
Н 2О
Фруктозо-1,6-дифосфат
HO
CH2OH
OH
OH
Фруктозо-6-фосфат
Третий обходной путь:
Эндоплазматический
P OCH2
H
HO
O
OH H
OH
H
HO CH2
Глюкозо-6фосфатаза
Н 2О
O OH
H
Pi
H
OH
Глюкозо-6-фосфат
HO
OH
H
H
OH
H
Глюкоза
ретикулум
Рис. 14.2. Реакции обходных путей в глюконеогенезе
200
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
14.2. Биосинтез полисахаридов
Полисахариды синтезируются из моносахаридов с соблюдением ряда закономерностей. Во-первых, моносахаридные единицы активируются первоначально путем фосфорилирования, катализируемого киназой. Затем моносахаридное звено акцептируется одним из нуклеозиддифосфатов, а образующийся сахаронуклеотид выполняет роль переносчика гликозильного остатка
(нуклеотидной «ручки») на удлиняющуюся цепь полисахарида.
Биосинтез гликогена. Предшественниками для биосинтеза гликогена
могут служить как свободная глюкоза, так и глюкозо-6-фосфат. В первом
случае глюкоза фосфорилируется киназой с образованием глюкозо-1фосфата, во втором — глюкозо-6-фосфат изомеризуется с участием фосфоглюкомутазы в глюкозо-1-фосфат (рис. 14.3).
Следующую стадию (образование сахаронуклеотида) катализирует пирофосфорилаза, причем у высших животных гликозильные остатки переносятся
на уридиндифосфат (UDP), а в клетках растений и микроорганизмов эту роль
выполняют ADP, CDP или GDP. На схемах (рис. 14.3, 14.4) показан процесс
синтеза гликогена у животных, и пирофосфорилаза здесь носит название
глюкозо-1-фосфат-уридилтрансфераза.
На следующем этапе гликозильная группа UDP-глюкозы переносится на
концевую часть цепи гликогена (у нередуцирующего конца) и формируется
очередная a(1®4)-гликозидная связь между первым атомом углерода добавляемого остатка глюкозы и кислородом гидроксила у четвертого атома углерода концевого остатка глюкозы цепи. Данную реакцию катализирует гликогенсинтетаза. С помощью этого фермента происходит постепенное удлинение
линейных цепей гликогена, однако не может осуществиться образование точек ветвления, характерных для молекул гликогена (рис. 14.3). Функцию образования
«ветвей»
гликогена
катализирует
другой
фермент —
трансгликозилаза.
После того как линейная цепь гликогена достигнет длины примерно в 10
остатков глюкозы, трансгликозилаза атакует гликозидную связь в каком-либо
месте цепи и переносит концевой олигосахаридный фрагмент, содержащий
6—7 гликозильных звеньев, на свободную 6-гидроксильную группу остатка
глюкозы той же или другой цепи. Так катализируется образование a(1®6)гликозидной связи, и в молекуле гликогена появляется точка ветвления
(рис. 14.4). Аналогичным образом в клетках растений осуществляется синтез
крахмала.
Биосинтез, а также распад гликогена регулируются у высших организмов
гормонами. В частности, у животных в этих процессах принимают активное
участие адреналин и глюкагон. При повышении их концентрации в крови
количество гликогена уменьшается и, соответственно, увеличивается количество глюкозы.
Биосинтез муреина. В отличие от гликогена, биосинтез которого протекает внутри клетки, муреин, являясь компонентом клеточной стенки бактерий, синтезируется с участием нескольких стадий, осуществляющихся вне
клетки — на наружной поверхности плазматической мембраны. При этом
201
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
клетка вынуждена транспортировать через мембрану отдельные структурные
компоненты муреина, для чего существует специальный механизм.
Непосредственным предшественником биосинтеза муреина служит Nацетилглюкозамин, и первые этапы биосинтеза происходят с соблю- дением уже описанных закономерностей, включая фосфорилирование
CH2OH
CH2OH
O
O
OH
Глюкоза
OH
Киназа
OH
HO
OH ATP
HO
OH
CH2OH
O
ADP
OH
OH
Глюкозо-1-фосфат
CH2O P
O
OP
HO
-
P O
HN
O
UTP
PPi
-
O
Фосфоглюко мутаза
O
O
O
Глюкозо-1-фосфатуридилтрансфераза
O
P
O
O
CH2
N
O
OH
OH
HO
OH OH
Уридиндифосфат-глюкоза
OH
Глюкозо-6-фосфат
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
O
O
O
O
HO
OH
+ UDP-глюкоза
OH 1
OH 2
OH 3
OH
Цепь гликогена (glc)3
OP
OH
Гликогенсинтетаза
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
O
O
O
OH 3
OH 4
O
HO
OH
OH 2
OH 1
O
O
OH
OH
Цепь гликогена (glc)3+1
+ UDP
OP
OH
Рис. 14.3. Биосинтез линейных цепей гликогена
202
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
O
O
O
n...O
OH 4
OH
O
O
OH
OH 1
OH 2
3
O
OH
OP
OH
OH
Линейная цепь гликогена
Трансгликозилаза
CH2OH
O
n...O
OH 4
O
HO
a(1
6)-гликозидная связь
3
OH
OH 1
2
O
O
HO
O
O
O
OH
CH2OH
CH2OH
CH2
OH
OH
OP
OH
Цепь гликогена с точкой ветвления
Рис. 14.4. Образование точек ветвления гликогена
предшественника и его перенос на остаток UDP (рис. 14.5). В результате этих
реакций формируется UDP-N-ацетилглюкозамин (UDP-NAG).
На следующем этапе UDP-NAG трансформируется во второй компонент
этого гетерополимера — UDP-N-ацетилмурамовую кислоту (UDP-NAM). Для
этого к молекуле UDP-NAG присоединяется остаток молочной кислоты при
взаимодействии с фосфоенолпируватом (РЕР). Далее к UDP-NAM добавляются последовательно остатки пяти аминокислот, и образуется UDP-Nацетилмурамилпентапептид (рис. 14.5).
Пентапепидная цепь в составе UDP-N-ацетилмурамилпентапептида строится необычным образом: образование пептидных связей здесь происходит за
счет энергии АТР с участием специальных ферментов. Такой пептид (содержащий D-аминокислоты и g-пептидную связь) не может быть синтезирован
обычным путем на рибосомах.
Сформированный N-ацетилмурамилпентапептид переносится с помощью
фермента от UDP на связанный с мембраной липидный переносчик —
гидрофобную молекулу, способную совершать челночные перемещения через
мембрану. После этого к NAM-пептидной единице, связанной с липидным
203
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
переносчиком, присоединяется NAG (его донором служит образованный
ранее UDP-NAG) и формируется дисахаридное
NAG + ATP
NAG-1-фосфат + ADP
+ UTP
O
UDP-NAG + PPi
HN
+ PEP
-
CH2OH
O O
O
O
P O
P O
O
O
O
O
N
CH2
O
-
+
Pi
HO
H3C
CH
NH
COO-
C=O
OH
OH
UDP-NAM
CH3
+ L-ala (ATP)
+ D-isoglu (ATP)
+ L-lys (ATP)
+ D-ala-ala (ATP)
O
HN
-
CH2OH
O
O
P O
P O
O O
O
O
O
O
N
CH2
O
-
HO
H3C
CH
NH
C O
COCH3
HN
CH
C
OH
D-isoglu
L-lys
OH
D-ala
D-ala
CH3 O
L-ala
UDP-N-ацетилмурамилпентапептид
Рис. 14.5. Биосинтез муреина. Стадии, ведущие к образованию UDP-N-
ацетилмурамилпентапептида (объяснения в тексте).
204
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
звено. Структура b(1®4)-гликозидной связи между моносахаридными единицами
представлена на рис. 5.4. Наконец, на e-аминогруппе остатка лизина в пентапептиде выстраивается пентаглициновый мостик (рис. 14.6).
Образовавшееся дисахарид-пептидное звено переносится от липидного
переносчика на растущую полисахаридную цепь (рис. 14.6). На последнем
этапе отдельные полисахаридные цепи поперечно связываются пентаглициновыми мостиками (реакция транспептидирования, катализируемая ферментом гликопептид-транспептидазой). В ходе этой реакции концевая аминогруппа пентаглицинового мостика атакует пептидную связь между двумя остатками D-аланина в пентапептиде другой дисахаридной единицы. Так возникает пептидная связь между концевым остатком глицина и остатком D-ala.
При этом второй (концевой) остаток D-ala высвобождается. Данная реакция
осуществляется уже вне клетки и не требует участия АТР, поскольку протекает за счет энергии гидролизу- емой связи D-ala—D-ala. Сформировавшаяся
структура представлена на рис. 5.6.
Липидный
переносчик
UDP-N-ацетилмурамилпентапептид +
Липидный
переносчик
NAM-пептидное звено
+ UDP-NAG
+ пентаглицин
Липидный
переносчик
NAG-NAM
L-ala
D-isoglu
L-lys
gly-gly-gly-gly-gly-NH3
D-ala
D-ala
COO+
полисахаридная цепь
(NAG-NAM-пептид)n
(HO-NAG-NAM-пептид
NAG-NAM-пептид
NAG-NAM-пептид)n+1
205
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 14.6. Биосинтез муреина. Образование дисахарид-пептидного звена и наращивание цепи (объяснения в тексте)
Процесс биосинтеза муреина подвержен ингибирующему действию со
стороны некоторых антибиотиков. В частности, b-лактамные антибиотики
ковалентно связываются с активным центром гликопептид-транспептидазы,
вызывая ее необратимое ингибирование (глава 18). В таком случае не может
осуществиться последняя стадия биосинтеза —образование поперечных сшивок между тетрапептидами. Бацитрацин блокирует регенерацию липидного
переносчика, останавливая синтез клеточной стенки.
Большинство экзополисахаридов синтезируется с соблюдением описанных для биосинтеза муреина закономерностей: участие нуклеозиддифосфатов, липидных переносчиков, сборка полисахаридных молекул из дисахаридных звеньев на поверхности клетки с помощью внеклеточных ферментов.
206
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 15. БИОСИНТЕЗ ЛИПИДОВ
Обмен липидов в клетках разных организмов включает два противоположно направленных процесса: биосинтез и деградацию. При этом ключевыми промежуточными соединениями данных процессов служат ацетил-СоА и
глицерол. Ацетил-СоА образуется на каждой стадии b-окисления жирных
кислот (глава 9) и используется в качестве предшественника при их биосинтезе. Глицерол может образовываться при разложении липидов, а также при
модификации промежуточных продуктов гликолиза (например дигидроксиацетонфосфата).
Обмен липидов осуществляется довольно интенсивно, что связано в первую очередь с процессами мембраногенеза (изменение структуры мембран,
синтез новых компонентов). Кроме этого, некоторые организмы используют
жиры (триацилглицеролы) в качестве основного резервного вещества. Например, у животных триацилглицеролы синтезируются и накапливаются в
специализированных клетках жировой ткани. В организме мужчины со средней массой присутствует до 12 кг запасных липидов, которые могут обеспечить поддержание основного обмена в течение 8 недель, в то время как запасов гликогена (несколько сотен грамм) хватает для обеспечения потребности
организма в энергии не более чем на 12 ч. Растения (особенно в составе плодов, семян) и многие микроорганизмы также способны синтезировать в качестве запасных питательных веществ триацилглицеролы.
15.1. Биосинтез насыщенных жирных кислот
Биосинтез жирных кислот осуществляется в цитоплазме эукариотических
клеток, у животных — в основном в клетках печени, жировой ткани, почек,
легких. Непосредственным предшественником их синтеза является малонилСоА, который образуется из ацетил-СоА. В свою очередь, основное количество ацетил-СоА образуется в матриксе митохондрий при окислительном декарбоксилировании пирувата, в процессе b-окисления жирных кислот, при
расщеплении углеродных скелетов аминокислот. Будучи заряженным соединением, ацетил-СоА не может преодолеть мембранный барьер митохондрий,
и для транспорта ацетильных групп в цитоплазму существует специальный
«челночный механизм» (рис. 15.1). С помощью этого механизма ацетильные компоненты попадают в цитоплазму в составе цитрата, который расщепляется, образуя ацетил-СоА (при участии АТР и СоА) и оксалоацетат. Последний восстанавливается в малат и возвращается в матрикс митохондрий,
где регенерируется цитрат.
207
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Цитрат
Цитрат
СоА
ATP + CoA
Ацетил - СоА
ADP + Pi
Оксалоацетат
+
Ацетил -СоА
Оксалоацетат
NADH
NADH
NAD+
NAD+
Малат
Митохондрия
Малат
Цитоплазма
Синтез
жирных
кислот
Рис. 15.1. Перенос ацетильных компонентов через мембрану
митохондрий при участии «челночного механизма»
Оказавшись в цитоплазме, ацетил-СоА подвергается карбоксилированию
с участием ключевого фермента биосинтеза жирных кислот —ацетил-СоАкарбоксилазы. В результате этой АТР-зависимой реакции формируется малонил-СоА (рис. 15.2). Простетической группой ацетил-СоА-карбоксилазы
служит биотин. Он выполняет роль «подвижной руки», переносящей СО2 на
молекулу ацетил-СоА. Реакция осуществляется в две стадии (рис. 15.2, см.
также главу 7, рис. 7.7). Стадия образования малонил-СоА лимитирует скорость всего процесса синтеза жирных кислот, поскольку на уровне ацетилСоА-карбоксилазы осуществляется регуляция данного пути: основным аллостерическим активатором фермента является цитрат. Этот метаболит образуется в митохондриях в большом количестве, когда там много ацетил-СоА,
т. е. ЦТК перегружен «топливом», и его избыток должен запасаться в виде
триацилглицеролов. В таком случае цитрат выходит в цитоплазму, выступая
там одновременно в роли донора ацетил-СоА и активатора ацетил-СоАкарбоксилазы. Связывание цитрата с неактивными мономерами ацетил-СоАкарбоксилазы приводит к их соединению в нитевидный олигомер, который
приобретает функциональную активность. Кроме этого, активность ацетилСоА-карбоксилазы регулируется в ходе ковалентной модификации: понижается при фосфорилировании и повышается при дефосфорилировании.
Образующийся в цитоплазме малонил-СоА служит источником большинства атомов углерода в молекулах жирных кислот. Формирование пальмитиновой кислоты, включающей 16 атомов углерода, происходит согласно
уравнению 15.1.
208
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
карбоксибиотин-фермент
CО2 + биотин-фермент
1
ATP
+ ацетил-СоА
ADP
O
Биотин-фермент + HOOC CH2 C SCoA
Малонил-СоА
O
cys
2
+ ацетил-СоА
E
cys
АПБ-ацилтрансфераза
SH
S
C CH3
E
CoA
+
pan SH
pan SH
АПБ-малонилтрансфераза + малонил-СоА
Синтаза ЖК
O
cys
SH
E
cys
3-КетоацилАПБ-синтаза
O
C CH3
+
E
O
C CH2 COOH
pan S
CO2
Ацетоацетил-
CoA
O
C CH2 C CH3
pan S
S
NADPH
3-КетоацилАПБ-редуктаза
NADP+
cys
Еноил-АПБдегидратаза
SH
E
O
pan S
OH
C CH2 CH CH3
O H
pan S
C C
транс-еноилЕноил-АПБредуктаза
NADP+
C CH2 CH2 CH3
cys
АПБ-ацилтрансфераза
E
SH
E
pan SH
новый цикл реакций,
начиная с присоединения
малонил - СоА
C CH3
H
NADPH
O
S
SH
E
Н2О
3-гидроксиацил-
cys
cys
O
pan S
C CH2 CH2 CH3
ацил-
Рис. 15.2. Биосинтез жирных кислот: 1 — образование малонил-СоА; 2 —
конденсация компонентов и наращивание цепи на синтазе жирных кислот (Е)
209
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Ацетил-СоА + 7 малонил-СоА + 14 NADPH + 14 H+ ®
(15.1)
® Пальмитат + 7 СO2 + 8 CoA + 14 NADP+ + 6 H2O
Удлинение цепи жирной кислоты происходит поэтапно, в ходе присоединения к ацетил-СоА двухуглеродных группировок, с участием сложной ферментной системы, называемой синтазой жирных кислот. Синтаза жирных
кислот представляет собой гомодимер, т. е. состоит из двух идентичных полипептидных цепей, объединенных в комплекс. Каждая из двух частей может
катализировать 7 последовательных реакций наращивания жирнокислотной
цепи, при этом соблюдается согласованность действий частей и фермент активен только в виде димера.
В составе каждой части синтазы жирных кислот присутствуют необходимые для связывания субстратов сульфгидрильные группы. Одна SH-группа
находится в составе фосфопантетеина (рис. 7.9) — простети-ческой группы
одного из доменов синтазы, называемого ацилпереносящим белком (АПБбелок). Вторая SH-группа принадлежит остатку цистеина в другом домене
фермента — 3-кетоацил-АПБ-синтазе.
Активность мультиферментного комплекса пространственно распределена по нескольким доменам, которые участвуют в катализе семи реакций, требующихся для построения молекулы пальмитата и высвобождения продукта
из комплекса с ферментом.
Первые этапы образования жирнокислотной цепи (рис. 15.2, 2) заключаются в переносе ацильного остатка на сульфгидрильную группу цистеина
(cys-SH), а малонильного остатка — на сульфгидрильную группу фосфопантетеина (pan-SH). Оба остатка располагаются в молекуле синтазы (Е) довольно близко друг к другу. Когда обе SH-группы заняты ацильными остатками,
происходит удлинение цепи вследствие переноса ацильного компонента на
второй атом углерода малонильного остатка, в ходе чего происходит отщепление карбоксильной группы в виде СО2. Это та молекула углекислоты, которая включилась в состав малонил-СоА при карбоксилировании ацетил-СоА.
Таким образом, фиксация СО2 (включение в состав органического вещества)
при биосинтезе жирных кислот не происходит! Декарбоксилирование необходимо, чтобы сдвинуть равновесие реакции вправо, поскольку при отщеплении СО2 резко возрастает реакционная способность оставшегося ацетильного
компонента, который легко конденсируется с остатком ацетил-СоА, присоединенным к SH-группе фосфопантетеина.
Следующие три реакции представляют собой восстановление 3кетогруппы, дегидратацию и восстановление двойной связи в остатке еноила.
После этого ацилтрансфераза переносит ацильный остаток (промежуточный
продукт, результат удлинения цепи на 2 атома углерода) на SH-группу цистеина, а освободившаяся SH-группа фосфопантетеина готова вновь акцептировать малонильный остаток.
После семи таких циклов формируется 16-углеродный пальмитоил, связанный с сульфгидрильной группой фосфопантетеина. Его распознает и отщепляет от синтазы ацил-АПБ-гидролаза, в среду высвобождается конечный
продукт — пальмитиновая кислота.
Пальмитиновая кислота используется в качестве предшественника для
210
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
синтеза других насыщенных жирных кислот с более длинной цепью. Эти
процессы осуществляются у эукариот в митохондриях и в эндоплазматическом ретикулуме. К активированным СоА-эфирам жирных кислот добавляются ацетильные остатки, донорами которых служит ацетил-СоА или малонил-СоА.
15.2. Образование ненасыщенных жирных кислот
Ненасыщенные жирные кислоты синтезируются из насыщенных с соответствующей длиной цепи. Образование двойной связи у аэробных организмов катализируется ферментом ацил-СоА-оксигеназой, и окисление происходит согласно реакции
Пальмитоил-СоА + NADPH + H+ + O2 ®
® Пальмитолеил-СоА + NADP+ + 2 H2O
В этом процессе одновременно окисляются два разных субстрата: жирная
кислота (возникает двойная связь) и NADPH, его катализируют монооксигеназы, называемые десатуразами. Известен и другой механизм образования
двойных связей в молекулах жирных кислот, не требующий участия молекулярного кислорода. Например, в клетках E.coli синтез пальмитолеиновой кислоты начинается еще на синтазе жирных кислот со стадии образования
двойной связи в составе С10-фрагмента. В этой реакции принимает участие
особый фермент, присутствующий в клетках кишечной палочки, — bоксидеканоилтиоэфирдегидратаза, который катализирует формирование цисb,g-двойной связи, а не транс-a,b-, как это имеет место на стадии образования еноил-производного при синтезе насыщенных жирных кислот. Затем
происходит удлинение ненасыщенного фрагмента до С16- и С18-производных.
У животных и растений введение в молекулу насыщенной жирной кислоты первой двойной связи осуществляется в цитозоле довольно легко. Образование дополнительных двойных связей у растений происходит в эндоплазматическом ретикулуме, а у животных не происходит вообще. Поэтому полиненасыщенные жирные кислоты (линолевая, линоленовая) являются для животных, в частности млекопитающих, незаменимыми компонентами и должны
поступать в организм с пищей (растительного происхождения). Эти жирные
кислоты служат субстратами для построения других полиненасыщенных
жирных кислот. Недостаток линолевой и леноленовой кислот в рационе животных приводит к торможению роста, поражению кожных покровов и почек,
нарушению функции размножения.
15.3. Биосинтез полярных и неполярных липидов
Биосинтез липидов в клетках эукариот осуществляется на мембранах
гладкого эндоплазматического ретикулума. Большинство ферментов, принимающих участие в этих процессах, ассоциированы с его мембранами и представляют собой липопротеины.
Основными предшественниками для синтеза нейтральных липидов (триацилглицеролов), а также полярных фосфо- и гликолипидов служат активиро211
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ванные жирные кислоты и глицерол-3-фосфат. Активация жирных кислот
происходит в следующей реакции:
Жирная кислота + АТР + СоА ® Ацил-S-СоА + АМР + PPi
Глицерол-3-фосфат образуется либо при прямом фосфорилировании за
счет АТР при участии глицеролкиназы, либо при восстановлении промежуточного продукта гликолиза — дигидроксиацетон-3-фосфата ферментом 3глицерофосфатдегидрогеназой, использующей в качестве кофермента NADH.
Биосинтез неполярных липидов. Если биосинтез триацилглицеролов
осуществляется de novo (из глицеролфосфата и жирных кислот), то на первой
стадии происходит последовательное ацилирование двух свободных гидроксильных групп молекулы глицерол-3-фосфата (рис. 15.3). При этом в реакции этерификации СоА-эфиром жирной кислоты по первому
O
CH2
OH
CH
OH
3-ГлицерофосфатО-ацилтрансфераза
+ ацил-S-CoA
CH2 O P
Глицерол-3-фосфвт
CH2
O
CH
OH
CH2
OP
C
R1
+ CoA
Лизофосфатид
1-Ацил-3-глицерофосфатО-ацилтрансфераза
+ ацил-S-CoA
O
CH2
O
C
R1
CH
O
C
R2
CH2
OPO
+
CoA
Фосфатидат
Фосфатидат фосфатаза
O
O
CH2
CoA + CH
CH2
O
C
R1
O
C
R2
O
O
C
R3
Диацилглицерол-О- CH
2
ацилтрансфераза
CH
+ ацил-S-CoA
CH2
O
C
R1
O
C
R2
+
Pi
OH O
Диацилглицерол
O
Триацилглицерол
Рис. 15.3. Биосинтез триацилглицеролов: R1, R2, R3 —
углеводородные цепи жирных кислот
212
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
атому углерода глицерол-3-фосфата вначале формируется моноацилглицерол-3-фосфат (лизофосфатид), а затем — диацилглицерол-3-фосфат (фосфатидат).
На следующей стадии происходит гидролитическое отщепление фосфатной группы от молекулы фосфатидата и образуется 1, 2-диацилглицерол, который взаимодействует с третьим СоА-производным жирной кислоты, в результате чего формируется триацилглицерол (триглицерид).
Кроме описанной схемы, синтез нейтральных липидов может осуществляться с участием в качестве предшественников продуктов расщепления липидов, попадающих в организм с пищей. Эти процессы особенно интенсивны
в слизистой кишечника животных. Нейтральные жиры расщепляются в пищеварительном тракте панкреатическими липазами до жирных кислот и 2моноацилглицеролов, которые всасываются слизистой кишечника. В клетках
слизистой оболочки происходит последовательное ацилирование 2моноацилглицерола СоА-эфирами жирных кислот с образованием триацилглицеролов. Эти реакции катализируют особые ацилтрансферазы.
Триглицериды, как уже отмечалось, являются основными запасными веществами в клетках животных и некоторых других организмов. Особое значение они имеют для впадающих в спячку и мигрирующих на далекие расстояния животных. Например, верблюды запасают триацилглицеролы в горбу
и используют их как источник воды, которая образуется при окислении. У
полярных животных (тюленей, моржей и др.) триглицериды часто выполняют
функцию теплоизолятора. Некоторые животные используют неполярные липиды для регулирования плавучести. Например, в спермацетовом мешке кашалотов находится несколько тонн триацилглицеролов, содержащих в составе молекул ненасыщенные жирные кислоты. Плотность (консистенция) этих
триглицеридов зависит от температуры среды: повышается при понижении
температуры. Питаясь кальмарами, кашалоты заплывают на большие глубины, где температура воды ниже обычной. Это индуцирует кристаллизацию
триглицеридов, увеличивается их плотность соответственно увеличению
плотности морской воды на глубине, и животное, не прибегая к дополнительным усилиям, может долго оставаться на большой глубине.
Биосинтез полярных липидов. Первые этапы биосинтеза фосфо- и гликолипидов совпадают с таковыми для синтеза триацилглицеролов: в ходе
этих реакций тоже образуются фосфатидат и диацилглицерол (рис. 15.3). На
следующих этапах к молекуле диацилглицерола может присоединяться с помощью специфического переносчика активированная полярная «голова» молекулы (чаще аминоспирт). В других случаях, наоборот, на полярную «голову» переносится активированная молекула диацилглицерола.
На рис. 15.4 представлены реакции биосинтеза фосфатидилхолина. В
этом процессе активация холина осуществляется путем соединения с СDP, и
этот нуклеозиддифосфат служит переносчиком холинфосфата на молекулу
диацилглицерола. Подобная закономерность наблюдается в биосинтезе полисахаридов, только там переносится сам моносахарид, а не его фосфорилированная форма (рис. 14.3).
213
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Аналогичным путем (с использованием цитидиндифосфатэтаноламина)
синтезируется другой важный компонент мембран — фосфатидилэтаноламин.
Другие фосфолипиды, такие, как фосфатидилинозит, фосфатидилглицерол, дифосфатидилглицерол, фосфатидилсерин, синтезируются при участии
активированного
диацилглицерола — цитидиндифосфатдиацил-глицерола.
Это соединение образуется при взаимодействии СТР с фосфатидатом
(рис. 15.5). Перенос остатка фосфодиацилглицерола на один из спиртов катализируется специфическими фосфатидилтрансферазами и приводит к формированию перечисленных выше глицерофосфолипидов.
Кроме охарактеризованных выше способов биосинтеза полярных липидов, существует возможность взаимопревращения глицерофосфолипидов между собой (рис. 15.5). Так при декарбоксилировании фосфатидилсерина образуется фосфатидилэтаноламин, а он, в свою очередь, может превращаться в
фосфатидилхолин при троекратном метилировании S-аденозилметионином
атома азота. Фосфатидилглицерол-1-фосфат способен превращаться в дифосфатидилглицерол.
Описанные закономерности биосинтеза глицерофосфолипидов характерны и для процессов синтеза других полярных липидов. На скорость биосинтеза липидов у животных очень сильно воздействуют гор+
OH
CH2 CH2 N
O-
CH3
Холинкиназа
CH3
O
CH3
Холин
-
ATP
ADP
CH3
+
P
O
O
CH2 CH2 N
Холинфосфат
CTP
CH3
CH3
СТР: холинфосфат цитидилтрансфераза
PPi
NH2
+
Холинфосфо трансфераза
O
CH2
O
C
CH
O
C
CH2
O
O
O
P O
R1
+
CMP
R2
+
CH2 CH2 N
CH2 CH2 N
O
+ диацил- глицерол O
P
O
CH3
P
-
O
CH3
N
CH3
O
O
CH3
O
O
CH2
O
N
CH3
-
CH3
O
Фосфатидилхолин (лецитин)
OH OH
Цитидиндифосфатхолин
Рис. 15.4. Биосинтез фосфатидилхолина: R1, R2 — углеводородные
цепи жирных кислот; СТР — цитидинтрифосфат
214
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
O
O
CH2
O
C
R1
CH
O
C
R2
CH2
OP
CDP-диглицеридсинтаза
+ CTP
O
-
O
CH2
O
C
R1
CH
O
C
R2
O
O
O
O
Фосфатидат
N
O
CH2
P
NH2
P
O
O
-
O
N
C
CH2
O
OH OH
Цитидиндифосфатдиацилглицерол
+ глицеролфосфат
+ серин
+ инозит
Фосфатидилглицерол-1-фосфат
+
CMP
Фосфатидилинозит
+
CMP
Фосфатидилсерин
Pi
+
CMP
CO2
Фосфатидилглицерол
Фосфатидилэтаноламин
+ Фосфатидилглицерол
+ 3(-СН3)
Фосфатидилхолин
Дифосфатидилглицерол
Рис. 15.5. Альтернативные пути биосинтеза полярных липидов
моны, в первую очередь инсулин, который стимулирует синтез жирных кислот из глюкозы (продуктов ее расщепления).
Биосинтез стеролов. Эти соединения могут синтезировать все организмы, однако многие из них используют стеролы, присутствующие в пище. Например, суточная потребность человека в холестероле удовлетворяется на
50% с продуктами питания, и на 50% — за счет биосинтеза.
Основным предшественником для биосинтеза стеролов является ацетилСоА, который поэтапно, с соблюдением определенных стадий (правило Ружечки) превращается в фарнезилпирофосфат (рис. 17.2), служащий также
промежуточным соединением в синтезе каротиноидов. При димеризации двух
молекул фарнезилпирофосфата по типу «голова к голове» возникает 30углеродный линейный изопреноид сквален, который циклизуется и модифицируется с образованием стеролов (рис. 15.6). Данный процесс идентичен
215
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
синтезу каротиноидов, и его принципы, а также этапы биосинтеза фарнезилпирофосфата, описаны в главе 17.
CH3
CH3
CH3
2
O
H3C
P P
Фарнезилпирофосфат
NADPH
NADP+
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
H3C
Сквален
В клетках растений,
дрожжей, мицели альных грибов
В клетках животных,
некоторых бктерий
Эргостерол
Холестерол
Другие стеролы
Рис. 15.6. Некоторые этапы биосинтеза стеролов
Эргостерол получают биотехнологическим путем при культивировании
дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candida
guilliermondii), а также мицелиальных грибов (Penicillium notatum). Эргостерол является предшественником эргокальциферола (витамина D2), а холестерол, синтезируемый животными и некоторыми бактериями, служит предшественником холекальциферола (витамина D3).
216
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 16. МЕТАБОЛИЗМ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ
В этой главе, нарушая установленную закономерность, будут рассмотрены
и те процессы превращения азотсодержащих соединений, которые приводят к
выделению энергии, и те, которые требуют притока энергии. Целесообразность такого отступления от принятого условия диктуется очень тесной связью между метаболическими процессами, происходящими с участием азотсодержащих молекул.
К азотсодержащим соединениям клетки относятся аминокислоты и сформированные из них белки, азотистые основания и содержащие их нуклеиновые кислоты, большинство кофакторов, многие витамины и некоторые другие
вещества. Среди перечисленных молекул первостепенное значение для организма имеют, конечно, белки — в количественном отношении они преобладают среди всех клеточных макромолекул. Поэтому баланс азота в организме (клетке) определяется метаболизмом белков.
16.1. Белковый обмен
Все клетки способны к синтезу белка. Структура белковых молекул уникальна для представителей каждого вида и определяется последовательностью триплетов нуклеотидов в смысловой цепи ДНК (глава 3). Именно специфика клеточных белков определяет видовую специфичность организмов.
Поэтому при образовании новых клеток белковые молекулы синтезируются
de novo из низкомолекулярных предшественников (аминокислот). Синтез и
распад белка постоянно осуществляются и в зрелых клетках, между этими
процессами в норме устанавливается динамическое равновесие. Показано,
что, например, в организме взрослого человека ежедневно разрушается до
аминокислот 300—400 г белка и примерно такое же количество аминокислот
включается во вновь образованные белковые молекулы. Почему метаболизирующая клетка вынуждена постоянно синтезировать белок? В первую очередь
потому, что время полужизни многих ферментных белков очень небольшое:
от 2 мин до нескольких дней. Наиболее короткоживущими являются ключевые ферменты метаболических путей. Постоянное разрушение и синтез белков позволяют клеткам быстро приводить в соответствие с метаболическими
потребностями уровень и активность ферментов. Недавно стало известно, что
время полужизни белка в клетке определяется природой его N-концевой аминокислоты: если она легко связывается со специфическим белком (убиквитином), то убиквитинированный белок легко атакуется протеиназами и разрушается. В противоположность ферментным структурные белки, гистоны,
гемоглобин, а также белки цитоскелета особо долговечны.
217
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Расщепление белков в клетках происходит в ходе гидролиза, который
наиболее эффективен у эукариот в лизосомах и специализированных органеллах — протеасомах, но частично имеет место и в цитозоле. Кроме того,
клетки, способные использовать экзогенный белок в качестве питательного
субстрата, как правило, обладают внеклеточными (секреторными) ферментами, с помощью которых осуществляется гидролитическое расщепление белка
вне
клетки.
Расщепление
белков
катализируют
ферменты —
пептидогидролазы, среди которых выделяют протеиназы и пептидазы.
Протеиназы (эндопептидазы) способны расщеплять пептидную связь внутри
пептидной цепи. Экзопептидазы атакуют пептидную молекулу с конца цепи:
аминопептидазы — с N-конца, карбоксипептидазы — с С-конца.
Итак, белки в каждой клетке постоянно расщепляются до аминокислот.
Аминокислоты не могут запасаться в клетках, они должны быть сразу расходованы либо в процессе синтеза белка, либо в процессах превращения аминокислот. Поскольку соотношения разных аминокислот в распадающихся и новосинтезируемых белках неодинаковы, какая-то часть аминокислот, образованных при гидролизе белка, не участвует в биосинтезе. Эти аминокислоты
подвергаются в первую очередь реакциям дезаминирования (отщепление
аминогрупп) и трансаминирования (обмен кето- и аминогруппами), а также
реакциям превращения по карбоксильной и боковым группам.
В ходе реакций дезаминирования накапливается аминный азот, который,
за исключением тех аминогрупп, которые повторно включаются в биосинтез
аминокислот, выводится из организма. Механизм выведения аммиака из организмов высших животных связан с образованием мочевины и представлен
циклом мочевины. Расщепление углеродных скелетов аминокислот связано
с их окислением и в конечном итоге приводит к формированию небольшого
числа продуктов (обычно 7), которые могут вовлекаться в ЦТК или использоваться иначе, в том числе обеспечивая энергетический выигрыш.
Синтез аминокислот может осуществляться в клетках всех организмов, но
в разном объеме. Так, автотрофные организмы (в первую очередь, растения),
а также многие гетеротрофные микроорганизмы способны самостоятельно
синтезировать все 20 входящих в состав белка аминокислот. В то же время
отдельные представители мира микробов могут нуждаться для роста в 10—18
аминокислотах (полиауксотрофные штаммы некоторых молочнокислых бактерий). В организме человека не могут синтезироваться 8 из 20 белковых
аминокислот, эти незаменимые аминокислоты должны потребляться с пищей.
Предшественниками для синтеза аминокислот служат промежуточные
продукты катаболических путей и ЦТК, а также аммонийный азот. С другой
стороны, нужные аминокислоты могут образовываться в процессе превращений (чаще трансаминирования) между кетокислотами и уже имеющимися в
клетке аминокислотами. Если бы в живой природе реализовывался только
второй путь, запасы белка на планете стремительно бы сокращались. Именно
азот, формирующий аминогруппы в составе белковых молекул, способствует
постоянному пополнению белковых ресурсов и в то же время выполняет роль
одного из основных лимитирующих факторов развития организмов. Каковы
источники аммонийного азота, который может включаться в состав аминокис218
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
лот? Ответ на этот вопрос можно получить, рассмотрев круговорот азота в природе.
16.2. Круговорот азота в природе
Разнообразие неорганических форм азота в природе достаточно велико:
это молекулярный азот, на долю которого приходятся основные запасы азота
биосферы, окисленные формы (нитраты, нитриты, разнообразные окислы
азота), а также восстановленные формы (аммиак и соли аммония). В составе
органических соединений азот в основном представлен аминогруппами аминокислот. На рис. 16.1 представлены основные пути превращений различных
форм азота.
Нетрудно заметить, что животные используют только органический азот,
который поступает в организм с пищей. Запасы органических форм азота пополняются за счет деятельности растений и микроорганизмов, которые способны восстанавливать окисленные формы азота и включать его в состав
аминогрупп. Но окисленные формы азота легко вымываются из почвы в моря
и океаны с осадками и, кроме того, восстанавливаются денитрификаторами
до окислов азота и N2, которые поступают в атмосферу. Поэтому запасы связанных форм азота на планете вскоре могли бы истощиться, если бы не постоянно протекающие процессы фиксаN2 атмосферы
Белок растений и
микроорганизмов
поедание
гибель
включение
в состав
аминокислот
1,2
Органика опада,
экскременты
Белок
животных
гибель, выде ление при жиз недеятельности
разложение
редуцентами
NH3, соли
аммония
1,3
восстанов ление в
клетках
растений,
многих
микроорга низмов
нитрификация
(1 стадия)
-
Ионы NO2
нитрификация
(2 стадия)
денит рификация
(бактерии)
-
Ионы NO3
Рис. 16.1. Круговорот азота в природе: 1 — промышленная фиксация азота; 2 — деятельность свободноживущих и симбиотических азотфиксаторов; 3 — физические силы природы
ции молекулярного азота. Эту деятельность частично осуществляет человек
при производстве азотных удобрений (очень дорогой и энергозатратный про219
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
цесс), частично — азотфиксирующие бактерии, среди которых есть свободноживущие формы а также те, которые осуществляют фиксацию в симбиозе
с растениями. Небольшое количество окисленных форм азота образуется в
атмосфере при грозовых разрядах, а также под действием космического излучения. Таким образом, ферментативная фиксация молекулярного азота —
основной естественный механизм возобновления запасов связанных форм
азота, обеспечивающих развитие жизни на Земле.
16.3. Фиксация азота и включение его в состав
органических молекул
Молекулярный азот представляет собой чрезвычайно инертное соединение, расщепление молекулы N2 требует больших затрат энергии. Из всех населяющих Землю организмов ферментативную фиксацию азота осуществляют лишь некоторые прокариоты. Данный процесс в их клетках катализируется нитрогеназной системой и осуществляется в процессе, который можно
описать общим уравнением:
N2 + 6H+ + 6з + 12 ATP ® 2NH3 + 12ADP + 12Pi
(16.1)
Нитрогеназная система бактерий локализуется во впячиваниях плазматической мембраны и состоит из двух компонентов: железосерного белка
(4Fe 4S2-) и молибдоферредоксина (белок, содержащий молибден и железо).
На одну молекулу молибдоферредоксина (MoFe) в активной нитрогеназной
системе приходится 2 молекулы железосерного белка. Вспомогательными
компонентами, участвующими в переносе электронов на нитрогеназную систему, служат флавиновые кофакторы и ферредоксин. Роль первичного донора
электронов в этом процессе обычно выполняет NADPH.
Процесс переноса электронов на молекулярный азот (рис. 16.2) осуществляется следующим образом: донор электронов восстанавливает ферредоксин,
который самостоятельно либо через флавин переносит электроны на железосерные центры нитрогеназной системы. Затем АТР связывается с железосерными белками и сдвигает их окислительно-восстановительный потенциал с –
0,29 В до –0,4 В путем изменения конформации белка. Подобное увеличение
восстановительной способности железосерных белков позволяет им переносить электроны на молибдоферредоксин. На следующей стадии гидролизуется
АТР, восстанавливается MoFe и нитрогеназная система диссоциирует на
компоненты. Считается, что перенос пары электронов от восстановленной
формы железосерных белков к молибдоферредоксину сопряжен с гидролизом
четырех молекул АТР.
Восстановление молибдоферредоксина связано с переходом атома молибдена из окисленного состояния Мо(VI) в восстановленное Мо(IV), от которого
электроны переносятся непосредственно на N2. Для полного восстановления
молекулы азота до двух молекул NH3 требуется три последовательных 2электронных перехода, которые будут сопряжены с гидролизом 12 (4 х 3)
молекул АТР.
На симбиотическую азотфиксацию, в которой кроме нитрогеназной системы бактерий принимают участие и некоторые структуры растений, расхо220
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
дуется энергия, запасенная обоими организмами. Есть сведения, что в этом
процессе потребляется до пятой части всей энергии, запасенной растением.
Нитрогеназная система восстанавливает не только молекулярный азот, но
и ацетилен, азид, закись азота, цианид, нитриты и протоны. Перенос части
восстановительных эквивалентов на Н+ осуществляется нитрогеназной системой в побочной реакции, поэтому наряду с аммиаком при фиксации азота
всегда образуется молекулярный водород.
Сильным ингибитором нитрогеназной системы является молекулярный
кислород: в его присутствии основные компоненты системы быстро инактивируются. Поэтому фиксация азота осуществляется в анаэробных участках
клеток. Например, у клубеньковых бактерий специальная форма гемоглобина
(леггемоглобин) защищает нитрогеназную систему от молекулярного кислорода, а у цианобактерий эту роль выполняют стенки гетероцист.
Следующей стадией включения азота в состав органических молекул является аминирование кетокислот, в результате которого возникают аминокислоты. Наиболее распространено восстановительное аминирование кетокислот. При этом основным продуктом, образующимся в данном процессе,
является глутамат. Глутамат используется в качестве субстрата для включения еще одной молекулы аммиака, в результате чего синтезируется глутамин
(рис. 16.3).
Перечисленные выше реакции имеют особое значение в биосинтезе аминокислот, поскольку катализирующие их ферменты наиболее активны, в результате чего данные процессы превращаются в основные пути включения
аммиачного азота в состав аминокислот. В ходе последующих превращений
аминогруппы глутамата и глутамина включаются в состав большинства других аминокислот. Подобные реакции носят название реакций трансаминирования.
ATP
NADPH
NADP+
Ферредоксин
окисленный
Ферредоксин
восстанов ленный
4Fe4S
восстанов ленный
Mo(VI)Fe
4Fe4S
окисленный
Mo(IV)Fe
2NH3
(в три
этапа)
N2
ADP + Pi
Рис. 16.2. Работа нитрогеназной системы прокариот при фиксации
молекулярного азота (объяснения в тексте)
221
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
COO
Глутамат дегидрогеназа
O C
CH2
COO
+
NADPH
Глутамат
COO
+
COO
CH2
C
H3N
Глутамин синтетаза
H
CH2
Н2О
COO-
a Кетоглутарат
(промежуточный
продукт ЦТК)
C
+
CH2
NADP+
COO-
+
H
CH2
+ NH4
CH2
H3N
C
H3N
H
CH2
+ NH4
CH2
ATP ADP + Pi
C O
+
COOГлутамат
NH3
Глутамин
Рис. 16.3. Включение аммиака в состав аминокислот
16.4. Биосинтез аминокислот
Пути биосинтеза формирующих белок аминокислот (протеиноген-ных)
довольно сложны, многоплановы (одна и та же аминокислота может синтезироваться разными способами) и могут существенно отличаться у разных организмов. Тем не менее существует довольно большое количество закономерностей в этих процессах, и для удобства все 20 протеиногенных аминокислот
можно разделить на 5 биосинтетических семейств. Для принадлежащих к
одному семейству аминокислот характерно наличие общих предшественников, которые образуются в ЦТК, в процессе гликолиза, в ходе пентозофосфатных путей.
Заменимые аминокислоты синтезируются с помощью довольно простых
реакций, в то время как пути биосинтеза незаменимых аминокислот очень
сложны. К незаменимым для белых крыс аминокислотам относятся: валин,
изолейцин, лейцин, треонин, метионин, лизин, фенилаланин, триптофан, гистидин и аргинин. Восемь из десяти перечисленных аминокислот не синтезируются также организмом человека, являются ли гистидин и аргинин незаменимыми для человека, остается спорным.
Биосинтез аминокислот семейства глутамата. К этому семейству
относятся: глутамат, глутамин, пролин, и аргинин. Первые две аминокислоты
222
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
образуются из a-кетоглутарата, а аминогруппы берут свое начало из молекул
аммиака (рис. 16.3). Пролин синтезируется из глутамата в ходе четырех реакций: g-карбоксильная группа глутамата реагирует с АТР, образуя ацилфосфат. Последний восстанавливается с участием NADРH до альдегида, а затем
в ходе самопроизвольной дегидратации преобразуется в циклическое соединение — пирролин-карбоксилат. Этот продукт восстанавливается при участии NADPH в пролин (рис. 16.4).
Синтез аргинина (рис. 16.5) также осуществляется из глутамата, который
вначале ацетилируется по аминогруппе, а затем подвергается уже описанным
выше реакциям фосфорилирования и формирования полуальдегида. Однако
g-полуальдегид N-ацетилглутамата не циклизуется, как в пути биосинтеза
пролина, а трансаминируется с участием глутамата (Glu). В результате этой
реакции образуется a-кетоглутарат (КГ) и N-ацетилорнитин. Последний подвергается деацетилированию с образованием орнитина. Орнитин превращается в аргинин в ходе нескольких реакций, представленных в цикле мочевины.
Биосинтез аминокислот семейства аспартата. К семейству аспартата относятся: аспартат, аспарагин, лизин, треонин, изолейцин и метионин.
Пять последних аминокислот из этого состава синтезируются из аспартата,
который, в свою очередь, образуется из оксалоацетата —промежуточного
продукта ЦТК — в ходе реакции трансаминирования. Донором аминогруппы
при этом выступает глутамат (рис. 16.6).
Аспартат служит предшественником для синтеза аспарагина, причем у
многих бактерий может осуществляться прямое аминирование аспартата в
АТР-зависимой реакции с участием аспарагинсинтетазы (16.2).
COO-
COO-
COO-
+
+
H3N
C
+
C
H3N
H
Глутамат-5киназа
CH2
H
Глутамилфосфат-редуктаза
CH2
COOГлутамат
ATP
ADP
CH2
NADPH
COO P
+
-
N
H2
Пролин
NADP+
NADP+ NADPH
C
O
g-Глутамилфосфат
Пирролин-5карбоксилатредуктаза
OOC
H
CH2
CH2
CH2
-
C
H3N
H
Полуальдегид
глутаминовой
кислоты
H2O
+
OOC
N
H
Пирролин-5-карбоксилат
223
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 16.4. Биосинтез пролина (пояснения в тексте)
COO-
O
N-Ацилтрансфераза ами- H3C C NH
нокислот
+
H3N
C
H
CH2
COOC
H
CH2
+ Ацетил-СоА
CH2
CH2
CoA
COO-
COON-Ацетилглутамат
Глутамат
ATP
ADP
COO-
O
H3C C NH C
Ацетилглу таматкиназа
N-Ацетилглутамил-5-фосфат
H
NADPH
N-Ацетил-g-глутамилфосфат-редуктаза
CH2
CH2
Ацетилорнитин трансаминаза
CH2
+
NH3
N-ацетилорнитин
КГ
NADP+
g-Полуальдегид -Nацетилглутамат
Glu
Ацетилорнитиндеацетилаза
COO-
Ацетат
+
COO-
H3N C
H
+
C
H3N
CH2
H
CH2
Цикл мочевины
CH2
CH2
CH2
NH
CH2
+
H3N
+
NH3
Орнитин
C
NH
Аргинин
Рис. 16.5. Биосинтез аргинина (пояснения в тексте)
Аспартат + NH3 + АТР ® Аспарагин + АМР + РPi
(16.2)
224
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
В клетках млекопитающих осуществляется другая реакция (рис. 16.6), в
которой донором аминогруппы при образовании аспарагина выступает глутамин.
COO-
COO-
+
H3N
C
COO-
H
CH2
COO-
O C
+
COO-
O C
+
C
H3N
H
CH2
+
CH2
CH2
CH2
COO-
COO-
COO-
CH2
Глутамат
Аспартаттранс аминаза
Оксалоацетат
Аспартат
a - Кетоглутарат
COO+
C
H3N
COO+
H3N
C
H
CH2
+
Аспартат
COOАспарагин синтаза
C O
+
+
C
H3N
H
CH2
ATP
C O
AMP +PPi
+
NH3
NH3
Аспарагин
Глутамин
COO-
+
CH2
CH2
COO-
H
H3N
+
C
H
CH2
CH2
COOГлутамат
Рис. 16.6. Биосинтез аспартата и аспарагина (пояснения в тексте)
Лизин, метионин и треонин синтезируются из производных аспартата
(рис. 16.7), а изолейцин — из треонина.
Лизин в клетках бактерий и растений синтезируется в ходе альдольной
конденсации полуальдегида аспарагиновой кислоты и пирувата с последующим восстановлением, присоединением остатка сукцината, трансаминированием с участием глутамата, внутримолекулярной перестройкой и декарбоксилированием. В клетках грибов используется другой путь биосинтеза лизина — из a-кетоглутарата и ацетил-СоА.
Углеродный скелет метионина формируется из гомосерина, атом серы
происходит от цистеина, а донором метильной группы служит Nметилтетрагидрофолиевая кислота.
Треонин служит источником четырех из шести углеродных атомов в молекуле изолейцина. На первой стадии синтеза треонин дезаминируется, превращаясь в 2-кетобутират, затем взаимодействует с пируватом, подвергается
структурным перестройкам и реакции трансаминирования, в которой донором аминогруппы выступает глутамат.
Биосинтез аминокислот семейства пирувата. Из пирувата синтезируются: аланин, валин и лейцин.
225
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Аланин образуется в реакции трансаминирования, где донором аминогруппы служит глутамат (рис. 16.8).
Синтез валина и лейцина имеет несколько общих стадий и начинается с
образования ацетолактата. Этот метаболит формируется из двух молеCOO-
COOH3N
C
Аспартат- H3N
киназа
H
C
COO-
Дегидрогеназа аль+
дегида аспарагино- H N
3
вой кислоты
+
+
H
C
CH2
CH2
ATP
COO-
NADPH
COO P
ADP
NADP+
Гомосериндегидрогеназа
COO+
H3N
C
H
COOC
H3N
CH2
CH2O P
H
COO-
CH2
ATP
ADP
+
CH2OH
Гомосерин
Гомосеринфосфорная
кислота
H
4-Полуальдегидаспартат
NADPH
NADP+
+
Гомосеринкиназа
C
O
Аспартил-4фосфат
Аспартат
H
CH2
C
H3N
(CH2 )4
+
+ Н2О Треонинсинтаза
H
NH3
Лизин
COO+
Pi
H3N
COOH3N
C
H
H
C
OH
C
H
( CH2 )2
+
S
CH3
CH3
Метионин
Треонин
COO+
H3N
C
H
CH
CH3
CH2
CH3
Изолейцин
Рис. 16.7. Биосинтез треонина. Схема путей биосинтеза метионина,
лизина, изолейцина (пунктирные стрелки)
226
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
кул пирувата: одна из них декарбоксилируется, и образованный активный
ацетат переносится на вторую молекулу (рис. 16.8). Эту реакцию катализирует ацетолактат-синтаза при участии тиаминпирофосфата.
2-Ацетолактат восстанавливается в диоксиизовалериановую кислоту, что сопровождается миграцией метильной группы. Диоксиизовалерат дегидратируется в 2-кетоизовалерат. Этот продукт может превращаться в валин в реакции
трансаминирования с участием глутамата, а также конденсироваться с ацетил-СоА и в ходе нескольких реакций (изомеризация, восстановление, декарбоксилирование, трансаминирование) преобразовываться в лейцин. Донором
аминогруппы в образовании лейцина также является глутамат (рис. 16.8).
Биосинтез аминокислот семейства серина. В семейство входят серин,
цистеин и глицин. Предшественником этих аминокислот является 3- фосфоглицерат — промежуточный продукт гликолиза.
COO-
COO-
+
C
H3N
H
O C
COO-
CH2
+
CH2
COOГлутамат
Аланинтранс аминаза
COO-
CH2
+
CH3
Пируват
CH3
Пируват
СО2
H3C
O
C
OH
Редукто изомераза
+
H3N
C
H3C
C H
H
CH3
CH3
2-Ацетолактат
Валин
Glu
Аланин
C
OH
C OH
CH3
2,3-Диоксиизовалерат
COOC
H3C
КГ
H
H3C
Н2О
COO-
H
COO-
C
Трансаминаза
аминокислот с
разветвленной
цепью
C
CH3
COOa-Кетоглутарат
COO-
2
H3N
CH2
O C
COO- Ацетолактат
синтаза
O C
+
O
C H
CH3
2-Кетоизовалерат
Диоксикислота дегидратаза
Glu
КГ
COO+
H3N
C
H
CH2
H3C
C H
CH3
Лейцин
227
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 16.8. Биосинтез аланина, валина и лейцина. Glu — глутамат;
КГ — a-кетоглутарат; пунктирная стрелка заменяет несколько
этапов синтеза (объяснения в тексте)
3-Фосфоглицерат окисляется в 3-фосфогидроксипируват, а затем аминируется с участием глутамата в 3-фосфосерин и дефосфорилируется в серин
(рис. 16.9). Существует и альтернативный путь, когда отщепление фосфатной
группы происходит до реакции окисления:
3-Фосфоглицерат ® Глицерат ® Гидроксипируват ® Серин
Серин служит субстратом для синтеза глицина и цистеина. При образовании глицина b-углеродный атом боковой цепи серина акцептируется переносчиком одноуглеродных фрагментов — кофактором тетрагидрофолиевой кислотой при участии фермента серин-гидроксиметил-трансферазы (рис. 16.9).
Существует и другой путь синтеза глицина: из СО2, NH4+ и метилентетрагидрофолиевой кислоты, который катализируется глицин-синтазой.
COO-
COO-
Фосфоглицерат дегидрогеназа
C OH
H
CH2O P
3-Фосфоглицерат
C O
NAD+ NADH
COO-
Фосфосерин трансаминаза
CH2O P
3-Фосфогидроксипируват
Glu
+
H3N
C H
CH2O P
КГ
3-Фосфосерин
H2O
Серин фосфатаза
Pi
COOH3N
COO-
Глицин-гидроксиметилтрансфераза
+
+
H
Глицин
N5N10-Метилентетрагидрофолиевая кислота
Тетрагидрофо лиевая кислота
COO-
COO+
+
H3N
C H
CH2
CH2
CH3
SH
a-Кетобутират
Цистеин
CH2
H2O
OH
Серин
Метионин
C O
C H
H3N
C H
Циста тионин синтаза
Гомоцистеин
Цистатионинg-лиаза
COO+
H3N
NH3
H2O
COO+
C H H3N
Н 2C S CH2
C H
CH2
Цистатионин
228
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 16.9. Биосинтез серина, цистеина и глицина. Пунктирной стрелкой показано
многоступенчатое превращение метионина в гомоцистеин; пунктирной линией в
молекуле цистатионина показана связь, атакуемая цистатионин-g-лиазой
Превращение серина в цистеин связано с замещением атома кислорода
боковой цепи на атом серы, донором которого является метионин. Вначале
метионин в серии АТР-зависимых реакций, где образуется его активированная форма (S-аденозилметионин), теряет метильную группу при атоме серы и
превращается в гомоцистеин:
L-метионин + АТР + Акцептор метильной группы ®
® Гомоцистеин + Аденозин + PPi + Pi + Метилированный акцептор
Затем гомоцистеин взаимодействует с серином, образуя цистатионин, который расщепляется цистатионин-g-лиазой на цистеин и a-кетобутират
(рис. 16.9).
У некоторых микроорганизмов существует альтернативный путь синтеза
цистеина, где донором атома серы служит сероводород. В этом случае серин
вначале ацетилируется за счет ацетил-СоА (катализирует реакцию серинтрансацетилаза), а затем ацетилсерин взаимодействует с сероводородом при
участии О-ацетилсерин-сульфгидролазы:
Ацетилсерин + Н2S ® Цистеин + Ацетат
Биосинтез аминокислот семейства пентоз. Принадлежащие к этому
семейству аминокислоты (гистидин, триптофан, фенилаланин и тирозин) синтезируются при участии пятиуглеродного промежуточного соединения пентозофосфатных путей — рибозо-5-фосфата, на основании чего их и объединяют
в семейство пентоз. На рис. 16.10 показаны пути преобразования рибозо-5фосфата, приводящие к формированию соединений, из которых синтезируются названные аминокислоты.
Процесс биосинтеза гистидина довольно сложен и осуществляется с участием 5-фосфорибозил-1-пирофосфата, АТР и глутамина. На рис. 16.10 в составе молекулы гистидина показано происхождение атомов углерода и азота:
один атом азота имидазольного кольца происходит из амидной группы глутамина, другой атом азота и один из углеродных атомов кольца берут начало
от АТР, а остальные углеродные атомы ведут происхождение от 5фосфорибозил-1-пирофосфата.
Биосинтез ароматических аминокислот начинается со стадии конденсации
эритрозо-4-фосфата с фосфоенолпируватом. Образующееся семиуглеродное
соединение (7-фосфо-2-кето-3-дезокси-D-арабиногептулозо-нат) дефосфорилируется, циклизуется, дегидратируется и восстанавливается при участии
NADPH в шикимовую кислоту. Шикимовая кислота претерпевает еще одну
конденсацию с фосфоенолпируватом и после элиминирования остатка фосфорной кислоты превращается в хоризмовую кислоту (рис. 16.11). Хоризмат
служит основным предшественником пути биосинтеза триптофана, который
изображен на рис. 16.11.
Хоризмовая кислота используется также для синтеза фенилаланина, т. е.
на этапе ее формирования пути биосинтеза двух незаменимых ароматических
аминокислот — триптофана и фенилаланина — расходят-ся (отсюда и назва229
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ние хоризмата, которое происходит от греческого слова, означающего «вилка»).
Фенилаланин образуется в ходе трех последовательных реакций: изомеризации хоризмата в префенат, дегидратирования и декарбоксилирования
префената в фенилпируват и трансаминирования фенилпирувата с участием
глутамата.
Заменимая кислота тирозин может синтезироваться из фенилаланина путем его гидроксилирования с участием фенилаланин-4-моноокси-геназы, а
также из префеновой кислоты после ее декарбоксилирования и аминирования.
230
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рибозо-5-фосфат
Изомеризация, меж молекулярные пере стройки в пентозо фосфатных путях
Рибозофосфат пирофосфокиназа
АТР
АМР
H
O
C
P
H
C OH
H
C
CH2
O
O
O
OH OH
OH
CH2O P
P
P
5-Фосфорибозил-1-пирофосфат
Эритрозо-4-фосфат
+ Фосфоенолпируват
COO-
Хоризмат
+
H3N
+
NH3
CH2
CH
COO
Триптофан
из глутамина
из АТР
+
NH3
Фенилаланин
CH2
OH
CH
N
C
H
CH2
N
H
COO
Гистидин
Тирозин
Рис. 16.10. Общая схема биосинтеза гистидина, триптофана, фенилаланина и
тирозина. Пунктирные стрелки обозначают многоэтапные процессы
231
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H
O
H
C
COO-
C OH
C
7-Фосфо-2-кето-3-дезокси-D-арабиногептулозонат- HO
CH2O P
синтаза
Эритрозо-4-фосфат
H
H
C
OH
+
H
COOC
C
O
H
C OH
C
-OOC
CH2
COO-
HO
Шикимовая кислота
CH2
OH
COO-
O
CH2O P
7-Фосфо-2-кето-3-дезокси-D-арабиногептулозонат
O P
CH2
Фосфоенолпируват
PO
OH
OH
O
HO
CH2
C
COOХоризмовая кислота
Антранилатсинтаза
Фосфорибозил антранилат трансфераза
HN
OH OH
5-Фосфорибозилантранилат
PPi Фосфорибо зилпиро фосфат
Пиру ват
COO- +
NH3
Антранилат
Фосфорибозил антранилат изомераза
CH2 CH
COONH CH
OH OH OH
C
CH
H
1(О-карбоксифениламино)-1дезоксирибулозо-5-фосфат
H2O
N
Триптофан
Триптофансинтаза
CO2
CH CH2 O P
+
Глицеральдегид-3-фосфат
Индол-3-глицерофосфатсинтаза
CH
NH3
N
CH CH2 O P
COO-
Серин
OH OH
H Индол-3-глицерофосфат
Рис. 16.11. Путь биосинтеза триптофана. Пунктирные стрелки обозначают многоэтапные процессы
232
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Закономерности биосинтеза аминокислот. Обзор путей биосинтеза
протеиногенных аминокислот позволяет выявить следующие основные закономерности этих процессов: 1) углеродные скелеты аминокислот берут свое
начало от промежуточных продуктов гликолиза (3-фосфоглицерат, фосфоенолпируват, пируват), пентозофосфатных путей (рибозо-5-фосфат и эритрозо4-фосфат), ЦТК (оксалоацетат и a-кетоглутарат); 2) донором аминогрупп для
большинства протеиногенных аминокислот служит глутамат, реже —
глутамин; реакции, в которых аминогруппа аминокислоты переносится на
кетокислоту, называются «реакции трансаминирования»; 3) биосинтез многих аминокислот осуществляется «семействами», для которых используются
общие предшественники; многие аминокислоты сами служат субстратами для
синтеза других аминокислот; 4) многие стадии биосинтеза аминокислот требуют притока энергии и сопровождаются гидролизом АТР (стадии синтеза
гистидина, пролина, метионина, аспарагина, глутамина, аргинина); кроме
этого, используется энергия активированных молекул, участвующих в синтезе; наконец, из катаболических и амфиболических процессов изымаются
промежуточные продукты, которые могли бы обеспечить клетке запасание
энергии; 5) многие этапы биосинтеза аминокислот требуют участия восстановительных эквивалентов (NADH и NADPH), которые могли бы быть окислены в дыхательной цепи и обусловить энергетический выигрыш.
Таким образом, биосинтез аминокислот обходится клетке достаточно дорого. Неудивительно поэтому, что данный процесс в каждом организме
(клетке) подвержен очень сложной регуляции (глава 19), которая, с одной
стороны, определяется сложностью и разветвленностью самого биосинтеза
протеиногенных аминокислот, а с другой стороны, должна обеспечить строгую экономию клеточных ресурсов (энергии, восстановительных эквивалентов, строительных блоков). Закономерным представляется и тот факт, что при
наличии экзогенных аминокислот, клетки микроорганизмов, в частности, не
осуществляют их синтез самостоятельно, а используют готовые формы.
16.5. Расщепление аминокислот
В первом разделе данной главы уже охарактеризована необходимость и
основная стратегия расщепления аминокислот. Она объясняется невозможностью запасания аминокислот впрок и невозможностью их выведения из клеток целиком. Избыточные аминокислоты используются организмами как метаболическое топливо: их углеродные скелеты при перестройках определенного рода могут вовлекаться в биосинтез жирных кислот, глюкозы, кетоновых тел, изопреноидов и др., а также окисляться в ЦТК, обеспечивая клетку
энергией. Следует отметить, что многие микроорганизмы, в частности аэробные бактерии, способны использовать отдельные аминокислоты в качестве
единственного источника энергии и углерода. У анаэробных микроорганизмов, при отсутствии в клетках цикла трикарбоновых кислот, выработался
другой механизм: катаболизм аминокислот в парах, когда одна из них служит
донором электронов, а вторая — акцептором. Важно, что в таком процессе
происходит образование АТР.
233
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Кроме углеродных скелетов, при деградации аминокислот образуется
аминный азот, который в отличие от углерода не пригоден для получения
энергии за счет окисления, и более того, является токсичным для клеток. Поэтому те аминогруппы, которые не могут повторно использоваться в биосинтезе, превращаются в мочевину (или другие вещества) и выводятся из организма.
Ниже будут рассмотрены основные типы реакций, в которые могут вступать аминокислоты: реакции по a-аминогруппе, карбоксильной группе и боковой цепи.
Расщепление аминокислот по аминогруппе. Эти процессы представлены в основном реакциями трансаминирования и дезаминирования по aаминогруппе. Реакции трансаминирования уже были рассмотрены в разделе,
касающемся биосинтеза аминокислот. Они катализируются трансаминазами
(аминотрансферазами), отличительной особенностью которых является использование пиридоксальфосфата (производное витамина В6) в качестве простетической группы. Наибольшее значение в процессах деградации аминокислот имеют глутамат-трансаминаза и аланин-трансаминаза. Эти ферменты
выполняют роль «воронок», собирающих аминогруппы от разных аминокислот и включающих их в состав глутамата и аланина. У животных эти две
аминокислоты служат переносчиками накапливающегося аминного азота из
тканей в печень. В печени аминогруппа аланина переносится аланинтрансаминазой на a-кетоглутарат с образованием глутамата:
Аланин + a-Кетоглутарат ® Пируват + Глутамат
Таким образом, большинство аминогрупп различных аминокислот оказывается в составе глутамата, который легко подвергается дезаминированию.
Реакции дезаминирования аминокислот приводят к освобождению NH2группы в виде аммиака и осуществляются тремя разными путями. Различают
окислительное, гидролитическое и прямое дезаминирование (рис. 16.12).
Наиболее распространенным типом является окислительное дезаминирование, которое осуществляется по a-аминогруппе и катализируется в основном
глутаматдегидрогеназой — типичным для печени ферментом. Необычным
свойством этого фермента является способность использовать как NAD, так и
NADP в качестве коферментов. Активность глутаматдегидрогеназы регулируется аллостерическими активаторами (ADP, GDP) и ингибиторами (ATP,
GTP).
Окислительное дезаминирование осуществляется в две стадии с образованием иминокислоты в качестве промежуточного продукта, который спонтанно гидролизуется, превращаясь в кетокислоту и аммиак (рис. 16.12). Обе реакции обратимы, и их константы равновесия близки к единице. Ранее
(рис. 16.3) было показано, как в ходе обратной реакции аммиак включается в
состав глутамата. Можно считать, что реакция образования и дезаминирования глутамата является центральной реакцией в процессе метаболизма аммиака.
234
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
1. Окислительное дезаминирование
Глутамат дегидрогеназа
COO+
H3N
H2N
C H
R1
COO-
COO+
NAD+ NADH
(NADP+) (NADPH)
Аминокислота
O
C H
H2O
R1
+
NH4
Иминокислота
C
R1
Кетокислота
2. Гидролитическое дезаминирование
COO+
H3N
C H
( CH2)n
COO-
Глутаминаза, аспарагиназа
+
H3N
+
NH4
H2O
C H
( CH2)n
CONH2
COOH
Глутамин,
аспарагин
Глутамат,
аспартат
3. Прямое (внутримолекулярное) дезаминирование
COO+
H3N
C H
CH2
R3
Аминокислота
COO-
Гистидин - аммиак лиаза
CH
CH
+
NH4
R3
Непредельная кислота
Рис. 16.12. Различные типы реакций аминокислот по аминогруппе
У многих организмов окислительное дезаминирование осуществляется с
помощью дегидрогеназ, использующих флавиновые кофакторы (FMN, FAD).
Эти ферменты называют оксидазами аминокислот. Они характеризуются широкой субстратной специфичностью: одни специфичны к L-аминокислотам,
другие — к их D-аналогам. Считается, что эти ферменты вносят небольшой
вклад в обмен аминогрупп.
Гидролитическому дезаминированию подвержены немногие аминокислоты, из протеиногенных — аспарагин и глутамин. При их дезаминировании образуются соответственно аспартат и глутамат. Этот процесс правильнее называть дезамидированием, поскольку он осуществляется за счет амидной группы (рис. 16.12). В редких случаях таким путем отщепляется и aаминогруппа аминокислоты, тогда образуются аммиак и оксикислота.
В результате прямого (внутримолекулярного) дезаминирования воз235
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
никают ненасыщенные соединения. Прямому дезаминированию обычно подвергается гистидин, а также серин. Однако первичная ферментативная атака
серина приводит к отщеплению молекулы воды (фермент —серингидратаза),
и в этом превращении участвует боковая гидроксильная группа серина. Спонтанному дезаминированию в данном случае подвергается нестабильное промежуточное соединение — аминоакрилат. Продуктом суммарной реакции
является пируват, и этот тип дезаминирования вызывается перестройкой в
боковой цепи аминокислоты.
Реакции аминокислот по карбоксильной группе. Превращения по карбоксильной группе аминокислот могут использоваться организмами для деградации этих молекул, а также для превращения в другие, необходимые
клетке соединения, в первую очередь аминоациладенилаты и биогенные
амины. Образование аминоациладенилатов на подготовительной стадии синтеза белка уже было описано в главе 3. Биогенные амины возникают в реакциях, катализируемых декарбоксилазами аминокислот. Эти ферменты широко распространены у животных, растений и особенно у микроорганизмов,
причем известно, что у патогенных микроорганизмов декарбоксилазы могут
служить факторами агрессии, с помощью которых возбудитель проникает в
соответствующие ткани. Декарбоксилазы L-аминокислот, так же как трансаминазы, используют в качестве простетической группы пиридоксальфосфат.
Моноамины (биогенные амины) выполняют в организмах разнообразные
функции. Например, этаноламин, образующийся при декарбоксилировании
серина, является составной частью полярных липидов. При декарбоксилировании цистеина и аспартата образуются соответственно цистеамин и bаланин, которые входят в состав такого важного для клеток кофермента, как
коэнзим А. Декарбоксилирование гистидина приводит к образованию гистамина — медиатора, участвующего в регуляции скорости метаболических
процессов, деятельности желез внутренней секреции, регуляции кровяного
давления у животных. Многие другие биогенные амины выполняют функции
сигнальных веществ, в частности широко распространенных у животных и
человека нейромедиаторов.
Реакции аминокислот по боковой цепи. Насколько разнообразна структура радикалов аминокислот, настолько разнообразны и химические превращения, которым они могут подвергаться. Среди этих многообразных реакций
можно выделить те, которые позволяют клетке получать из одних аминокислот другие. Например, тирозин образуется при окислении ароматического
кольца фенилаланина; гидролиз аргинина приводит к формированию орнитина (см. цикл мочевины); расщепление треонина сопровождается образованием глицина и т. п.
Кроме этих реакций, важное значение имеют превращения боковых
групп, связанные с возникновением физиологически активных веществ. Так,
из тирозина образуется гормон адреналин, из триптофана образуются никотиновая кислота (витамин РР, входящий в состав никотинамидных коферментов) и индолилуксусная кислота (ростовое вещество), из цистеина —
меркаптуровые кислоты (участвуют в обезвреживании ароматических соединений). Уже отмечалась возможность превращения серина в пируват при дегидратации его боковой цепи и дезаминировании.
236
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Таким образом, разнообразные химические превращения аминокислот
могут приводить к образованию биологически активных веществ с широким
спектром действия и, кроме того, к отщеплению аминогрупп в виде аммиака
с формированием углеродных скелетов. В следующем разделе будет рассмотрена судьба аммиака и углеродных атомов расщепленных аминокислот.
16.6. Выведение аммиака из организма
При деградации аминокислот, которая у млекопитающих осуществляется
в печени, высвобождается аммиак. Кроме этого, значительные количества
аммиака образуются при распаде пуринов и пиримидинов. Часть аммиака
сразу расходуется на синтез других аминокислот и азотистых оснований, а
оставшаяся часть должна быстро инактивироваться или выводиться из организма, поскольку это соединение является сильным клеточным ядом.
У организмов, стоящих на низших ступенях развития, а также у обитающих в воде животных аммиак выделяется непосредственно из клеток, а у рыб,
например, через жабры. Такие животные носят название аммониотелические. У большинства наземных позвоночных животных, в том числе у млекопитающих и у человека, аммиак превращается в мочевину. Организмы,
удаляющие аммиак (основную его часть) в виде мочевины называются уреотелические. Наконец, существуют урикотелические организмы (птицы и
рептилии), которые превращают аммиак в мочевую кислоту и выводят ее из
организма в твердом виде.
Свойства мочевины как вещества, в составе которого аммиачный азот
выводится из уреотелических организмов, заключаются в том, что это нейтральное, нетоксичное, низкомолекулярное соединение, способное легко (в
ходе пассивной диффузии) преодолевать мембранные барьеры, растворимое в
воде. Мочевина легко переносится кровью и выводится с мочой.
Образуется мочевина в клетках печени в замкнутой последовательности
реакций, которые носят название цикл мочевины.
Цикл мочевины. Один из атомов азота в составе молекулы мочевины
происходит из аммиака, второй — из аспартата. Углеродный атом мочевины
берет происхождение из молекулы СО2.
На первой стадии свободный аммиак и углекислота образуют в АТРзависимой реакции молекулу карбамоилфосфата, которая содержит ангидридную связь и характеризуется высоким потенциалом переноса карбамоильной группы. Карбамоильный остаток переносится на орнитин с помощью орнитин-карбамоилтрансферазы и образуется цитруллин (рис. 16.13).
На следующей стадии при участии аргининосукцинат-синтазы в цикл
включается вторая аминогруппа, которая присутствует в составе аспартата.
Конденсация цитруллина с аспартатом также сопряжена с гидролизом АТР и
приводит к образованию аргининосукцината.
На последнем этапе с участием аргининосукциназы происходит расщепление ее субстрата на аргинин и фумарат. Аргинин гидролизуется ар-
237
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Аспартаттранс аминаза
Реакции ЦТК
Фумарат
Оксалоацетат
Аспартат
Glu
КГ
NH2
P
Карбамоилфосфат-синтаза
C
+ 2ADP + Pi
O
Карбамоил фосфат
NH3 + CO2 + 2ATP
COOC
H3N
H
H3N
1
CH2
CH2
Pi
CH2
CH2
NH2
H
N
H
H
C
H
Орнитин
O
Мочевина
4
Цитозоль
COO-
H3N
H
COO2
+
H
C
H3N
H
C
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH
N
O
Цитруллин
Митохондрия
(м а т р и к с )
+
H
ATP
AMP + PPi
NH
N
C
Фумарат
NH2
N
C
Н2О
H
C
CH2
CH2
H2N
COO-
+
+
C
NH2
Аргинин
NH
-OOC
CH2
C
COO-
H
Аргининосукцинат
3
Рис. 16.13. Цикл мочевины. В кружках под стрелками — названия ферментов:
1 — орнитин-карбамоилтрансфераза; 2 — аргининосукцинат-синтаза; 3 —
аргининосукцинат-лиаза; 4 — аргиназа. Обозначения: Glu — глута-мат;
КГ — a-кетоглутарат
238
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
гиназой на мочевину и орнитин, который вновь может акцептировать карбамоильный остаток. Фумарат может превращаться в оксалоацетат (реакции
ЦТК), который в ходе трансаминирования с участием глутамата преобразуется в аспартат. Аспартат снова может поступать в цикл мочевины, конденсируясь с цитруллином (рис. 16.13).
Компартментализация цикла мочевины охватывает митохондрии и цитозоль: в матриксе протекают реакции образования карбамоилфосфата, его
включение в состав цитруллина и преобразование фумарата в аспартат. Остальные три реакции (образование аргининосукцината, аргинина и фумарата,
орнитина и мочевины) осуществляются в цитозоле.
На образование одной молекулы мочевины расходуется четыре макроэргических связи АТР, т. е. процесс инактивации аммиака стоит клетке больших затрат энергии.
Регуляция скорости цикла мочевины определяется первой реакцией. Катализирующая ее карбамоилфосфат-синтаза аллостерически активируется Nацетилглутаматом, предшественником орнитина, и в его отсутствие практически неактивна.
Цикл мочевины — основной процесс, в котором происходит обезвреживание аммиака. Однако даже уреотелические организмы способны выделять
небольшую долю аммиака непосредственно при гидролитическом дезамидировании глутамина и окислительном дезаминировании глутамата в клетках
почек. Высвободившийся аммиак диффундирует через клеточные мембраны
почечных трубочек в почечные канальцы (мочу), где соединяется с протонами, образуя ионы аммония. В такой форме аммиак уже не может преодолеть
мембранный барьер и возвратиться в клетку, поэтому полностью выводится в
составе мочи.
Известны наследственные заболевания, связанные с нарушением цикла
мочевины из-за дефектов в его ферментной системе. Это всегда связано с
увеличением концентрации аммиака в тканях и крови (гиперам-монемия),
что может приводить даже к летальному исходу. При подобных заболеваниях
страдают в первую очередь наиболее чувствительные к снижению содержания АТР системы — нервные клетки и мозг. Это можно объяснить тем, что
высокая концентрация аммиака сдвигает равновесие обратимой реакции, катализируемой глутаматдегидрогеназой, в сторону образования глутамата, что
неизбежно вызывает истощение запасов a-кетоглутарата. Но a-кетоглутарат
является промежуточным продуктом ЦТК, и его чрезмерное потребление
приводит к замедлению скорости цикла лимонной кислоты — основного поставщика восстановительных эквивалентов для дыхательной цепи. В результате уменьшается скорость образования АТР.
16.7. Судьба углеродных скелетов аминокислот
Стратегия разрушения углеродных скелетов, которые образуются при дезаминировании аминокислот, состоит в том, чтобы в клетке сформировались
ключевые промежуточные продукты, пригодные как для биосинтеза клеточных соединений, так и для дальнейшего окисления, связанного с запасанием
энергии. Углеродные скелеты 20 протеиногенных аминокислот в ходе много239
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
численных и сложных преобразований превращаются в итоге в семь различных продуктов деградации: пируват, ацетил-СоА, ацетоацетил-СоА, aкетоглутарат, сукцинил-СоА, фумарат и оксалоацетат.
Пять из семи перечисленных метаболитов (пируват, a-кетоглутарат, сукцинил-СоА, фумарат и оксалоацетат) могут служить субстратами для глюконеогенеза, поэтому аминокислоты, распадающиеся с образованием этих продуктов, называются глюкогенными. К глюкогенным относятся все протеиногенные аминокислоты, за исключением лейцина и лизина. Следует отметить, что все перечисленные продукты деградации аминокислот могут окисляться в ЦТК, являясь его промежуточными соединениями, либо (как пируват) способны включаться в цикл после превращения в ацетил-СоА или оксалоацетат.
Остальные продукты распада углеродных скелетов аминокислот —
ацетил-СоА и ацетоацетил-СоА — не способны превращаться в глюкозу в
организмах животных. Они используются для синтеза кетоновых тел (ацетоацетат, ацетон, 3-оксибутират), жирных кислот и изопреноидов. Аминокислоты, разрушение которых связано с образованием ацетил-СоА и ацетоацетилСоА, называются кетогенными. К ним относятся лейцин и лизин.
Четыре аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и изолейцин) являются и глюкогенными, и кетогенными, поскольку при их распаде образуются вещества, способные превращаться в глюкозу и кетоновые тела.
16.8. Метаболизм нуклеотидов
Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды — мономеры нуклеиновых кислот — представляют собой одни из наиболее сложно организованных метаболитов. Их синтез de novo требует участия большого количества ферментов
и затрат энергии, однако может осуществляться всеми организмами, за исключением некоторых ауксотрофных мутантов микроорганизмов. Ввиду особой сложности синтеза нуклеотидов их разрушение (например, при расщеплении ненужных нуклеиновых кислот) обычно происходит не полностью, а до
определенных составных частей. Эти составные части (в первую очередь,
пуриновые азотистые основания) могут снова участвовать в образовании нуклеозидмонофосфатов. Такое явление носит название ресинтез.
При полном расщеплении пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов образуются фосфорная кислота, углекислота и аммиак, при неполном —рибоза
(или рибозо-5-фосфат), азотистые основания, мочевина, аллантоиновая кислота, аллантоин и мочевая кислота. Как правило, самые низкоорганизованные формы живого (например, бактерии) обладают способностью к полному
расщеплению нуклеотидов, а организмы, занимающие более высокие ступени
эволюционной лестницы, расщепляют нуклеотиды и входящие в их состав
азотистые основания до менее простых соединений.
Биосинтез нуклеотидов. В этом процессе принимают участие аминокислоты, которые служат источниками большинства атомов углерода и всех
атомов азота в составе азотистых оснований. Синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов происходит различными путями.
240
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo начинается с постепенного наращивания кольца азотистого основания на молекуле 5-фосфорибозил-1пирофосфата, который также участвует в биосинтезе гистидина и триптофана
(рис. 16.10). Вначале к фосфорибозилпирофосфату в реакции трансаминирования присоединяется аминогруппа (N-9), донором которой является глутамин. Затем в состав пятичленного кольца включается два атома углерода (C4, C-5) и атом азота (N-7), берущие происхождение из глицина, а также атом
углерода (C-8) от формилтетрагидрофолиевой кислоты. После этого последовательно присоединяются компоненты шестичленного кольца: атом азота (N3) из глутамина, атом углерода (C-6) из СО2, атом азота (N-1) из аспартата и
атом углерода (С-2) из формилтетрагидрофолиевой кислоты. На последнем
этапе замыкается шестичленное кольцо и формируется молекула основного
промежуточного продукта биосинтеза пуринов — инозин-5`-монофосфата
(IMP). Этот метаболит затем превращается в АМР и GMP (рис. 16.14).
Синтез пуриновых нуклеозидмонофосфатов регулируется аллостерически:
ADP и GDP тормозят процесс образования фосфорибозилпирофосфата, а
AMP и GMP ингибируют активность первого фермента, катализирующего
образование кольца азотистого основания —амидофосфорибозилтрансферазы (реакция трансаминирования). Таким образом происходит саморегуляция образования пуриновых нуклеотидов, не допускающая их «перепроизводства». Кроме этого, регулируется соотношение между двумя пуриновыми
нуклеотидами, образующимися из инозинмонофосфата, с помощью перекрестного активирования (рис. 16.14).
Пуриновые нуклеозидмонофосфаты превращаются в нуклеозиддифосфаты
с участием нуклеозидмонофосфаткиназ:
АМР + АТР ® 2ADP
GMP + ATP ® GDP + ADP
Образующийся в этих реакциях ADP может превращаться в АТР в процессах субстратного и окислительного фосфорилирования, а также фотофосфорилирования. Гуанозиндифосфат превращается в гуанозинтрифосфат при
участии нуклеозиддифосфаткиназы:
GDP + ATP ® GTP + ADP
Рибонуклеотиды превращаются в дезоксирибонуклеотиды на стадии нуклеозиддифосфатов в реакции восстановления. Эта многоступенчатая реакция
катализируется двумя ферментами: тиоредоксинредуктазой и нуклеозиддифосфатредуктазой (рибонуклеотид-редуктаза). Донором водорода для восстановления остатка рибозы служит NADPH, который, однако, не переносит водород непосредственно на рибозу, а восстанавливает особый белок —
тиоредоксин. В составе молекулы тиоредоксина при этом расщепляется дисульфидный мостик, и образуются 2 сульфгидрильные группы, которые и
участвуют в восстановлении атомов углерода рибозы (рис. 16.15). Нуклеозиддифосфат-редуктаза катализирует от-
241
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
5-Фосфорибозил-1-пирофосфат
O
из СО2
C
из аспартата
HN 1
из формилтетра гидрофолата
HC 2
6
5C
3
4C
из глицина
N
7
8 CH
9
N
N
из формилтетрагидрофолата
из глутамина
из глутамина
P
O CH2
O
HO
OH
Инозин-5'-монофосфат
Аспартат
Аденилосукцинат-синтаза
NAD+
ATP
ADP
Инозинмонофос фатдегидрогеназа
NADH
Ксантинмонофосфат
Аденилосукцинат
АТР
Аденолосукцинат-лиаза
Фумарат
ADP
Глутамин
АМР
GMP-синтаза
Глутамат
GMP
Регуляция синтеза AMP и GMP из IMP:
Активирование
AMP
ATP
IMP
GTP
GMP
Активирование
Рис. 16.14. Схема биосинтеза пуриновых нуклеотидов и перекрестное активирование в регуляции соотношения AMP и GMP. В составе азотистого
основания инозинмонофосфата — гипоксантине показано
происхождение атомов углерода и азота
242
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
отщепление молекулы воды от остатка рибозы с помощью образующегося в
ее активном центре тирозин-радикала. В результате субстрат превращается в
радикал-катион, который восстанавливается в дезоксирибонуклеотид при
участии тиоредоксина, а в активном центре фермента регенерируется тирозиновый радикал.
Рибонуклеотид-редуктаза аллостерически активируется АТР и ингибируется dАТР (дезоксиаденозинтрифосфат), что позволяет регулировать соотношение окисленных и восстановленных форм нуклеозиддифосфатов.
Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов de novo осуществляется так: вначале синтезируется пиримидиновое кольцо, а затем к нему присоединяется
рибозо-5-фосфат. Синтез пиримидинового кольца происходит с участием
карбамоилфосфата и аспартата. В свою очередь, карбамоилфосфат образуется в цитоплазме из углекислоты и глутамина (донор аминогруппы) и катализирует эту реакцию карбамоилфосфат-синтаза, гидролизующая глутамин.
При конденсации карбамоилфосфата и аспартата (фермент — аспартаткарбамоилтрансфераза) формируется шестичленное кольцо — дигидрооротат.
Его окисление в оротат и присоединение фосфорибозилпирофосфата приводит к образованию оротидин-5- монофосфата, декарбоксилирование которого
дает основное промежуточное соединение биосинтеза пиримидинов —
уридин-5-монофосфат
Н2О
HO
Тиоредоксин
[ -S-S-]
NADPH
P
Азотистое
основание
OH
O
O
OH
P
O
CH2
O
O
H
1
NADP+
H
H
H
OH H
Дезоксинуклеозиддифосфат
2
Тиоредоксин
[ -S S-]
HO
H H
P
OH
Азотистое
основание
OH
O
O
P
O
CH2
O
O
H
H H H
OH OH
Нуклеозиддифосфат
1
тиоредоксинредуктаза
2
нуклеозиддифосфат -редуктаза (рибонуклеотид -редуктаза)
Рис. 16.15. Схема реакций восстановления рибонуклеотидов (объяснения в тексте)
243
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
(UMP). UMP затем превращается в другие пиримидиновые нуклеотиды
(рис. 16.16) довольно сложным образом.
O
Карбамоилфосфат
C
HN
CH
+
C
C
O
COOH
N
Аспартат
H
из карбамоилфосфата
из аспартата
Оротат
Фосфорибозил пирофосфат
Оротат-фосфорибозилтрансфераза
PPi
Оротидин-5-фосфатдекарбоксилаза
CO2
O
C
HN
CH
C
OH
HO
P
CH
O
O
N
CH2
O
O
dTTP
H
H
H
H
OH OH
Уридин-5-фосфат (UMP)
dTDP
2[H]
THF M THF
dTMP
dUMP
Тимидилатсинтаза
dUDP
2[H]
UDP
CDP
dCDP
CTP
dCTP
[NH2]
Pi
UTP
СТР-синтаза
Рис. 16.16. Схема этапов биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов: M-TGF —
метилентетрагидрофолиевая кислота; TGF — тетрагидрофолиевая кислота
244
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Пиримидиновые нуклеозидтрифосфаты образуются из нуклеозидмонофосфатов при участии АТР, как это описано выше для пуриновых нуклеотидов. Цитидилат образуется из уридилата на уровне нуклеозидтрифосфатов
(рис. 16.16) при участии цитидинтрифосфат-синтазы. Дезокситимидилат возникает из уридилата на уровне нуклеозидмонофосфата при метилировании
дезоксиуридинмонофосфата. Эту реакцию катализирует тимидилат-синтаза
при участии донора метильных групп —метилентетрагидрофолата. Восстановление рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды осуществляется по описанному ранее (для пуринов) механизму (рис. 16.15).
Регуляция биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов у бактерий описана
ранее (глава 6), и она осуществляется в ходе аллостерической регуляции активности фермента — аспартат-карбамоилтрансферазы. У животных ключевым ферментом биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов является карбамоилфосфатсинтаза, которая аллостерически активируется АТР и фосфорибозилпирофосфатом, а ингибируется UTP.
Итак, рассмотрен синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов de
novo. Однако это не единственный способ их образования, в целях экономии
ресурсов клетки часто образуют нуклеотиды в ходе так называемого ресинтеза. Этот путь предполагает использование свободных пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований, которые образуются при расщеплении нуклеиновых кислот, и фосфорибозилпирофосфата. Реакции образования нуклеозидмонофосфатов катализируются соответствующими фосфорибозилтрансферазами. Такой способ синтеза нуклеотидов особенно характерен для клеток
злокачественных опухолей.
Расщепление нуклеотидов. Данный процесс обычно завершает расщепление нуклеиновых кислот, которое катализируется нуклеазами. Различают
два типа нуклеаз — экзонуклеазы (атакуют полинуклеотидные цепи с концов) и эндонуклеазы (осуществляют расщепление ковалентных связей внутри молекулы, не нуждаясь в свободных 3`- и 5`-концах). Результатом деятельности нуклеаз является образование свободных нуклеотидов.
Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды расщепляются разными путями: пуриновое кольцо остается незатронутым и превращается в мочевую кислоту либо продукты ее преобразования, которые выводятся из организма;
пиримидиновые азотистые основания разрушаются до небольших фрагментов, которые способны снова включаться в метаболизм или могут выводиться
из организма.
У приматов, в том числе человека, птиц и рептилий распад пуриновых
нуклеотидов сопровождается образованием рибозо-фосфата (участ-вует в метаболизме) и мочевой кислоты (выводится с мочой). У других млекопитающих и моллюсков мочевая кислота окисляется в аллантоин, который выводится из организма. У костистых рыб аллантоин гидратируется в аллантоинат, а у амфибий и хрящекостных рыб аллантоинат расщепляется до мочевины и глиоксилата. Наконец, в клетках микроорганизмов пуриновые нуклеотиды
могут расщепляться до простейших соединений — аммиака, углекислоты, глицина, муравьиной кислоты. На рис. 16.17 показаны упрощенные схемы расщепления
пуриновых нуклеотидов.
245
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
АМР
GMP
H2O
H2O
Pi
NH3
Инозинмонофосфат
H2O
Pi
Инозин
Pi
Рибозо - Р
Гипоксантин
Гуанозин
Pi
Рибозо - Р
Гуанин
H2O
NH3
Ксантин
H2O Н О
2 2
О2
H2O
О2
Н2О 2
Мочевая кислота
Возможность
дальнейших
превращений
(см. текст)
Рис. 16.17. Упрощенные схемы расщепления пуриновых нуклеотидов
Важно отметить, что превращения гипоксантина в ксантин и ксантина в
мочевую кислоту катализирует один и тот же фермент — ксантин-оксидаза, и
на каждой из этих стадий в субстрат вводится оксогруппа в ходе окисления
молекулярным кислородом. При этом в качестве другого продукта образуется
перекись водорода (рис. 16.17), токсичное действие которой нейтрализуется
ферментами пероксидазами.
Мочевая кислота, в составе которой пуриновые азотистые основания выводятся из организма человека, в отличие от мочевины плохо растворима в
воде. Поэтому при некоторых нарушениях метаболизма, в том числе отдельных наследственных заболеваниях, а также при чрезмерном употреблении
мясных продуктов, содержащих высокие концентрации пуринов, в крови повышается концентрация мочевой кислоты (гипер-урикемия). Следствием
этого может являться отложение мочевой кислоты в суставах (подагра) и других органах.
При расщеплении пиримидиновых нуклеотидов вначале происходит отщепление остатка фосфорной кислоты и образование нуклеозида, а затем тимидин и уридин расщепляются до более простых соединений (рис. 16.18) в
ходе нескольких, общих для этих нуклеозидов реакций. Важными промежуточными соединениями этих путей являются урацил и тимин, которые могут
участвовать в ресинтезе пиримидиновых нуклеотидов или расщепляться одинаковым способом: пиримидиновое кольцо вначале восстанавливается, а затем гидролитически расщепляется.
246
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Следует отметить, что одна из аминогрупп пиримидиновых азотистых оснований отщепляется в процессе гидролитического дезаминирования, а вторая — в ходе трансаминирования, при котором акцептором аминогруппы
служат a-кетоглутарат (превращается в глутамат) или пируват (превращается
в аланин). Кроме ацетата и пропионата, продуктами расщепления пиримидиновых нуклеотидов являются СО2 и NH3.
UMP
dTMP
Pi
Дезокситимидин
Pi
Pi
NH3
Уридин
Pi
H2O
H2O
Pi
Цитидин
Рибозо- Р
Рибозо- Р
Тимин
CMP
H2O
H2O
Урацил
Восстановление,
гидратация,
дезаминирование,
декарбоксилирование,
трансаминироание,
деакрбоксилирование
Пропионат
Ацетат
Рис. 16.18. Упрощенные схемы расщепления пиримидиновых нуклеотидов
247
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 17. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ
И БИОСИНТЕЗ ВИТАМИНОВ
17.1. Общая характеристика витаминов
К витаминам относят группу низкомолекулярных органических веществ,
требующихся организму в следовых количествах, но выполняющих в нем
жизненно важные функции, чаще каталитические и регуляторные. Витаминами считаются вещества, чьи химические и физические свойства, а также
физиологическая роль зачастую совершенно различны, но общим для всех
них можно считать то, что без их присутствия невозможно нормальное развитие и жизнедеятельность человека и животных, в то же время большинство
витаминов этими организмами самостоятельно не синтезируются.
Таким образом, витамины должны поступать в организм с пищей или вырабатываться кишечной микрофлорой. При несбалансированном питании или
гибели кишечной микрофлоры (например, в результате антибиотикотерапии)
может наступать витаминная недостаточность, тяжелая форма которой носит
название авитаминоз. Проявлениями авитаминозов являются поражения
кожных покровов и слизистых оболочек, отставание в росте, нарушения
нервной и гуморальной систем, хрупкость сосудов, искривления костей, выпадения волос, зубов и др. Большинство витаминов не может накапливаться в
организмах человека и животных, поэтому важно регулярно восполнять их
дефицит. Синтезируются витамины в клетках растений и микроорганизмов,
кроме того, некоторые животные сохранили способность самостоятельно синтезировать те или иные витамины. Считается, что потребность в витаминах у
человека и большинства животных связана с утратой отдельных ферментов в
результате мутаций. На это указывает восстановление способности к синтезу
некоторых витаминов при добавлении в рацион определенных предшественников или в особых условиях. Например, витамин А может синтезироваться в
организме человека из каротина (провитамин), а витамин D — только под
воздействием ультрафиолетового облучения.
Открыты витамины русским ученым Н.И. Луниным в 1880 г., а свое название получили позже, в 1912 г., благодаря исследованиям польского биохимика К. Функа, который выделил в виде чистого вещества витамин В1, оказавшийся амином. С тех пор подобные вещества, в том числе не принадлежащие к аминам, называют витаминами, что в переводе означает «жизненные амины» (от лат. vita — жизнь). В настоящее время известно более 30
витаминов и их изучает особый раздел биохимии —витаминология.
Для системного изучения структуры, свойств и биосинтеза витаминов
следует обратиться к их классификации. Классифицируют витамины в соот247
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ветствии с их химическими свойствами (растворимость в воде и липидах), с
химической структурой, а также с основными функциями в организме. Номенклатура витаминов допускает использование тривиальных названий
(обычно связаны с симптомами авитаминозов), химических наименований и
буквенных обозначений.
В соответствии со способностью растворяться в воде или жировых растворителях витамины принято делить на две группы: водорастворимые и жирорастворимые. Большинство водорастворимых витаминов относятся к группе В и обладают коферментными функциями (входят в состав коферментов и
простетических групп). Некоферментные свойства витаминов характеризуются способностью участвовать в регуляции метаболизма, выполнять структурную функцию, служить пластическим материалом, проявлять антимутагенное
действие, участвовать в зрительном цикле, усиливать защитные свойства организма, повышать свертываемость крови, регулировать проницаемость сосудов и др.
Кроме витаминов, выделяют еще одну категорию веществ витаминной
природы — витаминоподобные вещества, однако между этими группами отсутствует четкая граница.
17.2. Жирорастворимые витамины
К жирорастворимым витаминам относятся витамины A, D, E, K, а также
Q и F. Последние два часто относят к витаминоподобным веществам. По химической структуре все эти витамины, кроме F, являются изопреноидами.
Изопреноиды (терпены) представляют собой обширную группу соединений, имеющих общие начальные стадии биосинтеза, в которых участвует в
качестве предшественника пятиуглеродный разветвленный ненасыщенный
углеводород — изопрен (2-метилбутадиен-1,3). К изопреноидам, кроме перечисленных витаминов, относятся каротиноиды, стеролы, каучук, фитол (входит в состав хлорофилла) и многие другие соединения.
Жирорастворимые витамины выполняют в организме некоферментные
функции.
Витамин А (ретинол). Этот витамин существует в форме двух витамеров (сходные по химическому строению формы витамина, обладающие разным физиологическим действием) — А1 (ретинол) и А2 (дегид-роретинол).
Дегидроретинол отличается от ретинола наличием двойной связи между 3-м
и 4-м атомами углерода в шестичленном кольце (рис. 17.1). Кроме этого, витамин А (спирт), легко окисляясь, дает начало группе ретиноидов, к которой
принадлежит ретиналь и ретиноевая кислота (рис. 17.1). Известно, что ретиналь выполняет роль зрительного пигмента (глава 13), а ретиноевая кислота
служит ростовым фактором, участвуя в развитии костной ткани и поддерживая нормальную секреторную функцию слизистых оболочек.
Биологическая роль витамина А и его форм состоит в регуляции дифференцировки клеток, предупреждении ороговения эпителиальных
248
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H3C
CH3
CH3
CH3
CH2OH H3C
Витамин А1 (ретинол)
CH3
CH3
CH2OH
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
Витамин А2 (дегидроретинол)
H3C
CHO
CH3
CH3
CH3
COOH
CH3
Ретиноевая кислота
CH3
Ретиналь
Рис. 17.1. Структура разных форм витамина А (пояснения в тексте)
тканей, участии в обмене белков и липидов, в окислительных процессах, в
регуляции проницаемости мембран. Суточная потребность в витамине составляет для взрослого человека 1 мг. А-авитаминозы сопровождаются утратой остроты зрения и возникновением сумеречной слепоты, поражением эпителиальных тканей и слизистых оболочек, торможением роста, уменьшением
массы тела, повреждением тканей нервной системы, клеток надпочечников и
семенников.
Следует отметить, что недостаток витамина А в пище особенно опасен
для детей, поскольку у взрослых этот витамин может запасаться, образуя
сложные эфиры с пальмитиновой кислотой. В таком виде ретинол более устойчив и накапливается в печени в количествах, способных обеспечить потребность в нем в течение 2 лет.
Источниками витамина А являются животные продукты (особенно печень
морских животных и рыб), а также растительные продукты, содержащие каротиноиды. Каротины служат в организме человека предшественниками
(провитаминами), из которых синтезируется витамин А.
В свою очередь, b-каротин содержится в свежих овощах и фруктах, особенно много его в моркови и тыкве. Кроме этого, каротиноиды синтезируются в клетках многих микроорганизмов: микроскопических водорослей, дрожжей, мицелиальных грибов, актиномицетов, микобактерий.
Биосинтез каротиноидов, так же как и других изопреноидов, осуществляется из ацетил-СоА в ходе нескольких стадий и подчиняется «изо-преновому
правилу», впервые сформулированному швейцарским химиком Л. Ружичкой.
Согласно этому правилу, обязательным в синтезе является участие изопреновых единиц и следующих превращений:
1) формирование
мевалоната
из
ацетил-СоА
или
лейцина;
2) фосфорилирование, дегидратация и декарбоксилирование мевалоната с
образованием «активного изопрена» — изопентенилпирофосфата; конденсация изопреновых звеньев с образованием линейных молекул разной
249
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
длины; 3) циклизация частей линейных молекул изопреноидов; 4) модификация циклических структур.
Основные стадии процесса биосинтеза b-каротина, подчиняющегося правилу Ружечки, представлены на рис. 17.2 и 17.3.
O
2 H3C
C
O
S
CoA
Ацетил - СоА
O
H3C C CH2 C S CoA
Ацетоацетил -СоА
CoA
O
H3C C
S
CoA
CoA
2NADP+ 2NADPH
CH3
CH3
-
-
OOC CH2
C
CH2
CH2
OOC
CH2OH
OH
Мевалонат
C
O
CH2
C
S
CoA
OH
3-Гидрокси-3-метилглутарил-СоА
CoA
2ATP
CH3
-
OOC
CH2
C
CH2
CH2
O
C
H2C
P P
OH
Мевалонилпирофосфат
CH3
CH3
ATP ADP+ Pi
2ADP
CO2 H2O
O
P P
Изопентенилпирофосфат (IPP)
CH3
CH3
C
H3C
O P P
Геранилпирофосфат
H3C
O
P P
Диметилаллилпирофосфат
PPi
IPP
PPi
CH3
PPi
IPP
CH3
CH3
CH3
O
H3C
P P
CH3
CH3
O
P P
Геранилгеранилпирофосфат
Конденсация двух молекул
« голова к голове»
CH3
CH3
H3C
Фарнезилпирофосфат
CH3
CH3
CH3
CH3
CH
NADP+
NADPH
2PPi
CH3
CH3
CH3
HC
H3C
H3C
Фитоен
250
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 17.2. Синтез бесцветного предшественника окрашенных каротиноидов — фитоена (С40-линейная молекула)
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH
H3C
CH3
CH3
CH3
HC
H3C
Фитоен
-2[H]
-2[H]
-2[H]
-2[H]
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH
H3C
CH3
CH3
CH3
HC
H3C
Ликопин
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH
CH3
CH3
H3C
C
HC
C
H3C
CH2
C
g-Каротин
CH3
H3C
C
H2C
CH3
CH
C
H2C
CH3
CH3
H3C
HC
C
C
CH2
C
CH3
H3C
b-Каротин
H
CH2
H
H
C
C
H
CH3
CH3
C
H3C
CH2
C
H
H
Оксигеназа
CH3
H3C
CH3
C
2
H2C
C
H2C
CH2OH
C
C
H
CH3
CH3
H
Ретинол
Рис. 17.3. Синтез окрашенных пигментов из фитоена, образование bкаротина и ретинола
Следует отметить, что промежуточное соединение, образующееся на на251
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
чальных
этапах
биосинтеза
каротиноидов — фарнезилпирофосфат
(рис. 17.2), является предшественником для синтеза стеролов (глава 15) и
витамина Q.
Фитоен — линейная 40-углеродная молекула, состоящая из повторяющихся изопреновых единиц, подвергается далее четырем последовательным
реакциям дегидрирования, в результате чего в ней образуется 4 дополнительные двойные связи (ликопин — красный пигмент томатов), а затем циклизуется в b-каротин через промежуточную стадию образования g-каротина
(рис. 17.3).
В клетках печени и слизистой кишечника животных и человека b-каротин
может подвергаться окислительному расщеплению с образованием двух молекул ретинола (рис. 17.3).
Витамин D (кальциферол). Кальциферол, как и витамин А, существует
в виде нескольких витамеров. Наиболее распространены витамины D2 и D3.
Витамин D2 образуется из провитамина эргостерола, а витамин D3 — из продукта модификации холестерола (7-дегидрохолестерола) под действием солнечной иррадиации. Ультрафиолетовое облучение приводит к раскрытию в
молекуле стерола кольца В в результате размыкания связи между 9-м и 10-м
углеродными атомами (рис. 17.4, сравни с рис. 4.4). У животных эта реакция
протекает в клетках кожи.
Поскольку провитамины (стеролы) способны синтезироваться в организмах животных и человека (глава 15), а также поступают с пищей, дефицит
витамина D у взрослых наблюдается редко (при недостатке солнечного облучения, иногда — в результате наследственных нарушений). Но у детей, в организмах которых происходит интенсивный мембраногенез, развитие тканей,
костной и мышечной систем, часто регистH3C
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
C
H2C
2
3
HO
1
A
4
9
10
5
B
6
CH3
D
1
2
7
3
10
A
5
9
B
6
8
7
4
HO
Витамин D2 (эргокальциферол)
O
CH3
CH3
HO
CH3
O
CH3
D
C
H2C
8
Витамин D3 (холекальциферол)
H3C
CH3
CH3
CH3
H
H
O
3
CH3
4
Витамин Е (a - токоферол)
Витамин К1 (филлохинон)
252
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 17.4. Структура витаминов D, E, К
рируется недостаточность витамина D, которая может привести к развитию
рахита — заболевания, связанного с нарушением процесса минерализации
костной ткани.
Витамин D принимает участие в реакциях перекисного окисления липидов, а, кроме того, витамер D3 гидроксилируется в печени и почках животных
с образованием гормона кальцитриола (1, 25-дигидрокси-холекальциферол).
Кальцитриол вместе с двумя другими гормонами участвует в регуляции обмена кальция в организме. В частности, известно, что кальцитриол стимулирует всасывание кальция в желудочно-кишеч-ном тракте и включение его в
костную ткань.
Витамином D3 богаты такие продукты, как рыбий жир, сливочное масло,
желток куриного яйца, печень животных, молоко. Суточная потребность в
витамине D составляет 0,01 мг. Важно присутствие витамина D в рационе
сельскохозяйственных животных, в первую очередь кур и коров, поскольку у
них кальциевый обмен происходит особенно интенсивно. Получают витамин
D (в основном эргокальциферол), облучая ультрафиолетом дрожжевую или
грибную биомассу либо уже выделенный эргостерол.
Витамин Е (токоферол). Под этим названием объединяется группа витамеров, синтезируемых растениями. Наиболее распространены a(рис. 17.4), b- и g-токоферолы, которые различаются числом и положением
метильных групп у бензольного кольца. Токоферолы обладают антиоксидантным действием по отношению к ненасыщенным липидам: выступают в
роли восстановителей, которые легко реагируют с окисляющими веществами
(например, с пероксидными радикалами) и таким образом защищают другие
молекулы от окисления. Наиболее полно это свойство токоферолов проявляется по отношению к липидам мембран, что стабилизирует их функции и,
соответственно, биохимические процессы, связанные с деятельностью мембран.
Кроме этого, токоферолы участвуют в регуляции синтеза ферментов, а
также контролируют обмен и функции убихинона — одного из компонентов
дыхательной цепи.
Наибольшее количество витамина Е содержится в проростках пшеницы и
растительных маслах, а также в салатах, капусте. Суточная потребность в
этом витамине для человека составляет 10 мг.
Недостаток витамина Е в рационе может приводить к нарушению эмбриогенеза, развитию заболеваний органов размножения, а также к мышечной
дистрофии, параличу конечностей, дегенерации спинного мозга и др. Однако
Е-авитаминозы встречаются достаточно редко при сбалансированном питании, поскольку витамин Е способен запасаться в тканях животных, восполняя
недостаточное поступление токоферола с пищей в течение нескольких месяцев.
Витамин К (филлохинон). К витаминам группы К относят соединения
со структурой молекул, подобных витамину К1 — филлохинону (рис. 17.4). Кроме
этого, распространены витамины К2 (менахиноны), отличающиеся строением
боковой цепи, а также многие производные нафтохинона.
Витамин К является антигеморрагическим фактором, способствующим
253
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
нормализации и ускорению свертываемости крови. При этом филлохинон
принимает участие в карбоксилировании остатков глутаминовой кислоты
белков плазмы крови. У растений и микроорганизмов менахиноны участвуют
в окислительно-восстановительных процессах, происходящих при окислительном фосфорилировании и фотофосфорилировании.
Суточная потребность в витамине К для взрослого человека составляет
0,08 мг. Большие количества этого витамина присутствуют в зеленых частях
и плодах растений (томаты, капуста, тыква), а также в печени животных.
Кроме того, витамин К синтезирует кишечная микрофлора, поэтому Кавитаминозы наблюдаются обычно только у новорожденных.
Витамин Q (убихинон). Хиноны, в том числе убихинон (Q10), уже рассмотрены в главе 12 как коферменты. Однако есть основания считать убихиноны веществами витаминной природы, поскольку, хотя они и синтезируются
в организмах животных и человека, известны заболевания, которые излечиваются при введении Q10. К таким заболеваниям можно отнести, например,
анемию или нарушения в костном мозге при белковом голодании у детей.
Известно участие убихинонов в процессах транспорта электронов при дыхании и фотосинтезе, а также антиоксидантное действие в мембранах, причем еще более эффективное, чем у токоферола.
Убихиноны синтезируются всеми организмами, за исключением некоторых бактерий. Предшественниками ароматического кольца служит поксибензойная кислота, которая у животных синтезируется из тирозина и фенилаланина, поэтому синтез убихинонов у животных зависит от белкового
питания. Боковая изопренильная цепь убихинонов синтезируется по правилу
Ружечки. Богатыми источниками убихинонов являются ткани, в которых интенсивно осуществляются окислительно-восстано-вительные процессы: сердечная мышца, печень, «бурый жир».
Витамин F (незаменимые жирные кислоты). Жирные кислоты с
большим количеством двойных связей — линолевая (18:2), линоленовая
(18:3) и арахидоновая (20:4) — не могут самостоятельно синтезироваться в
организме человека и должны поступать с пищей. На этом основании предложено относить их к витаминам. Арахидоновая кислота, однако, может образовываться из линолевой и линоленовой. Она служит предшественником
большой группы медиаторов (локальных гормонов эйкозаноидов). Эйкозаноидам присущи важные функции: они участвуют в высвобождении веществ
внутриклеточного синтеза, контролируют сокращение гладкомышечной ткани, оказывают влияние на метаболизм костной ткани, нервную и иммунную
системы и др.
Отмечено участие витамина F в регуляции обмена липидов, выявлена его
роль в выведении из организма избыточных количеств холестерола. Имеются
сведения о положительном влиянии ненасыщенных жирных кислот на состояние кожного и волосяного покрова. Однако случаев F-авитаминоза у человека не описано.
17.3. Водорастворимые витамины
254
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Водорастворимые витамины можно классифицировать по структуре их
молекул и выполняемым в организме функциям (рис. 17.5). КоферменКоферментные витамины
Гетероциклические
Тиамин
Рибофлавин
Пиридоксин
Никотиновая кислота
Биотин
Фолиевая кислота
Кобаламины (В12)
Алифатические
Пантотеновая кислота
Липоевая кислота
Соединения, не участвующие в образовании коферменто
Образованные из гексоз
Полиметильные
Аскорбиновая кислота
Инозит
Холин
Карнитин
Пангамовая кислота
Рис. 17.5. Классификация водорастворимых витаминов. На схеме показаны истинные витамины и витаминоподобные вещества
тные витамины выполняют функцию кофакторов ферментов, некоферментным витаминам присущи иные, довольно разнообразные функции.
Витамин В1 (тиамин). Этот витамин был выделен в виде чистого вещества первым (польским ученым К. Функом, 1912 г.). Молекула тиамина состоит из пиримидинового (П) и тиазолового (Т) колец, соединенных метиленовой группой (рис. 17.6). Активной формой витамина является тиаминдифосфат (рис. 17.6), выполняющий функции простетической группы декарбоксилаз кетокислот. Тиаминдифосфат (кокарбоксилаза) участвует в таких
важных процессах, как окислительное декарбоксилирование пирувата (глава 11), транскетолазные реакции пентозофосфатных путей и цикла Кальвина,
расщепление a-оксикетонов и a-дикетонов. Основным каталитическим центром фермента является 2-й углеродный атом тиазола (рис. 17.6). Для витамина В1 характерны и некоферментные функции: участие в активном переносе богатых энергией фосфатных групп, участие в окислительновосстановительных реакциях, в проведении нервного импульса.
Синтезируют тиамин растения, дрожжи, многие бактерии, в том числе те,
что населяют кишечник человека и животных (E.coli, Proteus vulgaris, Bacil255
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
lus mesentericus, Alcaligenes faecalis). Поэтому В1-витаминозы у взрослых
людей встречаются редко. Однако в определенные периоды жиCH3
R = H витамин В1 (тиамин);
OH
OH
+
N
N3 4
П
2
N
H3C
NH2
Т 5
1
CH2
CH2 OR
R = P
S
O
O
Кокарбоксилаза
(тиаминдифосфат)
P OH
O
R
CH2OH
HO
H3C
R = CH2OH
пиридоксин;
R = CH2NH2
N
Витамин В6
пиридоксамин;
C
CH2O P
HO
N
H3C
Пиридоксаль фосфат
Аминокислота 2
10
OH
N3 4
2
H2N
1
N
9CH2
N
5
8
6
7
N
Остаток
птеридина
CH2
HO
CH2O P
H3C
N
Пиридокс аминфосфат
Трансаминаза
C
Кетокислота 1
NH2
H
O
HN
пиридоксаль
H
Трансаминаза
Аминокислота 1
Функции
в составе
кофакторов
O
R=C
O
COO-
NH
CH
CH2
Остаток
п-аминобензойной
кислоты
CH2
COO-
Кетокислота 2
В молекуле тетрагидро филиевой кислоты
восстановлены атомы:
N-3, N-5 и N-8
Водород замещается на
одноуглеродные радикалы
у атомов: N-5 и N-10
Glu
Витамин В9 (птероилмоноглутаминовая кислота)
Рис. 17.6. Структура витаминов В1, В6, В9 и их коферментных форм. Участие пиридоксальфосфата в реакциях трансаминирования
256
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
зни потребность в тиамине может возрастать в несколько раз, например у
женщин при беременности и кормлении детей грудным молоком. Этот витамин содержится в зерновых культурах, бобовых, дрожжевых продуктах, в
постной свинине.
Суточная потребность взрослого человека в тиамине составляет 1,5 мг.
При его недостатке развиваются сердечно-сосудистые заболевания, мышечная атрофия, болезнь бери-бери, которая сопровождается расстройством
нервной системы.
Тиамин используют в медицине, им обогащают напитки и некоторые сорта хлеба, применяют в фармацевтической промышленности. Вносят в корма
для животных.
Витамин В2 (рибофлавин). Представляет собой гетероциклическое соединение флавиновой природы (рис. 7.4), содержащее функционально активную изоаллоксазиновую систему. Рибофлавин служит структурным элементом таких простетических групп, как FAD и FMN, функции которых описаны
в главе 7.
Суточная потребность в рибофлавине составляет 1,8 мг. Рибофлавином
богаты молоко, яйца, печень и почки животных, овощи, дрожжи. Этот витамин поступает в организм также за счет деятельности кишечной микрофлоры.
В2-авитаминозы выражаются в заболеваниях кожи (трещины в уголках рта),
задержке роста, воспалении слизистых оболочек, в том числе роговицы глаза,
что связано с ослаблением зрения, быстрой утомляемости, заболеваниях кроветворной и нервной системы.
В природе рибофлавин синтезируют растения, мицелиальные грибы,
дрожжи, бактерии. Пути биосинтеза рибофлавина хорошо изучены для бактерий Salmonella typhimurium, дрожжей рода Saccharomyces, грибов рода Eremothecium и имеют много общего. У дрожжей предшественником для синтеза
рибофлавина служит ГТР. На первой стадии происходит раскрытие имидазольного кольца в составе остатка гуанина и отщепление 8 углеродного атома, который выделяется в виде формиата (рис. 17.7). Затем происходит последовательное отщепление пирофосфата, внутримолекулярная перестройка
(перегруппировка Амадори), восстановление, отщепление аминогруппы (замещается на кетогруппу) и отщепление ортофосфата. Формируется диоксиаминорибитиламинопиримидин (ДОАРАП), к которому присоединяется восемь атомов углерода, необходимых для построения бензольного ядра. Полагают, что источником этих атомов углерода является пируват, который превращается в ацетоин или диацетил. Добавление атомов углерода происходит
в ходе двух стадий: на первой из них присоединение четырех атомов углерода
приводит к образованию диметилрибитиллюмазина, одна из молекул которого на второй стадии выступает в качестве донора еще 4 атомов углерода
(рис. 17.7).
Флавиновые кофакторы (FAD, FMN) образуются в клетках дрожжей и
бактерий с участием АТР:
Рибофлавин + АТР ® FMN + ADP
FMN + ATP ® FAD + PPi
257
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рибофлавин, а также его производные (FAD, FMN) находят применение в
медицине, витамином В2 обогащают некоторые сорта хлеба, его
O
O
N
HN
H2N
P P P
N
N
O CH2
NH2
HN
H2N
+ 2H2O
O
P
O
NH
N
CH2
O
PPi
HCOOH
OH OH
OH OH
2,5-Диамино-6-окси-4рибозиламинопиримидин
GTP
Перегруппировка
Амадори,
восстановление
NADPH
NADP+
O
N
HN
O
O
CH3
O
NH2
HN
N
N
CH3
O
CH2
+ 4[C]
H C OH
NH
N
H
H2N
CH2
N
NH
CH2
H C OH
H C OH
H C
H C OH
H C OH
Pi
NH3
H C OH
D -Фосфо рибитил
OH
H C OH
H C OH
CH2OH
2,6-Диокси-5-амино-4рибитиламинопиримидин
CH2OH
6,7-Диметил-8рибитиллюмазин
NH2
HN
CH2O P
2,5-Диамино-6-окси-4рибитиламинопиримидин
O
HN
Реагируют
2 молекулы
O
N
N
CH3
N
CH3
CH2
+
2,6-Диокси-5-амино-4рибитиламинопиримидин
( H C OH)3
CH2OH
Рибофлавин
Рис. 17.7. Биосинтез рибофлавина
258
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
используют для окраски в оранжево-желтые тона пищевых продуктов. Очень
важно присутствие рибофлавина в кормах животных.
Витамин В3 (пантотеновая кислота). Это соединение состоит из остатка пантоевой кислоты (a,g-дигидрокси-b,b-диметилбутирата) и b-аланина
(рис. 7.8). Пантотеновая кислота является составной частью СоА —
чрезвычайно важного для клетки кофактора, а также входит в состав простетической группы ацилпереносящего белка (глава 15). Таким образом, без витамина В3 не может осуществиться синтез названных кофакторов, что приводит к невозможности осуществления обмена жирных кислот, взаимопревращения углеводов, ЦТК и других процессов. Поэтому пантотеновая кислота
присутствует в клетках всех организмов: от бактерий до высших животных,
однако сами животные ее не синтезируют и получают с пищей. Наибольшее
количество пантотеновой кислоты содержится в печени, сердце и почках животных, в дрожжах, яичном желтке, горохе, молоке. Бактерии группы кишечной палочки, обитающие в кишечнике, снабжают витамином В3 своих хозяев.
Таким образом, В3-авитаминозы очень редки, однако связаны с тяжелыми
нарушениями: поражением кожных покровов и слизистых оболочек, дегенеративными изменениями органов и тканей, потерей волосяного покрова и др.
Суточная потребность в витамине составляет 7 мг.
Витамин В5
(никотиновая
кислота,
никотинамид,
витамин РР). Этот витамин необходим для синтеза двух коферментов — NAD и
NADP. Структура никотинамида представлена на рис. 7.1 (в составе NAD). В
молекуле никотиновой кислоты, которая, как и никотинамид, может использоваться для синтеза никотинамидных коферментов, аминогруппа в радикале
замещена на гидроксил. Небольшие количества никотиновой кислоты могут
синтезироваться из триптофана, однако этот процесс характеризуется низким
выходом, к тому же протекает при участии другого витамина — В6. Поэтому
В5-авитаминозы обычно связаны с недостатком триптофана и витамина В6, а
их проявление характеризуется заболеванием кожи (пеллагра), воспалением
слизистой желудочно-кишечного тракта, депрессией.
Значение витамина В5 для организма связано со значением для клетки
никотинамидных переносчиков восстановительных эквивалентов (глава 7).
Суточная потребность в нем составляет 20 мг или 1,2 г триптофана. Витамином богаты дрожжевые продукты, мясо, фрукты и овощи.
Витамин В6 (пиридоксин). Под витамином В6, строго говоря, подразумевают три производных пиридина: пиридоксаль, пиридоксин и пиридоксамин (рис. 17.6). Каждое из этих соединений способно превращаться в клетках
в активную форму — пиридоксальфосфат, который является простетической
группой более 50 ферментов, принимающих участие в синтезе аминокислот,
их распаде, в фосфорилировании углеводов, метаболизме жирных кислот и
липидов. Одна из наиболее важных функций пиридоксальфосфата заключается в переносе аминогруппы от аминокислоты к кетокислоте в реакциях
трансаминирования, описанных в главе 16. При этом пиридоксальфосфат
переходит в пиридоксаминфосфат (рис. 17.6).
Витамин В6 поступает в организм из кишечника благодаря деятельности
кишечной микрофлоры, он также содержится во многих продуктах, в первую
очередь в говядине, рыбе, горохе, овощах, яичном желтке, в зеленых частях
259
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
растений, в продуктах переработки зерновых. В6-авитаминозы встречаются
редко. Их симптомами служит анемия, дерматиты, судороги, а у молодых
особей — задержка роста. Суточная потребность в витамине — 2 мг.
Витамин В9 (фолиевая кислота). Под этим названием известно несколько форм птероилглутаминовой кислоты, различающихся количеством
остатков глутамата (от 1 до 6). На рис. 17.6 представлена структура молекулы
птероилмоноглутаминовой кислоты, которая состоит из трех структурных
компонентов: остатка птеридина, остатка парааминобензойной кислоты и
одного остатка глутаминовой кислоты. В восстановленной форме (тетрагидрофолиевая кислота) это соединение выполняет функции кофермента, осуществляя перенос одноуглеродных фрагментов. Такие реакции осуществляются
при биосинтезе метионина и тимина (перенос метильных групп), при биосинтезе серина (перенос оксиметильной группы), при синтезе пуринов и формилметионил-тРНК (перенос формильной группы) и т. п. Присоединение
фрагментов осуществляется к атому азота, находящемуся в 5 и/или 10 положении (рис. 17.6).
В клетках животных и человека фолиевая кислота не синтезируется, однако поступает в организм с пищей и всасывается из кишечника, где образуется микроорганизмами. Микроорганизмы не используют готовый витамин
В9, а синтезируют его de novo, при этом включение парааминобензойной
кислоты в состав фолиевой кислоты блокируется в присутствии сульфаниламидных препаратов, на чем основано их терапевтическое действие. Парааминобензойную кислоту называют витамином Вх (Н1).
В9-авитаминозы связаны с нарушением функций кроветворения и проявляются как анемия, множественные нарушения органов пищеварения. Суточная потребность в этом витамине составляет 0,2 мг. Фолиевыми кислотами
богаты свежие зеленые овощи, особенно шпинат и цветная капуста, печень
животных, зерновые.
Витамин В12 (кобаламины). Группа кобаламинов представляет собой
сложные соединения, состоящие из следующих частей: планарной, в основе
которой лежит тетрапиррольное кольцо коррина, стабилизованное атомом
кобальта; двух лигандов — верхнего (Х) и нижнего, а также аминопропанолового мостика (рис. 17.8). В свою очередь, верхний лиганд в витамине В12
может быть представлен цианид-ионом, гидроксильной группой, ионами нитрита, нитрата, хлора и др. Нижний лиганд представлен нуклеотидным ядром,
состоящим из остатка фосфорибозы и 5,6-диметилбен-зимидазола. Нуклеотидное ядро через аминопропаноловый мостик связано в цикл с заместителем
атома углерода одного из пиррольных колец.
Кобаламины в организме человека и животных превращаются в кофермент В12-кобамамид (аденозилкобаламин), у которого верхний лиганд
представлен остатком дезоксиаденозина, связанного с атомом кобальта необычной кобальт-углеродной связью. Биохимические функции аденозилкобаламина состоят в изомеризации соединений, которая имеет место в углеводном, азотистом, нуклеиновом и липидном обмене, в биосинтезе метионина из
гомоцистеина (участвует также витамин В9), в восстановлении рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов (у бактерий) и других процессах.
260
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Витамин В12 синтезируется только микроорганизмами, в том числе теми,
которые населяют желудочно-кишечный тракт человека и животных. Однако
для всасывания этого витамина слизистой желудка и кишечника необходим
особый протеин — так называемый «внутренний фактор». Таким образом,
В12-авитаминозы могут развиваться не только при недостатке витамина в
пище, но главным образом при отсутствии внутреннего фактора. Следствием
авитаминоза является развитие пернициозной (от лат. perniciosus —
гибельный) анемии.
Источниками витамина В12 могут служить продукты животного происхождения: мясо, печень, яйца, молоко, а также бобовые растения, где его продуцентами являются клубеньковые бактерии. Небольшие количества этого
витамина могут накапливаться у человека (животных) в печени. Суточная
потребность в нем составляет 0,002 мг.
Промышленное получение витамина В12 и аденозилкобаламина основано
на микробном синтезе. Продуцентами витамина являются бактерии следующих
родов:
Pseudomonas,
Propionibacterium,
Streptomyces,
Rhodopseudomonas, Bacillus, Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Flavobacterium, Nocardia, а также метанообразующие бактерии. Этот
витамин чрезвычайно важен для животноводства и находит широкое применение в медицине.
Биосинтез каждой из составных частей аденозилкобаламина происходит
независимо. Предшественниками для биосинтеза корринового макроцикла
служат глицин и сукцинил-СоА, которые взаимодействуют с образованием 5аминолевулиновой кислоты (рис. 17.8). Две молекулы аминолевулиновой
кислоты в ходе нескольких стадий димеризуются в порфобилиноген. Четыре
молекулы порфобилиногена поэтапно конденсируются с образованием уропорфириногена. Это соединение является также предшественником гема и
хлорофилла, на этапе его структурных перестроек расходятся пути биосинтеза названных соединений.
При синтезе кобаламинов уропорфириноген подвергается последовательным реакциям метилирования, восстановления, декарбоксилирования и другим указанным на рис. 17.8 превращениям. В результате образуется простейшее корриноидное соединение, не содержащее нуклеотида, — кобириновая
кислота, которая в ходе нескольких стадий амидируется в кобинамид.
Источником верхнего лиганда кобинамидов — аденозила служит АТР, и
образование аденозильного производного кобинамида происходит при непосредственном взаимодействии атома кобальта, связанного с корриновым
циклом, и АТР.
Аминопропанол, играющий роль мостика между нуклеотидным ядром и
одним из заместителей у корринового кольца, образуется при декарбоксилировании L-треонина. Нуклеотидное ядро синтезируется из рибофлавина, причем рибитильный остаток рибофлавина не включается в состав ядра, а содержащаяся в нем a-рибоза происходит из никотинамидмононуклеотида. В
присоединении нуклеотидного ядра к молекуле корриноида принимают участие АТР и GTP.
261
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
H2C
COO-
H2C
C
COO+
+ H3N
SCoA
C
H
H
O
Сукцинил -СоА
Глицин
A
P
P
A
H2C
COO-
H2C
C
NH3
O
5-Аминолевулиновая
кислота
Альдольная конденсация
двух молекул, дегидрата ция, замыкание кольца,
таутомеризация
COO-
Конденсация четырех
молекул, таутомеризация, разрыв и воссо единение цикла
N H HN
HN
NH
+ CoA + CO2
+
CH2
COO-
CH2
H2C
CH2
A
A
N
H
H2C
P
P
Уропорфириноген
+
NH3
Порфобилиноген
X
Y
Декарбоксилирование, включение
метильных групп, элиминирование
метиленового мостика между кольцами
А и D, восстановление, включение
центрального атома кобальта
CH2
Y
R
O
P
A
R
B
A
R
Co
P
R
R
C
D
A
++
N
N
R
P
R
R
Аминопропаноло- H C
3
вый
мостик
R
R
C
R
CH2
Y
HN
N
N
D
C
CH2
B
Co ++
N
N
Y
CH2
A
Y
Y
N
N
CH2
R
R
A
R
R
P
R
CH2
N
CH3
O HO N
CH3
CH O
O
P
-
P
O
Кобириновая кислота
O
CH2OH
Витамин В12
Рис. 17.8. Структура и биосинтез витамина В12. Обозначения:
А — -СН2СООН; Р — -СН2-СН2-СООН; R — -CH3;
Y — -CH2CONH2; X — верхний лиганд
262
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Витамин С (аскорбиновая кислота). Об этом витамине знают, пожалуй, все, что можно связать с его многосторонними функциями в организме, в
том числе терапевтическим и профилактическим эффектом при простудах, а
также мощными антиоксидантными свойствами.
Аскорбиновая кислота представляет собой g-лактон 2,3-дегидрогулоновой кислоты. Это соединение содержит группировку «редуктона»
(рис. 17.9), которая легко окисляется, в результате чего образуется дегидро-Lаскорбиновая кислота. Обе гидроксильные группы аскорбиновой кислоты
имеют кислотный характер, и при потере протона может образовываться третья активная форма витамина С — аскорбат-анион. L-аскорбиновая кислота
является самым сильным восстановителем в живом организме, и это важнейшее свойство лежит в основе ее физиологической активности: она участвует во многих окислительно-восстано-вительных процессах, а образующаяся
при этом дегидроаскорбиновая кислота легко восстанавливается с помощью
редуктазы. Среди множества биохимических реакций, протекающих с участием витамина С, можно упомянуть синтез коллагена, расщепление тирозина и лизина, синтез желчных кислот, обмен липидов, гидроксилирование
предшественников некоторых гормонов и др. Установлено участие аскорбиновой кислоты в предохранении SH-групп белков от окисления, что среди
прочего влияет на стабилизацию ферментативной активности. Аскорбиновая
кислота служит мощным антиоксидантом, предохраняющим биологически
активные вещества клетки от действия радикалов. Наконец, витамин С участвует в поддержании высокой концентрации в клетке сАМР —важного регуляторного вещества, оказывающего, например, обратное действие на развитие
раковой опухоли.
С-авитаминозы выражаются в развитии цинги (скорбута), что положено в
основу названия витамина. Болезнь выражается в повышении проницаемости
и хрупкости кровеносных сосудов, вследствие чего возникают спонтанные
кровоизлияния, а также в разрушении костных тканей (выпадение зубов).
Происходит атрофия соединительных тканей, расстройство системы кроветворения. Суточная потребность в витамине С составляет 60 мг, (довольно
много для витаминов). Большие количества аскорбиновой кислоты содержатся в свежих овощах и фруктах, особенно богаты витамином шиповник, красный сладкий перец, лимоны, черная смородина, капуста.
Синтезируют витамин С все растения и большинство животных, за исключением беспозвоночных, насекомых, рыб, некоторых птиц, морской
свинки, многих приматов и человека. У этих организмов отсутствует фермент
гулонолактон-оксидаза, который катализирует одну из стадий превращения
глюкозы в аскорбиновую кислоту (рис. 17.9).
Среди микроорганизмов лишь некоторые виды способны синтезировать
аскорбиновую кислоту из глюкозы. Это, в первую очередь, дрожжи Lipomyces
starkeryi, грибы Aspergillus niger и некоторые виды рода Fusarium, , бактерии
Streptococcus thermophilus. Крупномасштабное производство аскорбиновой
кислоты основано на химическом синтезе, в котором одну стадию (окисление
D-сорбита в L-сорбозу) осуществляют уксуснокислые бактерии.
263
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CH2OH
O
Глюкоза
Глюкозо-6-фосфат
COO-
HO
OH
O
Глюкозо-1фосфат
O
Уридиндифосфатглюкоза дегидрогеназа
OH
NAD+
NADH
NAD+
OH
HO
OH
O
NADH
UDP
UDP
Уридиндифосфат глюкоза
Уридиндифосфат глюкуроновая кислота
UDP
O
COO-
C
HO
C
HO
C
Альдоно - HO
O лактоназа
HO
H
H
C
H
H
H2O
C* H
HO
C
H
C
H
H
C
HO
C OH
C OH
COO-
Глюкуроновая
кислота
O
C
C
C
C
C H
O
O
HO
C OH
C OH NAD+
NADH H
C* H
H
HO
O
H
Гулонолактоноксидаза
+ O2
C
Глюкуронат - H
редуктаза
HO
CH2OH
L-Гулоновая
кислота
CH2OH
L-Гулонолактон
O
C
H
O Енолизация
C* H
CH2OH
2-Кето-1-гулонолактон
HO
C
HO
C
H
C
HO
-
O
-2H+, -2e
O C
O
O C
+2H+, +2e-
C* H
CH2OH
g-Лактон 2,3-дегидро-Lгулоновой кислоты
(L-аскорбиновая кислота)
H
HO
C
C* H
CH2OH
L-Дегидроаскорбиновая
кислота
Рис. 17.9. Биосинтез аскорбиновой кислоты из глюкозы. Структурные формулы соединений, участвующих в первых трех реакциях, и сами
реакции представлены на рис. 14.3. В пунктирную рамку в молекуле
аскорбиновой кислоты заключена группировка «редуктона»
264
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Витамин Н (биотин). Структура и функции этого витамина в составе
кофактора N5-карбоксибиотина описаны в главе 7 (рис. 7.7). Биотин принимает участие в реакциях переноса карбоксильной группы, которые лежат в
основе биосинтеза жирных кислот (рис. 15.2), синтеза пуриновых оснований,
превращения пирувата в щавелевоуксусную кислоту, синтеза аминокислот и
других процессах. Недостаток витамина Н в организме приводит к депигментации кожи, нервным расстройствам, воспалению кожных покровов, себорее
(усиленное выделение жира сальными железами).
Н-авитаминозы встречаются нечасто, поскольку биотин синтезируется
кишечной микрофлорой и содержится во многих продуктах: яичном желтке,
печени и почках крупного рогатого скота (в их организм биотин поступает в
основном благодаря деятельности микроорганизмов-симбионтов), дрожжевых продуктах, бобовых растениях, орехах, молоке, овсяной крупе, томатах,
сое и др. Суточная потребность человека в биотине составляет 0,1 мг.
Завершая этот, далеко не полный обзор свойств витаминов, следует добавить, что большинство данных соединений являются нестойкими, и разрушаются при воздействии определенных факторов. Так, витамины E, K, B2,
B6, B12 теряют активность и разрушаются под действием света; витамины К,
В1, С быстро разрушаются в щелочных растворах; витамины К, В2, С особо
чувствительны к нагреванию; витамины D, H легко расщепляются при действии окислителей и минеральных кислот. Кроме этого, в природе существует
большое количество антивитаминов —веществ, конкурирующих с витаминами в соответствующих биохимических процессах или инактивирующих
витамины. Таким действием обладают уже описанные выше сульфамидные
препараты, блокирующие образование фолиевой кислоты; яичный альбумин
служит антивитамином по отношению к биотину — связывает его в нерастворимый биологически неактивный комплекс; фермент тиаминаза расщепляет молекулу тиамина; D-аскорбиновая кислота — биологически неактивное
соединение, конкурирует с L-аскорбиновой кислотой и является ее антивитамином. Остановимся на этих примерах.
265
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 18. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ЗАКОНОМЕРНОСТИ
БИОСИНТЕЗА АНТИБИОТИКОВ
К антибиотикам относят специфические продукты обмена организмов и
их химические модификации, обладающие высокой физиологической активностью (биостатической или биоцидной) по отношению к определенным
группам микроорганизмов или к злокачественным опухолям.
Подавляющее большинство известных антибиотиков продуцируется мицелиальными грибами и актиномицетами, хотя открыты также антибиотики
растительного и животного происхождения. Важной отличительной особенностью антибиотиков является их высокая активность по отношению к чувствительным клеткам (вирусам), в результате чего они действуют даже в очень
низких концентрациях, чаще 1—100 мкг/мл. При воздействии антибиотика
на чувствительные клетки может наблюдаться торможение их роста (биостатическая активность) или гибель (биоцид-ная активность). Действие наиболее
распространенных антибиотиков направлено на бактерии, по отношению к
которым они проявляют бактериостатический или бактерицидный эффект,
но существует множество антибиотиков, чье действие направлено на грибы,
простейшие, вирусы, а также раковые клетки.
Характерной особенностью антибиотиков, отличающей их от других антимикробных веществ, является избирательность действия, которая состоит в
том, что каждый антибиотик оказывает действие на строго определенные организмы, не затрагивая другие. Кроме того, в клетках существуют определенные «мишени», которые повреждаются в соответствии со специфическим
механизмом действия, характерным для каждого антибиотика.
Классифицируют антибиотики в соответствии с разными критериями: по
химической структуре, типу воздействия (биостатическое, биоцидное), группам организмов, на которые оказывается воздействие (противобактериальные, противовирусные, противоопухолевые и т. д.), мишени воздействия в
клетке (клеточная стенка, плазматическая мембрана, аппараты репликации,
транскрипции и трансляции ДНК, ферменты и др.), типу организмапродуцента (актиномицеты, мицелиальные грибы, растения, простейшие и
др.)
В соответствии с химической структурой молекул антибиотики можно
разделить на следующие группы: пептиды и производные аминокислот, полиеновые соединения, вещества углеводной природы, алифатические, полициклические, ароматические соединения, кислородсодержащие и азотсодержащие гетероциклы. Уже этот перечень позволяет заметить, что природа антибиотиков весьма разнообразна, так же как разнообразны их биологические
функции.
266
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
В настоящее время известно более 6000 разных антибиотиков, и поиск
новых форм, а также химическая модификация известных не прекращается.
Это объясняется, с одной стороны, широкой функциональностью антибиотиков — они применяются в терапии заболеваний человека и животных, в профилактических мерах, как средства для борьбы с заболеваниями растений,
стимуляторы роста сельскохозяйственных животных и птицы, консерванты и
др. С другой стороны, у микроорганизмов, против которых в основном и направлено действие антибиотиков, со временем развивается устойчивость к
ним, обусловленная разными механизмами, в том числе генетическим обменом факторами лекарственной устойчивости (см. ниже). Наконец, антибиотики используются в исследовательских целях для выяснения механизмов различных клеточных процессов.
Поскольку в рамках данного издания обстоятельное рассмотрение структуры и свойств всех известных антибиотиков невозможно, логично остановиться на механизмах действия антибиотиков на клеточные мишени, что позволит еще раз коснуться и лучше понять взаимосвязь метаболических процессов.
18.1. Механизмы действия антибиотиков на клеточные мишени
Ингибиторы синтеза клеточной стенки. Таким действием обладают
b-лактамные антибиотики, к числу которых относятся пенициллины, цефалоспорины, нокардицин А, сульфазецин, тиенамицин и др. Все перечисленные соединения имеют в своем составе b-лактамное кольцо (рис. 18.1). Мишенью этих антибиотиков является бактериальный фермент гликопептидтранспептидаза, который катализирует формирование поперечных сшивок в
молекуле муреина. b-Лактамные антибиотики имеют структурное сходство с
фрагментом
субстрата
этого
фермента
(-D-Аla-D-Аla-OH) и связываются в активном центре транспептидазы таким
образом, что b-лактамное кольцо оказывается в непосредственной близости
от остатка серина. Гидроксильная группа серина участвует в формировании
устойчивой ковалентной связи с атомом углерода нестабильного bлактамного кольца (рис. 18.1). В результате образуется неактивная ацилированная форма транспептидазы, которая не способна катализировать реакцию
транспептидирования (глава 14). Такое ингибирование фермента является
необратимым, а действие антибиотиков носит бактерицидный характер: дефектная клеточная стенка не обладает должным запасом прочности и при
увеличении клетки в процессе роста или осмотического поступления в нее
воды разрушается.
Кроме b-лактамных антибиотиков, нарушение процесса синтеза клеточных стенок бактерий вызывает полипептидный антибиотик бацитрацин А.
Показано, что молекула бацитрацина может связывать в тройной комплекс с
ионами двухвалентных металлов молекулу фосфорилированного липидного
переносчика. В результате не происходит дефосфорилирование липидного
переносчика, т. е. регенерация его свободной формы. В таком случае не могут
осуществиться все стадии синтеза муреина, в ко-
267
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
R1
NH
Пенициллин G:
R1 = C6H5CH2CONH
Пенициллин V:
R1 = C6H5OCH2CONH
H
S
H
CH3
L
N
NH2
CH3
H
O
R1 = C6H5
Ампициллин:
HOOC
C
CONH
H
Пенициллины
Взаимодействие
с активным центром
транспептидазы
COOR1
NH
H
H
S
H
C
HN
O
O
R2OOC
CH3
CH3
H
C
NH3+
(CH2)3
C
O
NH
H
S
H
L
O
N
CH2 O
O
остаток серина
в составе активного
центра фермента
C
CH3
COOH
Цефалоспорин С
Ацилированный фермент
Рис. 18.1. Структура и механизм действия некоторых b-лактамных антибиотиков: L — b-лактамное кольцо
торых задействован липидный переносчик, и не формируется клеточная стенка (бактерицидный эффект).
Следует добавить, что перечисленные антибиотики наиболее активны
против грамположительных бактерий, поскольку именно их клеточные стенки содержат большое количество муреина. Для эукариот эти антибиотики
малотоксичны, что объясняется отсутствием в их клетках основной мишени — ферментов и других компонентов синтеза муреина.
Антибиотик циклосерин — производное аминокислоты серин подавляет
активность двух ферментов, участвующих в синтезе муреина: аланинрацемазы и D-аланил-D-аланинсинтетазы. Он активен против широкого круга бактерий, малотоксичен, но у людей может вызывать расстройства нервной системы.
Мембрано-активные антибиотики. Мишенью этих антибиотиков является, в первую очередь, плазматическая мембрана бактерий. Полимиксины
268
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
(группа пептидных антибиотиков с циклолинейной структурой) способны
связываться с фосфатными группами кардиолипина, фосфатидилэтаноламина
и других кислых липидов, входящих в структуру липидного бислоя мембран.
При этом наблюдается нарушение проницаемости мембраны — очень серьезное повреждение, влияющее на весь клеточный метаболизм (в первую очередь, происходит «потеря» ионов, создающих градиент на мембране). Кроме
этого, полимиксины активируют фосфолипазы наружной мембраны грамотрицательных бактерий, что приводит к разрушению липидного бислоя. Эти
нарушения носят бактерицидный характер, а действие полимиксинов направлено, в первую очередь, против грамотрицательных бактерий, обладающих
дополнительной (наружной) мембраной.
Похожим образом действуют на мембраны полиеновые антибиотики
(амфотерицин В, нистатин, леворин, трихомицин). Их молекулы содержат
сопряженную систему двойных связей, а мишенью действия является мембрана. Полиеновые антибиотики связываются со стеролами особой структуры, которые преобладают в мембранах грибов. В результате в мембранах
образуются крупные поры, приводящие к нарушению проницаемости.
Нарушают проницаемость мембран также антибиотики-ионофоры, описанные в главе 4.
Ингибиторы трансляции. К этой группе относится значительное количество антибиотиков (рис. 18.2), среди которых наибольшее распространение
имеют тетрациклины, аминогликозидные антибиотики (стрептомицин,
канамицины, неомицины, гентамицины), хлорамфеникол, макролидные антибиотики (эритромицины, олеандомицин, лейкомицины, тилозин). Особенностью этих веществ является способность связываться с рибосомами, блокируя синтез белка. Следует отметить, что большинство перечисленных антибиотиков характеризуется избирательностью связывания именно
с субъединицами (или их составными частями) 70S-рибосом, присутствующими в клетках прокариот. Поэтому данные антибиотики специфичны по
отношению к прокариотам. Их действие носит в основном обратимый характер, и поэтому они обусловливают чаще бактериостатический эффект.
Связываясь с рибосомами, ингибиторы трансляции либо препятствуют
взаимодействию с рибосомами аминоацилтранспортных РНК (тетрациклины), либо ингибируют инициацию трансляции (стрепто-мицин), либо ингибируют активность пептидилтрансферазы — структур-ной части 50Sсубъединицы рибосомы (хлорамфеникол), либо нарушают процесс транслокации рибосомы (эритромицин) и т. п.
Антибиотик пуромицин имеет структурное сходство с концевым фрагментом акцепторной ветви аминоацил-тРНК, но он значительно меньших
размеров. Благодаря этому пуромицин способен быстро связываться с Аучастком рибосом (70S и 80S), однако после присоединения к аминогруппе
пуромицина пептидного остатка (пептидилтрансферазная реакция) весь комплекс отщепляется от рибосомы из-за отсутствия кодон-антикодонового
взаимодействия. Пуромицин обладает высокой токсичностью по отношению
к эукариотическим клеткам, поскольку не имеет избирательности связывания
с 70S-рибосомами. Этот антибиотик
269
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
пептид
CH3
H3C
CH3 R
N
H
H
OH
X HO
пептид
CO
CO
N
NH2
NH2
O
OH
OH
OH
O
O
O
C
CH3
O
Тетрациклин: X = H, R = H
Хлортетрациклин: Х = Cl, R = H
Окситетрациклин: X = H, R = OH
Пептид:
L-Thr
CH3
D-Val
O
L-Pro
C
Саркозин
L-метил-Val
O
Тетрациклины
Актиномицин D
NH
C
H2N
NH
O
O
CHO
HO H
OH
HO
H3C
NH2
NH
O
CH2OH
C
H
N
H
CHCl 2
C
OH
NH
OH O
NO2
HOH2C
HO
HO
O
NHCH3
Хлорамфеникол
(левомицетин)
Стрептомицин
Рис. 18.2. Структура тетрациклинов, актиномицина D, стрептомицина, хлорамфеникола
активен против бактерий, простейших, гельминтов, а также некоторых злокачественных опухолей.
Антибиотики-интеркаляторы. Действие этих антибиотиков основано
на способности встраиваться (интеркалировать) в молекулы ДНК. Таким действием обладает, например, актиномицин D (рис. 18.2), адриамицин, дауномицин. Молекула актиномицина, в частности, встраивается своей плоской
гетероциклической частью между параллельными плоскостями пар оснований ДНК. Подобным образом ведет себя дауномицин, две молекулы которого
интеркалируют своими гетероциклическими ядрами между плоскостями пар
оснований G/C. При таком воздействии локально нарушается структура ДНК,
что приводит к ингибированию процессов репликации и транскрипции.
Поскольку структура ДНК отличается высокой консервативностью, антибиотики-интеркаляторы активны и в отношении ДНК эукариот, что делает их
высокотоксичными. Эти антибиотики находят применение при химиотерапии
270
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
злокачественных опухолей, клетки которых, как известно, делятся быстрее
нормальных, а значит, и матричные процессы, на которые воздействуют названные антибиотики, в них более активны.
ДНК-тропные антибиотики. Эти антибиотики взаимодействуют с молекулами ДНК, приводя к их разрушению. Классическим примером служат
митомицины (А, В, С), а также порфиромицин. Действие названных антибиотиков осуществляется двумя путями: во-первых, модификацией пуриновых оснований, во-вторых, формированием поперечных сшивок между антипараллельными цепями ДНК. Как результат, происходит подавление процесса репликации, возникают ошибки репликации, а также происходят разрывы
молекулы ДНК. Еще один тип антибиотиков — блеомицины вызывают многочисленные одно- и двухнитевые разрывы в молекулах ДНК.
Большинство ДНК-тропных антибиотиков высокотоксичны и используются в качестве противоопухолевых препаратов.
Ингибиторы транскрипции. Кроме уже названных антибиотиковинтеркаляторов, транскрипцию подавляют рифамицины. Эти антибиотики
взаимодействуют с ДНК-зависимыми РНК-полимеразами прокариот, в частности с b-субъединицей минифермента. Связывание носит нековалентный
характер, однако оказывается довольно прочным, из-за чего нарушается процесс синтеза цепей РНК.
Ингибиторы ферментативных процессов. В качестве таких антибиотиков выступают уже рассмотренные выше пенициллины, цефалоспорины,
циклосерин, хлорамфеникол и др. Кроме того, следует отметить антимицин,
подавляющий процесс транспорта электронов между цитохромами в дыхательной цепи, олигомицин, связывающийся с ферментами, обусловливающими сопряжение окисления субстратов с фосфорилированием, новобиоцин,
являющийся ингибитором фермента ДНК-гиразы (принимает участие в репликации), актиномицин А, ингибирующий активность цитохром Средуктазы.
18.2. Закономерности биосинтеза антибиотиков
Антибиотики относятся к вторичным метаболитам — низкомолекулярным веществам, функции которых несущественны для роста чистых культур. Вторичные метаболиты (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений, токсины) производятся представителями ограниченного числа таксономических групп. В отличие от первичных метаболитов, вторичные имеют
более сложное химическое строение и образуются, как правило, в ходе длинных метаболических путей.
Известно, что образование антибиотиков делает их продуцентов более
конкурентоспособными и является мощным фактором в борьбе организмов за
существование. Однако это не единственная роль антибиотиков: недавно обнаружено, что данные вещества осуществляют функцию контроля и регуляции процессов метаболизма, выполняя роль специфических эффекторов, контролирующих активность ряда ферментных систем. Кроме этого, существует
точка зрения, согласно которой антибиотики могут служить клеточными компонентами, в виде которых клетка избавляется от накопившихся в ней по тем
271
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
или иным причинам в избытке метаболитов и восстановительных эквивалентов.
Биосинтез большинства вторичных метаболитов, в том числе антибиотиков, обычно осуществляется на определенной стадии развития микроорганизма, в условиях торможения основных процессов анаболизма —биосинтеза
нуклеиновых кислот, белка, липидов, полисахаридов. Различают две принципиально различные стадии развития популяции продуцентов антибиотиков.
Первая, носящая название трофофаза или фаза сбалансированного роста,
характеризуется интенсивным синтезом соединений, требующихся для роста
клеток, что сопровождается быстрым потреблением основных питательных
компонентов среды. Эта фаза соответствует фазе логарифмического роста
периодической культуры микроорганизмов. После исчерпания некоторых
ингредиентов среды (в первую очередь, углерода, азота, молекулярного кислорода) и накопления продуктов метаболизма наступает вторая фаза (идиофаза, или фаза несбалансированного роста). Идиофаза отличается заметным
торможением или прекращением роста микробной популяции, что соответствует переходу в стационарную фазу роста периодической культуры. Здесь
начинают преобладать протеолитические процессы, происходит автолитический распад клеток. Именно в идиофазе многие микроорганизмы начинают
синтезировать вторичные метаболиты, к числу которых относятся и антибиотики. Описанные закономерности можно отобразить графически (рис. 18.3).
Рис. 18.3. Динамика биохимических изменений в культуре продуцента антибиотика: 1 — рост культуры; 2 — накопление антибиотика; 3 —
использование углеводов; 4 — использование фосфора в составе
минеральных соединений
272
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
В большинстве случаев максимум накопления антибиотика в культуральной жидкости наступает после максимума накопления биомассы. Это объясняется тем, что синтез ферментов, ответственных за образование антибиотиков, подавлен (репрессирован) во время трофофазы.
Биосинтез антибиотиков — наследственно закрепленное свойство организмов. Гены, ответственные за эти процессы, могут располагаться на хромосомах (нуклеоидах у прокариот), а также на плазмидах.
Регуляция процесса синтеза антибиотика осуществляется разными способами: чаще в ходе катаболитной репрессии, с помощью репрессии синтеза
ферментов конечным продуктом, а также при аллостерическом ингибировании антибиотиком активности ключевых ферментов своего биосинтеза. При
этом важными компонентами среды, оказывающими влияние на биосинтез
антибиотиков, являются глюкоза, а также фосфат. Как правило, избыток этих
веществ отрицательно сказывается на образовании антибиотиков.
Антибиотическая продуктивность организма отражает количество антибиотика (в мкг или в единицах), образованное единицей массы (обычно 1 мг)
сухих клеток микроорганизма-продуцента в единицу времени (обычно за 1 ч).
Этот параметр зависит, в первую очередь, от вида микроорганизма, фазы
роста клеток, состава среды, условий культивирования. Препараты антибиотиков характеризуются разной степенью чистоты и, соответственно, активности, которая выражается в количестве единиц антибиотической активности
(ЕД), содержащихся в 1 мг или 1 мл препарата. За единицу антибиотической
активности принимают минимальное количество чистого вещества антибиотика, способное подавить развитие определенного числа клеток стандартного
штамма микроорганизма (тест-микроба) в единице объема культуральной
жидкости. Например, 1 ЕД стрептомицина эквивалентна 1 мкг чистого основания этого вещества, 1 ЕД пенициллина соответствует 0,6 мкг натриевой
соли бензилпенициллина. При этом в качестве тест-микроба для стрептомицина используется E.coli, а для пенициллина — Staphylococcus aureus.
18.3. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибиотикам
Уже отмечалось, что антибиотики проявляют избирательность действия,
оказывая эффект только на определенные группы микроорганизмов (чувствительные к данному антибиотику), не затрагивая другие (устойчивые или резистентные). Однако в популяциях чувствительных к тому или иному антибиотику микроорганизмов всегда можно обнаружить определенное количество антибиотикорезистентных форм, которые возникают в результате мутаций
или генетического обмена. Устойчивость к антибиотикам может быть обусловлена следующими основными факторами:
1) превращением активных форм антибиотиков в неактивные под действием специфических ферментов. Например, пенициллины и цефалоспорины
расщепляются ферментами b-лактамазами, хлорамфеникол подвергается
ацетилированию, в результате чего утрачивает активность;
2) модификацией чувствительной к данному антибиотику мишени. Например, аминокислотная замена в белке S12 в составе 30S-субъеди-ницы рибосомы приводит к неспособности стрептомицина связываться с ней и блоки273
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ровать инициацию трансляции; изменение структуры ДНК-зависимой РНКполимеразы прокариот делает их устойчивыми к рифамицину; метилирование 23S-рибосомальной РНК в 50S-субъединице рибосомы делает синтез белка нечувствительным к эритромицину и линкомицину и т. д.;
3) утратой или снижением проницаемости мембран и клеточных стенок к
антибиотикам. Так, в результате синтеза белков, влияющих на транспорт в
клетку тетрациклинов, происходит снижение внутриклеточной концентрации
этих антибиотиков;
4) использованием альтернативного фермента или метаболического пути
взамен инактивированных антибиотиком;
5) увеличением содержания фермента, подверженного ингибированию
антибиотиком;
6) повышением концентрации метаболита, способного противодействовать антибиотику;
7) снижением потребности в продукте, образование которого находится
под контролем антибиотика.
Важно отметить, что механизмы устойчивости к антибиотикам, детерминируемые плазмидными генами (в составе R-факторов), часто отличаются от
контролируемых хромосомальными генами механизмов устойчивости к тем
же препаратам. Так, клетки, наследующие R-плазми-ды, в большинстве случаев проявляют устойчивость к стрептомицину и другим аминогликозидным
антибиотикам за счет специфических ферментов, инактивирующих молекулы
антибиотиков. В частности, устойчивость к стрептомицину в данном случае
является следствием модификации не мишени его действия (30S-субъединица
рибосомы), а самого антибиотика путем его аденилирования или фосфорилирования.
Изучение R-плазмид позволяет сделать вывод об их быстрой эволюции в
направлении увеличения числа детерминант резистентности. В результате
этого явления возникают плазмиды, контролирующие полирезистентность
(устойчивость к трем, четырем и более антибиотикам). Причиной этого может служить миграция транспозонов лекарственной устойчивости в популяциях клинических штаммов бактерий, которая, в свою очередь, обусловлена
широким применением самых распространенных лекарственных препаратов.
Транспозоны лекарственной устойчивости также могут содержать несколько
детерминант резистентности, как, например, Tn 1696, контролирующий устойчивость к стрептомицину, хлорамфениколу, гентамицину, сульфаниламиду, а также к ионам ртути.
Штаммы микроорганизмов — суперпродуценты антибиотиков в большинстве случаев обладают несколькими системами защиты от собственного
антибиотика.
274
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 19. ИНТЕГРАЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА
Каждый момент в метаболизирующей клетке осуществляется несколько
сотен химических реакций, и можно утверждать, что все они, так или иначе,
взаимосвязаны между собой. Это становится возможным благодаря тесной
интеграции клеточного метаболизма и его многоуровневой регуляции. Об
интеграции конструктивного и энергетического метаболизма частично уже
говорилось в главе 8, здесь речь пойдет о ключевых промежуточных метаболитах — веществах, с помощью которых клетке удается координировать
процессы обмена органических соединений различных классов.
На рис. 19.1 представлена упрощенная схема интеграции основных метаболических путей, общих для большинства клеток и организмов. Можно видеть, что процессы разложения и биосинтеза сложных органических соединений (белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов) связаны между собой,
в первую очередь, благодаря пирувату, ацетил-СоА и промежуточным соединениям цикла трикарбоновых кислот.
Основными ключевыми метаболитами являются: пируват, ацетил-СоА,
оксалоацетат, a-кетоглутарат. Рассмотрим их роль в клеточном метаболизме.
19.1. Роль ключевых промежуточных соединений
в интеграции метаболизма
Пируват. Эта трехуглеродная a-кетокислота связывает между собой гликолиз и глюконеогенез, а также обмен углеводов с обменом липидов, белков,
изопреноидов, кетоновых тел (рис. 19.1).
Пируват образуется в клетках в основном при катаболизме гексоз, при
окислении лактата, который накапливается в мышцах при молочном брожении, а также при дезаминировании аланина. Процессы катаболизма гексоз
охарактеризованы в главе 9. Молочнокислое брожение —основной метаболический процесс (глава 10), протекающий в клетках активно работающих
мышц человека и животных при недостаточном снабжении их кислородом.
При этом образование лактата позволяет организму быстро регенерировать
NAD+, необходимый для запасания АТР в гликолизе (процесс сокращения и
расслабления мышечных волокон требует гидролиза АТР).
Накапливающийся в мышцах лактат поступает в кровь и переносится в
печень, где окисляется снова в пируват. В ходе глюконеогенеза пируват может превращаться в глюкозу. Эта последовательность реакций известна как
цикл Кори.
275
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Нуклеиновые
кислоты
Углеводы
Нуклеотиды
Азотистые
основания
4
Рибозо-5- Р
4
Белки
Глюкоза
2
2
3
1
CO2
3
Аминокислоты
Глицерол
Пируват
Липиды
6
7
5
Ацетил-СоА
Жирные
кислоты
NH3
8
ЦТК
CO2
Мочевина
H2O
Рис. 19.1. Взаимосвязь основных клеточных процессов (упрощенная
схема):
1 — гликолиз;
2 — пентозофосфатные
пути;
3—
глюконеогенез; 4 — цикл Кальвина; 5 — b-окисление жирных кислот;
6 — дезаминирование; 7 — аминирование кетокислот; 8 —
цикл мочевины; ЦТК — цикл трикарбоновых кислот
Аланин образуется из пирувата в реакциях трансаминирования (рис. 16.8)
с участием аминокислот, образованных в ходе протеолиза белков. Аланин с
током крови поступает в печень, где снова превращается в пируват, выполняя
роль переносчика аммонийного азота, который в печени включается в цикл
мочевины. Кроме этого, образующийся из пирувата аланин может включаться в состав пептидов.
Превращения пировиноградной кислоты (рис. 19.2) связаны также с реакциями карбоксилирования и декарбоксилирования. В первом процессе, иду276
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
щем в митохондриях, образуется оксалоацетат, который может включаться в
ЦТК (одна из важнейших анаплеротических реакций) либо преобразовываться в фосфоенолпируват, а затем — в глюкозу (глюконеогенез).
Во втором случае пируват подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием ацетил-СоА, который также является ключевым метаболитом.
Еще одной важной частью превращений пирувата являются различного рода
брожения, в которых пировиноградная кислота служит субстратом.
Ацетил-СоА. Основными источниками этого ключевого промежуточного
соединения служат пируват и жирные кислоты (процессы окислительного
декарбоксилирования и b-окисления соответственно). Кроме этого, ацетилСоА образуется из кетогенных аминокислот при расщеплении их углеродных
скелетов.
Судьба ацетил-СоА, как и других ключевых метаболитов, зависит от потребностей клетки (организма): он может быть полностью окислен в цикле
трикарбоновых кислот, являясь его субстратом; может подвергаться последовательному конденсированию с образованием 3-гидрокси-3-метил-глутарилСоА — предшественника холестерола, терпеновых соЭтанол и другие продукты брожения
Полисахариды
Лактат
Глюкоза
Аминокислоты
(кроме ala)
Пируват
Аланин
Оксалоацетат
Аминокислоты
Жирные
кислоты
Ацетил - СоА
ЦТК
3-Гидрокси-3-метилглутарил-СоА
Холестерол
Изопреноиды
Белок
Липиды
Кетоновые
тела
277
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 19.2. Основные превращения пирувата и ацетил-СоА
в клеточном метаболизме
единений (изопреноидов), кетоновых тел (ацетоуксусная, 3-гидроксимасляная кислоты и ацетон); а также может превращаться в жирные кислоты
(рис. 19.2). Уже отмечалось, что в организме млекопитающих ацетил-СоА не
способен превращаться в углеводы. В то же время в клетках растений и микроорганизмов возможен синтез предшественников глюконеогенеза, а значит,
и углеводов из ацетил-СоА (рис. 11.7).
Кроме перечисленных реакций, ацетил-СоА принимает участие в процессах синтеза аминокислот, в частности аргинина, лейцина, лизина (в клетках
грибов), цистеина (у некоторых микроорганизмов), а также является субстратом для маслянокислого и ацетонобутилового брожения.
Участие основных промежуточных соединений ЦТК (оксалоацетата, aкетоглутарата) в интеграции метаболизма нетрудно проследить на схемах,
представленных на рис. 19.1 и 19.2.
Подводя итог сказанному, следует еще раз подчеркнуть, что все метаболические процессы, протекающие в клетке (организме), связаны между собой
с помощью промежуточных метаболитов, которые являются продуктами одних метаболических путей и субстратами других. Такая взаимосвязь и взаимозависимость метаболических процессов позволяет клетке (организму) координировать свои возможности с потребностями и быстро «настраивать»
уровень обмена веществ в соответствии с меняющимися условиями существования. Конечно, этот тонкий механизм был бы невозможен без регуляции
метаболических путей.
19.2. Регуляция метаболизма
Химические реакции, протекающие в клетках, катализируются ферментами. Неудивительно поэтому, что большинство способов регуляции обмена
веществ основано на двух ведущих процессах: изменении концентрации ферментов и их активности. Эти способы регуляции метаболизма характерны для
всех клеток и осуществляются с помощью разнообразных механизмов в ответ
на сигналы разного рода. Кроме этого, клетки владеют дополнительными
способами регуляции метаболизма, многообразие которых удобно рассмотреть в соответствии с несколькими уровнями организации.
Регуляция на уровне транскрипции. Этот тип регуляции рассмотрен в
главе 3 на нескольких примерах положительного и отрицательного контроля
транскрипции прокариотических генов. Данный механизм характерен, в первую очередь, для регуляции количества мРНК, определяющих структуру
ферментов, а кроме этого — белков-гистонов, рибосомальных, транспортных
белков. Группа последних, не обладая каталитической активностью, также
принимает большое участие в изменении скорости соответствующих процессов (формирование хромосом и рибосом, транспорт веществ через мембраны), а значит, и метаболизма в целом.
В регуляции транскрипции генов участвуют регуляторные белки, структура которых определяется специфическими генами (регулято-рами), их комплексы с лигандами (например, лактозой при индукции транскрипции или
278
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
триптофаном при репрессии), комплексы сАМР-САР, гуанозинтетрафосфат, а
в некоторых случаях таким действием обладают белки — продукты экспрессии собственных генов. Особое значение в данных процессах имеют такие
важные сигнальные молекулы, как сАМР и гуанозинтетрафосфат. Можно
сказать, что сАМР сигнализирует клетке об энергетическом голоде —
отсутствии глюкозы. В ответ на это увеличивается частота транскрипции
структурных генов, отвечающих за катаболизм других источников углерода и
энергии (активация катаболитных оперонов, катаболитная репрессия, глава 3). Гуанозинтетрафосфат (гуанозин-5ў-дифосфат-3ў-дифосфат) является
сигналом аминокислотного голодания. Этот нуклеотид связывается с РНКполимеразой и изменяет ее сродство к промоторам различных генов. В результате экспрессия генов, ответственных за биосинтез углеводов, липидов,
нуклеотидов и др. уменьшается, а экспрессия других генов, в частности детерминирующих процессы протеолиза белков, наоборот, повышается.
Процесс транскрипции чаще регулируется с помощью изменения частоты
событий инициации транскрипции, но, кроме этого, могут регулироваться
скорость элонгации транскрипции и частота ее преждевременной терминации. На события элонгации и терминации первостепенное влияние оказывает
конформационное состояние ДНК или самой мРНК (наличие «стопсигналов», шпилечных структур).
Аллостерическая регуляция активности ферментов. Этот тип регуляции является одним из самых быстрых и гибких, он осуществляется с помощью молекул-эффекторов, взаимодействующих с аллостерическим центром фермента (глава 6). Аллостерической регуляции, как и оперонной, подвержены ключевые ферменты тех или иных метаболических путей. Таким
образом, скорость всего биосинтетического или катаболического процесса
зависит от одной, реже нескольких реакций, катализируемых ключевыми
ферментами.
Особое значение регуляция имеет для процессов биосинтеза протеиногенных аминокислот. Поскольку их 20, и каждая в суммарном клеточном белке у
разных организмов представлена в определенном отношении, требуется
очень четкая регуляция, координирующая процессы синтеза отдельных аминокислот. Такой контроль исключает перепроизводство аминокислот, и выделение их из клетки возможно лишь у микроорганизмов с нарушенной регуляцией.
Пример регуляции биосинтеза аминокислот семейства аспартата у энтеробактерий представлен на рис. 19.3. Четыре аминокислоты имеют общий
предшественник — аспарагиновую кислоту. Ее превращение в аспартилфосфат у бактерий E.coli катализируют три изоферментные формы аспартокиназы, каждая из которых испытывает репрессию и/или ингибирование со стороны разных конечных продуктов данного разветвленного метаболического
пути. Аналогичным способом регулируется синтез гомосериндегидрогеназы.
Обращает на себя внимание существование механизма обратной связи,
который заключается в том, что конечные продукты метаболических процессов регулируют уровень синтеза и/или активность ферментов, катализирующих первые этапы образования этих метаболитов.
279
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Аллостерическими эффекторами могут выступать самые различные вещества: субстраты и конечные продукты метаболических путей, иногда
Аспартат
Аспартокиназа 1 2
3
Аспартил-4-фосфат
4-Полуальдегид-аспартат
1 Гомосерин Дигидродипиколинат 2
дегидрогеназа
синтетаза
Гомосерин
Гомосеринкиназа
Лизин
Треонин синтаза
Метионин
- репрессия
- ингибирование
Треонин
Треонин дезаминаза
1, 2, 3 - изоферментные формы
аспартокиназы и
гомосериндегидрогеназы
Изолейцин
Рис. 19.3. Схема регуляции синтеза и активности ферментов, участвующих в
пути биосинтеза аминокислот семейства аспартата у бактерий E.coli. Гены,
кодирующие аспартокиназу 1, гомосеринкиназу и треонинсинтетазу, составляют треониновый оперон, поливалентно репрессируемый треонином и изолейцином
— промежуточные метаболиты; в катаболических процессах — нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты, а также переносчики восстановительных эквивалентов; в каскадных реакциях — сАМР и сGMP, которые регулируют активность ферментов (например, протеинкиназ), участвующих в
ковалентной модификации белков; ионы металлов и множество иных соединений. Примеры аллостерической регуляции ферментов приведены в главе 6
и др. разделах.
Ковалентная модификация ферментов. Этот тип регуляции активности
ферментов иначе называют взаимопревращениями ферментов, поскольку
суть данного процесса состоит в превращении активных форм ферментов в
280
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
неактивные и наоборот. Особенности и примеры ковалентной модификации
описаны в главе 6. Эти процессы находятся под разнообразным контролем, в
том числе и гормональным. Классическим примером взаимопревращений
ферментов является регуляция метаболизма гликогена в печени.
Скорость синтеза этого резервного полисахарида находится под контролем гликоген-синтазы, а расщепление катализируется гликогенфосфорилазой. Оба фермента могут пребывать в активной и неактивной
формах. При голодании или в стрессовых ситуациях в кровь выделяются
гормоны — адреналин и глюкагон, которые связываются с рецепторами на
плазматических мембранах клеток и активируют при посредничестве Gбелков фермент аденилатциклазу (катализирует синтез сАМР). сАМР связывается с протеинкиназой А и активирует ее, что приводит к фосфорилированию гликоген-синтазы и переводу ее в неактивную форму. Гликоген перестает синтезироваться. Кроме этого, протеинкиназа А в ходе каскадных реакций
вызывает фосфорилирование гликоген-фосфорилазы, которая в результате
активируется и начинает расщеплять гликоген. На процессы синтеза и распада гликогена действует также другой гормон —инсулин. В этом примере сигнальными молекулами служат гормоны, а посредниками — G-белок и сАМР.
Взаимопревращения ферментов осуществляются в ходе фосфорилирования—
дефосфорилирования.
Гормональная регуляция. Этот тип регуляции метаболизма предусматривает участие гормонов — сигнальных веществ, образующихся в клетках
эндокринных желез, поэтому гормональная регуляция свойственна только
высшим организмам. Выше описано действие гормонов на процесс обмена
гликогена, в котором регулируется активность ферментов на уровне ковалентной модификации. Кроме этого, гормоны способны оказывать воздействие
на скорость транскрипции (оперонная регуляция).
Из специализированных клеток, где происходит синтез гормонов, последние поступают в кровь и переносятся к клеткам-мишеням, имеющим рецепторы, способным связывать гормоны и тем самым воспринимать гормональный сигнал. Связывание гормона рецептором запускает каскад реакций с участием молекул-посредников, которые завершаются клеточным ответом. Липофильные гормоны связываются с внутриклеточным рецептором (белок) и
регулируют транскрипцию определенных генов. Гидрофильные гормоны действуют на клетки-мишени за счет связывания с рецепторами на плазматической мембране.
Кроме гормонов, аналогичным действием обладают другие сигнальные
вещества: медиаторы, нейромедиаторы, ростовые факторы. Четкой границы,
позволяющей отличать гормоны от перечисленных веществ, нет. Медиаторами называют сигнальные вещества, которые продуцируются не железами
внутренней секреции, а различными типами клеток. К медиаторам относят
гистамин, простагландины, которые обладают гормоноподобным действием.
Нейромедиаторами считают сигнальные вещества, продуцируемые клетками центральной нервной системы.
Изменение концентрации метаболитов. Важным условием, обеспечивающим высокую скорость того или иного метаболического пути, является
концентрация субстратов. Она может зависеть от интенсивности протекания
281
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
других процессов, в которых также расходуются эти субстраты (конкуренция), или от скорости транспорта данных веществ через мембраны (плазматическую или органелл). В частности, у эукариотических клеток появляется
возможность регулировать метаболизм, перераспределяя метаболиты по отдельным компартментам.
Кроме этого, скорость метаболических процессов определяется концентрацией кофакторов. Например, гликолиз и ЦТК регулируются доступностью
ADP (глава 10, 11) на уровне изменения активности ключевых аллостерических ферментов.
Посттранскрипционная и посттрансляционная модификация макромолекул. Эти процессы также описаны в соответствующих разделах (глава 3). Модификация и/или процессинг первичных РНК-транскриптов осуществляются с разной скоростью, от чего зависит концентрация зрелых молекул
РНК, способных транслироваться, а значит, и интенсивность белкового синтеза. В свою очередь, пептиды, прежде чем превратиться в зрелый белок,
также должны модифицироваться, и если это касается ферментов, то речь
идет об их ковалентной модификации.
282
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Часть пятая. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНЖЕНЕРИИ
Глава 20. СОЗДАНИЕ И АНАЛИЗ КЛОНОТЕК ГЕНОМОВ
Генетическая инженерия как основа современной биотехнологии зародилась в семидесятые годы ХХ ст. в недрах молекулярной биологии. К этому
времени были расшифрованы механизмы основных матричных процессов,
происходящие в клетках прокариот — репликация, транскрипция и трансляция, кроме того, эти процессы были воспроизведены in vitro. Была определена структура генетического кода и синтезирован первый ген (аланиновой
тРНК дрожжей). Удалось выделить и изучить свойства некоторых ферментов,
использующих в качестве субстрата ДНК (рестриктазы, лигазы, ДНКполимеразы). Эмбриологи освоили методологию пересадки ядер соматических клеток животных (лягушки) взамен удаленного гаплоидного ядра, что
позволило воспроизводить животных неполовым путем, т. е. клонировать
(получать генетически идентичные особи).
Так, впервые появилась надежда на возможность замены определенных
генов (например, дефектных) в зародышевых клетках на другие —
полноценные, иными словами, осуществления генной терапии. Однако для
этого необходимо было освоить методологию выделения генов, их идентификации, тиражирования, устойчивого культивирования в составе автономно
реплицирующихся молекул, а также определения свойств продуктов этих генов. Все эти вопросы решает генетическая инженерия, под которой подразумевают комплекс молекулярно-генетических методов, позволяющих осуществить целенаправленное конструирование организмов путем манипуляций с
их наследственным аппаратом.
Поскольку микроорганизмы, в частности бактерии, как одни из наиболее
просто организованных форм живого, изучены гораздо лучше с генетической
точки зрения, чем макроорганизмы, первые эксперименты по получению рекомбинантных ДНК были осуществлены именно с бактериальными клетками.
И вскоре обнаружилась еще одна важная перспектива использования достижений генетической инженерии, а именно конструирование высокопродуктивных штаммов микроорганизмов—продуцентов биологически активных
веществ, обладающих комплексом заданных свойств.
В данной главе охарактеризованы основные методы, позволяющие получать определенные гены, вводить их в состав векторных молекул для клонирования в клетках-реципиентах, идентифицировать гены в клонотеках, определять последовательность нуклеотидов в ДНК. Знание данной методологии
283
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
необходимо для современных биотехнологов, использующих для создания
организмов — продуцентов нужных веществ достижения генетической инженерии.
Для конструирования организмов с заданными свойствами требуется
иметь набор генов, детерминирующих желаемые функции (утилизация определенных субстратов, биосинтез и секреция определенных продуктов, устойчивость к определенным физическим и химическим факторам, деградация
ксенобиотиков и т. п.). Такие гены можно выделить из любых организмов,
обладающих соответствующими свойствами, но для этого вначале следует
получить клонотеку генома данного организма и охарактеризовать ее. Под
клонотекой генома понимают набор клонов бактерий или бактериофагов, каждый из которых содержит один тип рекомбинантной ДНК, а в совокупности — весь геном изучаемого организма, фрагменты которого распределены
по отдельным клонам.
20.1. Получение генов
Используется три основных способа получения нужных генов: выделение
из состава ДНК, химико-ферментативный синтез (in vitro), транскрипция
изолированной из клетки матричной РНК с помощью обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы, ревертазы).
Выделение генов из ДНК. Большинство методик в генетической инженерии основано на вырезании из молекул ДНК определенных фрагментов и
соединении их с другими фрагментами для получения рекомбинантных
(химерных) ДНК. При этом фрагментация выделенной из клеток ДНК осуществляется с помощью ферментов, которые способны расщеплять ДНК в
строго определенных сайтах. В качестве таких ферментов используются эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), общая характеристика которых дана в
главе 2. В генетической инженерии используются рестриктазы, образующие в
ДНК однонитевые (липкие) концы (при разрезе уступом), а также те, что
формируют в ДНК двухнитевые (тупые) концы (при расщеплении по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар). Примером рестриктазы первого типа, образующей липкие концы, является Eco R1 (рис. 2.1), а рестриктазой второго типа является, например, Hind II.
Образование липких концов при расщеплении ДНК имеет преимущество,
которое состоит в возможности реассоциации образованных фрагментов по
гомополимерным липким концам (содержат комплементарные нуклеотиды).
В таком случае появляется возможность формирования ассоциатов из фрагментов, принадлежащих разным молекулам ДНК, что и лежит в основе
большинства генноинженерных манипуляций по получению рекомбинантных
ДНК (рис. 20.1). Образующиеся спонтанно ассоциаты могут быть превращены в целые молекулы путем «сшивания» с помощью ДНК-лигаз.
Следует указать, что в обычных условиях липкие концы в составе одной
молекулы могут удерживаться друг относительно друга с помощью водородных связей между комплементарными основаниями. Однако
284
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 20.1. Схема образования рекомбинантных ДНК при расщеплении
разных молекул ДНК рестриктазами, обнажающими во фрагментах
липкие концы
комплементарные цепочки легко разделить при небольшом нагревании растворов ДНК (денатурация ДНК). При охлаждении липкие концы гибридизуются вновь за счет восстановления водородных связей при соблюдении
принципа комплементарности (отжиг). В результате отжига набора фрагментов, полученных при воздействии на разные молекулы ДНК одной и той же
рестриктазой, могут образоваться как исходные молекулы ДНК, так и их гибриды — рекомбинантные ДНК.
В 1972 г. в Стэнфорде Дж. Мерц и Р. Дэвис осуществили первый подобный эксперимент. Позднее оказалось, что не все геномы могут содержать
сайты рестрикции для используемых рестриктаз. Особенно это касается небольших молекул: плазмид и профагов, которые настолько малы, что содержат лишь по несколько сайтов рестрикции для небольшого числа рестриктаз.
Данное обстоятельство существенно ограничивает возможности метода, по285
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
этому была разработана методология введения в геном фрагментов ДНК, содержащих необходимые сайты рестрикции.
Для этого используют искусственно синтезированные олигонуклеотидные
ДНК с тупыми концами (линкеры). Линкеры синтезируют таким образом,
чтобы в их составе содержались известные сайты рестрикции (предварительно требуется установить последовательность нуклеотидов в этих сайтах).
ДНК для введения линкеров в ее состав расщепляют одной из рестриктаз,
образующих тупые концы, а затем «сшивают» полученные фрагменты с линкерами с помощью лигаз (рис. 20.2). Альтернативным методом получения
тупых концов является механический разрыв крупных молекул ДНК при быстром перемешивании раствора или продавливании его через узкое отверстие. В результате этих манипуляций фрагменты ДНК приобретают сайты
рестрикции внутри добавочных последовательностей (линкеров).
Теперь полученный фрагмент ДНК, содержащий требуемые сайты рестрикции, можно присоединить к другой молекуле ДНК (например, к вектору),
обработанной такой же рестриктазой, либо превратить в кольцевую форму
путем сшивания взаимно комплементарных концов.
Описанные методы выделения генов в составе фрагментов ДНК с помощью рестрикционных ферментов широко распространены, но имеют ряд недостатков. Во-первых, не всегда удается подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, в котором содер-
Рис. 20.2. Присоединение линкеров, содержащих сайты рестрикции
(в данном случае для рестриктазы Eco R1 — обозначены
стрелками), к фрагментам ДНК с тупыми концами
286
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
жится интересующий ген. Во-вторых, в составе вырезанного фрагмента ДНК
могут оказаться затрудняющие дальнейшее использование гена последовательности, например интроны в эукариотических генах. В данном случае рекомбинантные ДНК не смогут экспрессироваться в прокариотических клетках, поскольку последние не обладают способностью к сплайсингу (глава 3).
Химико-ферментативный синтез генов. С помощью этого метода синтезированы, а впоследствии клонированы гены, определяющие структуру таких гормонов, как инсулин и соматостатин, а также лейкоцитарный интерферон человека. Синтез гена интерферона осуществлен в СССР в 1984 г. под
руководством академика М.Н. Колосова.
Суть метода сводится к следующему: in vitro осуществляют химический
синтез коротких (8—16 нуклеотидов) одноцепочечных фрагментов ДНК, которые затем соединяют с помощью лигаз и отжигают (дают возможность образоваться двухнитевым молекулам ДНК). Для этого метода необходимо
знать последовательность нуклеотидов в гене, поскольку синтез осуществляется без матрицы. Ее устанавливают обычно исходя из аминокислотной последовательности соответствующего полипептида, однако из-за вырожденности генетического кода определить истинную нуклеотидную последовательность гена оказывается невозможным. Установить истинную структуру гена
можно методом секвенирования ДНК, однако для этого требуется выделить и
клонировать соответствующий ген.
Этап химического синтеза олигонуклеотидов в настоящее время полностью автоматизирован. Метод основан на специфической защите 5ў или 3ўконца моно- или олигонуклеотида, предотвращающей его вступление в химические реакции. При необходимости блокирующие группы, с помощью которых осуществляют модификацию, можно удалить обработкой кислотой либо
щелочью. Цикл химического синтеза ДНК включает конденсацию нуклеотидов, удаление той или иной блокирующей группы и дальнейшую конденсацию. Модификацией метода является прикрепление первого нуклеотида к
твердому носителю и добавление следующих нуклеотидов по одному после
промывки носителя на каждом таком этапе.
Воссоединение одноцепочечных фрагментов с помощью лигаз требует
фосфорилирования 5ў-концов, что осуществляется с использованием фермента полинуклеотидкиназы и АТР. Одноцепочечные ДНК можно превратить в
двухцепочечные либо в процессе отжига с комплементарной антипараллельной цепью, также синтезированной химическим путем, либо при достройке
комплементарной цепи ферментом (обычно используют ДНК-полимеразу I).
При сочетании химического синтеза и ферментативных этапов, например, из
66 коротких синтетических фрагментов был воссоздан ген инсулина длиной
514 п. н.
Ферментативный синтез генов. Возможны два принципиально различающихся способа ферментативного синтеза ДНК. Один из них не требует
присутствия матрицы и осуществляется по программе, задаваемой экспериментатором. Такой синтез катализирует бактериальный фермент полинуклеотидфосфорилаза, специфичный в отношении рибонуклеотидов, но способный
с меньшей скоростью и к полимеризации цепей ДНК. Для такого синтеза не287
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
обходим праймер, включающий не менее 3 нуклеотидов. Реакции полимеризации имеют некоторые ограничения и с трудом поддаются контролю.
Другой способ ферментативного синтеза ДНК предполагает участие матрицы, которой на первом этапе служит мРНК, выделенная из клетки. Практически все мРНК эукариот имеют на 3ў-конце «шлейф» (полиаденилатную последовательность). Этот участок используют для образования затравки для
комплементарной цепи ДНК: к мРНК добавляют короткие последовательности, состоящие из тимидилатов, которые в результате отжига гибридизуются
с полиаденилатами (рис. 20.3). Обратная транскриптаза в присутствии набора
дезоксирибонуклеотидов катализирует их присоединение к затравке в последовательности, определяемой мРНК, в результате чего образуется двухнитевый гибрид РНК-ДНК. По невыясненным пока причинам новосинтезированная цепь ДНК имеет на конце шпильку (рис. 20.3), которая возникает только
при реакции in vitro (по-видимому, из-за того, что фермент «поворачивает
вспять»). Эту шпильку используют в качестве затравки для синтеза вто-
Рис. 20.3. Образование кДНК в ходе ферментативного синтеза на
основе МРНК
рой цепи ДНК. На следующем этапе осуществляют деградацию РНК с помощью рибонуклеаз либо в ходе щелочного гидролиза, а оставшуюся одноните288
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
вую ДНК со шпилькой используют как матрицу для синтеза второй цепи ДНК
(ДНК-полимераза 1). На заключительном этапе шпильку расщепляют с помощью нуклеазы S1, которая специфически гидролизует одноцепочечные
участки нуклеиновых кислот. Так образуется двухцепочечная «комплементарная» ДНК, или кДНК (в названии отражено основное ее отличие —
комплементарность мРНК).
Существуют модификации описанного метода, позволяющие избежать
многих его недостатков, в частности синтеза неполных копий РНК (особенно
в случае длинных мРНК). Одной из разновидностей метода является синтез
кДНК непосредственно на векторе.
20.2. Введение гена в состав вектора
Полученный тем или иным способом ген может обусловить синтез соответствующего продукта только в клетке, при условии, что он будет экспрессироваться. Кроме того, ген должен иметь возможность реплицироваться для
того, чтобы все клетки в популяции имели его в своем составе и образовывали необходимое количество продукта. Все эти условия (введение генов в
клетки, их репликация, транскрипция и трансляция) обеспечиваются с помощью векторных ДНК (векторов).
Векторами называют небольшие автономно реплицирующиеся молекулы
ДНК, в частности плазмиды, ДНК фагов или других вирусов, либо их модификации, обеспечивающие проникновение в клетку и стабильное наследование чужеродной ДНК (генов). Векторные репликоны должны отвечать ряду
требований: содержать ori репликации и автономно реплицироваться; стабильно наследоваться клеткой-хозяином; содержаться в большом числе копий
в клетке; обладать достаточной емкостью, позволяющей клонировать в их
составе крупные гены; содержать «удобные» сайты рестрикции; содержать
маркеры, по которым можно вести прямой отбор клеток, воспринявших клонированный сегмент ДНК и сам вектор; обладать широким кругом хозяев и
др.
Поскольку плазмиды, как и вирусы, на основе которых конструируют векторы для клонирования, неизбежно обладают специфичностью к видам организмов, в которых способны реплицироваться, при создании векторов следует
учитывать, в каких клетках-хозяевах будет осуществляться клонирование. Из
большого количества систем вектор—хозяин, разработанных к настоящему
времени, наибольшее распространение имеют те из них, где в роли хозяина
выступают бактерии E.coli, а в роли вектора — плазмиды или фаги кишечной
палочки. Следует отметить, что обеспокоенность ученых в отношении непредсказуемых результатов клонирования эукариотических генов стимулировала поиск и создание ослабленных штаммов бактерий-хозяев. В частности,
были получены «безопасные» штаммы E.coli К 12, отличающиеся рядом особенностей, исключающих «утечку» из лаборатории: потребность в особых
факторах роста, отсутствующих в природных экологических нишах, хрупкая
клеточная стенка, чувствительная к слабогипотоническим средам и др.
Плазмидные векторы. Для кишечной палочки создано большое количество векторов на основе плазмидных репликонов, среди которых особенное
289
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
распространение получили производные плазмиды СolE1, в частности
pBR 322 (рис. 20.4). Этот вектор сконструирован при сочетании генетических
методов in vivo и методологии рекомбинантной ДНК.
Плазмида pBR 322 имеет длину 4362 п. н., ее нуклеотидная последовательность полностью установлена. Вектор содержит гены устойчивости к
двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, а также 12 единичных
сайтов узнавания для рестриктаз (каждая из 12 рестриктаз может расщепить
молекулу только в одном сайте).
Преимущества данного вектора состоят в следующем. Во-первых, он может присутствовать в клетках в большом числе копий на хромосому. Вовторых, содержит два селективных маркера (устойчивость к ампициллину и
тетрациклину), причем внутри генов, детерминирующих устойчивость к антибиотикам, присутствуют сайты рестрикции для нескольких ферментов.
Данное преимущество выражается в том, что если осуществлять встраивание
чужеродного фрагмента ДНК в сайт, расположенный внутри гена устойчивости, то ген инактивируется и клетки, наследующие плазмиду с клонированным фрагментом ДНК, можно будет обнаружить по утрате устойчивости к
тому или иному антибиотику. Например, если для встраивания фрагмента
ДНК пользоваться рестриктазой Pst I, то нарушится целостность гена, ответственного за устойчивость к ампициллину. Однако при этом сохранится устойчивость к тетрациклину, и клетки, получившие такие векторы, можно будет отобрать на среде с тетрациклином, а затем по чувствительности ко второму антибиотику выявить те из них, которые содержат клонированный
фрагмент.
Рис. 20.4. Карта плазмиды pBR322. Показаны: точка начала репликации (4362/1);
гены устойчивости к ампициллину (Amp-r) и тетрациклину (Tet-r),
а также сайты рестрикции для некоторых рестриктаз
290
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Такой прием в генетической инженерии называется «инактивацией маркера в
результате вставки».
Существуют и другие приемы отбора клеток, воспринявших векторы со
встроенной ДНК. Один из них, например, заключается в способности Nконцевой части b-галактозидазы комплементировать определенную мутантную b-галактозидазу бактериальной клетки. Поступают следующим образом.
В вектор вводят часть lac-оперона E.coli, включающую промотор, оператор и
5ў-кодирующую область гена lac Z (кодирует N-концевую часть bгалактозидазы, рис. 3-5). В эту область встраивают полилинкер, который не
нарушает ни кодирующую рамку, ни активность N-концевой части bгалактозидазы. Полилинкер представляет собой искусственно синтезированную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для разных нуклеаз. Если в полилинкере отсутствует вставка, такой векторный геном
детерминирует синтез N-концевой части b-галактозидазы, которая вместе с
С-концевой частью, продуцируемой специальным штаммом E.coli, образует
активную b-галакто-зидазу. Этот фермент обеспечивает голубую окраску клеток на среде с хромогенным субстратом Xgal и индуктором. Если в состав полилинкера вводится чужеродная ДНК, нарушается комплементация и клетки,
воспринявшие рекомбинантную ДНК, образуют неокрашенные колонии.
У векторов, сконструированных на основе плазмидных репликонов, есть
отдельные недостатки, основной из которых заключается в снижении числа
копий на клетку при увеличении размера гибридной плазмиды. В результате
клонирование фрагментов ДНК, превышающих 10 т. п. н., становится малоэффективным. Для клонирования таких крупных фрагментов ДНК используют фаговые векторы, космиды и фазмиды.
Фаговые векторы. При использовании фаговых векторов жизнеспособным продуктом, содержащим рекомбинантную ДНК, является не популяция
клеток, как в случае с плазмидными векторами, а популяция фаговых частиц.
Фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, при клонировании
крупных вставок. Самыми распространенными для кишечной палочки являются векторы, сконструированные на основе фагов l и М13.
Геном умеренного фага l представлен двухцепочечной ДНК размером
48,5 т. п. н., которая упакована в головку в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы взаимно спариваются, молекула замыкается в
кольцо и сшивается с помощью ДНК-лигазы. Места спаривания липких концов получили название cos-сайтов, они принимают участие в образованиии
фаговых геномов при репликации по типу катящегося кольца (глава 1). Профаг l в лизогенных клетках находится в интегрированном с нуклеоидом состоянии (механизм и особенности этого явления описаны в главе 2).
Важными для конструирования векторов являются некоторые особенности генома фага l. Во-первых, вся центральная часть (более 1/3 генома) несущественна для литического цикла, а нужна только для установления лизогенного состояния. Таким образом, ее можно заместить на чужеродную ДНК,
и при этом фаг сохранит способность лизировать клетки. Во-вторых, для успешной упаковки ДНК в головки фага требуется, чтобы ее длина была более
38 т. п. н., но менее 52 т. п. н.
291
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
В настоящее время сконструировано большое количество разнообразных
векторов на основе фага l. Типичные из них содержат сайты рестрикции для
Eco RI, ограничивающие участок генома, не нужный для литического цикла
(рис. 20.5). При воздействии рестриктазой Eco RI на ДНК такого вектора образуется 3 фрагмента, среди которых можно отобрать концевые (содержат
гены, необходимые для литического цикла) благодаря их сравнительно большим размерам. Эти фрагменты смешивают с чужеродной ДНК, обработанной
Eco RI, и получают гибридные молекулы, у которых центральная часть представлена вставочным фрагментом (рис. 20.5). Затем полученные гибридные
молекулы упаковывают в головки фага l in vitro. Для этого используют культуры клеток E.coli, инфицированные мутантными штаммами фага l, один из
которых имеет повреждение в гене, ответственном за процесс упаковки ДНК
в головку, а второй — за синтез отдельных белков головки. Такие фаги не
способны
Рис. 20.5. Введение генов в состав векторов на основе фага l
292
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
обусловить литический цикл, но обеспечивают накопление в клетках большого количества промежуточных продуктов, необходимых для сборки фаговых
частиц: пустых головок, хвостовых отростков, ферментов, необходимых для
сборки. Если экстракты таких клеток смешать с векторной ДНК, содержащей
вставки определенной величины, произойдет их упаковка в головки фага и
сформируются зрелые фаговые частицы. На следующем этапе этими частицами инфицируют чувствительные клетки и получают потомство фагов с клонированными ДНК. В составе векторов на основе фага l можно клонировать
фрагменты длиной до 15 т. п. н.
Еще одна категория фаговых векторов для E.coli базируется на геноме
фага М13. Этот нитчатый «мужской» фаг (адсорбируется на F-пилях) содержит одноцепочечную ДНК. Когда фаговая ДНК проникает в клетки кишечной
палочки, она реплицируется с образованием двухцепочечных («+»/«-») промежуточных продуктов, «+»-цепи которых затем вновь упаковываются с образованием множества фаговых частиц. Двухцепочечный промежуточный
продукт (репликативная форма, РФ) накапливается в клетках в числе 100—
200 копий. Его выделяют и используют как вектор для клонирования. Особенностью фага М13 является то, что он не убивает клетки, а лишь замедляет
их деление. Частицы фага непрерывно выделяются в культуральную жидкость, и их титр может достигать 1012 в мл. При этом на газоне чувствительных бактерий фаг выявляется в виде мутных бляшек.
В состав ДНК фага для удобства введения чужеродной ДНК включают
полилинкеры. Когда в РФ ДНК М13 встраивается гетерологичная последовательность, в фаговые частицы упаковывается только одна из цепей этой
вставки (рис. 20.6).Одноцепочечные молекулы ДНК не применяют для конструирования векторов, поскольку их нельзя разрезать с помощью обычно используемых рестриктаз. Клонируя фрагмент в М13 в обеих ориентациях, можно получить большие количества каждой из цепей.
Для удобства отбора рекомбинантных форм (фагов, в геном которых произошла вставка чужеродной ДНК) используют вставки в некодирующую область вектора части lac-оперона E.coli, которая обусловливает комплементацию мутантной b-галактозидазы, и полилинкер. Когда в полилинкере отсутствует вставка, фаговые частицы на специальном мутантном штамме кишечной палочки в присутствии индуктора и хромогенного субстрата образуют
голубые негативные колонии. Встраивание фрагмента ДНК в вектор в области полилинкера нарушает комплементацию, и бляшки остаются неокрашенными.
Преимуществом фаговых векторов на основе М13 является способность
включать очень большие вставки, поскольку в данном случае процесс упаковки ДНК не зависит от размера фагового генома. Самое важное применение векторов-производных фага М13 состоит в получении одноцепочечных
ДНК-матриц для секвенирования методом Сэнгера. Кроме того, однонитевые
ДНК являются идеальной мишенью для сайт-специфического мутагенеза.
Анализ изложенного выше позволяет обнаружить у плазмидных и фаговых векторов свои преимущества, что послужило поводом для конструирования векторов, объединяющих свойства одних и других. Это
293
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 20.6. Встраивание фрагментов ДНК в векторы на основе фага М13
группа так называемых плазмидно-фаговых векторов, которая включает космиды и фазмиды.
Космиды. Представляют собой один из типов гибридных векторов, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, но обладают
способностью упаковываться in vitro в капсиды фага l. Иными словами, космиды представляют собой плазмиды, содержащие cos-участок (липкие концы) ДНК фага l. Благодаря cos-сайтам эти векторы могут быть введены в
клетку не с помощью трансформации, а путем обычной инфекции, в результате чего эффективность получения рекомбинантных клеток возрастает в 100
и более раз. В космидных векторах можно клонировать фрагменты ДНК размером 33—49 т. п. н., таким образом, эти векторы предназначены для
встраивания крупных эукариотических генов, что имеет особое значение для
создания клонотек эукариотических геномов.
Примером космидного вектора служит плазмида pBR322, у которой в со294
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ставе гена устойчивости к ампициллину клонированы cos-сайты фага l. Если
такой вектор расщепить рестриктазой и смешать с фрагментами чужеродной
ДНК, полученными при воздействии на геном тем же рестриктирующим
ферментом, может образоваться смесь конкатемеров.
Конкатемеры представляют собой длинные молекулы, в которых геномы
фага l (или замещающая их ДНК) повторяются несколько раз и отделены
друг от друга cos-сайтами (рис. 20.7). При смешивании этих конкатемеров с
белками, осуществляющими упаковку ДНК фага l, они разрезаются по cosсайтам и ДНК включается в состав капсида. Чтобы это произошло, расстояние между двумя соседними cos-сайтами должно составлять 38—52 т. п. н.
Как и в случае с l-векторами, смесь конкатемеров может включать векторные молекулы без вставок, а также с множеством повторяющихся вставок.
После инфицирования клеток рекомбинантная ДНК поддерживается в них в
виде плазмиды, детерминируя в данном случае устойчивость к тетрациклину.
Рис. 20.7. Использование космидных векторов для клонирования
295
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Фазмиды. Это тоже гибридные векторы, способные развиваться и как
фаг, и как плазмида, поскольку содержат в составе все гены, необходимые
для литического цикла, а также гены, нужные для репликации плазмиды. Емкость фазмид меньше, чем космид, и сопоставима с таковой для фаговых векторов. Преимуществом фазмид является то, что размер их ДНК слишком мал,
чтобы мономер мог упаковаться в капсид фага l, в то же время слишком велик, чтобы произошла упаковка димера вектора. Поэтому негативные колонии способны формировать только рекомбинантные фазмиды, поскольку их
размеры соответствуют емкости головки фага l.
Вставка в фазмиду чужеродного фрагмента ДНК осуществляется подобно
уже описанным примерам для других векторов, чаще — по сайтам рестрикции. После этого гибридные фазмиды упаковывают в капсиды in vitro, как
описано выше. При инфицировании чувствительных клеток фазмиды обусловливают литический цикл и формируют бляшки на газоне тест-культуры.
Однако если вектор содержит ген сI, кодирующий структуру белкарепрессора, то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг. Часто в
составе фазмид используют мутантные гены сI, определяющие структуру
температурочувствительного белка-репрессора, который инактивируется при
повышенной температуре. В этом случае фазмида ведет себя как плазмида
при низкой температуре, а при повышении температуры на несколько градусов
индуцируется к литическому циклу. Такое свойство фазмид во многих случаях
оказывается очень полезным.
Свойствами фазмид обладают некоторые бактериофаги, например фаг Р1,
который в состоянии профага не интегрирует в хромосому, а поддерживается
в виде плазмиды. Мутант фага Р1clr100 способен индуцироваться к литическому циклу при температуре выше 32° С, т. е. ведет себя как типичная фазмида.
Выше охарактеризованы типы векторов, используемых для клонирования
генов в клетках E.coli. Для других видов прокариот также сконструировано
множество различных векторных молекул, среди которых обращают на себя
внимание так называемые «челночные векторы». Их особенность состоит в
способности к репликации в разных клетках-хозяевах, что обеспечивается
введением в вектор дополнительных областей начала репликации (ori), а
также генов, требуемых для репликации и не поставляемых хозяйскими клетками. Одни из челночных векторов способны поддерживаться в клетках разных прокариот, другие — в клетках некоторых прокариот и эукариот (дрожжей, растений, животных). Использование челночных векторов составляет
определенное удобство для клонирования генов и анализа их продуктов, поскольку одни и те же гены получают возможность реплицироваться и экспрессироваться в разных организмах.
Одним из примеров конструирования челночных векторов является объединение части 2 мкм (двухмикронной) плазмиды дрожжей Saccharomyces
cerevisiae с плазмидой pBR322, содержащей дрожжевой ген HIS3 (кодирует
один из ферментов биосинтеза гистидина). Оказалось, что ген HIS3 экспрессируется и в бактериальных клетках благодаря тому, что содержит область,
гомологичную соответствующему промотору E.coli. Такой вектор реплицируется в клетках дрожжей S. cerevisiae и в бактериях E.coli и позволяет осуще296
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ствлять прямой отбор воспринявших его клеток при использовании гистидинзависимых штаммов на синтетической среде без этой аминокислоты.
Основой векторов для клонирования генов животных чаще всего является
геном вируса обезьян SV40. Общие принципы конструирования векторов в
этом случае такие же, как для векторов на основе фага l.
Для растительных клеток, которые не содержат собственных плазмид, основой векторов часто служат геномы вирусов растений, а также бактериальная плазмида pTi, которая опосредует перенос сегментов плазмидной ДНК в
геномы различных двудольных растений и индуцирует образование опухолей
(корончатых галлов). Семейство плазмид pTi выявлено в грамотрицательных
бактериях Agrobacterium tumefaciens.
20.3. Стратегия клонирования генов
Термин «клонирование» происходит от слова «клон», под которым подразумевается генетически однородное потомство клеток или вирусов, т. е. полученных при неполовом размножении. Простейшим примером клона является
изолированная колония бактерий на плотной среде. Когда говорят о клонировании гена, имеют в виду тиражирование копии гена в составе векторной молекулы в клетках клона (или вирусных частицах в составе бляшки). При этом
каждая клетка клона (каждая вирусная частица в пределах изолированной
негативной колонии) будут содержать одинаковые фрагменты чужеродной
ДНК. Это очень важный методологический прием, составляющий основу
всей генетической инженерии. Ведь при получении генов в ходе расщепления
ДНК какого-то организма и включении полученных фрагментов в состав векторов формируется очень сложная смесь молекул, в которой один ген или его
сегмент составляет ничтожную часть, так что невозможно изучить ни его
структуру, ни свойства продукта. Однако при введении рекомбинантных ДНК
(вектор со вставкой) в клетки или вирусные частицы возможность к репродукции в каждой клетке (вирусной частице) приобретает только один тип
гибридной ДНК. Выделив клон или содержимое бляшки, можно их инкубировать и получать неограниченное количество клонированных генов, а также
их продуктов.
В предыдущем разделе уже описано несколько схем клонирования фрагментов ДНК в составе разных векторов (рис. 20.5—20.7). Обобщая этот материал, следует отметить, что для клонирования генов используют самые
разнообразные системы вектор-хозяин. При этом наибольшее распространение получили системы, в которых реципиентными клетками служат бактерии
E.coli. Рекомбинантные ДНК вводят в клетки-хозяева или вирусные частицы
различными способами.
Для введения в клетки векторов, сконструированных на основе плазмид,
используют метод трансформации компетентных клеток или более эффективный способ — трансформацию протопластов (глава 2). Однако такой способ
переноса генетической информации характеризуется невысокой частотой (в
трансформации участвует ~1 из 500—10 000 молекул ДНК), поэтому для отбора клеток, воспринявших вектор, требуется наличие в его составе специальных маркеров. В качестве таких маркеров чаще всего используют гены
297
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
устойчивости к антибиотикам, позволяющие производить прямую селекцию
трансформированных бактерий на среде с соответствующим антибиотиком.
Векторы, сконструированные на основе вирусов, а также космиды и фазмиды имеют преимущества перед плазмидными векторами в том, что их с
высокой эффективностью удается упаковывать в вирусные капсиды in vitro, а
затем инфицировать чувствительные клетки. Метод инфекции намного эффективнее трансформации: инфекционной становится каждая десятая молекула ДНК. При этом космиды и фазмиды, попав в клетки, способны поддерживаться в них по типу плазмидной ДНК.
Еще одна задача в процедуре клонирования состоит в отборе клонов, воспринявших именно рекомбинантную ДНК, а не просто векторные молекулы,
которые обязательно присутствуют в смеси, полученной при включении
фрагментов ДНК в состав векторов. Для решения этой проблемы используют
уже описанные приемы, например, инактивацию маркера в процессе вставки.
Более прогрессивным способом отбора клонов бактерий или фагов, содержащих векторы со вставками, служит комплементационный анализ с использованием мутантных генов b-галактозидазы (см. выше). Применение этого метода позволяет отличать клоны бактерий (бляшки фагов), содержащие рекомбинантную ДНК, по цвету при высеве на среду определенного состава. Еще
одним подобным примером служит использование гена mel для конструирования плазмидных векторов. Этот ген определяет структуру фермента тирозиназы, катализирующей превращение тирозина в меланин (темная окраска
колоний). При вставках фрагментов ДНК в кодирующую область гена mel
происходит его инактивация, и трансформированные колонии утрачивают
окраску. Существуют и другие приемы для быстрого поиска среди трансформированных или инфицированных клонов тех из них, которые восприняли
рекомбинантную ДНК.
20.4. Создание клонотек геномов и идентификация в них генов
В большинстве случаев для изучения структуры и свойств определенного
гена какого-либо организма требуется осуществить предварительный этап —
создать банк генов данного организма. Банком генов, или библиотекой генома (клонотекой), называют совокупность клонов бактерий или фаговых
частиц, в которой содержится, по меньшей мере, по одному экземпляру каждой последовательности генома исследуемого организма. Необходимое количество клонов в клонотеке определяется отношением размера генома и размеров клонируемых фрагментов ДНК. Например, если гаплоидный геном
Saccharomyces cerevisiae содержит 1,4Ч107 п. н., а емкость используемого для
клонирования вектора составляет 15Ч103 п. н., то весь геном этих дрожжей
может быть представлен 1,4Ч107 /15Ч103 » 1Ч103 рекомбинантными клонами.
Однако реально для создания клонотеки в данном случае требуется 4000—
5000 клонов, среди которых искомый ген или сегмент генома может быть
обнаружен с вероятностью 99%. Такая избыточность клонотеки объясняется
тем, что лигирование отдельных фрагментов чужеродной ДНК с векторами
происходит случайно, и какие-то участки генома могут быть представлены в
298
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
небольшой выборке несколько раз, а другие — ни одного раза. Полная библиотека генома человека размещается в составе примерно 900 000 клонов.
Наиболее часто используются два типа клонотек: геномные библиотеки и
библиотеки кДНК. Геномные библиотеки представляют собой собрание генов
и последовательностей ДНК какого-то организма. Их получают обычно с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага l или космид.
Эти векторы характеризуются большой емкостью, что позволяет уменьшить
число клонов в клонотеке.
Библиотека кДНК («комплементарных» ДНК, см. раздел 1) представлена
набором клонов, содержащих двухнитевые ДНК-копии всех мРНК клетки.
Для создания этих клонотек чаще используют плазмидные или фаговые (на
основе фага l) векторы.
Оба типа клонотек, однако, можно сравнить с хаотическим собранием
книг, которые превращаются в библиотеку лишь после составления каталога,
позволяющего систематизировать все собрание. Иными словами, следующим
необходимым этапом является идентификация генов в клонотеке генома. Решить эту задачу можно несколькими способами: анализируя саму вставочную
полинуклеотидную последовательность либо продукты ее экспрессии в клетках-хозяевах. В первом случае стратегия скрининга рекомбинантных клонов
основана на использовании зондов, комплементарных определенным участкам генов или кДНК. Во втором случае скрининг основан на изменении фенотипа клеток, воспринявших определенный фрагмент ДНК, под влиянием
вновь синтезированного белка либо просто на свойствах самого белка. Рассмотрим некоторые способы идентификации генов в клонотеках.
Идентификация генов по изменению фенотипа клеток. Этот метод
чаще используется при «самоклонировании», т. е. при переносе генов на многокопийных плазмидах в тот же микроорганизм, из генома которого были
выделены эти гены. Например, требуется обнаружить в клонотеке E.coli клоны, содержащие гены, ответственные за биосинтез аланина. Для этого требуется перенести векторы с клонированными фрагментами ДНК в мутантные
штаммы E.coli, зависимые по аланину. Отбор потомства следует вести на
синтетической среде без аланина, где способны сформировать колонии лишь
те бактерии, которые восприняли комплементирующий соответствующую
мутацию ген. Подобная процедура носит название «тест на комплементацию» и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов.
Иммунологический скрининг продуктов генов. Если фрагменты ДНК
клонировались в составе экспрессируемых векторов, обеспечивающих транскрипцию и трансляцию чужеродных генов, то возможен отбор нужных клонов с помощью иммунологических тестов. Для этого колонии бактерий на
плотной среде (чашка-реплика) подвергают лизису парами хлороформа, а
затем методом реплик переносят содержимое на поливиниловую пластинку,
на которой адсорбированы антитела к искомому белку. Промывают пластинку таким образом, чтобы на ней остались только связанные с антителами белки (в мягких условиях). Затем пластинку обрабатывают мечеными изотопами
йода (125I) антителами к тому же белку. Таким образом, на пластине формируется комплекс антигена (искомый белок) и двух молекул антител, одна из
299
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
которых мечена радиоактивным изотопом. Обнаружить местоположение такого комплекса можно радиоавтографически. Сопоставляя положение меченого комплекса и положение колоний на чашке, можно выявить клон, содержащий ответственный за синтез искомого белка ген.
Скрининг клонотеки с помощью зондов. В разделе 1 этой главы описана процедура получения кДНК. Для поиска нужной кДНК в клонотеке поступают следующим образом. Отбирают изолированную колонию, содержащую
вектор со вставкой, и инкубируют ее для получения большого количества гомогенной культуры. Выделяют из клеток плазмидную ДНК и подвергают ее
денатурации, в результате чего цепи расходятся. Иммобилизуют денатурированную ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Пропускают через фильтр смесь
мРНК, выделенных из тех же клеток, чьи гены пытаются обнаружить. При
этом на фильтре задерживаются лишь те мРНК, которые комплементарны
гомогенной кДНК. Связавшуюся мРНК элюируют с фильтра и вносят в бесклеточную систему трансляции, где синтезируется соответствующий белок.
Этот белок можно идентифицировать иммунологическим методом или с помощью хроматографического анализа. Если это удается осуществить, в руках
исследователя оказывается идентифицированный клон, клетки которого содержат
кДНК, служащую зондом для поиска индивидуального гена или мРНК.
кДНК-зонд можно использовать для быстрого и очень эффективного
скрининга любой клонотеки. Схема такого эксперимента представлена на
рис. 20.8. Изолированные колонии микроорганизмов или бляшки вирусов на
газоне чувствительных клеток переносят методом реплик на нитроцеллюлозный фильтр, помещенный на поверхность плотной среды в чашке Петри.
Клетки разрушают (обычно щелочным лизисом с помощью NaOH) и подвергают ДНК денатурации. При определенных условиях (80° С, вакуум) ДНК
прочно прикрепляется к нитроцеллюлозному фильтру. Фильтр выдерживают
в растворе, содержащем денатурированный 32Р-меченный зонд. В этих условиях комплементарные последовательности ДНК образуют дуплексы. При
радиоавтографическом анализе в том месте фильтра, где содержалась комплементарная зонду ДНК, обнаруживается потемнение. Ищут соответствие
этой зоны той или иной колонии на чашке-матрице (либо бляшке).
В качестве зондов для скрининга клонотек вместо кДНК можно использовать мРНК или химически синтезированные олигонуклеотидные зонды. В
последнем случае требуется информация о последовательности нуклеотидов в
гене или последовательности аминокислот в искомом белке. Исходя из аминокислотной последовательности участка полипептида длиной 5—6 аминокислотных остатков, предсказывают все возможные последовательности
мРНК, которые могут кодировать этот участок. Вариантов обычно бывает
много из-за вырожденности генетического кода. Синтезируют соответствующий набор комплементарных олигонуклеоти-
300
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 20.8. Схема скрининга клонотеки с помощью зондов
дов in vitro. Эти нуклеотиды можно затем использовать непосредственно для
скрининга смеси кДНК или геномной библиотеки. Кроме этого, данные олигонуклеотиды можно применять вместо олиготимидилатов в качестве затравок для обратной транскриптазы, чтобы синтезировать кДНК, существенно
обогащенную искомыми последовательностями. В данном случае процессу
обратной транскрипции будут подвергаться преимущественно те мРНК, которые содержат комплементарные затравкам последовательности рибонуклеотидов.
20.5. Секвенирование ДНК
Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование)
является одной из важных, а часто и обязательных стадий изучения генома.
Секвенированию подвергают очищенные (однородные) фрагменты однонитевой ДНК длиной 100—200 нуклеотидов. Получить такие фрагменты можно в
301
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ходе следующих операций: методом клонирования добиваются однородности
рекомбинантных ДНК в составе одного клона; выделяют векторную ДНК из
клеток; с помощью рестрикционных ферментов расщепляют клонированный
сегмент ДНК на фрагменты указанной величины; при повышении температуры добиваются денатурации ДНК, получая однонитевые молекулы. Есть и
более простой способ подготовки ДНК (пригоден для метода Сэнгера) —
клонирование однонитевых фрагментов ДНК в составе векторов на основе
фага М13.
Широко применяются два метода секвенирования: метод химического
расщепления Максама и Гилберта и метод обрыва цепи Сэнгера. Наиболее
современным и менее трудоемким считается метод обрыва цепи Сэнгера.
Секвенирование ДНК методом обрыва цепи. Этот метод основан на использовании
специфических
терминаторов
синтеза
ДНК — 2ў,3ўдидезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Эти молекулы нормально включаются
в растущие цепи ДНК через свои 5ў-трифосфатные группы, однако не образуют фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеозидтрифосфатом (dNTP). Когда в реакционную смесь для синтеза ДНК наряду с четырьмя
нормальными dNTP вводят небольшое количество какого-либо дидезоксиNTP
(например, ddATP), синтезируется набор цепей, специфически терминированных данным ddNTP. Если с одним и тем же фрагментом ДНК поставить
четыре отдельные реакции, каждую с одним из ddNTP, то в каждой реакции
образуется смесь вновь синтезированных молекул разной длины. При этом
получается, что все синтезированные в такой системе цепи ДНК будут иметь
одинаковый 5ў-конец (он обусловлен использованием одной и той же затравки) и одинаковые нуклеотиды на 3ў-конце. Теперь такие продукты можно разделить с помощью электрофореза в геле и определить по относительной длине образованных цепочек ДНК последовательность нуклеотидов в них
(рис. 20.9).
Последовательность этапов в методе следующая: 1) получают однонитевые фрагменты ДНК, последовательность нуклеотидов в которых требуется
определить (ДНК-матрицы); 2) синтезируют набор ddNTP; 3) синтезируют
короткий фрагмент меченой ДНК, комплементарный 3ў-концу матрицы (затравка); 4) готовят четыре реакционные смеси для синтеза ДНК, в состав каждой из которых входит какой-либо один ddNTP и соответствующий dNTP в
строго определенном соотношении, а также три других dNTP; 5) в каждой из
реакционных смесей дают осуществиться синтезу ДНК. Если соотношение
ddNTP : dNTP выбрано правильно, образуется набор меченых молекул, длины которых равны расстояниям от остатков данного ddNTP до начала цепи;
6) денатурируют полученные смеси ДНК, добиваясь образования однонитевых молекул; 7) разделяют фрагменты по размеру методом электрофореза в
геле (в пористом агарозном или полиакриламидном геле под действием электрического поля молекулы движутся со скоростью, обратно пропорциональной их величине); 8) проводят радиоавтографию и по картине распределения
меченых фрагментов устанавливают нуклеотидную последовательность.
Наиболее современной модификацией метода Сэнгера является ис-
302
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
3'
5'
TACGTCGATTCCCAG
ДНК-матрица
P
P
P O
Азотистое
основание
H2C
O
+ меченая
затравка
5'
3'
TACGTCGATTCCCAG
H
H
ddNTP
GGGTC
3'
5'
Разделение фрагментов,
полученных в четырех
разных реакциях, в геле
+ ДНК-полимераза I
+ 4 dNTP
+ ddATP
5'
3'
TACGTCGATTCCCAG
A T G C A G C T A AG G G T C
3'
5'
5'
3'
TACGTCGATTCCCAG
ddATP ddTTP ddGTP ddCTP
T
A
C
G
AA GGGTC
3'
5'
5'
3'
TACGTCGATTCCCAG
T
C
G
A
T
T
C
C
C
A GGGTC
3'
5'
A
G
AGCTAA GGGTC
5'
5'
3'
TACGTCGATTCCCAG
3'
Смесь фрагментов ДНК
в реакции с ddATP
Радиоавтограф геля
Последовательность
цепи ДНК-матрицы
Рис. 20.9. Схема секвенирования ДНК по методу Сэнгера
пользование клонированных в векторах на основе фага М13 однонитевых
фрагментов ДНК. Место генома М13, в которое встраивается чужеродная
ДНК, точно известно. Поэтому получены 8—10-членные олигонуклеотиды,
комплементарные участку ДНК М13, непосредственно прилегающему к клонированной последовательности. Эти нуклеотиды и служат затравками в полимеразных реакциях, т. е. появляется возможность использования одной и
303
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
той же синтетической затравки для секвенирования любых вставок в данный
вектор.
При оптимальных условиях с помощью данного метода можно в одном
эксперименте определить строение фрагмента, включающего сотни нуклеотидов.
Секвенирование ДНК методом химического расщепления. Для фиксации начальной точки рестрикционных фрагментов ДНК осуществляют мечение их 5ў-конца радиоактивным изотопом фосфора 32Р с помощью фермента
полинуклеотидкиназы (рис. 20.10). Затем денатурируют ДНК, получая однонитевые цепи, и делят препарат на четыре порции. Каждую порцию обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно
5'
3'
CTGATCAGAG
GAC TAGTCTC
3'
5'
Мечение
5'- концов
5'
Функции расщепляющих реагентов:
1 - разрушает гуанин (G);
2 - разрушает гуанин и аденин (AG);
3 - разрушает тимин и цитозин (ТС);
4 - разрушает цитозин (С).
3'
CTGATCAGAG
GAC TAGTCTC
3'
5'
Разделение
цепей
1(G) 2(AG) 3(TC) 4(C)
5'
3'
CTGATCAGAG
G
Химическое расщепление цепей ДНК
A
G
A
4
C
3
2
1
T
5'
3'
A
G
T
CTG
5'
3'
CTGATCAG
5'
C
3'
CTGATCAGAG
5'
3'
Радиоавтограф геля
(выявлены только
меченые фрагменты)
Последо вательность
нуклеотидов
ATCAG
5'
Радиоавто графия геля
3'
AG
Четыре набора фрагментов
разной длины
Разделение по размеру
методом электрофореза
304
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 20.10. Схема секвенирования ДНК по методу Максама—Гилберта
или два из четырех возможных азотистых оснований. Условия этой реакции
подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось
лишь несколько повреждений. После этого поврежденные молекулы обрабатывают пиперидином, который обусловливает разрывы цепей за нуклеотидом
с поврежденным основанием. В результате получаются смеси, содержащие
фрагменты разной длины, среди которых только меченые имеют «фиксированную» начальную точку (5ў-конец), и они смогут быть выявлены при радиоавтографическом анализе. Например, если во фрагменте длиной
10 нуклеотидов гуанилат находился в 3, 8 и 10 положениях, то при обработке
реагентом, повреждающим гуанин, сформируются цепи из 3, 8, 10, 5 и 2 нуклеотидов. Из них только первые три, как содержащие радиоактивный изотоп
фосфора, смогут образовать потемнение на рентгеновской пленке.
На заключительном этапе наборы меченых фрагментов, образующиеся
при каждой из четырех реакций, подвергают электрофорезу в соседних дорожках полиакриламидного геля. Происходит разделение фрагментов ДНК в
соответствии с их размерами. Осуществляют радиоавтографию геля и читают
последовательность нуклеотидов в анализируемой цепи. При этом первый
нуклеотид в цепи определяется самым коротким фрагментом ДНК, т. е. последним на радиоавтографе геля (рис. 20.10).
305
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Глава 21. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
21.1. Получение эукариотических белков и решение проблем
экспрессии чужеродных генов
Одним из наиболее значимых достижений генетической инженерии является клонирование эукариотических генов, что дает возможность осуществлять синтез микробными клетками важнейших для народного хозяйства белков — ферментов, гормонов, иммуномодуляторов и др. Эукариотические организмы-доноры генетического материала характеризуются гораздо менее
высоким уровнем продукции природных белков, чем генноинженерные
штаммы-продуценты. Поэтому получение практически ценных белков для
изучения их структуры и свойств, а также для использования в хозяйственных целях осуществляют чаще с использованием гибридных микробных
штаммов, а не культур клеток растений и животных или их органов и тканей.
Названным способом получены такие ценные белки, как гормон роста человека и некоторых животных, инсулин, фактор роста эпидермиса человека,
фактор некроза опухолей человека и мыши, a-, b- и g-интерфероны, медиатор нервной системы соматостатин, гормон кальцитонин, миоглобин, гормоноподобные сигнальные белки интерлейкины, фактор свертывания крови,
отсутствующий у больных гемофилией, обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей, урокиназа, трипсин, некоторые онкобелки, вакцины против некоторых вирусов и др.
Когда ген в составе векторной молекулы переносится из клеток одного организма в клетки другого, возникают проблемы с его экспрессией —
транскрипция и трансляция мРНК могут не осуществляться вовсе либо происходить с низкой частотой. Это является следствием специфичности ферментов, катализирующих процессы транскрипции и трансляции, к определенным последовательностям ДНК (мРНК), структура которых бывает уникальной у различных таксономических групп организмов. Чаще всего проблемы
экспрессии наблюдаются при клонировании эукариотических генов в клетках
прокариот, в частности потому, что сигналы инициации транскрипции высших эукариот не распознаются РНК-полимеразами бактерий.
Для достижения эффективной экспрессии клонированных генов используют несколько подходов: 1) увеличение числа копий гена в клетке (амплификация гена); 2) подстановку перед структурной частью чужеродного гена
сильного промотора, распознаваемого РНК-полимеразой клетки-хозяина;
3) подстановку перед геном чужеродного белка регуляторного элемента,
обеспечивающего эффективную инициацию трансляции; 4) стабилизацию
306
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
образующейся мРНК и белкового продукта. Перечисленные методы достижения высокого уровня экспрессии генов наилучшим образом разработаны для
бактерий E.coli. Поскольку наличие такой методологии является определяющим условием конструирования новых продуцентов, кишечная палочка рассматривается как один из самых перспективных организмов, используемых
для этой цели.
Амплификация генов. Для усиления экспрессии генов можно увеличить
их количество в клетке. Осуществляют это двумя способами: увеличивая число копий рекомбинантных плазмид или увеличивая число копий гена в составе плазмиды.
Наиболее прост первый способ. Уже указывалось, что для конструирования векторов предпочтительнее использовать мультикопийные плазмиды,
находящиеся под нестрогим контролем репликации. В этом случае число копий плазмид составляет 10—200. Данный показатель можно увеличить до
нескольких тысяч, если подавить синтез белков бактериальной клетки или
использовать мутантные плазмиды. Применение таких векторов позволяет
значительно увеличить дозу целевого гена, а значит, и выход белкового продукта. Следует, однако, учитывать, что чрезмерная амплификация плазмид
может приводить к снижению жизнеспособности штамма-продуцента из-за
высокой токсичности некоторых чужеродных белков для бактерий, а также
из-за увеличения времени генерации клеток.
Копийность генов в составе векторных молекул обеспечивают, создавая опероны с повторяющимися идентичными цистронами чужеродных генов. Сочетание
перечисленных методов позволяет повысить дозу гена в клетке от нескольких
десятков до тысяч копий на нуклеоид и увеличить уровень синтеза соответствующих белков (в ряде случаев на 1—2 порядка).
Достижение высокого уровня транскрипции чужеродных генов. Для
того чтобы эукариотические гены транскрибировались в прокариотических
клетках, их обычно подставляют под контроль сильных промоторов (обеспечивают высокую частоту событий инициации транскрипции) прокариот.
Наиболее часто для этих целей используют сильные промоторы кишечной
палочки: лактозного оперона — PlacUV5, триптофанового — Ptrp; гибридные
промоторы, например Ptrp-lacUV5 (Ptac), а также промоторы фага l — PR, PL и
других фагов (Т5, Т7, jХ174). Выделение этих промоторов и включение их в
состав векторов осуществляют в ходе генно-инженерных манипуляций.
Еще более совершенной является методология использования регулируемых промоторов, которые инициируют процесс эффективной транскрипции
лишь в определенных условиях. Такими промоторами являются, например,
PR и PL фага l. Их используют в клетках, содержащих температурочувствительный сI-репрессор, ген которого может быть расположен на векторе или
совместимой с ним плазмиде. В таких клетках экспрессия чужеродного гена
под контролем PR или PL будет происходить лишь после инактивации репрессора повышением температуры ферментации.
Использование прокариотических регуляторных элементов, расположенных на многокопийных плазмидах, позволяет достигать уровня синтеза мРНК
чужеродного гена до 25% от всей РНК бактериальной клетки.
307
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Достижение высокого уровня трансляции чужеродных генов. Еще
одним условием эффективной экспрессии клонированных генов является наличие перед геном чужеродного белка оптимального сайта инициации трансляции мРНК. На частоту событий трансляции первостепенное значение оказывает структура участков мРНК, обеспечивающих ее связывание с рибосомой и тРНК. Показано, что олигонуклеотидная последовательность, расположенная на 5ў-конце и непосредственно примыкающая к стартовому кодону,
обеспечивает комплементарное спаривание с нуклеотидами антикодоновой
петли тРНК. В то же время среди нуклеотидов мРНК, участвующих во взаимодействии с рибосомой, достоверно установлена роль пуринбогатого участка
на расстоянии 3—15 нуклеотидов от стартового кодона (последовательность
Шайн—Дальгарно,
или
SD-последовательность).
Длина
SDпоследовательности, а также ее расположение относительно стартового кодона существенно сказываются на связывании рибосом с мРНК, а значит, и на
частоте событий инициации трансляции.
Известно три основных подхода к конструированию векторов, обеспечивающих трансляцию чужеродной ДНК в бактериальных клетках. Одним из
наиболее распространенных является метод конструирования «гибридных
участков связывания рибосом». Суть его заключается в том, что структурная
часть чужеродного гена (с собственным стартовым кодоном и несколькими
нуклеотидами перед ним) включается между последовательностью SD и стартовым кодоном прокариотического гена. Такой метод имеет преимущество,
состоящее в образовании полноразмерного чужеродного белка. Однако существенным недостатком метода является трудность достижения оптимального
удаления стартового кодона от SD-последовательности, что, как указывалось,
очень существенно для инициации трансляции. Поэтому применяют другой
подход, в котором чужеродный структурный ген, лишенный собственных регуляторных областей, внедряют в состав хорошо экспрессируемого бактериального гена. Для этих целей чаще всего используют lac-промотор с соответствующей последовательностью Шайна—Дальгарно. Сайт внедрения должен
быть достаточно удален от места инициации трансляции, чтобы новая нуклеотидная последовательность не мешала эффективной инициации транскрипции и трансляции бактериального гена. При экспрессии векторов такого
типа образуется гибридный белок, в котором N-концевая часть представлена
аминокислотами прокариотического пептида. Поэтому для выделения эукариотической полипептидной цепи требуется дополнительная химическая или
ферментативная обработка.
Наконец, третий подход к конструированию векторов, обеспечивающих
эффективную трансляцию, использует принцип «перекрывания» генов. В
этом случае чужеродный ген встраивают в концевую часть прокариотического гена таким образом, что SD-последовательность второго гена расположена
непосредственно в кодирующей области первого. При этом терминирующий
трансляцию кодон первого гена является частью инициирующего кодона второго гена. Этот метод разработан в 1985 г. в СССР. Он позволяет достигать
100%-ной инициации трансляции второго гена, поскольку рибосомы, транслировавшие первую часть полицистронной мРНК, не отсоединяются от нее, а
происходит реинициация трансляции второго гена. Таким образом, примене308
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ние векторов с частично перекрывающимися генами в оперонах позволяет
обеспечить эффективность инициации трансляции чужеродного гена не ниже,
чем у исходного прокариотического цистрона.
Стабилизация мРНК и белкового продукта чужеродного гена. Стабильность мРНК в клетках бактерий можно повысить введением мутаций, инактивирующих РНКазы. Кроме этого, на стабильность мРНК влияет
полинуклеотидфосфорилаза (pnp). Известны мутанты E.coli по генам pnp, в
которых время полужизни мРНК, определяющей чужеродные белки, увеличивается в 1,5 раза.
Серьезным препятствием при получении штаммов-сверхпродуцентов может стать протеолиз чужеродных белков в клетке. Ведь набор клеточных пептидаз как раз и предназначен в основном для быстрой деградации полипептидов с «аномальной» структурой, которые возникают, например, в результате ошибок трансляции. Для стабилизации чужеродных белков можно использовать в качестве реципиентов штаммы, дефектные по системе деградации
белков (lon-, htpR или deg-мутанты). Можно также вводить в бактериальную
клетку ген pin бактериофага Т4, который контролирует синтез ингибиторов
протеиназ, или другие гены с похожими функциями.
21.2. Локализованный мутагенез и белковая инженерия
Методы генетической инженерии, в частности клонирование индивидуальных генов или их частей, а также секвенирование ДНК, позволили значительно усовершенствовать методологию мутагенеза, устранив основные недостатки классических способов индукции мутаций в геномах. Классический
генетический анализ предполагает воздействие мутагенного фактора in vivo
на целый геном, в результате чего в нем возникают случайные мутации, зачастую множественные, что сильно осложняет идентификацию мутантов.
Выявление мутантных особей осуществляют по измененным фенотипическим
признакам, а природу мутации можно определить после секвенирования
ДНК. Современный локализованный мутагенез, по сути, предполагает обратные действия: вначале клонируют интересующий ген или его сегмент, определяют его структуру в ходе секвенирования, а потом in vitro вносят требуемые изменения в его состав. Последствия вызванной мутации определяют
после введения мутантного гена в исходный организм.
Самый простой вариант локализованного мутагенеза состоит в обработке
клонированного фрагмента ДНК одним из мутагенных факторов, однако результатом такого воздействия будут тоже случайные изменения в структуре
фрагмента. Более надежные и чаще применяемые методы локализованного
мутагенеза осуществляются без использования мутагенных факторов. Среди
типов мутаций преобладают делеции, вставки и замены нуклеотидов.
Делеции. Эти типы мутаций при локализованном мутагенезе получают с
помощью эндонуклеаз. Используют как рестриктирующие, так и неспецифические эндонуклеазы. Наиболее простой случай использования рестриктаз
состоит в расщеплении какого-либо генома с помощью рестриктазы, вносящей несколько разрывов с образованием липких концов. Полученные фрагменты вновь замыкают в кольцо с помощью ДНК-лигазы, что может привес309
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ти к образованию молекул, не содержащих один из сегментов ДНК. При таком подходе формируются протяженные делеции, и его используют, как правило, в предварительных экспериментах, чтобы определить функции относительно больших участков клонированной ДНК.
Небольшие делеции получают следующим образом. Клонированный
фрагмент расщепляют в составе вектора в подходящем сайте с помощью рестриктазы (рис. 21.1). Образовавшуюся линейную молекулу обрабатывают
экзонуклеазой III, которая гидролизует в составе ДНК одну цепь,
Рис. 21.1. Получение делеций в клонированных фрагментах ДНК
с помощью рестрикционных ферментов. Темным цветом выделена чужеродная ДНК, светлым — ДНК вектора
начиная с 3ў-конца. В результате получается набор молекул с одноцепочечными 5ў-хвостами разной протяженности. Эти хвосты гидролизуют нуклеазой
S1, специфичной к одноцепочечной ДНК, и в ДНК формируются делеции.
Можно также применять экзонуклеазу Bal 31, которая катализирует деградацию обеих цепей, начиная с концов линейных молекул ДНК. Ход нуклеотических реакций регулируют, варьируя время инкубации, температуру и концен310
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
трацию фермента, индуцируя образование делеций разной длины. Полученные делеционные варианты линейных ДНК часто перед циклизацией снабжают линкерами, чтобы в районе делеции присутствовали рестрикционные
сайты. Существуют и другие модификации описанных методов.
Вставки (инсерции). Для получения инсерций клонированную ДНК
расщепляют рестриктазой или неспецифической эндонуклеазой, а затем лигируют образующиеся фрагменты в присутствии сегмента, который хотят
вставить в ДНК. Чаще всего в качестве таких сегментов используют синтезированные химическим путем полилинкеры (глава 20).
Инсерции, как и делеции, способны нарушить целостность гена или
структуру его регуляторных областей, в результате чего будет синтезироваться дефектный белок (в случае протяженных делеций или сдвига рамки считывания, как правило, неактивный) либо будут наблюдаться изменения процесса транскрипции интересующего гена. Таким способом чаще получают регуляторные мутанты и конструируют экспрессируемые векторы (глава 20).
Точечные мутации. Эти мутации представляют собой замену нуклеотидов. Для их получения можно использовать несколько подходов: дезаминирование цитозина, включение аналогов нуклеотидов, неправильное включение
нуклеотидов при репарации пробела и др.
Первый способ основан на том, что остатки цитозина в одноцепочечной
ДНК можно дезаминировать с образованием урацила с помощью обработки
ионами бисульфита. Одноцепочечные участки в ДНК получают обычно вблизи сайтов рестрикции, например, при действии экзонуклеазы III. После обработки бисульфитом одноцепочечные бреши застраивают с помощью ДНКполимеразы и лигируют концы. В сайтах, где вместо цитидилата при дезаминировании образовался уридилат, комплементарное положение займет аденилат, а при репликации такой молекулы произойдет замена пары GС на пару
AT.
Другой подход при индукции замен состоит в обработке клонированной
ДНК какой-либо рестриктазой в присутствии бромистого этидия, который
встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в структуру дуплекса. В результате образуется только однонитевый разрыв ДНК. В
месте однонитевого разрыва создают небольшой пробел, а затем застраивают
его в присутствии ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dCTP и N-4гидроксицитозинтрифосфата вместо dTTP. Гидроксицитозинтрифосфат
включается в цепь вместо тимидилата, но при репликации ДНК спаривается
одинаково хорошо и с аденилатом, и с гуанилатом. В результате включения
гуанилата после дополнительного раунда репликации в данном сайте произойдет замена АТ®GC (рис. 21.2). Поскольку в данном методе замена
нуклеотидов осуществляется внутри
311
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 21.2. Получение замен нуклеотидов в процессе локализованного мутагенеза
сайта рестрикции, появляется возможность легко различить векторы с исходной последовательностью и мутантные. Для этого достаточно обработать их
используемой в эксперименте рестриктазой: мутантные молекулы не подвергнутся расщеплению.
Похожий метод основан на использовании только трех из четырех возможных нуклеотидов при заполнении однонитевой бреши ДНК-полимеразой.
В большинстве случаев фермент останавливается в том месте молекулы, где
встречается комплементарный отсутствующему нуклеотид. Однако изредка
ДНК-полимераза ошибается и включает один из трех присутствующих нуклеотидов. Это приводит к образованию кольцевых молекул, в составе которых присутствуют неспаренные некомплементарные азотистые основания.
При введении таких векторов в клетки бактерий в части молекул произойдет
репарация такого повреждения. В результате в половине молекул после репликации восстановится исходная последовательность, а в другой половине
закрепится мутация. Отличить мутантные молекулы можно описанным выше
способом.
Сайт-специфический мутагенез. Охарактеризованные методы локализованного мутагенеза отличаются тем, что сайты, где происходят мутации,
выбираются случайно. В то же время техника сайт-специ-фического мутагенеза позволяет вводить мутации в точно определенный участок гена. Это
осуществляется с использованием синтетических (полученных химическим
312
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
синтезом) олигонуклеотидов с заданной последовательностью. Метод удобен
тем, что не требует присутствия удобных сайтов рестрикции. В основу метода
положено образование гетеродуплексов между синтетическим олигонуклеотидом, содержащим мутацию, и комплементарной однонитевой ДНК в составе вектора.
Поступают следующим образом. Синтезируют небольшой олигонуклеотид
(8—20 мономеров), комплементарный той части гена, в которой хотят получить мутацию. В составе олигонуклеотида в центральной области допускают
одну или несколько нуклеотидных замен. Клонируют исследуемый ген или
его фрагмент в составе вектора на основе фага М13, чтобы получить кольцевые одноцепочечные рекомбинатные ДНК. Производят смешивание и отжиг
рекомбинантных векторов с олигонуклеотидами. Происходит гибридизация
олигонуклеотида с комплементарной областью, при этом некомплементарные
нуклеотиды остаются неспаренными. Олигонуклеотид выполняет роль праймера в полимеразной реакции с участием ДНК-полимеразы in vitro. Кольцо
замыкают лигазами. Полученная кольцевая молекула вводится в клетки
E.coli, где происходит частичная репарация мутантных участков и репликация. Частота мутаций обычно варьирует от 1 до 50%. Отбор клеток, содержащих мутантные молекулы ДНК, можно производить несколькими способами, среди которых преимущества имеет метод с использованием радиоактивно меченного олигонуклеотида, который применяется для мутагенеза. В
данном случае этот нуклеотид служит зондом. Принцип использования такого
зонда основан на том, что он полностью комплементарен мутантной ДНК и
частично комплементарен ДНК дикого типа. Можно подобрать такие условия
гибридизации (в первую очередь, температуру), что гибридизация меченого
зонда будет стабильной только с мутантной последовательностью ДНК, что
можно выявить на радиоавтографе.
Метод сайт-специфического мутагенеза особенно ценен тем, что позволяет изолировать мутации без контроля их фенотипического проявления. Этот
метод открывает новые возможности исследования функций регуляторных
элементов генов, позволяет изменять «силу» промоторов, оптимизировать
сайты связывания с рибосомами и т. д. Одним из основных применений данной методологии является белковая инженерия.
Белковая инженерия. Этим словосочетанием обозначают комплекс методических приемов, которые позволяют реконструировать молекулу белка
путем направленного введения соответствующих мутаций в структурный ген
(сайт-специфический мутагенез) и, следовательно, желаемых аминокислотных замен в первичную структуру белка.
Показательным примером конструирования более активных белков являются эксперименты Фершта и сотрудников с ферментом тирозил-тРНКсинтетазой из бактерий Bacillus stearothermophilus. Анализ последствий замен аминокислот в активном центре этого фермента позволил заключить, что
удаление групп, образующих с субстратом слабые водородные связи, может
улучшить его сродство к субстрату. При этом обнаружено, что треонин-51
(занимает 51 положение в составе пептида) образует длинную и слабую водородную связь с кислородом кольца рибозы при связывании тирозиладенилата. В то же время обнаружено, что у бактерий E.coli такое же положение за313
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
нимает пролин. Сайт-специфический мутагенез гена, определяющего структуру тирозил-тРНК-синтетазы B.stearothermophilus, позволил обеспечить замену thr-51®pro-51 в пептиде. В результате резко улучшилось связывание
АТР в активном центре фермента, а его каталитическая активность возросла
в 25 раз.
Другим, не менее значимым примером реконструкции белка, имеющим
практическое значение, является модификация субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens, осуществленная Эстеллом и соавторами. Субтилизины представляют собой сериновые протеиназы, секретируемые бациллами во внешнюю
среду. Эти ферменты выпускаются биотехнологической промышленностью в
больших масштабах и широко используются в составе моющих средств. Недостатком субтилизинов является резкое уменьшение протеолитической активности под действием окислителей, в том числе содержащихся в стиральных порошках. Задача реконструкции молекулы субтилизина BPN заключалась в стабилизации его к химическому окислению.
В предварительных экспериментах было установлено, что в присутствии
перекиси водорода субтилизин быстро снижает активность за счет окисления
остатка метионина-222, превращающегося в соответствующий сульфоксид.
Методами сайт-специфического мутагенеза была обеспечена замена этого
остатка метионина на все остальные 19 белковых аминокислот. Плазмиды с
мутантными генами вводили в штаммы с делециями в соответствующих генах и анализировали свойства продуцируемых субтилизинов. Достаточно
стабильными к действию перекиси оказались мутанты с серином и аланином222. Самым активным оказался мутант, содержащий остаток цистеина-222,
его удельная активность на 38% превышала активность штамма дикого типа.
Аналогичным путем удалось повысить активность b-интерферона. В числе других достижений белковой инженерии можно назвать исследования в
выяснении трансформирующей активности онкобелков; изменение термостабильности ферментов, например получение термолабильного ренина и термостабильной a-амилазы; увеличение эффективности связывания инсулина соответствующим рецептором плазматической мембраны за счет замены гистидина на аспартат в положении 10 b-цепи гормона, а также множество других
примеров. Большое количество продуктов белковой инженерии уже нашло
практическое применение в производственных процессах.
21.3. Достижения генетической инженерии в конструировании
штаммов-продуцентов биологически активных веществ
Если изначально методология генетической инженерии разрабатывалась
для исследования основных механизмов экспрессии генов, а также функций
их продуктов, то очень скоро выявились разносторонние прикладные аспекты
ее достижений. В числе самых первых генноинженерных триумфальных экспериментов было получение штаммов бактерий, продуцирующих человеческие белки (инсулин, гормон роста, интерфероны и др.). Можно сказать, что
эти исследования открыли эру широкого использования продуктов генетической инженерии. Поскольку данные эксперименты весьма показательны и
дают возможность осознать практическую значимость большей части опи314
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
санных выше приемов получения и анализа рекомбинантных ДНК, имеет
смысл рассмотреть их в данном разделе.
Получение бактерий-продуцентов человеческого инсулина. Инсулин
представляет собой гормон, секретируемый клетками поджелудочной железы
в кровь и участвующий в углеводном обмене. Процесс синтеза инсулина в
клетках осуществляется в ходе нескольких стадий: вначале на рибосомах образуется препроинсулин, который содержит сигнальный пептид, направляющий пептидную цепь внутрь эндоплазматического ретикулума. Там отщепляется сигнальный пептид и замыкаются дисульфидные мостики —
формируется проинсулин. Последний поступает в аппарат Гольджи и депонируется в клеточных везикулах, где в ходе отщепления С-пептида (33 аминокислотных остатка) образуется зрелый инсулин. Молекулы зрелого инсулина состоят из А- и В-цепей, соединенных дисульфидными мостиками.
Чистый инсулин необходим в большом количестве для лечения диабета.
До недавнего времени гормон приходилось получать дорогостоящим и трудоемким способом из поджелудочной железы животных. Этот инсулин вызывал
ответную реакцию — образование антител. В настоящее время инсулин человека получают с помощью сверхсинтеза бактериями, сконструированными
методами генетической инженерии. Инсулин стал первым коммерческим
генноинженерным продуктом, продуцируемым бактериями, разрешенным к
широкому применению в терапии диабета.
Ген инсулина млекопитающих содержит интрон, поэтому для клонирования нельзя было использовать сам ген, так как бактерии не способны к
сплайсингу. Оставалось две возможности: использовать кДНК, полученную
копированием проинсулиновой мРНК, либо синтезировать кодирующие последовательности химическим путем. На самом деле осуществлены оба эксперимента, при этом клонирование в бактериях проинсулиновой кДНК приводило к образованию предшественника гормона, который не мог превратиться в клетках E.coli в зрелый инсулин, поскольку в них не осуществляется
необходимый специфический посттрансляционный процессинг. Для получения инсулина нужна была дополнительная стадия ферментативного расщепления проинсулина in vitro. В другом, более результативном эксперименте
нуклеотидные последовательности, кодирующие А- и В-цепи инсулина, синтезировали химически. Для этого вначале определили последовательность
аминокислот в А- и В-цепях инсулина и предсказали последовательность
нуклеотидов во фрагментах ДНК на основании генетического кода. Афрагмент содержал 69 пар нуклеотидов: 60 п. н. — кодирующая часть, плюс
стартовый (ATG) и терминирующий (TGA) кодоны. Фрагмент В содержал
96 п. н. (рис. 21.3).
Стартовые метиониновые кодоны вводили в состав фрагментов гена инсулина для того, чтобы можно было отделить цепи инсулина от прокариотических аминокислотных последовательностей (N-участок b-галактозидазы).
315
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 21.3. Схема процесса образования человеческого инсулина бактериями
E.coli. RI — рестриктаза типа I; CnBr — цианогенбромид
Для экспрессии клонированных генов инсулина в клетках кишечной палочки осуществляли встраивание каждого синтезированного фрагмента в
плазмидный вектор под контроль b-галактозидазного промотора Данный регуляторный элемент выбран неслучайно. Уже упоминалось, что эукариотические белки, накапливаясь в клетках прокариот в больших количествах, тормозят их рост в основном из-за токсичности, а также деградируются протеазами. В таких случаях полезным может оказаться выращивание бактериальных клеток до высокой плотности, после чего их индуцируют к синтезу продукта. Известно (глава 3), что лактозный оперон E.coli регулируется по типу
индукции, т. е. инкубирование клеток с рекомбинантными ДНК в отсутствие
индуктора позволяет им быстро достичь необходимой плотности популяции
(инсулиновые гены не транскрибируются), а когда в культуральную жидкость
вносят индуктор (изопропилтиогалактозид), клетки начинают массово синтезировать цепи инсулина.
Итак, компетентные клетки E.coli трансформировали гибридными векто316
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
рами и отбирали потомство на среде с ампициллином (рис. 21.3). В трансформированных бактериях синтезировались предшественники А- и В-цепей
инсулина. С помощью цианогенбромида, разрушающего метионин и с меньшей эффективностью триптофан, от предшественников отщепляли короткий bгалактозидный участок вместе с одним остатком метионина (эти белки не содержат других остатков метионина и триптофана).
После очистки А и В-цепи смешивали в условиях, способствующих образованию прочных бисульфидных связей, в результате чего получался чистый
человеческий инсулин.
Разработка методов генетической инженерии изменила структуру и содержание современной промышленной микробиологии. Во-первых, значительно возросла продуктивность микроорганизмов, используемых для синтеза
биологически активных веществ (сайт-специфический мутагенез в области
регуляторных элементов генов, амплификация генов, введение в геном новых
кодирующих последовательностей и т. п.). Во-вторых, появилась возможность менять питательные потребности продуцентов, придавать им устойчивость к определенным факторам окружающей среды, повышать их конкурентоспособность, скорость роста и др. Наконец, изменилась сама логика промышленной микробиологии: ранее для обнаруженного вновь продуцента какого-либо метаболита создавались методы и средства его биотехнологической
эксплуатации, теперь появилась возможность воспользоваться только геном
или группой генов нового штамма и перенести их в адаптированный для производства соответствующей категории веществ, хорошо изученный микроорганизм.
21.4. Генетическая инженерия на службе медицины
и сельского хозяйства
Разработка методов клонирования и секвенирования ДНК позволила установить структуру геномов различных организмов: многих вирусов и бактерий, дрожжей, нематоды, дрозофилы, а к 2003 г. планируется завершить работу по «прочтению» генома человека. Создалась ситуация, при которой скорость накопления человеком знаний в области молекулярной биологии опережает его умение пользоваться ими. Возникают морально-этические и правовые проблемы, связанные с вопросами клонирования человеческих особей,
получения и использования трансгенных животных, сопоставления и предания огласке сведений из генетических паспортов индивидуумов и т. п. В то
же время стремительными темпами развиваются прикладные сферы генетической инженерии, особенно в области медицины и сельского хозяйства.
Нельзя не остановиться на нескольких, особенно ценных методах генетической инженерии, позволивших открыть новую эру в лечении заболеваний
человека, животных, растений, в выведении новых пород и сортов сельскохозяйственных объектов.
Полимеразная цепная реакция (PCR, или ПЦР). Это метод ферментативной амплификации сегментов ДНК или РНК, позволяющий многократно
воспроизводить интересующий фрагмент ДНК (РНК) без помощи рестриктаз,
векторов или клетки-хозяина. Метод осуществляется in vitro и полностью
317
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
автоматизирован. Для РСR-реакции необходимы: два олигонуклеотидапраймера длиной ~20 нуклеотидов, комплементарных двум участкам на 3ўконцах амплифицируемого фрагмента ДНК (рис. 21.4), набор дезоксинуклеозидтрифосфатов и термостабильная ДНК-полимераза. Праймеры синтезируют химическим способом, выяснив предварительно структуру комплементарных участков, с которыми они должны спариваться. Термостабильный фермент выделяют из термофильных бактерий Thermus aquaticus.
На первой стадии двухнитевую ДНК, выделенную из клеток, нагревают
до 90° С для денатурации (разделение цепей), затем смесь охлаждают, чтобы
произошла гибридизация праймеров с комплементарными участками (отжиг).
Далее устанавливают температуру, при которой происходит полимеризация
цепей (70—75° С, в этом интервале фермент наиболее активен). После этого
все события цикла повторяют, начиная с денатурации ДНК. Процесс осуществляется в термостате-амплифика-торе, работу которого контролирует компьютер.
Рис. 21.4. Схема событий полимеразной цепной реакции
(пояснения в тексте)
318
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Данный циклический процесс повторяют с той же реакционной смесью
20—60-кратно. После третьего цикла амплификации начинают накапливаться двухнитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя
праймерами (рис. 21.4). В каждом последующем цикле количество синтезированных фрагментов удваивается, т. е. за n циклов образуется 2n копий дуплексных сегментов с длиной, ограниченной праймерами.
Практическое применение метода PCR имеет несколько аспектов. Вопервых, с помощью амплификации определенных последовательностей ДНК,
уникальных для определенных геномов или даже целых генов, можно обнаружить данные сегменты даже при условии, что изначально они присутствуют в клетках в очень малых дозах (числе копий). Например, начальные этапы
вирусных инфекций характеризуются низким содержанием нуклеиновых кислот вирусов, но их можно обнаружить с помощью PCR-метода с последующей идентификацией при использовании зондов, комплементарных искомым
последовательностям. Такие методы в настоящее время широко используют
для детекции вирусов кори и краснухи, а также холерного вибриона.
Еще одним приложением метода является диагностирование наследственных заболеваний. Для многих наследственных заболеваний в настоящее
время уже выявлены гены, а также их локусы, мутации в которых приводят к
тяжелым болезням. Поскольку эти мутации передаются в поколениях индивидуумов, для ответа на вопрос — будет ли будущий новорожденный нести
ту или иную мутацию требуется выявить ее у плода (пренатальная диагностика). Для этого приблизительно на 16-й неделе беременности производят отбор
амниотической (околоплодной) жидкости, из которой можно выделить клетки
плода в ходе центрифугирования. Из клеток извлекают ДНК. Получить препаративные количества фрагментов ДНК, предположительно содержащие
мутации, можно двумя путями: клонированием соответствующих фрагментов
или их амплификацией методом PCR. Второй способ гораздо проще и дешевле. После того, как искомый фрагмент ДНК получен в достаточном количестве, можно осуществить его секвенирование и сопоставить нуклеотидные последовательности нормального и анализируемого генов. Существует и более
простой способ выявления мутаций во фрагментах ДНК — блотгибридизация.
Блот-гибридизация (блотинг по Саузерну). Этот метод разработан Саузерном в Эдинбурге. Он основан на способности гомологичных цепей ДНК
гибридизоваться в подходящих условиях. Суть метода состоит в следующем.
Исследуемую ДНК расщепляют рестриктазами на фрагменты, которые разделяют по размеру в ходе электрофореза в агарозном геле. Затем гель помещают на нитроцеллюлозный фильтр и пропускают через него соответствующий
буферный раствор в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. При этом фрагменты ДНК элюируются из геля и связываются с нитроцеллюлозным фильтром, на котором в результате получается реплика геля.
Для поиска нужных фрагментов ДНК на реплике проводят гибридизацию с
меченым зондом, специфичным к искомому гену (фрагменту). Аналогичная
методика используется для анализа РНК.
В основе обнаружения мутаций в генах лежит явление полиморфизма
длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ или RFLP от англ. restriction
319
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
fragment length polimorphism). Оно заключается в том, что последовательность ДНК, содержащая мутацию, может приобретать или, наоборот, утрачивать сайты рестрикции для тех или иных рестриктаз. Это можно обнаружить
при разделении полученных фрагментов электрофорезом и гибридизацией с
радиоактивным зондом. Сопоставление радиоавтографов для нормального и
мутантного генов в этом случае позволяет обнаружить разницу в количестве и
положении «полос» (рис. 21.5).
В качестве примера использования методов PCR и блот-гибриди-зации
для ранней диагностики наследственных заболеваний можно привести пренатальную идентификацию серповидно-клеточной анемии. Причиной этого недуга является мутация в гене, определяющем структуру b-глобиновой цепи
гемоглобина, в результате чего остаток глутамата в 6 положении (кодируется
триплетом GAG) замещается на остаток валина (кодируется триплетом GTG).
Измененный гемоглобин имеет тенденцию кристаллизоваться в эритроцитах,
при этом они становятся менее гибкими, задерживаются в селезенке, и возникает их дефицит в крови. Мутацию легко идентифицировать с помощью
рестрикционных ферментов Dde I и Mst II. Нуклеотидная замена аденилата
на тимидилат в смысловой цепи ДНК, вызывающая серповидно-клеточную
анемию, нарушает структуру сайтов рестрикции для названных ферментов,
которые, однако, остаются не измененными в нормальном гене b-глобина.
Это отличие и выявляется в ходе анализа.
Получают ДНК b-глобинового гена или его фрагмента, который может
содержать данную мутацию, используя метод клонирования или (проще) —
PCR-метод. Расщепляют фрагменты, например, с помощью Dde I и осуществляют блот-гибридизацию с меченной 32Р b-глобиновой ДНК. На радиоавтографе геля для нормальной ДНК выявляются два фрагмента длиной 201 и
175 п. н., а для мутантной ДНК — только один фрагмент размером 376 п. н.
(рис. 21.5).
PCR-метод совместно с блот-гибридизацией используются также в судебно-медицинской практике, в частности для установления отцовства, а также
для идентификации принадлежности биологической пробы тому или иному
лицу. В последнем случае обнаруженные на месте преступления образцы
биологического материала (кровь, слюна, волосы) используются для извлечения ДНК, в которой амплифицируются определенные участки (наиболее вариабельные по структуре). То же проделывают с ДНК, выделенной из крови
подозреваемых лиц. После расщепления амплифицированных фрагментов
рестриктазами и блот-гибридизацией с мечеными зондами получают радиоавтографы гелей. Сопоставление расположения «полос» на радиоавтографах
позволяет ответить на вопрос о принадлежности биологических образцов.
Принцип метода основан на том, что одинаковые фрагменты ДНК, полученной от генетически не идентичных индивидов, часто образуют рестрикционные фрагменты различной длины. Метод достаточно чувствителен, поскольку PCR позволяет получать микрограммы ДНК-копий
320
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Рис. 21.5. Идентификация серповидноклеточного мутантного гена b-глобина
сегмента, даже когда он присутствует в препарате в составе единственной
молекулы.
Возможность идентификации мутаций в генах и умение получать практически любые гены, лишенные мутаций, позволили приблизиться к лечению
наследственных заболеваний. Возникло новое направление на стыке медицины и генетической инженерии — генотерапия, под которой подразумевают
введение нуклеиновых кислот в клетку с целью направленного изменения
генных дефектов или придания клеткам новых функций. Основной подход
генотерапии, реализуемый в настоящее время, состоит в выделении ДНК из
больного организма, осуществлении исправления мутаций (например, в ходе
сайт-специфического мутагенеза), введение исправленной ДНК в организм
больного (метод ex vivo). Первый удачный результат генной терапии человека
получен в США в 1990 г., когда с помощью методологии ex vivo удалось вылечить четырехлетнюю девочку с врожденным иммунодефицитом (мутация в
гене аденозиндезаминазы). Внутривенно больной вводили собственные лимфоциты, трансформированные нормальным геном аденозиндезаминазы, кло321
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
нированном на ретровирусном векторе.
Еще одно приложение генноинженерных методов к медицинским проблемам состоит в производстве вакцин, отличающихся высокой надежностью,
применение которых исключает риск заболеваний (в отличие от вакцин, получаемых традиционными методами — инактивацией возбудителей). Разработаны и широко применяются генноинженерные вакцины против гепатита В
и А — очень опасных заболеваний, приобретающих характер эпидемий. Разрабатываются вакцины против СПИДа.
Основными достижениями генетической инженерии для сельского хозяйства можно считать создание трансгенных животных и растений. Трансгенными считают такие особи животных, растений или микроорганизмов, генетическая программа которых изменена с использованием методов генной инженерии.
Трансгенных животных — коров, свиней, овец, коз — используют для
секреции под промоторами «генов молока» высокоактивных биологических
веществ для медицины и фармакологии. Уже прошли лицензирование и поступили на рынок полученные через трансгенных животных антитрипсин
(для лечения легочных заболеваний), антитромбин III (для предотвращения
инфарктов и инсультов), факторы свертываемости крови, лактоферрин (связывает и транспортирует в организм железо, обладает биоцидными свойствами по отношению к патогенной микрофлоре, регулирует естественный иммунитет, замедляет развитие опухолей). Первый трансгенный бычок, наследующий ген человеческого лактоферрина, получен в Голландии в 1990 г. Теперь стада трансгенных коров с этим геном есть в нескольких странах.
Методы молекулярной диагностики в применении к животным позволяют
выявлять не только гены с «вредными» мутациями, которые обусловливают
наследственные заболевания, но и «полезные» гены, например детерминирующие устойчивость к инфекционным заболеваниям (лейкоз, колибактериоз
и др). Появляется возможность имплантировать эти гены селекционируемым
животным.
Аналогичная ситуация наблюдается в отношении трансгенных растений.
Изолированы гены, кодирующие ферменты деградации некоторых гербицидов. Введение этих генов в растения позволило получить устойчивые к гербицидам сорта. Другим примером является введение в геном растений модифицированных генов прототоксина Bacillus thuringiensis, в результате чего получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку, а также хлопок и кукуруза, устойчивые к вредителям.
Показано, что растения могут производить белки животного происхождения. Например, получены трансгенные растения табака, в которых собираются полностью функциональные моноклональные иммуноглобулины, в частности специфичные к бактериям, вызывающим кариес (перспектива получения
антикариесной зубной пасты). Разработаны подходы, позволяющие получать
бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. В
настоящее время у 120 видов растений существуют трансгенные формы. Разрешено использование трансгенных сои, кукурузы, хлопка, рапса, картофеля,
томатов, свеклы, тыквы, табака, льна. Эти растения выращивают в 11 странах мира. С их использованием, кроме перечисленных выше, решены такие
322
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
проблемы, как устойчивость к вирусным, грибковым и бактериальным заболеваниям, регуляция сроков созревания, повышение общей продуктивности,
продукция съедобных вакцин.
Перечисленные достижения, связанные с внедрением методов генетической инженерии в медицину и сельское хозяйство, получены за очень короткий срок, в основном в ходе последнего десятилетия. При этом ни научная, ни
широкая общественность не успела осознать всех последствий масштабного
внедрения подобных разработок в практику. Никто в настоящее время не способен гарантированно предсказать ни полную безвредность, ни безусловный
вред от использования в пищу продуктов, полученных из генетически модифицированных организмов, от возделывания в неконтролируемых условиях
(на естественных полях) трансгенных растений, от последствий генотерапии
и т. п. Поэтому в странах, где проводятся подобные работы, существует система государственного контроля за генноинженерной деятельностью, передачей и использованием генетически модифицированных растений и животных.
В большинстве государств приняты и действуют соответствующие законы,
правительственные нормативные акты, строго регламентирующие требования
к подобного рода исследованиям, порядок и ответственность научных организаций и государственных органов за безопасность при создании, выпуске в
окружающую среду и использовании трансгенных животных и растений. Это
становится особенно актуальным в связи с прогнозами специалистов, согласно которым в ближайшие годы на мировом рынке более 20 % объема всей
экспортно-импортной продукции составят товары и продукты, полученные с
помощью методов современной биотехнологии и биоинженерии.
323
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)