/
Author: Шерякова А.А.
Tags: фармация аптечное дело фармакология токсикология фармакопея
ISBN: 978-985-6967-17-0
Year: 2012
Similar
Text
... v ..........y ......... : ... .............-J-........... ..-,.. ....-.. = - .. ............ .._ .......""' ..... ....-J.. :...,...o" """"" J \.../......J \... .--=. .... ....... """"'. ........-..:. K..... .......... . .Jr ""'........ . .....,. ....... ..., ..././ - , ......... ;:: ..r -.. -----' '---' ....... / --------' ............... ..::.................J .......:. '-......./ ..... '"" ...... J \. ......J ... .:t...
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Республиканское унитарное предприятие «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении» rОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Разработана на основе Европейской Фармакопеи (rФ. РБ 11) в двух томах Том 1 Общие методы контроля качества лекарственных средств Введено в действие с 1 января 2013 аода приказом Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 25.04.2012 аода NQ 453 Молодечно . Типоrрафия «Победа» 2012
УДК 615.11 (476)(083.7) ББК 52.8(4Беи) 172 Под общей редакцией А. А. Шерякова r 72 rосударственная фармакопея Республики Беларусь. (rФ. РБ 11): Разработана на основе Европейской фармакопеи. В 2 т. Т. 1. Общие методы контроля лекарственных средств 1 Mвo здравоохр. Респ. Беларусь, УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении" ; под общ. ред. А. А. Шерякова. Молодечно: Тип. «Победа". 2012. 1220 с. ISBN 9789856967 17 o Первый том BToporo издания содержит обязательные стандарты и положения. реrламентмрующие качество лекарственных средств и субстанций для фармацевтическоrо использования: общие статьи на методы анализа (физические, физикохимические, биолоrические и фармакоrностические методы, определение подлинНOCТ1I, определение примесей, количественное определение, фармацевтикотехнолоrические испытания), контейнеры, реакrивы, общие тексты (по микробиолоrии, по биолоrическим продуктам, общие статьи и таблицы физических характеристик). ЭICCТeIIпоральные лекарственные средства, общие статьи, дозированные лекарственные формы, rомеопатические лекарственные средства. Книrа предназначена для специалистов, занимающихся разработкой, производством. контролем качества, хранением и реализацией лекарственных средств. УДК 615.11(476)(083.7) ББК 52.(4Беи) ISBN 978985б9б7 17-0 (Т.1.) 978985б9б7 194 @ УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении.», 2012 @Оформление УП ..Типоrpафия «Победа», 2012
3 СОДЕРЖАНИЕ Введен ие ................. ....... ................................................ ............ ...................................... 15 1. Общие сведения ....... .... ................... ........................ .... ....... ........... ......... .............. 17 2. Методы анализа ............... ..... ..................... ............. ........... ... ............... ................. ЗЗ 2.1 Оборудование ... ....... ................................ .............. ....... ........ ................. ......... ................... ............. ... 33 2.1.1. Каплемер ................................................................................................................................ 33 2.1.2. Сравнительная таблица пористости стеклянных фИfiЬТрОВ ............................................... 33 2.1.3. Лампы с ультрафиолетовым излучением для аналитических целей................................. 34 2.1.4. Сита ............. ..... ........... ... .............. ...... ...... ........ ...... ...... ........ ........ ..... ...................... ....... ......... з4 2.1.5. Пробирки для сравнительных испытаний ............................................................................ 35 2.1.6. Индикаторные трубки...... ..... ............................................................... ................................... 35 2.2. Физические и физ-икохимические методы ....................................................................................... 36 2.2.1. Определение прозрачности и степени мутности жидкостей .............................................. 36 2.2.2. Определение степени окрашивания жидкостей .................................................................. 39 2.2.3. Потенциометрическое определение рН ............................................................................... 41 2.2.4. Зависимость между реакцией раствора, приблизительным значением рН и цветом индикаторов....... ................ ......... ............................................................................ 43 2.2.5. Относительная плотность .. ....... .... ...... .... ... ................................... ............................. ........... 45 2.2.6. Показатель преломления (индекс рефракции).................................................................... 47 2.2.7. Оптическое вращение... ... ... ..... ...... ........ ... ................ ......... ....... ......... ............ ........ ....... .......... 47 2.2.8. Вязкость ....... ..... ................... ........ ..... .... ..... .......................... ........ ..... ...... ........ ........... ..... ........ 48 2.2.9. Метод капиллярной вискозиметрии........... ....................................................... .................... 49 2.2.10. Метод ротационной вискозиметрии ...................................................................................... 51 2.2.11. Температурные пределы переroнки ................................................................................ ..... 53 2.2.12. Температура кипения........... .................................................................................................. 54 2.2.13. Определение воды методом отrонки .................................................................................... 54 2.2.14. Температура плавления капиллярный метод ................................................................. 55 2.2.15. Температура плавления открытый капиллярный метод ................................................ 56 2.2.16. Температура плавления метод MrHoBeHHoro плавления ................................................ 56 2.2.17 . Температура каплепадения. ..................... ............................................................................. 57 2.2.18. Температура затвердевания .......................... ............................................ ..... ...................... 59 2.2.19. Амперометрическое титрование.............................. ............................................................. 60 2.2.20. Потенциометрическое титрование.................... ................................................................... 60 2.2.21. флуориметpI4я................................................................................................................... ...... 62 2.2 .22. Атомноэмиссионная спектрометрия................................. ................................................. 62 2.2.23. Атомноабсорбционная спектрометрия.................................... ............................................ 64 2.2.24. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной области.......................................... 67 2.2.25. Абсорбционная спектрофотометр.ия в ультрафиолетовой и видимой областях .................................................................................................. ... .......... 70 2.2.26. Бумажная хроматоrрафия ..................................................... ................................................ 76 2.2.27 . Тонкослойная хроматоrрафия.. ............. ................................................................................ 77 2.2.28. rазовая хроматоrрафия ................................... ........ .................... ......................... ................. 80 2.2.29. Жидкостная хроматоrрафия................:....................................................................... .......... 82 2.2.30. Эксклюзионная хроматоrрафия ........................ ..................... ....................... ..--.................... 84 2.2.31. Электрофорез.................................................................................................. --..................... 85 2.2.32. Потеря в массе при высушивании ........................................................................................ 92 2.2.33. Спектрометрия ядерноro маrнитноro резонанса ............................................................... 93 2 .2.34. Термический анализ.................................. .......................................... ................... ................ 98 2.2.35. Осмоляльность ..... ... ..... ................................... .......................... ......................................... 101 2.2.36. Потенциометрическое определение концентрации ионов с использованием ионоселективных электродов . ........................................................... 103 2.2.37. Рентrенофлуоресцентная спектрометрия..................... ......................................... .... ........ 104 2.2.38. Электропроводность................................................ ....... .................................................... 105 2.2.39. Молекулярномассовое распределение дeKcтpaHOВ.......................................... ............ 106 2.2.40. Спектрофотометрия ближнеro инфракрасноrо диanaзoнa.................__........................... 109 2.2.41. Круroвой дихроизм ... .... ....._.. . ........................................................... ................. ...... .... ........ 115
4 rосударственная фармакопея Республики Беларусь 2.2.42. Плотность твердых тел ......................... ................................ ....... ............. ...................... ..... 116 2.2.43. МассспеКТрометрия .. .......... ............................ ..... ............ ..... .... .............. ....... ........ ............. 117 2.2.44. Определение содержания общеro орrаническоro уrлерода в воде для фармацевтическоro применения ..................................................................... 121 2.2.45. Сверхкритическая флюидная хроматоrрафия........ ....... .............................. ... ......... .......... 123 2.2.46. Хроматоrрафические методы разделения ......................................................................... 123 2.2.4 7. Капиллярный элекТрофорез........ ..... .................... ... ........ ..... .............................. ................. 132 2.2.48. Рамановская спектрометрия ..... .... ........... ............ ............. .... ......... ................................. .... 140 2.2.49. Измерение вязкости на вискозиметре с падающим шариком.......................................... 142 2.2.54. Изоэлектрическое фокусирование................................ ............. ............................. ........... 142 2.2.55. Пептидное картирование... .......................................................................... ........................ 145 2.2.56. Анализ аминокислот .............................................................................................. .......... .... 150 2.2.57. Атомноэмиссионная спектрометрия с использованием индуктивно связанной плазмы ...... ................................. ... ........... ......... ....... ... ............. ........................... 161 2.2.58. Массспектрометрия с использованием индуктивно связанной плазмы .... ....................... ...... ........... ............. ............. .......... ............ 164 2.2.59. Анализ rликанов в rликопротеинах ......:... .................... ................................................... .... 166 2.2.60. Температура плавления инструментальный метод...................................................... 174 2.3. Подлинность (идентификация).. ... ...... ....... ......................... .... .... ........ ....... .............. ......... ............... 175 2.3.1. Реакции подлинности (идентификации) на ионы и функциональные rруппы................. 175 2.3.2. Идентификация жирных масел методом тонкослойной хроматоrрафии ........................ 181 2.3.3. Идентификация фенотиазинов методом тонкослойной хроматоrрафии ........................ 182 2.3.4. Определение запаха .............. ................ ..... .............. ................. ..... .... ..... ................. ........... 182 2.4. Испытания на предельное содержание примесей......................................................................... 183 2.4.1. Аммония соли ....... ............. ............. .............. ......... ................ ....... ................ ..... ...... ............. 183 2.4.2. Мышьяк..... ...... ..... ...... ............... .......... ......... ......... ...... ...... ........... .............. ......... .... .... .... ...... 183 2.4.3. Кальций.... ......... ............. .......... ....... ... ......... ............................. ................... .......................... 184 2.4.4. хлориды................................................................................................ ................................ 185 2.4.5. Фториды ................................... ............................................................................................. 185 2.4.6. Маrний......................................................................................................................... .......... 185 2.4.7. Маrний и щелочноземельные металлы.............................................................................. 186 2.4.8. Тяжелые металлы ................................................................................................................ 186 2.4.9. Железо .................. ........ ......................... ...... ........... ................ ..... .... ....... ... .... ................... .... 191 2.4.10. Свинец в сахарах ................................................................................................................. 191 2.4.11. Фосфаты ..... ....... ...... ....................... .... ..... ........... ........ ..................... ...... ............................... 191 2.4.12. Калий.... ........... ............ ....... .... ...... ...... ....... ............ .... ................... ....... ....... ............... ........ .... 191 2.4.13. Сульфаты.... ......... .......... ........ .... ......................... ..... ..................... ...... ................... ............... 192 2.4.14. Сульфатная зола..... ....... ........... .... ............ .... ............. ........ .... ..... ............................ ............. 192 2.4.15. Никель в полиолах ............................................................................................................... 192 2.4.16. Общая зола. ......... .... ........... ................ ......... ......... .......... ..... ..................... ....... ...... ............... 192 2.4.17. Алюминий.. .... ....... ...... ...... .... ....... ...... ....... ................ ............ ....... ................. ........................ 193 2.4.18. Свободный формальдеrид .................................................................................................. 193 2.4.19. Щелочные при меси в жирных маслах .. .............................................................................. 194 2.4.21. Посторонние масла в жирных маслах методом тонкослойной хроматоrрафии ............. 194 2.4.22. Посторонние жирные кислоты в маслах методом rазовой хроматоrрафии ................... 195 2.4.23. Стерины в жирных маслах .................................................................................................. 197 2.4.24. Идентификация и контроль содержания остаточных растворителей ............................ 200 2.4.25. Остаточные количества этиленоксида идиоксана............................................................ 204 2.4.26. N,пдиметиланилин............... ........... ........... ..... ........... ... ...... ........... ............................ ......... 207 2.4.27. Тяжелые металлы в лекарственном растительном сырье и жирных маслах ................. 208 2.4.28. 2Этилrексановая кислота...................... ...... ................... ..... ................................... ............ 209 2.4.29. Состав жирных кислот в маслах, обоrащенных OMera3 кислотами ................................ 210 2.4.30. Этиленrликоль и диэтиленrликоль в этоксилированных субстанциях ............................ 212 2.4.31. Никель в rидроrенизированных растительных маслах ..................................................... 213 в
5 2.4.З2. Общий холестерин в маслах, обоraщенных OMera3 кислотами ...................................... 213 2.5. Методы количественноro определения ........... ....... ........ ........................... ... .... ......... ... .................. 215 2.5.1. Кислотное число........... ........ .... ...... ...... ... ...... .... ............................................ ...... ....... .... ...... 215 2.5.2. Эфирное число.............. ....... .... ..... ...... ....... ... ............................. ...:....... ............. ..... ............. 215 2.5.3. rидроксильное число.............. ....... ....... ....... ........................................ ................ .......... ...... 215 2.5.4. Йодное число....... ....... ....................... ... ..... ........ ................................. .... ............. ................. 216 2.5.5. Перекисное (пероксидное) число ....................................................................................... 217 2.5.6. Число омыления....................... ....... .... ......... ...... .......................... ......... .... ....... ........ ..... ....... 218 2.5.7. Неомыляемые вещества ...........................:......................................................................... 219 2.5.8. Определение аминноro азота в соединениях, которые содержат первичную ароматическую аминоrруппу .... ........ ............. ........................................ ........... ......... .......... 219 2.5.9. Определение азота после минерализации серной кислотой ........................................... 220 2.5.10. Метод сжиrания в колбе с кислородом............................................................................... 220 2.5.11. Комплексометрическое титрование..... ............... .......................... ... .... ............ .... ............... 221 2.5.12. Вода: полумикрометод .. ...... ..... .... ........ ....... .... ......... ................ ............ ........... ......... .... ....... 222 2.5.1 З. Алюминий в адсорбированных вакцинах ........................................................................... 224 2.5.14. Кальций в адсорбированных вакцинах .............................................................................. 224 2.5.15. Фенол в иммуносыворотках и вакцинах ............................................................................. 224 2.5.16. Белок в полисахаридных вакцинах..................................................................................... 224 2.5.17. Нуклеиновые кислоты в полисахаридных вакцинах.......................................................... 225 2.5.18. Фосфор в полисахаридных вакцинах ................................................................................. 225 2.5.19. Оацетил в полисахаридных вакцинах ............................................................................... 226 2.5.20. rексозамины в полисахаридных вакцинах......................................................................... 226 2.5.21. Метилпентозы в полисахаридных вакцинах ...................................................................... 227 2.5.22. Уроновые кислоты в полисахаридных Вакцинах................................................................ 227 2.5.23. Сиаловая кислота в полисахаридных вакцинах ................................................................ 228 2.5.24. Уrлерода диоксид в rазах .................................................................................................... 228 2.5.25. Уrлерода монооксид в rазах ................................................................................................ 229 2.5.26. Азота монооксид и азота диоксид в rазах .......................................................................... 230 2.5.27. Кислород в rазах ..... ......... ................. ................ ............. .................... ........ ....... ................... 2З 1 2.5.28. Вода в rазах ....... ................... ......... .... ...... ... ....... ..... ..... ..... ... ..... ............ .... ...... ... ................... 231 2.5.29. Серы диоксид ............................................... ..... .......... ............... ...... ........................ ............ 231 2.5.30. Окисляющие вещества ................................................................................................ ... ..... 232 2.5.31. Рибоза в полисахаридных вакцинах................................................................................... 232 2.5.З2. Вода: микроопределение................ ...... ................... ............. ... ..................... ...... ..... ...... ...... 2ЗЗ 2.5.33. Общий белок... .... .............................. ... .... ... ....... ....... ....... ........ .... ........ ... ...... .... ....... ............. 23З 2.5.34. Уксусная кислота в синтетических пептидах...................................................................... 239 2.5.35. Азота закись в rазах ...................................................... . ...................................................... 2З9 2.5.36. Анизидиновое число ............................. ..... ................. ...... .......... ...... ... ................... ....... ...... 240 2.5.37. Метил, этил и изопропилметансульфонат в метансульфоновой кислоте..................... 240 2.5.38. Метил, этил и изопропилметансульфонат в фармацевтических субстанциях .... ...... ...... ......... ........ ......... ....................... ......... ... ........ 241 2.5.39. Метансульфонилхлорид в метансульфоновой кислоте.................................................... 243 #2.5.50. Титрование в неводных растворителях............................................................................ 244 2.6. Биолоrические испытания ........ .......... ....... .... .......... ..... .......... ... ....... ... ...... ..................... ................. 252 2.6.1. Стерильность....... ................. ...... .......... .... ......................... ... .......... ................. ................. .... 252 2.6.2. Микобактерии .. ........ ...... ........... .......................... ......... .......... ................. ............ .................. 257 2.6.7. Микоплазмы... ...... ... .... .......... ....... ...... .... ....... ............... ... ....... ....................... ...... ........ ..... ..... 257 2.6.8. Пироrенность. ... ........ ......... .... ........ ........ ............ ........ .......... ............ ... .......... ..... ................... 265 2.6.9. Аномальная токсичность... _.. .................................... ..... ...... ...... ....................... ................... 266 2.6.10. rистамин .................. ................................................... ....... ..... ................ .............................. 267 2.6.11. Депрессорные вещества ......................................._............................................................. 268 2.6.12. Микробиолоrические испытания нестерильной продукции: общее количество жизнеспособных аэробов .................................................................... 269 2. Зак 1712
6 rосударственная фармакопея Республики Беларусь 2.6.13. Микробиолоrические испытания нестерильной продукции: испытания на наличие специф';ческих микроорrаНизмов................................................ 276 2.6.14. Бактериальные эндотоксины .................. .... ...... ..................... ................................. ............. 288 2.6.15. Активатор прекалликреина................................................................ .................................. 294 2.6.16. Испытания на посторонние areHTbI в вирусных вакцинах для медицинскою применения............................ ............................................................. ....... ........................... 295 2.6.17. Испытание на антикомплементарную активность иммуноrлобулина.............................. 298 2.6.18. Испытание живых вирусных вакцин на . нейровирулентность.......................................... 301 2.6.19. Испытание пероральной вакцины полиомиелита на нейровирулентность..................... 301 2.6.20. АнтиА и антиВ rемаrrлютинины (непрямой метод) ......................................................... 303 2.6.21. Методы амплификации нуклеиновых кислот ..................................................................... 303 2.6.22. Активированные факторы свертывания крови .................................................................. 311 2.6.26. Испытание на антиD антитела в иммуноrлобулине человека для внутривенноro введения .................. ................. .... .............................. ............. ....... ...... 311 2.6.27. Микробиолоrический контроль клеточных продуктов ....................................................... 312 2.6.30. Испытание на активацию моноцитоВ.................................................................................. 314 2.6.31. Микробиолоrические испытания лекарственных средств растительною происхождения для внутреннеro применения . .................................................................. 323 2.7. Биолоrические методы количественноro определения ........................................................ ......... 325 2.7.1. Иммунохимические методы ............................................ ...... .................................. ............. 325 2.7.2. Количественное определение антибиотиков микробиолоrическим методом ................. 327 2.7.4. Количественное определение фактора свертывания крови V,l,...................................... 342 2.7.5. Количественное определение rепарина............................ .......... ..... ........................ .......... 344 2.7.6. Количестенное определение адсорбированной дифтерийной вакцины ......................... 346 2.7.7. Количественное определение вакцины . коклюша............................................................. 353 2.7.8. Количественное определение адсорбированной столбнячной вакцины......................... 354 2.7.9. Определение функциональною состояния Fсфраrмента иммуноrлобулина ................ 361 2.7.10. Количественное определение фактора свертывания крови человека Vll....................... 363 2.7.11. Количественное определение фактора свертывания крови человека IХ........................ 364 2.7.12. Количественное определение rепарина в концентратах факторов свертывания крови........ .......... .................. ........ ................. ......................... .................... ..... З65 2.7.13. Количественное определение антиDиммуноrлобулина человека................................. 366 2.7.14. Количественное определение антиrенной (иммуноrенной) активности вакцины rепатита А................ ............................................... ...... ............ .......... З69 2.7.15. Количественное определение вакцины rепатита В (рДНК) .............................................. 370 2.7.16. Количественное определение вакцины коклюша (бесклеточной).................................... 371 2.7.17. Количественное определение аНТИТР9мбина 111 человека................................................ 372 2.7.18. Количественное определение фактора свертывания крови 11 человека ......................... 373 2.7.19. Количественное определение фактора свертывания крови Х человека......................... 374 2.7.20. Количественное определение инактивированной вакцины полиомиелита iп vivo ....,.... 375 2.7.21. Количественное определение фактора ВИ{lебранда человека ........................................ 376 2.7.22. Количественное определение фактора свертывания крови ХI человека........................ 378 2.7.23. Подсчет клеток СО34/СО45+ в rемопоэтических продуктах ............................................. З79 2.7.24. Проточная цитометрия.................................... ................................................ .... .., .... .......... 381 2.7.25. Определение содержания инrибитора плазмина человека.............................................. 384 2.7.27. Значение флоккуляции (Lf) токсинов и анатоксинов дифтерии и столбняка (проба рамона) ................................................................................................ 385 2.7.28. Определение количества rемопоэтических клетокпредшественниц человека по колониеобразующим клеткам.................................................................... ..................... 386 2.7.29. Определение количества и жизнеспособности ядросодержащих клеток..................................................... ................................................. 388 2.7.30. Количественное определение человеческоro белка С..................................................... 391 2.7.31. Количественное определение человеческоro белка S...................................................... 392 2.7.32. Количественное определение инrибитора а1протеиназы человека ............................. 393
7 #2.7.50. Определение биолоrической активности инсулина......................................................... 394 2.8. Методы фармакоrнозии ................ ....... ............... ........................ .............. ......................... ............... 396 2.8.1. Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте...................................................... 396 2.8.2. Примеси ........ ........ .................... .......................... ......... .............. ............... .... ........................ 396 2.8.3. Устьичный коэффициент........ ..... ............... ... ....... ................. ....................... ....................... 397 2.8.4. Коэффициент набухания ....... ................... ... ........... ................ ................ ....... ...................... 397 2.8.5. Определение воды в эфирных маслах............................................................................... 397 2.8.6. Посторонние эфиры в эфирных маслах ............................................................................ 398 2.8.7. Жирные и минеральные масла в эфирных маслах .......................................................... 398 2.8.8. Запах и вкус эфирных масел............................................................................................... 398 2.8.9. Остаток после выпаривания эфирною масла ................................................................... 398 2.8.10. Растворимость эфирных масел в спирте ......................................................................... . 398 2.8.11. Определение 1 ,8цинеола в эфирных маслах................................................................... 399 2.8.12. Определение эфирноrо масла в лекарственном растительном сырье........................... 399 2.8.13. Остаточное количество пестицидов ................................................................................... 403 2.8.14. Определение дубильных веществ .:.................................................................................... 405 2.8.15. Определение показателя roречи......................................................................................... 405 2.8.16. Сухой остаток экстрактов .................................................................................................... 406 2.8.17. Потеря в массе при высушивании экстракта ..................................................................... 406 2.8.18. Определение афлатоксина В 1 в лекарственном растительном сырье............................ 407 2.8.20. Лекарственное растительное сырье: отбор проб.............................................................. 409 2.8.22. Определение охратоксина а в лекарственном растительном сырье............................... 410 2.8.23. #Макроскопический и# микроскопический анализ лекарственноro растительноrо сырья.. ....... ..... ... ...... ................................ ...... ........ ........ ........... ........ ........ .... 412 2.9. фармацевтикоТехнолоrические испытания ........................... ........................................................ 417 2.9.1. Распадаемость таблеток и капсул ...................................................................................... 417 2.9.2. Распадаемость суппозиториев и пессариев...................................................................... 419 2.9.3. Тест «Растворение» для твердых дозированных форм.................................................... 420 2.9.4. Тест «Растворение» для трансдермальных пластырей .................. ................................ 428 2.9.5. Однородность массы для единицы дозированноro лекарственноrо средства ............... 430 2.9.6. Однородность содержания действующеro вещества в единице дозированноro лекарственноro средства......................................................... 431 2.9.7. Прочность таблеток без оболочки на истирание ...............................................................432 2.9.8. Прочность таблеток на сжатие ............................................................................................ 433 2.9.9. Измерение консистенции методом пенетрометрии........................................................... 433 2.9.10. Содержание эта нола . ....... ...... ...... ......... .............. .......... ......... ......... ....... .......... ... ... .............. 435 2.9.11. Испытание на содержание метанола и 2пропанола ........................................................ 438 2.9.12. Ситовой анализ...... ........ .................. ........................ ....... ......... ..... ....... .......................... ...... 440 2.9.14. Удельная площадь поверхности ....................................................................................... . 441 2.9.16. Сыпучесть. ............... ....... ........ ................. ...... .......... ..... ........... ....... ........... .... ......... .............. 443 2.9.17. Определение извлекаемоro объема парентеральных лекарственных средств ..... . 444 2.9.18. Лекарственные средства для инrаляций: аэродинамическое испытание мелких частиц ................................................................................___............ ..... 445 2.9.19. Заrрязнение механическими включениями: невидимые частицы.................................... 459 2.9.20. Заrрязнение механическими включениями: видимые частицы..................__.................... 462 2.9.22. Определение времени размяrчения липофильных суппозиторИеВ................................. 469 2.9.23. Определение плотности твердых частиц при помощи rазовоro ПИlCНOМетра .................. 470 2.9.25. Высвобождение действующею вещества из лекарственных жевательных резинок ..... 471 2.9.26. Определение удельной площади поверхности методом raэoвoй адсорбции .................473 2.9.27. Однородность массы одной дозы, высвобожденной из мноroдозовоro контейнера.. ...... ......... ............... .......................................................... .... 477 2.9.29. Характеристическое растворение ...... ........ ...... ...................................................... ............ 477 2.9.31. Определение размера частиц методом дифракции лазерною излучения ..................... 479 2.9.32. Пористость и определение размера пер с ИСПОЛЬЗОванием ртутной порозиметрии...... 484
8 rосударственная фармакопея Республики Беларусь 2.9.33. Определение параметров KPl-1сталлических и частично кристаллических твердых веществ при помощи .L'.ифракции рентrеновскоro излучения на порошКе........ 487 2.9.34. Насыпная плотность и плотность после усадки ................................................................ 494 2.9.35. Степень измельчения порошков ...... .... .......... ................. ................ ...... ...................... ........ 497 2.9.36. Текучесть порошков ............ .......... ....... .......................... ........ .... ....... ........ ..... ...................... 497 2.9.37. Оптическая микроскопия.... ......... ...... ................ ....... ..................... ...................................... 501 2.9.38. Определение размера частиц методом аналитическоro просеивания............................ 504 2.9.40. Однородность дозированных единиц. ....... .............. .......................... .......................... ....... 508 2.9.41. Истираемость rранул и сфероидов .................................................................................... 512 2.9.42. Тест «Растворение» для липофильных твердых дозированных форм ........................... 513 2.9.43. Наблюдаемое растворение...... ........ ...... ....... ................. .... .... ............. ....... ............ ..... ........ 515 2.9.44. Лекарственные средства для распыления: характеристика ............................................ 515 2.9.45. Смачиваемость пористых твердых материалов, включая порошки ................................ 520 з. Контейнеры.. .... ................. .... ...... .... ....... ...... .......... .......................................... .... 525 3.1. Материалы, используемые для производства контейнеров......................................................... 525 3.1.1. Материалы, используемые для производства контейнеров для человеческой крови и компонентов крови......... ................ .... ........ ..... ....... ........... .............. ................. ....... 525 3.1.1.1. Материалы на основе пластифицированноrо поливинилхлорида, используемые для производства контейнеров для человеческой крови и ее компонентов... ................................................ .................. ........... ......... 525 3.1.1.2. Материалы на основе пластифицированноro поливинилхлорида для трубок, используемых в комплектах для переливания крови и компонентов крови ................ ............. .... ............ ........ ............. ..... ............ 530 3.1.3. Полиолефины ........ ................... ....... ....... ............... ............ ...................................... ..... ........ 533 3.1.4. Полиэтилен без добавок для контейнеров для парентеральных и офтальмолоrических лекарственных средств ................................................................ 538 3.1.5. Полиэтилен с добавками для контейнеров для парентеральных и офтальмолоrических лекарственных средств ................................................................ 538 3.1.6. Полипропилен для контейнеров и укупорочных материалов для парентеральных и офтальмолоrических лекарственных средств ............................ 545 3.1.7. Полиэтиленвинилацетат для контейнеров и трубок для лекарственных средств для парентеральноro питания ............................................. 550 3.1.8. Силиконовое масло, используемое в качестве смазывающей добавки......................................................................... ......................................................... 553 3.1.9. Силиконовый эластомер для укупорочных средств и трубок........................................... 554 3.1.10. Материалы на основе непластифицированноro поливинилхлорида для контейнеров для неинъекционных водных растВоров............................................... 556 3.1.11. Материалы на основе непластифицированноrо поливинилхлорида для контейнеров для твердых лекарственных форм для пероральноro применения... 559 3.1.13. Добавки к пластмассе .......................................................................................................... 561 3.1.14. Материалы на основе пластифицировэнноro поливинилхлорида для контейнеров для водных растворов для внутривенноro применения ...................... 565 3.1.15. Полиэтилентерефталат для контейнеров для лекарственных средств для непарентеральноro применения.................... ............. ................................................. 568 3.2. Контейнеры. ............................................................................................................................... ....... 571 3.2.1. Стеклянные контейнеры для фармацевтическоro использования .................................. 571 3.2.2. Пластмассовые контейнеры и укупорочные средства для фармацевтическоro использования ........ .............................................................................................................. 579 3.2.2.1. Пластмассовые контейнеры для водных растворов для инфузий .................... 580 3.2.3. Стерильные пластмассовые контейнеры для человеческой крови и ее компонентов.. 581 3.2.4. Пустые стерильные контейнеры из пластифицированноro поливинилхлорида для человеческой крови и ее компонентов ........................................................................ 584 3.2.5. Стерильные контейнеры из пластифицированноro поливинилхлорида
9 для человеческой крови, содержащие раствор антикоаryлянта ...................................... 585 3.2.6. Комплекты для переливания крови и компонентов крови ...........................................0.... 586 3.2.8. Стерильные одноразовые пластмассовые шприцы.......................................................... 588 3.2.9. Резиновые укупорочные средства для контейнеров, предназначенных для водных лекарственных средств для парентеральноro применения, порошков и лиофилизированных порошков....... ........... .................. ............... ......... ....... .......... ........... 590 4. Реактивы .................... ..... ......................................................'.' ........ ..................... 593 4.1. Реактивы, эталонные растворы, буферные растворы ...............................................................0.. 593 4.1.1. Реактивы ...... ......... ............... ....... .................. ............ "о." ..................... .................. ........... .... 594 4.1.2. Эталонные растворы для испытаний на предельное содержание примесей ...............0. 737 .4.1.3. Буферные растворы....................................................................о........................................ 743 4.2. Реактивы, титрованные растворы для объемноro анализ8.........................................................0 750 4.2.1. Исходные стандартные вещества для титрованных растворов....................................... 750 4.2.2. Титрованные растворы........... .......0...:..0...................... ............... ..0.....00............................ о" 751 5. Общие тексты ....................................... ............................ ............................ ....... 761 5.1. Общие тексты по микробиолоrии................................................................00.....00.0......................... 761 5.1.1. Методы приroтовления стерильных продуктов......................................о.........о................. 761 5.1.2. Биолоrические индикаторы стерилизации .....................................0.....0..0.......................... 764 5.1.3. Эффективность антимикробных консервантов ............................0..0....0.........000................ 766 5.1.4. Микробиолоrическая чистота нестерильных лекарственных средств и фармацевтических субстанций.......... ............ ....... ..........000...0..00........................ 768 5.1.5. Применение fo концепции при стерилизации паром водных растворов...................... .......... "0" ....... ......................................... ........o......o.o............... ..."" 770 5.1.6. Альтернативные методы контроля микробиолоrической чистоты 000.0...0..00...................... 771 5.1.7. Вирусная безопасность..............................................................................0..0000.............. ..... 789 5.1.8. Микробиолоrическая чистота лекарственных средств растителыюro происхождения для внутреннеro применения ...........................0.................00.................... 789 5.1.9. Руководство по применению испытания на стерильность ....0...................0...................0.. 791 5.1.10. Руководство по применению испытания на бактериальные ЭНДОТOI<сины ...................... 792 5.2. Общие тексты по биолоrическим продуктам.........................................о..........оооо......................... 796 5.2.1. Общепринятая терминолоrия в статьях на биолоrические продукты...о.......................... 796 5.2.2. Стаи кур, не имеющих конкретных патоrенов и используемых для производства и контроля качества вакцин.....................................оо.оо........................ 798 5.2.3. Клеткипродуценты для производства вакцин для медицинскoro применения .............. 802 5.2.8. Снижение риска передачи возбудителей rубчатой энцефалопатии животных при применении медицинских лекарственных средств .....00........0..0.............0................... 807 5.3. Статистический анализ результатов биолоrических испытаний и тестов....о............................... 825 #5.3.1. Статистический анализ результатов химическоro экспериМентаоо.о...о...о.о....................... 868 #5.3.2. Валидация аналитических методик и испытаний ..............0.0.0..........0................................ 895 5.4. Остаточные количества орrанических растворителей .........0.......0.000...........000.............................. 908 5.5 Алкоroлеметрические таблицы......... ........... .......................... ...... ...... ....... .0. .............................. ..... 918 5.6. Количественное определение интерферонов................... ........ .... ...... .................................. ..... .... 934 5.7. Таблица физических характеристик радионуклидов, упоминаемых в Фармакопее ................... 937 5.9. Полиморфизм .......... ........... .................. ...0........................ ........ ........0................................ ............... 943 5.10. Контроль примесей в субстанциях для фармацевтическоro использования.............................. 944 5.11. Раздел «Описание (свойства)>> в частных статьях ........................................................................ 949 5.12. Стандартные образllы.... .................................................. ......... ......... ..... ...... ........ ........................... 950 5.14. Лекарственные средства для rенной терапии для медицинскоro применения....................о...... 955 5.15. функциональнообусловленные характеристики вспомоrательных веществ.............................. 976 З.3ак.I712
1 О rосударственная фармакопея Республики Беларусь 5.16. Кристалличность.... ............ ........... ..... ...... ...... ..................................... ... ...... ....... .......... ...... '" .......... 980 5.17. Рекомендации по проведению испыта--lИЙ дозированных лекарственных средств.................... 982 5.17.1. Рекомендации по проведению теста «растворение»......................................................... 982 #6. Экстемпоральные лекарственные средства ................................................. 987 #6.1. Приroтовление экстемпоральных лекарственных средств........................................................... 987 #6.1.1. Жидкие лекарственные средства........................................................................................ 987 #6.1.2. Твердые лекарственные средства .................................................................................... 1006 #6.1.3. Мяrкие лекарственные средства....................................................................................... 101 О #6.1.4. Режимы стерилизации экстемпоральных лекарственных средств ................................ 1012 #6.2. Экспрессанализ экстемпоральных лекарственных средств...................................................... 1013 #6.3. Оценка качества экстемпоральных лекарственных средств...................................................... 1047 #6.3.1. Нормы отклонений. допустимых при изroтовлении лекарственных средств (в том числе roмеопатических) в . аптеКах........................................................................ 1048 #6.3.2. Нормы отклонений, допустимых при фасовке в аптеках лекарственных средств промышленноro производства ................................................. 1050 Общие статьи ............... .............................................................................................. 1053 Вакцины для медицинскоrо применения ......... ............................................................................ 1053 Иммунные сыворотки животноro происхождения для медицинскоro применения ..................-. 1058 Лекарственное растительное сырье...................... ....... .... .......... ... .......... ........................ ........ ..... 1061 #Лекарственное растительное сырье цельное или измельченное фасованное ....... ..................................................... ......................................... 1063 Лекарственные средства на основе аллерrенов ......................................................................... 1064 Моноклональные антитела для медицинскою применения ....................................................... 1068 #Настои, отвары и чаи... .......................... ........... ..... ..... ............. .......................... ............ ........ ...... 1072 Продукты технолоrии рекомбинантной ДНК ................................................................................ 1074 Продукты ферментации......................... ....... ...... ..... ...... .................. ................................ .... .......... 1077 Продукты, которые MOryT быть переносчиками ryбчатой энцефалопатии животною происхождения ... ...... ......... .................... .... ................. ........ .... ............................ ............... ........... 1079 Радиоактивные фармацевтические препараты ......................................... .................................. 1079 Растительные жирные масла. ...................... ............ ......... .................................................. .......... 1088 Растительные чаи.......... ............................... ...... ..... ........ .... ........................ ...... ..... .......... .......... ... 1090 #Сборы .......... ...... ......................... .... .................... ........ .... ...... .................... ... ........ ................. ......... 1091 #Реrистрационные требования и правила проведения исследований биодоступности и биоэквивалентности rенерических лекарственных средств .............. ....... .............................. ........... .................. .......... 1092 Субстанции для фармацевтическоro использования.................................................................. 1130 Экстракты........ ....... ...... ......... .......................... ........ ........ ....... ....... ... ............. .......... ...... ........ .......... 1133 Эфирные масла..... ... .... ............. ....... ............. ..... ...... .................. ......... ...... .............. ............. ..... ..... 1136 Дозированные лекарственные формы ................................................................. 1139 Основные термины и определения.. ..... .... .................... .... ................... ........ ..... .......... .................. 1139 rлазные лекарственные средства.............. ....... .... .............. ...... .............. ................. ......... .... ........ 1140 r ранулы ............................................................................................................................... ............ 1143 #Драже .............................................................................................................................. .............. 1145 Жевательные резинки лекарственные..... .................................. ............. .............. ..... .................. 1145 Жидкие лекарственные средства для внутреннеro применения ............................................... 1146 Жидкие лекарственные средства для наружноro применения................................................... 1150 Капсулы. ....... ............ ....... ...... .......... ... ...... ............. .................... ......... ....... ... ...... ...... ............. .... ... ... 1151 Лекарственные средства ДЛЯ ваrинальною применения ........................................................... 1153 Лекарственные средства для инrаляций ................. ................ .................... ..... ..... ............ ...... ..... 1156
11 Лекарственные средства для орошения...... ................ ................. ...... ......................................... 1162 Лекарственные средства для парентеральноrо применения ..................................................... 1163 Лекарственные средства для ректальноro применения ............................................................. 1166 Лекарственные средства для слизистой оболочки полости рта................................................. 1169 Лекарственные средства, находящиеся под давлением ............................................................ 1173 Мяrкие лекарственные средства для наружною применения.................................................... 1174 Назальные лекарственные средства .............. .......... ....... ................... ............. ..... ........................ 1178 Палочки.............. ...... ............. ............ ........... ......... ...... .... ............. .................................. ................. 1180 Пены медицинские ......... ...... ............ ...... ....... ............. ............................................. ........... ............ 1181 Порошки для внутреннеro применения ........................................................................................ 1182 Порошки для наружноro применения ........................................................................................... 1183 Таблетки..... ....... ... .... ......................... ....... ....... ...... ....... ......... ....... ......... ............. ................... ...... .... 1184 Тампоны медицинские ... .... ................................. ........... ........ ............. ..................... ............ .......... 1188 Трансдермальные пластыри ........... ............. ............. ............ ....... ..................................... .... .... .... 1188 Ушные лекарственные средства ................................................................................................... 1189 rомеопатические лекарственные средства ......................................................... 1193 rомеопатические лекарственные средства.. ............... ...... .... .................. ......... ....... ................. .... 1193 Методы приrотовления roмеопатических базисных препаратов и потенцирование................. 1197 Матричные настойки для roмеопатических лекарственных средств ......................................... 1211 Лекарственное растительное сырье для roмеопатических лекарственных средств................ 1213
12 /осударственная фармакопея Республики Беларусь Редакционный совет rосударственной фармакопеи Республики Беларусь Шеряков А. А. председатель редакционноro совета Марченко С. И. заместитель председателя, координатор Члены редакционноrо совета Общие сведения Марченко С. И. Стреха И. С. Шеряков А А., к. ф. н. Иванова Н. А. Иванова Т. Д. Ковальчук Н. В. Ковшик А. В. Кравец М. М. Ларченко Е. И. Лежава Т. И. Лемешевская Т. А Либерова С. Е. Марченко С. И. Мельникова r. r. Милькевич В. В. Назарова Е. Ф. Никифорова Л. Н. Осипова В. Н. Плаксицкая Т. д. Позняк И. А. Покачайло Л. И., к. Ф Н. Политова Е. В. Посконная Л. Б PorYTbKo И. В. Рябкова Л. П. Снарская r. С. Стреха И. С. Сыресина Н. В. Тарасова Т. И. Торбина Т. Д. Филиппова r. Н. Хвеженко О. В. Хишова О. М., д. ф. н. Чернявекая А. А., к. Х. н. Шеряков А. А, к. ф. н. Шерякова Ю. А. Методы анализа Александрова Н. В. Алексеев Н. А, к. ф. н. Бузук r. Н., д. ф. н. Марченко С. И. Покачайло Л. И., к. ф. н. Потапнев М. П., д. М. н. Стреха И. С. Черношей С. И. Шеряков А. А., к. ф. н. Контейнеры Марченко С. И. Шеряков А А., к. ф. н. Реактивы Зенько Л. А Коцур О. М. Марченко С. И. Стреха И. С. Шеряков А. А, к. ф. н. Общие тексты Марченко С. И. Рождественский Д. А, к. м. н. Стреха И. С. Чернявская А. А, к. Х. н. Шеряков А. А, к. ф. н. Общие статьи Бузук r. Н., д. ф. н. rолик r. И. Марченко С. И. Рождественский Д. А, к. М. н. Стреха И. С. Шеряков А. А., к. ф. н. Экстемпоральные лекарственные средства Аrафонова И. В. Артемьева О. И. Будай А. И. Валюкевич Я. М. Власик Е. Л. Войтюль Е. И. rалаrанова т. r. rолик r. И. rрибанова Б. П. Демидова О. Н. Евдокимова Л. Н. Закацура Л. Ф. Залесская С. В. Захарова Т. В. Зейдина Т. В. Дозированные лекарственные формы rолик r. И. Марченко С. И. Стреха И. С. Шеряков А А., к. ф. н. rомеопатические лекарственные средства Стреха И. С. Шеряков А А., к. ф. Н.
13 Список авторов Аrафонова И. В. Александрова Н. В. Алексеев Н. А., к. ф. н. Артемьева О. И. Будай А. И. Бузук r. Н., д. ф. н. Валюкевич Я. М. Власик Е. Л. Войтюль Е. И. rалаrанова т. r. repMaHeHKo Е. В. rолик r. и. rрибанова В. П. Демидова О. Н. Евдокимова Л. Н. Закацура Л. Ф. Залесская С. В. Захарова Т. В. Зейдина Т. В. Зенько Л. А. Иванова Н. А. Иванова Т. Д. Кенькова Н. Н. Ковальчук Н. В. Ковшик А. В. Кравец М. М. Ларченко Е. И. Лежава Т. И. Лемешевская Т. А. Либерова С. Е. Марченко С. И. Мельникова r. r. Милькевич В. В. Назарова Е. Ф. Никифорова Л. Н. Осипова В. Н. Плаксицкая Т. д. Позняк И. А. Покачайло Л. И., к. ф. н. Политова Е. В. Посконная Л. Б. Потапнев М. П., д. м. н. POryTbKO И. В. Рождественский Д. А., к. м. н. Рябкова Л. П. Сеткина С. Б. Снарская r. С. Стреха и. С. Сыресина Н. В. Тарасова Т. И. Торбина Т. д. Филиппова r. Н. Хвеженко О. В. Хишова О. М., д. ф. н. Черношей С. И. Чернявская А. А., к. Х. н. Шеряков А. А., к. ф. н. Шерякова Ю. А. 4 3a1l 1712
14 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Список орrанизаций, учреждений и предприятий Республики Беларусь, принимавших участие в разработке rосударственной фармакопеи Республики Беларусь РУП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении» Уа Витебский roсударственный медицинский университет РУП «Белмедпрепараты» ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов» 000 «Фармтехнолоrия» УП «Минскинтеркапс» РУП «Несвижский завод медицинских препаратов» АДА «Фармалэнд» rY «Республиканский научнопрактический центр трансфузиолоrии и медицинских биотехнолоrий» rY «Республиканский научнопрактический центр эпидемиолоrии и микробиолоrии» Отдел контроля качества аптечноro склада ТП РУП «БелФармация» Контрольноаналитическая лаборатория ТП РУП «Минская Фармация» Контрольноаналитическая лаборатория Брестскоro ТП РУП «Фармация» Контрольноаналитическая лаборатория Витебскоrо ТП РУП «Фармация» Контрольноаналитическая лаборатория rомельскоro ТП РУП «Фармация» Контрольноаналитическая лаборатория rродненскоro ТП РУП «Фармация» Контрольноаналитическая лаборатория Моrилевскоro ТП РУП «Фармация»
Введение 15 ВВЕДЕНИЕ Во втором издании 120 тома rосудар ственной фармакопеи Республики Беларусь в новой редакции приведены все общие статьи и тексты, опубликованные в первом издании Фармакопеи (тома 1, 2, 3). Введены новые общие статьи и тексты: 2.2.57. Атомноэмиссионная спектроме трия с использованием индуктивно связанной плазмы: 2.2.58. Массспектрометрия с использова нием индуктивно связанной плазмы; 2.2.59. Анализ 2ликанов в 2ликопротеинах; 2.2.60. Температура плавления иHcтpy ментальный метод; 2.4.29. Состав жирных кислот в маслах, об02ащенных OMe2a3 кислотами; 2.4.31. Никель в 2идР02енизированных pac тительных маслах; 2.4.32. Общий холестерин в маслах, об02а щенных OMe2a3 кислотами; 2.5.35. Азота закись в 2азах; 2.5.37. Метил, этил и изопропилметан сульфонат в метансульфоновой кислоте; 2.5.38. Метил, этил и изопропилметан сульфонат в фармацевтических субстанциях; 2.5.39. Метансульфонилхлорид в MeтaH сульфоновой кислоте; #2.5.50. Титрование в неводных pacтвo рителях (изменение номера статьи, ранее #2.5.35); 2.6.26. Испытание на aHтиO антитела в иММУН02лобулине человека для внутривеНН020 введения; 2.6.30. Испытание на активацию моноцитов; 2.6.31. МикробиОЛ02ические испыта ния лекарственных средств растительно 20 происхождения для внутренне20 приме нения; 2.7.22. Количественное определение фак тора свертывания крови Х/ человека; 2.7.23. Подсчет клеток СО34/СD45+ в 2e мопоэтических продуктах; 2.7.24. Проточная цитометрия; 2.7.25. Определение содержания иН2ибито ра плазмина человека; 2.7.27. Значение флоккуляции (Lf) токсинов и анатоксинов дифтерии и столбняка (проба Рамона); 2.7.28. Определение количества 2емопоэ тических клетокпредшественников человека по колониеобразующим клеткам; 2.7.29. Определение количества и жизне способности ядросодержащих клеток; 2.7.30. Количественное определение чело вечеСК020 белка с; 2.7.31. Количественное определение чело вечеСК020 белка s; 2.7.32. Количественное олределение ИН2И битора а1протеиназы человека; #2.7.50. Определение биОЛ02ической aKтив ности инсулина (изменение номера статьи, ранее #2.7.22); 2.8.2. Примеси (изменение номера статьи, ранее #2.8.2); 2.8.20. Лекарственное растительное сырье: отбор проб (взамен статьи #2.8.19. Правила приемки и методы отбора проб); 2.8.22. Определение охра токсина А в ле карственном растительном сырье; 2.8.23. #Макроскопический и# микроскопи ческий анализ лекарствеНН020 раститель Н020 сырья (взамен статьи #2.8.3. Техника макроскопичеСК020 и микроскопичеСК020 aHa лиза); 2.9.29. Характеристическое растворение; 2.9.32. Пористость и определение разме ра пор с использованием ртутной порозиме трии; 2.9.34. Насыпная плотность и плотность после усадки; 2.9.35. Степень измельчения порошков; 2.9.41. Истираемость 2ранул и сфероидов; 2.9.42. Тест «Растворение» для липофиль ных твердых дозированных форм: 2.9.43. Наблюдаемое растворение: 2.9.44. Лекарственные средства для pac пыления: характеристика: 2.9.45. Смачиваемость пористых твердых материалов, включая порошки; 5.1.6. Альтернативные методы контроля микробиОЛ02ической чистоты; 5.1.7. Вирусная безопасность; 5.1.8. МикробиОЛ02ическая чистота пе карственных средств растuтеЛЬН020 про исхождения для внутренне20 применения; 5. 1.9. Руководство по применению испыта ния на стерильность; 5. 1. 10. Руководство по примененuю испы тания на бактериальные эндотоксины: 5.3. Статистический анализ результатов биОЛ02ических испытаний и тестов (измене ние номера статьи, ранее 5.3.1): #5.3.1. Статистический анализ резуль татов химичеСК020 эксперимента (изменение номера статьи, ранее #5.3.2); #5.3.2. Валидация аналитических Meтo дик и испытаний (изменение номера статьи, ранее #5.3.3); 5.14. Лекарственные средства для 2енной терапии для медициНСК020 применения; 5. 15. Функциональнобусловленные xapaK теристики вСПОМ02ательных веществ; 5.16. Кристалличность: 5.17.1. Рекомендации по проведению теста «Растворение»; #6.1.4. Режимы стерилизации экстемпо ральных лекарственных средств; Моноклональные антитела для MeдициH СК020 применения (2031); Продукты теХНОЛО2ии рекомбинантной ДНК (0784);
16 rосударственная фармакопея Республики Беларусь #Ре2истрационные требования и прави ла проведения исследований биодоступн()стu и биоэквивалентностu zенерических леКбр ственных средств (РБОО05) (изменение номера статьи, ранее #5.8); Эфирные масла (2098); Методы при20товления 20меопатических базисных препаратов и потенцирование (2371). Исключены следующие общие статьи: #2.4.29. Цинк; #2.4.30. Ле2кооБУ2ливающиеся вещества; #2.5.35. Титрование в неводных pacтвopи телях (изменение номера статьи на #2.5.50); 2.6.3. Испытание на посторонние вирусы с использованием куриных эмбрионов (oтcyт ствует в Европейской Фармакопее); 2.6.4. Испытание на вирусы лейкоза (oт сутствует в Европейской Фармакопее); 2.6.5. Испытание на посторонние вирусы с использованием клеточных культур (oтcyт ствует в Европейской Фармакопее); 2.6.6. Испытание на посторонние а2енты с использованием цыплят (отсутствует в Eв ропейской Фармакопее); 2.7.3. Количественное определение Kopти котропина (отсутствует в Европейской Фар макопее); #2.7.22. Определение биОЛО2ической aK тивности инсулина (изменение номера статьи на #2.7.50); #2.8.2. Допустимые примеси (изменение номера статьи на 2.8.2); #2.8.3. Техника макроскопичеСК020 и MиKpO скопичеСК020 анализа (новая редакция, статья 2.8.23); #2.8.18. Определение содержания экстрак тивных веществ; #2.8.19. Правила прuемкu u методы отбора проб (новая редакция, статья 2.8.20); #2.8.20. Определение содержания токсиче ских веществ методом атомноабсорбционной спектроскопии (см. статью 2.4.27); #2.8.22. Определение содержания paдиOHY клидов; 2.9.13. Определение размера частиц Meтo дом микроскопии (см. статью 2.9.37); 2.9.15. Насыпной объем (см. статью 2.9.34); 2.9.24. Устойчивость суппозиториев и пессариев к разрушению (отсутствует в Eв ропейской Фармакопее); 2.9.28. Определение массы или объема содержиМ020 контейнера для жидких и МЯ2ких лекарственных средств (см. общие статьи на жидкие и МЯ2кие дозированные формы, статья отсутствует в Европейской Фарма копее) ; 5.2.6. Оценка безопасности вакцин (oтcyт ствует в Европейской Фармакопее); 5.2.7. Оценка эффективности вакцин (oт сутствует в Европейской Фармакопее); 5.3.1. Статистический анализ резуль татов биОЛ02ических исследований и коли чественнЬ/х определений (изменение номера статьи на 5.3); #5.3.2. Статистический анализ резуль татов химичеСК020 эксперимента (изменение номера статьи на #5.3.1); #5.3.3. Валидация аналитических Meтo дик испытаний (изменение номера статьи на #5.3.2).
Общие сведения 17 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ 1.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ #Положения rлавы «Общие сведения» pac пространяются на все общие статьи, частные статьи и друrие материалы rосударственной фармакопеи Республики Беларусь. В материалах rосударственной фармако пеи Республики Беларусь слово «Фармакопея» без уточнений подразумевает rосударственную фармакопею Республики Беларусь. Наряду с этим для обозначения rосударственной фарма копеи Республики Беларусь может быть исполь зова но также официальное сокращение rФ РБ. Все частные и общие статьи ФармакопеЙ rармонизированы с Европейской Фармакопеей и построены в следующем формате: адаптированный перевод соответствую щеro материала Европейской Фармакопеи; национальные общие и частные статьи, дополнительные испытания, информационные и иные материалы отмечены значком «#» перед названием rлавы, статьи, раздела, пункта на которые он распространяется; текст, отличаю щийся от текста Европейской Фармакопеи, OT мечается между двумя значками «#», например, #контрольный опыт#; статьи и нормы на лекарственное расти тельное сырье, соответствующие требованиям Европейской Фармакопеи, обозначены значком « ЕФ ».# Ссылка в материалах Фармакопеи на какую либо статью и/или ее раздел означает, что про дукт соответствует требованиям этой статьи. Ha звание статьи, на которую дается ссылка, и/или ее номер выделены курсивом. rOToBoe лекарственное средство должно co ответствовать требованиям Фармакопеи на про тяжении срока rодности. Компетентный упол номоченный opraH может принять решение о необходимости установления отдельноro срока roдности и/или требования спецификации для лекарственноro средства во вскрытом контейне ре. Объект любой частной статьи должен COOT ветствовать установленным требованиям в Te чение всеro периода еro использования. Срок roдности и дата, с которой он должен отсчиты ваться, соrласовываются компетентным упол номоченным opraHoM на основании эксперимен тальных исследований по стабильности данноro roтовоro продукта. Требования частной статьи являются обя зательными, если нет специальных указаний в разделе «Общие сведения» или в данной част ной статье. Общие статьи становятся обязатель ными, Korдa на них при водится ссылка в той или иной частной или общей статье, если только спе циально не указано, что ссылка приводится ис ключительно как информация или рекомендация. Действующие вещества (фармацевтические субстанции), вспомоrательные вещества, roто вые лекарственные средства и друrие продукты, описываемые в частных статьях Фармакопеи, предназначены для использования в медицине. Качество продукта является фармакопейным только при ero соответствии всем требованиям фармакопейной статьи. Это условие не подраз умевает необходимость выполнения производи телем всех испытаний, описанных в статье, при оценке соответствия требованиям Фармакопеи при выпуске в обращение. Для подтверждения соответствия продукта требованиям Фармакопеи производитель может использовать данные, по лученные, например, в ходе валидации производ cTBeHHoro процесса и внутрипроизводственноrо контроля. Таким образом, требование COOTBeT ствия продукта Фармакопее может выполняться и при выходном контроле в виде выпуска по па раметрам (parametric ,e/ease) при наличии разре шения компетентноro уполномоченноro opraHa. Субстанции, вспомoraтельные вещества и друrие продукты, на которые распростраНЯIQТСЯ требования Фармакопеи, мoryт иметь различные параметры качества в зависимости от цели ис пользования. Если на этот счет нет указаний в co ответствующей частной стаТЬе, ее требования pac пространяются на продукт независимо от целей еro применения. В некоторых случаях, в частности, в случае вспомоrательных веществ, для информа ции частная статья может быть дополнена списком функциональнообусловленных характеристик, KO торые являются важными для использования дaH ноro вещества. Также в информационных целях MOryr быть приведены методики контроля одной или нескольких таких характеристик. Системы качества. Стандарты качества. установленные в фармакопейных статьях, при менимы к продукту только при условии еro про изводства в рамках соответствующей системы обеспечения качества. Общие статьи. Субстанции и лекарствен ные средства, описанные в частных статьях, также должны выдерживать требования соот ветствующих подходящих общих статей. В част ных статьях обычно не указывают перекрестные ссылки на общие фармакопейные статьи. Действие общих статей распространяется на все субстанции и лекарственные средства, YKa занные в разделе «Определение» общей статьи, за исключением случаев, коrда вводная часть оrраничивает ее применение, например, только для субстанций и лекарственных средств, опи санных в этой фармакопейной статье. Требования общих статей на лекарственные формы распространяются на все лекарствен ные средства, изrотовленные в виде этой лекар ственной формы. Для конкретноro лекарствен ноro средства требования соответствующей общей статьи не обязательно являются исчер
18 rосударственная фармакопея Республики Беларусь пывающими, и компетентный уполномоченный opraH может ввести дополнительные требова ния, помимо указанных в статье. Общие и частные статьи являются взаимо дополняемыми. Если требования общей статьи неприменимы к определенному лекарственному средству, это однозначно указывается в частной статье. Валидация фармакопейных методик. Me тодики, приведенные в частных и общих статьях, были валидированы в соответствии с общепри нятой научной практикой и современными peKO мендациями по валидации аналитических MeTO дик. Если иное не указано в частной или общей статье, валидация методик испытания аналити ком не требуется. #Испытания и методики определения, приве денные в Фармакопее, являются официальными методиками, однако по соrласованию с компетент ными уполномоченными орrанами MOryт использо ваться и друrие методики, при условии. что они дают результаты, соответствующие фармакопейным Me тодикам. В случае сомнений или разноrласий реша ющей является фармакопейная методика." Общепринятые термины. #Термин «компе тентный уполномоченный opraH» означает Ми нистерство здравоохранения Республики Бела русь и Республиканское унитарное предприятие «Центр экспертиз и испытаний в здравоохране нии» В соответствии с ero компетенцией.# Выражение «если нет друrих указаний в частной статье» #(под частной статьей под разумевается частная статья Фармакопеи на субстанцию или нормативный документ по контролю качества (НД), утвеР'1енный уполно fv10ченным opraHoM)# означает, что требования общей статьи должны быть выполнены, за ис ключением случаев, коrда компетентный упол номоченный opraH соrласовал (утвердил) изме нения или исключения для таких требований, что указывается в частной статье. Положения со словом «следует» носят peKO мендательный или информационный характер. В некоторых общих и частных статьях Фар макопеи при описании реактива, микроорrаниз ма, методики и т. д. используется термин «подхо дящий». Если при этом критерии их приroдности не сформулированы, то приroдность конкретных реактивов, методик и т. д., используемых в част ной статье, должна быть обоснована перед KOM петентным уполномоченным opraHoM. Лекарственное средство. #Вещество или комбинация веществ природноrо, синтетическо ro или биотехнолоrическоrо происхождения, ()б ладающие фармаколоrической активностью и в определенной лекарственной форме применяе мые для профилактики и диаrностики заболева ний, лечения и медицинской реабилитаuии па циентов, предотвращения беременности путем BHYTpeHHero или внешнеro применения.# Лекарственное средство раститеЛЬН020 происхождения. Лекарственное средство, co держащее в качестве действующеro веще ства (действующих веществ) только лекар ственное растительное сырье или продукты из лекарственноro растительноro сырья или лекарственное растительное сырье в комби нации с продуктами из лекарственноro расти тельноrо сырья. #Продукт из лекарствеНН020 растительно 20 сырья однородный продукт, полученный из лекарственноro растительноro сырья путем экс тракции, переroнки, отжима, фраrментирова ния, очистки, концентрирования или фермента ции. Продукты из лекарственноro растительноro сырья включают, например, экстракты, эфир ные масла, соки, эксудаты и лекарственное pac тительное сырье, измельченное для специфи ческоro применения, например, измельченное лекарственное растительное сырье для после дующей фасовки, приrотовления чаев и сборов, капсулирования или таблетирования. Продукт из лекарственноro растительною сырья может представлять собой фармацевтическую суб станцию, промежуточный продукт или roтовое лекарственное средство. #Лекарственное растительное сырье. Ис пользуемые для промышленноrо производства, аптечноro изroтовления лекарственных средств цельные лекарственные растения или части ле карственных растений, на которые имеются co ответствующие фармакопейные статьи. Фармацевтическая субстанция (деЙству ющее вещество). "Вещество или комбинация нескольких веществ природноro, синтетическо ro или биотехнолоrическоro происхождения, об ладающие фармаколоrической активностью. используемые для промышленноrо производ ства, аптечною изroтовления лекарственных средств.# Такие вещества предназначены для оказания фармаколоrическоro или иноrо непо средственноrо действия при диаrностике, лече нии и профилактике заболеваний. или для воз действия на opraHbJ и функции орrанизма. ВСПОМ02ательное вещество. #Вещество или комбинация нескольких веществ, не обла дающих фармаколоrической активностью и ис пользуемых в процессе промышленноrо произ водства, аnтечноro изrотовления лекарственноro средства для придания ему определенной ле карственной формы.# Например, вспомоrатель ными веществами являются стабилизаторы, антимикробные консерванты, антиоксиданты, растворители, адъюванты. 1.2. друrИЕ ПОЛОЖЕНИЯ, РАСПРОСТРА НЯЮЩИЕСЯ НА ОБЩИЕ И ЧАСТНЫЕ ФАРМА КОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ Количество вещества. При описании коли чественноrо определения или испытания с чис лен но заданными пределами, количество веще ства, необходимое для проведения испытания. может отклоняться в пределах :t1 О % от указан
Общие сведения 19 ноro количества. Необходимо взять точную Ha веску анализируемою вещества (или отмерить ero какимлибо друrим способом) и все вычисле ния производить для этоro точноrо количества. Если пределы испытания заданы не числен но, а определяются путем сравнения со CTaH дартом при тех же условиях, для испытания берут указанное количество вещества. Реакти вы Bcerдa берут в указанных количествах. Количества вещества взвешивают или OTMe ривают с точностью. соответствующей указанной степени прецизионности. Точность взвешивания должна быть ж5 единиц после последней YKa занной цифры (например, навеска 0.25 r может находиться в пределах от 0,245 r до 0,255 r). Объемы отмеривают следующим образом: если после десятичной запятой стоит ноль или число, заканчивающееся ноль (например, 10,0 мл или 0,50 мл), требуемый объем отмеривают с по мощью пипетки, мерной колбы или бюретки. В остальных случаях можно использовать rрадуи рованный мерный цилиндр или rрадуированную пипетку. Микролитры отмеривают с помощью микропипетки или микрошприца. Тем не менее, в некоторых случаях точ ность. с которой указаны количества вещества, не совпадает с количеством значащих цифр, указанных в заданных числовых пределах. В таких случаях взвешивания и отмеривания про водят с существенно более высокой точностью. Оборудование и аналитические опера- ции. Стеклянная мерная посуда должна COOT ветствовать требованиям класса А Международ ноro стандарта, выпущенноro Международной орrанизацией по стандартизации (/50). "или Ha циональноrо стандарта Республики Беларусь". Аналитические операции, если нет друrих указаний, осуществляют при температуре от 15 ос до 25 ОС. Сравнительные испытания, если нет друrих указаний, проводят с использованием идентичных пробирок из бесцветною прозрачноro нейтрально ro стекла с плоским основанием и внутренним диа метром 16 мм, так как указываемые объемы жидко стей рассчитаны ДПЯ этоro диаметра; однако, при условии корректировки объемов, MOryт быть ис пользованы также пробирки с большим внутренним диаметром (2.1.5). Сравнивают равные объемы жидкостей оль вертикальной оси пробирки на белом (или, при необходимости, на черном) фоне. Испытания проводят в рассеянном свете. Если для проведения испытания или количе ственноro определения требуется использовать растворитель с растворенным в нем индикато ром и при этом не предусмотрен контропьный опыт, этот растворитель предварительно ней трализуют по этому индикатору. #Под контрольным опытом подразумева ют определение, проводимое с теми же количе ствами реактивов и в тех же условиях, но без ис пытуемоro образца.# Водяная баня. Если не указана вода с друroй температурой, то подразумевается баня с кипящей водой. Можно использовать и друrие способы наrревания, если они rарантированно обеспечивают температуру, близкую, но не пре восходящую 100 ос (или друryю указанную TeM пературу). #Ледяная баня. Подразумевается баня с TeM пературой О ОС. Если необходимо охлаждение до более низкой температуры, применяют смесь льда с некоторыми электролитами (соли, кислоты). Высушивание и прокаливаниедопостоян- ной массы. Результаты двух последних взвеши ваний должны отличаться не более чем на 0,5 Mr; интервал времени между двумя взвешиваниями определяется свойствами и количеством BЫCY шиваемоrо/прокаливаемоrо остатка. В тех случаях. Korдa требуется высушивание «в эксикаторе» или «в вакууме», оно осущест вляется в соответствии с условиями, описанны ми в статье 2.2.32. Потеря в массе при высуши вании. Реактивы. Надежность результатов, полу чаемых с помошью описанных в фармакопей ных статьях аналитических операций, зависит, в частности, от качества используемых реактивов. Реактивы описаны в rлаве 4. Реактивы. Под разумеваемая степень чистоты не ниже KBa лификации «аналитической чистоты» (aпa/ytica/ grade) Пили квалификации «чистый для анали за» (ч. д. а.)#. длq некоторых реактивов включе ны испытания для определения приrодности. Растворители. Если для растворов не Уf.;эзан растворитель, то подразумевают водные оастворы. Для проведения описанных в фармакопей НЫХ статьях аналитических операций и для при ютовления реактивов используют воду, COOTBeT ствующую требованиям частной статьи «Вода очищенная», за исключением случаев, Korдa требования по содержанию бактериальных эн дотоксинов (Вода очищенная ((iп bu/k») или по микробиолоrической чистоте (Вода" очищенная в контейнерах) не являются существенными. Под термином «вода дистиллированная» пони мают воду очищенную, полученную путем дис тилляции. Термин «этанол» без уточнений означает абсолютный этиловый спирт. Термин «спирт» без уточнений означает 96 % эта нол. Друrие степени разбавления обозначаются термином «этанол» или «спирт» С указанием содержания этанола (С 2 Н 6 О) в объемных процентах. #Термин «эфир» без уточнений означает ди этиловый эфир.# Способы выражения концентрации. Bыpa жение «%» может иметь одно из трех значений:
20 rосударственная фармакопея Республики Беларусь массовый процент (м/м) число rpaM мов вещества в 100 rpaMMax конечноro про дукта; объемный процент (об/об) число мил лилитров вещества в 100 миллилитрах конеч ноro продукта; #массообъемный про цент (м/об) число rpaMMoB вещества в 100 миллилитрах конечноro продукта#. Если не указано иноro, обозначение «ррт» (частей на миллион) подразумевает массовое соотношение. #Если указано, что при приroтовлении смеси растворителей их берут в соотношении (а:Ь), то имеется в виду соотношение объе мов. Например, соотношение reKcaH бензол (1 :З) означает, что смешивают 1 объем reKca на с З объемами бензола.# Температура. Кроме KOHKpeTHoro указа ния температуры, при проведении испытаний используют также следующие термины: rлубокое охлаждение ниже 15 ос; в холодильнике от 2 ос до 8 ОС; в холодном или прохладном месте от 8 ос до 15 ОС; при комнатной температуре от 15 ос до 25 ОС. #Кроме терминов, приведенных выше, MorYT использоваться также следующие Tep мины: теплый (от 40 ос до 50 ОС); rорячий (от 80 ос до 90 ОС); температура «водяной бани» от 98 ОС до 100 ОС; температура «ледяной бани» (О ОС).# 1.З. ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ Контейнеры. Материалы, используемые для контейнеров, описаны в rлаве 3.1. Для материалов, используемых для производ ства контейнеров, особенно для полимерных материалов, используют общие названия, каждое из которых охватывает ряд материа лов, отличающихся как свойствами OCHOBHOro компонента, так и используемыми добавками. Испытания и пределы нормирования зависят от конкретноro состава материала и, таким образом, применимы только при условии, что материал соответствует вводной части ero спецификации. По соrласованию с компе тентным уполномоченным opraHoM MorYT ис пользоваться материалы друrих составов, а также испытания для них. Спецификации на контейнеры, включен ные в rлаву 3.2, разрабатывались для всех контейнеров указанной катеrории. Однако, учитывая большое разнообразие существу ющих контейнеров и возможность появления новых контейнеров, публикация специфика ции не исключает возможности использова ния контейнеров, соответствующих друroй спецификации, если это обосновано и соrла сова но с компетентным уполномоченным op raHOM. В статьях Фармакопеи MorYT даваться ссылки на определения и спецификации KOH тейнеров, приведенные в rлаве 3.2. Контей неры. В разделах «Определение» или «Про изводство» общих статей на лекарственные формы может содержаться требование по ис пользованию определенноro типа контейне ра. В разделе «Хранение» некоторых статей может указываться тип рекомендуемоro KOH тейнера. 1.4. ЧАСТНЫЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ НА3ВАНИЯ #Кроме названий на русском языке, при водятся также анrлийское и латинское назва ния.# ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ АТОМНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАССЫ Относительную атомную массу (А. м.) или относительную молекулярную массу (м. м.) указывают, при необходимости, в начале частной фармакопейной статьи. Относитель ную атомную массу, относительную моле кулярную массу, молекулярную формулу и rрафическую формулу приводят как инфор мационный материал. РЕrИСТРАЦИОННЫЕ НОМЕРА CAS Реrистрационные номера Химической pe феративной службы CAS (Chemica/ Abstracts Se,vice) MorYT включаться для информации в частные фармакопейные статьи, rдe это при менимо, с целью предоставления пользовате лю удобноro доступа к полезной инфрмации. Реrистрационный номер CA (CAS Regist,y NubefFJ) является зареrистрированной торro вой маркой Американскоro Химическоro Об щества (Americaп Chemica/ Society). ОПРЕДЕЛЕНИЕ В разделе «Определение», идущей после названия частной статьи, при водится офици альное определение субстанции, roTOBOro ле карственноro средства или иноro продукта" являющеroся предметом частной статьи. Пределы содержания. Если указаны пределы содержания, то это пределы, 11OЛУ ченные с использованием метода, указанно ro в разделе «Количественное определение». Лекарственное растительное сырье. В частных статьях на лекарственное раститель ное сырье в разделе «Определение» указыва
Общие сведения 21 ют на предмет частной статьи. Это может быть, например, лекарственное растительное сырье в исходном виде или лекарственное растительное сырье, измельченное в порошок. Если частная статья распространяется на несколько вариан тов, например. на оба из указанных, то это оro варивается в разделе «Определение». ПРОИЗВОДСТВО Информация в разделе «Производство» призвана привлечь внимание к некоторым важным аспектам процесса производства и не обязательно является исчерпывающей. Coдep жащиеся в ней инструкции адресованы произ водителю. Они MOryT относиться, например, к материалам, к процессу производства, к ею Ba лидации и контролю, к постадийному контролю, а также к испытаниям, которые производитель должен проводить перед выпуском для каждой серии продукта или для выбранных серий. Эти положения не обязательно должны быть под тверждены посредством анализа конечноrо про дукта. Компетентным уполномоченным opra ном может быть установлено, что приведенные выше аспекты были выполнены. Такое заключе ние может быть сделано на основании проверки полученных от производителя данных, или при инспектировании производства или при испыта нии соответствующих образцов. Отсутствие раздела «Производство» не оз начает, что аспекты производственноro процес са, отмеченные выше, не требуют внимания Выбор вакцинноrо штамма, Выбор со- става вакцины. В разделе «Производство» частной фармакопейной статьи на вакцину MOryT быть указаны характеристики вакцинноro штамма или состав. Если иное не указано, опи сываемые в этом разделе методики испытаний для подтверждения этих параметров приводятся для информации в качестве примера. В случае разрешения компетентным уполномоченным op raHoM, MOryT использоваться иные методики ис пытаний без проведения их валидации в cpaBHe нии с методиками, приведенными в статье. В03МОЖНОСТЬ ФАЛЬСИФИКАЦИИ В связи с увеличением мошеннической aK тивности и случаев фальсификации, COOTBeT ствующая осведомленность может помочь пользователям Фармакопеи в обнаружении фальсификатов (т. е. фармацевтических суб станций, вспомоrательных веществ, промежу точных продуктов, нерасфасованых продуктов и rOToBbIx лекарственных средств). С учетом этоro, в раздел «Возможность фальсифицирования» частных статей на суб станции, для которых встречались случаи фаль сифицирования или у которых присутствует риск наличия умышленно добавленных примесей. может быть включена методика обнаружения возможных фальсификатов и соответствующие пределы вместе с напоминанием, что все стадии производства и снабжения должны быть частью надлежащей системы качества. Частота испыта ний, проводимых производителем или потреби телем (например, производителем промежуточ ных продуктов, нерасфасованных продуктов и roтовых лекарственных средств, rдe применимо) зависит от оценки риска, с учетом национальных требований и информированности о всей цепоч ки поставок. Данный раздел устанавливает требования ко всей цепочке поставок в целом, от производи телей до потребителей (например, производите лей промежуточных продуктов, нерасфасован ных продуктов и roтовых лекарственных средств. rдe применимо). Отсутствие данноro раздела не предполаrает тоro, что не должно уделяться вни мание моментам, упомянутым выше. ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА) Информация. приведенная в этом разделе, не должна рассматриваться как прямое указа ние и не является требованием. Растворимость. #Под «растворимостью» подразумевают свойство вещества растворяться в различных растворителях, принятых в rф РБ. Показатели растворимости вещества в различ ных растворителях приводятся в частных фар макопейных статьях.# Для обозначения растворимости в разделе «Описание (Свойства)>> используют описатель ные термины, которые в температурном интер вале от 15 ос дО 25 ос имеют следующие зна чения: Примерное количество рас- Термин творителя (мл), необходи- мое для растворения 1 r вещества Очень леrко 1 менее растворим Леrкорастворим от 1 до 10 Растворим от 10 до 30 Умеренно pac от 30 до 100 творим Малорастворим от 100 до 1000 Очень мало от 1000 до 1 О 000 растворим Практически более 1 О 000 нерастворим Термин «частично растворим» используют для характеристики смесей, у которых раствори мы толькО некоторые компоненты. Термин «CMe шивается с ...» используют для характеристики жидкостеЙ. смешивающихся с указанным paCT ворителем во всех соотношениях. =Прuмечание: Для веществ, образующих при растворении мутные растворы, соответствую щее указание должно быть приведено в частной
22 rосударственная фармакопея Республики Беларусь фармакопейной статье. Если указано, что суб станция растворима в жирных маслах, то име ется в виду, что она растворима в любом масле, относящемся к классу жирных масел.1' ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ) Область применения. Приводимые в этом разделе испытания не рассчитаны на полное подтверждение химической структуры или cocтa ва продукта. Они предназначены для подтверж дения с приемлемой степенью достоверности тоro, что продукт соответствует информации, приведенной на этикетке. Первая и вторая идентификации. В HeKO торых частных статьях есть подразделы «Первая идентификация» и «Вторая идентификация». Испытания, описанные в подразделе «Первая идентификация», MOryT быть использованы во всех случаях. Испытания, описанные в подраз деле «Вторая идентификация», MOryT быть ис пользованы в аптеках, если есть доказательства тоro, что данная серия субстанции была серти фицирована на соответствие всем друrим Tpe бованиям частной фармакопейной статьи. #Для лекарственноro растительноro сырья Moryт использоваться испытания, описанные в подразделе «Вторая идентификация», если есть доказательства тоro, что данная серия сырья была сертифицирована на соответствие всем требованиям частной фармакопейной статьи.# В некоторых частных статьях для первой идентификации приводятся два или более вида испытаний, которые являются эквивалентными и MOryт использоваться независимо друr от друrа. Один или более из этих рядов обычно coдep жат пере крестные ссылки на испытания, приве денные в разделе «Испытания» частной статьи. Это может быть использовано для облеrчения работы аналитика, проводящеrо идентифика цию и предписанные испытания. Например, один ряд испытаний для идентификации имеет ссылку на определение энантиомерной чистоты, в то время как в друroм ряде проводится опреде ление удельноro вращения: оба ряда преследу ют одну и ту же цель подтвердить присутствие необходимоro энантиомера. Порошкообразное лекарственное pac тительное сырье. Частные статьи на лекар ственное растительное сырье MOryT содержать схематические рисунки порошкообразноro ле карственноro средства. Эти рисунки дополняют описание, приведенное в соответствующем ис пытании на подлинность. ИСПblТАНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Область применения. Эти требования не рассчитаны на охват всех возможных приме сей. В частности, если примесь не определяет ся с помощью описанных испытаний, а здравый смысл и надлежащая производственная прак тика не допускают ее присутствия, не следу ет делать вывод, что она допустима. См. также ниже раздел «Примеси». #Если в испытаниях с использованием xpo матоrрафических методов после указания BBO димоro или наносимоro объема раствора в ми кролитрах в скобках указывается количество вещества в микроrраммах, то имеется в виду приблизительное количество. Если указано, что испытание проводят «в защищенном от света месте», то это означает, что следует принять меры для избеrания попа дания прямоro солнечноro света, любоro друroro яркоrо света, а также исключить попадание уль трафиолетовоro света, например, путем исполь зования посуды из специальноro стекла, работы в затемненной комнате и т. д.# Расчеты. Если при проведении вычислений требуется выполнить пересчет на сухое веще ство или безводное вещество или оroворено Ka коелибо друrое условие, то потерю в массе при высушивании, содержание воды или иной пока затель определяют с помощью метода, описан ноro в частной фармакопейной статье. Слова «в пересчете на сухое вещество» или «в пересче те на безводное вещество» и друrие указывают после результата. Пределы. Указываемые пределы OCHOBЫBa ются на результатах, полученных в рамках обыч ной аналитической практики; в них уже учтены обычные аналитические поrрешности, допусти мый разброс при производстве и приroтовлении, а также ухудшение качества в процессе xpaHe ния в пределах, которые считаются приемле мыми. При определении соответствия продук та требованиям частной фармакопейной статьи к указанным пределам не должны добавляться никакие дополнительные допуски. Результат, полученный в испытании, OKPy rляют до указанноro в пределе количества знача щих цифр (если нет друrих указаний). Пределы, независимо от тоro, выражены они в процентах или в абсолютных значениях, считаются значи мыми до последнеro указанноro знака (напри мер, число 140 обозначает три значимых знака). При этом последнюю цифру увеличивают на единицу, если цифра, отбрасываемая при oKpyr лении, больше или равна пяти. Если цифра, OT брасываемая при окруrлении, меньше пяти, по следнюю цифру оставляют неизменной. Определение допустимоrо предела при- месей. Для сравнительных испыта/-lИЙ пример ное допустимое содержание при меси или суммы примесей может быть указано в скобках только для информации. Решение об одобрении или OT клонении принимают на основании соответствия либо несоответствия приведенному в статье ис пытанию. Если для данной примеси не указано
Общие сведения 23 использование стандартноro образца, ее coдep жание может быть выражено исходя из номи нальной концентрации вещества, используемоrо для приroтовления указанноro в частной фарма копейной статье раствора сравнения (если нет друrих указаний). Лекарственное растительное сырье. Для лекарственноro растительноro сырья сульфатную золу, общую золу, растворимые в воде вещества, растворимые в спирте вещества, содержание воды, содержание эфирных масел и содержание действующих веществ рассчитывают в пересче те на лекарственное средство, которое не было специально высушено (если нет друrих указаний в частной фармакопейной статье). Эквиваленты (титры). В тех случаях, коrДа приводят эквивалент, еro дают с таким коли чеством значащих цифр, которое требуется в данной частной статьи. Питательные среды. Питательные среды, описанные в частных и общих статьях, являются удовлетворительными для использования их по предназначению. Однако изза непостоянноro качества компонентов среды, особенно биоло rическоrо происхождения, может по надобиться коррекция концентраций некоторых инrредиен тов, например: пептонов, мясных или дрожжевых экстрак тов с учетом их питательных свойств; буферных веществ; желчных солей, желчноro экстракта, дезок сихолата и красящих веществ, в зависимости от их селективных свойств; антибиотиков, в зависимости от их актив ности. ХРАНЕНИЕ Информация и рекомендации, при водимые в разделе «Хранение», не являются исчерпы вающими фармакопейными требованиями, и компетентные уполномоченные opraHbI MoryT указывать конкретные условия хранения, обяза тельные для исполнения. Описанные в Фармакопее продукты следу ет хранить таким образом, чтобы предотвратить их заrрязнение И, по возможности, разложение. Если рекомендуются особые условия хранения, включая тип контейнера (см. раздел 1.3. Общие фармакопейные статьи) и температурные пре делы, эти рекомендации при водятся в частной статье. Ниже разъясняются термины, используе мые в частных фармакопейных статьях в разде ле «Хранение». «В воздухонепроницаемом конrnейнере» обозначает, что лекарственное средство должно храниться в воздухонепроницаемом контейнере (3.2). При вскрытии контейнера во влажнои aT мосфере принимают меры предосторожности. При необходимости низкая влажность содержи моro можеr поддерживаться с помощью осуша ющеro вещества, помещаемоro в контейнер. при условии отсутствия прямоrо контакта между ним Таблица #1.4.1 . I . 1 1 дополнительно l' , ! Темпе ат ные n е елы ,Условия хранения лекарственноrо средства р ур р д , указание (при указываемые на упаковке I б ) нео ходимости Лекаственное средство Не требует особых # 1 Н ет I «Не охлаждать» и ли : ловии хранения I . . « Не замо раживать'>..j Лекарственное средство требует условий xpa ! «Хранить при температуре.еНе охла wдать» I-1ЛИ ) ' , нения при температуре не выше 30 ос (TeMlle I выше 30 ОС» или «Хранить I «Не замораживать» ; ратура хранения от +2 ос до +30 ОС) при температуре ниже 30 ОС» I ! Лекарственное средство требует условий xpa «Хранить при температуре не «Не охлаждать» или : нения при температуре не выше 25 ос (темпе выше 25 ОС» или «Хранить «Не замораживать» ! ратура хранения от +2 ос до +25 ОС) при температуре ниже 25 ОС» ! Лекарственное средство требует хранения при «Хранить при температуре от «Не охлаждать» или I комнатной температуре 15 ос до 25 ОС» «Не замораживать» I Лекарственное средство требует хранения в «Хранить при температуре от «Не замораживать» I холодном или прохладном месте 8 ос до 15 ОС» I Лекарственное средство требует хранения в «Хранить при температуре от «Не замораживать» i холодильнике 2 ос до 8 ОС» I Лекарственное средство требует хранения при «Хранить В морозильной I температуре ниже О ОС камере» или «Хранить И i транспортировать в морозиль ной камере» Прuмечанuя: r:ри дополнительном указании «Не охлаждать» не допускается подверrать лекарственное средство воздействию температуры ниже 8 'С. ;юnускается кратковременное изменение условий хранения в процессе местной транспортировки (в пределах одноro населен нoro пункта) для лекарственных средств. не имеющих дополнительное указание по хранению «Не охлаждать» или «Не замора --ЗТЬ .
rосударственная фармакопея Республики Беларусь ФУНКЦИОНАЛЬНООБУСЛОВЛЕННЬ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВСПОМОiАТЕЛЬНblХ ВЕЩЕСТВ 24 и лекарственным средством. #При указании «за щищать от вла2и», относительная влажность в условиях хранения должна быть не более 60 %. # «В защищенном от света месте» обозна чае что лекарственное средство должно xpa ниться в контейнере, изrотовленном из матери ала, в достаточной степени поrлощающею свет, способный вызвать фотохимические превраще ния (актиничный свет); или контейнер должен быть помещен во внешний контейнер, обеспечи вающий такую защиту; или лекарственное cpeд ство должно храниться в месте, исключающем возможность попадания такою света. #«Температура». Лекарственное средство должно храниться в соответствии с требования ми, указанными в таблице #1.4. 1.# МАРКИРОВКА Маркировка реrламентируется компетент ным уполномоченным opraHoM с изданием co ответствующеro нормативною правовою акта. Таким образом, информация в разделе «Марки ровка» не претендует на полноту. Она ориенти рована прежде всеro на фармакопейные цели, и обязательными являются только те положения, которые необходимы для подтверждения co ответствия продукта статье. Вся остальная ин формация носит рекомендательный xapaKTep В тех случаях, Korдa в Фармакопее употребля ется термин «этикетка», соответствующая ин формация может быть помещена на контейне ре, на упаковке, во вкладыше или в сертификате анализа, сопровождающем лекарственное cpeд ство, в зависимости от решения компетентною уполномоченноrо opraHa. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ Описываемые в Фармакопее продукты и реактивы MorYT оказаться опасными для здоро вья, если не предпринять необходимые Mepы Во всех случаях следует придерживаться прин ципов Надлежащей лабораторной практики (НЛП, GLP), а также соответствующих положе ний техники безопасности. В некоторые статьи включены специальные указания о необходи мых мерах предосторожности, но отсутствие таких указаний не следует трактовать как OTCYT ствие всякоro риска. ПРИМЕСИ В частной фармакопейной статье может быть приведен перечень всех известных и по тенциальных примесей, для которых показано, что они контролируются испытаниями. См. также статью 5. 10. Контроль прuмесей в субстанциях для фармацевтичеСК020 использования. При меси обозначают буквой или буквами латинско ro алфавита Если какаялибо буква пропущена. это означает, что примесь, обозначенная с по мощью нее, исключена из списка примесей при разработке частной статьи до публикации либо при пересмотре этой статьи. Частные статьи на вспомоrательные Be щества MorYT содержать раздел с перечнем функциональнообусловленных характери стик. Параметры, любые методики определе ния и нормы, приведенные в этом разделе. не являются обязательными требованиями; тем не менее, они MorYT быть важны для исполь зования вспомоrательных веществ и приве дены для информации (см. также раздел 1.1. Общие положения). I СТАНДАРТНЫЕ ОБРА3ЦbI Некоторые частные статьи предусматри вают использование стандартных образцов (фармакопейных стандартных образцов, био лоrических стандартных препаратов, эталон ных спектров). См. также статью 5. 12. CтaH дартные обраЗЦbl. #Стандартные образцы, стандартные препараты и эталонные спектры вводятся в действие компетентным уполно моченным opraHoM. Полный перечень может быть получен в соответствующей орrаниза ции.# Эти стандартные образцы являются официальными в случае арбитража. 1.5 СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ А Оптическая плотность A1; Удельный показатель поrлощения А. м. Относительная атомная масса [а IC БСП Удельное оптическое вращение Биолоrический стандартный пре парат Фармакопейный стандартный об разец ФСО d 20 20 Относительная плотность 1" МЕ М М. М. Длина волны Международные Единицы Молярность Относител ьная молекулярная масса п 2О о Показатель преломления Единица действия Европейской Фармакопеи Частей на миллиард (микроrрам мов на килоrрамм) Частей на миллион (миллиrрам мов на килоrрамм) Вещество или раствор. указанный в rлаве 4. Реактивы Ph. Еш. U ррЬ ррт Р
общие сведения 25 R. Фактор подвижности (статья 2.2.46) R Используется в хроматоrрафии для обозначения пути, пройденно ro испытуемым веществом, к пути, пройденному стандартным образ цом РО Исходное стандартное вещество для установки титра титрованных растворов в объемном анализе (статья 4.2.1) Аббревиатуры, используемые в частных фармакопейных статьях на иммуноrлобули ны, сыворотки и вакцины LD 50 Медианная летальная доза. CTa тистически определенное количе ство вещества, которое при COOT ветствующем применении может вызвать смерть 50 % испытуемых животных за исследуемый период MLD Минимальная летальная доза L +/1 О dose Наименьшее количество токсина, которое в смеси с 0,1 МЕ антиток си на при обычном пути введения способно вызвать rибель лабора торных животных в эксперимен тальных условиях за исследуемый период L + dose Наименьшее количество токсина, которое в смеси С 1 МЕ аНТИТОI< сина при обычном пути введения способно вызвать rибель лабора торных животных в эксперимен тальных условиях за исследуемый период Ir/100 dose Наименьшее количество токсина, которое в смеси с 0,01 МЕ анти токсина при внутрикожном BBeдe нии способно вызвать xapaKTep ные реакции в месте введения у лабораторных животных в экспе риментальных условиях за иссле дуемый период Lp/1 О dose Наименьшее количество токсина, которое в смеси с 0,1 МЕ антитокси на при внутрикожном введении спо собно вызвать характерные реакции в месте введения у лабораторных животных в экспериментальных yc лов иях за исследуемый период Lo/1 О dose Наименьшее количество токсина, которое в смеси с 0,1 МЕ антиток сина и обычном пути введения He способно вызвать токсическую pe акцию у лабораторных животных в экспериментальных условиях за исследуемый период Lf dose ССI0 50 Е 1050 1050 РD 50 ЕD 50 PFU 8PF Количество токсина или токсино подобноro вещества, которое спо собно связать 1 МЕ антитоксина за кратчайшее время Медианная инфицирующая доза кулыурыклеток. Статистиче ски определенная доза вирусных частиц, которая при внесении в клеточную культуру способна ин фицировать 50 % клеток Медианная инфицирующая доза яиц. Статистически определенная доза вирусных частиц, которая при внесении в оплодотворенные яйца способна инфицировать 50 % эм брионов Медианная инфицирующая доза. Статистически определенная доза вирусных частиц, которая при BBe дении в орrанизм животных спо собна инфицировать 50 % особей Медианная защитная доза. Стати стически определенная доза BaK цины, которая в эксперименталь ных условиях способна защитить 50 % животных от инфицирующей дозы микроорrанизмов или токси нов, В отношении которых эта BaK цина активна Статистически определенная доза вакцины, которая в эксперимен тальных условиях способна ин дуцировать выработку антител к соответствующим антиrенам BaK цинЬ! у 50 % животных Оспинообразующие единицы или бляшкообразующее число Свободный от специфических патоrенов Коллекции микроорrанизмов АТСС С/Р /М/ Американская коллекция типовых культур Атеriсап Туре Cu/ture Collectioп . 10801 Uпivеrsitу Bou/eva,d Мапаssаs, Virgiпiа 201102209, USA Коллекция Пастеровскоro институ та (штаммы бактерий) Collectioп de Bacteries /'/пstititиtе Pasteur В. р. 52,25 rue du Docteur Roux 75724 Pa,is Cedex 15, Fraпce Международный институт миколоrии /пtеrпаtiопа/ Myc%gica//пstitute Bakeham Lапе Surrey TW20 9 ТУ, Great Britaiп
26 rосударственная фармакопея Республики Беларусь 'Р NC/MB NCPF NCTC NCYC Национальная коллекция культур микроорrаНИЗМ08 Соllесtiоп Nationa'e de Cufture de Мiсrооrgапisтеs (CNCM) /nstititute Pasteur 25, (ие du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France Национальная коллекция промыш ленных и морских бактерий Nаtiопа' Соllесtiоп of fndustriaf апd Marine Bacteria Ltd. 23 5t Machar Orive Aberdeen АВ2 1 RY, Great Britaiп Национальная коллекция патоrенных rрибов Nationa' Collection of Pathogeпig Fungi Lопdоп Schoo' of Hyg/ene and Tro pica' Medicine Керре/ 5treet Lопdол WC1 Е 7 НТ, G,eat Вritаiп Национальная коллекция типовых культур Nаtiопа' Collection of Туре Cu'tures Сепtrа' РиМс Hea'th Laboratory Соliпdа/е Avenue Lопdоп NVV9 5НТ, Great Britain Национальная коллекция дрожжевых культур Nationa' Соllесtiоп of Yeast Cultures AFCR Food Research /nstitute Со'пеу Lапе Norwich NR4 7 ИА, Great Britain N'TE 55/ Центр биолоrических ресурсов Bio'ogica/ Resources Center Oepartment of Biotechпofogy Nаtiопа//пstitиtе of Techпo'ogy aпd Еvа/иаtiоп 258 Kazusakamatary, Кisarazushi, Chiba, 2920818 Japaп rосударственный институт CЫBO роток 5tateпs 5е,ит /пstitиt 80 Amager Bou'evard, Сорепhаgеп, Deпmark #Украинская коллекция микроор rанизмов Институт микробиолоrии им. д. К. Заболотноro НАН Украины 01000, Киев,ул.Заболотноrо, 154, Украина #Коллекция штаммов Российско ro музея патоrенных бактерий rосударственный институт CTaH дартизации и контроля медицин ских биолоrических препаратов им.Л.А. Тарасевича 121002, Москва, СивцевВражек, 41, Российская Федерация #Белорусская коллекция непато reHHbIx микроорrанизмов (научная коллекция непатоrенных типовых и промышленно ценных микроор rанизмов института микробиоло rии НАН Беларуси) rHY «Институт микробиолоrии» НАН Беларуси 220141, Минск, ул. Купревича. 2, Республика Беларусь 1.6. ЕДИНИЦЫ МЕЖДУНАРОДНОЙ СИСТЕМЫ (СИ), ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ФАРfv1АКОПЕЙНЫХ CTA ТЬЯХ, И ИХ СООТВЕТСТВИЕ дРУrим ЕДИНИЦI\М МЕЖДУНАРОДНАЯ СИСТЕМА ЕДИНИЦ (СИ) Международная система единиц состоит из трех классов единиц физических величин, а именно: основные единицы, производные единицы и вcnоМоraтельные единицы'. Основные единицы и их опре деления приведены в таблице 1.б. 1. основные единицы СИ Таблица 1.6. 1 Величина ! Единица i ! СИМВОЛ, i ' I I Определение Наименование принятый в I #=азме: Наимено I СИМВОЛ I Фармакопее ость : вание . ! I 1 Один метр представляет собой Длина I L метр м I путб, который проходит свет в I ; i вакууме за 1/299 792 458 долю ! i секунды I I I : килоrрамм I Один килоrрамм равен массе Масса т М Kr международноrо прототипа ! I килоrрамма 1 Определения единиц, используемых 8 МеждународноЙ системе, даны в буклете "Le 5ysteme /пteтatioпa/ O'Uпites (5/»>, опу бликованной Bиreaи /п/етаtiОПа/ des Poids et fvIesиres. PaVll10п de Bre/eui/. F92310 5evres.
Общие сведения 27 Наименование Величина Символ, i принятый в ; Фармакопее Единица #Разме р Наимено Символ НОСТЬ вание Определение Время т секунда с Одна секунда представля ет собой продолжительность 9 192 631 770 периодов излу ! чения, соответствующих пе реходу между двумя CBepx тонкими уровнями OCHOBHoro состояния атома цезия133 I Щ r я т ка, к торыи, при I прохождении по двум пря I молинейным параллель I ным проводникам бесконеч I Электрический ток I ( ампер А I ной длины и пренебрежимо малой площади круroвоro I I поперечноro сечения, pac I : положенным на расстоянии I I 1 метр один от друrоrо в Ba кууме, вызывал бы силу вза ! I имодействия, равную 2'107 ньютона на один метр длины I Один кельвин представляет jтермодинамическая собой 1/273,16 часть TepMO (=абсолютная#) I т е кельвин К I температура i I I динамической температуры I тройной точки воды I I I ' I : , I I i I I Один моль представля I ет собой количество веще , ства системы, содержащей I I i Количество п 1'11 моль моль столько же структурных эле I вещества I ментов, сколько атомов co j I I держится в 0,012 Kr уrлеро i i , : дa 12' Кандела представляет собой I силу света источника, испу скающеrо в данном направ лении монохроматическое ; , Сила света I J кандела кд излучение частотой 540 -1 О' z ! . rерц, энерrетическая сила KOToporo в этом направле нии составляет 1/683 ватт на один стерадиан Один ампер представля ет собой силу неизменяю е ос о о П Если использованы моль. то следует указывать, к чему они относятся, например, атомы, Мaлe«yJ1bI. ионы_ электроны, иные ча стицы или определенные rpYnnbI таких объектов_ С) Размерность приведена в соответствии с техническим реrламентом «Единицы измерений. дonyweHHыe к применению на Tep ритории Республики Беларусь)} (ТР 2007/О0З/ВУ). Производные единицы MorYT быть образованы путем комбинирования основных единиц, соrлас но алrебраическим взаимоотношениям, связывающим соответствующие количества. Некоторые из таких производных величин имеют свои собственные названия и обозначения. Единицы СИ, исполь зуемые в Фармакопее, приведены в таблице 1.6.2.
28 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Величина Единица Символ, #Раз- I Выраже- Выраже- Преобразование Наименова- принятый Наименова- Сим- ние в ос- ние в иных иных единиц в ние в Фарма- мер- ние вол новных единицах единицы СИ . копее НОСТЬ СИ единицах Волновое v единица на 1/м M' число метр Длина волны л микрометр мкм 106 м нанометр нм 109 м Площадь A,S метр квадрат м 2 м 2 ный Объем v метр кубиче м 3 м 3 1 мл = 1 см 3 = ский 1 O м 3 Частота v Т 1 rерц rц c1 Плотность Р килоrрамм на Kr/M 3 Kr'M3 1 r/мл = 1 r/CM 3 = метр кубиче 103 Kr'M3 ский Скорость v метр в ceKYH м/с M'C' ду Сила F LMT 2 ньютон Н M'Kr'c2 1 дин = 1 r'cM'c 2 = 1 05 Н 1 Krc = 9,80665 Н Давление р L lMТZ паскаль Па M"Kr.c2 H'M2 1 дин/см 2 = 1 o, Па = 10' H'M2 1 атм = 101 325 Па = 101,325 кПа 1 бар = 105 Па = 0,1 МПа 1 мм рт. ст. = 133,322387 Па 1 торр = 133,322368 Па 1 фунт на KBa i дратный дюйм ! (psi) = 6,894757 кПа Динамиче f] паскальсе Па'с M"Kr'c' H'C.M2 1 пз = 10' Па'с = ская вязкость кунда 10' H.C'M2 ! 1 спз = 1 мПа'с Кинематиче v метр квадрат м 2 /с M2.c, Па'с'м 3 .кr , 1 Ст = 1 см 2 .с, = ская вязкость ный в ceKYH H.M'C-Kr ., 10-4 м2.с., ду Энерrия W иMТZ джоуль Дж m2'kr,c- 2 Н'М 1 зрr = 1 cM'r'c2 = 1 динсм = 107 Дж 1 кал = 4,1868 Дж Мощность р uмтз ватт Вт ? , H'M'C' 1 эрr/с = M'Kr.c I Поток излу Дж'с' 1 дин'см'с' = чения I 107 Вт = i I 1СУ Н-М'С' = 1СУ Дж'С' Поrлощенная О иТ 2 rрей I rp I M2.c2 Дж'кr' 1 рад = 102 rp ! доза ионизи I I I рующеro из I лучения ! ! Электриче И eMT3/1 вольт В ! M;;'Kr'c3'A '1 Вт'А' ский потен I I I I циал, элек i тродвижущая ! сила I Таблица 1.6.2 Единицы СИ, используемые в Фармакопее, и их соответствие дРУ2им единицам
Общие сведения 29 Величина Единица Символ, #Раз- Выраже- Выраже- Преобразование Наименова- принятый Наименова- Сим- ние в ос- ние в иных иных единиц в ние в Фарма- мер- ние вол новных единицах единицы СИ . копее ность СИ единицах Электриче R еМТЗ/2 ом Ом м2'кr'сЗ'А2 В-А 1 ское сопро тивление Количество Q ТI кулон кл Ас электриче ства Радиоактив А Р беккерель Бк c1 1 Ки = 37.109 Бк = ность веще 37.109 c1 ства KOHцeHTpa с моль на метр молы моль,мз 1 молы/л = 1 М = ция (коли кубический м з 1 моль/дм з = чества Be 103 моль,м- з щества), > молярная KOHцeHTpa ция Массовая р килоrрамм на кr/м З кr'мЗ 1 r/л = 1 r/дм з = KOHцeHTpa метр кубиче 1 кr'мз ция ский (") Размерность приведена в соответствии с техническим реrламентом «Единицы измерений. допyщetll8ol8lr l1l 91e1lИlО на Tep ритории Республики Беларусь» (ТР 2007ЮОЗ/ВУ). Некоторые важные и широко используемые единицы, не входящие в МеЖДУНЩXQfYIOOICТему СИ, приведены в таблице 1.6.3. Тaбnицa 1.6.3 Единицы, используемые наряду с Международной системой единиц Величина Единица Значение в eдмrr- си I Наименование Символ Время минута мин 1 мин = 60 с час ч 1 ч = 60 мин = 3600 с сутки сут 1 сут = 24 ч = 86 400 с Плоский уroл rрадус о 10 = (п/180) рад Объем литр л 1 л = 1 дм 3 = 1 0-3 м 3 Масса тонна т 1 т = 1 ОЗ Kr Частота вращения оборот в минуту обlмин 1 об/мин = (1/60) с- 1 Множительные приставки для образования десятичных кратных и дольных единиц npмвeдeны в Ta блице 1.6А. Тaбnица 1.6А Множители и приставки для образования десятичных кратных и дольных единиц Множитель Приставка Обозначение Множитель Приставка Обозначение 10 1В экса Э 10-1 деци д 1015 пета П 1 02 санти С 1012 тера Т 10З милли м 109 rиrа r 106 микро мк 106 Mera М 109 нана н 10 З кило к 1012 ПИКО ; П 10: reKTO r 1 015 фемто I Ф 10' дека да 10-18 апо а ПРИМЕЧАНИЯ 1. В Фармакопее используется температура по Цельсию (символ t). Температура по Цельсию опре .::\еляется соrласно формуле:
30 rосударственная фармакопея Республики Беларусь t == Т То ' rде: То 273,15 К. Температура по Цельсию выражается в rpa дусах Цельсия (символ ОС). Один «rрадус Цель сия» равен одному «кельвину». 2. Практические выражения для KOHцeHTpa ций определены в Общих положениях. 3. Радиан представляет собой плоский уrол, вырезающий на окружности дуry, равную по длине радиусу. 4. Условия центрифуrирования определяют ся центробежным ускорением по отношению к ускорению свободноro падения (g), которое при нимается равным 9 = 9,80665 M.c2. 5. Некоторые величины используются без размерности, как, например. относительная плотность (2.2.5), оптическая плотность (2.2.25), удельный показатель поrлощения (2.2.25) и по казатель преломления (2.2.6). 6. Микрокатал определяется как энзимати ческа я активность, которая при указанных yc ловиях приводит К превращению (например, к rидролизу) 1 микромоль субстрата за одну ce кунду. #1.7. ОТБОР ПРОБ ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ Выборка количество штучной продук ции, отобранной из контролируемой серии (партии). ,отовое лекарственное средство (про дукт) лекарственное средство (продукт), прошедший все стадии технолоrическоrо про цесса, включая маркировку, упаковку, лабора торный контроль. Контейнер изделие, которое содержит продукцию или предназначено для ее xpaHe ния и находится или может находиться в He посредственном контакте с ней. Укупорочное средство является частью контейнера. Контроль процедура оценки COOTBeT ствия путем измерений, наблюдений, испыта ний или калибрования соответствующих xa рактеристик. Контаминация процесс заrрязнения. Нефасованный продукт (аН2РО или ,п bu/k product) продукт, прошедший все стадии технолоrическоro процесса, кроме упаковы ван ия. Отбор проб действия по изъятию проб сырья, материалов, полупродуктов, промежу точной и rотовой продукции для исследова ния их качества. Объем выборки число выборочных единиц в выборке. Объединенная проба .проба продукции, состоящая из нескольких точечных проб, OTO бранных из контролируемой партии. Образец продукции единица конкретной продукции, используемая в качестве представи теля этой продукции при исследовании, KOHTpO ле и оценке. Промежуточная продукция частично обработанное сырье или продукция, которые должны пройти последующие технолоrические операции прежде, чем стать нефасованной про дукцией. Проба количество нештучной продукции, отобранное из контролируемой серии (партии) .для принятия решения и состоящее из несколь ких точечных проб. Сырье субстанции для фармацевтиче скоro использования, части лекарственных pac тений или продукты их переработки, вспомоrа тельные вещества собственноro производства или получаемые от внешних постаВЩI4IЮВ, ис пользуемые в производстве лекарственных средств, за исключением маркировочных и упа ковочных материалов. Серия (партия) количество продукции одноrо наименования, полученное в одном Tex нолоrическом цикле или в течение определенно ro интервала времени, в одних и тех же услови ях и одновременно представленное на контроль. Качество серии (партии) должно быть YДOCTOBe рено одним документом. Точечная проба количество продук ции, взятое за один раз из одноro места серии (партии) одномоментно. Упаковка средство или комплект средств, обеспечивающее защиту продукции от повреж дений и потерь, окружающей среды от заrрязне ния, а также процесс обращения продукции. Упаковочная единица упаковка, содержа щая установленное количество продукции. Чистая зона зона. в которой окружающая среда контролируется на наличие контаминиру ющих частиц и микроорrанизмов, построенная и эксплуатируемая таким образом, чтобы YMeHb шить их проникновение и образование контами нантов внутри зоны. ОБЩИЕ ПРАВИЛА Если в частных статьях не указано иное, отбор проб для испытаний должен проводиться в соответствии с процедурой отбора. Процедура отбора проб включает: план или схему отбора проб; место и время отбора проб; извлечение и подroтовку проб продукции для испытаний; объем и тип отбора проб; параметры окружающей среды при отборе и подrотовке проб для испытаний. Все оборудование, используемое для отбора проб, включая измерительное оборудо вание для проведения испытаний, связанных
Общие сее)вJ.. 31 с отбором проб. ДОЛЖНО удовлетворять требо ванияu норматиsной документации или проце дуре отбора проб и работать в соответствии с данной npoцедурой или инструкциями (эксплу тационной документацией) на оборудование. Измерительное оборудование должно пройти в установленном порядке поверку или апеста цию Персонал, выполняющий отбор проб, должен владеть процедурой отбора. ДOKYMeH тация по процедуре отбора проб должна Haxo диться в местах отбора проб и быть доступной для персонала. В процоссе проведения отбора проб необ ходи'Мо учитывать факторы, которые должны контролироваться с тем, чтобы обеспечить достоверность результатов испыта.ний. К ним относятся: показатели, обеспечивающие co' ответствие контролируемых показателей каче ства и безопасности проб показателям объек та испытаний и стабильность этих показателей в течение периода проведения испытаний; па раметры окружающей среды и друrих воздей ствующих на пробы факторов. Пробы, прошедшие отбор, должны COOT ветствующим образом идентифицироваться с использованием единой маркировки и оформ ляться актом отбора или друrим документом, включающим дату, время и место отбора, усло вия окружающей среды при отборе, фамилию, имя и отчество лица, проводившеro отбор, и друrую необходимую информацию. Если поставка сырья или roтовой продук ции состоит из нескольких серий (партий), то каждую серию (партию) необходимо paCCMa тривать как отдельную в отношении отбора проб и проведения испытаний. Во избежание ошибок при отборе проб не допускается отбор проб одновременно от двух и более наименований, двух и более серий (партий) сырья или roтовой продукции. Отбор проб для нефасованной продукции (aHrpo или bu/k product) должен осуществлять ся в стерильные контейнеры. Упаковка должна обеспечивать приroдность пробы для проведе ния испытаний. К отбору от следующей серии (партии) поступившеro сырья или roтовой продукции можно приступать только после выполнения всей процедуры отбора от предыдущей серии (партии). Отбор проб следует производить только из неповрежденных укупоренных и упакован ных соrласно нормативной документации упа ковочных единиц. До liI после проведения испытаний пробы должны храниться в отдельном помещении. Yc ловия в помещении должны обеспечивать co хранность проб в течение всеro срока хранения. Перед отбором проб необходимо произве сти внешний осмотр упаковочной тары (ящики, короба, барабаны, бутыли и т. д.), определить ее количество, целостность, наличме П11OIo1б. правильность маркировки и оформленме проводительной документации, а также COOT ветствие тары и упаковки требованиям специ фикации. Количество упаковочных единиц, отобран ных для отбора, рассчитывают по формуле: 0,4.JП , rдe: п общее количество упаковочных единиц одной серии (партии). Количество вскрытых упаковочных единиц должно быть не менее 3 и не более ЗО. Отбор проб сырья необходимо производить в отдельном помещении или в складском поме щении таким образом, чтобы предотвратить KOH таминацию. Для проведения испытаний лекарственных средств на соответствие требованиям норматив ной документации проводят мноroступенчатый отбор проб. При мноroступенчатом отборе пробу образуют по ступеням и продукцию в каждой CTY пени отбирают случайным образом в пропорци ональных количествах из единиц, отобранных в предыдущей ступени. Число ступеней определя ется видом упаковки. 1 ступень: отбор единиц упаковочной тары (ящиков, коробок, мешков и др.) 11 ступень: отбор упаковочных единиц, Ha ходящихся в упаковочной таре (пакетов, флако нов, банок, бутылок, рулонов и др.) 111 ступень: отбор продукции в первичной упаковке (ампул, флаконов, туб, контурных упа ковок и др.) При отборе проб необходимо принимать меры предосторожности и требования безопас ности с учетом токсичности, взрывчатости, orHe опасности, rиrроскопичности и друrих свойств сырья, а также меры, направленные на предо хранение проб (образцов) от повреждения и заrрязнения во время работы с ними, к их упа ковке, транспортировке, складированию и xpa нению с учетом требований и методов последу ющих испытаний. При отборе проб лекарственных средств списка «А», наркотических и психотропных ле карственных средств следует PYKOBOДCTBOBaTb ся правилами, инструкциями и положениями, YT вержденными компетентным уполномоченным opraHoM, и частными статьями на эти лекар ственные средства. При отборе проб запрещается принимать пищу, пить, I{УРИТЬ, а также хранить еду, cpeд ства для курения в специальной одежде или месте отбора проб. Персонan, занятый отбором проб, должен строю соблюдать инструкции, реrламентирую щие состояние здоровья и требования личной rиrиены, носить специальную обувь.
32 Тосударственная фармакопея Республики Беларусь ОТБОР ПРОБ ИЗ НЕФАСОВАННОЙ ПРОДУКЦИИ (AHrpO ИЛИ /N BULK PROOUCT) Проба из нефасованной продукции должна представлять собой объединенные точечные пробы, взятые примерно в равных количествах. Отбор точечных проб (объединенная проба) необходимо производить из верхнеro, среднеro и нижнеro слоев каждой упаковочной единицы, убедиться в однородности сыпучих, вязких и re TeporeHHbIx препаратов. При отборе проб сыпучих и вязких лекар ственных средств, фармацевтических субстан ций и вспомоrательных веществ для предотвра щения перекрестной контаминации точечные пробы необходимо отбирать чистыми и стериль ными пробоотборниками, изroтовленными из материала, не реаrирующеro с данным сырьем. Детали пробоотборников, контактирующие с сырьем, должны быть обработаны специальны ми антисептиками, разрешенными к примене нию компетентным уполномоченным opraHoM. В случае, если перемешивание жидкости затруднено (большие емкости), точечные пробы отбирают без перемешивания из разных слоев. ОТБОР ПРОБ ,ОТОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННblХ СРЕДСТВ (rотовой ПРОДУКЦИИ) Отбор проб roтовых лекарственных средств (продукции) должен производиться из HeHapy шенных заводских упаковочных единиц. Отбор проб roтовых лекарственных средств для инъекций и rлазных лекарственных средств на отсутствие в них механических включений должен про изводиться соrласно соответствую щей документации, утвержденной компетент ным уполномоченным opraHoM. Отбор проб аэрозолей проводят в соответ ствии с требованиями частных статей.
2.1.2. Сравнительная таблица пористости стеКЛЯННblХ фильтров зз 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА 2.1. ОБОРУДОВАНИЕ 01/2013:20101 2.1.1. КдПЛЕМЕР Термин «капли» обозначает стандартные капли, вытекающие из стандартноro каплемера, как описано ниже. Стандартные каплемеры (рисунок 2.1.1 1 ) изrотавливают из бесцветноro стекла. Нижний конец имеет круrлое отверстие, расположенное в плоскости, перпендикулярной оси. Друrие каплемеры #(пипетки)# MOryT быть использованы, если они отвечают требованиям следующеro теста. 20 капель воды Р при температуре (20:t1) ОС, свободно вытекающих из каплемера #(пипетки)#, удерживаемоrо в вертикальном положении, со скоростью одна капля в секунду. должны иметь массу (1000:t50) Mr. Каплемер #(пипетки)# перед использовани ем должен быть тщательно вымыт. Проводят три определения для каждоro каплемера #(пипетки)#. Ни один из результатов не должен отклонять ся более чем на 5 % от среднеro значения трех определений. 5 '1 о I о с') l о 1,0 3,00 3,05 Рисунок 2.1.1. 1. Стандартный каплемер (размеры указаны в миллиметрах) 01/2013:20102 2.1.2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ТАБЛИЦА ПОРИСТОСТИ СТЕКЛЯННЫХ ФИЛЬТРОВ Пори Макси 1:1; 1:1; ,1:1; :S: :S: 0:S: стость мальный Ж ::r :о: Ж со Ж :S:CO # фильтра ::Е со I:; диаметр о. о. ф:s: (Ph. Eur.)(1) пор,мкм е то. \D 1.6 менее 1,6 5f пор 1,6 12,5 5 5 1,6З пор 3,0 4 1,6 4 5 310 ПОР 10 10 410 4f 4 ! 16 1016 4 4 пор 16 40 ! 160 3 3 3 пор 40 : 4050 2 I 100 40100 2 2 пор 100 5 3.а.. J "!2 Таблица 2.1.2. 1 Пори Макси 1:1; 1:1; , 1:1; :S: :S: о :S: СТОСТЬ мальный Ж ::r :.: :t со Ж :S: со # фильтра диаметр ::Е со к::: I Q. Q. ф:s: I (Ph. Eur.)(1) пор,мкм е т! 100120 1 I 160 100160 1 1 I !пор 160 150200 О О 250 160250 I I ПОР 250 200500 '00 250500 пор 500 ." Европейская Фармакoneя приняла систему. предложенную Международной по Стандартизации (150).
з4 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Возможно следующее применение филь тров (диаметр в микрометрах), пределы KOlpЫX являются приблизительными: #<1 ,6 фильтрование коллоидных pac творов;# #1 ,6 16 фильтрование аморфных ocaд ков;# <2,5 бактериолоrическое фильтрова ние; 410 ультратонкое фильтрование, OT деление микроорrанизмов большоro диаметра; 10------40 аналитическое фильтрование, очень тонкое фильтрование ртути, очень тонкое дисперrирование rазов; #16------40 фильтрование мелкокристалли ческих осадков;# 40 1 00 тонкое фильтрование, филь трование ртути, тонкое дисперrирование rазов; 100160 rрубое фильтрование, дис перrирование v. промывка rазов, использование в качестве подложки для друrих фильтрующих материалов; #фильтрование rрубозернистых и студнеобразных осадков#; 160500 очень rрубое фильтрование частиц, дисперrирование и промывка rазов. 01/2013:20103 2.1.3. ЛАМПЫ С УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ ДЛЯ u АНАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕИ В качестве источника улырафиолетово ro излучения используются пары ртути в KBap цевых лампах. Для устранения испускаемой лампой видимой части спектра может ИСI10ЛЬ зоваться подходящий фильтр. Если Фармакопея предписывает использование в испытании уль трафиолетовой лампы с длиной волны 254 нм или З65 нм, используют прибор, состоящий из лампы, содержащей пары ртути, и фильтра, дa ющеro спектр излучения с максимальной интен сивностью около 254 нм или 365 нм. Использу емая лампа должна позволять без затруднений обнаруживать стандартное пятно натрия сали цилата диаметром около 5 мм на пластинке со слоем силика2еля G Р, причем пятно должно ис следоваться в положении, перпендикулярном к излучению лампы. Для этой цели используют 5 мкл раствора 0,4 r/л натрия салицилата Р в 96 % спирте Р (спирт не должен флуоресцировать) для ламп с максимальным излучением 254 нм и 5 мкл paCT вора 2 r/л в. 96 % спирте Р для ламп с макси мальным излучением 365 нм. Расстояние между лампой и хроматоrрафической пластинкой, при проведении испытаний, указанных в общих и частных статьях, не должно превышать расстоя ния при проведении вышеуказанноro испытания. 01/2013:20104 2.1.4. СИТА Сита с квадратными отверстиями изroтав ливают из соответствующих материалов. Для неаналитических процедур MOryT быть исполь зованы сита с круrлыми отверстиями, диаметр которых в 1,25 раза превышает размер стороны квадратноro отверстия сита соответствующею номера. Не должно быть взаимодействия между материалом, из которою изютовлено сито, и Be ществом, которое просеивают. Степень измель чения в частной статье указывают, используя номер сита, соответствующий номинальному размеру стороны отверстия в микрометрах, KO торый приводится В скобках после названия Be щества (таблица 2.1.4. 1). 'S ::a :1: :е .lI ::.:: Е:; :е Ii S S :et Оа. :1: Ф co ra ... "'0 sQ. I i i Q. I ! 11 200 i 8000 5600 , 4000 2800 2000 1400 1000 710 500 355 250 180 125 90 63 45 38 Таблица 2.1.4.1 Диаметр прово ЛОКИ,мкм I Допуск дЛЯ OT rРСТИМ '::.:: I I u 1 :1:... U >. MU >. 50; eg. l ' 5 qS ФСО q ... :1:..., S 'S U qo ' ::аа. Ф ra ..а :l: Ф аоа. :1: .D U Ф б r::; о I ... qra q ::.::аоl Ф i ::.:: uo;,:e ra I о l ' :;: ОФ! 11:17 , ..+. i +Х ! :tY i +Z d d max 77 60 .1 2900 600 250 I 430 2000 2300 470 180 320 1600 1900 370 130 250 1400 1700 290 90 190 1120 1300 230 70 150 900 1040 180 50 110 710 820 140 30 90 560 640 112 25 69 450 520 89 18 54 315 360 72 13 43 224 260 58 9,9 34 160 190 47 7,6 27 125 150 38 5,8 22 90 104 32 4,6 18 63 72 26 3,7 15 45 52 22 3,1 13 32 37 30 35 Q. ... 'S Ф :е .lI ra :l:s q co,s &::а :1: :1: ф.lI , l ' (l) S а.:е I ! r::; Ф q Ф Q. Е: 'S ::а :е S ... U >. Е: о Q d. ; , mю 2100 i 1700 i 1300 I 1200 950 770 600 480 380 270 190 130 106 77 54 38 27 24
.2.1.6. Индикаторные трубки 35 Максимальный допуск (см. Международ ttый Стандарт /SO 3310/1(1975» для разме ра отверстия (+Х): не должно быть отверстий, размер которых превышает номинальный размер более чем на величину х: Х = 2(т О . 75 ) +4(т О . 25 ). 3 rде: т номинальный размер отверстия. Допуск для среднеro значения размера отверстия (:1: У): средний размер отверстия не должен отклоняться от номинальноrо размера более чем на величину :1: У: т о . 9В Y=+16. 27 ' Промежуточный допуск (+Z): не более 6 % общеro числа отверстий MorYT иметь разме ры между {(номинальный +Х» и «номинальный +Z»: z= x+y . 2 Диаметр проволоки d: диаметр проволо ки, применяемой для плетения металлич ской проволочной ткани, вставленной в рамку, представлен в таблице 2_1.4.1. Номинальный диаметр проволоки может отличаться от зна чения d внутри пределов d max и d miл . Пределы установлены в допустимом диапазоне :t15 0/0 от рекомендуемых номинальных размеров. Диаметр проволоки по всему ситу должен быть одинаковым. 01/2013:20105 2.1.5. ПРОБИРКИ ДЛЯ СРАВНIt1ТЕЛЬНЫХ ИСПЫТАНИИ Пробирки, используемые для сравнитель ных испытаний, это специально подобран ные пробирки из бесцветноro стекла с одина ковым внутренним диаметром и прозрачным плоским дном. Слой жидкости исследуется сверху вниз по вертикальной оси пробирки на белом или, при необходимости, на черном фоне. Испытание проводят при рассеянном свете. Обычно используются пробирки с BHYTpeH ним диаметром 16 мм. Пробирки с большим BHY тренним диаметром MorYT быть использованы вместо вышеупомянутых при условии увеличе- ния объема испытуемой жидкости на столько, чтобы высота жидкости в пробирках была не ниже, чем при аналоrичном испытании с исполь зованием жидкости в пробирках с внутренним диаметром 16 мм. 01/2013:20106 2.1.6. ИНДИКАТОРНЫЕ ТРУБКИ Индикаторные трубки это rерметизи рованные цилиндрические трубки, состоящие из инертноro прозрачноrо материала и CKOH струированные с учетом возможности пропу скания через них rаза. Они содержат peareHT, подходящий для визуализации обнаруживае моro вещества, адсорбированный на инерт ном носителе, и, при необходимости, очищаю щие слои и/или адсорбирующие фильтры для удаления веществ, которые MorYT взаимодей ствовать с обнаруживаемым веществом. Слой индикатора содержит либо один peareHT, по зволяющий обнаружить определенное веще ство, либо насколько peareHToB для обнару жения нескольких веществ (однослойные и мноroспойные трубки). Испытания проводят путем пропускания тре- буемоro объема rаза через индикаторную трубку. Длина окрашенноro слоя или интенсивность из менения цвета на rрадуировочной шкале явля ется функцией и мерой массовой концентрации определяемоro компонента. Проверка индикаторных трубок проводится в соответствии с инструкциями изroтовителя. Под20товка к измерению. Про водится со- rласно инструкциям изroтовителя или следую щим образом. Устройство для подачи rаза под соединяют к реryлятору давления с иrольчатым клапаном. Соединяют rибкий шланr трубки с Участью клапана и продувают систему (рисунок 2.1.6. 1). Присоединяют открытый конец индика торный трубки к короткому концу шланrа и pery лируют насосом объем анализируемою rаза, про- ходящеro через трубку. Записывают значения, соответствующие длине окрашенною слоя или интенсивности цвета на rрадуировочной шкале. При отрицательном результате анализа индика торная трубка должна быть откалибрована rазом, содержащим соответствующую примесь. Ввиду использования в воздухозаборном устройстве масла необходимо проверить peaK цию трубки на используемое масло. Информа ция о реакционной способности для различных масел приводится в сопроводительном листке, прилаrаемом к трубке. Если используемое масло не указано в сопроводительном листке, изrотовитель трубки должен проверить реакци онную способность и при необходимости обе спечить при60р специальной трубкой для дан- I-юю масла.
36 rосударственная фармакопея Республики Беларусь 2 з 4 5 6 1 подача rаза; 2 реryлятор давления; 3 иrольчатый клапан; 4 "у" конец; 5 индикаторная трубка; б насос для индикаторной трубки; 7 открытый конец для выхода rаза в атмосферу. Рисунок 2.1.6. 1. Прибор для индикаторных трубок Индикаторная трубка для диоксида уrле- рода. rерметизированная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подхо дящие носители для индикаторов: rидразина и кристаллическоro фиолетовоro. Минимальная определяемая концентрация 100 ррт с OTHO сительным стандартным отклонением :1:15 %. Индикаторная трубка для диоксида серы. rерметизированная стеклянная трубка, coдep жащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикаторов: йода и крахмала. Минимальная определяемая концентрация 0,5 ррт с относительным стандартным отклоне нием :1:15 %. Индикаторная трубка для масел. rермети зированная стеклянная трубка, содержащая aд сорбирующие фильтры и подходящие носители для индикатора кислоты серной. Минималь ная определяемая концентрация 0,1 мr/м З с относительным стандартным отклонением :1:30%. Индикаторная трубка для монооксида азота и диоксида азота. rерметизированная стеклянная трубка, содержащая адсорбирую щие фильтры и подходящие носители для окис ляющеro слоя (соль Cr (VJ» и индикатора ди фенилбензидина. Минимальная определяемая концентрация 0,5 ррm с относительным CTaH дартным отклонением :1:15 %. Индикаторная трубка для моноокси- да уrлерода. rерметизированная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикаторов: йода (V) оксида, селена диоксида и кислоты серной ды мящей. Минимальная определяемая KOHцeHTpa ция 5 ррm или менее с относительным CTaH дартным отклонением :1:15 %. 7 Индикаторная трубка для сероводорода. rерметизированная стеклянная трубка, coдep жащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикатора соли свинца. Мини мальная определяемая концентрация 1 ррm или менее с относительным стандартным откло нением :1:10 %. Индикаторная трубка для паров воды. rерметизированная стеклянная трубка, coдep жащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикатора перхлората маrния. Минимальная определяемая концентрация 67 ррт или менее с относительным CTaHдapT ным отклонением :1:20 %. 2.2. ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО- ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 01/2013:20201 2.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЗРАЧНОСТИ И СТЕПЕНИ МУТНОСТИ ЖИДКОСТЕЙ ВИЗУАЛЬНЫЙ МЕТОД Для определения прозрачности и степени мутности жидкостей используют одинаковые про бирки из бесцветноro, прозрачноro и нейтрально ro стекла с плоским дном, которые имеют BHYTpeH ний диаметр от 15 мм до 25 мм. Слой испытуемой жидкости толщиной 40 мм сравнивают с 40мил лиметровым слоем свежеприrотовленноro, как описано ниже, эталона. Сравнение растворов проводят при рассеянном дневном освещении через 5 минут после приroтовления эталона, про- сматривая объекты вдоль вертикальной оси про бирок на черном фоне. Рассеянный свет должен быть таким, чтобы эталон I леrко отличался от воды, а эталон 11 леrко отличался от эталона 1. Прозрачными считаются жидкости, которые по прозрачности не отличаются от воды Рили раствора, который используют при приroтовле нии жидкости в описанных выше условиях, или которые не превышают по интенсивности мут ность эталонной суспензии 1. Раствор rидразина сульфата. 1,0 r 2идpa зина сульфата Р растворяют в воде Р и доводят водой Р до объема 100,0 мл. Раствор выдержи вают в течение 46 ч. Раствор rексаметилентетрамина. 2,5 r 2eK саметилентетрамина р растворяют в 25,0 мл
2.2.1. Определение прозрачности и степени мутности жидкостей 37 воды Р в колбе вместимостью 100 мл со CTe клянной притертой пробкой. Исходная опалесцирующая суспензия (суспензия формазина). 25,0 мл раствора rидра _на сульфата прибавляют к приroтовленному раствору rексаметилентетрамина, перемеши вают и выдерживают в течение 24 ч. Суспензия стабильна в течение 2 месяцев при хранении в стеклянной посуде, которая не имеет дефектов rюверхности. Суспензия не должна прилипать к стеклу и перед применением должна быть тща тельно перемешана. Основная опалесцирующая суспензия. 15,0 мл исходной опалесцирующей суспензии доводят водой Р до объема 1000,0 мл. Срок rод ности основной опалесцирующей суспензии 24 часа. Эталоны. Приroтовление эталонов прово дят в соответствии с таблицей 2.2.1. 1. OCHOB ную опалесцирующую суспензию и воду Р CMe шивают и встряхивают перед применением. Таблица 2.2.1.1 1 11 111 IV Основная опа лесцирующая 5,0 10,0 30,0 50,0 суспензия, мл Вода Р, мл 95,0 90,0 70,0 50,0 Эталон мутности. Суспензия формазина, приroтовленная смешиванием равных объемов раствора rидразина сульфата и раствора reKca метилентетрамина, является исходной суспен зией с 4000 NTU (Nephe/omet,ic Tu,bidity Uпits нефелометрические единицы мутности). Эта лоны 1, 11, 111 и IV имеют значения 3 NTU, 6 NTU, 18 NTU и 30 NTU соответственно. Стабилизиро ванные суспензии формазина, приrодные для приroтовления стабильных разведенных этало нов мутности, являются коммерчески доступны ми и MOryT быть использованы в случае, если выдерживают сравнение с эталонами, приroтов пенными, как указано выше. Формазин обладает характеристиками, дe пающими ero превосходным эталоном MYTHO сти. Он может быть воспроизводимо приroтов пен из реактивов. Физические характеристики Qелают ero желательным эталоном для rрадуи :ювки светорассеяния. Полимер формазин co ::тоит из цепей различной длины, которые при имают случайные конфиrурации, что ПРИВОДИТ [ получению частиц с широким спектром форм 1 размеров, аналитически соответствующих ча :тицам С различными размерами и формами, lаходящимся в испытуемых образцах. Блаroда 'я трассируемости и воспроизводимости CBeTO ,ассеивающих свойств формазина инструмен альные калибровочные алroритмы и критерии '. Зак 1712 выполнения по большей части основаны на этом стандарте, ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЕ Степень мутности раствора может быть определена с помощью инструментальноro из мерения поrлощения или рассеяния света за счет субмикроскопических неоднородностей оп тической плотности опалесцирующих растворов и суспензий. На практике используются 2 метода: нефелометрия и турбидиметрия. Для измерения мутности окрашенных испытуемых образцов ис пользуют методы относительной турбидиметрии и нефелометрии с выбором отношения. Эффект рассеяния света суспендированны ми частицами может быть измерен с помощью либо проходящеro света (турбидиметрия), либо рассеянноro света (нефелометрия). Относитель ная турбидиметрия сочетает принципы и нефе лометрии, и турбидиметрии. Тубидиметрия и He фелометрия MOryT использоваться в случае со слеrка опалесцирующими суспензиями, Усло вия приroтовления эталона должны быть четко оroворены. Для количественных определений существенным является построение калибро вочноro rрафика, так как зависимость между оп тическими свойствами суспензий и KOHцeHTpa ции дисперrированной фазы является в лучшем случае полуэмпирической. . Определение опалесценции окрашенных жидкостей проводят методом относительной турбидиметрии или нефелометрии с выбором отношения, так как окрашивание оказывает He rативное воздействие, ослабляя как падающий, так и рассеянный свет, и уменьшает значение мутности. Эффект настолько велик, что даже в случае умеренно окрашенных образцов обыч ные нефелометры не MOryт быть использованы. Инструментальная оценка прозрачности и опалесценции является более селективным Me тодом, который не зависит от остроты зрения аналитика. Числовые результаты более наrляд ны для мониторинrа качества и контроля про цесса, особенно в проверке стабильности при хранении. Например, предварительные число вые данные по стабильности MOryT быть исполь зованы для определения возможности тоro, что данная партия лекарственноro средства или aK тивноro фармацевтическоrо инrредиента превы сит предельное значение для срока rодности до окончания срока хранения. НЕФЕЛОМЕТРИЯ при просматривании суспензии под опреде ленным уrлом к направлению падающею света система кажется мутной вследствие отраже ния света от частичек суспензии (эффект Тин даля). Опредeneнная часть световоro луча, по падающеro в мутную жидкость, проходит через нее, друraя часть поrлощается, а оставшаяся
38 rосударственная фармакопея Республики Беларусь часть рассеивается суспендированными части цами. Если измерение проводят под уrЛОlv: 900 к падающему лучу света. рассеянный суспен,L'И рованными частицами свет может быть исполь зован для определения их концентрации, обу словленной колlt1чеством и размерами частиц, влияющих на константу остаточноro рассеяния. Эталон должен иметь постоянную степень мут ности, а испытуемый образец и эталон должны быть приroтовлены в идентичных условиях. Эффект Тиндаля зависит и от числа частиц, и от их размеров. Нефелометрические данные более достоверны при низкой мутности суспен зий, Korдa наблюдается линейная зависимость между значением нефелометрической единицы мутности (NTU) и относительным сиrналом дe тектора. При возрастании степени мутности па дающий свет попадает не на все частицы, а pac сеянное излучение друrих частиц поrлощается на пути к детектору. Максимальное нефеломе трическое значение, при котором может быть проведено достоверное измерение, находится в диапазоне 17502000 NTu. ДЛЯ подтвержде ния линейности необходимо построение rрадуи ровочноro rрафика как минимум по 4M KOHцeH трациям. ТУРБИДИМЕТРИЯ Мутность это оптическое свойство, воз никающее при взаимодействии между светом и суспендированными в жидкости частицами. Это определение оптическою свойства, обусловли вающеro то, что падающий свет в большеи CTe пени рассеивается или поrлощается. чем про ходит через испытуемый образеu по прямой. Количество твердых частиu В суспензии r,'ожет быть определено с помощью измерения ин тенсивности прошедшеrо света. Линейная за висимость между мутностью и концентрацией наблюдается в случае однородности и roMoreH ности размера частиц в суспензии. Это справед ливо только для очень разведенных суспензий, содержащих маленькие частицы. Для подтверж дения линейности необходимо построение rpa дуировочноro rрафика как минимум по 4M KOH центрациям. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ТУРБИДИМЕТРИЯ В относительной турбидиметрии находит ся отношение интенсивности прошедшеro света к интенсивности рассеянноrо света под уrлом 900. Проведение такоro испытания компенсиру ет влияние окрашивания испытуемоro образца. Этоro эффекта можно добиться также за счет использования инфракрасноro светоиcnycкакr щеro диода при длине волны 860 НМ. ФоТОI\И одные детекторы прибора получают и измеря ют интенсивность рассеянноro света под уrлом 900, а также интенсивность рассеяния в прямом направлении (отраженный свет) перед испытуе мым образцом и интенсивность света, прошед шеro через испытуемый образец. Измеренные результаты в единицах NTU (отношение) рассчи тываются делением интенсивности рассеянно ro света под уrлом 900 на сумму интенсивности рассеяния в прямом направлении и интенсивно сти прошедшеro света. В относительной rурби диметрии влияние постороннею света становит ся незначительным. Нефелометры используют для измерения стеПЕ:НИ мутности бесцветных жидкостей. Определение степени мутности эталuнов IIV с помощью относитеЛЫ-iОИ 1 урбидимеТРIi:И показа ло, что зависимость между концентрациями и изме ренными значениями NTU (таблица 2.2.1.2) явля ется линейной. Эталоны IIV trф РБ) Muryт быть использованы для rpадуировки прибора. Таблица 2.2.1.2 I Сусп .нзия форма- Тз н а ч.;;и. о ';ап.сцен-I зина I ции (NTU) ! I Э эталон"" j ! I талон .. l ' 18 ' ! Этаrюн 111 ! Эталон IV r ' 301 i Основная I I : опалесцирующая I 60 ' : суспензия 1 i I Исходная i I lопалесцирующая! 4000 l суспензия . ... ИНСТРУМЕНТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПАЛЕСЦЕНЦИИ Требования, приведенные в частных фар макопейных статьях, указаны в терминах для визуальноro определения степени мутности в сравнении с конкретным эталоном. Может быть использован также и инструментальный метод определения степени мутности при yc ловии,чтоприБОРСGответствуеттрБованиям, указанным ниже, и если ПIJОБедена rрадуиров ка с использованием эталонов IIV и воды Р или используемоro растворителя. Прибор. В качестве используемых источ ников света в приборах для относительной TYP бидиметрии или нефелометрах с Вl:?lбором OT ношения используют вольфрамовую лампу со спектральной чувствительностью около 550 нм, работающую при температуре 2700 К, или ин фракрасный светоиспускающий диод, имеющий максимум испускания при 860 нм со спектраль ной полосой пропускания 60 нм. Moryт исполь зоваться И друrие подходящие источники света. В качестве детекторов, записывающих измене ния в рассеянии или пропускании света испыту емым образцом, обычно используют кремние вые фотодиоды и фотоумножители. Рассеянный свет под уrлом (90:!:2,5)0 реrистрируется первич ным детектором. Остальные детекторы реrи стрируют интенсивность рассеяния в прямом и В обратном направлениях. Используемые при боры rрадуируют с использованием эталонов с
39 2.2.2. Определение степени окрашивания жидкостей известной степенью мутности; кроме этою, при боры должны быть способны к автоматическому определению степени мутности. Результаты ис пытания, выраженные в NTU, считываются непо средственно с дисплея прибора и сравниваются со спецификацие, приведенной в частной фар макопейной статье. Прибор считают приroдным, если он COOTBeT ствует следующим техническим условиям. Единицы измерения: NTU NTU основана на мутности первичноro стандартноro образца фор мазина. Т аюке MOryт использоваться FTU (Forтaziп Turbidity Units единицы мутности по формазину) или FNU (Fоrтаziп Nephe/ometry Uпits формази новые нефелометрические единицы), которые эк вивалентны NTU при низких значениях (до 40 NТИJ Эти единицы используются во всех трех инстру ментальных методах (нефелометрия, турбидиме трия и относительная тур6идиметрия). Диапазон измерениЙ от 0,01 NTU до 1100 NTU. Разрешение: 0,01 NTU в диапазоне 10 NTU; 0,1 NTU в диапазоне 1100 NTU; 1 NTU в диапазоне более 100 NTU Прибор rpадуируют и контролируют с использованием эталонов форма зина. Точность: в диапазоне 10 NTU: :1:(2 % от показания прибора + 0,01) NTU; в диапазоне 1 1000 NTU::1:5 %. Повторяемость: в диапазоне 110 NTU: :1:0,01 NTU; в диапазоне 1 1000 NTU: :1:2 % от из меренною значения. rрадуировка: используют 4 эталона форма зина в интересующем диапазоне. Moryт быть ис пользованы стандартные образцы, описанные выше, или подходящие стандартные образцы, от калиброванные по исходным суспензиям опалес ценции. Посторонний свет: посторонний свет явля ется существенным источником ошибок при низких значениях турбидиметрических измерений; посто ронний свет попадает на оптическую систему дe тектора, но приходит не от испытуемоro образца: менее 0,15 NTU в диапазоне 10 NTU, менее 0,5 NТUвдиапазоне 11000 NTU Приборы, отвечающие требованиям, указан ным выше, и поверенные с использованием эта лонов, описанных в разделе «Визуальный метод», MOryт быть использованы для подтвер>!Щения co ответствия требованиям частной фармакопейной статьи вместо визуальноro определения. Moryт быть использованы приборы с xapaK теристиками (диапазоном измерения, разреше нием, точностью, повторяемостью), отличными от указанных выше, при условии, что они полностью валидированы и подходят для предполаrаемоrо использования. Для отдельных испытуемых фар мацевтических субстанций/лекарственных средств дпя подтвер>!Щения возможности использования также должна быть валидирована методика испы 1ания. Прибор и методолоrия не должны противо речить свойствам испытуемою образца. 01/2013:20202 2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ОКРАШИВАНИЯ ЖИДКОСТЕИ Определение степени окрашивания жид костей в ряду коричневыйжелтыйкрасный проводят визуально путем сравнения с COOT ветствующими эталонами (растворами cpaB нения) одним из двух описанных ниже методов настоящей статьи. Раствор считается бесцветным, если он выдерживает сравнение с водой Р или paCT ворителем, или окрашен не более интенсивно, чем эталон В(К)9' =Степень окрашивания испытуемоro paCT вора не должна превышать степени окраши вания соответствующеro эталона, а цвет испы туемоro раствора должен быть максимально приближен к цвету соответствующеro эталона.# МЕТОД I 2,0 мл испытуемой жидкости сравнива ют с 2,0 мл воды р, растворителя или эталона (см. таблицы эталонов), описанноro в HaCTa ящей статье, используя одинаковые пробир ки из бесцветноro, прозрачнorо, нейтральноro стекла с внешним диаметром 12 мм. CpaBHe ние окраски проводят при рассеянном ДHeB ном освещении, просматривая объекты roри зонтально (перпендикулярно оси пробирок) на белом матовом фоне. #По методу 1 обычно проводят сравнение окрашивания жидкостей с эталонами [В(К), ВУ(КЖ), У(Ж), GУ(ЗЖ), R(Кр)],з,# МЕТОД 11 40миллиметровыи слой испытуемой жид кости сравнивают с 40милпиметровым слоем воды Р. растворителя или эталона (см. табли цы эталонов), указанноro в частной статье, ис пользуя одинаковые пробирки из бесцветноro, прозрачноro, нейтральноro стекла с плоским дном, которые имеют внутренний диаметр от 15 мм до 25 мм. Сравнение окраски проводят при рассеянном дневном освещении, просма тривая объекты вдоль вертикальной оси про бирок на белом фоне. #По методу 11 обычно проводят сравнение окрашивания жидкостей с эталонами [В(К), ВУ(КЖ), У(Ж), GУ(ЗЖ), R(Kp)]49'# ЭТАЛОНЫ (РАСТВОРЫ СРАВНЕНИЯ) Исходные растворы Желтый раствор. 46 r железа (111) хлорида Р растворяют в 900 мл смеси кислота хлористов(l дородная Р вода Р (25:975, 06/06) и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Опре деля ют концентрацию полученноro раствора и разводят раствор этим же растворителем таким образом, чтобы содержание FeCl 3 '6НР в 1 мл paB нялось 45,0 Mr:
40 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Раствор хранят в защищенном от света месте. Определение концентрации. 10,0 мл полу ченноro раствора помещают в коническую кол5у вместимостью 250 мл с притертой пробкой, при бавляют 15 мл воды Р, 5 мл кислоты хлористово дородной Р и 4 r калия йодида Р, колбу закрывают и выдерживают в течение 15 мин в темном месте. Прибавляют 100 мл воды Р и выделившийся йод титруют 0,1 М раствором натрия тиосульфата, прибавляя в конце титрования в качестве индика тора 0,5 мл раствора крахмала Р. 1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 27,03 Mr FеСl з '6Нр. Красный раствор. 60 r кобальта хлорида Р растворяют в 900 мл смеси кислота хлористово дородная Р вода Р (25:975, об/о6) и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Опре деля ют концентрацию полученноro раствора и разводят раствор этим же растворителем таким образом, чтобы содержание CoCI 2 '6H 2 0 в 1 мл paB нялось 59,5 Mr: Определение концентрации. 5,0 мл полученно ro раствора помещают в коническую колбу вмести мостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют 5 мл раствора водорода пероксида разведенно 20 Р И 10 мл раствора 300 r/л натрия 2идроксида Р, осторожно кипятят в течение 1 О минут, охлаж дают и прибавляют 60 мл кислоты серной разве денной Р и 2 r калия йодида Р. Колбу закрывают и осторожно встряхивают до полноro растворения осадка. Выделившийся йод титруют 0,1 М pacтвo ром натрия тиосульфата, прибавляя в конце ти трования в качестве индикатора 0,5 мл раствора крахмала р, и титруют до появления бледнорозо воro окрашивания. 1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 23,79 Mr CoCI 2 '6Hp. Синий раствор. 63 r меди сульфата Р paCT воряют в 900 мл смеси кислота хлористоводо родная Р вода Р (25:975, 06/06) и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Опре деля ют концентрацию полученноro раствора и разводят раствор этим же растворителем таким образом, чтобы содержание Cu80 4 -5H 2 0 в 1 мл равнялось 62,4 Mr: Определение концентрации. 10,0 мл полу ченноro раствора помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, при бавляют 50 мл воды Р, 12 мл кислоты уксусной разведенной Р и 3 r калия йодида Р Выделивший ся йод титруют 0,1 М раствором натрия тиосуль фата, прибавляя в конце титрования в качестве индикатора 0,5 мл раствора крахмала р, и титруют до появления бледнокоричневоro окрашивания. 1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 24,97 Mr Cu80 4 '5H 2 0. основные растворы Пять основных растворов приroтавливают с использованием трех исходных, как указано в таблице 2.2.2.1. Основные растворы Таблица 2.2.2. 1 Объем,мл Основной раствор Желтый Красный Синий Раствор кислоты хлори раствор раствор раствор стоводородной (10 r/л HCI) В (Ьrowп) 3,0 3,0 2,4 1.6 К (коричневый) ВУ (Ьrоwпishуеllоw) 2,4 1,0 0,4 6,2 кж (коричневатожелтый) У (yellow) 2,4 0,6 0,0 7,0 Ж (желтый) GY (grеепishуеllоw) 9,6 0,2 0,2 0,0 ЗЖ (зеленоватожелтый) R (,ed) 1,0 2,0 0,0 7,0 Кр (красный) Эталоны для методов 1 и 11. Эталоны приroтавливают с использованием пяти основных растворов, как указано в таблицах 2.2.2.2 2.2.2.6. Эталоны шкалы В(К) Таблица 2.2.2.2 Объем,мл Эталон Основной Раствор кислоты раствор хлористоводородной В(К) (10 r/л HCI) В(К)1 75,0 25,0 В(К)2 50,0 50,0 Объем,МЛ Эталон Основной Раствор кислоты раствор хлористоводородной В(К) (10 r/л HCI) В(К)з 37,5 62,5 В(К)4 25,0 75,0
2.2.3. Потенциометрическое определение рН 41 Объем,МЛ Эталон Основной Раствор кислоты раствор хлористоводородной В(К) (10 r/л HCI) В(К)5 12,5 87,5 В(К)в 5,0 ! 95,0 ! В(К)7 2,5 I 97,5 В(К)в 1,5 98,5 В(К)9 1,0 99,0 Таблица 2.2.2.3 Эталоны шкалы ВУ(КЖ) Объем,мл Эталон Основной Раствор кислоты раствор хлористоводородной ВУ(КЖ) (10 r/л HCI) ВУ(ЮК)1 100,0 0,0 ВУ(ЮК)2 75,0 25,0 , ВУ(ЮК)З 50,0 50.0 ВУ(ЮК)4 25,0 75,0 ВУ(ЮК)5 12,5 87,5 ВУ(ЮК)6 5,0 95,0 ВУ(ЮК)7 2,5 97,5 Таблица 2.2.2А Эталоны шкалы У(Ж) Объем,МЛ Эталон Основной Раствор кислоты хло- раствор ристоводородной У(Ж) (10 r/л НС/) У(Ж)1 100,0 0,0 У(Ж)2 75,0 25,0 У(Ж)З 50,0 50,0 У(Ж)4 25,0 75,0 У(Ж)5 12,5 87,5 У(Ж)в 5,0 95,0 У (Ж)7 2,5 97,5 Таблица 2.2.2.5 Эталоны шкалы GУ(ЗЖ) Объем,мл Эталон Основной Раствор кислоты хло- раствор ристоводородной GУ(3Ж) (10 r/л HCI) GУ(ЗЖ)1 25,0 75,0 GУ(ЗЖ)2 15,0 85,0 GУ(ЗЖ)з 8,5 91,5 GУ(ЗЖ) 5.0 95,0 GУ(ЗЖ): I 3.0 97,0 GY(ЗЖ)_ I 1.5 I 98,5 (ЗЖ ) 0,75 i 99,25 Таблица 2.2.2.6 Эталоны шкалы R(Kp) Объем,мл Эталон Основной Раствор кислоты раствор хлористоводородной R(Kp) (1 О r/л HCI) R(Kp )1 100,0 0,0 R(Kp )2 75,0 25,0 R(Kp )з 50,0 50,0 R(Kp )4 37,5 62,5 R(Kp )5 25,0 75,0 R(Kp )6 12,5 87,5 i R(Kp )7 5,0 95,0 Хранение Эталоны для определения степени OKpa шивания жидкостей по методу I хранят в защи щенном от света месте в запаянных пробир ках из бесцветноro, прозрачноrо, нейтральноro стекла С внешним диаметром 12 мм. #Для при roТ08ления эталонов для определения степени окрашивания жидкостей по методу I используют основные растворы, приroтовленные непосред ственно перед применением.# Эталоны для определения степени окраши- вания жидкостей по методу 11 приroтавливают из основных растворов непосредственно перед применением. #Срок roдности первичных и основных pac творов при хранении в защищенном от света месте в штанrлазах с притертой пробкой 1 roд.# 01/2013:20203 2.2.3. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН Водородный показатель (рН) число, xapaK теризующее концентрацию (активность) ионов водорода в водных растворах. На практике рН определяют экспериментально. Значение рН ис пытуемоro раствора связано со значением рН стан- дартноro раствора (pHs) следующим уравнением: EE pH==PHSk' rдe: Е потенциал электрода в испытуемом растворе, В; Е, потенциал Toro же электрода в paCTBO ре с известным значением рН (pHJ, В; k температурный коэффициент (изменение потенциала при изменении значения рН на едини цу, рассчитанное по уравнению Нернста) (таблица 2.2_3. 1), В.
42 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Таблица 2.2.3. 1 Значения k при различных температУРаХ Температура, ос k,B 15 0,0572 20 0,0582 25 0,0592 30 0,0601 35 0,0611 Потенциометрическое определение рН проводят путем измерения разности потенциа лов между двумя электродами, поrруженными в испытуемый раствор: один из электродов чув ствителен к ионам водорода (обычно это CTe клянный электрод), друroй электрод cpaB нения (например, насыщенный каломельный электрод). Прибор. Измерительным прибором служит вольтметр с входным сопротивлением, как ми нимум в 100 раз превышающим сопротивление используемых электродов. Прибор обычно rpa дуирован в единицах рН и должен иметь такую чувствительность, чтобы можно было провести измерение с точностью не менее 0,05 единиц рН или не менее 0,003 В. Методика. Если иноro не указано в част ной статье, все измерения проводят при одной И той же температуре в интервале температур от 20 ос до 25 ОС. В таблице 2.2.3.2 приведена зависимость значения рН от температуры для различных стандартных буферных растворов, используемых для калибровки. При необходи мости используют температурные поправки 8 соответствии с инструкцией предприятияпро изводителя. Прибор калибруют с помощью бу ферноro раствора калия rидрофталата (пер вичный стандарт) и одноro из буферных растворов с друrим значением рН (предпочти тельно одноro из указанных в таблице 2.2.3.2). Показания прибора для третьеro буферноro раствора с промежуточным значением рН не должны отличаться более чем на 0,05 единиц рН от табличноrо значения рН, соответствую щеro этому раствору. Электроды поrружают в исследуемый раствор и измеряют рН при тех же условиях, что и для буферных растворов. Если прибор используется ежедневно, ero rрадуировку проводят реryлярно. В противном случае rрадуировку прибора проводят перед каждым измерением. Все испытуемые растворы и стандартные буферные растворы должны быть приroтовлены с использованием воды, свободной от У2лерода диоксида, Р. приrОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ 0,05Мрастворкалиятетраоксалата.12,61 r С 4 Н з КО в '2Н 2 О растворяют в воде, свободной от У2лерода диоксида, Р и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Насыщенный при 25 ос раствор калия rи дротартрата. Избыток С 4 Н 5 КО 6 смешивают при энерrичном встряхивании с водой, свободной от У2лерода диоксида, Р при температуре 25 ос в течение 30 мин. Фильтруют или сливают Haдo садочную жидкость. Раствор roтовят непосред ственно перед использованием. 0,05 М раствор калия диrидроцитрата. 11,41 r С 6 Н 7 КО 7 растворяют в воде, свободной от У2лерода диоксида, Р и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Раствор ro товят непосредственно перед использованием. 0,05 М раствор калия rидрофталата. 1 О, 1 3 r С в Н е КО 4 , предварительно высушенноro при TeM пературе (110:t2) ос в течение 1 Ч, растворяют в воде, свободной от уелерода диоксида, Р и ДOBO дят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. 0,025 М раствор калия диrидрофосфата и 0,025 М раствор динатрия rидрофосфата. 3,39 r КНРО4 и 3,53 r Na2HP04' предварительно высушенных при температуре (120:t2) ос в тече ние 2 ч, растворяют в воде, свободной от У2ле рода диоксида, Р и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. 0.0087 М раствор калия диrидрофосфата и 0,0303 М раствор динатрия rидрофосфата. 1,18 r кнро 4 и 4,30 r NэzНРО.,. Ilредваритель но высушенных при температуре (120:t2) сс в течение 2 часов, растворяют в воде. свободной от уелерода диоксида, Р и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. 0,01 М раствор натрия тетрабората. 3,80 r Na 2 B..0 7 '10H 2 0 растворяют 8 воде, свободной от У2лерода диоксида, Р и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Хранят в защищен ном от атмосферноrо уrлерода диоксида месте. 0,025 М раствор натрия карбоната и 0,025 М раствор натрия rидрокарбоната. 2,64 r Nа 2 СО з и 2,09 r NаНСО з растворяют в воде, свободной от У2лерода диоксида, Р и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Хранят в защищенном от атмосферноro уrлеро да диоксида месте. Насыщенный при 25 ос раствор каль- ция rидроксида. Избыток кальция 2идроксuда р встряхивают с водой, свободной от У2лерода диоксида, Р и сливают надосадочную жидкость при температуре 25 ОС. Хранят в защищенном от атмосферноro уrлерода диоксида месте. ХРАНЕНИЕ Буферные растворы хранят в химически стой ких плотноукупориваемых контейнерах, таких как контейнеры из стекла класса I или пластмассо вые контейнеры для водных растворов.
2.2.4. Зависимость между реакцией раствора, приблизительным значением рН 43 Таблица 2.2.3.2 Значение рН стандартных буферных растворов при разных температурах i I I s: I S..,., I u I " с:: о:: Io::t; .u о:: о о:: о:: S ro q ('1') i\j S I ro I rn' L() I ro qa. 1 0::0 -& а. ...а. ro NO:: roro No:: ro ! ro'" roro o:: ro S u !ro...' S :.::'" ! ss'" I:'::ro :.::... ,SL()O::", CtS О ro Ж o;ro S:1ro ro a.t:;ro а.а. a.ro I t:;NSro:.::o -& ж... а.L()sЖ a..aq а. t:; I 1:: ro а. ! , ' о'" о t:; I q -& а. S а. о а. ro О N о.. О 1:: t:; S о ro ,s :.:: !i r:a S r:a CtI I а. О CtI О ro g а. о а. r:a q, ... t!) 'S CtI U t ! ]g- t g t€- gs-& Iot; tf; S ctlro l ' Жr:aО ctla. ctlO I...qo -&CtI a. CtI 0..:':: 0 ЖОа. а. а. Ж ... а. а. q а. о.. u CtI а. а. ё.. u а. 0::'" а. CtI r:a q , ... I Q)uq S q ctI.dog О S a.t; ...Оа. Q)...S I ф l 3'ctls :Е.... s 0..1fr:a,-& а. ... :Eror:aq 3'u.... Lt')'" ]а..... L()....::2:0 1......0 10 L()5 ]CtI I О u ..... 1 0 L()-& &- Ж q INt!) "а. О CtI О О 8. q .... s О 6f; ::I: ciq О :.:: u о CtI о.. » ... CtI а. Q) 1:: :! Q) ..... , , ! I i 15 20 25 30 35 1 1 L\pH(1) Ы С 4 Н з КО в ' '2НР 1,67 1,68 1,68 1,68 1,69 Nа 2 СО з + NаНСО з 10,12 10,06 10,01 9,97 9,93 Са(ОН)2 12,81 12,63 12,45 12,29 12.13 С Н КО КНР04+ КНРО4+ в 5 4 I Na;HP04 I Na 2 HP0 4 4,00 I 6,90 1 7,45 4,00 6,88 7,43 4,01 6,87 I 7,41 I 4,02 i 6,85 I 7,40 I 4,02 I 6,84 7,39 +0'00121 0,0028 1 1 O,0028 I Na 2 B 4 0 7 ' '10НР 9,28 9,23 9,18 9,14 9,10 С 4 Н 5 К0 6 С 6 Н 7 КО 7 3,56 3,55 3,55 3,80 3,79 3,78 3,77 3,77 0,0082 0,0096 O,034 +0,001 0,0014 0,0022 .... ... .,... (1) дpH изменение рН на rрадус по Цельсию. 01/2013:20204 2.2.4. ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ РЕАКЦИЕЙ РАСТВОРА, ПРИБЛИЗИТЕЛЬНЫМ ЗНАЧЕНИЕМ рН И ЦВЕТОМ ИНДИКАТОРОВ к 10 мл испытуемоro раствора прибавляют 0,1 мл раствора индикатора, если иноrо не указано в таблице 2.2.4. 1. Таблица 2.2.4..1 Реакция раствора рН Индикатор Окраска J .J UЦелочная >8 Лакмусовая бума2а красная Р Синяя ! Раствор тимолов020 сине20 Р Серая или фиолеТ080серая : (0,05 мл) Слабо щелочная 8,O10,0 Раствор фенолфталениа Р Бесцветная или розовая : (0,05 мл) . I Раствор тимолов020 сине20 Р (0,05 мл) Серая Сильнощелочная >10 Фенолфталеиновая бума2а Р Красная 1 Нейтральная 6,O8,O Раствор метиловО20 краСНО20 Р Желтая I Раствор Фенолов020 краСН020 Р ! (0,05 мл) I Нейтральная по 4,56,0 Оранжево-красная i метиловому Kpac Раствор метилов020 краСНО20 Р jHOMY : Бесцветная; розовая или I Нейтральная по <8,0 Раствор фенолфталеина Р красная после прибавления I фенолфталеину I (0,05 мл) 0,05 мл 0,1 М раствора OCHO I I вания
44 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Реакция раствора рН Индикатор Окраска Кислая <6 Раствор i:lJетилов020 краСН020 Р Оранжевая или красная Раствор бромтимолов020 сине20 Р1 Желтая Слабокислая 4,06,0 Раствор метиловоzо KpaCHOZO Р Оранжевая Раствор бромкрезолов020 Зеленая или синяя зеленоzо Р Сильнокислая <4 Бума28 КОН20 краСН020 Р Зеленая или синяя #Зависимость между интервалом рН и переходом окраски индикаторов представлена в таблице #2.2.4.2.# Таблица #2.2.4.2 Индикаторный раствор Интервал рН Переход окраски перехода окраски Метилов020 фиолетов020 раствор Р1 O,11,5 От желтой до зеленой Малахитов020 зелеН020 раствор Р О, 12,0 От желтой до зеленоватоroлубой Крезоловоzо KpaCHozo раствор Р 0,2 1,8 От красной до желтой Метанилов020 желтО20 раствор Р 1 ,22,3 От красной до оранжевожелтой мКрезолов020 пурпуровоzо раствор Р 1 ,22,8 От красной до желтой Тимолов020 сине20 раствор Р 1 ,22,8 От красной до желтой Тролеолина 00 раствор Р . 1 ,43,2 От красной до желтой Хинальдинов020 краСНО20 раствор Р 1 ,43,2 От бесцветной до красной Метиловоzо фиолетов020 раствор Р1 1 ,53.2 От зеленой до фиолетовой Бромфенолов020 cUHezo раствор Р 2,8,4 От желтой до синеватофиолетовой ДиметuловО20 желт020 раствор Р r 3,0,O ОТ красной до желтой I Метилов020 оранжев020 раствор Р 3.0.4 I От красной ДО желтой I ; , Метилов020 оранжевО20 смешанный ОТ оранжевой до желтоватозеле раствор Р i 3.0,4 I ной КОН20 краСНО20 раствор Р 3,()"""",5,О От синей до розовой Бромкрезолов020 зелеНО20 раствор Р 3,65,2 От желтой до синей Ализарина S раствор Р 3,75,2 От желтой до фиолетовой Метилов020 краСН020 раствор Р 4,4,O От красной до желтой Лакмус Р 5,08,0 От красной до синей Метилов020 краСН020 смешанный 5,25,6 ОТ красноФиолетовой до зеленой раствор Р Бромкрезолов020 ПУрПУРО8020 раствор Р 5,2,8 От желтой до синеватофиолетовой Бромтимолов020 сине20 раствор Р1 5,87,4 От желтой до синей НейтраЛЬН020 краСН020 раствор Р 6,88,O От красной до желтой Фенолов020 краСН020 раствор Р 6,8,4 От желтой до красноватофиоле товой Крезолов020 краСН020 раствор Р 7,O8,6 От желтой до красной аНафтолфталеина раствор Р 7,48,6 От желтоваторозовой до зелено ватосиней мКрезоловО20 ПУРПУРН020 раствор Р 7,49,0 От желтой до краснофиолетовой Тимолов020 сине20 раствор Р 8.o9,6 От оливковозеленой до синей Фенолфталеина раствор Р 8,210,0 От бесцветной до яркорозовой НиЛЬСК020 сине20 А раствор Р 9,013,O От синей до красной Тимолфталеина раствор Р 9,310,5 ОТ бесцветной до синей ПротравН020 желт020 ЗR раствор Р 10,212,0 От желтой до красной Интервалы рН и переход окраски индикаторов
2.2.5. Относительная плотность 45 Индикаторный раствор Интервал рН Переход окраски перехода окраски Малахитов020 зелеН020 раствор Р 11,13,O От зеленоватоroлубой до бесцвет ной Инди20кармина индикаторный pacт 11,614,0 От синей до желтой ворР 2.2.5. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОТНОСТЬ Относительная плотность d:' представляет собой отношение массы определенноro объема вещества при температуре t, к массе paBHO ro ему объема воды при температуре t 2 . Если в частной статье не указано иноro, используют OT носительную плотность d;g. Часто используется также относительная плотность d: O . Может ис пользоваться плотность Р20' определяемая как масса единицы объема при температуре 20 ос и выражаемая в килоrраммах на кубический метр или в rpaMMax на кубический сантиметр (1 Kr/M 3 = 0,001 r/CM 3 ). Эти величины связаны между собой следующими уравнениями, в KOTO рых плотность выражена в rpaMMax на кубиче ский сантиметр: Р20 = 0,998203. d;g или d;g = 1,00180. Р20 ' Р20 = 0,999972. d;o или d;o = 1,00003 . Р20 ' d;o = 0,998230 . d;g . Относительную плотность или плотность определяют с точностью до десятичных знаков, обозначенных в частной статье, с помощью пик нометра (твердые вещества и жидкости), rидро статических весов (твердые вещества), apeo метра (жидкости) или цифровою плотномера с . осциллирующим датчиком (жидкости и rазы). AT мосферное давление в определениях с исполь зованием взвешивания не учитывают, так как связанная с ним ошибка не превышает единицы в третьем десятичном знаке. Давление воздуха не оказывает влияние на определения с исполь зованием плотномера. Плотномер с осциллирующим датчиком. Прибор состоит из следующих основных COCTaB ляющих: Uобразная трубка, обычно из боросили катноro стекла, в кот()рую помещают испытуе мую жидкость; reHepaTop маrнитоэлектрическоrо или пье зоэлектрическоro возбуждения, заставляющий колебаться Uобразную трубку с характеристи ческой частотой, зависящей от плотности испы туемой жидкости; 8 За.. 1712. 01/2013:20205 измерительный аппарат, определяющий период колебаний (7), который может быть пре образован прибором непосредственно в плот ность либо использован для расчета плотности с использованием постоянных А и В, как указа но ниже. Резонансная частота (f) является функцией динамической жесткости (с) и массы (т) систе мы: (2.. Т 2 т 4л- 2 Отсюда: 2 ( М p-V ) 2 т с + .4л- , rдe: м масса трубки; V внутренний объем трубки. Введение двух постоянных А с / (4л- 2 . V) И в М/ V приводит уравнение к классическому виду для осциллирующеro датчика: р = А- т 2 В . Постоянные А и В определяют для KOHKpeT ною прибора, заполняя Uобразную трубку двумя различными образцами с известными плотно стями, например, деrазированной водой Р и воз духом. Проверку получаемых данных проводят ежедневно с использованием деrазированной воды Р. Результаты, полученные при провер ке с использованием деrазированной воды Р, не должны отличаться от стандартных значе ний (Р20 = 0,998203 r/CM 3 , d;g = 1,000000) более чем на специфицированную ошибку. Например, прибор, специфицированчый до :1:0,0001 r/CM 3 , считается приюдным для дальнейших измере ний, если выдает значение (0,9982:1:0,0001) r/CM 3 . В противном случае необходима повторная Ha стройка. Реrулярно должна проводиться rраду ировка с использованием сертифицированных стандартных образцов. Измерения должны пpo
46 rосударственная фармакопея Республики Беларусl:. водиться при тех же условиях, что и rрадуиров ка. Перед помещением в трубку ИСПЫТУL''V1УЮ жидкость при необходимости термостатиру от при 20 ос для предотвращения образования ПУ зырьков rаза и для уменьшения времени, необ ходимоro для измерения. Факторы, влияющие на точность: неоднородность температуры во всем объеме трубки; отсутствие линейности в диапазоне изме ряемоrо значения плотности; мешающие резонансные эффекты; вязкость, вследствие чеro растворы с ВЯЗ костью, большей, чем у раствора, по которому проводилась rрадуировка, показывают плот ность заметно более высокую, чем истинная. Проблемы, связанные с эффектами OTCYT ствия линейности и вязкости, MOryT быть решены при использовании для rрадуировки веществ со значениями плотности и вязкости, близкими к Ta ковым для испытуемой жидкости (:!:5 % для плот ности И :!:50 % для вязкости). Плотномер может иметь функцию для автоматической коррекции вязкости и для коррекции ошибок, связанных с отсутствием линейности и с изменениями TeM пературы . Прецизионность является функцией воспро изводимости и стабильности частоты ОСЦИЛJ1И рующеrо датчика, которая зависит от стабиль ности объема, массы и динамической жесткости ячейки. Плотномеры способны проводить измере ния с точностью от 1.103 r/cM 3 до 1'105 r/CM 3 и повторяемостью от 1 .104 r/CM 3 до 1.10-6 r/CM 3 . #Определение плотности при помощи ПИК нометра проводят, как указано в методах 1 и 2, при помощи ареометра как указано в методе 3, если нет друrих указаний в частной статье.# #Метод 1. Применяют в случае определения плотности жидкостей с точностью до 0,001 r/см З . Чистый сухой пикнометр взвешивают с ТОЧ ностью до 0,0002 r, заполняют при помощи сухой воронки водой Р чуть выше метки, закрывают пробкой и термостатируют в течение 20 мин при температуре (20:!:0,1) ос. При этой температуре уровень воды в пикнометре доводят до метки, быстро отбирая избыток воды при помощи пи петки или завернутой в трубку полоски филь тровальной бумаrи. Пикнометр снова закрывают пробкой и термостатируют еще 1 О мин, прове ряя положение мениска по отношению к метке. Затем пикнометр вынимают из термостата, фильтровальной бумаroй вытирают внутреннюю поверхность шеЙКlA пикнометра, а также весь пикнометр снаружи, выдерживают под стеклом весов в течение 1 О мин и взвешивают с точно стью, указанной выше. Пикнометр освобождают от воды, высуши вают, ополаскивая последовательно 96 % спир том Р и эфиром Р (сушить пикнометр путем наrревания не допускается), удаляют остаТОI эфира продуванием воздуха, заполняют пикно. метр испытуемой жидкостью и затем ПрОВОДЯl те же операции, что и с водой Р. Плотность Р20 (r/см З ) рассчитывают по фор. муле: (т 2 т).O.99703 ...: + 0,0012. т, П? rдe: т масса пустоro пикнометра. r; т 1 . масса пикнометра с водой Р, r; т 2 масса пикнометра с испытуемой жид. костью, r; 0,99703 значение плотности воды прv 20 ос, r/см З (с учетом плотности воздуха); 0,0012 значение плотности ВОЗДУХе при 20 ос, смЗ И барометрическом давлениv 101,3 кПа (760 мм рт. ст.). #Метод 2. Применяют для определеНИf плотности твердых жиров и воска. Взвешивают пустой пикнометр, затем взве- шивают тот же пикнометр, заполненный водой Р После этоrо ВОДУ удаляют и пикнометр высуши- вают. Все операции проводят. соблюдая усло- вия. указанные в MeTO.ц 1. В пикномеТ/J вливают при помощи пипет- ки или небольшо воронки с тонкооттянутым концом расплавленны.i жир или воск в таком ко- пичестве, чтобы он занимал от 1/3 до 1/2 объема пикнометра. Пикнометр выдерживают в течение 1 ч без пробки в roрячей воде, затем охлаждают до температуры 20 ос, взвешивают, доводят до метки водой Р при температуре 20 ос, вытирают насухо и снова взвешивают. В обеих фазах и на поверхности их раздела не должно быть пузырь ков воздуха. Плотность Р20 (r/cM 3 ) рассчитывают по фор муле: (т т).O.99703 +0,0012, (щ +т2)(т+тз) rдe: т масса пустоro пикнометра, r; т 1 масса пикнометра с водой р, r; т 2 масса пикнометра с испытуемым об разцом, r; тз масса пикнометра с испытуемым об разцом и водой Р, r. #Метод 3. Применяют в случае определения плотности жидкостей с точностью до 0,01 r/см З . Испытуемую жидкость помещают в цилиндр, и при температуре жидкости 20 ос осторожно опускают в нее чистый сухой ареометр, шкала котороro позволяет определи1'ь ожидаемую Be личину плотности. Ареометр не выпускают из рук, пока не станет очевидным, что он плава ет; при этом необходимо следить, чтобы apeo
2.2.7. Оптическое вращение 47 метр не касался стенок и дна цилиндра. Отсчет плотности проводят через 3------4 мин после по rpужения ареометра по делению на шкале, co ответствующему нижнему мениску жидкости (в случае определения темноокрашенных жидко стей отсчет ПрОИЗ80ДЯТ по верхнему мениску). При отсчете rлаз должен быть на уровне мени ска. Определение плотности сильнолетучих Be ществ ареометром не допускается. 01/2013:20206 2.2.6. ПОКАЗАТЕЛЬ ПРЕЛОМЛЕНИЯ (ИНДЕКС РЕФРАКЦИИ) Показатель преломления среды относи тельно воздуха равняется отношению синуса уrла падения луча света в воздухе к синусу уrла преломления луча света в данной среде. #Абсолютным показателем преломления Ha зывают отношение скорости распространения света в вакууме к скорости распространения света в испытуемом веществе. Относительный показатель преломления это отношение CKOpO сти распространения света в воздухе к скорости распространения света в испытуемом веществе. # Если в частной статье нет друrих указаний, определение показателя преломления проводят при температуре (20:tO,5) ос при длине волны линии О спектра натрия (л.=589,3 нм); показатель преломления, определенный в таких условиях, обозначают символом пO. #Показатель преломления зависит от темпе ратуры и длины волны света, при которой про водят определение. В растворах показатель преломления зависит также от концентрации Be щества и при роды растворителя. Определение показателя преломления при меняется для установления подлинности и чи стоты вещества. Метод применяют также для определения концентрации вещества в paCTBO ре, которую находят по rрафику зависимости по казателя преломления от концентрации. В таком случае точность измерения показателя прелом ления должна быть не ниже :t2'10. На rрафи ке выбирают интервал концентраций, в котором соблюдается линейная зависимость между KO эффициентом преломления и концентрацией. В этом интервале концентрацию вещества в pac творе в процентах рассчитывают по формуле: пП'J F rдe: п показатель преломления раствора: по показатель преломления растворителя при той же температуре; F фактор, равный величине прироста по казателя преломления при увеличении KOHцeH трации на 1 % (устанавливается эксперимен тально).# Рефрактометры обычно определяют крити ческий уroл. В таком приборе rлавной частью является призма с известным показателем пре ломления, которая контактирует с анализируе мой жидкостью. Для калибровки прибора используют серти фицированные эталонные вещества. #rрадуировка прибора проводится по эта лонным жидкостям, прилаrаемым к прибору, или по воде Р, полученной методом дистилляции, для которой пO = 1,3330 (l1п/lJ.t = 0,000085).# При использовании белоro света рефрак тометры должны быть оборудованы компенса ционной системой. Прибор должен давать по казания с точностью как минимум до TpeTbero десятичноro знака и обеспечивать возможность проведения операций при заданной температу ре. Цена деления термометра не должна превы шать 0,5 ос. 01/2013:20207 2.2.7. ОПТИЧЕСКОЕ ВРАЩЕНИЕ Оптическое вращение это свойство Be щества вращать плоскость поляризации поляри зованноro света. Оптическое вращение считается положи тельным (+) для правовращающих веществ (то есть тех, которые вращают плоскость поляри зации по часовой стрелке) и отрицательным () для левовращающих веществ. Удельное оптическое вращение [aт]' BЫ раженное в радианах (рад), представляет собой вращение, вызванное слоем жидкости или paCT вора толщиной 1 м, содержащим 1 Kr/M 3 оптиче ски активноro вещества при прохождении через неro поляризованноro света с длиной волны .'" при температуре t. Для практических целей удельное оптическое вращение обычно выража ют в миллирадианметрах квадратных на кило rpaMM (мрад . м 2 . Kr .1). В Фармакопее используются следующие об щепринятые определения. У20Л оптичеСК020 вращения жидких Be ществ представляет собой уroл вращения а пло скости поляризации, выраженный в rрадусах (О), при длине волны IlИНИИ О спектра натрия (1,=589,3 нм), измеренный при температуре 20 ос в толщине слоя 1 дм. Для растворов способ при roтовления указывают в частной статье. Удельное оптическое вращение [а ]O жид кости представляет собой уroл вращения а ПЛ скости поляризации, выраженный в rpaдycax С).
48 rосударственная фармакопея Республики Беларусь при длине волны линии D спектра натрия (л.=589,3 нм), измеренный при температуре 20 ОС, расчи танный для толщины слоя 1 дм испытуемоro Ee щества и деленный на плотность, выраженную в rpaMMax на кубический сантиметр. Удельное оптическое вращение [a]O веще ства в растворе представляет собой уrол Bpa щения а плоскости поляризации, выраженный в rрадусах (О), при длине волны линии О спек тра натрия (л. = 589,3 нм), измеренный при TeM пературе 20 ос в растворе испытуемоro веще ства и рассчитанный для слоя 1 дм в пересчете на содержание вещества 1 r/мл в растворе. Для удельноro вращения вещества в растворе Bcerдa указывают используемый растворитель и концентрацию раствора. В Фармакопее удельное оптическое враще ние выражают без размерности; реальная раз мерность выражается в rрадусмиллилитрах на дециметрrрамм [(О) . мл . ДM1 . r1]. Пересчет удельноro вращения в единицах по Международной Системе в единицы, исполь зуемые Фармакопеей, проводят по формуле: [aт] := [a], .0,1745. В отдельных случаях, указанных в частной статье, уroл вращения может быть измерен при температурах, отличных от 20 ОС, и при друrих длинах волн. Используемый поляриметр должен обеспе чивать измерения с точностью до 0,010. Шкалу обычно проверяют при помощи сертифици рованных кварцевых пластинок. Линейность шкалы может быть проверена при помощи pac творов сахарозы. Методика. Определяют ноль поляриметра и уroл вращения плоскости поляризации при длине волны линии D спектра натрия (л. = 589,3 нм) при температуре (20:tO,5) ОС. Измерения оптическо ro вращения MOryT проводиться при друrих TeM пературах только в тех случаях, если в частной статье указан способ учета температуры. Опре деляют ноль прибора с закрытой трубкой; для жидкостей с пустой трубкой; для растворов твердых веществ с трубкой, заполненной co ответствующим растворителем. #Проводят не менее 5 измерений и рассчи тывают среднее значение.# Удельное оптическое вращение рассчиты вают по следующим формулам. Для жидкостей: [а];О =. ,. Р20 Для веществ в растворе: [ ] 20 1000'а а D , '.с rдe: с концентрация вещества в растворе, r/л. Содержание с (r/л) или с' (% (м/м») paCTBO peHHoro вещества рассчитывают по формулам: 1000'а с= , 1'[a]O . 100'а с = , 1'[a]O' Р20 rдe: a уroл вращения, измеренный при темпе ратуре (20:t0,5) ОС, в rрадусах; , длина поляриметрической трубки, в дe циметрах; Р20 плотность при температуре 20 ОС, в rpaMMax на кубический сантиметр. В фармако пейном анализе плотность заменяют относи тельной плотностью (2.2.5). #Если нет друrих указаний в частной статье, оптическое вращение растворов должно быть измерено в течение 30 мин после их приrо товления. Если известно, что вещества под вержены рацемизации или мутаротации, He обходимо установить время (интервал) между добавлениями вещества в растворитель и BBe дением приrотовленноrо раствора в трубку по ляриметра.# 01/2013:20208 2.2.8. ВЯЗКОСТЬ #Вязкость (внутреннее трение) свойство текучих тел оказывать сопротивление передви жению одной их части относительно друroй. Ньютоновскими жидкостями называют си стемы, вязкость которых не зависит от напряже ния сдвиrа и является постоянной величиной в соответствии с законом Ньютона. Неньютонов ские жидкости не попадают под действие закона Ньютона, так как их вязкость зависит от напря жения сдвиrа. Для ньютоновских жидкостей различают ди намическую, кинематическую, относительную, удельную, приведенную и характеристическую вязкости. Для неньютоновских жидкостей xapaK терна, rлавным образом, структурная вязкость.# Динамическая вязкость, или коэффици ент вязкости 17 это танrенциальная сила, приходящаяся на единицу поверхности, KOTO рая также называется напряжением сдви2а т, выраженная в паскалях (Па), которую необхо димо приложить для Toro, чтобы переместить слой жидкости площадью 1 м 2 со скоростью (v) 1 метр в секунду (м . c1) на расстояние (х) 1 м относительно друroro слоя, параллельно пло щади скольжения. Величина dvldx представляет собой rради ент скорости и обусловливает скорость сдви2а О, выраженную в обратных секундах (c1). Таким образом, rz:= r 1 D .
2.2.9. Метод капиллярной вискозuметрии 49 01/2013:20209 Единицей динамической вязкости явля ется паскальсекунда (Па' с). Чаще всеro ис пользуется дольная единица миллипаскаль секунда (м Па . с). Кинематическая вязкость и, выраженная в метрах квадратных в секунду (м 2 . c1), pac сматривается как отношение величины дина мической вязкости 1] к плотности жидкости р, BЫ раженной в килоrраммах на метр кубический (Kr . мЗ), измеренной при этой же температуре: v == 1] / р. Кинематическую вязкость обычно выражают в миллиметрах квадратных в ceKYH ду (мм 2 . c1). #Структурная (эффективная, или кажу щаяся) вязкость вязкость при данном Ha пряжении сдвиrа. В ряде случаев необходимо определить вязкость одной жидкости относи тельно друroй относительную вязкость 1] отн' Часто используют удельную вязкость '7 уд' показывающую, какой вклад в вязкость paCT вора вносит присутствие в нем pacTBOpeHfJOrO вещества: 17 170 17 17 у д == '70 == 7i: 1 == 170тн 1, rдe: '7 вязкость раствора; '70ТН вязкость растворителя. Удельную вязкость, отнесенную к единице концентрации раствора, называют приведенной вязкостью 17 прив: '7 прив '7 у д ==' С rдe с концентрация раствора. Для растворов полимеров вязкость явля ется функцией молекулярных масс, формы, размеров и rибкости макромолекул. Чтобы определить структурные характеристики по лимеров, приведенную вязкость экстраПОJ1И руют к нулевой концентрации. В таком случае вводится понятие характеристической вязкости ['7]: [ ] 1 . 1 . 17 уд '7 == Im'7npue == ,т CO CO С Характеристическая вязкость выражается в единицах, обратных единицам концентрации.# Для определения вязкости ньютоновских жидкостей можно использовать капиллярный вискозиметр; для определения вязкости как НЬЮТОНОВGКИХ, так и неньютоновских жидко стей можно использовать ротационный виско зиметр. Допускается использование и друrих вискозиметров с учетом, что точность и пра вильность измерений будут не худшими, чем на при мере использования вискозиметров, описанных ниже. 2.2.9. МЕТОД КАПИЛЛЯРНОЙ ВИСКОЗИМЕТРИИ Определение вязкости проводят. исполь зуя подходящий капиллярный вискозиметр. при температуре (20:1:0,1) ос, если в частной статье не указана друrая температура. Время BЫTeKa ния от одной отметки вискозиметра до друroй измеряется секундомером с точностью до одной пятой секунды. Полученные данные считаются достоверными при условии, что результаты двух последовательных измерений отличаются не более чем на 1 %. Время вытекания испытуемой жидкости опре деля ют как среднее не менее трех измерений. Динамическую вязкость 17 (2.2.8), Bыpa женную в миллипаскальсекундах (мПа . с), pac считывают по формуле: '7 = kpt , rде: k постоянная вискозиметра, в миллиме трах квадратных на секунду в квадрате (мм 2 . c2); Р плотность испытуемой жидкости. в миллиrраммах на миллиметр кубический (Mr . ммЗ), полученная умножением относитель ной плотности (d;g) на 0,9982; t время вытекания испытуемой жидкости, в секундах (с). Постоянную k определяют с использовани ем соответствующей жидкости для калибровки вискозиметров. Кинематическую вязкость, выраженную в миллиметрах квадратных на секунду (мм 2 . c1), рассчитывают по формуле: l} = kt. Определение вязкости может проводиться при помощи прибора (предложен Международ ной орrанизацией по стандартизации), xapaK теристики котороro представлены на рисунке 2.2.9.1 и в таблице 2.2.9.1. Минимальное время вытекания должно быть 350 с для размера 1 и 200 с для осталь ных размеров Методика. Испытуемую жидкость, имею щую температуру 20 ос, если в частной статье не указана иная, заливают в вискозиметр через трубку (L) в таком количестве, чтобы заполнить расширение (А), но при этом уровень жидкости в расширении (В) должен остаться ниже выхода к веНТИЛЯЦИОI-fНОЙ трубке (М). Вискозиметр в вертикальном положении поrружают в водяную баню при температуре (20:1:0:1) ос, если в част ной статье не указана иная температура, yдep живая ero в этом положении не менее 30 минут для установления температурноrо равновесия. Трубку (М) закрывают и повышают уровень жид
50 rосударственная фармакопея Республики Беларусь м N 1 I t:::1 I I Ni С"?! + i .. о (J) ! 1 1 01 ..;t, + 1 L (N) и открыв трубку (М). Затем открывают трубку (N) и измеряют время, за которое уровень жидко сти снизится от метки (Е) до метки (F), ceKYHДO мером с точностью до одной пятой секунды. "Работа с прибором, описанным выше, дo пускает использование вискозиметров капил лярных стеклянных с висячим уровнем (напри мер, вискозиметры капиллярные стеклянные типа ВПЖ 1), параметры которых аналоrичны приведенному на рисунке 2.2.9.1. Вязкость из меряют в соответствии с инструкцией по приме нению вискозиметра. Для определения относительной вязкости жидкости измеряют время t,'cп вытекания между верхней и нижней отметкоЙ вискозиметра той жидкости, относительно которой проводят из мерение '70тн' Затем в том же чистом и сухом вискозиметре при тех же условиях определяют время вытекания t Co. испытуемой жидкости. Одновременно измеряют плотность ЖИДКО стей, которые изучаются, пикнометром (Ро ир) при той же температуре, при которой определя ют вязкость, и рассчитывают относительную вяз кость по формуле: Е F R -: t ep ' Р , 1 Orr.H t Оер . Ро Для определения характеристической вязко сти roтовят не менее пяти испытуемых растворов разной концентрации. При этом должно выполнять ся условие возможности линейной экстраполяции приведенной вязкости к нулевой концентрации, то есть нужно выбирать минимальные концентрации раствора в пределах чувствительности и точности метода измерения. Для каждой концентрации paCT вора определяют t cc и рассчитывают приведенную вязкость. Затем строят зависимость '7 прuв от KOH центрации с и rpафически или линейным методом наименьших квадратов экстраполируют приведен ную вязкость к нулевой концентрации, то есть Ha ходят характеристическую вязкость.# Рисунок 2.2.9. 1. Вискозuметр с висячим уровнем (размеры указаны в миллиметрах) кости в трубке (N) таким образом. чтобы она Haxo дилась примерно на 8 мм выше метки (Е). Yдep живают жидкость на этом уровне, закрыв трубку Таблица 2.2.9.1 I Номиналь I Внутрен- Диапазон I Объем pac Внутренний ди Размер ная постоя н- кинематической ний диа- аметр трубки ная вискози- метр трубки ширения вязкости С N метра R мм 2 . с. 2 мм 2 . с" мм (:t2 %) мл (:t5 %) мм 1 0,01 От 3.5 до 10 0,64 5,6 От 2,8 до 3,2 1А 0,03 ОТ 6 до 30 0,84 5,6 От 2,8 до 3,2 2 0,1 От 20 до 100 , 1,15 5,6 I От 2,8 до 3,2 2А 0,3 От 60 до 300 1,51 5,6 I От 2,8 до 3,2 3 1,0 От 200 до 1000 2,06 5,6 I От 3,7 до 4,3 I 3А 3,0 От 600 до 3000 2,74 5,6 i От 4,6 до 5,4 4 10 От 2000 до 1 О 000 3,70 5.6 I От 4,6 до 5,4 I 4А 30 От 6000 до 30 000 4,07 5,6 От 5,6 до 6,4 5 100 I 6,76 5,6 От 6,8 до 7,5 От 20 000 до 100000 i
2.2.10. Метод ротационной вискозиметрии 01/2013:20210 51 2.2.10. МЕТОД РОТАЦИОННОЙ ВИСКОЗИМЕТРИИ Принцип метода заключается в измере НИИ силы, действующей на ротор (вращаю щий момент) во время ero вращения с посто янной уrловой скоростью (скорость вращения) в жидкости. Ротационные вискозиметры ис пользуются для измерения вязкости ньюто новских жидкостей (вязкость не заsи,:::и т от напряжения сдвиrа) и неньютоновских жидко стеи (вязкость зависит от напряжения сдвиrа, кажущаяся вязкость). Ротационные вискози метры MorYT быть разделены на две туппы. а именно: абсолютные вискозиметры v. 01 HO сительные вискозиметры. В абсолютнь,:< ви скозиметрах время вытекания в ИСllопозvе мой rеометрии хорошо известно. РеЗУ:1Ы аты измерений представляются в единицзл aoco лютнои вязкости, которые MorYT cpaBf-li'1БЭ Т ЬСЯ с любыми друrими абсолютными значниями. В относительных вискозиметрах время BЫTe кания в используемой rеометрии не опреде лено. Результаты измерений представляются в единицах относительной вязкости, которые не MorYT быть соотнесены с абсолютными ;jча чениями вязкости или со значениями относи тельной вязкости, полученными не на юм же самом приборе. Для данных диапазонов вязкости и для различных скоростей вращения доступны раз личные измерительные системы. ПРИБОР Наиболее обычными являются следующие типы инструментов. (J) J м Ro R, r h I I . , " ; //_///" ,//"//,//// ///,,' ./', ,./',,// //,,, ,//.' ./,'. ,/,;///",/' Рисунок 2.2.10.1. КОНЦЕНТРИЧЕСКИЕ ЦИЛИНДРИЧЕСКИЕ ВИСКОЗИМЕТРbI (АБСОЛЮТНblЕ ВИСКОЗИМЕТРbI) В концентрических цилиндрических вискози метрах (коаксиальный двойной цилиндрический вискозиметр или просто коаксиальный вискози Melp) вязкость определяют, помещая испытуе мую жидкость в зазор между внутренним и внещ ним цилиндрами. При проведении измерений вращают -'lибо внутренний цилиндр (вискозиметр типа Сирла (5e8r/e», либо внешний цилиндр (ви скозиметр типа Куэтта (Couette», как показано на рисунках 2.2.10. 1 111 2.2.10.2 соответственно. Для ламинарноrо потока вязкость (или кажущую ся вязкость) 17. выраженную в паскальсекундах (Па' с), рассчитывают по формуле: 1 . М \( 1 1 ') М 17 : '! i k , () 4лh Л R,L R;; J {jJ ,j:;,. м .- вращаюLЦИЙ момент, ,:..J,ействующий на .ИЛИf--щрическую поверхность. в HbfuToHMeTpax; ()) уrловая скорость, 8 радианах в секунду; h rлу'БИН2 поrружения внутреннеro ЦИЛИf-l др<з в жидкую среду, в метрах; R, радиус внутреннею цилиндра. в Fv1eTpax: R, радиус внешнеro цилиндра, в метрах; k' постоянная прибора, в раf1ианах на метр кубический. Для неньЮТОНОВСКИХ жидкостей необходимо указывать напряжение при сдвиrе (т ) или CKO рость сдвиrа (У), при которых измеряется вяз кость. В узком интервале условий (подходящих для абсолютных вискозиметров) наблюдается пропорциональная зависимость между М и т , а также между йJ и у: / j '/ / / / / / / j/ '/ / I/ J ///, '/// h /////,////" / / / / / / / / / / / ',' м Ro R, ! ro ,/ Рисунок 2.2.1 0.2.
52 rосударственная фармакопея Республики Беларусь r == АМ r == Вт , rдe А и В постоянные прибора, которые рассчитывают по следующим формулам: для концентрической поверхности: А == 1R j 2 +R; 4лhR,2R; в == R,2 + R R R,2 для устройства конусплита: A== 2nR З 1 B==, а rде: М вращающий момент, действующий на коническую или цилиндрическую поверхность, в ньютонметрах; йJ уrловая скорость, в радианах в секунду; Rj радиус внутреннеro цилиндра, в метрах; Ro радиус внешнеro цилиндра, в метрах; R радиус конуса, в метрах; h rлубина поrружения внутреннеro цилин дра в жидкую среду, в метрах; а уroл между плоским диском и конусом, в радианах; r напряжение при сдвиrе, в паска лях (Па); r скорость сдвиrа, в обратных ceKYH дах (c1). ВИСК03ИМЕТРbl КОНУСПЛИТА (АБСОЛЮТНblЕ ВИСКОЗИМЕТРbl) В вискозиметрах типа конусплита жид кость помещают в промежуток между пло ским диском И конусом с определенным уrлом. Определение вязкости проводят, вращая конус или плоский диск, как показано на рисунках 2.2.1 0.3 и 2.2.10.А соответственно. Вязкость (или кажущуюся вязкость) 1], выраженную в паскальсекундах (Па . с), для ламинарноro потока рассчитывают по формуле: [ M j( За ) М '7 k, {iJ, 2лR З (iJ rдe: м вращающий момент, действующий на коническую поверхность или поверхность пло cKoro диска, в ньютонметрах; йJ уrловая скорость, в радианах в секунду; а уroл между плоским диском и конусом, в радианах; R радиус конуса. в метрах; k постоянная прибора, в радианах на метр кубический. Постоянные А и В прибора определяют aHa лоrично, как для концентрических цилиндриче ских вискозиметров. о) / м R \ la /j// ///// //// м R a Рисунок 2.2.10А. ШПИНДЕЛЬНblЕ ВИСК03ИМЕТРbl (ОТНОСИТЕЛЬНblЕ ВИСК03ИМЕТРbl) В шпиндельном вискозиметре вязкость определяют с помощью вращающеroся шпин деля (например, цилиндрическоro или диско образноro, как показано на рисунках 2.2.1 0.5 и 2.2.1 0.6 соответственно), помещенноro в жид кость. Относительные значения вязкости (или кажущейся вязкости) MOryT быть рассчитаны He посредственно с использованием коэффициен тов пересчета исходя из показаний прибора при данной скорости вращения. В общем случае постоянная k прибора может быть определена для разных скоростей враще ния с использованием жидкости, сертифициро ванной для калибровки вискозиметра. После этоro вязкость 1] рассчитывают по формуле: м '] == k' {iJ МЕТОДИКА Измеряют вязкость (или кажущуюся вязкость) в соответствии с инструкциями производителя po тационноrо вискозиметра. Температуру, при KO торой измеряют вязкость, указывают в частных статьях. Для неньютоновских систем в частных статьях указывают тип используемоro вискозиме тра и, если используются абсолютные вискозиме
2.2.11. ТемператУРНblе пределы переzонки 53 /\ Рисунок 2.2.1 0.5. тры, уrловую скорость или скорость сдвиra, при которых производится измерение. В случае, если точно получить необходимую скорость сдвиrа He возможно, используют значения скорости сдвиrа выше и ниже необходимоro и интерполируют. В случае относительных вискозиметров CKO рость сдвиrа не является постоянной по всему объему образца, и, таким образом, она не может быть определена. В этих условиях вязкость He ньютоновских жидкостей, определенная по BЫ шеприведенной формуле, имеет относительный характер, который зависит от типа шпинделя, уrловой скорости, а также от размеров контейне ра для образцов (@ = не менее 80 мм) и rлубины поrружения шпинделя. Получаемые результа ты сопоставимы только при соблюдении CTporo одинаковых условий эксперимента. 100 L[). о со r I I ., I I Рисунок 2.2.10.6. 01/2013:20211 2.2.11. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПРЕДЕЛЫ ПЕРЕrонки Температурные пределы переroнки пред ставляют собой интервал температур, приве денных к давлению 101,3 кПа (760 мм рт. ст.), В пределах KOToporo переroняется жидкость или некоторая ее фракция в следующих условиях. Прибор. Прибор (рисунок 2.2.11.1) состоит из переroнной колбы (А), прямоro холодильни ка (В), присоединенноro к отводной трубке пере roнной колбы, и вставной трубки (алонжа) (С), присоединенной к концу холодильника. В каче стве альтернативы нижний конец холодильника может быть изоrнут для тоro, чтобы исv.лючить 1 Ri I J Рисунок 2.2.11. 1. Прибор для определения температурных пределов пере20НКU (размеры указаны в миллиметрах)
54 rосударственная фармакопея Республики Беларусь алонж. В rорловину колбы помещают термометр таким образом, чтобы верхний конец PTYTHO ro резервуара находился на 5 мм ниже нижнеro края отводной трубки переroнной колбы. Исполь зуют термометр с диапазоном шкалы, близким к 50 ОС, с ценой деления 0,2 ОС. Во время опреде ления колбу, включая и rорловину, предохраня ют от охлаждения подходящим экраном. Методика. 50,0 мл испытуемой жидкости и несколько кусочков пористоro материала поме щают в колбу (А). ДЛЯ сбора отroна используют цилиндр вместимостью 50 мл С ценой деления 1 мл. Для жидкостей, кипящих при температу ре ниже 150 ОС. при меняют охлаждение цирку лирующей водой. Колбу наrревают таким обра зом, чтобы быстро достичь кипения, и отмечают температур при которой в цилиндр поступа ет первая капля отroна. Устанавливают Harpe вание, которое обеспечивает переroнку от 2 до 3 мл В минуту, И отмечают температуру, при KO торой вся жидкость или некоторая ее фракция, объем которой измеряют при температуре 20 ОС, OTorHaHbI. Вносят поправку в наблюдаемую температу ру для приведения к нормальному давлению по формуле: t 1 == t 2 + k(1 01,3 Ь) . rдe: t 1 исправленная температура; t 2 наблюдаемая температура при бароме трическом давлении Ь; k поправочный коэффициент в соот ветствии с таблицей 2.2.11.1, если не указано иноro; Ь барометрическое давление во время переrонки, в килопаскалях. Таблица 2.2.11.1 Коэффициент поправки для приведения к нормальному давлению 1 , ' Поправочный Температура переrонки коэффициент k 0,30 0.34 0.38 0.41 0.45 Д0100 0 С Свыше 100 ос до 140 ос Свыше 140 ос дО 190 ос Свыше 190 ос до 240 ос Свыше 240 ос 01/2013:20212 2.2.12. ТЕМПЕРАТУРА КИПЕНИЯ Точкой кипения называется скорректирован ная температура, при которой давление паров жидкости равно 101,3 кПа. Прибор. В данном случае используется тот же прибор, что и для определения пределов переrонки (2.2.11), за исключением тоro, что термометр BBO дится в roрло колбы таким образом, чтобы нижний конец ртутноro резервуара был на уровне нижнеrо конца roрла переrонной колбы и чтобы сама колба располаrалась на пластине из изолирующеro MaTe риала со сквозным отверстием диаметром 35 мм. Методика. 20 мл испытуемой жидкости и He сколько кусочков пористоro материала помещают в колбу (А). Колбу наrревают таким образом, чтобы быстро достичь кипения, и отмечают температуру, при которой жидкость начинает вытекать из OTBO дной трубки в холодильник Вносят поправку в наблюдаемую температуру для приведения к нормальному давлению по фор муле: t, ==t 2 +k(101,3b), rдe: t 1 исправленная температура; t 2 наблюдаемая температура при бароме трическом давлении Ь; k поправочный коэффициент в COOTBeT ствии с таблицей 2.2.11.1; Ь барометрическое давление во время переroнки, в килопаскалях. 01/2013:20213 2.2.1 з. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БОДЫ МЕТОДОМ отrонки Прибор (рисунок 2.2.1 3. 1) состоит из стеклян ной круrлодонной колбы (А), соединенной труб кой (О) с цилиндрической трубкой (В), снабжен ной rрадуированным приемником (Е) и обратным холодильником (С). Цена деления приемника (Е) 0,1 мл. Для соответствующеrо наrревания целесо образно использовать электрический наrреватель с реостатом или масляную #(или песчаную)" баню. Верхняя часть колбы и соединительная трубка MOryт быть покрыты теплоизоляцией. Методика. Приемник и холодильник прибора очищают, промывают водой и высушивают. 200 мл толуола Р и около 2 мл воды Р поме щают в сухую колбу и переroняют в течение 2 ч. Колбу охлаждают в течение 30 мин и записывают объем воды с точностью до 0,05 мл. В колбу поме щают количество вещества, отвешенноro с точно стью ДО 1 %, которое содержит приблизительно от 2 до 3 мл воды. Если вещество имеет пастоподобную консистенцию, еro взвешивают на кусочке металли ческой фольrи. В колбу вносят несколько кусочков пористоro материала и осторожно наrревают в Te чение 15 мин. Korдa толуол начнет кипеть, отroня ют со скоростью около двух капель в секунду, пока
2.2.14. Температура плавления капиллярный метод 01/2013:20214 55 ' k ( и=\j : 11' О! I ! 1, с 1\1: п l 'V u 1\ \ , в LO . N о . .4/ ж ж- Е !I ЮI ) :1. "; . :1101-" I I.?t ,) V r<J, ----------T 17 I I ' I 500мл 'д \ ' ) 165 Pl1CYHOK 2.2.13. 1. Прuбор для определенu;l воды методом отеонки (размеры указаны в миллиметрах) большая часть воды не отrонится, а затем увеличи вают скорость отroнки до четырех капель в секунду. 'Кипячение прекращают, Korдa объем воды 8 приемнике перестанет увеличиваться и Bepx ний слой растворителя в приемнике станет про зрачным. Korдa вода отroнится полностью, внутреннюю трубку холодильника промывают толуолом Р. Ha rревание продолжают еще 5 мин, затем HarpeBa тель убирают, дают приемнику охладиться дО KOM натной температуры и стряхивают все капли воды, которые находятся на стенках приемника. После полноro разделения воды и толуола записывают объем воды и определяют ее содержание в мил лилитрах на килоrрамм по формуле: 1 00О(П 2 П 1 ) т rдe: П 1 объем воды, определенный при первом отroне, в миллилитрах; П 2 общий объем отоrнанной воды, опре деленный в обоих отroнах, в миллилитрах; т масса испытуемоro образца, в rpaM мах. 2.2.14. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ КАПИЛЛЯРНЫЙ МЕТОД Температураплавления,определеннаякапил лярным методом, представляет собой темneрату ру, при которой последняя твердая частичка ynлoт ненноro столбика вещества в капиллярной трубке переходит в жидкую фазу. #Весь процесс плавления протекает в течение определенноro промежутка времени и определен ноro интервала температур: начало плавления появление первой капли жидкости и конец плав ления (температура плавления) полный переход вещества в жидкое состояние. Этот интервал TeM ператур не должен преВbJшать 2 ос, если в частной статье нет друrих указаний. Целый ряд орrанических соединений при плав лении разлаrается (происходит резкое изменение Rн€шнеro вида вещества, например. вспенивание). Такую температуру называют температурой раз ложения. Она в значительной мере зависит от cкo j.JOсти HarpeBa, поэтому при определении темпе ратуры разложения в частных статьях указывают скорость HarpeBa. Капиллярный метод при меняют для опреде пения температуры плавления твердых веществ, леrко превращаемых в порошок.# Если есть указание в частной статье, тот же прибор и методику применяют для определения друrих показателей, таких, как образование мени ска или диапазона плавления, характеризующих поведение вещества при плавлении. Прибор. Составными частями прибора яв ляются: подходящий стеклянный сосуд, содержа щий жидкость (например, воду, вазелиновое или силиконовое масло), используемый в качестве бани и оснащенный подходящим устройством ДЛЯ HarpeBa; устройство для перемешивания. обеспечи вающее однородную температуру внутри бани; термометр с меткой поrружения и ценой де-- ления не более 0,5 ос. Разность между верхним и нижним делениями термометра в области измеря емой температуры не более 100 сс: запаянные с одноro конца капиллярные трубки из бесщелочноro прочноro стекла диаме тром от 0,9 мм до 1,1 мм и толщиной стенок от 0,10 мм до 0,15 мм. #Во время определения температуры плав ления ни колба, ни пробирка не должны быть за крыты rерметически.' Методика. Если в частной статье нет друrих указаний, тонкоизмеленное вещество сушат в вакууме над силика2елем безводным Р в течение 24 ч. Достаточное количество вещества помеща ют в капиллярную трубку до получения уплотнен ноro столбика высотой от 4 мм до 6 мм. #Необ ходи мое уплотнение вещества при заполнении капиллярной трубки можно получить, если ее He
56 rосударственная фармакопея Республики Беларусь сколько раз бросить запаянным концом вниз в стеклянную трубку длиной не менее 1 м, постав ленную вертикально на твердую поверхность." Повышают температуру бани до темпе ратуры приблизительно на 1 О ос ниже пред полаrаемой температуры плавления и затем продолжают наrревание со скоростью около 1 ОС/мин. Коrда температура достиrнет значе ния на 5 ос ниже предполаrаемой температу ры плавления, помещают капиллярную трубку с веществом в прибор. Для описанноro выше прибора капиллярную трубку помещают таким образом, чтобы ее запаянный конец распола rался около центра шарика термометра, метка поrружения котороro находится на уровне по верхности жидкости. Отмечают температуру, при которой последняя твердая частичка пере ходит в жидкую фазу. #Если в частной статье нет друrих указа ний, наrревание реryлируют так, чтобы к MO менту плавления была достиrнута необходи мая скорость подъема температуры: от 0,5 до 1 ОС/мин при определении TeM пературы плавления ниже 100 ос; от 1 до 1,5 ОСIмин при определении TeM пературы плавления от 100 ос до 150 ос; от 1,5 до 2 ОС/мин при определении TeM пературы плавления выше 150 ос; от 2,5 до 3,5 ОСIмин для веществ, неустойчивых при наrревании. Проводят не менее двух определений. За температуру плавления принимают среднее значение. Расхождение между определениями не должно превышать 1 ос.# iрадуировка прибора. Для rрадуировки при бора используют подходящие вещества, приroдные для этих целей. #Допускается применение друrих прибо ров, использующих капиллярный метод, если показано, что точность и правильность измере ний будут не хуже, чем в случае применения прибора, описанноro выше.# 01/2013:20215 2.2.15. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ ОТКРЫТЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ МЕТОД Данный метод используют для определения температуры плавления (также известной как температура сдвиrа или подъема, либо темпе ратура разжижения) некоторых веществ. #Открытый капиллярный метод применяют для веществ, имеющих аморфную структуру, не растирающихся в порошок и плавящихея ниже температуры кипения воды, таких как жиры, воск, парафин, вазелин. смолы.# Используют стеклянную капиллярную трубку, открытую с обоих концов, длиной около 80 мм, наружным диаметром от 1,4 мм до 1,5 мм и внутренним диаметром от 1,0 мм до 1,2 мм. Вещество, предварительно обработан ное, как указано в частной статье, помещают в каждую из пяти капиллярных трубок (капилляр ную трубку, открытую с обоих сторон, поrружают в вещество так, чтобы оно заполнило нижнюю часть трубки)" в количестве, достаточном для формирования в каждой трубке столбика BЫ сотой около 1 О мм. Трубки выдерживают опре деленное время при температуре, указанной в частной статье. Если не указано иноro, вещества с BOCKO образной консистенцией осторожно полностью расплавляют на водяной бане перед заполнени ем капиллярных трубок. Трубки выдерживают в течение 2 ч при температуре от 2 ос до 8 ос. Прикрепляют одну из капиллярных трубок к термометру с ценой деления 0,5 ос таким обра зом, чтобы вещество находилось в непосредствен ной близости к шарику термометра. Термометр с прикрепленной капиллярной трубкой помещают в стакан так, чтобы расстояние между дном CTaKa на и нижней частью шарика термометра составля ло 1 см. Стакан наполняют водой таким образом, чтобы высота слоя составляла 5 см. Повышают температуру воды со скоростью 1 ОС/мин. За температуру плавления принимают TeM пературу, при которой вещество начинает подни маться по капиллярной трубке. #В тех случаях, Korдa столбик вещества в капилляре не подни мается, за температуру плавления принимают температуру, при которой столбик вещества в капилляре становится прозрачным.# Повторяют эту операцию с четырьмя друrи ми капиллярными трубками и рассчитывают pe зультат как среднее из пяти показаний. 01/2013:20216 2.2.16. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ МЕТОД MrHOBEHHOrO ПЛАВЛЕНИЯ Температуру плавления по методу MrHoBeH ноro плавления рассчитывают по формуле: (1 +(2 , 2 rдe: (1 первая температура, определяемая в условиях, приведенных ниже; (2 вторая температура, определяемая в условиях, приведенных ниже. Прибор. Прибор состоит из металлическоro блока, изroтовленноro из материала, обладаю
56 rосударственная фармакопея Республики Беларусь сколько раз бросить запаянным концом вниз в стеклянную трубку длиной не менее 1 м, постав ленную вертикально на твердую поверхность." Повышают температуру бани до темпе ратуры приблизительно на 1 О ос ниже пред полаrаемой температуры плавления и затем продолжают наrревание со скоростью около 1 ОС/мин. Korдa температура достиrнет значе ния на 5 ос ниже предполаrаемой температу ры плавления, помещают капиллярную трубку с веществом в прибор. Для описанноro выше при бора капиллярную трубку помещают таким образом, чтобы ее запаянный конец распола rался около центра шарика термометра, метка поrружения котороro находится на уровне по верхности жидкости. Отмечают температуру, при которой последняя твердая частичка пере ходит в жидкую фазу. #Если в частной статье нет друrих указа ний, наrревание реryлируют так, чтобы к MO менту плавления была достиrнута необходи мая скорость подъема температуры: от 0,5 до 1 ОСIмин при определении TeM пературы плавления ниже 100 ос; от 1 до 1,5 ОС/мин при определении TeM пературы плавления от 100 сс до 150 ос; от 1,5 до 2 ОС/мин при определении TeM пературы плавления выше 150 ос: от 2,5 до 3,5 ОС/мин для веществ, неустойчивых при наrревании. Проводят не менее двух определений. За температуру плавления принимают среднее значение. Расхождение между определениями не должно превышать 1 ОС.- 'радуировка прибора. для rpадуировки прибора используют подходящие вещества, приroдные для этих целей. "Допускается применение дрyrих прибо ров, использующих капиллярный метод. если показано, что точность и пpaвмl1bНOCТb измере ний будут не хуже, чем в спучае npименения прибора, описанноro ВЫUJe. 8 0112013:20215 2.2.15. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ ОТКРЫТЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ МЕТОД Данный метод используют для определения температуры плавления (также известной как температура сдвиrа или подъема, либо темпе ратура разжижения) некоторых веществ. #Открытый капиллярный метод при меняют для веществ, имеющих аморфную структуру, не растирающихся в порошок и плавящихся ниже температуры кипения воды, таких как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы.# Используют стеклянную капиллярную трубку, открытую с обоих концов, длиной около 80 мм, наружным диаметром от 1,4 мм до 1,5 мм и внутренним диаметром от 1,0 мм до 1,2 мм. Вещество, предварительно обработан ное, как указано в частной статье, помещают в каЖдУЮ из пяти капиллярных трубок #(I<апилляр ную трубку, открытую с обоих сторон, поrружают в вещество так, чтобы оно заполнило нижнюю часть трубки)# в количестве, достаточном для формирования в каждой трубке столбика BЫ сотой около 1 О мм. Трубки выдерживают опре деленное время при температуре, указанной в частной статье. Если не указано иноrо, вещества с BOCKO образной консистенцией осторожно полностью расплавляют на водяной бане перед заполнени ем капиллярных трубок. Трубки выдерживают в течение 2 ч при температуре от 2 ос до 8 ос. Прикрепляют одну из капиллярных трубок к термометру с ценой деления 0,5 ос таким обра зом, чтобы вещество находилось в непосредствен ной близости к шарику термометра. Термометр с при крепленной капиллярной трубкой помещают в стакан так, чтобы расстояние между дном CTal<a на и нижней частью шарика термометра составля ло 1 см. Стакан наполняют водой таким образом, чтобы высота слоя составляла 5 см. Повышают температуру воды со скоростью 1 ОС/мин. За температуру плавления принимают TeM пературу, при которой вещество начинает подни маться по капиллярной трубке. #В тех случаях, Korдa столбик вещества в капилляре не подни мается, за температуру плавления принимают температуру, при которой столбик вещества в капилляре становится прозрачным.# Повторяют эту операцию с четырьмя друrи ми капиллярными трубками и рассчитывают pe зультат как среднее из пяти показаний. 01/2013:20216 2.2.16. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ МЕТОД MrHOBEHHOrO ПЛАВЛЕНИЯ Температуру плавления по методу MrHoBeH ноro плавления рассчитывают по формуле: t 1 + t 2 , 2 rде: t 1 первая температура, определяемая в условиях, приведенных ниже; t 2 вторая температура, определяемая в условиях, приведенных ниже. Прибор. Прибор состоит из металлическоro блока, изroтовленноrо из материала. облада
2.2.17. Температура каплепаденuя 57 щеro высокой теплопроводностью и не взаимо действующеro с испытуемым веществом, Ha пример, из латуни. Верхняя поверхность блока должна быть плоской и тщательно отполирован ной. Блок равномерно наrревают по всей массе rазовой rорелкой с микрореryлировкой или элек трическим наrревателем с тонкой реryлировкой. Блок имеет достаточно широкую цилиндриче скую полость для размещения термометра, стол бик ртути котороro должен находиться в одном и том же положении как при калибровке, так и при определении температуры плавления испытуе мою вещества. Цилиндрическая полость разме шена параллельно отполированной верхней по верхности блока и на расстоянии около 3 мм от нее. Прибор rрадуируют, используя подходящие вещества с известной температурой плавления. Методика. Блок быстро наrревают до TeM пературы на 1 О ос ниже предполаrаемой TeM пературы плавления и затем устанавливают скорость наrревания около 1 ОС/мин. Несколь ко частиц тонко измельченною вещества, BЫ сушенноro в вакууме над силика2елем безво дHыM Р в течение 24 ч, бросают через равные промежутки времени на поверхность блока в He посредственной близости от шарика TepMOMe тра, очищая поверхность после каждоro испы тания. Записывают температуру t 1 , при которой вещество плавится MrHoBeHHo при соприкосно вении с металлом. Останавливают наrревание. Во время охлаждения через равные временные промежутки бросают несколько частичек веще ства на поверхность блока, очищая ее после каждоro испытания. Записывают температуру t 2 , при которой вещество прекращает MrHoBeHHo плавиться при соприкосновении с металлом. ,радуировка прибора. Для rрадуировки при бора используют подходящие вещества, приroд ные для этих целей. 01/2013:20217 2.2.17. ТЕМПЕРАТУРА КдПЛЕПАДЕНИЯ Температура каплепадения представляет собой температуру, при которой в условиях, при веденных ниже, первая капля расплавленноro испытуемоro вещества падает из чашечки. #Определение температуры каплепадения проводят для веществ, не растирающихся в по рошок И плавящихся ниже температуры кипения воды, таких как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы. п Если в частной статье нет друrих указаний, определение проводят по методу А. Замена метода А методом В должна быть валидиро вана. МЕТОД А Прибор. Прибор (рисунок 2.2.17. 1) состо-- ит из двух металлических rильз (А) и (В), сое-- диненных одна с друroй посредством резьбы. rильза (А) прикреплена к ртутному термометру. В нижней части rильзы (В) с помощью двух уплот-- нителей (Е) свободно закреплена металлическая чашечка (F). Точное положение чашечки опреде-- ляется фиксаторами (О) длиной 2 мм, которые используются также для центровки термометра. Отверстие (С) в стенке rильзы (В) предназначено для выравнивания давления. Отводящая поверх ность чашечки должна быть плоской, а края BЫ ходноro отверстия под прямым уrлом к поверх ности. Нижняя часть pTYTHoro термометра имеет форму и размер, как показано на рисунке; рабо-- чий диапазон термометра от О ОС до 11 О ос и pac стояние на шкале в 1 мм соответствует разности температур в 1 ос. Ртутный шарик термометра имеет диаметр (3,5:!::0,2) мм и высоту (6,0:!::0,3) мм. Прибор устанавливают по оси пробирки длиной около 200 мм и наружным диаметром около 40 мм. Прибор прикрепляют к пробирке с помо ЩЬЮ пробки, В которую вставлен термометр и которая имеет боковую прорезь. Отверстие ча шечки должно находиться на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. Все устройство поrружа ют в стакан вместимостью около 1 л, заполнен ный водой. Дно пробирки должно находиться на расстоянии около 25 мм от дна стакана. Уровень воды должен достиrать верхней части rильзы (А). ДЛЯ равномерноro распределения темпера туры в стакане используют мешалку. 10 1U ,,,1 , с. . . _! .. д в .... N CjI i CYI . I I с . "!I' , .' i 1 r j о Е F 5 i i i б 1: 0.05 31:0.05 Рисунок 2.2.17. 1. Прибор для определения температуры каплепадения (размеры указаны в миллиметрах)
58 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Методика. Испытуемое вещество подroтав ливают. как указано в частной статье. Заполняю,. чашечку до краев испытуемым веществом. Из быток вещества удаляют с обеих сторон шпате лем. После тоro, как rильзы (А) и (В) COeJJtAHe ны, проталкивают чашечку BYTPb на ее месте, в rильзе (8) до упора. Удаляют шпателем веще. ство, выдавленное термометром. Прибор поме щают в водяную баню, как описано выше. Водя ную баню наrревают до температуры примерно на 1 О ос ниже предполаrаемой температуры Ka плепадения и устанавливают скорость HarpeBa около 1 ОС/мин. Отмечают температуру п;:щения первой капли. Проводят не менее трех опреде лений, каждый раз с новым образцом вещества Разность между показаниями не д()лжна пре вышать 3 ОС. Среднее из полученных значениЙ представляет собой температуру капл€пздения МЕТОД В АВТОМАТИЧЕСКИЙ МЕТОД Прибор. Прибор (рисунок 2.2.17.2) cocтo ит из сборноro картриджа, включающеro держа тель чашечки, в котором свободно фиксируется чашечка с испытуемым образцом. и приемноro стаканчика с roризонтальной щелью для света, фиксирующеroся ниже чашечки. Этот узел поме щают в наrревательный блок. Блок это метал лическии цилиндр с цилиндрическим отверсти ем, расположенным вдоль вертикальной оси. в который помещается сборный картридж. Кроме тоro, присутствует второе более узкое верти кальное отверстие, в которое помещается TeM пературный датчик, располаraющийся на одном уровне с чашечкой с испt.nyeМым образцом. Снаружи наrревательноro бnoка располаrается электрический наrревательный элемент Ниже наrревательноro блока находится лампа, pac положенная таким образом. что луч света про ходит сквозь roризонталblfYlO щель приемноro рукава и падает на фотоэлектрический датчик, расположенный налротив. Наrpeвательный блок с помощью наrревателbНOrO элемента может быть точно выведен на заданную температуру и, после начальноro И30терммческоrо периода, способен медленно и с постоянной скоростью наrреваться. Методика. Испытуемый образец расплав ляют, помещают в чашечку соrласно указаниям частной статьи и проводят испытание, как указа- но ниже или в соответствии с инструкциями про- изводителя. Избыток вещества удаляют с обеих сторон шпателем. Перед проведением испыа.. ния испытуемый образец выдерживают при тем- пературе и в течение времени, указанных в част- ной статье. Чашечку протаЛЮ-1вают в держатель и наталкивают приемный рукав I-Ja чашечку. Co бранный картридж помещают в наrревательный блок. Устанавливают начальную температуру и скорость последующеro наrревания, как указано в частной статье, и начинают проведение испы- тания. Автоматически реrистрируется темпера- тура, при которой первая капля расплавленноro Е к А F G в X. С .' Ш o (l) 11 J < н д держатель чашечки. Б нarревательныЙ блок; С . источник света: D щель; Е сборный картр.щж: F наrревательный элемент: G чашечка с испытуемым образцом; Н фотоэлеКТРИLlес"ий даТЧI'К: J приемный стаканчи; К температурныЙ датчик Рисунок 2.2.17.2. Пример прибора автоматичеСК020 определения температуры каплепадения испытуемоro образца капает из отверстия в дне чашечки. прерывая луч света. падающий на Фо тоэлектрический датчик. ,радуuровка прибора. Прибор используют в соответствии с инструкциями производителя и реrулярно проводят предписанные rрадуиров- ки и проверки приrодности системы в зависи мости от использования прибора и испытуемых образцов. В качестве сертифицированных стан- дартных веществ обычно используют бензойную кислоту и бензофенон. MoryT быть использова- ны и друrие вещества при условии, что они не обладают полиморфизмом. rрадуировку про во- дят в соответствии с инструкциями производи теля или следующим образом. Подroтавливают по три чашечки каждым из двух сертифициро ванных веществ. Помещают чашечки на чистую поверхность. В каждую чашечку помещают H большое количество испытуемоro образца и прижимают ко дну с помощью стержня (диаметр около 4,5 мм). Необходимо убедиться. что OT верстие полностью заполнено. Далее наполня ют чашечку примерно до ПОЛОВИНbI, уплотняют испытуемый образец стержнем (диаметр около. 9 мм) И, уплотняя, заполняют чашечку до краев. 1
2.2.18. Температура затвердевания 59 Температурная проrрамма для бензойной кислоты: начальная температура 118,0 ос; скорость HarpeBa 0,2 аС/мин; конечная TeM пература 126,0 C. После установки чашечки при температуре 118 ос выдерживают в течение ЗО с и продолжают наrревание. Температурная проrрамма для бензосрено на: начальная температура 44,0 ОС; скорость HarpeBa 0,2 ОС/мин; конечная температура 56,0 ос. После установки чашечки при темпера туре 44 ос выдерживают в течение 30 с и про должают наrревание. Приroдность системы: 3 единичных резуль тата испытания не должны отличаться более чем на 0,3 ос от среднеro значения. Рассчитывают скорректированную среднюю температуру (Tz>: T1F , rдe: Т 1 . средняя TeA'lepaTYf.'a каПJlAf' ",".., .,'1>", рассчитанная по трем I;спытачилм. ос: F . компенсирование различия MP')j(lY TeM пературой испытуемою образца и температурой в месте измерения температуры; это значение сильно зависит от конструкции прибора aBTOMa тическоro определения температуры каПj,еП;:jде ния и представляется производителем. Принимая во внимание температуру каriПе падения (ТО) сертифицированноro вещества, точность температурной шкалы считается IlрИ емлемой, если IT7 Тоl не более 0,3 ос. 01/2013:20218 2.2.18. ТЕМПЕРАТУРА ЗАТВЕРДЕВАНИЯ Температура затвердевания представлет собой максимальную температуру, при которой происходит затвердевание переохлажденной жидкости. Прибор. Прибор (рисунок 2.2.18. 1) состоит из пробирки для проведения определения диа метром около 25 мм и длиной около 150 мм, помещенной вовнутрь друrой пробирки диаме тром около 40 мм и длиной около 160 мм. BHY тренняя пробирка закрыта пробкой, снабжен ной термометром длиной около 175 мм с ценой деления 0,2 О С, который закреплен таким обра зом, чтобы ртутный шарик Н8ХОДИЛСЯ на уровне около 15 мм от дна пробирки. В пробке имеется отверстие, через которое проходит вал мешал ки, изrотовленный из стеклянноrо стержня или друrоro подходящеro материала, заrнутый на конце под прямым уrлом в виде петли, внеш ний диаметр которой около 18 мм. Внутреннюю пробирку вместе с внешней пробиркой разме щают в центре сосуда вместимостью 1 л, в KO торый помещают подходящую охлаждающую жидкость, уровень которой находится в преде лах 20 мм от верхнею края сосуда. Охлаждаю щая баня также должна быть снабжена TepMO метром. I i I I I , ! l' I '! ,i Ш о ;; .. со j. ц) , i . 'f .. i о " I .... L 40 Рисунок 22 .18. 1. Прибор для определения температуры затвердевания (размерbl у,,<азаНbI в миллиметрах) Методика. Во внутреннюю IlIJOбирку 110 мещают достаточное количество жидкости или предварительно расплавленноro вещества, чтобы покрыть ртутный шарик термометра (ртутный шарик термометра должен находить ся посередине слоя испытуемою вещества), и при быстром охлаждении определяют прибли зительную температуру затвердевания. BHY треннюю пробирку помещают в водяную баню с температурой на 5 ос выше приблизительно определенной температуры до полноro расплав ления кристаллов. Затем заполняют сосуд водой или насыщенным раствором натрия хлорида с температурой на 5 сс ниже ожидаемой темпе ратуры затвердевания. Внутреннюю пробирку вместе с внешней помещают в сосуд, убежда ются в наличии зародышей кристаллов и тща тельно перемешивают испытуемый образец в течение затвердевания. Отмечают наиболее BЫ сокую температуру, наблюдаемую во время за твердевания.
60 rосударственная фармакопея Республики Беларусь #Вначале ПРОИСХОДИТ постепенное пониже ние температуры, затем, при появлении TBep ДОЙ фазы, она остается некоторое время по стоянной или повышается перед тем, как стать ПОСТОЯННОЙ (в этот момент прекращают переме . шивание), а затем снова падает. Если вещество остается жидким при ожидаемой температуре затвердевания, еro затвердевание вызывают по тиранием о стенки внутренней пробирки TepMO метром или внесением кристаллика испытуемо ro вещества.# 01/2013:20219 2.2.19. АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ При амперометрическом титровании конеч ную точку титрования определяют по измене нию тока между поrруженными в испытуемый раствор электродами (один из них поляризущий ся индикаторный, а друrой неполяризующийся электрод сравнения, либо два поляризующихся индикаторных электрода) как функции от коли чества прибавленноro титранта при постоянной и контролируемой разности потенциалов. Потенциал индикаторноro электрода должен обеспечивать предельный диффузионный ток для электрохимически активноro соединения. Прибор. Прибор состоит из источника по стоянноro тока с реryлируемым напряжением и чувствительноro микроамперметра. Детектиру ющая система обычно состоит из индикаторно ro электрода (например, платиновоrо, ртутноro капельноro, вращающеroся дисковоro или rpa фитовоro электрода) и электрода сравнения (Ha пример, каломельноro или хлоридсеребряноro электрода). Иноrда используют трехэлектродную Си стему, состоящую из индикаторноro электрода, электрода сравнения и поляризованноrо вспо моrательноro электрода. Методика. Электроды помещают в испытуе мый раствор, устанавливают постоянный потен циал, указанный в частной статье. и прибавляют титрант порциями. По значениям силы началь ноro тока и значениям, полученным в процессе титрования, строят rрафик зависимости силы тока от количества прибавляемоrо титранта. Ти трант прибавляют последовательно, не менее чем тремя порциями, составляющими в сумме около 80 % от теоретическоro объема, COOTBeT ствующеro предполаrаемой точке эквивалентно сти. Три полученных значения силы тока должны укладываться на прямую. Продолжают последо вательно прибавлять титрант после предполаrа емой точки эквивалентности не менее трех раз. Полученные значения должны укладываться на прямую. Точка пересечения этих двух прямых представляет конечную точку титрования. #При амперометрическом титровании с двумя индикаторными электродами (без элек трода сравнения) оба электрода изroтовлены из одноro и Toro же материала и имеют одина ковую относительно небольшую поверхность. В этом случае реrистрируют всю кривую титрова ния и определяют конечную точку титрования по минимальному значению силы тока. Наиболь шая точность амперометрическоro титрования достиrается при потенциале на индикаторном электроде, соответствующем предельному диф фузионному току. При амперометрическом титровании, как пра вило, концентрация титранта в 1O20 раз превы шает концентрацию определяемоro вещества. В фармакопейном анализе амперометриче ское титрование целесообразно применять в ни тритометрии при определении воды полумикро методом (по К. Фишеру) и в йодометрии. В частных статьях необходимо указывать параметры, необходимые для корректноro BЫ полнения методики: типы электродов, задава емый потенциал, массу навески вещества, KOH центрацию титранта, температуру и т. д.# 01/2013:20220 2.2.20. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ При потенциометрическом титровании KO нечную точку титрования находят. измеряя элек тродвижущую силу (3ДС) электродной пары, состоящей из индикаторноrо электрода и элек трода сравнения или двух индикаторных элек тродов, поrруженных в испытуемый раствор, как функцию количества прибавленноro титранта. ЗДС обычно измеряют при нулевом или практически нулевом токе. =Потенциометрическое титрование обычно дает более точные результаты, чем индикатор ное, особенно при анализе мутных и окрашен ных растворов, позволяет автоматизировать процесс титрования. Как правило, электродную пару поrружа ют в испытуемый раствор, кроме случаев, Korдa ионы из электрода сравнения мешают титрова нию. В этом случае электрод сравнения соеди няют с испытуемым раствором электролитиче ским МОСТОМ.# Прибор. Используемый прибор (простой по тенциометр, электронное устройство, #pHMeTp#, #иономер#) включает вольтметр с разрешением около милливольта. Выбор индикаторноro электрода зависит от природы определяемоro вещества #и типа
2.2.20. Потенциометрическое титрование 61 Таблица # 2.2.20. 1 Электродные системы для потенциометричеСК020 титрования Тип аналитической Индикаторные 3лектродысравнения Применение ! реакции электроды ; Кислотоноосновной Стеклянный Хлоридсеребряный, Ka Титрование кислот, oc I ломельный нований и солей Осаждения Серебряный, сульфид Хлоридсеребряный, Ka Титрование rалоrени , серебряный ломельный, стеклянный ДОВ,роданидов, циани I дов, сульфидов Комплексонометриче Ртутный, ионоселектив Хлоридсеребряный, Ka Титрование катионов, ский ный ломельный, стеклянный образующих прочные комплексонаты Окислительновосстано Платиновый Хлоридсеребряный, Ka Титрование восстанови вительный ломельный, стеклянный телей различными окис лителями, например, броматом,дихроматом, перманrанатом, йодом, церием (IV). Титрование I окислителей различны ми восстановителями, например,арсенитом, тиосульфатом, нитри том. аналитической реакции#. Этот электрод может быть стеклянным или металлическим (напри мер, платиновым, золотым, серебряным или ртутным). #Индикаторный электрод выбира ют так, чтобы еro потенциал закономерно из менялся при протекании химической реакции между титруемыми ионами и ионами титранта (таблица # 2.2.20.1).# Электродом сравнения обычно служит Ka ломельный или хлоридсеребряный электрод. Для кислотноосновноrо титрования, если нет друrих указаний в частной статье, исполь зуют системы стеклянноro и каломельноrо или стеклянноro и хлоридсеребряноro электродов. Методика. При необходимости смесь раст ворителейнейтрализуют перед растворением испытуемоro образца. Строят rрафик зависимо сти изменения ЭДС от количества прибавлен ноro титранта, продолжая прибавлять титрант сверх предполаrаемой точки эквивалентности. Конечная точка титрования соответствует резко му изменению ЭДС. =При проведении анализа титрованный раствор прибавляют из бюретки равными объе мами при постоянном перемешивании. Вблизи точки эквивалентности прибавляют по 0,1 или 0,05 мл и после каждоro прибавления измеря ют ЭДС. Величина ЭДС особенно сильно изме няется вблизи точки эквивалентности, абсолют ное значение отношения изменения ЭДG (дЕ) к приросту объема приБЭl3ляемоrо титранта (Д v) в этой точке будет максимальным. Объем титранта в точке эквивалентности VЭ"В может быть определен описанными ниже способами. 1. По rpафику кривой титрования в коорди натах [V: Е], применяя метод касательных. 2. По rрафику: [ V' Д Е ] 'ДV' rдe: дЕ изменение ЭДС; / V соответствующее приращение объема титранта. При этом конечной точке титрования соот ветствует максимальное значение дЕ/д V; 3. Расчетным путем по максимальному зна чению дЕ/д V и соответственно д(дЕ/д V), как YKa зано в таблице # 2.2.202. Эквивалентный объем титранта VЭ"В рассчитывают по формуле: Ау V экв =о V, + (V 2 V, ), Ау, Ау. Таблица #2.2.20.2 V 1 ' дV Е, дЕ дЕ/д V Av=(EHV) мл мВ 5,00 250 I I 0,1 13 130 ; 5,10 263 +150 0,1 28 280 i 5,20 291 i +720 0,1 100 i 1000 5,30 391 , 450 , 0,1 I 55 i 550 5,40 446 i ззо 0,1 I 22 ! 220 5,50 468 120 0,1 10 100 5,60 478
62 rосударственная фармакопея Республики Беларусь rдe: V 1 объем титранта, соответствующий по следнему положительному (отрицательному) значению величины Av; V 2 объем титранта, соответствующий пер вому отрицательному (положительному) значе нию величины А.,; Av = д(дЕ/д v) приращенная величина дЕ/д V. При прохождении через точку эквивалентно сти Av меняет знак на противоположный. Пример: 720 V экв = 5,20 + (5,30 5,20) = 5,26 мл 720(50) . Потенциометрическое титрование может быть автоматизировано путем применения при боров двух типов: использующих математиче ский анализ кривой титрования или прекращаю щих прибавление титранта при достижении ЭДС электронной пары, соответствующей точке экви валентности.# 01/2013:20221 2.2.21. ФЛУОРИМЕТРИЯ Флуориметрия метод анализа, OCHOBaH ный на измерении интенсивности флуорес ценции, излучаемой испытуемым образцом, относительно флуоресценции, излучаемой CTaH рартным образцом. Методика. Испытуемый образец paCTBO ряют в растворителе или смеси растворителей, указанных в частной статье. Полученный pacт вор помещают в кювету или камеру флуориме тра и облучают возбуждающим светом. имею щим как можно большую монохроматичность, при длине волны. указанной в частной статье. Измеряют интенсивность испускаемоro света под уrлом 90 с относительно воз6уждаю щеro света после прохождения сквозь фильтр, пропускающий избирательно свет с длиной волны максимальной флуоресценции. MorYT быть использованы и друrие типы приборов при условии получения аналоrичных результатов. При проведении количественных опреде лений в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемых для paCT ворения испытуемоrо образца, и устанавли вают реrистрирующее устройство прибора на нулевое значение. Затем помещают раствор стандартною образца и устанавливают чув ствительность прибора таким образом. чтобы отклик показаний был больше 50 %. Если было проведено вторичное реrулирование с измене нием ширины щели, повторно устанавливают реrистрирующее устройство прибора на нуле вое значение и снова измеряют интенсивность флуоресценции раствора стандартноrо об разца. Затем в прибор помещают испытуемый раствор с неизвестной концентрацией и реrи стрируют показания прибора. Концентрацию (с) испытуемоro образца в растворе рассчиты вают по формуле: /xcs с =. х /, rдe: С х концентрация испытуемоro образца в растворе; С 5 концентрация стандартноro образца в растворе; / интенсивность флуоресценции раст вора Хиспытуемоrо образца; 15 интенсивность флуоресценции paCT вора стандартною образца. Если значения интенсивности флуорес ценции не CTpOro пропорциональны значениям концентрации растворов, измерения MOryт про водиться с использованием rрадуировочноro rрафика. В некоторых случаях измерения MOryт про водиться С использованием qpиксированно ro стандарта (например. флуоресцирующеro стекла или раствора флуоресцирующей жидко сти). В таких случаях концентрация испытуемо ro вещества может определяться с использова нием rрадуировочноro rрафика, построенноrо в тех же условиях. 01/2013:20222 2.2.22. АТОМ НО-ЭМИССИОННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП Атомная эмиссия это процесс испуска ния электромаrнитноro излучения возбужденны ми атомами или ионами. В атомноэмиссионной спектрометрии испытуемый образец подверrа ется воздействию достаточно высоких темпе ратур, вызывающих как диссоциацию на атомы, так и значительное количество соударений, при водящих к возбуждению и ионизации атомов ис пытуемоrо образца. Атомы и ионы, будучи в воз бужденном состоянии, r.пособны возвращаться в основное энерrетическое состояние с переда чей тепловой или излучающей энерrии и испу сканием (эмиссией) электромаrнитноro излуче ния. Эмиссионный спектр элемента содержит несколько больше линий, чем соответствующий абсорбционный спектр.
2.2.22. Атомноэмuccuонная спектрометрия 63 Атомноэмиссионная спектрометрия это метод определения содержания химическоro элемента в испьпуемом образце посредством измерения интенсивности одной из эмиссион ных линий атомноro пара элемента. Определе l1ие проводят при длине волны, соответствую щей выбранной эмиссионной линии. В данной статье описан только метод атоми зации с использованием пламени. Метод aTOM но--эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (АЭСИСП) описан в друrой общей статье. ПРИ БОР rлавными составляющими частями прибора являются: система введения и распыления образца; пламенный reHepaTop атомноro пара, монохроматор; детектор; блок сбора данных. Для получения пламени MOryт быть исполь зованы водород, ацетилен, пропан или бу",-ан в сочетании с кислородом или воздухом. Выбор reHepaTopa атомноro пара является критическим моментом, так как он должен обеспечивать дo статочную энерrию для возбуждения и распы ления атомов. Атомные спектры, полученные с использованием пламенною reHepaTopa aTOM ноro пара, имеют преимущества, будучи более простыми, по сравнению со спектрами. получен ными с использованием reHepaTopoB атомноro пара друrих типов, однако основным лимитиру ющим фактором в ею использовании являет ся недостаточная мощность для возбуждения атомов мноrих элементов. Предпочтительным растворителем для приroтовления испытуемых растворов и растворов сравнения является под кисленная вода, но MOryT быть использованы и орrанические растворители, если доказано, что они не влияют на стабильность пламеНI. ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ Спектральную интерференцию уменьша ют или исключают путем выбора для измере ния подходящей линии спектра либо подбора ширины щели. Физическую интерференцию Kap ректируют разведением раствора испытуемо ro образца, подбором матрицы или использова нием метода стандартных добавок. Химическую интерференцию уменьшают использованием химических модификаторов или ионизационных буферов. ЭФФЕКТ ПАМЯТИ Эффект памяти, вызванный остатками aHa лита в приборе, может быть лимитирован тща тельным промыванием прибора между испы таниями, разведением, если это возможно, измеряемых растворов, уменьшая таким обра зом содержание соли, и как можно быстрейшим впрыскиванием растворов. МЕТОД По возможности рекомендуется использо вать пластмассовую лабораторную посуду. Атомноэмиссионный спектрометр BЫBO ДЯТ на режим в соответствии с инструкцией за водапроизводителя и устанавливают необхо димую длину волны. Устанавливают пара метры эксперимента (температура пламени, настрой ка roрелки, использование ионноro буфера, KOH центрация растворов), необходимые для опре деления анализируемою элемента, учитывая матрицу образца. В reHepaтop атомноro пара вводят холостой раствор и настраивают реrи ст рирующее устройство на нулевое значение или на значение холостою опыта. Вводят paCT вор сравнения определяемоro элемента с наи большей концентрацией и настраивают прибор так, чтобы получить реrмстрируемый сиrнал в оптимальном диапазоне измерений. Предпочтительно, чтобы концентрации pac ТЕОрОВ находились в линейной части rрадуиро вочноro rрафика. Если это невозможно, MOryт быть использованы КРИВОШ1нейные rрадуиро BO'-lНbIе rрафики С применением подходящею проrраммною обеспечения. Определения ПРОВОДЯТ путем сравнения со стандартными растворами с звестными KOH цент рациями определяемою элемента методом rрадуировочною rрафика (метод 1) .1Ш1 методом стандартных добавок (метод 11). МЕТОД i МЕТОД rрАДУИРОВОЧНО,О ,РАФИКА Обычно для измерений rотовят и использу ют три раствора сравнения определяемоro эле мента и холостой раствор. Раствор испытуемоrо образца (испытуемый раствор) ютовят, как указано 6 'iастной статье. Не менее трех растворов сравнени определя GMQrO элемента roТОВЯl [ак. ';тсбы д..аr.азсн KOH цьнтраций этих растворив вКJ.ал ожидаемое знаение концентраций ,-,пределяемurо элемен- та в испытуемом растворе. Для количественно ro анализа оптимальные значения калибровки должны находиться в диапазоне от 0,7 до 1,3 от ожидаемоro содержания определяемою элемен та или от предела, указанноro в частной статье. Для анализа на содержание примесей оптималь ные значения калибровки должны находиться в диапазоне от предела обнаружения до 1,2 от предельноro значения для определяемоro эле мента. Любые реактивы. используемые при при ютовлении испытуемоro раствора, прибавляют в холостой раствор и растворы сравнения в таких же количествах, как и 13 испытуемый раствор. Вводят растворы, используя одинаковое KO личество повторов, для получения устойчивых результатов. Расчет. Строят rрадуировочный rрафик за висимости средних значений эмиссий растворов
64 rосударственная фармакопея Республики Беларусt. сравнения от концентрации, по которому опре деляют концентрацию элемента в испытуемом растворе. МЕТОД 11 МЕТОД СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК Раствор испытуемоro образца (испытуемый раствор) roтовят. как указано в частной статье. Равные объемы испытуемоro раствора помеща ют не менее, чем в три мерные колбы одинако воro объема. Во все мерные колбы кроме одной прибавляют пропорционально увеличивающие ся объемы раствора сравнения с известной KOH центрацией определяемоro элемента, получая серию растворов, содержащих устойчиво воз растающие концентрации элемента, значения эмиссии котороro, если это возможно, находят ся в линейной области rрадуировочноrо rрафи ка. Доводят содержимое каждой колбы paCTBO рителем до метки. Вводят растворы, используя одинаковое KO личество повторов. для получения устойчивых результатов. Расчет. Методом наименьших квадратов рассчитывают линейное уравнение rрафика и по нему концентрацию определяемоrо элемента в испытуемом растворе. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА Через определенные временные интервалы верифицируют удовлетворительное исполнение метода, описанноro в частной статье. ЛИНЕЙНОСТЬ rотовят и анализируют не менее четырех растворов сравнения, концентрация которых Ha ходится в пределах диапазона rрадуировки, и холостой раствор. Проводят не менее пяти по второв. Используя все полученные данные, рассчи тывают линейное уравнение rрафика методом наименьших квадратов. Строят кривую pefpec сии, отмечая средние значения, измеренные значения и доверительный интервал rрадуиро вочноro rрафика. Метод является приrодным при условии соблюдения следующих требований: коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99; на rрадуировочном rрафике поrрешности каждоro калибровочноro уровня должны быть распределены случайным образом. Рассчитывают среднее значение и относи тельное стандартное отклонение для наимень шеro и наибольшеro калибровочноro уровня. В случае если отношение рассчитанноro стандартноro отклонения наименьшеro и наи большеrо калибровочноro уровня менее 0,5 или более 2,0, то более точная оценка rрадуи ровочноrо rрафика может быть получена с ис пользованием взвешенной линейной реrрессии. Линейная и квадратичная весовая функции при меняются к полученным данным для нахожде. .ния наиболее ПОДХОДЯLЦей для использоваНИf весовой qpункции. Если средние значения пр сравнении с rрадуировочным rрафиком про. являют отклонение от линейности, использую, двухмерную линейную реrрессию. ПРАВИЛЬНОСТЬ Предпочтительно верифицировать правиль ность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываемость. Открываемость. В случае методик количе cTBeHHoro определения открываемость должна быть от 90 % до 110 %. Для друrих определе ний, например для определения следовых коли честв элемента, открываемость должна быть от 80 % до 120 % от теоретическоro значения. OT крываемость может быть определена с исполь зованием подходящеrо раствора сравнения (Ma триксноrо раствора), содержащеrо известное количество аналита (средняя концентрация rpa дуировочноro rраqpика). СХОДИМОСТЬ Сходимость должна быть не более 3 % для количественноrо определения и не более 5 % для испытания на содержание примесей. ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННО/О ОПРЕДЕЛЕНИЯ Удостоверяются, что предел количественно ro определения (например, определенный с ис пользованием приближения 10а) ниже измеряе моro значения. 01/2013:20223 2.2.23. АТОМНОАБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП Атомная абсорбция это процесс поrло щения электромаrнитноro излучения специфи ческой длины волны атомом в основном cocтo янии С переходом в возбужденное состояние. Атомы в основном состоянии поrлощают энер rию с резонансной частотой, и вследствие TaKoro резонансноro поrлощения электромаrнитное из лучение ослабляется. Поrлощенная энерrия фактически прямо пропорциональна количеству присутствующих атомов. Данная rлава приводит общую информа цию и определяет порядок действия при опре делении элементов атомноабсорбционной спектрометрией либо с помощью атомизации с
2. 2.23. Атомноабсорбцuонная спектрометрия 65 использованием пламени, электротермическоro испарения в rрафитовой печи, получения rидри дов либо методом холодноro пара для опреде ления ртути. Атомноабсорбционная спектрометрия это метод определения концентрации элемента в испытуемом образце путем измерения поrло щения электромаrнитноro излучения атомным паром элемента испытуемоro образца. Испыта ние проводят при длине волны одной из линий поrлощения (резонансных линий) определяемо ro элемента. Количество поrлощенноrо излуче ния, в соответствии с законом БуrераЛамберта Бера, пропорционально концентрации элемента. ПРИБОР Основными составляющими частями прибо ра являются: источник излучения; система введения и распыления образца: атомизатор; монохроматор или полихроматор; детектор; блок сбора данных. Прибор обычно оснащается системой KOp рекции фона. В качестве источника излуче ния используют лампы с полым катодом (ЛПК, HCL hollowcathode /атр) и безэлектродные rазоразрядные лампы (Бэrл, EDL e/ectrode /ess discha'ge /атр). Излучение таких ламп co стоит из спектра, представляющеro собой очень узкие линии с полушириной около 0,002 нм. Существует три типа атомизаторов: Пламенный метод Пламенный атомизатор состоит из систе мы распыления с пневматическим приспосо блением для получения аэрозоля, реrулятора rаза и roрелки. Для получения температуры от 2000 К до 3000 К используют различные смеси rорючеrо rаза (пропан, водород и ацетилен) и окислителя (воздух и оксид азота). Конфиrу рацию roрелки адаптируют под используемые rазы, скорость подачи rаза реrулируется. Об . разцы распыляют, используя подкисленную воду как предпочтительный растворитель для приroтовления испытуемых растворов и pac творов сравнения. MOryT быть использованы и орrанические растворители, если rарантиро вано, что они не влияют на стабильность пла мени. Метод электротермической атомизации Основными составляющими электротер мическоro атомизатора являются rрафитовая трубчатая пе% и источник электроэнерrии. При использовании rрафитовой трубчатой печи про исходит полная атомизация образца и атомный пар удерживается на пути излучения в тече ние длительноro времени, что улучшает предел определения. Образцы (жидкости и твердые Be щества) вводят непосредственно в rрафитовую 9 Заh 1712 трубчатую печь, которая наrревается постепен но по заданной проrрамме, сначала высушивая образец, затем удаляя основные компоненты матрикса путем пиролиза, после чеrо атоми зируя весь аналит. Очищают печь. наrревая ее до температуры более высокой, чем темпера тура атомизации. Продувание rрафитовой печи инертным rазом во время пиролиза приводит к более качественному процессу атомизации. Метод холодН020 пара и 2идридный метод Атомный пар может быть получен и вне спектрометра. Такой способ получения aTOMHO ro пара используют в методе холодноro пара при определении ртути или для определения таких элементов, образующих rидриды, как мышьяк, сурьма, висмут, селен и олово. В случае опре деления ртути, атомы rенерируют химическим восстановлением с помощью хлорида олова или борrидрида натрия, после чеro атомный пар быстро переносят с помощью инертноro rаза в холодную кварцевую кювету, расположенную на пути излучения, испускаемоro пампой. rидриды, rенерированные таким образом, пере носятся с помощью инертноrо rаза в roрячую кювету, rдe они диссоциируют на атомы. ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ При измерениях атомной абсорбции MOryT иметь место химическая, физическая, иониза ционная и спектральная интерференции. Хи мическую интерференцию компенсируют ис пользованием модификаторов матрикса или высвобождающих areHToB либо использовани ем высоких температур пламени оксид азота ацетилен. Ионизационную интерференцию компенсируют использованием специальных ионизационных буферов (например, лантановых или цезиевых). Физическую интерференцию, обусловленную высоким содержанием соли или вязкостью, компенсируют, используя разведе ние образца, посредством метода стандартных добавок или подбором матрикса. Спектральная интерференция происходит при перекрывании рзонансных линий, и для ее исключения ис пользуют друryю резонансную линию. Исполь зование коррекции фона Зеемана также компен сирует спектральную интерференцию и помехи, связанные с поrлощением излучения моле кулами, особенно при использовании метода электротермической атомизации. Также к спек тральной интерференции может при водить ис пользование мноroэлементных ламп С полым катодом. Специфическое или неспецифическое поrлощение ИЗМАРЯЮТ в спектральном диапа зоне, определяемом выбранной шириной щели монохроматора (0,22 нм). КОРРЕКЦИЯ ФОНА Рассеивание и фон увеличивают значе ние измеряемоro поrлощения при атомизации
66 rосударственная фармакопея Республики Беларусь пламенем или при электротермической атоми зации. Поrлощение фоном охватывает Ш:lрО кий диапазон длин волн, в то время как aTorv:bI поrлощают в очень узких диапазонах порядка O,005,02 нм. Поrлощение фоном может быть скорректировано использованием контрольно ro раствора, имеющеro точно такой же состав, что и раствор образца, за исключением опреде ляемоro элемента. что, однако, часто является неосуществимым. При электротермической ато' мизации температура пиролиза должна быть подобрана так, чтобы исключить продукты раз ложения матрикса, вызывающие фоновое по. rлощение. Коррекция фона может быть прове дена также с использованием двух различных источников энерrии: лампы с полым катодом. с помощью которой измеряют общее поrлощение (элемент + фон), и дейтериевой лампы с непре рыв ной эмиссией, с помощью которой измеря ют фоновое поrлощение. Для коррекции фона сиrнал, полученный от дейтериевой ламы, выи тают из сиrнала, полученною от лампы с полым катодом. Этот способ лимитирован спектраль ным диапазоном дейтериевой лампы (от 190 нм до 400 нм). Фоновое поrлощение также может быть найдено путем измерения поrлощения при двух длинах волн: резонансной линии и длине волны, близкоЙ к резонансной, но при которой не наблюдается поrпощения образцом, и последу ющим вычитанием из поrлощения резочянсной линии поrлощения второй длины волны. Еще один способ коррекции фона эффект 3еемана (основан на расщеплении 3€er"aHa линии поrлощения в маrнитном поле). Даннь:й способ особенно полезен в случае, если фон имеет тонкую структуру, а также позволяет зна чительно скорректировать фон в диапазоне от 185 нм до 900 нм. ВЫБОР УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЯ После подбора подходящей длины волны и ширины щели для определяемоro элемента pac сматривают следующие моменты: коррекцию неспецифическоro фоновоro поrлощения; необходимость прибавления химических модификаторов или ионизационных буферов к образцу, а также к контрольному раствору и pac творам сравнения; разведение образца (например, для мини мизации физической интерференции); детали температурной проrраммы, пред варительный HarpeB, высушивание. пиролиз, атомизацию, постатомизацию со временем ли нейноrо нарастания и временем удерживания: расход инертноro rаза; модификаторы матрикса для электротер мической атомизации (печь); химические восстанавливающие peareH ты для определения ртути или друrих rидри добразующих элементов вместе с температурой кюветы с холодным паром или температурой Ha rреваемой кюветы; технические требования по исполнению печи (камера, платформа Львова и друrие). МЕТОД По ВОЗМОХНОСТИ рекомендуется использо вать пластмассовую Л8бораторную посуду При roтовление образцов может вкпючать paCTBope ние, варку (преимущественно с использованием микроволновоro излучения), стадию прокалива ния или их сочетание для Toro, чтобы О<JИСТИТЬ Ma трикс образца и/или удалить уrлеродсодержащие вещества. Если процесс происходит в открытой системе, если в частной статье не указано иноrо, TeMf1epaTypa прокаJ"1ивания не должна превышать 600 ос по причине летучести некоторых металлов. Атомноабсорбциончый спектрометр BЫ водят на режим 8 соответствии с инструкци ей заводапроизвrщителя и устанавливают He обходимую длину волны. В reHepaToP aTOMHoro пара вводят холостой раствор и настраивают реrистрирующее устройство на максимум про пускания. Значение холостоro опыта может быть найдено при использовании растворителя для выведения при60ра на нулевое значение. Вводят раствор сравнения определяемоro эле мента с наибольшей концентрацией и настраи вают прибор так, чтобы получить максимальный реrИСТРli1руемый сиrнал. Во избежание заrряз нения и эффекта памяти тщательно промывают прибор. После завершения анализа прибор про r,lывают водой Рили ПО,'1кисленной водой. В С,'lучае использс::,ан;;'1 техники ввода T8ep дых проб все УСJlОВИ пооведения испытания описывают в частной статье. Предпочтительно. чтобы концентрации pac творов находились в линейной части rрадуиро вочноro rрафика. Если это невозможно, MOryT быть использованы криволинейные rрадуиро вочные rрафики с применением подходящеro проrраммноro обеспечения. Определения проводят путем сравнивания со стандартными растворами с известными co держаниями определяемоro элемента или MeTO дом rрадуировочноro rрафика (метод 1), или Me тодом стандартных добавок (метод 11). МЕТОД / МЕТОД rРАдУиРовочноrо rРАФИКА Обычно для измерений roтовят и использу ют три раствора сравнения определяемоro эле мента и холостой раствор. Испытуемый раствор rотовят, как указано в частной статье. Не менее трех растворов cpaBHe ния определяемоro элемента rотовят так, чтобы диапазон концентраций этих растворов включал ожидаемое значение концентрации определя емоro элемента в испытуемом растворе. ДЛЯ KO личественноrо анализа оптимальные значения Ka либровки должны находиться в диапазоне от 0,7 до 1,3 от ожидаемою содержания определяемо
2.2.24. Абсорбционная спектрофотометрuя в инфракрасной области 67 ю элемента или от предела, указанноro в част ной статье. Для анализа на содержание примесей оптимальные значения калибровки должны Haxo диться в диапазоне от предела обнаружения до 1 ,2 от предельноro значения для определяемоro эле мента. Любые реактивы, используемые при приro товлении испытуемою раствора, прибавляют в xo лостой раствор и растворы сравнения в таких же количествах, как и в испытуемый раствор. Вводят растворы, используя одинаковое KO личество повторов, для получения устойчивых результатов. Расчет. Строят rрадуировочный rрафик за висимости средних значений поrлощений pac творов сравнения от концентрации, по которому определяют концентрацию элемента в испыту емом растворе. МЕТОД 11 МЕТОД СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК Испытуемый раствор roтовят, как указа но в частной статье. Равные объемы испытуе моro раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы одинаковоro объема. Во все мерные колбы кроме одной прибавляют пропор ционально увеличивающиеся объемы раствора сравнения с известной концентрацией опре деляемоro элемента, получая серию paCTBO ров, содержащих устойчиво возрастающие KOH центрации определяемоro элемента, получая, если это возможно, значения в линейной обла сти кривой. Доводят содержимое каждой колбы растворителем до метки. Вводят растворы, используя одинаковое KO личество повторов, для получения устойчивых результатов. Расчет. Методом наименьших квадратов находят линейное уравнение rрафика и по нему рассчитывают концентрацию определяемоro элемента в испытуемом растворе. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА Через определенные временные интервалы верифицируют удовлетворительное исполнение метода, описанною в частной статье. ЛИНЕЙНОСТЬ rотовят и анализируют не менее четырех pac творов сравнения, концентрация которых Haxo дится в пределах диапазона rрадуировки, и холо стой раствор. Проводят не менее пяти повторов. Используя все полученные данные, рассчи тывают линейное уравнение rрафика методом наимеНhШИХ квадратов. Строят кривую perpec сии, отмечая средние значения, измеренные зна чения и доверительный интервал rрадуировоч ною rрафика. Метод является приroдным при условии соблюдения следующих требований: коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99; на rрадуировочном rрафике поrрешности каждоrо калибровочноro уровня должны быть распределены случайным образом. Рассчитывают среднее значение и относи тельное стандартное отклонение для наимень шеro и наибольшею калибровочноro уровня. В случае если отношение рассчитанноro стандартною отклонения наименьшею и наи большею калибровочноro уровня менее 0,5 или более 2,0. может быть получена более точная оценка rрадуировочною rрафика с использова нием взвешенной линейноЙ реrрессии. И пиней ная, и квадратичная весовая функции приме няются к полученным данным для нахождения наиболее подходящей для использования Beco вой функции. Если средние значения при cpaB нении с rрадуировочным rрафиком проявляют отклонение от линейности. используют ДBYXMep ную линейную реrрессию. ПРАВИЛЬНаСТЬ Предпочтительно верифицировать правиль ность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываем ость. Открываемость. В случае методик количе ственною определения открываемость должна быть от 90 % до 110 %. Для друrих определе ний, например для определения следовых коли честв элемента, открываемость должна быть от 80 % до 120 % от теоретическою значения. OT крываемость может быть определена с исполь зованием подходящеro раствора сравнения (Ma триксноro раствора), содержащею известное количество аналита (средняя концентрация rpa дуировочноro rрафика). СХОДИМОСТЬ Сходимость должна быть не более 3 % для количественноro определения и не более 5 % для испытания на содержание примесей. ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННО/О ОПРЕДЕЛЕНИЯ Удостоверяются,чтопределколичественно ro определения (например, определенный с ис пользованием приближения 100) ниже измеряе моro значения. 01/2013:20224 2.2.24. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ИНФРАКРАСНОЙ ОБЛАСТИ =Спектрофотометрию в инфракрасной об ласти спектра обычно используют для исследо
68 rосударственная фармакопея Республики Беларусь вания строения молекул, идентификации, коли чественною определения, а также для контроля примесей в субстанциях.# Инфракрасные спектрофотометры приме няют для записи спектров в области от 4000 CM1 ДО 650 CM1 (от 2,5 мкм до 15,4 мкм), а в HeKOТO рых случаях до 200 CM1 (до 50 мкм). ПРИ БОР Спектрофотометры для снятия спектров co стоят из подходящеro источника излучения, MO нохроматора или интерферометра и детектора. В спектрофотометрах с Фурьепреобразо ванием используется полихроматическое из лучение и рассчитывается спектр в заданной области частот путем Фурьепреобразования ис ходных данных. Также MOryT быть использова ны спектрофотометры, снабженные оптической системой, способной выделять монохроматиче ское излучение в измеряемой области. Обычно спектр представляется как функция пропускания, т. е. отношение интенсивности прошедшеrо к ин тенсивности падающеro на образец излучения. Но также может быть представлен как функция поrлощения. Оптическую плотность (А) определяют как десятичный лоrарифм величины, обратной про пусканию (7): (1\ (/ ) А =lgl 1=lg l , ,Т) /, rде: T=' /0 ' /0 интенсивность излучения, падающеro на вещество; I интенсивность излучения, прошедшеro через вещество. #Каждый инфракрасный спектр характеризу ется серией полос поrлощения, максимумы KO торых определяются волновым числом v или длиной волны Л и интенсивностью максимумов поrлощения. Волновое число v, выраженное в обратных сантиметрах (CM1), определяется из соотношения: 104 \' == , ). rдe: л длина волны, мкм.# подrОТОВКА ОБРАЗЦА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ ПРОПУСКАНИЯ ИЛИ поrЛОЩЕНИЯ Жидкости. Жидкости исследуют в форме пленки, находящейся между двумя пластинка ми, прозрачными для инфракрасноrо излучения, или в кювете с соответствующей толщиной слоя, также прозрачной для инфракрасноrо излучения. Жидкости или твердые вещества в рас- творе. rотовят раствор испытуемоro образца в подходящем растворителе. Выбирают KOH центрацию вещества и толщину слоя кюветы, позволяющие получить удовлетворительный спектр. Обычно хорошие результаты получа ют при концентрациях от 1 О r/л до 100 r/л при толщине слоя от 0,5 мм до 0,1 мм. Поrлощение растворителя компенсируют путем помещения в канал сравнения аналоrичной кюветы, содержа щей выбранный растворитель. При использова нии прибора с Фурьепреобразованием записы вают поочередно спектр растворителя и спектр образца и вычитают поrлощение растворителя с учетом коэффициента компенсации. Твердые вещества. Твердые вещества исследуют дисперrированными в подходящей жидкости в виде суспензии или в твердом co стоянии (диски из rалоrенидов щелочных метал лов). Если указано в частной статье, формиру ют пленку из расплавленной массы между двумя пластинами, прозрачными для инфракрасноro излучения. а) Суспензия. Небольшое количество ис пытуемоrо образца растирают с минимальным количеством вазелинов020 масла Рили друrой подходящей жидкости; обычно от 5 Mr до 1 О Mr испытуемоrо образца достаточно для получе ния подходящей суспензии с использованием одной капли вазелинов020 масла Р. Полученную суспензию сжимают между двумя пластинками, прозрачными для инфракрасною излучения. б) Диски. От 1 Mr до 2 Mr испытуемоro об разца растирают с ЗОООО Mr, если нет друrих указаний, тщательно измельченною калия бро мида Р или калия хлорида Р. Обычно этих KO личеств достаточно для получения диска ди аметром 1 o 15 мм и спектра соответствующей интенсивности. Смесь тщательно растирают, по мещают равномерно в пуансон и прессуют при давлении около 800 МПа (8 т,см 2 ). Диски из He стабильных при обычных атмосферных услови ях или rиrроскопичных веществ прессуют в Ba кууме. Причиной образования некачественных дисков MOryT быть такие факторы, как HeДOCTa точное или чрезмерное растирание, влажность или иные примеси в дисперсионной среде и He достаточное измельчение частиц. Диск неприro ден для испытания, если он при визуальном oc мотре неоднороден по прозрачности или если пропускание 2000 CM1 (5 мкм) составляет менее 60 % без компенсации при отсутствии специфи ческой полосы поrлощения вещества. rаЗi>I. rазы исследуют в кювете, прозрачной для инфракрасноro излучения, с длиной оптиче CKoro пути около 100 мм. Кювету откачивают и заполняют через кран или при помощи иroльча тоro клапана через подходящую rазовую линию между кюветой и контейнером с субстанцией, предназначенной для испытания.
2.2.24. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной области 69 Если необходимо, доводят давление в кювете до атмосферноro, используя rаз, про зрачный для инфракрасноro излучения (напри мер, азот Рили ар20Н Р). Мешающее влияние поrлощения воды, уrлерода диоксида или друrих атмосферных rазов исключают путем помеще ния в канал сравнения идентичной кюветы, KOTO рая либо вакуумирована, либо заполнена rазом, прозрачным для инфракрасноrо излучения. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ диФФУзноrо ОТРАЖЕНИЯ Твердые вещества. Растирают в порошок смесь из испытуемоro образца и мелко измель ченноro и высушенноro калия бромида Рили калия хлорида Р. Если иноro не указано в част ной статье, roтовят смесь, содержащую около 5 % испытуемоro образца. Смесь растирают, помещают в чашку для образца и записывают спектр отражения. После обработки записанноro спектра по функции КубелкаМунка (КиЬе/kаМипk) может быть получен спектр поrлощения испытуемоro образца. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ НАРУШЕнноrо полноrо BHYTPEHHErO ОТРАЖЕНИЯ Нарушенное полное отражение (включая MHoroKpaTHoe отражение) касается света, обычно MHoroKpaTHo внутренне отраженноro пропуска ющей средой. Существуют приборы, rдe проис ходит только одно отражение. Испытуемый об разец помещают на внутренний отражающий элемент (ВОЭ, /RE), например, из алмаза, repMa ния, цинка селенида, таллия бромида таллия йодида (KRS5) или из друrorо подходящеro Be щества с высоким коэффициентом преломления, и добиваются плотноro и однородноro контакта со всей поверхностью кристалла внутреннеro OT ражающеro элемента с помощью давления или растворяя испытуемый образец в подходящем растворителе и высушивая полученный раствор на внутреннем отражающем элементе. Просма тривают спектр нарушенноro полноro BHyтpeHHe ro отражения (Н ПВО, ATR). ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ Образцы испытуемоro вещества и стандарт HOro вещества roтовят по одной и той же методи ке и записывают спектры в области от 4000 CM1 ДО 650 CM1 (от 2,5 мкм до 15,4 мкм) в одних И тех же условиях. Минимумы пропускания (макси мумы поrлощения) в спектрах испытуемой суб стзнции должны соответствовать по положению и относительной величине таковым в спектре стандартноro образца. Если спектры, полученные в твердом co стоянии, отличаются по положению минимумов пропускания (максимумов поrлощения), то ис пытуемый образец и стандартный образец обра JO.Зак.1712. батывают одним и тем же способом так, чтобы они кристаллизовались или получались в одной и той же форме, или обрабатывают способом, указанным в частной статье, а затем снимают спектры. ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТАЛОННЫХ СПЕКТРОВ Контроль разрешающей способности. В случае приборов с монохроматором записыва ют спектр пленки полистирола толщиной около 35 мкм. Разность х (см. рисунок 2.2.24.1) между процентом пропускания в максимуме пропуска ния А при 2870 CM1 (3,48 мкм) и минимуме про пускания В при 2849,5 CM1 (3,51 мкм) должна быть более 18. Разность у между процентом пропускания в максимуме пропускания С при .1589 CM1 (6,29 мкм) и минимуме пропускания О при 1583 CM1 (6,32 мкм) должна быть более 10. В случае приборов с Фурьепреобразова нием устанавливают подходящее разрешение с подходящей аподизацией, рекомендуемое про изводителем. Для контроля разрешающей спо собности используют подходящие методы, Ha пример, записывают спектр пленки полистирола толщиной около 35 мкм. Разность между поrло щением в минимуме поrлощения при 2870 CM1 и максимуме поrлощения при 2849,5 CM1 должна быть более 0,33. Разность между поrлощени ем в минимуме поrлощения при 1589 CM1 и MaK симуме поrлощения при 1583 CM1 должна быть более 0,08. <F. 1\ " n ) с f 1 D ф :s; :х: ro "" u >. с: о Q. с: 80 80 60 60 40 40 20 А 20 6 о о 3200 3000 2800 2600 1800 1600 1400 волновое число, СМ ' Рисунок 2.2.24. 1. Типичный спектр полисти рола, используеМ020 для проверки разрешаю щей способности
70 rосударственная фармакопея Республики Беларусь 01/2013:20225 Проверка шкалы волновых чисел. Шкала волновых чисел может быть проверена с ис;->оль зованием пленки полистирола, которая имеет минимум пропускания (максимум поrлощения) при волновых числах (CM'), приведенных в Ta блице 2.2.24.1. Таблица 2.2.24. 1 Максимумы ПРОПУСКдния и допустимые пределы пленки полистирола М Допустимые приделы (CM1) ! .инимум пропускания Прибор ! Прибор с Фу- I (смо1) С монохрома-I рье-преОбра- 1 3060,0 I Т +З В 1 2849,5 :t2,0 :t1.0! 1942,9 :t1,5 :t1,0! 1601,2 :t1,0 I :t1,0 1 1583,0 :t1,O I - :t1 ,0 l , , 1154,5 :t1,O I :t1,0 ! 1028,3 :t1,O:t1 ,О i #Для проверки шкалы волновых чисел MOryT использоваться методики, приведенные в ин струкции К прибору. # Методика. Испытуемый образец rOTo вят к испытанию соrласно инструкции, при ложенной к эталонному спектру/стандартно му образцу. Использу УСJlСВ'Я. при KOTOpblX записывали эталонныЙ спектр обы'-iНО СО8па дающие с условиями для проверки разреша ющей способности, записывают спектр испы TyeMoro образца. Положения и относительные величины полос на спектре испытуемоro образца и на эталонном спектре должны соrласовываться между собой. Компенсация влияния паров воды и ат- мосферноrо уrлерода диоксида. В случае приборов с Фурье-преобразованием спектраль- ная интерференция, вызываемая парами воды идиоксидом уrлерода, компенсируется с ис пользованием подходящих алroритмов в соот- ветствии с инструкциями производителя. Кроме тоro, спектры MorYT быть получены либо с ис пользованием продутых приборов, либо при аб солютно одинаковых условиях записи однолу чевоro спектра фона и спектра образца. ПРИМЕСИ В rАЗАХ Для анализа примесей используют кювету, прозрачную для инфракрасноrо излучения и имеющую соответствующую длину оптическо ro пути (например, от 1 м до 20 м). Кювету за полняют так, как указано в разделе «rазы». Для определения и количественной оценки приме сей используют методики, указанные в частных статьях. 2.2.25. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ И ВИДИМОЙ ОБЛАСТЯХ Определение оптической плотности. Оп тическая плотнсть (А) раствора представляет собой десятичный ЛОi арифм обратной величи ны пропускания (т) для монохроматическоro из- лучения и выражается соотношением: 1 по '\ А = I g .. I = I g ,1 1, \ Т J 1C , j rдe: T=: 'о 'о интенсивность падающеrо MOHoxpOMa тическоro излучения; / интенсивность прошедшеro MOHoxpOMa' тическоro излучения. В отсутствие друrих физикохимических факторов измеренная оптическая плотность (А) пропорциональна длине пути (Ь), через который проходит излучение, и концентрации (с) веще ства в растворе в соответствии с уравнением: А = ;, с . Ь, rдe: [; молярный kо-эфсрициент ПОrJ IOщения; Ь длина оптичеекоrо пути. в сантиметрах, с концентрация вещества в растворе, в моль на литр. Величина Ас.. представляет собой удель- ный показатель поrлошения. то есть оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 1 О r/л в кювете с толшиной слоя 1 см: А ''''' = 10,[, . ,.,., Мм. Если нет друrих указаний в частной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кюветы 1 см. Если нет друrих указаний в част- ной статье, измерение проводят по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено веще ство. Оптическая плотность растворителя, из меренная против воздуха при указанной длине волны, не должна превышать 0,4 и желатель но, чтобы она была менее 0.2. Спектр поrло щения представляют таким образом, чтобы оп тическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция от длины волны по оси абсцисс. Если в частной статье приводят только одно значение для положения максимума поrлоще ния, то это означае что полученное значение
2.2.25. Абсорбционная спектрофотометрия в уф и видимой областях 71 максимума не должно отличаться от указанноro более чем на :!::2 нм. Прибор. Спектрофотометры, предназна ченные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптиче ской системы, выделяющей монохроматиче ское излучение в области от 200 нм ДО 800 нм. И устройства для измерения оптической плот ности. Проверка шкалы длин волн. Для провер ки шкалы длин волн используют линии BOДO родной или дейтериевой разрядной лампы или линии паров ртути, а также максимумы поrло щения раствора 20льмия перхлората Р, KO торые пред ставлены в таблице 2.2.25. 1. Дo пустимое отклонение составляет :!::1 нм для ультрафиолетовоrо и :!::3 нм для видимоro диа пазонов. Таблица 2.2.25.1 Максимумы ПО2лощения (или испускания) для проверки шкалы длин волн 241,15 нм (Но) 404,66 нм (Hg) 253,7 нм (Hg) 435,83 нм (Hg) 287,15 нм (Но) 486,0 нм (013) 302,25 нм (Hg) 486,1 нм (Н13) 313,16 нм (Hg) 536,3 нм (Но) 334,15 нм (Hg) 546,07 нм (Hg) 361,5 нм (Но) 576,96 нм (Hg) 365,48 нм (Hg) 579,07 нм (Hg) Проверка шкалы оптической плотности. Проверяют значения оптических плотностей, используя подходящие фильтры или раствор калия дихромата Р при длинах волн, указан ных в таблице 2.2.25.2. В таблице 2.2.25.2 приведены точные значения удельноro пока зателя поrлощения и ero допустимые пределы для каждой длины волны. Данные таблицы oc нованы на допустимой поrрешности при изме рении поrлощения :!:О,01. ДЛЯ проверки шкалы оптических плотно стей используют растворы калия диxpOMa та Р, который предварительно сушат при TeM пературе 130 0 С ДО постоянной массы. Для проверки шкалы оптических плотностей при длинах волн 235 нм, 257 нм, 313 нм и 350 нм растворяют 57 ,063,0 Mr калия дихромата Р в 0,005 М растворе кислоты серной и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Для проверки шкалы оптических плотностей при длине волны 430 нм растворяют 57,0 63,0 Mr калия дихромата Р в 0,005 М pac творе кислоты серной и доводят до объема 100,0 мл этим же растворителем. Также MorYT быть использованы и друrие сертифицирован ные стандартные вещества. Таблица 2.2.25.2 Длина Удельн ый I показатель Допустимые волны, поrлощения пределы А;;: нм А ' % I 1см 235 124,5 от 122,9 до 126,2 257 144,5 от 142,8 до 146,2 313 48,6 от 47,0 до 50,3 350 107,3 от 105,6 до 109,0 430 15,9 от 15,7 до 16,1 Предельный уровень рассеянноrо света. Рассеянный свет может быть опреде лен при данной длине волны с использовани ем соответствующих фильтров или растворов. Например, оптическая плотность раствора 2 r/л калия хлорида Р в кювете с толщиной слоя 1 см резко возрастает между 220 нм и 200 нм И имеет значение более 2,0 при 198 нм при использовании воды в качестве компенса ционноro раствора. Также MorYT быть исполь зованы и друrие сертифицированные CTaH дартные вещества. Разрешающая способность (для каче ственноro анализа). Если указано в частных статьях, то определяют разрешающую способ ность спектрофотометра следующим образом. Записывают спектр 0,02 % (об/об) раствора толуола Р в 2ексане Р. Минимаf1ЬНО допусти мое значение отношения оптической плотно сти в максимуме поrлощения при 269 нм к оп тической плотности в минимуме поrлощения при 266 нм указывают в частной статье. Также MorYT быть использованы и друrие сертифици рованные стандартные вещества. Ширина спектральной щели (для коли чественноro анализа). В случае использования спектрофотометра с изменяемой шириной спек тральной щели при выбранной длине волны возможны поrрешности, связанные с шириной этой щели. Для их исключения ширина спек тральной щели должна быть малой по cpaB нению с полушириной полосы поrлощения и в то же время должна быть максимально велика для получения высокоro уровня 'о' Таким обра зом, ширина щели должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло вели чину измеряемой оптической плотности. Кюветы. Допустимые вариации в толщи не слоя используемых кювет должны быть не более :!:О,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемоro и компенсационноrо растворов, должны иметь одинаковое пропускание (или оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать. Чистка и обращение с кюветами должны быть аккуратными.
72 rосударственная фармакопея Республики Беларусь ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В производной спектрофотометрии исr:()ль зуется преобразование исходною спектра поrло щения (нулевой порядок) в производные спек тры первоro, второro и более высоких порядков. ПроизводНblЙ спектр перв020 порядка представляет собой rрафик зависимости rради ента кривой поrлощения (скорость изменения оптической плотности с длиной волны, dА/dл) от длины волны. ПроизводНblЙ спектр втОр020 порядка представляет собой rрафик зависимости кри визны спектра поrлощения от длины волны (d 2 А/dл 2 ). Вторая производная при любой длине волны л связана с концентрацией следующим соотношением: d 2 А d 2 А;с: с'Ь d 2 АЕ сЬ ==''I d/. 2 dл 2 1 О dл. 2 1 О rдe: с' концентрация поrлощающеro paCT вора, в rpaMMax на литр. Прибор. Используют спектрофотометр, OT вечающий указанным выше требованиям и oc нащенный аналоювым резистентноемкостным дифференцирующим модулем, цифровым диф ференциатором или друrими средствами полу чения производных спектров. Некоторые методы получения производных спектров второro поряд ка сдвиrают их относительно спектра нулевою порядка, что следует учитывать там, rдe это He обходимо. Разрешающая способность. Если указа но в частных статьях, записывают производный спектр второю порядка для раствора 0,2 r/л тo луола Р в метаноле Р, используя метанол Р в качестве компенсационноrо раствора. На спек тре должен присутствовать небольшой отри цательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстрему мами при 261 нм и 268 нм соответственно, как показано на рисунке 2.2.25. 1. Если нет друrих указаний в частных статьях, отношение NB (см. рисунок 2.2.25. 1) должно быть не менее 0,2. Методика. rотовят раствор испытуемоro Be щества, устанавливают различные инструмен тальные характеристики в соответствии с ин струкцией к прибору и рассчитывают количество определяемою вещества, как указано в частной статье. #ИДЕНТИФИКАЦИЯ Абсорбционную спектрофотометрию в уль трафиолетовой и видимой областях спектра обычно применяют для идентификации лекар ственною средства в следующих вариантах. 1. Сравнение спектров поrлощения испыту емоro раствора и раствора сравнения; в указан d 2 А/dл 2 26З + + А 265 в 261 268 240 260 280 290 нм Рисунок 2.2.25.1. ной области спектра должно наблюдаться co впадение положений максимумов, минимумов, плеч и точек переrиба. 2. В указанной облаС1И спектра при YKa занных длинах волн должны наблюдаться MaK симумы, минимумы. плечи и точки переrиба; возможно указание только некоторых из этих характеристик. Расхождение между наблюда емыми и указанными длинами волн не должно обычно превышать :t2 нм. 3. В дополнение к варианту 2 при водят еще и удельные показатели поrлощения при указан ных длинах волн. 4. В дополнение к варианту 2 при водят OT ношения оптических плотностей при указанных длинах волн. Возможны и друrие варианты применения, оroворенные в частных статьях. #КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Рекомендуется такая схема про ведения спектрофотометрических измерений: «В изме рительную кювету помещают иСПblтуеМblЙ раствор и определяют ezo оптическую плот ность по сравнению с компенсациОННblМ pac твором. 3атем кювету вblнимаюm, удаляют ее содержимое, снова помещают иСПblтуе МblЙ раствор и снова определяют оптическую плотность. Операцию повторяюm, получая не менее трех значений оптической плотности для иСПblтуеМ020 раствора. Таким же образом получают не менее трех значений оптической плотности для раствора сравнения. Следует избе2ать попадания исследуеМ020 раствора
2.2.25. Абсорбционная спектрофотометрия в уф и видимой областях 73 на внешнюю стенку кюветы. Для расчетов иc пользуют среднее значение полученных опти ческих плотностей испытуеМ02О раствора и раствора сравнения». Однокомпонентный ОДНОВОЛНОВОЙ анализ. Однокомпонентный одноволновой анализ (или «обычная спектрофотометрия» ) это количественное определение одноro из KOM понентов лекарственноro средства посредством измерения оптической плотности раствора ис пытуемою образца при одной аналитической длине волны (АДВ). Такой анализ может проводиться методом показателя поrлощения (МПП) и методом CTaH дарта (М С). При использовании МПП количественное определение проводят посредством измерения оптической плотности (А) раствора испытуемо ю образца при АДВ и расчете концентрации (с) анализируемою компонента по формуле: c А , (1) А 1 % 1см rде: А;;: удельный показатель поrлощения анализируемою компонента при АДВ; с концентрация анализируемою веще ства, % (м/об). При использовании МС количественное определение про водят посредством измерения при АДВ оптических плотностей раствора испы туемоro образца (А) и раствора сравнения (Ао) с концентрацией со и расчета концентрации (с) анализируемою компонента, исходя из форму лы: =. (2) Gэ Ао Измерение оптических плотностей испы туемоro раствора и раствора сравнения следу ет проводить в одних И тех же условиях с мини мальным интервалом времени. В общем случае более надежным является МС. Возможность применения МПП необходи мо в каждом конкретном случае обосновывать, исходя из допусков количественною содержания анализируемоrо компонента, метролоrических характеристик методики и требований к спектро фотометру. Обычно МПП применим при допу сках содержания анализируемоro компонента не менее :!:10 % от номинальноro содержания. Во всех случаях применения одновслновоro однокомпонентноro анализа необходимо, чтобы остальные компоненты препарата не оказывали существенною влияния на результаты. Обычно доля их суммарноro поrлощения в оптическом поrлощении образца при АДВ не должна превы шать десятой части допусков содержания aHa лизируемоro компонента. 11.30K.1712 Мноrокомпонентный спектрофотометри- ческий анализ. Мноroкомпонентный спектро фотометрический анализ применяют для oд HOBpeMeHHoro количественноrо определения компонентов лекарственных средств. В обычной спектрофотометрии поrpешность собственно спектрофотометрических измере ний (<<спектрофотометрическая поrрешность») мало зависит от типа анализируемоro вещества и выбора аналитической длины волны, а определя ется классом спектрофотометра и не превышает обычно 0,5 %. С учетом поrрешностей приroтовле ния растворов это приводит к суммарной поrреш ности анализа, не превышающей обычно 1 %. В отличие от обычной спектрофотометрии, спектрофотометрическая поrрешность мноro компонентною анализа определяется не только > классом прибора, но и сильно зависит от COCTa ва анализируемоrо лекарственноrо средства и особенно выбора аналитических длин волн. Эта поrрешность может быть охарактеризована KO эффициентом усиления К, который показывает, во сколько раз спектрофотометрическая поrреш ность определения данноro вещества в анали зируемой смеси с помощью мноroкомпонентной спектрофотометрии превышает спектрофотоме трическую поrрешность определения этою же вещества в чистом растворе (без друrих компо нентов) методом обычной спектрофотометрии. Способы расчета коэффициентов усиления для каждоro компонента при использовании различ ных методов представлены ниже. Обычными являются величины К в диапазоне 10, но возможны и значения К равные 100 и более, что может приводить к общей поrрешности анализа, составляющей дe сятки и даже сотни процентов. Для получения надежных результатов при количественном определении лекарственных средств коэффициенты усиления К не должны обычно превышать 5. Поэтому проrноз поrрешности определения и сравнение ее с допусками содержания aHa лизируемоro компонента является обязатель ным условием при обосновании применимости методик мноroкомпонентной спектрофотоме трии. Если нет соответствующею обоснования, то должно выдерживаться следующее COOTHO шение между полной относительной поrрешно стью количественноro определения k компонен та анализируемоro образца (Д k r %) и' допусками (:1:8) содержания этоro компонента в образце: l\k.r:5: 0,32. В, (3) l\k.r = 2. SCk,r' (4) rдe: SCkr относительное rенеральное CTaH дартное отклонение полной поrрешности коли чественноro определения k, компонента анали зируемоro образца.
74 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Количественное определение в MHoroKOM понентном спектрофотометрическом ана,lизе основывается обычно на использовании ypaBl;e ния: т А; == L,Eij 'С, j ==1...п, (5) i=-1 rдe: А, оптическая плотность испытуемоro раствора при iой длине волны; Е показатели поrлощения (зависящие q от способа выражения концентрации) Joro KOM понента образца при iой аналитической длине волны; С ] концентрация joro компонента об разца. Для решения данноro уравнения MorYT при меняться различные подходы, среди KOТO рых можно выделить три основных: метод наи меньших квадратов (МНК), модифицирован ный метод наименьших квадратов (ММНК) и метод отношения рассчитанных концентраций (МОРК). Метод наименьших квадратов. Метод наи меньших квадратов (МНК) является об06щени ем метода показателя поrлощения одноволно воro однокомпонентноro анализа. В рамках МНК решение уравнения (3) имеет вид: п C k == Ia k , .А" 1< =1...п, (6) 1=1 Расчетные коэффициенты a MHk находят в соответствии с матричным соотношением: а МНК == (Е Т . E)1 ЕТ, (7) rдe: а МНК матрица расчетных коэффициен тов; Е матрица показателей поrлощения; т символ транспонирования. Выбор аналитических длин волн (АДВ). Выбор АДВ описан в разделе «Модифициро ванный метод наименьших квадратов». ПрО2НОЗ П02решности определения. Полная поrрешность количественноro опреде ления компонента с помощью МНК определя ется из соотношения: S;k., ==(к;нк )2 .(S., +S,)+S" (8) (к;нк )2 == t( ak:,51 J, (9) rде: SCk., относительное стандартное отклоне ние полной поrрешности количественноro опре деления koro компонента образца; А,51 оптическая плотность раствора MO дельной смеси образца, содержащей номи нальные концентрации всех компонентов; c;st номинальная концентрация koro компонента образца в модельной смеси; SA, относительное стандартное OT клонение сходимости оптической плотности на спектрофотометре (включая кюветную по rрешность); SfC' относительное стандартное откло нение правильности оптической плотности на спектрофотометре; Sv,r относительное стандартное OT клонение поrрешности приroтовления pac творов. Величины SA.r И SE.r извеСТНbI из паспорт ных данных спектрофотометра. а Sv., оцени вают, исходя из поrрешностей взятия навесок и разбавлений. При этом должны выполняться соотноше ния (34). Преимуществом МНК является то, что еro применение не требует использования CTaH дартных образцов. Однако изза значитель ной поrрешности правильности оптической плотности (из таблицы 2.2.25.2 видно, что Be личины Sv. MorYT достиrать нескольких про центов) и ее неконтролируемости полная по rрешность анализа посредством МНК может достиrать десяти и более процентов, что делает МНК ненадежным методом. Ero применение предъявляет очень BЫ сокие требования 1( спектрофотометрам и уровню работы аналитическоro персонала, поэтому он применим обычно только в Ha учных исследованиях на стадии разработки лекарственных средств при больших колеба ниях в концентрации анализируемых компо нентов. Модифицированный метод наимень- ших квадратов. Модифицированный метод наименьших квадратов является одним из вариантов обобщения метода стандарта на случай мноroкомпонентной спектрофотоме трии и основан на уравнениях: А m С. т d == = 'r .== 'r.X ( 10) , A SI L.- 1) 51 IJ 1, J=1 С ] J=1 Е 51 '! 'C j r == " т IEik .С: , k=1 , (11) rде переменные имеют тот же смысл, что и в уравнениях (5) и (9), величины 'q представ ляют собой информационные коэффициенты, а Х ; .100 представляет собой концентрацию joro компонента препарата в процентах к ero номинальному содержанию. Решение уравнения (10) имеет вид:
2.2.25. Абсорбционная спектрофотометрия в уф и видимой областях 75 п Х '" ММНК d . k==L,.a ki . ,I=1...п, ,1 (12) rдe расчетные коэффициенты а ММНК находят по матричному уравнению а ММНК =(r T .r(1r T , (13) Выбор аналитических длин волн (АДВ). АДВ находят исходя из критерия минимума KO эффициента усиления КММНК, получаемоro из co отношения: т т п (KMMHK)L == I-K: == I-I-(а;МНК)2, (14) J1 j1 ;1 rдe: к J коэффициент усиления для joro компо нента образца. В случае анализа двух соединений по двум длинам волн АДВ можно находить из условия максимума информационных коэффициентов каждоro компонента при одной из двух длин волн. Схема проведения анализа. rотовят MO дельную смесь, содержащую все компоненты препарата точно в номинальных концентраци ях (раствор сравнения). Проводят необходимые разбавления, измеряют попеременно оптиче ские плотности испытуемоro раствора и paCT вора сравнения при АДВ и проводят расчет по уравнениям (1 o 11 ). ПрО2НОЗ П02решности определения. Полную поrрешность количественноro опреде ления компонента с помощью ММНК определя ют из соотношения: S2 = 2. [(кММНК ) 2 .S2 +s2] ( 15) ck,r k А" V,r J Должно выполняться соотношение (3). Недостатком ММНК является необходи мость приroтовления точной номинальной смеси образца, однако он является самым надежным и точным из всех мноroволновых методов количе ственноro определения лекарственных средств. Частный случай количественное опре деление одН020 компонента смеси по одной длине волны. Если информационный коэффици ент (J k компонента при iой длине волны зна чительно превосходит все остальные, то количе ственное определение этоro компонента можно проводить по упрощенной формуле: X k =dj> (16) Максимальная поrрешность такоro прибли жения не превосходит 2B(1k)' Данное прибли жение является обоснованным при k 0,95. Метод отношения рассчитанных KOH центраций. Метод отношения рассчитанных концентраций (МОРК) является одним из вари антов обобщения метода стандарта на случай мноroкомпонентной спектрофотометрии и oc нован на допущении, что отношение KOHцeH траций, рассчитанных для испытуемоro paCT вора и раствора сравнения, является более точным, чем сами рассчитанные KOHцeHTpa ЦИИ, то есть: п Iakj.A j Х == j1 , (17) k 5t п C k Ia k ; .A;st 1=1 rдe: a kj коэффициенты расчетной матрицы, полученные с помощью МНК (уравнение (7» или друrими методами цифровой фильтрации, например, методом производной спектрофото метрии. В отсутствии фона поrлощения самым точным является применение МНК. Выбор аналитических длин волн (АДВ). Смотрите выбор АДВ и ммнк. Процедура проведения анализа. Такая же, как для ММНК, но для изrотовления модель ной смеси можно использовать концентрации компонентов, близкие (а не точно равные) к HO минальным. Расчет концентраций проводят по уравнению (17). Пр02НОЗ П02решности определения (в случае использования МНК) проводят по COOT ношению: S;k" = 2. [(к;нк)2 .S;" +S.,]. (18) Должно выполняться соотношение (3). МОРК менее точен, чем ММНК, но он не требует приroтовления точно номинальной смеси и поэтому проще в применении. #ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ Производную спектрофотометрию исполь зуют для количественноro определения обычно в тех случаях, Korдa имеется фоновое поrло щение, вызванное присутствием веществ, co держание которых не реrламентируется. Она может применяться в двух вариантах. В первом случае получение производной проводит сам аналитик с помощью произво дных полиномов, которые представляются в уравнении (17) вместо величин a k ;. Проrноз по rрешности концентрации должен учитывать в этом случае поrрешность неполноro обраще ния в нуль поrлощения друrих компонентов смеси. Во втором случае непосредственчо ис пользуют значения производных, получаемых на спектрофотометре. Процедура анализа при этом аналоrична применению метода CTaHдap та в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют произво дные.
76 01/2013:20226 /осударственная фармакопея Республики Беларусь 2.2.26. БУМАЖНАЯ ХРОМАтоrРАФt'fЯ #Хроматоrрафия на бумаrе представляет собой хроматоrрафический метод разделения. при котором подвижная жидкая фаза перемеща ется по капиллярам и поверхности xpoMaTorpa фической бумаrи либо веществ, предварительно нанесенных на ее волокна. В бумажной xpOMaTO rрафии используют хроматоrрафическую бумаry нужной плотности квалификации «Для xpOMaTO rрафии».# ВОСХОДЯЩАЯ ХРОМАтоrРАФИЯ НА БУМАrЕ Оборудование. Оборудование представляет собой стеклянную камеру с тщательно пришли фованной крышкой, соответствующую по разме рам используемой хроматоrрафической бумаrе. Камера в верхней части должна быть снабжена приспособлением для закрепления xpoMaTorpa фической бумаrи, с помощью котороro ее можно опускать, не открывая камеры. На дне камеры помещена емкость (лодочка) для подвижной фазы, в которую должен быть поrружен нижний край бумаrи. Хроматоrрафическая бумаrа пред ставляет собой соответствующую фИЛЫр08аль ную бумаry, разрезанную на ПОЛОСКИ достаточ ной длины и шириной не менее 2.5 см: бумаrа должна быть разрезана так, чтобы подвижная фаза двиrалась вдоль направления волокна бумаrи. #В некоторых случаях допускается использо вание хроматоrрафических камер друrих типов с описанием их в частной статье." Методика. Обозначенную в частной СТЭlъе подвижную фазу помещают в лодочку в количе стве, достаточном для образования слоя 2,5 см. Если указано в частных статьях. между CT€Hl\a ми камеры и лодочки помещают хроматоrрафи ческую бумаry. Для насыщения камеру закрыва ют крышкой и выдерживают в течение 24 ч при температуре от 20 ос до 25 СС. Подцерживают заданную температуру камеры на протяжении всеro испытания. На расстоянии 3 см от одноro края по всей ширине полоски бумаrи карандашом наносят тонкую roризонтальную линию. Обозначенный в частной статье объем раствора наносят на полу ченную линию при помощи микропипетки. Если весь обозначенный раствор образует пятно диа метром более 10 мм, раствор наносят неболь шими порциями, давая каждой из них высохнуть перед нанесением следующей. Если на одной полоске бумаrи должно быть получено больше одной xpoMaTorpaMMbI, растворы наносят вдоль линии так, чтобы расстояние между точками Ha несения отдельных проб было не менее 3 см. #Если условия насыщения хроматоrрафи ческой камеры, нанесения пятен или xpOMaTO rрафирования отличаются от условий, описан ных выше, они должны быть описаны в частной статье." Бумаry помещают в камеру, закрывают камеру крышкой и выдерживают в течение 1,5 ч. Бумаry опускают в подвижну.о фазу и проводят элюирование в соответствии с указанным Bpe менем или на указанное расстояние, которое должна пройти подвижная фаза. На протяжении всеro процесса злюирсвзния бумаrу защищают от воздействия яркоrо света. Полоску бумаrи BЫ нимают из камеры и сушат на воздухе. #После прохождения подвижной фазой He обходимоrо расстояния, обозначенною в част ной статье, бумаry вынимают, отмечают KapaH дашом конец положения фронта подвижной фазы, сушат и проявляют пятна обозначенным в частной статье способом. Визуальную оценку и количественные из мерения проводят в соответствии со статьей 2.2.27. Тонкослойная хромат02рафия.# НИСХОДЯЩАЯ ХРОМАтоrРАФИЯ НА БУМАrЕ Оборудование. Оборудование представляет собой стеклянную камеру с тщательно пришли фованной крышкой, соответствующую по разме рам используемой хроматоrрафической бумаrе. В центре КрЫШКИ должно быть отверстие с диа метром около 1,5 см, закрытое тяжелой стеклян ной пластиной или пробкой. В верхней части камеры располаrается лодочка для подвижной фазы, снабженная пр.1способлением для закре пления хроматоrраф1ческой бумаrи. От каждой стороны лодочки параллельно ей инемною выше верхнеro ее края размещены два прямых стеклянных стержня, которые подцерживают бумаry в таком положении, чтобы она не сопри касалась со стенками "амеры. Хроматоrрафиче екая бумаrа представляет собой соответствую щую фильтровальную бумаry, разрезанную на полоски достаточной длины шириной не менее 2,5 см и не более длины лодочки; бумаrа должна быть разрезана таким образом, чтобы подвиж ная фаза двиrалась вдоль направления волок на бумаrи. #В необходимых случаях допускается ис пользование хроматоrрафических камер друrих типов с описанием их в частной статье.# Методика. Обозначенную в частной статье подвижную фазу помещают на дно xpoMaтorpa фической камеры в количестве, достаточном для образования слоя 2,5 см. Для насыщения камеру закрывают крышкой и выдерживают в Te чение 24 ч при температуре от 20 ос дО 25 ос. Подцерживают заданную температуру камеры на протяжении всеro испытания. По всей ширине полоски бумаrи KapaHдa шом наносят тонкую rоризонтальную линию от закрепленною в лодочке края на таком paCCTO янии, чтобы линия была размещена параллель но направляющему стержню и несколькими caH тиметрами ниже еro. Обозначенный в частной
2.2.27. Тонкослойная хромат02рафuя 77 статье объем раствора наносят на полученную линию при помощи микропипетки. Если весь обозначенный раствор образует пятно диаме тром более 1 О мм, раствор наносят небольшими порциями, давая каждой из них высохнуть перед нанесением следующей. Если на одной поло ске бумаrи должно быть получено больше одной xpoMaTorpaMMbI, растворы наносят вдоль линии так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. #Если условия насыщения хроматоrрафиче ской камеры, нанесения пятен или хроматоrрафи рования отличаются от условий, описанных выше, они должны быть описаны в частной статье.# Бумаry помещают в камеру, закрывают камеру крышкой и выдерживают в течение 1 ,5 ч. Через отверстие в крышке в лодочку помещают достаточное количество подвижной фазы и прd водят элюирование в соответствии с указанным временем или на указанное расстояние, которое должна пройти подвижная фаза. На протяжении всеro процесса элюирования бумаry защищают от воздействия яркоro света. #После прохождения подвижной фазой He обходимоro расстояния, обозначенноrо в част ной статье, бумаry вынимают, отмечают KapaH дашом конец положения фронта подвижной фазы, сушат и проявляют пятна обозначенным в частной статье способом. Визуальную оценку и количественные из мерения проводят в соответствии со статьей 2.2.27. Тонкослойная хромато?рафия.# 01/2013:20227 2.2.27. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАтоrРАФИЯ Тонкослойная хроматоrрафия (ТСХ) пред ставляет собой метод разделения, в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящеro материала, нанесенноro в виде тонкоro слоя и зафиксированноro на подложке (пластинке) из стекла, металла или пластмас сы. Перед хроматоrрафированием растворы анализируемых веществ наносят на пластин ку. Разделение основано на процессах адсорб ции, распределения, ионноro обмена или на их комбинации и осуществляется посредством пе ремещения в тонком слое (не подвижной фазе) исследуемых веществ, растворенных в paCTBO рителе или в соответствующей смеси раствори телей (подвижной фазе). ОБОРУДОВАНИЕ Пластинки. Хроматоrрафирование прово дят с использованием пластинок, полученных, как указано в статье 4.1.1. Реактивы. 12. За.. 1712. #Допускается использование пластинок, приroтовленных в промышленных условиях, если они отвечают требованиям статьи 4.1.1. Реактивы, а также выдерживают испытание «Проверка приroдности хроматоrрафической системы», описанное в частной статье. PeKO мендуется каждую партию получаемых пласти но к, приroтовленных в промышленных условиях, проверять на близость величин R F . # #Близость величин R F . Испытания прово дят не менее чем на трех пластинках испыту емой партии. Для этоro используют методику проверки хроматоrрафической разделяющей способности, указанной в статье 4. 1. 1. PeaKти вы (ТСХ пластинка со слоем силика2еля Р). На линию старта каждой пластинки наносят по 5 пятен раствора для проверки при20дности ТСХ пластинок Р, хроматоrрафируют и рассчитыва ют величины R F красителей для каждоro HaHece ния. В пределах каждой пластинки наибольшая разница величин R F среди разных нанесений для каждоro красителя не должна превышать 0,02. В противном случае такие пластинки не pe комендуется использовать для фармакопейноro анализа. Предварительная под20товка пластинок. В некоторых случаях может по надобиться про мывка пластинок перед хроматоrрафировани ем, которая может быть выполнена посредством предварительноro элюирования чистых пла стинок подходящим растворителем. Пластинки MOryт быть также импреrнированны (пропитаны) посредством таких процедур, как элюирование, поrружение или опрыскивание. Перед использо ванием пластинки активируют, если необходимо, посредством наrревания в термостате при TeM пературе от 100 ос до 105 ос в течение 1 ч. #Допускаются друrие условия активации пластинок, описанные в частных статьях.# Хроматоrрафическая камера представля ет собой емкость с плотно подоrнанной крыш кой и С плоским дном или дном с двумя же лобами из инертноro прозрачноrо материала, соответствующими по размеру используемым пластинкам. Для rоризонтальноro элюирова ния хроматоrрафическая камера имеет желоб для подвижной фазы и дополнительно coдep жит устройство для подачи подвижной фазы к неподвижной фазе. #Допускается использование xpoMaTorpa фических камер друrих типов С описанием их в частных статьях.# Микропипетки, микрошприцы, калибро ванные капилляры или друrиЕ:' устройства, приrодные для нанесения растворов. Устройство для обнаружения флуорес ценции для обнаружения непосредственной флуоресценции или для обнаружения тушения флуоресценции.
78 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Проявляющие устройства и реаК""ивы. Для проявления разделенных веществ иcri. }пь зуют подходящие устройства, приroдные для нанесения реактивов на пластинку (посред ством опрыскивания, поrружения или обработ ки парами) и, если это необходимо, для Harpe вания. Документирование. Для обеспечения дo кументирования проявленных xpoMaTorpaMM MOryт быть использованы различные приемы, например фотоrрафирование или создание KOM пьютерноro файла. МЕТОДИКА #Если в частной статье нет друrих указаний, хроматоrрафическое разделение выполняют восходящим способом. Предпочтительнее использовать такие под вижные фазы, которые обеспечивают величи ны R F испытуемых соединений в пределах от 0,3 до 0,7. Слой жидкости в хроматоrрафической камере должен быть таким, чтобы после поме щения в неro пластинки пятна ипи полосы Haxo дились над уровнем жидкости." Нанесение. Указанные объемы растворов наносят на подходящем расстоянии от нижнеro края и от боковых краев пластинки на линию, па раллельную нижнему краю пластинки: расстоя ние между центрами круrлых пятен должно co ставлять не менее 10 мм (5 мм для пластинок для высокоэффективной тонкослойной XOOMa тоrрафии (ВЭТСХ), расстояние между краями полос не менее 5 мм (2 мм для пластинок ДЛfl ВЭТСХ). Растворы наносят минимальными пор циями для получения пятен диаметром 25 мм (12 мм для пластинок для ВЭТСХ) или полос длиной 1020 мм (10 мм для пластинок дЛЯ ВЭТСХ) и шириной 12 мм. Если частная статья предусматривает ис пользование наряду с обычными пластинками и пластинок для ВЭТСХ. рабочие условия дЛЯ BЫ сокоэффективной тонкослойной хроматоrрафии указываются в скобках [ ] после указания усло вий для обычных пластинок. Вертикальное элюирование. Стенки xpo матоrрафической камеры выстилают филь тровальной бумаroй. Подвижную фазу нали вают в камеру в количестве, достаточном для тоro, чтобы после смачивания фильтровальной бумаrи покрыть дно камеры слоем жидкости, He обходимым для хроматоrрафирования. Для Ha сыщения хроматоrрафическую камеру с подвиж ной фазой закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 ч при температуре от 20 ос до 25 ос. Если в частной статье нет друrих указаний, xpo матоrрафирование проводят в насыщенной камере. Наносят указанные объемы растворов, как описано выше. После испарения раствори телей из нанесенных проб пластинку помещают в хроматоrрафическую камеру как можно более вертикально, следя за тем, чтобы пятна или полосы находились выше поверхности подвиж ной фазы. Камеру закрывают, оставляют ее при температуре от 20 ос дО 25 ос в защищенном от попадания прямых солнечных лучей месте. После тоro, как подвижная фаза пройдет paCCTO яние, указанное в частной статье, пластинку BЫ нимают, сушат и обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье. В случае двухмерной хроматоrрафии после первоro хроматоrрафирования пластинку сушат и выполняют второе хроматоrрафирование в Ha правлении, перпендикулярном первому. rоризонтальное элюирование. HaHO сят указанные объемы растворов, как описано выше. После испарения растворителей из Ha несенных проб в желоб хроматоrрафической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, поме щают пластинку. убеждаясь, что она расположе на roризонтально и подсоединена к устройству для подачи подвижной фазы, в соответствии с инструкциями производителя. Если указано в частной статье. пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрыва ют и проводят хроматоrрафирование при темпе ратуре от 20 ос дО 25 'с. После тоro, как под вижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна YKClzaHHbIM способом. В случае двухмернои )(роматоrрафии после первоro хроматоrрафирования пластинку СУШа1 и выполняют второе хроматоrрафирование в Ha правлении, перпендикулярном первому. ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА Идентификация. Основное пятно на xpo MaTorpaMMe испытуемоro раствора сравнивают с соответствуюшим пятном на xpoMaTorpaMMe раствора сравнения, сравнивая ЦBe размер и фактор подвижности (R F ) "(или фактор удержи вания (R,»" обоих пятен. Фактор подвижности (R F ) определяют как OT ношение расстояния от точки нанесения пятна до центра пятна после хроматоrрафирования к расстоянию, пройденному фронтом растворите ля от точки нанесения. Проверка разделяющей способности He подвижной фазы для идентификации. Обычно для оценки приroдности достаточно испытания на приroдность неподвижной фазы, описанноro в статье 4.1.1. Реактивы. В особых случаях дo полнительные требования указывают в частных статьях. Сопутствующие примеси. Дополнитель ное пятно (пятна) на xpoMaтorpaMMe испытуе моro раствора сравнивают визуально с COOTBeT ствующим пятном (пятнами) на xpoMaTorpaMMe
2.2.27. Тонкослойная хроматоzрафия 79 раствора сравнения. В качестве стандартноrо образца для приrотовления раствора cpaBHe ния используют как саму примесь (при меси), так и различные разведения испытуемоro раствора. Проверка разделяющей способности. Tpe бования для проверки разделяющей способности приводят в соответствующих частных статьях. Проверка чувствительности. Чувстви тельность считается удовлетворительной, если на xpOMaтorpaMMe наиболее разведенноro paCT вора сравнения четко обнаруживается пятно или полоса. #Способы оценки содержания примесей методом ТСХ. При контроле примесей нежела тельно включение в частную статью требования отсутствия пятна контролируемой при меси на xpoMaтorpaMMe испытуемоro раствора. Методом ТСХ MOryT контролироваться как конкретно YKa зываемые (специфицированные) при меси, так и сумма примесей. Контроль специфицированных примесей. Контроль специфицированных примесей приме няют в тех случаях, коrда содержание каких то конкретных примесей, возникающих в процес се производства лекарственноrо средства или еro хранения, должно быть оrраничено ввиду их токсичности или по друrим соображениям. При контроле специфицированных примесей обычно используют сравнение пятен реrламентирован ных примесей на xpoMaTorpaMMax испытуемоro раствора и раствора сравнения. Контроль обще20 содержания примесей. В тех случаях, Korдa нет оснований считать какие то примеси особо токсичными, часто не так важно знать их истинное содержание. Важно знать, что это содержание не превосходит опре деленноro уровня. В таких случаях использу ют метод внутренней нормализации: в качестве растворов сравнения обычно используют pac творы самой испытуемой субстанции различной концентрации, а содержание примесей находят в пересчете на эту субстанцию. В зависимости от количества различных растворов субстанции, наносимых на xpoMaTorpaMMY в виде растворов сравнения, контроль общеro содержания приме сей может быть одноуровневым, двухуровневым и трехуровневым. В ДBYX и трехуровневых вари антах возможна реrламентация и общей суммы примесей. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ Требования к разрешению и разделению при водят в частных статьях. В том случае, KOrдa вещества, разделяемые методом тонкослойной хrюматоrрафии, поrло щают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом свете, их можно количественно определить непосредственно на пластинке, ис пользуя подходящее оборудование. Для этоro измеряют отражение или пропускание падающе ro света, передвиrая пластинку или измеряющее устройство. Аналоrичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию. Вещества, содержа щие радионуклиды, MOryт быть количественно определены тремя способами: непосредственно на пластинке передви жением пластинки вдоль подходящеro счетчика радиоактивности или счетчика радиоактивности вдоль пластины (см. статью Радиофармацевти ческие препараты); разрезанием пластинки на полосы и из мерением радиоактивности на каждой полосе, с использованием подходящеro счетчика радиоак тивности; соскребанием неподвижной фазы, pac творением ее в подходящем сцинтилляционном коктейле и измерением радиоактивности с ис пользованием жидкостноrо сцинтилляционноrо счетчика. Оборудование. Оборудование для измере ний непосредственно на пластинке включает в себя: устройство для точноro нанесения в опре деленном месте пластинки необходимоro коли чества вещества; механическое устройство для передвиже ния пластинки или измерительноrо устройства вдоль осей Х или У; реrистрирующее устройство и интеrратор или компьютер; для веществ, П02лощающих или флуо ресцирующих в ультрафиолетовом или види мом свете: для измерения отражения или про пускания используются фотометр с источником света, оптическое устройство, rенерирующее монохроматический свет, и фотоэлемент COOT ветствующей чувствительности; в том случае, Korдa измеряется флуоресценция, требуется дo полнительно монохроматический фильтр для выбора соответствующей спектральной области излучаемоro света; для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий счетчик радиоактивности; для неro необходимо проверить линейность диапазона. Методика. rотовят раствор испытуемоro об разца (испытуемый раствор), как указано в част ной статье, и, при необходимости, растворы стандартных образцов анализируемых веществ (растворы сравнения), используя тот же раствори тель, что и для приroтовления испытуемоro paCT вора. Одинаковые объемы каждоro из растворов наносят на пластинку и хроматоrрафируют. Вещества, П02лощающие или флуорес цирующие в ультрафиолетовом или видимом свете. rотовят и наносят не менее трех paCTBO ров сравнения, концентрации которых OXBaTЫBa ют ожидаемое значение концентрации в испыту емом растворе (около 80 %, 100 % и 120 % от этой концентрации). Опрыскивают, если необхо димо, указанным реактивом и реrистрируют OT
80 rосударственная фармакопея Республики Беларусь ражение, пропускание или флуоресценцию на xpoMaTorpaMMax испытуемоro раствора и !)ac творов сравнения. По полученным данным pc.c считывают количество вещества в испытуемом растворе. Вещества, содержащие радионуклиды. ro товят и наносят испытуемый раствор, содержа щий около 100 % ожидаемоro значения KOHцeH трации. Измеряют радиоактивность как функцию длины пути и записывают радиоактивность каж доro полученноro пика в процентах от CYMMap ной радиоактивности. Критерии приroдности системы описаны в статье 2.2.46. Хромат02рафические методы разделения. Допустимые величины изменений, которые можно вносить с хроматоrрафическую систему для удовлетворения критериям приroд ности системы, также указаны в данном разделе. 01/2013:20228 2.2.28. rАЗОВАЯ ХРОМАтоrРАФИЯ rазовая хроматоrрафия (rx) представля ет собой метод разделения, основанный на раз личном распределении образца между двумя несмешивающимися фазами, в котором подвиж ной фазой является rаз (rазноситель), а непод вижной фазой, помещенной в колонку, TBep дое вещество или жидкость, нанесенные на твердый инертный носитель или равномерно по крывающие внутренние стенки колонки. rазовая хроматоrрафия основана на механиз мах адсорбции, распределения или эксклюзии. ПРИБОР Прибор состоит из блока ввода проб (ин жектора), хроматоrрафической колонки, поме щенной в термостат, детектора и реrистрирую щеro устройства (интеrрирующее устройство или самописец). rазноситель проходит с задан ной скоростью или давлением через колонку, а затем через детектор. Определение проводят при постоянной TeM пературе колонки или в соответствии с заданной температурной проrраммой. БЛОК ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОР) Прямой ввод растворов является обычным способом ввода проб, если в частной статье нет друrих указаний. В90Д пробы может осущест вляться либо непосредственно в начало колон ки с использованием шприца или инжекторноro клапана, либо в испаритель, который может oc нащаться делителем потока. Ввод паровой фазы может осуществляться с использованием статической или динамиче ской парофазной системы ввода. Динамическая парофазная (продувка и уло витель ) система ввода включает барботажную установку, при помощи которой летучие веще ства в растворе продуваются в абсорбирующую колонку при невысокой температуре. Задержан ные на колонке вещества затем десорбируются в подвижную фазу при быстром наrревании аб сорбирующей колонки. Статическая парофазная система ввода включает термостатируемую наrревающую камеру для образцов, в которую помещены за крытые виалы с твердыми или жидкими образ цами на фиксированный период времени, позво ляющий летучим компонентам образца достичь равновесия между неrазовой и паровой фазами. После достижения равновесия заданное количе ство паровой фазы из виал вводится в rазовый хроматоrраф. НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА Колонки с помещенной в них неподвижной фазой MOryT быть описаны следующим образом: капиллярные кварцевые колонки с покры тыми неподвижной фазой внутренними CTeHKa ми; колонки, заполненные инертными части цами, импреrнированными неподвижной фазой; колонки, заполненные твердой неподвиж ной фазой. Капиллярные колонки имеют внутренний диаметр (0) от 0,1 мм до 0.53 мм и длину от 5 м до 60 м. Жидкость или неподвижная фаза, KOTO рая может быть химически связана с внутренней поверхностью, представляет собой пленку с тол ЩИ ной слоя от 0,1 мкм до 5.0 мкм. Набивные колонки. изroтовленные из стекла или металла, имеют длину обычно от 1 м до 3 м и внутренний диаметр (0) от 2 мм до 4 мм. He подвижная фаза обычно состоит из пористых полимеров или твердых носителей, импреrниро ванных жидкой фазой. Носители для анализа полярных соеди нений на колонках, набитых малоемкой мало полярной неподвижной фазой. должны быть инертными для предотвращения образования пиков с размытым тылом. Реакционная способ ность носителей может быть снижена путем си ланизации, предшествующей нанесению жидкой фазы. Обычно используют обработанный кис лотой и прокаленный диатомит. Размер частиц может быть разным, но наиболее часто исполь зуются частицы размером от 150 мкм до 180 мкм и от 125 мкм до 150 мкм. ПОДВИЖНАЯ ФАЗА Время удерживания и характеристики пика зависят от скорости потока rазаносителя; время удерживания прямо пропорционально длине KO лонки, а разрешение пропорционально KBaдpaT ному корню из длины колонки. Для набивных колонок скорость потока rазаносителя обычно выражают в миллилитрах в минуту при атмосфер
2.2.28. rазовая хромат02рафия 81 ном давлении и комнатной температуре. Скорость потока измеряется при рабочей температуре KO лонки на выходе из детектора как rрадуирован ным механическим устройством, так и с помощью пенноrо измерителя. Линейная скорость rазано сителя через набивную колонку обратно пропор циональна квадратному корню из внутреннеro диаметра колонки для данноro объема потока. Скорости потока 60 мл/мин при внутреннем диа метре колонки 4 мм и 15 мл/мин при внутреннем диаметре 2 мм дают одинаковые линейные CKOpO сти и близкие времена удерживания. В качестве rазаносителя для набивных KO лоно!< обычно используют rелий или азот, для Ka пиллярных азот, rелий и водород. ДЕТЕКТОРЬ! Обычно используется пламенноионизаци онные детекторы; кроме этоro, в зависимости от цели анализа моryтприменяться следующие типы детекторов: электронноro захвата, азотнофос форный, массспектрометрический, TepMOKOH дуктометрический, ИКспектрофотометрический с преобразованием Фурье и друrие. МЕТОДИКА Колонку, устройство ввода пробы и детектор термостатируют при указанной в частной статье температуре и скорости rазаносителя до полу чения стабильной базовой линии. rотовят испы туемый раствор(ы) и раствор(ы) сравнения, как указано в частной статье. Растворы не должны содержать твердых частиц. Критерии для проверки приroдности xpo матоrрафической системы описаны в статье 2.2.46. Хромат02рафические методы разделе ния, rдe кроме этоro приводятся интервалы, в пределах которых MOryт изменяться различные пара метры хроматоrрафических испытаний без принципиальноro изменения методики, для тоro, чтобы удовлетворять критериям приroдности хроматоrрафической системы. Парофазная rазовая хроматоrрафия Парофазная rазовая хроматоrрафия явля ется методом, наиболее подходящим для раз деления и определения летучих соединений, которые присутствуют в твердых или жидких образцах. Метод основан на анализе rазовой фазы, находящейся в равновесии с твердой или жидкой фазой. ПРИБОР Прибор состоит из rазовоrо xpoMaтorpa фа, снабженноro уr.тройством для ввода испы TyeMoro образца, которое может быть связано с модулем автоматическоro контроля давления и температуры. При необходимости используют устройство для удаления растворителей. Испытуемый образец вводят в контейнер, снабженный подходящей пробкой и клапанной системой, которая реryлирует прохождение ra заносителя. Контейнер помещают в TepMOCTa тируемую камеру с температурой, устанавлива емой в соответствии со свойствами испытуемоro образца. Пробу выдерживают при заданной темпе ратуре в течение времени, достаточноro для установления равновесия меЖдУ твердой или жидкой фазой и rазовой фазой. В контейнер вводят rазноситель и по исте чении указанноro времени открывают клапан, чтобы rаз поступал в хроматоrрафическую KO лонку, перенося с собой перешедшие в rазовую фазу компоненты. Вместо специально оснащенноro устрой ства для ввода образцов хроматоrрафа воз можно использование rазовых шприцов и обыч ноro хроматоrpафа. Уравновешивание в таком случае проводится в отдельной камере, а па ровая фаза вводится в колонку с соблюдением необходимых мер предосторожности для пре дотвращения любых изменений в равновесной системе. МЕТОДИКА Настраивают прибор для получения необхо димоro сиrнала, используя подroтовленные об разцысравнения. МЕТОД ПРЯМОЙ ,РАДУИРОВКИ В одинаковые флаконы раздельно помеща. ют испытуемый образец и каждый из образцов сравнения, приroтовленные, как указано в част ной статье, избеrая контакта между устройством для ввода проб и образцами. Флаконы rерметично закрывают и помеща ют в термостатируемую камеру с температу рой и давлением, указанными в частной статье. После установления равновесия паровую фазу хроматоrрафируют в указанных условиях. МЕТОД СТАНДАРТНblХ ДОБАВОК Равные объемы испытуемоro образца поме щают в одинаковые указанные в частной статье контейнеры. Во все контейнеры, кроме одноro, прибавляют указанные количества раствора сравнения, содержащеro известную KOHцeHTpa цию анализируемоro вещества, для получения ряда образцов с равномерно увеличивающими ся концентрациями этоro вещества. Контейнеры rерметично закрывают и поме щают в термостатируемую камеру с температу рой и давлением, указанными в частной статье. После установления равновесия хроматоrрафи руют rазовую фазу в указанных условиях. Уравнение линейной зависимости рассчи тывают методом наименьших квадратов. По по лученному уравнению определяют KOHцeHTpa цию анализируемоro вещества в испытуемом образце. Допускается определение концентрации с использованием rрафическоro метода. Для этоro
82 rосударственная фармакопея Республики Беларусь по оси ординат откладывают средние значения полученных результатов, а по оси абсцисс концентрации стандартных добавок анализиру емоro вещества. Экстраполируют линию, прохо дящую через полученные точки, до пересечения с осью абсцисс. Расстояние между этой точкой и началом координат представляет собой KOHцeH трацию анализируемоro вещества в испытуемом растворе. МЕТОД ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫХ ОТБОРОВ (мноrОКРАТНАЯ ПАРОФА3НАЯ ЭКСТРАКЦИЯj Применение данноro метода описано в част ной статье. 01/2013:20229 2.2.29. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАтоrрдФия Жидкостная хроматоrрафия (ЖХ) пред ставляет собой метод разделения, основанный на различном распределении образца между двумя несмешивающимися фазами. rдe под вижной фазой является жидкость, которая про ходит сквозь неподвижную фазу, помещенную в колонку. Жидкостная хроматоrрафия основана на механизмах адсорбции, распределения, ион ноro обмена, разделения по размерам молекул (эксклюзии) или стереохимическоrо взаимодей ствия. ПРИБОР Прибор обычно состоит из системы подачи подвижной фазы, блока ввода пробы (инжек тора), хроматоrрафической колонки (может ис пользоваться устройство контроля температуры колонки), детектора и реrистрирующеro устрой ства (интеrрирующее устройство или самопи сец). Подвижная фаза из одной или нескольких емкостей протекает обычно с постоянной CKOpO стью через колонку, а затем через детектор. СИСТЕМА ПОДАЧИ ПОДВИЖНОЙ ФАЗbI Система подачи подвижной фазы (насосная установка) необходима для подцержания посто янной скорости подачи подвижной фазы. Коле бания давления должны быть минимизированы, например, путем пропускания подвижной фазы, находящейся под давлением, через устройство, сrлаживающее пульсацию давления (демпфер). Пр080дящая система капилляров и соединитель ные узлы должны выдерживать давление, которое развивается при работе насосной установки. Ha сосные установки, использующиеся в жидкостной хроматоrрафии, MOryт оснащаться деrазаторами. Система, контролируемая микропроцессо ром, должна обеслечивать точную подачу под вижной фазы постоянноro (изократическое элюирование) или переменноro (rрадиентное элюирование) состава в соответствии с опреде ленной проrpаммой. В случае rpадиентноrо элю ирования необходима насосная установка, по дающая растворители из нескольких емкостей, а смешивание растворителей должно проводить ся на стороне либо низкоro либо высокоro дaB ления насоса(ов). БЛОК ВВОДА ПРОБЫ (ИНЖЕКТОР) Раствор испытуемоro образца вводится в поток подвижной фазы, поступающей в колон ку, при помощи блока ввода, функционирующе ro при высоком давлении. Для ввода пробы ис пользуют петлевые дозаторы фиксированноrо объема или устройства с реryлируемым объе мом, которые MOryт управляться вручную либо посредством автосамплера. Частичное запол нение петлевоro дозатора, осуществляющееся вручную, приводит к снижению точности вводи моro объема пробы. НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА В жидкостной хроматоrрафии используется большое количество типов неподвижных фаз: силикаrель, оксид алюминия или пори стый rрафит. используемый в нормальнофазо вой хроматоrрафии, в которой разделение ос- новано на разнице в адсорбции и/или массовом распределении; смолы или полимеры, модифицированные кислотными или основными r'руппами, использу ющиеся в ионообменной хроматоrрафии, в KO торой разделение основано на конкурирующем взаимодействии между разделяемыми ионами и ионами подвижной фазы; пористый силикаrель или полимеры, ис пользующиеся в эксклюзионной xpoMaTorpa фии, в которой разделение основано на разнице в размерах молекул, соответствующих стериче ской эксклюзии; большое количество химически модифи цированных носителей, изroтовленных из по лимеров, силикаrеля или пористоro rрафита, использующихся в обращеннофазовой xpOMa тоrрафии, в которой разделение основано на разделении молекул между подвижной и непод вижной фазами; специальные химически модифицирован ные неподвижные фазы, например, производны ми целлюлозы или амилозы, белками и пептида ми, циклодеКСТРll'нами и т. д., использующиеся для разделения энаl-iтиомеров (хиральная xpo матоrрафия). Большая часть разделений основана на механизме распределения между химически модифицированным силикаrелем, использу ющимся в качестве неподвижной фазы, и по лярными растворителями, использующимися в
2.2.29. Жидкостная хромат02рафия 83 качестве ПОДВИЖНОЙ фазы. Поверхность носи теля, например, силанольные rруппы силикаrе ля, реаrирует с различными силановыми pea rентами с образованием ковалентно связанных силильных производных, покрывающих различ ное число активных rрупп на поверхности носи теля. При рода модифицированной фазы явля ется важной характеристикой, определяющей разделяющие свойства хроматоrрафческой системы. Ниже представлены наиболее часто исполь зуемые модифицированные фазы: Октильная Октадецильная Фенильная Цианопропильная Аминопропильная Диольная Si[СН2]7СНЗ СВ SНСН2]17СНЗ С 1В Si[CH2JпC6H5 C6H Si[СН2)З CN CN Si[CH2kNH2 NHz SНСН 2 ]з OCH(OH )CH2 OH Если производитель не дает друroй инфор мации, находящаяся в колонках обращеннофа зовая неподвижная фаза на основе силикаrеля считается стабильной в подвижных фазах при значениях рН в диапазоне от 2,0 до 8,0. Непод вижная фаза, представляющая собой пористый rрафит или частицы полимерноro материала, такою как сополимер стиролдивинилбензола, стабильна в более широком диапазоне значе ний рН. В некоторых случаях для анализа приме няют нормальнофазовую хроматоrрафию, ис пользуя в качестве неподвижной фазы HeMO дифицированный силикаrель, пористый rрафит или силикаrель, химически модифицированный полярными rруппами (например, цианопропиль ными или диольными). Размер частиц для большинства неподвиж ных фаз, использующихся для аналитическоro разделения, составляет от 3 мкм ДО 1 О мкм. Ча стицы MOryT иметь сферическую или неправиль ную форму, различную пористость и удельную площадь поверхности. Эти параметры опреде ляют хроматоrрафические свойства конкретных неподвижных фаз. В обращеннофазоврй xpo матоrрафии дополнительными определяющи ми факторами являются природа неподвижной фазы, степень связывания, выраженная в co держании уrлерода, а также эндкепирование подвижной фазы (т. е. силилирование остаточ ных силанольных rрупп). Остаточные силаноль ные rруппы MOryт являться причиной размытия тыла пика, особенно для веществ основною xa рактера. Если нет друrих указаний в частной статье, в аналитической хроматоrрафии используют KO лонки, изroтовленные из нержавеющей стали, с различными длиной и внутренним диаметром (0). Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм часто относят к микроколонкам. Темпера туры подвижной фазы и колонки в течение aHa лиза должны сохраняться постоянными. Боль шинство анализов проводится при комнатной температуре, однако для повышения эффек тивности допускается наrревание колонки. Pe комендуется не HarpeBaTb хроматоrрафическую колонку выше 60 ОС, так как это может привести к разрушению неподвижной фазы или измене нию состава подвижной фазы. ПОДВИЖНАЯ ФАЗА В нормальнофазовой хроматоrрафии ис пользуют малополярные растворители. Для по лучения воспроизводимых результатов нормаль н<rфазовой хроматоrpафии необходимо cтporo контролировать содержание воды в подвижной фазе. В обращенно--фазовой жх используют водные подвижные фазы, содержащие либо не содержащие орrанический модификатор. Компо ненты подвижной фазы обычно фильтруют для удаления частиц с размером более 0,45 мкм. При приrотовлении мноroкомпонентных подвиж ных фаз смешивают отмеренные объемы (или массы) индивидуальных компонентов. Кроме этоro, растворители MOryт подаваться инди видуальными насосами и с помощью дозиру ЮIЦI1Х клапанов смешиваться в необходимых пропорциях. Для предотвращения образования пузырьков rаза и попадания их на детектор pac творители обычно деrазируют при помощи бар ботирования rелием, обработкой ультразвуком или с использованием мембранновакуумных модулей, работающих в режиме «опliпе». Растворители для приrотовления подвиж ных фаз обычно не содержат стабилизаторов, а при использовании ультрафиолетовых дeTeKTO ров должны быть прозрачными при длине волны детектирования. Растворители и друrие компо ненты подвижной фазы должны быть соответ ствующей степени чистоты. Корректировку рН при необходимости проводят для водноro KOM понента подвижной фазы, а не для смеси. Для предотвращения кристаллизации солей после проведения хроматоrрафирования с использо ванием буферных растворов проводят промыв ку системы с использованием смеси воды и op rаническоro модификатора (5 % (об/об». Подвижные фазы MOryT содержать друrие компоненты, например, контрионы для ион парной хроматоrрафии или хиральные модифи каторы для хроматоrрафии, использующей ахи ральные неподвижные фазы. ДЕТЕКТОРЫ Наиболее часто используемыми дeTeKтopa ми являются спектрофотометры, работающие в ультрафиолетовой/видимой (UVNis) областях, а также диодноматричные детекторы. Кроме этоro MOryT использоваться специальные дe текторы: флуоресцентные спектрофотометры, дифференциальные рефрактометры, электро
84 rосударственная фармакопея Республики Беларусь химические детекторы, массспектрометры, дe текторы радиоактивности и друrие. МЕТОДИКА Колонку уравновешивают при указанном составе и скорости подвижной фазы, а также при комнатной температуре или температуре, указанной в частной статье, до получения CTa бильной базовой линии. rотовят испытуемый раствор(ы) и раствор(ы) сравнения, как указа но в частной статье. Растворы не должны coдep жать твердых частиц. Критерии для проверки приroдности xpOMa тоrрафической системы описаны в статье 2.2.46. Хромат02рафuческие методы разделения, rде также при водятся интервалы, в пределах KOTO рых MOryт изменяться различные параметры хроматоrрафических испытаний без принципи альноro изменения методики для тою, чтобы удовлетворять критериям приroдности xpOMaTO rрафической системы. 01/2013:20230 2.2.30. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАтоrРАФИЯ Эксклюзионная хроматоrрафия представля ет собой хроматоrрафический метод, в котором процесс разделения молекул в растворе проис ходит в соответствии с их размерами. В случае использования орrанической подвижной фазы метод называют 2ельпроникающей xpOMaтo 2рафией, а в случае использования водной подвижной фазы 2ель-фuльтрационной хромат02рафией. Проба вводится в колонку, заполненную rелем или пористыми частичками наполнителя, и переносится подвижной фазой через колонку_ Разделение в соотвеТСТВИI4 с размерами происходит в процессе движения и мноrоразовых обменов молекул растворенною вещества между молекулами растворителя под вижной фазы и тем же самым растворителем, находящимся в порах материала, которым за полнена колонка (неподвижная фаза). Диапазон размеров распределенных молекул определяет ся диапазоном размеров пор наполнителя. Достаточно маленькие молекулы, способ ные проникать во все поры материала, элю ируются в полном проникающем объеме колон ки (V/, #объем пор#). Молекулы с размерами, пре вышающиlV'И размер всех пор материала колон ки, миrрируют лишь сквозь пространство между частицами наполнителя, не препятствуя им, и элюируются В свободном объеме колонки или объеме эксклюзии (V O ' объем пустот). Разделе ние молекул в соответствии с размерами про исходит между объемом эксклюзии и полным проникающим объемом колонки; наиболее эф фективное разделение происходит в первые две трети данноro диапазона. Прибор. Специфичной частью оборудования является хроматоrрафическая колонка с различ ными длиной и внутренним диаметром (0), за полненная материалом, который обеспечивает разделение молекул соответствующих размеров в необходимом диапазоне. При необходимости колонку термостатируют. Через колонку с посто янной скоростью пропускают элюент. К одному концу колонки обычно присоединяют приспосо бление для введения пробы, например, инжек тор с прерывателем потока, шприцевой инжек тор с мембраной или инжектор с клапаном. К этому же концу колонки также может быть присо единен соответствующий насос для подачи элю ента с контролируемой скоростью. Проба может также наноситься непосредственно на сухую по верхность материала колонки или, если вязкость пробы превышает вязкость элюента, может Ha слаиваться на поверхность материала колонки под элюент. Друroй конец колонки обычно при соединяют к соответствующему детектору с при способлением, реrистрирующим и обеспечива ющим контроль соответствующих концентраций распределенных компонентов пробы. Обычно используют следующее детекторы: фотометри ческий, рефрактометрический или люминес центный. При необходимости может быть присо единен автоматический коллектор фракций. В качестве наполнителя может использо ваться или мяrкий носитель, такой как набухший rель, или твердый пористое стекло, силика rель или подходящий для данноro растворителя поперечносшитый орrанический полимер. При использовании твердых носителей обычно при меняют принудительную подачу подвижной фазы под давлением, что ускоряет разделение. Подвижную фазу выбирают исходя из природы пробы, наполнителя и метода детектирования. Указания по обработке материала для запол нения колонки перед выполнением разделения и наполнения колонки представлены в COOTBeT ствующей частной статье или инструкции изro товителя. Критерии для проверки приroдности xpOMa тоrрафической системы описаны в статье 2.2.46. Хромат02рафические методы разделения, rдe также приводятся интервалы, в пределах KOTO рых MorYT изменяться различные параметры хроматоrрафических испытаний без принципи альноro изменения методики для тою, чтобы удовлетворять критериям приroдности xpOMaTO rрафической системы. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕльноrо КОМПОНЕНТНОiО СОСТАВА СМЕСЕЙ Разделение проводят, как описано в частной статье. По возможности постоянно контролиру ют элюирование компонентов и измеряют пло щади соответствующих пиков. Если контроль
2.2.31. Электрофорез 85 пробы проводится по физикохимическим свой ствам, по которым все интересующие компонен ты обладают одинаковыми откликами (напри мер, они имеют одинаковое удельное оптическое поrлощение), относительное содержание каж дою компонента рассчитывают как отношение площади пика соответствующеro компонента к сумме площадей пиков всех компонентов. Если отклики компонентов по детектируемому свой ству отличаются, содержание каждою компо нента рассчитывают с помощью rрадуировоч ных rрафиков, полученных с использованием соответствующих стандартных образцов для rрсщуировки, как указано в частной статье. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНblХ МАСС Эксклюзионная хроматоrрафия может быть использована для определения молеКУllЯРНЬ масс веществ путем сравнения с соответсrвую щими стандартными образцами для rрС1ДУИрОВ ки, указанными в частной статье. Для молекуляр ных масс стандартных образцов строят rрафик зависимости объема удерживания от лоrариф ма молекулярных масс. rрафик, выстроенный в пределах, оrраниченных значениями объема эксклюзии и полноrо проникающеro объема, обычно для данной колонки в данных экспери ментальных условиях приближается к ПрЯflliOИ линии. На основании этоro rрафика MorYT быть рассчитаны молекулярные массы. ИСПОЛЬЗ0ва ние молекулярномассовой rрадуировки позво ляет получать достоверные результаты лишь для частных случаев систем высокомолекуляр ное вещество/растворитель в описанных эк(.rlе риментальных условиях. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО МАССОВО/О РАЗДЕЛЕНИЯ ПОЛИМЕРОВ Эксклюзионная хроматоrрафия может быть использована для определения молеКУIlЯРНО массовоro распределения полимеров. Однако сравнить между собой результаты можно лишь в одинаковых экспериментальных условиях. Стандартные образцы, используемые для rpa дуировки, и методики анализа описывают в co ответствующих частных статьях. 01/2013:20231 2.2.31. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ОБЩИЙ ПРИНЦИП Под действием электрическоro поля заряженные частицы, растворенные или дисперrированные в растворе электро лита, передвиrаются в направлении элек трода противоположной полярности. В rель электрофорезе движение частиц замедляется взаимодействием с окружающей матрицей rеля, который действует как молекулярное сито. Встречные взаимодействия электри ческой силы и молекулярною сита приводят к дифференциации скорости передвижения частиц в зависимости от их размеров, форм и зарядов. В ходе электрофореза изза раз личия физикохимических свойств разные Ma кромолекулы смеси передвиrаются с разной скоростью и, таким образом, разделяются на дискретные фракции. #Скорость передви жения прямо пропорциональна суммарному заряду частицы и обратно пропорциональна ее размеру либо молекулярной массе.# #Электрофоретическая подвижность яв ляется величиной, характерной для данною вещества. Различают абсолютную и относи тельную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвиж насть под влиянием rрадиента потенциала 1 В на 1 см измеряется в сантиметрах в секунду. Относительная электрофоретическая подвиж нооь это отношение подвижности испыту eMoro вещества к подвижности друrorо веще ства, принятоrо за стандарт.# Электрофоретическое разделение может бы f ь 11роведено 8 системах без неподвижных фаз (например, свободное разделение paCT вора в капиллярном электрофорезе) и в CTa билизираванных средах, таких как тонкослой ные пластинки, пленки или rели. #Существует два различных метода элек трофореза: фронтальный и зональный. Фрон тальный электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде, и он является един ственным способом определения абсолютной электрофоретической подвижности. Зональ i-IЫЙ электрофорез про водят в закрепленной среде, цель которой состоит в стабилизации электрофоретических зон.# ЭЛЕКТРОФОРЕЗ СО СВОБОДНОЙ ИЛИ ПОДВИЖНОЙ rРАНИЦЕЙ Этот метод обычно используется для определения электрофоретической подвиж ности, экспериментальной характеристики Be ществ, непосредственно измеренной и воспро изведенной. Этот метод обычно применяется для веществ с высокой относительной моле кулярной массой, которые имеют малую спо собность к диффузии. Перед началом опреде ления определяют месторасположение rраниц физическими методами, например, рефракто метрией или. кондуктометрией. После нало жения определенноrо электрическоrо поля в течение точно измеренноrо времени опреде ляют новые rраницы и их относительное по ложение. Условия испытания подбирают так, чтобы можно было определять столько rраниц, сколько веществ присутствует в испытуемом образце.
86 rосударственная фармакопея Республики Беларусь ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАЗЫ НОСИТЕЛЯ Для проведения этою испытания требует ся лишь небольшое количество испытуемоro об разца. Природа носителя (бумаrи, rеля arapa. aцe тата целлюлозы, крахмала, аrарозы, полиакри ламида, смешанноro rеля) служит причиной ряда дополнительных факторов, влияющих на подвижность: а) вследствие наличия каналов в фазе носи теля кажущееся пройденное расстояние меньше реальноro лройденноrо расстояния; б) некоторые фаЗbl носителя не являются электрически нейтральными. Поскольку носи тели являются неподвижной фазой, это иноrда может приводить к значительно большему элек троэндоосмотическому потоку; в) любое наrревание в результате эффек та Джоуля может вызвать некоторое испарение жидкости с фаЗbl носителя, что вследствие Ka пиллярности приводит к движению раствора в направлении от краев к центру. Ионная сила в этом случае возрастает. Следовательно, скорость передвижения за висит от четырех rлавных факторов: подвижно сти заряженной частицы, скорости потока элек троэндоосмоса, испарения жидкости С фазы носителя, напряженности поля. Поэтому необхо димо проводить испытание в строro определен ных экспериментальных условиях и, по возмож ности, использовать стандартные вещества. Основными составляющими прибора для электрофореза являются следующие. Источник постОЯНН020 тока, напряжение KOToporo можно контролировать и, желательно, стабилизировать. Электрофоретическая камера. Обычно это камера из стекла или твердой пластмас сы, состоящая из двух отдельных резервуа ров анодною и катодною, содержащих раст вор электролита. В каждый резервуар камеры поrружается электрод, например, платиновый или rрафитовый. Они присоединяются изолиро ванной схемой к соответствующему выходу ис точника питания и образуют анод и катод. Во избежание сифонирования уровень жидкости в обоих резервуарах камеры поддерживается оди наковым. Электрофоретическая камера снабжена воздухонепроницаемой крышкой, которая под держивает атмосферу насыщенной влажности на протяжении испытания и уменьшает испаре ние растворителя. При снятии крышки ток отклю чается предохранителем. Если электродвижу щClЯ сила измерена в интервале, превышающим 10 В, желательно охладить носитель. Приспособление установки носителя. Электрофорез на полосках. Полоски с HO сителем, предварительно смоченные одним и тем же электродным раствором, поrружают в электродный резервуар, закрепляют и фикси руют соответствующим держателем для преду преждения диффузии электролита. Такими дep жателями MOryт быть roризонтальная рамка, перевернутоVобразный штатив или OДHOpOД ная поверхность с точками контакта через опре деленные интервалы. r ельэлектрофорез. Основной частью при способления является стеклянная пластинка (например, предметное стекло), на поверхность которой нанесен слой хорошо закрепленноro rеля одинаковой толщины. Соединение rеля с электродным раствором осуществляется разны ми способами в зависимости от типа использу емоro прибора. Необходимо принять меры для предупреждения конденсации воды или Bыcыxa ния твердоro слоя. Измерительное устройство или дeтeK тор. Методика. Раствор электролита помеща ют в электродный резервуар. Соответствующим образом импреrнированныи носитель С электро литным раствором помещают в камеру в соот ветствии с инструкцией для используемоro при бора. Устанавливают линию старта и наносят образец. Подают электрический ток в течение определенноro времени. После отключения тока носитель вынимают из камеры, высушивают и проявляют. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КОЛОНКАХ С ПОЛИАКРИЛАМИДНЬifv1 rЕЛЕМ При электрофорезе на колонках с полиакри ламидным rелем стационарной фазой являет ся rель, приroтовленный из смеси акриламида и N,N'метиленбисакриламида. Колонку с rелем roтовят с использованием трубок длиной 7,5 см и внутренним диаметром 0.5 см; во всех трубках должен быть использован один и тот же раствор. Прибор. Прибор состоит из двух BCTaB ленных вертикально один над одним резер вуаров для буферноrо раствора, изroтовлен ных из подходящею материала, например, поли(метилметакрилата). КаЖдЫЙ резервуар снабжен платиновым электродом. Электроды присоединены к источнику тока, что позволяет проводить испытание I'IЛИ при пос'юянном токе, или при постоянном напряжении. В основании BepxHero резервуара имеется ряд держателей, равноудаленных от электрода. Методика. Обычно растворы деrазируют до начала полимеризации и rели используют сразу после приroтовления. rотовят предписанную смесь компонентов, заливают в соответствую щие закрытые снизу стеклянные колонки до оди наковоro уровня около 1 см от верхнеro края, из беrая попадания пузырьков воздуха в колонки. На смесь rеля наслаивают слой воды Р, чтобы исключить попадание воздуха, и оставляют для полимеризации. rелеобразование обычно зани мает около 30 минут и завершается, Korдa об разуется четкое разделение поверхности rеля и водноro слоя. Водный слой удаляют. Нижний
2.2.31. Электрофорез 87 резервуар наполняют указанным буферным pac твором. Колонки открывают И вставляют в дep жатели верхнеro резервуара так, чтобы дНО KO лонок было поrружено в буферный раствор нижнеro резервуара. Колонки осторожно напол няют указанным буферным раствором. rотовят испытуемые образцы и образцы сравнения, co держащие индикаторный краситель, и уплотня ют путем растворения в них, например, caxapo зы Р. Приroтовленные образцы наслаивают на поверхность rеля, используя для каждоro об разца отдельную колонку. Верхний резервуар наполняют тем же буферным раствором. Элек TpДЫ подключают к источнику тока и прово дят процесс электрофореза при указанных yc ловиях: температуре и постоянном напряжении или токе. Источник тока отключают, Korдa инди каторный краситель почти переходит в нижний резервуар. Каждую колонку сразу вынимают из прибора и извлекают rель. Определяют местопо ложение полос на электрофореrрамме. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С НАТРИЯ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ rЕЛЕ (ДСНПАr, SOSPAGE) Область применения. Электрофорез в полиакриламидном rеле применяется для Ka чественной идентиqpикации белков в биолоrи ческих препаратах, контроля их чистоты и коли чественных определений. Цель. Аналитический rельэлектрофорез метод, позволяющий идентифицировать и oцe нить roMoreHHocTb белков в лекарственных средствах. Метод обычно используется для определения молекулярных масс белковых субьединиц и субьединичноro состава очищен ных белков. Имеется разнообразный ассортимент KOM мерчески доступных roTOBbIX к использованию rелей и реактивов, которые MOryT быть исполь зованы вместо описанных в общей статье, если получаются эквивалентные результаты и выпол няются условия раздела «Валидация испыта ния», приведенноrо ниже. СВОЙСТВА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ rЕЛЕЙ Ситовые свойства полиакриламидных rелей обусловлены трехмерной сеткой rеля, образо ванной поперечными сшивками соседних акри ламидных цепей бифункциональным бисакрила мидом. Процесс полимеризации катализируется системой rенерирующей свободные радикалы состоящей из аммония персульфата и TeTpaMe тилэтилендиамина. При увеличении концентрации акрилами да в rеле уменьшается эффективный размер пор. Практически эффективный размер пор rеля определяется еro ситовыми свойствами, то есть сопротивлением миrрации макромолекул. Из этоro следует, что акриламид может использо ваться только В определенных концентрациях. При высоких концентрациях акриламида reли чаще ломаются и являются сложными 8 обра ботке. Поскольку размер пор rеля уменьшает ся, уменьшается скорость миrрации белка через rель. Реryлируя размер пор rеля, изменяя KOH центрацию акриламида, можно оптимизиро-- вать условия разделения испытуемоro белков<r ro продукта. Следовательно, данный конкретный rель характеризуется содержанием акриламида ибисакриламида. Кроме состава rеля, важным компонентом электрофоретической подвижности является структура белка. В случае определения белков электрофоретическая подвижность зависит от значения рК заряженных rрупп и размера M<r лекулы. На это влияют тип, концентрация и рН буфера, температура и сила электрическоro поля, а также природа материала носителя. ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ rЕЛЕ Данный метод является примером анали за мономерных полипептидов с молекулярной массой от 14 000 дальтон до 100 000 дальтон. Возможно расширение rраниц молекулярных масс (например, путем использования rрадиент ных rелей, особенностей буферной системы), но такие методики анализа не обсуждаются в данной статье. Денатурирующий электрофорез в полиакри ламидном rеле с использованием натрия дoдe цилсульфата (ДСНПАr; SOSPAGE) является наиболее общепринятым методом электрофо реза, который используется для оценки качества белковых лекарственных средств и описан ниже в качестве примера указанноro метода. Обычно аналитический электрофорез белков ПРОВОДЯТ в полиакриламидных rелях в условиях, обеспечи вающих диссоциацию белков на отдельные по липептидные субьединицы и минимизирующих их аrреrацию. Чаще всеro перед нанесением на rель белки подверrают диссоциации, наrревая их с сильным анионным детерrентом натрия додецилсульфатом (ДСН). Денатурированные полипептиды связываются с ДСН, превращаясь в отрицательно заряженные частички с посто янным отношением массы к заряду независимо от типа белка. Поскольку количество связанно ro ДСН почти Bcerдa пропорционально молеку лярной массе полипептида и не зависит от ero последовательности, ДСНполипептидные KOM плексы миrрируют в полиакриламидном rеле со скоростью, зависящей от размера полипептида. Электрофоретическая подвижность по лучР.нных детерrент полипептидных комплек сов находится в функциональной взаимосвязи с их молекулярными массами. Миrрация ДCH комплексов происходит в направлении к аноду предсказуемым образом: комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем комплексы с большими молекулярными Macca
88 rосударственная фармакопея Республики Беларусь ми. Следовательно, молекулярная масса белка может быть определена калибровкой ДСНПАr, и наличие единичной полосы в rеле является критерием чистоты белка. Однако модификации полипептидной цепи. например, N или Оrликозилирование при водят к значительному влиянию на кажущую ся среднюю молекулярную массу белка, так как ДСН не связывается с уrлеводным компонентом так, как с полипептидным. В этом случае посто янное отношение заряда к молекулярной массе не сохраняется. Средняя молекулярная масса белков, подверrнутых поспрансляционной MO дификации, не является истинным отображени ем массы полипептидной цепи. Восстанавливающие условия. Полипеп.. тидные субъединицы и трехмерная структура белков часто поддерживаются блаrодаря при сутствию дисульфидных связей. Целью ДCH пдr испытаний в восстановленных условиях является разрушение структуры белка 80CCTa новлением дисульфидных связей. Полная дe натурация и диссоциация белков обработкой 2меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (ДТТ) приводит к развертыванию полипептидной цепи и дальнейшему комплексообразованию с ДСН. В этих условиях молекулярную массу попипеп тидных субъединиц можно рассчитать по линей ной зависимости в присутствии соответствую щих стандартов молекулярных масс. Невосстанавливающие условия. Для ряда испытаний полная диссоциация белка на субъенидичные пептиды невозможна. Изза OT сутствия восстанавливающих areHToB. таких как 2меркаптоэтанол или ДТТ, дисульфидные KOBa лентные связи становятся недоступными, coxpa няя олиroмерную Форму белка. Олиroмерные ДСНбелковые комплексы миrрируют медлен нее, чем их ДСНполипептидные субъединицы. Кроме TOro, невосстановленные белки не MorYT быть целиком насыщены ДСН и, COOTBeTCTBeH но, поэтому не MOryт связывать детерrент с по стоянным соотношением масс. Это делает MO лекулярномассовое определение этих молекул с помощью ДСНПАr неадекватным в сравнении с анализом полностью денатурированных поли пептидов, так как необходимо наличие CTaHдap тов, которые имеют идентичную с испытуемым неизвестным белком конфиryрацию для aдeK BaTHoro сравнения. Однако проявление одной полосы в таком rеле является критерием чисто ты белка. СВОЙСТВА ЭЛЕКТРОФОРЕ3А В rЕЛЕ С ПРЕРblВИСТОЙ БУФЕРНОЙ СИСТЕМОЙ Наиболее широко используемый электро форетический метод исследования сложных белковых смесей включает использование пре рывистой буферной системы, которая состоит из двух rелей: разрешающеrо или разделяюще ro (нижнеro) rеля и концентрирующеro (Bepx неro) rеля. Два rеля отличаются пористостью, рН и ионной силой. Кроме тоro, используются разные по подвижности ионы в rеле и электро-- дных буферах. Блаroдаря буферной прерыви стости происходит концентрация больших объе мов образца, приводя к лучшему разрешению После подключения источника тока перепад Ha лряжения приводит к тому, что белки проника ют в концентрирующий rель. rлицинатионы из электродноro буфера двиrаются вслед за белка ми в концентрирующий rель. Быстро образуется область подвижной rраницы с высокоподвижны ми хлоридионами на переднем краю и относи тельно медленными rлицинатионами на заднем краю. Образуется локализованный высоковольт ный rрадиент между фронтами лидирующих и отстающих ионов, заставляя ДСНбелковые комплексы формировать тонкие зоны (полосы) и миrрировать между фазами хлорида и rлицина.. та. В широких rраницах, независимо от высоты HaHeceHHoro образца, все ДСНбелки KOHцeH трируются в очень узкую область и двиrаются к разделяющему rелю в виде четко определенной тонкой зоны с высокой плотностью белка. Круп нопористый концентрирующий rель не задержи вает миrрацию БОЛЫIJинства белков и, в OCHOB ном, служит антиконвективной средой. На rранице раздела концентрирующеro и разделяющеro rелей происходит резкое возрас-- тание эффекта задерживания белков вслед ствие оrраниченноrо размера пор разделяющеro rеля. Одновременно движение белков в разде ляющем rеле продолжает замедляться вслед ствие ситовых свойств матрицы. rлицинатионы доroняют белки, которые далее передвиrаются в пространстве с постоянным рН. образованным трис(rидроксиметил)аминометаном и rлицином. Молекулярноситовые свойства фазы при водят к разделу ДСНполилептидных комплексов в co ответствии с их молекулярными массами. приrОТОВЛЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНblХ ПРЕРЫВИСТОБУФЕРНЫХ ДСНПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ rЕЛЕЙ Сборка кассет, формирующих rель. Две стеклянные пластинки (например, размером 10 см х 8 см). политетрафторэтиленовую rpe бенку. две прокладки и силиконовые трубки (на-- при мер, диаметром 0,6 мм и длиной 35 см) моют с мяrким моющим средством и ополаскивают водой. Все предметы сушат бумажным полотен цем или тканью. Прокладки и трубки смазывают несиликоновым маслом. Прокладки укладыва-- ют вдоль двух коротких сторон стеклянных пла стин на расстоянии 2 мм от их краев и 2 мм от длинной стороны, являющейся дном rеля. Ис пользуя одну прокладку в качестве основы, Ha чинают укладывать трубку. Осторожно просо вывают трубку к низу прокладки и протяrивают вдоль длинной стороны стеклянной пластинки. Придерживая трубку вдоль длинной стороны
2.2.31. Электрофорез 89 пластинки, укладывают трубку по короткой CTO роне стеклянной пластинки, используя проклад ку в качестве направляющей. Накрывают друrой стеклянной пластинкой, плотно прижимая Kacce ту руками. Устанавливают по два зажима на две короткие стороны кассеты. Осторожно YCTaHaB ливают четыре зажима на длинную сторону Kac сеты rеля, формируя дно кассеты. Необходимо удостовериться, что трубка проходит вдоль края стеклянной пластинки и ниrде не выдавливает ся при размещении зажимов. Кассета rOTOBa для заливания rелем. Приrотовление rеля. В случае прерыви стоro буферноro ДСНполиакриламидноro rеля рекомендуется залить разделительный rель, дождаться еro полимеризации и затем залить концентрирующий rель, поскольку rели отлича ются содержанием акриламидабисакриламида, буфером и рН. При20товление разделитеЛЬН020 2еля. В конической колбе roтовят соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования rеля, исполь зуя указания, приведенные в таблице 2.2.31.1. Компоненты смешивают в указанной после довательности. Если необходимо, перед при бавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцел люлозную мембрану (диаметр пор 0,45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбал тывая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырь ков. Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭД, как указано в таблице 2.2.31.1, взбалтывают и сразу заливают в пространство между двумя пластинками кассеты. Оставляют необходи мое место для концентрирующеro rеля (к длине зубца rребенки прибавляют 1 см). Используя заостренную стеклянную пипетку, осторожно наслаивают насыщенный водой раствор изо бутанола. rель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре для по лимеризации. При20товленuе разделитеЛЬН020 2еля Таблица 2.2.31.1 Компоненты раствора Объем компонента (мл) на 1 кассету rеля вместимостью 5мл 10 мл 15 мл 20мл 25мл 30 мл 40мл 50мл 6 % акриламид Вода Р 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5 Раствор акриламида (1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0 1,5 М Трис (рН 8,8)(2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 Раствор 100 r/л ДСН(З) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 Раствор 100 r/л АПС(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 ТЕМЭД(5) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04 8 % акриламид Вода Р 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2 Раствор акриламида (1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3 1,5 М Трис (рН 8,8)(2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 Раствор 100 r/л ДСН(З) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 Раствор 100 r/л АПС(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 ТЕМЭД(5) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03 1 О % акриламид Вода Р 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8 Раствор акриламида (1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7 1,5 М Трис (рН 8,8)(2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 Раствор 100 r/л ДСН(З) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 Раствор 100 r/л АПG<4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 ТЕМЭД(5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 12 % акриламид Вода Р 1,6 3,З 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5 Раствор акриламида (1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0 1,5 М Трис (рН 8,8)(2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 Раствор 100 r/л ДСН(З) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 Раствор 100 r/л АПС(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 ТЕМЭД(5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 14 % акриламид Вода Р 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8
90 rосударственная фармакопея Республики Беларусь r ! Объем компонента (мл) на 1 кассету rеля вместимостью I Компоненты раствора rs мл 10 мл I 15 мл 20 мл 25мл 30 мл 40мл 50 мл I i Раствор акриламида (11 : 2,3 4.6 993 11,6 13,9 18,6 23,2 11,5 М Трис (рН 8,8}12) J 1,2 2,5 3,6 ! 5.0 6,3 7,5 10,0 12,5 , I Раствор 100 r/л ДСН(3) i 0,05 0,1 o,o,2 0,25 0,3 0,4 0,5 Раствор 100 r/л АПС,-1, I 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 I 0,5 ТЕМЭД(5 J i 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 15% акрилмид Вода Р I 1,1 2.3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5 Раствор а рламда (1) I 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 i 15,0 I 20,0 25,0 1,5 М Трис (рН 8,8)(2) =h 1 ,3 2,5 3,8 5,0 6,3 ! 7.5 I 10,0 12,5 0:31 - Раствор 100 r/л ДСН(З1 0,05 0,1 I 0,15 0,2 0.25 I 0,4 0,5 I Раствор 100 r/л АПС(4) I 0,05 0,1 i 0,15 0,2 0,25 i 0,3 ! 0,4 0,5 : ТЕМЭД(5) I 0,002 0,004 ! 0,006 0,008 O, 0,012 0,016 0,02 , (1) Раствор акриламида. 30 % раствор акриламидбuсакриламида (29.'1) Р. (2) 1,5 М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор тpиC2идpoxr;пpидa РН 8.8 Р. (3) Раствор 100 r!л ДСН: раствор 100 r/л натрия додецuлсульфата Р. (4) Раствор 100 r/л АПС: раствор 100 r!л аммония персульфата Р Блаrодаря аммония персульфату появляются свободные pa дикалы. ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата медленно разла rается, свежие растворы следует roтовить еженедельно. (5) ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамuн Р При20товление концентрирующе20 2еля. После завершения полимеризации (около 30 мин) сливают изобутанол и промывают Bepx нюю поверхность rеля несколько раз водой для удаления нанесенноro изобутанола и любых неполимеризованных излишков акриламида. Удаляют как можно больше жидкости с поверх ности rеля при помощи кончика бумажной сал фетки. В конической колбе roтовят COOTBeTCTBY ющий объем раствора с необходимой KOHцeH трацией акриламида для формирования rеля, используя указания. приведенные в таблице 2.2.31.2. Компоненты смешивают в указанной последовательности. Если необходимо, перед прибавлением раствора аммония персульфа та и ТЕМЭД раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0,45 мкм); раствор выдерживают под Ba куумом, встряхивая фильтрационное приспо собление до окончания образования в paCTBO ре пузырьков. Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭД. как указано в таблице 2.2.31.2, взбал тывают и сразу заливают в пространство между двумя пластинками кассеты прямо на поверх ность полимеризованноro разделительноro rеля. В раствор концентрирующеro rеля сразу вкладывают чистую политетрафторэтиленовую rребенку во избежание появления воздушных пузырьков. Прибавляют еще раствор KOHцeH трирующеrо rеля до полноro заполнения про странства rребня. rель выдерживают в верти кальном положении при комнатной температуре для полимеризации. Сборка электрофоретическоrо прибо ра и проведение электрофоретическоrо раз- деления. После завершения полимеризации (около 30 мин) осторожно удаляют политетра фторэтиленовую rребенку. Сразу ополаскива ют стенки водой или буферным рабочим pac При20товление концентрuрующе20 2еля Таблица 2.2.31.2 Компоненты раствора Объем компонента (мл) на 1 кассету rеля вместимостью 1 мл 2 мл Змл 4мл 5мл 6 мл 8 мл 10 мл Вода Р I 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8 Раствор акриламида (1, 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7 1,0 М Трис (рН 6,8)(2) i 0,13 0,25 0.38 ! 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25 Раствор 100 r/л ДСН(З) 0,01 I 0,02 0,03 I 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 i I I Раствор 100 r/л АПС(4) 0,01 I 0,02 0.03 0,04 I 0,05 0,06 0,08 0,1 I ! I 0,001 ! 0,002 I 0,003 ! 0,004 0,005 0,006 I 0,008 0,01 ТЕМЭЦ5! i (1) Раствор акриламида: 30 % раствор акриламидlбисакрuламuда (29'1) Р. (2) 1.0 М Трис (рН 6,81: 1 М буферный раствор mpUC2UapCK7cr;ura рН 6.8 Р (3) Раствор 100 r/л ДСН: раствор 100 r/л натрия додецuлсульфата Р (4) Раствор 100 r/л АПС: раствор 100 r/л аммония персульфата Р Блаroдаря аммония персульфату появпяются свободные pa дикалы. ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата медленно разла rается, свежие растворы следует roтовить еженедельно. (5) ТЕМЭД: тетраметuлэтилендuамин Р.
2.2.31. Электрофорез 91 твором для электрофореза в системе натрия додецилсульфат полиакриламидный 2ель (SOSPAGE) Р для удаления излишков неполи меризованноro акриламида. При необходимости поправляют зубцы концентрирующеro rеля тупой rиподермичной иrлой, надетой на шприц. Снима ют зажимы с одной короткой стороны. осторож но вытяrивают трубку и возвращают зажимы на место. Повторяют эти операции с друroй корот кой стороны. Затем удаляют трубку со дна rеля. Помещают rель в прибор для электрофореза. Верхний и нижний резервуары наполняют Ьуфе ром для электрофореза. Уцаляют все пузырь ки, образующиеся да дне rеля между двумя CTe клянными пластинками. Для этих целей лучше всеro использовать изоrнутую иrлу, надетую на шприц. Не следует проводить первоначальный электрофорез до нанесения образцов. так как это приведет к нарушению прерывистостv. бу ферной системы. Перед нанесением образцов осторожно ополаскивают лунки буферным pa бочим раствором для электрофореза в cиcтe ме натрия додецилсульфат полиакрuламид ный 2ель (SOSPAGE) Р rотовят испытуемые растворы и растворы сравнения в peKOMeHДO ванном буфере для образцов и обрабатывают, как указано в частной статье. Наносят необхо димое количество каждоro раствора в лунки KOH центрирующеro rеля. Начинают электрофорез в условиях, указанных в инструкции к прибору. Изroтовители ДСНПАr приборов MOryT постав лять rели разных размеров и толщины. Для по лучения оптимальноrо разделения необходимо подбирать время проведения электрофореза, а также силу тока/напряжения в соответствии с указанием изroтовителя приборов. Необходимо удостовериться, что окрашен ный фронт доходит до разделительноro rеля. Korдa краситель доходит до нижнею края rеля, электрофорез заканчивают. Кассету rеля выни мают из прибора и отделяют стеклянные пла стинки. Вытаскивают прокладки, отрезают и OT деляют концентрирующий rель и немедленно окрашивают полученный rель. ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ В iЕЛЯХ Наиболее широко применяется метод OKpa шивания белков красителем Кумасси, позволя ющий определить от 1 MKr до 1 О MKr белков в одной полосе. Окрашивание серебром наи более чувствительный метод для окрашивания белков в rелях, при этом определяются полосы, содержащие от 1 О Hr до 100 Hr белка. Все стадии окрашивания rеля проводят при комнатной температуре, осторожно встряхивая (например, на платформе встряхивателя с KPy roвыми движениями) в подходящей посуде. При окрашивании rелей необходимо надевать перчат ки, так как на rеле остаются отпечатки пальцев. Окрашивание Кумасси. rель поrружают в большой объем красяще20 раствора Кумасси Р, выдерживают в течение не менее 1 ч. Затем сли вают раствор для окрашивания. rель обесцвечивают большим объемом обесцвечивающе20 раствора Р. Обесцвечива ющий раствор меняют несколько раз до четко ю проявления белковых полос на прозрачном фоне. Чем тщательнее обесцвечивают rель, тем меньшее количество белков можно найти этим методом. Обесцвечивание можно ускорить ис пользованием нескольких rpaMMoB анионооб мен ной смолы или маленьким кусочком пори стою материала, смоченным обесцвечивающим раствором Р. ПРИМЕЧАНИЕ. Кислотноспиртовые pac творы, используемые в указанной методике, не полностью фиксируют белки в 2еле. Это может привести к потерям некоторых низкомолеку лярных белков в процессе окрашивания и обесц вечивания тонких 2елей. Стойкая фиксация обеспечивается выдерживанием 2еля в смеси трихпоруксусная кислота Р метанол Р вода Р (1:4:5, об/об/об) в течение 1 ч перед по 2ружением 2еля в красящий раствор Кумасси Р Окрашивание серебром. rель поrружают в большой объем фиксирующе20 раствора Р и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий paCT вор сливают, rель заливают свежим фиксиру ющим раствором, выдерживают в течение не менее 1 ч или, если возможно, в течение ночи. Фиксирующий раствор сливают и rель промы вают большим объемом воды Р в течение 1 ч. Затем rель выдерживают в растворе 1 % (об/об) 2лутаров020 альде2uда Р в течение 15 мин, дважды промывают большим объемом воды Р, каждый раз в течение 15 мин, помещают в CBe жеприrотовленный реактив серебра нитрата Р и выдерживают в течение 15 мин в темном месте. Затем трижды промывают большим объе мом воды Р, каждый раз в течение 5 мин. rель выдерживают в растворе проявителя Р в Te чение около 1 мин до достаточноro окрашива ния. Проявление останавливают, помещая rель в блокирующий раствор Р на 15 мин. Ополаски вают rель водой Р. ВblСУШИВАНИЕ ОКРАШЕННblХ ДСНПОЛИАКРИЛАМИДНblХ ТЕЛЕЙ rели высушивают в зависимости от исполь зованноro метода окрашивания. Кумассиокра шенные rели после стадии обесцвечивания BЫ держивают в растворе 100 r/л 2лицерина Р в течение 2 ч (возможно инкубирование в течение ночи). При окрашивании серебром на конечной стадии ополаскивания выдерживают rель в pac творе 20 r/л 2лицерина Р в течение 5 мин. Два листа пористой целлюлозной пленки поrружают в воду Р и выдерживают в тече ние 510 мин. Один из листов помещают на рамку высушивания, осторожно наносят на нею rель, удаляют воздушные пузырьки и Ha носят несколько миллилитров воды Р по краям
92 rосударственная фармакопея Республики Беларусь rеля, накрывают друrим листом, удаляют воз душные пузырьки и завершают сборку рамки высушивания. Рамку помещают в сушилку и оставляют при комнатной температуре дО BЫ сыхания rеля. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЬ! Молекулярные массы белков определя ют, сравнивая их подвижность с подвижностью маркерных белков с известной молекулярной массой. Для rрадуирования rелей используют доступные rOToBbIe смеси равномерно окраши ваемых маркерных белков с точно известными молекулярными массами. Такие смеси доступ ны для различных диапазонов молекулярных масс. Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят co ответствующим буферным раствором для об разцов и наносят на тот же rель, что и испыту емый образец. Сразу после проведения электрофореза фиксируют электрофоретический фронт Kpa сителя бромфеноловоro синеrо. Это можно сделать нанесением насечки на край rеля или введением иrлы, смоченной индиroкармином, в rель на линии фронта красителя. После OKpa шивания измеряют пройденное расстояние каждой белковой полосы (известной и неиз вестной) от верха разделительноrо rеля. Pac стояние, пройденное каждым белком, делят на расстояние, пройденное красителем. По лученные результаты называются относи тельной подвижностью белков (относительно фронта красителя) и условно обозначаются Rr Строят rрафик зависимости лоrарифма OTHO сительных молекулярных масс (М м.) MapKep ных белков от условно полученных значений Rf' Обычно rрафик имеет слеrка сиrмовидную форму Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью линейной зависимо сти или интерполяцией rрафика зависимости 19 М. м. от Rf' если значения, полученные для неизвестных образцов, располаrаются на ли ней ной части rрафика. ВАЛИДАЦИЯ ИСПblТАНИЯ Результаты испытания признаются дocтo верными, если белки, которые являются MapKe рами молекулярных масс, расположены вдоль 80 % длины rеля и по всей области разделения (то есть области, включающей образец и ero димеры или образец и сопутствующие примеси), разделение соответствующих белковых полос проявляет линейную зависимость лоrарифма молекулярной массы от Rr Дополнительные Tpe бования к валидации по отношению к Io-'спытуе-- мым растворам указываются в частной статье. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ Если в частной статье указывают предел содержания примесей, в испытании необхо димо использовать раствор сравнения COOT ветствующеrо разведения. Например, если предел содержания примесей составляет 5 %. необходимо использовать раствор cpaB нения. разведенный по отношению к испы туемому раствору в соотношении 1 :20. На электрофореrрамме испытуемоro раствора ни одна примесь (ни одна полоса, кроме oc новной ) не должна быть интенсивнее OCHOB ной полосы на электрофореrрамме раствора сравнения. Для валидированной методики содержа ние примесей может определяться методом внутренней нормализации по отношению к основной полосе с использованием интеrри рующеro денситометра. При валидации Me тодики необходимо подтвердить линейность сиrнала. 01/2013:20232 2.2.32. ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ ВЫСУШИВАНИИ Определение потери в массе при высушива нии проводят одним из приведенных способов и выражают в процентах (м/м). Методика. Указанное в частной статье KO личество испытуемоro образца помещают во взвешенный бюкс, предварительно высушенный в условиях, описанных для испытуемоro веще ства. Вещество сушат до постоянной массы или в течение времени, указанноrо в частной статье, одним из следующих ниже способов. Если TeM пературный интервал не указан, то высушива ние проводят при указанной температуре :t2 ос. а) «в эксикаторе»: высушивание проводят над фосфора (V) оксидом Р при атмосферном давлении и комнатной температуре; Ь) «в вакууме»: высушивание проводят над фосфора (V) оксидом Р при давлении от 1,5 кПа до 2.5 кПа и комнатной температуре; с) «в вакууме в пределах указанноro темпе ратурноro интервала»: высушивание проводят над фосфора (V) оксидом Р при давлении от 1.5 кПа до 2.5 кПа и температуре, указанной в част ной статье; d) «В пределах указанноro TeMnepaTYPHoro интервала»: высушивание проводят в сушиль ном шкафу в температурном интервале, указан ном в частной статье; е) «в rлубоком вакууме»: высушивание про- водят над фосфора (V) оксидом Р при давле-- нии не более 0,1 кПа и температуре. указанной в частной статье. Если указаны иные условия, используемая методика полностью описывается в чаcтнoil статье.
01/2013:20233 2.2.33. Спектрометрия ядерН020 ма2нитН020 резонанса 93 2.2.33. СПЕКТРОМЕТРИЯ ЯДЕРноrо МАrнитноrОРЕЗОНАНСА ВВЕДЕНИЕ Спектрометрия ядерноro маrнитноro pe З0нанса (ямр) это аналитический метод, позволяющий выяснить химическую CTPYКТY ру орrанических молекул по интерпретации их ЯМР спектров по маrнитным моментам 'Н или изотопов '3С, '9F, '5N, 3'р. ямр спектры MorYT использоваться для качественноrо и KO личественноrо определения. В соответствующих эксперименталь ных условиях интеrрированная интенсив ность ЯМР сиrналов прямо пропорциональ на числу спинов ядер молекулярной rруппы, ответственной за сиrнал. Эти интеrралы MorYT использоваться для количественноrо анализа. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ При помещении rруппировки ядер с уrло вым моментом и маrнитным моментом в CTa тическое маrнитное поле (ВО) ядра занимают по отношению к оси маrнитноrо поля опре деленные ориентации, разрешенные в KBaH товой механике. Эти уровни энерrетич€ски различны. Колебательное высокочастотное маrнитное поле (В,), перпендикулярное ВО' вызывает переходы между этими уровня ми С поrлощением энерrии. Соrласно усло вию резонанса 0)0 = УВ О (у rиромаrнитное отношение, 0)0 частота Лармора), для по лучения спектра MorYT варьироваться Mar нитное поле ВО или частота поля В, (метод непрерывной волны (НВ; cw. coпtiпuous wave)). В настоящее время излучение В1 по лучают при помощи радиочастотноrо импуль са (метод Фурье преобразования (ФП; FТ, Fourier trапsfоrт». KorepeHTHoe излучение, .1спускаемое при возвращении в первона чальное состояние, реrистрируют в виде за тухающей кривой, называемой спадом CBO бодной индукции (ССИ; F/D, free iпductioп decay). Последующее Фурьепреобразование дает спектр в области частоты, предоставляя информацию о молекулярной структуре. Дo полнительные радиочастотные области при меняются во время реrистрации сиrнала ССИ дЛЯ Toro. чтобы подавить скалярные взаимо действия (прямая связь) между ядрами (Ha зывается «распаривание»). Для качествен ноro и количественноrо анализа жидких или твердых образцов можно применить OДHO и MHoroMepHble методы. Важную информацию о структуре веще ства получают из следующих спектроскопиче ски"Х параметров: резонансная частота определяется .. ядер I число резонансных сиrналов (синrлеты, ! мулыиплеты) I химический сдвиr l) i (ррт) I I количество OTдenb- ных химических rрупп ядер определяется хим ческая природа и окружение CTPYКТY ных rрупп I относительное число I резонансных ядер в отдельной химиче ской rруппе интенсивность резо- I нансных сиrналов I t мультиплетность со- ! пряженной структуры ! количество ядер, KO торые скалярно свя заны с наблюдае мым ядром 'константа спин- I количество взаимо I ' спиновоrо взаимодей- J действующих ядер и ! ствия nj (rц) rеометрия связей I Корреляции различных спектральных па раметров (например, химический сдвиr и KOH станта спинспиновоro взаимодействия, или химические сдвиrи различных ядер в преде лах одной молекулярной системы) MorYT быть получены rOMO и rетероядерными ДBYMep ными и более мноroмерными методами. Ин формацию о времени релаксации Т 1 и ТЗ' О ядерных эффектах Оверхаузера (ЯЭО, NOE) и кинетике процессов, зависящих от BpeMe ни, также можно получить с помощью COOT ветствующих экспериментов. ПРИБОР ЯМРспектрометр с высокой разреша ющей способностью состоит из следующих частеЙ: маrнит для создания постоянноro Mar нитноrо поля Во; термостатируемый датчик с держате лем образца, предназначенный для подачи высокочастотноrо импульса и определения излучения, испускаемоrо образцом; электронное устройство для создания мощных высокочастотных импульсов, реrи страции и преобразования сиrнала ССИ в циф ровую форму; это устройство также поддержи вает стабильность электроники прибора; устройства сбора и обработки данных (компьютер); и может также включать: проточную кювету для проведения жид костной ЯМРхроматоrрафии или проточно инъекционноro анализа; систему для создания импульсноrо rpa диента маrнитноrо поля ЯМР Сильное маrнитное поле r'енерируется Ka тушкой сверхпроводимости в сосуде Дьюара,
94 rосударственная фармакопея Республики Беларусь заполненноrо ЖИДКИМ Iелием. Датчик, как пра вило, содержит образец в пробирке с внеш ним диаметром 5 мм ИЛИ в riРС,ОЧНОЙ кювете и соединен радиочастотными кабелями с электронным блоком, настроенным на часто ту 1Нядер и изотопов Хядер. Необходимы ми являются дополнительные устройства для настройки и реrулировки электронных KOHTY ров; кроме Toro, часто используют TepMOCTa тирование образцов. Следует проверять надлежащее функ ционирование ЯМРспектрометра Для про верки используют соответствующие испыта ния, включающие. как правило, измерение ширины спектральной линии на полувысо те опредепенных пиков при определенных условиях, отношение сиrнал/шум (8/N) для стандартных смесей. интенсивносrь иr,,1ПУЛЬ са (измеренная как 900 ширины импульса) и воспроизводимость импульса. Все изroтови тели при боров предоставляют спецификации и протоколы измерения указанных параме тров для определенных комбинаций приборl датчик, и необходимо проводить проверку co ответствия этим спецификациями. ямр С ФУРЬЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕМ (ЯМРФП) Как правило, в современных спектроме трах используется принцип Фурьепреобра зования (ФП): после возбуждения образца высокочастотным импульсом соответствую щей частоты (u), амплитуды (В 1 ) и ПРОДОЛЖИ- тельности (Т р ) И последующей коро. кой паузы (td) (время восстановления чувствительности приемника), усиленный аналоrовый сиrнал ССИ реrистрируют в течение определенноro Бемени (t ac ) и переводят 8 цифровую форму аналоrовоцифровым преобразователем (АЦП), результаты сохраняют !3 памяти спек трометра. Выходной сиf нал перед оцифров кой усиливается, чтобы максимально повы сить чувствительность, не переrружая АЦП. В случае наблюдения за Хядрами CTaHдapT ный эксперимент включает, в случае необхо димости, широкополосное 'Н распаривание, то есть возбуждение всех протонов во время эксперимента. Чтобы увеличить отноше ние сиrнал/шум, MHoroKpaTHbIe сиrналы ССИ MorYT быть KorepeHTHo накоплены и сумми рованы. При Фурьепреобразовании данных этоrо BpeMeHHoro интервала получают спектр области частот. ПАРАМЕТРЫ Следующие параметры I3лияют на резуль тат эксперимента ФП и должны контролиро ваться. Ширина импульса (1). Импульс возбуж дения направлен вдоль оси х, так называемой рамки вращения. ее продолжительность (или «ширина», Т р ) определяет уroл пере ворота (8: и, таким образом, интенсивность (1) резонанс- ноro синала: в = у' . В 1 . Т р, (1) Му = МО .sinB, (2) Наблюдаемая намаrниченность М мак- у симальна при В = 900. ПродолжитеЛЬНОСТI: импульса должна быть короткой, чтобы ra- рантировать, что все сиrналы возбуждения в спектральной ширине (SW. spectra/ width; имеют одинаковую интенсивность. Намаrни ченность затухает вследствие процессов ре- лаксации. Длительность паузы (t d )- Пауза время между окончаниеrll подачи импуль са и началом сбора данных, необходимое по техническим причинам, поскольку ее дли тельность может влиять на интенсивность сиrнала и фазу пика. Быстро затухающие сиr налы (дающие начало широким спектраль ным линиям) уменьшаются в интенсивности больше, чем медленно затухающие сиrналы (которые дают начало узким спектральным линиям). Время сбора данных (taJ. Время сбора данных (t ac ) связано со спектральной шири ной (то есть всей наблюдаемой областью) и количеством точек цифровоrо разреше ния (ОР), собранных 80 время обнаружения сиrнала. DР t =- - . (3) ar 2SW Максимальная интенсивность сиrнала и отношение сиrнала к шуму будут достиr нуты, если (ас 1 ,2/(лт, 2),rдe V 1l2 полная ширина на полувысоте, но для минимизации искажения сиrнала эта величина должна быть больше чем 5/(::т. J. Время повторения (t.). Спинрешеточная релаксация (Т.) влияет на время, требуемое для спиновой системы, чтобы прийти в paB новесие после импульса. Релаксация может быть уменьшена при помощи специальных реактивов. В количественном анализе ис пользуемое время повторения должно YCTa навливаться относительно Т 1 и В для Toro. цтобы избежать эффектов насыщения. Усиление приемника. Аналоrовыи сиrнал. детектируемый датчиком, усилива ют до оцифровки и хранения. Амплификация сиrнала должна быть отреrулирована aBTO матически или вручную так, чтобы сиrнал не
2.2.33. Спектрометрия ядеРН020 ма2нитН020 резонанса 95 переrрузил АЦП, что может привести к иска жению сиrнала, и позволит случайному шуму, произведенному при исследовании, быть пе реведенным в цифровую форму (то есн. быть отличным от нуля). ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ СБОРА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ Помимо параметров сбора данных. ин тенсивность сиrнала зависит еще от неr!(')ль ких парамеТР08 После сбора ДOCTaTC'-!HO ro количества циклов сканирования сводный сиrнал ССИ преобразовывается с ПОfJ:ОЩЬЮ Фурьепреобразования. Для надежных коли честв€нных определений должны быть опти мизированы следующие параметры. Цифровое разрешение. Цифров:'е раз решение разнесение по частоте Mew,c:y из меренными точками. У обработанноr'J r;иr 'ала должно быть не меньше 5 измеречъ!х точек выше полувысоты интеrрируеМIJ!Х сиr налов. Чтобы улучшить цифровое разре!lJе ние, перед преобразованием к концу экспе риментальной ССИ MorYT быть прибавпены ДОПОJlнительные точки нулевой интеНСИRНО сти (<<нулевое заполнение»). Отношение сиrнал/шум. Это отнсшсрие между интенсивностью (высотой пика) опроде ленноro сиrнала в ЯМРспектре и интенсиsно стью случайных колебаний, которые оfычно измеряются в области спектра, который H co держит сиrналов от анализируемоro вещества. Недостаточное отношение сиrнал/шум crpa ничивает точность интеrрирования пика и KO личественных определений. При отношении сиrнал/шум равным или более 150:1 CTaHдapT ное относительное отклонение при интеrриро вании пика может быть менее 1 %. В проrрамм ном обеспечении современных спектроме-тров имеются алroритмы по определению отноше ния сиrнал/шум соответствующих пиков. При анализе разбавленных растворов получить дo статочно высокое отношение сиrнал/шум дo вольно трудно, особенно при детектировании ядер, кроме 1Н. Способы увеличения отноше ния сиrнал/шум включают в себя: увеличение числа суммируемых изме рений (п), поскольку отношение сиrнал/шум увеличивается с увеличением Jп ; использование экспоненциальноrо YM ножения сиrнала ССИ перед Фурьепреобра зованием: экспонениальный коэффициент умножения должен быть в зоне полной пико вой ширины на полувысоте; использование спектрометров с более высоким маrнитным полем Во' так как отноше ние сиrнал/шум пропорционально ag/ 2 ; использование цифровоrо фильтра для уменьшения шума; использование датчиков, которые MaK симизируют фактор заполнения; использование криодатчиков, которые уменьшают тепловые помехи. Область интеrрирования. Интенсив ность ЯМРсиrналов получают интеrрирова нием квазианалоrовоro сиrнала или с помо щью ступенчатоro rрафика, или более точным интеrрированием отдельных линий и цифро вым представлением данных. При исследова НИ!1 жидких образцов получают ЯМРсиrналы в виде линий лоренцевой формы. Если в частной статье не определено иначе или Korpa происходит перекрывание пика, для ис пытуемоrо пика и пика сравнения должен ис ользоваться одинаковый диапазон интеrри рования, выраженный в виде кратноro числа rюлной ширине на полувысоте пика. Динамический диапазон. Динамический диапазон аналоrовоцифР080rо преобразова теля (АЦП) определяет минимальную линию интенсиЕ'НОСТИ. которую можно наблюдать или количественно определить при интеrри рова1ИИ двух сиrналов с той же самой ши Р!.I-IОЙ спеv.трэпьной линии. 16битовый АЦП ПfJЗ:ЗОЛ9ет идентифицировать сиrнал интен сивностью 0,003 % относительно сильноro сиrнала, rЮrJНОСТЬЮ заполняющеro дин<'!миче ский диапазон АЦП. ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ ОБРАЗЦОВ В РАСТВОРАХ Большинство ЯМР исследований про водят на разведенных растворах (приблизи тельно 1 %) испытуемоro вещества 8 COOTBeT ствующем растворителе, к которому может быть прибавлен в известной концентрации подходящий стандарт для калибровки хими ческоro сдвиrа. Растворители. Растворитель должен растворять испытуемое вещество без даль нейшеro взаимодействия, если не обозна чено иначе. Для минимизации интенсивных сиrналов растворителей следует ИСIJОЛЬЗО вать полностью дейтерированные раствори тели (дейтерия оксид Р, дейтерированный хлороформ Р, дейтерированный диметил сульфоксид Р, дейтерированный ацетон Р, дейтерированный метанол Рит. д.). Атомы растворителя дают сиrналы, которые леrко идентифицируются по их химическому сдвиrу и MorYT использоваться для калибровки оси химическоro сдвиrа (ВТОрИЧl-iЫЙ стандарт). Сравнение. Спектральная характери стика, наиболее зависящая от химическо ro окружения атома в молекуле, называется химическим сдвиrом, обозначается буквой ь и измеряется в миллионных долях. Химиче
96 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Ядра Вода 1 Друrие .::. .::. растворители 1Н 0882 1,00000000 ТМС 1,00000000 1ЗС 0882 0,25144953 ТМС 0,25145020 15N NН з 0,10132912 СН з N0 2 0,10136767 19F СFзСООН не указан ССlзF 0,94094011 З1р НРО4 (85 %) 0,40480742 (СНР)з РО 0,40480864 1 Химический сдвиr зависит от значения рН. 2 DSS натрия 2.2диметил2силапентан5сульфонат- ский сдвиr между резонансом для ЯМР aK тивноrо ядра Х (ь х ' б ) измеряется в мил о разец лионных долях (ррт) как разность между частотой резонанса этоro ядра (\' х ' б ) И о разец внутреннеro сдвиrа ядра стандартноro об разца (V x ' ), вы р аженная в rе р цах, дe сравнение ленная на основную рабочую частоту ЯМР спектрометра (\lX' сравнение)' в меrаrерцах, при данном Во: 8 (v Х, образец }/ Х. сравнение) Х,образец . (4) \' Х. сравнение Принято, что стандарт точноro химиче cKoro сдвиrа устанавливается по 1Н резонан су тетраметилсuлана Р (ТМС) и обознача ется как Отмс = О ррт. Формально, установив шкалу сдвиrов 1Н относительно ТМС, можно вычислить точную частоту любоro друrоro Х резонанса и откалибровать масштаб ero хи мическоro сдвиrа. Частота (вторичноro) CTaH дартноro образца при о х = о ррm (v x ' ) сравнение рассчитывается по 1Н частоте ТМС (V H ' тмс) и табличному значению отношения (:::: Х ' ) сравнение определенной для изотопа частоты относи тельно 'Н в ТМС: \' Х. сравнение == V н тмс':=: Х, сравнение . (5) Стандартные образцы при <'\ = о ррт и соответствующие значения ::::Х' cpaChEHUE приве дены в таблице. На практике химические сдвиrи Х cpaB нивают, непосредственно используя COOTBeT ствующий стандарт. В 1Н и 1ЗС ямр rлавным образом используется внутренний CTaHдap который при исследовании непосредственно прибавляют к испытуемому образцу. В 15N, 19F и З1р ЯМР часто используется внешний CTaH дарт, коrда образец и стандарт находятся в отдельных коаксиальных цилиндрических проб ирках. Стабилизация. Чтобы предотвратить дрейф спектра во времени, выполняется CTa билизационная процедура, названная дей териевой стабилизацией (дейтериевый лок). Для этоro используется сиrнал 2Н (дейтерия), вызываемый дейтерированными растворите лями, если в частной статье не указано иначе. КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ Качественные ямр спектры используют ся как испытания на подлинность, при KOTO рых 1Н или 1ЗС спектр испытуемоrо образца сравнивают со спектром стандартноro образ ца или, реже, с опубликованным стандартным спектром. Спектры стандартных и испытуемых образцов должны быть получены с использо ванием тех же самых методик и условий. Пики в этих 2 спектрах или характеристичных об ластях спектров должны совпадать по поло жению, интенсивности и мультиплетности. В соответствующих случаях может быть прове дено математическое сопоставление, напри мер. вычисление коэффициента корреляции. При отсутствии стандартноrо образца может использоваться рабочий стандартный обра зец, идентичность котороro была подтверж дена альтернативными методами или путем подтверждения Toro. что ямр спектр полно стью совпадает с заявленной структурой Ma териала. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ Интенсивность сиrнала в основном ис пытании ЯМР представляет собой интеrри рованную площадь под кривой измеренноro сиrнала. Высота сиrнала может быть мерой интенсивности только при одинаковом значе нии полной ширины на полувысоте и одинако вой мультиплетности двух сиrналов. В усло виях практически полной релаксации между реrистрируемыми сиrналами интенсивность сиrнала (/J является истинной мерой количе ства ядер (N A ), ответственных за COOTBeTCTBY ющий сиrнал: 'A=Ks.N A .(6) Константа Ks включает фундаменталь ные постоянные, свойства образца и пара метры приемника и может не учитываться в
2.2.33. Спектрометрия ядеРН020 ма2нитН020 резонанса 97 случаях, коrда интенсивности сиrналов сопо ставимы и можно получить прямую зависи мость между количеством ядер в двух cpaB ниваемых структурных rруппах А и В: !А == N А . (7) 'в N B Количества (N,) ядер, принадлежащих различным структурным rруппам одной моле кулы, представляют собой небольшие целые числа. Измеренные значения окруrляют до целых чисел. Однако правильное функцио нирование блока сбора и обработки данных леrко проверяется путем сравнения точной интенсивности в пределах спектра любоro подходящеro орrаническоro соединения из вестной структуры. Помимо тоro, что интенсивность сиrна лов, полученных от каждоro компонента в смеси, связана друr с друrом небольшими целыми числами, относительные молярные количества этих компонентов MorYT быть из мерены сравнением нормализованных интен сивностей резонансов различных компонен тов. Молярное отношение двух компонентов смеси вычисляют с помощью следующеro уравнения: ПА ==. N B . (8) П в 'в N A Результаты определения являются ДOCTO верными только в случаях, коrда структуры молекул, для которых определены ,д и I B , из вестны (или, по крайней мере, известны зна чения N для проверенных rрупп). Определе ния проводя используя метод BHYTpeHHero стандарта или метод нормализации пиков. Метод BHYTpeHHero стандарта. Масса (тА) аналита (А) может быть определена, если к раствору в качестве стандарта интен сивности прибавлена известная масса (тв) вещества (В) с известным процентным coдep жанием (Р В )' Уравнение (8) может быть пре образовано в уравнение (9): тА ==!А. N B . М А .т в . Р В ,(9) /в N A Мв 100 rдe М ; молекулярные массы. Необходимо тщательно выбирать CTaH дарт интенсивности; он должен быть полно стью растворим в растворителе, использу емом для иr.пытуемоrо вещества, должен производить лишь небольшое количество сиrналов, и у «мониторной rруппы» должен быть сиrнал в пустой спектральной области. Для этих целей рекомендуется выбирать coe динение с высокой чистотой и с относительно высокой молекулярной массой. 11 __ J7IZ Метод внутренней нормализации. OT носительное содержание компонентов в смеси, степень замещения в структурноиз мененном полимере или количество при меси можно определить с помощью сравнения OT носительных интенсивностей полученных pe зонансов. Методика должна быть валидирована в отношении отсутствия наложения COOTBeT ствующих сиrналов. Коrда в образце при сутствуют вещества с плохо определенной структурой или молекулярной массой (Ha при мер, эмульrатор), прибавление извест Horo количества этоro материала в пробирку для ЯМР позволяет построить калибровоч ную кривую. МЕТОД Подrотовка испытуемоrо образца. Ис пытуемый образец растворяют в раствори теле, к которому может быть прибавлен co ответствующий стандартный образец для калибровки химическоro сдвиrа, как указано в частной статье. Для количественноro анализа растворы не должны содержать HepaCTBopeH ных частиц. При некоторых количественных определениях может потребоваться прибав ление внутреннеro стандарта для сравнения интеrрированных резонансов испытуемоro и стандартноro образцов. Соответствующие стандартные образцы и их концентрации YKa заны в частных статьях. В друrих количе ственных исследованиях результат получают путем сравнения относительной интенсивно сти двух или всех резонансов, полученных при исследовании образца. После помеще ния образца в пробирку и укупорки, образец вводят в маrнит ЯМР установки устанавлива ют параметры испытания и проводят измере ния. Основные параметры испытания приво ДЯТСЯ в частных статьях. Процедура измерения. Уравновешива ют образец в датчике и реrулируют прибор для получения наиболее оптимальных усло вий резонанса и максимальноro отношения сиrнал/шум путем подбора настройки датчи ка для данноro объема образца для обеспе чения максимальной однородности маrнитно ro поля во всем объеме испытуемоro образца (процедура называется «шиммирование»). Параметры настройки записывают или co храняют в компьютере. Условия испытания MorYT включать выполнение мноroкратных по следоватеЛЬНlJстей циклов «импульссбор данныхпауза», и отдельные ССИ сиrналы суммируются в памяти компьютера, с ycpeд нением уровня шума. Коrда соответствующий уровень отношения сиrнал/шум достиrнут, ССИ сохраняют и спектр области частот по лучают путем Фурьепреобразования сумми рованных ССИ сиrналов.
98 rосударственная фармакопея Республики Беларусь ЯМР СПЕКТРОМЕТРИЯ ОБРАЗЦОВ В ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ Анализ образцов в твердом состояни может быть выполнен с помощью специально оборудованных ЯМР спектрометров. Опреде ленные технические операции обеспечивают выделение отдельных линий для определен ных положений атомов, а также позволяют ис пользовать ЯМР для оценки неорrанических материалов. Одна из таких операций быстрое Bpa щение (430 кrц) порошкообразноro образ ца в роторе (внешний диаметр около 4 мм) находящеrося под уrлом 54,70 (<<маrический уroл») к оси маrнитноrо поля Во. Этот способ называется вращением под маrическим уrлом. Второй эффективный способ сило вое распаривание, и третий способ пере нос поляризации от леrковозбудимых ядер к менее поляризуемым ядрам, то есть KpOCC поляризация. Комбинация этих методов по зволяет получить спектры с высоким разре шением, содержащие большое количество информации о химических и структурных xa рактеристиках твердых стекловидных тел, Be ществ в аморфном состоянии, кристаллов Ke рамической, полимерной или минеральной природы. Если ЯМР используют для оценки образ ца в твердом состоянии, полное описание процедуры приводят в частной статье. 01/2013:20234 2.2.34. ТЕРМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Термический анализ объединяет rруппу методов, при помощи которых определяется зависимость различных физических свойств веществ от температуры. Обычно в большин стве используемых методов определяют из менение энерrии или массы испытуемоro об разца. #Характерной особенностью термических методов анализа является их универсаль ность. Инструментальные методы термиче скоro анализа дают информацию о кристал лической структуре, температуре кипения, способности к сублимации, деrидратации, твердофазном взаимодействии. Эта инфор мация может быть использована для иденти фикациl.1, определения чистоты, влажности и стабильности веществ, количественноro опре деления термонестойких веществ, выявления присутствия полиморфных форм, для xapaK теристики совместимости субстанций и вспо моrательных веществ в лекарственных cpeд ствах, выбора упаковки и контроля качества. Различают термоrравиметрию, TepMOMe трическое титрование, дифференциальный термический анализ (ДТА) , дифференциаль ную сканирующую калориметрию (ДСК), дe риватоrрафию, термомикроскопию. Термические методы анализа. как прави ло, не требуют больших количеств веществ, непродолжительны по времени выполнения. В частности, определение потери в массе при высушивании методом тepM02paвиMe трии включают в частные статьи на дороrие субстанции. В частных статьях следует YKa зывать пара метры, необходимые для KOp ректноro выполнения методики, например, скорость и температуру наrревания, инерт ный rаз и скорость ero потока.# ТЕРмоrРАВИМЕТРИЯ Термоrравиметрия представляет собой MeTOД, при помощи котороro реrистрируют изменение массы испытуемоrо образца в за висимости от проrраммированноrо измене ния температуры. Прибор. Основными составляющими ча стями прибора являются: приспособление для наrревания или охлаждения вещества в соответствии с заданной температурной про rраммой. камера для образца с контролиру емой атмосферой, электронные весы и pe rистрирующее устройство. К прибору может быть присоединено приспособление для aHa лиза летучих веществ. Проверка температурной шкалы. Про верку температурной шкалы проводят в COOT ветствии с инструкцией изroтовителя. rрадуировка электронных весов. Под ходящее количество подходящеro сертифи цированноrо стандартноro образца (напри мер, ФСО кальция оксалата МОН02идрата) помещают в держатель и реrистрируют еro массу. Начинают наrревание образца по за проrраммированному изменению темпера туры соответствии инструкции изrотовителя. Термоrравиметрическую кривую реrистриру ют в виде rрафика: показания температуры или времени откладываются по оси абсцисс по возрастанию значений слева направо; по казания массы откладываются по оси орди нат по возрастанию значений снизу вверх. При температуре около 230 ос повышение температуры останавливают. На rрафике из меряют расстояние между начальным и KO нечным плато массатемпература или плато массавремя, что соответствует изменению массы образца. Полученную величину потери в массе сертифицированноro испытуемоro образца сопоставляют с величиной, указан ной на маркировке.
2.2.34. Термический анализ 99 Методика. Изменение массы испытуемо ro образца определяют в условиях, указанных в частной статье. Потерю в массе испытуемо ro образца определяют, измеряя расстояние между начальным и конечным плато на rpa виметрической кривой, и выражают в процен тах (д.м/м). При реrулярном использовании прибора периодически проводят rрадуировку и про верку температурной шкалы. В противном случае эти операции проводят перед каждым использованием. Так как характеристики атмосферы при проведении испытания очень важны, для каж доro измерения отмечают следующие пара метры: давление или скорость потока, состав rаза. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ КАЛОРИМЕТРИЯ Дифференциальная сканирующая кало риметрия (ДСК, OSC) является методом, KOTO рый используется для демонстрации энерrети ческих явлений, происходящих при наrревании (или охлаждении) вещества (или смеси Be ществ), и для определения изменений в энталь пии и удельной теплоемкости, а так же темпе ратур, при которых эти изменения происходят. Этот метод используется для нахождения различий в количестве теплоты, выделенной или поrлощенной испытуемым образцом, по сравнению с ячейкой сравнения в зависимо сти от температуры. Существует два типа при боров дЛЯ ДСК: приборы, использующие KOM пенсацию энерrии для удерживания нулевой разницы температуры между испытуемым об разцом и образцом сравнения; приборы, под держивающие постоянную скорость HarpeBa и определяющие температурный дифференци ал как разность в тепловом потоке между ис пытуемым образцом и образцом сравнения. Прибор. Прибор дЛЯ ДСК с компенсаци ей энерrии состоит из печи, имеющей держа' тель образцов с испытуемой ячейкой и ячей кой сравнения. Прибор дЛЯ ДСК с тепловым потоком имеет единственную ячейку с держа телем образца для испытуемоro тиrля и тиrля сравнения. К прибору присоединяют устройство для проrраммирования температуры, темпера турный детектор (детекторы) и реrистрирую щую систему, которая может быть подсоеди нена к компьютеру. Измерения про водятся в контролируемой атмосфере. Калибровка прибора. Прибор калибру ется на изменения температуры и энталь пии с использованием индия высокой чисто ты или любоro друroro сертифицированноro стандартноrо образца в соответствии с ин струкцией изroтовителя. Использование двух металлов, например, индия и цинка, может применяться для проверки линейности. Проведение испытания. В подходящий тиrель взвешивают подходящее количество испытуемоro образца и помещают в держа тель для образца. Устанавливают температу ру начала и конца испытания и скорость Ha rpeBa, указанные в частной статье. Начинают испытание и реrистрируют кривую дифференциальноrо термическоro анализа, откладывая значения температуры или времени по оси абсцисс (по возрастанию значений слева направо) и изменения энер rии по оси ординат (уточняют, процесс эндо термичный или экзотермичный). Температура, при которой происходит явление (начальная температура), COOTBeT ствует точке пересечения (А) продолжения базовой линии и касательной к точке caMOro большоro наклона (точке переrиба) кривой (см. рисунок 2.2.34.1). Конечная температура тепловоro явления соответствует пику на кривой. А ЭНДQтерма ....__.__.__.__._._____.__.__..!________._.______._._._!пература Рисунок 2.2.34.1. ТеРМ02рамма Значение энтальпии явления пропорцио нально значению площади под кривой, orpa ниченной базовой линей; коэффициент про порциональности находят путем измерения теплоты плавления известноro вещества (Ha пример, индия) при тех же условиях проведе ния испытания. Каждая TepMorpaMMa может СОПрОВО ждаться следующими данными: условия ис пытания, запись последней калибровки, размер и идентификация (включая термиче скую историю) образца, контейнер, aTMOC фера (состав, скорость потока, давление), направление и скорость температурных из мерений, чувствительность прибора и реrи стрирующеrо устройства. Область применения Фазовые превращения. Определение температуры, изменения теплоемкости и эн тальпии при фазовых превращениях, проис ходящих с веществом, как функции темпе ратуры.
100 rосударственная фармакопея Республики Беларусь переход твердое вещество твердое BeUleCTBf): аллотропияполиморфизм прозрачность стекла десольватация аморфностькристалличность exoд твердое вещество жидкость: плавление переход твердое вещество rаз: , сублимация переход жидкость твердое вещество: ! замерзание I перекристаллизация переход жидкость rаз: испарение 1 ос Температура .. .............._....._.O... ;;- r "'-- :' I I "'-- . .0.... ... ........ : I I ........... ; ..... .... "': , ....0.. .... ...... '\, ! I I ........ ......, \ I I ..... \ ; \ I \ ,[ \ I ..... \; \ I I .... I 99,10 % \. " \ I I .. ........: \ \ I 99 3 5 0/ \ J \ I , /О .. ".... \ 99.50 % \./ ................ дН о "tJ С Ш 99,80 % Рисунок 2.2.34.2. Термические диа2раммы вещества в зависимости от чистоты Изменения химичеСК020 состава. Измеряя теплоту и температуру реакции при данных yc ловиях. можно определить, например, кинетику разложения или десольватации. Использование для фазовых диа2рамм. Соз дание фазовых диаrрамм для твердых смесей. Создание фазовой диаrраммы может быть важным шаroм при предварительной постановке и оптимизации процесса лиофилизации. Определение чистоты. Измерение тепло ты плавления и температуры плавления с по мощью ДСК делает возможным определение содержания примесей в веществе по одной диаrрамме с использованием нескольких мил лиrрамм образца и без необходимости прове дения повторных точных измерений истинной температуры. Теоретически плавление полностью чисто ro кристаллическоro вещества при постоянном давлении характеризуется теплотой плавления Ь.Н, с бесконечно узким диапазоном, COOTBeT ствующим температуре плавления То. Расшире ние этоrо диапазона является чувствительным индикатором присутствия примесей. Таким об разом, при испытании образцов одноro и тоro же вещества с содержанием примесей, отличаю щимся на насколько десятых процента, получа ют визуально отличающиеся друr от друrа Tep мические диаrраммы (см. рисунок 2.2.З4.2). Определение молярной чистоты с помощью ДСК основано на использовании математиче скоro приближения интеrральной формы ypaB нения Вантrоффа применительно к KOHцeH трациям (не к активностям) в бинарной системе [ln(1x2)==X2 и Т.То ==To2J: RТo 2 т == т. !L.. х , (1) о ""Н 2 , rдe: Х 2 молярная доля примеси, то есть число молекул примеси, разделенное на общее число молекул в жидкой фазе (или в расплавленной фазе) при температуре Т (выраженной в Кель винах); ТО температура плавления химически чи стоro вещества, в кельвинах; R универсальная rазовая постоянная для идеальных rазов, в джоуль'кельвин' 1 ,моль'\ ""Н, молярная теплоемкость плавления вещества, в джоулях. Таким образом, определение чистоты с помощью ДСК оrраничено обнаружением примесей, образующих эвтектические смеси с основным веществом и присутствующих в испытуемом образце с молярной долей менее 2 %.
2.2.35. Осмоляльность 101 Данный метод не применяют для: аморфных веществ; сольватов или полиморфных соединений, которые нестабильны в пределах используемых при испытании температур; примесей, образующих твердые растворы с основным веществом; примесей, которые нерастворимы в жидкой фазе или в расплаве основноro вещества. Во время наrревания испытуемоro вещества при меси полностью плавятся при температуре эвтектической смеси. Выше этой температуры твердая фаза содержит только чистое вещество. Так как температура постепенно увеличивается от температуры эвтектической смеси до темпе ратуры плавления чистоro вещества, молярная доля примеси в жидкой фазе постоянно падает, так как количество расплавленноro чистоro Be щества постоянно увеличивается. Для всех TeM ператур выше эвтектической точки: Х 2 =. х;, (2) F rдe: F расплавленная доля анализируемоrо образца; Х; молярная доля примеси в анализируе мом образце. Если образец расплавлен полностью, то F = 1 и Х 2 = Х;. При объединении уравнений (1) и (2) полу чается следующее выражение: т = т. x; RT o2 .. О дН F , Значение теплоты плавления получают путем интеrрирования пика плавления. Температура плавления То чистоro веще ства экстраполируется из rрафика зависимости lIF от температуры, выраженной в кельвинах. Наклон (а) rрафика, при необходимости полу ченноrо после линеаризации, соответствующий х. RTo2 позволяет определить значение х;. дН, Доля х;, умноженная на 100, дает молярную долю всех эвтектических примесей в процентах. ТЕРМОМИКРОСКОПИЯ Фазовые изменения MOryT быть визуализи рованы с помощью термомикроскопии метода, который позволяет исследовать образец, KOТO рый подверrается температурному воздействю по заданной проrрамме, под микроскопом в по ляризованном свете. Наблюдения, сделанные с помощью Tep момикроскопии, позволяют точно идентифи амювать природу явления, обнаруженноro с 81С1ЮЛьзованием термоrравиметрии и диффе ренциальной сканирующей калориметрии. и _ 1712 Прибор. Прибор состоит из микроскопа, снабженноro поляризатором света, наrреватель ной пластинки, проrраммноro реryлятора TeM пературы и скорости HarpeBa и/или остывания и реrистрирующеro устройства для температур фазовых переходов. Moryт дополнительно ис пользоваться видеокамера и видеомаrнитофон. 01/2013:20235 2.2.35. ОСМОЛЯЛЬНОСТЬ Осмоляльность это показатель, позволя ющий оценить суммарный вклад различных pac творенных веществ в осмотическое давление раствора. Приближенный расчет осмоляльности qm водноro раствора проводят по формуле: т ==итФ, rде: v суммарное число ионов, образующих ся из одной молекулы растворенноro вещества в результате диссоциации; в случае если pac творенное вещество не диссоциирует на ионы, и = 1; т моляльность раствора, т. е. число молей растворенноro вещества на килоrрамм растворителя; Ф моляльный осмотический коэффи циент, учитывающий взаимодействие между ионами противоположноro знака в растворе и зависящий от величины т. По мере усложнения состава раствора усложняется и определение величины Ф. Единицей осмоляльности является осмоль на килоrрамм (осмоль/кr), но на практике обычно используется единица миллиосмоль на кило rpaMM (мосмоль/кr). Если нет друrих указаний в частной статье, осмоляльность определяют по понижению температуры замерзания раствора. Зависи мость между осмоляльностью и понижением температуры замерзания !'J. Т выражают COOT ношением: дТ т = .1 000 мосмоль/кr. 1,86 Прибор. Составными частями прибора (oc мометра) являются: приспособление для охлаждения сосуда с измерительной кюветой; система для измерения температуры, co стоящая из чувствительноro к температуре co противления (термистора) с соответствующим устройством для измерения тока или разно
102 /осударственная фармакопея Республики Беларусь Таблица 2.2.35.1 Масса натрия хлорида Р, в rpaMMax на кило rpaMM воды Р 3,087 6,260 9,463 12,684 15,916 19,147 22,380 Стандартные раСl., оры ля 2радуировки осмометра Фактическая Те,)реР1'еская Моляльный осмоляльность осмоляльность осмотический (мосмоль/кr) i идеальноrо paCT коэффициент вора (мосмоль/кr) 105,67 I 0,9463 0,186 ! 2',4,20 F ,9_, 0.372 ?З,З 0,9264 J. 0,558 4Э4.о7 0,9264 () 558 ! 5;'< 'T' t:t:;" ; БJ:, 765. I t 100 200 300 400 500 600 700 сти потенциалов; измерительное устройство может быть rрадуировано в rрадусах пониже ния температуры или непосредственно в едй ницах осмоляльности; как правило, приспособление для переме шивания образца. Методика. rотовят стандартные paCTBO ры в соответствии с таблицей 2.2.35.1. YCTa навливают нулевое значение на шкале прибо ра, используя воду Р. Проводят rрадуировку прибора, используя стандартные растворы: помещают от 50 мкл ДО 250 мкл CTaHдapTHO ro раствора в измерительную кювету и начина ют охлаждение системы. Чтобы предотвратить переохлаждение, измерительное устройство, как правило, проrраммируют на работу при температурах более низ"их, чем ожидаt';МОt; криоскопическое понижение температуры. Подходящее устройство указывает на AOCl и жение равновесия. Перед каждым измерением ячейку ополаскивают соответствующим CTaH дартным раствором. Те же операции проводят с испытуемым раствором. При этом перед каждым измерением кювету ополаскивают испытуемым раствором. Результаты либо непосредственно определяют по шкале прибора, либо рассчитывают по изме ренному понижению температуры замерзания. Результаты считают достоверными, если полу ченное значение осмоляльности испытуемою раствора не выходит за пределы значений OCMO ляльности двух стандартных растворов, исполь зованных для rрадуировки. #Наряду с понятием «осмоляльность» В практике используется понятие «осмоляр ность». Данные показатели близки и отличают ся друr от друrа только различным способом выражения концентрации растворов MO ляльной И молярной: осмоляльность количество осмоле.::! на 1 килоrрамм раствора; осмолярность количество осмолей на 1 литр раствора. Единицей осмолярности явля ется осмоль на литр (осмоль/л), но на практике обычно используется единица миллиосмоль на литр (мосмоль/л). Криоскопическое I понижение I температуры 05 О 9180 I . О:9ЗО 24 0,9157 1, 16 I . 86 0,9140 I 1,302 I Для идеальных растворов масса осмоля в rpaMMax представляет собой отношение rpaMM молекулярной массы вещества к числу частиц или ионов, образующихся при ею растворении. Для разбавленных растворов, близких к иде альным, осмоляльность и осмолярность MorYT быть рассчитаны теоретически. Осмолярность идеальных растворов может быть рассчитана по формуле: Осмолярность !<.онцентрацuя ве щт. .!<.олu ч ест 'lCJ с;тULi , молекулярная масса rдe: конценrпрация вeLЦecrпвa количество растворенною вещества на литр раствора, в rpaMMax; количество частиц число частиц или ионов, образующихся ПрИ растворении одной молекулы вещества. При повышении концентрации раствора взаимодействие между частицами вещества возрастает, и фактическая осмолярность по нижается по сравнению с осмолярностью иде альноrо раствора. Теоретический расчет oc молярности растворов веществ с большой молекулярной массой (например, белковых rидролизатов) и высококонцентрированных растворов невозможен. В таких случаях опре деля ют осмоляльность экспериментальным путем по понижению температуры замерзания раствора или по понижению давления пара над раствором. Понижение температуры за мерзания на 1,86 ос и понижение давления пара на 0,3 мм рт. ст. при температуре 25 ос соответствует 1 осмолю на килоrрамм воды. Растворы, равные по осмоляльности (OCMO лярности) 0,9 % раствору натрия хлорида, назы вают изотоничными. Наряду с прибором, описанным выше, для определения осмоляльности MOryT использо ваться также осмометры, основанные на изме рении давления пара над раствором. Они Tpe буют малоro объема вводимой пробы (около 5 мкл), при этом точность и правильность опре деления сравнима с величинами, получаемыми на приборах, основанных на измерении темпе ратуры замерзания.
2.2.36. Потенциометрическое определение концентрации ионов 103 в осмометрах, основанных на измерении понижения температуры замерзания, объем вводимой пробы образца можно варьировать. Значение осмоляльности (осмолярности) необходимо указывать на этикетках растворов для инфузий.# 01/2013:20236 2.2.36. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИОНОСЕЛЕКТИВНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ Теоретически потенциал Е ионоселективно ro электрода изменяется линейно от лоrариф ма активности а; данноro иона, что выражается уравнением Нернста: RT Е -=Ео +2.303lga;' z;F rде: Ео стандартный электродный потенциал используемоrо электрода; R универсальная rазовая постоянная; т абсолютная температура; F число Фарадея; z, величина заряда иона с обозначением ero знака. При постоянной ионной силе выполняется уравнение: k Е -= Е О + Ig (С., z. ' , rде: С, молярная концентрация иона; (коэффициент активности (а ; = ('С;); k RT . F Если: Ео +Ig (-= E и S == , rдe Zj z. S наклон rрадуировочной кривой электрода (наклон электродной функции), в таком случае выполняется уравнение: Е = E +Slg С, и для lgC; -= рС;: Е == E SpC;. Потенциометрическое определени KOHцeH трации иона проводят путем измерения разницы noтeнциaпoв между двумя подходящими элек И, поrpуженными в испытуемый раствор; ЫЙ электрод является селективным по orнowe нию к анализируемому иону, друroй _1ЯeТCЯ электродом сравнения. Прибор. Используют вольтметр, позволяю щий выполнять измерения с точностью О, 1 мил ливольта, с входным сопротивлением, в 100 раз превышающим сопротивление используемых электродов. Ионоселективные электроды преимуще ственно электроды с кристаллической или некри сталлической мембраной или с твердой основой (например, стеклянные электроды); или элек троды с заряженными (положительно или отри цательно) или с незаряженными подвижными носителями; или сенсибилизированные электро ды (ферментные электроды, rазиндикаторные электроды). Электродом сравнения обычно яв ляется хлорсеребряный или каломельный элек трод с подходящими соединяющими жидкостя ми, исключающими их перемешивание. Методика. Измерения проводят при посто янной температуре с точностью ::1:0,5 ОС, учиты вая изменение наклона электродной <рункции электрода в зависимости от температуры (см. таблицу 2.2.36. 1 ). Таблица 2.2.36.1 3начения k при различных температурах Температура, ос k 20 0,0582 25 0,0592 30 0,0602 Реryлируют ионную силу и, если необходи мо, рН испытуемоro раствора, используя буфер ные растворы, указанные в частной статье, и уравновешивают электрод, поrружая еro в пере мешиваемый с постоянной скоростью испытуе мый раствор, до получения постоянноro значе ния потенциала. Если электродная система используется часто, то реryлярно проверяют воспроизводи мость и стабильность сиrнала, линейность rpa дуировочной кривой или расчетноro алroритма в пределах концентраций испытуемоro раствора; если нет, то проводят проверку перед каждой серией измерений. Показания электрода можно считать линей ными, если наклон S rрадуировочной кривой приблизительно равен k/z, на единицу рС;. МЕТОД I (МЕТОД ПРЯМОЙ rРАДУИРОВКИ) Измеряют последовательно не менее трех раз потенциалы не менее трех растворов cpaB нения предположительно близких к испытуемо му раствору концентраций. Рассчитывают ypaB нение rрадуировочноro rрафика или строят rрадуировочный rрафик в координатах cpДHee значение потенциала Е соответствующее ему значение концентрации анализируемоrо иона, выраженное как logC; или pCj' rотовят испытуемый раствор, как указано в частной статье. Измеряют потенциал три раза и по среднему значению потенциала рассчитыва
104 Тосударственная фармакопея Республики Беларусь ют концентрацию анализируемоro иона, исполь зуя rрадуировQЧНЫЙ rрафик. МЕТОД 11 (МЕТОД мноrОРАЗОВЫХ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК) rотовят испытуемый раствор, как указано в частной статье. Измеряют равновесный потен циал Е т в объеме V T этоro раствора с неизвест ной концентрацией С т анализируемою иона. Не менее трех раз последовательно к объему V т ис пытуемоro раствора прибавляют объем V s раст вора сравнения, незначительный в сравнении с V T (V s S 0,01 V 7 ), с концентрацией C s ' значения которой находятся в пределах линейной части rрадуировочноrо rрафика. После каждоro при бавления измеряют потенциал и рассчитыва ют разницу потенциалов ДЕ между измеряемым потенциалом и Er ДЕ связано с концентрацией анализируемоro иона уравнением: или ( С V '1 ESlog 1+ ) CTV T 106: o=1+ CsVs , CTV T rдe: V T объем испытуемою раствора; С т концентрация анализируемоrо иона в испытуемом растворе; V s объем прибавляемоro раствора cpaB нения; C s концентрация анализируемоro иона в растворе сравнения; S наклон электродной функции, YCTa новленный экспериментально при постоянной температуре путем измерения разницы между потенциалами двух растворов сравнения, KOH центрации которых отличаются в 1 О раз и pac считаны в пределах линейной области rрадуиро вочноro rрафика. 6Е Строят rрафик зависимости 10 s (ось у) OT носительно V s (ось х) и экстраполируют полу ченную линию до пересечения с осью Х. В точке пересечения концентрацию С т анализируемою иона в испытуемом растворе рассчитывают по формуле: С CsV s . т V T МЕТОД 111 (МЕТОД ОДНОЙ СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ) К объему V T испытуемоro раствора, приro товленною, как указано в частной статье, при бавляют объем V s раствора сравчения, вмеща ющеro такое количество анализируемоro иона, чтобы сиrнал находился в линейной части rpa дуировочноro rрафика. Параллельно в тех же условиях ютовят контрольный раствор. Потен циалы испытуемоro раствора и контрольно ro раствора измеряют не менее трех раз перед прибавлением и после прибавления раствора сравнения. Рассчитывают концентрацию С т aHa лизируемоrо иона, используя уравнение и учи тывая контрольный раствор: С т 6Е CsV s 10 S(V7 +VS)V7 rдe: С т концентрация анализируемою иона в испытуемом растворе; C s концентрация анализируемоro иона в растворе сравнения; V s объем прибавляемоrо раствора cpaB нения; дЕ среднее значение разницы потен циалов, измеренных до и после прибавления объема V s ; S наклон электродной функции, YCTa новленный экспериментально при постоянной температуре путем измерения разницы между потенциалами двух растворов сравнения, KOH центрации которых отличаются в 1 О раз и pac считаны в пределах линейной области rрадуиро вочноrо rрафика; V T объем испытуемою раствора или KOH трольноro раствора. 01/2013:20237 2.2.37. РЕнтrЕНОФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ Рентrенофлуоресцентная спектрометрия с волновой дисперсией это метод анализа, в котором измеряют интенсивность флуоресцент ноro излучения, испускаемоro элементом, имею щим атомный номер от 11 до 92, возбуждаемоro непрерывным первичным рентrеновским излу чением. Интенсивность флуоресценции эле мента зависит от ею концентрации в образце, а также от поrлощения матрицей возбуждающеro и испускаемоrо излучения. При следовых коли чествах определяемоro вещества в области ли нейности rрадуировочною rрафика измеренная при определенной длине волны интенсивность флуоресценции элемента, находящеroся в Ma трице определенноrо состава, прямо пропор циональна концентрации данноrо элемента и обратно пропорциональна маСС090МУ коэффи циенту ослабления (поrлощения) МClтрицы при этой длине волны. Методика. Настройку и использование при бора проводят в соответствии с инструкция ми производителя. Жидкие образцы помещают непосредственно в прибор; твердые образцы предварительно прессуют в таблетки (rранулы),
2.2.38. Электропроводность 105 01/2013:20238 иноrда после смешивания с подходящим связы вающим материалом. Для определения концентрации элемента в образце измеряют скорость сетевоro импуль са, создаваемоro одним или несколькими стан- дартными образцами, содержащими известные количества данноrо элемента в матрицах опре деленноro состава, и рассчитывают или измеря ют массовый коэффициент ослабления матри цы анализируемоro образца. rрадуuровка. с помощью rpадуировочно ro раствора или серии растворов, содержащих разные концентрации определяемоro элемента в различных матрицах, определяют уrловой коэф фициент rрадуировочноro rpафика Ь о по формуле: 1 ,N bo=....f:... 11м С rде: 11м рассчитанный или измеренный массо- вый коэффициент ослабления матрицы М; , скорость ceTeBoro импульса; С концентрация определяемоrо элемента в стандартном образце. Массовый коэффициент ослабления ма- трицы образца. Если эмпирическая формула анализируемоro образца известна, ero массовый коэффициент ослабления рассчитывают исходя из справочных значений массовых коэффициен тов ослабления составляющих элементов. Если элементный состав образца неизвестен, изме- ряют интенсивность рассеянноrо peHTreHoBcKoro излучения 'и (Комптоновское рассеяние) и рас- считывают величину MaccoBoro коэффициента ослабления матрицы образца по формуле: 1 =a+Ыи' I1MP rде: I1 MP массовый коэффициент ослабления образца; 'и рассеянное peHTreHoBcKoe излучение. Определение скорости сетевоео импульса для определяеМ020 элемента в образце. Pac считывают скорость ceTeBoro импульса 'P дЛЯ определяемоro элемента по измеренным интен- сивностям флуоресцентной линии и фоновой линии (линий), принимая во внимание все за rрязняющие вещества пробирки. Расчет содержания следов. Если KOHцeH трация элемента входит в область линейности rрадуировочноrо rрафика, ее можно рассчитать по формуле: с = 'P . " 1 Ь О H J.J МР rде: f фактор разведения. 15 э-- 1712 2.2.38. ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТЬ Сила тока' (в амперах) в проводнике пря- мопропорциональна приложенной электродви- жущей силе Е (в вольтах) и обратнопропорцио- нальна сопротивлению R (в омах) проводника: Е '=' R Электропроводность (ранее удельная электропроводность) раствора (к) величина, обратная удельному сопротивлению (р). Удель- ное сопротивление определяют как отношение напряженности электрическоro поля к плотности тока. Сопротивление R (Ом) проводника, име- ющеrо площадь сечения $ (см 2 ) и длину L (см), рассчитывают по формуле: L R=PS' 1 L 1 L Таким образом: R =. или к =., к $ R $ rде L/$ соответствует постоянной идеаль- ной камеры. Единица электропроводности в системе СИ сименс на метр (См . M1). На практике элек- тропроводность растворов выражают в сименсах на сантиметр (См . CM1) или В микросименсах на сантиметр (мкСм . CM1). Единица удельноro со- противления в системе СИ ом-метр (Ом . м). На практике сопротивление раствора обычно вы- ражают единицах ом-сантиметр (Ом' см). Если нет друrих указаний в частной статье, значения электропроводности или удельноro сопротивле- ния обозначают для температуры 25 ос. Описание прибора и порядок проведения испытания, приведенные ниже, приrодны для лабораторноrо измерения электропроводности большей чем 1 О мкСм . см- 1 . Определение элек- тропроводности воды проводят, как указано в co ответствующих частных статьях. ПРИБОР Принцип работы ИСПОЛЬЗуемоro прибора (кон- дуктометра или омметра) основан на измерении удельноro сопротивления столба жидкости между электродами иммерсионноro измерительноro при- способления (электропроводной камеры). Во из бежание поляризации электродов используют пе- ременный ток. Прибор снабжают температурным компенсатором или прецизионным термометром. Измерительная камера вмещает два плати- новых электрода, каждый с площадью поверх- ности $, располаrающихся параллельно один к друrому на расстоянии L и покрытых платиновой чернью. Обычно оба электрода защищены сте- клянной трубкой. Moryт использоваться и друrие типы измерительных камер.
106 rосударственная фармакопея Республики Беларусь ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЯ Определение постоянной камеры Выбирают измерительную камеру, COOT ветствующую свойствам и электропроводно сти испытуемоro раствора. Чем выше ожидае мая электропроводность, тем большей должна быть постоянная камеры (ниже р). Обычно ис пользуемые измерительные камеры имеют постоянную порядка О, 1 CM1, 1 см. 1 И 10 см. 1 , Используют сертифицированный стандарт. ный образец, например, раствор калия хло рида, который приrоден для измерения. Значение электропроводности сертифициро BaHHoro стандартноro образца должно быть близким к ожидаемому значению электропро водности испытуемоro раствора. MorYT быть использованы друrие сертифицированные стандартные образцы, особенно для камер с постоянной порядка О, 1 CM1. Камеру опола скивают несколько раз водой дистиллирован ной Р и как минимум дважды используемым для определения постоянной измерительной камеры сертифицированным стандартным образцом. Измеряют сопротивление измери тельной камеры, используя сертифицирован ный стандартный образец при температуре (25:t1) ос. Постоянную К (CM1) измерительной камеры рассчитывают по формуле: К=- Rcco . Косо' rдe: Rooo измеренное сопротивление, МОм: Кооо электропроводность ИСПОЛЬ2уемо ro сертифицированноro стандартноro образца. мкСм . см. 1 . Измеренное значение постоянной К камеры не должно отличаться от указаннсrо более чем на 5 %. Если определение постоянной камеры проводится при температуре, отличающейся от указанной для сертифицированноro CTaH дартноro образца, значение проводимости рассчитывают по формуле: КТ =- к тесе' [1 + а(Т Тссо)], rдe: кт значение электропроводности при отличающейся температуре; К теоо значение электропроводности cep тифицированноro стандартноro образца; т температура при проведении rраду ировки; Теео температура, указанная для серти фицированноro стандартноro образца; а температурный коэффициент для значения электропроводности сертифициро ванноro стандартноro образца; для калия хло рида а=0,021. Определение удельной электропровод ности испытуемоrо раствора После тоro, как прибор отrрадуирован с ис пользованием одноro из стандартных растворов, измерительную камеру промывают несколь ко раз водой дистиллированной Р и как мини мум дважды испытуемым водным раствором. Измерения проводят так, как указано в частной статье. 01/2013:20239 2.2.39. МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕКСТРАНОВ Определение проводят методом эксклюзи он ной хроматоrрафии (2.2.30). Испытуемый раствор. 0,200 r испытуемо ro образца растворяют в подвижной фазе и дo водят до объема 1 О мл этим же растворителем. Маркерный раствор. 5 Mr 2ЛЮКОЗЫ Р и 2 Mr ФСО декстрана V o растворяют в 1 мл подвиж ной фазы. iрадуировочные растворы. Навеску каж доro из указанных стандартных образцов: 15 Mr ФСО декстрана 4 для 2радуировки, 15 Mr ФСО декстрана 10 для 2радуировки, 20 Mr ФСО дeK страна 40 для 2радуировки, 20 Mr ФСО дeKcтpa на 70 для 2радуировки и 20 Mr ФСО оекстрана 250 для 2радуировки по отдельности растворяют в 1 мл подвижной фазы. #Допускается использование стандартных образцов декстранов для rрадуировки с друrими паспортными данными, в этом случае для rpa дуировки хроматоrрафической системы peKO мендуется использовать дополнительно еще не менее двух стандартных образцов декстранов. # Раствор для проверки при20дности xpOMa т02рафической системы. 20 Mr ФСО дeKcтpa на 40 для проверки при20дности xpOMaт02pa фической системы (для анализа субстанции декстрана 40) или 20 Mr ФСО декстрана 60ПО для проверки при20дности хромат02рафиче ской системы (для анализа субстанций дeK страна 60 и декстрана 70) растворяют в 1 мл подвижной фазы. Если нет друrих указаний в частной статье, можно использовать следующие условия xpOMa тоrрафирования,: колонка длиной 0,3 м и внутренним диаме тром 10 мм, заполненная а2арозой поперечно сшитой для хромат02рафии Р, или серия коло нок длиной 0,3 м и внутренним диаметром 1 О мм каждая, заполненных полиэфирным 2идPOKcи лированным 2елем для хромат02рафии Р; подвижная фаза: раствор 7 r натрия сулъфа та безводН020 Р и 1 r хлорбутанола Р в 1 л воды Р;
2.2.39. Молекулярномассовое распределение декстранов 107 скорость подвижной фазы: от 0,5 мл/мин до 1 мл/мин, поддерживаемая постоянно с точ ностью:t1 % в час; детектор: дифференциальный рефрак тометрический; петлевой дозатор: объем от 100 мкл ДО 200 мкл; температура системы: поддерживают постоянной с точностью :1:0,1 ОС. rРАДУИРОВКАХРОМАтоrРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ Хроматоrрафируют несколько раз BЫ бранный объем MapKepHoro раствора. На xpo MaTorpaMMe должны присутствовать два пика: первый пик соответствует ФСО декстрана V o ' второй пик соответствует 2люкозе Р. Исходя из объема элюирования декстрана V Q , рассчи тывают объем эксклюзии V Q ; полный объем V/ рассчитывают по пику, соответствующему rлюкозе. Хроматоrрафируют определенный объем каждоro из rрадуировочных растворов. Для каждой полученной xpoMaTorpaMMbI проводят базовую линию. Каждую xpoMaтorpaMMY делят вертикальными равноудаленными линиями на р секций (количеством не менее 60), что co ответствует равным объемам элюирования. Для каждой секции i, соответствующей объему элюирования V i , измеряют высоту (у) от базо вой линии ДО линии xpoMaTorpaMMbI и рассчи тывают коэффициент распределения (К,) по формуле: (\I;Vo) ,(1) (\1; V o ) rде: V o объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему ФСО декстрана V o на xpoMaTorpaMMe MapKepHoro раствора; V/ полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему rлюкозе на xpOMaTO rpaMMe маркерноro раствора; объем элюирования для секции i, полу < ченный для xpoMaTorpaMMbI каждоro из rрадуи ровочных растворов. rрадуировку проводят, используя один из следующих методов. rрадуировка путем построения rpa- дуировочноrо rрафика. По уравнению (1) для каждоrо из декстранов для rрадуировки рассчитывают коэффициент распределения Kma.' соответствующий максимальной высоте линии xpoMaTorpaMMbI. На полулоrарифми ческой бумаrе строят зависимость значений Krra. (ось абсцисс) от молекулярной массы для максимальной высоты линии xpoMaTorpaMMbI (AI....) каждоro из декстранов для rрадуировки .. fПЮкозы (ось ординат). Через все получен ные точки про водят первую rрадуировочную линию, экстраполируя ее из точки Ктах' полу- ченной для ФСО декстрана 250 для 2paдyи ровки, до более низких значений К, получен ных для тех же стандартных растворов (см. рисунок 2.2.З9.1). I I I I I I I , ! , , I i \1 I I i t . . .., , ' j I , I 1 , 1 r i , I f , , , i , ,; , 'r -.. Декстран 250 I 5 ; ,1 "'1 _.. , . ." Де.стран 70 , '\. . ' I --_.. : Декстран -IO I I I ш I I ,Ш I ! i \ I дJстран 10 ! i ш 1\ I 1 ; I 1 ш\ шшr ш ш шf Ш - I\. Де.'стра I , ш\ i 3 ; ; ! ! I \ i i I ! I I I ; i ! I 250 i 7 4 i 1 4 м 1()б 10 1()4 H-l 10 rлюкоза к Q1 Q2 QЗ Q4 Q5 Q6 Q, Q8 Q9 1Ю Рисунок 2.2.39.1. Пример 2радуировОЧН020 2рафика Пунктиром обозначена часть 2радуировочно 20 2рафика, полученная экстраполированием. tоризонтаЛЬНblми линиями в нижней части pи сунка указаНbI ширина и положения xpOMaтo 2рафических линий, полученных для кажд020 декстрана для 2радуировки Используя полученный первый rрадуиро вочный rрафик, находят для всех значений К; для всех xpoMaTorpaMM соответствующие зна чения молекулярных масс Mi' получая таким об разом rрафическую зависимость для расчета молекулярномассовоro распределения. Для всех декстранов для rрадуировки рассчитыва ют среднюю молекулярную массу по уравне- нию (3), приведенному ниже. rрадуировочный rрафик может быть Иi;пользован для расчетов, если рассчитанные значения для каждоro из декстранов для rрадуировки не отличаются от указанных в паспорте значений больше чем на 5 % и среднее отклонение для всех дeKCTpa нов не превышает :1:3 %. Если данные условия не выполняются, rрадуировочный rрафик CMe
108 rосударственная фармакопея Республики Беларусь щают ВДОЛЬ оси ординат и повторяют вышео писанные операции, пока рассчитанные и YKa занные в паспорте значения будут отличаться не более чем на 5 %. rрадуировка при помощи расчетноrо метода. При помощи уравнений (2) и (3), при веденных ниже, и подходящеro метода (воз можно использование итеративноro метода, такоro как модифицированноro Хартли метода rауссаНьютона; также возможно построение кривой при помощи компьютерных проrрамм, которые используют принцип нелинейноro pe rрессивноro анализа) рассчитывают значе ния коэффициентов Ь 1 , Ь 2 , Ь З ' Ь 4 И Ь 5 , которые MorYT отличаться не более чем на 5 % от co ответствующих паспортных значений для каж доro декстрана для rрадуировки и 180:t2 для rлюкозы. #При расчетах rлюкозы в уравнении (2) дo пускают К;=1.# М, = Ь 5 + е{ь.ь,К,+Ь2К:+ЬЗК), (2) р I(y;M;) М = ;, , (3) w р LY; 1==1 rAe: р число секций, на которые поделена xpo MaTorpaMMa; У; высота хроматоrрафической линии над базовой линией в iтой секции; М, молекулярная масса для секции i. приrодность ХРОМАтоrРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ Хроматоrрафируют подходящий объем co ответствующеro раствора для проверки приroд ноСТи хроматоrрафической системы. Средняя молекулярная масса ФСО дек- страна для проверки приrодности хро- матоrрафической системы. Рассчитывают значение М,." как указано в разделе «rраду ировка хроматоrрафической системы», ис пользуя rрадуировочный rрафик или значения коэффициентов Ь" Ь 2 , Ь З ' Ь 4 И Ь 5 . Результаты анализа считаются достоверными, если полу ченное значение находится в пределах: от 41 000 до 47 000 (для ФСО дeKcтpa на 40 для проверки при20дности xpOMaтo 2рафической системы); от 67 ООО до 75 000 (для ФСО дeKcтpa на 60/70 для проверки при20дности xpOMa m02рафической системы). Средняя молекулярная масса 10% вы- сокомолекулярной фракции декстрана. Значение М,.) для 1 О % высокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секциях от 1 до п включительно, рассчитыва- ют по формуле: n L (у;М; ) М = м , (4) W n LYi 1..::1 rдe п определяется неравенствами: t y , so,{t y ,}, (5) Yj > о,{ Y. ), (6) rде: р количество секций, на которые разделе на xpoMaTorpaMMa; У; высота хроматоrрафической линии над базовой линией для секции i; М; молекулярная масса для секции i. Результаты анализа считаются ДOCTOBepHЫ ми, если полученное значение для 1 О % BЫCO комолекулярной срракции декстрана находится в пределах: от 11 О 000 до 130 000 (для ФСО декстра- на 40 для проверки приеодности хроматоара- фической системы); от 190 000 до 230 000 (для ФСО дeKcтpa на 60/70 для проверки приаодности xpOMaтo 2рафической системы). Средняя молекулярная масса 1 О % низ- комолекулярной фракции декстрана. Значе ние для 1 О % низкокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секции и после секции xpoMaTorpaMM т, рассчитывают по фор- муле: р м = t.;(Y;M') ,(7) W р LY; im rAe m определяется неравенствами: Y, so,{t y ;), (8) ,tr i > о,{ y;), (9) rAe: р количество секций, на которые разделе на хроматоrраммэ; У; высота хроматоrрафической линии над базовой линией для секции i; М; молекулярная масса для секции i. Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение для 1 О % низкомолеку- лярной фракции декстрана находится в пределах:
2.2.40. Спектрофотометрия ближне20 инфракраСН020 диапазона 109 от 6000 до 8500 (для ФСО декстрана 40 для проверки при20дности хромат02рафиче СКОЙ системы); от 7000 до 11 000 (для ФСО декстрана 60ПО для проверки при20дности xpOMaт02pa фической системы). МОЛЕКУЛЯРНОМАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИСПЫТУЕмоrо ДЕКСТРАНА Хроматоrрафируют выбранный объем ис пытуемоro раствора и рассчитывают: значение Мы для молекулярномассовоro распределения декстрана, значение Мы для 10 % высокомоле кулярной фракции декстрана и значение Мы для 1 О % низкомолекулярной фракции декстрана рассчитывают, как описано в разделе «Приrод насть хроматоrрафической системы». 01/2013:20240 2.2.40. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ БЛИЖНЕrо ИНФРАКРАсноrо ДИАПАЗОНА Спектрофотометрия ближнеro инфракрас ноro (БИК) диапазона метод с широкими м разнообразными способами применения в фармацевтическом анализе. Ближний инфра красный спектральный диапазон охватывает oбnасть от около 780 нм до около 2500 нм (от около 12 800 CM1 ДО около 4000 CM1). В HeKO торых случаях наиболее полезная информация находится в спектральном диапазоне от около 1700 нм ДО около 2500 нм (от около 6000 CM1 ДО около 4000 CM1). В спектрах БИКдиапазона представлены rлавным образом обертона коле баний CH, NH, OH и SH и комбинации oc новных типов колебаний; они являются очень информативными при условии, если информа ция обрабатывается с помощью COOTBeTCTBY ющих хемометрических алrоритмов. Полосы в БИКобласти значительно более слабые, чем полосы основных колебаний в средней ИК области, от которых они происходят. Так как значения молярноro поrлощения в БИКобласти малы, излучение обычно проникает в материал (включая твердые вещества) на несколько мил лиметров. Кроме тоro, мноrие вещества, такие как стекло, являются прозрачными в этом диа пазоне длин волн. Измерения MOryT быть проведены как на об разцах iп situ, так и с использованием CTaHдapT ноro отбора образцов и методов испытаний. Из БИКспектра доступна как физическая инфор мация, так и химическая, а также качественная и количественная информация. Однако непо средственное сравнение полученноrо спектра 16 30. 1712 со спектром химическоro стандартноro образца, как это происходит в абсорбционной спектро фотометрии в среднем ИКдиапазоне, в данном случае не приемлемо. Требуется проведение соответствующей валидированной математиче ской обработки полученных данных. БИКспектрофотометрия широко использу ется как для химическоro анализа, так и для фи зическоrо. Химический анализ: идентификация активных субстанций, вспомоrательных веществ, rOToBbIx лекарствен ных форм, промежуточных продуктов производ ства, химическоro сырья и упаковочных матери алов; количественное определение содержа ния активных субстанций и вспомоrательных Be ществ, определение химических чисел, таких как rидроксильное число, йодное число, кислотное число, определение содержания воды, опреде ление степени rидроксилирования, контроль co держания растворителей; контроль процесса производства. Физический анализ: кристаллическая форма и кристаллич ность, полиморфизм, псевдополиморфизм, размер частиц; процесс растворения, схема распада, твердость; исследование свойств пленок; контроль процесса производства, напри мер, контроль смешивания и rрануляции. На измерения в БИКдиапазоне влияют мноrие химические и физические факторы, опи санные ниже; воспроизводимость и релевант ность результатов зависят от контроля этих фак торов; измерения справедливы обычно только для конкретной модели rрадуировки. ПРИБОР БИКспектрофотометры используются для получения спектров в области от около 780 нм < ДО около 2500 нм (от около 12 800 CM1 ДО около 4000 CM1). Все измерения в БИКдиапазоне oc нованы на прохождении луча света через об разец или в неro и измерении ослабления выходящеro (прошедшеro, рассеянноro или OT раженноro) излучения. Спектрофотометры для измерений в БИКдиапазоне включают подходя щий источник света и монохроматор или интер ферометр. Обычно монохроматорами являются акустикооптические перестраиваемые фильтры (AOTF), дифракционные решетки или призмы. Обычно используются источники света высокой интенсивности, такие как кварцевые или воль фрамовые лампы или аналоrичные. Вольфра мовые лампы в качестве источника излучения MOryт быть высоко стабилизированы. Поэтому мноrие БИКспектрофотометры имеют однолу чевую конструкцию. В качестве материала дe тектора обычно используются кремния диоксид,
110 rосударственная фармакопея Республики Беларусь свинца сульфид, индия арсениД, индия rаллия арсен ид, ртути кадмия теллурид (МС7) и Аей терированный триrлицинсульфат. CTaHдapTHЫ ми приспособлениями для образцов являются обычные кюветные держатели, оптиковолокон ные зонды, трансмиссионная кювета для по rружения, вращающиеся или траверсные дep жатели образцов. Выбор производят исходя из предполаrаемоro применения, уделяя особое внимание приrодности приспособления отбора проб для типа анализируемых образцов. Подхо дящие блоки по обработке данных и их оценке обычно являются частью системы. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЙ Режим пропускания. Пропускание (7) явля ется мерой ослабления интенсивности излуче ния при данной длине волны при прохождении излучения сквозь образец. Образец помещают в оптический пучок между источником и дeTeK тором. Расположение аналоrично таковому во мноrих традиционных спектрофотометрах_ Pe зультат может быть представлен непосредствен но в единицах пропускания (7) и/или поrлоще ния (А). 1 T' 10 rдe: 1 интенсивность падающеro излучения; /0 интенсивность прошедшеro излучения. A==lo910 Т == 10910 (;) == 10910 ( 1; )- Режим диффузноrо отражения. Режим диффузноro отражения основан на измере нии отражения (R) отношения интенсивности света, отраженноro от образца (1) к интенсивно сти света, отраженноro от фона или стандартной отражающей поверхности (/,). БИКизлучение может проникать в образец на существенную rлубину, rде может быть поrлощено колебатель ными комбинациями и обертонами аналитов, присутствующих в образце. Непоrлощенное из лучение отражается от образца на детектор. БИКспектр отражения обычно получают расче том и построением зависимости Ig(1/R) от длины волны или волновоro числа. 1 R' 1, rдe: 1 интенсивность излучения, диффузноо траженноrо от образца; 10 интенсивность излучения, диффузно отраженноro от фона или отраженноro от по верхности сравнения. A R 10910( ) 10910( 1; )- Режим пропускания-отражения. Этот режим является комбинацией пропускания и OT ражения. При измерении пропусканияотраже ния (Т*) используется зеркало или диффузная отражающая поверхность для отражения излу чения, прошедшеro сквозь образец второй раз, удваивая, таким образом, оптический путь. He поrлощенное излучение отражается от образца на детектор. T*' 17 rде: /т интенсивность прошедшеro и отражен ноro излучения без образца; / интенсивность прошедшеro и отражен ною излучения, измеренная с образцом. , 1 I A*== I0 91Ol т * )" приrОТОВЛЕНИЕ/ПОДАЧА ОБРАЗЦА Режим пропускания. Измерение' и расчет пропускания (7) зависят от фоновоro спектра пропускания. В качестве фона MOryT выступать воздух, пустая кювета, используемый раствори тель или, в специальных случаях, стандартный образец. Метод в основном применяется для исследования разведенных инеразведенных жидкостей, дисперсионных систем, растворов и твердых веществ. Для измерения пропуска ния твердых веществ необходимо использовать подходящие приспособления для образцов. Об разцы исследуются либо в кюветах подходящей длины (обычно от 0,5 мм до 4 мм), прозрачных в БИКдиапазоне, либо путем поrружения оптико волоконноro зонда подходящей конфиryрации, позволяющеro получать спектр, находящийся в зоне, отвечающей требованиям спецификации прибора и подходящей для намеченных целей. Режим диффузноrо отражения. Данный метод обычно при меняется для исследования твердых веществ. Образец исследуется в под ходящем приспособлении. Должны быть приня ты меры по соблюдению как можно более BOC производимых условий измерений от образца к образцу. При использовании оптиковолоконноro зонда внимание должно быть уделено позицио нированию зонда, чтобы убедиться, что он OCTa ется неподвижным во время получения спектра и что условия испытания воспроизводимы от об разца к образцу. Излучение, отраженное от CTaH дартной отражающей поверхности (фона), CKa нируется для получения базовой линии, и затем измеряется отражение одноro или более анали тическоro образца. Распространенными CTaH дартными отражающими веществами являются керамическая плитка, перфторированные по лимеры и золото. MorYT быть использованы и друrие подходящие вещества. Непосредствен
2.2.40. Спектрофотометрия ближне20 инфракраСНО20 диапазона 111 ное сравнение возможно только лишь между спектрами, полученными при использовании фона с одинаковыми оптическими свойствами. Должны учитываться влияния размера частиц, rидратационной воды и степени сольватации. Режим пропускания-отражения. Отража тель размещается позади образца таким обра зом, чтобы удваивать оптический путь. Такая конфиryрация может быть предназначена для разделения одной и той же rеометрии прибора на систему с отражателем и систему с оптико волоконным зондом, Korдa источник излучения и детектор располаrаются по одну сторону об разца. Образец исследуется в кювете с зерка лом или подходящим диффузным отражателем, сделанным либо из металла, либо из инертноro вещества (например, титана оксида), которое не поrлощает в БИКдиапазоне. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА СПЕКТРАЛЬНЫЙ ОТКЛИК Температура образца. Данный параметр важен при исследовании водных растворов и мноrих жидкостей, Korдa различие на несколько rрадусов может приводить к значительным отли чиям спектров. Кроме тоro, температура иrрает важную роль при исследовании твердых Be ществ и порошков, содержащих воду. Влаrа и остаточные растворители. Влаrа и остаточные растворители, присутствующие в образце, будут приводить к значительным поло сам поrлощения в БИКдиапаЗ0не. Толщина образца. Толщина образца яв ляется известным источником спектральной вариабельности и должна учитываться и/или контролироваться. Например, при измерении отражения образцы должны быть «бесконечно» толстыми, а более тонкие образцы постоянной толщины должны иметь стабильный диффузи онноотражающий материал подложки с посто янной и, желательно, высокой отражающей спо собностью. Оптические свойства образца. Для TBep дых веществ должны учитываться как поверх ностные свойства, так и объемные свойства образца. Для записи спектров физически, хи мически или оптически неоднородных образцов может понадобиться усреднение путем увели чения пучка излучения или путем проведения большоro числа измерений или путем враще ния зонда. Определенные факторы, такие как различltlЯ в степени уплотнения или в размерах частиц порошков, а также в качестве поверхно сти, MOryT вызывать значительные спектраль ные изменения. Полиморфизм. Вариации в кристалличе ской структуре (полиморфизм) влияют на спек тры. По этой причине различные кристалличе ские формы, так же как и аморфные формы, твердых веществ MOryт быть отличены друr от друrа на основании БИКспектров. В случае присутствия мноroчисленных кристаллических форм необходимо обращать особое внимание на то, чтобы rрадуировочные стандартные об разцы имели распределение кристаллических форм, подходящее для решения поставленной задачи. Возраст образца. С течением времени в образце MOryT происходить изменения физиче ских, химических или оптических свойств. He обходимо убедиться, что образцы, предназна ченные для БИКспектрофотометрии, являются однотипными с образцами, взятыми для rраду ировки. В случае анализа образцов различноro возраста необходимо принимать в расчет потен циальные отличия в их свойствах. КОНТРОЛЬ ПАРАМЕТРОВ ПРИБОРА Прибор используют в соответствии с ин струкциями производителя. Реryлярно проводят необходимые проверки в соответствии с исполь зованием прибора и испытуемыми веществами. Проверка шкалы длин волн (за исклю- чением прибора с фильтром). Проверяют ис пользуемую шкалу длин волн обычно в диапазо не от около 780 нм до около 2500 нм (от около 12800 см. 1 ДО около 4000 см. 1 ) или В планируемом для анализа диапазоне, используя один или He сколько более подходящих стандартных образцов для проверки длин волн, имеющих характеристи ческие максимумы или минимумы в данном диа пазоне. Подходящими стандартными образцами являются, например, метиленхлорид или смесь оксидов редкоземельных металлов. Записывают спектр с таким же спектральным разрешением, как и при получении сертифицированноro значе ния, и определяют расположение не менее трех пиков, расположенных в используемом диапазо не. Допустимыми отклонениями являются :!::1 нм при 1200 нм, :!::1 нм при 1600 нм и :!::1,5 нм при 2000 нм (:!::8 см. 1 при 8300 см. 1 , :!::4 см. 1 при 6250 см. 1 и :!::4 см. 1 при 5000 см. 1 ). В зависимости ОТ'исполь зуемоro стандартноro образца проверку допусти моro отклонения для каждоro используемоro пика осуществляют, применяя требования для ближай шей длины волны (волновоro числа) из описанных выше. Для приборов с преобразованием Фурье rpадуировка шкалы длин волн может быть прове дена с использованием узкой линии паров воды при 7299,86 см. 1 или узкой линии сертифициро ванноro образца. Из оксидов редкоземельных ме--- таллов наиболее подходящим стандартным об разцом является NI8T 1920 (а). Измерения в режиме пропускания. Может быть использован метиленхлорид Р с длиной оптическоro пути 1,0 мм. Метиленхлорид имеет характеристические резкие полосы при 1155 нм,
112 /осударственная фармакопея Республики Беларусь 1366 нм, 1417 нм, 1690 нм, 18З8 нм, 1894 нм, 2068 нм и 2245 нм. Полосы при 1155 нм, 1417 нм, 1690 нм и 2245 нм используются для rрадуиров ки. Moryт быть использованы и друrие подходя щие стандартные образцы. Измерения в режиме диффУЗН020 отраже ния. Может быть использована смесь оксидов диспрозия, roльмия и эрбия (1 + 1 + 1 по массе) или друroй подходящий стандартный образец. Указан ный стандартный образец имеет характеристиче ские пики при 1261 нм, 1681 нм и 1935 нм. Если использование внешних твердых стандартных об разцов является невозможным и если измерения диффузною рассеивания проводят в кюветах или с использованием оnтоволоконноro зонда, то He посредственно в кювету или зонд помещают тща тельно перемешанную суспензию из 1,2 r титана диоксида Р в около 4 мл метиленхлорида Р. Спектр записывают через 2 мин. Титана оксид не обладает поrлощением в БИКдиапазоне. Спек тры записывают с максимальной номинальной ин струментальной шириной щели 1 О нм при 2500 нм (16 CM1 при 4000 CM1). Измерения осуществля ют на не менее трех пиках, расположенных в ис пользуемом диапазоне. Допустимые отклонения такие же, как указаны выше (при проверке шкалы длин волн). В зависимости от используемоro CTaH дартноro образца, проверку допустимою отклоне ния для каждою используемоro пика осуществля ют, применяя требования для ближайшей длины волны (волновою числа) из описанных выше. Проверка СХОДИМОСТИ длин волн (за ис- ключением прибора с фильтром). Проверяют сходимость длин волн с использованием подхо-- дящих стандартных образцов. Стандартное OT клонение длины волны должно соответствовать спецификации производителя прибора. Проверка фотометрической линейности и стабильности отклика. Проверку фотометри ческой линейности проводят с использованием стандартных образцов пропускания или oтpa жения и известными значениями пропускания и отражения, выраженными в процентах. При измерениях отражения используют уrлеродсо держащие стандартные образцы. В диапазоне 1 090 % используют не менее 4 стандартных образцов: 10 %, 20 %, 40 % и 80 % со значени ями оптическою поrлощения 1,0, 0,7, 0,4 и 0,1 соответственно. Если система используется для аналитов с оптической плотностью более 1,0, дополнительно используют 2 % и/или 5 % CTaH дартные образцы. Строят rрафик зависимости наблюдаемой оптической плотности стандарт ны)( образцов от их стандартных оптических плотностей и рассчитывают линейную perpec сию. Допустимые отклонения: для уrла накло на (1,00:1:0,05); для точки пересечения с осью абсцисс (0,00:1:0,05). Спектры, полученные с использованием стандартных образцов отражения, проявляют вариабельность по причине отличий условий испытаний, при которых они калибровались в заводских условиях, от условий испытаний, при которых они далее используются. По этой причине процентные значения отражения CTaH дартных образцов, используемых для rрадуи ровки, MOryT быть не достаточны для «абсолют ной» rрадуировки данноro прибора. Однако, до тех пор, пока стандартные образцы не изменя ются химически или физически, и до тех пор, пока используется та же стандартная отражаю щая поверхность (фон), что использовалась и при получении сертифицированноro значения, последующие измерения тех же стандартных образцов при идентичных условиях, включая точное расположение образца, дают информа цию о долroсрочной стабильности фотометри ческою отклика. Для долroсрочной стабиль ности допустимыми отклонениями являются :1:2 %; это необходимо в случае, только если спектры записывают без предварительной об работки образца. Проверка фотометрическоrо шума. Ha ходят фотометрический шум при помощи под ходящеrо стандартноro отражающеrо образца, например, белых керамических плиток или OT ражающих термопластических смол (например, ПТФЭ). Сканируют отражение стандартноro об разца в необходимом диапазоне длин волн или волновых чисел с соблюдением рекомендаций производителя прибора и рассчитывают фото метрический шум как пик/пик шум. Фотометри ческий шум должен соответствовать специфика ции спектрофотометра. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ (КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ) Создание библиотеки спектров сравне- ния. Записывают спектры подходящею количе ства серий субстанции, которые были провере ны на соответствие требованиям спецификации и которые проявляют типичную для данной суб станции вариабельность (обусловленные. Ha пример, различными производителями, физиче ской формой, размером частиц). Набор спектров представляет информацию для идентификации и характеристики, которая определяет rрани цы сходства для данной субстанции; этот набор вносят в библиотек используемую для иден тификации данной субстанции. Количество Be ществ в библиотеке зависит от специфики ее ис пользования, но слишком большие библиотеки способны вызывать некоторые сложности в BЫ явлеНИL1 отличий между различными вещества ми и при валидации. Все спектры используемой библиотеки должны иметь одинаковые: спектральный диапазон и количество точек получения данных; методику измерения; предварительную обработку данных.
2.2.40. Спектрофотометрuя ближне20 инфракраСНО20 диапазона 113 Если создаются подrруппы (библиотеки), то указанные выше параметры применяются неза висимо для каждой rруппы. Коллекция спектров библиотеки может быть представлена различны ми способами в соответствии с математически ми методами, используемыми для идентифика ции. Коллекции MOryT включать: все индивидуальные спектры субстанции; средний спектр каждой серии субстанции; при необходимости, описание вариабель ности спектра субстанции. Электронные рабочие данные, использо ванные для создания библиотеки, должны быть сохранены. Предварительная обработка данных. Во мноrих случаях, особенно для спектров, снятых в режиме диффузноro отражения, MOryT применяться различные виды предваритель ной математической обработки спектров перед разработкой классификации или проведени ем rрадуировки. Целью этоro может быть, Ha при мер, уменьшение вариаций базовой линии, уменьшение влияния известных изменений, Me шающих дальнейшему использованию MaTeMa тических моделей, или сжатие данных перед использованием. Типичными методами являют ся коррекция мультипликативноrо рассеивания (MSC), преобразование КубелкаМунка, спосо бы сжатия спектральных данных, которые MOryт включать использование весовой функции и по давление шумов, а также числовой расчет про изводных спектра первоro или второro порядка. Производные более высокою порядка не peKO мендуются. В некоторых случаях спектры также MOryт быть нормализованы, например, по MaK симуму поrлощения, среднему поrлощению или интеrрированной площади под спектром поrло щения. При проведении любых математических преобразований должна соблюдаться осторож ность во избежание появления помех или воз можной потери важной информации (важных для квалификации методик). Необходимо пони мание алroритма обработки, и во всех случаях лоrическое обоснование использования преоб разования должно документироваться. Оценка данных. Спектры, полученные в испытании, сравнивают напрямую с отдельны ми или усредненными спектрами сравнения всех субстанций, находящихся в базе данных, на основании их математической корреляции или друrих подходящих алюритмов. Набор из вестных усредненных спектров сравнения и ОТJ<лонений от них может быть использован в соответствии с алюритмом классификации. Раз личные алroритмы, основанные на анализе oc новных компонентов в комбинации с кластер ным анализом, S/MCA (soft iпdерепdепt тоdе'iпg Ьу c'ass апа'оgу проrраммное независимое моделирование на основе сходства классов), COMPARE функциях, использующих фильтры, UNEQ (ипеqиа/ dispe,sed c/ass HepaBHOMep но рассеянный класс) и друrие, используются в проrраммном обеспечении приборов для БИК спектрофотометрии, а также в стороннем про rpaMMHoM обеспечении. Достоверность выбран ноro алroритма должна валидироваться для конкретноro использования. Например, коэффи циент корреляции, сумма квадратов разниц или расстояний при кластерном анализе, должны co ответствовать критериям приемлемости, опре деленным в процессе валидации. Валидация базы данных Специфичность. В процессе валидации должна быть установлена селективность клас сификации, использующей базу данных спектра для положительной идентификации данноro вещества и достоверноro отличия от спектров друrих веществ. Должны быть установлены пределы приемлемости. Строrие критерии при емлемости обладают большей способностью к различению спектров, но MOryT вызывать HeKO торые ошибки, связанные с присущей данному веществу вариабельностью. Мяrкие критерии приемлемости решают эти проблемы, но MorYT приводить к появлению неоднозначных pe зультатов. Исследование веществ, близких по внешним признакам, химической структуре или наименованию к веществам, входящим в базу данных спектров, должно дать отрицательные результаты при идентификации. Образцы Be ществ, входящих в базу данных, но не исполь зованных для ее создания (т. е. друrие серии, смеси) при идентификации должны давать по ложительные результаты. Робастность. Робастность качествен ноro анализа должна быть оценена для YCTa новления влияния незначительных изменений стандартных условий на проведение испыта ний. Не допускаются изменения параметров предварительной обработки и алroритма rpa дуировки. Факторами, влияющими на робаст ность, являются: эффект различных условий окружающей среды (например, температуры и влажности в лаборатории ); эффект температуры образца, размеще ния образца в оптическом окне, rлубины зонда и уплотнения/наполнения вещества; замена частей прибора или устройств подачи образца. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ Создание библиотеки стандартных спек тров для rрадуировки. rрадуировка это процесс получения математической модели co отношения отклика, полученною от прибора, и свойств испытуемоro образца. Используют любой алroритм rрадуировки, который может описываться точной математической форму лой и давать удовлетворительные результаты.
114 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Записывают спектры необходимоro количества образцов с известными значениями определя емой величины во всем диапазоне rрадуировки (например, содержание воды). При rрадуировке проверяют правильности выбора длин волн для испытуемоro образца путем сравнения полос ис лытуемоrо образца и матрицы. Создают модель rрадуировки с использованием около 213 из меренных образцов. Оставшуюся 1/3 часть из меренных образцов сравнивают с полученной базой данных. Все образцы должны иметь зна чения количественноro содержания в точно ycтa новленных пределах в соответствии с постав ленной задачей. Корректность количественноro определения должна быть продемонстрирова на изменениями матрицы в пределах заданно ro интервала. Обычно используют множествен ную линейную реrрессию (MLR, тиltiр/е liпеаr ,eg,essioп), метод частных наименьших KBaдpa тов (PLS, partia/ Jeast squa,es) и реrpeссию oc новноro компонента (PCR, priпcip/e сотропепt ,eg,еssiоп). В случае rpадуировок PLS и PCR на rрафик наносят коэффициенты или наrрузки, и области высоких коэффициентов сравнивают ся со спектрами анализируемоro образца. Рабо чие данные, использованные для rрадуировки, должны быть сохранены без предварительной обработки. Предварительная обработка данных. Предварительная обработка данных может быть представлена как математическое превращение БИКспектральных данных для улучшения Ka чества спектров и/или для удаления или YMeHb шения нежелательных источников отклонений перед проведением rрадуировки. Существует мноro подходящих алroритмов для предвари тельной обработки данных и калибровки. Выбор алroритма основывается на приroдности для решения поставленной задачи. Выбор длины волны может повысить эффективность Moдe лей rрадуировки, таких как MLR (например, для определения размера частиц). В некоторых слу чаях весьма полезным является удаление части шкалы длин волн, например, в случае опреде ления rидратной воды. Кроме этоro используют прием компрессии шкалы длин волн. Параметры валидации. При валидации методик в БИКобласти спектра используются такие же аналитические характеристики, как и для друrих аналитических методик. Специфиче ские критерии приемлемости для каждоro пара метра валидации должны учитывать предпола raeMoe использование метода. Специфичность. Относительная различи тельная способность и селективность дЛЯ KO личественноro анализа должны быть анало rичны таковым для «Качественноro анализа». Объем испытаний на специфичность определя ется предполаrаемым использованием метода и контролируемыми рисками. Отличия KOHцeHTpa ций матрицы в пределах рабочеro диапазона не должны значительно влиять на количественное измерение. Линейность. Валидация по показателю ли нейность включает в себя корреляцию БИК результатов, рассчитанных из БИКоткликов, полученных по используемым алroритмам, от результатов, полученных стандартным методом и распределенным в пределах определенноro диапазона модели rрадуировки. Также MOryт Ba лидироваться БИКотклики, находящиеся в He линейном диапазоне. Дипазон примененuя. Диапазон CTaHдapT ных значений испытуемоro образца определяе-т диапазон БИКметодики и ее пределов количе cTBeHHoro определения. Необходимо контроли ровать, чтобы результаты определения не BЫ ходили за пределы валидированноro диапазона. Правильность. Правильность может быть определена путем сравнения результатов aHa лиза с результатами, полученными по валиди рованной методике, или с результатами анализа извес-тных образцов (холостые образцы и образ цы, к которым добавлено известное количес-тво испытуемой субстанции). Правильность может быть выражена как с-тандартная ошибка про rнозирования (SEP, stапdаrd e,ror о' рrеdiсtiоп) БИКметодики, которая должна соrласовывать ся С данными валидированной методики. CTaH дартная ошибка проrнозирования представляет собой стандартное отклонение разниц, получен ных при сравнении данных, полученных по ис пользуемой БИКметодике, с аналитическими данными метода сравнения. Путем сравнения стандартной ошибки проrнозирования с MeTO дом сравнения, использованным для валида ции, демонстрируется корреляция результатов БИКметодики и аналитических данных метода сравнения. Для сравнения результатов БИК методики со стандартными результатами MOryт при меняться альтернативные статистические методы (двухсторонний Tec оценка система тической поrрешности). Точность (прецизионность). Точность Bыpa жает степень близости результатов для серии из мерений при заданных условиях. Она устанавли вается на не менее 6 измерениях, выполненных в соответствии с разработанной аналитической Me тодикой. Точность рассматривается на двух ypOB нях: сходимость (повторяемость), которая опре деляется повторными измерениями одноrо и тoro же образца с изменениями еro положения или без них, и внутрилабораторная точность (прове дение измерений различными аналитиками, BЫ полнение измерений в различные дни). Робастность. Робастность включает влия ние изменений температур, влажности, обработки образца, а также инструментальных изменений. Выбросы (outliers). Выбросы данных БИК измерений образца за пределы диапазона rpa дуировки указывают на необходимость дальней ших испытаний. Если дальнейшие испытания
2.2.41. Круаовой дихроизм 115 образца соответствующей аналитической MeTO ДИКОЙ дают значения, укладывающиеся в нормы спецификации, полученный результат paccмa тривается как соответствующий спецификации. Таким образом, выбросы данных БИКизмерений образца MOryт рассматриваться как COOTвeTCTBY ющие спецификации для испытуемоro образца. ОЦЕНКА ДЕЙСТВУЮЩЕЙ МОДЕЛИ Валидированные для использования БИК модели подверrаются непрерывной оценке производительности и контролю за валидаци онными параметрами. При обнаружении He соответствий необходимо применять KoppeK тирующие действия. Степень необходимой ревалидации зависит от при роды изменений. Ревалидация модели качественноrо анализа необходима в случае внесения HOBOro веще ства в библиотеку стандартов и может быть He обходима, если наблюдаются изменения фи зических свойств вещества и если изменяется поставщик материалов. Ревалидация модели количественноro анализа необходима при из менении состава roTOBOro продукта, производ cTBeHHoro процесса и поставщиков/квалифи кации сырья. ПЕРЕНОС БАЗЫ ДАННЫХ При переносе базы данных на друroй прибор должны быть учтены спектральный диапазон, количество экспериментальных точек, спек тральное разрешение и друrие параметры . Для демонстрации TOro, что модель остается приroд ной для новой базы данных или новоro прибора, должны быть проведены последующие валида ционные процедуры и установлены COOTBeTCTBY ющие критерии. ХРАНЕНИЕ ДАННЫХ Электронные версии БИКспектров, библио теки и данные сохраняют в соответствии с дей ствующими правилами. БИКспектры сохраняют с предварительной обработкой данных для конкретноro использо вания (например, для идентификации, анализа размера частиц, определения содержания воды и др.) в соответствии с действующими специфи кациями. 01/2013:20241 2.2.41. круrовой ДИХРОИЗМ Круroвым дихроизмом называют разность оптических плотностей в пределах полосы по rлощения для света с левой и правой круrовой поляризацией, присущую оптически активным веществам. Прямое измерение дает величину: A == A L AR, rде: М оптическая плотность круroвоro дих роизма; A L оптическая плотность для света с левой круroвой поляризацией; A R оптическая плотность для света с правой круroвой поляризацией. Круroвой дихроизм рассчитывают по фор муле: дА Дr:= Е E ==, l. R с./ rде: ДЕ молярный круroвой дихроизм или молярный дифференциальный дихроич ный коэффициент поmощения, выраженный л . моль. 1 . см. 1 ; E L молярный коэффициент поmощения (2.2.25) для света с левой круrовой поляриза цией; E R молярный коэффициент поmощения для света с правой круrовой поляризацией; с концентрация вещества в испытуемом растворе, моль. л. 1 ; f длина оптическоro пути, см. Для характеристики KpyroBoro дихроизма MOryт быть также использованы следующие еди ницы: Фактор диссимметрии: ДЕ g==. Е rдe: Е молярный коэффициент поrлощения (2.2.25). Молярная эллиптичность: Некоторые типы приборов непосредствен но показывают величину эллиптичности 0, BЫ раженную в rрадусах. При использовании таких приборов молярная эллиптичность [0] может быть рассчитана по формуле: ] 0.М L0 == , c.f.10 rде: [0] молярная эллиптичность, rрадус' см 2 . дмоль. 1 ; o величина эллиптичности, показывае мая прибором; М относительная молекулярная масса ис пытуемоro вещества; с концентрация испытуемоro вещества в растворе, r/мл; f длина оптическоro пути, см.
116 rосударственная фармакопея Республики Беларусь Молярная эллиптичность также связана с молярным круroвым дихроизмом следующим уравнением: 4500 е == 2,30ЗДЕ ;:; З300ДЕ. П Молярная эллиптичность часто использует ся при анализе белков и нуклеиновых кислот. В этом случае молярная концентрация, выражен ная в единицах мономерных остатков, рассчиты вается, исходя из выражения: молекулярная масса число аминокислот Для белков среднее значение относитель ной молекулярной массы мономерноro остатка составляет от 100 до 120 (в среднем 115), для нуклеиновых кислот (в виде натриевой соли) около 330. Прибор. Источником света (S) является Kce ноновая лампа (рисунок 2.2.41. 1); свет прох дит через двойной монохроматор (М), снабжен ный кварцевыми призмами (Р1, Р2). so /' '}м " '" Q , "" < ']] m т,: c :?:]: М4[,',:::'--:::=," СС', ,.,g...-"", [}{I-,,: :o"'f""" r Ф С. Р.М Рисунок 2.2.41.1. Оптическая схема дихроарафа Линейный луч из первоro монохроматора расщепляется на два компонента, поляризуе мые под правым уrлом вторым MOHoxpOMaTO ром. Дополнительный луч устраняется выходной щелью монохроматора. Поляризованный и монохроматический свет проходит через двоякопреломляющий модуля тор (Cr); в результате образуется свет с круrовой поляризацией. Затем луч проходит через исследуемый образец (С) и попадает на qpотоумножитель (Р.М.), за которым следует усилитель, произ водящий два электрических сиrнала: один по стоянноro тока V c ' а друroй переменноro тока с частотой модуляции V ac ' характерной для ис