/
Author: Луппа X.
Tags: биология клетки и субклеточных частиц цитология биохимия гистология гистохимия
Year: 1980
Text
Х!' ‘ ОСНОВЫ
гистохимии
Hans Luppa
GRUNDLAGEN DER HISTOCHEMIE
AKADEMIE-VERLAG • BERLIN
X. Луппа ОСНОВЫ
ГИСТОХИМИИ
ПЕРЕВОД С НЕМЕЦКОГО
канд. биол. наук И. Б. Бухвалова
и канд. биол. наук Е.Д. Вальтер
ПОД РЕДАКЦИЕЙ
д-ра мед. наук, проф. Н.Т. Райхлина
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
МОСКВА 1980
УДК 576.72
В книге описаны основные методические приемы, используе-
мые в гистохимии. Приведены наиболее употребительные методы
подготовки тканей к исследованию (замораживание, лиофильная
сушка, заливка в парафин, химическая фиксация и т. п.), методы
определения белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов.
Большое внимание уделено гистохимии ферментов, а также пиг-
ментов и биогенных аминов. Описаны методы с использова-
нием радиоавтографии и иммунохимии.
Предназначена для гистологов, гистодимиков, цитологов,
биохимиков, врачей, для студентов, аспирантов и преподавате-
лей университетов, медицинских, сельскохозяйственных и педаго-
гических институтов.
Редакция литературы по биологии
2007010000
21003—132 © Akademie-Verlag, Berlin, 1977
Л————“132—80 —.
© Перевод на русский язык, «Мир», 1980
041(01)—80
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА
Сегодня гистохимия занимает достойное место в методическом ар-
сенале биологов и медиков. Об этом свидетельствует систематическое
увеличение числа соответствующих публикаций, издание специальных
гистохимических журналов и монографий, регулярное проведение меж-
дународных конгрессов, а также организация в целом ряде стран на-
учных гистохимических обществ. Автор данной книги профессор Лейп-
цигского университета X. Лулла является председателем такого
общества в ГДР. В выборе и изложении материала отразился большой
педагогический опыт автора.
Перевод на русски* язык книги X. Луппы окажется несомненно по-
лезным для дальнейшего развития гистохимии в нашей стране.
В этой книге в отличие от опубликованных ранее на русском языке
руководств по гистохимии в каждой главе описанию гистохимических
методик предпослано краткое изложение теоретических предпосылок.
Расположение материала соответствует последовательности операций
гистохимического анализа: предварительная обработка материала (фик-
сация, заливка, приготовление срезов), гистохимическое распознавание
различных соединений по классам, дифференциальное вышление от-
дельных соединений внутри классов. Самостоятельные разделы посвя-
щены гистохимии нуклениовых кислот, белков, липидов, полисахаридов,
пигментов, биогенных аминов и неорганических веществ. Особое место
занимает гистохимия ферментов. Отдельные главы посвящены описа-
нию принципов радиоавтографин, иммуногистохимии и цмтофотоме-
трии. <
дЛри малом объеме, выгодно отличающем книгу от таких руко-
водств, как «Гистохимия» Э. Пирса и «Электронная гистохимия»
Г. Гайера, она охватывает все важнейшие разделы и отражает современ-
ное состояние данной науки. Написанная доступным языком, книга
X. Луппы может служить хорошим современным учебным и практиче-
ским пособием. Нет сомнений в том, что книга эта не залежится на пол-
ках; она станет настольной книгой не только для гистохимиков, но и для
всех, кому приходится сталкиваться с подобными методами,—для мор-
фологов, биохимиков и физиологов разных направлений.
Н. Райхлин
ПРЕДИСЛОВИЕ
За последние два десятилетия гистохимические методы получили
широкое распространение как в исследовательской, так и в практической
работе биологов и врачей. Позволяя выявлять локализацию веществ
и ферментов в клетках и тканях, гистохимия обеспечивает связь между
биохимией и морфологией.
Данная книга в первую очередь преследует цель ориентировать чи-
тателя в принципах и методах гистохимии. С этой целью теоретический
раздел в каждой главе, за исключением главы по иммуногистохимии, со-
провождается методической частью, включающей в себя апробиро-
ванные стандартные методы, которые, как правило, могут быть исполь-
зованы в обычных лабораториях. >
В соответствии с характером книги светомикроскопическая гистохи-
мия была умышленно вынесена на первый план. Это ни в коей мере не
умаляет значения бурно развивающейся электронно-микроскопической
гистохимии, прекрасно описанной Г. Гайером в его книге «Электронная
гистохимия». Более полные сведения по теории практике гистохимии
читатель найдет в первую очередь в книге Пирса «Гистохимия», в «Руко-
водстве по гистохимии», а также в различных гистохймических жур-
налах, например в Acta histochemica (VEB Fischer-Verlag, Jena).
Выражаю свою благодарность издательству Akademie-Verlag и его
ответственному редактору Шульцу, который с готовностью выполнял
все мои пожелания при работе над этой книгой. Особую признатель-
ность выражаю И. Эртель, Д. Кратш и д-ру Г. Фойстелю за просмотр
рукописи, критические замечания и рекомендации при подготовке
иллюстраций.
Лейпциг, март 1976 г.
X. Луппа
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ ГИСТОХИМИИ
Будучи разделом науки о тканях и клетке, гистохимия
имеет своей целью изучение химического состава тканей
и клеток при сохранении их структуры, а также установле-
ние локализации химических веществ в определенных ком-
понентах тканей, типах клеток и клеточных структурах.
Термин цитохимия применяется в литературе в двух значе-
ниях—либо как ультрагистохимия клетки, либо как сумма
микроскопических , методов, позволяющих проводить хи-
мический и ферментативный анализ клеток или групп кле-
ток при сохранении их морфологии., Именно как сумма ме-
тодов, изучающих вещества и ферментативную активность
в клетках in situ, и будет рассматриваться цитохимия
в этой книге. Поскольку гистохимия имеет своей основной
целью установление связи между выявляемыми вещества-
ми и их структурной локализацией, ее можно в значитель-
ной мере рассматривать как топохимию, или гистотопохи-
мию. Иногда вместо термина топохимия используется
определение микроскопическая гистохимия.
Хотя своими корнями гистохимия уходит во вторую
половину предыдущего столетия, особенно бурное разви-
тие ее наблюдалось в последние три-четыре десятилетия
благодаря внедрению новых методов; сегодня гистохимия
со своим разнообразным методическим арсеналом стала
незаменимой в цитологии и в различных биологических
дисциплинах. Ее растущее значение проявляется в органи-
зации научных обществ, а также в издании журналов
и руководств.
Быстрое развитие гистохимических методов является
результатом сильного влияния со стороны биохимии, что
особенно проявилось за последние два десятилетия. На-
иболее заметно это воздействие сказалось в бурном разви-
8 1. Введение
тии гистохимической энзимологии. Кроме того, в основе
целого ряда гистохимических методов лежат различные
принципы аналитической химии. Несмотря на выражен-
ную, главным образом в энзимогистохимии, тесную связь
между гистохимическими и биохимическими методами,
имеются и существенные различия. Биохимик с помощью
различных приемов гомогенизации и разделения может
качественно и количественно анализировать клетки и тка-
ни, а также их компоненты, мирясь при этом с потерями
веществ, происходящими при смене сред. Гистохимия же
проводит свои исследования на клетках и тканях при со-
хранении структуры отдельных компонентов, получая та-
ким образом возможность анализировать продукт реак-
ции на месте его прижизненной локализации как качествен-
но, так и количественно. Требование точной сохранности
структуры как основной предпосылки всякого топохими-
ческого выявления веществ означает, что гистохимия в от-
личие от биохимии не может использрвать химические ме-
тоды, ведущие к сильным изменениям структуры.
Нынешнее преимущество биохимических методов по
сравнению с гистохимическими определяется их возмож-
ностью направленно изолировать вещества из клеток
и тканей и не только подробно изучать их химические и фи-
зико-химические свойства, но и проводить точный количе-
ственный анализ. Развитие и совершенствование оптиче-
ских и препаративных методов за последние годы
позволяет, однаКо, ожидать дальнейшего прогресса также
и в области количественной гистохимии.
Признание многими биохимиками возможности более
точной функциональной интерпретации многочисленных
биохимических данных по различным органам благодаря
локализации веществ вплоть до ультраструктурного уров-
ня породило потребность в сотрудничестве в области ги-
стохимии и биохимии. Необходимость упрочения контак-
тов между гистохимиками и биохимиками вытекает также
из того факта, что получаемые гистохимическими метода-
ми данные по выявлению веществ и ферментативной ак-
тивности могут быть правильно истолкованы лишь при
сравнении их с результатами соответствующих биохими-
ческих исследований. Подобный подход начинает играть
все большую роль, особенно при идентификации фермен-
I, Введение 9
тов в гистохимических системах. Это требует от гистохи-
миков широкого знания биохимических методов, исполь-
зуемых параллельно с гистохимическими, например
методов разделения веществ и ферментов при помощи
электрофореза и хроматографии.
Гистохимия со своим обширным арсеналом методов
завоевала прочное место в биологии и медицине—как
в теории, так и в практике. Будучи по существу морфологи-
ческой дисциплиной, она вносит существенный вклад
в преодоление разрыва между морфологией и физиоло-
гией.
1.2. ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ГИСТОХИМИИ
Развитие гистохимии и микроскопической морфлогии
происходило при постоянном взаимодействии этих дисци-
плин. В конце XIX и начале XX вв. существенное влияние
на развитие гистохимии оказали неорганическая, органи-
ческая и физическая химия, а позднее и физиологическая
химия, или биохимия. В двадцатых годах нынешнего века
на дальнейшее становление гистохимии сильно повлияло
развитие химии красителей.
В истории гистохимии можно проследить два этапа:
один с преобладанием статического, а другой—динамиче-
ского аспектов. Статический этап характеризовался иссле-
дованиями описательного плана, направленными на топо-
химическое установление локализации ферментов и ос-
новных веществ с помощью имевшихся в то время
методов.'В этойфазе гистохимия во многом рассматрива-
лась как придаток гистологии. Технический подход, харак-
теризующийся недостаточно критическим отношением
к методикам, оказался несостоятельным.
Динамический подход, выступивший на первый план
с середины пятидесятых годов, получает решающий им-
пульс от формирующихся как раз в это время количествен-
ной гистохимии и электронно-микроскопической гистохи-
мии. Следует здесь упомянуть также постоянно совершен-
ствующиеся количественные микрометоды в комбинации
с выделением клеток и клеточных компонентов.
Развитие новых, особых подходов, которые представ-
ляли собой комбинацию гистохимических методов с мето-
10 1. Введение
дами другого характера, способствует повышению инфор-
мативности гистохимии. И наконец, становлению функ-
ционального подхода способствует использование таких
оптических методов, как поляризационная и флуоресцент-
ная микроскопия и особенно радиоавтография. Следует
также отметить все более настойчивые попытки повысить
информативность получаемых результатов путем выявле-
ния физико-химических механизмов гистохимических ре-
акций. Большие надежды по праву возлагаются на имму-
ногистохимию—метод, отличающийся высокой чувстви-
тельностью и специфичностью.
Разнообразие гистохимических методов и их широкое
использование в биологии и медицине еще раз доказывает,
что в этой современной отрасли морфологических иссле-
дований будущее за гармоничным сотрудничеством иссле-
дователей, достигших высокой квалификации в своих
областях.
2. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИИ
Гистохимические методы, как правило, складываются
из двух компонентов:
1) подготовка ткани,
2) гистохимическая реакция.
Поскольку подготовка ткани играет решающую роль
в успехе последующей гистохимической реакции, на нее
следует обращать соответствующее внимание. Главной за-
дачей предварительной подготовки является такое сохра-
нение исследуемых веществ в тканях и клетках, при кото-
ром можно судить об их прижизненном состоянии. При
этом необходимо перевести исследуемую ткань из лабиль-
ного состояния живого вещества в стабильное. Для этой
цели используются два метода:
1) Консервирование нативного материала глубоким
замораживанием.
2) Химическая фиксация.
Для сохранения прижизненной структуры в тканях
йригодны оба этих подхода. Тонкие срезы получают с по-
мокцью • микротома. При этом используются обычные
приемы гистологической техники.
Гистохимическая реакция проводится на тонких сре-
зах. Продукт гистохимической реакции должен быть или
окрашенным для обычной микроскопии, или обладать
способностью давать свечение для флуоресцентной микро-
скопии.
При использовании гистохимической реакции для на-
учных или диагностических целей следует соблюдать два
условия:
1. Гистохимическое выявление, насколько это воз-
можно, должно быть специфичным. Для выполнения это-
го требования необходимо проведение соответствующих
12 2. Методы гистохимии
контрольных реакций или параллельных биохимических
исследований.
2. Реакцию по возможности следует оценить количе-
ственно при помощи стандартизованного метода.
3. Результаты реакции должны по мере возможности
указывать на место прижизненной локализации исследуе-
мого вещества (вплоть до ультраструктурного уровня).
Короче говоря, гистохимическая реакция должна безоши-
бочно маркировать место локализации.
4. Продукт гистохимической реацин должен быть свя-
зан с тканевыми и клеточными структурами. Эго условие
может быть выполнено линь в том случае, если в процессе
прохождения реакции ткань подвергается самому мини-
мальному воздействию.
В последних двух пунктах требования гистохимиков
строже требований гистологов, которых, как правило, за-
ботит лишь то, как сохранить структуру и избежать
грубых сжатий и набуханий в срезах ткани.
2.1. МЕТОДМ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ТКАНИ
2.1.1. ЗАМОРАЖИВАНИЕ - ВЫСУШИВАНИЙ
(ЛИОФИЛЬНАЯ СУШКА)
Метод замораживания—высушивания основан глав-
ным образом на том, что путем замораживания удает-
ся полностью остановить все жизиеиные процессы, избегая
при этом химической фиксации и обычного обезвоживания
ткани, что позволяет исключить или свести до минимума
всевозможные химические и физические изменения в тка-
ни. Следует добавить также, что потери даже легкораство-
римых веществ цри замораживании—высушивании пол-
ностью или по крайней мере почти полностью уст-
раняются. Преимущество метода заключается в том, что
удаление воды из ткани происходит без смещения и по-
терь вещества, а также в том, что не происходит дена-
турирования тканевой структуры.
Эти преимущества сопряжены, одаако, со значительны-
ми техническими трудностями. Рекомендуется тщательно
продумывать процедуру замораживая»!—высушивания.
2. Методы гистохимии 13
Метод замораживания—высушивания складывается
из трех этапов:
1) замораживание ткани,
2) сублимация воды из замороженной ткани,
3) пропитка высушенной ткани парафином.
2.1.1.1. ЗАМОРАЖИВАНИЕ ТКАНИ
При помощи быстрого замораживания ткани—важ-
нейшего этапа лиофильной сушки—достигается полная
остановка всех жизненных процессов и стабилизация
структуры ткани. Химических и морфологических измене-
ний при этом не происходит. Замораживание кусочков тка-
ни проводят в соответствующей жидкости, например в
изопентане, н-пентане или фреоне, которые лучше всего
охладить до —180° С жидким азотом. Благодаря этому
достигается мгновенное и достаточно глубокое заморажи-
вание воды в ткани. Крупные кристаллы льда, способные
повредить структуру замороженной ткани, в таких усло-
виях не образуются. Образование многочисленных мел-
ких, равномерно распределенных кристалликов льда, на-
оборот, способствует сохранению структуры. Рекомен-
дуется замораживать не слишком большие кусочки ткани.
2.1.1.2. ВЫСУШИВАНИЕ ТКАНИ
- Процесс высушивания состоит из двух фаз: основное
высушивание и заключительное высушивание. В процессе
основного высушивания сублимируется вода, находящаяся
в ткани в виде кристаллического льда (98—99% всей воды
ткани). Остатки влаги (2—4%) удаляются заключительным
высушиванием при повышенной температуре. Исследова-
ния показали, что нет необходимости стремиться к полно-
му удалению остатков влаги, поскольку присутствие
1—2% воды в ткани не мешает заливке. Кроме того, опре-
деленный процент воды в макромолекулах, например
в белках и нуклеиновых кислотах, необходим для сохране-
ния макромолекулярной структуры.
Успех основного высушивания зависит в значительной
мере от соответствия режимов давления и температуры.
Продолжительность высушивания зависит от темпера-
14 2. Методы гистохимии
туры: более высокая температура замороженной ткани
обусловливает более высокое давление пара, что ведет
к более быстрому высушиванию. Оттаивания материала
в процессе высушивания необходимо избегать, поскольку
при этом может происходить смещение структур.
При выборе температуры высушивания следует исхо-
дить из того, что в клетках и в межклеточном пространстве
ткани имеется раствор, точка замерзания которого зависит
от концентрации в нем солей. Поскольку вследствие испа-
рения воды в процессе сушки концентрация солей постоян-
но возрастает, точка замерзания снижается.
Минимальная температура замерзания раствора, зави-
сящая от концентрации солей, определяется как эвтектиче-
ская точка. Практически в этой точке вода насыщена рас-
творенным в ней веществом. Оптимальный режим
высушивания осуществляется лишь в том случае, когда
температура ткани вплоть до заливки в парафин лежит ни-
же эвтектической точки. Эмпирически установлено, что
требуемым условиям удовлетворяет интервал температур
Рис. 1. Уменьшение влажности ткани в процессе сушки при —20° С.
I—основное высушивание; II—заключительное высушивание.
от —45 до —55° С. Органы, богатые неорганическими со-
лями, подлежат высушиванию при — 55° С. При темпера-
турах от -45 до -60° С необходим вакуум по меньшей
мере 10 3 мм рт. ст.
2. Методы гистохимии 15
Температуру ткани, которую на протяжении всего про-
цесса сушки необходимо поддерживать ниже эвтектиче-
ской точки, регулируют с помощью охлаждающих смесей
или элемента Пельтье. В качестве охлаждающих смесей ис-
пользуют смеси ацетон—сухой лед, спирт—сухой лед,
этилоксалат—углекислота, нонан—изопропиловый эфир,
а также твердую углекислоту. Температуру первых двух
смесей можно регулировать дозированием сухого льда.
Преимущество элемента Пельтье заключается в том, что
его легко регулировать, а также в возможности нагрева
и расплавления заливочной среды путем перевода потока
в обратное направление.
Динамику отдачи воды в процессе сушки можно про-
следить по рис. 1. Перелом кривой в том месте, где окан-
чивается равномерная и быстрая отдача воды, обозначает
Переход от основного высушивания к заключительному.
В этой точке в ткани еще остается от 3 до 4% остаточной
влаги.
2.1.1.З. ЗАЛИВКА ВЫСУШЕННЫХ ТКАНЕЙ
Следующий за высушиванием этап—заливка материа-
ла—является важным процессом, поскольку неправиль-
ная обработка даже хорошо высушенной ткани может при-
вести к значительным нарушениям структуры. Высу-
шенный материал можно заливать в следующие зали-
вочные среды: парафин, поливаксы (например, акваффин,
карбовакс 1000, 1500, 4000), целлоидин и комбинация цел-
лоидина с парафином. Заливка в поливаксы (карбо- и оксид-
ваксы) рекомендуется при исследованиях липидов, по-
скольку при парафиновой заливке возможны их потери
и смещения. Хорошие срезы на микротоме получаются
при заливке в смеси из 3 частей карбовакса 1500 или карбо-
вакса 1000 и одной части карбовакса 4000. Искусственные
смолы, например метакрилат, менее пригодны для заливки
высушенных тканей, поскольку они вызывают нарушения
структуры тканей.
Пропитка высушенного исследуемого объекта может
проводиться или в самом аппарате для сушки, или вне его
в специальном сосуде с заливочной средой. При заливке
в аппарате для сушки сосуд с парафином нагревается на
16 2. Методы гистохимии
водяной бане. При втором методе удается избежать неже-
лательного съеживания материала, так как ткань после вы-
сушивания нагревается до комнатной температуры.
Залитые парафиновые блоки для защиты от воздей-
ствия воздуха следует хранить над СаС12 в эксикаторе. При
хранении блоков в холодильнике ферментативная актив-
ность сохраняется несколько недель.
2.1.1.4. ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА ВЫСУШЕННОЙ ТКАНИ
При приготовлении срезов с объектов, высушенных
в замороженном состоянии, следует полностью исключить
контакт срезов с водой, а также сократить время контакта
срезов с воздухом. Эти условия легче всего выполняются
при нанесении лент приготовленных срезов на сухие пред-
метные стекла. Расправление лент парафина проводится
на предварительно прогретых предметных стеклах при по-
мощи пинцета; при необходимости срезы разглаживают
кисточкой. В качестве расправляющей среды можно ис-
пользовать теплое минеральное масло.
Депарафинизация проводится в ксилоле, петролейном
эфире или изопентане. После того как растворитель уда-
лен, причем удаление проводится только путем испарения,
вновь высушенные и депарафинированные срезы подвер-
гают дальнейшей обработке. При этом возможны три
варианта:
1. Непосредственное помещение срезов ткани в реак-
ционную смесь. В результате реакции исследуемое соеди-
нение дает нерастворимый продукт.
2. Денатурирование ткани перед помещением ее в вод-
ный раствор при помощи сухой фиксации (например, на-
греванием или обработкой парами).
3. Проведение гистохимического выявления (например,
радиоавтографии) на обезвоженном срезе ткани.
Практическое значение имеет лиофильная сушка крио-
статных срезов. Поскольку в срезах ткани содержатся
лишь небольшие количества воды, достаточным оказы-
вается высушивание в небольших эксикаторах, поме-
щенных в криостат. Температура при этом должна по воз-
можности поддерживаться ниже — 18° С. Продолжитель-
ность сушки значительно меньше, чем для кусочков ткани.
2. Методы гистохимии 17
Для срезов толщиной 10 мкм она составляет от 45 мин до
1 ч. Срезы можно после этого расправить на стекле или
фиксировать по Винклеру, расправляя их на предметном
стекле в капле фиксирующего раствора (изопропиловый
спирт, этанол).
При исследовании отдельных клеток или клеточных
культур, выращиваемых в виде монослоя, рекомендуется
высушивать их на воздухе, поскольку после заморажива-
ния—высушивания таких препаратов некоторые веще-
ства, особенно ферменты, могут полностью диффундиро-
вать в среду. Чтобы избежать потерь ферментативной ак-
тивности, монослои клеток следует защитить от доступа
влаги и воздуха парафиновой пленкой (парафильм) и хра-
нить при — 30° С. При рассмотрении структуры ткани сле-
дует учитывать возможные артефакты, обусловленные
техникой получения срезов в криостате.
2.1.1.5. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ—
ВЫСУШИВАНИЯ
Метод замораживания—высушивания оказался весь-
ма ценным при подготовке тканей для гистохимических
исследований. Его применение имеет преимущества в тех
случаях, когда необходимо наряду с точной локализацией
сохранить тонкую структуру и предотвратить потери ве-
ществ, присутствующих в ткани в низких концентрациях.
Помимо уже упомянутых возможностей применения этого
метода в исследованиях низкомолекулярных органических
и^Неорганических веществ, следует отметить радиоавто-
графические исследования, цитофотометрию в видимом
и ультрафиолетовом свете, рентгеновскую гистоспектро-
графию и, наконец, электронную микроскопию.
Заметные успехи были достигнуты с помощью замора-
живания—высушивания в изучении локализации био-
генных аминов в нервной системе. Выявление даже незна-
чительных количеств биогенных аминов в тончайших
волокнах оказалось возможным в первую очередь благо-
даря медленному, щадящему высушиванию. Несомненно,
что гистохимическое выявление биогенных аминов, осно-
ванное на применении замораживания—высушивания,
18 2. Методы гистохимии
обусловило значительный прогресс в изучении нервной
системы.
2.1.1.6. АППАРАТУРА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ—ВЫСУШИВА-
НИЯ
Аппараты, используемые для сушки тканей, должны
обладать двумя важными качествами:
1) они должны обладать способностью работать при
очень низких температурах (вплоть до — 66° С),
Рис. 2. Схема аппарата для замораживания—высушивания.
1—форвакуумный насос, 2—диффузионный насос, 3—вакуумметр, 4—сушильная установка,
5—охлаждающий палец, 6—сосуд с парафином, 7—термос для охлаждающей смеси.
2) задерживать при низких температурах лишь незначи-
тельные остатки влаги.
Этим они отличаются от промышленной аппаратуры
для лиофильной сушки.
Установка для лиофильной сушки, используемая в ги-
стологии и гистохимии, состоит из следующих частей:
2. Методы гистохимии 19
1) герметичная емкость для сушки с регулировкой тем-
пературы ткани,
2) приспособление для удаления сублимированных из
ткани паров воды.
Удаление паров воды может проводиться с помощью
вакуумного насоса с вымораживанием или поглощением
паров воды.
Простейшим аппаратом для лиофильной сушки
является эксикатор с внешним охлаждением. Дальнейшие
усовершенствования касаются главным образом техниче-
ской стороны, в частности удаления паров воды. Схема ап-
парата для лиофильной сушки представлена на рис. 2,
Из современных аппаратов следует упомянуть аппарат
для замораживания—высушивания с холодильной ловуш-
кой и термоэлектрический аппарат для лиофильной сушки,
сконструированный Пирсом (Pearce). В последнем аппара-
те молекулы воды, улетучивающиеся из препарата, полу-
чают дополнительную энергию в располагающейся над
объектом тепловой зоне. Поток водяных паров улавли-
вается ловушкой с Р2О5 на дне камеры.
Установку для лиофильной сушки (выпускаемую в ГДР
Народным предприятием “Labortechnik Ilmenau”), в кото-
рой пары воды удаляют путем прямой откачки, можно ре-
комендовать особенно в условиях замедленной сушки, не-
обходимой, в частности, для сохранения структуры
тончайших нервных волокон при выявлении биогенных
аминов.
2.1.1.7. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРОВЕДЕНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ—
ВЫСУШИВАНИЯ
Процедура замораживания—высушивания проб тка-
ней включает в себя следующие этапы:
1. Быстро иссеченные пробы ткани нарезают с по-
мощью острого лезвия на кусочки толщиной 1—2 мм
и помещают на алюминиевую фольгу (можно и на спе-
циально приготовленные чашечки).
2. Затем кусочки погружают в охлажденный жидким
азотом изопентан или пропан.
3. После непродолжительного замораживания ткань
20 2. Методы гистохимии
помещают в камеру для сушки, предварительно охлажден-
ную до —50 — 80 С.
4. Сушку ткани проводят в течение нескольких дней
в условиях высокого вакуума, поддерживаемого при по-
мощи диффузионных и ротационных насосов.
5. Ткань заливают в вакууме при постепенном подогре-
вании парафина.
При проведении сушки на установке “Labortechnik Il-
menau” рекомендуется в камеру для сушки через специаль-
ное отверстие вставить на шлифе охлаждающий палец, до-
стигающий расположенного на дне камеры сосуда
с замерзшим парафином.
Материал, замороженный в изопентане, быстро поме-
щают на парафин, находящийся на дне камеры для сушки.
Камеру для сушки предварительно охлаждают до — 50° С
и вводят в нее заполненный жидким азотом охлаждающий
палец. После этого установку можно запускать в действие,
начав с включения форвакуумного насоса. По достижении
вакуума 0,1 мм рт. ст., включают масляный диффузи-
онный насос.
При вакууме, превышающем 10 _ 3 мм рт. ст., и при на-
личии жидкого азота в охлаждающем пальце пер-
вая фаза сушки длится от 8 до 10 ч. Вторая фаза сушки
(также длительностью от 8 до 10 ч) начинается с того, что
охлаждающий палец при отключенной вакуумной системе
замещают пробкой со шлифом соответствующего диаме-
тра и медленно впускают в систему сухой воздух через со-
суд с силикагелем После этого вновь включают форва-
куумный, а затем и масляный диффузионный насос.
Основное высушивание считается законченным, когда
показания вакуумметра в резервном сосуде форвакуумно-
го насоса соответствуют максимальной величине, дости-
гаемой с помощью форвакуумного насоса в начале сушки.
В фазе заключительного высушивания температура высу-
шиваемой ткани при сохранении вакуума доводится до
комнатной. Для этого удаляют охлаждающую жидкость,
окружающую камеру. Заключительное высушивание длит-
ся около 2 ч.
Пропитка и заливка в парафин проводится еще в вакуу-
ме, после чего масляный диффузионный насос отключают.
Парафин расплавляют нагреванием, например, в горячей
2. Методы гистохимии 21
Таблица 1
Технические данные установки для лиофильной сушк Ilmenau”) Достигаемый вакуум Скорость откачки при 10 3 мм рт. ст. Требуемый вакуум для масляного диффузионного насоса Продолжительность высушивания 0,1 г ткани: Основное высушивание при температурах до - 35°С от -45 до —50°С - -60 С Заключительное высушивание и (“Labortechnik 10"5 ммрт.ст. ~ 100 мэ/ч 0,1 мм рт. ст. 5—10ч 20- 30ч 30- 50ч 1—2ч
воде. Ткань сравнительно быстро погружают в парафин.
По достижении кусочком ткани дна сосуда с парафином
вакуумный насос отключают и в систему запускают воз-
дух. Через 10— 15 мин ткань заливают, как обычно,
в блок. Можно поступить иначе: высушенную ткань, бы-
стро вынув из камеры, перенести в термостат с парафином,
при этом пропитку парафином следует проводить несколь-
ко дольше.
2.12. ЗАМЕЩЕНИЕ В ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯ-
НИИ
Согласно этому методу, предварительно заморожен-
ный материал помещают в охлажденную до температуры
от — 20 до — 50u С (или ниже) фиксирующую или обезво-
живающую жидкость, например этанол, метанол, эфир,
Хлороформ, ацетон, смесь ацетона с этанолом или гликоль;
В результате двусторонней диффузии происходит замеще-
ние превращенной в лед воды на замещающую жидкость.
Замещающие жидкости служат при этом средами, раство-
ряющими лед. Замещение воды ткани растворителем зани-
мает несколько дней. Поскольку замещение проводится
в безводных средах, то происходит обезвоживание или вы-
сушивание ткани. Этот процесс проходит до конца лишь
в случае повторной замены охлажденной замещающей
жидкости.
Принципиальные возможности использования метода
замещения в замороженном состоянии зависят от выби-
22 2. Методы гистохимии
раемого для замещения раствора. Возможны три вариан-
та: /
1) использование полярного растворителя, например
этанола,
2) использование раствора, содержащего фиксирующее
средство,
3) замещение в замороженном состоянии на полярный
растворитель с фиксацией при низких температурах.
Сведения о дальнейших возможностях использования
варианта 3 представлены в табл. 2.
Как только кусочек ткани пропитается замещающей
жидкостью (через 3 — 4 дня), процесс можно считать закон-
ченным. Продолжительность замещения в замороженном
состоянии зависит от выбора растворителя и температуры,
при которой оно проводится. Последующая заливка в па-
рафин или другую среду происходит при более высоких
температурах. Для предотвращения нарушения структуры
в результате резкого перехода из холодной среды в теплую
объект помещают в 75%-ный спирт при температуре, при
которой проводится замещение (от, — 20 до — 50° С), и за-
тем постепенно повышают температуру до комнатной.
После этого проводится обычное обезвсйкивание через аб-
солютный этанол и заливка в парафин.
При постоянных условиях результаты замещения в за-
мороженном состоянии, проведенного в соответствии
с указаниями, приведенными в табл. 2, могут считаться
удовлетворительными. Трудности иногда возникают из-за
слишком высокой температуры при замещении или из-за
образования кристаллов льда при замораживании.
Преимущество замещения в замороженном состоянии
перед замораживанием—высушиванием заключается
в его простоте. Недостаток же метода замещения в замо-
роженном состоянии в первую очередь заключается в том,
что он по своей природе представляет собой химическую
(хотя и очень мягкую) фиксацию, которая при температу-
рах около — 80°С практически прекращается или же проте-
кает очень медленно. Кроме того, возможности метода
ограничены тем, что для высушивания и фиксации приме-
нимы лишь такие среды, которые остаются жидкими при
низких температурах. Метод замещения в замороженном
состоянии обеспечивает прекрасную сохранность гликоге-
2. Методы гистохимии 23
Таблица 2
Возможности приметши различных методов замещения в замороженном
состоянии
Замещающая жидкость Метод Время обезвожи- вания и темпера- тура, °C Достижимая цель
Этанол Woods, Pollister (1955) 6 дней, от —41 Сохранение
до -45 белков в ми- нимально де- натурирован- ной форме
Метанол Ацетон Осмирован- ный ацетон Осмирован- ный HgCl2- ацетон Смесь Рос- Rebhun, Gagne (1962) Feder, Sidman (1958) 6 дней, -108° 6 Дней, —70° Хорошая со- хранность структуры
смана Этанол Peyrot (1956) 6 дней, —60° 6 дней, —50° Фиксация 1—3 дня прн -50° 2,5%-ным раствором трихлор- уксусной кислоты в этаноле Сохранение гликогена Стабилизация сульфгид- рильных групп, связан- ных с бел- ками
Ацетон Davis et al. (1959) 6 дней, -50° Фиксация 1—3 дня при —50° 1%-ным раствором OsO4 в аце- тоне Выявление эсте- разной актив- ности при хо- рошей со- хранности структуры
на и клеточных органелл, например митохондрий. Потери
вещества в процессе замещения также незначительны. При
использовании метанола в качестве замещающей жидко-
сти отмечены значительные потери N и Р, в то время как
24 2. Методы гистохимии
при использовании ацетона потери N и Р весьма незна-
чительны.
Что касается экстракции липидов, то с ней приходится
считаться, особенно при повышении температуры, следую-
щем за фазой замещения в замороженном состоянии. Ста-
билизации митохондриальных и других липидов способ-
ствует добавление в замещающую жидкость солей
металлов. Наилучшие результаты при этом были полу-
чены с использованием уранилнитрата вместе с хлоралги-
дратом.
Кроме того, метод замещения в замороженном состоя-
нии применим для выявления целого ряда гидролитиче-
ских и окислительных ферментов, таких, как щелочная
и кислая фосфатаза, АТФаза, 5 -нуклеотидаза, аминопепти-
даза, а также различных дегидрогеназ и диафораз (табл. 3).
Таблица 3
Сохранность ферментативной актности в тканях нрн замещена
ацетоном
Фермент АТФаза Кислая фосфатаза Щелочная фосфатаза 5'-нуклео- тидаза » > Сукци- нат дегид- рогеназа
Доля актив- ности, % 70 76 92 95 75
Предшествующий опыт свидетельствует о том, что ме-
тод замещения в замороженном состоянии обеспечивает
стабилизацию структуры тканей, особенно в сочетании
с подходящей фиксацией. Очень, хорошими фиксаторами
оказались четырехокись осмия и хлорид ртути (табл. 2).
Метод замещения в замороженном состоянии, обеспечи-
вающий прекрасную сохранность гликогена (табл. 2),
можно рекомендовать также для выявления углеводов,
белков и нуклеиновых кислот. Сульфгидрильные группы,
связанные с белками, лучше всего выявляются после фик-
сации в 2,5%-ной трихлоруксусной кислоте в 95%-ном эта-
ноле. Этот метод дает также хорошие результаты при выя-
влении неорганических веществ и ферментов. Весьма
успешной оказалась фиксация при низкой температуре, ко-
торую можно проводить сразу же вслед за замещением
2. Методы гистохимии 25
в замороженном состоянии. Однако возможности этого
метода для электронной микроскопии еще недостаточно
изучены.
2.1.3. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАМОРОЖЕННЫХ СРЕЗОВ
При этом методе объекты приобретают необходимую
для резки консистенцию благодаря превращению содержа-
щейся в тканях воды в лед. Для сохранения структуры ре-
шающее значение имеет быстрое замораживание, посколь-
ку от этого зависит характер образования кристаллов
льда.
Замораживание осуществляется, как правило, за счет
поглощения тепла в процессе испарения жидкой угле-
кислоты, выпускаемой из баллона через небольшое от-
верстие. От загрязнений или остатков воды при использо-
вании нового баллона с углекислотой удается избавиться
резким выпусканием нескольких порций углекислоты.
Приготовление замороженных срезов примерно одина-
ковой толщины возможно лишь при условии дополнитель-
ного охлаждения ножа с помощью специального подвода
углекислоты. Скрученные или расправленные срезы
с охлажденного ножа переносят непосредственно в инкуба-
ционную или фиксирующую среду, или в дистиллирован-
ную воду, или же монтируют на предметных стеклах. Не-
посредственно перенести с ножа на предметное стекло
можно лишь такие срезы, которые расправлены на ноже.
В жидкости, применяемой при дальнейшей обработке,
срезы иногда распадаю ся на мелкие фрагменты за счет
поверхностного натяжения среды. Этому процессу можно
воспрепятствовать, добавив к инкубационной среде 7,5%
поливинилпирролидона и 1—2 капли Твина 20 или 40.
Криотомия требует определенных навыков в работе.
Соответствующий опыт позволяет регулярно получать
срезы хорошего качества. Правда, при высокой температу-
ре и влажности воздуха в помещении неизбежно возни-
кают трудности. Подобная зависимость резки от внешних
факторов является существенным недостатком. Послед-
ний можно устранить, если готовить срезы в холодной
комнате или поместить замораживающий микротом в хо-
26 2. Методы гистохимии
лодильную камеру. Для этой цели годится обычный
холодильник.
Качество срезов в значительной мере зависит от конси-
стенции объекта; она, как правило, должна быть мягче той,
при которой замороженный материал становится хруп-
ким. Но даже при оптимальной консистенции следует счи-
таться с тем, что срезы различаются по толщине. Это
является следствием недостаточного контроля за темпера-
турой ткани и раздельного охлаждения ножа и объекта,
так что приготовление серийных срезов на замораживаю-
щем микротоме невозможно.
Чтобы свести к минимуму влияние внешних факторов,
в конструкцию замораживающего микротома был внесен
целый ряд модификаций. Важнейшая из них заключается
в том, что материал и бритва постоянно охлаждаются су-
хим льдом, а срезы с помощью специальной насадки пере-
носятся сразу в инкубационную или фиксирующую смесь
(ацетон, этанол, формол-этанол). Однако даже эти приспо-
собления не предохраняют полностью от атмосферных
воздействий.
Все эти недостатки метода получения замороженных
срезов с помощью охлажденного ножа в*значи*гельной ме-
ре устраняются при использовании криостата.
2.1.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КРИОСТАТА
Этот метод был разработан Линдерштрём-Лангом
(Linderstrom-Lang) и является по существу усовершенство-
ванием метода получения срезов с помощью охлажденно-
го ножа. Резка объекта проводится в термически изолиро-
ванной камере с низкой, регулируемой температурой (от
— 10 до — 30°С). Это предотвращает оттаивание срезов
с последующим нарушением структуры. Постоянные усло-
вия приготовления срезов позволяют получать серийные
срезы различной толщины и различной площади. В спе-
циальных криостатах можно также получать срезы с цело-
го лабораторного животного, что в сочетании с радиоавто-
графией дает весьма ценные результаты.
Преимущество криостата в первую очередь заключает-
ся в возможности получения серийных срезов нативного
материала для энзимогистохимических исследований.
2. Методы, гистохимии 27
Обычно получают срезы толщиной 10—40 мкм, но, ис-
пользуя рекомендованное Пирсом приспособление для
глубокого охлаждения ножа (от — 30 до — 60°С), можно
для специальных исследований получать срезы толщиной
до 3 мкм. Для энзимогистохимических исследований не-
обходимо наличие большого числа интактных клеток
в срезе, поэтому толщина срезов должна быть от 30 до
40 мкм.
Существует два основных типа криостатов. В первом
типе управление осуществляется снаружи через два бо-
ковых отверстия при закрытом криостате. Во втором—
управление ведется при снятой крышке криостата. В совре-
менных криостатах такого типа при открытой крышке над
микротомом создается воздушная прослойка с устано-
вленной температурой, так что даже при высокой темпера-
туре и влажности воздуха в помещении условия для резки
остаются идеальными. К этому следует добавить, что при
удобном и легком управлении приготовление срезов с фик-
сированных объектов легче удается в криостатах открыто-
го типа. В криостате “Cryo-Cut” резка осуществляется ав-
томатически с помощью мотора.
Качество срезов находится в полной зависимости от
температуры ткани и ножа; контроль за этими параметра-
ми осуществляется с помощью термо-электрических дат-
чиков.
Для приготовления криостатных срезов материал сле-
дует заморозить как можно быстрее, лучше всего на сухом
льду, как при криотомии. Эту процедуру можно провести
иЬи на*тканедержателе, или, еще лучше, в специальной за-
мораживающей камере, прикрепляемой к контейнеру
с углекислотой. Если для замораживания используется изо-
пентан, охлажденный сухим льдом или жидким азотом,
то кусочки ткани примораживаются к тканедержателю
в криостате на капле воды. Замороженный материал перед
резкой лучше всего поместить на 30 мин в криостат для
достижения оптимальной температуры резки от — 18 до
— 20°С. При массивном заборе материала замороженные
пробы можно хранить на сухом льду в помещенном в со-
суд Дьюара пакете из синтетического материала для за-
щиты от воздуха. Для успешного приготовления срезов
имеют значение:
28 2. Методы гистохимии
1) правильная ориентация и правильная резка блоков
ткани,
2) оптимальная температура,
3) правильная установка расправляющей пластинки.
Оптимальная температура резки зависит от ткани. Для
различных тканей млекопитающих, например ткани пече-
ни, сердца, желез, мышц, наиболее благоприятная темпера-
тура лежит между — 15 и — 20°С. Нервная ткань лучше
всего режется при температуре от — 10 до — 15°С, тогда
как для резки тканей с высоким содержанием жира тре-
буется температура ниже — 20°С
• Скручиванию срезов препятствует располагаемая па-
раллельно оправе ножа расправляющая пластинка, закре-
пленная в подвижном держателе (рис. 3). Ширина щели ме-
жду ножом и расправляющей пластинкой в значительной
мере определяет качество срезов.
Рис. 3. Схема расположения ножа криостата н расправляющей плас-
тинки (криостат Dittes-Duspiva).
1—нож криостата, 2—расправляющая пласпшка, 3—регулировочный винт для расправляю-
щей пластинки, 4— оправа для расправляющей пластинки, 5—регулировочное колесо для рас-
правляющей пластинки.
Срезы наносятся на охлажденные предметные стекла,
помещаемые заблаговременно в криостат, и расправляют-
ся охлажденной кисточкой. Для оттаивания среза к нижней
стороне предметного стекла прижимают палец. В процессе
оттаивания срезы расправляются на предметном стекле
и приклеиваются к его поверхности. В открытых термоста-
тах рекомендуется непосредственное расправление срезов
на предметном или покровном стекле.
Расправленные срезы подвергаются дальнейшей обра-
ботке или хранятся в криостате до использования. При
этом следует помнить, что в криостате срезы высыхают.
2. Методы гистохимии 29
Высыхание можно предотвратить, помещая срезы в закры-
тый контейнер с обычным льдом. Если высушивание сре-
зов желательно, то этот процесс можно форсировать, по-
мещая в криостат пятиокись фосфора.
Для определенных целей, например при энзимогисто-
химических исследованиях, срезы можно инкубировать без
высушивания и фиксации или же после предварительной
фиксации в течение 15 мин. Для гидролитических фермен-
тов пригодна фиксация в холодном кальций-формоле.
Криостат используется в клинической практике и в ис-
следовательской работе в гистологических и гистохимиче-
ских лабораториях во всем мире. Его популярность
объясняется, кроме того, его растущим значением в ра-
диоавтографии и иммуноцитохимии.
Усовершенствование криостата продолжается; по мне-
нию Пирса, оно должно идти по пути совершенствования
микротома и контроля за условиями резки.
2.1.5. РЕЗАК ДЛЯ ТКАНИ, ВИБРАТОМ
Резак для ткани и недавно сконструированный вибра-
том обеспечивают быстрое получение тонких срезов фик-
сированных и нефиксированных тканей без заморажива-
ния. Благодаря этому удается в значительной мере
избежать нежелательных нарушений структуры, обусло-
вленных в первую очередь оттаиванием замороженного
материала и особенно сказывающихся при электронно-ми-
кроскопических исследованиях ферментов.
Управление обоими аппаратами не представляет труд-
ности. При работе на резаке модели Sorvall TG-2 объект
прикрепляют на фильтровальную бумагу 7%-ным раство-
ром агара или желатины. Агар перед использованием рас-
плавляют на водяной бане (+ 60°С). При энзимологиче-
ских исследованиях агар охлаждают до + 40°С. Затверде-
вание агара, окружающего ткань, можно ускорить, поме-
стив объект в холодильник. *
Для резки используется одностороннее лезвие бритвы,
закрепляемое в специальном держателе. Хорошие срезы
получаются в интервале от 20 до 200 мкм. Трудности на-
блюдаются лишь при получении срезов нативной ткани
(тоньше 100 мкм) таких органов, как мозг, легкие, печень,
30 2. Методы гистохимии
почки или селезенка, однако и эти трудности удается пре-
одолеть при помощи вибратома. Этот аппарат, в котором
резка осуществляется с помощью вибрирующего ножа, по-
зволяет получать тонкие срезы (вплоть до 10 мкм) любой
растительной или животной ткани без заливки. Он с успе-
хом используется в энзимогистохимических, радиоавто-
графических и иммуноцитохимических исследованиях.
В электронно-микроскопических исследованиях фер-
ментов при работе с этими двумя аппаратами рекомен-
дуется фиксация перфузией.
2.1.6. КРИОУЛЬТРАМИКРОТОМИЯ
С помощью этого, безусловно, пока еще нового метода
можно делать срезы с биологического материала без ка-
кой-либо химической подготовки и заливки.
Срезы при низких температурах могут быть получены
на производимой фирмой LKB (Стокгольм) приставке
“Cryo-Kit”, которая легко и быстро монтируется на уль-
тратоме этой же фирмы.
Приставка состоит из подвергаемых глубокому охла-
ждению препаратодержателя и ножедержателя, двух сосу-
дов Дьюара с охлаждающим вещество^, а также устрой-
ства для регулирования температуры и уровня охлаждаю-
щей жидкости. Это приспособление работает эффективно
с точной автоматической регулировкой в широком диапа-
зоне температур^ Объемная холодильная камера позво-
ляет разместить в ней необходимые предметы для предва-
рительного охлаждения и хранения.
Электронная регулировка температуры с двумя канала-
ми для препаратодержателя и ножедержателя поддержи-
вает температуру на любом уровне в интервале между
—170° С (для препарата) или —150° С (для ножа) и 0° С для
жидкости в сосудах с охлаждающим веществом. Охлаж-
дающее вещество подводится из сосудов Дьюара к препа-
ратодержателю и ножедержателю автоматически. Для за-
щиты от образования кристаллов льда используются
различные жидкости, такие, как глицерин, диметилсуль-
фоксид и сахароза.
Помимо нефиксированного материала можно исполь-
зовать и объекты, фиксированные в альдегидах. В целом
2. Методы гистохимии 31
ряде методов ткань перед замораживанием и резкой за-
ключают в такие среды, как желатина, гуммиакация, ме-
тилцеллюлоза или альбумин. Эти среды образуют вокруг
объекта своего рода капсулу без пропитывания. По цито-
химическому методу Бернара исследуемый материал пос-
ле фиксации в глутаральдегиде от 30 до 60 мин сначала
инкапсулируют в альбумине, а затем для защиты от фор-
мирования кристаллов льда обрабатывают диметилсуль-
фоксидом.
Ультратонкие срезы получаются при очень низких тем-
пературах, около —140° С. Срезы большой площади, на-
оборот, получаются лучше при температуре от —70 до
-90° С.
Метод криоультрамикротомии лишь начинает приме-
няться в гисто- и цитохимии. Большие перспективы откры-
лись в связи с появлением приставки “Cryo-K.it”, позво-
ляющей точно контролировать условия резки. Можно
надеяться, что цитохимические исследования в сочетании
с криоультрамикротомией, не требующей фиксации и за-
ливки материала, чреватых изменениями структуры ткани,
обогатят наши познания в физиологии клетки.
2.1.7. ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ
Фиксация преследует своей целью, «убивая», по воз-
можности стабилизировать структуры в прижизненном со-
стоянии. Однако это требование не удается удовлетворить
по следующим причинам: в результате химической фикса-
ции в каждом случае вводятся чуждые клетке вещества.
Они образуют соединения с компонентами клетки, что ве-
дет к изменению ее структуры. Вместе с тем фиксация про-
являет структуры и высвобождает группы, которые необ-
ходимы для связывания красителей, а следовательно, и для
окрашивания клетки.
2.1.7.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ
На основании многочисленных экспериментальных
данных Цайгер разделил фиксирующие вещества на осади-
тели, или коагуляторы, белков и стабилизаторы липидов.
К коагуляторам белков принадлежат, в частности, спирт
32 2. Методы гистохимии
и ацетон, кислоты, такие, как уксусная и пикриновая, а так-
же соли тяжелых металлов, например сулема. Эти фикси-
рующие вещества способны сделать видимыми структуры,
которые до того были маскированы из-за сильной гидра-
тации; они могут также, вызывая конгломерацию со-
ставных компонентов, переводить в характерный светоми-
кроскопический эквивалент структуры, до того невидимые
вследствие их субмикроскопических размеров. Этими
свойствами объясняется успешное использование таких
фиксаторов в светомикроскопической гистохимии.
Согласно все еще актуальным теоретическим предста-
влениям Цайгера, для сохранения прижизненной струк-
туры решающее значение имеет стабилизация жиров и ли-
поидов, образующих липоидный покров опорных структур
с имеющимися на них активными группами. К липоидным
стабилизаторам относятся четырехокись осмия, альде-
гиды (например, формальдегид, глутаральдегид) и, с опре-
деленными ограничениями, бихромат {салия. Слишком ин-
тенсивная стабилизация липоидов ведет к экранированию
связывающих красители групп и соответственно к осла-
блению реакций окрашивания. Фиксирующее вещество
особенно хорошо сохраняет структуру /тогда, когда оно
лишь незначительно влияет на окрашиваемость опорных
структур, закрепляя их путем поперечного сшйвания.
Фиксирующие вещества используются обычно в виде
забуференных растворов или смесей. При составлении сме-
си фиксирующих веществ преследуется цель использовать
в процессе фиксации свойства каждого из них. Отдельные
компоненты фиксирующей смеси диффундируют в ткань
с разной скоростью. Если в смеси .содержится кислый ком-
понент, то он проникает в ткань раньше прочих. Таким
образом, на ткани сказывается изолированное воздействие
этого компонента прежде чем к месту реакции подоспеют
другие буферные или фиксирующие компоненты.
2.1.7.2. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФИКСАЦИЮ
На результаты фиксации помимо непосредственного
воздействия фиксирующих сред влияет целый ряд других
факторов. В первую очередь это pH и изотоничность фик-
2. Методы гистохимии 33
сирующей смеси, а также температура и продолжитель-
ность фиксации.
2.1.7.2.1. pH, ИЗОТОНИЯ, ТЕМПЕРАТУРА
pH фиксирующей смеси оказывает существенное влия-
ние на процесс фиксации. Концентрация ионов водорода
должна соответствовать их нормальному уровню в тканях
(около pH 7,2). Это особенно важно при электронно-гисто-
химических исследованиях; хорошо известно, что из-за по-
вышенной чувствительности основного вещества цито-
плазмы к кислотам кислые растворы искажают ультра-
структуры клетки. Легкое закисление среды в клетке,
следующее за ее гибелью, не удается нейтрализовать рас-
творами фиксаторов, забуференными до нейтральных ве-
личин. Невозможно также при помощи буфера предотвра-
тить смещение изоэлектрической точки в кислую сторону,
наступающее под влиянием формальдегида.
Бдлыпая часть фиксирующих сред дает кислую реак-
цию. Фиксирующее действие, основанное главным обра-
зом на способности фиксатора консервировать вещества,
существенно ослабляется при доведении pH до ней-
тральных величин. Неизбежные при кислой фиксации по-
вреждения структуры при световой микроскопии имеют
меньшее Значение, чем при электронной.
Использование растворов фиксаторов, изотоничных
тканевой среде, должно ослабить сморщивание или набу-
ханце ткани, но не снимает их полностью. При светоопти-
ческих исследованиях эта проблема не имеет-большого
значения, однако в электронной микроскопии дело об-
стоит иначе. Здесь отклонение осмотического давления
фиксатора от тканевого оказывает нежелательное воздей-
ствие на структуру основного вещества цитоплазмы и ци-
топлазматических вакуолей. Полезным может оказаться
добавление в раствор сахарозы. Независимо от выбора
ткани для гистохимических целей наиболее часто исполь-
зуют 7,5%-ный раствор сахарозы. В отличие от макромо-
лекулярных соединений (например, поливинилцирролидо-
на) сахароза имеет то преимущество, что она легче
проникает в ткань.
В последнее время все чаще используют фиксацию на
2-235
34 2. Методы гистохимии
холоду (от 0 до +4° С). В основе этого выбора лежат сле-
дующие наблюдения.
1. При температуре холодильника ферментативные
процессы резко замедляются; поэтому по сравнению
с фиксацией при комнатной температуре процессы аутоли-
за сильно подавляются.
2. Под влиянием низкой температуры скорость диффу-
зии фиксирующего вещества меняется лишь незначитель-
но.
Фиксацию на холоду можно считать неотъемлемой
частью энзимогистохимического исследования как на све-
товом, так и на электронно-микроскопическом уровне. Что
же касается гистохимического выявления веществ на све-
тооптическом уровне, то здесь обычно достаточно фикса-
ции при комнатной температуре.
2.1.7.З. ФИКСАЦИЯ ПЕРФУЗИЕЙ
Быстрой остановки аутолитических процессов можно
достичь не только фиксацией на холоду, но и перфузией
фиксирующего вещества через кровеносную систему. Пра-
вильно установленное давление перфузии в течение
10—20 мин обеспечивает равномерную фиксацию клеток
и тканей при оптимальной стабилизации структур. После-
дующая фиксация погружением маленьких кусочков ткани
в эту же фиксирующую среду при температуре холодиль-
ника на 24 ч позволяет стабилизировать вещества и фер-
менты на месте их прижизненной локализации. Фиксация
перфузией не требует большой затраты времени и считает-
ся предпочтительной.
2.1.7.4. ФИКСАЦИЯ В ПАРАХ
Щадящая стабилизация ткани достигается фиксацией
в парах. Согласно данным сравнительных исследований
для фиксации в парах, можно рекомендовать следующие
фиксирующие агенты: формальдегид, акролеин, глута-
ральдегид, четырехокись осмия, глиоксиловую кислоту,
хромилхлорид и этанол.
2. Методы гистохимии 35
2.1.7.5. ХАРАКТЕР ДЕЙСТВИЯ И ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВА-
НИЯ НЕКОТОРЫХ ФИКСИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ
Происходящие во время фиксации процессы можно
суммировать следующим образом:
1. Необратимое образование солей с компонентами
клетки, выражающееся в выпадении осадков (пикриновая
кислота, формальдегид).
2. Химическое сшивание составных компонентов струк-
тур (пикриновая кислота, альдегиды).
3. Изменение заряда, т. е. изоэлектрической точки со-
ставных компонентов клетки.
4. Химическое изменение компонентов клетки.
5. Изменение числа химических связей в результате рас-
творения или химического разрушения веществ.
6. Изменения ткани в результате сморщивания или на-
бухания (особенно под воздействием этанола и ацетона).
7. Изменения ферментативной активности в результате
нарушений вторичной и третичной структуры белка.
Знания о характере действия используемого фиксирую-
щего вещества необходимы для интерпретации результа-
тов гистохимического исследования.
2.1.7.5.1. АЛЬДЕГИДЫ
Механизм действия альдегидов в процессе фиксации за-
висит в первую очередь от их способности образовывать
поперечные связи (сшивки), что особенно благоприят-
ствует сохранению структуры.
1. ФОРМАЛЬДЕГИД
Благодаря своей способности образовывать мостики
между соседними пептидными цепями по принципу окси-
метиленовой полимеризации формальдегид может по пра-
ву считаться полимеризующим фиксирующим веществом.
Формальдегид за счет своего атома водорода легко обра-
зует оксиметильный комплекс:
RH + CH2O <± RCH2(OH).
За счет другого атома водорода затем образуется мети-
2*
36 2. Методы гистохимии
леновый мостик (— СН2 —):
RCH2(OH)+HR' & R—СН2—R'+Н2О.
Метиленовые мостики могут подвергаться гидролити-
ческому расщеплению. Стабилизирующее действие фор-
мальдегида определяется образованием поперечных сши-
вок в белках за счет сложных связей. Формальдегид
реагирует как обратимо, так и необратимо с целым рядом
аминогрупп, с амидами кислот и пептидами.
Обратимы реакции с амино-, имино-, гуанидиновыми,
гидроксильными, карбоксильными и сульфгидрильными
группами, а также с амидами кислот и пептидами.
Необратимы реакции с ароматическим водородом ти-
розина, триптофана, фенилаланина и гистидина. При ис-
пользовании формальдегида следует также иметь в виду,
что этот фиксатор сдвигает изоэлектрическую точку бел-
ков в кислую сторону, что объясняется метилированием
свободных аминогрупп.
Формальдегид и смеси с формальдегидом можно ис-
пользовать в большинстве рядовых гистохимических ис-
следований. Кальций-формол по Бейкеру, используемый
при температуре холодильника, хорошо себя зарекомендо-
вал при выявлении ферментов (особенно гидролитических)
и липидов.
2. ГЛУТАРАЛЬДЕГИД^
Глутаральдегид был введен в гистохимию Сабатини,
Беншем и Барнетом в первую очередь благодаря его спо-
собности сохранять структуру клеток и тканей.
.с—сно
Hic\ Глутаральдегид
н2
Механизм действия глутаральдегида объясняется—в
определенной мере подобно формальдегиду—его способ-
ностью к образованию стабильных поперечных сшивок,
что и обеспечивает сохранение структуры. Кроме того,
этот фиксатор способен заполнять пространство между со-
седними аминогруппами за счет образования мостиков.
2. Методы гистохимии 37
Помимо глутаральдегида, очень хорошими сшивающими
агентами являются используемые главным образом
в электронной микроскопии другие диальдегиды (табл. 4),
которые очень быстро реагируют с активным водородом,
с амино- и иминогруппами в белках, а также с гидрок-
сильными группами полиспиртов. В процессе фиксации
диальдегиды в отличие от моноальдегидов (табл. 4) реаги-
рует не только с активными группами в белках, но и обра-
зуют одновременно межмолекулярные мостики. Способ-
ности к образованию поперечных сшивок у моноальдеги-
дов примерно такие же, как и у формальдегида. По своей
Таблица 4
Условия фиксации ткани печени крысы ди- и моноальдегидами (Sabatini,
Bensch, Barmett)
Концен- Буфер: фосфат/ какодилат Сахароза, конечная концент- рация Продол- житель- ность фиксация, ч(блок 1 мм3) Качество фиксации после ОС- м₽- pH
Диальдегиды Глутаральде- 4-6,5 0,1 м Без до- 0,5-2 А 7,2
гид Глиоксаль 4 0,2 М бавле- ния са- харозы 0,22— 2-4 Б 6,5
Оксиадипин- альдегид 12,5 0,1 М 0,33 м 0,44 М 2-6 Б-Г 7,5
Моноальдегиды Кротональде- гид * 10 0,1 м 0,44 М 2-6 Б 7,4
Метакролеин 5 0,1 м 0,22- 2—4 Б 7,6
Ацетальдегид 10 0,1 м ОЗЗМ 0,22- 2-6 Д 7,5
Акролеин 10 0,1 м 0,33 М Без до- 0,5-2 А 7,6
Пирувальде- гид 5 0,2 М бавле- ния са- харозы 0,44 М 2-6 Д 5,5
Формальдегид (насыш раст 4 енный вор) 0,1 М 0,22- 2-4 В 7,4
0,44 М
А-*Д — от очень хорошей до плохой сохранности.
38 2. Методы гистохимии
способности сохранять структуру альдегиды могут быть
расположены в следующем порядке:
1) альдегиды с очень хорошими фиксирующими свой-
ствами: глутаральдегид, акролеин;
2) альдегиды с удовлетворительными фиксирующими
свойствами: глиоксаль, метакролеин, кротональдегид,
формальдегид;
3) альдегиды с менее удовлетворительными фиксирую-
щими свойствами: оксиадипинальдегид, пирувальдегид,
ацетальдегид.
Однако, анализируя данные табл. 4, можно видеть, что
способность альдегидов сохранять структуру не всегда
коррелирует с их способностью сохранять ферментатив-
ную активность. Например, акролеин—плохой фиксатор
для ферментов, а альдегиды 3-й группы не подавляют фер-
ментативной активности. Хорошим фиксатором является
глутаральдегид, который обеспечивает и сохранность
структуры и стабилизацию ферментрв. Благодаря этому
он служит основным фиксатором при электронно-микро-
скопическом выявлении ферментов.
При работе с глутаральдегидом следует обращать вни-
мание на следующее:
1. При гистохимических исследованиях растворы глута-
ральдегида должны быть свободны от примесей'; желае-
мой степени очистки можно достичь лишь путем перегон-
ки под вакуумом; рекомендуется использовать стандарти-
зованные растворы.
2. Требуемую для фиксации оптимальную физиологи-
ческую величину pH при работе с глутаральдегидом и дру-
гими альдегидами лучше всего устанавливать с помощью
какодилатного или фосфатного буфера (табл. 4).
3. В связи с малой скоростью проникновения глута-
ральдегида в ткань и во избежание появления зон различ-
ной стабилизации подготавливаемые для фиксации кусоч-
ки должны быть не толще 2 мм. Наилучшие результаты
достигаются с помощью перфузии (10—30 мин) с после-
дующей фиксацией погружением (2—4 ч от 0 до +4° С).
Для лучшего контрастирования и стабилизации материала
рекомендуется дофиксация в забуференном 1—2%-ном
растворе OsO4.
4. При большом числе проб фиксированные кусочки
2. Методы гистохимии 39
ткани или срезы можно хранить в холодильнике (от 0 до
+ 4°С) в забуференном растворе сахарозы (табл. 4) или
в растворе гуммиарабика с сахарозой (0,88 М или
7,5%-ный раствор сахарозы с 1% гуммиарабика); хранение
в течение нескольких недель, а то и месяцев не сопрово-
ждается большими потерями активности гидролитических .
ферментов.
2.1.7.5.2. ЧЕТЫРЕХОКИСЬ ОСМИЯ
По данным поляризационной и электронной микроско-
пии четырехокись осмия обеспечивает хорошую сохран-
ность субмикроскопических структур клетки. Щадящая
фиксация объясняется главным образом воздействием на
белки, которые не коагулируют, а желатинизируются. При
этом определенную роль играет и эффект образования
сшивок. Минимальное воздействие четырехокиси осмия на
структуру по сравнению с другими фиксирующими веще-
ствами объясняется процессом желатинизации, который
практически не сопровождается сморщиванием ткани.
Четырехокись осмия реагирует с белками или их амино-
кислотными группами и, что особенно характерно, с липи-
дами. Различные реакции четырехокиси осмия с активны-
ми группами различных аминокислот перечислены
в табл. 5.
С четырехокисью осмия реагируют лишь ненасы-
щенные липиды, которые восстанавливают OsO4 с образо-
Таблица 5
Группы различных аминокислот, реагирующие с OsO4
Аминокислота Реагирующие группы
Орнитин Лизин Вторая а-аминогруппа
Цистеин Метионин SH-rpynna
Цистин SS-rpynna
Триптофан Индольная группа
Гистидин Пролин Имидазольная группа
Оксипролин Пиррольная группа
40 2. Методы гистохимии
ванием черного осадка. Имеет значение—особенно в элек-
тронной микроскопии—тот факт, что после обработки
четырехокисью осмия липиды не могут более растворять-
ся в безводных средах.
Характерной реакцией для четырехокиси осмия являет-
ся образование нестабильных циклических, легко гидроли-
зуемых моноэфиров в результате окисления двойных
связей:
сн Ох
ён + у/030’
НГ°)
НС-О'
I
0S о?
В результате взаимодействия гидролизованных моно-
эфиров, перешедших в диольную форму, с другой молеку-
лой моноэфира образуются стабильные диэфиры, что мо-
жет способствовать образованию поперечных сшивок
в ткани. Этот процесс оказывает благотворное влияние на
сохранность клеточных структур.
НС-О\
I .0S02
нс-о'
।
но-сн
но-сн
I
I I
НС-СК /О-СН
1 1
нс-о^н ^о-сн
1*0’ I
Почернение или побурение, наблюдаемое в клетках
и тканях после фиксации осмием, объясняется тем, что
часть восстановленного осмия остается в ткани. Благодаря
этому четырехокись осмия является активным контрасти-
рующим веществом.
Учитывая механизм действия OsO4, при ее использова-
нии в качестве фиксирующего вещества необходимо обра-
щать внимание на следующее:
1. Длительная фиксация в четырехокиси осмия может
привести к растворению стабильных диэфиров в результа-
те переокисления.
2. OsO4 сдвигает изоэлектрическую точку белков ткани
в кислую сторону, в первую очередь, в результате блокиро-
вания или разрушения NH2-rpynn.
3. OsO4 оказывает окисляющее действие на биогенные
амины, но не реагирует с нативными нуклеиновыми кисло-
тами и полисахаридами.
2. Методы гистохимии 41
Четырехокись осмия используется в основном в уль-
траструктурных и в ультрагистохимических исследова-
ниях. Для дофиксации в подобных исследованиях она неза-
менима. Фиксирующее действие OsO4 может быть усилено
в результате комбинации с другими фиксирующими веще-
ствами, например в смеси с глутаральдегидом. Эта смесь
при фиксации перфузией с последующей обработкой ура-
нилацетатом дает очень хорошие результаты. В комбина-
ции с уранилацетатом осмий фиксирует липиды лучше,
чем при фиксации одной четырехокисью осмия. В недавнее
время открылась новая возможность использования четы-
рехокиси осмия в реакции с осмиофильными веществами,
например при электронно-микроскопическом выявлении
ферментов.
2.1.7.5.З. ХРОМОВАЯ КИСЛОТА И ХРОМАТЫ
Хромовая кислота и хромат калия окисляют ненасы-
щенные жирные кислоты, что ведет к стабилизации липи-
дов. Окисленные липиды менее растворимы в растворите-
лях жиров, чем неокисленные. Этот фактор используется
при выявлении липидов на парафиновых срезах. Характер-
ной реакцией для хроматов является комплексообразова-
ние с водой и способность таких комплексов, подобно фор-
мальдегиду, образовывать связи с реакционноспособными
группами белка. На окисляющем действии хроматов осно-
вана так называемая «хромаффинная реакция», которая
выражается в побурении. Этот окислительный процесс ве-
дет f. образованию биогенными аминами (например, адре-
налином, норадреналином, окситриптамином) коричнево-
го пигмента с последующей полимеризацией продуктов
окисления.
но н
Адреналин
।
СНз
Адренохром
(коричневый пигмент)
42 2. Методы гистохимии
2.1.7.5.4. СОЛИ РТУТИ
Для солей ртути, используемых в различных фиксирую-
щих смесях (например, смесь с суммой по Гайденгайну),
типичны следующие реакции:
1. Реакция с кислыми группами белков, особенно с кар-
боксильными и гидроксильными.
2. Связывание с фосфорной кислотой нуклеопротеидов.
3. Сродство к SH-группам, ведущее к образованию
очень прочной связи между атомами ртути и серы.
На этом основании фиксирующие растворы с ртутью
не могут быть использованы для гистохимического выя-
вления кислых групп и SH-групп, а также для выявления
нуклеиновых кислот.
При использовании ртутьсодержащих фиксирующих
веществ следует учитывать, что они поначалу быстро про-
никают в ткань, но затем ведут к образованию труднопро-
ницаемых зон. Поэтому для фиксации следует брать ма-
ленькие кусочки. В фиксирующих смесях ртуть применяет-
ся в виде сулемы [хлорид ртути (II)]. Обычно используют
смеси по Ценкеру и Хелли, сулему в ледяной уксусной кис-
лоте, сулему в спирте, смесь с сулемой по,Гайденгайну
(Суза), пикриновую кислоту-сулему.
2.1.7.5.5. ЭТАНОЛ И АЦЕТОН
В основе фиксирующего эффекта этанола и ацетона ле-
жит их воздействие на степень гидратации белков. В ре-
зультате потери воды белковые молекулы уменьшаются
в размере и происходит коагуляция плазматического ком-
понента. Таким образом, этанол и ацетон являются ти-
пичными осадителями белков.
В процессе фиксации эти две жидкости проявляют сле-
дующие особенности:
1. Снижение диэлектрической постоянной белков с со-
ответствующим усилением взаимного притяжения между
молекулами.
2. Возникновение новых стереохимических связей в ре-
зультате сближения ранее отдаленных групп белковой
молекулы.
3. Отсутствие влияния на активные группы белков.
Поскольку этанол и ацетон не оказывают необратимо-
2. Методы гистохимии 43
го влияния на активные группы, их можно особенно реко-
мендовать для гистохимического исследования белков.
Сморщивание ткани можно уменьшить добавлением ук-
сусной кислоты или фиксацией на холоду. Обычно этанол
используют в высокой концентрации в смеси с уксусной
кислотой или же с уксусной кислотой и хлороформом
(Карнуа).
2.1.7.5.6. КИСЛОТЫ
Кислоты (например, уксусная, трихлоруксусная, пикри-
новая, азотная и др.) в процессе гидролиза воздействуют
на гетерополярные валентные связи и способствуют осла-
блению состояния гидратации (Цейгер). Они очень быстро
проникают в ткань и вызывают своего рода «префикса-
цию». Чистые кислоты в качестве фиксаторов непригодны.
Однако как добавки к фиксирующей смеси они проявляют
свое смягчающее действие, препятствуя сморщиванию
ткани, благодаря тому, что проникают в ткань быстрее,
чем прочие компоненты фиксирующей смеси (табл. 6).
2.1.7.6. СОСТАВ ФИКСИРУЮЩИХ РАСТВОРОВ И ИХ ИСПОЛЬ-
ЗОВАНИЕ в гистохимии
Фиксация, как правило, является первым важным эта-
пом в гистохимическом выявлении. От правильного выбо-
ра фиксирующего вещества и от точного проведения про-
цедуры фиксации зависят результаты и оценка гистохими-
ческой реакции. Ошибки, допущенные в процессе фикса-
ций", не могут быть исправлены при выполнении гистохи-
мической реакции. Для обеспечения сопоставимости
результатов гистохимических исследований фиксацию сле-
дует проводить в определенное время суток с учетом
дневных ритмов клеток. В большинстве гистохимических
лабораторий в настоящее время отдают предпочтение хи-
мической фиксации, поскольку физические методы (замо-
раживание—высушивание, замещение в замороженном
состоянии и др.) требуют специальной аппаратуры или
большой затраты времени.
Приведенные ниже таблицы содержат перечень раз-
личных фиксирующих средств, рекомендуемых к использо-
Фиксирующие смеси для выявления белков и полисахаридов
Класс веществ Фиксирующая смесь Состав Продолжи- тельность фиксации
Белки и амино- кислоты Формальдегид по Лилли (Lillie) 40%-ный формальдегид - 100 мл; дистиллирован- ная вода-900 мл; NaH2PO4 2Н2О-4,0 г, Na2HPO4 (безводный) - 6,5 г 24-72 ч, срезы - 10 мин
Формальдегид с ацетатом кальция по Лилли (Lillie) Трихлоруксус- ная кислота - этанол по Бар- нету (Barrnett) и Зелигману (Seligman) 40%-ный формальдегид - 100 мл; дистиллирован- ная вода-900 мл; аце- тат кальция(моногид- рат) - 20 г 1%-ная трихлоруксусная кислота в 80%-ном эта- ноле 3-6 ч 12-24 ч 24 ч
Полисаха- риды Полисаха- риды Спиртовый рас- твор нитрата свинца по Лилли (Lillie) Раствор пикри- новой кисло- ты и формаль- дегида по Россману (Rossman) 40%-ный формальдегид, нитрат свинца-8 г, дистиллированная во- да-10 мл; 96%-ный эта- нол - 8 мл Насыщенный раствор пикриновой кислоты в 90%-ном этаноле - 90 мл; 40%-ный формальде- гид -10 мл 24 ч 2-3 дня 14 дней 1-4 ч
Таблица 6
Т емпера- тура фик- сации, °C Применение Примечания
группа веществ микро- скопия
+4° Тирозин, о- аминокис- лоты, арги- нин, SS- группы Свето- вая, элект- рон- ная Возможно добавле- ние 7,5%- ной саха- розы
Комнат- ная +4° Триптофан Свето- вая
+4° SH-группы, SS-группы » Рекомен- дуется как обыч- ная фик- сация
Комнат- ная +4° -25 Кислые му- кополисаха- риды »
от +3 до 0° Гликоген » Целлоиди- нировать срезы не нужно
2. Методы гистохимии 45
ванию в практической гистохимии для выявления от-
дельных классов веществ. Метод замораживания—высу-
шивания используется лишь тогда, когда нельзя обойтись
без немедленной стабилизации ткани.
2.1.7.6.1. БЕЛКИ
Стабилизация белков лучше всего удается при фикса-
ции методом замораживания—высушивания. Белки при
этом денатурируются лишь незначительно. Данных об ис-
пользовании метода замещения в замороженном состоя-
нии для фиксации белков недостаточно. Поэтому химиче-
ская фиксация продолжает играть важную роль. Из
приведенных в табл. 6 фиксирующих средств для стабили-
зации специфических групп наиболее пригодны смеси
с этанолом, поскольку они слабо реагируют с активными
группами белков. Формальдегид имеет то преимущество,
что его реакции с белками хорошо изучены; известно так-
же, что эти реакции обратимы. Кроме того, следует отме-
тить, что не упомянутые в табл. 6 и 7 фиксирующие смеси,
содержащие тяжелые металлы и пикриновую кислоту (на-
пример, Ценкера, Буэна, Суза), также могут быть исполь-
зованы в гистохимии белков.
2.1.7.6.2. ПОЛИСАХАРИДЫ
Для общего выявления углеводов рекомендуется фик-
сация в смесях формальдегида с этанолом при температу-
ре'от 0 до + 4° С. Кислые мукоидные вещества очень хоро-
шо осаждаются цетилпиридинийхлоридом. В смеси
с формальдегидом он является хорошим фиксатором для
Этой группы всшцсп. Очень хорошие результаты при выяв-
лении кислых мукоидных веществ достигаются путем ис-
пользования окраски альциановым синим и реакций
связывания железа. Смеси, содержащие хлорид ртути или
пикриновую кислоту, также дают хорошие результаты.
Наилучшая стабилизация слизистых веществ достигается,
по-видимому, замораживанием — высушиванием с после-
дующей фиксацией в парах формалина. Для электронно-
микроскопического выявления мукоидных веществ хоро-
46 2. Методы гистохимии
шо себя зарекомендовали смеси с глутаральдегидом
и формальдегидом.
Адекватная фиксация гликогена, соответствующая его
прижизненной локализации, весьма затруднительна. При
помощи рекомендуемых методов получить постоянные ре-
зультаты на различном материале весьма затруднительно.
Частично это объясняется наличием различных легкора-
створимых разновидностей гликогена. При обычной ги-
стологической фиксации в срезах сохраняются лишь боль-
шие молекулы высокомолекулярного гликогена, тогда как
гликоген меньшей степени полимеризации легко вымы-
вается. Поэтому желательно для каждого материала под-
бирать наилучший фиксатор путем предварительных проб.
С тем чтобы снизить потери гликогена и избежать арте-
фактов его смещения, при выборе фиксирующей смеси сле-
дует по возможности согласовать ее состав и температуру
фиксации.
«
2.1.7.6.З. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
При оценке результатов фиксации следует учитывать,
что нуклеиновые кислоты существуют в различных поли-
мерных формах. Очевидно, что каждое фиксирующее ве-
щество вызывает изменения как в степени полимеризации,
так и в способности вступать в химические реакции. Не ре-
комендуется применять фиксаторы, блокирующие реак-
ционноспособные группы и таким образом ослабляющие
окрашиваемость нуклеиновых кислот (например, фор-
мальдегид). Хорошую сохранность структур обеспечивают
кислые фиксирующие смеси, такие, как этанол-уксусная
кислота и смесь Карнуа. Они, кроме того, постепенно раз-
рывают связи между нуклеиновыми кислотами и белками
и таким образом увеличивают число реакционноспо-
собных кислых групп, что способствует хорошей окраши-
ваемости основными красителями. Следует, однако,
учитывать, что длительная фиксация в кислых смесях ведет
постепенно к экстрагированию сначала РНК, а затем
ДНК. В критических случаях (например, при цитофотоме-
трическом количественном определении нуклеиновых кис-
лот) следует согласовывать продолжительность фиксации
с величиной объекта и температурой. Наиболее рацио-
2. Методы гистохимии 47
нальной считается фиксация объектов величиной 2—3 мм
в течение 2 ч при 2°С в фиксаторе Карнуа (табл. 7).
2.1.7.6.4. ЛИПИДЫ
Для фиксации липидов наиболее часто используется
формальдегид, который может изменять физические свой-
ства липидов (растворимость, дисперсия, первичная флуо-
ресценция и др.). Возможное в процессе фиксации частич-
ное растворение и вымывание липидов, особенно фосфоли-
пидов, можно в значительной мере ограничить добавле-
нием в фиксирующую смесь ионов Са, Со или Cd,
поскольку эти электролиты способствуют образованию
комплексов между липидами и белками. Поэтому фикси-
рующая смесь Бейкера, содержащая формальдегид и каль-
ций, широко используется в гистохимии липидов. Фикса-
ция липидов формальдегидом в значительной мере
предотвращает растворение липидов в процессе обезвожи-
вания и заливки тканей в полиэтиленгликоль или карбо-
вакс. Другая возможность предотвращения вымывания
липидов, особенно фосфолипидов, в органических раство-
рителях, используемых при заливке в парафин, заключает-
ся в добавлении в фиксирующую смесь бихроматов. Дли-
тельное хромирование при высоких температурах позво-
ляет обеспечить сохранность нейтральных жиров при
заливке в парафин. Хорошим дополнением к фиксации об-
щих липидов формальдегидом служит рекомендуемая
Элфтманом (Elftman) фиксация тканей (За исключением
нервной) в смеси растворов сулемы и бихромата (табл. 7).
*~ Для большей точности следует параллельно окрасить
и нативную ткань. Нативные замороженные срезы можно
окрасить, помещая их в раствор краски или в свободном
виде, или закрепленными на покровном стекле.
2.1.7.6.5. ФЕРМЕНТЫ
При первых попытках гистохимического выявления ги-
дролитических ферментов для фиксации предпочитали хо-
лодный ацетон или этанол, поскольку обе эти жидкости
вызывают лишь незначительную инактивацию фермента.
При последующей заливке в парафин процесс обезвожива-
Таблица 7
Фиксирующие смеси для гистохимического выявления нуклеиновых кислот и липидов
Класс веществ Фиксирующие смеси Состав Продолжи- тельность фиксации Температура фиксации. *С Применение Применение
группа веществ микро- скопия
Нуклеино- вые кис- лоты Липиды Липиды Смесь Карнуа по Зандритте- ру (Sandritter) Кальций-фор- мол по Бей- керу (Baker) Бихромат калия со ртутью по Элфтману (Elftman) 96%-ный эта- нол - 60 мл; хлороформ - 30 мл; уксус- ная кислота - 10 мл 40%-ный фор- мальдегид - 100 мл; 10%- ный хлорид , кальция (беЗ- водный)- 10 мл; дистил- лированная вода - 500 мл Хлорид ртути (HgCL)-Sr; бихромат ка- лия-2,5 г; дистиллиро- ванная вода -. 100 мл 2 ч 16-24 ч, срезы - 10 мин 'ч 3 дня 1 + 2° + 4° Комнатная » ДНК и РНК Общие ли- пиды Фосфоли- пиды после заливки в пара- фин Свето- вая » Особенно пригод- на для количе- ственного изуче- ния нуклеиновых кислот в сочета- нии с окраской хромовые квас- цы - галлоцианин Добавление 1% Co(NO4), или 1% Cd; Особенно пригодна для вы- явления липидов в нервной ткани Усиление стабили- зации липидов благодаря обра- ботке ежедневно заменяемым 2,5%- ным бихроматом калия; менее при- годна для выяв- ления липидов в нервной ткани
2. Методы гистохимии 49
ния в меньшей степени влияет на ферментативную актив-
ность, чем температура заливки. Гистохимически выявляе-
мая активность некоторых гидролитических ферментов,
особенно фосфатаз, сохраняется лишь в том случае, когда
заливка проводится при температурах ниже +50° С, про-
питка парафином завершается за 30 мин (заливка
в вакууме).
Удовлетворительная сохранность активности гидроли-
тических ферментов достигается при фиксации в предло-
женном Холтом и Хиксом растворе забуференного фор-
малина (4%), к которому добавляют 7,5%-ную сахарозу,
с последующей обработкой в смеси сахарозы с гуммиара-
биком или с гуммиакацией при температуре от 0 до 4- 2°С
в течение 1—24 ч (табл. 8). Такая дополнительная обра-
ботка положительно сказывается на сохранности фермен-
тативной активности и на получении срезов ткани.
Данные, касающиеся стабилизации связанных и раство-
римых оксидоредуктаз, приведены в табл. 9. Наиболее
чувствительной по отношению к химической фиксации
оказалась цитохромоксидаза. Хорошая сохранность ак-
тивности этого фермента, по-видимому, возможна лишь
при фиксации замораживанием—высушиванием. Сукци-
натдегидрогеназа достаточно хорошо стабилизируется
холодным ацетоном. Однако нельзя не отметить опреде-
ленных трудностей, связанных с последующей обработкой
ткани и с обеспечением сохранности структуры.
Заслуживает внимания предложенная Уокером и Зелиг-
манрм (Walker, Seligman) возможность стабилизации свя-
занных и растворимых дегидрогеназ фиксацией в фор-
мальдегиде низкой концентрации (0,7—2%). Стабилизация
растворимых дегидрогеназ достигается также с помощью
забуференных растворов глутаральдегида при непродол-
жительной фиксации.
Значение моно- и диальдегидов для фиксации фермен-
тов при ультраструктурных исследованиях сегодня неоспо-
римо (табл. 10). Из перечисленных в табл. 10 фиксаторов
наименьшим инактивирующим действием обладают
глиоксаль, оксиадипинальдегид или адипинальдегид, тог-
да как 6%-ный глутаральдегид вызывает наиболее силь-
ную инактивацию. Таким образом, хорошая сохранность
структур, достигаемая при помощи глутаральдегида, со-
Таблица 8
Фиксирующие смеси для гистохимического выявления ферментов
Фиксирующая смесь Состав Продолжи- тельность фиксации Темпера- тура фик- сации, 0 С Применение Примечания
фермент/группа ферментов микроско- пия
Ацетон Формальдегид Формальдегид- метанол по Каплову (Kaplow) Абсолютный ацетон, 80%-ный ацетон 4-10% 40%-ный формальдегйд - 10 мл; метанол - 90 мл 24 ч 10-16 ч 30 с +4° +4° На льду Щелочные фос- фатазы, кис- лые фосфата- зы То же Щелочная фос- фатаза в маз- ках крови Световая Заливка в пара- фин
Формальдегид по Холту (Holt) 40%-ный формальдегид - 100 мл; 0,067 М фос- фатный буфер-500 мл; сахароза-75 г 18-24 ч От 0 до +4° Кислые гидро- лазы Перенесение ма- леньких ку- сочков ткани после фикса-
Кальций-формол по Холту (Holt и. Mitarb.) 4%-ный формальдегид с 1% СаС12; доведение pH до 7,0 дальнейшим добавлением СаС12 18-24 ч От 0 до 44° То же ции 24 ч или дольше при температуре от 0 до +4°С в 0,88 М саха- розу с добав- лением 1% гум- миакации
Г лутаральдегид по Вайсенфель- су (Weissen- fels) 2%-ный глутаральдегид в 0,05 М какодилатном буфере, pH 7,4; добав- ление 0,5% Са С12 12 мин +4° Кислая фосфа- таза в культу- рах тканей Электрон- ная -V
Формальдегид- сахароза-амми- ак по Пирсону (Pearson) 4%-ный формальдегид - 10 мл; сахароза-15 г; 0,880 аммиак 1 мл; дис- тиллированная вода до 100 мл 18-24 ч +4° Холинэстеразы Световая
Таблица 9
Действие фиксации на различцые оксидоредуктазы (Chayen u. Mitarb.)
Фермент Фиксация Продолжи* тельность фиксации, ч Температу- ра фикса- ции, °C Последующая обработка Остаточная активность, процент от исходной активности в нефиксирован- ном материале
НАДФН-тетразолийредук- таза НАДФН-тетразолийредук- таза Цитохромоксидаза Цитохромоксидаза Сукцинатдегидрогеназа Сукцинатдегидрогеназа Кальций- формол » » Заморажи- вание - высуши- вание То же Формаль- дегид Ацетон 12 12 2-4 24 От 0 ДО +4° То же +4° +4° Заливка в парафин Заливка в парафин 30 мин при 4-60° С 5-25 4-10 56 0 0 60
Сукциноксидаза Заморажи- вание - выс шивание Заливка в парафин 30 мин при +60°С 37
Сукциноксидаза То же 0
Таблица 10
Фиксирующие вещества для электронно-микроскопического выявления ферментов (по Janigan, с измене-
ниями)
Фиксирующее вещество Количе- ство, мл Сахаро- за', г Фосфатный или какодилатный буфер Конечный объем, мл Конечная концентра- ция, % Примечание
Формальдегид 40% 5 3,76 0,1 М, pH 7,4 50 4 Можно использовать
Глутаральдегид 25% 13 0,1 М, pH 7,2 50 6,5 в конечной концентра-
Акролеин 100% , 5 — 0,1 М, pH 7,6 50 10 ции до 2%
Метакролеин 100% 2,5 3,76 0,1 М, pH 7,6 50 4
Кротональдегид 100% 5 7,52 0,1 М, pH 7,4 50 10
Глиоксаль .6,1 3,76 0,2 М, pH 6,5 50 4
Оксиадипинальдегид 22,5°/ 27,7 7,52 0,1 М, pH 7,5 50 12,5
Сахарозу растворить в буфере, прежде чем довести фиксириощин раствор до конечного объема. Продолжительность фиксации для кусоч
ков толщиной 3-4 мм при+4° С 2-6 ч.
2. Методы гистохимии 53
провождается утратой ферментативной активности. Сте-
пень инактивации можно уменьшить, снизив концентра-
цию глутаральдегида до 1,5—3%. Моноальдегиды—мета-
кролеин, кротональдегид и акролеин—менее пригодны
для выявления ферментативной активности на электрон-
но-гистохимическом уровне.
Специфические действия фиксирующих веществ на фер-
ментативную активность трудно определить с помощью
гистохимических методов. Для этой цели требуются срав-
нительные биохимические исследования. Необходимо по-
мнить, что физические и химические свойства целого ряда
ферментов меняются в зависимости от того, связаны ли
они с субклеточными структурами или находятся в изоли-
рованном виде.
2.2. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ
Имеющиеся в нашем распоряжении гистохимические
реакции охватывают методы для выявления белков и ами-
нокислот, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов, био-
генных аминов, неорганических веществ и ферментов. По-
скольку выявление ферментативной активности во многих
отношениях отличается от выявления веществ, ферменты
рассматриваются отдельно от белков. В специальные ме-
тодические разделы выделены также радиоавтография
и иммуногистохимия.
2.2.1. ТИПЫ РЕАКЦИЙ
'’Лишь в редких случах удается выявить отдельные ве-
щества одной лишь микроскопией, без какой-либо окраски
(таковы, например, меланин и липохром). Как правило, для
выявления необходимо получить хорошо оптически разли-
чимый в большинстве случаев окрашенный продукт.
Это достигается с помощью одноэтапной или двух-
этапной реакции. Если при одноэтапной реакции выявляе-
мое вещество непосредственно превращается в окра-
шенный продукт, то при двухэтапных реакциях первый
этап ведет к образованию неокрашенного продукта, ко-
торый переводится в окрашенный лишь на втором этапе.
Для электронно-микроскопического выявления веществ
54 2. Методы гистохимии
и ферментативной активности необходимо применять ме-
тоды контрастирования—повышения электронной плот-
ности продукта реакции.
Возможность систематизации реакций, ведущих к обра-
зованию окрашенного продукта, продемонстрирована
в табл. 11.
Таблица
Обзор типов реакций, используемых для выявления различшх веществ (Агпщ
Тип реакции Источник Применение (пример) 5 Выявляемое вешесп|
Микрохимические Неорганическая аналитическая химия Реакция образо- вания берлин- ской лазури Железо
Реакция суль- фид — серебро Тяжелые мета1« лы
Образование кра- сителя Реакции замеще- ния, ведущие к образованию окрашенного продукта ШИК-реакция Реакция Фёль- гена Углеводы, ДНЦ
Электростатичес- кое окрашива- ние Методы электро- химии Определение ба- зофилии г Кислые группьь so3o,po3hoI соо~
Растворение кра- сителя Физико-химиче- ские процессы растворения Окрашивание су- даковыми кра- сителями Липиды
2.2.2. ПРИМЕРНЫЙ ПЛАН ГИСТОХИМИЧЕСКОЙ
ПРОЦЕДУРЫ
Необходимая для выявления какого-либо вещества ги-
стохимическая реакция состоит, как правило, из следую-
щих этапов: фиксация ткани, приготовление заморо-
женных или криостатных срезов или заливка ткани после
соответствующей предварительной обработки и резка за-
литого материала, прикрепление среза к предметному
стеклу, подготовка среза к гистохимической реакции, за-
ключение среза с окрашенным продуктом реакции.
Замороженные срезы не требуют какой-либо специаль-
ной обработки. Их помещают в дистиллированную воду
или непосредственно в реакционную смесь. Парафиновые
же срезы необходимо перед проведением гистохимической
2. Методы гистохимии 55
Среды для заливки и их применение в гистохимии
Таблица 12
Среды Коэффициент преломления Применение и примечания
Водорастворимые 1,420 Пригодны для заключения замороженных срезов Среда для заключения на основе искусственных смол; хорошо подходит для заключения замо- роженных срезов
Глицерин—желатина Желатинол
Желатина — бальзам Геринга (Hering) 1,442 Среда для заключения замороженных срезов; после наложения по- кровного стекла на срез со средой предметное стекло следует поместить на 10 мии в термостат
Пласдои С (поливинилпирроли- дон) С^еда Фарранта 1,463 Заливочная среда при ок- рашивании на жиры и реакциях с образованием азокрасителя Для заключения заморо- женных срезов, особенно после проведения фер- ментативных реакций
Безводные
Нейтральный бальзам 1,520 Хорошо подходит для заключения обезвожен- ных препаратов
Цедакс DePX 1,550 Нейтральная заливочная среда для заключения обезвоженных препара- тов Заливочная среда для обез- воженных препаратов при хорошей сохран- ности окрашивания; не подходит для препаратов с осадками серебра
Эукитт 1,489 Очень быстро высыха- ющая заливочная среда
56 2. Методы гистохимии
реакции депарафинировать (две смены ксилола, ряд спир-
тов убывающей концентрации, дистиллированная вода).
Для ультрагистохимических целей во многих случаях гисто-
химическую реакцию можно провести на кусочках ткани
или же на толстых срезах перед обычным обезвоживанием
и заливкой в смолу.
После проведения реакции срез для дальнейшего изуче-
ния следует заключить в подходящую среду. При этом
важно, чтобы коэффициенты преломления продукта гисто-
химической реакции и среды, используемой для заключе-
ния, были бы близки. Для заключения срезов после прове-
дения гистохимической реакции используются как водора-
створимые, так и безводные среды (табл. 12).
3. ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ВЕЩЕСТВ
В практической работе часто бывает необходимо пред-
варительное топохимическое изучение имеющихся в незна-
комой ткани групп веществ. При больших изменениях
в концентрациях веществ, которые могут происходить
в результате экспериментальных воздействий, желательно
проводить сначала более грубую предварительную оценку
химического состава исследуемых клеток и тканей.
Для анализа веществ особенно пригодны групповые ре-
акции, позволяющие провести выявление класса веществ
(табл. 13 и 14). Аналогичный подход уже давно практи-
куется в аналитической химии, где на основании проведе-
ния реакции на группы веществ определяется химический
состав данной пробы.
Таблица 13
Топохимические реакции для идентификации классов веществ в клетках
и тканях
Класс вещества Реакция
Йелки Углеводы Нуклеиновые кислоты Липиды Реакция с дииитрофторбеизолом ШИК-реакция Окрашивание метиловым зеленым— пироиином Окрашивание Суданом черным В
Большую группу неорганических веществ не удается
охватить одной общей реакцией. Лишь в случае тяжелых
металлов можно с помощью реакции сульфид — серебро
выделить их из общей группы неорганических веществ.
Таблица 14
Топохимические методы определении класса неизвестного вещества (на оснопе схемы Chayen u. Mitarb.)
Неизвестное вещество
Метод определения
ДНФБ-реакция Метиловый зеле-
ный-пиронин
Судановый черный В
Специальные
методы
ШИК-реакция
Дкролеин-Шифф
Толуидиновый
синий (pH 6,0)
Бензпирен—кофеин
Выявление
тирозина
Кислый гематеин
Класс веществ
Белки
Кислые Углеводы Липиды
компоненты
(например, нук-
леиновые кис-
лоты)
Неорганические
вещества, пиг-
менты и т. п.
3. Гистохимическая диагностика веществ 59
3.1. ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОТДЕЛЬНЫХ
КЛАССОВ ВЕЩЕСТВ
Помимо подобного аналитического подхода к разделе-
нию классов веществ можно провести более точную иден-
тификацию компонентов внутри класса.
3.1.1. БЕЛКИ
После получения положительной реакции с динитро-
фторбензолом можно разграничить основные, кислые и
нейтральные белки путем окрашивания прочным зеленым
при различных значениях pH (табл. 15). Наличие основных
белков в исследуемых структурах может быть подтвержде-
но реакцией на основные аминокислоты—аргинин и ли-
зин, а также выявлением SH-групп. Для дальнейшей диф-
ференцировки белков можно использовать пробу на
метахромазию для общей фракции кислых белков (кислые
мукопротеиды), ШИК-реакцию для выявления углеводно-
го компонента нейтральных белков (гликопротеиды). Ли-
попротеиды (гликолипиды) дают положительную ШИК-
реакцию, окрашиваются Суданом черным В, но не
окрашиваются кислым гематеином. Идентификация ну-
клеопротеидов возможна по их ортохроматическому окра-
шиванию толуидиновым синим при pH 4,2 или по различ-
ной окрашиваемости метиловым зеленым — пиронином.
3.1.2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
О наличии нуклеиновых кислот в исследуемой ткани
свидетельствует положительное окрашивание метиловым
зеленым — пиронином. Дезоксирибонуклеиновую кислоту
(ДНК) выявляют с помощью реакции Фёльгена, путем
окрашивания метиловым зеленым по Курнику или иссле-
дуя УФ-спектры поглощения (265 нм) при контроле с кри-
сталлической дезоксирибонуклеазой (ДНКазой).
О присутствии рибонуклеиновых кислот (РНК; свиде-
тельствует окраска пиронином при pH 4,2 при контроле
с рибонуклеазой. Поскольку рибонуклеаза не влияет на ба-
зофилию, обусловленную наличием сильно полимеризо-
ванной ДНК, проба с рибонуклеазой позволяет надежно
различать ДНК и РНК.
Таблица 15
Схема гистохимического анализа белков (по Chayen и. Mitarb., с изменениями)
Основные белки Кислые белки Нейтральные белки Нуклеопротеиды
простые сложные простые сложные
Окрашивание прочным зеленым Ортохроматическое окрашивание толуидиновым синим при р Н 4,1; окрашивание метиловым зеленым— пиронином
при кйслом pH при нейтральном pH
Аргинин (реакция Са- кагучи - положитель- ная) Лизин (реакция Сакагу- чи - отрицательная; положительная с прочным зеленым при pH 8,0; отрицательная после дезаминирова- ния) SH-группы (положи- тельная проба по Шев- ремону (Ch6vremont) или Беннету (Bennet) Не изменя- ется после обработки 5%-ной три- хлоруксус ной кисло- той Метахромазия с толуиди- новым си- ним; кислые мукопротеи- ды (мукоид- ные веще- ства) Не изменя- ется после обработки 5%-ной три- хлоруксус- ной кисло- той ШИК-реакция: гликопроте- иды Обработка 5%-ной трихлор- уксусной кислотой пред- отвращает окрашивание толуидиновым синим и метиловым зеленым- пиронином; остаточные белки окрашиваются прочным зеленым при pH 8,0
3. Гистохимическая диагностика веществ 61
Если обработка ДНКазой или РНКазой не предотвра-
щает окрашивания основными красителями (базофилии),
то речь, как правило, может идти о реагирующих метахро-
матически сульфатированных и несульфатированных по-
лисахаридах, обусловливающих метахроматическое окра-
шивание толуидиновым синим или метиленовым синим.
Ионизированные фосфаты или полифосфаты выявляются
с помощью пробы Эбеля. Несульфатированные кислые по-
лисахариды, кроме того, дают положительную ШИК-реак-
цию (табл. 14).
3.1.3. УГЛЕВОДЫ
В гистохимии углеводов ШИК-реакция играет главную
диагностическую роль. Положительная ШИК-реакция
в сочетании с отсутствием окрашивания после бензоилиро-
вания или ацетилирования может с большой долей вероят-
ности рассматриваться как доказательство присутствия
углеводов в исследуемом объекте. Проба с ацетилирова-
нием одновременно помогает отдифференцировать не-
насыщенные жирные кислоты, на которых эта процедура
не действует. Надежным свидетельством присутствия гли-
когена служит окрашивание кармином по Бесту в сочета-
нии с предварительной обработкой контрольных срезов
диастазой или а- и р-амилазой. Крахмал удается отдиффе-
ренцировать от гликогена по реакции Люголя с иодом.
Для идентификации кислых мукоидных веществ ис-
пользуют следующие методы:
а) определение базофилии, б) выявление метахромазии,
в) окрашивание альциановым синим и астрасиним, г) опре-
деление способности связывать коллоидную окись железа,
д) ферментативное расщепление: гиалуроновой кислоты—
гиалуронидазой, сиаломуцина — сиалидазой, нейрамино-
вой кислоты—нейраминидазой.
Гликолипиды (цереброзиды или ганглиозиды) в отли-
чие от прочих полисахаридов, будучи полисахарид-ли-
пидными комплексами, дают положительную ШИК-реак-
цию и при этом окрашиваются Суданом черным В.
Ненасыщенные жирные кислоты в полисахарид-ли-
пидных комплексах можно отдифференцировать от ШИК-
62 3. Гистохимическая диагностика веществ
положительных а-гликолей и а-аминоспиртов по пробе
с бромированием и ацетилированием. В процессе ацетили-
рования реакционноспособные гидроксильные группы
и аминогруппы в отличие от ненасыщенных жирных кис-
лот блокируются и теряют свою способность окисляться
иодной кислотой. Бромирование же, наоборот, ведет
к блокированию двойных связей, тогда как гликоли про-
должают оставаться доступными для окисляющего дей-
ствия иодной кислоты (табл. 16).
3.1.4. ЛИПИДЫ
Для выявления липидов в клетках и тканях наиболее
пригодны окрашивание Суданом черным В и флуорес-
центный метод с бензпиреном. Материал, дающий поло-
жительную реакцию в любой из этих проб, содержит ли-
пиды. Для выделения фосфолипидов рекомендуется проба
с кислым гематеином в сочетании ,с бромированием.
Положительная реакция до бромирования и отрица-
тельная реакция после обработки свидетельствуют о при-
сутствии фосфолипидов в исследуемой ткани. Связанные
со структурами так называемые «маскированные липиды»
выявляются после демаскирования обработкой в смеси
метанол — хлороформ при помощи окраски кислым гема-
теином. Присутствие гликолипидов в исследуемой тка-
ни устанавливается по следующим критериям (табл. 16):
положительная ШИК-реакция, окрашивание Суданом
черным В, отрицательная реакция с масляным красным
и кислым гематеином даже после демаскирования. Сво-
бодные жиры, например нейтральные триглицериды, окра-
шиваются масляным красным и дают с нильским синим
красное окрашивание, чем четко отличаются от синего
окрашивания кислых липидов. Родственные липидам сте-
роиды не окрашиваются обычными жировыми красителя-
ми. Их идентифицируют по аутофлуоресценции, при помо-
щи реакции Адамса (Adams) или при помощи метода
Шульца (табл. 16).
Целый ряд гистохимически выявляемых веществ при-
сутствует в клетках и тканях, как правило, в низкой концен-
трации и, кроме того, не имеют всеобщего распростране-
ния. К таким веществам принадлежат аутофлуоресцирую-
Таблица 16
Схема гистохимического выявления липидов
Триглицериды Гликолипиды Фосфолипиды Стероиды
несвязанные связанные
Окраска Суданом черным В Флуоресценция с бензпиреном Аутофлуоресценция Метод с перхлорной кислотой и нафтохи- ноном (Adams) Метод Шульца
Окраска масляным красным Красное окрашивание с нильским синим сульфатом ШИК-положи- тельные Положительная реакция с кис- лым гематеином Положительная ре- акция с кислым ге- матеином после де- маскирования
Отрицательная реакция с кис- лым гематеином Синее окрашивание нильским синим
Слабое окрашивание масляным крас- ным
Частично блоки- руется бромиро- ванием Блокируется бромированием
64 3. Гистохимическая диагностика веществ
щие вещества (например, каротиноиды, порфирины,
птеридины), восстанавливающие вещества (например,
аскорбиновая кислота, полифенолы) и пигменты. Динами-
ческие компоненты можно выявлять лишь с помощью
радиоавтографии.
4. ГИСТОХИМИЯ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ
ВЕЩЕСТВ И ФЕРМЕНТОВ
4.1. БЕЛКИ
Гистохимйческое выявление белков осуществляется
двумя способами:
1) по их общим физико-химическим и биологическим
свойствам,
2) по специфическим химическим группам и аминокис-
лотам.
4.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ИХ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ
К этой группе методов относятся:
а) Иммунохимические методы
Специфические белки при использовании специфических
реакций антиген — антитело выявляются под микроско-
пом с помощью реакций с антителами, меченными
флуоресцеином.
б) Радиоавтографические методы
В этом методе метаболически активные белки выявляются
по излучению после введения меченных тритием амино-
кислот.
в) Методы окрашивания, направленные на выявление кис-
лотно-щелочных свойств
Подходящим методом является оценка изоэлектрической
точки с помощью экстинкции метиленового синего. Лишь
3-235
66 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
при соблюдении стандартных условий можно говорить об
идентичности или различии двух веществ. При определе-
нии базофилии следует обращать внимание на то, что по-
мимо белков базофилией обладают также нуклеиновые
кислоты и некоторые полисахариды. Для того чтобы ис-
ключить воздействие фиксации на белки, желательно ис-
пользовать свежие криостатные срезы.
г) Методы, основанные на различиях в растворимости
Эти методы основаны главным образом на экстрагирова-
нии белков солевыми растворами различной ионной силы
и pH. Для этих целей используют криостатные срезы,
а также срезы лиофилизированного материала или ткани,
подвергнутой замещению в замороженном состоянии.
Срезы, предварительно обработанные растворителями
(водой, 1%-ным раствором NaCl, буферными растворами
или растворами сульфата аммония или аммиака), подвер-
гают специальному окрашиванию на белок (реакция Мил-
лона или реакция с ДНФБ) одновременно с нефиксиро-
ванными контрольными срезами. Различия между срезами
указывают на присутствие белка, вымываемого опреде-
ленным раствором.
д) Методы ферментативного расщепления
Эти методы основаны на том, что белки по-разному отно-
сятся к катаболическим ферментам. Действие фермента
определяется по продуктам распада белка или путем ми-
кроскопического изучения обусловленных фермента-
тивным действием изменений субстрата в гистологиче-
ском препарате. Именно этот второй подход и находит
применение в гистохимических методах. Изменения суб-
страта, происходящие в препарате, оцениваются при помо-
щи методов окрашивания, направленных на выявление ре-
акционноспособных групп в молекулах белка, а также при
помощи окрашивания забуференными растворами краси-
теля. Помимо этого, используются также и гисто-физиче-
ские методы (например, интерференционная или поляриза-
ционная микроскопия). Эти методы позволяют исследова-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 67
телю делать важные заключения, поскольку воздействие
протеаз ведет к изменениям в макромолекулярной струк-
туре белков.
4.1.2. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕ-
ТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ
Гистохимическое выявление белков основано главным
образом на наличии реакционноспособных групп в амино-
кислотах. При помощи гистохимических методов можно
выявлять аминокислоты, включенные в структуру белка.
Простые аминокислоты и низкомолекулярные белки вы-
мываются из ткани в процессе фиксации и заливки. Как это
будет видно из дальнейшего рассмотрения, в настоящее
время существуют гистохимические методы для выявле-
ния лишь части аминокислот. Эти методы не обеспечи-
вают информации ни об аминокислотном составе и амино-
кислотной последовательности, ни о величине и простран-
ственном расположении белковой молекулы. Для иденти-
фикации белка эти методы применимы лишь в том случае,
когда выявляемые реакционноспособные группы присут-
ствуют в высоких концентрациях и могут служить харак-
терным признаком данного специфического белка. Так,
для кератиноподобных структур характерны высокие кон-
центрации дисульфидных групп. Для общего изучения бел-
ка можно рекомендовать методы выявления концевых
амино- и карбоксильных групп.
При помощи реакций окрашивания можно выявлять
следующие реакционноспособные группы и аминокислоты
в белках:
а) аминогруппы концевых а-аминокислот (— СН2 —
-CHNH2 СООН),
б) концевые или боковые карбоксильные группы
(СООН),
в) сульфгидрильные группы цистеина (— SH),
г) дисульфидные группы цистина (— S — S),
д) индольную конфигурацию триптофана,
и) n-замещенную фенольную конфигурацию тирозина,
ж) гуанидильные группы аргинина,
е) имидазольные группы гистидина.
3*
68 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов '
4.1.2.1. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА
Надежным методом выявления общего белка являет-
ся метод с динитрофторбензолом (ДНФБ-реакция).
2,4-ДНФБ реагирует количественно со свободными амино-
группами, с е-аминогруппами лизина, с фенольными ОН-
группами тирозина и с имидазольными группами гистиди-
на. В то время как образующиеся с тирозином и гистиди-
ном комплексы бесцветны, со свободными аминогруппами
эта реакция ведет к образованию окрашенных (желто-
ватых) производных динитрофенола. Визуализация более
или менее бесцветных комплексов ДНФБ с белком (рго-
tein-P) осуществляется при помощи реакции восстановле-
ния по Даниелли (Danielli) в щелочном растворе этанола.
В результате последующего диазотирования комплекса,
в реакции сочетания с нафтолом или нафтол-серной кисло-
той образуется окрашенный комплекс азокрасителя.
ДНФБ-реакция может также использоваться для выяв-
ления отдельных реакционноспособных групп. Для этого,
необходимо прежде блокировать остальные группы. Бло-
кирование тирозина и гистидина осуществляется при по-
мощи соли диазония (например, стабилизированный 5-ни-
троанизидин), что делает возможным проведение реакции
ДНФБ только с аминогруппами. SH-группы можно ис-
ключить при помощи окисления иодом. Если же необходи-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 69
мо провести реакцию с тирозином, то в этом случае блоки-
руют МН2-группы азотной кислотой, a SH-группы—окис-
лением иодом.
Помимо ДНФБ-реакции в качестве надежных груп-
повых реакций для морфологического анализа белков
(табл. 17) можно использовать реакцию с тетразонием по
Даниелли (Danielli, 1947), Пирсу (Pearse, 1960) и Лизону (Li-
son, 1960), а также реакцию с нитробензоилхлоридом но
Берстону (Burstone, 1955). Сравнение этих трех методов по-
казывает, что здесь имеются заметные различия в отноше-
нии выявляемых реакционноспособных групп аминокис-
лот, которые могут иметь значение при направленном
исследовании.
Таблица 17
Методы одновременного выявления различных реакциошосиособных групп
и аминокислот (Gdssner)
Реакция
Реакционноспособные группы или аминокислоты
окси- I амино-
цролин группы
.тирозин! трип- I гистн- I лизни (аргинин
I тофан 1 дин 1 1
сульф-
идриль
ные
Тетразониевая реакция |
(Danielli, Pearse) .
Реакция с дииитрофтор-
бензолом (Danielli, Bur-1
stone) ।
Реакция с нитробензоил-,
хлоридом (Burstone) I
Флуоресцентно-микроскопическое выявление общих
белков осуществляется с помощью сульфафлавина по Ле-
манну и Руху (Leemann, Ruch, 1972). Результаты реакции
поддаются количественной оценке при помощи флуорес-
центной цитофотометрии.
4.1.2.2. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ РЕАКЦИОННО-
СПОСОБНЫХ ГРУПП И АМИНОКИСЛОТ
а) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ АМИНОГРУПП
Аминогруппы концевых аминокислот в результате
окислительного дезаминирования превращаются в альде-
70 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
гиды, которые в свою очередь выявляются при помощи рй
актива Шиффа. По этому же механизму протекает сравни
тельно просто проводимое окислительное выявлений
а-аминокислот при помощи нингидрина, аллоксана, гипо.
хлорита натрия и хлорамина Т. В основе этих методов лей
жит принцип окислительного дезаминирования; механизм
этой реакции можно разбить на несколько промежуточны!
этапов.
о о
' ° /он ° /<*
R-C-C-ОН + Г 5 /сч R-C-C-OH + Г I )с\ + Н»0
NHz ОИ NH H
6 0
о 0
// //
R-C-C-OH + H20 —► R-C-H + COj + NH3
NH
К наиболее надежным методам выявления а-аминокис
лот принадлежит метод с О-диацетилбензолом. Исследо;
вателю приходится, однако, самому проводить синтез ре
актива, поскольку последний не выпускается примышлен,
ностью.
В качестве чувствительного флуоресцентного метод,
для выявления NH2-rpynn следует упомянуть метод со ще
лочным раствором салицилового альдегида по Стовард]
(Steward, 1963).
б) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКАМИ К АРБОЙ
СИЛЬНЫХ ГРУПП
В основе разработанного Барнетом и Зелигмано^
(Barmett, Seligman, 1958) гистохимического метода выявлб
ния связанных с белками ациламидо-карбоксильных rpyiri
лежит следующий механизм. В результате обработки у»
сусным ангидридом в пиридине связанные с белками зд
ациламидо-карбоксильные группы переводятся в соотвец
ствующие кетоны, которые в свою очередь реагирую]
с реагентом на карбонильную группу—гидразидом 2-ой!
си-3-нафтойной кислоты. Гидразид в свою очередь ста?
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 71
ловится видимым в результате реакции сочетания с проч-
ным синим В.
R CONH СН2СООН + СН3СО О ОС сЩПиридин
а-Ациламидокарбоксил Уксусный ангидрид
R CONH СН2СОСН3 + СН3СООН + СО2
Карбонильное производное
Однако, согласно исследованиям на модельных вещест-
вах с уксусным ангидридом реагируют в первую очередь
карбоксильные группы боковых цепей. Предполагается,
что в результате обработки уксусным ангидридом в пи-
ридине на боковых цепях образуются смешанные ангид-
риды с карбоксильными группами (I). На последующем
этапе смешанные ангидриды реагируют с гидразидом
2-окси-З-нафтойной кислоты. При этом образуется дигид-
разид (И), который становится видимым благодаря реак-
ции сочетания с прочным синим В.
I К(СН2)„СООН + СН3СОООССН3Пири™
Карбоксильная группа Уксусный ангидрид .
боковой цепи
R (СН2)„ со о ос сн3 + сн3 соон
Смешанный
ангидрид
II R(CH2)„COOOCCH3 + H2NHNOC ZyX-*
Смешанный ангидрид НО кч 'к У
Гидразид 2-окси-З-нафтойной кислоты
R (СН2)„ СО HN HN OC
НО
+ СН3СООН
Для практического использования реакции выявления
карбоксильных групп по Барнету и Зелигману имеет значе-
ние, что смешанные Ангидриды разрушаются в результате
обработки 0,1 н. NaOH в течение 15 мин при + 22°С, тог-
да как примеси метилкетонов, образующиеся из концевых
72 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
карбоксильных групп, остаются без изменений. В резуль-
тате этого можно провести дифференцировку между бо-
ковыми и концевыми карбоксильными группами.
в) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ ТИРОЗИНА
Для выявления фенолов (тирозина) пригодна реакция
Миллона, а также реакция диазосочетания. Благодаря про-
стоте и малым затратам реактивов для повседневного ис-
пользования рекомендуется реакция Миллона. Она осно-
вана на способности фенола к образованию окрашенных
комплексных соединений с солью ртути и азотной кис-
лотой. Из модификаций реакции Миллона интенсив-
ным окрашиванием продукта реакции выделяется мо-
дификация Бейкера, в которой в результате обработки ти-
розина хлоридом ртути в присутствии нитрита калия
образуется интенсивно окрашенный продукт реакции.
ОН HNOj
Тирозин 2~ Нитрозотирозин
л-ОН Ъ* кислоты
------------------
Диазтирозин
Тирозин-в - азо- 1-на<ртол - 5-сулыроновая
кислота (окрашенный продукт реакции)
Помимо реакции Миллона, надежные результаты мо-
гут быть получены при помощи реакции диазосочетания
по Гленнеру и Лилли (Glenner, Lillie, 1957), которая пред-
ставляет собой гистохимическую модификацию реакции
Мореля-—Сисли. Эта специфичная для тирозина реакция
имеет следующие преимущества перед реакцией Миллона:
она дает более интенсивное окрашивание и позволяет уста-
новить более точную локализацию продукта реакции.
В основе метода лежит следующий принцип: в резуль-
тате диазотирования тирозина образуются вначале нитро-
зотирозин, а в результате длительной обработки холодной
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 73
азотной кислотой—диазотирозин. Путем сочетания с S-
кислотой(8-амино-1-нафтол-5-сульфоноваякислота)диазо-
тированный тирозин переводится в имеющий интенсив-
ную красную окраску азокраситель. Помимо упомянутой
S-кислоты для реакции сочетания вполне пригодна 1-ами-
но-8-нафтол-4-сульфоновая кислота. Правда, эту S-кисло-
ту трудно синтезировать.
г) ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ГИСТИДИНА
Гистохимическое выявление гистидина проводится на
основе метода, разработанного Лзндингом и Холлом
(Landing, Hall, 1956). Правда, слабым местом в этой реак-
ции является этап блокирования тирозина и гистидина
с помощью иодирования, проводимого исходя из требова-
ний специфичности реакции. Бахманн и Зайтц (Bachmann,
Seitz, 1961) модифицировали в методе Лэндинга—Холла
процедуру иодирования и состав среды, в которой прово-
дится реакция сочетания, а также процесс восстановления
метабисульфатом калия. Эта модифицированная процеду-
ра позволяет проводить гистохимическое выявление ги-
стидина с достаточной специфичностью.
д) МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТРИПТОФАНА
Гистохимические методы выявления триптофана осно-
ваны на образовании окрашенного продукта конденсации
с альдегидами. Помимо триптофана по этому методу выяв-
ляются триптамин, серотонин и скатол. Методы, в основе
которых лежит конденсация с п-диметиламинобензальде-
гидом (ДМАБ-реагент Эрлиха), отличаются образованием
интенсивно окрашенного продукта реакции и высокой
специфичностью.
1. Реакция диметиламинобензальдегиднитрит по Адамсу
(ADAMS, 1967)
В этой реакции n-диметиламинобензальдегид конден-
сируется с триптофаном в присутствии окисляющего аген-
та (у Адамса—нитрит натрия) с образованием темно-го-
лубого пигмента. С помощью обработки концентрирован-
74 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ной соляной кислотой Адамсу удалось получить интенсив-
ное окрашивание.
Альдегид
Окисление
Производное Л ~ кардалина
Голудда пигмент
2. Розиндольная реакция по Гленнеру (Glenner, 1957)
Этот метод представляет собой вариант метода кон-
денсации с n-диметиламинобензальдйгидом. При этом
в присутствии хлорной кислоты происходит бензилидено-
вая конденсация триптофана с диметиламинобензальдеги-
дом; образуется фенилиндолилметановый компонент, на-
ходящийся в равновесии со своей лейкоформой. Окисление
лейкоформы при помощи азотной кислоты ведет к образо-
ванию фенилиндолилиндолиденметана или так называе-
мого розиндольного красителя, который может существо-
вать в трех резонансных формах.
Лейкокомпонент
Окисление
Розиндол (фенилиндолилиндодилиден-
метан)
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 75
3. Бензилиденовая реакция по Гленнеру и Лилли (Glenner,
Lillie, 1957)
В реакции сочетания с и-диметиламинобензилиденом
исследуемые срезы обрабатываются и-ДМАБ в уксусной
кислоте, вслед за чем происходит реакция сочетания со све-
жеприготовленной диазотированной 8-амино-1-нафтол-5-
сульфоновой кислотой. Индольные производные в этом
методе в зависимости от их концентрации окрашиваются
в различные тона голубого—от светлого до темного.
Триптофанбензилидин
Триптофанбензилидин-8~ азо- 1~ нафтол-5- сульфоновая
кислота
4. Ксантгидрольная реакция по Лилли (Lillie, 1957)
Гистохимическое выявление в своей основе имеет реак-
цию определения триптофана по Дикману и Кроцетту
(Dickman, Crocett, 1957). По сравнению с биохимическим
методом было изменено соотношение соляной и уксусной
кислот в сторону снижения. Продукт конденсации ксантги-
дрола с триптофаном (триптамином, индолом, скатолом,
пирролом) фиолетового цвета, нестабилен. Эта реакция
76 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
специфична и более чувствительна, чем реакция с и-диме-
тил аминобензальдегидом.
Ксантгиброл
Ксантгидрилтриттмран
е) ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ АРГИНИНА
Легкорастворимая в воде, дающая щелочную реакцию
аминокислота аргинин является составной частью многих
основных белков. Гистохимическое выявление аргинина,
таким образом, имеет важное диагностическое значение
для выявления основных белков в ткани.
Гистохимическая реакция окрашивания для выявления
гуанидильных групп основана на методе выявления арги-
нина, предложенном Сакагучи (Sacaguchi). Положительная
реакция указывает исключительно на присутствие веществ
со следующей общей химической структурой:
/НН-сг
c=N-p
\ /Т
NH-c(<y
че
Среди гистохимических методов выявления аргинина
своей простотой и надежностью выделяется модификация
Бейкера. Стабильность реакции окрашивания удается по-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 77
высить, если вместо ос-нафтола использовать 2,4-дихлор-1-
нафтол. В основе этого метода лежит реакция Сакагучи,
в соответствии с которой белки, содержащие аргинин, под
воздействием а-нафтола и гипохлорита или гипобромита
натрия приобретают красную или оранжево-красную
окраску. С 2,4-дихлор-1-нафтолом вместо а-нафтола в ще-
лочной среде развивается окрашивание, интенсивность
которого позволяет проводить фотометрические изме-
рения.
ж) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКАМИ СУЛЬФГИД-
РИЛЬНЫХ И ДИСУЛЬФИДНЫХ ГРУПП
Гистохимическое выявление сульфгидрильных (SH —)
и дисульфидных групп (— S — S —) основано на наличии
в белковых молекулах цистеина или цистина. Поскольку
почти все гистохимические реакции направлены лишь на
SH-группы, перед проведением основной реакции SS-
группы следует восстановить до SH-групл, применив для
этого какой-нибудь восстанавливающий агент. Свободные
серусодержащие аминокислоты и глутатион не выявляют-
ся гистохимически, поскольку они присутствуют в тканях
в очень незначительной концентрации, а также потому, что
они вымываются в процессе предварительной обработки
ткани.
Наиболее часто используемые методы выявления SH-
или S — S-групп перечислены в табл. 18. Ниже описывают-
ся три стандартных метода.
1. Метод с ртутным оранжевым по Бенету (Bennett, 1951)
Механизм реакции при этом методе основан на способ-
ности SH-групп реагировать с алкильными или арильны-
ми ртутными соединениями, образуя меркаптиды. Синте-
зированный Бенетом для гистохимических целей ртутный
оранжевый [1-(4-хлорртутьфенилазо)-2-нафтол] первона-
чально был назван красным сульфгидрильным реагентом.
Этот реагент является азокрасителем, который благодаря
содержащейся в нем фенилртутной группе образует с SH-
группами окрашенный меркаптид.
Сравнение гистохимических методов выявления SH- и S - S-rpynn
।
Таблица 18
Реакция Группа Авторы Чувствительность Реакция блокирования Примечания
Реакция с азидом иода -SH Ratzenhofer Сравнительно высокая Клеточная локализа- ция невозможна
Реакция сидом с нитропрус- -SH- Hammet, Chap- man (1938,1939) Очень низкая Специфична; продукт реакции легко диф- фундирует; требуются толстые срезы
Реакция нидом с феррициа- -SH Chevremont, Fre- deric (1943); Adams (1956) - Низкая Хлорпикрин, мо- ноиодуксусная кислота, суле- ма Неспецифична для SH-групп, поэтому необходимы конт- рольные реакции
Метод с жевым ртутным оран- -SH Bennett (1951) » » Насыщенный раствор фенил- меркурихлори- да в этаноле или бутаноле Пригодна для цито- фотометрических количественных ис- следований; реакти- вы труднодоступны
Реакция Группа Авторы
ДЦД-реакция -SH ' Barmett, Selig- man (1954)
Реакция с надмуравьи- ной кислотой и аль- циановым синим -S-S- -SH Adams, Sloper (1956)
Реакция с надмуравьи- ной кислотой и псев- доизоцианином S-S- -SH Schiebler, Schies- sler (1959); Sterba (1964)
Продолжение табл. 18.
Чувствительность Реакция блокирования Примечания
Высокая Очень низкая Низкая Окисление иодом 0,1 М моно- иодацетат 0,1 MN-этил- малеимид Специфична (исклю- чение: окрашивание эластических воло- кон в результате их сродства к нафтолу); возможна количе- ственная оценка со- держания SH-rpynn в срезах ткани Низкая чувствитель- ность обусловлива- ет избирательное выявление веществ с высоким содержа- нием серы Отличный способ вы- явления SH- и S-S- групп в нейромедиа- торах, а также в ин- сулине
80- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
R- SH + С1Н9
ОН
ОН
2. Диоксидинафтилдисульфид (ДДД)-реакция для выявле-
ния связанных с белками сульфгидрильных питал по Барне-
ту и Зелигману (Barmett, Seligman, 1952, 1953)
Специфический дисульфид (ДДД-реагент), синтезиро-
ванный Барнетом и Зелигманом, образует со связанными
SH-группами белка при щелочном pH (8,5) бесцветное со-
единение, которое нерастворимо ни в воде, ни в органиче-
ских растворителях. В результате сочетания с солью диазо-
ния образуется азокраситель;
Тетраазотированный диоршаанузиЛш
(Окрашенный конечный
продукт)
белок
4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 81
ДДД-реакция позволяет проводить количественные ми-
кроспектрофотометрические измерения содержания SH-
групп в срезах тканей, ДДД-реагент может, кроме того, ис-
пользоваться для химического определения SH-rpynn
в белках.
Помимо описанного метода выявления SH-групп, с по-
мощью ДДД-реакции можно проводить общее определе-
ние SH- и S - S-групп, а также отдельно S - S-групп, В пер-
вом случае содержащиеся в срезах S - S-группы восстана-
вливают до SH-групп, а затем одновременно с уже
имеющимися в срезах SH-группами выявляют при помо-
щи ДДД-реагента,
Выявление отдельно S — S-групп проводится в два эта-
па. Сначала блокируют имеющиеся в тканях активные SH-
группы (например, иоданетатом или N-этилмалеимидом),
затем восстанавливают дисульфидные группы до
SH-групп и выявляют последние гистохимически,
3. Метод окисления надмуравьиной кислотой для выявления
S—S и SH-групп по Пирсу (Pearse, 1951)
В этом методе цистин окисляется надмуравьиной кис-
лотой. Образующиеся сульфиновые (HSO2), сульфоновые
(HSO3) или альдегидные группы реагируют с реактивом
Шиффа. HSO2 и HSO3 -группы можно определять также
методом измерения базофилии, Структуры, которые в от-
личие от необработанных контрольных препаратов после
окисления надмуравьиной кислотой связывают метиле-
новый синий при pH 2,8, должны содержать S — S- или
SH-группы.
R-5-5-» + 5Н СООН + HjO —* ZR-5O2O'H+ + 5НСООН
Цистин Надмуравьиная Цистеиновая Муравьиная
кислота кислота кислота
Предполагается, что альдегидные группы, образую-
щиеся из этиленовых групп липидов в результате окисле-
82 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ния надмуравьиной кислотой, также реагируют с реакти-
вом Шиффа.
—СН=СН— + 2Н • О • С • ОН -> 2—СНО + 2Н СООН
Этиленовая Надмуравьиная Альдегид Муравьиная
связь кислота кислота
Вследствие этого в условиях данной реакции определе-
ние базофилии является более предпочтительным, чем
применение реактива Шиффа. Вслед за окислением надму-
равьиной кислотой в течение 24 ч при 25°С срезы помет
щают в 5-10~4 М раствор метиленового синего, забуфе-
ренный глициновым буфером до pH 2,8, заключают под
покровное стекло в дистиллированной воде и сразу иссле-
дуют под микроскопом. Хорошие результаты достигаются
путем окрашивания основными красителями альциа-
новым синим и астрасиним (растворенными в 2 н. H2SO4).
Преимущество метода окисления с последующим окра-
шиванием альциановым синим и астрасиним основано на
избирательном окрашивании структуры с содержанием
цистеина выше 4%. Хорошим примером ^такого окрашива-
ния является избирательное выявление нейромедиаторов,
Сульфогруппы, образующиеся в результате окисления
кислым раствором КМпО4, можно выявлять с помощью
псевдоизоцианина в монохроматическом свете в обычном
или флуоресцентном микроскопе.
4.1.3. БЛОКИРОВАНИЕ И ПРЕВРАЩЕНИЕ РЕАК-
ЦИОННОСПОСОБНЫХ ГРУПП В БЕЛКАХ
Методы блокирования незаменимы в качестве контро-
ля при гистохимических реакциях. Блокирование осущест-
вляется путем разрушения определенных химических
групп, путем обратимого блокирования или в результате
связывания с образованием окрашенных комплексов или
комплексов, приобретающих окраску после соответствую-
щей дополнительной обработки. Эти методы могут одно-
временно служить реакциями выявления определенных
реакционноспособных групп (например, окислительное де-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 83
Таблица 19
Методы Блокированные группы или аминокислоты
Дезаминирование Динитрофенилирование -nh2 NH2-, фенольные, имидазольные, SH- группы
Ацилирование Нитробензоилирование Метилирование а) в мягких условиях б) в жестких условиях Деметилирование NH2-, окси-, фенольные и SH-группы NH2-, тирозил-ОН соон- СООН-, nh2- Этерифицированные кислые группы вновь высвобождаются
Окисление надмуравьиной кислотой Окисление надуксусной кислотой Окисление персульфатом Иодирование Окисление иодом Карбоксиалкилирование Блокирование малеинимидом Блокирование меркаптидом а) хлоридом ртути б) хлоридом фенил ртути Восстановление тиогликолатом Триптофан, цистин То же Триптофан Тирозин (триптофан) -SH -SH -SH -SH -SH -S-S-
заминирование, реакция с динитрофторбензолом).
В табл. 19 перечислены обычно используемые реакции
подобного, рода.
4.1.4. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВ-
ЛЕНИЕ БЕЛКОВ
Принципы используемых в световой микроскопии ме-
тодов, основанных на выявлении реакционноспособных
групп белков, применимы и в электронной микроскопии.
Но их основной недостаток состоит в слабом для элек-
тронной микроскопии контрастировании.
В табл. 20 представлены электронно-микроскопиче-
ские методы выявления белков, позволяющие получать до-
ступные интерпретации результаты.
84 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 20
Группе Метод Авторы
-nh2 Реакция нингидрин-Т- протеинат серебра Flynn (1970)
-S-S- Реакция метенамин — се- ребро — тиосульфат Swift (1969)
Основные амино- кислоты Контрастирование фос- форновольфрамовой кислотой Silverman, Glick (1969a, b)
Преимущественно имидозольные и фенильные группы Реакция сочетания с диазонием Tice, Bartnett (1965)
4.1.5. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ
РЕАКЦИЯ С ДИНИТРОФТОРБЕНЗОЛОМ (ДНФБ-РЕАКЦИЯ) ДЛЯ
ВЫЯВЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА—МОДИФИКАЦИЯ Б ЕР СТО НА
(BURSTONE)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в этаноле, ацетоне, формальдегиде; за-
ливка в парафин.
2. Промыть депарафинированные срезы в этаноле.
3. Обработать в 1%-ном растворе ДНФБ в 90%-ноМ
этаноле, содержащем 0,01 н. (0,04%) NaOH, 20—24 я пр»
комнатной температуре.
4. Промыть в четырех сменах 90%-ного этанола*.
5. Промыть в дистиллированной воде.
6. Восстановить 5%-ным дитионитом натри*
(Na2S2O4), 40 мин, 45 — 60° С (при этой процедуре желта*
окраска обесцвечивается; при комнатной температуре про*
должительность восстановления нитрогрупп больше). ?
7. Для диазотирования поместить срезы на 5 мин прй
температуре от 0 до —4° С в следующий раствор: 3
10%-ной серной кислоты (H2SO4) довести до 50 м*
5%-ным нитритом натрия (раствор NaNO2 и серную кио
лоту перед сливанием следует охладить до 4° С).
8. Промыть в дистиллированной воде.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 85
9. Обработать холодным (4° С) веронал-ацетатным
буфером (pH 9,2), насыщенным Н-кислотой или 0-нафто-
лом, 15 мин.
10. Промыть в дистиллированной воде и в 70%-ном
этаноле, содержащем 1% НС1.
И. Обезводить, просветлить в ксилоле и заключить
в синтетическую среду.
РЕЗУЛЬТАТ
Положительная реакция выражается в образовании
комплекса азокрасителя красновато-оранжевого цвета.
Поскольку выявляемые группы встречаются повсюду,
окрашивание наблюдается во всем срезе. Интенсивно
окрашиваются эластические волокна, коллагеновые волок-
на и эритроциты.
НИНГИДРИН-ШИФФ (АЛЛОКСАН-ШИФФ)-РЕАКЦИЯ ДЛЯ ВЫ-
ЯВЛЕНИЯ NHj-rPynn
МЕТОДИКА
1. Фиксация в жидкостях Карнуа, Ценкера, этаноле
с 5%-ной уксусной кислотой, заливка в парафин.
2. Депарафинировать срезы и промыть в двух сменах
абсолютного этанола.
3. Обработать срезы 0,5%-ным нингидрином или
1%-ным раствором аллоксана в абсолютном этаноле
(16^20 ч при 37°С).
4. Промыть проточной водой, 2—5 мин.
5. Поместить срезы в реактив Шиффа, 30 мин при ком-
натной температуре.
6. Промыть в 3-—4 сменах 8О2-воды (200 мл дистилли-
рованной воды +10 мл 10%-ного бисульфита натрия
+10 мл 1 н. НС1), 2 мин.
7. Промыть проточной водой, 10 мин.
8. Обезводить в спиртах, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
NHj-группы, связанные с белком, приобретают окра-
ску от красной до красно-фиолетовой.
86 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ПРИМЕЧАНИЯ
Пункт 6 можно опустить. После пункта 7 можно прове-
сти окрашивание ядер, например гемалауном. Поскольку
ЫН2-группы, связанные с белком, имеют повсеместное
распределение, реакцию с нингидрином или реакцию ал-
локсан-Шифф можно использовать также для ориентиро-
вочного изучения распределения белков.
СМЕШАННЫЙ МЕТОД С АНГИДРИДОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БО-
КОВЫХ КАРБОКСИЛЬНЫЕ ГРУПП ПО БАРНЕТУ И ЗЕЛИГМА-
НУ (BARRNETT, SELIGMAN)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: 10%-ный формальдегид, 80%-ный эта-
нол; заливка в парафин.
2. Депарафинировать срезы в петрелейном эфире, бы-
стро просушить и промыть в ледяной уксусной кислоте,^
2 мин.
3. Инкубация в смеси из равных частей уксусного ан-
гидрида и безводного пиридина, 1 ч щЗи 60°’С.
4. Промыть в ледяной уксусной кислоте и абсолют-
ном этаноле.
5. Инкубировать срезы в 0,1%-ном гидразиде 2-ок-;
си-3-нафтойной кислоты (50 мг гидразида растворить
в 2,5 мл теплой уксусной кислоты и добавить 47,5 мл 50%!
этанола), 2 ч при 22° С. '
6. Промыть в трех сменах 50%-ного этанола по
10 мин.
7. Инкубировать в 0,5 н. НС1, 10 мин при 22° С.
8. Промыть в дистиллированной воде и затем в трех
сменах 1%-ного бикарбоната натрия.
9. Промыть многократно в нескольких сменах ди-
стиллированной воды.
10. Перенести срезы в раствор из равных частей 0,06 М
фосфатного буфера Сёренсена (pH 7,6) и абсолютного эта-:
нола, к которому добавлен прочный синий В (1 мг/мл). Ре-
акция окрашивания развивается за 2—5 мин.
11. Промыть в дистиллированной воде.
12. Обезводить в спиртах; ксилол, бальзам.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 87
РЕЗУЛЬТАТ
Карбоксильные группы в боковых цепях, связанные
с белком, обусловливают пурпурно-красное окрашивание.
РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА ПО БЕЙКЕРУ (BAKER, 1956)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: формальдегид; заливка в парафин или
целлоидин.
2. Депарафинировать и провести через 50%-ный этанол
до дистиллированной воды. Целлоидиновые срезы толщи-
ной от 20 до 30 мкм провести через 50%-ный этанол до ди-
стиллированной воды.
3. Поместить срезы в стеклянный сосуд, наполненный
реактивом Миллона, и нагреть до кипения (реактив Мил-
лона: к 100 мл 10%-ной H2SO4 добавляют 10 г сульфата
ртути и при нагревании растворяют; раствор охлаждают
и доводят дистиллированной водой до 200 мл; к 5 мл это-
го раствора перед употреблением добавляют 0,5 мл 0,25%
нитрита натрия.
4. Охладить до комнатной температуры в течение не-
скольких минут.
5. Промыть срезы в трех сменах дистиллированной во-
ды, по 2 мин.
6. Заключить в глицерин-желатину, обезводить в эта-
ноле и заключить в бальзам через ксилол.
РЕЗУЛЬТАТ
Положительная реакция проявляется красным или жел-
товато-красным окрашиванием. Интенсивность окрашива-
ния зависит от количества тирозина в структурах, содержа-
щих белки.
РЕАКЦИЯ ДИМЕТИЛАМИНОБЕНЗАЛЬДЕГИД-НИТРИТ ПО
АДАМСУ (ADAMS, 1957)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: 4—10%-ный нейтральный формалин,
88 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
4—12 ч; 80%-ный этанол с 1%-ной трихлоруксусной кисло-
той, 24 ч; заливка в парафин.
2. Депарафинирование срезов в ксилоле, помещение
в абсолютный этанол, просушивание при комнатной темпе-
ратуре (30—50 с).
3. Обработать 50%-ным п-диметиламинобензальдеги-
дом в концентрированной НС1, 1 мин.
4. Поместить срезы в 1%-ный нитрит натрия в концен-
трированной НС1 на 1 мин.
5. Промыть срезы в проточной воде, 30 с.
6, Быстро промыть в 1%-ном HCl-этаноле.
7, Обезводить в спиртах возрастающей концентрации,
ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Белки, содержащие триптофан, окрашиваются в темно-
синий цвет различной интенсивности. Сильное окрашива-
ние дают: гранулы клеток Панета, гранулы пепсиногена
в главных клетках, зимогенные гранулы экзокринных кле-
ток поджелудочной железы (хороший тест-объект!),
мышцы, фибрин, фибриноид, нейрокератин, чеХлы воло-
сяных луковиц.
ПРИМЕЧАНИЯ
В п. 2 срезы вместо высушивания можно после удале-
ния этанола покрывать тонкой пленкой целлоидина
(0,25%-ный раствор целлоидина в смеси этанол-эфир
1:1).
Для приклеивания среза более пригодна хромат —
желатина, чем белок-глицерин.
РЕАКЦИЯ САКАГУЧИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АРГИНИНА; МОДИ-
ФИКАЦИЯ БЕЙКЕРА (BAKER, 1947)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: Ценкер, Буэн, Карнуа, Суза, сулема-фор-
малин по Гейденгайну (допустим также нейтральный фор-
малин); заливка в парафин.
4. Гистохимия Отдельных классов веществ и ферментов 89
2. Парафиновые срезы, приклеенные к предметному сте-
клу смесью белок—глицерин, депарафинировать в ксило-
ле или толуоле и после обработки абсолютным спиртом
покрыть тонкой пленкой целлоидина (1%-ный раствор цел-
лоидина в смеси этанол — эфир 1:1) и уплотнить в 70%-ном
этаноле.
3. Через 50%-ный этанол довести срезы до дистиллиро-
ванной воды и тщательно промыть.
4. Вынуть срезы из воды и высушить движениями на
воздухе.
5. Обработать раствором а-нафтол — гипохлорит нат-
рия 15 мин (приготовление раствора а-нафтол — гипохлорит
натрия: к 4 мл 1% NaOH добавить 4 капли 1%-ного рас-
твора а-нафтола в 70%-ном этаноле и 8 капель 1%-ного
раствора гипохлорита натрия; раствор необходимо гото-
вить непосредственно перед употреблением). Реакция
окрашивания развивается в реакционной смеси постепен-
но. .
6. Реактив слить с предметного стекла, препараты осто-
рожно просушить фильтровальной бумагой н поместить
на 3 мин в смесь высушенного пиридина и безводного
хлороформа.
7. Препараты заключить под покровное стекло в смесь
пиридин — хлороформ или в безводный пиридин. Посколь-
ку сохранность таких срезов непродолжительна, рекомен-
дуется просматривать их сразу.
РЕЗУЛЬТАТ '
Йелки, содержащие аргинин, окрашиваются в раз-
личные оттенки оранжевого.
ПРИМЕЧАНИЯ
Модификации реакции Сакагучи для гистохимического
выявления аргинина всегда связаны с определенными не-
достатками. Их можно суммировать следующим образом:
а) малая стабильность окраски, б) для проявления окра-
шивания требуется гипохлорит, который, однако, мешает
реакции образования красителя; в) щелочная реакционная
среда разрушающе действует на ткань; г) точная локализа-
90 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ция реакции затруднена возможной диффузией продукта.
Среди используемых вместо а-нафтола его про-
изводных наиболее интенсивную окраску дает 2,4-ди-
хлор-1-нафтол; эта окраска в щелочной среде достаточно
стабильна для фотометрических измерений.
ДИОКСИДИНАФТИЛДИСУЛЬФИД (ДЭД)-РЕАКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВ-
ЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКОМ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП
ПО БАРНЕТУ И ЗЕЛИГМАНУ (BARRNETT, SELIGMAN, 1952, 1953)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: смесь трихлоруксусной кислоты с этано-
лом (1%-ная трихлоруксусная кислота в 80%-ном этаноле),
24 ч, Карнуа, формалин.
2. Быстрая заливка в парафин (вакуумный сушильный
шкаф); парафиновые срезы прикрепляют небольшим коли-
чеством смеси белок—глицерин на предметное стекло.
3. Срезы депарафинировать и через серию спиртов по-
нижающейся концентрации довести до дистиллированной
воды.
Варианты: срезы, депарафинированные>в ксилоле, про-
мыть в абсолютном этаноле и покрыть 0,5%-ным целлои-
дином (0,5 г целлоидина растворить в 100 мл абсолютно-
го этанола и эфира 1:1). Тонкую пленку целлоидина на
срезах просушить, уплотнить в 70%-ном этаноле, перене-
сти срезы в дистиллированную воду.
4. Срезы обработать (в кювете) при +50° С ДДД-реа-
гентом (50 мг 2,2-диокси-6,6-динафтилдисульфида; 30 мл
абсолютного этанола; 70 мл натрцй-вероналового буфе-
ра, pH 8,5), 1 ч.
5. Кювету со срезами охладить при комнатной темпера-
туре, 10 мин.
6. Быстро промыть срезы в дистиллированной воде.
7. Промыть в дважды сменяемой дистиллированной во-
де. подкисленной до pH 4—4,5 уксусной кислотой, 10 мин.
8. После проведения через ряд спиртов возрастаю-
щей концентрации промыть срезы в двух сменах абсолют-
ного эфира. 5 мин.
9. Довести через ряд спиртов до дистиллированной
воды и сполоснуть в ней.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 91
10. Срезы при комнатной температуре поместить в све-
жеприготовленный 0,1%-ный раствор тетразотированного
диортоанизидина (соль прочного синего В) на 0,1 М фос-
фатном буфере Сёренсена, pH 7,4, 2 мин.
И. Промыть в проточной воде и затем в дистиллиро-
ванной.
12. Монтировать в глицерин-желатине или провести че-
рез серию спиртов возрастающей концентрации и ксилол
и заключить в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры с большим количеством активных SH-rpynn
окрашиваются в синий цвет, при меньшем количестве бо-
лее рассеянных SH-групп возникает красное окрашивание.
ПРИМЕЧАНИЯ
Для прохождения реакции имеет значение концентра-
ция используемой соли диазония. Более высокие концен-
трации ведут к получению непостоянных результатов.
Вместо прочного синего В можно использовать следую-
щие соли диазония: прочный красный RC, прочный синий
RR, прочный черный К. ДДД-реакция допускает проведе-
ние микроспектрофотометрической количественной оцен-
ки содержания SH-групп в срезах тканей. ДДД-реагент
можно также использовать для химического определения
SH-групп в белках.
МЕТОД ОКИСЛЕНИЯ НАДМУРАВЬИНОЙ КИСЛОТОЙ ДЛЯ ВЫ-
ЯВЛЕНИЯ S-S- И SH- ГРУПП ПО ПИРСУ (PEARSE, 1951)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: кальций-формол, формалин, Ценкер и др.,
заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды.
3. Обработать раствором надмуравьиной кислоты,
10—30 мин (к 40 мл 98%-ной муравьиной кислоты доба-
92 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
вить 4 мл 30%-ной свежей перекиси водорода (Н2О2)
и 0,5 мл концентрированной H2SO4; смесь готовить за час
до использования и применять не более 24 ч).
4. Срезы промыть в дистиллированной воде, 2—5 мин.
5. Поместить в реактив Шиффа, 30—60 мин. (Особенно
пригодны реактивы Шиффа, приготовленные по De Toma-
si, Itikawa.)
6. Промыть в проточной слегка теплой воде, 10 мин.
7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концен-
трации, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, содержащие цистин, в зависимости от его
количества окрашиваются в цвета от розового до темно-
красного. Особенно интенсивно окрашивается кератинсо-
держащие структуры. Четкую реакцию дают нейромедиа-
торы, содержащие S —S-группы, а т^кже базофильные
клетки передней доли гипофиза.
4.2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Нуклеиновые кислоты представляют собой полину-
клеотиды, образованные из многочисленных мононуклео-
тидов. Каждый мононуклеотид состоит из пентозы (дез-
оксирибозы или рибозы), ортофосфорной кислоты и пури-
нового или пиримидинового основания. Пентоза связана
диэфирной связью с фосфорной кислотой и гликозидной
связью—с основанием. Нуклеиновые кислоты объеди-
няются с основными белками (гистонами) в нуклеопро-
теиды. В животных и растительных тканях встречаются
два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая
кислота (ДНК, пентоза представлена дезоксирибозой)
и рибонуклеиновая кислота (РНК, пентоза представлена
рибозой). ДНК содержит пуриновые основания—аденин
и гуанин—и пиримидиновые основания—тимин и цито-
зин. В РНК тимин замещен урацилом. Согласно модели
Уотсона—Крика, молекула ДНК состоит из двух нера-
зветвленных полинуклеотидных цепей, закрученных в одну
двойную спираль вокруг общей оси. Пуриновое основание
одной цепи связано водородным мостиком с пиримиди-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 93
новым основанием другой. При этом возникают две воз-
можности спаривания оснований—аденина с тимином
и гуанина с цитозином. Подобное строение молекулы
ДНК играет роль как в объяснении генетической реплика-
ции молекулы ДНК, так и в гистохимическом ее выявле-
нии.
Согласно современным представлениям, РНК в от-
личие от ДНК всегда существует в виде одиночной
цепи.
Как правило, ДНК находится в клеточном ядре—в
хромосомах и в меньшей мере в митохондриях и пласти-
дах. РНК же встречается в цитоплазме, в ядрышках, в хро-
мосомах и в митохондриях. В цитоплазме РНК находится
главным образом в микросомной фракции (гранулы Пала-
да, связанные, с эндоплазматическим ретикулумом).
При гистохимическом выявлении нуклеиновых кислот
используются следующие принципы (табл. 21):
1. Выявление пуриновых и пиримидиновых оснований
по УФ-поглощению.
2. Выявление углеводного компонента.
3. Выявление фосфорной кислоты.
4. Выявление базофилии.
5. Выявление с помощью методов специфической фер-
ментативной и химической экстракции.
4.2.Г. ВЫЯВЛЕНИЕ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИ-
НОВЫХ ОСНОВАНИЙ ПО УФ-ПОГЛОЩЕНИЮ
Разработанные Касперссоном методы поглощения
ультрафиолетовых лучей для количественного и качествен-
ного выявления ДНК и РНК основаны на свойстве гетеро-
циклических колец пуриновых и пиримидиновых основа-
ний поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны
260 нм. Этот трудоемкий и технически сложный метод дал
сильный толчок исследованиям нуклеиновых кислот.
Правда, с его помощью нельзя проводить прямое диффе-
ренциальное выявление ДНК и РНК.
Гистохимические методы выявления нуклеиновых кислот
Таблица 2J
Основа Метод Результат реакции окрашивании Примечания
ДНК РНК
Пуриновые и пири- мидиновые осно- УФ-поглощенне при 2600 А + + Доступно количествен- ной оценке
вания Пентоза Фосфорная кислота Реакция Фёльгена Реакция Фёльгена - сереб- ро-метенамин (Korson, 1964) Метод Турчини (Blackler, Alexander, 1952) Флуорохромирование с по- мощью бис(4-аминофе- нил)-1,3,4-оксадиазола - БАО (Ruch, 1970) Определение базофилии Окрашивание галлоциани- ном и хромовыми квасца- ми (de Boer, Samaker, 1956) Метиленовый зеленый-пи- ронин (Kurnick, 1955) + + (Черное) Голубовато-пур- пурное + + + Зеленое Красно-оранже- вое + + Красное То же м 9»
Ферментативная и химическая эк- стракция Рибонуклеаза Дезоксирибонуклеаза Экстракция хлорной кисло- той Экстракция трихлоруксусной кислотой Экстпакпия соляной кисло- + + (10%-ная хлорная кислота, 18 ч, при 44° С + Надежные методы с дос- таточной специфич- ностью 10%-ная хлорная кислота за 20-30 мин при +70° С экстрагирует все нуклеи- новые кислоты 5-10%-ная трихлоруксус- ная кислота удаляет при +90° С за 10 мин все нуклеиновые кис- дохы
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 95
4.2.2. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДНОГО КОМ-
ПОНЕНТА
1. РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕНА
Этот классический метод выявления ДНК основан на
том, что в результате мягкого гидролиза под влиянием
1 н. НС1 в фиксированных препаратах происходит отще-
пление пуриновых оснований, связанных с Сх-атомом
дезоксирибозы.
C^-C^-Cj- С2- Ct -Пу
\
НО-Р^О
Св-С^-Сз-Сг-^-Пи
НСЬР^О
Сд— Cjj” С3- С2—q — Пу
+1,0н.НС1; + 60*С
4 //°
Св-CrCj-Cj-C,^
о
НО-Р=О
Cg- с^- Сз- с2- q - Пи
о
НО-Р=О
ce-c4-cs-c2-q'/
хн
Образующиеся при этом реакционноспособные аль-
дегидные группы дают с реактивом Шиффа кислото-
стойкий краситель — от красного до красно-фиолето-
вого цвета. Для гистохимического выявления ДНК
имеет значение тот факт, что при точном соблюдении ус-
ловий гидролиза фосфатные мостики дезоксирибозы не
96 4*. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
разрушаются; все соединение не теряет кислотного харак-
тера и сохраняет нерастворимость. Образования альдеги-
дов из рибозы РНК в результате кислотного гидролиза не
происходит, поскольку при этой процедуре РНК практиче-
ски полностью вымывается из среза. Поэтому при пра-
вильном проведений реакции Фёльгена РНК всегда
остается неокрашенной. Свободные альдегидные группы
(плазмали) выявляются в контрольных опытах при обра-
ботке реактивом Шиффа и без солянокислого гидроли-
за; это позволяет отдифференцировать их от альдегидных
групп пентозы, высвобождающихся в результате гидроли-
за. Правда, так называемая «плазмалевая реакция» встре-
чается, как правило, лишь в замороженных срезах.
Результаты реакции Фёльгена зависят от используемой
фиксирующей смеси и от продолжительности гидролиза.
Слишком продолжительный гидролиз ведет к расщепле-
нию эфирной фосфатной связи между С3 и С5 и, следова-
тельно, к образованию растворимого нуклеотида. Ниже
указано оптимальное время гидролиза для разных фикси-
рующих смесей:
Нейтральный формалин 8 мин
Карнуа * 8 мин
80%-ный этанол 5 мин
Формалин — этанол — уксусная кислота ~ 7 мин
Смесь с пикриновой кислотой 22 мин
по Буэну-Аллену
Ценкер .. 5 мин
Ньюкомер (растительная ткань) 10 мин
Ньюкомер (животная ткань) 20 мин
2. ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ БАО (RUCH,
197в)
В этой модифицированной реакции Фёльгена вместо
парарозанилина используется флуорохром БАО [бис-(4-
аминофенил)-1,3,4-оксадиазол]. Гидролиз можно прово-
дить при различных температурах и разных концентра-
циях НО. Для количественных исследований и для достиг
жения высокого контраста между клеточным ядром н ци-
топлазмой наиболее пригоден гидролиз с помощью 1 н.
НО при +60° С. Можно вместо БАО для флуорохроми-
рования взять аурамин О в концентрации 0,2%.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 97
3. РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕН- СЕРЕБРО -МЕТЕНАМИН (KORSON,
1964)
После гидролиза в 1 М лимонной кислоте в срезах раз-
вивается четкое черное окрашивание ДНК при обработке
в растворах метенамин — серебро. Сходные результаты
достигаются и при обычном солянокислом гидролизе при
+ 60°С.
4. МЕТОД ТУРЧИНИ (BLACKLER, ALEXANDER, 1952)
В этом методе за мягким гидролизом с помощью 1 н.
НС1 следует реакция с метилтриоксифлуореноном.
При этом углеводные компоненты нуклеиновых кислот,
реагируя с флуоренонами, образуют окрашенные соедине-
ния (ДНК—фиолетовое; РНК—желто-розовое).
4.2.3. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ ФОСФОРНОЙ КИС-
ЛОТЫ
Фосфатные группы нуклеиновых кислот можно выяв-
лять с помощью таких гистохимических методов, как
окрашивание основными красителями, микроозоление и
радиоавтография. Наибольшее применение в практике на-
шел метод окрашивания основными красителями.
1. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ
при ПОМОЩИ КИСЛОТНОГО ГИДРОЛИЗА
Методы выявления фосфатных групп ДНК основаны
на кислотном гидролизе в присутствии молибдата аммо-
ния. Осадок фосфомолибдата аммония на втором этапе
реакции восстанавливается бензидином до молибденовой
сини (например, Serra, Queiroz Lopes, 1945). Диффузное си-
нее окрашивание, развивающееся в результате реакции, не
позволяет установить четкой локализации.
2. ВЫЯВЛЕНИЕ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ ОСНОВНЫМИ КРАСИ-
ТЕЛЯМИ
Основные красители дают с отрицательно заряженны-
ми фосфатными группами более или менее избирательное
4-235
98 4„ Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
окрашивание. Поскольку ни один из методов окрашивания
нуклеиновых кислот не является абсолютно специфичным,
необходимо проводить контрольные реакции, чтобы выяс-
нить, действительно ли выявляемые кислотные группы
принадлежат нуклеиновым кислотам.
а) ОКРАШИВАНИЕ ТИАЗИНОВЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ
Из группы этих красителей можно рекомендовать ме-
тиленовый синий:
Этот легкоокисляемый краситель может содержать
примеси азуров или метилового фиолетового. Окрашива-
ние забуференным раствором метиленового синего дает
надежные результаты. Следует обращать внимание на то,
что при значениях pH от 3 до 5 окрашиваются не только
нуклеиновые кислоты, но и кислые мукополисахариды. Их
удается отдифференцировать с помощью контрольных
опытов с нуклеазами.
Для выявления нуклеиновых кислот помимо метилено-
вого синего можно использовать и толуидиновый синий,
который при pH 4,0—6,0 связывается с РНК в стехиоме-
трических соотношениях. Различное окрашивание обеих
нуклеиновых кислот можно получить при помощи метода
Федера и Вольфа (Feder, Wolf) с использованием акролеина
и толуидинового синего (ДНК—темно-синий цвет;
РНК—нежно-красный). Крезиловый фиолетовый реаги-
рует с РНК стехиометрически (при pH 4,2) и поэтому мо-
жет быть использован для цитофотометрического количе-
ственного определения РНК.
б) ОКРАШИВАНИЕ КОМПЛЕКСОМ ГАЛЛОЦИАНИН - ХРОМОВЫЕ
КВАСЦЫ
В результате этого простого окрашивания обе нуклеи-
новые кислоты приобретают темно-синий цвет. Специфич-
ность окрашивания зависит от pH раствора красителя;
При значениях pH от 1,5 до 1,7 специфичность по отношен
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 99
нию к нуклеиновым кислотам довольно высока. Принад-
лежащий к оксазиновым красителям галлоцианин в во-
дных растворах существует в виде катиона. Образование
комплекса галлоцианина с хромовыми квасцами ведет
к появлению новых красящих свойств. За связывание ком-
плекса галлоцианин — хромовые квасцы с нуклеиновыми
кислотами ответствен главным образом хром.
Ниже приводится структура комплекса (Harms) и меха-
низм его связывания с ДНК (Sandritter):
Дезоксирибоза
СООН
Предполагается, что при взаимодействии катионов
красителя с нуклеиновыми кислотами каждая фосфатная
группа нуклеиновой кислоты связывается с одной мо-
лекулой красителя.
Поскольку краситель соединяется с субстратом в сте-
хиометрических соотношениях, этот метод может быть ис-
пользован для количественного цитофотометрического
определения. Для такого определения имеет также значе-
ние то, что комплекс галлоцианин — хромовые квасцы
связывается с нуклеиновыми кислотами весьма прочно.
в) ОКРАШИВАНИЕ МЕТИЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ - ПИРОНИНОМ ДЛЯ ИЗБИ-
РАТЕЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК
Окрашивание метиловым зеленым — пиронином было
4»
100 4. Гистохимия отдельных классов веществ и 4>ерментов
введено в практику в качестве эмпирического метода еще
Паппенгеймом (Pappenheim). Более тщательные исследо-
вания, особенно в сочетании с расщеплением рибонуклеазой
для установления специфичности окрашивания РНК пиро-
нином, показали, что при помощи этого метода на одном
срезе одновременно выявляются и ДНК, и РНК. Интер-
претация дифференциального выявления ДНК и РНК с по-
мощью метилового зеленого и пиронина, из которых оба
являются катионными красителями, долгое время натал-
кивалась на трудности. Предполагается, что в данном ме-
тоде поведение красителя объясняется не электростатиче-
скими взаимоотношениями красителя с нуклеиновыми
кислотами, а различной степенью полимеризации обеих
нуклеиновых кислот. Значительно большие по размерам
молекулы ДНК всегда связываются с метиловым зеленым,
тогда как менее полимеризованные молекулы РНК за-
хватывают пиронин. Определенным свидетельством в по-
льзу такого предположения может служить тот факт, что
после деполимеризации ДНК окрашивается пиронином.
Интенсивность окрашивания метиловым зеленым
в контролируемых условиях можно оценивать количе-
ственно с помощью цитофотометрии. Полученные при
этом результаты следует, однако, сравнивать с результата-
ми других методов, таких, как реакция Фёльгена или био-
химическое определение. Взаимодействие пиронина с РНК
протекает, по-видимому, нестехиометрично. Поэтому пи-
ронин малопригоден для количественного анализа.
Структурная ффмула пиронина Y (GJ
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 101
4.2.4. ВЫЯВЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПО-
МОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ХИ-
МИЧЕСКОЙ ЭКСТРАКЦИИ
Удалять нуклеиновые кислоты из гистологических сре-
зов можно двумя способами:
1) путем воздействия ферментом; 2) путем химической
экстракции.
Хотя оба способа имеют определенные недостатки,
предпочтение все же следует отдать ферментативным ме-
тодам. Из факторов, влияющих на действие фермента
t (концентрация фермента в растворе, температура, pH
“и др.), в первую очередь следует учитывать влияние фикса-
ции на ткань.
4.2.5. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯ-
ВЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Методы электронно-микроскопического выявления ну-
клеиновых кислот лишь начинают разрабатываться.
Имеющиеся в распоряжении исследователя методы по-
.зволяют проводить ультраструктурное выявление ДНК
и РНК главным образом с помощью различных приемов
контрастирования: все они, однако, сопряжены со значи-
тельной неопределенностью получаемых результатов. Хо-
рошее контрастирование ДНК и РНК достигается с по-
мощью растворов уранилацетата и солей свинца. Можно
повысить специфичность контрастирования по отноше-
нию к нуклеиновым кислотам путем исключения белков.
Применяемые методы приведены в табл. 22.
4.2.6. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИС-
ЛОТ
СТАНДАРТНАЯ РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕНА
МЕТОДИКА
1. Фиксация одним из перечисленных выше (стр. 96)
фиксирующих веществ, заливка в парафин.
Таблица 22
Методы ультрагистохимического выявления нуклеиновых кислот (но Geyer, с изменениями)
Нуклеиновые кислоты Метод Авторы Примечания
ДНК Тиокарбазид-протеинат се- ребра Требуются контроли специфич- ности, например блокирование альдегидных групп, расщепле- ние ДНК
ДНК и РНК Акрифлавин - фосфоволь- фрамовая кислота (Акр- ФВК) А) Контрастирование спирто- вым раствором Акр-ФВК Б) Контрастирование вод- ным раствором Акр-ФВК Chan-Curtis., Belt, La- doulis (1970) Контрастирование хроматина, яд- рышек и рибосом; кроме того, раствор Б контрастирует миели- новую оболочку
РНК Регрессивное контрастиро- вание уранилацетатом Bernhard (1969) Близкое к избирательному кон- трастирование рибонуклеопро- . теидов; специфичность контрастирования РНК следует проверить в контрольных опы- тах с химическим или фермен- тативным расщеплением нуклеи- новых кислот
ДНК или РНК Расщепление нуклеиновых кислот в толстых срезах Swift (1962, 1964) Для каждого исследуемого объек- та необходимо предварительно подобрать оптимальные усло- вия кислотного или фермента- тивного гидролиза
ДНК или РНК Расщепление нуклеиновых кислот в гликольмета- крилатных ультратонких срезах Leduc, Marinozzi, Bernhard (1961, 1963) Хорошая сохранность структуры и быстрое расщепление ДНКа- зой и РНКазой
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 103
2, Срезы депарафинировать и через рад спиртов убы-
вающей концентрации довести до воды.
3. Быстро промыть в холодной 1 н. НС1.
4. Срезы поместить при 60° С в 1 н. НС1 на опти-
мальное время гидролиза.
5. Быстро промыть в 1 н. НС1, а затем в дистиллиро-
ванной воде.
6. Перенести в реактив Шиффа (стр. 131) на 45 мин.
7. Промыть в 3 сменах свежей 8О2-воды (5 мл
10% K2S2O5, 5 мл 1 н. НС1, дистиллированная вода до
100 мл), 3x2 мин.
8. Промыть в дистиллированной воде, 2 мин.
9. Возможна докраска 0,5%-ным светлым зеленым,
20 с.
10. Обезвоживание в спиртах возрастающей концент-
рации, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в красно-
лиловый цвет. После обработки дезоксирибонуклеазой ре-
акция отрицательна.
ПРИМЕЧАНИЯ
В замороженных срезах реактив Шиффа окрашивает
помимо ДНК и ацетальфосфатиды. Для проведения ги-
дролиза вместо 1 н. НС1 можно использовать следующие
реагенты: хлорную кислоту, трихлоруксусную кислоту,
еорную кислоту, азотную кислоту, серную кислоту,
Интенсивность реакции Фёльгена можно оценивать ко-
личественно с помощью цитофотометрических измерений,
поскольку при оптимальных сроках гидролиза реакция
окрашивания альдегидных групп пропорциональна содер-
жанию ДНК. Сопоставимые результаты можно получать
при полном соблюдении постоянных условий опыта, та-
ких, как способ фиксации, продолжительность и темпера-
тура гидролиза, качество реактива Ши< фа, состав
8О2-воды.
104 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов -
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК
С ПОМОЩЬЮ БАО (RUCH, 1970)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в этаноле, этанолуксусной кислоте или
формальдегиде.
2. Депарафинированные срезы, клетки или изолиро-
ванные субклеточные частицы поместить в дистиллиро-
ванную воду на 2 мин.
3. Срезы поместить при +60° С в 1 н. НС1 на опти-
мальное время гидролиза (8 — 12 мин).
4. Промыть в дистиллированной воде, 5 мин.
5. Окрасить БАО-раствором (100 мл 0,01% БАО-ра-
створа, 10 мл 1 н. НС1, 5 мл 10% NaHSOJ, 2 ч.
6. Промыть в дистиллированной воде, 2 мин.
7. Промыть в растворе сульфита (180 мл дистиллиро-
ванной воды, 10 мл 1 н. НС1, 10 мл 10% NaHSO3), 3 х
х 2 мин.
8. Промыть в проточной воде, 10 мин.
9. Обезводить в 50, 70, 95 и 100%-ном этаноле, по 30 с.
10. Просветлить глицерином или ксилилом, 2 х 30 с.
11. Заключить во флуормаунт. *
12. Исследовать в флуоресцентном микроскопе; фильтр
УФ (UG1), пропускающий возбуждающий свет.
РЕЗУЛЬТАТ
Хроматиновые структуры дают яркую синюю флуорес-
ценцию.
ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК И РНК МЕТИЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ -
ПИРОНИНОМ (МОДИФИКАЦИЯ KURNICK 1955)
МЕТОДИКА
1. Фиксация 10%-ным забуференным формальдегидом,
pH 7,0, 4—12 ч или по Карнуа, 4—24 ч при +4°С; за-
ливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 105
3. Окрасить срезы в смеси метилового зеленого—пи-
ронина, 6 мин при температуре от 4-18 до 4- 24°С. (Смесь
метилового зеленого с пиронином: 12,5 мл 2%-ного пи-
ронина GS (Chroma), 7,5 мл 2%-ного метилового зеленого
(Fluka), 30 мл дистиллированной воды.)
4. Просушить фильтровальной бумагой.
5. Дифференцировать в н-бутаноле, 2x5 мин.
6. Просветлить в ксилоле, 3x5 мин.
7. Заключить в нейтральный бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в голубо-
вато-зеленый цвет, а содержащие РНК—в красный.
КОНТРОЛЬ
Предварительная обработка срезов рибонуклеазой или
дезоксирибонуклеазой. В зависимости от фермента
остаются неокрашенными места локализации РНК или
ДНК.
ПРИМЕЧАНИЯ
В метиловом зеленом седьмая метильная группа фик-
сирована слабо. Поэтому данный краситель обычно содер-
жит примесь метилового фиолетового. Эту примесь реко-
мендуется перед использованием удалять экстракцией
в хлороформе, лучше всего путем встряхивания в дели-
тельной воронке.
При оценке содержания РНК в клетке следует обра-
щать внимание на то, что пиронин частично экстрагирует-
ся из срезов при промывании и обезвоживании.
ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК И РНК СМЕСЬЮ Г АЛЛОЦИАНИН -
ХРОМОВЫЕ КВАСЦЫ
МЕТОДИКА
1. Фиксация маленьких кусочков ткани в жидкости
106 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Карнуа или в этаноле, 2—4 ч при температуре от +2 до
+4° С, заливка в парафин.
2. Срезы депарафинировать и через рад спиртов убы-
вающей концентрации довести до воды.
3. Поместить при комнатной температуре в раствор
галлоциананин — хромовые квасцы на 24—48 ч.
Приготовление красителя: 0,15 г галлоцианина кипя-
тить в 10 мл 5%-ных хромовых квасцов; после охлаждения
профильтровать и довести дистиллированной водой до
100 мл pH красящего раствора довести до 1,64 (можно
1 н. НС1).
4. Дифференцировка желаемой продолжительности
в дистиллированной воде, рад спиртов возрастающей кон-
центрации, заключение в нейтральный бальзам или цедакс.
РЕЗУЛЬТАТ
Ядра, цитоплазматические структуры, содержащие
РНК, такие, как тельца Ниссля в нервных клетках, окраши-
ваются в темно-синий или черный цвет.
ПРИМЕЧАНИЯ
Продолжительность окрашивания можно сократить
(правда, при одновременном усилении неспецифического
окрашивания) 'благодаря повышению температуры
(44—56° С) до 4 ч. Галлоцианин—хромовые квасцы
можно также использовать для докрашивания ядер при
радиоавтографии.
МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
а) ЭКСТРАКЦИЯ НУКЛЕАЗАМИ
МЕТОДИКА
1. Фиксация в жидкости Карнуа, заливка в парафин.
2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убы-
вающей концентрации довести до дистиллированной во-
ды.
3. Инкубировать при 4- 37°С в растворе кристалличе-
ской рибонуклеазы или дезоксирибонуклеазы в концентра-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 107
ции от 0,5 до 1 мг в 1 мл дистиллированной воды, 1—3 ч;
параллельные срезы инкубируют в аналогичных условиях
в дистиллированной воде.
4. Промыть в дистиллированной воде.
5. Окрашивать обработанные ферментом и кон-
трольные срезы основным красителем.
РЕЗУЛЬТАТ
Базофильный материал, удаляемый рибонуклеазой,—
РНК, а удаляемый дезоксирибонуклеазой,—ДНК.
ПРИМЕЧАНИЯ
Используемая рибонуклеаза должна быть свободна от
примесей солей и протеаз; Ценкер-формол в качестве фик-
сирующего средства непригоден. Дезоксирибонуклеазы
при воздействии высокой температуры денатурируются
и инактивируются. Для подавления протеолитической ак-
тивности дезоксирибонуклеазы в инкубационную среду
можно добавить 0,05 М цистеин или гидроксиламин.
б) ЭКСТРАКЦИЯ соляной кислотой
МЕТОДИКА
1. Фиксация в жидкости Карнуа или этанол-уксусной
кислоте, заливка в парафин.
' 2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убы-
вающей концентрации довести до дистиллированной во-
ды.
3. Для удаления РНК срезы обработать 2 н. НС1 при
4- 3°С, 16 ч, или 1 н. НС1 при 4- 60°С, 3—10 мин. Для уда-
ления РНК и ДНК поместить срезы в 1 н. НС1 при 4- 60°С
на 20—30 мин.
4. Срезы тщательно промыть и провести реакцию на
нуклеиновые кислоты.
108 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ПРИМЕЧАНИЯ
Экстракция соляной кислотой не является специфичной
в узком смысле этого слова. Сохранность ткани в этом
случае лучше, чем при экстракции хлорной или трихлорук-
сусной кислотой.
4.3. УГЛЕВОДЫ
Методы гистохимического выявления углеводов отно-
сятся, как правило, к методам общего анализа групп. Раз-
работка методов идентификации отдельных углеводов на-
ходится лишь в начальной стадии.
4.3.1. КЛАССИФИКАЦИЯ УГЛЕВОДОВ
Знание структуры и свойств углеводов является необхо-
димой предпосылкой для развития методов их гистохими-
ческого анализа. Часто бывает трудно привести и согласо-
вать результаты гистохимических и биохимических иссле-
дований.
Углеводы можно разделить на трц основные группы:
1. Моносахариды. 2. Олигосахариды. 3. Полисахариды.
Моносахариды, или простые сахара, равно как и олигоса-
хариды (сложные углеводы, молекулы которых состоят из
небольшого числа моносахаридных единиц), находятся
в организме главным образом в растворенном состоянии,
и поэтому выявить их гистохимическими методами очень
трудно. Исключение составляют моносахариды, свя-
занные в форме гликолипидов, и нейраминовая кислота.
Полисахариды состоят из моносахаридных единиц,
связанных в цепочки гликозидными связями. К ним отно-
сится гликоген, который в тканях встречается в комплексе
с белками и липоидами.
В тканях встречаются следующие полисахариды.
1. Запасаемые полисахариды, например гликоген, пред-
шественники гликогена и крахмал.
2. Нейтральные мукополисахариды (нейтральные му-
коидные вещества). К нейтральным полисахаридам, свя-
занным с белками, принадлежат, в частности, хитин, слизь
желудка свиньи, углеводы, образующие капсулу пневмо-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 109
кокков, а также некоторые продукты секреции желез эпите-
лиального происхождения.
3. Кислые мукополисахариды (кислые мукоидные веще-
ства). Полисахариды этой группы состоят из гексозамина
и гексуроновой кислоты. Кислый характер этих полисаха-
ридов объясняется, присутствием в них радикалов серной,
сиаловой, глюкуроновой, идуроновой кислот или других
групп, дающих кислую реакцию.
4. Мукопротеиды представляют собой полисахариды,
ковалентно связанные с пептидами и содержащие более 4%
гексозамина. Во многих случаях концевой группой являет-
ся сиаловая кислота. В качестве примера можно назвать
муцины подчелюстной железы и слизистой оболочки
желудка.
5. Гликопротеиды, например овальбумин, фракции сы-
вороточного альбумина и сывороточного глобулина (им-
муноглобулины), коллаген и ретикулин, близки к мукопро-
теидам, но содержат менее 4% гексозамина.
6. Гликолипиды содержат жирные кислоты, сфингозин
и углеводы. Они представлены главным образом церебро-
зидами и ганглиозидами. В качестве углеводного компо-
нента в них содержатся гексозы (глюкоза или преимуще-
ственно галактоза в цереброзидах); нейраминовая кислота
представлена сиаловыми кислотами.
За исключением запасаемых полисахаридов (гликоген,
крахмал), все прочие углеводы в гистохимии в настоящее
время классифицируются как мукополисахариды (му-
коидные вещества).
, Согласно Спайсеру и сотр. (Spicer u. Mitarb.) тканевые
полисахариды делят, исходя из двух основных аспектов:
1) локализации выявляемых веществ,
2) характера реакции—нейтральные и кислые муко-
вещества (сульфомуцин и сиаломуцин).
Такое разделение осуществляется на основании присут-
ствия или отсутствия вицинальных гликолей, уроновых
кислот, сульфатных групп и карбоксилов сиаловых кислот.
Эти компоненты обозначаются буквами Г, У, Су, Си. Воз-
можна и более подробная классификация углеводов в зави-
симости от их отношения к реакциям окрашивания.
В табл. 23 дана классификация углеводов; приставка «му-
ке», обычно используемая в гистохимии углеводов, здесь
опущена.
Таблица 23
Классификация углеводов (Pearse, с изменениями)
I. Гликаны (полисахариды или олигосахариды)
а) Гомогликан (моносахаридный компо-
нент)
Гликоген
Крахмал
Целлюлоза
Декстран
Галактан (Helix)
б) Гомоаминогликан
Хитин
в) Гомогликуронан
Пектиновая кислота
Альгининовая кислота
г) Гетерогликаны (полисахаридные компо-
ненты мукополисахаридов)
Сиалогликаны
(хондроитинсуль-
(хондроитинсуль-
III.
IV.
II. Протеогликаны
Кератансульфаты
Гиалуроновая кислота
Хондроитин-4-сульфат
фат А)
Хондроитин-6-сульфат
фат С)
Дерматансульфат (хондроитинсульфат В)
Гепарин
Гиалуроновая кислота
Хитин-белок
Группоспецифические антигены крови
Гликопротеиды и гликополипептиды
Овомукоид
Мукоид слюнных желез (сиалогликопротеид)
Гликопротеид сыворотки (включая имму-
ноглобулины)
Гликолипиды
Цереброзиды
Ганглиозиды
Комплекс гликолипид-белок
Муколипид из мозга крупного рогатого скота
Страндин
_____4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 111
4.3.2. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ
УГЛЕВОДОВ
Гистохимические методы выявления углеводов можно
разделить на методы окисления, метахроматическое окра-
шивание, связывание ионов металлов, реакции блокирова-
ния и превращения реакционноспособных групп, методы
ферментативного гидролиза, а также методы радиоавто-
графии и иммуногистохимии полисахаридов. Центральное
место среди этих методов занимает ШИК-реакция (реак-
тив Шиффа — иодная кислота) для выявления полисахари-
дов.
43.2.1. МЕТОДЫ ОКИСЛЕНИЯ
4.3.2.1.1. РЕАКЦИЯ ШИФФ - ИОДНАЯ КИСЛОТА (ШИК-РЕАКЦИЯ)
Метод, предложенный Малапраде (Malaprade) в анали-
тической химии для выявления полиспиртов, впоследствии
был с успехом модифицирован для гистохимических целей
Мак-Манусом (McManus, 1946), Лилли (Lillie, 1947) и Хоч-
киссом (Hotchkiss, 1948). Химическим субстратом окисле-
ния иодной кислотой являются ос-гликоли, т. е. спирты,
в которых соседние атомы углерода несут гидроксильные
группы. Иодная кислота воздействует на обе гидрок-
сильные группы ос-гликолей и при расщеплении С —
— С-связей в результате окисления образуются диальде-
гиды.
R'CH-O\
R СН-ОХ
R СН-О\
>03-
R СН-О'
Гликолевые группы могут находиться в цис- или транс-
положении. Окисление цис-ориентированных гидроксилов
проходит быстрее, чем в случае транс-гидроксилов.
Помимо а-гликолей с иодной кислотой могут реагиро-
вать с образованием альдегидов также и карбонильные со-
единения (например, ос-кетолы), а-аминоспирты и иногда
этиленовые группы.
Из большого числа встречающихся в различных веще-
ствах а-гликолей положительную реакцию дают лишь те,
в которых гидроксильные группы не замещены.
112 4. Гистохимия отдельных' классов веществ и ферментов
Согласно Хочкиссу, ШИК-реакция положительна при
следующих условиях:
1. Выявляемые специфические группы (1,2-гликолевые,
эквивалентные аминоалкиламино-производные, продукты
окисления СНОН—СО) не должны быть замещены.
2. Вещества должны выдерживать фиксацию.
3. Продукт окисления иодной кислотой не должен об-
ладать способностью к диффузии.
4. Должно быть достаточно много реакционноспособ-
ных групп для взаимодействия с реактивом Шиффа.
При соблюдении перечисленных условий белки хотя
и содержат остатки оксиаминокислот, не дают ШИК-
реакции, поскольку реакционноспособные группы замеще-
ны пептидными связями и соответственно защищены от
окисляющего действия иодной кислоты. Список основ-
ных веществ, дающих ШИК-реакцию на гистологических
срезах, приведен в табл. 24.
Надежность ШИК-реакции в значительной мере опре-
деляется процессом окисления иодной кислотой. При
концентрациях растворов иодной кислоты от 0,5 до .2,5%
интенсивность реакции примерно одинакова. В гистохими-
ческой практике обычно используют 0,5г- 1%-ные раство-
ры. Среди факторов, влияющих на интенсивность реак-
ции, в первую очередь следует упомянуть продолжитель-
ность окисления и температуру, при которой проводит-
ся реакция. Повышение температуры всего на несколько
градусов увеличивает скорость окисления и препятствует
превращению 1,2-гликолей в диальдегиды под влиянием
иодной кислоты. Поэтому ШИК-реакцию следует прово-
дить при комнатной температуре. Продолжительность
окисления иодной кислотой следует ограничить 10 мин,
поскольку за это время ос-гликоли и а-спирты в условиях
гистохимической реакции практически полностью окисля-
ются. При выявлении веществ, относящихся к группам
I, II, III (табл. 24), эти условия необходимо соблюдать.
4.З.2.1.2. ОКИСЛЯЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ВМЕСТО ИОД-
НОЙ КИСЛОТЫ
При гистохимическом выявлении углеводов вместо
иодной кислоты можно использовать другие окисляющие
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 113
Таблица 24
ШИК-ноложигельные комиженты псам (Pearse)
I. Полисахариды (гликаны) II. Аминогликаны и глюкуроно- аминогли- каны III. Гликопротеи- ды и глико- пептиды Мукоид слюнных желез, серо- мукоид, серогликоид, муко- ид желудка, гонадотропный гормон хориона Гонадотропные гормоны гипо- физа, тиреотропный гормон гипофиза, группоспецифичес- кий антиген крови Тиреоглобулин Ганглиозиды (Керазин Цереброзиды । Френозин Гликоген Крахмал Целлюлоза Сиалогликан Фракции: сывороточного альбумина сывороточного глобулина Коллаген Инозитолфосфа- тиды
IV. Гликолипиды
V. Ненасыщенные Сфингомиелин Липофусцин
липиды н Кардиолипин
фосфоли- Церонд
ПИДЫ
вещества. Наиболее часто используют ацетат свинца, хро-
мовую кислоту, перманганат, висмутат натрия, ацетат на-
трия, арилиодацетат и фенилиодацетат.
Однако все эти вещества по своим окисляющим свой-
ствам в условиях проведения гистохимических реакций
уступают иодной кислоте. Прежде всего речь идет о недо-
статочной контролируемости окисляющего действия, что
особенно относится к хромовой кислоте и перманганату,
у которых обнаруживается тенденция к дальнейшему окис-
лению образующихся альдегидных групп. Заслуживает
рассмотрения механизм окисления ацетатом свинца, ко-
торый обладает способностью окислять только те гидрок-
сильные группы, которые находятся в t/uc-положении от-
носительно друг друга, тогда как иодная кислота
воздействует на гидроксильные группы, находящиеся
в цис- и транс-положении.
114 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
В то время как тетраацетат свинца и иодная кислота ве-
дут себя одинаково по отношению к 1,2-гликолям, тетра-
ацетат свинца образует из ос-аминоспиртов один, а иодная
кислота два иодных радикала. ос-Оксикислоты окисляются
только тетраацетатом свинца с образованием альде-
гидных групп, но не окисляются иодной кислотой.
Методы окисления тетраацетатом свинца в сочетании
с реактивом Шиффа (ТСШ-реакция) ведут к образованию
тех же продуктов реакции, что и в случае окисления иодной
кислотой (ШИК-реакция). Предполагается, что ТСШ-реак-
ция в присутствии белков более специфична для полисаха-
ридов, чем ШИК-реакция.
Хромовая кислота в качестве окисляющего агента осо-
бенно для выявления гликогена впервые была использова-
на Бауером (Bauer). Поскольку эта кислота, подобно пер-
манганату, имеет тенденцию окислять альдегидные
группы далее до карбоксильных, продолжительным хро-
мированием, а также повышением концентрации хромо-
вой кислоты ослабляют интенсивность реакции. В отноше-
нии использования висмутата натрия, ацетата марганца
и фенилацетата в качестве окисляющих агентов в гистохи-
мии углеводов необходимы дальнейшие исследования.
4.З.2.1.З. ИОДНАЯ КИСЛОТА - ПСЕВДО-ШИФФ-РЕАКЦИИ
Для выявления альдегидных групп, образовавшихся
в результате окисления иодной кислотой, вместо фуксин-
сернистой кислоты (реактив Шиффа) можно использовать
основные красители из серии аминоакридинов в водных
растворах, к которым добавляют минеральную кислоту и
SO2. Механизм взаимодействия этих реагентов с альдеги-
дами отличается от механизма реакции Шиффа. Можно
предположить, что псевдо-Шифф-реагенты помимо обра-
зовавшихся полиальдегидов выявляют также базофильные
структуры, содержащие РО4- или 8О4-группы (Stoward).
4.З.2.1.4. МЕТОДЫ ОКИСЛЕНИЯ ИОДНОЙ КИСЛОТОЙ, В КОТОРЫХ ВМЕ-
СТО ОСНОВАНИЯ ШИФФА ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ДРУГИЕ РЕАКТИВЫ
В этих методах выявления мукоидных веществ в каче-
стве окисляющего агента используется иодная кислота,
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 115
а для выявления образованных альдегидных групп вместо
основания Шиффа используют гидразид салициловой кис-
лоты, фенилгидразон, ариламин, парадиамин и др. Меха-
низм реакции альдегид-фенилгидразонов с солями диазо-
ния представлен на следующей схеме:
2 R~CH=NNH^^
Фенилгидразон
Диазотированный
о-дианизидин
Дирюрмазан
(темно-красный )
4.3.2.2. КОНТРОЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИ-
ФИЧНОСТИ МЕТОДОВ ОКИСЛЕНИЯ
Специфичность методов, основанных на окислении иод-
ной кислотой, особенно ШИК-реакции, можно контро-
лировать путем ацетилирования реакционноспособных
групп. Ацетилирование блокирует реакционноспособные
гидроксильные и аминогруппы полисахаридов. При этом
способность к реакции теряют практически все ШИК-по-
ложительные вещества. Поскольку двойные связи ненасы-
щенных жирных кислот в результате ацетилирования
остаются неизменными и таким образом сохраняют свою
способность окисляться, реакцию ацетилирования можно
использовать для различения ШИК-положительных со-
116 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
единений, содержащих липиды и свободных от них. При
обработке слабыми щелочами блокирование реакционно-
способных групп может быть обратимым.
неон
।
неон
।
Пиридин
+ (СН3 СО)г О --------•
нс-о-с=о
I
нс-о-с=о
I I
СНз
1,2-гликоль Зйгдоим? ангидрид 1,2-ацетилэфир
! V”
НС“0-0=0
НС-0-С=0
1 I
СНз
+ 2 КОН
неон
неон
+ 2СН,С00К
Омыление
43.23. ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ
Для гистохимического выявления кислых мукоидных
веществ и дифференцировки их от ШИК-положительных
нейтральных используют следующие приемы.
1. Определение метахромазии.
2. Реакцию связывания коллоидных металлов.
3. Окрашивание альциановым синим.
4. Окрашивание астрасиним.
5. Выявление базофилии.
6. Методы блокирования кислых групп.
7. Экстрагирование гиалуронидазой.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАХРОМАЗИИ
Метахромазия выражается в изменении спектров по-
глощения используемых красителей в гистохимических ус-
ловиях при окрашивании определенных элементов тканей
и клеток. При окраске толуидиновым синим наблюдается
метахромазия от красно-фиолетового до красного. Под
метахромотропностью понимают способность компонен-
тов ткани вызывать метахроматическое смещение. Термин
«сила метахромотропности» (Graumann, 1959, 1961) помо-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 117
гает охарактеризовать различия между отдельными
кислыми мукоидными веществами.
Метахромазия определяется по двум критериям (Pear-
se, 1968):
а) смещение максимума поглощения красителя в сторо-
ну более коротких волн (табл. 25);
б) уменьшение молярного коэффициента экстинкции
в области максимума поглощения.
Таблица 25
Спектры поглощения красителей, дающих метахро-
мазию (Pearse, 1968)
Краситель Максимум поглощения, нм
ортохроматический метахроматический
Толуидиновый си- ний 630 480-540
Азур А 620 480-530
Метиленовый си- ний 665 570
Крезиловый синий 625 530
Кристаллический фиолетовый 590 510
Основной фуксин 543 510
Тионин 597 557
Как видно из табл. 25, использование какого-либо кра-
сителя для определения метахромазии основано на том,
что ортохроматический и метахроматический максимумы
поглощения находятся, насколько это возможно, далеко
друг от друга.
Метахроматически реагирующие вещества обладают,
как правило, высоким молекулярным весом и свободными
анионными группами. Сюда относятся прежде всего дис-
социирующие кислые группы. Проявление метахромазии
определяется плотностью анионов на поверхности моле-
кулы субстрата, а также степенью ионизации. Если рас-
стояние между заряженными группами составляет, напри-
мер, 10 А, то никакой метахромазии не наблюдается
(табл. 26).
118 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 26
Связь между метахромазией и плотностью заряда на поверхности субст-
рата
Субстрат Анионные группы Расстояние между анионными группами, А Реакция с мет ахроматическим красителем
Разведенный вод- ный раствор гиа- луроновой кисло- ты соо~ 10,3 Отсутствие метахро- мазии
Полимер-пектинат с линейной цепью СОО" Около 5 Слабая метахромазия
Г люкуроноамино- гликаны OSO“- и СОСГ- группы пооче- редно 4-6 Умеренная стабиль- ная метахромазия
П олисахаридные единицы в кислых мукополисаха- ридах Замещение от двух до трех ОН-групп OSO"- группами Менее 4 Сильная стабильная метахромазия
Сила анионных групп снижается в следующем ряду:
ROSO3 - R О НРО3 - RCOO
Развитие метахромазии может проходить по двум эта-
пам. Первый этап характеризуется возникновением по-
лярных связей между анионами субстрата и основными
группами красителя:
Краситель
На втором этапе в присутствии воды происходит
связывание соседних молекул красителя с теми молекула- ,
ми красителя, которые уже были ранее связаны с субстра-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 119
том благодаря вандерваальсовым силам:
По-видимому, после реакции красителя с анионами вы-
являемого мукополисахарида происходит укладка моле-
кул красителя в упорядоченную структуру и возникает при
этом межмолекулярное взаимодействие. В результате по-
является характерный для метахромазии новый спектр по-
глощения. Поскольку метахромазия, согласно Сильвену
(Sylven), может рассматриваться как особый тип упорядо-
ченной агрегации молекул красителя, то она характери-
зуется образованием новых межмолекулярных связей ме-
жду соседними молекулами красителя. Все факторы,
способствующие сохранению обычной молекулярной
ориентации, препятствуют метахромазии.
Проводимое Сильвеном разделение на резистентную
к спирту «истинную метахромазию» (называемую также у-
метахромазией—от красного к розовому) и лабильную
в отношении спирта «ложную метахромазию» (0-метахро-
мазия—фиолетовое окрашивание) основано на присут-
ствии в первом случае эфиров серной кислоты, устойчивых
к спирту. Лабильная метахромазия, например, обусловле-
на веществами, не имеющими сульфатных групп.
Изменение окраски толуидинового синего или тионина
на «зеленоватую» (так называемая «отрицательная мета-
хромазия»), наблюдаемое в случае нуклеиновых кислот в
зависимости от концентрации, не нашло еще теоретичес-
кого обоснования.
Полисахариды, которые обычно не дают метахрома-
зии, после введения отрицательно заряженных радикалов
при помощи различных воздействий (продолжительное
окисление хромовой кислотой или перманганатом, суль-
фатирование, фосфатирование) могут проявить метахро-
матическую реакцию. И наконец, метахроматический эф-
120 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
фект способны давать также метафосфаты, нуклеиновые
кислоты и полипептиды.
Что касается практики, то для выявления метахрома-
зии общепринятых методов не существует. По имеющимся
данным, предварительная гистологическая обработка тка-
ни на метахроматическое окрашивание не влияет. Правда,
фиксация и заливка способны ослабить метахромазию.
Однако это влияние незначительно. Потеря растворимых
мукоидных веществ может быть предотвращена использо-
ванием замораживания — высушивания и фиксацией в па-
рах формалина. Криостатные срезы с непродолжительной
последующей фиксацией также дают хорошие результаты.
Из химических фиксирующих средств можно выбрать
смеси, рекомендуемые для фиксации кислых мукоидных
веществ.
Важной предпосылкой успеха^ исследований с метахро-
мазией является химическая чистота используемого краси-
теля. Это же касается флуоресцентных’ красителей, из ко-
торых наиболее часто используют акридиновые красители
(акридиновый желтый, акридиновый оранжевый, корифос-
фин, бензофлавин) и псевдоизоцианин.
Поскольку все приемы последующей обработки срезов
влияют на метахромазию, необходимо перед заливкой
в водорастворимую среду или перед обезвоживанием
в спирте и заключением в безводную среду просматривать
окрашенные срезы под покровным стеклом, наложенным
на срез с дистиллированной водой или средой, в которой
проводилось растворение красителя.
2. РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОЛЛОИДНЫХ МЕТАЛЛОВ
Целый ряд катионов металлов, подобно катионным
красителям, образует с анионами кислых мукоидных ве-
ществ соединения по тому же принципу, что и катионные
красители. В гистохимии до сих пор в первую очередь ис*
пользовались методы соединения коллоидного железа
с кислыми мукоидными веществами. Помимо этого, ис-
пользовались также коллоидный хлорид золота и ионы ба-
рия. В сочетании с основными красителями ионы алюми-
ния, по-видимому, влияют лишь на интенсивность окраски
или флуоресценции. С точки зрения гистохимика, наиболь-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 121
шее практическое значение для световой микроскопии
в настоящее время имеют реакции связывания железа. То-
рий, барий и висмут используются главным образом для
контрастирования кислых мукоидных веществ на ультра-
тонких срезах.
Реакции связывания железа
Метод, разработанный Хэйлом (Hale, 1946), основан на
связывании Fe3+ с кислыми мукоидными веществами
и последующем выявлений связанного железа при помощи
ферроцианида калия (реакция берлинской лазури). Есть до-
статочные основания считать, что положительно заря-
женные частички золя железа связываются в первую оче-
редь с карбоксильными группами и группами сульфоновой
кислоты кислых мукоидных веществ, при условии что pH
используемого коллоидного раствора железа не превы-
шает 2,0. Нуклеиновые кислоты и белки связывают кол-
лоидную гидроокись железа в гистологических срезах, по-
видимому, лишь при более высоких значениях pH.
3. ОКРАШИВАНИЕ АЛВЦ ПАНОВЫМ СИНИМ
Альциановый синий 8 GS, фталоцианин меди, содержа-
щий до четырех групп изотиурония, обусловливающих его
растворимость, был впервые использован в гистохимии
для выявления кислых мукополисахаридов Стидменом
(Steedman, 1950).
Водорастворимый краситель образует с полианионами
сильноокрашенные нерастворимые в воде пигменты. Аль-
циановому синему 8 GS позднее пришел на смену альциа-
новый синий 8 GX, который по сравнению с 8 GS имеет бо-
лее высокую растворимость. К альциановому синему по
своим свойствам приближаются альциановый зеленый
3 ВХ и альциановый зеленый 2 GX.
Специфичность окрашивания альциановым синим
можно контролировать. При этом играют роль три сле-
дующих фактора: условия окрашивания, предварительная
химическая и ферментативная обработка. Так, при дли-
тельном окрашивании выявляются почти все компоненты
ткани, тогда как при менее длительном (около 30 мин)
122 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
удается более или менее специфично выявить муцины эпи-
телиального и соединительнотканного происхождения.
Различия между сульфатированными и несульфатиро-
ванными мукоидными веществами наиболее надежно
устанавливаются при определенных значениях pH раство-
ра красителя и при добавлении электролитов. Использова-
ние раствора красителя с pH 1,0 позволяет выявить лишь
кислые мукоидные вещества с сульфатными и сульфо-
новыми группами, тогда как при pH 2,0 выявляются
главным образом мукоидные вещества, содержащие
группы уроновон кислоты. Мукоидные вещества, содержа-
щие сульфатированные и карбоксильные группы, связы-
вают альциановый синий при более низких концентрациях
электролитов (концентрация MgCl2 ниже 0,3 М), тогда
как при концентрациях MgCl2 0,8 М и выше окраши-
ваются исключительно мукоидные вещества, содержащие
8О4-группы. И наконец, в присутствии электролитов (НС1,
NaCl, КО) окрашивание альциановым синим усиливается.
Влияние электролитов на связывание альцианового синего
свидетельствует в пользу ведущей роли электростатиче-
ских сил при связывании альцианового синего с субстра-
том.
4. ОКРАШИВАНИЕ АСТРАСИНИМ
Астрасиний, будучи красителем из группы фталоциани-
нов меди, близкородствен альциановому синему. В кислых
средах этот краситель проявляет выраженное сродство по
отношению к мукополисахаридам. Механизм окрашива-
ния, однако, еще далеко не ясен. В отличие от окрашивания
альциановым синим продолжительность окраски астраси-
ним не оказывает существенного влияния на результаты
окраски.
5. ВЫЯВЛЕНИЕ БАЗОФИЛИИ
Отделить кислые мукоидные вещества от нейтральных
и отдифференцировать сульфатные, фосфатные и карбок-
сильные группы можно путем выявления базофилии. Этот
метод основан на определении способности элементов тка-
ни связывать основные красители при различных значе-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 123
ниях pH. В процессе окрашивания забуференными раство-
рами метиленового синего с различными значениями pH
установлено, что по мере снижения этих значений окраши-
вание отдельных структур ослабляется (так называемая эк-
стинкция метиленового синего, табл. 27). В гистохимии
Таблица 27
Окрашивание анионных групп метиленовым синим при различных зна-
чениях pH
pH Окрашиваемые группы или вещества
1,5 2,8 4,0 5,0 SO. ' т poysojo 1 v СООН(РО SO,,)1) J Кислые мукоидные вещества Все кислые группы Нейтральные мукоидные вещества
*) Группы в скобках ионизированы и поэтому также дают окрашивание.
полисахаридов представляют интерес значения pH ниже
4,0, поскольку лишь в этих условиях теряют свой заряд
анионные группы белков, значительно осложняющие ин-
терпретацию результатов. Это особенно касается повсе-
местно распространенных карбоксильных групп, свя-
занных с белками.
Нуклеиновые кислоты, которые при pH 3,0 также
связывают метиленовый синий, могут быть отдифферен-
цированы от углеводов, исходя из их локализации, а также
при помощи специфических реакций. Кроме того, нуклеи-
новые кислоты удается исключить добавлением MgCl2
к раствору красителя. Вместо метиленового синего для
определения базофилии можно пользоваться растворами
азура А (0,02%) в НС1 — фосфатном или фосфат —
цитратном буфере
6. МЕТОДЫ БЛОКИРОВАНИЯ КИСЛЫХ ГРУПП
Воздействуя метанол—НС1, метанол—тионилхлори-
дом и метанол—метилиодидом, удается блокировать
кислые группы (карбоксильные, фосфатные и сульфат-
124 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ные) и ослабить базофилию и метахромазию эле-
ментов ткани. С помощью метилирования по Фишеру
и Лилли (Fisher, Lillie) можно блокировать метахромазию
растворимых кислых групп уже при 37°С и сравнительно
непродолжительном воздействии (так называемое мягкое
метилирование):
на
- соон + СН3ОН -> - соо сн3 + Н2О,
на
- СН О SO3 Н + + СН3ОН - - СН О • СН3 + H2SO4.
Обработка метилированных срезов гидроокисью калия
снимает метилирование и восстанавливает базофилию.
Как правило, однако, на деметилированных срезах мета-
хромазия ослаблена. Это явление, по-видимому, связано
с тем, что метилирование сопровождается десульфирова-
нием без последующего восстановления прн омылении
слабым щелочным раствором.
Помимо карбоксильных групп метилиодид блокирует
также и другие реакционноспособные группы различных
классов веществ (табл. 28). Следует призбать, что алкили-
рование карбоксильных групп происходит специфическим
образом.
Таблица 28
Алкилирование концевых групп в тканях метилио-
дцдом (Pearse, 1968)
Группы Алкилирование Время (+4^С), ч
Карбоксильные + 6-18
Фсюфатные + 18-24
О-сульфатные 0 24
N-сульфатные 0 24
Амино + 4
Гуанидин 0 24
Тирозин + 6
Сульфгидрильные + 1
Гликольные 0 24
Триптофан 0 24
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 125
7. УДАЛЕНКЕ КИСЛЫХ МУКОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮО ФЕР-
МЕНТОВ
Для идентификации кислых мукоидных веществ наибо-
лее часто используют гиалуронидазы и нейраминидазы.
а) Расщеплете гиалуронидазой
Гиалуронидаза, выделенная из семенников, отличается
по механизму действия от бактериальной гиалуронидазы.
Так, гиалуронидаза пневмококков отщепляет лишь гиалу-
роновую кислоту, а гиалуронидаза, выделенная из семен-
ников, гидролизует не только гиалуроновую кислоту, но
и хондроитинсульфаты А и С (табл. 29).
Таблица 29
Действие различных гиалуронидаз на кислые мукопелисахариды
?ип кислого мукополисахарида Тип ткани Источник гиалуронидазы
-малиновый хряийпупочныйканатик семенники быка пневмококки
(ондоитинсульфат А В 'иалуроновая С :ислота Имеется Не имеется Имеется Не имеется Не имеется То. же Имеется ,, Расщепляет Не действу- ет Расщепляет Не действу- ет То же Расщепляет
Гиалуронидаза, выделенная из семенников, может со-
держать ^-глюкуронидазу, ^-гексозаминидазу и 0-галакто-
заминидазу. Активность рибонуклеазы, встречающейся
в виде примеси в препаратах гиалуронидазы, можно специ-
фически блокировать перекисью водорода, Си2+ и Fe3+.
В большинстве проводимых в настоящее время иссле-
дований с использованием гиалуронидазы применяют
обычно легкодоступный фермент, выделенный из семенни-
ков быка.
б) Расщепление нейраминидазой (сналидазой)
Для гистохимической идентификации мукоидных ве-
ществ, содержащих сиаловую кислоту, можно использо-
вать нейраминидазы, выделенные из противогриппозной
126 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
вакцины, а также из культур Clostridium perfringens и Vibrio
cholerae. В гистохимии обычно используют очищенный
фермент из культур вибрионов. При этом следует учиты-
вать, что буфер, не содержащий нейраминидазы, переводит
в раствор значительную часть связанной нейраминовой
кислоты в составе сиаломукоидов. Косвенное определение
нейраминовой кислоты с помощью нейраминизады в сре-
зах ткани возможно лишь при существенном различии
в интенсивности окраски альциановым синим после инку-
бации в буфере без фермента и после обработки нейрами-
нидазой. Количественные выводы делать при этом нельзя.
Равным образом невозможно выявлять нейраминовую
кислоту альциановым синим после метилирования и деме-
тилирования, поскольку при метилировании сульфатиро-
ванные мукоидные вещества и сиаломукоиды из-за потери
своих кислых групп ведут себя сходным образом.
4.3.2.4. ВЫЯВЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА
В живых клетках гликоген диффузно распределен по
цитоплазме преимущественно в форме субмикроскопиче-
ских мельчайших частиц. Он служит хранилищем энерге-
тических запасов животного организма. В растениях место
гликогена в качестве резервного углевода занимает крах-
мал. В зависимости от степени полимеризации различные
гликогены различаются по растворимости. При электрон-
но-микроскопическом исследовании частицы гликогена
можно разделит^ по размеру на 3 группы: 1) 130 А; 2)
1500 А; 3) 3000 А. Наблюдаемые в световом микроскопе
частицы гликогена в электронном микроскопе имеют вид
розеток. При гистохимическое исследовании удается
идентифицировать лишь ту фракцию тканевого гликогена,
которая растворима в трихлоруксусной кислоте (лиогли-
коген), тогда как фракция, связанная с белками (десмогли-
коген), остается неокрашенной. Таким образом, положи-
тельный результат пробы на гликоген зависит от
присутствия хотя бы в минимальном количестве гликоге-
на, растворимого в трихлоруксусной кислоте (например,
в ткани печени 6 мкг/100 г).
Специфических методов гистохимического выявления
гликогена не существует. Для практических целей рекомен-
Методы гистохимического выявления гликогена
Метод Принцип реакции
Реакция с иодом Гликоген окрашивается иодом в темно-коричневый цвет
Хромовая кисло- та-Шифф Окисление хромовой Кислотой; выявление образующихся альде- гидных групп реактивом Шиффа
Тетраацетат свинца-Шифф Расщепление С-С-связей полиса- харидов; выявление образую- щихся альдегидных групп реак- тивом Шиффа
ШИК-реакция Окисление иодной кислотой; вы- явление образующихся альде- гидных групп реактивом Шиф- фа
Кармин по Бесту Эмпирическое окрашивание, зави- сящее от физических и стерео- химических факторов
Метод серебренш Выявление при помощи раство- ров солей серебра альдегидных групп, образующихся в резуль- тате окисления
Таблица 30
Авторы Примечания
Mancini (1944, 1946) Стабильность связи глико- ген - иод повышается в ре- зультате перевода в ком- плекс гликоген - иод - ртуть
Bauer (1933) Окрашиваются различные компоненты ткани, кото- рые не содержат гликоге- на
Shimizu, Kumamoto (1952) Четкое выявление гликогена
McManus, Findley (1949) Доля полисахаридов, выяв- ляемых помимо гликоге- на, больше, чем в реакции Бауера
Best (1906) Пригоден для повседневных исследований
Arzac, Flores (1949), Gomori (1946), Lud- wig (1951, 1952) Требуется параллельный контроль для проверки специфичности
,128 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
дуется использовать ШИК-реакцию в сочетании с диаста-
зой и окрашиванием кармином по Бесту (табл. 30).
43.2.5. ВЫЯВЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ, ПЕКТИНА И АСКОРБИНОВОЙ
КИСЛОТЫ
4.З.2.5.1. ГЛЮКОЗА
Гистохимическое выявление глюкозы основано на оса-
ждении ее барием. Комплекс глюкозы с барием восстана-
вливает соли серебра до гранул серебра, имеющих черный
цвет. Ценность этой гистохимической реакции, к сожале-
нию, ограничена тем, что с ее помощью выявляются
главным образом нефизиологические концентрации глю-
козы. Для .специальных исследований используйэт метод
Окамото, модифицированный Мюллером (Muller, 1955).
4.3.2.5.2. ПЕКТИН
Аминная реакция КраЙсиновича (Krajcinovic, 1954,
1955), которая считается специфической для пектина,
в своей основе имеет образование соединения между пек-
тиновой кислотой и бензидином. После диазотирования
свободных концевых NH2-rpynn в результате обработки р-
нафтолом образуется азокраситель красного цвета.
4.3.2.5.3. АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА
В основу гистохимического выявления аскорбиновой
кислоты (витамин С) легло наблюдение Сент-Дьёрди, от-
метившего, что кора надпочечника способна восстанавли-
вать растворы нитрата серебра. Принцип реакции заклю-
чается в обработке срезов сильно подкисленными раство-
рами нитрата серебра; восстановленная форма аскорбино-
вой кислоты восстанавливает часть нитрата серебра. Не-
восстановленное серебро удаляется из препарата промы-
ванием. Окисленная форма аскорбиновой кислоты не
восстанавливает нитрат серебра. Исходя из этих соображе-
ний, срезы перед обработкой нитратом серебра подвер-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 129
гают восстановлению с помощью H2S.
сн2он
он-с-н
он
-2Н.
'+2Н
(H2S)
Аскорбиновая кислота Дегидроаскорбиновая кислота
(восстановленная форма) (окисленная форма)
Однако, по-видимому, эта процедура не ведет к увели-
чению выявляемых в срезах отложений серебра. Из суще-
ствующих гистохимических реакций выявления аскорби-
новой кислоты Пирс рекомендует методы Барнета и Бурна
(Barmett, Bourne, 1941), Бакхуса (Bacchus, 1950) и Йенсена
и Кавальяна (Jensen, Kavaljian, 1956).
Методы выявления аскорбиновой кислоты с помощью
солей серебра имеют следующие недостатки:
а) опасность смещения продукта, вызываемого прежде
всего применением уксусной кислоты, которая проникает
в срез быстрее, чем нитрат серебра; б) восстановление дру-
гих веществ нитратом серебра (например, некоторых липи-
дов, фосфата, меланина); в) адсорбция ионов серебра на
различных структурах.
4.3.3. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫ-
ЯВЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ
Для идентификации полисахаридов и полисахарид-бел-
ковых комплексов на ультраструктурном уровне можно
использовать целый ряд проверенных методов, большая
часть из которых основана на реакции окисления иодной
кислотой (табл. 31). Выявление альдегидов, образованных
в результате окисления иодной кислотой, может прово-
диться различными способами. Пирс (Pearse, 1972) выде-
ляет три основных подхода:
1. Применение солей серебра. 2. Применение тиосеми-
карбазидов и сходных реакций. 3. Флуорометрия с приме-
нением арилгидразина.
Выявление свободных моно- и олигосахаридов натал-
кивается на ряд трудностей, хорошо известных еще по све-
товой микроскопии.
5-235
Электронно-микроскопическое выявление углеводов
Вещества Методы
Гликоген Контрастирование гликоге- на Контрастирование гликоге- на кармином Беста
Крахмал Контрастирование иодом и цитратом свинца
Мукоидные вещества, реагирующие с иод- ной кислотой Иодная кислота - хромовая кислота - метенамин - се- ребро Реакция иодная кислота - тиокарбогидразид - OsO4 (ИКТ О-реакция) ИКТО-реакция •» Реакция иодная кислота - тиокарбогидразид - протеи- нат серебра (ИКТС-про- теинат-реакция)
Таблица 31
Авторы j Примечания
Perry (1967) Themann (1960, 1963) Flood (1970) Интенсивное контрастиро- вание гликогена цитратом свинца особенно хорошо удается после окисления иодной кислотой
Rambourg, Hernandez, Leblond (1969)
Hanker u. Mitarb. (1964)
Seligman u. Mitarb. (1964, 1965) Thiery (1967) В качестве агентов, восста- навливающих OsO4 (обра- зование осмиевой черни), помимо тиокарбазида мож- но использовать тиосеми- карбазид Помимо нейтральных и кис- лых мукоидных веществ контрастируется также гликоген; протеинат сереб- ра можно заменить про- тарголом
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 131
4.3.4. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ
ШИК-РЕАКЦИЯ ПО МАК МАНУСУ
МЕТОДИКА
1. Фиксация: забуференный формалин, формалин —
— цетилпиридиниевый хлорид, Россман, Карнуа, Ценкер;
заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы поместить в дистилли-
рованную воду.
3. Срезы при комнатной температуре окислять
0,5—1%-ным водным раствором иодной кислоты (H5JO6,
HJO4), 10 мин.
4. Промыть в проточной воде, 10 мин.
5. Поместить в дистиллированную воду, 2x2 мин.
6. Поместить срезы в реактив Шиффа, 15—30 мин при
комнатной температуре. [Реактив Шиффа по Грауманну:
0,5 г парарозалина (парафуксин, свободный от акридина,
стандартный) полностью растворить в 15 мл 1 н. НС1 без
нагревания при помешивании и довести до 85 мл дистил-
лированной водой с растворенными в ней 0,5 г метаби-
сульфита калия (K2S2O5); прозрачный интенсивно-
красный раствор, будучи помещенным в темноту в сосуде
с плотной пробкой, в течение 24 ч приобретает желто-
ватый цвет; его встряхивают 2 мин с 0,3 г активированно-
го угля (порошок) и затем дважды фильтруют. Такой рас-
твор готов к употреблению и может храниться в сосудах
коричневого цвета с пришлифованной пробкой по крайней
мере 2 мес.]
7. Срезы промыть 8О2-водой (600 мл дистиллирован-
ной воды, 30 мл 10% K2S2O5, 30 мл 1 н. НС1), 3x2 мин.
8. Тщательно промыть в проточной и дистиллирован-
ной воде.
9. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концен-
трации, ксилол, бальзам.
После п. 8 можно провести окраску ядер (кислый
гемалаун по К. Майеру, 45 с).
РЕЗУЛЬТАТ
Мукоидные вещества, содержащие гексозу, окраши-
132 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ваются в красно-лиловый цвет. Гликоген приобретает бо-
лее интенсивное окрашивание.
КОНТРОЛЬ
Расщепление гликогена, реакция ацетилирования для
блокирования гидроксильных групп.
ПРИМЕЧАНИЯ
Для выявления водорастворимых веществ Хочкисс
(Hotchkiss) предложил использовать спиртовый раствор
иодной кислоты следующего состава: 0,4 г иодной кис-
лоты, 35 мл этанола, 5 мл 0,2 М (2,72%) ацетата натрия.
Этот раствор иодной кислоты окисляет медленнее, чем
соответствующий водный раствор. Для окисления таким
раствором при комнатной температуре требуется 1 — 2 ч.
По данным Барки (Вагка), после фиксации гликоген ос-
тается устойчивым к действию водных растворов.
Предложенное Хочкиссом промывание восстанавли-
вающей жидкостью для удаления йодатов после окисления
иодной кислотой ведет к образованию соединений между
бисульфитами и альдегидами, которые неблагоприятно
влияют на заключительную реакцию альдегидов с реакти-
вом Шиффа.
7/° /0Н
R + NaHSOj —► RCrSOjNa
'Н 'Н
Иодаты можно удалить из срезов и простым тща-
тельным промыванием в проточной воде.
МЕТОД С ИОДНОЙ КИСЛОТОЙ И ПАРАДИАМИНОМ (ИКП-МЕ-
ТОД) ПО СПАЙСЕРУ (SPICER, 1966)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в одной из сред, используемых для выявле-
ния углеводов, заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы довести до воды.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 133
3. Окисление в 1%-ном водном растворе иодной кис-
лоты, 10 мин.
4. Промывание в проточной воде, 10 мин.
5. Срезы обработать в растворе парадиамина, 7, 24 или
48 ч. рС 50 мл цитрат — фосфатного буфера (4,8 мл 0,1 М
лимонной кислоты; 7,2 мл 0,2 М двузамещенного фосфа-
та натрия; 38 мл дистиллированной воды) добавляют не-
посредственно перед употреблением 50 мг Ы,Ы-диметил-
п-фенилендиамина—HC1.J
6. Дифференцировать в 1% НС1 в 70%-ном этаноле 8 с
после окрашивания в течение 24 ч или 10 с после окра-
шивания в течение 48 ч.
7. Промыть в воде, 5 мин.
8. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концен-
трации, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Нейтральные мукополисахариды окрашиваются в ко-
ричневый цвет; иодат-реактивные полимеры окрашивают-
ся в темно-красный или серо-коричневый цвет; мукоидные
вещества, которые не реагируют с иодной кислотой, окра-
шиваются в черный цвет.
ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОПОЛИСАХАРИДОВ С ПОМОЩЬЮ
КОЛЛОИДНОГО ЖЕЛЕЗА; МОДИФИКАЦИЯ РЕАКЦИИ ХЭЙЛА
ПО ГРАУМАННУ И КЛАУСУ (GRAUMANN, CLAUS, 1958)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: забуференный формалин, Карнуа,
формалин — этанол, формалин — цетилпиридин (4%-ный
формалин 4- 0,5%-ный N-цетилпиридинийхлорид), Жандр,
заливка в парафин; срезы без фиксации или криостатные
срезы, фиксированные в смеси Вольмана (5 мл ледяной ук-
сусной кислоты + 95 мл абсолютного этанола) также по-
зволяют получать хорошие результаты.
2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убы-
вающей концентрации довести до дистиллированной во-
ды. Обработка свежйх криостатных срезов начинается
134 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
с п. 3. Фиксированные срезы хорошо промыть в дистилли-
рованной воде.
3. Поместить срезы на 10 мин в коллоидный раствор
железа, подкисленный уксусной кислотой: маточный рас-
твор—10 частей, 96—99%-ной уксусной кислоты—4 ча-
сти. (Маточный раствор: 750,0 мл дистиллированной воды
довести до кипения и добавить 12,0 мл 32%-ного раствора
хлорида железа (III). Образовавшаяся гидроокись железа
может храниться в течение месяца.)
4. 5%-ная уксусная кислота, 2x5 мин.
5. Срезы поместить в следующий, свежеприготовлен-
ный раствор (реакция берлинской лазури): 30 мл 2%-ного
гексацианоферрата (II) калия + 60 мл 1%-ной НО, 10 мин.
6. Дистиллирования вода, 2x2 мин.
7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концен-
трации, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, в которых содержатся кислые мукополиса-
хариды, окрашиваются в синий цвет.
ПРИМЕЧАНИЯ
Специфичность метода Хэйла для выявления кислых
мукоидных веществ следует контролировать с помощью
вспомогательных реакций. Ложную положительную реак-
цию, обусловленную присутствием железа в тканях, можно
исключить путем обработки контрольных срезов в раство-
ре гексапианоферрата (II) калия и НО (этап 5 данного ме-
тода). По Иммерсу (Immers, 1954), реакция Нэйла специ-
фична для выявления свободных кислотных групп,
например для эфиров серной и фбсфорной кислот, сво-
бодных гидроксильных групп уроновой и моноаминоди-
карбоновых кислот белков. По данным сравнительного ис-
следования Грауманна (Graumann, 1958) модификация
метода Хэйла по Мюллеру (1955) особенно пригодна для
выявления кислых веществ матрикса в клетке.
Благодаря предложенной Грауманном (1959) модифи-
кации реакции Хэйла с коллоидным раствором железа,
подкисленным уксусной кислотой до pH 1,15, и с использо-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 135
ванием 5%-ной уксусной кислоты в качестве промывающе-
го раствора вместо дистиллированной воды удается в зна-
чительной мере избежать образования нестабильных
и неспецифических осадков железа, образующихся в недо-
статочно кислой реакционной среде.
Реакцию связывания железа можно комбинировать
с ШИК-реакцией. В этом случае после п. 6 следует окисле-
ние иодной кислотой. В результате кислые мукоидные ве-
щества окрашиваются в темно-синий цвет, белковые
структуры—-в светло-синий, а нейтральные мукоидные ве-
щества в красный цвет различных оттенков. Эта комбина-
ция двух методов дает контрастную гистологическую кар-
тину при исследовании ткани почек и кожи.
ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОПОЛИСАХАРИДОВ АЛЬЦИА-
НОВЫМ СИНИМ 8GX ПО СТИДМЭНУ (STEEDMAN, 1950)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: забуференный формалин, формалин —
этанол, формалин—цетилпиридин, Карнуа, Буэн, за-
ливка в парафин (можно использовать также и нефиксиро-
ванные замороженные срезы).
2. Депарафинированные срезы провести через ряд спир-
тов убывающей концентрации до дистиллированной воды.
3. Окрашивание в свежеотфильтрованном растворе
альцианового синего 8 GX (1% или 0,1%) в 3%-ной уксусной
кислоте, 10—30 мин.
4. -Промывка в дистиллированной воде.
5. Окрашивание ядер ядерным прочным красным.
6. Тщательно промыть в проточной и дистиллирован-
ной воде.
7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концент-
рации.
После п. 4 вместо окрашивания ядерным прочным
красным можно провести докраску гемалауном Эрлиха,
после чего следует дифференцировка в 1%-ном этаноле.
С помощью обработки срезов после п. 4 1%-ным ще-
лочным этанолом (pH 8 или выше) в течение 2 ч удается
перевести краситель в нерастворимый монастральный
прочный синий пигмент.
136 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
РЕЗУЛЬТАТ
Кислые мукополисахариды окрашиваются в сине-зе-
леный цвет.
ОКРАШИВАНИЕ АЛЬЦИАНОВЫМ СИНИМ ПРИ pH 2,5
МЕТОДИКА
Этапы 1 и 2, как и в методе Стидмэна.
3. Окрашивание в свежеотфильтрованном растворе
альцианового синего 8 GX (1%) в 3%-ной уксусной кислоте
(pH 2,5), 30 мин.
4. Промыть в проточной воде, 5 мин.
5. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концен-
трации, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Слабокислые сульфатированные мукоидные вещества,
гиалуроновые кислоты и сиаломуцины окрашиваются
в темно-синий цвет. Сильнокислые сульфатированные му-
цины окрашиваются слабо или не окрашиваются вовсе.
ОКРАШИВАНИЕ. АЛЬЦИАНОВЫМ СИНИМ ПРИ pH 1,0
МЕТОДИКА
1. Срезы поместить в дистиллированную воду.
2. Окрашивание в альциановом синем 8 GX (1%) в 0,1 н.
НС1 (pH 1,0), 30 мин.
3. Срезы просушить фильтровальной бумагой.
4. Обезводить в этаноле, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Окрашиваются только сульфатированные мукоидные
вещества.
Большинство кислых муцинов окрашиваются сравни-
тельно слабо.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 137
ПРИМЕЧАНИЯ
Вместо альцианового синего 8 GX можно использовать
альциановый синий 8 G, альциановый синий 8 GX 300, аль-
циановый зеленый 3 ВХ или альциановый зеленый 2 GX.
Для окрашивания очень кислых мукоидных веществ реко-
мендуется модификация окраски альциановым синим по
Гомори (1954).
МЕТИЛИРОВАНИЕ ПО БЕЛЛО (BELLO, 1956) И ГАЙЕРУ (GEYER,
1962)
МЕТОДИКА
1. Депарафинированные срезы промыть в двух сменах
абсолютного этанола, а затем в двух сменах абсолютного
метанола.
2. Поместить срезы в следующий раствор: 1 мл SOC12
в 50 мл абсолютного метанола (SOC12 добавлять медлен-
но; раствор можно перед употреблением хранить в течение
ночи), при +24° С, 4—6 ч; контрольные срезы без обра-
ботки SOCI2-
3. Промыть в 70%-ном этаноле и дистиллированной
воде.
4. Провести соответствующее окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТ
6-часовая обработка полностью снимает базофилию
ткани. Базофилия цитоплазмы, обусловленная СООН-
группами и РНК, снимается через 30 мин, а базофилия,
обусловленная присутствием сульфатированных мукопо-
лисахаридов,—через 4 ч.
УДАЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ ФЕРМЕНТА-
ТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ—ГИАЛУРОНИДАЗОЙ
МЕТОДИКА
1. Фиксация в одной из смесей, рекомендованных для
фиксапии мукоидных веществ (стр. 133), заливка в пара-
фин.
138 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды через ряд спиртов убывающей концентрации.
3. Обработать срезы следующим раствором: 0.3 —
0,6 мг/мл гиалуронидазы из семенников в 0,1 н. фос-
фатном или ацетатном буфере (pH 6,0), 4—6 ч при 4- 37°С.
Контрольные срезы инкубировать в буфере в таких же
условиях.
4. Окрашивание контрольных срезов и срезов, обрабо-
танных в растворе гиалуронидазы, 0,1%-ным толуиди-
новым синим, 1—2 ч.
5. Тщательно промыть в дистиллированной воде.
6. Заключить в глицерин—желатину или после обезво-
живания и просветления в ксилоле—в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Метахроматическое окрашивание, присутствующее
в контрольных срезах и отсутствующее в срезах, обрабо-
танных гиалуронидазой, свидетельствует о наличии гиалу-
роновой кислоты или хондроитинсульфатов А и С.
ПРИМЕЧАНИЯ
Переваривание гиалуронидазой может усиливать или
вызывать предварительное окисление некоторых структур
уксусной кислотой. Добавление NaCl усиливает актив-
ность фермента. Для гиалуронидазы из семенников опти-
мальная концентрация NaCl лежит между 0,07—0,17 М.
Примесь к ферментам основных белков приводит к связы-
ванию и маскированию анионов кислых мукоидных ве-
ществ, что создает ложную картину действия гиалурони-
дазы.
УДАЛЕНИЕ СИАЛОМУЦИНОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИ-
ЗОМ-НЕЙРАМИНИДАЗОЙ
МЕТОДИКА
1. Фиксация в холодном формалин — этаноле или фор-
мальдегиде; криостатные срезы или заливка в парафин.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 139
2. Депарафинированные срезы поместить в дистилли-
рованную воду, а затем инкубировать 6—24 ч при
39—41° С в растворе нейраминидазы (Vibrio cholerae) сле-
дующего состава: 500 ед/мл нейраминидазы в равном
объеме 0,1 М ацетатного буфера. Раствор содержит, кро-
ме того, 1% NaCl и 0,1% СаС12, pH 5,5.
3. Контрольные срезы инкубировать в 0,05 М буфере
в аналогичных условиях.
4. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.
5. Окрашивание альциановым синим или альциановым
синим - ШИК.
6. Обезвоживание, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Об удалении сиаломуцинов свидетельствуют различия
в окрашивании контрольных срезов и срезов, обрабо-
танных ферментом.
ОКРАШИВАНИЕ КАРМИНОМ ПО БЕСТУ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
ГЛИКОГЕНА
МЕТОДИКА
1. Фиксация в одной из смесей, перечисленных на
стр. 44, заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы довести до абсолют-
ного спирта.
Зг Целлоидировать срезы путем помещения в 1%-ный
раствор целлоидина (в смеси из равных частей этанола
и эфира), 2 мин.
4. Просушить срезы на воздухе, уплотнить в 70%-ном
этаноле и поместить в дистиллированную воду.
5. Провести интенсивное окрашивание ядер в гемалау-
не по Майеру (Мауег).
6. Тщательно промыть в дистиллированной воде.
7. Окрашивание в красящем растворе кармина,
10—20 мин. Маточный раствор кармина: 2 г кармина, 1 г
карбоната калия и 5 г хлорида калия растворить в 60 мл
дистиллированной воды и кипятить несколько минут на
140 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
слабом огне. Раствор после охлаждения отфильтровать
и добавить 20 мл аммиака. Раствор готов к непосред-
ственному применению и может храниться в течение не-
скольких недель (в холодильнике до 3 мес).
Красящий раствор кармина: 20 мл профильтрованно-
го маточного раствора кармина, 30 мл аммиака, 30 мл
метанола (сохранность несколько дней!).
8. Срезы перенести непосредственно в смесь для диффе-
ренцирования (в двух порциях смеси дифференцировать до
того момента, как видимые глазом следы красителя пере-
станут выходить из среза в раствор), от нескольких секунд
до нескольких минут.
Смесь для дифференцирования: 40 мл метанола, 80 аб-
солютного этанола, 100 мл дистиллированной воды.
9. Промыть в 80%-ном этаноле, провести через ряд
спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Гликоген окрашивается в интенсивный красный цвет,
ядра—в темно-синий.
ПРИМЕЧАНИЯ
Окрашивание кармином по Бесту рекомендуется осо-
бенно в тех случаях, когда в изучаемой ткани помимо гли-
когена присутствуют в больших количествах другие
ШИК-положительные вещества.
Целлоидирование срезов после депарафинирования
должно защищать гликоген от вымывания. Этот этап, од-
нако, может считаться излишним, если была проведена хи-
мическая фиксация (Barka, Anderson, 1964). Поскольку гли-
коген в животных тканях бесспорно имеет различную
степень полимеризации, то необходимо в каждом случае
находить оптимальные условия для окрашивания. Измене-
ния в степени полимеризации могут наблюдаться у одного
животного даже в течение дня.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 141
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ДИАСТАЗОЙ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ
ГЛИКОГЕНА
МЕТОДИКА
1. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды.
2. Обработать в 1%-ном растворе диастазы при ком-
натной температуре, 2 ч.
3. Промыть в дистиллированной воде и провести окра-
шивание на гликоген (ШИК-реакция или окрашивание кар-
мином по Бесту).
РЕЗУЛЬТАТ
Вещества, которые в прямом опыте окрашиваются при
ШИК-реакции или кармином по Бесту, но исчезают из сре-
за после обработки диастазой, следует считать гликоге-
ном.
ПРИМЕЧАНИЯ
Различие между молекулами гликогена с развет-
вленными и неразветвленными цепями могут быть выяв-
лены в срезах путем обработки 0,5%-ной 0-амилазой
в 0,004 М ацетатном буфере (pH 5,0) вместо а-амилазы. 13-
Амилаза расщепляет только молекулы с разветвленными
цепями.
4.4. ЛИПИДЫ
Под собирательным термином липиды понимают груп-
пу природных, преимущественно неполярных соединений,
основным компонентом которых являются жирные кис-
лоты. Липоидами принято называть все жироподобные ве-
щества, кроме нейтральных жиров. Иногда, однако, тер-
мин липоид используют как синоним слова липид. Липиды,
как правило, растворимы в эфире, этаноле, хлороформе,
ацетоне, пиридине и т. п. Способность растворяться в ор-
ганических растворителях и другие физические свойства
липидов объясняются высоким содержанием неполярных
142 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
остатков углеводородов. На их растворимости основаны:
1) выявление липидов с помощью жирорастворимых кра-
сителей и 2) классификация липидов, присутствующих
в тканях.
В тканях млекопитающих липиды обычно связаны
с белками. Липопротеидные комплексы образуют также
так называемые «маскированные» липиды, т. е. липиды,
выявление которых, как правило, возможно лишь при раз-
рушении связи липид — белок. Именно потому, что ли-
пиды встречаются в виде смесей, некоторые из них до сдх
пор не удается с достоверностью выявить гистохимически.
4.4.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ЛИПИДОВ
Единой номенклатуры и классификации липидов пока
не существует. На основании их гистохимических свойств
липиды можно разделить на следующие группы:
А) Простые липиды
а) Триглицериды
б) Воска
в) Стероиды и стероидные эфиры
Б) Сложные липиды
а) Глицеролипиды х ]
1. Фосфатидные кислоты f I
2. Эфиры фосфатидных кислот I Фосфатиды I
а) Лецитины > Г
Р) Кефалины I I Фосфолипиды
у) Фосфатидилинозиты ) /
3. Плазмалогены - (
б) Сфинголипиды 1
1. Фосфосфинголипиды I
а) Сфингомиелины 1
р) Кефалин В I
2. Гликосфинголипиды J
а) Цереброзиды
р) Ганглиозиды
у) Сульфатиды
4.4.2. СВОЙСТВА ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП ЛИПИДОВ
1. ТРИГЛИЦЕРИДЫ
Триглицериды являются тройными сложными эфира-
ми трехатомного спирта глицерина с жирными кислотами.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 143
В их состав входят как насыщенные, так и ненасыщенные
жирные кислоты. Молекулы жирных кислот обладают
двойным лучепреломлением. Для выявления жиров с по-
мощью красителей большое значение имеет присутствие
ненасыщенных жирных кислот. Если они содержатся
в большом количестве, то такие липиды находятся при
комнатной температуре в жидком или полутвердом со-
стоянии. Подобное физическое состояние является важной
предпосылкой для их выявления с помощью жирораство-
римых красителей.
CH2-O-CO-R
CH -O-CO-R'
СН2 - О - СО - R"
2. ВОСКА
Воска представляют собой смеси сложных эфиров, в ко-
торых оба компонента—ненасыщенные жирные кислоты
и спирты—имеют длинную углеводородную цепь. Воска,
встречающиеся в 'организме человека и животных,, пред-
ставляют собой эфиры жирных кислот и холестерина.
з. СТЕРОИДЫ
Для стероидов характерно наличие группировки цикло-
пентанопергидрофенантрена. Особый интерес в этой груп-
пе представляют гистохимически выявляемые холестери-
ны и гормоны надпочечника.
Холестерин—вторичный одноатомный спирт с двой-
ной С = С-связью в молекуле. В различных физических
и химических формах холестерин может служить ис-
ходным материалом для построения других стеринов жи-
вотной клетки, иногда встречаясь в форме эфиров с раз-
личными жирными кислотами. Стероидные гормоны
состоят из гидрированных циклопентанфенантреновых
единиц; соединения с кетогруппой у С17 выделяются в осо-
бую группу кетостероидов.
144 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
4. ГЛИЦЕРОЛИПИДЫ
К этой группе принадлежат жироподобные вещества,
в молекулу которых входит фосфатная группа, связанная
со спиртом. Важным исходным компонентом для построе-
ния фосфатидов служат a-формы глицерофосфорной кис-
лоты:
сн2—он
сн—ОН он
сн2— о—Р = о
''он
а- ГлииерофОСфорния кислота
Другими компонентами фосфатидов являются жирные
кислоты, соединенные с глицерином сложной эфирной
связью. У млекопитающих в различных органах находятся
различные по составу смеси жирных кислот. В фосфа-
тидных кислотах простейших глицеролипидов обе ОН-
группы а-глицерофосфорной кислоты замещены жирными
кислотами:
ch2-o-cZ-r'
R"-C-O-CH ОН
СН2-О-Р = О
'он
а-9ос<ратиЗная кислота
5. СФИНГОЛИПИДЫ
Широко распространенные у животных и растений не-
растворимые в эфире сфинголипиды наиболее богато
представлены в нервной ткани. Главным, характерным для
них структурным элементом служит сфингозин, заменяю-
щий в молекуле сфинголипида глицерин.
СН2ОН - chnh2 - СНОН - СН
II
СН - (СН2)12 - сн3
Сфингозин
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 145
Из жирных кислот для сфинголипидов характерны ок-
сикислоты. В отличие от эфироподобных связей, харак-
терных для глицеролипидов, в сфинголипидах жирные кис-
лоты образуют амидную связь с ТЧН2-группой сфингозина.
Сфинголипиды делятся на фосфор- и сахарсодержащие.
К группе фосфорсодержащих сфинголипидов относят-
ся сфингомиелины (обозначаемые так же, как липиды мие-
линовых оболочек), состоящие из сфингозина, фосфорной
кислоты, холина и жирной кислоты. Сфингомиелины
Ьстречаются в первую очередь в ткани мозга.
СН3-(СН2)Й-НС=СН
о но-с-н
R C-HN-C-H О +СНз
Н2С-О-Р-О-СН2-СН2-Й-CHj
о- 'сн,
Сфингомиелин
Сахарсодержащие сфинголипиды состоят из сфингози-
на, жирной кислоты и гексозы. Фосфорная кислота отсут-
ствует. Их растворимость в воде зависит от числа са-
харных остатков: чем больше таких остатков, тем выше
растворимость.
Изолированные впервые из мозга цереброзиды обычно
содержат D-галактозу и реже D-глюкозу. В некоторых це-
реброзидах гексоза этерифицирована серной кислотой
(сульфатвды или сульфолипиды).
CHS-(CH2)12-HC=CH
4>Н0ТН СНгОН
R-C-HN-C-H /0------Loh
Н2-С-О-С Н0/1
--------------ИН
он
Цереброзид
Цереброзиды встречаются в большом количестве в бе-
лом веществе мозга и в меньшем—в почках, селезенке,
легких, надпочечниках, печени, тимусе, сетчатке, эритроци-
тах и т. д.
146 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Ганглиозиды, которые встречаются преимущественно
в нервных клетках, представляют собой сложные кислые,
свободные от фосфора липиды.
сн2он
но-сн
но- сн
он н
Нейраминовая кислота
Помимо высокого содержания сахаров их отличает от
цереброзидов наличие характерной только для них нейра-
миновой кислоты.
4.4.3. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Гистохимическое выявление и анализ липидов можно
осуществлять физическими и химическими методами. Спе-
цифическое выявление отдельных видов липидов часто
возможно лишь при комплексном использовании раз-
личных методов.
4.43.1. ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
К физическим методам относятся методы экстракции,
поляризационная микроскопия, флуоресцентная микро-
скопия, окрашивание жирорастворимыми красителями.
44.3.1.1. МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ
Используемые в гистохимии липидов методы экстрак-
ции основаны на законах растворимости, известных из
аналитической органической химии. Трудности гистохи-
мического выявления заключаются в том, что липиды
в тканях находятся обычно в виде смесей и часто связаны
с белками и углеводами. Это нередко сказывается на раст-
воримости. И наконец, не следует забывать, что экстраги-
руемость жиров может меняться в процессе предваритель"
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 147
ной обработки ткани, в частности под влиянием фиксации.
Об этих трудностях надо помнить при использовании ме-
тодов экстракции для гистохимического изучения от-
дельных липидов. Методы экстракции липидов в соче-
тании с окрашиванием липидов преследуют две цели:
а) контроль специфичности окрашивания, б) изучение
свойств жировых веществ на основании различий в их
растворимости. В гистохимической практике выявление
липидов проводится после обработки нативного материа-
ла (в лучшем случае это криостатные срезы) различными
жировыми растворителями. Экстракцию следует прово-
дить в горячем растворителе в колбе с обратным холо-
дильником или в аппарате Сокслета.
В гистохимии обычно используют два метода экстрак-
ции: а) пиридиновый метод по Бейкеру (Baker); б) экстрак-
ция липидов по Кейлиг (Keilig).
Экстракция по Бейкеру чаще всего используется при
выявлении фосфолипидов с помощью окрашивания
кислым гематеином. Эта процедура экстракции, проводи-
мая при + 60°С, не позволяет получать надежных резуль-
татов. Большие трудности в интерпретации результатов
возникают также при изучении тканей, фиксированных
в других смесях, помимо слабого раствора Буэна.
Экстракция липидов по Кейлиг разработана для изоли-
рованных липидов. При работе с тканями, в которых, как
правило, липиды находятся в виде смесей, этот метод не
позволяет получать надежных результатов. В качестве
вспомогательных процедур можно использовать экстрак-
цию 100%-ным холодным ацетоном и горячим
хлороформ — метанолом(1:1).
И наконец, при исследовании липидов с помощью ме-
тодов экстракции следует учитывать, что липиды в физио-
логическом состоянии обычно связаны с белками и поэто-
му устойчивы по отношению к экстрагирующим агентам.
44.3.1.2. МЕТОДЫ ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Ценность поляризационно-микроскопических исследо-
ваний заключается в первую очередь в том, что они помо-
гают установить организацию липидов в субмикроскопи-
ческих структурах. Однако в отношении химического
148 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
состава липидов эти методы не позволяют делать серь-
езных выводов.
В животном организме нативные липиды находятся
в жидком состоянии и не обладают двойным лучепрелом-
лением. Двойное лучепреломление характерно для кри-
сталлов, образующихся при охлаждении липидов. Так на-
зываемая кристаллизация липидов зависит главным
образом от окружающей температуры и от предваритель-
ной обработки ткани (фиксация, заливка). Почти все ли-
пиды способны переходить в кристаллическое анизотроп-
ное состояние, поэтому определение изотропности или
анизотропности липидов не имеет большого значения для
их идентификации.
Согласно Лизону, липиды при поляризационно-микро-
скопических исследованиях могут находиться в трех со-
стояниях: 1) изотропном, 2) анизотропном (двойное луче-
преломление) и 3) анизотропном с эффектом «мальтийско-
го креста». В первом случае невозможны какие-либо
выводы о химической природе липидов; это могут быть
нейтральные жиры или жирные кислоты; если условия
проведения опыта препятствуют образованию жидких
кристаллов, то подобную картину мопут также давать хо-
лестерин и фосфолипиды; анизотропное (двойное лучепре-
ломление) без эффекта мальтийского креста также не по-
зволяет делать никаких выводов, поскольку в таком
состоянии может находиться любой кристаллизованный
липид; двойное'лучепреломление с эффектом мальтийско-
го креста свидетельствует о присутствии фосфатидов, це-
реброзидов или эфиров холестерина. Двойное лучепрело-
мление некоторых, липидов может также указывать на их
упорядоченное расположение в гистологических структу-
рах, например в липидном бислое мембран.
4.4.З.1.З. МЕТОДЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
При флуоресцентно-микроскопических исследованиях
следует различать методы первичной и вторичной флуо-
ресценции. Методы первичной флуоресценции основаны
на собственной флуоресценции отдельных липидов, тогда
как методы вторичной флуоресценции основаны на ис-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 149
пользовании флуоресцентных красителей (так называемые
флуорохромы).
а) МЕТОДЫ ПЕРВИЧНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
В гистохимии липидов первичная флуоресценция на-
блюдается лишь у липопигментов (от желтой до желто-зе-
леной), липидов с растворенным каротином (зеленая флуо-
ресценция в УФ-лучах) и стероидных гормонов (зеленая
флуоресценция, изменяющаяся во времени). Представляет
интерес метод выявления витамина А.
6) МЕТОДЫ ВТОРИЧНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Эти методы позволяют точнее устанавливать присут-
ствие липидов в клетках и тканях, чем обычные методы
с использованием красителей. Но еще важнее то, что с по-
мощью флуорохромирования липиды и липопротеиды вы-
являются даже в низких концентрациях. Это особенно от-
носится к флуорохромированию бензпиреном. С по-
мощью фосфина 3R удается получить серебристо-белую
флуоресценцию липидов, которая четко выделяется на фо-
не общей флуоресценции ткани. Оба метода отличаются
тем, что флуоресцентные красители могут использоваться
в водных растворах без растворения мельчайших капель
жира.
4.4.З.1.4. ОКРАШИВАНИЕ ЖИРОРАСТВОРИМЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ
С помощью жировых красителей выявляются только
липиды. Окрашивание липидов так называемыми жировы-
ми красителями, согласно Михаэлесу, представляет собой
обычный процесс растворения, т. е. процесс физический,
а не химический. В конечном счете окрашивание липидов
обусловлено лучшей растворимостью красителя в липидах
по сравнению с его растворимостью в исходном раствори-
теле. Поскольку окрашивание жиров представляет собой
физический процесс, избирательное окрашивание от-
дельных липидов в соответствии с их химическим соста-
вом практически невозможно. Для всех жировых красите-
150 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
лей единственным общим признаком является отсутствие
солюбилизирующих сульфо (— SO3H)- или карбок-
сильных (—СООН)-групп (Harms, 1957).
Основными представителями подобных жировых кра-
сителей являются суданы и их различные варианты
(табл. 32).
Таблица 3.
Методы окрашивания липидов, применяемые в световой микроскопии (Gediglt
Totovic, с изменениями)
Краситель Раствор Авторы
Судан IV Судан IV Судан черный В Судан черный В Судан черный В Масляный красный О Различные суданы Шарлаховый красный Судан Ш Судан III, IV 70%-ный этанол или раствор Герксхаймера 55-70%-ный этанол 35%-ный трет-бутанол 50%-ный диацетин 65%-ный изопропанол Пропиленгликоль 55%-ный диацетин Этанол-фенол-уксусная кислота Уксусная кислота-же- латина Kay, Whitehead, 1941 Jin Pearse, 1968) Lison (1960) Lisoii, Hadler, Sampaio (Lison, 1960) Leach (1938) Lillie (1944) Chifelle, Putt (1951) Gross (1930) Jackson (1944) Govan (1944)
По сравнению с часто применявшимися ранее красны-
ми диазокрасителями Суданом III и Суданом IV введенный
Лизоном в практику гистохимии судан черный В обладает
лучшими красящими свойствами. Он, однако, имеет и су-
щественный недостаток—способен окрашивать белки
и мукополисахариды. По своей химической структуре Су-
дан черный В является диметилнафталинпиримидин-4-
азо-(1-нафтил)-4-азобензолом
Судан черный В
Помимо Судана черного, интенсивное окрашивание жи-
ров, в том числе и мельчайших жировых капель, достигает-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 151
ся при помощи масляного красного О и особенно масляно-
го красного 7 В:
сн3 он
Масляный красный О
Результаты окрашивания определяются не только
свойствами красителя, но и используемым растворителем
(см. табл. 32). На практике хорошо себя зарекомендовала
смесь Герксхаймера, состоящая из равных частей 70%-ного
этанола и ацетона, которая растворяет жиры клетки лишь
в незначительной степени. Экстракцию липидов можно
полностью предотвратить использованием коллоидных
растворов—например, растворы Джексона (Jackson) или
Гована (Govan).
4.4.3.2. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИ-
ЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРАСИТЕЛЯ
К этой категории принадлежит метод выявления нейт-
ральных и кислых липидов с использованием нильского
синего. Двойственное его поведение при окрашивании вод-
ными растворами объясняется следующим образом: не-
диссоциированный краситель (нильский красный) раство-
ряется в липидах, а диссоциированный (нильский синий),
наоборот, в липидах не растворяется, но связывается
с кислыми группами липидов и различными другшии ком-
понентами ткани посредством электростатических сил.
Метод окрашивания нильским синим обладает низкой чув-
ствительностью, причем особенно синий компонент его
склонен к неспецифическим реакциям.
4.43.3. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИПИДОВ
Для выявления липидов помимо физических методов
используются методы, основанные на химических реак-
циях. К этой группе принадлежит большая часть гистохи-
мических методов выявления липидов (табл. 33).
Методы выявления липидов и липопротеидов
Выявляемый липид Фиксация1* Тип среза0 Реакция
Фосфоли- пиды Са-Ф 3 Хромирование (проба с кислым гематеином)
Фосфоли- пиды Са-Ф и ДР- 3, п Окрашивание фта- лоцианином ме- ди (люксоловый прочный синий)
Фосфоли- пиды ф 3 Окрашивание же- лезным гематок- силином
Фосфо- и глико- липиды Различ- ные фик- сато- ры п Окрашивание фта- лоцианином меди
Гликоли- То же 3, п ШИК
ПИДЫ
Липопро- теиды Са-Ф 3 Бензпирен - кофеин (Berg)
Ненасы- » 3, п OsO4-HA
щенные липиды
Ненасы- щенные » 3, п Четырехокись ос- мия
липиды
Таблица 33
Результаты (окрашивание) Специфичность Примечание2*
Черное (сине- черное) Нё абсолютная с
Синее Неспецйфична, необхо- димы контроля о
Темно-синее Специфична с экстрак- цией в контроле с, о
Синее Неспецифична О
Красное Неспецифична, необхо- димы контроля О
Синяя или голу- бовато-белая флуоресцен- ция То же с
Черное Специфична лишь со вспомогательными ре- акциями с, о
Черное (сине- Неспецифична, необхо- димы контроля с, О
черное)
Выявляемый липид Фиксация0 Тнп среза0 Реакция
Сфинго- » 3 NaOH-OsO-HA
миелин
Сфинго- » 3 NaOH - гематеин'
миелин
Жирные кислоты » к Медь - рубеановая кислота
Холесте- рин ф Са-Ф 3 ХКН (хлорная кис- лота - нафтохи- нон)
Холесте- рин Ф-Са. -Cd-Ф 3 Метод окисления с использовани- ем железных квасцов (Schultz)
Плазмало- ген - к Плазмалевая реак- ция (Hayes)
Двойные Са-Ф 3 Бром - серебро
связи
Двойные связи Этанол (не- про- дол- жи- тель- но) к УФ-Шифф
Продолжение табл. 33
Результаты (окрашивание) Специфичность Примечание2*
Оранжево-крас- ное Достаточно специфична для сфингомиелина в сочетании с экстрак- цией ацетоном с, о
Сине-черное Цереброзиды окрашива- ются очень слабо с, О
Зеленовато-чер- ное Специфична с, О
Синее Синее окрашивание спе- цифично для холесте- рина с, О
Сине-зеленое Достаточно специфична с, О
Красное На нефиксированных срезах специфична с, о
От коричневого до черного Достаточно специфична; низкая чувствитель- ность с, о
Темно-красное Неспецифична, необхо- димы контроли с
Выявляемый липид Фиксация1* Тип, среза Реакция
Кислые липиды Са-Ф 3 Базофилия
Кислые липиды Са-Ф (непро- дол- жи- тель- к Окрашивание при заключении (Feyrter)
Кислые липиды но Без фик- сации или не- про- дол- жи- тель- но фик- сиро- ван- ные в эта- к Кислый солохром- цианин
но-
ле3)
Продолжение табл. 33
Результаты (окрашивание) Специфичность Т-Г 2) Примечание
Связывание ме- Неспецифична, необхо- с
тиленового синего при pH ниже 4 димы контроли
Красное Неспецифична, необхо- С, О
димы контроли
Темно-синее в кислом Неспецифична, необхо- с
растворе кра- сителя (pH димы контроли
2,1)
Продолжение табл. 33
Выявляемый липид Фиксация1* Тип,, среза Реакция Результаты (окрашивание) Специфичность Примечание2*
Липиды, содер- жащие холин ф 3 АЦАК-реакция (ангидрид цис- аконитовой кис- лоты) Фиолетовое Специфична (возможно вымывание различных липидов) с
Фосфогли- цериды Са-Ф 3 Гидроксамат золо- та Темно-красное Специфична для лецити- на и кефалина С, О
° Сокращения: Ф-формалин; Са-Ф - кальций-формол; Ca-Cd-Ф - кальций-кадмий-формол; П - парафиновые срезы; 3 - замороженные сре-
зы' К - криостатные срезы.
О-для обычных исследований, С-для специальных исследований.
Уксусная кислота-этанол.
156 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
4.4.З.З.1. ПРИНЦИПЫ РЕАКЦИЙ
1. ФОСФОЛИПИДЫ
Из перечисленных в табл. 33 методов выявления фос-
фолипидов следует отметить пробу с кислым гематеином
и метод с железным гематоксилином по Элледеру и Лойде
(Elleder, Lojda) вследствие их достаточно высокой специ-
фичности. Проба с кислым гематеином основана на окис-
лении фосфолипидов хромированием. Связывающийся
с фосфолипидами хром переводится с помощью кислого
гематеина в соединение хром — гематеин темно-синего
цвета. Диагностическое значение имеет лишь темно-синее
окрашивание.
Механизм реакции при окрашивании железным гема-
токсилином в деталях еще не выяснен, но предполагается,
что в окрашивании играет роль катионный хелат, обла-
дающий способностью связывать ионы железа с фос-
фатными группами.
При менее специфичном методе с фталоцианином меди
по Клюверу и Баррере (Kliiver, Barrera) происходит связы-
вание красителя с остатком холина в фосфолипидах.
Предполагается, что в спиртовых растворах реакция
протекает согласно следующему механизму:
// . Фталоцианин меди
R-0-P-0
xoch2ch2N(ch3]3 + (Cupcjso3h- Основание—►
R-О-Р-О
'0СН2СН2Н(СНз)з0з5(СиРС) + Основание
Люксоловый прочный синий ARN и люксоловый проч-
ный синий G образуют комплексы с фосфолипидами
в 0,1%-ных растворах в абсолютном этаноле. Сравнитель-
но низкая специфичность окрашивания люксоловыми кра-
сителями компенсируется их значением для обзорных ней-
рогистологических исследований.
_____4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 157
2. НЕНАСЫЩЕННЫЕ ЛИПИДЫ
Для выявления ненасыщенных липидов пригоден ме-
тод четырехокись осмия-а-нафтиламин (OsO4-HA) по
Адамсу (Adams) в сочетании со вспомогательными реак-
циями. В этой реакции гидрофобные липиды в результате
окисления OsO4 до OsO2 окрашиваются в черный цвет,
тогда как гидрофильные липиды, образуя хелатные ком-
плексы с осмий — нафтиламином, окрашиваются
в красный цвет. При помощи этого метода можно разли-
чать 3 типа липидов: а) ненасыщенные гидрофобные ли-
пиды (черный цвет), б) ненасыщенные гидрофильные ли-
пиды (красный цвет) и в) насыщенные липиды (бесцветные).
При помощи метода хром — серебро по Нортону (Norton)
происходит образование галогенидов серебра и их восста-
новление до металлического серебра с помощью фото-
проявителя.
3. КИСЛЫЕ ЛИПИДЫ
Из приведенных в табл. 33 методов наиболее на-
дежным следует считать метод установления базофилии
с помощью забуференных растворов метилового синего
для отграничения от кислых мукоидных веществ и нуклеи-
новых кислот. Выявление кислых липидов, кроме того, воз-
" можно при помощи нильского синего.
4. ФОСФОГЛИЦЕРИДЫ
- Принцип, лежащий в основе метода с образованием
гидроксамата золота, основан на гидроксиламинолизе
жирных кислот. Образующиеся при этом гидроксамовые
кислоты выявляются путем восстановления серебром и по-
следующего их перевода в гидроксамат золота. Фосфогли-
цериды окрашиваются в цвета от стабильного красного до
пурпурно-красного.
5. СФИНГОМИЕЛИН
Сфингомиелин относится к липидам, устойчивым
к действию щелочей. Довольно специфично сфингомиелин
выявляется путем гидролиза с NaOH в сочетании с
158 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ОзО4-НА-реакцией, методом Элледера—Лойды и пробой
с кислым гематеином.
6. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ
В основе гистохимического выявления свободных
жирных кислот лежат два принципа: а) омыление с по-
мощью солей металлов; б) образование солей красителей
в реакциях жирных кислот с некоторыми основными кра-
сителями. Среди методов, основанных на омылении—ме-
тоды Фишлера (Fischler), Окамото (Okamoto), Уэда (Ueda)
и Като (Kato) и др.—наиболее надежные результаты обес-
печивает метод Хольцингера (Holczinger, 1959). В этом ме-
тоде жирные кислоты окрашиваются с помощью ком-
плексного соединения (рубеановая кислота—медь)
в зеленовато-черный цвет. Важной предпосылкой для по-
лучения надежных результатов является использование не-
фиксированных замороженных срезов свежего материала.
7. ХОЛЕСТЕРИН
Из методов гистохимического выявления холестерина
своей высокой специфичностью выделяется метод Адамса
(Adams, 1961) с хлорной кислотой и нафтохиноном (ХКН-
метод). Достаточной гистохимической специфичностью
обладает окислительный метод Шульца (табл. 33) с же-
лезными квасцами.
Выявление холестерина
В методе с хлорной кислотой и нафтохиноном хлорная
кислота образует с холестерином нерастворимый хлорат.
_____4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 159
При избытке хлорной кислоты эта соль теряет одну моле-
кулу воды. При этом образуется холеста-3,5-диен.
В последующей реакции с 1,2-нафтохинон-4-сульфоно-
вой кислотой образуется темно-синий пигмент.
8. ПЛАЗМАЛОГЕН
Впервые гистохимическое выявление плазмалогена
провели Фёльген и Фойт (Feulgen, Voit, 1924) при помощи
разработанной ими так называемой плазмалевой реакции.
Впоследствии этот метод неоднократно модифицировал-
ся. По-видимому, плазмалевая реакция достигает макси-
мальной интенсивности лишь при использовании ионизи-
рованных соединений ртути; при этом ртуть встраивается
в структуру плазмалогена. Этот же принцип реакции был
использован в плазмалевой реакции Хайеса (Hayes, 1949).
При этом в результате непродолжительного воздействия
сулемы на плазмалоген отщепляются высшие альдегиды,
которые становятся видимыми под действием реактива
Шиффа.
9. ВЫЯВЛЕНИЕ СВЯЗАННЫХ, ИЛИ МАСКИРОВАННЫХ, ЛИПИДОВ
Липиды, существующие в тканях в невидимой форме,
объединяются термином «маскированные липиды». Неко-
торые из них принимают участие в построении основной
1 структуры цитоплазмы или находятся в клетке в виде
мельчайших диспергированных коллоидных частиц. Осо-
бенно характерно образование липидами комплексов
с белками. Связывание липидов с углеводами наблюдается
реже. В результате связывания маскированных липидов,
прежде всего с белками, их прямое выявление оказывается
невозможным. Для гистохимического выявления маскиро-
ванных липидов должны быть выполнены два условия:
объединение мелкодиспергированных липидов в большие
по размерам комплексы и разрушение связи липид —
— белок.
В методе Беренбаума (Berenbaum, 1958) с использова-
нием Судана черного В в ацетоне связанные (маскиро-
ванные) липиды (хроматин, ядрышко и др.) окрашиваются
в цвета от темно-серого до черного. Для установления ли-
160 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
пидной природы окрашиваемых структур необходимо
проводить контрольные опыты с экстракцией.
10. ВЫЯВЛЕНИЕ КЕТОСТЕРОИДОВ
Гистохимическое выявление кетостероидов основано
на замещении кетогрупп фенилгидразином (или динитро-
фенилгидразином) с образованием окрашенных гидразо-
нов:
/
R • с-он
4NH NH
• с6н5_
+ Н20
Поскольку образование гидразонов возможно и при
наличии в исследуемом материале альдегидных групп, ги-
стохимические методы выявления кетостероидов нельзя
считать специфичными. Эти ограничения распространяют-
ся и на метод выявления кетостероидов по Ашбелю и Зе-
лигману (Ashbel, Seligman, 1949). В этом методе гидразид
2-окси-З-нафтойной кислоты конденсируется с кето- и аль-
дегидными группами и образует гидразоны, которые в ре-
зультате сочетания с солью диазония (прочный синий В),
образуют азокраситель:
Продукт азосочетания
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 161
11. ВЫЯВЛЕНИЕ КАРБОНИЛЬНЫХ ГРУПП
Перечень реакций для выявления карбонильных групп
приведен в табл. 34. В сочетании с реакциями иодирования
может быть достигнута достаточная специфичность выяв-
ления.
Таблица 34
Методы выявления карбонильных групп (Gedick, Totovic)
Фиксация Заливка Реакция Окрашивание Специфичность
Ф; Ф-Са 3 п Шифф Красно-фиолето- вое Преимущественно альдегиды, неко- торые кетоны
ф; Са-Ф 3 Аммиачный раст- вор серебра (ме- тенамин-сереб- ро) Коричнево-черное То же
Ф; Са-Ф 3 Нафтойная кисло- та и гидразид Сине-фиолетовое
Ф; Са-Ф 3 Фенил-гидразин- формазан От красного до красно-коричне- вого Только альдегиды
4.4.3.4. ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКО-
; ПИЧЕСКОМ УРОВНЕ
Ультрагистохимия липидов находится еще в начальной
фазе своего развития. Особенно трудно обеспечить сохран-
ность липидов в процессе фиксации и последующей обра-
ботки фиксированного материала. Количественные иссле-
дования свидетельствуют о том, что дофиксация в OsO4
лишь частично предотвращает потери вещества. Осмиро-
вание оказывает стабилизирующее действие главным
образом на ненасыщенные липиды. Связанный осмий зна-
чительно усиливает контрастирование структур. Этот факт
играет, однако, лишь незначительную роль в идентифика-
ции липидов, поскольку OsO4 образует электроноплотные
соединения и с другими веществами. В табл. 35 представ-
лен перечень ультрагистохимических методов выявления
липидов.
.6-235
Таблица 35
Ультрагистохимическое выявление'липидов (Geyer, с изменениями)
Выявляемые липиды Метод Авторы Примечания
Триглицериды Фосфоглицериды Холестерин Ферментативное отщеп- ление жирных кислот Реакция образования гидроксамовых кислот Реакция холестерин-ди- гитонин Adams, Abdulla, Bayliss, Weller (1966) Galiyas (1963); Weller, Bayliss, Abdulla, Adams, (1965) ’ Scallen, Dietert (1969) Специфичность метода зависит от чистоты препарата липазы Положительно реагируют гид- рофильные фосфоглицериды и гидрофильные триглицери- ды с очень короткими цепя- ми; продуктом реакции явля- ются крупные электроноплот- ные гранулы серебра Реакция сопровождается неко- торым смещением выявляе- мого вещества
-----4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 163
4.43.5. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИПИ-
ДОВ
ОКРАШИВАНИЕ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ В ПО ЛИЗОНУ (LISON, 1960)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в кальций—формоле, замороженные сре-
зы или заливка в поливакс.
2. Промыть в 70%-ном этаноле.
3. Окрасить Суданом черным В (насыщенный раствор
Судана В в 70%-ном этаноле перед использованием филь-
тровать!), 20—30 мин.
4. Промыть в 70%-ном этаноле, 30 с.
5. Быстро промыть в дистиллированной воде.
6. Окрасить 1%-ным ядерным прочным красным,
1 мин.
7. Быстро промыть в дистиллированной воде и заклю-
чить в глицерин — желатину или в глицерин по Целлеру.
РЕЗУЛЬТАТ
Липиды окрашиваются в цвета от черного до темно-си-
него, ядра окрашиваются в красный цвет. Окрашиваются
также и фосфолипиды.
ПРИМЕЧАНИЯ
Для контроля неспецифического окрашивания за счет
адсорбции можно воспользоваться экстракцией ацетоном
или этанолом.
ОКРАШИВАНИЕ МАСЛЯНЫМ КРАСНЫМ О В ИЗОПРОПАНОЛЕ ПО ЛИЛ-
ЛИ (LILLE, 1944)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в кальций—формоле, замороженные
срезы.
2. Замороженные срезы поместить в дистиллирован-
ную воду и быстро промыть в 60%-ном изопропаноле.
6»
164 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
3. Срезы поместить в свежеотфильтрованный, разве-
денный раствор масляного красного, 10—20 мин. (Раствор
масляного красного: 0,5 г масляного красного О раство-
рить в 100 мл 98%-ного изопропанола. Перед употребле-
нием развести дистиллированной водой (6:4), выдержать
24 ч и затем профильтровать.)
4. Быстро дифференцировать в 60%-ном изопропаноле
или тотчас промыть в дистиллированной воде.
5. Окрашивание ядер в гемалауне по Майеру.
6. Промыть в проточной воде, 10 мин.
7. Срезы заключить в глицерин—желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Нейтральные жиры окрашиваются в красный цвет,
ядра—в синий.
ПРИМЕЧАНИЕ
Вместо масляного красного О можно рекомендовать
в первую очередь масляный красный 7 В, который окра-
шивает липиды в ярко-красный цвет. Масляный красный
7 В можно также использовать в виде насыщенного от-
фильтрованного раствора в 70%-ном этаноле.
ОКРАШИВАНИЕ 3,4-БЕНЗПИРЕНОМ ПО БЕРГУ
МЕТОДИКА
1. Фиксация в формалине или в кальций—формоле, за-
мороженные срезы толщиной 10 мкм.
2. Обработать срезы раствором бензпирен — кофеина,
20 мин. (Раствор бензпирена: к 100 мл насыщенного от-
фильтрованного 1,5%-ного раствора кофеина в воде доба-
вить 0,002 г 3,4-бензпирена; раствор выдержать два дня при
+ 37° С, отфильтровать и развести равным объемом ди-
стиллированной воды. Оставить раствор на 2 ч и вновь,
отфильтровать. Колбу с раствором плотно закрыть и по-'
местить в темное место; в таком виде его можно хранить'
несколько месяцев.)
_____4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 165
3. Срезы быстро промыть в дистиллированной воде.
4. Заключить под покровное стекло с водой и тапас ис-
следовать под флуоресцентным микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТ
Липиды выделяются своей синей или бело-синей
флуоресценцией.
ПРИМЕЧАНИЯ
Бензпирен растворяется в липидах ткани. Этот метод
не позволяет отдифференцировать различные классы ли-
пидов. Цвет флуоресценции—от сине-зеленой до бело-си-
ней и бело-желтой,—по-видимому, зависит от концентра-
ции липидов.
ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЕ ЛИПИДОВ ФОСФИНОМ 3R ПО ФОЛЬКУ
И ПОППЕРУ (VOLK, POPPER)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в кальций—формоле, приготовление за-
мороженных срезов толщиной в 10 мкм.
2. Замороженные срезы поместить в дистиллирован-
ную воду.
3. Срезы обработать 0,1%-ным водным раствором
фосфина 3 R.
4» Быстро промыть в дистиллированной воде.
5. Заключить в 90%-ный глицерин или дистиллирован-
ную воду, исследовать под флуоресцентным микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТ
Липиды, включая эфиры холестерина, дают серебри-
сто-белую флуоресценцию. Исключения: жирные кислоты,
мыла и холестерин. Благодаря однозначно-диагностируе-
мой флуоресценции необходимость в контрольных реак-
циях отпадает.
166 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
МЕТОД С ФТАЛОЦИАНИНОМ МЕДИ ПО КЛЮВЕРУ И БАРРЕЙРЕ
(KLUVER, BARRERA)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в кальций-формоле по Бейкеру, приго-
товление замороженных или парафиновых срезов.
2. Срезы поместить в абсолютный этанол.
3. Окрашивание при 56—60° С в 0,1%-ном растворе
люксолового прочного синего (MBS, ARN, G) в 95%-ном
этаноле, 16—18 ч.
4. Срезы промыть в 70%-ном этаноле и в дистилли-
рованной воде
5. Дифференцировать в 0,05%-ном водном растворе
карбоната лития, от 30 мин до 2 ч (замороженные срезы,
фиксированные в формалине, 90 мин).
6. Промыть в дистиллированной воде.
7. Докраска 1%-ным водным раствором нейтрального
красного, от 1 до 30 мин (под контролем микроскопии).
8. Промыть в дистиллированной воде, провести через
ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, баль-
зам.
РЕЗУЛЬТАТ
Фосфолипиды, за исключением сфингомиелина, окра-
шиваются в синий цвет. Окрашиваются также ганглио-
зиды, а возможно, и цереброзиды. Сфингомиелин удается
окрасить лишь при использовании в качестве растворителя
хлороформа вместо этанола. При этом, однако, усиливает-
ся неспецифическое окрашивание. Этот метод рекомен-
дуется лишь для парафиновых срезов.
МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ ЖЕЛЕЗНЫМ ГЕМАТОКСИЛИНОМ ПО ЭЛЛЕ-
ДЕРУ И ЛОЙДЕ (ELLEDER, LOJDA, 1973) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФОСФОЛИ-
ПИДОВ
МЕТОДИКА
1. Приготовление свежих замороженных срезов.
2. Срез А в сухом состоянии обработать при температу-
-----4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 167
ре от 0 до +4° С абсолютным ацетоном (10 мин) и высу-
шить на воздухе.
Срез Б при комнатной температуре экстрагировать
смесью хлороформ — метанол (10 мин), а затем быстро
промыть в ацетоне и дистиллированной воде.
3. Срезы А и Б фиксировать в кальций—формоле
(5—10 мин), а затем промыть в дистиллированной воде.
4. Окрашивание обоих срезов смесью раствора I (3 ча-
сти) и раствора II (1 часть), 6—8 мин.
Раствор 1: 298 мл дистиллировайной воды, 2 мл кон-
центрированной НС1; FeCl3-6H2O —2,5 г; FeSO4-7H2O —
4,5 г.
Раствор II: 100 мл дистиллированной воды; 1 г гема-
токсилина (растворить при слабом нагревании).
5. Промыть в дистиллированной воде.
6. Несколько раз промыть в 0,2%-ной НС1.
7. Хорошо промыть в проточной воде.
8. Заключить под покровное стекло в глицерин-
желатину или после обезвоживания в ацетоне и просвет-
ления в ксилоле—в нейтральный бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Фосфолипиды окрашиваются в темно-синий цвет. Их
можно идентифицировать, лишь сравнив с окрашиванием
срезов, экстрагированных ацетоном и хлороформ —
метанолом, последние не должны давать окрашивания,
обусловленного присутствием липидов.
ПРИМЕЧАНИЯ
Можно также использовать замороженные срезы тка-
ней, фиксированных в формалине. Перед экстракцией аце-
тоном срезы следует подсушить. Продолжительность эк-
стракции в хлороформ — метаноле для материала, фикси-
рованного в формалине, должна составлять 1—2 ч.
С помощью обработки срезов NaOH после экстракции
ацетоном удается выявлять сфингомиелин. Плазмалогены
можно удалять при помощи гидролиза в 1% HgCl2 или
в 1% HgCl2 в 1 н. НС1 в течение 10 мин. Преимуществом
этого метода являются быстрота и надежность.
168 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
МЕТОД С ПРИМЕНЕНИЕМ ЧЕТЫРЕХОКИСИ ОСМИЯ а-НАФТИЛАМИНА
(OsO^-HA-МЕТОД) ПО АДАМСУ (ADAMS)
МЕТОДИКА
1. Фиксация ткани в кальций-формоле, приготовление
замороженных срезов толщиной 10—15 мкм.
2. Обработка свободноплавающих срезов в следующей
смеси: 1 часть 1% OsO4, 3 части 1% КС1О3—18 ч.
3. Промыть в дистиллированной воде, 10 мин.'
4. Срезы монтировать на покровные стекла.
5. Обработать насыщенным водным раствором а-наф-
тиламина при + 37° С, 10—20 мин (насыщенный раствор
а-нафтиламина готовится путем добавления а-нафтилами-
на к дистиллированной воде и последующего фильтрова-
ния после нагревания до +40° С).
6. Промыть в дистиллированной воде, 5 мин.
7. Окрашивание 2%-ным альциановым синим в 5%-ной
уксусной кислоте, от 15 до 60 с (под контролем микроско-
пии!).
8. Заключение в глицерин —желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Фосфолипиды окрашиваются в оранжево-красный
цвет, эфиры холестерина и триглицериды—в черный.
ПРИМЕЧАНИЯ
Гидрофобные липиды, окрашенные в черный цвет, во
многих случаях могут маскировать имеющиеся в тканях
фосфолипиды. В результате гидролиза свободноплаваю-
щих замороженных срезов в 2 н. NaOH, 1 ч при +37° С,
глицерофосфолипиды вымываются, а устойчивые к дей-
ствию щелочи сфингомиелины сохраняются и окраши-
ваются в оранжево-красный цвет. Этот метод выявления
надежен лишь при условии предварительной фиксации сре-
зов в абсолютном ацетоне.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 169
РЕАКЦИЯ ШУЛЬЦА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА И ЕГО ЭФИРОВ
(WEBER, С ИЗМЕНЕНИЯМИ)
МЕТОДИКА
1. Фиксация кусочков тканей в кальций—формоле, 2—
3 дня в холодильнике.
2. Приготовление замороженных срезов толщиной
20—30 мкм.
3. Свободноплавающие срезы промыть в нескольких
сменах дистиллированной воды, 24 ч.
4. Поместить срезы в забуференный раствор сульфата
железо(Ш)-аммония, 7 дней при + 37°С [2,5%-ный сульфат
железо(Ш)-аммония (фиолетовые кристаллы) в 0,2 М аце-
татном буфере, pH 3,0; окончательная величина pH раство-
ра около 2,0].
5. Замороженные срезы промыть в ацетатном буфере,
3 х 1 ч.
6. Промыть в дистиллированной воде.
7. Перенести в 5%-ный формалин, 10 мин.
8. Срезы из раствора формалина нанести на пред-
метные стекла, затем осторожно дать жидкости стечь, по-
сле чего просушить фильтровальной бумагой.
9. Нанести на покровное стекло одну каплю смеси ук-
сусной и серной кислот (смесь из равных частей химически
чистых уксусной и серной кислот); серную кислоту осто-
рожно по каплям добавлять к уксусной кислоте! (при этом
колбу лучше всего охлаждать в ледяной бане). Переверну-
тое предметное стекло со срезом осторожно положить на
покровное и слегка прижать так, чтобы жидкость равно-
мерно распределилась по срезу.
10. Сразу же исследовать под микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТ
Холестерин и его эфиры через несколько секунд при-
обретают сине-зеленое окрашивание. Через 30—60 мин
цвет меняется на синий. Хотя при помощи реакции Шульца
выявляются не только холестерин и его эфиры, метод мож-
но считать достаточно специфичным. Выявление различий
между холестерином и его эфирами возможно в реакции
с дигитонином по Фейгину (Feigin, 1956).
170 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ВЫЯВЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ПО ХОЛЬЦИНГЕРУ (HOLCZINGER,
1959)
МЕТОДИКА
1. Приготовление замороженных срезов нефиксирован-
ного материала.
2. Обработка срезов 0,005%-ным водным раствором
ацетата меди, 3—5 ч.
3. Промыть в двух сменах 0,1%-ного раствора двуна-
триевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭД-
ТУК) при pH 7,1 по 10 с.
4. Промыть в дистиллированной воде.
5. Срезы обработать в 0,1%-ной рубеановой кислоте
в 70%-ном этаноле (100 мг рубеановой кислоты раство-
рить в 70 мл абсолютного этанола при легком нагрева-
нии). После охлаждения раствор довести до 100 мл ди-
стиллированной водой, 30 мин.
6. Промыть в 70%-ном этаноле, Несколько мин.
7. Промыть в дистиллированной воде.
8. Окрасить ядерным прочным красным (в случае
необходимости).
9. Заключить в глицерин — желатину или обезводить
в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол,
бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Жирные кислоты окрашиваются в зеленовато-черный
цвет.
ПРИМЕЧАНИЕ
Согласно Хольцингеру, использование замороженных
срезов свежего материала является важной предпосылкой
для получения надежных результатов. Адамс (Adams, 1955)
считает этот метод абсолютно специфичным для выявле-
ния свободных жирных кислот.
Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 171
ПЛАЗМАЛЕВАЯ РЕАКЦИЯ ПО ХАЙЕСУ (HAYES, 1949)
МЕТОДИКА
1. Фиксация ткани в кальций — формоле, 3—6 ч.
2. Замороженные срезы прикрепить к предметному
стеклу.
3. Обработка в 1—5%-ном растворе хлорида ртути,
10 мин.
4. Промыть в трех сменах дистиллированной воды.
5. Поместить срезы в реактив Шиффа, 20 мин.
6. Промыть срезы в 8О2-воде, 3x1 мин.
7. Промыть в проточной воде, 20 мин.
8. Заключить под покровное стекло в глицерин—же-
латину.
РЕЗУЛЬТАТ
В срезах, обработанных сулемой, плазмали окраши-
ваются в красно-фиолетовый цвет. Контрольные срезы по-
сле п. 2 переносятся непосредственно в реактив Шиффа.
ПРИМЕЧАНИЯ
Срезы, не обработанные раствором сулемы, должны
оставаться неокрашенными. Появление красноватого
окрашивания—признак псевдоплазмалевой реакции,
обусловленной окислением ненасыщенных липидов. Выс-
вобождаемые в результате гидролиза липиды блокируют-
ся при помощи соответствующих реакций сочетания. Реак-
тив Шиффа можно заменить фенилгидразином.
4.5. ФЕРМЕНТЫ
За последние три десятилетия в области энзимологии
были достигнуты поразительные успехи, однако, если био-
химикам известно более 900 различных ферментов, гисто-
химическому изучению доступны лишь около 90 фермен-
тов, т. е. в 10 раз меньше. И все-таки было бы ошибкой
предположить, что информация, получаемая с помощью
гистохимических методов, настолько же менее содержа-
172 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
тельна. Так, например, при изучении обмена веществ в ка-
ком-либо типе клеток нет необходимости выявлять все
ферменты данного цикла. Для ответа на поставленный во-
прос гистохимику достаточно выявить ключевой фермент
(например, начальный или конечный фермент пути обмена
веществ). Точный ответ, однако, во многих случаях может
быть дан лишь при использовании комбинации различных
методов.
4.5.1. РАЗДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Многочисленные известные нам ферменты можно раз-
делить на шесть основных классов, если за классифици-
рующий признак принять тип реакции, катализируемой
данным ферментом:
1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4.
Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтазы).
Официальная классификация ферментов основана на
рекомендациях Международного биохимического союза.
Помимо систематических используются тривиальные на-
именования ферментов. Например: лактатдегидрогена-
за—тривиальное наименование, лактаТ: НАД — оксидо-
редуктаза (КФ 1.1.1.27)—систематическое. В гистохимиче-
ской литературе в последнее время наряду с тривиальными
все чаще используются систематические наименования.
В основном гистохимические реакции разработаны для
выявления различных оксидоредуктаз и гидролаз. Гисто-
химическое выявление изомераз и лигаз пока не удается.
4.5.2. ОБЩИЕ QCHOBbl ГИСТОХИМИИ ФЕРМЕНТОВ
Поскольку ферментные белки по реакциям связывания
красителей практически не отличаются друг от друга, в ос-
нове гистохимии ферментов лежит выявление продукта
ферментативной реакции. Специфическое выявление фер-
ментного белка может быть проведено лишь с помощью
сложных иммуногистохимических методов (см. стр. 297)
При этом следует обращать внимание на то, что гистохи-
мические методы не могут дать сведений о том, в каком со-
стоянии находится фермент—в активном или неактивном.
_____4- Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 173
4.5.2.1. УСЛОВИЯ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ФЕР-
МЕНТОВ
Основной задачей гистохимии ферментов является не
описание цепей внутриклеточных реакций, а в первую оче-
редь точная локализация ферментативной активности,
а следовательно, ферментного белка в клетках и тканях.
Под активностью фермента в гистохимии понимают фер-
ментативное превращение какого-либо субстрата. Решаю-
щую роль играет точная локализация образовавшегося
продукта реакции. В биохимии понятие активности обяза-
тельно связано с определенными экспериментальными ус-
ловиями. Эти условия должны быть подобраны так, чтобы
ферментативная реакция протекала при насыщении суб-
стратом, т. е. чтобы скорость превращения не зависела от
концентрации субстрата.
Результаты выявления фермента могут дать сведения
о его локализации лишь при следующих двух условиях:
1. В процессе подготовки ткани и химического превра-
щения субстрата не должно происходить смещения.
2. Продукт реакции должен выпадать в осадок в том
месте, в котором выявляемый фермент находится при жиз-
ни клетки.
Выполнение этих условий предполагает использование
методов, при которых конечный продукт ферментативной
реакции либо сам по себе нерастворим и окрашен, либо
может быть переведен в нерастворимый и окрашенный
продукт.
При ультрагистохимическом выявлении ферментов ме-
сто их нахождения должно быть достаточно контрастным.
Это возможно при условии, что первичный продукт реак-
ции либо сам имеет достаточную электронную плотность,
либо может быть переведен в другое соединение достаточ-
ной электронной плотности.
4.5.2.2. ПРИНЦИПЫ ВЫЯВЛЕНИЯ
Наиболее часто используемым принципом .гистохими-
ческого выявления гидролитических и окислительных фер-
ментов (гидролаз и оксидоредуктаз) является реакция
одновременного захвата, которая также называется реак-
174 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
цией одновременного сочетания. Схематически ее можно
представить следующим образом:
Ферментативная Реакция
реакция захвата
Субстрат------------> Первичный ------->
продукт
реакции
Конечный
продукт
реакции
В так называемой реакции последующего сочетания ко-
нечный продукт реакции формируется в два раздельных
этапа. Прежде всего срез ткани инкубируют с субстратом.
На втором этапе гидролизованный, находящийся преиму-
щественно в нерастворимой форме продукт переводится
в нерастворимое окрашенное соединение. При выявлении
гидролитических ферментов предпочтение отдается реак-
циям одновременного сочетания. Исключение составляет
метод выявления гетеро-р-галактозидазы.
Результаты ферментативной реакции в значительной
мере определяются свойствами первичного продукта. Ос-
новным препятствием служит диффузия продукта, которая
зависит от скорости гидролиза субстратна, коэффициента
диффузии первичного продукта и pH инкубационной
среды. Диффузию можно ослабить двумя способами: 1)
подбором первичного продукта реакции с большей суб-
стантивностью (склонность к связыванию с белками) и 2)
большей скоростью сочетания в реакции захвата.
Идеальные условия исследования с помощью светового
и электронного микроскопа создаются при наличии таких
продуктов реакции, которые представляют собой окра-
шенные полимеры, связывающиеся с белками ткани.
4.5.2.3. ЛИО- И ДЕСМОФЕРМЕНТЫ
Ферменты существуют в клетке, как правило, в двух
формах: в виде экстрагируемых, растворимых лиофермен-
тов и в виде нерастворимых, связанных с клеточными
структурами десмоферментов. Если гистохимическое
выявление десмоферментов при наличии подходящих ме-
тодов не представляет большой сложности, то выявление
лиоферментов сопряжено со значительной, а иногда и пол-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 175
ной потерей активности, особенно в процессе инкубации
свежей, нефиксированной ткани. Об этом следует помнить,
поскольку значительная часть ферментов любого органа
находится в лиоформе. С помощью фиксации удается до-
стичь определенной иммобилизации растворимых фермен-
тов. Но и сама по себе фиксация сопряжена с определенны-
ми потерями ферментативной активности. Неплохие
возможности для светомикроскопического топохимиче-
ского выявления растворимых ферментов дает метод по-
лупроницаемых мембран и субстратной пленки. Хотя оба
этих метода начали разрабатываться лишь недавно, с их
помощью уже была установлена локализация целого ряда
ферментов без потери лиоформ.
4.S.2.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Ферменты, которые выявляются с образованием на-
блюдаемого в микроскоп продукта реакции, могут быть
идентифицированы, а их свойства должны быть сравнимы
со свойствами ферментов, описанных в биохимических си-
стемах. В табл. 36 суммированы имеющиеся возможности
установления специфичности и биохимической идентично-
сти локализуемых ферментов.
Гистохимические реакции выявления ферментов сле-
дует дополнять контрольными реакциями с активаторами
и ингибиторами, проверкой влияния температуры, pH
и концентрации субстрата. Ферменты с перекрывающейся
субстратной специфичностью удается иногда отдифферен-
цировать по их различной локализации в морфологически
выявляемых структурах. Выявление гидролиза различных,
но родственных субстратов в разных клетках свидетель-
ствует о том, что некогда в исследуемых типах клеток су-_
ществовали различные ферменты. Для дифференцировки
перекрывающихся видов ферментативной активности мо-
гут быть использованы ингибиторы. Таким путем удается,
в частности, разграничить различные типы эстераз
в лизосомах.
Биологически важным методом определения фермен-
тативной активности и ее специфичности в гистохимиче-
ской системе является изучение свойств фермента, прово-
димое на изолированной ткани. Здесь имеется две
176 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 36
Возможности оценки специфичности гистохимических реакций дли выявле-
ния ферментов (Glenner)
Полное или частичное исклю- 1. Выявление с помощью различных близ-
чение локализации кородствеиных субстратов 2. Сравнительное проведение реакции с полифункциональным субстратом и со специфическим продуктом частичного гидролиза
Неконкурентные ингибиторы Подавление связывания фермента с субстратом
Конкурентные ингибиторы Блокирование активных центров фер- мента
Исключение с помощью ин- На химически родственные ферменты
гибитора действует активный ингибитор, спе- цифичный лишь для одного из фер- ментов
Активаторы Сравнение с биохимическими данными
Определение рН-оптимума Сравнение с биохимическими данными
Выделение фермента из Гомогенизация и микропрепарирование
ткани с последующим выявлением фермента- тивной активности
Разделение комплекса фер- Гель-фильтрация, ионообменники, элект-
ментов рофорез
возможности: метод микропрепарирования и метод гомо-
генизации цельной ткани. Метод микропрепарирования
позволяет судить о свойствах фермента в одной клетке или
группе клеток. В связи со значительными трудностями
в освоении этого метода, а также с необходимостью в спе-
циальном оборудовании этот метод крайне редко исполь-
зуется в гистохимических лабораториях для изучения фер-
ментов. В большинстве лабораторий используется метод
работы с гомогенатами из больших тканевых комплексов.
Для сравнения свойств ферментов можно рекомендовать
их разделение с помощью диск-электрофореза. Этим мето-
дом удается установить ферментный состав определенных
участков ткани и дать направление последующему энзимо-
химическому анализу.
Существующие в настоящее время методы позволяют
настолько подробно охарактеризовать фермент, выяв-
ленный в срезе ткани in situ, что становится возможной
оценка его функционального значения.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 177
4.5.3. ГИДРОЛАЗЫ
Эти ферменты катализируют расщепление химических
соединений с присоединением воды, или же обратную ре-
акцию с выделением воды. По типу расщепляемой связи
гидролазы делятся на фосфатазы (фосфоэстеразы), эсте-
разы, гликозидазы, амидазы.
4.5.3.1. ФОСФАТАЗЫ
Важную группу гидролаз составляют фосфатазы, или
фосфоэстеразы, которые расщепляют эфирную связь меж-
ду фосфатом и остатком спирта (R):
о
II
Л—О—р— ОН + H2O«S ЯОН + Н3РО4
он
На фосфомоноэфиры действуют фосфомоноэстеразы.
Они неспецифичны в отношении связанного с фосфатной
группой радикала спирта (R) и поэтому способны стимули-
ровать гидролиз многих органических фосфатов. По рН-
оптимуму фосфомоноэстеразы можно разделить на под-
группы (табл. 37).
4.53.1.1. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЩЕЛОЧНЫЕ ФОСФАТАЗЫ (КФ 3.13.1)
? Щелочные фосфатазы способны гидролизовать много-
численные фосфомоноэфирные соединения. Биологическое
значение этой группы ферментов связано с обменом ну-
клеопротеидов, жиров и гликогена, с процессами гликонео-
генеза и регенерации, как, например, при росте костей,
а также с эмбриогенезом. На основании электронно-микро-
скопических исследований щелочная фосфатаза была отне-
сена к группе мембранных ферментов, функции которых
связаны с различными процессами, протекающими
в мембранах.
Методы гистохимического выявления этих ферментов
основаны на выявлении фосфорной кислоты (метод с соля-
Таблица 3
Разделение фосфомоноэстераз по рН-оптнмуму
Фермент рН-оптимум Ингибиторы Активаторы
Фосфомоноэстераза I (щелочная фосфата- за) 9,2-9,6 Э ДТА, цистеин, глутати- он, фторид» цианид, Be, фосфат, арсенат, L-фенилаланин Аланин, Mg2+ Со2+ Мп2+ Zn2+
Фосфомоноэстераза II (кислая фосфатаза) Фосфомоноэстераза III (растительная кис- лая фосфатаза) 5,0-5,3 3,4-4,2 Фосфат, арсенат, молиб- дат, тартрат и др. a-оксикарбоновые кис- лоты, Fe3*, Са2+, Zn2+, фторид; отсутст- вие подавления 0,5%- ным формалином Mg24" (нейтральные раст- воры) Отсутству- ют
Фосфомоноэстераза IV 5,2-6,2 Cu2+, Со2+, Zn2+, Са2+ 0,5%-ный формалин, слабое подавление фторидом Mg2+
ми металлов) или радикала спирта (метод с азокрасителя-
ми).
НгСОН
2HCOPOjNa2+ 2HjO
H2C0H
Динатрий-2-
глицерофосфат
Ca^PO^I + Шицерин^ 4Na*+ 2Н*
Со2(РОД —► ЪСоЪ (черный)
ЗСа** 2Р0*~
Метод с солями металлов
O-POjNa2
он
осн.
HjO
Na-a-нафтил <х-Нафтол
фосфат
он »
OCHj
M:N
а-
Тетраазотированный
о-дианизидин /соль прочного
он синего В)
+ НцрРОА+№
+ 2НС1
ОСНз оснэ
продукт реакции, окрашенный в темно-голубой цвет
Метод с азокрасителями
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 179
На развитие современной гистоэнзимологии огром-
ное влияние оказал разработанный независимо друг от
друга Гомори (Gomon) и Такаматсу (Takamatsu)
кальций — кобальтовый метод.
Этот метод складывается из двух этапов:
1. Высвобождаемый под действием фермента неоргани-
ческий фосфат осаждается в месте локализации фермента
ионом металла (Са2+).
2. Превращение растворимой бесцветной соли металла
СаНРО4 путем обработки сульфидом аммония в видимый
глазом черный сульфид металла (например, сульфид ко-
бальта или сульфид свинца).
В последующее время в эту реакцию вносили измене-
ния. Она послужила основой для выявления кислой фосфа-
тазы, аденозинтрифосфатазы, 5'-нуклеотидазы, глюкозо-6-
фосфатазы, тиаминпирофосфатазы, аденилатциклазы,
фосфодиэстеразы, неорганической пирофосфатазы, эсте-
разы тиоуксусной кислоты.
Плохая растворимость фосфатов тяжелых металлов,
а также мелкая зернистость их осадка позволяют выявлять
четкую локализацию фермента.
Эти преимущества и отчетливый контраст тяжелых
металлов на электронных микрофотографиях делают
в принципе возможным использование метода Гомори
с солями металлов для ультраструктурной локализации
ферментов, высвобождающих фосфат. Благодаря легкой
растворимости фосфата кобальта и сульфида кобальта в
OsO4 в процессе дофиксации в электронно-микроскопиче-
ских исследованиях для выявления щелочной фосфатазы
вместо Са2 + используют РЬ2 +. Для предотвращения выпа-
дения солей свинца в осадок, наблюдаемого уже при сла-
бощелочных значениях pH, в инкубационную среду доба-.
вляют комплексообразователи, такие, как тартрат, тирон,
цитрат. Принцип комплексообразования зарекомендовал
себя очень хорошо. Благодаря ему появилась возможность
заменить методы, состоящие из двух последовательных
реакций, одновременными реакциями, ведущими непос-
редственно к образованию конечного гистохимического
продукта.
Методы с азокрасителями основаны на выявлении
спиртовых радикалов. Принцип заключается в осаждении
180 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_
и окрашивании с помощью соли диазония высвобождае-
мого ферментативным путем фенольного соединения.
В результате образуется нерастворимый азокраситель. Из
проверенных субстратов наиболее подходящий натрий-а-
нафтилфосфат. Плодотворным оказалось также введение
в гистохимию замещенных нафтола и особенно гексазоти-
рованного парарозанилина в качестве сочетающих аген-
тов. Замещенные нафтолы отличаются низкой раствори-
мостью и высокой субстантивностью.
Основными преимуществами метода одновременного
азосочетания являются следующие:
1) В значительной мере устраняется неспецифическое
окрашивание и адсорбция на тканевых частицах. 2) При со-
кращении сроков инкубации уменьшается опасность лож-
ной локализации.
Щелочная фосфатаза, выявляемая в пищеварительном
тракте, представлена двумя хорошо изученными изофер-
ментами—«интестинального типа» и «печеночного типа».
Щелочная фосфатаза интестинального типа избирательно
подавляется L-фенилаланином (12,5 мМ); щелочная фос-
фатаза печеночного типа ингибируется L-гомоаргинином
(12,5 мМ), но не подавляется Ь-фенилазГанином.
Для выявления щелочной фосфатазы с помощью свето-
вого микроскопа пригодны кальций — кобальтовый метод
Гомори (221) и метод одновременного азосочетания.
Для выявления данного фермента на электронно-микро-
скопическом уровне рекомендуется метод с солями свинца
по Хугону и Боргерсу (Hugon, Borgers).
4.5.З.1.2. НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА (КФ 3.1.3.2)
Неспецифические кислые фосфатазы гидролизуют фос-
фомоноэфиры при pH 3,8—6,0. Электрофоретические
и хроматографические исследования позволили описать
группу кислых фосфомоноэстераз с характерной, хотя
иногда и перекрывающейся, субстратной специфичностью.
Эти группы принято обозначать римскими цифрами II, III
и IV. В тканях животных встречается главным образом
кислая фосфомоноэстераза II с рН-оптимумом 5,0—5,3.
У простейших была описана, кроме того, кислая фосфата-
за с рН-оптимумом 3,0—4,0. Мультиферментный характер
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 181
неспецифической кислой фосфатазы особенно резко выра-
жен у растений. Так, из водоросли Acetabularia mediterranea
было изолировано 5 различных изоферментов кислой
фосфатазы.
Биохимические и электронно-микроскопические иссле-
дования показали, что неспецифическая кислая фосфатаза,
так же как и другие кислые гидролазы, локализуется
главным образом в лизосомах. Поэтому она считается
маркерным ферментом для лизосом (табл. 37). Поскольку
лизосомы связаны своим происхождением с комплексом
Гольджи, то, как и следовало ожидать, активность этого
фермента выявляется также на внутренней мембране этого
комплекса и цистерн гладкого эндоплазматического рети-
кулума.
Результаты гистохимического выявления кислой фос-
фатазы, несомненно, зависят от выбора субстрата. Для ги-
стохимического выявления фосфатаз в качестве субстрата
наиболее пригодны нафтол-AS-BI- и -TR-фосфат. Мето-
дом Лойды (Lojda) с нафтол-А8-В1-фосфатом выявляется
широкий спектр кислых фосфатаз. Все проведенные до сих
пор исследования по электрофоретическому разделению
кислых фосфатаз показали, что данные по числу изофер-
ментов кислой фосфатазы неоднозначны. Чаще всего вы-
деляют 3—4 типа. Кислая фосфатаза является широко
распространенным ферментом, отличающимся выражен-
ной изменчивостью.
По вопросу о выявлении кислой фосфатазы в клеточ-
ном ядре особенно с помощью методов с солями металлов
ведется живая полемика. Несомненно, что концентрация
ионов свинца, используемого в качестве осаждающего ре-
агента, в значительной мере влияет на результаты реакции.
Неспецифическое осаждение ионов свинца часто бывает
следствием неправильного подбора концентрации ионов
свинца в инкубационной среде. В связи с выявлением кис-
лой фосфатазы в клеточном ядре следует отметить
данные, предполагающие здесь наличие особого типа фос-
фатазы, отличающегося от кислой фосфатазы цито-
плазмы.
Для гистохимического выявления неспецифической
кислой фосфатазы на светомикроскопическом уровне ис-
пользуются в первую очередь методы с солями свинца, ос-
182 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
нованные на принципе, предложенном Гомори, и реакции
с образованием азокрасителей при использовании в каче-
стве субстрата гексазотированного парарозанилина и на-
фтол- AS-B1- или -TR-фосфата.
Для ультрагистохимического выявления кислой фосфа-
тазы наиболее пригодны методы с солями свинца. Следует
учитывать возможность артефактов диффузии в реакциях
образования азокрасителей с использованием в качестве
сочетающих реагентов диазотированных фталоцианинов
свинца, а также хлоридов диазония, содержащих свинец.
4.5.З.1.З. У-НУКЛЕОТИДАЗА (КФ 3.1.3.5)
5'-Нуклеотидаза (аденозинмонофосфатаза) является
специфической фосфомоноэстеразой. Этот фермент расще-
пляет аденозин-5-фосфат, так называемую мышечную
адениловую кислоту и инозин-5'-фосфат. pH-Оптимум ле-
жит между 7,2 и 8,5, а также в кислой зоне между 3,5 и 5,5.
В нервных клетках при pH 5,5 этот фермент помимо лизо-
сом, цистерн и пузырьков комплекса Гольджи, выявляется
также в ядре и эргастоплазме. При нейтральных и ще-
лочных значениях pH активность этого фермента выяв-
ляется преимущественно на мембранах. В отношении
функционального значения локализации этого фермента
имеются различные данные, что, возможно, определяется
выбором исследуемой ткани. В частности, значение этого
фермента обсуждается в связи с использованием предше-
ственников нуклеозидфосфатов.
Гистохимическое выявление 5’-нуклеотидазы основано
на разработанном Вакстейном и Майзел (Wachstein, Mei-
sel) методе с применением соли свинца, который оказался
приемлемым и для электронно-гистохимического выявле-
ния этого фермента. Надежные результаты дает также ме-
тод Найду и Пратта (Naidoo, Pratt), в котором для осажде-
ния ионов фосфата также используются ионы свинца.
Выявление активности 5 -нуклеотидазы в лизосомах при
pH 4,5 удается как с помощью световой, так и электронной
микроскопии (Galabow, Davidoff, 1973). Для установления
специфичности реакции при pH 7,5 и выше необходимо ис-
ключить активность щелочной фосфатазы при помощи ин-
гибитора. Никель и цинк подавляют 5 -нуклеотидазу пол-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
183
ностью, тогда как активность неспецифической щелочной
фосфатазы всегда остается неизменной. Специфичность
реакции в кислой зоне следует проверять с помощью инги-
биторов, подавляющих активность кислой фосфатазы.
4.5.З.1.4. АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ (КФ 3.6.1.3; КФ 3.6.1.4)
Аденозинтрифосфатазы (аденилпирофосфатазы, моно-
фосфоаденозинтрифосфатазы) играют центральную роль
в обмене веществ в клетке. Эти ферменты катализируют
отщепление концевой ортофосфатной группы от аденозин-
трифосфата (АТФ). При этом образуется аденозиндифос-
фат:
и и II _ АТФ аза~
Аденозин -р-о-р-о-р-о-он + н,о — =*
ill *
он он он
о о
. к »
Аденозин -р-о-р-он + н3ро4
о* он
Химическая энергия, высвобождающаяся при расщеп-
лении пирофосфатной связи, используется в различных
процессах в клетке. При участии АТФазы осуществляется
не только высвобождение энергии при расщеплении АТФ,
но и обратный синтез АТФ из АДФ (аденозиндифосфата)
при окислительном фосфорилировании. Из печени крысы
было выделено два типа АТФазы—активируемая каль-
цием миозин-АТФаза (КФ.3.6.1.3) и активируемая магнием
митохондриальная АТФаза (КФ 3.6.1.4). Свойства и лока-
лизация этих ферментов охарактеризованы в табл. 38.
Можно с уверенностью предположить существование
в клетке многочисленных изоферментов АТФазы с раз-
личными рН-оптимумами. Их гистохимическое выявление
возможно лишь путем проведения реакции при различных
значениях pH.
Большого внимания заслуживает топохимия АТФазы,
активируемой ионами натрия и калия (Na-K-АТФаза, или
транспортная АТФаза). С уверенностью можно утверж-
дать, что этот очень лабильный фермент был выявлен с по-
мощью гистохимических методов только в сарколемме.
184 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 38
Типы АТФазы
Тип АТФазы Локализация в клетке Активатор Ингибитор
Миозиновая АТФаза (ак- тивируемая кальцием) Митохондриальная АТФаза (активируе- мая магнием) Са2*, Ba2*, Sr2* 2,4-динитрофенол (ДНФ) Mg2*, Мп2*, Со2* 2,4-динитрофенол в присутствии Mg2* Mg2* п-Хлормеркурибензо- ат (пХМБ) Са2*, NaF п-Хлоромеркурибен- зоат (пХМБ) Формальдегид 80 - 90%-ный
По-видимому, новые перспективы открывает гистохими-
ческое выявление активности Na-K-АТФазы, подавляемой
NaF. При этом в качестве активатора используют ионы ка-
лия, в качестве субстрата—п-нитрофенцлфосфат, а вместо
свинца в качестве осаждающего агента—стронций. В от-
личие от свинца стронций не подавляет активность
фермента.
Гистохимическое выявление АТФазы основано на
принципе Гомори и Такаматсу (Gomori, Takamatsu), разра-
ботанном для визуализации активности щелочной фосфа-
тазы с помощью солей металлов. Высвобождающаяся под
действием фермента фосфорная кислота сначала оса-
ждается находящимися в инкубационной среде ионами ме-
талла. На следующем этапе образовавшаяся соль металла
переводится в видимый глазом (бурый или черный) осадок
сульфида металла:
(NH4)2SONa2S
Mg + АТФ Mg • АТФ —iMg • АДФ + PbS
В качестве субстрата, как правило, используют АТФ.
Вместо него можно использовать другие нуклеозидтри-
фосфаты, например инозинтрифосфат (ИТФ) или уридин-
трифосфат (УТФ), или же нуклеозиддифосфаты.
Удовлетворительное топохимическое выявление фер-
мента зависит в первую очередь от следующих двух факто-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 185
ров: от предварительной обработки ткани и от концентра-
ции ионов свинца, используемого для осаждения фосфа-
тов. В этом случае фиксацию замороженных или
криостатных срезов рекомендуют проводить после прове-
дения гистохимической реакции; в качестве фиксирующей
смеси рекомендуется раствор формалина с кальцием, охла-
жденный на ледяной бане. Равным образом пригодна фик-
сация в 2%-ном холодном забуференном растворе глута-
ральдегида. Для выявления Са — АТФазы необходимо
использовать нефиксированные замороженные или крио-
статные срезы.
Хотя фиксация в формалине и глутаральдегиде ведет
к значительной инактивации фермента, сохраняющаяся ак-
тивность АТФазы оказывается достаточно высокой для ее
гистохимического выявления.
В результате использования ионов свинца в инкуба-
ционной среде часть ферментативной активности подав-
ляется и одновременно усиливается неферментативный гид-
ролиз нуклеозидфосфатов. Из этого следует, что выпаде-*
ние продукта гистохимической реакции не во всех случаях
обусловлено ферментативными факторами. Использова-
ние тирона в качестве комплексообразующего агента по-
зволяет уменьшить ингибирующий эффект и значительно
ограничить диффузию продукта реакции. Выше упоми-
налось о больших возможностях, которые нам дает ис-
пользование стронция в качестве осаждающего агента.
Проводимые до сих пор исследования показали, что при
концентрации ионов свинца в инкубационной среде
мМ, достигается удовлетворительное выявление АТФ-
азы при значительном ограничении диффузии продукта
реакции.
В световой и электронной микроскопии для выявления
аденозинтрифосфатаз используется принцип Вахстайна
и Майзел (Wachstein, Meisel). Однако гистохимическое вы-
явление Na-K-зависимой АТФазы в различных тканях на-
талкивается на серьезные трудности. Хорошие результаты
позволяют получать методы Шульце и Волленбергера
(Schulze, Wollenberger, 1971), Палкама и сотр. (Palkama et
al., 1972), а также гистохимическая модификация биохими-
ческого метода Скоу по Фаркухар и Паладу (Farquhar, Pa-
lade, 1966). Надежность выявления этого фермента обусло-
186 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
вливается четким подавлением ферментативной активно-
сти специфическим ингибитором уабаином в контрольных
срезах.
4.5.З.1.5. ГЛЮКОЗО-б-ФОСФАТАЗА (КФ 3.1.3.9)
Эта специфическая фосфомоноэстераза расщепляет
глюкозо-6-фосфат:
Глюкозо-6-фосфат-Г™г—6ч|>ос<1‘атаз> Глюкоза + Ортофосфат.
+ Н2О
Фермент связан с микросомной фракцией и может слу-
жить маркером гранулярного и агранулярного (гладкого)
эндоплазматического ретикулума. Кроме того, он локали-
зуется и в ядерных мембранах. В аппарате Гольджи и дру-
гих органеллах этот фермент не обнаруживается. В разных
_ органах активность глюкозо-6-фосфатазы различна. Наи-
более высокая активность данного фермента выявлена
в печени. В почках, тонком кишечнике, плаценте, мозге
и других органах активность его ниже. Очень низкой, но
все же гистохимически выявляемой активностью глюко-
зо-6-фосфатазы обладают клетки миокарда. Оптимум ак-
тивности фермента лежит при pH 6,0; в изолированном со-
стоянии он наиболее активен при pH 8,0; при pH 5,0 он
денатурируется.
Функциональное значение глюкозо-6-фосфатазы в пер-
вую очередь определяется высвобождением глюкозы
в кровоток. Врожденная недостаточность этого фермента
в печени, где он обычно содержится в максимальной кон-
центрации, лежит в основе известной генетически обусло-
вленной болезни накопления гликогена.
При предварительной обработке ткани для гистохими-
ческого выявления глюкозо-6-фосфатазы следует обра-
щать внимание на значительную чувствительность фер-
мента к действию фиксатора. Фиксация погружением
в холодный формалин или глутаральдегид приводит к зна-
чительной инактивации фермента. Наилучшей можно счи-
тать непродолжительную фиксацию перфузией глутараль-
дегидом в низкой концентрации. Поскольку гистохимиче-
ское выявление этого фермента проводится при pH 6,5,
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 187
следует учитывать возможность неспецифической реакции
за счет щелочной и кислой фосфатаз. Эти трудности удает-
ся обойти при помощи блокады SH-групп, что ведет к по-
давлению активности глюкозо-6-фосфатазы, тогда как ак-
тивность неспецифических фосфатаз остается без измене-
ний. Для контроля специфичности можно, кроме того,
использовать в качестве субстрата Na-P-глицерофосфат
вместо глюкозо-6-фосфата, инактивацию ферментативной
активности путем обработки кислотой и 1,5-сорбитан-6-
фосфат в качестве специфического ингибитора.
Гистохимический метод выявления глюкозо-6-фосфа-
тазы был разработан Чикуином (Chiquoine) на основе
принципа осаждения солями металлов по Гомори (Gomo-
ri). На этом же принципе основаны дальнейшие модифика-
ции этого метода по Вакстейну и Майзел для световой ми-
кроскопии и по Хугону, Боргерсу и Маэстрацци—для
электронной.
433.1.6. ТИАМИНПИРОФОСФАТАЗА
Данный фермент катализирует отщепление концевых
фосфатных групп тиаминпирофосфата. При этом необхо-
димо присутствие ионов двухвалентных металлов, напри-
мер Mn2+, Mg2+, Са2 + . В условиях гистохимического ис-
следования сравнительно устойчивая к действию фиксато-
ров тиаминпирофосфатаза (ТПФаза) выявляется в жи-
вотных и растительных клетках преимущественно
в аппарате Гольджи. Поэтому и в световой, и в электрон-
ной микроскопии этот фермент можно считать маркерным
для аппарата Гольджи. В биохимических исследованиях
ТПФаза может считаться маркером аппарата Гольджи
лишь с оговорками, поскольку и другие фракции клетки
способны катализировать гидролиз тиаминпирофосфата.
В гидролизе тиаминпирофосфата, по-видимому, прини-
мают участие многие ферменты. Вместе с тем один и тот
же фермент оказывается способным стимулировать гидро-
лиз многих субстратов, однако с различной интенсив-
ностью. pH-Оптимум ТПФазы в значительной мере зави-
сит от выбора ткани, о чем свидетельствуют следующие
примеры: pH-оптимум для миобластов сердца цыпленка
188 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
составляет 5,6, для нервных клеток мозга млекопитаю-
щих—7,2, а для придатка семенника мыши—9,5.
О функциональном значении этого фермента суще-
ствуют различные предположения. В последнее время по-
мимо признанной роли в синтезе кокарбоксилазы (тиамин-
пирофосфата) этому ферменту приписывают роль индика-
тора функционального состояния секреторных клеток.
Выявление ТПФазной активности в световой
и электронной микроскопии основывается на принципе
осаждения солями металлов. Отщепляемый в результате
реакции неорганический фосфат осаждается ионами свин-
ца или кальция на месте реакции, а затем выявляется
в форме сульфида свинца. Надежное выявление фермента
с помощью световой и электронной микроскопии может
быть достигнуто с помощью метода Новикова и Гольдфи-
шера (Novikoff, Goldfischer).
4.5.З.1.7. НУКЛЕОЗИД-ДИФОСФАТАЗА (КФ 3.6.1.6), НЕОРГАНИЧЕСКАЯ ПИ-
РОФОСФАТАЗА (КФ3.6.1.1),3,5-ЦИКЛО-НУКЛЕОТИД - ФОСФОДИЭСТЕ-
РАЗА (КФ 3.1.4.17), ГЕКСОЗОДИФОСФАТАЗА (КФ 3.1.3.11), ДЕЗОКСИРИ-
БОНУКЛЕАЗА П (КФ 3.1.4.6), АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА (КФ 4.6.1.1)
„ г
Перечисленные ферменты не подвергаются здесь под-
робному обсуждению, хотя их гистохимическое изучение
имеет большое значение. Перечень ферментов и важней-
ших методов представлен в табл. 39.
4.S.3.2. ЭСТЕРАЗЫ (КФ 3.1.1-)
Эстеразы расщепляют эфиры карбоновых кислот
и спиртов, фенолов и нафтолов:
R—COOR' + Н2О R—СООН + ROH.
Поскольку данная реакция обратима, эти же эстеразы
катализируют синтез соединений со сложной эфирной
связью.
Классификация этой неоднородной группы ферментов
основывается, согласно данным биохимических исследова-
ний, в первую очередь на субстратной специфичности
и действии активаторов и ингибиторов (Gomori, 1955). Это
Фермент Методы
Нуклеозид-дифосфатаза Инозин-(уридин, гуано- зин) дифосфат+РЬ2+ (С и Э)»
3'5'-цикло-нуклеотид - фосфо диэстераза Циклический 3',5'-АМФ+ +5'-нуклеотидаза+РЬ2+ (СиЭ)
3', 5'-цикло-нуклеотид- фосфодиэстераза Индигогенные методы (СиЭ)
Г ексозодифосфатаза Фруктозо-1,6-дифосфат + РЬ2+(Э)
Дезоксирибонуклеаза II ДНК-Ца+Кислая фосфа- таза+РЬ2+ (С и Э)
Аденилатциклаза I. АТФ + РЬ2+ (С и Э)
/ II. 5'-аденилилимидоди- фосфат +РЬ2+ (Э)
О С-световая микроскопия; Э-электронная микроскопия.
Таблица 39
Авторы Примечания
Novikoff, Goldfischer (1961) Локализация в эндоплазма- тическом ретикулуме и аппарате Гольджи
Shanta et al. (1966); Flo- rence, Barmett, Green- gard (1971) Tsou (1975) Многоступенчатая реакция с опасностью ложной ло- кализации продуктов реак- ции
Saito, Ogawa (1968) Zotikov, Bernhard (1970) Необходим основной цитрат свинца как осаждающий реагент Наиболее подходят ультра- тонкие срезы; следует иметь в виду возможность смещения продуктов реак- ции
Reik et al. (1970) Субстратная специфичность
Howell, Whitfield (1972); Schulze et al. (1972, 1975) Специфический субстрат; опасность полного подав- ления активности фермен- та за счёт РЬ2+
190 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
положение, однако, осложняется тем фактом, что различия
между ферментами разных групп довольно незначи-
тельны, а также тем, что их субстратная специфичность
в значительной мере перекрывается. Отдельные ферменты
(изоферменты одной группы) могут действовать на один
и тот же субстрат при тех же значениях pH. Маркерту
и Хантеру (Markert, Hunter, 1959) с помощью электрофоре-
за на крахмальном геле удалось обнаружить в экстрактах
печени взрослых мышей десять различных изоферментов
эстеразы, которые удалось выявить и охарактеризовать
с помощью гистохимических методов окрашивания. Одна-
ко этими методами не удается локализовать отдельно раз-
личные эстеразы и установить их роль в обмене веществ на
срезах ткани. Информативность гистохимических методов
можно значительно повысить благодаря использованию
комбинации физических и химических методов (хромато-
графия, электрофорез) с гистохимическими в сочетании
с контрольными опытами по субстратной специфичности,
активации и ингибированию ферментов.
Гистохимически выявляемые эстеразы могут быть раз-
биты на следующие 4 группы:
1. Неспецифические эстеразы.
2. Липазы.
3. Ацетилхолинэстеразы.
4. Холинэстеразы.
Неспецифические эстеразы и липазы можно объеди-
нить в общую группу алиэстераз. Холинэстеразы удается
отдифференцировать от неспецифических эстераз благода-
ря их чувствительности к эзерину уже при низких концен-
трациях (10-5 М). Поскольку неспецифические эстеразы
способны в значительной мере гидролизовать те же суб-
страты, что и липазы, и наоборот, то четкое разделение
между • этими двумя группами не представляется воз-
можным. Однако, как правило, эфиры с меньшим числом
С-атомов (С2 — Сп) расщепляются преимущественно не-
специфическими эстеразами, а эфиры с большей длиной
углеводородной цепи (С12 — С18)—липазами. Длина угле-
водородной цепи используемого субстрата, определяемая
числом С-атомов, может следовательно служить факто-
ром, характеризующим алиэстеразы в клетках и тканях.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 191
4.5.З.2.1. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭСТЕРАЗЫ
СВОЙСТВА
Олдридж (Aldrige, 1953), а также Бергман и сотр. (Berg-
man et al., 1957) разделили неспецифические эстеразы, гид-
ролизующие эфиры с короткой углеводородной цепью в за-
висимости от их чувствительности к органическим фосфа-
там (особенно диэтил-и-нитрофенилфосфату—«Е 600»
и диизопропилфторфосфату—«ДПФ»), на 3 группы:
А-эстераза, карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1);
В-эстераза, арилэстераза (КФ 3.1.1.2);
С-эстераза, ацетилэстераза (КФ 3.1.1.6).
1. А-эстеразы не подавляются ингибитором Е 600 (диэ-
тил-и-нитрофенилфосфатом) в концентрации вплоть до
10”3 М; они, кроме того, устойчивы и по отношению
к ДПФ. Ингибиторами для них служат ионы металлов, на-
пример Hg2+, Ni , Cu2+, иодацетат, а также желчные со-
ли (таурохолат) и фтор. К активаторам относятся амино-
кислоты, такие, как аргинин, лизин и гистидин. А-астеразы
расщепляют ацетаты интенсивнее, чем бутираты.
Судя по данным цитохимических исследований, А-эсте-
разы локализуются, по-видимому, преимущественно
в лизосомах.
2. В-эстеразы подавляются ингибитором Е 600 в кон-
центрации 10“ 8 М и весьма чувствительны к ДПФ. В-эсте-
разы гидролизуют бутираты с такой же скоростью или да-
же несколько быстрее, чем ацетаты. Они локализуются
преимущественно вне лизосом.
- 3. С-эстеразы отличаются устойчивостью к ДПФ. Их
активность подавляется солями металлов (ацетат ртути,
сульфат меди и др.) и активируется и-хлормеркурибензоа-
том в концентрации 10“5 М.
Гомори (Gomori, 1955) разделил эстеразы (В-эстеразы),
чувствительные й Е 600, по их отношению к NaF (фторид
натрия) на КаРфезистентный панкреатический тип эсте-
разы и на NaF-чувствительный печеночный тип эстеразы.
ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ
Поскольку эстеразы, как правило, являются фермента-
ми с низкой субстратной специфичностью, вопрос о выбо-
192 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_
ре субстрата при их гистохимическом выявлении играет
особо важную роль. В каждом случае необходимо тща-
тельно проверять, действительно ли с используемым суб-
стратом выявляется требуемый фермент. Особенно низкой
субстратной специфичностью, по-видимому, обладают на-
фтилацетаты, которые расщепляются также различными
протеазами (например, трипсином или химотрипсином)
и карбоангидразой или глицератдегидрогеназой.
При использовании методов азосочетания (субстраты:
а-нафтилацетат, -пропионат, -бутират, нафтол-AS-, -AS-D-,
-AS-MX-ацетат, -пропионат, -бутират), согласно данным
световой микроскопии, в клетках печени выявляются пре-
имущественно микросомные В-эстеразы. Для одновремен-
ного выявления локализующихся в гранулярном эндоплаз-
матическом ретикулуме микросомных В-эстераз и устой-
чивых к действию органических фосфатов лизосомных
А-эстераз используются индигогенные методы с 5-бромин-
доксилацетатом и 5-бром-4-хлориндоксилацетатом в каче-
стве субстрата. 5-бром-4-хлориндоксилацетат, по-видимо-
му, в большей мере пригоден для выявления ферментов
этих двух локализаций.
—с-он Эстераза^
4An>CH ’
н
Индиго
Принцип реакции заключается в освобождении под
действием эстеразы индоксильной группы с последующим
окислением этой группы и превращением ее в нераство-
римый синий краситель из группы индиго.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 193
Для выявления активности ферментов, расщепляющих
эфиры в лизосомах, как для световой, так и для электрон-
ной микроскопии можно рекомендовать метод с тиолук-
сусной кислотой и РЬ2 + . Предполагается, что локализую-
щиеся в лизосомах эстеразы, обладающие довольно
высокой термостабильностью, идентичны кислым липа-
зам. Кроме того, хорошие результаты дает метод Дайм-
линга (Deimling), а также метод Даймлинга и Мадрайте-
ра (Deimling, Madreiter) с использованием биохимически
проверенных субстратов (табл. 40).
4.5.3.2.2. ЛИПАЗЫ
Липазы гидролизуют эфиры жирных кислот с довольно
длинной цепью независимо от того, являются ли они триэ-
фирами или моноэфирами. Согласно Деснуйе (Desnuelle),
под липазами, как правило, понимают большую группу
ферментов, гидролизующих различные эфиры, к которым
могут относиться как водорастворимые, так и водонера-
створимые моно- и полиэфиры. Поскольку ацильная груп-
па может быть алифатической или ароматической, а вто-
рая группа спиртовой или фенольной, обычно исполь-
зуемый термин «липаза» мало чем отличается от
определения «эстераза». Для гистохимического выявления
липаз обычно используют в качестве субстратов раз-
личные виды твинов, которые могут, однако, расщеплять-
ся и неспецифическими эстеразами. Разработанный Гомо-
ри метод с солями металлов для выявления липаз не
позволяет получать достаточно определенных результатов
и поэтому не может считаться надежным для выявления
этих ферментов.
4.5.3.23. АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗА (КФ 3.1.1.7)
Встречающаяся в эритроцитах, в нервной ткани и в дви-
гательных концевых пластинках ацетилхолинэстераза (аце-
тилхолингидролаза, «истинная», или «специфическая» хо-
линэстераза, АХЭ) расщепляет преимущественно ацетил-
холин—известный нейромедиатор. Этот фермент гидро-
лизует, однако, и эфиры, не столь близко родственные
ацетилхолину по своей структуре. Кроме того, особен-
7-235
Таблица 40
Методы выявления неспецифических «тераз с помощью световой и электронной микроскопии (Lojda, 1972)
Метод Авторы Примечания0
о-Нафтилацетат 4- Г ексазоний-л-роза- нилин Lehrer, Ornstein (1959) С: хорошо пригоден Э: плохой контраст
Тиолуксусная кислота+ РЬ2+ Wachstein et al. (1961) С и Э: хорошо выявляются лизосомы; возможен спонтанный распад суб- страта
8-пропионокси-5-нитрохинолин + Bi3 + Deimling (1965) С: предпочтительное выявление эс- теразы А
Индоксилацетат 4- Г ексазоний «-роза- нилин Holt, Hicks (1966) С: хорошее выявление, особенно ли- зосомных эстераз Э: контраст от умеренного до слабого
Индоксилацетат Ч-Тетразоний-N, N'- бис (л-аминофенил)-1,3-ксилендиа- мин Kawashima (1968) Э: многообещающий метод
Нафтилтиолацетат или 2-тиолацеток- сибензанилид + Прочный синий BBH+TCH + OsO4 Seligman et al. (1966) Э: возможны артефакты при образо- вании азокрасителей; кроме того, неполный переход липидов в не- растворимую форму
Тиолацетоксибензанилид + Си2++ + Железо (III) —цианид калия Hanker et al. (1972) С и Э: точное выявление лизосом
л—Нитрофенилтиолацетат,-пропио- нат, -бутират + Au Vatter et al. (1968) Э: возможно выявление лизосом, субстрат нестабильный
Продолжение табл. 40
Метод Авторы Примечания^
Нафто л-AS-D-ацетат + Последующее сочетание с диазониевыми солями фталоцианинов свинца (5-нитро)-8-оксихинолинацетат, -про- пинат, -бутират + Bi3+ 8-Меркаптохинолинбутират +ВР+ или Fe2++8-меркаптохинолинацетат Livingston et al. (1969) Deimling, Madreiter (1972a) Deimling, Madreiter (1972b) Э: выявление лизосомных и рибо- сомных эстераз сомнительно из-за артефактов диффузии Э: локализация продуктов реакции преимущественно в митохондриях и липидных каплях, кроме того, в лизосомах и цистернах эндоплаз- матического ретикулума С: результаты реакции, как с «• нафтилбутиратом и прочным синим В Э: продукты реакции локализуются главным образом в цистернах гра- нулярного эндоплазматического ретикулума
1) С - световая микроскопия, Э - электронная микроскопия.
196 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_
ность данного фермента состоит в том, что в отличие от
холинэстеразы он подавляется высокими концентрациями
субстрата.
Для светомикроскопического выявления холинэсте-
разы были разработаны следующие методы: 1) с тиохоли-
ном меди и солями металлов, 2) с тиолуксусной кислотой,
3) с осмиофильным тиоловым эфиром, 4) прямого окраши-
вания с тиохолином по Карновскому и Рутсу (Kamovsky,
Roots).
Прямое выявление АХЭ по ферментному белку воз-
можно с помощью иммуногистохимического метода (Ben-
da, 1970), а также с помощью маркированных ингибиторов
(Ostrowski, Bernhard, 1963). Специфическое выявление аце-
тилхолинэстеразы и холинэстеразы возможно лишь при
использовании специфических ингибиторов. Отдифферен-
цировать оба этих фермента от неспецифических эстераз
можно по их чувствительности к эзерину (физостигмину).
Избирательное подавление активности АХЭ достижимо
с помощью BW284c51, тогда как активность холинэсте-
разы подавляется мипафоксом или изо-ОМРА.
Перечисленные методы имеют как преимущества, так
и недостатки. Метод Кёлле и Фриденталь да (Koelle, Frie-
denwald), открывших в 1949 г. эру гистохимического выя-
вления АХЭ, основан на следующем принципе:
Ацетилхолин + Си2 + -> Тиохолин + Си2 + -> Тиохолин
меди-> Сульфид меди.
В последних публикациях (Tsuji, 1974) высказывается
мнение о том, что иод ацетилхолиниодида ответствен за
осаждение комплекса меди. Большой недостаток метода
Кёлле—Фриденвальда сводится к тому, что положитель-
но заряженный атом азота в тиохолиновом субстрате пре-
пятствует его проникновению в ткань. Низкая проникаю-
щая способность субстрата, а также проблемы,
с которыми сопряжены все неспецифические методы с со-
лями металлов, побудили многочисленных исследователей
модифицировать метод Кёлле—Фриденвальда. При ис-
пользовании в качестве осаждающего реагента свинца или
золота вместо меди были получены хорошие результаты.
Используя соли золота в методе с тиохолином, Кёлле
и Громадский (Koelle, Gromadski) добились довольно тон-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 197
кой локализации ацетилхолинэстеразы и холинэстеразы
в двигательных концевых пластинках.
Метод «прямого окрашивания» (Karnovsky, Roots.
1964) представляет собой шаг вперед по сравнению с дру-
гими тиохолиновыми методами, особенно если речь идет
об электронной микроскопии. Принцип этой реакции за-
ключается в восстановлении тиохолином, высвобождаю-
щимся под действием фермента феррицианида до ферро-
цианида. Ферроцианид образует с ионами меди нераство-
римый электроноплотный осадок коричневого цвета
(коричневый пигмент Хэтчетта). Для подавления неспеци-
фической реакции с феррицианидом ионы меди связы-
ваются в комплекс с цитратом. Образование продукта ре-
акции, устойчивого по отношению к OsO4, делает
возможным перенос этого метода на ультраструктурный
уровень.
Хэнкеру (Hanker) удалось путем связывания осмиевой
чернью усилить и стабилизировать продукт реакции в ме-
стах образования коричневого осадка ферроцианида меди.
Соединение ферроцианида меди с четырехокисью осмия
осуществляется посредством тиокарбогидразида или в ре-
зультате окислительного сочетания с 3,3 -диаминобензиди-
ном (ДАБ).
Ацетилхолин-
(CHs)jNCH2CH2SCOCHs зстеРа.за. » ССН8)ЭЙСН2СН25Н
г ₽Н5’6 J-
Cu*tZ
/Na/tlCNlj' н20
Cu2Ft(CN)6 7Н20|
Ферроцианид меди
(1) H2NNHCSNHNH2 I (1) ДАБ
OR
(2) OsO4 I (2) 0s04
Осмиевая чернь
Методы ультраструктурного выявления АХЭ можно
разделить на четыре группы; каждый из них имеет свои
преимущества и недостатки. При попытках найти корреля-
цию между локализацией фермента и его функцией всегда
выявлялись противоположные мнения.
198 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_
4.53.2.4. ХОЛИНЭСТЕРАЗА (КФ 3.1.1.8)
Холинэстеразы, встречающиеся во многих органах,
расщепляют бутирилхолин быстрее, чем ацетилхолин. По-
скольку для гистохимического выявления этого фермента
часто используют бутирилтиохолиниодид, фермент назы-
вают также бутирилхолинэстеразой. Г истохимическое выя-
вление холинэстеразы лучше всего удается с помощью ме-
тода Карновского и Рутса в сочетании с соответствующи-
ми контрольными опытами и ингибированием.
4.5.3.3. СУЛЬФАТАЗЫ
Эти ферменты катализируют обратимый гидролиз
эфиров серной кислоты:
ROSO3H + Н2О ROH + H2SO4.
Сульфатазы широко распространены в тканях высших
животных. Они выполняют в организме самые разно-
образные функции (участвуют, например, в обмене углево-
дов, в обезвреживании ядов и в синтезе стероидов), но их
физиологическое значение еще не полностью выяснено. На
основании биохимических данных арийсульфатазы были
разделены на 3 группы: арилсульфатазы А, В и С. Арил-
сульфатазы А и В локализуются во фракции лизосом;
предполагается, что тип В связан с мембранами лизосом,
тогда как тип А локализуется внутри лизосом. Сульфатаза
С выявляется в микросомной фракции и как фермент,
обладающий активной SH-группой, подавляется циани-
дом. Эти три типа сульфатаз удается различать по их суб-
стратной специфичности в отношении и-нитрокатехол-
сульфата и n-нитрофенилсульфата или и-ацетилсульфата,
а также по их устойчивости к действию KCN.
Гистохимическое выявление арилсульфатаз требует
предварительной фиксации ткани (глутаральдегид или
формалин). Имеется 3 основных принципа выявления этих
ферментов: реакция азосочетания, реакция осаждения со-
лями металлов и индигогенные методы.
Методам осаждения солями металлов в настоящее вре-
мя отдается предпочтение, поскольку с их помощью удает-
ся определять локализацию фермента и на электронно-ми-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 199
кроскопическом уровне. Чаще всего используют в качестве
субстрата и-нитрокатехолсульфат, который расщепляется
арилсульфатазами А и В. Для осаждения высвобождаю-
щихся ионов сульфата используют ионы РЬ2+ и Ва2+. Для
световой микроскопии рекомендуется использование ио-
нов свинца, которые могут быть переведены в видимый
глазом сульфид свинца; сульфат бария выявляется лишь
с помощью фазово-контрастного микроскопа. При помо-
щи электронной микроскопии в лизосомах удается наблю-
дать более равномерное распределение осадка при исполь-
зовании Ва , чем при осаждении РЬ2+. К этому следует
добавить, что барий даже при высоких концентрациях не
подавляет активности этих ферментов.
4.5.3.4. ГЛИКОЗИДАЗЫ
Гликозидазы растительных и животных тканей расще-
пляют гликозидные соединения следующего строения:
^>СНО—R
Речь идет о связи между кислым остатком сахара и ще-
лочным остатком другого соединения (R), которое может
быть сахаром или спиртом. Существовавшее ранее пред-
ставление об узкой специфичности гликозидаз требует
пересмотра. Так, например, кислая Р-галактозидаза спо-
собна расщеплять и p-D-фукозиды (Lojda, 1972).
В гистохимии используются как методы азосочетания,
так и индигогенные методы. С их помощью выявляют
целый ряд ферментов этой группы, такие, как Р-глюкози-
дазу, р-галактозидазу, Р-глюкуронидазу и Р-ацетилглю-
козаминидазу. Три последних фермента локализуются
в лизосомах.
4.5.З.4.1. Р-ГЛЮКУРОНИДАЗА (КФ 3.2.1.31)
Этот фермент катализирует гидролиз природных и син-
тетических P-D-глюкуронидов:
/ОНО—R -I- Н80 * С\СНОН + ROH
200 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Согласно классификации ферментов (КФ), Р-глюкуронида-
зу относят к лизосомным ферментам, хотя Фишману
и сотр. (Fishman u. Mitarb.) удалось выявить этот фермент
и в эндоплазматическом ретикулуме.
При световой микроскопия для гистохимического выявле-
ния этого фермента используют хорошо зарекомендовав-
ший себя метод одновременного сочетания по Хайяси
(Hayashi) с нафтол-А8-В1-глюкуронидом в качестве суб-
страта и с гексазоний-парарозанилином в качестве соче-
тающего реагента. Близкие результаты позволяет полу-
чать индигогенный метод с использованием в качестве
субстрата 4-хлор-5-бром-3-индоксил-Р-0-глюкуронида, а
в качестве окисляющего агента феррицианида калия (Lo-
jda, 1971).
Для ультрагистохимического выявления активности Р-
глюкуронидазы в цитоплазме, несмотря на недостатки
в отношении точности локализации, пригоден метод по-
следующего сочетания по Смиту и Фишману (Smith, Fish-
man, 1963). Необходимая электронная плотность дости-
гается при этом благодаря использованию диазотирован-
ного п-(ацетоксимеркури)-анилина. Этот так называемый
АМА-диазотат, по-видимому, более пригоден в качестве
сочетающего реагента, чем гексазоний-парарозанилин.
4.53.4.2. Р-ГАЛАКТОЗЙДАЗА (КФ 3.2.1.23)
Этот широко распространенный в животных тканях
фермент расщепляет различные Р-галактозиды, включая
лактозу, но не Р-глюкозиды. pH-Оптимум фермента лежит
в пределах 3—4,5 и зависит от вида животного, исследуе-
мого органа, применявшегося субстрата и буфера. В каче-
стве ингибиторов известны галактонолактон и и-хлормер-
курибензоат. Согласно данным, полученным с использова-
нием метода дифференциального центрифугирования, ак-
тивность этого фермента связана с лизосомной фракцией.
Этот фермент участвует в катаболизме мукоидных ве-
ществ и гликолипидов.
В кишечнике и почках была выявлена еще одна Р-галак-
тозидаза с более высоким pH-оптимумом и более прочной
связью со структурами, которая известна как нейтральная
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 201
[3-галактозидаза, или лактаза. Ее физиологическая роль со-
стоит в расщеплении лактозы пищи.
Для гистохимического выявления р-галакгозидазной
активности в качестве субстрата используют лактозу
и синтетические галактозиды. Однако методы, в которых
используются эти субстраты, не позволяют получать удо-
влетворительных результатов. Особенно с синтетическими
галактозидами нельзя добиться ни разделения двух типов
0-галактозидазы, ни четкой лизосомной локализации. Все
эти трудности устраняются, если в качестве субстрата ис-
пользовать 5-бром-4-хлор-3-индоксил-Р-О-галактозид для
кислой 0-галактозидазы и 5-бром-4-хлор-3-индоксил-р-О-
фукозид—для нейтральной; для инкубационной среды
при этом рекомендуется цитратно-фосфатный буфер,
а в качестве окисляющего агента—феррицианид калия (Lo-
jda, 1970). Выявленная при таких условиях локализация
обеих 0-галактозидаз in situ хорошо согласуется с биохи-
мическими данными.
Для электронно-гистохимической локализации Р-га-
лактозидазы можно использовать реакцию образования
коричневого пигмента Хэтчетта (результат связывания
восстановленного феррицианида с Си2+).
4.53.5. ПЕПТИДАЗЫ
Будучи протеолитическими ферментами, пептидазы
расщепляют (— СО — NH — )-связи. Эти ферменты делят-
ся иа две основные группы:
1. Экзопептидазы, которые расщепляют только кон-
цевые пептидные связи.
2. Эндопептидазы, или протеиназы, расщепляющие
пептидные связи, находящиеся внутри полипептидноЙ
цепи.
В обеих группах встречаются ферменты, действующие
как вне-, так и внутриклеточно; их pH-оптимум лежит
в пределах 4—6. Правда, описаны также ферменты с опти-
мумом при pH 3 и при pH 11. Группу внутриклеточных
кислых пептидаз объединяют под термином «катепсины»
с порядковыми буквенными обозначениями от А до Е.
К эндопептидазам относятся катепсины В, D и Е, к экзо-
пептидазам—катепсины А и С. Катепсины А, В, С и D ло-
202 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
кализуются в лизосомах. Пептидазная активность была
выявлена в клетках проксимального отдела извитых ка-
нальцев почек в мембрацах гладкого энодоплазматическо-
го ретикулума и в пузырьках Гольджи в области щеточной
каемки. В остальном из-за недостаточной надежности уль-
трагистохимических методов корреляция между субкле-
точными структ} рами и активностью ферментов этой
группы точно неустановлена.
Как в световой, так и в электронной микроскопии, ги-
стохимическое выявление касается главным образом ами-
нопептидаз, относящихся к экзопептидазам. В световой
микроскопии для локализации экзопептидаз мы распола-
гаем практически лишь методом с протеинатом серебра по
Ямаде и Офуги (Yamada, Ofugi, 1968), механизм реакции
при котором пока еще не выяснен.
Выявление аминопептидаз основано на принципе одно-
временного азосочетания. При световой микроскопии вы-
явление основано на отщеплении соединения нафтола от
субстрата в результате действия фермента. При одновре-
менном сочетании. этого соединения с солью диазония
образуется нерастворимый азокраситель. Из применяемых
субстратов следует выделить Ь-лейцил-4-метокси-2-нафти-
ламид или Ь-аланил-4-мето. си-2-нафтиламид, обладаю-
щие высокой скоростью сочетания. Правда, на локализа-
цию красителя в месте нахождения фермента влияет
также поведение используемых солей диазония по отноше-
нию к липидам:
В световой микроскопии для выявления аминопепти-
дазной активности пригодны методы с L-лейцил-Р-нафти-
ламидом или Ь-лейцил-4-метокси-р~нафталамидом.
В электронной гистохимии выявление этого фермента воз-
можно с помощью реакции образования азокрасителя по
Зелигману и др. (Seligman et al., 1970).
4.5.3.6. ФОСФОРИЛАЗЬ!
Фосфорилазы катализируют следующую реакцию без
захвата или отдачи молекулы воды:
Глюкозо-1-фосфат Полисахарид + Н3РО4.
Из рассмотрения механизма этой реакции следует, что
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 203
участвующие в ней ферменты ответственны как за распад,
так и за синтез гликогена. Однако предполагается, что фос-
форилазы в тканях ответственны главным образом за про-
цесс распада гликогена, за счет укорочения глюкозной
цепи. Находящаяся в тканях неактивная фосфорилаза
(фосфорилаза В) переводится под действием киназы
в активную форму (фосфорилаза А) в присутствии
Mg2+; при этом расходуется АТФ.
2 Фосфорилаза В + 4 АТФ -» Фосфорилаза А + 4 АДФ.
В синтезе гликогена с неразветвленной цепью и глико-
гена с разветвленной цепью участвуют разные ферменты.
В построении неразветвленных полисахаридов принимает
участие так называемая амилофосфорилаза (а-глюкозил-
трансфераза, КФ 2.4.1.1), или Р-фермент. Синтез развет-
вленных полисахаридов, наоборот, катализируется другим
ферментом. Этот так называемый ветвящий фермент, или
Q-фермент, катализирует образование 1-» 6-связей в ме-
стах ветвления полисахаридной цепи. Он называется а-
глюкантрансферазой (КФ 2.4.1.18), или 1,4-а-глюкан-ветвя-
щим ферментом.
Для гистохимии, кроме того, представляет интерес
У ДФ-глюкоза—гликогенглюкозил трансфераза (КФ
2 .4.1.11)—фермент, который участвует в синтезе гликогена
из уридиндифосфоглюкозы. Поскольку этот фермент ката-
лизирует синтез гликогена, его называют также гликоген-
синтазой (Luppa, Bernstein, 1977).
Гистохимическое выявление трех биохимически оха-
рактеризованных гликозилтрансфераз основано на визуа-
лизации синтезированного полисахарида. Таким образом,
речь идет о прямом выявлении естественного продукта ре-
акции. Для демонстрации продукта реакции имеются два
основных метода: иодная реакция и ШИК-реакция. Можно
рекомендовать гистохимическую реакцию с иодом, разра-
ботанную Такеучи и Куриаки (Takeuchi, Kuriaki, 1955).
Принцип этой реакции заключается в выявлении ново-
образованного полисахарида типа амилозы. При этом
проводят инкубацию в растворе, содержащем в качестве
субстрата глюкозо-1-фосфат, в качестве активаторов—ад-
енозин-5-фосфат и инсулин, а также гликоген для затрав-
ки. Возможность осаждения высвобождающегося неорга-
204 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
нического фосфата по принципу Гомори при помощи
ионов свинца представляет скорее теоретический, нежели
практический интерес, поскольку ионы свинца сильно по-
давляют фосфорилазную активность (Pearse, 1972). Между
тем разработаны реакции, позволяющие осуществлять
точную ультраструктурную локализацию фосфорилазы
и УДФ-глюкоза—гликогенглюкозилтрансферазы без ис-
пользования ионов свинца в качестве осаждающего агента
(Takeuchi, Sasahi, 1970).
При световой микроскопии для выявления фосфори-
лазной активности, как правило, отдается предпочтение
иодной реакции, поскольку в отличие от ШИК-реакции с ее
помощью удается отличать новообразованный гликоген
от нативного или эндогенного. Зассе (Sasse, 1966) исполь-
зует для этого гидролиз 10%-ной серной кислотой.
Если в световой микроскопии надежная дифференци-
ровка нативного гликогена от новообразованного возмож-
на лишь с помощью удаления нативиого гликогена после
проведения реакции, то на ультраструктурном уровне эта
задача разрешается на основе различий в морфологии обо-
их типов гликогена (Geyer, 1973). Нельзя не отметить, од-
нако, что установление таких различий между нативным
гликогеном и новообразованной полиглюкозой сопряжено
с определенными трудностями.
Фосфорилазная активность в тканях, в которых содер-
жание нативного гликогена сильно снижено (вплоть до
полного отсутствия) в результате экспериментальных воз-
действий или патологических процессов, может быть выяв-
лена методом с использованием декстрана в качестве
естественного акцептора для гликозильных остатков (Mei-
jer, 1968). Этот метод считается в настоящее время
предпочтительным.
Различия между фосфорилазой и ветвящим ферментом
могут быть установлены с помощью вспомогательных
процедур, перечисленных в табл. 41.
4.5.4. ТРАНСФЕРАЗЫ
К трансферазам принадлежат ферменты, катализирую-
щие перенос групп (например, фосфатных, карбоксильных,
ацильных). Набор надежных гистохимических методов вы-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 205
Таблица 41
Различая между фосфорилазой и ветвящим ферментом (Kiszely, Р6-
zalaky)
Реакции Фосфорилаза Ветвящий фермент
Синтезированный полисахарид
Амилоза типа А Амилопектин-гликоген
Иод ШИК а-Амилаза Р-Амилаза Этанол (20%) Меркурихлорид (ИГ* М) Голубое окрашивание Положительна Полное расщепление То же Слабое подавление То же Фиолетово-красное, ко- ричневато-пурпурное Положительна Полное расщепление Расщепления нет Сильное подавление Полное подавление
явления трансфераз в настоящее время невелик. На уровне
световой и электронной микроскопии могут быть выяв-
лены следующие ферменты: аспартат—карбамоилтранс-
фераза (КФ 2>1.3.2; выявляется лишь при электронной ми-
кроскопии), орнитин — карбамоилтрансфераза (КФ 2.1.3.3),
холин-ацетилтрансфераза (КФ 2.3.1.6), аспартатамино-
трансфераза (КФ 2.6.1.1; ранее известна как
глутамат-оксалацетат — трансаминаза, или ГОТ),
орнитин-оксокислота — аминотрансфераза (КФ 2.6.1.13),
гексокиназа (КФ 2.7.1.1; выявляется при световой микро-
скопии), глюкокиназа (КФ 2.7.1.2; световая микроскопия),
креатинкиназа (КФ 2.7.3.2), фосфоглюкомутаза (КФ 2.7.5.1;
световая микроскопия), у-глутамилтрансфераза (КФ
2.3.2.2).
4.5.4.1. ХОЛИН-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (КФ 2.3.1.6)
Этот фермент в противоположность ацетилхолинэсте-
разе принимает участие в синтезе нейромедиатора ацетил-
холина. В его задачу входит перенос ацетильной группы от
ацетил-КоА на холин.
Предполагается, что холин-ацетилтрансфераза встре-
чается в нескольких молекулярных формах, или конфигу-
рациях. Она является растворимым цитоплазматическим
ферментом, активность и растворимость которого зависят
от ионной силы. Как показали исследования, этот фермент
206 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 42
Область мозга Сохранность гистохямнчесхи выявляемой ак- тивности холин-ацетилтрансферазы в криостат- ных срезах в процентах по отношению к об- щей активности (радиохимические измерения)
Спинной мозг 43-44
Неостриатум (хвостатое тело, скор- лупа) и лобная кора 26-27
Область ядер гипоталамуса 39-74
обладает различной растворимостью в различных участ-
ках мозга (табл. 42).
Создание надежного гистохимического метода локали-
зации холин-трансферазы диктуется необходимостью ло-
кализации синтеза ацетилхолина in situ, поскольку прямое
топохимическое выявление нейромедиатора ацетилхолина
в настоящее время методически невозможно.
Берт (Burt) и Каза (Kasa) разработали методы гистохи-
мического выявления этого фермента на основе одинако-
вого принципа: SH-группа, высвобождаемая из ацетил-
КоА в процессе образования ацетилхолина, осаждается
с помощью ионов тяжелых металлов, например свинца.
Однако практически любой фермент^ действие которого
в условиях данной инкубационной среды направлено на
высвобождение кофермента А, может давать положитель-
ную реакцию. Поэтому зависимость реакции от холина
является необходимым критерием специфичности. Невы-
ясненным остается вопрос, является ли содержание эндо-
генного холина достаточным для прохождения гистохими-
ческой реакции.
Однако наибольшим недостатком этого метода
является то, что для холин-ацетилтрансферазы нет специ-
фического необратимого ингибитора, который бы мог
быть использован в гистохимических условиях. На основа-
нии радиохимических сравнительных исследований Берт
приходит к выводу, что 70% выявляемого с помощью его
метода продукта реакции может быть отнесено за счет хо-
лин-ацетилтрансферазной активности. Каза полагает, что
с помощью его метода, который отличается от метода
Берта концентрацией ионов свинца, ацетил-КоА, холина
и буфера, удается выявлять вплоть до 90% ферментатив-
ной активности. Модификация этого метода с использова-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 207
нием полупроницаемых мембран позволяет снижать поте*
ри ферментативной активности в результате вымывания.
Добавление NaCl в инкубационную среду в качестве акти-
ватора позволяет еще более повысить специфичность это-
го метода (Hiither, Luppa).
4.5.5. КАРБОАНГИДРАЗА (КФ 4.2.1.1)
Цинксодержащий фермент карбоангидраза катализи-
рует следующую реакцию:
Карбоангидраза f
Н2СО3 - - »со2 + н2о.
Значительно повышая скорость этой реакции, карбоан-
гидраза играет важную роль в целом ряде процессов, про-
текающих в организме.
Как показывают биохимические данные, этот фермент
не относится к категории повсеместных: он встречается
лишь в некоторых органах, например в жабрах у рыб,
слюнных железах, эритроцитах, почках, слизистой желуд-
ка, поджелудочной железе, центральной нервной системе,
цилиарном теле глаза у млекопитающих. Этот факт под-
черкивает значение топохимического выявления карбоан-
гидразы.
Основное условие гистохимического выявления этого
фермента заключается в том, что в процессе гистохимиче-
ской реакции срезы ткани должны находиться на поверх-
ности инкубационного раствора, что обеспечивает беспре-
пятственное выделение СО2.
После того как выяснилось, что применявшийся
с 1953 г. метод Кураты (Kurata) не обладает специфич-
ностью, для выявления карбонагидразы как в световой, так
и в электронной микроскопии стали применять методы
Хаузлера (Hausler, 1958) и Ханссона (Hansson, 1967), а так-
же их модификации. Согласно Хаузлеру, ферментативная
реакция имеет следующий механизм:
2 НСОз г±СО32~+ Н2СО3
Карбоигидраза
Н2СО3^=^ГН2О + со2.
СО2- осаждается ионами Со2+ из среды в виде СоСО3.
208 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Ханссон, наоборот, видит предпосылку для осущест-
вления этой реакции в обогащении среды ионами ОН .
При этом в месте локализации фермента должен выпадать
в осадок гидроксид кобальта или основной карбонат
кальция.
t
СОз + Н+ 5=± HCOf + Н+ Н4СОз • COi + Н10
+ +
ОН" ОН"
11 U
Н20 Н20
Ферментативная активность при выявлении ее с по-
мощью этих двух методов ингибируется ацетазоламидом,
которым лучше обрабатывать срезы до инкубации. Чув-
ствительность к. ацетазоламиду считается важным крите-
рием специфичности данной реакции*. Особенно наглядно
результаты этой реакции можно наблюдать, используя та-
кие объекты, как обкладочные клетки и эритроциты.
По мнению Мазера (Muther, 1972), методы выявления
карбоангидразы лишены необходимой*специфичности по
следующей причине: продукт реакции образуется в виде
неизвестного соединения кобальта под влиянием не зави-
сящего от действия фермента защелачивания среды. Инги-
биторы карбоангидразы подавляют окрашивание через
промежуточную реакцию с кобальтом, а не в результате
подавления самого фермента. На эту реакцию могут
оказывать влияние агенты, не относящиеся к ингибиторам
карбоангидразы (например, лаурилсульфат натрия, 5-ами-
нотиодиазол).
Согласно Мазеру, данные методы в принципе выяв-
ляют активность карбоангидразы, однако механизм реак-
ции, по его мнению, отличается от механизмов, предло-
женных авторами этих методов.
4.5.6. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ
Ферменты этой группы ответственны за высвобожде-
ние необходимой организму энергии из питательных ве-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 209
ществ в процессе окисления. Согласно механизму
высвобождения энергии, различают дегидрогеназы и окси-
дазы.
4.5.6.1. ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
Дегидрогеназами называют ферменты, которые отщеп-
ляют водород от соответствующего субстрата и переносят
его на акцептор.
Этот механизм действия используется в гистохимиче-
ских методах, при которых в систему вводится индикатор,
принимающий на себя водород. Индикатор должен при
этом менять окраску и выпадать в осадок. В качестве инди-
каторов ранее применяли теллурит натрия и калия, а также
селенит натрия. Кроме того, используется эффект обесцве-
чивания метиленового синего под влиянием воздействия
дегидрогеназ. Однако эра гистохимии дегидрогеназ нача-
лась лишь с того момента, как в практику вошли соли
тетразол ия.
Использование водорастворимых солей тетразолия ос-
новано на том, что под действием восстанавливающих ве-
ществ они превращаются в водонерастворимый окра-
шенный формазан. В гистохимических реакциях соли
тетразолия выступают в роли акцепторов водорода, что
легко показать на примере восстановления часто приме-
нявшегося ранее трифенолтеТразолийхлорида (ТТХ) до
имеющего красный цвет формазана:
*N-N-R ,u+ .N-N-R
R-c* R-c’ +HCI
'n=n+-r 'n=n-r
СГ
Сом тетразолия Фармазон
(бесцветная) (окрашенный)
Постепенно на смену ТТХ пришел целый ряд новых со-
лей тетразолия, более пригодных для микроскопических
исследований. К ним принадлежат: неотетразолийхлорид
(НТ), синий тетразолий (СТ, тетразолиевый синий),
3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифинилтетразолийбромид
(МТТ), иоднитрофенилтетразолий (ИНТ), нитро-СТ и те-
гранитро-СТ (ТНСТ).
210 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Пригодность солей тетразолия определяется их особы-
ми свойствами. Будучи акцепторами водорода (электро-
нов), они должны принимать на себя водород, который,
проходя через всю систему переносчиков, соединяется
с молекулярным кислородом. Соответственно окислитель-
но-восстановительный потенциал (окисляющая способ-
ность) различных солей тетразолия является важным кри-
терием их гистохимической пригодности.
Помимо окислительно-восстановительного потенциа-
ла солей тетразолия для гистохимического выявления де-
гидрогеназ важное значение имеют свойства формазанов;
к ним относятся: а) тонкая структура, б) субстантивность,
в) растворимость.
Локализация фермента в клетке возможна лишь тогда,
когда используемые соли тетразолия образуют аморфный
или хотя бы микрокристаллический формазан. Посред-
ством связывания в комплекс солями металлов в процессе
инкубации можно предотвратить растворение кристаллов
формазана, как это и делается при использовании МТТ-ко-
бальтового метода.
Формазаны должны обладать также определенной суб-
стантивностью, т. е. способностью связываться с белками.
При этом не должно происходить вторичной адсорбции на
других компонентах ткани.
Формазаны нерастворимы в воде, но имеют тенденцию
растворяться в липидах. Такими нежелательными свой-
ствами обладали применявшиеся прежде препараты тетра-
золия (например, ТГС). Нитро-СТ и особенно тетранитро-
СТ обладают низкой растворимостью в липидах или же
вовсе не растворяются в них. Согласно многочисленным
исследованиям, формазаны, полученные при использова-
нии МТТ, нитро-СТ и тетранитро-СТ, позволяют устана-
вливать внутриклеточную локализацию дегидрогеназ под
световым микроскопом.
Для электронно-микроскопического выявления деги-
дрогеназ подходящими реагентами оказались нитро-СТ
и тетранитро-СТ, с осмиофильной тиокарбамильной груп-
пой (ТК-НСТ). Для этих целей можно также использовать
тетранитро-СТ. Правда, следует учитывать возможное вы-
мывание формазана в процессе заливки.
Кроме того, для выявления различных дегидрогеназ
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 211
и диафораз используется феррицианид, способный прини-
мать на себя электроны с дыхательной цепи, восстанавли-
ваясь до ферроцианида. В присутствии Си2+ ферроцианид
образует электроноплотный мелкозернистый ферроциа-
нид меди.
Выявление НАД + - и НАДФ + -зависимых дегидрогеназ
проходит в два этапа (I и II):
I п
Субстрат НАп+ Формазан
(вкстановяенныйл /..." Л /
I / НАДФ*!/
Субстрат ^\^>Ни,п^
(окисленный) НАДФН
Ферментативное окисление субстрата сопровождается
образованием НАДН или НАДФН (I). На втором этапе ре-
акции (Л) соль тетразолия в сопряженной «индикаторной
реакции» восстанавливается до формазана при участии
диафоразы. При этом НАДН или НАДФН снова окис-
ляются. Образование формазана, таким образом, происхо-
дит в месте действия диафоразы, как правило в митохон-
дриях.
4.5.6.1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕНАЗИНМЕТОСУЛЬФАТА И СРЕД С ГЕЛЬ-
ОБРАЗУЮЩИМ ПОЛИВИНИЛОВЫМ СПИРТОМ (ГЕЛЬ-ПВС)
1. ФЕН АЗИН МЕТОСУЛЬФАТ
Светочувствительный феназинметосульфат может при
выявлении дегидрогеназ заменять липопротеидный комп-
лекс фермента. Будучи неферментативным переносчиком
водорода, он способен переносить водород непосредствен-
но от кофермента на индикатор (схема на стр. 213). Бла-
годаря этому цветную реакцию (образование формазана)
коферментзависимых дегидрогеназ можно проводить без
участия диафоразы. Важно, что благодаря феназинмето-
сульфату нитро-СТ сохраняет свою способность связыва-
ния со структурами (субстантивность).
Добавление к инкубационной среде феназинметосуль-
212 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
фата (0,08 мг/мл) ослабляет, но не устраняет полностью
потери растворимых дегидрогеназ. При этом следует так-
же учитывать возможность смещения ферментов.
2. СРЕДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕЛЬ-ПВС
Среды с гель-ПВС используются при выявлении рас-
творимых НАД-зависимых дегидрогеназ, поскольку
добавление ПВС к инкубационной среде в значительной
мере, хотя и неполностью, предотвращает диффузию фер-
ментов. Еще успешнее проблема диффузии решается путем
использования полупроницаемых мембран (описано да-
лее).
f
4.5.6.1.2. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ И ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА ПРЕПАРА-
ТОВ
Правильная оценка интенсивности гистохимической
реакции на дегидрогеназную активность возможна лишь
при линейной зависимости между ферментативной актив-
ностью в срезе и количеством продукта реакции. При этих
условиях фиксация является нежелательной, поскольку она
всегда ведет к частичной инактивации фермента. Если
определение дегидрогеназной активности предпринимает-
ся при изучении обменных процессов, то следует избегать
фиксации как на Целой ткани, так и на срезах. Препарат ре-
комендуется фиксировать 10%-ным формалином после ин-
кубации (постфиксация).
4.5.6.1.З. БЕССУБСТРАТНАЯ ДЕГИДРОГЕНАЗА
Под реакцией бессубстратной дегидрогеназы пони-
мают образование формазана, которое может проходить
в среде, содержащей НАД, в отсутствие субстрата и усили-
вается при подщелачивании среды. Повышение концентра-
ции НАД также увеличивает эффект. Вещества, блокирую-
щие сульфгидрильные группы, полностью подавляют
активность «бессубстратной (nothing-) дегидрогеназы»,
Чтобы избежать реакции, не зависящей от активности выяв-
ляемого фермента, следует придерживаться нейтральных
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 213
величин pH (7,0—7,2), а подходящую концентрацию НАД
определять в предварительных опытах с серией различных
концентраций без добавки субстрата. Реакция «бессуб-
стратной дегидрогеназы» бывает частично обусловлена
ферментативной активностью.
4.5.6.1.4. ГИСТОХИМИЯ НЕКОТОРЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ
1. СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗА —СУКЦИНАТ (АКЦЕПТОР) ОКСИДО-
РЕДУКТАЗА; КФ 1.3.99.1
Этот фермент, обладающий высокой субстратной спе-
цифичностью, катализирует в цикле Кребса окисление ян-
тарной кислоты до фумаровой:
СООН - СН2 - СН, - СООН СООН - СН = СН —
-СООН.
Сукцинатдегидрогеназа является SH-содержащим фер-
ментом, прочно связанным с митохондриями (митохон-
дриальный «маркерный» фермент). Поскольку он принад-
лежит к флавопротеидам, то обладает способностью
переносить электроны без участия пиридиннуклеотидов.
Сукцинат
и 2Н -^ци/п.&—-*-цит.с— -* цит. айр—ыь
_ *Сукцинат\
Фумарат Оегидро- феназин-метосулырат
геназа г
Добавление феназинметосульфата к инкубационной
среде усиливает реакцию. 0,05 М малонат ведет к избира-
тельному подавлению сукцинатдегидрогеназной активно-
сти. При точном соблюдении условий реакции количество
продукта реакции линейно зависит от ферментативной ак-
тивности. Этот факт подчеркивает важность гистохимиче-
ского выявления сукцинатдегидрогеназы.
2. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА (L-ЛАКТАТ: НАД+ — ОКСИДОРЕДУКТАЗА;
КФ 1.1.1.27)
Этот принадлежащий к гликолитической системе рас-
214 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
творимый фермент катализирует окисление лактата до
пирувата:
сн3 сн3
С НОН + НАД Х=* с=о + надн2
СООН СООН
Лактат Пируват
Лактатдегидрогеназа встречается в различных молеку-
лярных формах. В органах млекопитающих она пред-
ставлена пятью изоферментами, каждый из которых
построен из 4 мономеров. Поскольку эти 5 изофер-
ментов различаются по своим биохимическим и физиче-
ским характеристикам, их можно разделять на срезах. Для
дифференцирования изоферментов было предложено
3 метода:
а) изменение концентраций субстрата для определения
двух типов мономеров (А и В-мономеры); б) предваритель-
ная инкубация с мочевиной; в) подавление сульфитом.
С помощью этих методов удалось установить колеба-
ния в распределении изоферментов лактатдегидрогеназы
в печени. Использование полупроницаемых мембран по-
зволило ограничить диффузию лактатдегидрогеназы в ин-
кубационную среду, так что для изучения проблем метабо-
лизма гистохимический подход стал ныне более при-
годным, чем биохимический.
3. ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ—ДЕГИДРОГЕНАЗА (ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ:
НАДФ + —ОКСИДОРЕДУКТАЗА: КФ 1.1.1.49)
Этот растворимый НАДФ-зависимый фермент, будучи
первым в пентозофосфатном цикле, катализирует в при-
сутствии НАДФ следующую реакцию:
Глюкозо-6-фосфат + НАДФ 6-фосфоглюконовая
кислота-6-лактон + НАДФН + Н +
В процессе промежуточного обмена этот фермент уча-
ствует не столько в выработке энергии, сколько в синтезе
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 215
специфических предшественников РНК (например, ри-
бозы) и в регенерации восстановленного НАДФ (НАДФН).
Топохимическое выявление фермента позволяет устана-
вливать места, где протекает пентозофосфатный цикл.
4.5.6.2. ОКСИДАЗЫ И ПЕРОКСИДАЗЫ
Оксидазы переносят водород от субстрата на кислород,
восстанавливая его до воды.
Пероксидазы катализируют окисление субстрата с по-
мощью перекиси водорода:
Пероксидаза + Н2О2 -» Пероксидаза-Н2О2,
Субстрат-Н2 + Пероксидаза-Н2О2 -» Окисленный
субстрат + Пероксидаза + 2Н2О.
4.5.6.2.1. ЦИТОХРОМОКСИДАЗА (КФ 1.9.3.1)
Фермент катализирует перенос электронов с цитохро-
ма с на кислород. Он представляет собой железосодержа-
щую истинную аэробную оксидазу, которая встречается
практически во всех клетках, за исключением эритроцитов
и анаэробных бактерий. Этот фермент нерастворим
и прочно связан с митохондриями. Его действие зависит от
обратимого окисления и восстановления кофактора желе-
за. При этом электроны водорода переносятся на молеку-
лярный кислород. В этом процессе образуется вода:
Fe3+ ^Fe2*
Субстрат • Н2 +102 Субстрат + Н2О.
(Цитохром)
Гистохимическое выявление цитохромоксидазы осно-
вано на наблюдении Эрлиха, который заметил, что при
взаимодействии растворов а-нафтолов и диметил-и-фени-
лендиамина (сокращенно—НАДИ) с тканями животных
216 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
образуются гранулы индофенолового синего:
Диметил-п-
фениленвиамин
+ 2Н2О
Индофеноловый синий
На основании тщательных исследований было установ-
лено, что индофеноловый синий образуется под действием
цитохромоксидазы и что фермент, который ранее называ-
ли индофенолоксидазой, идентичен цитохромоксидазе.
Ценность НАДИ-реакции несколько снижается из-за сла-
бой сохранности продукта реакции (индофенолового сине-
го) и его склонностью растворяться в липидах.
Успешному выявлению цитохромоксидазы при свето-
вой микроскопии сильно способствовали исследования
Бёрстоуна (Burstone). В предложенном им методе обра-
зуется стабильный продукт реакции. Из большого числа
апробированных аминов наиболее подходящим субстра-
том оказался N-фенил-и-фенилендиамин. В качестве соче-
тающего агента можно использовать целый ряд заме-
щенных нафтолов, например 1 -окси-2-нафтойную кислоту.
Стабильность продукта реакции повышается путем обра-
зования хелата с кобальтом.
н
ОН
оон Окисленный
цитохром
>-»иг *
Н-фенил-п-фенилен 1-окси-2~
диамин * нафтойная
кислота
о
ноос
цитохромоксидаза
♦О»
Ч
Восстановленный
цитохром
Индофенол
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 217
Для электронно-микроскопического выявления цитох-
ромоксидазы пригодным оказался 3,3 -диаминобензидин
(ДАБ). В системе НАДИ-реакции ДАБ дает осмиофильный
продукт, который может быть переведен с помощью OsO4
в черный электроноплотный, нерастворимый осадок (ос-
миевая чернь). Продукт реакции локализуется только
в митохондриях.
4.5.6.2.2. МОНОАМИНОКСИДАЗА (КФ 1.4.3.4)
Моноаминоксидаза (МАО) катализирует окислитель-
ное дезаминирование моноаминов до альдегидов:
RCH2NH2 + О2 + Н2О RCHO + Н2О2 + NH3.
Этот связанный со структурами и локализующийся
в митохондриях фермент легко реагирует с такими суб-
стратами, как триптамин, 5-окситриптамин и тирамин. На
распад норадреналина фермент влияет в меньшей степени.
Моноаминоксидаза играет важную роль в процессах де-
токсикации и в метаболизме аминов. Его функциональное
значение выяснено еще не во всех деталях. В нервной систе-
ме активность МАО подавляют амфетамин и марсилид;
она часто служит индикатором аминэргических структур.
В световой микроскопии гистохимическое выявление
МАО основано на трех принципах:
а) выявление альдегидных групп, образующихся в ре-
зультате окисления аминов; б) образование пигмента при
окислительном распаде триптамина или 5-окситриптами-
на; в) образование формазана в результате восстановле-
ния тетразолия в процессе окислительного дезаминирова-
ния аминного субстрата.
На последнем принципе основан метод Гленнера, Берт-
нера и Брауна (Glenner, Burtner, Brown) с использованием
триптамингидрохлорида в качестве субстрата и нитро-СТ
в роли акцептора водорода. Этот метод оказался весьма
эффективным, особенно для выявления МАО в централь-
ной нервной системе. На основе этого метода было разра-
ботано несколько дальнейших модификаций.
Электронно-микроскопическое выявление фермента
также основано на восстановлении солей тетразолия, из
218 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
которых наиболее подходящим оказался осмиофильный
ТК-НФТ.
4.5.6.2.3. ПЕРОКСИДАЗА (КФ 1.11.1.7)
Различные пероксидазы образуют ферментную систе-
му, основная задача которой—расщепление Н2О2 в клет-
ках. Подобную функцию могут выполнять также цитох-
ром-с-пероксидаза и каталаза. Каталаза и пероксидаза
имеют сходный принцип действия. При высокой концен-
трации Н2О2 каталаза реагирует как каталаза, тогда как
при низких концентрациях Н2О2 она действует как перок-
сидаза. В физиологических условиях почти всегда каталаза
действует как пероксидаза.
Пероксидазы животных и растительных тканей разли-
чаются по геминовой группе. Растительная пероксидаза
содержит в качестве простетической группы протогемин
(Fe3 -протопорфирин—красный гемин); животные перок-
сидазы, или вердопероксидазы, наоборот, содержат зе-
леный гемин. Особую роль играет пероксидаза хрена: она
используется в качестве метки антител, а также как мар-
керный фермент при изучении процессов транспорта
и проницаемости в животных тканях. При этом очень под-
ходящим оказался низкий молекулярный вес фермента
(44 000).
Пероксидазы обладают способностью окислять раз-
личные ароматические амины и фенолы до окрашенных
соединений. Именно на этом их свойстве основано в пер-
вую очередь их гистохимическое выявление. В гистохимии
используют следующие методы:
а) метод с бензидином; б) щелочную НАДИ-реакцию;
в) реакцию с а-нафтолом; г) методы с лейкокрасителями;
д) метод с тиоиндоксилом; е) метод с ДАБ.
Особенно важную роль играет разработанный Грэхе-
мом и Карновским (Graham, Karnowsky) метод с диамино-
бензидином (ДАБ), в котором продукт окисления 3,3 -диа-
минобензидина конденсируется в осмиофильный полимер.
Этот метод используется главным образом для электрон-
но-цитохимической идентификации пероксисом. Его мож-
но использовать для тех же целей и в световой микроско-
пии.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 219
4.5.7. ВЫЯВЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВА-
НИЕМ СУБСТРАТНОЙ ПЛЕНКИ И ПОЛУПРОНИ-
ЦАЕМЫХ МЕМБРАН
43.7.1. МЕТОД СУБСТРАТНОЙ ПЛЕНКИ
Разработанный Дау (Daoust) метод предполагает нане-
сение тонкой пленки с субстратом непосредственно на све-
жий срез ткани. После инкубации определенной продолжи-
тельности на пленке с субстратом благодаря гистохимиче-
ским реакциям или обычному окрашиванию возникают
места просветления. Неокрашенные участки на пленке
соответствуют локализации ферментативной активности
в срезе ткани, находящемся в контакте с пленкой (рис. 4).
Этот в принципе простой метод требует определенных
навыков, поэтому удовлетворительные результаты дости-
гаются лишь после приобретения опыта работы. Кроме
того, успех метода зависит от целого ряда условий: в част-
ности, субстрат должен быть нерастворимым в воде и
доступным для действия фермента.
До сих пор методом субстратной пленки изучали
главным образом гидролитические ферменты, причем этот
метод не позволяет делать выводов о локализации фер-
ментативной активности на клеточном уровне. Наиболее
известны методы выявления нуклеаз (ДНКаза и РНКаза)
и протеаз. Кроме того, этот метод позволяет выявлять
различные гликозидазы. Из группы оксидоредуктаз до сих
пор этим методом выявляют только каталазы.
Весьма чувствительным методом выявления протеаз
может служить метод окрашенной пленки (Frattello, 1968).
43.7.2. МЕТОД ПОЛУПРОНИЦАЕМЫХ МЕМБРАН
Этот метод был разработан главным образом с той
целью, чтобы сделать растворимые ферменты доступными
для гистохимического изучения. При этом отпадает необ-
ходимость в фиксации замороженных срезов, которая, ос-
лабляя диффузию фермента, неизбежно ведет к его частич-
ной инактивации. Данный метод не только ослабляет
диффузию фермента в среду с субстратом, но и обеспечи-
вает надежную локализацию ферментативной активности
in situ.
Рис. 4. Схема метода субстратной пленки (Pearse, 1972).
А. Необработанный материал. Б. Материал в процессе обработки. В. Пленка и срезы ткани после
разделения и окрашивания. I — предметное стекло, 2 — пленка и? желатины с ДНК, 3 — срез
ткани, 4—желатина—глицерин, 5 — окрашенная пленка с ДНК, 6 — неокрашенный участок,
7 — окрашенный срез ткани.
Рис. 5. Приспособление для работы по методу с полупроницаемой
мембраной (объяснение в тексте).
1—срезы, 2 — полупроницаемая мембрана, 3— инкубационная среда с агаром, 4— сосуд для
инкубации.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 221
Принцип метода заключается в отделении среза ткани
от среды мембраной, препятствующей проникновению
белка (диализная трубка). Поскольку срез ткани наносится
на такую мембрану с наружной стороны, последняя заме-
няет предметное стекло. На практике применяют цилиндр
из легкого металла или пластмассы, который на специаль-
ном приспособлении помещается в термостат на время ин-
кубации (рис. 5). Цилиндр наполняют средой с агаром;
среда соприкасается с мембраной со стороны, противопо-
ложной той, на которой находится срез. По окончании ин-
кубации срез ткани вместе с мембраной снимается с цилин-
дра. После удаления агара срез можно фиксировать
4%-ным формалином, обезводить, прикрепить к предмет-
ному стеклу и заключить в глицерин — желатину.
С помощью метода полупроницаемых мембран был
выявлен целый ряд лизосомных (Lojda) и окислительных
ферментов (Meijer) с хорошей локализацией. Очевидно, эн-
зимогистохимические методы с использованием полупро-
ницаемых мембран особенно пригодны для изучения раз-
личных аспектов метаболизма.
4.5.8. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕ-
НИЯ ФЕРМЕНТОВ
КАЛЬЦИЙ-КОБАЛЬТОВЫЙ МЕТОД ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИ-
ЧЕСКОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ПО ГОМОРИ (GOMORI, 1952)
МЕТОДИКА
1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в 10%-ном ней-
тральном формалине, 10 ч при +4° С, или в этанол—
— ацетоне (1 :1) при + 4°С, 12 ч.
2. Дальнейшая обработка препарата:
а) после фиксации в формалине
Многократная промывка кусочка ткани в дистиллиро-
ванной воде и приготовление срезов в криостате.
б) после фиксации в этанол — ацетоне по Гёсснеру
(Gossner)
Обезвоживание и заливка в парафин согласно следую-
222 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
щей схеме:
3 смены ацетона каждая по 3 ч
эфир—этанол (1 :1) 3 ч (при 4° С)
2%-ный целлоидин в эфире 12 ч
2 смены бензола каждая по 30 мин при комнат-
ной температуре
Пропитка парафином в вакууме (вакуумный шкаф или
водоструйный насос) при температуре от + 54 до + 56°С,
30 мин, с последующей заливкой. Приготовление парафи-
новых срезов, расправление на плите с подогревом (не вы-
ше + 40°С), удаление воды фильтровальной бумагой
и просушивание среза в термостате при 37°С, 30 мин. Де-
парафинирование срезов и их проводка до дистиллирован-
ной воды по следующей схеме:
Ксилол—Ацетон (абсолютный)—Ацетон: во да (1:1)—
Вода.
3. Инкубация полученных срезов после п. 2(a) или
2(6) в следующей инкубационной среде, от 5 мин до 4 ч
при +37°С:
3%-ный натрий-0-глицерофосфат
2%-ный веронал-натрий
Дистиллированная вода
2%-ный СаС12
5%-ный сульфат магния
10 мл
Ю мл
5 мл pH 9,4
20 мл
1 мл
4. Срезы промыть в проточной воде.
5. Обработать 2%-ным раствором нитрата кобальта
или ацетата кобальта, 3—5 мин.
6. Промывка в дистиллированной воде.
7. Обработка разбавленным раствором сульфида ам-
мония, 1—2 мин.
8. Тщательно промыть в дистиллированной воде (до-
краска в 1%-ном эозине, 5 мин, при необходимости).
9. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей кон-
центрации, ксилол, нейтральный бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, содержащие щелочную фосфатазу, окраши-
ваются в черный или коричневато-черный цвет.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 223
КОНТРОЛЬ
Инкубация без субстрата; инкубация с добавлением
в среду 0,05 М L-фенилаланина; срезы перед инкубацией
прокипятить в течение 10 мин в дистиллированной воде.
ПРИМЕЧАНИЯ
При использовании заливки в парафин удается достичь
хорошей локализации фермента, например в щеточной
каемке эпителия тонкого кишечника или в клетках главно-
го отдела почечных канальцев. Однако потери фермента-
тивной активности в этом случае больше, чем при исполь-
зовании замороженных срезов, фиксированных в формали-
не. Реакция в ядрах часто объясняется осаждением
диффундирующих ионов фосфата в ядре.
СВИНЦОВЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ КИСЛЫХ
ФОСФАТАЗ ПО ГОМОРИ (GOMORI. 1950)
МЕТОДИКА
1. Фиксация кусочков в холодном кальций — формоле
по Бейкеру, замороженные срезы. Криостатные срезы
с постфиксацией в холодном кальций — формоле,
10—15 мин, или в холодном ацетоне, 15—30 мин.
2. Инкубация до 30 мин при 37°С в свежеприготовлен-
ном растворе субстрата:
0,05 М ацетатный буфер, pH 5,3
3%-ный натрий-0-глицерофосфат
Ацетат свинца или нитрат свинца
50,0 мл
5,0 мл
80 мг
3. Срезы промыть в четырех сменах дистиллированной
воды, всего за 1—2 мин.
4. Обработать 0,5—1%-ным раствором сульфида аммо-
ния, около 1—2 мин.
5. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде
в нескольких сменах.
6. Заключить в глицерин — желатину или обезводить
в ряду спиртов возрастающей концентрации, просветлить
в ксилоле и заключить в нейтральный бальзам.
224 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
РЕЗУЛЬТАТ
Активность фермента проявляется коричневато-
черным окрашиванием в местах выпадания осадка сульфи-
да свинца.
КОНТРОЛЬ
Реакция после инкубации без субстрата или после добав-
ления 0,01 М фторида натрия в инкубационную среду
должна быть отрицательной.
ПРИМЕЧАНИЯ
Наиболее надежные результаты получают на свободно
плавающих срезах. При фиксации ацетоном с последую-
щей заливкой в парафин под вакуумом время инкубации
в зависимости от исследуемой ткани следует увеличивать
до 4 ч. Обезвоживание срезов и заключение через ксилол
в нейтральный бальзам или другие синтетические зали-
вочные среды ведет к небольшим потерям осадка сульфи-
да свинца, который указывает локализацию ферментатив-
ной активности.
Кусочки ткани, фиксированной в холодном формалине,
хранятся в 0,88 М сахарозе или 1%-ной гуммиакации
(+4° С) несколько недель без существенных потерь фермен-
тативной активности. Выраженных посмертных изменений
в локализации кислой фосфатазы в первые 6 ч не
наблюдается.
ВЫЯВЛЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ С НАФТО-
ЛОМ-AS- И ГЕКСАЗОТИРОВАННЫМ ПАРАРОЗАНИЛИНОМ ПО ЛОЙДЕ
(LOJDA, 1962)
МЕТОДИКА
1. Фиксация маленьких кусочков ткани в кальций —
формоле по Бейкеру при +4° С, 12—24 ч; приготовле-
ние замороженных или криостатных срезов. Постфиксация
свежих замороженных срезов в холодном кальций —
формоле, 15 — 60 мин, промыть в холодной воде, 5 мин?
______4. Гистохимия отдельных классов веигесп» и ферментов 225
2. Инкубация 30—90 мин при комнатной температуре
(при + 37С время инкубации сокращается) или в холо-
дильнике (несколько часов) в следующем растворе:
Нафтол-А5-В1-фосфат 5 мг (свежерастворенный в 0,25 мл
диметилформамида)
0,1 М ацетатный буфер 10 мл (добавлять (фазу)
(pH 5,0—5,5)
5% MgCl2
Гексазотированный
1 — 2 капли
0,3—0,9 мл
парарозанилин
Проверить и, если необходимо, установить нужную вели-
чину pH; раствор ^профильтровать!
Приготовление гексазотированного парарозанилина.
Равные части холодного 4%-ного парарозанилина в 2 и.
НС1 и холодного 4%-ного водного NaNO2 слить при по-
стоянном помешиваниина ледяной бане, пока раствор не
приобретет бдедно-желтый цвет (около 1—2 мин). 1, н. Na-
ОН добавлять по каплям до pH 6,0 (из-за быстрого испаре-
ния жидкости проверку pH следует проводить быстро!).
3. Срезы промыть в дистиллированной и проточной
воде.
4. Заключить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Активность неспецифичесКой кислой фосфатазы про-
является выпадением осадка светло-красного красителя.
КОНТРОЛЬ
Как при методе Гомори.
ПРИМЕЧАНИЯ
Рекомендуется перед приготовлением замороженных
или криостатных срезов промывать кусочки ткани, фикси-
рованные в кальций — формоле, 3—4 ч, или дольше в хо-
лодном 7,5%-ном растворе сахарозы. Светло-желтое окра-
шивание раствора гексазотированного парарозанилина не
мешает реакции. Загрязнение красителя, а также неполное
8-235
226 ^.'Гистохимия отдельных классов веиееств и ферментов
Гексазотирование Приводит иногда к сильному неспецифи-
ческому окрашиванию фона.
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕ-
СКОЙ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ СОЛЕЙ СВИНЦА
(MAUNSBACH, 1966, ПО GOMORI, 1952)
МЕТОДИКА
1. Маленькие кусочки ткани фиксировать в 2—3%-ном
глутаральдегиде на 0,1 М какодилатном буффе, pH 7,2
при температуре от 0 до +4°С, 2—4 ч.
2. Промыть в 0,1 М какодилатном буфере(рН 7,2) с до-
бавлением 1,5%-нбй сахарозы при температуре от 0 до
+4°С, 2—4 ч. ' • ’ '
3. Замороженные срезы толщине» 30-^50 мкм, полу-
ченные на резаке, собрать й буферныйраствор.
4. Инкубация 7 —15мин при +37’С в следующей
среде: • *
Na-P-глицерофосфат 10 мл
0,05 М ацетатный буфер (pH 5,0—ДЗ) Юмд,
0,2%-ный нитрат свинца 20 мл
Дистиллированная вода 10 мл
5. Срезы промыть в 0,05 М ацетатном буфере (pH
5,0—5,3), 2—5 мин. (Для контроля можно несколько срезов
проявить в растворе сульфида аммония.)
6. Дофиксация в забуференном растворе OsO4:12,5 мл
2% OsO4, 5,5 мл 0,1 н. НО, 1,8 мл 8,5% NaCL 5 мл
0,1 М веронал-ацетатного буфера (pH 7,2), ДО мин -1 ч,
или обезвоживание срезов без дофиксации.
7. Обезвоживание в этаноле, заливка в эпон или микро-
пал (вестопал). Контрастирование на ультратонких срезах.
РЕЗУЛЬТАТ . .
Выпадение в осадок продукта реапщи происходит в ме-
стах локализации активности кислой фосфатазы в лизосо-
мах и в комплексе Гольдки.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 721
КОНТРОЛЯ
Инкубация среды без субстрата. Добавление в инкуба-
ционную смесь 0,01 М NaF.
ПРИМЕЧАНИЯ
Результаты реакции зависят от качества субстрата. При
наличии в субстрате небольшого количества d-изомеров
образования осадка практически не происходит. При ис-
пользовании Na-0-глицерофосфата с содержанием всего
0,1% а-изомера Маунсбаху (Mdunsbach, 1966) не удалось
наблюдать осадкани в ядре, ни в цитоплазме. Неспецифи-
ческое окрашивание фона удается в значительной мере
предо1Вра1н1ь, если срезы после Инкубации (и. 4) промыть
в 2%-ной уксусной кислоте не более 30 с (как Правило, од-
нако, достаточно нескольких секунд). При этом, по-види-
мому, частично вымывается и специфический осадок
(Desmet).
ВЫЯВЛЕНИЕ КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМОЙ АТФАЗЫ С ПОМОЩЬЮ
КАЛЬЦИЙ—КОБАЛЬТОВОГО МЕТОДА ПО ПАДИКУЛЕ И ГЕРМАНУ
(PADYKUEA, HERMAN, 1955) В МОДИФИКАЦИИ НОВИКОВА И ДР. (NOVI-
KOFF ЕТ А1_ 1961)
МЕТОДИКА
1. Ткань быстро заморозить на сухом льду или в охлаж-
денном изопентане.
2. Приготовить замороженные или криостатные^ срезы
толпшной 15 мкм и перенести их кисточкой в холодный
(от —2 до —3°С!) 10%-ный раствор Нейтрального
калыцш — формола (10 мл 35—40%-ного формальдегида,
90 мл 1%-ного раствора СаС12, добавить несколько кусоч-
ков карбоната кальция, профильтровать), 10 мин?'
3. Срезы промыть в 1%-ном растворе хлорида кальция,
2 мин.
4. Инкубация свободноплавающих, срезов, 15 мин при
228 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
37°С, в следующей свежеприготовленной среде:
0,1 М (2,062%) барбитурат натрия 20 мл
2% СаС12 10 мл
Дистиллированная вода 30 мл
АТФ (натриевая соль) 152 мг
Установить pH 9,2 — 9,4 добавлением 0,1н. NaOH и довес-
ти раствор, дистиллированной водой до 100 мл.
5. Промыть срезы в 3 сметах 1%-нс^р растдора СаС12.
. 6. Перенести срезы в 2%-ный раствор хлорида (или
нитратд) кобальта,3—5 мин.
7. Промыть в 4 сменах дистиллирцданной воды, все-
го 1 мин.
8. Обработка раствором сульфида аммония (несколько
капель на 100 мл дистиллированной; воды), 3—5 мин.
9, Промыть в нескольких сменах дистиллированной и
ПРОТОЧНОЙ ВОДЫ, 3.-^5 мин,, f. ..
10. Заключение под покровное стекло в глицерин —
желатину или обезвоживание в ряду спиртов возрастаю-
щей концентрации; просветление в ксилоле, нейтральный
бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Локализация ферментативной активности маркируется
черным осадком сульфида кобальта.
КОНТРОЛИ
а) Инкубация в среде без субстрата.
б) Инкубационная среда без СаС12 для выявления спон-
танного гидролиза. >
в) Инкубация в растворе с заменой аденозинтрифосфа-
та Na-^-глицерофосфатом или п-нитрофенилфосфатом,
инозиндифосфатом или другими дифосфатами в равных
количествах. /
г) Добавление 2,5-10 ~ 3 М n-хлормеркурибензоата в ин-
кубационную среду.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 229
ПРИМЕЧАНИЯ
Высвобождение фосфатов может быть усилено добавле-
нием в инкубационную среду 2,4-динитрофенола (Niles et
al.). Если исследуемая ткань содержит мало кальция, реко-
мендуется увеличить до 5 мин обработку срезов в 1%-ном
растворе СаС12 (п. 3).
Для успеха реакции большое значение имеет чистота
препарата АТФ. Опыт показывает, что субстрат может
храниться в холодильнике, оставаясь пригодным для ги-
стохимических целей не более 1 года.
СВИНЦОВЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АТФАЗЫ ПО ВАКСГАЙНУ И МАЙ-
ЗЕЛ (WACHSTEIN, MEISEL, 1956) В МОДИФИКАЦИИ ФАРКУХАР И ПАЛА-
ДА (FARQUHAR, PALADE, 1966)
МЕТОДИКА
1. Фиксация маленьких кусочков ткани в следующих
растворах: а) 1,5%-ный глутаральдегид (свежая дистилля-
ция!) в 0,067 М какодилатном буфере (pH 7,2) при + 4°С,
2—4 ч или
б) кальций — формол по Бейкеру при + 4°С, 16—24 ч.
2. Промывка и при необходимости хранение срезов при
+ 4°С в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,2) с добавле-
нием 7,5%-ной сахарозы после фиксации в глутаральдегиде
или в 7,5%-ной сахарозе без буфера после фиксации по Бей-
керу. (Хранение в течение нескольких недель не ведет к сни-
жению АТФазной активности.)
~ 3. Срезы ткани толщиной 10 мкм (при световой микро-
скопии) или 50 мкм (при электронной микроскопии), при-
готовленные на замораживающем микротоме или резаке.
4. Инкубация 10—90 мин при комнатной температуре
или при +37°С в следующей среде:
26 мг АТФ (натриевая соль) в 0,83 мМ
50 мл mpuc-малеатного буфера (pH 7,2); 80 мМ
растворить 123 мг MgSO4 и 10 мМ
40 мг Pb(NO3)2 2,4 мМ
Установить рн 7,2 с помощью NaOH!
5. Дальнейшая обработка срезов:
а) Для световой микроскопии: промывка в дистиллиро-
230 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ванной воде, помещение в 1%-ный сульфид аммония,
1 мин; промывка в нескольких сменах дистиллированной
воды и заключение под покровное стекло в глицерин —
— желатину.
б) Для электронной микроскопии: промывка срезов
толщиной 50 мкм в веронал-ацетатном буфере (pH 7,4)
с добавлением 7,5%-ной сахарозы, 5 мин. Фиксация срезов
в 1% OsO4 на фосфатном буфере (pH 7,6), 45 мин. Обезво-
живание в ряду спиртов возрастающей концентрации, за-
ливка в аралдит или микропал (вестопал). Контрастирова-
ние срезов: обработка срезов перёд обезвоживанием
в 0,5%-ном уранилацетате на веронал-ацетатном буфере,
1—2 ч, или контрастирование ультратонких срезов
0,5%-ным уранилацетатом.
РЕЗУЛЬТАТ
При световой микроскопии осадок; сульфида свинца
маркирует места ферментативной активное™.
При электронной микроскопии локализацию АТФаз-
ной активности маркирует осадок фосфата свинца.
МЕТОД С СОЛЬЮ СВИНЦА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТАЗЫ
ПО ВАКСТАЙНУ И МАЙЗЕЛ (WACHSTEIN, MEISEL, 1956)
МЕТОДИКА
1. Кусочки ткани быстро заморозить и приготовить за-
мороженные или криостатные срезы толщиной
10—4 5 мкм; нанести на предметное стекло и подсушивать,
1—2 мин.
2. Инкубация в течение 5—20 мин цри температуре от
+ 32 до +37°С в следующей среде:
0,125% глюкозо-6-фосфата (калиевая соль) 0,2 М триомалеатный буфер (pH 6,7) 2%-ный нитрат свинца Дистиллированная вода 20 мл 20 мл 3 мл 7 мл
3. Промывка в 4 сменах дистиллированной воды, все-
го 1 мин.
4. Обработка срезов в растворе сульфата аммония
(0,5 — 1%), 5 мин. '
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 231
5. Фиксация срезов в 10%-ном растворе формальдеги-
да, 60 МИН;
6. Промывка в нескольких сменах дистиллированной
воды.
7. Срезы заключить под покровное стекло в глицерин -
желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Места ферментативной активности маркируются
черным осадком сульфида свинца.
КОНТРОЛЬ
Инкубация без субстрата.
ПРИМЕЧАНИЯ
Даймлйнг (Deimling) рекомендует для выявления глю-
козо-б-фбсф^тазы метод одновременного окрашивания со-
лями тяжелых металлов в результате Образования ком-
плексов свинца. В качестве комплексообразоватёля ис-
пользуется бренцкатехин-3,5-дисульфанат (тирон). В каче-
стве субстрата вместо калиевой соли используется легче
доступная динатриевая соль глюкозо-6-фосфата.
ВЫЯВЛЕНИЕ ТИАМИНПИРОФОСФАТАЗЫ ПО НОВИКОВУ И ГОЛЬДФИ-
ЩГРУ (fsIOVIKOFF, GOLDFISCHER, 1961)
МЕТОДИКА
1. Нефиксированные замороженные или криостатные
срезы, замороженные или криостатные срезы, постфикси-
рованные в холодном кальций — формоле по Бейкеру
(15 мин) промыть в дистиллированной воде.
2. Инкубация при + 37° С до 1 ч в следующей среде:
0,01 М тиаминпирофосфат 3,0 мл
Дистиллированная вода 1,2 мл
0,2 М тирис-малеатный буфер (pH 7,2) 6,0 мл
1% нитрат свинца 1,8 мл
0,025 М МпС12 3,0 мл
232 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Медленное встряхивание во время инкубации создает бо-
лее благоприятные условия для протекания реакции.
3. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.
4. Обработать желтоватым раствором сульфида аммо-
ния. .
5. Промывка в дистиллированной воде.
6. Заключение в глицерин—желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Положительная реакция (почти исключительно в аппа-
рате Гольджи) выражается в выпадении черного осадка.
ВЫЯВЛЕНИЕ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТАЗЫ ПО НОВИКОВУ И ГОЛЬД-
ФИШЕРУ (NOVIKOFF, GOLDFISCHER, 1961)
МЕТОДИКА
1. Свежие замороженные или криостатные срезы тол-
щиной 10—15 мкм нанести на предметное стекло и фикси-
ровать в холодном кальций — формоле, 10—15 мин.
2. Промывка срезов в дистиллированной воде.
3. Инкубация от 15 до 20 мин при +25°С иди +37° С
в следующей среде:
4 мМ субстрат (лучше всего соль инозин-5-дифосфат-Наэ)
80 мМ mpuc-малеатный буфер (pH 7,0)
3,6 мМ нитрат свинца
5 мМ МпС12 или MgCl2
4. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде
и затем поместить в раствор сульфида аммония на 1 мин.
5. Тщательно промыть в дистиллированной воде и за-
ключить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Ферментативная активность маркируется осадком
сульфида свинца, преимущественно в аппарате Гольджи.
ПРИМЕЧАНИЕ
Нуклеозиддифосфатаза вместе с тиаминпирофосфата-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 233
зой характерны для аппарата Гольджи, но встречаются и
в эндоплазматическом ретикулуме.
ВЫЯВЛЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭСТЕРАЗЫ ПО ДЭВИСУ И OPH-
ШТЕЙНУ (DAVIS, ORNSTEIN, 1959)
МЕТОДИКА
1. Маленькие кусочки ткани фиксировать в кальций —
— формоле по Бейкеру или в 2—3%-ном глутаральдегиде
при +4°С; приготовить замороженные или криостатные
срезы толщиной 10—15 мкм; нефиксированные заморо-
женные или криостатные срезы дофиксировать этими же
фиксаторами, 10—15 мин.
2. Срезы промыть в дистиллированной воде и инкуби-
ровать при комнатной температуре, 1—15 мин.
Инкубационная среда: 15 мг а-нафтилацетата на водя-
ной бане расплавить при температуре от + 50 до + 55°С
при энергичном встряхивании (до помутнения), добавить
2—3 мл дистиллированной воды и довести объем 0,2 М
Na2HPO4 до 25 мл. К этому раствору добавить диазоти-
рованный парарозанилин (8 капель 4%-ного парарозанили-
на в 2 н. НС1 + 8 капель 4%-ного NaNO2 при помешива-
нии на ледяной бане). pH инкубационной смеси доводится
0,2 М NaH2PO4 от 8,0—8,5 до 7,0—7,1.
3. Срезы промыть в дистиллированной воде и заклю-
чить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Эстеразная активность проявляется красно-корич-
невым окрашиванием.
КОНТРОЛЬ
Инкубация без субстрата; предварительная инкубация
с 10“5 или 10“3 МЕ600 (параоксон), после которой тща-
тельно промыть в дистиллированной воде и провести
инкубацию.
9-235
234 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ВЫЯВЛЕНИЕ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ С АЦЕТИЛХОЛИНИОДИДОМ
ПО ГОМОРИ
МЕТОДИКА
1. Фиксация: холодный кальции — формол по Бейкеру,
замороженные или криостатные срезы, нефиксированные
в холодном кальций — формоле по Бейкеру (10—15 мин)
с последующей тщательной промывкой в дистиллирован-
ной воде, или срезы нефиксированного материала.
2. Инкубация свободноплавающих срезов или срезов,
прикрепленных на покровные или предметные стекла при
+ 37°С в Свежеприготовленном инкубационном растворе,
10—60 мин.
Приготовление инкубационного раствора:
а) Маточный раствор
Сульфат меди (CuSO4-5H2O) 0,3 г
Глицин , 0,375 г
Хлорид магния (MgCl2-6H2O) 1,0 г
Малеиновая кислота 1,75 г
NaOH (4%) 30 мл
Na2SO4 (40%, насыщенный при подо- 170 мл
греве) pH 6,0 »
б) Инкубационный раствор: 20 мг ацетилтиохолинио-
дида растворить в нескольких каплях дистиллированной
воды и добавить 10 мл маточного раствора.
3. Промыть в'З сменах насыщенного раствора Na2SO4.
4. Поместить срезы в раствор сульфида аммония,
2 мин.
5. Быстро промыть в проточной и дистиллированной
воде и заключить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Активность ацетилхолинэстеразы проявляется окраши-
ванием различных оттенков—от коричневого до черного.
КОНТРОЛЬ
Инкубация без субстрата; инкубация с 10 _ 4 М эзери-
ном (физостигминсалицилат) в инкубационной среде без
4. Гистохимия отдельных классов веществ и фермента» 235
субстрата (предварительная инкубация) и в среде с суб-
стратом (основная инкубация) для подавления ацетилхо-
линэстеразной и холинэстеразной активности.
ПРИМЕЧАНИЯ
Реакция дает надежные результаты и пригодна как дл._
исследовательских целей, так и в практической работе. Для
выявления холинэстеразной активности можно вместо
ацетилтиохолиниодида использовать бутирилтиохолинио-
дид.
ВЫЯВЛЕНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПО КЁЛЛЕ(КОЕЬЬЕ) В МОДИФИКАЦИИ
ЛЬЮИСА (LEWIS, 1961)
МЕТОДИКА
1. Перфузия для промывания кровеносных сосудов изо-
тоническим раствором сульфата натрия, подогретым до
температуры тела, а затем для фиксации 10%-ным форма-
лином в изотоническом растворе сульфата натрия (16,2 г
безводного Na2SO4 на 1 л воды), 15—30 мин. После этого
ткань режут на кусочки не толще 1 см и погружают в тот
же фиксирующий раствор на 6—18 ч при температуре
+ 4°С. Промыть в 2—3 сменах дистиллированной воды
и поместить в 20%-ный этанол, в котором ткань можно
хранить при + 4°С несколько недель без потери активно-
сти фермента. Согласно Льюису, такая обработка опти-
мальна.
2. Приготовление замороженных или криостатных сре-
зов толщиной 10—20 мкм.
3. Инкубация в «висячей» капле (предметное стекло на-
кладывается в перевернутом виде на инкубационную сре-
ду)—при + 37°С в течение 1 ч, а при +4°С—в течение
ночи—в следующей среде: 10 мг ацетилтиохолиниодида
(11 мг бутирилтиохолиниодида) растворяют в 0,4 мл ди-
стиллированной воды, осаждают 0,7 мл 0,1 М CuSO4
(25 г/л CuSO4-5H2O) при добавлении по каплям и встряхи-
вании, после' чего оставляют раствор на 10 мин; осадок
удаляют центрифугированием при 2000 об/мин. В 1 мл
236 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
над осадочной жидкости растворяют 6,2 мг глицина; pH
этого раствора в зависимости от выявляемого фермента
доводят 1 М ацетатом натрия до 4,5—6,0. Объем среды
доводят дистиллированной водой до 5 мл.
4. После инкубации срезы тщательно промыть в ди-
стиллированной воде.
5. Помещение в раствор сульфида (2—3 г сульфи-
да натрия чд.а.—быстро взвесить—растворить
в 90—135 мл 0,2 н. уксусной кислоты; pH довести 1 н. ук-
сусной кислотой или 1 н. ацетатом натрия до 5—6. Рас-
твор следует готовить в день опыта), 1—2 мин.
6. Тщательно промыть в проточной и дистиллирован-
ной воде.
7. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей кон-
центрации, ксилол, заключение в энтеллан. Возможно так-
же заключение в глицерин — желатину (после п. 6).
РЕЗУЛЬТАТ
Ацетилхолинэстеразная активность маркируется осад-
ком черного цвета.
ПРИМЕЧАНИЯ
Реакция особенно пригодна для исследовательских це-
лей. В отличие от реакции Гомори она позволяет выявлять
тончайшие волокна, содержащие АХЭ. Заключение в
глицерин — желатину неблагоприятно влияет на резуль-
таты реакции.
МЕТОД С ТИОХОЛИНОМ и ФЕРРОЦИАНИДОМ МЕДИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОН-
НО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ
ПО КАРНОВСКОМУ И РУТСУ (KARNOVSKY, ROOTS)
МЕТОДИКА
1. Фиксация: а) фиксация перфузией 3%-ным глутараль-
дегидом на фосфатном буфере (pH 7,6), 15—30 мин, с по-
следующей фиксацией погружением на 2—4 ч при темпе-
ратуре 2 -4rfC; б) маленькие кусочки ткани фиксировать
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 237
в 4%-ном формалине на 0,75 М фосфатном буфере (pH 7,6)
с добавлением 0,44 М сахарозы, 2—-4 ч при температуре
2—ГС.
2. Фиксированную ткань просушить фильтровальной
бумагой и промыть в 0,44 М сахарозе, 16 ч при температу-
ре 2—ГС.
3. Срезы толщиной 50—80 мкм приготовить на резаке
или замороженные срезы толщиной 50 мкм приготовить
на замораживающем микротоме и поместить их в 0,44 М
сахарозу при температуре 2—4°С.
4. Предварительная инкубация срезов с ингибитором
в 0,1 М Na-малеатном буфере (pH 6,0) 1 ч при температу-
ре 2—4°С. Ингибиторы: 10 ~ 4 М изо-ОМФА (ингибитор
холинэстеразы).
5. Инкубация в течение 15—120 мин при 0°С (ледяная
баня) в следующей среде:
Ацетилтиохолиниодид 5,0 мг
0,1 М натрий-малеатный буфер (pH 6,0) 6,5 мл
0,1 М цитрат натрия 0,5 мл
30 мМ сульфат меди 1,0 мл
Ингибитор (10-4 М изо-ОМФА) 1,0 мл
5 мМ феррицианид калия 1,0 мл
Сахароза 1,5 г
Рекомендуется прежде всего растворить в буфере ацетил-
тиохолиниодцд, после чего добавлять все остальные ком-
поненты инкубационной среды в указанном порядке. Рас-
творы для инкубационной среды готовятся накануне;
используется дистиллированная вода, перегнанная в стек-
лянной посуде.
, 6. Промывка инкубированных срезов в холодной
0,44 М сахарозе, 2x4 мин.
7. Дофиксация в 1%-ном OsCr-s-коллидине (pH 7,2).
8. Обезвоживание, заливка в эпон или микропал (весто-
пал), контрастирование срезов цитратом свинца по Рей-
нолдсу, 10—15 мин.
РЕЗУЛЬТАТ
Активность ацетилхолинэстеразы, считающаяся специ-
фичной после подавления холинэстеразы с помощью изо-
ОМФА, маркируется осадком ферроцианида меди. Для
238 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
выявления неспецифической холинэстеразной активности
вместо ацетилтиохолиниодида можно использовать бути-
рилтиохолиниодид, а в качестве специфического ингибито-
ра АХЭ—10 3 4 М BW 284с51.
МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОГО АЗОСОЧЕТАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ₽-
ГЛЮКУРОНИДАЗЫ ПО ХАЙЯСИ И ЛОЙДЕ (HAYASHI, LOJDA)
МЕТОДИКА
1. Фиксация маленьких кусочков ткани в холодном
кальций — формоле по Бейкеру; приготовление заморо-
женных или криостатных срезов после тщательной
промывки кусочков ткани в растворе гуммиарабика и саха-
розы по Хольту; свежие замороженные или криостатные
срезы с использованием постфиксации в холодном
кальций — формоле по Бейкеру тщательно промывают
в дистиллированной воде или в растворе Хольта.
2. Инкубация в холодильнике при +4° С в течение ночи
или при комнатной температуре 1—2 ч в следующем
растворе:
а) Водная среда
А) 0,2 М ацетат натрия 20 мл
Гексазоннйпарарозанилин (pH довести до 5,0 с 0,6 мл
помощью NaOH)
Б) Нафтол-АБ-В1-р-Г>-глюкуронид 4 мг
Диметилформамид 0,5 мл
А) и Б) хорошо смешать и отфильтровать
б) Среда для метода с использованием мемб-
ран по Лойде (Lojda, 1973)
А) 0,2 М ацетат натрия 10 мл
Гексазоннйпарарозанилин (pH 5,0) 0,6 мл
Б) Нафтол-А8-В1-Р-В-глюкуронид 4 мг
Диметилформадид 0,5 мл
В) 2%-ный агар в дистиллированной воде, ра-
зогретой на водяной бане (80—90° С)
3. Срезы хорошо промыть в дистиллированной воде
или в 10%-ном формалине (несколько часов).
4. Заключение в глицерин — желатину.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 239
РЕЗУЛЬТАТ
Положительная реакция проявляется красным окраши-
ванием.
ВЫЯВЛЕНИЕ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (СТАНДАРТНЫЙ МЕТОД)
МЕТОДИКА
1. Приготовление нефиксированных замороженных или
криостатных срезов толщиной 5—10 мкм.
2. Срезы просушить и инкубировать 10—60 мин в сле-
дующей среде:
2,5 М ди-Ма-сукцинат 1,0 мл
(6,75 г/10 мл, нейтрализовать 1 н. НС1)
Нитро-СТ (4 мг/мл)
0,2 М трис-На-буфер (pH 7,4)
5 мМ MgCl2
Дистиллированная вода
100 мМ KCN (65,1 мг/10 мл)
2,5 мл
2,5 мл
1,0 мл
3,0 мл
1,0 мл
Проверить pH и, если необходимо, довести его с по-
мощью маточного раствора триса или 1 н. НС1 до 7,0—7,1.
3. Инкубационную смесь стряхнуть со срезов и фикси-
ровать их в 10%-ном нейтральном формалине, 15—30 мин.
4. Промыть в проточной воде, 2 мин, и затем
в дистиллированной.
5. Заключение в глицерин — желатину или обезвожива-
ние в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол,
бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Места сукцинатдегидрогеназной активности марки-
руются кристаллами формазана красного или синего
цвета.
КОНТРОЛЬ
Инкубация без субстрата.
240 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ПРИМЕЧАНИЯ
Вместо нитро-СТ можно использовать нерастворимый
в липидах ТНСТ в той же концентрации. Ингибирование
системы цитохромов с помощью KCN усиливает реакцию,
поскольку на восстановление соли тетразолия остается
больше водорода. Непродолжительная фиксация малень-
ких кусочков ткани формальдегидом или глутаральдеги-
дом способствует локализации фермента; она ведет, одна-
ко, к частичной инактивации фермента и осложняет сужде-
ние об истинной ферментативной активности. Согласно
Андерсену и Хойеру (Andersen, Hoyer, 1973), хорошая лока-
лизация фермента in situ без потерь достигается с по-
мощью следующей фиксации: 1%-ный забуференный, сво-
бодный от метанола формальдегид, приготовленный из
параформальдегида (pH 7,2 устанавливается 0,2 М фос-
фатным буфером). Продолжительность фиксации 5 мин
при температуре от 0 до + 4°С. Кусочки ткани следует вы-
резать быстро; толщина их не должна превышать
1—2 мм. Такая фиксация способствует проникновению
нитро-СТ в ткань и повышает субстантивность формазана.
ВЫЯВЛЕНИЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ ПО БЁРСТОНУ (BURSTONE, 1959)
МЕТОДИКА
1. Нефиксированные замороженные или криостатные
срезы толщиной 5—10 мкм снимают с микротомного но-
жа охлажденной кисточкой, переносят на покровное или
предметное стекло, расправляют и просушивают.
2. Срезы инкубировать при комнатной температуре
1—2 ч в следующей среде:
Нафтол-А8-Ь3 G,
или 1-окси-2-нафтойная кислота 10 мг
п- Аминодифениламин
(Ы-фенил-и-фенилендиамин) 10 мг
растворяют в 0,5 мл этанола, добавляют 35 мл дистилли-
рованной воды и 15 мл 0,2 М трис-буфера. После встря-
хивания раствор следует профильтровать.
3. Срезы для дофиксации и для образования комплекс-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 241
ной соли кобальта перенести в 1%-ный ацетат кобальта,
растворенный в 4%-ном формалине, на 1 ч.
4. Тщательно промыть в дистиллированной воде и за-
ключить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Локализация фермента маркируется стабильным мел-
козернистым коричневатым осадком красителя.
КОНТРОЛЬ
Обработка срезов ткани перед инкубацией
в 0,1—1%-ном растворе цианида калия.
ПРИМЕЧАНИЕ
Благодаря своей простоте и стабильности продукта ре-
акции метод Берстона является более совершенным, чем
НАДИ-реакция.
МЕТОД С ТЕТРАЗОЛИЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ
ПО ГЛЕННЕРУ И ДР. (GLENNER u. Mitarb.)
МЕТОДИКА
1. Нефиксированные замороженные или криостатные
срезы толщиной 10—40 мкм поместить на покровное или
предметное стекло и быстро просушить.
2. Инкубация 30—45 мин при +37° С в следующей
среде:
Триптамингидрохлорид 25 мг
Сульфат натрия 4 мг
Нитро-СТ 5 мг
0,1 М фосфатный буфер (pH 7,6) 5 мл
Дистиллированная вода 15 мл
3. Промывка в проточной воде, 2 мин; быстро промыть
в дистиллированной воде и заключить в глицерин—
— желатину.
242 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
РЕЗУЛЬТАТ
Места локализации моноаминоксидазной активности
маркируются синими гранулами формазана.
КОНТРОЛИ
Инкубация в среде без субстрата; предварительная
обработка срезов на холоду в 10 *М Р-фенилизопропил-
гидразине в изотоническом растворе NaCl, 1 ч, или в 10 “ 3
марсилиде (1-изоникотинил-2-изопропилгидразин) на
0,1 М фосфатном буфере (pH 7,6), 30 мин при + 37°С.
ПРИМЕЧАНИЕ
Метод отличается простотой и дает хорошо воспроиз-
водимые результаты.
МЕТОД С ДИАМИНОБЕНЗИДИНОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ
ПО ГРЭХЕМУ И КАРНОВСКОМУ (GRAHAM, KARNOVSKY)
МЕТОДИКА
1. Кусочки ткани толщиной 3—4 мм фиксировать
в смеси формалина и глутаральдегида; буфер pH 7,2, 5 ч
при комнатной температуре.
Приготовление' фиксирующей смеси: к 25 мл дистил-
лированной воды в колбе добавить 2 г параформальдеги-
да и при постоянном помешивании нагревать до + 70° С.
К этому раствору добавляют по-каплям 1 н. NaOH до
просветления (2—3 капли). После охлаждения добавляют
5 мл 50%-ного глутаральдегида, 20 мл 0,2 М какодилат-
ного буфера и 25 мг СаС12. Раствор тщательно перемеши-
вают.
2. Кусочки ткани промывать в течение ночи в 0,1 М ка-
кодилатном буфере (pH 7,2).
3. Замороженные или криостатные срезы должны быть
толщиной 10—40 мкм; срезы, приготовленные на резаке,
могут иметь толщину 50 мкм.
4. Инкубация в течение 3—10 мин при комнатной тем-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 243
пературе в следующей среде: 5 мг 3,3 -диаминобензидин-
тетрагидрохлорида растворить в 10 мл 0,05 М mpuc-HCl-
буфера (pH 7,6) и добавить 0,2 мл 1% Н2О2 (свежеприго-
товленной из 30% Н2О2). Сохранность инкубационной
среды около 1 ч.
5. Срезы промыть в 3 сменах дистиллированной воды.
Для световой микроскопии срезы заключить в глицерин —
— желатину.
6. Для электронной микроскопии срезы дофиксировать
в 1,3% OsO4 на 0,2 М коллидиновом буфере (pH 7,2—7,4)
с добавлением 5% сахарозы, 90 мин. (ОД М коллидиновый
буфер pH 7,2—7,4: 2,67 мл чистого s-коллидина раство-
ряют в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 9 мл
1 н. НС1. Этот раствор доводят дистиллированной водой
до 100 мл.)
7. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей кон-
центрации; заливка в эпон.
8а. Срезы толщиной 0,5—1 мкм для световой микро-
скопии подвергают непродолжительному окрашиванию
толуидиновым синим.
86. Ультратонкие срезы контрастируют растворами
свинца.
РЕЗУЛЬТАТ
а) Места ферментативной активности (пероксидаза, ка-
талаза) после п. 5 окрашиваются в коричневый цвет.
б) Продукт реакции представляет собой гомогенный
электроноплотный осадок.
ПРИМЕЧАНИЯ
В отдельных случаях положительную реакцию могут
давать и лизосомы. Согласно нашим наблюдениям, в п. 6
дофиксацию можно проводить в 1,3% OsO4 на 0,1 М како-
дилатном буфере с pH 7,2—7,4 (вместо коллидинового бу-
фера с 5%-ной сахарозой) в течение 90 мин.
244 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ВЫЯВЛЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ПО ГРЭХЕМУ, ЛУНДХОЛМУ И КАРНОВ-
СКОМУ (GRAHAM, LUNDHOLM, KARNOVSKY)
МЕТОДИКА
1. Маленькие кусочки ткани фиксировать при 0°С в за-
буференном растворе формалина и сахарозы, 18 ч, с после-
дующей промывкой в холодном 5%-ном растворе саха-
розы, 24 ч.
2. Криостатные срезы толщиной 8 мкм нанести на по-
крытые желатиной покровные или предметные стекла
и подсушить на воздухе.
3. Срезы инкубировать при комнатной температуре
в следующей среде: 2 мг З-амино-9-этилкарбазола раство-
рить в 0,5 мл диметилформамида и добавить 9,5 мл
50 мМ ацетатного буфера (pH 5,0). Непосредственно перед
употреблением добавить к раствору 1—2 капли 30%-ной
Н2О2.
4. Срезы промыть в дистиллированной воде и заклю-
чить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Пероксидазная активность выявляется по красному
цвету продукта реакции.
4.6. ПИГМЕНТЫ
Термин «пигмент» охватывает целую группу веществ,
главным образом эндогенного происхождения, различаю-
щихся по своему отношению к кислотам, щелочам, раство-
рителям, жиров, реакциям на железо, солям серебра и кра-
сителям, и имеющих различные микроморфологические
признаки. В гистохимическом отношении пигменты обыч-
но проявляют мало различий.
По своему происхождению пигменты делятся на фе-
нольные (тирозин—триптофановые), пигменты крови
и жировые пигменты, или на гематогенные и негемато-
генные (аутогенные) пигменты. К гематогенным пигмен-
там относится, Например, гемоглобин и его производные,
а к аутогенным—меланин, липофусцины и каротиноиды.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 245
Из экзогенных пигментов следует отметить, в частности,
угольную пыль, отложения металлов, а также отложения
инородных веществ, связанные с терапевтическими или
диагностическими воздействиями на организм.
4.6.1. МЕЛАНИН
Меланин встречается преимущественно в форме гранул
(гранулы меланина, или меланосомы) в эктодерме и в тка-
нях, происходящих из эктодермы.
Под электронным микроскопом различимы зерна круг-
лой овальной и палочковидной формы.
Синтез меланина в промеланосомах протекает через
окисление тирозина до ДОФА при участии пероксидазы
и тирозиназы.
Доля участия каждого из этих ферментов в синтезе ДО-
ФА в клетках разного типа варьирует.
Возникновение меланина
Пероксидаза
Тирозиназа
Тирозин до<рд БыстР£. Промежуточные
продукты
—► Меланин г *
Сведения о гистохимических реакциях с участием пиг-
ментов суммированы в табл. 43 и 44. В гистохимическом
отношении меланин и липофусцин имеют много общего;
так, оба они обладают способностью восстанавливать ам-
миачный раствор нитрата серебра. Отдифференцировать
их можно с помощью нильского синего, а также по способ-
ности липофусцина в отличие от меланина давать види-
мую собственную флуоресценцию в ультрафиолетовом
свете. Меланин образует комплексы с ионами железа, ко-
торые легко выявить с помощью феррицианида калия. На
этом принципе основан «железный» метод выявления ме-
ланина по Лилли (Lillie). Специфическое контрастирование
и ультраструктурное выявление прёмеланосом возможно
с помощью реакции на тирозиназу.
От меланина гистохимически отличается его разновид-
ность—так называемый нейромеланин; он встречается
246 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 43
Гистохимический дифференциальный диагноз различных эндогенных пиг-
ментов (Bucher)
Гистохимическая реакция Гемоглобин Гематоидин Гемосиде* рин Меланин Липофусцин
Псевдопероксидаз- ная реакция с бен- зидином + — — — +
Реакция Гмелина с И№3 + — — —
Выявление железа феррицианидом калия (турнбуле- ва синь) +
Восстановление аммиачного нит- рата серебра + +
Обесцвечивание с помощью силь- ных окислителей- Н2О2 и КМпО4 + Быстрое + Медленное
Окрашивание жира, например Суда- ном черным — — — — +
Собственная флуо- ресценция в ульт- рафиолетовом свете +
в ганглиозных клетках нервной системы. В отличие от ме-
ланина нейромеланин содержит капли жира и не дает
ДОФА-реакции.
4.6.2. ГЕМОСИДЕРИН
Внутриклеточный пигмент в форме гранул, имеющих
цвет от желтого до коричневого, содержит железо, что явля-
ется важным диагностическим признаком. Гемосидерин не-
растворим в щелочах, но растворяется в сильных кислотах.
Он не обесцвечивается сильными окислителями, не проявля-
ет аргентаффинности, свободен от жира и дает положитель-
ную ШИК-реакцию, обусловленную его нахождением в бел-
ково-полисахаридном комплексе. Этот комплекс-носитель,
кроме того, дает резко положительную реакцию с тетразо-
лием после бензоилирования.
Таблица 44
Сравнительная гистохимия липофусцина, гемосидерина и меланина (Pearse, с изменениями)1
Липофусцин Гемосидерин Меланин
ганглиозные клетки миокард клетки печени
Цвет От желтого до темно-коричне- вого Золотисто-ко- ричневый Светло-корич- невый От желтого до коричневого От коричневого до черного
Эозинофилия — — — — —
Базофилия От слабо + до + Слабо + + От слабо + до - +
Кислотоустойчивость — — + — —
Судан черный + + + , — —
Масляный красный О — Умеренно — — —
(замороженные срезы)
Шифф-надмуравьиная + (вар) + (вар) + (вар) - -
кислота
ШИК-реакция ± + + — —
Плазмалевая реакция — — — — —
Щелочной раствор се- ребра Реакция Шморля Слабо + - От слабо + до - - +
Сильно + От слабо + до - + - +
Реакция Гмелина — — — — —
Н2О2 (обесцвечивание) 48+ 48 + 48 + - -
Диазореакция (щелоч- — — — — —
ная)
Диазореакция (кислая) — — — — —
Флуоресценция в Золотисто-жел- Красно-корич- Светло-коричне- ; — —
ультрафиолете тая невая вая — —
Хромовый гематокси- + + + - -
ЛИН
1) Обозначения: ± преимущественно отрицательная реакция; + (вар) - обычно положительная, но частично отрицательная; 48 + означает более 48 ч.
248 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Гистохимическое выявление гемосидерина основано
в первую очередь на присутствии железа, которое выяв-
ляется самыми разнообразными методами, например с по-
мощью метода Перлса (Peris). Родственный липофусцину
гемосидерин может быть выявлен в серийных срезах путем
последовательного выявления липофусцина и железа (ме-
тод Перлса).
4.6.3. ЛИПИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ
Принадлежащие к этой группе пигменты (липофусцин,
гемофусцин, цероид, псевдомеланин, железосодержащие
липопигменты, каротиноиды), как правило, имеют соб-
ственную окраску от светло-желтой до темно-коричневой
и встречаются в виде мелких зерен и глыбок. Они содержат
в качестве строительных блоков, в частности, труднора-
створимые продукты окисления и полимеризации ненасы-
щенных карбоновых кислот или их эфиры, а также белки.
В отношении важнейших физических и . гистохимиче-
ских свойств, а также по способности окрашиваться
различные липидные пигменты имеют много общего. По-
этому их не удается однозначно дифференцировать друг от
друга с помощью гистохимических методов. Различия
в первую очередь следует искать в количестве и качествен-
ном составе белкового компонента. Из группы гистохими-
чески выявляемых липидных пигментов наиболее тща-
тельно был изучен имеющий важное биологическое
значение липофусцин. Сравнение гистохимических свойств
этого пигмента с гистохимическими свойствами гемоси-
дерина и меланина проведено в табл. 44.
Отмечена определенная связь между липофусцином (в
частности, его образованием) и лизосомами; важную роль
при этом играют кислые гидролазы—например, кислая
фосфатаза и неспецифическая эстераза (рис. 6). Липофус-
цин, меланин и гемосидерин накапливаются в остаточных
тельцах и вместе с ними идентифицируются.
Для гистохимического выявления липофусцина были
разработаны различные методы. Надежные результаты
дает реакция Шморля и метод Циля—Нильсена. Реакция
Шморля основана на выявлении восстанавливающих ве-
ществ; метод Циля—Нильсена использует способность
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 249
липофусцина окрашиваться основными, жирорастворимы-
ми красителями. В присутствии фенола растворимость
красителей в липидах повышается.
Для дифференцировки меланина и липофусцина можно
использовать окраску нильским синим по Хуэку (Hueck).
Лизосома
Рис. 6. Механизм образования липофусцина и меланина в лизосомах
(Pearse, 19721
Химически однородная группа каротиноидов ранее на-
зывалась липохромами или лутеинами. Каротиноиды ши-
роко распространены в растительных и животных тканях;
они представляют собой безазотистые соединения разного
цвета—от светло-желтого до красно-фиолетового. Их
углеродный скелет построен из изопреновых единиц.
Отличительным свойством каротиноидов является то,
что их спектр поглощения лежит в сине-зеленой области
и имеет 3 четко выраженных пика. С помощью спектров
поглощения можно легко опознавать различные красите-
ли.
Гистохимические методы выявления каротиноидов ос-
нованы в первую очередь на легкой окисляемости сопря-
женных двойных связей в их молекуле. Под действием кис-
лот, например концентрированной серной, соляной, фос-
форной, хлорной и других, каротиноиды приобретают
интенсивное синее, зеленое или фиолетовое окрашивание.
10-235
250 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
С хлоридами сурьмы (III) и мышьяка (III) каротиноиды
образуют соли карбония синего цвета. Практическое зна-
чение имеют реакции с серной кислотой, а также проба
Карра—Прайса с хлоридом сурьмы в хлороформе.
4.6.4. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ПИГМЕНТОВ
МЕТОД ШМОРЛЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИПОФУСЦИНА
МЕТОДИКА
1. Фиксация в формалине; приготовление заморожен-
ных или парафиновых срезов.
2. Срезы промыть в дистиллированной воде.
3. Поместить срезы в реакционную смесь на 5—20 мин.
Реакционная смесь: 3 части 1%-ного раствора FeCl3 сме-
шивают с 1 частью 1%-ного раствора гексацианоферрата
(III) калия (красная кровяная соль). Раствор использовать
в течение 30 мин! f
4. Срезы хорошо промыть в проточной воде. В особо
важных случаях рекомендуется проводить микроскопию
срезов, заключенных в воду.
5. Быстро обезводить в ряду спиртов возрастающей
концентрации, ксилол, нейтральный бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Липофусцин и меланин окрашиваются в темно-синий
цвет. Кроме того, положительную реакцию дают арген-
таффинные гранулы, а также ткани, содержащие активные
SH-группы.
ПРИМЕЧАНИЕ
После п. 4 можно провести окрашивание ядер 1%-ным
нейтральным красным в течение 3 мин.
«ЖЕЛЕЗНЫЙ» МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ МЕЛАНИНА ПО ЛИЛЛИ (LILLIE)
МЕТОДИКА
1. Фиксация в различных смесях, заливка в парафин.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 251
2. Депарафинированные срезы довести до воды.
3. Поместить в 2,5%-ный раствор сульфата железа,
60 мин.
4. Промыть в 4 сменах дистиллированной воды, по
5 мин.
5. Поместить в 1%-ный раствор гексацианоферрата (III)
калия в 1%-ной уксусной кислоте, 30 мин.
6. Промыть в 1%-ной уксусной кислоте.
7. Провести через ряд спиртов возрастающей концен-
трации, ксилол, нейтральный бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бес-
цветном фоне. Такой же цвет имеет гемосидерин.
ПРИМЕЧАНИЕ
После п. 6 возможно докрашивание ядер.
МЕТОД ЦИЛЯ - НИЛЬСЕНА (ZIEHL - NEELSEN) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КИС-
ЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ЛИПОФУСЦИНОВ
МЕТОДИКА
1. Фиксация в различных смесях, заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды.
3. Окрашивание срезов в раствоое карбол-фуксина при
+ 60°С, 3 ч (10 г основного фуксина, 50 г фенола, 100 мл
этанола, 1000 мл дистиллированной воды).
4. Промывка в проточной воде.
5. Дифференцирование в 1%-ной соляной кислоте в эта-
ноле до тех пор, пока эритроциты станут розовыми.
6. Промывка в дистиллированной воде.
7. Докраска в железных квасцах или 0,5%-ном растворе
толуидинового синего.
8. Промывка в проточной воде.
9. Обезвоживание в раду спиртов возрастающей кон-
центрации, ксилол, бальзам.
10*
252 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
РЕЗУЛЬТАТ
Кислотоустойчивые липофусцины ярко-красного цвета,
а липопротеиды—красноватого. Ядра окрашиваются
в темно-синий или синий цвет.
примечание
Из-за базофилии липофусцина слишком сильная докра-
ска ведет к развитию темно-красного окрашивания.
ОКРАШИВАНИЕ НИЛЬСКИМ СИНИМ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ РАЗЛИ-
ЧИЙ МЕЖДУ МЕЛАНИНОМ И ЛИПОФУСЦИНОМ ПО ХУЭКУ (HUECK)
МЕТОДИКА
1. Любая фиксация, заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы поместить в дистилли-
рованную воду. ч
3. Срезы окрашивать свежеприготовленным насыщен-
ным водным раствором нильского синего, 30 мин.
4. Промыть в дистиллированной воде.
5. Обесцветить 10%-ной перекисью водорода, 24 ч.
6. Промыть в проточной воде.
7. Заключить в глицерин — желатину.
РЕЗУЛЬТАТ
Липофусцин окрашивается в синий цвет, меланин не
окрашивается.
4.7. БИОГЕННЫЕ АМИНЫ
Термин «биогенные амины» охватывает физиологиче-
ски и фармакологически важные низкомолекулярные орга-
нические основания, которые образуются в процессе об-
менных реакций в организме и находятся в тесной связи
с белками и аминокислотами. Биогенные амины широко
распространены в природе и встречаются как в животных,
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 253
так и в растительных тканях. Они играют важную физио-
логическую роль в передаче в нервной системе сигналов
возбуждения и торможения (нейромедиаторы).
4.7.1. СВОЙСТВА, КЛАССИФИКАЦИЯ И РАСПРО-
СТРАНЕНИЕ
Биогенные амины образуются в процессе декарбокси-
лирования аминокислот. Важную роль при этом играют
ферментативные системы. Ферменты, участвующие в ме-
таболизме биогенных аминов, известны все без исключе-
ния.
Аминокислота
Тирозин
Гистидин
л Триптофан
5-окситриптофан
Гистохимичебки важные
Биогенный амин
Тирам ин
Гистамин
Триптамин
Серотонин (5-окси-
триптамин)
биогенные амины: 5-окси-
триптамин, триптамин, тирамин, адреналин, норадрена-
лин и дофамин являются моноаминами. Их принято де-
лить на 2 группы—катехоламины и индоламины.
Катехоламины* являются производными аминокис-
лоты тирозина, которая в свою очередь может обра-
зовываться из фенилаланина. Катехоламины, к кото-
рым принадлежат адреналин, норадреналин и дофамин,
имеют катехиновое ядро (-диоксифенильную группу)
(рис. 7).
Индоламины образуются из аминокислоты триптофа-
на или родственных ей продуктов, таких, как 5-окситрипто-
фан. Их ядром является индольная группа. К индолами-
нам принадлежит серотонин (5-окситриптамин).
Концентрация биогенных аминов в большинстве орга-
нов, особенно в мозге, очень низка (табл. 45).
Поэтому для их топохимического выявления в нервной
системе пригодны лишь высокочувствительные реакции
конденсации на лиофилизированной ткани мозга. В других
тканях (например, в желудочно-кишечном тракте, мозго-
вом веществе надпочечника) выявление этих активных ве-
ществ уже давно было осуществлено с помощью хромаф-
финных или аргентаффинных реакций. Из ряда доступных
254 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Н Н
I I
C-C-NHz
Н СООН
Фенилаланин
Тирозин
ДОФА
Дофамин
Норадреналин
ОН
I НН
I I
^ч^хС-C-NH
L Ял'ми Ан
On п Cnj
Адреналин
он
Рис.7. Схема образования катехоламинов из аминокислот (Schade).
Таблица 45
Концентрация биогенных аминов
в неокортексе у собаки и кошки, нг/г
Область мозга Ацетилхолин Дофамин Норадре- катан Серотонин Гиста- мин
Неокортекс 2000 100 100 300 100
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 255
гистохимическому выявлению биогенных аминов выпа-
дает нейромедиатор ацетилхолин, для которого до сих пор
не существует надежного гистохимического метода выя-
вления. Разработка такого метода представляет собой
важную задачу.
Помимо центральной и периферической нервной систе-
мы биогенные амины встречаются в эпителии желудочно-
кишечного тракта, в мозговом веществе надпочечника
(клетки, вырабатывающие адреналин и норадреналин),
в островковой ткани поджелудочной железы, в щитовид-
ной железе, тимусе и в фабрициевой сумке у птиц, а также
в других органах. В центральной и периферической нерв-
ной системе биогенные амины встречаются большей
частью в синаптических пузырьках, причем в центральной
нервной системе содержание этих медиаторов в разных
ядрах различно. Ретикулярная формация и гипоталамус,
например, отличаются высоким содержанием
норадреналина, « область полосатого тела—очень низ-
ким. Дофамин локализуется главным образом в области
бледного ядра (pallidum) и скорлупы (putamen). Особенно
большие количества катехоламина выявляются в пост-
ганглионарных симпатических нейронах.
4.7.2. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ БИО-
ГЕННЫХ АМИНОВ
Для гистохимического выявления биогенных аминов
разработаны следующие методы:
1) хромаффинная реакция;
2) аргентаффинная реакция;
3) реакция окрашивания;
4) реакция конденсации.
Методы, используемые для выявления биогенных ами-
нов в световой и электронной микроскопии, суммированы
в табл. 46.
4.7.2.1. ХРОМАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ
В результате окислительного действия соединений, со-
держащих хром (например, бихромата калия), на целый
256 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Таблица 46
Гистохимические методы выявления биогенных вмннов (Hahn v. Dorsche
u. Mitarb., 1975)
Метод Световая микроскопия Электронная микроскопия Аминогруппа/амии
Конденсация с формальдегн- + Катехоламин
ДОМ серотонин
Конденсация с глиоксиловой + То же
кислотой Конденсация с о-фтальальде- + Гистамин, се-
ГИДОМ ротонин
Хромаффинная реакция + + Катехоламин
Аргентаффинная реакция + +
Реакция с перманганатом Реакция с иодом + +
Осаждение солью Райнеке + + Гистамин, ка-
техоламин,
серотонин
Преципитация турнбулевой + Катехоламин
СИНИ
Метод с солями тетразолия Метод с диазосульфаниловой +
кислотой—азур А +
Метод с п-броманилином + ,3
Метод с диазосафранином . + г
ряд биогенных аминов
образуется коричневый пигмент:
Норадреналин Норадренохром
Развитие коричневого окрашивания никак не связано
с окрашивающим действием хромовых солей; оно по-
является также и под действием других окислителей, не со-
держащих хрома, например йодата калия.
Эту в общем неспецифическую реакцию можно превра-
тить в специфическую особым типом фиксации. Так, с по-
мощью глутаральдегида можно отделить первичные
амины (норадреналин, окситриптамин) от вторичного ами-
на—адреналина. Формальдегидная фиксация с последую-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 257
щей хромаффинной реакцией ведет к окрашиванию серото-
нина, тогда как адреналин, норадреналин и дофамин не
дают окрашивания.
4.7.2.2. АРГЕНАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ
Под аргенаффинностью понимают способность опре-
деленных структурных элементов восстанавливать ам-
миачный раствор серебра до металлического серебра без
применения восстановителей. Процесс восстановления
свидетельствует о наличии 5-окситриптамина (серотони-
на), норадреналина и дофамина. Адреналин дает отрица-
тельную реакцию. Скорость восстановления серебра для
разных аминов различна: норадреналин восстанавливает
серебро за несколько секунд, дофамин примерно за 1 мин,
а 5-окситриптамин—за 30 мин. На этом основании воз-
можна дифференцировка 3 типов аминов.
Для выявления аргентаффинности в световой микро-
скопии наиболее пригоден метод Массона—Гамперля (см.
Romeis, 1948 или 1968).
Для электронно-микроскопического выявления аргент-
аффинных веществ рекомендуется метод Трамеццани,
Киоккио и Вассерманна (см. Geyer, 1973).
4.7.2.3. РЕАКЦИИ ОКРАШИВАНИЯ
Из этой категории следует упомянуть в первую очередь
три метода: диазониевая реакция, индофенольная реакция
и реакция Гибса. В диазониевой реакции (реакция диазосо-
четания) в щелочной среде выявляются фенольные про-
изводные с незамещенной гидроксильной группой.
4.7.2.4. МЕТОДЫ КОНДЕНСАЦИИ
Перечисленные в табл. 46 методы конденсации, ис-
пользуемые для установления внутриклеточной локализа-
ции биогенных аминов, основаны главным образом на ме-
тоде флуоресценции с формальдегидом по Фальку
и Хилларпу (Falck, Hillarp), для которого можно использо-
вать как парафиновый материал после замораживания —
— высушивания, так и высушенные криостатные срезы.
258 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
При этом образуются флуорофоры, которые можно ана-
лизировать и подвергать количественной оценке с по-
мощью микроспектрофлуориметрического анализа.
Вместо формальдегида можно использовать глиокси-
ловую кислоту в качестве флуоресцирующего гистохими-
ческого реагента на биогенные амины.
4.7.2.4.1. МЕТОД КОНДЕНСАЦИИ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ
При обработке парами формальдегида происходит
конденсация катехоламина и 5-окситриптамина в очень
мягких условиях в присутствии белков или определенных
аминокислот. При этом образуются интенсивно флуорес-
цирующие 3,4-дигидроизохинилины (III) или производное
Р-карболина. 3,4-дигидроизохинолин представляет собой
дегидрогенированный 1,2,3,4-тетрагидрохинолин (II).
Дигидроизохинолины (III) находятся в рН-зависимом
равновесии со своей таутомерной хиноидной формой (IV).
Этот компонент ответствен за флуоресценцию при гисто-
химической реакции.
ш
IV
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 259
Поскольку продукт реакции, по-видимому, связан ча-
стично метиленовыми мостиками с белками, его не удает-
ся экстрагировать органическими растворителями. Срезы
свежей и фиксированной формалином нервной ткани, по-
лученные на вибратоме при температуре от 0 до + 5°С,
подвергают высушиванию на воздухе и воздействию па-
ров формальдегида; на таких срезах удается выявлять ка-
техоламины высокочувствительным стандартным мето-
дом Фалька—Хилларпа. Измерение с помощью микро-
спектрофлуориметра спектров возбуждения и флуоресцен-
ции таких продуктов конденсации дает возможность
дифференцировать в клетках различные амины, такие, как
норадреналин, дофамин и 5-окситриптамин. Параметры
флуоресценции некоторых биогенных аминов и их предше-
ственников, а также родственных им соединений суммиро-
ваны в табл. 47.
Таблица 47
Параметры флуоресценции продуктов конденсация аминов и
их предшественников (Pearse)
Амин Возбуждение, V а . нм шах Флуоресценция,
1. м-Тирамин 385 415/510
2. м-Оксиамфетамин 385 415/510
3. Метараминол 385 415/510
4. Дофамин 410 480
5. а-Метилдофамин 410 480
6. Дофа 410 490
7. а*Метилдофа 400 480
8. Норадреналин 410 480
9. Адреналин * 410 480
10. а-Метилнорадреналии 410 480
11. 3,4-диоксифенилсерин 380 370
12. 3-метокситирамин 370 470
13. Триптамин 370 490
14. N-метилтриптамин 370 490
15. Триптофан 375 490
16. 5-окситриптофан 410 525
17. 5-окситриптамин 385-410 520-540
18. 6-окситриптамин 400 505
19. 5,6-диокситриптамин 400 500
20. 5-метокситриптамин 380 525
21. а-Метил- 410 520
5-окситриптамин
260 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
4.7.24.2. МЕТОД КОНДЕНСАЦИИ С ГЛИОКСИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
При воздействии паров глиоксиловой кислоты катехо-
ламины и индоламины образуют интенсивно флуоресци-
рующие соединения. Эти пары вызывают, кроме того,
сильную флуоресценцию N-ацетилированных индолами-
нов (например, мелатонина), метоксилированных катехо-
ламинов (например, 3-метокситирамина) и триптофан- или
ДОФА-содержащих пептидов на NH2- или СООН-конце.
Эти соединения не выявляются с помощью стандартного
- метода Фалька—Хилларпа.
4.7.3. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕ-
НИЯ БИОГЕННЫХ АМИНОВ
ХРОМАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА И НОРА-
ДРЕНАЛИНА ПО ХИЛЛАРПУ И ХЁКФЕЛЬТУ (HILLARP, H0KFELT)
МЕТОДИКА
1. Свежие, тонкие кусочки ткани (в первую очередь над-
почечника) обрабатывают следующим равтвором: 5%-ный
бихромат калия К2Сг2О7, 90 мл, 5%-ный хромат калия
К2СгО4, 10 мл (pH 5—6), 1—2 дня.
2. Промывка в дистиллированной воде, 30—60 мин.
3. Приготовление замороженных срезов, промывка их
в дистиллированной воде, заключение в глицерин—жела-
тину.
РЕЗУЛЬТАТ
Клетки, содержащие адреналин и норадреналин, окра-
шиваются в темно-коричневый цвет. После фиксации глу-
таральдегидом окрашиваются только те клетки, в которых
содержится норадреналин.
ПРИМЕЧАНИЯ
Реакция с биохроматом калия позволяет выявлять
лишь вещества в достаточной концентрации. Практически
этим условиям удовлетворяет только мозговое вещество
_____4. Гистохимия отдельных классов, веществ и ферментов 261
надпочечника. Поскольку горячий парафин частично вы-
мывает окрашенный продукт реакции, заливки в парафин
следует избегать.
РЕАКЦИЯ ДИАЗОСОЧЕТАНИЯ ДЛЯ АРГЕНТАФФИННЫХ ГРАНУЛ
В КЛЕТКАХ
МЕТОДИКА
1. Фиксация в формалине, заливка в парафин.
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды.
3. Срезы обрабатывать в течение 30 с в следующем рас-
творе : 1 мг/мл соли прочного красного В в 0,1 М веронал-
ацетатном буфере, pH 9,2.
4. Тщательная промывка в воде.
5. Окрашивание ядер в железных квасцах по Майеру,
6—10 мин.
6. Промывка в проточной воде, 30 мин.
7. Ряд спиртов, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Фенольные производные гранул в аргентаффинных эн-
терохромаффинных клетках окрашиваются в оранжево-
красный цвет, а ядра—в синий.
ПРИМЕЧАНИЕ
Вместо соли прочного красного В можно использовать
другие, устойчивые соли диазония, такие, как гранатовый
прочный, соль прочного синего В. Растворы этих диазосое-
динений не подлежат длительному хранению.
МЕТОДЫ КОНДЕНСАЦИИ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
БИОГЕННЫХ АМИНОВ НА КРИОСТАТНЫХ СРЕЗАХ ПО СПРИГГСУ, ЛЕ-
ВЕРУ, РИСУ И ГРЭХЕМУ (SPRIGGS, LEVER, REES, GRAHAM, 1966), РЕЙТЕ-
РУ (REUTTER, 1968) [ЦИТ. ПО АРНОЛЬДУ (ARNOLD, 1968)]
МЕТОДИКА
1. Свежие кусочки ткани заморозить на сухом льду или
262 4. Гистохимия отдельных класов веществ и ферментов
в изопентане (предварительное охлаждение жидким возду-
хом или жидким азотом).
2. Криостатные срезы толщиной 15—20 мкм поме-
стить на покровное стекло и высушивать несколько недель
в плотно закрытой кювете над пятиокисью фосфора при
— 20°С, лучше всего в криостате.
3. Срезы обрабатывать при + 80°С в эксикаторе пара-
формальдегидом, 2 ч. (Для установления постоянного
уровня влажности 50 г параформальдегида выдержать
' в течение недели нйд 25%-ной серной кислотой в эксикато-
ре.)
4. Заключить в парафиновое масло и исследовать с по-
мощью флуоресцентного микроскопа.
РЕЗУЛЬТАТ
Катехоламин дает флуоресценцию от зеленого до
желто-зеленого цвета (максимум спектра возбуждения—
410 нм, максимум спектра флуоресценции—480 нм). Се-
ротонин дает флуоресценцию от желтого до оранжевого
цвета (410 нм/525 нм).
КОНТРОЛИ
1. Окситирамин и норадреналин дают с параформаль-
дегидом флуоресцирующие продукты конденсации за 1 ч,
а адреналин и серотонин—за 3 ч.
2. Флуоресцирующие 3,4-дигидроизохинолины и 3,4-ди-
гидрокарболин восстанавливаются спиртовым раствором
боргидрида натрия (NaBH4) до нефлуоресцирующих
1,2,3,4-тетрагидропроизводных. Повторная обработка па-
рами параформальдегида вновь переводит эти соединения
Ч флуоресцирующую форму.
МОДИФИКАЦИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ФАЛЬКА—ХИЛЛАР-
ПА ПО ХЁКФЕЛЬТУ И ЛЬЮНГДАЛЮ (HOKFELT, LJUNGDAHL, 1972)
МЕТОДИКА
Для нефиксированной ткани:
1. Быстро извлеченную нервную ткань помещают в хо-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 263
лодный раствор Тироде без кальция (вместо СаС12 исполь-
зуется MgCl2). (См. Schulze-Graupner.)
2. Приготовление срезов ткани толщиной 20—40 мкм
с помощью вибратома. Ткань при этом заливается хо-
лодным (ниже + 5°С) раствором Тироде.
3. Перенос срезов на покровное стекло; избыток буфер-
ного раствора отсасывается фильтровальной бумагой.
4. Высушивание срезов в токе теплого воздуха (напри-
мер, с помощью фена), 15 мин, или перенос в плотно за-
крытую кювету со свежей пятиокисью фосфора.
5. Срезы помещают на ночь в эксикатор и затем при
+ 80°С обрабатывают в нем же параформальдегидом, 1 ч.
6. Заключение хранящихся в эксикаторе срезов в кси-
лол, иммерсионное масло или в флуормаунт (Е. Gurr);
флуоресцентная микроскопия.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, содержащие катехоламин, дают четкую зе-
леную флуоресценцию.
Для фиксированной ткани:
1. Наркотизированных (нембутал) крыс подвергают
перфузии холодным 40%-ным или 10%-ным формальдеги-
дом (приготовленным из параформальдегида по Пирсу)
в 0,1 М фосфатном буфере в течение 15 мин. Для получе-
ния специфической флуоресценции катехоламина требует-
ся во время перфузии держать исследуемых животных на
ледяной бане (смесь льда, воды и NaCl, примерно — 2°С).
2. Кусочки из быстро извлеченного мозга подвергают
дофиксации в холодном 4%-ном формальдегиде,
10—20 мин.
3. Приготовление срезов толщиной 10—20 мкм на виб-
ратоме для дальнейшей обработки в соответствии с пре-
дыдущей прописью, начиная с п. 3.
РЕЗУЛЬТАТ
При точном соблюдении всех пунктов данной проце-
дуры структуры, содержащие катехоламины, дают четко
локализованную зеленую флуоресценцию.
264 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ПРИМЕЧАНИЯ
В отличие от замораживающего микротома И криоста-
та вибратом позволяет получать срезы без разрывов. При
использовании ткани, фиксированной формалином, можно
на серийных срезах или даже на тех же срезах провести ре-
акцию на холинэстеразу, импрегнацию серебром по Фин-
ку—Хаймеру или иммуннофлуоресцентное исследование
в сочетании с флуоресцентным методом. Фиксация и обра-
ботка срезов при низкой температуре в значительной сте-
пени ослабляют диффузию катехоламинов.
МЕТОД КОНДЕНСАЦИИ с глиоксиловой КИСЛОТОЙ ДЛЯ ФЛУО-
РЕСЦЕНТНО-ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ
ПО БЬЁРКЛУНДУ И ДР. (BJORKLUND ЕТ AL, 1973)
МЕТОДИКА
1. Наркотизированных взрослых крыс подвергали пер-
фузии; через восходящую аорту вводили 50 мл охлажден-
ной на льду 2%-ной глиоксиловой кислоты на бикарбонат-
ном буфере Кребса—Рингера (pH буфера доводится до 7,0
с помощью NaOH) в течение 3—5 мин.
2 Кусочки быстро извлеченного мозгЙ помещают в хо-
лодный буфер.
3. Приготовление срезов толщиной 20—50 мкм на виб-
ратоме (при приготовлении срезов кусочки ткани следует
заливать бикарбонатным буфером Кребса—Рингера, pH
7,0).
4. Сразу или после 5-минутной обработки в перфу-
зионной среде с глиоксиловой кислотой, охлажденной на
льду, перенести срезы на предметное стекло.
5. Удалить избыток буфера фильтровальной бумагой.
6. Высушить срезы в токе теплого воздуха, 15 мин.
7. Поместить на ночь в эксикатор с пятиокисью фосфо-
ра под вакуумом.
8. Проведение конденсации с глиоксиловой кислотой.
Для этой цели срезы подвергают следующей обработке:
2 г глиоксиловой кислоты (высушенной над пятиокисью
фосфора в течение 24 ч) нагревают при 100°С в течение 1 ч
в закрытом сосуде, соединенном с реакционным сосудом.
После этого из реакционного сосуда откачивают ва-
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 265
куумным насосом воздух до 300 мм рт.ст.; в сосуд впу-
скают горячий, насыщенный глиоксиловой кислотой воз-
дух, а затем теплый воздух до нормального атмосферного
давления. Температура на протяжении всей реакции сос-
тавляет + 100°С.
В качестве контроля служат неперфузированные сре-
зы мозга, не подвергнутые обработке глиоксиловой кис-
лотой.
9. Заключение срезов в жидкий парафин и исследование
их под флуоресцентным микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТ
Структуры, содержащие катехоламины, дают интен-
сивную флуоресценцию.
ПРИМЕЧАНИЯ
При использовании светофильтров BG 12/44 + 47
(Schott/Zeiss)y катехоламинов отмечается голубовато-зеле-
ная флуоресценция. Клетки, содержащие индоламины,
дают варьирующую коричневато-желтую флуоресценцию.
Приготовление срезов на вибратоме не позволяет полу-
чать серийные срезы одинаковой толщины.
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НОРАДРЕНАЛИ-
НА С ПОМОЩЬЮ ХРОМАФФИННОЙ РЕАКЦИИ ПО ВУДУ И БАРНЕТТУ
(WOOD, BARRNETT, 1964)
ПРИНЦИП
См. хромаффинную реакцию (стр. 260). Гранулы
норадреналина дают при pH 4 отчетливый контраст,
тогда как пузырьки с адреналином при этом же pH имеют
довольно низкую оптическую плотность. На этом основа-
нии Вуд и Барнетт предлагают проводить реакцию при pH
4,1.
МЕТОДИКА
1. Фиксация тонких кусочков ткани 6,5%-ным глутараль-
дегидом на какодилатном буфере (pH 7,4), 2 ч.
266 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
2. Промывка в буферном растворе (0,1 М какоди-
латный буфер, pH 7,47 на протяжении ночи).
3. Отпрепарированные участки ткани, содержащие ка-
техоламины, инкубировать в течение 24 ч при + 4°С в сле-
дующем растворе: 5%-ный биохромат калия, 50 мл; 0,2 М
апетатный буфер (pH 4,1), 30 мл; сульфат натрия, 1 г.
4. Промывка в ацетатном буфере pH 4,1, 30 мин.
5. Возможна дофиксация в 1% OsO4 с сахарозой,
1—2 ч; допускается также контрастирование срезов.
6. Обезвоживание, заливка в эпоксидные смолы или
полиэфиры.
РЕЗУЛЬТАТ
Гранулы норадреналина дают отчетливый контраст.
Гранулы адреналина имеют умеренную оптическую плот-
ность и мелкозернистую структуру.
ПРИМЕЧАНИЕ
Дофиксация в OsO4 ведет к контрастированию других
компонентов клетки. При pH 6,5 выявляются‘адреналин
и норадреналин.
4.8. НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА
Топохимическое выявление внутриклеточных неорга-
нических веществ сопряжено с большими трудностями из-
за их низкой концентрации, хорошей растворимости
и большой подвижности. Определенную помощь оказы-
вает электронная микроскопия, позволяющая .наряду
с точной структурной организацией выявлять небольшие
количества веществ. На уровне световой микроскопии
с помощью метода с сульфидом серебра возможно гисто-
химическое выявление очень малых количеств веществ
благодаря образованию зерен серебра, имеющих объем
больший, чем размеры выявляемых частичек тяжелых ме-
таллов. В последние годы в локализации элементов в био-
логическом материале начинает играть все большую роль
метод рентгеновского микроанализа. ’
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 267
Гистохимическое выявление неорганических веществ
в световой микроскопии основано на следующих принци-
пах:
1) образование лаков; 2) образование хелатов; 3) обра-
зование окрашенных солей; 4) замещение одного иона
на другой с последующим выявлением.
Кроме того, существуют методы микросжигания и ра-
диоавтографии. С помощью метода озоления среза можно
получить хорошую обзорную картину распределения ми-
неральных веществ в клетках и тканях. Этот метод может
быть использован также и на ультратонких срезах.
Надежны и используются в практической работе ме-
тоды выявления железа, кальция, калия. Выявление физио-
логически важных ионов натрия и хлора сопряжено с боль-
шими трудностями. При работе с этими методами
предпочтение следует отдавать криостатным и заморо-
женным срезам, а также лиофилизированному материалу;
химическая фиксация и заливка ткани менее желательны.
В табл. 48 перечислены методы выявления неорганиче-
ских веществ, которые могут быть использованы как
в практической, так и в исследовательской работе.
4.8.1. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕ-
НИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
ВЫЯВЛЕНИЕ ЖЕЛЕЗА, КАЛЬЦИЯ И КАЛИЯ ПРИ СВЕТОВОЙ МИКРО-
СКОПИИ
а УВыявление Fe(II) по образованию турнбулевой сини ( Ur-
man, 1898; Schmeltzer)
Принцип реакции описан на стр. 271.
МЕТОДИКА
1. Фиксация в формалине, замороженные или парафи-
новые срезы.
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды. (В результате обработки срезов 10%-ным
раствором сульфида аммония в течение 1—24 ч выявляет-
ся также трехвалентное железо.)
Таблица 48
Методы выявления металлов1)
Ме- талл Реакция Результат Примечания
Ag Образование хела- та с рубеановодо- родной КИСЛОТОЙ (Gedick, Pioch) Соединение сереб- ра темно-корич- невого цвета Хорошая локали- зация
Al Образование лака с ауринтрикарбо- новой кислотой (Irwin, Gedick, Pioch) Соединение алю- миния темно- красного цвета Специфична для солей алюминия
Au Метод восстанов- ления для неор- ганического зо- лота (Christeller) Гранулы черного и темно-корич- невого цвета Выявляется исклю- чительно только неорганическое золото
Ba Родизонатный ме- тод (Waterhouse, Pearse) Черный осадок; после обработки НС1 - интенсивно Неспецифич еская реакция; диффе- ренцировка от
Красного цвета солей стронция путем обработки НС1
Be Метод с нафтохро- мовым зеленым-/5 (Denz) Щелочной солб- Соединения берил- лия яблочно-зе- леного цвета Соединения берил- В кислом растворе нафтохромового зедеиого Са вы- мывается Соединения Са
хром-азурин (Pearse) лия черного цве- та удаляются при обработке кисло* той
Ca Метод с ализари- новым красным S (Dahl, модифи- кация McGee- Russel) Метод с ядерным красным (McGee- Russel) Отложения кальция красно-коричне- вого цвета Са, светло-красно- го цвета Неорганическое железо темно- красного цвета Другие структуры розового цвета
Cu Метод с рубеано- водородной кис- лотой (Okamoto, Uzmann) Метод с диэтилди- тиокарбаматом (Waterhouse) Соединения меди черного цвета Соли меди желто- коричневого цве- та Реакция после об- работки парами концентрирован- ной соляной кис- лоты может быть проведена также на парафиновых срезах Проверенный ме- тод для тканей беспозвоночных
Продолжение табл. 48
Ме- талл Реакция Ре гулы ат Примечания
Fe (II) Fe(III) Метод турнбуле- вой сини (Tir- rnann, 1898; Schmeltzer) Метод берлинской лазури (Peris, Li- son, 1936) Соединения желе- за (II) темно-го- лубого цвета Соединения желе- за (III) темно-го- лубого цвета По методу Лилли выявляется лишь небольшая часть имеющегося в ткани железа Метод отличается высокой чувстви- тельностью
Hg Mg Ni Pb Pd Метод с дифенил- карбазидом (Brandino, Lison) Метод Краута и Дженнингса (Crout, Jennings) Метод с л-нитро- бензеназо-1-наф- толом Метод с диметил- глиоксимом (Feigl) Метод с хроматом (Fairhall) Родизонатный ме- тод (Molnar, Lillie, Gedick, Pioch) Метод с диметил- аминобензили- денрод амином (Okamoto, Mikami, Nishida) Соединения Hg фиолетового цве- та Нитрит калия-ко- бальта в форме желтоватых крис- таллов Соли магния свет- ло-синего цвета Розовый различных оттенков Соединения свинца выявляются в ви- де желтоватого хромата свинца Фон нежно-голубо- го цвета, отложе- ния свинца крас- ного цвета Соединения палла- дия красно-фио- летового цвета Специфичность ре- акции зависит от pH Реакция специфич- на, но локализа- ция может быть ошибочной Специфический ме- тод с точной ло- кализацией, но с плохой сохран- ностью окраски Желательна пред- варительная об- работка нативных или фиксирован- ных в формалине криостатных сре- зов Специфическая ре- акция с хорошей локализацией Меры для повыше- ния специфич- ности: окраши- вание при кислом pH (2,8); предва- рительная обра- ботка срезов раз- веденной H2SO4 Чувствительный метод, однако не отличается спе- цифичностью; кроме Pd реаги- руют Ag, Au, Hg и Си
270 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
Продолжение табл. 48.
Ме- талл Реакция Результат Примечания
Zn Метод с дитизоном (Mayer u. Mitarb.) Оксихинолиновый метод (Smith et Соединения цинка от красного до пурпурно-красно- го цвета Гранулы лейкоци- тов дают флуо- Хорошая локализа- ция дитизоновой реакцией возмож- на лишь на сре- зах, прикреплен- ' ных к стеклу После обработки 1%-ной уксусной
Pb,A.u, al.) ресценцию от бе- лой до светло-зе- леной кислотой флуо- ресценция исче- зает
Ag,Pt, Метод с сульфидом Перечисленные тя- Метод со сравни-
Fe,Cd, серебра для тя- желые металлы тельно низкой
X Co, желых металлов дают соединения специфичностью,.
Ni, Zn Hg (Timm) коричнево-черно- го цвета но с высокой чувствительно- стью
11 Литературу см. у Romeis, 1968; Pearse, 1972.
3. Тщательно промытые в дистиллированной воде
срезы обработать свежеприготовленным раствором, со-
стоящим из равных частей 20%-ного водного раствора гек-
сацианоферрата (III) калия и 1%-ной соляной кислоты в те-
чение 10—20 мин.
4. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.
5. При желании можно ядра докрасить ядерным проч-
ным красным.
6. Промывка в дистиллированной воде.
7. Ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол,
бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Соединения железа (II) окрашиваются в темно-синий
цвет.
ПРИМЕЧАНИЕ
Надежность этого метода можно повысить путем конт-
рольной экстракции железа. С этой целью ткань фикси-
_____4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 271
руют в 80%-ном этаноле, насыщенном H2S по Нету (Neth,
1968) в течение 24 ч при + 4°С с последующей обработкой
при комнатной температуре в следующем растворе: 1 г
1,10-фенантролинийхлорида, 100 мл дистиллированной
воды. Этот раствор сменить несколько раз до исчезнове-
ния красного окрашивания, после чего срезы промыть
в дистиллированной воде. Провести реакцию выявления
железа.
б) Выявление Fe (III) с помощью метода берлинской лазу-
ри (Peris, lison, 1936)
ПРИНЦИП
Обработка раствором гексацианоферрата (II) калия ве-
дет в присутствии Fe (Ш) к образованию нерастворимого
комплекса берлинской лазури.
МЕТОДИКА
1. Фиксация формальдегидом, заливка в парафин (замо-
роженные срезы менее пригодны).
2. Депарафинированные срезы довести до дистиллиро-
ванной воды.
3. Срезы поместить в свежеприготовленный раствор,
состоящий из равных частей 2%-ного гексацианоферрата
(II) калия и 2%-ной соляной кислоты, в течение 30—60 мин
(новый раствор использовать спустя 30 мин).
^4. Промывка в дистиллированной воде.
5. В случае необходимости окрасить ядра ядерным
прочным красным; после этого промыть дистиллирован-
ной водой.
6. Ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол,
бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Соединения железа (1П) окрашиваются в темно-синий
цвет.
272 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ПРИМЕЧАНИЯ
Следует избегать контакта срезов с приборами, содер-
жащими железо. Возможно проведение контрольной реак-
ции с экстракцией железа.
в) Выявление кальция, модификация по Мак-Ги—Расселу
(McGee—Russel)
ПРИНЦИП
Отложения кальция с ализарином S в зависимости от
pH образуют окрашенный комплекс
МЕТОДИКА
1. Фиксация в формалине или в формалин—этаноле,
заливка в парафин (кислые или металлосодержащие фик-
сирующие смеси менее пригодны).
2. Депарафинированные срезы поместить в 50%-ный
этанол.
3. Быстро промыть в дистиллированной воде.
4. Под контролем микроскопии окрашивание ализари-
новым красным S (в 2%-ный раствор алиЗаринбвого крас-
ного S добавляют слабый раствор аммиака (1:100), доводя
pH до 4,1—4,3), 30 с—5 мин.
5. Срезы без промывки подсушить фильтровальной
бумагой.
6. Поместить срезы в абсолютный ацетон на 10—20 а
7. Ацетон — ксилол (1:1), 10—20 с.
8. Ксилол, заключение в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Отложения кальция окрашиваются в оранжево-
красный цвет (двойное лучепреломление); остальные
структуры окрашиваются в розовый цвет.
ПРИМЕЧАНИЕ
При изменении pH могут окрашиваться другие неорга-
нические соединения.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 273
г) Выявление калия по Крауту и Дженнингсу (Crout,
Jennings)
ПРИНЦИП
Калий, находящийся в тканях, осаждается нитритом
кобальта.
МЕТОДИКА
1. Замораживание—высушивание, заливка в парафин.
2. Лиофилизированные парафиновые срезы толщиной
10 мкм переносят для депарафинирования непосредствен-
но в петролейный эфир (срезы к предметному стеклу не
прикреплять!).
3. Свободноплавающие срезы поместить в новую смену
петролейного эфира.
4. Срезы прикрепить к предметному стеклу (без покры-
тия стекол белком с глицерином) и высушить на воздухе,
после чего прижать их слегка фильтровальной бумагой.
5. Обработать раствором нитрита кобальта, охла-
жденным на льду, 15 мин. (Раствор -нитрита кобальта:
25 г нитрита кобальта растворить в 7 мл воды, добавить
12,5 мл уксусной кислоты; 120 г нитрита натрия раство-
рить в 180 мл дистиллированной воды; к раствору нитри-
та кобальта в уксусной кислоте добавить 210 мл раствора
нитрита натрия. Смесь оставить на воздухе 1—2 ч для уда-
ления NO2, охладить в холодильнике и отфильтровать
перед употреблением на холоду.)
*б. Просушить фильтровальной бумагой, промыть
в трех сменах дистиллированной воды, охлажденной на
льду, по 15 с (пока не перестанут отделяться желтоватые
облачка красителя).
7. Серия спиртов возрастающей концентрации, ксилол,
бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Нитрит калия — кобальта выпадает в осадок в виде
желтовато-коричневых кристаллов.
274 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
ПРИМЕЧАНИЕ
Реакция имеет достаточную специфичность, но следует
считаться с возможностью смещения продукта реакции.
д) Выявление тяжелых металлов с сульфидом серебра по
Тимму (Timm)
ПРИНЦИП
В результате обработки раствором, содержащим H2S,
происходит образование труднорастворимых аргиро-
фильных сульфидов тяжелых металлов, на которых проис-
ходит осаждение серебра из восстанавливающей среды, со-
держащей нитрат серебра.
МЕТОДИКА
Необходимые растворы:
а) Раствор гуммиарабика: 20 или 40 г неизмельченного
гуммиарабика растворить в 100 мл дистиллированной во-
ды, оставив раствор стоять 7—14 днец (100, мл).
б) 10%-ный водный раствор нитрата серебра; свежеприго-
товленный! (1 мл).
в) Восстанавливающая среда: 5 г лимонной кислоты и 2 г
гидрохинона растворить в 100 мл бидистиллированной
воды (10 мл). Растворы а, б и в (проявляющий раствор)
смешать непосредственно перед употреблением.
1. Фиксация маленьких кусочков ткани в 70%-ном этаноле,
насыщенном H2S (добавить 2 капли концентрированного
аммиака к 100 мл) 10—12 ч; заливка в парафин.
2. Срезы, толщиной 6—8 мкм, прикрепленные к пред-
метным стеклам (без приклеивающего вещества) довести
через ксилол и ряд спиртов убывающей концентрации до
дистиллированной воды.
3. Срезы, прикрепленные к предметным стеклам, поме-
щают в плоские чашки, осторожно заливают проявляю-
щей средой и проявляют в темноте при + 20°С до тех пор,
пока срезы не приобретут светло-коричневый цвет, от 20
до 60 мин, максимально 6 ч.
4. Промыть в дистиллированной воде.
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 275
5. Докраска ядер ядерным прочным красным или гемалау-
ном.
6. Промыть в дистиллированной и проточной воде.
7. Серия спиртов, ксилол, бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Тяжелые металлы (Pb, Pt, Au, Ag, Fe, Cd, Cu, Co, Ni, Zn,
Hg) окрашиваются в темно-коричневый цвет. Ядра окра-
шиваются в синий (гемалаун) или в красный (ядерный про
чный красный) цвет.
ПРИМЕЧАНИЯ
Специфичность реакции можно повысить, используя
контроли. Образование осадка в процессе окрашивания
можно ослабить путем использования бидистиллирован-
ной воды в кварцевом стекле.
е) Метод с сульфидом серебра для криостатных срезов по
Брунку и Шельду (Brunk, Skold)
МЕТОДИКА
1. Из свежей ткани вырезать тонкие кусочки (макси-
мальная толщина 2 мм).
2. Кусочки ткани обработать во влажной камере при
температуре + 20°С парами H2S, 20 мин.
3. Криостатные срезы толщиной 6—8 мкм прикрепить
на.лредметные стекла.
4. Дальнейшая обработка по стандартному методу
Тимма (п. 3, проявление срезов).
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НАТРИЯ И ХЛОРА
а) Электронно-микроскопическое выявление натрия по
Комнику (цит. по Geyer, 1973)
ПРИНЦИП
Ионы Na+ осаждаются гексаоксиантимонатом калия
276 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов
K[Sb(OH)6], с которым они дают нерастворимый осадок:
K[Sb(OH)6] + Na+ -> Na[Sb(OH)6] + К+ .
МЕТОДИКА
Фиксация очень маленьких кусочков ткани в 1% OsO4
с 2%-ным раствором K[Sb(OH)6] при постоянном встря-
хивании при +1° С, от 60 до 90 мин. Фиксирующий раст-
вор: гексаоксиантимонат калия растворить в дистиллиро-
ванной воде на водяной бане и после охлаждения добавить
OsO4. pH раствора довести 0,01 н. уксусной кислотой до
7,2—7,4.
2. Кусочки ткани без предварительной промывки про-
вести через ряд ацетонов (10, 30, 50 и 70% по 5 мин), затем
провести через 90%-ный ацетон (10 мин) и через 3 смены
абсолютного ацетона (по 10 мин). Для контрастирования
в 70%-ный ацетон добавляют 1%-ную фосфовольфрамо-
вую кислоту и 0,5%-ный уранилацетат.
3. Заливка в эпоксидные смолы или полиэфиры.
РЕЗУЛЬТАТ
Продукт осаждения—Na[Sb(OH)6] дает отчетливый
контраст.
ПРИМЕЧАНИЕ
Следует учитывать, что, помимо натрия, гексаоксиан-
тимонатом калия могут осаждаться и ионы других метал-
лов (например, Са, Mg, Ba, Zn, Fe) и некоторые амины (ги-
стамин, спермин).
б) Электронно-микроскопическое выявление хлора по Ком-
нику (цит. по Geyer, 1973)
ПРИНЦИП
Хлор осаждается ионами Ag + (ацетатом или лактатом
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов- 277
серебра) в вице нерастворимого осадка:
СН3СНОН COOAg + Cl" AgCl + СН3СНОНСОО '.
МЕТОДИКА
1. Фиксировать маленькие кусочки ткани, постоянно
помешивая (+ 1°С) в темноте или при слабом красном све-
те, 2 ч. Фиксирующая смесь: 1,5% OsO4, а также 1%-ный
лактат серебра в 0,05—0,1 М какодилат-уксусном буфере,
pH 6,4 6,6.
2. Кусочки ткани поместить в темноте или при слабом
красном свете в 10%-ный и 30%-ный ацетон по 5 мин.
3. Дифференцировать в 0,1 н. HNO3 в 50%-ном ацето-
не—2 смены по 5 мин.
4. Обезводить в 2 сменах (70%-ном и 90%-ном) ацетона
по 5 мин и в 3 сменах абсолютного ацетона по 10 мин.
5. Заливка в эпоксидные смолы и полиэфиры.
РЕЗУЛЬТАТ
Хлорид серебра выпадает в виде электроноплотного,
мелкозернистого осадка.
ПРИМЕЧАНИЕ
Возможные артефакты диффузии осложняют выявле-
ние связи между наблюдаемым осадком и истинным рас-
пределением ионов in vivo.
5. РАДИОАВТОГРАФИЯ
Радиоавтография позволяет устанавливать локализа-
цию радиоактивных веществ в клетках и тканях благодаря
действию излучения на фотографическую эмульсию. Со-
держащиеся в эмульсии кристаллы бромида серебра вы-
полняют роль микродетекторов радиоактивности.
Радиоавтография, которую в применении к исследова-
нию локализации радиоактивности в тканях называют
иногда гисторадиоавтографией, может дать ответ на сле-
дующие вопросы:
1. Где локализуется радиоактивность в данном объек-
те?
2. Сколько радиоактивного вещества содержится
в объекте? ,
3. В каких веществах находится метка?
Кроме того, радиоавтография позволяет наблюдатв
обмен веществ до уровня отдельных клеток и субкле-
точных структур и определять интенсивность их обновле-
ния. Благодаря этому радиоавтография является пре-
красным дополнением гистохимии. Особенно ценные
сведения по обменным процессам дает комбинированное
использование гистохимии и радиоавтографии.
5.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
Первые радиоавтографические исследования были про-
ведены в 1924 г. на ткани почек с естественным радиоак-
тивным элементом полонием-210. Однако свое подлинное
место радиоавтографические методы завоевали лишь с от-
крытием искусственной радиоактивности.
Различные изотопы химических элементов могут быть
стабильными и нестабильными. Распад нестабильных изо-
5. Радиоавтография 279
топов сопровождается выделением энергии в форме ра-
диоактивного излучения. Процесс радиоактивного излуче-
ния характеризуется периодом полураспада—временем,
в течение которого распадается половина всей имеющейся
массы радиоактивного изотопа. Для каждого радиоактив-
ного изотопа характерен свой период полураспада
(табл. 49). Периоды полураспада разных изотопов варьи-
руют от долей секунды до нескольких миллионов лет.
В радиоавтографии используются преимущественно изо-
топы с периодом полураспада не менее нескольких дней.
Таблица 49
Изотопы, используемые в радиоавтографии, и некоторые их важные пара-
метры (Pearse, 1972)
Изотоп Период полураспада Испускаемое излу« чение Максимальная энергия излучения, кэВ
Зн 12,3 года 0 18
14с 5568 лет 0 156
32р 14,2 дня 0 1700
35g 87,2 дня 0 157
45Са 164 дня 0 256
”Fe 45,3 дня 0.7 1561
90Сг 28 дней 0 544
1251 60 дней 7 34
131 j 8,07 дня 0.7 812
226Ra 1,62-103 лет а,7 478,459
232Th 1,39 103 лет а.7 401,395.
Для радиоавтографии пригодны радиоизотопы, испу-
скающие заряженные частицы, т. е. а-, Р- и реже у-лучи. Ис-
точниками у-лучей являются, в частности, 51Сг и 1251.
Практическое значение в радиоавтографии имеют, однако,
главным образом источники P-излучения. а-Излучение
лишь незначительно поглощается фотоэмульсией.
Р-Частицы—это электроны, выделяющиеся при пре-
вращении нейтрона в протон.
Источниками P-излучения служат 3Н, 14С и 35S. Осо-
бенно подходящим для цитологических и гистологических
исследований считается тритий (3Н). Его период полурас-
пада продолжительностью 12,5 лет позволяет проводить
протяженные во времени исследования. Правда, 34С обла-
дает в 10 раз более продолжительным периодом полурас-
280 5. Радиоавтография
пада, но преимуществом трития является чрезвычайно
низкая энергия и очень мягкое 0-излучение, которое пол-
ностью поглощается слоем эмульсии толщиной 1 мкм;
благодаря этому возможна более точная локализация ис-
точника излучения в исследуемой структуре и в 10 раз бо-
лее высокое разрешение по сравнению с 14С
(3Н—0,2 мкм; 14С—2 мкм; рис. 8). Оптимальное ра-
диоавтографическое разрешение при работе с тритием по-
зволяет прослеживать за включением соответствующих
Слабое
Сильное
Рис. 8. Образование зерен серебра в фотографической эмульсии (Chay-
ent et al.).
при более сильном излучении разрешение снижается.
соединений, меченных тритием, вплоть до субклеточного
уровня. Этот пример подчеркивает то болыпде значение,
которое энергия излучения наряду с видом излучения и пе-
риодом полураспада играет в выборе изотопов для ра-
диоавтографических исследований.
Во всех исследованиях с радиоактивным материалом не-
обходимо строго соблюдать правила радиационной за-
щиты!
5.2. ФОТОЧУВСГВИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ, ЭКСПО-
ЗИЦИЯ
5.2.1. ФОТОЧУВСГВИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ
Эмульсии, используемые в радиоавтографических ис-
следованиях, должны обладать следующими свойствами:
а) высокой чувствительностью; б) возможностью четкой
локализации; в) хорошим разрешением.
Высокая чувствительность обеспечивается значительно
более высоким по сравнению с фотографической эмуль-
сией содержанием бромида серебра. Точность локализа-
5. Радиоавтография 281
ции и разрешение зависят от размера кристаллов, диаметр
которых составляет 0,04 и 0,3 мкм. Чем меньше кри-
сталлы, тем, как правило, точнее локализация и выше раз-
решение. В световой микроскопии разрешение на радиоав-
тографах составляет 1 мкм; это означает возможность
различения двух радиоактивных частиц, удаленных друг от
друга на расстоянии 1 мкм. В электронной микроскопии
разрешение выше в 5 — 10 раз. В мелкозернистых эмуль-
сиях, используемых при микроскопической радиоавтогра-
фии, для дальнейшего повышения чувствительности увели-
чивают содержание бромида серебра. Чувствительность
эмульсии характеризуется также числом зерен серебра,
образующихся при прохождении одной частицы. Эффек-
тивность радиоавтографического метода характеризуется
величиной отношения числа зерен серебра на радиоавто-
графе к числу актов распада в препарате.
В табл. 50 представлены данные о некоторых выпу-
скаемых промышленностью эмульсиях. Из известных
эмульсий типа Ilford для радиоавтографии при световой
и электронной микроскопии наиболее пригодна Ilford L4.
В цитологии с успехом используют эмульсию ORWO Кб.
Надежные результаты дают также эмульсии Eastman-Ko-
dak и Agfa-Gevaert.
5.2.2. ЭКСПОЗИЦИЯ
В процессе экспозиции излучение должно воздейство-
вать на эмульсию достаточно долго для получения скры-
того изображения. Воздействие на фотоэмульсию а- или Р-
чаётиц сразу же ведет к почернению, возрастающему
в линейной зависимости от времени. Все кристаллы бро-
мида серебра, с которыми сталкиваются частицы, восста-
навливаются до мелких черных зерен (металлическое
серебро).
Экспозиция, как правило, проводится всегда при одина-
ковых условиях: а) при постоянной температуре ( + 4° С);
б) при минимальной влажности в присутствии гигроскопи-
ческих веществ, например хлорида кальция; в) в абсолют-
ной темноте.
Для хранения экспонируемых препаратов используют,
как правило, хорошо моющиеся, черные небольшие кон-
11-235
282 5. Радиоавтография
Таблица 50
Типы эмульсий, наиболее часто используемых в радиоавтографии, и
их свойства
Тип эмульсии Диаметр крис- талла, мкм Примечания
Ilford L4 0,12 Пригодна для радиоавтографии при световой и электронной микроско- пии, особенно для Р-частиц. Эту эмульсию следует перед употребле- нием разводить водой
ORWO Кб 0,16 Радиоавтография при световой и электронной микроскопии. Эмуль- сию всегда перед употоеблеиием следует разбавлять! (Осторожно! Взрывоопасна!)
Gevaert NUC 307 0,07 Радиоавтография при электронной микроскопии, особенно для выяв- ления бедных энергией Р-частиц (3Н), но, кроме того, и для 14С И 35S
Eastman NTB 1 Kodak 0,29 Радиоавтография при световой мик- роскопии; хранится в виде гелей и пленок; преимущественно для а- и р-частиц низкой энергии (3Н)
Kodak AR 10 0,20 В виде пленок (при световой микрос- копии); область применения: а- Р-частицы, излучение Аугера; 3Н- и 1 ^-предшественники. Разреше- ние в среднем 2,5 мкм
НИКФИ тип M (НИИХИМФОТО Ленинград) . 0,14 Сходный с Ilford L4
тейнеры или ящики из пластмассы. Их хранят в холодиль-
нике в специальной проявочной комнате.
Устанавливаемое экспериментальным путем время экс-
позиции зависит от следующих факторов: а) от вида изото-
па, б) его дозы, в) типа эмульсии и г) задач опыта. При не-
обходимости подсчета зерен серебра следует прекратить
экспозицию в тот момент, когда зерна еще четко разли-
чимы отдельно друг от друга.
При установлении оптимального времени экспозиции
пробные препараты помещают в проявочный бокс и под-
вергают их последовательному пробному проявлению че-
5. Радиоавтография 283
рез определенные промежутки времени. Зависимость
между временем экспозиции и плотностью зерен серебра
на единицу площади иллюстрирует графически рис. 9
(срезы печени мыши, 14С-аденин).
Рис. 9. Связь между продолжительностью экспозиции и плотностью
зерен серебра на единицу площади в меченых срезах печени мыши.
5.3. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАВТОГРАФОВ
Получение радиоавтографов в принципе состоит из
следующих 6 этапов:
1. Введение метки (например, введение радиоактивных
веществ животным, инкубация срезов в радиоактивных
средах, нанесение радиоактивных веществ на объект).
2. Подготовка меченого объекта (подбор времени воз-
действия радиоактивным изотопом, взятие пробы и даль-
нейшая обработка).
3. Нанесение фоточувствительного материала на ме-
чейЬш объект.
4. Экспозиция (выдерживание меченого материала
в контакте с фотоматериалом в светонепроницаемых
контейнерах).
5. Фотохимическое проявление.
6. Оценка радиоавтографов.
5.4. РАДИОАВТОГРАФИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ОБЪЕКТОВ
Для локализации радиоактивности используются сле-
дующие приемы:
и*
284 5. Радиоавтография
1. Макрорадиоавтография (например, радиоавтогра-
фия целого животного).
2. Микрорадиоавтография (радиоавтография микро-
скопических объектов).
5.4.1. РАДИОАВТОГРАФИЯ ЦЕЛОГО ЖИВОТНОГО
Этот прием используется главным образом при работе
с мелкими экспериментальными животными, например
мышами, крысами и морскими свинками, поскольку рабо-
та с более крупными животными связана с определенными
техническими трудностями и чревата большим числом
ошибок. Для приготовления срезов (толщиной около
20 мкм) требуется микротом с тяжелой станиной, который
для работы при постоянной низкой температуре встраи-
вается в криостат.
Быстрое замораживание экспериментального животно-
го предотвращает смещение введенных радиоактивных ве-
ществ. Хорошо зарекомендовало себя на практике замора-
живание в смеси изопентана с жидким азотом при
температуре — 150°С. Приготовленные срезы подвергают-
ся дальнейшей обработке контактным» методом.
В основном радиоавтография на целых животных ис-
пользуется при изучении распределения в организме жи-
вотного фармацевтических препаратов и их радиоак-
тивных метаболитов.
5.4.2. МИКРОРАДИОАВТОГРАФИЯ
Для локализации радиоактивности в микроскопических
объектах используются следующие методы:
а) Контактный метод.
б) Метод монтированных радиоавтографов.
в) Метод съемной пленки.
г) Методы с жидкими эмульсиями («методы погруже-
ния»),
д) Методы покрытия.
Эти методы можно использовать в исследованиях, про-
водимых на мельчайших организмах, таких, как бактерии
и одноклеточные, а также на клетках и тканях.
При планировании эксперимента с применением ра-
5. Радиоавтография 285
диоавгографии в каждом случае следует предварительно
выяснить, какой из методов наиболее пригоден для реше-
ния поставленного вопроса. В настоящее время наиболее
часто используют метод погружения и метод съемной
пленки. Для лабораторий, в которых радиоавтографиче-
ские исследования проводятся лишь иногда, рекомендует-
ся использование метода съемной пленки. Использование
жидких эмульсий имеет значение в опытах, где требуется
большое разрешение и при постановке больших серий
экспериментов.
5.4.2.1. ОСНОВЫ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ ТКАНИ
Качество радиоавтографа в значительной мере зависит
от качества среза. В частности, надо обращать внимание на
следующее:
а) Фиксация, выбор которой всегда определяется усло-
виями эксперимента, ие должна оказывать химического
влияния на радиоавтографическую пленку или эмульсию.
Следует поэтому избегать использования фиксирующих
смесей, содержащих ртуть и свинец. К надежным фикси-
рующим веществам, например, относятся: метанол, Кар-
нуа, Буэн, кальций—формол по Бейкеру.
Потери вещества при промывании в процессе обработ-
ки ткани можно предотвратить, используя вместо химиче-
ской фиксации замораживание — высушивание, И наконец,
при работе с нативными криостатными срезами можно из-
бежать вымывания метки. Наиболее подходящими следует
считать криостатные срезы, которые фиксируют для луч-
шей сохранности структур по окончании экспозиции не-
посредственно перед проявлением.
б) Для нанесения срезов ткани следует использовать
полностью обезжиренные и чистые предметные стекла
(обработка подогретой смесью бихромата калия с серной
кислотой с последующим длительным промыванием
в воде).
в) Парафиновые срезы необходимо тщательно депара-
финировать (2 смены ксилола, ряд спиртов возрастающей
концентрации; растворы для депарафинирования следует
сменять после двукратного употребления!). Остатки па-
рафина в срезе ткани препятствуют прикреплению эмуль-
сии или съемной пленки.
286 5. Радиоавтография
5.4.2.2. АРТЕФАКТЫ ПРИ РАДИОАВТОГРАФИИ
Исследователь сталкивается главным образом со сле-
дующими артефактами:
а) Слишком сильное диффузное почернение («фон»).
Причины: негодная эмульсия, проникновение света в про-
цессе экспозиции, слишком высокая температура проявле-
ния, неправильный выбор проявителя или фиксатора, хи-
мическое воздействие на фотоматериал, исходящее от
среза или предметного стекла.
б) Пятнистое почернение фона, не связанное с выя-
вляемыми тканевыми структурами. Причины: отпечатки
пальцев, пылинки, неполное депарафинирование срезов,
механическое воздействие на эмульсию в процессе приго-
товления радиоавтографов или во время экспозиции.
в) Отслойка эмульсии или образование пузырьков под
ней. Причины: неполное обезжиривание или депарафини-
рование предметного стекла, слишком большие различия
в температуре сред, экспозиции и проявления.
г) Побурение или исчезновение зерен серебра на го-
товых радиоавтографах. Причины: слишком малое время
экспозиции или слишком короткая промывка,, воздействие
веществ на фотоматериалы при окрашивании и дифферен-
цировке радиоавтографов.
д) «Выцветание»: под этим понимают побледнение
скрытого изображения, в частности при слишком высокой
температуре и высокой влажности в процессе экспозиции.
В результате образуется меньше зерен серебра, чем можно
было ожидать. Это явление особо неблагоприятно сказы-
вается при длительной экспозиции.
5.4.2.3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ РАДИОАВТОГРАФИЯ
Задачей количественной радиоавтографии является
оценка содержания метки в клетках и тканях. Обычно для
этих целей используются следующие приемы:
а) Подсчет зерен серебра на единицу площади эмуль-
сии.
б) Подсчет следов (треков) на единицу площади
эмульсии.
в) Подсчет меченых единиц (например, ядер).
5. Радиоавтография 287
г) Фотометрическая денситометрия.
При использовании радиоактивных изотопов, испу-
скающих 0-частицы, подсчет зерен серебра осуществляется
простейшим и наиболее надежным способом. Он позво-
ляет количественно оценить низкие концентрации ра-
диоактивных изотопов в небольших участках ткани. По-
скольку плотность зерен серебра (число зерен на единицу
площади) зависит от радиоактивности, то по числу зерен
можно сделать вывод о содержании метки в данном
участке.
При подсчете зерен серебра следует учитывать гра-
нулы, имеющиеся в эмульсии без обработки препарата.
С этой целью в контрольных препаратах подсчитывают
число этих гранул на единицу площади и это число (так на-
зываемый «фон») вычитают из общего числа зерен на
радиоавтографе.
В зависимости от особенностей препарата микрофото-
метрирование радиоавтографов проводят, измеряя эф-
фективность отражения или поглощения падающего
света.
Для фотометрической оценки используются выпу-
скаемые промышленностью микрофотометры. Стандар-
тизация фотометрических измерений осуществляется
с помощью электронной аппаратуры.
При подсчете треков учитывают испускаемые препара-
том а-частицы, которые образуют в слое фотоэмульсии
почти линейные, практически непрерывные треки. Этот
прием позволяет выявлять различия между почернением
фотоматериала, вызываемым радиоактивностью и други-
ми’факторами. Этим методом можно исследовать также
препараты с низкой радиоактивностью.
Фотометрическая денситометрия основана на выявле-
нии общей активности на единицу площади с учетом ха-
рактера распределения зерен серебра.
Изящной формой количественной радиоавтографии
является количественное выявление ферментов с помощью
меченых ингибиторов, основанное в первую очередь на
стехиометрическом соотношении между числом молекул
фермента и молекул меченого ингибитора. Убедительные
результаты были получены с использованием 3Н-ДФФ
(динитрофторфосфат, меченный тритием) для количе-
288 5. Радиоавтография
ственного выявления ацетилхолинэстеразы в концевых мо-
торных пластинках.
В настоящее время количественная радиоавтография
все чаще используется для оценки электронно-микроско-
пических препаратов. Хорошие результаты были полу-
чены, например, в работах по синтезу белка в митохон-
дриях и по распределению ацетилхолинэстеразы
в моторных концевых пластинках.
5.4.2.4. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ РАДИОАВТОГРА-
ФИЯ
Для этого метода требуется специальная эмульсия
с очень высоким содержанием галогенида серебра с Не-
большими зернами одинакового размера. Для электронно-
микроскопической радиоавтографии пригодна тонкая фо-
тографическая эмульсия толщиной в один слой зерен
с гомогенно распределенными и плотно упакованными
кристаллами; такие слои можно наносить на ультратонкие
срезы методом погружения или методом покрытия. На-
дежные результаты дает эмульсия Ilford L4.
Из изотопов чаще всего использую^ те, которые харак-
теризуются низкой энергией излучения, например тритий;
доза должна быть значительно выше (примерно в 10 раз),
чем при световой микроскопии. Но и в таких случаях сле-
дует считаться со значительным рассеянием испускаемых
частиц. Надежная локализация меченых веществ возможна
с точностью до 0,1 мкм, иногда и с более высокой.
В цитохимических исследованиях все большее значение
приобретает метод дополнительной импрегнации тонких
срезов радиоактивными веществами. Это позволяет изби-
рательно метить отдельные компоненты клетки. В иссле-
довании водорастворимых радиоактивных веществ поми-
мо методов замораживания—высушивания и замещения
в замороженном состоянии можно использовать метод
криоультрамикротомии.
Нанесенная эмульсия высушивается в токе воздуха, ос-
вобожденного от пыли. Экспозиция проводится в светоне-
проницаемых кассетах в присутствии осушающего веще-
ства (хлорид кальция, пятиокись фосфора) при температу-
ре холодильника, причем время экспозиции для тонких
5. Радиоавтография 289
срезов ткани должно быть значительно большим, чем для
обычных радиоавтографов.
В случае успешно проведенной процедуры зерна сереб-
ра на радиоавтографах выглядят под электронным микро-
скопом как рыхлые мотки шерсти. Более подробные техни-
ческие сведения читатель может найти у Гайера (Geyer,
1973).
5.4.3. МЕТОД СЪЕМНОЙ ПЛЕНКИ И МЕТОД ПОГРУ-
ЖЕНИЯ
5.43.1. МЕТОД СЪЕМНОЙ ПЛЕНКИ
Практическое значение и широкие возможности приме-
нения данного метода основаны главным образом на а)
применении обычных фотоматериалов (фотопленки), б)
сравнительной простоте выполнения.
К этому следует добавить высокую чувствительность
фотоматериала и высокое разрешение.
Пелк (Pelc) следующим образом описывает свой ва-
риант применения съемной пленки (цит. по Pearse, 1972).
МЕТОДИКА
1а) Фиксация небольших кусочков ткани в кальций—
—формоле, этанол-уксусной кислоте (3:1) или Карнуа,
обычная заливка в парафин. Мягкая заливка в парафин по-
сле фиксации в этанол-уксусной кислоте или Карнуа:
15 мин бензол (комнатная температура), 15 мин теплый
бензол (+ 56°С), 4 смены жидкого парафина (+ 56°С) по
30 мин, затем заливка в парафин (+60° С). Приготовление
парафиновых срезов (1 мкм или тоньше) и расправление
срезов на теплой бане.
16) Криостатные срезы нефиксированной ткани с пост-
фиксацией в этанол-уксусной кислоте в течение 15 мин.
Для водорастворимого материала использовать нефикси-
рованные криостатные срезы.
2. Прикрепление срезов на желатинизированные пред-
метные стекла (предметные стекла, тщательно вымытые
в смеси биохромата калия с серной кислотой, для желати-
низации помещают в следующий свежеприготовленный
290 5. Радиоавтография
раствор: 5 г желатины, 0,5 г хромовых квасцов, 1000 мл
дистиллированной воды); в заключение просушить на
воздухе.
3. Наложение пленки (п. 3—6 в темноте!): для этой цели
пленка нарезается острым скальпелем или бритвой на по-
лоски необходимой величины, снимается с подложки
(съемная пленка!) и затем при комнатной температуре
( + 20° С) помещается на поверхность дистиллированной
воды ( + 20°С) эмульсией вниз, от 3 до 5 мин (рис. 10).
Плавающие кусочки пленки подхватывают предметным
или покровным стеклом, на которое нанесен депарафини-
рованный срез ткани, содержащей радиоактивную метку.
Рис. 10. Метод съемной пленки (Harbers).
А. Отделение пленки от стеклянной пластинки. Б. Расправление пленки по поверхности воды
и нанесение на предметное стекло, на котором находится ткань (остальные объяснения в
тексте).
В результате светочувствительная эмульсия вступает
в контакт с препаратом. Выступающие края пленки
обертывают вокруг предметного стекла (рис. 10).
4. Высушивание покрытого пленкой препарата на воз-
5. Радиоавтография 291
духе (требуется повышенная влажность воздуха, около
60—70%), примерно 2 ч.
5. Экспонирование пленки в обычных имеющихся
в продаже кассетах для засветки или в простых, собствен-
ного приготовления, светонепроницаемых картонных ко-
робках; обцчно при температуре от + 14 до + 16°С, а
в случае более длительной экспозиции желательно при +
+ 442.
Экспозиция обычно длится от нескольких дней до не-
скольких недель в зависимости от трех факторов: характе-
ра излучения используемого радиоактивного изотопа,
удельной активности радиоактивных веществ в опыте
и чувствительности эмульсии.
6. Проявление препарата в стеклянных кюветах или
в проявочных сосудах при постоянной температуре
(17—18°С) с . использованием нормальных проявляющих,
промывочных и фиксирующих сред. Продолжительность
проявления—30 мин; промывка—30 с; фиксация—4
мин при постоянном перемешивании.
В качестве проявителя рекомендуется: 2,2 г мономе-
тил-п-аминофенолсульфата (элон); 72 г безводного суль-
фита натрия; 8 г гидрохинона; 48 г безводного карбоната
натрия; 4 г бромида калия; 1000 мл дистиллированной
воды. Перед употреблением фильтровать!
7. Тщательная промывка в проточной воде,
30—60 мин.
8. Заключение в глицерин—желатину для фазово-кон-
трастной микроскопии или окрашивание препаратов гема-
лауном—эозином или метиловым зеленым — пиронином.
’* 9. При окрашивании гемалауном—эозином дифферен-
цировать в 1%-ном растворе НС1 до тех пор, пока не
начнут ясно вырисовываться ядра клеток, примерно
30—60 с.
10. Высушивание препаратов на воздухе (без пыли) при
горизонтальном положении слоя пленки, 1 ч.
РЕЗУЛЬТАТ
Участки почернения (или точки) в фотоэмульсии свиде-
тельствуют о наличии радиоактивности.
292 5. Радиоавтография
ПРИМЕЧАНИЯ
После п. 10 препараты можно обезводить в ряду спир-
тов возрастающей концентрации и заключить в ней-
тральный бальзам через ксилол. Окрашивание срезов
можно также проводить еще до покрытия их слоем пленки.
Для этого особенно рекомендуется реакция Фёлы ена, по-
скольку фотографическая фиксация (и. 6) влияет на нее
лишь незначительно.
Кроме упомянутых выше преимуществ метода съем-
ной плетки, следует отметить постоянную толщину слоя
эмульсии, наносимой в фабричных условиях, что обеспечи-
вает воспроизводимость как в качественных, так и в коли-
чественных исследованиях. Этот фактор имеет особое зна-
чение при работе с изотопами, характеризующимися
высокой энергией излучения.
Недостаток метода—невозможность его использова-
ния для электронно-микроскопической радиоавтографии,
а также ограниченные возможности применения в двух-
слойной радиоавтографии. Кроме того, слой желатины не-
сколько снижает резкость изображения. Особенно это
сказывается при исследовании препарата в темном поле
при фотометрии (эффект рассеяния свбта в ’окрашенной
желатине).
5.4.3.2. МЕТОД ПОГРУЖЕНИЯ
Метод погружения наряду с методом съемной пленки
относится к наиболее часто применяемым в радиоавтогра-
фий. Эмульсий поставляются в форме геля и состоят из же-
латиновой основы с галогенидом серебра. Их можно нано-
сить на препарат в виде очень тонкого слоя; в отличие от
съемной пленки они не прокрашиваются вместе с препара-
том. В преобладающем числе работ с использованием ра-
диоавтографии в световой микроскопии применялась
эмульсия Ilford L4 и К2. Хорошие результаты дает также
эмульсия ORWO Кб.
Успех метода погружения зависит от целого ряда мето-
дических предпосылок, которые необходимо учитывать,
чтобы избежать ошибок. Важно, особенно при использова-
нии источников с более жестким излучением, надлежащим
5. Радиоавтография 293
образом разводить поставляемые эмульсии. Для световой
микроскопии рекомендуется разведение эмульсии Ilford L4,
К2 или ORWO Кб в соотношении примерно 1:1 при тем-
пературе + 40°С. Для тщательного перемешивания разве-
денных эмульсий используют вращающиеся мешалки.
Основные этапы метода погружения показаны на
рис. 11. Все описанные операции следует проводить при
красном свете с защитным фильтром, например ORWO
№ 107, с лампой мощностью 15 Вт.
Рис. 11. Основные этапы метода погружения (Junqueira et. al„ 1975).
294 5. Радиоавтография
кмлааер (Amlacher, 1974) дает следующее описание ме-
тода погружения.
МЕТОДИКА
1. Выдерживание эмульсии в темной камере до вырав-
нивания температур (18—20° С).
2. Взятие эмульсии из сосуда, в котором она постав-
лена фирмой. Эмульсии типа Ilford поставляются в виде
отдельных навесок, помещенных в удобные для работы ко-
ричневые широкогорлые флаконы с навинчивающейся
крышкой. Взятие эмульсии из термостатированного кон-
тейнера ORWO следует проводить, как этого требует тех-
ника безопасности, в очках и в маске для защиты дыха-
тельных путей. Эмульсии типа ORWO, поставляемые
в виде грубых комков, следует перед употреблением раз-
мельчить стеклянной палочкой внутри сосуда. Эмульсию
берут из сосуда стеклянным шпателем или стеклянной
палочкой.
3. Подготовка эмульсии к использованию.
а) Кусочки эмульсии помещают в стеклянный стакан
емкостью 50 мл (высота 6 см, диаметр 3—5 см), заполняя
его до половины.
б) Стакан с эмульсией помещают в металлический па-
трон следующих размеров: высота 8 см, внешний диаметр
7 см, внутренний диаметр 4 см, глубина 4 см. Толщина
стенки соответственно составляет 1,5 см.
в) Стеклянный стакан в металлическом патроне поме-
щают на плиту с регулируемой температурой ( + 40°С).
Для контроля за температурой на эту же плиту помещает-
ся заполненный дистиллированной водой стеклянный ста-
кан большего размера с помещенным в него термометром.
Нагревание эмульсии можно также проводить на водяной
бане.
г) Как только эмульсия размягчится, проверяют, напол-
нен ли стакан до 25 мл (первая отметка); если нет, то добав-
ляют эмульсию.
д) В стакан доливают до 50 мл (вторая отметка)
2%-ный раствор глицерина на дистиллированной воде, на-
гретый до +40°С.
е) Металлический стакан с эмульсией снимают с плиты
5. Радиоавтография 295
и разведенную эмульсию перемешивают на механической
мешалке примерно 1 мин. После этого эмульсию оста-
вляют на 5 мин для выхода из нее всех пузырьков воздуха.
В эмульсию медленно и равномерно опускают чистое
предметное стекло без среза. Вынув его, удостоверяются,
действительно ли эмульсия перемешана равномерно и не
содержит ли пузырьков воздуха.
ж) Для освобождения от пузырьков воздуха можно, вы-
нув стеклянный стакан из металлического патрона, пере-
лить эмульсию через воронку с мелкой капроновой сеткой
в предварительно нагретый стакан.
4. Перед нанесением эмульсии препараты депарафини-
руют, доводят до воды и высушивают. Предметные сте-
кла, не покрытые слоем хромовых квасцов с желатиной,
необходимо перед нанесением на них объекта обработать
согласно п. 2 (см. стр. 289). Высушенные препараты сле-
дует хранить в условиях, не допускающих попадания пыли.
Для нанесения на них эмульсии препараты предварительно
нагревают до +40°С.
5. Нагретые предметные стекла с помощью зажима
медленно погружают в эмульсию (лучше по одному)
и медленно извлекают. Стекающую эмульсию отсасывают
фильтровальной бумагой; стекла высушивают в верти-
кальном положении на воздухе в полной темноте не менее
2 ч. Предварительно можно стереть эмульсию с нижней
поверхности предметного стекла, а затем поместить его
для застывания на охлажденную плиту (10 мин).
6. Экспозиция, проявление при + 20°С, промывка в во-
де, при необходимости докраска; высушивание на воздухе
(без пыли), заключение в нейтральный бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ
Радиоактивность регистрируется в фотоэмульсии в ви-
де участков почернения и отдельных точек.
ПРИМЕЧАНИЯ
Результаты в значительной мере зависят от качества
слоя нанесенной эмульсии. Под влиянием температуры
и влажности воздуха возможны неконтролируемые измене-
296 5. Радиоавтография.
ния толщины слоя в процессе высушивания (п. 5). При
слишком быстром высушивании возможны так назы-
ваемые артефакты механического сжатия. Однородные
слои эмульсии с равномерным распределением зерен гало-
генида серебра получают при высушивании в термостате
при + 28с (Leblond et al., 1963) или при + 40°С и относи-
тельной влажности воздуха 60—80% (Amlacher, 1974).
5.5. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИОАВТОГРАФИИ
В настоящее время радиоавтография широко исполь-
зуется в различных исследованиях, где необходимо дать
Истинную оценку меченых функциональных групп; этот
метод можно считать наиболее важным. Многие исследо-
вания, проводимые с помощью радиоавтографии, напра-
влены на изучение интенсивности белкового синтеза с ис-
пользованием меченых предшественников белка и нуклеи-
новых кислот. При проведении эксперимента с учетом
временных интервалов можно определять скорость об-
менных процессов. Радиоавтография позволяет устано-
вить локализацию и провести анализ процессов обмена
углеводов, липидов, белков и нуклеиновых кислот. Спе-
циальные исследования позволяют, например, определять
локализацию и продолжительность синтеза ДНК в клеточ-
номядреи в митохондриях, выявлять сульфатирование гли-
копротеидов в аппарате Гольджи в бокаловидных клетках
и фибробластах. Широкое привлечение радиоавтографии
к световой и электронной микроскопии создает условия
для решения актуальных проблем клеточной дифференци-
ровки.
6. ИММУНОГИСТОХИМИЯ
Этот бурно развивающийся раздел гистохимии ис-
пользует способность организма к образованию специ-
фических антител против чужеродного материала (анти-
генов). Антиген и антитело взаимодействуют друг с
другом с высокой специфичностью. Антигены, антитела,
а также комплексы антиген — антитело не видны под
микроскопом. Можно, однако, получить конъюгат анти-
тел с флуоресцентным красителем, не вызывая при этом
ослабления сродства антител к антигену. При нане-
сении такого конъюгата на срез ткани происходит спе-
цифическая реакция антиген —антитело, которую легко
увидеть благодаря характерной флуоресценции в ульт-
рафиолетовом свете при наблюдении в флуоресцентном
микроскопе. На этом принципе основан метод флуо-
ресцирующих антител, позволяющий локализовать спе-
цифические реакции антиген — антитело.
Метод флуоресцирующих антител складывается из сле-
дующих этапов (Barka, Anderson, 1964):
1. Приготовление специфической антисыворотки.
%. Приготовление и очистка у-глобулиновой фракции,
или фракции специфических антител.
3. Конъюгация антител с подходящим флуоресцентным
красителем (например, с изотиоцианатом флуоресцеина,
родамином В, дансилом).
4. Очистка конъюгатов.
5. Подготовка срезов (можно использовать крио-
статные срезы, фиксированные в холодном ацетоне или
этаноле, замороженные срезы, фиксированные в формали-
не, срезы материала, фиксированного замораживанием—
высушиванием, замещением в замороженном состоянии
или после фиксации на холоду и парафиновой заливки).
298 6. Иммуногистохимия
6. Реакция меченых антител со срезом.
7. Промывка обработанного среза.
8. Исследование с помощью флуоресцентного микро-
скопа.
Из используемых красителей (флуорохромов) наиболее
интенсивной флуоресценцией и стабильностью отличается
изотиоцианат флуоресцеина. Дансил быстрее и легче
связывается с белками. Использование диахромов для дан-
ного метода еще требует доработки. Высокая стабиль-
ность конъюгатов обеспечивается связыванием красителей
с белками за счет главных валентностей.
Отдельные этапы, особенно п. 1—4, должны прово-
диться при строгом контроле. Специфичность реакции до-
стигается при соблюдении следующих условий:
а) Выявляемый белок должен обладать антигенностью
и иммуногенностью и иметь высокую степень иммуноло-
гической чистоты.
б) В качестве антигена нельзя использовать гетероген-
ную смесь белков, поскольку в этом случае на срезе можно
получить смешанное окрашивание.
в) Антигенный характер выявляемого белка не должен
изменяться в процессе обработки. г
г) Флуорохромы, используемые для конъюгации, не
должны изменять свойств антител (например, их способно-
сти к преципитации).
При применении метода иммунофлуоресценции ре-
зультат должен быть подтвержден контрольной пробой на
специфичность. Сравнительно надежна в этом отношении
реакция торможения: флуоресцентное окрашивание по-
давляется после предварительной обработки среза не-
конъюгированной специфической антисывороткой; обра-
ботка неиммунной сывороткой не приводит к торможе-
нию.
Метод предполагает наличие определенных иммуноло-
гических навыков. При использовании иммуногистохими-
ческих методов гистохимику рекомендуется обращаться за
помощью к иммунологам, поскольку иммуногистохими-
ческие методы относятся к наиболее сложным.
При использовании для иммунизации неочищенного
антигена в антисыворотке образуются дополнительные
лишние антитела иной специфичности, которые симули-
6. Иммуногистохимия 299
руют высокий титр специфических антител и искажают ре-
акцию выявления антигена.
6.1. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА
АНТИГЕН-АНТИТЕЛО С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕС-
ЦЕНТНОГО МИКРОСКОПА
6.1.1. ПРЯМАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ АНТИГЕНА
Этот сравнительно простой метод состоит в нанесении
меченых антител непосредственно на срез. При этом про-
исходит специфическое связывание с антигеном. После от-
мывания антител, не вступивших в реакцию, препа-
рат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа
(рис. 12,А).
Рис. 12. Прямая (Л) и непрямая (Б) локализация антигена (по схеме
Junqueira et al., 1975).
Объяснения в тексте.
6.1.2. ПРЯМАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ АНТИТЕЛ
Этот метод сводится к локализации антител путем пря-
мого связывания с флуоресцирующим антигеном.
6.1.3. «СЭНДВИЧ»-МЕТОД
Серологически активные слои используют при непря-
мом выявлении антител и антигенов; Решающее преиму-
300 6. Иммуногистохимия
щество этого метода заключается в повышении чувстви-
тельности реакции и в более интенсивной флуоресценции.
С помощью непрямого метода можно выявлять мини-
мальные количества антигенов, поскольку в данном мето-
де в отличие от прямого каждое антитело способно связы-
вать несколько молекул флуоресцирующего анти-у-гло-
булина (рис. 12,Б).
При непрямом выявлении антител клетка, содержащая
антитела, связывает антигены, которые в свою очередь
вновь связывают антитела.
Для непрямого выявления антигена необходимы две
различные антисыворотки—одна немеченая и одна ме-
ченая. Немеченые антитела сначала связываются с антиге-
ном. На втором этапе связанные антитела выявляются
с помощью меченого анти-у-глобулина (рис. 12,Б).
6.1.4. МЕТОДЫ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ С ИС-
ПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕМЕНТА
Эти методы представляют собой дальнейшее развитие
«сэндвич»-метода. Создав условия для связывания компле-
мента с комплексом антиген—антитело? выявляют затем
Рис. 13. Схема метода с использованием комплемента для непрямого
выявления антигенов.
А. по Гольдвассеру и Шепарду. Б. По Саччи и corp. Антиген антитело (хххх); комплемент
(------); антикомплемеят (+ + + +). Стрелка—метка флуоресцентным красителем.
этот комплемент с помощью соответствующих антител,
меченных флуоресцентным красителем. Для выявления ан-
тигенов в клетке сначала создают условия для взаимодей-
ствия антител с комплементом, а затем комплемент, свя-
6. Иммуногистохимия 301
занный с комплексом антиген — антитело, выявляют
с помощью антикомплемента с флуоресцентной меткой
(рис. 13,Л).
6.2. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ИММУ-
НОГИСТОХИМИЯ
Основной предпосылкой является маркирование анти-
тела с образованием продукта реакции, обладающего вы-
сокой электронной плотностью. Для этой цели исполь-
зуют метки, дающие контраст, а именно ферритин, мелкие
вирусы и тяжелые металлы—ртуть и уран. Кроме того,
в качестве метки можно использовать ферменты.
6.2.1. МАРКИРОВАНИЕ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ
И ФЕРРИТИНОМ
Маркирование антител железосодержащим белком,
ферритином, проводится в два этапа (рис. 14). Образую-
щийся на первом этапе комплекс диизоцианатферритин,
связывается на последующем этапе с антителом. Из со-
единений диизоцианата, имеющих две функциональные
Ядамямог fy/puma»
Рис. 14. Три различных метода идентификации специфических белков
при помощи иммуноцитохимии (Junqueira et al., 1975).
А. Антитела метят флуоресцентным красителем после вза»*юдействия с антетеном исследу-
ют при помов» ф^оресцеитиого микроскопа, Б. Аятатеяа метят пероксидазой, после рек*-
цп актетен—антитело приводится гистохимическое выявление пероксидазы; конечный продукт
гистохимической ре&кщп исследуют при помои» светового илк электронного микроскопа.
В. Антитело метят с ферритином, коиодый Продукт реакхдея азпцгек—антитело исследуют
при помощи светового микроскопа.
302 6. Иммуногистохимия
группы (л<-ксилолдиизоцианат, толуол-2,4-диизоцианат),
толуол-2,4-диизоцианат образует исключительно кова-
лентные связи. Поэтому он является более пригодным, чем
.и-ксилолдиизоцианат не обладающий подобными свой-
ствами. Кроме того, конъюгацию антитела с ферритином
можно проводить при участии дисульфонат-п,и-дифтор-
м,м -динитрофенилсульфона, а также глутаральдегида.
Маркирование соединениями ртути, которое может осу-
ществляться опосредованно через диазотирование и соче-
тание, ведет к слабой реакции, локализацию которой не
всегда легко установить. К тому же возможно неспецифи-
ческое окрашивание за счет взаимодействия ртути, напри-
мер, с SH-группами.
Хорошей меткой могут служить ионы уранила, обеспе-
чивающие контрастирование антител на месте их истин-
ной локализации. Успешное введение метки, осуществляе-
мое в три этапа, зависит от присутствия соответствующего
антигена, предотвращающего нежелательное воздействие
на места связывания антител.
6.2.2. МАРКИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОМ
Для маркирования антител можно ист/ользовать целый
ряд гидролитических и окислительных ферментов. Очень
хорошие результаты дает маркирование пероксидазой хре-
на (рис. 14,Б).
После реакции антиген — антитело локализацию анти-
гена устанавливают по активности связанного фермента.
Использование пероксидазы в качестве ферментной метки
имеет два решающих преимущества: 1) фермент выпу-
скается промышленностью в сравнительно чистом виде; 2)
для его выявления разработаны надежные гистохимиче-
ские методы на световом и электронно-микроскопическом
уровнях. Успех реакции определяется высокой удельной
активностью антитела и чистотой ферментного препарата.
Для конъюгации антител с ферментом используют различ-
ные реагенты. Помимо функционального реагента—п, п'-
дифтор-л/^м'-динитродифенилсульфона, который не оказы-
вает существенного воздействия ни на ферментативную, ни
на иммунологическую активность, важное значение, по-
видимому, имеет также глутаральдегид, поскольку и он не
6. Иммуногистохимия 303
оказывает нежелательного воздействия на эти виды актив-
ности. По методу Накане и Пирса (Nakane, Pierce, 1967) ан-
титела, меченные пероксидазой, вводятся в реакцию с со-
ответствующими антигенами на срезах ткани или на
ультратонких срезах. Связанный фермент затем выявляет-
ся при световой или электронной микроскопии с помощью
метода Грэхема и Карновского (Graham, Kamovsky); в ка-
честве субстратов используют диаминобензидин (ДАБ) и
Н2О2. Маркирование пероксидазой благодаря стабильно-
сти и четкой локализации хорошо окрашенного продукта
реакции во многих случаях оказывается предпочтительнее
методов флуоресцентной метки.
Для ультраструктурной локализации антигенов Накане
(Nakane) разработал 3 различных, непрямых иммуногисто-
химических метода: а) выявление антигена на толстых сре-
зах; б) выявление антигена на ультратонких срезах; в) выя-
вление антигена на тонких срезах ткани, залитой
в полиэтиленгликоль.
Чувствительность реакции может быть повышена за
счет использования мультиреактивности иммуноглобули-
нов в процессе связывания молекул фермента на месте ло-
кализации антигена в ткани. Для этой цели служит так на-
зываемый «мостиковый» метод связывания иммуногло-
булина с ферментом..
Для проведения этой реакции на тканевых срезах тре-
буются следующие сыворотки:
а) специфическая антисыворотка против выявляемого
антигена;
J5) антисыворотка против у-глобулина животного, ис-
пользованного для получения упомянутой антисыворотки
(например, овечья антисыворотка против кроличьего у-
глобулина);
в) специфическая антисыворотка против фермента-
метки;
г) фермент-метка (лучше всего пероксидаза).
Для установления локализации антигена на ультратон-
ких срезах используются следующие приемы:
1. Кусочки ткани фиксируют, обезвоживают, заливают
в метакрилат или эпон.
2. Ультратонкие срезы ткани, залитой в метакрилат,
обрабатывают водой, насыщенной ксилолом, а срезы тка-
ни, залитой в эпон, обрабатывают 10% Н2О2.
304 6. Иммуногистохимия
3. Ультратонкие срезы на сеточках помещают на кашпо
специфической антисыворотки кролика и затем промыва-
ют раствором хлорида натрия в фосфатном буфере.
4. Срезы помещают на каплю антисыворотки овцы
против кроличьего у-глобулина, конъюгированного с ком-
плексом пероксидаза-антипероксидаза.
5. Пероксидазная реакция проводится с 4-хлор-1-наф-
толом или Н2О2 в качестве субстрата.
В результате антигены маркируются электроно-
плотным продуктом гистохимической реакции на перокси-
дазную активность.
63. ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИИ
Быстрое развитие иммуногистохимических методов су-
щественно расширило возможности применения этой важ-
ной ветви гистохимии. Ценность иммуногистохимии опре-
деляется ее возможностью весьма специфично маркиро-
вать и локализовать белки, в частности ферментные белки.
Благодаря этому удается получать ценные дополнения
к исследованиям, проводимым с помощью обычных гисто-
химических методов, направленных на выявление веществ
или ферментативной активности. Обширной, еще мало
разработанной областью применения гистохимии являет-
ся специфическое выявление ферментных белков. Имеется
в виду в первую очередь выявление растворимых фермен-
тов, труднодоступных методам обычной энзимогистохи-
мии. Применение иммуногистохимических методов для
выявления ферментов имеет особое значение в тех случаях,
когда специфичность данного метода и локализация фер-
мента оспариваются.
Большое число фундаментальных исследований в обла-
сти биологии и медицины по внутриклеточной локализа-
ции гормонов, в частности гормонов гипофиза, было про-
ведено с использованием антител, меченных пероксидазой
(рис. 15). Такие антитела позволили также идентифициро-
вать антигены базальной мембраны и внутриклеточные
иммуноглобулины в плазматических клетках и лимфобла-
стах. Прекрасным примером иммуногистохимического
выявления ферментов является установление локализации
амилазы, трипсиногена и химотрипсиногена в экзокринных
/Ърмон
(антиген)
Г)Антитело\
(f-глобулин)
\л гормону^
Пормон
(антиген)
г Антитело^
(f-глобулин)
Сл гормону л
Инкубация с
б, Удиаминобензидином
Рис. 15. Внутриклеточное выявление гормонов гипофиза методами иммуноцитохимии (Junqueira et al., 1975).
I. Срезы обрабатывают в растворе, содержащем антитела против изучаемого гормона; антитела связываются с гормоном. II. Срез инкубируют с
раствором, содержащим меченные пероксидазой антитела к антителам (у-глобулину). 111. Срез инкубируют с субстратом—3,3'-диаминобеизидином, в
результате образуется коричневый осадок в местах нахождения гормона.
306 6. Иммуногистохимия
клетках поджелудочной железы. В качестве ан-
тигенов использовали соответствующие кристаллические
ферменты, которые вводили кроликам, растворяя их в бу-
фере, и смешивали с адьюваном Фрейнда. После очистки
кроличьих антител против соответствующего фермента
и конъюгации с красителем выявляли образовавшийся
комплекс антиген — антитело с присоединенным к послед-
нему флуоресцентным красителем—изотиоцианатом
флуоресцеина. Флуоресцирующие участки в срезе ткани со-
ответствуют локализации антигена, а стало быть,
и фермента.
7. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ГИСТОХИМИЯ
За последние два десятилетия количественная гистохи-
мия превратилась в важнейшую отрасль гистохимии. Ее
цель—количественное определение веществ на месте их
прижизненной локализации. Выражаемая в относительных
единицах интенсивность гистохимической реакции пред-
ставляет собой более объективную оценку результатов опы-
та, чем простое наблюдение. Для проведения соответ-
ствующих измерений размера и формы клетки, а также
определения содержания ее химических компонентов вы-
пускается специальная, большей частью автоматизирован-
ная аппаратура.
7.1. ЦИТОФОТОМЕТРИЯ
7.1.1. МИКРОФОТОМЕТРЫ
При количественных исследованиях, проводимых с по-
мощью цитофотометрической аппаратуры, измеряют
поглощение света, интерференцию, флуоресценцию про-
дуктов реакции и отражение света. Особенно широкое при-
менение нашли однолучевые микроспектрофотометры
(принципиальная схема этого прибора представлена на
рис. 16), работающие в видимой области. Кроме того,
с помощью микроспектрофотометров можно снимать
спектры поглощения при любых длинах волн.
В качестве примера рассмотрим микроспектрофото-
метр, разработанный фирмой FEB Carl Zeiss Ампливал.
Это однолучевой прибор, работающий в видимой обла-
сти—от 400 до 710 нм; с его помощью можно измерять
пропускание и поглощение света веществом, находящимся
непосредственно в клетке. Необходимым этапом цитофо-
308 7, Количественная гистохимия
тометрических измерений является связывание красителя
с выявляемым биологическим веществом. Измерив вели-
чину пропускания или экстинкции, можно вычислить кон-
центрацию связанного в результате гистохимической реак-
ции красителя и найти концентрацию исследуемого веще-
ства.
Микроскоп Изображение
1
Рис. 16. Схема микрофотометрии (Caspersson, 1950 и Sandritter, 1965).
J—лампа, 2—призма, 3—щель, 4—фотоэлемент.
Микроспектрофотометр состоит из микроскопа Ам-
пливал с апохроматическими объективами, оптической
скамьи с источником света и светофильтрами, а также фо-
тометрического устройства с фотометрической насадкой,
фотометрической головкой и усилителе^ тока с регистри-
рующим прибором. В аппарате два источника света—один
для просмотра препарата, другой для измерения. Послед-
ним служит галогеновая лампа мощностью 100 Вт, спектр
испускания которой лежит в области 400—710 нм. С по-
мощью самописцами аналогового преобразователя резуль-
таты измерений либо печатаются на машинке, либо за-
писываются на магнитную ленту.
Количественное определение флуоресцирующих соеди-
нений можно проводить с помощью цитофлуориметра, ко-
торый представляет собой комбинацию флуоресцентного
микроскопа с фотометром. Применение простого флуорес-
центного микроскопа в сочетании с фотометром имеет, од-
нако, серьезный недостаток: время возбуждения флуорес-
ценции для одного измерения составляет несколько
секунд. За это время интенсивность флуоресценции суще-
ственно уменьшается, что искажает результаты измерений.
Следовательно, время возбуждения является важным па-
раметром флуориметрии. Желательно поэтому, чтобы оно
не превышало 1 с.
7, Количественная гистохимия 309
С помощью интерференционного микроскопа, снаб-
женного измерительным компенсатором, можно опреде-
лять толщину и коэффициент преломления микроскопиче-
ского объекта, сухую массу живых и фиксированных
клеток, а также проводить количественное исследование
живых клеток и клеточных органелл.
Непрозрачные продукты, находящиеся в клетке, не под-
даются исследованию методом интерференционной ми-
кроскопии. Особое значение в биологии и медицине имеет
определение сухой массы живых и фиксированных клеток.
В основе этих измерений лежит зависимость между кон-
центрацией вещества, находящегося в растворенном со-
стоянии в живой клетке, и коэффициентом преломления
раствора. Для определения сухой массы можно пользо-
ваться также методом гисторентгенографии.
Количественная микрофотометрия в отраженном свете
(рефлектометрия) особенно ценна для определения числа
частиц в осадке. В первую очередь она используется при
подсчете точек, например осадков формазана или зерен се-
ребра, на радиоавтографах.
7.1.2. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ
Основой фотометрического исследования окрашенных
веществ в клетках и тканях является закон Ламберта—Бэ-
ра. Согласно этому закону, слои гомогенной поглощаю-
щей среды равной толщины поглощают равное количе-
ство света. При использовании красителей или гистохими-
ческих реакций окрашивания для выявления веществ
в клетках и тканях количество связываемого красителя
должно линейно зависеть от количества выявляемого ве-
щества (стехиометричность связывания красителя). В реак-
ции Фёльгена, используемой для выявления ДНК, связыва-
ние лейкофуксина с образующимися в результате гидроли-
за альдегидными группами происходит в стехиометриче-
ском соотношении. Интенсивность реакции окрашивания
зависит от числа альдегидных групп, а при соответствую-
щих условиях и от количества ДНК.
Для определения ферментативной активности приме-
нимы те же требования.
310 7. Количественная гистохимия
При цитофотометрическом определении необходимо
иметь в виду ряд обстоятельств:
а) надежность используемой оптической системы для
измерения количества вещества (она достигается с по-
мощью точной проверки и юстировки системы по соответ-
ствующим стандартам); б) характер подготовки препара-
та; в) точное соблюдение условий проведения гистохими-
ческой реакции; г) заключение срезов под покровное
стекло в среду, которая не оказывает влияния на продукт
гистохимической реакции.
Помимо уже упомянутого закона Ламберта—Бэра не-
обходимо учитывать следующие предпосылки для получе-
ния надежных результатов измерения:
1. В процессе гистохимической реакции выявляемое ве-
щество не должно смещаться в другие участки ткани или
диффундировать в фиксирующую смесь или в инкубацион-
ную среду.
2. При фиксации не должно происходить вымывания
исследуемого вещества и не должна изменяться его спо-
собность к последующей гистохимической реакции.
3. В гистохимическую реакцию должно вступать все
присутствующее выявляемое вещество, ^количество обра-
зующегося при этом продукта должно линейно зависеть от
количества выявляемого вещества.
Выполнение всех этих условий не всегда возможно. В не-
которых случаях приходится в опытах на модельных си-
стемах подбирать* компромиссные решения. Возможность
количественного определения продукта реакции сама по
себе является шагом вперед по сравнению с субъективным
методом (оценка интенсивности реакции числом крестов).
Особенно важно сопоставление с результатами, добытыми
с помощью других методов.
При цитофотометрии тонких срезов возникают опреде-
ленные трудности, связанные с оптической негомоген-
ностью срезов, подвергаемых гистохимической обработке.
При работе со срезами одинаковой толщины возможные
колебания в измерениях сглаживаются регистрацией цито-
фотометрических данных по большому числу клеток (от 20
до 100). При этом следует иметь в виду, что число иссле-
дуемых клеток зависит от морфологии ткани. Точность из-
мерений можно повысить, сканируя образец узким пучком
7, Количественная гистохимия 311
света при смещении препарата. Полученные данные дают
интегральную оптическую плотность объекта. Еще одним
путем измерения является фотометрирование при двух
длинах волн.
При измерении поглощения света на окрашенных тка-
нях необходимо перед началом измерений определить
спектр поглощения для продукта каждой реакции окраши-
вания. Только таким образом можно проводить количе-
ственные измерения при оптимальной длине волны.
Одним из источников ошибок при цитофотометриче-
ских измерениях является выцветание продукта реакции,
особенно в условиях высокой интенсивности освещения.
Поэтому в каждом случае следует проверять, на протяже-
нии какого времени интенсивность окрашивания продукта
реакции остается стабильной при данных условиях освеще-
ния.
7.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ГИСТОХИМИЯ НУКЛЕИ-
НОВЫХ КИСЛОТ
Количественный гистохимический анализ нуклеиновых
кислот проводится с помощью следующих методов: 1)
ультрафиолетовая микроспектрофотометрия (Caspersson,
1950; Sandritter) для исследования РНК и ДНК; 2) реакции
окрашивания: по Фёльгену (для ДНК) и основными
красителями.
Поскольку исследование нуклеиновых кислот в ультра-
фиолетовом свете требует сложной аппаратуры, в послед-
ние годы все чаще используют стандартизованные реакции
окрашивания в сочетании с цитофотометрией. Так как
классическая реакция Фёльгена недостаточно воспроизво-
дима (Sandritter), на первый план выдвигаются методы вы-
явления фосфатных групп нуклеиновых кислот с помощью
основных красителей.
7.2.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НУ-
КЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАФИО-
ЛЕТОВОЙ МИКРОСПЕКТРОФОТОМЕТРИИ
Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), несмотря на раз-
личие в составе азотистых оснований, имеют близкие ха-
312 7, Количественная гистохимия
рактерные спектры поглощения, лежащие в ультрафиоле-
товой области, с четко выраженным максимумом (260 нм).
На этом их свойстве основан весьма чувствительный ме-
тод ультрафиолетовой микроспектрофотометрии, позво-
ляющий с помощью сложной и дорогой аппаратуры (уль-
трафиолетовые цитофотометры) измерять содержание
нуклеиновых кислот в клетках и тканях. Через срез ткани
пропускают пучок ультрафиолетового света, интенсив-
ность поглощения которого (спектры поглощения) реги-
стрируется с помощью фотоэлемента и соответствующего
усилителя. В то время как содержание ДНК в ядре опреде-
ляется довольно легко, количественные измерения РНК
сопряжены с возможностью целого ряда труднопреодо-
лимых ошибок. Точное количественное определение РНК
с помощью ультрафиолетовой цитофотометрии возможно
при соблюдении двух условий:
1. Когда исследуемая ткань либо совсем не содержит
ДНК, либо содержит ее в минимальном количестве.
2. Когда ДНК может быть полностью удалена из ткани
так, чтобы в ткани оставалась лишь РНК, или когда о ко-
личестве РНК можно судить по ослаблению поглощения
света после обработки рибонуклеазой. Неполное удаление .
одной из двух нуклеиновых кислот в каждом случае ведет
к искажению результатов.
Кроме того, следует считаться с возможностью смеще-
ния обеих нуклеиновых кислот, особенно при определении
их содержания в ядре. И наконец, поглощение света белка-
ми в ультрафиолетовой области также может послужить
источником ошибки, особенно при их высоком содержа-
нии. Поглощение ультрафиолетового света жирами и угле-
водами в большинстве тканей не играет никакой роли.
7.2.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК
И РНК ПРИ ОКРАШИВАНИИ ОСНОВНЫМИ КРАСИ-
ТЕЛЯМИ
Помимо количественного определения РНК по погло-
щению ультрафиолетового света имеют значение также
методы выявления РНК по окрашиванию основными кра-
сителями. В основе такого окрашивания лежит полиа-
нионный характер нуклеиновых кислот и связывание ими
7, Количественная гистохимия 313
красителей главным образом за счет электростатических
сил. Имеющиеся в ткани другие анионы можно исключить,
уменьшив величину pH раствора красителя (примерно до
4). Количественное определение нуклеиновых кислот осно-
вано на стехиометрическом характере реакции связывания
красителя с выявляемым веществом. Необходим строгий
контроль за концентрацией красителя в растворе, а также
за ионной силой и величиной pH раствора.
Под действием фиксации происходит высвобождение
заряженных фосфатных групп, нейтрализованных в натив-
ном состоянии; при этом количество фосфатных групп, вы-
являемых в исследуемой ткани, под действием соответ-
ствующей обработки повышается. Поскольку число
высвобождаемых фосфатных групп зависит от используе-
мого метода фиксации, при сравнительных исследованиях
содержания РНК необходимо придерживаться стандарти-
зованной методики фиксации и последующей обработки
ткани.
Для количественного определения РНК подходящими
оказались следующие красители: галлоцианин—хромовые
квасцы (Einarson, Sandritter, 1963; Kiefer), метиленовый синий
(Deitch ), крезиловый фиолетовый (Ritter, азур В (Flax, Hi-
mes). Галлоцианин—хромовые квасцы обладают целым ря-
дом важных преимуществ для фотометрического опреде-
ления количества связанного красителя (Sandritter, 1963).
1. Краситель связывается с нуклеиновыми кислотами
настолько прочно, что при последующем промывании пре-
парата потерь красителя не наблюдается.
2. Краситель придает нуклеиновым кислотам ортохро-
матическую окраску, которая, согласно Эйнарсону (Einar-
son, 1951), имеет высокую специфичность для обеих ну-
клеиновых кислот в зоне pH от 1,50 до 1,75 с оптимумом
окрашивания 1,54. При этом увеличение продолжительно-
сти окрашивания по сравнению с общепринятой ведет
лишь к незначительному росту количества связанного кра-
сителя. Однако галлоцианйн—хромовые квасцы связы-
ваются с фосфатными группами нуклеиновых кислот не
только за счет электростатических сил, что несколько огра-
ничивает ценность этого метода для количественной оцен-
ки содержания нуклеиновых кислот.
В настоящее время реакции окрашивания являются на-
12-235
314 7. Количественная гистохимия
илучшим методом количественной оценки содержания ну-
клеиновых кислот. Окрашивание метиленовым синим, азу-
ром В и крезиловым фиолетовым не имеет каких-либо
преимуществ по сравнению с окрашиванием галлоциани-
ном—хромовыми квасцами. При окрашивании забуфе-
ренным раствором метиленового синего в зависимости от
фиксации и величины pH окрашивающего раствора можно
проводить раздельные определения РНК и ДНК, что
имеет значение для количественного анализа обеих ну-
клеиновых кислот. После фиксации клеток печени неполо-
возрелых мышей формалином (1:4) окрашивание ДНК на-
блюдается при pH 2,7, а РНК—при pH 3,1. После
фиксации в жидкости Карнуа начало окрашивания ДНК
наблюдалось при pH 3,8, а РНК—при pH 3,4 (v. Mayers-
bach).
Результаты окрашивания основными красителями
представляют ценность для количественного анализа
лишь при условии проведения контрольных специфических
экстракций нуклеазами или кислотным гидролизом. При
этом необходимо следить за полнотой удаления соответ-
ствующей нуклеиновой кислоты. Для подтверждения цито-
фотометрических измерений рекомендуется проводить
предварительные биохимические исследования.
7.2.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК ПО
РЕАКЦИИ ФЁЛЬГЕНА
Фотометрическую оценку интенсивности реакции
Фёльгена можно использовать для количественного опре-
деления ДНК в ядре при обязательной стандартизации ус-
ловий фиксации, pH раствора, продолжительности и тем-
пературы гидролиза, качества реактива Шиффа и содержа-
ния SO2 в воде. Важной предпосылкой надежности
цитофотометрических данных является гомогенность рас-
пределения ядерного материала. Фиксирующие смеси, спо-
собствующие образованию грубых глыбок ядерного хро-
матина (например, такие кислые фиксирующие смеси, как
спирт — уксусная кислота), непригодны.
Для количественного определения ДНК фотометриро-
вание обычно проводят при длине волны, при которой по-
глощение света продуктом реакции Фёльгена максималь-
7. Количественная гистохимия 315
но. Максимум поглощения зависит от типа фиксации
(560 нм при фиксации в Карнуа и 570 нм при фиксации
в формалине). Поэтому при проведении измерений на не-
знакомом материале рекомендуется сначала снять спектр
поглощения на одном или двух ядрах для установления
длины волны, при которой следует проводить измерение.
Этот же прием используется при анализе гидролиза ну-
клеиновых кислот.
В большинстве исследований содержание ДНК, опреде-
ляемое с помощью цитофотометрических измерений, вы-
ражается в произвольных единицах. Измерение содержа-
ния ДНК осуществляется с помощью определения
поглощения (экстинкции) в центральном участке клеточно-
го ядра (метод зонда). Произвольные единицы вычисляют-
ся на основе данных по среднему оптическому поглоще-
нию и площади ядра с учетом поправки (2/3) на
шаровидную или эллипсоидную форму ядра. Для вычисле-
ния абсолютных величин содержания ДНК необходимы
сравнительные исследования на тканях, в которых содер-
жание ДНК на ядро известно. Наиболее надежные резуль-
таты дает использование лиофилизированного материала.
7.3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ГИСТОХИМИЯ БЕЛКОВ
Для количественного определения белков в клетках
и тканях в первую очередь используются следующие
методы:
1. Поглощение ультрафиолетового света.
2. Автофлуоресценция.
6. Интерферометрия.
4. Реакции окрашивания.
7.3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО ПОГЛОЩЕНИЮ
В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОМ СВЕТЕ
При цитофотометрическом определении содержания
белка с помощью ультрафиолетового микроскопа исполь-
зуется область спектра от 230 до 300 нм, где находятся
в первую очередь максимумы поглощения ароматических
аминокислот, таких, как триптофан и тирозин. Отдиффе-
ренцировать эти аминокислоты невозможно. Кроме того,
12»
316 7. Количественная гистохимия
следует учитывать возможность смещения максимума по-
глощения для белков за счет присутствия нуклеиновых кис-
лот, а также за счет поглощения алифатическими амино-
кислотами. Определение положения и величины максиму-
ма поглощения для белков сопряжено поэтому
с большими трудностями. Определение содержания бел-
ков с помощью ультрафиолетовой цитофотометрии со-
пряжено с большими ошибками, чем определение содер-
жания нуклеиновых кислот.
7.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ АВТО-
ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Белки имеют характерные спектры флуоресценции
в ультрафиолетовой и видимой области. Пропорциональ-
ность интенсивности флуоресценции при определенных ус-
ловиях содержанию белка в клетках является теоретиче-
ской предпосылкой возможности количественной оценки.
Однако практическому применению этого метода мешают
трудности дифференцирования отдельных белков и раз-
граничения белков и ведущих себя сходным образом ну-
клеиновых кислот. Кроме того, такую же флуоресценцию
дают связанные нуклеотиды (например, АТФ, АДФ).
7.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ИН-
ТЕРФЕРОМЕТРИИ
Интерференционный микроскоп с очень высокой на-
дежностью позволяет определять общее содержание белка
в живых клетках и абсолютные величины сухой массы. Ком-
бинируя этот метод с методами специфического выявле-
ния белков, можно выразить в единицах сухой массы коли-
чество выявляемого соединения или какого-либо компо-
нента клетки (Ruch). Из многочисленных возможностей
применения интерференционной микроскопии следует
упомянуть определение потерь веществ, обусловленных
подготовкой материала, и определение толщины микро-
томных срезов.
7. Количественная гистохимия 317
7.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ РЕАК-
ЦИЙ ОКРАШИВАНИЯ
Несмотря на многочисленные трудности, обуслов-
ленные главным образом многообразием и сложностью
Таблица 51
Обзор методов количественной гвстохвмии (Sandritter, 1965)
Вид излучения X, нм Выявляемое вещество и реакция окрашивания Метод
Излуче- ние в види- мой об- ласти 800 700 600 Гистон Прочный зеленый, Тирозин pH 8,2 (Millon) Триптофан Гек, тетразониум Аргинин (Sakaguchi) ДНК Реакция Фёльгена Цитофото-
Уф-излу- чёние Вакуум- ный УФ Рентге- новс- кое из- луче- ние 500 400 300 200 10 1 0,1 0,01 РНК Окрашивание галло- цианин — хромо- вые квасцы Barr- nett, Bahr) SS + SH Нафтоловый желтый Свободные S, Прочный зеле- основные ный, pH 1,2 группы Гемоглобин Сухой вес Пигменты Пиридин-нукле- отиды Цитохром Липофуксин Гемосидерин и ДР- Тирозин-трипто- фан Нуклеиновые кис- лоты Сухой вес Na, Mg, Р, S, Cl, К, Са, Fe, Си Ag, I и т.д. метрия в видимой области Интерфе- ренцион- ная мик- роскопия Ультрафио- летовая мик- рофото- метрия Микрорент- геногра- фия Рентгенов- ская гис- тоспект- роскопия
318 7. Количественная гистохимия
белковых молекул, а также иногда недостаточной
воспроизводимостью метода, количественная гистохимия
белков, основанная на использовании реакций окрашива-
ния, продолжает развиваться. При условии специфичности
реакции и линейности соотношения между количеством
выявляемого вещества и оптической плотностью с по-
мощью реакций окрашивания обычно удается выражать
количество выявляемых веществ лишь в относительных
единицах. Абсолютные величины можно получать с при-
влечением сравнительных исследований на стандартных
объектах известного состава.
Специфичность реакции окрашивания реакционноспо-
собных групп зависит от процедуры подготовки субстрата
и окрашивания, а также от качества красителя. Имеет зна-
чение использование апробированных оптимальных мето-
дов фиксации, поддержание постоянной температуры
в процессе всей процедуры подготовки препарата и ис-
пользование стандартизованных химияески чистых краси-
телей. Для установления специфичности реакции необхо-
димо также привлекать методы торможения. Оценка
белковой реакции, как правило, проводится по спектрам
поглощения. Наиболее известные реакции йеречислены
в табл. 51.
8. БУФЕРНЫЕ СМЕСИ
0,2 М АЦЕТАТ-УКСУСНОКИСЛЫЙ БУФЕР, pH
3,5—5,6
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР
А) 0,2 М раствор ацетата натрия (16,4г/1000мл)
Б) 0,2М уксусная кислота (12,0мл/1000мл)
хмл раствора А + хмл раствора Б
pH А Б рн А Б
3,6 3,7 46,3 4,8 30,0 20,0
3,8 6,0 44,0 5,0 35,2 14,8
4,0 9,0 41,0 5,2 39,5 10,5
4,2 13,2 36,8 5,4 41,2 8,8
4,4 19,5 30,5 5,6 45,2 4,8
4,6 24,5 25,5
0,05 М КАКОДИЛАТНЫЙ БУФЕР, pH 5,0—7,4
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР
0,1 М какодилат натрия [Na(CH3)2-AsO2-3H2O,
21,4г/1000мл]
Маточный раствор 100
0,1 н. HQ х
Дистиллированная вода до 200
320 8. Буферные смеси
pH Мн.НС pH ),1и.НС1
5,0 93,5 6,4 36,5
5,2 90,1 6,6 26,6
5,4 85,2 6,8 18,6
5,6 78,4 7,0 12,6
5,8 69,6 7,2 8,3
6,0 59,1 7,4 5,4
6,2 47,7
ВЕРОНАЛ-АЦЕТАТНЫЙ БУФЕР, pH 2,62—9,16
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР
А) 9,714 г ацетата натрия + 14,714 г веронала натрия
(барбитала натрия) растворить в 500мл дистиллированной
воды
Б) 0,1 н. НС1 (8,4мл/1000мл)
Буферный раствор: Маточный раствор А 5 мл
Маточный раствор В х мл
Дистиллированная вода у мл
pH Б Дистиллиро- ванная вода рн Б Дистиллиро- ванная вода
2,62 16,0' 2,0 6,99 6,0 12,0
3,20 15,0 3,0 7,25 5,5 12,5
3,62 14,0 4,0 7,42 5,0 13,0
3,88 13,0 5,0 7,66 4,0 14,0
4,13 12,0 6,0 7,90 3,0 15,0
4,33 н,о 7,0 8,18 2,0 16,0
4,66 10,0 8,0 8,55 1,0 17,0
4,93 9,0 9,0 8,68 0,75 17,25
5,32 8,0 10,0 8,90 0,5 17,50
6,12 7,0 и,о 9,16 0,25 17,75
6,75 6,5 11,5
8. Буферные смеси 321
0,05М 7РИС-МАЛЕАТНЫЙ БУФЕР, pH 5,2—8,6
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР
0,2 М mpuc-малеатного раствора (24,2 г
трисоксиметиламинометана + 23,2 г малеиновой кислоты
или 19,6 г малеинового ангидрида на 1000 мл дистиллиро-
ванной воды)
50 мл маточного раствора + хмл 0,2 н. NaOH +
+ Дистиллированная вода до 200 мл.
pH 0,2 н. NaOH pH ),2 н. NaOH
5,2 7,0 7,0 48,0
5,4 10,8 7,2 51,0
5,6 15,5 7,4 54,0
5,8 20,5 7,6 58,0
6,0 26,0 7,8 63,5
6,2 31,5 8,0 69,0
6,4 37,0 8,2 75,0
6,6 42,5 8,4 81,0
6,8 45,0 8,6 86,5
0,05 М Na-МАЛЕАТНЫЙ БУФЕР, pH 5,2-6,8
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР
0,2 М раствор гидрата окиси натрия и малеата (23,2 г
малеиновой кислоты или 19,6г малеинового ангидрида +
4-^8г NaOH/ЮООмл дистиллированной воды)
50мл маточного раствора + хмл 0,2 н. NaOH +
+ Дистиллированная вода до 200 мл
pH 0,2 н. NaOH pH ),2 н. NaOH
5,2 7,2 6,2 33,0
5,4 10,5 6,4 38,0
5,6 15,3 6,6 41,6
5,8 20,8 6,8 44,4
6,0 26,9
322 ' 8. Буферные смеси
0,05 М ТРИС-НС БУФЕР, pH 7,19—9,10
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР
0,2 М трисоксиметиламинометан (24,2 г на 1000мл дистиллированной
воды)
Мато^ раствор
Дистиллированная вода
25 мл
до 1о6мл
pH од и. на pH од н. на
7,19 45,0 8,23 22,5
7,36 42,5 8,32 20,0
7,54 40,0 8,41 17,5
7,66 37,5 8,51 15,0
7,77 35,0 8,62 12,5
7,87 32,5 8,74 10,0
7,96 30,0 8,92 7,5
8,05 27,5 9,10 5,0
8,14 25,0 1
0,1 М ФОСФАТНЫЙ БУФЕР, pH 5,7—8,0
МАТОЧНЫЙ РАСТВОР '
А) 0,2М раствора NaH2PO4-H2O (27,58 г/1000мл)
Б) 0,2 М раствора Na2HPO4 (28,38 г/1000 мл)
хмл раствора А 4- у мл раствора В + Дистиллированная
вода до 200мл
pH А Б pH А Б
5,7 93,5 6,5 6,9 45,0 55,0
5,8 92,0 8,0 7,0 39,0 61,0
5,9 90,0 10,0 7,1 33,0 67,0
6,0 87,7 12,3 7,2 28,0 72,0
6,1 85,0 15,0 7,3 23,0 77,0
6,2 81,5 18,5 7,4 19,0 81,0
6,3 77,5 22,5 7,5 16,0 84,0
6,4 73,5 26,5 7,6 13,0 87,0
6,5 68,5 31,5 7,7 10,5 90,5
6,6 62,5 37,5 7,8 8,5 91,5
6,7 56,5 43,5 7,9 7,0 93,0
6,8 51,0 49,0 8,0 5,3 94,7
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Adams С. W. М. (1956). A stricter interpretation of the ferric ferricyanide re-
action with particular reference to. the demonstration of protein-bound
sulfhydryl and disulfide groups, J. Histochem. Cytochem, 4, 23—35.
Adams C. W. M., Sloper J'. C. (1956). The hypothalamic elaboration of poste-
rior pituitary pnnciples in man, the rat and dog. Histochemical evidence
derived from a performic acid alcian blue reaction for cystine, J. Endoc-
rin., 13, 221—228.
Adams C. W. M. (1957). A p-dimethylaminobenzaldehyde-nitrite method for
the histochemical demonstration of tryptophane and related compounds,
J. Clin. Path., 10, 56—62.
Adams C. W. M. (1961). A perchloric acid-naphthoquinone method for the his-
tochemical localization of cholesterol, Nature (bond.), 192, 331—332.
Andersen H., Hoyer P.E. (1973). Studies in Succinate Dehydrogenase Histoc-
hemistry, Histochemie, 35, 173—188.
Arnold M.. 19681 Histochemie. Emfiihrung in Grundlagen und Prinzipien der
Methoden, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York.
Arzac J. P., Elores L. G. (1949). The histochemical demonstration of glycogen
by silver complexes. Stain Technol., 24, 25.
Axelsson St., Bjorklund A., Falck B., Lindvall O., Svensson L. A. (1973). Gly-
oxylic acid condensation: A hew fluorescent method for the histochemical
demonstration of biogenic monoamines, Acta physiol, scand, 87, 57—62.
Axelsson St., Bjorklund A., Lindvall O. (1972). Fluorescence histochemistry of
biogenic monoamines: A study of the capacity of various carbonyl co-
mpounds to form fluorophores with biogenic monoamines in gas phase
reactions, J. Histochem. Cytochem-, 20, 435—444 (1972).
Bacchus H. (1950). Amer. J. Physiol., 163, 326.
Bachmann R., Seitz H. M. (1961). Zum histochemischen Nachweis des Histi-
din mit Diazoniumsalzen, Histochemie, 2, 307—314.
Baker J.R. (1947). The histochemical recognition of certain guanidine deriva-
tes, Quart. J. Mier. Sci., 88, 115—121.
Baker J. R. (1956). Histochemical recognition of phenols, especially tyrosine,
Quart. J. Mier. Sci., 97, 161—164.
Barka T., Anderson P. J., 1964. Histochemistry. Theory, Practice and Biblio-
graphy, Harper and Row, Pablishers, Inc, New York, Evanston and
London.
Barnett S.A., Bourne G, Fisher R.B. (1941). Nature (Lond.), 147, 542.
Barmett R.J., Seligman A.M. (1952). Histochemical demonstration of pro-
tein bound sulfhydryl groups, Science, 116, 323—327.
324 Список литературы
Barmett R. J..Seligman A.M. (1953). Investigation of the histochemical loca-
lization of disulfides, J, Histochem,. 1, 392—398.
Barmett R. J., Seligman A. M. (1954). Histochemical demonstration fo sulfhy-
dryl and disulfide groups of protein, J. Nat. Cancer Inst., 14, 769—803.
Barmett R.J., Seligman A.M. (1958). Histochemical demonstration of pro-
teinbound alpha-acyl-amido carboxyl groups, J. Biophys. Biochem. Cy-
tol, 4, 169.
Bauer H. (1933). Mikroskopisch-chemischer Nachweis von Glykogen und ei-
nigen anderen Polysacchariden, Z. mikr.-anat. Forsch., 33, 143-160.
Bello J. (1956). The specific esterification of carboxyl groups of gelatin with
methanol and thionylchloride, Biochem. Biophys.' Acta, 20, 426.
Bennett H.S. (1951). The demonstration of thiol groups in certain tissues by
means of a new colored sulfhydryl reagent. Anat. Rec., 110, 231.
Berenbaum M. C. (1958). The histochemistry of bound lipids, Quart. J. micr.
Sci., 99, 231—242.
Bernhard W. (1969). A new staining procedure for electron microscopical cyto-
logy, J. Ultrastruct. Res., 27, 250—265.
Best F. (1906). Uber Karminfarbung des Glykogens und der Kerne, Z. wiss.
mikrosk., 23, 319—322.
Bjbrklund A., Lindvall O., Svensson L.-A. (1972). Mechanisms of fhiorophore
formation in the histochemical glyoxylic acid method for monoamines,
Histochemie, 32, 113—131.
Biorklund A_ Hcikanson R., Lindvall O., Sundler £.’(1973). Fluorescence his-
tochemical demonstration of peptides with NH2-or COOH-terminal try-
ptophan or DOPA by condensation with glyoxylic acid, J. Histochem.
Cytochem., 21, 253—265.
Blackler B. S., Alexander W.F. (1952). A modified Turchini for the dif-
ferential staining of nucleic acids, Stain Techn^l., 27, 147.
de Boer J., Samaker R. (1968). Med. Proc. S. A. 2, 218 (zit. nach Pearse, His-
tochemistry, Theoretical and Applied, 3rd ed. Vol. 1, J. and A. Churchill,
London, 1956).
Burstone M.S. (1955). An evaluation of histochemical methods for protein
groups, J. Histochem. Cytochem., 3, 32—49.
Burstone M. S. (1959k New histochemical technique for the demonstration of
tissue oxidase (cytochrome oxidase), J. Histochem. Cytochem., 7,
112—122
Caspersson T. O., 1950. Cell growth arid cell function. A cytochemical study,
W.W. Norton Company-Inc., New York.
Chan-Curtis V., Belt W.D., Laboulis C.T. (1970). Cytochemical localiza-
tion of nucleic acid by an acriflavine-phosphotungstate complex for fluo-
rescence microscopy and electron microscopy, J. Histochem. Cytochem.,
18, 609—627.
Chevremont M., Frederic J. (1943). Une nouvelle methode histochimique de
mise en evidence des substances a fonction sulfhydrile, A. de Biol., 54,
589—601.
Chiffelle T. L., Putt F. A. (1951). Propylene and ethylene glycol as solvents for
Sudan IV and Sudan black B, Stain TechnoL, 26, 51-56.
Danielli J.F. (1947). A study of techniques for the cytocheiriical demonstra-
tion of nucleic acid and some components of proteins, Symp. Soc. Exp.
Biol., 1, 101—113.
Danielli J.F. (1949). Studies on the cytochemistry of proteins, Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 14, 32—39.
Список литературы 325
Davidoff Н. S., Galahov G. Р., 1974. Lysosomen und lysosomale Enzyme im
Zentralnervensystem der Ratte. Progress in Histochemistry and Cytoche-
mistry, Gustav-Fischer-Verlag, Stuttgart.
Davis B. J., Omstein L (1959). High resolution enzyme localization with a new
diazo reagent hexazonium pararosaniline, J. Histochem. Cytochem, 7,
297.
Davis J., Omstein L, Taleporos, Koulish S. (1959). J. Histochem. Cytochem,
7, 291.
Deimling O. (1965). Histochemische Darstellung der А-Esterase mit einer
Schwermetallmethode, Histochemie, 5, 141—144.
Deimling O., Madreiter H. (1972a). Esterase. II. A New Method for the Ele-
ctron Microscopical Demonstration of a Nonspecific Esterase in Animal
Tissues, Histochemie, 29, 83—96.
Deimling 0., Madreiter H. (1972b). Esterase. III. Demonstration rtf' an as yet
Histochemically Unknown Thiolesterase by Means cd Light and Electron
Microscopy, Histochemie, 29, 340—354.
EUeder M., Lojda Z. (1973). Studies in lipid histochemistry. XI. New, rapid,
simple and selective method for the demonstration of phospholipids, His-
tochemie, 36, 149—166.
Farquhar M. G„ Palade G. E. (1966). Adenosine triphosphatase localization in
amphibian epidermis, J. Cell Biol., 30, 359-379.
Feder N., Sidman R.L (1958). Methods and principles of fixation by freeze
substitution, J. Biophys. Biochem. Cyt, 4, 593.
Flood P.R. (1970). Preliminary experiments with iodine in electron opaque
stains for ultrathin sections. VII. Internal. Congr. EM, Grenoble I,
431—432.
Florence N.T., Barmett R.J., Greengard P. (1971). Cyclic 3,5-nucleotide
phosphodiesterase: cytochemical localization in central cortex, Science,
173, 645—647.
Flynn J. J. (1970) Ultrastructural localization of amino groups. VII. Internal.
Congr. EM, Grenoble, 1, 545—546.
Fratello B., 1972. Stain Technol, 43, 125 (zitiert nach Pearse A.G.E, Histo-
chemistry Theoretical and Applied, 3rd ed, Churchill Livingstone, Edin-
bergh-London, Vol. 2, 1968).
Galiyas. F. (1963). The histochemical identification of phosphoglycerides in
myelin, J. Neurochem, 10, 125—126.
Geyer G. (1962). Histochemische Methylierung mil Methanol und Thionylch-
lorid, Acta histochem, 14, 184—296.
Geyer G.. 1973. Ultrahistochemie, 2. Aufl, VEB Gustav Fischer-Verlag, Je-
na. [Имеется перевод: Гайер Г, Электронная гистохимия-М.:
Мир, 1974.]
Glenner G. G. (1957). The histochemical demonstration of indole derivatives
by the rosindole reaction of E. Fischer, J. Histochem. Cytochem, 5,
297—304.
Glenner G. G, Lillie R.D. (1957). The histochemical demonstration of indole
derivatives by the post coupled p-dimethylaminobenzylidine reaction,
J. Histochem. Cytochem, 5, 279—296.
Gomori G. (1946). A new histochemical test for glycogen and mucin, Am. J.
Clin. Path, 10, 177—179.
Gomori G. (1950). An improved histochemical technic for acid phosphatase,
Stain Technol, 25, 81.
326 Список литературы
Gomori G., 1952. Microscopic histochemistry. Principles and Practice, The
University of Chicago Press, Chicago.
Gomori G. (1954). The histochemistry of mucopolysaccharides, Brit. J. exp.
Path. 35, 377—380.
Gomori G. (1955). Histochemistry of human esterases, J. Histochem. Cyto-
chem., 3, 479—484.
Govan A.D. T. (1944). Fat-staining by Sudan dyes suspended in watery media,
J. Path. Bact, 56, 262—264.
Graumann W. (1958a). Vergleichende Untersuchungen zur Frage der Spezifitat
verschiedener Modifikationen der Polysaccharid-Eisenreaktion, Acta his-
tochem., 5, 49.
Graumann W„ Clauss W. (1958b). Weitere Untersuchungen zur Spezifitat der
histochemischen Polysaccharid-Eisenreaktion, Acta histochem., 8, 1—7.
Gross W. (1930). Zur Technik der Fettfarbung, Z. wiss. Mikr., 47, 64—68.
Hahn von Dorsche H., Krause R., Fehrmam P., Sulzmann R. (1975). Histo-
chemische Nachweismethoden flit biogene Amine, Acta histochem., 52,
281—302.
Hale C. W. (1946). Histochemical demonstration of add mucopolysaccharides
in animal tissues, Nature, 157, 802.
Hammett F.S., Chapman S.S. (1939). The quantitative unreliability of the ni-
troprusside test for SH- and SS-, J. Lab. Clin. Med.,' 24, 293.
Hanker. J. S., Anderson W. A., Bloom F. E. (1972). Osmiophilic Polymer Gene-
ration: Catalysis by Transition Metal Compounds in Ultrastructural Cy-
tochemistry, Science, 175, 991—993.
Hansson H.P.J. (1967). Histochemical demonstration of carbonic anhydrase
activity, Histochemie, 11, 112—128.
Harms H., 1965. Handbuch der Farbstoffe fiir die Mikroskopie, Stauffen-Ver-
lag, Kamp-Lintfort. *
Haustfr G. (1958). Zur Technik und Spezifitat des histochemischen Carboan-
hydrasenachwdses im Modellversuch und in Gewebeschnitten von Rat-
tennieren, Histochemie, 1, 29—47.
Hayes E.R. (1949). A rigorous re-definition of the plasmal reaction, Stain
Technol., 24, 19—2Д.
Hokfelt T.,LjngdahlL.A. (1972). Modification of the Falck-Hillarp formalde-
hyde fluorescence method using the vibratome: Simple, rapid and sensiti-
ve localization of catecholamines in sections of unfixed or formalin-fixed
brain tissue, Histochemie, 29, 325—339.
Holczinger L. (1959). HistochemischerNachweisfreierFettsauren, Acta histo-
chem. (Jena), 8, 167—175.
Holt S.J., Hicks R.M. (1966). The importance of osmiophilia in the produc-
tion of stable azoindoxyl complexes of high contrast for combined enzyme
cytochemistry and electron microscopy, J. Cell Biol., 29, 361 — 366.
Howell S. L., Whitfield M. (1972). Cytochemical localization of adenylcyclase
activity in rat islets of Langerhans, J. Histochem. Cytochem., 20,
873—879.
Jackson C. (1944). An improved method of staining lipides: Aceticcarbol-Su-
dan, Onderstopoort J. vet. Res., 19, 169—177.
Jensen WA. Kavaljian L.G. (1956). J. Biophys. Biochem. Cytol., 2, 87.
Junqueira L. C., Caneiro J., Contopoulos A.N., 1975. Basic Histology, 2 nd.,
Lange Medical Publications, Los Altos.
Список литературы 327
Kamovsky М. J., Roots L. (1964). A ’’direct-coloring" Thiochofine method for
cholinesterase, J. Histochem. Cytochem., 12, 219—221.
Kawashima T., Acta histochem. cytochem., 1,147 (zitiert nach Pearse, 1972).
Kay W. W. (1941). The role of impurities and mixtures of isomers in the stai-
ning of fat by commercial sudans, J. Path. Bact., 53, 279—284.
Korson R. (1964). A silver stain for desoxyribonucleic acid, J. Histochem. Cy-
tochem., 12, 875—879.
Krajcinovic M.,Puric V., Krajcinovic M. (1954—1955). Der qualitative Nach-
weis des Pektins in der Pflanzenzelle mit Hilfe der Aimnreaktion, Acta
histochem, 1, 76—81.
Xurnick (1955). Histochemistry of nucleic acids, Internal. Rev. Cytol., 4,
leach Е.И. (1938). Fat staining with sudan black B.J. Path. Bact, 47,
635-637.
leduc E.H., Bernhard W. (1961). Ultrastructural'cytochemistry. Enzyme and
acid hydrolysis of nucleic acids and protein, J. Biophys. Biochem. Cyt, 10,
437-455.
leduc E.H.,Marinozzi V., Bernhard W. (1963). The use of water-soluble glycol
methacrylate in ultrastructural cytochemistry, J. Roy. Mier. Soc, 81,
119-130.
leemann U„ Ruch F. (1972). Cytofluorometric determination of basic and to-
tal proteins with Sulfaflavine, J. Histochem. Cytochem, 20, 659—671.
lehrer G.M., Omstein LA. (1959). Diazo coupling for the electron microsco-
pic localization of cholinesterase, J. biophys. biochem. Cytol, 6,
399-406.
lewis P. R., 1961. The effect of varying the conditions in the Koelle technique.
In: Histcthemistry of cholinesterase. Symposium Basel, 1960. Bibl. anat.
2, 11—20, Karger, Basel-New York.
Ellie R.D. (1944). Various oil soluble dyes as fat stains in the supersaturated
isopropanol technic, Stain Techn, 19, 55—58.
Ellie R.D. (1957). The xanthydrol reaction for pyrroles and indoles in histo-
chemistry : Zymogen granules, lens, enterochromaffin and melanin, J. His-
tochem. Cytochem, 5, 188—195.
lison L, 1936. Histochimie Animale, Gauthier-Villars, Paris.
lison L, 1960. Histochimie et Cytochimie Animales, Principles et Methodes, 3.
Aufl, Masson, Paris.
Evmgston D.C., Coombs M.M., Franks LM„ Maggi- V, Gahan P.B. (1969).
A lead phthalocyanin method for the demonstration of acid hydrolases in
plant and animal tissues, Histochemie, 18, 48—60.
lojda Z„ 1962. Detection of acid phosphatase (czech.). Paper delivered at the
1st conference of Czechoslovac Histochemical Commitee on 28th Sept.
lojda Z. (1971). Indigogenic methods for glycosidases. IV. An improved me-
thod for P-glucuronidase, Histochemie, 27, 182—192.
lojda Z. (1973). Histochemical methods for acid P-galactosidase. Technics for
semipermeable membranes, Histochemie, 37, 375—378.
lojda Z.,Gossrau R.,Schiebler Т.Н., 1976. Enzymhistochemische Methoden,
Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York.
luppa H., Bernstein H.-G. (1977). Histochemischer Nachweis von Phosphory-
lase und Glykogen-Synthetasen, Acta histochem. Suppl. Bd. XIX,
333—338.
328 Список литературы
McManus J.F.A. (1946). Histological demonstration of mucin after periodic
acid, Nature, 158, 202.
McManus J. F. A., Findley L (1949). Histochemical Studies on Glycogen in
Carcinoma in Situ of Cervix Uteri. Surg., Cynec. Obstet., 89, 516—620.
Maunsbach A.B. (1966). Observations on the Ultrastructure and Acid Phos-
phatase Activity of the Cytoplasmic Bodies in Rat Kidney Proximal Tu-
bule cells, Ultrastruct. Res., 16, 1—42.
Mayers bach H. 1966. Immunhistologische Methoden in der Histochemie
(Ergiinzungsbeitrag zu Bd. 1/1). In: Handbuch der Histochemie, Bd. 1/2,
188—268, Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart.
Meijer A.E.F.H. (1968). Improved histochemical method for the demonstra-
tion of the activity of a-glucan-phosphorylase. II. Relation of molecular
weight of glycosyl-acceptor dextran to activation of phosphorylase, His-
tochemie, 16, 134—143.
Meijer A.E.F.H. (1975). Zur Histochemie der Enzyme. In: Acta histochem.,
Suppl.-Bd. XIV, 33—46.
Muller G. (1955). Uber den histotopochemischen Nachweis von Glucose in
der Leber und Niere der weiBen Maus, Acta histochem., 2, 73.
Muther Th.F. (1972). A critical evaluation of the histochemical methods for
carbonic anhydrase, J. Histochem. Cytochem., 20, 319—330.
Nakane P. K., Pierce G. P. (1967). Enzymelabeled antibodies for the light and
electron microscopic localization of tissue antigens, J. Cell BioL, 33,
307—318.
Novikoff A. B., Goldfischer S. (1961). Nucleosidediphosphatase activity in the
Golgi apparatus and its usefulness for cytological studies, Proc. Nat.
Acad. Sci., 47, 802—810.
Ostrowski K., Barnard E. A., Stocka Z., Darzynkiewic^ Z. (1963). Autoradio-
graphic methods in enzyme cytochemistry. 1. Localization of acetylcholi-
nesterase activity using a 3 H-labeled irreversible inhibitor, Exptl. Cell
Res., 31, 89—99.
Padykula H.A., Herman E. (1955).. The specificity of the histochemical me-
thod for adenosine triphosphatase, J. Histochem. Cytochem., 3,
170—195.
Palkama A.,Unsitalo R., 1972. Histochemical demonstration of Na—K-AT-
Pase activity in the optic nerve of the rat. In: T. Takeuchi, K. Ogawa
und S. Fujita (Eds.), Histochemistry and Cytochemistry, Abstr. of the IV.
International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, p. 321,
Kyoto.
Pearse A.C.E. (1951). The histochemical demonstration of keratin by me-
thods involving selective oxidation. Quart. J. Mier. Sci., 92, 393.
Pearse A. С. E., 1968. Histochemistry Theoretical and Applied, 3rd ed., Vol. 1,
J. and A. Churchill, London. [Имеется перевод с 2-го англ, изд.:
Пирс Э., Гистохимия теоретическая и прикладная.—М.: ИЛ, 1962Л
Pearse А. С. Е., 1972. Histochemistry Theoretical and Applied, 3rd ed., Vol. 2,
Churchill Livingstone, Edinburgh, London.
Perry M.M. (1967). Identification of glycogen in thin sections of amphibian
embryos, J. Cell Sci., 2, 257—264.
Peyrot A. (1956). П metodo del congelamento-sostituzione nel]a ricerca istolo-
gica ed istochemica. I. Riv. Istochim. norm, pat., 2, 197.
Pollister A. W., Ris H. (1947). Nucleoprotein determination in cytological pre-
parations, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 12, 147—157.
Список Литературы 329
Rambourg A., Hernandez W.,Ieblond С. Р. (1969). Detection of complex car-
bohydrates in the Golgi apparatus of rat cells, J. Cell Biol, 40.395—414.
Rebhun L. f,, Gaghk H. T., 1962. Some aspects of freeze-substitution in elec-
tron-microscopy. V. Intemat. Congr. EM, New York, L-2.
Reik J.,Perzold G.L, HigginsJ.A., Greengard P.,Barmett R. J. (1970). Hor-
mone-sensitive adenyl cyclase: cytochemical localization in rat liver,
Science, 168, 382-384.
Romeis B„ 1948, 1968. Mikroskopische Technik. R. Oldenbourg-Verlag
Miinchen-Wien, 15. Aufl, 16. Aufl. [Имеется перевод: Ромейс Б., Мик-
роскопическая техника.— М: ИЛ, 1953.]
Ruch F., 1970. Principles and some applications of cytofluorotneter. In: Intro-
duction to quantitative cytochemistry, vol. 2, p. 341—450, Academic
Press, New York.
Sqito T, Ogawa K. (1968). Ultracytochemical demonstration of D-fructo-
se-l,6-diphosphatase (D-fhictose-l,6-diphosphate-l-phosphohydrolase)
activity m the liver using lead nitrate as capture reagent, J. Mircrosc, 7,
521—532.
Sandritter W. (1965). I. Zytophotometrie. 1. Gerate. Einleitung zu den Proble-
men der Zytophotometrie. In: Acta histochem. Suppl. Bd. VI, 35—46.
Sasse D. (1966). Untersuchungen zur Nachweismethodik der Uridinphospho-
glucose-Glycogentransferase, Histochemie, 7, 39—49.
Scallan T.J., Dietert S.E. (1969). The quantitative retention of cholesterol in
mouse liver prepared for electron microscopy by fixation in a digitonin-
con taining aldehyde solution, J. Cell Biol., 40, 802 — 813.
Schiebler Th. H., Schiessler S. (1959). Uber den Nachweis von Insulin mit den
metachromatisch reagierenden Pseudoisocyaninen, Histochemie, 1,
445—465.
Schulze W., Wolfenberger A., 1971. Cytochemistry of membrane bound ATPa-
se systems of cardiac muscle. Methods in Achievment Exper. Path., 5,
347—383. Eds.: E. Bajas and G. Jasmin, Karger, Basel.
Schulze W.. Krause E. G., Wolfenberger A. (1972). Cytochemical demonstra-
tion and localization of adenylatcyclase in skeletal and cardiac muscle,
Advanc. Cyclic Nucleotide Res., 1, 249- 260.
Seligman A.M. (1965). Histochemical demonstration of some oxidized macro-
molecules with thiocarbohydrazide (TCH) or thiosemicarbohydrazide
(TSC) and osmium tetroxide, J. Histochem. Cytochem, 13, 629—639.
Seligman A.M., Ueno H., Wasserkrug H.L, Hanker J.S. (1966). Esterase me-
thod for light and electron microscopy via the formation of osmiophilic
diazothioethers, Ann. Histochim, 11, 115—129.
Seligman A.M., Wasserkrug H.L, Plaginger R.E., Seito T., Hanker J.S.
(1970). Membraneous ultrastructural demonstration of aminopeptidase
and y-glutamyl transpeptidase activities with a new diazonium salt that
yields a lipophobic, osmiophilic azo dye, J. Histochem. Cytochem, 18,
542—551.
Shanta R.T., Woods W.D., Waitzaman M.B., Bourne G.H. (1966). Histoche-
mical method for localization of cycle 3', 5'-nucleotide phosphodiesterase,
Histochemie, 7, 177—196.
Silverman L, Glick D. (1969). The reactivity and staining of tissue proteins
with phosphotungstic add, J. Cell Biol, 40, 761—767.
Smith R.E., Fishman W.H. (1966). A post-coupling technique for light and
electron microscopic localization of p-glucuronidase employing naphthol
330 Список литературы
AS—BI—р—D-glucuronid acid and placet oxymercuri) aniline diazo-
tate, J. Histochem. Cytochem., 14, 824.
Spicer S.S., Leppi T.J., Steward P.J. (1966). Suggestion for a histochemical
terminology of carbohydrate-rich tissue components, J. Histochem. Cyto-
chem, 13, 599—603.
Spriggs T.LB., lever J.D., Rees P.M., Graham J.D.P. (1966). Controlled
formaldehyde-catecholamine condensation in cryostat sections to show
adrenergic nerves by fluorescence, Stain Technol, 41, 323—327.
Steedman H.F. (1950). Alcian blue 8 GS: A new stain for mucin, Quart. J.
Mier. Sci, 91, 477—479.
Sterba G. (1964). Grundlagen des histochemischen und biochemischen Nach-
weises von Neurosekret (-Tragerprotein der Oxytozine) mit Pseudoiso-
cyaninen, Acta histochem, 17, 268—292.
Steward P.J., 1963. D. Phil. Thesis, University of Oxford.
Swift H., 1962. Nucleoprotein localization in electron micrographs: metal bin-
ding and radioautography. In: Harris R.J.C, The interpretation of ul-
trastructure, New York, p. 213—228.
Swift H., Larsen K. (1964). Electron microscope cytochemistry of nucleic acids
in Drosophila salivary glands and Tetrahymena, J. Roy. Mier. Soc, 83,
161—167.
Swift H. (1969). The electron histochemical demonstration of cystinecontai-
ning proteins in the guinea pig hair follicle, Histochemie, 19, 88-98.
Takeuchi T., Kuriaki H. (1955). Histochemical detection of phosphorylase in
animal tissues, J. Histochem. Cytochem, 3, 153—160.
Takeuchi T., Sasaki M. (1970). Electron microscopical observation of polyglu-
cose synthesized from glucose-l-phosphate by the phosphorylase activity
in rat skeletal muscles, Histochemie, 23, 310—348.
Themann H. (1960). Zur elektronenmikroskopischen Darstellung von Glyko-
gen mit Best’s Carmin, J. Ultrastruct. Res, 4, 401-412.
Themann H., 1963. Elektronenmikroskopische Untersuchungen uber das Gly-
kogen im Zellstoffwechsel, Verofftl. Morph. Path. Heft 66, Stuttgart.
ThieryJ. P. (1967). Miese en evidence des polysaccharides sur coupes fines en
microscopic electroriique, J. Microsc, 6, 987—1018.
Tice L, W., Barrnett R. J. (1965). Diazophthalocyanins as reagents for fine
structural cytochemistry, J. Cell Biol, 25, 23-41.
Urman J. (1898). Einiges zur Frage der Hamatologie und Genese der Gallen-
farbstoffbildung bei Vergiftungen, Gorbersdorfer Verofftl, 2, 111.
Tiou К. C., 1975.5'-Nucleotide Phosphodiesterase. Id: Hayat M. A, Electron
Microscopy of Enzymes. Principles and Methods, vol. 4, 141—155, van
Nostrand Reinhold Company, London—Toronto—Melbourne.
Vatter A.E., Reiss O.K., Newman J.K., Lindquist L, Groeneboer E. (1968).
Enzymes of the lung. I. Detection of esterase with a new cytochemical me-
thod, J. Cell Biol, 38, 80—98.
Wachstein M„ Meisel E. (1956). On the histochemical demonstration of glu-
cose-6-phosphatase, J. Histochem. Cytochem, 4, 592.
Wachstein M., Meisel E. (1957). Histochemistry of hepatic phosphatases at
a physiologic pH, Am. J. Clin. Path, 27, 13—23.
Wachstein M., Ealcon C. (1961). Histochemistry of Thiolactic Acid Esterase:
a Comparison with Nonspecific Esterase with Special Regard to the Ef-
fect of Fixatives and Inhibitors on Intracellular Localization, J. Histo-
chem. Cytoclfem, 9, 325—339.
Список литературы 331
Weller R.O., Bayliss О. В., Abdulla Y.H., Adams C.W.M. (1965). The elec-
tron-histochemical demonstration of phosphoglyceride, J. Histochem.
Cytochem, 13, 690—692.
Wollenberger A., Schulze W., 1975. Cytochemical studies on sarcolemmal ad-
enosintriphosphatase. Recent advances in studies on cardiac structure
and metabolism, Vol. 9, University Park Press, Baltimore.
Wood J.G, Barmett R. J. (1964). Histochemical demonstration of norepine-
phrine at a fine structural level, J. Histochem. Cytochem, 12, 197—209.
Yamada M., Ofuji S. (1972). J. invest. Dennat, 50, 231; (zit. nach Pearse A.
G. E, Histochemistry Theoretical and applied, 3rd ed. vol. 2, p. 975, Edin-
burgh and London, Churchill Livingstone, 1968.)
Zotikov L, Bernhard W. (1970). Localization au microscope electronique de
I’activite de certaines nucleases dans des coupes a congelation ultrafines,
J. Ultrastruct. Res, 30, 642—663.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Автофлуоресценция 315
Автофлуоресцирующие вещества
62, 64
Аденозиидифосфат 183, 316
Адеиозиитрифосфат 183, 316
Адеиозинтрифосфатаза (АТФаза)
24, 183
— методы выявления 227—229
Адреналин 41, 254
— выявление 260, 265
Адъювант Фрейнда 306
Азокраситель 68, 160
Азот жидкий 13, 19, 27
Азур А, растворы 123
Азур В, краситель 313
Акридиновый желтый 120
— оранжевый 120
Акролеин 52, 98
Ализарин 268, 272
Аллоксан 70
Аллоксаи-Шифф-реакция 85
Альдегиды 35
Альдегидные группы 69, 70, 73,
103, 111, 132, 159
Альциановый зеленый 121
— синий 121, 122, 135, 136
Амилаза 304
Аминогруппы 36, 40, 62, 67—69,
124
— выявление 85
Аминокислоты 44, 53, 59, 67, 69,
252, 315
Аминопептидазы 202
Ампливал, фотометрия 307
Аити-у-глобулии меченый 299, 300
Антиген, выявление 297, 299, 300
— ультраструктурные методы
303, 304
Антигеи—антитело, выявление
299
— комплексы 297, 300, 301
— реакция 297
Антитела, локализация 299
— ^мостиковый» метод 303
— свойства 298
— специфические, титр 299
Аргинин 59, 67, 76, 86
Арилгидразии, флуорометрия 129
Аскорбиновая кислота 64,128,129
Астрасииий, окрашивание 61, 116,
122 *
Ацетальфосфатиды 102
Ацетилирование 62, 115, 132
Ацетилхолин 254
Ацетилхолинэстеразы 193
— в моторных концевых пластин-
ках 288
— метод выявления 234
Ацетон 50
Базальная мембрана, антигены
304
Базофилия 54, 61, 66
— выявление 54, 93, 94, 116, 122
Базофильные клетки 92
Бальзам нейтральный 55
БАО [бис-(4-амииофеиил)-1,3,4-ок-
сидазол] 96
— выявление ДНК 104
— флуорохромироваиие 94, 96,
104
Барий 120, 121
Белки 60, 65—92
— гистохимический анализ 60
Предметный указатель 333
Белки
— методы выявления 84
— фиксация 44, 45
Бензилиденовая реакция 75
Бензоилирование 61
Бензофлавин 120
Берлинская лазурь 54
----выявление 269
---- реакция 121
Биогенные амины 17, 40
— гистохимическое выявление
252, 253, 255
----методы 260
Бромирование 63
Буфер 33, 37, 38
— ацетат-уксуснокислый 319
— веронал-ацетатный 320
— какодилатный 38, 319
— Na-малеатный 321
— трис-НС1 322
— трис-малеатный 321
— фосфатный 37, 38, 322
Вакуум 20
Вакцина противогриппозная 125
Вандерваальсовы силы 119
Вещества, выявление 54
— классы, гистохимический ана-
лиз 57—59, 65
—разделение 9
Вибратом 29, 263
Вибрион холерный 126
Висмут 121
Витамин С 128
Влага, остатки 13—15
Возбуждение, время 308
Восстановление 73, 129, 157
Высушивание 13, 29
— методика 13
«Выцветание» 286
Р-Галактозаминидаза 125
Галло цианин-хромовые квасцы
48, 94, 98, 99, 105, 106, 313, 317
Ганглиозид 61, 142, 146
Р-Гексозаминидаза 125
Гематеин кислый 58, 62, 63
Гемосидерин 246, 247, 251
Гиалиновый хрящ 125
Гиалуронидаза 61, 125
— переваривание 125
Гиалуроновая кислота 61, 125
Гидроксиадипинальдегид 52
Гидроксильная группа реакцион-
носпособная 115, 116
Гидроксильные группы 36, 42, 62,
132
Гидролазы кислые 177
Гидролиз солянокислый 96, 97,
101, 103, 314
— ферментативный 101, 103, 137
Гидроокись железа коллоидная
121
Гидрохинон 291
Гипофиз, передняя доля 92
Гистамин 253
Гистидин 36, 67, 68, 253
— выявление 73
Гистология 9
Гистон 317
Гисторадиоавтография 278
Гистотопохимия 7
Гистохимия 7
— задачи 7
— методы 11
— этапы развития 9
Гликоген 22, 23, 44, 46, 61, 108
— выявление 126,131,132,139,140
— контрастирование 130
— ферментативный гидролиз 141
Гликолипиды 59, 61—63, 109
1,2-гликоль 116
Гликольные группы 124
Гликопротеиды 59, 109
Глиоксаль 52
Глиоксиловая кислота, метод кон-
денсации 260
Глицерин—желатина 55
Глицеролипиды 142, 144
у-Глобулиновая фракция 297
Глубокое замораживание, методы
11
Глутаральдегид 31, 36, 37, 46, 52,
53, 226, 260, 302
Глюкоза, выявление 128
Глюкозо-6-фосфатаза 186, 187
у-Глюкуронидаза 125, 199
— метод азосочетания 238
Глюку роиоаминогликан 118
Гольджи комплекс 226, 232
Гомогенизация, методы 8
Гуанидиновые группы 36, 67, 76,
124
334 Предметный указатель
Гуммиакация 49
Гуммиарабик 39, 49
Дапсил 298
Двойные связи 40
ДДТ-реагент 80
— реакция 90
Дегидрогеназы 24,49,209, 212, 213
Дезаминирование 70
Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза)
59, 94
— методы экстракции 106
Дезоксирибонуклеиновая кислота
(ДНК) 46, 54, 59, 92—94, 97
----выявление 98—101,
103—105, 312—315
Демаскирование липидов 52
Деметилированные срезы 124
Депарафинирование 16, 56
Деполимеризация 100
Десмогликоген 126
Десульфатирование 124
Диазониевая реакция 257
------ метод 261
Диазония соли 68, 115, 160, 261
Диазосочетания реакция 257
— для аргентаффинных кле-
точных гранул 261
Диазотирование 68, 72, 302
Диальдегид 37, 38
3,3-диаминоазобензидин 303, 305
Диастаза 61, 128
Диафоразы 24
Диахром 298
Диизоцианат, соединения 302
Диметиламинобензальдегид-ни-
трит, реакция 87
Диметиламинобензилиденрода-
мин, метод 269
Диметилглиоксим, метод 269
Диметилсульфоксид 30
Динитрофторбензол, реакция 58,
66, 68, 84
Диортоанизидин тетраазотиро-
ванный 91
Дисульфидные группы 44, 67
Дитизоновый метод 270
Дифенилкарбазйдный метод 269
2,4-дихлор-1-нафтол 77, 90
Диэтилдитиокарбаматный метод
268
пщ-Дифтор-мди'-динитрдфенил-
сульфон 302
ДМАБ-реагент (п-диметиламино-
бензальдегид) 73
Дофамин 254
Железо 54, 61, 267, 317
— коллоидный раствор 61, 121
— реакции связывания 120, 121
Железный гематоксилин, метод
166, 167
Жирные кислоты 41, 61, 141, 143,
153, 158
—- — метод выявления 170
Жиры нейтральные 47
Заключение, среды 54, 55
Заливка 15, 55, 56
Замещающие жидкости 16, 17
Замещение в замороженном со-
стоянии 21—23, 44
Замороженные срезы 25, 54
Золото, хлЬрид 120
Излучение, энергия 278, 279, 292,
317
Изоэлектрическая точка 33,36, 40,
Изопентан 13, 16, 19, 27
Изопропиловый эфир 15
Изотиуроний 121
Изотония 33
Изотопы 279
Ильфорд-эмульсии 293
Имидазольные группы 67, 68
Иминогруппы 36
Иммунизация 298
Иммуногистохимия 10, 297, 302,
303
— электронно-микроскопическая
301
Иммунофлуоресценция 264
Иммуноглобулин, «мостиковый»
метод связывания с ферментом
303, 304
— мультиреакТивность 303, 304
Иммунологическая чистота 298
Инактивация 49
Ингибиторы маркирующие 287,
288
Индоламин 253, 265
'Предметный указатель 335
Индольная конфигурация 67
Интерференционная микроскопия
66, 309, 316, 317
Интерферометрия 316
Иод-цитрат свинца, метод контра-
стирования 130
Иодная реакция 127
Иодная кислота 62, 111—115, 127,
131—133
----парадиамин, ИКП-метод
132, 133
----псевдо-Шифф-реакция 114
Иодная кислота—тиокарбогидра-
зид—OsO< (ИКТО-реакция) 130
Иодная кислота—тиокарбогидра-
зидпротеинат серебра (ИКТС—
протеинат-реакция) 130
Иодная кислота—хромовая кис-
лота — метенамин — серебро
130
Ионизация 117
Ионная сила 66 -
Ионы алюминия 120
Калий 267
— бромид 291
— выявление 269
— гексаоксиантимонат 276
— гексацианоферрат 270, 271
— перманганат ИЗ
— хромат 41
Кальций 267, 317
Карбовакс 15, 47
Карбоксильные группы 36, 42, 67,
70, 71, 114, 121—124, 137
—алкилирование 124
----метод выявления с ангидри-
дом 86
----связанные с белком 70, 71,
86, 123
Карбонильные группы 161
Карбоновые кислоты ненасы-
щенные 248
Кармин по Бесту 127, 139, 140
Каротиноиды 64, 244, 249
Катехоламины 253, 254, 261—263
Кератинсодержащие структуры 92
Кетоны 72
Кетостероиды 143, 160
Кислотно-основная природа 65
Кислотные группы 54, 108, 109
Ковалентные связи 302
Количественная гистохимия 8, 9,
100, 307, 310—316
Количественная радиоавтография
286—288
Коллидиновый буфер, пригото-
вление 243
Комплексы, образованне 41, 47
Комплемент 300
Конденсация, метод выявления
биогенных аминов 255—257,260
Контрастирование 53, 54, 101, 121,
130, 161
Конъюгация антител и ферментов
302, 303
Корифосфин 120
Красители 104, 105, 146, 150, 315,
318
— жирорастворимые 149
— основные 46, 123, 313
Крезилвиолет 98, 313
Криостат 26—29, 54—66
Криоультрамикротомия 30, 31
Кротональдегид 52
Ксантгидрольная реакция по Лил-
ли 75
м-Ксилолдиизоцианат 302
Ламберта—Бэра закон 309
Лед сухой 12, 21
Лизни 59, 68
Лизосомы 226, 243, 248
Лиогликоген 126
Лиофильная сушка 12—18, 44, 49,
264
Липиды 15,24,36,39—41,54,57,62,
141—171
— гистохимическое выявление 63,
150, 152, 153, 162
— классификация 142, 143
— маскированные 62, 142, 159
— методы 163—171
— принципы реакции 151—161
— фиксация 47, 48
— характеристика 142, 143
— экстракция 151
Липоиды 141
— стабилизация 31, 32
Липофусцин 244, ,247, 248, 317
— методы выявления 250—252
336 Предметный указатель
Магний 269, 317
Маркирование ферментов 302
Масляный красный 62, 63,150,163,
164
Межмолекулярные связи 119, 120
Мелании 53, 247—249
— методы выявления 250—252
Метакрилат 15
Метакролеин 52
Металлы 266, 267, 317
— выявление 268—270
— методы 288—294
— реакции связывания кол-
лоидных металлов 120, 121
Метанол 123, 124
Метафосфат 120
Метахромазия 59, 60, 61, 117—120,
124
— истинная 119
— лабильная в отношении к спир-
ту 119
— ложная 119
— отрицательная 119
Метахромотропия 116
Метиленовые мостики 35, 36, 259
Метиленовый синий 59, 82,98,117,
123, 313, 314
— экстинкция 66, 117, 123
Метилиодид 123, 124
Метилирование мягкое 124
Метиловый зеленый—пиронин
57, 59, 99, 100, 291
Метилтриоксифлуоренон 97
Микрорадиоавтография 284, 285
— артефакты 286
— предварительная обработка
ткани 285
Микроскопическая гистохимия 7
— морфология 8, 9
Микроспектрофотометр 307
Микроспектрофотометрическая
оценка 91, 100, 102, 307
Микротом 11
Микрофотометры 287, 307
Миллона реакция 66, 72, 87, 317
Молибдат аммония 97
Моноальдегиды 37
Моноамииоксидаза 217, 218
— метод выявления 241, 242
Монометил-п-аминофенолсуль-
фат 291
Мореля—Сисли реакция 72
Муковидные вещества кислые 116
-----выявление 116, 137, 138
-----нейтральные 116
-----иесульфатированные 122
-----растворимые 119—121
-----удаление с помощью фер-
ментов 125, 137, 138
Мукополисахариды 44—46, 61
— выявление 131—141
— кислые 45, 46, 59, 109, 118, 125
— нейтральные 108, 109
Мукопротеиды 59, 109
Муцины в соединительной ткани
121, 122
Надмуравьиная кислота 81, 91
НАДФ-тетазолий редуктаза 51
Натрий 317
— выявление электронно-микро-
скопическое 275
а-Нафтол $9, 75, 90
Негомогенность оптическая 310
Нейраминовая кислота 61, 146
Нейраминидаза 61
Нейромедиаторы 198
Неорганичесяие вещества 54, 57,
266—268, 270
-----гистохимические методы
выявления 267—277
Нильский синий 62
Нингидрин 70
Ниссля тельца 73
Нитробензоилхлорид 69
Нонан 15
Норадреналин 41, 254
— выявление 260, 265
Нуклеазы 106, 107, 314
Нуклеиновые кислоты 24, 40, 41,
46, 48, 53, 57, 58, 60, 61, 66,
92—108, 157, 313—315, 31?
-----количественное выявление
311
-----методы выявления 101,
103—116
-----ультрагистохимия 94, 101
-----фиксация 46
Нуклеозиддифосфатаза 188, 232
Нуклеопротеиды 42
5'-нуклеотидаза 24
Нуклеотиды 316
Предметный указатель 337
Обезвоживание 55
Однолучевой метод 287, 307, 308
Окисление 49, 120
— контрольная реакция для уста-
новления специфичности 115,
116
— методы 111—116
— средства 122, 113
Оксидоредуктазы 51, 208—218
Окситирамин 41, 253, 262
Окситриптамин 253
Окситриптофаи 253
Оксихолин 270
Омыление 116, 124
ORWO Кб эмульсия 292, 294
Ортохроматическое окрашивание
116, 117, 313
Осаждение 298
Осмия четырехокись 24,32,39—41,
161, 168
Основные красители 122, 123
О-сульфатные группы 124
Парарозанилин 131, 225, 233, 238
Парафин 14—16, 23, 24, 47
Параформальдегид 240, 242, 262
Пектин 128
Пектиновая кислота 128
Пельтье элемент 15
Пептиды 109, 112, 260
Перекись водорода 303
Пероксидаза хрена 218, 242, 302
Перфузия, фиксация 30, 34, 41
pH 33, 38, 58, 66, 313, 314
Пигменты 58, 244—252, 317
Пикриновая кислота 45
Пиридин 86, 89, 116, 317
Пиримидины 92, 93
Пиронин 59, 99, 100
Плазма левая реакция 96, 171
Плазмалоген 159
Полисахариды 41, 44, 61, 66, 108,
246
Полисахаридно-белковый ком-
плекс 129
Полиэтиленгликоль 47
Полупроницаемые мембраны, ме-
тод 219
Поляризационная микроскопия
10, 66
Порфирин 64
Протаргол 130
Протеазы 66, 67
Прочный зеленый 59, 317
Прочный синий В 70
Птеридин 64
Пупочный канатик 125
Пурины 92, 93, 95, 96
Радиоавтография 10, 278, 283—285
— сэндвич-метод 292
— физические основы 278—280
— фоточувствительные мате-
риалы 280, 281
— целого животного 284
— экспозиция 281
Радиоактивные вещества, водора-
створимые 288
Резак 29
Рентгеногистоспектроскопия 317
Рефлектометрия 309
Рибонуклеаза 61, 94, 105—107, 127
РНК 59, 94, 100—103, 105, 314, 317
Родамин В 297
Родизонатный метод 269
Розиндольная реакция 74
Ртутный оранжевый 77
Ртуть 42, 72, 301
Рубеановодородная кислота 268
Сахароза 33, 44
Серебрение 253, 257
Серебро 317
— галогенид 292
— методы 129
— подсчет зерен 286, 287
— протеинат 130
Сернистая вода 85, 102, 131, 314
Серотонин (5-окситриптамин) 253
Сиалидаза 61, 125
Сиаловая кислота 125
Сиаломукоид 125
Сиаломуцин 61
Синтетические смолы 55
Соляная кислота 94, 106, 107
Стероиды 63, 143
Субстратная пленка 219
< Судан черный В 59, 62, 163
-Суда новые красители 54, 57, 62,
150
Сукцинатдегидрогенеза 24, 239
Сульфгидрильные группы 36, 42,
338 Предметный указатель
59, 68, 79, 90, 124, 250
Сфингозин 145
Сфинголипиды 144
Сфингомиелин 145, 153, 157, 158
Съемная пленка, метод 289—292
Тетраацетат свинца 114
Тетразолий, соли 209, 210, 239
— метод 256
Тетразониевая реакция 69
Тиаминпирофосфатаза 187, 231
Тиокарбогидразид 130
Тионилхлорид 123, 124
Тионин 117, 119
Тиосемикарбазиды 129
Тирамин 253
Тирозин 36, 67, 68, 72, 87, 124, 253,
317
Тирои 231
Ткань предварительная обработ-
ка 11
— сморщивание 35, 44
— набухание 35
Толуидиновый синий 58, 98, 117
Толу о л-2,4-диизоцианат 302
Топохимия 7
Торий 121
Точечный метод измерения 309
Триглицериды 63, 142, 143
Трипсиноген 304
Триптамин 73, 253
Триптофан 36, 37, 73, 87, 88, 124,
253, 317
Трихлоруксусная кислота 94
Турнбулевая синь 269
Турчини метод 97
Тяжелые металлы, выявление 54
---маркирование • 301, 302
Углеводы 54, 108—141
— выявление 111, 129—141
— классификация 108—110
Уксусная кислота ледяная 44
Уксусный ангидрид 116
Ультрафиолет, поглощение 317
Уран 301
Уранил, ионы 302
Уранилацетат 41, 101
Уроновая кислота 122
Фенилаланин J6, 254
Ферменты 48—51, 171—244
— выявление 172—174
— гидролитические 177
— действие 101, 104, 137
— лизосомные 220, 221
— маркирование 302
— методы экстракции 101
— окислительные 208—218
— переваривание 101, 104, 137
— разделение 9
— стабилизация 50, 51
— электронно-микроскопическое
выявление 38
Ферритин, маркирование 301, 302
Фёльгена реакция 54,94,95,97,101,
102.311,314,317
Фиксация И, 12, 31, 32
— в парах 34
— погружением 34
— условия 37
фиксирующие агенты 31, 32
---для белков и полисахаридов
44
--------нуклеиновых кислот
и липидов 48
--------ферментов 50, 51
Флуоресцеин 298
Флуоресцентная микроскопия, ме-
тоды 10, 62, 63, 103, 247, 259
Флуоресценция 259
Флуоресцирующие антитела, ме-
тод 297, 298
Флуорохромирование 96
— липидов 165
— метод 103
Формальдегид 31, 32, 35, 36
— конденсации 258, 261, 262
Фосфатаза неспецифическая кис-
лая 24, 50, 180—182
— в культуре ткани 50
— методы 223—227
Фосфатаза щелочная 24, 50
— метод 221, 222
Фосфатные группы 124
Фосфолипиды 62, 63, 152, 156
— методы' выявление 166, 167
Фосфомоноэстеразы 177
Фосфорная кислота 97, 98
Фталоцианин меди 121, 122
Предметный указатель 339
Хлорная кислота 94
Цереброзиды 61. 142, 145, 146
Цистеин 67, 107
Цистин 67, 92
Цитофлуориметр 307, 308
Цитохромоксидаза 49, 51,215, 216,
240
ШИК-реакция 54, 59, 111, 113, 247
Шиффа реактив 101, 103, 131, 314
Шульца метод 63
Экстракция, методы 104, 146, 147,
167
Электролиты, влияние 122
Электрофорез 9, 53
Эмульсии 282
Эстеразы 188, 190, 191
— методы выявления 194,195,233
Ядерный прочный 268
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие редактора перевода............................. 5
Предисловие................................................ 6
1. Введение................................................ 7
1.1. Предмет и задачи гистохимии....................... 7
1.2. Этапы развития гистохимии......................... 9
2. Методы гистохимии....................................... ц
2.1. Методы консервирования ткани .................... 12
2.1.1. Замораживание—высушивание (лиофильная сушка) 12
2.1.2. Замещение в замороженном состоянии .......... 21
2.1.3. Получение замороженных срезов ............... 25
2.1.4. Использование криостата ..................... 26
2.1.5. Резак для ткани, вибратбм.....*.............. 29
2.1.6. Криоультрамикротомия......................... 30
2.1.7. Химическая фиксация.......................... 31
2.2. Гистохимическое выявление........................ 53
2.2.1. Типы реакций................................. 53
2.2.2. Примерный план гистохимической процедуры ... 54
3. Гистохимическая диагностика веществ.................... 57
3.1. Гистохимический анализ отдельных классов веществ 59
3.1.1. Белки........................................ 59
3.1.2. Нуклеиновые кислоты.......................... 59
3.1.3. Углеводы......................, . ........... 61
3.1.4. Липиды....................................... 62
4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов .... 65
4.1. Белки........................................... 65
4.1.1. Характеристика белков на основе их физико-химиче-
ских и биологических свойств........................ 65
4.1.2. Специфические гистохимические методы выявления
белков.............................................. 67
4.1.3. Блокирование и превращение реакционноспособных
групп в белках...................................... 82
Оглавление '• 341
4.1.4. Электронно-микроскопическое выявление белков
4.1.5. Методы выявления белков...................
42. Нуклеиновые кислоты...........................
4.2.1. Выявление пуриновых и пиримидиновых оснований
по УФ-поглощению.................................
4.2.2. Реакции выявления углеводного компонента ....
4.2.3. Реакции выявления фосфорной кислоты.......
4.2.4. Выявление нуклеиновых кислот с помощью специфи-
ческих ферментов и химической экстракции.........
4.2.5. Эледтроино-микроскопнческое выявление нуклеи-
новых кислот.....................................
4.2.6. Методы выявления нуклеиновых кислот.......
4.3. Углеводы......................................
4.3.1. Классификация углеводов...................
4.3.2. Гистохимические методы выявления углеводов . .
4.3.3. Электронно-микроскопическое выявление углеводов
4.3.4. Методы выявления углеводов................
4.4. Липиды............ ...........................
4.4.1. Классификация липидов.....................
4.4.2. Свойства отдельных групп липидов..........
4.4.3. Гистохимическое выявление липидов.........
4.5. Ферменты......................................
4.5.1. Разделение ферментов......................
4.5.2. Общие основы гистохимии ферментов.........
4.5.3. Гидролазы.................................
4.5.4. Трансферазы...............................
4.5.5. Карбоангидраза (КФ 4.2.1.1)...............
4.5.6. Оксидоредуктазы...........................
4.5.7. Выявление ферментов с использованием субстратной
пленки и полупроницаемых мембран............
4.5.8. Методы гистохимического выявления ферментов .
4.6. Пигменты................................ у
4.6.1. Меланнн...................................
4.62. Гемосидерин ..............................
4.6.3. Лишщные пигменты..........................
4.6.4. Методы выявления пигментов................
4.’7. Биогенные амины..............................
4.7.1. Свойства, классификация и распространение ....
4.7.2. Гистохимическое выявление биогенных аминов . .
4.7.3. Методы гистохимического выявления биогенных
аминов...........................................
4.8. Неорганические вещества.......................
4.8.1. Методы гистохимического выявления неорганиче-
ских веществ.....................................
83
84
92
93
95
97
101
101
101
108
108
111
129
131
141
142
142
146
204
207
208
219
221
244
245
246
248
250
252
253
255
260
266
267
5. Радиоавтография ..................................... 278
5.1. Физические основы............................... 278
5.2. Фоточувствительный материал, экспозиция......... 280
5.2.1. Фоточувствительный материал................. 280
5.2.2. Экспозиция.................................. 281
342 Оглавление
5.3. Получение радиоавтографов......................... 283
5.4. Радиоавтография биологических'объектов............ 283
5.4.1. Радиоавтография целого животного.............. 284
5.4.2. Микрорадиоавтография.......................... 284
5.4.3. Метод съемной пленки и метод погружения .... 289
5.5. Применение радиоавтографии........................ 296
б. Иммуногистохимия........................................ 297
6.1. Методы выявления комплекса антиген—антитело с по-
мощью флуоресцентного микроскопа................. 299
6.1.1. Прямая локализация антигена.................. 299
6.1.2. Прямая локализация антител............... 299
6.1.3. «Сэндвич»-метод.......................... 299
6.1.4. Методы иммунофлуоресценции с использованием
комплемента........................................... 300
6.2. Электронно-микроскопическая иммуногистохимия . . . 301
6.2.1. Маркирование тяжелыми металлами и ферритином 301
6.2.2. Маркирование ферментом................... 302
6.3. Применение иммуногистохимии.................. 304
7. Количественная гистохимия.......................... 307
7.1. Цитофотометрия............................. 307
7.1.1. Микрофотометры............................ 307
7.1.2. Гистохимические предпосылки................... 309
7.2. Количественная гистохимия нуклеиновых кислот. ... 311
7.2.1. Количественное исследование нуклеиновых кислот
с помощью ультрафиолетовой микроепектрофотоме-
трии.......................>...................... 311
7.2.2. Количественное определение ДНК и РНК при окра-
шивании основными красителями ........... 312
7.2.3. Количественное определение ДНК по реакции Фёль-
гена........................................... 314
7.3. Количественная гистохимия белков............ 315
7.3.1. Определение белков по поглощению в ультрафиоле-
товом свете..................................... 315
7.3.2. Определение белков с помощью автофлуоресценции 316
7.3.3. Определение белков с помощью интерферометрии 316
7.3.4. Определение белков с помощью реакций окрашива-
ния . ........................................... 317
8. Буферные смеси..................................... 319
ОД М ацетат-уксуснокислый буфер, pH 3,5—5,6 ...... 319
Маточный раствор................................. 319
0,05 М какодилатный буфер, pH 5,0—7,4............. 319
Маточный раствор................................. 319
Веронал-ацетатиый буфер, pH 2,62—9,16............ 320
Маточный раствор................................ 320
Оглавление 343
0,05 М mpuc-малеатный буфер, pH 5,2—8,6........... 321
Маточный раствор................................. 321
0,05 М Na-малеатный буфер, pH 5,2—6,8............. 321
Маточный раствор.................................. 321 .
0,05 М mpuc-HCl буфер, pH 7,19—9,10............... 322
Маточный раствор............................... 322
0,1 М фосфатный буфер, pH 5,7—8,0................ 322
Маточный раствор................................. 322
Список литературы..................................... 323
Предметный указатель..............................
332
X. Луппа
основы гистохимии
Ст. научный редактор Е.А. Яновская
Мл. научный редактор О. А. Горгун
Художник В. С. Стуликов
ХудожественшЙ редактор Б. Н. Юдаин,
Технические редакторнН. И. Борисова, М. А Страшном
Корректор М.П. Левченко
ИБ № 1877
Сдано в набор 18.06.79.
Подписано к печати 25.12.79.
Формат 84 х Юв’/зг-
Бумага офсетная № 1.
Гарнитура тайма Печать офсетная.
Объем 5,38 бум. л. Усл. печ. л. 18,06.
Уч.-изд л. 17,79 Изд № 4/0381
Тираж 12000 экз. Зак. 235. Цена 1 р. 30 к.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
'Москва, 1-й Рижский пер, 2.
Можайский полнграфкомбинат Союзполиграфпрома
при Государственном комитете СССР по дедам издательств,
полиграфии и книжной торговли.
г. Можайск, ул Мира. 93.