Text
                    

PLANT VIROLOGY R.E.F Matthews Department of Cell Biology University of Auckland Auckland, New Zealand ACADEMIC PRESS New York and London 1970
R МЭТЬЮЗ ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ Перевод с английского В. К. Випшиченко, А. А. Кричевской, И. П. Родионовой и Н. Д. Шаскольской Под редакцией и с предисловием пр оф. И. Г. Атабекова ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР» МОСКВА 1973
УДК 576.858.8 Современное исчерпывающее руководство по вирусам растений. Автор рассматривает методы обнаружения и выделения вирусов и их компонентов; структуру вирусных частиц; изменчивость и реп- ликацию вирусов растений; их передачу от одного растения другому; различных переносчиков; типы вирусных болезней; системные пора- жения; цитологические и биохимические изменения, происходящие в зараженных вирусом растениях; проблему инактивации вирусов; экологию вирусов и их экономическое значение; меры борьбы с вирус- ными болезнями; проблему номенклатуры вирусов и теории их про- исхождения. Предназначена для вирусологов, фитопатологов, микробиоло- гов, генетиков, биохимиков, физиологов растений, семеноводов, селекционеров, энтомологов, эпидемиологов, а также для студентов и преподавателей биологических факультетов и сельскохозяйствен- ных институтов. Редакция биологической литературы 2102-127 © Перевод на русский язык, «Мир», 1973 г. 041(01)-73 Р. Мэтьюз ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ Редактор И. А. Сысина. Художник В. И. Кейдан. Художественный редактор Ю. Л. Максимов. Технический редактор А. Г. Резоухоза Сдано в набор 8/П 1973 г. Подписано к печати 27/VI 1973 г. Бумага тип. Ni 1 70xl081/u“21,5 бум. л. Усл. печ. л. 60,20, в т. ч. 7,35 печ. л. иллюстр. на мелов. бум. + 2 вкл. цвети. Уч.-изд. л. 61,05. Изд. М 4/6169. Цена 5 р. 87 к. Темплаи изд-ва «Мир», 1973 г. Пор. АЛ 127. Тираж 4300 экз. Зак. 0803 ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР» Москва, 1-й Рижский пер., 2 Ордена Трудового Красного знамени Московская типография АЛ 7 «Искра революции» Союзполиграфпрома при Государственном комитете Совета Министров СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. Москва, К-1, Трехпрудный пер., 9'
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ Известно, что история вирусологии началась с открытия вируса табачной мозаики (ВТМ). Таким образом, зарождение вирусологии связано с вирусом растений, который наряду с некоторыми другими вирусами сыграл важную роль в раинии период развития этой науки. Можно считать, что этот перво- начальный период продолжался примерно до конца 50-х годов, когда началось бурное развитие вирусологии, продолжающееся и поныне. Однако важнейшие достижения этого второго периода связаны отнюдь не с виру- сами растений. Главная роль принадлежала здесь вирусам животных и бактериофагам., В настоящее время о вирусах растений известно гораздо меньше, чем о бактериофагах и вирусах животных, что как будто бы находится в явном противоречии с объемом книги, предлагаемой читателю. Впрочем, противо- речие это кажущееся. Дело в том, что сейчас идет бурный процесс накопле- ния фактов, касающихся вирусов растений. Эта информация, и без того весьма обширная, растет подобно снежному кому. Такое ^сравнение в зна- чительной степени оправдано еще и некоторой бессистемностью усилий в данной области вирусологии, в частности преобладанием работ чисто опи- сательного и прикладного характера. Предлагаемая читателю монография Р. Мэтыоза — пример умелого обобщения и систематизации обширного и порой очень разноречивого мате- риала, накопившегося в области исследования вирусов растений. Р. Мэтьюз широко известен своими научными публикациями и поль- зуется большим и заслуженным авторитетом среди вирусологов всех на- правлений. В этой'книге ему удалось с исключительной полнотой'/изложить самые разнообразные вопросы и, в частности, проблемы прикладной'вирусо- логии и фитопатологии. Пожалуй, именно исчерпывающая полнота в изло- жении фактов, касающихся самых разных аспектов исследования вирусов растений, составляет основную ценность этой книги, которая окажется весьма полезной специалистам в различных областях биологии и сельского хозяйства. И. Г. АТАБЛКОВ

ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА Как и во многих других областях биологии, наши знания о вирусах растений и вызываемых ими болезнях в последние годы быстро развиваются. В связи с этим возникла необходимость в появлении нового руководства, охватывающего все стороны этой проблемы. Эта книга написана в первую очередь для студентов, специализирую- щихся в области фитопатологии, изучения вирусов растений, общей вирусо- логии и микробиологии, а также для преподавателей и научных работников. Мы надеемся, что она будет полезна в качестве справочника и для исследова- телей, изучающих смежные области науки — молекулярную биологию, биохимию, физиологию растений и энтомологию. Мы пытались хотя бы частично охватить все стороны проблемы, что представляет большие трудности, если учесть широкий круг смежных дис- циплин. В первой главе приводится краткий исторический обзор достижений в области изучения вирусов растений, ио в целом подход не является исто- рическим. Тем, кого интересует история вопроса, мы рекомендуем обра- титься к ранее вышедшим руководствам. В книге освещаются следующие вопросы: структура вирусов и вирус- ных компонентов; репликация вирусов; макроскопические, цитологические и биохимические проявления воздействия вирусов на растение-хозяина; характер мутационного процесса вирусов; взаимоотношения вирусов с пере- носчиками, относящимися к типу беспозвоночных, а также вопросы, свя- занные с экологией и контролем. На протяжении всей книги мы пытались показать, как прогресс в любой узкой области знаний зависит от разработки и применения соответствующих экспериментальных методов. Специфические детали методологии здесь не приводятся, поскольку они описаны в других изданиях. Рассматриваемый нами предмет охватывает столь широкий круг вопро- сов и столь расширился, что было бы невозможно процитировать в книге такого размера все имеющиеся статьи по каждому из интересующих читателя вопросов. Как правило, мы ссылались на ранее вышедшие работы в этой области, имеющие большое значение, а также на наиболее важные или наи- более хорошо иллюстрированные работы последнего времени. Это должно помочь читателю быстро найти нужную ему литературу по любому из отно- сящихся к этой области знания вопросов. Мы считаем, что в руководстве по проблеме, охватывающей большое число научных дисциплин, наиболее важным является иллюстративный материал, особенно для студентов и для начинающих исследователей. Поэтому мы старались при поддержке мио-
8 Предисловие автора гих коллег как можно лучше подобрать рисунки и фотографии, которые служили бы ярким дополнением к тексту. В некоторых областях, особенно в области молекулярнобиологических основ репликации вирусов, наши знания о вирусах растений отстают от знаний о вирусах животных и бактерий. Поэтому мы заимствовали информа- цию о двух последних типах вирусов там, где это представлялось наиболее целесообразным, чтобы создать как бы платформу для рассмотрения более отрывочных данных о вирусах растений. Одним из последних открытий, позволивших поставить ряд новых вопро- сов, было установление того факта, что некоторые болезни, возбудителями которых ранее считались нестабильные вирусы, весьма вероятно, вызы- ваются организмами типа микоплазм. Хотя, как правило, мы не включаем в наше описание болезни, вероятность участия в возникновении которых подобного рода организмов представляется высокой, одна глава о возбуди- телях, вызывающих заболевания, подобные вирусным, посвящена в основ- ном рассмотрению|роли таких организмов в фитопатологии. Результатом других работ последнего времени, представляющих значительный интерес, явилось открытие того, что генетический материал некоторых вирусов расте- ний распределен между двумя или более вирусными частицами. В связи с этим мы посвятили одну главу рассмотрению дефектных вирусных частиц, зависимых вирусов и многокомпонентных вирусов. Мы придерживались списка названий вирусов растений, опубликован- ного Микологическим Институтом в Англии в 1968 г. [1164], и не пытались описывать отдельные вирусы или вирусные болезни систематически или всеобъемлюще. Поэтому упомянутый список следует рассматривать как цен- ное приложение к настоящему руководству, особенно для тех, кто интере- суется весьма обширной литературой по фитопатогенным вирусам. В последней главе мы кратко описали различные мнения, касающиеся ' номенклатуры и классификации вирусов. Поскольку, согласно давно суще- ствующей точке зрения, классификация вирусов должна учитывать их про- исхождение, некоторое место мы уделили рассуждениям по этому вопросу.
ГЛАВА I ВВЕДЕНИЕ Как и в любой другой отрасли экспериментальной науки, развитие наших знаний о вирусах растений тесно связано с существующими методами их исследования. В настоящей главе мы кратко обрисуем достижения в этой области и суммируем наиболее важные аспекты исследований последнего времени. Хотя около семидесяти лет назад вирусные болезни растений еще не выделялись в самостоятельную группу, отличную от других инфекционных заболеваний, имеются гораздо более ранние сообщения, которые в настоя- щее время можно рассматривать как указания на существование вирусных инфекций. Например, на цветной вклейке 1, А изображены цветки тюль- пана с симптомами пестролепестности, характерными для вирусной инфек- ции. В то время пестролепестные тюльпаны высоко ценились как особые разновидности. В конце XIX в. утвердилась мысль о том, что инфекционные болезни вызываются микроорганизмами, и появились фильтры, задерживаю- щие возбудителей известных бактериальных заболеваний. Майер [1193] описал заболевание табака, названное им мозаичной болезнью. Он показал, что эта болезнь может быть передана здоровым растениям путем инокуляции их соком больных растений. Ивановский [857] установил, что сок растений табака, пораженных описанной Майером болезнью, оставался инфекцион- ным после того, как был профильтрован через бактериальный фильтр, хотя и не содержал бактерий. Это сообщение Ивановского не привлекло большого внимания, пока те же опыты не были повторены Бейеринком [141]. Баур [89] показал, что инфекционный хлороз абутилона может передаваться путем прививки, но не передается механической инокуляцией. При описании воз- будителей, вызывающих эти болезни, Бейеринк и Баур использовали термин «вирус», чтобы противопоставить этих возбудителей бактериям. В старых работах исследователи часто применяли этот термин как синоним термина «бактерии». По мере обнаружения все большего числа болезней такого рода неизвестных возбудителей стали называть фильтрующимися вирусами. В пе- риод между 1900 и 1935 гг. были описаны многие болезни растений, возбу- дителями которых считались фильтрующиеся вирусы, но поскольку в то время еще не существовало адекватных методов, позволяющих дифферен- цировать различные вирусы, положение оказалось очень запутанным. Важным шагом вперед явилось установление того факта, что некоторые вирусы могут переноситься от одного растения к другому насекомыми. Так, Смит и Бонке [1631] подтвердили ранее существовавшие предположения, что заболевание, называемое курчавостью верхушки сахарной свеклы, пере- дается цикадкой Eutettix tenella (Baker). Они показали, что одно насекомое, питавшееся на зараженном растении, способно передать инфекцию в резуль- тате лишь пятиминутной подкормки на здоровом растении. Однако в то время эти ученые еще не предполагали, что курчавость верхушки сахарной свеклы вызывается вирусом. На первых порах вирус определяли как инфекционное начало, способ- ное проходить через фильтры с достаточно мелкими порами, задерживаю- щими все известные до тех пор возбудители болезней, представляющие собой
10 Глава I клеточные организмы. Однако вскоре были обнаружены болезни, сходные но своим симптомам с вирусными заболеваниями; эти болезни не были свя- заны с каким-либо патогенным агентом, который можно было обнаружить с помощью светового микроскопа, и не передавались путем механической инокуляции. К возбудителям таких болезней нельзя было применить кри- терий фильтруемости. Инфекционная природа этих заболеваний была уста- новлена передачей путем прививки, а в некоторых случаях — насекомыми- переносчиками. Таким образом, оказалось, что некоторые болезни типа желтух и ведьминых метел (например, желтуху астр) на основании недо- статочно обоснованных данных стали рассматривать как вирусные. Только в самое последнее время тщательные электронно-микроскопические иссле- дования, а также применение ингибиторов ясно показали, что ряд считав- шихся ранее вирусными болезней в действительности вызывается агентами типа микоплазм [466]. На протяжении почти всего периода между 1900 и 1935 гг. внимание исследователей было сосредоточено на описании как макроскопических симптомов болезней, так и цитологических нарушений, обнаруживаемых с помощью светового микроскопа. Проводилось также изучение спектра растений-хозяев и способов передачи болезнетворных агентов. Были пред- приняты довольно безуспешные попытки улучшить методы фильтрации, чтобы иметь возможность более точно определить размеры вирусных частиц. Это были почти единственные аспекты проблемы вирусных инфекций, кото- рые можно было изучать с помощью существовавших в то время методов. Проводилось также исследование влияния различных физических и химиче- ских факторов на инфекционность вирусов, но методы тестирования инфек- ционного материала были примитивными. Холмс [814] показал, что местные поражения, возникающие у некоторых растений-хозяев в результате меха- нической инокуляции, могут быть использованы для быстрого количествен- ного определения инфекционности вируса. Этот способ значительно облег- чил изучение свойств вирусов и явился основой методов их выделения и очист- ки, появившихся несколько лет спустя. Почти до 1930 г. большинство ученых расходились во мнениях и суще- ствовала значительная путаница как в анализе болезней, вызываемых виру- сами, так и в вопросах, касающихся самих вирусов. Это не удивительно, так как о вирусах практически ничего не было известно, кроме того, что они очень малы. Значительным оказался вклад Смита [1626] в изучение этого вопроса, что помогло внести ясность в создавшуюся ситуацию. Работая с вирусными болезнями картофеля, он понял необходимость использования растений-индикаторов, т. е. растений других видов, чем картофель, кото- рые по-разному бы реагировали на вирусы, содержащиеся в картофеле. С помощью нескольких новых биологических методов разделения вирусов он смог показать, что многие вирусные болезни картофеля вызываются комбинацией двух вирусов с различными свойствами. Смит обозначил их как вирусы X и Y. Х-вирус картофеля не передавался тлей Myzus persicae (Sulz.),тогда какУ-вирус передавался. Таким образомСмит получил У-вирус, не содержащий примеси Х-вируса. Оба вируса могли передаваться иноку- ляцией иглой, но Смит обнаружил, что некоторые растения из семейства пасленовых устойчивы к У-вирусу. Например, при подобном введении смеси вирусов в растения дурмана (Datura stramonium) он смог получить Х-вирус, не содержащий примеси У-вируса. Кроме того, Смит наблюдал, что в зави- симости от источника Х-вируса степень жесткости вызываемых этим виру- сом симптомов значительно варьировала у различных хозяев. Вот цитата из работы Смита [1626]: «Таким образом, путаница, существующая в на- стоящее время в вопросе о мозаичных болезнях картофеля, вызвана двумя факторами. Во-первых, это до сих пор не подозревавшаяся двойственная
Введение 11 природа большого числа вирусных болезней мозаичной группы, поражаю- щих картофель. Во-вторых, это колебание вирулентности одного из вирусов этой группы, т. е. Х-вируса картофеля». Другим открытием, которому суждено было сыграть важную роль, явилась находка Била [133], обнаружившего, что растения, зараженные вирусом табачной мозаики, содержат какой-то специфический антиген. Грациа (671, 672] показал, что растения, зараженные разными вирусами, содержат различные специфические антигены. Честер [369] установил, что разные штаммы вируса табачной мозаики (ВТМ) и Х-вируса картофеля можно различить серологически, и разработал первую серологическую классификацию вирусов растений [370]. Как оказалось, серологические методы можно использовать для грубого определения концентрации вируса. Еще до выделения ВТМ Честер [367] на основании сравнительного определе- ния предельных серологических титров с использованием сока зараженных растений табака и некоторых очищенных невирусных антигенов установил, что ВТМ должен содержаться в соке табака в концентрации по крайней мере 0,1—1,0 мг на 1 мл. (Впоследствии было показано, что концентрация вируса в растениях с системным поражением составляет около 2—4 мг на 1 мл.) Высокая концентрация некоторых вирусов в зараженных растениях и их относительная стабильность сыграли решающую роль на первых этапах выделения и изучения химических свойств вирусов, так как методы экстрак- ции и очистки белков не были достаточно хорошо развиты. В 1926 г. Самнер [1704] выделил первый из ферментов — уреазу, получил ее в кристалличе- ском виде и доказал белковую природу этого фермента. Вскоре последовало выделение других ферментов. В начале 30-х годов исследователями в раз- личных странах были предприняты попытки выделить и очистить вирусы растений при помощи методов, сходных с методами, используемыми для ферментов. После проведения детальных химических исследований, позволивших высказать предположение о белковой природе инфекционного начала ВТМ, Стэнли [1663] сообщил о выделении этого вируса в кристаллическом состоя- нии. Сначала Стэнли [1663, 1664] считал, что этот вирус представляет собой глобулин, не содержащий фосфора. Примерно в то же время Бест [180] сообщил, что глобулиноподобный белок, обладающий вирусной активно- стью, осаждался из экстрактов зараженных листьев при подкислении. Боудэн и др. [130] выделили из зараженных ВТМ листьев нуклеопротеид, имеющий структуру жидкого кристалла и содержащий нуклеиновую кисло- ту, в которой углеводным компонентом была пентоза. Они показали, что вирусные частицы имеют палочкообразную форму, подтвердив тем самым более раннее предположение Такахаси и Роулипза [1738], основанное на обнаружении анизотропии в потоке у растворов, содержащих ВТМ. Бернал и Фаикухен [176] применили метод рентгепоструктурного апализа для иссле- дования очищенных препаратов вируса. Они получили точные данные о ши- рине частиц ВТМ и показали, что игловидные образования, формируемые при солевом осаждении вируса, характеризуются правильной упаковкой только в двух измерениях и поэтому их лучше обозначать как паракристаллы, а ие как истинные кристаллы. Вскоре были выделены другие палочкообразные и сферические вирусы, образующие истинные кристаллы. Было показано, что все они состоят из белка и нуклеиповой'кислоты, углеводным компонен- том которой является пентоза. Электронная микроскопия и рентгеноструктурный, анализ являются основными методами, используемыми для исследования строения вирусных частиц. Ранние электронные микрофотографии [958] подтвердили данные о палочкообразной форме ВТМ и позволили определить его приблизитель-
12 Глава I ные размеры, но они были не очень четкими из-за недостаточного контраста между вирусными частицами и пленкой-подложкой. Появление метода отте- нения тяжелыми металлами [1239, 1912] значительно увеличило ценность электронной микроскопии для определения общего размера и формы вирус- ных частиц. Однако покрытие металлом в большей или меньшей степени затрудняло выявление структурных деталей. С появлением в 1950-х годах микроскопов с высоким разрешением и метода негативного контрастирова- ния электронная микроскопия стала важным средством изучения субструк- туры вирусов. На основании сравнительного изучения физико-химических свойств вирусного нуклеопротеида и пустой вирусной белковой оболочки, обнару- женной в препаратах вируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ), Маркхэм: [1147] пришел к выводу, что РНК вируса должна находиться внутри белковой оболочки. Эта точка зрения сейчас уже широко подтверждена в отношении этого и других вирусов данными рентгеноструктурного анализа. Крик и Уот- сон [417] предположили, что белковые оболочки мелких вирусов построены из большого числа идентичных субъединиц, образующих либо палочкообраз- ные частицы со спиральной симметрией, либо сферические структуры с ку- бической симметрией. Последующие рентгенографические и химические исследования подтвердили эту точку зрения. Каспар и Клуг [332] сформули- ровали общую теорию, ограничивающую возможное число и расположение белковых субъединиц, образующих оболочки мелких изометрических виру- сов. Наши современные знания о крупных вирусах с более сложной симмет- рией и структурой основаны на данных электронной микроскопии с исполь- зованием методов негативного контрастирования и ультратонких срезов. Почти до 1948 г. наибольшее внимание исследователей концентрирова- лось на белковом компоненте вирусов. Это обусловлено, вероятно, несколь- кими причинами. В количественном отношении белок составляет большую часть вирусных препаратов. Было известно, что ферменты, выполняющие важные функции в клетках, являются белками, а знания о нуклеиновых кислотах, углеводным компонентом которых является пентоза, были эле- ментарными. Функция их в клетке была неизвестна, и обычно считалось, что они представляют собой небольшие молекулы. Такое представление возникло потому, что в то время было неизвестно, насколько легко нуклеи- новые кислоты гидролизуются кислотами, щелочами, а также ферментами, которые обычно содержатся в вирусных препаратах. Маркхэм и Смит [1157] выделили ВЖМТ и показали, что очищенные препараты содержат два класса частиц, одни из которых представляют собой инфекционный нуклеопротеид с содержанием РНК около 35%, а другие (внешне идентичные первым) — белковые частицы, не содержащие РНК и не обладающие инфекционностыо. Эти данные ясно показали, что для био- логической активности вируса необходима РНК. При проведении аналити- ческих исследований [468, 1153—1156] было обнаружено, что разные вирусы имеют сильно различающийся состав оснований, тогда как родственные вирусы по составу оснований близки. К этому времени стало ясно, что раз- меры вирусных РНК могут быть значительно больше, чем считалось ранее. Херши и Чейз [773] установили, что при заражении Escherichia colt вирусом бактерий вирусная ДНК проникала в клетку-хозяина, а большая часть белка оставалась вне ее. Эти эксперименты подчеркнули важность нуклеиновых кислот для репликации вирусов. Харрис и Найт [711] пока- зали, что ферментативное удаление из ВТМ 7% треонина не сказывается на его биологической активности и заражение таким вирусом приводит к появлению нормального потомства с обычным содержанием треонина. При введении в инфицированные растения аналога гуанина — 8-азагуа- нина — последний частично включался в РНК ВТМ и ВЖМТ вместо гуа-
Введение 13 вина. Данные о том, что препараты вируса, содержащего аналог, обладали меньшей инфекционностыо, чем нормальный вирус [1174, 1176, 1177], послужили дальнейшим экспериментальным подтверждением того, что инфек- ционность вируса обусловливается вирусной РНК. Однако классическими экспериментами, которые продемонстрировали инфекциониость свободной РНК ВТМ и защитную роль белковой оболочки, были эксперименты Гирера и Шрамма [630], Френкель-Конрата и Вильямса [5391, а также Френкель- Конрата [531]. Последующие исследования показали, что в вирусах, подоб- ных ВТМ, РНК находится в виде одной нити и единичный разрыв этой нити приводит к инактивации вирусной частицы. Все вирусы растений, исследованные до недавнего времени, содержали в качестве генетического материала одноцепочечную РНК. Сейчас известно, что вирус раневых опухолей [210] и вирус карликовости риса [1228] содержат двухцепочечную РНК, а вирус мозаики цветной капусты содержит двух- цепочечную ДНК [1561; Шеферд, личное сообщение]. Вероятно, будут обна- ружены также вирусы растений, содержащие одноцепочечную ДНК, по- скольку такие вирусы известны среди вирусов бактерий и вирусов животных. Разные вирусы растений отличаются друг от друга по объему частиц примерно в 300 раз (от 2,6-103 нм3 для ^вируса-сателлита вируса некроза табака до 8,0 -103 нм3 для вируса некротического пожелтения салата-латука и сходных вирусов). Молекулярная масса нуклеиновых кислот вирусов растений, размеры которых известны, различается приблизительно в 20 раз (от 0,4 >105 дальтон для вируса-сателлита до 10’ дальтон для вируса раневых опухолей), и, вероятно, будут обнаружены молекулы нуклеиновых кислот еще больших размеров. Полная последовательность оснований еще не определена ни для одной из вирусных РНК. Связанные с этим технические проблемы и обычно боль- шие размеры вирусных РНК заставляют думать, что определение последо- вательности оснований у них будет возможно только через много лет. Однако недавно была определена полная последовательность 120 оснований рибосом- ной 5S-PHK Escherichia coli [293]. Подобно вирусным РНК, эта РНК не содержит необычных оснований, облегчающих идентификацию фрагментов. Таким образом, возможность определения полной последовательности осно- ваний для РНК вируса-сателлита, содержащей около 1200 нуклеотидов, не кажется столь отдаленной. Уровень знаний о репликации вирусов растений в клетке-хозяине значительно отстает от того, что известно о вирусах животных и вирусах бактерий. Это обусловлено в основном техническими причинами. Так, до сих пор не удалось разработать систему из тканей растений, в которой все клетки могли бы быть инфицированы одновременно и последующие этапы репликации вирусов проявлялись бы более или менее синхронно. Появление такой системы явилось бы огромным шагом ^вперед. Другой трудностью при работе с вирусами растений является крайне низкая эффективность суще- ствующих методов инокуляции клеток. Для многих вирусов, которые могут передаваться механической инокуляцией, требуется нанести на поверхность листа около 10*—10е вирусных частиц в расчете на 1 клетку, чтобы добиться ее инфицирования. В случае многокомпонентных вирусов, которые будут рассмотрены ниже, эта величина значительно выше. Для сравнения укажем, что для многих вирусов бактерий это отношение равно 1 : 1 и близко к нему для некоторых вирусов животных. Несмотря на перечисленные трудности, некоторый прогресс в этой обла- сти достигнут. Из листьев, зараженных ВТМ и ВЖМТ, были выделены двух- цепочечиые вирусные РНК [302,1139,1573], но о деталях функционирования этих структур в процессе репликации вирусных РНК в настоящее время можно судить лишь по экспериментам со сходными вирусами бактерий
14 Глава I и животных. Известно, что в листьях, зараженных ВЖМТ, синтез вирусного белка может продолжаться после подавления синтеза РНК каким-либо ингибитором [550], однако и в этом случае о деталях процесса синтеза вирус- ных белков можно говорить главным образом на основании результатов, полученных на системах из клеток животных и бактериальных клеток. Многие вирусы бактерий и вирусы животных вызывают гибель клеток, в которых они размножаются. Это может также произойти и у растений, но многие вирусы, как оказалось, встречаются в растительных клетках в высокой концентрации, не оказывая сильного цитопатического воздействия. У растений с системным поражением вирус инфицирует делящиеся клетки вблизи точки роста и может достигать высокой концентрации в клетках, которым предстоит еще пройти много циклов клеточного деления, прежде чем образуется зрелый орган. В таких случаях синтез вируса, по-види- мому, является процессом столь же четко регулируемым, как, например, синтез рибосом. Природа такой регуляции совершенно неясна. Известна полная последовательность 158 аминокислот в полипептидных цепях капсидного белка ВТМ [23, 1797, 1928] и определена полная амино- кислотная последовательность белков многих природных штаммов и искус- ственно полученных мутантов. Эти исследования внесли важный вклад в установление универсальной природы генетического кода и в наше пони- мание химических основ мутаций. После того как было показано, что генетический код представляет собой последовательность триплетов оснований в нуклеиновой кислоте, каждый из которых определяет одну аминокислоту в белке, выяснилось следующее: большинство вирусов содержит значительно больше генетической инфор- мации, чем требуется для кодирования белка или белков, обнаруженных в составе вирусной частицы. Например, многие вирусы растений содержат молекулу РНК с молекулярной массой 2-10° дальтон. Этого достаточно, чтобы, кроме капсидного белка, кодировать еще 5—8 белков средней моле- кулярной массы. Эти белки, по-видимому, нужны для размножения вируса и синтезируются в инфицированной клетке. По аналогии с результатами исследований на вирусах животных и вирусах бактерий можно предполо- жить, что одним из таких белков является, вероятно, вирусоспецифичная РНК-синтетаза. Выделение и изучение свойств этих некапсидных белков является предметом дальнейших исследований. Было проведено много исследований по изучению влияния вирусной инфекции на такие процессы метаболизма растения-хозяина, как дыхание и фотосинтез, а также на концентрацию различных встречающихся в норме метаболитов и макромолекул. Связь между изменениями, наблюдаемыми в ходе этих процессов, или содержанием указанных компонентов и размно- жением вирусов останется, вероятно, невыясненной до тех пор, пока не расширятся наши знания об активности различных белков, образующихся в инфицированных клетках под влиянием вирусного генома. Что касается взаимодействия вирусных капсидных белков и нуклеи- новых кислот при формировании вирусных частиц, то мысль о том, что сборка белковых оболочек мелких вирусов является спонтанным процессом, зави- сящим от свойств субъединиц капсидного белка, была подтверждена экспе- риментами на палочкообразных вирусах [539] и мелких изометрических вирусах [76]. В этих экспериментах изолированные РНК и белковые субъ- единицы воссоединялись в соответствующих условиях in vitro с образова- нием интактных инфекционных вирусных частиц. Усовершенствование методов получения тонких срезов для электронной микроскопии в течение последних нескольких лет позволило наблюдать полностью сформированные вирусные частицы непосредственно в клетке. Иногда вирусные частицы видны в ядре. Чаще их можно видеть в цитоплазме
Введение 15 либо лежащими свободно, либо находящимися в различных включениях. Однако место (или места) синтеза вирусных компонентов и их сборки с обра- зованием зрелого вируса ни для одного вируса в растительных клетках еще ясно не установлено. После того как Фукуси [577] показал, что вирус карликовости риса может передаваться с яйцами цикадки-переносчика на протяжении семи поколе- ний, происходящих от одной вирофорной самки, без повторного доступа вируса, возник большой интерес к вопросу о способности некоторых виру- сов размножаться как в клетках растений, так и в клетках насекомых. Мно- гие исследования по этому вопросу касались болезней, которые, как сейчас стало известно, вызываются агентами типа микоплазм. Тем не менее несом пенно, что некоторые вирусы размножаются в клетках хозяев обоих типов- Это известно, например, о вирусе деформированное™ листьев клевер. [204] и вирусе раневых опухолей [208]. Бракке [259, 260] разработал метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы для очистки вирусов. Этот метод наряду с расширением наших представлений о действии химических факторов, влияющих на ста- бильность вирусов в экстрактах, позволил осуществит!, выделение и частич- ное изучение большего числа нестабильных вирусов. В настоящее время почти для 40 вирусов известны размер и форма частиц, а также количество и тип содержащейся в них нуклеиновой кислоты. В очищенных препаратах ряда вирусов были обнаружены вирусные частицы с неполным содержанием нуклеиновой кислоты [1181, 1182, 1424, 1950]. С тех пор неполные частицы такого рода уже выявлены в препаратах большинства мелких икосаэдриче- ских вирусов. Исследование инфекционное™, этих частиц, выделяемых обычно методом фракционирования в градиенте плотности, сначала навело на мысль, что только полностью сформированные частицы инфекциопны. Более тщательное фракционирование показало, что для проявления инфек- ционное™ некоторых из этих вирусов необходимо взаимодействие частиц двух типов (см., например, [1822, 1823]). Нечто подобное было обнаружено и при исследовании препаратов палочкообразных частиц вируса погремко- вости табака, которые содержат длинные и короткие палочки. Длинные частицы могут осуществлять синтез вирусной РНК, ио не способны произ- водить капсидный белок. Короткие палочки сами по себе инертны, но содер- жат РНК, используемую в качестве матрицы для синтеза капсидного белка, имеющегося как в длинных, так и в коротких частицах [568, 1077, 1078]. Более сложная система, состоящая из 4 или даже 5 компонентов, обнаружена в препаратах вируса мозаики люцерны [1835]. Биологическое значение этих многокомпонентных вирусов пока неясно, однако возможно, что у таких вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, достигается большая гене- тическая гибкость. Их обнаружение, по-видимому, делает возможным про- ведение генетических экспериментов на вирусах растений. Уже удалось получить искусственно смешанные вирусы путем одновременного введения в клетку крупной частицы одного штамма и малой частицы другого штамма [1078, 1837]. Другая форма зависимости характерна для вируса-сателлита вируса некроза табака [937]. Это самый мелкий из известных вирусов. В его РНК содержится количество информации, достаточное для кодирования собст- венного капсидного белка и, возможно, специфической РНК-полимеразы. В отношении других существенных, но пока неизвестных функций он зави- сит от присутствия неродственного ему вируса некроза табака. В течение первых десятилетий этого века усилия, направленные па борьбу с вирусными болезнями в поле, часто оказывались неэффективными. Обычно они сводились к различным агротехническим приемам, удалению явно зараженных растений и поискам генетически устойчивых линий. В по-
16 Глава I следние годы новые достижения значительно улучшили возможности борьбы с некоторыми болезнями. Обнаружение двух видов почвенных переносчиков вируса — нематод [774] и грибов [683] — открыло возможности для борьбы с рядом важных вирусных заболеваний. Достигнуты значительные успехи в отношении выявления устойчивых к вирусам культурных растений. Тепловая обработка и методы культуры апикальной меристемы при- меняются по отношению ко все возрастающему числу вегетативно размно- жающихся растений для получения не содержащего вирусов материала, который затем может размножаться в условиях, сводящих к минимуму возможность повторного заражения. Эти достижения часто включают введе- ние сертификационных систем. Инсектициды системного действия, иногда применяемые в распыленной форме во время посадки, в значительной сте- пени защищают от некоторых персистентных вирусов (т. е. от вирусов, раз- витие которых в течение определенного времени проходит в организме насекомых), переносимых тлями. Болезни, возбудители которых (в данном случае неперсистентные) переносятся механическим способом на стилетах тлей, труднее контролировать. Проводимая в настоящее время работа позво- ляет предположить, что покрытие растений очень тонкой пленкой раститель- ного или минерального масла может служить полезным в коммерческом отно- шении приемом для снижения распространения таких болезней. В заключение этого краткого вступительного обзора мы хотели бы кос- нуться трудного вопроса, связанного с определением понятия «вирус». С го- дами, по мере детализации наших представлений о структуре и активности вирусов, это определение претерпело изменения и стало еще более сложным. Три приведенных ниже примера иллюстрируют эту тенденцию. Боудэн [94] определял вирус как облигатно паразитический патогенный агент, характе- ризующийся размерами меньше 200 нм. Как подчеркивал Боудэн, это опре- деление не содержит ничего определенного о вирусах, а просто ставит своей целью внести некоторые ограничения в употребление этого слова. Лурия [1108] предложил следующее определение: «Вирусы есть субмикроскопиче- ские объекты, способные проникать в определенные живые клетки и репро- дуцироваться только внутри этих клеток». В этом определении ничего не говорится о том, что вирусы вызывают болезнь, хотя на практике почти все вирусы обнаруживают именно потому, что их наличие в организме некото- рых хозяев приводит к заболеванию. В определении подразумевается произ- вольный предел размеров, который был принят равным менее 200 нм (линей- ные размеры частиц). Согласно Львову и Турнье [1112], вирусы отличаются от всех осталь- ных биологических объектов, обладающих признаками живого, по пяти признакам: 1. Зрелые вирусные частицы содержат только один тип нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. Другие агенты содержат оба типа нуклеиновых кислот. 2. Целые вирусные частицы развиваются, начиная с одного исходного компонента — своей нуклеиновой кислоты, тогда как другие биологические объекты формируются при участии всех своих компонентов и размножаются делением. 3. Вирусные частицы неспособны к росту и делению надвое. 4. Вирусы лишены генетической информации, необходимой для синтеза важнейших систем, свойственных клеточным формам жизни, например си- стем, ответственных за образование энергии. 5. Вирусы используют рибосомы клеток-хозяев. Это определение четко разграничивает агенты, которые в настоящее время принято считать вирусами, и те, которые не относят к вирусам, а имен- но бактерии, микоплазмы, риккетсии и хламиды (возбудитель пситтакоза
Введение 17 и родственные агенты). В рассмотрении этого вопроса Львовым и Турнье важно то, что ученые подчеркивают основные характерные особенности, присущие вирусам позвоночных, беспозвоночных, растений и бактерий. Однако результаты некоторых исследований самого последнего времени не отражены в приведенном определении. Например, вирусу-сателлиту для репликации недостаточно только своей собственной РНК. Утверждение, что вирусные частицы воспроизводятся лишь на основе генетической инфор- мации, заложенной в их собственной нуклеиновой кислоте, неприложимо также и к многокомпонентным вирусам растений, у которых одна частица представляет генетическую информацию, необходимую для репликации дру- гой. Важным обстоятельством, касающимся нуклеиновой кислоты вируса, может быть то, что вся она является материалом генома, а не то, что она представляет собой нуклеиновую кислоту одного типа. По определению Льво- ва и Турнье, зрелая частица ДНК-содержащего «вируса», которая содержит также некоторое количество РНК, не может быть названа вирусом; с дру- гой стороны, если в частице РНК-содержащего вируса будет присутствовать некоторое количество транспортной или какой-либо другой негенетической РНК, то такую частицу следует рассматривать как вирус. В свете исследований последнего времени мы позволим себе внести некоторые изменения в составленный Львовым и Турнье перечень характер- ных признаков вируса. Вирус представляет собой систему из одной или более молекул матрич- ной нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК — со следующими свойствами: 1. Репликация этих молекул возможна только в соответствующей внут- риклеточной среде. К числу внутриклеточных компонентов, от которых зави- сит размножение вируса, относятся рибосомы, транспортные РНК и систе- ма, участвующая в образовании энергии. Для некоторых вирусов может быть также необходимо наличие другого вируса. 2. В зрелой вирусной частице генетический материал обычно упакован в белковую или липопротеидную защитную оболочку. В тех случаях, когда геном вируса представлен более чем одной молекулой нуклеиновой кислоты, либо каждая из них может быть заключена в свою собственную оболочку, либо все они могут находиться в одной общей. Зрелый вирус не содержит иной нуклеиновой кислоты, кроме нуклеиновой кислоты, составляющей вирусный геном. 3. При наличии соответствующих условий вирус может вызвать болезнь по крайней мере у одного хозяина. Любая попытка точного определения вируса связана всегда с необхо- димостью дополнительной проверки. Например, реовирус, вероятно, служит исключением из приведенного выше определения. В каждой его частице содержится генетический материал, представленный не менее чем десятью дискретными единицами, состоящими из двухцепочечной РНК, а кроме того, еще несколько сотен единиц, состоящих из какого-то низкомолекулярного полирибонуклеотида, богатого адениловой кислотой. Функция этого низко- молекулярного полирибонуклеотида, на долю которого приходится около 20% всей вирусной РНК, пока неизвестна [143, 144, 1840, 1867]. Таким образом, реовирус содержит относительно большое количество полирибону- клеотидпого материала, который, вероятно, не выполняет генетической функции. Читатель сейчас, возможно, склонен согласиться с мнением Локка, высказанном в его трактате «Опыт о человеческом разуме», о том, что хотя определения должны служить для объяснения наименования сущностей, поскольку они выражают наши мысли, тем не менее они оставляют их несо- вершенными, так как они олицетворяют вещи. 2-0893
ГЛАВА II КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ Количественная оценка содержания вирусов является в большинстве случаев необходимым этапом их выделения и исследования. С этой целью используют четыре главных метода: определение инфекционности, методы, связанные с серологическими свойствами вирусов, а также основанные на действии физических и химических факторов на вирусы. Среди этих методов основным является метод определения инфекционности, так как именно на основании биологической активности можно судить о присутствии вируса. В большинстве экспериментов для количественного определения вирусов полезно (а часто необходимо) одновременное применение двух или более методов, основанных на различных свойствах вируса. ИНФЕКЦИОННОСТЬ Подсчет числа местных поражений Холмс [814] показал, что местные некротические поражения, образую- щиеся на листьях Nicotiana glutinosa в результате механической инокуляции ВТМ, можно использовать для оценки относительной инфекционности вируса. Этот метод оказался более точным и требовал меньше опытных расте- ний, чем старый способ оценки в инокулируемой группе числа инфицирован- ных растений с системным поражением. Начиная с этого времени много усилий было направлено на поиски растений-хозяев, у которых те или иные вирусы вызывали местные поражения. Вероятно, именно поэтому все имею- щиеся в нашем распоряжении сведения о вирусах растений имеют тот недо- статок, что большая часть исследований проводила^ с использованием виру- сов, для которых были известны растения-индикаторы, реагирующие обра- зованием местных поражений в ответ на заражение. Различные аспекты механической передачи вирусов обсуждаются в гл. VI. Во всех возможных случаях для подсчета числа местных поражений используются виды растений-хозяев, реагирующие на заражение вирусом образованием отчетливо выраженных некрозов или реакцией типа кольцевой пятнистости (цветная вклейка 1 и фото 35). Некоторые вирусы вызывают образование хорошо воспроизводимых хлоротических поражений, однако в других случаях такие поражения могут варьировать от четких пятен до неясных желтых зон, оценка которых оказывается произвольной и субъек- тивной. При этом иногда удается использовать тот факт, что содержание крахмала в клетках пораженного участка может отличаться от содержания его в неинфицированных клетках [815]. В конце светового периода инфици- рованные вирусом клетки могут содержать меньше крахмала, в конце тем- нового — больше. Чтобы выявить подобные участки, листья обесцвечивают этанолом и окрашивают иодом. Для получения удовлетворительных и вос- производимых результатов при выявлении некрозов с помощью иод-крах- мальной пробы необходимо тщательно контролировать условия окружающей среды и время взятия образцов.
Количественное определение вирусов 19 На четкости образующихся местных поражений может отражаться характер питания растения. Например, у растений китайской капусты, страдающих от недостатка азота, ВЖМТ может вызывать отчетливо выражен- ные некрозы фиолетового цвета, которые легче заметить, чем слабые хлоро- тические поражения, возникающие при заражении обычным штаммом вируса [455]. При внимательном проведении опыта, поставленного в соответствий? с точно намеченным планом, количественное определение вируса, основанное па подсчете числа местных поражений, позволяет выявит!, различия между двумя препаратами даже в пределах 10—20%. Однако в литературе есть много примеров, когда выводы, сделанные на основании такого подсчета местных поражений, не гарантировали точных данных. При рассмотрении этого вопроса следует иметь в виду три основных момента: 1) значительные колебания в числе местных поражений, образуемых на разных листьях стан- дартным инокулумом вируса; 2) общий вид кривой, описывающей зависи- мость числа некрозов от разведения инокулума, и 3) необходимость статисти- ческой обработки результатов для получения надежной сравнительной оценки инфекциониости образцов. Различия между листьями В гл. XII мы рассмотрим физиологические факторы и факторы окру- жающей среды, влияющие па чувствительность растения к инфекции. К их числу относятся возраст растения, генетическая изменчивость растения- хозяина, положение листа на стебле, питание, водный режим, температура, интенсивность освещения, сезон года и время дня. Самуэль и Волд [1483] установили, что при определении числа местных поражений, когда для этого используются половинки одного и того же листа, наблюдается гораздо меньше различий, чем в случае разных листьев растения. С тех пор в боль- шинстве экспериментов по подсчету числа местных поражений применяется метод сравнительной оценки па половинках листьев. У растений типа Phaseo- lus vulgaris, имеющих два доступных для использования первичных листа, находящихся в одинаковом положении на растении, в пашем распоряжении имеется 4 совершенно одинаковые половинки листьев. Число половинок листьев, необходимых для сравнения, зависит от требуемой точности эксперимента, однородности используемых растений и числа образцов, взятых для сравнения. При оценке растений, растущих при вполне стандартных условиях, после проведения нескольких опытов обычно можно отобрать отдельные растения, значительно отличающиеся по чувствительности от группы, и изъять их. При единичном сравнении инфек- ционное™ двух образцов должно быть использовано как минимум 6—8 ли- стьев. При сравнении более чем двух образцов можно воспользоваться раз- личными экспериментальными приемами. Половинка каждого листа может быть ипокулирована одним и тем же стандартным препаратом вируса, а на другую половинку листа наносят различные исследуемые препараты. Этот прием прост, но требует довольно большого числа растений. В определенных случаях эффективным оказывается метод латинских квадратов. Например, при использовании растений типа TV. glutinosa, каж- дое из которых имеет 4—8 листьев, пригодных для заражения, некоторое ограниченное число образцов можно нанести таким образом, что для срав- нения различных проб каждого образца можно использовать листья, нахо- дящиеся в разных положениях на растении. Если число обработок превышает количество листьев, то используется один план, согласно которому каждый исследуемый инокулум следует наносить в данном положении листа одинаковое число раз. Рядом авторов 2*
20 Глава II 1573, 985, 13591 были разработаны некоторые образцы более сложных экспе- риментальных схем. Однако должен существовать разумный предел слож- ности метода нри подсчете числа местных поражений. При проведении широ- кого круга экспериментов увеличивается вероятность ошибок в процессе инокуляции и маркировки. В связи с тем что инокуляция при этом занимает много времени, на результатах могут сказаться изменения в чувствительно- сти растений, которая зависит от времени дня. Избежать этого можно, толь- ко усложняя схему эксперимента с учетом этого эффекта, который часто бывает весьма значительным. Зависимость между разведением инокулума. и числом поражений Бест [182] исследовал характер кривой, описывающей зависимость между числом местных поражений, индуцируемых ВТМ на листьях N. glu- tinosa, и разведением инокулума. Он показал, что кривую можно разделить на три части: 1) часть кривой, соответствующую высоким концентрациям вируса, где изменение этих концентраций сопровождается очень небольшим изменением в числе местных поражений, 2) среднюю часть кривой, где изме- нение концентрации более или менее эквивалентно изменению числа пора- жений, 3) часть кривой, соответствующую области низких концентраций, где изменение концентрации вируса незначительно отражается на числе пора- Разведенае инокулума Фиг. 1. Зависимость между числом местных поражений, индуцируемых двумя различ- ными вирусами растений на Ntcotiana glutinosa [985]. I— вирус кустистой карликовости томатов; II — ВТМ.
Количественное определение вирусов 21 жений. Это справедливо в отношении многих, по не всех вирусов. Две кри- вые, описывающие подобного рода зависимость, приведены на фиг. 1. Кривые разведения вируса интересны как с теоретической, так и с прак- тической точек зрения. Математический анализ процесса инфекции рассма- тривается в гл. VI. С практической точки зрения форма кривой разведения дает возможность сделать несколько важных выводов. Во-первых, пе имеет смысла сравнивать два образца со слишком большим или слишком малым числом местных поражений, так как при этом ошибка будет очень значитель- ной. Во-вторых, сравнение инфекционности может быть проведено только в той области концентраций, где число поражений более или менее пропор- ционально разведению. В-третьих, наклон кривой разведения несколько меняется от одного эксперимента к другому. Это означает, что два образца следует сравнивать при нескольких разведениях (обычно двух-, пяти- или десятикратных). Вообще говоря, для листьев, примерно сходных по размеру с листьями N. glutinosa, средние цифры в пределах 10—100 поражений на каждую половинку листа наиболее удобны при оценке инфекционности. Для более крупных или более мелких листьев диапазон должен быть иным. На наклон кривой разведения могут оказывать влияние следующие факторы: 1) присутствие ингибиторов в инокулуме, причем при разбавле- нии ингибитора кривая может пойти менее круто, чем ожидалось, 2) дез- агрегация вируса, который находился ранее в агрегированном состоянии, при разбавлении инокулума также может сделать кривую более пологой, 3) необходимость присутствия более чем одной вирусной частицы для мест- ного поражения, что может сделать кривую круче, чем следовало ожидать [587], и что было обнаружено в отношении нескольких вирусов, заражение которыми возможно только с участием двух или более частиц (фиг. 21), и 4) изменение в чувствительности испытуемых растений в течение времени, необходимого для инокуляции, что может влиять на наклон кривой тем или иным путем в зависимости от порядка инокуляции. Зависимость числа поражений от концентрации инфекционных вирусных частиц Даже в том случае, если посредством введения оптимальной схемы эксперимента учесть индивидуальные колебания в числе поражений для разных листьев, а также при условии, что титрование проводится в средней части кривой разведения, число поражений нельзя непосредственно выразить в виде относительного содержания обладающего инфекционностыо вируса. Самым простым практическим путем преодоления этой проблемы является приведение инокулума к такому разбавлению (на основании предваритель- ного исследования), при котором сравниваемые образцы дают приблизи- тельно равное число некрозов в пределах наиболее рационального диапазона примерно от 10 до 100 поражений на лист. Для правильного использования данных титрования требуется приме- нение некоторых элементов статистического анализа. Клечковский [984, 986, 988] обратил внимание на тот факт, что такие показатели, как число местных поражений или логарифм этого числа (раньше ученые пользовались логарифмом), непригодны для такого анализа. Число некрозов не подчи- няется нормальному распределению, и дисперсия среднего возрастает с уве- личением среднего. В качестве показателя, пригодного в тех случаях, когда среднее число X > 10, Клечковский предлагает пользоваться величиной y = logw(X+C), где X — число местных поражений, а С — константа. Ее можно оценить для каждого эксперимента в отдельности, но, вообще говоря, любая величина
22 Глава II С в пределах от 5 до 20 вполне удовлетворительна. Для случаев, когда X < 10, Клечковский предлагает несколько более сложный показатель. Если среднее хотя бы в одной группе данных меньше 10, то для того> чтобы применять дисперсионный анализ, нужно пользоваться вторым преобразо- ванием ко всем данным. Некоторые общие соображения При планировании и применении системы анализа инфекционное™ и определения числа местных поражений следует иметь в виду многие фак- торы, которые влияют на инфекционность вирусов и чувствительность расте- ний. Изучая влияние какой-либо обработки на инфекционность препарата, важно знать, не может ли эта обработка каким-то образом изменить условия среды (например, pH) еще до того, как она окажет непосредственное воз- действие на вирус. Объем и сложность анализа должны соответствовать требованиям экспе- римента. Бесполезно планировать сложную схему опыта со случайными выборками, когда даже очень приблизительная оценка инфекционности дает требуемый ответ. Чаще встречающийся недостаток заключается в том, что выводы делают из неполностью обдуманных и неверно интерпретированных экспериментов. В этой связи одним из факторов, которым часто пренебрегают, является влияние времени дня па чувствительность испытуемых растений (гл. XII). Степень этого влияния значительно варьирует, и для анализов, продолжающихся лишь в течение часа или около того, этим, влиянием, вероятно, можно пренебречь. Однако в случае сложных экспериментальных схем и большего числа растений, требуемых для максимальной точности, а также в случае большого количества анализируемых образцов этот фактор может систематически влиять на результаты. В подобного рода эксперимен- тах по исследованию этого эффекта при заражении листьев фасоли (Phaseolus vulgaris L.) вирусом некроза табака мы нашли значимые различия (при Р ==>0,1%) наклона кривых разведения в зависимости от того, инокулирова- ли ли растения сначала низкими разведениями вируса или высокими или некоторым растениям вводили по очереди каждую из суспензий вируса. Инокуляцию проводили в этих опытах в течение трех часов. Оценка инфекционности, основанная на определении числа инфицированных растений До того как Холмс [814] предложил метод подсчета местных поражений, единственным способом определения инфекционности, имевшимся в распоря- жении исследователей, было заражение нескольких групп растений образ- цами различного разведения и последующая регистрация растений с систем- ным поражением. Этот способ занимает много времени и требует гораздо большего числа растений для получения надежных данных. Однако в отдель- ных случаях такой метод определения инфекционности используется и сей- час, например в отношении вирусов, которые не имеют растений-хозяев с хорошо выраженной местной некротической реакцией, или вирусов, пере- носимых насекомыми. Механическая инокуляция растений и подсчет числа растений с системным поражением В этом случае группы, состоящие из 12—25 растений, заражают серией разведений инокулума и впоследствии регистрируют наличие или отсутствие симптомов системного поражения. Степень разведения должна быть не
Количественное определение вирусов 23 слишком малой (иначе заражение будет 100%-ным) и не слишком большой (тогда заражение совсем не произойдет). Табл. 1 иллюст- рирует характер полученных дан- ных. На основании этого экспери- мента можно сделать вывод, что так называемый верхний компо- нент вирусного препарата при- мерно в четыре раза более инфек- циопен, чем компонент, осаждае- мый на дно (при центрифугирова- нии). При наличии таких данных можно использовать пробит-анализ для определения LD50 и дать ста- тистическую оценку точности по- лученных результатов. Инкубация образцов тканей Иногда можно оцепить ско- рость, с которой вирус передви- гается из одной части растения в другую, путем отбора многих небольших кусочков ткани, не содержащих вируса вовсе или со- держащих его в небольших коли- чествах. Изолированные образцы ткани затем инкубируют, чтобы дать возможность присутствующе- му в них вирусу размножиться и накопиться таким образом в ко- личестве, достаточном для опреде- ления, после чего присутствие или отсутствие в них вируса выявляют либо по инфекциоипости, либо каким-то другим методом. Подоб- ного рода процедура была исполь- зована Фреем: и Мэтьюзом [571] для определения времени, прошед- шего после инокуляции, в течение которого клетки, распределенные под эпидермисом листа табака, инфицируются ВТМ. Они удаляли эпидермис с ипокулированной части листа и вырезали затем диски из нижележащей ткани, которые инкубировали в течение определенного времени. По отно- сительному числу инфицирован- ных дисков можно судить о вре- мени, в течение которого вирус передвигается в расположенные под эпидермисом клетки мезо- филла. £3 СЧ СО СО 1.0 см 00 2 nF CM с\Т 1) В таблице представлена относительная инфекционность верхнего и нижнего компонентов, выделенных из препарата вируса деформирующей мозаики гороха [858]- Вторая цифра в каждом случае означает число инокулпрованных растений гороха. Первая цифра соответствует числу заразившихся растений.
24 Глава II Насекомые-переносчики При определении инфекционности вирусов, которые не передаются механическим путем, но имеют насекомых-переносчиков, для оценки отно- сительного количества вируса можно использовать процент удачных передач инфекции, осуществленных с помощью насекомых. Насекомые могут полу- чать вирус (перед подкормкой на здоровых растениях) через мембрану на содержащих вирус растворах или в результате инъекции насекомым таких растворов [268, 439, 1243, 1717, 1900). Результаты, полученные в экспери- ментах, в которых насекомые кормились на инфицированной ткани, отра- жают, вероятнее всего, различия в доступности вируса для насекомых, а не в его концентрации в ткани или в органе. Все эти методы трудоемки и осложняются биологической изменчивостью как у насекомых, так и у ра- стения-хозяина. Например, на результаты может влиять продолжительность времени, необходимого для кормления насекомого на испытуемом растении. Кроме того, насекомые могут погибать в различное время в ходе эксперимен- та на опытных растениях. Если для каждого такого растения используется больше чем одно насекомое, для оценки полученных результатов требуется более сложная статистика. Все эти трудности ограничивают широкое при- менение описываемого метода, однако таким путем удалось получить цен- ную информацию в отношении некоторых интересных вирусов (например, вируса раневых опухолей). АНАЛИТИЧЕСКОЕ УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ Вирусы растений имеют такие размеры, которые делают очень удобным их анализ с помощью аналитического ультрацентрифугирования. Этот метод особенно полезен для контроля этапов очистки вируса, а также для изуче- ния влияния различных обработок на физическое состояние вирусных частиц и определения количества вируса в неочищенном экстракте ткани. При использовании шлирен-оптики обычно можно обнаружить вирус в кон- центрации около 100 мкг на 1 мл. Иногда удается работать с вирусом даже при концентрации 50 мкг на 1 мл. Верхний предел концентрации отчасти зависит от вируса, а также от скорости центрифугирования. При концен- трации вируса, составляющей 3—4 мг/мл, возможно зашкаливание, так что появляется черная линия, пересекающая пик. Оптимальными являются условия, при которых концентрация каждого компонента находится в преде- лах 0,5—2 мг/мл. При измерении поглощения в ультрафиолете нижний предел концен- трации должен составлять около 5 мкг/мл для вирусов с высоким содержа- нием РНК и 20 мкг/мл для вирусов с низким содержанием РНК. Естественно, что при изучении нуклеиновых кислот или нуклеопротеидов ультрафиолето- вая оптика оказывается намного более чувствительной, чем шлирен-система (фото 1) К С помощью интерференционного микроскопа можно очень точно опре- делить количество вируса, но этот метод мало применяется при изучении вирусов растений, главным образом потому, что для получения хороших результатов необходимы высокие концентрации вируса (5—10 мг/мл). При работе с неочищенными экстрактами, содержащими большое коли- чество низкомолекулярных веществ, поглощающих в ультрафиолете, лучше использовать шлирен-систему, а не ультрафиолетовую оптику. 1 Все фотографии помещены в конце книги.— Прим- ред.
Количественное определение вирусов 25 Одно из значительных преимуществ применения аналитического ультра- центрифугирования при работе с вирусами состоит в том, что с помощью этого метода, помимо определения количества вирусных частиц, их можно также идентифицировать на основании физического критерия — коэффи- циента седиментации. Коэффициент седиментации — это скорость седимен- тации в воде при 20 °C, отнесенная к единице центробежной силы. Его обо- значают через «го, w и выражают в единицах Сведберга (S). Величины s2o w для большинства вирусов растений колеблются в пределах 50—200 S. Марк- хэм [1150] предложил быстрый и простой графический метод определения коэффициента седиментации вещества на основании первичных седимента- ционных данных. Точное определение s2o.w из экстрактов листьев затруд- нительно, поскольку не известны ионная сила и другие факторы, от которых зависят результаты. Однако эти трудности можно преодолеть, добавляя в качестве маркера в экстракт, содержащий неизвестные компоненты, такой вирус, как ВЖМТ, величина s20, w для которого известна. Таким образом, путем сравнения с маркером можно приблизительно вычислить коэффициент седиментации компонента, для которого он не был известен. В неочищенном экстракте из листьев большинства здоровых растений присутствуют четыре основные группы макромолекул и частиц — фракция I и фракция II белков, а также 68S- и 838-рибосомы. Фракция I (белки хлоропластов) имеет s201 «s 19, фракция II представляет собой сложную смесь растворимых белков с меньшей молекулярной массой. На фото 76 представлены шлирен-диаграммы, полученные при анализе экстракта листьев китайской капусты, инфицированных ВЖМТ. Отчетливо виден пик вируса (коэффициент седиментации 114 S), так же как пик, соответствующий пустым белковым оболочкам вируса, или верхнему ком- поненту (52 S). Другие вирусы по их седиментационным свойствам нельзя четко отличить от рибосом (например, вирус крапчатости конских бобов [1151]). При определенных условиях рибосомы могут мешать обнаружению на седи- мептограмме и такого вируса, как ВЖМТ. При слишком высокой концен- трации 838-рибосом (например, в экстрактах очень молодых листьев) в пре- парате могут присутствовать димеры рибосом (s2o,w^ 122 8), седименти- рующие немногим быстрее, чем ВЖМТ. Аналогичным образом высокое содержание в препарате полисом, если условия экстракции не обеспечивают полной их диссоциации на 68S- и 838-мономеры (например, при быстрой экстракции на холоду), может привести к образованию серии рибосомных компонентов с коэффициентом седиментации в пределах 100—200 8. Аналитическое центрифугирование можно считать ценным методом определения чистоты вирусных препаратов, имея при этом в виду: 1) вирусо- подобные частицы с различной скоростью седиментации; 2) наличие какого-то иного вируса; 3) такие примеси, как макромолекулы клетки-хозяина; 4) степень агрегации вируса. Частицы палочкообразных вирусов могут агре- гировать либо конец в конец, либо соединяясь своей боковой поверхностью. Как указал Маркхэм [1151], линейная агрегация незначительно отражается на скорости седиментации, так как эффект увеличения массы частицы нивели- руется возрастанием коэффициента трения палочковидного агрегата. Поскольку в растворе могут иметь место оба типа агрегации, очищенные пре- параты таких вирусов, как ВТМ, представляются весьма негомогенпыми при исследовании в аналитической центрифуге. Сферические вирусы также могут образовывать агрегаты, хотя это наблюдается не так часто. Маркхэм [1151] описывает пример такого рода, наблюдавшийся при обработке вируса кустистой карликовости томатов на ранних стадиях очистки осветляющим агентом тиодигликолем. Это привело к появлению димеров, тримеров и тетрамеров вируса, в которых отдельные частицы были, по-видимому, свя- заны между собой дисульфидными мостиками. Коэффициенты седиментации
26 Глава II мономеров, димеров и тримеров, как было найдено, находились в соотноше- нии 1,0 : 1,4 : 1,7. Маркхэм [1151] указывал, что, если агрегация происхо- дит в препаратах, содержащих целые вирусные частицы и пустые белковые оболочки, димеры, состоящие из такой оболочки и вирусной частицы, должны иметь величину saо, w, близкую к коэффициенту седиментации интактного виру- са, и не могут быть выявлены обычными приемами седиментационного анализа. Ультрафиолетовую оптику можно с успехом применять для исследования очищенных вирусных препаратов. В этом случае требуется меньшее коли- чество материала и можно обнаружить минорные вирусные компоненты или примеси, не выявляемые с помощью шлирен-оптики. Для того чтобы пере- вести площадь пика, измеренную на шлирен-диаграмме, в концентрацию вируса (в мг на 1 мл), необходимо определить коэффициент пересчета площади в концентрацию, используя для этого хорошо очищенный препарат вируса известной концентрации. Проблемы, связанные с калибровкой, при опреде- лении абсолютной концентрации вируса с помощью ультрафиолетовой оптики значительно более сложны. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ Метод центрифугирования в градиенте плотности, разработанный Бран- ке [259, 260, 262, 265], можно использовать как для выделения, так и для получения количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось, этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время широко используется в области вирусологии и молекулярной биологии. При проведе- нии исследований методом центрифугирования в градиенте плотности центри- фужную пробирку частично наполняют раствором, плотность которого умень- шается в направлении от дна к мениску. Для создания градиента при фрак- ционировании вирусов растений наиболее часто используют сахарозу. Перед началом центрифугирования частицы вируса могут быть либо распре- делены во всем объеме раствора, либо нанесены на вершину градиента. Бракке [262] предложил три различных приема центрифугирования в гра- диенте плотности. При изопикническом (равновесном) центрифугировании процесс продолжается до тех пор, пока все частицы в градиенте не достигнут уровня, где плотность среды равна их собственной плотности. Таким обра- зом, фракционирование частиц происходит в этом случае в соответствии с различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают достаточной плотностью для изопикнического разделения многих вирусов. При скорост- ном зональном центрифугировании вирус сначала наносят на предвари- тельно созданный градиент. Частицы каждого типа седиментируют при этом через градиент в виде зоны, или полосы, со скоростью, зависящей от их размера, формы и плотности. Центрифугирование при этом закапчивают, когда частицы еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное центрифугирование сходно со скоростным зональным центрифугированием, но в этом случае центрифугирование продолжается до достижения изопикни- ческого состояния. Роль градиента плотности при скоростном центрифуги- ровании заключается в том, чтобы препятствовать конвекции и фиксировать различные виды молекул в определенных зонах. Теория центрифугирования в градиенте плотности сложна и не совсем понятна [262]. На практике же это простой и изящный метод, который широко применяется при работе с виру- сами растений. Для этого необходимы лишь высокоскоростная препаратив- ная ультрацентрифуга типа Spinco L50 и соответствующие бакет-роторы. После центрифугирования зоны, содержащие вирус, можно визуали- зировать благодаря большой светорассеивающей способности. Перед ана- лизом материала содержимое пробирки собирают с помощью одного из воз-
Количественное определение вирусов 27 •Фиг. 2. Количественное определение вирусов в неочищенном экстракте при центрифу- гировании в градиенте плотности сахарозы (Аткинсон и Мэтьюз, неопубликованные данные). Экстракт из 30 мг эпидермиса (Л) или из нижележащей ткани листьен табака (В), пнфициропаппых ВТМ, центрифугировали в градиенте сахарозы (10—40%) при 35 000 об/мин в течение 2 ч. Вдоль по длине раствора сахарозы измеряли поглощение в ультрафиолете при 254 им с помощью автомати- ческого сканирующего устройства. В эпидермальной ткани не удастся обнаружить (iSS-риГюсэм в количестве, доступном для определения. можных методов. Мощно проколоть дно пробирки и дать содержимому вытечь, собирая его в виде серии фракций. Эффективное фракционирование содержимого пробирки с раствором сахарозы высокой плотности может быть достигнуто путем использования прибора ISCO. При этом обеспечи- вается измерение и регистрация оптической плотности (при 254 нм) в объеме пробирки; кроме того, можно отбирать фракции требуемого объема. Фиг. 2 иллюстрирует чувствительность этого метода. Бракке [260] показал, что в светорассеивающей золе можно обнаружить вирус желтой карликовости картофеля в таком незначительном количестве, как 1 мкг. Применительно к более мелким вирусам эта величина должна быть больше. С помощью прибора ISCO удается выявить с достаточной точ- ностью зону, содержащую около 2 мкг нуклеопротеида ВЖМТ. После того как фракции градиента собраны, для идентификации вируса, неипфекциоп- пых вирусоподобных компонентов и материала хозяина можно использо- вать различные методы. К ним относятся методы определения инфекцион- пости, исследование спектров поглощения в ультрафиолете и анализ с помо- щью электронного микроскопа. В тех случаях, когда известны коэффициенты седиментации некоторых компонентов смеси, метод скоростного зонального центрифугирования позволяет оцепить приблизительные значения s2o.w Дру- гих компонентов. При наличии антисыворотки полученные фракции могут быть проанали- зированы с помощью серологических методов или антисыворотка смешивается с образцом перед нанесением на градиент. При этом компоненты, реагирую- щие с антисывороткой, удаляются из фракционируемой смеси (фото 80). Штромейер [1688] предложил специальную секционную ячейку для фракцио- нирования вирусных частиц в градиенте плотности. С помощью этого устрой- ства можно вначале провести фракционирование неочищенного экстракта, а затем после перестройки секции осадить частицы повторным центрифуги- рованием с разных положений градиента па пленки-подложки для электрон- но-микроскопического исследования. Таким образом можно обнаружить вирус в концентрации 10s частиц на 1 мл, в то время как при обычно приме- няемом методе распыления капель, описанном ниже, требуется концен- трация порядка 1.011 частиц па 1 мл. Ширина зоны, образованной одиночным компонентом, зависит от количества материала. Если два компонента, при- сутствующие в разных количествах, образуют зоны, располагающиеся непосредственно одна под другой, вещество, содержащееся в большем коли- честве, может перекрывать минорный компонент. До недавнего времени ана- лиз в градиенте плотности сахарозы, рассматривали как вполне надежный метод при работе с вирусами растений. Однако Блэк [212] обнаружил, что
28 Глава II квазиравновесное центрифугирование вируса раневых опухолей в градиенте сахарозы приводит к потере одной трети количества вирусных частиц, опре- деленного серологически, и связано со значительным снижением инфекцион- ности оставшегося вируса. Эти потери не, обнаруживаются в условиях скоро- стного зонального центрифугирования. Центрифугирование в течение 4 ч при 22 500 об/мин приводит к серьезным потерям, тогда как за 25 мин этого не происходит. На основании этого можно предположить, что выталкиваю- щаяся сила, отнесенная к единице массы, действующая на вирусную РЫК и вирусный белок, может отличаться даже в 4 раза, что приводит либо к пря- мому разрушению вирусной РНК, либо к разрыву белковой оболочки, вслед- ствие чего РНК может остаться незащищенной. С применением соответствующей ячейки можно выполнить эксперименты в градиенте плотности в аналитической центрифуге, использовав таким образом преимущества в чувствительности ультрафиолетовой оптики [1845]. При этом образец небольшого объема (15 мкл) вводится в колонку жидкости с высокой плотностью. Во время седиментации образуется градиент, который стабилизирует зоны седиментирующих частиц. При такой процедуре удается обнаружить примерно до 0,2 мкг вируса или другого нуклеопротеида. Однако при этом нельзя препаративно выделить фракции градиента, как это де- лается при применении бакет-ротора. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Особенности серологических реакций, применяемых при изучении виру- сов растений, обсуждаются в гл. XV. Здесь же мы рассмотрим методы, с помощью которых взаимодействие между вирусным антигеном и специфи- ческим антителом можно использовать для количественного анализа вирусов. Серологические тесты являются быстрыми и удобными методами для обнаружения вирусов растений. Основные преимущества этих методов состоят в следующем: 1) специфичность реакции позволяет обнаружить вирус в присутствии материала клетки-хозяина и других примесей; 2) работа требует наличия очень небольших количеств вируса; 3) результаты могут быть получены в течение нескольких минут или часов, тогда как для опре- деления инфекционности требуется несколько дней; 4) полученные данные отражают содержание вируса в широком диапазоне концентраций; 5) подоб- ного рода тесты особенно полезны при работе с вирусами, которые не имеют растений-хозяев, реагирующих на заражение образованием четко выражен- ных местных поражений, или не передаются соком растения (например, вирус полосатой мозаики пшеницы [1606]); 6) антисыворотка может дли- тельно храниться, что дает возможность проводить сравнительные исследо- вания в течение весьма продолжительного периода. Серологические методы имеют следующие основные недостатки: 1) поль- зуясь ими, можно определить количество вирусного белкового антигена, но не количество обладающего инфекционностью вируса: в некоторых слу- чаях этот факт, конечно, имеет преимущество; 2) постановкой теста на инфек- ционность обычно удается обнаружить и измерить приблизительно от 1/10 до Vido количества вируса, требуемого для проведения реакции преципитации в пробирке. Однако при некоторых модификациях этот метод требует меньше материала, чем при измерении инфекционности; 3) линейная агрегация палочкообразных вирусов может заметно влиять на результаты некоторых методов количественного определения, описанных ниже; 4) до сих пор (и это самое главное) эти методы можно использовать лишь в отношении ограниченного числа вирусов растений, хотя число это очень быстро уве- личивается [1829].
Количественное определение вирусов 29 В вирусологии лучше всего использовать антисыворотки, которые можно получить в большом количестве путем иммунизации кроликов. При этом весьма желательно получать сыворотку с высоким титром. Это позволяет использовать в работе сильно разбавленную сыворотку, исключая, таким образом, неспецифические ингибиторные эффекты, наблюдаемые при низких разбавлениях, и создает возможность постановки большего числа тестов с одним и тем же количеством сыворотки. При наличии большого запаса исходной сыворотки, приготовленной для использования в серийных иссле- дованиях, имеет смысл получить диаграмму преципитации (подобную изоб- раженной па фиг. 70). Такие диаграммы позволяют быстро определить соот- ветствующие разбавления и количество реагентов, необходимое для раз- личных целей. Методы предельного разбавления при постановке тестов на преципитацию Преципитация в пробирках В этом случае готовится серия двукратных разведений образцов вируса в 0,14 М NaCl. Равные объемы разбавленной антисыворотки добавляют в каждую пробирку, содержимое встряхивают и инкубируют при 30—37°С. Затем отмечают предельное разбавление каждой пробы, при котором обра- зуется видимый преципитат. Применительно к мелким сферическим вирусам растений этот метод дает хорошо воспроизводимые результаты. Однако при работе с палочкообразными вирусами чем более агрегирован препарат, тем меньше вируса требуется для образования видимого преципитата. Преципитация при диффузии в геле Этот микрометод очень полезен при исследовании небольших сфериче- ских вирусов растений. При этом в агаре на предметном стекле вырезают ряд лунок, а также канавку для антисыворотки. Готовят ряд двукратных разведений антигена и помещают небольшие пробы антигена (около 7 мкл) в лунки. С помощью этого метода можно определить около 0,02 мкг ВЖМТ путем визуальной оценки полос преципитации. При использовании меченного 35S ВЖМТ и последующей радио автографии мы смогли определить этот вирус даже в количестве 0,002 мкг. Иммуноосмофорез Рагетли и Вайнтрауб [1377] разработали быстрый тест для определения вирусов, имеющих достаточно высокий отрицательный заряд при pH 7,0. При этом в агаре, содержащем буфер со значением pH, близким к нейтраль- ному, вырезают группы из двух лунок. Антисыворотку помещают в одну из лунок каждой пары, а раствор вируса — в другую, после чего создается градиент напряжения. Антитела двигаются в этой системе с эндосмотическим потоком, тогда как вирус перемещается благодаря своему отрицательному заряду. В результате эти два реагента приходят в соприкосновение друг с другом при условиях, обеспечивающих появление полосы преципитации значительно быстрее, чем при простой гель-диффузии. Для образования полос требуется приблизительно 60—90 мин. Джон [879] предложил гораздо более быстро выполнимую и обладающую большей чувствительностью моди- фикацию этой процедуры, при которой можно было обнаружить около 0,03 мкг ВТМ в течение 5 мин.
30 Глава II Определение а-оптимума Положение а-оптимума довольно строго пропорционально разведению реагентов (фиг. 70). На этом основывается его использование в качестве количественного теста. При применении этого метода готовят серию двукрат- ных разведений вируса. Затем в каждую пробирку добавляют антисыворотку определенного разбавления и содержимое перемешивают как можно быстрее. Первая пробирка, в которой образуется видимый преципитат, фиксируется как а-оптимум. Если антисыворотка была оттитрована с вирусом, абсолют- ная концентрация которого известна, то результаты определения а-оптимума можно перевести в приблизительную концентрацию вируса на 1 мл. Поло- жение а-оптимума в том случае, когда объектами исследования служат палочкообразные вирусы, вероятно, в значительной мере зависит от степени агрегации вирусного препарата. Следует отметить, что копреципитация компонентов хозяина, по-видимому, сильнее влияет на положение а-опти- мума, чем на определение точки предельного разведения при преципитации вируса. Положение а-оптимума нельзя использовать для оценки концентра- ции штаммов вируса, пользуясь антисывороткой к одному из них, если только они не близкородственны серологически. Время, требуемое для преципитации Для оценки концентрации сферических вирусов [1179.1 можно использо- вать минимальное время, необходимое при нормальных условиях для обра- зования видимого преципитата. Уиткомб и Блэк [1899] и Уиткомб [1900], работая с вирусом раневых опухолей, применили этот способ для получения количественных данных с помощью метода кольцевой преципитации, для чего потребовалось гораздо меньше материала. Количество специфического преципитата Количество вируса в специфических преципитатах можно измерить несколькими способами: путем определения общего азота, выделения и опре- деления нуклеотидов из вирусной рибонуклеиновой кислоты и, наконец, измерения радиоактивности. С помощью этих методов можно точно оценить концентрацию вируса, на которую при исследовании палочкообразных вирусов степень их агрегации не влияет вовсе или влияет весьма незна- чительно. Можно объединить серологический и хроматографический методы (с характерной для них спецификой) и создать таким образом удобный микро- метод для определения содержания вируса в растительных экстрактах [1176, 1179]. При этом вирус осаждается количественно из осветленного растительного экстракта путем добавления избытка антисыворотки. Нуклеи- новую кислоту в преципитате гидролизуют щелочью, нуклеотиды выделяют методом хроматографии, а концентрацию их определяют спектрофотометри- ческим методом. Рассеяние света При взаимодействии антител с вирусом (образование комплекса анти- ген — антитело) в растворе появляются агрегаты, большие по своему объему, чем отдельные вирусные частицы, и рассеяние света этим раствором воз- растает. Это свойство можно использовать для того, чтобы проследить ход взаимодействия вируса с антителом, т. е. исследовать кинетику этой реак- ции, а также для измерения количества вирусного антигена. Применение
Количественное определение вирусов 31 этого метода требует наличия довольно больших объемов исследуемого раствора (5 мл и более). Однако этим методом можно пользоваться вплоть до таких низких концентраций вируса, как мкг на 1 мл. Добавление частиц или клеток для повышения чувствительности серологической реакции Чувствительность реакции преципитации определяется минимальным количеством антигена, способного образовать видимый преципитат. Чем меньше молекула антигена, тем большее его количество требуется для прояв- ления реакции. Было разработано несколько различных методов, в которых вирус перед реакцией с антисывороткой адсорбируется на значительно больших по размеру частицах или эритроцитах. Чувствительность подоб- ного рода методов выше, чем обычной реакции преципитации, однако пи один из них не получил до сих пор широкого распространения. Например, Сайто и Ивата [1472] использовали метод адсорбции очищенного вируса штрихова- той мозаики ячменя на эритроцитах овцы, обработанных танинном. С помощью этого метода можно было тестировать даже такое незначительное количество вируса, как 0,01 мкг. Бойцикевич и др. [236] адсорбировали вирусоспецифичные антитела на бентоните, а затем окрашивали препарат метиленовым сипим, чтобы улучшить возможность визуального определения преципитата. При этом можно было выявить 0,015 мкг ВТМ, 0,03 мкг вируса южной мозаики фасоли и 0,05 мкг вируса кольцевой пятнистости табака (каждый в объеме 0,1 мл). Беркс [169] провел сравнительные исследования латекса, бентонита и суль- фата бария и обнаружил, что сульфат бария дает неспецифическую реак- цию, тогда как латекс было легче использовать и он требовал меньше анти- сыворотки, чем бентонит. ПОДСЧЕТ ЧИСЛА ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА Не очень точную, по быструю информацию об относительном содержа- нии вирусных частиц в препаратах можно получить путем применения метода контрастирования вирусных частиц фосфовольфрамовой кислотой и последующего анализа препаратов в электронном микроскопе. Чтобы точно определить число вирусных частиц с помощью электронного микро- скопа, необходимо знать объем исследуемого раствора и суметь сосчитать все частицы, находящиеся в этом объеме. Бекас и Вильямс [58] описали метод, согласно которому образцы вирусов разбавляются растворами, содер- жащими летучие соли (ацетат или карбонат аммония). Затем вирусный пре- парат смешивают с раствором, содержащим частицы полистиролыгого латекса какой-то определенной концентрации, а также известной и однородной формы. Смесь распыляют с помощью пульверизатора на пленку-подложку, которая должна находиться на таком расстоянии от пульверизатора, чтобы микрокапли попадали именно на нее. Капли должны быть достаточно мел- кими, чтобы их можно было легко различить в электронном микроскопе при увеличении, необходимом для идентификации вирусных частиц (около х 10 000). Можно использовата капли диаметром 5—10 мкм, но капли диаметром в пределах 1—3 мкм предпочтительнее. На фото 2 представлена электронная микрофотография капли, используемой для такого анализа. Летучие соли не образуют осадка, затрудняющего обнаружение вирус- ных частиц. Растворы ацетата аммония при высушивании имеют pH около 4, тогда как pH раствора карбоната аммония равен при этом 10. Возможное
32 Глава II воздействие такого изменения pH на вирусные частицы следует принимать во внимание. К исследуемой смеси перед распылением можно добавить сыво- роточный альбумин в низкой концентрации, чтобы сделать четким контур высохшей капли. Затем образец оттеняется металлом. Никсон и Фишер [1278] описали усовершенствованный метод получения микрокапель, достаточно однородных по размеру, с помощью специального прибора. Число частиц полистирольного латекса, присутствующих в капле, можно подсчитать на микрофотографиях и таким образом определить объем капли. Одновременно в капле подсчитывается число характерных вирусных частиц. Соотношение числа вирусных частиц и числа частиц латекса варьи- рует в разных каплях. Поэтому для получения надежной оценки числа частиц следует исследовать несколько капель и результаты подвергнуть статисти- ческой обработке [1110, 1914]. При таком подсчете имеется два источника ошибок: 1) неизбежные колебания, обусловленные броуновским движением вирусных частиц и частиц латекса в растворе; 2) различные привходящие обстоятельства, обусловлен- ные отклонениями от точной схемы опыта, такими, как недостаточное смеши- вание или загрязнение во время распыления. Процесс подсчета вирусных частиц — это довольно трудоемкий процесс, а при попытках определения числа частиц мелких изометрических вирусов в растворах, содержащих значительное количество нелетучих веществ, возникают, кроме того, дополнительные трудности, поскольку эти вещества обычно скапливаются по краям капли, не позволяя таким образом рассмот- реть вирусные частицы. Однако этот метод представляется ценным, особенно при исследовании палочкообразных вирусов, когда необходимо выяснита распределение частиц по длине (см., например, [725]). Пинтерик и Тейлор [1333] описали методический прием, названный ими методом уменьшающейся капли. При этом макрокапли вирусной суспен- зии подсушивают таким образом, чтобы вирусные частицы на пленке-под- ложке распределились равномерно. Хорошее распределение частиц было получено лишь при добавлении к суспензии какого-либо белка, например сывороточного альбумина. Как и в случае метода распыления капель, для оценки объема раствора были использованы частицы латекса. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С ОЧИЩЕННЫМИ ВИРУСАМИ Методы, применяемые для химического анализа, можно использовать также для количественного определения вирусов, полученных в достаточно очищенном состоянии. Самым простым методом, которым часто пренебре- гают, является определение содержания сухого вещества в данном объеме раствора. Правда, в этом случае нельзя разграничить, например, вирус и неинфекционные частицы, содержащие меньшее количество нуклеиновой кислоты, чем нативный вирус. Этот метод лежит в основе определения азота и фосфора вируса, а также других его компонентов, например рибозы или тех или иных аминокислот. Определение содержания одного из этих ком- понентов можно затем использовать для количественного определения вируса в очищенных растворах. Растворы же, содержащие известное количество очищенного вируса, можно использовать для определения величины опти- ческой плотности при 260 нм на единицу массы вируса в 1 мл. Аналогичный прием можно применить для отыскания коэффициентов пересчета, которые позволяли бы определять концентрацию вируса по величине коэффициента преломления раствора, а также по площади пиков на шлирен-диаграмме или абсорбционных пиков, полученных при анализе фракций после центра
Количественное определение вирусов 33 фугирования в градиенте плотности сахарозы. Эти величины можно затем использовать для количественного определения вируса в других препаратах. Определение оптической плотности при 260 нм может быть ненадежно при работе с палочкообразными вирусами, степень агрегации которых в разных препаратах сильно варьирует. Последнее обстоятельство приводит к изме- нению интенсивности светорассеяния при дайной концентрации вируса, что влияет па результаты измерения. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ Эксперименты in vivo Если в ткань, где размножается вирус, ввести радиоактивный изотоп заР в виде ортофосфата, то вирусная РНК оказывается меченой. Для этого либо целое растение выращивают на питательной среде, содержащей меченый ортофосфат (в результате чего он попадает в растение через корни), либо ткань погружают в раствор изотопа. Аналогичным образом для метки вирус- ного белка можно использовать з58-сульфат. Эти два изотопа довольно дешевы, и их высокая удельная активность в ткани достигается легко. При определенных условиях их можно использовать для определения очень небольших количеств вируса. Описанный ниже эксперимент с ВЖМТ в листьях китайской капусты иллюстрирует этот метод. В два растения, которые предварительно (за 48 ч до начала экспери- мента) были заражены ВЖМТ, вводили через корни 5 мКи з2Р-ортофосфата. Ииокулированиые листья собирали через 6 ч после введения изотопа. Шесть молодых листьев китайской капусты бтлли заражены путем введения им 0,3 мл экстрагированного сока. Впоследствии па этих листьях было обнару- жено в среднем по 30 некрозов на один лист. Для выделения содержащегося в листьях меченого вируса брали 3 мл сока. К соку добавляли 10 мг неме- ченого вируса в качестве носителя и выделяли из смеси вирус четырьмя цикла- ми дифференциального центрифугирования с последующим фракционирова- нием в градиенте хлористого цезия. Двадцать процентов вируса удалось таким образом вновь выделить. Активность вирусного препарата составляла .20 000 имп/мин. РНК вируса гидролизовали щелочью и половину гидролизата подвергали хроматографии на бумаге в растворителе, который обеспечивал разделение четырех рибонуклеотидов. Отношение радиоактивностей этих четырех фракций было характерно для нуклеотидного состава РНК ВЖМТ. Общая радиоактивность составляла 9000 имп/мин. Мы легко могли измерить •сотую часть этого количества. Таким образом, эта процедура оказалась для ВЖМТ приблизительно в 10—100 раз более чувствительной, чем анализ инфекционности при определении вновь образованного вируса па ранних стадиях инфекции. Недостаток этого метода, по крайней мере при кратко- временном включении изотопа, состоит в том, что измеренную радиоактив- ность невозможно перевести в абсолютные количества вируса, поскольку удельная активность вирусной РНК в растении неизвестна. Эксперименты in vitro В работе с такими вирусами, как ВТМ и ВЖМТ, которые довольно легко могут быть освобождены от большей части примесей, использование радио- активного вируса позволяет повысить точность и чувствительность метода его количественного определения в некоторых опытах in vitro. Чтобы подуг- лить паилучший выход меченого вируса, в растение вводят изотоп в течение 3-0893
34 Глава II нескольких дней в период максимального накопления вируса. Для> интактных растений наибольшее количество изотопа, применяемое для метки, составляет 10 мКи з2Р-ортофосфата или зб3-сульфата на растение. Используя эти количества, мы получили очищенный вирус с удельной актив- ностью 1000 имп (мин-мкг) при эффективности счета примерно 5%. Исполь- зуя 50—100 мКи иСОг и вводя изотоп в течение 12—14 дней, Сигияма и Френкель-Конрат [1699] получили препарат ВТМ с активностью, 2—10-103 имп(мии-мкг). СМЕШАННЫЕ МЕТОДЫ Метод, который применялся в вирусологии еще до того, как был выделен; первый вирус, основывается на явлении анизотропии в потоке. Растворы палочкообразных вирусов достаточно высокой концентрации становятся анизотропными при перемешивании жидкости. Перемешивание вызывает ориентацию частиц в направлении тока жидкости. Явление анизотропии в потоке наблюдается при встряхивании или при вращении жидкости; в небольшом сосуде, расположенном между скрещенными поляроидными пластинками. Это грубый, но быстро дающий результаты метод для выявле- ния в неразрушенном состоянии таких вирусов, как ВТМ или JV-вирус картофеля, в растворах, содержащих более чем 100 мкг вируса на 1 мл.. Было описано несколько экспресс-методов количественного определения вирусов. Эти методы обычно разрабатывают и применяют в работе с виру- сами, которые накапливаются в высокой концентрации. К сожалению, к этой категории относятся вирусы, для количественного определения кото- рых уже существуют другие вполне удовлетворительные методы. Например, применительно к ВТМ был описан метод экстракции дисков зараженной ткани с помощью смеси воды с хлороформом [1741]. Вирус осаждали суль- фатом аммония при 25 %-ном насыщении, осадок растворяли и измеряли поглощение при 260 нм. Таким образом удалось определить содержание ВТМ; в одном диске диаметром 9 мм. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ В табл. 2 суммированы сведения относительно минимальных концентра- ций и количеств вируса, определяемых с помощью различных методов. Эти оценки очень приблизительны, поскольку они значительно варьируют у раз- ных вирусов и зависят от условий проведения анализа. Тем не менее эти данные позволяют подчеркнуть широкие различия в чувствительности разных методов. В зависимости от конкретной цели исследования чувствительность- и точность отдельных методов следует оценивать критически в отношении каждого изучаемого вируса и растительного материала. Например, при сравнении относительной чувствительности методов электронной микроско- пии, микропреципитации и инфекционности с целью количественного опре- деления трех палочкообразных вирусов картофеля Сэмспон и Тейлор [1480] показали, что выбор наиболее чувствительного метода зависит от вируса, а также от той части растения, которая была взята для исследования. Вообще метод подсчета числа местных поражений является гораздо- более чувствительным, чем физические и химические методы. Некоторые серологические методы приближаются по своей чувствительности к методам; определения инфекционности. Применение изотопов для метки растений,.
Количественное определение вирусов 35 Таблица 2 Приблизительные минимальные количества вируса, которые можно выявить и измерить с помощью различных методов!) Количество вируса выявляемое измеряемое концен- трация, мкг на 1 мл количе- ство, мкг концен- трация, мкг на 1 мл количе- ство, мкг 1. Определенно путем подсчета числа 0,001 0,0001 0,01 0,01 местных поражении 2. Аналитическое центрифугирование а) шлиреп-оптика 50 20 100 40 б) ультрафиолетовая оптика 1,0 0,4 10 4,0 3. Центрифугирование в градиенте плотности а) видимые зоны — 1,0 — — б) спектрофотометрические измеро- 5 1,0 10 2 ния в градиенте сахарозы в) равновесный градиент в CsCl 1,0 0,3 1,0 0,3 4. Некоторые серологические методы а) предельное разбавление при пре- 1,0 0,5 1.0 0,5 ципитации в пробирках б) диффузия или электрофорез 1,0 0,02 1.0 0,02 в агаровом голо (визуальная оцен- ка) в) диффузия пли электрофорез в ага- 0,2 0,002 0,2 0,002 ровом геле (радиоавтография) г) флоккуляцнониая проба с бенто- 0,1 0,01 0,1 0,01 нитом I) Обратите внимание иа то, что некоторые из этих величин отличаются друг от друга в 10 и более раз, что зависит от вируса, а также от той тщательности, с которой проводится исследование. в которых размножается вирус, может оказаться значительно более чув- ствительным методом, чем определение инфекционности, позволяя выявить очень небольшие количества вируса на ранних стадиях после заражения. При проведении многих экспериментов наибольший интерес вызывают результаты, полученные путем применения различных методов, основанных па разных свойствах вируса. В таких случаях следует иметь в виду труд- ности интерпретации результатов, связанные с различной чувствительностью применявшихся методов. Некоторые примеры такого рода обсуждаются в гл. VII. 3*
ГЛАВА III ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ Начиная с классических исследований Стэнли, Боудэна, Нири и других в 1930-х годах, много усилий было направлено на разработку методов выде- ления и очистки вирусов растений. Чтобы изучить основные свойства вируса, необходимо уметь получать препараты, более или менее свободные от ком- понентов клетки-хозяина, но сохраняющие, однако, при этом инфекцион- ность. Не удивительно поэтому, что первыми выделенными и эффективно изученными вирусами были те, которые достаточно стабильны и содержатся в растении-хозяине в относительно высокой концентрации (ВТМ, А-вирус картофеля и вирус кустистой карликовости томатов). В настоящее время круг такого рода вопросов расширился и возник интерес к ряду вирусов, сильно различающихся по своей концентрации в растении-хозяине, а также по устойчивости к различным физическим и химическим воздействиям. В этом случае нет общепринятых правил: методы, эффективные в отношении одного вируса, могут быть совершенно неприменимы к другому, по всей вероятности, сходному вирусу. Даже разные штаммы одного и того же вируса могут требовать для успешного выделения применения различных методов. Много было написано о чистоте и гомогенности препаратов в приложе- нии к вирусам растений. В химическом смысле нет такого понятия, как очищенный препарат вируса растений. Даже в том случае, если допустить, что препарат не содержит абсолютно никаких примесей низко- и высокомоле- кулярных компонентов клетки-хозяина (что весьма маловероятно), имеются другие обстоятельства, которые следует принять во внимание. 1. Можно почти с полной уверенностью утверждать, что большинство вирусных препаратов представляет собой смесь инфекционных и неинфек- ционных частиц вируса. Частицы последнего типа, вероятно, имеют один или более разрывов в цепи РНК. Эти разрывы у разных частиц могут прои- зойти в разных участках РНК. 2. Большинство вирусных препаратов почти всегда представляет собой смесь мутантов, даже если родительский штамм в основном преобладает в препарате. Травянистые растения, обычно используемые при работе с вирусами, содержат в целом около 109—1010 клеток мезофилла. Если инфицировано все растение, то в нем имеется около 104—10° вирусных частиц на клетку (т. е. 1013—1016 вирусных частиц на растение). Благодаря этому создаются широкие возможности для возникновения мутантов, которые появляются даже в том случае, когда растение первоначально было зара- жено одной-единственной вирусной частицей. РНК таких мутантов будут различаться по крайней мере по одному нуклеотиду. Если такая мутация происходит в цистроне, кодирующем белок оболочки, то этот белок в таком случае также будет отличаться от белка родительского штамма. 3. Очищенные препараты некоторых вирусов могут содержать неполные частицы, которые не обладают инфекционностыо. 4. В настоящее время известно несколько вирусов, существующих в виде многокомпонентных систем, в которых две или более разные частицы взаимо- действуют при репликации вируса.
Выделение вирусов 37 5. У некоторых крупных вирусов инфекционные частицы могут быть самых разных размеров. При этом трудно ожидать, чтобы инфекционные частицы крупных вирусов, окруженных мембраной, имели бы абсолютно идентичную структуру. 6. Для таких вирусов, как ВЖМТ, которые содержат в качестве струк- турного компонента низкомолекулярный полиамип, кажется маловероят- ным, чтобы одно и то же число молекул полиамииа присутствовало в одних и тех же участках вирусной частицы. 7. Харрис и Найт [712] показали, что удаление концевого остатка трео- нина с помощью карбоксипептидазы не снижает; инфекционности препара- тов ВТМ. Такие модификации вирусных частиц могут иметь место в растении или возникать в процессе выделения вируса. Например, экстракт фасоли (Phaseolus vulgaris) содержит фермент, подобный карбоксипептидазе, который отщепляет концевой треонин белка ВТМ [1412]. Таким образом, для вирусов растений понятия чистоты и гомогенности являются чисто рабочими терминами, целиком определяемыми самим вирусом и методами, применяемыми для его выделения. Препарат вируса можно считать практически чистым (для определенной цели), если имеющиеся в нем примеси посторонних компонентов или мутантных частиц не влияют на изучаемые свойства или если мы можем учесть это влияние. В настоящее время для целого ряда вирусов растений разработаны эффективные методы препаративного выделения. Прежде чем описать эти методы в деталях, мы рассмотрим в общих чертах проблемы, возникающие в процессе выделения вируса. ВЫБОР РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА Испытание на иифекциоипость В процессе разработки процедуры выделения очень важно иметь воз- можность произвести определение инфекционности во фракциях. Конечно, лучше всего для этой цели использовать растения, реагирующие на зараже- ние вирусом образованием местных поражений. В ходе предварительных анализов большая точность обычно необязательна, однако надежность и быстрое развитие некрозов дают большие преимущества в работе. В отсут- ствие растений-хозяев с подобного типа реакцией для количественного опре- деления вирусов можно использовать растения, реагирующие на заражение возникновением симптомов системного поражения. В тех случаях, когда метод механической инокуляции не может быть использован, растения зара- жают с помощью насекомых-переносчиков. Исходный материал Выбор растения-хозяина для размножения вируса может иметь решаю- щее значение и для его успешного выделения. По-видимому, одной из наи- более важных особенностей, присущих такому растению, должно быть отсутствие в его клетках некоторых веществ в концентрациях, достаточных для того, чтобы вызвать ингибирование или необратимое осаждение вируса (гл. XIV). К числу этих веществ относятся фенольные соединения, органи- ческие кислоты, слизи и камеди, некоторые белки и ферменты, особенно рибонуклеазы. Например, многие вирусы косточковых плодовых очень трудно или даже невозможно выделить из природных хозяев, так как в листьях большинства представителей сем. Rosaceae содержатся таинины, и притом в высокой концентрации. Выделение нескольких таких вирусов
38 Глава, III стало возможным после обнаружения других хозяев, не относящихся к сем. Rosaceae, например огурца (Cucumis sativus L.) [1230]. В настоящее время существует сравнительно небольшая группа растений-хозяев, которые пригодны для выделения целого ряда вирусов. К этой группе, помимо огурца и родственных ему растений, как, например, тыквы, относятся Vigna sinenisis (Endl.) [585], Chenopodium amaranticolor (Goste et Reyn) и Petunia hybrida (Vilm). Однако даже эти хозяева могут содержать сильные ингиби- торы, действующие на некоторые вирусы. Так, Франки [546] показал, что экстракты листьев огурца при смешивании с очищенным вирусом огуречной мозаики снижают инфекционность этого вируса в 100 раз. В присутствии ингибирующих веществ происходит осаждение вируса. Соответствующее растение, условия, в которых оно выращивается, а также время, когда растение можно использовать для выделения вируса, следует выбирать так, чтобы исходная концентрация инфекционных вирус- ных частиц была как можно выше. Для многих вирусов их концентрация достигает максимума через несколько дней или недель и затем довольно быстро падает (фиг. 31). Иногда распределение вируса в растении столь неравномерно, что имеет смысл использовать для выделения лишь те его части, которые содержат вирус в высокой концентрации. Нередко содержа- ние вируса оказывается более низким в средней жилке, чем в листовой пла- стинке. Если средняя жилка и черешок велики по размеру, то их полезно удалить. В отдельных случаях отделение определенной ткани является почти обязательным приемом. Например, в случае выделения вируса раневых опухолей это необходимо, так как вирус накапливается только в опухолевой ткани. Другая причина, заставляющая использовать для выделения вируса лишь определенные части инфицированного растения, состоит в том, чтобы избежать накопления высоких концентраций ингибиторов, а также веществ, которые могли бы адсорбироваться на вирусе; такие вещества крайне трудно удалять. В молодых растениях содержание таких веществ часто бывает низким, и поэтому вирусы в некоторых случаях можно выделять только из такой ткани. Следует всегда иметь в виду возможность того, что растение-хозяин, используемое для накопления вируса, еще раньше было заражено другим вирусом или может быть инфицировано в процессе культивирования. Нередко загрязнение материала нежелательным вирусом происходит в процессе выращивания растений в теплице. Так, штаммы вируса табачной мозаики, Х-вируса картофеля и вируса некроза табака могут преобладать в теплицах, которые в течение некоторого времени использовались для работы с этими вирусами. В этом случае для выделения примеси не всегда достаточно исполь- зовать растения, реагирующие на заражение балластным вирусом лишь образованием местных поражений (например, N. glutinosa — для удаления примеси ВТМ). Даже при незначительном количестве такого стабильного вируса его концентрация при выделении основного вируса может сильно возрастать. Замораживание растительной ткани перед экстракцией вируса облег- чает последующее удаление компонентов клетки-хозяина, и этот прием полезно применять при выделении таких стабильных вирусов, как ВТМ. Однако для многих других вирусов замораживание оказывается вредным. Инфицированные насекомые-переносчики (тли) недавно были использованы как исходный материал для выделения небольших количеств вируса скручи- вания листьев картофеля [1324].
Выделение вирусов 39 СРЕДА ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ Такая среда, как, например, сыворотка, является естественной средой для большинства вирусов животных. Аналогичная среда отсутствует в случае вирусов растений. После разрушения растительных клеток и освобождения, а также смешивания их содержимого вирусные частицы попадают в необыч- ную для них среду. Поэтому для выделения вирусов обычно используется искусственная среда, предназначенная для сохранения вирусных частиц в инфекционном, интактном и пеагрегированиом состоянии иа различных стадиях очистки. Условия, благоприятствующие сохранению стабильности очищенного вирусного препарата, вероятно, отличаютсяйот условий, которые необходимы для получения неочищенного экстракта или частично очищенных вирусных препаратов [263, 264]. Кроме того, различные факторы могут сильно воздействовать друг на друга, оказывая таким образом влияние на стабильность вируса. Ниже мы рассмотрим основные факторы, которые необходимо принимать во внимание при выборе подходящей среды для выделения вируса. pH и буферная система Многие вирусы стабильны в довольно узком диапазоне значений pH, и при выделении вируса pH экстракта не должен выходить за эти пределы. Важное значение может иметь выбор подходящего буфера, а также соот- ветствующая ионная сила. Часто применяют фосфатные буферы, но на неко- торые вирусы они оказывают вредное влияние. Например, при использова- нии фосфатного буфера не удается получить инфекционный препарат вируса мозаики салата-латука, тогда как при использовании боратного буфера могут быть выделены высокоинфекционные препараты [780]. Применявшийся в этой работе боратный буфер имел незначительную емкость. Ионы металлов и ионная сила Для сохранения инфекционности некоторых вирусов необходимо при- сутствие в среде дивалентных ионов (Са2+ или Mg2+). Важным фактором является ионная сила буферного раствора. В средах с ионной силой ниже 0,2М некоторые вирусы распадаются, тогда как другие нестабильны при более высокой ионной силе [1671]. Вирус мозаики люцерны преципитирует при концентрации Mg2+ выше 0,001 М и'деградирует при концентрации, превы- шающей 0,1 М [845]. Восстанавливающие агенты и вещества, защищающие от фенольных соединений К средам для экстракции часто добавляют восстановители (сульфит натрия, тиогликолят натрия или цистеингидрохлорид). Эти соединения способствуют сохранению инфекционности, которую вирус легко теряет в окислительных условиях, а также уменьшают адсорбцию на вирусе ком- понентов клетки-хозяина. Как это показано в гл. XIV, фенольные соедине- ния, встречающиеся в растительных тканях, могут серьезно затруднять выделение и хранение вирусов. Ниже приведены некоторые методы, которые более или менее успешно использовались для того, чтобы во время выделения свести к минимуму действие фенолов на вирусы растений.
40 Глава III Восстанавливающие серусодержащие агенты Цистеин и сульфит натрия, добавляемые к среде для экстракции, вероят- но, действуют путем ингибирования фенолоксидазы и соединения с хино- ном [1329]. Хелатные агенты Полифенолоксидаза является медьсодержащим ферментом. Два хелат- ных агента — диэтилдитиокарбамат и этилксантагинат калия,— более или менее специфично реагирующие с медью, были использованы для получения инфекционных препаратов некоторых вирусов, например вируса некротиче- ской кольцевой пятнистости вишни [698], вируса мозаики яблони, переда- ваемого механически [1222], вируса огуречной мозаики [728, 1331]. Вещества, конкурирующие с вирусом за фенолы Для получения инфекционных препаратов вируса деформации побегов дерева какао из его листьев были применены различные растворимые белки и суспензии белка [298]. При этом оказалось, что лучше использовать суспен- зии, так как они легче удаляются из экстракта, в то время как яичный альбу- мин до конца выделения присутствовал в препарате и в дальнейшем мешал проведению серологических тестов. Для связывания таннинов достаточно эффективными оказались синтетические полимеры, содержащие амидную связь, которая необходима для образования комплексов с таннинами. Среди них наибольшее значение имеет поливинилпирролидон [ПВП]. Как растворимая, так и нерастворимая формы ПВП образуют комплексы с таннинами. «Поликлер АТ» является вполне удовлетворительным коммер- ческим препаратом ПВП. При удалении фенолов с помощью ПВП важно- контролировать значение pH, так как эффективность связывания быстро- уменьшается при pH выше 8 [1097]. Никотин также осаждает таннины и используется для получения инфек- ционных экстрактов вируса [409, 1772], однако с его помощью можно лишь частично предотвратить потерю инфекционности ВТМ, вызываемую танни- нами [1765]. Вещества, используемые для удаления растительных белков и рибосом Бентонит был первоначально применен для выделения РНК, свободной от рибонуклеазы [292, 542]. Как известно, многие вирусы довольно быстро- теряют инфекционность in vitro, что, в частности, может быть следствием присутствия в экстрактах или в частично очищенных препаратах вирусов рибонуклеаз из листьев. При внимательном изучении возможности исполь- зования Mg-бентонита при выделении вирусов оказалось, что в соответствую- щих условиях примесь нуклеаз в вирусном препарате существенно умень- шалась или вовсе отсутствовала [475]. Кроме того, рибосомы, 188-белок и содержащие частицы препараты, окрашенные в зеленый цвет, получаемые из фрагментированных хлоропластов, легко адсорбировались на бентоните при условии, что концентрация Mg2+ была 10~3 М или выше. Этот метод оказался очень полезным для ряда вирусов и вирусных штаммов, однако- некоторые вирусы адсорбировались на бентоните. В ряде случаев эту труд- ность удавалось преодолеть, если внимательно контролировалась концен- трация Mg2+. Нативный вирус и пустые белковые оболочки некоторых виру- сов по-разному адсорбировались на бентоните [799]. Следует отметить, что
Выделение вирусов 4! различные сорта бентонита различались по своей способности адсорбировать рибосомы. Определенную трудность представляло также загрязнение вирус- ных препаратов небольшими количествами тонкой фракции бентонита. Эти примеси, по крайней мере у некоторых исследованных вирусов, удалялись соответствующими обработками. Для адсорбции и удаления некоторых при- месей клетки-хозяина и особенно пигментов можно использовать активиро- ванный уголь. Однако при последующей фильтрации с целью удаления угля возможны существенные потери вируса па фильтре, и для этой цели лучше применять центрифугирование [598]. Использование этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в форме натриевой соли в 0,01 М буфере при pH 7,4 приводит к разрушению большей части рибосом, тем самым предотвращая их соосаждение с вирусом. ЭДТА также ингибирует некоторые ферменты, нуждающиеся в металле. Однако это соединение можно применять только в отношении вирусов, которые не тре- буют дивалентных ионов для сохранения стабильности. МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ Для измельчения или гомогенизации небольших количеств инфициро- ванной вирусом ткани пользуются ступкой и пестиком, для работы с более значительными количествами материала используются различные типы гомо- генизаторов и соковыжималок. Если требуется переработать до нескольких килограммов ткани, применяются шаровые и коллоидные мельницы, а также мясорубки. При использовании специальной среды для экстракции часто' необходимо обеспечить непосредственный контакт разрушенных клеток с этой средой. Измельченная ткань обычно отжимается через марлю или другую ткань. ПЕРВИЧНАЯ ОЧИСТКА ВИРУСА Осветление экстракта В неочищенном экстракте вирус смешивается с различными клеточ- ными компонентами, размеры которых колеблются в тех же широких преде- лах, что и размеры вируса, и свойства которых в некоторых отношениях напоминают свойства вируса. К этой категории частиц относятся рибосомы, IOS-белок хлоропластов (фракция I), имеющий тенденцию образовывать агрегаты, фитоферритин [407], фрагменты мембран и фрагменты разрушен- ных хлоропластов. В этой смеси присутствуют также неразрушенные клетки, растворимые белки и вещества с низкой молекулярной массой. Целью первого этапа выделения вируса обычно является удаление как можно большей части макромолекулярных компонентов клетки-хозяина; вирус при этом остается в растворе. Среда для экстракции может быть пред- назначена для осаждения рибосом и других органелл или для их дезинтегра- ции. Далее экстракт можно подвергнуть некоторой обработке, например прогреть при 50—60 °C в течение нескольких минут, или добавить К2НРО4 с целью коагуляции большей части примесей. При очистке некоторых виру- сов очень эффективным для осаждения компонентов клетки-хозяина является добавление к экстракту органичесих растворителей, например этанола. При выделении других вирусов экстракт встряхивают со смесью, содержа- щей н-бутанол — хлороформ, что вызывает денатурацию большинства при- месей. Обработанный таким образом экстракт затем центрифугируют при довольно низкой скорости (например, 10—20 мин при 5000—10 000 g).
42 Глава III При этом осаждается клеточный детрит и коагулируемый материал клеток хозяина. В результате центрифугирования экстракт, обработанный и-бута- иол — хлороформом, разделяется на две фазы, причем вирус остается в вод- ной фазе, а основная часть денатурированного материала находится в интер- фазе. Следует заметить, что, хотя некоторые вирусы устойчивы к обработке н-бутаиол — хлороформом, у других она может вызвать довольно серьез- ные потери. Обработка одним лишь хлороформом является более мягким приемом, чем обработка смесью бутанол — хлороформ. Для некоторых вирусов эмульгирование экстракта из листьев с фторуглеродом (фреон-113) дает хорошее первоначальное осветление без серьезной потери инфекцион- ности [423]. Иногда вместо центрифугирования для первичного удаления загрязняю- щего экстракт материала клеток растения-хозяина применяют фильтрова- ние через фильтры из бумаги и тому подобных материалов. Для многих вирусов, вероятно, очень важно проводить их выделение как можно быстрее после получения экстракта из листьев. Однако Боудэн и Пири [124] описали систему из листьев табака, инактивирующую вирус. Когда вирус осаждали из свежеотжатого сока, то инактивирующая система осаждалась вместе с вирусом. В ресуспендированном осадке инактивирующая система была стабильна и инактивировала вирус некроза табака и вирус кольцевой пят- нистости табака (но не ВТМ). В экстракте из листьев, хранившихся при 18 °C в течение дня, инактивирующая система разрушалась, в связи с чем из таких экстрактов путем осаждения можно было получить гораздо более стабильные препараты вируса. В клетке некоторые вирусы существуют в виде окруженных мембранами агрегатов (фото 54). Поэтому требуется время для высвобождения вируса после получения экстракта из листьев. Если проводить центрифугирование вскоре после экстрагирования, то даже при низкой скорости большая часть вируса будет потеряна с первым же осадком. Концентрирование вируса и удаление низкомолекулярных примесей Высокоскоростное центрифугирование Центрифугирование при высокой скорости в течение достаточного периода времени приводит к осаждению вируса. Если при этом вирус не дена- турирует, то его можно затем перевести в активной форме обратно в раствор. Этот этап выделения очень важен, так как он преследует сразу две цели. Во-первых, при этом происходит концентрирование вируса, а во-вторых, препарат вируса освобождается от низкомолекулярных примесей. Не следует применять при центрифугировании растворы вирусов в низкой концентра- ции, так как это приводит к значительным потерям (фиг. 3). Центрифугирование в градиенте плотности Многие вирусы, особенно палочкообразные, могут образовывать после центрифугирования осадки, которые затем очень трудно вновь суспенди- ровать. Центрифугирование в градиенте плотности дает возможность кон- центрировать такие вирусы без осаждения (см., например, [404] для Х-вируса картофеля). С появлением больших 6-местных бакет-роторов этот метод стал находить все более широкое применение в качестве первой ступени кон- центрирования вирусов. Описанная ниже модификация этого метода позво- ляет использовать даже угловые роторы для первичного концентрирования
Выделение вирусов 43 вируса без осаждения на дно пробирки. При этом на дно пробирки наливают слой раствора сахарозы высокой плотности толщиной в несколько милли- метров, па него наслаивают слой сахарозы низкой плотности высотой около 2 см, а остаток пробирки заполняют осветленным клеточным экстрактом. При соответствующих условиях вирус может быть собран в области иптерфазы между двумя слоями сахарозы. Появление в последнее время зональных роторов дает возможность еще шире использовать градиенты плотности для препаративных целей [1783]. Высаливание и кристаллизация Этот метод широко применялся еще до того, как в распоряжении иссле- дователей появилась высокоскоростная центрифуга. До сих пор он остается цепным для вирусов, которые не инактивируются в концентрированных солевых растворах. Наиболее часто для высаливания применяют сульфат аммония в концентрации, составляющей около х/3 насыщающей, хотя другие соли также могут осаждать вирус и кристаллизовать его (фото 3). После выдерживания в течение нескольких часов или дней препарат вируса осаж- дают путем низкоскоростного центрифугирования и вновь растворяют в небольшом объеме соответствующей среды. Осаждение в изоэлектрической точке Многие белки имеют низкую растворимость в изоэлектрической точке или вблизи нее (фиг. 61, Б). Изоэлектрическое осаждение может приме- няться для вирусов, которые стабильны при таких условиях. После центри- фугирования или фильтрования осадок собирают и вновь растворяют в под- ходящей среде. Гелъ-филътрация С помощью гель-фильтрации на сефадексе, агаре или агарозе из раствора вируса удаляют примеси небольших молекул. Экстракт наслаивается на вер- шину колонки гранулированного геля, уравновешенного соответствующей средой. Частицы вируса, не проникая внутрь гранул геля, будут двигаться через колонку быстрее, чем низкомолекулярные вещества, которые могут проникать в гранулы. Гель-фильтрацию обычно используют на последнем этапе очистки вируса. Этот метод удобен также для некоторых вирусов, которые должны быть быстро удалены из первичного осветленного экстрак- та, так как обеспечивает замену растворителя, в котором находится вирус. Колонка с сефадексом G-100 диаметром 5 см и длиной 50 см обладает доста- точной емкостью для нанесения 200 мл осветленного экстракта [1671]. Диализ Для удаления низкомолекулярных веществ из первичного экстракта или для смены среды можно провести диализ через целлюлозные мембраны. Этот метод более длителен, чем фильтрование через гель, и чаще приме- няется для удаления соли после высаливания и кристаллизации, а также после фракционирования в градиенте плотности солей или сахарозы, что обсуждается ниже. Коацервация При коацервации происходит разделение раствора макромолекул на две жидкие фазы — богатую и бедную коллоидами. Описаны системы полимеров [12, 13], которые разделяются вследствие своей несовместимости независимо
44 Глава III от присутствия вируса. Если к такой системе добавить вирус, то он скон- центрируется в одной либо в другой фазе или в интерфазе, что зависит от концентрации соли. Хеберт [752] показал, что некоторые вирусы растений можно избирательно осадить в однофазной системе, содержащей полиэтилен- гликоль. При сравнительном исследовании двухфазной системы, содержа- щей полиэтиленгликоль и декстрансульфат, и однофазной системы из поли- этиленгликоля в присутствии соли Леберман [1055] показал, что простая процедура осаждения вируса с помощью полиэтиленгликоля так же эффек- тивна, как и выделение вируса с помощью двухфазной системы. Эти методы требуют дальнейшей разработки с использованием ряда вирусов. Их, вероят- но, можно рассматривать как полезный этап на пути первичного концентри- рования вируса из осветленного клеточного экстракта. Венекамп и Мош [1842] описали метод выделения некоторых вирусов с помощью колонки с порошком целлюлозы, смешанным с полиэтиленглико- лем, декстраном, глюкозой и солями. Сходную смесь добавляли к экстрак- там листьев и экстракт наносили на колонку. Вирус при этом осаждался и задерживался на колонке, в то время как большая часть веществ, харак- терных для клеток растения-хозяина, проходила сквозь нее. Вирус элюиро- вали с колонки средой без полиэтиленгликоля и хлористого натрия. Однако сомнительно, чтобы с помощью одного лишь этого метода удавалось получать вирусные препараты, свободные от материала растения-хозяина. ДАЛЬНЕЙШАЯ ОЧИСТКА ПРЕПАРАТОВ ВИРУСА Вирусные препараты, прошедшие одну стадию очистки и концентриро- вания, еще содержат некоторое количество низко- и высокомолекулярных веществ, происходящих из ткани хозяина. Большая часть этих, примесей может быть удалена на дальнейших стадиях очистки. Метод, который следует при этом использовать, в значительной степени зависит от стабильности вируса, количества выделенного препарата и цели, для которой требуется препарат. Иногда препараты вируса высокой степени чистоты можно получить путем повторного применения одного и того же метода. Например, иногда препарат можно подвергнуть повторной кристаллизации с помощью суль- фата аммония или провести несколько циклов дифференциального центри- фугирования. Последний метод предпочтителен для удаления макромолеку- лярных примесей, так как они не растворяются при ресуспендировании осадка, полученного после высокоскоростного центрифугирования. Однако при этом часто наблюдаются и потери вируса, что происходит либо вследствие того, что часть вируса или весь он становится нераство- римым, либо из-за того, что для растворения осадка было недостаточно времени. Последнее обстоятельство представляет особую трудность при выделении некоторых палочкообразных вирусов. При растворении небольших осадков, для которых характерно высокое отношение поверхности к объему, серьез- ные потери могут иметь место вследствие того, что вирус вновь переходит в раствор еще до удаления надосадочной жидкости. Вообще говоря, в процессе выделения полезно использовать сочетание по крайней мере двух методов, которые зависят от разных свойств вируса. По-видимому, для удаления примесей это более эффективный прием, чем повторное применение одного и того же метода.
Выделение вирусов 45 Центрифугирование в градиенте плотности Одним из наиболее распространенных методов, применяемых для даль- нейшей очистки вирусов, является центрифугирование в градиенте плот- ности, уже обсуждавшееся в гл. II как метод выявления вирусов. Самым обычным материалом для создания градиента является сахароза. Для пол- ной очистки вирусов наиболее часто используют метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Несмотря на то что этот метод не связан с жестким воздействием на вирус, все же случается, что некоторые вирусы и в этом случае утрачивают инфекционность (стр. 28). Этот метод дает воз- можность получить некоторое представление относительно чистоты препара- та. Он позволяет выявить связь между частицами и инфекциоиностыо; с его помощью также можно часто выявить присутствие неинфекционных вирусо- подобных частиц или многокомпонентных вирусов. Зона отдельного компо- нента может распределяться в градиенте более широко, чем это следует из данных измерения оптической плотности. Может понадобиться несколько циклов центрифугирования в градиенте плотности, чтобы в достаточной степени исключить взаимное загрязнение компонентов. Недавние исследова- ния с многокомпонентными вирусами показали, что даже при повторном фракционировании в градиенте плотности сахарозы бывает чрезвычайно трудно выделить один компонент, полностью свободный от другого ком- понента (гл. VIII). При недостаточно адекватных условиях седиментации зоны главного и минорного компонентов могут перекрываться [266]. Способ удаления зон из градиента также может заметно влиять на степень загрязнения одной фракции другой. При фракционировании путем сбора фракций после про- калывания дна порбирки может произойти довольно сильное смешивание, если скорость вытекания слишком высока. Эффективным материалом для создания градиента в случае достаточно стабильных вирусов являются также концентрированные растворы таких солей, как тартрат калия или хлористый цезий. Электрофорез в градиенте плотности При использовании этого метода, примененного Бракке [261] для работы с вирусами растений, суспензия вируса наслаивается на соответствующим образом забуференный градиент плотности, формируемый в U-образной трубке. Макромолекулы с различным общим зарядом мигрируют с различной скоростью и при соответствующих условиях разделяются, образуя дискрет- ные полосы, которые можно выявить по данным светорассеяния it затем изолировать с колонки. Этот метод не получил широкого распространения, но может оказаться полезным для нестабильных вирусов. Описаны раз- личные модификации аппаратов, используемых для электрофореза [1673, 1828]. Другие виды электрофореза Электрофорез на агаровом, крахмальном геле и т. д. не находит широ- кого применения для исследования вирусов растений. Мало применялся также метод непрерывного электрофореза, при котором поперек листа вися- щей фильтровальной бумаги прикладывается разность потенциалов. Через лист сверху вниз протекает буфер. Этот метод не нашел широкого примене- ния, что, по-видимому, обусловлено невозможностью разделения больших количеств материала, слишком большой затратой времени и другими при- чинами.
46 Глава III Гель-фильтрация в агаре Фильтрование через агаровый гель можно рассматривать как полезный этап для дальнейшей очистки вирусов, которые оказываются нестабиль- ными при осаждении путем высокоскоростного центрифугирования [5, 342, 1672]. Этот метод применяется также для разделения частиц различной длины, встречающихся в препаратах таких палочкообразных вирусов, как ВТМ [1670]. Фракции вируса, полученные с колонки агарового геля, могут содержать также некоторое количество компонентов клетки-хозяина, сход- ных по размеру с вирусом, для удаления которых требуется некоторая допол- нительная обработка. Вирус получают в объеме жидкости, по крайней мере в два раза превышающем объем исходного материала, и обычно требуется проводить концентрирование элюата. Хроматография Иногда как эффективный этап дальнейшей очистки частично очищенных препаратов вируса используют хроматографические методы. Например, для очистки вируса некротического пожелтения салата-латука Мак-Лин и Франки [1127] использовали метод хроматографии на колонках с кальций- фосфатным гелем в фосфатном буфере. При элюции фосфатным буфером (pH 7,6) вирус проходит через колонку, в то время как большая часть приме- сей остается адсорбированной на геле. В таких условиях с колонки элюиро- вали 50—80% инфекционного вируса, что составляло лишь 10% нанесенного на колонку материала, поглощающего при 260 нм. Концентрирование вируса и удаление низкомолекулярных веществ На различных стадиях выделения вируса возникает необходимость сконцентрировать вирусный препарат и удалить из него соли или сахарозу. Для вирусов, которые стабильны при осаждении, с целью концентрирования вируса и удаления низкомолекулярных примесей обычно применяют высоко- скоростное центрифугирование, а для удаления или смены солей используют обычный диализ. Для работы с нестабильными вирусами применяют неко- торые другие приемы. К препарату можно добавить порошок сухого геля (например, сефадекса) или поместить препарат в мешочек для диализа, обложенный порошком сухого геля, и оставить на холоду в течение несколь- ких часов. Для концентрирования больших объемов и удаления солей можно применить ультрафильтрацию под давлением через мембранные фильтры. Испарение, которое происходит в то время, когда препарат вируса нахо- дится в мешочке для диализа и висит в токе воздуха, может вызвать потери вируса вследствие локального подсушивания стенок мешка и концентрирова- ния в таких местах солей, имеющихся в препарате. Для концентрирования очищенных препаратов ВТМ применяются также бактериальные фильтры из пористого стекла с размером пор 1,0—1,7 мкм [1308]. Задержка вируса на фильтре зависит от концентрации соли и обусловлена, по-видимомут эффектом высаливания и адсорбцией вируса на поверхности стекла. Далее вирус элюируют с фильтра водой. ХРАНЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ ВИРУСОВ Хранение очищенных препаратов многих вирусов растений в течение более чем нескольких дней обычно связано с определенными трудностями. Поэтому наиболее желательно использовать препараты сразу после выделе- ния. Многие вирусы (кроме ВТМ) теряют инфекционность даже при опти-
Выделение вирусов 47 мальных условиях хранения — при 4 °C в растворе или в виде кристалличе- ских препаратов под сульфатом аммония. Такое хранение не исключает полностью роста грибов и бактерий, в результате чего препараты вируса загрязняются чужеродными антигенами и ферментами. Добавление азида натрия или тимола в низких концентрациях предотвращает рост микро- организмов. Препараты могут храниться при низкой температуре в присут- ствии равного объема глицерина. Вирусный препарат может сохранить инфекционность в течение довольно длительного времени в условиях глубо- кого замораживания в виде растворов или лиофилизированных порошков. При этом следует обращать внимание на среду, в которой хранится вирус (использовать для хранения подходящий буфер и некоторые белки или полисахариды, обладающие защитным действием). Препараты, которые используются для аналитических исследований белка или нуклеиновой кислоты, лучше всего хранить в виде замороженных растворов. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЧАСТИЦ И КРИТЕРИЙ ЧИСТОТЫ Выбор метода для определения чистота препарата вируса зависит от цели экспериментов. Наиболее часто препараты вируса выделяют для двух основных целей: 1) установления идентичности и общей природы вирус- ных частиц, связанных с каким-то определенным заболеванием, 2) проведе- ния детальных физических или химических исследований этих частиц и их компонентов. Идентификация вирусных частиц При работе с вновь выделенными вирусами или при попытках выделить их главной задачей является очистка вируса, которая была бы достаточной для того, чтобы идентифицировать инфекционные частицы и по крайней мере предварительно охарактеризовать их. Наиболее удобным в этом случае является метод центрифугирования очищенных препаратов в градиенте плотности сахарозы. После фракционирования можно определить инфек- ционность либо в каждой отдельной фракции, собранной из градиента, либо комбинируя их, если присутствует многокомпонентный вирус. Далее можно снять спектр поглощения в ультрафиолете и исследовать образцы в электрон- ном микроскопе с целью обнаружения характерных частиц. При этом можно пользоваться методом подсчета в капле, который позволяет выявить количе- ственную связь по всему градиенту между инфекционностыо и присутствием во фракциях характерных частиц вируса. Открытие многокомпонентных вирусов, которые описаны в гл. VIII, привело к тому, что оказалось необ- ходимым в первую очередь осторожно интерпретировать результаты, полу- ченные после центрифугирования в градиенте сахарозы (или в других гра- диентах). Одним из преимуществ экспериментов в градиенте сахарозы является возможность применения относительно небольших количеств вируса. Кроме того, в этом случае можно получить приблизительную оценку коэффициентов седиментации исследуемых веществ. О том, как используется градиент плотности сахарозы для характеристики многокомпонентных вирусов, можно узнать, взглянув на фиг. 39. Критерии чистоты Для получения многих критериев оценки чистоты вирусных препаратов необходимо применение методов количественного определения вирусов, уже обсуждавшихся в гл. II. Используемая для выделения вирусов кристал-
48 Глава III .лизация считается важным критерием чистоты, однако в этом случае нельзя разграничить вирусоподобные частицы, которые кристаллизуются вместе с вирусом. Часто как доказательство чистоты препарата используют наличие спектра поглощения в ультрафиолете, характерного для нуклеопротеидов. Однако этого совершенно недостаточно, так как таким образом примеси больших количеств нуклеопротеидов клеток-хозяев, полисахаридов, а также значительное количество клеточных белков могут легко остаться незамечен- ными. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или седимента- ционный анализ в аналитической ультрацентрифуге часто позволяют обнару- жить присутствие невирусного материала при условии, что примеси не седи- ментируют вместе с вирусом и присутствуют в достаточно высокой кон- центрации. С помощью седиментационного анализа в очищенных препаратах некото- рых сферических вирусов можно выявить присутствие димеров и тримеров вирусных частиц [1151], однако без дополнительного контроля их можно принять за примесь. Подобно этому препараты палочкообразных вирусов часто содержат набор частиц различной длины, более коротких, чем вирус. Эти короткие частицы и вирус могут агрегировать, создавая ряд частиц такого диапазона размеров, которые седиментируют в виде широкой полосы или образуют два или более дискретных пика. С меньшим успехом седимен- тационный анализ применим для обнаружения материала невирусиого про- исхождения при исследовании многокомпонентных вирусов, так как в этом случае большая часть седиментационного профиля занята самими вирус- ными частицами. Применительно к вирусным компонентам или к вирусам, стабильным в концентрированных солевых растворах, равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия является более чувствительным критерием гомогенности, чем скоростное центрифугирование. Например, при скоростном центрифугировании очищенного препарата неинфекцион- ного нуклеопротеида Во, выделенного из вируса желтой мозаики турнепса, обнаруживается один компонент (фото 4, Л), тогда как при равновесном центрифугировании того же препарата в хлористом цезии удается четко выявить смесь, содержащую более чем один компонент (фото 4, В). Применение метода электронной микроскопии для выявления примесей целесообразно, если этот материал имеет достаточный размер и по внешнему виду отличается от вируса. Таким образом, в очищенных препаратах можно обнаружить белковую фракцию I, фитоферритин или фрагменты мембранных структур клеток растения-хозяина. Низкомолекулярные белки и другие низкомолекулярные вещества не обнаруживаются в этом случае, если только они не кристаллизуются на пленке-подложке и не присутствуют в препара- тах в относительно больших количествах. Примесь клеточных веществ, которые способны диффундировать и обла- дают антигенными свойствами, можно выявить с помощью очень чувстви- тельных серологических методов, таких, как иммунодиффузия и иммуно- электрофорез (гл. XV). Для вирусов с хорошо установленным элементарным химическим соста- вом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяют обнаружить примеси, содержащие азот или фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоя- тельствах могут быть применены также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющий обнаружить всего- навсего одну аминокислоту. Можно также использовать метод «отпечатков пальцев» для разделения пептидов триптического гидролизата хорошо охарактеризованных вирусных белков, но чувствительность его как критерия чистоты также невысока.
Выделение вирусов 49 В качестве теста на чистоту можно использовать различные радио- химические методы. Например, для определения фосфорсодержащих приме- сей, иных, нежели РНК, в растение, в котором размножается вирус, в каче- стве метки вводят мР-ортофосфат. Затем вирус выделяют и РНК гидролизуют 1 и. щелочью либо прямо в интактном вирусе, либо после выделения ее из вируса. Гидролизат разделяют хроматографией или электрофорезом. Радиоактивность должна обнаруживаться только в четырех рибонуклео- тидах РНК. Другой метод использования радиоактивных изотопов для контроля эффективности очистки состоит в следующем. В здоровое растение в течение нескольких дней вводят 32Р-ортофосфат или :153-сульфат. Материал, содержащий метку, затем смешивают (прежде чем получить экстракт из листьев) с равным количеством немеченой инфицированной вирусом ткани. При активности метки порядка нескольких милликюри чувствительность этого метода поразительна. Но при всем том полученные результаты не могут служить окончательным критерием отсутствия компонентов, содержащих Р или S. В частности, не исключено, что при инфицировании вирусом в клетке образуются вещества, которых нет в здоровой ткани. В настоящее время имеется лишь одно общее правил,о при решении вопроса о чистоте препарата вируса — он должен отвечать требованиям эксперимента. КОНЦЕНТРАЦИЯ ВИРУСА В РАСТЕНИЯХ И ВАЛОВОЙ ВЫХОД ОЧИЩЕННОГО ВИРУСА Определение выхода В вопросе, связанном с определением концентрации вируса в растении, еще много сложного и неясного. Неэкстрагируемый вирус Часто при выделении вируса различное, но достаточно большое коли- чество его остается связанным с клеточным детритом или с пузырьками и органеллами клетки. Некоторые вирусы, особенно палочкообразные, образующие в клетке крупные, типа волокон, включения, могут остаться агрегированными па первоначальных стадиях выделения. Степень потери вируса под влиянием этого фактора|часто в достаточной мере не учитывается. Метод измерения концентрации Путем определения инфекционности нельзя получить абсолютно точной оценки количества вируса, и это зависит от многих условий. При использо- вании физических и химических методов, для применения которых необхо- димо наличие очищенных препаратов, довольно значительные и варьирую- щие потери вируса могут иметь место еще до определения концентрации в ходе его выделения. При работе с достаточно стабильным вирусом такие потери можно оценить после добавления к исходному материалу известного (небольшого) количества радиоактивного вируса. Содержание метки, остав- шейся в конечном препарате, служит мерой потери вируса. Этот метод не учитывает потери вируса, находящегося внутри клеточных частиц и т. д. Для определения общего количества вируса в осветленном экстракте используют, если это возможно, комбинацию серологических методов с хро- матографическими; при этом специфичность серологических реакций соче- тается с точностью химических измерений (гл. П). Вероятно, одним из наи- более четких методов определения количества вируса в экстрактах растений в том случае, когда концентрация его достаточно высока, является анализ 0893
50 Глава 1П осветленных экстрактов в градиенте плотности сахарозы. Если вирусные частицы имеют достаточно типичную форму, очень полезным даже в неочи- щенных экстрактах и при низкой концентрации может оказаться метод подсчета частиц в электронном микроскопе. Подсчитывают с помощью элек- тронного микроскопа частицы также и на ультратонких срезах. Таким путем можно получить непосредственную, хотя и приблизительную, оценку числа вирусных частиц, содержащихся в одной клетке. Образец ткани Как обсуждается в гл. VII, концентрация вируса в разных частях расте- ния может широко варьировать, что наблюдается даже в пределах одного листа с симптомами мозаики. Выражение результатов Концентрацию, или выход, вируса обычно выражают величиной массы на единицу сырой массы или величиной массы на 1 мл экстракта. Однако разные ткани и разные листья даже в пределах одного и того же растения и при одних и тех же условиях значительно различаются по содержанию в них воды, что может быть следствием, например, разного размера вакуо- лей или количества волокнистого материала. Данные о валовом выходе вирусов В настоящее время многие из проблем, связанных с этим вопросом, так и не получили своего окончательного разрешения. Большинство исследо- Таблица 3 Валовой выход очищенного вируса Вирус Растение-хозяин Приблизи- тельный выход, мкг на 1 г Источник данных Мозаики люцерны Табак 200 [99] Желтой карликовости ячменя Овес 0,05 [1438] Мозаики костра Ячмень 1000 [373] Мозаики Centrosema Кроталярия 7,0 [421 [ Хлоротической крапчатости коровьего Коровий горох 300 [761 Мозаики коровьего гороха Коровий горох 1000 [1822] Огуречной мозаики Табак 300 [1517[ Огуречный вирус 3 (штамм ВТМ) Огурец 300 [991 Желтой жилки винограда (родствен вирусу Фасоль обыкновен- 15 [661], желтой почки персика) Мозаики белены пая Табак 2 [99] Деформирующей мозаики гороха Горох 300 [8581 Х-вирус картофеля (штаммы) Томат 700 [991 У-вирус картофеля Табак 2 [991 Вирус-сателлит вируса некроза табака Табак, фасоль 0,3 [5601 Гравировки табака обыкновенная Табак 7 [99[ Южной мозаики фасоли Фасоль обыкновен- 400 199] Мозаики тыквы пая Огурец 50 [1195] Мозаики табака Табак 2000 [99] Погремковости табака Ntcotiana Cleveland)) 50 [725| Кольцевой пятнистости табака Коровий горох 100 [408] Кустистой карликовости томатов Томат 150 [99] Бронзовости томатов N. glutinosa 10 [189] Желтой мозаики турнепса Китайская капуста 1000 [1157]
Выделение вирусов 51 вателей, сообщая о выделении вируса, если они вообще приводят данные о выходе, выражают его в виде массы очищенного вируса, отнесенной к массе исходного материала. Этот исходный материал обычно представляет собой целые листья или листовые пластинки без средней жилки. Данные, при- веденные в табл. 3, содержат информацию о широте диапазона концентраций, получения которых следует ожидать при выделении разных вирусов. Этот список не является исчерпывающим пи с точки зрения числа описанных вирусов, ни с точки зрения цитируемой литературы. Цитируются в основном работы последнего времени. ФАКТОРЫ, ОГРАНИЧИВАЮЩИЕ ПРИМЕНЕНИЕ СУЩЕСТВУЮЩИХ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ На фиг. 3 суммированы данные о валовом выходе ряда вирусов растений, для которых такие определения проводились. В литературе не имеется дан- ных о выделении вирусов, выход которых был бы меньше чем 0,5 мкг па 1 г. Почти все методы, используемые в настоящее время при выделении вирусов, включают один или более циклов дифференциального центрифугирования. Маркхэм [1147, 1151] теоретически рассмотрел те недостатки метода седи- ментации, которые возникают при исследовании очень разбавленных раство- ров макромолекул. В таких условиях на седиментограмме не может сформи- роваться граница и наблюдается конвекционный тип седиментации. При этом скорость уменьшения концентрации в иадосадочной жидкости падает с точением времени по экспоненциальному закону. Для определения концентрации, при которой седиментация становится неэффективной, мы осаждали при различных концентрациях типичный мел- кий икосаэдрический вирус (ВЖМТ), меченный по 3BS, при 29 000 об/мин в течение 2 ч (ротор № 30, центрифуга Спиико) (Коллард и Мэтьюз, неопубли- кованные данные). Количество вируса в осадке после центрифугирования, измеренное по радиоактивности, быстро падало при концентрации ниже примерно 0,02 мкг па 1 мл (фиг. 3). После двух или трех циклов цептрифуги- Фиг. 3. Различия в величинах валового выхода у вирусов растений. На гистограмме приведены данные для тех вирусов, у которых валовой выход различается в 10 раз. Пунктиром показано относительное количество ВЖМТ, получаемого в осадке после одного цикла высокоскоростного центрифугирования. 4*
52 Глава III рования в этой области концентраций выход вируса приближался к пулю, если исходная концентрация была ниже 0,01 мкг на 1 мл. Таким образом, невозможность препаративного выделения некоторых вирусов может быть обусловлена тем, что они содержатся в концентрациях, слишком низких для того, чтобы обычные седиментационные методы оказа- лись эффективными. Маркхэм [1147] показал, что молекулы с относительно небольшим коэф- фициентом седиментации, присутствующие в растворе в концентрации, достаточной для образования границы при центрифугировании, могут захватывать при соосаждении любые более крупные молекулы, присутствую- щие в малом количестве. Этот способ можно использовать как начальную стадию выделения вирусов, содержащихся в очень низкой концентрации. Кроме того, подавно было показано, что ВТМ может адсорбироваться из очень разбавленных растворов на поверхности нерастворимых сополиме- ров производных малеиновой кислоты [890]. Потенциальные возможности таких материалов для выделения вирусов еще не изучены. Как мы уже отмечали в начале этой главы, концентрацию трудно выде- ляемых вирусов в исходном материале можно значительно увеличить при соответствующих условиях выра1цивания необходимого нам растения и вни- мательном отношении к ряду других факторов.
ГЛАВА IV СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ Анализ элементарного химического состава очищенных вирусных пре- паратов, выполненный в ранних работах, показал, что они содержат углерод, азот, водород, серу, фосфор и металлы (зола). Углерод (около 50%), водород (около 7%) и азот (около 15—17%) содержатся в сходных соотношениях во всех исследованных вирусах. Содержание серы колеблется между 0 и 1,6% в зависимости от количества сорусодержащих аминокислот в белке вируса. Количество фосфора варьирует от 0,5 до 4,0% и свидетельствует о содержании РНК в вирусе, поскольку весь или почти весь фосфор скон- центрирован в вирусной РНК, за исключением тех вирусов, которые имеют в своем составе фосфолипиды. Зольные элементы — еще более вариабель- ный компонент, что отчасти определяется вариабельностью содержания фосфора, а отчасти — воздействием ионов при обработке вирусов в про- цессе выделения. Углеводы в вирусе присутствуют в виде рибозы в случае РНК и дезоксирибозы в случае ДНК. Однако препараты вируса часто бывают загрязнены углеводами из клеток растения-хозяина. Мелкие вирусы растений, описанные до сих пор, содержат одпоцепочеч- ную или двухцепочечпую нуклеиновую кислоту, заключенную в белковую оболочку. Структурный белок состоит из целого ряда правильно упакован- ных идентичных субъединиц небольшого размера (молекулярная масса обычно « 20 000). Некоторые мутанты вирусов, изолированные в лабора- тории, по синтезируют функциональный структурный белок. Сообщалось также о двух встречающихся в естественных условиях вирусах, которые содержат только «голую» РНК [456, 1540, 1601]. В состав некоторых вирусов растений входят такие вещества, как полиамины и липиды. В этой главе мы рассмотрим вопросы, касающиеся выделения и некоторых свойств раз- личных компонентов, входящих в состав вирусов. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Почти все изученные до сих пор вирусы растений содержат РНК. Утвер- ждение, что вирус скручивания листьев содержит ДНК, не подтвердилось [667, 1015], по Шеферд и др. [1561], а также Шеферд (личное сообщение) показали, что вирус мозаики цветной капусты содержит двухцепочечную ДНК. Этот вирус мы рассмотрим отдельно в конце этого раздела. Выделение РНК вируса Выделение РНК из очищенных или частично очищенных препаратов вируса включает освобождение РНК от защитной белковой оболочки и после- дующее отделение этой нуклеиновой кислоты от белка и любых других вирусных компонентов, например липидов, а также от любых примесей, имеющихся в препарате вируса. В большинстве ранних работ, связанных с исследованием вирусной РНК, не учитывали лабильность молекул РНК, так что обычно выделяли сильно деградированные продукты. Однако, с тех
54 Глава IV пор как было показано, что именно РНК вируса обладает инфекционностыо, возникла задача получать недеградированные, обладающие инфекцион- ностыо препараты или выделять свободную РНК в состоянии, максимально близком к тому, в котором она находится в вирусной частице. В настоящее время совершенно очевидно, что, применяя различные физические и химические агенты, можно удалить вирусный белок и выде- лить инфекционную РНК при условии, что 1) еще в интактной вирусной частице РНК была инфекционной, 2) во время выделения не применялись бы крайние значения pH среды и 3) РНК была бы защищена от действия нуклеаз. Методы, которые используются для удаления вирусного белка, иллюстри- руют стабильность вирусов в отношении различных химических и физиче- ских обработок. Другие аспекты этой проблемы обсуждаются в гл. XIV. Факторы, имеющие важное значение для выделения инфекционной РНК I. Концентрация водородных ионов. При выделении не следует применять крайние значения pH. Известно, что при pH выше 10 начинают гидролизоваться фосфодиэфирные связи, а при pH несколько ниже 3 медленно высвобождаются пуриновые основания, тогда как при еще более низких значениях pH наступает интенсивная и быстрая деграда- ция молекул РНК. П. Действие ферментов. Одноцепочечная вирусная РНК крайне чувствительна к действию рибонуклеаз. Поскольку достаточно только одного разрыва в молекуле РНК, чтобы она потеряла инфекционность, крайне важно избежать действия фермента в процессе выделения РНК. В очищенных вирусных препаратах часто присутствуют следы рибонуклеаз из листьев. Они должны быть удалены либо из интактного вирусного пре- парата, либо во время выделения РНК, либо, наконец, в ходе этого про- цесса следует использовать ингибиторы рибонуклеаз. Деградация под дей- ствием нуклеаз может быть также сведена к минимуму, если использовать условия, при которых активность фермента минимальна — низкая тем- пература (0—4 °C), соответствующие значения pH и ионной силы. III. Повторные процедуры. Полностью удалить незначи- тельные примеси нуклеаз весьма трудно. Поэтому при выделении нужно избегать методов, к числу которых относятся продолжительный диализ или повторное переосаждение из водных растворов. IV. Гидродинамические воздействия. Опасность раз- рушения под влиянием подобных воздействий не является проблемой для одноцепочечных РНК мелких вирусов. Однако в случае больших двух- цепочечных РНК (вирус раневых опухолей и вирус карликовости риса), а также при работе с двухцепочечными формами одноцепочечных вирусных РНК, обладающими выраженной ДНК-подобной структурой, следует избе- гать различных жестких воздействий при выделении. V. И о н н а я с и л а. В растворах с низкой ионной силой одноцепочеч- пая РНК в значительной мере утрачивает вторичную структуру и поэтому более чувствительна к действию нуклеаз, обнаруживающихся в виде при- месей при выделении. Обычно РНК получают в растворах 0,1 М NaCl. Соле- вые растворы высокой ионной силы (при концентрации NaCl > 1 М или MgCl2 > 0,01 — 0,1 М) вызывают преципитацию высокомолекуляр- ной РНК. VI. Подготовка вирусного препарата к выде- л е н и ю РНК. Первые исследования вирусной РНК были выполнены главным образом на вирусе табачной мозаики. Однако РНК этого вируса, находясь внутри белковой оболочки, в высшей степени стабильна; РНК
Структурные компоненты 55 большинства других вирусов даже внутри интактной вирусной частицы, вероятно, подвержена некоторой деградации, выраженной в различной степени и связанной с потерей инфекционности. Этот процесс имеет место как в интактном растении, так и во время выделения и хранения вируса. Оптимальные условия, необходимые для сохранения интактной РНК внутри вирусной частицы, варьируют от вируса к вирусу. Некоторые вирусы отно- сительно стабильны при pH 7,0, тогда как другие, например вирус хлоро- тической крапчатости коровьего гороха, при таком pH теряют инфекцион- ность и происходит частичная деградация РНК [74]. Методы выделения РНК Характерной особенностью метода выделения РНК является использо- вание фенола. Однако для некоторых вирусов использование фенола не дает удовлетворительных результатов, и при выделении РНК из нового вируса необходимо сравнение нескольких методов с целью выбора наилучшего из пих. Детали различных методов, применяемых теперь для выделения РНК вирусов, суммированы в обзоре Ральфа и Берквиста [1378]. I. Ф е п о л ь н а я о б р а б о т к а. Гирер и Шрамм [630] использо- вали фенольную депротеинизацию при выделении инфекционной РНК из ВТМ. Фенол активно денатурирует белок и ингибирует нуклеазы. В этом случае суспензию вируса в буфере при pH около 7,0, содержащую не более нескольких мкг вируса на 1 мл раствора, встряхивают с примерно равным объемом насыщенного водой фенола. Вирусный белок отделяют от РНК центрифугированием, в результате чего РНК остается в водной фазе. Затем РНК можно осадить из водной фазы добавлением двух объемов этанола, отмыть этанолом от следов фенола и растворить вновь в разбавленном буфере. Существует много модификаций этой основной процедуры. Определенные методы, эффективные для одного вируса, могут быть совершенно бесполезны- ми для другого. Например, для выделения РНК из некоторых вирусов была предложена однофазная фенольная система, содержащая фенол — этанол — воду или фенол — детергент — воду [459]. Однофазная система, вероятно, полезна при работе с небольшими количествами вируса, так как при этом можно исключить потери РНК в белковом слое, что характерно для двухфазной системы. II. Применение детергентов. При выделении РНК ВТМ с целью денатурации и солюбилизации белка можно использовать водный 1%-ный раствор додецилсульфата натрия. Белок затем удаляют путем осаждения сульфатом аммония [1654]. Френкель-Конрат и др. [540] полу- чили инфекционную РНК ВТМ при использовании додецилсульфата натрия при 50 °C в присутствии ЭДТА. Однако применение одного лишь детергента оказалось не особенно успешным для выделения РНК ряда вирусов, напри- мер вируса кустистой карликовости томатов [1459]. Изолированная таким образом РНК была инфекционка, но содержала 1—2% белка. Этот детергент пе нашел широкого применения в качестве основного агента при выделении РНК вирусов растений, но очень часто он является ингредиентом водной фазы среды, используемой для экстракции фенолом. III. II а г р е в а н и е в разбавленном солевом раст- вор е. Боудэн и Пири [115] нагревали растворы ВТМ для освобождения вирусной РНК от белка и осаждения белка, который при этом денатурирует. Этот прием впоследствии использовали для многих вирусов. Нагревание проводят обычно в присутствии соли (в основном в 0,1 М NaCl) в буферном: растворе при pH, близком к 7,0. Температура, необходимая для высвобожде- ния РНК, варьирует в зависимости от вируса. РНК, выделенная с помощью нагревания, обычно неиифекциоина, довольно сильно деполимеризована
56 Глава IV и полидисперсна, о чем можно судить по результатам седиментационного анализа. Тот факт, что РНК, получаемая путем нагревания, обычно оказы- вается деградированной, по-видимому, объясняется несколькими причи- нами: 1) действием нуклеазных примесей на освобожденную от белка РНК, ибо имеются данные о том, что если принять меры предосторожности с целью удаления нуклеаз, то можно получить инфекционную РНК ВЖМТ [798]; 2) разрывами в цепи РНК под влиянием высокой температуры и длительной обработки; 3) тем, что в таких вирусах, как ВЖМТ, РНК, находящаяся еще внутри вирусной частицы, может иметь разрывы, которые и выявляются путем нагревания, тогда как при обработке фенолом отдельные фрагменты РНК удерживаются вместе при помощи вторичных связей [738]. Кипячение в течение коротких промежутков времени при тщательно контролируемых условиях позволило получить инфекционную РНК, например, из вируса кольцевой пятнистости табака [919] и из ВЖМТ [920]. РНК некоторых вирусов, как, например, вируса мозаики дикого огурца и вируса морщинистости турнепса, не удается выделить фенольной обработ- кой, в связи с чем Симонс и др. [1726] использовали для выделения РНК этих вирусов нагревание в 2 М растворе КС1 при 100 °C в течение 10 мин. IV. Гуанидин гидрохлорид. Рейхман и Стейс-Смит [1414] использовали гуанидингидрохлорид для выделения инфекционной РНК из Х-вируса картофеля. После обработки 2,5 М гуанидином в присутствии 5 мМ ЭДТА при pH 8,4 в течение 1 ч вирусная РНК осаждалась, тогда как белок оставался в растворе. В то же время фенольная экстракция не дала удовлетворительных результатов при выделении РНК из Х-вируса кар- тофеля. V. Мочевина. Концентрированный раствор мочевины был одним из первых агентов, использованных для диссоциации ВТМ па белок и РНК [1665]. Впоследствии, как показал Базел [309], оказалось, что таким образом трудно полностью отделить белок от РНК. Однако Джонарду [895] путем обработки ВЖМТ 8 М мочевиной при pH 7,0 удалось выделить высокомоле- кулярную РНК, но при условии, что в качестве ингибитора рибонуклеазы использовался бентонит. VI. Уксусная кислота. ВТМ можно диссоциировать на белок и РНК с помощью 67%-ной уксусной кислоты [115]; при этом РНК осаждается, а белок остается в растворе. Однако РНК, выделенная таким способом, как показал Френкель-Конрат [532], обладала низкой инфекционностыо. Кроме того, не все вирусы растений диссоциируют под действием уксусной кис- лоты [1726]. VII. Концентрированные растворы солей. Вирус крапчатости конских бобов и вирус мозаики костра распадаются на РНК и белок под действием 1 М СаС12 [1951, 1952]. VIII. Смешанные методы. Многие вирусы деградируют под действием органических растворителей. Например, Маркхэм и Смит [1157] использовали для денатурации ВЖМТ и освобождения РНК 33%-ный этанол при комнатной температуре. Однако РНК, выделенная таким способом, оказалась сравнительно низкомолекулярной [394], вероятно, вследствие ее деградации под действием нуклеаз. При добавлении бентонита удалось получить инфекционную высокомолекулярную РНК [476]. Для выделения РНК из ВЖМТ Кейпер [912, 913] применил щелочную обработку при pH 12,0 и температуре 30 °C в течение 30 мин, но полученный таким образом продукт имел очень низкую молекулярную массу. Для расщепления ВТМ при комнатной температуре использовали нитрат стронция (7 М) [1335], по выделенная при этом РНК оказалась неинфекционной. Для выделения инфекционной РНК из ВЖМТ применяли также замораживание до —75 °C с последующим оттаиванием [918].
Структур пае компо нент ы 57 Дальнейшая очистка РНК I. Ф р а к ц и о и и р о в а и и е Р II К, в ы деле и и ой из о ч и - щ е и н ы х в и р у с п ы х препарато в. Для фракционирования или частичного фракционирования рибонуклеиновых кислот существуют раз- личные методы. К ним относятся центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (см., например, фиг. 39), равновесное центрифугирование в гра- диенте плотности растворов сульфата цезия, фракционирования на колон- ках с метилированным бычьим сывороточным альбумином па кизельгуре (MAH') [1913] и электрофорез в полиакриламидном геле [1094, 1320]. 11. Ф р а к ц и о и и о п и р о в а п и е с м е с и и у к л е и и о в ы х к и с л о т, в ы д е л е и и ы х из расти т о л ь и о й ткан и. С помощью различных модификаций метода экстракции фенолом можно выделить из инфицированной ткани нуклеиновые кислоты всех типов. Если соблюдать меры предосторожности при выделении, такие препараты сохра- няют высокую инфекциониость. Для последующего фракционирования смеси нуклеиновых кислот наилучшими из существующих методов являются обычно хроматография па колонках МАК или электрофорез в полиакрил- амидном геле [1320], хотя емкость этих методов в препаративном плане сравнительно невелика. Для некоторых экспериментов удобнее применять фракционирование в градиенте плотности сахарозы. Следует заметить, что с помощью существующих в настоящее время методов фракционирования достигнуть четкого разделения многих вирусных РНК от рибосомной РНК очень трудно или невозможно. В самом деле, для некоторых вирусов суще- ствование комплекса, образованного между вирусной РНК и рибосомной РНК, может накладывать серьезные ограничения на применение различных методов фракционирования. Например, было найдено, что РНК ВЖМТ обра- зует довольно стабильные комплексы с рибосомной РНК из листьев китайской капусты (фиг. 4) [1191]. Этот комплекс возникает, вероятно, благодаря высокому содержанию цитидиловой кислоты в РНК ВЖМТ и высокому содержанию гуаниловой кислоты в рибосомной РНК. Данных о том, что РНК ВТМ с более низким содержанием цитидиловой кислоты может образо- вывать такие комплексы, не имеется. Подобные же трудности возникают и при использовании других методов фракционирования РНК ВЖМТ, например при хроматографии на колонках МАК. Несмотря па то что случай с РНК ВЖМТ, вероятно, является исклю- Фиг. 4. Образование комплекса между РНК ВЖМТ и рибосомной РНК [1191. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы смеси молекул РНК, выделенных и.ч здоровых листьев китайской капусты (Л) и ив листьев, инфицированных ВЖМТ в течение 14 дней
58 Глава IV читальным, необходимо помнить, что такие комплексы наблюдали и в других системах и они могут действительно служить препятствием в большей или меньшей степени при фракционировании смесей нуклеиновых кислот из здо- ровых или инфицированных клеток. Компоненты, входящие в состав вирусной РНК В состав РЫК вирусов растений, как и других РНК, входят фосфат, D-рибоза, а также два пуриновых (аденин и гуанин) и два пиримидиновых (цитозин и урацил) основания. Подобно РЫК из других источников, их остов построен из чередующихся фосфатных и рибозных остатков, соединенных 3',5'-фосфодиэфирной связью. К .Г-атому углерода каждого остатка сахара присоединено одно из азотистых оснований. Всего таких оснований в РНК четыре: два пуриновых и два пиримидиновых. РНК вирусов растений исполь- зовали в качестве объекта в тех основных исследованиях, которые внесли большой вклад в наши знания о структуре РНК в целом [1154—1156]. В составе некоторых клеточных РНК, особенно транспортной РНК, обнаружены некоторые необычные основания, например псевдоурацил и различные метилированные пурины. Такие редкие, или минорные, основа- ния не встречаются в составе РНК вирусов растений [1081, 1625]. В табл. 4 приведены нуклеотидный состав, число цепей, а также моле- кулярная масса РНК различных вирусов растений. Для вирусов растений, которые имеют в качестве генетического материала одноцепочечную РНК, нельзя ожидать, чтобы количество гуанина было равно количеству цито- зина, а количество аденина — количеству урацила. И действительно, кат? явствует из табл. 4, такие вирусы не подчиняются никакому правилу спари- вания оснований. Только для двух вирусов, у которых РНК двухцепочечная, отмечается та же закономерность в составе оснований РНК, что и в случае ДНК, а именно количество гуанина равно количеству цитозина, а количество аденина — количеству урацила. Размеры молекул РНК Данные о размерах молекул некоторых РНК вирусов растений приве- дены в табл. 4. Вопросы, касающиеся количества генетической информации, заключенной в вирусной РНК, обсуждаются в гл. VII. У вирусных частиц, содержащих одноцепочечную РНК, геном существует в виде одпой-един- ственной полинук леотидной цепи. Лучшим доказательством этого в случае ВТМ послужило совпадение данных о размерах молекул его РНК, рассчи- танных на основании известной структуры вирусной частицы и измеренных в экспериментах с изолированной РНК ВТМ. Каспар [331] вычислил, что число нуклеотидов на 0,1 им длины вирусной палочки составляет 2,13,± ±0,5%. Длина палочкообразных частиц на основании электронно-микро- скопических исследований (что наиболее достоверно) была определена рав- ной 298 нм, что соответствует 6340 нуклеотидам на одну вирусную частицу. Средняя молекулярная масса нуклеотидного остатка в РНК с тем же составом оснований, который обнаружен в РНК ВТМ, составляет 322,3. Таким образом, молекулярная масса РНК ВТМ равна 6340-322,3 = = 2,05-10° дальтон. Эта величина колеблется в пределах примерно ± 2% [331] и рассчитана для свободной РНК. Натриевая соль РНК ВТМ должна иметь молекулярную массу, равную 2,19-10° ±2%. Гирер [627, 628] использовал физико-химические методы для определе- ния размера РНК, выделенной из ВТМ. При этом необходимо было знать коэффициент седиментации и величину характеристической вязкости вирусной РНК. Измерение характеристической вязкости осложнялось тем,
Таблица 4 Молекулярная масса и состав оснований РНК некоторых вирусов растений — ——- Мол. масса, Состав оснований, % Источник данных Вирус дальтон гуанин аденин ЦИТОЗИН урацил С одноцепочечной РНК 29,6 Мозаики люцерны (нижний компо- 1,3-106 21,1 27,8 21,6 [847, 1835] нент) 1,4-106 1,1-Ю6 25,8 26,4 27,3 22,7 24,2 [910] Кольцевой пятнистости гвоздики Хлоротической крапчатости коровье- 25,3 20,3 28,2 [82] го гороха Мозаики коровьего гороха (нижний 1,7-106 23,8 29,1 18,3 28,7 [1822] компонент) 1,0-106 1,6-Ю6 2,0-Ю6 4,0-105 23,4 24.3 23,2 29,0 [921] Огуречной мозаики 26 1 24,1 24,0 25,8 [1560] Деформирующей мозаики гороха 21,8 25,0 34,3 22,8 21,3 [1149, 1511] Х-вирус картофеля Вирус-сателлит вируса некроза 28,0 22,1 24,9 [1415. 1416] табака Вирус мозаики Chenopodium rubrum 1,4-10в 2,4-Ю6 26,0 25,8 22,8 25,3 23,0 24,4 28,0 •’3.0 23,0 26,8 [904] [1787] Южной мозаики фасоли Мозаики тыквы (нижний компонент) зо’в 29,8 16,2 18,5 30,0 26,3 [1195] [331, 1011] Табачной мозаики Некроза табака 1,6-Ю6 2,0-Ю6 1,5-106 24,4 24 7 27,9 23,9 22,0 23,2 25,7 28,2 [1149, 1511] [919, 1511, 1657] Кольцевой пятнистости табака 28,4 26,0 20,8 25,8 [442, 1008] Кустистой карликовости томатов 27,8 26.1 23,7 22,4 [1726] Морщинистости турнепса 1,9-106 17,4 22,5 38,0 22,3 [1149, 1226] Желтой мозаики турнепса 16,0 33,0 28,0 22,0 [1206] Мозаики белого клевера Мозаики дикого огурца 2,4-106 16,4 17,0 41,0 25,6 [1726, 1949] С двухцепочечной РНК 21,8 28,4 21.6 28,2 [1228] Карликовости риса Раневых опухолей 10-106 18,6 31,1 19,1 31,3 [210, 656]
60 Глава ZF что препараты содержали некоторое количество частично деградированной РНК. Гирер определил экспериментально соотношение между молекуляр- ной массой, коэффициентом седиментации и вязкостью. На основании полу- ченных данных он вывел следующее соотношение между молекулярной массой т и коэффициентом седиментации s: т = 1100 s2>2. Для интактной РНК, выделенной из ВТМ и имевшей коэффициент седиментации (s), равный 31 S, молекулярная масса оказалась равной 2,1 -Ю6. Эта величина была подтверждена путем измерения светорассеяния в препаратах биологически активной РНК, полученной путем тепловой обработки [217]. РНК ВТМ, выделенная с использованием дюпонола С или методом фенольной экстрак- ции, имела коэффициент седиментации, равный 30 S, который был определен с применением сепараторной ячейки. Молекулярная масса этой РНК, изме- ренная методом рассеяния света, составила 2-10® [563]. Несколькими авто- рами было предложено в общей форме следующее соотношение между моле- кулярной массой РНК и коэффициентом седиментации: т = кзЛ. Спирин предложил соотношение т = 1550 s3-1 [1652], тогда как Холл и др. [846] на основании данных о 38 различных видах РНК получили следующее соотношение: т = 1557 з2’07. Такие эмпирические формулы очень полезны, но следует помнить, что величина коэффициента седиментации зависит от условий эсперимента. В одних и тех же условиях значения коэффициентов седиментации двух РНК одного и того же размера могут быть различными, если они имеют в растворе различное относительное число участков со вто- ричной структурой. После обработки различных РНК формальдегидом можно получить истинное соотношение [219]. Инфекционность РНК В настоящее время имеется ряд убедительных доказательств, что РНК ВТМ, выделенная из вирусных частиц (т. е. лишенная белковой оболочки), при соответствующих условиях обладает инфекционностыо. Гирер и Шрамм [630] использовали несколько критериев для выявления различий между инфекционностыо интактного вируса и инфекционностыо свободной РНК. Так, под действием антисыворотки, специфичной в отношении ВТМ, интакт- ный ВТМ полностью утрачивал свою инфекционность, тогда как инфекцион- ность РНК лишь незначительно снижалась. Напротив, панкреатическая рибонуклеаза в низкой концентрации лишала инфекционности вирусную РНК и не влияла на инфекционность интактного вируса. Интактные инфек- ционные вирусные частицы в отличие от свободной РНК осаждались при центрифугировании в течение 1 ч при 50 000 об/мин. Вирус табачной мозаики может длительное время выдерживаться при комнатной температуре, что мало влияет на его инфекционные свойства, тогда как препараты РНК ВТМ в значительной мере теряют свою инфекционность в этих условиях за 48 ч. Инфекционность препаратов свободной РНК, выделенной из ВТМ, составляла лишь 0,1% инфекционности интактного вируса, содержащего эквивалентное количество РНК. Френкель-Конрат и Вильямс [539] пока- зали, что инфекционность изолированной РНК значительно повышалась в результате реагрегации белковых субъединиц ВТМ вокруг РНК и образо- вания вновь палочкообразных вирусных частиц. Когда РНК одного штамма ВТМ смешивали in vitro с белком другого штамма, с тем чтобы получить «гибридную» частицу, и этим препаратом заражали растения, то оказалось, что потомство такого вируса имело белок, специфичный для используемой в реконструкции РНК [531]. Это было серьезным доказательством в пользу того, что только РНК определяет специфичность структуры вирусного кап- сидного белка.
Таблица 5 Сравнение инфекционности препаратов свободной РНК с инфекционностью интактных вирусов 1) Вирус Растение-индикатор Метод выделения РНК Пн<1«кционность РНК по сравне- нию с инфекцпон- ноетью интакт- ного вируса, % Содержание белка в пре- паратах РНК, % (по массе) Источник данных Табачной мозаики IV. glutlnosa Бентонпт —фенол 0,05 0,04 [542, 1594] Табачной мозаики То же Фенол 0,1 0,4 [630] Табачной мозаики Детергент 0,1 0,4 [540] Желтой мозапкп турнепса Brassica pekinensis Нагревание 11,3 0,3 [920] Полосатости висконсинско- го гороха Chenopodium amarantico- lor Бентонит—Na-ДС — фе- нол 0,18 ? [1134] Кольцевой пятнистости та- бака Vigna sinensis Нагревание 0,1—1,0 0,7 [919] Погремковости табака Nicotiana tabacum Фепол 1 ? [726] Погремковости табака Pkaseolus vulgaris » 5 ? [726] Крапчатости конских бобов Glycine max » 11 4,4 [1013] Южной мозаики фасоли Phaseolus vulgaris Na-ДС—фенол 16 1 [453] Крапчатости конских бобов Glycine max Бентонит—фенол 28 0,37 [1013] Мозаики костра Ghenopodium hybridum. Бентонит—Na-ДС—фе- нол 30 ? [215] Хлоротической крапчатости коровьего гороха Glycine max Бентонит— Na-ДС—фе- нол 46 (диапазон изменений 12-90) ? [74] Огуречной мозапкп (У-штамм) Vigna sinensis Фепол 50 (диапазон изменений 10-100) 1 [455] Огуречной мозапкп To же 1,5 М КС1 75 8 [915] (Y-штамм) 1) Сравнение проводилось из расчета одинаковой концентрации РНК в ииокулуме. В таблице соблюдается последовательность в соответствии с увеличи- вающейся инфекционностью по отношению к РНК интактного вируса.
62 Глава IV В настоящее время инфекционную РНК удалось выделить из многих вирусов растений. Инфекционность РНК, отнесенная к инфекционности интактного вируса, сильно варьирует в зависимости от вируса и от метода выделения РНК (табл. 5). Может быть несколько причин, обусловливающих тот факт, что большая часть препаратов вирусных РНК обладает значительно менылей инфек- ционностыо по сравнению с эквивалентным количеством РНК в интактном вирусе. Рассмотрим эти причины. 1. Свободная РНК большинства вирусов гораздо сильнее подвержена инактивации под действием нуклеаз в сравнении с РНК интактного вируса. Следы нуклеаз из препарата вируса, отстающиеся после экстракции фенолом или случайно внесенные в раствор РНК из загрязненной стеклянной посуды, а также из растительного материала во время инокуляции, могут привести к быстрой инактивации РНК [532]. Однако при проведении всей процедуры должным образом усовершенствованная техника выделения РНК позволяет в настоящее время получать препараты РНК, сохраняющие инфекционность в течение часов или даже дней, если выдерживать их при комнатной тем- пературе в разбавленных солевых растворах. Инактивация в процессе выделения РНК вряд ли является основной причиной тех различий в инфек- ционное™, которые можно наблюдать, взглянув на табл. 5. Из исследован- ных РНК изолированная РНК ВТМ имеет почти самую низкую инфекцион- ность по сравнению с интактным вирусом. Тем не менее большая часть РНК в этих препаратах остается потенциально инфекционной, так как при взаимо- действии ее с белковыми субъединицами инфекционность реконструирован- ных частиц может опять возрастать, составляя 50—70% инфекционности исходного вируса (гл. VII). 2. Свободная РНК, несомненно, более чувствительна к действию нуклеаз во время инокуляции. Различного рода данные подтверждают точку зрения о том, что инактивация РНК в инокулуме нуклеазами происходит именно на этой стадии. Например, добавление ингибитора нуклеаз бентонита к ино- кулуму или распыление его на листья перед инокуляцией приводит к увели- чению инфекционности РНК ВТМ в 10—30 раз при заражении листьев TV. tabacum (сорт Ксапти); отчасти этот эффект, вероятно, может быть объяс- нен абразивным действием бентонита [1594]. Растения могут очень заметно отличаться друг от друга по чувствительности к вирусной РНК, причем их чувствительность к РНК может быть совсем иной, чем при заражении интакт- ным вирусом [903]. При исследовании зависимости между активностью РНКазы в листьях Phaseolus vulgaris (сорт Пинто) и чувствительностью листьев к инфицирова- нию ВТМ и РНК ВТМ при различных условиях Сантилли и др. [1484] пока- зали, что во всех случаях наблюдается положительная корреляция между уменьшением количества РНКазы и снижением чувствительности листьев с увеличением их возраста [1484]. С другой стороны, в листьях, подвергну- тых нагреванию в темноте, увеличение количества РНКазы сопровождалось понижением чувствительности. Таким образом, по крайней мере для данной комбинации растения-хозяина и вируса весьма сомнительно, чтобы низкая инфекционность вирусной РНК была непосредственно связана с актив- ностью РНКазы. 3. Различные предварительные обработки растений перед инокуляцией влияют на число местных поражений, образуемых РНК, по-иному, чем на число подобных же поражений, вызываемых интактным вирусом [125, 126]. Реакция РНК ВТМ на изменение pH инокулума очень отличается от реакции интактного вируса [1473]. Так, для РНК имеется очень четкий оптимум при pH около 9, который не обнаружен при изучении нативного вируса. Применяя при инокуляции бентонит и щелочной фосфатный буфер,
Структурные компоненты 63 удалось значительно повысить инфекционность’’препарата РНК ВТМ, почти достигнув инфекционности ВТМ (сравнения проводили, используя листья N. tabacum (сорт Ксанти) [1473, 1475]. 4. Нет никакого сомнения в том, что большая часть белка в препаратах РНК, перечисленных в табл. 5, была представлена структурным белком, однако возможность того, что в этих препаратах присутствовало также очень небольшое количество какого-либо другого белка, нельзя исключить. Можно предположить, например, что каждый инфекционный РНК-геном должен содержать одну молекулу белка или один полипептид, необходимый при проникновении вируса в клетку или для прикрепления к некоторому специ- фическому рецептору клетки. В вирусе, имеющем РНК с молекулярной массой 2,0 •10° дальтон, одна белковая молекула, соответствовавшая по размеру химической субъединице капсида, составляла бы 1% массы РНК. Это количество белка было доста- точно легко обнаружить, но РНК в этом случае сохраняла лишь 0,1—1,0% инфекционности интактного вируса. Таким образом, из 100 или даже из 1000 «комплектов» РНК только один мог иметь белок, необходимый для прикре- пления к клеточным рецепторам. Кроме того, этот предполагаемый полипептид должен иметь размеры значительно меньшие, чем капсидный белок вируса. Вызывает сомнение, можно ли вообще выделить какую-либо инфекцион- ную вирусную РНК таким образом, чтобы она была совершенно свободна от белка, который можно было бы выявить в препарате. Наиболее низкое содержание белка было обнаружено в препаратах инфекционной РНК, выделенных Фреикель-Конратом и др. [534]. Используя для выявления белка меченный 3SS вирус, они показали, что их препараты РНК, выделен- ные с помощью бентонита, содержали ие более 0,03—0,05% белка, имевшего аминокислотный состав, отличный от состава капсидного белка ВТМ. Это количество белка в препарате РНК соответствовало одному полипептиду, соизмеримому с капсидным белком, на каждые 23 молекулы РНК. Взаимо- действие PHI? с немеченым структурным белком при реконструкции приво- дило к вытеснению практически всей метки из препарата РНК . Эти экспери- менты до сих пор, по-видимому, служат лучшим доказательством того, что для проявления инфекционности вирусной РНК белок не требуется. Тем не менее следует иметь в виду несколько обстоятельств. Для образо- вания одного пораженного участка на листе необходимо примерно 10е моле- кул РНК. Около 5-104 этих молекул в описанных выше препаратах могли иметь связанную с ними молекулу белка. Возможно, что препараты белка ВТМ, применяемые для реконструкции, содержат какой-то особый важный белок (скажем, примерно одну молекулу на 2000 молекул капсидного белка), который включается в препарат РНК при реконструкции. Холоубек [828] показал, что белок ВТМ, добавленный к препаратам инфекционной РНК, увеличивал инфекционность даже в тех случаях, когда реконструкция не имела места. Яичный альбумин не обладал таким действием. Размер молекул РНК, необходимый для обеспечения инфекционности Ранее предполагали, что РНК ВТМ состоит из нескольких сходных или идентичных субъединиц, каждая из которых обладает инфекционностыо. Различного рода эксперименты с очевидностью показали, что инфекцион- ность обеспечивается всем РНК-геномом в целом. Лауфер и др. [1046] показали, что облучение ВТМ рентгеновскими лучами приводит к уменьшению характеристической вязкости РНК, выделен- ной из такого вируса. Они пришли к выводу, что рентгеновские лучи инакти- вируют ВТМ, вызывая одиночный разрыв где-то в полииуклеотидной цепи
64 Глава IV РНК. Гиноза и Норман 1649] показали, что при стандартных условиях интактный вирус так же чувствителен к инактивации рентгеновскими лучами, как и свободная РНК (гл. XIV). Они смогли определить молекулярную массу инфекционной РНК ВТМ, чувствительной к облучению, которая оказа- лась в пределах от 1,4-Ю8 до 5,4 >10° дальтон. Гирер [627, 628] исследовал скорость, с которой панкреатическая РНКаза уменьшает вязкость, средне- весовую молекулярную массу и инфекциониость РНК ВТМ, и пришел к выво- ду, что размер инфекционной единицы совпадает с размером целого РНК- генома вируса и что ферментативный гидролиз одной межнуклеотидной связи достаточен для того, чтобы молекула утратила инфекциоиность. Даже удаление одного основания с 5'-конца цепи РНК оказывается достаточным для потери инфекционности [1677]. Более прямым подходом к проблеме были опыты Фризена и Синсхей- мера [563] с применением сепараторной ячейки в аналитической ультра- центрифуге. В этом случае после седиментации в определенных условиях можно непосредственно получить данные о величине коэффициента седи- ментации инфекционной РНК путем определения инфекционности в капле жидкости из верхней части центрифужной пробирки. Фризен и Синсхеймер проанализировали нативную РНК и серию препаратов, содержащих от 4 до 61% первоначального количества недеградированной; РНК. Независимо от степени деградации препарата РНК в целом коэффициент седиментации инфекционного материала был равен приблизительно 30S. Хазелькорн [738] использовал метод фракционирования в градиенте плотности сахарозы препаратов РНК ВЖМТ, которые содержали как натив- ные (молекулярная масса«2,3-10е) молекулы РНК, так и продукты деграда- ции различного размера. При этом оказалось, что инфекционностью обладал лишь материал, имевший большую молекулярную массу. Поглощение в ультрафиолете Подобно другим нуклеиновым кислотам, РНК вирусов растений погло- щает в ультрафиолетовой области между 230 и 290 нм, что в основ- ном обусловлено пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. В результате суммирования максимумов поглощения отдельных оснований образуется сильный пик вблизи 260 нм с впадиной около 230—235 нм. Спектр поглощения в ультрафиолете обычно мало полезен, если требуется отличить одну вирус- ную РНК от другой. Однако в случае РНК, подобных РНК ВЖМТ, харак- теризующейся высоким содержанием цитидиловой кислоты (максимум погло- щения примерно при 280 нм), спектр поглощения в ультрафиолете заметно отличается от спектра поглощения РНК с более обычным составом, напри- мер РНК ВТМ. Удобным методом определения концентрации РНК в растворе является измерение поглощения в ультрафиолете при 260 нм в кювете шириной 1 см. При этом поглощение на единицу массы несколько варьирует в зависимости от состава оснований. При концентрации 1 мг на 1 мл величина оптической плотности для РНК ВТМ и РНК ВЖМТ составляет примерно 29 и 23 соот- ветственно (в 0,01 М растворе NaCl при pH 7,0) [738]. Различные факторы, влияющие на спектр поглощения РНК в ультра- фиолете, обсуждаются ниже. Вторичная структура одпоцепочечиых вирусных РНК В интактной вирусной частице трехмерная структура молекулы РНК частично или полностью определяется ее взаимодействием с вирусным белком (гл. V). Здесь мы кратко рассмотрим сведения о конфигурации РНК вирусов
Структурные компоненты 65 240 260 280 300 320 Длина волны, им Фиг. 6. Влияние изменения концентрации ионов натрия и температуры па поглоще- ние РНК ВТМ в ультрафиолете (15 мкг/мл) [218]. 1 — 0,06 мМ Na+; 11=0,17 Л1М Na+; III — 15 «М Na+; IV — 34 мМ Na+; V — 153 мМ Na+; VIX— 1430 мМ Na+. Фиг. 5. Влияние изменения pH па спектр поглощения РНК ВЖМТ в ультрафиолете (27 мкг/мл) [1226]. I — pH ,4,7 в ацетате калия; II — pH 4,4 п аце- тате калии; III -- pH 6,9 в какодилате калия; IV — pH 7,0 в фосфате калия; V — pH 8,0 в mpue-HCl. Вос буферы содержали 0,1 МКС1 и име- ли одинаковую ионную силу, равную 0,12. в растворе. Двухцепочечная ДНК имеет хорошо выраженную вторичную структуру, которая возникает как следствие спаривания оснований и уклад- ки их в двойную спираль. Молекулы одноцепочечных РНК не имеют такой регулярной структуры. Однако с помощью различных физических методов было показано, что РНК, подобная РНК ВТМ, в растворе при pH около 7,0 и комнатной температуре, например в 0,1 М растворе NaCl, не может суще- ствовать в форме вытянутой цепи. При сравнительном изучении поведения ДНК, синтетических полину- клеотидов и природных PI-IK при нагревании в растворе Доти и др. [469] пришли к выводу, что при определенных условиях РНК содержит много- численные незначительной длины спиральные участки, образованные спа- ренными посредством водородных связей основаниями, перемежающиеся с одноцепочечными областями. Молекулы РНК при этом имеют более или менее компактную структуру. Степень спирализации молекулы РНК при стандартных условиях в некоторой степени зависит от состава оснований. При различных изменениях в окружающей среде спиральные участки исчезают и молекула РНК превращается в беспорядочный клубок [165]. Такой эффект может быть достигнут при нагревании, повышении и пони- жении pH, а также в результате снижения концентрации ионов или изме- нения ионного состава среды. Переход от спирали к беспорядочному клубку изменяет ряд физических свойств вирусной РНК. Оптическая плотность при 260 нм и вязкость увеличиваются, в то время как скорость седимен- тации уменьшается. На фиг. 5 показано влияние изменения pH на спектр поглощения РНК ВЖМТ в ультрафиолете. Изменение оптических свойств РНК при различ- 5-0893
66 Глава IV Фиг. 7. Зависимость температуры плавле^ иия РНК ВЖМТ от pH [1226]. ных pH обусловлено отчасти изменением в степени спирализации моле- кулы, а частично связано с изменением в спектре поглощения отдельных оснований вследствие изменения их ионизации. На фиг. 6 показано влияние одновременно концентрации ионов Na+ и температуры на оптическую плотность РНК ВТМ [218]. При высокой концентрации соли (1430 мМ) и температуре 20 °C и ниже относительная оптическая плотность наименьшая (наибольшая степень спирализации). При повышении температуры оптическая плотность повышается, так как происходит «плавление» спиральных участков. При понижении концентрации соли температура, необходимая для перехода к беспорядочному клубку, уменьшается. Кривые, приведенные на фиг. 6, известны как кривые плавления, а тем- пература, при которой возрастание оптической плотности составляет половину максимального, называется температурой плавления (7"Пл)- Для каждого данного типа нуклеиновой кислоты величина Тпл заметно зависит от pH, как показано на фиг. 7 для РНК ВЖМТ. Ионы Mg2+ в 25 000 раз эффективнее как стабилизирующие спиральные' области РНК, чем ионы Na+, о чем свидетельствуют результаты изучения; кривых плавления [218]. При изменении концентрации ионов Na+ в пределах от 0,2 до 150 мМ коэффициент седиментации возрастает от 3,26 до 28,2 S; параллельно с увеличением гипохромного эффекта при 258 нм. Бёдткер пришла к выводу, что уменьшение скорости седиментации при низкой кон- центрации соли обусловлено очень большим увеличением эффективной величины молекул РНК вследствие утраты компактных спиральных участков. Поглощение в растворах полирибонуклеотидов, утративших вторичную' структуру, составляет около 90% поглощения в ультрафиолете, характер- ного для соответствующих нуклеотидных гидролизатов. С другой стороны, для структуры, содержащей максимальное число спаренных водородными связями оснований (например, синтетический спиральный полинуклеотид, содержащий поли-А и поли-У), поглощение в ультрафиолете составляет около 60% поглощения составляющих ее нуклеотидов. Доти и др. [469], на основании сравнения влияния нагревания на оптические свойства РНК ВТМ и некоторых синтетических полинуклеотидов с известной структурой пришли к выводу, что при оптимальных условиях около 60% оснований в растворе РНК должно быть спарено водородными связями. Подобным же- образом Хазелькорн [738] установил, что в 0,01 М растворе соли около 2/3 оснований РНК ВЖМТ в интактном вирусе спарены, образуя спиральную структуру и большая часть этой упорядоченной структуры сохраняется при выделении РНК в благоприятных условиях.
Структурные компоненты 67 Киселев и др. [978] изучили переход спираль — клубок в растворах РНК ВТМ с помощью электронной микроскопии. В зависимости от ионной силы, температуры и pH растворов, из которых выделяли образцы для исследований, удалось наблюдать три различные конфигурации: 1) ком- пактные молекулы (растворы с высокой ионной силой при комнатной тем- пературе), 2) палочки диаметром около 3 нм (растворы с низкой ионной силой при комнатной температуре), 3) вытянутые нити (нагретые или под- кисленные растворы). Эти конфигурации представлены на фото 5. Кольцевая РНК Известно, что одноцепочечная ДНК бактериофага <рХ174 существует внутри вирусной частицы в виде замкнутого кольца [515]. В связи с этим возникает вопрос, могут ли некоторые икосаэдрические или крупные вирусы растений содержать кольцевую РНК. Такая возможность исключается для палочкообразных вирусов, так как в этом случае имеется одиночная нить РНК, расположенная по длине палочкообразной частицы. Страциелли и др. [1686] провели сравнительное исследование деградации РНК ВЖМТ под действием ЭДТА и панкреатической рибонуклеазы. Об изме- нении средневесовой молекулярной массы и радиуса вращения судили на основании данных светорассеяния. Для PITK ВЖМТ, применяя оба метода деградации, они нашли, что радиус вращения увеличивался перед началом интенсивной деградации молекулы, в то время как радиус вращения и средневесовая молекулярная масса РНК ВТМ уменьшались с самого начала этого процесса. Страциелли и др. объяснили эти данные, иредполб- жив, что РНК ВЖМТ существует в форме замкнутой петли. Однако эти результаты можно интерпретировать и по-иному. Например, Хазелькори [738] показал, что РНК ВТМ и РНК ВЖМТ седиментировали совместно в условиях pH и ионной силы, сходных с теми, которые были использованы Страциелли и др. [738]. В противоположность этому кольцевая и линейная форма ДНК фага срХ174 легко различимы по своим седиментационным свой- ствам [515]. Кейпер [915] на основании данных о седиментации при различ- ных условиях высказал предположение, что изолированная РНК вируса огуречной мозаики (штамм Y) может существовать в двух формах: незамкну- той цепи и кольцевой структуры. Однако эти данные, также как и в описан- ном выше случае, можно объяснить по-разному. Вторичная структура двухцепочечньхх вирусных РНК Двухцепочечные РНК вируса раневых опухолей и вируса карликовости риса, подобно двухцепочечной ДНК, обладают значительно более высоко- упорядоченной вторичной структурой, чем одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Путем определения состава оснований этих РНК можно заключить, что количество аденина равно количеству урацила, а количество гуанина — количеству цитозина (табл. 4), т. е. в этом случае точно соблюдается правило спаривания основанийУотсонаиКрика. Высокоупорядочениая структура этих РНК позволяет исследовать их, пользуясь рентгенографическими методами, Томита и Рич [1778] показали, что существует сходство дифракционных кар- тин, полученных на препаратах нативной РНК вируса раневых опухолей и препаратах нативной клеточной ДНК, особенно ДНК в A-форме (ДНК существует в A-форме при низкой влажности, и плоскости пар оснований в этой структуре наклонены к оси спирали. В В-форме ДНК плоскость пар оснований перпендикулярна оси спирали). С другой стороны, по некоторым другим свойствам, например по расстоянию между основаниями (0,303 нм), РНК вируса раневых опухолей ближе к В-форме ДНК (0,34 нм), чем 5*
68 Глава IV Температура/С Фиг. 8. Сравнение крутой кри- вой плавления двухцепочечной РНК вируса карликовости риса (ВКР), сходной с той, которая обнаруживается для ДНК, с кри- вой плавления рибосомной РНК и денатурированной РНК вируса карликовости риса [1228J. Плавление проводили в буферном рас- творе 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата натрия при pH 7,0. I — РНК ВКР; II — рибосомпая РНК; III — дена- турированная РНК ВКР. к А-форме (0,25 нм). Структурные свойства РНК вируса раневых опухолей очень сходны со свойствами двухцепочечной РНК реовируса (крупного вируса, патогенного для животных). Таким образом, как подчеркивают Томита и Рич [1778], природные двухцепочечные РНК, по-видимому, обра- зуют класс двухспиральных структур, сходных с ДНК, хотя и несколько отличающихся от нее. > При нагревании РНК вируса раневых опухолей в 0,15 М растворе NaCl и 0,015 М растворе цитрата натрия наблюдали гиперхромный эффект, кото- рый обнаруживается для ДНК; при этом температура плавления (Тпл) была очень высока (около 90 °C) и в пределах нескольких градусов поглощение в ультрафиолете резко возрастало [656]. Дальнейшее подтверждение двухцепочечного строения РНК вируса раневых опухолей было получено при электронно-микроскопических иссле- дованиях [1001]. Эта РНК по общему виду и жесткости структуры похожа на двухцепочечную ДНК. Длина большей части цепей РНК оказалась значи- тельно меньше 5 мкм, т. е. той величины, которой можно было ожидать, если бы РНК внутри вирусной частицы представляла собой одиночную цепь. Большинство цепей имело длину менее 1,5 мкм, а наиболее часто встреча- лись частицы длиной около 0,3 мкм. Это может объясняться деградацией интактной структуры РНК или же тем, что РНК может существовать в виде нескольких единиц внутри вирусной частицы, как это было найдено для реовирусов (см. ниже). Двухцепочечное строение РНК вируса карликовости риса было подтвер- ждено рентгеноструктурным анализом [1489]. Миураи др. [1228] исследовали влияние повышения температуры на поглощение этой РНК в ультрафиолете с целью оценки степени спирализации. Подобно РНК вируса раневых опу- холей, РНК вируса карликовости риса имела кривую плавления, сходную с кривой плавления ДНК — Тяп = 80 °C в 0,01 SSC (сокращение от 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрата натрия при pH 7,0) (фиг. 8). После денатурации РНК вируса карликовости риса нагреванием с последующим быстрым охлажде- нием она вела себя подобно рибосомной и транспортной РНК. Дальнейшие рентгеноструктурные исследования подтвердили, что ОН-группы рибозы в двухцепочечной РНК способны участвовать в образо- вании водородных связей с другими молекулами РНК [36].
Структурные компоненты 69 РНК реовируса представляет собой не непрерывную двухцепочечную структуру, а состоит приблизительно из 10 или И отдельных двухцепочеч- ных фрагментов [1840, 1867]. Кроме того, каждая вирусная частица содер- жит несколько сотен небольших одноцепочечных полинуклеотидов, богатых адениловой кислотой, функция которых пока неизвестна [143, 1549]. Исходя из наличия других черт сходства с реовирусами кажется вполне вероятным, что в вирусе раневых опухолей и в вирусе карликовости риса будут найдены такие же небольшие одноцепочечные фрагменты. Вирус раневых опухолей и вирус карликовости риса содержат прибли- зительно в пять раз больше РНК, чем многие другие вирусы растений (напри- мер, ВТМ и ВЖМТ). В связи с этим высказывали мысль о том, что двух- цепочечная структура для таких высокомолекулярных РНК необходима для того, чтобы сделать их стабильными в отношении клеточных нуклеаз, однако следует иметь в виду, что на единицу длины цепи небольшие моле- кулы РНК так же чувствительны к деградации нуклеазами, как и крупные. Кроме того, некоторые вирусы животных имеют еще более крупные РНК, для которых характерна тем не менее одноцепочечная структура (например, вирусы лейкоза птиц). Несмотря на то что эти вирусы, конечно, весьма нестабильны, они в то же время обладают высокой степенью инфекционности; Последовательность оснований Хотя различного рода данные свидетельствуют о том, что общепринятая концепция генетического кода является правильной, до сих пор не осла- бевает интерес к попыткам непосредственного сопоставления данных хими- ческого анализа последовательности оснований в природных информацион- ных РНК и последовательности аминокислот в кодируемых ими белках. Такие данные могут дать интересную информацию, касающуюся природы «мест узнавания» и регуляции считывания полицистронной матрицы, т. е. дать ответ на вопрос как начинается и как заканчивается трансляция матрицы и как осуществляется контроль скорости считывания различных цистронов. Мелкие вирусы растений, как, например, ВТМ и вирус-сателлит вируса некроза табака, представляются очень удобной моделью для такого рода исследований. Преимущества ВТМ в этом плане связаны с доступностью больших количеств вируса, а также с тем, что здесь известна аминокислот- ная последовательность структурного белка большинства мутантов; удобство использования вируса-сателлита обусловлено небольшими размерами его РНК. Верхний компонент вируса мозаики люцерны (гл. VIII) благодаря своему небольшому размеру также может служить подходящим материа- лом для изучения нуклеотидной последовательности РНК. Первичная структура полностью определена только для некоторых транспортных РНК и 5S-PHK. В сравнении с ними даже небольшие РНК вирусов растений выглядят слишком крупными, и к тому же в их составе не обнаружено необычных оснований, которые могли бы облегчить иденти- фикацию фрагментов. Определение последовательности нуклеотидов воз- можно почти всегда только при использовании меченой РНК. Однако воз- можность получения с помощью современных методов РНК вирусов растений с достаточно высокой удельной активностью вызывает сомнение. Например, вводя в зараженное растение МСО2 с активностью 50—10 мКи в течение 12—14 дней, Сугияма и Френкель-Коират [1699] получили ВТМ с удельной активностью 2—10-10° имп (мин-мг). Таким образом, технические стороны проблемы достаточно сложны. Первой ступенью в исследовании последовательности оснований является определение концевых групп в цепи РНК. Результаты ранних
70 Глава IV работ в этой области оказались сведенными к нулю вследствие того, что исследуемая РНК была уже частично деградирована, что обусловливалось применявшимися тогда методами ее выделения, и, кроме того, вирусные препараты содержали примесь загрязняющего их нуклеотидного материала. Другой трудностью было присутствие следов рибонуклеазной активности даже во многих высокоочищенных препаратах ВТМ [1908]. Витфельд и Вильямс нашли, что обработка очищенного ВТМ 0,02 М версеном при соответствуюпщх условиях почти полностью удаляет примесь фермента. Два исследованных вируса растений — ВТМ [1700] и ВЖМТ [1413] — содержат нефосфорилированный аденозин па 5'-конце РНК. С другой сто- роны, РНК вируса-сателлита имеет на 5'-конце фосфорилированную после- довательность: ффАфГфУ — [1416, 1920, 1921]. Предложенный Витфельдом [1906] метод ступенчатой деградации поли- рибонуклеотидов и различные более современные его модификации дают возможность определить лишь последовательность нескольких концевых оснований вследствие того, что некоторые из используемых реакций не идут до конца, а также в связи с лабильностью межнуклеотидных связей. В РНК ВТМ была определена последовательность двух оснований на З'-копце (— ЦфА) [1907]. Штейшпнейдер и Френкель-Конрат [1677], применяя анилин в качестве катализатора при деградации межнуклеотидных связей, получили данные, позволяющие предполагать, что концевая последовательность имеет следующий вид: ГфЦфЦфЦфА, что и было в дальнейшем подтверждено [651]. Некоторую информацию об относительной частоте встречаемости опре- деленных нуклеотидных последовательностей в вирусной РНК можно полу- чить с помощью двух ферментов, которые расщепляют РНК в специфиче- ских местах: 1) панкреатической рибонуклеазы, которая гидролизует 3',5'- фосфодиэфирную связь со стороны 5'-атома углерода рибозы в местах, где пиримидиновое основание расположено со стороны З'-фосфодиэфирной связи .[1148], 2) рибонуклеазы Т17 выделенной из такадиастазы, которая специфически расщепляет РНК там, где находятся остатки гуаниловой кислоты [485]. В своих классических исследованиях по изучению действия панкреа- тической рибонуклеазы на РНК вирусов растений Маркхэм и Смит [1154— 1156] использовали хроматографию на бумаге и методы электрофореза для разделения фрагментов длиной до трех нуклеотидов. Современные методы хроматографии на колонках оказались более эффективными для разделения длинных олигонуклеотидов. При фракционировании олигонуклеотидов на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой в 7 М мочевине смеси разделяют вплоть до фрагментов, содержащих 8 нуклеотидов [1643]. Олигонуклеотиды такого размера можно затем разделить с помощью ионообменной хроматографии на колонках со смолой Дауэкс I. Солимози и др. [1643] удалось удачно фрак- ционировать уникальные олигонуклеотиды, содержащие до 5 нуклеотидов. Таким образом, оказалось возможным получить данные об относительной частоте определенных последовательностей длиной до пяти нуклеотидов и сравнить их с частотой, вычисленной в предположении беспорядочного распределения нуклеотидов. Такой анализ можно провести для РНК раз- личных штаммов одного вируса (гл. XIII). Однако это слишком длинный путь для получения информации о полной последовательности оснований в какой-то вирусной РНК. Необходимой промежуточной стадией при выяс- нении полной последовательности оснований будет выделение фрагментов РНК, достаточно больших, чтобы в них содержались уникальные последо- вательности оснований и идентифицируемые участки перекрывания с дру- гими последовательностями, но в то же время достаточно коротких для того, чтобы было осуществимо определение последовательности оснований. Эти требования ограничивают средний размер таких фрагментов РНК длиной приблизительно 20—50 нуклеотидов.
С тру кту р ные компо ненты 71 Интересные данные, касающиеся этой проблемы, были полупены Мун- дри [1247] при исследовании РНК ВТМ. РНК в этих опытах гидролизовали рибонуклеазой и продукты гидролиза фракционировали па колонках с гидроксилапатитом. В результате применения таких колонок не было достигнуто хорошего разделения коротких нуклеотидов, по это позволило сконцентрировать внимание на материале, элюируемом много позже, нем основная масса гидролизата, и хорошо отделявшемся от всех других ком- понентов (фиг. 9). Мундри установил, что этот полинуклеотид состоял из 39 ± 2 оснований и, по-видимому, содержал единственный остаток гуанина, как и можно было ожидать, исходя из специфичности действия рибонукле- азы Tt. Мундри пашел такой полинуклеотид в обычном и далемском штамме и штамме U2 ВТМ, тогда как в подорожниковом штамме Холмса он отсут- ствовал. Существование этого полинуклеотида Мундри попытался связать с современными данными о кодировании определенных аминокислот, встре- чающихся в структурном белке различных штаммов ВТМ. Эта работа наглядно показывает те трудности, с которыми мы сталкиваемся при опреде- лении полной последовательности оснований в молекулах такого размера, как ВИК ВТМ, и при попытках связать те или иные участки этой последо- вательности со структурным белком. Во-первых, упомянем технические трудности, связанные с необходимо- стью специфичного расщепления РНК, с тем чтобы получить уникальные полинуклеотиды нужного размера, выделить их и определить в них после- довательности оснований. Во-вторых, высокая степень вырожденности гене- тического кода делает возможным существование стольких различных вари- антов последовательностей оснований, что предсказание, основанное на известной последовательности аминокислот, может принести очень мало поль- зы. В-третьих, как мы увидим в гл. VII, большая часть вирусных РНК типа РНК ВТМ кодирует более чем один белок. Таким образом, возникает проб- лема, является ли тот или иной фрагмент РНК цистроном структурного белка, служит ли он частью этого цистропа или вообще не входит в него. Полинуклеотид, содержащий 39 оснований, найденный в РНК ВТМ, воз- можно, удастся идентифицировать путем сравнения РНК ряда штаммов, различающихся по аминокислотной последовательности. Выбрав комбина- ции триплетов, не содержащие гуанина, способные кодировать аминокис- лоты структурного белка, Мундри рассчитал, что максимальная длина устойчивого к рибонуклеазе Tt полинуклеотида в цистроне структурного белка ВТМ пе должна превышать 31 нуклеотид. Следовательно, эксперимен- тально выделенный полинуклеотид, состоящий из 39 оснований, должен, Номер фракции Фиг., 9. Профиль элюции олигонуклеотидов, полученных в результате гидролиза РНК ВТМ (штамм Us) рибонуклеазой Ti, фракционированных на колонках с гидроксилапати- том [1247]. Элюирование фосфатным буфером, содержащим мочевину. Компонент, элюируемый последним и хорошо отделяемый от остального материала, представляет собой олигонуклеотид из 39 оснований (фракция примерно 440). Но оси ординат справа отложена молярность фосфатного вуфера.
72 Глава IV вероятно, содержать цо крайней мере несколько нуклеотидов, не имеющих отношения к структурному белку. Подобным же образом Менделес [1140] изолировал из Т,-гидролизата РНК ВТМ три уникальных олигонуклеотида. Каждый из них встречался в молекуле РНК только один раз, и самый большой из них содержал 70 нук- леотидов. Состав оснований этих олигонуклеотидов еще не определен, но Менделесу удалось установить приблизительное положение этих олигонук- леотидов в молекуле РНК, удаляя структурный белок методом ступенчатой депротеинизации под действием детергента со стороны З'-конца, как это делали Мэй и Найт [1192] (гл. XIII). Удаляя разное количество структурного белка, Менделес определил, какая часть каждой из уникальных последова- тельностей «обнажалась» в каждом случае. Затем он смог определить их положение относительно З'-конца. Оказалось, что они не выявлялись вблизи того участка, где, как установили Кадо и Найт [906], находится ген, ответ- ственный за возникновение местных поражений (фиг. 52). Рассматривая возможную кодирующую роль 69 нуклеотидов, не содер- жащих гуанина, Менделес пришел к выводу, что ближайшая it З'-концу уникальная последовательность не могла целиком участвовать в кодирова- нии капсидного белка и что поэтому, вероятно, данный цистрон распола- гался не у З'-конца РНК. Хайтон и Бир [776] в предварительном сообщении описали совершенно иной подход к проблеме нуклеотидной последовательности РНК ВТМ. Они определили условия, при которых удается расположить интактные моле- кулы РНК на пленке-подложке электронного микроскопа в растянутом виде. Расстояние между основаниями, как было установлено, составляет 0,6—0,7 нм. Если в принципе возможно связать малые электронноплотные молекулы-маркеры со специфическими основаниями РНК, расположенными на расстоянии 0,6—0,7 им, то, возможно, мы могли бы получить данные о распределении оснований по длине молекулы РНК. Вирус растений, содержащий ДИК Шеферд и др. в 1968 г. представили первые убедительные доказатель- ства существования вируса растений, содержащего ДНК. Было обнаружено, что вирус мозаики цветной капусты, для которого характерны сферические Фиг. 10. Установление природы нуклеиновой кислоты вируса мозаики цветной капусты [1561]. Видно совпадение пиков, соответствующих ДНК, и пиков инфекционности после равновесного центри- фугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Содержание ДНК выражено числом микрограмм на фракцию. I — оптическая плотность при 260 нм; II — инфекционность; III — ДНК. Л
Структурные компоненты 73 частицы диаметром около 50 нм [1343], после соответствующей очистки со- держит только ДНК. Эта нуклеиновая кислота была идентифицирована как ДНК на основании следующих признаков: 1) положительной реакции с ди- фениламином; 2) наличия тимина; 3) потери инфекционности выделенной из вируса нуклеиновой кислоты под действием панкреатической дезоксирибо- нуклеазы, но не рибонуклеазы; 4) того факта, что при равновесном центри- фугировании очищенного вируса в градиенте плотности хлористого цезия материал, поглощающий при 260 нм, материал, определяемый как ДНК по реакции с дифениламином, и материал, обладающий инфекционностью, сосредоточивались в одной зоне градиента (фиг. 10). Результаты более поздних исследований (Шеферд, личное сообщение) позволяют предположить, что ДНК этого вируса является двухцепочечной. БЕЛКОВАЯ СУБЪЕДИНИЦА Обычно принято считать, что все белковые субъединицы, из которых построена оболочка палочкообразных или мелких изометрических вирусов растений, идентичны. Однако эта однородность не продемонстрирована до- статочно убедительно ни для одного вируса. Наиболее вероятно, что это утверждение справедливо для таких палочкообразных вирусов, как ВТМ. Очищенные препараты вируса крапчатости бобов фасоли и вируса желтой мозаики коровьего гороха (ВЖМКГ) обладают электрофоретической гетеро- генностью. Электрофорез в полиакриламидном геле в 8 М мочевине позво- ляет выявить в препарате белка, экстрагированного из интактного ВЖМКГ 67%-пой уксусной кислотой, 6 основных и 2 минорные полосы [1534]. При- рода этих фракций пока не установлена, но вполне возможно, что это одна и та же химическая субъединица в различных физических состояниях, а не ряд разных полипептидов. Некоторые мелкие вирусы животных содержат более одного типа структурных белков. Вероятно, то же будет обнаружено и для некоторых вирусов растений. Так, исследования последнего времени позволяют предположить, что в состав капсида вируса мозаики коровьего, гороха, вероятно, входят по крайней мере два различных белка (Шеферд, личное сообщение). Выделение белка из вирусных препаратов Многие условия и реактивы, применяющиеся для выделения вирусной РНК, могут быть также использованы для получения вирусного белка, в боль- шей или меньшей степени свободного от РНК. Однако наилучший метод, применяемый для выделения интактной РНК данного вируса, обычно отли- чается от метода, позволяющего получать удовлетворительные препараты белка. Химическое и физическое состояние получаемого белка широко, варьируют в зависимости от вируса и применявшейся обработки. Можно получить несколько разных типов белковых продуктов: 1) интактные белко- вые оболочки вируса, из которых удалена РНК; 2) нативные и в различной степени агрегированные химические субъединицы; 3) необратимо денатури- рованные белковые агрегаты, нерастворимые в водных растворах. Основным фактором, приводящим к образованию нерастворимых агрегатов, является образование дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками в бел- ковых субъединицах вследствие окисления сульфгидрильных групп. Обра- зование дисульфидных связей между цепями может быть блокировано раз- личными способами.
74 Глава IV Кислотная обработка Френкель-Конрат [532] описал изящный и простой метод выделения белковых субъединиц из ВТМ путем обработки вируса холодной 67%-ной уксусной кислотой. Степень легкости, с которой диссоциирует вирус, варьи- рует в зависимости от штамма данного вируса. При низких концентрациях белка или в щелочной среде (pH 13,0) субъединицы существуют в виде моно- меров с константой седиментации « 2,0 S. В других условиях субъединицы находятся в состоянии различной степени агрегации. К сожалению, описан- ный метод экстракции белка уксусной кислотой не всегда применим. Так, обработка ВЖМТ 67%-ной уксусной кислотой приводит к образованию нерастворимого агрегата благодаря тому, что четыре сульфгидрильные группы в белке ВЖМТ чрезвычайно легко окисляются. После окисления надмуравьиной кислотой или восстановления сульфитом в 8 М мочевине агрегированный белок превращается в химически модифицированный водо- растворимый продукт [710]. Широкие различия в степени устойчивости разных вирусов к обработке 67%-ной уксусной кислотой можно проиллюстрировать тем, что вирус мо- заики дикого огурца, как было показано, не полностью диссоциирует на белок и РНК [1726, 1949, 1950] и при этом возникает нерастворимый про- дукт, тогда как вирус морщинистости турнепса вообще не деградирует. Мики и Найт [1205] показали, что в результате обработки вируса крапчато- сти конских бобов 66 %-ной муравьиной кислотой в течение 18 ч при 37 °C образуется водорастворимый продукт, тогда как применение ряда других методов было безуспешным. В настоящее время существуют более эффектив- ные способы получения белка из этого вируса [775]. Белок большинства вирусов можно выделить в денатурированном со- стоянии путем соответствующей кислотной обработки. Например, нагрева- ние до 90 °C в 5—10%-ной трихлоруксусной кислоте в течение 10 мин обычно приводит к деградации РНК до низкомолекулярного материала. Денатури- рованный белок может быть выделен путем осаждения этанолом. Концентрированные солевые растворы Обработка 1 М раствором хлористого кальция приводит к диссоциации и солюбилизации белка оболочки вируса крапчатости конских бобов [1951] и вируса мозаики костра [1952]. Белок, полученный этим способом из вируса мозаики костра, оказался, согласно данным седиментационного анализа, относительно стабильным димером химических субъединиц. Был разработан также простой метод получения низкомолекулярного белка из нескольких мелких изометрических вирусов; этот белковый препарат при реконструк- ции с РНК образует инфекционные вирусные частицы [775]. Белковые субъ- единицы из вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха, вируса мозаики костра и вируса крапчатости конских бобов были получены путем диализа вируса против раствора, содержащего 1 М NaCl, 0,02 М трис- буфер, 10-3 М реактив Клеланда (pH 7,4 при 22 °C), в течение 24щ при 4 °C. Далее белок выделяли центрифугированием. Щелочная обработка РНК ВЖМТ легко выделить в нейтральной или слабощелочной среде; при этом выявляются интактные или почти интактные пустые белковые оболочки (процесс зависит от температуры и ионной силы) (см. гл. XIV). Обработка ВТМ при pH 10,0—10,5 использовалась многими исследо- вателями (см., например, [118, 1507]) для диссоциации вируса и получения
Структурные компоненты 75 растворимого белкового препарата, названного А-белком. Основным компо- нентом препарата А-белка является агрегат трех химических субъединиц, сохраняющих нативное состояние [85], однако молекулярная масса его колеб- лется от 50 000 и выше в зависимости от pH, температуры, ионной силы и концентрации (гл. V). В мягких щелочных условиях можно отделить белок от РНК также у других вирусов, ио образующийся при этом продукт часто нерастворим при pH около 7,0 или находится не в мономерном состоянии (например, Х-вирус картофеля [111]; вирус мозаики дикого огурца [1950]). Нагревание Для выделения РНК большинства вирусов растений, а также для денату- рации и осаждения белка достаточно нагревания при 95—100 °C в присут- ствии. соли (>0,1 М) при pH 7,0 в течение пяти или более минут. Темпера- тура, необходимая для освобождения РНК какого-то определенного вируса, может сильно зависеть от pH и ионной силы среды. Обработка детергентами Для диссоциации некоторых вирусов на белок и РНК применяли доде- цилсульфат натрия [533, 1654]. Образующийся при этом белок обычно рас- творим и имеет низкую молекулярную массу, но денатурируется под дей- ствием этого детергента. Детергент связывается с белком, и это может серьез- но мешать дальнейшему исследованию материала. В случае ВТМ связанный детергент делает белок непригодным для опытов по реконструкции. Мэй и Найт [1192] установили, что обработка ВТМ додецилсульфатом натрия приводит к удалению белка предпочтительно с того конца палочки, где находится З'-конец РНК. Действие гуанидингидрохлорида и мочевины Эти два соединения, вызывающие денатурацию белка, также приме- нялись для диссоциации вирусов на РНК и белковые субъединицы. Диссо- циация в мочевине часто оказывается неполной. Джонард и др. [895] показа- ли, что высокомолекулярная РНК может высвободиться из ВЖМТ в слу- чае обработки 8 М мочевиной при pH 7,0, что приводит к образованию боль- шого количества интактных пустых белковых оболочек. Однако Харрис и Хиндли [710] осуществили карбоксиметилирование ВЖМТ иодацетатом в присутствии 8 М мочевины при pH 8,2 и температуре 30 °C, получив водо- растворимый мономер. Этот метод, вероятно, является лучшим среди извест- ных в настоящее время методов получения водорастворимых белковых субъ- единиц ВЖМТ. Фенольная обработка Обработка фенолом, применявшаяся для выделения вирусных РНК, вызывает денатурацию вирусного белка. В большинстве случаев эта денату- рация, вероятно, необратима. Однако Андерер [20, 21] нашел, что денату- рированный белок ВТМ может быть выделен из фенольной фазы осаждением метанолом и ренатурирован нагреванием до 60 °C при pH 7,0—7,5. О рена- турации белка ВТМ свидетельствовали его растворимость в нейтральной водной среде, серологическая активность, а также способность образовывать вирусоподобные палочки при реполимеризации, а при инкубации с РНК .ВТМ — инфекционные вирусные частицы.
76 Глава IV Смешанные обработки ВЖМТ деградирует под действием четвертичных солей аммония, имею- щих общую формулу CnH2n+iN(CH3)3Br, в то время как пустые вирусные' белковые оболочки значительно более стабильны в этих условиях. Реакция вируса с янтарным [564] или уксусным [536] ангидридом приводит к обра- зованию химически модифицированных белковых субъединиц. Аминокислотный состав Белки всех исследованных до сих пор вирусов растений построены из тех же 20 аминокислот, которые обнаружены в белках клеток растений,, животных и бактерий. Аминокислотный состав вирусных белков определяют следующим обра- зом: 1) выделяют вирус, не содержащий значительных примесей других белков; 2) удаляют вирусную РНК; 3) гидролизуют белок (обычно с помо- щью 6 п. НС1) для расщепления его на аминокислоты; 4) фракционируют и определяют отдельные аминокислоты. Триптофан определяют отдельно, при помощи специального метода. Детали использованных методов мы не можем здесь рассматривать, однако некоторые обстоятельства следует отметить. Например, в процессе гидролиза происходит превращение амидов — аспарагина и глутамина — в соответствующие кислоты. Поэтому если эти амиды содержатся в белках, то они выявляются в виде аспарагиновой и глутаминовой кислот, как это показано в табл. 6. Если в нативном белке содержится цистин, то при- анализе он определяется как цистеин. Чтобы определить число различных аминокислотных остатков в белко- вой субъединице, необходимо знать ее размер. Его можно определить раз- ными путями, например на основании седиментационных данных, по процент- ному аминокислотному составу (приняв, что аминокислота, содержащаяся^ в наименьшей концентрации, представлена только одним остатком в субъ- единице), по данным количественного определения триптических пептидов и по анализу концевых аминокислот. В табл. 6 приведено число остатков различных аминокислот в белковых субъединицах ряда вирусов растений. Зная аминокислотный состав, мы можем лишь в общих чертах судить о сходстве белков между собой. В то же время последовательность амино- кислот в полипептидной цепи, имеющая исключительно важное значение в определении вторичной и третичной структуры, а тем самым и уникаль- ного набора свойств каждого белка, позволяет нам понять, как белки раз- личаются между собой. Тем не менее имеются некоторые моменты, на которые стоит обратить внимание при рассмотрении аминокислотного состава. В струк- турных белках вирусов растений не только найдены те же 20 аминокислот, что и в других объектах, но и содержатся они в соотношениях, сходных с теми, которые наблюдаются в других живых организмах. Например, цистеин, метионин, триптофан, гистидин и тирозин обычно обнаруживаются- в малых количествах. С другой стороны, как указывали Харрис и Хиндли [710], относитель- но высокое содержание оксиаминокислот (серина и треонина) является неиз- менным свойством до сих пор изученных вирусов растений. Они предпо- лагают, что возможности связывания водорода, обусловленные боковыми: цепями этих аминокислот, вероятно, облегчают сборку вирусных частиц,., которые оказываются полностью сформированными.
Таблица 6 Аминокислотный состав капсидных белков 1) Вирус Ала Apr Асп Цис Глу Гли Гис Иле Лей Лиз Мет Фен Про Сер Тре Три Тир Вал Всего Источник данных Икосаэдрические вирусы Мозаики люцерны 30 16 30 5 25 21 8 7 29 21 4 20 23 20 15 2 5 16 297 [846] Крапчатости бобов фасоли 2) 14 6 21 — 17 21 3 12 18 9 7 11 13 18 14 — 2 15 201 [1534] Крапчатости кон- 22 12 13 2 17 10 2 7 18 15 2 7 9 18 10 0 4 22 190 [1951] ских бобов Мозаики костра 33 13 10 1 18 10 4 8 15 13 3 5 7 13 11 2 5 18 189 [1689] Крапчатости гвоз- дики 31 19 36 5 31 29 1 19 28 25 9 14 24 28 36 2 10 35 382 [1788] Кольцевой пятни- 24 16 34 3 23 20 2 16 26 14 7 12 20 37 37 4 16 36 347 [910] стости гвоздики Хлоротической 25 9 И 2 16 10 2 7 16 12 1 4 7 16 17 4 5 19 183 (82] крапчатости коровьего гороха Огуречной мозаи- 17 24 30 0 20 16 4 16 26 18 8 7 18 32 17 1 11 22 287 [1831] ки Некроза огурца 41 17 46 0 24 32 3 20 33 16 1 20 23 32 31 7 12 33 391 [1788] Деформирующей 17 21 21 3 14 21 4 7 10 11 3 7 И 16 13 2 5 13 199 [1560] мозаики гороха Вирус-сателлит 28 25 57 3 32 28 8 25 29 15 9 14 9 24 34 — 8 25 373 Риис и Касса- ниСь личное вируса некроза табака сообщение Мозаикп Chenopo- dium rubrum 15 8 16 2 12 16 3 9 12 12 5 4 12 14 13 3 7 13 176 [904]
Продолжение табл. 6 Вирус Ала Apr Асп Цис Глу Гли Гис Иле Лей Лиз Мет Фен Про Сер Тре Три Тир Вал Всего Источник данных Южной мозаики фасоли 24 20 18 3 18 19 2 12 28 7 7 4 14 26 32 5 10 21 270 [1787] Мозаики тыквы2) 19 7 21 — 14 15 3 14 19 8 4 10 10 16 17 — 3 9 189 [1195] Кустистой карли- ковости тома- тов 2) 37 20 44 3 21 38 5 13 43 13 3 14 16 35 45 2 10 40 402 [442] Кольцевой пятни- стости томатов 15 11 10 5 18 18 5 13 24 10 3 15 12 16 15 5 7 10 218 [1789] Кольцевой пятни- стости табака 15 8 17 — 14 15 6 11 14 9 3 10 11 14 13 — 6 И 177 [1657] Морщинистости турнепса 17 9 14 1 16 15 1 5 И 12 2 6 9 12 14 4 4 12 164 [1426] Желтой мозаики турнепса 15 3 11 4 15 8 3 15 18 7 4 5 20 16 26 2 3 14 189 [1726] Мозаики дикого огурца 15 5 15 2 11 9 3 13 24 9 1 8 Палочкообразные вирусы 19 26 13 1 3 12 190 [1726] Х-вирус картофе- ля 38 8 19 2 15 11 2 10 8 10 6 10 14 14 24 6 2 И 210 [1207] S-вирус картофеля 13 11 16 1 17 9 3 10 9 4 6 4 И 10 8 — 3 10 144 [1788] Табачной мозаики 14 11 18 1 16 6 0 9 12 2 0 8 8 16 16 3 4 14 158 [1794] Погремковости табака (нижний компонент) 21 10 20 — 16 7 1 3 14 15 3 И 13 21 10 — 5 8 178 [1533] Мозаики белого клевера 19 6 12 2 9 7 2 9 10 8 2 6 8 10 И 2 3 7 133 [1206] 1) Вероятно, некоторые данные об общем числе аминокислотных остатков в капсидном белке ряда вирусов значительно завышены вследствие того, что гид- родинамические измерения проводили на агрегатах субъединиц [1207]. 0 — аминокислота отсутствует; — аминокислота не определялась. 2) Данные пересчитаны Тременом и Голдшоком [1788].
Структурные компоненты 79» Концевые аминокислоты Харрис и Найт [711], используя карбоксипептидазу (одну из экзопеп- тидаз, отщепляющих С-копцевую аминокислоту), доказали, что С-конце- вой аминокислотой в белке ВТМ является треонин. Этот фермент действует па интактный ВТМ, тогда как интактный ВЖМТ устойчив к действию карбо- ксипептидазы. Однако в окисленном или карбоксиметилированном ВЖМТ' треонин выявляется как С-концевая аминокислота. Концевые аминокислот- ные остатки белков различных вирусов приведены в табл. 7. Таблица 7 Концевые аминокислоты и молекулярная масса капсидных белков некоторых вирусов растений Вирус N-копцевая аминокислота С-копце- вая амино- кислота Молеку- лярная масса белковой субъеди- ницы Источник, данных Мозапкп люцерны N-ацотилсерип Аргинин 32 600 [846, 1826J Крапчатости конских бобов По определяется; вероятно, ацетили- рована Алапин 20 500 [1951] Огуречный вирус 3 и 4 То же )> 29 000. [1276], Х-вирус картофеля Неизвестная ацети- лированная амино- кислота Пролин [1207], Вирус-сателлит ви- руса некроза табака Алании Алании 27 000 [1413,. 1452]' Мозаики Chenopodium rubrum Не определяется; вероятно, ацетили- рована Лизин 19 200 [904]. Табачной мозаики N-ацетилсерин Треонин 17 530 [711, 1261] Кустистой карлико- вости томатов Ие определяется; вероятно, ацетили- рована Лейцин — [1276] Желтой мозаики тур- непса N-ацотилмотиоиин Треонин 20 000 [709, 710} Мозаики белого кле- вера Не определяется; вероятно, ацетили- рована Аргинин 14 300 [1200] Интересным свойством белков многих вирусов является отсутствие в них свободной N-копцевой аминогруппы. Во многих капсидных белках, исследованных до настоящего времени, N-концевая аминокислота ацетили- рована. Это создавало большие трудности для исследователей, изучавших аминокислотную последовательность белка ВТМ. Ведь именно то, что N- концевая аминокислота ацетилирована, приводило к выводу об отсутствии свободной N-концевой аминогруппы при использовании таких стандартных методов анализа N-концевых групп, как обработка 1-фтор-2,4-динитробензо- лом и лейцинаминопептидазой. Существование ацетилированных N-конце- вых групп было показано путем выделения из ферментативного гидролизата отдельного пептида, не содержащего основных групп, а также на основании результатов химических тестов. Последовательность аминокислот в структурных белках Первичная структура белка ВТМ была установлена Френкель-Конра- том и его сотрудниками [1797], а также группой немецких исследователей [23]. Однако, прежде чем это удалось сделать, было много трудностей, касаю-
80 Глава IV 5 10 о 15 Ацетил-Я-Сер-Тир-Сер-Иле-Тре—Тре-Про-Свр-Елн-Фен-Вал-Фел-Лей—Сер —Сер % 30 25 20 С Ала—Лен — Тре — Цис—Лей—Асн—Иле-Лей—Глу—Иле—Про—Асп—Ала—Три—Ала.-4 35 40 /—ч 4S Лей — Гли—Асн—Глн—Феи—Глн—Тре —Глн—Глн — Ала-(Арг)-Тре —Вал— Глн— Вал, 60 55 50 ч С Вал—Тре —Вал— Глн—Про—Сер—Про —Лиз —Три -Вал-Глн - Сер—Фен —Глн — (Аре) 65 Z-X 70 х—, 75 Арг) -Фен-Про-Асп-Сер—Асп-Фен—(jluej-Вал-Тир-Мрг)—Тир-Лен—Ала— Вал, 90 85 80 С(Арг)—Тре —Асп —Фен — Ала— Гли—Лей —Лей -Ала-Тре —Вал—Леи —Про —Асп —Леи > 95 100 105 Асн -(Арг)-Иле-Иле-Глу —Вал-Глу —Асп —Глн —Ала—Асн — Про—Тре —Тре —Ала, 120 115 х-, 110 С Ала—Вал—Тре -Ала-Асп —Асп—Вал—Аре-(Apej-Tpe —Ала—Асп—Лей—Тре-Глу^ 125 130 z-ч. 135 Иле—(Apaj-Cep—Ала—Иле—Асн — Асн— Леи-Иле-Вал—Глу—Лей — Илв-(Арг) — Гли, 150 145 ^-=4 140 С Лей —Гли—Сер-Сер— Сер—Глу—Фен—Сер—Сер-0рг)—Асн—Тир-Сер—Гли—Тре * 155 15.8 Вал—Три —Тре—Cep-Гли—Про—Ала—Тре Фиг.' 11. Последовательность расположения аминокислот в капсидном белке ВТМ (обыч- ный штамм) [535]. Кружками указаны места действия трипсина. щихся методов определения аминокислотной последовательности и интер- претации получаемых данных. Установление полной последовательности 158 аминокислот, приведенной на фиг. 11, является значительным дости- жением. Знание последовательности аминокислот в капсидном белке ВТМ имеет огромное значение при изучении связи химических изменений РНК с изме- нениями аминокислотной последовательности капсидных белков мутантов вируса (гл. XIII). Белок ВТМ является единственным капсидным белком вирусов расте- ний, для которого полностью выяснена аминокислотная последовательность. Частичные последовательности установлены также для ВЖМТ Харрисом и- Хиндли [710]. Оказалось, что специфическое расщепление белка ВЖМТ трипсином приводит к образованию четырех довольно больших пептидов, которые плохо растворимы. Это и явилось препятствием на пути к опреде- лению полной аминокислотной последовательности белка ВЖМТ. Однако специфичность действия трипсина можно изменить. Так, аминоэтилирование остатков цистеина делает их доступными триптическому расщеплению [1798]. Методы гидролиза белков рассмотрены Хиллом [778]. Вторичная и третичная структура белковой субъединицы Благодаря изящным исследованиям с использованием рентгеноструктур- ного анализа сейчас детально известна вторичная и третичная структура нескольких белков. Однако это пока еще неосуществимо ни для одного белка вирусов растений. Для получения данных рентгеноструктурного анализа, которые можно было бы интерпретировать, используя современ-
Структурные компоненты 81 пые методы, необходимо иметь кристаллический белок, обладающий трех- мерной симметрией. Палочкообразные вирусы (такие, как ВТМ) образуют «паракристаллы», характеризующиеся только двумерной симметрией. При- близительная трехмерная форма молекулы белка ВТМ была рассчитана путем сравнения результатов рснтгеноструктуриого анализа интактного вируса и белковых «палочек», образующихся при агрегации субъединиц в отсутствие РНК (фото 8). Белок ВТМ, подобно многим другим белкам, содержит несколько а- слиральпых участков. Исходя из результатов измерения дисперсии оптиче- ского вращения па частично диссоциированных субъединицах, Симмонс и Блоут [1586] пришли к выводу, что 25—35% этого белка находится в а- спиралыюй конфигурации. Изучение дихроизма интактного ВТМ в инфра- красной области спектра позволяет предположить, что а-сниральные участки могут располагаться более или менее перпендикулярно оси частицы (т. е. вдоль длины субъединицы) [556]. ДРУГИЕ КОМПОНЕНТЫ ВИРУСА Полиамины Маркхэм [1149] обнаружил в вирусах растений присутствие веществ основного характера, а Джонсон и Маркхэм [894] пришли к заключению, что полиамин, содержащийся в ВЖМТ, является бис-(3-аминопропил)-ами- иом (в настоящее время его называют 1,7-диамипо-4-азагептапом). Этот амин раньше не обнаруживали в биологических системах, по в структурном отношении он напоминает другие полиамины, например спермин и сперми- дин, обнаруженные в вирусах бактерий [19]. Исследования последнего вре- мени позволяют предположить, что основным полиамипом в ВЖМТ в дей- ствительности является спермидин [140]. Джонсон и Маркхэм установили, что по массе полиамин составляет около 0,7% ВЖМТ. Они обнаружили так- же это соединение в вирусе морщинистости турнепса, вирусе крапчатости конских бобов и в ВТМ. После диссоциации ВЖМТ на РНК и белок около 2/3 количества этого полиамина было выявлено во фракции РНК. Джонсон и Маркхэм считают, что в интактном вирусе он в основном связан с РНК. Опи не смогли обнаружить этот полиамип в здоровых растениях китайской капусты, хотя он и мог содержаться в концентрациях, находящихся за пре- делами чувствительности метода определения. В здоровых растениях были обнаружены различные моноамины и диамины. Липиды Известно, что многие крупные вирусы животных содержат липиды, которые, по-видимому, являются частью внешней оболочки, окружающей внутренний пуклеокапсид, содержащий нуклеиновую кислоту. Большин- ство вирусов растений, интенсивно изучавшихся при помощи химических способов, относится к категории мелких икосаэдрических или палочко- образных вирусов. Ни один из них, вероятно, не содержит липидов. Однако недавно было показано, что некоторые крупные вирусы растений содержат определенное количество липидов. Препараты вируса бронзовое™ томатов (штамм Е), выделенного из N. glutinosa, содержат после экстракции смесью метанол — хлороформ — эфир около 19% липидов (по массе) [192]. Из них 9% приходятся на долю липидов, экстрагируемых петролейным эфиром, и 10% составляют липиды, 6-0893
82 Глава IV нерастворимые в петролейном эфире. Листья N. glutinosa, зараженные вирусом, в расчете на сухую массу содержали на 10% больше липидов, чем здоровые листья, хотя концентрация вируса в зараженной ткани весьма невелика. Вирус желтой карликовости картофеля, выделенный из N. rustica, содержит, как было показано, более 20% липидов после экстракции смесью хлороформ — метанол [11]. Естественно, при этом возникает вопрос, в какой степени липиды, при- сутствующие в этих вирусах, имеют клеточное происхождение, т. е. яв- ляются ли они либо примесью, загрязняющей вирусный препарат, либо- составными компонентами вирусных частиц. Ахмед и др. [И] пришли к за- ключению, что не более х/в липидов в препаратах вируса желтой карлико- вости картофеля обусловлено примесью балластных компонентов клетки- хозяина, однако для точного установления этого факта требуются более детальные химические исследования. Как частицы вируса желтой карликовости картофеля, так и частицы вируса бронзовости томатов имеют внешнюю оболочку. Способность этих оболочек окрашиваться определенными красителями предполагает наличие в них липидов. При электронно-микроскопическом исследовании ультра- тонких срезов клеток, зараженных некоторыми вирусами, выявляются ча- стицы, находящиеся в окруженных мембраной пузырьках (гл. VII). В связи с этим было высказано предположение, что внешняя оболочка такого рода вирусов образуется за счет отпочковывания от мембран этих структур. Та- ким образом, эти внешние оболочки могут в равной степени включать как компоненты клетки-хозяина, так и вирусоспецифичпые материалы. Смесь ком- понентов клетки-хозяина и вируса обнаружена также во внешних оболочках некоторых вирусов животных, которые, созревая у поверхности клеточной мембраны, затем высвобождаются из нее. Металлы Со времени уже давно проведенного исследования состава вирусов ра- стений [1664] было установлено, что зольная фракция очищенных препаратов содержит различные металлы. Пири [1334] обнаружил кальций, натрий и сле- ды 12 других металлов в вирусе кустистой карликовости томатов. Было- показано, что ВТМ и РНК ВТМ содержат девять металлов в значительных количествах [1100, 1853]. Лоринг и др. [1101] рассчитали, что подавляющее- большинство кислотных групп в вирусе, выделенном в деионизированной воде, связано с магнием и кальцием. Уокер и др. [1853] обнаружили, что- общее содержание металлов в интактном ВТМ, подвергнутом исчерпываю- щему диализу против не содержащей металлов воды, было значительно- выше (260 г-ат/моль), чем в изолированной вирусной РНК (50 г-ат/моль). Диализ целого вируса против 0,1 М ЭДТА снижал содержание металлов до- уровня, сравнимого с найденным в препаратах РНК. Уокер и др. [1853], заключили, что металлы присоединяются it ВТМ двумя различными путями: 1) соединяясь с белком (металл, удаляемый путем обработки ЭДТА); 2) обра- зуя с РНК связь, которая устойчива по отношению к ЭДТА даже при повы- шенных температурах. Уменьшение содержания металла после диализа против ЭДТА не влияло на инфекционность вирусных препаратов. Таким образом, те металлы, которые связаны, как предполагают, с белком, по- являются необходимой частью вирусной структуры. Содержание металлов в препаратах ВТМ, выделенных из трех различ- ных хозяев, оказалось очень сходным. Эти данные наряду с тем, что резуль- таты анализа интактного ВТМ, проведенного в разных лабораториях, в об- щем одинаковы, позволяют предположить, что металлы являются обычным компонентом ВТМ и РНК ВТМ. Вопрос о том, необходимы ли металлы, свя-
Структурные. компоненты 83 заиные с РНК ВТМ, для инфекционности, требует еще выяснения. Участки РНК, связывающие металлы, точно не определены. Прочность связи свиде- тельствует о том, что фосфатные группы в образовании связи участия не принимают. Уокер и др. [1853] считают наиболее вероятным, что металлы образуют хелатные комплексы с азотистыми основаниями. Чео и др. [360] обнаружили, что присутствие в среде никеля в очень низких концентрациях оказывало заметное стабилизирующее влияние на инфекционность препаратов РНК ВТМ. Однако они пришли к выводу, что защитное действие было обусловлено ингибированием какого-то внешнего фактора. Вполне вероятно, что этим фактором могла быть рибонуклеаза. Джонсон [892] исследовал содержание металлов в ВЖМТ, выделенном различными методами. При этом оказалось, что содержание металла в пре- паратах вируса широко варьировало в зависимости от метода выделения. Изоэлектрическое осаждение с последующим ресуспендированием в рас' творе этилепдиаминтетраацетата тетраэтил аммония позволило получать пре- параты с очень низким содержанием металлов. Воздействие, которое оказы- валось эффективным в отношении удаления ионов металлов из вирусов, при- водило к необратимому осаждению пустых белковых оболочек в вирусных препаратах, но нуклеопротеид сохранял высокую степень инфекционности. ВЖМТ, полученный таким образом, был способен связывать большое коли- чество ионов металлов неспецифически и ие очень прочно. Большая часть связанных ионов металлов могла быть удалена диализом против воды или солевых растворов. Ионы урана связывались с вирусом в количестве, доста- точном для увеличения коэффициента седиментации на 20%. Небольшие количества Mg2+ и Sr2+ оставались прочно связанными с вирусом, причем большая часть Sr2+ была связана с вирусной РНК. Поведение препаратов ВЖМТ в градиентах плотности хлористого цезия зависело от вида и коли- чества ионов металла, связанных с вирусом. Итак, представляется вероятным, что: 1) большая часть непрочно свя- занных ионов металлов, обнаруженных в очищенных препаратах вирусов, взаимодействует с кислотными группами белковой оболочки и иногда с РНК; 2) эти металлы не являются необходимой или фиксированной частью струк- туры вируса и 3) «ассортимент» обнаруживаемых металлов в значительной степени зависит от происхождения вирусного препарата. Значение прочно связанных ионов металлов, подобных тем, которые обнаружены в РНК ВТМ, пока не выяснено. На 6500 нуклеотидов приходится примерно 50 атомов раз- личных металлов, и определить роль этих атомов — дело весьма трудное. Если эти металлы действительно связаны с азотистыми основаниями, трудно представить себе, какой механизм мог бы обеспечить их специфическое рас- положение вдоль цепи. Возможно, прочно связанные металлы влияют на матричную или информационную функцию вирусной РНК. Наличие прочной связи металлов с изолированной РНК не обязательно означает, что они также прочно связаны и в интактном вирусе. Не исклю- чено, что в процессе освобождения РНК из интактного вируса некоторые иопы металлов, ранее связанные с белком, связываются с РНК. Весьма важным является выяснение вопроса о том, распределены ли прочно связан- ные ионы металлов более или менее равномерно среди всех молекул РНК в препарате или же содержание металлов в некоторых молекулах РНК значительно выше среднего, тогда как в других они вовсе отсутствуют. В таком сферическом вирусе, как ВЖМТ, небольшое число ионов ме- таллов могло бы играть важную роль в стабилизации трехмерной вторичной структуры РНК в интактном вирусе. С другой стороны, маловероятно, что ионы металла играют такую роль в вирусе, подобном ВТМ, где РНК стаби- лизуется в форме одноцепочечной спирали благодаря белковым субъеди- ницам. G*
84 Глава IV Изучение связывания Са2+, К+ и С1~ с деполимеризованным и полимери- зованным белком ВТМ при различных значениях pH показало, что эти ионы не играют никакой существенной роли в полимеризации белка ВТМ 115431. Вода Важное значение, которое имеет вода в живых клетках, хорошо известно, однако иногда забывают, что вирусы в растворе содержат значительное количество связанной воды, причем содержание ее в мелких вирусах равно примерно массе нуклеопротеидного материала частицы. Изучать гидратацию вирусов можно в кристаллах и в растворе. Бернал и др. [179] па основании изучения дифракции рентгеновских лучей и непосредственных измерений под микроскопом кристаллов вируса кустистой карликовости томатов, изменяющихся при высушивании, при- шли к выводу, что эти кристаллы содержат около 47% воды. Аналогичные исследования с ВЖМТ [175] позволили предположить, что содержание воды в кристаллах этого вируса составляет около 58%. На основании дальнейших исследований было высказано предположение, что степень гидратации этих вирусов в кристаллах может быть еще более высокой [1047]. Бернал и Фанкухен [177, 178] изучали структуру влажных и высушенных гелей, образуемых очищенными препаратами ВТМ. Они обнаружили, что при всех степенях гидратации вирусные палочки ориентируются параллельно друг другу, причем в плоскости, перпендикулярной длинным осям параллельных палочек, наблюдается гексагональная симметрия. С другой стороны, они были расположены нерегулярно в направлении длинной оси. Расстояние между параллельными палочками варьировало в зависимости от содержа- ния воды в геле. Удовлетворительных сведений о степени гидратации не уда- лось получить, так как расстояние между частицами непрерывно менялось от 15,2 нм в высушенном геле до очень значительной величины, при которой палочки начинали дезориентироваться. Далее было показано, что содержание воды в гелях ВТМ и кристаллах других вирусов зависит от pH и концен- трации солей в растворах, где эти кристаллы образуются. Измерение различных гидродинамических свойств вируса в растворе позволяет определить степень гидратации. Точность определения степени гидратации варьирует в зависимости от метода измерения. Эту проблему рассматривали Лауфер и Бендет [1047]. Они приводят следующие величины гидратации некоторых вирусов растений в растворе (число граммов воды на 1 г вируса), определенные различными методами: ВТМ — 0,27; вирус кустистой карликовости томатов — 0,14—0,78; вирус южной мозаики фасоли - 0,4-1,2; ВЖМТ - 0,68-0,71.
ГЛАВА V СТРОЕНИЕ ВИРУСОВ Три основных направления исследований привели нас к существующим в настоящее время представлениям о строении вирусов: 1) физический и химический анализ вирусных компонентов, о чем мы говорили в предыду- щем разделе; подобного рода сведения важны для понимания структуры интактного вируса; 2) электронная микроскопия, обеспечивающая возмож- ность получения непосредственных данных о размере и форме вирусных частиц, а также некоторой информации об их поверхности и внутренней структуре; 3) методы рентгеиоструктурного анализа, позволяющие получить однозначные сведения о трехмерной структуре при исследовании соответст- вующих вирусов. Рассматривая этот вопрос в историческом аспекте, можно отметить, что с помощью других методов также удалось получить некоторые сведения о структуре вирусов. Исследование анизотропии в потоке, обнаруживаемой в растворах ВТМ, позволило предположить, что частицы этого вируса имеют палочкообразную форму. Существование частиц двух типов в препаратах ВЖМТ — частиц интактного вируса, содержащих около 35% РНК, и бел- ковых частиц, не содержащих РНК, по очень сходных с первыми по разме- рам и имеющих идентичные поверхностные свойства, что было установлено на основании результатов электрофоретических и серологических исследо- ваний,— позволило Маркхэму [1147] предположить, что вирусная РНК должна содержаться внутри белковой оболочки. Эта точка зрения в даль- нейшем была подтверждена рядом исследований. Тем не менее наиболее детальную информацию о структуре вирусов нам удалось получить, исполь- зуя сочетание методов рентгеноструктурного анализа и электронной микро- скопии. Термин «капсид» был предложен для обозначения оболочки сферических или палочкообразных вирусов, а термин «капсомер»— для обозначения групп субъединиц, выявляемых на электронных микрофотографиях. Зрелый вирус называется вирионом [334]. Эти названия, вероятно, не являются терминологически необходимыми. Мы будем применять термин «белковая субъединица», или «структурная субъединица», для обозначения ковалентно связанной пептидной цепи. В принципе структурная субъединица, выявляе- мая кристаллографически, может содержать две или более идентичные (или неидентичные) полипептидные цепи. Однако в вирусах растений такие структуры обнаружены не были. Термином «морфологическая субъединица» мы будем обозначать группы белковых субъединиц, обнаруживаемые мето- дами электронной микроскопии и рентгеиоструктурного анализа. Термин «белковая оболочка» соответствует защитному белковому слою вирусной частицы. В течение последних 12 лет теоретические и экспериментальные иссле- дования структуры вирусов развивались параллельно. Так, Крик и Уот- сон [417] выдвинули гипотезу относительно структуры мелких вирусов, кото- рая была затем полностью подтверждена. Используя имевшиеся в то время знания о ВЖМТ и ВТМ, а именно что вирусная РНК заключена внутри белковой оболочки и что (данные только в отношении ВТМ в тот период)
86 Глава V обнаженная РНК инфекционна, они предположили, что у мелких вирусов основное назначение белковой оболочки состоит в защите их рибонуклеи- новой кислоты. Они полагали, что наиболее эффективный путь образования белковой оболочки, имеющей относительно крупные размеры, состоит в синтезе в клетке под контролем вируса большого числа небольших иден- тичных белковых субъединиц, а не одной или нескольких очень крупных молекул. Крик и Уотсон отметили, что если один и тот же тип взаимодействия между субъединицами повторяется многократно при построении вирусной частицы, то белковые молекулы должны быть правильно упакованы вокруг молекулы РНК. Существует ограниченное число способов упаковки субъ- единиц в вирусном капсиде. Большинство вирусов имеет либо палочко- образную, либо сферическую форму. Число белковых субъединиц, распола- гающихся в виде спирали в частицах палочкообразных вирусов, теорети- чески неограниченно. Исходя из кристаллографических соображений, Крик и Уотсон пришли к выводу, что белковая оболочка мелкого «сферического» вируса, вероятно, построена из идентичных белковых субъединиц, расположение которых ха- рактеризуется кубической симметрией; в этом случае число субъединиц должно быть кратным двенадцати. В дальнейших исследованиях Каспар и Клуг [332, 333] развили эти принципы, касающиеся строения мелких вирусов (особенно сферических). В ранних электронно-микроскопических исследованиях для контрасти- рования вирусных частиц использовали метод оттенения тяжелыми метал- лами. Такое оттенение затрудняло исследование деталей поверхности, но позволяло получить информацию об общем размере и форме сухой частицы. В тех случаях, когда техника оттенения при исследовании сферических вирусов применялась с достаточно высоким экспериментальным мастерством и проводилось сравнение форм теней, наблюдаемых на электронных микро- фотографиях, с тенями, образуемыми моделями, иногда удавалось сделать заключение о симметрии наружной поверхности вирусной оболочки. Напри- мер, Харрисон и Никсон [727] пришли к выводу о том, что некоторые вирусы, распространяющиеся через почву, имеют форму икосаэдра, но не представ- ляют собой ромбододекаэдр. Вильямс и Смит [1910] применили метод двой- ного оттенения под двумя разными углами для получения более точных данных о симметрии частиц крупного вируса насекомых (радужный вирус долгоножки). Однако в случае мелких вирусов растений нанесение двой- ного слоя металла затемняло детали и результаты оказывались неудовле- творительными [727]. При изучении более крупного вируса раневых опухо- лей двойное оттенение оказалось полезным и было установлено, что частицы этого вируса, представляющие собой многогранники, имеют форму икоса- эдра [199]. Для изучения тонкой структуры вирусных частиц был также разработан метод негативного и позитивного контрастирования, который оказался зна- чительно более ценным, чем метод оттенения металлами. При позитивном контрастировании вещество с высокой электронной плотностью, например различные соединения осмия, свинца и уранила, а также фосфовольфрамо- вая кислота (ФВК) при соответствующих условиях, химически реагирует с вирусом и связывается с ним. Химическое взаимодействие может приводить к изменению или дезинтеграции структуры вирусов. Напротив, в методе негативного контрастирования электронноплотное вещество не реагирует с вирусом, но проникает в доступные микропространства на поверхности или внутри вирусной частицы. В настоящее время при исследовании структу- ры вирусов с помощью электронной микроскопии предпочитают применять именно этот метод. При негативном контрастировании обычно используют
Строение вирусов 87 ФВК при pH 7,0, уранилацетат или уранилформиат при pH около 5,0. Структура вируса при этом визуализируется иа фойе окружающего электроп- поилотного вещества. Углеродные пленки, используемые в качестве под- ложки для контрастируемых образцов, дают гранулярный фон. Часто детали структуры удается различить наиболее четко на изображениях частиц в участ- ках, где контрастирующее вещество оказывается нанесенным над отверстия- ми в углеродной пленке-подложке. Контрастирующее вещество может проникать или но проникать в пустые пространства внутри вирусной частицы. При использовании этого метода для изучения палочкообразных частиц, обладающих спиральной симметрией, часто выявляется центральный полый капал. При электронно-микроскопическом исследовании мелких сфериче- ских вирусов, которые часто ассоциируются с пустыми белковыми оболоч- ками, иногда обнаруживаются частицы с электропноплотпой внутренней полостью; ио мнению некоторых исследователей, эти частицы представляют собой пустые оболочки, содержащиеся в препарате. Однако оказалось, что в определенных условиях контрастирования РНК той или иной части интакт- ных вирусных частиц может теряться, давая возможность контрастирующему веществу проникать внутрь вируса. Подобного рода вещества различаются по их способности разрушать или изменять структуру вируса. Действие ФВК, вероятно, является наиболее разрушающим. Например, частицы вируса мозаики люцерны, не будучи предварительно фиксированы формальдегидом, разрушаются ФВК [619]. Однако структура этого вируса сохраняется при •обработке уранилацетатом (Р. Д. Вудс, личное сообщение). Следует все же отметить, что даже на лучших электронных микрофотографиях тонкие детали вирусной структуры несколько затемнены. Это обусловлено прежде всего незначительными неправильностями в структуре вируса, а также такими факторами, как неравномерности контрастирования. Кроме того, изучение деталей структуры затрудняется тем, что при использовании кон- трастирующих веществ степень контраста иа обеих сторонах частицы часто оказывается различной [1007]. Для преодоления этих трудностей и получе- ния наиболее достоверной и детальной информации о структуре отдель- ных вирусных частиц при изучении их в электронном микроскопе с помощью негативного контрастирования было использовано несколько методов. Маркхэм с сотрудниками разработали фотографический метод, позволяю- щий более четко выявлять детали изображения в тех случаях, когда объект состоит из периодически повторяющихся структур. Если объект обладает вращательной симметрией, электронную микрофотографию частицы, ориен- тированной соответствующим образом, поворачивают на определенный угол и многократно фотографируют, причем следующие друг за другом снимки накладываются на один и тот же негатив. Если выбран правильный для данной симметрии угол и правильный центр вращения, детали изображения при этом резко усиливаются [1159]. Маркхэм и др. [1160] применили этот принцип к таким линейным объектам, как ВТМ. Они разработали прибор, при помощи которого изображение определенной части вирусной частицы перемещается последовательно на соответствующее расстояние и ряд фото- графий накладывается друг на друга. Расстояние, на которое следует пере- местить изображение, определяется методом нроб и ошибок. Для выявления закономерностей структуры Клуг и Бергер [1007] использовали дифракционные картины, получаемые путем увеличения элек- тронных микрофотографий отдельных частиц. Позднее для той же цели был разработан метод, по которому результаты наложения друг на друга воз- можных моделей, полученных при помощи ЭВМ и сфотографированных с де- монстрационного экрана, сравнивали с истинными электронными микрофо-
88 Глава V Фиг. 12. Схема, иллюстрирующая разнообразие размеров и формы вирусов растений. а — вирус-сателлит; б — вирус желтой мозаики тур- непса; в —вирус раневых опухолей; г — вирус бронзо- вое™ томатов; В — вирус желтухи сахарной свеклы; е — пять частиц вируса мозаики люцерны; ж — две ча - стицы вируса погремковости табака (штамм ORB); а — вирус табачной мозаики; и — Л'-впрус картофеля; к — вирус некротического пожелтения салата-латука. тографиями сферических частиц, наблюдавшихся в различных направле- ниях [520]. Некоторые стороны структуры вирусов, особенно более крупных, можно изучить, используя для этого ультратонкие срезы. Этот метод применяется как для изучения вирусов в клетках, так и при изучении вирусов, находя- щихся в осадке. На современном уровне знаний можно разделить вирусы растений на пять больших групп на основании различий в структуре их частиц. Наиболее многочисленными и лучше всего исследованными являются палочкообраз- ные частицы и частицы, характеризующиеся икосаэдрической симметрией. Мы выделили вирус мозаики люцерны в самостоятельную группу, так как он представляет собой многокомпонентный вирус, включающий как ико- саэдрические, так и палочкообразные частицы. Хотя вирусы раневых опухо- лей и карликовости риса, вероятно, имеют белковые оболочки, обладающие икосаэдрической симметрией, они в настоящее время являются единствен- ными представителями вирусов растений, содержащими двухцепочечную РНК, и поэтому рассматриваются как самостоятельная группа. Наконец, имеется группа крупных вирусов с внешними оболочками, мембранами, окружающими центральный внутренний компонент. Ни один из таких виру- сов точно не охарактеризован с химической точки зрения. Почти все наши сведения об этой группе получены с помощью электронной микроскопии. Вопрос об использовании морфологии частиц в классификации вирусов рассматривается в гл. XX. Схематические изображения вирусов на фиг. 12 приведены для того, чтобы показать, насколько разнообразны формы и размеры, характерные для вирусов растений. Препараты многих вирусов содержат различные неполные или дефект- ные вирусоподобные частицы. Их структуру мы рассмотрим в гл. VIII.
Строение вирусов 89- Основы структуры нескольких многокомпонентных вирусов обсуждаются в этой главе, тогда как некоторые другие ее аспекты — в гл. VIII. Как мы знаем, нуклеиновая кислота почти всех вирусов, встречающихся в природе, защищена белковой оболочкой. Однако известны мутанты, полученные в ла- бораторных условиях, которые имеют дефектную оболочку (гл. XIII), а так- же два вируса, вызывающие веретеповидность клубней картофеля и заболе- вание коры цитрусовых, обладающие многими свойствами, характерными для обнаженной двухцепочечпой молекулы РНК [456, 457, 1540, 1601]. ПАЛОЧКООБРАЗНЫЕ ВИРУСЫ Электронная микроскопия оказалась весьма полезной для определения длины и ширины частиц палочкообразных вирусов, в особенности чрезвы- чайно длинных гибких частиц, которые было бы очень трудно измерить каким-либо иным путем. Тем не менее при оценке результатов таких измере- ний следует иметь в виду различного рода трудности и неясности, могущие возникнуть в ходе их проведения: 1) необходимость точной калибровки уве- личения микроскопа; 2) артефакты, вызванные процессом: приготовления препарата, особенно при измерении ширины частиц в случае образцов, оттененных металлами; 3) тот факт, что препараты почти всех палочкообраз- ных вирусов содержат частицы одного или более классов, которые короче частицы, обладающей инфекционностью. Инфекционные частицы сами по себе могут агрегировать конец в конец. Таким образом, палочкообразные вирусы широко варьируют по длине (примеры такого рода приведены в гл. VIII); 4) даже если разделение по классам провести самым тщательным образом, длины частиц, принадлежащих к каждому классу, будут характе- ризоваться некоторым распределением около среднего. Обычно модальная (наиболее часто встречающаяся) длина, соответствующая основному пику, содержащему инфекционные частицы, принимается за нормальную длину данного вируса. Часто оказывается невозможным выяснить, являются ли наблюдаемые отклонения результатом ошибки измерений или они отражают истинные колебания длины частиц; 5) высушивание па пленках-подложках может приводить к некоторому сокращению длины палочек. Введение методов с использованием ФВК и сходных контрастирующих веществ дало возможность получить сведения о топкой структуре палочко- образных вирусов, однако во многих случаях некоторые мелкие детали обна- ружить не удается. Использование уранилформиата позволило выявить закономерности субструктуры одного из наиболее широких палочкообразных вирусов (вирус погремковости табака) [1283], а также некоторых других вирусов со спиральной симметрией [1838]. В настоящее время выделены и в большей или меньшей степени охарак- теризованы многие палочкообразные вирусы. Все они характеризуются довольно высоким отношением белка к нуклеиновой кислоте, что соответст- вует их структурным особенностям. Белковые субъединицы наиболее хорошо исследованного представителя этой группы — ВТМ — расположены в виде спирали. Все другие палочкообразные вирусы почти наверняка имеют ту же структуру. Существует два типа палочкообразных вирусов. Одни из них, подобно ВТМ и вирусу погремковости табака, представляют собой жесткие палочки длиной порядка 300 нм или менее. Другую, значительно более многочисленную группу образуют длинные и достаточно гибкие палочки. У представителей первой группы шаг основной спирали составляет 2,3—2,5 нм, в то время как у более длинных палочек он равен 3,3—3,7 нм [1838].
1)0 Глава V Жесткие палочкообразные частицы ГШ ВТМ, вероятно, является наиболее хорошо изученным и наиболее по- нятным в структурном отношении нуклеопротеидом во всей биологии. Для этого вируса характерна чрезвычайно стабильная структура. Имеются дан- ные о том, что он сохраняет инфекционность в нестерильных экстрактах при комнатной температуре в течение 50 лет [1584]. Стабильность обнаженной РНК ВТМ не больше стабильности любой другой одноцепочечной РНК. Сле- довательно, стабильность этого вируса является следствием взаимодействий между соседними белковыми субъединицами, а также между белком и РНК. Длина палочки ВТМ была определена на основании электронных микро- фотографий. Вильямс и Стир [1911] нашли, что длина ВТМ равна 298 ± ± 1 нм, в то время как по данным Холла [693] наиболее частой является величина 295—305 нм. Обычно длина палочки ВТМ принимается равной 300 ± 5 нм. Большинство исследователей, измерявших распределение длин палочек ВТМ по электронным микрофотографиям, находит, что величина стандартного отклонения составляет примерно ±2%. Хотя некоторые из этих колебаний, несомненно, обусловлены ошибкой измерений, Маркхэм и др. [1160] подчеркивали, что истинная длина палочек может быть не сов- сем однородной вследствие того, что к концам этих палочек сверх того коли- чества, которое требуется для защиты РНК, присоединяется не содержа- щий нуклеиновой кислоты белок, количество которого варьирует. Приведем основные величины, характеризующие структуру ВТМ [331]: Экспериментально определенные величины^ Молекулярная масса белковой субъединицы 17 530 Число субъединиц на единицу длины (на 0,1 нм) 0,710±0,5% Число нуклеотидов на единицу длины (иа 0,1 нм) 2,13±0,5% Средняя молекулярная масса нуклеотида РЫК 322±0,2% Длина сформированной частицы ВТМ 300 пм±1,7% Производные величины, Число субъединиц в частице ВТМ 2130±2% Число нуклеотидов в частице ВТМ 634(1±2% Молекулярная масса вирусной РНК 2,05-100±2% Молекулярная масса частицы ВТМ 39,4-10|)±2% После частичного'удалепия белка при помощи одного из известных мето- дов (например, обработки детергентом при повышенной температуре или щелочной обработки) можно визуализировать посредством электронной мик- роскопии нить РНК, выходящую из интактных участков палочки ВТМ [735, 1508]. Корбетт [405] обнаружил, что фенол удаляет белок оболочки ВТМ, начиная не с каких-то определенных мест, а случайно, в разных точках вирусной частицы. При рассмотрении электронных микрофотографий, полученных с пре- паратов, оттененных металлом (фото 6), создается впечатление, что вирус- ная РНК расположена в центре палочки. В действительности в центре палочки имеется полый канал, а РНК погружена в белковую оболочку. Нали- чие этого центрального полого канала впервые было продемонстрировано Хаксли [851], использовавшим при негативном контрастировании фосфо- вольфрамовую кислоту (фото 7). Полый канал выявляется в электронном микроскопе как плотная линия, заполненная контрастирующим веществом, в центре палочек. Кроме того,
Строение вирусов 91 <1>иг. 13. Радиальпоо распределение элект- ронной плотности, полученное в резуль- тате рентгеиоструктурного анализа ВТМ {сплошная линия) и палочкообразных агрегатов белка ВТМ (пунктирная линия [330, 352]. При сравнении этих двух кривых распределения электронной плотности становится очевидным, что фосфатные группы РНК расположены па рас- стоянии около 4 нм от центра палочки. короткие фрагменты частиц часто могут быть ориентированы торцом вверх таким образом, что центральная полость оказывается отчетливо видимой. Многие исследователи изучали субструктуру ВТМ при помощи элек- тронной микроскопии с высоким разрешением. Наблюдавшаяся при этом периодичность,?не*согласу1ощаяся с данными рентгеиоструктурного анализа, объясняется образованием групп субъединиц в процессе высушивания пре- паратов при подготовке их для исследования в электронном микроскопе (см., например, [690]). Путем расчета распределения электронной плотности вдоль радиуса частицы,{проведенного на основании рентгенографических данных, удалось более’точио определить диаметр центральной полости и установить радиаль- ное расположение РНК. Авторы провели сравнительное исследование ради- ального распределения электронной плотности интактного ВТМ и белковых палочек, образующихся при агрегации субъединиц in vitro [330,552,553]. Эти исследования (фиг. 13) ясно показали, что РНК, или, точнее, фосфатные группы РНК, располагаются па расстоянии примерно 4 нм от центральной •оси. Радиус центральной полости составляет примерно 2 пм. Ранние рент- генограммы ВТМ показали, что отдельные палочки построены из правильно расположенных субъединиц [177, 178]. Более поздние рентгенографические исследования дали нам детальную картину расположения белковых субъ- единиц и РНК в вирусной палочке. Рисунок на цветной вклейке 1 иллюстри- рует ориентированный золь ВТМ, используемый для рентгеиоструктурного анализа [678]. Субъединицы плотно упакованы в виде спирали. Шаг спирали, по данным[рентгеиоструктурного анализа, равен 2,3 нм. Цепь РНК образует компактную спираль, соответствующую спирали белковых субъединиц (фото 8). На каждую белковую субъединицу в спирали приходится три нуклеотида РНК, а на каждый виток — 49 нуклеотидов и 16Ц3 белковые субъединицы. Вирус погремковости табака Частицы вируса погремковости табака представляют собой жесткие цилиндрические палочки, общий план строения которых сходен с планом строения ВТМ. Существует много различных штаммов этого вируса. Для
92 Глава V образования интактных частиц вируса погремковости табака в зараженной клетке необходимо взаимодействие частиц двух типов — длинных и коротких (см. гл. VIII). Здесь мы рассмотрим структуру длинных частиц, так как ко- роткие частицы построены по той же схеме с участием тех же белковых субъ- единиц. Большая часть информации о структуре этого вируса была полу- чена с применением электронной микроскопии при использовании уранил формиата для повышения разрешения [1283]. Некоторые сведения были полу- чены при изучении оптической дифракции. У штаммов, изученных Оффор- дом, длина частиц, обладавших инфекционностью, составляла примерно’ 191 им. Диаметр частиц был равен 25,6 ± 0,3 нм, а шаг спирали (по-види- мому, левовращающей, как и в случае ВТМ) составлял 2,55 -I- 0,0.3 нм. Радиус центральной полости был равен около 2,7 им. На расстоянии при- мерно 8,2 им от оси частицы наблюдалось кольцевидное образование, кото- рое может представлять собой нить РНК. 1Та каждые три витка спирали в частице вируса погремковости табака приходится 76 субъединиц, тогда как для частицы ВТМ соответствующее число равно 49. Оба эти числа можно выразить общей формулой 3q 1, где q — 42 для ВТМ и 52 для вируса по- гремковости табака. Остается определить, является ли это совпадением или же эта формула отражает какое-то общее свойство, присущее вирусам со спиральной симметрией. На фото 9 суммированы некоторые особенности структуры вируса погремковости табака и для сравнения в том же масштабе изображен ВТМ. Молекулярная масса белковых субъединиц, характерных для частиц вируса погремковости табака, составляет « 24 000 дальтон. Спираль, обра- зуемая белковой оболочкой в частицах изученного штамма этого вируса, состоит из 72 витков, следовательно, молекулярная масса этой белковой оболочки равна 44-10°. На одну белковую субъединицу приходится, вероят- но, 4 нуклеотида, т. е. всего частица содержит 7100 нуклеотидов со сред- ней молекулярной массой около 322. Таким образом, молекулярная масса РНК этого вируса составляет 2-10°, а длинной частицы — около 46 -10'1. Харрисон и Клуг [724], используя данные по измерению длины и гидродина- мические данные, пришли к выводу, что молекулярная масса этого вируса составляет 48-10° — 50-10°. Харрисон и Вудс [731] отмечали, что на многих из их электронных мик- рофотографий различных изолятов вируса погремковости табака концы частиц имели разную форму. Один конец был слегка выпуклым, в то время как на другом конце центральный канал был несколько расширен. Они пред- положили, что такой вид концов палочек мог быть обусловлен формой бел- ковых субъединиц (напоминающей форму банана), длинные оси которых не располагались точно перпендикулярно по отношению к оси частицы. Вирус штриховатой мозаики ячменя О структуре вируса штриховатой мозаики ячменя известно не так много, как о двух палочкообразных вирусах, описанных выше. Этот вирус интере- сен тем, что обычно имеются палочки трех размеров — 111, 128 и 148 нм, причем преобладают частицы длиной 128 нм, диаметр которых составляет около 20 нм. Эти частицы слишком близки по размерам, для того чтобы их можно было разделить в градиенте плотности сахарозы, так что еще не уста- новлено, являются ли все три типа палочек инфекционными и требуется ли для репродукции вируса присутствие более одного вида частиц. Харрисон и др. [734] указывают на трудность определения в таких условиях длины вирусных частиц, которая считалась бы нормальной. При использовании метода негативного контрастирования в частицах обнаруживается цен- тральный канал и поперечная исчерченность с интервалами между поло сами
Строение вирусов 93 около 2,5 нм. Эта испорченность может представлять собой последователь- ные витки спирально расположенных субъединиц [734]. Некоторые частицы обладают рыхлой структурой, что может быть результатом раскручивания спирали, т. е. ранним этапом дезинтеграции частицы. Применение рентгено- структурного анализа показало наличие субъединиц, расположенных в виде спирали, шаг которой составляет 2,6 им [516]. Гибкие палочкообразные частицы Брандес и Беркс [270] перечисляют 4 группы нитевидных вирусов, имеющих более или менее гибкие палочкообразные частицы. Мы кратко рассмотрим по одному представителю каждой из этих групп. Х-вирус картофеля Частицы этого вируса имеют форму относительно гибких палочек длиной около 515 нм и шириной 11,5 ± 0,3 нм [1838] (фото 10, А, В). Используя в качестве контрастирующего вещества при электронно-микроскопическом исследовании уранилформиат, Варма и др. с помощью метода оптической дифракции смогли установить, что шаг основной спирали таких палочек составляет в среднем 3,4 ± 0,1 нм. На некоторых электронных микрофото- графиях они наблюдали дисковидные частицы почти такого же диаметра, что и интактный вирус. В этих частицах был виден центральный канал, диа- метр которого варьировал, окруженный 10 радиально расположенными субъединицами. Существование 10 субъединиц в этих дисках было определе- но наложением фотографий 5 дисков и методом Маркхэма и др. [1159] (см. стр. 87). Y-вирус картофеля Этот вирус имеет гибкие частицы длиной около 730 им. Ширина палочки составляет 10,5 ± 0,3 им [1838], а шах1 основной спирали равен в среднем 3,3 им (фото 10,Б). S-вирус картофеля Этот вирус представляет собой относительно гибкую палочку диамет- ром около 15 нм и длиной 650 нм. Для представителей этой группы, иссле- дованных Варма и др. [1838], характерен шаг основной спирали, состав- ляющий в среднем около 3,4 нм (фото 10, В). Вирус желтухи свеклы Частицы этого вируса имеют вид очень длинных гибких палочек (1250 нм), диаметр которых составляет 13,3 ± 0,2 нм. У них имеется полый централь- ный канал диаметром около 3,5 им. По длине палочки наблюдалась также поперечная исчерченность поверхности с периодом 2,6—3,0 нм [831]. Варма и др. [1838] установили, что шаг спирали составляет в среднем 3,4 нм и па один виток спирали приходится 12—14 белковых субъединиц (фото 10, Г). Однородность строения палочек по длине На основании данных реитгеноструктурного анализа, все белковые субъединицы в таких частицах, как ВТМ, находятся в одинаковом окруже- нии (с точки зрения своих соседей), за исключением тех, которые располо- жены иа концах палочки. Однако некоторые наблюдения наводят на мысль,
94 Глава V Фиг. 14. Распределение частиц ВТМ по дли- не после отщепления белковых субъединиц путем обработки детергентом в контролируе- мых условиях [1725]. А. Частицы не обрабатывались детергентом. Б. Про- изводилась 15-мунутнал обработка; распределение длин коротких палочек оказалось бимодальным. По оси ординат отложено число частиц данного размера по сравнению с общим числом частиц. что в интактных частицах ВТМ по длине палочки существуют зоны различ- ной устойчивости. Так, концы палочки различаются по их устойчивости в отношении отщепления белковых субъединиц от РНК детергентом или щелочью. Мэй и Найт [1192] показали, что субъединицы предпочтительно удаляются с того конца палочки, где находится З'-конец вирусной РНК. Саймингтон и Коммонер [1725], используя в качестве исходного материала препарат, состоящий из палочек одинаковой длины, определили условия контролируемого отщепления белковых субъединиц детергентом (начиная с того конца палочки, который содержит З'-конец РНК). Распределение длин коротких палочек, образующихся после отщепления, оказалось бимодаль- ным с максимумами в области 80—90 и 180—190 нм. Это свидетельствовало о том, что в частице могут быть участки с повышенной устойчивостью к дей- ствию детергента (фиг. 14). Саймингтон [1724] в дальнейшем подтвердила данные о том, что стабильность белковой оболочки по отношению к дей- ствию детергента варьирует по длине палочки. Оказалось, что существуют 3 относительно устойчивые зоны: 1) вблизи З'-конца РНК, 2) в области между 225 и 150 нм и 3) в пределах 100 нм. Структурные основы этих различий пока непонятны. В недавно проведенном исследовании влияния различных препаратив- ных методов на распределение частиц ВТМ по длине в свежевыжатом соке [547] было найдено два чаще всего встречающихся значения длин коротких палочек (фиг. 36). Их размеры очень хорошо согласуются с теми, которые обнаруживаются после 15-минутной обработки интактного вируса детерген- том (фиг. 14). ИКОСАЭДРИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ Крик и Уотсон [417] указали, что изометрическая вирусная частица должна обладать кубической симметрией. Имеется три типа кубической симметрии: тетраэдрическая (2 : 3), октаэдрическая (4:3:2) и икосаэдри- ческая (5:3:2). Таким образом, икосаэдр характеризуется вращательной симметрией 5-го, 3-го и 2-го порядка. Для вирусной частицы три указанных типа симметрии в кубической системе предполагают наличие 12, 24 или 60 идентичных субъединиц, симметрично расположенных на поверхности сферы. Субъединицы могут иметь любую форму. В течение некоторого времени су-
Строение вирусов 95 щсствовала парадоксальная ситуация, например, с ВЖМТ. В соответствии с данными рентгеиоструктурного анализа считалось, что по крайней мере большая часть такой структуры (ВЖМТ) характеризуется икосаэдрической симметрией, т. е. его капсид построен из 60 субъединиц (или это число крат- но 60). На основании химического анализа было установлено, что число субъединиц в составе частицы ВЖМТ гораздо больше 60. Вместе с тем элек- тронно-микроскопические наблюдения выявили 32 морфологические субъ- единицы [852, 1279]. Каспар и Клуг [332] с помощью выдвинутой ими теории квазиэквива- лентности иашли решение этой дилеммы и заложили основы более глубокого понимания того, каким образом построена оболочка мелких изометрических вирусов. Если говорить в общих чертах, химические субъединицы в оболоч- ке не располагаются строго эквивалентно (в математическом смысле слова), а лишь квазиэквивалентно. Каспар и Клуг высказали предположение о том, что основу структуры оболочки составляют однотипные связи, по в зависи- мости от локальных условий эти связи могут несколько деформироваться. Они подсчитали, что необходимая степень деформации является физически приемлемой, и, приняв разумные допущения, касающиеся степени квази- эквивалентности, пришли к выводу о том, что изометрические белковые оболочки, построенные из большого числа идентичных субъединиц, могут иметь только икосаэдрическую симметрию. Икосаэдр — это правильный многогранник с 12 вершинами, 20 гра- нями и 30 ребрами. Многогранник, все грани которого — равносторонние треугольники, называют дельтоэдром. Каспар и Клуг [332] перечислили возможные классы дельтоэдров, характеризующихся икосаэдрической сим- метрией (икосадельтоэдры). Икосаэдр имеет 20 граней, представляющих собой равносторонние треугольники, а любой икосадельтоэдр — 20 Т гра- ней, где Т — триангуляционное число, равное Р/а (Р — любое число из ряда 1, 3, 7, 13, 19, 21, 31, 37, . . ., а / — любое целое число). Каждую структурную субъединицу оболочки можно представить как третью часть треугольной грани, так что в оболочке будет 20-3-.Т — 60 Т квазиэквивалеитных субъединиц. На фото 11 приведены модели простейших икосадельтоэдров, относящихся к двум классам (Р — 1 и Р = 3). Структурные субъединицы часто (но не всегда) объединяются в группы из 5 или 6 субъединиц — пентамеры и гексамеры. Такое объединение делает возможным установление максимального контакта между структурными субъединицами па поверхности белковой оболочки. Могут быть образованы также группы из двух или трех субъединиц (димеры или тримеры). Объеди- нение структурных субъединиц в группе приводит к возникновению более крупных морфологических субъединиц, обнаруживаемых в электронном микроскопе. Иллюстрацией этому могут служить модели, изображенные на фото 15. Икосаэдрические вирусы растений, у которых структура поверхности в настоящее время установлена, распадаются па два класса, соответствую- щих значениям Р = 1 и Р = 3. Исходя из принципа группировки в пентамеры и гексамеры, Каспар и Клуг нашли, что число морфологических субъединиц можно описать фор- мулой М = 10 7’ + 2 — 10 (Г — 1) гексамеров 12 пентамеров. В любой оболочке будет 12 и только 12 пентамеров. Для двух классов икосаэдриче- ских вирусов, известных в настоящее время, о которых мы говорили выше, возможные числа морфологических и структурных субъединиц приведены в табл. 8. Расположение морфологических субъединиц у простейших вирусных частиц, относящихся к этим двум классам, представлено на фото 12. Участие этих структур в самосборке вирусов обсуждается в гл. VII.
96 Глава У Таблица 8 Число морфологических и структурных субъединиц в квазиаквивалентиых белковых оболочках, характеризующихся икосаэдрической симметрией, в случае объединения структурных субъединиц в гексамеры и нептамеры р= 1 Р = 3 1 т Ч исло морфоло- гических с у tn. еди- ниц Число структур- ных субъеди- ниц f т Число морфоло- гических субъеди- ниц Число структур- ных субъеди- ниц 1 1 12 60 — .— —— — 1 3 32 180 2 4 42 24(1 .— .—, 3 9 92 540 — — 2 12 122 72(1 4 16 162 960 — — 5 25 252 1500 —. — 3 27 272 162(1 В этом разделе мы рассмотрим несколько мелких изометрических виру- сов, структура которых наиболее хорошо изучена, или же они представляют особый интерес по другим причинам. Многие из не описываемых, здесь виру- сов такого типа были исследованы при помощи электронной микроскопии, например вирус желтой карликовости ячменя [1483], вирус риса (tuiigro) 1(500 , 601]. ВЖМТ Используя метод негативного контрастирования, Хаксли и Зьгоби [852], а также Никсон и Гиббс [1279] показали, что белковая оболочка ВЖМТ по- строена из 32 морфологических субъединиц, занимающих в оболочке два различных в структурном отношении типа участков. Клуг и его сотрудники интенсивно использовали ВЖМТ при разработке методов рентгеноструктур- ного анализа и электронной микроскопии, пригодных для изучения мелких изометрических вирусов. В их более поздних работах [519, 1009] два обстоя- тельства позволили получить более определенные данные при исследовании частиц этого вируса методом рентгеноструктурного анализа. Во-первых, они использовали охарактеризованные в химическом отношении свежевыде- ленные препараты вирусов и, во-вторых, применяли усовершенствованный метод рентгеноструктурпого анализа, обеспечивающий более высокое раз- решение. Таким образом они пришли к выводу, что в белковой оболочке имеется 180 рассеивающих центров, расположенных на расстоянии около 14,5 нм от центра частицы. По мнению авторов, они соответствуют высту- пам структурных белковых субъединиц па поверхности частицы. Данные, полученные методом рентгеноструктурного анализа, находились в соответ- ствии с моделью, имеющей 32 рассеивающих центра, расположенных на рас- стоянии около 12,5 нм от центра частицы. Эти 32 центра идентифицировали как «пакеты» или складки РНК, что было подтверждено исследованием препаратов, где в качестве контрастирующего вещества использовали ура- нилацетат. Авторы пришли к заключению, что значительная доля РНК глубоко погружена в белковую оболочку. Характер свертывания одиночной цепи РНК внутри вирусной частицы должен быть таким, чтобы большие сегменты этой цепи были тесло связаны с 32 морфологическими субъедини- цами. По-видимому, именно наличие РНК внутри или вокруг этих участков усиливает изображение 32 морфологических субъединиц, выявляемых па электронных микрофотографиях ВЖМТ, по сравнению с тем, что мы видим в том случае, когда имеются лишь пустые оболочки ВЖМТ [519] (фото 13).
Строение вирусов 97 Фиг. 15. Схема строения ВЖМТ и суммарные данные о его структуре. Л. Схематическое изображение поверхности частицы, где можно видеть объединение структурных субъединиц из группы б и В 1519). В. Схема, показывающая основные параметры ВЖМТ, вычисленные на основании рентгеноструктурного анализа [10091. Внизу справа показаны усредненные размеры бел- ковой оболочки: внешний радиус а «= 14 нм, внутренний радиус Ь = 10,5 нм. Внизу слева — усред- ненный радиус сферы, заполненной РНК (е = 11,7 нм), вычисленный по результатам опытов с заменой солей. Вверху справа схематически изображены колебания плотности белковой оболочки: расстояние между частицами в кристалле е = 15 им; аффективный радиус рассеяния выступов, соответствующих бел- ковым субъединицам, d = 14,5 им. Это расстояние существенно не отличается от внешнего радиуса. Вверху слева — схематическое изображение колебаний плотности РНК: аффективный радиус (У) 32 высту- пов РНК равен 12,5 ям. В. Схема, построенная па основании размеров, приведенных на фиг. Б, на кото- рой показано расположение массы РНК вирусной частицы относительно белковых субъединиц, Схема представляет собой разрез вирусной частицы, проведенный через ее центр. Точная форма субъединиц и детали расположения РНК неизвестны. Распределение белка и РНК по направлению к центру частицы также неизвестно [1009]. В рамках теории квазиэквивалеитпости мы можем установить следую- щие численные соотношения, характеризующие число белковых субъеди- ниц в оболочке ВЖМТ: У (триангуляционное число) Число структурных субъединиц Класс: М (число морфологических субъеди- ниц) = 3 = 60-3=180 р _ з = 10-34-2 = 32 = = 20 гексамеров-}-12 пента- меров На фиг. 15 изображена схема строения ВЖМТ и приведены все имею- щиеся в настоящее время данные о расположении белковых субъединиц и распределении РНК внутри вирусной частицы. Разрешение на фото 13 недостаточно для четкого выявления структур- ных субъединиц. На фото 14 представлена электронная микрофотография отдельной частицы ВЖМТ, полученная методом Маркхэма (стр. 87). Точное распределение РНК и положение полиамина в частицах ВЖМТ неизвестны. Некоторые сведения, касающиеся взаимодействия оснований РНК в интактном вирусе, получены при изучении оптических свойств ВЖМТ [738]. Для интактного ВЖМТ относительное поглощение РНК по 7-0893
98 Глава V сравнению с поглощением составляющих ее мононуклеотидов (с поправкой на светорассеяние и поглощение белка) равно приблизительно 0,7. Сравнив эту величину с данными, опубликованными для синтетического полимера А 4- У, Хазелькорн [738] пришел к выводу, что по крайней мере две трети оснований вирусной РНК имеют в достаточной мере упорядоченную ориен- тацию, для того чтобы обеспечить наблюдаемую степень гипохромного эффекта полинуклеотидной спирали. Кратковременная щелочная обработка ВЖМТ при 30 °C и высокой ионной силе in situ вызывает разрывы, приводя к образованию фрагментов РНК, довольно однородных по величине, у которых s2o,w равно л; 5 S [915]. Этой величине должны соответствовать отрезки, составляющие примерло- 1/so всей молекулы РНК, что в свою очередь, вероятно, находится в соответ- ствии (каким образом, мы пока не знаем) с наличием 32 участков, где РНК связана с капсидным белком вируса, как это следует из данных рентгено- структурного анализа [914]. Бош и др. [228] показали, что после мягкой щелочной обработки этого вируса его РНК можно выделить из белковой оболочки фенолом. В соответствующих условиях фрагменты РНК из отдель- ной вирусной частицы существуют в виде компактной структуры, седимен- тирующей быстрее и более однородно, чем интактная РНК ВЖМТ. Деталь- ное изучение этих агрегатов может облегчить выяснение вопроса о располо- жении РНК в интактном вирусе. Пока еще определенно не установлено, имеет ли РНК ВЖМТ, находящаяся в интактном вирусе, форму замкнутой петли или нет. Результаты рентгеноструктурного анализа говорят в пользу существования такой структуры. Вирус крапчатости конских бобов Структура поверхности частицы вируса крапчатости конских бобов; (ВККБ) сходна со структурой ВЖМТ. Судя по электронным микрофотогра- фиям, полученным методом негативного контрастирования, оболочка ВККБ состоит из 32 морфологических субъединиц, расположенных в узлах икоса- эдрической решетки с триангуляционным числом, равным 3 [520]. Подобно ВЖМТ, белковая оболочка этого вируса построена из 180 белковых субъ- единиц с молекулярной массой около 20 500 дальтон. Морфологические единицы выступают по крайней мере на 1,5 нм над поверхностью частицы; при негативном контрастировании электронноплотное вещество проникает, по-видимому, в центр вирусной частицы; это наводит на мысль о существо- вании центральной полости, которая не обнаружена.у ВЖМТ. Наличие такой полости, радиус которой составляет около 5,5 нм, было подтверждено- рентгеноструктурным анализом [523]. Финч и Клуг высказали мысль о том, что отсутствие центральной полости у ВЖМТ, возможно, обусловлено необ- ходимостью упаковки в частице большего количества РНК (37% по сравне- нию с 22% у ВККБ). Более детально морфология ВККБ была изучена пу- тем сравнения изображений вирусных частиц, полученных методом негатив- ного контрастирования, с полученными методом наложения расчетными мо- делями возможного расположения единиц в икосаэдрической поверхностной решетке с триангуляционным числом, равным 3. Основные особенности структуры ВККБ, постулированные Финчем и Клугом [520], представлены (и сравниваются с особенностями структуры ВЖМТ) на фото 15 (пробковые модели). Диаметр ВККБ примерно па 7% меньше диаметра ВЖМТ. Группы из 5 или 6 структурных субъединиц располагаются в направлении, примерно совпадающем с ближайшей осью симметрии 5-го или 6-го порядка. У ВЖМТ субъединицы расположены под некоторым углом к ближайшей оси симмет- рии 5-го или 6-го порядка. На основании сравнения распределения материи
Строение вирусов 99 в ВККБ, ВЖМТ и в пустых оболочках ВЖМТ Финч и Клуг [520] пришли к выводу, что РНК ВККБ связана, по крайней мере частично, с 32 морфоло- гическими субъединицами. Вирус огуречной мозаики Вирус огуречной мозаики (ВОМ) сходен с ВККБ по содержанию РНК в частице, но для него характерны значительно большие размеры белковых субъединиц (табл. 6). Финч и др. [522], используя методы электронно-мик- роскопического исследования, аналогичные тем, которые применялись при изучении ВККБ, показали, что эти вирусы очень сходны друг с другом как по структуре их поверхности, так и по тому, что в частице этих вирусов имеет- ся центральная полость. Белковая оболочка ВОМ состоит из 180 субъединиц, сгруппированных в 32 морфологические субъединицы (12 пентамеров и 20 гек- самеров). Диаметр частиц этого вируса при использовании для их изучения метода негативного контрастирования составлял 30 нм (диаметр ВККБ 26 нм). Таким образом, по структуре поверхности вирус огуречной мозаики можно рассматривать как увеличенный вариант ВККБ. На основании экспе- риментов по изучению гипохромного эффекта интактного вируса и изоли- рованной РНК ВОМ Кейпер и др. [92] пришли к выводу, что РНК в вирус- ной частице обладает выраженной вторичной структурой, эквивалентной степени спирализации порядка 70%. Вирус хлоротической крапчатости коровьего гороха Диаметр частиц вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха (ВХККГ) составляет ta 25 нм, а молекулярная масса структурной белковой субъединицы — 19 500 дальтон. Морфологические субъединицы окружены пятью или шестью соседями.. Четкая электронная микрофотография, полу- ченная Банкрофтом и др. [81], говорит о том, что, так же как и ВЖМТ, ВХККГ имеет 20 морфологических субъединиц, расположенных на осях симметрии третьего порядка и состоящих каждая из 6 структурных субъ- единиц, и 12 морфологических субъединиц на осях симметрии пятого поряд- ка (по 5 структурных субъединиц в каждой), что в сумме дает 180 субъеди- ниц во всей белковой оболочке. Вирус некроза табака Этот вирус содержит около 20% РНК, и его частицы имеют форму многогранника. Диаметр частиц на электронных микрофотографиях, полу- ченных методом негативного контрастирования, составляет от 26 до 30 нм, что зависит от особенностей приготовления препарата [54, 949]. Детальная структура этого вируса не выяснена, но он представляет значительный интерес, поскольку некоторые изоляты содержат связанный с этим вирусом вирус-сателлит, описанный ниже, а также в гл. VIII. Вирус-сателлит Вирус-сателлит (ВС) имеет форму многогранника и является одним из самых мелких среди известных вирусов. Исходя из данных о коэффициенте седиментации и коэффициенте диффузии, Рейхман и др. [1415] рассчитали, что молекулярная масса частицы должна составлять 1,97 -Ю0. Диаметр частицы равен примерно 18 нм. Вирус-сателлит содержит около 20% РНК, которая представляет собой единую молекулу, состоящую примерно из 1200 нуклеотидов [1413]. Молекулярная масса белковой субъединицы ВС 7*
100 Глава V составляет около 25 000 [1415], что соответствует 240 аминокислотным остат- кам. Рейхман [1413] считает, что минимальная молекулярная масса белковой субъединицы равна 13 000 (124 аминокислотных остатка). По данным: ана- лиза концевых групп, показавшего, что на обоих концах пептидной цепи находится аланин, величина молекулярной массы белковой субъединицы ПС равна примерно 40 000 [1413, 1416]. Однако следует иметь в виду, что результаты анализа концевых групп могут ввести в заблуждение. Рис и Кас- санис (личное сообщение) повторно исследовали размер химической субъ- единицы, используя исходный изолят ВС1, пассированный из единичного некроза, чтобы избежать возможного загрязнения другими вирусами-сател- литами. Было найдено, что белок ВС1 состоит из 213 аминокислот, что соот- ветствует молекулярной массе субъединицы, равной 24 000. При обработке трипсином образуется 22 пептида; это соответствует 8 остаткам лизина и 14 — аргинина, обнаруженным при аминокислотном анализе. Три из этих пептидов содержат гистидин, а четыре — тирозин, что также соответст- вует данным аминокислотного анализа. На основании исследований мето- дом гель-электрофореза Рой и др. [1452] полагают, что молекулярная масса белковой субъединицы составляет 27 000. Результаты исследования электронных микрофотографий и сравнения их с моделями позволили Хёглунду [807] заключить, что ВС, по-видимому, построен из 12 морфологических субъединиц (т. е. Т = 1, Р ~ 1, а число химических субъединиц в белковой оболочке составляет 60). Такая струк- тура подтверждается и более поздними исследованиями Клуга и Финча (личное сообщение) (фото 16). Вирусы, состоящие, возможно, из 42 структурных субъединиц Изучение электронных микрофотографий по методу Маркхэма (стр. 87) позволило предположить, что частицы вируса кольцевой пятнистости табака [351, 1387] и вируса мозаики резухи [8], возможно, представляют собой икосаэдры, для которых характерно наличие 42 структурных субъединиц (тип симметрии 532). Хотя вероятность того, что некоторые изометрические вирусы растений имеют такую структуру, существует, этот факт нуждается в подтверждении и требует более глубокого анализа. ВИРУС МОЗАИКИ ЛЮЦЕРНЫ Частицы вируса мозаики люцерны (ВМЛ) отличаются от других вирусов растений своей бацилловидной формой. Структуре этих вирусов присущи некоторые особенности, характерные как для палочкообразных, так и для изометрических вирусов. Из вирусного препарата ВМЛ было выделено 5 компонентов (t0, ta, М и В). По крайней мере четыре из них оказались необходимыми для возникновения инфекции (гл. VIII). Халл и др. [847] исследовали размеры разных частиц и сопоставили их с величинами sanw, полученными для компонентов, разделяемых в ультрацентрифуге. Эти данные наряду с размерами, найденными для фиксированных препаратов, таковы: нижний компонент (В) — 99 S, 59-18 нм; средний компонент (М) — 88 S, 53 -18 нм; верхний компонент tb — 76 S, 42 -18 нм; верхний компонент tn—68 S, (26—39)-18 нм; верхний компонент t0 — 53S, сферические частицы диаметром около 18—19 им. Гиббс и др. [619] предложили модель, удовлетворительно объяснявшую картины, наблюдаемые при негативном контрастировании частиц. Халли др. [847], пересмотрев данные о размерах частиц и содержании РНК (17,8%
Строение вирусов 101 для частиц всех классов), провели расчеты, которые показали, что исходя из модели Гиббса и др. [619] нельзя получить правильных значений молеку- лярной массы частиц. Они предложили модель, комплементарную этой мо- дели в том отношении, что расположение белка и контрастирующего веще- ства в ней является обратным. В основе предлагаемой ими модели лежит сфера (фото 17). На основании изучения оптической дифракции они пришли к выводу, что диаметр субъединиц составляет около 9,6 нм. Субъединицы такого раз- мера должны были бы образовать икосаэдр, состоящий из 12 морфологи- ческих субъединиц, диаметром около 18 нм, соответствующий по величине наименьшему компоненту. Данные о размере и молекулярной массе хорошо соответствуют предположению о том, что каждая морфологическая субъ- единица состоит из 5 пептидов. Ряд начинается с частицы, содержащей 60 химических субъединиц, число которых в принципе может последова- тельно увеличиваться на 18 (три гексамера). Существующие частицы не за- полняют все теоретически возможные положения в ряду (компонент t.o со- стоит из 60 химических субъединиц; ta — 96; tb — 114; М — 150 и В — 186 субъединиц). Вероятно, капсидный белок идентичен для всех частиц. Однако детальный сравнительный анализ с применением метода «отпечатков паль- цев» и серологических методов [1229] был осуществлен только в отношении белка верхнего и нижнего компонентов. Содержание РНК в ВМЛ высоко по сравнению с содержанием в палочко- образных вирусах, и, возможно, имеющегося количества белка едва хватает для эффективной защиты РНК. Вирусоподобные частицы сходной величины, формы и внешнего вида были выделены из больных шампиньонов [810], но в серологическом отношении они оказались не родственными ВМЛ. При изучении препаратов вируса деформации побегов дерева какао было обна- ружено, что они содержат палочки различной длины с округленными кон- цами. Ширина палочек составляла около 28 нм, а средняя длина прибли- зительно 121 нм [299]. Детали строения вируса неизвестны. ВИРУСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ДВУХЦЕПОЧЕЧНУЮ РНК Вирус раневых опухолей Билс и Холл [199] исследовали вирус раневых опухолей в электронном микроскопе, используя для этого метод оттенения металлами, а также пози- тивное и негативное контрастирование. Применяя метод двойного оттенения, они получили некоторые данные о том, что для частиц этого вируса, возмож- но, характерна икосаэдрическая симметрия. Диаметр частиц на электрон- ных микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирова- ния, составлял около 62 нм. Центральная часть частицы заметно выделялась при контрастировании уранилацетатом. Это позволяет предположить, что данная область диаметром около 35 нм, на долю которой приходится 20% объема частицы, заполнена РНК. На поверхности частицы можно было на- блюдать морфологические субъединицы диаметром около 7,5 нм. Билс и Холл пришли к выводу, что число таких морфологических субъединиц составляет, вероятно, 92. Согласно табл. 8, такая частица должна относиться к классу Р--1, 7=9, а число структурных субъединиц в ней должно быть равно 540. Вирус карликовости риса Фукуси и др. [580] изучали строение вируса карликовости риса на уль- тратонких срезах тканей растений и цикадок, а также в изолированных пре- паратах. В вирусных препаратах можно было наблюдать многочисленные
102 Глава V' сферические частицы или частицы, имеющие форму многогранника, размер которых варьирует (диаметр около 70 нм). Внутри частиц были обнаружены центральные темные участки, однородные по величине, диаметр которых составлял около 40—50 нм. Частицы диаметром 70 нм нередко были окру- жены мембранами, имеющими, вероятно, клеточное происхождение. Эти вирусные частицы можно отделить от окружающих их мембран путем обработки смесью хлороформа с бутанолом, и тогда на электронных микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирования, выявляются некоторые из ожидаемых деталей структуры икосаэдра [578] (фото 18). КРУПНЫЕ ВИРУСЫ, ИМЕЮЩИЕ ВНЕШНЮЮ ОБОЛОЧКУ Сферические частицы Вирус броизовости томатов Имеется много штаммов этого вируса, и разные исследователи исполь- зовали различные его изоляты для изучения строения частиц либо на тонких срезах листа, либо в изолированных суспензиях вируса, либо, наконец, в исходных экстрактах. Этот вирус нестабилен, в связи с чем его структура до сих пор окончательно не исследована. Судя по препаратам, полученным методом распыления капель, частицы различных штаммов вируса, очевидно, различаются по своей жесткости [189]. В листьях инфицированного расте- ния N. glutinosa с системным поражением Бест [190] обнаружил частицы различной величины и формы. Среди них были округлые, трубчатые и ните- видные частицы, а также можно было наблюдать спиральные нити, которые, возможно, представляли собой вытянутые центральные стержни. Ряд авто- ров [193, 853, 979,1825] описали частицы, размеры которых колеблются от 55 до 120 нм. Вероятно, эти колебания в некоторой степени были обусловлены уплощением и разрушением частиц в процессе высушивания. Частицы окру- жены мембраной толщиной около 5 нм. С внешней стороны мембраны имеется зона белковых субъединиц приблизительно такой же толщины (фото 19, Л). Милн [1216] обратил внимание на сходство по величине, форме и внут- реннему строению между вирусом броизовости томатов и вирусом гриппа (фото 19, Б), когда методы, используемые для их электронно-микроскопи- ческого исследования, были одинаковы. Бест [190] также пришел к выводу о том, что вирус броизовости томатов является по существу плеоморфным миксовирусом. Бацилловидные частицы, или частицы, имеющие форму пули Эта группа крупных вирусов растений имеет сложное строение, причем они поразительно сходны с некоторыми вирусами животных, особенно с ви- русом везикулярного стоматита и другими рабдовирусами [333, 464]. По своей форме все они напоминают пулю. Если наблюдается какая-либо иная форма, то это следует, вероятно, рассматривать как артефакт, вызванный процессом приготовления препарата. Размеры, которые определяли для этих частиц (особенно диаметр), являются только приблизительными вслед- ствие изменений, происходящих в таких крупных частицах в процессе подготовки препаратов для электронно-микроскопического исследования. Число сообщений о вирусах этого типа из разных стран быстро возрастает, но пока выполнено мало исследований по выяснению возможных взаимо-
Строение вирусов 103 отношений между различными вирусами, относящимися к этому типу. Их легко наблюдать в электродном микроскопе, но не так легко выделить и изу- чить с химической точки зрения. Вполне вероятно, что они содержат РНК, но это еще не установлено. Вирус желтой карликовости картофеля, Частицы вируса желтой карликовости картофеля (ВЖКК) имеют ба- цилловидпую форму с округленными концами и средние размеры 380 -75 нм. Вирусная оболочка состоит из трех слоев толщиной около 3,5 нм, располо- женных па расстоянии 5 нм друг от друга [ИЗО] (фото 20). Отдельные слои образованы, вероятно, из соединенных своей боковой поверхностью субъ- единиц диаметром около 3,5 нм. При изучении электронных микрофотогра- фий можно предположить, что внутренний компонент вируса расположен в виде спирали. На основании ранних исследований, выполненных на очищенных пре- паратах этого вируса (см., например, [211]), был сделан вывод, что частицы ВЖКК имеют форму, близкую it сферической. Как оказалось в дальнейшем, эти частицы образовывались, вероятно, в результате разрушения бацилло- видных частиц в процессе выделения и подготовки препаратов для электрон- но-микроскопического исследования [1128, ИЗО]. Вирус некротического пожелтения салата-латука Частицы вируса некротического пожелтения салата-латука (ВНПЛ) бацилловидпые или имеют форму пули; ширина их составляет 66 пм, а наи- более обычная длина — около 227 нм [722, 1930]. Для ВНПЛ характерно наличие внешней оболочки, которая окружает внутреннюю трубчатую часть вируса, но неплотно примыкает к ней. На этой оболочке имеются равномерно расположенные выступы длиной около 6 нм, расстояние между которыми составляет примерно 6 пм. Во внутренней части вируса обнаруживается поперечная исчерчениость с интервалами 4,5 им. У некоторых частиц эта поперечная исчерчениость соответствует, по-видимому, структуре, имеющей вид спирали, тогда как для других частиц более вероятно, что структура имеет вид стопки колец. На некоторых электронных микрофотографиях по- перечные полосы представляются состоящими примерно из 10 бусинок (25 па виток), что позволяет предположить наличие субъединиц. Во внут- ренней части вируса имеется центральный канал, который выявляется мето- дом негативного контрастирования. Окончательный химический анализ ВНПЛ не проведен, так как до сих пор не удавалось достаточно полно очистить вирус от примесей материала растения-хозяина. Однако вполне вероятно, что вирус содержит РНК, а исчезновение инфекционности после обработки хлороформом и диэтило- вым эфиром позволяет предположить наличие в его составе липидов. Вирус гомфрены Этот вирус, найденный в Бразилии [980], относится к числу сложных и очень напоминает по особенностям своей структуры ВНПЛ, обнаруженный в Австралии, хотя, согласно имеющимся данным, несколько отличается по своим размерам. Частицы этого вируса бацилловидпые, и для них харак- терна длина 220—260 нм и диаметр 80—100 нм. Частицы имеют внешнюю оболочку толщиной 8—10 нм. На этой мембране можно наблюдать равно- мерно расположенные выступы типа бусинок длиной 6—7 нм. Во внутренней
104 Глава V трубчатой части вируса длиной 200—240 им и диаметром 60—70 им имеется осевой канал шириной 35—40 нм. В этой сердцевине видны 80—90 чередую- щихся светлых и темных поперечных полос шириной 2,6 им каждая. Вирус мозаики кукурузы В тканях растений кукурузы, зараженных вирусом мозаики кукурузы, были найдены бацилловидные вирусоподобные частицы [771]. Эти частицы, длина которых оказалась равной около 240 нм и диаметр 48 нм (измерения проводили на ультратонких срезах), имели две отграничивающие их мем- браны и плотную палочковидную сердцевину диаметром около 10 нм. Частицы подобного же размера наблюдались в слюнных железах и в клетках эпителия стенки кишечника инфицированных особей насекомого-переносчика Peregrinus maidis (Ashm.) [767]. Частицы, обнаруженные в препаратах, при- готовленных методом распыления капель, имели значительно больший диа- метр — около 90 нм [770]. Разница, вероятно, была обусловлена сморщива- нием частиц, изучавшихся на срезах, и уплощением частиц при распылении их на пленке-подложке. Вирус до сих пор не выделен, и вывод о том, что эти частицы представляют собой вирус мозаики кукурузы, основан только на отсутствии подобных частиц в тканях здоровых растений кукурузы или здоровых насекомых-переносчиков. Частицы сходного строения, но несколь- ко отличающиеся по размерам наблюдали в растениях ячменя, заражен- ных вирусом риса (tungro), и в тканях цикадки-переносчика Laodelphax stri- atellus Fallen [1563]. Вирус полосатой мозаики пшеницы Этот вирус (не смешивать с европейским вирусом полосатой мозаики пшеницы) имеет бацилловидные частицы длиной 250—275 нм, длй которых характерен диаметр 78 нм. Частицы кажутся плоскими на одном конце и имеют внешнюю оболочку шириной 5 нм, окружающую электроиноплот- ную сердцевину с центральным полым каналом шириной 23 нм. Более короткие частицы, наблюдаемые в очищенных препаратах, образуются, вероятно, в результате разрушения частиц длиной 250 нм [1062]. В препаратах вируса, полученных методом негативного контрастирова- ния, выявляется однослойная оболочка [1059, 1061]. На тонких срезах зара- женной ткани вирусные частицы иногда кажутся имеющими двойную обо- лочку. Ли [1061] высказал мысль о том, что внутренняя часть вируса, воз- можно, представляет собой спиральный тяж, подобно тому как это был О' установлено для некоторых вирусов животных, имеющих в основном сходное строение. При выявлении этой внутренней спирали на поперечных срезах вирусов мы и видим двойную оболочку. Вирусоподобные частицы в растениях подорожника Хитчборп и др. [1804] наблюдали в пораженных растениях подорож- ника (Plantago lanceolata) вирусоподобные частицы, напоминающие по своей форме пулю. Они имели приблизительно такую же ширину, что и частицы ВНПЛ, и для них была характерна такая же поперечная исчерчеиность центральной части частицы с полосами, расположенными на расстоянии около 4,5 нм друг от друга. Наиболее часто встречающаяся длина частиц была, однако, около 330 нм, т. е. значительно больше, чем длина ВНПЛ. Центральный стержень частицы казался заполненным каким-то мате- риалом.
Строение вирусов 105 Вирус пожелтения жилок осота Бацилловидные частицы длиной приблизительно 220 нм и шириной 80 нм (фото 20, Д) наблюдали в ядрах клеток осота, зараженного этим виру- сом, а также в ядрах клеток слюнной железы тли-переносчика Byperomyzus lactucae, питавшегося на больных растениях [1426]. СВЯЗИ, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ СТРУКТУРУ ВИРУСА О характере связей, объединяющих белковые субъединицы друг с дру- гом и РНК с белком в вирусной частице, известно немного. Взаимодействия белок — белок Белковые субъединицы ВТМ, выделенные из интактного вируса in vitro, обнаруживают заметную тенденцию к образованию агрегатов. Такая агрегация в значительной степени зависит от температуры, pH, ионной силы и концентрации белка. Агрегаты разной величины образуются в различ- ных условиях. Наиболее мелкие стабильные агрегаты являются, вероятно, тримерами химических субъединиц и имеют величину s20,w, равную 4,3 3 [331, 1046]. Такой агрегат известен под названием А-белка. Такахаси и Исии [1737] и Джинер и Лемойн [866] описали низкомолекулярный вирусоспе- цифичпый белок, выделенный из зараженных листьев табака. Такахаси и Исии назвали его Х-белком. Х-белок, вероятно, идентичен А-белку, обра- зующемуся in vitro (фото 81). Более крупные агрегаты белка ВТМ (по более короткие, чем вся вирусная частица) можно наблюдать на электронных микрофотографиях, полученных при изучении инфекционного сока листьев, а также в очищенных препаратах. Эти палочки могут содержать РНК или состоят только из одного белка. В белковых палочках субъединицы могут 1 быть расположены в виде спирали, как в интактном вирусе (16 j белковых субъединиц иа виток), или же они образуют стопку дисков. Из опытов с бел- ком ВТМ in vitro очевидно, что наличие вирусной РНК не является необ- ходимым условием для упаковки белковых субъединиц в виде палочек со спиральной симметрией, что характерно для интактного вируса. При фор- мировании стопки дисков 16 или 17 субъединиц образуют плоское кольцо, и наименьшим стабильным агрегатом является двойной диск, состоящий из двух колец, построенных из субъединиц. Такой тип агрегации представлен на фото 21. Мак-Карти [1118] изучал размеры агрегатов, обнаруживаемых в пре- паратах А-белка, путем седиментационного анализа, электронной микроско- пии и электрофореза в акриламидном геле. Полученные результаты нахо- дятся в соответствии с данными о том, что стабильными агрегатами мономе- ров являются тример, гептамер, двойной диск из 34 субъединиц, сегмент спирали, состоящий из 3 витков, и димер двойных дисков. На основании рентгеноструктурного анализа трехмерных кристаллов белка ВТМ, образуемых из субъединиц при pH 8,0 в 0,5 М сульфате аммония, Финч и др. [521] пришли к выводу, что элементарным «блоком» в кристал- лической решетке служит диск, построенный из двух колец, образованных субъединицами. Методами рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии было установлено, что число субъединиц в каждом диске равно 17. В соответствующих условиях in vitro могут образовываться истин- ные трехмерные кристаллы белковых субъединиц ВТМ [1129] (фото 22).
106 Глава V Мутантные штаммы ВТМ могут образовывать необычные формы белко- вых агрегатов (гл. XIII). Тот факт, что пустые белковые оболочки, внешне сходные с целыми вирусами, существуют или их можно получить искусственно из интактных икосаэдрических вирусов, таких, например, как ВЖМТ, говорит о том, что структура оболочки, образованная субъединицами, может сохраняться и в отсутствие РНК. Опыты по реконструкции, проведенные с использова- нием белковых субъединиц как сферических, так и палочкообразных виру- сов, которые рассматриваются в гл. VII, указывают на существование спе- цифических связей между белковыми субъединицами, главным образом и определяющих строение этих мелких вирусов. Весьма вероятно, что поверхности белковых субъединиц ВТМ содержат в основном гидрофобные группы и что наиболее важная роль при взаимо- действии субъединиц принадлежит гидрофобным (неполярным) связям [1052]. Образование таких связей предполагает существование некоторой стерео- специфичности [331]. Дополнительным источником специфичности при взаи- модействии могут служить водородные и ионные связи между субъедини- цами. Однако исследования кинетики реакции полимеризации — деполи- меризации белка ВТМ позволяют предположить, что соединенные при помощи водородных связей карбоксильные группы, вероятно, играют очень неболь- шую роль при взаимодействии субъединиц ВТМ между собой [28]. Исследования Каспара показали, что атомы свинца связываются с кар- боксильными группами с аномально высокими рК и располагаются в двух различных местах па расстоянии 2,5 и 8,4 нм от оси частицы. В каждой такой точке субъединицы связываются две карбоксильные группы. Каспар [331] предполагает, что водородные связи между карбоксилами внутри субъ- единицы обусловливают стабильность спирали ВТМ, ио не непосредственно, а путем уменьшения отрицательного заряда субъединиц, снижая таким обра- зом электростатическое отталкивание между ними. Взаимодействия белок — РНК Наличие РНК внутри белковой спирали ВТМ в значительной степени стабилизирует структуру этого вируса. С каждой белковой субъединицей связаны три нуклеотида спирали РНК. Кислые фосфатные группы, вероятно, нейтрализованы ионными связями с основными группами на поверхности белковой субъединицы, расположенными в желобке, где находится РНК, или поблизости от пего. Минимальное количество полиамина, связанного с ВТМ [894], могло бы нейтрализовать лишь небольшую долю фосфатных групп. Джонсон и Маркхэм [894] предположили, что в состав «пробок», запе- чатывающих РНК в вирусной палочке с обоих ее концов, возможно, входит полиамид. Число прочно связанных ионов металлов также мало по отно- шению к числу фосфатных групп. Каспар [331] высказал мысль о том, что могут существовать какие-то специфические связи менаду РНК ВТМ и бел- ковыми субъединицами. Однако специфичность этих связей не должна быть сильно выраженной, так как все возможные триплеты оснований, вероятно, располагаются вдоль длины РНК и все они связаны с идентичными белко- выми субъединицами. Кроме того, белковые субъединицы ВТМ в соответст- вующих условиях образуют палочки с РНК ВЖМТ, имеющей совершенно иной состав оснований [1184]. Одиако вполне возможно, что образование более прочных связей происходит между субъединицами и триплетами, бога- тыми каким-то одним или более основаниями. Образование подобного рода сильных связей могло бы объяснить тот факт, что белок предпочтительно отщепляется с одного конца РНК.
Строение вирусов 107 Известно, что реконструкция происходит более эффективно, когда белок ВТМ смешивают с РНК ВТМ, а не, скажем, с РНК ВЖМТ. Возможно, это связано с тем, что свободная РНК в растворе в условиях проведения экспе- риментов по реконструкции обладает в той или иной мере вторичной струк- турой и дело здесь вовсе не в специфичности последовательности оснований как таковой. Еще меньше известно о связях между РНК и белком у икосаэдрических вирусов. В ВЖМТ содержится значительное количество полиамина, и он может участвовать в нейтрализации фосфатных групп. При добавлении этого полиамина к изолированной РНК in vitro он, по-видимому, стабили- зирует молекулу, сохраняя тем самым более или менее сферическую форму, что было установлено при помощи электронной микроскопии [8931; кроме того, полиамин повышает устойчивость РНК к раскручиванию под дейст- вием температуры [1226]. Спиральные участки в молекуле РНК могут спо- собствовать стабильности частицы в целом. Благодаря экспериментам по реконструкции, проведенным с использованием вирусной РНК и белковых субъединиц in vitro, мы получили некоторые сведения о роли белка и РНК в структуре вируса. Эти данные рассматриваются в гл. VII.
ГЛАВА VI СПОСОБЫ ПЕРЕДАЧИ ВИРУСОВ И МЕТОДЫ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИИ В отдельных особях долгоживущих древесных растений вирусы могут сохраняться в течение сотен лет. Однако, будучи облигатными паразитами, вирусы для того, чтобы выжить, должны обладать способностью переда- ваться от одной чувствительной особи к другой с достаточной частотой. Зна- ние тех способов, с помощью которых вирусы могут передаваться от одного растения к другому, представляется важным для нас по нескольким причи- нам: 1) при экспериментальной работе вывод о том, что данное заболевание вызвано вирусом, можно сделать лишь в том случае, если с помощью какого- либо метода удается передать вирус на здоровые особи и воспроизвести забо- левание; 2) вирусы важны в экономическом отношении лишь тогда, когда передаются от растения к растению с большой частотой, учитывая нормаль- ную продолжительность вегетационного периода, характерного для данной, ценной в хозяйственном отношении культуры; 3) для разработки успешных защитных мероприятий необходимо знание путей распространения вируса и механизмов развития инфекции; 4) вопрос о взаимоотношениях вирусов с переносчиками — беспозвоночными и грибами — имеет значительный общебиологический интерес; 5) некоторые способы передачи вирусов, особен- но механические, играют большую роль при исследовании вирусов в лабо- ратории. Вирусы, по-видимому, не обладают способностью проникать через не- поврежденную кутикулу листа растения. Возникающую при этом проблему можно преодолеть, либо избежав необходимости проникать через кутикулу (например, передача вирусов с помощью семян или при вегетативном размно- жении), либо используя некоторые методы, обеспечивающие эту возмож- ность, связанные с повреждением кутикулы, что можно наблюдать при ме- ханической инокуляции и передаче вирусов с помощью насекомых-пере- носчиков. Наши знания о способах передачи вирусов еще далеко не доста- точны. Так, в отношении многих из них, для которых в настоящее время известны лишь 1—2 способа передачи, можно почти с полной уверенностью сказать, что будут найдены и другие способы. Многое еще предстоит выяс- нить о взаимоотношениях между вирусами и насекомыми, вирусами и гри- бами, а также о возможности переноса вирусов (или отсутствии этой воз- можности) через завязь и пыльцу. ПРЯМАЯ ПЕРЕДАЧА ВИРУСА Передача вирусов с помощью семян Примерно один из десяти известных вирусов растений передается через семена инфицированных растений-хозяев или в результате опыления цветков здоровых растений пыльцой зараженных. Передача вируса с помощью се- мян представляет собой весьма эффективный способ заражения какой-либо культуры на ранних стадиях развития, причем на участке, занятом этой культурой, появляются беспорядочно разбросанные очаги инфекции. Таким
Способы передачи, вирусов и методы инфицирования растений 109 образом, если па данном участке вирус может передаваться от растения к растению и какими-либо другими способами, внесение вируса с помощью семян, вероятно, представляет собой очень важный экономический фактор. Вирусы могут находиться в семени в течение длительного периода времени, так что распространение подобного рода вирусов на очень большие расстоя- ния с помощью семян может оказаться весьма эффективным. Фултон [588] составил список, куда входят 36 вирусов, которые, как установлено, пере- носятся с помощью семян, находясь внутри них. Этот список включает вирусы: кольцевой пятнистости табака, мозаики салата-латука, штриховатой мозаики ячменя, мозаики фасоли, южной мозаики фасоли, мозаики ильма и кольцевой пятнистости сливы. Иной тип передачи, когда распространение вируса в значительной сте- пени ограничено семенной кожурой, можно наблюдать в случае передачи ВТМ с помощью семян томатов. В своем недавнем исследовании, касаю- щемся этого вопроса, Бродбент [284] подтвердил результаты более ранних работ [1751], в которых было показано, что вирус у большинства инфициро- ванных семян томатов переносится на их наружных покровах. Расположен- ный на поверхности семян вирус можно легко инактивировать. Небольшое и вместе с тем варьирующее количество семян может содержать вирус в эндо- сперме, что наблюдается главным образом в семенах плодов, которые обра- зовались из цветков, развившихся после заражения растения. В эндосперме вирус может находиться, как было показано, в течение 9 лет, однако при этом в зародыше вирус не обнаруживается. Заражение проростков вирусом, находящимся в семени, происходит лишь при пикировке, неизбежно приво- дящей к поранению растения. ВТМ, по-видимому, также может переноситься, находясь внутри семян яблонь, груш [645] и винограда [644], однако эти данные нуждаются в проверке, при которой соответствующие контрольные опыты позволили бы исключить возможность контаминации исследуемых растений вирусом. Факторы, влияющие на количество инфицированных семян I. Свойства вируса и вирусных штаммов. Коли- чество содержащих вирус семян, образовавшихся на зараженных растениях, широко варьирует в зависимости от типа вируса. Так, Этхау и Банкрофт [43] показали, что процент передачи через семена отдельных растений сои вируса кольцевой пятнистости табака может доходить до 100. Напротив, растения салата, инфицированные вирусом мозаики салата-латука, обра- зуют примерно 3—15% семяп, из которых развиваются зараженные расте- ния [413, 569]. Большинство штаммов вируса южной мозаики фасоли инфи- цируют зародыши, по вирус обычно инактивируется, когда семя созревает. Шеферд и Фултон [1558] описали штамм вируса южной мозаики фасоли, который передавался примерно 3—4% семян инфицированных растений коровьего гороха. II. Растение-хозяин. Некоторые вирусы, передача которых обычно осуществляется с помощью семян, переносятся семенами многих • видов растений-хозяев. Так, вирус черной кольцевой пятнистости томатов, передавался всеми девятью исследованными видами растений из шести се- мейств [1075]. Другие вирусы могут передаваться через семена одного ра- стения-хозяина, но не передаются через семена другого. Например, латент- ный вирус мозаики повилики передается 5% семян инфицированных расте- ний Cuscuta campestris, но не передается через семена дыни-канталупки, гре- чихи или кермеса. Различные разновидности одного и того же вида растения-хозяина могут широко варьировать в зависимости от их способности передавать какой-то
110 Глава VI определенный вирус через семена. Так, вирус мозаики салата-латука, по- видимому, не передается через семена сорта Чесхант Эрли Джайнт, тогда как от 1 до 8% семян других сортов салата-латука обладают способностью передавать этот вирус [680]. III. Сроки заражения растения. Вообще говоря, чем раньше растение заражено, тем выше процент семян, которые оказываются способными передавать вирус (см., например, [307]). Описано, по-видимому, единственное исключение из этого правила. При инфицировании растения ячменя на разных стадиях развития вирусом штриховатой мозаики ячменя количество семян, способных передавать вирус, неуклонно возрастает но- мере развития растения, достигая своего максимума при заражении растений за 10 дней до колошения. Если производить заражение позже, то процент инфицированных семян снижается [501]. Опытами других исследователей [1774] было установлено, что семена растений ячменя, инокулированных 'за 7 дней до цветения или на более поздних стадиях развития, пе обладают способностью передавать вирус. Кроули [419] исследовал вопрос о связи между временем цветения и сро- ками инокуляции растений на количество образовавшихся семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.), зараженных вирусом южной мозаики фасоли. Само- опыление у этих растений происходит в тот момент, когда раскрывается цветок. В проведенных опытах фиксировали время наступления этого собы- тия и сроки проведения инокуляции. Из образовавшихся семян удаляли зародыши еще до того, как они были полностью сформированы, и исследовали их на инфекционность. Оказалось, что вирус способен инфицировать зародыш как в результате заражения гамет, так и в результате заражения уже обра- зовавшегося зародыша, однако лишь на ранних стадиях его развития (до- четырех дней после оплодотворения). Аналогичные результаты были полу- чены Кроули при исследовании вируса кольцевой пятнистости табака в ра- стениях сои и вируса штриховатой мозаики ячменя в ячмене. IV. Местоположение семени на растении. По- видимому, не существует никакой закономерности в том, каким образом расположены на растении инфицированные и неинфицированпые семена. Так, было показано [44], что расположение семян в бобе и местоположение бобов на растении, по-видимому, не оказывают влияния на количество се- мян сои, зараженных вирусом кольцевой пятнистости табака. В этих экспе- риментах были использованы растения, инфицированные вирусом в течение продолжительного времени. У растений, семена которых образуются после- довательно в течение какого-то определенного периода, заражение, проис- ходящее незадолго до цветения или во время цветения, иногда приводит к тому, что более молодые семена оказываются сильнее зараженными вирусом, чем ранее созревшие семена. V. Возраст семян. Некоторые вирусы, по-видимому, исчезают из семян быстрее, чем снижается всхожесть семян. Так, Валло [1805] пока- зал, что количество семян табака, зараженных вирусом кольцевой пятни- стости, через 5,5 лет хранения уменьшилось, однако в этих опытах такой эффект мог быть обусловлен понижением жизнеспособности семян. Фултон [588] описал действительно имевшее место исчезновение вируса некротиче- ской кольцевой пятнистости вишни из семян Primus pensylvanica. В этом случае в течение первых четырех лет храпения семян при 2 °C процент ин- фицированных семян оставался довольно постоянным и был равен 60—70. Через 6 лет хранения инфицированными оказались менее 5% семян, тогда как снижение жизнеспособности семян было ничтожным. Положение с ви- русом южной мозаики фасоли в растениях Phaseolus vulgaris можно рассма- тривать как крайний случай исчезновения вируса из зараженных семян. Этот вирус можно выделить из зародышей еще не созревших семян, но ко
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 111 времени созревания семени, когда оно становится уже сухим, вирус там не. обнаруживается [357]. VI. Температура. Хорошо высушенные семена значительно бо- лее устойчивы к действию высоких температур, чем большинство других частей растения. Некоторые вирусы, которые передаются с помощью семян, примерно в такой же степени, по-видимому, устойчивы к высоким темпера- турам, как и семя, которое они инфицируют. Это справедливо, в частности, в отношении вируса мозаики дыни-канталупки, который, возможно, пред- ставляет собой вирус мозаики тыквы [1374]. Вирусы могут быть более устой- чивы, находясь в сухом семени, чем при исследовании их in vitro. Так, ви- рус мозаики фасоли не очень устойчив к нагреванию in vitro. Вместе с тем тепловая обработка зараженных семян фасоли при 100 °C в течение несколь- , ких часов не приводит к элиминации вируса из семени [713]. Причина повышенной устойчивости вирусов, находящихся в семенах, не совсем ясна. Возможно, эта устойчивость обусловлена общим стабилизи- рующим воздействием иа интактные вирусные частицы, которое оказывают па них низкое содержание воды и высокая концентрация белка. Передача вирусов с помощью инфицированной пыльцы Болыпинство переносимых с помощью семян вирусов, по-видимому, передается также и через пыльцу зараженных растений, однако не все они были адекватно изучены. Говоря иными словами, по-видимому, не существует пи одного примера какого-либо вируса, переносимого с помощью пыльцы, который по передавался бы также через семена.<Исследования, касающиеся относительной эффективности переноса вирусов через зараженную яйце- клетку и через пыльцу, немногочисленны. Что касается вируса мозаики фасоли, находящегося в растениях фасоли, то Нелсон и Даун [126В] нашли, что процент инфицированных семян, образовавшихся в результате опыления цветков здоровых растений пыльцой зараженных, был примерно тем же, что и в случае образования таких семян из цветков зараженных растений, опы- ленных пыльцой здоровых. Однако Крэспин Медина и Гроган [415] пока- зали, что передача этого вируса с помощью пыльцы несколько более эффек- тивна. Напротив, передача вируса мозаики салата-латука осуществляется через семяпочки этого растения; в результате переноса через пыльцу обра- зуется менее 0,5% зараженных семян [1465]. Самоопыление зараженных ра- стений может привести, по-видимому, к образованию большего количества инфицированных семян, чем в том случае, когда в этом участвует лишь одна из гамет инфицированного растения. Вопрос о том, насколько важную роль играет инфицированная пыльца в процессе передачи вирусов в полевых условиях, еще достаточно не изучен. Вполне возможно, что в случае перекрестноопыляющихся древесных много- летников этот способ передачи имеет более важное экономическое значение, чем в случае однолетних культур. Для некоторых вирусов характерно, что инфицированная пыльца может вызывать заражение только образующихся в конце концов семяп, когда опыляются цветки здоровых растений. Однако в случае других вирусов заражается, вероятно, само растение. Например, Джилмер [642] сообщил об экспериментально!! передаче вируса желтухи вишни от дерева к дереву с помощью пыльцы. Локализация вируса в семенах Некоторые вирусы, передача которых осуществляется с помощью семян, как было показано, локализуются в зародыше, тогда как в отношении дру- гих это можно лишь предположить. С помощью электронной микроскопии
112 Глава VI установлено, что вирус штриховатой мозаики ячменя (палочкообразный вирус) присутствует как в зародыше, так и в эндосперме. Содержание вирус- ных частиц во всех исследованных семенах, взятых с зараженных растений, было примерно таким же, как и в тканях листа, хотя передавать вирус могли лишь 50% семян. Вирус обнаруживали также в пестиках (до и после оплодо- творения), пыльниках и пыльце заболевших растений. Различные теории относительно передачи вирусов с помощью семян На основании полученных до сих пор данных не создается ясной картины, с помощью которой мы могли бы обрисовать процесс передачи вирусов через семена. Подобная способность не является свойством, присущим определен- ным группам или семействам покрытосеменных, так же как не ограничи- вается и вирусами, принадлежащими к одному определенному морфологиче- скому типу. Этим свойством обладают некоторые палочкообразные вирусы, характеризующиеся спиральной симметрией, мелкие икосаэдрические ви- русы и крупные вирусы, тогда как многие другие вирусы того же типа этим свойством не обладают. Требует объяснения также тот странный факт, по- чему многие вирусы, в том числе и стабильные, содержащиеся в листьях в большом количестве, не передаются через семена. Обычно полагают, что для передачи вируса действительно через семена он должен проникнуть в зародыш и сохранить, находясь там, свои инфекционные свойства. По- видимому, утрата вируса может иметь место на одной из двух стадий инфи- цирования семени. При этом вирус либо оказывается неспособным проник- нуть в зародыш, либо проникает туда, но затем элиминируется. I. Неспособность вируса инфицировать заро- дыш. Бэннет [157] высказал предположение, согласно которому именно отсутствием сосудистых связей можно объяснить невозможность инфици- рования зародыша вирусами, характеризующимися тропизмом к прово- дящей ткани (гл. VII). Этим нельзя, однако, объяснить неспособность мно- гих вирусов, инфицирующих клетки паренхиматозной ткани, передаваться через семена. Колдуэлл [319] обнаружил, что вирус аспермии томатов нарушает мойоз в стадии профазы. Деление материнских клеток, как микроспор, так и мега- спор, по-видимому, блокируется, в результате чего семена либо пе образуют- ся вовсе, либо образуются в очень небольшом количестве (отсюда и проис- ходит название вируса). Колдуэлл [320] отметил, что растения, инфициро- ванные вирусами, обычно образуют меньше семян по сравнению со здоро- выми растениями, и высказал предположение, что вызванные вирусами нару- шения мейоза, вероятно, довольно широко распространены и, возможно, служат причиной того, что вирус не передается через семена. Было показано, например, [1653], что вирус штриховатой мозаики ячменя, который пере- дается через семена ячменя, но не передается через семена кукурузы, ока- зывает мутагенное действие на растения кукурузы. Это действие выражалось в увеличении частоты утраты генов-маркеров семенами поколения Ft в тех случаях, когда для опыления использовалась пыльца растений, зараженных вирусом. При помощи тестов па инокуляцию вирус не удалось обнаружить пи в нормальных проростках, ми в проростках с пониженным содержанием хлорофилла поколения F2. Бэпнет высказал также предположение, что некоторые вирусы, воз- можно, не способны выжить, находясь в гаплоидных клетках. Это очень инте- ресно, но непосредственных данных, которые подтверждали бы это пред- положение, пе существует. Однако большинство вирусов, которые пере- даются с помощью семян, могут передаваться также через пыльцу. Кроме
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 113 того, Крэспип Медина и Гроган [415] обнаружили фасолевый вирус 1 (ви- рус, передаваемый с помощью семян) в пыльце и семяпочках фасоли, но не смогли обнаружить фасолевый вирус 2 (не передаваемый с помощью семян) пи в семяпочках, пи в пыльце. Этот вирус был выделен из пестиков и лепестков, по не из пыльников. II. Неспособность вируса выживать в з а р о - д ы in е. Некоторые вирусы, несомненно, проникают в зародыш, но позднее исчезают из него. Этим молено объяснить многие из наблюдавшихся фактов. Так, способен или не способен какой-либо определенный вирус передаваться с помощью семян того или иного вида растения-хозяина, а также эффектив- ность этой передачи могут зависеть от степени элиминации вируса из заро- дышей, которые первоначально все или почти все были заражены вирусом. Вещества, ингибирующие вирусную инфекцию, были обнаружены в эк- страктах из семян, например в экстрактах из семян фасоли [357]; однако нет никаких оснований полагать, что эти вещества обладают ингибирующей активностью in vivo. Листья многих растений содержат значительные коли чества обладающих ингибирующей активностью полифенолов и тем не ме- нее способствуют развитию вирусов. Искусственный цитокинин, известный под названием кинетина, оказывает ингибирующее действие на реплика- цию некоторых вирусов растений (гл. XIV). В кукурузе естественные цито- кинины, как известно, встречаются в развивающихся семенах в больших концентрациях, чем в других частях растения [1210]. Активность цитокини- нов высока в экстрактах прорастающих семян многих видов растений [1063]. Возможно, что естественные цитокинины играют какую-то роль в контро- лировании распределения некоторых вирусов в семенах и плодах. Существует и другой возможный фактор, который может нести неко- торую долю ответственности за наблюдаемую нами неспособность вирусов передаваться с помощью семян. Если какой-то вирус растений может всту- пить во взаимосвязь со своей клеткой-хозяином, аналогичную наблюдаемой в случае некоторых бактериофагов и их клеток-хозяев, то это лизогенное состояние может сохраняться в клеточной линии, которая участвует в обра- зовании семян. В результате этого можно ожидать, что какая-то часть (ве- роятно, очень незначительная) потомства, возникшего из семян заражен- ных растений, окажется устойчивой it вирусной инфекции. Передача вируса в процессе вегетативного размножения растений Вегетативное размножение представляет собой важный прием, исполь- зуемый в садоводстве, но, к сожалению, является столь же эффективным способом сохранения и распространения вирусов. Вирусы, наносящие зна- чительный ущерб экономике сельского хозяйства, обладают способностью к системному распространению по большей части вегетативных органов рас- тения, причем растение, однажды системно инфицированное вирусом, обычно сохраняет вирус в течение всего периода своей жизни. Таким образом, любые органы растения, служащие для вегетативного размножения, как, например, клубни, луковицы, клубнелуковицы, усы, черенки, обычно инфицированы вирусами. Во многих случаях каждая исследованная особь какого-либо опре- деленного сорта инфицирована тем или иным вирусом; например, растения некоторых сортов картофеля оказываются зараженными Х-вирусом карто- феля. Однако, если заражается здоровое растение размножающегося веге- тативным путем вида, причем даже на довольно ранней стадии развития, распространения вируса по растению в течение первого сезона вегетации может и не произойти (гл. VII). 8-0893
114 Глава VI Передача вирусов в результате прививки Прививка по существу представляет собой форму вегетативного размно- жения, при которой часть одного растения растет на корнях другого. При этом, как только произойдет срастание тканей, подвой и привой вместе образуют одну особь. В том случае, когда для подвоя или для того растения, часть которого использована в качестве привоя, характерна системная инфекция, привитое растение в целом оказывается зараженным при условии, что оба партнера чувствительны к вирусу. Начиная с первых дней исследо- вания вирусов растений в качестве доказательств вирусной природы забо- левания обычно принимались два рода фактов, а именно возможность пере- дачи заболевания с помощью прививки и отсутствие какого-либо патоген- ного агента, который можно было бы обнаружить с помощью светового микроскопа. Теперь известно, что многие вирусы, которые, как когда-то считалось, передаются только путем прививки, столь же успешно пере- даются и другими способами. В целях передачи вирусов в эксперименте применяется много разно- образных способов прививки, используемых в практике садоводства (см., например, фото 23). Оказалось также, что передачу некоторых вирусов можно успешно осуществить с помощью и таких методов прививки или псевдо- прививки, которые обычно не используются в садоводстве. Так, например, передать вирусы можно, вставляя кусочки инфцированпых листьев под кору, причем передача при этом происходит, вероятно, в результате объеди- нения ткани подвоя и привоя в участках срезов жилохх листа [1858]. В резуль- тате передачи вируса путем прививки может развиться заболевание, которое отличается от заболевания, возникающего, скажем, в результате механиче- ской инокуляции. Так, у N. glutinosa в случае механической инокуляции его ВТМ обычно образуются местные некротические поражения, причем системного распространения вируса не наблюдается. Однако прививка на здоровые растения N. glutinosa черенков N. tabacum, системно инфи- цированного ВТМ, приводит к гибели N. glutinosa в результате системного некротического заболевания. Вероятно, описанное влияние прививки свя- зано с проникновением вируса в проводящие элементы сверхчувствительного хозяина [1973]. Прививка может оказаться эффективным способом передачи вирусов, когда другие методы безуспешны, однако использование прививки не всегда приводит к достижению ожидаемых результатов. В ряде случаев это может объясняться тем, что в растении, от которого взят якобы зараженный привой, не произошло полного системного распространения вируса. В других слу- чаях, когда ткань здорового растительного материала, который используется для прививки, реагирует на заражение вирусом местной некротической реакцией, передачи болезни может и не произойти. Так, Чемберлен и др. [349] показали, что если здоровые почки слив сортов Бербанк и Салтен привиты на растение сливы, инфицированное вирусом мозаики, вызывающим пожелте- ние жилок, то почки реагируют на это некротической реакцией и погибают. Возможно, именно этим и объясняется тот факт, что эти сорта слив очень редко оказываются инфицированными данным вирусом в садах. При обычных условиях для различных вирусов необходимо различное минимальное время для того, чтобы осуществилась их передача в результате прививки. Так, для 12 вирусов, поражающих Prunus, которые были исследованы Фридлендом [562], минимальное время, необходимое для передачи вируса в 100% случаев при прививке почек, варьировало от, 48 до 152 ч [562]. Самопроизвольная прививка — довольно редкое событие, и подобный способ передачи вирусов не имеет широкого распространения в природе.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растении 115 Тем не менее для некоторых видов растений этот способ, вероятно, представ- ляет собой существенный фактор, играющий роль в их передаче. Так, Шеффилд [1555] описала распространение заболевания гвоздичного дерева (это заболевание известно под названием «внезапной гибели»), причиной возникновения которого, как оказалось, служит самопроизвольная прививка в его корень. Хотя в настоящее время прививка пе играет такой роли в эксперименте, как это было ранее, она до сих пор имеет большое эко- номическое значение, особенно при выращивании древесных многолетни- ков, необходимые нам сорта которых можно сохранить лишь путем прививки. Передача вирусов с помощью повилики Повилика (Cuscuta spp.) — это вьющееся растение, лишенное настоящих листьев и хлорофилла и паразитирующее на высших растениях. Это расте- ние принадлежит к сем. Convolvulaceae. Существует множество разных видов этого рода, имеющих различный круг растений-хозяев, причем круг растений-хозяев некоторых видов очень широк. Паразит образует гаустории, соединяющиеся с проводящей системой растения-хозяина. Бэннет [156] показал, что повилика способна передавать вирусы от растения к растению. Передача вирусов с помощью повилики в некоторых отношениях сходна с их передачей путем прививки. Однако в последнем случае удачная совме- стимость тканей привоя и подвоя наблюдается в пределах достаточно близко- родственных друг другу растений, обычно в пределах рода. Напротив, повилику можно использовать для передачи вирусов растениям, состоящим друг с другом в отдаленном родстве. При экспериментальной передаче с помощью повилики вирус может и не репродуцироваться в клетках пара- зита. В таких случаях повилика выполняет пассивную функцию канала, соединяющего два растения. Например, ВТМ, по-видимому, не размно- жается в клетках повилики, и эффективная передача вируса наблюдается лишь в том случае, когда с помощью одного и того же растения повилики осуществляется связь между больным и здоровым растением того вида, который способен служить хозяином вируса. Степень передачи ВТМ суще- ственно увеличивалась в результате обрезки повилики и затемнения здоро- вых растений, т. е. в условиях, которые, как предполагают, приводят к перемещению питательных веществ от больных растений к здоровым [385]. Бэннету [156] удалось отделить вирус огуречной мозаики от ВТМ, исполь- зуя способность первого сохраняться в клетках повилики, когда паразит поражает растения, иммунные к обоим вирусам. При этих условиях ВТМ исчезает. В ряде случаев растения повилики, используемые в экспериментах по передаче вирусов, могут служить резервуаром вирусов, о присутствии которых не подозревали. Так, Бэннет [158] показал, что пе обнаруживающие симптомов поражения растения Cuscuta californica (Choisy) были часто инфи- цированы каким-то вирусом, названным вирусом латентной мозаики пови- лики и вызывавшим тяжелые заболевания у ряда неродственных повилике растений, например у свеклы, кермеса и картофеля. Одним из основных достижений при использовании повилики в экспе- рименте оказалась возможность передачи с помощью этого растения вирусов от растений-хозяев, где их трудно изучать, на растения, которые удобны для проведения экспериментальных исследований. Что касается поле- вых условий, то, по-видимому, повилика не играет существенной роли в распространении вирусов, приносящих большой ущерб сельскому хозяйству. 8»
116 Глава VI ПЕРЕДАЧА ВИРУСОВ С ПОМОЩЬЮ ОРГАНИЗМОВ, НЕ ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К ВЫСШИМ РАСТЕНИЯМ Беспозвоночные В природе многие вирусы растений передаются от растения к растению с помощью беспозвоночных-переносчиков. Эта большая самостоятельная тема обсуждается в гл. XVI. Грибы В настоящее время известно примерно 7 вирусов растений, которые передаются обитающими в почве грибами. Наиболее изучен в этом отношении гриб-переносчик Olpidium brassicas (Wor) Dang., относящийся к классу архимицетов, который представляет собой распространяемый через почву облигатный паразит, заражающий корни многих растений. В клетках корня гриб образует покоящиеся споры, которые попадают в почву при разрушении тканей корня. Из этих покоящихся спор при благоприятных условиях в корне и в почве высвобождаются в почвенную влагу многочисленные зооспоры. Зооспоры могут затем заразить корни здоровых растений. На фиг. 16 схе- матически представлен жизненный цикл этого гриба. Проведенные недавно электронно-микроскопические исследования [175] позволили установить существование двух фаз в процессе заражения клеток корня грибом Olpidium. В течение фазы цистообразования зооспора прочно прикрепляется к корню и ее единственный жгутик исчезает, а внутри зооспоры видны беспорядочно свернутые оксонемиалыше фибриллы. Затем зооспора образует оболочку цисты. В ходе второй фазы заражения оболочка клетки-хозяина разру- Фиг. 16. Схематическое изображение стадий жизненного цикла гриба Olpidium- Относительно половой стадии имеются некоторые сомнения. 1 — зооспора; г — зооспорангии в клетках корня; 3 — половое слияние; 4 — спорангии в растительных остатках в почве.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 117 шается и цитоплазма цисты проникает в эту клетку; эктопласт и тонопласт цисты остаются при этом снаружи (фото 24). Внутри клетки-хозяина цитоплазма гриба оказывается окруженной вновь образованным тонопластом. Взаимоотношения между грибом и вирусами еще далеки от того, чтобы быть полностью понятыми, однако работы последнего времени позволяют предполагать, что вирус может переноситься в корень, находясь на поверх- ности зооспоры (например, вирус некроза табака) или внутри нее (например, вирус крупных жилок салата-латука и вирус карликовости табака). Попытки передать ряд других вирусов, используя Olpidium, оказались безуспешными [1753]. Вирус некроза табака Было описано несколько вирусов некроза табака (ВИТ), обладающих аналогичными свойствами и легко передающихся через почву корням расте- ний. Заражение листьев этим вирусом путем механической инокуляции обычно приводит к образованию местных некротических поражений у чув- ствительных растений-хозяев, однако системного распространения вируса не происходит. Несмотря на отдельные расхождения в деталях, вся совокуп- ность различного рода данных, полученных разными исследователями, фак- тически свидетельствует о том, что вирус некроза табака передается корням здоровых растений салата-латука зооспорами гриба Olpidium. Об этом говорят следующие факты: 1) вирус проникает в корень примерно в то же самое время, что и гриб (через 2—Зч после инокуляции) [944,1752]; 2) число зараженных участков зависит от концентрации как ВНТ, так и зооспор [944]; 3) если путем фильтрования из суспензии, содержащей ВНТ и зоо- споры Olpidium, удалить зооспоры, то с помощью фильтрата, содержащего только ВНТ, оказывается невозможным передать вирус корням здоровых растений [570]; 4) Olpidium поражает зону, лежащую за кончиком корня, и вирус некроза табака обнаруживается тоже в этой зоне [570]; 5) передачу вируса можно предотвратить, если к суспензии зооспор незадолго до сме- шивания с ВНТ или вскоре после него добавить антисыворотку к ВНТ с высоким титром антител. Передача вируса прекращается и в том случае, если зооспоры, освобождающиеся из корней инфицированных ВНТ растений, попадали в антисыворотку к ВНТ [321]. Тот факт, что специфическая антисыворотка блокирует инфекционность зооспор, позволяет предполагать, что вирус находится либо на поверхности зооспоры, либо вблизи лее. Вместе с тем промывание зооспор, несущих ВНТ, благодаря повторяющемуся несколько раз центрифугированию не препят- ствует передаче этого вируса, заставляя предположить, что этот вирус прочно связан с зооспорой [321]. Данные электронно-микроскопических наблюдений, о которых говорилось выше, свидетельствуют о том, что клеточ- ные мембраны инцистированпых зооспор не проникают в клетки корней растений, тем самым подтверждая мысль о том, что вирус, вероятно, нахо- дится в цитоплазме зооспоры. Однако вирус, проникающий в корень, может быть расположен на том участке поверхности зооспоры, где происходит разрыв, что позволяет цитоплазме переместиться в клетку растения-хозяина. Кэмпбелл и Фрэй высказали предположение, согласно которому в момент освобождения из клеток корня зооспоры не содержат ВНТ, но затем при- обретают этот вирус, который также попадает в почвенную влагу. Olpidium, по-видимому, является очень эффективным переносчиком, поскольку пере- дача осуществляется даже с помощью суспензий, содержащих лишь около 50—100 зооспор в 1 мл [570, 944]. ВНТ может передаваться зооспорами этого гриба в культивируемую ткань каллюса табака при использовании менее
118 Глава VI концентрированного инокулума, чем тот, который эффективен в случае механической инокуляции таких тканевых культур [945]. Способность различных изолятов Olpidium передавать ВНТ варьирует [946, 1754]. Так, Кассанис и Мак-Ферлейн показали, что гриб, выделенный из растений капусты, неспособен передавать два изолята ВНТ какому бы то ни было растению-хозяину. Из двух изолятов Olpidium, выделенных из сала- та-латука, один передавал оба изолята ВНТ с большей эффективностью, чем другой. Эти различия не были связаны с чувствительностью растений- хозяев к различным штаммам Olpidium. Моуот [1238] показал, что штаммы Olpidium, обладающие способностью передавать ВНТ, и штаммы, не обла- дающие этой способностью, различались по электрофоретической подвиж- ности их зооспор. Этот исследователь высказал предположение, что фак- торами, обусловливающими специфичность передачи вируса различными переносчиками, возможно, являются различия в суммарных поверхностных зарядах зооспор и в их способности связывать определенные ионы. Вирус крутых жилок салата-латука {ВКЖС) Этот вирус вызывает распространяющееся через почву заболевание салата-латука, приносящее большой экономический ущерб, однако частицы вирусаТдо настоящего времени не охарактеризованы. Результаты различных наблюдений! показывают, что вирус передается спорами гриба Olpidium и находится, вероятно, внутри спор. Данные эти являются, однако, косвен- ными, поскольку Olpidium до сих пор не был выделен в чистой культуре, и наши предположения^ 'подтверждаются лишь следующими фактами: 1) инфекционный агент имеет те же размеры, что и зооспоры Olpidium («5 мкм) [322]; 2) способность ВКЖС передаваться через почву утрачи- вается в том случае, когда этот вирус передается с помощью прививки расте- ниям салата-латука, свободным от Olpidium. Если эти растения затем зара- жаются не содержащим вирус грибом, способность ВКЖС передаваться через почву восстанавливается [322, 1781, 1782]; 3) культуры Olpidium, не зараженные ВКЖС, Г приобретают этот вирус уже в первом вегетативном поколении в корнях растений, инокулированных вирусом путем прививки [323]; 4) инфекционность высушенной на воздухе почвы, содержащей ВКЖС, сохраняется по крайней мере 8 лет [1367]. Кэмпбеллу и Фрэю [321] удалось выделить покоящиеся споры Olpidium из корней растений, инфицированных ВКЖС, после 39 мес хранения. Эти споры обрабатывали затем сильной кислотой, и при этом способность гриба передавать вирус сохранялась. Вопрос о том, размножается ли этот вирус в клетках гриба, до настоя- щего времени не решен, и немногие имеющиеся в нашем распоряжени