Генетика развития животных. Учебник - Мамон Л.А., Голубкова Е.В.

Author: Мамон Л.А. Голубкова Е.В.

Tags: общая генетика общая цитогенетика иммуногенетика эволюционное учение видообразование филогенез генетика

ISBN: 978-5-288-06528-6

Year: 2026

Similar

Практическая молекулярная генетика для начинающих 8-9 классы

Вирусы: Скорее друзья, чем враги

Любопытные факты о грибах

Материалы заданий Всероссийской междисциплинарной олимпиады школьников «Национальная технологическая олимпиада» по профилю «Геномное редактирование» (2023/24 учебный год)

Text

Л. А. Мамон, Е. В. Голубкова

РАЗВИТ

животны;

Санкт-Петербургский
государственный
университет
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Л. А. Ма*мон, Е. В. Голубкова

ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
ЖИВОТНЫХ

Учебник

ИЗДАТЕЛЬСТВО САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
УДК 575.16

ББК 28.043

М22

Рецензенты:

д-р биол. наук, проф. Л. И. Ким (Моск. гос. ун-т);

д-р биол. наук О. Б. Симонова (Институт биологии гена РАН)

Рекомендовано к публикации
Учебно-методической комиссией по УГСН 06.00.00 «Биологические науки»
Санкт-Петербургского государственного университета

Мамон Л. А., Голубкова Е. В.

М22 Генетика развития животных: учебник. — СПб.: Изд-во C.-Петерб. ун-та,
2026. — 226 с.

ISBN 978-5-288-06528-6

В основу учебника положен курс лекций по генетике развития животных, ко-
торый читается на кафедре генетики и биотехнологии биологического факультета
Санкт Петербургского государственного университета. Основное внимание уделено
эволюционно консервативным механизмам, участвующим в реализации программ
раннего развития, с учетом различий в стратегии эмбрионального развития у разных
животных. Рассмотрены механизмы дифференциации и их происхождение в связи
с возникновением многоклеточноеги; роль цитоскелета в определении статуса клетки;
особенности формирования клеток зачаткового пути у представителей разных система
тических групп животных; механизмы регуляции экспрессии генов в развитии и роль
сигнальных систем и некодирующих РНК в этом многоуровневом процессе. В качестве
примера реализации относительно автономных программ развития, в результате раз
ворачивания которых формируются клетки со специализированными функциями,
подробно рассмотрены сперматогенез и нейрогенез.

Издание предназначено для студентов и аспирантов медико биологических
специальностей, а также может быть полезно преподавателям соответствующих
дисциплин.

УДК 575.16

ББК 28.043

Победитель ежегодного открытого конкурса учебных изданий СПбГУ'
«Университетский заказ — 2024»

ISBN 978-5-288-06528-6

государственный университет, 2026
ОГЛАВЛЕНИЕ

Список основных сокращений............................................... 4

Введение................................................................. 5

Глава 1. Механизмы дифференциации и методы генетики развития.........

Глава 2. Стволовые клетки и роль цитоскелета в развитии.
Типы дифференцированных клеток.......................................... 19

Глава 3. Генетический контроль раннего эмбрионального развития
Drosophila melanogaster................................................. 42

Глава 4. Формирование клеток зачаткового пути у разных животных......... 60

Глава 5. Сигнальные системы, участвующие в регуляции экспрессии генов
на уровне транскрипции, в развитии.................................... 80

1лава 6. Регуляция экспрессии зиготических генов на уровне транскрипции. 96

Глава 7. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции в развитии. ... 120

Глава 8. Некодирующие РНК в развитии.................................. 142

Глава 9. Комплексы генов, контролирующих развитие...................... 160

Глава 10. Нейрогенез как автономная программа развития............... 182

Глава 11. Особенности формирования мужских половых клеток.............. 200

Глава 12. Многоклеточность как причина дифференциации клеток
в развитии животных.................................................. 213

Заключение

Глоссарий .

221

223
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
мРНК — матричная, или информационная, РНК

МТ — микротрубочки

РНК — рибонуклеиновая кислота

РНП — рибонуклеопротеин

ТФ — транскрипционный фактор

цАМФ — циклический аденозинмонофосфат

сАМР — cyclic adenosine monophosphate — циклический аденозинмонофосфат

Cas — CR1SPR associated protein — CRlSPR-ассоциированный белок

CPE — cytoplasmic polyadenylation element — цитоплазматический элемент полиаде-
нилирования

CRE — сАМР-response element — элемент ответа на цАМФ — последовательность ДНК
CREB — CRE-binding protein — белок, связывающий элемент ответа на цАМФ

CREM — CRE-modulator protein — белок CRF. модулятор

CRISPR — clustered regularly interspaced short palindromic repeats — сгруппированные
регулярно расположенные короткие палиндромные повторы

ESC — embryonic stem cells — эмбриональные стволовые клетки

GMC — ganglion mother cell — материнская ганглиозная клетка

GSC — germ Jine stem cell — стволовая клетка зародышевой линии

GFP — green fluorescent protein — зеленый флуоресцентный белок

HAT — histone acetyltransferase — гистоновая ацетилтрансфераза

HDAC — histone deacetylase — гистоновая деацетилтаза

HMG — high-mobility group — белки высокомобильной группы

iPSC — induced pluripotent stem cells — индуцированная плюрипотентная стволовая
клетка

METRO — message transport organizer — организатор транспорта сообщений — митохон-
дриальное облако

МТОС — microtubule organization center — центр организации микротрубочек

NLS — nuclear localization signal — сигнал ядерной локализации

ORE — open reading frame — открытая рамка счит ывания

РАМ — protospacer adjacent motif — мотив, примыкающий к протоспейсеру

PGCs — primordial germ cells — первичные половые клетки

RET — red fluorescent protein — красный флуоресцентный белок

SSC — somatic stem cell — соматическая стволовая клетка

L’AS — upstream activation sequence — последовательность активации, расположенная
перед промо гором

UTR — untranslated region — нетранслируемый регион

VPCs — vulval precursor cells — клетки-предшественницы вульвы

YEP — yellow fluorescent protein — желтый флуоресцентный белок
ВВЕДЕНИЕ

Каждый сложный многоклеточный организм развивается из одной един-
ственной клетки — зиготы. Откуда зигота знает, как должен выглядеть
взрослый организм; почему ноги в норме не растут на голове и хвост на-
ходится на положенном ему месте. Важно понять, как и почему сестринские
клетки, являющиеся потомками одной родительской клетки, становятся
разными в отношении выбора программы развития. Какие субклеточные
структуры играют важную роль в дифференциации клеток и обеспечении
межклеточной коммуникации? Можно ли контролировать процесс диффе-
ренциации клеток? На подобные вопросы отвечает генетика развития. Это
одна из самых завораживающих областей генетики. Сегодня эта область
тесно переплетается с эволюционной биологией, образуя новое направление,
называемое evo-devo (evolutionary developmental biology) — эволюционная
биология развития. И это не случайно. Эволюцию невозможно понять без
изучения процессов развития и их влияния на эволюцию. «Ничто в био-
логии не имеет смысла, кроме как в свете эволюции», — так сказал выдаю-
щийся генетик Ф. Г. Добржанский. Многие гены, контролирующие развитие,
проявляют удивительную консервативность, в то же время стратегия реали-
зации сходных программ развития у представителей разных таксонов может
различаться.

Достижения генетики развития имеют огромное значение в понимании
причин патологий развития и при разработке методов лечения или для пре-
дотвращения их появления. Они являются основополагающими при расши-
рении возможностей трансплантации органов и тканей.

В настоящей кнше будут рассмотрены следующие основные вопросы ге-
нетики развития:

1. Механизмы дифференциации.

2. Гены, контролирующие развитие.

3. Механизмы реализации программ раннего развития с учетом различий
в стратегии эмбрионального развития у разных животных.

4. Особенности регуляции экспрессии генов в развитии.

Учебник опирается на курсы лекций «Молекулярная генетика», «Транс-
крипция», «Трансляция», «Мир РНК», читаемых на кафедре генетики
и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета,
а также на курс «Молекулярно-генетические основы генетики индивиду-
ального развития», читаемый на кафедре эмбриологии. Основу этих кур-
сов составляют дисциплины «Общая генетика», «Клеточная биология»
и «Биохимия». Каждый из представленных разделов книги может быть
предметом отдельной монографии и может служить фундаментом для
дальнейшего самостоятельного углубленного изучения рассматриваемой
проблемы.

В конце каждой главы в списке литературы приведены современные пуб-
ликации по представленной теме, которые позволяют более углубленно ос-
воить материал.
ГЛАВА I

МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ
И МЕТОДЫ ГЕНЕТИКИ РАЗВИТИЯ

Механизмы дифференциации клеток

Основной вопрос, на который пытается ответить генетика развития: как
и почему из одной клетки возникает организм, состоящий из множества не-
похожих друг на друга клеток, выполняющих разные функции? Каким обра-
зом, большей частью при идентичном наборе генов, формируется клеточное
многообразие и морфофункциональная специализация органов и тканей?

Для объяснения этого феномена были предложены две гипотезы.

Первая гипотеза сформулирована Томасом Хантом Морганом: в разных
клетках многоклеточного организма в разные моменты развития работают
различные гены. Таким образом, клетки различаются потому, что в них ра-
ботают разные гены.

Автор второй гипотезы Рихард Гольдшмидт предположил, что в разных
клетках могут работать одни и те же гены, но их продукты попадают в раз-
ную клеточную плазму. В одной плазме способны функционировать про-
дукты одних генов, в другой — других. В этом случае специализация клеток
осуществляется на уровне дифференциального функционирования генных
продуктов в зависимости от типа клеток [Корочкин, 2002].

Таким образом, Т. X. Морган объяснял возникающие в процессе развития
различия между клетками дифференциальной транскрипционной активностью
генов, т. е. избирательным включением и выключением определенных генов
при дифференциации клеток. Р. Гольдшмидт обращал внимание па дифферен-
циальное функционирование продуктов одного и того же гена. С точки зрения
современных знаний правы оба — и Т.Г. Морган, и Р. Гольдшмидт, но каждая
«модель» может быть реализована или на разных стадиях развития, или в раз-
ных клеточных типах. Кроме того, сегодня мы понимаем, что одному гену
может соответствовать несколько различных продуктов. В результате каких же
событий мо1ут появиться разные продукты одного гена? В основе этого явления
лежат особенности экспрессии генов на транскрипционном (разные промото-
ры и терминаторы транскрипции), посттранскрипционном (альтернативный
сплайсинг, альтернативное полиаденилирование) и трансляционном уровнях.

Несомненно, клетки, вступившие на разные пути развития, разли-
чаются набором работающих генов, но это не единственная причина
дифференциации клеток. Благодаря успехам реализации программ анализа
генома, транскриптома и протеома различных организмов стало понятным,
что транскриптом и протеом имеют гораздо большую сложность, чем геном.
Одному гену может соответствовать не один, а несколько разных продуктов,
иногда десятки тысяч. По результатам анализа транскриптомов человека,
более 70 % генов имеют продукты, возникающие в результате альтернатив-
ного сплайсинга. Многообразие транскриптов, соответствующих одному гену,
увеличивается и благодаря тому, что считывание транскриптов может осу-
ществляться с альтернативных промоторов, а также из-за использования
альтернативных сайтов расщепления и полиаденилирования при форми-
ровании З'-конца транскрипта, а также вследствие существования системы
редактирования транскриптов.

Наибольшее разнообразие вариантов альтернативных транскриптов ха-
рактерно для генов, экспрессия которых осуществляется в клетках мозга
и семенников. Существуют гены-рекордсмены в этом отношении. Например,
в гене NRXN3 человека, кодирующем пресинаптический белок NEUREXIN3,
который вовлечен в нацеливание отростков нервных клеток и формирова-
ние синапсов, есть два промотора — дистальный и проксимальный. Их ис-
пользование приводит, соответственно, к появлению двух форм этого белка:
а- и p-NEUREXIN3. Кроме того, альтернативные варианты сплайсинга с ис-
пользованием пяти разных сайтов увеличивают разнообразие транскриптов
гена neurexin3 настолько, что их число составляет более 1000.

У дрозофилы ген Dscam (Down syndrome cell adhesion molecule), кодирую-
щий аксон-нацеливающие рецепторы, имеет 95 экзонов и из-за исключения
тех или иных экзонов производит 38 016 разных транскриптов. Это в свою
очередь создает многообразие аксон-нацеливающих рецепторов. Получается,
что число разных транскриптов гена Dscam больше, чем число белок-кодиру-
ющих генов у дрозофилы.

У дрозофилы известно 15 189 аннотированных генов. Они кодируют свы-
ше 50 000 транскриптов. Таким образом, соотношение числа генов и соответ-
ствующих им транскриптов у дрозофилы составляет в среднем 1:3. У человека
это соотношение 1:9,5, т. е. па 20 500 генов приходится 195 1Т1 транскриптов.

Многообразие транскриптов одного и того же гена является одной из при-
чин полифункциональности генов. Эта полифункциональность еще больше
расширяется на уровне протеома. Белки способны подвергаться протеолизу,
тем самым увеличивая разнообразие белковых продуктов. Кроме того, раз-
личные модификации белков, в том числе и тканеспецифичные, изменяют
их функции. А если учесть, что многие белки функционируют в составе раз-
личных макромолекулярных комплексов, то один и тот же функциональный
модуль (в данном случае конкретный белок) позволяет обеспечивать работу
разных более сложных систем.

Что же лежит в основе различий, приводящих к дифференциации клеток?
Почему две дочерние клетки после деления становятся неодинаковыми? Каким
образом возникающие различия способны наследоваться в ряду клеточных по-
колений: в чем заключаются механизмы клеточной памяти? Как долго в ряду
клеточных поколений клетки будут сохранять появившиеся изменения? Для
ответов на эти и другие вопросы генетики развития необходимо применение
широкого спектра методов. Кроме того, прогресс в любой науке во многом
определяется появлением новых методов, позволяющих решать вопросы, от-
веты на которые невозможно получить путем использования ранее доступных
методов. Роль метода в науке настолько велика, что разработка некоторых
методов принесла мировую известность их создателям. Они были удостоены
Нобелевской премии по физиологии и медицине или по химии.

Методы генетики развития

Мутации генов, контролирующих развитие

Получение и анализ мутаций генов, контролирующих развитие, форми-
ровали представления о генетическом контроле развития и создали пред-
посылки для изучения структуры и функции генов (рис. 1.1). Коллекции
мутантов — материал, позволяющий путем гибридологического анализа по-
нять механизмы взаимодействия мутантных аллелей генов, контролирующих

Рис. 1.1. Мутанты по генам, контролирующим развитие:

1 — bithorax — мутация у Drosophila melanogaster, в результате которой появляется допол
нительная пара крыльев [Lewis, 1998]; 2 — А-С — вариации фенотипа у гомозигот по му-
тации сах (compact axial skeleton) у мыши [Schuster-Gossler et al., 2009]; 3 — эктродактмлия
у человека [Paththinige et al., 2019]
Рис. 1.2. Схема редактирования генома CRISPR-Cas9

развитие, и устанавливать генные сети, представляющие собой систему взаи-
модействующих генов, контролирующих определенные этапы развития.

Методы направленного получения мутаций постоянно совершенствуются,
и в настоящее время исследователи получили технологию редактирования
генома CRISPR-Cas9, позволяющую направлено изменять последовательности
ДНК. За внедрение технологии редактирования генов с помощью технологии
CRISPR-Cas9 Нобелевскую премию по химии (2020) получили Дженнифер
Дудна и Эмманюэль Шарпантье.

Метод включает следующие этапы. В клетку вводят генетические кон-
струкции, которые содержат последовательности, отвечающие за синтез
РНК-гида и белка Cas9. РНК-гид (guide RNA — направляющая РНК) состоит
из двух функциональных доменов. Назначение первого состоит в том, чтобы
найти в геноме мишень и взаимодействовать с ней по правилу комплемента-
ции. Второй домен — последовательность CRISPR — является своеобразным
маяком, узнаваемым нуклеазой Cas9 (рис. 1.2).

Последовательность, называемая CRISPR (clustered regularly interspaced
short palindromic repeats), содержит кластер коротких палидромных (зер-
кально комплементарных) участков ДНК, способных формировать струк-
туры типа шпилек за счет комплементарного взаимодействия палиндромов.
В геномах бактерий и архей наличие подобных кластеров определяет систему
адаптивного иммунитета против вирусов. Шпильки разделены спейсерны-
ми последовательностями, которые представляют собой вставки чужерод-
ной ДНК. Эти вставки соответствуют фрагментам геномов вирусов. Если
вирус с совпадающей ДНК попадет в бактериальную клетку, он довольно
быстро будет распознан специальным ферментом — нуклеазой Cas9 (CRISPR
associated). Последний для поиска вирусной ДНК использует синтезирован-
ную с последовательностей CRISPR РНК-копию — РНК-гид.

Технология редактирования генома

При геномном редактировании последовательность, комплементарная
целевому гену, находится на 5'-конце направляющей РНК, а за ней — после-
довательность CRISPR, которая и привлекает нуклеазу Cas9 (рис. 1.2). Узнав
структуру CRISPR, нуклеаза Cas9 наносит двунитевой разрыв геномной ДНК,
комплементарной спейсерной последовательности направляющей РНК.

Участок в гене-мишени, комплементарный последовательности спейсера
в направляющей РНК, называется протоспейсером. Это может быть любой
участок гена, но соседствовать с ним обязательно должен тринуклеотид NGG,
называемый РАМ (protospacer adjacent motif). При комплементарном взаимо-
действии спейсера в направляющей РНК с комплементарным участком гена
(протоспейсером) образуется триплекс ДНК РНК-гид-ДНК. Тринуклеотид
РАМ (NGG) должен находиться на З'-конце нити ДНК, свободной от взаи-
модействия с РНК; в другой нити ДНК — тринуклеотид, комплементарный
РАМ. Эти тринуклеодиты являются мишенью действия нуклеазы Cas9. Имен-
но в этом месте нуклеаза Cas9, привлеченная структурой CRISPR, наносит
двунитевой разрыв. Далее ферменты клеточной репарации должны «зале-
чить» этот двунитевой разрыв.

Репарация может происходить двумя путями (рис. 1.3). Первый путь — не-
гомологичное сшивание концов. В этом случае может возникнуть небольшая

Нетождественная репарация Гомологичная рекомбинация

Точная вставка

Рис. 1.3. Возможности технологии CRISPR-Cas9
делеция или инсерция, а может — и большая делеция. Второй путь осущест-
вляется ио механизму рекомбинационной репарации: необходимо вводить
дополнительную последовательность, фланкированную участками, гомоло-
гичными последовательностям хозяйской ДНК. Этот подход очень перспек-
тивен, поскольку позволяет внедрять в геном любую последовательность
(олигонуклеотид), предварительно встроенную в плазмиду, используя ме-
ханизм рекомбинационной репарации. Последовательность, которую хотят
встроить, помещают между двумя фланкирующими участками, гомологич-
ными хозяйской ДНК. Фланкирующие последовательности необходимы для
гомологичной рекомбинации, которая обеспечивает вставку расположенного
между ними участка ДНК в том районе генома, который хотят изменить.

Система редактирования генома позволяет направленно менять геномные
последовательности: вносить точковые мутации, удалять фрагменты генома,
встраивать новые последовательности в заданные участки генома, заменять
одни последовательности на другие.

Методы идентификации продуктов генов,
контролирующих развитие

Для выявления локации продукта определенного гена в организме в целом,
отдельном органе и даже в пределах клетки используют следующие методы:

1. Иммуногистохимический метод. Основан на получении и использова-
нии меченых антител к белкам — продуктам генов, контролирующих раз-
витие. Такой подход позволяет увидеть момент, когда в развитии появляется
исследуемый белок, в каких клетках белок присутствует или отсутствует;
давать количественную характеристику его содержания в органе или клетке;
определять связь исследуемого белка с определенными структурами или ор-
ганеллами клетки.

2. Репортерные генетические конструкции. В этом случае инструментом
анализа служат не антитела, а продукты экспрессии рекомбинантных ге-
нетических конструкций (как встроенных, так и не встроенных в геном).
Регуляторные области генов, контролирующих развитие, соединяются с по-
следовательностями, производящими репортерные белки, легко детектируе-
мые в клетке. Это Moiyr быть флуоресцентные белки, например GFP (green
fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein) или RFP (red fluorescent
protein), или белки, выявляемые путем простой гистохимической реакции,
такие как бета-галактозидаза или хлорамфеникол-ацетилтрансфераза. За от-
крытие и разработку принципов использования зеленого флуоресцентного
белка (GFP) О. GiiMoMypa, М. Чалфи и Р. Тсьен получили Нобелевскую пре-
мию по химии (2008).

3. Метод гибридизации РНК-РНК, или ДНК-РНК in situ. Позволяет оце-
нивать пространственную и временную экспрессии генов, контролирующих
развитие, выявляя с помощью меченого зонда РНК-продукт работы генов.
Это особенно важно в том случае, когда нужно детектировать появление,
перемещение и места сохранения в нетранслируемом состоянии так называ-
емых локализованных транскриптов.

Методы анализа механизмов регуляции

экспрессии генов в развитии

Механизмы регуляции экспресии генов весьма разнообразны, многочис-
ленны и очень сложны. Рассмотрим методы, позволяющие выявлять регуля-
торные последовательности генома.

1. Метод задержки в геле. Существенный прогресс в изучении регуля-
ции экспрессии генов на уровне транскрипции в развитии был достигнут
благодаря разработке методов, позволяющих выявлять транскрипционные
факторы (ТФ), взаимодействующие с ДНК и влияющие на эффективность
транскрипции, а также методов, позволяющих идентифицировать последо-
вательности ДНК, с которыми эти факторы взаимодействуют. Самым про-
стым является метод задержки в геле, или метод ретардации фрагментов
ДНК в геле. Клонированный фра! мент регуляторной области гена подвер-
гают гель электрофорезу с добавлением (рис. 1.4, б) или без добавления
транскрипционного фактора (рис. 1.4, а). Если исследуемый белок взаимо-
действует с ДНК, фрагмент ДНК движется в геле медленнее, чем такой же
фрагмент, свободный от взаимодействия с транскрипционным фактором
(рис. 1.4, б).

2. Метод foot printing {«отпечатка ноги»). Этот метод используют для
определения последовательности ДНК, которая взаимодействует с конкрет-
ным ТФ. Принцип этого метода заключается в следующем. Фрагмент ДНК,
предварительно инкубированный с ТФ, узнающим определенные последо-
вательности в этом фрагменте ДНК, обрабатывают ДНКазой I. Один ко-
нец исследуемого фрагмента ДНК обычно делают меченым, для того чтобы

Рис. 1.4. Результаты использования метода задержки в геле:

а — перемещение в геле фрагмент» ДНК, соответствующего регуляторной части гена;
б — перемещение в геле искомого фрагмента с добавлением транскрипционного фактора
Рис. 1.5. Использование метода foot printing для выявления участков регуляторной области
гена, взаимодействующих с транскрипционными факторами:

а — схема, отражающая набор фрагментов ДНК, полученных после обработки ДНКазой I
(прямоугольники соответствуют двум разным транскрипционным факторам); б — схема
результатов сиквенсною гель-электрофореза

фрагменты ДНКазного расщепления можно было идентифицировать в геле.
ДНКаза I производит случайные разрывы ДНК в тех местах, которые не за-
щищены белком. Условия расщепления подбирают таким образом, чтобы
разрывы, случайно наносимые ДНКазой I, происходили с шагом в один нук-
леотид. Далее полученные после ДНКазного расщепления фрагменты ДНК
подвергают сиквенсному электрофорезу и сравнивают дорожки, на которые
наносили ДНК без инкубации с транскрипционным фактором и ту ДНК,
которая взаимодействовала с исследуемым ТФ (или факторами). Участок
ДНК, связанный с ТФ, недоступный для нуклеазы (ДНКазы 1), выглядит
па электрофореграмме как белое пятно — «отпечаток ноги» (рис. 1.5). Этот
метод позволяет анализировать наличие сайтов связывания с различными
транскрипционными факторами, оценивать конкурентные взаимоотношения
между ТФ за сайты связывания, если инкубацию проводят одновременно
с двумя и более факторами, а также определять последовательности нуклео-
тидов в ДНК, отвечающие за взаимодействие с определенным ТФ.

Методы, позволяющие влиять на характер экспрессии генов,
контролирующих развитие

Приведем некоторые из этих методов.

1. РНК-интерференция (RNA-mediated interference — RNAi). Позволяет
подавлять экспрессию исследуемого гена за счет введения малых интерфери-
рующих РНК (siRNA — small interfering RNA). Последние взаимодействуют
с сайтами-мишенями в определенных мРНК по правилу комплементации,
вызывают их деградацию в клетке или блокируют работу соответствующего
Gal4

Тканеспецифичный
промотор

Белок Gal4

UAS - ген X

Gal4

Тканеспецифичная
экспрессия Go/4

М UAS — Upstream Activation sequence
(CGG-N11-CCG)

Активация
транскрипции гена X
в присутствии белка Gai4

Рис. 1.6. Система UAS — GAL4 (Brand, Perrinton, 1993]

гена на посттранскрипционном уровне. Сайты-мишени, узнаваемые миРНК,
чаще всего располагаются в 3'UTR (3' untranslated region) тех мРНК, пост-
транскрипционная судьба которых регулируется этим механизмом. За от-
крытие интерференции РНК были удостоены Нобелевской премии по физио-
логии и медицине (2006) Э. Файер и К. Мелло.

2. Система CAS — CAL4. Дает возможность маркировать определенные
типы клеток или подавлять экспрессию гканеспецифичных генов.

Идентифицированный впервые у дрожжей S. cerevisiae ген GAL4 кодирует
белок в 881 а. к., являющийся регулятором транскрипции. Белок GAL4 вза-
имодействует с последовательностью CGG-N11-CCG в ДНК. Эта последо-
вательность называется UAS (upstream activation sequence). Для повышения
эффективности взаимодействия с белком GAL4 последовательность HAS, как
правило, представлена повторами CGG-N11-CCG.

У дрозофилы данная система включает в себя две трансгенные линии
(рис. 1.6). Одна линия содержит конструкцию трапскрипционно неактивной
последовательности гена X с предшествующими повторами UAS. В качестве
гена X может быть ген-репортер, отвечающий за синтез репортерных белков,
таких как GFP, YFP, RFP, p-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза,
различные формы родопсина и др. Ген X может кодировать и антисмысловую
последовательность, которая путем интерференции РНК участвует в дегра-
дации транскриптов интересуемого гена. Другая линия несет последователь-
ность гена GAL4 под тканеспецифичным энхансером (драйвером). У особей
этой трансгенной линии в определенных клетках в зависимости от тканеспе-
цифичного драйвера синтезируется белок GAL4.

Скрещивание особей этих двух трансгенных линий позволяет у гибридов
идентифицировать клетки определенных типов, в зависимости от выбранных
драйверов, по присутствию в этих клетках репортерных белков или пода-
влять экспрессию определенного гена в конкретных клетках, а не в организме
в целом (рис. 1.6).

Методы широкого назначения

В настоящий момент существенный прогресс в генетике развития связан
с использованием следующих методов:

1. Методы биоинформатики. Задачами метода являются: создание банков
данных, позволяющих проводить сравнение генов, контролирующих развитие
разных организмов, поиск эволюционно консервативных последовательностей,
выявление и анализ генных семейств. Сравнение кДНКовых библиотек, соз-
данных на основании РНК, выделенных из образцов различных тканей, сборка
и анализ ткане- и органоспецифичных транскриптомов направлены на выяв-
ление генов, контролирующих развитие, и изучение их структуры и функции,
формирование представлений об особенностях стратегии индивидуального
развития в разных систематических группах животных.

2. Метод трансплантации ядер и клеток. Позволяет решать не толь-
ко теоретические задачи, по и имеющие большое практическое значение,
включая клонирование животных, клонирование и трансплантацию органов,
регуляцию пола сельскохозяйственных животных. Исследования по транс-
плантации ядер клеток шпорцевой лягушки Дж. Гёрдона были удостоены
Нобелевской премии по физиологии и медицине (2012) за открытие пере-
программирования зрелых дифференцированных клеток в плюрипотентные.
Использование метода пересадки ядер привело к открытию такого явления,
как геномный импринтинг. За разработку принципов введения специфи-
ческих генных модификаций в организм мышей посредством транспланта-
ции эмбриональных стволовых клеток Нобелевскую премию по физиологии
и медицине (2007) получили М. Капекки, О. Смитис и М. Эванс. Получение
нокаутных животных с выключением работы определенного гена позволяет
определять роль конкретного гена в развитии (рис. 1.7). В эмбриональных
стволовых клетках черной мыши молекулярными методами удаляют или де-
лают неработающим определенный ген — генетический нокаут. Такие клетки
помещаю г в бластоцель эмбриона коричневой мыши на стадии бластоцисты.
Эмбрионы подсаживают в матку суррогатной мыши. В результате рождаются
химерные мышата, у которых клетки с генетическим нокаутом могут стать
родоначальником репродуктивной системы. Таким образом, при скрещива-
нии химерных мышей можно получить особей, гомозиготных по неработа-
ющему гену.

Хотя технология получения нокаутных мышей представляет собой цен-
ный исследовательский инструмент, существуют некоторые важные ограни-
чения. Около 15 % нокаутов генов являются летальными, это означает, что
Эмбриональные стволоаые

клетки черной мыши

Генетический нокаут —
введение последовательности
неработающего гена

Эмбрион коричневой мыши
на стадии бластоцисты

Рождение химерного потомства

Отбор гомозигот
по нокаутному гену

Имплантация эмбриона
в матку суррогатной матери

Скрещивание

Рис. 1.7. Схема получение нокаутных мышей посредством трансплантации
эмбриональных стволовых клеток

генетически измененные эмбрионы не мо1ут вырасти во взрослых мышей. Эта
проблема часто преодолевается с помощью использования условных мутаций.
Кроме того, во всей процедуре существует вариабельность, в значительной
степени зависящая от линии, из которой были получены стволовые клетки.

Почему определенные клетки вступают на путь программированной кле-
точной гибели? Возможен ли возврат к исходному состоянию, в гом числе
возврат клеток в недифференцированное состояние? Поиск ответов на эти
вопросы имеет большое практическое значение, в частности, позволяет ре-
шить проблему трансплантации органов. Можно получить in vitro из группы
клеток больного необходимый орган или его часть, а затем заменить пора-
женный орган.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные проблемы генетики развития?

2. Какие методы позволяют изучать механизмы регуляции экспрессии генов?

3. Что такое геномное редактирование?

4. В чем состоят особенности получения и значение нокаутных животных по генам, контро-
лирующим индивидуальное развитие?

5. Что лежит в основе дифференцировки клеток?

ЛИТЕРАТУРА

Корочкин Л. И. Биология индивидуального развития: генетический аспект: учебник. 2002. М.:
Изд-во МГУ. 264 с.

Серов О.Л. Генный и хромосомный контроль развития // Онтогенез. 2004. № 35. Р. 245-253.
Bhat G.R., Sethi I., Rah B„ Kumar R., Afrozc D. Innovative in Silico Approaches for Characterization
of Genes and Proteins // Front. Genet. 2022. Vol. 13. P. 865182.

Brand A. H., Perrinton N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating
dominant, phenotypes// Development. 1993. Vol. 118. P. 401-415.

Hofer M., Lutolf M. P. Engineering organoids // Nat. Rev. Mater. 2021. Vol. 6. P. 402-420.

Le P„ Ahmed N., Yeo G. IV Illuminating RNA biology through imaging // Nat. Cell Biol. 2022. Vol. 24.

P. 815-824.

Lewis E. B. The bithorax complex: the first titty years // Int. J. Dev. Biol. 1998. Vol. 42 (3). P. 403-415.

Manton L„ Ginanova V., KliverS., Toropko M., Golubkova E. Organ-specific transcripts as a source of
gene multifunctionality: lessons learned from the Drosophila melanogaster sbr (Dm tixfl) gene //
Bio. Comm. 2019. Vol. 62 (2). P. 146- 157.

Paththinige C. S., Sirisena N. D., Escande E, Manouvrier S., Petit F., Dissanayake V H. IV Split hand/foot
malformation with long bone deficiency associated with BHLHA9 gene duplication: a case report
and review of literature // BMC Med. Genet. 2019. Vol. 20 (1). P. 108.

Redman M„ King A., W'titson C„ King D. What is CRISPR/Cas9? // Arch Dis Child Educ Pract Ed.
2016. Vol. 101. P. 213-215.

Schuster-Gossler K., Harris B.. Johnson K.R., Serth]» Gossler A. Notch signalling in the paraxial
mesoderm is most sensitive to reduced Pq/ut/levels during early mouse development // BMC
Dev. Biol. 2009. Vol. 9 (1). P. 6
Глава 2

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

И РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА В РАЗВИТИИ.

ТИПЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК

В зависимости от степени дифференциации клетки принято подразделять
на тотипотентные, плюрипотентные, мулыпипотентные и унипотентные.

Тотипотентные клегки способны дать начало всем возможным типам
эмбриональных клеток, обеспечивающих в конце концов формирование
взрослого организма, в том числе и формирующих внешние эмбриональные
ткани (рис. 2.1). Примером тотипотентных клеток позвоночных являются
зигота — оплодотворенная яйцеклетка — и бластомеры — клетки морулы,
появившиеся в результате дробления при образовании эмбриона. Наличие
тотипотентных клеток определяет возможность рождения у человека моно-
зиготных (однояйцевых) близнецов.

Плюрипотентными называются клетки с таким же потенциалом, что и то-
типотентные. Они способны производить клетки трех зародышевых лист-
ков — энтодермы, эктодермы и мезодермы. Но, в отличие от тотипотентных
клеток, плюрипотентные клетки не способны к образованию клеток внешней
эмбриональной (экстраэмбриональной) ткани, или трофэктодермы.

Мулътипотентные — это клетки, способные дать начало многим типам
клеток, но не всем, обычно в пределах зародышевого листка.

Унипотентные клетки приводят к появлению только одного типа клеток.

ТОТ1111О1СНТНЫС

сперматозоид

зигота

Плюрипотентные

внутренняя

клеточная масса

морула

бластоциста

трофобласт
(трофэктодерма)

Рис. 2.1. Раннее эмбриональное развитие млекопитающих
Клетки внутренней клеточной массы в бластоцисте млекопитающих —
плюрипотентные — относятся к эмбриональным стволовым клеткам (ESC —
embryonic stem cells). Отличительная особенность стволовых клеток — от-
сутствие ограничений в числе последующих делений. Ограничение в числе
делений, существующее для дифференцированных клеток, известно как пра-
вило Хейфлика, или предел Хейфлика. Это правило основано на наблюдениях
за клетками человека в культуре. Число последовательных делений клеток
в культуре ограничено — около 50. Затем клетки прекращают делиться, ста-
реют и умирают. Клетки, находящиеся на крайней ступени дифференциации,
мо!ут вообще утрачивать способность к делению. Так происходит, например,
с нейронами или клетками, имеющими ресничку.

Можно ли вернуть дифференцированные клетки в состояние плюрипо-
тентности? Этот вопрос — один из важнейших в генетике развития.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

За работы в области биологии развития и получения индуцированных
стволовых клеток Нобелевской премии (2012) по физиологии и медицине
были удостоены Дж. Гёрдон и С. Яманака. Еще в 1962 г. Дж. Гёрдон опубли-
ковал статью о том, что специализация клеток взрослого организма обра-
тима [Gurdon, 1962]. В его экспериментах ядро яйцеклетки лягушки было
заменено ядром дифференцированной клетки желудочно-кишечного тракта.
В ряде случаев из яйцеклетки с замененным ядром развивался нормальный
головастик. Тем самым были получены экспериментальные доказательства
в пользу того, что ДНК специализированной клетки содержит всю необхо-
димую информацию для развития сложного организма. Однако в большин-
стве случаев развитие трансформированных яйцеклеток в экспериментах
Дж. Гёрдона прерывалось на ранних стадиях, не достигая стадии головастика.
Это свидетельствует о том, что в специализированных клетках происходят
изменения генетического материала, не позволяющие вернуться в исходное
состояние, характерное для недифференцированных клеток. Встал вопрос:
можно ли перепрограммировать специализированные клетки в недифферен-
цированные? Эта проблема была решена С. Яманакой в 2006 г. Ему удалось
перепрограммировать специализированные клетки (мышиные фибробласты)
взрослого организма в плюрипотентные стволовые клетки, способные диф-
ференцироваться, давая начало всем типам клеток. Таким образом, получен-
ные стволовые клетки стали называть индуцированными плюрипотентными
стволовыми — iPS (induced pluripotent stem cells). Замечательно то, что пре-
вратить специализированные клетки в плюрипотентные стволовые можно
путем активации работы всего четырех генов: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус.

Что же это за гены, в чем состоят их основные функции? Экспрессия
генов с-Мус и Klf4 приводит к модификации структуры хроматина в местах
взаимодействия продуктов этих генов с ДНК. В свою очередь изменение
структуры хроматина допускает взаимодействие транскрипционных фак-
торов Oct4 и Sox2 со своими мишенями в ДНК. Так или иначе продукты
всех четырех генов содержат последовательности (домены), определяющие
взаимодействие с ДНК. Это позволяет относить их к факторам, влияющим
на транскрипцию, — транскрипционным факторам. Для активации или
репрессии генов-мишеней в нужный момент и в определенных клетках орга-
низма необходимо появление соответствующих транскрипционных факто-
ров или их активация, если они уже присутствуют в клетке, доступ к регуля-
торным областям генов-мишеней, а в ряде случаев — появление (активация)
белков-партнеров, участвующих в формировании комплекса, активирующего
(подавляющего) транскрипцию. Присутствие в транскрипционном факторе
ДНК-связывающего домена определяет его взаимодействие с «регуляторны-
ми элементами», называемыми цис-действующи.ми элементами. Такое взаи-
модействие может активировать (или наоборот — подавлять) транскрип-
цию; изменять структуру хроматина, привлекая факторы, модифицирующие
гистоны или азотистые основания в ДНК; а также притягивать кофакторы
к соответствующим районам в генах-мишенях.

Рис. 2.2. Доменная структура белка Klf4:

а — взаимодействие активационных и репрсссионных доменов с белком РЗОО (ацетилтранс-
феразой) (NLS — сш нал ядерной локализации); б — ДНК-связывающий домен, представ-
ленный тремя последовательностями, — «цинковыми пальцами» [Vangapandu, Ai, 2009J
Факторы дедифференциации клеток

Kriippel-like factor 4 (Klf4) — это транскрипционный фактор, содержа-
щий домены, привлекающие друше регуляторные факторы, последователь-
ность, определяющую способность проникать в ядро, — NLS (рис. 2.2, а),
и ДНК-связывающий домен из трех «цинковых пальцев» (zinc fingers}
(рис. 2.2, 6}: две последовательности, состоящие из 25 а. к. (первые два «паль-
ца»), и одна — из 23 а. к. (т ретий «палец»). Каждая из этих последовательно-
стей («пальцев») содержит два цистеина и два гистидина (С2Н2), связанных
с ионом цинка (Zn2t). Тем самым аминокислотная последовательность обра-
зует структуру, похожую на палец.

Последовательность ДНК, узнаваемая «цинковым пальцем», обогащена
цитозином и гуанином. Одна из таких последовательностей-мишеней —
GC/CACCC. Ген Klf4 гомологичен гену Kriippel (Кг), который у дрозофилы
контролирует сегментацию эмбрионов. Участвуя в регуляции т ранскрипции
генов в качестве транскрипционного фактора, Klf4, как правило, взаимо-
действует с другими факторами, например белком РЗОО. В свою очередь
Р ЭДО способен взаимодействовать с белком CREB (CRE-binding), который
в ДНК узнает последовательность CRE (сАМР-response element). Последова-
тельности CRE широко представлены в геноме в виде октамерного палин-
дрома — 5'-TGACGTCA 3'. Этот октамер объединяет группу генов-мишеней,
регуляция которых осуществляется с участием сигнальной системы цАМФ
(сАМР). РЗОО обладает ацетилтрансферазной активностью, влияя на ацети-
лирование гистонов и тем самым регулируя транскрипционную активность
генов за счет изменения структуры хроматина. Взаимодействуя с последова-
тельностями в регуляторной области генов-мишеней, Klt4 привлекает в эти
районы белки, модифицирующие хроматин. Взаимодействие с РЗОО и белком
CREB приводит к активации транскрипции генов-мишеней, а с деацетилазой
гистонов (HDAC3 — histone deacetylase 3) — к репрессии генов.

Белок Klf4 содержит как домен активации транскрипции генов мишеней,
так и репрессирующий домен (рис. 2.2, а). Между этими доменами распола-
гается последовательность PEST, обогащенная аминокислотами Pro (пролин),
Glu (глутаминовая кислота), Ser (серин) и Thr (треонин) и характерная для
белков, присутствие которых в клетке контролируется механизмом протеа-
сомной деградации путем убиквитинирования. Белки, содержащие последо-
вательность PEST, как правило, короткоживущие. В белке КИ4 есть и последо-
вательность, свидетельствующая о его функции в ядре, — это сигнал ядерной
локализации (NLS) — PKRGRR Присутствие положительно заряженных
аминокислот (отмечены жирным шрифтом) является характерной особенно-
стью NLS в белке. Сигнальная аминокислотная последовательность NLS, как
правило, эволюционно неконсервативна. Большинство ТФ несут подобную
последовательность. Иногда таких последовательностей в транскрипционном
факторе бывает несколько.
Рис. 2.3. Гстеродимср, образуемый белками Мах и с-Мус,
и его взаимодействие с ДНК (Turner, 2ииЗ]

с-Мус — известный протоонкоген, белковые продукты которого, как
и К114, относятся к транскрипционным факторам, влияющим на пролифе-
рацию, рост, дифференциацию и апоптоз. с-Мус имеет сходство с вирусным
онкогеном v-Myc, вызывающим миелоцитоматоз у птиц. Гену с-Мус у млеко-
питающих соответствует несколько белковых форм с разными молекуляр-
ными массами: 76, 64 и 45 кДа. Началом трансляции для появления самой
тяжелой формы белка с-Мус является не канонический кодон AUG, а пред-
шествующий ему в мРНК с-Мус-кодон CUG, что свидетельствует о возможно-
сти регуляции на уровне инициации трансляции. Белок с-Мус присутствует
в клетке не в виде мономера. Как регулятор транскрипции, он функциониру-
ет в виде гетеродимера, взаимодействуя с белком Мах (рис. 2.3). В результате
ДНК-связывающую активность определяют домены basic-region/helix-loop-
helix/leucine-zipper (BR/HLH/LZ). Основной район (basic-region) обогащен
положительно заряженными аминокислотами и обеспечивает взаимодей-
ствие с ДПК. Участок, называемый спираль-петля-спираль (helix-loop-helix),
состоит из двух а-спиралей, включающих по 15-20 а. к. каждая, а-спирали
разделены более коротким участком, образующим петлю. Последователь-
ность «петли» варьируется по длине и менее консервативна, чем последова-
тельности, формирующие а-спирали.

«Лейциновая молния» (leucine-zipper — LZ) — последовательность, включа-
ющая несколько лейцинов, — обеспечивает белок-белковые взаимодействия,
что часто необходимо для совместного функционирования транскрипцион-
ных факторов, образующих функциональные гомо- или гетеродимеры. По-
этому последовательность LZ в белке часто соседствует с ДНК-связывающим
доменом. В регуляторных областях генов-мишеней рядом располагаются по-
следовательности, с каждой из которых взаимодействует соответствующий
транскрипционный фактор. Гетеродимср с-Мус/Мах узнает в ДНК после-
довательность CAC(A/G)TG, называемую E-box (CANNTG, где N — любой
нуклеотид). В геноме человека существует около 25 000 потенциальных сай-
тов взаимодействия с с-Мус. Способность белка с-Мус взаимодействовать
с комплексом, содержащим ацетилтрансферазу гистонов (HAT — histone
acetyltransferase), позволяет относить этот ТФ к тем, которые влияют на струк-
туру хроматина.

Транскрипционный фактор Oct-4 (octamer-binding transcription
factor) получил такое название из-за способности узнавать в ДНК октамер
ATGC( А/Т)ААТ, чаще — ATGCAAAT. Ген, кодирующий этот транскрипцион-
ный фактор, — Pou5fl — экспрессируется в клетках внутренней клеточной
массы, но не экспрессируется в трофэктодерме. ДНК-связывающий домен
Okt4 принадлежит к семейству POU (Pit-Oct-Unc). В скобках перечислены
ТФ, имеющие такой же домен. Название семейства сложилось из первых
букв белков, содержащих этот домен. Домен POU состоит из двух струк-
турно независимых субдоменов: POU specific (POUs) — последовательности
из 75 а. к., обогащенной пролином и отрицательно заряженными аминокис-
лотами, и POU homeodomain (POUh) — из 60 а. к. Последовательность POUh
богата пролином, серином и треонином. Присутствие серинов и треонинов
позволяет регулировать характер взаимодействия Okt4 с ДНК за счет моди-
фикации серина и треонина путем фосфорилирования.

Последовательность октамера ATGC(A/T)AAT полно представлена в регу-
ляторной области многих генов-мишеней с широким диапазоном экспрессии.
Это могут быть как гены, кодирующие гистоны, так и гены с тканеспецифич-
ным характером экспрессии. Причем домен POUs узнает последовательность
5'ATGC, а 3' — половину октамера АААТ У — домен POUh (рис. 2.4). Число
и ориентация в ДНК таких половинок октамера может варьироваться. Это
создает определенный код и предполагает участие в регуляции не только
мономеров, но и димеров и олигомеров, образованных транскрипционными
факторами. Белок Oct-4 способен образовывать гетеродимер с Sox2.

Среди мишеней транскрипционных факторов Oct-4 и Sox2 находится
ген Nanog, который кодирует ТФ, содержащий гомеодомен. Экспрессия гена
Nanog является маркером клеток внутренней клеточной массы бластоцисты,

ДНК-свяаываюпшй домен

AGTC

АЛАТ

Рис. 2.4. Доменная структура транскрипционного фактора Oct4 [Pan el al., 2002]
она необходима для поддержания плюрипотентности этих клеток. Клетки
внутренней клеточной массы способны дифференцироваться как в клетки
всех трех зародышевых слоев — эктодермы, энтодермы и мезодермы, — так
и в клетки зачатковою пути. Исходно экспрессию гена Oct-4 можно видеть
во всех бластомерах при формировании бластоцисты. Однако в клетках ее
наружного слоя (трофобласта) Oct-4 не выявляется, а по мере развития
эмбриона экспрессия Oct-4 ограничивается клетками .зачаткового пути. Тем
самым Oct-4 в конечном итоге является маркером клеток зачаткового пути.

Sox2 (SRY-related HM€S-box) относится к транскрипционным факторам,
содержащим последовательность HMG (high-mobility group), которая в ДНК
узнает последовательность CATTGTT или похожие на нее. Впервые домен
HMG был идентифицирован в транскрипционном факторе Sry (sex region in
Y-chromosome), определяющем развитие особи мужского пола у млекопита-
ющих. HMG состоит из трех а-спиралей, обеспечивающих взаимодействие
транскрипционного фактора с ДНК (рис. 2.5).

В результате этого процесса происходят локальные конформационные
изменения молекулы ДНК, что повышает транскрипционную активность
гена мишени за счет сближения цис-действующих элементов. Это создает
предпосылки для взаимодействия сближающихся ТФ. Взаимодействие HMG
происходит по малой бороздке ДНК и приводит к изгибу молекулы ДНК бо-
лее чем на 90° в сторону от взаимодействующего с ДНК транскрипционного
фактора. Среди генов-мишеней, регулируемых Sox2, находятся гены Fgf4
(fibroblast growth factor 4) и Zfp206 (zinc finger protein 206). В регуляторной! об-
ласти гена Zfp206 рядом располагаются сайты связывания Sox2 и сайты вза-
имодействия с Oct-4. Это свидетельствует о кооперации транскрипционных
факторов Sox2 и Oct-4 в регуляции экспрессии гена Zfp206, продукт которого

Рис. 2.5. Структура транскрипционного фактора, содержащего последовательность HMG,
представленную тремя а-спиралями (1-3). Взаимодействие происходит по малой бороздке
и вызывает изгиб молекулы ДНК [Bartlow, 2011]
содержит 14 доменов «цинковых пальцев». Sox2, образуя гетеродимер с Oct4,
регулирует экспрессию генов Oct4, Sox2 и Nanog. Экспрессия этих трех ге-
нов важна для поддержания плюрипотентности клеток. Следует обратить
внимание на авторегуляцию этой системы генов. Большинство названных
ТФ и других регуляторов транскрипции формируют белковые комплексы,
участвующие в регуляции экспрессии определенных генов. Однако состав
таких комплексов меняется в процессе развития, что приводит к изменению
набора работающих генов.

Каждый из перечисленных транскрипционных факторов содержит в сво-
ей структуре домены, обеспечивающие взаимодействие с другими фактора-
ми, формируя макромолекулярные комплексы, варьирующие по составу. Это
обеспечивает специализацию в выборе генов-мишеней.

Роль стволовых клеток в образовании

различных типов клеток в овариолах яичников дрозофилы

Лишь небольшая часть клеток среди тканей взрослого организма обладает
способностью сохранять свой потенциал после клеточных делений и произ-
водить дочерние клетки, способные к дифференциации. Именно эти клетки
позволяют поддерживать численность клеток определенного органа, выра-
батывая новые клетки взаимен естественно утраченных или поврежденных
в результате травмы. Дрозофила является уникальной моделью для изучения
генетических процессов, лежащих в основе регуляции поддержания ство-
ловых клеток и их способности генерировать клетки, способные к соответ-
ствующей дифференциации, благодаря небольшому числу стволовых клеток
и простоты их идентификации, а также генетической и методической раз-
работанности дрозофилы.

В качестве примера рассмотрим дифференциацию различных клеток
в овариолах яичников.

В яичнике дрозофилы существует три популяции стволовых клеток: гене-
ративные — GSC (gcrmline stem cell) — из них получаются питающие клетки
и ооцит; соматические — SSC (somatic stem cell) — являются родоначальника-
ми трех типов соматических клеток: полярных на заднем полюсе яйцевой ка-
меры, стеблевых, сохраняющих связь между яйцевыми камерами, и фоллику-
лярных, окружающих яйцевую камеру; сопровождающие (эскортные) — ESC
(escort stem cell) — в результате их деления появляются клетки внутреннего
слоя, соседствующие с развивающимися яйцевыми камерами (рис. 2.6).

У дрозофилы яичники парные, каждый из которых содержи) 12-16 овари-
ол (отдельные яйцевые трубки). Стволовые клетки в овариоле располагаются
в районе гермария. В каждой овариоле на апикальном конце 8-10 дисковид-
ных клеток, которые формируют терминальный филамент (TF — terminal
filament), затем следуют 5-7 клеток шапочки (СС — cap cell) (рис. 2.6). К этим
GSC - germline stem cell ермарий

Рис. 2.6. Стволовые клетки в овариоле яичников дрозофильп генеративные (GSC), эскортные
(ESC) и соматические (SSC). Центросома отмечена черным кружком [Kirilly, Xie, 2007]

клеткам примыкают две группы стволовых клеток: 2-3 GSC и 4-6 ESC. GSC
(стволовая генеративная клетка) производит способный к дифференциации
цистобласт. В результате поляризованного деления GSC одна из дочерних
клеток (цистобласт) утрачивает контакт с нишей, другая клетка, сохраняю-
щая контакт с нишей, поддерживает статус стволовой.

Цистобласт соседствует с дифференцирующимися потомками соматиче-
ских стволовых клеток ESC. Нишей для GSC являются клетки терминального
филамента (TF) и шапочки (СС). GSC непосредственно взаимодействует с СС
благодаря формированию комплекса адгезии и спектросомы. Спектросома —
это клеточная органелла, соседствующая с центросомой, которая редупли-
цируется перед каждым клеточным делением. Особенность спектросомы —
удерживать самую старую центриоль.

Четыре митотических деления цистобласта происходят с неполным цито-
кинезом и приводят к образованию яйцевой камеры, состоящей из 16 клеток,
из них только одна становится ооцитом. Достигнув этой стадии, яйцевая
камера окружается эпителиальными фолликулярными клетками, которые
являются потомками еше одной популяции соматических стволовых кле-
ток, — это 2-3 SSC в средней части гермария. Группа стволовых клеток SSC
производит три линии соматических клеток: полярные, стеблевые и фолли-
кулярные эпителиальные клетки, покрывающие яйцевую камеру.

Поддержание статуса стволовых клеток определяется, с одной стороны,
внешними сигналами, получаемыми из соседствующих с ними клеток ниши,
с другой — факторами, синтезируемыми самими стволовыми клетками. Сиг-
нальным белком, поступающим из клеток ниши, является Decapentaplegic
(Dpp) — гомолог белка bone morphogenic protein (BMP) у млекопитающих.
В клетках шапочки и внутреннего слоя гермария происходит синтез Dpp,
который активирует Mad-сигналинг в соседней GSC. Белок Dpp определя-
ет взаимодействие двух рецепторов серин-треониновых прогеинкиназ типа
I и II, что позволяет второму рецептору фосфорилировать и активировать
рецептор I, а тот в свою очередь фосфорилирует активатор Mad (Mother
against Dpp). Mad обеспечивает перемещение в ядро транскрипционного ак-
тиватора Medea (Med), который стимулирует экспрессию набора генов, нахо-
дящихся под контролем 1)рр. В то же время Dpp репрессирует транскрипцию
гена bag of marbles (bam) в GSC. Продукт гена bam нужен для дифференциа-
ции половых клеток. Комплекс Mad/Medea взаимодействует с последователь-
ностью в регуляторной области гена bam и подавляет его экспрессию в GSC.

Веретено деления GSC заякоривается на кортексе с помощью спектросо-
мы, что делает деление полярным с сохранением связи одной из дочерних
клеток с нишей. Дочерняя клетка, которая утрачивает такую связь, не испы-
тывает действия факторов сигнальной системы. В ней происходит активация
транскрипции гена bam. Это позволяет начать дифференциацию и одновре-
менно ограничить число возможных делений.

Взаимодействие GSC с клетками шапочки или терминального фила-
мента обеспечивает комплекс адгезии. В состав комплекса входят белки
E-cadherin — гомолог Shotgun, и 0-catenin — гомолог Armadillo. Комплекс
адгезии удерживает GSC в контакте с клетками ниши, чтобы обеспечить
передачу сигнала. Веретено деления GSC ориентируется перпендикулярно
нише благодаря спектросоме, которая состоит из цитоскелетных белков:
а- и [3-спектринов, аддуцин-подобного белка Hu-li tai shao (Hts) и анкирина.

Роль цитоскелета при асимметричном делении клеток

Причиной асимметричного деления клеток является полярность, которая
может быть обусловлена как внеклеточными, так и внутриклеточными сиг-
налами (рис. 2.7). Вследствие неслучайной ориентации веретена клеточного
деления дочерние клетки становятся разными. Определяющую роль в фор-
мировании полярности клетки, приводящей к ее асимметричному делению,
играет цитоскелет. Основными компонентами цитоскелета являются: микро-
трубочки (МТ), состоящие из тубулинов; актиновые филаменты; промежу-
точные филаменты, представленные виментином, а также спектринами.

Микротрубочки — полимер, состоящий из соединенных «голова к хво-
сту» гетеродимеров а- и |3-тубулина (рис. 2.8). Замечательным свойством
МТ является их внутренняя полярность: 0-тубулин ориентирован в сторону
быстрорастущего плюс-конца МТ, а-тубулин — медленнорастущего минус -
конца (рис. 2.8, б). Это свойство позволяет формировать клеточную поляр-
ность, зависящую от МТ. Гетеродимеры, образованные а- и |3-ту6улинами,
формируют линейные протофиламенты. Микротрубочка состоит из 13 про-
тофиламентов, прилегающих друг к другу латеральными поверхностями,
и представляет собой полый цилиндр диаметром около 25 нм (рис. 2.8, а)

Эта динамичная структура постоянно собирается и разбирается на обоих
концах, при этом рост МТ с плюс-конца происходит быстрее. К растущему
Рис. 2.7. Сигналы, создающие условия для асимметричного деления клеток: внеклеточные
(л и б) и внутриклеточные (в). Полярность образуется за счет:

а — одностороннего контакта стволовых клеток с клетками ниши; б— одностороннего
контакта с окружающими полярными клетками; в — полярного распределения внутри-
клеточных детерминант [Neumiiller, Knoblich, 2009]

концу МТ могут присоединяться димеры или более протяженные олигоме-
ры, в последнем случае скорость роста МТ значительно возрастает. Доказана
способность МТ к самосборке in vitro, но в клетке этому процессу способ-
ствуют многочисленные помощники. Динамичные изменения цитоскелета
нуждаются в локальном белковом синтезе, обеспечивающем возобновление
ресурсов, необходимых для сборки и роста тубулинового цитоскелета. Это
согласуется с тем, что с цитоскелетом ассоциированы определенные лока-
лизованные мРНК, соответствующие РНК-связывающие белки и факторы
инициации трансляции. Особый класс мРНК связан с МТ — microtubule-
bound mRNAs (MT-mRNAs). С цитоскелетом взаимодействуют как кодиру-
ющие белки, так и некодирующие РНК, из которых первые обеспечивают
локальный синтез белков, в том числе необходимых для роста цитоскелета,

Рис. 2,8. Внутренняя полярность в организации МТ:

а — поперечное сечение МТ; б — вид сбоку с обозначением полярности МТ
Рис. 2.9. Схематичное изображение клетки на стадии метафазы митоза

а вторые — выполняют структурную роль, привлекая РНК-связываюшие
белки и мРНК.

Динамичные изменения МТ связаны с их нуклеацией, заякориванием
и стабилизацией. Центром нуклеации (зарождения) МТ является центр
организации микротрубочек — МТОС (microtubule organization center).
В большинстве случаев основой МТОС является центросома, но есть и та-
кие МТОС, которые не содержат центросому. Тогда они называются псМТОС
(non-centrosomal). Ключевым фактором, ответственным за нуклеацию МТ,
является у-тубулин. Он входит в состав кольцевого комплекса у-тубулина
(y-TuRC — y-tubulin ring complex), состоящего из у-тубулина и кольцевых
белков (Grips — gamma-tubulin ring proteins).

Одной из важнейших функций МТ является формирование веретена де-
ления клетки. МТ веретена деления классифицируют (рис. 2.9) следующим
образом: 1) кинетохорные — плюс-концом взаимодействуют с центромерны-
ми районами хромосом (кинетохорами), а минус-концами собраны в районе
центросомы; 2) межполярные — отходят от центросомы, как и кинетохорные
МТ, но не взаимодействуют с кинетохорами, а перекрываются в центре вере-
тена и нужны для цитокинеза; 3) астральные (образующие астру) — от цен-
тросомы устремляют свои плюс-концы к клеточному кортексу, где они могут
взаимодействовать с актиновым цитоскелетом.

Минус-концами все микротрубочки взаимодействуют с центросомами.

Актиновый цитоскелет

Актин — это эволюционно консервативный белок, который в боль-
шинстве эукариотических клеток довольно многочислен. Актиновые фи-
ламенты — полимеры, состоящие из мономеров актина и включающие как
1 2

Рис. 2.10. Актомиозиновый цитоскелет. Актиновая фибрилла представлена
филаментозным F-актином.

1 и 2 — разбирающийся и растущий конец соответственно, к которому присоединяются
мономеры глобулярного G актина. По: (Зверев и др., 2016 с изменениями]

одинаковые, так и разные формы актина, например а-, [3- или у-актин. Фи-
ламентозный актин, называемый F-актином, — это спиральный полимер,
собирающийся из мономеров актина (G-actin — globular actin) и образующий
актиновые филаменты.

Актиновые филаменты — динамичная структура, обладающая, как и МТ,
полярностью и имеющая растущий и разбирающийся концы (рис. 2.10).
In vivo динамичным изменениям актиновых филаментов способствуют та-
кие факторы, как комплекс, включающий белок Arp2/3 (actin related protein)
и различные актин-связывающие белки. Актиновый цитоскелет играет опре-
деляющую роль в движении клетки, для которого нужна быстрая полимери-
зация актина в растущей кромке клетки.

Способность актинового цитоскелета реагировать на внеклеточные сиг-
налы делает движение направленным в зависимости от получаемого сигнала,
который может быть аттрактивным (притягивающим) или отталкивающим.
В зоне активного роста клетки образуются ламеллоподии и филоподии (вы-
росты клетки), содержащие филаментозный актин и обогащенные мРНК бе-
та-актина. Присутствие мРНК бета-актина способствует локальному синтезу
актина, необходимому для формирования и роста ламеллоподии и филопо-
дий. Лучше всего изучена роль локализованной трансляции мРНК бета-ак-
тина в рефляции роста отростков нервных клеток и ми! рации фибробластов
у позвоночных.

При получении соответствующего сигнала в ростовом конусе аксона может
протекать локализованный синтез бета-актина, что определяет рост аксона.
мРНК бета-актина обогащает лидирующую кромку фибробластов и расту-
щие конусы отростков нервных клеток. В отростках нервных клеток при
формировании синаптических контактов происходит локальная трансляция
мРНК бета-актина, при этом важную роль играют РНК-связывающие белки,
взаимодействующие с мРНК. Фактор элонгации трансляции (EF1 — elongation
factor 1) является актин-связывающим белком, что свидетельствует о взаи-
модействии аппарата трансляции с цитоскелетом. Полимеризация актина
и активация киназы МАР нужны и для избирательной локализации мРНК
Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated) в районе синапсов, которые были
активированы недавно, что важно для процессов памяти и обучения.

Актиновые и тубулиновые элементы цитоскелета тесно взаимодейству-
ют. Известны белки, осуществляющие связь между этими цитоскелетными
системами. По МТ в район клеточного кортекса, обогащенного актиновыми
филаментами, доставляются соответствующие мРНП (рибонуклеопротеи-
ны — комплексы, состоящие из РНК и белков). В районе взаимодействия
МТ с актиновым цитосклетом происходит заякоривание комплексов мРНП.
Асимметрия в распределении локализованных мРНП является определяю-
щей в поддержании статуса стволовых клеток.

Взаимодействие актинового и тубулинового цитоскелетов

Актиновый цитоскелет формирует структуру клеточного кортекса, кото-
рый располагается в районе клеточной мембраны. Связь актинового скелета
с клеточной мембраной в районе клеточного кортекса зависит от белков
Ezrin, Radixin и Moesin (ERM). С кортикальным слоем клетки взаимодейству-
ют плюс-концы МТ.

С растущим плюс-концом МТ связан комплекс белков +TIPs (Microtubule
plus-end tracking proteins). Он контролирует динамичные изменения цитоске-
лета, важные для деления и миграции клеток, а также процессов морфогенеза.
Белок EBI (End Binding 1) и его гомологи эволюционно консервативны, они
обеспечивают взаимодействие комплекса +TIPs с плюс-концом МТ. Боль-
шинство белков, взаимодействующих с ЕВ1, содержат последовательность
Ser-x-Ile-Pro (SxlP), названную MtLS (Microtubule tip Localization Signal), ко-
торая используется многими компонентами +TlPs, включая раковый супрес-
сор — АРС (Adenomatous Polyposis Coli), трансмембранный белок — STIM1
(Stromal Interaction Molecule-1) и моторный белок кинезин — МСАК (Mitotic
Centromere-Associated Kinesin).

Взаимодействие плюс-концов МТ с клеточным кортексом играет особую
роль в фиксации веретена деления клетки за счет заякоривания плюс-концов
астральных МТ в районе клеточного кортекса на полюсах клетки. В заяко-
ривании принимают участие следующие белки: у млекопитающих — это
белок Leu-Gly-Asn-enriched protein, который является гомологом белка Pins
(Partner of inscuteable) Drosophila. Белок I.GN взаимодействует с тяжелой це-
пью динеина. Существенную роль в организации клеточного кортекса игра-
ет белок Gai, который представляет собой одну из субъединиц гримерных
G-белков. Динеин взаимодействует с комплексом Gai/LGN/NuMA (Nuclear
Mitotic Apparatus) и транспортирует этот комплекс по астральным МТ.
LGN является основным кофактором, который удерживает цитоплазмати-
ческий динеин в районе клеточного кортекса. Динеин — моторный белок —
осуществляет перемещение связанных с ним комплексов в сторону минус-
конца хМТ. Поскольку МТ закреплены в клеточном кортексе благодаря вза-
имодействию с комплексом Gai/LGN/NuMA, динеин действует па веретено
как тянущая сила, направленная в сторону клеточной мембраны. В ряде
случаев ориентация веретена деления клетки является существенным фак-
тором в определении судьбы дочерних клеток: одна из дочерних клеток,
не утрачивая связь с нитей, сохраняет статус стволовой, а другая — теряет
такую связь и, не получая соответствующих сигналов от клеток ниши, встает
на путь дифференциации.

Роль актомиозинового цитоскелета

в обеспечении миграции клеток и цитокинеза

Сеть актиновых филаментов внутри выростов клеток — филоподий и ла-
меллоподий — это высокодинамичная структура. Взаимодействие актиновых
филаментов с моторным белком — миозином — способствует сокращению
филоподий во время движения различных типов клеток, включая нейроны,
фибробласты и кератиноциты (рис. 2.10). Перед сокращением вырост ламел -
лоподий или филоподий в лидирующей кромке достигает максимума. Со-
кращение актомиозинового цитоскелета происходит за счет скольжения тро-
помиозина по актиновым филаментам. Это обеспечивает миграцию клеток
и цитокинез. Актомиозиновый компонент цитоскелета сосредотачивается
в клетках, располагающихся на границе отдельных структур многоклеточ-
ного организма (компартментов). Актомиозиновый цитоскелет связывает
митотически делящиеся клетки эпидермиса, которые создают барьер, не по-
зволяющий клеткам определенной структуры проникать в соседние компар-
тменты. Целостность и прочность клеточных слоев обеспечивают адгези-
онные контакты. Для установления этих контактов необходима трансляция
локализованных мРНК актина и других мРНК, вовлеченных в обеспечение
межклеточной коммуникации и динамичных изменений цитоскелета.

Центросома

Полярность клетки важна как для стволовых клеток, так и для диффе-
ренцированных. Формируется она благодаря неслучайному расположению
клеточных структур, среди которых значительную роль играет центросо-
ма. Центросома состоит из пары центриолей, расположенных ортогональ-
но по отношению друг к другу. Кроме центриолей центросома содержит
околоцентриольный матрикс (РСМ — Pericentriolar Material). Положение
центросомы в клетке влияет на ориентацию веретена деления, а это в свою
очередь на положение клетки в многоклеточном организме. Материнская
и дочерняя центросомы могут различаться по содержанию эффекторных
молекул. Поэтому распределение материнской и дочерней центросом между
дочерними клетками становится причиной различий между этими клетками.

В клеточном цикле центросома дуплицируется один раз (рис. 2.11).
До дупликации центросома содержит пару центриолей: материнскую (более

Дезориентация
центриолей

Рис. 2.11. Поведение центриолей в клеточном цикле. А — поперечный срез центриоли
(цилиндр из девяти радиальных триплетов микротрубочек) (Мамон, 20081
старую) и дочернюю (построенную перпендикулярно материнской). Каждая
центриоль имеет форму цилиндра, продольные стенки которого включают
девять триплетов МТ, называемых радиальными, и расположенных по кру-
гу [9(3)+ 0] (А на рис. 2.11). Они создают радиальную симметрию на по-
перечном срезе. Вокруг материнской центриоли концентрируются факторы,
формирующие околоцентриольный матрикс. Центросома является центром
организации микротрубочек веретена деления, в ее районе сосредотачивают-
ся минус-концы МТ. По МТ в район центросомы перемещаются различные
молекулы и макромолекулярные комплексы с помощью моторного белка
динеина, который собирает в районе центросомы белки и РНК.

Дупликация центросом может происходить при отсутствии ядра, она
контролируется цитоплазматическими факторами. Это позволило предпо-
ложить, что центросома, как и другие органеллы, например митохондрии или
хлоропласты, содержит нуклеиновые кислоты как носители информации,
способные к дупликации. Но в центросомах не нашли ДНК, тогда как РНК
там присутствует. Вопрос о том, имеет ли центросома симбиотическое про-
исхождение, как митохондрии, ост ается открытым. Известны два механизма
появления новых центриолей: матричный и de novo, хотя и в последнем слу-
чае нельзя исключить, что для построения новой центриоли нужна матрица.

Какие конкретно молекулы служат матрицей при построении дочерней цен-
триоли — до сих пор неизвестно. Используются ли при этом матрицы первого
рода, представляющие собой молекулы нуклеиновых кислот, или это кон-
формационные матрицы, обеспечивающие самосборку макромолекулярных
комплексов и имеющие белковую природу, — на этот вопрос еще предстоит
ответить. Центриоли дуплицируются, как только клетка входит в S-фазу кле-
точного цикла, при этом дочерние центриоли растут ортогонально (под пря-
мым углом) по отношению к родительским и сохраняют такую конфигурацию
до вступления в митоз (рис. 2.11). Дупликация центриолей осуществляется
полуконсервативно и согласована с репликацией ДНК. Нарушение такой со-
гласованности может привести к появлению дополнительных центросом и, как
следствие, к анеуплоидии. На стадии G2 пары центриолей, каждая из которых
представлена материнской и построенной перпендикулярно к ней дочерней,
расходятся и принимают участие в формировании полюсов веретена деления.
В конце митоза и в ранней G1 можно видеть, как пара центриолей в составе
каждой центросомы утрачивает ортогональную ориентацию. Именно разь-
единение центриолей способствует их последующей дупликации.

Ресничка

Превращение центриоли в базальное тельце реснички (cilia) — про-
цесс эволюционно консервативный, характерный для разных таксонов —
от жгутиковых водорослей до млекопитающих. На стадии G1 в интерфазе
клеточного цикла в некоторых дифференцированных клетках центриоли пе-
ремещаются в район клеточной мембраны, создавая основу (базальное тель-
це) формирования реснички — выроста клетки. У млекопитающих из двух
центриолей, попавших в клетку после митоза, только старшая центриоль
превращается в базальное тельце реснички.

Ресничка выполняет сенсорную или двигательную функцию. Сенсор-
ные — это ренальные, панкреатические, фоторецепторные и ольфакторные
реснички клеток позвоночных. Реснички обнаружены на концах дендритов
сенсорных нейронов у дрозофилы и нематоды. У млекопитающих клетки
трахей, содержащие много ресничек, способны продуцировать 200-300 цен-
триолей.

Реснички, характерные для клеток, обеспечивающих различные сенсорные
процессы: восприятие запахов, механо- и фоточувствительность — относятся
к типу неподвижных, или первичных. На поперечном срезе базальное тельце
реснички имеет 9-членную радиальную симметрию, создаваемую девятью
триплетами МТ [9(3) + 0]. Большинство подвижных ресничек, как и жгутик
(аксонема сперматозоида), помимо радиальных, имеют еще и центральную
пару МТ 19(3) + 2]. Подвижность жгутика или подвижной реснички опреде-
ляется структурами, называемыми динеиновыми ручками.

Дефект в формировании реснички лежит в основе таких особенностей
развития человека и его заболеваний, как зеркальное расположение внутрен-
них органов, дистрофия сетчатки, ожирение, поликистоз почки, а нарушение
структуры жгутика сперматозоидов приводит к мужскому бесплодию.

Преобразование центриоли в ресничку или жгутик (flagellum) обеспечи-
вает клетку уникальными возможностями, но предотвращает возможность
дальнейших клеточных делений. Если деления такой клетки все-таки проис-
ходят, то перед делением ресничка разбирается с формированием центриоли.

Роль цитоскелета в слиянии пронуклеусов

при оплодотворении и первом делении зиготы

У дрозофилы мейоз в ооците заканчивается образованием четырех гапло-
идных наборов хромосом, которые располагаются гандемно и ориентиро-
ваны радиально по отношению к поверхности ооцита. Тот набор хромосом,
который находится далее всего от поверхности ооцита, двигается к центру
ооцита и формирует женский пронуклеус. Центросомных микротрубочек
или центросомного материала, связанных с женским пронуклеусом, у дрозо-
филы обнаружить не удалось.

Центросома в ооцит попадает вместе со сперматозоидом. Она-то и фор-
мирует астру из МТ. До того момента как пронуклеусы встретятся, из двух
центров, организующих МТ и связанных с мужским пронуклеусом, отходят
хорошо развитые радиальные пучки МТ. Как только мужской и женский
Рис. 2.12. Роль цитоскелета в сближении пронуклеусов при оплодотворении
у млекопитающих. Сперматозоид проникает в яйцеклетку вместе с хвостом и привносит
центросому [Payne et al., 2003]

пронуклеусы сблизятся, пучки МТ и центросомы, связанные с мужским про-
нуклеусом, начинают разделяться. В этот момент уже можно четко различить
две астры МТ. В прометафазе первого митотического деления рост МТ вере-
тена приводит к образованию аппарата митотического деления, соединенно-
го с двумя группами хромосом (отцовских и материнских) в районе экватора.
От каждого полюса отходит по два отдельных пучка микротрубочек веретена,
каждый удерживает разделенные наборы родительских хромосом. К концу
метафазы два родительских набора хромосом располагаются настолько близ-
ко друг к другу, что их пространственная разобщенность уже неразличима,
хотя материнский и отцовский набор хромосом претерпевают митоз раздель-
но. Такой митоз называется гономерическим.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку за-
вершается мейоз в ядре ооцита и формируется гаплоидный женский про-
нуклеус, а ядро сперматозоида, попавшее в яйцеклетку, становится мужским
пронуклеусом (рис. 2.12). От центросомы, проникающей в яйцеклетку вместе
со сперматозоидом, растут МТ в виде астры, а их плюс-концы достигают
женского пронуклеуса. Как только МТ достигают женского пронуклеуса,
возникает контакт между плюс-концами МТ, растущими от мужского про-
нуклеуса, и структурами, находящимися на поверхности женского прону-
клеуса. Этот контакт является сигналом к движению женского пронуклеуса
в сторону мужского.

Комплекс динеина и динактина обеспечивает перемещение груза (жен-
ского пронуклеуса) в сторону минус-конца МТ, т. е. в сторону мужского про-
нуклеуса, связанного с центросомой (рис. 2.12). Промежуточные и тяжелые
цепи динеинов преимущественно концентрируются вокруг женского про-
нуклеуса, а субъединицы динактина pl50Glued, р50 и р62 локализуются на по-
верхности обоих пронуклеусов. Введение антител к динеину и динактину
блокирует миграцию женского лронуклеуса в оплодотворенной яйцеклет-
ке. Результаты иммунопреципитации показали, что субъединица динактина
pl50'jlucd взаимодействует с белками порового комплекса, а также с вименти-
ном, образующим промежуточные филаменты, и динеином.

Как только плюс-концы МТ достигают женского пронуклеуса, в районе
которого концентрируется промежуточные и тяжелые цепи динеинов, созда-
ются предпосылки для перемещения женского пронуклеуса. Динактин вместе
с виментином, взаимодействуя с нуклеопоринами (белками ядерных поровых
комплексов), создают сайты прикрепления для плюс-концов МТ на оболочке
женского пронуклеуса. Когда их плюс-концы дорастут до женского прону-
клеуса, они могут закрепиться в районе поровых комплексов на поверхно-
сти женского пронуклеуса, а динеин-динактиновый комплекс обеспечивает
транспорт женского пронуклеуса к минус-концам МТ. Нарушения слияния
пронуклеусов могут приводить к стерильности.

У нематоды проникновение сперматозоида в яйцеклетку определяет
асимметрию первого деления дробления после оплодотворения. Организа-
ция веретена первого деления дробления зиготы устанавливает различия
между двумя дочерними клетками. При оплодотворении та часть яйцеклетки,
куда проникает сперматозоид со своей «отцовской» центросомой, становится
задним полюсом будущего эмбриона (рис. 2.13).

Перед оплодотворением Р-гранулы — рибонуклеопротеиновые частицы,
необходимые для формирования клеток зачаткового пути (линии генератив-
ных клеток), — равномерно распределяются в яйце нематоды. С проникно-
вением сперматозоида в яйцеклетку гранулы перемещаются на задний полюс
одноклеточной зиготы (рис. 2.13). Изменения, происходящие в яйцеклетке,
в том числе особенности формирования веретена первого деления митоза,
приводят к поляризации оплодотворенной яйцеклетки, а после деления —
к появлению двух разных дочерних клеток: передней АВ — более крупной,
и задней Р1 — меньшего размера. Известны гены, мутации которых прояв-
ляются в том, что получаемые в результате первого деления клетки АВ и Р1
не различаются по размеру.

Эти гены получили название Par (partitioning defective). У нематоды шесть
генов — Раг-1-Раг-6 — участвуют в формировании полярности оплодот-
воренной яйцеклетки. Мутации этих генов характеризуются материнским
эффектом: гермафродитные особи, гомозиготные по рецессивной мутации
гена с материнским эффектом, жизнеспособны, но не могут производить
жизнеспособное потомство. Оно гибнет на эмбриональной стадии разви-
тия. Продукты генов Par формируют полярность одноклеточной зиготы,
локализуясь в клеточном кортексе (часть цитоплазмы, граничащая с кле-
точной мембраной). Белок PAR-2, содержащий домен RING finger, вместе
Рис. 2.13. Асимметричное первое деление зиготы нематоды Caenorhabditis elegans:
а — центросома, попадающая в яйцеклетку вместе со сперматозоидом; б — изменение
состава клеточного кортекса на заднем (Р) полюсе яйцеклетки: появление белков PAR 1
и PAR 2, на переднем (А) полюсе остаются PAR 3, PAR b и РКС 3; в — плюс конец МТ, ори
вотированный в сторону заднего полюса, подтягивает центросому к клеточному кортексу
заднего полюса эмбриона с участием белков Gai, GPR-1/2 и L1N-5

с белком PAR-1 располагаются в задней части будущего эмбриона, a PAR3
и PAR-6, взаимодействуя своими доменами PDZ с атипичной протеинкиназой
С (РКС-3), формируют комплекс в передней части. Несмотря на то что раннее
развитие дрозофилы и млекопитающих отличается от того, что характерно
для нематоды, у всех объектов есть гены, гомологичные генам Par нематоды,
и эти гены вовлечены в формирование полярности клеток, определяющей
фиксированную ориентацию веретена деления. Ген Раг-1 кодирует серин-
треониновую протеинкиназу.

В кортексе переднего полюса одноклеточного эмбриона С. elegans при-
сутствуют три белка, вовлеченные в контроль внутренней клеточной поляр-
ности. Это — PAR-3, который содержит три домена PDZ; PAR-6, имеющий
один домен PDZ, домен CRIB-like и G-protein-binding, а также РКС-3, которая
получила название атипичной протеинкиназы С (аРКС, РКС(). Гомологи
перечисленных белков у дрозофилы вовлечены в кон гроль асимметричных
делений нейробластов, а у млекопитающих гомологи входят в состав белко-
вого комплекса тРагба, который формирует внутреннюю полярность эпите-
лиальных клеток, локализуясь в апикальной области этих клеток.

Проникновение сперматозоида в яйцеклетку ведет к поляризации ци-
топлазматических детерминант. Сигналом к этому служит отцовская цен-
тросома, способствующая модификации актинового цитоскелета в клеточ-
ном кортексе в районе проникновения сперматозоида. На будущем заднем
полюсе эмбриона в районе клеточного кортекса появляются PAR-1 и PAR-2
(рис. 2.13, б). А комплекс PAR-3, PAR-6 и аРКС сосредотачивается на будущем
переднем полюсе. При этом PAR-2 препятствует детерминантам передней ча-
сти эмбриона занять позиции в его заднем полюсе, а РКС-3 фосфорилирует
PAR-2, нс давая этому фактору занять позицию в передней части эмбриона.
Такая поляризация определяет ориентацию веретена первого деления зиготы
после слияния пронуклеусов. Веретено деления располагается параллельно
переднезадней оси эмбриона.

Комплекс белков Gai, GPR-1/2 и LIN5 взаимодействует, с одной стороны,
с клеточным кортексом, а с другой — с комплексом динеин, LIS-1 и динак-
тин, который движется по МТ к их минус-концу, тем самым подтягивая
центросому заднего полюса эмбриона к клеточному кортексу (рис. 2.13, в).
Веретено становится асимметричным, его середина смещается в сторону за-
днего полюса эмбриона. В результате цитокинеза появляются две клетки,
различающиеся но размеру: передняя клетка АВ — большая, и задняя клетка
Р1 — меньшая по размеру. Каждая из двух дочерних клеток детерминирована
в развитии по своему пути.

***

Цитоскелет в регуляции процессов развития выполняет следующие
функции:

• определяет морфологию клетки и ее перемещения;

• образует транспортную систему клетки для перемещения макромолеку-
лярных комплексов и органелл, в том числе ядер;

• контролирует распределение хромосом между дочерними клетками
и цитокинез;

* определяет асимметричное расположения ядер в клетках, важное для
поддержания статуса стволовых клеток;

• формирует клеточный кортекс, взаимодействующий с плюс-концами
астральных микротрубочек и комплексами клеточной адгезии, обеспе-
чивающими межклеточную коммуникацию.

Контрольные вопросы

1. Что является отличительными особенностями стволовых клеток?

2. Что такое индуцированные плюрипотентные стволовые клетки?

3. Какие факторы способствуют созданию полярности клетки?

4. В чем особенности асимметричного деления клеток?

5. Какова роль цитоскелета в формировании клеточной полярности?

ЛИТЕРАТУРА

Зверев А. А., Аникина Т.А., Крылова А. В., Зефиров Т.П. Физиология мышц- учеб.-метод, посо-
бие. Казань: Казан, федер. ун-т. 2016. 41 с.

Мамон Л. А. Центросома как «мозг» животной клетки И Цитология. 2008. Т. 50. № 1. С. 5-17.
Bartlow К. М. Identification of transcriptional targets of the nerve injury induced transcription factor
Soxll. Phi) Th. 2011. Pittsburgh: Univ, of Pittsburgh.

Chhabra S.N., Booth B.W. Asymmetric cell division of mammary stem cells // Cell Div. 2021.
Vol. 16(1). P. 5.

Gurdon J. B. The Developmental Capacity of Nuclei taken from Intestinal Epithelium Cells of Feeding
Tadpoles // Journal of Embryology and Experimental Morphology. 1962. Vol. 10. P. 622-640.

KirillyD., XieT Ihe Drosophila ovary: an active stem cell community // Cell Res. 2007. Vol. 17.
P. 15-25.

Knoblich I. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division // Cell. 2008. Vol. 132 (4). P. 583-597.

Neumiiller R. A., Knobitch J, Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications
for stem cells and cancer // Genes Dev. 2009. Vol. 23. P. 2675-2699.

Pan G.J., Chang Z. Y., Schbler H. R., Pei D. Stem cell pluripotency and transcription factor Ocl4 // Cell
Res. 2002. Vol. 12. P. 321-329.

Payne C., Rawe V„ Ramalhu-Santos Simerly C., Schatten G. Preferentially localized dynein and
perinuclear dynactin associate with nuclear pore complex proteins to mediate genomic union
during mammalian fertilization // J. Cell Sci. 2003. Vol. 116. P. 4727-4738.

Sunchu B„ Cabernard C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division 11 Develop. 2020.
Vol. 147(13). dev 167650.

Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult
fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. Vol. 12б. P. 663-676.

Turner R. Taking Мус to the Max // Nat. Struct. Biol. 2003. Vol. 10. P. 157.

Vangapandu H., Ai IV. Kruppel like factor 4 (KLF4): a transcription factor with diverse context-
dependent functions // Gene Iher. Mol. Biol. 2009. Vol. 13. P. 194-203.

Wilcockson S. G., Ashe И. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically
receive and attenuate BMP signaling // Dev. Cell. 2019. Vol. 5u. P. 296-312, e295.
Глава з

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

РАННЕГО ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

DROSOPHILA MELANOGASTER

Исследования генетических механизмов, контролирующих развитие,
начинались на самом разработанном генетическом объекте — дрозофиле.
Именно на дрозофиле была показана роль генов в установлении осей сим-
метрии организма; доказано, что клетки определяют свое положение в про-
странстве по градиентам морфогенов; открыты Иох-гены. Дальнейшие иссле-
дования показали, что многие принципы генетического контроля развития,
открытые на дрозофиле, справедливы и для других животных. За открытие
генетического контроля ранних стадий эмбрионального развития Нобелев-
скую премию по физиологии и медицине (1995) получили Э. Льюис, К. Нюс-
сляйн-Вольхард и Э. Вишауз.

Гены, контролирующие ранние этапы эмбрионального развития у дрозо-
филы, делятся на три группы:

1. Гены материнского эффекта. Работают в оогенезе в питающих и фол-
ликулярных клетках. Продукты этих генов попадают в ооцит и формируют
позиционную информацию или влияют на ее реализацию.

2. Гены сегментации, или зиготические гены. Начинают экспрессироваться
спустя 1,5-2 ч после оплодотворения на стадии синцитиальной бластодермы.
В порядке их экспрессии во времени гены сегментации разделяются на три
под! руины:

a) gap — гены пробелов;

б) pair-rule — гены правила парности сегментов;

в) segmental polarity — гены полярности сегментов.

3. Гомеотические гены. Влияют не на размер или число сегментов, а фор-
мирую! фенотип каждого сегмента. Мутации этих генов приводят к тому, что
на месте одного сегмента тела развивается другой. Это группа регуляторных
генов, которые содержат высококонсервативную последовательность — го-
меобокс, кодирующую ДНК-связывающий гомеодомен. Белки, кодируемые
этими генами, обладают морфогенетическим действием, являясь факторами,
контролирующими транскрипцию других генов. Гены НОХ организованы
в кластеры.
Гены материнского эффекта

Формирование и реализация позиционной информации в ооците
посредством генов материнского эффекта

Концепция позиционной информации была сформулирована Л. Вулпер-
том в 1989 г. Развитие многих животных предопределено организацией яй-
цеклетки (ооцита). Позиционная информация создается благодаря неслу-
чайному распределению в ооците продуктов генов материнского организма
в виде белка или РНК.

Тело дрозофилы состоит из набора повторяющихся, но не идентичных мо-
дулей (сегментов) и имеет несегментированные структуры на заднем и перед-
нем концах тела. В каждом сегменте работает группа генов, определяющих
морфообразовательные процессы, происходящие в конкретном модуле. Та-
кая пространственная организация взрослого насекомого начинает форми-
роваться еще в яйце (ооците).

Для того чтобы понять, как формируется позиционная информация
в ооците дрозофилы, необходимо рассмотреть особенности оогенеза у этого
объекта. Яичник самки дрозофилы — парный орган, в каждом из которых
по 16-20 овариол. Каждая овариола имеет зону гермария и вителлария. В об-
ласти гермария происходят митотические деления стволовых генеративных
клеток, появляются цистобласты (см. рис. 2.6), а в результате их деления —
16-клеточная циста, окруженная фолликулярными клетками, — яйцевая
камера. Область вителлария представлена яйцевыми камерами, располага-
ющимися в порядке их созревания. Оогенез у дрозофилы — от появления
цистобласта до формирования зрелого ооцита — длится почти неделю.
По морфологии яйцевых камер процесс их развития делят на 14 стадий
по Кингу (рис. 3.1). На 7-й стадии происходит перестройка цитоскелета
в ооците, что приводит к перемещению ядра ооцита от заднего полюса в пе-
реднеспинную часть ооцита. Трапскрипционно активные питающие клетки
обеспечивают рост ооцита и деградируют в конце оогенеза, а фолликулярные
клетки — формирование хориона, покрывающего яйцо.

из овариолы яичника у D. melanogaster
Рис. 3.2. 16-клеточная циста, возникающая в результате четырех
последовательных митотических делений цистобласта

Яйцеклетка (ооцит) у дрозофилы созревает в яйцевой камере, родоначаль-
ницей которой является диплоидная гениальная клетка (цистобласт), которая
претерпевает четыре последовательных митотических деления с неполным
цитокинезом. В результате получается 16 клеток, связанных кольцевыми ка-
налами (рис. 3.2). Такое сообщество неразделенных клеток называется син-
цитием. Каждая клетка синцития, в зависимости от числа предшествующих
делений, имеет от одного до четырех кольцевых каналов, соединяющих эту
клетку с соседней или соседними. Только две клетки синцития яйцевой камеры
имеют по четыре кольцевых канала, из них одна становится ооцитом (рис. 3.2,
указана стрелкой). В результате первого митотического деления цистобла-
ста получается две клетки. Именно эти две исходные клетки, после заверше-
ния последовательных митозов и формирования 16-клеточной цисты, имеют
но четыре кольцевых канала. Асимметричное распределение нехромосомных
детерминант между этими дочерними клетками определяет их дальнейшую
судьбу. У остальных клеток цисты три, два или один кольцевой канал. Пятнад-
цать клеток цисты становятся питающими, или трофоцитами. Ядра питающих
клеток из-за эндоредупликации ДНК содержат политенные хромосомы. Они
транскрипционно активны, тогда как в ооците транскрипция не происходит.

Все клетки яйцевой камеры связаны между собой структурой — фьюсо-
мой. Молекулярными компонентами фьюсомы являются аддуцин-подобный
белок Hts (hu-li tai shao) и а-спектрин. Эта структура, проникающая в каждую
клетку через кольцевой канал, состоит из кортикальных цитоскелетных ком-
понентов и ассоциирует с микротрубочками и центросомами.

Ооцитом становится клетка, которая содержит самую «старую» центри-
оль, которая напрямую наследуется после асимметричного деления ство-
ловых клеток зародышевой линии и сохраняется в процессе дальнейшего
развития ооцитов, таким образом, уже представляя собой маркер для иден-
тификации ооцита в начале его формирования и на последующих стадиях
развития [Riparbelli et al., 2021]. Детерминация ооцита зависит и от фьюсо-
мы, которая контролирует в дальнейшем попадание в ооцит всех центросом
с образованием центра образования микротрубочек — МТОС. После исчез-
новения фьюсомы спецификация ооцита проявляется в том, что в кортексе
на заднем конце ооцита концентрируется белок Раг-1, тогда как в кортексе
на переднелатеральном конце ооцита локализуются белки Par-6, Baz, Cdc42
и аРКС. Это определяет полярность ооцита.

Яйцевая камера окружена фолликулярными клетками, имеющими мате-
ринское происхождение. Родоначальницами фолликулярных клеток являют-
ся соматические стволовые клетки. Геном ооцита не работает, а рост ооцита
происходит за счет факторов, поступающих из 15 питающих клеток яйцевой
камеры и фолликулярных клеток. Одни факторы распределяются в ооците
равномерно, а другие — формируют позиционную информацию. Гены, про-
дукты которых накапливаются в ооците, являются генами с материнским
эффектом. Продукты этих генов определяют события, разворачивающиеся
в раннем эмбрионе дрозофилы. Это особенно важно, поскольку в этот период
нет транскрипции зиготических генов. Мутации генов с материнским эффек-
том приводят к женской стерильности. Они могут не влиять на жизнеспособ-
ность материнского организма в гомозиготном состоянии, но способствуют
гибели потомства самок, гомозиготных по мутациям с летальным материн-
ским эффектом, причем гибнет все потомство, независимо от их генотипа.

Свойства мутаций генов с материнским эффектом:

1. Гомозиготы по рецессивной мутации жизнеспособны, их можно полу-
чить в потомстве гетерозиготных самок и гетеро- или гомозиготных по этой
мутации самцов.

2. Самки, гомозиготные по таким мутациям, откладывают внешне абсо-
лютно нормальные яйца, но из этих яиц потомство не развивается, и это
не зависит от генотипа яйца.

3. Самцы, гомозиготные по этим мутациям, дают жизнеспособное по-
томство, если скрещиваются с самками, не гомозиготными по мутации генов
с материнским эффектом.

4. Гибель потомства происходит из-за нарушений пространственной ор-
ганизации эмбриона. У погибших эмбрионов нарушения часто проявляются
в том, что какие-то сегменты эмбриона отсутствуют, зато другие могут быть
представлены в двойном количестве. При этом погибшие эмбрионы имеют
сходный фенотип.
Функции генов с материнским эффектом:

1. Регуляция транскрипции зиготических генов и генов с материнским
эффектом.

2. Регуляция экспрессии генов с материнским эффектом на уровне транс-
ляции.

3. Обеспечение неслучайной локализации продуктов генов с материнским
эффектом за счет следующих механизмов:

а) пост роения т ранспортной сети и кортикального цитоскелета;

б) осуществления транспорта макромолекул;

в) формирования сигнальной системы (лиганды, рецепторы, адаптерные
молекулы);

г) деградации продуктов (мРНК или белков) генов с материнским эф-
фектом.

В ооците продукты генов с материнским эффектом часто распределяются
неравномерно, формируя градиенты концентрации. При этом возникает два
вопроса:

1. Как устанавливается градиент концентрации и как он поддерживается?

2. Как непрерывный градиент превращается в дискретный, что ведет
к формированию cei ментов или парасегментов насекомого?

Экспрессия материнских генов и формирование градиентов

Градиенты макромолекул создаются мРНК или белками, которые являются
продуктами генов материнского эффекта. Уже в яйце существует переднезад-
ний (АР) и дорзовентральный (DV) градиенты морфогенетических факторов.

Гены АР-оси представлены тремя группами генов, которые отвечают:
А-системы — за сегментацию головы и торакса; Р-системы — за сегментацию
брюшка и формирование генеративных клеток; Т-системы — за формиро-
вание терминальных структур: акрона (передняя несегментированная часть
эмбриона) и тельсона (задняя несегментированная часть э.мбриона). Двойные
мутанты (мутации генов из разных систем) показали независимость, за од-
ним исключением: для развития акрона необходимо функционирование как
генов A-системы, так и генов Т-системы.

В работе всех названных систем просматривается общий принцип:

1. Продукты этих генов синтезируются либо фолликулярными, либо пи-
тающими клетками и локализуются в специфическом районе яйца, функци-
онируя как пространственный сигнал.

2. В каждой системе есть транскрипционный фактор, который запускает
или репрессирует зиготические гены-мишени.

3. Соответствующий транскрипционный фактор распределяется с учетом
градиента концентрации, что в свою очередь определяет пространственные
границы экспрессии одного или нескольких зиготических генов.
4. Комбинация продуктов генов трех систем эмбриона определяет экс-
прессию зиготических генов-мишеней, образуя на первом этапе семь районов
по переднезадней оси. DV-система генов контролирует формирование трех
районов но дорзовентралъной оси. Затем, при взаимодействии зиготиче-
ских генов, работающих на каждом из участков, происходит формирование
сегментации.

Роль цитоскелета в формировании позиционной информации в ооците

В перемещении продуктов генов с материнским эффектом из питающих
клеток в ооцит большую роль играет цитоскелет. У дрозофилы на на-
чальном этапе формирования яйцевой камеры (стадии 1-6) минус-концы
микротрубочек располагаются в единственном центре организации микро-
трубочек — МТОС, локализованном в ооците, в то время как дистальные
плюс-концы микротрубочек через кольцевые каналы в составе фьюсомы
уходят в питающие клетки. В район МТОС мигрируют центросомы всех
клеток цисты. До стадии 6 ядро находится в районе заднего полюса ооцита
(рис. 3.3). На стадиях ооцита 7-8 происходит реорганизация цитоскеле-
та. Локализованный на заднем конце МТОС и ядро ооцита перемещаются
в переднюю часть ооцита. Сигнал, вызывающий перестройку цитоскелета,
поступает из фолликулярных клеток. Основным элементом сигнальной си-
стемы является белок Gurken (Grk).

мРНК grk локализована на заднем полюсе ооцита на стадиях 2-6. Белок
Grk является гомологом трансформирующего ростового фактора — TGFa
(Transforming Growth Factor а). Этот белок появляется в результате транс-
ляции локализованной мРНК grk, взаимодействует с рецепторами EGFR
(Epidermal Growth Factor Receptor), расположенными в фолликулярных

Стадии

Рис. 3.3. Перестройка цитоскелета в оогенезе у D. melanogaster [Steinhauer, Kalderon, 2006]
клетках на заднем полюсе яйцевой камеры. Egfr — продукт гена torpedo. Ак-
тивируется тирозинкиназа Top/DER. Это приводит к активизации сигналь-
ного пути Ras, и клетки фолликулярного эпителия на заднем полюсе ооцита,
получив сигнал, приобретают особый статус. Измененные фолликулярные
клетки посылают обратный сигнал ооциту, ведущий к перестройке микро-
трубочкового цитоскелета. В результате перестройки цитоскелета ядро ооци-
та на стадии 7 перемещается в переднюю область ооцита (рис. 3.3). Ориента-
ция МТ изменяется: их плюс-концы направляются в сторону заднего полюса
ооцита, что важно для формирования клеток зачаткового пути. На стадии 9
ооцит полярен как в отношении его окружения, так и элементов кортекса.

В оогенезе (стадии 7-10а) мРНК grk. занимает позицию, соседствующую
с ядром ооцита, — между ядром и фолликулярными клетками. Синтезируе-
мый при этом белок Grk служит сигналом для соседствующих фолликуляр-
ных клеток и определяет полярность ооцита по дорсовентральной (DV) оси.
Так сигнальная система, включающая Grk, устанавливает переднезаднюю
и спинно-брюшную полярности ооцита.

Поздний оогенез (стадии 10b—12) характеризуется еще одной перестрой-
кой, но теперь уже актинового цитоскелета. Сокращение цитоскелета пита-
ющих клеток выбрасывает их цитоплазмы в ооцит и способствует ее актив-
ному движению в самом ооците.

Три основных механизма обеспечивают неслучайное распределение мРНК
в клетке: 1) активное и направленное перемещение по цитоскелету; 2) распре-
деление путем диффузии; 3) захват цитоскелетными элементами и локальная
защита мРНК от деградации.

Гены А-системы

В этой системе и сигналом, и транскрипционным фактором, запускающим
экспрессию генов материнского эффекта, является продукт гена bicoid (bed).
Ген bed входит в состав комплекса гомеотических генов Antennapedia и лока-
лизуется рядом с геном zercniillt. мРНК bed синтезируется в питающих клет-
ках, но не транслируется, а перемещается в ооцит. Для инициации ее транс-
ляции не требуется оплодотворения. Сигналом к началу трансляции служит
от кладывание яйца. Такая же ситуация характерна и для мРНК caudal, кото-
рая является маркером заднего полюса. Если сравнивать синтез белка Bicoid
в оплодотворенных и неоплодотворенных яйцах, то можно обнаружить, что
в неоплодотворенных яйцах данный белок присутствует в гораздо большем
количестве, чем в оплодотворенных, видимо, это связано с тем, что в не-
оплодотворенных яйцах белок Bicoid или мРНК bed более стабильны. мРНК
bed имеет в ооците неслучайную локализацию, которая зависит от микротру-
бочек, поскольку как ингибиторы (колхицин, нокодазол, тубулозол-С), так
и стабилизаторы микротрубочек нарушают локализацию мРНК bed в ооците.
Белок Bicoid (Bed) относится к транскрипционным факторам, содержащим
ДНК-связывающий гомеодомен.

Бедок Bicoid в эмбриональном развитии дрозофилы выполняет следую-
щие функции:

1) регулирует транскрипцию зиготического гена hunchback (hb) путем
непосредственного связывания с определенными районами в его регуля-
торной области. При этом эффективность транскрипции гена hb зависит
от концентрации белка Bicoid. Тем самым белок Bed является инициатором
транскрипционного каскада в развитии, когда продукт одного гена запу-
скает транскрипцию другого гена, продукт которого, также являясь транс-
крипционным фактором, способен регулировать транскрипцию следующей
группы генов;

2) подавляет трансляцию равномерно распределенной мРНК caudal на пе-
реднем конце эмбриона. Как следствие, в задней половине эмбриона образу-
ется вторичный градиент транскрипционного фактора Caudal, содержащего
гомеодомен. Градиент концентрации Caudal противоположен градиенту рас-
пределения белка Bed;

3) ограничивает экспрессию зиготического гена Krilppel.

Градиент распределения белка Bed в эмбрионе не линейный, а описывается
экспоненциальной кривой. В каждом следующем ядре, по мере продвижения
от переднего к заднему концу эмбриона, концентрация белка Bed уменьшает-
ся на 5-10 % по сравнению с концентрацией его в предыдущем ядре. 1радиент
концентрации белка Bed определяется скоростями трансляции мРНК bcd>
диффузии белка Bed и его протеолитической деградации.

Белок Bed путем диффузии перемещается от места синтеза к заднему по-
люсу эмбриона, и на стадии синцитиальной бластодермы его распределение
составляет 45 % длины яйца. На распространение белка, по-видимому, влия-
ют волнообразные движения цитоплазмы, возникающие при делениях ядер
эмбриона. Градиент концентрации белка Bed относительно стабилен до за-
вершения клеточной бластодермы, затем белок Bed быстро исчезает. Этому
способствует домен, содержащий последовательность со 170-й по 203-ю ами-
нокислоту белка Bed. Она называется PEST, поскольку обогащена пролином
(Р), глутаминовой кислотой (Е), серином (S) и треонином (Т). Последователь-
ность PEST имеют многие короткоживущие белки. Ее присутствие является
сигналом протеасомной деградации белка.

Факторы неслучайной локализации мРНК bed в ооците

Для правильной локализации мРНК bed нужны три белка: Exuperantia
(Exu), Swallow (Swa) и Staufen (Stau). Exu — это РНК-связывающий белок,
необходимый для перемещения мРНК bed в питающих клетках. Если мРНК
bed ввести в ооцит, это не обеспечит ее локализацию в нужном месте.
Белок Swa играет роль посредника между мРНК bed и цитоскелетом. Он
важен для формирования актинового цитоскелета и присутствует в бел-
ковых комплексах, участвующих в формировании веретена деления. Для
правильной локализации мРНК bed нужно взаимодействие с кортикаль-
ным актиновым цитоскелетом, где она будет закреплена. Об этом свиде-
тельствует участие актин-регулирующего фактора hu-li tai shao в судьбе
мРНК bed.

Exuperantia (Exu)

В питающих клетках мРНК bed находится в составе рибонуклеопротеино-
вого комплекса (РНП), в состав которого входит продукт гена ехи, который
впервые появляется на стадии ооцита 9. Белок Ехи необходим для перемеще-
ния мРНК bed в питающих клетках и прикрепления комплекса, содержащего
мРНК bed, к микротрубочкам. Он входит в состав так называемых 1убчатых
тел — sponge body.

Разнообразие морфологии губчатых тел не позволяет классифицировать
данные тела как что-то определенное. Губчатые тела в ооцитах дрозофи-
лы аналогичны тельцам Бальбиани в ооцитах ксенопуса [Сох, Spradling,
2003]. В ооцитах ксенопуса описан транспорт комплексов, содержащих
РНК, опосредованный как микротрубочками, так и микрофиламентами.
Необходимым компонентом такого транспорта является и цитоплазмати-
ческий тропомиозин — cTmll. Микротрубочки и микрофиламенты прини-
мают участие в транспорте макромолекул, по-видимому, каждый на своем
этапе.

На большие расстояния перемещение транспоргных комплексов осу-
ществляется по микротрубочкам, на более короткие — по сети актиновых
микрофиламентов. Кроме того, актиновые филаменты обеспечивают заяко-
ривание транскриптов в районе кортекса. Кортекс — это тонкий слой цито-
плазмы, прилегающий к цитоплазматической мембране и представляющий
собой плотную цитоскелетную сеть, состоящую из актиновых филаментов,
пучков микротрубочек и кератина. В районе кортекса происходит взаимо-
действие разных цитоскелетных систем. В состав кортекса входят также
компоненты мембран, спектрин и другие белки, образующие промежуточ-
ные филаменты. Именно в составе кортекса и обнаруживают мРНК bed.
Белок Ехи вовлечен в транспорт мРНК bed к месту назначения и входит
в состав очень крупных РНП-частиц, транспортируемых в ооцит из питаю-
щих клеток. Можно видеть, как в середине оогенеза меченый белок GFP-F.xu
собирается вокруг ядер питающих клеток, находится в кольцевых каналах
и накапливается на переднем полюсе ооцита. Там же располагается и мРНК
bed. Деполимеризация микротрубочек вызывает нарушение локализации
как GFP-Exu, так и мРНК bed.
Белок Swallow (Swa)

Продукт гена sw впервые появляется па стадиях ооцита ЮБ-12. Этот
РНК-связываюший белок обнаруживают в районе цитоскелета, по которо-
му мРНК bed перемещается в составе рибонуклеопротеиновых комплексов
и обеспечивает заякоривание мРНК bed в кортикальном слое ооцита на ста-
диях ооцита ЮБ-11. Белок Swa нужен для формирования цитоскелета: он
обеспечивает заякоривание соответствующих мРНК как на переднем полюсе
ооцита, так и РНК, входящих в состав полярных гранул на заднем полюсе
ооцита.

Этот белок присутствует в белковых комплексах, участвующих в форми-
ровании веретена деления, влияет на синхронность деления ядер в ранних
делениях дробления и определяет миграцию ядер к периферии эмбриона.

С белком Swa непосредственно взаимодействует легкая цепь динеина,
которая участвует в перемещении грузов по направлению к минус-концу
микротрубочек. Таким образом, белок Swa может служить связующим звеном
между мРНК bed и моторным белком, который и определяет локализацию
мРНК bed на переднем полюсе ооцита. Белок Swa узнает в РНК определенную
последовательность, которая локализуется в 3'UTR различных мРНК. Такая
последовательность впервые была идентифицирована в транскрипте гена hu-
ll tai shao khts) (adducin-like). Эта последовательность получила название hts.

Локализация мРНК bed возможна только в составе комплекса РНП.
Чаще всего связь между моторными белками и РНП осуществляется через
адаптерные молекулы, которые имеют домены, устанавливающие их связь
с определенным моторным белком, с одной стороны, и с белками комплекса
РНП — с другой. Легкая цепь динеина 1, участвующая в перемещении гра-
нул РНП по направлению к минус-концу микротрубочек, непосредственно
взаимодействует с белком Swallow. Предполагают, что Swallow является мем-
бран-связывающим белком, который обеспечивает закрепление актинового
и тубулинового цитоскелетов в районе кортекса на переднем полюсе ооцита
[Weil et al., 2010].

Белок Staufen (Stau)

Белок Stau — эволюционно консервативный РНК-связывающий белок —
важен для правильной локализации мРНК bed. Вторичная структура 3'UTR
мРНК bed является определяющей в узнавании ее белком Stau, который
содержит домены, распознающие в РНК двунитевые структуры — dsRBD
(double-stranded RNA-Binding Domain), и домен, отвечающий за взаимодей-
ствие с моторным белком — динеином.

Впервые продукт гена stau появляется на стадиях ооцита 13-14. Продукт
этого гена необходим для заякоривания мРНК bed на переднем конце яйца
[Ferrandon et al., 1994]. У мутантов по гену stau мРНК bed в ооците распро-
страняется дальше — к заднему концу ооцита, и ее распределение более раз-
мытое. Создается такое впечатление, чю у мутантов по гену stau нарушается
фиксация мРНК bed на переднем полюсе ооцита. Интересно, что при транс-
плантации очищенной мРНК bed в ооцит опа не перемещается в передний
конец ооцита.

Помимо обеспечения неслучайной локализации мРНК bed в ооците белок
Stau необходим и для локализации определенных мРНК на заднем полюсе
ооцита, например мРНК oskar, которая перемещается по микротрубочкам
из питающих клеток через весь ооцит к его заднему полюсу. Факторы, при-
водящие к дестабилизации микротрубочек, вызывают нарушение распреде-
ления в ооците как белка Stau, так и мРНК oskar.

Д,пя создания позиционной информации в виде мРНК необходимо нали-
чие следующих факторов:

1. Присутствие в мРНК цис-действующего элемента. Обычно подобный
элемент локализуется в 3'UTR и определяет формирование комплекса РНП.

2. Транспортирование мРНК по актиновым филаментам и микротрубоч-
кам, которые образуют сеть, ('вязь мРНК с моторными белками опосредована
компонентами, входящими в состав комплекса РНП.

3. Заякоривание транскриптов на цитоскелет. Определяет возможность
трансляции соответствующих мРНК и защищает их от деградации.

Перемещение макромолекул на значительные расстояния особенно акту-
ально в клетках большого размера (в ооцитах дрозофилы и ксенопуса), при
формировании отростков нервных клеток (дендриты, аксоны) или в синци-
тиях (пребластодерма эмбриона дрозофилы).

Особенностью раннего эмбриогенеза дрозофилы является синхронное де-
ление ядер; после девятого деления начинается миграция ядер к периферии.
Затем происходит еще четыре синхронных деления; ядра на поверхности

Рис. 3.4. Эмбрион Г), melanogaster, на заднем конце которого обосабливаются
клетки зачаткового пути (в рамке):

а — стадия клеточной бластодермы; б — стадия гаструляции: группа полярных клеток
мигрирует вглубь эмбриона вместе с впячиванием первичной кишки. Фото Е. В. Голубковой
эмбриона формируют синцитиальную бластодерму. Она состоит приблизи-
тельно из 6000 ядер. Все ядра на этой стадии тотипотентны. После тринад-
цатого деления вокруг ядер формируется мембрана, возникает клеточная
бластодерма. Бластодерма — однослойная клеточная структ ура. Каждое ядро
получает островок своей собственной цитоплазмы, что определяет судьбу
клетки в будущем.

На стадии синцитиальной бластодермы ядра располагаются по периферии
яйца в один слой. Уже на этой стадии на заднем конце эмбриона обосабли-
ваются полярные клетки, которые дают начало клеткам-предшественникам
зародышевого (зачаткового) пути (germ cells) (рис. 3.4).

Формирование заднего полюса ооцита у D. melanogaster

Важной особенностью формирования заднего полюса ооцита является
детерминация развития будущих гонад и клеток зачаткового пути, которые
обеспечивают у животных «бессмертие» вида в ряду поколений.

Гены P-системы у дрозофилы

Спецификация заднего полюса ооцита D. melanogaster определяется изме-
нением статуса фолликулярных клеток в этом районе. На стадиях 2-6 форми-
рования яйцевой камеры полярные фолликулярные клетки ооцита получают
сигнал в результате трансляции локализованной на заднем полюсе мРНК^гА'.
Фолликулярные клетки на заднем полюсе ооцита, измененные полученны-
ми от Grk. сигналами, посылают обратный сигнал, который меняет кортекс
ооцита, граничащий с ними. Это определяет состав молекул, формирующих
задний полюс, создавая позиционную информацию в задней части ооцита.
Главными компонентами являются мРНК nanos {nos) и oskar (osk). Белковые
продукты этих генов не являются транскрипционными факторами. Белок
Osk принимает непосредственное участие в формировании полярной плаз-
мы, попадающей в полярные клетки, и детерминирует образование брюшка
у дрозофилы. мРНК osk перемещается из питающих клеток на задний полюс
ооцит а по МТ с помощью кинезина 1 (моторный белок плюс-конца МТ) уже
после перестройки цитоскелета в ооците на стадиях 7-8.

Белок Osk синтезируется в двух формах. Для этого используются разные
инициирующие кодоны. Короткий белок Osk достаточен для накопления
компонентов полярной плазмы на заднем полюсе ооцита. Длинная форма
белка необходима для заякоривания мРНК osk на заднем полюсе ооцита.
В раннем оогенезе мРНК osk находится в составе комплексов, не допуска-
ющих трансляцию. Из питающих клеток мРНК osk перемещается в составе
комплексов РНП (рибонуклеопротеинов), содержащих белок Stau и другие
белки, например Exuperantia и Yps — РНК-связывающий белок, имеющий
домен the cold shock domain RNA-binding protein Ypsilon Schachtel.

В 3'UTR мРНК osk находятся три последовательности, называемые Bruno-
response element (BRE). С белком Bruno взаимодействуют белки Vasa и Apontic
(Apt). В состав этого комплекса входит и РНК-связывающий белок Bicaudal-C,
который блокирует инициацию трансляции и поддерживает локализацию
мРНК osk на заднем полюсе ооцита, которая зависит от актин-связывающих
белков Cappuccino, Spire и Profilin (Chickadee).

В трансляции мРНК osk на заднем полюсе важную роль играет гели-
каза Vasa, которая относится к семейству геликаз, содержащих DEAD-box
(где D — аспарагиновая кислота, Е — глутаминовая кислота, А — аланин,
D — аспарагиновая кислота). Геликаза Vasa сходна с фактором инициации
трансляции eIF4A: она участвует в инициации трансляции мРНК osk, непо-
средственно взаимодействуя с белком Bruno, осуществляющим трансляци-
онную репрессию. Трансляция мРНК osk регулируется изменением длины
поли(А)-последовательности в 3'UTR путем аденилирования/деаденилиро-
вания при участии белка Orb (гомолог СРЕВ — cytoplasmic polyadenylation
element binding protein). Orb (00I8 RNA binding) имеет два домена RRM (RNA
recognition motif) и небольшой район, обогащенный цистеином и гистиди-
ном, сходный с доменом цинковых пальцев. Orb взаимодействует с двумя
поли(А)-полимеразами — РАР и Wispi (Wisp), в свою очередь уровень по-
лиаденилирования влияет на трансляцию мРНК-мишеней.

мРНК nos не используют МТ для своего перемещения в ооците и равно-
мерно распределены в нем. Транслируется лишь небольшая часть этих мРНК
(около 4 %), которая заякоривается на заднем полюсе ооцита. Не фиксиро-
ванные на заднем полюсе мРНК nos, подвергаются быстрой деградации.

Белок Nanos (Nos) содержит два домена «цинковых пальцев» и относится
к РНК-связывающим белкам. В РНК-мишенях, с которыми он взаимодейству-
ет, присутствует последовательность NRE (Nanos Response Element). Главной
мишенью белка Nos является материнская мРНК hb, которая поступает в оо-
цит из питающих клеток и распределяется в нем равномерно. В 3'UTR мРНК
hb последовательность NRE представлена двумя расположенными рядом эле-
ментами: A (GUUGU) и В (AUUGUA). Жирным шрифтом выделены главные
нуклеотиды, отвечающие за взаимодействие с белковым комплексом, в составе
которого, кроме белка Nos, присутствуют белки Pumilio и Brat. Этот комплекс
обеспечивает деградацию мРНК hb в задней половине ооцита. Последователь-
ность NRE есть и в мРНК bed. Возможно, белок Nos отвечает и за деградацию
мРНК bed, не допуская ее попадание в заднюю половину ооцита.

В 3'UTR мРНК nos присутствует сигнальная последовательность ТСЕ
(translation control element) (90 н.), которую узнают компоненты полярной
плазмы. ТСЕ формирует вторичную структуру и отвечает за репрессию
трансляции мРНК nos. С ТСЕ взаимодействует белок Smaug (Smg). В ре-
прессии участвует и белок Сир. Механизм репрессии в этом случае такой же,
как и для мРНК osk: за счет подавления инициации трансляции, он зависит
от деаденилирования (укорочения поли(А)-последовательности З'-конца),
блокирующего трансляцию. Механизм подавления трансляции различных
мРНК, входящих в состав полярной плазмы за счет деаденилирования, кото-
рое происходит с участием комплекса Smg с деаденилазой CCR4, достаточно
распространен. В репрессии участвует еще один белок — Glorund. В пределах
последовательности ТСЕ находятся два пространственно разделенных участ-
ка, каждый из которых ответственен за взаимодействие с трансляционным
репрессором Smaug — SRE (Smaug recognition element).

SRE образует структуру стебель-петля (14-23 н.). В петлю попадает вы-
сококонсервативная последовательность CUGGC, в то время как последова-
тельность, формирующая стебель, эволюционно неконсервативна. Мутаци-
онные изменения последовательности петли приводят к нарушению связы-
вания с белком Smaug и подавляют трансляционную репрессию мРНК nos.
SRE в мРНК nos и BRE в мРНК osk функционально схожи. Локализация мРНК
nos важна для ее трансляции. Нелокализованная мРНК nos не транслируется.
От места трансляции белок Nos путем диффузии распространяется прибли-
зительно до половины яйца. Однако, в отличие от белка Bed, определяющего
полярность ооцита, маркируя его переднюю половину (A-система), белок Nos
не является транскрипционным фактором, хотя и создает полярность ооцита,
определяя программу развития в задней половине эмбриона (Р-система).

В развитии важно не только своевременное появление каких-то факторов,
но и деградация тех, которые выполнили свою функцию. В эмбриогенезе пере-
ход от экспрессии материнских генов к экспрессии зиготических генов сопро-
вождается деградацией запасенных материнским организмом мРНК. Зиготи-
ческая экспрессия кластера генов, ответственных за синтез miR-309, участву-
ет в деградации многих материнских мРНК. miR-309 определяет деградацию
материнских мРНК путем прямого связывания с последовательностями в их
3 -нетранслируемых областях во время материнско-зиготического перехода.

Главной мишенью белка Nos в задней половине ооцита служит транскрип-
ционный фактор НЬ — репрессор зиготическою гена knirps. Для этого нуж-
на деградация равномерно распределенной в только что отложенном яйце
материнской мРНК hb (только в задней половине ооцита). Доказательства
в пользу того, что продукт гена nos активно элиминирует мРНК hb в задней
половине эмбриона, было показано в следующих экспериментах:

1. Самки, гомозиготные по мутации nos, имеют равномерное распределе-
ние мРНК hb по переднезадней оси.

2. Если у эмбрионов, несущих генетическую конструкцию с геном hb под
промотором гена hsp (heat shock protein), индуцировать экспрессию гена hb
тепловым воздействием в период бластодермы, т. е. заставить ген hb экс-
прессироваться везде, включая заднюю половину эмбриона, это приведет
к фенотипу, характерному для эмбрионов в потомстве матерей, гомози] отных
по мутации гена nos.
Важно отметить, что ген hb затем включается как зиготический. В пе-
редней половине эмбриона экспрессия зиготического гена hb запускается
транскрипционным фактором Bed. Белки НЬ и Bed, являясь ТФ, включены
в транскрипционный каскад, представляющий собой последовательное вклю-
чение одного транскрипционного фактора (НЬ) другим (Bed) в цепи событий,
в которой с каждым шагом вовлекаются новые ТФ, позволяя динамично из-
менять спектр включаемых и выключаемых генов в процессе развития. Так,
белок НЬ является репрессором транскрипции зиготического гена knirps
в эмбрионе дрозофилы, и предотвращение появления белка НЬ в задней
половине эмбриона разрешает транскрипцию гена knirps. Белок Knirps вы-
ступает в качестве транскрипционного фак гора, запускающего следующую
группу генов-мишеней.

Продукт гена nos является морфогеном, т. е. фактором, способным запу-
стить программу развития по определенному сценарию. Инъекция очищен-
ной мРНК nos в переднюю часть яйца может вызвать образование структур,
характерных для задней части эмбриона. Главным партнером белка Nos яв-
ляется белок Pumilio.

Pumilio (Pum) — эволюционно консервативный белок широкого спек-
тра действия. Он важен для поддержания статуса стволовых клеток, фор-
мирования памяти, регуляции ионных каналов, нарушение функции ко-
торых вызывает паралич и двигательные аномалии. Молекулярная масса
РНК-связывающего белка Pum около 160 кДа. С-терминальная часть этого
белка содержит восемь тандемных повторов из 36 а. к., называемых повтора-
ми РОЕ Эта последовательность взаимодействует с цис-элементом в мРНК
генов-мишеней, что приводит к регуляции трансляции мРНК-мишеней.

Регулируемая трансляция локализованных мРНК позволяет формиро-
вать градиенты белков в клетке, что в свою очередь при асимметричном
делении материнской клетки приводит к спецификации судьбы дочер-
них клеток. У человека два гена — PUM1 и PUM2, как и у мыши — Puml
и Рит2. Ортологами гена Pumilio у нематоды являются гены FBF (Fem-3
Binding Factor), поэтому семейство генов получило название PUF (Рит и FBF).
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae шесть генов, принадлежащих семейству
PUF, у нематоды С. elegans — одиннадцать, а у дрозофилы — только один
ген. РНК-связывающий домен белка Pum у дрозофилы, названный Pum-НО
(Pumilio Homology Domain), состоит из восьми несовершенных повторов.
Фланкирующие N- и С-участки домена Pum-HD представляют собой по-
ловинки повтора, поэтому получили названия повтор 1' и повтор 8' соот-
ветственно. Наиболее консервативные аминокислоты находятся в середине
повтора (R) — они взаимодействую! с определенным азотистым основанием
в NRF, (Nanos Response Element) в РНК (рис. 3.5). По структуре домен Pum-
HD похож на повторы Armadillo (ARM) в белках катенин |* и кариоферин а.
Так между РНК и Pum-HD получается молекулярное соответствие: каждый
повтор взаимодействует с определенным основанием в РНК (рис. 3.5).
Ct

”1 7

е <

о и

w j о

X 2

0 2 0

еа
CN

<м

с
и

СМ

со
ОС

ОС

Г)
ОС

3 н
ф
О СП

С4

2 2

NRE (Nanos Response Element)

.. Водородные связи

Ван дер Ваальсовы
взаимодействия

Стэкинг
взаимодействия

Рис. 3.5. Молекулярное соответствие между азотистыми основаниями в РНК и определенными аминокислотами
в повторах РНК-связывающего домена Pum-HD белка Pumilio [Wang et al., 2002 с изменениями]

ГЧ г- Г4
КОД
202

0 2 0

<•»
ы
2

<
tu
7-

ГЧ г-
ы ш

Г-5

-< ГМ

W G р
2 С X

J о:

2 О

• 4 гч
2 О

О G

' I 2 О

— Л г,
2 X С

а-спирали повторов 1-8,
выстилающие внутреннюю
вогнутую поверхность
PUM-HD

Гены P-системы у

§
Рис. 3.6. Взаимодействие комплекса белков Brat — Nanos — Pumilio
с последовательностью в 3'UTR мРНК hunchback

Специфичность взаимодействия определяется двумя-тремя аминокисло-
тами в середине повтора. При этом взаимодействующие молекулы (РНК
и белок) антипараллельны. Белки PUF узнают в РНК последовательность
NRE. Впервые такая последовательность была обнаружена в мРНК hb у дро-
зофилы. Каждый из 11 белков Pum нематоды узнает специфичную последо-
вательность, например CUCUGUAUCUUGU или UGUANAUA, где N — лю-
бой нуклеотид. В этой последовательности тринуклеотид UGU неизменен,
а остальные могут варьировать. Почти идентичную последовательность уз-
нает PUM1 человека и Pum2 мыши. Pumilio непосредственно взаимодей-
ствует с NRE в мРНК hb вместе с двумя белками — Nos и Brain Tumor (Brat)
(рис. 3.6). Для взаимодействия с РНК достаточно участия в этом процессе
домена Pum-HD. Кристаллическая структура домена Pum-HD выглядит как
изогнутая волнистая арка.

Комплекс с участием Brat и Nanos формируется благодаря ассоциации
этих белков с Pum. Повторы в белке Brat образуют структуру бета-пропелле-
ра, что делает их похожими на повторы WD40. Результатом взаимодействия
является деаденилирование материнской мРНК hb и ее деградация в задней
половине ооцита.

Эмбриональное развитие дрозофилы детерминировано. Детерминация
определяется формированием в транскрипционно инертном ооците пози-
ционной информации за счет продуктов генов материнского эффекта, ко-
торые экспрессируются в клетках материнского происхождения (питающих
и фолликулярных). Существенную роль в формировании позиционной ин-
формации в ооците играют локализованные мРНК, регулируемая трансля-
ция которых приводит к появлению факторов, вызывающих активацию или
репрессию зиготических генов в ядрах эмбриона на стадии синцитиальной
бластодермы в соответствии с их позицией по переднезадней оси.
Контрольные вопросы

1. Что такое позиционная информация и какова се роль в развитии?

2. В чем заключается функция генов материнского эффекта?

3. Как устанавливается переднезадняя ось в эмбрионе дрозофилы?

4. Какие гены относятся к A-системе дрозофилы?

5. Какова функция белка Pumilio?

ЛИТЕРАТУРА

ДондуаА. К. Биология развития. Т. 2. Клеточные и молекулярные аспекты индивидуального
развития. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2005. 237 с.

Серов О. Л. Генетика развития: курс лекций. Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т, 1998. 349 с.

Arvola R. М., Weidmann С. А.> Tanaka-Hall Т.М., Coldstrohm А. С. Combinatorial control of
messenger RNAs by Pumilio, Nanos and Brain Tumor Proteins // RNA Biol. 2017. Vol, 14 (11).
P 1445-1456.

Cox R. T., Spradling A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during
Drosophila oogenesis // Develop. 2003. Vol. 130 (8). P. 1579-1590.

Derrick C. J. Translational control of gurken mRNA in Drosophila development // Cell Cycle. 2017.
Vol. 16. P. 23-32.

Ferrandon D„ Elphick L., Nusslein-Volhard C., St Johnston D. Staufen protein associates with the 3'UTR
of bicoid mRNA to form particles that move in a microtubule-dependent manner // Cells. 1994.
Vol. 79 (7). P. 1221-1232.

Lazzaretti D., Bono F. mRNA localization in metazoans: A structural perspective П RNA Biol. 2017.
Vol. 14(11). P. 1473-1484.

Riparbelli M. G., Persico V., Callaini G. Early Drosophila Oogenesis: A Tale of Centriolar Asymmetry
// Cells. 2021. Vol. 10 (8). P. 1997.

Steinhauer J„ Kalderon D. Microtubule polarity and axis formation in the Drosophila oocyte // Dev.
Dyn. 2006. Vol. 235. P. 1455-1468.

Stumpf C. R., Kimble J., Wickens M. A Caenorhabditis elegans PUF protein family with distinct RNA
binding specificity // RNA. 2008. Vol, 14, P. 1550-1557,

Vargesson N. Positional Information -• A concept underpinning our understanding of developmental
biology // Dev. Dyn. 2020. Vol. 249. P. 298-312.

WangX., McLachlan J., Zaniore P. D., HallT.M. Modular recognition of RNA by a human pumilio-
homology domain // Cell, 2002. Vol. 110 (4). P, 501-12.

Weil T. T, Xanthakis D., Parton R., Dobbie I., Rabouille C., Cavis E. R., Davis 1. Distinguishing direct
from indirect roles for bicoid mRNA localization factors// Develop. 2010. Vol. 137 (1). P. 169-176.

Wolpert L. Positional information and pattern formation // Curr. Top. Dev. Biol, 2016. Vol 11.
P. 597 608.
Глава 4

ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОК

ЗАЧАТКОВОГО ПУТИ У РАЗНЫХ ЖИВОТНЫХ

Т’Система генов с материнским эффектом

у Drosophila melanogaster

Гены Т-системы у Drosophila melanogaster определяют формирование го-
ловной и хвостовой несегментированных частей животного (акрон и тельсон
соответственно). Главным событием в формировании терминальных частей
тела является активация рецепторной протеинкиназы Torso (Тог). Для ак-
тивации рецептора Тог необходимо взаимодействие двух лигандов — про-
дуктов генов torsolike (tsi) и trunk (trk). Ген tsi экспрессируется в оогенезе
фолликулярными клетками на обоих концах ооцита. Белок Tsi обнаруживают
в районе вителлиновой мембраны на переднем и заднем полюсах яйца. Он
может контактировать с компонентами перивителлинового пространства,
расположенного между вителлиновой мембраной и оболочкой ооцита. Белок
Trk (еще один лиганд для рецептора Тог) секретируется в виде неактив-
ного предшественника в перивителлиновое пространство. Кроме лигандов
Trk и Tsi для активации сигнальной системы Torso нужны продукты генов
женской стерильности female sterile(l) Nasrat (fs(l) N) и female sterile(l) pole
hole(fs(l) ph). Экспрессия генов fs(l) ph и fs(l) N важна для обеспечения
целостности слоя клеток эмбриональной бластодермы на заднем полюсе.

мРНК tor перемещается в ооцит из питающих клеток и равномерно рас-
пределяется в ооците. В период синцитиальной бластодермы мРНК tor дви-
жется к периферии эмбриона. В конце бластодермы можно увидеть такую
картину: расположенные по периферии ядра эмбриона, а рядом с ними слой
мРНК tor (рис. 4.1). Белок Torso присутствует лишь временно на раннем
этапе развития эмбриона и не обнаруживается после гаструляции. В раннем
синцитиальном эмбрионе Torso равномерно распределен, но активируется
только в двух терминальных областях лигандами, продукция которых про-
странственно ограничена концами эмбриона.

Белковый продукт гена torso похож на рецепторы ростовых факторов.
Это трансмембранный белок, состоящий из трех доменов: внецитоплазма-
тического (380 а. к.), трансмембранного (22 а. к.) и цитоплазматического
(402 а. к.). Внецитоплазмагический домен отвечает за прием сигнала извне,
выполняя рецепторную функцию. Цитоплазматический домен обнаруживает
Белок Torso

Рис. 4.1 Распределение белка Torso в эмбрионе дрозофилы на стадии синцитиальной
бластодермы и его активация на полюсах эмбриона

сходство с тирозинкиназой. Это позволяет относить Torso к рецепторным
протеинкиназам.

Ее активация зависит от появления лиганда Tsi, который секретируется
в перивителлиновое пространство на переднем и заднем полюсах эмбриона.
Белок Torsolike (Tsi) имеет аминотерминальный домен, характерный для се-
кретируемых белков. Этот белок содержит и лейцин-богатые повторы — та-
кие же, как и продукт гена Toll.

Ген tor имеет два типа аллелей: нулевые аллели (loss-of-function) рецес-
сивны и приводят к тому, что у эмбрионов в потомстве самок, гомозиготных
по этим аллелям, не развиваются терминальные структуры; доминантные ал-
лели (gain-of-function) по эффекту противоположны рецессивным (рис. 4.2):
присутствуя у самок, они способствуют тому, что у потомства герминальные
маркеры распределяются по всей поверхности эмбриона.

tailless

Рис. 4.2. Фенотип эмбрионов в потомстве самок D. melanogaster,
несущих разные типы аллелей гена torso
Аллеям, gain-of-function кодируют белок Тог, активность которого не зави-
сит от связывания с лигандом и проявляется по всему эмбриону, в результате
чего происходит экспрессия зиготического гена tailless по всей поверхности
эмбриона, т. е. везде будет запускаться программа, соответствующая обра-
зованию терминальных структур. Рецессивные аллели torso вообще не при-
водят к активации экспрессии гена tailless, а доминантные — активируют
экспрессию данного гена и там, где это не нужно.

Трансляция мРНК tor начинается после оплодотворения. Следующей
за протеинкиназой Тог в системе передачи сигналов является серин/треони-
новая протеинкиназа D-raf. Она и активирует продукты зиготических генов
tailless и huckebein на терминальных концах эмбрионов. Эти транскрипцион-
ные факторы в результате активации запускают экспрессию генов, необходи-
мых для развития головы и хвостовых структур.

Сигнальный путь D-raf регулирует детерминацию, дифференциацию
и пролиферацию клеток в разных частях развивающегося эмбриона. Он
также участвует и в формировании сложных глаз у дрозофилы. Передача
сигналов от клеточной мембраны к ядру зависит от функционирования эво-
люционно консервативных сигнальных кассет, состоящих из гомологов киназ
Ras/raf/MEK/MAPK.

Характерной особенностью эмбрионов в потомстве самок, гомозиготных
по tor , является фенотип pole hole с нарушениями целостности слоя клеток
на заднем полюсе.

Фенотип pole-hole (полярное отверстие) у эмбрионов
в потомстве самок, гомозиготных по мутантным аллелям
генов Т-системы

Особенностью заднего полюса эмбриона у D. melanogaster является при-
сутствие полярных клеток (клеток полового пути) (см. рис. 4.1), для которых
невозможна транскрипция, в то время как соседние соматические клетки
транскрипционно активны. Это обусловлено тем, что на стадии бластодермы
в период формирования клеточных стенок в клетки зачаткового пути попа-
дает особая цитоплазма (полярная плазма).

Влияние сигнальной системы Тог на формирование зачаткового пути
не простое. Во-первых, гены tailless и huckebein не экспрессируются в гер-
минальных клетках. Во-вторых, уровень белка Тог понижен на мембранах
клеток зачаткового пути по сравнению с соседними соматическими клетка-
ми. В-третьих, в герминальных клетках снижен уровень фосфорилирования
митоген-активированной протеинкиназы (МАРК — Mitogen-Activated Protein
Kinase) по сравнению с соседними соматическими клетками. В-четвертых,
дисрегуляция сигнального пути Тог связана с дефектами в образовании
и миграции ядер зачатковых клеток, что приводит к появлению эмбрионов
с нарушением непрерывности клеточного слоя на заднем полюсе эмбриона,
т. с. к фенотипу pole-hole. Последний характерен и для эмбрионов в потом-
стве самок с клоном клеток зачаткового пути, гомозиготным по мутации
гена fs(l) ph. Интересно, что в отсутствии зачатковых клеток эмбрионы в по-
томстве самок tor не имеют фенотипа pole-hole. Такую же картину можно на-
блюдать и у эмбрионов в потомстве самок, мутантных одновременно по генам
vasa (vas ), который является маркером зачатковых клеток, и torso {tor ), от ко-
торого зависит непрерывность клеточного слоя на заднем полюсе эмбриона.

Формирование заднего полюса в ооците Xenopus laevis

Как и у Г). melanogaster, у X. laevis продукты, синтезированные генами ма-
теринского организма, играют ключевую роль в эмбриональном развитии.
Раннее эмбриональное развитие X. laevis, как и у дрозофилы, происходит в от-
сутствии транскрипции зиготических генов, последняя начинается на стадии
средней бластулы, когда эмбрион состоит из 4000 клеток. В отличие от дрозо-
филы, у X. laevis синтез материнских молекул, формирующих позиционную
информацию, происходит в самом ооците. Среди локализованных мРНК,
важных для образования зачатковых клеток, можно назвать те, которые со-
средотачиваются на заднем (вегетативном) полюсе ооцита (рис. 4.3), где каждая
из локализованных мРНК имеет свой рисунок неслучайного распределения.

Ооцит X. laevis вначале представляет собой небольшую сферическую клет-
ку диаметром 30 мкм. Однако даже на этой стадии ядро и цитоплазматиче-
ские органеллы распределены асимметрично. В отличие от оогенеза дрозо-
филы, который длится около недели, оогенез X. laevis продолжается гри года,
и большая часть содержимого ооцита синтезируется в течение последнего
(третьего) года. За этот период ооцит достигает диаметра 1,5 мм.

Показателем асимметрии ооцита является митохондриальное облако, или
тельце Бальбиани, которое в ооците появляется рано. Данная структура

Рис. 4.3. мРНК Vgl (a), Xcat2 (б) и РНК Xlsirt (в), локализованные на вегетативном полюсе
ооцита шпорцевой лягушки Xenopus laevis [Bashirullah et al., 1998]
на стадии ооцита I находится на одной стороне герминального пузырька,
который является ядром ооцита. Эта сторона и сформирует вегетативный
полюс ооцита. В состав митохондриального облака входят митохондрии, эн-
доплазматический ретикулум, мембранные пузырьки и капельки жира.

Митохондриальное облако растет и приобретает сферическую форму
(рис. 4.4). На стадии ооцита II оно начинает перемещаться к будущему ве-
гетативному полюсу и становится дископодобным, а затем клиноподобным.
Митохондриальное облако необходимо для накопления и локализации ма-
териала, важного для образования зародышевой плазмы на вегетативном
полюсе раннего эмбриона. По структуре и функции зародышевая плазма
X. laevis сравнима с полярной плазмой дрозофилы и содержит герминальные
гранулы, которые необходимы для детерминации зачатковых клеток. Однако,
если у дрозофилы полярные гранулы являются достаточными для индукции
зачатковых клеток, у X. laevis примордиальные зачатковые клетки не являются
необратимо детерминированными. Многие компоненты герминальных гранул
эволюционно консервативны. В обоих случаях для формирования герминаль-
ных гранул важно присутствие в их составе различных локализованных РНК.

Цитоскелет в раннем оогенезе организован симметрично. До стадии
ооцита II герминальный пузырек тесно связан с МТОС. От МТОС к плазма-
тической мембране радиально отходят МТ, плюс-концы которых достигают
кортекса ооцита. Как только герминальный пузырек начинает двигаться к бу-
дущему анимальному полюсу, а митохондриальное облако конденсироваться
на противоположном, вегетативном полюсе, пучки МТ исчезают. В позднем

Стадии

Анимальный полюс

Рис. 4.4. Перемещение локализованных мРНК Vgl и Хеа12

в район вегетативного полюса в ооците Xenopus laevis [Bashirullah et al., 1998]
оогенезе МТ вновь будут сформированы для участия в образовании вегета-
тивного полюса ооцита. Именно в ооците X. laevis впервые были обнаружены
локализованные мРНК, обогащающие анимальную полусферу ооцита — Ап1,
Ап2, АпЗ — и вегетативную полусферу — Vgl, VgT, Xcat2, Xwnt 11, Xcat3, Вб,
B7, CIO и Xlsirt.

Транскрипты вегетативного полюса

Вегетативного полюса транскрипты могут достигать двумя путями. Ран-
ний путь предполагает перемещение транскриптов с помощью специальной
структуры, называемой METRO (message transport organizer) в составе мито-
хондриального облака. Поздний путь происходит с участием МТ.

Ранний путь перемещения в сторону вегетативного полюса ооцита харак-
терен для следующих РНК: Xcat2, Xdazll, Xwntll, Xcat3, Вб, B7, СЮ и Xlsirt. Их
перемещение проходит в три этапа:

1. РНК попадают из герминального пузырька в митохондриальное облако.

2. Внутри METRO происходит перераспределение РНК.

3. В составе METRO РНК перемещаются к вегетативному полюсу.
Транскрипты заякориваются в кортексе на вегетативном полюсе ооцита.
Как только в середине стадии ооцита I митохондриальное облако конден-
сируется в сферу, туда начинают перемещаться РНК. Причем мРНК Xcat2
попадает в METRO первой, затем последовательно туда проникаю! Xlsirts,
Xwnt и остальные транскрипты. Затем, когда METRO напоминает диск, мРНК
Xcat2 перемещается на периферию диска, мРНК Xwntll — в центр, а РНК
Xlsirts находится между ними. METRO движется к вегетативному полюсу,
и вместе с ним все названные РНК. мРНК Xcat2, инъецированная в поздний
ооцит, не может локализоваться кортикально на вегетативном полюсе без
ассоциации с METRO. Участки в 3'UTR мРНК Xcat2, ответственные за кор-
тикальную локализацию или локализацию в METRO, разные, хотя частично
перекрываются. В 3'UTR мРНК Xcat2 известны две последовательности, вза-
имодействующие с РНК-связывающими белками: одна обеспечивает пере-
мещение мРНК Xcat2 в митохондриальном облаке — MCLE (Mitochondrial
Cloud Localization Element), а другая — определяет попадание мРНК Xcat2
в герминальные гранулы — GGLE (Germinal Granule Localization Element)
на вегетативном полюсе ооцита. MCLE содержит шесть повторов — UGCAG.
Xcat2 и Xdazll — трансляционные репрессоры.

После оплодотворения транскрипт В7 исчезает, а транскрипты Xlsirt, Xcat2
и Xcat3 оказываются связанными с зародышевой плазмой в примордиаль-
ных зародышевых клетках. Другие транскрипты (В9, В12, СЮ, Vgl, Xcat4,
Xwntll) локализуются в вегетативной области бластодермы.

РНК Xlsirt (Xenopus laevis interspersed repeats) не транслируется. Она со-
держит последовательности в 79-81 н., которые повторены 3-13 раз. В этом
транскрипте есть и уникальная последовательность, которую окаймляют по-
вторы, но за локализацию транскрипта, видимо, отвечают все-таки повторы.
Транскрипты, подобные Xlsirt, относятся к классу длинных некодирующих
РНК. В формировании герминальной плазмы РНК Xlsirt выполняет струк-
турную роль, позволяя транскриптам других генов локализоваться в этом
районе ооцита. Экспериментально показано непосредственное взаимодей-
ствие РИК Xlsirt с мРНК Vgl [Kloc, Etkin, 1994].

Среди материнских мРНК, которые накапливаются в митохондриальном
облаке на ранней стадии оогенеза, можно назвать следующие: мРНК Xwntll,
кодирующую сигнальный белок Wnt; Xdazl, кодирующую белок, важный для
формирования зачатковых клеток; Xcat2, кодирующую белок, похожий на бе-
лок Nanos, и участвующую в формировании генеративных клеток.

Транскрипты, перемещающиеся

к вегетативному полюсу по цитоскелету

Такие мРНК, как Vgl и VegT, сначала равномерно распределены в ооците.
Они транспортируются на вегетативный полюс, минуя METRO, и заякори-
ваются в кортексе, оставаясь там до конца оогенеза. мРНК VegT кодирует
транскрипционный фактор, содержащий Т-бокс. Этот ТФ нужен для специ-
фикации энтодермы и мезодермы.

мРНК Vgl пол уч и л а название благодаря способности этой мРНК локали-
зоваться на вегетативном полюсе. Vgl является белком из семейства TGF0
(Transforming Growth Factor 0). мРНК Vgl взаимодействует, по крайней мере,
с шестью различными РНК-связывающими белками, которые обеспечивают
ее локализацию на вегетативном полюсе. Среди этих белков XStau — гомо-
лог белка Stau у D. melanogaster, который вовлечен в контроль локализации
мРНК bed на переднем полюсе ооцита, и мРНК osk — на заднем полюсе.
Белок XStau содержит пять доменов, взаимодействующих с двуцепочечны-
ми РНК (dsRBD), и домен связывания с тубулином TBD (Tubulin-Binding
Domain).

В 3'UTR мРНК Vgl идентифицировано несколько последовательностей,
которые отвечают за ее локализацию. С этими цис-действующими элемента-
ми взаимодействуют следующие транс-действующие факторы: VglRBP (Vgl
RNA Binding Protein), который способен связываться и с МТ, а также белок
VglRBPbO. Белок VglRBP (Vera) гомологичен белку ZBP-1, который нужен
для локализации мРНК fl-actin в фибробластах цыпленка. Это означает, что
родственные белки могут являться компонентами транспортной машины,
использующей как микротрубочки, так и микрофиламенты для перемещения
разных РНК. Эти транспортные системы связаны между собой.

Белок Vgl RBP60 гомологичен hnRNPl человека, который контролирует
альтернативный сплайсинг и ядерный экспорт различных мРНК. Сохраняя
связь с мРНК и после выхода из ядра, VgRBP60 может влиять па дальнейшую
судьбу этих мРНК в цитоплазме. Если 3'UTR мРНК tau (у млекопитающих
эта мРНК локализуется в аксонах) инъецировать в ооцит ксенопуса, этот
фрагмент мРНК можно обнаружить на вегетат ивном полюсе, там же, где ло-
кализуется мРНК Vgl. Перемещение 3'UTR мРНК tau, как и транспорт мРНК
Vgl, зависит от МТ, а заякоривание — от актиновых филаментов. О том, что
локализация мРНК Vgl на вегетативном полюсе зависит от цитоскелета,
свидетельствует тот факт, что Тритон Х-100 не переводит в растворимое со-
стояние локализованные мРНК Vgl, в отличие от других мРНК. Наиболее ве-
роятный кандидат для заякоривания мРНК Vgl — это актиновые филаменты,
поскольку после обработки цитохалазином, вызывающим деполимеризацию
актина, распределение мРНК Vgl становится дисперсным. На вегетативном
полюсе в кортексе ооцита располагается цитоскелетная сеть из цитокерати-
нов и актиновых филаментов.

Взаимодействие различных локализованных мРНК с цитоскелетом кон-
тролируется независимо для каждой мРНК. Трансляция мРНК зависит
от того, локализована она или нет. При этом за локализацию мРНК и спо-
собность к трансляции отвечают разные участки их 3'UTR.

мРНК Vgl и VegT содержа! в 3'UTR несколько копий двух последователь-
ностей, которые обеспечивают локализацию этих мРНК на вегетативном
полюсе ооцита. В 3'UTR мРНК Vgl присутствует пять последовательно-
стей Е2 (UUCAC), с которыми связывается белок Vera/VglRBP. С последо-
вательностью ViMl (YYUCU, где Y — пиримидин) взаимодействует другой
РНК-связывающий белок VglRBP60/hnRBP 1. Повторы Е2 есть и в 3'UTR
мРНК VegT. Многие мРНК, локализованные на вегетативном полюсе, содер-
жат в 3'UTR множественные копии различных последовательностей, в каж-
дой из которых присутствует коровая — САС. Если белки Vera/VglRBP
и VglRBP60/hnRBP I взаимодействуют с мРНК Vgl и VegT в ядре, то XStau
присоединяется к комплексу РНП после его выхода из ядра в цитоплазму.

Формирование, перемещение гранул РНП в клетке
и трансляция

Для направленного перемещения гранул РНП в клетке необходимо осу-
ществление следующих этапов:

1. Образование частиц РНП, которое начинается в ядре и преобразуется
в цитоплазме.

2. Перемещение данных частиц к месту их назначения.

3. Заякоривание частиц на цитоскелете.

4. Трансляция локализованных мРНК.

Образование РНП-частиц начинается в ядре, где очень часто и опреде-
ляется судьба локализованных РНК в цитоплазме. Для локализации мРНК
в ооците нужны компоненты комплекса EJC (exon-exon junction complex),
участвующего в сплайсинге. Компоненты этого комплекса сохраняют связь
с транскриптом после сплайсинга и могут сопровождать транскрипт после
его выхода из ядра. Показали, что белки hnRNPl и VglRBP/Vera связаны
с мРНК Vgl и VegT как в ядре, так и в цитоплазме | Kress et al., 2004]. По-
сле выхода из ядра коровый РНП-комплекс ремоделируется, и в его состав
входят дополнительные факторы, например Prrp (proline-rich RNA-binding
protein) и XStau, которые присоединяются к комплексу РНП в цитоплазме.

Большинство локализованных РНК имеют особые цис-действующие эле-
менты, чаще всего они располагаются в 3'UTR. Эти цис-действующие элементы
взаимодействуют с разнообразными транс-действующими факторами, боль-
шинство из которых относится к РНК-связывающим белкам. Иногда цис-
действующие элементы — это короткие последовательности, как NRE или BRE,
но встречаются и довольно протяженные последовательности, составляющие
340 н. — для мРНК Vgl и 625 н. — для мРНК bicoid. Некоторые факторы взаи-
модействуют с РНК, реагируя на ее конформацию, а не на последовательность
нуклеотидов. Важно, что разные нуклеотидные последовательности способны
образовывать сходные конформомеры последовательностей РНК.

Большую роль в перемещении мРНК по микротрубочкам играют белки
из суперсемейств кинезинов и динеинов. Тип моторных белков, который бу-
дет использован при перемещении конкретной мРНК, определяет направле-
ние ее перемещения с учетом полярности микротрубочек. Например, мРНК
bicoid и oskar локализуются соответственно на переднем и заднем конце
ооцита и для своего перемещения используют разные моторные белки: мРНК
bed — динеин — моторный белок минус-конца МТ. мРНК osk для своего пе-
ремещения к заднему полюсу ооцита использует кинезин — моторный белок
плюс-конца МТ, поскольку после перестройки цитоскелета плюс-концы МТ
сосредотачиваются на заднем полюсе.

В перемещении определенных мРНК могут принимать участие актин
и миозин. Доказательство участия актомиозина в перемещении мРНК по-
лучены в экспериментах, в которых применяли цитохалазин — препарат,
вызывающий деполимеризацию актина. мРНК для своего перемещения мо-
гут использовать филаменты, состоящие из актина, и микротрубочки. Обе
эти транспортные системы со своими моторными белками задействованы
и в перемещении гранул РНП в отростках нервных клеток.

Герминальные (полярные) гранулы

Герминальные (полярные) гранулы РНП — электронно-плотные структу-
ры — описаны более 100 лет тому назад. Их относят к немембранным клеточ-
ным органеллам фибриллярного состава. Называют их по-разному: полярны-
ми гранулами — у дрозофилы, Р-гранулами — у нематоды, герминальными
гранулами — у ксенопуса и хроматоидными телами — у млекопитающих. Эти
образования называют также и nuage (с фр. — «облако»). Такие гранулы часто
располагаются рядом с ядром и связаны с митохондриями.

У D. melanogaster в период синхронных делений ядер эмбриона часть ядер
мигрирует в особую цитоплазму, свободную от желтка, образуя примор-
диальные половые клетки (полярные клетки). Эта цитоплазма называется
полярной плазмой. В ней находятся полярные гранулы, состоящие из РНК
и белка. Это плотные структуры, не окруженные мембраной. Пересадка по-
лярной плазмы в другие части эмбриона может вызвать образование поляр-
ных клеток. В полярной плазме находятся цитоплазматические детерминан-
ты, определяющие судьбу половых клеток.

Полярная плазма содержит белки, несущие домен Tud, способные узнавать
метилированный аргинин и лизин в белках Piwi. Полагают, что присутствие
Tud позволяет защищать ДНК клеток зачаткового пути от мутаций, вы-
званных перемещением транспозонов. Благодаря белок-белковым и белок-
РНК взаимодействиям гранулы являются высоко динамичной структурой,
способной контролировать трансляцию, регулировать стабильность РНК
и обеспечивать ее локализацию. В полярной плазме X. laevis локализуется
нейроспецифичный белок XGRIP2 (Xenopus Glutamate Receptor Interacting
Protein 2), который содержит несколько доменов PDZ. Существование
РНК-связывающих белков, важных для формирования и функционирования
как нервных, так и генеративных клеток, свидетельствует о том, что регуля-
ция экспрессии генов на уровне трансляции в обоих случаях имеет особое
значение и использует общие механизмы.

Р гранулы у нематоды С. elegans

У нематоды перед оплодотворением Р-гранулы равномерно распреде-
ляются в яйце нематоды. С проникновением сперматозоида в яйцеклетку
Р-гранулы перемещаются на задний полюс одноклеточной зиготы.

Р-гранулы обогащают линию Р-клеток, поэтому и получили такое назва-
ние. Р-клетка дает начало генеративным клеткам. При электронной микро-
скопии Р-гранулы выглядят как плотные фибриллярные структуры. В со-
ставе Р-гранул идентифицировали около 40 разных белков. В основном это
РНК-связывающие белки. В составе Р-гранул присутствуют белки PGL-1
(Р granule less) и PGL-3, которые содержат RGG-box, названный так потому,
что представлен С-терминальными повторами Arg-Gly-Gly, отвечающими
за связывание с РНК. Белки PGL-1 и PGL-3 содержат также домены, опре-
деляющие димеризацию и обладающие эндонуклеазной активностью. Белки
Мех-3, Мех-4, Мех-5 и Мех-6 принадлежат к группе РНК-связывающих бел-
ков с доменом цинковых пальцев, который взаимодействует с короткими
участками поли-(и) в 3'UTR мРНК-мишеней. Они важны для биогенеза
Р-гранул. Р-гранулы — структура динамичная, регулируемая путем фосфори-
лирования белков, входящих в их состав. Они могут находиться в цитоплазме
и в районе ядерной оболочки, обнаруживая ассоциацию с ядерными поровы-
ми комплексами. В Р-гранулах находятся и компоненты биогенеза пиРНК.

Таким образом, клетки, содержащие Р-гранулы, предетерминированы
к развитию в генеративные.

Формирование половой системы

Вулперт (Wolpert) в своем труде «The Triumph of the Embryo» (1991) писал,
что именно гаструляция — а не рождение, смерть или другие события —
в развитии организма является главным событием, поддерживающим не-
прерывность жизни. Именно на этом этапе развития обособляются клетки
зачаткового пути. Зачатковый путь позволяет сохранить и передать геном
будущим поколениям. В этом заключается «бессмертие зачаткового пути»
[Wolpert, 1991].

Главные особенности формирования клеток зачаткового пути заключа-
ются в транскрипционной репрессии, в том числе и за счет ремоделирования
хроматина. Транскрипционная репрессия обеспечивает тотипотентность ге-
нома зачатковых клеток через все генерации. С генетической точки зрения
важно попять, как половые клетки могут делиться, не утрачивая тотипотент-
ности. В то время как соматические клетки неизбежно теряют это свойство.
Клетки зачаткового пути — это примордиальные зародышевые клетки —
PGCs (Primordial Germ Cells), которые у многих организмов способны мигри-
ровать в район будущей гонады. Они дают начало генеративным стволовым
клеткам — GSCs (Germline Stem Cells), которые делятся асимметрично, давая
стволовую клетку и клетку, способную к дифференциации, т. е. вступающую
на путь гаметогенеза. Гаметогенез — это процесс, при котором половые
клетки делятся ограниченное число раз и дифференцируются, превращаясь
в гаметы (ооцит или сперматозоид). Для большинства животных важной
характеристикой гаметогенеза является мейоз, позволяющий осуществлять
рекомбинацию наследственных задатков, полученных от матери и отца, и ре-
дуцировать число хромосом в клетке, делая гаметы гаплоидными.

Важнейшей особенностью клеток зачаткового пути на ранних этапах раз-
вития является подавление в них транскрипции. У дрозофилы и нематоды
клетки зачаткового пути детерминированы за счет изменения характера фос-
форилирования РНК-полимеразы II (RNAP — RNA polymerase II) и модифи-
кации хроматина, а у мыши клетки половой линии индуцируются благодаря
сигналам из экстраэмбриональной эктодермы. Сигнальным белком является
BMP (Bone Morphogenetic Protein). Белки BMP принадлежат к суперсемейству
TGFp. Эта сигнальная система блокирует активацию РНК полимеразы II
и участвует в процессах, ведущих к модификации хроматина.
Полярные гранулы как основа полярной плазмы

Полярная плазма у дрозофилы обогащена митохондриями и содержит
электронно-плотные структуры, называемые полярными гранулами. В состав
полярных гранул входят белки Vasa (Vas) и Tudor (Tud), а также eIF4A (фак-
тор инициации трансляции), МеЗВВ (геликаза, относящаяся, как и Vasa, к се-
мейству DEAD-box) и TF.R94 (Transitional Endoplasmic Reticulum 94). Все эти
факторы так или иначе участвуют в регуляции экспрессии генов на уровне
трансляции. Присутствие белка Aubergine (Aub) свидетельствует о значении
полярных гранул в сохранении мРНК в состоянии, временно недоступном
для трансляции, и возможности их деградации, а также в биогенезе пиРНК.
Присутствие РНК, а также факторов, регулирующих трансляцию и участву-
ющих в метаболизме локализованных мРНК, предполагает, что полярные
гранулы являются носителями информации, которая обеспечивает реали-
зацию программы развития в условиях подавления транскрипции. Белки
Aub, Ме31В и eIF4A — это эволюционно консервативная составляющая РНП
(рибонуклеопротеиновых) гранул. Они обеспечивают хранение, трансля-
ционную репрессию и деградацию РНК. Эти детерминанты определяют са-
мобытность клеток зачат кового пути и сохранение этого свойства в течение
продолжительного промежутка времени.

Герминальные гранулы представляют собой большие рибонуклеопротеи-
новые комплексы, которые обычно располагаются вокруг ядер будущих гер-
минальных клеток и, по предположению, участвуют в посттранскрипцион-
ной регуляции экспрессии генов. Основными компонентами герминальных
гранул являются белки, мРНК и некодирующие РНК. Состав гранул изме-
няется и зависит от типа клеток и стадии развития. Обязательная составля-
ющая герминальных гранул геликаза Vasa. Эту геликазу находят в половых
клетках многих видов, включая мышь, нематоду, человека, шелкопряда и др.

Интересно, что мРНК rasa у дрозофилы равномерно распределяется
по всему эмбриону, а белок Vasa можно увидеть только на заднем полюсе
в составе полярных гранул полярной плазмы. Такая же особенность харак-
терна для ксенопуса и нематоды. И у рыбы-зебры мРНК vasa накапливается
в структурах, похожих на герминальную плазму у других организмов. Белок
Vasa обнаруживают только в ограниченном наборе клеток. Он своеобразный
маркер половых клеток.

Есть еще одна особенность герминальных гранул — присутствие сосед-
ствующих с ними митохондриальных рибосом. В состав рибосом митохон-
дриального типа у Drosophila входит особая рибосомная РНК — mtrRNA
(mitochondrially encoded ribosomal RNA). Такие рибосомы обогащают по-
лярную плазму.

Это предполагает значимость трансляции не только на эукариотических,
но и на прокариотических рибосомах, при образовании клеток зачаткового
пути. Действительно, количество полярных клеток уменьшается как при
действии циклогексимида — ингибитора трансляции на эукариотических
рибосомах, так и при действии хлорамфеникола или казугамицина — ин-
гибиторов трансляции на прокариотических рибосомах. Кандидатом для
трансляции на рибосомах митохондриального типа является мРНК^с/ (germ
cell-less), поскольку оба типа ингибиторов трансляции снижают количество
белка GCL. Использование трансляционной машины митохондрий для син-
теза белков полярной плазмы способствует появлению специализирован-
ных белковых форм, поскольку митохондриальные рибосомы прочитывают
в мРНК gel нонсенс-кодон UGA как триптофан. Это приводит к тому, что
С-терминальный конец белка GCL при трансляции с участием митохондри-
альных рибосом дополнительно содержит 31 а. к.

Примордиальные половые клетки — primordial germ cells (PGCs)

PGCs возникают в результате преформации (дрозофила и нематода) или
индукции (мышь). У млекопитающих формирование PGCs индуцирует сиг-
нальный белок BMP.

В развивающемся эмбрионе дрозофилы ядра будущих PGCs обособляют-
ся гораздо раньше, чем остальные ядра. После миграции на задний полюс
ооцита они делятся еще 1-2 раза, в то время как остальные ядра эмбриона
продолжают делиться. В середине бластулы (1,5-2 ч от начала эмбриональ-
ного развития), когда в ядрах будущих соматических клеток индуцируется
транскрипция, в ядрах PGCs транскрипция блокирована. Во время гаструля-
ции PGCs перемещаются внутрь эмбриона, и только после этого в них начи-
нается транскрипция. Это происходит на стадии 9 эмбрионального развития
дрозофилы. На стадиях 10-13 PGCs проходят сквозь эпителий кишечника,
а затем по базальной стороне кишечника мигрируют в направлении двух
групп соматических клеток, расположенных в мезодерме. Эти клетки назы-
ваются соматическими предшественниками гонады — SGPs (somatic gonadal
precursor cells). С участием клеток SGPs и PGCs формируется пара эмбри-
ональных гонад.

Для поддержания статуса PGCs важно получение сигналов от сигнальной
системы BMP. В этой системе у дрозофилы лигандом является белок Dpp
(Decapentaplegic), а рецептором — продукт гена thickveins — BMP. Рецептор
воспринимает сигнал и вызывает фосфорилирование транскрипционного
фактора Mad (Mothers against Dpp).

Эти сигналы PGCs получают из соседних клеток, с которыми они контак-
тируют. Клетки, вырабатывающие сигнальные молекулы, называются нишей.
Если PGC утрачивает контакт с нишей и не получает соответствующих сиг-
налов, она встает на путь дифференциации. Если вообще все клетки (PGCs)
потеряют такую связь или не будут получать сигнал, — это приведет к бес-
плодию. Если по каким-то причинам произойдет разрастание клеток ниши
или усиление сигнала, — это станет причиной увеличения пролиферации
PGCs, т. е. рака.

Подавление транскрипционной активности в PGCs происходит за счет из-
менения статуса фосфорилирования РНК-полимеразы II (рис. 4.5). Карбокси-
терминальный домен (CTD — carboxy-terminal domain) РНК-полимеразы II
содержит последовательность YSPTSPS. В этой последовательности серины 2
и 5, отмеченные жирным шрифтом, подвергаются модификации путем фос-
форилирования. Модификация серина 5 (P-Ser5) необходима для того, чтобы
РНК-полимераза II формировала преинициирующий комплекс транскрип-
ции. Фосфорилирование серина 2 (P-Ser2) — необходимое условие функцио-
нирования РНК-полимеразы II на этапе элонгации транскрипции. У С elegans
белок РТЕ-1 является транскрипционным репрессором.

В экспериментах на D. melanogaster показано, что продукт гена pgc по-
давляет фосфорилирование по серину 2 в CTD РНК-полимеразы II. До га-
с груляции ни у D. melanogaster, ни у С. elegans в районе герминальных клеток
не идентифицируется РНК-полимераза II, фосфорилированная по серину
в положении 2 или 5 (P-Ser2 или P-Ser5). В то же время в соматических клет-
ках фосфорилированная РНК-полимераза II присутствует и на более ранних
стадиях развития. У D. melanogaster нет гена, гомологичного гену pie-1 нема-
тоды. Такую функцию берут на себя гены gel (germ cell-less) и pgc (polar granule

Дрозофила

зародышевого пути

Нематода

зародышевого пути

клеточной массы

соматические

сигнальный
белок

BMP

GCL

RNAP

PGC

PIE-1

RNAP

Mes

клетки

НЗК4те2

Активный хроматин

НЗК27теЗ

Неактивный хроматин

НЗК27теЗ

Неактивный хроматин

Рис. 4.5. Особенности формирования зачатковых клеток — примордиальных зародышевых
клеток (PGCs — Primordial Germ Cells) — у разных животных [Seydoux, Braun, 2006J
component), что является примером функциональной гомологии. У самок,
мутантных по генам gel и pgc, получаются эмбрионы, накапливающие зи-
готические транскрипты в ранних половых клетках. В этих клетках можно
идентифицировать и РНК-полимеразу II с P-Ser2. Другим подтверждением
участия генов gel и pgc в транскрипционной репрессии являются результаты
эктопической экспрессии генов gel и pgc в соматических клетках, которая
приводит к уменьшению содержания РНК-полимеразы II с P-Ser2.

Транскрипционная репрессия у D. melanogaster происходит с участием
продукта гена pgc и gel, у С. elegans — pie-1, а у млекопитающих — Blimp 1
(PR domain zink finger protein 1, или В lymphocyte-induced maturation protein 1).
В их отсутствии разрешается экспрессия генов, характерных для сомати-
ческих клеток, что превращает зачатковые клетки в соматические. Глав-
ное в транскрипционном замолкании, характерном для клеток зачаткового
пути, — это не допустить работу генов, которые кодируют транскрипци-
онные факторы, способные запустить программу дифференциации, свой-
ственную соматическим клеткам.

Но не только статус фосфорилирования РНК-полимеразы II не допускает
транскрипцию генов в зачатковых клетках: в период формирования зачатко-
вых половых клеток модифицируется и структура хроматина.

Модификация хроматина

как характерная особенность клеток зачаткового пути

Диметилированный лизин 4 в гистоне НЗ (Н3-К4те2) является маркером
транскрипционно-активного хроматина. И у дрозофилы, и у нематоды в ран-
них половых клетках уровень Н3-К4те2 низкий (рис. 4.5). У дрозофилы сниже-
ние уровня Н3-К4те2 коррелирует со снижением уровня РНК-полимеразы II
с P-Ser5 и P-Ser2. У нематоды С. elegans уровень Н3-К4те2 снижается после
исчезновения PIE-1, что сопровождается появлением РНК-полимеразы II
с P-Ser2 и P-Ser5. У нематоды дополнительно повышается относительное
содержание триметилированного лизина 27 в гистоне НЗ (НЗ-К27теЗ), что
является маркером неактивного хроматина. За триметилирование гистона НЗ
по лизину 27 в PGCs у нематоды отвечает ген Mes-2, кодирующий специфич-
ную для гистона НЗ меги л трансферазу. Это предполагает существование двух
независимых механизмов транскрипционной репрессии в PGCs: на первом
этапе блокируется активность РНК-полимеразы II, а на более поздних стади-
ях включается механизм репрессии транскрипционной активности за счет
модификации хроматина.

У мыши PGCs появляются в эпибласте в период гаструляции. В алланто-
исе (структуре, локализованной в экстраэмбриональной мезодерме) можно
идентифицировать около 40 PGCs. В формировании PGCs решающую роль
играет получение сигналов из экстраэмбриональных тканей. В будущих PGCs
начинает экспрессироваться ген Blimp 1. У мутантов по этому гену число
PGCs уменьшается. Blimp 1 — это гистоновая метилтрансфераза. Клетки,
в которых экспрессируется ген Blimpl, утрачивают способность к экспрес-
сии генов Нох, но сохраняю!' экспрессию генов Oct4, Nanog и Sox2, г. е. такие
клетки поддерживают состояние плюрипотентности.

Примордиальные зародышевые клетки (PGCs)

у разных животных

У большинства животных PGCs формируются в период эмбриогенеза
до возникновения многих тканей, часто — на периферии эмбриона. Суще-
ствуют три возможности появления примордиальных зародышевых клеток:

1. Преформация. Характерна для D. melanogaster, С. elegans и X. laevis. Ос-
нову для поддержания тотипотентного состояния ядер создает цитоплазма
с продуктами генов материнского эффекта: цитоплазматическими детерми-
нантами, определяющими судьбу примордиальных клеток, в которые эти
детерминанты попадают.

2. Индукция. Служит для формирования зачатковых клеток у млекопита-
ющих. Предшественники половых клеток появляются из плюрипотентных
клеток благодаря попаданию в соответствующее окружение, способное ин-
дуцировать в клетках программу развития, соответствующую будущим по-
ловым клеткам.

Таким образом, либо в клетки попадает специфичная материнская цито-
плазма — она предопределяет их дальнейшую судьбу, — либо судьба кле-
ток решается позднее, в эмбриональном развитии, за счет внеклеточных
сигналов.

Индукция — механизм формирования зачаткового пути у млекопита-
ющих. Для образования половых клеток у млекопитающих нужны линии
клеток с непрерывной экспрессией ключевых генов плюрипотентности, таких
как Okt4 и RNAP (RNA polymerase).

3. Формирование зачатков половых клеток у гидры и полипов. У неко-
торых беспозвоночных животных половые клетки могут образовываться
из соматических на протяжении всего онтогенеза. У губок половые клетки
дифференцируются в течение всей жизни из двух источников: из подвижных
амебоидных археоцитов и из специализированных воротничковых жгутико-
вых клеток — хоаноцитов. У кишечнополостных есть недифференцирован-
ные резервные клетки, которые называются интерстициальными клетками
(i-клетками), они мо1ут дать начало разным типам дифференцированных
клеток, в том числе половым. Этот процесс протекает в течение всей жизни
животного и может зависеть от сезонных причин, условий питания, состава
среды. Например, у пресноводной гидры образование половых клеток (или
«сексуализация») часто спонтанный, неожиданный процесс.
Нематода как модельный объект

с детерминированной программой развития

Нематода (Caenorhabditis elegans) относится к типу круглых червей. Взрос-
лая особь имеет длину около 1 мм. Ее тело состоит примерно из 1000 со-
матических клеток и такого же (или большего) числа генеративных клеток.
Полный цикл развития проходит следующие этапы: оплодотворение, эмбрио-
генез, стадии личинки четырех возрастов (LI, L2, L3, L4) и появление по-
ловозрелой особи. Развитие до появления половозрелой особи длится трое
суток. После рождения (вылупления из яйца) появляется личинка первого
возраста (L1), которая состоит из 558 клеток. Развивающаяся особь немато-
ды увеличивается в размере, при этом к делениям приступает ограниченное
число клеток.

Особи нематоды бывают самцами или гермафродитами. Самцы состо-
ят из 1031 соматической клетки, а гермафродиты — из 959. Гермафродиты
могут давать не только потомство от скрещивания с самцами, но и раз-
множаться путем самооплодотворения. У гермафродитной особи пять пар
аутосом и две Х-хромосомы, а у особи мужского пола — столько же аутосом
и только одна Х-хромосома. Самцы появляются в результате скрещивания
гермафродитных особей с самцами, и частота появления самцов в этом слу-
чае составляет около 50 %. При самооплодотворении гермафродитной особи
самцы обычно появляются с частотой не более 0,2 % — из-за образования
гамет, случайно утративших Х-хромосому. Хромосомы С. elegans мелкие
и не имеют выраженной центромеры, поэтому относятся к голоцентриче-
ским (с диффузной центромерой). На генетических картах центральные
районы аутосом представлены группой близко расположенных генов, что
является следствием более низкой частоты рекомбинации в этом районе
по сравнению с остальными районами хромосомы. Геном нематоды был
полностью секвенирован в 1998 г. Его размер составляет 97 МБ. Компьютер-
ный анализ предсказывает около 19 000 генов, кодирующих белки. Средняя
плотность генов в геноме нематоды более высокая, чем известная у других
животных. Это может быть связано с тем, что интроны в генах нематоды
имеют относительно меньшие размеры, чем это характерно для интронов
в генах других животных.

Существуют особенности и в экспрессии генов нематоды: более 70 %
мРНК на 5'-конце имеют одну из двух эволюционно консервативных по-
следовательностей, называемых сплайс-лидеро.м (splice-leader). Эта после-
довательность длиной в 22 н. присоединяется к мРНК в результате транс-
сплайсинга при созревании первичного транскрипта, который сам по себе
не несет сплайс-лидера. Еще одной особенностью, отличающей С. elegans
от других организмов, является полигенность первичного транскрипта. При-
близительно 25 % соседствующих генов транскрибируются подобно оперо-
нам у прокариот. Затем полигенный первичный транскрипт подвергается
транс-сплайсингу, разделяясь на отдельные мРНК, из которых путем обыч-
ного сплайсинга вырезаются интроны.

Тело нематоды прозрачно, поэтому можно наблюдать за делением, мигра-
цией и дифференцировкой клеток прижизненно. Такая особенность немато-
ды позволила С. Бреннеру и Д. Салстону проследить за происхождением всех
клеток организма — от оплодотворенной яйцеклетки до клеток взрослого
организма. Благодаря тому, что у С. elegans можно проследить за судьбой каж-
дой клетки в развитии, Р. Хорвиц идентифицировал гены, контролирующие
клеточный суицид, или апоптоз. Было установлено, что в процессе эмбрио-
генеза часть клеток погибает, и эта гибель генетически запрограммирована.
Апоптоз, или программированная клеточная гибель, характеризующаяся де-
градацией ДНК, контролируется работой специальных генов, получивших
название ced (cell death). Гомологичные гены есть и у других организмов.
Работа этих генов позволяет контролировать размер клеточных популяций
и удалять избыточные или аномальные клетки. Появление раковых клеток
у человека часто сопряжено с мутациями генов, контролирующих апоптоз.

Норма

Нп-32(~)

в Пп-22(-)

Пп-32(-); Нп-22(-) г

Рис. 4.6. Клеточные родословные в норме (д) и у мутантов нематоды Caenorhabditis elegans
(а-б) [WormBook. 'Ihe Online Review of C. elegans Biology. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
books/NBK 19662/ (дата обращения: 21.04.2025); Horvitz et al., 1983]
Особенность развития нематоды связана с тем, что происхождение от-
дельных клеток ее тела является строго детерминированным, т. е. развитие
подчиняется одной и той же генеалогической схеме. Можно заранее опре-
делить: какие и сколько клеток получится из определенной родительской
клетки, будет ли клетка делиться и далее или нет, каким клеткам суждено по-
гибнуть, встав на путь программированной клеточной гибели, или апоптоза.
В результате развития нематоды формируется организм, состоящий всегда
из строго постоянного числа клеток (в отличие от высших животных, для
которых возможны вариации в судьбе клеток). Клеточные родословные по-
зволяют проследить путь появления каждой клетки, число предшествующих
делений, устанавливать степень родства определенных клеток, определять
варианты программированной гибели клеток. В этих родословных каждой
клетке дано соответствующее ей имя. Анализ клеточных родословных пока-
зал, что клетки одной ткани не обязательно являются близкородственными
(рис. 4.6). Они могут происходить из разных «клеток-основательниц». И на-
оборот, в ряде случаев сестринские клетки могут иметь разную тканевую
принадлежность. Например, гиподермальная и нервная клетки могут быть
сестринскими.

Хотя тело нематоды не разделено на сегменты, оно имеет черты, характер-
ные для метамерного строения, и состоит из повторяющихся групп клеток.
Вдоль вентральной стороны личинки L1 располагается 12 клеток-основатель-
ниц, которые производят клеточные сублинии, состоящие из мотонейронов
и клеток гиподермы (наружного слоя клеток, аналога кожи).

Шесть клеток-основательниц (АВ, MS, Е, С, D и Р4) дают основные эмбри-
ональные клеточные линии, из которых Р4 является родоначальницей клеток
зачаткового пути.

За введение Caenorhabditis elegans в лабораторную практику и открытия
в области генетического регулирования программированной клеточной ги-
бели Сидней Бреннер, Роберт Хорвиц и Джон Салстон были удостоены Но-
белевской премии (2002).

Распространенные модели животных, используемые для исследования
спецификации и поддержания зародышевых клеток, включают нематоду
Caenorhabditis elegans, плодовую мушку Drosophila melanogaster, рыбку-да-
нио Danio rerio, лягушку Xenopus laevis, сверчка Gryllus bimaculatus и мышь
Mus musculus. У C. elegans, D. melanogaster, D. rerio и X. laevis спецификация
зародышевых клеток происходит путем преформирования: идентичность
зародышевой линии непрерывна и передается через ооцит к первичным за-
родышевым клеткам (PGCs), образованным во время раннего эмбриогенеза.

У сверчков и мышей спецификация судьбы зародышевых клеток осущест-
вляется путем индукции: зародышевая линия прерывиста, поскольку PGCs
должны быть заново индуцированы из подмножества эмбриональных клеток
на более поздних стадиях развития. Такие PGCs не наследуют зародышевую
плазму, а вместо этого индуцируются клеточными сигнальными системами.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается функция генов Т-системы у Drosophila melanogaster7

2. Как происходит формирование заднего полюса в ооците Xenopus laevis7.

3. Что такое полярные гранулы?

4. Каковы механизмы формирования примордиальных зародышевых клеток (PGCs)?

5. В чем состоят особенности развития нематоды Caenorhabditis elegans7.

ЛИТЕРАТУРА

Aniikura R., Sato К., Kobayashi S. Role of mitochondrial ribosome-dependent translation in germline
formation in Drosophila embryos // Mechanisms of Dev. 2005. Vol. 122. P. 1087-1093.

Bashirullah A., Cooperstock R. L., Lipshitz H. D. RNA localization in development // Annu. Rev.
Biochem. 1998. Vol. 67. P. 335-394.

de las Heras J. M., Martinho R. G., Lehmann R., Casanova J. A functional antagonism between the pgc
germline repressor and torso in the development of somatic cells // EMBO Rep. 2009. Vol. 10.
P. 1059-1065.

Hanyu-Nakamura K., Sonobe-Nojima H., Tanigawa A., Lasko P., Nakamura A. Drosophila Pgc protein
inhibits P-TEFb recruitment to chromatin in primordial genn cells II Nature. 2008. Vol, 451.
P. 730-733.

Holstein T. IV The Hydra stem cell system-Revisited II Cells Dev. 2023. Vol, 174. P. 203846.

Horvitz H.R., Sternberg P. W„ Greenwald J. S., Fixsen IV., Ellis H.M. Mutations that affect neural cell
lineages and cell fates during the development of the nematode Caenorhabditis elegans // Cold
Spring Harb Symp. Quant, Biol, 1983. Vol. 48 (2). P. 453-463.

Kimble J., Niisslein-Volhard C. 'Ihe great small organisms of developmental genetics: Caenorhabditis
elegans and Drosophila melanogaster П Develop Biol. 2022. Vol. 485. P. 93-122.

Kloc M., Etkin L. D. Delocalization of Vgl mRNA from the vegetal cortex in Xenopus oocytes after
destruction ofXlsirt RNA // Science. 1994. Vol. 265 (5175). P. 1101-1103.

Kloc M., FtkinL.D. RNA localization mechanisms in oocytes 11 J. Cell Sci. 2005. Vol 118(2).
P. 269-282.

Kress T.L., Yoon Y. J., Mowry K.L. Nuclear RNP complex assembly initiates cytoplasmic RNA
localization П J. Cell Biol. 2004. Vol. 165 (2). P 203-211.

Pitt J.N., Schisa J. A., Priess ).R. P granules in the germ cells of Caenorhabditis elegans adults are
associated with clusters of nuclear pores and contain RNA // Develop. Biol. 2000. Vol. 219.
P. 315-333.

Seydoux G., Braun R.E. Pathway to totipotency: lessons from germ cells И Cell. 200c>. Vol. 127.
P. 891- 904

St гите S., Updike D. Specifying and protecting germ cell fate // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2015.
Vol. 16(7). P. 406-416.

Suzanne M„ Steller H. Shaping organisms with apoptosis 11 Cell Death Differ. 2013. Vol. 20. P. 669-675.

Thomas L., Putnam A., Folkmann A. Germ granules in development // Develop. 2023. Vol. 150 (2).
dev201037.

Wang J. T., Seydoux G. P granule // Curr Biol. 2014. Vol. 24. RO37-638.

Wolpert L. The Triumph of the Embryo. Oxford: Oxford University Press, 1991. 211 p.
Глава 5

СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ

В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ, В РАЗВИТИИ

Транскрипционные факторы — регуляторы транскрипции

Одной из причин дифференциации клеток в процессе развития являются
различия в транскрипционной активности, проявляющейся в активации одних
генов и репрессии других. Специфичность и характер транскрипционной ак-
тивности зависят от транскрипционных факторов (ТФ), взаимодействующих
с основным (базовым) комплексом транскрипции, и либо усиливают ее, либо
подавляют. У эукариот основной, или базовый, комплекс транскрипции состо-
ит из ТАТА-связывающего белка TBP (ТАТА binding protein) (TF-IID), который
взаимодействует с РНК-полимеразой II, и множества белков, называемых TAF
(TBP associated factors — TF-IIA, TF-IIB, TF-IIE и TF-IIF). Базовый транскрипци-
онный комплекс обладает малой специфичностью. Она создается расположен-
ными в цис-положении регуляторными элементами, называемыми энхансера-
ми, с которыми взаимодействуют различные ТФ. Энхансеры могут находиться
достаточно далеко от проксимального промотора. Они мо1ут располагаться
до и после промотора, например в интронах. Эти элементы определяют специ-
фичность и эффективность транскрипции. Относительная гибкость сегментов
ДНК, способных образовывать петли, обеспечивает физическое взаимодействие
между белками, которые связываются с энхансерами, и белками, образующими
базовый комплекс транскрипции. Огромное разнообразие ДНК-связывающих
белков, играющих роль активаторов или репрессоров транскрипции, обуслов-
лено теми последовательностями в ДНК, с которыми они взаимодействуют.
Существует более 100 различных типов ДНК-связывающих доменов. Наиболее
распространенными типами ДНК-связывающих доменов являются следующие:

* НТН (helix-turn-helix) — спираль-поворот-спира,ть;

• HLH (helix-loop-helix) — спираль-петля-спираль;

• HD (homeodomain) — гомеодомен;

• bZIP (basic zipper) — последовательность, обогащенная положительно за-
ряженными аминокислотами и богатая лейцинами (лейциновая молния);

• ZF (zinc finger) — «цинковые пальцы».

Число генов, контролирующих ТФ у человека, достигает 10 % от обще-
го числа генов, кодирующих белки. ТФ взаимодействуют с ДНК в районе
локализации генов, кодирующих белки или нкРНК. Район, предшествующий
сайту инициации транскрипции (промотор), состоит из двух частей: дисталь-
ной и проксимальной. 11роксимальная часть взаимодействует с комплексом,
инициирующим транскрипцию, а дистальная — с ТФ. Сайты связывания с ТФ
часто располагаются кластерами, представленными дискретными модулями.

Многие ТФ функционируют в виде димеров или более сложных белковых
комплексов. Примером транскрипционных факторов, функционирующих
как гомо- или гетеродимеры, являются белки, содержащие домен bZIP: лей-
циновая молния обеспечивает димеризацию, а соседние домены — basic
regions — контролируют связь с ДНК.

Кроме того, существуют факторы, которые выполняют вспомогательную
роль активаторов или репрессоров транскрипции, не связываясь с ДНК не-
посредственно. Регуляторный потенциал создается за счет комбинации таких
взаимодействующих факторов. Комбинация факторов, способных регулиро-
вать транскрипцию, является тем кодом, который включает и выключает опре-
деленные гены, а также регулирует интенсивность их экспрессии в развитии.

Программы генной активности в развитии регулируются за счет после-
довательного появления транскрипционных факторов и запуска так назы-
ваемых транскрипционных каскадов. В этом случае один ТФ индуцирует'
экспрессию гена или генов, продукты которых также являются транскрип-
ционными факторами, а те в свою очередь запускают экспрессию следую-
щей группы генов, вызывая разворачивание программы последовательной
экспрессии генов, многие из которых также являются транскрипционными
факторами или сигнальными молекулами, вовлеченными в активацию или
репрессию ТФ.

Отличительной особенностью ТФ является присутствие одного или не-
скольких ДНК-связывающих доменов. Каждый из этих доменов способен
узнавать определенную последовательность в регуляторной области гена.
Таких последовательностей может быть много; они могут перекрываться, рас-
полагаться на разных нитях ДНК. Это свидетельствует о том, что регуляция
экспрессии генов в развитии зависит от присутствия определенной комбина-
ции ТФ и от возможности активации (репрессии) транскрипции с участием
разного набора ТФ.

Транскрипционные факторы в развитии могут появиться благодаря ак-
тивации кодирующих их генов, а мо1ут существовать в клетке в неактивном
состоянии и становиться активными за счет различных механизмов. По-
следний вариант — распространенная стратегия регуляции экспрессии генов,
определяющих раннее развитие, в тех случаях, когда включается система
быстрого реагирования на соответствующие сигналы. Транскрипционные
факторы могут быть продуктами генов материнского организма и активиру-
ются различными способами: за счет модификации, например в результате
фосфорилирования; путем взаимодействия с другим фактором или, наобо-
рот, в результате освобождения от связи с ингибитором.
Транскрипционная регуляция генов в развитии

Транскрипционные факторы играют важную роль в реализации програм-
мы развития через включение и выключение определенною набора генов,
контролирующих развитие.

Транскрипционные факторы в развитии выполняют разные роли, регули-
руя экспрессию генов:

1) могут запасаться в яйцеклетке как продукты генов материнского орга-
низма (в виде белка или мРНК) и синтезируются в активной форме;

2) нуждаются в активации;

а) содержат трансактивационный домен, модификация которого приводит
к их активации;

б) находятся в комплексе, сохраняющем их в неактивном состоянии;

в) требуют взаимодействия с активирующим фактором;

3) синтезируются в результате экспрессии контролирующего их гена, яв-
ляющегося мишенью ТФ, синтезированного или активированного на преды-
дущем этапе развития;

4) формируют комплексы, инициирующие или репрессирующие транс-
крипцию. В этом случае ТФ влияют на эффективность экспрессии генов-ми-
шеней по правилу трех К: кооперации, конкуренции, концентрации.

Эволюционно консервативные сигнальные системы

Примером эволюционно консервативной системы активации транскрип-
ции являются продукты генов Ип12 и glp-1 — у нематоды и Notch — у дрозофи-
лы. Все перечисленные белки имеют общий план строения: N-терминальная
часть содержит EGF-подобные повторы, в середине — трансмембранный до-
мен и на С-конце — повторы CDC10 (рис. 5.1). У позвоночных белки L1N-12/
Notch расщепляются по сайту 1 с участием фурина (один из трех сайтов на-
ходится в районе трансмембранного домена, по которому может происходить
расщепление).

GLP-1

LIN-12

11.1.1Г1ГНП1 гтг

EGF-подобные повторы Говторы CDC10

Трансмембранный
домен

Notch

Рис. 5.1. Структура ортологичных белков-рецепторов, обеспечивающих межклеточные
взаимодействия в развитии нематоды — GLP-1, LIN-12, и дрозофилы — Notch
Латеральное ингибирование

в дифференциации двух дочерних клеток

Важную роль в определении судьбы дочерних клеток играет механизм
латерального ингибирования. У нематоды механизм латерального инги-
бирования можно рассмотреть на примере принятия решения о судьбе
двух дочерних клеток — Zl.ppp или Z4.aaa: какая из них будет якорной
(АС — anchor cell), а какая — вентральной родоначальницей клеток
матки (VU — ventra] uterine precursor cells). Обе эти клетки обладают
потенциалом, влияющим на образование соматических клеток гонады.
Решение о том, какая из клеток станет АС, а какая — VU, зависит от экс-
прессии гена 1т-12 и является вероятностным событием. Эта ситуация
аналогична латеральному ингибированию с участием системы Delta-Notch
у D. melanogaster при решении вопроса о том, какая из дочерних клеток
станет на путь нейробласта, а какая — останется эпителиальной. Рецеп-
торный белок LIN-12 у нематоды гомологичен связанному с клеточной
мембраной рецепторному белку Notch, взаимодействующему с ростовым
фактором (лигандом) Delta у дрозофилы.

Развитие вульвы (влагалища) у нематоды

У нематоды есть еще один белок, гомологичный белку L1N-12, — это GLP-1
(germline proliferation-1). Оба белка относятся к рецепторам и содержат до-
мен, состоящий из повторов EGF (epidermal growth factor); затем следует
последовательность LNR (LIN-12/Notch repeats), а далее трансмембранный
домен, содержащий два эволюционно консервативных цистеина. Трансмем-
бранный домен может расщепляться секретазами по трем сайтам (рис. 5.2, а).
Внутриклеточный домен представлен повторами (CDCIO/Ankirin) и завер-
шается последовательностью PEST, которая характерна для белков, контроли-
руемых системой деградации. Лигандами, взаимодействующими с рецепто-
рами типа LIN-12 и GLP-1, являются белки LAG-2, DSL-1 и АРХ-1. Эти белки
гомологичны и содержат последовательность DSL и повторы EGE Лиганды
могут быть трансмембранными белками, как LAG-2 и АРХ-1, или секретиру-
емыми — как DSL-1.

У нематоды лиганды LAG-2, АРХ-1 и DSL-1, относящиеся к семейству
DSL (Delta и Serrate у Drosophila и Lag-2 у С. elegans), содержат повторы EGF
и последовательность, называемую DSL. Взаимодействие рецептора с лиган-
дом активирует расщепление рецептора по сайту 2 (рис. 5.2, б). В результате
с мембраной связанным остается только внутриклеточный домен рецептора.
Затем с участием у-секретазы происходит расщепление по сайту 3 с освобож-
дением внутриклеточного домена от связи с мембраной, и освободившаяся
часть белка, взаимодействуя с белком LAG-1, может транспортироваться
а Рецепторы

EGF

LNR

Плазматическая

мембрана LAG-2

С[)С10/Апк АРХ-1

PEST

DSL-1

Рецепторы

LIN-12. GLP-1

LIN 12
GLP-1

Рис. 5.2. Сигнальная система рецепторов LIN-12, GLP-1 и лигандов типа DSL
в активации транскрипции у С. elegans:

а — структура трансмембранных рецепторов I IN-12, GLP-1 и лигандов типа DSL: повто-
ры EGF, LNR, CDC10/Ank (Ankirin), последовательность белков PEST, характерная для
короткоживущих белков, подвергающихся протеасомной деградации; б — при взаимо-
действии рецептора с лигандом происходит расщепление рецептора по сайту 2 (этап 1),
затем у-секретаза наносит разрыв по сайту 3 (этап 2) и освобожденный внутриклеточный
домен перемещается в ядро (этап 3)

в ядро. Этот транскрипционный фактор принадлежит к семейству CSL
(CBF1 — у млекопитающих, Su(H) — у дрозофилы и LAG-1 — у нематоды).

Интересно отметить, что белковый комплекс (у-секретаза), расщепля-
ющий молекулу рецептора LIN-12/Notch по сайту 3, осуществляет и рас-
щепление белка-предшественника бета-амилоида ([3-АРР) в районе транс-
мембранного домена.

Приведенный пример описывает механизм транскрипционной регуля-
ции генов в развитии, в основе которого лежит межклеточное взаимодей-
ствие рецептора, находящегося на поверхности одной клетки, и лиганда,
синтезируемого соседней клеткой. Такие взаимоотношения у С. elegans ре-
шают судьбу двух сестринских клеток, определяя, какая из них станет АС,
а какая — превратится в VU. Эти клетки взаимодействуют друг с другом
через LAG-2 и LIN-12, и только одна из них становится якорной. Вначале
обе клетки содержат и LAG-2, и LIN-12, но лишь небольшой сдвиг в соот-
ношении этих белков является определяющим. Взаимодействие рецептора
LIN-12 с лигандом LAG-2 приводит к активации транскрипции гена Ип-12
и подавлению транскрипции гена lag-2 в одной из клеток. Эта клетка ста-
новится VU. На ее поверхности находится рецептор LIN-12. У мутантов
с потерей функции гена Ип-12 обе клетки становятся якорными.

Альтернативный фенотип имеют доминантные (gain-of-function) мутанты
но гену Ип-12: обе клетки становятся клетками-предшественниками матки.
Якорная
клетка

Клетки-предшественницы
вульвы (VPC)

Рис. 5.3. Роль якорной клетки в формировании вульвы у Caenorhabditis elegans

Разворачивание программы развития нематоды во многом определяется
взаимодействием автономных клеточных процессов (автономных программ
развития) и межклеточных связей, определяющих пусковые механизмы про-
грамм развития.

Межклеточные взаимодействия осуществляются через межклеточные сиг-
налы, роль которых в развитии очень велика, но не менее важна способность
клеток к восприятию сигнала. Клетки должны быть компетентными к нему,
а это определяется предыдущей историей развития клетки.

В качестве примера можно рассмотреть развитие вульвы, или влагалища,
у С. elegans. Генеалогия клеток этого органа у нематоды изучена очень хоро-
шо. На вентральной стороне личинки третьего возраста (L3) среди клеток ги-
подермы как раз под гонадой находятся шесть клеток гиподермы (Р3.р-Р8.р),
детерминированных к развитию вульвы (рис. 5.3). Их называют клетками-
предшественницами вульвы VPCs (Vulval Precursor Cells). Вульва развива-
ется из трех клеток-предшественниц вульвы — Vulval Precursor Cell (VPC).
Каждая из этих клеток претерпевает три последовательных митотических
деления. В результате из каждой клетки VPC может максимально получить-
ся восемь клеток. Так и происходит с одной из клеток VPC. Для двух других
генеалогия отличается. Претерпевая три последовательных деления, они про-
изводят не по восемь, а только по семь клеток. Поэтому из трех клеток VPC
суммарно получается 22 клетки вульвы. На поверхности клеток VPC нахо-
дится рецептор LET-23, воспринимающий сигнал, поступающий из якорной
клетки. Сигнальной молекулой является продукт гена Ип-З, который синте-
зируется только якорной клеткой. Рецептор LET-23 гомологичен рецептору
EGF у млекопитающих. Мутации, приводящие к потере функции генов let-23
и Ип-З, имею! фенотип — отсутствие вульвы. Тогда как доминантная мутация
(gain-of- function) гена let-23 приводит к увеличению числа клеток вульвы или
к образованию нескольких вульв.

Особенностью якорной клетки является ее автономность. Она проявля-
ется в том, что якорная клетка содержит детерминанты, свойственные толь-
ко этой клетке. Если уничтожить якорную клетку лазерным лучом, вульва
не образуется. Но если уничтожить все клетки гонады и оставить только
якорную клетку, вульва будет образовываться. Из шести клеток VPC только
три (РЗ.р, Р4.р и Р5.р), ближайшие к якорной клетке, в дальнейшем делятся
и производят 22 клетки, формирующие вульву. Если уничтожить эти три
клетки, нормальную вульву сформируют потомки оставшихся трех клеток
гиподермы (Р1.р, Р2.р и Рб.р). Эти клетки, так же как и клетки РЗ.р, Р4.р
и Р5.р, детерминированы к развитию вульвы (содержат в клеточной мем-
бране рецепторы LET-23) (рис. 5.3). Поступающий в клетки сигнал от якор-
ной клетки запускает каскад сигнальных событий, приводящих к активации
транскрипционных факторов, индуцирующих экспрессию генов-мишеней,
контролирующих превращение трех детерминированных клеток гиподермы
в клетки вульвы.

Если уничтожить и эти три клетки, развитие вульвы не произойдет
ни при каких обстоятельствах. Таким образом, к развитию вульвы детер-
минированы все шесть клеток VPC, составляя так называемую группу
эквивалентности. Детерминированными называются такие клетки, кото-
рые уже выбрали определенную программу развития. В этих клетках, как
предполагают, происходят стойкие изменения хроматина, которые отлича-
ют детерминированную клетку от других и предопределяют ее развитие
по определенному пути. Таким образом, детерминация подразумевает выбор
определенного пути развития и возникновение отличий, наследующихся
в ряду клеточных поколений. Явление детерминации хорошо известно для
дрозофилы, у которой детерминированными являются клетки имагиналь-
ных дисков.

Гетерохронные мутации

У нематоды детерминирована не только судьба каждой клетки, но и вре-
менной период деления соответствующей клетки, т. е. существует генети-
ческий контроль того момента, когда клетка приступит к делению. Гены,
мутации которых нарушают временные параметры клеточных делений,
называются гетерохронными, или «генами-переключателями». Мутации
этих генов могут быть двух типов — loss-of-function и gain-of-function.
Они оказывают противоположное действие на то, когда в развитии клетка
приступит к делению: раньше того момента, который характерен для нор-
мального развития, или наоборот — позже. Эти гены получили название
lin (linage). Известна гетерохронная мутация — Ип-15, которая приводит
Рис. 5.4. Межклеточные сигналы, определяющие путь развития для потомков четырех клеток
[по: Gilbert, 2000 с изменениями!

к тому, что три последовательных деления будут претерпевать все шесть
клеток VPC, в результате чего образуется вульва, состоящая из 48 клеток
вместо 22.

Рецессивная (loss-of-function) мутация гена Ип-14 вызывает появление
определенных клеточных линий гораздо раньше в развитии, чем это харак-
терно для нормального развития. А доминантная мутация (gain-of-funclion)
приводит к тому, что у носителей этой мутации клеточные линии, которые
появляются в раннем развитии, продолжают возникать и на поздних личи-
ночных стадиях.

Есть еще одно сходство в раннем развитии у дрозофилы и нематоды.
На судьбу клеток в развитии нематоды влияет сигнальный белок GLP-1.
Функция GLP-1 заключается в регуляции митозов и предотвращении пе-
рехода клетки к мейозу. Белок GLP-1 появляется на стадии двух клеток
и только в клетке АВ (рис. 5.4). До стадии 28 клеток данный белок можно
обнаружить только в клетках клеточной линии, происходящей от клеток
АВ. мРНК glp-1 на стадии четырех клеток присутствует во всех клетках,
но транслируется только в клетках АВ. мРНК glp-1 в 3'UTR содержит по-
следовательность NRE, и в клетках, возникших из клетки Р, (Р2 и EMS),
не транслируется. В этом проявляется сходство мРНК glp-l у С. elegans
с материнской мРНК hb D. melanogaster. Связанный с мембраной рецептор
GLP-1 у С. elegans локализуется в районе клеточной мембраны клеток АВа
и АВр. Лиганд, продукт гена арх-l, синтезируется только в клетке Р2. По-
этому сигнал получает только клетка АВр, граничащая с клеткой Р2. Клетка
Р2 является источником двух типов сигналов: 1 — белок АРХ-1 (гомолог
Delta) взаимодействует с рецепторо^м GLP-1 (гомологом Notch) на поверхно-
сти клетки АВр, 2 — белок МОМ-2 (гомолог Wnt) взаимодействует с рецеп-
тором типа Frizzled — МОМ-5 на поверхности клетки F.MS, что определяет
судьбу дочерних клеток — Ей MS, которые становятся родоначальницами
клеток энтодермы и мезодермы соответственно. Клетка АВр, получая соот-
ветствующий сигнал, встает на свой путь развития. Клетка Р, становится
родоначальницей зачаткового пути.
Среди различных стратегий разворачивания программ развития наиболее
распространенной является индукция синтеза транскрипционных факторов de
novo. Но эта стратегия требует разрешения на транскрипцию. В эмбриогенезе
дрозофилы развитие в течение первых полутора-двух часов происходит в от-
сутствии транскрипции зиготических генов. Такая ситуация может существо-
вать и у млекопитающих, когда необходимо экстренно включить гены в ответ
на внешнее воздействие, например при действии патогена. Этому способствует
существование системы активации предсуществующихТФ путем их модифика-
ции за счет сигнала, получаемого извне. ТФ постоянно присутствуют в клетке
в неактивном состоянии, например в комплексе с другими белками, подавля-
ющими их активность. Хорошо изучена система регуляции транскрипцион-
ных факторов из семейства рецепторов стероидных гормонов. Их активация
требует взаимодействия с небольшими, способными к диффузии, лигандами
или гормонами. Известно, что рецепторы стероидных гормонов в цитоплазме
находятся в неактивном состоянии, образуя комплекс с белками теплового
шока HSP90 и HSP70. Этот комплекс не способен проникать в ядро и тем самым
препятствует связыванию ТФ с ДНК. При появлении стероидного гормона про-
исходит взаимодействие рецептора стероидного гормона с гормоном, и конфор-
мация рецептора изменяется. Рецептор обретает способность проникать в ядро
и связываться с соответствующими последовательностями ДНК в регуляторной
области генов-мишеней, экспрессию которых он регулирует.

Существует множество путей активации ТФ. Например, посттрансляци-
онная модификация (фосфорилирование и т.п.), связывание лиганда или
белок-белковые взаимодействия с членом родственного семейства факторов
транскрипции с образованием ДНК-связывающего димера либо с нерод-
ственным фактором. Активация ТФ может происходить за счет модифика-
ции не самих ТФ, а белков, которые с ними взаимодействуют и обеспечивают
их неактивное состояние. Примером такой регуляции может служить актива-
ция транскрипционного фактора Dorsal у дрозофилы и NF-кВ у млекопитаю-
щих. У D. melanogaster роль сигнальной системы в реализации позиционной
информации в DV-системе состоит в том, что сигнал к активации гена dorsal
поступает по так называемому DER — Drosophila EGF receptor — сигнально-
му пути. Сигналом к активации этого пути служит оплодотворение.

DV (dorso-ventral) — система генов с материнским эффектом

у L). melanogaster

Система DV у D. melanogaster включает 12 основных генов материнско-
го эффекта: windbeutel, gastrulation defective, nudel, tube, pipe, snake, easter,
Toll, spatzle, pelle, dorsal и cactus. Мутации первых 11 генов приводят к дор-
сализации эмбриона, а мутация по гену cactus вызывает частичную ней-
трализацию эмбриона. Дорсализация проявляется в том, что у потомков
самок, гомозиготных по мутантным аллелям соответствующих генов, не фор-
мируется вентральная борозда и не наблюдается переднего впячивания
кишки.

Морфогеном в системе DV является транскрипционный фактор — про-
дукт гена dorsal (dl). В раннем развитии концентрация мРНК dl и белка D1
равномерна по периферии эмбриона. На стадии бластодермы, как только
митотические ядра занимают поверхностный слой эмбриона, белок D1 из ци-
топлазмы перемещается в ядра только на вентральной стороне эмбриона.
В этом и заключаются особенность белка D1 как морфогена. Результаты
вестерн-блот анализа показывают, что концентрация белка D1 не меняется,
изменяется лишь его локализация.

Определяющую роль в формировании позиционной информации в систе-
ме DV играют две сигнальные системы.

1. Передача сигнала Gurken от развивающегося ооцита к фолликулярным
клеткам яйцевой камеры на будущей дорсальной стороне эмбриона (рис. 5.5).
На стадиях 7-8 оогенеза, когда ядро развивающегося ооцита перемещается
в переднюю часть ооцита, направление выбирается случайно, но та сторона,
к которой примкнет ядро, станет дорсальной. Ядро ооцита транскрипци-
онно инертно. Между ядром и плазматической мембраной располагается
мРНК^//гА;ем и белок Gurken. На мембране фолликулярных клеток находятся
рецепторы Torpedo или EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), которые
взаимодействуют с сигнальным белком Gurken, имеющим сходство с росто-
вым фактором TGFa. В фолликулярных клетках, получающих сигнал Gurken,
происходит транскрипционная репрессия гена pipe. Фолликулярные клетки,
получившие сигнал, становятся дорзальными, а мРНК pipe появляется толь-
ко в фолликулярных клетках вентральной части яйцевой камеры. Таким

Рис. 5.5. Изменение фолликулярных клеток при получении сигнала Gurken
(обозначен стрелками):

а — формирование полярности ооцита на стадии 6: на переднем конце ооцит контактирует
с питающими клетками, ядро ооцита локализуется на заднем конце ооцита; б — транс-
ляция локализованной мРНК^иг/сея способствует появлению соответствующего белка
между ядром ооцита и соседними фолликулярными клетками, это приводит к перестройке
цитоскелета и миграции ядра ооцита к верхне-передней части ооцита, и новое положение
ядра определит спинно-брюшную (дорсо-венгральную) полярность ооцита; в — синтез
белка Gurken служит сигналом к изменению фолликулярных клеток на дорсальной стороне
ооцита: транскрипционной репрессии гена pipe в этих клетках
образом, экспрессия гена pipe становится локализованной за счет подавления
экспрессии этого гена на уровне транскрипции в фолликулярных клетках,
окружающих яйцевую камеру, на дорсальной стороне.

2. Включение второй сигнальной системы. Она срабатывает после опло-
дотворения за счет секреции фолликулярных клеток на вентральной стороне
яйца и вызывает появление лиганда в результате протеолитического каскада
в перивителлиновом пространстве, располагающемся между вентральной
частью эмбриона и оболочкой яйца. Синтез сигнальных белков начинается
в оогенезе.

Для правильной локализации и функционирования белка Pipe необходим
белок эндоплазматического ретикулума — Windbeutel. Существует предпо-
ложение, что продукты генов pipe и windbeutel нужны для модификации
протеогликана, который секретируется фолликулярными клетками в пери-
вителлиновое пространство (рис. 5.6). Белок Pipe участвует в модификации
неизвестного фактора X в вентральных фолликулярных клетках. Фактор X
взаимодействует с Nudel, который запускает протеолитический каскад в пе-
ривителлиновом пространстве.

Перивителлиновое пространство у D. melanogaster разделяет слой фолли-
кулярных клеток и ооцит, а с развитием эмбриона оно располагается между

Рис. 5.6. Формирование спинно-брюшной полярности (D-V — Dorso-Ventral) эмбриона
с участием генов с материнским эффектом
плазматической мембраной эмбриона и вителлиновой мембраной, которая
составляет внутренний слой оболочки яйца (рис. 5.6). Это пространство за-
полнено перивителлиновой жидкостью.

Трансмембранный рецептор Toll распределяется по всей поверхности эмб-
риона. Его внеклеточный рецепторный домен располагается в перивителли-
новом пространстве, а внутриклеточный — в клетках эмбриона. Активации
рецептора Toll предшествует протеолитический каскад, в который вовлечены
трипсин-подобные сериновые протеазы: Gastrulation Defective, Snake и Easter.
Полноразмерные белки Nudel, Snake, Easter и Spatzle присутствуют в периви-
теллиновом пространстве везде.

Nude] — белок, содержащий не только сериновый протеазный домен,
но и домен, обеспечивающий ассоциацию белка Nudel с внеклеточным ма-
триксом. Синтезируется белок Nudel, как и белки Pipe и Windbeutel, фолли-
кулярными клетками. Активация белка Nudel запускает протеолитический
каскад, в результате которого расщепление белка Gastrulation Defective спо-
собствует появлению активного фрагмента этого белка, расщепляющего бе-
лок Snake. Активный фрагмент Snake приводит к расщеплению белка Easter
с образованием активного фрагмента Easter, участвующего в расщеплении
белка Spatzle, что, в конечном итоге, способствует образованию лиганда, вза-
имодействующего с рецептором Toll.

Лигандом является С-терминальный фрагмент белка Spatzle, который
связывается с трансмембранным рецептором, кодируемым геном Toll. Хотя
белок Toll равномерно распределяется на мембране раннего эмбриона,
но активируется он только на его вентральной стороне, т. е. там, где по-
является взаимодействующий с ним лиганд. Взаимодействие внутриклеточ-
ного домена рецептора Toll через адаптерный белок Tube с протеинкиназой
Pelle обеспечивает передачу сигнала на брюшной стороне раннего эмбриона,
приводящего к модификации белков Cactus и Dorsal и распаду образуемого
ими гетеродимера. Это приводит к активации транскрипционного фактора
Dorsal и его перемещению в ядра эмбриона только на брюшной стороне
(рис. 5.6).

Сериновые протеазы действуют по общему механизму. Они, как правило,
синтезируются в виде неактивных проэнзимов, называемых зимогенами.
Зимогены могут преобразовываться (конвертироваться) в активные энзимы
благодаря протеолитическому расщеплению. Сериновые протеазы вовлечены
во множество процессов, такие как свертываемость крови, фиксация компле-
мента. Превращение проэнзима в активную форму требует взаимодействия
с кофактором, который располагается на поверхности мембраны. Сериновые
протеазы содержат последовательность, которая называется DSN — disulfide
knot (дисульфидный узелок). Этот участок в молекуле белка отвечает за взаи-
модействие молекул данного протеолитического каскада и содержит уни-
кальный серин, расположенный в активном центре, для связывания и ката-
литического гидролиза пептидных связей в белковых субстратах. Мишени
для сериновых протеаз — специфические пептидные связи в белках (часто
в других сериновых протеазах). Для расщепления важно узнать не только со-
ответствующую пептидную связь, по которой пройдет расщепление, но и не-
которые аминокислоты, окружающие пептидную связь, подвергающуюся
ферментативному гидролизу.

Трансмембранный рецептор Toll

Ген Toll кодирует трансмембранный рецептор с двумя лейцин-богатыми
повторами (LRR — leucine rich repeats). Белки с подобными LRR обычно во-
влечены в обеспечение клеточной адгезии или связывание с лигандом. Ци-
топлазматический домен белка Toll гомологичен рецептору интерлейкина 1
у млекопитающих. Ген Toll представлен тремя типами аллелей: дикого типа —
TolT, нулевого — TolT (loss-of-function) — с потерей функции, которые яв-
ляются рецессивными, и доминантными — Toll” (gain-of-function) (рис. 5.7).
В норме белок Dorsal (D1) присутствует в ядрах на брюшной стороне эмбри-
она. У эмбрионов в потомстве самок, гомозиготных по нулевой аллели гена
(TolT/TolT), белок Dorsal можно обнаружить в цитоплазме поверхностного
слоя эмбриона, белок D1 не перемещается в ядра эмбриона. У эмбрионов в по-
томстве самок, несущих доминантную аллель гена TollD, белок Dorsal присут-
ствует в ядрах по всей поверхности эмбриона. Это вызывает вентрализацию
эмбрионов. Частичной нейтрализации эмбриона способствуют и рецессив-
ные мутации в гене cactus. Доминантные аллели Toll' кодируют продукт, про-
являющий свои функции независимо от связывания с лигандом. В результате
продукт гена dorsal перемещается в ядра независимо от сигнала, разрешаю-
щего такое перемещение в норме. Нейтрализация эмбриона фенотипически
проявляется как распространение вентральных и латеральных элементов на
дорсальные структуры. Подобный фенотип возникает вследствие того, что
Dorsal является репрессором дорсализирующих генов Dpp, tolloid и zerknullt
в вентральной области.

Toll4 / TolC Toll' / Toll' Toll01 Toll4

Рис. 5.7. Фенотип эмбрионов в потомстве самок, несущих различные сочетания аллелей гена
Toll. Поперечный срез эмбриона на стадии синцитиальной бластодермы [Gilbert, 2000]
Транскрипционный фактор Dorsal

Белок DI содержит последовательность NLS (nuclear localization signal),
характерную для белков с ядерной локализацией, и принадлежит к семейству
транскрипционных факторов NF-кВ. Транскрипционные факторы этого се-
мейства узнают в регуляторных районах генов-мишеней последовательность,
названную кВ. Эта последовательность впервые была обнаружена в гене,
кодирующем одну из цепей иммуноглобулинов, — каппа-В. Белки Cactus
и D1 образуют гетеродимер. Эта пара белков гомологична паре NF-кВ (транс-
крипционный фактор) и I-кВ (ингибитор этого транскрипционного фактора)
у млекопитающих. Транскрипционный фактор NF-кВ неактивен при взаи-
модействии с I-кВ. Для активации и перемещения белка D1 в ядро требуется
сигнал, возникающий при взаимодействии рецептора Toll с лигандом Spatzle.
У D. melanogaster элементами сигнального пути являются также продукты
генов tube и pelle.

Сигнальный бедок Pelle — это серин-треониновая протеинкиназа, го-
мологичная протеинкиназам, действующим в системе передачи сигналов,
полученных от рецептора интерлейкина. Протеинкиназа Pelle относится
к подсемейству raf-mos. К этой же группе относится и протеинкиназа, на-
зываемая IRAK (Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase). В лимфоцитах ак-
тивация рецептора IL 1 приводит к освобождению ядерного фактора NF-kB
путем быстрой деградации ингибитора этого фактора — l-кВ. Зависящее
от поступающего сигнала фосфорилирование l-кВ индуцирует протеолиз
этого белка.

Мишенью действия протеинкиназы Pelle у дрозофилы является белок
Cactus, а возможно, и Dorsal. Инактивация каталитического домена белка
Pelle блокирует передачу сигнала на комплекс Dorsal/Cactus и приводит к дор-
сализации эмбриона.

Биохимическая активность белка Tube неизвестна. Известно, что его вза-
имодействие с Pelle приводит к разрушению белка Cactus. Кроме того, Tube
сопровождает Dorsal при его миграции в ядро, где он может служить для
активации дорсальной транскрипции.

Cactus является ингибитором белка Dorsal. Взаимодействуя друг с дру-
гом, продукты генов cactus и dorsal остаются в цитоплазме. Cactus является
гомологом I-кВ у млекопитающих. При фосфорилировании I-кВ комплекс
I-кВ/NF-kB распадается, и NF-kB перемещается в ядро и там действует как
транскрипционный фактор, связываясь с регуляторной областью генов-ми-
шеней. Такой же механизм лежит в основе активации транскрипционного
фактора D1 у дрозофилы.

Мишенями действия транскрипционного фактора D1 являются зиготиче-
ские гены twist (twi), zerknullt (zen), snail, decapenteplegic (dpp).

twi и snail необходимы для формирования мезодермы в вентральной части
эмбриона.
zen и dpp нужны для развития дорсальных элементов развивающегося
эмбриона. Белок DL является актива юром для twi и snail и репрессором для
zen и dpp.

Белок 1)рр относится к семейству ростовых факторов TGF|3. Этот белок се-
кретируется только из клеток, расположенных в дорсальной части эмбриона
и вызывает морфогенетические процессы, которые характерны для дорсаль-
ной части эмбриона.

Исследование экспрессии белков twi и zen на стадии ранней бластодермы
показало, что белок Zen появляется в дорсальной части эмбриона, занимая
40 % ЕС (Egg Circumference) поверхности яйца. Белок Twi обнаруживается
в вентральной части эмбриона, занимая 20 % ЕС. На латеральной поверх-
ности эмбриона не выявляется ни тот, ни другой белок. В эмбрионах, полу-
ченных от самок dl~, белок Zen выявляется по всей поверхности эмбриона,
а белок Twi не обнаруживается вообще.

Dorsal/Cactus у дрозофилы гомологична системе NF-kB/1-kB, вовлеченной
у млекопитающих в регуляцию иммунитета. За работы по изучению актива-
ции врожденного иммунитета, иммунные ответы и их протекание у насеко-
мых Нобелевскую премию (2011) получил Жюль Хоффманн.

Одной из стратегий развития является присутствие в клетке ТФ в не-
активном состоянии, что допускает их активацию за счет различных меха-
низмов. Эволюционно консервативной является регуляция экспрессии генов
с участием ТФ, которые находятся в неактивном состоянии благодаря взаи-
модействию с ингибитором. Это способствует быстрой активации генов-ми-
шеней, не требуя синтеза соответствующих ТФ. Определяющим становится
появление экзогенных и эндогенных стимулов, активирующих ТФ или осво-
бождающих их от связи с ингибитором.

Контрольные вопросы

1. Какова роль транскрипционных факторов в развитии?

2. Что такое гетерохромные мутации?

3. Какова функция DV-системы генов у D. melanogaster?

4. Что такое латеральное ингибирование?

5. В чем состоят особенность и функция якорной клетки Caenorhabditis elegans?

ЛИТЕРАТУРА

Гилберт С. Биология развития: в 3 г. / пер с англ., под ред. С. Г. Васецкого. М.: Мир. 1995.

Gavis Е. R. Pattern formation. Gurken meets torpedo for the first time 11 Curr Biol. 1995. Nov 1. Vol. 5

(11). P. 1252-1254.

Gilberts. E Developmental Biolog)'. 6,h ed. Sunderland (MA). Sinauer Associates, 2000.

Greenwald I. L1N-12/Notch signaling in C. elegans. WormBook. 2005. P. 1-16. WormBook. The

Online Review of C. elegans Biology. URL: http://www.wormbook.org/chapters/www_linl2Notch/
linl2notch.html (дата обращения 21.04.2025).
Rahimi N., Averbakh I., CarmonS., Schejter E. D., BarkaiN., ShiloR.Z. Dynamics of Spaetzle
morphogen shuttling in the Drosophila embryo shapes gaslrulation patterning // Develop. 2019.
Vol. 146(21). devl81487.

Reeves G. T., Stathopoulos A. Graded dorsal and differential gene regulation in the Drosophila embryo
// Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009. Vol. 1, no.4. a000836.

Riechmann V., Ephrussi A. Axis formation during Drosophila oogenesis // Curr. Opin. Genet. Develop.
2001. Vol. 11. P. 374-383.

SchloopA.E., Carrell-Noel S., Friedman J., Thomas A., Reeves G.T Mechanism and implications of
morphogen shuttling: Lessons learned from Dorsal and Cactus in Drosophila // Dev. Biol. 2020.
Vol. 461 (1). P. 13-18.

Sherwood D. R., Plastino J. Invading, Leading and Navigating Cells in Caenorhabditis elegans: Insights
into Cell Movement in Vivo Genetics // Genetics. 2018. Vol. 208 (1). P. 53-78.

Stathopoulos A., Van Drenth M., Erives A., Markstem M„ Levine M. Whole genome analysis of dorsal-
ventral patterning in the Drosophila embryo // Cell. 2002. Vol. 111 (5). P. 687-701.
Глава 6

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ЗИГОТИЧЕСКИХ ГЕНОВ
НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ

Различные механизмы транскрипционной регуляции экспрессии генов
в развитии можно продемонстрировать на примере активации или репрессии
зиготических генов у эмбрионов D. melanogaster.

Зиготические гены в раннем развитии D. melanogaster

Экспрессия зиготических генов у D. melanogaster начинается на стадии
синцитиальной бластодермы, т. е. спустя полтора-два часа с начала эмбри-
онального развития. К этому моменту в эмбрионе происходит 13 синхрон-
ных делений. К концу девятого цикла синхронных делений ядра мигрируют
к периферии эмбриона и располагаются в районе кортикальной цитоплазмы.
После формирования периферического слоя ядер эмбрион остается синцити-
альным в течение трех последовательных циклов делений ядер, которые уже
претерпели миграцию в поверхностный слой эмбриона. Затем из кортекса
вырастает мембрана, разделяющая клетки. Так формируется клеточная бла-
стодерма. Экспрессия зиготических генов начинается еще до полного обосо-
бления клеток, т. е. до формирования клеточной бластодермы. В этот период
устанавливается план строения эмбриона.

Эмбрион разделяют на следующие сегменты: головы (Md, Mx Lb), торакса
(Т1-ТЗ) и брюшка (А1-А8) (рис. 6.1).

Каждый из сегментов имеет переднюю (А) и заднюю (Р) части, разделы
между которыми являются границами парасегментов (PS — parasegment).
Подразделение на парасегменты необходимо для описания областей экспрес-
сии зиготических генов, границы которых могут совпадать или с границами
сегментов, или с границами парасегментов. Сегментация эмбриона соответ-
ствует сегментации будущего насекомого.

Идентификацию сегментов удобнее всего проводить по вентральной кути-
куле, которая у только что вылупившейся личинки разделяется на сегменты.
В каждом из сегментов можно увидеть белую полосу дентикул (выростов),
которая имеет специфический рисунок, позволяющий отличать один сег-
мент от другого (рис. 6.2). Это помогает увидеть, какие сегменты исчезают
в результате мутации, и понять, какие из генов важны для формирования
knirps

III
lailless

Рис. 6.1. Зоны экспрессии зиготических генов в ранних эмбрионах D. melanogaster в соответ-
ствии с сегментами: головы (Md, Мх и Lb), торакса (Т1-ТЗ) и брюшка (А1-А8)

конкретных сегментов. Например, при отсутствии материнского белка Bed
можно видеть только шесть зон дентикул: нет сегментов, из которых форми-
руются голова и торакс, а часть оставшихся сегментов дуплицирована.

Число и спецификация каждого из сегментов детерминирована продук-
тами генов материнского эффекта, сочетание которых определяет характер
экспрессии зиготических генов.

Зиготические гены у дрозофилы можно разделить на гри группы:

1. Гены пробелов (gap). Мутации этих генов приводят к исчезновению
определенных сегментов.

2. Гены правила парности (pair-rule). Продукты одних генов этой группы
экспрессируются в четных сегментах или парасегментах, в то время как про-
дукты других — в нечетных. Иногда зона их экспрессии захватывает границы
сегментов, но во всех случаях существует чередование зон наличия или от-
сутствия экспрессии каждого из генов, принадлежащих к этой группе.

3. Гены полярности сегментов (polarity of segments) экспрессируются или
в передней, или в задней части сегмента, определяя границы сегмента.

Гены трех названных групп начинают работать последовательно в том по-
рядке, в котором они перечислены.

Т1 Т2 ТЗ А1 А2 АЗ А4 А5 Аб А7 А8 А9

Голова

Рис. 6.2. Брюшная сторона только что вылупившейся личинки 1). melanogaster
Гены gap

На стадии синцитиальной бластодермы белковые продукты генов gap об-
разуют широкие частично перекрывающиеся градиенты концентраций. Они
экспрессируются до стадии гаструляции. Экспрессия этих генов начинается
за два деления до образования клеточной бластодермы.

Тело насекомого метамерно, т. е. состоит из серии повторяющихся единиц,
или сегментов. Каждый из сегментов впоследствии дифференцируется и об-
разует специфические структуры. Формирование и спецификация сегментов
в эмбриогенезе зависят от двух различных, но в то же время интегративных
процессов. Это — образование повторяющихся субъединиц и спецификация
этих субъединиц в процессе дифференцировки.

У мутантов по генам gap исчезают какие-то сегменты или группы сегмен-
тов. Иногда вместо исчезнувших сегментов развиваются дополнительно уже
имеющиеся сегменты, т. е. происходит дупликация сегментов — тандемная
или инвертированная.

Экспрессия генов gap запускается продуктами генов материнского эф-
фекта, которые в свою очередь также являются транскрипционными факто-
рами. Продукты всех генов gap — транскрипционные факторы. Они имеют
ДНК-связывающий домен, чаше всего относящийся к «цинковым пальцам».

Цинковый палец — это последовательность в 30 а. к., содержащая цистеин
или гистидин в определенной позиции. Пары цистеин-гистидин (С-Н) или
цистеин-цистеин (С-С) взаимодействуют с ионом цинка.

Границы экспрессии генов gap, как правило, совпадают с границами сег-
ментов или парасегментов (см. рис. 6.1): hunchback (hb) имеет две зоны экс-
прессии: в районах Lb-Al и А7р-А8а (PS13); Kriippel (Кг) — в интервале
Т1-А5;£ш'Щ (gt) имеет две зоны экспрессии: сегмент Lb и область А5-А7;
knirps (kni) — в интервале А1-А8; tailless — акрон и А7.

В соответствии с распределением продуктов генов gap проявляются и нару-
шения у мутантных эмбрионов. Так, эмбрионы, мутантные по гену Кг, характе-
ризуются отсутствием всех торакальных и первых пяти абдоминальных сегмен-
тов, в то время как сегменты Аб, А7 и А8 развиваются нормально. У мутантов
по гену hb отсутствуют сегменты Т1 и Т2. Экспрессия генов gap разделяет эм-
брион на участки, различающиеся набором транскрипционных факторов, пред-
ставленных продуктами этих генов. Рассмотрим гены gap-группы подробнее.

hunchback

Ген hunchback (hb) (пер. — «горбун») кодирует транскрипционный фактор
с ДНК-связывающим доменом «цинковых пальцев». Регуляторная область
гена hb содержит более пяти сайтов связывания с белком Bed — транскрип-
ционным фактором с ДНК-связывающим доменом, относящимся к классу
гомеодоменов. Сайты связывания с белком Bed похожи между собой. Кон-
сенсусом является последовательность 5' ТСТААТССС 3'.
Для активации зиготической экспрессии гена hb достаточно наличия как
минимум грех сайтов связывания с белком Bed в районе от -50 до -300 нук-
леотидов от точки старта транскрипции. Сайты связывания с белком Bed
различаются по степени сродства.

Высоким сродством к белку Bed обладают три сайта (жирным шриф-
том выделены нуклеотиды, совпадающие с таковыми в консенсусе —
ТСТААТССС):

. А1-282-274 — CGTAATCCC;

. А2-172-164 — ТСТААТССА;

. АЗ-67-59 - ТСТААТССС.

При взаимодействии с этими сайтами достаточно даже небольшой кон-
центрации белка Bed, чтобы произошла индукция экспрессии гена hb.

Три других сайта в большей степени отличаются от последовательности
консенсуса и обладают низким сродством к белку Bed:

* XI-241-233 — TGCTAAGCT;

. Х2-225-217 — CGCTAAGCT;

. ХЗ-212-204 — GATCATCCA.

Связывание с сайтами слабого сродства происходит только при высокой
концентрации белка Bed.

Присутствие рядом нескольких сайтов связывания с транскрипционным
фактором Bed подразумевает существование кооперативных контактов это-
го фактора. При этих взаимодействиях особое значение приобретает кон-
центрационный градиент транскрипционных факторов. В этом случае даже
незначительное изменение концентрации определяет включение или вы-
ключение гена в пределах узкой границы изменения концентрации. Градиент
концентрации белка Bed по длине эмбриона создается за счет диффузии
и описывается экспоненциальной кривой. При такой системе множествен-
ных сайтов связывания, обладающих различным сродством к белку Bed,
градиент концентрации Bed обеспечивает формирование дискретных доме-
нов экспрессии зиготического гена hb, экспрессию которого он регулирует.
В эмбрионе есть два пространственных домена (две области) экспрессии
зиготического гена hb: l.b — Al и PS 13.

Гену hb соответствуют два типа транскриптов, использующих альтерна-
тивные промоторы: 2,9 kb — это зиготический транскрипт и 3,2 kb — зи-
готический и материнский транскрипты. Материнский транскрипт гена hb
поступает из питающих клеток и равномерно распределяется в эмбрио-
не. У каждого из зиготических транскриптов свой домен экспрессии.
Промотор, используемый для образования короткого транскрипта, от-
вечает за раннюю зиготическую экспрессию в передней половине эм-
бриона. Инициация зиготической транскрипции гена hb зависит от ТФ
Bed и Кг.

Второй промотор, используемый для синтеза длинного транскрипта, от-
вечает за материнскую экспрессию и позднюю зиготическую экспрессию гена
hb в задней четверти эмбриона. На зиготическую экспрессию гена hb, контро-
лируемую вторым промотором, влияет продукт гена til.

Мишенью действия транскрипционного фактора НЬ является ген even-
skipped из группы генов правила парности.

caudal

Два промотора имеет и ген caudal (cd), который, как и ген hb, экспрессиру-
ется и как материнский, и как зиготический. Белок Caudal является транскрип-
ционным фактором, который был идентифицирован по гомологии с гомео-
боксом. Следовательно, белок Caudal имеет ДНК-связывающий гомеодомен.
Эмбрионы, гомозиготные ио мутации гена cd, нежизнеспособны. Зиготическая
экспрессия cd в районе брюшка (абдомена) находится под контролем гради-
ента белка НЬ. Транскрипция активируется низкими концентрациями белка
НЬ и подавляется высокими. Материнская мРНК cd, подобно материнской
мРНК hb, равномерно распределяется в яйце и не транслируется. На стадии
синцитиальной бластодермы возникает концентрационный градиент мРНК
cd и формируется градиент белка Cd с наибольшим уровнем концентрации
в задней части эмбриона. Трансляция мРНК cd и накопление белка Cd не тре-
буют оплодотворения и происходят после откладки яиц. Градиент мРНК cd,
по-видимому, формируется за счет деградации мРНК cd на переднем конце эм-
бриона с участием белка Bed. Мишенью действия ТФ Cd является зиготический
ген fushi tarazu. Кроме того, продукт гена cd нужен для активации генов kni и gt.

Kriippel

Название гена начинается с прописной буквы, потому что первая полу-
ченная мутация этого гена является доминантной. Она и дала название гену
Kriippel (Кг) (с нем. — «калека»). Мутации в гетерозиготе характеризуются
аномалиями торакса (грудной части), метаторакальных конечностей и не-
полной пенетрантностью. Гомозиготы по Кг легальны и погибают на эм-
бриональной стадии, перед вылуплением из яйца, обнаруживая фенотип
gap. У таких эмбрионов не хватает грудных сегментов, что предполагает
значимость экспрессии гена Кг в грудной части эмбриона. Продукт гена Кг
можно идентифицировать до стадии гаструлы. Эксперименты по получению
мозаиков по 0-аллелю гена Кг свидетельствуют о том, что отсутствие экспрес-
сии этого гена в более поздний период развития не приводит к летальному
эффекту на клеточном уровне.

В регуляторном районе гена Кг методом foot-printing обнаружены сайты
связывания с белками Bed и НЬ. Активация гена Кг зависит от концентрации
белка Bed. Высокая концентрация белка Bed на переднем конце эмбриона по-
давляет экспрессию гена Кг. Белок НЬ также регулирует экспрессию гена Кг:
низкая концентрация белка НЬ индуцирует экспрессию гена Кг, а высокая —
приводит к его репрессии. Это еще один пример того, как один и тот же транс-
крипционный фактор в зависимости от концентрации может активировать
или репрессировать транскрипцию гена-мишени. В регуляторной области
гена Кг локализуется несколько сайтов связывания с транскрипционными
факторами Bed и НЬ. Эти сайты ориентированны в прямом и обратном направ-
лении и обладают разным сродством к соответствующим транскрипционным
факторам.

Белок Кг содержит домен «цинковых пальцев». Обнаруженная гомология
между белком Кг и транскрипционным фактором TF-IIIA предполагает,
что белок Кг может связываться с транскриптами тех генов, в регуляции
которых он принимает участие. Для TF-TIIA показана способность к вза-
имодействию не только с ДНК, но и с РНК. TF-IIIA связывается не только
с регуляторной областью гена, кодирующего 5S РНК, но и с самой 5S РНК.
Такая двойственная функция TF-IIIA позволяет авторегулировать про-
цесс транскрипции 5S РНК. Как только возникает избыточное количество
5S РНК, транскрипция этого гена прекращается, поскольку 5S РНК начинает
связываться с TF-II1A и подавлять его активность в качестве ТФ. Возможно,
подобный механизм регуляции существует и для генов, экспрессия кото-
рых регулируется белком Кг. Регуляцию генов, контролирующих развитие,
определяет существование четких пространственных и временных границ
экспрессии генов. Последние прежде всего контролируются дозой продукта
соответствующего гена. Мишенью действия ТФ Кг являются гены even-
skipped и hairy.

knirps

Продуктом гена knirps (kni) (с нем. — «карапуз») является транскрипци-
онный фактор — белок Kni, который имеет домен «цинковых пальцев» та-
кой же, как у Кг и НЬ. Домены экспрессии гена kni частично перекрываются
с доменами экспрессии гена hb на переднем и заднем концах эмбриона.

gaint

Белок Gaint (Gt), являясь ТФ, отличается ДНК-связывающим доменом
от продуктов других генов gap. Для транскрипционного фактора Gt — это по-
следовательность b-Zip, состоящая из четырех-пяти гептадных повторов лей-
цина. Такая последовательность характерна для белков, способных образо-
вывать гомо- или гетеродимеры благодаря взаимодействию альфа-спиралей
лейциновых молний. А последовательность basic обогащена положительно
заряженными аминокислотами и взаимодействует с ДНК.

Белок Gt in vivo фосфорилируется, что инициирует образование димеров
или тримеров субъединиц Gt, и тем самым активирует его. Таким образом,
экспрессия генов-мишеней транскрипционного фактора Gt находится под
контролем сигнальной системы, регулирующей данный процесс.

Известны сайты в ДНК, которые узнаются транскрипционным факто-
ром Gt. Это — TGACGT, TGACTT и TGACTA. Подобная последователь-
ность (API) характерна для генов быстрого ответа. API присутствует
в регуляторной области генов, экспрессия которых запускается транскрип-
ционными факторами Jun и Fos. Ген^шт (gt) содержит участки, гомологич-
ные генам fos и jun. Продукт гена#/ является репрессором для генов Кг и kni

tailless

Продукт гена tailless (til) — Til — не похож на другие зиготические гены дро-
зофилы. Он гомологичен белку Tlx у млекопитающих и относится к классу ор-
фанных ядерных рецепторов. У млекопитающих белок Tlx (NR2E1) — важный
фактор в поддержании статуса нервных стволовых клеток. Фактор Tlx может
привлекать к генам-мишеням деацетилазу гистонов (HDAC), тем самым осу-
ществляя репрессию транскрипции этих генов. В этом случае гены, экспрессия
которых приводит к дифференциации, оказываются репрессированными. Так
стволовые клетки сохраняют способность к делениям, поддерживая свой статус.

Белок Til (Tlx) помимо ДНК-связывающего домена (DBD — DNA-binding domain)
содержит и домен взаимодействия с лигандом (LBD — ligand-binding domain).

В активации экспрессии гена til на переднем конце эмбриона дрозофилы
принимают участие три системы генов с материнским эффектом: А, Т и DV.

Продукт гена til необходим для формирования структур головы и задних ку-
тикулярных структур, начиная с сегмента А7. Таким образом, район действия til
совпадает с районом функционирования гена с материнским эффектом — torso.

Ген til — мишень для действия продукта гена torso. У мутантов torso наблю-
дается избыточность сегментации. У двойных мутантов по генам til и torso
сегментация восстанавливается.

Зиготические гены til и hukebcin экспрессируются на обоих концах эмбри-
она. Продукты этих генов формируют концентрационные градиенты с наи-
большей концентрацией на самых концах эмбриона.

Вовлеченность DV-системы в формирование домена экспрессии гена
til в передней части эмбриона доказывается в экспериментах с мутантами
по гену dl. У эмбрионов дикого типа мРНК til можно обнаружить толь-
ко в дорсальной части эмбриона, а у мутантов dl — по всей поверхности
эмбриона. Таким образом, если не происходит миграции белка D1 в ядра
на вентральной стороне, то экспрессия гена til разрешается и в вентральной
части эмбриона. Следовательно, белок D1 является репрессором гена til. Такая
репрессия наблюдается только в передней части эмбриона. В задней части эм-
бриона не обнаруживается влияния белка D1 на экспрессию гена til. Это озна-
чает, что эффект белка D1 в качестве репрессора зависит от генов системы А.

Действие 1)1 на экспрессию гена ill является прямым, а не опосредован-
ным продуктом других зиготических генов, экспрессия которых запускается
транскрипционным фактором D1, например twist и snail. Экспрессия этих
генов активируется транскрипционным фактором D1 на вентральной сторо-
не эмбриона. Это доказывается в экспериментах по изучению локализации
мРНК til у мутантов по генам twist и snail. У таких мутантов распределение
мРНК til такое же, как и у эмбрионов дикого типа.
На переднем конце эмбриона экспрессия гена til репрессируется высокой
концентрацией белков Bed и Torso. При этом оба продукта названных генов
должны присутствовать одновременно.

В отличие от эмбрионов, полученных от самок дикого типа, у самок, му-
тантных по гену bed, ген til в одинаковой степени экспрессируется на обоих
концах эмбриона. В то время как у эмбрионов от самок дикого типа экспрес-
сия гена til на заднем конце эмбриона более интенсивная. В период образова-
ния клеточной бластодермы задняя шапочка экспрессии мРНК til занимает
16-20 % длины яйца — EL (egg length).

В это время на переднем конце эмбриона изменяется распределение бел-
ка TH (Tailless). Шапочка, сформированная на стадии NC9 (девятый цикл
синхронных делений ядер эмбриона), превращается в полоску, сдвинутую
к переднему концу эмбриона (рис. 6.3). Эти изменения контролируются про-
дуктом гена bed и зависят от его концентрации. В зависимости от концентра-
ции продукт гена bed може г выступать в качестве активатора или репрессора
гена til. В регуляторной области гена til существуют участки, обладающие
различным сродством к белку Bed (Bicoid). С началом трансляции мРНК bed

Сайты

взаимодействия Эмбрион в начале

с белком Bed д экспрессии /// Р

Рис. 6.3. Роль концентрационного градиента транскрипционного фактора Bed (Bicoid)
в установлении границ распространения белка '1'11
появляется белок Bed, но концентрация его в это время не очень высокая.
Bed связывается с сайтами, обладающими высоким к нему сродством. Это
приводит к экспрессии гена til. С увеличением концентрации белок Bed на-
чинает взаимодействовать и с сайтами, обладающими низким сродством
к нему. Связывание с этими сайтами приводит к репрессии гена til, и область
распространения белка Т11 превращается в полоску. Таким образом, один
и тот же транскрипционный фактор (Bed), регулируя экспрессию гена til,
может выступать в качестве активатора и репрессора в зависимости от кон-
центрации. В регуляции экспрессии гена в качестве репрессора принимает
участие и транскрипционный фактор DI (Dorsal), ограничивая экспрессию
гена на брюшной стороне только в передней части эмбриона.

Мишенями действия транскрипционного фактора Т11 являются гомео-
тические гены Dfd и Abd-H, для первого — Т11 является репрессором, а для
второго — активатором.

Сочетание доменов экспрессии разных gap-генов с доменами экспрессии
генов с материнским эффектом создает поперечную исчерченность эмбриона,
при этом в каждой полосе появляется определенная комбинация транскрип-
ционных факторов, не похожая на ту, которая имеется в соседней полосе.
Это позволяет запустить экспрессию определенного набора генов-мишеней
в строго определенном районе эмбриона.

Конкурентные и кооперативные взаимоотношения различных транскрип-
ционных факторов и их концентрация решают проблему выбора пути раз-
вития и определяют спецификацию каждого сегмента насекомого.

Взаимодействие gap-генов

Гены gap способны регулировать экспрессию друг друга, тем самым обе-
спечить формирование четких границ на первом этапе экспрессии зиготиче-
ских генов. Взаимная регуляция генов gap подтверждается использованием
мутантов по этим генам, характеризующихся изменением границ доменов
экспрессии продуктов генов gap, не затронутых мутацией. Например, левая
граница экспрессии гена Кг контролируется продуктом гена hb, а правая —
продуктом гена kni. У мутантов по гену hb продукт гена Кг перемещается
влево, а у мутантов по гену kni — правая i раница экспрессии гена Кг сдвига-
ется вправо.

Такие же взаимоотношения и между генами kni wgt.Y мутантов gt граница
экспрессии kni сдвигается вправо. Таким образом, продукты генов gap взаи-
модействуют, контролируя границы распределения друг друга.

Широкие районы экспрессии gap-генов впоследствии формируют узкие
и четкие полосы экспрессии последующих генов. Изучение проявления мута-
ций gap-генов показало, что такие преобразования в узкие зоны экспрессии
последующих генов являются результатом перекрестных взаимоотношений
в регуляции экспрессии самих генов gap. Они взаимно влияют на экспрессию
друг друга и экспрессию последующих генов.

Зоны распространения продуктов генов Кг и kni связаны с различной чув-
ствительностью экспрессии этих генов к градиенту концентрации материн-
ского белка bib. Кроме того, высокая концентрация белка Kni ограничивает
распространение продукта гена Кг. У мутантов по гену kni продукт гена Кг
распространяется дальше, к заднему концу эмбриона.

В норме домены экспрессии генов gt и Кг не перекрываются, но у мутантов
по гену Кг домен экспрессии гена gt сдвигается к центру эмбриона, туда, где
должен быть продукт гена Кг в норме.

Гены gap устанавливают дискретные области экспрессии зиготических ге-
нов, благодаря взаимной регуляции экспрессии друг друга. Это не позволяет
продуктам gap-генов распространяться в области экспрессии друг друга, хотя
последние частично перекрываются. Продуктами генов gap являются ТФ. Они
могут быть и активаторами, и репрессорами — в зависимости оттого, с какими
сайтами в регуляторной области гена-мишени они взаимодействуют. Сайты
с сильным сродством являются энхансерами, а сайты со слабым сродством —
сайленсерами. Так концентрационные градиенты ТФ позволяют устанавливать
границы экспрессии соответствующих генов-мишеней.

11ерекрывание между доменами экспрессии gap -генов является необходимым
условием активации следующей группы генов — правила парности сегментов.
Система взаимодействующих gap-генов позволяет создавать биологические мо-
дели реализации программы развития — модели генных сетей, определяющих
ранний эмбриогенез дрозофилы. Хотя видимые механизмы развития достаточно
сложны и противоречивы, молекулярные механизмы, лежащие в основе процес-
сов развития, достаточно просты и эволюционно консервативны.

Возникновение семи полос экспрессии объясняют следующим образом:
когда запускается экспрессия gap-генов, параллельно реализуются две про-
граммы — терминального распределения зон экспрессии генов (ter-gt-Kr-gt-
ter) и распределения по переднезадней оси (hb-Kr-kni-hb). Наложение этих
двух распределений дает gt-hb-Kr-km-gt-hb-tll. А это уже семиполосый код,
создаваемый продуктами gap-генов.

Мишенью действия gap-генов являются pair-rule-гены, или гены правила
парности сегментов.

Гены правила парности (Pair-rule) сегментов

Включение генов правила парности в каждой конкрет ной полосе сегмен-
тации эмбриона отвечает на определенную комбинацию продуктов gap-генов
и продуктов генов материнского эффекта.

Все гены правила парности имеют сложно организованную регулятор-
ную зону, состоящую из набора регуляторных цис-действующих элементов.
Согласно гипотезе [Howard et al., 1988], регуляторные районы генов правила
парности имеют модульный принцип организации и состоят из набора цис-
действующих элементов, называемых модулями. Каждый из таких модулей
активирует транскрипцию хена в конкретной полосе. Для такой активации
должна существовать соответствующая комбинация и концентрация транс-
крипционных факторов, которые являются продуктами генов материнского
эффекта и (или) gap-генов. Такой способ напоминает принцип действия
кодового замка, для открытия которого существует несколько кодовых ком-
бинаций. В каждом домене экспрессии гена правила парности, т. е. в каждой
полосе, действует свой собственный код, позволяющий активировать работу
соответствующего гена. Таких независимых доменов экспрессии для генов
парности семь.

Регуляторная зона генов правила парности по размерам часто в несколько
раз превышает кодирующую область. Например, регуляторная область гена
even-skipped составляет 8 т. п. н., а рехуляторная область гена hairy — 14 т. п. н.
Элементы регуляторной зоны генов правила парности имеют сайты, обла-
дающие высоким или низким сродством к различным транскрипционным
факторам. Это в свою очередь позволяет реализовать информацию, создан-
ную не только присутствием соответствующего транскрипционного фактора,
но и его концентрационным градиентом.

Экспрессия генов правила парности разделяет тело эмбриона на мета-
мерные зоны. Ширина каждой зоны приблизительно четыре клетки. При
этом соответствующий ген экспрессируется в одной такой полосе и не экс-
прессируется в соседней. Зоны экспрессии разных генов правила парности
могут перекрываться, частично перекрываться или дополнять друг друга.
Регуляция экспрессии генов правила парности подчиняется взаимодействию
ТФ по правилу грех К: концентрация, конкуренция, кооперация. Это своеоб-
разный код, который открывает возможность экспрессии соответствующего
гена правила парности в определенном домене экспрессии (определенной
полосе).

К генам правила парности относятся even-skipped, odd-skipped, runt, paired,
hairy и fushi tarazu.

even-skipped

Продукт гена even-skipped (eve) можно идентифицировать в нечетных па-
расегментах (рис. 6.4). Поэтому у мутанта eve остаются только четные па-
расегменты, а нечетные исчезают. Нет экспрессии — нет соответствующего
сегмента. Продукт гена eve является транскрипционным фактором. Он со-
держит гомеодомен. Экспрессию гена eve можно видеть в семи поперечных
полосах по длине эмбриона. Такая «полосатая» экспрессия играет ключевую
роль в установлении метамерного плана строения дрозофилы. Экспрессия
гена eve в каждой полосе контролируется отдельно. Возникновение «полоса-
той» экспрессии представляет собой двухэтапный процесс.
Рис. 6.4. Распределение белка Even-skipped (Eve) в эмбрионе D. melanogaster: белок присутству-
ет в нечетных парасегментах, образуя семь полос. Шкала 100 мкм. Фото Е. В. Голубковой

На первом этапе домены экспрессии гена eve являются более широкими —
шириной в 5-6 ядер. Транскрипцию регулируют продукты генов с материн-
ским эффектом и генов gap, которые действуют по правилу трех К.

На втором этапе — после появления продукта гена eve — происходит авто-
регуляция данного гена. Продукт гена eve взаимодействует с дистальным эн-
хансерным элементом, который локализуется в районе от -5,9 до -5,2 т. п. н.
вверх по течению от сайта инициации транскрипции. В результате такого
взаимодействия домены экспрессии гена eve сужаются.

Полоса 2
Eve

Рис. 6.5. Сочетание транскрипционных факторов, влияющих на экспрессию
гена eve в районе полосы 2: активаторами транскрипции гена eve являются ТФ Bed и НЬ, при-
сутствующие в этом районе; левая граница полосы 2 ограничена областью распределения ТФ Gt,
а правая — Кг, которые являются репрессорами транскрипции гена eve в полосе 2 [Small et al.. 1991 ]
Картирование последовательностей регуляторной области гена eve про-
водили с помощью гибридной генетической конструкции, в которой регуля-
торную область гена eve объединили с кодирующей областью гена-репорте-
ра, позволяющего легко следить за экспрессией, используя гистохимические
методы. Гибридная генетическая конструкция включала часть регуляторной
области гена eve, минимальный промотор гена и кодирующую область бак-
териального гена lacZ. Получали трансгенных дрозофил, в геном которых
данная хибридная последовательность была введена с помощью трансформа-
ции, опосредованной P-элементом. Экспрессию бета-галактозидазы у транс-
генных животных исследовали в норме и, используя различных мутантов,
по gap-генам.

Полоса 2 экспрессии eve слева ограничена белком Gt, а справа — белком
Кг (рис. 6.5).

Механизмы регуляции экспрессии гена even-skipped
в полосе 2

Для выяснения механизмов регуляции экспрессии гена eve в качестве
участка регуляторной области была выбрана последовательность, отвечаю-
щая за экспрессию этого гена в полосе 2. Ее протяженность 480 п. н.; содер-
жит сайты связывания с транскрипционными факторами Bed, Hb, Gt и Кг.
(рис. 6.6). На схеме выделены участки регуляторной зоны, в которых ме-
ста взаимодействия с транскрипционными факторами перекрываются. Эти
участки, названные дистальным и проксимальным промоторами, исполь-
зованы для создания генетической конструкции. У нормальных эмбрионов
с трансгеном eve-lacZ экспрессия бета-галактозидазы видна только в районе
полосы 2. Для того чтобы понять, каким образом на экспрессию eve влияют
транскрипционные факторы (ТФ), — продукты генов Кг и gt — путем ги-
бридизации получили особей, несущих мутацию Кг* и gl а также трансген
eve-laeZ. Оба гена gt и Кг экспрессируются в районе полосы 2.

Картина экспрессии бета-галактозидазы была следующей. На распреде-
ление зоны экспрессии бета-галактозидазы влияют гены Кг и gt и не влияют
гены kni и til. У мутантов по генам Кг и gt зона экспрессии бета-галактозидазы
перемещается в районы экспрессии этих генов: вправо у мутантов Кг~ и влево
у мутантов gt . Полоса 2 экспрессии гена eve слева ограничена экспрессией
гена gt, а справа — экспрессией гена Кг (см. рис. 6.5).

Следующим этапом данного исследования был поиск последовательностей
в регуляторной области гена eve, взаимодействующих с ТФ, которые могли
повлиять на экспрессию гена eve в полосе 2. Таких транскрипционных факто-
ров было несколько. Это продукты генов Kr,gt, hb, bed. Методом foot-printing
были идентифицированы зоны в регуляторной области гена eve, взаимодей-
ствующие с этими транскрипционными факторами.
Рис. 6.6. Схема создания генетической конструкции, используемой при сотрансфекции клеток
дрозофилы в культуре для определения влияния ТФ (Gt, Кг, Bed, Hb) (с учетом их концентра-
ции) на экспрессию зиготического гена eve:

а — фрагмент ре!улягорной области гена eve: б — генетическая конструкция [Small et al., 1991 ]

Оказалось, что участки, с которыми связываются различные ТФ, в ряде слу-
чаев перекрываются. Причем одна нить ДПК была способна контактировать
с одним транскрипционным фактором, а другая — с другим. Перекрывание зон
взаимодействия транскрипционных факторов с ДНК было неполным.

Эксперименты, в которых метод foot-printing применяли в конкурентных
условиях, т. е. ДНК инкубировали в растворе, содержащем смесь транскрип-
ционных факторов, показали, что белки Кг и Bed не могут одновременно
занимать перекрывающиеся последовательности. Это указывало на конку-
ренцию между транскрипционными факторами за сайты связывания.

Эксперименты проводили в культуре клеток дрозофилы и использовали
следующие материалы [Small et al., 1991]:

1. Плазмиды с гибридными конструкциями, содержащими регуляторную
область гена eve и кодирующую область гена-репортера CAT (chloramphenicol
acetyltransferase) (рис. 6.6). Регуляторная зона гена eve включала районы, в ко-
торых участки взаимодействия с различными транскрипционными фактора-
ми перекрывались.

2. Плазмиды экспрессии с полноразмерными копиями кодирующих последо-
вательностей генов bed, Кг, hb, gt, находящихся под активным промотором 5С.

3. Клетки клеточной культуры Schneider, в которые вводили плазмиды
в различном сочетании. Если в клетки вводят не одну плазмиду, а несколь-
ко — это называется сотрансфекцией. Оценивали экспрессию гена CAT,
изменяя концентрацию каждой из вводимых плазмид экспрессии. Чтобы
избежать влияния изменения количества вводимых плазмид, их суммарную
концентрацию выравнивали путем добавления плазмид без вставок соот-
ветствующих генов.

Показали, что экспрессия CAT увеличивается с повышением концентра-
ции как плазмид с bed, так и с hb. Bed и Hb являются активаторами, а Кг
и Gt — репрессорами транскрипции (см. таблицу).
Результаты экспериментов, иллюстрирующие влияние концентрации,
кооперации и конкуренции ТФ (Bed, Hb, Кг и Gt) на экспрессию гена-репортера CAT
в составе генетической конструкции (рис. 6.6) [Small et al., 1991]

Плазмиды экспрессии с указанием концентрации (pgj и кодирующей последовательности Экспрессия CAT, определяемая как относительное содержание в клетках CAT по отношению к 1,0 и копт роле
0.01 bed 5,2
0,2 bed 16,1
0,0) hb 1,6
0,2 hb 4,4
0,1 bed + 0,2 hb 44,2
0,1 bed + 0,2 hb + 0.05 Kr 33,6
0,1 bed + 0,2 hb + 0,8 Kr 2,0
0,1 bed + 0,2 hb + Kr* 45,8-47,8
0,1 bed + 0,2 hb + 0,05 gt 9,1
0,1 bed + 0,2 hb + 0,8 gt 0,7
0,1 bed + 0,2 hb + gt”4 44,2-40,2

Результаты этого эксперимента демонстрируют роль концентрации ТФ,
а пятая строчка в таблице — роль кооперативных взаимодействий разных
ТФ в регуляции экспрессии генов.

Продукты обоих генов Кг и gt являются репрессорами экспрессии гена eve.
Причем Gt более эффективный репрессор, чем Кг. Мутанты Кг9 и gtBA были
использованы для доказательства, что в определении конкурентных взаимо-
отношений между ТФ важны именно ДНК-белковые взаимодействия.

Аллель Кг4

Мутация Кг9 приводит к замене всего одной аминокислоты (цистеина (С))
во втором цинковом пальце на серин (S). Нарушение связи с ионами Zn из-
меняет конформационные свойства молекулы, и ДНК-связывающий домен
теряет способность связываться с ДНК (рис. 6.7, а). Способность проникать
в ядро у измененного в результате мутации ТФ при этом не нарушается.

Аллель gt84

Мутация gt8A приводит к замене двух аминокислот в основном (basic) до-
мене — два аргинина (R) заменены на аспарагиновую кислоту и глицин (D G),
который в белке Gt соседствует с доменом лейциновая молния (рис. 6.7, 6).
Мутация gtBA нарушает ДНК-белковые взаимодействия транскрипционного
Рис. 6.7. ДНК-связывающие домены транскрипционных факторов:
а — Kriippel; о — Gaint [Small et al., 1991)

фактора Gt. Стабильность и внутриклеточный транспорт белка Gt в случае
мутации не нарушаются.

Использование последовательностей, измененных в результате мутации,
показало, что продукты соответствующих генов утрачивают способность
влиять на экспрессию гена eve в полосе 2.

hairy

Регуляторная область гена hairy содержит кластер цис-действующих эле-
ментов, которые, как и в случае гена eve, активируют экспрессию гена h в каж-
дой конкретной полосе благодаря комбинации, концентрации и конкуренции
продуктов gap-генов и транскрипционных факторов, которые являются про-
дуктами генов с материнским эффектом.

С регуляторным районом гена h связываются продукты генов hb, Кг и kni.

Для регуляторной области гена h построена карта распределения участков,
отвечающих за экспрессию данного гена в каждой конкретной полосе (рис. 6.8).
Построение такой карты осуществляли путем получения трансгенных линий
дрозофилы с использованием гибридной генетической конструкции. Такая
генетическая конструкция содержала различные фрагменты регуляторной
зоны гена h, часть промотора гена Hsp27 и кодирующую часть гена-репорте-
ра — lacZ. Бета-галактозидазу — продукт гена lacZ, так же как и продукт гена h,
можно обнаружить в ядре. Goздaниe трансгенных линий дает возможность
одновременно оценивать экспрессию h и lacZ, используя методы иммунофлуо-
ресценции (антитела к Н) и гистохимический (окраска на бета-галактозидазу).
Это позволяет анализировать экспрессию гена h в конкретной полосе (рис. 6.8,
черные прямоугольники) в зависимости от структуры i ибридной конструкции,
т. е. в зависимости от участка регуляторной области гена h, соединенной с ко-
дирующей областью гена lacZ (на рис. 6.8 обозначены участки а и б регулятор-
ной области гена h, отвечающие за его экспрессию в полосе 6 или 1). На схеме
также указаны сайты рестрикции: R — EcoRI; S — Sal I.
Полосы Hairy

1234567

Фрагмент регуляторной области hairy
R R S R RR R

Участки генетической конструкции

Рис. 6.8. Фрагмент карты регуляторной области гена hairy (h) при определении участка,
отвечающего за экспрессию гена h в конкретной полосе [Lardelli, Ish Horowicz, 1993;

Riddihough, Ish-Horowicz, 1991]

Чтобы понять, какую роль в экспрессии гена h играют другие гены, транс-
ген комбинировали с мутациями различных генов. Показали, что у самок,
мутантных по bed, stau, swa, не было экспрессии гена h в полосе 1. Интересно,
что на экспрессию h в полосе 1 не влияет ни один из генов gap. У мутантов
по разным gap-генам эта полоса проявлялась нормально, как у особей дикого
типа, и никуда не сдвигалась. Полосы 3 и 4 обнаруживались в зоне экспрес-
сии Кг, что подразумевало, что Кг является активатором экспрессии в этих
полосах. У мутантов по Кг полосы 3 и 4 более узкие, но не исчезают совсем.
Это означает, что Кг не единственный активатор гена h в полосах 3 и 4.

Использование мутаций при изучении характера экспрессии гена-репор-
тера в соответствующей гибридной генетической конструкции позволило
в каждом конкретном случае (для каждой конкретной полосы) находить
потенциальных претендентов на роль активаторов или репрессоров гена h.

Например, полоса 6 у мутантов Кг перемещалась в зону экспрессии гена
Кг, а это означает, что Кг является репрессором гена h в районе этой полосы.
У мутантов по гену torso полоса 6 сдвигалась в заднюю часть эмбриона. Зна-
чит, продукт гена torso также является репрессором гена h в полосе 6, и эта
репрессия ограничивает полосу с задней части эмбриона.

У эмбрионови kni' полоса 6 вообще не наблюдалась. Это означает, что
продукты этих генов являются потенциальными активаторами экспрессии
гена h в полосе 6.

Полосы экспрессии h и eve отчасти совпадают, но полоса экспрессии h
сдвинута по сравнению с зоной экспрессии eve на одну-две клетки вперед.
Возможно, именно этот сдвиг определяет в перспективе экспрессию генов
сегментной полярности в 14 полосах.
Между генами правила парности существует перекрестная взаимная регу-
ляция их экспрессии, которая не запускает «полосатую» экспрессию, а только
уточняет и поддерживает ее. Экспрессия генов правила парности запускается
комбинацией и концентрацией продуктов gap-генов и продуктов 1енов ма-
теринского эффекта, которые активируют гены правила парности в районе
соответствующей полосы и репрессируют их экспрессию в зоне между по-
лосами.

Экспрессия гена h в каждой полосе зависит в большинстве случаев от про-
дуктов двух генов gap, и только для полос 5 и 6 нужны продукты трех генов
gap. Хотя экспрессия гена h в отдельных полосах отвечает на конкретный
независимый код, каждый элемент (stripe) в регуляторной области гена h
не является простым или абсолютно дискретным. Только для полосы 1 уда-
лось выявить дискретный район. Во всех остальных случаях такие элементы
в гибридной генетической конструкции обеспечивают экспрессию гена-ре-
портера, которая сдвигается на одну клетку по сравнению с зоной экспрессии
самого гена И. Причем сдвиг происходит только в одну сторону, в то время
как другая граница остается неизменной. Эти результаты позволили предпо-
ложить, что существуют минорные разбросанные по регуляторной области
участки связывания с продуктами генов gap. Эти минорные сайты могли
утрачиваться при создании гибридных генетических конструкций.

Оказалось, что одни и те же гены имеют разные эффекты в разных поло-
сах экспрессии гена h. В одних случаях кодируемые ими транскрипционные
факторы выступают как активаторы, а в других — как репрессоры. Напри-
мер, у мутантов Кг сужаются полосы 3, 4 и 5, но расширяется полоса 6.

У мутантов gt расширяется полоса 5, по сужается полоса 6. Функция gap-
генов в качестве активаторов или репрессоров может зависеть от взаимодей-
ствия с другими факторами.

Но еще много неясного в регуляции экспрессии гена h. Во-первых, как
на большие расстояния передается команда начать транскрипцию без проме-
жуточных сигналов. Во-вторых, как устанавливаются такие четкие границы
экспрессии гена h. Регуляторные последовательности, отвечающие за экс-
прессию h в определенной полосе, могут перекрываться, а это означает, что
одни и те же факторы могут участвовать в регуляции экспрессии гена h
в разных полосах.

Продукт гена h является транскрипционным фактором, содержащим
ДНК-связывающий домен, который относится к классу helix-loop helix —
спираль-петля-спираль.

runt

Продукт гена runt относится к семейству регуляторов транскрипции, ко-
торые вовлечены в важнейшие процессы, определяющие развитие половой
системы и развитие нервной системы у млекопитающих. В 1993 г. у млекопи-
тающих был описан транскрипционный фактор РЕВР2/СВЕ Было показано,
-6,1

Энхансер

Регуляторная часть

-3,4

Neurogenic Zebra
stripe

-2.5 -0,67

Кодирующая часть

Рис. 6.9. Структура гена fushi tarazu (fiz) [Bakkali, 2011 ]

что этот ТФ связывается с энхансерной последовательностью ретровируса
млекопитающих типа С, а также регулирует экспрессию генов в клетках эм-
бриональной карциномы. Транскрипционный фактор активен в виде гетеро-
димера, т. е. состоит из двух неродственных субъединиц. Одна из этих субъ-
единиц гомологична белку Runt дрозофилы. Участок гомологии, называемый
доменом Runt, содержит 128 а. к. и связывается с последовательностью в ДНК
PuACCPuCA, где Ри — пурин.

При поиске генов-мишеней, транскрипция которых регулируется продук-
том гена runt, использовали трансгенные линии дрозофилы, содержащие ген
runt под промотором гена Hsp70. У таких трансгенных животных при дей-
ствии теплового шока можно индуцировать эктопическую экспрессию гена
runt. Индуцируя эктопическую экспрессию гена runt, определяли экспрессию
генов eve и hairy. Оказалось, что для этих генов продукт гена runt является ре-
прессором; для гена ftz — активатором. Причем при эктопической экспрессии
гена runt наблюдается равномерная по всему эмбриону экспрессия гена ftz.
Скорее всего, влияние runt на экспрессию ftz не прямое, а опосредованное —
через eve и h, которые в свою очередь являются репрессорами экспрессии ftz.
Снятие репрессора приводит к активации ftz в тех полосах, где она подавля-
ется продуктами генов eve и /г.

Экспрессия гена runt влияет на экспрессию не только генов правила пар-
ности, но и gap-генов, таких как Кг, kni, gt и hb. Продукт гена runt вовлечен
в регуляцию экспрессии генов мишеней, взаимодействуя с различными ТФ,
влияя на регулируемую ими транскрипционную активность генов-мишеней.

fushi tarazu

На пребласюдермальной и бластодермальной стадиях развития продукт
гена ftz образует семь полос. Ширина каждой из полос составляет 3-4 клетки,
а между ними полоса без экспрессии fiz приблизительно такой же ширины.

Эксперименты по коррекции фенотипа fiz с помощью плазмиды, содер-
жащей кодирующую часть гена ftz и различные участки регуляторной об-
ласти данного гена, показали следующее: чтобы фенотип был нормальным,
необходим фрагмент протяженностью 6,1 т. п. н., который является цис-
действующим элементом данного гена (рис. 6.9). Эта регуляторная область
гена является своеобразным морфогенетическим сенсором.
Путем получения набора делеций регуляторной области гена ftz выявлено
по крайней мере три контролирующих элемента (рис. 6.9). Один из этих эле-
ментов отвечает за экспрессию гена ftz в нервных клетках. Поэтому данный
участок назван Neurogenic.

Другой — энхансер — необходим для авторегуляции гена ftz. Большинство
продуктов генов, контролирующих раннее развитие у дрозофилы, являются
короткоживущими. Короткоживущим является и продукт гена ftz. Период
полураспада транскрипта 6-8 мин. Белок Ftz также подвержен быстрому
протеолизу. Белок Ftz — активатор гена ftz, он является примером авторе-
гуляции. Это еще один пример положительной обратной связи в развитии,
при которой продукт гена не выключает его работу, а наоборот, способен
некоторое время поддерживать его экспрессию, индуцированную другими
транскрипционными факторами.

Третья зона в регуляторной области называется zebra stripe. Она представ-
ляет собой мозаику последовательностей, взаимодействующих с активатора-
ми и репрессорами транскрипции данного гена. Район, определяющий экс-
прессию ftz в виде семи полос, не такой протяженный и сложный, как в генах
eve или h. Он составляет всего 600 п. н. Поэтому предполагают, что основной
контроль экспрессии гена ftz сводится к репрессии данного гена за счет про-
дуктов генов h и eve. Если гены h и eve не экспрессируются, экспрессия ftz
становится равномерной по длине эмбриона.

На роль активатора транскрипции гена ftz претендует продукт гена caudal,
присутствующий в задней половине эмбриона. Продукт гена caudal связыва-
ется с последовательностью TTTATG. У мутантов caudal отсутствуют три
задние полосы экспрессии ftz.

Факт, что репрессором гена ftz является продукт гена h, объясняется тем,
что в тех зонах, где есть экспрессия гена h, в основном нет экспрессии гена
ftz. У мутантов h~ полосы экспрессии гена ftz шире, чем у особей дикого типа.
Репрессором экспрессии гена ftz также выступает и продукт гена eve. Про-
дукт этого гена связывается с последовательностью в пределах регуляторной
области zebra stripe.

Белок Ftz относится к транскрипционным факторам, имеющим гомеодо-
мен. Кроме этого домена, в белке есть еще и последовательность PEST, харак-
терная для короткоживущих белков.

Для поиска генов-мишеней для транскрипционного фактора использовали
трансген HSftz (кодирующая область гена ftz под промотором гена белка теп-
лового шока (HS — heat shock)). Такая конструкция позволяет индуцировать
эктопическую экспрессию гена ftz при действии теплового шока. Этот подход
позволил установить, что ген ftz является регулятором экспрессии других
генов правила парности и генов полярности сегментов, выступая в качестве
активатора в одних случаях и репрессора — в других. Ген ftz — важный регу-
лятор генов полярности сегментов: он активатор для гена engrailed и репрес-
сор для гена wingless.
Особенности регуляции экспрессии генов правила парности в развитии
дрозофилы позволяют понять, как сочетание определенного набора и кон-
центрации взаимодействующих транскрипционных факторов в результате
их взаимодействия с определенными участками в сложно организованной
регуляторной области, представленной дискретными модулями, определя-
ет пространственные и временные параметры активации или репрессии
одного и того же гена. Тем самым существование набора дискретных цис-
действующих элементов в регуляторной области гена разрешает каждому
из этих элементов (модулей) реагировать на определенный набор транс-
действующих транскрипционных факторов активацией или репрессией со-
ответствующего гена в определенной клетке или клетках, благодаря ее/их
предшествующей истории или позиции в организме.

Гены полярности сегментов

Эю прежде всего гены engrailed (еп) и wingless (wg), кроме того — patched
(ptc), naked (ncd), hedgehog (hh), cubitus interruptus Dominant (ciD), gooseberry
(gsb). Среди перечисленных генов только еп кодирует транскрипционный
фактор с ДНК-связывающим доменом, относящимся к классу гомеодоме-
нов. Остальные гены кодируют факторы, вовлеченные в межклеточный
сигналинг.

Экспрессия генов полярности сегментов запускается продуктами генов
парности сегментов. Гак, у мутантов eve~ полоса экспрессии vyg расширяется,
а полоса экспрессии еп исчезает. Значит, Eve является активатором для еп
и репрессором для wg.

Гены iyg и еп начинают экспрессироваться перед гаструляцией и форми-
руют 14 полос экспрессии. При этом происходит разделение каждого из сег-
ментов на передний и задний компартменты.

Полосы экспрессии гена еп ограничены передней границей каждого па-
расегмента и задней границей каждого сегмента. Запускает эту экспрессию
либо Eve, либо Ftz. Перед полосой еп располагается полоса экспрессии vrg
(рис. 6.10). Последовательность гена wg гомологична протоонкогену int-1, ко-
торый кодирует секретируемый гликопротеин. Белок Wg у дрозофилы тесно
связан с мембраной тех клеток, в которых экспрессируется соответствующий
ген veg. .мРНК wg имеет неслучайную локализацию в клетке, и отвечают за это
два элемента (WLE1 и WLE2 — wingless localization element), локализованные
в 3'UTR.

Регуляция экспрессии генов сегментной полярности осуществляется в два
этапа.

Первый этап. Запускается экспрессия генов полярности сегментов. Этот
процесс зависит от комбинации продуктов генов правила парности. Конкрет-
ная комбинация продуктов генов правила парности отвечает за включение
определенного гена полярности сегментов. На этом этапе во всех клетках
экспрессируется ген patched (ptc) (рис. 6.10, а).

Второй этап. Происходит так называемая поддерживающая экспрес-
сия генов, и определяющая роль принадлежит межклеточным сигналам
(рис. 6.10, 6).

В тех клетках, в которых индуцируется экспрессия еп, подавляется экс-
прессия ptc. Возможно, эта репрессия является прямой, поскольку у мутантов
еп~ продукт гена ptc распределяется равномерно. С началом экспрессии генов
wingless (wg) и engrailed (ей), продукты которых маркируют соответственно

мутанты patched"

Рис. 6.10. Работа генов полярности сегментов в эмбрионах D. melanogaster дикого типа (а, 6)
и мутантных (в, г), д — сигнальная система, обеспечивающая взаимное поддержание
экспрессии генов wg и еп в соседних клетках. PS — parasegment (Gilbert, 2000]
правую и левую границы парасегментов, в клетке с Еп исчезает Ptc, a Wg и Еп
взаимно поддерживают активацию друг друга (рис. 6.10, б).

Продукт гена wg, являющийся секретируемым белком, синтезируется
в клетке, располагающейся как раз впереди той, в которой происходит экс-
прессия гена еп. Wg обеспечивает экспрессию гена еп в соседней клетке,
связываясь с рецептором Frizzled на клеточной стенке. Однако делать это
он может только в отсутствии продукта гена ptc. Если в клетке есть про-
дукт гена ptc, клетка неспособна воспринимать сигнал Wg. У мутантов
ptc клетки, находящиеся перед клетками Wg, начинают экспрессировать
еп (рис. 6.10, в).

Далее продукт гена еп поддерживает экспрессию wg в соседних клетках,
но не сам, а через продукт гена hedgehog (hh). Это подтверждается тем, что
у мутантов hh на этой стадии исчезает экспрессия wg (рис. 6.10, г). Таким
образом, продукт гена hh как сигнальный белок выступает в качестве по-
средника при передаче сигнала от клетки с экспрессией гена еп к клетке
с экспрессией гена wg. Hh взаимодействует с трансмембранным рецепто-
ром Ptc, который присутствует в соседней клетке Wg. Сигнал активирует
транскрипционный фактор Cubitus interruptus с ДНК-связывающим доме-
ном — «цинковым пальцем» (рис. 6.10, д). Его перемещение в ядро обе-
спечивает экспрессию wg. Соседние клетки могут реагировать на продукт
гена wg как на сигнал в том случае, когда клетки являются компетентными
к восприятию сигнала, т. е. когда в них нет экспрессии гена patched (ptc),
который кодирует трансмембранный белок, но есть трансмембранный ре-
цептор Wg — Frizzled (Fz), воспринимающий сигнал Wg. Рецептор Fz нахо-
дится на апикальной поверхности клеток Еп (рис. 6.10, д). Передача сигнала
опосредована каскадом сигнальных белков Dsh (Dishevelled), Zeste-white 3
(Zw3) и Armadillo, которые передают сигнал, активирующий транскрипцию
генов hh и еп в ядре клетки Еп.

Итак, для экспрессии еп необходима ее начальная стимуляция продукта-
ми генов правила парности. В результате этого происходит элиминация Ptc
за счет продукта гена еп, а затем гены wg и еп взаимно поддерживаю! экс-
прессию друг друга в соседних клетках. Это еще один пример положительной
обратной связи.

engrailed

Ген кодирует ТФ, содержащий гомеодомен. У мутантов по этому гену
задние структуры крыла трансформируются в передние, задняя часть ноги
трансформируется в переднюю часть ноги, задняя часть гальтеры — в перед-
нюю часть гальтеры.

wingless

У мутантов wingless крылья превращаются в зеркально отраженную ду-
пликацию дорсального торакса.
Регуляция экспрессии зиготических генов в развитии дрозофилы является
демонстрацией того, как межклеточная коммуникация формирует и поддер-
живает образование дискретных структур или органов в пределах организма.

Контрольные вопросы

1. На какие три группы можно разделить зиготические гены у дрозофилы?

2. Каков механизм регуляции зиготических генов белком Bed?

3. В чем состоят особенности экспрессии гена hunchback?

4. Что такое правило трех К?

5. Как регулируется работа генов полярности сегментов?

ЛИТЕРАТУРА

Bakkali М. Microevolution of cis-reguiarory elements: an example from the pair-rule segmentation
gene fushi tarazu in Drosophila melanogaster subgroup // PLoS ONE. 2011. Vol. 6. e27376.

Howard K., Ingham P., Rushlow C. Region-specific alleles of the Drosophila segmentation gene hairy
// Genes & Develop. 1988. Vol. 2 (8). P. 1037-1046.

Lardelli M., Ish-Horowicz D. Drosophila hairy pair-rule gene regulates embryonic patterning outside
its apparent stripe domains /I Develop. 1993. Vol. 118. P. 255-266.

Manoukian A.S., Krause H.M. Concentration-dependent activities of the even-skipped protein in
Drosophila embryos // Genes & Develop. 1992. Vol. 6. P. 1740-1751.

Riddihough G., Ish-Horowicz D. Individual stripe regulatory elements in the Drosophila hairy promoter
respond to maternal, gap, and pair rule genes // Genes & Develop. 1991. Vol. 5 (5). P. 840 -854.

Small S„ Arnosti D. N’. Transcriptional Enhancers in Drosophila 11 Genetics. 2020. Vol. 216 (1). P. 1-26.

SmallS., Kraut R., HoeyT., Warrior R., Levine M. Transcriptional regulation of a pair-rule stripe in
Drosophila // Genes & Develop. 1991. Vol. 5. P. 827 -839.

Zhang Y., Beachy P. A. Cellular and molecular mechanisms of Hedgehog signalling // Nat. Rev. Mol.

Cell Biol. 2023. Vol. 24. P. 668-687.
Глава 7

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

НА УРОВНЕ ТРАНСЛЯЦИИ В РАЗВИТИИ

На определенных этапах развития или в конкретных органах, тканях
и даже в отдельных клетках возникает ситуация, при которой доминирующей
становится регуляция экспрессии генов на уровне трансляции, поскольку
транскрипция временно заблокирована, или есть необходимость в немед-
ленном появлении продукта соответствующе] © гена в ответ на внешний или
внутренний стимул. Примерами могут быть: раннее эмбриональное развитие
у разных животных; сперматогенез, главным образом в период формирова-
ния сперматозоида; рост и функционирование отростков нервных клеток,
в особенности при установлении синаптических контактов; период деления
ядра и клет ки; установление межклеточных связей.

Для решения проблем развития необходимо, чтобы продукты генов по-
являлись и (или) исчезали в нужный момент и в нужном месте. Регуляция
синтеза белков в определенном месте клетки возможна благодаря так на-
зываемым локализованным мРНК. Такие мРНК находятся в составе РНП
(рибонуклеопротеиновых) комплексов, в состоянии временно недоступном
для трансляции, распределяясь в клетке не случайно. Развитию исследова-
ний в этой области способствовало появление новых методов, позволяющих
идентифицировать отдельные мРНК и следить за их локализацией и пере-
мещением в клетке.

Методы идентификации РНК в клетке

Рассмотрим некоторые методы идентификации мРНК в клетке.

1. Инъекция меченых мРНК или гибридизация in situ с меченым
ДНК-зондом, комплементарным искомой мРНК

Сначала мРНК транскрибируют in vitro в присутствии меченых нукле-
отидов, а затем меченые мРНК инъецируют в живые клетки (рис. 7.1, а).
За перемещением меченой мРНК следят непосредственно в клетке с помо-
щью микроскопии.

Используют и другой способ идентификации мРНК в тканях и клетках.
Меченые однонитевые ДНК-зонды способны находить комплементарные
последовательности в РНК и взаимодействовать с ними. Этот метод
называется флуоресцентной гибридизацией — FISH (fluorescence in situ
hybridization).

2. Совместная экспрессия генетических конструкций

В качестве примера можно привести систему MS2-GFP, с успехом исполь-
зуемую для дрожжей, дрозофилы и в культуре клеток. В этом случае одна
генетическая конструкция под регулируемым промотором X несет кодирую-
щую часть гена MS2, слитого (с химической точки зрения) с последователь-
ностью, кодирующей зеленый флуоресцирующий белок GFP. Экспрессия этой
конструкции приводит к появлению белка MS2, слитого с GFP (MS2-GFP).
Другая генетическая конструкция представляет собой интересующий ген
с его собственным промотором Y, а также последовательность, состоящую
из повторов в 12-24 н. (рис. 7.1, б). Эти повторы в мРНК узнаются белком
MS2. Совместная экспрессия обеих генетических конструкций может быть
достигнута в результате скрещивания трансгенных особей, каждая из ко-
торых несет одну из конструкций, или в результате одновременной транс-
фекции. У гибридных особей, несущих обе конструкции, при одновремен-
ной экспрессии трансгенов можно идентифицировать искомый транскрипт
благодаря его взаимодействию с MS2-GFP и определять локализацию этого
транскрипта в клетке.

3. Метод молекулярного маяка

Молекулярный маяк — это короткий олигонуклеотид, содержащий
на одном конце флуоресцентные молекулы, на другом — флуоресцентные
глушители (рис. 7.1, в). В несвязанном состоянии вторичная структура

Регулируемый

промотор X MS2ORF GFP

Повторы MS2

Промотор Y Ген Y

Рис. 7.1. Методы идентификации транскриптов в клетке:

а — трансформация клеток меченой мРНК; б — совмещение генетических конструкций;
в — использование «молекулярного маяка» [Van de Bor, Davis, 2004]
олигонуклеотида удерживает флуорофор вблизи глушителя флуоресценции,
и свечения не наблюдается. Последовательность олигонуклеотида в петле
«молекулярного маяка» комплементарна участку исследуемого транскрипта.
Одновременное присутствие в клегке исследуемого транскрипта и меченого
олигонуклеотида приводит к комплементарному взаимодействию олигону-
клеотида с последовательностью-мишенью. Маяк разворачивается, и проис-
ходит разобщение флуорофора и глушителя флуоресценции, что вызывает
свечение флуорофора. Молекулярные маяки позволяют увидеть в живой
клетке и эндогенные РИК.

Регуляция трансляции мРНК, запасенных в ооците

Раннее эмбриональное развитие у многих животных (дрозофила, ксе-
нопус) осуществляется без транскрипции. В этом случае значительную
роль играет регуляция экспрессии генов на уровне трансляции материн-
ских мРПК, которые до поры до времени остаются грансляционно неак-
тивными и могут приступить к трансляции тогда, когда появится потреб-
ность в соответствующем белке. Это позволяет регулировать синтез белков
на запасенных матрицах. Впервые локализованные РНК были обнаружены
в ооцитах Xenopus. И в ооците дрозофилы и ксенопуса позиционная инфор-
мация создается благодаря неслучайному распределению продуктов генов
материнского эффекта, среди которых важное место принадлежит локали-
зованным мРНК.

У D. melanogaster ядро зиготы претерпевает 13 синхронных делений без
цитокинеза, образуя синцитиальный эмбрион, состоящий из нескольких ты-
сяч ядер в одной цитоплазме. Ядра делятся в отсутствие транскрипции. Ре-
гуляция экспрессии генов, контролирующих ядерные деления и миграцию
ядер, осуществляется на уровне трансляции и пост-трансляционных модифи-
каций соответствующих белков. К концу 14-го цикла ядерных делений около
6000 ядер находится в кортикальном слое яйца. На этой стадии происходит
инвагинация клеточной мембраны и образуются клетки. Эмбрион переходит
к стадии клеточной бластодермы. Клетки обретают судьбу, получая набор
транскрипционных факторов и сигнальных молекул, определяющих путь их
дальнейшей дифференциации.

У Xenopus, как и у дрозофилы, транскрипция зиготических генов начина-
ется не после оплодотворения, а на стадии средней бластулы, когда эмбрион
состоит из 4000 клеток. Если у дрозофилы синтез материнских молекул про-
исходит в питающих или фолликулярных клетках, то у Xenopus — в самом
ооците. Ооцит ксенопуса транскрипционно активен, а у дрозофилы транс-
крипционно инертен. Локализованные мРНК формируют позиционную ин-
формацию, а регуляция их трансляции определяет пространственную диф-
ференциацию клеток на ранних этапах эмбриогенеза.
Функции локализованных мРНК

Локализованные мРНК могут выполнять следующие функции:

1. Обеспечивать высокий уровень кодируемого ими белка в районе их
локализации.

Примером может служить мРНК bicoid, которая локализуется в передней
части эмбриона дрозофилы.

Такая стратегия характерна и для почкующихся дрожжей S. cerevisiae,
у которых мРНК Ashl локализуется в почке и дочерней клетке до заверше-
ния митоза. Ген Ashl кодирует репрессор, не позволяющий переключать тип
спаривания в дочерней клетке.

Асимметричное распределение Ashlp возникает из-за локализации мРНК
Ashl на дистальном конце дочерней клетки. Локализация .мРНК Ashl зависит
от четырех последовательностей, формирующих структуру стебель-петля, —
«zipcodes»: El, Е2А, Е2В, ЕЗ. Первые три последовательности располагаются
в кодирующем районе и одна — в 3'UTR мРНК Ashl (рис. 7.2). Эти цис-
действующие элементы взаимодействуют с транс-действующим фактором —
РНК-связывающим белком She2p, который обладает сродством к моторному
белку — миозину Муо4р через адаптерный белок She3p. Перемещение мРНК
Ashl происходит по актиновому цитоскелету. Если путем мутаций нарушить
последовательность, соответствующую ЕЗ, мРНК Ashl будет присутствовать
и в материнской, и в дочерней клетках. Помещение всех четырех последова-
тельностей в 3'UTR мРНК Ashl приводит к тому, что мРНК Ashl локализует-
ся правильно, однако она способна к преждевременной трансляции. Транс-
ляционная репрессия мРНК Ashl в период ее перемещения определяется

Рис. 7.2. Перемещение локализованной мР1 IK Ashl на дистальный конец
дочерней клетки (почки) 5. cerevisiae
тремя зип-кодами в кодирующем районе этой мРНК. Такая задержка транс-
ляции позволяет мРНК Ash 1 достигнуть своего места прежде, чем появится
белок Ashl.

2. Предотвращать появление кодируемого ими белка в том месте клетки,
где это нежелательно.

Примером может служить мРНК oskar и nanos у Drosophila, которые в нор-
ме локализуются или транслируются только на заднем конце ооцита, опреде-
ляя будущую судьбу клеток заднего полюса эмбриона. В результате наруше-
ния локализованной трансляции этих мРНК клетки переднего полюса обре-
тают судьбу клеток заднего полюса, что вызывает существенные нарушения
эмбрионального развития.

3. Могут служить основой для сборки органелл, не окруженных мем-
браной.

11римером являются некодирующие локализованные транскрипты, напри-
мер Pgcl (Polar granule component /), которые локализуются на заднем полюсе
ооцита раннего эмбриона дрозофилы. Они способствуют локализации дру-
гих мРНК на заднем полюсе ооцита дрозофилы и тем самым решаю! судьбу
половых клеток в эмбриогенезе.

Специфическая локализация мРНК приводи)' к синтезу определенною
белка в нужном месте, что необходимо для создания концентрационного гра-
диента морфогенов путем диффузии белка от места локализованной транс-
ляции.

Локализованные мРНК в виде комплекса РНП занимают определенное ме-
сто в клетке. Их трансляция — регулируемый процесс. Существует несколько
возможностей экспрессии генов на уровне трансляции. Каждая локализован-
ная мРНК имеет свой сценарий, обеспечивающий репрессию или активацию
трансляции, а также деградацию мРНК.

Присутствие в локализованных мРНК цис-действующих элементов и по-
явление соответствующих транс-действующих факторов в определенном
пространственно-временном интервале существования клетки создают пред-
посылки для дифференциации или разворачивания соответствующей про-
граммы развития.

Роль 5'UTR в регуляции трансляции

Структура 5'UTR играет важную роль в инициации трансляции. Рибосома
очень чувствительна к структуре 5'UTR и в особенности к наличию в этом
районе вторичных структур тина стебель-петля. Такие структуры способны
блокировать инициацию трансляции (рис. 7.3).

В 5'UTR часто встречается палиндром cugcag и другие cg-содержащие
повторы. Иногда эти преграды при инициации трансляции позволяют
преодолеть последовательность, называемую внутренним сайтом посадки
Рис. 7.3. Сигнальные последовательности мРНК, обеспечивающие ее стабильность, эффек-
тивность трансляции и локализацию в определенном месте клетки.

uORF — upstream open reading frame, IRES — Internal Ribosome Entry Site, CPE — Cytoplasmic
Polyadenylation Element |Pesole et al., 2001]

рибосомы, — IRES (Internal Ribosome Entry Site), который имеет характерную
вторичную структуру (рис. 7.3).

Трансляцию регулирую!' и присутст вие в 5'UTR нескольких стартовых ко-
донов и, соответственно, наличие нескольких рамок считывания, следующих
друг за другом с перекрыванием или последовательно. Преждевременные
рамки считывания, не соответствующие основной рамке, называются uORFs
(upstream open reading frames). Они репрессируют трансляцию основной ORF.
Причем эта репрессия тканеспецифична. Для того чтобы uORFs были функ-
циональными, протяженность преждевременной рамки считывания должна
составлять не менее 10 кодонов.

В 5'UTR мРНК RAR-fi2 (Retinoid Acid Repressor |32) — репрессоре ретиное-
вой кислоты р2, имеющем протяженность в 461 н„ находится 5 uORFs.

мРНК c-mos в семенниках мышей имеет 5'UTR в 300 н., который включает
4 uORFs. В то же время в ооцитах мРНК c-mos содержит 5'UTR в 80 н. без
uORFs. По этой причине в сперматогенезе репрессия трансляции мРНК c-mos
более жесткая.

Скорость инициации трансляции

мРНК может быть недоступной для инициации трансляции, если она
связана с белком, находясь в составе частиц РНП. Последовательности, от-
вечающие за блок инициации трансляции, называются masking. Существу-
ют белки, обладающие сродством к 5'UTR; при этом одни белки способны
заблокировать трансляцию, тогда как другие — могут ей способствовать.
Сохранение не транслируемых до определенного периода времени мРНК
является обычным явлением в развитии. мРНК, которые синтезируются в га-
метогенезе, но не транслируются, называются masked mRNA. Они не могут
присоединяться к рибосомам.

Выделить такие мРНК и попробовать транслировать их in vitro нельзя.
Они начинают эффективно транслироваться только в том случае, если путем
фенольной экстракции удалить связанные с ними белки. Таким образом,
мРНК компетентна к трансляции, но не может ее начать из-за взаимодей-
ствия с белками. Белки, взаимодействующие с мРНК, относятся, как правило,
к фосфопротеинам. Одним из важнейших сигналов, вызывающих актива-
цию masked mRNA, является оплодотворение, которое изменяет характер
фосфорилирования белков, связанных с мРНК. Два таких белка выделены
из ооцитов Xenopus: mRNP3 и FRGY2. Это консервативные белки, имеющие
РНК-связывающий домен. Но наличия только этих белков недостаточно для
подавления трансляции, хотя в системе in vitro они действуют как неспеци-
фические ингибиторы трансляции.

Большую роль в активации трансляции masked mRNA играет также орга-
низация их 3'UTR.

Структура 3'UTR в регуляции трансляции

Чаще всего именно нетранслируемые части мРНК влияют на ядерно-ци-
топлазматический транспорт, на субклеточную локализацию мРНК, ее ста-
бильность и эффективность трансляции. РНК-связывающие белки взаимо-
действуют с определенными последовательностями. Узнаваемыми могут быть
как вторичные структуры, так и открытые для взаимодействия однонитевые
участки РНК (см. рис. 7.3).

Присутствие в 3'UTR AU-богатых последовательностей типа AUUUA
влияет на стабильность мРНК. Эти последовательности, называемые ARE
(AU-Rich Element), присутствуют в 3'UTR многих короткоживущих мРНК,
кодирующих цитокины, лимфокины, протоонкогены и ростовые факторы.
Существует три класса ARE: первый — представлен несколькими непере-
крывающимися последовательностями AUUUA в 3'UTR, второй — пере-
крывающимися последовательностями AUUUA и третий — U-богатыми
последовательностями. Большинство белков, узнающих ARE, подвергаются
посттрансляционной модификации, что позволяет регулировать характер
их взаимодействия с ARE, влияя тем самым на стабильность соответ-
ствующих мРНК. Взаимодействие ARE с белком HuR (Human antigen R)
повышает стабильность транскрипта, чго регулируется фосфорилирова-
нием HuR.

Особую роль в биогенезе мРНК в цитоплазме играют последовательности,
комплементарные микроРНК, что позволяет относить такие мРНК к классу
временно нетранслируемых или приводить к их деградации (см. гл. 8).
Альтернативное полиаденилирование

Формирование З'-конца мРНК является необходимым этапом ее созре-
вания в ядре. Он включает два процесса: экзонуклеотическое расщепление
и нематричное присоединение аденинов (полиаденилирование) с участием
сложных макромолекулярных комплексов, включающих CPSF (Cleavage and
Polyadenylation Stimulatory Factor), CStF (Cleavage Stimulatory Factor), CFIm
и CFIIm (Cleavage Factors) и др. (рис. 7.4). CPSF узнает сигнал полиадени-
лирования PAS (Polyadenylation Signal), который располагается на 10-30 н.
ранее сайта расщепления. Разнообразие мРНК большинства эукариотических
генов обеспечивается, помимо альтернативного сплайсинга, и присутствием
нескольких PAS, которые способствуют разнообразию 3'UTR по длине и со-
держанию. Наиболее распространенными PAS являются гексануклеотиды
AAUAAA и AUUAAA. Кроме них, в редких случаях используются минор-
ные PAS, список которых постоянно дополняется. Примером таких PAS мо-
гут служить: UAUAAA, AGUAAA, AAGAAA, AAUAUA, AAUACA, CAUAAA,
GAUAAA, AAUGAA, UUUAAA, ACUAAA, AAUAGA, AAAUAA, AUAAAA,
AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUAA, AUAAAC, AAAAUA, АААААА,
AAAAAG, AACAAA, UUAUAU, AAAAAU и UUUAUU. Такие неканонические
PAS узнаются специфичными транс-активирующими факторами, обеспечи-
вая варианты альтернативного органоспецифичного полиаденилирования.
При этом важно не только присутствие альтернативного PAS, но и смеж-
ных последовательностей, таких как U-богатая последовательность —
U-rich/UGUA, которая предшествует PAS, — UpStream Element (USE) и по-
следовательность U-/GU-rich — Down Stream Element (DSE) (рис. 7.4). После-
довательность DSE узнается комплексом CStF, обеспечивающим расщепление

Рис. 7.4. Последовательности, участвующие в формировании З'-конца мРНК.

PAS — Polyadenylation Signal: USE — UpStreant Element, с которым взаимодействует CFIm
(Cleavage Factor Im); CS — Cleavage Site и DSE — Down Stream Element, с которым взаимо
действуют CPSF и CStF [Liu et al., 2007]
по сайту CS (Cleavage Site). В этот процесс вовлечен и комплекс CFlm, ко-
торый взаимодействует с USE. Комплекс CFlm способствует терминации
транскрипции и привлекает поли(А)-полимеразу— PAP (poly(A) polymerase),
которая обеспечивает нематричное присоединение аденинов. 3'UTR созда-
ет предпосылки для контроля за судьбой мРНК, которая зависит, с одной
стороны, от наличия цис-действующих элементов, а с другой — от присут-
ствия соответствующих транс-действующих факторов, взаимодействующих
с ними. Изменение этих параметров определяет судьбу мРНК: локализацию,
регуляцию трансляции и деградацию. Большинство альтернативных PAS рас-
полагается в 3'UTR, но они могут находиться в интронах и даже в экзонах.
Альтернативное полиаденилирование является распространенным источни-
ком появления органоспецифичных транскриптов в развитии.

Регуляция трансляции в развитии

путем цитоплазматического полиаденилирования

Несмотря на то что практически все мРНК получают поли(А)-последо-
вательность в ядре, часто мРНК попадают в цитоплазму трансляци-
онно неактивными с коротким поли( А)-3'-концом. Изменение длины
поли(А)-последовательности влияет на эффективность трансляции. Это спо-
собствует активации трансляции за счет цитоплазматического полиаденили-
рования: чем длиннее поли( А)-последовательность, тем интенсивнее процесс
трансляции [de Moor, Richter, 1999]. Факторы, связанные с 3'UTR, обладают
сродством к комплексу, инициирующему трансляцию и взаимодействую-
щему с последовательностью кэп (cap) в мРНК, с одной стороны, и с малой
частицей рибосом — с другой.

Существует физическое взаимодействие между 5'- и З'-концами мРНК.
Обнаружены так называемые кольцевые полисомы. Этот контакт осущест-
вляется через белки, которые взаимодействуют с 5'- или З'-концами мРНК
и обладают сродством друг к другу. Очищенный комплекс, инициирующий
трансляцию, связывается с поли(А)-последовательностью. Это послужи-
ло основанием для предположения о том, что последняя играет роль цис-
действующего элемента, оттягивающего на себя факторы инициации транс-
ляции.

Известно, что за счет полиаденилирования особенно эффективно регули-
руется трансляционная активность мРНК в оогенезе и сперматогенезе.

Путем полиаденилирования при активации яйца инициирует-
ся трансляция следующих мРНК дрозофилы: bed, Toll и torso. Длина
поли(А)-последовательности может изменяться в процессе онтогенеза. Та-
кое явление известно для мРНК c-mos мыши. Продукт гена c-mos — это
протоонкоген, необходимый для созревания ооцита. В оогенезе мРНК c-mos
полиаденилирована, и происходит эффективная трансляция мРНК c-mos.
В зрелых ооцитах перед оплодотворением эта мРНК деаденилируется. В ре-
зультате этого блокируется ее трансляция. мРНК снова полиаденилируется
в эмбриогенезе. Изменения в характере полиаденилирования мРНК c-mos
коррелируют’ с ее трансляционной активностью.

Программа полиадснилирования/деаденилирования записана в структу-
ре 3'UTR и регулируется соответствующими транс-действующими фактора-
ми. Цитоплазматическое полиаденилирование требует присутствия в 3'UTR,
по крайней мере, двух последовательностей. К ним относятся U-богатый эле-
мент цитоплазматического полиаденилирования UUUUUAU — Cytoplasmic
Polyadenylation Element (CPE) и сигнал полиаденилирования — гексану-
клеотид AAUAAA — Polyadenylation Signal (PAS). Обычно CPE располага-
ется в 3'UTR на несколько нуклеотидов ранее сигнала полиаденилирова-
ния — AAUAAA. С последовательностью СРЕ взаимодействует белок СРЕВ
(CPE-binding protein). Мишенями СРЕВ являются CPE-содержащие мРНК,
регуляция трансляции которых может осуществляться путем изменения
длины поли(А)-хвоста. С гексануклеотидом связывается белок CPSF, ко-
торый используется всеми мРНК. Интересно отметить, что белок СРЕВ
и взаимодействующий с ним белок Maskin локализуются в центросомах
и на веретене деления, что предполагает участие локализованных мРНК
в расхождении хромосом и регуляции трансляции этих мРНК путем из-
менения уровня их полиаденилирования. В ооцитах Xenopus белок СРЕВ
является субстратом для протеинкиназы p34cdc2. РНК-связывающий до-
мен белка СРЕВ на 62 % гомологичен белку Orb дрозофилы. Белок Orb
(00I8 RNA-binding) у дрозофилы отвечает за неслучайное распределе-
ние материнских мРНК в ооците дрозофилы. Orb — это эволюцион-
но консервативный РНК-связывающий белок, относящийся к семейству
белков СРЕВ.

Таким образом, 3'UTR содержит не только последовательности, которые
отвечают за полиаденилирование, но и такие, которые будут его блокировать
и, соответственно, трансляцию. Механизмы, по которым белок СРЕВ вовле-
кается в регуляцию трансляции, могут быть разными. Например, у Xenopus
СРЕВ связывается с МТ и помогает локализовать мРНК cyclin В1 па веретене
деления. СРЕВ необходим для митотических делений дробления в раннем
эмбриогенезе и ксенопуса, и дрозофилы.

В регуляции трансляции путем изменения длины поли(А)-последова-
тельности участвуют важнейшие белки:

1. СРЕВ. Важен для цитоплазматического полиаденилирования. Его поли-
аденилирующая активность повышается при фосфорилировании с участием
киназы Aurora А.

2. Maskin. Взаимодействует не только со СРЕВ, но и с eIF4E (фактором ини-
циации трансляции). Если Maskin связан с eIF4E, то последний не может вза-
имодействовать с eIF4G. Поскольку eIF4G нужен для того, чтобы поместить
малую частицу рибосомы на мРНК, инициация трансляции блокируется.
Связь Maskin с eIF4E разрушается, если длина поли( А)-последовательности
увеличивается, что позволяет elF4G взаимодействовать с eIF4E. А это в свою
очередь обеспечивает формирование инициирующего комплекса трансляции
и запускает трансляцию.

Регуляция трансляции мРНК
в период деления ядра и клетки

Характер полиаденилирования РНК зависит от стадии клеточного цикла.
Клеточный цикл — это серия событий, участниками которых являются регу-
ляторные факторы, среди которых важную роль играют циклины. Во время
фазы Gj (GapB) циклины D и Е взаимосвязаны и действуют в качестве ко-
факторов для некоторых циклин-зависимых протеинкиназ (cdks — cyclin-
dependent kinases), которые в свою очередь фосфорилируют ряд субстратов,
что обеспечивает переход клетки в стадию S (синтеза ДНК). На стадии S дан-
ные циклины разрушаются, и клетка переходит в стадию G2 (Gap2). В течение
стадии G2 происходит синтез и накопление циклина В, что приводит к свя-
зыванию его с протеинкиназой Cdkl, тем самым формируется фактор, при-
ближающий М-фазу — MPF — М phase-promoting factor, который вызывает
фосфорилирование многочисленных субстратов, стимулирующих вхождение
в митоз (М-фазу). MPF состоит из регуляторной субъединицы (циклина)
и протеинкиназы Cdkl.

У Xenopus вспед за активацией MPF, в процессе созревания ооцита, СРЕВ
претерпевает второй раунд фосфорилирования, что способствует деструкции
80-90 % белка. СРЕВ, который остается стабильным, локализуется на ани-
мальных полюсах созревающего ооцита и бластомеров в развивающемся
эмбрионе. В этих бластомерах белок СРЕВ. как и Maskin, концентрируется
на веретене и центросомах. мРНК cyclin В и ХЬиЬЗ, содержащие СРЕ, также
локализуются на митотическом аппарате.

Выход из М-фазы происходит тогда, когда циклин В узнается комплексом,
приближающим анафазу, — АРС — anaphase-promoting complex. Функция
данного комплекса состоит в деструкции белков. Выход из М-фазы требует
не только деструкции циклина В в составе АРС, но, возможно, и инактива-
ции и (или) деструкции киназы Aurora, дефосфорилирования СРЕВ по сери-
ну 174 и деаденилирования мРНК cyclin В. Снижение уровня циклина В спо-
собствует переходу клетки в фазу G] и началу нового клеточного (ядерного)
цикла.

Как деструкция циклина В с участием АРС, так и регуляция на уровне
трансляции мРНК cyclin В являются важными в изменении уровня циклина
В в клеточном цикле.

Уровень циклина В изменяется и при переходе к мейозу у млекопита-
ющих. Временно не транслируемые, молчащие мРНК, имеют относительно
короткую поли(А)-последовательность: обычно меньше 20-40 н. Перед
входом в мейоз, в период созревания, происходит стимуляция ооцита
прогестероном, тогда в таких мРНК поли(А)-последовательности удлиня-
ются и инициируется трансляция. Стимуляция прогестероном вызывает
синтез циклина В, формируя активный MPF. В ооците реактивируется
мейоз (созревание ооцита) и наступает стадия метафазы I (MI). В период
мейоза контроль трансляции мРНК cyclin Al, mos, cdkl также регулиру-
ется путем полиаденилирования. В покоящемся ооците эти мРНК тоже
имеют короткую поли(А)-последовательность. Поскольку уровень СРЕВ
не изменяется на протяжении клеточного цикла, а фосфорилирование
серина 174 происходит только на стадии М-фазы, это позволяет пред-
положить, чго в клеточном цикле контролируется уровень или актив-
ность белка СРЕВ и полиаденилирование CPE-содержащих мРНК. мРНК
без СРЕ в это время не полиаденилируются. Фосфорилирование СРЕВ,
а возможно и белка Maskin, приводит к конформационным изменениям,
вызывает диссоциацию белка Maskin от кэп-связывающей субъединицы
eIF4E и способствует привлечению факторов полиаденилирования CPSF
и РАР, обеспечивающих удлинение поли(А)-последовательности. Таким об-
разом происходит стимуляция иолиаденилирования мРНК c-mos и мРНК
cyclin В. В регуляции трансляции мРНК cyclin В у дрозофилы важную
роль играет и белок Pumilio. Полиаденилирование 3'UTR мРНК cyclin
В осциллирует в клеточном цикле, при этом высокий уровень циклина
В коррелирует с высокой активностью MPF и наибольшей конденсацией
хроматина.

Maskin также претерпевает несколько событий фосфорилирования при созре-
вании ооцита, ряд из которых имеет значение для диссоциации Maskin от eIF4E
и активации трансляции мРНК, содержащих CPE [Barnard et al., 2005]. В белке
Maskin могут фосфорилироваться аминокислотные остатки Т58, S152, S311, S453

UUUUAU PAS

3'UTR

Рис. 7.5. Регуляция трансляции мРНК путем цитоплазматического полиаденилирования.

СРЕ — Cytoplasmic Polyadcnylalion Element; СРЕВ — CPE-Binding; eIF4 — eukaryotic Initiation
Factor 4; PAS — Polyadenylation Signal; CPSF — Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor;

PAP — Poly A Polymerase; PABP — Poly-A Binding Protein |Mendez, Richter, 2001]
и S638. Фосфорилирование белка СРЕВ стимулирует его взаимодействие с CPSF
(рис. 7.5). Как и при ядерном полиаденилировании пре-мРНК, так и при цито-
плазматическом полиаденилировании, CPSF привлекает поли(А)-полимеразу
(РАР — poly(A) polymerase) к З'-концу соответствующей мРНК.

Поскольку СРЕВ взаимодействует с МТ, он, вероятно, заякоривает мРНК
на митотическом аппарате. Однако если у мутантов связь СРЕВ с МТ нару-
шается, то все равно происходит трансляция мРНК cyclin В1, но не в районе
веретена. Потеря локализованной трансляции вызывает нарушения в ми-
тотическом аппарате: образуются трехполюсные веретена и подавляются
клеточные деления.

Когда поли(А)-последовательность удлиняется за счет работы
поли(А)-полимеразы РАР, к ней присоединяются белки РАВР — poly(A)
binding protein и eIF4G. Благодаря образованию комплекса PABP-eIF4G по-
вышается сродство eIF4G к eIF4E, что приводит к разрушению связи между
белком .Maskin и eIF4E. В этом случае возможна сборка комплекса, иниции-
рующего трансляцию, обеспечивающего локализацию субъединицы 40S ри-
босомы на 5'-конце мРНК для запуска трансляции.

Доказано, что СРЕВ и Maskin вовлечены в локализованную трансляцию
мРНК, по крайней мере, в двух случаях [Mendez, Richter, 2001]:

1) в митотическом аппарате в эмбрионах Xenopus-,

2) в синапсах нейронов млекопитающих.

Деаденилирующая активность, вероятно, регулируется рибонуклеазой
PARN — poly(A)-specific ribonuclease. Эта рибонуклеаза впервые была вы-
делена из клеток млекопитающих, но присутствует и у Xenopus. Несмотря
на то что этот фермент проявляет активность на всех стадиях клеточного
цикла, деаденилирование мРНК, содержащих последовательность СРЕ, наи-
более эффективно на стадии S (рис. 7.5).

Таким образом, в эмбриональном клеточном цикле РНК циклина В поли-
аденилируется и деаденилируется. Фосфорилирование СРЕВ, катализируемое
киназой Aurora, необходимо для полиаденилирования мРНК cyclin В, что
индуцирует ее трансляцию и вход в стадию М-фазы клеточного цикла. При
этом цитоплазматическое полиаденилирование, опосредованное СРЕ, име-
ет место на стадии M-фазы клеточного цикла не только в эмбриональных,
но и в соматических клетках млекопитающих.

Эволюционно консервативные РНК-связывающие белки,
контролирующие развитие

Гетерогенная группа белков контролирует все этапы биогенеза РНК
в клетке: созревание, ядерный экспорт, транспорт, локализацию, трансляцию
и деградацию. Все эти этапы осуществляются с участием макромолекулярных
РНП (рибонуклеопротеиновых) комплексов. В формировании комплексов
РНП определяющую роль играют цис-действующие элементы в мРНК
и транс-действующие факторы, которые входят в состав РНП-комплексов.
Цис-действующие элементы — это не только определенные однонитевые по-
следовательности, но и вторичные структуры РНК: двунитевые участки (стеб-
ли), структуры типа стебель-петля или выпячивания однонитевых участков
по ходу двунитевых. Как правило, однонитевые участки РНК более эволю-
ционно консервативны. Они узнаются определенными РНК-связывающими
белками.

РНП-комплексы формируются в ядре. Этот процесс сопряжен с транс-
крипцией и процессингохМ мРНК, который включает копирование, сплайсинг
и полиаденилирование транскрипта. Все эти процессы могут осуществлять-
ся в альтернативных вариантах и зависят от набора факторов, специфич-
ных для определенного типа клеток. Ядерному экспорту РНП предшествует
формирование комплекса TREX (TRanscription-EXport), который привлекает
экспортные факторы. После выхода из ядра те мРНК, которые не присту-
пают к трансляции, направляются к определенному месту в клетке, по-
этому их называют локализованными. При этом происходит ремодели-
рование РНП-комплекса. Часть белков покидает РНП-комплекс, а новые
белки присоединяются к данному комплексу. Локализованные мРНК при-
сутствуют в составе сложных и динамичных по составу РНП-комплексов.
Такие РНП комплексы могут содержать разные мРНК, объединенные об-
щностью их функции, поэтому их называют функциональными оперонами.
Интересно, что в состав комплексов РНП часто входят белки, содержа-
щие домен LC (Low Complexity). Присутствие подобного домена обеспе-
чивает способность белка к полимеризации с образованием амилоидных
фибрилл.

РНК-связывающие белки содержат домены, узнающие различные после-
довательности РНК. Это могут быть однонитевые последовательности РНК,
их узнают домены класса ssRBl) (single-stranded RNA-binding domain). Среди
них домены: RRM (RNA recognition motif), KH (hnRNP К homology, ZF (zinc
tinge) или CSD (cold shock domain). Узнаваемая последовательность обычно
имеет протяженность 4-6 н.

Среди РНК-связывающих белков есть такие, которые узнают двунитевые
участки в РНК, — double-stranded RNA-binding proteins (dsRBPs). К ним от-
носится эволюционно консервативный белок Staufen. У млекопитающих два
паралогичных гена: Staul и Stau2. Ген Staul экспрессируется в большинстве
типов клеток, включая нервные, а ген Stau2 работает в основном в нервных
клетках. Stau2 взаимодействует с мРНК Proxl (prospero homeobox 2) (ортолог
дрозофилиного prospero) и мРНК Trim32 (ортолог Brat дрозофилы). Белок
Stau2 играет важную роль в формировании и поддержании дендритных ши-
пиков в нейронах гиппокампа. Дендритные шипики являются морфологиче-
ской структурой, которая выступает из основного тела дендритов, контакти-
руя с пресинаптическими нервными окончаниями.
Два гена, кодирующих белок Stau, представлены и в геноме Xenopus. Они
отвечают за локализацию мРНК Vgl и VegT на вегетативном полюсе ооцита.
У дрозофилы единственный ген Stau контролирует неслучайную локали-
зацию мРНК bicoid и oskar в ооците, а в нейрогенезе обеспечивает неслу-
чайную локализацию мРНК prospero на апикальном полюсе асимметрично
делящегося нейробласта. Соответствующие домены в белке Stau обеспечи-
вают его транспорт как по МТ, так и по актиновым филаментам. Белок Stau
содержит пять доменов dsRBD, взаимодействующих с двунитевыми участ-
ками мРНК. По своей структуре dsRBD представляет собой чередование
а-спиралей и (З-слоев: а (3 0 р а. Второй, третий и четвертый домены присут-
ствуют во всех вариантах белка, при этом третий и четвертый наиболее эво-
люционно консервативны. Домены dsRBD могут проявляться не только как
РНК-связывающие, но и как важные для белок-белковых взаимодействий.
В этом случае взаимодействие с РНК является опосредованным и осущест-
вляется за счет других РНК-связывающих белков.

Stau взаимодействует с протяженными двунитевыми участками РНК,
которые могут быть результатом образования вторичной структуры РНК,
а могут формироваться в силу комплементарных взаимодействий участков
разных мРНК или мРНК и длинных некодирующих РНК — TINCR (terminal
differentiation-induced ncRNA).

Анализ, сочетающий иммунопреципитацию с последующим анализом
РНК, идентифицированных с помощью микрочипов (RIP-Chip — RNA
immunoprecipitation chip), позволяет идентифицировать мРНК, взаимодей-
ствующие с РНК-связывающим белком Staul. Оказалось, что белок Stau яв-
ляется участником механизма деградации мРНК — SxMD (Staufen-mediated
decay) (рис. 7.6). Как стабилизация, так и дестабилизация мРНК зависят
от присутствия соответствующих регуляторных факторов, способных запу-
стить процесс деградации.

Staul взаимодействует с 3'UTRмРНК-мишеней и привлекает фактор Upfl,
который относится к классу АТФ-зависимых РНК-геликаз. Фактор Upfl
обеспечивает деградацию мРНК не только по механизму NMD (Nonsense-
Mediated mRNA Decay), но и SMD (Staul-Mediated mRNA Decay). Белок Upfl
служит адаптером между белковым комплексом PNRC2 (Proline-rich nuclear
receptor coactivator 2), с одной стороны, и Staul — с другой (рис. 7.6). Извест-
ным субстратом SMD является мРНК для синтеза антиадипогенного факто-
ра Kriippel-like factor 2 (KLF2). Адипогенез — это образование адипоцитов
из стволовых клеток. Адипоциты — основной тип клеток, из которых состоит
жировая ткань. Комплекс, стимулирующий SMD, располагается в 3'UTR ниже
ио течению по отношению к стоп-кодону. Белок PNRC2 привлекает факторы
Dcp2 и Dcpl, обеспечивающие удаление кэпа, что приводит к эндонуклеаз-
ной деградации мРНК KLF2 в направлении от 5'- к З'-концу.

Процесс деградации мРНК может происходить с участием экзонукле-
аз, привлекаемых комплексом UPF1 и UPF2 (рис. 7.6). Димеризация Staul
ААДА

Рис. 7.6. Деградация мРНК, опосредованная взаимодействием димера РНК-связывающего
белка Staufen 1 (Stau 1) с двунитевой последовательностью в 3'UTR, — SBS (Stau-binding site)
[Gowravaram et al., 2019]

способствует формированию комплекса c UPF1 и UPF2. В мРНК-мишенях,
подверженных SMD, присутствует последовательность, которую узнает бе-
лок Staul. Эта последовательность называется Stau-binding site (SBS). После-
довательность, взаимодействующая со Staul, обнаружена и в 3'UTR мРНК
для синтеза ADP ribosylation factor (ARF) 1. В группу мишеней для SMD ча-
сто попадают мРНК, содержащие Alu-последовательности в составе 3'UTR.
С помощью компьютерного анализа идентифицировали около 350 длинных
нкРНК, содержащих одну или более Alu-последовательностей. Поскольку
протяженные двунитевые участки в 3'UTR могут формироваться не только
за счет шпилек, но и в результате комплементарного взаимодействия 3'UTR,
содержащего Alu, с длинными нкРНК с А1п, механизм деградации мРНК
контролируется взаимодействием цис-действующих элементов и появлением
соответствующих транс-действующих факторов.

Регуляция трансляции мРНК, создающих позиционную
информацию в ооците дрозофилы

3'UTR является своеобразным адресом, который отправляет соответству-
ющую мРНК в определенный компартмент ооцита, где и происходит акти-
вация ее трансляции. Регуляция на уровне трансляции каждой мРНК, как
правило, осуществляется по своему сценарию.

Сравним регуляцию на уровне трансляции трех локализованных мРНК,
создающих позиционную информацию в ооците дрозофилы.
Регулируемая трансляция мРНК nanos

Не более 4 % мРНК nanos (nos) локализуется на заднем полюсе ооцита
в районе кортекса. Остальные 96 % мРНК распределены в ооците равномер-
но. При этом транслируется только локализованная мРНК nos.

Это подчеркивает важность трансляционной репрессии нелокализо-
ванных мРНК nos. Трансляционная активация происходит в результате
удаления трансляционного репрессора, что сопровождает локализацию
мРНК nos.

З'-UTR мРНК nos содержит последовательность размером 184 н.» назван-
ную ТСЕ — translation control element. В пределах этой последовательности
находятся два разделенных участка, ответственные за взаимодействие с бел-
ком Smaug. Эти последовательности называются SRE — Smaug recognition
element. SRE формирует структуру стебель-петля (14-23 н.).

Белок Smaug (Smg) имеет РНК-связывающий домен SAM — sterile alpha
motif. Белок Smg впервые был идентифицирован как фактор, взаимодей-
ствующий с мРНК nos, которая, находясь в цитоплазме раннего эмбриона,
не транслируется, если не закреплена на заднем полюсе эмбриона. Smg как
РНК-связывающий белок узнает петлю CUGGC в структуре стебель-петля
3'UTR мРНК nos и регулирует стабильность и трансляцию. Трансляционный
репрессор Smg эволюционно консервативен, присутствует у дрожжей и че-
ловека.

Если 3'UTR мРНК nos заменить на З'иТК-тубулиновой мРНК, го такая
мРНК будет равномерно распределяться в эмбрионе и транслироваться неза-
висимо от локализации. В этом случае разовьются эмбрионы, которые будут
иметь два зеркально повторенных абдомена. Трансляция мРНК nos индуци-
руется оплодотворением. Полагают, что актин-зависимое закрепление мРНК
nos определяет локализованную трансляцию мРНК nos [Forrest, Gavis, 2003].
Для локализации и инициации трансляции мРНК nos требуются продукты
генов oskar и vasa. У мутантов по этим генам мРНК nos не локализуется на за-
днем полюсе эмбриона и не транслируется. Белки Osk и Vas, как и мРНК nos,
локализуются на заднем полюсе. Активатор Osk вытесняет репрессор Smg.
Специфическая локализация не только активирует трансляцию, но и предо-
храняет РНК от деградации. После оплодотворения 99 % мРНК nos и 95 %
мРНК Hsp83 деградируют в течение первых 2 часов. Деградации не подверга-
ются только мРНК, локализованные на заднем полюсе мРНК. В сохранении
мРНК в нетранслируемом состоянии принимают участие геликазы, содержа-
щие DEAD-box.

Количество белка Osk определяет, какое количество мРНК nos и белка Vas
будет находиться на заднем полюсе, а также какое количество белка Nos будет
синтезироваться. Для генов, контролирующих развитие, очень важен эффект
дозы: она должна быть строго определена. Регуляция трансляции мРНК osk
отличается от таковой для мРНК nos.
Контроль трансляции мРНК oskar

Локализация мРНК oskar (osk) определяется последовательностью, лока-
лизованной в ее 3'UTR, и осуществляется в несколько этапов:

1. Транспорт из питающих клеток в ооцит и накопление в задней части
ооцита.

2. Заякоривание транскриптов на заднем полюсе. До этого трансляция
мРНК osk была подавлена. Наличие белка Osk является необходимым и до-
статочным для формирования полярной плазмы, определяющей формирова-
ние половых клеток и абдоминальных структур.

Появление белка Osk в процессе транспорта мРНК osk приводит к зна-
чительным нарушениям развития. Процесс репрессии трансляции мРНК
osk во время ее транспорта достаточно сложен и происходит с участием не-
скольких транс-действующих факторов. Bruno имеет три РНК-связывающих
домена (RRM) и является трансляционным репрессором. Этот белок взаимо-
действует с повторяющимися последовательностями в 3'UTR мРНК osk. Эта
последовательность называется BRE — Bruno response element.

Однако присутствия только белка Bruno недостаточно для репрессии
трансляции мРНК osk. Получены мутации, затрагивающие элемент BRE.
У таких мутантов мРНК osk транслируется независимо от ее локализации.
На этом основании было сделано заключение, что белок Bruno может быть
репрессором трансляции нелокализованной мРНК osk. Для трансляции
мРНК osk с нарушенным BRE требуется продукт гена stau. Это предполага-
ет, что белок Stau нужен не только для локализации, но и для трансляции
мРНК osk.

В репрессию трансляции мРНК osk вовлечены также продукт гена apontic,
факторы Bicaudal-C, р50. Белок Bicaudal-C содержит РНК-связывающий до-
мен, такой же как в hnRNP К, называмый КН (hnRNP К homology). Точко-
вые мутации, в результате которых изменяется данный домен и нарушается
взаимодействие между белком Bicaudal-C и мРНК osk, вызывают прежде-
временную трансляцию мРНК osk. Если репрессия трансляции определяется
последовательностями, локализованными в 3'UTR мРНК osk, то активация
трансляции этой мРНК зависит от последовательностей, локализованных
в 5'UTR. Без определенного участка 5'UTR данная мРНК локализуется, как
и в норме, на заднем конце ооцита, но не транслируется. Таким образом,
только правильной локализации недостаточно, для того чтобы запустить
трансляцию. Полагают, что с мРНК osk взаимодействуют определенные фак-
торы, которые способны блокировать функцию белков, репрессирующих
трансляцию. На эту роль претендуют два РНК-связывающих белка: р68 и р50,
которые способны взаимодействовать с 3'UTR. Функция данных белков —
установление связи с репрессором. В активации трансляции мРНК osk при-
нимают участие и другие факторы, например РНК-геликаза Vasa, которая
взаимодействует с Bruno.
Геликаза Vasa, содержащая DEAD-бокс, взаимодействует с elF5B, а также
с U-богатой последовательностью в 3'UTR ряда мРНК. Этот белок много-
функционален: обеспечивает сайленсинг транспозонов с участием пиРНК
и регулирует конденсацию хроматина митотических хромосом в зачатковых
клетках.

Многие РНК, регулируемые в процессе развития на уровне трансляции,
представлены в виде комплексов с РНК-связывающими белками. А. С. Спи-
рин назвал такие РНП-комплексы информосомами [Спирин и др., 1964].
Функции белков информосомы: стабилизация, регуляция трансляции,
транспорт мРНК. Состав комплексов РНП многообразен, как и их назва-
ния: Р-тельца (processing bodies), S-гранулы (S-granules), полярные гранулы,
нейронные гранулы и др. В состав таких комплексов входят и рибосомы.
Формирование гранул РНП начинается в ядре, где с долгоживущими мРНК
взаимодействуют белки, некоторые из них сохраняют с ними связь и после
выхода из ядра.

Активация трансляции мРНК osk происходит за счет блокирования функ-
ции Bruno, но и в отсутствии ключевого фактора нужен белок Vasa. При этом
белок Vasa взаимодействует с основными компонентами трансляционной
машины, непосредственно связываясь с фактором инициации трансляции
eIF5B. Для активации трансляции мРНК osk нужен как белок Stau, так и Orb.
Белок Staufen связывается с 3'UTR мРНК osk. РНК-связывающие домены Stau
выполняют самостоятельные функции: dsRBD3 необходим для локализации
мРНК osk и bed, dsRBD2 — посредник в транспорте по МТ, a dsRBD5 отвечает
за дерепрессию трансляции мРНК osk после ее локализации.

С мРНК osk взаимодействует Orb, который является гомологом белка
СРЕВ. У мутантов по orb мРНК osk имеет более короткий поли(А)-хвост,
по сравнению с мРНК osk у особей дикого типа. Таким образом, для актива-
ции трансляции мРНК osk необходимо цитоплазматическое полиаденили-
рование.

мРНК osk для локализованной трансляции нуждается в компонентах плаз-
мы заднего полюса. Для локализации мРНК osk требуется функционирова-
ние восьми генов — cappucino, spire, staufen, orb, mago nashi, Notch, Delta —
и материнская форма протеинкиназы А. С мРНК osk взаимодействуют Нгр48,
Squid (Sqd) и Glorund ((Ио). Нгр48 является самым многочисленным гетеро-
ядерным рибонуклеопротеином из семейства hnRNPA/B.

Нелокализованная мРНК osk не может транслироваться. С двух разных
стартовых кодонов продуцируется две изоформы белка Osk. Для формирова-
ния элементов полярной плазмы необходима более короткая изоформа этого
белка. Короткий белок Osk нужен для локализованной трансляции мРНК nos.

Исходная локализация мРНК osk на заднем полюсе ооцита разрешает
трансляцию этой мРНК, а затем белок Osk регулирует трансляцию своей
собственной мРНК. Это еще один пример положительной обратной связи
в регуляции экспрессии генов в развитии.
Если мРНК osk и nos транслируются только как локализованные, то транс-
ляция мРНК bed не зависит от ее локализации. У мутантов с нарушенной
локализацией нет нарушений в трансляции мРНК bed. Трансляция мРНК bed
регулируется полиаденилированием.

Регуляция трансляции мРНК gurken

Для правильной локализации мРНК gurken нужны 230 н., расположенных
в белок-кодирующем (ORF) районе. 3'UTR важен для заключительного этапа
локализации, когда локализованная мРНК gurken образует шапочку вокруг
ядра ооцита. Два элемента присутствуют и в 5'UTR — это GLE1 (Gurken
Localization Element) (35 н.) и GLE2 (59 н.). Они нужны для стабильности
и контроля трансляции мРНК gurken и на ранних этапах локализации этой
мРНК. Единственный извест ный белок, который обнаруживает связь с мРНК
gurken, — это Squid (Sqd), он взаимодействует с 3'UTR мРНК gurken.

Локализованными являются и т ранскрипты зиготических генов, например
even skipped, fushi tarazu и wingless, однако сходства между 3'UTR этих мРНК
не обнаружено.

Следующий пример, свидетельствующий об отсутствии какого-либо сход-
ства последовательностей, определяющих локализацию мРНК в определен-
ном компартменте клетки, — это мРНК Vgl и VegT У Xenopus они локализу-
ются на вегетативном полюсе и играют определенную роль в установлении
полярности эмбриона, но последовательности, отвечающие за этот процесс,
неидентичны. VglLE (340 н.) содержит серию повторов в 5-9 н. Этот район
существенен для локализации мРНК Vgl. VegTLE (370 н.) также содержит
повторы. Однако между ними нет сходства ни в отношении последовательно-
сти, ни в отношении вторичной структуры. Сигналы, определяющие взаимо-
действие с РНК-связывающими белками, чаще всего являются уникальными.

Для некоторых мРНК описаны сигналы, отвечающие за отдельные этапы
на пути к локализации. Так, в мРНК bed каждый элемент стебель-петля в ее
3'UTR отвечает за свой этап в судьбе этой мРНК.

После завершения процессинга мРНК освобождается от места транс-
крипции и экспортируется из ядра через ядерные поры. В этот момент одни
факторы, связанные с мРНК, покидают ее, другие — исчезают после того, как
мРНК оставит ядро. Но некоторые факторы продолжают взаимодействовать
с мРНК и после экспорта из ядра. Например, Mago nashi или Y14 взаимодей-
ствуют с мРНК в ядре и остаются связанными с местами сплайсинга в соста-
ве FJC — exon-exon junction complex. Они существенны и для локализации
мРНК.

В цитоплазме мРНК встречаются факторы, которые осуществляют ее
транспорт, участвуют в ее трансляции, деградации и заякоривании. Такое
взаимодействие обеспечивает доставку мРНК к месту назначения. Транспорт
в цитоплазме происходит в составе сложных РНП-частиц, и на этом этапе
мРНК могут менять партнеров. Так делает мРНК bed: сначала Exu, затем Swa
и, наконец, Stau.

Не все мРНК несут LE в 3'UTR: мРНК Ash 1 у дрожжей и мРНК gurken
у дрозофилы имеют LE в кодирующем районе. Это подразумевает взаимодей-
ствие между аппаратами трансляции и локализации мРНК.

Возможности контроля экспрессии генов на уровне трансляции имеют су-
щественное значение в регуляции процессов развития благодаря следующим
факторам: относительной независимости от процесса транскрипции; быстро-
му появлению необходимого продукта в ответ на действие эндогенного или
экзогенного стимула с учетом пространственно-временных особенностей
развития организма; многообразию функциональных возможностей РНК,
включая нехромосомный тип наследования.

Контрольные вопросы

1. Какие методы можно использовать для идентификации РИК в клетке?

2. В чем заключаются функции локализованных мРНК?

3. Какова роль 5'UTR в регуляции трансляции?

4. Какова роль 3'UTR в регуляции трансляции?

5. Как РНК-связывающие белки участвуют в контроле индивидуального развития?

ЛИТЕРАТУРА

Воронина А. С. Трансляционная регуляция в раннем развитии // Успехи биологической химии.

2002. № 42. С. 139-160.

Спирин А. С., Величина Н.В., Айтхожин М.А. Информационные РНК в раннем эмбриогенезе
// Журнал общей биологии, 1964. Т. 25. С. 321-338.

Abouward R., Schiavo G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and
localization in neurons and beyond // Cell Mol. Life Sci. 2021. Vol. 78. P. 2665-2681.

Barnard D. C„ CaoQ., Richter J. D. Differential phosphorylation controls Maskin association with
eukaryotic translation initiation factor 4E and localization on the mitotic apparatus // Mol. Cell
Biol. 2005. Vol. 25 (17). P. 7605-7615.

Forrest K.M., GavisE.R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment
mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila 11 Curr. Biol. 2003. Vol. 13 (14). P. 1159-
1168.

Gowravaram M., Schwarz J., KhiljiS.K., Urlaub H., Chakrabartis. Insights into the assembly and
architecture of a Staufen mediated mRNA decay (SMD)-competent mRNP // Nat Commun. 2019.
Vol. 10(1). P. 5054.

Huang Y.S., Mendez R., Fernandez M., Richter J. D. CPEB and translational control by cytoplasmic
polyadenylation: impact on synaptic plasticity, learning, and memory // Mol. Psychiatry. 2023.
Vol. 28. P. 2728-2736.

Kloc M„ Zearfoss N. R., EtkmL.D. Mechanisms of subcellular mRNA localization // Cell. 2002.
Vol. 108 (4). P. 533-544.

Liu D., Brockman J. M., Dass B., Hutchins L. N., Singh P„ McCarrey J. R . MacDonald С. C„ Graber }. H.
Systematic variation in mRNA З'-processing signals during mouse spermatogenesis // Nucleic
Acids Res. 2007. Vol. 35. P. 234-246.
Mendez К., Richter J. Г>. Translational control by СРЕВ: a means to the end // Mol. Cell Biol. 2001.
Vol. 2. P. 521-529.

de MoorC.H., Richter J. D. Cytoplasmic polyadenylation elements mediate masking and unmasking
of cyclin Bl mRNA // EMBO J. 1999. Vol. 18 (8). P. 2294-2303.

Resale G., MignoneF,, GissiC,, Grillo G., Licciulli F., LiuniS. Structural and functional features of
eukaryotic mRNA untranslated regions // Gene. 2001. Vol. 276. P. 73-81.

Takada Y., Fierro L., Sato K., Sanada T., Ishii .4., Yamamoto T., Kotani T. Mature mRNA processing
that deletes 3' end sequences directs translation»! activation and embryonic development // Sci
Adv. 2023. Vol. 9 (47). P. eadg6532.

Van de Bor V., Davis I. inRNA localization gets more complex // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. Vol. 16.
P. 300-307.

Xiang K., Bartel D.P. The molecular basis of coupling between poly(A)-tail length and translational
efficiency // eLife. 2021. Vol. 10. P. e66493.

Xiang K., LyJ., Bartel D. P. Control of poly(A)-tail length and translation in vertebrate oocytes and early
embryos // Develop. Cell. 2024. Vol. 59 (8). P. 1058-1074.
НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК В РАЗВИТИИ

Исследования с использованием высокочувствительных методов сек-
венирования РНК показали, что транскриптомы оказались чрезвычай-
но разнообразными. Среди множества транскриптов, обнаруживаемых
в клетке, присутствуют как альтернативные продукты белок-кодирующих,
так и продукты некодирующих белки последовательностей [Mazin et al.,
2021; Poliseno et al., 20241. Оказалось, что у человека более 90 % транс-
криптов не кодируют белок. Такие транскрипты получили название неко-
дирующих РНК (нкРНК). Источником многих нкРНК являются интроны,
межгенные участки генома, антисмысловые последовательности белок-
кодирующих генов. В целом нкРНК подразделяю! на две группы: струк-
турные и регуляторные. К структурным относят транспортные — тРНК,
рибосомные — рРНК, малые ядерные РНК (компоненты сплайсосомы) —
мяРНК (snRNAs — small nuclear/spliceosomal RNAs) и малые ядрышковые
(snoRNAs — small nucleolar RNAs).

Регуляторные некодирующие РНК можно разделить на два класса.

Первый класс. Длина нкРНК меньше 100 н. Это: микроРНК (microRNAs),
миРНК — малые интерферирующие (siRNA — small interfering RNAs), пиРНК
(piwi-interacting RNAs).

Второй класс. Это длинные нкРНК (IncRNAs — long noncoding RNAs) —
более 100 н. Половина из всех IncRNAs обнаружена в разных районах мозга,
причем некоторые имеют определенную субклеточную локализацию. Значи-
тельное число нкРНК появляется на определенной стадии развития и в опре-
деленных клетках, имея неслучайную локализацию в клетке. В ряде случаев
дисбаланс нкРНК может вызвать различные заболевания.

Впервые регуляция экспрессии генов в развитии с участием микроРНК
была показана у нематоды С. elegans, пост эмбриональное развитие которой
до появления взрослой особи включает четыре личиночные стадии. Пере-
ход от одной личиночной стадии к другой сопровождается изменением
набора работающих генов-переключателей. Особенность этих генов —
они работают на одной стадии развития и не работают — на другой.
Мутации генов-переключателей называются гетерохронными, они приво-
дят к нарушениям клеточных родословных, а также могут приводить к
значительным изменениям в фенотипе организма и играть важную роль
в эволюции.
микроРНК в регуляции экспрессии

генов-переключателей программы развития у С. elegans

У нематоды детерминирована не только судьба каждой клетки, но и вре-
менной период ее деления. Существует генетический контроль того момента,
когда клетка приступит к делению и сколько делений она совершит. Гены,
гетерохронные мутации которых нарушают временные параметры клеточ-
ных делений, относятся к генам-переключателям. Мутации таких генов могут
быть двух типов — рецессивными (loss-of-function) и доминантными (gain-
of-function). Они оказывают противоположное действие, когда в развитии
клетка приступит к делению: раньше того момента, который характерен для
нормального развития или, наоборот, позже.

Эти гены получили название lin (linage). Например, рецессивная (loss-of-
function) мутация гена Нп-14 вызывает появление определенных клеточных
линий гораздо раньше в развитии, чем это происходит в норме. А доми-
нантная мутация (gain-of-function), представляющая собой делецию 3'UTR,
приводит к тому, что у носителей этой мутации клеточные линии, которые
возникают на раннем этапе развития, продолжают появляться и позднее.
Ген lin-14 контролирует переход от первой личиночной стадии ко второй
(рис. 8.1). Регуляция экспрессии гена Нп-14 зависит от гена lin-4, который
не кодирует белок. Делеция гена Ип-4 имеет такой же фенотип, что и му-
тации gain-of-function гена Нп-14. Транскрипт гена Нп-4 — это микроРНК

Гены-мишени,
специфичные для

1т-14

R ысокий
уровень
экспрессии

Нп-28

Низкий уровень
экспрессии

lin-14

Нп-28

Нет экспрессии

Рис. 8.1. Рефляция экспрессии генов Нп-14 и Нп-28 с участием миРНК Нп-4
(малой некодирующей РНК) при переходе от одной личиночной стадии к другой
(Ll, L2,1.3) у С. elegans [Moss et al., 1997]
размером в 22 п. (рис. 8.2, а). Эта микроРНК частично комплементарна каж-
дой из семи повторяющихся последовательностей в 3'-некодирующем районе
мРНК Ип-14 (рис. 8.2, б). Активация работы гена Нп-4 приводит к появлению
микроРНК и их взаимодействию с комплементарными последовательностя-
ми в 3'UTR мРНК Ип-14, что блокирует ее трансляцию. Снижение концентра-
ции белка LIN-14 за счет блока трансляции мРНК Ип-14 и деградации белка
LIN-14 вызывает переход от личиночной стадии L1 к L2.

Следующий ген-переключатель, Нп-28, производит мРНК, в 3'UTR ко-
торой находятся сайты взаимодействия с микроРНК, также производимой
геном Нп-4. Взаимодействие соответствующих микроРНК с 3'UTR мРНК
Нп-28 приводит к репрессии трансляции мРНК Нп-28. Это обеспечивает пере-
ход к следующей личиночной стадии — 1.3 (см. рис. 8.1).

И наконец, еще один ген-переключатель — Ип-41. Трансляция мРНК
Нп-41 подавляется взаимодействием 3'UTR этой мРНК с микроРНК, которая
является продуктом гена let-7. Ген let-7 активируется в отсутствии LIN-28. Это
разрешает переход к следующей личиночной стадии — L4, во время которой
активируется ген Нп-29, запускающий программу развития взрослой особи.

пре-мРНК//л-4

микроРНК Нп-4

O3GICOD

Рис. 8.2. Происхождение микроРНК Нп-4 (д) и ее взаимодействие с семью вырожденными
повторами в 3'UTR мРНК Нп-14 (6) [Ghosh, 2011 ]
Регуляция экспрессии генов с участием микроРНК

Более трети генов человека находятся под регуляторным контролем со сто-
роны микроРНК. Многие микроРНК эволюционно консервативны. Гены-ми-
шени, попадающие под регуляцию нкРНК, часто находятся в непосредственной
близости от района, который транскрибируется с образованием нкРНК, или
с ним перекрываются. Одни микроРНК считываются с последовательностей,
располагающихся в межгенных районах, другие — в интронах кодирующих
генов. микроРНК, которые происходят из интронов белок-кодирующих генов,
свидетельствуют о том, что они транскрибируются РНК-полимеразой II.

Основная функция микроРНК — подавление экспрессии генов на уровне
трансляции либо путем временного запрета трансляции, либо за счет дегра-
дации соответствующей мРНК. Репрессия мРНК-мишеней происходит за счет
взаимодействия с последовательностями микроРНК по правилу комплемента-
ции. Сайты узнавания, как правило, располагаются в 3'UTR мРНК-мишеней.
Это предопределяет судьбу соответствующей мРНК в клетке. К местам взаимо-
действия привлекаются белки семейства Argonaute (Ago), что приводит к фор-
мированию РНП-комплекса — RISC (RNA Induced Silencing Complex). Выбор
между двумя последствиями в судьбе мРНК-мишени определяется уровнем
комплементарное™ при взаимодействии с микроРНК. При полной компле-
ментарное™ формируется комплекс, приводящий к деградации мРНК. Если
комплеменгарность неполная, комплекс сохраняет мРНК в состоянии, времен-
но недоступном для трансляции. При сохранении мРНК в нетранслируемом
состоянии к этому комплексу может присоединяться белок GW182. Это соз-
дает дополнительные возможности для регуляции экспрессии генов на уровне
трансляции, в том числе и за счет привлечения деаденилазы, активность кото-
рой приводит к укорочению поли(А)-последовательности на З'-конце мРНК.

Особенно важными регуляторами экспрессии генов на уровне трансляции
микроРНК являются в нервной системе позвоночных. В качестве примера
можно привести miR-134, которая негативно регулирует размеры дендритных
шипиков в нейронах гиппокампа. Она подавляет трансляцию мРНК Limkl
(Lim kinase 1), контролирующую актиновый цитоскелет в дендритных шипиках.

Биогенез микроРНК

Исходно микроРНК находятся в составе более протяженного по длине
транскрипта, называемого первичной микроРНК, — при-микроРНК (pri-
microRNA — primary microRNA). Около трети микроРНК являются частью
последовательностей, локализованных в интронах. В ядре вторичную струк-
туру типа стебель-петля, которую образует при-микроРНК, узнает комплекс
РНКазы III — Drosha и ее партнера — DGCR8 (DiGeorge syndrome critical
region gene 8), который взаимодействует с двунитевой РНК. У беспозвоночных
ортологом DGCR8 является Pasha. Комплекс белков, участвующий в созрева-
нии при-микроРНК, называется микропроцессором. Длинный транскрипт
расщепляется с образованием предшественника микроРНК — пре-микроРНК
(pre-microRNA — precursor microRNA). пре-микроРНК длиной 55-70 н. — это
шпилька. У дрозофилы пре-микроРНК обычно в 2 раза длиннее, чем у позво-
ночных. На З'-конце пре-микроРНК после расщепления первичной микроРНК
остается 2 н., которые находятся вне шпильки. В таком виде пре-микроРНК
транспортируется из ядра в цитоплазму с участием экспортина-5. В цитоплаз-
ме пре-микроРНК еще раз подвергается расщеплению с участием белка Dicer
и его партнера TRBP (TAR RNA-binding protein), которые взаимодействуют
с двунитевой РНК. У дрозофилы функции TRBP выполняет Loquacious. В ре-
зультате расщепления пре-микроРНК образуется несовершенный дуплекс с од-
нонитевыми З’-концами. Одна из нитей дуплекса связана с белком Ago и фор-
мирует функциональный комплекс RISC. Участок микроРНК со второго ну-
клеотида по девятый называется зерном — seed. Этот участок отвечает за связь
микроРНК с мРНК-мишенями. Взаимодействие может быть не полностью
комплементарным. У .микроРНК может быть несколько сайтов связывания,
присутствующих в одной и той же мРНК. А мишенями для взаимодействия с
одной микроРНК могут служить разные мРНК.

Вырезаемые при сплайсинге ин гроны иногда способны формировать
шпильки, по размеру и структуре похожие на пре-микроРНК. Такие интро-
ны — источники микроРНК — были названы мир тронами. Впервые миртро-
ны были идентифицированы у дрожжей и нематоды. Последовательность,
соответствующая микроРНК, в миртронах, как правило, находится на ин-
трон-экзонной границе. Характерной особенностью миртронов является
способность формировать шпильку с однонитевым З'-концом. Миртроны
похожи на пре-микроРНК, но в своем биогенезе не требуют участия Drosha,
поскольку образуются в результате сплайсинга. При попадании в цитоплазму
миртроны претерпевают расщепление с участием нуклеазы Dicer.

микроРНК могут участвовать в регуляции экспрессии генов на посттран-
скрипционном и транскрипционном уровнях. На транскрипционном уров-
не микроРНК взаимодействуют с соответствующими сайтами-мишенями
в ДНК. Такая связь формирует комплекс RITS (RNA-induced Transcriptional
Silencing), привлекающий метилтрансферазу гистонов и ДНК-метилазу.

Таким образом, микроРНК являются мощным инструментом переключе-
ния программ развития как на посттранскрипционном, так и транскрипци-
онном уровнях.

Экспрессия самих генов микроРНК также может регулироваться на несколь-
ких уровнях. На транскрипционном уровне она может изменяться вместе (вну-
тривенные микроРНК) или независимо (межгенные микроРНК) от их генов-хо-
зяев. Межгенные микроРНК имеют свои собственные промоторы, экспрессиру-
ются независимо и могут регулироваться отдельными факторами транскрипции.
На посттранскрипционном уровне экспрессия микроРНК может подавляться
из-за изменений активности ключевых ферментов их биогенеза, таких как Dicer и
Drosha. Кроме того, новый класс нкРНК — кольцевые РНК (circRNAs) могут дей-
ствовать как «губки» микроРНК, влияя на регуляцию экспрессии целевых генов.

Биогенез пиРНК

пиРНК (piRNA) — класс нкРНК, имеющих особое значение для генератив-
ных клеток. Их длина 23- 30 н„ т. е. они немного больше микроРНК. У млеко-
питающих число разных пиРНК превышает 50000. Нуклеотидные последова-
тельности пиРНК неконсервативны даже у близких видов. Изначально пиРНК
обнаружили в половых клетках дрозофилы и мыши, но затем их присутствие
выявили в клетках нервной системы мыши и аплизии, а также в фолликуляр-
ных клетках яйцевых камер у дрозофилы. пиРНК есть и в плюрипотентных
стволовых клетках у разных животных. В соматических клетках пиРНК не столь
многочисленны, как в половых, поэтому их функции изучены в меньшей сте-
пени. Полагают, что они участвуют в регуляции экспрессии генов, привлекая
факторы, модифицирующие хроматин, к соответствующим участкам генома.

В генеративных клетках функция пиРНК связана с подавлением активности
транспозонов. Участки хромосом, содержащие транспозоны, у млекопитаю-
щих в значительной степени подвержены метилированию ДНК, что делает
их неактивными. В гаметогенезе у млекопитающих есть такая стадия, когда
происходит полное деметилирование генома. Утрачивая эпигенетические мар-
керы сайленсинга, мобильные элементы становятся активными и способны
перемещаться по геному, нарушая его структуру. Такие перестройки генома
не узнаются системами репарации, потому что никакого повреждения ДНК
нет: транспозон просто встраивается в новое место. Чтобы избежать пере-
строек генома при формировании половых клеток, как у самцов, так и у самок,
необходимо подавить активность мобильных элементов генома. Репрессор-
ную функцию выполняют малые РНК, взаимодействующие с белками PIW1
(P-element induced wimpy testis), поэтому их называют пиРНК (piRNA — P1WI-
interacting RNA). У большинства позвоночных и беспозвоночных животных
пиРНК синтезируются в клетках зачатковой линии, где функция пиРНК — по-
давление экспрессии транспозонов, что защищает геном от нестабильности.
В эмбриогенезе дрозофилы пиРНК регулируют экспрессию генов материнского
эффекта и защищают теломеры, которые обогащены транспозонами.

У дрозофилы кластеры пиРНК располагаются в прицентромерных и суб-
теломерных районах хромосом, составляя 3,5 % генома, а у мыши — в эухро-
матиновых районах. Каждый кластер может содержать от десяти до несколь-
ких тысяч копий пиРНК. Транскрипция пиРНК в одних кластерах может
осуществляться с одной нити ДНК.

Такие кластеры называются однонаправленными. Но может происходить
и в разных направлениях — при использовании обеих цепей ДНК в качестве
Рис. 8.3. Биогенез пиРНК. А. Первичный процессинг путем разрезания предшественника
пиРНК эндонуклеазой Zucchini (ZUC). Б. Механизм «пинг-понга» при амплификации пиРНК
с участием белков семейства Argonaute: AUB и AGO3. Процессинг 5'-конца РНК происходит
с участием эндонуклеазы (вертикальная стрелка), которая наносит разрыв перед уридином

матрицы. Такие кластеры называются двунаправленными. пиРНК много-
численны и в дендритных шипиках, а нокдаун пиРНК уменьшает плотность
шипиков в аксонах.

В соматических клетках дрозофилы синтезируется длинный транскрипт,
соответствующий кластеру пиРНК. Этот транскрипт переносится в тельца
Yb, которые часто взаимодействуют с митохондриями. Пам эндонуклеаза
Zucchini (ZUC) разрезает предшественник пиРНК на короткие фрагменты
(рис. 8.3, а), антисмысловые по отношению к мобильным элементам. Этот
механизм называется первичным процессингом. После созревания пиРНК
формируют комплекс PIWI-piRITS, который связывается с ДНК и подавляет
транскрипцию транспозонов.

Комплементарные последовательности образуют частично двунитевые
участки, с которыми взаимодействуют Aub и Ago3. Они перекрываются сво-
ими 5'-концами участком в 10 н. Этот факт является определяющим в меха-
низме, лежащем в основе амплификации пиРНК, который получил название
механизм «пинг-понга» (рис. 8.3, б).

Белки, взаимодействующие с пиРНК, принадлежа) семейству Argonaute.
У дрозофилы в состав семейства Argonaute, кроме белка Piwi, входят белки
Aubergine (Aub) и Argonaute 3 (Ago3). Эти белки обладают эндонуклеазной
активностью за счет домена P1WI, нанося однонитевой разрыв при форми-
ровании 5'-конца. Благодаря этому на 5'-конце пиРНК первым нуклеотидом
Рис. 8.4. Хроматоидные тельца в генеративных клетках мыши (я) и дрозофилы {б)
(указаны стрелками). У мыши они соседствуют с ядрами округлых сперматид (я)
[Kotaja et al., 2006], а у дрозофилы — с ядрами сперматоцитов (о) [Kibanov et al., 2011]

в 80-90 % случаев является уридин и фосфатная группа. Биогенез пиРНК,
в отличие от биогенеза других малых нкРНК, в цитоплазме не зависит от Dicer.

У дрозофилы пиРНК обнаруживаются в составе герминальных (поляр-
ных) I ранул наряду с белками Aubergine и Argonaute 3. Распределение белков
семейства Argonaute в яйцевых камерах у дрозофилы имеет особенность:
белок Piwi присутствует в ядрах питающих и фолликулярных клеток, а белки
Aub и Ago3 — в цитоплазме. Белки Ago3 взаимодействуют с последователь-
ностями, соответствующими сенс-последовательностям транспозонов, a Piwi
и Aub — с антисенс-последовательностями.

При образовании пиРНК используются два механизма: первичный и бо-
лее сложный путь — «пинг-понг» (рис. 8.3).

У дрозофилы известны оба механизма, и большинство пиРНК транскри-
бируются с обеих цепей ДНК. У мыши на стадии пахитены пиРНК считыва-
ются только с одной нити ДНК. Причем 20 % таких пиРНК располагаются
в районах белок-кодирующих генов.

У млекопитающих превращение предшественника пиРНК в зрелые моле-
кулы происходит в расположенных по соседству с ядром хроматоидных телах,
называемых nuage (рис. 8.4, а). У дрозофилы эти структуры получили название
тельца piNG (piRNA Nuage Giant) (рис. 8.4, б). Хроматоидные тела можно увидеть
в световом и электронном микроскопе. Эта органелла имеет фибриллярную
структуру и не окружена мембраной. У дрозофилы в составе хроматоидных
телец, помимо пиРНК, находится белок Vasa, который является маркером клеток
зачаткового пути, а также трансляционный репрессор Bruno, РНК-связывающий
белок Tudor и и белки Aub и Ago3, участвующие в метаболизме пиРНК.

У млекопитающих хроматоидные тельца содержат белки из семейства
Argonaute, участвующие в биогенезе пиРНК, у мыши — это белки MILI
и MIWI. В состав хроматоидных телец входят также белки Vasa, Spindle-E
(TDRD-9 — у мыши), Krimper, Maelstrom и др. Геликаза Vasa — многофунк-
циональный белок, который способствует конденсации хромосом путем
привлечения комплекса конденсин 1 к хромосомам. Компонентами комплекса
конденсин 1 являются САР-Н (известный у дрозофилы как Barren) и CAP-D2.
Комплекс конденсин 1 вовлечен не только в конденсацию, но и в расхож-
дение хромосом во время деления. У дрозофилы геликаза Vasa участвует
во множестве процессов, включая дифференциацию герминальных стволо-
вых клеток, подавление активности транспозонов с участием пиРНК, сборку
полярной плазмы и пролиферацию генеративных клеток. У мыши гомолог
белка Vasa обеспечивает замолкание транспозонов и регулирует пролифера-
цию генеративных клеток.

У мыши в сперматогенезе белки, взаимодействующие с пиРНК, на-
зываются MIWI, MILI и MIWI2. Белки MIWI и MILI функционируют
в цитоплазме, a MIWI2 — в ядре. У мышей с нулевыми аллелями генов
МШ и Miwi2 блокируется мейоз, а у гомозигот по нулевому аллелю Miwi
нарушается спермиогенез. Соответствующие белки у человека — это
HIW1 (или PIWIL1), HILI (или PIWIL2), HIWI2 (или PIWIL4) и HIWI3
(или PIWIL3). Мутации в любом из генов, кодирующих эти белки, при-
водят к мужской стерильности.

Последовательности пиРНК похожи на последовательности транспозо-
нов. После выхода из ядра предшественник пиРНК обрезается с З'-конца.
З'-конец метилируется, что делает пиРНК стабильными. В сперматогенезе
мыши образуется два типа пиРНК: препахитенные и пахитенные. Препахи-
тенные пиРНК составляют лишь 5 % от всех пиРНК. Их можно обнаружить
в сперматогониях еще до рождения мыши, они взаимодействуют с белками
MIWI2 и MILL С белком MIL1 связаны смысловые пиРНК, которые имеют
ту же ориентацию, что и соответствующий мобильный элемент, а с MIWI2 —
антисмысловые пиРНК, комплементарные фрагменту мобильного элемента.
Антисмысловые пиРНК инициируют путь амплификации пиРНК по меха-
низму «пинг-понга» (рис. 8.3, б).

В питающих клетках дрозофилы в образовании пиРНК задействованы
двунаправленные кластеры. В этом случае в биогенезе пиРНК участвуют все
три белка — Piwi, Aub и Ago3, а амплификация пиРНК происходит по меха-
низму «пинг-понга». Предшественники пиРНК считываются с обеих нитей
ДНК в кластере. Подвергаясь первичному процессингу, пиРНК взаимодей-
ствуют с белками PIWI и AUB. В 80 % случаев эти пиРНК комплементарны
мобильным генетическим элементам дрозофилы. В этом случае их называют
антисмысловыми пиРНК. Чаще всего это пиРНК с уридином на 5'-конце.

пиРНК, которые взаимодействуют с AUB, могут участвовать в дальнейшем
процессе их амплификации по механизму «пинг-понга». Антисмысловые
пиРНК в составе комплекса ALTB — piRTSC связаны по правилу комплемен-
тарности с транскриптом соответствующего мобильного элемента или длин-
ным транскриптом кластера пиРНК, образуя частичный дуплекс. Белок AUB,
обладающий эндонуклеазной активностью, разрезает транскрипт мобиль-
ного генетического элемента между 10 и 11 н. от начала комплементарного
взаимодействия пиРНК с транскриптом-предшественником (см. рис. 8.3. б).
В результате получается вторичная пиРНК, которая взаимодействует с AGO3
и подвергается процессингу 3'-конца и его метилированию с участием ме-
тилтрансферазы Henl. Это приводит к формированию комплекса AGO3 —
piRISC со смысловой пиРНК, имеющей аденин в положении 10. Транскрипт,
защищенный Aub, обрезается с З'-конца и метилируется. Так появляется
антисенс-пиРНК, способная к комплементарному взаимодействию с пред-
шественниками пиРНК или транскриптами мобильных элементов (МЭ),
и вовлекается в процесс формирования сенс-пиРНК.

Репрессия транспозонов с участием пиРНК происходит с использовани-
ем двух механизмов: на уровне транскрипции (TGS — Transcriptional Gene
Silencing) и на посттранскрипционном уровне (PTGS — Post-Transcriptional
Gene Silencing). Подавление активности транспозонов на уровне транскрип-
ции начинается с привлечения модификаторов структуры хроматина. Ре-
прессия транспозонов на посттранскрипционном уровне сопровождается
амплификацией пиРНК, участвующих в сайленсинге. Такой механизм при-
водит не только к увеличению числа пиРНК, но и к репрессии транскриптов
мобильных генетических элементов.

В отсутствии белков Piwi в районе регуляторных последовательностей
мобильных элементов идентифицируется РНК-полимераза Pol II. А на тех
участках хромосом, где располагаются МЭ, уменьшается количество меток
неактивного хроматина — НЗК9теЗ. В результате повышается уровень экс-
прессии МЭ. Комплексы, содержащие зрелые пиРНК и белок Piwi, в ядре уча-
ствуют в транскрипционной репрессии МЭ путем инактивации хроматина,
привлекая белковые комплексы, обеспечивающие модификацию гистонов
и метилирование ДНК.

Длинные некодирующие РНК

После секвенирования генома, в ходе проекта FANTOM, на него наложи-
ли данные модификаций гистонов, которые получили путем CHiP-seq. Кар-
тина оказалась следующей: НЗК4теЗ (метка промоторов активных генов)
и НЗКЗбтеЗ (метка участков ДНК, транскрибируемых РНК-полимеразой II)
присутствовали в геноме там, где не было аннотированных открытых рамок
считывания (ORFs) (рис. 8.5). Метод RNA-seq также показывал, что этим рай-
онам соответствуют транскрипты, претерпевающие сплайсинг. Комбинация
этих двух методов (CHiP-seq и RNA-seq) позволила убедительно доказать су-
ществование длинных транскриптов, не кодирующих белок. Это особый класс
нкРНК (длинные некодирующие РНК — длнкРНК) размером от сотни до де-
сятка тысяч нуклеотидов. Интересно, что в геноме последовательности, произ-
водящие длнкРНК (IncRNAs — long noncoding RNAs), часто располагаются ря-
дом с генами, в регуляции которых они принимают участие. Транскрибируются
Экзон-ингронная структура I--------*4—*-----

Рис. 8.5. Ген, соответствующий дликРНК с экзон-интронной структурой, НЗК4теЗ
и НЗКЗбтеЗ — метки активного хроматина

длинные нкРНК с помощью РНК-полимеразы II. При созревании такие транс-
крипты претерпевают те же процессы, что и мРНК, кодирующие белок, т. е.
копирование, полиаденилирование и сплайсинг, но экспрессия генов для длин-
ных нкРНК более тканеспецифична. Гены, транскрибируемые с появлением
IncRNAs, имеют меньшие размеры и содержат меньше экзонов.

Примерами длнкРНК являются Xist, HOTAIR, Н19, MALAT1.

Приведем классификацию длинных нкРНК в зависимости от положения
по отношению к соседним генам:

1) используют один и тот же промотор, но считывание мРНК происходит
с одной нити ДНК, а нкРНК — с нити антисенс в противоположном направ-
лении;

2) для считывания мРНК и нкРНК используются разные промоторы;

3) гены для синтеза нкРНК располагаются в межгенном пространстве;

4) перекрываются в локализации с последовательностью, соответствую-
щей мРНК, и могут считываться как с одной и той же нити ДНК, так и с про-
тивоположных;

5) могут служить в качестве разнонаправленных и однонаправленных
энхансеров;

6) транскрибируются в составе интронов других генов;

7) могут служить источником микроРНК или пиРНК.

Длинные нкРНК часто образуют сложную вторичную структуру, элементы
которой могут иметь функциональное значение и называются структурными
доменами. Каждый из доменов отвечает за взаимодействие с определенным
фактором, и эти домены в длинных нкРНК мо>ут выполнять разные функ-
ции: привлекать другие РНК по правилу комплементарности оснований;
служить скэффолдом для множества РНК-связывающих белков; вызывать
альтернативный сплайсинг за счет комплементарного взаимодействия; при-
влекать белки, модифицирующие структуру хроматина.
Важно отметить, что конформация длинной нкРНК с образованием вто-
ричной структуры может меняться при изменении сайтов комплементарных
взаимодействий. Это увеличивает разнообразие функциональных доменов.

Некоторые IncRNAs могут в результате сплайсинга формировать кольце-
вые структуры. Такие некодирующие РНК получили название circular RNAs
(circRNAs).

В 2012 г. была идентифицирована еще одна группа некодирующих РНК —
внеклеточные (encRNA — extracellular ncRNAs). Их можно обнаружить в со-
ставе экзосом, способных мигрировать во внеклеточное пространство. Ин-
терес к этому типу РНК определяется тем, что они могут служить биомарке-
рами при онкологических и других заболеваниях человека.

Антисмысловые транскрипты

Считывание антисмысловых транскриптов (Natural antisense transcripts —
NATs) происходит, как правило, в противоположном (антисенс) направлении
по отношению к направлению транскрипции генов, кодирующих белки. Чаще
всего последовательности NATs соответствуют началу или концу гена и ком-
плементарны 5'- или 3'-концу мРНК. 5-29 % транскриптов могут образовывать
пары сенс — антисепс. Анализ транскриптомов показал, что 797 таких анти-
смысловых транскриптов являются консервативными для мыши и человека.

Исследования, позволяющие определять связь между белками, взаимодей-
ствующими с хроматином и РНК (RNA-ChiP analysis), показали, что NATs
присутствуют во фракции, содержащей триметилированпый гистон НЗК4теЗ
и белок млекопитающих MLL — гомолог Trithorax дрозофилы, который уча-
ствует в триметилировании гистона НЗ по К4. Это свидетельствует о регуля-
торной роли транскриптов NATs и на уровне транскрипции [Dinger et al., 2008].

Энхансерные и премоторные нкРНК

Особую группу составляют некодирующие РНК, называемые энхансер-
ными РНК (эРНК) (enhancer RNAs — eRNAs). Эти РНК более короткие, чем
другие IncPHK. Их размер менее 2 г. н., и они, как правило, не полиаденили-
рованы. В большинстве случаев эРНК синтезируются в обоих направлени-
ях — от центра энхансерного домена в ДНК. Локализуются эРНК преиму-
щественно в ядре. В районе энхансеров присутствуют гистоны H3K4mel,
НЗК27ас и НЗК79те2, концентрация РНК-полимеразы II повышена. Это
свидетельствует о том, что присутствие эРНК способствует модификации
хроматина, делая его доступным для РНК-полимеразы II. Существует связь
между уровнем экспрессии последовательностей, отвечающих за синтез
эРНК, и расположенных рядом генов, кодирующих мРНК.
Если нкРНК образуются в результате транскрипции промоторной области
гена, кодирующего белок, их присутствие в клетке может влиять на связь ТФ
с промотором и, соответственно, изменять характер экспрессии гена, кодиру-
ющего белок. Благодаря способности взаимодействовать как с нуклеиновыми
кислотами, так и с белками, нкРНК направляют белки Polycomb-group (PcG)
и Trithorax-group (TrG) к соответствующим сайтам генома, участвуя в ремо-
делировании структуры хроматина. Взаимодействуя с ДНК, они формируют
тройственную структуру (триплексы) ДНК — ДНК — РНК, которая подавляет
активность промотора, репрессируя прохождение РНК-полимеразы И. нкРНК
могут быть антисмысловыми последовательностями для последовательностей,
кодирующих мРНК, и использовать механизм комплементарного взаимодей-
ствия нуклеотидов при идентификации мишеней, регулируя экспрессию генов.

Нсевдогены

Источником длинных нкРНК могут быть псевдогены. Псевдогены — это
реликтовые копии работающих генов, которые появляются в геноме в резуль-
тате транспозиции. В процессе мутаций псевдогены утрачивают белок-коди-
рующие свойства. От 2 до 20 % псевдогенов транскрибируются, производя
нкРНК. Последние могут участвовать в регуляции генов, от которых они
произошли. Транскрипты этих генов часто являются маркерами заболеваний
человека.

Длинные нкРНК в мозге

В мозге много разных длинных нкРНК. Например, в мозге взрослой мыши
идентифицировано более 800 различных длнкРНК, причем распределены они
не случайно: присутствуют в определенных районах мозга и типах клеток,
и даже в субклеточных структурах. Анализ 659 эволюционно консервативных
IncRNAs из межгенных районов показал, что они преимущественно локали-
зуются рядом с белок-кодирующими генами. В зависимости от того, являют-
ся ли клетки плюрипотентными или дифференцированными, относятся ли
они к нейронам или глиальным клеткам, уровень содержания IncRNAs меня-
ется, предполагая, что IncRNAs влияют на спецификацию клеточной судьбы.
Поскольку IncRNAs преимущественно локализуются в ядре и многие из них
обогащают фракцию хроматина, полагают, что их назначение состоит в при-
влечении комплексов, ремоделирующих хроматин, например PRC2. Репрес-
сирующий комплекс Polycomb repressive complex 2 (PRC2) принимает участие
в ди- и триметилировании лизина в гистоне НЗ (H3K27me2/3) и с участием
энзиматических субъединиц EZH1 и EZH2 обеспечивает замолкание работы
генов.
Большинство IncRNA присутствуют в ядре и выявляются во фракции хро-
матина, но есть и такие, которые обнаруживаются в цитоплазме. С участием
IncRNA происходит геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы
у млекопитающих.

Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих

Согласно гипотезе Лайон [Lyon, 1961], у особей женского пола, имеющих
две Х-хромосомы, активной является только одна Х-хромосома, а вторая —
инактивируется. В этом заключается механизм дозовой компенсации у мле-
копитающих, уравнивающий особей женского иола с двумя Х-хромосомами
и особей мужского пола — XY, имеющих только одну Х-хромосому. В фазе
инициации этого процесса определяется, что активной должна остаться
только одна Х-хромосома из хромосомного набора. Какая из Х-хромосом
станет активной, определить сложно: это случайный процесс. Принятое ре-
шение наследуется в клеточных поколениях. Инактивация дополнительных
Х-хромосом происходит в раннем эмбриогенезе на 12-20-й день развития.

В Х-хромосоме находится участок, называемый центром инактивации
Х-хромосомы (XIC — X-inactivation center), размером 100-500 т. п. н. Этот
центр отвечает за определение числа Х-хромосом в диплоидном наборе
хромосом, выбор единственной Х-хромосомы, которая останется активной
(Ха), и инактивацию остальных Х-хромосом — Xi. Центр инактивации со-
держит локус Xist, транскрипция которого может происходить с обеих ни-
тей ДНК: считывание с одной нити дает транскрипт Xist (X-Inactive-Specific
Transcript), а с другой — Tsix. Инактивации предшествует процесс сближе-
ния Х-хромосом. В ходе сближения определяется, какая из хромосом будет
оставаться активной (Ха). Возможно, этот процесс увеличивает локальную
концентрацию транскрипционных факторов, необходимых для регуляции
экспрессии генов в районах Xie.

На цитологической карте Xie локализуется в районе Xql3. Для сближения
Х-хромосом необходим участок Х-хромосомы — Xpr (X pairing region). Сле-
дующим этапом является выбор, какая из Х-хромосом будет активной, — Ха,
а какая — подвергнется инактивации — Xi. Результатом такого выбора яв-
ляется то, что локус Xist активно транскрибируется в той хромосоме, кото-
рая будет инактивирована, и взаимодействует с той Х-хромосомой, которая
предоставляет матрицу для ее синтеза. РНК Xist размером 19 т. н. (у челове-
ка) и 17 т. н. (у мыши) содержит 6-7 экзонов, соответственно, подвергается
сплайсингу, не выходит из ядра и не транслируется. В составе РНК Xist на-
ходится семь типов повторов (А — F) (рис. 8.6, а). На 5'-конце РНК Xist рас-
полагаются тандемные повторы, называемые A-повторами (рис. 8.6, 6), с ко-
торыми взаимодействуют РНК-связывающий белок SPEN и другие факторы,
в том числе комплекс белков PRC2.
Белки PcG взаимодействуют с более чем 1000 генов человека, подавляя
их экспрессию. Белки этого комплекса привлекаются к соответствующим
генам-мишеням некодирующими РНК. Гистоновая метилтрансфераза Ezh2
(Enhancer of zeste homolog 2), входящая в состав репрессирующего ком-
плекса PRC2, непосредственно взаимодействует с повторами [Zhao et al.,
2008]. Повторы на З'-конце Xist, по-видимому, отвечают за определение числа
X-хромосом и выбор той, которая остается активной, а также играют опре-
деляющую роль в инактивации генов Х-хромосомы. С-повторы отвечают
за связь Xist с хромосомой Xi, т. е. за ее «одевание». А-повторы образуют
структуры типа стебель-петля, которые и взаимодействуют с белком SPEN.
Партнерами SPEN являются деацетилазы гистонов.

Сложная вторичная структура РНК Xist создает условия для взаимо-
действия с различными факторами. Сложный РНП-комплекс обеспечивает
разные способы инактивации Х-хромосомы: исключение РНК-полимеразы,
удаление гистоновых меток, характерных для активного хроматина (аце-
тилированный НЗК9 и метилированный НЗК4), и привлечение модифи-
каторов, вызывающих появление гистонов неактивного хроматина, мети-
лирование ДНК и компактизацию хроматина, перемещение неактивной
Х-хромосомы к клеточной мембране. Неактивная Х-хромосома представ-
лена двумя типами факультативного гетерохроматина. Первый тип — это
Х-хромосома, связанная с гистонами H3K27me3, Н2А1.2 и Н2А, убикви-
тинированным по лизину К119. Второй — это хроматин, обогащенный

б UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGCCCAWCGGGGYNNYGGAUACCUGC

Консенсус повтора А

шпилька 12 н шпилька 10 н

иА С

A G U А
С-G А С
C-G G-C

С- G G U

UUU G"Cu NN....3 С

Рис. 8.6. Повторы в РНК Xist:

а — распределение повторов A-F в РНК Xist мыши и человека. Повторы А локализуются
в районе 5'-конца РНК Xist, протяженность около 1000 н.; б— повторяющийся элемент
в составе А - повторов [Plath et al., 2002]
НЗК9теЗ, Н4К20теЗ и белком НР1. Все эти модификации приводят к тому,
что неактивная Х-хромосома приобретает статус гетерохроматина в кле-
точном цикле. Большинство генов инактивированной Х-хромосомы оста-
ются неактивными в ряду клеточных поколений. Доля генов, избегающих
инактивацию в хромосоме Xi, составляет 15 %. В их число входят гены,
имеющие гомологи, локализованные в Y-хромосоме. Доза таких генов у XX-
и XY-особей одинакова.

У мыши в районе Xie, кроме Xist, находятся и другие гены, отвечающие
за синтез нкРНК, — Tsix, Xite, Епох (Jpx). Некоторые из них важны для регу-
ляции XCI (X-chromosome inactivation). Tsix негативно регулирует экспрес-
сию Xist и транскрибируется в антисмысловой ориентации по отношению
к Xist. Подобно Xist, транскрипт Tsix не имеет ORF и находится только в ядре.
В недифференцированных женских эмбриональных стволовых клетках Xist
и Tsix коэкспрессируются на обеих хромосомах, хотя уровень экспрессии Tsix
в 10-100 раз превышает уровень экспрессии РИК Xist.

В начале дифференциации клеток Tsix экспрессируется асимметрично —
преимущественно на будущей активной хромосоме. Это позволяет Xist распре-
деляться по будущей неактивной хромосоме. Сохранение связи Tsix с будущей
активной хромосомой и обеспечивает ее дальнейшее активное сост ояние. Tsix
действует как бинарный переключатель и затем выключается. Транскрипт Tsix
считывается со своего промотора, расположенного в антисмысловой ориен-
тации по отношению к гену Xist. Транскрипция Tsix подавляет транскрипцию
генаХ/st в той Х-хромосоме, которая остается активной. В этом случае к промо-
тору гена Xisf на Ха привлекается метилтрансфераза За (DNA methyltransferase
За — Dnmt3a), которая осуществляет метилирование цитозина de novo. В этих
районах происходит также и триметилирование лизина в положении 27 в ги-
стоне НЗ (К27теЗ), что вызывает транскрипционную репрессию. Затем под-
ключается еще один комплекс PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), который
поддерживает эту модификацию в ряду клеточных поколений, сохраняя ком-
пактное состояние хроматина. Если Tsix является негативным регулятором Xist,
то другой ген — Jpx — позитивным регулятором.

Х-инактивация обеспечивает дозовую компенсацию генов Х-хромосомы,
которая происходит только у ХХ-особей, причем инактивирована будет толь-
ко одна из двухХ-хромосом, и это состояние будет поддерживаться на протя-
жении всей жизни; Xie у М. musculus включает минимум пять генов, отвечаю-
щих за синтез IncRNRs: Xist, Tsix, Jpx, RepA, Ftx; инактивация осуществляется
путем привлечения хроматин-ремоделирующих комплексов и модификато-
ров гистонов, а также метилирования промоторов генов.

Для обьяснения, как Tsix регулирует ген Xist, предложено несколько ме-
ханизмов:

1) Tsix взаимодействует с транскрипционным фактором для Xist;

2) Tsix взаимодействует с промотором Xist и мешает транскрипционному
фактору для Xist;
3) образование дуплекса Tsix-Xist не позволяет Xist связываться с фак-
торами сайленсинга на Ха, вызывая деградацию Xist, привлекая механизм
интерференции РНК.

Изучение механизмов инактивации Х-хромосом у млекопитающих спо-
собствует пониманию того, как в развитии устанавливается и поддержива-
ется в ряду клеточных поколений определенный статус экспрессии генов.

Регуляция экспрессии генов с участием нкРНК основана на уникальных
возможностях РНК. Это, с одной стороны, комплементарное взаимодействие
с последовательностями как ДНК, так и РНК, что поддерживает высокую
специфичность такого взаимодействия. С другой — обеспечивает привлече-
ние белков, которые узнают определенные нуклеотидные последовательности
или вторичные структуры нкРНК, а также структуры комплексов ДНК-РНК
или РНК-РНК с учетом полного или частичного комплементарного взаи-
модействия. Все это позволяет нкРНК участвовать в регуляции экспрессии
генов на уровне трансляции путем формирования макромолекулярных ком-
плексов, осуществляющих деградацию мРНК или обеспечивающих сохране-
ние мРНК в состоянии, временно недоступном для трансляции. Сложный
состав этих комплексов контролирует их доставку в определенное место
клетки и регуляцию трансляции мРНК, присутствующих в их составе. Уча-
стие нкРНК в регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции чаще
всего происходит за счет адресного привлечения белков, модифицирующих
структуру хроматина, к определенным последовательностям ДНК. Длин-
ные нкРНК привлекают комплексы, модифицирующие структуру хромати-
на, и тем самым участвуют в регуляции экспрессии генов. Функционально
нкРНК связаны с клеточной пролиферацией, нейрогенезом, они обеспечи-
вают плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток. Информация
о нкРНК собрана в базах данных GENCODE, LNCipedia, DIANA-lncBase и др.

Контрольные вопросы

1. Что представляют собой некодирующие РНК?

2. Что такое микроРНК?

3. Как происходит биогенез пиРНК?

4. В чем заключаются функции длинных нкРНК?

5. Каков механизм инактивации Х-хромосомы у млекопитающих?

ЛИТЕРАТУРА

Жарикова А. А„ Миронов A. A. piPHK: биология и биоинформатика // Молекулярная биология.
201b. № 50. С. 80-88.

Миронова Л. Н., Падкина М. В., Самбук Е. В. РНК: синтез и функции. СПб.: Эко-Вектор. 2017.
287 с.
Словников И. А., Калмыкова А. И. piPHK кластеры как основной источник коротких РНК в гер-
минальных тканях животных // Биохимия. 2013. № 78. С. 747-762.

Brosnan С. A., Voinnet G. fhe long and the short of noncoding RNAs // Curr. Opin. Cell Biol. 2009.
Vol. 21. P. 416-425.

Dinger M. E., Amaral P P., Mercer T. R., Pang К. C. et al. Long noncoding RNAs in mouse embryonic
stem cell pluripotency and differentiation // Genome Res. 2008. Vol. 1 (9). P. 1433-1445.

Ghosh S. Micro RNA-biogenesis, mechanism of action and applications — a Review H Internal J. Res.
Biotechn Biochem. 2011. Vol. 1. P. 11-36.

KibanovM.V, Egorova K.S., Ryazansky S.S., Sokolova O. A., Kotov A. A., Olenkina O.M.,
Stolyarenko A. D., Gvozdev VA., Olenina L.V. A novel organelle, the piNG-body, in the nuage of
Drosophila male germ cells is associated with piRNA-mediated gene silencing // Mol. Biol. Cell.
2011. Vol 22. P. 3410-3419.

Kotaja N„ Bhattacharyya S. N., Jaskiewicz L., Kimmins S., Parvinen M. The chromatoid body of male
germ cells: similarity with processing bodies and presence of Dicer and microRNA pathway
components И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. P. 2647-2652.

Lyon M. F. Gene Action in the X-chromosome of the Mouse (Mus musculus L.) // Nature. 1961.
Vol. 190. P. 372- 373.

Mattick). S, The central role of RNA in the genetic programming of complex organisms // An Acad.
Bras. Cienc. 2010. Vol. 82. P. 933- 939.

Mattick J. S., Amaral P.P., Carninci P. et al. Long non coding RNAs: definitions, functions, challenges
and recommendations // Nat Rev. Mol. Cell Biol. 2023. Vol. 24. P. 430-447.

Maztn P. V, Khaitovich P., Cardoso-Moreira M., Kaessmann H. Alternative splicing during mammalian
organ development // Nat Genet. 2021. Vol. 53. P. 925-934.

MossE.y Rosalind C. L., Ambros V. Ihe cold shock domain protein LIN-28 controls developmental
timing in C.elegans and is regulated by the lin-4 RNA // Cell. 1997. Vol. 88. R 637-646.

Panni S., Lovering R.C., Porras P„ Orchards. Non-coding RNA regulator)- networksm // Biochim
Biophys Acta Gene Regul. Meeh. 2020. Vol. 1863 (6). P. 194417.

Plath K., Mlynarczyk-Evans S., Nusinow D.A., Panning D. Xist RNA and the mechanism of X
chromosome inactivation П Annu. Rev. Genet. 2002. Vol. 36. P. 233-278.

Poliseno L., Lanza M., PandolfiP.P. Coding, or non-coding, that is the question // Cell Res. 2024.
Vol. 34. P. 609-629.

Rougvie A. E., Moss E. G. Developmental transitions in C. elegans larval stages 11 Curr. Top. Dev. Biol.
2013. Vol. 105. P. 153-180.

Statello L., Guo C. J., Chen L L., Duarte M. Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological
functions // Nat Rev. Mol. Cell Biol. 2021. Vol. 22. P. 96-118.

Xu D., TangL., Kapranov Ph. Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA
enrichment techniques // Trends in Genetics. 2023. Vol. 39 (4). P. 320-333.

Zhao J., Sun B. K.y Erwin J. A., Song J. J., Lee J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to
the mouse X chromosome // Science. 2008. Vol. 322 (5902). P. 750-756.
КОМПЛЕКСЫ ГЕНОВ,
КОНТРОЛИРУЮЩИХ РАЗВИТИЕ

Тело большинства животных имеет метамерное строение: состоит
из повторяющихся метамерных единиц, у насекомых — это сегменты. Об-
устройство каждого сегмента контролируется группой генов, названных го-
меотическими. Эти гены впервые были идентифицированы у дрозофилы.
Способность к развитию определенных структур в конкретном сегменте
у дрозофилы закладывается еще в эмбриогенезе и сохраняется в личиночный
период развития, когда будущие структуры взрослого насекомого представ-
лены имагинальными дисками.

Концепция детерминации имагинальных дисков у дрозофилы была сфор-
мулирована Е. Хадорном в 1965 г. Детерминация — приобретение группой
клеток свойств (обязательств), которые точно определяют судьбу потомков
этих клеток. Продукты гомеотических генов или факторы, определяющие их
экспрессию, появляются на ранних стадиях эмбриогенеза и обладают теми
свойствами, которые формируют детерминацию.

В отличие от многих других систем имагинальные диски дрозофилы явля-
ются примером, на котором можно продемонстрировать различие между де-
терминацией и дифференцировкой. Имагинальные диски детерминированы
к развитию задолго до дифференциации, их судьба — быть дифференциро-
ванными в определенном направлении. Они сохраняют детерминированное
состояние в ряду клеточных поколений при трансплантации в брюшко ли-
чинки и в дальнейшем способны к автономному развитию и дифференциа-
ции. Приобретенное состояние детерминации коррелирует со способностью
детерминированных клеток узнавать друт друта после диссоциации. Если
клетки разных имагинальных дисков разделить, а затем смешать, то клетки,
полученные из определенного имагинального диска или фрагмента диска, на-
ходят друг друга и формируют некую целостную структуру. Клетки из разных
дисков или разных частей одного диска отделяются друг от друта, формируя
самостоятельные образования. В установлении пространственной организа-
ции важную роль играют механизмы межклеточной коммуникации.

Состояние детерминации может изменяться при длительном культивиро-
вании детерминированных клеток, т. е. может происходить трансдетермина-
ция. Например, клетки диска, из которого должна была образоваться нога,
начинают образовывать крыло. Таким образом, состояние детерминации
является обратимым и обладает определенной пластичностью.
Гомеотические гены

Название этой группы генов происходит от термина «гомеозис», который
ввел в научный оборот (1894) Уильям Бэтсон. Под гомеозисом он понимал
превращение одной части тела в другую в процессе развития. У. Бэтсон об-
ратил внимание на то, что важно не столько то, что произошло какое-то
изменение, а то, что благодаря такому изменению образовалась структура,
имеющая сходство с определенной структурой, которая обычно формируется
в другом месте организма.

Исследования на дрозофиле (плодовой мушке) (Drosophila melanogaster)
помогли раскрыть фундаментальные принципы генетического контроля раз-
вития. Именно у этого объекта впервые был обнаружен класс генов, кон-
тролирующих развитие. Функция этих генов — определять формирование
пространственной организации тела животного. Сочетание подходов клас-
сической и молекулярной генетики позволило установить организацию этих
генов и механизмы регуляции их экспрессии.

Продукты гомеотических генов образуют взаимодействующую сеть транс-
крипционных факторов, участвующих во взаимной регуляции и способных
в определенной группе клеток запустить морфогенетическую программу,
направленную на формирование соответствующих структур, — морф. В со-
ставе генов Нох содержится эволюционно консервативная последователь-
ность в 180 п. н., называемая гомеобоксом (homeobox — Нох). Участок белка,
кодируемый этой последовательностью, соответствует ДНК-связывающему
домену в 60 а. к., относящемуся к классу гомеодоменов. Гомеодомен бо-
гат положительно заряженными аминокислотами — аргинином и лизином.
По своей структуре гомеодомен относится к классу НТН (helix-turn-helix) —
спираль-поворот-спираль (рис. 9.1).

Гомеодомен представлен тремя а-спиралями. Первая и вторая спирали
антипараллельны. Третья спираль направлена под углом 90° и перпендику-
лярна им. Гомеодомен узнает определенную последовательность в большой
бороздке ДНК. Коровой частью этой узнаваемой последовательности являют-
ся четыре нуклеотида ТААТ. С ними взаимодействует третья распознающая
спираль в гомеодомене. Сравнение 29 различных гомеодоменов показало,
что 13 из 60 а. к. неизменны. Определены и наиболее важные аминокислоты
в составе гомеодомена, определяющие связывание с ДНК. Аминокислота
в позиции 9 узнающей спирали гомеодомена является критической в опре-
делении специфичности гомеодомена в процессе узнавания определенных
последовательностей в регуляторной области генов-мишеней.

Так, замена серина на лизин в гомеодомене класса paired приводит к тому,
что такой измененный гомеодомен начинает узнавать последовательности
ДНК, которые обычно узнает гомеодомен типа bicoid, содержащий гомеодо-
мен с лизином в этом положении. Очень большое значение в специфичности
узнавания имеет и аминокислота в положении 28. На основании характерных
Рис. 9.1. ДНК-связывающий гомеодомен

консенсусных последовательностей 300 гомеобоксных генов можно разде-
лить на 30 классов.

Гомеодомены одного и того же типа могут узнавать разные последова-
тельности ДНК. В то же время разные гомеодомены могут конкурировать
за одни и те же сайты связывания в регуляторной области генов-мишеней.
Поэтому даже незначительные изменения в структуре гомеодомена могут
повлиять на способность конкретного гомеодомена конкурировать с дру-
гим гомеодоменом за сайт связывания в регуляторной области гена-мише-
ни. Определяющую роль в активации транскрипции соответствующих ге-
нов-мишеней играет также взаимодействие продуктов гомеотических генов
с другими транскрипционными факторами. Большинст во белков, содержа-
щих гомеодомен, действуют в комбинации с другими транскрипционными
факторами.

За успехи в изучении гомеозисных генов у дрозофилы Нобелевскую пре-
мию (1995) получили Э. Льюис, К. Нюсляйн-Фольхард и Э. Вишаус.

Структура комплексов НОХ-генов

ИОХ-1ены имеют следующие свойства: организованы в кластеры; крайне
эволюционно консервативны.

Дрозофила имеет два кластера генов НОХ. Комплекс ANT-C (Anten-
napedia-Complex) состоит из пяти генов; Lb, pb, Dfd, Scr, Antp. Комплекс
Bithorax-Complex (ВХ-С) включает три гена: Ubx, abd-A, Abd-B (рис. 9.2).

Оба кластера расположены на хромосоме 3 в районах цитологической
карты 84АВ и 89Е соответственно.

Считывание мРНК, соответствующих генам одного кластера, происхо-
дит с одной и той же нити ДНК. Поэтому идентифицируют 5'- и З'-концы
Jab pb Dfd Scr Antp

передняя часть

Ubx abd-A Abd-B

задняя часть

Scr < Antp < Ubx < abd-A < Abd-В

Рис. 9.2. Пространственная и временная коллинеарность комплексов генов ANT-C: Lb,pb,
Dfd, Scr, Antp и BX-C: Ubx, abd-A, Abd-В у D. melanogaster. Нижняя строчка рисунка
иллюстрирует взаимодействие генов в фенотипической супрессии

кластера. В районе 5'-конца кластера располагается тот ген, чья зона макси-
мальной экспрессии ближе к хвостовому концу зародыша. В этом состоит
пространственная коллинеарность экспрессии НОХ-генов. Известна и вре-
менная коллинеарность экспрессии НОХ-генов: первыми в эмбриогенезе
экспрессируются те гены, которые находятся ближе к З'-концу кластера ге-
нов НОХ.

Таким образом, порядок генов в кластере необходим для обеспечения пра-
вильной пространственно-временной экспрессии НОХ-генов в эмбриогенезе.

Для генов НОХ существует явление фенотипической супрессии: гены,
имеющие в норме зону максимальной экспрессии в более задних регионах
тела, функционально доминируют над генами, более интенсивно экспрес-
сирующимися в более передних отделах, подавляя их фенотипическое про-
явление.

Вследствие фенотипической супрессии расширение зоны экспрессии ка-
кого-либо из гомеозисных генов вызывает трансформацию только в сегмен-
тах, расположенных впереди от нормальной границы зоны максимальной
экспрессии данного гена.

ANT-C отвечает за развитие головы и передней половины торакса. При
утрате функции гена Antp грудные сегменты вплоть до передней части ТЗ
приобретают свойства головных. Наоборот, в случае доминантной мута-
ции этого гена у дрозофилы вместо антенны появляется нога, т. е. голов-
ной сегмент обретает свойства грудных. АТР-С занимает участок разме-
ром в 350 т. п. н. (рис. 9.3, й). В состав этого комплекса входят следующие
гены (по порядку слева направо): labial (lab), proboscipedia (pb), zercnult (zen),
bicoid (bed), am a, Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr), fushi tarazu (fiz)
и Antennapedia (Antp) (выделенные жирным шрифтом гены формально не от-
носятся к гомеозисным).

Ген Antp протяженностью 103 т. п. н. содержит 8 экзонов и 7 интронов
(рис. 9.3, 6). Длина самого большого интрона 35 т. п. н. Открытая рамка счи-
тывания начинается только в пятом экзоне, а гомеодомену соответствует
lab pb zen bed ата Dfd Scr ftz Antp

Рис. 9.3. Организация ANT-C (u), экзон интронная структура гена Antp (6)
и соответствующие ему транскрипты (в, г)

часть экзона 8. Транскрипция гена Antp происходит с двух промоторов (Ill
и 112). Причем второй (проксимальный) промотор находится в интроне, ко-
торый транскрибируется, если транскрипция начинается с первого (дис-
тального) промотора (рис. 9.3, о, г). Транскрипты, считываемые с первого
промотора, не включают экзон 3 и различаются местом терминации. Транс-
крипты, считываемые со второго промотора в экзоне 3, также имеют разные
точки терминации.

Активация и репрессия разных промоторов осуществляется за счет раз-
ных сигналов: активатором первого промотора является продукт гена Kriippel,
а активаторами транскрипции, которая начинается со второго промотора, —
продукты генов hunchback и fushi tarazu. Репрессором первого промотора
является Ubx, а второго — oskar.

Существует два разных сайта терминации транскрипции (рис. 9.3 в, г).
Кроме того, благодаря альтернативному сплайсингу могут возникать разные
формы транскрипта Antp. Гомеобокс находится ближе к З'-концу первичного
транскрипта в экзоне 8. Кодирующая белок часть составляет всего 1 % от об-
щей длины гена. Молекулярная масса белка 43 кДа.

Большая по протяженности нетранслируемая часть транскрипта предпо-
лагает регуляцию на посттранскрипционном уровне и, возможно, обеспечи-
вает сохранение мРНК в нетранслируемом состоянии в составе комплекса
РНП. Различный состав некодирующей части транскриптов одного и того же
гена повышает регуляторный потенциал транскриптома.
Cbx abx Ьх

Ubx

bxd pbx iab-2 iab-4 iab-5 iab-6 iab-7 iab-8

Рис. 9.4. Организация Bithorax-Complex: распределение цис-действующих элементов Cbx, abx,
hx, bxd и pbx в районе локализации гена Ubx, кодирующего белок, и цис-действующих элемен-
тов iab-2, iab-4, iab-5, iab-6, iab-7 и iab-8 в той части комплекса, где локализуются белок-коди-
рующие гены abd-A и Abd-B

abd A

Abd В

Bithorax-Complex (ВХ-С) отвечает за дифференциацию части торакса, со-
седствующей с брюшком, и всего брюшка. Протяженность ВХ-С у дрозофилы
более 200 т. п. н.; 95 % этого комплекса приходится на цис-регулирующие эле-
менты и мутации, которые их затрагивают: Contrabithorax (Cbx), anterabithorax
(abx), bithorax (bx), bithoraxoid (bxd), postbithorax (pbx) (рис. 9.4). Они локали-
зуются вне кодирующей части Ubx. В районе локализации генов, кодирующих
белок, — abd-A и Abd-B — распределены цис-действующие элементы iab-2,
iab-4 (miR-196), iab-5, iab-6, iab-7 и iab-8.

Ген Cbx отвечает за спецификацию сегментов ТЗ и А1, а гены abd-A и Abd В
контролируют дифференцировку брюшных сегментов А2-А4 и А5-А8 соот-
ветственно.

Область Ubx рассматривается как сложный локус протяженностью
125 т. п. н. Этот локус имеет интрои-экзоиное строение. Протяженность са-
мого большого из нитронов 20 т. п. н. Первичный транскрипт процессирует-
ся, давая три транскрипта длиной 3,7, 4,3 и 4,7 т. н.

Организация гена Abd-B протяженностью около 100 т. п. н.: кодирующая
часть составляет всего 5 т. п. н., т. е. около 5 % всего транскрипта. В регуля-
торной области гена Abd-B найдено четыре промотора.

С одного промотора считывается транскрипт, кодирующий белок с моле-
кулярной массой 54 кДа, а с трех других — с молекулярной массой 36 кДа.
Оба белка содержат один и тот же гомеодомен. Этот факт подтверждает важ-
ную регуляторную роль некодирующей части транскрипта, определяющей
дополнительные возможности для регуляции экспрессии гена на посттран-
скрипционном уровне.

Первые транскрипты гомеозисных генов появляются через 2-4 ч после
оплодотворения, т. е. еще на стадии бластодермы. Следовательно, гены, кон-
тролирующие морфогенез, функционируют задолго до начала формообразо-
вательных процессов, которые они контролируют.

Несмотря на то что комплексы ANT-C и ВХ-С пространственно разобще-
ны и формируют независимые кластеры, функциональная иерархия гомео-
тических генов соответствует их порядку слева направо в обоих комплексах.
Нох А

Но* В

Нох С

Нох D

В1 |[“В2 ]

[ Д9 )[ дю ][ All I

ДП

С13

D13

1 2 3

" "’ll ‘

Рис. 9.5. Кластеры генов Нох у дрозофилы и мыши. Черные прямоугольники — отсутствие
в кластере некоторых иарологов

У позвоночных комплексы генов Них более компактны, их размер 80-
120 т. п. н. Все гены семейства Нох обнаруживают сходство в структуре,
ор!анизации и экспрессии.

У млекопитающих 39 генов Нох организованы в четыре кластера (А, В,
С, D), каждый из которых представлен 9-11 генами (рис. 9.5). Гены из раз-
личных кластеров на основании их структурного сходства группируются
в подсемейства, которые называют паралогичными группами. Таких пара-
логичных групп 13. В каждом из кластеров могут быть представлены гены
не всех 13 пара логичных групп. Удивительный факт, что и порядок генов
в кластерах является эволюционно консервативным. Это означает, что по-
рядок паралогичных групп в одном и том же кластере генов Нох у разных
животных оказывается одинаковым. За небольшим исключением все гены
кластера транскрибируются с одной и той же нити ДНК, что позволяет иден-
тифицировать 5'- и З'-концы кластера генов. Гены, локализованные ближе
к З'-концу, имеют домен экспрессии ближе к переднему концу эмбриона.

Мутации гомеозисных генов

Для генов группы Нох описаны как мутации loss-of-function (с потерей
функции), так и gain-of-function (с приобретением доминантной функции).
Они вызывают разнонаправленную трансформацию специфических моно-
мерных субъединиц, из которых составлено тело животного. У насекомых
такими метамерными единицами являются сегменты, у позвоночных —
это определенные отделы позвоночника. Рецессивные мутации с потерей
функции приводят к тому, что сегмент, соответствующий зоне экспрессии
конкретного гена, превращается в предшествующий сегмент. Например,
ТЗ в случае мутации Ubx~ становится похожим на Т2 (вместо жужжальца
Рис. 9.6. Фенотип мутантов Ubx с дупликацией части торакса и появлением дополнительно
пары крыльев (а) и Antp с формированием конечности вместо антенны (о)

развиваются крылья) (рис. 9.6, а). Иными словами, сегменты приобретают
свойства впереди лежащих сегментов.

Доминантные мутации gain-of-function, или эктопическая экспрессия, со-
ответствующего гена, наоборот, способствуют тому, что определенные мета-
мерные сегменты приобретают черты, характерные для более задних сегмен-
тов. Например, доминантная мутация Antp, которая приводит к развитию
конечности на месте антенны (рис. 9.6, б). Такой же эффект дает и эктопи-
ческая экспрессия нормального аллеля Antp под действием теплового шока
(ТШ) у трансгенных дрозофил, в геном которых был встроен ген Antp под
промотором гена Hsp70. Это позволило отнести гомеотические гены к генам-
переключателям программы развития в каждом сегменте. В соответствии
с локализацией данного сегмента они запускают экспрессию определенных
генов-мишеней, контролируя рост и дифференциацию группы клеток, зани-
мающих определенное положение по передне-задней оси организма. Домены
экспрессии многих генов Нох перекрываются, а это означает, что в опреде-
ленных случаях в регуляции генов-мишеней необходима комбинация соот-
ветствующих главных (командных) генов.

Максимальная экспрессия гена Antp наблюдается в PS4, а гена Ъ'Ьх —
в PS6. В PS5 происходит экспрессия и того и другого гена, но концентрация
каждого из них небольшая. Следовательно, в PS5 контроль генной экспрессии
осуществляется за счет комбинации командных генов. Перекрывание зон
экспрессии генов Нох создает возможность для взаимной регуляции их экс-
прессии.

Как правило, гены, экспрессирующиеся в более задних доменах экспрес-
сии, способны корректировать экспрессию генов в более передних доменах
экспрессии. Так, у трансгенных дрозофил, у которых в геноме был нормаль-
ный аллель Antp под промотором гена ТШ, при действии ТШ наблюдалось
влияние ANTP только в передней части эмбриона, и передние сегменты
приобретали свойства PS4, в то время как сегменты, находящиеся сзади
PS4, почти не изменялись. Это явление получило название фенотипической
супрессии. Оно иллюстрирует иерархию взаимоотношений между генами
группы Нох.

Фенотипической супрессией объясняют тот факт, что мутации генов НОХ
у дрозофилы оказывают незначительный эффект на задние сегменты, в ко-
торых экспрессируются гены НОХ с более задними доменами экспрессии.
Следовательно, для задних сегментов гены более переднего плана несуще-
ственны.

Фенотипическая супрессия представляет собой общее явление, однако су-
ществуют исключения из этого общего правила. Так, ген Scr, помещенный под
промотор гена Н$р70 и экспрессирующийся равномерно при действии ТШ,
не супрессируется геном Antp, расположенным сзади него. Супрессию Src
осуществляют гены, расположенные дальше Antp, — это Ubx, abd-A и Abd-B.
Фенотипической супрессии нет и в клетках периферической нервной систе-
мы у дрозофилы, где в дальнейшем наблюдается экспрессия многих гомеоти-
ческих генов. В тканях нервной системы гены lab, Dfd и Src не сунрессируются
более задними генами НОХ. Таким образом, фенотипическая супрессия тка-
неспецифична.

Для объяснения механизма фенотипической супрессии была высказа-
на следующая гипотеза [Noro et al., 2011]. Разные гены НОХ конкурируют
за сайты связывания в регуляторной области одних и тех же генов-мишеней.
При этом они обладают различным сродством к этим сайтам. Кроме того,
существенным моментом является концентрация соответствующих ТФ, ко-
дируемых различными генами НОХ. Таким образом, регуляция соответству-
ющих генов-мишеней находится под двойным контролем: с одной стороны,
по мере продвижения к заднему концу эмбриона, повышается концентрация
продуктов более задних генов НОХ, с другой — последние обладают большим
сродством к соот ветствующим генам-мишеням по сравнению с продуктами
более передних генов. Тем самым продукты более задних генов оказывают
супрессирующий эффект на экспрессию генов-мишеней, регулируемых более
передними генами. Если продучсты более задних генов оккупировали соответ-
ствующие сайты связывания в регуляторной области генов-мишеней, то гены
более переднего плана не могут эти гены активировать.

Гены Нох, запускающие морфогенетическую

программу развития

Детерминация, определяемая экспрессией генов НОХ у дрозофилы, фор-
мируется в эмбриогенезе на стадии бластулы. Однако эта детерминация
достаточно пластична. Она может быть изменена в дальнейшем, например
на стадии поздней куколки. Это свидетельствует о том, что детерминация,
сформированная на стадии бластодермы, является обратимой. Интересно,
что в клетках нервной системы гены НОХ работают постоянно.
Превращение гальгеры в крыло при наличии мутации Ubx позволяет рас-
сматривать влияние генов НОХ на характер межклеточных взаимодействий.
Кроме того, поскольку при трансформации гальгеры в крыло образование
крыла происходит из того же начального числа клеток, что и число клеток,
из которого образуется соседняя гальтера, можно предположить, что ген
Ubx вовлечен в контроль клеточной пролиферации, возможно, регулируя
экспрессию генов, контролирующих клеточную пролиферацию, поскольку
крыло содержит почти в семь раз больше клеток, чем гальтера.

Среди генов-мишеней, экспрессия которых регулируется генами Нох, при-
сутствуют гены, контролирующие транскрипционные факторы, сигнальные
молекулы, р-3-тубулин, коннектин, а также белки, обеспечивающие кле-
точную адгезию. Это позволяет отнести гены Нох к основным регуляторам
морфогенеза.

Некоторые гены из группы Нох, как у дрозофилы, так и у мыши, участвуют
в авторегуляции, поддерживая свою собственную экспрессию в районе их
активности. В регуляторных районах генов Dfd и lab обнаружены участки,
способные взаимодействовать со своими продуктами. У мыши такая способ-
ность к авторегуляции показана для гомологов Dfd и lab, у млекопитающих —
это гены НохЬ-4 и Hoxb-l соответственно. Способность к авторегуляции за-
висит от функционирования гена extradenticle (exd). У позвоночных имеется
ген из класса РЬх, гомологичный гену exd дрозофилы. Ген РЬх является прото-
онкогеном, который впервые был идентифицирован в районе хромосомной
перестройки в пре-В-клетках при лейкемии.

Экспрессия гена Ubx также поддерживается за счет авторегуляции,
но в данном случае система более сложная. Авторегуляция не является пря-
мой — она опосредована другими транскрипционными факторами.

Итак, гомеотические гены — это эволюционно консервативная группа
генов, запускающих морфогенетическую программу развития, реализация
которой приводит к формированию определенной анатомической структуры.

Для объяснения генетического контроля морфогенетических процес-
сов Ян-Эриком Эдстремом в 1968 г. была высказана гипотеза «генов-рабов»
(«Slaves Genes») и «генов-хозяев» («Master Genes»). Согласно этой гипотезе,
существуют гены, способные запустить определенную морфогенетическую
программу, включая экспрессию группы генов, отвечающих за формирование
отдельной морфогенетической структуры. Вальтер Геринг проверил эту ги-
потезу экспериментально, получив трансгенных дрозофил, которым в геном
был встроен нормальный аллель гена eyeless, под регулятором UAS [Gehring,
1996]. Эта последовательность отвечала за активацию транскрипции гена
eyeless в том случае, если в клетке присутствовал дрожжевой активатор транс-
крипции — GAL4. Для его появления в клетке была также создана гене-
тическая конструкция, в которой участок, ответственный за синтез GAL4,
был помещен под различные регуляторные последовательности, содержа-
щие тканеспецифичные энхансеры. Сочетание в геноме дрозофилы обеих
генетических конструкций приводило к тому, что глаз формировался в самых
разных местах, в зависимости от типов тканеспецифичных энхансеров, об-
разующих регуляторную зону конструкции, контролирующую экспрессию
GAL4. Тканеснецифичность экспрессии данной конструкции (она содержала
также ген lacZ) контролировалась путем анализа экспрессии [3-галактозидазы
в соответствующих тканях. Эти эксперименты демонстрировали, как экто-
пическое включение гена eyeless способно запустить морфообразовательные
процессы в самых разных местах, что приводит к формированию глаза в рай-
оне индукции GAL4.

Регуляция экспрессии генов Нох с участием нкРНК

Не только активация, но и репрессия генов определяет пространственные
и временные параметры в работе генов в процессе развития. В трансляцион-
ной репрессии важную роль играют микроРНК.

В кластерах генов Нох позвоночных локализуются последовательности,
отвечающие за синтез miR 10, miR-196 и miR-615. Эти микроРНК имеют
участки, комплементарные 3'UTR в мРНК определенных генов Нох. По-
следовательность, производящая miR-10, локализуется между генами Нох4
и Нох5, которые являются паралогами генов дрозофилы — Deformed и Sex
combs reduced соответственно (рис. 9.7). У млекопитающих miR-196 соответ-
ствуют три последовательности (miR-196a-l, rmR-196a-2 и miR-196b), которые
локализуются в кластерах ИохА, В и С между генами Нох9-13. Последователь-
ность, паралогичная miR-196, у дрозофилы производит miR-iap-4. У млеко-
питающих гены, фланкирующие miR-196, представляют собой паралогичные
группы, которым у дрозофилы соответствуют abd-A и Abd- В. Последователь-
ности miR-196a-l и miR- 196а-2 отличаются от miR-196b всего на один нукле-
отид. Участок 3'UTR в мРНК Нох8, комплементарный miR-196, эволюционно
консервативен от рыбы до человека. Эти микроРНК комплементарны участку
3'UTR в мРНК НохВ8, НохС8, HoxD8.

Фрагменты РНК, образующиеся при расщеплении мРНК НохВ8 с участи-
ем mir-196, находят в мышиных эмбрионах. Посттранскрипционное огра-
ничение экспрессии генов Нох за счет расщепления мРНК или подавления
трансляции — известный механизм регуляции развития.

Организм, состоящий из дифференцированных тканей, устанавливает
тканеспецифичный характер экспрессии генов на ранних этапах развития
и должен поддерживать такой характер экспрессии генов в течение всей жиз-
ни. Благодаря экспрессии определенных генов Нох в соответствующем отделе
организма формируется позиционная информация, которая представлена
набором транскрипционных факторов, взаимодействующих с НОХ. Благо-
даря этому в определенном компартменте организма кон тролируется деление
клеток, их миграция, характер дифференциации или апоптоз. Кроме того,
Рис. 9.7. микроРНК (mir-10, mir-196 и mir-iab-4) (черные треугольники), локализованные
в пределах комплексов генов Нох и принимающие участие в регуляции их экспрессии
у млекопитающих и дрозофилы [Yekta et al., 2004]

должен существовать механизм, обеспечивающий поддержание установив-
шегося характера экспрессии генов.

Большинство решений в определении клеточной судьбы принимается
путем регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции. При этом экс-
прессия некоторых транскрипционных факторов в развитии происходит
кратковременно, т. е. на определенном этапе развития, в то время как гены,
которые они включают, в дальнейшем работают в течение продолжительного
времени. Поддержание транскрипционного состояния обеспечивают особые
факторы, регулирующие и экспрессию гомеотических генов у D. melanogaster.

Эпигенетическое поддержание состояния активного или неактивного
хроматина — это ключевой механизм регуляции экспрессии гомеотических
генов в развитии.

нкРНК, которые являются продуктами локусов Нох, непосредственно вза-
имодействуют с гистоновой метилтрапсферазой Ashl in vitro и могут привле-
кать белки TrxG к определенным районам в хромосоме. Это приводит к ме-
тилированию лизинов в положении 4 и 9 гистона НЗ и лизина 20 в гистоне
Н4; позволяет поддерживать у дрозофилы активную транскрипцию гена Ubx
в третьей конечности и в гальтерном имагинальном диске. Специфическое
привлечение Ashl к гену Ubx обеспечивает нкРНК, которая синтезируется
с участка, расположенного на 22 т. п. н. ранее промотора Ubx.

У дрозофилы пять генов Нох из восьми регулируются микроРНК. В 3'UTR
гена мРНК Src находится сайт взаимодействия с miR-10, которая считыва-
ется с участка, локализованного в комплексе Antennapedia между Dfd и Src.
3'UTR мРНК Src является мишенью и для miRNA Bantam и miR-125. miR-125
является гомологом микроРНК Нп-4 нематоды. Мишенью miR-125 является
мРНК Src. Между генами Src и Antp находится ген ftz. Все три гена ком-
плекса Bithorax кодируют белки и регулируются разными микроРНК. Гены
abd-A и Abd-B являются мишенями miR-iab-4-З-р. Последовательность, про-
изводящая miR-iab-4-З-р, локализуется между abd-A и Abd-B. А локус iab-4,
отвечающий за синтез микроРНК, гомологичной miR-196, контролирует экс-
прессию гена Ultrabithorax.

У млекопитающих 39 генов, кодирующих транскрипционные факторы
Нох, расположены кластерами в четырех хромосомных локусах: НохА, НохВ,
НохС и Нох D.

На 15-й день у мыши miR-196 непосредственно расщепляет мРНК НОХВ8
и ингибирует гены НОХС8, H0XD8, НОХА7.

Последовательность, соответствующая HOTAIR (НОХ Antisense Intergenic
RNA) у млекопитающих, располагается в комплексе НохС, расположенном
в хромосоме 12 между генами HoxCl 1 и НохС12. нкРНК HOTAIR необходима
для репрессии генов комплекса HoxD, который локализуется в хромосоме 2.
Длина этой нкРНК 2158 н. Последовательность HOTAIR эволюционно кон-
сервативна: сходство HOTAIR человека и HOTAIR шимпанзе составляет
от 99,5 %, и до 85 % — с HOTAIR собаки. HOTAIR связана с факторами, мо-
дифицирующими хроматин, и тем самым участвует в регуляции экспрессии
генов. 5'-конец этой нкРНК взаимодействует с метилтрансферазным ком-
плексом, контролирующим метилирование лизина в положении 27 в гисто-
не НЗ, что обеспечивает привлечение комплекса PRC2 (Polycomb repressive
complex 2). З'-конец HOTAIR взаимодействует с гистоновой деметилазой
LSD1. Еще одна нкРНК HOTTIP вызывает координированную активацию
генов Нох А.

Длительные наследуемые модификации хроматина

В ядрах эукариот ДНК упакована определенным образом, и для транс-
крипции необходимо подготовить (распаковать) матрицу, т. е. сделать ДНК
доступной для факторов аппарата транскрипции. Первым уровнем укладки
хроматина является взаимодействие ДНК с нуклеосомами, так формируется
фибрилла толщиной 10 нм. Нуклеосома представляет собой гистоновый ок-
тамер, вокруг которого намотано 1,65 витков ДНК. Протяженность участка
ДНК, входящего в состав витка, 147 п. н. Гистоны — это белки, обогащенные
положительно заряженными аминокислотами (лизином, аргинином и ги-
стидином). Структуру нуклеосомы формируют по две молекулы каждого
из гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Между двумя соседними нуклеосомами есть
свободный участок ДНК, называемый линкером. Его длина 20-50 п. н. С лин-
кером и гистонами октамера взаимодействует гистон Н1. Второй уровень
укладки ДНК — взаимодействие нуклеосом друг с другом и рядом негисто-
новых белков.

Молекула гистона имеет центральный домен — гистоновый кор (глобулу)
и N-концевой домен, который часто называют «хвостом гистона», хотя по сути
это начало гистоновой молекулы или ее свободный (выступающий из глобу-
лы) N-конец. Протяженность N-концевого домена 15-30 а. к. Он отвечает
за взаимодействия между гистонами и соответствующим гистоном и ДНК.
Аминокислоты, составляющие гистоны, в основном имеют положительный
заряд, этим определяется притяжение гистонов к ДНК, имеющей отрица-
тельный заряд. Аминокислоты N-концевого домена гистонов подвержены
посттрансляционной модификации, в результате чего изменяется их взаимо-
действие с ДНК и другими белками, что в свою очередь изменяет доступность
ДНК для других молекул и влияет на эффективность транскрипции.

Репрессию, созданную взаимодействиями ДНК-гистонов, могут разру-
шить «комплексы, ремоделирующие хроматин», на изменения структуры
хроматина влияют модификации гистонов.

Модификации гистонов

Ацетилирование гистонов коррелирует с транскрипционной активно-
стью многих генов. В.Олфри впервые (1977) связал ацетилирование гистонов
и транскрипцию ДНК. Гистоновая ацетилтрансфераза — фермент, который
ацетилирует гистоны.

Затем было показано, что нуклеосомы в активно транскрибирующихся
генах — районы промоторных и энхансерных элементов — содержат ацети-
лированные гистоны.

Ацетилирование аминокислот в выступающей N-концевой части моле-
кулы гистона приводит к деконденсации хроматина в районе промоторов,
но необходимо еще и освобождение этого участка ДНК от нуклеосом. Дей-
ствительно, промоторы и энхансеры активно работающих генов обычно сво-
бодны от нуклеосом. Нуклеосомы вытесняются из районов энхансеров и про-
моторов комплексами, ремоделирующими хроматин [Barral, Zaret, 2024].

Существует два типа таких комплексов.

Первое семейство белков — SWI/SNF (SWItch/Sucrose Non-Ferinentable).

Белки и соответствующие им гены были впервые обнаружены у дрож-
жей. Гомологичные белки затем были найдены у млекопитающих. Белки
SWI и SNF формируют комплекс, который имеет АТФ-азную активность.
Этот комплекс нарушает контакт между ДНК и гистонами и заставляет
нуклеосому покинуть ее место. Она может переместиться на свободную
нить ДНК.

Второе семейство белков — 1SWI (Imitation SWItch), или NURF.

Этот комплекс заставляет нуклеосомы скользить но ДНК.
В нормальной конфигурации хроматин транскрипционно неактивен.
Районы хроматина, которые характеризуются плотно расположенными ну-
клеосомами, формируют гетерохроматин или транскрипционно инертные
районы.

Нуклеосомы — это мощный модулятор экспрессии генов. Транскрипци-
онные факторы могут действовать через нуклеосомы для подавления транс-
крипции или могут привлекать модификаторы гистонов к нуклеосомам для
ее усиления.

Модификации гистонов включают: метилирование аргинина (R), метили-
рование, ацетилирование, убиквитинирование и сумоилирование лизинов
(К), фосфорилирование серина (S) и треонина (Т). Из известных модифика-
ций самыми распространенными являются ацетилирование и метилирова-
ние, осуществляемые гистоновыми соответственно ацетил- и метилтранс-
феразами (HAT и МЕТ). Ацетилирование различных лизинов гистонов НЗ
и Н4 приводит к активации транскрипции. Эффект этих модификаций объ-
ясняется главным образом тем, что они уменьшают положительный заряд
гистонов, благодаря которому последние взаимодействуют с отрицательно
заряженной ДНК. В отличие от ацетилирования, метилирование гистонов
может способствовать не только активации, но и репрессии транскрип-
ции. Так, метилирование лизинов 9 и 27 в гистоне НЗ и лизина 20 в гистоне
Н4, а также аргинина 8 в гистоне НЗ связано с репрессией транскрипции,
в то время как метилирование лизинов 36 и 79, аргининов 2, 17 и 26 гистона
НЗ — с ее активацией. Кроме того, наблюдается влияние друг на друга моди-
фикаций, затрагивающих различные сайты гистонов. Например, фосфори-
лирование H3S10 и метилирование НЗК4 подавляют метилирование НЗК9.
Если остаток лизина ацетилирован, то он может быть метилирован только
после деацетилирования.

Влияние метилирования гистонов на транскрипцию генов зависит от сай-
та метилирования и числа метильных групп. Так, диметилирование по НЗК9
(НЗК9те2) приводит к гетерохроматинизации и подавлению экспрессии
генов, а ди- и триметилирование по НЗК27 (НЗК27ше2 и НЗК27теЗ) связано
главным образом с репрессией генов, расположенных в эухроматинс. Три-
метилирование гистона НЗ лизина 4 (НЗК4теЗ) и ацетилирование НЗ и Н4,
напротив, ассоциируются с транскрипционной активностью и характерно
для эухроматина. Разнонаправленность влияний метилирования гистонов
на транскрипцию генов объясняется тем, что метилирование изменяет транс-
крипцию не само по себе, а путем привлечения ингибиторов и активато-
ров транскрипции. Подавление транскрипции генов посредством НЗК9те2
и НЗК27теЗ обусловлено гем, что эти модификации узнаются белками, име-
ющими так называемый хромодомен (домен организации хроматина). Это
прежде всего белок НР1 (heterochromatin protein 1).

Белок НР1 — основной компонент гетерохроматиновых участков хро-
матина. Признаками гетерохроматина являются присутствие гистона НЗ,
Период развития

Услинные обозначения: ------- - ДНК; 5 3' — ДНК кластера Нох; ' х — транс-

крипт; 0 — нуклеосома с НЗК27тЗ; О — нуклеосома с НЗКЗтЗ; ] — цис-действующий
элемент, обеспечивающий транскрипционную репрессию; 0 - цис-действующий элемент,
обеспечивающий активацию транскрипции

Рис. 9.8. Схема регуляции генов кластера Нох в процессе развития [Mallo, Alonso, 2013]

триметилированного по лизину в положении 9 (Lys9) (H3K9me3) и гипо-
ацетилированных гистонов. Аминотерминальный хромодомен белка НР1
взаимодействует с гистоном НЗК9теЗ — маркером транскрипционно репрес-
сированного хроматина. Эволюционно консервативные гены семейства НР1
содержат хромобокс (СВХ — chromobox), которому в белке соответствует
хромодомен. Еще один эволюционно консервативный домен в белке НР1 —
это карбокситерминальный домен — CSD (chromoshadow domain), отвеча-
ющий за белок-белковые взаимодействия и формирование гомо- и гетеро-
димеров. Таким образом, в формирование структуры хроматина вовлечены
белковые комплексы.

В регуляции экспрессии генов кластера Нох участвуют наследуемые в ряду
клеточных поколений модификации хроматина и неслучайное распределение
активно транскрибируемого и молчащего хроматина в ядре (рис. 9.8). Орга-
низация хроматина в ядре и его состав позволяют изменять и в дальнейшем
поддерживать характер экспрессии генов Нох в пределах дискретных струк-
тур по передне-задней оси развивающегося организма. На начальном этапе
развития хроматин, содержащий последовательность кластера генов Нох, не-
активен. Нуклеосомы в ее составе содержат гистон НЗК27тЗ, что привлекает
белки, характерные для неактивного хроматина. Первыми в процессе разви-
тия начинают работать гены Нох, расположенные ближе к З'-концу кластера.
Это сопровождается изменениями структуры хроматина, связанными с мо-
дификацией гистона НЗ (деметилирование НЗК27тЗ) и появлением формы,
характерной для активного хроматина. Активный хроматин перемещается
в соответствующую ядерную зону, где цис-действующие элементы взаимо-
действуют с факторами, поддерживающими активную транскрипцию. Такая
схема регуляции генов Нох согласуется с изменениями структуры хроматина
Рис. 9.9. Фенотип мутанта Polycomb: половые гребешки (стрелка), расположенные
на 1,2 и 3-й конечностях самцов дрозофилы [Cunningham et al., 2012]

в пределах кластера в зависимости от характера экспрессии соответствующих
генов.

В раннем эмбриогенезе устанавливается определенный характер экспрес-
сии генов Нох. Затем выбранный характер экспрессии гомеотических генов
поддерживает набор вторичных факторов, к которым относятся продукты
генов из групп Polycomb (PcG) и trithorax (trxG). Механизм поддержания
определенного уровня транскрипции в ряду клеточных поколений включает
модификацию гистонов, изменение положения и конформации нуклеосом,
специфическое присоединение мультисубъединичных комплексов к регули-
руемым генам. Все это определяет, будет ли ген включен или выключен, а так-
же будет ли данное состояние стабильно поддерживаться.

В геноме дрозофилы около 40 генов относятся к PcG. Первую мутацию
Polycomb (Рс) получил П. Льюис (1947). У самцов с мутацией Рс половые гре-
бешки находятся не только на 1-й конечности, но и на 2-й, и 3-й (рис. 9.9).
Белок Рс, который дал название всему семейству белков, гомологичен белку
гетерохроматина НР1.

Белки семейства Рс способны репрессировать гомеотические гены путем
формирования структур, подобных гетерохроматину. Важно отметить, что
белковые комплексы Рс сохраняют хроматин в неактивном состоянии в ряду
клеточных поколений. В состав комплекса PcG, кроме белков группы Рс,
входит белок Posterior sex comb — Psc, который содержит домен цинковых
пальцев, и другие ДНК-связывающие белки (Ph — Polyhomeotic, Scm — Sex
comb on midleg). Система поддержания характера генной экспрессии за счет
белков PcG эволюционно консервативна и, влияя на структуру хроматина,
регулирует экспрессию не только генов Нох.
Репрессия генов с участием комплекса PcG

Комплекс белков PcG взаимодействует с определенными последовательно-
стями в ДНК, которые называются Polycomb response elements (PREs). Функ-
ция PRE состоит в захватывании эволюционно консервативных белков PcG,
в результате этого структура хроматина изменяется таким образом, что он
становится транскрипционно неактивным. Благодаря последовательностям
PRE репрессия за счет PcG может возобновляться после каждого клеточного
деления. Белки PcG связываются с участками хроматина, содержащими «мол-
чащие» гены. Активно работающие гены не взаимодействуют с комплексами
PcG и не репрессируются, они остаются активными, в то время как нерабо-
тающие гены сохраняют состояние репрессии.

Белки PcG узнаю г транскрипционно неактивное состояние хроматина
в репрессированных генах согласно самой простой модели, поскольку такой
хроматин позволяет сборку комплексов PcG.

Транскрипционно неактивный хроматин отличается от транскрипционно
активного набором связанных с хроматином белков, модификацией гисто-
нов, компактизацией хроматина. Особенностью активно транскрибируемых
генов может быть то, что в этом районе PREs недоступны для сборки ком-
плексов PcG или эти комплексы оказываются нестабильными.

Молекулярные различия между транскрибируемыми и нетранскриби-
руемыми генами заключаются в соответствующей модификации гистонов,
что влияет на расположение нуклеосом. Гиперацетилирование гистона Н4
в районе стабильно активных генов может защищать их от репрессии за счет
PcG [Cavalli, Рато, 1999].

Транскрипция — многоэтапный процесс, и репрессоры могут действовать
на одном или нескольких этапах. Репрессия на уровне структуры хроматина
может заключаться в непосредственном блоке присоединения транскрипци-
онной машины к хроматину либо осуществляться опосредованно — через
подавление ремоделирования нуклеосом. Мишенью репрессора могут быть
основные или геноспецифичные регуляторные факторы или взаимодействие
между ними. Кроме того, репрессия может происходить в специфических
ядерных доменах (см. рис. 9.8).

Комплексы PcG взаимодействуют с нуклеосомами в районе PRF. и фор-
мируют повторяющиеся единицы из нескольких нуклеосом (рис. 9.10, а), что
препятствует их перемещению. Комплексы PcG могут концентрироваться
в районе PRE, а также распространяться по хроматину в районы, соседствую-
щие с репрессированным геном на довольно большие расстояния, возможно,
узнавая элементы структуры хроматина более высокого порядка, а не просто
последовательности ДНК.

Важно, как белки PcG, связываясь с определенным местом в хроматине, пе-
редают репрессию на промотор. Структуры, инициированные в районе PRE,
могут распространяться по длине ДНК в сторону промотора (рис. 9.10, б).
Рис. 9.10. Участие белковых комплексов РсСт в формировании структуры транскрипционно
неактивного хроматина: а — взаимодействие PcG с открытыми последовательностями PRE
в ДНК; б — взаимодействие комплексов PcG с пространственно разобщенными PRE
[Francis, Kingston, 2001]

Это продвижение может стимулироваться взаимодействием белков PcG
с хроматином, или же белки PcG связываются с соседними, более слабыми
последовательностями, содержащими PRE. Белки PcG способны связываться
как с последовательностью PRE, так и с промоторами, образуя петлю хрома-
тина или серию петель. Возможно, благодаря такому механизму белки PcG
взаимодействуют и формируют репрессирующую структуру хроматина, ко-
торая захватывает и промотор.

Существует два комплекса: Polycomb repressive complex 1 и 2.

PRC1 (Polycomb repressive complex 1-3 MDa) выделен из эмбрионов дрозо-
филы. Он содержит белки: Рс — Polycomb, Ph — Polyhomeotic, Psc — Posterior
sex combs и Scm — Sex comb on midleg. PRC1 блокирует ремоделирование ну-
клеосом. Белки PcG заякоривают нуклеосомы и предотвращают их разборку.
Тем самым гены сохраняются в репрессированном состоянии. Субъединица
Ring], входящая в состав PRC1, отвечает за убиквитинирование гистона Н2А
по лизину 119 (uH2AKl 19).

Комплекс Enhancer of Zeste Homolog 2 содержит метилтрансферазу гисто-
нов и метилирует гистон НЗ по лизину 27 (НЗК27теЗ). Комплекс включает
белки: Esc (Extra sex combs), E(z) (Enhancer of Zeste), Su(z)12 (Suppressor of
Zeste) и Nurf55 (Nucleosome remodeling factor 55). C H3K27me3 через хромодо-
мен взаимодействует Pc. Комплекс PRC2 у дрозофилы содержит деацетилазу
гистонов, что может говорить о его деацетилазной активности. Это харак-
терно и для гомологичного комплекса, описанного у млекопитающих. Ком-
плексы PRC.31 и PRC2 направлены на удержание хроматина в неактивном
состоянии через модификацию гистонов.

Члены обоих комплексов вовлечены в регуляцию гомеотических генов.

Комплексы trxG, включающие белки Brm (Brahma), GAG A-фактор и др.,
обеспечивают транскрипционно активное состояние хроматина. Белковые
комплексы trxG взаимодействуют с цис-действующим элементом в ДНК —
TRE (Trithorax Response Element). Эти комплексы регулируют транскрипцию,
влияя на структуру хроматина. Они участвуют в модификации гистонов, что
способствует ремоделированию хроматина как важного компонента клеточ-
ной памяти.

Тгх — метилтрансфераза — обеспечивает модификацию гистона ИЗ по К4.
Tri (Trithorax-like) кодирует GAGA-фактор, который в ДНК узнает после-
довательность GAG AG. Мутации, приводящие к уменьшению количества
GAGA-фактора в период раннего эмбрионального развития, вызывают асин-
хронность циклов ядерных делений, нарушение конденсации хроматина,
аномалии в расхождении хромосом и фрагментацию хромосом.

Характер укладки ДНК в нуклеосомах создает структуру хроматина, обе-
спечивая регуляцию экспрессии генов. 5'-регуляториые области активно
работающих генов обычно свободны от нуклеосом и называются «сайты,
гиперчувствительные к ДНКазе I» (DH sites — DNase 1 hypersensitive sites).

Для репрессии важны не только нуклеосомы, но и характер укладки хро-
матина более высокого порядка. Как правило, гомеотические гены организо-
ваны в кластеры и содержат протяженные участки, которые белки не коди-
руют, но выполняют регуляторную функцию.

Механизм ремоделирования, который является АТФ-зависимым, может
сдвигать нуклеосомы, вызывая изменение их положения и приводя их
к «соскальзыванию», или к перемещению гистонового кора с одной нити
ДНК на другую, делая нуклеосомную укладку пластичной. Однако в целом
структура хроматина достаточно стабильна. Однажды установленный ха-
рактер экспрессии генов поддерживается в ряду клеточных поколений.
Недавние открытия показали, что изменение состояния хроматина может
происходить благодаря модификации гистонов, в особенности гистонов
НЗ/Н4, которые в активных доменах являются ацетилированными по ли-
зину, а в неактивных районах — гипоацетилированными. Посттрансляци-
онная модификация других гистонов, так же как использование вариантов
линкерного и коровых гистонов, может существенно влиять на упаковку
100 А-фибриллы, изменяя нуклеосомную стабильность и расположение
нуклеосом. Все это может влиять на активность РНК полимеразы, направ-
ляя ее на участки, свободные от нуклеосом или, наоборот, блокировать
этот процесс благодаря укладке в структуры более высокого порядка —
300 А-фибриллы.
***

В процессе развития и дифференцировки клеточный фенотип стабильно
сохраняется в ряду клеточных поколений. Это явление получило название
клеточная память. За счет клеточной памяти можно поддерживать стабиль-
ный характер экспрессии генов. Основными механизмами клеточной памяти
являются метилирование ДНК и способность к наследованию специфических
структур хроматина.

В клеточном цикле существует два препятствия, которые стоят на пути
наследования специфических структур хроматина:

1) данная структура должна сохраняться, пройдя вилку репликации
в S-фазе;

2) конфигурация хроматина должна преодолеть митоз, когда она достига-
ет максимума. В этот период не происходит транскрипция, и почти все бел-
ки, связанные с двунитевой ДНК и участвующие в транскрипции, покидают
хромосомы.

В то же время после митоза все восстанавливается. Результаты анализа
ДНК в точке старта транскрипции in vivo в митозе свидетельствуют об изме-
нении ее конформации в районе генов, которые будут реактивированы. В ре-
прессированных генах таких изменений в конформации ДНК не обнаружено.
Эти протеин-зависимые варианты конформации хроматина могут помогать
возобновлять транскрипцию после митоза. Они как бы маркируют гены для
их повторной экспрессии.

PcG/trxG — это система поддержания характера генной экспрессии,
но не только гомеотических генов. Она является эволюционно консерватив-
ной системой эпигенетического контроля экспрессии генов.

Контрольные вопросы

1. Что такое гомеозис?

2. В чем состоит явление фенотипической супрессии?

3. Каковы особенности регуляции экспрессии генов Нох'Ч

4. Какие функции у комплекса PcG?

5. Каковы механизмы клеточной памяти?

ЛИТЕРАТУРА

БаттулинН.Р. Генетика развития // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2014. 18.

С. 103-111.

Зарайский А. Г. ЕЮА’-гены в эмбрио- и филогенезе // Онтогенез. 2001. № 32. С. 3-13.

Barral A., Zarct К. S. Pioneer factors: roles and their regulation in development // Trends Genet. 2024.

Vol. 40 (2). P 134-148.

Cavalli G., Pare R. Epigenetic inheritance of active chromatin after removal of the main transactivator
// Science. 1999. Vol. 286 (5441) P. 955-958.

Cunningham M. D., Cause M., Cheng Y., Noyes A., Dorsett D., Kennison J. A., KassisJ.A. Wapl
antagonizes cohesin binding and promotes Polycomb-group silencing in Drosophila // Develop.
2012. Vol. 139. P. 4172-4179.

Edstrom J.E. Masters, slaves and evolution // Nature. 1968. Vol. 220 (5173). P. 1196-1198.
Francis N.J., Kingston R. Е. Mechanisms of transcriptional memory // Mol. Cell Biol. 2001. Vol. 2.
C.409-421.

Gaunt S.). Seeking Sense in the Hox Gene Cluster // J. Dev Biol. 2022. Vol. 10, no. 4. P. 48.

Gehring W J. The master control gene for morphogenesis and evolution of the eye // Genes Cells. 1996.
Vol, 1 (1). P. 11-15.

Mallo M„ Alonso C. R. The regulation of Hox gene expression during animal development // Develop
2013. Vol. 140. P. 3951-3963.

Miller A., Dasen J,S. Establishing and maintaining Hox profiles during spinal cord development //
Semin Cell Dev. Biol. 2024. Vol. 152-153. P. 44-57.

Noro B., belli K., Sun L., Mann R.S. Competition for cofactor-dependent DNA binding underlies Hox
phenotypic suppression // Genes Dev. 2011. Vol. 25 (22). P. 2327-2332.

Wellik D. Al. Hox genes and vertebrate axial pattern // Curr. Top. Dev. Biol. 2009. Vol. 88. P. 257-278

Yekta S., Shih H„ Bartel D. P. MicroRNA directed cleavage of HOXB8 mRNA // Science. 2004. Vol. 304.

P. 594-596.
Глава io

НЕЙРОГЕНЕЗ КАК АВТОНОМНАЯ
ПРОГРАММА РАЗВИТИЯ

Реализацию относительно автономных программ развития можно рас-
смотреть на примере нейрогенеза и сперматогенеза.

Происхождение нервных клеток

Нервная система происходит из дорсальной эктодермы, называемой ней-
роэктодермой. Сигналы, поступающие из мезодермы по средней линии эм-
бриона, приводят к утолщению слоя соседствующей эктодермы и форми-
рованию нервной пластинки. Края пластинки загибаются и в конце концов
смыкаются дорсально, образуя нервную трубку. При ее формировании клет-
ки нервного гребня мигрируют в пространстве между эпидермисом и нерв-
ной трубкой. Передний район нервной трубки формирует головной мозг,
а задний — спинной.

Стволовые нервные клетки называются нейробластами. В появлении
нейробласта решающую роль играет латеральное ингибирование в пределах
монослойной нейроэктодермы. У дрозофилы в эмбриональный период ней-
рогенеза эмбриональные нейроэпителиальные клетки бипотенциальны, они
могут давать нейробласт (стволовую клетку) или эпидермальную клетку.

Механизм латерального ингибирования

в формировании нейробласта

В выборе судьбы нейробласта определяющую роль играет эволюцион-
но консервативная сигнальная система Delta/Notch (рис. 10.1). Взаимодей-
ствие клеток, находящихся в непосредственном контакте, может происходить
на молекулярном уровне благодаря существованию сигнальных молекул:
рецепторов и взаимодействующих с ними лигандов. Межклеточный сиг-
налинг определяет судьбу соседствующих клеток, из которых одна станет
эпидермальной, а другая — нейробластом. Сигнальные молекулы — Notch
как рецептор и Delta, являющаяся лигандом, — на начальном этапе взаимо-
действия клеток присутствуют в обеих клетках. Такое равновесие является
Будущая
эпидермальная клетка

Рис. 10.1. Механизм латерального ингибирования при образовании нейробласта

неустойчивым. Активация Notch при получении сигнала Delta ведет к ре-
прессии пронейральных генов и к уменьшению содержания Delta в этой клет-
ке. Соседняя клетка не получит сигнала активации Notch и, соответственно,
разрешит экспрессию пронейральных генов. Механизм латерального инги-
бирования заключается в следующем: активация рецептора Notch уменьшает
количество лиганда Delta в активированных клетках. А это приводит к тому,
что в соседних клетках не активируется Notch, в результате чего в этих клет-
ках стимулируется увеличение концентрации лиганда Delta.

Предполагаемые механизмы латерального ингибирования различны.

Взаимодействие Notch и Delta приводит к регуляции экспрессии генов-
мишеней (trans-activation).

Семейство белков Notch включает белки-рецепторы, которые располага-
ются на поверхности клеток. У млекопитающих четыре гена-паралога при-
надлежат к семейству Notch (Notch 1-4). Как и большинство трансмембран-
ных рецепторов, белки Notch содержат внеклеточный, трансмембранный
и внутриклеточный домены. Важнейшей составляющей внеклеточных до-
менов белков семейства Notch являются повторы EGF-like (Epidermal Growth
Factor). В районе трансмембранного домена находятся сайты узнавания се-
кретазами, в том числе и у-секретазой. Внутриклеточный домен включает ан-
кириновые повторы, сигнал ядерной локализации — NI.S (nuclear localization
signal), домен активации транскрипции и последовательность PEST (Р — про-
лин, Е — глутаминовая кислота, S — серин, Т — треонин), которая распозна-
ется протеасомами и отвечает за деградацию белка.

Рецепторы Notch активируются при взаимодействии с лигандами се-
мейства Delta или Jagged (у дрозофилы — Serrate). Эти лиганды, как и со-
ответствующие рецепторы, — трансмембранные белки. Они принадлежат
к семейству DSL (Delta, Serrate, Lag2). У дрозофилы — это Delta и Serrate.
У млекопитающих — Delta-like (Dill, D113 и D114) и Jagged (1 и 2). У немато-
ды — Lag2. Лиганды связаны с мембраной клеток, расположенных по сосед-
ству с теми, мембраны которых содержат рецепторы. Связывание рецептора
с лигандом приводит к расщеплению молекулы рецептора, внутриклеточная
часть которого — NICD (Notch Intracellular Domain) — в цитоплазме способна
взаимодействовать с транскрипционным регулятором CSL (назван по первым
буквам в обозначении соответствующих факторов; CBF-1 — у млекопитающих,
Suppressor of Hairless — у дрозофи лы и LAG-2 — у нематоды). Комплекс белков,
включающих CSL, проникает в ядро и активирует или репрессирует экспрес-
сию генов-мишеней, кодирующих транскрипционные факторы (ТФ).

У дрозофилы пронейральные гены принадлежат к комплексу Achaete-
Scute-Complex: achaete, scute, lethal of scute и atonal. Они кодируют эволюцион-
но консервативные ТФ с доменом basic helix-loup-helix (bHI.H). Транскрипци-
онные факторы этого семейства формируют гомо- и гетеродимеры. К этому
семейству относятся и транскрипционные факторы Мах, Мус, Mad, Mnt, Mga
и др. В ДНК генов-мишеней присутствует последовательность CACGTG,
называемая Е-box, с которой взаимодействуют перечисленные ТФ. Смена
партнеров при димеризации факторов расширяет спектр контролируемых
генов-мишеней, а также характер их регуляции, т. е. активацию или репрес-
сию. При высоком уровне Notch клетки становятся эпителиальными за счет
репрессии пронейральных генов.

Условные обозначения Q — эпидермальная клетка;

О — презумптивная эпидермальная клетка; О — презумптивный нейробласт

Рис. 10.2. Спецификация нейробласта:

а — выдавливание в базальном направлении клетки с высоким уровнем пронейральных
генов из слоя клеток нейроэктодермы; б — асимметричное деление нейробласта, контак-
тирующего апикальным полюсом с клетками нейроэктодер.мы (Egger et al,, 2008]
Активация экспрессии пронейральных генов achaete, scute или lethal of
scute запускает генетическую программу формирования нейробласта. В ней-
робластах дрозофилы не экспрессируются гены, кодирующие маркеры ней-
ронов и глии, но работают гены, контролирующие клеточные деления. Для
нейробластов характерен высокий уровень пролиферации, но это не ве-
дет к раку. При высоком уровне пролиферации происходит так называе-
мая прогрессивная рестрикция, в результате которой некоторые нейро-
бласты утрачивают свойство стволовых клеток. Эго ограничивает число
нейробластов.

Клетка с высоким уровнем экспрессии пронейральных генов выдавлива-
ется (деламинирует) в базальном направлении из слоя нейроэпителиальных
клеток (рис. 10.2). Тем самым она становится полярной — ее апикальная
поверхность контактирует с клетками нейроэктодермы. Спецификация ней-
робласта зависит от его положения в нейроэктодерме, времени деламинации
и комбинации тех генов, которые в этом нейробласте работают. У дрозофилы
каждый нейробласт имеет свое название и свой профиль экспрессирующихся
генов.

Асимметричное деление нейробласта

Важнейшими в формировании нейробласта являются процессы, ведущие
к его асимметрии:

1. Изменение в нейробласте ориентации веретена деления на перпендику-
лярный по отношению к слою клеток нейроэктодермы.

2. Эффекторные молекулы или органеллы, влияющие на судьбу дочерних
клеток, в пределах нейробласта распределены неравномерно.

3. Ориентация митотического веретена в результате цитокинеза позволяет
асимметрично распределять детерминанты клеточной судьбы между дочер-
ними клетками.

4. Каждая из двух дочерних клеток обретает свою судьбу в зависимости
от получаемых цитоплазматических детерминант и занимаемой позиции
по отношению к нейроэктодерме.

Рассмотрим эти процессы подробнее.

Ориентация веретена деления играет определяющую роль в специфи-
кации нейробласта. Веретено деления клеток нейроэктодермы направлено
параллельно монослою эктодермальных клеток, в результате деления появля-
ются две одинаковые клетки. Такое деление называется симметричным. При
делении нейробласта веретено деления изменяет ориентацию на перпенди-
кулярное монослою нейроэктодермальных клеток, что позволяет произво-
дить две разные клетки: одна из них сохраняет контакт с нейроэктодермой
и статус нейробласта, а другая — меньшего размера — становится ганглиоз-
ной материнской клеткой — GMC (ganglion mother cell). Маленькая клетка
Нейроэпителиальные клетки

Рис. 10.3. Асимметричное расположение цитоплазматических детерминант
в нейробласте и GMC [Yu et al., 2006 с изменениями]

делится еще раз и дает либо два способных к дифференциации нейрона, либо
две глиальные клетки, либо нейрон и глиальную клетку.

Таким образом, веретено деления нейробласта перпендикулярно слою
нейроэпите;анальных клеток. Плюс-концы астральных микротрубочек (МТ)
удерживаются в районе апикального кортекса нейробласта с участием специ-
ального комплекса белков. В состав апикального кортекса входят следующие
факторы: Bazooka, аРКС и Рагб.

Для судьбы нейробласта важно сохранение связи с нишей — клетка-
ми нейроэктодермы. Ниша является источником внешних стимулов, позво-
ляющих нейробласту сохранять свой статус клетки, способной к делению,
но не способной к дифференциации. Сохранение связи с нишей обеспечи-
вается стабильным расположением одной из центросом (материнской), ко-
торая с участием астральных МТ сохраняет ее связь с клеточным кортексом,
контактирующим с клетками нейроэктодермы (рис. 10.3). Перед делением
нейробласта дочерняя центросома мигрирует и формирует противополож-
ный полюс веретена деления. Фиксированное положение веретена позволяет
осуществлять асимметричное распределение цитоплазматических детерми-
нант, влияющих на судьбу дочерних клеток. Асимметрия веретена формиру-
ет асимметричное распределение цитоплазматических детерминант между
дочерними клетками, из кот орых клетка большего размера сохраняет связь
с нейроэпителиальными клетками и статус нейробласта, а другая (GMC) —
меньшего размера, — получая вместе с дочерней центросомой набор факто-
ров (Prospero, Brat, Miranda, Numb, Partner of Numb и мРНК prosperity встает
на путь дифференциации в нервные клетки.
Апико-базальная субклеточная локализация детерминант связана с мем-
браной, центросомой, полюсом веретена и астральными МТ.

У дрозофилы иейробласты бывают двух типов: эмбриональные которые
(дают начало относительно простой нервной системе личинки) и личиноч-
ные которые (дают начало тысяче нейронов, которые формируют централь-
ную нервную систему взрослой мухи). В отличие от эмбриональных нейро-
бластов, которые с каждым делением становятся все мельче, личиночные
нейробласты после каждого деления восстанавливают свой исходный размер
и могут делиться сотни раз.

Между внутренними и внешними причинами, определяющими асимме-
тричные деления клеток, существуют различия. В первом случае все решает
внутренняя полярность детерминант в клетке, во втором — все зависит
от сигналов, которые получает только одна из клеток, — та, которая контак-
тирует с нишей.

Комплекс Bazooka (РагЗ) и аРКС-Рагб, называемый Par, локализуется
в кортексе на апикальной стороне нейробласта и обеспечивает анико-ба-
зальную ориентацию веретена деления нейробласта (рис. 10.3). Асимметрия
веретена контролируется не только апикальным комплексом Bazooka-РагЗ
и аРКС-Рагб, но и комплексом Gai-Pins-Loco. Эти комплексы ингибирует
репрессор миозина — I.GL (lethal giant larvae). аРКС фосфорилирует и тем
самым инактивирует цитоскелетиый белок LGL. Inscutable (Insc) обеспечи-
вает связь Baz и аРКС. Insc участвует в ориентации веретена, взаимодействуя
с N-терминальной частью белка Pins. Белок Pins на С терминальном участке
содержит три последовательности GoLoco.

Последовательность GoLoco обеспечивает связывание с а-субъединицами
в гетеротримерных G-белках (Gal). Так, на апикальном полюсе нейробласта
формируются сайты прикрепления плюс-концов астральных МТ к корти-
кальному цитоскелету. Функции Pins и Gal эволюционно консервативны
от нематоды до человека. Эти белки взаимодействуют с митотическим вере-
теном через белок, который связывается с МТ, — это белок NuMA, гомологом
которого у дрозофилы является белок Mud (mushroom body defect). G-белки
поддерживают апикальную локализацию Insc, а также комплекса Par и регу-
лируют ориентацию веретена в метафазе. Нарушение G-белков может при-
водить к дефектам локализации комплекса Par и Insc. Таким образом, ком-
плексы Par и Insc обеспечивают связь центросомы с кортексом апикального
полюса нейробласта. Апикальная центросома удерживает соответствующий
околоцентромерный материал (ОЦМ). Перед митозом дочерняя центросо-
ма движется к противоположному полюсу будущего веретена деления. Она
не содержит компонентов апикального ОЦМ и является центром образова-
ния обычных МТ. В метафазе дочерняя центросома накапливает свои ком-
поненты ОЦМ — у-тубулин и киназу Polo. Дочерняя центросома попадает
в GMC, а апикальная (материнская) постоянно сохраняет связь с клеточным
кортексом. Центросомы различаются и по тому, с какими детерминантами
они связаны. Это позволяет не случайно разделять детерминанты «между
дочерними клетками. Поскольку в нейробластах расстояние между апикаль-
ным полюсом веретена и экватором больше, чем между базальным полю-
сом веретена и экватором, получаются две дочерние клетки, различающиеся
по размеру. Большая — нейробласт, маленькая — GMC, способная к диф-
ференцировке.

У дрозофилы среди асимметрично расположенных детерминант суще-
ственное значение имеет мРНК prospero, располагающаяся в базальном кор-
тексе нейробласта (рис. 10.3). Белок Prospero — транскрипционный фак-
тор, содержащий гомеодомен. Для локализации мРНК prospero нужен белок
Staufen и белок Miranda. В состав комплексов РНП, содержащего мРНК
prospero, входят миозин II (Zipper) и миозин IV (Jaguar).

В поздней интерфазе мРНК prospero и белки Inscuteable, Prospero и Staufen
локализованы апикально, но при переходе к митозу белок Inscutable оста-
ется локализованным апикально, а комплекс мРНК prospero, белки Miranda
и Staufen перемещаются и формируют базальный полумесяц. За асимметрич-
ную локализацию детерминант отвечают микрофиламенты, а не МТ. Важно,
что актиновый цитоскелет играет определяющую роль в неслучайном распре-
делении и других локализованных мРНК в клетке. У нематоды локализация
Р-гранул также зависима от актина и независима от МТ.

После митоза белки Stau, Miranda и Numb, а также мРНК prospero, локали-
зованные в базальном кортексе, попадают в GMC. Белок Mira, ассоциирован-
ный с мембраной, нужен для локализации мРНК pros.

Белок Numb как мембран-связывающий белок нужен для формирова-
ния кортекса, с которым взаимодействуют комплексы РНП, содержащие
локализованные мРНК. Белок Mira после попадания в GMC деградирует.
Транскрипционный фактор Pros проникает в ядро GMC, репрессирует гены,
контролирующие клеточный цикл, и активирует гены, контролирующие диф-
ференциацию нервных клеток.

В эмбрионе апикальная сторона каждого нейробласта находится но со-
седству с внеклеточным матриксом, который секретируется клетками ней-
роэктодермы.

Стволовая клетка (нейробласт) делится много раз, a GMC имеет огра-
ничения в пролиферации. GMC становится родоначальницей двух типов
нервных клеток — нейронов и глиальных клеток (рис. 10.4). Нейробласты
(NB — Neuroblast) у дрозофилы могут быть двух типов. Первый тип при
делении дает нейробласт и GMC, которая делится всего один раз, давая два
нейрона или нейрон и глиальную клетку (рис. 10.4, а). Другой тип нейро-
бластов при делении может давать вторичный нейробласт или глиобласт
(рис. 10.4, б). Вторичный нейробласт после деления дает нейробласт и GMC,
которая производит два нейрона. Глиобласт становится родоначальником
глиальных клеток. Соотношение между количеством нейронов и глиальных
клеток разное у беспозвоночных и позвоночных животных. Так, у дрозофилы
Глиальная
клетка

Рис. 10.4. Нейро: енез у дрозофилы:

а — нейробласт (NB — Neuroblast) в результате деления производит NB и GMC с ограни
чением потенциала делений, которая делится один раз и дает две клетки: два нейрона или
нейрон и глиальную клетку; б — NB является родоначальником вторичного нейробласта
(NB) или глиобласта (GB — Glioblast) [Egger et al., 2008]

лишь 10 % клеток мозга приходится на нейроглию, а у позвоночных, по раз-
ным данным, — от 40 до 90 %.

В зависимости от выполняемой функции нейроны делятся на следующие
типы:

1. Моторные, или эфферентные, — передают импульсы из центральной
нервной системы мышечным или железистым клеткам.

2. Чувствительные, или афферентные, — отвечают за передачу сигнала
от различных органов чувств или рецепторных клеток, воспринимающих
внешние стимулы (свет, цвет, температуру, звук, запах, прикосновение, боль,
давление и др.).

3. Промежуточные (интеркалярные), или ассоциативные, — обеспечивают
связь между различными нейронами.

Место контакта между нейронами или между нейроном и другой клеткой
называется синапсом. В районе синапса происходит выход из нервной клетки
эффекторных молекул, называемых нейромедиаторами. Нейроны классифи-
цируют в зависимости от производимого ими нейромедиатора (нейротранс-
миттера).

Глиальные клетки

Глиальные клетки играют важную роль в нейрогенезе. У позвоночных эти
клетки выполняют трофическую, секреторную, опорную, разграничительную
и защитную функции.
У D. melanogaster глию, в зависимости от локализации и функции, приня-
то подразделять на следующие главные типы: 1) поверхностную (perineural
и subpei ineural), которая располагается на поверхности мозга и выполняет
функцию гематоэнцефалического барьера; 2) коргексную, окружающую тела
нейронов, которые занимают поверхностную часть мозга; 3) глию, окру-
жающую отростки нейронов, в том числе и аксоны в нейропилях. Послед-
няя, наиболее гетерогенная группа представлена клетками, выстилающими
нейропиль, — это оберточная (ensheathmg) глия и астроглия. Отдельные
аксоны или их пучки окружены обертывающей (wrapping) глией. Существуют
и специализированные формы, например ковровая глия, располагающаяся
в районе оптического нерва.

У млекопитающих клетки нейроглии делятся на две группы: одни при-
сутствуют в мозге, другие характерны для периферической нервной систе-
мы. Первая группа клеток представлена астроцитами, олигодендроцитами,
эпендимой и микроглией, а вторая — шванновскими клетками. На астроциты
приходится 30 %. Это большие звездчатые клетки с отростками, контактиру-
ющими с нейронами и капиллярами. Олигодендроциты почти также много-
численны, как и астроциты, но они меньше по размеру и с более короткими
отростками. Олигодендроциты присутствуют в составе миелиновых оболо-
чек, изолирующих длинные аксоны. Клетки эпендимы выполняют барьерную
функцию, выстилая желудочки головного мозга и канал спинного мозга. Роль
микроглии — устранение погибших клеток. Шванновские клетки входят в со-
став миелиновых оболочек периферических нервов. Присутствие шваннов-
ских клеток дает возможность для предпочтительного проведения нервного
импульса.

Глиогенез находится под контролем сигнальной системы Delta-Notch.

Пронейральные гены активируются под действием сигнальных молекул
EGF и FGF в стволовой клетке. Потомки этой клетки испытывают латераль-
ное ингибирование, и та клетка, в которой происходит активация проней-
ральных генов, в дальнейшем встает на путь дифференциации, превращаясь
в нейрон, а та клетка, в которой активность пронейральных генов подавля-
ется, превращается в клетки глии (астроциты и олигодендроциты). Проней-
ральные гены не только активируют экспрессию каскада нейронных генов,
но и подавляют экспрессию генов глии.

Высокая степень специализации нервных клеток согласуется с гем, что
в нервных клетках одному гену соответствует многообразие продуктов. Это
позволяет увеличивать функциональное разнообразие продуктов одного
и того же гена.

Огромные размеры нервных клеток и их назначение — обеспечение меж-
клеточной коммуникации и реакция на экзогенные стимулы — определили
особенности регуляции экспрессии генов. Локализованная трансляция в от-
вет на экзогенные стимулы играет определяющую роль в формировании
и функционировании нервной системы.
Экспрессия генов в нейрогенезе

Нейрогенез, как и сперматогенез, в значительной степени зависит от экс-
прессии генов на посттранскрипционном уровне. В нервных клетках это
особенно актуально в нескольких случаях:

1) при делении нейробласта (стволовой клетки);

2) в процессе роста аксона к своим мишеням;

3) при формировании синаптических контактов;

4) в период миграции нервных клеток.

Локализованная трансляция в конусе роста аксона

Длина аксона отдельных нейронов позвоночных иногда достигает более
1 м. Удаленность дистального конца аксона от тела нейрона и относительно
низкая скорость транспорта белков в цитоплазме требуют локального синте-
за определенных белков в том месте, где они необходимы. Наиболее удален
от ядра конус роста аксона, он играет определяющую роль в поиске мишени,
в направлении которой растет аксон.

Ростовой конус аксона содержит набор факторов, необходимых для это-
го процесса. Это позволяет ему реагировать на экзогенные факторы ло-
кальной трансляцией соответствующих мРНК. Внешние факторы Netrinl
и BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) индуцируют синтез (3-актина,
способствуя его полимеризации, a Sema3A (Semaphorin ЗА) и Slit2 — синтез
белков Cofilin и RhoA, участвующих в деполимеризации актина (рис. 10.5).
Регуляция трансляции мРНК, локализованных в ростовом конусе, зависит
от РНК-связывающих белков, которые узнают цис-действующие элементы
в соответствующих мРНК. Другой возможный механизм регуляции транс-
ляции — это изменение длины поли(А)-хвоста. Сверхэкспрессия фактора
СРЕВ, участвующего в регуляции цитоплазматического полиаденилирова-
ния, влияет на рост аксонов.

Поиск аксонами правильного пути к своим мишеням

Дистальный конец аксона (конус роста) способен отвечать на внешние
сигналы (привлекающие и отталкивающие) и расти или поворачиваться
в сторону привлекающего сигнала (рис. 10.5). Это позволяет аксону пра-
вильно находить свою мишень. Установившаяся связь между аксоном и его
мишенью должна поддерживаться. В противном случае аксон, а вслед за ним
и вся нервная клетка, подвергаются деструкции. Дегенерации подвергаются
и те нейроны, аксоны которых по какой-то причине не достигают своих ми-
шеней.
<=>, °

Условные обозначения: -^о — временно нетранслируемые мРНК; — трансляция,
разрешенная при получении аттрактивного сигнала, и синтез факторов, вызывающих
полимеризацию актина; — трансляция, разрешенная при получении рспеллентного
сигнала, и синтез факторов, вызывающих деполимеризацию актина

Рис. 10.5. Конусы роста аксона, достигающие мишень благодаря сигналам извне,
привлекающим (аттрактивным) и отталкивающим (репеллентным):

а — аттрактивные сигналы, индуцирующие трансляцию мРНК actin р-, б — репеллентные
сигналы, вызывающие трансляцию мРНК Cofilin и RhoA [Lin, Holt, 2008]

Каковы же механизмы, позволяющие аксонам находить правильный путь
к своим мишеням? В основе этого процесса лежат динамичные изменения
цитоскелета в конусе роста аксона (рис. 10.5). Прежде всего, это касается ак-
тиновых микрофиламентов, т. е. актина и связанных с ним белков.

Цис-действующие последовательности, участвующие в посттранскрип-
ционной регуляции мРНК, чаще располагаются в некодирующих белок-по-
следовательностях мРНК, таких как 3'UTR, 5'UTR, но могут располагаться
и в кодирующей области, т. е. в районе ORF, или в сохраненном в транс-
крипте интроне. Эти последовательности распознаются транс-действующими
факторами: РНК-связывающими белками или некодирующими РНК. Узна-
ются как специфические нуклеотидные последовательности, так и вторич-
ные структуры, образуемые однонитевой мР1 IK, которая благодаря присут-
ствию взаимнокомплементарных последовательностей может формировать
структуры типа шпилек и стебель-петля. Это позволяет одним и тем же
РНК-связывающим белкам взаимодействовать с разными мРНК не в зави-
симости от присутствия одинаковых нуклеотидных последовательностей,
а благодаря формированию похожих вторичных структур мРНК. Такая воз-
можность увеличивает структурно-функциональную сложность межмолеку-
лярных взаимодействий.
Цис-действующие последовательности в мРНК могут присутствовать
не в одной, а в нескольких копиях, позволяя им взаимодействовать с несколь-
кими одинаковыми РНК-связывающими белками, мультимеризация которых
делает связь более прочной. Несколько разных цис-действующих последова-
тельностей в одной молекуле мРНК обеспечивают взаимодействие разных
транс-действующих факторов, входящих в состав частицы мРНН. Каждый
из транс-действующих факторов может нести самостоятельную функцио-
нальную нагрузку, гем самым повышая пластичность регуляции трансляции.

К транс-действующим факторам относятся и малые некодирующие РНК
(микроРНК), способные привлекать определенные белки. Последователь-
ности, комплементарные микроРНК, в мРНК обычно локализуются в 3'UTR.
В зависимости от степени комплементарности взаимодействующих РНК
(мРНК и микроРНК), мРНК деградирует или формируется комплекс, не до-
пускающий ее трансляцию.

Одни РНК-связывающие белки взаимодействуют с мРНК еще в ядре,
а другие — присоединяются к РНП-частице после ее выхода из ядра, опреде-
ляя судьбу мРНК в цитоплазме. От того, какие белки входят в состав гранулы
мРНП, зависит, куда мРНК будет доставлена, каким образом произойдет ин-
дукция ее трансляции, а также эффективность ее трансляции и деградации.
Гранулы мРНП представляют собой форму существования мРНК в состоя-
нии, временно недоступном для трансляции. В цитоплазме комплексы мРНП
взаимодействуют с моторными белками (динеинами и кинезинами), которые
осуществляют перемещение мРНП по цитоскелетным филаментам (микро-
трубочкам или актиновым микрофиламентам) к месту назначения в клетке,
где мРНК может транслироваться или оставаться в составе PHI 1-комплекса
в недоступном для трансляции состоянии до того момента, пока не получит
сигнал, ремоделирующий частицу мРНП и разрешающий трансляцию входя-
щей в ее состав мРНК.

В составе макромолекулярного комплекса мРНК перемещается к цито-
плазматическим мембране или органелле (например, к митохондрии или
центросоме) в такие области клетки, как конус роста аксона или лидирую-
щая кромка фибробласта, апикальная или базальная мембраны клетки, т. е.
в те участки, где трансляция локализованных мРНК может регулироваться
при получении соответствующего сигнала. Важно, что локализованная транс-
ляция — процесс, который может регулироваться независимо от ядра.

После трансляции мРНК может вернуться в состав гранулы, сохраняющей
ее в состоянии временно недоступном для трансляции, до появления сигнала,
разрешающего трансляцию. Такой механизм обеспечивает долговременное
сохранение носителей информации в определенном месте клетки.

Асимметричная трансляция мРНК fl-actin в конусе роста аксона опреде-
ляет его поворачивание в направлении привлекающего сигнала (рис. 10.5).
Локальная трансляция — процесс более быстрый, чем транспорт 0-актина
по микротрубочкам к месту назначения. Существует еще одна причина,
по которой локализованная трансляция р-актина обладает преимуществом
по сравнению с транспортом ранее синтезированных мономеров р-актина
к месту построения актинового цитоскелета. Предсуществующие мономеры
р-актина часто подвергаются посттрансляционнькм модификациям, таким
как аргинилироваиие или глутатионилирование. Вновь синтезированные
молекулы, не претерпевшие модификаций, более склонны к полимеризации
с образованием актиновых филаментов.

Важно отметить, что локализованный синтез определенных белков в ко-
нусе роста аксона нужен не только для сборки цитоскелета при получении
аттрактивного (привлекающего) сигнала, но и для синтеза факторов, участву-
ющих в разборке цитоскелета при получении репеллентного (отталкивающе-
го) сигнала.

Растущие аксоны обогащены мРНК, кодирующими Р-актин, виментин,
кофилин 1, RhoA, тау (tau) или ADF (actin-depolymerizing factor). К сигналь-
ным белкам, регулирующим локализованную трансляцию в конусе роста
аксона, относятся: netrin 1, Sema ЗА, Slit2, engrailed 1 и engrailed 2, РАСАР
(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide), NGF (nerve growth factor),
BDNF и neurotrophin 3.

На уровне трансляции регулируется и синтез фактора Robo3, который яв-
ляется рецептором секретируемого лиганда Slit. Активация рецептора Robo3
направляет аксоны к средней линии. А это означает, что локализованными
могут быть и мРНК, кодирующие факторы сигнальных путей.

Преимущества локализованной трансляции: этот механизм, с одной сто-
роны, позволяет производить множество копий одного и того же белка в не-
обходимом месте, и с другой — избежать появление конкретного белка в не-
желательном месте во время его транспорта к месту назначения.

У позвоночных локализованную трансляцию выявляют в аксонах, отыс-
кивающих свой путь к мишеням, и не обнаруживают ее в аксонах, уже до-
стигших своих мишеней. Важно отметить, что с участием локализованной
трансляции происходит регенерация аксона после повреждения.

Формирование синаптических контактов

Трансляция локализованных мРНК важна и при формировании синап-
тических контактов. Синаптический контакт на поверхности дендрита про-
исходит с образованием мембранного выроста, называемого шипиком. В ос-
новании шипиков идентифицированы полирибосомы, что подтверждает
трансляцию локализованных мРНК. Среди мРНК, локализованных в дендри-
тах, известны кодирующие нейротрофический фактор МАР2 (microtubule-
associated protein 2), взаимодействующий с МТ; а-субъединицу кальций/
кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (СаМКПа); белок Arc (Activity-
regulated cytoskeleton-associated protein), регулирующий динамичные
изменения цитоскелета; субъединицу NR1 рецепторов NMDAR и кодирую-
щую рецептор АМРА (a-ainino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid).
Оба названных рецептора задействованы в сигнальных каскадах, активирую-
щих трансляцию различных локализованных мРНК в районе синаптических
контактов.

Среди названных мРНК есть такие, которые содержат в 5'UTR последова-
тельность в 62 н., комплементарную длинной некодирующей РНК ВС1 (brain
cytoplasmic 1). Размер РНК ВС1 около 100 н. Она образует ст руктуру стебель-
петля, что позволяет ей участвовать в транспорте по микротрубочкам.

Еще одним цис-действующим элементом, присутствующим в нескольких
разных мРНК, является последовательность A2RE, размером 11 н. Эта по-
следовательность обеспечивает взаимодействие с белком hnRNP А2. Она
обнаружена в мРНК СаМКПа, Аге и neurogranin, причем все эти три мРНК
и взаимодействующий с ними белок hnRNP А2 выявлены в составе одних
и тех же гранул РНП, присутствующих в дендритах.

Особая регуляция возможна и для мРНК МАР2, которая содержит в 3'UTR
последовательность протяженностью 640 н., способную формировать
сложную вторичную структуру, представляющую собой цис-действующий
элемент.

К локализованным относятся и мРНК, которые закодированы в ядре
и важны в нейронах для активности митохондрий, обеспечивающих их
энергетический метаболизм. Эти мРНК транспортируются в районы, обо-
гащенные митохондриями, и зам транслируются. Так, в 3'UTR мРНК CoxIV
(cytochrome С oxidase IV) идентифицирован цис-действующий элемент
в 38 и., имеющий структуру стебель-петля и отвечающий за транспорт этой
мРНК в аксонах.

Известен механизм регуляции трансляции мРНК СаМКПа путем поли-
аденилирования в клетках мозга (рис. 10.6). В 3'UTR мРНК СаМКПа нахо-
дится последовательность СРЕ. В синапсах активация трансляции нужда-
ется в получении соответствующего сигнала. Нротеинкиназы из семейства
Аврора являются компонентами сигнального пути, активирующего транс-
ляцию целого ряда мРНК путем полиадснилирования. Трансляция мРНК
в синапсах, по-видимому, активируется в ответ на стимуляцию глутама-
том — N-methyl-D aspartate (NMDA) — глутаматного рецептора — NMDAR.
В культуре нейронов гиппокампа и клеток нейробластомы при стимуляции
NMDAR индуцируется поток ионов кальция в клетку, что вызывает актива-
цию киназы Aurora, которая в свою очередь локально — вблизи стимулиро-
ванного синапса — фосфорилирует ('РЕВ. Фосфорилирование индуцирует
цитоплазматическое полиаденилирование и трансляцию СРЕ-содержащей
мРНК в определенном месте. Белки, возникающие в результате трансляции,
могут влиять на синаптическую пластичность. Предложенная модель рассма-
тривает механизм репрессии специфических мРНК в дендритах и их быструю
активацию в стимулированных синапсах. Полиаденилирование ряда мРНК
происходит в синапсах при действии глутамата (NMDA), в том числе транс-
ляция репортерной РНК, содержащей 3'UTR мРНК СаМКПа, индуцируется
стимуляцией нейронов гиппокампа при обработке глутаматом.

Синаптическая активность не только стимулирует трансляцию мРНК
в дендритах, но также индуцирует транспорт мРНК CaMKIla, BDNF, Аге
и trkB, — поскольку влияет на цитоскелетные белки в этом районе.

В нейроне наивный и стимулированный синапсы различаются за счет
формирования так называемого места (tag) синапса, который однажды был
стимулирован [Martin, Kosik, 2002]. Ответ синапса на стимуляцию (т. е. пла-
стичность) основывается на узнавании такого tag. Природа тагов неизвест-
на, но для формирования двух форм пластичности — long-lasting long-term
potentiation (L-LTP) — долговременного возбуждения и long-term depression
(LTD) — долговременного торможения — необходим белковый синтез в рай-
оне синапса. При получении сигнала в районе синапса терминаль аксона вы-
деляет в синаптическую щель глутамат, который улавливается рецептором
на поверхности стимулированного синапса, что приводит к активации про-
геинкиназы Aurora. Фосфорилирование белка СРЕВ активирует трансляцию
временно нетранслируемой CPE-содержащей мРНК путем ее полиаденили-
рования.

Рис. 10.6. Регуляция трансляции мРНК в синаптическом шипике путем полиаденилирования
[Richter, Lorenz, 2002]
Для обнаруженных в дендритах мРНК, как до, так и после стимуляции
синапса, преждевременная трансляция имеет обратный эффект на синапти-
ческую пластичность. Если мРНК, претерпевающая транспорт, стимулиру-
ется к трансляции, можно ожидать, что вновь синтезированные белки будут
метить стимулированные синапсы, поскольку их в дендритах много. Белок
СРЕВ может регулировать трансляцию в синапсах, обеспечивая транспорт
CPE-содержащих мРНК в дендриты. В культуре клеток гиппокампа репор-
терные РНК, содержащие СРЕ, транспортируются более эффективно, чем те,
которые их не имеют.

Стимуляция глутаматом синапсов индуцирует полиаденилирование, за-
висимое от СРЕВ, и CPE-зависимую трансляцию. Нейроны, полученные
от нокаутных по СРЕВ мышей, показывают уменьшение, но не полное пре-
кращение транспорта CPE-содержащих РНК. Это говорит о том, что в про-
цесс транспорта вовлечены и другие белки. У мышей четыре гена СРЕВ.
СРЕВ-2 и СРЕВ-3, скорее всего, в функциональном отношении перекрыва-
ются со СРЕВ-1, участвуя в дендритном транспорте РНК.

Локальный синтез белков в дендритах может регулироваться синаптиче-
ской активностью, что важно для памяти и обучения.

В пользу участия СРЕВ в регуляции трансляции локализованных мРНК
рассматривают следующие данные: СРЕВ позволяет активировать белковый
синтез за счет внеклеточных сигналов; может активировать мРНК, которые
временно трансляциопно неактивны; активация может происходить в огра-
ниченном пространстве; ряд мРНК, которые являются мишенями СРЕВ, во-
влечены в клеточный рост, необходимый для формирования структур типа
шипиков.

Одним из модельных объектов, используемых для изучения молеку-
лярных механизмов формирования памяти, является морской брюхоногий
моллюск — аплизия (Ap/ys/а), или морской заяц. Этот моллюск поддается
простейшим формам обучения. Интересно, что у аплизии N-терминальная
часть белка АрСРЕВ действует как прионоподобный домен, который
влияет на возможность образовывать агрегаты. N-терминальная часть
белка способна к конформационным изменениям, поэтому белок АрСРЕВ
может находиться в разных состояниях. Заключения относительно до-
мена, обогащенного аминокислотами Q/N, впечатляют. Нейронная форма
АрСРЕВ функционирует как СРЕВ, но делает это в бинарной системе
через прионоподобное переключение двух функциональных состояний
белка, которые могут создавать долговременные изменения в белке. Та-
ким образом, для аплизии показана двойственная природа синаптической
пластичности.

Поскольку СРЕВ в дендритах вовлечен в локализацию СРЕ-содержащих
мРНК, это рождает предположение о том, что прионоподобные переключе-
ния могут быть важны для функционирования нервных клеток. Возможно,
у млекопитающих нейронные РНК-связывающие бедки в дополнении к СРЕВ
могут играть роль в регуляции трансляции мРНК, важных для формирова-
ния синаптических контактов.

У млекопитающих не выявлено, что белок СРЕВ способен служить при-
оноподобным переключателем, поскольку Q-богатый домен слишком ко-
роткий. Однако среди нейронных белков много таких, которые могли бы
иметь отношение к этому явлению. Например, ряд белков с Q-обогащенным
N-терминальным участком вовлечены в нейрологические нарушения (бо-
лезнь Гентингтона, спиноцеребеллярная атаксия). Если это явление имеет
широкое распространение, то можно предположить распространение модели
СРЕВ-зависимого переключения при образовании синаптических меток.

Спецификой нервной системы является особая роль в регуляции экспрес-
сии генов на посттранскрипционном уровне, что определяет формирование
и функционирование нервных клеток. Сохранение и передача информации
в виде временно нетранслируемых, или локализованных, мРНК обеспечива-
ет относительную автономность в реализации наследственной информации
в ответ на внешние стимулы.

Локализованные мРНК в формировании и функционировании нервной
системы выполняют следующую роль:

1) формируют позиционную информацию в нейробласте;

2) влияют на локальный синтез белков в конусе роста аксона;

3) обеспечиваю! быстрые ответы на поступающие сигналы (формируют
синаптические контакты);

4) регулируют механизмы, задействованные в поведении, памяти и об-
учении.

Контрольные вопросы

1. Что такое латеральное ингибирование?

2. Каков механизм спецификации нейробласта?

3. Как аксоны находят правильный путь к своим мишеням?

4. Какова роль локализованной трансляции мРНК в формировании синаптических контактов?
5, Что представляет собой один из механизмов регуляции трансляции мРНК в клетках мозга?

ЛИТЕРАТУРА

Рябова Е. В., Латыпова Е.М., Сурина И. В., Комиссаров А. Е., Саранцева С. В. Развитие, струк
тура и функции глиальных клеток И Интегративная физиология. 2020. Vol. 1. Р. 202-211.

Arora A., Goering R.. Lo Н. Y. G., Lo J., Moffatt C., Taliaferro J. M. The Role of Alternative Polyadenylation
in the Regulation of Subcellular RNA Localization // Front Genet. 2022. Vol. 12. P. 818668.

Egger B„ Chell J.M., Brand A. H. Insight into neural stem cell biology from flies // Philosoph. Trans.
Royal Soc. 2008. Vol. ЗбЗ. P. 39-56.

Gallicchio L., Olivares G. H., Berry C.W., Fuller M.T. Regulation and function of alternative
polyadenylation in development and differentiation // RNA Biol. 2023. Vol. 20 (1). P. 908-925.
Huang Y.S., Mendez К., Fernandez М., Richter], О. СРЕВ and translational control by cytoplasmic
polyadenylation: impact on synaptic plasticity, learning, and memory // Mol. Psychiatry. 2023.
Vol. 28. P. 2728-2736.

Lin A. C., Holt C.E. Function and regulation of local axonal translation // Curr. Opin. Neurobiol. 2008.
Vol. 18. P. 60-68.

Martin К. C„ Kosik K.S. Svnaptic tagging — who's it? // Nat Rev Neurosci. 2002. Vol. 3 (10). P. 813-
820.

Richter).!')., Lorenz L. J. Selective translation of mRNA at synapses // Curr. Opin. Neurobiol. 2002.
Vol 12. P. 300-304.

Yu F., KuoC.T., JanY.N. Drosophila neuroblast asymmetric cell division: recent advances and
implications for stem cell biology// Neuron. 2006. Vol. 51. P. 13-20.
Глава i i

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ

МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК

Сперматогенез — это процесс развития мужских половых клеток,
в результате которого из диплоидных клеток получаются гаплоидные. Га-
плоидные клетки развиваются до зрелых подвижных сперматозоидов, спо-
собных к самостоятельному существованию вне организма. Сперматогенез
происходит в специальном органе — семенниках — и состоит из четырех
этапов. На первом этапе совершаются митотические деления гониалбласта
с образованием диплоидных сперматогониев, причем число таких делений
у каждого вида животных постоянно. У дрозофилы четыре последователь-
ных деления с неполным цитокинезом приводят к появлению 16 клеток,
образующих синцитий (рис. 11.1). Соматические стволовые клетки цисты
CySC (Cyst Stem Cell) и GSC (Germline Stem Cell), контактирующие c Hub,
являются родоначальниками CPC (Cyst Progenitor Cell) и гониалбласта. Го-
ниалбласт претерпевает четыре последовательных деления, образуя 16-кле-
точную цисту из диплоидных растущих сперматоцитов, которые готовятся
к мейозу. Второй этап заключается в подготовке к мейозу: диплоидные
сперматоциты первого порядка увеличиваются в размерах. Это период
наибольшей транскрипционной активности. Третий этап — мейотический.
Два последовательных деления мейоза у дрозофилы приводят к появлению
цисты, состоящей из 64 гаплоидных клеток, называемых сперматидами.
В результате мейоза формируется циста из 64 гаплоидных клеток, назы-
ваемых округлыми сперматидами.

Синцитиальное развитие мужских половых клеток консервативно — ха-
рактерно не только для дрозофилы, но и для млекопитающих. У млекопи-
тающих межклеточные контакты между продуктами мейоза (сперматида-
ми) способствуют тому, чтобы уравнять гаплоидные клетки, различающиеся
присутствием X- или Y-хромосомы (рис. 11.2). Диплоидные сперматогонии
в результате митозов дают сперматоциты. В результате мейоза каждый спер-
матоцит производит четыре гаплоидные округлые сперматиды, связанные
цитоплазматическими мостиками. В процессе спермиогенеза округлые спер-
матиды превращаются в удлиненные сперматиды. Гаплоидная фаза сперма-
тогенеза у млекопитающих длится 13 дней, а у дрозофилы — семь. Этот этап
сперматогенеза называется спермиогенезом. Он протекает без транскрип-
ции. В период спермиогенеза происходит созревание сперматозоида. На этом
200
Рис. 11.1. Стадии сперматогенеза у дрозофилы

спермашды

Рис. 11.2. Стадии сперматогенеза у мыши

этапе формируются структуры, обеспечивающие подвижность сперматозои-
да, его способность находить яйцеклетку, препятствовать полиспермии и др.

Сперматогенез у модельного объекта дрозофилы очень хорошо изучен. Он
позволяет рассмотреть особенности рефляции экспрессии генов и динамику
изменения органелл в этом процессе развития. Одной из важных органелл
клетки является центросома.

Центросома в сперматогенезе

Биогенез центросомы в сперматогенезе заслуживает особого внимания,
так как именно мужская центросома после оплодотворения у большинства
животных определяет характер делений дробления в эмбриогенезе.

Сперматоциты первого порядка имеют две центросомы, каждая из ко-
торых содержит пару центриолей. Перед вторым мейотическим делением
не происходит дупликация центриолей, как и редупликация ДНК. В спер-
матоцитах второго порядка пара центриолей разделяется на две единичные
центриоли, которые расходятся к противоположным полюсам клетки.

Таким образом, каждый сперматоцит II перед вторым делением мейоза имеет
две центросомы, содержащие по одной центриоли, претерпевает второе деление
мейоза, в результате которого в каждую клетку попадает одна центриоль. Она
становится базальным тельцем при формировании аксонемы. Как только аксо-
нема сформируется, ядра принимают обтекаемую форму и будущие спермато-
зоиды ориентируются головками в направлении выхода из семенников. Затем
включается комплекс индивидуализации, разделяющий сперматозоиды.

Митохондрии в сперматогенезе

У дрозофилы митохондрии в спермиогенезе претерпевают сложный
биогенез. Сначала митохондрии сближаются и взаимодействуют на уровне
мембран. Затем мембраны сливаются и формируется структура, называ-
емая небенкерном (с нем. — «находящийся рядом с ядром») (рис. 11.3, а).

Рис. 11.3. Этапы спермиогенеза у дрозофилы:

а — стадия округлых сперматид, сохраняющих связь за счет цитоплазматических мостиков
(**). Рядом с ядром (длинная стрелка) особая структура — небенкерн (наконечник стрел-
ки), образованная слиянием митохондрий [Riparbelli, Callaini, 20и7]; б — контактирование
аксонемы (указана стрелкой) в районе мембраны с производными митохондрий (малым
(’) и большим (**)) при формировании хвоста сперматозоида [Mamon et al., 2017|; в, в' —
стадия индивидуализации сперматид с характерным движением актиновых конусов (на-
конечник с трелки) в направлении от ядра к кончику хвоста и нротеасомной деградацией
белков, выполнивших свои функции (стрелка) (шкала: 20 мкм) [Zhong, Belote, 2007]
Небенкерн — результат взаимодействия и слияния всех митохондрий в еди-
ный агломерат. Организация мембран митохондрий делает эту структуру
похожей на срез луковицы, поэтому данную стадию сперматогенеза называют
стадией луковицы. Следующий этап преобразований — формирование двух
производных митохондрий: большого и малого. На поперечном срезе видно,
что мембраны аксонемы и митохондриальных производных контактируют
(рис. 11.3, б). В месте контакта митохондриального производного большего
размера с мембраной аксонемы можно видеть электронно-плотные паракри-
сталлиновые тела (рис. 11.3, б). Значение паракристаллиновых тел неизвестно.

Каждое производное митохондрий окружено особыми микротрубочками
(МТ) (рис. 11.3, б), которые располагаются параллельно аксонеме. Эти МТ,
как и аксонемные, выходят из базального тельца.

Малое производное митохондрий отвечает за подвижность актинового
конуса, важного для индивидуализации сперматид. Перед индивидуализаци-
ей сперматид митохондриальная ДНК разрушается в результате активации
эндонуклеазы G и устраняется комплексом индивидуализации. Таким обра-
зом, в эмбрион, как правило, попадает только материнская мтДНК.

У млекопитающих в поверхностном слое митохондриальной капсулы,
окружающей аксонему сперматозоида, локализуется белок SMCP (Mitochond-
ria-Associated Cysteine- Rich Protein), который отвечает за подвижность спер-
матозоида. мРНК Smcp синтезируется в округлых сперматидах, но транслиру-
ется на стадии удлиненных сперматид. Белок SMCP задействован в иммунной
несовместимости при оплодотворении.

До сих пор не существует единого мнения о роли митохондрий в подвиж-
ности сперматозоида. Согласно одной точке зрения, митохондрии являются
источником энергетических молекул для «динеинового» мотора, другой —
источником энергии для движения жгутика служит гликолиз, а митохондрии
обеспечивают окислительно-восстановительные процессы, необходимые для
жизненных функций сперматозоида (Amaral, 2022].

Сперм иогенез

Спермиогенез — это процесс превращения округлых сперматид в зрелые
сперматозоиды.

В период спермиогенеза происходят процессы, готовящие сперматозоид
к участию в оплодотворении. Это компактизация хроматина в результате за-
мены гистонов на протамины, формирование акросомы и аксонемы.

Эти процессы во многом зависят от запасенных мРНК, которые транс-
крибируются в растущих сперматоцитах первого порядка в профазе мейоза
или в гаплоидных округлых сперматидах. мРНК сохраняются во временно
недоступном состоянии для трансляции и транслируются позднее — при
формировании сперматозоида. В контроль спермиогенеза вовлечено много
генов. У грызунов и других млекопитающих транскрипция на стадии окру-
глых сперматид является основным источником мРНК, трансляция которых
обеспечивает спермиогенез.

У дрозофилы большинство мРНК, трансляция которых происходит
в спермиогенезе, транскрибируются в сперматоцитах первого порядка.
На стадии элонгации сперматид ядро приобретает форму каноэ, становится
асимметричным, и ядерные поры располагаются на одной стороне удли-
ненного ядра. На наружной поверхности ядра, со стороны сосредоточения
ядерных пор, можно видеть структуру, называемую плотным телом. Плотное
тело включает МТ и актин-богатые элементы, а также белок, который с ними
взаимодействует, — аниллин. Оно похоже на структуру, называемую у позво-
ночных manchette. Плотное тело, как и manchette у позвоночных, разбирается
при индивидуализации сперматид.

В районе плотного тела присутствует фактор ядерного экспорта мРНК
(NXF1 — Nuclear eXport Factor) и его постоянный партнер — белок (NXT1 —
nuclear transport factor 2-like export 1). Возможно, эта структура является
местом локализации запасенных мРНК, трансляция которых необходима
для формирования головки сперматозоида и его хвоста. Белки, выполнившие
свои функции, в том числе РНК-связывающие, освобождающие мРНК для
трансляции, подвергаются протеасомной деградации (рис. 11.3, в, в').

Протеасомная деградация в спермиогенезе

На заключительной стадии спермиогенеза все белки, выполнившие свои
функции, подвергаются протеасомной деградации. Протеасома — это боль-
шой субъединичный комплекс, который нужен для деградации белков за счет
убиквитин-опосредованной протеолитической системы (рис 11.4).

Большое число генов-паралогов, участвующих в системе протеасомной
деградации, говорит о том, что есть специфичность по отношению к мише-
ням деградации. Это подтверждается и наличием семенниково-специфичных
генов, контролирующих протеасомную деградацию.

Деградация белков через убиквитин-протеасомный путь включает два
этапа: 1) мечение субстрата посредством ковалентного присоединения мо-
лекул убиквитина, т. е. убиквитинирование; 2) деградация меченых белков
в комплексе протеасомы 26S. При этом убиквитин освобождается специ-
альными ферментами — DUBs (deubiquitinating enzymes) — и используется
повторно.

Протеасома — большой субъединичный комплекс, состоящий из катали-
тического кора, — протеасомы (20S) и регуляторной части (193) — регулятора
(рис. 11.4). Протеасомный путь деградации белков используется во многих
процессах, таких как продвижение по клеточному циклу, сигнальная транс-
дукция и детерминация клеточной судьбы. Этот путь важен и для контроля
АТФ-азы
а кольцо

0-кольца

- 19S

а-кольцо

АТФ-азы

Рис. 11.4. Протеасома 26S (каталитический кор 20S и регуляторная часть 19S) обеспечивает
деградацию белков, которые выполнили свою функцию [Цимоха, 2010]

за качеством белков. Коровая частица протеасомы состоит из двух идентичных
наружных a-колец и двух идентичных внутренних (5-колец. Каждое кольцо
имеет семь эволюционно родственных субъединиц (а 1-7 и (51-7), которые фор-
мирую! цилиндр. Регуляторная субъединица состоит из шести гомологичных
субъединиц АТФ-азы из семейства ААА, работающих с белками, разворачивая
их и перемещая во внутреннюю камеру коровой частицы. Функции остальных
двенадцати субъединиц регуляторной частицы не очень хорошо понятны.

Протеасомы нужны для устранения ненужных белков, за счет которых ак-
тиновые конусы могут осуществлять процесс индивидуализации сперматид.

Мутанты по гену Prosa6T (ген, кодирующий семенниково-специфичную
а-субъединицу протеасомы) характеризуются мужской стерильностью, со-
провождающейся нарушением движения актиновых конусов в период инди-
видуализации сперматид. Мутанты имеют аномалии в формировании голов-
ки сперматозоида, что проявляется в нарушении ее морфологии.

Процесс индивидуализации сперматид

У дрозофилы 64 конических комплекса индивидуализации (ICs —
individualization complexes) состоят в основном из актина (см. рис. 11.3 в, в').
Актиновые конусы движутся параллельно аксонеме от ядра к концу хвоста,
захватывая избыток цитоплазмы и митохондрии. В комплекс индивидуали-
зации, кроме актина, входят и другие белки, например динеин. Удлинение
аксонемы не требует обычного процесса внутрифлагеллярного транспорта,
возможно, этот процесс осуществляется благодаря трансляции локализован-
ных мРНК, в том числе тех, которые нужны для формирования актинового
конуса.

Расположение удаляемых гранул, содержащих белки, по отношению к ак-
тиновым конусам изменяется в процессе спермиогенеза. Когда комплекс ин-
дивидуализации только начинает собираться вокруг удлиняющегося и кон-
денсирующегося ядра, перед актиновыми конусами видны гранулы. А когда
комплекс отделяется от ядра, актиновые конусы и iранулы пересекаются,
а затем гранулы движутся позади актиновых конусов. Значит, процесс дегра-
дации продолжается и после прохождения актиновых конусов.

Трансляция локализованных мРНК,
обеспечивающая спермиогенез

В период спермиогенеза экспрессия генов в основном контролируется
на посттранскрипционном уровне, обеспечивая трансляцию мРНК, которые
были синтезированы на стадии растущих сперматоцитов и округлых сперма-
тид. У дрозофилы мРНК, кодирующие тубулин и другие белки аксонемы, ак-
тивно транслируются внутри специализированных карманов (ciliary pocket),
сформированных плазматической мембраной. Эта структура находится
на дистальном (по отношению к ядру) конце растущей аксонемы. С этой
идеей согласуется то, что в районе ciliary pocket присутствуют рибосомы.

Регуляция экспрессии генов

на стадии гаплоидных сперматид у мыши

В сперматогенезе существуют два периода, в течение которых необходима
регуляция экспрессии генов за счет трансляции локализованных и временно
не транслируемых мРНК. Это период мейотических делений и спермиогенез.
Большинство локализованных мРНК в сперматогенезе синтезируется в про-
фазе мейоза I на стадии сперматоцитов первого порядка. Вторым пиком
транскрипции с образованием локализованных мРНК является гаплоидная
ст адия округлых спермат ид. На этой стадии у мыши транскрибируется около
500 генов, продукты которых нужны для спермиогенеза. Долгое время пола-
гали, что у дрозофилы в округлых сперматидах не происходит транскрипции,
но оказалось, что в гаплоидных сперматидах дрозофилы работают' 24 гена,
мРНК которых можно обнаружить в хвосте сперматозоида. Среди них мРНК
гена scotti, продукт которого необходим для нормального формирования ак-
тиновых конусов. мРНК 12 генов образуют «шапочку» на дистальном конце
хвоста сперматозоида; мРНК остальных 12 генов распределены на дисталь-
ном конце хвоста сперматозоида в виде кометы.
Регуляция экспрессии генов в семенниках мыши

У мыши в промоторах многих генов, специфичных для семенников, при-
сутствует последовательность CRE (cyclic AMP response element). Эту после-
довательность узнает белок CREM (CRE-modulator protein). У мышей с деле-
цией гена CREM сперматогенез останавливается на ранних этапах спермио-
генеза, и большая часть постмейотических генов не экспрессируется.

С последовательностью CRE взаимодействуют белки CREM, имеющие
множество изоформ, различающихся по способности образовывать гетеро-
димеры с белком CREB и активироваться при фосфорилировании. На ста-
дии спермапюгониев и сперматоцитов синтезируются укороченные изо-
формы, которые могут образовывать гетеродимеры с CREB, но не способны
к активации, что приводит к репрессии генов-мишеней (рис. 11.5). На ста-
дии округлых сперматид появляются полноразмерные формы белка CREMt,
способные активировать транскрипцию CRE-содержащих генов-мишеней.
На стадии удлиненных сперматид форма CREM-6-CG, взаимодействующая
с CRE, вытесняет CREMt, что приводит к репрессии CRE-содержащих ге-
нов-мишеней.

Гормональные стимулы в сперматогенезе у мыши индуцирую! образо-
вание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Переход аденозин-
трифосфата (АТР) в цАМФ индуцирует накопление последнего и вызывает
диссоциацию неактивного тетрамерного комплекса протеинкиназы А на ре-
гуляторную и каталитические субъединицы (РКА). Каталитические субъ-
единицы РКА фосфорилируют и тем самым активируют факторы CREB
и CREM. Фосфорилированные CREB и CREM образуют гетеродимер и вза-
имодействую! с генами-мишенями, активируя их транскрипцию. CRE —
цис-действующий элемент в 8 н. — TGACGTCA. В сперматидах CREM

Гены мишени

Сперматогонии
сперматоците!

5’ -------- 3'

----- CREM -----------

Альтернативные Альтернативный
промоторы | сплайсинг
мРНК СН£М а, в, х ________________

Альтернативный

Округлые
сперматиды

промотор
5'

CREM

мРНК CRFM г

Удлиненные
сперматиды

мРНК CREM-&CQ

Белки CREM а, Р, х
+ CREB

Рис. 11.5. Регуляция CRE-содержащих генов в сперматогенезе мыши [Steger, 1999]
модулирует транскрипцию генов, зависимую от уровня цАМФ. Гену CREM
соответствуют множество белковых форм: полноразмерных белков (CREMtci,
CREMt, CREMtI, CREMt2), способных к активации CRE-содержащих генов-
мишеней, и укороченных белков (CREMa, CREMp, CREM^) (рис. 11.5). мРНК
CREMa, CREMfl, CREM% появляются в результате альтернативного сплай-
синга и считывания мРНК с альтернативных промоторов. В белках CREMa,
CRF.Mp, CREM\ отсутствуют глутамин-богатые транс-активирующие доме-
ны. Эти факторы образуют с CREB неактивные гетеродимеры или действуют
как репрессоры путем связывания с CRE непродуктивно. Взаимодействуя
с промотором самого гена CREM, эти варианты CREM репрессируют актив-
ность альтернативного промотора. Так происходят негативная авторегуляция
по типу обратной петли и переключение экспрессии генов CREM.

Функции CREM меняются от ингибитора к активатору. Вариантами акти-
ваторов являются белки CREMt, которые отличаются от CREM-ингибиторов
присутствием двух глутамин-богатых доменов, отвечающих за активацию
транскрипции генов-мишеней. В сперматогониях присутствуют мРНК
CREM CREMa, CREMft, CREM%; соответствующие им укороченные фор-
мы белка CREM не позволяют активировать гены-мишени с CRF.. В мей-
озе транскрипт CREMx (активатора) многочисленен, он стабилизируется
под влиянием FSH (Follicule-Stimulating Hormone). В гюстмейотических
округлых сперматидах выявляется только активаторная форма — CREMt.
На более поздних стадиях присутствует альтернативно сплайсированная
форма CREM — CREM-S-CG, сохраняющая последовательность экзона, ко-
дирующую ДНК-связывающий домен. В то же время, при созревании мРНК
CREM-5-CG в результате сплайсинга, вырезается экзон, который кодиру-
ет домен, активируемый фосфорилированием, и глутамин-богатый домен
транскрипционной активации.

Белок CREM-6-CG взаимодействует с CRE и конкурентно блокирует свя-
зывание с CRE гетеродимеров CREM и CREB. У крысы CREM-5-CG найден
в удлиненных сперматидах, возможно, он участник программирования, не-
обходимого для дифференциации сперматид в сперматозоиды.

Мыши с делецией гена CREM стерильны, поскольку нарушается постмей-
отическая экспрессия генов-мишеней, и сперматиды не дифференцируются
в сперматозоиды. Наблюдается гибель клеток в семенниках, хотя уровень
фолликулостимулирующего гормона (FSH) нормальный. У мужчин с об-
структивной азооспермией и нормальным сперматогенезом белок CREM
можно обнаружить в ядрах округлых сперматид. У мужчин с арестом со-
зревания сперматид белок CREM отсутствует. Среди генов-мишеней, регу-
лируемых CREM, могут быть гены transition protein I и protamine I, поскольку
промоторы этих генов содержат CRE.

Промотор гена CREM содержит два участка метилирования; эти участки
промотора CREM могут модулировать его экспрессию в ответ на экологиче-
ские или генотоксические факторы, влияя на фертильность спермы.
мРНК, синтезируемые в сперматогенезе

При созревании З'-конца транскриптов в сперматогенезе часто выбира-
ется более проксимальный сайт иолиаденилирования (PAS). Таким образом,
транскрипты, специфичные для семенников, как правило, короче транскрип-
тов тех же самых генов в соматических клетках. Узнавание проксимального
сайта полиаденилирования в сперматогенезе определяется дополнительными
факторами, которые в соматических клетках отсутствуют. Поэтому прокси-
мальный сайт поли аденилирования не используется в соматических клет-
ках. К особым факторам, участвующим в полиаденилировании транскрип-
тов в сперматогенезе, относятся CstF-50 (Cleavage stimulation factor 50 kDa
subunit) и CstF-64. Эти факторы обеспечивают специфический выбор сайта,
по которому произойдет расщепление транскрипта с его последующим по-
лиаденилированием. В процессе семенниково-специфичного альтернатив-
ного иолиаденилирования принимают участие и другие РНК-связывающие
белки, а также микроРНК. Полагают, что более короткий 3'UTR обеспечивает
большую эффективность трансляции, позволяя за короткое время произво-
дить относительно большее количество белка.

Локализованные РНК в сперматогенезе

У млекопитающих в ранних сперматидах до компактизации хроматина
в головке сперматозоида идет активная транскрипция. Большинство синте-
зированных на этом этапе мРНК являются локализованными и регулируются
на посттранскрипционном уровне.

В 3'UTR транскриптов были выявлены элементы, которые марки-
руют мРНК, транслирующиеся в раннем — AU(U/A)(U/A)UGAGU
и (A/U)AUUA(U/C/G) - и в позднем — (G/A)GUACG(U/C/A)(A/U)(A/U)
и UGUAGC — спермиогенезе.

Замена гистонов на протамины — важнейший этап изменения структуры
хроматина в ядре формирующегося зрелого сперматозоида. Сначала гистоны
замещаются транзитными белками ТР1 и ТР2 (Transition Protein), которые
впоследствии заменяются протаминами — protamines. У дрозофилы замена
гистонов на протамины осуществляется с участием промежуточной формы
белка хроматина — transition protein like (Tpl).

Присутствие протаминов ведет к очень высокой степени компактизации
хроматина в головке сперматозоида.

В округлых сперматидах мыши протаминовые мРНК транскрибируют-
ся на стадии 1-8 (округлых сперматид), а их трансляция происходит более
чем неделю спустя — на этапе удлиняющихся сперматид (стадии 12-15).
Временно нетранслируемые мРНК присутствуют в виде гранул РНП. Раз-
ные цитоплазматические структуры: nuage, митохондриальный компонент,
герминальные гранулы, хроматидные тела — участвуют в деградации, про-
цессинге, локализации и хранении мРНК и нкРНК.

Наиболее представительными белками, взаимодействующими с локали-
зованными мРНК мыши, являются TB-RBP (Testis/Brain RNA-binding protein)
и MSY2. TB-RBP взаимодействует не только с мРНК, по и с РНК, не кодирую-
щими белок. MSY2 — это транскрипционный фактор, узнающий в генах-ми-
шенях последовательность протяженностью 12 н. — CTGATTGGCCAA. Эта
последовательность называется Y-box. На этапе транскрипции MSY2 выступа-
ет как коактиватор, а в дальнейшем сохраняет связь с определенными мРНК,
участвуя в их трансляционной репрессии в цитоплазме. У мыши и других мле-
копитающих три гена кодируют белки, взаимодействующие с последователь-
ностью Y-box в генах-мишенях. Это гены Msyl, Msy2, Msy3. Им соответствуют
пять белковых форм: MSY1, MSY2A, MSYB2B, MSY3L и MSY3S.

В наибольшей степени изучена регуляция экспрессии генов Prml и Ргт2,
которые кодируют проламины 1 и 2. Идентифицированы цис-действующие
элементы в 3'UTR мРНК protamine 1 и 2 и транс-действующий фактор, кото-
рый узнает цис-действующие элементы. У мыши — это белок 26 kDa, называ-
емый ТВ RBP. Он является гомологом белка Translin у человека.

TB-RBP взаимодействует с консервативным элементом в 3'UTR большого
числа мРНК, регулируемых на уровне трансляции не только в семенниках,
но и мозге — мРНК tau, myelin basic protein. TB-RBP репрессирует трансляцию
мРНК и подавляет ее связь с МТ. Этот белок многочисленен в ядрах на ста-
дии пахитены и локализуется в цитоплазме в постмейотических округлых
сперматидах. Существуют и другие РНК-связывающие белки, взаимодейству-
ющие с 3'UTR мРНК protamine 1 и 2.

Белок ТВ RBP взаимодействует с Y- и H-like-последовательностями
в мРНК и прикрепляет мРНК к МТ. Электронно-микроскопические иссле-
дования показали, что белок TB-RBP участвует в транспорте мРНК из ядра
в цитоплазму, а в цитоплазме половых клеток самцов находится в составе
комплексов РНП. Транспорт комплексов РНП осуществляется с участием
кинезин-подобного фактора KIF17b (Kinesin-like Factor).

KIF17b коиммунопреципетируется c TB-RBP и комплексом РНК-белок,
содержащим специфические, регулируемые CREM (сАМР-responsive element
modulator) мРНК. KIF17b служит в качестве молекулярного мотора для ри-
бонуклеопротеиновых комплексов, содержащих TB-RBP. Этот моторный
белок транспортирует группу специфичных CREM-регулируемых мРНК
в постмейотических клетках самцов млекопитающих. KIF17b контролирует
CREM-зависимую транскрипцию в мужских половых клетках и участвует
в локализации соответствующих мРНК, это указывает на связь процессов
транскрипции и локализации специфических мРНК в половых клетках мле-
копитающих.

мРНК-связывающий белок TB-RBP мыши входит в состав комплекса RISC.
Он связывается со специфическими мРНК не только в постмейотических
половых клетках, но и в нейронах. Мишенью TB-RBP в нейронах являются
такие мРНК, как a-Ca2i -calmodulin-dependent protein kinase 11 и ligatin.

KIF17b транспортирует мРНК в трансляционно-репрессированной форме.
Трансляция начинается, когда TB-RBP покидает мРНК.

Сперматогенез имеет некоторые особенности.

Многие гены, которые экспрессируются как в генеративных, так и в со-
матических клетках, дают транскрипты, которые отличаются по структуре.
При их образовании часто используются альтернативные промоторы, а при
созревании мРНК реализуются альтернативные сайты сплайсинга и полиаде-
нилирования. Это приводит к появлению укороченных семенниково-специ-
фичных продуктов. Кроме того, многие генные семейства содержат семен-
никово-специфичные паралоги. Они возникают в результате дупликации
основного гена, принадлежащего к семейству, и претерпевают последующую
дивергенцию, определяющую их специализацию.

Многие мРНК экспрессируются на значительно более высоком уровне
в мейотических и гаплоидных клетках семенников по сравнению с сомати-
ческими, а некоторые транскрипты, специфичные для генеративных клеток
семенников, кодируют укороченные белки, в которых отсутствуют домены,
важные для функционирования в соматических клетках.

Y-хромосома

Особое значение для экспрессии генов в семенниках играет Y-хромосома.

Эта хромосома является уникальной в геноме различных животных.

Y-хромосома имеет следующие особености: состоит в основном
из участков сателлитной ДНК и транспозонов; имеет низкую плотность
белок-кодирующих генов; генетически инертна, что проявляется в отсут-
ствии рекомбинации и ее гетерохроматиновой природе; содержит малое
число участков, гомологичных районам Х-хромосомы; утрата участков
Y-хромосомы не приводит к гибели организма, но, как правило, вызывает
мужскую стерильность.

***

Сперматогенез — это уникальный процесс развития. Его уникальность
заключается не только в том, что он происходит у особей одного из полов,
но и в том, что в течение достаточно протяженного периода времени сложные
морфологические и функциональные изменения происходят в отсутствии
транскрипции. Эти изменения наделяют клетку свойствами самостоятельно-
го одноклеточного организма. На заключительном этапе сперматогенеза, при
формировании зрелого сперматозоида, регуляция экспрессии генов на уровне
трансляции становится определяющей. И поскольку для каждой из локали-
зованных мРНК, как правило, характерны свои пространственно-временные
Контрольные вопросы и литература

особенности регуляции на посттранскрипционном уровне, это определяет
многообразие регуляторных механизмов и участие разнообразных факторов,
обеспечивающих регуляцию.

Контрольные вопросы

1. Перечислите основные стадии сперматогенеза.

2. Какова роль митохондрий в сперматогенезе?

3. Как осуществляется процесс индивидуализации сперматид?

4. Каковы особенности регуляци экспрессии генов в семенниках?

5. Какие РНК в сперматогенезе локализованы?

ЛИТЕРАТУРА

ЦимохаА. С. Протеасомы: участие в клеточных процессах // Цитология. 20)0. Vol. 52.

Р. 277- 300.

Amaral A. Energy metabolism in mammalian sperm motility // WIREs Meeh Dis. 2022. Vol. 14 (5).
P. el 569.

Ernst C., ElingN.t Martinez-Jimenez C.P., Marioni J.C., OdomD.T. Staged developmental mapping
and X chromosome transcriptional dynamics during mouse spermatogenesis // Nat Common.
2019. Vol. 10. P. 1251.

Fabian L., Brill J. A. Drosophila spermatogenesis // Spermatogenesis. 2012. Vol. 2. P. 197-212.

Mamon I.. A., Ginanova V.R., KlivcrS.F., Yakimova A. O., Atsapkma A. A., Golubkova E. V. RNA-binding
proteins of the NXF (nuclear export factor) family and their connection with the cytoskeleton //
Cytoskeleton. 2017. Vol. 74. P. 161-169.

Riparbelli AI. G., Callaini G. Ihe Drosophila parkin homologue is required for normal mitochondrial
dynamics during spermatogenesis H Dev. Biol. 2007. Vol. 303. P. 108-120.

Riparbelli M. G„ Persico V., Callaini G. The microtubule cytoskeleton during the early Drosophila
spermatogenesis // Cells. 2020. Vol. 9. P. 2684.

Steger K. Tranacriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids // Anat.
Embriol. 1999. Vol. 199. P. 471-487

White-Cooper H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis 11
Reproduction. 2010. Vol. 139. P. 11-21.

Yoshida S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems
// Cold Spring Harb Perspect Biol. 2020. Vol. 12 (12). a036186.

Zhong L., Belote J. M. Ihe testis-specific proteasome subunit Prosa6T of D.melanogaster is required
for individualization and nuclear maturation during spermatogenesis 11 Develop. 2007. Vol. 134.
P. 3517-3525.
Глава 12

МНОГОКЛЕТОЧНОСТЬ КАК ПРИЧИНА

ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КЛЕТОК

В РАЗВИТИИ ЖИВОТНЫХ

Основной вопрос генетики развития: как из одной клетки появляется
сложный организм, состоящий из множества различных по морфологии
и функции клеток?

Чтобы ответить на этот вопрос, следует обратиться к первым этапам по-
явления дифференцированных клеток в эволюции животных. Каждый аспект
жизни животных — от морфологии до поведения — требует сотрудничества
тысяч и миллиардов клеток. Почти у всех животных многоклеточное состо-
яние устанавливается посредством последовательных делений одной-един-
ственной клетки — зиготы — и, как правило, по единому плану в каждом по-
колении. Под совместным контролем генома и окружающей среды дочерние
клетки, образующиеся в результате этих делений, меняют форму, мигрируют
и избирательно прикрепляются или отсоединяются, давая начало взрослой
форме тела посредством процесса, известного как морфогенез. Параллельно
процесс дифференцировки клеток под тонким пространственно-временным
контролем определяет разделение функций между конечными типами кле-
ток. Адекватная совместная работа этого клеточного ансамбля, повторяемая
заново в каждом организме из поколения в поколение, имеет основополага-
ющее значение для жизни каждого животного на планете.

Механизмы, необходимые для формирования
многоклеточности

Механизмы, лежащие в основе мноюклеточности животных и простран-
ственно-контролируемой клеточной дифференцировки, вероятно, возникли
еще у предковых одноклеточных форм. Примечательно, что многие гены,
кодирующие белки, необходимые для многоклеточности животных, напри-
мер тирозинкиназы, кадгерины, интегрины и белки внеклеточного матрик-
са, эволюционировали еще до возникновения многоклеточных животных
(рис. 12.1). Следует отметить, что белок Claudin, хотя и представлен как
инновация базальных многоклеточных животных, был идентифицирован
только у Cnidaria. У базальных многоклеточных животных присутствуют
а

Choanoflagellate

Базальные
многоклеточные

Билатеральные

Базальные многоклеточные Билатеральные
Организмы Белки Choanoflagellate Placozoa Porifera Ctenophora Cmdaria C. elegans D melanogaster M. musc.ulus H- sapiens
4
ZO-1 (Poiychaetoid) X • • • - • • •
ZO2 X • • • • • •
р Catenin - • « • • • •
a-catenm X • • * • • »
E-Cadhenn • • • Ml> • • •
Occludin X X X * X X -
Claudin ** ** **• **
Magi 1 - • • * • •
F -actin • • • • •
Integnn (a- and p-) • • • • • • •
lahn • • 4 * 4 • •
FAK (focal adhesion kinasei • • • ♦

Условные обозначения: — белок присутствует; х — белок отсутствует;
-----------частичное наличие белка; * — недостаточно данных

Рис. 12.1. Белки клеточных контактов (а) и их представленность в разных группах
организмов (б) | Wright et al., 2022]
окклюдин-подобные гены, но неизвестно, обладают ли их белковые продукты
теми же функциональными свойствами, что и у билатеральных животных.

Определяющие свойства и правила, необходимые для создания архитек-
туры мноюклеточных организмов, включают развитие адгезивных клеточ-
ных взаимодействий, ориентацию оси деления и способность перемещать
дочерние клетки на большие расстояния. Центральное место во всех этих
свойствах занимает способность генерировать асимметрию (полярность),
координируемую высококонсервативным набором белков, известных как
регуляторы клеточной полярности (рис. 12.2). Комплексы клеточной поляр-
ности, Scribble, Par и Crumbs, считаются нововведением многоклеточных
животных с апико-базальной полярностью.

В целом можно выделить шесть характерных особенностей многоклеточ-
ности животных: 1) регулируемый клеточный цикл и рост; 2) запрограмми-
рованная гибель клеток; 3) межклеточная адгезия и адгезия клеток к субстра-
ту; 4) передача сигналов развития и регуляция генов в ответ; 5) врожденный
иммунитет; 6) специализация типов клеток.

Эти кардинальные особенности многоклеточности берут свое начало
в предке многоклеточных животных и часто являются результатом сочетания
новых генов, возникающих, например, за счет дупликации и дивергенции
с более древними генами.

Одноклеточные реагируют на изменения среды посредством мембран-
ных рецепторов, жгутиков, светочувствительных органелл. Для формиро-
вания многоклеточного организма необходимы три условия: агрегирован-
ность; разделение функций между клетками в таком агрегате; наличие между
агрегированными клетками устойчивых специфических контактов. Модель
возможного происхождения многоклеточности предоставляют, например,
хоанофлагелляты (рис. 12.3).

Некоторые виды, такие как Salpingoeca rosetta, несмотря на то что они
в основном являются одноклеточными жгутиконосцами, способны обра-
зовывать простейшие многоклеточные структуры, в том числе стабильно
прикрепленных клеток в результате ориентированных клеточных делений
из одной клетки-основателя. Жизненный цикл Salpingoeca rosetta включает
одноклеточную бесполую стадию, которая представляет собой одну клетку
с текой, прикрепленную к субстрату, или медленно и быстро плавающие
отдельные клетки, а также два тина многоклеточных колоний (цепочечные
и розеточные), в которых соседние клетки связаны межклеточными мости-
ками. При определенных условиях жгутиконосные клетки S. rosetta также
способны трансдифференцироваться в амебоидные клетки. Голод запускает
половой цикл S. rosetta, в котором диплоидные клетки (медленно плаваю-
щие) подвергаются мейозу, а их генетический материал — рекомбинации,
и полученные гаплоидные клетки (которые также могут делиться бесполым
путем) спариваются анизогамно. Другие виды, такие как недавно описанный
Choanoeca flexa, способны образовывать огромные чашеобразные колонии.
а

Базальные мноюклеточные Билатеральные
Организмы Белки Choanotlagellate Placozoa Porrfera Ctenophora Cnidaria C. elegans D. melanogaster M. musculus H. sapiens
z <££> & О M
Scribble X • X • •
Dig • • • •
Lg! • • • • •
РагЗ X • • ♦ •
Pare X • • • •
аРКС • • • • •
Crumbs X X •
Palsl X X • •
PatJ X • X • •
Prosoero (Proxl) X * X X X • •
Numb X - X •** - • •
Gcu • • • • • • •

Рис. 12.2. Белки апико-базальной полярности (л) и их представленность в разных группах
организмов (б) [Wright et al., 2022]. Условные обозначения см. на рис. 12.1
Рис. 12.3. Возможное происхождение многоклеточное™ на модели колониальной
хоанофлагелляты Salpingoeca roselta |Ros-Rocher et al., 2021 ]

Примечательно, что эти колонии обратимо меняют свою кривизну в ответ
на свет через путь родопсин-цГМФ, представляя поведение, похожее на со-
гласованное движение и морфогенез у многоклеточных животных.

Координация поведения клеток
в многоклеточных образованиях

Необходимость координации в многоклеточных образованиях между раз-
ными типами клеток возникает для выполнения определенных функций от-
дельных клеток. Реакция организма на изменения во внешней и внутренней
среде требует специальных клеток для восприятия — рецепторов. Появле-
ние нервных клеток в организме связано непосредственно с реагированием
на внешние раздражения, т. е. с функцией, которая в первую очередь обна-
руживается в пограничных пластах клеток, отделяющих внутреннюю часть
организма от внешнего мира. Пограничными тканями являются эпителии,
клетки которых имеют полярную организацию. Первые нейроны должны
были обладать этой полярностью и, вероятно, по оси полярности и пошел
импульс от рецепторной точки к эффектору.

Интересные данные предоставил анализ геномов хоанофлагеллят, в част-
ности были идентифицированы гены синаптических белков [Burkhardt et al.,
2014]. У одноклеточной Monosiga brevicollis явно отсутствуют синапсы и нейро-
ны, но этот организм обладает многими важными компонентами для функции
синапсов, известными у животных. Например, потенциал-зависимыми кальци-
евыми каналами, которые очень похожи на те, которые обнаружены в нервных
клетках животных, потенциал-зависимыми натриевыми каналами, важными
для генерации потенциалов действия в нервных клетках животных, и несколь-
кими белками, которые в нервных клетках животных используются для закре-
пления рецепторов нейромедиаторов на постсинаптической мембране, так на-
зываемые белки постсинаптического каркаса, такие как PSD-95, Homer и Shank.
Кроме того, у М. brevicollis идентифицирован нейросекреторный аппарат.

Консервативный набор пресинаптических нейросекреторных белков: бел-
ки SNARE и Muncl8 являются ключевым компонентами механизма высво-
бождения синаптических везикул в нейронах позвоночных. Эти белки лока-
лизуются на апикальной мембране М. brevicollis и могут опосредовать высво-
бождение молекул из везикул. Кроме того, примечательно, что у М. brevicollis
присутствуют гены транскрипционных факторов р53, Мус и Sox/TCF, специ-
фичных для многоклеточных животных. Эти ТФ, возможно, сыграли раннюю
и решающую роль в эволюции предков многоклеточных животных, регули-
руя дифференциальную экспрессию генов, позволяя нескольким типам кле-
ток существовать в одном организме.

На первых стадиях многоклеточности, видимо, изначально имела место
плюрифункциональная сенсорно-сократительная миоэпителиальная клетка
(клетка-основатель нервной системы). После активации апикально распо-
ложенных механосенсорных каналов потенциалы действия генерировались
в ресничках, распространялись вдоль тела клетки и активировали сокраще-
ние базальной части той же клетки. Древние сигналы (такие как глутамат
или ГАМК — гамма-аминомасляная кислота) секретировались латеральным
экзоцитозом и обнаруживались соседними миоэпителиальными клетками,
что способствовало распространению волны сокращения клеток. Первое
разделение клеточных функций привело к различиям между механосенсор-
ными клетками, специализирующимися на восприятии и передаче сигнала,
и сократительными клетками. Механосенсорные клетки сохраняют те же
каналы, потенциалы действия и секрецию; сократительные эпидермальные
клетки — потенциалы действия и сокращения. Дальнейшее разделение труда
клеток привело к различиям между механосенсорными нейронами, которые
исключительно секретируют нейротрансмиттеры, но не реагируют на них,
и интернейронами (или ганглиозными клетками), которые отвечают на ней-
ротрансмиттеры и активируют сокращение миоэпителиальных клеток.

На происхождение плюрипотентности проливает свет анализ транскрип-
томов, судьбы и поведения трех основных типов клеток губок (хоаноцитов,
плюрипотентных мезенхимальных археоцитов и эпителиальных пинакоци-
тов) в сравнении с хоанофлагеллятами и другими одноклеточными голозой-
ными. Этот анализ показал, что транскриптом хоаноцитов губок наименее
похож на транскриптомы хоанофлагеллят и значительно обогащен транс-
криптами, уникальными либо для животных, либо только для губок. Данные
результаты противоречат предположению о гомологии хоаноцитов губок
и одноклеточных хоанофлагеллят. В плюрипотентных археоцитах активи-
руются гены, которые контролируют пролиферацию клеток и экспрессию
генов сходным образом со стволовыми клетками многоклеточных животных,
а также со стадиями пролиферации одноклеточных голозойных животных,
включая колониальных хоанофлагеллят.

Хоаноциты губки Amphimedon queenslandica существуют во временном
метастаби льном состоянии и легко трансдифференцируются в археоциты,
которые могут дифференцироваться в ряд других типов клеток. Эти преоб-
разования типа клетки у губки подобны временным изменениям состояния
клеток, которые происходят у одноклеточных голозойных. В совокупности
эти данные согласуются с тем, что первая животная клетка была способ-
на переходить между несколькими состояниями аналогично современным
трансдифференцирующимся и стволовым клеткам.

Недавние результаты анализа геномов одноклеточных голозойных живот-
ных подтверждают это предположение, причем некоторые геномные осно-
вы плюрипотентности были обнаружены далеко в одноклеточном прошлом
[King et al., 2008]. Геномные инновации, уникальные для многоклеточных жи-
вотных, включая возникновение и расширение ключевых сигнальных путей
и семейств транскрипционных факторов, а также регуляторных классов РНК,
возможно, придали этой предковой плюрипотентной клетке способность
развивать регуляторную систему, посредством которой она могла бы суще-
ствовать в нескольких состояниях дифференцировки, давая начало первому
многоклеточному животному.

***

В эволюции одни пути дифференциации клеток проявляют удивительную
консервативность, при этом в иных случаях может развиваться уникальный
путь дифференциации, характерный для определенной группы животных.
Доступные геномные ресурсы и новые транскриптомные данные, а также
развитие новых методов и технологий, позволят получить более ясную кар-
тину того, как простейшие предки перестали быть представителями микроб-
ного мира и сформировали многоклеточных животных, а также вскрыть
механизмы, лежащие в основе многообразных путей решения одной и той же
задачи в генетике развития.

Контрольные вопросы

1. В чем причина возникновения дифференциации клеток?

2 Какие модельные организмы используются для анализа механизмов возникновения много-
клеточности?

3. Каковы характерные особенности многоклеточности животных?

4. Чем обусловлено появление нервных клеток в организме?

5. Каков основной механизм возникновения новых генов?
Контрольные вопросы и литература

ЛИТЕРАТУРА

Brunet Т„ Arendt D. From damage response to action potentials: early evolution of neural and
contractile modules in stem eukaryotes // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2016. Vol 371 (1685).
P. 20150043.

Brunet T., King N. ihe Origin of Animal muiticellularity and cell differentiation // Develop. Cell. 2017.
Vol. 371 (43). P. 2124-2140.

Brunet T., Larson В. T, Linden T.A., Vermeij M.J. A., McDonald K., KingN. Light-regulated collective
contractility in a multicellular choanollagellate 11 Science. 2019. Vol. 366 (6463). P. 326-334.

Burkhardt P., Gronborg M., McDonald K., SulurT., WangQ.„ King Bl. Evolutionary insights into
premetazoan functions of the neuronal protein homer // Mol. Biol. Evo). 2014. Vol. 31 (9).
P. 2342-2355.

Fidler A. L., Darris С. E., Sergei V., Vadim K., Boudko S.P., Kyle L. B. et al. Collagen IV and basement
membrane at the evolutionary dawn of metazoan tissues // ELife. 2017. Vol. 6. e24176.

Hoffmeyer T. T, Burkhardt P. Choanollagellate models — Monosiga brevicollis and Salpingoeca rosetta
// Curr Opin Genet Dev. 2016. Vol. 39. P. 42-47.

KingN., Westbrook M., Young S. et al. The genome of the choanollagellate Monosiga brevicollis and the
origin of metazoans // Nature. 2008. Vol. 451. P. 783-788.

Ros-Rocher N., Perez-Posada A., Leger M.M., Ruiz-Trillo I. The origin of animals: an ancestral
reconstruction of the unicellular-to-multicel)ular transition // Open Biol. 2021. Vol. 11 (2).
P. 200359.

Sogabe S., Hatleberg W.L., Kocot K.M. et al. Pluripotency and the origin of animal muiticellularity //
Nature. 2019. Vol. 570. P. 519-522.

Srivastava M., Simakov O„ Chapman J. et al. The Amphimedon queenslandica genome and the evolution
of animal complexity // Nature. 2010. Vol. 4б6. P. 720-726.

Wright B. A., Kvansakul M., Schierwater B., Humbert P.O. Cell polarity signalling at the birth of
muiticellularity: What can we learn from the first animals // Front. Cell Dev. Biol. 2022. Vol. 10.
P. 1024489.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генетика развития животных является одним из самых активно развиваю-
щихся направлений в современной генетике. Прогресс в этой области чрезвы-
чайно востребован и в области фундаментальных исследований, и в приклад-
ной области, в особенности в медицине. Знания о генах, контролирующих
развитие, и понимание того, как в каждом конкретном случае разворачива-
ется генетическая программа развития, создает, например, возможности для
восстановления утраченных органов или частей тела человека. В последние
годы был достигнут значительный прогресс в получении индуцированных
плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и органоидов, получаемых на их
основе. Органоиды можно использовать в качестве модели для исследования
фундаментальных процессов развития, регенерации, а также в диагностике,
моделировании заболеваний, разработке лекарственных средств и персона-
лизированной медицине.

Среди генов, контролирующих развитие, многие принадлежат к классу ре-
гуляторов генной экспрессии на самых разных уровнях. Это гены, от которых
зависит организация генетического аппарата в клетке, которые обеспечивают
регуляцию всех матричных процессов в клетке, сохранение, транспорт и дли-
тельность существования макромолекул. Генетика развития пытается найти
ответ на вопрос: как в ряду клеточных поколений в определенной группе кле-
ток сохраняется свойственный этим клеткам уровень и характер экспрессии
генов? И наконец, что является сигналом для тою, чтобы клетка или группа
клеток встали на путь дифференциации. На конкретных примерах показано,
как используются возможности регуляции экспрессии генов на самых разных
уровнях.

Другой важный аспект генетики развития — это генетический контроль
разворачивания конкретных программ развития. Блестящим примером явля-
ется механизм взаимной регуляции включения и выключения генов, контро-
лирующих раннее эмбриональное развитие дрозофилы, демонстрирующий
модульный принцип в организации сложного многоклеточного организма,
при котором в отдельных частях эмбриона разворачивается самостоя гельная
генетическая программа развития. Модульность — характерная черта инди-
видуального развития животных, позволяет определенным частям эмбриона
изменят ься, не затрагивая другие части. Отделение одного модуля от другого
характеризуется гетерохронией (изменением сроков развития одной области
по отношению к другой) и аллометрией (когда различные части организма
растут с разной скоростью). При этом модули развития могут включать не-
сколько типов тканей, в результате коррелированной прогрессии изменение
в одной части модуля вызывает изменения и в других частях, когда меняются
кости скелета, нервы и мышцы, обслуживающие их, также меняются.

По мере развития включаются новые механизмы: переход от материнско-
го к зиготическому геномному контролю, взаимодействия между клетками,
клеточная дифференциация и миграция клеток, эмбриональные индукции,
функциональные взаимодействия на уровне тканей и органов, рост.

Многие гены, контролирующие развитие, являются эволюционно кон-
сервативными. Такие гены часто формируют генные семейства, используя
дупликацию с последующей дивергенцией, что дает возможность осущест-
влять тонкую настройку и специализацию генетических процессов. Ярким
примером эволюции генных семейств являются гены Нох. Они участвуют
в формировании opi анизации частей тела животных на нескольких уровнях
регуляторных иерархий. Ранняя экспрессия генов Нох в различных доменах
вдоль эмбриональной переднезадней (А/P) оси у насекомых, позвоночных
и других животных устанавливает региональную идентичность. В дальней-
шем функция Нох-генов требуется и на более поздних этапах развития для
морфогенеза конечностей и других органов.

В книге внимание сфокусировано в первую очередь на структуре, функ-
ции и регуляции генов, контролирующих развитие, генетическом контроле
реализации конкретных программ развития и эволюционных аспектах ге-
нетики развития, которая сегодня является неотъемлемой частью эволюци-
онного учения. Высокая эволюционная консервативность общих принципов
реализации генетических программ развития всего царства многоклеточных
животных позволяет лучше понять морфологическую эволюцию, опосредо-
ванную модификацией единых регуляторных систем.
ГЛОССАРИЙ

Адгезия клеток — способность клеток слипаться друг с другом и с различными субстра-
тами, обусловленная специфическими мембранными белками.

Генная сеть — группа координированно работающих генов, выполняющих какую-либо
общую функцию,

Герминальные (полярные) гранулы — уникальные РНП-гранулы, характерные для клеток
зародышевой линии и объединяемые под общим термином «зародышевые гранулы» —
безмембранные биомолекулярные конденсаты, в образовании которых ведущую роль
играют процессы фазовых переходов типа «жидкость-жидкость» и «жидкость-твердое
тело».

Гомеозис — превращение одной части тела в другую, которое происходит из-за мутаций
или ошибок экспрессии специфических генов, принимающих участие в развитии.
У животных явления гомеозиса могут быть вызваны мутациями в гомеозисных генах,
у растений — мутациями в генах семейства MADS-box.

Гомеозисные гены (гомеотические гены) — гены, определяющие процессы роста и диффе-
ренцировки в организме. Гомеозисные гены кодируют транскрипционные факторы,
контролирующие программы формирования органов и тканей. Мутации в гомеозис-
ных генах могут вызвать превращение одной части тела в другую.

Зачатковый (зародышевый) путь — ряд поколений клеток от первичных половых клеток
(ППК) зародыша до половых продуктов взрослого организма. Выделение линии поло-
вых клеток является важнейшим событием, так как определяет сохранение и передачу
новым поколениям генетической, а также эпигенетической информации.

Комнартменты — пространственно разграниченные совокупности клеток, также ком-
партментами называются обособленные области в клетке, которые, как правило,
окружены билипидным слоем мембраны.

Латеральное ингибирование — в эмбриологии концепция латерального ингибирования
была адаптирована для описания процессов развития типов клегок. Это система,
при которой экспрессия гена в одной клетке подавляет экспрессию того же гена в со-
седней, что приводит к расхождению клеточных судеб. Латеральное ингибирование
описывается как часть сигнального пути Notch.

Лиганд — химическое соединение, способное к связыванию с рецептором (обычно бел-
ком), что вызывает определенную ответную реакцию со стороны клетки — например,
дифференцировку или запуск апоптоза.

Морфоген — сигнальная молекула, неравномерное распределение которой определяет пат-
терн развития в процессе морфогенеза. Морфогеном может быть любое химическое
соединение или вещество, которое действует на клетки и вызывает специфический
ответ в зависимости от его локальной концентрации.

Онтогенез, или индивидуальное развитие, — это совокупность процессов развития орга-
низма с момента слияния гамет с образованием зиготы и до смерти.
Глоссарий

Паттерн (от англ. — «шаблон», «узор») — определенный способ организации элементов
(например, живых клеток).

Позиционная информация — это сигналы, которые сообщают клетке о ее положении в за-
родыше. Чаще всего такими сигналами служит концентрация биологически активных
веществ — морфогенов. В зависимости от полученных сигналов клетка реализует
ту или иную программу развития.

Полиаденилирование — это процесс присоединения большого количества остатков аде-
нозинмонофосфата к З'-концу первичной мРНК, является частью процессинга мРНК.
Иными словами, поли(А)-хвост — это фрагмент молекулы мРНК, азотистые основа-
ния которого представлены только аденином

Промотор — последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как
стартовая площадка для начала транскрипции. Промотор играет одну из ключевых
ролей в процессе инициации транскрипции.

Примордиальные зародышевые клетки, или первичные половые клетки, — клетки-пред-
шественники зрелых гамет, способные передавать всю генетическую информацию
организма следующему поколению.

РНК-гид (guide RNA) — направляющая РНК, которая «ведет» систему к определенному
району ДНК при использовании CRJSPR-Cas опосредованного геномного редактиро-
вания.

Стволовые клетки — это особые клетки, обладающие способностью дифференцировать-
ся во многие типы клеток, обновляться и размножаться на протяжении всей жизни
организма.

Транскрипционные факторы (факторы транскрипции) — белки, контролирующие про-
цесс синтеза РНК на матрице ДНК (транскрипцию) путем связывания со специфич-
ными участками ДНК.

Цитоскелет — совокупность белковых структур в цитоплазме, составляющих опорно-
двигательную систему эукариотической клетки. Цитоскелет обеспечивает простран-
ственную организацию цитоплазмы, с его помощью осуществляется эндо-, экзо- и фа-
гоцитоз, перемещение органелл, движение самих клеток и др.

Энхансер — генетический цис-элемент, обладающий усиливающим транскрипцию дей-
ствием, — участок ДНК, который после связывания с ним факторов транскрипции
стимулирует транскрипцию с основных промоторов гена или группы генов. Энхан-
серы не обязательно находятся в непосредственной близости и на одной хромосоме
от генов, активность которых они регулируют. Могут располагаться как в 5'-, так
и в З'-положении относительно матричной цепи регулируемого гена и в любой ори-
ентации к ней.

Evo-devo (evolutionary developmental biology) — эволюционная биология развития — новое
направление в понимании эволюции, которое базируется на открытиях в области
молекулярной биологии онтогенеза. Evo-devo не просто объединение эволюционных
представлений с биологией развития, оно прежде всего связано с выдающимися от-
крытиями в области молекулярной генетики онтогенеза, которые, в первую очередь,
относятся к изучению главных регуляторных генов (master control genes), определя-
ющих план строения тела.

ORF (open reading frame) — открытая рамка считывания — последовательность нуклеоти-
дов в составе ДНК или РНК, потенциально способная кодировать белок.
Учебное издание

МАМОН Людмила Андреевна,
ГОЛУБКОВА Елена Валерьевна

ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ ЖИВОТНЫХ

Учебник

Редактор Н. И. Сочивко

Корректоры А. В Фролова, Т. В, Хорошавина
Компьютерная верстка О. Е. Степурко, А. М. Вейшторт
Обложка И. А. Колтушиной

Подписано в печать 11.12.2025. Формат 70х 100 1/14.

Усл. печ. л. 18,37. Тираж 1000 экз. Print-on-Demand. Заказ

Издательство Санкт-Петербургского университета.

199004, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, 11

Тел./факс +7(812)328-44-22
publi$hing(®spbu.ru

publislinig.spbu.ru

Типография Издательства СПбГУ. 199034, С.-Петербург, Менделеевская линия, д. 5.
Книги и журналы СПбГУ можно приобрести
по издательской цене
в интернет-магазине: publishing.spbu.ru
и
в сети магазинов «Дом университетской книги», Санкт-Петербург:
Менделеевская линия, д. 5,
6 я линия, д. 15,
Университетская наб., д. и,
Университетская наб., д. 7'9"11

Справки: +7(812)328-44-22, publishing.spbu.ru

Книги СПбГУ продаются в центральных книжных магазинах, РФ,
интернет магазинах ozon.ru. bookvoed.ru,
chitai-gorod.ru, dk-spb.ru, urss.ru

В электронном формате: litres.ru, stioki.mts.ru
Людмила Андреевна Мамон —
доктор биологических наук, про-
фессор кафедры генетики и био-
технологии Санкт-Петербургско-
го государственного университе-
та. Автор более 100 научных пуб-
ликаций. посвященных функци-
ям белков теплового шока, кон-
тролю расхождения хромосом,
механизмам плейотропного дей-
ствия генов.

Елена Валерьевна Голубкова —
кандидат биологических наук,
доцент кафедры генетики и био-
технологии Санкт-Петербургско-
го государственного университе-
та. Научные интересы автора:
генетика развития, регуляция
экспрессии генов, механизмы
изменчивости.

Почему у змей нет ног, а у комара два крыла, а не че-
тыре? Как сложные организмы развиваются из одной
клетки и как клетки приобретают специализирован-
ные функции? На подобные вопросы отвечает генети-
ка развития — увлекательная и завораживающая об-
ласть науки, которая изучает, как гены контролируют
формирование органов, тканей и структуры тела. По-
нимание генетических механизмов развития является
ключом к пониманию эволюции развития и, следова-
тельно, эволюции жизни в целом. Генетика развития
не только помогает нам понять, как мы становимся те-
ми, кто мы есть, но и открывает возможности для улуч-
шения качества жизни. Это действительно захватыва-
ющая область, которая продолжает удивлять своими
открытиями.

Издание предназначено для студентов и аспиран-
тов медико-биологических специальностей, а также
может быть полезно преподавателям соответствую-
щих дисциплин.

ИЗДАТЕЛЬСТВО
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО

УНИВЕРСИТЕТА

publishing.spbu.ru