Text
                    Основы биохимической инженерии

BIOCHEMICAL ENGINEERING FUNDAMENTALS Second Edition James E. Bailey California Institute of Technology David F. Ollis North Carolina State University McGraw-Hill Book Company New York St. Louis San Francisco Auckland Bogota Hamburg Johannesburg London Madrid Mexico Montreal New Delhi Panama Paris Sao Paulo Singapore Sydney Tokyo Toronto
Дж.Бейли, Д.Оллис ОСНОВЫ биохимической инженерии В 2-х частях 2 Перевод с английского А. А. Кирюшкина Москва «Мир» 1989
ББК 28.07 Б 40 УДК 57.04 Бейли Дж., Оллис Д. Б 40 Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. В 2-х час- тях. Ч. 2. — М.: Мир, 1989. — 590 с., ил. ISBN 5-03-001029-7 Фундаментальный труд, написанный известными американскими специали- стами в области проектирования, разработки и применения процессов, связанных с переработкой биологических материалов и использованием биологических аген- тов, в первую очередь ферментов и клеток. Ои написан с целью заполнить про- бел, часто существующий между биологией и технологией на их пути к био- технологии. В русском переводе книга выходит в двух частях. Вторая часть посвящена собственно вопросам биотехнологии — рассмотрению особенностей биологических реакторов, систем управления и контроля, методов выделения и очистки конечных продуктов, а также экономике биопроцессов. Предназначена для студентов и преподавателей биологических и технологи- ческих специальностей, научных работников, инженеров, работающих в микро- биологической и медицинской промышленности. „ 1901000000—370 Б 041 (01)—89 93—89 ББК 28.07 Редакция литературы по химии ISBN 5-03-001029-7 (русск.) © 1986, 1987 by McGraw-Hill, Inc. ISBN 5-03-001027-0 ISBN 0-07-003212-2 (англ.) © перевод на русский язык, «Мир», 1989
Глава 9 Проектирование и расчет биологических реакторов Знание кинетики биологических превращений и процессов массопередачи (этим проблемам были посвящены гл. 7 и 8) необходимо для понимания основных принципов работы биоло- гических реакторов. Чтобы создать полную картину работы биологического реактора, эти два фундаментальных явления необходимо связать с данными о перемешивании газовой и жид- кой фаз и о контакте между фазами в реакторе. Для реакторов с различными характеристиками течений и перемешивания нужны различные способы проектирования, расчета и масштаб- ного перехода. Из сказанного следует, что нашей основной за- дачей в этой главе должна быть разработка общих подходов к расчету биологических реакторов, в которых учитывалась бы совокупность всех указанных явлений, факторов и характери- стик. При изучении кинетики клеточного роста в гл. 7 мы подчер- кивали сложную, многофазную, согласованную природу про- цессов с участием живых клеток, происходящих в биореакто- рах. В этой связи мы рассмотрели различные приближения и допущения, которые могли бы упростить описание кинетики ро- ста популяций клеток и вывод математических выражений, при- менимых в практических расчетах; в то же время мы стара- лись свести к минимуму погрешности, обусловленные этими приближениями и допущениями. С подобными проблемами мы столкнемся и в ходе изучения методов проектирования, расчета и анализа биологических реакторов. Здесь мы рассмотрим многосторонние взаимосвязи между обсуждавшейся ранее слож- ной кинетикой клеточного роста и сложными процессами тече- ния жидкой фазы (или газожидкостной дисперсной системы), перемешивания и теплопередачи. В этой главе мы изучим влия- ние масштаба процесса или объема реактора на перемешива- ние, структуру течений, явления тепло- и массообмена в реак- торе, а также многостороннее взаимное влияние течений и яв- лений переноса, с одной стороны, и кинетики биокаталитиче- ских процессов, с другой. Основное внимание в настоящей гла- ве будет уделено описаниям контакта взаимодействующих фаз в реакторе и взаимосвязи между характером этого контакта и
6 Глава 9 биохимическими превращениями. Как и ранее при изучении кинетики клеточного роста, для вывода полезных в практиче- ской работе математических выражений нам придется восполь- зоваться обоснованными приближениями и упрощениями. Что касается рассматриваемых в настоящей главе методов приближенного математического описания биореакторов, то в качестве введения к этой теме чрезвычайно полезно рассмотреть Растительные и животные клетки Дрожжи Бактерии Плесени. f Н | Продолжительность клеточного цикла <------------- Репликация хромосомы 10'610'510'* 10'31О'г 1O'J 10' 10г 103 10* Ю5 Ю6 -Н+ +Н -I I I I I I I I I------peSSw, с 10° --------> <----------------------> Элементарные Регуляция химические транскрипции реакции <-------------------- Аллостери ческая регуляция белков Возникновение мутантов <-------> Изменение концентрации ферментов РИС. 9.1. Характерное время биологических явлений и процессов, играющих большую роль в биохимической технологии (по данным Роуэлса [9]). относительные масштабы времени и длины в интересующих нас процессах. Как схематично показано на рис. 9.1 и 9.2, диа- пазоны масштабов времени и длины, которые встречаются при проектировании и расчете реакторов, чрезвычайно широки. Ключ к анализу биореакторов — определение масштабов време- ни и длины для явлений, представляющих наибольший интерес в расчете конкретного реактора. После этого явления с мас- штабами времени или длины, значительно большими или зна- чительно меньшими по сравнению с соответствующими масшта- бами, представляющими основной интерес в данном процессе, часто удается анализировать с помощью относительно простых приближений. С таким подходом мы уже сталкивались при об- суждении приближения квазиравновесного состояния в гл. 3 и
Проектирование и расчет биологических реакторов 7 структурированных моделей клеточного роста в разд. 7.4.1. Здесь же путем сравнения масштабов длины и времени попы- таемся создать четкую картину процессов, наиболее важных при описании биореактора с точки зрения определенного проек- та или анализа. При принятии решения о соответствующем описании реак- тора следует учитывать, кроме того, степень доступности экспе- ______Явления, связанные Молекулярная с течением жидкостей. ^диффузия > Турбулентные вихри Граничные слои -2 -7 + 2 1g (метры) -I -------> "Животные клетки Биополимеры Газовые пузырьки Микроорга- Скопления назмы микроорганизмов, Органоиды растительные клетки Биореакторы Меоаалки Гранулы биокатализаторов РИС. 9.2. Характерные диапазоны длин, часто встречающиеся при проектиро- вании и расчете биореакторов (по данным Коссена [8]). риментальных методов количественной оценки важных транс- портных явлений и химических реакций, а также возможность решения основанных на определенном описании реактора мате- матических моделей с помощью имеющихся методов в числен- ной форме и в приемлемое время. В 9 главе мы увидим, что возможность создания надежных математических моделей биореакторов наиболее реальна в отно- сительно простых ситуациях, когда одна или несколько реакций катализируются одним или несколькими ферментами. Напротив, анализ процессов с участием культур клеток в сложной много- фазной перемешиваемой системе из-за недостатка данных о ки- нетике таких процессов и структуре течений жидкой фазы в настоящее время затруднен. В этой связи становится понятной насущная необходимость новых работ по изучению взаимосвя- зей между биореакциями и течениями в многофазных системах. Не обладая достаточно разработанной теорией этих сложных
8 Глава 9 процессов, мы всегда будем вынуждены в существенной степени опираться на эмпирический подход и осуществлять масштабные переходы только с помощью большого числа экспериментов по- следовательно возрастающего масштаба, причем даже в этом случае всегда существует опасность, что разработанный нами режим будет весьма далек от оптимального. Изучение проектирования, расчета и анализа биореакторов мы начнем с идеальных реакторов периодического действия с полным перемешиванием и проточных реакторов с полным пе- ремешиванием (ПРПП), упоминавшихся ранее в связи с изу- чением кинетики клеточного роста в гл. 7. 9.1. Идеальные биореакторы В разд. 7.1 мы познакомились с идеальными биореакторами с полным перемешиванием. Предполагается, что в таких реак- торах перемешивание настолько эффективно, что концентрации биокатализаторов и условия протекания реакций практически одинаковы в любой точке объема реактора. Это приближение будет справедливым только в том случае, если любые сущест- вующие в реакторе градиенты достаточно малы, так что ло- кальная скорость реакции для данной клетки или данной части- цы биокатализатора в существенной степени не меняется при перемещении частицы катализатора (или клетки) из одной зо- ны реактора в другую. Возможна и альтернативная ситуация, когда частицы биокатализатора очень быстро циркулируют между различными зонами реактора, и тогда расчет реактора на базе усредненных условий, считающихся одинаковыми во всем объеме реактора, обычно дает удовлетворительные резуль- таты. Эта ситуация может реализоваться (в зависимости от ти- па изучаемого процесса) в лабораторных и даже в пилотных промышленных установках небольшого объема. Напротив, при росте культур филаментозных организмов или организмов, продуцирующих внеклеточные полимерные соединения, и при высокой плотности организмов культуральная жидкость при- обретает в высшей степени неньютоновские свойства, поэтому даже в случае небольших лабораторных реакторов система ни- когда не приближается к режиму идеального перемешивания. Изучение теории идеальных биореакторов с полным переме- шиванием важно с нескольких точек зрения. Во-первых, такие реакторы обеспечивают достаточно определенные условия, что необходимо для изучения кинетики соответствующих процессов в лабораторных условиях. Во-вторых, модели на основе идеаль- ных реакторов часто могут сравнительно успешно применяться даже в тех случаях, когда требуемые этими моделями условия выполняются не полностью. Наконец, реакторы с полным пе-
Проектирование и расчет биологических реакторов 9 ремешиванием являются отправной точкой для изучения и оп- ределения параметров реакторов с неполным перемешиванием и со значительной объемной неоднородностью условий реакций. Как мы увидим позднее, иногда в лаборатории удается рассчи- тать и смоделировать крупномасштабные реакторы с неполным перемешиванием, воспользовавшись модельными системами, состоящими из каскада взаимосвязанных реакторов. Прежде все- го мы рассмотрим идеальные реакторы периодического дейст- вия и идеальные ПРПП, с которыми познакомились в разд. 7.1, а затем перейдем к изучению идеальных реакторов полного вы- теснения (с поршневым потоком), в которых обратное переме- шивание (осевое смешение) пренебрежимо мало. 9.1.1. Реакторы периодического действия с добавлением субстрата Часто в ходе микробиологического процесса возникает не- обходимость во введении в биореактор периодического действия потоков жидких веществ, например растворов предшественни- ков синтезируемых продуктов метаболизма, соединений с регу- ляторной активностью (в частности, индукторов, потребность в которых может возникнуть только в определенный момент про- цесса), растворов веществ, способствующих поддержанию низ- ких концентраций питательных веществ (в частности, для по- давления катаболитной репрессии), или растворов питательных веществ (что позволяет увеличить продолжительность стацио- нарной фазы и тем самым повысить выход продукта). Когда поток жидких питательных веществ поступает в реактор, есте- ственно, изменяется и объем культуры; этот факт необходимо учитывать и в уравнениях, описывающих работу реактора. Пусть F(t)—объемная скорость поступающего в реактор рас- твора питательных веществ во время t, a Cif(t)— концентра- ция компонента i в этом растворе; тогда уравнение материаль- ного баланса по компоненту i можно записать в такой форме l + F(t)-cll (9.1) Если принять, что и плотность поступающего в реактор раство- ра, и плотность культуральной жидкости в реакторе равны р, то уравнение полного материального баланса содержимого ре- актора примет вид (9.2) (Как можно модифицировать это уравнение, чтобы в нем учи- тывалось различие плотностей поступающего в реактор раство-
10 Глава 9 ра и содержимого реактора, обусловленное, например, аэраци- ей культуральной жидкости?) При условии, что р практически не меняется в ходе периодического процесса, уравнение (9.2) упрощается -^- = Г(0 (9.3) Дифференцируя выражение, стоящее в левой части уравне- ния (9.1) (с учетом того, что Vr теперь является функцией от времени), и подставляя dVRldt из уравнения (9.3), после пре- образований можно получить следующее удобное рабочее вы- ражение для материального баланса по компоненту i: d-ci _ F (0 r„ z,.i I f ---------— fo,-C,]+r,( (9.4) Уравнения (9.3) и (9.4) описывают материальный баланс по всему содержимому реактора и одному из компонентов соот- ветственно. Если известны математические выражения, описы- вающие кинетику rfi, то эти уравнения можно использовать для моделирования влияния различных режимов введения веществ F(t) на работу реактора. 9.1.2. Реакции в ПРПП, катализируемые ферментами В зависимости от способа обеспечения ферментативной ак- тивности при осуществлении катализируемых ферментами ре- акций используются ПРПП различных конструкций (рис. 9.3). В проточном реакторе простейшей конструкции ферменты по- стоянно вводятся в реактор и выводятся из него по соответст- вующим линиям (рис. 9.3, а). Очевидно, такая конструкция оправдана только в том случае, если ферменты настолько де- шевы, что их расходом можно пренебречь. Более дорогостоящие ферменты необходимо удерживать в реакторе или возвращать в него путем рециркуляции. Ознако- мившись в гл. 4 с методами иммобилизации ферментов, мы уже знаем, что эту цель можно достигнуть несколькими путями. Во-первых, (рис. 9.3, б) на пути вытекающего из реактора пото- ка можно установить ультрафильтрационную мембрану с пора- ми, диаметр которых позволяет удерживать относительно боль- шие молекулы ферментов в растворе. Если фермент иммобили- зован на частицах нерастворимого носителя, суспендированного в реакционной смеси, то для предотвращения потери фермента с вытекающим из реактора потоком достаточно установки про- стого сетчатого фильтра (рис. 9.3, в). Принцип другого подхода к удерживанию иммобилизованных ферментов в реакторе схе- матично изображен на рис 9.3, а; здесь фермент удерживается в
Проектирование и расчет биологических реакторов 11 сетчатых контейнерах, укрепленных на валу мешалки. Реакто- ры такой конструкции, широко применявшиеся также для изу- чения реакций в газовой фазе на металлических катализаторах на носителях, позволяют свести к минимуму сопротивление мас- сопередаче между жидкой фазой и гранулами иммобилизован- ного фермента. Та же цель может быть достигнута и более удобным путем — посредством циркуляции реакционной смеси РИС. 9.3. Схематическое изображение ПРПП различного типа, применяемых для проведения катализируемых ферментами реакций. а — реактор с непрерывной подачей раствора ферментов; б — реактор с удер- живанием ферментов в растворе с помощью полупроницаемой мембраны; в — реактор с удерживанием гранул иммобилизованного фермента с помощью сет- чатого фильтра; г — реактор с удерживанием гранул иммобилизованного фермента в контейнерах, размещенных на валу мешалки; д—реактор с ре- циркуляцией реакционной массы через короткую колонну, наполненную им- мобилизованным ферментом. в системе реактор с полным перемешиванием — короткая ко- лонна с насадкой иммобилизованного фермента (рис. 9.3, д). Если скорость рециркуляции достаточно высока и в каждом цикле при однократном прохождении реакционной смеси через колонну превращению подвергается небольшая часть субстрата (менее 1%), то вся система становится эквивалентной проточ- ному реактору с полным перемешиванием [4]. Отсюда следует, что эта конструкция реактора особенно удобна для изучения кинетики реакций в лабораторных исследованиях. Рециркуляция фермента возможна только при условии, что фермент легко выделить из вытекающего из реактора потока продуктов реакции. Есть два перспективных подхода к реше- нию этой задачи, один из которых связан с включением фер- мента в мембрану из жидкого поверхностно-активного вещест-
12 Глава 9 ва или фосфолипида, а второй — с иммобилизацией ферментов на магнитных носителях. Независимо от типа и конструкции реактора основная зада- ча всегда сводится к поддержанию заданной концентрации фер- мента в ПРПП. Если эта задача решена, то мы можем скон- центрировать наше внимание на расчете концентраций субстра- та и продукта реакции в вытекающем из реактора потоке. Здесь применимы рассмотренные выше общие принципы и уравнения материального баланса, используемые для описания роста по- пуляции микроорганизмов, а также дополнительные ограниче- ния, налагаемые относительно простой стехиометрией изучае- мых реакций. Например, для простой реакции S —Р из каждого моля прореагировавшего вещества S образуется один моль вещества Р, и, следовательно, концентрации этих ве- ществ на входе в реактор (s0, р0) и на выходе из реактора (s, р) связаны соотношением s0 — s=p — ро (9.5) Если условие уравнения (9.5) выполнено, то скорость реакций v(s, р), которая является функцией как s, так и р, можно вы- разить только через s, что упрощает соответствующие выраже- ния. В этом случае уравнение материального баланса по суб- страту принимает форму E(s0 — s) — Vrv{s, po + so — s)=0 (9.6) В табл. 9.1 даны решения этого уравнения для различных ти- пов кинетики реакций. Приведенные в таблице уравнения про- ще использовать непрямым путем; для этого нужно в правую часть уравнения перенести необходимые параметры превраще- ния субстрата и рассчитать искомое время пребывания и (или) концентрацию фермента. Аналогичными способами можно по- лучить уравнения для более сложных реакций и типов кинетики превращений. 9.1.3. Проточные реакторы с полным перемешиванием для культур клеток и пристеночный рост клеток Для повышения выхода биомассы и продуктов жизнедея- тельности организмов в единице объема реактора в единицу времени ПРПП можно снабдить сепаратором (гл. 11) и устрой- ством для рециркуляции концентрированной суспензии клеток. В соответствии с принятыми на рис. 9.4 обозначениями, симво-
Проектирование и расчет биологических реакторов 13 Таблица 9.1. Зависимости между степенью превращения субстрата 6= (s0—s)/s0, средним временем пребывания и концентрацией катализатора в случае катализируемых ферментами реакций в ПРППа Уравнение, описывающее скорость реакции Уравнение, описывающее Vvm3x/F в ПРПП Уравнение Михаэлиса — Мен- тен: ^maxs Уравнение Михаэлиса — Мен- тен для обратимой реакции: ртах($—Р/К) К-р Конкурентное ингибирование продуктом реакции: _____^тах$____ а~1гКт( Ингибирование субстратом: ^тах о АГ„ , л । ^т(Ро + so5) О Кт + so — dso Н" 1 -d(l+ 1/К) А Г v । х । 4~ Sq6) О Лт > S0 os0 -р 1-6 а Messing R. A., Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, p. 158, table 1, Acade- mic Press, New York, 1975. лами Fo и Fr мы будем обозначать объемные скорости потоков поступающих в систему питательных веществ и рециркуляции соответственно, а символами хь х0 и х— концентрации био- массы в реакторе, рециркулирующем потоке и в выходящем из реактора потоке соответствен- но. Эти величины могут разли- чаться в силу специфики рабо- ты сепаратора (которым мо- жет быть, например, отстой- ник), расположенного в точке разделения потока, вытекаю- щего из реактора. При а — = Fr/F0 и Ь=х0/х( в стацио- нарном состоянии уравнение материального баланса по Гг,Л0 РИС. 9.4. Схема ПРПП с рецир- куляцией.
14 Глава 9 биомассе для системы с рециркуляцией выглядит следующим образом: FrXo+цх!^— (Fo+Frjx^G (9.7) Тогда общая (или внешняя) скорость разведения D (равная Fo/Vr) составит: Поскольку концентрация микроорганизмов в циркулирую- щем потоке обычно выше концентрации на выходе из реактора, то Ь>1. В этом случае, как показывает уравнение (9.8), ско- рость разведения выше удельной скорости роста организмов. Следовательно, рециркуляция при той же скорости роста орга- низмов позволяет перерабатывать за единицу времени больше питательных веществ в единице объема реактора. Эта особен- ность проточных реакторов с рециркуляцией с большим успе- хом используется в процессах биологической переработки от- ходов, подробнее рассматриваемых в гл. 14. (Каков эффект рециркуляции при 6=1? Объясните физический смысл получен- ного вами результата.) Другие важные преимущества системы с рециркуляцией об- наруживаются после ряда преобразований уравнений материаль- ного баланса по компонентам системы. Если принять, что эко- номический коэффициент постоянен, то уравнение материально- го баланса по субстрату можно записать в виде О(5»-«)--^ = 0 (9-9) Из уравнений (9.9) и (9.8) нетрудно найти, что скорость обра- зования биомассы в единице объема реактора (pxi) равна: |iK(s0 —s)_ (910) г 1 1 -а (&- 1) Эта величина больше скорости образования биомассы без ре- циркуляции в [1—а(Ь—I)]-1 раз. Если принять, что ц подчи- няется уравнению Моно, то можно показать, что и скорость разведения в точке вымывания при рециркуляции возрастает во столько же раз. В экспериментах с растущими популяциями клеток в ПРПП иногда и в отсутствие рециркуляции можно добиться более вы- соких скоростей разведения без вымывания по сравнению с ве- личиной, предсказываемой теорией идеальных ПРПП (вспом- ните разд. 7.1.2). Это явление может быть обусловлено ростом организмов на стенках реактора (так называемым пристеноч- ным ростом). В общем случае в реакторе может быть несколь-
Проектирование и расчет биологических реакторов 15 ко центров образования твердых пленок организмов. Колонии микроорганизмов могут возникать, например, над уровнем жид- кой фазы там, где разбрызгиваемые капли культуры попадают на стенки резервуара, или в трещинах и щелях в относительно неперемешиваемых (застойных) зонах биореактора. Если допу- стить, что концентрация клеток в пленках на стенках реактора Xf постоянна во времени, то размножение организмов в этих пленках должно сопровождаться переносом клеток со стенок в жидкую перемешиваемую культуру. В этом случае уравнения материального баланса для стационарного состояния в проточ- ном реакторе примут следующую общую форму: Dx = nx+nfXf (9.11) D(s0—s) = -t-iix+-±- pfXf (9.12) Здесь pf и Yf — удельная скорость клеточного роста и экономи- ческий коэффициент в пленке соответственно. Эти параметры по целому ряду причин отличаются от соответствующих пара- метров основной массы культуры ц и У, в том числе из-за влия- ния диффузии на скорость реакции. Здесь необходимо отметить, что слагаемое р/Х/ в уравнении (9.11) отражает второй источник поступления клеток в культу- ральную жидкость, который практически не зависит от D, по- этому пристеночный рост организмов предотвращает вымыва- ние. В этой связи следует также подчеркнуть, что у лаборатор- ных реакторов отношение поверхности к объему значительно выше, чем у крупномасштабных промышленных реакторов, и, следовательно, вклад пристеночного роста в лабораторных уста- новках также в общем случае должен быть большим. Таким образом, для систем, в которых наблюдается существенный пристеночный рост организмов, последний необходимо учиты- вать при масштабном переходе от данных по кинетике роста микроорганизмов, полученных в лаборатории, к промышленным реакторам большого объема. 9.1.4. Идеальный трубчатый реактор полного вытеснения (ТРПВ) Если при течении жидкости по трубопроводу сравнительно большого диаметра или по каналу число Рейнольдса достаточ- но велико (например, больше 2100 для трубы), то течение в такой системе приближается к режиму полного вытеснения (поршневому потоку), при котором в поперечном сечении пото- ка осевые скорости не изменяются. Если допустить, что режим полного вытеснения приближенно описывает движение жидко- сти через реактор, то, воспользовавшись понятием об элемен-
16 Глава 9 тарном объеме, можно вывести уравнения материального ба- ланса по компонентам системы в трубчатом реакторе полного вытеснения (ТРПВ). Как показано на рис. 9.5, при таком под- ходе принимается, что в трубчатом реакторе стационарное со- стояние сохраняется в элементарном объеме потока, перпенди- кулярном оси реактора. Материальный баланс произвольному компоненту С в элементарном выразить следующим уравнением: по некоторому объеме можно Аис —Аис г + AAzrfc (9.13) г+Дг Здесь г/с — скорость образования через его количество в единице = 0 Z компонента объема за единицу времени. z z + ZJz С, выраженная ис|2 и ИС\г+Л и z= О z = L РИС. 9.5. Реактор полного вытеснения. Преобразование и деление на ЛДг дает lz+Дг ис 1г_______________________, ------------- (9.U) Az Вспомнив определение производной, нетрудно найти, что в пре- деле это уравнение преобразуется, давая в окончательном виде („<;) = Г (9.15) dz Если в результате реакции плотность жидкости не изменяется (справедливо ли это допущение для микробиологического про- цесса?) и если осевая скорость постоянна, то уравнение (9.15) принимает вид: de dz Величина z/w равна времени, которое затрачивает элементар- ный объем жидкости на движение от входа в реактор до осе- вого положения z. Если в качестве новой независимой перемен- ной использовать время движения элементарного объема t, равное (9.16) t== — и (9.17)
Проектирование и расчет биологических реакторов 17 то уравнение материального баланса по компоненту С примет вид: de (9.18) Последнее уравнение полностью совпадает с уравнением мате- риального баланса по компоненту С в реакторе периодического действия. Приведенное выше математическое доказательство можно дополнить следующей аргументацией: в режиме поршне- вого потока при постоянной скорости каждый элементарный объем жидкой фазы движется вдоль трубчатого реактора без какого-либо взаимодействия с соседними объемами. Следова- тельно, система полностью сегрегирована, и каждый элементар- ный объем ведет себя как реактор периодического действия. Отсюда следует, что если исходная смесь в реакторе периоди- ческого действия имеет тот же состав, что и смесь, подаваемая в реактор полного вытеснения, и если среднее время пребыва- ния Lfu в последнем равно времени реакции в реакторе перио- дического действия, то и вытекающая из трубчатого реактора масса будет идентична по своему составу продукту в реакторе периодического действия. Этой модели отвечает граничное условие с ~cQ (9.19) z=0 Здесь г = 0 отвечает точке ввода исходных веществ в реактор, а с0 — концентрация компонента С в исходной смеси. Допустим, например, что кинетика процесса в хемостате Моно не отличается от кинетики процесса в ТРПВ (или в экви- валентном реакторе периодического действия). В этом случае уравнения материального баланса по клеточной массе и субст- рату [уравнение (9.18)] преобразуются следующим образом: dx PmaxXS dt s -f- Ks ds _ 1 PmaxXS ~dT~~ Y s+Ks с начальными условиями %(0)=Xo s(O)=so Логическим путем или посредством преобразования уравнений (9.20) и (9.21) нетрудно найти, что концентрации s и х связа- ны стехиометрически х+ Уз = %о+ (9.23) (9.20) (9.21) (9.22) 2-746
18 Глава 9 Если при помощи уравнения (9.23) выразить х через s и под- ставить полученное выражение в уравнение (9.21), то мы полу- чим обычное дифференциальное уравнение: __ Ртах 1хо Т~ Е (s0 s) ] S dt ~ Y s + Ks ' Это уравнение при условии (9.22) можно интегрировать анали- тическим путем; тогда получим: +Y («,+К.) In _ К,у In 2- - (x0+1%) Л0 d0 (9.25) Концентрации субстрата на выходе из реактора отвечает зна- чение 5 при t=Lju-, соответствующее значение х легко найти с помощью уравнения (9.23). Если считать, что уравнение (9.20) описывает кинетику периодического процесса, нетрудно видеть, что эта математическая модель не учитывает лаг-фазу и фазу отмирания клеток, но отражает стационарную фазу клеточного роста. В отличие от ПРПП стерильность исходных веществ в ТРПВ автоматически предполагает и нулевую концентрацию биомас- сы на выходе из реактора, поскольку поршневой характер по- тока предотвращает инокуляцию движущегося по трубчатому ре- актору элементарного объема жидкости. Этот недостаток мож- но устранить, например, путем предварительной инокуляции по- ступающего в реактор потока исходных веществ. Не представляет затруднений интегрирование уравнений ма- териального баланса по отдельным компонентам в реакторе полного вытеснения; таким образом можно получить выраже- ния, описывающие связь между концентрациями компонентов в продуктах и общим временем пребывания в реакторе L/u для некоторых обычных реакций, катализируемых ферментами. Ре- зультаты таких расчетов приведены в табл. 9.2. Сравнительные характеристики идеальных ПРПП и ТРПВ зависят от типа осуществляемых в них реакций и их кинетики. При протекании одностадийной реакции с обычной кинетикой (когда скорость реакции снижается при увеличении превраще- ния субстрата; примером могут служить реакции, описываемые уравнением Михаэлиса — Ментен) ТРПВ обеспечивает более высокую степень превращения субстрата и большую концентра- цию продукта реакции на выходе из реактора по сравнению с ПРПП равного объема. Для автокаталитических реакций (ког- да скорость реакции возрастает при снижении концентрации субстрата) справедливо обратное соотношение характеристик ТРПВ и ПРПП. В микробиологических процессах ТРПВ обыч-
Проектирование и расчет биологических реакторов 19' Таблица 9.2. Взаимосвязь между степенью превращения субстрата 6= (s0—s)/s0 и важнейшими параметрами ферментативных реакций в ТРПВа Данные относятся к ферментам в растворе или к гранулам иммобилизованных ферментов с пренебрежимо малым сопротивлением массопередаче; для ферментов в растворе выражение (1—е)/е равно единице Уравнение, описывающее скорость реакции и Уравнение, описывающее [(1— е)/е] • [Lv;nax/u] в ТРПВ Уравнение Михаэлиса — Мен- тен: ^тах5 s06—Amln(l -б) Уравнение Михаэлиса — Мен- тен для обратимой реакции: flmax(s—Р/К) Кт + s + Ктр!Кр s° G \т — ~' \ Ар / L — ^Ат + $о + 1п(1 — &б) \ А р / 0 , К + 1 где b = К Конкурентное ингибирование продуктом реакции: Атах$ H-Km(l + P/Ki) So6-^ [6-{-ln(I — б)]- \ Ai / / Am \ — 1 Am + So + „ Po I ln( 1 \ Aj J Ингибирование субстратом: gmar 1 4" Kmls + s/Ki ( 62 \ S06- Amln( 1 - 6) + -Мб- — A i \ / а Воспроизведено из работы: Messing R. A., Immobilized Enzymes for Industrial Re- actors, p. 158, Academic Press, Inc., New York, 1975. но обеспечивает большую концентрацию продукта в вытекаю- щем из реактора потоке. В то же время необходимость непре- рывного внесения посевного материала и ряд затруднений тех- нического характера при осуществлении газового обмена в ТРПВ часто приводят к тому, что на практике выгоднее при- менять аналогичные реакторы периодического действия, даже если высокая концентрация продукта в вытекающем из реак- тора потоке является важным фактором. В фазе экспоненциаль- ного роста ПРПП эффективнее ТРПВ или реакторов периоди- ческого действия. Сравнительное изучение идеальных ТРПВ и 2
20 Глава 9 ПРПП при их использовании для различных простых сочета- ний реакций составляет основную тему учебных пособий по хи- мической технологии, перечисленных в списке литературы в конце этой главы. С другими примерами сравнительного изуче- ния различных реакторов мы познакомимся в упражнениях. 9.2. Динамика процессов в реакторах В этом разделе мы рассмотрим динамические характеристи- ки биореакторов. Хотя основное внимание мы будем уделять динамике процессов в ПРПП, многие из анализируемых здесь принципов и концепций можно успешно перенести и на ре- акторы других типов. Сначала выведем основные уравнения, необходимые для описания работы реактора в нестационарном состоянии, а затем рассмотрим возможность применения этих уравнений для изучения процессов в биореакторах в неустано- вившемся состоянии. Как мы увидим, успешному применению изучаемых здесь подходов часто препятствует отсутствие кине- тических моделей, достаточно точно описывающих особенности переходного состояния. 9.2.1. Динамические модели В основу изучения динамики процессов в ПРПП может быть положено уравнение материального баланса (7.4), преобразо- ванное в соответствующее уравнение для нестационарного со- стояния: ---- (общее количество компонента в реакторе) = dt (скорость \ /скорость поступления I — I выведения в реактор) / \ из реактора скорость образования в реакторе Тогда для компонента i в реакторе с полным перемешиванием получим: ^-(rR-ei) = K(ci/-ci)+Vf< (9.26) dt Если считать плотности потока исходных веществ и содержи- мого реактора равными, то при одинаковых объемных скоро- стях на входе в реактор и на выходе из него объем содержимо- го реактора будет постоянным и уравнение (9.26) можно при- вести к такому виду: dc{ "dt =D(cif—ct)+rfi (9.27)
Проектирование и расчет биологических реакторов 21 Это уравнение материального баланса по компоненту i в не- стационарном состоянии является отправным пунктом при изу- чении динамики процессов в реакторе. Прежде чем приступить к изучению некоторых общих математических приемов, успеш- но используемых при анализе динамики процессов в реакторах, следует привести ряд новых доводов, подтверждающих обосно- ванность применения модели ПРПП для соответствующих рас- четов. Дело в том, что здесь мы сосредоточим внимание только на явлениях перемешивания, а соответствующую модель кине- тики биологических превращений для анализа процессов в пе- реходном состоянии рассмотрим позднее. Как мы уже упомина- ли в гл. 8, одним из важных параметров перемешивания явля- ется время циркуляции. Этот параметр приближенно характе- ризует время, необходимое, чтобы элемент жидкости, циркули- рующий в соответствии с существующей в реакторе структурой течений, возвратился в тот же участок объема реактора. Этот параметр применим к ПРПП только в том случае, если время циркуляции мало по сравнению с масштабом времени других процессов в ПРПП. При изучении динамики процессов в ПРПП появляется не- обходимость во введении нового параметра времени. Действи- тельно, теперь мы сталкиваемся с возможностью изменения во времени скорости ввода или концентрации питательных ве- ществ. Тогда приближение идеального перемешивания будет справедливым только в том случае, если время циркуляции бу- дет намного меньше характерного масштаба времени флуктуа- ций в составе поступающего в реактор потока исходных ве- ществ или любых других веществ, например раствора основа- ния, с помощью которого поддерживается необходимое значе- ние pH. Все сказанное относится и к только что рассмотрен- ным идеальным реакторам периодического действия с добавле- нием субстрата. Уравнение (9.27) применимо к любому компоненту, рас- сматриваемому в модели биореактора. Следовательно, в самом общем (и самом сложном) случае динамическая модель реак- тора должна состоять из системы уравнений типа уравнения (9.27), каждое из которых обычно связано с другими через па- раметры скоростей образования . Таким образом, в общем случае скорость образования компонента I зависит от концент- раций всех других компонентов в реакторе. Чтобы не записы- вать большое количество уравнений, здесь удобно воспользо- ваться методами векторного исчисления и матричной алгебры. В дальнейшем строчными жирными буквами (например, с) мы будем обозначать векторы, а прописными жирными буквами (например, А) — матрицы. Тогда систему уравнений, состоя-
22 Глава 9 щую из уравнений типа (9.27), можно записать в форме: -^-=Г(с(О.Р) (9.28) Здесь с — вектор концентраций m-го измерения (т— число элементов или компонентов; m-вектор), которое равно числу компонентов, рассматриваемых в модели; р — ^-вектор пара- метров модели (в том числе концентраций питательных ве- ществ, скорости разведения, кинетических параметров); i-й компонент векторной функции f равен правой части уравне- ния (9.27). Поскольку описываемая уравнением (9.28) система в общем случае нелинейна, то при ее анализе без тех или иных прибли- жений обычно не удается продвинуться очень далеко. Часто основной интерес представляют динамические свойства систе- мы вблизи какого-либо конкретного стационарного состояния cs. В системе уравнений (9.28) вектор концентраций в стацио- нарном состоянии должен удовлетворять условию: f(cs, р)=0 (9.29) Можно попытаться определить поведение системы вблизи cs путем разложения правой части уравнения (9.28) в ряд Тейло- ра относительно cs, пренебрегая всеми членами второго и выс- шего порядков в отклонениях Ci(t)—cis, поскольку они должны быть малы. Тогда мы получим следующее приближенное ли- нейное описание нашей системы: -^- = Ах(0 (9.30) dt где x(Q—вектор отклонений от стационарного состояния с8: х(/)=с(/)—cs (9.31) Элемент ац в i-м столбце матрицы А определяется выражением: ди== (9.32) dcj Следует подчеркнуть, что А отвечает какому-либо конкретному стационарному состоянию. Для некоторых систем при данном р характерно несколько стационарных состояний, каждому из ко- торых отвечает своя матрица А. Определение динамических свойств линеаризованной систе- мы не представляет особых затруднений, поскольку все реше- ния уравнения (9.30) обычно имеют форму: х(0 = 2 <9-33) Z=1
Проектирование и расчет биологических реакторов 23 Параметры & и X; представляют собой соответствующие пары собственных векторов и собственных значений А. Таким обра- зом, условию Х = Х»- удовлетворяет следующее характеристиче- ское уравнение: det (А — XI) =0 (9.34) Здесь I — единичная матрица, а р,- удовлетворяют (А—Хг1)0,- = О i-l,..., т (9.35) Символом аг обозначены константы, выбранные таким образом, чтобы они отвечали заданным начальным условиям; следова- тельно, они удовлетворяют алгебраическим уравнениям т £афг = х(0) (9.36) i=i где х(0)—заданный вектор начальных отклонений. Описанная линеаризованная динамическая модель реактора представляет собой систематическую основу для оценки харак- терных времен отклика системы. Что касается рассматривае- мой здесь локальной динамики, то из уравнения (9.33) следует, что масштаб времени затухания возмущений относительно стандартного стационарного состояния cs характеризуется соб- ственными значениями Xi матрицы А. Таким образом, для ло- кального поведения системы свойствен спектр характерных вре- мен, приближенно описываемых уравнением: Ц = |Хг|-1 i = l,...,/n (9.37) Этими значениями можно пользоваться, например, для сравне- ния относительных масштабов времени изменений в реакторе и в поступающих в реактор потоках. Хотя уравнение (9.37) позволяет систематически и локаль- но достаточно строго оценить масштабы времени, полученным таким путем оценкам трудно приписать определенный физиче- ский смысл. Собственные значения Xi в общем случае являются функциями всех переменных, входящих в матрицу А, и как та- ковые зависят от всего вектора стационарного состояния cs и всего вектора параметров р. В такой ситуации трудно сравни- вать масштабы времени перемешивания, реакции и других взаимодействий в системе. Можно показать, что в случае ПРПП собственные значения имеют форму —(значение, характер- ное для данной сети реакций)*. Эта закономерность в каком-то * Fjeld М., Asbjernsen. О. A., Astrotn К- Reaction Invariants and their Importance in the Analysis of Eigenvectors, State Observability, and Controllability of the Continuous Stirred Tank Reactor; Chem Ene Sci 29 1917 (1974). '
24 Глава 9 смысле может оказаться полезной, но тем не менее она не поз- воляет выяснить сложные зависимости между другими парамет- рами и Л,;. Поэтому для разработки достаточно обоснованных и в то же время математически не вполне строгих подходов к оп- ределению различных характерных масштабов длины и време- ни необходимы прежде всего здравый смысл, большой опыт и своего рода искусство. Впрочем, в химической технологии хоро- шо известен систематический подход к решению таких задач, основанный на переводе всех уравнений системы в безразмер- ную форму с последующими преобразованиями, позволяющи- ми определить безразмерные параметры, которые характери- зуют поведение системы. Часто в качестве базразмерных пара- метров используют отношения масштабов характерных длин или времен. 9.2.2. Устойчивость В этом разделе мы рассмотрим зависимость динамических характеристик системы в реакторе от функции f и ряда задан- ных значений параметров р. Для нас наибольший интерес здесь будет представлять локальная устойчивость определенного ста- ционарного состояния cs. Если стационарное состояние локаль- но асимптотически устойчиво, то после небольшого возмущения, вызывающего малые отклонения концентраций компонентов системы от изучаемого стандартного стационарного состояния, они вновь примут исходные значения стационарного состояния. В неустойчивом стационарном состоянии некоторые небольшие возмущения приведут к необратимому отклонению концентра- ций в системе от значений, характерных для стационарного со- стояния. Во избежание двусмысленного толкования полезно пе- ревести эти положения на более строгий язык математики. Мы будем называть стационарное состояние cs локально асимптотически устойчивым, если lim^oo cs при условии, что начальное состояние с0 достаточно близко к cs. [Здесь ма- тематической мерой близости векторов является евклидова нор- ма, определяемая как (m X 1/2 V с<2 /=1 / Тогда выражение «с0 и cs достаточно близки» означает, что | Со—cs| представляет собой достаточно малое действительное число.] Стационарное состояние cs называют глобально асимп- тотически устойчивым, если lim^0Oc(Z) =cs при любом Со (за исключением бессмысленных значений, например отрицатель- ный концентраций). Если cs — неустойчивое стационарное со-
Проектирование и расчет биологических реакторов 25 стояние, то некоторые сколь угодно близкие к cs начальные состояния Со будут приводить к зависимости с от t, причем с не будет приближаться к cs и не будет располагаться сколь угодно близко от cs. Таким образом, состояние неустойчивости характеризуется тем, что при некоторых начальных отклонени- ях величина отклонения х(/) стремится к росту по сравнению с ее начальным значением. Локальная устойчивость в большинстве случаев определяет- ся собственными значениями Хг матрицы А [уравнение (9.32)]. Стационарное состояние cs локально асимптотически устойчи- во, если действительная часть всех собственных значений А отрицательна: Re(A,;)<0 i=l, т (9.38) Напротив, cs неустойчиво, если действительная часть любого собственного значения А положительна: Re(A,/)>0 при любом / (9.39) Эти выводы легко понять, если обратиться к уравнению (9.33). В самом деле, если наибольшая действительная часть собствен- ных значений системы равна нулю, то мы имеем дело с крити- ческим состоянием и для определения локальных динамических характеристик системы необходим дальнейший анализ (см., на- пример, работу [Ю]). К счастью, для проверки указанных вы- ше неравенств нет необходимости рассчитывать все собствен- ные значения. Можно, например, преобразовать определитель уравнения (9.34) в алгебраическое уравнение m-го порядка: + ... +Bm-^ + Bm = 0 (9.40) Теперь можно применить критерий Гурвица*, который устанав- ливает, что все корни уравнения (9.40) имеют отрицательные действительные части в том и только в том случае, если удов- летворяются следующие условия (9.41): В, > О det В3~ В2 О В, В3 В5 det 1 в2 В4 > О О в. в3 * Walter С. F., Kinetic and Biological and Biochemical Control Mechanisms, p. 335 in Biochemical Regulatory Mechanisms in Eucaryotic Cells, Kun E., Gri- sola S. (eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, 1972.
26 Глава 9 Bi В3 Bs 1 в2 В, О В1 в3 о о (9.41} В качестве примера рассмотрим ситуацию, когда клеточный рост лимитируется одним субстратом, и изучим динамический вариант модели хемостата Моно. Применение как к биофазе,, так и к субстрату общего уравнения материального баланса для нестационарного состояния [уравнение (9.27)] и использо- вание уравнения Моно [уравнение (7.10)] для удельной скоро- сти роста клеток приводит к следующим выражениям: -^- = D(x0-x) + -!^- (9.42а> dt s -J- /\§ И — = D (s0—s)------!---- dt Ух/s x + Ks При стерильности исходных питательных веществ (хо=0) воз- можны два стационарных состояния, одно из которых (нетри- виальное) описывается уравнениями (7.14) и (7.15), а другое отвечает состоянию вымывания (х = 0; s=so). Определив устой- чивость каждого из этих стационарных состояний, можно опре- делить, какое из них будет наблюдаться в проточной культуре. Локальную устойчивость можно изучать с помощью линеаризо- ванных уравнений типа (9.42). Результаты такого изучения ло- кальной стабильности в хемостате Моно приведены ниже: (9.42б> „ Чтах«о ^тах5° Ks-t-$o Нетривиальное стационарное состояние [уравнения (7.14) и Неустойчиво Устойчиво (7.15)1 Стационарное состояние вы- Устойчиво Неустойчиво мывания Из этого анализа следует также, что концентрации компо- нентов системы не могут достигать величин, соответствующих стационарному состоянию, в режиме затухающих колебаний.
Проектирование и расчет биологических реакторов 27 Поскольку подобные колебательные изменения концентраций на- блюдались экспериментально, то описываемая модель системы субстрат — клетка, очевидно, не может предсказывать все дина- мические особенности этой системы в некоторых специфических условиях. Известны и другие недостатки динамической модели хемо- стата Моно. Так, она предсказывает мгновенный отклик удель- ной скорости клеточного роста на изменение концентрации суб- страта, а в эксперименте обнаружена лаг-фаза (см. упражне- ние. 9.6. Устойчивые колебания концентрации пирувата (жирные точки) в непрерывной культуре Е. coli. Обратите внимание на то, что концентрация клеток (отмечена крестиками) остается приблизительно постоянной. [Воспро- изведено из статьи: Sikyta В., Continuous Cultivation of Microorganisms; Suom. Kemistil., 38, 180 (1965).] ние 10.6). Кроме того, экспериментально наблюдались гистере- зис скорости клеточного роста и нестабильность экономического коэффициента, а в некоторых экспериментах обнаружены и устойчивые колебания концентраций (рис. 9.6). Следовательно, модель хемостата Моно, в ряде случаев вполне приемлемая для анализа стационарных состояний, имеет многочисленные недо- статки, когда речь идет об изучении динамики процессов. Некоторые явления, которые нельзя объяснить при помощи модели Моно, могут быть учтены путем введения в модель до- полнительных переменных (посредством ее «структурирова- ния»), В таких случаях необходимость структурированных мо- делей обусловливается некоторыми соображениями общего по- рядка, упоминавшимися ранее в гл. 7 и во введении к этой гла- ве. В переходном состоянии приближение сбалансированного роста не применимо, если масштаб времени изменений в среде сравним с масштабом времени биологического отклика (напри-
мер, посредством индукции или репрессии синтеза ферментов). В таких случаях кинетическую биологическую модель необхо- димо расширить, включив в нее большее число компонентов (или псевдокомпонентов; разд. 7.4) клеточной фазы. В разд. 7.4.1 мы уже познакомились с двухкомпонентной структурированной моделью Уильямса. В применении к динами- ке роста проточных культур эта модель воспроизводит некоторые наблюдаемые в эксперименте особенности систем, не отражае- мые моделью Моно. Расширяя аналогию между уравнением Моно для клеточного роста [уравнение (7.10)] и уравнениями кинетики ферментативного катализа, Джеффресон и Смит включили в свою динамическую модель хемостата промежуточ- ные компоненты, в известной степени отвечающие фермент-суб- стратным комплексам [11]. В модели Рамкришны, Фредриксо- на и Цучии учтено ингибирование клеточного роста [12]. В ка- ком-то смысле такой подход можно рассматривать как струк- турирование фазы питательного вещества. Совершенно другой подход применили Ли, Джекман и Шрё- дер, изучавшие влияние флокуляции клеток на процесс их ро- ста [13]. Мы уже указывали, что во многих микробных систе- мах индивидуальные клетки образуют скопления (иногда назы- ваемые флокулами или хлопьями). Считается, что в таких скоплениях метаболические процессы могут отличаться от ана- логичных процессов в отдельных диспергированных клетках. Действительно, для того чтобы питательные вещества могли войти в контакт с клетками, расположенными внутри скопле- ний, они должны сначала диффундировать внутри этих скопле- ний. Поэтому биофаза рассматривается как двухкомпонентная система (скопления клеток и индивидуальные клетки), в ко- торой каждый компонент характеризуется своей кинетикой и в которой в то же время возможен обмен отдельными клетками между двумя морфологически различными формами. Эта мо- дель отражает флуктуации общего экономического коэффициен- та, гистерезис скорости роста и характеризуется замедленным откликом по сравнению с моделью Моно. Вообще такая модель гораздо лучше согласуется с экспериментальными данными, чем модель Моно. Для модели Янга, Брюли и Бангэя характерен другой под- ход [14]. Эти исследователи предположили, что в силу сопро- тивления процессам массопередачи, обеспечивающим клетку питательными веществами, концентрация субстрата внутри клетки не равна концентрации питательного вещества в среде, причем на скорость роста клетки непосредственно влияет имен- но первая величина. Основанная на таком подходе модель от- ражает часто наблюдаемую в эксперименте лаг-фазу после из- менения условий среды.
Проектирование и расчет биологических реакторов 29 В завершение нашего обзора динамики процессов в хемо- стате отметим еще один потенциально важный фактор, не учи- тываемый моделью Моно. Если клеточный рост ингибируется избытком питательного вещества, то для удельной скорости роста клеток следует применять уравнение (7.32): ..____Hmaxs____ ^s + s+sWp Поведение системы в хемостате, в котором удельная скорость клеточного роста определяется этим уравнением, может суще- ственно отличаться от поведения системы в классическом хемо- стате Моно: теперь в некоторых условиях могут наблюдаться три стационарных состояния. Динамическое поведение такой си- стемы может быть весьма сложным, а вклад нелинейных эффек- тов, не учитываемых в анализе локальной устойчивости, очень велик. Предполагалось, что эта модель с ее необычными харак- теристиками окажется полезной в объяснении ряда трудностей, возникающих обычно в процессах анаэробной переработки от- ходов. Некоторые другие проблемы, связанные с эффектами субстратного ингибирования в ПРПП, будут рассмотрены в гл. 14. Сложное динамическое поведение может быть характерным и для смешанных культур, состоящих из клеток различных ви- дов. Биологические превращения в подобных системах мы рас- смотрим детальнее в гл. 13. Там же мы познакомимся с други- ми общими математическими методами и результатами их при- менения в анализе и в описании динамики процессов в реак- торах. 9.3. Реакторы с неидеальным перемешиванием Закончив изучение идеальных реакторов с полным переме- шиванием или трубчатых реакторов полного вытеснения, кото- рые можно воспроизвести в лабораторных мелкомасштабных экспериментах, рассмотрим теперь более реальную ситуацию, типичную для больших промышленных реакторов. Здесь основ- ное внимание будет уделено методам изучения параметров пе- ремешивания и структуры течений в резервуарах реакторов, применению полученных данных в проектировании биореакто- ров, а также исследованию некоторых взаимосвязей между био- логическими или биокаталитическими реакциями и характером перемешивания и структурой течений в реакторе. Сначала рас- смотрим вопрос о времени выравнивания концентраций компо- нентов в перемешиваемых резервуарах, что необходимо для знакомства с масштабами времени; здесь мы познакомимся так-
30 Глава 9 Без отражательных перегородок ектрод Введение индикаторов |— Электрод Несколько отражательных перегородок, большая лопастной меш-алка. Время
Проектирование и расчет биологических реакторов ЗВ же с существованием крупномасштабных циркуляций в реакто- рах и получим некоторое представление о характерном для био- реакторов порядке величин времени циркуляции. 9.3.1. Время выравнивания концентраций в реакторах с перемешиванием Под временем выравнивания концентраций понимают время,, необходимое для достижения определенного уровня гомогенно- сти содержимого реактора после импульсного введения индика- тора в определенную зону реактора. Функции индикатора мо- жет выполнять раствор соли, кислоты или основания, нагретая или охлажденная жидкость. Циркуляционные характеристики реактора и время выравнивания концентраций можно опреде- лить путем непрерывного мониторинга концентрации индикато- ра в одной или нескольких точках реактора. Как схематично показано на рис. 9.7, характер циркуляции и время выравнива- ния концентраций в общем случае зависят от конструкции ре- актора (в особенности от наличия и конструкции внутренних, приспособлений) и перемешивающих устройств. На представ- ленных на том же рисунке графиках отражен периодический характер изменения концентрации индикатора, указывающий на то, что для выравнивания концентраций компонентов смеси необходимо определенное число циркуляций всего содержимо- го реактора. Время циркуляции является важным параметром и с другой точки зрения: оно приближенно указывает харак- терный временной интервал, в течение которого суспендирован- ные в перемешиваемой жидкости клетки или частицы биоката- лизатора циркулируют через различные зоны реактора, воз- можно, сталкиваясь на этом пути с различными условиями реакций. Затем, как упоминалось выше, необходимо опреде- лить, могут ли эти флуктуации условий в силу своей интенсив- ности и временного диапазона в существенной степени влиять на локальное кинетическое поведение системы. К вопросу о времени выравнивания концентраций вы вернемся в заключи- тельной части этого раздела при анализе некоторых экспери- ментальных работ, повященных изучению влияния перемеши- вания на активность биокатализаторов. С математическими выражениями, позволяющими опреде- лить время выравнивания концентраций в ньютоновских жидко- РИС. 9.7. Влияние различных перемешивающих и других внутренних устройств в резервуарах с перемешиванием на соответствующие характерные отклики системы, наблюдаемые после импульсного введения индикатора. От- клик системы здесь представлен как отклонения от концентрации индикатора' в конечном, полностью перемешанном состоянии. (По данным Нагаты [15]
32 Глава 9 стях и мицелиальных культурах, и с экспериментальными дан- ными по оценке времени выравнивания концентраций в раство- рах полисахаридов, продуцируемых микроорганизмами, можно познакомиться в обзоре Чарльза [18]. Установлено, что в не- которых ферментерах емкостью 2,5—160 м3 время выравнива- ния концентраций составляет 29—104 с. С другой стороны, со- общалось, что в ряде случаев время выравнивания концентра- ций достигает нескольких минут. В реакторе объемом 25 м3 при глубокой струйной аэрации время выравнивания концентрации составило 80 с (в случае воды). Чарльз указывал, что время выравнивания концентраций в 1%-ном растворе ксантана рав- но приблизительно 6 мин при скорости вращения мешалки 300 об/мин в отсутствие аэрации и около 1 мин при скорости вращения мешалки 500 об/мин и аэрации воздухом, когда объ- ем последнего составляет 0,25% объема смеси. С другой сторо- ны, упоминалось, что в небольших реакторах время выравнива- ния концентраций составляет 2—3 с. Эти величины дают пред- ставление о порядке величин времени выравнивания концентра- ций в реакторах различной емкости в зависимости от природы содержащейся в биореакторе реакционной массы. В данном разделе мы будем изучать закономерности циркуляции в боль- ших объемах жидкости и связанную с этим возможность неод- нородности состава смеси и ее температуры. Анализ меньших реакторов, где главную роль играют турбулентность и ее взаи- мосвязь с массопередачей и ростом клеток, был дан в гл. 8. Очевидно, что некоторое единое время циркуляции, напри- мер в перемешиваемом резервуаре, является приближенным по- нятием. Если мы проследим за движением элементов жидкости из области, прилегающей к мешалке, то различные элементы будут перемещаться в реакторе по различным траекториям и, следовательно, будут иметь различное время циркуляции. Брайант описал метод экспериментального определения распре- деления времен циркуляции fc(t) с помощью небольшого сво- бодно плавающего радиопередатчика и контролирующей его положение антенны, размещенной в реакторе [19]. По опреде- лению fc(t)dt — доля циркуляций с продолжительностью в ин- тервале от t до t-\-dt. Брайант указывал, что для реакторов с перемешиванием распределение времен циркуляции обычно можно с хорошим приближением описать функцией логариф- мически нормального распределения: f ft) =___!__exp Г___(ltU~ fr-)2-l (9.43) lc щ УГл Р L 2а^ J V В этом выражении два параметра — среднелогарифмическое время циркуляции h и стандартное отклонение среднелогариф- мического времени циркуляции щ — связаны со средним време-
Проектирование и расчет биологических реакторов 33 нем циркуляции t и стандартным отклонением а времени цир- куляции fc уравнениями t = e{ii+ai2/2) (9.44а) o = t^e°i2—l) (9.446) Экспериментально можно определить t и о, а затем с помощью уравнений (9.44) найти значения параметров для fc в уравне- нии (9.43). Позднее в этой же главе мы познакомимся с ис- пользованием понятия о времени циркуляции для расчета влия- ния циркуляции жидкой фазы на общие характеристики био- реактора. 9.3.2. Распределение времени пребывания Попытаемся представить себе, что случится с небольшим объемом жидкости после его введения в проточный биореактор непрерывного действия. Благодаря перемешиванию этот малый объем будет разбит на еще более мелкие объемы, которые бу- дут отделены друг от друга и распределены во всем объеме реактора. Таким образом, какая-то часть первоначально мало- го объема жидкости достаточно быстро достигнет вытекающего из реактора потока, а другие части будут в течение различного времени перемещаться по реактору, пока не попадут в выхо- дящую из реактора линию. Другими словами, вытекающий из реактора поток можно представить как смесь элементов жид- кой фазы с разным временем пребывания в реакторе. Распре- деление времени пребывания элементов жидкой фазы в покида- ющем реактор потоке характеризует режим перемешивания и структуру течений в реакторе. Ниже мы познакомимся с мето- дами оценки распределения времени пребывания. Рассмотрим сначала произвольный сосуд с одной линией подачи исходных веществ и одной линией выведения продуктов процесса. Допустим на мгновение, что в этой системе совершен- но отсутствует обратная диффузия в подающую линию из со- суда и в сосуд из линии выведения продуктов процесса. Для определения характеристик перемешивания в сосуде можно вы- полнить эксперимент типа стимул — отклик с использованием инертного индикатора. Для этого в нулевой момент времени (/ = 0) введем в линию подачи исходных веществ индикатор в концентрации с* и продолжим его подачу в течение времени £>0, а затем проконтролируем отклик системы (в данном слу- чае концентрацию индикатора на выходе из сосуда) на этот специфический стимул. На рис. 9.8 схематично изображены ос- новные узлы такого эксперимента, а также типичная кривая 3—746
3* Глава 9 зависимости отклика (концентрации индикатора на выходе из сосуда) от времени c(t). В таких условиях отклик системы на однократный ввод ин- дикатора c0(t)=H(t), где "Н? ti0 (9'45) определяется как отношение полученной в описанном выше экс- перименте зависимости c(t) к использовавшейся в этом экспери- РИС. 9.8. Экспериментальное определение отклика системы (^"-функции) на импульсный ввод индикатора. менте концентрации индикатора с* в линии подачи. Рассчитан- ный таким путем однократный отклик сосуда с перемешивани- ем называют ^“-функцией (рис. 9.8): (Г) = —-— = отклик на однократный ввод индикатора (9.46) Во многих случаях удобнее применять не функцию а функцию распределения времени пребывания (РВП)* <^(0> которая определяется как $(/)б# = доля выходящего из реактора потока жид- (9.47) кости, время пребывания которой в реак- торе составляет от t до i+dt * Согласно принятой в статистике терминологии, S — функция плотно- сти, а — соответствующее распределение. В литературе по химической тех- нологии, однако, закрепилась употребляемая здесь терминология, которой во избежание недоразумений мы и будем пользоваться в дальнейшем.
Проектирование и расчет биологических реакторов 35 Таким образом, доля выходящего из реактора потока, время пребывания которого в реакторе меньше t, равна: t J $ (х) dx о Из определения (9.47) следует, что Jg(x)dx=l (9.48) о Взаимосвязь между функциями и ST можно выяснить с помощью несложного рассуждения. Возвращаясь к эксперимен- ту типа стимул — отклик (рис. 9.8), представим, что содержи- мое сосуда состоит из двух различных жидкостей, причем жид- кость I содержит индикатор в концентрации с*, а жидкость II вообще не содержит индикатора. Следовательно, все элементы жидкости I должны были бы поступить в сосуд за некоторое время t>Q и тогда любой элемент жидкости I на выходе из ре- актора в момент времени t находился бы в системе в течение времени, меньшего t. С другой стороны, жидкость II должна была бы находиться в реакторе при t = 0, поскольку после это- го в реактор поступала только жидкость I. Следовательно, вре- мя пребывания всех элементов жидкости II, покидающих со- суд в момент времени t, больше t. Допустим, что нам известна ^-функция, тогда мы можем выразить концентрацию индикато- ра на выходе из реактора с(/) как сумму вкладов жидкостей I и II: t со c(t) = c*- p(x)dx4-0. p(x)dx (9.49) 6 't Из уравнений (9.49) и (9.46) следует искомое выражение: t f(t) = ^(x)dx (9.50) о которое путем дифференцирования по t можно преобразовать в такую форму: (9.51) Прежде всего отметим, что, согласно уравнению (9.51), функ- цию &> (/) можно определить путем дифференцирования функ- ции ££"(/), найденной экспериментальным путем. Кроме того, теория линейных систем утверждает, что производная одно- 3*
36 Глава 9 кратного отклика по времени есть одноимпульсный отклик, от- куда следует, что <S (0 можно интерпретировать как отклик на- ходящейся в реакторе реакционной смеси на однократное вве- дение (импульс) индикатора в нулевое время. Хотя «импульс» представляет собой абстрактное математическое понятие, в экс- перименте ему приближенно соответствует введение определен- ного количества концентрированного раствора индикатора в те- чение очень короткого промежутка времени. Функцию РВП можно определить не только описанным вы- ше экспериментальным путем, но иногда и теоретически, если известна математическая или логическая модель процесса пе- ремешивания. Например, в случае идеального ПРПП уравне- ние материального баланса по индикатору (не взаимодействую- щему с компонентами системы) в нестационарном состоянии можно записать в такой форме: = (952) Для определения результата ^“-эксперимента для этой системы допустим, что с(0) = 0 (9.53) = (9.54) Решение уравнения (9.52) при условиях (9.53) и (9.54) дает: = (9.55) с* Из уравнений (9.51) и (9.55) следует, что функцию РВП для ПРПП можно выразить уравнением: $(/) = — e~Ft'v* (9.56) VR Что касается реакторов полного вытеснения, то функция РВП вытекает уже из определения такого типа реакторов. Дей- ствительно, если в поток исходных веществ введен импульс ин- дикатора, то последний проходит через реактор, не смешиваясь с соседними элементами жидкости, и выходит из реактора че- рез время L/u. Следовательно, импульс индикатора на выходе из реактора имеет точно такой же профиль, что и на входе в реактор, но смещен во времени на однократное время удержи- вания реактора. Отклонения от такого поведения свидетельст- вуют о нарушении режима идеального вытеснения. При работе с функциями распределения типа <§ (t) часто полезно учитывать и моменты распределения; k-и момент $*(0
Проектирование и расчет биологических реакторов 37 определяется по формуле: = 6 = 0,1,2... (9.57) о Поскольку для определения ^-функции в реактор вводят еди- ницу количества индикатора и поскольку весь индикатор в кон- це концов должен покинуть реактор, то т0=1 (9.58) Первый момент является средним РВП или средним време- нем пребывания t. Можно показать, что при отсутствии обрат- ной диффузии (это допущение мы приняли в начале настояще- го раздела) для однофазной жидкости в произвольном сосу- де [2]: = (9.59) Иными словами, среднее время пребывания равно номинально- му времени удерживания реактора. Это соотношение неприме- нимо ни к одной фазе многофазной системы, ни к одной фазе системы с нерастворимым катализатором или адсорбентом. Второй момент т2 часто используется для оценки отклонения распределения а2 (а2 = т22—mi2); о представляет собой средне- квадратичное отклонение от среднего времени пребывания. Из других сходных функций, применяющихся в анализе па- раметров перемешивания реакторов, следует упомянуть функ- цию распределения времени пребывания в реакторе /(/); I(t)dt представляет собой долю содержащейся в реакторе жидкости, находящейся в реакторе в промежутке времени от t до Уравнение материального баланса для этой доли жидкости можно записать в виде: /(f) = F-1[l—^(/)] (9.60) Производная A(Q dt функции интенсивности Л(/) отражает ве- роятность того, что элемент жидкости, находившийся в реакто- ре в течение времени t, покинет реактор в следующий за t ко- роткий интервал времени dt. Эта функция полезна при изуче- нии отклонений от режима идеального перемешивания. С ранее рассмотренными функциями A(Q связана соотношениями [16]: 1 — еЛ (t) at Для идеального ПРПП функция Л(7) постоянна. На рис. 9.9 показано поведение функции Л(() при некоторых типах откло- нений от идеальных режимов в реакторах с перемешиванием.
38 Глава 9 В общем случае наличие максимума, после которого функция Л(0 убывает, свидетельствует о том, что в реакторе имеются застойные зоны или зоны с быстрым и медленным течением на пути от входа в реактор до выхода из него. Не имея возможности обсуждать здесь все детали, мы все же должны отметить, что РВП, как это в настоящее время на- дежно установлено, не характеризует процесс перемешивания РИС. 9.9. Функция интенсивности, характеризующая различные варианты неполного смешения в емкостных реакторах с перемешиванием. а — время между поступлением в реактор и выходом из него невелико (нор- мальная ситуация); б — задержка в реакторе поступающего раствора обуслов- лена неэффективным перемешиванием; в — поступающий в реактор раствор выводится из него, не перемешиваясь с реакционной массой; г — то же, что в пункте «в» и, кроме того, в силу неэффективного перемешивания в реакторе имеются застойные зоны. (Из работы [16]). со всех сторон (подробнее и детальнее эта проблема рассмотре- на в приведенной в конце главы литературе). РВП содержит данные о том, как долго различные элементы вытекающей из реактора жидкой фазы находились в реакторе, но ничего не го- ворит о том, когда произошло выравнивание концентраций между элементами жидкости с различным временем пребыва- ния в реакторе. Эти выводы можно пояснить, рассмотрев два предельных варианта. Сначала предположим, что все элементы жидкой фазы независимо от их предыстории постоянно и эффективно перемешиваются. Другими словами, поступающие в реактор исходные вещества сразу же контактируют с другими элемен- тами жидкой фазы независимо от времени их пребывания в ре- акторе. Такая ситуация, называемая состоянием максимально-
Проектирование и расчет биологических реакторов 39 го смешения, преобладает в идеальном ПРПП. В другом край- нем случае элементы жидкости с различным временем пребы- вания в реакторе вообще не смешиваются и контактируют друг с другом только в выходящем из реактора потоке. В этом слу- чае, называемом состоянием полной сегрегации, реакции проте- кают независимо в каждом элементе жидкости, причем на ход реакции в одном элементе жидкости не влияют условия и ско- рости реакций в соседних элементах. Между этими двумя пре- дельными случаями располагаются различные промежуточные случаи перемешивания в небольшой части объема реактора или микросмешения. РВП реактора совершенно не зависит от характеристик мик- росмешения. Часто это обстоятельство не играет большой роли, поскольку микросмешение обычно мало влияет на функциони- рование реактора в целом. Впрочем, в особых случаях микро- смешение может оказать существенный эффект на ход процес- са. Предполагалось [16], что степень влияния микросмешения на данный реактор можно достаточно надежно оценить путем расчета работы реактора в особых случаях максимального сме- шения и полной сегрегации. Если режимы работы в этих экст- ремальных ситуациях существенно различаются, то проектируе- мый реактор будет чувствителен к микросмешению, а соответ- ствующий масштабный переход будет вызывать большие за- труднения. В таких случаях надежность масштабного перехода можно повысить за счет применения ТРПВ или реактора близ- кого типа (см. следующий раздел), поскольку микросмешение не влияет на параметры процессов в ТРПВ независимо от типа реакций или их кинетики. В реакторе с полной сегрегацией каждый независимый эле- мент жидкости ведет себя подобно небольшому реактору перио- дического действия. Продукт процесса представляет собой смесь продуктов, образовавшихся в каждом из этих микрореакторов, причем время пребывания каждого из продуктов в реакторе различно. Переходя на язык математики, обозначим символом Cib(t) концентрацию компонента i в реакторе периодического действия спустя время t после начала процесса. Допустим, что начальный состав реакционной смеси в реакторе периодическо- го действия идентичен составу поступающей в проточный реак- тор смеси исходных веществ. Если только реакция (или реак- ции) не вызывает существенного повышения температуры или заметного изменения объема, то в данном случае не играет ро- ли, происходит ли здесь одна или несколько различных реак- ций. Доля вытекающего из реактора потока содержит элементы жидкости с временем пребывания в реакторе около t и, следовательно, с концентрацией компонента i около <?,&(/). Суммирование всех таких долей жидкости дает выражение для
40 Глава 9 концентрации Ct компонента i на выходе из реактора при усло- вии полной сегрегации: ci=Jcib(t)g (i)dt (9.62) о При выводе уравнения (9.62) принималось, что условия ре- акции (температура, pH, концентрация растворенного кислоро- да и т. д.) практически одинаковы как в «микрореакторе пе- риодического действия», так и во всем реакторе с перемешива- нием, обладающим определенным РВП. Говоря «практически одинаковы», мы подразумеваем, что любые имеющиеся разли- чия в условиях оказывают пренебрежимо малое или допустимо малое влияние на изучаемые биологические (биохимические) процессы. Это допущение может оказаться несостоятельным в случае реакторов большого объема, для которых характерна существенная объемная неоднородность условий реакции. Функция РВП для данного реактора сама по себе не говорит о том, как циркулирует в нем жидкость по зонам с различными условиями реакций. Отсюда следует, что если реакционная смесь в биореакторе заметно неоднородна, то уравнение (9.62) применимо только для грубой оценки системы. Понятно, что индивидуальные клетки или их скопления в биохимических реакторах отделены друг от друга (сегрегиро- ваны), поэтому применение уравнения (9.62), по-видимому, оправдано в случае любого микробиологического процесса. Это предположение, однако, не столь обосновано, как это может показаться на первый взгляд. Не надо забывать, что живые клетки содержат сложные контрольные системы, с помощью которых они приспосабливаются к изменениям в среде и пере- страивают свои функции в соответствии с этими изменениями. Следовательно, происходящие в периодической культуре изме- нения отражают взаимное влияние и взаимодействие жидкой фазы (среды) и биологической фазы (клеток). Состав любой одной из этих фаз в периодическом процессе изменяется только в непосредственной связи с изменениями в другой фазе. По- этому клетка или скопление клеток будут вести себя в проточ- ной системе как небольшой реактор периодического действия только в том случае, если окружающая клетку среда (жид- кость) также будет сегрегирована. Если изменения в составе среды не оказывают существенного влияния на биологические реакции в периодическом процессе, то это условие необязатель- но и применение уравнения (9.62) становится более обоснован- ным. С примерами такого типа мы познакомимся позднее в этой же главе.
Проектирование и расчет биологических реакторов 41 Возвращаясь к вопросу о влиянии микросмешения, рассмот- рим простую необратимую реакцию порядка 0,5: S —> Р r=ks'h (9.63) Пусть эта реакция осуществляется в перемешиваемом реакто- ре с полной сегрегацией, который имеет, однако, то же РВП, что и ПРПП. Реакцию порядка 0,5 можно приближенно рас- сматривать как реакцию, описываемую уравнением Михаэли- са— Ментен в довольно узком интервале концентраций субст- рата. Путем расчета зависимости s(t) для реакции (9.63) в ре- акторе периодического действия с учетом уравнений (9.56) и (9.62) получим: ( . kt 1 \ 1 s = s0 1------1—exp---------f- l so L \ kt / jj (9.64) С другой стороны, если та же самая реакция происходит в иде- альном ПРПП, в котором по определению достигается макси- мальное смешение, то концентрация субстрата на выходе из ре- актора будет равна: s = s0 1 (ki)2 2s0 4Sq 11 (^)2 ]| (9.65) Общий метод расчета степени превращения субстрата в усло- виях максимального смешения при произвольном времени пре- бывания в реакторе описан в работе [20]. Часто микросмешение не оказывает большого влияния на режим работы реактора; очевидно, что это обстоятельство об- легчает проектирование соответствующих реакторов. Например, при протекании в ПРПП необратимой реакции второго порядка наибольшая разница между степенью превращения субстрата при полной сегрегации и при максимальном смешении состав- ляет менее 10%. Таким образом, даже если уравнение (9.62) заведомо не отражает реальную ситуацию, с его помощью можно иногда с хорошим приближением описать работу реак- тора. [Путем ряда преобразований уравнений (9.64) и (9.65) найдите выражение для разности |1—s (9.64)/s (9.65) |.J Максимальное превращение субстрата во всех простых ре- акциях с порядком меньше единицы достигается при макси- мальном смешении. Напротив, полная сегрегация обеспечивает наивысшую степень превращения для реакций с порядком боль- ше единицы. Как можно показать с помощью принципа супер- позиции для линейных систем, степень микросмешения не влия- ет на реакции первого порядка. Следовательно, в случае одной или нескольких реакций первого порядка уравнение (9.62) мож- но использовать независимо от степени микросмешения.
42 Глава 9 Данные о РВП можно также применять для определения параметров различных моделей неидеальных проточных реак- торов. Ряд моделей такого типа мы рассмотрим в следующем разделе. 9.3.3. Модели неидеальных реакторов Очевидно, РВП содержит полезную информацию о структу- ре течений и характере перемешивания содержимого реактора. Для оценки степени отклонения поведения реактора от иде- ального режима можно использовать, например, функции <S и SF. Выше мы рассчитали функции <S и для идеального ПРПП; если теперь эти функции сравнить с соответствующими функ- циями для реального реактора, то можно получить представ- РИС. 9.10. ST- и ^-функции для идеального ПРПП (а); ПРПП с обводной (байпасной) линией (б); ПРПП с застойной зоной (в). ление о том, насколько режим в реальном аппарате приближа- ется к режиму полного перемешивания. Типичные отклонения от идеального режима часто проявля- ются в виде определенных зависимостей характеристик реак- тора. Оценить эти зависимости можно, построив соответствую- щие модели, которые отражают различные типичные отклоне- ния от системы с идеальным перемешиванием. На рис. 9.10 при-
Проектирование и расчет биологических реакторов 43 ведены модели а) идеального ПРПП, б) реактора с обводной (байпасной) линией потока исходных веществ и в) реактора с застойной зоной (1—a) VR. При наличии байпасной линии влия- ние индикатора сказывается на З^-функции немедленно, а при- сутствие застойной зоны приводит к более быстрому (по срав- нению с идеальным реактором) спаду кривой ^-функции. Другая полезная и часто применяемая модель неидеального проточного реактора с перемешиванием состоит из двух свя- занных идеальных ПРПП (рис. 9.11). В этой модели содержи- мое системы разделено на две меньшие полностью перемеши- ваемые зоны. Потоки исходных веществ и продуктов процесса проходят через зону 1, объ- ем которой составляет а (в долях единицы) от общего объема реактора. В свою очередь содержимое зоны 1 обменивается с застойной зоной 2 с объемной скоро-, стью F'. Если допустить, что кинетика данного процесса подчиняется уравнению Мо- но с постоянным экономиче- ским коэффициентом, то РИС. 9.11. Модель реактора с неполным перемешиванием и с застойной зоной. стационарное состояние в этой системе можно описать следующими уравнениями матери- ального баланса: М —^x/s(so—si) субстрат в зоне 1 (9.66а) х2—M=;^x/s(si—5г) субстрат в зоне 2 (9.666) х24-ауртах—;----М = (1 +?^)М клетки в зоне 1 (9.66в) As si М + (1—а) YРтах-7-7—х?~х2 клетки в зоне 2 (9.66г) Здесь V п— F U= номинальная скорость разведения (9.67) В этой модели скорость разведения, отвечающую вымыванию, можно определить, подставив в уравнения (9.66) D вымывания PmaxSp + So J (! — «)2YPmaxS0 (1 a) Y|.iniaxso (9.68) Поскольку первое выражение в правой части этого уравнения идентично выражению для скорости разведения, отвечающей
44 Глава 9 РИС. 9.12. Вычисленная с помощью модели реактора с застойной зоной (рис. 9.11) зависимость концентрации клеток в продуктах процесса х1 от скорости разведения D при различных относительных объемах а зоны активно- го перемешивания. На верхнем графике представлены кривые зависимости скорости образования биомассы xiD (7=0,5) от той же переменной. вымыванию в системе с полным перемешиванием [уравнение (7.16)], то неполное перемешивание, очевидно, приведет к повы- шению скорости разведения, необходимой для начала вымыва- ния. Если выражение, стоящее в квадратных скобках правой части уравнения (9.68), будет иметь отрицательное значение, это означает, что вымывание в данной системе невозможно. (Какой физический смысл имеет такое решение уравнения?) На рис. 9.12 представлены графики зависимостей концентра- ции клеток в продуктах процесса хг и продуктивности системы x^D от скорости разведения при у = 0,5 и различных а. Эти за- висимости были вычислены при тех же значениях Ks и s0, что и зависимости на рис. 7.10; изменение характера кривых x = f(D) при снижении а от 1 (идеальное перемешивание) до 0,9 или
Проектирование и расчет биологических реакторов 45 0,85 (небольшая застойная зона) очень напоминает различия между теоретическими и экспериментальными данными для хемостата (рис. 7.10), причем значение а = 0,9 примерно соот- ветствует находящейся над мешалкой доле объема эксперимен- тального реактора, использовавшегося для получения представ- ленных на рис. 7.10 опытных данных. При изучении РВП до сих пор мы ограничивались реактора- ми с непрерывными потоками среды и культуры клеток, забы- вая о том, что в периодических процессах с аэрацией также участвуют газовые потоки. Функция РВП применялась и для оценки газосодержания и степени смешения газа в биореакто- рах периодического действия. Результаты исследований пока- зали, что в этом случае многое определяется конструкцией применяемого смесителя и реологией реакционной смеси. На- пример, РВП в системе ТРПВ — ПРПП очень близко к РВП газа в реакторах с механическим перемешиванием, если эти реакторы заполнены маловязкими жидкостями (водой, водными растворами солей, суспензией Saccharomyces cerevisiae). Более сложные функции РВП газа характерны для перемешиваемых высоковязких растворов. На рис. 9.13 приведены результаты изучения распределения времен пребывания газа в реакторе, когда поток газа поступал через барботер в стандартный реак- тор с перемешиванием, содержащий суспензию Penicilliutn chrysogenum (10 г/л). Соответствие этих экспериментальных данных расчетным было достигнуто только после введения в математическую модель (рис. 9.11) выражения, соответствую- щего элементу полного вытеснения. Модели, построенные на основе идеальных реакторов разно- го типа, обычно называют комбинированными, или смешанными моделями; они представляют собой только один из множества способов описания неполного перемешивания. Комбинирован- ные модели имеют то преимущество, что они могут одновремен- но являться полезным инструментом для теоретического изуче- ния структуры течений и перемешивания в реакторе, служить основой для расчета параметров неидеального сосуда в качест- ве реактора, а также при конструировании лабораторных реак- торов для изучения эффектов, вызываемых отклонениями от идеального режима в аппаратах большого объема. Если для описания данного неидеального биореактора мы выбрали одну из указанных выше комбинированных моделей, то ее можно применять и для расчета параметров этого реак- тора. Иными словами, в рамках выбранной комбинированной теории можно записать и решить уравнения, характеризующие кинетику реакций и материальные балансы по субстратам, про- дуктам процесса и эффекторам реакций. Примером может слу- жить приведенная выше система уравнений (9.66), основанная
46 Глава 9 _£о Fc 8FC, РИС. 9.13. Результаты экспериментального определения распределения вре- мени пребывания газа в сосуде с перемешиванием (Д). Сплошная кривая отвечает расчетным данным для того же распределения, полученным с по- мощью описанной в тексте комбинированной модели при указанных на рисун- ке значениях параметров. (Воспроизведено с разрешения из работы: Popo- vic М., Papalexiou A., Reufi М., Gas Residence Time Distribution in Stirred Tank Reactors, VI International Fermentation Symposium, London, Canada, 1980.) на модели типа изображенной на рис. 9.11 и уравнении Моно. При этом, однако, необходимо помнить о свойственных такому подходу ограничениях, поскольку даже если РВП комбиниро- ванной модели согласуется с РВП реального реактора, то в лю- бом случае характеристики микросмешения и циркуляции для модели и реактора будут различными. Следовательно, комби- нированная модель в некоторых случаях не может удовлетво-
Проектирование и расчет биологических реакторов 47 рительно описывать функционирование системы как реактора. Например, комбинированные модели типа изображенных на рис. 9.11 будут обеспечивать одно и то же РВП независимо от того, располагается ли трубчатый элемент полного вытеснения в начале или в конце системы, но в случае процесса с нелиней- ной кинетикой расположение элемента полного вытеснения бу- дет влиять и на параметры всей системы. Напротив, если все реакции и физические явления (например, массообмен) имеют первый порядок, то один и тот же результат будет получен не- зависимо от положения элемента полного вытеснения. Несмотря на указанные ограничения, комбинированные мо- дели в некоторых ситуациях можно распространить и на такие процессы, в которых условия реакции пространственно неодно- родны. Часто чисто интуитивно можно найти соответствие меж- ду различными идеальными компонентами комбинированной модели и реальными зонами и участками объема биореактора. Так, при обсуждении комбинированной модели, изображенной на рис. 9.11, мы уже отмечали, что один компонент модели мо- жет соответствовать зоне реактора, примыкающей к мешалке, а другой — остальному объему реактора. Если поток воздуха вводится в систему с помощью барботера вблизи мешалки, то можно допустить, что концентрация растворенного кислорода будет относительно высокой в первом элементе комбинирован- ной модели, но сравнительно низкой во втором элементе и, со- ответственно, во всех удаленных от мешалки зонах жидкой фа- зы большого аппарата. Следовательно, в расчетах режимов ра- боты реактора можно учитывать как результаты теоретической оценки различных сочетаний связанных реакторов, так и экспе- риментально найденные параметры условий процесса в различ- ных зонах биореактора. Для надежного моделирования процесса, осуществляющегося в однородных условиях, одних только данных о кинетике био- логических превращений может оказаться недостаточно. К этой теме мы вернемся в следующем разделе. Возможность описа- ния реальных крупномасштабных биореакторов с помощью мо- дели с различными условиями реакций в различных идеаль- ных элементах модели подсказывает один из подходов к реше- нию проблемы обратного масштабного перехода. Под обрат- ным масштабным переходом мы понимаем достаточно обосно- ванный метод разработки лабораторных экспериментов с целью моделирования и изучения функционирования больших неиде- альных реакторов. Поскольку в лабораторных экспериментах с помощью ограниченного числа реакторов, насосов и соедини- тельных устройств удается с достаточно хорошим приближени- ем воспроизвести идеальные системы, особенно ПРПП, то та- кие эксперименты могут выполнять функции физической моде-
48 Глава 9 ли, отвечающей комбинированной математической модели. В отдельных небольших реакторах этой установки можно со- здать разные интенсивности перемешивания, степени аэрации, значения pH и другие условия и тем самым попытаться моде- лировать и изучить влияние изменения этих параметров на ход биологических процессов (в том числе на их кинетику) в боль- в каскада последовательно РИС. 9.14. Различные варианты модели на основе соединенных реакторов: а — последовательные реакторы; б — последователь- ные реакторы с рециркуляцией; в — последовательные реакторы с обратным потоком. ших аппаратах. Такой подход применим к изучению как реак- торов периодического действия, так и проточных реакторов. Для моделирования каскадов реакторов и колонных реакто- ров, а также режимов перемешивания, приближающихся к ре- жиму полного вытеснения, применяются различные типы ком- бинированных моделей с последовательно связанными идеаль- ными ПРПП (рис. 9.14). Функции РВП для этих моделей мож- но определить с помощью уравнений материального баланса по индикатору в каскаде реакторов с перемешиванием путем определения распределения этого индикатора после его одно- кратного импульсного введения. Если, как обычно, допустить, что общий объем системы Vr поделен между N равными по объему реакторами, т. е. у у =. ,>==у (9.69) 12 А
Проектирование и расчет биологических реакторов 49 РИС. 9.15. Кривые функции РВП для каскада из N идеальных ПРПП (Ук — общий объем системы, Vr/N— объем одного реактора). то после несложного математического анализа системы, схема- тично изображенной на рис. 9.14, а, получим: g(0= (Z"1)| (тгГ‘/Л,~'ехр(—vr') (9-70’ Графики этой функции при различных N приведены на рис. 9.15. Нетрудно видеть, что при увеличении У функция & (t) из- меняется от экспоненциально затухающей (М=1) до функции с резким максимумом при t=VR!F (N — 20). Отклонение РВП, описываемого уравнением (9.70), равно: а= = А. (9.71) Это уравнение полезно при разработке модели с последователь- ными ПРПП для произвольного сосуда, РВП которого опреде- лено экспериментально. Если принять, что общий объем ка- скада ПРПП и скорость пото- ка F равны соответствующим параметрам в реальном про- цессе, то среднее время пре- бывания для модели будет со- ответствовать среднему вре- мени пребывания в реальном реакторе. Если, кроме того, принять N равным экспери- ментально найденному обрат- ному отклонению РВП реаль- ного сосуда, то моменты вто- рого порядка РВП модели ка- скада ПРПП и изучаемого со- суда также будут одинаковы. Модель с последовательными ПРПП, вероятно, будет удов- летворительно описывать функционирование реального реактора в том случае, когда кривая функции РВП этого реактора имеет ту же форму, что и кривые на рис. 9.15. (На- помним, что идентичные РВП гарантируют идентичные пара- метры работы реакторов только при полной сегрегации или в случае реакций первого порядка.) Обратите внимание на то, что при N->oo РВП этой модели приближается к РВП реакто- ра полного вытеснения. На рис. 9.16 приведены результаты экспериментального изу- чения РВП в колонне с ситчатыми тарелками с параллельными потоками. Были выполнены две серии экспериментов, в кото- 4—746
50 Глава 9 рых колонна была разделена тремя тарелками на четыре сек- ции, причем в первой серии тарелки имели отверстия диамет- ром 3 мм, а во второй — 2 мм, но общая поверхность отверстий составляла 10% поверхности тарелки в обоих случаях. Сравне- ние экспериментально найденных РВП с результатом, предска- зываемым теорией при N = 4 (рис. 9.16), показывает, что та- релки с отверстиями диаметром 2 мм обеспечивают удовлетво- рив 9.16. РВП, характеризующее структуру течений в колонне с ситчатыми тарелками и с параллельными потоками газовой и жидкой фаз: 1 — диаметр отверстий 3 мм, доля общей площади отверстий в тарелке 0,0981; 2 — диа- метр отверстий 2 мм, доля общей площади отверстий в тарелке 0,0975; 3 — вычислено с помощью модели на основе каскада из 4 ПРПП. [Воспроизведе- но из статьи: Ketal A. et al., Performance of a Perforated Plate Column as a Multistage Continuous Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 911 (1969).] рительную сегрегацию секций колонны. Очевидно, при большем диаметре отверстий в колонне наблюдается обратный поток через отверстия в тарелках. Таким образом, в данном случае изучение РВП может служить основой для выбора режима, обеспечивающего необходимую степень сегрегации в колонне. Иногда введение в реактор растущей популяции микроорга- низмов коренным образом меняет его РВП. Так, эксперимен- тальное определение РВП для башни с 8 тарелками в отсутст- вие растущих организмов показало (рис. 9.17, а), что здесь проявляется четкий сегрегационный эффект. Если же в башне растет культура пекарских дрожжей, то найденное с помощью различных индикаторов РВП гораздо лучше соответствует од- ному идеальному ПРПП, чем каскаду из 8 ПРПП (сплошная кривая на рис. 9.17,6). Вероятно, исчезновение сегрегационного эффекта обусловлено осаждением дрожжевой суспензии. Если
1,4 1,Z 1,0 0,6 1,6 Клетка, меченные > кониент- u радиоактивным фоарором 1 и Вода, меченная \ Р%£пде u ГГфиГПи&М > 6^X000 а s Кпнирит- 9 рядаоакггывньж фосфорам I ^Г7Г„ И вода, меченная^ Р А f/Жяе тритием >а'и '}ине В уравнении с/с0 ---- U-i)i 0,8- 0,4 - о,г. \ \ о 1,0 Z,0 3,0 4,0 Сггшосигпельное время 9-l't/Vn б РИС. 9.17. Определение РВП в колонне с 8 тарелками (доля общей площади отверстий в тарелке равна 0,15) различными методами и в различных условиях. а. — изучение с помощью солевого индикатора показывает, что повышение интенсивности аэрации уплощает и уширяет кривую распределения времени пребывания; б — колонна заполнена культурой дрожжей, а в качестве инди- каторов использована меченая вода и меченые клетки. \Prokop A. et al., Design and Physical Characteristics of a Multistage, Continuous Tower Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 945 (1969).] 4
52 Глава 9 в четырех тарелках колонны площадь отверстий будет состав- лять только 3%, то РВП колонны с растущей популяцией дрож- жей будет практически таким же, что и в случае каскада из 4 ПРПП. Теперь перейдем к изучению изображенных на рис. 9.14 кас- кадов ПРПП как биореакторов. Уравнение материального ба- ланса по произвольному компоненту с в /-м реакторе можно за- писать в следующем виде: Fci-x-^/+Р/Гм|реактор/ =0 (9.72) Если, например, мы рассмотрим рост культуры микроорганиз- мов в каскаде реакторов при условии нестерильности питатель- ного вещества (х^О), то уравнения материального баланса по биомассе для реакторов от 1- до N-ro будут выглядеть следую- щим образом: F(.Xf — Xi) + F(Xj-i— Xj) + Vj[ijXj = Q j = 2, 3, ..., N (9.73) Решение этих уравнений дает: Fxf Е-у1И1 (9-74) и Fi~1x1 Xj (F - Н2У2) (f - НзЕ3) . . . (F — pjVJ j=2,...,N (9.75) Если объемы реакторов равны, то уравнение (9.75) упрощается: Xj (^1-Н2)(^1-Нз) . • • (^1-HJ) (9.76) Здесь Di — скорость разведения в каждом реакторе (Di = = F/Vl). Влияние сегрегационного эффекта и рециркуляции на ско- рость разведения в точке вымывания Dmax можно оценить пу- тем изучения системы, изображенной на рис. 9.14,6. Показано, что если кинетика клеточного роста подчиняется уравнению Моно с учетом метаболизма поддержания жизнедеятельности клеток [уравнение (7.22) J, то при стерильной питательной сре- де, равных объемах реакторов и постоянстве экономического коэффициента DmZx удовлетворяет уравнению: Hrnax N (1 + /<S/SO) {1 -[r/(l + r)]1/jV) Pmax 1 — (^e/P'max)(l 4“ Ks/Sf) (9.77)
Проектирование и расчет биологических реакторов 53 Здесь D, как обычно, выражено через параметры системы в целом: р F _ F _ О* VR лгух — W Подстановка в уравнение (9.77) г = 0 дает выражение для кри- тической скорости разведения в каскаде реакторов равных объ- емов без рециркуляции. Если, кроме того, принять ke = 0, т. е. допустить, что кинетика клеточного роста описывается уравне- нием Моно в его первичной стится до уже известного (7.16)J: (9.78) форме, то уравнение (9.77) упро- нам выражения [ср. уравнение D' max Pmaxso Ks + so (9.79) Такой результат можно было бы предполагать интуитивно; дей- ствительно, если вымывание происходит в первом из ряда по- следовательно соединенных реакторов равного объема, то куль- тура будет вымываться и из всех последующих реакторов. (Что произойдет, если объемы реакторов не равны и если F~>VjD*max При /=1, 2, ...,& — 1 И F< 14Е>*тах?) Теоретической модели каскада ПРПП с обратным потоком (рис. 9.14, в) близка дисперсионная модель, которая представ- ляет собой модификацию модели идеального ТРПВ; в ней до- полнительно учитывается процесс осевой диффузии, налагаю- щийся на процесс конвективного потока через трубу. Для этого модель элементарного объема ТРПВ, изображенную на рис. 9.5, нужно дополнить членом, описывающим дисперсионный поток A(Dzdcldz)z\ аналогичное слагаемое А(—Dzdc/dz)z+!iZ вводится в левую часть уравнения (9.13). Произведя описанные выше преобразования с учетом лимитирующих процессов, это уравне- ние можно перевести в следующее уравнение материального ба- ланса по компоненту с дисперсионной модели: d (ис) _ d [п de ''i t 3 Г~ uz “3 “Г rfc dz dz \ dz J (9.80) В случае жидкостей и и коэффициент эффективной осевой дис- персии Dz обычно приблизительно постоянны и уравнение (9.80) принимает вид: de n d.zc . и-------= D,-------------Urf(. dz z dz^ i c (9.81) Поскольку (9.81) является дифференциальным уравнением второго порядка, необходимы два граничных условия. Обычно
54 Глава 9 принимают следующие условия: ucf = f ис—Dz-^-\ 1 к dz Л=о — =0 dz 2=1 (9.82) (9.83) Если, как это часто бывает, Dz не слишком велико, то сложное условие (9.82) можно упростить: с |2=о = cf В этом случае отклонение РВП дисперсионной равно: о2 = ——— Г 1--— (1 — е~Ре)" Ре |_ Ре _ (9.84) модели будет (9.85) Здесь осевое число Пекле Ре определяется как Ре = -^- (9.86) С точки зрения физического смысла Ре можно рассматривать' как отношение конвективной массопередачи (жис) к массопе- редаче за счет дисперсии i^cDzc!L)- Анализируя пределы урав- нения (9.85), нетрудно найти, что при Ре->0, как и в случае отклонения РВП идеального ПРПП, о2-^1. При очень боль- ших числах Пекле о2->0, что отвечает режиму идеального вы- теснения. Как и в случае моделей с каскадами реакторов, урав- нение (9.85) можно использовать для определения числа Ре дис- персионной модели, если величина о2 найдена эксперименталь- но. При условии, что кинетика клеточного роста описывается уравнением Моно с учетом метаболизма поддержания, скорость разведения в точке вымывания Z)max для дисперсионной модели определяется уравнением: Ртах 1 4~ Ks/Sf) (9 87) ^тах 1 (^e/Pinax) (1 4" Ks/Sf) Когда влияние дисперсии очень мало (Ре—-0), то Dmax умень- шается до нуля. Этот вывод согласуется с очевидным фактом: в идеальном ТРПВ не поддерживается существование популя- ции при условии стерильности исходных веществ. Следует подчеркнуть, что коэффициент осевой дисперсии D: обычно не равен коэффициенту молекулярной диффузии. Dz представляет собой модельный параметр, отражающий разно- сторонние эффекты ряда физических явлений. Из такого рода явлений мы упомянем три — ламинарное течение в трубах, тур- булентное течение в трубах и течение в слоях насадки.
Проектирование и расчет биологических реакторов 55 Если осевая и радиальная диффузия, характеризующаяся коэффициентом диффузии S>, налагается на осевой конвектив- ный перенос, обусловленный ламинарным течением, то можно показать, что коэффициент эффективной осевой дисперсии бу- дет определяться уравнением: D‘=®+-^ (9-88) Здесь й — средняя осевая скорость (й равно половине скоро- сти в средней линии). Дисперсионная модель, Dz которой опре- деляется уравнением (9.88), хорошо описывает РВП ламинар- ного потока с учетом диффузии для труб достаточно большой длины (Л»й;2/40.2)). При турбулентном течении в трубах (Re>2100) перенос масс, количества движения и энергии осуществляется главным образом путем движения макроскопических вихрей жидкой фа- зы. Влияние вихревого переноса напоминает влияние процессов молекулярной диффузии, но турбулентные потоки обычно гораз- до более интенсивны. Следовательно, в этом случае коэффици- ент эффективной осевой дисперсии зависит главным обра- зом от режима потока жидкой фазы. Число Пекле для турбу- лентного потока обычно равно примерно 3, но уменьшается при снижении числа Рейнольдса. Такое поведение турбулентных по- токов, а также ряд данных, относящихся к ламинарным пото- кам, представлены на рис. 9.18. Одним из наиболее известных биологических трубчатых реакторов без насадки является, веро- ятно, проточный стерилизатор жидкостей, подробно рассмат- риваемый в следующем разделе. В некоторых трубчатых реакторах применяется насадка из твердых частиц иммобилизованного фермента или иного биока- тализатора. Частицы катализатора составляют неподвижный слой, и текущая по трубе жидкость омывает эти частицы. По- скольку жидкость течет в промежутках между твердыми части- цами, то любой элемент жидкой фазы при осевом движении со- вершает также беспорядочные перемещения в радиальных на- правлениях. Влияние такого прерываемого твердыми частицами движения на РВП системы может быть описано с помощью дисперсионной модели. Теория предсказывает, что осевое число Пекле Рер, учитывающее диаметр частиц, т. е. Рер=^ (9.89) в данном случае равно приблизительно 2 (dp — диаметр час- тиц). Это предположение в ряде случаев было подтверждено экспериментально, но, как показано на рис. 9.19, в общем слу- чае Рер зависит от Sc и Rep.
56 Глава 9 РИС. 9.18. Зависимость осевого числа Пекле (Ре) от чисел Рейнольдса (Re) и Шмидта (Sc) для течения жидкости в трубах. В заключение нашего анализа процессов, связанных с дис- персией, следует отметить, что характер течения жидкостей может осложняться в результате влияния других факторов, на- пример изгибов трубопроводов, изменений профиля рек и дру- гих водных потоков. В таких сложных случаях установить Dz расчетным путем не представляется возможным, и для опреде- ления этого параметра приходится опираться только на данные о РВП, найденные экспериментальным путем. Описанные выше модели с каскадом последовательно соеди- ненных реакторов и дисперсионного типа содержат по одному параметру (N и Dz соответственно) и описывают режимы не- полного перемешивания. Каждая из этих моделей относится к определенному диапазону состояний смешения и сегрегации,
Проектирование и расчет биологических реакторов 57 начиная от идеального ПРПП и кончая идеальным ТРВП. Та- ким образом, в каждом конкретном случае мы должны выбрать модель определенного типа. С точки зрения удобства расчета и анализа модель каскада последовательно соединенных реак- торов обычно намного выгоднее. Кроме того, применение дис- персионной модели при большом обратном смешении (о2) обыч- но связано с рядом трудностей. С другой стороны, как показа- но на рис. 9.14, для описания режима, близкого к режиму пол- РИС. 9.19. Зависимости осевого числа Пекле Ре„ от Рер и Sc для течения в трубах с насадкой. Обратите внимание на то, что в выражения для крите- риев подобия в данном случае входит диаметр частиц dp, а не диаметр тру- бы dt. кого вытеснения, необходимо очень большое число реакторов в каскаде. По этой причине дисперсионная модель предпочтитель- нее при небольших отклонениях от режима полного вытеснения (например, при о2, равном или меньшем 0,05), а модель с кас- кадом последовательно соединенных реакторов точнее описы- вает режимы при существенном обратном смешении (о2 ^0,2). Последняя ситуация типична для ферментеров и бассейнов для биологической переработки отходов. Небольшие отклонения от режима полного вытеснения встречаются при непрерывной сте- рилизации жидкостей, которую мы рассмотрим позднее в этой же главе. 9.3.4. Взаимосвязь между перемешиванием и биологическими превращениями Характер течений и явления переноса влияют на кинетику клеточных процессов в различных масштабах. Так, эффекты, проявляющиеся при определенных масштабах длины (вспомни-
58 Глава 9 те рис. 9.2), могут различными путями влиять на наблюдаемую кинетику роста популяции клеток. Эти влияния необходимо учитывать с тем, чтобы изучение кинетики и разработка моде- лей осуществлялись в условиях, аналогичных в основном усло- виям в большом реакторе. В настоящем разделе мы изучим не- которые стороны взаимосвязи между кинетикой клеточного роста и перемешиванием в биореакторах. Изучение начнем с анализа наибольшего масштаба, вклю- чающего циркуляцию всей жидкой фазы, в результате которой клетки переносятся в различные зоны реактора, где, как мы уже отмечали, в случае больших аппаратов обычно имеются разные концентрации растворенного кислорода и различные уровни турбулентности. Влияние циркуляции жидкой фазы на общую кинетику клеточного роста можно понять, обратившись к простому примеру. Предположим, что кислород подается ло- кально в какую-то определенную зону реактора (как обычно и бывает в случае реакторов с перемешиванием) и что утилизация кислорода происходит в изолированных элементах жидкости, циркулирующих в реакторе. Такая ситуация может возникнуть в высоковязких микробиологических системах. Если начальная концентрация кислорода в воде близка к уровню насыщения (0,3 моль/м3) и если кислород поглощается с обычной скоро- стью 10—100 моль/(ч-м3), то в отдельном элементе системы кислород истощится через И—50 с. Эта величина имеет тот же порядок, что и время циркуляции в большом реакторе. Для того чтобы оценить влияние циркуляции жидкой фазы с количественной стороны в более общем виде, а также чтобы учесть статистическое распределение времен циркуляции, рас- смотрим работу реактора периодического действия с распреде- лением времени циркуляции Допустим далее, что в пол- ностью сегрегированных элементах жидкой фазы осуществля- ется реакция нулевого порядка. Распространение этой модели на другие типы локальной кинетики реакций, в том числе и на реакции, описываемые уравнением Михаэлиса — Ментен, не представляет принципиальных затруднений, а только немного усложняет соответствующие расчеты, но все выводы качествен- ного характера при этом сохраняют свою силу. В реакции ну- левого порядка, константа скорости которой равна k0, при начальной концентрации реагента s0 его концентрация в эле- менте жидкой фазы будет изменяться согласно уравнениям: s(/) = t ^== t>te (9.90) Здесь мы впервые ввели параметр времени истощения питатель- ного вещества te, равный &o/so. Далее символом F обозначим долю времени, которую элемент жидкости находится в условиях
Проектирование и расчет биологических реакторов 59 полного истощения питательного вещества. Эту долю можно рассчитать по уравнению: t — te 1 (9.91) где t — среднее время циркуляции. Уравнение (9.91) было ре- шено при различных относительных величинах t, te и различных стандартных отклонениях о распределения времен выравнива- ния вии, ски ние. 9.20 что Л» Ъ Qj Cj а о i г з Относительное^рремя циркуляции РИС. 9.20. Зависимость времени пре- бывания клеток в циркулирующих элементах жидкой фазы в условиях истощения питательных веществ от относительного времени циркуляции и стандартного отклонения времени циркуляции (из работы [19]). I § i концентраций при усло- что fc(0—логарифмиче- нормальное распределе- Представленные на рис. результаты показывают, время пребывания клеток в истощенной среде возраста- ет при увеличении как сред- него времени циркуляции, так и стандартного отклонения времени циркуляции. Пара- метр 1—F можно интерпрети- ровать как отношение реаль- ного выхода продукта процес- са к выходу, который был бы достигнут при условии подачи питательного вещества ко всем точкам объема реактора. Эти расчеты показывают, что при данном времени циркуляции реактор должен иметь такую конструкцию, которая бы обес- печивала минимальную дис- персию времени выравнивания концентраций перемешивае- мых веществ. Описанная модель, хотя и обладает некоторой информатив- ностью, но не учитывает того влияния, которое могут оказывать на кинетику клеточного роста изменения условий во времени, обусловленные циркуляцией культуральной жидкости в реак- торе. Как мы уже видели на рис. 9.1, масштабы времени цирку- ляции в больших биореакторах сравнимы с масштабами време- ни некоторых метаболических превращений и адаптационных изменений. Это говорит о том, что модель, разработанная для специфических условий перемешивания в малом реакторе, мо- жет оказаться несостоятельной в случае большого аппарата, для которого характерны большое время выравнивания кон-
60 Глава 9 центраций перемешиваемых компонентов и большие флуктуации условий процесса. Эксперименты, выполненные с помощью встроенного непо- средственно в реактор флуориметрического устройства, описы- ваемого подробнее в разд. 10.2, наглядно показали близость времени выравнивания концентраций и биологического отклика системы. Время выравнивания концентраций в аэрируемом (0,5% по объему) 70-литровом реакторе с механическим пере- мешиванием (рабочий объем 40 л) определяли путем импульс- ного введения раствора хинина в 0,05 М. H2SO4 и последующего Таблица 9.3. Сравнение времени выравнивания концентраций в аэрируемом (0.5% по объему) реакторе объемом 70 л (рабочий объем 40 л) и времени отклика процесса утилизации глюкозы дрожжами (в секундах) при различных скоростях перемешивания3 Скорость вращения мешалки, об/мин 200 500 700 Время отклика флуоресценции внутриклеточной 8,5 6,8 5,9 Время выравнивания концентраций в жидкой фазе 4,2 2,5 1,5 Разность (время ческой системы) отклика биологи- 4,3 4,3 4,4 а Воспроизведено с разрешения из статьи: Einsele A., Risiroph D. L., Humphrey А. Е.г Mixing Times and Glucose Uptake Measured with a Fluorometer; Biotech. Bioeng., 20. 1487 (1978). контроля изменения флуоресценции культуры во времени. Эти изменения позволили определить процессы циркуляции жидкой фазы и смешивания в реакторе. Затем флуоресценцию измеря- ли после импульсного введения глюкозы в культуру дрожжей. В этом случае источником флуоресценции являлись внутрикле- точные восстановленные нуклеозиды, концентрации которых в большой степени зависят от скорости превращений глюкозы в клетке. Таким образом, результаты второго эксперимента дают ценную информацию о времени отклика полной последо- вательности процессов переноса (смешение с жидкой фазой -* -> диффузия к клеткам транспорт в клетки) и метаболических превращений, связанных с утилизацией питательного вещества. В табл. 9.3 приведены время выравнивания концентраций и время отклика процесса утилизации субстрата, найденные для этого реактора при различных скоростях перемешивания. Инте- ресно отметить, что время отклика процесса утилизации глюко- зы, как и можно было предположить, практически одно и то же во всех трех случаях, а время выравнивания концентраций при повышении скорости перемешивания существенно снижается.
Проектирование и расчет биологических реакторов 61 Эти данные интересны и с еще одной точки зрения — обращает на себя внимание сходство порядка величин времени отклика процесса локального поглощения и утилизации глюкозы и вре- мени выравнивания концентраций в растворе. Отсюда следует, что в ходе циркуляции клетки сталкиваются с различными условиями в разных зонах реактора и, вероятно, постоянно находятся в некотором переходном метаболическом состоянии, поскольку время отклика метаболизма мало отличается от ха- рактерного масштаба времени изменения условий в среде, обус- ловленного циркуляцией культуры. В некоторых экспериментах наблюдалось заметное влияние неоднородности среды на метаболизм клеток. Так, в трубчатом реакторе с линией циркуляции, в которой наблюдаются колеба- ния концентрации растворенного кислорода, в культуре Candida tropicalis повышается экономический коэффициент образования биомассы относительно субстрата, снижается скорость потреб- ления кислорода, расходуемого на образование биомассы, по- нижается дыхательный коэффициент. При колебании концент- рации растворенного кислорода в проточной культуре Pseudo- monas methylotropha ASI, растущей на метаноле как источнике углерода и энергии, наблюдались противоположные эффекты — снижение скорости клеточного роста и экономического коэффи- циента образования биомассы по субстрату. В другом экспери- менте в культуре Penicillium chrysogenum Pl концентрацию растворенного кислорода изменяли периодически (с периодом 2 мин), так что средняя концентрация О2 составляла 30% от концентрации при насыщении воздухом. В данном случае удель- ная скорость биосинтеза пенициллина существенно снижалась, причем в общих чертах этот эффект напоминал влияние пони- жения средней концентрации растворенного кислорода, что свидетельствовало о нелинейном характере влияния изменений условий на биореакцию. Если перейти к анализу более мелкомасштабных флуктуаций скорости турбулентного течения жидкой фазы, то логично ожи- дать существенного влияния интенсивности турбулентных вих- рей различных масштабов на морфологию (и, вероятно, на характер метаболизма) некоторых организмов. Можно далее предположить, что эта зависимость будет иметь наибольшее значение в случае организмов, вырастающих до размеров, мас- штаб которых сравним с ожидаемым масштабом турбулентных вихрей. Последние в свою очередь изменяются от крупномас- штабных (соответствующих масштабу высоты лопасти мешалки, например 0,1 м) до самых мелкомасштабных, образующихся в каскаде передачи энергии турбулентного потока (разд. 8.3). В биореакторах с перемешиванием размер самых мелких вих- рей равен примерно 20—100 мкм. Чтобы определить, на какие
62 Глава 9 биологические системы флуктуации скоростей в этом масштабе будут влиять в наибольшей степени, можно обратиться к рис. 9.2. Нетрудно видеть, что размеры скоплений микроорганизмов (особенно мицелиальных) соответствуют среднемасштабным турбулентным вихрям, и, следовательно, интенсивность переме- шивания и распределение зон турбулентности в реакторе будут оказывать влияние в основном именно на эти образования. РИС. 9.21. Зависимость концентрации лимонной кислоты, образовавшейся че- рез 7 сут в культуре Aspergillus niger, от скорости вращения турбинной ме- шалки (кривые 1, 2 и 3 отвечают штаммам S59, N233 и Е81 соответственно), а также зависимость количества сухой биомассы, образующейся в культуре штамма S59, от того же параметра (кривая 4). [Воспроизведено с разреше- ния из статьи: Ujcovd Е., Fencl Z., Musi’lkovd М„ Siechert L„ Dependence of Release of Nucleotides from Fungi on Fermentor Turbine Speed; Biotech. Bioeng., 22, 237 (1980).] В предыдущих главах мы уже обсуждали связанное с диф- фузионными ограничениями влияние общего размера клеточных скоплений на общие скорости процессов. Здесь же основное внимание мы уделим более скрытым эффектам, включая изме- нения морфологии и метаболического состояния организмов, в существенной степени влияющие на микробиологические про- цессы. Интересным примером такого рода эффектов является влияние интенсивности перемешивания на рост, образование продуктов жизнедеятельности и секрецию нуклеотидов в среду в случае различных мутантов Aspergillus niger — эффективных продуцентов лимонной кислоты. Как показано на рис. 9.21, при повышении интенсивности перемешивания возрастает урожай
Проектирование и расчет биологических реакторов 63 биомассы, однако зависимость скорости биосинтеза лимонной кислоты от интенсивности перемешивания носит более сложный характер и в случае всех трех изученных мутантов характери- зуется наличием четко выраженных максимумов. Параллельное изучение зависимости процесса секреции нуклеотидов в среду от скорости перемешивания показало, что характер этой зави- симости определяется природой штамма. Для ряда штаммов убыстрение вращения мешалки сопровождалось увеличением концентрации нуклеотидов в среде, а для другого штамма со- вершенно неожиданно была обнаружена обратная зависимость, когда при более высоких скоростях вращения мешалки скорость секреции нуклеотидов снижалась. Влияние скорости вращения мешалки на морфологию мицелия этого необычного мутанта представлено на рис. 9.22. На микрофотографиях видно, что при низких скоростях перемешивания мицелий имеет длинные, тон- кие и мало разветвленные филаменты с небольшим числом септ, в то время как при высоких скоростях перемешивания преобла- дают толстые, в высшей степени септированные, более разветв- ленные и скрученные гифы. Этот пример показывает, что интен- сивность перемешивания может оказывать на организмы боль- шое влияние, в существенной степени определяющее кинетику всего процесса. В обсуждении материала этого раздела и в приведенных примерах мы старались подчеркнуть потенциально сложную реакцию растущих клеток на физические и химические пара- метры окружения и невозможность разработки общей матема- тической модели кинетики, применимой при любых обстоятель- ствах. Поэтому необходимы тщательный учет совместного- влияния химических и физических параметров среды в данном биореакторе и применение соответствующего математического описания кинетики процессов, необходимого именно в данной ситуации. Очевидны трудности, связанные с масштабным пере- ходом в случае систем, кинетика которых отличается высокой чувствительностью к флуктуациям параметров окружения. В этих случаях нужно попытаться найти такую конструкцию реактора, которая обеспечивала бы определенные (но не обя- зательно одинаковые во всем объеме) параметры окружения, что может быть чрезвычайно трудной задачей, если речь идет о крупномасштабных реакторах. Выбрав реактор иной конст- рукции (см. разд. 9.7), иногда удается снизить разброс в зна- чениях времени выравнивания концентраций и степени флук- туаций параметров окружения и тем самым получить более определенную картину смешения, для которой легче подыскать соответствующее математическое выражение, описывающее ки- нетику процесса. Однако в общем случае нельзя рассчитывать на успех рационального, заранее спланированного масштабиро-
64 Глава 9 РИС. 9.22. На этих микрофотографиях отчетливо видно различие в морфоло- гии и септации клеток A. niger S59, выращенных при 400 (а) и 1200 (б) обо- ротах в минуту (увеличение Х400). [Воспроизведено с разрешения из статьи: Ujcova Е.. Fencl Z., Musi'lkova М., Siechert L., Dependence of Release of Nucleotides from Fungi on Fermentor Turbine Speed: Biotech Bioene 22 237 (1980).] ’
Проектирование и расчет биологических реакторов 65 вания биореакторов до тех пор, пока мы не будем лучше пони- мать процессы переноса в различных масштабах и кинетику биореакций на нескольких условиях сложности и пока не сможем объединить эти данные с тем, чтобы достаточно надежно рас- считать работу реактора на основе одних лишь теоретических данных. Пример 9.1. Моделирование и оптимизация процесса производства «-га- лактозидазы с помощью плесневого гриба Monascus sp. Фермент а-галакто- Продолжитпелъносгпъ культивирования, ч РИС. 9П1.1. Результаты изучения роста периодической культуры плесневого гриба Monascus sp. на глюкозно-галактозной среде [начальный состав среды; 1% (по массе) глюкозы, 0,3% галактозы, 0,5% NH4NO3, 0,5% КН2РО4, 0,1% MgSO4-7H2O, 0,01% дрожжевого экстракта]. Посевной материал выращен на глюкозной среде. При расчете исходили из следующих начальных условий: х=5-10-4 г/мл, $1 = 1-10-2 г/мл, $2=3-10-3 г/мл; $2/=0 мкгДмг клеток), г$2/=0,910 мкг/(мг клеток), е=0 единицДмг клеток). [Воспроизведено из статьи: Imanaka Т. et al., Unsteady-State Analysis of a Kinetic Model for Cell Growth and a-Galactosidase Production in Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 51, 423 (1973).] зидаза применяется в производстве сахара из сахарной свеклы благодаря его способности разрушать рафинозу — ингибитор кристаллизации сахарозы. В ря- де интересных работ Иманака, Кайеда, Сато и Тагучи изучили процесс про- изводства этого внутриклеточного фермента с помощью плесневого гриба, вы- деленного ими из почвы*. Опубликованные этими исследователями данные заслуживают тщательного анализа, мы же суммируем некоторые основные результаты. * Приведенные в этом примере данные заимствованы главным образом из статей: Imanaka Т., Kaieda Т., Sato К., Taguchi Н., a-Galactosidase Produc- tion in Batch and Continuous Culture and a Kinetic Model for Enzyme Produc- tion, J. Ferment. Technol. (Japan), 50, 633 (1972); Imanaka T., Kaieda T., Ta- guchi H., Optimization of a-Galactosidase Production by Mold II III- J Fer- ment. Technol. (Japan), 51, 423, 431 (1973). 5—746
66 Глава 9 На первом этапе разработки высокоэффективного процесса биосинтеза фермента были изучены различные условия культивирования плесени в пе- риодическом и непрерывном процессах. К числу основных результатов изуче- ния периодической культуры относятся следующие: 1. Из 20 изученных источников углерода (в том числе глюкозы, фруктозы» маннита, крахмала) только четыре вещества углеводной природы доста- РИС. 9П1.2. Концентрации клеток и субстрата, а также удельная фермента- тивная активность в проточной культуре при 30 °C в стационарных состояниях после ступенчатого повышения скорости разведения. Начальные концентраций глюкозы и галактозы составляли 2 и 0,5% соответственно. [Воспроизведена из статьи: Imanaka Т. et al., Optimization of a-Galactosidase Production by Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 50, 633 (1972).] точно эффективно индуцируют высокий уровень а-галактозидазной актив- ности. Эффективными индукторами являются галактоза, мелибиоза, рафи- ноза и стахиоза. 2. Что касается источников азота, то большие концентрации фермента проду- цируются в присутствии нитрата аммония; мочевина, KNO3, (NH^SO* и пептон в этом отношении менее эффективны. Оптимальная концентрация NH4NO3 в среде составляет 0,3—0,5% (по массе). 3. При росте на галактозной среде урожай клеточной массы пропорционалев- а-галактозидазной активности. Если в качестве источника углерода исполь- зуется смесь глюкозы и галактозы, то наблюдается явление диаукси» (рис. 9П1.1): до тех пор, пока не истощится почти вся глюкоза, галактоз» практически не утилизируется.
er Проектирование и расчет биологических реакторов л Как покачано на пис 9П1.1, продуцирование а-галактозидазы начинается * ™ьк"сктощи™ почти вся глюкоза. В отдельных аксперимен- тах было показано, что глюкоза в концентрациях, превышающих 0,05 /0 (по массе), подавляет синтез фермента. „„„„„ Изучению непрерывной культуры в стационарном состоянии были посвя- щены две серии экспериментов, которые были выполнены в одном ПРПП. В первой серии экспериментов скорость разведения вначале удерживали на РИС. 9П1.3. Концентрации клеток и субстрата, а также удельная фермен- тативная активность в стационарных состояниях после ступенчатого сниже- ния скорости разведения проточной культуры при 30 °C. Начальные концентра- ции глюкозы и галактозы составляли 2 и 0,5% соответственно. [Воспроизве- дено из статьи: Imanaka Т. et al., Optimization of a-Galactosidase Production by Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 50, 633 (1972).] очень низком уровне, а затем ступенчато повышали, определяя параметры системы в стационарном состоянии при каждом значении D. Полученные ре- зультаты приведены на рис. 9Ш.2. Особенно интересно резкое изменение свойств системы при £>=0,142 ч-1. При скоростях разведения ниже этой вели- чины происходит утилизация галактозы и синтез а-галактозидазы. Если же D превышает 0,142 ч-1, то оба процесса прекращаются и начинается утилизация глюкозы как единственного источника углерода для плесени. Очевидно, это скачкообразное изменение обусловлено влиянием глюкозы, уже упоминавшим- ся при анализе поведения периодической культуры данного организма. При относительно большой удельной скорости роста (больших величинах £>) пле- сень утилизирует преимущественно глюкозу. На рис. 9П1.3 представлены результаты аналогичной серии опытов ® ПРПП при высокой начальной скорости разведения, которую постепенно и 5*
68 Глава 9 также ступенчато уменьшали. В новой серии экспериментов снова обнаруже- но скачкообразное изменение параметров, хотя и менее резкое, чем в первой серии, причем на этот раз скачок наблюдался приблизительно при D=t = 0,008 ч-1. Ниже этой критической скорости разведения ассимилируется га- лактоза и продуцируется фермент; при £>>0,008 ч-1 а-галактозидазной актив- ности не наблюдалось, что не согласуется с результатами первой серии экспе- риментов, в которых фермент продуцировался вплоть до £> = 0,142 ч-1. РИС. 9П1.4. Здесь еще раз воспроизведены некоторые кривые из рис. 9П1.2 и 9П1.3, отражающие наличие нескольких стационарных состояний и гистере- зиса в проточной культуре. Два устойчивых стационарных состояния наблю- даются в диапазоне скоростей разведения от 0,008 до 0,142 ч-1. Какое из этих стационарных состояний реализуется, зависит от начальных условий. [Воспроизведено из статьи: Itnanaka Т. et al., Optimization of a-Galactosidase Production by Mold, J. Ferment. Tech. (Japan), 50, 633 (1972).] На рис. 9П1.4 воспроизведены также некоторые данные из двух предыду- щих рисунков, которые достаточно наглядно показывают, что в диапазоне между £> = 0,008 и £> = 0,142 ч-1 система имеет несколько устойчивых ста- ционарных состояний. В этом диапазоне скоростей разведения способность си- стемы продуцировать а-галактозидазу зависит от начальных условий работы реактора, причем синтез а-галактозидазы обеспечивается только при подходе к этому диапазону со стороны более низких скоростей разведения. На базе этих и ряда других экспериментальных данных была разработана математическая модель, описывающая утилизацию субстрата, рост клеток и синтез фермента. Приведенные в табл. 9П1.1 индивидуальные параметры мо- дели в общих чертах нам уже знакомы: так, например, удельная скорость клеточного роста Цг на галактозе описывается уравнением Моно, а уравнение
Проектирование и расчет биологических реакторов 69 Таблица 9П1.1. Математическая модель процесса образования а-галактозидазыа’* 6 Утилизация субстрата ds} ~dt 1 ~y-V-ix Yi j=\ (глюкоза), 2 (галактоза) (9П1.1) Скорость роста биомассы dx — =(Н1 + М* (9П1.2) си где в Ц. = ^ma*-1S1 (9П1.3) Si+Kid+s,/^) ' 1 P-max, 2S2 /пт H2=—(9П1.4) од “г Да Оперонная модель биосинтеза Внутриклеточная галактоза: f ^2^2 \ — (S2J-X) = Ux\T------;--- — S2/ I — «1S2/* При Si<Sic dt \Ams + s2 / = — kiS2lX при S1>S1C Репрессор: d ~(r-x) = k2s-k3r-x —kir.sirx + k3(rs2l)x'} Комплекс галактоза — репрессор: d ~1("2/)X1 = V-S2/-X —*B(rSa/)X мРНК галактозидазы: d ( kg(rc—r)x — k,m-x при rc>r ~—(m-x) = 1 dt ( —kjtn-x при r ^rc Фермент: d = kgtn-x (9П1.5а) (9П1.56) (9П1.6) (9П1.7) (9П1.8а) (9П1.86) (9П1.9) а Imanaka T., Kaieda T., Sato K„ Taauchi (1972). 1 J. Ferment. Technol. (Japan), 50,633 б В уравнениях модели концентрации компонентов системы обозначены следующими символами: биомасса — xt глюкоза — внеклеточная галактоза ~~ внутриклеточная галактоза — s2p внутриклеточный репрессор — г, внутриклеточный комплекс индуктор — репрессор — rs2p внутриклеточная мРНК — т, внутриклеточная а-галактозидаза — е. Дру- гими символами обозначены параметры кинетики процессов, выходов и транспортных явлений.
70 Глава 9 удельной скорости роста клеток на глюкозе Ц1 включает член, учитывающий конкурентное ингибирование галактозой. Все константы, входящие в эти урав- нения, были определены в экспериментах с непрерывной культурой в двух различных средах. В табл. 9П1.2 параметры с индексом G отвечают глюкозной среде (20 г глюкозы, 5 г NH4NO3, 5 г КН2РО4, 1 г MgSO4-7H2O, 0,1 г дрож- жевого экстракта в 1000 мл водопроводной воды при pH 4,5), а индекс р отвечает галактозной среде (5 г галактозы, 5 г NH4NO3, 5 г КН2РО4, 1 г MgSO4-7H2O в 1000 мл водопроводной воды, pH 4,5), в которой преимущест- венно и осуществляется синтез фермента. Таблица 9П1.2. Параметры математической модели биосинтеза а-галактозидазыа Находящиеся в правом столбце параметры определены экспериментально; другие параметры скорректированы таким образом, чтобы достигалось соответствие результатам экспериментального изучения периодической и неп- рерывной культур. Здесь индексами G и р обозначены параметры, относящие- ся к глюкозной (30 °C) и галактозной (35 °C) средам соответственно £1 = 40 ч-1 £2=1 мг/(мг клеток-ч) £з=1 ч-1 £4 = 0,1 (мг клеток)/(мг-ч) £5 = Н0-4 ч-1 £е=1 ч-1 £? = 8 ч-1 £sg = 3,2787 ед./(мг мРНК-ч) £вр = 5,0442 ед./(мг мРНК-ч) (7=100 ч-1 б2=1 мг/(мг клеток) /Сп2=1-10_8 мг/(мг клеток) sic = 2,25-10-4 г/мл гс=0,934 мг/(мг клеток) gmax.lG = 0,215 Ч-1 gmax,2G = 0,208 Ч~‘ Kig= 1,54-10-“ г/мл K2g = 2,58 • 10-4 г/мл |Хтах,1р = 0,190 Ч-1 Цтах,2р = 0,162 Ч * К1р= 1,45-10"4 г/мл /С2р=3,07- 10-4 г/мл «1=1,39-10-4 г/мл У1(?=0,530 y2G = 0,516 У1Р=0,377 У2Р=О,361 в Imanaka Т., Kaieda Т., Sato К.. Taguchi Н., J. Ferment. Technol. (Japan), Б0, 558 (1972). Модель биосинтеза фермента основана на оперонной теории индукции синтеза ферментов, рассмотренной нами в гл. 6. Считается, что удельная ско- рость синтеза а-галактозидазы пропорциональна внутриклеточной концентра- ции кодирующей этот фермент мРНК. Далее допускается, что эта мРНК разрушается в реакции первого порядка, а продуцируется только при условии, что внутриклеточная концентрация репрессора R меньше некоторого порого- вого значения гс. Ниже этой пороговой величины удельная скорость синтеза мРНК повышается при снижении концентрации г. Репрессор образуется с по- стоянной удельной скоростью £2 и разрушается по реакции первого порядка с удельной скоростью £3г. Концентрация репрессора снижается также за счет его связывания с индуктором — внутриклеточной галактозой. В уравнении материального баланса по внутриклеточной галактозе ско- рость транспорта галактозы в клетку описывается членом с коэффициентом U. Допускается, что при концентрации глюкозы si выше некоторой критической величины Sic (принимается равной 2,25-10-4 г/мл) этот член равен нулю; таким образом учитывается влияние глюкозы. Прямое определение констант скоростей в модели оперона затруднено из-за отсутствия соответствующих данных. Для оценки значений £3 и £7 еде-
Проектирование и расчет биологических реакторов 71 лано допущение, что периоды полураспада репрессора и мРНК составляют 40 и 5 мин соответственно. Приведенные в табл. 9П1.2 значения других пара- метров определены методом проб и ошибок так, чтобы в конце концов дости- галось приемлемое соответствие экспериментальным данным. Эта модель обладает рядом преимуществ, обусловленных высокой сте- пенью структурирования, базирующейся в основном на хорошо известных био- логических особенностях системы. С другой стороны, известные возражения может вызвать большое число корректируемых параметров. Для изучения диапазона применимости этой модели можно использовать несколько тестов. РИС. 9П1.5. Переходное состояние в ПРПП, инициируемое изменением ско- рости разведения от £> = 0,140 до £> = 0,142 ч-1. Среда содержит два источника углерода — глюкозу (2%) и галактозу (0,5%). В расчетах были приняты сле- дующие начальные условия: х=1,30-10~2 г/мл, si=2,23-10“4 г/мл, s2= =5,01-10“5 г/мл, s2/ = 2,5 мкг/(мг клеток), г=0,718 мкг/(мг клеток), rs2! — = 1,28 мкг/(мг клеток), т= 1,04-10-2 мкг/(мг клеток), е = 0,297 ед./(мг кле- ток). [Из статьи: Imanaka Т. et al., Unsteady-state Analysis of a Kinetic Model for Cell Growth and a-Galactosidase Production by Mold; j. Ferment. Tech., (Japan), 51, 423 (1973).] Один из них сводится к ответу на вопрос, могут ли другие модели, основанные на иных допущениях и содержащие аналогичное число нуждающихся в кор- ректировке параметров, так же хорошо соответствовать экспериментальным данным? Если это так, то у нас нет оснований предпочитать именно эту мо- дель. Иманака и сотрудники провели несколько подобных тестов, включая варианты, когда внутриклеточная концентрация галактозы считается пропор- циональной концентрации галактозы в среде, когда скорость образования репрессора принимается пропорциональной внутриклеточной концентрации глюкозы или когда скорость образования мРНК считается обратно пропор- циональной концентрации репрессора. Любое из указанных изменений модели приводило к серьезному расхождению между расчетными и эксперименталь- ными данными. Другие тесты, рассмотренные Иманакой и сотрудниками, включали ана- лиз соответствия моделй экспериментальным данным в широком диапазоне условий. Действительно, именно этот критерий определяет право на существо- вание сложной высокоструктурированной кинетической модели, поскольку только достаточно универсальная модель может использоваться для опреде- ления оптимальных параметров процесса. Здесь описываемая модель также
72 Глава 9 Таблица 9П1.3. Оптимальные условия биосинтеза а-галактозидазы в реакторах шести различных типов. Во всех случаях среда содержала 2% глюкозы и 0,5% галактозы* Система Схема пр Glc + Gal- 1 Glc + Gal- 2 Glc—। 3 fl 30°C Glc—i 4 оце 3 30° 3 35° 3 Ga Оптимальные фермента- Скорость об- условил; ве- тивная ак- разования сса личины D тивность, фермента, выражены ед./(мг кле- ед./(лч) в 4 Ток) £> = 0,142 0,325 554 — । Повышение скорости — 1 * разведения С £> = 0,121 0,500 559 Повышение — скорости разведения С GiaI £>1 = 0,200 0,293 415 , 1 £>2=0,250 £> = 0,118 5 °C 1 £>1=0,133 0,500 582 £>2=0,286 £>=0,097 1 » 30°C Glc—। 5 _ 30=C Glc—I 6 30 G 35°С Gal £>1 = 0,193 0,500 702 £>2=2,342 I £>3 = 0,286 Lj j-1— । £>=0,117 °C 35°С £>1 = 0,178 0,500 702 £>2=0,286 я! £> = 0,117 С=1,34 г 01 = 0,266 0,500 870 | _ и 2 — U,zou 1 * л — л 145 30°C 35СС С=200 а Imanaka Т., Kaieda Т., Taguchi Н., J. Ferment. Technol. (Japan), 51, 558 (1973).
Проектирование и расчет биологических реакторов 73 дала отличные результаты. Кривые на рис. 9П1.1 были рассчитаны с помощью рассматриваемой модели при указанных начальных условиях, причем соответ- ствие между расчетными данными н экспериментом оказалось очень хорошим. Уравнения модели, отражающие нестационарное состояние в ПРПП» можно получить путем введения в каждое из уравнений, описывающих пе- риодическую культуру (табл. 9П1.1), слагаемого, отвечающего скорости раз- ведения D (разности концентраций в питательном растворе и реакционной смеси). Затем получают соответствующие уравнения для стационарного со- стояния в ПРПП, приняв, что все производные по времени равны нулю. С по- мощью таких уравнений, в частности, были рассчитаны кривые, изображен- Скоростъ разведется в первом ПРПП W,n/4 -----0/133 Скорость разведения во втором ПРПП (Dz), л/ч РИС. 9П1.6. Вычисленная и экспериментально найденная зависимости скоро- сти образования фермента в непрерывной культуре в системе из двух ПРПП (система 3 в табл. 9П1.3). [Из статьи: Imanaka Т. et al., Optimization of a-Galactosidase Production in Multi-stage Continuous Culture of Mold; J. Fer- ment. Tech. (Japan), 51, 431 (1973).] ные на рис. 9П1.2 и 9П1.3. Модель хорошо воспроизводит наблюдаемые в экс- перименте гистерезис и скачкообразные изменения параметров. В качестве последнего теста, предшествовавшего работе по оптимизации реактора, модель применяли для расчета параметров переходного состояния в ПРПП в режиме повышения скорости разведения. Вычисленные на базе модели и соответству- ющие экспериментальные данные представлены на рис. 9П1.5; между найден- ными и вычисленными данными наблюдается очень хорошее соответствие, включая скачкообразные повышение концентрации глюкозы и снижение кон- центрации клеток. Детально разработанную описанным путем модель применяли затем для расчета выхода фермента в непрерывных реакторах различных конструкций (табл. 9П1.3), причем в каждом случае объемы отдельных сосудов корректи- ровались с целью обеспечения максимального выхода фермента. Указанная в таблице общая скорость разведения D равна отношению общей скорости потока поступающей в систему питательной среды к общему объему всех сосудов системы. Здесь несколько детальнее мы рассмотрим системы 3 н 4, в которых, как и в системах 5 и 6, первая часть (первый сосуд) системы служит для созда- ния высокой концентрации клеток с участием одной лишь относительно деше-
74 Глава 9 вой глюкозы; позднее в систему вводят галактозу, индуцирующую биосинтез фермента. Поскольку процесс индукции происходит не мгновенно, а в течение какого-то времени, то необходимо учитывать и этот период адаптации внут* риклеточных систем регуляции. В математической модели стадия индукции рассматривается изолированно, а ферментативная активность на выходе из реактора рассчитывается по уравнению (9.62), которое для данного случая можно записать в форме: оо ee=\eb{t)^{t)dt (9П1.10) 6 Здесь вь{{) —концентрация фермента в момент времени t, рассчитанная с по- мощью математической модели периодической культуры. При расчете послед- ней в качестве начальных условий принимаются значения концентраций ком- понентов питательной смеси перед стадией индукции. ь боо 500 5} С ^ЮО £ В 300 О Ж £ I 100 о loo гоо зоо боо Время пребывания во Z-м реакторе, мин РИС. 9П1.7. Скорость образова- ния фермента в системе из ПРПП и трубчатого реактора (система 4 в табл. 9П1.3). [Из статьи: 1та- naka Т. et al., Optimization of a-Galactosidase Production in Mul- ti-stage Continuous Culture of Mold; J. Ferment Tech. (Japan), 51, 431 (1973).] Описанным путем была рассчитана скорость образования фермента (Deex) в двухстадийной системе 3; результаты расчетов представлены на рис. 9П1.6. Расчеты показали, что скорость образования фермента должна быть максимальной при 01 = 0,20 ч-1; результаты соответствующих экспери- ментов практически полностью совпадали с расчетной зависимостью выхода фермента от Di. В системе 4 на второй стадии применялся биореактор, при- ближенно соответствующий реактору полного вытеснения. И в этом случае (рис. 9П1.7) расчетные данные (сплошная линия) хорошо согласовались с результатами эксперимента (точки). Приведенные в табл. 9П1.3 данные показывают, что соответствующим образом подобранная многостадийная система для культивирования организ- мов обеспечивает существенное повышение выхода фермента по сравнению с лучшим одностадийным процессом. Например, в системе 6 синтезируется на 55% больше фермента, чем в простом ПРПП. Наличие обоснованной кинети- ческой модели и применение общих принципов расчета реакторов в этом случае, очевидно, оказались важнейшими взаимодополняющими элементами В создании и оптимизации высокоэкономичного непрерывного процесса. 9.4. Стерилизаторы Жидкости, обычно водные растворы, можно стерилизовать несколькими методами, в том числе облучением (ультрафиоле- товым или рентгеновским излучением), воздействием ультра- звука, фильтрованием, нагреванием и обработкой особыми
Проектирование и расчет биологических реакторов 75 химическими агентами. В крупномасштабном производстве широ- ко применяются только два последних метода, хотя сравнитель- но небольшие количества растворов неустойчивых витаминов и других сложных соединений иногда стерилизуют путем про- пускания через пористые мембраны. В этом разделе основное внимание будет уделено процессам и аппаратам для стерилиза- ции путем тепловой обработки. Необходимые для разрушения жизнеспособных микроорга- низмов и вирусов условия могут изменяться в очень широких пределах в зависимости от природы стерилизуемого объекта и сферы его последующего использования. Иногда, например при квашении капусты или при биологической очистке сточных вод, необходимые превращения обеспечивают уже присутствующие в системе микроорганизмы. В процессах производства спирта, винного уксуса и заготовки силоса быстро вырабатываются ин- гибиторы, подавляющие рост нежелательных организмов, по- этому здесь требования к стерилизации также невысоки. Пасте- ризация молока сопровождается гибелью большинства, но да- леко не всех активно растущих микроорганизмов. Более жесткая обработка молока опасна из-за деструкции его полезных ком- понентов. Вообще оптимальный баланс между разрушением полезных компонентов и гибелью нежелательных микроорганиз- мов играет основную роль в выборе метода стерилизации и пастеризации, а также при расчете соответствующих аппаратов. Процессы с участием чистых культур, работа с культурами тканей и обработка некоторых пищевых продуктов требуют гораздо более жесткой стерилизации. В таких случаях систему необходимо практически полностью освободить от всех нежела- тельных микроорганизмов, хотя «полнота» стерилизации также зависит от конкретной системы. По экономическим соображе- ниям, например, для периодического процесса допустима веро- ятность заражения [(1—Ро) в уравнении (7.131)] порядка 10~2. Это означает, что один процесс из каждых 100 может быть за- бракован именно из-за недопустимо высокого заражения. С таким ущербом можно примириться, если стоимость потерь сравнима со стоимостью дополнительного стерилизующего обо- рудования. Значительно более жесткие правила приняты в консервной промышленности. Здесь необходима действительно полная сте- рилизация, поскольку единственная жизнеспособная спора Clostridium botulinum может в конце концов привести к смер- тельному отравлению. Обычно в такой ситуации основное тре- бование, предъявляемое к процессу стерилизации, состоит в снижении вероятности выживания спор (1— Ро) до величины менее 10~12. Этот пример наглядно демонстрирует опасность даже небольших отклонений от совершенно полного превраще-
76 Глава 9 ния субстрата (спор и вегетативных клеток) в продукты про- цесса (инактивированные споры, погибшие клетки) в стерили- зационных реакторах. Отсюда следует, что расчет таких реак- торов необходимо выполнять чрезвычайно тщательно. Сначала мы рассмотрим периодические, а затем непрерывные процессы стерилизации. 9.4.1. Периодическая стерилизация Изучение процессов стерилизации мы начнем с анализа за- крытого сосуда с полным перемешиванием, содержащего суспен- зию клеток или спор. Жидкость должна стерилизоваться при нагревании, а затем охлаждаться до температуры, отвечающей требованиям дальнейших этапов процесса. Концентрацию орга- низмов, оставшихся жизнеспособными после такой обработки, можно вычислить по уравнениям (7.125) и (7.126): = —kdoe-Ed/RT (9.92) dt В это уравнение в явной форме включена зависимость темпера- туры жидкости от времени. Путем разделения переменных в уравнении (9.92) и интегрирования находим *f \n-^-^(e~Ed/RTii}dt (9.93) nt J о Индекс f указывает, что данный параметр отражает конечные условия. Конструкция стерилизатора периодического действия обыч- но включает одно или несколько нагревающих устройств, где нагревание может осуществляться путем барботирования пара (пропускания острого пара через стерилизуемую среду), с по- мощью электрических нагревателей, посредством нагревания или охлаждения в жидкостном теплообменнике. Дейндорфер и Хамфри* предложили подразделять различные способы нагре- вания или охлаждения в соответствии с формой кривой измене- ния температуры во времени (температурным профилем); соот- ветствующие функции приведены в табл. 9.4. Интеграл в правой части уравнения (9.93) можно определить, разделив весь диа- пазон интегрирования на три интервала — нагревание (повыше- ние температуры), выдержку и охлаждение. В конечном счете мы получим четыре интегральных уравнения, одно из которых ♦ Deindoerfer F. Н., Humphrey А. Е., Analytical Method for Calculating Heat Sterilization Times; Appl. Microbiol., 7, 256 (1959).
Проектирование и расчет биологических реакторов 77 Таблица 9.4. Температурные профили периодических процессов стерилизации’ Тип теплообмена Температурный профиль Параметры Барботаж пара Электрические нагреватели гиперболический 7=7о(1,О+аО линейный Пар (в тепло- обменниках) Охлаждение (с помощью теплообмен- ников) 7=7w(l-f-&e-°‘) эксп оненци ал ьны й 7=7ео(1+&е-“‘) экспоненциальный hs $ --------- __ — МТорСр М _ я МТцрСр и А , T0-TN = — ь ---------- Me Тк = WC'- П _e-UA/wc\ МрСр ( > __ Тр Тео Обозначения: И — разность между энтальпией пара (при температуре барботажа) и энтальпией среды; s — массовая скорость потока пара; М— начальнаи масса среды; То— начальная температура среды; q — скорость теплопередачи, ккал в единицу вре- мени; U — коэффициент общей теплопередачи, ккал/(м2-ч-град); А — площадь поверхно- сти теплообмена, м2; TN— температура источника тепла; w — массовая скорость потока охлаждающего агента; с'—удельная теплоемкость охлаждающего агента; Те0 — темпе- -ратура охлаждающего агента на входе; р — плотность среды; Ср — средняя теплоемкость среды. а По данным статьи: Deindoerjer F. Н., Humphrey А. Е., Appl. Microbiol., 7, 256 (1959). описывает интервал постоянной температуры, а три других — интервалы изменения температуры по гиперболическому, линей- ному или экспоненциальному законам. Постоянная температура: In = Г kd.e~EdIRTdi = kdotfe~EdfRT (9.94) rt,f J о Изменение температуры по гиперболическому закону: 1П ”о . _ kdOa(Ed/RTo) c-(E,,IRTa)fbl(a+bH nf (a-\-b)2 у P f ^d . ____1 ~b Mf________1_______p I Ed_____a _ 21 RT0 L 1 + (a+b)tf a+ b ]j fl+Jj ^9'95^ Линейное повышение температуры: Ini (p Ed^r,----- nf RTpa \ 1 + atf RT0 /
78 Глава 9 Изменение температуры по экспоненциальному закону: In »о ( Ед/РТн \__f Ed/RTfj \ ___ nf ~ a |_ 4 1 + & ) 41 + bef~at}_ kd0 (.-EJRT/A g ( —Ed b \ ( —Ed bef~at y a L 4 RTh i + b J-r 4 RTh 1 + bef~at / (9.97) Здесь En — интеграл экспоненциальной функции: oo £n(z)=C^ (9.98) J Величины En(z) приведены в различных справочниках и вклю- чены в стандартные программы компьютеров. Соответствующие выражения для охлаждения получают, заменяя Тн на Тс0 и ис- пользуя отвечающие охлаждению определения параметров а и b (табл. 9.4). В каждом случае в результате решения уравнения получа- ется логарифм отношения конечной и начальной концентраций 1п(п^/по). Если, например, за электрическим нагреванием сле- дует выдерживание при повышенной температуре, а затем охлаждение с помощью жидкостного теплообменника, то отно- шение конечной и начальной концентраций жизнеспособных клеток можно выразить в виде уравнения: nf nf (выдержка) nf (нагревание) "1 ggj _ п0 (охлаждение) п0 (выдержка) п0 (нагревание) J ln-2L=ln n0 поскольку «о (охлаждение) =п} (выдержка) и п0 (выдержка) = = nf (нагревание). Если уравнение (9.99) записать в другой форме: 1пА = 1пДНЧ-+1п-Щ^- + 1пЛН£1 (9.100) п0 По (с) «о (Л) по (е) где с — охлаждение, h — выдержка и е — нагревание, то ста- новится очевидным, что общий результат 1п(п^/п0) получается путем сложения указанных выше трех индивидуальных реше- ний, каждое из которых относится к определенному временному интервалу, охватывающему определенный режим теплопередачи. Здесь целесообразно изучить также математическую модель другого процесса, а именно тепловой стерилизации твердых тел или жидкостей в состоянии покоя. Одной из областей использо- вания тепловой стерилизации является разрушение токсичных организмов в герметично упакованных пищевых продуктах. Час- то возникает необходимость и в максимальном удалении попу-
Проектирование и расчет биологических реакторов 79 ляций микроорганизмов, способных разлагать или каким-либо другим образом вызывать порчу продуктов в закрытых контей- нерах. В подлежащих стерилизации жидкостях часто содержат- ся суспендированные твердые частицы или скопления микроор- ганизмов. Если внутри этих частиц или скоплений имеются не- желательные организмы, то они труднее поддаются тепловой обработке, и поэтому для их стерилизации необходимо более продолжительное нагревание или более высокая температура. Математический анализ этих двух типов стерилизации, по крайней мере для случая простого контейнера той или иной гео- метрии, можно выполнить в упрощенном виде с помощью дву- стадийной модели, аналогичной рассмотренной выше. Прежде всего необходимо определить температуру в твердом теле как функцию положения и времени, т. е. решить задачу о теплопро- водности в нестационарном состоянии. Если допустить, что удельная теплопроводность k постоянна, то эту задачу можно сформулировать в виде уравнения: f>C„-^ = ky‘T (9.101) Здесь V2 — оператор Лапласа, а определения символов р и Ср даны в табл. 9.4. Помимо частного дифференциального уравне- ния (9.101), Т определяется также как функция положения внутри твердого тела при / = 0; кроме того, известно, что тем- пература наружной поверхности твердого тела при t>0 явля- ется функцией времени. Если, например, изучать сферическое твердое тело, то для определения температуры внутри этого тела при £>0 необходи- мо решить следующие уравнения: дТ k 1 д / 2 дТ\ dt рСр г2 dr \ dr J Т(г, 0) =f(r) ОсгсА? T(R,t)=g(f) />0 (9.102) (9.103) (9.104) Здесь г —расстояние от центра сферы, a f и g — соответствую- щие функции. Если первоначально температура в любой точке сферы равна То и если температуру ее поверхности T(t,R) при />0 поддерживать на одном и том же уровне 7\, то эту задачу можно решить путем разделения переменных: Т (G t) = 7\ + у J-1)” Sin 2ЕК- exp f-— пг Й n R \ pCp Для определения температуры в центре сферы (г=0) R* J (9.105) найдем
80 Глава 9 предел функции (9.105) при г->0. Таким путем получим Т (0, t) = Л 4- 2 (7\ - То) 2 (-1 )"ехр - М- П= 1 ' Р^Р ' (9.106) Рассчитанные с помощью этих уравнений профили распреде- ления температур в сфере при различных t представлены на рис. 9.23. Что касается процессов стерилизации, то наиболее РИС. 9.23. Температурные профили в сфере радиусом R в зависимости от от- носительного времени kt/pCpR2 (обозначено цифрами на каждой кривой). То — начальная температура в любой точке сферы, а Т\— температура на- ружной поверхности сферы при />0. важным выводом из обсуждаемой модели является наличие лаг-фазы между временем приложения высокой температуры к поверхности твердого тела и установлением аналогичной тем- пературы во всем объеме тела. Следовательно, в общем случае разрушение организмов в центре твердого тела будет менее полным, чем на его поверхности. Качественно этот вывод сохра- няет свою силу для тел любой другой геометрии и любых на- чальных и граничных условий. Не имея возможности углублять- ся в детали проблемы теплопроводности в различных системах в нестационарных условиях, мы рекомендуем читателю моно- графию Карслоу и Егера [29], содержащую много дополнитель-
Проектирование и расчет биологических реакторов 81 ной информации, описывающей теории и аналитические ре- шения. Если зависимость температуры от времени и положения внутри твердого тела определена, то затем можно рассчитать и долю погибших микроорганизмов и спор в этом теле. Для этой цели в пищевой промышленности использовались два под- хода. В первом из них рассматривается концентрация организ- мов в центре твердого тела. Поскольку центр нагревается в последнюю очередь, то, если его нагреть до соответствующей температуры, будет обеспечена достаточная степень стерилиза- ции и всего твердого тела. Далее для расчета доли выживших организмов в центре нам достаточно ввести в уравнение (9.93) функцию зависимости температуры от времени в этой же точке и вычислить соответствующий интеграл. Последнюю операцию часто удобнее выполнять в численной или графической форме, поскольку зависимость Т от t обычно выражается довольно сложным уравнением, например (9.106). В другом подходе описанные выше вычисления повторяют много раз и таким путем определяют концентрацию выживших организмов в каждой точке внутри твердого тела. Затем, инте- грируя эти концентрации по всему объему твердого тела, можно определить численность выжившей популяции или вероятность выживания организмов. Хотя принцип такого подхода очевиден и несложен, соответствующие расчеты довольно трудоемки. Поэтому для решения конкретных задач пищевой промышлен- ности были разработаны упрощенные методики расчета, осно- ванные на том же принципе. Объяснение этих методик невоз- можно без введения новых понятий и определений; интересую- щийся этой проблемой читатель может ознакомиться с ней детальнее в книге Чарма [30]. Преимущество периодической стерилизации состоит в отно- сительной простоте процесса, но вместе с тем ей свойствен и ряд недостатков. Один из них связан с продолжительным на- греванием и охлаждением, другой вытекает из первого и за- ключается в возможности разрушения полезных компонентов стерилизуемой системы. Действительно, при нагревании разру- шаются многие витамины, а белки подвергаются денатурации. Необходимо подчеркнуть, что кинетика разрушения этих ком- понентов системы часто описывается теми же уравнениями, что и кинетика гибели организмов [уравнение (9.92)], а энергия активации этих нежелательных побочных превращений обычно намного ниже энергии «реакции» стерилизации. Приведенные в табл. 9.5 величины, например, на 50—100 ккал/моль меньше энергии, обычно необходимой для разрушения клеток и спор. Поскольку энергия активации необходимого процесса выше энергии активации побочной реакции, то повышение температу- б-746
<82 Глава 9 ры благоприятно влияет на отношение скоростей необходимого и побочного процессов. Отсюда следует, что для подавления реакции Майяра или предотвращения разрушения лабильных соединений процесс стерилизации нужно проводить при возмож- но более высокой температуре в течение минимального времени, обеспечивающего гибель нежелательных организмов (высоко- температурная кратковременная обработка, или режим ВТКВ). .В процессах периодической стерилизации при медленном нагре- Таблица 9.5. Приближенные величины энергии активации некоторых нежелательных побочных реакций, происходящих при тепловой обработке Реакция Энергия ак- тивации Е, ккал/моль Реакция Майяра между белками и уг- 31,2 леводами Разрушение витамина Bi 21,0 Разрушение рибофлавина (витамина В2) 23,6 Денатурация пероксидазы 23,6 вании и медленном охлаждении эти цели не достигаются. В рас- сматриваемой ниже непрерывной стерилизации в потоке режим ВТКВ обеспечивается значительно легче. 9.4.2. Непрерывная стерилизация На рис. 9.24 схематично изображены два основных типа непрерывных стерилизаторов. В первом из них (рис. 9.24, а) нагревание осуществляется путем введения струи пара, затем нагретая жидкость проходит через секцию с постоянной темпе- ратурой и, наконец, охлаждается путем распыления. В схеме, изображенной на рис. 9.24,6, стерилизуемая жидкость нагрева- ется в пластинчатом теплообменнике. Предложено много вари- антов стерилизаторов каждого типа; многие из них отличаются особенно высоким отношением поверхности теплообмена к объ- ему аппарата. Такие стерилизаторы обеспечивают относительно быстрое нагревание и охлаждение, поэтому в них может быть реализован режим ВТКВ. Если допустить, что температура в каждой точке непрерыв- ного стерилизатора приблизительно одинакова (это допущение справедливо по крайней мере для секции выдержки температу- ры), то для математического анализа и расчета стерилизатора применимы два подхода. В первом подходе используется опи- санная выше дисперсионная модель, в которой в уравнениях (9.81) — (9.83) заменено на —kdn, а с — на п. Тогда кон- .центрацию организмов в выходящей из трубчатого стерилиза-
Проектирование и расчет биологических реакторов среда РИС. 9.24. Два типа стерилизаторов непрерывного действия: инжекционный стерилизатор с непосредственным введением пара (а) и стерилизатор с пла- стинчатым теплообменником (б). (Из работы: Аиба Ш„ Хемфри А., Мил- лис Н., Биохимическая технология и аппаратура. — М.: Пищевая промышлен- ность, 1975, с. 182.) тора среде можно определить аналитически и при наличии осе- вой дисперсии. Таким путем можно найти, что величину п в выходящей из стерилизатора среде можно выразить уравнением: п (L) =__________________4t/exp [Ре/2]_______________ (9 107) «о (1 + у)аехр[(Ре)(!/)/2]-(1-у)2ехр[ -(Pe)(t/)/2] 7 где ! 4Da\1/а £/ = ( 1+-^-) (9.Ю8) \ Ре / а число Дамкелера Da определяется по формуле: Da=-^- (9.109) ь
-84 Глава 9 При небольших отклонениях от режима полного вытеснения (при малых Ре-1) уравнение (9.107) упрощается: п (L) f Т> I Da2 \ /л 1 —x_2_ = eXp^_£)a_|____j (9.110) Эти уравнения удобно решать графически в виде зависимо- сти доли выживших клеток n(L)/n0 от критерия подобия Da для различных значений числа Пекле (рис. 9.25). Эти зависи- мости показывают, что при Ре->-оо (и, следовательно, при при- ближении к режиму полного вытеснения) необходимая степень стерильности может быть достигнута в самом коротком труб- чатом стерилизаторе. Отсюда далее следует, что конструкция непрерывного стерилизатора должна обеспечивать минимальную осевую дисперсию. Если по какой-либо причине поток через изотермический непрерывный стерилизатор нельзя удовлетворительно описать дисперсионной моделью, то мы можем обратиться к общей тео- рии РВП. Трудно представить себе лучший пример полностью сегрегированной системы, чем суспензия клеток или спор, под- вергающаяся тепловой обработке. Поэтому, если обратная диф- фузия организмов в линию подачи в стерилизатор исходной суспензии ничтожно мала, то концентрацию выживших орга- низмов п на выходе из стерилизатора можно рассчитать с по- мощью уравнения (9.62). Записав это уравнение в параметрах концентраций организмов, получим n = Jnb(tyt(t)dt (9.111) о Здесь <S(t)—функция РВП непрерывного стерилизатора. На- помним, что п&(0—концентрация организмов в периодическом стерилизаторе в момент времени t, причем Пь(О)=по. Из урав- нений (7.125) и (9.111) следует, что оо -А-= f (9.112) п0 J о Иногда вычисление правой части уравнения (9.112) облегчается тем, что формально оно идентично преобразованию Лапласа функции S, в котором обычный параметр преобразования Лап- ласа 5 заменен на ka. В заключение следует отметить некоторые другие (помимо упоминавшейся возможности осуществления режима ВТКВ) преимущества непрерывной стерилизации. Во-первых, непрерыв- ная стерилизация по сравнению с периодическим процессом обычно менее трудоемка. Во-вторых, аппараты для непрерывной
Проектирование и расчет биологических реакторов 85 РИС. 9.25. Влияние осевой дисперсии на разрушение организмов в непрерыв- ном стерилизаторе. (Из работы: Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н., Биохимиче- ская технология и аппаратура. — М.: Пищевая промышленность, 1975, с. 187.)
86 Глава 9 стерилизации обеспечивают большую однородность условий и воспроизводимость результатов, что особенно важно в пищевой промышленности, где даже небольшие отклонения от режима обработки могут существенно влиять на вкусовые качества продукта. В микробиологической промышленности периодическая сте- рилизация обычно осуществляется непосредственно в реакторе (in situ). В таких случаях скорость нагревания и охлаждения зависит от отношения площади поверхности реактора к его объему, а эта величина в свою очередь изменяется при мас- штабном переходе. В непрерывной стерилизации может быть снижена зависимость влияния стерилизации на организмы и компоненты среды от размеров аппарата, и, кроме того, при проектировании реактора отпадает необходимость учитывать требования, предъявляемые к эффективному периодическому стерилизатору. Конечно, стерилизация в потоке имеет и свои недостатки. Так, стерилизация путем прямого ввода пара в среду может привести к излишнему разведению системы водой, а использу- ющиеся для нагревания или охлаждения поверхностные тепло- обменники могут засоряться в результате осаждения суспенди- рованных твердых частиц. При непрерывной стерилизации по- вышается вероятность вспенивания культуральной жидкости. Другие сведения о преимуществах и недостатках различных стерилизаторов можно найти в работе [33], приведенной в гл. 7. 9.5. Иммобилизованные биокатализаторы Работа биологического реактора в основном определяется свойствами применяющихся биокатализаторов. Ранее мы об- суждали различные методы и способы использования фермен- тов, при помощи которых последние могли бы успешно выпол- нять свои каталитические функции. Кроме того, нами уже изучены методы генетической модификации клеток, позволяю- щие повысить выход синтезируемых ими ценных соединений. Прежде чем перейти к изучению реакторов других типов, позна- комимся с еще одним типом биокатализаторов. Этот раздел мы посвятим в основном изучению катализато- ров на основе иммобилизованных клеток. В таких катализаторах клетки связаны или включены в структуры, позволяющие удер- живать их в определенной зоне реактора. Клетки, как и фер- менты, могут быть иммобилизованы путем их включения в не- большие частицы или посредством закрепления на поверхности этих частиц, или с помощью того или иного макроскопического барьера, препятствующего переносу клеток из одной зоны реак- тора в другую.
Проектирование и расчет биологических реакторов 87 Прежде чем перейти к изучению методов иммобилизации клеток и некоторых экспериментов, выполненных к настоящему времени с участием такого рода катализаторов, мы должны -ответить на вопрос, почему вообще возникает необходимость в иммобилизации клеток. Одно из преимуществ иммобилизован- ных клеток связано с возможностью достижения гораздо боль- шей их плотности в культуре по сравнению с суспендированны- ми клеточными системами. В биореакторах периодического действия иммобилизованные клетки обладают и некоторыми другими преимуществами. Так, некоторые клетки млекопитаю- щих растут только в том случае, если они связаны с поверхно- стью, и, следовательно, для них иммобилизация является обя- зательным условием, а не одним из возможных вариантов. Кроме того, иммобилизованные клетки могут использоваться для создания специфических электродов, предназначенных для определения концентраций питательных веществ, метаболитов, лекарственных препаратов и токсичных веществ в биореакторах, а также в других процессах и в клинической практике. Иммо- билизация клеток может оказаться полезной как средство для регуляции морфологии клеток и реологии бульонов. Действи- тельно, рост микроорганизмов ограничен пустотами и поверх- ностями частиц носителя, что позволяет достаточно точно регу- лировать реологические свойства бульона и соответствующие параметры массопереноса, которые уже не изменяются в ходе процесса в такой степени, в какой это типично для периодиче- ского роста отдельных культур. Иммобилизация клеток создает возможность для осуществления непрерывного процесса без вымывания организмов и изменения их генетической природы, з в некоторых случаях позволяет непрерывно отделять продукт и удалять ингибирующие вещества. Как и в случае других им- мобилизованных катализаторов, стоимость иммобилизованных клеток может быть довольно высока и не обязательно бу- дет компенсироваться указанными преимуществами. В случае биореакторов непрерывного действия применение иммобилизованных клеток дает возможность расширить вре- менной диапазон, в течение которого клетки проявляют свои каталитические свойства при осуществлении необходимой хи- мической реакции или последовательности реакций. В отличие от иммобилизованных ферментных катализаторов иммобилизо- ванные клетки выполняют целый спектр каталитических функ- ций самой разнообразной сложности. Как схематично показано на рис. 9.26, катализаторы на основе иммобилизованных клеток могут быть нескольких типов в зависимости от того, какая часть метаболического аппарата клетки сохранила свою активность в данном процессе. При работе с суспензиями клеток для пред- отвращения их частичного вымывания необходимо, чтобы рост
88 Глава 9 клеток осуществлялся и в реакторе. Рассмотренное в первых разделах этой главы повышение скорости разведения, отвечаю- щей точке вымывания, за счет рециркуляции, по сути дела, представляет собой частичную иммобилизацию клеток в мас- штабе всего реактора. Таким образом можно повысить произ- РИС. 9.26. Различные уровни сложности сети реакций, осуществляемых ка- тализаторами на основе иммобилизованных клеток. водительность процесса в какой-то мере независимо от скорости роста организмов. Если клетки полностью удерживаются в ре- акторе, то в силу отсутствия затрат питательных веществ и энергии на клеточный рост можно ожидать проявления полного спектра каталитической активности. В сущности в таких слу- чаях клеточный рост часто вообще нежелателен, поскольку он может привести к снижению выхода необходимого продукта и поскольку накопление клеточной массы может нарушить гидро- динамические и реологические свойства системы. На самом низком уровне катализ иммобилизованными клет- ками сводится к проявлению активности одного или нескольких
Проектирование и расчет биологических реакторов 89 ферментов (без участия кофакторов). В этом случае иммобили- зованные клетки выполняют ту же функцию, что и иммобили- зованные ферментные катализаторы, и применение целых клеток целесообразно только с точки зрения снижения трудоемкости и стоимости процесса изготовления иммобилизованного катали- затора. При использовании таких катализаторов следует, одна- ко, учитывать трудности, связанные с дополнительным сопро- тивлением клеточной оболочки массопереносу и с возможностью расщепления необходимого фермента внутриклеточными проте- азами. Впрочем, в других случаях нативное клеточное окруже- ние может способствовать стабилизации некоторых ферментов. Далее, нерастущие иммобилизованные клетки могут катали- зировать многостадийные превращения, включая стадии утили- зации и регенерации кофактора. Если в системе присутствуют все кофакторы, ферменты, субстраты и регенерирующие вещест- ва, то в общем случае связанные с этими каталитическими про- цессами биосинтетические реакции и клеточный рост не нужны; если к тому же в организме уже существует определенный путь метаболизма с участием кофакторов, то иногда целесообразно использовать этот естественный путь, а не пытаться создать другой механизм утилизации и регенерации кофактора. На следующем по степени сложности каталитической актив- ности уровне осуществляются процессы биосинтеза и поддержа- ния жизнедеятельности клеток, но их рост и деление несущест- венны. Наконец, в самом сложном случае активна вся метабо- лическая сеть, клетки растут и делятся. В упоминавшихся выше реакторах периодического действия с участием культур иммо- билизованных клеток, например, возникает каталитическая активность именно этого наивысшего уровня сложности. Такой же уровень каталитической активности иммобилизованных кле- ток иногда целесообразен и в реакторах непрерывного действия с регенерацией катализатора, поскольку некоторые организмы плохо реагируют на среду, которая не способствует росту, и в таких условиях быстро теряют активность. Как мы увидим в приведенных ниже примерах, чередование условий процесса с менее сложным уровнем каталитической активности клеток до режима полного роста представляет собой обычный прием, позволяющий продлить срок службы катализатора. Катализатор, который выполняет необходимые каталитиче- ские функции, но не инициирует большое число побочных реак- ций, имеет два преимущества. Первое из них связано с увели- чением выхода продукта. Если субстрат можно стехиометриче- ски превратить в конкретный продукт определенного пути метаболизма микроорганизмов, избежав при этом клеточный рост или образование других конечных веществ, то выход необ- ходимого продукта в таких условиях, очевидно, будет макси-
90 Глава 9 мальным. Другое преимущество обсуждаемых катализаторов* заключается в более высокой общей скорости реакций. По мере усложнения каталитического процесса от простейшего однофер- ментного до наиболее сложного — полного клеточного роста (рис. 9.26)—резко возрастает и характерное время пребывания, в реакторе, необходимое для существенного превращения суб- страта. На одноферментном уровне скорости реакций определя- ются скоростями катализируемых ферментом отдельных эле- ментарных стадий, которые обычно завершаются примерно за одну минуту. Напротив, время удвоения клеток, характеризую- щее время осуществления всей сети метаболических превраще- ний, обычно составляет от нескольких часов до нескольких суток во всех случаях за исключением наиболее быстро расту- щих бактерий. Поэтому- по мере усложнения метаболических превращений (см. рис. 9.26) в общем случае значительно воз- растает и время пребывания реакционной смеси в реакторе, необходимое для превращения значительной доли субстрата. Отсюда следует, что выгоднее использовать только ферменты и кофакторы, необходимые для данного превращения; если этот путь удается реализовать, то тем самым удается существенно сократить расчетное время пребывания компонентов в реакторе. Закончив на этом изложение основ проблемы использования иммобилизованных клеток, перейдем теперь к изучению катали- заторов на основе иммобилизованных клеток, методов их полу- чения и изучения, а затем рассмотрим ряд примеров, иллюстри- рующих различные области применения этих катализаторов. 9.5.1. Типы биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток и их свойства В этом разделе мы рассмотрим методы, применявшиеся для иммобилизации клеток и изучения свойств полученных катали- заторов, играющих важнейшую роль в процессах с их участием. Иммобилизация клеток чаще всего осуществляется путем их включения в полимерный носитель. В табл. 9.6 перечислены раз- личные методы, применявшиеся для создания сшитых попереч- ными связями полимерных носителей. Гораздо чаще других применяется метод включения клеток в слой или в гранулу аль- гината (природного полисахарида) путем сшивки последнего ионными поперечными связями. Мягкие условия процедуры сшивки (в отличие от методов химической полимеризации) обеспечивают значительно более высокий уровень жизнеспособ- ности иммобилизованных клеток. На рис. 9.27 представлена схема одной из методик получения сферических гранул альги- ната кальция, содержащих иммобилизованные клетки.
Проектирование и расчет биологических реакторов 91 Таблица 9.6. Полимерные носители, применяющиеся для иммобилизации клеток Способ получения носителя Тип поперечных связей Примеры Осаждение Неспецифические Коллаген, полистирол, каррагинан Гелеобразование, связан- Ионные ное с ионным обменом Поликонденсация Ковалентные Полимеризация Ковалентные Альгинаты алюминия Эпоксидные смолы Полимеры на основе акриловой и метакри- ловой кислот При выборе методики и конкретных условий включения в полимерный носитель необходимо учитывать и конечные свой- ства получаемого иммобилизованного катализатора. В табл. 9.7 перечислены некоторые основные свойства носителей, представ- ляющие наибольший интерес с точки зрения процесса, в кото- ром будет использоваться катализатор. На проницаемость но- сителя по отношению к субстратам, ингибиторам, продуктам реакции и другим компонентам среды могут влиять как хими- ческие, так и механические характеристики носителя. Так, на- Таблица 9.7. Важнейшие свойства полимерных носителей, применяющихся для иммобилизации клеток Механические Химические Проницаемость Геометрия частиц Токсичность Сжимаемость, механическая Гидрофобность, гидрофиль- прочность частиц Чувствительность к сдвигу ность Ионный состав пример, механические свойства носителя могут налагать опре- деленные ограничения на допустимую геометрию частиц ката- лизатора. Сжимаемость и другие механические свойства ката- лизатора, не столь существенные в лабораторных эксперимен- тах, могут оказаться чрезвычайно важными в крупномасштабных процессах. Гранулированные полисахаридные носители, широко использующиеся в лабораторных исследованиях благодаря сво- ей высокой биосовместимости, мало подходят для крупномас- штабного производства из-за большой сжимаемости и по этой причине их можно применять только в невысоких реакторах колонного типа. Точно так же неустойчивые к ударам иммоби- лизованные катализаторы непригодны в тех случаях, когда
92 Глава 9 45 мл 8 %-нога (масса / объем} раствора альгината Юг клеток (во влажном состоянии) В Z7o-miii (масса/объем) раствор CaClg 0,1 М раствор AlgCSO^ РИС. 9.27. Схема методики включения клеток в гранулы альгината. гранулы катализатора должны выдерживать соударения без истирания и разрушения (например, в реакторах с перемеши- ванием). Перечисленные в табл. 9.7 химические свойства носителей могут влиять на каталитическую активность иммобилизованных клеток непосредственно, т. е. путем воздействия на системы регуляции клеточного метаболизма, или опосредованно, через локальное окружение клеток. Если, например, полимерный но- ситель содержит токсичные вещества, то можно ожидать сни- жения активности клеток. Заряд, ионный состав и гидрофобные свойства носителя могут влиять на коэффициенты распределе-
Проектирование и расчет биологических реакторов 95 ния компонентов реакционной смеси и тем самым вызывать из- менение их концентрации в зонах непосредственного контакта с клетками по сравнению с концентрациями в жидкой фазе, не контактирующей с частицами катализатора. Другой метод иммобилизации клеток состоит в их включе- нии в полупроницаемые или пористые материалы. В качестве носителей для растущих микроорганизмов использовали очень- мелкие сита из нержавеющей стали. Кроме того, как посевной, материал для периодических процессов применяли споры плес- Таблица 9.8. Примеры иммобилизации клеток путем связывания с поверхностью носителей Клетки Носитель Адсорбция Е. coll, Cl. acetobutylicum Asp. orysae Streptomyces Lactobacilli, дрожжи S. carlsbergensis Pseudomonas sp. Клетки тканей Ионообменные смолы Модифицированная целлюлоза Модифицированный сефадекс Желатин Поливинилхлорид Антрацит Полисахариды Ковалентное связывание В. subtilis Е. coli Агароза и карбодиимид Оксид титана(IV) невых грибов, включенные в автоклавированные гранулы порис- того фильтрующего материала. Клетки также включали в мак- ропористые зоны асимметричных полых волокон. Помимо ука- занных методов включения клеток в носители полная или; частичная иммобилизация клеток, как мы уже не раз упомина- ли, может быть достигнута в масштабе всего реактора путем их рециркуляции. В альтернативном подходе относительно низко- молекулярные продукты выделяют из суспензии клеток методом диализа или ультрафильтрации с помощью помещенного в сус- пензию мембранного устройства; таким же путем можно вводить субстрат в суспензию клеток. Клетки многих типов иммобилизовали путем адсорбции или ковалентного связывания с поверхностями твердых носителей. Примеры иммобилизованных клеток (от бактерий до клеток тканей животных) и соответствующих природных или синтети- ческих носителей приведены в табл. 9.8. Другие сведения о методах иммобилизации читатель может найти в приведенной в конце главы литературе, а также в литературе, цитируемой- в рассматриваемых ниже примерах.
94 Глава 9 9.5.2. Применение биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток Рассматривая примеры, иллюстрирующие степень сложности процессов катализа с участием иммобилизованных клеток, мы начнем с самого простого случая и постепенно будем переходить ко все более и более сложным случаям. Путем иммобилизации целых клеток, предварительно обработанных с целью повышения их проницаемости литическими ферментами, спиртами или ди- метилсульфоксидом (ДМСО), мы, по сути дела, иммобилизуем входящие в их состав индивидуальные ферменты, в той или иной мере сохраняя их естественное окружение; такие катализаторы в принципе пригодны для использования в непрерывных процес- сах. К настоящему времени получено большое число катализа- торов типа «иммобилизованные ферменты в иммобилизованных РИС. 9.28. Инактивация аспартазы и фумаразы в суспендированных и иммо- билизованных клетках. (Воспроизведено с разрешения из работы: Immobilized Enzymes, Chibata I. (ed.), p. 140, Kodansha Ltd., Tokyo, 1978.) клетках»; некоторые из этих катализаторов нашли применение в промышленности. Такой подход к иммобилизации ферментов проще, чем выделение ферментов из клеток с последующей им- мобилизацией. С точки зрения практического использования, по-видимому, важнее другое преимущество иммобилизованных клеток, заключающееся в возможном повышении стабильности ферментов. На рис. 9.28 представлены результаты экспериментов по изучению инактивации аспартазы и фумаразы в иммобилизован-
Проектирование и расчет биологических реакторов 95 ных клетках Е. coll и в суспендированных интактных клетках того же организма. В иммобилизованных клетках инактивация как первого, так и второго ферментов происходит значительно медленнее. Возможно, что отчасти эта стабильность является кажущейся и обусловлена ограничениями ферментативных про- цессов за счет сопротивления массопереносу (см. разд. 4.4). Действительно, если катализатор на основе иммобилизованных клеток (или ферментов) функционирует в режиме, строго лими- тируемом диффузией, то наблюдаемая скорость инактивации будет значительно ниже действительной скорости этого процес- са. Однако в дальнейших экспериментах Шибата и др. показа- ли, что в данном конкретном случае имеет место истинная ста- билизация фермента вследствие его включения в нативное клеточное окружение. Интактные клетки Е. colt были обрабо- таны ультразвуком, затем растворимая и нерастворимая фрак- ции продуктов обработки были разделены и иммобилизованы. В иммобилизованной растворимой фракции аспартазная актив- ность снижалась значительно быстрее, чем в иммобилизованной нерастворимой фракции. Кроме того, обработкой интактных клеток агентами, солюбилизирующими связанные с мембранами белки (дезоксихолатом или тритоном Х-100), также были по- лучены растворимая и нерастворимая фракции, которые после иммобилизации быстро теряли активность. Эти результаты сви- детельствуют о возможности стабилизации аспартазы путем связывания или ассоциации с клеточными мембранами или с их компонентами. Следует отметить, однако, что в других случаях иммобилизация ферментов в интактных клетках сопровождается и обратным эффектом. Так, в проницаемых иммобилизованных клетках некоторых организмов глюкозоизомераза теряет актив- ность быстрее, чем тот же самый фермент, выделенный из этих клеток. Этот эффект объясняли протеолизом фермента под дей- ствием внутриклеточных ферментов. Проблема внутриклеточной протеолитической активности очень важна при любом применении иммобилизованных клеток. Как мы упоминали в гл. 6, для нормальной жизнедеятельности клеткам необходимы внутриклеточные гидролазы. Очевидно, что потеря ферментативной активности в результате внутрикле- точного гидролиза, а также разрушение клеточной мембраны или утрата клеткой способности транспортировать вещества за счет какого-либо другого процесса играют основную роль в оп- ределении полезного времени жизни катализатора на основе иммобилизованных клеток. Для оптимизации генетической при- роды клеток и разработки более совершенных катализаторов на основе иммобилизованных клеток, соответствующих конструк- ций реакторов и оптимальных режимов их эксплуатации, оче- видно, необходимо лучше понимать механизмы процессов внутри-
96 Глава 9 клеточного гидролиза, а также других процессов инактивации, связанных с изменением конформаций белковых молекул или с повреждением мембран вследствие химического взаимодейст- вия с компонентами среды. Действительно, на разработку штам- мов микроорганизмов, успешно применяющихся в настоящее время в культурах суспензий клеток, были затрачены десятиле- тия; в этой связи представляется вполне вероятным, что для получения генетически модифицированных штаммов, специаль- но предназначенных для их использования в иммобилизованной форме, потребуются еще очень большие усилия. Следующий по степени сложности уровень каталитической активности включает многостадийные превращения, связанные о использованием и регенерацией кофакторов. Из процессов такого типа наиболее широко изучалось превращение глюкозы в анаэробных условиях. Много работ посвящено изучению пре- вращения глюкозы в этанол иммобилизованными дрожжами (Saccharotnyces cerevisiae) или бактериями (в первую очередь Zymomonas mobilis)-, по меньшей мере один процесс с участием биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток реали- зован на пилотной установке [34]. Изучению превращения глюкозы в этанол при участии им- мобилизованных клеток предшествовали работы по исследова- нию непрерывных процессов пивоварения в присутствии склон- ных к флокуляции штаммов дрожжей; по сути дела, флокуляция обеспечивает достаточно эффективное удерживание (иммоби- лизацию) клеток в реакторе с псевдоожиженным слоем ката- лизатора (разд. 9.6.4). Позднее дрожжи иммобилизовали путем адсорбции на желатиновой пленке и включения в х-каррагинан, альгинат или полиакриламид. Показано, что для реактора ко- лонного типа с клетками Saccharomyces carlsbergensis, иммо- билизованными в х-каррагинане, характерен стартовый период с неустановившимся режимом, продолжающийся около 7 сут, после чего колонна функционирует в стационарном режиме с постоянными концентрациями жизнеспособных клеток в геле, а также глюкозы и этанола в продуктах процесса. После ряда конструкционных доработок концентрацию этанола в продуктах процесса удалось довести до 100 г/л и более. Японская компания Kyowa Hakko Kogyo Company сообщила о создании пилотной установки для производства этанола с по- мощью иммобилизованных дрожжей в реакторе с псевдоожи- женным слоем катализатора (разд. 9.6.4). Схема этой установ- ки представлена на рис. 9.29. После трехмесячных испытаний удалось найти режим, при котором разбавленная меласса са- харного тростника (содержащая 14% глюкозы) при 30 °C пре- вращалась в 8,5%-ный (по объему) водный этанол с объемной скоростью [(объем раствора исходных веществ) • (объем ге-
Проектирование и расчет биологических реакторов 97 ля)-1^-1] от 0,4 до 0,5 ч-1. Степень превращения сахара в этанол составляла 95%, а производительность установки в рас- чете на единицу объема колонны 20 г/ (л-ч). Более сложен процесс превращения глюкозы в ацетон, бута- нол и этанол с помощью бактерии Clostridium acetobutylicum и родственных организмов. Пути катаболизма в^этой бактерии контролируются сложной регуляторной системой, которая до Воздух Охлаждающая Ферментер вода РИС. 9.29. Схема установки для производства этанола с помощью иммоби- лизованных дрожжей [34]. настоящего времени детально не изучена, несмотря на большой практический опыт по применению этого организма в традици- онных ферментациях с участием суспендированных культур. В зависимости от состава и условий среды и состояния клеток в одних случаях основными конечными продуктами метаболиз- ма глюкозы могут быть органические кислоты, а в других об- разуются необходимые органические растворители. По сравне- нию с катализируемым дрожжами превращением глюкозы в этанол эта система значительно сложнее, поскольку здесь мы должны уметь регулировать селективность процесса, направляя его в сторону образования ценных веществ. Возможность практической реализации непрерывного дли- тельного процесса биопревращения глюкозы в органические растворители была продемонстрирована Фёрбергом и др. [35]. 7-746
98 Глава 9 В разработанном ими процессе катализатором служил организм Cl. acetobutylicum, включенный в гель на основе альгината, кальция, а глюкозная среда была лишена факторов, необходи- мых для клеточного роста. Время от времени, сначала с интер- валом 2—4 ч, а затем через каждые 8 ч в культуру вводили полную питательную среду, что позволяло регенерировать час- тично инактивированный катализатор. Сообщалось, что в таком режиме, сочетающем не связанное с клеточным ростом много- стадийное биологическое превращение с короткими периодами Таблица 9.9. Выход бутанола в расчете на единицу клеточной массы, массы субстрата или объема культуры с участием иммобилизованных3 и суспендированных6 клеток Биокатализатор УР/Х, г бутанола из 1 г сухнх веществ клетки Tp/S, г бутанола из 1 г глюкозы /у г бутанола нз 1 л культуры в сутки Растущие иммобилизован- ные клетки (полная сре- да) 1,3—1,9 0,11 16,8 Иммобилизованные клетки (чередование сред, обеспе- чивающих только клеточ- ный рост или только пре- вращение субстрата) 50 0,20 Периодическая суспензион- ная культура 3,6 0,19 6,9 а Forberg С., Enfors S.-О., Haggstrom, Eur. Appl. Microbiol. Biotech., 17, 143 (1983). 6 Moreira A. R., Ulmer D. C., Linden J. C., Biotech. Bioeng. Symp. no. 11, 567 (1981). полного клеточного роста, система устойчиво функционировала в течение 8 недель. В этом процессе существенно подавлялось образование биомассы, а выход бутанола в расчете на единицу массы утилизированной глюкозы был значительно выше, чем в процессе, в котором иммобилизованные клетки контактировали с полной средой. В табл. 9.9 сравниваются важнейшие парамет- ры процессов с использованием иммобилизованных клеток в полной среде, иммобилизованных клеток с чередованием сред (обеспечивающих только клеточный рост или только превраще- ние субстрата), а также обычного периодического процесса с суспензией бактерий. Очевидно, что для дальнейшего совершенствования катали- заторов на основе иммобилизованных клеток необходимы фун- даментальные исследования и проектные разработки. Вместе с тем приведенный пример достаточно наглядно свидетельствует о возможности изменения кинетики и стехиометрии процесса путем подбора типа катализатора и соответствующего режима;
Проектирование и расчет биологических реакторов 99 этот путь создает дополнительные возможности для управления биокаталитпческими процессами и их оптимизации. В связи с рассмотренными примерами целесообразно изучить и интересную проблему переноса газов в иммобилизованных клеточных катализаторах и реакторах с такими катализатора- ми. Здесь мы рассмотрим только частную проблему массопере- носа в самом биокатализаторе. Допустим, что стехиометрию данного биопревращения можно описать уравнением простой химической реакции и что перенос субстрата S и продукта про- цесса Р в частицы катализатора и из них характеризуется ко- эффициентами эффективной диффузии Ds и Dp соответственно. С помощью основных уравнений материальных балансов и гра- ничных условий на частице катализатора нетрудно показать, что концентрации продукта процесса ср и субстрата cs внутри катализатора связаны уравнением ср = сро+ n s (cso~cs) (9.113) в котором а обозначает число молей продукта, образующегося из 1 моля утилизированного субстрата, а подстрочный индекс О указывает на условия на наружной границе (поверхности) час- тицы катализатора. Подставив в уравнение (9.113) cs = 0 и ре- шив полученное уравнение, можно оценить максимальную для данного катализатора концентрацию продукта, основываясь только на данных о стехиометрии и массопереносе. . Если в системе происходит поглощение и образование газов, это простое уравнение позволяет сделать важные выводы. Пред- положим сначала, что субстрат представляет собой ограниченно растворимый газ, например кислород. Тогда из уравнения (9.113) следует, что в результате реакции с одной частицей ка- тализатора произойдет лишь незначительное повышение кон- центрации продукта. Если мы далее рассмотрим другой вариант, когда в биокаталитическом процессе образуется умеренно рас- творимый газ, например СО2, и когда используется хорошо растворимый субстрат, например глюкоза, то, очевидно, может наступить такой момент, когда концентрация СО2 в катализа- торе превысит уровень насыщения, что приведет к зарождению и росту газовых пузырьков внутри частицы катализатора. Со- общалось, что такое явление вызывает серьезные затруднения в работе реакторов с иммобилизованными клетками, так как газовые пузырьки механически разрывают частицы носителей с включенными клетками, продуцирующими СО2, или патроны с дрожжевыми клетками, иммобилизованные в полых волокнах. Итак, мы сталкиваемся с определенными трудностями как при получении продукта из малорастворимых субстратов, так и при выведении из катализатора малорастворимых продуктов. 7*
100 Глава 9 Очевидно, эти трудности можно преодолеть путем снижения толщины частиц катализатора. Тогда отпадет необходимость в использовании неэффективной внутренней зоны частиц в слу- чае ограниченно растворимого газа-субстрата, а ограниченно растворимые продукты не будут в избытке образовываться внутри частицы катализатора. В свою очередь для снижения толщины катализатора нужно или уменьшить размер частиц,, или использовать катализаторы с тонким слоем клеток, иммо- билизованных путем включения или связывания на наружной поверхности большей частицы или иного объекта, которые бы удерживали клетки в реакторе. Выполнение требований, предъ- являемых к вводу и выводу ограниченно растворимых соедине- ний, является одним из основных условий при проектировании всего процесса и соответствующего реактора. Интересно отметить, что, как было обнаружено эксперимен- тально, процессы получения этанола из глюкозы с помощью иммобилизованных или суспендированных дрожжей в сходных условиях имеют различные общие скорости. В некоторых из этих экспериментов, возможно, существенный вклад в общую ско- рость процесса вносили диффузионные ограничения и связанные с ними эффекты; вместе с тем в тщательно контролируемых идентичных условиях и в отсутствие ограничений массопереносу наблюдалось обусловленное иммобилизацией клеток повышение удельной скорости образования этанола на 30—50%. Высказы- валось предположение, что причиной этого явления может быть или локальное изменение активности воды, вызванное матрицей- носителем или ее поверхностью, или изменение химического ми- кроокружения носителя, рассмотренное ранее. В общем случае нас не должно удивлять существенное изме- нение метаболической активности клеток, обусловленное их необычным окружением в иммобилизованном состоянии. Свя- зывание или сцепление клетки с твердой поверхностью может узнаваться специфическими клеточными рецепторами, влияю- щими на метаболические функции клетки. Точно так же нару- шение нормального морфологического развития клетки вследст- вие ее связывания в нескольких точках с твердой поверхностью, влияния полых волокон, в которые включены клетки, или меж- клеточных контактов может обусловливать заметное изменение картины метаболизма клетки, которое не наблюдается в отно- сительно неконцентрированных суспензиях. Кроме того, в плотных скоплениях иммобилизованных клеток некоторые секрети- руемые клетками продукты жизнедеятельности могут накапли- ваться в значительно более высоких по сравнению с суспензия- ми концентрациях. Наконец, можно достаточно обоснованно ожидать, что каталитические свойства относительно независимо развивающихся клеток и катализатора на основе иммобилизо-
Проектирование и расчет биологических реакторов 101 ванных клеток, который по клеточной плотности ближе к тка- невым препаратам, будут заметно различаться. Следовательно, применению катализаторов на основе иммобилизованных клеток должно предшествовать изучение их собственных кинетических характеристик, которые могут отличаться от кинетики анало- гичных превращений в суспензии клеток, а поэтому результаты изучения последних даже в идентичных условиях могут ока- Таблица 9.10. Примеры процессов биосинтеза, осуществляемых с помощью иммобилизованных клеток Субстраты Иммобилизованные клетки Продукт процесса Выход продукта процесса Глюкоза, неорга- Corynebacterium Глутаминовая 15 г/л за 144 ч нические соли аммония, ионы металлов Пантотеновая кис- glutamicum Brevibacterium кислота Кофермент А 500 мкг/мл лота, цистеин, ATP, MgSO4 Глюкозная среда ammoniagenes Penicillium Пенициллин 1,5 ед./(мл-ч) Пептонная (1 %) chrysogenum Bacillus sp. Бацнтрацнн 16—19 ед./мл среда Мясной экстракт (KY 4515)a Bacillus subtilis а-Амилаза 15 000 ед./мл (1%), дрожже- вой экстракт (0,05%) Бульон LB FERM-P № 2040 Escherichia coli В-Лактамаза 1-ю-11 а Включенные в 1 & Включенные в i C600(pBR 322)6 толиакриламидный гель. полые полупроницаемые волокна. ед./(клетка-ч) 8 ед./(мл-ч) заться неприменимыми к иммобилизованным клеткам. При рас- смотрении более сложных биокаталитических функций мы впра- ве ожидать еще более сложных зависимостей биохимической активности клеток от морфологии. Пока что в области применения иммобилизованных клеток для биосинтеза продуктов метаболизма и биополимеров успехи не очень велики. Это и не удивительно, если принять во внима- ние указанные выше осложнения и тот факт, что разработка методов осуществления многостадийных превращений, катали- зируемых иммобилизованными клетками, по сути дела, пока еще только начинается. В табл. 9.10 перечислены некоторые резуль- таты экспериментального изучения методов биосинтеза ряда веществ с участием иммобилизованных клеток. В некоторых из приведенных примеров рост клеток был существенно ограничен,
102 Глава 9 в других для расширения периода активной жизни клеток при- менялось чередование фаз полного клеточного роста и подавле- ния роста, а в третьих рост клеток вообще не ограничивался. Разумеется, при росте клеток с некоторой ограниченной скоро- стью должны иметь место вымывание или лизис клеток, причем скорость этих процессов должна уравновешиваться скоростью клеточного роста; в противном случае не будет достигнуто ста- ционарное состояние. При культивировании на твердых поверх- ностях клеток тканей животных регуляторные механизмы оста- навливают рост клеток примерно на стадии монослоя и затем переключают метаболизм с роста на образование продуктов метаболизма. Однако для достижения идеала — системы с им- мобилизованными клетками, способной синтезировать сложные вещества с высокими выходом и скоростью в проточных реак- торах, — нам еще предстоит исследовать множество проблем. 9.6. Биореакторы с многофазными системами В биореакторах реакционная масса почти всегда состоит из нескольких фаз (клетки, малорастворимые субстраты или про- дукты процесса, газовые пузырьки или частицы катализатора); тем не менее во многих случаях целесообразно приближенно описывать реакционную массу как практически гомогенную. В других случаях, однако, при расчете или анализе работы ре- актора важно принимать во внимание многофазную природу содержимого реактора. В этом разделе мы сосредоточим вни- мание именно на таких подходах к изучению реакторов и на некоторых методах математического описания многофазных систем. 9.6.1. Превращение нерастворимых субстратов Превращение нерастворимых субстратов типично для про- цессов утилизации крахмала и целлюлозы, модификации стерои- дов, а также для роста микроорганизмов на парафиновых углеводородах. В таких случаях мы прежде всего должны уста- новить (или принять допущение), где происходит реакция: или на границе раздела фаз, или в жидкой фазе с участием очень небольшого количества растворенного субстрата. Иногда могут реализоваться оба варианта одновременно. Так, например, час- тицы целлюлозы при трансформации сначала взаимодействуют с адсорбированными целлюлазными ферментами, а далее глюко- за утилизируется микроорганизмами в растворе. В случае не- растворимых субстратов важнейшим параметром системы явля- ется площадь межфазной поверхности, отнесенная к единице объема реактора; в свою очередь этот параметр иногда зависит
Проектирование и расчет биологических реакторов 103 от способа предварительной обработки субстрата, а чаще всего непосредственно связан с режимом работы реактора. Приведен- ный ниже пример роста микроорганизмов на нерастворимом источнике углерода наглядно иллюстрирует различные факторы, которые необходимо учитывать при анализе, расчете и эксплуа- тации реакторов с такими системами. Пример 9.2. Расчет ПРПП для микробиологической переработки жидких углеводородов*. Некоторые микроорганизмы, например дрожжи Candida lypo- lytica, могут расти на практически нерастворимых в воде додекане и других парафиновых углеводородах. Для роста микроорганизмов на границе раздела углеводородная — водная фаза предложены два альтернативных механизма. Во-первых, если характерный диаметр клеток Dc значительно меньше диамет- ра Dtl диспергированных капель углеводорода, то клетки могут концентриро- ваться вблизи капель. С другой стороны, если Dh<PDc, то можно допустить, что капельки углеводорода будут адсорбироваться на наружных поверхностях относительно больших микроорганизмов. В заключительной части разд. 8.4 мы указывали, что при микробиологиче- ской трансформации углеводородов с аэрацией в ходе периодического процес- са меняются соотношения между адсорбцией и флокуляцией в системе воз- душные пузырьки — клетки — углеводородные капли. Можно ожидать, однако, что в проточном процессе будет преобладать один определенный тип клеточного роста и одна соответствующая структура системы пузырек — клет- ка — углеводород; это облегчит количественное описание процесса. Му-Янг и сотрудники изучили обе ситуации и предложили следующее модифицированное уравнение Моно, учитывающее фактор доступности поверх- ности раздела фаз: Вариант I; Dc<zpDh s/Dh В — Вшах ! /п (9П2.1) As “Г Ь/Чь. Вариант II-, Dc~^>Dh s/(Dft)2 кАА^ <9П2-2> Здесь Ks и Кз' — модифицированные константы K.s. Как показано на рис. 9П2.1, экспериментальные данные для системы С. lipolytica— додекан (изображенные в координатах Лайнуивера — Бэрка) свидетельствуют в поль- зу второго гипотетического механизма. Уравнения, пригодные для расчета ПРПП, можно получить, связав мощ- ность, расходуемую перемешивающим устройством, с размером диспергиро- ванных капелек углеводорода (гл. 8). Если диаметр Dtl капель углеводород- ного субстрата определяется напряжением сдвига в области, прилегающей к концам лопасти мешалки, то уравнения, приведенные в примере 8.2, пока- зывают, что Л Г ( Р \~°’4 UhZ=(jAA) (9П2.3) Найдено, что это уравнение удовлетворяет опытным данным описываемого * Из статьи; Moo-Young М., Microbial Reactor Design for Synthetic Protein Production; Can. J. Chem. Eng., 53, 113 (1975).
104 Глава 9 эксперимента при С=0,023. Подстановка этого выражения в уравнение (9П2.2) дает s (P/V)°,s = P-max (9П2.4) Если описываемую уравнением (9П2.4) удельную скорость клеточного роста отнести к процессу в идеальном ПРПП, то при постоянстве экономического коэффициента и стерильности питательных веществ получим х = У DKS" ( Р \~0’8' Ртах D \, V / (9П2.5) Скорость разведения, отвечающая максимальной скорости роста биомассы, будет определяться уравнением: D = ----S( р ?-,8 • (9П2.6) Ks " + so На рис. 9П2.2 представлены зависимости скорости образования биомассы Dx от скорости разведения D, рассчитанные по уравнению (9П2.5). Эти графики, как и уравнения (9П2.5) и (9П2.6), наглядно демонстрируют важность учета РИС. 9П2.1. Результаты экспери- ментального определения скорости роста дрожжей С. lipolytica на додекане (в двойных обратных координатах) согласуются с мо- делью, в которой принимается, что микрокапли углеводорода адсор- бируются на поверхности клеток. [Из статьи: Moo-Young М., Micro- bial Reactor Design for Synthetic Protein Production; Can. J. Chem. Eng, 53, 113 (1975).] взаимосвязи между биологическими реакциями и гидродинамическими харак- теристиками при расчете и анализе микробиологических реакторов. Хотя для периодического процесса типично изменение характера адсорб- ционных явлений (см. разд. 8.4 и рис. 8.14), модель, в которой принимается, что клетки С. lipolytica, растущие на углеводородных каплях, непрерывно ад- сорбируются на их поверхности, образуя монослой, в некоторой степени согласуется с результатами экспериментального изучения периодического про- цесса. [См. работу: Erickson L. Е, Humphrey А. Е.. Prokop A, Growth Models of Cultures with Two Liquid Phases. I. Substrate Dissolved in Dispersed Phase; Biotech. Bioeng, 11, 449 (1969).]
Проектирование и расчет биологических реакторов 105 РИС. 9П2.2. Зависимость скоро- сти образования биомассы в про- цессе ферментации жидкого угле- водорода от скорости разведения и расхода мощности на перемеши- вание, отнесенного к единице объема (P/V), л. с./м3. 9.6.2. Реакторы с неподвижным слоем биокатализатора Колонны с насадкой иммобилизованного катализатора в на- стоящее время используются в нескольких промышленных про- цессах, и есть все основания полагать, что в ближайшее время область их применения существенно расширится. В таких реак- торах, называемых реакторами с неподвижным слоем катализа- тора, с помощью иммобилизованных ферментов осуществляют изомеризацию глюкозы, частичный селективный гидролиз пени- циллина, селективное расщепление смеси производных рацеми- ческих аминокислот. В реакторах с неподвижным слоем изуча- лись также процессы с участием иммобилизованных клеток. В простейшем и часто довольно успешно применяющемся математическом описании работы реактора с неподвижным слоем катализатора в основу положена модель реактора полно- го вытеснения, модифицированная с целью учета влияния ка- талитической насадки на структуру течений и кинетику реакций. Поверхностную скорость потока через реактор определяют как объемную скорость потока исходных веществ, отнесенную к пло- щади поперечного сечения пустот, которая представляет собой произведение общей площади поперечного сечения колонны на долю пустот е. Соответствующее уравнение скорости реакции, пригодное для трубчатых реакторов, основано на учете коэф- фициентов эффективности, описанных в гл. 4. Например, для простой реакции S-*P, протекающей с собственной скоростью v = v(s, р), скорость образования продукта в единице объема гранулы иммобилизованного катализатора в какой-либо опре- деленной точке реактора равна: (общая в единице объема ~ nCWsMs8? Ps) I гранулы катализатора (9.114)
106 Глава 9 Здесь ss и ps — концентрации субстрата и продукта соответст- венно на наружной поверхности частицы катализатора в данной точке объема реактора. Как указано в уравнении (9.114), в общем случае коэффициент эффективности -q, определяющий скорость диффузии в частицу катализатора, и скорость реакции v зависят как от ss, так и от ps. Прежде чем перейти к анализу сопротивления массопере- носу между жидкой фазой и поверхностью гранулы катализа- тора, запишем уравнение материального баланса по субстрату в сферической частице катализатора радиусом R в стационар- ном состоянии: Скорость диффузии субстрата из жидкой фазы = =скорость трансформации субстрата внутри частицы в результате реакции или 4nR2ks(s — ss) =4/3n7?3T](Ss, ps)v(ss,ps) (9.115) С помощью этого уравнения и учитывая стехиометрию реакции величины ss и ps можно выразить через концентрацию субстра- та s в жидкой фазе. Последующая подстановка полученных выражений в уравнение (9.114) дает выражение, позволяющее определить общую скорость утилизации субстрата, отнесенную к единице объема частиц катализатора, если известна концент- рация субстрата в жидкой фазе. При выводе уравнения материального баланса по субстрату в элементарном объеме реактора полного вытеснения с непод- вижным слоем катализатора нельзя забывать о том, что жидкая фаза и катализатор занимают е-ю и (1—е)-ю доли этого объ- ема соответственно. Применяющийся в этом уравнении параметр концентрации s отнесен к единице объема жидкой фазы, поэто- му уравнение материального баланса по субстрату принимает вид: = — р-21— ps)v(ss, Ps) (9.116) dz \ & J Здесь, как мы отмечали выше, параметры правой части уравне- ния можно выразить через s, что позволит проинтегрировать уравнение (9.116) по заданным концентрациям субстрата и продукта. Ситуация существенно упростится, если сопротивление мас- сопереносу внутри частицы и вне ее пренебрежимо мало, по- скольку в таких условиях т]->1 и s.s->s соответственно. В такой ситуации основные уравнения материального баланса можно интегрировать аналитически и прийти к приведенным ранее в табл. 9.2 уравнениям, описывающим процессы в реакторах пол- ного вытеснения.
Проектирование и расчет биологических реакторов 107 Как мы уже упоминали выше в ходе обсуждения дисперси- онной модели проточных реакторов, течение вокруг частиц, со- ставляющих слой насадки, и особенности смешения жидкой фазы в пустотах между частицами создают обратное (осевое) смешение, которое может вызвать отклонения от режима пол- ного вытеснения. В таких случаях можно применять дисперси- онную модель (коэффициент дисперсии можно определить так, как мы указывали выше) или модель на основе каскада реак- торов. Влияние небольшой дисперсии на работу реактора в сравнении с режимом идеального вытеснения мы уже обсуждали при изучении стерилизаторов. Другие подходы к математиче- скому моделированию реакторов с неподвижным слоем катали- затора с различными степенями обратного смешения и с раз- ными типами взаимодействий между неподвижной и подвижной фазами можно найти в приведенной в конце главы литературе. 9.6.3. Биореакторы типа барботажных колонн Под биореакторами типа барботажных колонн мы подразу- меваем реакторы с большим отношением высоты к диаметру, которые в отличие от реакторов с перемешиванием, обычно имеющих менее вытянутую форму, по форме напоминают ко- лонны или башни, а перемешивание в них осуществляется ис- ключительно за счет восходящего потока газа, подаваемого в реактор под давлением. Реакторы такого типа уже давно ши- роко распространены в химической промышленности благодаря относительно малым затратам на их изготовление и монтаж, простоте конструкции и невысокому расходу энергии в процессе эксплуатации. В промышленности, связанной с использованием биологических процессов, башенные реакторы довольно редки; в то же время такие биореакторы широко используются в про- изводстве пива и винного уксуса. Кроме того, близкие по кон- струкции башенные реакторы входят в состав весьма крупно- масштабных установок, предназначенных для культивирования микроорганизмов при производстве белка одноклеточных орга- низмов (БОО) в качестве корма для скота. В некоторых случаях применяют только одну колонну, кото- рую иногда снабжают внутренними тарелками или даже пере- мешивающими устройствами на отдельных или всех ступенях. Колонные реакторы могут функционировать как в периодиче- ском, так и в непрерывном режимах. В последнем случае воз- можны два варианта, в первом из которых направления потоков жидкой фазы и газа параллельны (т. е. совпадают), а во втором варианте используется принцип противотока. В разработанных сравнительно недавно так называемых эрлифтных реакторах с помощью наружного устройства осуществляется рециркуляция
108 Глава 9 жидкой фазы. Рециркуляционные устройства обеспечивают вы- сокоэффективный теплообмен, необходимый в крупномасштаб- ных микробиологических процессах с участием парафиновых или метанольных субстратов. Рециркуляционное устройство, кроме того, способствует формированию устойчивой структуры течений и определенных характеристик перемешивания в реак- торе. Особенности барботажных колонн, в том числе с внешни- ми рециркуляционными устройствами, с одной или несколькими ступенями были детально изучены Шюгерлем и сотрудниками; результаты этих работ опубликованы в ряде статей [36, 37]. Здесь мы ограничимся рассмотрением ряда основных концепций и понятий, которые полезны для вывода уравнений при расчете таких реакторов и анализе полученных с их помощью экспери- ментальных данных. В гл. 8 мы показали, что при достаточной плотности куль- туры быстро растущих аэробных организмов общая скорость клеточного роста обычно лимитируется скоростью переноса кис- лорода из газовых пузырьков в жидкую фазу. Анализ переноса кислорода, лимитирующего скорость всего процесса, требует сведений о параметрах перемешивания газовой и жидкой фаз в башне. Изучение системы воздух — вода в барботажной ко- лонне без рециркуляционного устройства показало, что жидкая и газовая фазы полностью перемешиваются, если скорость га- зового потока намного выше скорости течения жидкой фазы и если высота башни L близка ее диаметру dt. В случае более обычных высоких колонн необходимую скорость переноса О2 можно определить по уравнению (8.115) при L = z. В интегральной форме уравнение (8.115) справедливо при практически постоянной величине удельной площади межфазной поверхности а по всей высоте колонны. Это требование в свою очередь выполняется только при сохранении пузырьковой струк- туры газового потока. Эксперименты с системой воздух — вода показали, что если объемная доля газа е превышает критиче- скую ВеЛИЧИНу бтах, равную приблизительно 0,3, то поднимаю- щиеся через слой жидкости газовые пузырьки коалесцируют вплоть до образования воздушных пробок. Для того чтобы пе- ревести на язык математики требование о необходимости под- держания объемной доли газа ниже етах и связать его с диа- метром колонны, отметим, что в любой точке башни (9.117) Здесь Fg и ug — объемная и линейная скорости потока газа соответственно. Достаточно обоснованно можно принять, что равна конечной скорости щ отдельного газового пузырька в не- перемешиваемой жидкости и что FG приблизительно равна ско-
Проектирование и расчет биологических реакторов 109 рости поступающего в реактор газа FGf. Последнее допущение основывается на том факте, что поглощающийся из пузырьков Ог по меньшей мере частично замещается на СО2. При этих допущениях из уравнения (9.П7) следует, что е меньше етах, когда ¥/! (9.118) \ uGsmax J Это неравенство можно использовать для оценки геометриче- ских размеров колонны. В нашем упрощенном анализе мы не учитывали увеличение размеров воздушных пузырьков, обуслов- ленное снижением гидростатического давления в верхней части колонны. Этот фактор может привести к тому, что сначала воз- растет величина Н/, а затем пузырьки примут грибообразную форму. Достаточно малый размер пузырьков по всей высоте колон- ны обеспечивают ситчатые тарелки и (или) перемешивающие или другие внутренние устройства, разрушающие все воздушные пробки и таким образом способствующие сохранению высокой величины площади контакта между газовой и жидкой фазами. Сведения об иных механических приспособлениях, использую- щихся в биореакторах, приведены в разд. 9.7.3. На рис. 9.30 представлена схема, положенная в основу ма- тематической модели башенного реактора с рециркуляционным устройством и с параллельными потоками газовой и жидкой фаз (биореактор эрлифтного типа). В собственно башне реак- тора (на рисунке изображенной справа) в одном направлении движутся потоки жидкой и газовой фаз. В верхней части башни газ отделяется, а жидкая фаза через рециркуляционное устрой- ство (изображенное слева) возвращается в нижнюю часть ре- актора, где расположено барботирующее устройство. При мате- матическом описании жидкость и газ рассматриваются как от- дельные фазы, поднимающиеся снизу вверх по башне с различными линейными скоростями uL и uG соответственно. Занимаемые жидкой и газовой фазами доли объема обозначают символами ед и 8g соответственно; эти величины можно опре- делить экспериментально или расчетным путем с помощью уравнений для оценки величины газосодержания. На движение газожидкостной дисперсной системы в режиме полного вытес- нения налагается осевая дисперсия как в газовой, так и в жид- кой фазах, характеризующаяся различными коэффициентами. В жидкой фазе в результате микробиологических превращений происходит утилизация субстрата и кислорода, а газовая фаза обедняется кислородом за счет его переноса в жидкость. Переходя теперь к изучению элементарного объема башни между положениями z и z + dz (см. рис. 9.30,6), можно вывести
РИС. 9.30. Схема, положенная в основу математической модели реактора колонного типа с барботажем и рециркуляци- ей (а), и элементарный объем этого реактора (б); указаны термины и параметры, применяющиеся при выводе уравнений материального баланса в газовой (g, G) и жидкой (I, L) фазах [37],
Проектирование и расчет биологических реакторов 111 указанные ниже уравнения материального баланса по концент- рации кислорода в жидкой фазе и мольной доли кислорода в газовой фазе. Для этого нужно воспользоваться теми же мето- дами, которые мы применяли при анализе стационарного со- стояния системы в реакторах полного вытеснения. В оконча- тельной форме уравнения этих материальных балансов можно записать следующим образом: Жидкая фаза: дС1 '* = О, (0 ----uL (0 S“ {г' ° -г, (х, S, с„ г, t) + dt d9-z L dz r + (z, f) a\z, t) [сг* (г, t)—ct (z, /)] (9.119) Газовая фаза: p (z, t) dxs =Dg(t)—lp (z, t) — ' dt gy’dz[K dz J ---~(p(z,f) X (z, t) uG (z,rt) — .уел(Д -)—(z, t) a(z, t)[ct* (z,t)— dz \ s - Mo2eG(t) J -cdz,t)] (9.120) В сочетании с аналогичными уравнениями для утилизации суб- страта и клеточного роста и с такими же уравнениями матери- альных балансов для жидкой фазы в рециркуляционном уст- ройстве эти уравнения можно использовать для описания экспериментов по изучению массопереноса в нестационарном состоянии, работы биореактора в периодическом или непрерыв- ном режиме как в стационарном, так и в переходном состояниях с непрерывной подачей исходных веществ и непрерывным отбо- ром продуктов. Результаты обширных экспериментальных ис- следований и методы определения параметров рассматриваемой модели описаны в статье [37]. 9.6.4. Биореакторы с псевдоожиженным слоем катализатора Процессы в псевдоожиженном слое катализатора обычно осуществляют в реакторах колонного типа, рассмотренных в предыдущем разделе, поэтому если такие процессы включают подачу или отвод газа, то расчет газовых потоков и массопере- носа должен выполняться так, как мы только что описали. В то же время в реакторах с псевдоожиженным слоем катали- затора появляется еще одна фаза. В башенном реакторе с псевдоожиженным слоем катализа- тора, например в изображенном на рис. 9.31, поток жидкости направлен снизу вверх по высокому вертикальному цилиндру.
112 Глава 9 РИС. 9.31. Башенные ферментеры, применяющиеся в непрерывных про- цессах пивоварения. (Фотография любезно предоставлена компанией А. Р. V. Со., Ltd.) Частицы нерастворимого био- катализатора (скопления мик- роорганизмов, частицы иммо- билизованных ферментов или клеток) суспендируются, увле- каемые восходящим потоком жидкости. Вовлеченные в этот поток частицы катализатора в верхней расширяющейся части реактора прекращают подъем и затем вновь поступают в баш- ню. Если тщательно подо- брать режим работы реактора с учетом характеристик орга- низма, то биокатализатор уда- ется удерживать в реакторе, несмотря на то что через ре- актор непрерывно протекает среда. Биологические реакторы с псевдоожиженным слоем ка- тализатора намного сложнее рассмотренных нами ранее ПРПП и ТРПВ. Например, в башенных ферментерах, ис- пользующихся в непрерывных процессах пивоварения, созда- ется определенный градиент концентрации дрожжевых кле- ток по высоте башни, причем вблизи от дна реактора кон- центрация микроорганизмов (определенная по отношению массы влажного осадка, обра- зующегося после центрифуги- рования и отделения суперна- тантной жидкости, к массе бульона) может достигать 35%, а в верхней части башни этот параметр снижается до 5—10%. Более того, в зависи- мости от высоты в реакторе постепенно изменяются и ха- рактеристики среды. Так, вблизи зоны поступления ис- ходных питательных веществ превращениям подвергаются прежде всего легко ферментируемые сахара (глюкоза, фрукто- за, сахароза, частично мальтоза), что приводит к снижению плотности среды. В средней и верхней зонах башни скопления дрожжевых клеток трансформируют мальтотриозу и отчасти
Проектирование и расчет биологических реакторов 113 мальтозу. Такая картина, характеризующаяся быстрыми реак- циями в начальной стадии процесса и последующими более медленными реакциями с участием менее «удобных» субстра- тов, согласуется с экспериментальными данными, представлен- ными на рис. 9.32. Рудиментарная модель реакторов с псевдоожиженным слоем катализатора может быть разработана, если допустить, во-пер- вых, что частицы биологиче- ского катализатора (хлопья скоплений микроорганизмов или частицы иммобилизован- ного фермента) однородны по форме и размерам; во-вторых, что плотность жидкой фазы является функцией концентра- ции субстрата; в-третьих, что движение жидкой фазы в ре- акторе осуществляется в режи- ме полного вытеснения; в-чет- вертых, что реакция утилиза- ции субстрата имеет первый порядок по биомассе, но нуле- вой порядок по субстрату; в-пятых, что числа Рейнольдса Кажущееся время ферментации., ч РИС. 9.32. Рост дрожжей в реакторе' колонного типа на смеси сахаров; в начале процесса субстраты утили- зируются очень быстро (что отра- жается в изменении удельной плот- ности сусла), а затем следует период значительно более медленного усво- ения сахаров. (Из работы: Green- shield R. N., Smith Е. L., Tower-Fer- mentation Systems and Their Applica- tions; The Chemical Engineer, May 1971, 182.) частиц катализатора, рассчи- танные по их конечной скоро- сти, достаточно малы, так что движение частиц может быть описано законом Стокса (вспомните пример 1.1). Чет- вертое и пятое допущения до- статочно обоснованны во мно- гих ситуациях; первое, второе и третье допущения в ряде слу- чаев также могут быть оправ- данны. При указанных допущениях скорость утилизации субстрата можно описать уравнением типа (9.15): d (su) dz ИЛИ ds и----- dz du dz kx (9.121) 8-746
114 Глава 9 Если движение частиц (клеток) описывается законом Стокса, то зависимость концентрации суспендированной биомассы от скорости потока жидкости в псевдоожиженном слое должна подчиняться уравнению: Г , ( U XTI/4.65 х = р0 1-Мч (9.122) \ / J Здесь ро — плотность культуры микроорганизмов (масса сухого клеточного вещества в единице объема), a ut— конечная ско- рость сферы в стоксовом потоке [уравнение (8.34)]. (Какую плотность биомассы — рассчитанную по сухой или влажной массе клеток — следует учитывать в формуле для определения конечной скорости?) Обратите внимание на то, что при анализе процессов в реакторах с псевдоожиженным слоем катализатора мы допускаем, что локальная концентрация биомассы опреде- ляется только гидродинамическими факторами. Этим рассмат- риваемые реакторы резко отличаются от реакторов других типов, в которых определяющую роль играют биохимические реакции и метаболизм организмов. Подстановка уравнения (9.122) в уравнение (9.121) приводит к выражению с двумя неизвестными 5 и и, величина которых зависит от положения z в реакторе. Построение модели завершается применением уравнения (9.15) при условии, что /7 = 0: — (pw) = 0 (9.123) Раскрыв уравнение (9.123) и подставив p(s) вместо р, получим , ч du . ( Р s) ~ + и dz \ dp \ ds d s J dz (9.124) 0 Чтобы перевести это уравнение в форму, пригодную для инте- грирования в численной форме, рассмотрим уравнения (9.121) и (9.124) как систему алгебраических уравнений с неизвестными dsjdz и du/dz. Решение этой системы уравнений, приводить которое здесь полностью нет необходимости, дает выражения для dsfdz и du[dz, определяемые через переменные s и и, т. е. систему двух дифференциальных уравнений, которые следует интегрировать при начальных условиях: s(0) = s^ дг (0) = (9.125) Здесь Af — площадь поперечного сечения нижней секции баш- ни. Концентрация субстрата в продуктах процесса se зависит от высоты реактора L: se = s (z = L).
Проектирование и расчет биологических реакторов 115- Положение существенно упрощается, если допустить, что любое изменение плотности жидкой фазы мало сказывается на величине и. Если и не зависит от положения в реакторе, то уравнение (9.121) можно проинтегрировать непосредственно и таким путем получить sc = sf—&р0 1—V/4,65 _L (9.126> L \ Uf J и Здесь L — высота башни; при выводе этого уравнения прини- малось, что х определяется уравнением (9.122). Отражаемая уравнением (9.126) линейная зависимость концентрации суб- страта от среднего времени реакции L/u (если допустить, что р также линейно зависит от s) действительно наблюдается по меньшей мере на некоторых участках соответствующей кривой (рис. 9.32). Как показывают данные, представленные на рис. 9.32, основ- ным недостатком этой модели является обезличивание субстра- тов. Действительно, в обсуждаемой модели различные сахара,, утилизируемые в ходе анаэробного спиртового брожения, сгруп- пированы в некий гипотетический единый или средний субстрат. При таком подходе мы лишены возможности учесть эффект глюкозы, играющий очень важную роль в процессах пивоваре- ния в башенных ферментерах непрерывного действия. Что касается потока жидкой фазы через псевдоожиженный слой, то обычно желательно поддерживать режим полного вы- теснения. Нестабильная структура течений в слое в ряде случаев может вызывать существенное обратное смешение, нарушающее ход процесса и нормальную работу реактора. Вероятность об- ратного смешения возрастает при уменьшении диаметра колон- ны и снижении скорости потока жидкой фазы. В то же время в биореакторах с псевдоожиженным слоем катализатора в силу малых размеров его частиц и небольшого различия между плотностями жидкой фазы и катализатора приходится ограни- чиваться относительно невысокими линейными скоростями по- тока жидкости. Кроме того, при понижении скорости потока жидкой фазы повышается концентрация катализатора в реак- торе. Показано, что введение в биореактор с псевдоожиженным слоем катализатора статических элементов перемешивания мо- жет значительно улучшить характеристики расширения слоя и. снизить нежелательное обратное смешение [44]. Поскольку реакторы с неподвижным слоем катализатора в общем случае ближе к реакторам полного вытеснения, может возникнуть вопрос о целесообразности и преимуществах биоре- акторов с псевдоожиженным слоем катализатора. Прежде всего преимущества реакторов с псевдоожиженным слоем очень ярко проявляются при необходимости контакта реакционной смеси с 8*
116 Глава 9 газами. В реакторах с неподвижным слоем катализатора до- вольно трудно добиться эффективной аэрации (особенно при большом объеме реактора), а если в ходе процесса образуются газообразные продукты, например СО2, то нелегко и предупре- дить избыточное накопление газа в верхней части реактора с неподвижным слоем. Реактор с псевдоожиженным слоем ката- лизатора обеспечивает режимы течений, в большей степени способствующие межфазному контакту в системе газ — жид- кость — твердое тело. Хороший контакт между газовой и жид- кой фазами, с одной стороны, и биокатализатором, с другой, обеспечивают также реакторы со струйным течением жидкости, которые мы и рассмотрим в заключение этого раздела. 9.6.5. Реакторы с неподвижным слоем катализатора и со струйным течением жидкости Содержимое реакторов с неподвижным слоем катализатора и струйным течением жидкости представляет собой трехфазную систему, состоящую из неподвижного слоя нерастворимого ка- тализатора, а также подвижных газовой и жидкой фаз. Посту- пающие в реактор жидкая и газовая фазы содержат по одному или несколько реагентов, поэтому скорость биохимической ре- акции зависит от характеристик контакта между жидкостью, в которую переносится ограниченно растворимый реагент из газовой фазы, и поверхностью катализатора. Отсюда следует, что на работу таких реакторов в существенной степени влияет физическое состояние газожидкостного потока, проходящего через неподвижный слой катализатора, и связанные с этим про- цессы массопереноса. К числу важных характеристик таких реакторов и содержа- щихся в них систем относятся площадь поверхности катализа- тора, эффективность смачивания катализатора подвижной жид- кой фазой, структура течений газожидкостной смеси, массопе- реноса ограниченно растворимых реагентов из газовой в жидкую фазу, массопереноса реагентов к поверхности катализатора, а в случае пористого или проницаемого катализатора—диффу- зия реагентов к каталитическим центрам, находящимся внутри частиц катализатора. Одной из первых областей применения биореакторов с на- садкой и струйным течением жидкости, сохраняющей свое зна- чение и в настоящее время, является обработка сточных вод с помощью биологических капельных фильтров, описанных де- тальнее в гл. 14: вращающееся распределительное устройство разбрызгивает поток жидких отходов по кольцевому слою гра- вия, на котором находится пленка микроорганизмов. Жидкость
Проектирование и расчет биологических реакторов 117 стекает через неподвижный слой в почти ламинарном режиме, а воздух поднимается через слой катализатора благодаря ес- тественной конвекции за счет выделяющейся в микробиологи- ческом процессе теплоты. Аналогичный принцип лежит в основе традиционного способа производства винного уксуса (биологи- ческого окисления этанола до уксусной кислоты), где применя- ются прямоугольные колонны с насадкой из древесной щепы. Для ламинарного течения жидкой фазы и упрощенной геомет- рии слоя, например для плоского слоя, можно создать деталь- ную математическую модель, описывающую характеристики потоков и процессов переноса, и решить соответствующие урав- нения. Детальнее ознакомиться с этой проблемой можно в мо- нографии Аткинсона [5]. В промышленности встречаются и другие конструкции реак- торов со струйным течением жидкости и неподвижным слоем катализатора, в частности такие, в которых параллельные по- токи газовой и жидкой фаз движутся: сверху вниз или снизу вверх. Подобные реакторы уже давно применяются в нефтепе- рерабатывающей и нефтехимической промышленности для гид- рокрекинга, гидроочистки и других многофазных процессов. При изучении режима работы таких реакторов и разработке соот- ветствующих моделей необходимо помнить, что в зависимости от относительных скоростей газовых и жидкостных потоков (и в некоторой степени от других свойств газожидкостной сис- темы) можно получить самые разные дисперсные системы, на- чиная от непрерывной жидкой фазы с диспергированными в ней газовыми пузырьками и кончая непрерывной газовой фазой с диспергированными каплями жидкости (туманом) (рис. 9.33). На этом рисунке выделена и зона нестабильности потока, когда через реактор попеременно проходят газ и жидкость в виде крупных газовых пузырей и жидких поршней соответственно. Участки графика, обозначенные как «пилотная установка» и «промышленная установка», заимствованы из опытных данных, полученных при изучении процессов переработки нефти. В не- которых режимах работы биореактора применяются низкие скорости потока воздуха. Так, в процессах биологической обра- ботки отходов на капельных фильтрах аэрация осуществляется за счет естественной конвекции, обусловленной небольшой экзо- термичностью происходящих реакций. Конструкционно реакторы с неподвижным слоем катализа- тора и со струйным течением жидкости напоминают реакторы, рассматривавшиеся ранее в этом разделе. При математическом моделировании систему обычно условно рассматривают как твер- дую фазу, находящуюся в контакте с жидкой пленкой, которая в свою очередь контактирует с газовой фазой. В сущности такой подход к моделированию является расширенным вариантом уже
118 Глава 9 упоминавшейся двухфазной модели барботажной колонны. Затем рассматриваются процессы переноса между фазами и в каждой из фаз, а также ограничения, налагаемые на скорость реакций диффузионными эффектами. Блестящим примером инженерного подхода к анализу биологических реакторов со Скорость жидкости, кс/(.мг>с) РИС. 9.33. Различные состояния двухфазной дисперсной системы с параллель- ными потоками газовой и жидкой фаз в неподвижном слое катализатора. [Воспроизведено с разрешения из работы: van de Vusse J. G„ Wesselingh J. A., Multiphase Reactors, p. 561 in Chemical Reaction Engineering: Survey Papers (4th International/6th European Symposium on Chemical Reaction Engineering), DECHEMA, Frankfurt, 1976.] струйным течением жидкости могут служить работы Бриффо и Энгассера, посвященные изучению превращения глюкозы в лимонную кислоту в биореакторе со струйным течением жидко- сти и с неподвижной пленкой катализатора [46]. Как обычно, при выборе конкретной конструкции реактора приходится учитывать самые различные характеристики проек- тируемого процесса и эксплуатационные параметры. В табл. 9.11 суммированы преимущества и недостатки трех типов реак- торов, применяемых для осуществления процессов в трехфазных
Проектирование и расчет биологических реакторов 119 Таблица 9.11. Сравнение основных конструкционных и эксплуатационных характеристик различных реакторов для трехфазных систем (_|_ положительные характеристики, — отрицательные характеристики)" Реактор Характеристики С неподвижным слоем катализа- тора и струй- ным течением жидкости С перемешивае- мой суспензией С псевдоожи- женным слоем катализатора Разделение реактора на —h — + ступени Перепад давлений — + 4~ Максимальная скорость по- — + н—н тока Отвод теплоты (+) 4- 4- Замена катализатора + 4- Истирание катализатора (+) — (+) Утилизация катализатора — + + Простота конструкции 4- •— 4—h Масштабирование (+) + —— а Воспроизведено с разрешения из статьи: van de Vusse J. F., Wesselingh J. A., Mul- tiphase Reactors, p. 561 in “Chemical Reaction Engineering: Survey Papers” (4th Internatio- nal/6th European Symposium on Chemical Reaction Engineering), DECHEMA, Frankfurt, 1976. системах: реакторов с неподвижным слоем катализатора и струйным течением жидкости, реакторов с перемешиваемой суспензией и реакторов с перемешиваемой суспензией и с бар- ботажем (с псевдоожиженным слоем катализатора). 9.7. Технология микробиологических процессов Для того чтобы получить некоторое представление о различ- ных практических аспектах расчета и эксплуатации биореакто- ров, а также об осуществляемых в них процессах, рассмотрим ряд вопросов, связанных с промышленным применением микро- биологических реакторов (которые по традиции часто называют ферментерами). Основное внимание мы будем уделять типичным материалам и методам, используемым в периодических процес- сах. В завершающей части этого раздела мы изучим некоторые альтернативные конструкции реакторов, разработанные для лабораторных и пилотных установок и в некоторых случах ус- пешно перенесенные на крупномасштабные промышленные установки. На рис. 9.34 представлена схема важнейших этапов типич- ного микробиологического, процесса. Ранее мы уже упоминали о подходах к выбору соответствующей среды (разд. 7.1.2), спо- собах ее стерилизации (разд. 9.4) и различных газах, приме-
120 Глава 9 РИС. 9.34. Основные этапы и операции типичного аэробного микробиологиче- ского процесса. няющихся в таких процессах (гл. 8). В следующем разделе мы дадим дополнительные сведения о подборе состава среды. Хотя в гл. 7 мы уже обсуждали некоторые стороны влияния природы посевного материала на ход процесса, ряд проблем микробио- логического характера, связанных с введением инокулята в сре- ду, целесообразно несколько детальнее рассмотреть и здесь. Разд. 9.7.2 посвящен изучению конструкций собственно фермен- теров. Контрольно-измерительная аппаратура и соответствую- щие методы измерений рассматриваются в гл. 10, а операции по выделению клеточной массы и других продуктов — в гл. 11. 9.7.1. Подбор состава среды При подборе необходимого для определенного микробиоло- гического процесса состава среды следует принимать во внима- ние множество факторов. Один из них связан со стехиометрией
Проектирование и расчет биологических реакторов 121 клеточного роста и количеством биомассы, которое мы хотели бы получить по завершении процесса. Основой любых расчетов здесь является простой материальный баланс, связанный с пре- вращением в процессе клеточного роста низкомолекулярных органических и неорганических соединений, например глюкозы и аммиака, в биомассу. Для синтеза заданного количества био- массы (продукта процесса) в систему необходимо ввести доста- точное количество питательных веществ (реагентов), взятых в определенном соотношении. Очевидно, что для расчета требую- Таблица 9.12. Элементный состав различных микроорганизмов3 Элемент Содержание, г в 100 г сухого клеточного вещества Бактерии Грибы Дрожжи Фосфор 2,0—3,0 0,4—4,5 0,8—2,6 Сера 0,2—1,0 0,1—0,5 0,01—0,24 Калий 1,0—4,5 0,2—2,5 1,0-4,0 Магний 0,1—0,5 0,1-0,3 0,1—0,5 Натрий 0,5—1,0 0,02—0,5 0,01—0,1 Кальций 0,01 — 1,1 0,1—1,4 0,1—0,3 Железо 0,02—0,2 0,1—0,2 0,01—0,5 Медь 0,01—0,02 0,002—0,01 Марганец 0,001—0,01 0,0005—0,007 Молибден 0,0001—0,0002 Всего золы 7—21 2—8 5—10 а Воспроизведено из работы: Aiba S., Humphrey А. Е., Millis N. F., Biochemical En- gineering, 2d ed., p. 29, Academic Press, Inc., New York, 1973. щегося количества различных субстратов необходимо знать эле- ментный состав продукта (биомассы). Примеры элементного состава ряда микроорганизмов приведены в табл. 5.10. В среде должны присутствовать и необходимые неорганические вещест- ва (табл. 9.12). Если требования к элементному составу питательных ве- ществ определены, то мы должны далее выбрать конкретные соединения, содержащие необходимые для клеточного роста эле- менты. Многие из применяемых в промышленности микроорга- низмов являются хемогетеротрофами, потребности которых в энергии и углероде удовлетворяются простыми сахарами. В про- мышленности в качестве источников энергии и углерода часто применяют не очищенные сахара, а те или иные полупродукты, например свеклосахарную, тростниково-сахарную или кукуруз- ную мелассу (содержащую от 50 до 70% ферментируемых са- харов). В некоторых случаях дешевым, но в то же время вполне удовлетворительным источником углерода для микроорганизмов могут служить отходы, например сыворотка или отходы консерв- ного производства. Так, один из видов пищевых дрожжей полу-
122 Глава 9 чают в промышленном масштабе путем роста культуры на побочном продукте бумажного производства, сульфитно-спирто- вой барде, содержащей всего лишь около 2% способных к фер- ментации гексоз и пентоз. К числу доступных источников азота относятся аммиак, мо- чевина и нитрат. Вместе с тем микроорганизмы, продуцирующие протеолитические ферменты, могут усваивать азот и из разно- образных смесей, содержащих белки. Из потенциально ценных источников такого рода следует упомянуть фильтрат барды,, зерно хлебных злаков, пептоны, мясные отходы, соевую муку,, казеин, дрожжевые экстракты, муку из жмыха семян хлопчат- ника, арахисовый шрот, муку из жмыха льняного семени, куку- рузный настой. В производстве пенициллина особенно важен кукурузный настой, представляющий собой концентрированный (50% твердых веществ) водный раствор, образующийся в ка- честве отхода при замачивании кукурузы в процессах получения крахмала, клейковины и других продуктов. В предыдущих главах мы упоминали, что для нормального роста и жизнедеятельности некоторых микроорганизмов необхо- димо наличие в питательной среде определенных аминокислот и факторов роста. Другие микроорганизмы, не столь требова- тельные к составу среды, тем не менее растут значительно быстрее в присутствии определенных (хотя и не обязательных) факторов роста и источников азота и углерода. Что касается промышленных процессов, то необходимые факторы роста обыч- но обеспечивает какой-либо из полупродуктов, входящих в со- став среды, например кукурузный настой или дрожжевой авто- лизат. Кроме того, полупродукты часто являются источниками различных минеральных веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности клеток. Другие минеральные вещества до- бавляют в среду по мере необходимости. Если основной целью процесса является синтез продукта жизнедеятельности микроорганизмов, то к среде для повышения выхода или для улучшения качества продукта процесса можно добавлять определенные вещества-предшественники. Обычно молекула предшественника или его близкого производного включается в молекулу продукта. Так, например, в производст- ве новобиоцина, пенициллина G и витамина B[2 в качестве предшественников используют бензойную кислоту, фенилуксус- ную кислоту и 5,6-диметилбензимидазол соответственно. Входя- щие в состав среды полупродукты также могут содержать полезные вещества-предшественники. Более подробные сведения о подборе состава среды можно найти в приведенной в конце главы литературе. Теперь мы мо- жем переключить наше внимание на другие аспекты технологии микробиологических процессов.
Проектирование и расчет биологических реакторов 123 9.7.2. Проектирование типичного асептического аэробного микробиологического процесса и его ведение Большинство промышленных микробиологических процессов имеют те или иные общие черты, однако на практике появляют- ся существенно различающиеся проекты процессов и способы их ведения, что часто обусловлено разными требованиями к зара- жению системы вредными организмами. Если заражение вообще нежелательно, то процесс необходимо вести в асептических ус- ловиях при поддержании чистоты культуры. В некоторых случа- ях, например при росте дрожжей в слабокислой среде или при ферментации углеводородов тщательно подобранными штамма- ми бактерий, требования к соблюдению асептических условий могут быть несколько снижены, так как условия процесса сами по себе не стимулируют рост многих потенциально вредных микроорганизмов. В этом разделе основное внимание будет уделено способам поддержания асептического режима, поскольку именно здесь очень многое зависит от умения и искусства биохимика-техно- лога. В нашем обсуждении мы будем придерживаться последо- вательности операций, принятой в периодическом процессе, и начнем с получения посевного материала (инокулята) из чис- той культуры. Подготовка посевного материала сводится к пролиферации небольшого числа клеток в строго контролируемых условиях до плотной суспензии, объем которой составляет 1—20% объема промышленного ферментера. Эта операция выполняется ступен- чато путем постепенного увеличения масштаба. Исходным ма- териалом служит чистая культура-—тщательно поддерживаемая популяция данного штамма микроорганизма. Обычно нужный штамм получают в результате многочисленных экспериментов, включающих выведение множества мутантов, их скрининг и селекцию. Поскольку полученный таким путем штамм микро- организмов может обладать целым рядом преимуществ, то при хранении необходимо обеспечить неизменность его генетической природы. Обычно генетическая стабильность штамма микроорга- низмов достигается за счет максимального снижения его мета- болической активности при хранении. Микроорганизмы, как правило, хранят в состоянии покоя в частично обезвоженном виде; обезвоживание осуществляют путем лиофилизации (суб- лимационной сушки) суспензии клеток в жидкости или путем тщательного высушивания дисперсии спор или клеток в сте- рильной почве или песке. Склонные к мутациям организмы часто подвержены обратным мутациям или иным нежелатель- ным генетическим изменениям. В таких случаях важно регуляр- но контролировать чистоту культуры.
124 Глава 9 Если мы в качестве примера возьмем лиофилизованную куль- туру, то следующей стадией процесса получения посевного ма- териала будет приготовление суспензии клеток в стерильной жидкости. Затем каплю этой суспензии переносят на скошенный агар, который приготавливают желатинизацией стерильной пи- тательной среды в наклоненной пробирке с помощью агара — полисахарида, выделяемого из водорослей. После инкубации, обеспечивающей достаточный рост, клетки опять суспендируют в жидкости и наносят на агаровую поверхность большей площа- ди в плоских сосудах Блэйка или Ру или переносят во встряхи- ваемый сосуд. Эти сосуды затем устанавливают на качалках, обеспечивающих перемешивание за счет вращательного или вращательно-поступательного движения; таким путем достига- ется рост погруженной культуры, а также адекватное поступле- ние кислорода в культуру и выведение газов из нее. Обычно эту операцию повторяют несколько раз с сосудами все больших объемов и только затем переходят к следующей стадии. Все описанные операции переноса культуры должны выполняться в строго стерильных условиях. Для осуществления этих тонких операций на предприятиях микробиологической промышленно- сти обычно предусматривают специальные помещения со сте- рильной атмосферой, асептическими условиями и регулирова- нием температуры. Дальнейшая пролиферация культуры осуществляется в одном или нескольких сосудах для посевного материала — небольших ферментерах, снабженных почти всеми контрольно-измеритель- ными приборами, которые применяются в крупномасштабных процессах. В этих реакторах подбираются такие условия, кото- рые бы обеспечивали максимальную скорость роста культуры. На этой стадии получения посевного материала мы перехо- дим от лабораторных экспериментов к заводским установкам и условиям. Здесь уместно ознакомиться с некоторыми основными принципами и методами поддержания асептического режима, а также с устройствами и операциями, применяющимися для достижения этой цели. Прежде всего система должна иметь та- кое устройство, чтобы можно было проводить независимую стерилизацию всех входящих в ее состав узлов и компонентов. В качестве примера чрезвычайных мер предосторожности, кото- рые должны предусматриваться в проекте системы и соблюдать- ся в процессе ее эксплуатации, рассмотрим частную проблему переноса инокулята из сосуда для посевного материала в про- мышленный реактор. На представленной на рис. 9.35 схеме изображены основные узлы и устройства, а также последова- тельность операций. Все клапаны системы должны быть доступ- ны для проверки, чистки и стерилизации; по этой причине здесь наиболее популярны шаровые клапаны. Рис. 9.35 дает представ-
Проектирование и расчет биологических реакторов 125 ление и о некоторых других общих принципах асептического процесса. Особое внимание должно быть обращено на пароне- проницаемость всех соединений системы; в системе должны быть Резервуар для посев- РИС. 9.35. Система трубопроводов и запорно-регулирующей арматуры, ис- пользуемая для асептической инокуляции крупномасштабного ферментера. Последовательность операций: 1) установить участок трубопровода АВ\ 2) стерилизовать этот участок паром при давлении 1,055 кг/см2 в течение 20 мин; клапаны D и J открыты, клапан С закрыт, а конденсат собирается в ловушках, расположенных в узлах И и 1\ 3) клапаны С, G, Н, I, J закрыть; клапаны D, Е, F открыть; охладить ферментер под давлением стерильного- воздуха, при этом стерильная среда заполняет соединительный трубопровод; 4) в резервуаре для посевного материала повысить давление до 0,7 кг/см2, а в ферментере снизить до 0,14 кг/см2; 5) перевести инокулят в ферментер, открыв клапан С; 6) отключить резервуар для посевного материала и фермен- тер от системы подачи пара, закрыв вентили F и С; открыть вентили G и J, спустить пар и конденсат, частично открыв вентили D и Е. полностью исключены любые контакты между стерильными и нестерильными зонами. Поддержание в системе небольшого избыточного давления способствует тому, что все случайные утечки будут происходить только из системы, а не в обратном направлении. На рис. 9.36 приведен чертеж общего вида (с указанием основных узлов и размеров) промышленного ферментера, вы- пускаемого в серийном масштабе. Обычно такие ферментеры, изготавливают из нержавеющей стали, что существенно снижает’
ООО? 1 ooos Привод электродвигателя Редуктор Пеногаситель Отвод газов Система подшипников Асептическое уплотнение Оэслаждаюьций змеевик Подача стерильного воздуха 4 _____Cs РИС. 9.36, а. Ферментер объемом 100 000 л для получения пенициллина. [Из работы: Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н., Биохимическая технология и аппа- ратура.— М.: Пищевая промышленность, 1975.] 1700 wo-^ 300j^ 3100 ШО’ 3000' 300 I Отражательные ' перегородки Мешалка турбинного типа с плоскими лопастями Барботер
Проектирование и расчет биологических реакторов 127 РИС. 9.36, б. Большой промышленный ферментер; вид сверху. [Из статьи' Milller R., Kieslich К., Technology of the Microbiological Preparation to Orga- nic Substances; Angew. Chem., Intern. Edit., 5, 653 (1966).] возможность коррозии аппаратуры и сводит к минимуму опас- ность загрязнения культуральной жидкости нежелательными ионами металлов (вспомните приведенные в разд. 5.9.2 данные о влиянии ионов железа на процесс микробиологического син- теза лимонной кислоты). Как в самом ферментере, так и в лю- бых других аппаратах и элементах системы не должно быть застойных зон, щелей, трещин и других участков, в которых могут накапливаться устойчивые к стерилизации твердые веще- ства и в которых растущие микроорганизмы могут образовывать плотные скопления и пленки. Решить эти проблемы помогает применение цельносварных конструкций с тщательно зачищен- ными и отполированными сварными швами. Перемешивающее устройство должно обеспечивать переме- шивание и аэрацию системы в той степени, в какой это необхо- димо (гл. 8). Чтобы исключить возможность заражения культу- ры, при проектировании и в процессе эксплуатации реакторов особое внимание следует уделять асептическим уплотнениям. В лабораторных ферментерах обычно достаточно одной лопаст- ной мешалки, а в больших промышленных реакторах могут по- требоваться несколько перемешивающих устройств. Обычно только 70—80% объема реактора занимает жидкая фаза, а верхнюю его часть заполняют газы. Часто перемешива-
128 Глава 9 ние и аэрация жидкости способствуют образованию пены на ее поверхности, особенно если в среде в больших концентрациях содержатся пептиды. Пена препятствует газообмену между культуральной жидкостью и находящимся над ней пространст- вом; она может выйти из ферментера и загрязнить систему, если составляющие пену пузырьки коалесцируют и образующая- ся жидкая фаза вновь поступает в ферментер. В изображенном на рис. 9.36 ферментере для разрушения пены над уровнем жидкой фазы устанавливают дополнительную мешалку. В слу- чае особенно устойчивых пен к культуральной жидкости добав- ляют особые вещества — пеногасители, дестабилизирующие пену путем снижения поверхностного натяжения. Как мы уже отме- чали в гл. 8, поверхностно-активные свойства пеногасителей могут явиться причиной снижения скорости переноса кислорода. Змеевик теплообменника в реакторе может выполнять не- сколько функций. Если предполагается периодически стерили- зовать среду в самом ферментере, то змеевик должен обеспечи- вать необходимые скорости нагревания и охлаждения. Тепло- обменное устройство должно также справляться с пиковыми нагрузками, куда входят тепловые эффекты микробиологическо- го процесса, а также вязкое рассеяние теплоты, выделяющейся при перемешивании (разд. 8.10). Коэффициенты теплопередачи для неинокулированной среды примерно равны коэффициенту теплопередачи воды, в то время как плотная мицелиальная культура по этим характеристикам приближается к пастам. Процесс в ферментере может продолжаться от суток (или даже менее) до 2 нед и более; чаще всего процесс биосинтеза антибиотика длится от 4 до 5 сут. В течение этого времени необходимо поддерживать строгий режим процесса, а в ряде случаев те или иные параметры необходимо изменять в соответ- ствии с определенной программой. Такие проблемы в эксплуа- тации реакторов мы рассмотрим подробнее в гл. 10. Тем не менее даже наш краткий обзор может дать представление о сложности и трудоемкости асептических процессов ферментации, а также о высокой стоимости этих работ. Очевидно, в такой ситуации потеря продуктов даже одного периодического про- цесса может быть связана с очень большими расходами, что оправдывает отмечавшееся выше большое внимание, уделяемое стерилизации. 9.7.3. Биореакторы других типов В табл. 9.13 перечислен ряд факторов, стимулировавших разработку новых типов и конструкций биореакторов. Многие .из этих факторов сыграли свою роль при разработке компанией JCI чрезвычайно крупномасштабного процесса производства
Проектирование и расчет биологических реакторов 129 белка одноклеточных организмов. Общий объем соответствую- щего реактора составляет 2300 м3 (колонна диаметром 7 м и высотой 60 м, рабочий объем реактора 1560 м3). Более того, в этом реакторе микроорганизмы растут на метаноле, что при- водит к выделению чрезвычайно большого количества тепла. При таком объеме ферментеры обычной конструкции с механи- ческим перемешиванием и барботажем совершенно непригодны, что и послужило стимулом для разработки новых реакторов эрлифтного типа, упоминавшихся в предыдущем разделе. Предлагались и другие конструкции реакторов, которые про- шли испытания в различных масштабах — от лабораторного Таблица 9.13. Факторы, оказавшие влияние на разработку реакторов новых типов [50] Изготовление и монтаж реакторов очень большого объема Проблемы, связанные с расчетом и проектированием Высокий расход мощности (при постоянном P/V) Большие затраты на энергию и охлаждающую воду Проблемы, связанные с необходимостью отвода теплоты Снижение удельных капиталовложений Снижение удельного расхода энергии Снижение степени механического повреждения клеток Снижение потерь субстрата (обусловленных испарением и дыханием) Повышение степени превращения субстрата * В прибора и пилотной установки до крупномасштабного промыш- ленного аппарата. Хорошая обзорная статья, посвященная срав- нительному изучению реакторов различных конструкций и их характеристик с точки зрения эффективности использования энергии для диспергирования газа и перемешивания, опублико- вана Шюгерлем [50]. В этом обзоре предложено подразделять реакторы на три основных группы в соответствии со способом потребления энергии. В реакторах первой группы энергия расходуется на механи- ческое перемещение внутренних устройств (рис. 9.37). В неко- торых из реакторов этой группы с помощью внутренних каналов устанавливается определенная структура течений, например циркуляция жидкости. Реактор 1.6 представляет собой горизон- тально расположенный аппарат с циркуляцией жидкой фазы и с пеноотделителем, заполненным газожидкостной смесью. В реакторе типа 1.9 перемешивание происходит за счет пульса- ции жидкой фазы, а в реакторах конструкции 1.11 (представлен вид сбоку) путем периодического погружения размещенных на вращающемся валу дисков в жидкую реакционную смесь, нахо- дящуюся в нижней части реактора. На рис. 9.38 представлены конструкции реакторов другой группы, в которых энергия, расходуемая на циркуляцию жидко- 9—746
Пульсация 1.9 ^0
Проектирование и расчет биологических реакторов 131 сти, подается с помощью насоса, расположенного вне реактора. В реакторе 2.1 направленная сверху вниз струя жидкости стре- мительно уходит в реакционную смесь, а в конструкции 2.7 имеются сопла, распыляющие жидкость и расположенные на концах вращающегося стержня. Схемы реакторов последней группы, в которых энергия рас- ходуется на сжатие газа, поступающего в реактор, изображены на рис. 9.39. В большинстве реакторов этой группы имеются те или иные внутренние устройства, способствующие более тща- тельному диспергированию газа, а также различные устройства для циркуляции жидкой фазы. Дополнительные сведения о всех упомянутых конструкциях реакторов и расширенный перечень литературы читатель может найти в обзоре Шюгерля [50]. 9.8. Особенности технологии процессов с участием растительных и животных клеток и соответствующих реакторов В настоящее время культуры животных клеток использу- ются для производства ряда ценных продуктов, в том числе вак- цин, протеолитического фермента урокиназы, моноклональных антител и интерферонов. С помощью культур животных клеток можно также получать лимфокины (белки, оказывающие регу- ляторный эффект на иммунную систему), многие ферменты, факторы роста, факторы свертывания крови и гормоны. Техно- логия рекомбинантных ДНК позволяет получать некоторые из этих веществ и другими путями, и в то же время открывает новые перспективы для синтеза различных веществ с помощью культур животных клеток. С одной стороны, возможность эк- спрессии чужеродных белков в микроорганизмах означает, что для производства этих белков в значительных количествах можно пользоваться микробиологическими процессами. В то же время, как отмечалось в разд. 6.4.4, белок, синтезируемый в животных клетках, часто подвержен различным посттрансля- ционным модификациям; прокариоты не способны осуществлять такие превращения. Отсюда следует, что для получения веществ, проявляющих необходимую активность или устойчивость только после посттрансляционных модификаций, нужны эукариотиче- ские клетки-хозяева. Экспрессия некоторых эукариотических РИС. 9.37. Биореакторы, в которых энергия расходуется на механическое дви- жение внутренних устройств [50]. Обозначения-. Г —газ (воздух); К—внутренний канал; Д —двигатель; ОП— отражательные перегородки; ПГ — пеногаситель; Ж —жидкая фаза; ВЦ — вращающийся цилиндр, 9*
132 Глава 9 РИС. 9.38. Реакторы, в которых энергия расходуется внешним насосом, вклю- ченным в систему рециркуляции [50]. Обозначения-. Г—газ; Ж — жидкая фаза; ИС — инжекционное сопло; П — поплавок.
Проектирование и расчет биологических реакторов 133 РИС. 9.39. Реакторы, предназначенные для проведения процессов с участием погруженных культур; расход энергии Связан со сжатием и подачей га- за [50]. Обозначения-. Г — газ; Ж—жидкая фаза; 1 — газовый клапан; 2 — статиче- ское перемешивающее устройство; клапан 1 периодически закрывают и откры- вают. белков в прокариотах-хозяевах затруднена также в силу про- теолиза этих белков или невозможности их складывания в определенную пространственную структуру. Наряду с совершен- ствованием методов экспрессии чужеродных генов в животных клетках расширяются перспективы промышленного применения рекомбинантных систем с участием животных клеток. Многие полезные и интересные вещества в принципе можно синтезировать в культурах растительных клеток. Кроме того, культивирование растительных клеток может облегчить реше- ние задач генной инженерии растений и в конце концов приве-
134 Глава 9 сти к реализации возможности регенерации целого продуктив- ного растения из клеток культуры тканей. Культивированию растительных и животных клеток свойст- венны некоторые общие черты, осложняющие проектирование реакторов, предназначенных для роста культур таких клеток. Многие типы растительных и животных клеток в естественной сфере их обитания существуют в виде тканей — плотных струк- тур, построенных из множества одинаковых клеток. В нативном окружении ткани постоянно контактируют с жидкостями орга- низма, которые имеют определенный состав и содержат множе- ство регуляторных соединений, оказывающих существенное влияние на функционирование клеток. Наконец, скорости роста многих растительных и животных клеток в естественных усло- виях очень низки. При росте погруженных культур таких клеток возникают трудности в обеспечении окружения, способ- ствующего росту клеток; многие типы растительных и живот- ных клеток, помещенные в культуральную среду, вообще не растут. Если эти трудности устранены, то наша следующая цель будет заключаться в подыскании таких условий культивирова- ния, которые обеспечивают достижение высокой плотности клеток в культуре за минимальное время при сохранении мета- болических механизмов клеток, ответственных за необходимые реакции. В этом разделе основное внимание будет уделено изучению подходов к созданию сред и условий, поддерживающих жизне- способность животных клеток; здесь мы дадим также краткий обзор результатов некоторых работ с животными клетками. Изучение культур растительных клеток пока только начинается, и поэтому мы уделим ему лишь несколько строк в конце разде- ла. Количественные параметры кинетики процессов с участием культур животных клеток практически неизвестны из-за высо- кой стоимости таких процессов, малой скорости роста клеток, что приводит к существенному увеличению продолжительности экспериментов, и отчасти из-за недостаточной изученности этих объектов. Во многих случаях неизвестны даже лимитирующие рост клеток питательные вещества, а описания зависимости кинетики роста животных клеток и образования продуктов их жизнедеятельности от концентрации питательных веществ и ин- гибиторов, pH, температуры и других параметров окружения вообще недоступны. Хотя при проектировании реакторов опре- деляющим фактором считается влияние механических сил на культуры растительных и животных клеток, до сих пор не проводилось систематического изучения влияния механического воздействия на жизнеспособность, рост и морфологию клеток с тем, чтобы результаты этих исследований были бы положены в основу инженерных расчетов. Вместо этого были предложены
Проектирование и расчет биологических реакторов 135 конструкции аппаратов и конкретные формы биокатализато- ров, обеспечивающие повышение скорости роста клеток, дости- жение более высокой плотности клеток в культуре и более высокого выхода продукта процесса с участием животных и рас- тительных клеток. Хотя на базе такого чисто эмпирического подхода достигнуты значительные успехи, тем не менее оче- видно, что выяснение закономерностей кинетики роста живот- ных и растительных клеток и их технологических характеристик позволит добиться еще более существенного прогресса. 9.8.1. Культивирование животных клеток; требования к среде По сравнению с микроорганизмами для культивирования животных клеток требуются более сложные и дорогие среды. Обычно для предотвращения заражения в среду вводят анти- биотики. В состав большинства сред входит сыворотка живот- ных в концентрации 5—20%, которая способствует репликации клеток. Известны и другие (но далеко не все) функции, выпол- няемые сывороткой в среде для роста животных клеток. Сыворотка обеспечивает возможность применения данной среды для роста животных клеток различных типов, которые требуют различных питательных веществ и факторов роста. Показано, что потребность в питательных веществах может зависеть от условий культивирования; в некоторых случаях применение очень богатой и высококонцентрированной среды в какой-то степени компенсирует отсутствие точных данных о необходимо- сти определенных компонентов. По не вполне понятным пока причинам клетки, выросшие в среде с более высоким содержа- нием сыворотки, часто оказываются более устойчивыми к ме- ханическим повреждениям. Вместе с тем использование сыворотки для культивирования животных клеток не свободно от ряда проблем, важнейшей из которых является высокая стоимость сыворотки; это особенно сильно сказывается на общей стоимости крупномасштабных процессов. Так, например, если содержание сыворотки в среде составляет 10%, то затраты на сыворотку стоимостью до 300 долларов за литр составляют 80% общих материальных затрат. Сыворотка, кроме того, представляет собой главный источник заражения культуры вирусами, микоплазмой (паразитными или патогенными грамотрицательными прокариотами) и бак- териями. Она может содержать ингибиторы, затрудняющие репликацию вирусов (в производстве вакцин) или биосинтез ферментов. Как и сложные природные компоненты сред для роста микроорганизмов, сыворотка представляет собой компо- нент непостоянного и отчасти непредсказуемого состава. Нако-
136 Глава 9 нец, вместе с сывороткой в среду поступают пирогенные (вызы- вающие лихорадку) вещества, затрудняющие выделение продукта. Содержащийся в сыворотке фоновый белок альбумин также затрудняет выделение белков, синтезируемых в неболь- ших количествах; именно по этой причине для облегчения РИС. 9.40. Культивирование клеток с применением в качестве одного из ком- понентов среды профильтрованной лимфы крупного рогатого скота. (Воспро- изведено с разрешения Bio-Response, Inc.) выделения продукта (например, моноклональных антител) иног- да прибегают к бессывороточным средам. На рис. 9.40 представлена схема недавно предложенного иного подхода к снижению стоимости сложных компонентов среды. В этом методе цельную лимфу живой коровы фильтру- ют и вводят в камеру клеточного роста, где лимфа через полу- проницаемые полые волокна контактирует с клетками. На ри- сунке указано также положение устройств для введения других компонентов среды и газообмена. Большие успехи достигнуты в создании бессывороточных сред определенного гормонального состава. К потенциальным
Проектирование и расчет биологических реакторов 137 преимуществам таких сред относятся возможность регулирова- ния состава среды в соответствии с особенностями клеток данного типа и условий культивирования, снижение опасности заражения, лучшая воспроизводимость результатов. С другой стороны, подобные среды определенного состава имеют более высокую стоимость и к тому же могут оказывать то или иное воздействие на организмы, которое проявляется лишь спустя некоторое время и которое трудно предвидеть заранее или обнаружить в ходе сравнительно кратковременных эксперимен- тов по подбору состава среды. Животные клетки не имеют типичных для микроорганиз- мов клеточных стенок, обеспечивающих механическую проч- ность; кроме того, животные клетки обычно значительно крупнее клеток микроорганизмов. Поэтому на любое механическое воздействие на культуру животных клеток (перемешивание суспензии клеток или частиц носителей, содержащих клетки на поверхности или во всем объеме, с целью поддержания одно- родности реакционной массы или ускорения переноса кислоро- да к клеткам) должны налагаться определенные ограничения. Для культур животных клеток концентрация кислорода долж- на составлять приблизительно 25—40% от концентрации кислорода в насыщенной воздухом системе, поэтому проекти- рование систем подачи кислорода в большой объем культуры животных клеток всегда представляет собой сложную инженер- ную проблему. Жесткие требования, предъявляемые к насыще- нию системы кислородом, могут быть несколько смягчены благо- даря низким скоростям роста животных клеток и протеканию метаболических процессов в клетках. При типичной плотности культуры, составляющей 106 кле- ток в 1 мл, потребность в кислороде составляет 0,05—0,6 ммоль О2 на литр культуры в час. В небольших сосудах, обычных для лабораторных экспериментов, потребность в кислороде может быть удовлетворена за счет диффузии кислорода из газовой смеси, находящейся над поверхностью жидкости, в жидкую фазу. При переходе к реакторам большего объема такой меха- низм переноса кислорода уже не может обеспечить потребность культуры в кислороде. Иногда в таких случаях с успехом при- меняется прямой барботаж газа в жидкую фазу. В других ситуациях непосредственный барботаж повреждает клетки и может вызвать интенсивное пенообразование, особенно если в состав среды входит значительное количество сыворотки. Для насыщения культуры животных клеток кислородом предлагался и другой метод, заключающийся во введении в культуру сили? коновых трубок, через стенки которых кислород диффунди- рует в среду, не образуя пузырьков. Общий коэффициент массопередачи кислорода через стенку силиконовой трубки
138 Глава 9 составляет около 0,35 ммоль Ог/(атм-см2-ч); по этой величине можно рассчитать необходимое количество трубок. По мере увеличения масштаба процесса возможность обеспечения куль- туры кислородом с помощью силиконовых трубок становится все более и более проблематичной. В относительно хорошо отработанных технологических про- цессах с участием культур животных клеток pH культуры пос- тоянно контролируется и поддерживается на постоянном уровне, обычно около 7,0. К настоящему времени накоплен лишь очень небольшой опыт работы с культурами животных клеток в реакторах, снабженных всеми необходимыми контроль- но-измерительными приборами, обеспечивающими получение наиболее полного набора аналитических данных и самые раз- нообразные методы контроля. Как мы увидим в следующей главе, многие контрольно-измерительные приборы и методы, которые находят применение при работе микробиологических реакторов, в будущем можно будет использовать и для оптими- зации работы реакторов с культурами животных клеток. Регулирование pH культуры клеток осуществляется несколь- кими способами. Введение в состав среды компонентов с буфер- ными свойствами может сглаживать флуктуации pH, часто обусловленные продуцируемой клетками молочной кислотой. Величиной pH среды можно также управлять путем изменения концентрации СОг в газовой фазе, находящейся в контакте с культурой. Другим методом регулирования pH является непос- редственное добавление основания. Флуктуации pH в реакто- рах могут быть сглажены и путем постоянной или периодиче- ской замены среды в реакторе на свежую. 9.8.2. Промышленные реакторы для крупномасштабных процессов с участием животных клеток Все животные' клетки по способности к росту в суспензии можно разделить на две группы. Так, клетки крови, лимфы, опухолевой ткани и многие трансформированные клетки могут расти в суспендированной культуре. Клетки других типов растут только в том случае, если они связаны с совместимой твердой поверхностью; в этом случае регуляторный механизм контакт- ного ингибирования обычно останавливает клеточный рост, как только на поверхности твердого носителя образуется монослой клеток. В небольшом масштабе для перемешивания суспензи- онных культур достаточно магнитной мешалки и колбы или сосуда, частично заполненного средой, вращающегося в гори- зонтальном положении со скоростью около 1 об/мин. По своей конструкции многие реакторы, предназначенные
Проектирование и расчет биологических реакторов 139 для культивирования больших количеств животных клеток, на- поминают микробиологические биореакторы. Обычные для культур микроорганизмов турбинные мешалки с плоскими ло- пастями в случае культур животных клеток часто заменяют на пропеллерные. Предложена конструкция эффективного реакто- ра с рабочим объемом около 100 л, в котором для перемеши- вания суспензионной культуры применяется не лопастная мешалка, а устройство с «парусами» из моноволокна. В отличие от культур микроорганизмов для перемешивания культур жи- вотных клеток в реакторах сравнительно часто применяется устройство типа «вибромиксер», представляющее собой плоский круглый диск с несколькими отверстиями, укрепленный в гори- зонтальном положении на конце вала у дна реактора. Быстрое перемещение вала вверх и вниз и соответствующее колеба- тельное движение перфорированного диска вызывают циркуля- цию перемешиваемой жидкости. Для культур животных клеток применялись и эрлифтные системы, аналогичные рассмотрен- ным выше. В случае культур животных клеток понятие о крупномасш- табном процессе приобретает несколько иной смысл. В силу высокой стоимости продукта процесса и высоких эксплуатацион- ных расходов реактор объемом 10 л уже может считаться круп- номасштабным, а реактор объемом 100 л, безусловно, относится к числу очень больших. Преимущественное применение относительно небольших реакторов отчасти обусловлено и довольно низкой скоростью роста животных клеток. На рис. 9.41 представлены данные, характеризующие рост периодической культуры клеток адено- карциномы печени человека (линия SK-HEP-1). В табл. 9.14 суммированы экспериментально найденные удельные скорости клеточного роста и скорости поглощения кислорода для не- скольких линий клеток; в первых двух случаях клетки выра- щивали в суспензии в ферментере эрлифтного типа, а клетки двух других типов представляли собой линии, растущие только на твердых поверхностях; особенности культивирования таких клеток мы вкратце рассмотрим ниже. Показано, что очень высокая локальная плотность клеток может быть достигнута двумя различными методами иммоби- лизации— с помощью ультрафильтрационных мембран или путем микрокапсулирования. Хотя принципы иммобилизации животных клеток и клеток микроорганизмов в общих чертах одинаковы, к иммобилизации относительно больших по разме- рам животных клеток предъявляются и свои специфические требования. В одном очень перспективном способе микро- капсулирования [60] клетки сначала включают в гранулы
но Глава 9 РИС. 9.41. Изменения, происходя- щие в периодической культуре суспензии клеток SK-HEP-1 (аде- нокарциномы печени человека), во времени; объем культуры 100 л. Штриховая линия на верхнем графике отвечает экспоненциаль- ному росту со временем удвоения 62 ч. Спустя трое суток начинают барботировать чистый кислород со скоростью 0,2 мл/мин. [Воспроиз- ведено с разрешения из статьи: Tolbert W. R., Schoenfled R. А., Lewis С., Feder J., Large-Scale Mammalian Cell Culture: Design and Use of an Economical Batch Suspension System; Biotech, Bio- eng., 24, 1671 (1982).] альгината (см. рис. 9.27). Затем на гранулы наносят слой полилизина и послед- ний сшивают поперечными связями, после чего альги- натный гель можно удалить растворением. В этом случае находящиеся внутри полили- зиновой капсулы клетки по- сле стадии роста могут за- полнить весь объем внутри капсулы, и их плотность приблизится к плотности в тканях. Подобные катализа- торы перспективны с точки зрения возможности дости- жения более высокой произ- водительности реакторов (в расчете на единицу объема). Специфические проблемы возникают при увеличении масш- таба биореакторов с клетками, растущими на поверхностях. Для вращающихся сосудов отношение площади поверхности к объему мало, поэтому переход к аналогичным сосудам боль- шего объема практически нецелесообразен. Предложено не- сколько способов увеличения отношения площади поверхности биореактора к его объему (S/V) и, следовательно, объемной плотности растущих на поверхностях клеток. Ряд конструктив- ных решений этой задачи схематично изображен на рис. 9.42; здесь же приведены соответствующие величины S/V. Из раз-
Проектирование и расчет биологических реакторов 141 Таблица 9.14. Удельные скорости клеточного роста и поглощения кислорода для клеток различных линий. Рост непрерывной культуры осуществляли в реакторе колонного типа с барботажем11 Тип клеток Метод культиви- рования Удельная скорость по- глощения Оа [мкмоль О2/(10в кле- ток-ч)]10-’ Удельная скорость клеточного роста ц, ч-1 Давление С>2, мм рт. ст. ВНК 21С13 (из почек новорож- денных хомя- ков) Клетки лимфобла- стов человека (Namalwa) Клетки мыши L929 Препуциум чело- века FS-4 Непрерывная культура Непрерывная культура На микроно- сителе На микроно- сителе На микроно- сителе 85 НО 54 75 20 65 50 85 0,018 0,033 0,012 0,020 Стационарная фа- за после форми- рования монослоя клеток Экспоненциальная фаза роста 0,010 0,025 60 60 50 50 60—80 ~60 ~60 ~60 а Воспроизведено с разрешения из статьи: Katinger Н. W. D., Scheirer W., Status and Development of Animal Cell Technology using Suspension Culture Techniques; Acta Bio- technologica, 2, 3 (1982). личных принципиально возможных путей решения задачи в пос- ледние годы наибольшее внимание уделяется микроносителям — небольшим бусинам, на поверхности которых могут расти клетки и которые можно суспендировать в культуральной жид- кости. Основное преимущество микроносителей связано с возможностью их использования в тех же реакторах и с теми же перемешивающими устройствами, которые применяются для процессов с участием животных клеток без носителей. Потен- циальные возможности микроносителей впервые были проде- монстрированы на заряженных декстрановых бусинах. Наблю- давшееся в первых экспериментах ингибирование клеточного роста удалось позднее подавить путем изменения состава бусин и снижения их поверхностного заряда. Один из выпускаемых в промышленном масштабе и поступающих в продажу мик- роносителей состоит из бусин поперечно-связанного декстрана, на которые нанесен слой денатурированного коллагена, кова-
142 Глава 9 материал Отдельный капилляр связанные с наружной поверхностью капилляра Неподвижный слой Реактор с перемеш иванием 6 о ° о о о О о оо о о о о ° , о о 0 oo°g° О о о °о о о о ° Псевдоожиженный слой Питатель ные вещества Продукты метаболизма в Отдельный кидающийся сосуд Фильтр Отходы (можно стерилизовать или сжигать} Параллельные пластины V 00 Магнитная мешалка Стерильный Двига- воздух тель Меилалка Отдельный сосуд /Оо°оо\ /Ооо°оооо' Г0о°ооо00 °Оо°оооооу Го°оооооо/ \°ООООо/ Вращающийся стенд
Проектирование и расчет биологических реакторов 143 лентно связанного с декстрановой основой. Сообщалось, что плотность такого катализатора в реакторе для культур клеток может составлять от 3 до 25 г/л. Переход от исходной чистой культуры к культуре с высокой плотностью клеток в большом реакторе обычно осуществляют ступенчато с постепенным повышением масштаба. На рис. 9.43 схематично изображены основные стадии операции по повы- шению масштаба для суспензионной и растущей на поверхно- стях культур животных клеток. Обратите внимание на то, что здесь объем инокулята, переносимого в следующий по масштабу реактор, довольно велик по сравнению с системами на основе культур микроорганизмов. Культуры животных клеток выращивают в различных режи- мах. Наряду с простым периодическим режимом применяют и ступенчатый периодический режим, при котором по окончании одного периодического процесса определенную часть культуры используют как посевной материал для другого реактора, где и происходит затем окончательное созревание клеток. Дру- гим вариантом являются периодические процессы с добавлени- ем субстрата, в которых по мере роста клеток в культуру вводят питательные вещества по определенной программе или в соответствии с данными анализов. В перфузионной системе клетки удерживаются в реакторе, а среда частично замещается на свежую; такая система представляет собой вариант рассмот- ренных ранее методов иммобилизации клеток в масштабе всего реактора. Наконец, использовались и непрерывные культу- ры с постоянным обновлением как клеток, так и среды. Обнов- ление среды позволяет снизить эффекты ингибирования, обус- ловленные накоплением продуктов клеточного метаболизма. Действительно, аммиак ингибирует клеточный рост в концент- рациях выше 4 мМ. Скорость образования продуктов метаболизма животных клеток может варьировать в очень широких пределах в зави- симости от типа процесса и пути образования данного продук- та метаболизма. В некоторых случаях скорость образования РИС. 9.42. Аппараты и устройства, обеспечивающие высокую площадь поверх- ности контакта животных клеток со средой, а — пучок искусственных капил- ляров (обычно полупроницаемых) (S/V=31 см-1); б — гранулированные но- сители (S/V= 120 см-1 при плотности 20 г гранул в 1 л); в — свернутый лист (с прокладками, обеспечивающими постоянное расстояние между'витками) (S/V=4 см-1); г — культиватор с параллельными пластинами (и эрлифтным устройством) (S/P=l,7 cm-i)j д — наклоненные вращающиеся сосуды (от- дельный сосуд или вращающийся стенд, вмещающий до нескольких сотен со- судов) (S/l/=0,2—0,7 см-1).
144 Глава 9 Культура на поверхности | Культура в суспензии О Чистая культура в атмосфере Ng А (3-Ю5 клеток/смг) | \(5~ 10)-Ю5 клеток/мл\ М Культура в сосудах АААА кУльтУРа иииив сосудах Культура, в сосудах \ со встряхиванием > (7-Ю9) (<? • Юв) Промышленный масштаб 1 биореактор (7,5 - Ю") 1 биореактор (7,5- Юп) Iсистема для типового процесса роста клеток на поверхности (1-1(11!) u --------1 (. 1 биореактор (3,7-Ю72) т----1— Культура на микроносителях? Технологи чест гй предел достигнут? РИС. 9.43. Увеличение масштаба культур животных клеток (на примере ВНК 21—клеток из почек новорожденного хомяка). В скобках указано общее ко- личество клеток, образующихся на данной стадии. [Воспроизведено с разре- шения из статьи: Katinger Н. W. D., Scheirer W., Status and Development of Animal Cell Technology using Suspension Culture Techniques; Acta Biotechno- logica, 2, 3 (1982).] метаболита связана с клеточным ростом. В других ситуациях после того, как клетки прошли определенную стадию роста, в систему вводят те или иные вещества-предшественники, из которых позднее и образуется продукт метаболизма. В произ- водстве вирусов, в котором клетки, по сути дела, являются для них питательной средой, может наблюдаться очень сложная
Проектирование и расчет биологических реакторов 145- кинетика. В литературе, посвященной изучению применения культур животных клеток для получения вирусов, клеточный слой обычно называют «субстратом». Посев вируса часто производят только после того, как культура клеток достигнет высокой плотности. Затем вирусы развиваются в соответствии со своим жизненным циклом (см. разд. 6.2.1), включающим стадии проникновения вируса в клетку, синтеза его отдельных компонентов и сборки частиц вируса из этих компонентов; только после этого вирус можно обнаружить в клетках или среде. Разработка способов производства моноклональных анти- тел может служить примером тех потенциальных возможностей, которые заложены в оптимизации процессов с участием живот- ных клеток. Гибридомы клеток мыши выращивали в периодиче- ской, периодической с добавлением субстрата и в непрерывной культурах с целью получения моноклональных антител для поверхностного антигена клеток Rhizobium japonica NR-7*. Изучение различных сред показало, что для данного случая подходит недорогая среда типа Dulbecco’s Modified Eagle Medium, к которой добавлено 0,25% приматона RL, 0,01% детергента плюроник F-68 и совсем немного (1%) сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота. В этой среде концентра- ция клеток в суспензии достигает 2-106 мл-1 при времени удвоения 24 ч. Для этого процесса не было предложено деталь- ной модели кинетики клеточного роста, но полученные резуль- таты тем не менее представляют большой интерес (рис. 9.44 и 9.45). Снижение концентрации растворенного кислорода (с 60 до 25% относительно концентрации при насыщении возду- хом) привело к уменьшению максимальной плотности клеток в культуре, но способствовало увеличению времени жизни культуры, так что окончательная концентрация моноклональ- ных антител оказалась более высокой (рис. 9.44). . Высказывалось предположение, что в любых условиях об- разуется ингибитор клеточного роста. Если это предположение справедливо, то периодический процесс с добавлением субстра- та должен дать лучшие результаты в силу ступенчатого сниже- ния концентрации ингибитора. С этой гипотезой согласуются результаты сравнительного изучения периодических процессов с добавлением и без добавления субстрата (рис. 9.45); действи- тельно, и жизнеспособность клеток, и концентрация антител выше в периодическом процессе с добавлением субстрата. Не- большие количества моноклональных антител удобнее получать в брюшной полости мыши, однако крупномасштабное производ- * Reuveny S., Velez D., Riske F., Macmillan J. D., Miller L., Production of Monoclonal Antibodies in Culture; E.S.C.A.T. Mtg., Italy, May, 1984. 10-746
146 Глава 9 (А) Концентрации клеток, 106[мл (л) Концентрация клеток, Ю^/лт гоо 100 о гоо 100 о РИС. 9.44. Рост гибридом и образование моноклональных антител в фер- ментере объемом 3 л при различных концентрациях растворенного кислорода. (Воспроизведено с разрешения из статьи: Reuveny S., Valez D., Riske F„ Mac- millan, J. D., Miller L., Production of Monoclonal Antibodies in Culture; E.S.C.A.T. Mtg., Italy, May, 1984.) ctbo антител целесообразнее осуществлять в биореакторах с недорогой питательной средой в условиях, обеспечивающих максимальное время жизни клеток и наибольший выход анти- тел. Для роста гибридом и получения продуктов их жизнедея- тельности (моноклональных антител) в большом масштабе перспективно применение культур клеток, иммобилизованных в полых волокнах или с помощью полупроницаемых мембран. 9.8.3. Культивирование растительных клеток Растительные ткани, выделенные из внутренних частей органов растений, после промывки и дезинфекции можно куль- тивировать на агаре в соответствующей питательной среде.
Проектирование и расчет биологических реакторов 147 РИС. 9.45. Сравнение методов получения моноклональных антител в периоди- ческом процессе (б) и в периодическом процессе с добавлением свежей сре- ды (а). Культуру выращивали во вращающихся сосудах емкостью 100 мл. В периодическом процессе с добавлением свежей среды каждые 24 ч к куль- туре добавляли 5—10% среды, а 30% культуры периодически отбирали. (Воспроизведено с разрешения из работы: Reuveny S., Valez D., Riske F., Macmillan J. D„ Miller L., Production of Monoclonal Antibodies in Culture; E.S.C.A.T. Mtg., Italy, May, 1984.) Питательная среда для растительных клеток обычно состоит из смеси неорганических солей и глюкозы или сахарозы в каче- стве источника энергии и углерода. (В культуре растительные клетки обычно являются хемогетеротрофами, а не фотоауто- трофами.) В среду указанного выше состава обычно вводят также регуляторы роста растений, фитогормоны, витамины, аминокислоты и многоосновный спирт инозит. В такой культуре деление клеток осуществляется только в присутствии кислоро- да, поэтому ее следует аэрировать путем диффузии через свободную поверхность жидкости или посредством барботажа. Увеличение численности популяции в периодическом процессе 10*
148 Глава 9 подчиняется обычным закономерностям клеточного роста, рас- смотренным в гл. 7, но здесь обычно удается добиться только трех- или четырехкратного удвоения популяции, что соответству- ет увеличению клеточной массы в 10—15 раз по сравнению с массой посевного материала. Культуры растительных тканей могут быть полезными при решении многих задач. Так, ферментные и метаболические системы растений можно использовать для проведения как сравнительно простых, так и очень сложных биохимических превращений. Примером таких реакций может служить полу- чение дигоксина (важного стимулятора сердечной деятельности) из дигитоксина путем введения гидроксильной группы в 12^-по- ложение последнего с помощью клеток наперстянки (Digitalis). Растительные клетки можно также использовать в биосинтезе сложных соединений из сравнительно простых предшественни- ков; в частности, культуры растительных тканей способны осуществлять полный синтез сложных веществ, обычно вторич- ных метаболитов, из простых компонентов среды. К числу вторичных растительных метаболитов, представляющих интерес с точки зрения их промышленного производства, относятся фармацевтические препараты (в настоящее время около одной четверти всех разрешенных к применению в США лекарствен- ных препаратов имеют растительное происхождение), красите- ли (например, шиконин), камеди, природные инсектициды группы пиретринов, вкусовые вещества, а также пряности и душистые вещества типа продуцируемых ванилью и жасмином. Культуры растительных тканей, кроме того, служат ценным инструментом в генной инженерии растений: с их помощью можно существенно повысить урожайность, а в будущем воз- можно добиться выращивания целых растений хлебных злаков из культуры клеток. По сравнению с обычным методом выра- щивания растений в грунте и последующего сбора урожая культуры растительных тканей могут обеспечить более высокую продуктивность, надежность и предсказуемость урожая. В суспензионной культуре растительные клетки находятся в изолированном состоянии или в виде крупных скоплений. Отмечалось, что в скоплениях растительные клетки в некото- рой степени дифференцированы так, что клетки, находящиеся на наружной поверхности и внутри скопления, морфологически различны. В некоторых случаях необходимый продукт метабо- лизма вэобще не синтезируется отдельными клетками, а только их скоплениями. Отсюда следует, что при определенных обстоя- тельствах некоторая степень дифференциации клеток способст- вует реализации тех путей метаболизма, в которых синтезиру- ется необходимое вещество. В других случаях предпочтительнее недифференцированное состояние клеток в культуре. Дальней-
Проектирование и расчет биологических реакторов 149 шее практическое развитие этой области биотехнологии требует более глубокого изучения процессов регуляции дифференциации клеток, обусловленных дифференциацией эффектов, и возмож- ности управления дифференциацией в культурах клеток путем изменения условий роста. О кинетике роста растительных клеток в культуре опублико- вано мало данных. Одно из немногих исключений представля- ют результаты работ Уилсона и сотрудников по изучению культивирования растительных клеток в хемостате. В табл. 9.15 Таблица 9.15. Время удвоения и экономические коэффициенты для культур растительных клеток3 Лимитирующее Экономический ко- Время удвое- Культура клеток питательное ве- эффициент, НИЯ, ч щество 10s клеток/мкмоль Galium (подмаренник) Фосфат (РО4~) 3,95 40 Galium (подмаренник) Фосфат (РО4~) 2,47 25 Acer (белый клен) Фосфат (РО4_) 3,47 182 Acer (белый клен) Фосфат (РО4_) 1,28 36 Acer (белый клен) Нитрат (NO3-) 0,263 109 Acer (белый клен) Глюкоза 0,039 109 а Воспроизведено с разрешения из статьи: Wilson. G., Continuous Culture of Plant Cells Using the Chemostat Principle, in Adv. Biochem. Eng., Fiechter A. (ed ), vol. 16, p. 1. 1980. приведены найденные этими исследователями экономические коэффициенты и время удвоения для культур растительных клеток двух типов при росте в средах с различными лимитирую- щими питательными веществами. Обратите внимание на чрез- вычайно большое время удвоения популяции, что является одним из основных препятствий как в экспериментальном изу- чении культур растительных клеток, так и в их промышленном применении в качестве катализаторов. Оценка константы насы- щения Ks (или константы Моно) показала, что в случае роста культуры клеток Acer (клена белого) на лимитирующих субст- ратах (нитрате, глюкозе и фосфате) величина Ks составляет 0,13, 0,5 и 0,032 мМ соответственно [66]. Рост культур растительных клеток осуществляли не только во встряхиваемых сосудах, но и в реакторах с механическим перемешиванием, а также в реакторах колонного типа с барбо- тажем. Для того чтобы повысить объемную плотность клеток в культуре, обеспечить возможность повторного их использования и сохранить в определенной стадии морфологического развития и дифференциации, а также для лучшего регулирования контак- та между средой и клетками, несколько исследовательских групп изучали реакторы с иммобилизованными растительными
150 Глава 9 клетками. В частности, исследовалось включение растительных клеток в полупроницаемые полые волокна, гранулы альгинат- ного геля и другие гранулированные носители [67, 68]. Многие продукты метаболизма растений накапливаются только внутри клеток, что может затруднять осуществление промышленных процессов с участием иммобилизованных клеток. Для решения этой проблемы предлагалось попеременно изменять проницае- мость клеточных стенок путем изменения состава среды, чтобы Реактор 1-й стадии. {Z00л, 9 су гл} Реактор 2~й стадии. {750л, сут} РИС. 9.46. Схема установки для производства вторичного метаболита шико- нина с помощью культуры клеток растений {Lithospermum erthrorhizon). (Вос- произведено с разрешения из работы; Curtin М. Е., Harvesting Profitable Products from Plant Tissue Culture; Bio/Technology, October, 1983, p. 649.) одна среда обеспечивала рост клеток, а другая образование и секрецию продукта метаболизма [68]. Как мы уже отмечали при изучении способов производства вторичных метаболитов с помощью периодических культур мик- роорганизмов, в этом случае необходимо разделять во време- ни или в объеме фазу роста клеток и фазу образования вторич- ного метаболита. Такой подход был осуществлен и в первом промышленном крупномасштабном процессе с участием куль- туры растительных клеток, разработанном компанией Mitsui Petrochemical Industries. В этом процессе, включающем три последовательные операции общей продолжительностью более трех недель, в культуре Lithospermum erythrorhizon получают ценный краситель и фармацевтический препарат шиконии (рис. 9.46). Клетки сначала выращивают в аэрируемом реакторе, а затем переносят в меньший реактор со средой типа М-9, которая
Проектирование и расчет биологических реакторов 151 стимулирует образование шиконина. Далее культуру переносят в третий емкостный реактор, в котором в течение 14 сут шико- нин накапливается в клетках. О выходе продукта компания, производящая шиконин, не сообщала; согласно независимым оценкам, производительность установки составляет около 5 кг шиконина за один периодический процесс. Очевидно, трудоза- траты, расходы на сооружение установки и приобретение доро- гой среды должны окупаться высокой стоимостью продукта. Действительно, продажная цепа шиконина в октябре 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм! 9.9. Заключение В этой главе мы рассмотрели основы расчета и проектирова- ния реакторов и основные принципы соответствующих техноло- гий, которые находят применение в настоящее время и, воз- можно, будут использоваться в будущем для производства тех или иных продуктов с помощью микроорганизмов или клеток высших организмов. Мы попытались показать, как на основе данных о кинетике биологических процессов и параметров, характеризующих течения и перемешивание в реакторе, можно составить математическое описание процесса, пригодное для его расчета и оптимизации. Такой традиционный и успешно приме- нявшийся в классической химической технологии подход к решению проблем технологии химических реакций уходит сво- ими корнями в химическую и нефтеперерабатывающую про- мышленность. К сожалению, вследствие отсутствия достаточно- го количества данных о кинетике биологических превращений, применения сложных сред с неопределенным составом и непред- сказуемыми эффектами, использования реакторов с нечетко определенными структурой течений и параметрами перемеши- вания, а также в силу того, что до сих пор не проводилось комплексных работ по поиску более систематических универ- сальных и надежных методов расчета биореакторов, разработан- ные с помощью описанной в этой главе систематической методо- логии режимы работы биореакторов и спецификации соответ- ствующих проектов встречаются крайне редко. Масштабирова- ние биопроцессов чаще всего осуществляют в нескольких последовательных экспериментах с постепенным увеличением масштаба (что, естественно, приводит к удорожанию проектных работ), причем масштабы последовательных экспериментов гораздо меньше отличаются один от другого, чем в случае аппаратов и процессов химической технологии. При разработке биологического реактора периодического действия в настоящее время основная задача, скорее всего, будет заключаться в обес- печении необходимой скорости массопереноса, а не в расчете
152 Глава 9 оптимального режима работы реактора на основе данных о ки- нетике процесса. Опыт работы отраслей промышленности, в которых широко, применяются методы химической технологии., показывает, что за счет оптимизации процессов можно добиться существенного снижения капитальных вложени?! и эксплуатационных расхо- дов, уменьшения количества побочных продуктов и повышения выхода основного продукта. Кроме того, в нефтеперерабатываю- щей промышленности благодаря хорошо разработанной теории процессов и аппаратов масштаб процесса можно обычно увели- чивать в 10 000 раз, что соответствует непосредственному пере- ходу от лабораторной установки к крупномасштабному аппара- ту. Поскольку в ближайшем будущем откроется возможность- получения многих новых продуктов с помощью новых организ- мов и новых процессов, мы вправе надеяться на развитие технологии биохимических процессов, что позволит обеспечить большую эффективность масштабирования, проектирования и эксплуатации биореакторов. Это в свою очередь будет способ- ствовать повышению их надежности и ускорению экономически оправданного внедрения биопроцессов в промышленность. Следующая глава будет посвящена знакомству с контроль- но-измерительной аппаратурой для биореакторов. Отсутствие данных о явлениях переноса основных компонентов системы и химических процессах в реакторе ограничивают число мето- дов контроля для установления оптимального режима работы реактора. Хотя в следующей главе основное внимание будет уделено контролю и регулированию процессов в емкостных реакторах, большая часть рассматриваемых контрольно-измери- тельных приборов может с тем же успехом применяться и для аппаратов с восходящим или нисходящим потоком. Закончив изучение контрольно-измерительной аппаратуры, мы перейдем к рассмотрению основных процессов разделения, позволяющих превратить выходящий из биореактора поток смеси веществ в достаточно чистый целевой продукт. Упражнения 9.1. Анализ ПРПП. а) Проверьте справедливость всех приведенных в табл. 9.1. уравнений, описывающих процессы в ПРПП. б) Как с помощью соответствующих графиков можно определить все па- раметры, входящие в уравнения скоростей реакций в ПРПП (табл. 9.1)? 9.2. Анализ ТРПВ. а) Проверьте справедливость приведенных в табл. 9.2 выражений путем их интегрирования. б) Какие переменные удобнее применять в каждом из уравнений для ТРПВ? Начертите графики, по которым можно определить каждый кинетиче- ский параметр в уравнении скорости реакции. в) Параметры какой модели — ПРПП или ТРПВ — в общем случае легче поддаются определению? Почему?
Проектирование и расчет биологических реакторов 153 9.3. Производство белка одноклеточных организмов. Экспериментально определены следующие значения параметров кинетики роста Methylomonos methanolica на метаноле при 30 °C и pH 6: р,тах = 0,53 ч-1; Ys (экономический коэффициент по метанолу) =0,48 г/г; Уо2=0,53 г/г; эффективность утилизации углерода (сбНомасса/сметаноЛ) =0,57 г/г; кислородный коэффициент — 0,90 молей О2 на ’моль СН3ОН; дыхательный коэффициент (RQ)=0,52 моль СО2 на моль О2; коэффициент поддержания т = 0,35 г СН3ОН/г; 7G = 2,0 мг/л \Dostolek М., Molin N., Studies of Biomass Production of Methanol Oxidizing Bacteria, p. 385 in Single Cell Protein II, Tannenbaum S. R., Wang D. I. C. (eds.), MIT Press, Cambridge, Mass., 1975]. Приведенные выше экономические коэффициенты отвечают скорости разведения 0,52 ч-1. а) Запишите уравнения, описывающие зависимости скоростей образова- ния клеточной массы, поглощения кислорода и образования СО2 от скорости разведения в ПРПП. б) Постройте графики зависимостей х, xD и s от D (ч-1) и определите максимальные значения х и xD при концентрации метанола в питательной среде s=7,96 г/л. в) На том же чертеже постройте график зависимости скорости потребле- ния кислорода от D. Определите расходуемую на перемешивание мощность (в расчете на единицу объема), которая обеспечивает максимальную продук- тивность системы (xD)max. Сформулируйте принятые допущения. г) На том же чертеже постройте график зависимости расчетной скорости выделения теплоты в единице объема от D. д) Показано, что удельная скорость роста ц линейно зависит от концент- рации субстрата и снижается от 0,53 ч-1 при s = 3 г/л до нуля при s= 13 г/л (последняя величина найдена путем экстраполяции). Повторите решение за- дачи 9.3. б с учетом указанных данных. е) При каких условиях на выходе каскад реакторов выгоднее, чем один реактор того же объема? 9.4. Стерилизация жидкостей. Составьте уравнение, позволяющее опреде- лить вероятность достижения полной стерильности (и<1,0) в непрерывном стерилизаторе, работающем в режиме полного вытеснения при следующих параметрах: удельная скорость гибели клеток 10 мин-1; объем стерилизатора 10 л; средняя скорость потока 10 л/мин; температура среды 131 °C; время сбора 5 мин; начальная концентрация клеток п0=Ю3 л-1. Как, по вашему мне- нию, изменится вероятность достижения полной стерильности, если при тех же указанных переменных стерилизатор будет короче и шире? Поясните ваш ответ и приведите соответствующие уравнения. 9.5. Клеточный рост при непостоянном экономическом коэффициенте. Выведите уравнения для зависимостей x(Z)) и s(D). аналогичные уравнениям (7.14) и (7.15), если Y определяется уравнением (7.26). 9.6. Микробиологический процесс в реакторе с перемешиванием в присут- ствии инертного носителя. Предположим, что питательный раствор содержит суспендированные инертные частицы, а также субстрат для анаэробной фер- ментации. Перемешивание обеспечивает полное диспергирование частиц. Рас- пределение микроорганизмов (одного штамма) между частицами и жидкой фазой описывается уравнением: Л\(клеток/см2) = КХжидкая фаза (КЛвТОК/мл) где К имеет размерность мл/см2. Адсорбция не изменяет максимальной удель- ной скорости роста Цтах, но влияет на Ks (будем считать, что рост клеток описывается уравнением Моно). а) Приняв диаметр частиц равным 0,1 мм, а их объемную долю равной 1%, определите во всем доступном диапазоне скоростей разведения, во-пер- вых, отношение скорости утилизации субстрата в присутствии инертных час- тиц к скорости утилизации субстрата в их отсутствие и, во-вторых, влияние
154 Глава 9 суспендированных частиц на скорость разведения, отвечающую началу вымы- вания. б) Предложите конструкцию устройства для регенерации клеток на вы- ходе из реактора, которое бы обеспечивало максимальный выход биомассы. 9.7. Метод быстрого определения Ks. Уилльямсон и Мак-Карти [William- son, McCarty, A Rapid Measurement of Monod Half Velociity Coefficients for Bacterial Kinetics; Biotech. Bioeng., 17, 915 (1975)] разработали метод относи- тельно быстрого определения Ks — константы в уравнениях, описывающих ки- нетику микробиологических процессов. В этом методе в микробиологический реактор постепенно вводят концентрированный раствор питательных веществ в таком количестве, чтобы общий объем смеси существенно не увеличивался в течение нескольких часов. Если величина s такова, что скорость утилизации субстрата клетки ниже максимально возможной (ЦшахК/У), то стационарное состояние достигается менее чем за 1 ч. а) Покажите, что с помощью графической зависимости типа графика Лайнуивера — Бэрка (зависимости обратной скорости клеточного роста от обратной концентрации субстрата в «стационарном состоянии») можно опре- делить Ks. б) В каком диапазоне времени отбора проб применим указанный метод? 9.8. Реактор периодического действия с добавлением субстрата, а) Взяв за основу уравнение (9.4), выведите общее уравнение, описывающее зависи- мость х от t, если при ц —Цтах клетки находятся в экспоненциальной фазе роста. б) При каких условиях параметр х будет возрастать, уменьшаться или оставаться постоянным? в) Найдите выражения, описывающие х при t<ti, при Ь<1<12 и при сколь угодно большом t, если концентрация питательных веществ F изменяет- ся во времени следующим образом: F=FQ при F=0 при F=F0 при t2<t<t3 и т. д. г) Пусть удельная скорость роста штамма микроорганизмов, утилизирую- щих метанол, описывается уравнением (7.32) (т. е. уравнением Моно плюс выражение, учитывающее субстратное ингибирование). Объясните, почему периодический процесс с добавлением субстрата дает лучшие результаты по сравнению с периодическим процессом с введением всего метанола в начале процесса. 9.9. Последовательная утилизация субстратов. Как упоминалось в тексте настоящей главы, при наличии нескольких субстратов характер их утилизации в каскаде реакторов или реакторе башенного типа может быть весьма слож- ным. Рассмотрим очень простую модель диауксии, т. е. роста клеток на двух субстратах, одним из которых является глюкоза (G), а вторым — другой уг- левод (S), так что rx = p(g,s)x = PGg . HSS _ Kg + g Ks + s Кк + g Г а) Если, как обычно, глюкоза играет роль репрессора, то следует ожи- дать, что И Ks~Kg»Kr. Нарисуйте графики зависимостей g, s и 1пх от времени в периодическом процессе; укажите взаимосвязь между измене- нием концентрации биомассы и двух субстратов G и S. [Считайте, что (go, So)»(Ks, Kg).] б) Какой реактор лучше применять — реактор полного вытеснения, кас- кад хемостатов или один хемостат, — если целью микробиологического про- цесса с участием двух субстратов является их полная утилизация? в) Поскольку Kr<Kg, Ks, то уравнение клеточного роста можно значи- тельно упростить, получив в конечном итоге два выражения для g>K* и КК>ё~0. Выведите упрощенное уравнение, описывающее процесс в потоке полного вытеснения, и путем интегрирования найдите зависимости x(z), g(z)* и s(z).
Проектирование и расчет биологических реакторов 155 г) Начертите графики зависимостей, найденных в предыдущем упражне- нии, при следующих значениях параметров: |Хо=1 ч_, = 1,1 p,s, Kg = Ks = = 10 ммоль, Kr = 0,1 ммоль, хо=О,1 г/л, Уо = Уз = 0,5 г/г, go=So=O,l ммоль, а отношение Uo/L (отношение скорости потока к длине реактора) равно 1, 3 или 5 ч~*. д) В вертикальных ферментерах башенного типа микроорганизмы могут образовывать медленно осаждающиеся скопления. Как модифицировать про- стое уравнение, найденное при решении упражнения 9.9, б, чтобы оно учиты- вало и осаждение клеток со средней скоростью ис (ис>ио)7 (Результирующая скорость осаждения клеток равна ис—и0.) 9.10. Расчет хемостата на основе данных для периодического процесса. Уравнения материального баланса по компоненту С в реакторе периодическо- го действия (или в реакторе полного вытеснения) и в хемостате (в ПРПП) можно записать в следующей форме: Периодический процесс (или реактор полного вытеснения) = f(c) (I) dt Процесс в хемостате (в стационарном состоянии) D(c;.—с) = —)(с) (II) Поскольку зависимость f(c), согласно уравнению (I), можно найти диффе- ренцированием, то график зависимости f от с можно построить по результа- там изучения периодического процесса. С другой стороны, уравнение (II) по- казывает, что график зависимости D(c—с0) от с будет пересекаться с кривой зависимости [(c) от с при с*, отвечающем решению уравнения (II). [Этот ме- тод, позволяющий найти с* для любого заданного D, применим только в том случае, если процесс ферментации описывается одной переменной, например с; он описан в статье: Luedeking R., Piret Е. L., Transient and Steady States in Continuous Fermentation; Theory and Experiment; J. Biochem. Microbiol. Tech- nol. Eng., 1, 431 (1959).] В этой статье приведены результаты сравнения рас- четных и экспериментальных данных, иллюстрирующие потенциальные воз- можности метода: Найдено (единиц оптической плотности в 1 мл) Вычислено графическим методом по результатам изучения периодического процесса 5,37 5,35 2,4 2,3 8,0 7,15 а) Рассмотрим логистическое уравнение dx/dt=\ix(\ — x/xmax). Описанным выше графическим методом определите х* при ц=1 ч-1, xmax=10 г/л и х0 (в исходных веществах) равном нулю, если скорость разведения D составляет 1,5, 0,75 или 0,25 ч-1. Проверьте правильность полученных вами результатов прямым аналитическим решением. б) В каскаде ферментеров продукты, полученные в одном реакторе, яв- ляются исходными веществами для следующего реактора. Как графически определить х3* (концентрацию биомассы в последнем реакторе каскада, со- стоящего из трех ПРПП) при общей скорости разведения £> = 0,75 ч~‘? в) Внимательно изучите данные, относящиеся к росту культуры на двух субстратах (рис. 7.14). Путем дифференцирования найдите зависимость dx/dt от х и начертите график этой зависимости. Чем этот график отличается от кри- вой простого логистического уравнения? С помощью описанного метода реши-
156 Глава 9 РИС. 9У11.1. Зависимость степе- ни превращения субстрата (О) и высоты псевдоожиженного слоя (+) от объемной скорости потока. На кривых указана молярная кон- центрация субстрата в исходной смеси. [Из статьи: Gelf G., Boud- rant Enzymes Immobilized on a Magnetic Support; Biochim. Bio- phys. Acta, 334, 468 (1974).] те задачу (графическим путем) о ходе процесса в каскаде из 5 ре- акторов, в котором потребляется вся глюкоза и большая часть вто- рого углевода. 9.11. Иммобилизованные ферменты в псевдоожиженном слое, а) Чинлой (Chinloy, PhD thesis, Princeton University, 1976) изучал зависимость степени превращения субстрата от обратной объемной скорости потока 0-1 (выражен- ной в миллилитрах на грамм частиц катализатора в секунду) в неподвижном и псевдоожиженном слоях протеазы, иммобилизованной на непористых части- цах из нержавеющей стали. И в первом, и во втором случае эту зависимость можно изобразить одной и той же прямой линией, проходящей через начало координат. Допустим, что s0»7(m; покажите, что в этом случае на степень превращения субстрата не влияет массоперенос и что константу удельной ско- рости процесса можно определить непосредственно по указанной зависимости, если известно количество фермента, адсорбированного на частицах катализа- тора (миллиграммов Е в грамме катализатора). б) Джелф и Боудрант [Gelf, Boudrant, Preliminary Study of a Fluidized Bed Enzyme Reactor; Biochim. Biophys. Acta, 334, 467 (1974)] изучали гидро- лиз этилового эфира бензоиларгинина (ЭЭБА) папаином, иммобилизованным на пористых частицах диаметром 170—250 мкм. Для указанной реакции сооб- щались следующие значения параметров: для растворимого папаина К,п = = 5-10-3М, щПах = 19 межд. ед. (мкмолей ЭЭБА/(мин-мг) при pH 6,0 и 20°C); для иммобилизованного папаина /Ст=1,2-10—2 М (кажущаяся величина), Umax = 0,05 межд. ед. (мкмолей ЭЭБА/(мин-мг носителя}}. Пористый носитель в данном случае состоял в основном из частиц оксида железа. По приведен- ным на рис. 9У11.1 данным определите, какое сопротивление массопереносу — внешнее или внутреннее—играло в этом случае основную роль. Укажите, ка- кие допущения вы приняли. В псевдоожиженном слое содержалось 10 г ката- лизатора, который получали из 100 мг кристаллического папаина и 30 г окси- да железа. в) Обсудите, как вы стали бы рассчитывать реактор с псевдоожиженным слоем иммобилизованной протеазы, предназначенный для гидролиза 1) ЭЭБА, 2) казеина, 3) частиц желатины диаметром 1 мкм. 9.12. Оптически чистые аминокислоты. Тоса и Др. [Tosa et al., Studies on Continuous Enzyme Reactors II. Preparation of DEAE-Cellulose Aminoacylase Columns and Continuous Optical Resolution of Acetyl-d,l-methionine; Enzymo- logia, 31, 225 (1966)] разработали процесс, схема которого изображена на рис. 9У12.1. На время допустим, что Umax не зависит от pH. В этом процессе исходная рацемическая аминокислота ацетилируется уксусным ангидридом.
Проектирование и расчет биологических реакторов 157 а в колонне с L-аминоацилазой идет обратная реакция, в результате которой образуется свободная L-аминокислота, очищаемая перекристаллизацией из водного спирта. а) Допустим, что начальная концентрация аминокислоты намного больше Кт. Найдите уравнения, описывающие гидролиз ацетил-Ь-аминокислоты под действием фермента в колонне в режиме полного вытеснения, а также при на- личии осевой дисперсии. б) Можно принять, что реакция рацемизации обратима и имеет первый порядок, так что ее скорость пропорциональна cDa —c*Da, где c*Da— концен- Мсходная ИЬ-ациламиио- кислота РИС. 9У12.1. Каталитическое разделение рацемических аминокислот. [Из статьи: Tosa Т., Mori Т., Fuse N., Shibata I., Enzymologia, 31, 225 (1966).] трация ацетил-В-аминокислоты в растворе при равновесии. Какой объем дол- жен иметь ПРПП, в котором осуществляется рацемизация, если заданная степень приближения к равновесию равна 95% и если с продуктами из систе- мы выводится 90% L-аминокислоты, 1% ацетил-D-аминокислоты и 10% вод- ной фазы? в) При ферментативном деацетилировании выделяется уксусная кислота. Если процесс инактивации фермента имеет pKi = 5 и рК2=8, то при каком pH превращение ацетил-DL-аминокислоты в 10-6, 10~4 и в 10-1 М растворах бу- дет максимальным? (Примите, что процесс происходит в реакторе полного вытеснения.) Четко сформулируйте принятые допущения. 9.13. Превращение нерастворимых субстратов. Для выращивания куль- туры дрожжей на газетной бумаге в качестве нерастворимого субстрата была предложена следующая последовательность операций: механическое измель- чение субстрата, его кислотный гидролиз, нейтрализация среды, введение не- большого количества других питательных веществ, необходимых для роста1 Дрожжей, рост дрожжей в аэробном процессе, фильтрование под вакуумом для отделения жидкой фазы от биомассы. а) Нарисуйте технологическую схему указанного процесса, на которой стрелками укажите места введения компонентов, а кружками выделите от- дельные типовые операции. При необходимости укажите также расположение- транспортеров для подачи твердых веществ и насосов для подачи жидкостей. б) Нарисуйте аналогичную схему процесса переваривания пищи в орга- низме человека, взяв за основу любой учебник по физиологии человека.
158 Глава 9 в) Бионика — это наука об изучении природных систем с целью разработ- ки искусственных аналогов. Обсудите сходство и различие между процессами, описанными в упражнениях 9.13, а и 9.13,6. Предложите схему устройства' для обработки твердых веществ (упражнение 9.13, а), воспользовавшись прин- ципом подачи «транспортером» из упражнения 9.13, б. 9.14. Поддержание жизнедеятельности клеток; вымывание при небольших S. Для достижения нетривиального стационарного состояния популяций неко- торых микроорганизмов субстрат может потребоваться в минимальной кон- центрации. Рассмотрим, например, систему, в которой кинетика клеточного роста описывается уравнениями: Цтах5^ , 1 Цтах5-^ гх — jz I о %еХ rs — v- jz । As + s Ks /Cs + S .Допустим, что к этой системе применим аналитический подход, описанный в упражнении 9.10. а) Покажите, что при концентрации субстрата ниже keKs/famax—ke) един- ственное стационарное состояние в ПРПП достигается при х=0. б) Постройте график зависимости dxfdt от х (для периодического про- цесса) при gmax = 0,5 ч-1, 7G = 0,2 г/л, ke=0,1 ч~’, /5=0,6 г клеток/г субстра- та; аналитическим решением указанных уравнений покажите, что для соответ- ствующего непрерывного процесса dx/dt={) при малых величинах s и при D > Двымывания. в) Определите устойчивость каждого стационарного состояния по отно- шению к небольшим возмущениям. 9.15. Ферментация сыворотки. Показано, что процесс превращения содер- жащейся в сыворотке лактозы в молочную кислоту в присутствии Lactobacil- lum bulgaricus при 44 °C и pH 5,6 можно описать уравнением Льюдикина — Пайрета [уравнение (7.93)], если его модифицировать следующим образом: 1. Максимальная скорость роста равна ,.О (,______Р__ I* max I 1 \ Ртах 2. g°max=0,48 Ч-1, Ртах = 5% При £<3,8% g°max=l,l Ч-1, £тах = 4,3°/о ПрИ £>3,8% 3. Параметры непрерывного процесса: а=2,2; [3 = 0,2 ч-1; У=0,88 г про- дукта/г субстрата; /<=50 мг/л. а) Напишите уравнения, описывающие изменение s, х и р в непрерывном процессе. б) Покажите, что в стационарном состоянии при общем времени удержи- вания 15 ч субстрат превращается полнее в каскаде из двух реакторов, однако дальнейшее увеличение числа реакторов практически не влияет на степень превращения субстрата. Относится ли этот вывод и к урожаю биомассы? (Рассмотрите вариант, когда So=5,O%, хо=ро=О.) в) Келлер и Герхардт [Keller, Gerhardt, Continuous Lactic Acid Fermenta- tion of Whey to Produce a Ruminant Feed Supplement High in Grude Protein; Biotech. Bioeng., 17, 997 (1975)] отмечали, что при s0 меньше 5% ингибирова- ние продуктом процесса не слишком велико, и поэтому, по их мнению, «...с практической точки зрения... сыворотку сыра чеддер (4,9% лактозы, •0,2% молочной кислоты) можно с удовлетворительным результатом ферменти- ровать в одностадийном ферментере, тогда как при получении сыра коттедж (5,8% лактозы, 0,7% молочной кислоты) этот процесс выгоднее осуществлять в каскаде из двух ферментеров». Оцените количественно преимущества систе- мы из двух ферментеров для переработки сыворотки сыра коттедж, повторив ^решение упражнения 9.15,6 при s0=5,8%, ро=О,7%. г) Эти исследователи отмечали также, что добавление сахара может при- вести к снижению количества воды, которое нужно удалить для получения
Проектирование и расчет биологических реакторов 159 определенного количества продукта. Как эта операция (добавление сахара) отразится на общей схеме реактора? 9.16. Каскад реакторов; переработка углеводородов. Предположим, что в вашем распоряжении имеется кривая, описывающая изменение скорости клеточного роста в периодическом процессе переработки углеводородов с по- мощью микроорганизмов; этот процесс очень живо описан Мимурой и др. (разд. 8.8). В упражнении 8.11 вы определяли возможные лимитирующие процесс сопротивления на каждой из его фаз. Ваша компания решила (в ва- РИС. 9У17.1. Ход периодического процесса биосинтеза пенициллина во вре- мени. ше отсутствие) расширить масштаб производства, дополнив установку п по- следовательно соединенными реакторами, где п — число реакторов, равное числу фаз с определенной структурой системы клетка — пузырек — субстрат (рис. 8.14). Найдите лимитирующие процесс сопротивления для каждой фазы и обсудите (учитывая количественные аспекты), как можно осуществить мас- штабный переход от лабораторной к промышленной установке, если рабочий объем или потребляемая мощность, или другие параметры последней превос- ходят соответствующие параметры лабораторной установки в 5000 раз. 9.17. Производство пенициллина. Приведенные на рис. 9У17.1 данные относятся к процессу синтеза пенициллина в культуре Penicillium chrysoge- пит. Эксперимент проводили в реакторе периодического действия с полным перемешиванием объемом 10 л, при объемной скорости аэрации 0,2 объема газа на объем ферментера в минуту. Начальный состав среды, в которой осу- ществляется рост культуры и биосинтез пенициллина (в г/л): КН2РО4— 3,0;. Na2SO4 —0,9; MgCl2 —0,25; MgSO4-H2O — 0,05; глюкоза—10; NH4C1 —2. Кроме того, в ходе процесса в среду постоянно вводили глюкозу, а pH регу-
160 Глава 9 .лнровали добавлением NH4OH. Бензилпенициллин имеет брутто-формулу C16H18N2O4S. а) Объясните характер изменения концентраций биомассы, пенициллина, глюкозы и NH3 в этом периодическом процессе. б) Совершенно неожиданно биосинтез пенициллина резко прекратился, хотя организм был способен синтезировать еще в 5 раз больше пенициллина, чем было накоплено в системе к моменту прекращения синтеза. Как главного консультанта компании Antibiotics Unlimited, Ltd., вас попросили найти при- чину прекращения синтеза пенициллина. 9.18. Полупериодические процессы. В общем случае поддерживать низкую, строго контролируемую скорость поступления питательных веществ в реактор труднее, чем периодически добавлять субстрат, одновременно отбирая равный объем культуральной жидкости. Допустим, что рост микроорганизмов лими- тируется одним субстратом в соответствии с уравнением типа уравнения Моно и что скорость клеточного роста пропорциональна скорости изменения кон- центрации субстрата. Пусть процесс начинается при f=0 (т. е. продолжитель- ность лаг-фазы пренебрежимо мала). В момент времени t из ферментера (с объемом жидкой фазы V) отбирают объем Vi и добавляют точно такой же объем свежей питательной среды с концентрацией субстрата Sf. а) Покажите, что в момент времени t (до отбора УД концентрация суб- страта s описывается уравнением: 1 + (х0/Г) 4~ s0 _ 1 — s/sQ 1 _ Ks Г_5 *o/(>%) J (x0/K) -Ho L sc б) В момент времени t отбирают объем Vi, добавляют свежую питатель- ную среду, после чего процесс возобновляется. Выразите «о, х0 через s, xt. в) Покажите также, что эффективность утилизации субстрата описывает- ся выражением P = (Sf — S1)/sf= 1 -—(W/Vi) sfg>/As 1 —<р где <р= V\/V. г) Покажите, что при ф->0 эффективность утилизации субстрата стано- вится такой же, как и в случае непрерывной культуры: sf [рт (V/Vx) t - 1] где Vt/Vi — обратная скорость разведения. д) Покажите графически, что при Sf//G=l,0 и конечном значении Ф (при периодическом добавлении свежей среды) параметр р больше, чем для про- точного реактора, если (|XmW/Ui) >4. 9.19. Культура тканевых клеток в псевдоожиженном слое. Непрерывные культуры тканевых клеток предлагалось выращивать в псевдоожиженном слое на непористом гранулированном носителе (рис. 9У19.1). При этом питательная среда движется снизу вверх, поддерживая носитель в суспендированном со- стоянии, выходит из реактора через ситчатый фильтр, задерживающий грану- лы носителя, и затем поступает в насос. Если разность плотностей гранул носителя и воды невелика, то процесс может идти и при невысокой объемной скорости жидкой фазы, и тогда насос не повреждает содержащиеся в ней макромолекулы. Допустим, что жидкая фаза движется в режиме полного вытеснения и что гранулы носителя полностью диспергированы во всем объеме реактора. Гранулы, проходящие через выходную воронку, осаждаются на ней и постоянно отбираются; выходящая из реактора жидкая фаза после фильтро- вания вновь поступает в реактор.
Проектирование и расчет биологических реакторов 161 а) Допустим, что приведенные на рис. 9У19.2 данные отражают кинетику клеточного роста на каждой грануле, причем р,=0 при />160 ч [вследствие завершения образования монослоя клеток (контактное ингибирование)]. Най- дите выражение, описывающее концентрацию биомассы, отнесенную к одной грануле, на выходе из реактора через объем пустот в псевдоожиженном слое е, скорость введения в реактор инокулированных гранул носителя (Z ч-1), объем реактора VR и соответствующее уравнение скорости клеточного роста. Подача, инокулированных гранул со скоростью Z- Насос РИС. 9У19.1. Биореактор с псевдоожиженным слоем микроносителя для про- цессов с участием культур клеток ткаией. Примите, что начальная концентрация клеток на гранулах равна Со (в расчете на одну гранулу). б) Повторите решение предыдущего упражнения для случая, когда кон- центрация клеток на поступающих в реактор частицах носителя характери- зуется распределением типа: Вероятность нахождения у клеток на одной грануле= Ае~^у~ут)2 где А — нормализующий фактор. в) Предложите конструкцию системы, обеспечивающей «непрерывную» подачу в реактор свежих гранул носителя и непрерывную регенерацию жидкой среды в стерильных условиях. 9.20. Ингибирование роста культур тканевых клеток носителем. Экспе- риментально показано, что твердые носители в высоких концентрациях (см2/см3) могут ингибировать клеточный рост в силу адсорбции на поверх- ностях этих носителей факторов роста и сывороточных белков из среды, при- чем адсорбированные белки не могут взаимодействовать с клетками \Horng С. В., McLimens W., Biotech. Bioeng., 17, 713 (1975)]. Рассмотрим 11—746
162 Глава 9 реактор с полным перемешиванием, содержащий культуру клеток тканей на микроносителе, частицы которого равномерно распределены в жидкой фазе. а) Найдите выражение, описывающее изменение общего количества био- массы в системе во времени, если рост клеток подчиняется логарифмическому закону (все питательные вещества присутствуют в избытке) до тех пор, пока на всей доступной поверхности частиц носителя не образуется монослой кле- ток (см. рис. 9У19.2). РИС. 9У19.2. Изменение количества клеток и титра вируса во времени, и — зависимость с//со от времени (с/ и со — концентрация связанных с носителем клеток в момент времени t и при /=0 соответственно; ------- 75 %-ное насы- щение О2;-------5%-ное насыщение О2); б — зависимость TCID50 от времен» (TCID50 — доза вирусов, приводящая к 50%-ному заражению культуры тка- ни в 1 мл; ----- начальная концентрация клеток 13-105 в 1 мл;---------на- чальная концентрация клеток 3,5" 105 в мл). (Из статьи: van Wezel A. L., Microcarrier Cultures of Animal Cells, in Tissue Culture: Methods and Appli- cations, p. 372, Academic Press, Inc., New York, 1973.) б) Теперь допустим, что скорость роста клеток завнснт от концентрация фактора роста sg, не расходующегося в процессе роста, н что зависимость скорости клеточного роста от sg описывается уравнением типа уравнения Моно. Выведите аналогичное уравнение для зависимости количества биомассы от времени, если фактор роста обратимо адсорбируется на твердой поверх- ности (и при этом обратимо инактивируется) и если процесс адсорбции опи- сывается линейным уравнением: Sg (ty = Ksg в жидкой на твердой фазе поверхности в) Покажите, что при конечном времени существования периодической культуры (например, 6 сут) существует оптимальная величина начальной загрузки носителя в посевной материал культуры клеток ткани, если в конце концов рост клеток прекращается из-за отсутствия свободной поверхности носителя, Выведите уравнение, с помощью которого можно определить эту величину. г) Поскольку частицы носителя в известном смысле выполняют роль ин- гибитора клеточного роста, казалось бы, в этом случае целесообразно вместо
Проектирование и расчет биологических реакторов 163 одного реактора использовать каскад реакторов. С какими трудностями столк- нется экспериментатор, если ои приступит к изучению системы с каскадом реакторов? 9.21. Деацилирование пенициллина V; реакции, протекающие по несколь- ким направлениям. Ферментативное деацилирование пенициллина V (фенокси- метилпенициллина) до 6-аминопенициллановой кислоты (6-АРА; гл. 12), яв- ляющейся исходным веществом для получения полусинтетических пеницилли- нов, включает следующие последовательные и параллельные реакции: Г1 А-(пенициллин V) —> Р-(б-АРА)+<ЭОН(феноксиуксусная кислота) Г2 А- —> R2- (неактивное вещество)+Н+ гз р- —>- HS- (неактивный продукт расщепления кольца) Ki QOH QO- + H+ Р-+Н+ HP (устойчивое соединение) Существует некоторое оптимальное для этого процесса значение pH, посколь- ку протонирование Р_ приводит к стабильному соединению HP, однако даль- нейшее повышение кислотности снижает скорость первой реакции гь а) Допустим, что скорость первой реакции г\ можно описать уравнением Михаэлиса — Ментен с учетом неконкурентного ингибирования протонами, а гг и гз можно выразить через простые уравнения скорости необратимой реакции первого порядка. Запишите эти уравнения, а также уравнения, опи- сывающие скорости двух последних (предположительно обратимых) про- цессов. б) Выведите уравнение для стационарного режима в ПРПП с полной рециркуляцией фермента, описывающее концентрацию А- в исходной смеси, при которой обеспечивается максимальная степень превращения А- в Р-. в) Для обеспечения очень высокой степени превращения дорогого исход- ного вещества представляется целесообразным применение каскада из не- скольких ПРПП. Обсудите преимущества и недостатки такой системы; приве- дите соответствующие расчеты. Считайте, что величины г2 и г3 составляют при- мерно 2—5% от скорости fi в первом реакторе. [Karlsen L. G., Villadsen J., Optimization of a Reactor Assembly for the Production of 6-APA from Penicil- lin V; Biotech. Bioeng., 26, 1485 (1984).] 9.22. Производительность реактора с полыми волокнами. Реакторы раз- личных типов резко отличаются друг от друга по плотности микроорганизмов и производительности. Так, например, по сравнению с реактором с суспензион- ной культурой в реакторе с полыми волокнами достигается в 5 раз меньшая удельная 0-лактамазная активность: Реактор Производительность, ед. фермента в 1 ч, в расчете на 1 клетку Сосуд с перемешиванием (встряхиванием) Реактор с полыми волок- нами 1 • 10"10 2-10-11 11
164 Глава 9 а) Вычислите производительность реактора каждого типа (в единицах ферментативной активности в объеме реактора за 1 ч), если концентрация биомассы в реакторе с полыми волокнами в 1000 раз выше, чем в реакторе с суспендированной культурой. Примите, что концентрация биомассы х в со- суде с перемешиванием (встряхиванием) равна 109 клеток/мл. б) Считается, что выход р-лактамазы несколько повышается за счет лизи- са клеток в полых волокнах и секреции белка. Объясните, как бы вы опреде- лили параметры кинетики лизиса клеток, чтобы затем с помощью этих пара- метров описать процесс образования р-лактамазы путем секреции и лизиса. [Inloes D. S. et al., Hollow Fiber Membrane Bioreactors Using Immobilized E. coll for Protein Synthesis; Biotech. Bioeng., 25, 2653 (1983).] 9.23. Образование не связанного с клеточным ростом продукта жизне- деятельности в периодическом процессе. Периодический микробиологический процесс обычно включает фазы роста биомассы и образования продукта жиз- недеятельности клеток, причем субстрат утилизируется в каждой из фаз. Предположим, что рост периодической культуры описывается логистическим уравнением, а хтах соответствует решению такого уравнения при начальной концентрации второго субстрата зг (не используемого для образования про- дукта метаболизма). Тогда для процесса образования не связанного с клеточ- ным ростом продукта жизнедеятельности микроорганизмов (например, L-глу- тамата в культуре Micrococcus glutamicus) можно записать dx/d t=jix (1 — х/хт ах) dp/dt=nx ds/dt=—(dp/dt)/Yp — (dx/dt)/Yx а) Путем интегрирования каждого из указанных уравнений найдите вы- ражения, описывающие зависимости x(t), p(t) и s(t). б) Обсудите, как вы смогли бы найти хтах, если вам необходимо добиться максимальной величины р(0) или р(0)/Дз(0), где 0 — известное время окон- чания процесса ферментации. в) При каких обстоятельствах вы бы стали искать максимум р(0) и при каких — максимум р(0)/Дз(9)? Литература Довольно много сведений о проектировании и анализе реакторов содер- жится в литературе, приведенной в гл. 7. Дополнительные данные можно найти в следующих источниках: 1. Levenspiel О., Chemical Reaction Engineering, 2d ed., John Wiley and Sons,. Inc., New York, 1972. Эта книга, возможно, является лучшей монографией по проблемам перемешивания и распределения времени пребывания; в та же время здесь рассматриваются и многие другие вопросы проектирова- ния реакторов. Имеется перевод первого издания этой книги: Левен- шпиль О., Инженерное оформление химических процессов. — М.: Химия, 1969. 2. Smith J. М., Chemical Engineering Kinetics, 2d ed., McGraw-Hill Book Com- pany, New York, 1970. Одна из наиболее популярных книг в этой области; ее достоинством является множество конкретных примеров, рассмотренных в применении к реальным реакторам. 3. Carberry J. J., Chemical and Catalytic Reaction Engineering, McGraw-Hill Book Company, New York, 1976. Книга очень информативна; особое вни- мание в ней уделяется гетерогенному катализу и многофазным реакторам. 4. Hill С. С., Jr., An Introduction to Chemical Engineering Kinetics and Reac- tor Design, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1977. Здесь хорошо пред-
Проектирование и расчет биологических реакторов 165 ставлены многие темы, начиная от проблем кинетики и кончая технологией реакторов. В перечисленных ниже источниках широко трактуются многие вопросы проек- тирования и анализа биореакторов: 5. Аткинсон Б., Биологические реакторы. — М.: Пищевая промышленность, 1979. 6. Erickson L. Е„ Stephanopoulos G., Biological Reactors, Chap. 13 in Chemical Reaction and Reactor Engineering, Carberry J. J., Varma A. (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, 1985. Влияние пристеночного роста на работу биологических реакторов рассмотрено в статье: 7. Howell J. A., Chi С. Т., Pawlowsky U., Effect of Wall Groth on Scale-Up Problems and Dynamic Operating Characteristics of the Biological Aerator; Biotech. Bioeng., 14, 253 (1972). Хорошие обзоры по проблеме масштабов времени и длины и ее роли в проек- тировании реакторов даны в статьях: 8. Kossen N. W. F., Models in Bioreactor Design, p. 23 in Computer Applica- tions in Fermentation Technology, Society of Chemical Industry, London, 1982. 9. Roels J. A., Mathematical Models and the Design of Biochemical Reactors; J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 59 (1982). Элементарная теория устойчивости и динамика реакторов рассмотрены в статьях: 10. Amundson N. К., Aris К., An Analysis of Chemical Reactor Stability and Control, Parts I—III; Chem. Eng. Sci., 7, 121 (1958). 11. Jeffreson С. P., Smith J. M., Stationary and Nonstationary Models of Bacte- rial Kinetics in Well-Mixed Flow Reactors; Chem. Eng. Sci., 28, 629 (1973). 12. Ramkrishna D., Fredrickson A. G., Tsuchiya H. M., Dynamics of Microbial Propagation: Models Considering Inhibitors and Variable Cell Composition; Biotech. Bioeng., 9, 129 (1967). 13. Lee S. S., Jackman A. P., Schroeder E. D., A Two-State Microbial Growth Kinetic Model; Water Res., 9, 491 (1975). 14. Young T. B., Bruley D. F., Bungay H. R., Ill, A Dynamic Mathematical Model of the Chemostat; Biotech. Bioeng., 12, 747 (1970). Проблемы, связанные с неидеальным перемешиванием в реакторах, освещают- ся в следующих источниках: 15. Nagata S., Mixing: Principles and Applications, Wiley, New York, 1975. 16. Shinnar R., Residence Time and Contact Time Distributions in Chemical Reactor Design, in Chemical Reaction and Reactor Engineering, Carberry J. J., Varma A. (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, 1985. 17. Villermaux J., Mixing in Chemical Reactors, p. 135 in Chemical Reaction Engineering —Plenary Lectures, Wei J., Georgakis C. (eds.), American Che- mical Society, Washington, D.C., 1983. 18. Charles M., Technical Aspects of the Rheological Properties of Microbial Cultures, p. 1 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 8, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York. 1978. 19. Bryant J., The Characterization of Mixing in Fermenters, p. 101 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 5, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York, 1977.
166 Глава 9 20. Zweitering Th. N., The Degree of Mixing in Continuous Flow Systems; Chem. Eng. Sci., 11, 1 (1959). 21. Popovic M., Papalexiou A., Reuss M., Gas Residence Time Distribution in Stirred Tank Bioreactors; Chem. Eng. Sci., 38, 2015 (1983). Модели нендеальных реакторов: 22. Sinclair C. G., Brown D. E., The Effect of Incomplete Mixing on the Analy- sis of the Static Behavior of Continuous Cultures; Biotech. Bioeng., 12, 1001 (1970). 23. Gschwend K., Fiechter A., Widmer F., Oxygen Transfer in a Loop Reactor for Viscous Non-Newtonian Biosystems; J. Ferment. Technol., 61, 491 (1983). Взаимосвязь между перемешиванием и биореакцней: 24. Vardar F., Problems of Mass and Momentum Transfer in Large Fermen- ters; Process Biochem., 18, 21 (1983). 25. Ujcovd E., Fend Z., Musi’lkovd M., Seichert L., Dependence of Release of Nucleotides from Fungi on Fermentor Turbine Speed; Biotech. Bioeng., 22, 237 (1980). 26. van Suihdam J. C., Metz B., Influence of Engineering Variables upon the Morphology of Filamentous Molds; Biotech. Bioeng., 23, 111 (1981). 27. Wang D. I. C„ Fewkes R. C. J., Effect of Operating and Geometric Para- meters on the Behavior of Non-Newtonian, Mycelial, Antibiotic Fermenta- tions; Devel. Ind. Microbiol., 18, 39 (1977). 28. Vardar F., Lilly M. D., Effect of Cycling Dissolved Oxygen Concentrations on Product Formation in Penicillin Fermentations; European J. Appl. Micro- biol. Biotechnol., 14, 203 (1982). Вопросы теплопроводности в неустановившемся состоянии в твердых телах рассмотрены в известной монографии: 29. Карслоу Г. С., Егер Д., Теплопроводность твердых тел. — М.: Наука, 1964. Процессы и аппараты для тепловой обработки в пищевой промышленности рассматриваются в монографии: 30. Charm S. Е., The Fundamentals of Food Engineering, 2d ed., Avi Publishing Co., Inc., Westport, Conn., 1971. Проблемы получения, изучения и применения биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток изложены в ссылках [14, 15] гл. 4, а также в сле- дующих источниках: 31. Immobilized Microbial Cells, Venkatsubramanian К. (ed.), ACS Symposium Series 106, American Chemical Society, Washington, D.C., 1979. 32. Jack T. R., Zajic J. E.t The Immobilization of Whole Cells, p. 125 in Advan- ces in Biochemical Engineering, vol. 5, Ghose T. K-, Fiechter A., Blake- brough N. (eds.), Springer-Verlag, New York, 1977. 33. Gbewonyo K., Wang D. I. C., Confining Mycelial Growth to Porous Micro- beads. A Novel Technique to Alter the Morphology of Non-Newtonian Myce- lial Cultures; Biotech. Bioeng., 25, 967 (1983). 34. Nagashima M., Azuma M., Noguchi S., Technology Developments in Bio- mass Alcohol Production in Japan: Continuous Alcohol Production with Immobilized Microbial Cells; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 457 (1983). 35, Forberg C., Enfors S.-О., Haggstrbm L., Control of Immobilized, Non-Gro- wing Cells for Continuous Production of Metabolites; Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 17, 143 (1983).
Проектирование и расчет биологических реакторов 167 Башеииые и эрлифтные реакторы: 36. Schugerl К., LUcke J., Oels U., Bubble Column Bioreactors (Tower Bioreac- tors Without Mechanical Agitation), p. 1 in Advances in Biochemical Engi- neering, vol. 7, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer- Verlag, New York, 1977. 37. Schugerl K., Characterization and Performance of Single- and Multistage Tower Reactors with Outer Loop for Cell Mass Production, p. 93 in Advan- ces in Biochemical Engineering, 22, Fiechter A. (ed.), Springer-Verlag, New York, 1982. 38. Kiiai A., Tone H„ Ozaki A., Performance of a Perforated Plate Column as a Multistage Continuous Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 911 (1969). 39. Prokop A. et al., Design and Physical Characteristics of a Multistage Con- tinuous Tower Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 945 (1969). 40. Falch E. A., Gaden E. L., Jr., A Continuous, Multistage Tower Fermentor, I: Design and Performance Tests; Biotech. Bioeng., 11, 927 (1969); II: Analy- sis of Reactor Performance; ibid., 12, 465 (1970). 41. Ault R. G. et al., Biological and Biochemical Aspects of Tower Fermenta- tion; J. Inst. Brewing, 75, 260 (1960). 42. Greenshields R. N., Smith E. L., Tower-Fermentation Systems and Their Applications, Chem. Eng. London, May 1971, p. 182. Реакторы с псевдоожиженным слоем, насадкой и струйным течением жидкости: 43. Scott С. D., Fluidized-Bed Bioreactors Using a Flocculating Strain of Zymo- monas mobilis for Ethanol Production; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 448 (1983). 44. Flaschel E., Fauquex P.-F., Renken A., Zum Verhalten von Fhissigkeits- Wirbelschichten mit Einbauten; Chem.-Ing.-Tech., 54, 54 (1982). 45. van de Vusse J. G., Wesselingh J. A., Multiphase Reactors, p. 561 in 4th International/6th European Symposium on Chemical Reaction Engineering, vol. 2, DECHEMA, Deutsche Gesellschaft fur Chemisches Apparatewesen, e. V., Frankfurt, 1976. 46. Briffaud J., Engasser J., Citric Acid Production from Glucose. II. Growth and Excretion Kinetics in a Trickle-Flow Fermentor; Biotech. Bioeng., 21, 2093 (1979). Технология микробиологических процессов: 47. Microbial Technology, Peppier H. J., Perlman D. (eds.), 2d ed., vols. I and II, Academic Press, Inc., New York, 1979. Необычно обширный сборник обзорных статей по технологии, продуктам и применению процессов мик- робиологической технологии. 48. Casida L. Е., Jr., Industrial Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.. New York, 1968. Хороший обзор продуктов, процессов и методов микробиоло- гической промышленности, в том числе проблем патентоведения и эконо- мики. Многочисленные иллюстрации дают достаточно полное представле- ние о практической стороне этой отрасли промышленности. 49. Уэбб Ф. Ч., Биохимическая технология и микробиологический синтез.— М.: Медицина, 1969. В этой монографии обсуждены проблемы проектиро- вания аппаратов для микробиологической промышленности, рассмотрены получаемые в них продукты. Особенностью этой книги является анализ ряда других важных тем, в том числе посвященных коллоидным систе- мам, эмульсиям, редокс-потенциалам, химической дезинфекции, дегидра- тации, радиации и производству вакцин. 50. Schhgerl К., New Bioreactors for Aerobic Processes; Int. Chem. Eng 22 591 (1982).
168 Глава 9 Культуры животных клеток: 51. Feder J., Tolbert W. R., The Large-Scale Production of Mammalian Cells; Scientific American, 248, 36 (1983). 52. Tolbert №. R., Schoenfeld R. A, Lewis C., Feder J., Large-Scale Mammalian Cell Culture: Design and Use of an Economical Batch Suspension System; Biotech. Bioeng., 24, 1671 (1982). 53. Fiechter A., Batch and Continuous Culture of Microbial, Plant and Animal Cells, p. 453 in Biotechnology, vol. 1, Rehm H.-J., Reed G. (eds.), Veriag Chemie, Weinheim, 1982. 54. Katinger H. W. £>., Scheirer W., Status and Development of Animal Cell Technology using Suspension Culture Techniques; Acta Biotechnologica, 2 3 (1982). 55. Glacken M. W., Fleischaker R. J., Sinskey A. J., Large-scale Production of Mammalian Cell and Their Products: Engineering Principles and Barriers to Scale-up; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 355 (1983). 56. Kruse P. F., Jr., Patterson M. K., Jr., Tissue Culture: Methods and Appli- cation, Academic Press, Inc., 1973. 57. Johnson I. S., Boder G. B., Metabolites from Animal and Plant Cell Culture; Adv. Microbiol., 15, 215 (1973). 58. Cell Culture and its Application, Acton R., Lynn J. D. (eds.), Academic Press, New York, 1977. 59. Acton R. T., Lynn J. D., Description and Operation of a Large-Scale, Мань malian Cell, Suspension Culture Facility, in Advances in Biochemical Engi- neering, vol. 7, Ghose T. K-, Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer- Verlag, New York, 1977. 60. Lim F., Moss R. D., Microencapsulation of Living Cells and Tissues; J. Pharm. Sci, 70, 351 (1981). 61. Ku K-, Kuo M. J., Delente J., Wildi B. S, Feder J., Development of a Hollow- Fiber System for Large-Scale Culture of Mammalian Cells; Biotech. Bioeng, 23, 79 (1981). 62. Scattergood E. M., Schlabach A. J., McAleer W. J., Hilleman M. R., Scale-Up of Chick Cell Growth on Microcarriers in Fermenters for Vaccine Production; Ann. N. Y. Acad. Sci, 413, 332 (1983). 63. White R. J., Klein F., Chen J. A, Stroshane R. M., Large-Scale Production of Human Interferons, in Annual Reports on Fermentation Processes, vol. 4, Tsao G. T. (ed.), Academic Press, 1980. Культуры растительных клеток: 64. Tissue Culture and Plant Science, Street H. E. (ed.), Academic Press, Lon- don, 1974. 65. Advances in Biochemical Engineering, Fiechter A. (ed.), vols. 16, 18, Sprin- ger-Verlag, Berlin, 1980. 66. Wilson G„ Continuous Culture of Plant Cells Using the Chemostat Principle, p. 1 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 16, Fiechter A. (ed.), Springer-Verlag, New York, 1980. 67 Shuler M L., Sahai О. P„ Hallsby G. A, Entrapped Plant Cell Tissue Cultu- res; Ann. N.Y. Acad. Sci, 413, 373 (1983). 68. Brodelius P., Production of Biochemicals with Immobilized Plant Cells: Possibilities and Problems; Ann. N.Y. Acad. Sci, 413, 383 (1983). 69. Curtin M. E., Harvesting Profitable Products from Plant Tissue Culture; Bio/Technology, 1, 649 (1983).
Глава 10 Контрольно-измерительная аппаратура и управление процессами биохимической технологии В предыдущих главах мы уже неоднократно имели возмож- ность убедиться в том, что активность и полезное время жизни ферментного катализатора или популяции клеток непосредствен- но зависят от их окружения. Следовательно, для проектирова- ния, оптимизации и наиболее эффективной эксплуатации био- реакторов необходимо сначала изучить влияние окружения на свойства катализатора, а затем контролировать и регулировать параметры окружения. Эту цель в свою очередь можно достичь путем определения параметров среды, анализа полученных данных и соответствующего управления параметрами. В настоя- щей главе мы опишем имеющуюся в настоящее время контроль- но-измерительную аппаратуру для биореакторов и ее работу, а затем после беглого рассмотрения быстро развивающихся методов регистрации и расчета данных ознакомимся с некото- рыми способами их анализа и управления параметрами процес- са. Хотя в этой главе основное внимание уделяется контроль- но-измерительной аппаратуре и регулированию процессов, протекающих в биореакторах, рассматриваемые в ней общие принципы приложимы и к другим процессам, в том числе к операциям получения исходных веществ. 10.1. Детекторы для определения физических и химических параметров среды и газов На рис. 10.1 представлена одна из последних схем прибор- ного оснащения биохимического реактора. Она предназначена в основном для определения химического состава и физических свойств среды и газовой фазы и лишь очень немногих особен- ностей популяции клеток. Следовательно, при анализе резуль- татов определения параметров системы в биореакторе жела- тельно (или даже необходимо) оценить особенности популяции клеток по доступным данным физико-химического анализа газовой фазы и среды. В этом разделе мы сконцентрируем внимание на неавтономной аппаратуре, работающей в реальном масштабе времени и предназначенной для контроля физических и химических параметров системы в биореакторе.
170 Глава 10 Мощность перемешивающего устройства Торсионный динамометр (внешний} Тензодатчик (внутренний} Скорость добавления жидких . исходных веществ FL Счетчик капель Динамометрический датчик ' Электромагнитный расходомер Давление Обычный мембранный''-^ Обнаружение пены манометр По электрической емкости По электропроводности ---- Регулирование пенообразования Механические устройства Силиконовый эмульсион- ный пеногаситель (при применении масел возникают проблемы сохранения стерильности} Температура Ртутный термометр Термопара Терморезисторы Мощность | мешалки Скорость вращения мешалки Тахометр общего типа (при увеличении объема реактора число м'оборотов мешалка в минуту уменыиа- - м ется, но окружная скорость лопасти мешалки ли остается постоянной} Окислительно-восстановительный pH потенциал Стеклянный Сочетание платинового и стан- электрод дрртного электрода (результаты ерений трудно интерпрети- ровать ) Влияние растворенного кислорода Растворенный кислород Полярографический стерилизу- емый электрод 02+4Н+ + 4р" ->ZHzO Вязкость Ет Рог, Рсог У Ньютоновская ньютоновская Выход продукта Слив, регулирование уровня, динамометрический датчик Скорость потока газа Fg pQz Ротаметры Парамагнитное определение 02 Массовые расходомеры Электрохимическая ячейка рсог ИН- анализатор Мутность Спектрофотометр Измерение количества биомассы (при невысокой плотности} Детекторы, находящиеся в стадии разработка Глюкоза Этанол NHj, Mgz+, К+, Na*, Сиг+, РО^ ATP, ADP, АМР ДНК, РНК NADH РИС. 10.1. Схема приборного оснащения биохимического реактора. [Воспроиз- ведено с разрешения из работы: Erickson L. Е., Stephanopoulos G., Biological Reactors, in Chemical Reaction and Reactor Engineering, Carberry J. J., Var- ma A. (eds.), chap. 13, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985.]
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 171 10.1.1. Детекторы для определения физических свойств среды и газов Из параметров, влияющих на жизнедеятельность клеток и экономичность биопроцесса, в ходе процесса можно непрерывно определять температуру, давление, мощность, расходуемую на перемешивание, скорость вращения мешалки, вязкость бульона, объемные скорости газовой и жидкой фаз, пенообразование, объем или массу содержимого реактора. На небольших лабора- торных установках обычно измеряют только температуру и объемную скорость воздуха. Определение и регулирование давления более типично для больших ферментеров. В качестве датчика температуры чаще всего применяют терморезисторы — полупроводниковые устройства, электричес- кое сопротивление которых зависит от температуры. Хотя зави- симость сопротивления терморезистора от температуры носит нелинейный характер, это обстоятельство не является серьез- ным препятствием в узком температурном интервале (25— 45°C), в котором проходит подавляющее большинство микро- биологических процессов. В качестве датчиков температуры также используются платиновые термометры сопротивления, ртутные термометры в стальном чехле и термопары. Контроль давления особенно важен при стерилизации, когда в реакторе необходимо поддерживать небольшое избыточное давление (около 1,2 атм), чтобы предотвратить заражение системы. В микробиологических реакторах давление обычно контролируют с помощью мембранных манометров, дающих пневматический сигнал, который может быть преобразован в электрический. Для измерения мощности, расходуемой реактором с механи- ческим перемешиванием, применяются различные методы. С помощью ваттметра, работающего на принципе эффекта Холла, измеряется общая энергия на якоре электродвигателя, потребляемая перемешивающим устройством. Для определения мощности можно также использовать торсионный динамометр, установленный на валу мешалки. Как первый, так и второй метод измерения позволяют определять только суммарную мощность, куда входят также потери на подшипниках и уплот- нениях. Изучение перемешивания в 270-литровом ферментере с рабочим объемом 200 л показало, например, что 30% энергии двигателя расходуется на преодоление трения в соединитель- ных и герметизирующих деталях между двигателем и частью вала мешалки в реакторе. Показано также, что доля таких потерь возрастает при увеличении скорости вращения мешалки. Непосредственно определить мощность, передаваемую мешал-
172 Глава 10 кой реакционной массе, можно с помощью балансированных тензодатчиков, установленных на валу мешалки в реакторе. Устройства для непрерывного измерения (в процессе рабо- ты) вязкости и других реологических характеристик культураль- ного бульона пока еще не разработаны. Одно из возможных решений заключается в измерении мощности, потребляемой при нескольких скоростях вращения мешалки. Предлагался также динамический метод, в котором потребляемую мешалкой мощ- ность измеряют во время и после короткого (продолжительно- стью менее 30 с) отключения питания электродвигателя, вра- щающего вал мешалки. Как показано на рис. 10.1 (и подтверж- дено экспериментально), ньютоновские и неньютоновские жидкости в течение этого короткого нестационарного периода характеризуются различным поведением. Существует несколько типов приборов для измерения скоро- стей газовых потоков (поступающего в реактор воздуха или отходящих газов). На простейшем из них — расходомере с переменной площадью проходного сечения (ротаметре) можно считывать показания непосредственно или преобразовывать их с помощью соответствующего устройства в электрический сигнал. В последнее время все большую популярность приобре- тают термические массовые расходомеры, особенно в лабора- торных и пилотных установках. В этих приборах поток газа проходит через нагретый участок трубки, разность температур в сечении которого зависит от массовой скорости потока. Точность этих приборов составляет около 1 % от измеряемого диапазона; их целесообразно применять при скоростях потока ниже 500 л/мин. Имеются также устройства для определения скорости ламинарных потоков, которые измеряют перепады давления на матричном устройстве, разделяющем общий поток на множество параллельных капиллярных потоков. Важность определения скоростей газовых потоков определяется тем об- стоятельством, что эти параметры часто применяются при рас- четах материальных балансов (разд. 10.5). Скорость потока жидкостей можно контролировать электро- магнитными расходомерами, но эти приборы не находят широко- го применения из-за их высокой стоимости. Иногда, особенно в лабораторных установках, необходимую скорость потока жидкости устанавливают с помощью дозиметра или тщательно откалиброванного насоса. В другом варианте жидкость вводят в реактор порциями строго определенного объема или массы. Длительный контроль скорости поступающего в реактор потока можно осуществлять посредством непрерывного взвешивания заполненного реактора с помощью тензометра (в случае реак- торов объемом более 250 л) или весов (в случае реакторов меньшего объема). Для контроля за количеством находящейся
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 173 в реакторе жидкой фазы мож- но также использовать датчик уровня жидкости, измеряю- щий электрическую емкость на заданном уровне в реакто- ре. Аналогичные зонды, дейст- вие которых основано на из- мерении электрической емкос- ти или электропроводности, можно применять и для конт- роля пенообразования на по- верхности находящейся в ре- акторе жидкой фазы. Иногда измерение осуществляют в циркуляционной линии (см. ниже), которая служит для отделения продукта процесса, рециркуляции клеток, для теп- ло- или газообмена (см. гл. 9 и 14). В таких случаях опре- деление скорости потока жид- кой фазы могут затруднять суспендированные нераствори- мые вещества, а также не- постоянство реологических свойств бульона. 10.1.2. Детекторы для определения химического состава среды В настоящее время разра- ботаны электроды для опреде- ления pH, окислительно-вос- становительного потенциала (Ен), парциального давления Электролит солевого мостика Отверстие для ввода электролита сравнения ---Навинчива- ющийся колпачок Герметичные [J-g пробки Отверстие для ввода электролита солевого мостика Электролит сравнения Элемент сравнения -Диафрагма - Стартовый элемент Мембрана растворенного кислорода и СОг, которые можно подвер- гать неоднократной стерили- зации паром на месте уста- новки. Чаще других применя- ют pH-электроды, отличаю- РИС. 10.2. Комбинированный элект- род типа Ingold 465 для определения pH, выдерживающий стерилизацию паром в автоклаве. (С любезного разрешения Ingold Electrodes Inc.) щиеся высокой надежностью; обычно в качестве рН-электрода применяют стеклянный мембранный электрод. На рис. 10.2 изображено устройство pH-электрода, предназначенного для
174 Глава 10 контроля процесса стерилизации в автоклаве. Электроды, сте- рилизуемые на месте установки, должны быть заключены в че- хол, защищающий их от повышения давления. Окислительно- восстановительный потенциал среды можно измерять платино- вым электродом в сочетании с электродом сравнения. Имеются и комбинированные зонды для определения pH и окислитель- но-восстановительного потенциала. Неоднократно показано, что pH влияет на кинетику биохимических превращений, поэтому необходимость измерения pH очевидна. Напротив, интерпретация результатов определения окислительно-восстановительных по- тенциалов и выяснение взаимосвязи между окислительно-вос- становительным потенциалом и активностью клеток могут вы- зывать затруднения. Одной из перспективных областей приме- нения электродов для измерения окислительно-восстановитель- ных потенциалов является определение низких концентраций кислорода (<1 млн-1) в анаэробных микробиологических про- цессах (—450 mB<£\<—150 мВ), когда скорость образования продукта может быть очень чувствительной к изменению Eh. Для определения концентрации растворенного кислорода применяют гальванические (потенциометрические) или поляро- графические (амперометрические или электрод Кларка) зонды. По сути дела, эти электроды измеряют не концентрацию раство- ренного кислорода, а его парциальное давление (или актив- ность). И в первом, и во втором зонде собственно электрод обычно отделен от среды мембраной (рис. 10.3), а на поверхно- сти катода осуществляется восстановление кислорода Катод: Pt ‘ЛОг+НгО+ге- 2ОН" (10.1 > Реакция на аноде в гальваническом электроде: Анод (гальванический электрод): РЬ РЬ2++2е- (Ю.2> Катод и анод образуют гальванический элемент, напряжение которого зависит от количества кислорода, достигающего по- верхности электрода. В кислородном электроде полярографиче- ского типа на катоде также происходит реакция (10.1), а на аноде осуществляется другой процесс Анод (полярографический): Ag+CP —* AgCl + e- (Ю.3> Между катодом и анодом устанавливают постоянное напряже- ние и измеряют силу тока, которая зависит от притока кислоро- да к катоду. Недостатком как первого, так и второго электрода является дрейф сигнала (силы тока или напряжения), обуслов- ленный накоплением гидроксильных ионов или ионов металла»
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 175 отверстие Анод Изоляция - Кольцо Платиновая проволока Платиновый катод Раствор -электролита РИС. 10.3. Устройство и основные элементы электрохимического зонда для определения парциального давления растворенного кислорода. (Воспроизве- дено с разрешения из работы: Wang N. S., Stephanopoulos G., Computer Appli- cation to Fermentation Processes, CRC Critical Reviews in Biotechnology, vol. 2, p. 1. © CRC Press, Inc., 1974.) Мембрана или истощением Cl-. Дрейфу способствует также загрязнение наружной поверхности мембраны. В стационарном состоянии приток кислорода к катоду зави- сит от ряда процессов переноса, включая перенос кислорода из жидкой фазы к наружной поверхности мембраны, диффузию через мембрану и, наконец, диффузию через раствор электро- лита к поверхности катода, где реакция происходит практически мгновенно. Если общая скорость переноса, а следовательно, и концентрация кислорода вблизи катода лимитируется первой стадией, то сигнал электрода будет зависеть от свойств жидкой фазы (например, от ее вязкости) и локальных гидродинамиче- ских условий вблизи электрода. По этой причине, в частности, рекомендовалось, чтобы скорость движения жидкости вблизи
176 Глава 10 полярографического электрода была не менее 0,55 м/с. Чув- ствительность сигнала электрода к переносу через наружный граничный слой можно снизить за счет применения менее про- ницаемой мембраны. (Почему?) Однако в этом случае увели- чивается запаздывание отклика электрода на изменение пар- циального давления кислорода, которое в случае мембранных электродов и без того довольно велико (10—100 с). В то же время, как показано в приведенном ниже примере, такие элект- роды можно применять и для изучения процессов массопереноса в биореакторах в переходном состоянии, если при анализе данных учитывать диффузию через мембрану электрода. Пример 10.1. Электрохимическое определение kia. В аэрируемом с посто- янной скоростью реакторе периодического или непрерывного действия уста- навливают кислородный электрод. После того, как отклик электрода достиг- нет некоторого постоянного уровня, ток кислорода резко прерывают и сразу же с такой же скоростью начинают пропускать азот, который постепенно вы- тесняет кислород из среды. В этом случае изменение напряжения на электро- де во времени можно описать уравнением [11] Е (О = Ео т1/2 ехр ( — р/) sin т1/2 СО П = 1 ( — l)rt ехр ( — £)o„t / L?) 1 — п2л2/т (10П1.1> Здесь T = pL2/S5o2; E(t) —напряжение на электроде в момент времени Ео — напряжение на электроде в нулевое время; Fs— скорость потока газа; V — объем жидкости в реакторе; М — константа в уравнении закона Генри; L — толщина мембраны электрода; —коэффициент диффузии О2 через мем- брану электрода; 2 = Pm/L, где Рт— проницаемость мембраны. 1 1 VRT — = постоянная времени системы (реактора) — —----+ ~ ~~ (10П1.2) Р kia FgM Если постоянная времени системы велика (т. е. kia мало), то величину р опре- деляют по напряжению на электроде при времени, значительно превышающем время отклика электрода; в этом случае вклад второго слагаемого в правой части уравнения (10П1.1) пренебрежимо мал. Большие значения kia (50— 500 ч-1) Вернан и Уилке [11] предложили определять по наклону касатель- ной к кривой зависимости отклика электрода от времени в точке ее перегиба (где вторая производная Е по t равна нулю). Как было показано, этот метод обеспечивает такую же точность результатов, как и подбор эмпирической кривой с помощью вычислительных машин во всем диапазоне E(t). При непостоянном времени релаксации электрода обратное время релаксации мож- но определить по графику зависимости этого параметра от наклона касатель- ной к кривой E(f) в точке перегиба. Далее искомую величину kia находят в три этапа: 1. Определяют наклон касательной к кривой зависимости отклика Е от t в точке перегиба (рис. 10П1.1). 2. По обобщенной графической зависимости, описываемой уравнением (10П1.2), (рис. 10П1.2), определяют [} для данных величин наклона каса- тельной к кривой и постоянной времени электрода.
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 177 3. По приведенному выше определению постоянной времени системы (1/$) находят kia. Очевидно, что полезность этого метода, особенно в случае больших величин kia, определяется той точностью, с которой может быть найден отклик электрода.- При высоких концентрациях растворенных веществ могут изменяться рас- творимость кислорода (табл. 8.1), коэффициент диффузии кислорода и харак- теристики самого электрода, в том числе и его отклик. Для того чтобы учесть- каждый из этих факторов, необходима калибровка электрода с помощью неза- висимых методов определения концентрации растворенного кислорода. Времfi от начала ступенчатого изменения условий, с РИС. 10П1.1. Наклон кривой в точке- перегиба определяют по графику за- висимости отклика электрода на за- мену барботируемого кислородсодер- жащего газа азотом. [Воспроизведе- но из статьи: Wernan W. С., Wil- ke С. R., New iMethod for Evaluation of Dissolved Oxygen Response for kLa Determination; Biotech. Bioeng., 15T 571 (1973).] Выдерживающие стерилизацию паром электрохимические детекторы для определения парциального давления растворен- ного СО2 применяются сравнительно недавно. В таких детекто- рах, выпускаемых, в частности, компанией Ingold Electrodes Inc., определение рсо2 основано на измерении pH стандартного раствора бикарбоната, отделенного от изучаемой жидкости газо- проницаемой мембраной. Детекторы калибруют посредством замены раствора бикарбоната на стандартный буферный раст- вор с последующим определением pH. В другом методе неавтономного определения летучих компо- нентов среды и растворенных газов в изучаемую жидкость погружают трубку известной длины, стенки которой проницаемы для определяемого компонента системы. Через трубку непре- рывно пропускают поток газа-носителя, который уносит прони- кающие внутрь трубки компоненты в газоанализатор (см. следующий раздел), где они и определяются. Недостатком такого подхода является существенное запаздывание (2— 10мин) отклика анализатора, что делает его мало пригодным для контроля быстрых изменений концентраций. Для определения специфических компонентов жидкой фазы разработан ряд биодетекторов (биосенсоров). Принцип действия 12—74 6
178 Глава 10 РИС. 10П1.2. Эти графики позволяют определить величину по наклону кри- вой в точке перегиба и параметрам транспорта через мембрану. Затем по уравнению (10П1.2) находят kia. [Из статьи: Wernan W. С., Wilke С. R., New Method for Evaluation of Dissolved Oxygen Response for kLa Determination; Biotech. Bioeng., 15, 571 (1973).] биосенсоров заключается в определении с помощью того или иного аналитического устройства конкретного продукта реакции, катализируемой иммобилизованными ферментом или клетками. Примеры сочетания катализируемых ферментами реакций с электрохимическими детекторами мы уже рассматривали в разд. 4.3.3. Широко изучаются также ферментные терморези- сторы, в которых с помощью калориметра определяется количество теплоты, выделяющейся в процессе катализируемой ферментом реакции. В табл. 10.1 перечислены некоторые опре- делявшиеся этим методом соединения и соответствующие
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 17? Таблица 10.1. Примеры применения ферментных терморезисторов в аналитической химии3 Определяемое соединение Иммобилизованный фермент Диапазон опреде- ляемых концентра- ций или предел обнаружения, ммоль/л Аскорбиновая кислота Оксидаза аскорбиновой кисло- ты 0,05—0,6 Альбумин (антиген) Иммобилизованные антитела и связанный с ферментом ан- тиген 10-ю АТР Апираза или гексокиназа 1—8 Целлобиоза ^-Глюкозидаза, глюкозооксида- за и каталаза 0,05—5 Цефалоспорин Цефалоспориназа 0,005—10 Холестерин Холестерпиоксидаза 0,03—0,15 Сложные эфиры холе- Холестеринэстераза и холесте- 0,03—0,15 стерина риноксидаза Креатинин Креатининиминогидролаза 0,01—10 Этанол Алкогольоксидаза 0,01—1 Галактоза Г алактозооксидаза 0,01—1 Гентамицин (антиген) Иммобилизованные антитела и связанный с ферментом антиген 0,1 мкг/мл Глюкоза Глюкозооксидаза и каталаза 0,002—0,8 Ионы тяжелых металлов (например, РЬ2+) Уреаза 10"в Инсектициды (например, паратион) Ацетилхолинэстераза 5-Ю-3 Инсулин (антиген) Иммобилизованные антитела и связанный с ферментом антиген 0,1—1,0 ед./мл Лактат Лактат-2-монооксигеназа 0,01 — 1 Лактоза Лактаза, глюкозооксидаза и каталаза 0,05—10 Щавелевая кислота Оксалатоксидаза 0,005—0,5 Пенициллин G Пенициллиназа 0,01—500 Фенол (субстрат) Тирозиназа 0,01—1 Сахароза Инвертаза 0,05—100 Триглицериды Липаза, липопротеин Уреаза 0,1—5 Мочевина 0,01—500 Мочевая кислота Уриказа 0,5—4 а По данным, приведенным в работе: Danielsson В., Mosbach, К., The Prospects for Enzyme-Coupled Probes in Fermentation, in Computer Application in Fermentation Techno- logy. P- 137, Society of Chemical Industry, London, 1982. ферменты. Иммобилизованные ферменты можно применять и в биосенсорах других типов, например в таких, в которых продук- ты реакции (водород) изменяют электронную проводимость полупроводниковых устройств (кремниевых кристаллов, на ко- торые нанесен слой SiO2 и пленка Pd). 12
180 Глава 10 Сферу применения биосенсоров можно существенно расши- рить за счет использования различных биохимических превраще- ний, в том числе многостадийных и разветвленных реакций, в результате которых образуется детектируемое вещество. Во многих случаях с помощью иммобилизованных клеток анализи- руемое соединение можно превратить в более подходящее для непосредственного определения соединение. В основу разработ- ки и применения биосенсоров с иммобилизованными клетками была положена дыхательная активность интактных иммобили- Таблица 10.2. Микробиологические детекторы для определения компонентов жидкой фазы Определяе- мое соеди- нение Микроорганизм ,, Принцип из- Метод иммобилизации мерения Детектирую- щее устрой- ство Уксусная Trichosporon Связывание с пори- Одновремен- Кислород- кислота, brassicae стой ацетилцеллюло- ное погло- ный элект- этанол зой щение О2 род Аммиак Nitrosomonas Удерживание газо- Одновремен- Кислород- sp., Nitrobac- проницаемой мембра- ное погло- ный элект- ter sp. ной щение О2 род Цефало- Citrobacter Включение в колла- Образова- рН-Элект- спорин freundii геновую мембрану ние Н+ [род Муравьи- Clostridium Включение в агар на Образова- Топливный пая кислота butyricum ацетилцеллюлозном ние Н2 электрод фильтрате Глюкоза Pseudomonas Включение в колла- Одновре- Кислород- fluorescens геновую мембрану менное пог- ный элект- лощение О2 род Глутамино- Escherichia coli Удерживание целло- Образова- СО2-элект- вая кислота фановой мембраной ние СО2 [род зованных клеток (определение с помощью кислородного элект- рода), а также образование или поглощение интактными клетками электроактивных метаболитов (определение с помо- щью топливного электрода, pH- или СО2-электродов). В табл. 10.2 приведены свойства ряда биосенсоров на основе иммобили- зованных клеток; подробнее подобные аналитические устройства описаны в работе [12]. Шульц и сотрудники [13] разработали и описали другой интересный и перспективный подход к определению индивиду- альных метаболитов, основанный на применении специфичных «аффинных сенсоров». Для реализации этого подхода необходи- мы агент, специфично связывающий определяемое соединение; меченое соединение, конкурентно связываемое тем же самым агентом; метод выделения связывающего агента из анализируе- мого раствора. Так, например, для определения глюкозы с по- мощью иммобилизованного конкопавалина А (Con-А) [белка
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 181 из канавалии мечевидной (растения семейства бобовых), селек- тивно связывающего сахара] создан флуоресцентный детектор на основе волоконной оптики, в котором Con-А иммобилизован на внутренней поверхности аналитической ячейки. Последняя отделена от анализируемого раствора диализационной мембра- ной, проницаемой для глюкозы, и содержит также декстран, меченный флуорохромом — флуоресцеинизотиоцианатом (ФИЦ). Мембрана непроницаема для ФИЦ-декстрана, который конкури- рует с глюкозой за связывание с Соп-А: Глюкоза+Соп-А Соп-А-глюкоза ФИЦ-декстран+Con-А Соп-А-ФИЦ-декстран Таким образом, количество несвязанного ФИЦ-декстрана, а следовательно, и интенсивность флуоресценции зависят от кон- центрации глюкозы в растворе. Основной недостаток этого метода обусловлен возможностью взаимодействия связываю- щего агента с другими сахарами (например, с мальтозой, са- харозой и фруктозой в случае Con-А), но принцип этого инте- ресного подхода в силу его общности, безусловно, заслуживает дальнейшего изучения. При использовании любых сенсоров на основе клеток, фер- ментов или других объектов биологического происхождения необходимо принимать во внимание также возможность инактивации биосенсора в ходе стерилизации реактора. Для решения этой проблемы были сконструированы механические устройства, позволяющие вводить биосенсор в реактор и выво- дить из него в асептических условиях. Как и в случае других датчиков, сигнал которых зависит от транспорта определяемого соединения через мембрану, загрязнение мембраны биосенсоров клетками или иными компонентами среды и увеличение сопро- тивления внешнему массопереносу может вызвать дрейф сиг- нала или изменение калибровки биосенсора. 10.1.3 . Газовый анализ Концентрация СО2 в отходящих газах биореактора, содер- жащего культуру клеток, связана с дыхательной или иной ферментативной активностью клеток. Неудивительно, что этот параметр широко и успешно применяется для контроля и регу- лирования биореакторов. Концентрацию СОг в отходящих газах биореактора чаще всего определяют с помощью инфракрасного спектрофотометра. Для предотвращения повреждений стекол ячейки анализируемый газ до поступления в спектрофотометр необходимо высушить. Концентрацию СОг в потоке газа можно также определять по теплопроводности, методом газовой хрома- тографии или масс-спектрометрии.
182 Глава 10 Парциальное давление кислорода в газовом потоке обычно измеряют с помощью парамагнитного анализатора. Приборы этого типа также требуют предварительного высушивания и тщательного регулирования скорости газового потока; только в этом случае обеспечиваются минимальный дрейф и достаточ- ная надежность результатов. Парамагнитные анализаторы,, кроме того, очень чувствительны даже к небольшим колебани- ям общего атмосферного давления, поэтому необходим одно- временный контроль барометрического давления, чтобы внести, соответствующие поправки в результаты анализа на кислород. В силу дрейфа показаний парамагнитных анализаторов их применение в микробиологических процессах часто требует повторной калибровки в ходе процесса. С помощью газовой хроматографии можно определять не- сколько компонентов отходящих газов: Ог, СО2, СН4 (образу- ющегося, например, в анаэробных процессах) и Н2 (выделяемо- го, например, культурами Hydrogenomonas). Этим методом можно также определять парциальное давление летучих ком- понентов газовой фазы — этанола, ацетальдегида и карбоновых кислот. Таким образом, газовая хроматография дает ценную информацию о ходе микробиологического процесса в целом, а также о концентрациях перечисленных выше веществ в жид- кой фазе. Применению газовой хроматографии для контроля процессов в нестационарном состоянии препятствует периодиче- ский характер измерений, поскольку интервал между двумя последовательными измерениями составляет примерно 15 мин. Для контроля состава газового потока в последнее время все чаще применяют масс-спектрометрический метод. Появление сравнительно недорогих серийных масс-спектрометров позволи- ло расширить область применения этих приборов в исследова- тельских работах, а выпуск надежных, устойчивых к внешним воздействиям промышленных масс-спектрометров обусловил целесообразность их использования в промышленности. Масс- спектрометры выгодно отличаются малым временем отклика (менее 1 мин), высокой чувствительностью (предел обнаруже- ния около 10-5 М), способностью определять несколько компо- нентов одновременно, линейной зависимостью отклика от концентрации в достаточно широком диапазоне и очень малым дрейфом калибровки. Ввиду высокой стоимости масс-спектро- метров целесообразно обслуживать одним прибором несколько биореакторов с помощью управляемого ЭВМ переключающего устройства, которое последовательно вводит в масс-спектрометр потоки из различных реакторов (рис. 10.4). Как показано на рис. 10.4, с помощью этой же ЭВМ можно управлять и процес- сом (здесь показаны три реактора, но практически один масс- спектрометр может обслуживать до 30 реакторов).
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 183 РИС. 10.4. Схема управляемой ЭВМ системы отбора проб при использовании масс-спектрометра для контроля процессов в нескольких реакторах. (Воспро- изведено с разрешения из работы: Buckland R. С., Fastert Н.г Analysis of Fermentation Exhaust Gas Using a Mass Spectrometer, in Computer Applications in Fermentation Technology, p. 119, Society of Chemical Industry, London, 1982.) Часто в анализах принимают, что поступающий в систему воздух имеет стандартный состав (20,91% Ог, 0,03% СО2), однако иногда в целях повышения надежности и достоверности результатов измерений целесообразно определять состав и поступающего в реактор воздуха, включив, как это показано на рис. 10.4, его поток в распределяющее устройство. Конечно, такое комплексное и многостороннее использование аналити- ческих приборов с помощью распределяющих устройств выгод- но не только в случае масс-спектрометров. 10.2. Детекторы для непрерывного контроля характеристик популяции клеток К сожалению, в настоящее время имеется очень ограничен- ное число приборов, предназначенных для непрерывного конт- роля за поведением популяции клеток в биореакторе. Чаще
184 Глава 10 всего возникает потребность в определении содержания или концентрации биомассы или, что еще важнее, концентрации активной биомассы. Существует несколько принципиально- возможных подходов к определению этих параметров, однако надежный и достаточно универсальный метод, применимый к самым различным организмам и средам, пока что не разрабо- тан. Широко изучались оптические методы, основанные на изме- рении поглощения света (спектрофотометрические методы) или рассеяния света (нефелометрические методы, определение- коэффициента отражения). Можно, например, непрерывно про- Ввод _------/ пробы *------- D d Трубка, внутри, кюветы Вывод пробы Дистиллированная вода РИС. 10.5. Схема проточной кюветы с внутренним разведением, для чего внут- ри кюветы имеется трубка, заполненная дистиллированной водой. При диа- метре кюветы D=12 мм и диаметре трубки d=8 мм это устройство обеспечи- вает линейную зависимость оптической плотности при 600 нм от концентрации1 клеток, даже если величина последней превышает 1,8 г/л. [Из статьи: Lee С., Lim Н., New Device of Continuously Monitoring the Optical Density of Con- centrated Microbial Cultures; Biotech. Bioeng., 22, 636 (1980).] пускать поток культуры через ячейку спектрофотометра, но в этом случае возникают затруднения, связанные с нелинейным характером зависимости оптической плотности от концентраций биомассы, если последняя превышает 0,5 г/л или если оптиче- ская плотность превышает 0,5. Следовательно, более концент- рированные культуры можно изучать, разбавив изучаемую пробу или уменьшив длину пути светового луча. На рис. 10.5' приведена схема проточной кюветы, разработанной Лимом и сотрудниками; такая конструкция кюветы хорошо зарекомендо- вала себя в ряде лабораторий. Предлагались также принципи- ально иные аналитические устройства, в которых оптическая плотность культуры определяется с помощью зондов, погружае- мых в изучаемую культуральную жидкость. Единственным методом, пригодным для непрерывного кон- троля биохимического или метаболического состояния популя- ции клеток непосредственно в реакторе, является флуорометрия. В этом методе культуральную жидкость облучают ультрафиоле- товым светом с длиной волны 366 нм. Это излучение вызывает флуоресценцию восстановленных пиридиновых нуклеотидов (NADH и NADPH), причем максимальная интенсивность
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 185 •флуоресценции наблюдается приблизительно при 460 нм. Флуоресценцию культуры измеряют соответствующим детекто- ром, например фотодиодом или фотоумножителем. Первоначаль- но такие измерения проводили через кварцевые окна, вмонти- рованные в стенки лабораторных ферментеров. Создание флуо- ресцентных зондов, которые могут быть установлены в реакто- рах так же, как и электроды, должно существенно расширить •область применения флуорометрических методов в биотехноло- гии (рис. 10.6). Охлаждающее К самописцу Подвод устройство и ЭВМ электроэнергии РИС. 10.6. Принципиальная схема зонда для непосредственного изучения флуоресценции культуральной жидкости. [Воспроизведено с разрешения из работы: Beyeler W„ Einsele A., Fiechter A., On-Line Measurements of Culture Fluorescence: Method and Application, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 13, 10 (1981).] A — усилители; LA — источник УФ-излучения; D — фотоприемник; Fj — фильтр, пропускающий коротковолновое УФ-излучение (336 нм); F2 — фильтр, пропускающий излучение с длиной волны 450 нм; Li-6 — линзы; СС — градуировочная кювета; М — дихроичное зеркало, пропускающее излучение с длиной волны 460 нм и отражающее излучение с длиной волны 366 нм. Интенсивность флуоресценции зависит от плотности популя- ции клеток, среднего состояния метаболической активности и эмиссии флуоресценции, а также от поглощения света средой. Эксперименты в свободной от нерастворимых частиц среде показали, что изучение флуоресценции культуры дает полезную информацию о концентрации биомассы, переносе кислорода, а также о времени выравнивания концентраций, истощении субстрата и изменении характера метаболизма. Так, Айнзеле й сотрудники изучали динамику перемешивания жидкости в ферментере рабочим объемом 40 л с механическим перемеши-
186 Глава 10 ванием (при скорости вращения мешалки 200 об/мин) в срав- нении с динамикой перемешивания в том же реакторе при. условии, что в нем находится культура дрожжевых клеток в глюкозной среде. В первом эксперименте в раствор, содержащий 0,05 М H2SO4, в импульсном режиме вводили порцию хинина РИС. 10.7. Изменение флуоресценции системы после импульсного добавления раствора хинина в 0,5 М H2SO4 (результаты характеризуют процесс выравни- вания концентрации растворенного вещества) (а) и после добавления глюко- зы к культуре дрожжей (результаты характеризуют как процесс выравнива- ния концентраций, как и утилизацию глюкозы клетками) (б). [Воспроизведе- но с разрешения из статьи: Einsele A., Ristroph D. L., Humphrey А. Е., Mixing Times and Glucose Uptake Measured with a Fluorometer; Biotech. Bioeng., 20, 1487 (1978).] и затем измеряли флуоресценцию (хинин имеет примерно такой же спектр флуоресценции, что и NADH). Результаты этого эксперимента представлены на рис. 10.7, а, где виден колеба- тельный характер изменений концентрации индикатора (хини- на), отражающий структуру циркуляции жидкости в реакторе и показывающий, что новое стационарное состояние в реакторе достигается только после довольно продолжительного переход- ного периода. На рис 10.7, б представлены результаты изуче-
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 187 ния флуоресценции восстановленных пиридиновых нуклеотидов в культуре дрожжей после введения глюкозы (при t=0). Во втором эксперименте время отклика системы больше, что свидетельствует о существенном динамическом запаздывании процесса утилизации глюкозы клетками. О необходимости учета подобных эффектов при операциях масштабного перехода мы уже упоминали в разд. 9.3.4. о 4,00 ^.3,50 S 3,00 с: В 2,50 С is 2,00 Ч У 1,50 § 1.00 ^4,00 3,50 м ts 3,00 § § 2,50 Е "> 2,00 Ч § 1,50 Б 1,00 ? °’50 В 2,50 £ 2,00 § S’ 1,50 i 1,00 g 0,50 § s 0 e-e® ^-1,00 -1,50 14,00 * 13,00 Y ^12,00 - §11,00 g 10,00 Is,00 is 8,00 ~ & 7,00 - & 6,00'— 23 24 25 26 27 28 Время от начала процесса, ч v 1; л 2; a 3 ; о 4 РИС. 10.8. Взаимосвязь между флуоресценцией культуры (4), концентрацией этанола (2), дыхательным коэффициентом (3) и концентрацией ацетата (1) в культуре С. utilis при периодическом добавлении субстрата (этанола). [Вос- произведено с разрешения из статьи: Watteeuw С. М., Armiger W. В., Ris- troph D. L., Humphrey A. E., Production of Single Cell Protein from Ethanol by a Fed-Batch Process; Biotech. Bioeng., 21, 1221 (1979).] Другой областью применения флуорометрического метода в биотехнологии является контроль метаболического состоя- ния клеток в культуре, отражающего ход ферментации. При экспериментальном изучении роста культуры Candida utilis на этаноле в периодическом процессе с добавлением субстрата с помощью флуорометрии определяли время истощения субст- рата (этанола) и контролировали добавление свежих порций этанола к системе. На рис. 10.8 представлены зависимости флу- оресценции культуры, дыхательного коэффициента и концентра- ции этанола от времени в этом процессе. Кружками выделена кривая флуоресценции культуры, найденная при непрерывном контроле этого параметра. В представленной на этом рисунке части эксперимента в систему импульсно вводили 1,85, 1,85 и 3 г/л этанола спустя 23, 24,5 и 26,15 ч после начала процесса. Очевидно, что истощение субстрата (этанола) сопровождается снижением интенсивности флуоресценции.
188 Глава 10 На результаты непосредственного измерения оптических свойств культур клеток может влиять ряд факторов. Так, по- верхности оптических приборов, находящиеся в контакте с культуральной жидкостью, могут загрязняться клетками или компонентами среды. Проведению измерений в многофазных системах могут мешать газовые пузырьки или частицы нераст- воримых веществ. Что касается самого флуорометрического метода, то ряд компонентов среды или продуктов процесса мо- жет флуоресцировать при длинах волн, используемых для контроля состояния клеток, что, очевидно, затрудняет интерпре- тацию результатов измерений. Тем не менее надо полагать, что флуорометрические и другие оптические методы в будущем найдут гораздо более широкое применение, поскольку концент- рация биомассы и метаболическая активность клеток являются ключевыми параметрами в контроле, регулировании и оптими- зации микробиологических процессов. В следующем разделе рассматриваются некоторые автоном- ные, периодические методы изучения поведения клеток и свойств среды, играющих важную роль в биотехнологических процес- сах. Следует отметить, что между непрерывными методами мониторинга (осуществляемыми обычно с помощью встроен- ных в реактор или другой аппарат детекторов) и периодически- ми, автономными методами измерения нет четкой границы. Если время между последовательными анализами с помощью автономного аналитического прибора меньше характерного масштаба времени изменений определяемого параметра, то периодический отбор проб с некоторым запаздыванием во вре- мени и их последующий анализ дадут точно такую же инфор- мацию, как и непрерывные измерения изучаемой системы в процессе работы (в реальном масштабе времени). Поскольку масштабы времени изменений свойств ферментов, культур кле- ток и жидкой фазы могут варьировать от нескольких минут до нескольких часов и даже дней, то некоторые автономные мето- ды анализа с предварительным отбором проб дают ценную для контроля и регулирования процесса информацию. 10.3. Автономные методы анализа В этом разделе мы рассмотрим принципы работы некоторых аналитических методов определения свойств культуральных жидкостей, биокатализаторов и биосорбентов. Вообще говоря, для этой цели можно использовать любые методы аналитиче- ской химии, спектроскопии и биохимии; очевидно, что в настоя- щем пособии не представляется возможным дать сколько-ни- будь полное описание этой темы. Поэтому мы сосредоточим внимание на некоторых новых методах определения тех свойств
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 183^ клеток, которые наиболее важны для контроля микробиологиче- ских процессов и управления ими, а также рассмотрим другие- наиболее часто применяемые методы анализа. 10.3.1. Определение свойств среды Первая стадия обработки пробы, отобранной из биореактора или аппарата, где происходит разделение продуктов, обычно- заключается в отделении твердой фазы (клеток или любых, других нерастворимых компонентов) от жидкой путем фильтро- вания или центрифугирования. Применение затем той или иной конкретной аналитической методики зависит от природы изу- чаемого материала и цели анализа. Действительно, методы, анализа, пригодные для изучения синтетической среды, могут оказаться неточными или вообще неприменимыми в случае- сложной среды неопределенного состава, которая может содер- жать мешающие ходу анализа вещества. Из параметров находящейся в биореакторе системы обычно- наибольший интерес представляют концентрации субстратов ц других компонентов, влияющих на скорости реакций, а также концентрации продуктов реакции и ингибиторов. В микробио- логических процессах часто желательно также определять, содержание источников углерода и азота, а иногда и ряда ио- нов, например ионов магния или фосфатного иона. По свойствам: и степени сложности химической структуры продукты жизнеде- ятельности клеток могут варьировать в очень широких пределах,, например, от этанола до гораздо более сложных соединений типа пенициллина и биологических макромолекулярных ве- ществ типа ферментов и других белков. Соответственно и- методы анализа продуктов микробиологических процессов очень, разнообразны. Для количественного определения компонентов жидкой фа- зы обычно применяют методы, основанные на измерении пока- зателя преломления с помощью рефрактометрических детекто- ров, поглощения света при определенной длине волны с помо- щью спектрофотометра или флуоресценции (после возбуждения, при одной длине волны и последующей эмиссии при больших: длинах волн) с помощью спектрофлуорометра. Сахара, напри- мер, практически не поглощают свет и не флуоресцируют, по- влияют на показатель преломления раствора. С другой стороны,, белки и нуклеиновые кислоты удобно определять спектрофото- метрическим и спектрофлуорометрическим методами. Послед- ний метод обычно более чувствителен и позволяет определять более низкие концентрации веществ, однако спектрофлуоро- метры намного дороже спектрофотометров, поэтому спектро- фотометрия остается одним из самых распространенных и попу-
190 Глава 10 лярных методов. Чтобы устранить помехи со стороны других растворенных веществ, часто приходится прибегать к операциям концентрирования или отделения определяемого соединения от других растворенных веществ. Иногда отделение удается осу- ществить путем химической обработки, в результате которой мешающие вещества разрушаются или осаждаются. Так, на- пример, РНК экстрагируют из лизатов клеток перхлорной кислотой НС1О4 при 37 °C и определяют с помощью орсина (специфического реагента на рибозу). Мешающие определению сахара отделяются в процессе экстракции. В ходе изучения химического состава среды обычно приме- няют и более тонкие методы разделения близких по химической природе веществ, например хроматографические. Хроматогра- фические методы разделения, подробнее рассматриваемые в разд. 11.4, основаны на селективном удерживании некоторых соединений неподвижной фазой, находящейся в колонке. Селек- тивность удерживания обеспечивается предпочтительным срод- ством по отношению к неподвижной фазе одних веществ по сравнению с другими. Так, при анализе смесей сахаров (напри- мер, мальтозы и глюкозы) применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в котором разделение достигается за счет различного сродства этих двух углеводов к первичным аминогруппам на поверхности носителя (непод- вижной фазы), содержащегося в обычной выпускаемой серийно колонке. Различные сахара вымываются с колонки в разное время; их можно обнаружить и определить количественно с по- мощью рефрактометрического детектора. Метод ВЭЖХ приме- няется и для определения многих других компонентов среды. Помимо ВЭЖХ для разделения смесей близких веществ ис- пользуют ионообменную и эксклюзионную хроматографию (в отличие от ВЭЖХ в этих хроматографических методах разделе- ние осуществляется при атмосферном или слегка повышенном давлении) с последующим количественным определением ин- дивидуальных компонентов среды. Как мы уже отмечали в гл. 4, полезным методическим прие- мом органического анализа является селективное превращение определяемых соединений в производные, легко поддающиеся непосредственному определению. На этом принципе основан один из стандартных лабораторных методов определения глю- козы, в котором ферменты глюкозооксидаза и пероксидаза селективно превращают глюкозу в окрашенное соединение, концентрацию которого определяют спектрофотометрически. глюкозооксидаза Глюкоза+2Н2О----------------- глюконовая кислота+2Н2О2 пероксидаза Н2О2+о-дианизидин ----------* продукт окисления о-дианизидииа (бесцветный) (коричневый)
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 191 В последние годы для определения ряда биологически важ- ных ионов широко применяют ионоселективные электроды. Так, азотсодержащие клеточные вещества можно определять с по- мощью КНз-электрода непосредственно (NH3, а после соответ- ствующего изменения pH также 1NH4+) после восстановления (NO2~, NO3“) или после обработки ферментами (аминокислоты, мочевина). Разработаны ионоселективные электроды для опре- деления многих других ионов, влияющих на биохимические структуры и их функции, в том числе К+, .Na+, Са2+. Иногда концентрацию того или иного вещества в растворе определяют путем измерения его биологической активности. Именно таким способом обычно определяют, например, кон- центрацию пенициллина в культуральной жидкости при произ- водстве этого антибиотика. Здесь мерой активности пеницилли- на в растворе является размер зоны погибших бактерий, окружающей пористый диск, пропитанный изучаемым раство- ром. Содержание ферментов в подавляющем большинстве слу- чаев определяют путем измерения их активности. Для этой цели раствор пробы обрабатывают стандартным субстратом в стан- дартных условиях с последующим измерением скорости исчезновения субстрата или образования продукта реакции; соответствующие измерения часто осуществляют спектрофото- метрическим или спектрофлуорометрическим методами. Другой подход к анализу биологически важных веществ осно- ван на их переведении в газовую фазу и последующем опреде- лении. Глюкозу, например, превращают в триметилсилильное (ТМС) производное, которое затем переводят в газовую фазу в системе ввода газового хроматографа, а потом определяют с помощью пламенно-ионизационного детектора. Понятно, что таким же путем без модификации изучаемых веществ можно определять содержание в культуральной жидкости относительно летучих компонентов, например этанола, ацетона и бутанола. В аналитических лабораториях при пилотных и крупномас- штабных промышленных ферментерах часто имеется один или несколько автоанализаторов для проведения мокрого химиче- ского анализа, где автоматически осуществляются операции экстракции, разведения и определения нескольких веществ. Время выполнения анализов составляет 10—30 мин, что во многих случаях вполне достаточно для успешного контроля за ходом процессов в биореакторе. 10.3.2. Анализ состава популяции клеток Методы анализа популяций клеток можно классифициро- вать примерно таким же образом, как и математические моде- ли, описывающие кинетику роста культур клеток (вспомните
•192 Глава 10 тл. 7 и рис. 7.2). Большинство классических методов биохимии дает усредненную по всей популяции и, следовательно, несегре- тированную информацию. Такие методы можно распространить на очень большое число компонентов клетки вплоть до отдель- ных белков, молекул РНК и ДНК и даже последовательностей -их фрагментов. Если же экспериментальные данные относятся к одной клетке или могут дать информацию о состоянии отдель- ных клеток, так что в конечном счет удается получить сведения о распределении свойств отдельных клеток, то такие данные можно назвать сегрегированными. Прежде всего мы обсудим методы, дающие информацию не- •оегрегированного типа. К наиболее грубым результатам таких методов после данных по определению массовой или численной плотности популяции относятся данные об элементном составе клеток, включая содержание углерода, водорода и азота. Раз- работаны автоматические анализаторы, предназначенные, например, для определения общего азота в пробах. Известно, что в биологических процессах важную роль играет ряд ионов, поэтому в анализах на элементы обычно определяют также общее содержание железа, магния, фосфора и кальция. Общее содержание белков, РНК, ДНК и других компонентов клеток большой молекулярной массы определяют с помощью хорошо известных методов. В качестве примера на рис. 10.9 перечисле- ны основные операции методики определения макромолекуляр- ных компонентов дрожжей. Здесь мы не имеем возможности детально описывать каждый из методов анализа различных макромолекулярных соединений; подробные сведения можно найти в работах [14, 15], а также в многочисленных статьях, посвященных определению состава клеток в процессе их роста. С помощью этих методов получен ряд ценных результатов, на- пример данные, приведенные на рис. 7.17. Хотя любую конкрет- ную методику определения какого-либо вещества, например бел- ка или ДНК, можно применять для анализа различных организ- мов, в зависимости от вида последних может потребоваться та или иная модификация этой аналитической методики. Усредненное содержание конкретных белков в популяции клеток можно определять несколькими методами. Что касается «ферментов, то для контроля за изменением их концентрации в ходе процесса обычно измеряют соответствующую ферментатив- ную активность. В табл. 10.3 перечислены характерные реакции и принципы измерений, используемые для определения концент- раций основных ферментов, участвующих в метаболическом превращении глюкозы в органические растворители в микробио- логическом процессе производства ацетона и бутанола с помо- щью Clostridium acetobutylicum. На рис. 10.10 представлены .зависимости активности ряда основных ферментов этого орга-
Контрольно-измерительная аппаратура и управление 193 Культуральная жидкость (10-20 мл) Центрифугирование (10 мин, 10000 об/мин) Анализ растворимых ' компонентов среды Осадок (клетки) 1мл, 100мкг клеток 10-20 мл, 20-60мг клеток Определение белков Определение РНК Промывка фосфатным буфером (удаление мешающей определению глюкозы) Удаление растворимых в кислотах веществ промывкой 0,25 н. НСЮ 4 ( О °C, 15 мин} Растворение белка (0,5 мл NaOH, 100 °C, 5мин} Центрифугирование Добавление реагента Лоури Экстракция РНК 0,5 н, НС104, 37°C | Центрифугирование Измерение поглощения при 750нм. I Сравнение со стандартной кривой | (например, для альбумина Супернатант из с