Text
                    Основы биохимической инженерии

BIOCHEMICAL ENGINEERING FUNDAMENTALS Second Edition James E. Bailey California Institute of Technology David F. Ollis North Carolina State University McGraw-Hill Book Company New York St. Louis San Francisco Auckland Bogota Hamburg Johannesburg London Madrid Mexico Montreal New Delhi Panama Paris Sao Paulo Singapore Sydney Tokyo Toronto
Дж. Бейли, Д.Оллис ОСНОВЫ биохимической инженерии В 2-х частях 1 Перевод с английского А. А. Кирюшкина Москва «Мир» 1989
ББК 28.07 Б 40 УДК 57.04 Бейли Дж., Оллис Д. Б 40 Основы биохимической инженерии. Пер. с англ, в 2-х частях. Ч. 1. — М.: Мир, 1989. — 692 с., ил. ISBN 5-03-001028-9 Фундаментальный труд, написанный известными американскими специали- стами в области проектирования, разработки и применения процессов, связанных с переработкой биологических материалов и использованием биологических аген- тов, в первую очередь ферментов и клеток. Он написан с целью заполнить про- бел, часто существующий между биологией и технологией на их пути к биотех- нологии. В русском переводе книга выходит в двух частях. В первой части рассматриваются теоретические основы микробиологии, био- химии и биологии клетки, ферментативного катализа и молекулярной генетики. Отдельные главы посвящены стехиометрии и энергетике клеточных процессов, ки- нетике роста популяций клеток, транспортным явлениям в процессах с участием биокатализаторов и микроорганизмов. Предназначена для студентов и преподавателей биологических н технологи- ческих специальностей, научных работников, инженеров, работающих в микро- биологической и медицинской промышленности. Б 1901000000—196 041(01)—89 93—89, ч. 1 ББК 28.07 Редакция литературы по химии ISBN 5-03-001028-9 (русск.) ISBN 5-03-001027-0 ISBN 0-07-003212-2 (англ.) © 1986, 1987 by McGraw-Hill, Inc. © перевод на русский язык, «Мир», 1989
От переводчика Биохимическая технология (биотехнология) —одна из самых старых и одновременно одна из самых молодых наук и отраслей промышленности, если под биотехнологией понимать использо- вание живых организмов или биологических процессов в про- изводстве,— ведь такие процессы, как хлебопечение, сыроделие, виноделие и др., известны человечеству с незапамятных времен. Однако термин «биотехнология» привился только с середины 70-х годов, когда биотехнология пережила свое второе рожде- ние в связи с появлением генетической инженерии. В настоящее время процессы биохимической технологии ши- роко используются при производстве ценных биологически ак- тивных веществ (антибиотиков, ферментов, гормонов и др.), для предотвращения загрязнения окружающей среды, защиты растений от болезней и вредителей, в крупномасштабном про- изводстве белков и аминокислот, предназначенных в качестве добавок к кормам в животноводстве. Развитие генетической и клеточной инженерии позволило получать ранее недоступные вещества — в первую очередь лекарственные препараты (ин- терфероны, гормоны роста, инсулин человека и др.). Другое перспективное направление биотехнологии связано с получени- ем гибридом и продуцируемых ими антител, последние уже сейчас широко используются в качестве лекарственных и диа- гностических препаратов и специфических реагентов. Для того чтобы все возможности генетической инженерии стали реальностью, необходимо перенести ее методы из стек- лянной лабораторной пробирки в стальные промышленные реакторы*. Биохимическая технология в настоящее время пе- реживает период чрезвычайно бурного роста, который был сти- мулирован успехами в фундаментальных и теоретических ис- следованиях в области наук о жизни, заметно опередивших практическое использование результатов этих исследований. До- стижениям фундаментальных наук посвящено немало изданий, опубликованных как в СССР, так и за рубежом; в то же время * Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии: Пер, с англ. — М.: Мир, 1984, с. 6.
6 От переводчика чрезвычайно важные проблемы, связанные с использованием этих достижений в производстве, освещались главным образом в специальной периодической литературе. В какой-то мере эту диспропорцию поможет исправить пред- лагаемый читателю перевод книги известных американских специалистов в области биохимической и химической техноло- гии Дж. Бейли и Д. Оллиса, которые попытались охватить тео- ретические и практические аспекты всех основных проблем био- химической технологии*. Основное внимание авторы уделяют математическому мо- делированию и методам расчета и проектирования аппаратов и процессов с участием биокатализаторов (клеток или фермен- тов). Эти проблемы рассматриваются ими главным образом с точки зрения взаимного влияния биологических и биохимиче- ских процессов, с одной стороны, и явлений переноса и кон- струкций биореакторов — с другой. Они сравнительно подробно останавливаются на особенностях иммобилизованных фермен- тов и клеток и их использовании в биотехнологии, вопросах стехиометрии и энергетики биотехнологических процессов, яв- лениях массо- и теплопередачи, конструкциях реакторов, типах и принципах работы контрольно-измерительной и регулирую- щей аппаратуры, методах выделения и очистки продуктов био- процессов, экономических аспектах биотехнологии, проблемах биологической очистки сточных вод. Поставленная авторами задача настолько широка и много- гранна, что, естественно, ряд проблем и тем освещены ими в какой-то степени фрагментарно. Этот недостаток частично компенсируют включенные в текст примеры конкретных про- цессов или расчетов, а также многочисленные упражнения и задачи, приведенные в конце каждой главы. Упражнения по- добраны таким образом, чтобы читатель мог не только прове- рить степень усвоения материала, но и расширить приобре- тенные знания, поскольку решение задач часто требует озна- комления с дополнительной литературой, выполнения расчетов, а иногда и экспериментальных работ. * Что касается литературы, изданной в СССР, то по широте и глубине охвата основных проблем биотехнологии (особенно ее практических аспектов) с настоящей книгой может конкурировать, пожалуй, только одна монография: Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н., Биохимическая технология и аппаратура. — М.: Пищевая промышленность, 1975. Последняя, однако, уже в известной сте- пени устарела и, будучи издана небольшим тиражом, давно стала библио- графической редкостью. В 1988 г. выпущена еще одна книга, написанная коллективом авторов (Англия, США, Швейцария), представляющая собой учебник по биотехноло- гии, где особое внимание уделено связи биотехнологии и химической техноло- гии: Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ./Под ред. И. Хиг- гинса, Д. Беста, Дж. Джонса. — М.: Мир, 1988.
От переводчика 7 Книга Бейли и Оллиса представит большой интерес для очень широкого круга читателей. В первую очередь она пред- назначена для студентов и аспирантов, специализирующихся в области биохимической технологии. Она полезна и для ин- женерно-технических работников предприятий химической, мик- робиологической, медицинской и фармацевтической промыш- ленности, для конструкторов и технологов проектных организа- ций соответствующего профиля. И наконец, этой книгой можно пользоваться и при самостоятельном изучении предмета, по- скольку анализу любых проблем собственно биотехнологии в ней всегда предшествуют главы или разделы, в которых на очень доступном и в то же время вполне современном уровне изложены основы микробиологии, биологии и биохимии клетки, ферментативного катализа и молекулярной кинетики. А. Кирюшкин
Предисловие авторов Биохимическая технология имеет дело в основном с процес- сами, связанными с переработкой биологических материалов и с использованием биологических агентов, например клеток, ферментов или антител. Для успешного решения задач био- химической технологии необходимо владеть знаниями как основ биологии, так и методологией и стратегией химической техно- логии. Решение современных проблем биотехнологии базирует- ся на использовании новейших данных и самой передовой тех- нологии из обеих областей, и на этой основе разрабатываются новые биотехнологические процессы, способы их контроля и управления и намечаются пути их дальнейшего развития и оп- тимизации. Для того чтобы стать хорошим специалистом в этой области, нужны многолетние тщательное теоретическое изуче- ние предмета и практическая работа. Главная задача настоящего учебного пособия заключается в том, чтобы помочь читателю сделать первые шаги на этом чрезвычайно интересном и трудном пути. При этом все основ- ные теоретические концепции рассматриваются с точки зрения их практического применения в биохимической технологии. В книге излагаются также основы способов проведения реак- ций и процессов разделения, используемых в настоящее время в биотехнологии. Особое внимание уделяется той центральной роли, которую играют биологические свойства систем в дости- жении цели данного процесса оптимальным путем. Мы также остановимся на различных осложнениях и ограничениях, обу- словленных чувствительностью и неустойчивостью биологиче- ских компонентов систем. Концентрируя внимание на фунда- ментальных принципах биологических наук и технологии и постоянно подчеркивая необходимость их комплексного при- менения, мы стремились в первую очередь помочь читателю создать достаточно прочную основу для дальнейшего более тщательного их изучения и практической работы. Однако мно- голетняя успешная деятельность в такой чрезвычайно быстро развивающейся области, как биотехнология, возможна только в том случае, если специалист следит за всеми новейшими ре- зультатами фундаментальных исследований в биологии.
Предисловие авторов 9 Настоящая книга представляет собой вводный курс по био- химической технологии, изучаемой студентами старших курсов и аспирантами, специализирующимися в области химической технологии. В то же время отдельные разделы и части книги могут послужить основой для других курсов по химической технологии, технологии пищевых продуктов и ряду других от- раслей промышленности, в том числе связанных с охраной окружающей среды. Как и в первом издании, весь материал изложен систематично, в строгой логической последовательно- сти, начиная с самых общих принципов биологии. Поэтому книгой можно пользоваться и при самостоятельном изучении предмета, например работникам промышленности. Чтобы сделать ее более доступно?! для самостоятельного изучения и создать необходимую базу для одно- или полуго- дичного факультативного или вводного курса, в текст в качестве самостоятельных разделов включены основные положения био- химии, биологии клетки, кинетики ферментативного катализа и молекулярной генетики. Само собой разумеется, что в таких разделах дается только введение в эти отрасли науки и даже в совокупности они ни в коей мере не претендуют на полноту изложения основ наук о жизни в той мере, в какой это необ- ходимо для тех, кто будет глубоко изучать биохимическую технологию или работать в этой области. Последним, очевидно, необходимо более глубокое изучение основ биологии и методов практической работы в индивидуальном порядке или по соот- ветствующим программам высших учебных заведений. В ходе изложения основ биологических наук мы старались постоянно иллюстрировать их примерами технологических про- цессов и методов анализа. На связь основ биологических наук с биохимической технологией часто указывается уже в разде- лах, посвященных основным концепциям биологии, а разработ- ка конкретных инженерных решений рассматривается только после изучения соответствующего теоретического материала. Так, вопросы кинетики ферментативного катализа и технологии соответствующих процессов изложены непосредственно после описания белков и других биологически важных соединений, а кинетика роста клеток рассматривается вслед за описанием стехиометрии и регуляции путей метаболизма. ^Примеры, приведенные в тексте, и упражнения в конце каж- дой главы дают читателю возможность самому проверить прак- тическую применимость основных концепций и расширить пред- ставление об изучаемом предмете. Решение этих 150 упражне- ний различной степени сложности потребует от читателя необходимых обсуждений, самостоятельной работы с литера- турой или расчетов. Основной причиной выпуска в свет второго издания настоя-
ю Предисловие авторов щей книги послужил скачкообразный прогресс в биологических науках, революционизировавший наши представления о воз- можностях трансформации организмов и материалов и созда- нии на этой основе новых веществ и процессов. Технология рекомбинантных ДНК и гибридом послужила базой для созда- ния совершенно новой биотехнологической промышленности. В текст книги включены новые данные о методах клонирования и экспрессии генов, слияния клеток, а также об основных путях развития перспективных технологических процессов крупно- масштабного производства сверхчистых веществ белковой при- роды. Во втором издании большее внимание уделено ряду проблем технологии: например, включены новые главы, посвященные процессам разделения, приборного обеспечения и контроля био- технологических процессов и их экономической эффективности, а также впервые освещены также другие важные темы, в том числе стехиометрия метаболических превращений, конструкция многофазных реакторов, технология процессов с участием жи- вотных и растительных клеток. Кроме того, в процессе подготовки второго издания в текст были внесены многочисленные изменения, позволившие улуч- шить систематизацию и изложение материала. В частности, был сокращен, но тем не менее стал более информативным основной описательный материал, а также более системно рас- смотрены вопросы стехиометрии, кинетики и конструкции био- реакторов. Во втором издании также более подробно изложены важные проблемы коалесценции и диспергирования в много- фазных реакторах. Много ценных улучшений во второе издание было внесено благодаря обоснованным критическим замечаниям М. Шюлера, Д. Лауффенбергера, П. Рейлли, Ф. Арнолд, Д. Кирвана и Э. Гэйдена. В настоящем издании учтены также отдельные предложения, связанные с проблемами освещения фундамен- тальных исследований и (или) новыми упражнениями, которые внесены нашими коллегами, студентами и уже закончившими обучение специалистами. Мы, наконец, хотели бы выразить нашу искреннюю призна- тельность многочисленным друзьям, коллегам, студентам и ру- ководителям, стимулировавшим наше становление как специа- листов в биохимической технологии за годы, прошедшие с пер- вого издания. Во многих отношениях они также являются соавторами этой книги. Джеймс Э. Бейли Дэвид Ф. Оллис
Глава 1 Введение в микробиологию Жизнь человека связана многочисленными нитями с кро- хотными живыми существами, называемыми микроорганизма- ми. В масштабе биосферы в целом, включающей все регионы планеты, где существует жизнь, микроорганизмы играют важ- нейшую роль в усвоении солнечной энергии. Биологическая деятельность микроорганизмов является одним из основных этапов в кругооборотах углерода, кислорода, азота и других необходимых для жизни элементов. С другой стороны, микро- организмы вызывают различные заболевания человека, живот- ных и растений. В настоящей книге основное внимание будет уделено ис- пользованию микроорганизмов человеком. Эти универсальные биологические катализаторы служат человечеству уже многие тысячи лет. Древние греки приписывали богу Дионису изобре- тение процесса брожения в виноделии, а на «Голубом мону- менте», датируемом седьмым тысячелетием до нашей эры, изо- бражен процесс пивоварения в Вавилоне. В питании человека уже давно большую роль играют процессы брожения, с по- мощью которых получают, например, сыр, хлеб, йогурт и сое- вый соус. В конце прошлого века Пастер и Тиндалл показали, что любые процессы брожения инициируются микроорганизма- ми; тем самым было положено начало микробиологии как нау- ки. Эти работы стимулировали дальнейшие исследования, и уже в начале двадцатого века Бухнер, Нейберг и Вайцманн разра- ботали технологические схемы производства этанола, глицерина и других химикатов. В сороковых годах нашего столетия успехи биологии, гене- тики микроорганизмов и технологии ознаменовали начало эры антибиотиков, позволивших избавить человечество от ряда за- болеваний и существенно повысить среднюю продолжитель- ность жизни. В этот период и родилась биохимическая техноло- гия, т. е. технология, в которой используются катализаторы, исходные вещества и (или) сорбенты биологического проис- хождения. Началось превращение биотехнологии из эмпириче- ского искусства в область предсказуемой, поддающейся плани- рованию и оптимизации технологии.
12 Глава 1 На следующем этапе развития биохимической технологии были разработаны способы получения стероидов, предназна- ченных для контроля рождаемости, а также для лечения артри- та и воспалительных процессов. Применение методов культиви- рования растительных и животных клеток позволило наладить массовое производство вакцин и других ценных биологических препаратов. Не вызывает сомнения тот факт, что успешное использование и целенаправленное изменение клеточных про- цессов человеком оказало огромное воздействие на различные стороны жизни прошлых и живущих ныне поколений, в том числе на проблемы здравоохранения, экономики, охраны окру- жающей среды и на социальные вопросы. Результатом комплексных работ в области молекулярной биологии и генетики микроорганизмов явилось понимание основ различных способов контроля и катализа, лежащих в основе биосинтетических процессов в живых клетках. Эти теоретиче- ские работы послужили основой для разработки методов тех- нологии рекомбинантных ДНК, возможности применения кото- рых настолько велики, что с трудом поддаются воображению. Таким путем уже производятся новые вакцины и лекарственные препараты, но это только начало будущих поистине революци- онных преобразований. В изучении биохимической инженерии наша задача будет заключаться в том, чтобы читатель смог понять суть биотехно- логических процессов, научился их анализировать и на этой основе разрабатывать и рационально использовать новые про- цессы. Для этой цели, однако, необходимо овладеть минимумом знаний о росте и функциях клетки. Эти факторы и ряд других особенностей биологического характера обычно определяют весь биотехнологический процесс. Представим себе, что живой мик- роорганизм в самом первом приближении можно рассматривать как саморасширяющийся химический реактор, который потреб- ляет из среды определенные соединения, называемые питатель- ными веществами, растет, самовоспроизводится и выделяет про- дукты жизнедеятельности в окружающую среду. В таких слу- чаях, как очистка сточных вод, цель технологического процесса состоит в усвоении питательных веществ (в данном случае за- грязняющих органических веществ). Если же микроорганизмы выращивают в качестве источника пищи или компонента пи- щевой смеси, то в результате процесса получают микробную массу. Напротив, в процессе очистки сточных вод эта микроб- ная масса, образующаяся в процессе усвоения питательных веществ, оказывается нежелательным побочным продуктом, и ее количество должно быть сведено к минимуму. Наконец, во мно- гих естественных процессах и в промышленном производстве, например при получении пенициллина или этанола, основной
Введение в микробиологию 13 интерес представляют продукты, образующиеся в результате жизнедеятельности клеток и выделяемые ими в среду. На отно- сительные скорости усвоения питательных веществ, роста клеток и выделения продуктов жизнедеятельности в очень большой степени влияет тип клеток, а также температура, состав и спо- соб перемешивания среды. Для понимания этих взаимосвязей необходимо знать основы биохимии, биофизики и биологии клетки. Значительная часть настоящей книги будет посвящена этим дисциплинам, поскольку их изучение обычно не включают в программы подготовки инженеров и технологов. Во всех случаях, когда это только представляется возмож- ным, мы будем давать не только качественную оценку биоло- гических процессов, но и приводить соответствующие матема- тические выражения, характеризующие количественную сторону этих процессов. Часто эти математические модели будут чрез- мерно упрощенными и идеализированными, поскольку даже единичный микроорганизм представляет собой очень сложную систему. Тем не менее основные концепции микробиологии бу- дут полезными для создания математических моделей и про- верки их корректности так же, как, например, основные поло- жения гидродинамики позволяют понять корреляцию между коэффициентом трения и числом Рейнольдса. 1.1. Биофизика и клеточная теория Микробиология — это наука, изучающая живые организмы, не видимые невооруженным взглядом. Как правило, диаметр микроорганизмов не превышает 0,1 мм. В настоящее время мы знаем, что даже простейшие микроорганизмы вмещают слож- нейший комплекс удивительно эффективных и в высшей степе- ни координированных химических реакторов, систем информа- ции, контроля, управления и массопередачи. Эти данные были получены в результате многочисленных экспериментальных ис- следований с использованием методов, заимствованных из фи- зических и химических наук. Поскольку такой подход оказался чрезвычайно плодотворным, применимость основных положений химии и физики к биологическим системам является в настоя- щее время широко распространенной в комплексе наук о жизни рабочей гипотезой. Для более четкого ограничения области науки, в которой биологические проблемы решаются физиче- скими методами, иногда употребляют термин «биофизика». Поворотным пунктом в понимании живых систем можно считать 1838 г., когда Шлейден и Шванн впервые сформули- ровали клеточную теорию, постулирующую, что все живые си- стемы состоят из клеток и продуктов их жизнедеятельности. Таким образом была создана концепция основного модуля или
14 Глава 1 основного строительного элемента жизни. Эта концепция об общем для всех живых организмов элементе структуры позво- ляет разделить изучение живых систем на два этапа, на первом из которых исследуют составляющие систему клетки, а затем на этой основе стараются понять структуру всего организма. Целесообразность такого разделения исследований базиру- ется на том факте, что выделенные из самых разнообразных организмов клетки имеют много общего как в отношении их строения, так и в отношении выполняемых ими функций. По- этому данные, полученные при экспериментах на клетках од- ного организма, во многих случаях удается успешно перенести на клетки других типов. Наличие общих для всех клеток осо- бенностей упрощает и нашу задачу изучения поведения микро- организмов. Сконцентрировав внимание на самых универсаль- ных функциях клеток, можно создать основу для понимания функций всех живых систем. Нам не хотелось бы, однако, чтобы у читателя создалось впечатление, будто бы все клетки одинаковы. Напротив, клетки мышц, например, резко отличаются от клеток глаза или мозга. Точно так же существует множество типов одноклеточных ор- ганизмов, которые в соответствии с описанными ниже особен- ностями их организации могут быть разделены на две основные группы. 1.2. Строение клеток С помощью электронного микроскопа было установлено, что существуют два существенно различающихся типа клеток. Хотя им свойственны и некоторые общие черты, все же клетки одного типа настолько отличаются от клеток другого типа по структуре и функциям, что целесообразно рассматривать их раздельно. Все известные в настоящее время клетки относятся к первому или второму типу. 1.2.1. Прокариотические клетки Прокариотические клетки не имеют заключенного в мембра- ну ядра. Прокариоты отличаются относительно небольшими размерами и простотой строения. Обычно они существуют изо- лированно, вне связи с другими клетками. Линейные размеры этих клеток, которые могут иметь сферическую, палочкообраз- ную или спиральную форму, как правило, составляют от 0,5 до 3 мкм*. Чтобы представить себе эти размеры, полезно срав- * 1 м (метр) = 103 мм (миллиметров) = 106 мкм (микрометров; ранее так- же употреблялся термин микрон) = 109 нм (нанометров) = 1010 А (ангстремов).
В в едение в микробиологию 15 о Ангстремов, Л Максимально уда- ленные объекты, ко- ю36 торые можно наилю- — дать с помощью опти- -109 Световых лет веского телескопа с диаметром зеркалалйкзо— 603 см / /z? II Маша галактика Солнечная система----- 10го Земля —— /0ю 10° - Атом водорода ------ Атомное ядро------ г 10"в Космический мир -7 Световой год биологический мир Мир молекрл Мир атомов Ангстремов, А 10™ ----Рост человека. Ю9 ----Радиус гигантской клетки водорослей 10 s- Радиус гигантской амевы (100 мкм) ----20мкм.--------- Радиус > большин- ства теток ----1мкм ---------- Эукариоты Прокариоты Разрешение оптического ~микроскопа -10 —радиус мельчайшей бактерии ---Толщина плазматической мембраны Разрешение злектрон- ---кого микроскопа Радиус молекулы J_I jq о аминокислоты РИС. I.I. Характерные размеры объектов Вселенной. Диапазон размеров представителей живого мира весьма широк. (Из работы: Лёви А., Сике- виц Ф., Структура и функция клетки. — М.: Мир, 1984, с. 45.) нить их с размерами других объектов Вселенной. Как показано на рис. l.l, прокариотическая клетка настолько же меньше че- ловека, насколько человек меньше земного шара или насколько атом водорода меньше клетки. Как мы увидим позднее, эти отношения приобретают большое значение при детальном изу- чении функций клетки. Объем одной прокариотической клетки составляет около 10~12 мл, из которых 50—80% приходится на
16 Глава 1 воду. В первом приближении можно считать, что масса одного прокариота составляет 10~12 г. Микроорганизмы этого типа растут очень быстро и широко распространены в природе. Некоторые прокариоты могут удваи- ваться в размере, массе и числе за 20 мин. Прокариоты, как правило, биохимически универсальны в том смысле, что они могут усваивать самые разнообразные питательные вещества и, более того, способны выбирать наилучшие питательные ве- РИС. 1.2. Электронная микрофотография прокариоты Bacillus subtilis. Эта почвенная бактерия, изображенная здесь почти в конце процесса деления, используется в промышленности для производства некоторых биологических катализаторов и антибиотиков. Длина клетки около 2 мкм, ширина 1 мкм. В. subtilis является также важной клеткой-хозяином для рекомбинантных ДНК. (Фотография любезно предоставлена А Райтер.) щества из имеющейся в среде смеси. Эта особенность прока- риот и некоторые другие их свойства, на которых мы остано- вимся позднее, способствуют тому, что прокариотические клетки могут приспосабливаться к самым различным условиям. По- скольку прокариоты обычно существуют как изолированные одноклеточные организмы, у них практически нет средств конт- роля окружающей среды. По этой причине проявляемая ими гибкость в выборе питательных веществ необходима для их выживания. Быстрый рост и биохимическая универсальность прокариот делают их незаменимыми в биологических исследо- ваниях и биохимической технологии. На рис. 1.2 изображены основные структурные элементы прокариотической клетки. Клетка окружена жесткой стенкой толщиной около 200 А. Стенка обеспечивает сохранение клетки как единого целого, что необходимо для ее выживания в ме- няющихся условиях среды. Непосредственно под стенкой рас- положена клеточная мембрана, которая обычно имеет толщину
Введение в микробиологию 17 около 70 А и по строению не отличается от мембран других клеток. Иногда ее называют плазматической мембраной. Важ- нейшая функция мембраны заключается в транспорте веществ из клетки в среду и наоборот, причем от мембраны зависит, какие вещества и с какой скоростью будут транспортироваться в клетку и из клетки. Внутри клетки имеется довольно большая, четко не ограниченная область, называемая нуклеоидом, кото- рая играет основную роль в контроле жизненно важных функ- ций клетки. Темные пятнышки неправильной формы внутри клетки изображают рибосомы — центры важнейшего биохими- ческого процесса — белкового синтеза. Цитоплазмой называется жидкость, занимающая весь остальной объем клетки. В про- кариотической клетке имеются также светлые, напоминающие пузырьки области, называемые резервными гранулами; их не видно на приведенном рисунке, но можно различить на неко- торых других микрофотографиях. Строение и функции перечис- ленных структурных элементов прокариотической клетки мы рассмотрим более детально позднее, после того как будут из- ложены необходимые основные положения и объяснены соот- ветствующие термины. Обладая многими общими структурными и функциональны- ми элементами, различные прокариоты могут в то же время существенно отличаться друг от друга. У сине-зеленых водо- рослей, например, имеются мембраны, способные улавливать энергию света и использовать ее для фотосинтеза. В этом слож- ном процессе утилизации солнечной энергии клетки обеспечи- ваются необходимым для их жизнедеятельности органическим веществом и выделяют в атмосферу кислород. 1.2.2. Эукариотические клетки Второй основной тип клеток составляют эукариотические клетки. Эукариотическими называют клетки, ядро которых за- ключено в мембрану. Как правило, эукариотическая клетка по объему в 1000—10 000 раз больше прокариотической. К этому типу клеток принадлежат все клетки высших организмов. Эука- риотические клетки отличаются большим разнообразием форм, что необходимо, в частности, для обеспечения различных спе- циализированных функций. В составе высших организмов эти клетки сосуществуют и взаимодействуют друг с другом различ- ными путями и поэтому не нуждаются в биохимической гибко- сти и приспособляемости, столь необходимых для прокариот. К эукариотам относятся и многие важные виды микроорганиз- мов. В следующем разделе мы приведем ряд примеров одно- клеточных эукариот. 2—537
18 Глава 1 РИС. 1.3. Типичная эукариотическая клетка. Такой идеализированной клетки с указанной обобщенной структурой в природе не существует; на самом деле эукариоты существенно различаются по своей организации. Тем не менее не- которые общие черты и структурные элементы характерны для многих эука- риот, поэтому концепция типичной эукариоты в ряде случаев оказывается удобной и полезной. Как показано на рис. 1.3 и 1.4, по степени сложности внут- ренней структуры эукариоты намного превосходят прокариоти- ческие клетки. Для эукариот характерна высокая степень про- странственной организации и дифференциации отдельных эле- ментов клеточной структуры. Внутренний объем клетки разделен на ряд четко ограниченных структурных компонентов, которые подробнее мы рассмотрим позднее; каждый из этих компонентов имеет свою структуру и функцию, необходимую для нормальной жизнедеятельности всей клетки. Здесь мы обсудим только самые основные детали строения эукариотических клеток. Клетка окружена плазматической мембраной, аналогичной мембране прокариот. Снаружи эта мембрана может быть за-
Введение в микробиологию 19 ХЛА шт*. Пга ' Л . it ,у Комплекс ЧЗчЁЯШМЯ| ГЬллджа dpnutfio {яраяео. kj W.nfl jfaGeeOMCr >Л .^fjffopa '^*Дд м&мёране Ядро w<? Х^ммал^а ~ \яшчес#(ш .ре/т/мрлун НдКЮЗЮНдрия РИС. 1.4. Электронная микрофотография клетки печени крысы (X11 000). (Фотография любезно предоставлена Дж. Э. Пэйладом, Йельский универси- тет.) щищена клеточной стенкой, или оболочкой. Природа других покровных структур клетки зависит от ее типа. Так, клетки высших животных обычно окружены тонкой оболочкой, особые адгезивные свойства которой существенны для связывания кле- ток друг с другом и последующего образования специализиро- ванных тканей и органов (например, печени). Клетки растений, напротив, обычно окружены очень толстой и прочной стенкой. Стенки отмерших клеток деревьев представляют собой основ- ную составную часть древесины. В специализации различных структурных элементов эука- риот большую роль играют внутриклеточные мембраны. От клеточной мембраны внутрь клетки отходит сложная мембран- ная система, называемая эндоплазматическим ретикулумом или эндоплазматической сетью. Ядра эукариот окружены пористыми мембранами. К поверхности большинства элементов эндоплаз- матического ретикулума прикреплены рибосомы — центры бел- кового синтеза, о чем уже упоминалось в разделе, посвященном 2*
20 Глава 1 прокариотам. Рибосомы последних, однако, несколько меньше рибосом эукариот. Основной функцией ядра эукариот являются контроль и ре- гулирование каталитической активности рибосом, причем вы- деляемые ядром химические посредники (информационные и др. РНК) не только регулируют скорость реакций, но и опре- деляют последовательность присоединения аминокислот при синтезе белка. РИС. 1.5. Электронная микрофотография эукариотической водоросли Chlamy- donomas reinhardii (Х13 000). На фотографии видны хлоропласты (х), стен- ка (с), ядро (я) и ядрышко (як), вакуоли (в) и комплекс Гольджи (г). [Воспроизведено из работы: Goodenough U. R„ Porter К- В., J. Cell. Biol., 38, 403 (1968)]. Ядро представляет собой один из структурных элементов клетки, окруженных мембранами. Эти специализированные за- ключенные в мембраны структуры в общем случае называют органоидами. Митохондрии — это органоиды с чрезвычайно спе- циализированной и высокоупорядоченной структурой; митохонд- рии катализируют реакции, являющиеся основным источником клеточной энергии. Они встречаются во всех эукариотических клетках, потребляющих кислород в процессе генерирования энергии. В клетках прототрофов, которые в качестве первичного источника энергии используют свет, роль основного генератора энергии играют другие органоиды — хлоропласты (рис. 1.5). Помимо обеспечения клеток энергией хлоропласты и митохонд- рии выполняют и многие другие биохимически важные функции.
Введение в микробиологию 21 На рис. 1.3—1.5 изображены и другие органоиды — комплекс Гольджи (аппарат Гольджи, пластинчатый комплекс), лизосомы и вакуоли. В самых общих чертах их функции сводятся к осу- ществлению некоторых химических реакций и к компартмента- лизации (т. е. к приуроченности к определенным участкам клет- ки) ряда соединений, обеспечивающей изоляцию последних от остальной цитоплазмы. Процессы компартментализации важны как с точки зрения эффективности реакций, так и с точки зре- ния предотвращения нежелательных взаимодействий между со- держимым органоидов и другими компонентами клетки. Обнаружение описанных выше типов органоидов в самых раз- личных эукариотах позволило по-новому оценить основные пре- имущества клеточной теории. Теперь различные стороны жизне- деятельности клеток можно рассматривать как сумму происхо- дящих в органоидах процессов, каждый из которых в свою очередь можно изучать отдельно. Считается, что органоиды одного типа выполняют аналогичные операции и функции не- зависимо от природы клеток, к которым они принадлежат; пока что не было обнаружено исключений из этого правила. Таким образом, основной путь изучения клетки заключается в определении химического состава, строения и биохимической активности органоидов. Большая часть имеющихся в настоящее время данных о биохимии клетки получена именно таким путем. Поэтому в следующем разделе мы вкратце рассмотрим методы центрифугирования, широко применяющиеся для выделения составных частей клеток. 1.2.3. Фракционирование клеток Основная проблема в изучении свойств определенных орга- ноидов из данного типа клеток заключается в получении доста- точного для последующего биохимического анализа количества этих органоидов. Обычно для этой цели выделяют большое число органоидов из большого числа клеток (из так называемой по- пуляции клеток). Как правило, стандартная методика выделе- ния органоидов включает в себя в качестве первой стадии гомо- генизацию суспензии клеток в специальном растворе с помощью трубки с вращающимся пестиком или ультразвука. Таким путем пытаются разрушить клетки, не затрагивая содержащиеся в них органоиды и не нарушая их структуру. Следующая стадия за- ключается во фракционировании полученной суспензии, которая в идеальном варианте представляет собой смесь выделенных из клеток целых органоидов. Как инженеры-технологи, мы знаем, что любой процесс раз- деления основан на различиях в физических п (или) химиче- ских свойствах разделяемых компонентов. Обычный метод
22 Глава 1 фракционирования органоидов клетки базируется на различиях в их физических характеристиках: размере частиц, их форме и плотности. Упрощенно процесс центрифугирования рассмот- рен в приведенном ниже примере. Пример 1.1. Изучение движения частицы в условиях центрифугирования. Предположим, что сферическая частица радиусом и плотностью рр поме- щена в центрифужную пробирку, содержащую жидкую среду плотностью Центрифужная пробирка РИС. 1П1.1. При вращении центрифуги с высокой скоростью суспендирован- ные в центрифужных пробирках частицы движутся в направлении от оси вращения. Поскольку скорость движения этих частиц зависит от их размеров, формы и плотности, метод центрифугирования позволяет разделять частицы, различающиеся по этим параметрам. р, и вязкостью Цс. Если затем эту пробирку укрепить в центрифуге и вра- щать с угловой скоростью со (рис. 1П1.1), то можно вычислить параметры движения частицы, используя следующее уравнение (какие допущения при- няты в этом уравнении?) : Сила сопротивления среды = выталкивающей силе 6л|лс/?ц,. = ^^-С(рр — pf) (1П1.1) где иг — скорость частицы в направлении г: </,=-£- (1П1.2) и G — центробежное ускорение: G = co2r (Ш1.3)
Введение в микробиологию 23 Для определения действующей на частицу силы сопротивления среды в урав- нении (1П1.1) использован закон Стокса, так как в условиях центрифугиро- вания скорости частиц (и, следовательно, их числа Рейнольдса) обычно очень малы. Коэффициент силы тяжести в уравнении (1П1.1) отсутствует, поскольку направление г перпендикулярно направлению силы тяжести (см. рис. 1П1.1). В то же время при вращении ротора центрифуги с большой уг- ловой скоростью развивается ускорение G, которое обычно во много раз пре- восходит силу тяжести и может достигать величин 600—600 000 g. Гомогенат Центри/ругиро- Супернатант, содержа- бание супернатанта щий растворимые пом- ири 15000у б течение 5 нин поненты цитоплазмы Ядра и ин та кт- Митохондрии, Фрагменты эндо- ные клетки лизосоме/ плазматического ретикулума, ридосомы РИС. 1П1.2. Основные стадии процесса разделения структурных элементов клеток методом центрифугирования. На более поздних стадиях процесса вы- деляют все более и более мелкие компоненты клеток. Интегрированием указанного выражения можно определить время, необ- ходимое для движения частицы из положения rj в положение г2: Нс t = ---------------------1п — 2 со2Я2 (рр - pf) гг (1П1.4) Сферические частицы различного размера и(или) плотности будут про- ходить одно и то же расстояние в центрифужной пробирке за разное время; этот факт лежит в основе дифференциального центрифугирования. Посколь- ку относительно большие частицы, например ядра и интактные клетки, осаж- даются довольно быстро, их можно собрать и отделить в виде осадка после центрифугирования суспензии в течение ограниченного времени при сравни- тельно невысоких скоростях. Затем супернатантную суспензию подвергают повторному кратковременному центрифугированию при более высоких ско- ростях вращения ротора, после чего отделяют второй осадок, содержащий митохондрии. Продолжая эту операцию, получают ряд фракций компонентов клетки. Весь процесс схематично изображен на рис. 1П1.2. В более сложных методах центрифугирования применяют жидкие среды с градиентом плотности по высоте центрифужной пробирки. Эти методы ис-
24 Глава 1 пользуются также для предварительного разделения и фракционирования более мелких компонентов клетки, например некоторых типов макромолекул. Другие полезные методы разделения таких сложных смесей, основанные на различиях химических свойств разделяемых компонентов, подробнее будут рассмотрены в гл. 11. В применении и интерпретации результатов фракциониро- вания компонентов клеток методом центрифугирования имеется ряд ограничений, хорошо освещенных в книге Малера и Кордеса (Mahler Н. R., Cordes Е. Н., Biological Chemistry, 2nd ed., Harper and Row, Publishers, Inc., New York, 1971). Одна из трудностей характерна для любых работ в области изучения и применения микроорганизмов. Для того чтобы получить до- статочное для последующих работ количество клеток, органои- дов, биологически важных молекул и других компонентов кле- ток, мы вынуждены использовать популяцию, т. е. большое число индивидуальных клеток. Обычно принимается, что эта популя- ция гомогенна, или, иными словами, все входящие в ее состав микроорганизмы идентичны. В таких случаях популяция нужна только для увеличения числа этих микроорганизмов с тем, что- бы облегчить дальнейшие экспериментальные исследования. Обычно, однако, входящие в состав популяции микроорга- низмы в той или иной степени различны; такую популяцию называют гетерогенной. Например, в популяции растущих кле- ток имеются старые и молодые, большие и малые клетки, часто различающиеся по биохимическому составу и активности. Если же рассматривать структурные элементы клетки, то следует отметить, что органоиды одного типа, например митохондрии, находящиеся в одной и той же клетке, также несколько отли- чаются друг от друга. Поэтому содержащая митохондрии кле- точная фракция также представляет собой гетерогенную попу- ляцию. При дальнейшем изучении таких смесей определяют, по сути дела, некоторые усредненные характеристики популя- ции клеток, и, следовательно, найденные параметры будут за- висеть от состава популяции. 1.3. Важнейшие типы клеток В этом разделе будет вкратце рассмотрена классификация царства протистов, к которому относятся все живые существа с очень простой биологической организацией в сравнении с рас- тениями и животными. К царству протистов принадлежат все одноклеточные, а также многоклеточные организмы, построен- ные из клеток только одного типа. Напротив, растения и жи- вотные отличаются большим разнообразием типов клеток. В конце настоящего раздела мы приведем примеры раститель- ных и животных клеток, которые могут быть выращены на твердой или жидкой питательной среде.
Введение в микробиологию 25 В табл. 1.1 показано деление царства протистов на удобные для наших целей таксоны. Последние различаются рядом ха- рактеристик: источниками и способом получения энергии и пи- тательных веществ, скоростями роста и выделения продуктов жизнедеятельности, способами самовоспроизведения, способно- стью к передвижению и средствами для его осуществления. Все эти факторы очень важны с точки зрения практического ис- пользования протистов. Не последнюю роль в классификации Таблица 1.1. Классификация организмов царства протистов различных типов организмов играют морфологические разли- чия, т. е. различия в их форме и структуре. Морфология мик- роорганизма влияет на скорость массопередачи питательных веществ и может также в существенной степени определять динамические свойства суспензий, содержащих этот организм. Все приведенные выше данные свидетельствуют о том, что каж- дый из перечисленных в табл. 1.1 таксонов микроорганизмов следует рассматривать отдельно. Искусство биологической классификации называется таксо- номией. В этой классификации основной единицей является вид; организмы одного вида характеризуются высокой степенью бли- зости морфологических и биохимических свойств и в то же вре- мя существенно отличаются по этим свойствам от организмов близких видов. Биологический вид обозначается двумя латин- скими словами, первое из которых начинается с прописной буквы и обозначает род организма, а второе (часто носящее
26 Глава 1 описательный характер)—собственно вид. Например, кишечная палочка — очень подробно изученная бактерия, обнаруженная в кишечнике человека,— называется Escherichia (наименование рода) coli (наименование вида). Латинское название выделяет- ся курсивом; если из контекста ясно, о каком роде идет речь, то наименование рода обычно сокращается до первой буквы, например Е. coli. В целях систематизации видов и родов организмов разрабо- тана иерархическая система таксономии, в которой родственные роды объединены в семейства, близкие семейства образуют от- ряды, объединяющиеся в свою очередь в классы; далее классы сгруппированы в отделы, или типы, и, наконец, близкие отделы объединены в царства. Например, в табл. 1.1 указаны царство протистов, отдел грибов и класс дрожжей. Часто, однако, раз- личия в свойствах микроорганизмов выражены не слишком от- четливо и подробная классификация становится в известной степени искусственной и произвольной; особенно это относится к бактериям и дрожжам. 1.3.1. Бактерии Как мы уже упоминали в ходе предварительного изучения прокариот, бактерии представляют собой относительно не- большие организмы, обычно заключенные в жесткую оболочку. У многих видов бактерий наружная сторона клеточной стенки покрыта упругой, вязкой оболочкой, называемой капсулой или слизистым слоем. Бактерии представляют собой одноклеточные организмы; морфологически они могут быть разделены на три основные группы (рис. 1.6). Большинство бактерий не способно поглощать световую энергию, может самопроизвольно передви- гаться и размножается путем деления на две дочерние клетки, хотя из всех этих правил известно множество исключений. Существует большое число подотделов бактерий; некоторые основные типы бактерий и их характерные особенности пере- числены в табл. 1.2. В столбце «реакция Грама» имеется в виду реакция бактерий на относительно прямой и быстрый цветной тест. В этом тесте клетки сначала окрашивают красителем кристаллическим фиолетовым, затем обрабатывают раствором иода и промывают спиртом. Клетки, сохраняющие после такой обработки голубой цвет красителя, называют грамположитель- ными\ потеря окраски свидетельствует о принадлежности бак- терий к грамотрицательному типу. Многие характеристики бак- терий хорошо коррелируют с этой цветной реакцией, отражаю- щей существенные различия в структуре их оболочек. При промышленном использовании микроорганизмов особен- но важен вопрос, обязательна ли подача кислорода в питатель-
Введение в микробиологию 27 ную среду (гл. 8, 12 и 14). В аэробных процессах для питания микроорганизмов подают кислород, обычно в виде воздуха. К числу таких процессов относятся практически важные мик- робиологические способы производства уксуса, некоторых ан- тибиотиков и добавок к кормам для животных. Одна из основ- ных трудностей в разработке таких процессов связана с ограни- ченной растворимостью кислорода в типичных для этих систем РИС. 1.6. Три формы бактерий. водных средах (гл. 8). В анаэробных процессах, например в производстве некоторых спиртов или при переработке орга- нических отходов, микроорганизмы функционируют в отсутствие кислорода. В промышленном применении и в контроле бактериального заражения не менее важна способность бактерий образовывать в неблагоприятных условиях так называемые эндоспоры. По- следние представляют собой «спящую» форму клетки, в которой они без вредных для себя последствий переносят воздействие повышенной температуры, радиации и ядохимикатов. Когда споры оказываются в пригодной для их жизнедеятельности сре- де, они превращаются в нормально функционирующие клетки. В отличие от споровой формы это нормальное, биологически активное состояние клеток часто называют вегетативной фор- мой. Как свидетельствуют приведенные в табл. 1.2 данные, су-
Таблица 1.2. Некоторые основные типы бактерий и их отличительные особенности Тип бактерий Доминирующая морфологическая структура Некоторые особен- ности питания Обычная сфера обитания Потребность в кислороде для большинства видов Способность к фотосинтезу Способность к образова- нию спор Реакция Грама Уксуснокис- Палочковая; Часто усваивают Разлагающие- Необходим Нефотосин- Не образу- Отрица- лые бакте- рии (Aceto- bacter, Glu- conobacter) некоторые ви- ды Acetobacter образуют про- тяженные сли- зистые слои спирт; кислото- устойчивы ся растения тезирующие ют тельная Bacillus Палочковая Универсальны; су- ществуют в самых различных пита- тельных средах Почва Необходим Нефотосин- тезирующие Образуют Положи- тельная Clostridium Палочковая Для различных видов характер- ны различные тре- бования к пита- тельной среде Почва Большинство видов не пере- носят О2 Нефотосин- тезирующие Образуют Положи- тельная Corynebacte- Неправильная Нетребовательны Почва, Необязателен, Нефотосин- Не образу- Положи- rium форма; не раз- множаются де- лением; часто не способны к движению организм че- ловека но может ис- пользоваться при его нали- чии тезирующие ют тельная Энтеробакте- Палочковая Несложные орга- Естественная Необязателен, Нефотосин- Не образу- Отрица- рии или ко- либактерии (например, Е. coli) нические соедине- ния среда обита- ния некото- рых видов — кишечник выс- ших живот- ных но может ис- пользоваться при его нали- чии тезирующие ют тельная
Молочнокис- Палочковая Кислотоустойчивы; Растения лые (Lacto- или сфериче- молочная кислота bacillus, ская является основным Streptococcus, конечным про- Leuconostoc) дуктом перера- ботки питатель- ных веществ Необязателен Нефотосин- Не образу- Положи- тезирующие ют тельная Pseudomonas Палочковая Некоторые виды очень неприхотли- вы и растут на самых различных питательных сре- дах Почва, вода Необходим Нефотосин- тезирующие Не ют образу- Отрица- тельная Rhlzoblum Палочковая Связывают азот в симбиозе с бобо- выми растениями Почва; в клу- Необходим беньках бобо- вых растений Нефотосин- тезирующие Не ют образу- Отрица- тельная Rhodospir il- ium Палочковая, спиралевидная Могут связывать N2 или продуци- ровать Н2 Особые водные Необязателен среды Фотосинте- зирующие Не обра- зуют Отрица- тельная Zymomonas Палочковая Превращает глю- Почва козу в этанол Необязателен; Нефотоспн- Не образу- Отрпца- бактерпи пере- тезирующие ют тельная носят невысо- кие концентра- ции О2
30 Глава 1 ществуют две основные группы спорообразующих бактерий. Аэробные бактерии рода Bacillus чрезвычайно широко распро- странены в природе и легко адаптируются в любых условиях. Для нормально развивающихся в анаэробных условиях веге- тативных форм некоторых видов Clostridium кислород детален, однако споры этих бактерий устойчивы к действию кислорода. Другие бактерии, вегетативные формы которых быстро погиба- ют при 45°C, образуют споры, выдерживающие кипячение в во- де в течение нескольких часов. Отсюда следует, что если мы хотим убить микроорганизмы нагреванием {тепловой стерили- зацией), то для уничтожения спорообразующих бактерий необ- ходимы более высокие температуры — обычно кипячение под давлением в автоклаве при температурах выше 120°C. Мы не будем рассматривать здесь сине-зеленые водоросли (цианобактерии), не имеющие большого промышленного зна- чения. Следует отметить, однако, что активно участвующие в кругообороте азота цианобактерии важны в общем кругообо- роте веществ в водных экосистемах (гл. 14). 1.3.2. Дрожжи Дрожжи составляют один из важных классов отдела гри- бов. Грибы, как и бактерии, широко распространены в природе, хотя обычно они живут в почве в относительно менее влажных по сравнению с бактериями регионах. Грибы не способны усваивать энергию солнечного света и, как правило, существу- ют изолированно в виде отдельных одноклеточных организмов. Хотя для большинства грибов характерна довольно сложная морфология, дрожжи легко отличить по внешнему виду — обыч- но они представляют собой отдельные небольшие клетки дли- ной от 5 до 30 мкм и шириной от 1 до 5 мкм. Дрожжи могут размножаться бесполым и половым путями; схема бесполого размножения (посредством почкования и де- ления) изображена на рис. 1.7. При почковании на родитель- ской клетке сначала начинает расти небольшой отросток; от- деление дочерней клетки от родительской происходит не сразу, благодаря чему становится возможным образование колоний дрожжевых клеток, состоящих из нескольких поколений. В ре- зультате деления из одной клетки образуются две новые. По- ловое размножение осуществляется путем слияния двух гапло- идных, (имеющих одинарный набор хромосом) клеток, которое сопровождается разрушением пограничной стенки и образова- нием диплоидной (имеющей два набора хромосом) зиготы. Яд- ро в диплоидной клетке может претерпевать одно или несколько делений, в результате которых образуются аскоспоры\ каждая из аскоспор в конце концов становится индивидуальной новой
Введение в микробиологию 31 РИС. 1.7. На приведенных в нижней части рисунка фотографиях изображен процесс бесполого размножения клетки дрожжей путем почкования. (Числа обозначают время процесса в минутах.) Как схематически показано в верхней части рисунка, в жизненном цикле дрожжей определенную роль играет и по* ловое размножение. (Фотографии любезно предоставлены К. Ф. Робиновым.)
32 Глава 1 гаплоидной клеткой, которая может затем размножаться по- средством почкования, деления или половым путем. Аскоспоры, представляющие собой в данном случае закономерный резуль- тат размножения этих организмов, не следует путать с рас- смотренными выше эндоспорами, образующимися в качестве защитной реакции на враждебную среду. В производстве спиртных напитков дрожжи представляют собой единственный промышленно используемый тип микроор- ганизмов. Помимо производства пива и вина анаэробные дрож- жи применяются для получения в промышленных масштабах технического спирта и глицерина. Дрожжи используются также при выпечке хлеба и в качестве белковых добавок к кормам для животных (см. гл. 12). 1.3.3. Плесени Плесени — это высшие грибы, обладающие вегетативной структурой, называемой мицелием. Как показано на рис. 1.8, мицелий представляет собой сильно разветвленную систему трубок. Внутри этих трубок находится подвижная цитоплазма, содержащая множество ядер. Мицелий может состоять из не- скольких типов родственных клеток. Длинные, тонкие нити кле- ток мицелия называют гифами. В некоторых случаях мицелий может быть очень плотным. Учитывая необходимость подачи кислорода для нормальной жизнедеятельности плесеней, это обстоятельство может вызвать большие затруднения в их куль- тивировании, поскольку мицелий может оказывать существен- ное сопротивление массопередаче. Эта проблема, как и необыч- ные гидродинамические свойства суспензий мицелия, будут подробнее рассмотрены в гл. 4 и 8. Как и дрожжи, плесени не содержат хлорофилла и обычно не способны передвигаться. Как правило, плесени размножа- ются спорами половым или бесполым путем. Свойства спор играют большую роль в классификации грибов. С промышленной точки зрения наиболее важны плесени Aspergillus и Penicillium (рис. 1.9). К числу основных продук- тов метаболизма этих микроорганизмов относятся антибиотики (продукты жизнедеятельности, убивающие некоторые микроор- ганизмы или подавляющие их рост), органические кислоты и биологические катализаторы. Один из штаммов Aspergillus niger в нормальных условиях продуцирует щавелевую кислоту (НО2ССО2Н), но если пита- тельная среда обеднена фосфатами и ионами некоторых метал- лов, например меди, железа и магния, то преимущественно об- разуется лимонная кислота НООССН2С(ОН) (СООН)СН2СООН. Эта особенность лежит в основе промышленного биохимиче-
Введение в микробиологию 33 РИС. 1.8. Структура мицелия плесеней. Условия в центре плотного мицелия и в его периферийных участках могут существенно различаться. ского способа производства лимонной кислоты. Таким образом, плесень A. niger может служить интересным примером различия в подходах к разработке и оптимизации биохимических и не- биологических процессов. В биологических системах путем сравнительно небольшого изменения состава питательной среды иногда может быть достигнута значительно большая селектив- ность. Этот пример, как и приведенный ниже пример пенициллина, показывает, насколько для специалиста в области биохимиче- ской технологии важно знать строение клеток, их метаболизм и функции; другие многочисленные подтверждения этого поло- жения мы найдем в последующем изложении. Без учета основ- ных свойств клеток и происходящих в них процессов все умение инженера-технолога, проявляемое при разработке, проектиро- вании и анализе различных промышленных биохимических про- цессов, может оказаться совершенно бесполезным, поскольку при этом не будут приниматься во внимание ключевые биоло- гические свойства изучаемой системы. 3-537
34 Глава 1 Второе фундаментальное различие между микробиологиче- скими и небиологическими процессами можно проиллюстриро- вать на примере производства пенициллина. Основные успехи в производстве пенициллина были достигнуты благодаря полу- чению высокопродуктивных мутантов исходного штамма Penh cilliutn путем ультрафиолетового облучения его спор (рис. 1.10). Мутации могут вызываться различными агентами и часто при- РИС. 1.9. Гифы Aspergillus и Penicillium двух промышленно важных пле- сеней. водят к увеличению выхода нужного продукта метаболизма на несколько порядков. Рассматриваемая в гл. 6 технология ре- комбинантных ДНК позволяет получать генетически видоизме- ненные варианты некоторых организмов иным, целенаправлен- ным и строго контролируемым путем. Таким образом стало возможным, в частности, наладить производство некоторых про- дуктов жизнедеятельности животных организмов (белков) с по- мощью простых бактерий. Эти примеры говорят о той большой роли, которую играет в биохимической технологии генетика. В настоящее время генетике уделяется большое внимание как в высших учебных заведениях и научных учреждениях, так и в промышленных исследовательских центрах биологического направления. Практическая важность разработки генетически
Введение в микробиологию 35 РИС. 1.10. Повышение выхода пенициллина за 30-летний период исследова- ний, Разработка методов получения особых мутантных штаммов плесени привела к экспоненциальному росту выхода за прошедшие 25 лет. Аналогич- ная тенденция характерна и для производства антибиотика стрептомицина. [Воспроизведено с разрешения из работы: Demain A. L., Overproduction of Microbial Metabolites due to Alteration of Regulation, in Advances in Bioche- mical Engineering 1, Ghose T. K-, Fiechter A. (eds.), p. 129, Springer-Verlag, New York, 1971.] модифицированных организмов (или, в других случаях, сохра- нения исходной генетической природы организма) свидетель- ствует о необходимости тесного сотрудничества инженеров, биологов и биохимиков в ходе планирования и критической оценки промышленных биохимических процессов. История раз- вития производства пенициллина является примером разработ- ки новых методов, включая культивирование в чрезвычайно толстом слое, экстракцию больших количеств лабильных соеди- нений растворителями, стерилизацию больших объемов воздуха при высоких скоростях потока и выделение мутантных микро- организмов, продуцирующих большие количества пенициллина. Прежде чем закончить этот раздел, посвященный бактериям и грибам, следует кратко упомянуть об актиномицетах — группе микроорганизмов, которые обладают свойствами как грибов, так и бактерий. Эти микроорганизмы широко применяются 3*
36 Глава 1 в производстве очень важных антибиотиков. Хотя формально актиномицеты относят к бактериям, по способности образовы- вать длинные, чрезвычайно разветвленные гифы они напоми- нают грибы. Процессы производства антибиотиков с использо- ванием актиномицетов и плесеней также имеют много общего. Актиномицеты сближает с бактериями их восприимчивость к заражению одними и теми же вирусами и к вирусным заболе- ваниям. Вирусы мы вкратце рассмотрим ниже, в гл. 6. 1.3.4. Водоросли и простейшие Эти относительно большие эукариоты обладают сложным и высокоупорядоченным строением. Эвгленовые водоросли, на- пример, передвигаются с помощью жгутиков, у них нет жесткой оболочки, но имеется чувствительное к свету пятно, называе- мое глазком. Последнее реагирует на свет и заставляет клетки двигаться к более освещенному месту, что немаловажно для жизнедеятельности этой водоросли, усваивающей, как и боль- шинство других водорослей, световую энергию. Многие диато- мовые (другой вид водорослей) имеют наружные двустворча- тые оболочки (панцири) разнообразной формы, состоящие в ос- новном из кремнезема. Эти панцири широко используются в промышленности в качестве фильтрующего материала. Повышенный интерес к водорослям обусловлен их потенци- альной ценностью в качестве продукта питания или как добавки к пищевым продуктам. В Японии, например, в настоящее время работает несколько промышленных установок, на которых во- доросли культивируют именно для этих целей. Кроме того, в Азии в довольно широких масштабах в пищу употребляют морские водоросли. Последние не являются микроорганизмами и построены из множества однотипных клеток. Как и более простые сине-зеленые водоросли, водоросли-эукариоты выпол- няют важную функцию в круговороте веществ на земле (гл. 14). В известном смысле водоросли можно рассматривать как примитивные растения; точно так же простейших, не способных усваивать солнечную энергию, можно считать примитивными животными. Естественная среда обитания, морфология и актив- ность простейших изменяются в довольно широких пределах. Некоторые трипаносомы, например, являются переносчиками серьезных заболеваний, включая африканскую сонную болезнь, или трипаносомиаз. С другой стороны, простейшие Trichonympha населяют кишечник термитов и помогают им переваривать дре- весину. Амебы не обладают какой-либо определенной формой и постоянно меняют свои внешние очертания, в то время как для солнечников (Heliozoa) характерно наличие внутреннего скелета и определенной формы.
Введение в микробиологию 37 Хотя простейшие в настоящее время не используются в про- мышленном масштабе ни для производства клеточной массы, ни для синтеза продуктов их жизнедеятельности, они наряду с микроорганизмами играют большую роль в биологической очистке сточных вод (гл. 14). С точки зрения микробиолога эти процессы, широко применяющиеся во всем мире в городах и на больших промышленных предприятиях, поразительно слож- ны. Бытовые и промышленные сточные воды представляют со- бой сложную смесь, в состав которой входят различные пита- тельные вещества и самые разнообразные микроорганизмы; по- этому для обработки стоков необходимо также большое число различных протестов. Эти организмы конкурируют в потребле- нии питательных веществ, уничтожают друг друга и взаимо- действуют многими другими путями, характерными для неболь- шой экологической системы. Подробнее вопросы взаимодействия между различными видами будут рассмотрены и проанализи- рованы в гл. 13. 1.3.5. Растительные и животные клетки Многие вакцины и другие биохимикаты продуцируются в хо- де роста животных клеток в реакторах, т. е. при выращивании клеток вне организма животного. Совершенствование методов культивирования тканевых клеток и разрабатываемые в послед- ние годы методы генетической трансформации животных и рас- тительных клеток открывают новые многообещающие пути для их значительно более широкого промышленного использования. Тканевые клетки можно выращивать почти в таких же реакто- рах, какие используются для культивирования микроорганиз- мов; по этой причине кинетика роста как тканевых, так и мик- робных клеток и применяющиеся для этой цели биохимические реакторы будут рассмотрены в одних главах (гл. 7 и 9 соответ- ственно). Ниже мы вкратце обсудим важнейшие типы клеток высших организмов, культуры которых могут быть выращены в технологической аппаратуре независимо от организма живот- ного или растения, от которого эти клетки были отобраны. Если часть ткани животного (обычно полученную путем раз- рушения межклеточных связей) поместить в соответствующую питательную среду, то большинство типов клеток, в частности клетки крови, погибнут в течение нескольких дней, недель или месяцев. Другие клетки в этих условиях размножаются и дают так называемую первичную линию клеток. Часто эти клетки удается пассировать, т. е. перенести в свежую питательную среду, где снова происходит размножение клеток, приводящее ко вторичной линии клеток. Некоторые вторичные клетки, вы- держивающие, по всей вероятности, неограниченное число пас-
38 Глава 1 сажей, называют стабильной, перманентной или установившейся линией клеток. Многие линии клеток получены из эпителиальных тканей (кожного покрова и тканей, окружающих органы и ограничи- вающих полости организма), соединительных тканей, крови и РИС. 1.11. Полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа микрофотография культуры клеток LA-9, выращенных на твердом носителе. Обычно эти клетки из фибробластов мыши имеют ширину около 15 мкм и длину 75—90 мкм. (Фотография любезно предоставлена Ж. П. Ревелем.) лимфы ряда животных, в том числе человека, хомяка, обезьяны и мыши. На рис. 1.11 приведена электронная микрофотография клетки LA-9, выделенной из фибробластов мыши и растущей на твердом носителе. Примеры линий клеток, их источники и обозначения приведены в табл. 1.3. Как отмечено в таблице, источником некоторых линий клеток являются злокачественные опухоли (карциномы) различных тканей. Злокачественный рост клеток крови и лимфы обычно называют лейкемией. Культуры некоторых тканевых клеток можно выращивать в виде суспензии в жидкой среде, но для роста большинства линий клеток необходимо их закрепление на твердой поверх-
Введение в микробиологию 39 ности, что налагает серьезные ограничения на масштабы про- мышленного производства вакцин и других биологических про- дуктов на основе культур животных клеток. Метод культиви- рования на микроносителях, который мы подробнее рассмотрим в гл. 9, позволил значительно повысить производительность ре- акторов (в расчете на единицу объема), предназначенных для выращивания культур клеток, растущих только на носителях. Культуры некоторых клеток растительного происхождения можно выращивать также в виде каллюса (нароста недиффе- Таблица 1.3. Примеры стандартных линий клеток животных и их происхождение Обозначение линии клеток Животное Ткань HeLa (CCL2)a HLM FS-4 MK2 CHO (CCL 61) L-M (CCL 2) Человек Человек Человек Обезьяна Китайский хомяк Мышь Карцинома шейки матки Печень эмбриона Фибробласт препуциума Почки Яичник Соединительная ткань а Обозначение CCL применяется Банком культур клеток Американской коллекции типов культур (Cell Culture Repository, American Type Culture Collection, 12301 Park- lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA); эта организация является хранителем и поставщиком линий клеток. ренцированной ткани растения на твердой питательной среде) или в виде суспензии агрегированных клеток. Поскольку рас- тения продуцируют множество практически важных соединений, в том числе душистые вещества, красители, лекарственные средства и опиаты, использование культур растительных клеток в будущем может оказаться весьма перспективным. Культуры растительных клеток могут также служить весьма специфичны- ми катализаторами ряда ценных реакций. Культуры раститель- ных клеток могут оказаться полезными и в сельском хозяйстве, например для регенерации целого растения. В то же время будущему широкомасштабному применению культур раститель- ных клеток должно предшествовать более тщательное изучение общей биологии растений, а также особенностей и ограничений процессов культивирования растительных клеток. Следует от- метить, что можно культивировать также тканевые клетки на- секомых и других беспозвоночных, однако в последующих гла- вах при обсуждении культур тканевых эукариот мы ограни- чимся клетками животного и растительного происхождения.
40 Глава 1 1.4. Перспективы дальнейшего изучения Приведенные в этой главе краткие сведения о строении и классификации клеток позволяют убедиться в обоснованности и полезности клеточной теории в качестве основы биологической науки. Здесь мы также неоднократно подчеркивали важность фундаментальных основ биохимии для понимания процессов биохимической технологии. И в последующих главах мы по- стоянно будем уделять внимание основным положениям биоло- гии клетки. В гл. 2 будут рассмотрены основные типы химических соеди- нений, которые клетка должна синтезировать для обеспечения нормальной жизнедеятельности и размножения; гл. 3 и 4 посвя- щены биологическим катализаторам, используемым клеткой для осуществления химических реакций. Затем в гл. 5 мы изучим последовательности реакций, необходимые для нормального функционирования клеток, а гл. 6 будет посвящена главным образом способам контроля и регулирования этих реакций и проблемам генетики. В гл. 7 мы рассмотрим вопросы кинетики роста микробных систем, а последующие главы будут посвя- щены проблемам анализа, проектирования, контроля и оптими- зации процессов биохимической технологии. Упражнения 1.1. Выдающиеся микробиологи. Ознакомьтесь с биографией одного из известных в прошлом микробиологов, например Роберта Гука, Антони ван Левенгука, Ладзаро Спалланцани, Луи Пастера, Уолтера Рида, Д. И. Ива- новского, П. Роуза, Теодора Шванна или М. Я. Шлейдена. Подготовьте крат^ кий обзор, указав в нем, какие технические и социальные трудности при- шлось преодолеть этим ученым, какие методические достижения были (или не были) достигнуты в ходе его работ, укажите, какое место занимали ме- тоды индукции и дедукции в его исследованиях. 1.2. Экспериментальная микробиология. Микробиология располагает мно- жеством простых и хорошо отработанных методик, которые, однако, могут оказаться незнакомыми специалистам в области общей, органической и фи- зической химии. Поскольку любое экспериментальное изучение базируется на наблюдениях и измерениях, необходимо ознакомиться с методами практиче- ского исследования, в том числе с обеспечиваемой ими точностью. Если вы ранее не прошли курс лабораторных работ по микробиологии, то желатель- но сделать это одновременно с изучением данного теоретического курса или после него. При отсутствии такой возможности внимательно изучите разделы краткого руководства по лабораторным работам (например, [7]), соответст- вующие главам этой книги. При этом не забывайте высказывание Клода Бер- нара: «Постановка эксперимента без четко поставленной цели равносильна бесцельному блужданию». При изучении экспериментальных методов в лабо- ратории или по руководству старайтесь сформулировать цель (или цели) каждого эксперимента. Подумайте, какую дополнительную информацию мож- но получить в ходе каждого эксперимента. 1.3. Методы изучения. Ознакомьтесь с кратким описанием методов мик-
41 В в е д ен ие в микробиологию ппскопии в том числе с методами темного поля, фазового контраста, флуо- ресцентной и электронной микроскопии. Сформулируйте относительные р HMy^cTBj"^^nole^nocTapa^Jec^ минам, а при наличии нескольких терминов в одной строке постараит дать сравнительную их оценку: а) б) "S™XOaTVeS“°^3MaT„,ecKaa мембрана, эндоплазматический ретикулум; в) цитоплазма; г) ядро, нуклеоид; д) рибосома, митохондрия, хлоропласт; е) морфология; ж) спиральные, сферические и палочковые формы бактерий; з) почкование, половое слияние, деление, спорообразование; и) простейшие, водоросли, мицелий, амебы. 1.5. Идентификация и классификация, а) Начертите схему царства про- тистов (по памяти). б) Таксономическое деление микроорганизмов на виды в основном бази- руется на результатах визуальных наблюдений с помощью оптического мик- роскопа. Найдите изображения микроорганизмов Escherichia coli, Staphylo- coccus aureus, Bacillus cereus и Spirillum serpens в справочных пособиях [например, Краткий определитель бактерий Берги (М.: Мир, 1980) или «А Guide to the Identification of the Genera of Bacteria» Скермана]. Перечислите отличи- тельные черты любых двух видов из этих бактерий, которые позволили бы идентифицировать их достаточно надежно. Начните с самых общих черт и по- степенно переходите от семейства к более детализированным подразделениям (подсемейству, роду) и, наконец, к виду. 1.6. Поэтапное изучение проблемы. Выберите интересную микробиологи- ческую тему (процессы брожения в пивоварении, производство антибиотиков, рост дрожжей, обработка сточных вод, микробиология почвы, вакцины, ква- шение, производство сыра, экология озер, микробиология морской воды и т. д.). Сначала ознакомьтесь с темой в том объеме, в каком она изложе- на в общих руководствах, например, в книге «Encyclopedia of Chemical Technology» Кирка и Отмера. Начертите схему технологического процесса или явлений, происходящих в природной системе, укажите важнейшие участ- вующие в этом процессе микроорганизмы, источники их питания, потоки сточных вод или отходящие потоки. В ходе изучения курса каждую неделю добавляйте к этой схеме одну-две страницы текста, в которых указывайте, в частности, важность (или ее отсутствие) темы пройденной главы для дан- ного процесса. По окончании курса подготовьте краткий доклад по вашей теме и представьте его студентам вашей группы. 1.7. Промышленная микробиология. Краткое описание истории промыш- ленной микробиологии и ряд предложений по ее развитию можно найти в статье «Industrial Microbiology» \Demain A. L., Solomon N. A., Scientific American, 245, 67—75 (1981)]. Прочтите эту статью и подготовьте краткий (объемом около одной страницы) обзор об историческом развитии промыш- ленной микробиологии, датах основных событий, продуктах и (или) процессах этой отрасли промышленности и о видах применяющихся микроорганизмов. 1.8. Подвижность простейших. Предположим, что с помощью микроскопа вы наблюдаете движение сферических простейших и можете определить их размеры и скорость движения, выраженную в количестве длин организма, преодолеваемых им в единицу времени. а) Вычислите числа Рейнольдса для потока жидкости вокруг организма для приведенных ниже размеров организмов и скоростей их движения при условии, что жидкостью является вода при 20 °C и что поток жидкости
42 Глава 1 практически не подвергается возмущению жгутиками, слизистыми оболочка- ми или вращением организмов. Размеры: 10 мкм, 50 мкм, 100 мкм. Скорости: 10 длин организма в секунду; 1 длина организма в секунду; 0,1 длины организма в секунду. Какие режимы потоков характерны для этих движений клеток? б) Для замедления движения микроорганизмов и, следовательно, для облегчения наблюдений за ними в микроскопии часто применяют раствор метилцеллюлозы. Как скажется на скорости движения клеток увеличение вязкости окружающей их жидкости в 104 раз, если принять, что расходы энергии на движение организма не меняются? 1.9. Пластинчатая разводка Е. coli. При выращивании Е. coli для дальнейших экспериментов желательно иметь генетически гомогенную попу- ляцию. Обычно для этой цели исходный бульон разбавляют до такой кон- центрации, при которой на агаровых пластинках образуются отдельные ко- лонии, образовавшиеся из одной клетки. Далее популяцию выращивают на основе одной из таких колоний. а) Предположим, что нам даны круглая агаровая пластинка радиусом 4 см, 1 мл бульона с концентрацией 1010 клеток на литр и 1 л стерильного бульона для разбавления. Насколько следует разбавить бактериальный бульон, чтобы на агаровой пластинке образовалось около 100 отдельных колоний? (Примите, что пластинку радиусом 4 см можно покрыть 5 мл раствора.) б) Как вы смогли бы получить колонии из индивидуальных клеток, если концентрация клеток в бульоне неизвестна? 1.10. Разделение с помощью центрифугирования. Рассмотрим разбавлен- ную суспензию частиц типа А и типа В. Первоначально однородная суспен- зия вращалась в центрифуге с угловой скоростью со в течение времени t. Найдите уравнение, позволяющее определить, сколько частиц типа А оста- лось в супернатантной суспензии после центрифугирования (по отношению к исходной относительной концентрации f0 частиц А). Время t следует при- нять достаточно малым, чтобы в суспензии остались частицы как типа А, так и типа В. 1.11. Центрифугирование с угловым ротором. Рассмотрим схематично изображенную на рис. 1У11.1 центрифугу, в которой пробирки расположены под углом к оси вращения. Найдите время, за которое сферическая частица РИС. 1У11.1.
Введение в микробиологию 43 радиусом R и плотностью р₽ пройдет расстояние от г=п до г=г2 при угло- вой скорости вращения ротора <в, плотности жидкости р/ и ее вязкости у./, если угол вращения составляет 0 от вертикали. Учтите, что стеклянная стен- ка пробирки прилагает к частице вертикально направленную силу. Литература 1. Sistrom IF. R., Microbial Life, 2d ed., Holt, Rinehart and Winston, Inc., N.Y., 1969. В первых трех главах этого введения в микробиологию рассмотрено большинство тем первой главы настоящего учебного пособия. В эту книгу включены также сведения о метаболизме, росте и генетике микроорганиз- мов, которые здесь будут рассмотрены в последующих главах. 2. Frobisher М., Fundamentals of Microbiology, 8th ed., W. B. Saunders Com- pany, Phila., 1968. В этой книге описаны различные формы микробной жиз- ни, а также классификация клеток, вирусы, проблемы стерилизации, имму- нологии и применения микроорганизмов. Особое внимание уделено много- численным связям между микроорганизмами и человеком. 3. Pelczar М. J., Jr., Reid R. D., Chan E. C. S., Microbiology, 4th ed., McGraw- Hill, New York, 1977. Пособие для углубленного изучения микробиологии. Детально рассмотрены грибы, водоросли, простейшие и вирусы, а также промышленная микробиология и микробиология окружающей среды, физи- ческие и химические методы регулирования размножения микроорганизмов. 4. Stanier R. Y„ Doudoroff М., Adelberg Е. A., The Microbial World, 4th ed., Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs., N.J., 1975. Книга также довольно глубокого содержания, написанная очень хорошим языком. В ней рассмот- рены история микробиологии, классы микроорганизмов, вопросы симбиоза, природы заболеваний, а также микробного метаболизма. Детально освеще- на генетика на молекулярном уровне, включая проблемы мутаций и регу- ляции. 5. The Living Cell, readings from Scientific American, W. H. Freeman and Com- pany, San Francisco, 1965. Сборник статей из журнала «Scientific American», посвященных проблемам строения, энергетики, синтеза, деления и диффе- ренциации клеток, а также ряду специальных вопросов, например коммуни- кации, стимулированию и сокращению мышц. Несмотря на то что некото- рые статьи отчасти устарели, этот тематически разнообразный и хорошо иллюстрированный сборник все еще заслуживает большого внимания. 6. Paul J., Cell and Tissue Culture, 5th ed., Churchill Livingstone, Edinburgh, 1975. Великолепная исчерпывающая вводная монография, посвященная ли- ниям животных клеток, методам и принципам культивирования клеток и практическому использованию результатов биологических исследований. Литература к разделу «Упражнения» 7. Crabtree К. Т., Hinsdill R. D., Fundamental Experiments in Microbiology, W. B. Saunders Co., Phila., 1974.
Глава 2 Химические основы жизни Любой организм должен синтезировать все химические сое- динения, необходимые для жизнедеятельности и размножения клеток. В последующих главах мы рассмотрим вопросы кине- тики, энергетики и регулирования основных биохимических пу- тей таких синтезов, однако, прежде чем приступить к этим вопросам, необходимо ознакомиться с реагентами, продуктами реакций, катализаторами и химическими регуляторами, которые принимают участие в сложной сети происходящих в клетке химических превращений. Настоящая глава посвящена главным образом изучению преобладающих в клетке высокомолекулярных соединений, а также соответствующих небольших мономерных молекул, из которых построены эти полимеры. Полимерные соединения клетки делятся на четыре основных класса: жиры и липиды, полисахариды (целлюлоза, крахмал и т. д.), носители инфор- мации полидезоксирибонуклеиновые и полирибонуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), а также белки. Физико-химические свой- ства этих соединений важны как для понимания функций клет- ки, так и для рационального проектирования технологических процессов с участием живых клеток. В зависимости от строения различные биологические поли- меры целесообразно подразделять на гомополимеры и сополи- меры. Биологические гомополимеры построены из мономерных единиц одного типа; в таком случае полимеры, содержащие мономерные звенья одного типа, отличаются один от другого прежде всего молекулярной массой и степенью разветвленности полимерных цепей. Основная функция гомополимеров в клетке заключается в создании структурных элементов, обладающих необходимыми механической прочностью, химической инертно- стью и достаточной проницаемостью. Кроме того, в виде гомо- полимеров в клетках часто хранятся запасы питательных ве- ществ-, 1 М раствор глюкозы, например, может храниться в ви- де полимера гликогена, своеобразного резервного полисахарида клетки, обеспечивающего снижение молярной концентрации раствора в 10000 раз или даже в еще большей степени. По- лимер является особенно удобной формой хранения питатель-
Химические основы жизни 45 ных веществ в тех случаях, когда клетке необходимо создать их избыток без существенного изменения внутриклеточного ос- мотического давления. Сополимеры построены из нескольких различных мономер- ных звеньев, число которых может достигать 20. Каждый из таких полимеров имеет определенную молекулярную массу и характерный мономерный состав; более того, остатки мономеров соединены в строго определенной, генетически запрограммиро- ванной последовательности. Таблица 2.1. Элементный состав Е. со11л Элемент Процентное содер- жание в расчете на массу сухого веще- ства Элемент Процентное содер- жание в расчете иа массу сухого веще- ства Углерод 50 Натрий 1 Кислород 20 Кальций 0,5 Азот 14 Магний 0,5 Водород 8 Хлор 0,5 Фосфор 3 Железо 0,2 Сера 1 Все другие эле- 0,3 Калий 1 менты а Данные из работы: Luria S. Е„ in The Bacteria, Gtmsalus I. C., Stanier R. Y. (eds.), vol. 1, chap. 1, Academic Press, Inc., New York, 1960, На приведенном в табл. 2.1 элементном составе Е. coli мож- но видеть пример того набора химических элементов, из кото- рых построены биополимеры. Преобладающие элементы (водо- род, кислород, азот и углерод) образуют химические связи путем заполнения своих внешних электронных оболочек одним, двумя, тремя и четырьмя электронами соответственно. Это са- мые легкие элементы периодической системы; за исключением водорода, все они способны также образовывать кратные хи- мические связи. Из этих элементов, а также в меньшей степени из фосфора и серы построено огромное множество соединений, в том числе и все четыре основных класса биополимеров. Биохимические соединения, построенные из этих элементов, отличаются не только большим разнообразием, но и высокой устойчивостью; как правило, они очень медленно взаимодейству- ют друг с другом, с водой или другими компонентами клетки. Химические реакции с участием таких соединений ускоряются биологическими катализаторами — особыми белками, называе- мыми ферментами (напомним, что катализатором называется вещество, повышающее скорость реакции, но само при этом
46 Глава 2 не подвергающееся необратимым изменениям). Таким образом, клетка может регулировать как природу, так и скорость про- исходящих в ней химических реакций путем изменения концент- раций ферментов. Детали этих регуляторных механизмов будут рассмотрены в гл. 6. Фосфор и сера входят в состав органического вещества всех живых существ, хотя и в относительно небольших количествах. В клетках всегда присутствуют также ионы натрия, калия, маг- ния, кальция и хлора, а следовые количества марганца, железа,, кобальта, меди и цинка необходимы для активации определен- ных ферментов. Для нормальной жизнедеятельности некоторых организмов требуются также ничтожные количества бора, алю- миния, ванадия, молибдена, иода, кремния, фтора и олова.. В общем случае для жизни необходимы по меньшей мере- 24 различных химических элемента. Клетки живут в водной среде. Вода обладает целым рядом весьма необычных свойств (высокой теплотой испарения, высо- кой диэлектрической проницаемостью, способностью образовы- вать при диссоциации кислоты и основания, склонностью к об- разованию водородных связей), благодаря которым она явля- ется чрезвычайно важным реагентом, участвующим во многих катализируемых ферментами реакциях. Кроме того, проявляе- мые биополимерами свойства в большой степени зависят от свойств того растворителя, в среде которого они находятся; на этом принципе основаны, в частности, многие процессы разде- ления. взаимосвязь воды с другими обычными компонентами клеток обсуждена Блюмом [12]. 2.1. Липиды Липидами называют соединения биологической природы, растворимые в неполярных растворителях (бензоле, хлорофор- ме, эфире и т. п.) и практически нерастворимые в воде. Из такого определения следует, что липиды могут иметь различное химическое строение и выполнять различные биологические функции. Их относительно низкая растворимость в водных сре- дах является причиной того, что липиды встречаются в основ- ном в неводных биологических фазах, в особенности в клеточ- ных мембранах и мембранах органоидов. К липидам относятся жиры, представляющие собой резервы полимерного биологиче- ского топлива, а также некоторые важные медиаторы биологи- ческих процессов. Липиды также входят в состав более слож- ных соединений, например липопротеинов и липосахаридов, которые опять-таки в основном располагаются в биологических мембранах клеток и во внешних оболочках некоторых вирусов.
Химические основы жизни 47 2.1.1. Жирные кислоты и родственные липиды Насыщенные жирные кислоты представляют собой отно- сительно простые липиды общей формулы СНз(СНг)яСООН. В процессе биосинтеза углеводородная цепь жирных кислот строится из идентичных мономерных звеньев с двумя атомами углерода, поэтому жирные кислоты можно рассматривать как не несущие информации биополимеры с концевой карбоксиль- ной группой. В биологических системах п обычно принимает четные значения от 12 до 20. Полярная карбоксиль- ная группа 1 Липидный монослой на границе раздела раз воздух-вода деполярная 'углеводородная цепь Липидная мицелла в воде РИС. 2.1. Некоторые устойчивые агрегированные состояния жирных кислот в воде. Ненасыщенные жирные кислоты образуются при замене на- сыщенной (—С—С—) связи на двойную связь (—С=С—). Например, олеиновая кислота является ненасыщенным анало- гом стеариновой кислоты (п=16): СНз (СН2) 16СООН СНз (СН2) 7СН=СН (СН2) 7СООН стеариновая кислота олеиновая кислота Углеводородная цепь придает этим соединениям гидрофоб- ные свойства, но карбоксильная группа в высшей степени гид- рофильна. Поэтому, когда жирная кислота находится на гра- нице раздела фаз воздух — вода, небольшое ее количество образует ориентированный мономолекулярный слой (монослой), в котором полярные карбоксильные группы связаны водой, а углеводородные цепи направлены в сторону воздушной фазы (рис. 2.1). Это явление лежит в основе механизма действия моющих средств, представляющих собой соли жирных кислот. Образование мыльного монослоя значительно снижает поверх-
48 Глава 2 костное натяжение на границе воздух—вода, что резко повы- шает способность раствора смачивать и очищать загрязненные места. О II Na+~O—С—(СН2)7НС=СН(СН2)7СНз мыло — олеат натрия Такого рода гидрофобно-гидрофильные молекулы липидов обладают очень невысокой растворимостью; повышение кон- центраций раствора выше того предела, который необходим для создания монослоя, приводит к агрегированию избытка растворенного вещества в виде сравнительно больших упоря- доченных структур, называемых мицеллами (рис. 2.1). Движу- щей силой этого процесса является уменьшение общей свобод- ной энергии системы в процессе формирования мицелл из раствора. Та или иная структура мицеллы диктуется увеличе- нием числа энергетически выгодных контактов между группи- ровками одинаковой степени гидрофобности (гидрофильности) и соответствующим уменьшением числа взаимодействий между гидрофобными и гидрофильными группировками. Известно, что аналогичные взаимодействия между гидрофобными и гидро- фильными участками одного биополимера являются причиной существования полимерной цепи в одной предпочтительной кон- формации. Такое поведение ДНК и белков мы вкратце рассмот- рим позднее. Жиры, выполняющие важную функцию внутриклеточного топлива, представляют собой сложные эфиры, образующиеся при конденсации жирных кислот с глицерином: СН2ОН НО—ОС(СН2)„ — сн3 + СНОН + НО—ОС(СН2)„:—сн3 + СН2ОН НО—ОС(СН2)Лз—сн3 глицерин жирная кислота СН2О—С-(СН2)„-сн, о II СНО—С—(СН2)„,—СН3 о II СН2О-С-(СН2)„-СН3: жир В щелочной среде при нагревании жиры и другие липиды, рассматриваемые в настоящем разделе, гидролизуются до гли- церина и солей жирных кислот (мыла) — именно таким путем мыла были впервые получены из животных жиров. Подобная
Химические основы жизни 49 реакция, обратная приведенной выше схеме синтеза жиров, в пищеварительном тракте животных осуществляется при тем- пературе тела и катализируется особыми ферментами, способ- ными расщеплять жиры; микроорганизмы также продуцируют такие ферменты, роль которых заключается в гидролизе неко- торых жиров на более мелкие фрагменты, способные затем про- никать в клетку через клеточные мембраны. По строению (но не по выполняемой ими функции) жирам близки фосфоглицериды. В молекулах последних остаток фос- форной кислоты замещает один из концевых остатков жирной кислоты. В результате получается соединение, в молекуле ко- торого опять-таки имеются гидрофильные и гидрофобные ос- татки, поэтому фосфоглицериды в достаточно высоких концент- рациях также способны образовывать мицеллы. Если в раствор фосфолипида поместить пластинку с небольшим отверстием, то в последнем может сформироваться плоский бимолекулярный слой (бислой) толщиной около 70 А (7-Ю-7 см) (рис. 2.2, а). Биологические плазматические мембраны обычно содержат зна- чительные количества фосфолипидов и других полярных липи- дов. Кроме того, для плазматических мембран характерен хо- рошо различимый на электронных микрофотографиях бимоле- кулярный слой (рис. 2.2,6) примерно такой же толщины, как и изображенный на рис. 2.2,а самопроизвольно образующийся двойной фосфоглицеридный слой. По этой причине синтетиче- ские бислойные липидные мембраны могут служить удобной моделью для изучения основных особенностей тонких биологи- ческих мембран. По ряду физических свойств липидные бислойные мембраны напоминают клеточные мембраны. Оба типа мембран имеют высокое электрическое сопротивление и значительную электри- ческую емкость, что в большой степени обусловливает непро- ницаемость природных мембран для веществ, несущих электри- ческий заряд, например фосфорилированных соединений. Это свойство мембран в свою очередь позволяет клеткам хранить запас заряженных питательных веществ и промежуточных про- дуктов метаболизма, а также поддерживать высокую разность концентраций небольших катионов (Н+, К+, Na+ и т. п.) внутри клетки и вне ее. Другие компоненты мембран и их роль в обмене веществ между клеткой и средой будут рассмотрены в разд. 2.5 и 5.7. Барьеры и каналы транспорта биохимически важных соедине- ний определяют, какие вещества из числа участвующих в слож- ной сети катализируемых ферментами процессов проникнут в клетку, какие останутся в ней, а какие будут выведены из клетки. Функции регулирования транспорта веществ обязатель- ны для нормальной жизнедеятельности любой клетки; они так- 1—537
50 Глава 2 РИС. 2.2. а — самопроизвольное образова- ние устойчивого фосфоглицеридного бислоя отверстии перегородки, помещенной в со- суд с раствором липида; б — по внешнему виду самопроизвольно образующийся двой- ной слой напоминает аналогичные структу- ры клеточных мембран, хорошо различимые на электронных микрофотографиях. [Рис. 2.2,6 воспроизведен с разрешения из рабо- ты: Robertson J. В., Membrane Models: Theoretical and Real, in The Nervous Sys- tem, vol. 1: The Basic Neurosciences, To- wer B. D. (ed.), p. 43, Raven Press, New York.]
Химические основы жизни 51 же играют важную роль в технологических процессах, в кото- рых клетки являются катализаторами. Путем добавления небольшого количества различных ве- ществ можно селективно изменять проницаемость как модель- ных бимолекулярных, так и плазматических мембран относи- тельно определенных ионов. В частности, было установлено, что некоторые антибиотики и другие соединения, связывающие катионы в комплексы, способны значительно усиливать пассив- ный ионный транспорт в обеих типах мембран. Более сложные процессы обусловливают повышение проницаемости клеточных стенок живых организмов после их мягкой химической или тепловой обработки. Это свойство клеток с успехом использу- ется в процессах микробиологического производства веществ, являющихся промежуточными соединениями в клеточном ме- таболизме, а также в целях снижения содержания нуклеино- вых кислот в клеточной массе, применяемой в качестве корма для животных. 2.1.2. Жирорастворимые витамины, стероиды и другие липиды Витаминами называют органические вещества, следовые ко- личества которых необходимы для нормальной жизнедеятель- ности клеток. Незаменимыми называют те витамины, которые сам организм не может синтезировать; при их отсутствии в пи- тании клетка погибает. (Этот факт послужил основой теста на наличие или отсутствие какого-либо витамина путем выра- щивания микроорганизмов в исследуемой среде.) Понятно, что. водорастворимые витамины, например витамин С (аскорбино- вая кислота), не являются липидами. В то же время витамины А, Е, К и D не растворяются в воде, но растворимы в органи- ческих растворителях, поэтому их относят к липидам. Биоло- гическая роль жирорастворимых витаминов до конца не выяс- нена; исключение составляет витамин А, необходимый для предотвращения дневной слепоты (никталопии) у человека. Интерес к микроорганизмам и пищевым продуктам как ис- точникам витаминов обусловлен тем обстоятельством, что к чис- лу незаменимых (или считающихся незаменимыми) для детей и (или) взрослых относятся водорастворимые витамины тиамин, рибофлавин, ниацин (никотиновая кислота), пантотеновая кис- лота, биотин, фолиевая кислота, холин, а также липидные ви- тамины A, D, Е и К. Многие из этих соединений могут синте- зироваться различными микроорганизмами. Дрожжи, например, продуцируют эргостерол — предшественник витамина D2 (каль- циферола), превращающийся в него под действием солнечного света. Жирорастворимый витамин К синтезируется микроорга- низмами в пищеварительном тракте животных и человека; этот 4*
снз. с=о холестерин в< РИС. 2.3. Некоторые примеры структур стероидов. он пример является прекрасной иллюстрацией взаимной помощи, оказываемой одним видом организмов другому (так называе- мого комменсализма, рассматриваемого далее в гл. 13). Из- вестно, что некоторые водорастворимые витамины необходимы для перевода ряда ферментов в активную форму. Стероиды представляют собой класс биологически важных липидов, обладающих общим углеродным скелетом (рис. 2.3,а). К стероидам относятся, в частности, гормоны, являющиеся чрезвычайно мощными регуляторами скоростей биологических
Химические основы жизни 53 реакций; в тканях человека гормоны эффективны в концентра- циях порядка 10-8 М. В настоящее время микроорганизмы используются только для осуществления относительно неслож- ных превращений, позволяющих из одних стероидов получать другие, более ценные. Например, прогестерон можно превра- тить в кортизон в две стадии: первая осуществляется микро- биологическим путем, а вторая — химическим (рис. 2.3,6). Дру- гие подобные примеры приведены в табл. 12.15. Структура исходного прогестерона настолько сложна, что только опреде- ленный фермент, продуцируемый одним или несколькими типа- ми микроорганизмов, позволяет провести необходимую реакцию с достаточной степенью селективности (т. е. с минимальным образованием побочных продуктов). Широко известный стероид холестерин (рис. 2.3, в) обнаружен практически только в мемб- ранах животных тканей. Показано, что родственные стероиды обладают способностью изменять проницаемость плазматиче- ских мембран клетки. Важным полимерным резервом питательных веществ для ряда бактерий, в том числе Alcaligenes eutrophus, служит поли-р-гидроксимасляная кислота (ПГМ), мономерное звено которой имеет строение —ОСН(СН3)СН2СО—. Этот полимер находится в клетках в виде гранул. В отсутствие достаточного количества питательных веществ клетка деполимеризует ПГМ с образованием растворимой, легко включающейся в метабо- лический цикл p-гидроксимасляной кислоты. Физические и ме- ханические свойства ПГМ позволяют изготовлять из нее упа- ковочные материалы; если учесть, что ПГМ легко подвергается биодеградации, то можно предположить, что этот биополимер в будущем будет производиться в промышленных масштабах. 2.2. Сахара и полисахариды Углеводами называют органические соединения общей фор- мулы (СН2О)П, где п>3. Эти соединения, содержащиеся во всех животных, растительных и микробных клетках, выполняют функции как конструкционных элементов, так и резервных пи- тательных веществ клетки. Формула (СН2О)П достаточно точно отражает их состав и может использоваться в расчетах стехио- метрии происходящих в клетке реакций и высвобождающейся при этом энергии. В биосфере вещества углеводной природы (включая крахмал и целлюлозу) по массе превосходят все другие органические соединения, вместе взятые. В процессе фотосинтеза диоксид углерода под действием солнечного света превращается в про- стые сахара, содержащие от 3 до 9 атомов углерода (подробнее эти вопросы и другие проблемы биоэнергетики рассмотрены
54 Глава 2 Таблица 2.2. Моносахариды, обычно встречающиеся в биологических системах Альдозы (производные альде- Кетозы (производные ке- гидов; префикс альдо-) тонов; префикс кето-) Триозы (3 угле- СНО СН2ОН родных атома) 1 неон с=о сн2он СН2ОН D-глицерииовый альдегид днгидроксиацетов Пентозы (5 угле- СНО СН2ОН родных атомов) 1 1 о неон е=о неон нс'он I неон неон сн2он сн2он D-рибоза D-рибулоза Гексозы (6 угле- СНО СНО СН2ОН родных атомов) неон НОСН С=О носн НОСН НОСН неон неон неон неон неон неон СН2ОН СН2ОН СН2ОН D-глюкоза D-манноза D-фруктоза СНО 1 неон 1 носн 1 носн неон 1 СН2ОН D-галактоза в гл. 5). Образующиеся моносахариды затем полимеризуются, превращаясь в вещества, удобные для построения конструкци- онных элементов клетки (целлюлоза) или для хранения резерва сахаров (крахмал). Описанные процессы обеспечивают усвоение солнечной энергии и ее накопление в виде определенных хими-
Химические основы жизни 55 ческих соединений для последующего использования. Подсчита- но, что таким путем ежегодно трансформируется около 1018ккал энергии, что составляет около 0,1% от всей падающей на землю солнечной энергии. Само собой разумеется, что большая часть этих ежегодно поступающих 1018 ккал в конце концов вновь рассеивается в результате последующего окисления (в основ- ном путем клеточного дыхания) до диоксида углерода. 2.2.1 D-Глюкоза и другие моносахариды Моносахариды, или простые сахара, представляют собой простейшие углеводы. Моносахариды содержат от трех до де- вяти атомов углерода и выполняют роль мономерных звеньев при построении не несущих генетической информации биополи- меров с молекулярной массой до нескольких миллионов. Глюкоза, как и другие простые сахара, представляет собой производное полигидроксиуглеводорода (табл. 2.2) и в природ- ных источниках всегда встречается в виде d-( + )-глюкозы, т. е. в виде оптического изомера, вращающего плоскость поляриза- ции света вправо. Хотя D-глюкоза по распространенности намного превосходит все другие моносахариды, в живых организмах встречаются и иные простые сахара (табл. 2.2). Все они имеют альдегидную или кетонную группу. В названии сахаров сначала обычно ука- зывается природа этой группы, а затем уже число углеродных атомов в цепи. Так, например, глюкоза называется альдогексо- зой; символ d обозначает определенный оптический изомер, в виде которого этот моносахарид практически всегда присут- ствует в живых системах (относительно оптической активности см. разд. 2.4). В растворах D-глюкоза большей частью существует в виде циклического соединения, так называемой пиранозы, образую- щейся в результате взаимодействия альдегидной группы С-1 с гидроксилом при С-5 (обратите внимание на принятую систе- му нумерации шести атомов углерода, а также на символы а и р, обозначающие пространственное положение гидроксильной группы при С-1).
56 Глава 2 Пятичленные сахара D-рибоза и дезоксирибоза являются основ- ными компонентами мономерных звеньев нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и других биологически важных соединений, ко- торые мы вкратце рассмотрим позднее. 2.2.2. Дисахариды и полисахариды Поскольку в растворах многие простые сахара существуют преимущественно в циклической форме, они не дают реакций, характерных для альдегидов или кетонов. В то же время в D-гликопиранозном кольце гидроксильная группа при С-1 отличается от других гидроксилов большей реакционной спо- собностью. Как показано ниже, на схеме реакции, эта гидрок- сильная группа, занимающая a-положение, может вступать в реакцию с гидроксильной группой при С-4 другого сахара, в результате чего элиминируется молекула воды и образуется оАД-гликозидная связь-. он <х-£-глюкоза ос -D-глюкоза конденсация гидролиз ос-7,4-гликозидная связь -а-паль/поза В результате конденсации двух молекул моносахаридов обра- зуется дисахарид. Помимо мальтозы, образующейся из двух молекул d-глюкозы, относительно широко распространены еле-
Химические основы жизни 57 дующие дисахариды: (Х-В-глюкоза /-В-фруктоза сахароза /-Д-галактоза Ji-D-глюкйза лактоза Важнейший пищевой продукт, обыкновенный сахар, представ- ляет собой сахарозу, которая обнаружена во всех фотосинте- зирующих растениях. Сахароза легче других дисахаридов под- вергается гидролизу; образующаяся при этом смесь моноса- харидов глюкозы и фруктозы называется инвертным сахаром. Относительно редкий, но важный дисахарид лактоза находится только в молоке. Поскольку некоторые люди не переносят лак- тозу и поэтому не могут употреблять в пищу молоко, в настоя- щее время разрабатываются ферментативные процессы гидро- лиза молочного сахара. При дальнейшей полимеризации глюкозы могут образовы- ваться новые 1,4-гликозидные связи. Амилоза представляет со- бой неразветвленный полимер, построенный из остатков глюко- зы с молекулярной массой от нескольких тысяч до полумил- лиона: а-/,4-гликозидные сдязи Участок цепи амилозы f—ОН-группы не показано!)
58 Глава 2 Резервный источник питания растений крахмал обычно содер- жит около 20% амилозы, хотя эта величина может меняться в довольно широких пределах. Гранулы крахмала достаточна велики, и с помощью микроскопа их легко увидеть во многих растительных клетках. Амилозная фракция крахмала, как уже упоминалось, со- стоит из нерастворимых в воде линейных полимеров; основная же часть крахмала представляет собой амилопектин, также полимер d-глюкозы, отличающийся от амилозы разветвленной структурой*. В среднем на 25 остатков глюкозы приходится один центр разветвления; разветвление цепи осуществляется за счет образования гликозидной связи между гидроксилом при С-1 одной цепи и гидроксилом при С-6 другой цепи: Как правило, молекулы амилопектина больше молекул амило- зы; их молекулярная масса составляет от 1 до 2 миллионов. Амилопектин растворим в воде и, адсорбируя воду, может об- разовывать гели. Частичный кислотный или ферментативный гидролиз крахмала приводит к образованию различных раз- ветвленных фрагментов амилопектина, называемых декстрина- ми. Декстрины применяются в качестве загустителей и при изготовлении паст. Конечно при частичном гидролизе образу- ются также глюкоза, мальтоза и другие относительно неболь- шие сахара. Таким путем из кукурузного крахмала получают кукурузную патоку. Резервным источником глюкозы в животных клетках, осо- бенно в клетках печени и мышц, служат полимерные гранулы гликогена, по степени разветвленности напоминающего амило- пектин. В гликогене длина линейных участков между центрами разветвления обычно составляет около 12 звеньев; таким об- разом, молекулы гликогена разветвлены даже в большей сте- пени, чем молекулы амилопектина. Молекулярная масса глико- * См. статью: Green М. М., Blankenhorn G., Hart Н., «Textbook Errors. 123; Which Starch Fraction is Water-Soluble, Amylose or Amylopectin?> J. Chem. Educ., B52, 729 (1975).
Химические основы жизни 59 гена может составлять 5 миллионов и более. Гликоген выпол- няет функции резервного источника энергии и в некоторых микроорганизмах, в том числе в энтеробактериях. 2.2.3. Целлюлоза Целлюлоза является главным структурным элементом всех растительных клеток, от водорослей до деревьев, и самым рас- пространенным органическим соединением на земле. Типичны- ми примерами материалов, состоящих в основном из целлюлозы, могут служить хлопок и древесина. Считается, что в биосфере ежегодно образуется 1011 т целлюлозы. Каждая молекула цел- люлозы представляет собой длинную неразветвленную цепь, по- строенную из остатков d-глюкозы и имеющую молекулярную массу от 50 000 до 1 миллиона и более. Хотя в целлюлозе остатки глюкозы связаны 1,4-гликозидны- ми связями, эти связи отличаются от тех, которые участвуют в построении амилозы (сравните приведенную ниже структур- ную формулу с формулой амилозы). Это на первый взгляд небольшое различие имеет важные последствия. Гликозидные связи типа а-1,4, характерные для крахмала и гликогена, легко расщепляются (гидролизуются) ферментами множества микро- организмов, растений и животных; напротив, лишь очень не- многие живые существа способны гидролизовать £- 1,4-связи целлюлозы. Одним из обычных продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы является дисахарид целлобиоза, молеку- ла которой построена из двух остатков глюкозы, соединенных {1-1,4-гликозидной связью. Устойчивость целлюлозы к расщеплению как в природных, так и в лабораторных условиях обусловлена не столько особен- ностями ^-1,4-гликозидной связи, сколько кристаллической с Полиглюкозидная цепь целлю- лозы структурой целлюлозы и особой «упаковкой» ее молекул в био- логических структурах. Как показано на рис. 2.4, для целлю- лозы характерны внутрицепочечные водородные связи между гидроксильной группой при С-3 и атомом кислорода пираноз- ного кольца, а изредка также и водородные связи между от-
60 Глава 2 дельными цепями. Эти связи обусловливают формирование из отдельных цепей целлюлозы больших надмолекулярных струк- тур, называемых кристаллитами и легко различимых на элект- ронных микрофотографиях. Предложено несколько различных моделей кристаллической структуры целлюлозы. Для наших целей достаточно привести основные черты этих моделей, схематически изображенные на рис. 2.5. Большая часть целлюлозы концентрируется в высоко- РИС. 2.4. Схематическое изображение системы водородных связей между остатками глюкозы в целлюлозе. Символом R обозначен центр возможной химической модификации целлюлозы. Так, в метилцеллюлозе, ацетилцеллюло- зе и карбоксиметилцеллюлозе R = CH3, СОСН3 и CHsCOONa соответственно. упорядоченных кристаллических областях, в которых цепи или фибриллы целлюлозы упакованы настолько плотно, что в них с большим трудом проникают даже молекулы воды. По этой причине целлюлоза не может растворяться в воде. Менее упо- рядоченные участки, называемые аморфными, обычно составля- ют около 15% микроструктуры целлюлозы. Аморфные участки сравнительно легко гидролизуются, например, кислотами; кри- сталлические области поддаются деструкции гораздо труднее. Цепи молекул целлюлозы сгруппированы в микрофибриллы, которые часто изображают в разрезе так, как это показано на рис. 2.5, а. Здесь сплошные черточки обозначают плоскости мономерных звеньев глюкозы, а прерывистыми черточками ука- заны ориентации другого важного полисахарида, называемого гемицеллюлозой. В древесине и других материалах целлюлоз- ной природы молекулы гемицеллюлозы окружают кластеры микрофибрилл; эти сложные элементы структуры в свою оче-
Химические основы жизни 61 РИС. 2.5. Строение микрофибрилл целлюлозы. [Воспроизведено из работы Mulethaner К., Ann. Rev. Plant Physiol., 18, 1 (1967).] редь окружены оболочкой из лигнина, упрочненной многочис- ленными поперечными связями. Материалы описанной структуры часто называют лигноцел- люлозой. Приведенные в табл. 2.3 данные показывают, что растительная биомасса, продукция целлюлозно-бумажной про- мышленности и ее отходы содержат значительные количества лигноцеллюлозы, в которой относительное содержание целлю- лозы, гемицеллюлозы и лигнина может меняться в широких пределах. Эти данные свидетельствуют также о том, что рас- тительная биомасса является самовозобновляемым источником Таблица 2.3. Относительное содержание (масс. %) целлюлозы, гемицеллюлозы и лигиина в растительной биомассе, продукции целлюлозно-бумажного производства и ее отходах Материал Целлюлоза Гемицел- люлоза Лигнин Древесина твердых пород Древесина мягких (хвойных) пород Трава Листва Волоски хлопкового семени Газетная бумага Отходы бумажного производства 40—55 24—40 18—25 45—50 25—35 25—35 25—40 25—50 10—30 15—20 80—85 ~0 80—95 5—20 ~0 40—55 25—40 18—30 60—70 10—20 5—10
62 Глава 2 не только материалов на основе целлюлозы, но и огромных количеств другого потенциально ценного сырья. В связи с этим ниже мы рассмотрим свойства гемицеллюлозы и лигнина. Состав гемицеллюлоз изменяется в довольно широких пре- делах в зависимости от природы растения. В общем случае гемицеллюлозы представляют собой короткие разветвленные полимеры, построенные из остатков пентоз (ксилозы и арабино- зы) и некоторых гексоз (глюкозы, галактозы и маннозы). Эти мономерные звенья, как правило содержащие большое коли- чество ацетильных групп, связаны 1,3-, 1,6- и 1,4-гликозидными связями. Основные черты химического строения гемицеллюлозы твердой древесины показаны на следующей схеме: 3 А — -X—X—х—X—X—X—X—X—X—X- - 3 2 А А 3 3 2 3 А А А ^.80—276 2 а 1 GA 4 М X — ксилоза GA — глюкуроновая кислота А—ацетильная группа М — метоксильная группа На этой схеме черточками обозначены £-1,4-гликозидные связи, а цифры указывают порядковые номера атомов углерода, участ- вующих в образовании различных связей. Глюкуроновую кислоту мы ранее не упоминали. Она явля- ется типичным представителем класса уроновых кислот, обра- зующихся в результате селективного окисления одной из пер- вичных гидроксильных групп моносахарида до карбоксильной группы; в частности, глюкуроновая кислота представляет собой производное глюкозы с карбоксильной группой в положении 6. Гемицеллюлоза довольно легко поддается гидролизу с обра- зованием растворимых соединений, например при обработке разбавленной (0,05—3%-ной) серной кислотой или даже горя- чей водой. Значительно более устойчива к гидролизу лигнино- вая оболочка полисахаридных компонентов биомассы. Лигнин представляет собой полифенол переменного состава. Известное представление о степени сложности и гетерогенности этого вещества дает модель структуры лигнина ели, приведен- ная на рис. 2.6. Такая неупорядоченная комбинация различных деталей структуры в высшей степени устойчива к действию хи- мических и ферментативных агентов. Некоторые из применяю- щихся в настоящее время методов переработки лигнина будут
Химические основы жизни 63 М2СОН НС ИСОН Н2СОН СО сн2 МеО Н2СОН —СН (I НС — н2сон со н2сон сн2 ° ' __[2У ^-^Ъме он (ОМе)05 Н2СОН^ МеОФоме н2сон нс —4^ОМе О--------СН Нс----° нс— О Me НС---О Н2СОН ОМе НС — о НСО(С6Н10О5)пН МеО 1 2 нсо н2сон НС НС II I НС со н2сон т НС---1 неон Н2С' 'СН нс-сн нс сн. , Н2СОН ОМе I -СН нс—о ос^°-СН2 нс---СН НС неон оме^ОМе он о Н2СОН О---СН Н2СОН Ц^оме НСОН НС---о МеоЦ^> ОН МеО -о МеО ОМе ОН Н2СОН НС— неон С^ОМе ОН ОМе МЗН сн н2сон сн —сн 6 ОМе —О' 1 2 РИС. 2.6. Схематическое изображение на плоскости химического строений лигнина ели. [Воспроизведено с разрешения из работы: Freudenberg К., Lig- nin: Its Constitution and Formation from p-Hydroxycinnamyl Alcohols; Science, 148, 595 (1965). © 1965 by the American Association for the Advancement of Science.] вкратце рассмотрены в гл. 4. В заключение этого краткого обзора химии и строения биомассы следует отметить, что про- дукты частичного расщепления лигнина сами по себе являются потенциально ценными химикатами и сырьем для химической промышленности. 2.3. От нуклеотидов к РНК и ДНК Информационный биополимер ДНК (дезоксирибонуклеино- вая кислота) содержит всю генетическую информацию клетки. При делении каждая дочерняя клетка наследует по меньшей мере одну полную копию родительской ДНК, что позволяет потомству сохранять все морфологические и функциональные
. ДезоксириОонуклеотады (оВщая структура) он Основание ОН Н Фоарорная кислота W л Сахар Основание " V РиВонуклеотиды он он Азотист&/е основания Лирилшдаял/ I Лурины а б
Химические основы жизни 65 особенности, присущие данному виду. Генетическая информа- ция в ДНК хранится в виде последовательности составляющих ее полимерную цепь остатков нуклеотидов. Механизм передачи информации и место процесса репликации ДНК в жизненном цикле клетки, а также другие аспекты регуляции жизнедеятель- ности клетки мы обсудим в гл. 6. Здесь же будут рассмотрены химия мономеров нуклеиновых кислот, структура полимерной ДНК и информация, закодированная в ее последовательности, ’йг* ’ 2.3.1. Структурные элементы нуклеиновых кислот; переносчик энергии и коферменты Помимо их роли как структурных элементов нуклеиновых кислот нуклеотиды и их производные представляют и самостоя- тельный биологический интерес. Все нуклеотиды построены из трех компонентов: фосфорной кислоты, альдопентоз рибозы или дезоксирибозы и азотистого основания, обычно производного пурина или пиримидина. пурин I II НС. СН пиримидин Эти три компонента образуют два типа нуклеотидов, отли- чающихся природой остатка альдопентозы (рис. 2.7). Рибонук- леиновые кислоты (РНК) представляют собой полинуклеотиды, содержащие остаток рибозы, а полимерные цепи дезоксирибо- нуклеиновых кислот (ДНК) построены с участием моносахарида дезоксирибозы. На рис. 2.7 изображены также химические фор- мулы пяти азотистых оснований, входящих в состав нуклеотидов ДНК и РНК. Три из этих оснований, аденин (А), гуанин (G) и цитозин (С), типичны как для ДНК, так и для РНК. Напро- тив, тимин (Т) входит в состав только ДНК, а родственное пиримидиновое основание урацил (U) специфично для РНК. Оба типа нуклеотидов представляют собой сильные кислоты, что обусловлено наличием остатка фосфорной кислоты. Отщепление фосфатной группы от 5'-углеродного атома нуклеотида приводит к соответствующему нуклеозиду. Как по- казано в табл. 2.4, названия нуклеозидов и нуклеотидов явля- РИС. 2.7. а — общая структура рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов; б — пять азотистых оснований, входящих в состав ДНК и РНК. 5—537
66 Глава 2 ются производными от названий соответствующих азотистых оснований. Следует отметить, однако, что для нуклеотидов при- меняется и другая номенклатура. Например, аденилат можно назвать также аденозин-5'-монофосфатом. Номенклатура по- следнего типа применяется обычно для производных нуклеози- дов, у которых гидроксильная группа при С-5' этерифицирована дифосфатной или трифосфатной группировкой, например адено- зин-5'-трифосфат (АТР). С биологической точки зрения особенно важен нуклеозид аденозин, построенный из остатков рибозы и аденина. На Таблица 2.4. Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов. Как показано в последней строке, префикс «дезокси-» применяется для обозначения соединений, содержащих остаток дезоксирибозы Основание Нуклеозид Нуклеотид Аденин (А) Цитозин (С) Гуанин (G) Урацил (U) Тимин (Т) Аденозин Цитидин Гуанозин Уридин Дезокситимидин Аденилат (АМР) Цитидил ат (СМР) Гуанилат (GMP) Уридилат (UMP) Дезокситимидилат (dTMP) рис. 2.8 изображено строение аденозин-5'-монофосфата (АМР) и ряда его важных производных. К АМР могут быть присоеди- нены еще один или два остатка фосфорной кислоты, в резуль- тате чего образуются ADP (аденозин-5'-дифосфат) и АТР со- ответственно. При гидролизе соединяющих фосфатные группы фосфодиэфирных связей высвобождается большое количество энергии. Например, превращение АТР в ADP и фосфат при 3°С и pH 7 (напомним, что рН=—lgaH, где ан — концентрация ионов Н+ в растворе в моль/л) сопровождается изменением стандартной энергии Гиббса, равным —7,3 ккал/моль. Мы привыкли оценивать энергетический эффект реакций прежде всего в единицах тепловой энергии, т. е. теплоты, одна- ко клетка представляет собой, в сущности, изотермическую си- стему, в которой, как правило, реализуются химические пути трансформации энергии. Позднее, в гл. 6, мы значительно под- робнее рассмотрим АТР в качестве основного переносчика хи- мической энергии во всех клетках без исключения. По сути дела, АТР является аккумулятором энергии, получаемой из пи- тательных веществ или солнечного света, которая затем рас- ходуется в биосинтезе полимеров, транспорте веществ через мембраны и движении клеток. Дифосфаты и трифосфаты дру- гих нуклеотидов также могут выполнять аналогичные функции
67 Химические основы жизни ОН НО —Р—О — СНг^ф^^Аденин ° \н Н/ л Н\1 IZH Аденозинмонофосфат уМВГ (АМР? он он ОН он Аденозиндифосфат (ADP) ОН ОН ОН НО —Р—О—Р—О—Р—О—СН2 ^Ох Аденин Аденозинтрифосфат (АТР) Н ОН . ОН О О О РИС. 2.8. Фосфаты аденозина. AMP, ADP и АТР участвуют в процессах пе- реноса энергии в клетке, а циклический АМР выполняет регуляторные функ- ции. в химии клетки, но основными переносчиками энергии служат все же аденозинфосфаты. Циклическая форма АМР, содержащая внутримолекулярный цикл с участием фосфатной группы (рис. 2.8), выполняет функ- ции регулятора множества клеточных реакций, включая реакции образования полисахаридов и резервных полимеров (жиров). 5*
68 Глава 2 Флавинадениндинуклеотид (FAD), окисленная форма NH2 Никотинамидадениндинуклеотид. (NAD) NH2 Аденин Кофермент А NH2 Аденин I о он но-p—он Аденин | ОН ОН но-^=о о НО—Р=О । О I II CH но-т>=о о сн2 носн Рибофлавин о— он он ♦ о НО—Р=О 0Р03-в NADP+ HO—Р=0 О I сн, I сн3—с—сн3 но—in о I но-р^о реакционноспо- собный центр Н / нс с—conh2 нс, сн N+ никотинамид НОСН носн - ^н ""С—сн3 СН3 н с=о HN СН, СН2 с=о- остаток пантотеновой кислоты HN ли g-меркапто- ,п2 этиленамин СН2 ОН OH SH РИС. 2.9. Три важных кофермента, являющиеся производными нуклеотидов. Недостаток циклического АМР в тканях связывают с одним из видов рака, т. е. состояния относительно неконтролируемого ро- ста клеток. Аденозинмонофосфат не только является структурным эле- ментом нуклеиновых кислот, но и служит основой для построе- ния ряда коферментов, химические формулы которых изобра- жены на рис. 2.9. Кинетика ферментативных реакций рассмат- ривается в следующей главе; здесь же достаточно отметить, что коферментами мы называем органические соединения, не- обходимые для активации некоторых ферментов, т. е. для их перевода в ту форму, в которой они способны выполнять ката-
Химические основы жизни 69 литические функции. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, изменение концентраций коферментов представляет собой удобный способ регуляции активности соответствующих ферментов в клетке и таким путем изменения скорости некоторых внутриклеточных процессов. 2.3.2. Хранение биологической информации, ДНК и РНК Как и полисахариды, полинуклеотиды образуются путем конденсации мономеров. И в РНК, и в ДНК нуклеотиды соеди- нены фосфатными связями, образующимися с участием гидрок- сильных групп при С-3' и С-5' рибозы или дезоксирибозы. В качестве примера на рис. 2.10 приведена структура одного из тринуклеотидов. Клеточные молекулы ДНК невероятно ве- лики: вся наследственная информация прокариот хранится в од- ной молекуле ДНК с молекулярной массой порядка 2-Ю9. В эукариотах ядро может содержать несколько больших мо- лекул ДНК. Отрицательные заряды ДНК нейтрализуются дву- зарядными катионами (в прокариотах) или основными амино- кислотами (в эукариотах). Следует подчеркнуть, что последовательность нуклеотидов, как это показано на рис. 2.10, а, имеет направление или поляр- ность, обусловленную тем обстоятельством, что на одном конце цепи находится свободная гидроксильная группа при С-5', а на другом — гидроксил при С-3'. На рис. 2.10,6 приведен удобный способ изображения нуклеотидной последовательности в на- правлении от 5'- к З'-концу. Часто применяют и еще более короткие обозначения. Предположим, например, что основания 1, 2 и 3 на рис. 2.10,6 являются цитозином, аденином и тимином соответственно; тогда та же самая нуклеотидная последова- тельность может быть записана в виде рСрАрТ или даже еще короче: CAT. Как предположили в 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик, молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, обра- зующих двойную спираль (рис. 2.11). Имеющий форму пра- вильной спирали каркас молекулы построен из остатков сахаров и фосфатных групп. Внутри двойной спирали расположены пу- риновые и пиримидиновые основания. Именно последователь- ность четырех различных азотистых оснований в полинуклео- тидной цепи содержит в себе всю генетическую информацию, в частности данные о структуре синтезируемых рибонуклеино- вых кислот и белков. Механизмы, регулирующие и использую- щие генетическую информацию ДНК, мы рассмотрим в гл. 6. Азотистое основание одной цепи двойной спирали взаимо- действует с пространственно наиболее близко расположенным
СНгоН (]СНОвание / $-//онце&ая группа а. он группа Схематическое изобра- жение Основа- Основа- Основа- ние 1 нце2 ние 3 РИС. 2.10. а — конденсация нескольких нуклеотидов с образованием цепи, свя- /'занной фосфодиэфириыми связями; б — упрощенное схематическое изображение нуклеотидной цепи.
ОН С вдхюфо- ► диз/рирных сЗязях *С и N яоснойа- к ниях >р РИС. 2.11. Изображенная несколькими способами структура двойной спирала ДНК. На этом рисунке показана классическая структура Уотсона — Кри- ка [7], называемая также В-ДНК; она представляет собой правую спираль, в которой плоскости пар оснований перпендикулярны оси спирали. В нижней части рисунка приведена схема, иллюстрирующая некоторые геометрические параметры этой структуры. [Верхний и нижний рисунки воспроизведены с раз- решения из работы: Yudkin М., Offord R., A Guidebook to Biochemistry, р. 52, Cambridge University Press, London, 1971.]
72 Глава 2 РИС. 2.12. Комплементарные пары оснований аденин — тимин и гуанин — цитозин, образующиеся за счет водородных связей и обладающие очень близкими пространственными характеристиками, что способствует формиро- ванию пар оснований внутри двойной спирали молекулы ДНК- (Из работы: Лёви А., Сикевиц Ф., Структура и функция клетки. — М.: Мир, 1971, с. 164.) основанием другой цепи строго определенным образом, так что аденин специфично связывается только с тимином, а гуанин — с цитозином. На рис. 2.12 показано замечательное геометриче- ское сходство этих пар оснований, а также наличие двух и трех водородных связей в парах оснований А—Т и С—G соответ- ственно. Две цепи ДНК имеют противоположную направленность (5'—>-3' и 3'—>-5'). Поэтому, располагая информацией о нуклео- тидной последовательности одной дезоксирибонуклеотидной це- пи, например 5,CGAATCGTA3/, можно сделать вывод о строе- нии соответствующего фрагмента двуспиральной молекулы
Химические основы жизни 73 ДНК; в нашем случае этот фрагмент будет иметь структуру 5'CGAATCGTA3' 3'GCTTAGCAT5' К той же самой двуспиральной структуре мы пришли бы, если бы нам была задана последовательность 5'TACGATTCG3'. Та- ким образом, в информационном смысле последовательность одной цепи определяет последовательность комплементарной цепи, т. е. каждая цепь служит матрицей для другой. Это характерное свойство ДНК является основой для син- теза дочерних ДНК из исходной родительской молекулы ДНК — процесса, называемого репликацией ДНК. Если две компле- ментарные цепи ДНК разделяются и затем на каждой из цепей в соответствии с правилами образования пар оснований стро- ятся двойные спирали, то конечным продуктом такого процесса будут две новые молекулы, каждая из которых идентична ис- ходной двухцепочечной ДНК и содержит одну новую и одну старую цепь (рис. 2.13). Таким образом, образование пар осно- ваний составляет химическую основу считывания биологической информации, закодированной в нуклеотидной последовательно- сти ДНК. Справедливость общих принципов такого механизма, схематично изображенного на рис. 2.13, была убедительно до- казана экспериментами по выращиванию клеток Е. coli сначала в среде, содержащей 15N, а затем в среде только с нормальным изотопом азота HN. Содержащие различные изотопы ДНК мо- гут быть разделены на ультрацентрифуге. Ультрацентрифуги- рование и применение изотопных меток, в том числе радиоак- тивных, являются важнейшими инструментами эксперименталь- ных исследований в современной биохимии. Другая важная деталь структуры ДНК—водородные связи, с помощью которых формируются пары оснований (рис. 2.12). Водородные связи способствуют стабилизации двухцепочечной структуры ДНК, однако эта стабилизация не является ни по- стоянной, ни необратимой. Как это показано на схеме репли- кации (рис. 2.13), биологическая функция ДНК основана на раскручивании спирали и разделении двух цепей. В ходе даль- нейшего изучения молекулярной генетики (гл. 6) мы ознако- мимся и с другими важными функциями одноцепочечных сег- ментов ДНК. Разделение двух цепей ДНК при нагревании является ос- новой важного метода идентификации различных ДНК. По- скольку пары оснований АТ связаны двумя водородными свя- зями, а пары GC — тремя, то содержащие большее число пар АТ участки ДНК плавятся (так условно называется процесс раз- деления двух цепей) раньше, чем участки, обогащенные пара- ми GC. Процесс плавления легко контролируется путем изме-
74 Глава 2 РИС. 2,13. Упрощенная схема репликации ДНК. По мере разделения цепей родительской ДНК на них синтезируются комплементарные цепи, что приво- дит к образованию двух дочерних молекул, идентичных родительской ДНК. Обратите внимание на то, что каждая дочерняя молекула содержит одну цепь родительской ДНК. (Из работы: Лёви А., Сикевиц Ф., Структура и функция клетки.— М.: Мир, 1971, с. 169.) рения поглощения раствора ДНК при 260 нм; одноцепочечные днк поглощают сильнее, и процесс плавления ДНК регистри- руется по увеличению общей абсорбции. Температурой плав- ления, Тил, называют температуру, при которой изменение аб- сорбции составляет 50% от разницы в абсорбции между полностью двухцепочечной и полностью расплавленной (одно- цепочечной) ДНК. Как и следовало ожидать, величина Тпл коррелирует с содержанием GC. Например, ДНК из Е. coli, содержащая 50% GC, имеет ТПЛ = 69 °C, а ДНК из Pseudomonas aeruginosa с 68% GC характеризуется Тпл—76 °C. Содержание GC в различных организмах меняется в широких пределах (от 23 до 75%). Особенности нуклеотидного состава иногда используются для идентификации организмов.
Химические основы жизни 75 Если раствор расплавленной ДНК охладить, то разделенные комплементарные цепи вновь образуют структуру типа двойной спирали (эту операцию называют отжигом). Аналогично два различных одноцепочечных сегмента ДНК с частично компле- ментарными последовательностями могут подвергаться гибри- дизации с образованием сегмента двойной спирали. Гибриди- зация является важнейшим экспериментальным приемом в био- химии и технологии рекомбинантных ДНК (гл. 6). В завершение этого краткого введения в физическую химию ДНК следует отметить, что двухцепочечную ДНК можно также расплавить или денатурировать путем добавления щелочи или кислоты, что приводит к ионизации оснований. Можно упомянуть также, что с точки зрения гидродинамики двухцепочечная ДНК в растворе ведет себя подобно жесткому стержню, в то время как одно- цепочечная ДНК по своему поведению напоминает неупорядо- ченный полимерный клубок. Как уже упоминалось выше, вся информация, необходимая для выполнения клеткой ее важнейших функций, в том числе роста и деления, в бактериях типа Е. coli содержится в одной молекуле ДНК, которая имеет строение гигантского кольца. В нативном состоянии ДНК из Е. coli существует в сверхспи- рализованной форме, что отчетливо видно на электронных мик- рофотографиях бактерии в виде несколько размытого нуклео- тида (см. рис. 1.2). Эта большая основная ДНК клетки назы- вается хромосомой бактерии; кольцевая хромосома Е. coli по- строена из 4,7 миллиона пар оснований*. В заключенном в мембрану ядре эукариот ДНК обычно поделена между несколькими хромосомами; последние могут быть намного больше хромосом прокариот. В состав хромосом эукариот входят также небольшие основные белки, называемые гистонами, которые составляют около половины массы хромо- сомы. Этот комплекс нуклеиновых кислот и белков хромосом эукариот называется хроматином. В хлоропластах и митохонд- риях эукариотических клеток также имеются отдельные, более мелкие молекулы ДНК- Очень существен тот факт, что клетки могут содержать и другие молекулы ДНК- Относительно небольшие ДНК, суще- ствующие во многих бактериях и эукариотах, называют плаз- мидами. Бактериальные плазмиды, например, представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие от 4 до 50 тысяч * Выраженную в тысячах оснований длину ДНК можно перевести в еди- ницы длины, приняв, что 1 тысяче оснований соответствует длина 0,34 мкм. Кроме того, молекулярная масса двухцепочечной ДНК с 1 тысячью оснований, равна приблизительно 660 000 атомных единиц массы.
76 Глава .2 пар оснований. Биологические функции плазмид состоят в обе- спечении клетки-хозяина полезными, но не самыми необходи- мыми качествами, например устойчивостью к антибиотикам. В биохимических исследованиях и в технологических процессах плазмиды занимают одно из самых центральных мест, являясь важным инструментом методов рекомбинантных ДНК. Как мы увидим в гл. 6, модификация плазмид в лабораторных условиях и последующее введение рекомбинантных плазмид в живые клетки позволяют изменить их генетическую программу, с тем чтобы заставить продуцировать новые соединения или более эффективно расти. Другие небольшие молекулы ДНК могут быть введены в жи- вые клетки вирусами. Небольшие вирусы, способные заражать бактерии, называют бактериофагами или, короче, фагами. По- следние могут вызывать ряд трудностей в крупномасштабных технологических процессах с использованием чистых бактери- альных культур. В то же время изучение фагов позволило вне- сти большой вклад в развитие молекулярной генетики. Кроме того, фаги используются для создания стабильных рабочих кол- лекций или библиотек сегментов ДНК. Фаг % Е. coli содержит одну циклическую двухцепочечную молекулу ДНК, построенную из 48,6 тысяч пар оснований. ДНК фага Т2 Е. coli состоит из 166 тысяч пар оснований. Основная функция ДНК заключается в хранении инструк- ций для синтеза молекул РНК определенной нуклеотидной последовательности и длины; некоторые из этих РНК затем направляют синтез различных специфических белков. Кодирую- щий последовательность молекулы РНК. сегмент ДНК называ- ется геном. Ниже мы вкратце расмотрим различные типы РНК, а затем перейдем к обсуждению белков и тех структурных эле- ментов, из которых они построены. Во всех клетках имеются рибонуклеиновые кислоты трех типов, четвертый тип характерен для некоторых вирусов. Моле- кулы РНК построены из остатков рибонуклеотидов, углеводным компонентом которых является рибоза (а не дезоксирибоза, как в ДНК). Подобно ДНК, в РНК нуклеотиды расположены в определенной последовательности. В сущности, нуклеотидная последовательность РНК строится на основе той информации, которая содержится в соответствующих сегментах ДНК- В пе- редаче информации от ДНК к РНК основную роль опять-таки играет образование пар оснований. Правила образования пар оснований в этом случае аналогичны тем, которым подчиняется процесс образования пар оснований двухцепочечных ДНК, за исключением пары аденин-тимидин; при синтезе РНК вместо нее формируется пара аденин-урацил:
Химические основы жизни 77 ДНК (матрица) РНК (синтезируе- мая на матрице) ДНК (матрица) РНК (синтезируе- мая на матрице) Т А С G А и G С В нормальном цикле жизнедеятельности клетки участвуют раз- личные РНК, выполняющие важную функцию прочтения и реа- лизации генетической информации, заложенной в ДНК. Мат- ричная, или информационная, РНК (мРНК или иРНК) компле- ментарна последовательности оснований гена в ДНК- Каждая молекула мРНК переносит определенную информацию от ДНК к другому механизму биохимического аппарата клетки. По- скольку объем этой информации меняется в довольно широких пределах, то и величина молекул мРНК тоже может быть различной; обычно цепь мРНК содержит 103—104 нуклеотидов. РНК почти всегда имеют одноцепочечную структуру, тогда как образование меж- и внутримолекулярных пар оснований часто играет важную роль в структуре или функции РНК- Содержащаяся в мРНК информация считывается в рибосоме (рис. 1.2 и 1.3). До 65% рибосомы составляет рибосомальная РНК (рРНК), которая в свою очередь может быть разделена (например, центрифугированием) на РНК нескольких типов. В частности, рибосома Е. coll содержит три различные РНК, обозначаемые 23S, 16S и 5S, которые содержат около 3-103, 1,5-103 и 102 нуклеотидных остатков соответственно. В рибосо- мах из цитоплазмы клеток-эукариот, с другой стороны, имеются 28S, 18S, 7S и 5S рРНК, а в рибосомах митохондрий и хлоро- пластов обнаружены РНК, специфичные только для этих ор- ганоидов. Транспортные РНК (тРНК) отличаются наименьшей моле- кулярной массой и содержат всего лишь от 70 до 95 нуклеотид- ных остатков; они находятся в цитоплазме клетки и участвуют в процессе реализации генетического кода в рибосоме. В табл. 2.5 приведены основные свойства различных РНК бак- терии Е. colt. Нуклеотидные последовательности и, следователь- но, структуры и функции различных клеточных рРНК и тРНК, как и мРНК, определяются последовательностями нуклеотид- ных остатков соответствующих генов клеточной ДНК. Конечный результат этого сложного процесса передачи и трансляции информации состоит в синтезе молекулы белка. Белки представляют собой материальное биохимическое выра- жение генетической информации и инструкций, носителем ко- торых является ДНК. Используя терминологию, принятую в тео- рии управления процессами, можно сказать, что белки — это
78 Глава 2 Таблица 2.5. Свойства РНК Е colia Тип Коэффи- циент Число нуклеотид- Содержание, % РНК седи- Молекулярная масса иых остатков 'от всей РНК мента- клетки) ции мРНК 6 S—25 S 25 000—1 000 000 75—3 000 ~2 TPHK-4S 23 000—30 000 75—90 16 рРНК 5 S —35 000 ~100 16 S —550000 ~1 5000 | 82 23 S 100 000 ~3 100 а Воспроизведено из работы: Lehninger A. L. Biochemistry, 2d ed., Table 12-3, Worth Publishers, Inc., New York, 1975; есть перевод более раииего издания: Ленинджер А., Биохимия.— М.: Мир, 1976. конечные элементы управления, которые передают командные сигналы ДНК клеточным процессам. Ниже и в некоторых по- следующих главах мы рассмотрим динамику и свойства этих элементов управления. 2,4. Аминокислоты и белки Белки представляют собой наиболее распространенные орга- нические соединения клетки; обычно они составляют от 30 до 70% массы сухих веществ клеток. Все белки построены из че- тырех самых распространенных биологических элементов — уг- лерода, водорода, азота и кислорода. В среднем белки содер- жат 50% С, 7% Н, 23% О и 16% N. Кроме того, в белках имеется до 3% серы, которая играет важную роль в стабилиза- ции трехмерной структуры почти всех белков за счет образо- вания дисульфидных (S—S) связей между атомами серы, рас- положенными в различных участках полимерной цепи. Моле- кулярные массы этих неповторяющихся полимеров изменяются в широких пределах от 6000 до миллиона и более. На рис. 2.14 изображены два основных типа пространственной структуры белков — фибриллярный и глобулярный. Преобладание в клетке веществ белковой природы неуди- вительно, если принять во внимание разнообразие их биологи- ческих функций (табл. 2.6). Главнейшая функция белков за- ключается в катализе. Белковые катализаторы, называемые ферментами, определяют скорость происходящих в клетке хи- мических реакций. Ферменты локализуются в самых различных участках клетки, а некоторые из них находятся в растворенном или суспендированном виде в цитоплазме и таким образом рав- номерно распределяются по всему объему клетки. Другие фер- менты связаны с мембранами или существуют в виде ассоциа- тов с другими веществами, с которыми они образуют надмоле-
Химические основы жизни 79 Одно цепочечный йеной (миоглойин) ЦК- Тан- тиларал- лельный складча- тый лист) РИС. 2.14. Два основных типа структур белков и их варианты — фибрилляр- ные (а) и глобулярные (б). Олигомерный белок, построенный из четырех субъединиц (гемоглобин) S) Гло5улярнь/е оелки кулярные агрегаты. Некоторые связанные с мембранами белки, называемые пермеазами, помогают транспортировать специфи- ческие питательные вещества в клетку. Другие белки являются структурными элементами клеточных мембран, а ряд белков выполняет двигательные функции. У мно- гих одноклеточных организмов имеются небольшие образования, по форме напоминающие волоски, которые называются жгути- ками. Эти жгутики движутся под действием способных сокращаться белков, обеспечивая тем самым перемещение всей
80 Глава 2 Таблица 2.6. Различные биологические функции белков Белок Функция или источник выделения Ферменты (биологические катали- заторы) глюкозоизомераза трипсин алкогольдегидрогеназа РНК-поли мер аза Регуляторные белки /ас-репрессор белок — активатор катаболизма ай Изомеризация глюкозы во фруктозу Гидролиз некоторых пептидов Окисление спиртов до альдегидов Катализ синтеза РНК Регуляция синтеза РНК Подавление синтеза РНК за счет катаболизма интерфероны Индуцирование устойчивости к ви- русам инсулин гормон роста быка Транспортные белки лактозопермеаза Регуляция метаболизма глюкозы Стимулирование роста и лактации Транспорт лактозы через клеточные мембраны миоглобин гемоглобин Защитные белки крови позвоночных антитела Транспорт О2 в мышцах Транспорт О2 в крови Образование комплексов с чужерод- ными молекулами тромбин Участие в механизмах свертывания крови Токсины токсин Bacillus thuringiensis токсин ST Е. coll токсин Clostridium, botulinum Токсичен для насекомых Вызывает заболевания свиней Вызывает заражение пищевых про- дуктов Резервные белки овальбумин казеин зеин Сократительные белки динеин Структурные белки коллаген гликопротеины эластин Яичный белок Белок молока Белок кукурузных зерен Реснички и жгутики Хрящи, сухожилия Стенки и оболочки клеток Связки клетки. Другие нитевидные и трубчатые придатки, называемые фимбриями, участвуют в инициировании связывания патоген- ных бактерий с чувствительными к ним тканями. Белки выделяют, очищают и характеризуют различными фи- зическими и химическими методами. Методы разделения белков (гл. 11) основаны на различиях в их молекулярных свойствах, которые в свою очередь частично определяются природой со- ставляющих их аминокислот; последним мы и посвятим следую- щий раздел.
Химические основы жизни 8Г 2.4.1. Белковые аминокислоты и полипептиды Мономерными звеньями полипептидов являются сс-аминокис- лоты общей формулы Н h2n—С—соон I Таким образом, аминокислоты различаются природой группы R,. связанной с а-углеродным атомом (соседним с карбоксильной группой). Поскольку в общем случае все заместители у этого атома углерода различны (за исключением глицина, у которого R = H), этот углеродный атом асимметричен. Многие биологически важные органические соединения, в том числе сахара и аминокислоты, оптически активны, т. е. обладают по меньшей мере одним асимметрическим атомом углерода и поэтому могут существовать в двух формах, как это показано ниже на примере аминокислот: н Г H2N -с .-соон R L-форма н ! ноос- с- nh2 R D-форма Раствор одного изомера вращает плоскость поляризации света вправо (правая или d-форма) или влево (левая или Z-форма). Оптическая изомерия представляет собой чрезвычайно важное явление, поскольку при отсутствии ферментов, превра- щающих один изомер в другой, живые организмы могут усваи- вать только один из изомеров. Ферменты, как правило, также катализируют превращения только одного из оптических изо- меров. Это свойство ферментов используется в промышленности для разделения смесей рацемических ациламинокислот, когда гидролизу подвергается только один из изомеров, так что в про- дуктах реакции содержатся два существенно различающихся и, следовательно, легче разделяемых вещества. Подробнее этот процесс мы рассмотрим в гл. 4. Поскольку метод прямого фи- зического разделения оптических изомеров дорог и неэффек- тивен, подобные микробиологические и ферментативные (а так- же химические) способы разделения могут оказаться гораздо более выгодными. Интересно, что в подавляющем большинстве белков найдены только ь-изомеры аминокислот, о -Аминокислоты в природных 6—537
Циклические Число атомов углерода в группе д Jo 1 2 з 4 н— сн,— сн3 СН — сн3 сн3 \н—сн2— СНз глицин (Gly; й) аланин (Ala; А) Валин (Vai; V) лейцин (Leu; L) триптофан (Ггр, или Try, W) 0 1 2 НО-СН2- I СН--СН- серин треонин (Ser; Sj (Thr; Т) Mb \ ' с-сн, о4 аспарагин (Азп; Л9 ~0 \ с-сн,- о7/ ' аспарагиновая кислота (Asp; D) Й5-СН2- цистеир (Cys‘}C) СИ,—S—сн2—сн2— метионин (Met; М) Ml, \ ' с—сн2—сн2 o/z глутамин (Gin; 0.) Фенилаланин (Phe; Г) сн,—сн,—сн — I СН3 изолейцин (Не; I) ~о С-СИ,-СН,- +H,N-(CH,).- // i О глутаминовая лизин кислота (Lys; К) (Glu; Е) h2N-C-NH-(CH2)3~ М12‘ аргинин (Ary ; R) НС=С-СН2- 4 HN NH ¥ н гистидин (His; Н) н2 о // Другие § 5s I с- H2C^N/ Xj| О' Н пролин (Pro; Р) (изображена веб молекула)
Химические основы жизни 83 источниках встречаются редко; они были обнаружены в клеточ- ных стенках некоторых микроорганизмов и в ряде антибиотиков. Кислотная (—СООН) и основная (—NH2) группировки ами- нокислот в водных растворах могут подвергаться ионизации. Таблица 2.7. Величины рК (—1g К) концевых аминных и карбоксильных групп, а также группировок в боковых цепях Ra Аминокислота рК1 а-СООН рА'а a-NH2 pKR группа R Глицин 2,34 9,6 Аланин 2,34 9,69 Лейцин 2,36 9,60 Серин 2,21 9,15 Треонин 2,63 10,43 Глутамин 2,17 9,13 Аспарагиновая кислота 2,09 9,82 3,86 Глутаминовая кислота 2,19 9,67 4,25 Гистидин 1,82 9,17 6,0 Цистеин 1,71 10,78 8,33 Тирозин 2,20 9,11 10,07 Лизин 2,18 8,95 10,53 Аргинин 2,17 9,04 12,48 а Воспроизведено из работы: Lehninger A. L., Biochemistry, 2d ed., Table 4-2, Worth Publishers, Inc., New York, 1975; есть перевод более раннего издания: Ленинджер А., Биохимия.— М.: Мир, 1976. Аминокислота несет положительный заряд (катион) при низ- ких значениях pH и отрицательный заряд (анион) при высо- ких pH. При некотором промежуточном значении pH амино- кислота представляет собой биполярный ион (цвиттер-ион) с нулевым результирующим зарядом. Эта величина pH назы- вается изоэлектрической точкой и определяется природой за- местителя R (табл. 2.7). В изоэлектрической точке аминокис- лота под влиянием электрического поля не способна мигриро- вать ни к аноду, ни к катоду, и, кроме того, ее растворимость минимальна. На этих свойствах аминокислот основаны такие методы разделения смесей, как ионный обмен, электродиализ и электрофорез (гл. 11). На рис. 2.15 приведены формулы 20 аминокислот, обычно встречающихся в белках. Помимо характерных для всех ами- РИС. 2.15. 20 белковых аминокислот. 6* '
84 Глава 2 нокислот карбоксильной и аминной (кроме пролина) групп не- которые из них содержат ионизирующиеся группы и в заме- стителе R. Для одних аминокислот типичны неполярные гидро- фобные группы R, в других заместители R обладают гидро- фильными свойствами. Как мы увидим в следующем разделе, природа этих боковых цепей важна с точки зрения как функции белка, так и его структуры. Простые белки представляют собой полимеры, образующие- ся путем конденсации одних только аминокислот. Реакция кон- денсации, лежащая в основе синтеза белков, осуществляется между аминогруппой одной аминокислоты и карбоксильной группой другой и приводит к образованию пептидной связи-. но но I II г..- | || Н—С-т ОН + Н—N С—ОН ZC\ ... XCZ н R, Н R2 Пептидная связь частично имеет характер двойной связи, по- этому шесть атомов (на схеме они лежат внутри прямоугольни- ка, ограниченного штриховыми линиями) расположены в одной плоскости. Запомните, что каждая аминокислота соединяется с последующей пептидной связью, поэтому вся белковая цепь может строиться с помощью одного фермента; в то же время порядок расположения аминокислот определяется другими ме- ханизмами (гл. 6). Название образовавшегося в результате возникновения пеп- тидной связи фрагмента (аминокислотного остатка) производят от названия соответствующей аминокислоты путем добавления окончания ил; например, остатками глицина и аланина явля- ются глицил и аланил соответственно. Перечисление остатков в олигопептиде начинают с конца, несущего свободную амино- группу. Полипептиды представляют собой сравнительно короткие цепи, построенные из аминокислотных остатков (рис. 2.16). По- нятно, что по мере увеличения длины цепи физико-химические свойства полимера все в большей степени будут определяться природой групп R аминокислотных остатков, а роль концевых аминной и карбоксильной групп будет все менее и менее важ- ной. Полипептидами принято называть относительно небольшие
Химические основы жизни 85 полиаминокислотные цепи. Многие полипептиды имеют большое биологическое значение; в частности, к числу полипептидов относится ряд гормонов, например инсулин, гормон роста и со- матостатин. Большие полиаминокислотные цепи называют белками-, гра- ница между полипептидами и белками строго не определена; обычно считают, что она лежит в пределах 50—100 аминокис- лотных остатков. Поскольку средняя молекулярная масса ами- соо" р— f . + HN==\ СОО" I 7-8 H3N\ н к сх I сн I сн2 6 сн2 II I сн2 СН2 I сн2 сн2 сн2 I СН3 I Н з- N I .СОО" С^ I Н н о сн I NH NH X 12-13 4* nh2 Gly-Asp-Lys-Glu-Arg-His-Ala РИС. 2.16. Гипотетический полипептид с различными ионизированными груп- пами. Запомните, что перечисление аминокислотных остатков начинают с N-конца последовательности. Числа возле каждой ионизированной группы указывают соответствующие величины рК. нокислотного остатка составляет около 120, то молекулярная масса белков должна превышать 10 000; известны отдельные белки с молекулярной массой более миллиона. Аминокислотный состав какого-либо белка или смеси белков может быть определен с помощью автоматического аминокис- лотного анализатора. Полный гидролиз белка осуществляют нагреванием в 6 н. НС1 в течение 10—24 ч при 100—120°C. При этом с количественным выходом в виде гидрохлоридов обра- зуются все аминокислоты (за исключением триптофана, аспара- гина и глутамина); их разделяют и определяют количественно. Для определения содержания триптофана можно применить ще- лочной гидролиз. Результаты такого изучения белков из ки- шечной палочки Е. coli приведены в табл. 2.8. Эти и ряд других данных показывают, что не все 20 аминокислот (перечислен- ных на рис. 2.15) входят в состав любого белка. Ни в одном известном белке аминокислоты не содержатся в эквимолярных количествах. Для любого конкретного белка, однако, относи-
86 Глава 2 тельные количества различных аминокислот представляют со- бой строго определенные величины. Аминокислоты не являются единственными компонентами белков. В состав многих сложных белков входят другие орга- нические или даже неорганические группировки, называемые простетическими группами. Если белок построен только из ос- татков аминокислот, его иногда, как уже упоминалось выше, называют простым белком. Широко известный пример сложных Таблица 2.8. Относительные количества различных аминокислот в белках Е. coli3- Аминокислота Относительное со- держание (содержа- ние аланина принято равным 100) Аминокислота Относительное со- держание (содержа- ние аланина принято равным 100) Аланин 100 Треонин 35 Глутаминовая Пролин 35 кислота и глу- Изолейцин 34 тамин 83 Метионин 29 Аспарагиновая Фенилаланин 25 кислота и аспа- Тирозин 17 рагин 76 Цистеин 14 Лейцин 60 Триптофан 8 Глицин 60 Гистидин 5 Лизин 54 Серин 46 Валин 46 Аргинин 41 а Воспроизведено из работы: Lehninger A. L., Biochemistry, 2d ed.. Table 5-3, Worth Publishers, Inc., New York, 1975; есть перевод более раннего издания: Ленинджер А., Биохимия. — М.: Мир, 1976. белков представляет гемоглобин— переносчик кислорода в крас- ных кровяных тельцах,— в состав молекулы которого входят четыре группировки гема, представляющие собой железосодер- жащие металлоорганические комплексы. В близком по струк- туре, но меньшем по молекулярной массе миоглобине имеется один гем. Каждая молекула фермента оксидазы с-аминокислот, катализирующей дезаминирование ряда ь-аминокислот, содер- жит два остатка флавинадениндинуклеотида (FAD) (см. рис. 2.9). Как указывалось выше, простетической группой рибосом можно считать РНК. 2.4.2. Структура белков Способность белков выполнять множество специфических функций (табл. 2.6) большей частью обусловлена тем обстоя- тельством, что белки могут существовать в самых различных
Химические основы жизни 87 конформациях. В целях облегчения анализа строения белков принято подразделять их структуру на три уровня, а при нали- чии нескольких полипептидных цепей рассматривают еще и чет- вертый уровень. Приведенные в табл. 2.9 данные показывают, Таблица 2.9. Структура белков 1. 2. 3. 4. Первичная Вторичная Третичная Четвертичная Последовательность аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями Способ расположения полимерной цепи в прост- ранстве, обусловленный главным образом водо- родными связями между сравнительно близко расположенными в последовательности аминокис- лотными остатками Складывание и сгибание полипептидной цепи, обусловленное водородными, ионными и ковалент- ными (дисульфидными) связями, а также гидро- фобным и гидрофильным взаимодействиями Характер упаковки полипептидных цепей (субъ- единиц); структура стабилизируется теми же си- лами, что и третичная что каждый структурный уровень определяется различными факторами, которые в сумме обеспечивают все разнообразие структур и функций белков. 2.4.3. Первичная структура Под первичной структурой белка подразумевают свойствен- ную ему последовательность аминокислотных остатков. Первым белком, у которого удалось выяснить полную первичную струк- туру, был инсулин (Сэнджер и сотрудники, 1955 г.). Теперь можно считать доказанным, что для любого белка характерен не только определенный аминокислотный состав, но и специфи- ческая аминокислотная последовательность. Как мы увидим ниже (разд. 6.1), эта последовательность определяется нуклео- тидной последовательностью ДНК. Детальное изучение методов определения аминокислотной последовательности не входит в цели настоящей книги, поэтому мы ограничимся только самыми общими сведениями. Существу- ет много методов расщепления белка на различные полипептид- ные фрагменты. Известны, например, ферменты, способные рас- щеплять связи между строго определенными аминокислотными остатками. Определить аминокислотную последовательность об- разующихся относительно коротких полипептидных цепей мож- но далее с помощью методов, разработанных Сэнджером и дру- гими исследователями. Известные частично перекрывающиеся последовательности фрагментов белка затем комбинируют та- ким образом, чтобы в конце концов получить полную картину,
88 Глава 2 характеризующую аминокислотную последовательность всего белка. На автоматических приборах для определения амино- кислотной последовательности в белках (секвенаторах) с вра- щающимся реакционным сосудом можно последовательно опре- делить до 100 аминокислотных остатков в цепи; для опреде- ления одного остатка требуется около 2 ч. Предложенный недавно газофазный метод позволил значительно снизить коли- чество белка, необходимое для определения его аминокислотной последовательности. Например, для выяснения полной первич- ной структуры полипептида, состоящего из 50 аминокислотных остатков, на газофазном секвенаторе требуется 50—100 пико- молей вещества, а на анализаторе с вращающимся сосудом 1—5 наномолей вещества. Как мы увидим позднее в гл. 6, ами- нокислотная последовательность белка может быть выяснена и косвенным путем на основе результатов экспериментального определения нуклеотидной последовательности соответствующе- го гена. В настоящее время известна аминокислотная последователь- ность многих полипептидов и белков. Пока что в белках не было обнаружено повторяющихся участков с идентичными по- следовательностями, хотя некоторые данные позволяют пред- положить, что подобная картина возможна для ряда фибрил- лярных белков. В качестве примера на рис. 2.17 приведена аминокислотная последовательность фермента из яичного бел- ка, называемого лизоцимом. Как мы уже неоднократно отме- чали, нумерация аминокислотных остатков начинается с N-koh- цевого, в данном случае лизина, и завершается С-концевым остатком, которым в этом ферменте является лейцин. Боковые цепи аминокислотных остатков взаимодействуют друг с другом и с непосредственным окружением белка, тем самым определяя геометрическую конфигурацию белковой мо- лекулы. Складывание полипептидной цепи в строго определен- ную трехмерную структуру приводит к белковой молекуле сложной, запутанной формы типа изображенной на рис. 2.17, б для случая лизоцима. Такое сложное пространственное строение белка детерминируется в первую очередь его первичной струк- турой. Значимость первичной структуры белков становится особен- но очевидной, если учесть, что она в свою очередь определяется клеточной системой кодирования (разд. 6.1). Таким образом, аминокислотная последовательность белков является как бы тем звеном, которое соединяет главный командный центр клет- ки, ДНК, со сложными, высокоспецифичными молекулами бел- ков, осуществляющими и регулирующими разнообразные био- химические процессы, необходимые для роста и выживания клетки.
РИС. 2.17. а — аминокислотная последовательность или первичная структура фермента яичного белка лизоцима; б — трехмерная (третичная) структура мо- лекулы кристаллического лизоцима. [Воспроизведено с разрешения автора и издательства из работы: Blake С. С. F., Structure of Hen Egg-White Lysozyme; Nature, 206, 757 (1965).]
90 Глава 2 2.4.4. Пространственная структура белков; вторичная и третичная структуры Под вторичной структурой белков понимают относительное расположение в пространстве аминокислотных остатков, зани- мающих соседние положения в аминокислотной последователь- ности. Напомним, что частичная двоесвязность амидной связи обусловливает ее планарность. По этой причине вращение воз- можно только вокруг двух из каждых трех связей пептидной цепи (рис. 2.18), что ограничивает число конформаций, которые может принимать короткий участок цепи. РИС. 2.18. Планарная природа пептидной связи ограничивает вращение во- круг связей пептидной цепи. (Воспроизведено из работы: Lehninger A. L., Biochemistry, 2d ed., р. 128, Worth Publishers, New York, 1975; есть перевод более раннего издания: Ленинджер А., Биохимия. — М.: Мир, 1976.) Как мы уже отмечали (рис. 2.14), существуют две основные формы вторичной структуры белков: а-спираль и 0-структура (0-слой). Считается, что конформация фибриллярных белков волос, шерсти и ряда других объектов стабилизируется водо- родными связями между атомами соседних аминокислотных остатков. При свертывании белковой цепи в спираль возможно образование таких же связей между группой —С=О одного остатка и группой —NH другого, отделенного от первого тремя аминокислотными остатками. Такое связывание без существен- ной деформации связей и углов полипептидной цепи возможно только при одной конформации, называемой а-спиралъю. Пред- полагается, что в молекуле коллагена, самого распространен- ного белка высших животных, имеются три а-спиральных участ- ка, объединенных в одну суперспираль. Жесткие и относительно малоэластичные молекулы коллагена выполняют механическую (опорную) функцию. Коллаген обнаружен в коже, сухожилиях, роговице глаза и многих других органах; он важен в иммоби-
Химические основы жизни 91 лизании ферментов и клеток и как составляющая часть био- совместимых материалов. Водородные связи не отличаются высокой прочностью, по- этому а-спиральные структуры легко разрушаются. Белки мо- гут терять спиральную структуру в водных растворах в резуль- тате конкурентного образования водородных связей с молеку- лами воды. Если волокна шерсти обработать паром и растянуть, то белки шерсти принимают иную конформацию, называемую ^-структурой (fi-слоем, складчатым слоем). Последняя харак- терна для нативных белков волокна шелка. ^-Структура также стабилизирована водородными связями, однако в этом случае они возникают между соседними параллельными цепями. Для этой структуры характерны гибкость и в то же время высокая устойчивость к растяжению. Свойства вторичной структуры фибриллярных белков ис- пользуются в пищевой промышленности. Некоторые пищевые продукты растительного происхождения, например соевые бобы, являются ценными источниками незаменимых аминокислот; в то же время они не обладают консистенцией и текстурой мясных продуктов. Для придания им этих качеств растворенные гло- булярные белки перерабатывают в так называемый «тексту- рированный белок» путем их трансформации в структуры, более близкие к линейным. В результате чрезвычайно трудоемких и сложных экспери- ментов удалось определить полное пространственное строение (третичную структуру) нескольких белков. Для этой цели вы- ращивали кристаллы чистого белка, которые затем изучали методом рентгеноструктурного анализа. В результате рассеяния рентгеновских лучей на атомах образуется сложная дифракци- онная картина, которая содержит информацию о деталях строе- ния белка при разрешении до 2 А. Дешифровка этой информа- ции в случае миоглобина (рис. 2.19) потребовала расчета 10 000 рядов Фурье, поэтому выяснение строения белков этим методом в общем случае целесообразно только при условии использования высокоэффективных компьютеров. Как показано на рис. 2.17,6 и 2.19, третичная структура белков, особенно глобулярных, чрезвычайно сложна. На ука- занных рисунках без труда можно найти области со спиральной вторичной структурой, а в молекуле лизоцима, кроме того, име- ются и участки с ^-структурой. Каким путем стабилизируются эти структуры и какой цели служит класс соединений, молекулы которых обладают таким разнообразным строением? Взаимодействия между боковыми группами R, удаленными друг от друга в аминокислотной последовательности белков, определяют характер складывания или изгиба белковой цепи с образованием компактных конфигураций, типичных для гло-
92 Глава 2 булярных белков. Трехмерная структура белка формируется в первую очередь за счет некоторых слабых взаимодействий, в том числе ионных и водородных связей, а также гидрофобного взаимодействия между неполярными группами R (рис. 2.20). Подобно рассмотренным ранее мицеллам, образующимся из липидов, у многих глобулярных белков гидрофобные остатки сконцентрированы во внутренней части молекулы, а более гид- рофильные группировки располагаются на ее поверхности. Та- РИС. 2.19. Трехмерная структура миоглобина. Точками указаны положения а-углеродных атомов 121 аминокислотного остатка в этом белке, выполняю- щем функцию переносчика кислорода. В середине верхней части молекулы более крупным кружком выделен атом железа, расположенный в центре един- ственного гема белка. (Воспроизведено из работы: Edwards N. A., Hassall К. А., Cellular Biochemistry and Physiology, p. 57, McGraw-Hill Publishing Co., Ltd., London, 1971.) кая конформация, иногда называемая моделью масляной капли, вероятно, наиболее устойчива в естественной для нативных бел- ков водной среде. (Чем, по вашему мнению, отличается от опи- санной структура белка, входящего в состав клеточной мемб- раны?) В биохимической технологии со многих точек зрения чрез- вычайно важно понять, что эти слабые взаимодействия легко нарушаются при различных изменениях окружающей среды. В биологических системах энергия водородной связи составляет от 3 до 7 ккал/моль, а энергия ионной связи обычно равна 5 ккал/моль, поэтому уже умеренное нагревание может нару- шить некоторые из этих связей. Изменение pH, ионной силы,
Химические основы жизни 93 РИС. 2.20. Различные типы связей и взаимодействий, стабилизирующих мо- лекулярную структуру белка. (Из работы: Лёви А., Сикевиц Ф., Структура и функция клетки.—М.: Мир, 1971, с. 245.) физические воздействия и добавки органических веществ, оче- видно, также могут нарушать третичную структуру белков, свой- ственную им в нативной форме. В создании устойчивых конформаций белков важную роль играют также ковалентные связи, особенно часто образующие- ся между двумя остатками цистеина. Дисульфидная связь обра- зуется между двумя группами —SH путем элиминирования двух атомов водорода: —NH—СН—СО— —NH—СН—СО— сн2 сн2 I I SH —2Н S + ---> . | <- Дисульфидная связь SH S сн2 сн2 —NH—СН—СО— —NH—СН—СО — Дисульфидные мостики играют роль поперечных связей в по- липептидной цепи, а иногда они связывают две различные це- пи; молекула инсулина, например, представляет собой две це- пи, содержащие 21 и 30 аминокислотных остатков, соединенные-
94 Глава 2 двумя дисульфидными связями; третий дисульфидный мостик образует внутреннюю поперечную связь в короткой цепи (рис. 2.21). По сравнению с указанными выше слабыми связя- ми дисульфидные ковалентные мостики более устойчивы к тер- мическому воздействию. В то же время дисульфидные связи легко восстанавливаются избытком сульфгидрильных соедине- ний, например ^-меркаптоэтанолом. в Ser—Leu—' t—-яCys-Vai I NH» внутри- I _____________) 1*2 целочеч- J I ная связи Д I Gly—Leu—Vai —Glu—Glu —Cvs Ser •Туг Glu—NH2 Leu Glu ------------'I I Cys Phe NH2 NH^_________ Vai Asp—Glu—His—L eu—Cys ----Ala почечная >язь Asp—NH2 Туг Gly Se/ His' Leu xnh2 Cys—As/ J Д Нежцедочв' чная Туг—Leu—Vai —Cys—Gly—Glu Vai. । Glu—Ala [Ala—Lys—Pro j Arg ^Gly Phe' РИС. 2.21. Дисульфидные мостики связывают две пептидные цепи, называе- мые цепью А (21 аминокислотный остаток) и цепью В (30 остатков), в изобра- женной здесь молекуле бычьего инсулина; инсулины других видов животных построены аналогичным образом. Обратите внимание на третью внутрицепо- чечную дисульфидную связь между двумя остатками короткой цепи А. (Вос- произведено из работы: Reithel F. J., Concepts in Biochemistry, p. 237, McGraw- Hill Book Co., New York, 1967.) Конформация белка в существенной степени определяет его биологическую активность. Многочисленные эксперименталь- ные факты свидетельствуют о том, что во многих случаях бе- лок способен выполнять свойственную ему функцию, только находясь в определенной трехмерной структуре. Этот принцип, в частности, положен в основу так называемой модели «замка и ключа», достаточно наглядно объясняющей высокую специ- фичность белковых ферментов, катализирующих биохимические превращения. Известно, что данный фермент способен превра- щать только определенные соединения, называемые субстрата- ми. Согласно модели замка и ключа (рис. 2.22), фермент обла- дает специфическим участком («замком»), который по своей структуре комплементарен молекуле субстрата («ключу»), по- этому с ферментом могут связываться (и, следовательно, под-
Химические основы жизни 95 вергаться дальнейшим каталитическим превращениям) только субстраты, обладающие необходимой пространственной струк- турой. Полученные в ходе изучения третичной структуры бел- ков данные не только подтвердили эту гипотезу, но и помогли глубже понять механизм каталитического эффекта ферментов; на этой теме мы остановимся подробнее в следующей главе. Неоднократно показано, что непосредственная связь между пространственным строением белков и их высокоспецифически- Активный центр фермента Комплекс (pep- мент-субстрат Продукты Сбододный рермент РИС. 2.22. Упрощенная схема модели ферментативного катализа типа «замок и ключ». Здесь форма каталитически активного центра фермента (замка) комплементарна форме субстрата (ключа). (Воспроизведено из работы: Pelc- zar М. J., Jr., Reid R. D., Microbiology, 3d ed., p. 158, McGraw-Hill Book Co., New York, 1972.) ми взаимодействиями с другими веществами характерна также для пермеаз, гормонов, антител и других белков. Если белок находится в условиях, отличающихся от его обычного биологического окружения, он может подвергаться структурным изменениям, которые обычно сопровождаются по- терей его функциональных свойств (рис. 2.23); этот процесс называют денатурацией. Денатурация может быть вызвана,, например, относительно небольшими изменениями pH и темпе- ратуры раствора; в этом случае, как правило, она не сопро- вождается разрушением ковалентных связей. При медленном охлаждении разбавленного раствора денатурированного белка до свойственной ему в природных условиях температуры часто происходит обратный процесс, называемый ренатурацией, со- провождающийся восстановлением функции белка. Как и в случае многих других превращений, повышение температуры способствует росту энтропии (разупорядоченности) и, следова- тельно, разрушению глобулярных структур белков; охлаждение благоприятствует осуществлению взаимодействий, обеспечива- ющих компактную структуру белка и его ренатурацию.
96 Глава 2 Принимаемая белком и определяющая его свойства конфор- мация характеризуется минимумом свободной энергии молеку- лы. Пока что эту концепцию нельзя использовать для предска- зания структуры и функции белка, если известна только его аминокислотная последовательность. Она может, однако, ока- заться полезной в тех случаях, когда необходимо высказать обоснованные предположения об изменении свойств белка в условиях конкретного технологического процесса (которые часто существенно отличаются от условий существования на- ЛатиВная КлуВок (неупорядо- форма ценная структура) <рорма РИС. 2.23. Денатурированный под влиянием тех или иных факторов бе- лок часто может вновь принять на- тивную биологически активную кон- формацию, как только действие этих факторов прекращается. Такого рода эксперименты показывают, что пер- вичная структура белка определяет его вторичную и третичную структу- ры. (Воспроизведено из работы: Leh- ninger A. L., Biochemistry, 2d ed„ р. 62, Worth Publishers, New York, 1975; есть перевод более раннего из- дания: Ленинджер А., Биохимия.— М.: Мир, 1976.) дивного белка) или в результате частичного изменения его аминокислотной последовательности. В частности, эта концеп- ция помогает понять, почему связанный с твердой поверхностью фермент менее активен, чем тот же фермент в растворе. В настоящей главе много внимания было уделено связи между строением белков и их функцией. В то же время не сле- дует забывать, что в силу слабости большинства взаимодейст- вий и связей, стабилизирующих молекулы белков, реальные конформации последних могут в существенной степени откло- няться от некоторой характерной усредненной конформации. Более того, эта способность белков в ряде случаев тесно свя- зана с их биологической функцией подобно тому, как биологи- ческая функция ДНК определяется ее способностью разделять- ся в изотермических условиях внутри клетки на две цепи. С точки же зрения биохимика-технолога относительная лег- кость термической или химической денатурации многих белков говорит в первую очередь о том, что ферментативные и клеточ- ные процессы можно регулировать путем изменения, например pH, температуры и ионной силы, только в довольно узких пре-
Химические основы жизни 97 делах. Денатурацию полезно учитывать и в некоторых других случаях, например при выделении белков (гл. 11) ив конст- рукциях стерилизаторов (гл. 7 и 9). 2.4.5. Четвертичная структура и регулирование биологических процессов Белки могут быть построены из нескольких полипептидных цепей (субъединиц); из таких белков наиболее широко извес- тен, по-видимому, гемоглобин. Под четвертичной структурой белка понимают способ упаковки субъединиц. Как видно из приведенных в табл. 2.10 данных, множество белков, в особен- ности ферментов (обычно их названия оканчиваются суффиксом -аза), представляют собой олигомеры и поэтому должны обла- дать характерной четвертичной структурой. Считается, что чет- вертичная структура стабилизируется теми же силами и связя- ми, что и третичная. Иногда, как в случае инсулина, в обра- зовании четвертичных структур участвуют дисульфидные свя- зи, однако в большинстве приведенных в табл. 2.10 примеров субъединицы удерживаются в олигомерной молекуле белка за счет более слабых взаимодействий. Известно, что многие оли- гомерные белки способны к самоконденсации\ так, например, разделенные а- и [1-цепи гемоглобина в растворе быстро ассо- циируют с образованием молекул интактного гемоглобина. Это свойство белков чрезвычайно показательно в том смысле, что оно свидетельствует (по меньшей мере в некоторых случаях) об определяющей роли биохимического одномерного кода ДНК, который характеризует не только первичную структуру белков, но и посредством ее все высшие структурные уровни белков, а следовательно, и их специфические биологические функции. Имеющиеся в настоящее время данные показывают, что построение молекул некоторых белков из нескольких субъеди- ниц обеспечивает выполнение по меньшей мере двух важных биологических функций: во-первых, регулирует каталитическую активность ферментов и, во-вторых, создает широкие возмож- ности для построения родственных, но не идентичных молекул из одного и того же набора субъединиц. Иллюстрацией послед- ней функции могут служить белки, называемые изофермента- ми или изозимами. Изоферменты представляют собой различ- ные молекулярные формы фермента, катализирующие одну и ту же реакцию в организмах одного вида. Существование изо- ферментов само по себе может показаться ненужным, однако на самом деле доступность параллельных, но различных ката- литических процессов является важным элементом ряда систем биохимической регуляции (гл. 3 и 5). Известно, что некоторые изоферменты представляют собой олигомерные белки; описан 7—537
98 Глава 2 Таблица 2.10. Характеристики некоторых олигомерных белкова Белок Молекулярная масса Число поли- пептидных цепей Число ди- сульфидных связей Инсулин 5798 1+1 3 Рибонуклеаза 13 683 1 4 Лизоцим 14 400 1 5 Миоглобин 17 000 1 0 Папаин 20 900 1 3 Трипсин 23 800 1 6 Химотрипсин 24 500 3 5 Карбоксипептидаза 34 300 1 0 Гексокиназа 45 000 2 а Такаамилаза 52 000 1 4 Альбумин сыворотки быка 66 500 1 17 Енолаза дрожжей 67 000 2 0 Гемоглобин 68 000 2+2 а Алкогольдегидрогеназа из печени 78 000 2 а Щелочная фосфатаза 80 000 2 4 Гемэритрин 107 000 8 а Глицеральдегидфосфатдегидроге- наза 140 000 4 а Лактатдегидрогеназа 140 000 4 0 у-Глобулин 140 000 2-f-2 25 Алкогольдегидрогеназа из дрожжей 150 000 4 О' Триптофансинтетаза 159 000 2+2 Альдолаза 160 000 4(?) 0 Фосфорилаза b 185 000 2 Треониндезаминаза из сальмонелл 194 000 4 Фумараза 200 000 4 0 Триптофаназа 220 000 8 4 Формилтетрагидрофолатсинтетаза 230 000 4 Аспартаттранскарбамилаза 310 000 4+4 0 Глутаматдегидрогеназа 316 000 6 0 Фибриноген 330 000 2+2+2 Фосфорилаза а 370 000 4 Миозин 500 000 2+3 0 [ГГалактозидаза 540 000 4 Рибулозодифосфаткарбоксилаза 557 000 24 а Воспроизведено с разрешения из работы: Лёви А., Сикевиц Ф., Структура и функ- ция клетки. — М.: Мир, 1971. случай изоферментов, построенных из пяти субъединиц только1 двух типов. Подобную конструкцию можно считать выгодной и целесообразной, поскольку она позволяет синтезировать пять различных белков всего лишь из двух полипептидных цепей. 2.5. Биохимические соединения смешанного строения Существует много веществ биологического происхождения, представляющих интерес с научной или практической точки зрения, которые трудно отнести к одному из рассмотренных в
Химические основы жизни 99 предыдущих разделах классов соединений. Эти вещества име- ют смешанное строение и сформированы из остатков липидов, сахаров и аминокислот в различных сочетаниях. Как указано в табл. 2.11, соединения смешанного строения выполняют ряд важных биологических функций. В следующем разделе мы бо- Таблица 2.11. Некоторые примеры биохимически важных соединений смешанного строения, их основных элементов структуры и биологических функций Название Элементы структуры Локализация в клетке, функция Пептидогликаны Связанные поперечными связями дисахариды и пептиды Стенки клеток бактерий Протеогликаны Углеводы (95%) и белки (5%) Соединительные ткани Гликопротеины Углеводы (1—30%), остальное — белки Находятся в различных объектах, в том числе в антителах; являются компонентами наружных оболочек эукариот Гликолипиды Липиды, содержащие от 1 до 7 остатков сахаров Компоненты мембран Липопротеины В липопротеинах плазмы от 1 до 50% белков, остальное — липиды Мембраны, компоненты плазмы крови Липополисахариды Липид и в высшей сте- пени вариабельная оли- госахаридная цепь Наружные оболочки грамотрицательных бактерий лее детально обсудим химию и строение наружных оболочек различных клеток; здесь встречаются смешанные соединения, а также специфические полисахариды и белки. 2.5.1. Клеточные стенки; пептидогликаны и липополисахариды В разделе, посвященном липидам, мы уже говорили о том, что клеточные мембраны играют жизненно важную роль в ре- гуляции транспорта веществ в клетку и из клетки. В этом от- ношении не менее важны и другие структурные элементы на- ружных поверхностей клеток микроорганизмов и тканей. С точ- ки зрения условий существования микроорганизмы, например бактерии, живут в гораздо более изменчивом и менее контро- лируемом окружении, чем клетки тканей животных, например клетки печени, поэтому микроорганизмы должны обладать го- раздо большей жесткостью, устойчивостью к физическим на- грузкам и резким изменениям осмотического давления. Отсюда следует, что по структуре наружные оболочки бактерий долж- ны сильно отличаться от клеток животных. 7*
100 Глава 2 В процессах биохимической технологии оболочки клеток представляют интерес в нескольких аспектах. Во-первых, свой- ства наружных поверхностей клеток определяют их способность к адгезии друг с другом, а также со стенками реакторов, тру- бопроводов и сепараторов. Как мы увидим в последующих гла- вах, такие явления необходимо учитывать при получении им- мобилизованных клеточных катализаторов. Они влияют также на работу микробных реакторов непрерывного действия и на процессы отделения клеток от жидкости. Химические и меха- нические характеристики оболочек определяют также устойчи- Жгутик (спираль диаметром (2-78 нм) Ресничка (диа- метром 4-35 нм) •UM (толщиной-8 нм) Грамположи-' тельная РИС. 2.24. Схематическое изображение структуры стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий. Обозначения: ЦМ — цитоплазматическая мем- брана; ПГ — пептидогликан; ПП — периплазматическое пространство; ВМ — внешняя мембрана. (Воспроизведено из работы: Stanier R. ¥., Adelberg Е. А., Ingraham J. L., Wheelis М. L., Introduction to the Microbial World, p. 128, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.Y. 1979.) Капсула (различ- ной толщина/) ПГ (толщиной J5-80 нм) Грамотрица- тельная Капсула (различной толщины) ВМ (толщиной-8 нм) КГ (толщиной -2 нм) ПП (толщиной -7 нм) ЦМ (толщиной-8 нм) вость клетки к воздействию физических, ферментативных и хи- мических факторов, что существенно в процессах выделения компонентов клетки. Как уже упоминалось выше при обсуждении реакции Грама, структуры оболочек грамположительных и грамотрицательных клеток сильно отличаются друг от друга (рис. 2.24). У тех и у других оболочки состоят из нескольких слоев, но их положение, толщина и состав далеко не идентичны. На этом рисунке не показаны различные белки, находящиеся внутри клеточной мембраны или закрепленные на ее поверхности; их мы рассмот- рим ниже, в гл. 5, в ходе изучения транспорта веществ через мембраны. Грамположительные бактерии имеют одну мембрану, а грамотрицательные клетки — две аналогичные мембраны. Меж- ду наружной и цитоплазматической мембранами в грамотрица-
Химические основы жизни 101 тельных бактериях находится область, называемая периплазма- тическим пространством или периплазмой. В периплазматичес- ком пространстве, включающем от 20 до 40 процентов общей массы клетки, находится ряд ферментов, а также белков, свя- зывающих сахара и аминокислоты. Как в грамположительных, так и в грамотрицательных бак- териях непосредственно к внешней поверхности цитоплазмати- ческой мембраны примыкает пептидогликановый слой. Пепти- догликаны построены из остатков дисахарида [состоящего из N-ацетилмурамовой кислоты (NAM) и N-ацетилглюкозамина (NAG), связанных {3-1,4-гликозидной связью], мостикового пен- тапептида, состоящего только из остатков глицина, и тетрапепти- да. Строение последнего зависит от вида микроорганизма; в Staphylococcus aureus, например, этот тетрапептид содержит ос- татки ь-аланина, D-глутамина, ь-лизина и D-аланина (рис. 2.25, а; обратите внимание на наличие редких D-аминокислот). Все перечисленные элементы структуры пептидогликанов связаны множеством поперечных связей, образуя как бы одну гигантс- кую макромолекулу, окружающую всю клетку (рис. 2.25,6). Фермент лизоцим, структура которого приведена на рис. 2.17, является эффективным антибактериальным агентом. В основе его бактерицидного действия лежит гидролиз глико- зидных {3-1,4-связей между остатками NAM и NAG пептидогли- кана, приводящий к разрушению и удалению пептидогликано- вой оболочки бактерий и таким путем к разрыву (лизису) клет- ки в нативных гипотонических растворах. В лабораторных ус- ловиях в изотонической среде удается получить живые клетки, не содержащие пептидогликановых оболочек. После обработки лизоцимом в таких условиях образуются клетки, которые те- ряют свойственные им очертания и принимают сферическую форму; их называют сферопластами. Если известно, что кле- точная стенка удалена полностью, то такие клетки называют протопластами. Важными компонентами внешней части наружных мембран грамотрицательных бактерий являются липополисахариды. Не- которые липополисахариды называют эндотоксинами, посколь- ку они в высшей степени токсичны для животных. Токсичность липополисахаридов — одна из причин того, почему заражение крови Е. coll может быть чрезвычайно опасным. По этой же причине при очистке белков, синтезируемых генетически транс- формированной Е. coll, необходимо тщательное удаление эн- дотоксинов. Молекулы липополисахаридов внешней мембраны имеют три участка: а), липидный компонент А, состоящий из шести ненасыщенных жирных кислот, углеводородные цепи которых проходят в мембрану; они связаны с остатком диглюкозами-
N-А цетил- D- глюкозагшн ^Ацетилмурагювая кислота Пептидогликановые цепи РИС. 2.25. а — строение основных структурных элементов пептидогликанов; б — схематическое изображение пептидогликана клеточной стенки грамположи- тельной бактерии Staphylococcus aureus, содержащего большое количество по- перечных связей. (Из работы: Ленинджер А., Основы биохимии, т. 1—3. — М.: Мир, 1985, т. 1, с. 317.)
Химические основы жизни 103 на; б) центральную! олигосахаридную область, построенную из остатков десяти моносахаридов; некоторые из них относятся к числу редких сахаров; в) боковую О-цепь, состоящую из мно- жества повторяющихся тетрасахаридных остатков. Централь- ная область и О-цепь направлены от клетки в среду. Таким об- разом, именно наружные боковые О-цепи взаимодействуют с иммунной системой зараженного животного. Путем мутаций бактерии могут достаточно быстро менять структуру О-цепей, что является частью системы их антииммунной защиты. На этом, однако, рассказ о структуре клеточных стенок бактерий не кончается. У многих видов микроорганизмов внеш- няя мембрана окружена капсулой или слизистым слоем, по хи- мической природе представляющим собой полисахарид. Капсу- ла одного из штаммов пневмококков (бактерий, вызывающих пневмонию) построена из чередующихся остатков глюкозы и глюкуроновой кислоты. Не имеющие такой полисахаридной капсулы мутанты не обладают патогенными свойствами. Поли- сахаридная капсула некоторых бактерий может растворяться в среде. Производство внеклеточных полисахаридов является важным промышленным процессом, который, однако, сущест- венно осложняется неньютоновским характером течения жид- кой среды (гл. 8). Слизистые слои, кроме того, принимают участие при флокуляции бактерий, являющейся важным этапом процессов обработки сточных вод методом активного ила. Цитоплазматическая мембрана дрожжевых клеток состоит из липидов, белков и полисахаридов, содержащих остатки маннозы. Если двигаться дальше к внешней оболочке клетки, то за цитоплазматической мембраной будет расположено пери- плазматическое пространство, окруженное в свою очередь кле- точной стенкой. В пекарских дрожжах, Saccharomyces cerevi- siae, клеточная стенка содержит от 6 до 8% белков (в том чис- ле несколько ферментов), а также приблизительно по 30% (по массе) глюкана (полисахарида, построенного из остатков d- глюкозы, соединенных {3-1,6-связями, а также поперечными {3-1,3-связями) и маннана (полиманнозы с а-1,6-связями и сс- 1,2-боковыми цепями). При обработке S. cerevisiae ферментом, гидролизующим глюкан, например 1,3-глюканазой, можно по- лучать соответствующие протопласты. Такую обработку обыч- но проводят при введении рекомбинантных молекул ДНК в дрожжевые клетки. Клеточные стенки дрожжей и многих плесеней содержат хитин, макромолекула которого построена из остатков N-аце- тилглюкозамина, соединенных гликозидными р-1,4-связями (строение хитина показано на следующей странице). Животные клетки, существующие обычно в строго контро- лируемом изотоническом окружении, не имеют клеточных сте-
104 Глава 2 нок. Помимо фосфолипидов и белков в их плазматических мембранах содержится от 2 до 10% углеводов. Последние об- наружены на внешней поверхности всех клеток млекопитаю- щих, изученных до настоящего времени; они связаны с липида- ми и белками в виде гликолипидов и гликопротеинов соответ- ственно. scu/пин 2.5.2. Антитела и другие гликопротеины Белки, содержащие ковалентно связанные остатки моноса- харидов или коротких олигосахаридных цепей, называют гли- копротеинами. Гликопротеины самых различных типов обнару- жены в эукариотах и окружающей их среде. К числу глико- протеинов относится ряд ферментов, например глюкозооксида- за, продуцируемая Aspergillus niger. Упоминавшийся выше кол- лаген— биологический опорный элемент—также представляет собой гликозилированный белок. Гликопротеинами являются и некоторые интерфероны, мощные противовирусные агенты. По сути дела, большая часть белков эукариот, контактирующих с окружением клетки или выделяемых ею в среду, представляет собой гликопротеины. Некоторые гликопротеины уже стали или, по всей вероятности, скоро станут ценными промышленны- ми продуктами. Биосинтез гликопротеинов и их участие в транспорте веществ мы рассмотрим в гл. 5 и 6. К гликопротеинам относятся и антитела — важнейшее ору- жие иммунологической защиты позвоночных (рис. 2.26). С по- мощью обсуждаемых в гл. 6 методов слияния клеток можно получать в значительных количествах гомогенные антитела в организмах животных или в биологических реакторах, что по- зволит в будущем широко применять антитела для диагности- ческих целей, введения лекарственных препаратов и разделе- ния биологически важных веществ. По этой причине нам ка- жется целесообразным вкратце обсудить здесь происхожде- ние, строение и функции антител. В состав иммунной системы позвоночных входят В-клетки, принадлежащие к одному из двух типов обнаруженных в ор-
РИС. 2.26. а — схематичное изображение структуры иммуноглобулина. Сим- волами С и V обозначены постоянные и вариабельные части цепей соответст- венно, а индексами Н и L — тяжелые и легкие цепи соответственно. Показаны дисульфидные связи, а также место присоединения углеводного остатка (СНО) к тяжелым цепям. Область ствола (Fc) и центр, связывающий антиген, рас- положены на карбоксильном и аминном концах тяжелых цепей соответствен- но. Специфичность связывания антигена и сродство к нему определяются вариабельными частями как тяжелых, так и легких цепей; б — молекулярная структура антитела IgG, иммуноглобулина G. [Воспроизведено с разрешения из работы: Silverton Е. W„ Navia М. A., Davies D. R., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5142 (1977).]
106 Глава 2 ганизме лимфоцитов; в присутствии чужеродного вещества, ви- руса или клетки (антигена) В-клетки дифференцируются и об- разуют плазматические клетки, которые выделяют антитела. Последние специфично связывают антигены (и близкие по строению вещества); образующийся комплекс антиген-антитело осаждается и выводится из организма. Антитела представляют собой особый класс белков, назы- ваемых иммуноглобулинами', свойственные иммуноглобулинам общие детали структуры изображены на рис. 2.26. Молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных, более длинных «тяжелых» цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, а нековалентными связями с двумя другими, также идентичными, но более короткими «легкими» цепями. В наибо- лее широко распространенном классе иммуноглобулинов, обо- значаемом IgG, легкие и тяжелые цепи имеют молекулярные массы 23 000 и 53 000 соответственно. C-Концевые участки как легких, так и тяжелых цепей, практически не отличающиеся по структуре в иммуноглобулинах одного типа, называют по- стоянными участками. Область Fc, представляющая собой ствол молекулы антитела, построена из С-концевых последовательно- стей постоянных участков тяжелых цепей. Дифференциация антител в пределах одного типа осущест- вляется прежде всего в N-концевых участках цепей, называе- мых вариабельными. Связывающий антиген активный центр антитела (паратоп) формируется из вариабельных участкоз легких и тяжелых цепей. Как и в случае каталитической актив- ности ферментов, связывающие антиген центры в различных антителах могут существенно различаться по своей специфич- ности и сродству к антигенам. 2.6. Иерархия клеточной структуры В предыдущих разделах мы рассмотрели основные типы биологически важных соединений небольшой молекулярной массы и построенных из них биополимеров. Хотя мы неодно- кратно подчеркивали связь между химическим строением этих веществ и их функциями в клетке, полезно еще раз обсудить динамическую природу и компартментализацию этих функций. По мере роста живой клетки в ней должны постоянно синтези- роваться все рассмотренные в настоящей главе биополимеры. Обычно питательная среда клетки состоит из сахаров, диокси- да углерода, некоторых аминокислот, воды и ряда неорганичес- ких ионов, а биополимеры и ряд необходимых для их построе- ния мономеров, как правило, в сколько-нибудь значительных количествах отсутствуют. Таким образом, клетка должна синте- зировать все другие необходимые ей аминокислоты, нуклеино-
Химические основы жизни 107 'Клетка - h Органоиды Ядро Митохондрии /поропласты h Надмолекулярные комплексы (мол. масса частиц (О6-/О9) Ферментные комплексы Рибосомы Сократительные системы Макромолекулы (мол. масса 103-109) Основные Нуклеиновые белки кислоты д темы гл. 2 Строительные дроки (мол. масса 100-350) Мононуклео- Амино- тиды кислоты Простые Жирные сахара кислоты, 11 глицерин I Промежуточные Рибоза, соединения (мол. карбамоил- масса 50-250) (росрат А-Не то- Фосфо- Ацетат, кислоте/ пирубат, малонат малат Предшественники, поступающие из среды \(Мол. масса 18 44) РИС. 2.27. Распределение описанных в настоящей главе биологически важ- ных веществ в порядке усложнения их структуры и повышения степени орга- низации. (Из работы: Ленинджер А., Биохимия. — М.: Мир, 1976, с. 22.)
108 Глава 2 вые кислоты, липиды, белки и другие вещества из имеющихся простейших предшественников. Протекающие с поглощением энергии процессы синтеза предшественников и образования биополимеров рассматриваются в гл. 5. В клетке существует множество надмолекулярных, структур. Как мы уже видели, клеточная мембрана, например, представ- ляет собой сложное сочетание молекул многих типов. Другим примером могут служить рибосомы, являющиеся специфичес- Связанные с кле- точной мем- браной фер- менты Полирибосома Свободная рибосома (белки и мРНН) Связанная с клеточ- ной мембраной хромосома СДНН) I ТПРНп Свобод- ные фермен- те/ (бел- ка) клеточная стен- ка (полисахариды и пептиды) молеку- влеточная мембра- на (липиды и белки) Небольшие лы (аминокислоты, нуклеотиды, прос- тые сахара, гли- церин, жирные кис- лоты, ацетат, па- ри ват, кетокислоты и т. л.) РИС. 2.28. Схема компартментализации описанных в настоящей главе био- логически важных молекул в клетке кишечной палочки Е. coli. ким комплексом нескольких различных белков и нуклеиновых кислот. Во многих случаях ферменты, катализирующие не- сколько последовательных химических реакций, объединены в одном ферментном комплексе, в котором, по-видимому, обес- печивается максимальная эффективность использования проме- жуточных веществ. Последний по сложности уровень организа- ции, непосредственно предшествующий самой клетке, занимают органоиды типа митохондрий и хлоропластов. Различные уров- ни сложности от простейших веществ до клетки схематически изображены па рис. 2.27. Схема локализации различных биологически важных ве- ществ, рассмотренных в этой главе, в клетке микроорганизма- прокариоты приведена на рис. 2.28, а общий химический со- став Е. coli суммирован в табл. 2.12. Небольшие молекулы
Химические основы жизни 109 Таблица 2.12. Состав быстрорастущей клетки Е. со№ Содержание, % от общей Средняя мо- Приблизитель- ное число МО- Число различ- Компонент лекулярная лекул в клет- ных типов массы клетки масса ке Н2О 70 18 4-Ю10 1 Неорганические ионы 1 40 2,5-Ю8 20 (Na+, К+, Mg2+, Са2+, Fe2+, С1-, РО43-, SO42- и т. п.) Углеводы и их предше- 3 150 2-Ю8 200 ственники 3-107 Аминокислоты и их пред- 0,4 120 100 шественники 1,2-107 Нуклеотиды и их пред- 0,4 300 200 шественники 2,5-Ю7 Липиды и их предшест- 2 750 50 венники 1,5-Ю7 Другие небольшие моле- кулы (гемы, хиноны, 0,2 150 200 продукты распада пита- тельных веществ и т. п.) Белки Нуклеиновые кислоты: 15 40 000 2,5-109 106 2000—3000 ДНК 1 4 1 РНК 16s рРнк 6 500 000 3-104 1 23S рРНК 1 000 000 3-104 1 тРНК 25 000 4-105 40 мРНК 1 000 000 103 1000 а Уотсон Дж., Молекулярная биология гена, —М.: Мир, 1978, с. 70. типа аминокислот и простых сахаров, а также некоторые зна- чительно большие молекулы, например ряд ферментов и тРНК, равномерно распределены по всему объему цитоплазмы. Дру- гие биополимеры локализованы в определенных участках внут- ри клетки или на ее поверхности, например на клеточной мем- бране. Связь между различными ионами, питательными вещества- ми, промежуточными соединениями и другими составными час- тями клетки осуществляется с помощью разветвленной сети химических реакций (гл. 5 и 6). Отдельные реакции этой сети катализируются ферментами, которые обеспечивают их осу- ществление в мягких условиях, способствующих, как это было показано выше, сохранению нативной формы белков. Ряд ре- акций, протекающих с поглощением энергии (гл. 5), а также тенденция некоторых молекул к самопроизвольному образова- нию локализованных в объеме клетки структурных элементов
по Глава 2 обеспечивают образование мембран, ферментных комплексов и органоидов. Гл. 3 и 4 посвящены кинетике катализируемых ферментами реакций и практическому использованию последних. Далее в гл. 5—7 мы рассмотрим вопросы энергетики и стехиометрии в клеточных процессах, проблемы генетики и регуляции сети про- исходящих в клетке реакций, а также математические выраже- ния, характеризующие кинетику роста популяций клеток. Пос- ле этих вводных глав мы перейдем к основной теме книги — изучению биохимических реакторов. Упражнения 2.1. Химическое строение, а) Напишите полные или обобщенные химиче- ские формулы перечисленных ниже веществ. Объясните (возможную) функ- циональную роль различных группировок в молекулах этих веществ. 1. Жнр, фосфолипид, мицелла, витамин А. 2. D(+)-Глюкоза, пираноза, лактоза, крахмал, амилопектин, целлюлоза. 3. Рибонуклеотид, аденозинмонофосфат (АМР), аденозинтрифосфат (АТР), никотинамидадениндинуклеотид (NAD), дезоксирибонуклеино- вая кислота (ДНК). 4. Аминокислота, лизин, трипептид, белок. 5. Глобулярные и фибриллярные белки. б) Начертите схему уровней строения белков, укажите важнейшие осо- бенности каждого из уровнен (от первичной до четвертичной структуры). 2.2. Спектрофотометрия. Интенсивность поглощения света раствором при определенных длинах волн измеряется с помощью спектрофотометра — при- бора, имеющего очень большое значение в аналитической биохимии. Методом спектрофотометрии определяют концентрации растворенных веществ, а по характеру спектров поглощения их можно идентифицировать. Спектрофото- метрическое определение концентрации основано на законе Бера — Ламберта: А = 1g = атЬс где А — поглощение или оптическая плотность; 10 — интенсивность падающего света; I — интенсивность пропускаемого света; ат — молярный коэффициент экстинкции; Ь — длина пути светового пучка; с — молярная концентрация растворенного вещества. Обычно длину волны падающего света выбирают равной ктах, при ко- торой изучаемое растворенное вещество поглощает в наибольшей степени. В табл. 2У2.1 приведены величины ^тах ряда биологически важных соедине- Таблица 2У2.1 Соединение ^тах* им ат-10~3, л/(сммоль) Триптофан 218 33,5 АТР 259 15,4 NAD+ 259 18 Рибофлавин 260 37 NADH 339 6,22 FAD 450 11,3
Химические основы жизни 111 ний и соответствующие молярные коэффициенты экстинкции (при длине све- тового пути Ь = 1 см и pH 7). Другие необходимые данные можно найти в справочниках; обратите внимание на то, что значения Ктах часто лежат в ультрафиолетовой области. а) Раствор АТР в кювете толщиной 1 см пропускает 70% падающего света при 259 нм. Вычислите концентрацию АТР. Какова оптическая плот- ность 5-10—5 М раствора АТР? б) Предположим, что соединения А и В имеют одинаковые молярные коэффициенты экстинкции, приведенные в табл. 2У2.2. Вычислите Таблица 2У2.2 Длина волны, нм ат, л/(см-моль) А в 340 14 000 7100 410 2900 6600 концентрации А и В в растворе, содержащем как А, так и В и обладающем оптической плотностью (в кювете толщиной 1 см) 0,35 при 340 нм и 0,220 при 410 нм. 2.3. Молекулярные массы. Для оценки молекулярной массы методами седиментации и диффузии часто пользуются уравнением Сведберга: М= — <0(1 — vp) где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; s — коэффициент седиментации, с; 2D —коэффициент диффузии, см2/с; v — парциальный удель- ный объем вещества, см3/г; р — плотность раствора, г/см3. Проверьте молекулярные массы перечисленных в табл. 2У3.1 веществ (7’=20°С). Примите р = 1,0. Таблица 2У3.1 Вещество s -1013 D-107 А’ ,м Лизоцим 1,91 • П,2 0,703 14 400 Фибриноген 7,9 2,02 0,706 330 000 Вирус карликовости 132 1,15 0,74 10 700 000 кустарниковых 2.4. Буферная емкость и pH растворов полимеров, а) Вычислите pH 0,2 М растворов серина, гидрохлорида серина, калиевой соли серина. б) Начертите кривую титрования раствора гидрохлорида серина сильным основанием (КОН); шкалы градуируйте в величинах pH и числе молей КОН, добавленных к 1 молю серина соответственно. в) Вычислите pH растворов линейных полипептидов, содержащих 5, 20 и 100 остатков серина, соответствующих гидрохлоридов и калиевых солей при их процентной концентрации, равной концентрации 0,2 М. раствора гид- рохлорида серина. Примите, что константа диссоциации не зависит от степе- ни полимеризации. г) Вычислите pH раствора моногидрохлорида лизина при его процентной концентрации, равной концентрации 0,2 М раствора гидрохлорида серина.
112 Глава 2 Считайте константы равновесия реакций протонирования а-аминогруппы и аминогруппы боковой цепи равными 8,91 -Ю-6 и 2,95-10-11 л/моль соответ- ственно. д) Вычислите pH 1%-ных (по массе) растворов целлюлозы и крахмала (примите, что молекулярная масса крахмала очень велика, >106). Как в общем случае влияют резервные полимеры на pH клетки? 2.5. Разделение аминокислот, а) Оцените, правильны ли следующие утверждения, обоснуйте ваши ответы: 1. рК простой аминокислоты выражается формулой р/= V2 (рКсоон+рКянг) 2. В диапазоне между рКсоон и рКин2 аминокислоты нейтральны. б) При разделении аминокислот хроматографическими методами успеш- но используются хроматографические носители, являющиеся сульфирован- ными производными полистирола. Основные группы аминокислот взаимодей- ствуют с отрицательно заряженными сульфогруппами, а гидрофобные участ- ки аминокислот взаимодействуют с ароматическими группировками полимера. Оцените, в каком (приблизительно) порядке будут элюироваться аминокисло- ты при pH 3, 7 и 10 из колонки, содержащей: 1. Только сульфогруппы на инертном носителе. 2. Только полистирол. 3. Сульфированный полистирол с доступными в одинаковой степени суль- фогруппами и фенильными кольцами. в) Какие взаимодействия, гидрофильные или гидрофобные, будут играть определяющую роль в процессе разделения смеси полипептидов и смеси бел- ков на хроматографических носителях, перечисленных в предыдущем уп- ражнении? 2.6. Физическая химия макромолекул, а) Используя свои знания, спе- циальную литературу по химии и другие источники, опишите общие химиче- ские процессы и (или) физические конформационные изменения, сопровож- дающие поджаривание яичницы, приготовление теста, свертывание молока, застывание желе, выдувание мыльного пузыря, кристаллизацию белка, дуб- ление кожи, взбивание яичных белков. б) Важными параметрами заменителей пищевых продуктов из микроб- ных и других источников, например белков одноклеточных организмов, за- менителей мяса растительного происхождения, являются степень их тексту- рирования и реологические свойства (текучесть при приложении усилия). Опишите в общих чертах, как бы вы организовали лабораторию испытаний проб синтетической пищи. (Какую подготовку вы бы предусмотрели для персонала лаборатории? Какие методы проверки вы бы организовали?) 2.7. Уравнение материального баланса; стехиометрия. Из химических элементов для роста клеток необходимы в первую очередь углерод, кисло- род, водород и азот. Предположим, что источниками углерода и азота явля- ются СН2О и NH4+ соответственно: aCH2O + jJNH4+ + £O2 —> CaHz,OcNd+nCO2+yH2O новое клеточное вещество а) Опишите ограничения, налагаемые на коэффициенты a, f и т. д. в си- лу сохранения элементного состава. Какая дополнительная информация необходима для определения всех коэффициентов при заданном «составе» клетки? б) Выполните такое же задание для фотосинтезирующей системы: aCO2+jJNH4+ + YH2O —> CaHftOcNd+eO2 в) Подробно опишите ряд экспериментов, с помощью которых вы могла бы определить элементный состав клетки (коэффициенты a, b, с, d).
Химические основы жизни 113 2.8. Стехиометрия; аэробные и анаэробные микроорганизмы. Для облег- чения расчетов потребности в питательных веществах, скоростей аэрации и теплопередачи (гл. 5, 8) можно приписать клетке кажущуюся молекулярную формулу и на этой основе записать общее стехиометрическое уравнение кле- точного роста. а) Вычислите формулу клетки дрожжей, которые растут на питательной среде, содержащей сахар, если экспериментально для этого процесса опреде- лен следующий баланс веществ (примите, что образуется 1 «моль» клеток): 100 г СбН12О6+5,1 г NHs+46,63 г О2 —> —>- 43,23 г клеточной массы+41,08 г Н2О +67,42 г СО2 б) Какую формулу следует приписать клетке, если в приведенной выше реакции образуется 0,30017 «моля» клеток? в) При анаэробном брожении наряду с клеточной массой обычно обра- зуется множество частично окисленных соединений. Исходя из «молекуляр- ной формулы» клетки, найденной в предыдущем упражнении, вычислите не- известные коэффициенты для следующих типичных уравнений реакций (здесь коэффициенты указывают количество молей, а не массу): 0,55556 глюкоза+<х аммиак —>- р клеточная масса-)- 0,05697 глицерин + у бутанол (типичный продукт метаболизма спиртовой природы) + 8 янтарная кислота (типичный продукт метаболизма кислотной природы) + 0,01164 Н2О+1,03076 СО» 1,00380 этанол Скорости процессов, описанных в упражнениях 2.8а и 2.8в, легко регулиру- ются путем изменения скорости аэрации, что позволяет получать дрожжи и этанол в любом промежуточном соотношении (венский процесс) [Harrison J. В., Adv. Ind. Microbiol., 10, 129 (1971)]. 2.9. Клеточные и искусственные липидные двуслойные мембраны. В табл. 2У9.1 приведены сравнительные характеристики природных и ис- кусственных двуслойных липидных мембран. Таблица 2У9.1а Природные мембраны Искусственные липидные мем- браны Толщина (А) по данным: электронной микроскопии 40—130 60—90 реитгеноструктурного анализа 40—85 оптических методов 40—80 определения электрической емкости 30—150 40—130 Сопротивление, Ом/см2 102—105 103—109 Напряжение пробоя, В 100 100—550 Электрическая емкость, мкФ/см2 0,5—1,3 0,4—1,3 а Tien И. Т„ Bilayer Lipid Membranes: An Experimental Model for Biological Mem- branes, in Chemistry of Biosurfaces, Hair M. L. (ed.), vol. 1, p. 239, Marcel Dekker, New York, 1971. 8—-537
114 Глава 2 а) Почему два типа мембран имеют примерно одинаковую толщину? (Постарайтесь дать подробный и обоснованный ответ.) б) Выполнению каких функций клетки (вероятно) способствуют высокое сопротивление и высокая электрическая емкость мембран? в) Сравните напряжение пробоя порядка 1 В/A с отношением потенциа- ла ионизации любого углеводорода, содержащего 10 или более атомов угле- рода, к длине его молекулы. Обсудите полученные результаты. 2.10. Модель согласованных переходных состояний для связывания кис- лорода гемоглобином. Согласно модели согласованных переходных состоя- ний. неактивная форма белка То находится в равновесии с активной фор- .мой Ro: L Ro < То L — константа равновесия В свою очередь активная форма, в случае гемоглобина построенная из четы- рех субъединиц, может связывать одну молекулу субстрата S каждой субъ- единицей : +S +S -]-S +S Ro < Ri < •*- Ro < у Rs < R< —S —S —S —S Обозначим константу диссоциации комплекса гемоглобина с субстратом, об- разующимся в каждой из приведенных выше стадий, символом Kos'- „ _____ [S] [несвязанные центры] Ds [связанные центры] и вычислим для различных s/Kds и L отношения №=• концентрация связанных с S субъединиц общая концентрация субъединиц Постройте график зависимости у от sIKds при /.=9000. Найдите в биохими- ческой литературе график зависимости количества связанного гемоглобином О2 от парциального давления О2 и сравните с вашим графиком. В найденной литературе прочтите о других кооперативных явлениях в биохимии. 2.11. Ферменты, построенные из нескольких субъединиц; вероятность ошибки. На первый взгляд может показаться, что ферменты, состоящие из нескольких субъединиц, например аллостерические ферменты, имеют более сложное строение, чем одноцепочечные белки. Тем не менее относительная вероятность ошибки при биосинтезе таких белков может оказаться меньшей. а) Рассмотрим синтез двух белков, каждый из которых построен из -850 аминокислотных остатков. Пусть первый белок состоит из одной поли- пептидной цепи, а второй — из трех субъединиц с 200, 300 и 350 остатками. Оцените относительное количество первого и второго белка с одной или бо- лее ошибками, если вероятность ошибки одинакова для любого остатка и со- ставляет 5-Ю-9 на остаток и если наличие двух ошибок в любой цепи предотвращает ее дальнейший синтез или включение в активную структуру. б) Как ни убедительны расчеты, приведенные в упражнении 2.11а, из- вестно, что у ряда ферментов отщепление небольшой части аминокислотной последовательности не сопровождается потерей активности н что одну и ту же функцию может выполнять довольно большое количество белков с раз- личными первичными структурами (см., например, различные структуры ци- тохромов с в монографии: Ленинджер А., Основы биохимии, т. 1. — М.: Мир, 1985). Какие другие функции могут выполнять в клетке эти на первый взгляд несущественные аминокислотные последовательности и остатки? (Вспомните внутреннюю структуру клетки.)
Химические основы жизни 115 2.12. Обмен веществ. Для изучения энергетического и массового балан- сов клеточных процессов необходимо знать, в какой последовательности осуществляются химические превращения и в каких участках клетки проис- ходит каждое из них. (Детальнее различные пути метаболизма мы изучим в последующих главах.) На основе данных, приведенных на рис. 2.27 и 2.28, начертите схему образования основных биополимеров и высших структурных элементов клетки; стрелками укажите последовательность процессов и из- менение мест их осуществления; считайте, что все структурные элементы клетки образуются из простых предшественников, например О2, Н2О, NH4+ и глюкозы. В необходимых случаях укажите наличие (или отсутствие) про- странственных ограничений для данных промежуточных продуктов мета- болизма. 2.13. Соответствие биологически важных соединений. В этой главе были рассмотрены мономерные соединения и биополимеры, играющие важнейшую1 роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Прочтите книгу [12], в которой с точки зрения истории развития планеты обсуждается вопрос, почему именно эти соединения возникли в процессе эволюции. Перечислите основные доводы Блюма в пользу пригодности воды, глюкозы и АТР для выполнения их биологической роли. 2.14. Реакция Грама. Из всех цветных реакций в бактериологии чаще всего используется реакция Грама. Перепишите из какого-либо руководства по микробиологии стандартную методику реакции Грама. Обсудите основ- ные пункты методики и механизм реакции Грама. 2.15. Внутриклеточные концентрации. Рассчитайте молярные концентра- ции ДНК, различных РНК, аминокислот и их предшественников, липидов- и их предшественников в клетке Е. coli. Определите общую молярную кон- центрацию веществ в Е. coli и обсудите возможность применения термоди- намических законов для разбавленных (идеальных) растворов к цитоплаз- ме Е. coli. 2.16. Строение ферментов. В состав активного центра фермента карбок- сипептидазы, содержащего 307 аминокислотных остатков, входят аргинин (145), тирозин (248) и глутаминовая кислота (270) (числа обозначают по- рядковый номер аминокислотного остатка, начиная с N-конца цепи). При- нимая, что молекула фермента имеет структуру а-спирали, рассчитайте рас- стояния между тремя указанными остатками. Какие необходимые для осу- ществления каталитического эффекта структурные изменения происходят в нативной молекуле карбоксипептидазы, если они приводят к сближению этих трех остатков до расстояний порядка десятых долей нанометра? 2.17. Термодинамика складывания полипептидных цепей белков. Рас- смотрим гипотетический белок, находящийся в водной среде. Предположим, что часть молекулы этого белка имеет определенную вторичную структуру,, а другая часть содержит Ser, Thr, Asn и два неполярных остатка. Определи- те AG (ккал/моль белка) н оцените, произойдет ли складывание второй части белка в следующих условиях: а) Все полярные группы в последовательности образуют водородные связи. б) Все полярные группы, за исключением расположенных в боковых цепях, образуют внутримолекулярные водородные связи. в) Ни одна из полярных групп в последовательности не участвует в об- разовании внутримолекулярных водородных связей. Примите, что перемещение гидрофобного остатка из водной среды с ней- тральным pH в неполярную внутреннюю область белка сопровождается &G«—4 ккал/моль (в расчете на остаток) и что для образования водородной связи между двумя любыми несвязанными полярными группами AG« «—5 ккал/моль (в расчете на одну полярную группу). Учтите, что не уча- ствующие во внутримолекулярных водородных связях остатки могут обра- зовывать водородные связи с водой. 8*
116 Глава 2 Таблица 2У18.1 Агент Необходимый Ri Необходимый R? Трипсин Lys, Arg Любой Химотрипсин Phe, Тгр, Туг Любой Пепсин Любой Phe, Тгр, Туг, Leu, Asp, Glu Бромциан Met Любой 2.18. Определение аминокислотной последовательности белков. При ча- стичном гидролизе полипептидных цепей белков образуются фрагменты, ами- нокислотная последовательность которых может дать необходимую инфор- мацию о первичной структуре всего белка. В табл. 2У18.1 перечислен ряд .агентов, специфично гидролизующих определенные пептидные связи: Другим важным инструментом определения аминокислотной последователь- ности является реакция Сэнджера, в которой 2,4-динитрофторбензол реаги- рует с N-концевой аминокислотой с образованием соответствующего динитро- фенильного (DNP) производного. Таблица 2У18.2 Обработка Результат Частичный кислотный гидролиз Пепсин Реакция Сэнджера Определение С-концевой аминокисло- ты Пептидные фрагменты с последова- тельностями Gly-Ile-Val-Glu-Glu, Glu-Glu-Cys, Glu-Asp-Tyr, Ser-Val- Cys, Ser-Leu-Tyr, Glu-Cys-Cys, Glu- Leu-Glu, Cys-Asp, Leu-Tyr-Glu, Cys- Cys-Ala, Tyr-Cys При гидролизе одного из пептических пептидов образовывались фрагмен- ты Ser-Val-Cys, Ser-Leu DNP-глицин Аспарагиновая кислота В табл. 2У18.2 приведен ряд экспериментальных результатов, получен- ных в ходе изучения цепи А бычьего инсулина. Определите ее первичную структуру. При полном кислотном гидролизе белковой цепи образуются Gly, Ala, 2 Vai, 2 Leu, He, 4 Cys, 2 Asp, 4 Glu, 2 Ser и 2 Туг. Литература 1. Страйер Л., Биохимия, т. 1— 3. — М.: Мир, 1984. Углубленный, написанный очень понятным языком учебник, освещающий основные биохимические концепции в свете последних достижений молекулярной биологии.
Химические основы жизни 117 2. Yudkin М., Offord R., A Guidebook to Biochemistry, Cambridge University Press, London, 1971. Хороший вводный курс, в котором даются основы биохимии с привлечением минимального количества деталей. 3. Лёви А., Сикевиц Ф., Структура и функция клетки. — М.: Мир, 1971. Третья часть этой книги представляет собой великолепное короткое введе- ние в биохимию; его особенно сильной стороной является большое внима- ние, уделяемое экспериментальной проверке биологических теорий и мо- делей. 4. Lehninger A. L., Biochemistry, 2d ed., Worth Publishers, New York, 1975; есть перевод первого издания: Ленинджер А., Биохимия. — М.: Мир, 1976. Великолепное пособие для углубленного изучения биохимии. Постоянное обращение к примерам из области физиологии клетки и человека помогает читателю лучше понять, запомнить и усвоить материал. 5. Ленинджер А., Основы биохимии, т. 1—3. — М.: Мир; 1985. Это не так давно вышедшее издание предназначено для студентов; написанное в том же стиле, что и предыдущая книга, оно в то же время отличается более подробным изложением современных проблем и перспектив развития мо- лекулярной биологии. 6. Mahler Н. R., Cordes Е. Н., Biological Chemistry, Harper and Row, Pub- lishers, Inc., New York, 1971. Здесь более детально, чем в книгах Ленинд- жера, рассмотрены химические и математические аспекты биохимии, а в разделах, посвященных экспериментальным методам биохимии и мик- робиологии, вопросы моделирования и транспорта веществ изложены глубже и подробнее, чем в большинстве других книг. 7. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. — М.: Мир, 1978. Хотя в основ- ном эта хорошо написанная и уже ставшая классической книга посвящена молекулярной биологии, в ее начальных главах кратко изложены и основы биохимии. Здесь убедительно показана важность слабых взаимодействий и молекулярной динамики для структуры и функции биохимически важ- ных соединений. 3. Wood W. В., Wilson J. Н., Benbow R. М., Hood L. Е., Biochemistry: A Prob- lems Approach, 2d ed., Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, 1981. Краткое изложение основ биохимии, дополненное упраж- нениями (и ответами на них). 9. Dowben R. М., General Physiology: A Molecular Approach, Harper and Row, Publishers, Inc., New York, 1969. Эта интересно и увлекательно написанная книга посвящена физиологии клетки, рассматриваемой с точки зрения ос- нов физической химии. 10. Dickerson R. W., Geis I., The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, Inc., New York, 1969. Написанная совместно биологом и популяризатором науки, эта монография своеобразно рассматривает различные функции белков, особенно связь между строением и функцией. Ее полезно прочесть наряду с одной из перечисленных выше книг. 11. Уотсон Дж. Д., Двойная спираль. — М.: Мир, 1969. История открытия структуры ДНК, поворотного пункта в развитии биологии. Здесь доста- точно откровенно показан также сам процесс рождения открытий в совре- менной науке. 12. Blum Н. F., Time’s Arrow and Evolution, 3d ed., Princeton University Press, Princeton, N.J., 1968. Изучение биологического соответствия элементов и соединений с точки зрения эволюции. 13. Fukui, Ishida, Microbial Production of Amino Acids, Kodansha Ltd., Tokyo, and John Wiley and Sons, Inc., New York, 1972. Интересный обзор различ- ных способов выделения промежуточных продуктов метаболизма, в дан- ном случае аминокислот.
Глава 3 Кинетика катализируемых ферментами реакций В предыдущей главе мы узнали, что в клетке имеется мно- жество химических соединений. Как они синтезируются и вза- имодействуют друг с другом с достаточно высокими скоростями при относительно низких температурах и давлениях? Как клет- ка делает свой выбор, какие именно вещества следует в данный момент ввести в реакцию, а какие молекулы подвергнуть де- градации? Ответ на оба этих вопроса один — все реакции в клетке осуществляются и регулируются путем ферментативно- го катализа; ферменты же, как мы уже знаем, представляют собой глобулярные белки. Поворотным пунктом в развитии энзимологии был 1897 г., когда Бухнер впервые выделил активные ферменты из живых клеток. Эта работа имела большое значение с двух точек зре- ния. Во-первых, было показано, что работающие в живом ор- ганизме катализаторы могут функционировать совершенно не- зависимо от любого другого клеточного процесса; как мы уви- дим в следующей главе, изолированные ферменты в настоящее время находят самое широкое применение. Во-вторых, откры- тие Бухнера стимулировало работы по выделению и очистке индивидуальных ферментов. В чистом виде один из ферментов впервые был выделен Самнером в 1926 г. Его изучение показа- ло, что он является белком; сейчас известно, что все ферменты представляют собой белки. После основополагающих работ Самнера число известных ферментов постоянно возрастало и в настоящее время уже намного превысило 1500. Судя по количеству генетической ин- формации, заложенной даже в таких простых организмах, как Е. coli, можно уверенно предсказать, что в будущем будет идентифицировано и охарактеризовано множество новых фер- ментов. Действительно, единственная молекула ДНК, состав- ляющая хромосому Е. coli, несет в себе информацию, достаточ- ную для кодирования структур от 3000 до 4500 различных бел- ков. Поскольку в этой главе и позднее мы будем упоминать ряд конкретных ферментов, здесь уместно сказать несколько слов об их номенклатуре. К сожалению, не существует общих пра-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 119 вил номенклатуры, применимых ко всем ферментам. В подав- ляющем большинстве случаев в названии фермента отражается ,ег0 функция, а не строение', обычно к названию субстрата до- бавляют суффикс -аза (например, уреазой называют фермент, катализирующий разложение мочевины). Иногда тот же суф- фикс добавляется к названию реакции, которую катализирует данный фермент (алкогольдегидрогеназа, например, катализи- рует окислительное дегидрирование спирта). Исключения из этого правила представляют исторически сложившиеся назва- ния ферментов (как правило, давно известных); сюда относят- ся пепсин и трипсин из пищеварительного тракта человека, используемый в сыроделии реннин и «старый желтый» фермент, вызывающий появление коричневой окраски на срезах яблок. Ферменты катализируют реакции шести основных типов, ко- торые лежат в основе системы, рекомендованной Комиссией по ферментам (КФ), классификации и условного цифрового обоз- начения всех ферментов (табл. 3.1). Эта «официальная» систе- ма позволяет выразить в табличной форме и классифицировать выполняемые ферментами разнообразные функции, хотя наря- ду с ней до сих пор широко используется и прежняя более тра- диционная номенклатура ферментов. Во избежание недоразумений давайте вспомним, что такое катализатор вообще. Катализатором называют вещество, ко- торое повышает скорость химической реакции, не претерпевая при этом необратимых химических изменений. Повышая ско- рость химической реакции, катализатор в то же время не на- рушает равновесия реакции (рис. 3.1). Равновесные концент- рации можно вычислить на основе одних лишь термодинами- ческих свойств субстратов (напомним, что субстратом в био- химии называют вещество, вступающее в катализируемую ферментом реакцию) и продуктов реакции. Кинетика реакции, однако, зависит от молекулярной динамики, и в настоящее вре- мя ее невозможно достаточно точно предсказать, не распола- гая экспериментальными данными. Для изучения какой-либо реакции и разработки соответст- вующего технологического процесса необходимо располагать математическим выражением, определяющим скорость реакции (т. е. число молей вещества, реагирующего в единицу времени в единице объема) в зависимости от состава, температуры, дав- ления и других параметров реакционной смеси. Если вы ранее изучали каталитические реакции, то вам должны быть извест- ны общие принципы вывода выражений, характеризующих скорость реакций. Обычно прежде всего высказываются доста- точно обоснованные соображения относительно элементарных реакций, происходящих на молекулярном уровне. Затем с при- влечением некоторых приближений, затрагивающих динамику
Таблица 3.1. Классификация ферментов в соответствии с рекомендациями Международной комиссии по ферментам (указаны название класса ферментов, кодовые номера Комиссии по ферментам, тип катализируемых реакций)3 1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные реакции) 1.1. Действуют на группу —СН—ОН 1.2. Действуют на группу —С=О 1.3. Действуют на группу —СН=СН— 1.4. Действуют на группу —СН—NH2 1.5. Действуют на группу — СН—NH— 1.6. Действуют на NADH, NADPH 2. Трансферазы (перенос функциональных групп) 2.1. Переносят одноуглеродные остатки 2.2. Переносят альдегидные и кетонные группы 2.3. Переносят ацильные группы 2.4. Переносят гликозильные группы 2.7. Переносят фосфатные группы 2.8. Переносят группы, содержащие серу 3. Гидролазы (реакции гидролиза) 3.1. Действуют на сложноэфирные связи 3.2. Действуют на гликозидные связи 3.4. Действуют иа пептидные связи 3.5. Действуют иа С—N-связи, отличающиеся от пептидных связей 3.6. Действуют на кислотноангидридные связи 4. Лиазы (присоединение по двойным связям) 4.1. — С=С— I 4.2. — С = О I 4.3. — C = N— 5. Изомеразы (реакции изомеризации) 5.1. Рацемазы 6. Лигазы (образование связей, сопровождающееся расщеплением АТР) 6.1. Образуют С—О-связи 6.2. Образуют С—S-связи 6.3. Образуют С—N-связи 6.4. Образуют С—С-связи а Воспроизведено из работы: Lehninger A. L„ Biochemistry, 2d ed., table 8-1, Worth Publishers, Inc., New York, 1975; есть перевод первого издания: Ленинджер А., Биохи- мия. — М.; Мир, 1976. 120
Кинетика катализируемых ферментами реакций 121 Некаталитическая реакция Глюкоза-Г фоарат Глюноэо-6- - фосфат Высокая энергия активации Изменение стандар- тной свободной энергии реакции AG°=-1,7S ккал _’L_________________ Каталитическая реакция AG°=-17S ккал Глюкоза-f- фосфагп Гл/окозо-6- фосфат Низкая энергия активаищи Необходимый для реакции минимум энергии Число молекул Высокая энергия активации Энергия, Энергия, Только эти моле - приходящаяся кулы обладают ” достаточной для начала реакции внутренней энер- гией'. скорость реакции низка Средняя внутренняя энергия Необходимый для реанции минимум энергии Низкая энергия активации Средняя внутренняя энергия Все эти молекулы обладают достаточ- ной для начала реак- ции внутренней энергией; скорость реакции высока Энергия, приходящаяся на одну молекулу на одну молекулу РИС. 3.1. Катализатор снижает энергию активации реакции и тем самым обеспечивает возможность реакции фермента с молекулами субстрата, обла- дающими малой внутренней энергией. [Воспроизведено с разрешения из ра- боты: Lehninger A. L., Bioenergetics, 2d ed., р. 35, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, С A, 1971.] одного или нескольких реакционноспособных промежуточных соединений, и с использованием ряда простых математических преобразований находят выражение для скорости суммарной реакции. В настоящей главе мы воспользуемся точно таким же подходом для оценки скоростей катализируемых ферментами реакций. Аналогия между синтетическими катализаторами и фер- ментами не заканчивается на принципах моделирования кине- тики реакций. Математические выражения, определяющие ско- рости реакций, катализируемых этими двумя типами катализа- торов, очень близки, а иногда даже идентичны. Это объясня- ется тем, что в обоих случаях, как известно, в качестве проме-
122 Глава 3 жуточного соединения образуется тот или иной комплекс реаги- рующего вещества (субстрата) с катализатором; общий механизм каталитических процессов, естественно, приводит к одинаковым выражениям для их скоростей. Позднее мы еще- раз вкратце остановимся на этом вопросе. В то же время важно не забывать и о существенных разли- чиях между синтетическими катализаторами и ферментами; о некоторых из таких различий мы уже упоминали. Подавляю- щее большинство синтетических катализаторов неспецифична в том смысле, что они могут катализировать аналогичные ре- акции с участием самых разнообразных реагентов. Некоторые ферменты также не отличаются высокой специфичностью, но многие катализируют только одно превращение крайне ограни- ченного числа субстратов. Обычно степень специфичности фер- мента соответствует его биологической функции. Высокая спе- цифичность нежелательна, например, для фермента, основная задача которого заключается в гидролизе белков до небольших пептидов и аминокислот. Напротив, фермент, катализирующий изомеризацию одного конкретного соединения, должен быть в высшей степени специфичным. Как уже упоминалось выше в разд. 2.2.4, считается, что специфичность фермента обусловлена его сложной объемной структурой, позволяющей сформировать ответственный за каталитические свойства фермента активный центр. Другой отличительной чертой многих ферментов является наличие кофакторов, необходимых для проявления'фермента- тивной активности. Кофактором называют соединение небелко- вой природы, которое связывается с неактивным белком (апо- ферментом) с образованием каталитически активного комплек- са. Последний биохимики часто называют голоферментом, мы же чаще будем называть его просто ферментом. Существует два различных типа кофакторов. Простейшими кофакторами являются ионы металлов (табл. 3.2). Роль кофакторов могут выполнять и сложные органические соединения, называемые коферментами. В предыдущей главе мы уже упоминали кофер- менты NAD, FAD и кофермент А(СоА); иногда кофактором может быть и АТР. Часто кофакторы связываются с фермента- ми довольно слабыми связями; в таких случаях существует равновесие между ферментом, апоферментом и кофактором. Вообще говоря, и прочно связанные с ферментом небелковые элементы структуры также являются коферментами, как, на- пример, гем в цитохроме с. Однако, как мы уже упоминали, ча- ще такие необратимо связанные группы называют простетичес- кими. Приведенные в табл. 3.2 данные интересны и с той точки зрения, что здесь содержатся сведения, к которым мы будем
Кинетика катализируемых ферментами реакций 123 неоднократно возвращаться при изучении процессов выделения и применения ферментов. Обратите внимание на то, что рядом с названиями некоторых ферментов указаны источники их вы- деления; например, глюкозоизомераза из бактерии Bacillus coagulans проявляет максимальную активность в присутствии кобальтового кофактора. Для того чтобы точно определить, о каком ферменте идет речь, во многих случаях необходи- Таблица 3.2. Некоторые ферменты, содержащие в качестве кофакторов ионы металлов или проявляющие активность только в присутствии ионов металлов Са2+ а-Амилаза (из поджелудочной железы свиньи) Коллагеназа Липаза Со2+ Нуклеаза микрококков Глюкозоизомераза (из Bacillus coagulans; для активации необходим также Mg2+) Cu2+ (Си+) Г алактозооксидаза Триозиназа Fe2+ или Fe3+ Каталаза Цитохромы Пероксидаза Mg2+ Дезоксирибонуклеаза (из поджелудочной железы быка) Mn2+ Na+ Аргиназа Аденозинтрифосфатаза из плазматических мемб- ран (для активации необходимы также К+ и Zn2+ Mg2+) Алкогольдегидрогеназа Щелочная фосфатаза Карбоксипептидаза мо указывать и его происхождение. Дело в том, что другие организмы также синтезируют ферменты, катализирующие изомеризацию глюкозы во фруктозу, и поэтому их тоже назы- вают глюкозоизомер азами. В то же время ферменты с одина- ковыми названиями, но выделенные из разных организмов, час- то имеют различные аминокислотные последовательности и по этой причине различаются по свойствам и каталитической ак- тивности. Например, для глюкозоизомеразы из В. coagulans необходим ион Со2+, а глюкозоизомераза из мутантного штам- ма того же организма при рН>8 активна и в отсутствие ко- бальта. Надо иметь всегда в виду, что одно лишь название фермента ничего не говорит о природе какого-либо конкретно- го белка с определенными свойствами и соответствующими тех- нологическими требованиями. Чтобы устранить возможность Двусмысленного толкования, нужно указать полное название продуцирующего этот фермент организма.
124 Глава 3 Как синтетические, так и биологические катализаторы в ходе выполнения своей каталитической функции постепенно утрачивают активность, однако ферменты в общем случае го- раздо более недолговечны. Сложная и запутанная пространст- венная структура ферментов, обусловливающая их необычно Таблица 3.3. Сравнительная активность ферментов и синтетических твердых катализаторов (N — число молекул субстрата, превращаемых одним активным центром катализатора в 1 с)а Фермент Субстрат или ката- лизируемая реакция Диапазон найденных зна- чений N при 0—37 °C Рибонуклеаза Перенос фосфатной группы полинуклеоти- да 2—2-Ю3 Трипсин Гидролиз пептидов з-ю-3—1 -102 Папаин Гидролиз пептидов 8-Ю-2—1-Ю1 Бромелаин Гидролиз пептидов 4.10-3—5-10-* Карбонилангидраза Обратимая гидратация карбонильных соеди- нений 8-Ю-1—6-Ю5 Фумаратгидратаза Обратимое превраще- ние малата в фумарат и воду 1-Ю3 (прямая реакция) З-Ю3 (обратная реак- ция) Твердый катализатор Катализируемая реакция Температура, N °C SiO2—А120з (импрегни- рованный) Крекинг кумола 3-10-8 25 2-Ю4 420 Декатионизированный цеолит Крекинг кумола ~103 25 ~Ю8 325 V2O5 Дегидрирование цикло- гексена 7-Ю"11 25 102 350 Обработанный Cu3Au Дегидрирование НСО2Н 2-Ю7 25 З-Ю10 327 AICI3- А120з Изомеризация н-гексана (в жидкой фазе) 1-10~2 25 1,5-Ю“2 60 а Воспроизведено из работы: Maatman R. W., Enzyme and Solid Catalyst Efficien- cies and Solid Catalyst Site Densities, Catal. Rev., 8, 1 (1973). высокие специфичность и активность, легко нарушается, что приводит к потере ферментом его каталитических свойств. Раз- личные пути инактивации ферментов и кинетика этих процес- сов будут рассмотрены в разд. 3.7. Часто утверждают, что ферменты более активны в том смысле, что они повышают скорость реакций в большей степе- ни, чем небиологические катализаторы. Степень активности ка- тализатора обычно выражают числом оборотов, которое пред-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 12S ставляет собой число молекул субстрата, реагирующих с актив- ным центром катализатора в единицу времени. Для сравнения в табл. 3.3 приведены параметры ряда реакций, катализируе- мых ферментами и синтетическими катализаторами. Оказыва- ется, что в диапазоне температур, в котором ферменты наибо- лее активны, они действительно повышают скорость реакций & большей степени, чем большинство синтетических катализато- ров. При более высоких температурах, однако, активность ис- кусственных катализаторов обычно превосходит активность ферментов. К сожалению, ферментативная активность не мо- жет бесконечно возрастать при повышении температуры; на- против, ферменты обычно теряют свою активность уже при сравнительно низких температурах, часто лишь на несколько градусов превышающих температуру живой клетки. Характерной особенностью ферментативного катализа явля- ется возможность его регуляции с помощью соединений не- большой молекулярной массы. Некоторые ферменты «выключа- ются» в присутствии определенных веществ; последними часто оказываются конечные продукты последовательности реакций,, в которой участвует регулируемый фермент. Эта особенность ферментов играет большую роль в нормальном жизненном цик- ле клетки. Некоторые аспекты кинетики ферментативных реак- ций такого типа мы изучим в разд. 3.5, а в гл. 6 мы узнаем,, как посредством изменения нормальных каналов регуляции внутриклеточных реакций можно резко повысить эффектив- ность промышленных биологических процессов. Прежде чем приступить к моделированию кинетики фермен- тативного катализа, мы рассмотрим имеющиеся эксперимен- тальные данные о характере молекулярных превращений, ко- торые действительно происходят в процессе катализируемых ферментами реакций. На этой основе мы сможем высказать обоснованные гипотезы о последовательности элементарных, реакций и затем применить эти гипотезы для вывода матема- тических выражений, характеризующих скорость реакций. 3.1. Фермент-субстратные комплексы и механизм действия ферментов В настоящее время не существует единой теории, объясня- ющей необычно высокую специфичность и активность фермент- ных катализаторов. В то же время в отношении небольшого числа конкретных ферментов был выдвинут целый ряд вполне- вероятных гипотез, подтвержденных экспериментальными дан- ными. По-видимому, положенные в основу этих гипотез явле- ния в совокупности и обусловливают специфические свойства, ферментов. В настоящем разделе мы вкратце рассмотрим не-
126 Глава 3 которые из этих гипотез; более подробные сведения читатель сможет найти в литературе, приведенной в конце главы. По- скольку все рассматриваемые здесь гипотезы только частично объясняют механизм действия ферментов, мы не будем пытать- ся обобщить эти данные с целью создания единой теории фер- ментативной активности. Существование фермент-субстратных комплексов доказано с помощью различных экспериментальных методов, в том чис- ле рентгеноструктурного анализа, спектроскопических методов и электронного парамагнитного резонанса. Субстрат связыва- ется с ферментом в определенной области молекулы фермента, называемой активным центром, где осуществляется катализи- руемая ферментом реакция и образуются ее продукты. В свя- зывании субстрата с ферментом и образовании комплекса иног- да принимают участие слабые взаимодействия, рассмотренные в разд. 2.4.3, а в некоторых случаях при этом образуются и ковалентные связи. Как схематически показано на рис. 2.24 и 3.2, комплекс образуется тогда, когда субстратный «ключ» вхо- дит в ферментный «замок». На рис. 3.2 особенно отчетливо видно, что фермент-субстратный комплекс образуется с по- мощью водородных связей между субстратом и группами, рас- положенными в самых разных участках аминокислотной после- довательности фермента. Этот пример также наглядно иллюстрирует понятие об ак- тивном центре. Молекула белка сложена таким образом, что реакционноспособные группы в боковых цепях нескольких ами- нокислотных остатков фермента образуют в высшей степени специфичную, пространственно организованную конструкцию, точно отвечающую конфигурации субстрата. В состав актив- ных центров ферментов входят боковые цепи остатков Asp, Cys, Glu, His, Lys, Met, Ser, Thr, а также концевые аминные и карбоксильные группы. Поскольку в среднем возле субстрата расположено около 20 таких групп (значительно меньше, чем общее число аминокислотных остатков в молекуле фермента), принято считать, что непосредственное участие в функциониро- вании активного центра фермента принимает только его не- большая часть. У больших ферментов может быть несколько активных центров. Большинство аминокислотных остатков, не входящих в активный центр, определяют характер складывания полипептидной цепи (вторичную структуру) и пространственное расположение одной части цепи относительно другой (третич- ную структуру), в результате чего и создается активный центр фермента (рис. 3.4). Хотя ряд изложенных ниже более детальных гипотез вес еще не лишен некоторых противоречий, следует подчеркнуть, что понятия об активном центре и фермент-субстратиом комп-
РИС. 3.2. Схематическое изображение активного центра лизоцима. Жирными? линиями выделена молекула гексасахаридного субстрата, большими и малень- кими кружками обозначены атомы кислорода и азота соответственно, а штри- ховыми линиями—водородные связи. [Воспроизведено с разрешения из ра- боты: Yudkin М„ Offord R., A Guidebook to Biochemistry, р. 48, Cambridge- University Press, London, 1971.]
128 Глава 3 лексе в настоящее время общеприняты и лежат в основе боль- шинства теорий, объясняющих механизм действия ферментов. В дальнейшем мы также будем пользоваться этими понятиями при математическом анализе кинетики ферментативного ката- лиза. Два различных подхода к объяснению ферментативной ак- тивности схематически отображены на рис. 3.3. Фермент может связывать молекулы, двух субстратов таким образом, что реак- РИС. 3.3. Фермент ускоряет реакцию за счет пространственного сближения двух субстратов (эффект сближения) и их расположения под выгодным уг- лом (эффект ориентации). (Воспроизведено с разрешения Д. Э. Кошланда.) ционноспособные группы последних будут располагаться побли- зости друг от друга и от каталитических групп фермента. Это, естественно, будет способствовать ускорению химической реак- ции; такой эффект известен под названием эффекта сближе- ния. Предположим далее, что молекулы двух субстратов не обладают сферической симметрией. В этом случае реакция про- изойдет только в том случае, когда при сближении молекулы располагаются в ориентации, обеспечивающей тесное взаимо- действие реакционноспособных атомов или групп. Считается, что ферменты связывают молекулы субстратов, так что по- следние занимают особенно благоприятное положение, созда- вая таким образом эффект ориентации, который и обеспе- чивает ускорение реакции. Это явление, иногда называемое также орбитальным управлением, вносит свой вклад в процесс ферментативного катализа, однако количественную величину соответствующего эффекта в общем случае пока еще опреде- лить трудно. Прежде чем приступить к краткому обзору химии фермента- тивного катализа, следует упомянуть еще одну гипотезу, связан-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 129 ную с геометрией фермента. Известно, что связывание субст- рата сопровождается небольшим изменением пространственной структуры некоторых ферментов. В частности, путем изучения трехмерной структуры ферментов лизоцима и карбоксипепти- дазы А в виде комплексов с субстратами и без субстратов бы- ло показано, что конформации ферментов при связывании суб- страта несколько изменяются. Такое индуцированное соответст- вие фермента и субстрата может вносить свой вклад в процесс ферментативного катализа. Предлагались также усложненные варианты модели индуцированного соответствия, в которых в ходе процесса последовательно образуется несколько промежу- точных фермент-субстратных комплексов. Некоторая эластич- ность и гибкость молекулы фермента может способствовать тщательной пространственной подгонке его каталитических групп и тем самым ускорению превращений каждого из проме- жуточных соединений. Возможно, что индуцирование субстра- том изменений в конформации активного центра характерно для ферментативного катализа вообще, хотя эксперименталь- ное обнаружение этого эффекта связано с рядом трудностей и поэтому было осуществлено только в случае нескольких фер- ментов. Некоторые ферменты осуществляют реакции, хорошо извест- ные химику-органику. Одной из таких реакций является общий кислотно-основной катализ, в котором катализатор на одной из стадий процесса захватывает или отдает протон. Этот тип катализа, в частности, лежит в основе механизма действия од- ного из немногих ферментов, для которых предложена доста- точно убедительная полная последовательность элементарных стадий каталитического процесса (рис. 3.4). Выделяемый из поджелудочной железы химотрипсин представляет собой про- теолитический (т. е. гидролизующий белки) фермент, специ- фично расщепляющий пептидные связи, образованные карбок- сильными группами остатков тирозина, триптофана и фенила- ланина. Считается, что в реакции химотрипсинового катализа как при отщеплении, так и при присоединении протонов роль переносчика последних играет вода. В сущности, к общему кислотно-основному катализу можно свести целый ряд очень важных в химии клетки реакций, в том числе процессы присо- единения к карбонильным соединениям и гидролиз сложных эфиров. В ферментативном катализе важную роль могут играть и Другие факторы, например ковалентный катализ, деформация связей, электростатический катализ, многофункциональный ка- тализ и эффекты растворителя (вспомните структуру масляной капли, приведенную в предыдущей главе). Детальное описание этих эффектов можно найти в приведенной в конце главы ли- 9-537
Липептидныи суде трат нонк, I II I I R—С—C—N - CH-COO I + NH3 Продукт реакции 7 Продукт реакции 2 I CHj, б—H- H О Н R, । LI । R—С—С—N—CH— COO O R, R I I + R NH, — СН —ООО- Н —С —NHj I I н—с—ЫН3 СООН с=о О N^'NH Ser 195 -------- His 57 Белок CH;, СН2 б— I Г СН ----- Белок Белок Ser 195 ----- Белок His 57 Свободный химотрипсин A Рцилгсиыотрик - сгт Свободный химотрипсин РИС. 3.4. а — предполагаемая последовательность реакций при расщеп- лении пептидной связи химотрипсином. (Воспроизведено из работы: Lehninger A. L., Biochemistry, 2d ed., рр. 229—231, Worth Publishers, New York, 1975; есть перевод первого издания: Ленинджер А., Биохи- мия.— М.: Мир, 1976, с. 203); б — структура химотрипсина. [Воспроиз- ведено из статьи: Matthews В. W. и др., Three-Dimensional Structure of Tosyl-a-Chymotrypsin; Nature, 214, 652 (1976)]. A. — Гидроксильная.группа Serl95 связана водородной связью с имид- азольным атомом азота His 57. Б. Протон очень быстро мигрирует от Serl95 к имидазольному атому азота His57. Образуется временная водородная связь между имид- азольным кольцом и субстратом, ориентирующая дипептид таким обра- зом, что становится возможной нуклеофильная атака атома кислорода серина на карбонильный атом углерода субстрата. В. Аминоацильная группа отрывается от дипептида и переносится к ферменту; одновременно образуется свободная С-концевая аминокис- лота субстрата. Г. Под действием Н2О аминоацильная группа отделяется от Serl95, в результате чего регенерируется свободный фермент.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 131 тературе; вероятно, они, как и рассмотренные в настоящем раз- деле факторы, могут оказывать влияние на некоторые катали- зируемые ферментами реакции. Поскольку в общем случае ре- акции ферментативного катализа включают в себя множество эффектов, неудивительно, что пока еще не удалось разработать простую общую схему, которая позволила бы оценить их сум- марное влияние и относительную значимость каждого из них. К счастью, математические выражения для скоростей катали- зируемых ферментами реакций можно вывести, опираясь лишь на основную концепцию о фермент-субстратном комплексе как основном промежуточном соединении. 3.2. Кинетика простых ферментативных реакций с одним и двумя субстратами В настоящем разделе мы попытаемся вывести математиче- ские выражения, характеризующие скорости катализируемых ферментами реакций. Естественно, важнейшим критерием пра- вильности такого выражения будет соответствие вычислен- ных и экспериментально найденных скоростей. Чтобы исклю- чить возможные недоразумения, сначала мы в общих чертах опишем некоторые экспериментальные методы определения ско- ростей реакций. Прежде всего определим, что мы имеем в виду под ско- ростью реакции. Рассмотрим реакцию S ---> Р Скорость этой реакции в приближении квазиравновесного со- стояния (раздел 3.2.1) определяется как ds dp dt dt (3-1) где символами s и р обозначены молярные концентрации ис- ходного вещества S и продукта реакции Р соответственно. От- сюда следует, что v выражается в числе молей в единице объе- ма в единицу времени. Скорость реакции является интенсивной величиной, имеющей определенное значение в каждой точке реакционной смеси. Поэтому, если концентрации или другие интенсивные переменные изменяются от точки к точке, то и скорости реакции в этих точках будут различными. При экспе- риментальном изучении кинетики часто используют реакторы с эффективным перемешиванием, в которых обеспечивается од- на и та же скорость реакции во всем объеме реакционной смеси. Как и при моделировании любых других технологических процессов, слово «точка» в определении скорости реакции ис- 9*
132 Глава 3 пользуется не в строго геометрическом смысле. Напротив, здесь под точкой подразумевается некоторый объем, в который вхо- дит множество молекул, но который тем не менее очень мал по сравнению с объемом всей реакционной смеси. Это на пер- вый взгляд не столь существенное уточнение очень важно не забывать при переходе от гипотетических моделей к конкрет- ным биологическим системам. Например, при моделировании молекулярных процессов в отдельной изолированной клетке понятия о концентрации данного вещества Ai и скорости его превращения в определенной точке могут оказаться вообще не- применимыми, если в клетке содержится только небольшое чис- ло молекул А]. К этому вопросу мы вернемся позднее, при изучении кинетики роста клетки (гл. 7). Типичный эксперимент по изучению кинетики ферментатив- ных. реакций (т. е. реакций, катализируемых ферментами) обычно проводят следующим образом. В нулевой момент вре- мени растворы субстрата и соответствующего очищенного фер- мента смешивают при эффективном перемешивании в закрытом сосуде, в котором поддерживается постоянная температура и который содержит буферный раствор, необходимый для под- держания определенного значения pH. Далее через заданные промежутки времени определяют концентрации субстрата и (или) продукта реакции. Для этой цели применяют различ- ные методы, в том числе спектрофотометрические, манометри- ческие, электродные, поляриметрические, а также методы, свя- занные с отбором проб. Обычно используют только данные о начальных скоростях реакций. Поскольку условия реакции, в том числе концентрации фермента и субстрата, точнее всего известны при нулевом времени реакции, начальный наклон кривой, отражающей изменение концентрации субстрата или продукта реакции в зависимости от времени, определяется по следующим данным: = п|/=о, где е = е0, s=s0 и р = 0 (3.2) /=о На рис. 3.5 приведены данные, полученные в одном из экспе- риментов описанного типа. Обратите внимание на то, что при ( = 0 в смеси уже имеется некоторое количество продукта реак- ции; отсюда следует, что нулевое время на самом деле не яв- ляется временем начала реакции. В этом заключается одна из трудностей, присущих методу определения начальных скорос- тей реакций; другие недостатки метода описаны в специальной литературе по химической кинетике. Тем не менее метод на- чальных скоростей позволяет с достаточной воспроизводи- мостью определять ферментативную активность и концентрации dp _______ ds dt dt
Кинетика катализируемых ферментами реакций 133 веществ в первый момент реакции и поэтому с успехом может применяться в практической работе. Проблема воспроизводимости результатов определения фер- ментативной активности важна со многих точек зрения, в том числе и с точки зрения конструкций реакторов, в которых осу- ществляются процессы с изолированными ферментами. В пре- дыдущих разделах мы уже упоминали, что белки в условиях, О 20 40 60 80 100 120 140 Ародолжителбность реакции, мин РИС. 3.5. Экспериментальное определение скорости гидролиза 30%-го рас- твора крахмала глюкоамилазой в реакторе периодического действия (60 °C, е0=И 600 единиц, объем реактора I л). отличающихся от свойственного им биологического окружения, легко подвергаются денатурации; в этой связи неудивительно, что изолированный фермент в «необычной» для него водной среде может постепенно терять свою каталитическую актив- ность (рис. 3.6). Известно, что такая инактивация характерна для многих ферментов; в то же время во многих руководствах по кинетике ферментативного катализа это явление в лучшем случае только упоминается. Проблема постепенной потери ка- талитической активности ферментами не столь существенна in vivo (в интактном живом организме), когда снижение концент- раций ферментов за счет инактивации компенсируется их био- синтезом в необходимых количествах. Напротив, инактивацию фермента in vitro (вне живой клетки) необходимо учитывать как при изучении кинетики реакций, так и при проектировании
134 Глава 3 ферментативных реакторов. К этой теме мы обратимся еще раз в разд. 3.7. В подписи1 к рис. 3.5 (в скобках) нам впервые встречается другая типичная для кинетики ферментативного катализа осо- бенность. Обратите внимание на то, что количество фермента, использовавшегося в этом эксперименте, выражено в неких РИС. 3.6. Инактивация фермента в растворе. В течение 1 ч при 37 °C раствор аспартазы теряет более 5% исходной активности. [Воспроизведено из статьи: Tosa Т. et al., Continuous Production of L-Aspartic Acid by Immobilized Aspar- tase, Biotech. Bioeng., 15, 68 (1973)]. «единицах». Что это за таинственные единицы и почему нельзя количество фермента выразить более понятным и более опре- деленным способом, например в молях или в единицах массы? Сначала ответим на вторую часть вопроса. Количество фер- мента обычно не выражают, например, в единицах массы, по- скольку ферментные препараты, как правило, представляют собой смесь различных белков, в которой данный фермент яв- ляется всего лишь одним из нескольких компонентов. Содержа- ние интересующего нас фермента в этой смеси часто неизвест- но; более того, оно может быть различным в разных партиях препарата. Чтобы охарактеризовать препарат, содержание фер- мента обычно выражают в единицах каталитической активно- сти, содержащейся в единице массы ферментного препарата.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 135 Единицей или единицей активности называют количество фермента, которое обладает определенной каталитической ак- тивностью в заданных для этого фермента стандартных усло- виях. Например, в эксперименте по гидролизу крахмала, ре- зультаты которого приведены на рис. 3.5, за единицу активно- сти глюкоамилазы принимали количество фермента, которое в 4%-ном растворе крахмала Линтнера при pH 4,5 и температу- ре 60 °C образует 1 мкмоль глюкозы в 1 мин. Отсюда следу- ет, что единица активности каждого конкретного фермента бу- дет иметь свое специфическое определение и, более того, один фермент может иметь несколько определений активности в за- висимости от конкретных условий катализируемых им реакций. Поэтому во избежание ошибок при интерпретации или исполь- зовании результатов изучения кинетики реакций ферментатив- ного катализа всегда следует тщательно проверять применяемое в каждом случае определение единицы ферментативной актив- ности. Конечно, вероятность ошибки резко снижается, если из- вестна активность высокоочищенного фермента. 3.2.1. Уравнение Михаэлиса — Ментен Предположим теперь, что в нашем распоряжении имеется целый ряд экспериментальных данных по определению скорос- ти ферментативной реакции (рис. 3.7) и перед нами стоит зада- ча выразить эти данные в математической форме. Информация типа показанной на рис. 3.7 часто позволяет сделать следую- щие выводы качественного характера: 1. При относительно низких концентрациях субстрата реакция имеет первый порядок по субстрату. (Напомним, что если v=k-sn, где k — константа, то п называют порядком реак- ции.) 2. По мере повышения концентрации субстрата порядок реак- ции по субстрату постепенно снижается от единицы до нуля. 3. Скорость реакции пропорциональна общему количеству фер- мента в реакционной смеси. На базе экспериментальных данных такого рода в 1902 г. Ан- ри предложил следующее выражение для скорости фермента- тивной реакции: g:=7m^ ’ где = (3.3) В уравнении (3.3) учтены все три указанные выше закономер- ности. Обратите внимание, что при s, равном Km, и = итах/2. Во избежание недоразумений, связанных с употреблением в лите- ратуре различных символов и сокращений, подчеркнем, что s
136 Главе 3 РИС. 3.7. Экспериментальное изуче- ние кинетики катализируемых фер- ментами реакций, а — зависимость скорости реакции от концентрации субстрата при посто- янной концентрации фермента. [Вос- произведено из работы: Laidler К. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Ac- tion, p. 64, The Clarendon Press, Oxford, 1958, по данным, опублико- ванным ранее в статье: Quellet L„ Laidler К. J., Morales M. F., Molecular Kinetics of Muscle Adenosine Tripho- sphate, Arch. Biochem. Biophys., 39, 37 (1942).] 6 — зависимость скорости реакции (изменение оптической плотности при 200 нм за 1 мин) от концентрации фермента при постоянной концентра- ции субстрата. Из работы: Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 1—3. — М.: Мир, 1982.) обозначает концентрацию свободного субстрата в реакционной смеси, а е0 — общую концентрацию фермента как в свободном, так и в связанном виде (см. ниже). Хотя Анри дал теоретическое толкование уравнению (3.3) на базе гипотетического механизма реакции, его доказательст- во, равно как и близкое обоснование, предложенное в 1913 г. Михаэлисом и Ментен, в настоящее время считается в общем случае не строгим. В то же время в этой главе мы неодно- кратно и не без успеха будем применять общий ход рассужде- ний Михаэлиса и Ментен (так и не нашедший до сих пор стро- гого подтверждения) для разработки более сложных моделей
Кинетика катализируемых ферментами реакций 137 кинетики ферментативного катализа. Поэтому сначала мы рас- смотрим основные положения гипотезы Михаэлиса — Ментен. В качестве одного из исходных положений принимают, что фермент Е и субстрат S, вступая в реакцию, образуют комп- лекс ES, который затем диссоциирует на продукт реакции Р и свободный (несвязанный) фермент Е: S+E ES (3.4а) Л-1 ES Р + Е (3.46) В этом механизме учтены как рассмотренное выше образование фермент-субстратного комплекса, так и регенерация катализа- тора в исходной форме по завершении последовательности ре- акций. Уравнения (3.4) в принципе верны, хотя и чрезмерно упрощены. Анри, а также Михаэлис и Ментен предположили, что реак- ция (3.4а) обратима, и, следовательно, в соответствии с зако- ном действующих масс мы можем записать: = -4^- = Кт=-константа диссоциации (3.5) (es) j «1 771 Здесь s, е и (es) обозначают концентрации S,E и ES соответ- ственно. Кроме того, принимается, что процесс разложения комплекса на продукт реакции и свободный фермент необра- тим: (з.б) Поскольку весь фермент находится или в свободной, или в связанной форме, то e+(es)=eo (3.7) где е0 — общая концентрация фермента в системе, известная из исходных данных и равная количеству фермента, загружен- ного в реактор. Теперь путем исключения (es) и е из трех по- следних уравнений можно получить уравнение (3.3), в котором vma*=k2e0. Обычно, говорят, что реакция характеризуется урав- нением Михаэлиса — Ментен, если ее скорость может быть описана уравнением (3.3), хотя в разработку и подтверждение правильности этого выражения внесли не меньший вклад и другие исследователи. Параметр итах называют максимальной или предельной скоростью, а Кт известна как константа Миха- элиса. Уравнение Михаэлиса — Ментен удачно описывает ки- нетику многих катализируемых ферментами реакций, но тем не менее оно не универсально. В последующих разделах и в уп- ражнениях мы рассмотрим ряд модифицированных вариантов
138 Глава 3 РИС. 3.8. Изменение концентраций веществ в реакции £+i k+2 Е + S <—ES -------> Р + Е при k+1 « « k+2 k-i этого уравнения, которые точнее описывают конкретные фер- ментативные реакции, протекающие в специфических условиях. Бриггс и Холдейн пришли к уравнению (3.3) другим путем, который, как было показано позднее путем экспериментального изучения кинетики и математического анализа, носит наиболее общий характер. Если реакция осуществляется в закрытом со- суде при энергичном перемешивании, то уравнения материаль- ного баланса для субстрата и фермент-субстратного комплекса можно записать следующим образом: и = —= k^e—k_l (es) и = kiSe—(£_t + k2) (es) С учетом выражения (3.7) эти два уравнения представляют собой систему двух обычных дифференциальных уравнений с двумя неизвестными, s и (es). Понятно, что соответствующие начальные условия при / = 0 выражаются следующим образом: s(O) = so (es)(0)=0 Эти уравнения нельзя решить аналитически, но путем ин- тегрирования с помощью компьютеров можно пайти зависимо- сти концентраций S, Е, ES и Р от времени. Полученные та- ким путем результаты приведены на рис. 3.8; очевидно, что
Кинетика катализируемых ферментами реакций 139 после короткого стартового периода можно с весьма большой точностью принять, что d(es) dt Ключевым пунктом анализа Бриггса и Холдейна явилось до- пущение о правильности условия (3.8). Можно показать, что для нашего случая катализируемой ферментом реакции в за- крытой системе это допущение, называемое обычно приближе- нием квазиравновесного состояния, справедливо при условии достаточно малой величины отношения e0/s0. Если же началь- ная концентрация субстрата сравнима с общей концентрацией фермента, то допущение (3.8) может оказаться неверным. В большинстве случаев, однако, количество ферментного ката- лизатора намного меньше количества реагентов; в такой ситуа- ции после стартового периода реакции выражение (3.8) мож- но считать применимым с достаточно высокой точностью. Если далее, следуя рассуждениям Бриггса и Холдейна, из приведенных выше уравнений с помощью выражения (3.7) исключить е и (es), то мы придем к уравнению __________________k2e0s______ /о q\ dt [(fe-x + ^/M + s__________{ ' Таким образом мы получили выражение типа уравнения Миха- элиса — Ментен, в котором ишах=^2^о (3.10) И (ЗЛ1) Обратите внимание на то, что здесь Кт по физическому смыслу уже не является константой диссоциации. Располагая математическим выражением для скорости ре- акции типа уравнения Михаэлиса — Ментен, мы можем опре- делить изменения концентраций реагентов во времени путем интегрирования ПРИ условии, что s(O) = so (3.12) Таким путем получаем, что ^max^~so (3.13) Разумеется, на практике это уравнение проще использовать для
140 Глава 3 расчета времени /, необходимого для достижения определен- ных концентраций субстрата, а не наоборот. Полезно сравнить ход реакции, предсказываемый уравне- нием (3.13), с результатами, полученными без приближения квазиравновесного состояния. Как показано на рис. 3.9, откло- нения могут быть значительными, если общая концентрация фермента приближается к s0, поэтому в таких случаях не сле- РИС. 3.9. Вычисленные зависимости степени гидролиза эфира ацетил-Ь-фенил- аланина химотрипсином от продолжительности реакции в реакторе периоди- ческого действия. При больших величинах eo/so=a наблюдается значитель- ное несоответствие между точным решением и решением в квазиравновесном приближении. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Lim Н. С., On Kinetic Behavior at High Enzyme Concentrations, Amer. Inst. Chem. Eng. J., 19, 659 (1973).] 1—решение в квазиравновесном приближении; 2 — точное решение. дует применять уравнение Михаэлиса — Ментен. На рис. 3.10 приведен другой пример, а именно зависимость эстеразной ак- тивности от концентрации фермента. Здесь предсказываемая моделью Михаэлиса — Ментен линейная зависимость справед- лива при малых концентрациях фермента, но также не соблю- дается при более высоких концентрациях. Запомните, что для линейного участка кривой тангенс угла наклона равен ^2s/ (Кт +5) • В некоторых случаях в зависимости от скоростей отдельных стадий реакции приближение квазиравновесного состояния мо- жет оказаться справедливым и при больших значениях eo/so- В частности, такая ситуация могла бы возникнуть, если бы комплекс ES диссоциировал гораздо быстрее, чем образовывал- ся, т. е. если бы Кт была значительно большего. Одйако обыч-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 141 но константа Михаэлиса очень мала и составляет от 10-2 до 10_5, поэтому такие случаи не типичны. Отсюда следует, что если концентрация фермента сравнима с So, то, как правило, у нас пет достаточных оснований для уп- рощения модели кинетики соответствующего процесса с исполь- зованием приближения квазистационарного состояния. Относи- тельная концентрация фермента может достигать больших зна- Содержание фермента, ед. РИС. 3.10. При высоких начальных концентрациях фермента зависимость эстеразной активности от концентрации эстеразы не подчиняется уравнению Михаэлиса — Ментен. (Воспроизведено с разрешения из работы: Frobisher М„ Fundamentals of Microbiology, 8th ed., p. 61, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1968.) чений, например, если работа ферментативного реактора про- должается и. тогда, когда большая часть субстрата уже под- верглась превращению. В таком случае s уменьшается до зна- чений, сравнимых с во, и на последнем этапе процесса уравне- ние Михаэлиса — Ментен может уже не отражать его реальной кинетики. К счастью, в этот период реакция резко замедляет- ся и поэтому, как правило, уже не представляет практического интереса. Концентрация субстрата вблизи фермента может быть незначительной и при проведении ферментативных реак- ций на поверхности раздела фаз; реакции такого типа мы рассмотрим в разд. 4.4. В таких случаях следует учитывать и скорость переноса субстрата к границе раздела фаз. Ограни- чения, свойственные модели Михаэлиса — Ментен, выявились лишь в самое последнее время, и поэтому соответствующее уравнение все еще широко используется при изучении и проек-
142 Глава 3 тировании ферментативных реакторов. Хотя в некоторых ситу- ациях равновесное приближение и уравнение Михаэлиса — Ментен нельзя считать достаточно точными, в целом они оказа- лись очень полезными инструментами исследования, и в этом качестве мы часто будем их применять и в дальнейшем изло- жении. Говоря о простом уравнении Михаэлиса — Ментен, нельзя не упомянуть, что точно таким же математическим выражени- ем широко пользуются для оценки скоростей многих реакций, ускоряемых твердыми катализаторами. Уравнение (3.3) в хи- мической технологии называется уравнением Ленгмюра — Хин- шелвуда или Хоугена — Уотсона. Поскольку в химической и нефтяной промышленности широко применяются реакции на синтетических твердых катализаторах, анализу и проектирова- нию таких каталитических реакторов было посвящено огромное число работ. В большей части этих работ использовали урав- нение Ленгмюра — Хиншелвуда; следовательно, их результаты с успехом могут быть перенесены и на катализируемые фер- ментами реакции, описываемые уравнением Михаэлиса — Ментен. В последующих главах мы еще не раз встретимся с аналогиями и сходством между классической химической и био- химической технологиями, но в то же время узнаем и многие особенности, характерные только для биологических процес- сов. 3.2.2. Определение параметров в уравнении Михаэлиса — Ментен В своей первоначальной форме уравнение Михаэлиса — Ментен (3.3) неудобно для определения кинетических пара- метров утах и Кт. Как показано на рис. 3.7, по графику зави- симости v от s довольно сложно определить точное значение Утах. Путем ряда несложных преобразований уравнения (3.3) нетрудно, однако, найти приведенные ниже уравнения, более пригодные для изображения результатов в графической форме и для графического определения параметров: — -- ----(3.14) и ушах ^тпах 5 — = ---— .S (3.15) и ymax ушах У = ашах—(зл6) Каждое из приведенных уравнений отражает линейную за- висимость одной величины от другой. В то же время при опре-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 143 делении кинетических параметров по таким зависимостям сле- дует принимать во внимание ряд свойственных им ограничений и недостатков. В графическом выражении уравнения (3.14) в виде зависимости 1/и от 1/s (известном под названием графика Лайнуивера—Бэрка) четко разделены зависимая и независи- мая переменные (рис. 3.11, а). Определяемые с наибольшей РИС. 3.11. а — результаты экспериментального изучения ферментативной ак- тивности пепсина в координатах Лайнуивера — Бэрка; б — экспериментальные данные по изучению катализируемого химотрипсином гидролиза метилового эфира дигидрокоричной кислоты в координатах Эди — Хофсти. [Воспроизведено с разрешения из работы: Laidler К. J-, The Chemical Kinetics of Enzyme Action, pp. 65—66, The Clarendon Press, Oxford, 1958.] точностью значения скоростей реакций, близкие umax, концент- рируются возле исходной точки, а менее точно определяемые значения v удалены от нее и таким образом в наибольшей степени влияют на наклон прямой Кт/атгх; поэтому в таких случаях нельзя применять метод наименьших квадратов. Вто- рое уравнение (3.15) обеспечивает более равномерное распре- деление больших значений v и, таким образом, более точное определение наклона кривой 1/итах, однако отрезок, отсекае- мый прямой на координатной оси, часто слишком мал, что не позволяет достаточно точно определить этим методом Кт- В третьем методе применяется так называемый график Эди — Хофсти, представляющий собой график зависимости и от v/s (рис. 3.11,6); здесь наименее точно определяемая переменная v является составной частью как функции, так и аргумента. Приведенные выше соображения диктуют следующую стра- тегию определения утах и Кт: сначала определяют ’ итах по графику уравнения (3.14) (находят точную величину отрезка,
144 Глава 3 отсекаемого прямой на оси 1/и) или уравнения (3.15) (точно определяют наклон прямой). Затем возвращаются к графику зависимости v от s и находят Si/2, т. е. такую концентрацию субстрата, при которой v равно vmsx/2. Как мы уже упоминали при обсуждении уравнения (3.3), Кт по величине и размернос- ти равно Si/2. Важно представлять себе, в каких диапазонах могут изме- няться эти кинетические параметры. В табл. 3.4 приведен ряд параметров, характерных для различных ферментов. Обратите внимание на то, что величина Л2, может изменяться в очень широких пределах, а Кт, напротив, обычно имеет значения 2-Ю-3—10-10—3 М. Почти все приведенные в табл. 3.4 данные были получены при умеренной температуре и почти нейтраль- ном pH. Исключение составляет пепсин, основная биологичес- кая функция которого сводится к гидролизу белков в кислой среде желудка и который поэтому наиболее активен при низ- ких значениях pH; эти значения, естественно, использовались и при экспериментальном определении его кинетических па- раметров. Модели, отражающие влияние pH и температу- ры на кинетику ферментативных реакций, мы рассмотрим в разд. 3.6. 3.2.3. Кинетика обратимых реакций, реакций с двумя субстратами и с активацией фермента кофактором Равновесие многих катализируемых ферментами реакций, например реакций гидролиза биополимеров, сильно смещено в сторону продуктов реакции, поэтому, как правило, такие пре- вращения можно считать необратимыми. В других случаях, например при изомеризации глюкозы во фруктозу под дейст- вием фермента глюкозоизомеразы, может установиться равно- весное состояние, требующее учета вклада обратной реакции. В качестве простейшей модели обратимой ферментативной ре- акции рассмотрим кинетику последовательных превращений типа S+E ES (3.17а) k-i ES Р + Е (3.176) *-2 Эта последовательность элементарных реакций отличается от последовательности реакций, предложенных Анри — Михаэ- лисом— Ментен и выражаемых уравнениями (3.4), только тем, что уравнение (3.176) теперь предусматривает образова- ние комплекса ES из продукта реакции и свободного фермента.
Таблица 3.4. Кинетические параметры некоторых ферментативных реакций® zss-ei Фермент Субстрат Температу- рН с_, м_, Пепсин Трипсин Химотрипсин Карбоксипептидаза Аденозинтрифосфатаза Уреаза Этиловый эфир карбобензокси-Е-глутамил-Е-ти- 31,6 4,0 0,00108 530 розина Карбобензокси-Ь-глутамил-Ь-тирозин 31,6 4,0 0,00141 560 Бензоил-Ь-аргининамид 25,5 7,8 27,0 480 Химотрипсиноген 19,6 7,5 2900 <770 Стурнн 24,5 7,5 13100 400 Эфир бензоил-Е-аргинина 25,0 8,0 26,7 12 500 Метилгидроциннамат 25,0 7,8 0,026 256 Метиловый эфир «Я-а-хлор-р-фенилпропионовой 25,0 7,8 0,135 83,3 кислоты Метиловый эфир d-fJ-фенилмолочной кислоты 25,0 7,8 0,139 28,6 Метиловый эфир /-fj-фенилмолочной кислоты 25,0 7,8 1,38 100 Метиловый эфир бепзоил-Е-фенилаланипа 25,0 7,8 51,0 217 Этиловый эфир ацетил-Е-триптофана 25,0 7,8 30,7 588 Этиловый эфир ацетил-Б-тирозина 25,0 7,8 193,0 31,2 Этиловый эфир бензоил-Б-о-нитротирозина 25,0 7,8 3,27 90,9 Этиловый эфир бензоил-Б-тирозина 25,0 7,8 78,0 250 Этиловый эфир бензоил-Е-фенилаланина 25,0 7,8 37,4 167 Этиловый эфир бензоил-Е-метионина 25,0 7,8 0,77 1250 Бензоил-Е-тирозинамид 25,0 7,8 0,625 23,8 Ацетил-Б-тирозинамид 25,0 7,8 0,279 12,3 Карбобепзоксиглицил-Б-триптофан 25,0 25,0 7,5 8,2 89 94 196 164 Карбобензоксиглицил-Б-фенилаланин 25,0 7,5 181 154 Карбобензоксиглицил-Б-лейцин 25,0 7,5 10,6 37 АТР 25,0 7,0 104 79 000 Мочевина | 20,8 20,8 7,1 8,0 20 000 30 800 250 256 а Воспроизведено из работы: Laidler К. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, p. 67, Oxford University Press, London, 1958.
146 Глава 3 Как и ранее, будем считать, что реакционная смесь нахо- дится в закрытом сосуде и эффективно перемешивается. Тогда на основе материального баланса различных форм фермента [уравнение (3.7)] с учетом приближения квазистационарного состояния [уравнение (3.8)] легко находим, что 7, = _ ds = dp _ (vs/Ks) S - (Vp/Kp) p /о 1 m dt dt ~ l + slKs+plKp ' ' Здесь vs и Ks аналогичны wmax и Km в уравнениях (3.10) и (3.11) соответственно, и к»=-¥г <ЗЛ9> Подавляющее большинство катализируемых ферментами реакций протекает с участием по меньшей мере двух субстра- тов. В то же время чаще всего, одним из субстратов является вода, концентрация которой практически постоянна и обычно в 1000 или более раз превышает концентрации других субстра- тов. Как мы покажем позднее в этом же разделе, в таких случаях можно считать, что реакция протекает с одним субст- ратом S, и, следовательно, ее кинетику можно изучать так, как это было описано в предыдущем разделе. Кроме того,, описан- ные ниже кинетические модели иногда могут объяснять и влияние кофакторов на скорости ферментативных реакций. По всей вероятности, во многих процессах с участием двух субстратов могут образовываться тройные комплексы, в кото- рых фермент одновременно связан с двумя субстратами. В та- ком случае возможна, например, такая последовательность ре- акций: Константа равновесия диссоциации Е +Sj ESr Kj Е +S2 =рь ES2 К.2 (3.20) ES1 + S2 ES1S2 К\2 ES2+S1 ESiSs К21 k ESjSj --> P + E так что v=k{es\Si) (3.21) Как и раньше, строчными буквами мы будем обозначать кон- центрации, а такими же буквами в скобках — концентрацию одной формы, например фермепт-субстратпого комплекса. Ес-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 147 ли допустить, что первые четыре реакции (3.20) равновесны, то получим V — ke0 , . к21 . К12 , х/2 (К2к21 + КтКтг) 1+~+ —+ (3.22) Вывод этого выражения не представляет затруднений, если учесть, что общая концентрация фермента е0 должна быть рав- на сумме концентраций свободного фермента е и трех комп- лексов ESj, ES2 и ESiS2. Как и в случае реакций с одним субстратом, в ферментативных реакциях с двумя субстратами можно применить приближение квазиравновесного состояния. В общем случае, однако, в результате получается довольно громоздкое уравнение с таким числом параметров, что оно ста- новится непригодным для практического использования. Удов- летворительное по ряду параметров приближение описывается уравнением (3.22). Уравнение (3.22) можно далее несколько упростить, если принять во внимание, что условия равновесия требуют, чтобы K±K12 = K2K2i (3.23) Соответствующим преобразованием уравнения (3.22) можно прийти к уже знакомой форме уравнений: у ^*maxsi Kl* H-Si где _______ ^g0S2 u max _i_ /г- й2 I л 12 И ' _ ^21S2 + ММ2 S2 + М2 (3.24 (3.25) (3.26) Из последних трех уравнений следует, что если s2 постоянна, а Si изменяется, то реакция будет подчиняться уравнению Миха- элиса— Ментен. В то же время уравнения (3.25) и (3.26) по- казывают, что кажущиеся максимальная скорость и константа Михаэлиса зависят от концентрации S2. Если считать приведенные выше последовательность реак- ций и выражение для скорости реакции с двумя субстратами правильными, то мы можем проверить справедливость уравне- ния Михаэлиса — Ментен (3.3), допустив, что один субстрат находится в большом избытке. Тогда y*max становится равной keQ, a М* приближается к постоянному значению Следова- 0
148 Глава 3 тельно, реакцию с двумя субстратами при s2^>Ki2 можно рас- сматривать как реакцию с одним субстратом. На рис. 3.12 изображена схема механизма ферментативной реакции с одним субстратом (или с двумя субстратами при S2^>/Ci2) при участии кофактора, которым может быть ион ме- талла или кофермент. Поскольку эта ситуация аналогична только что рассмотренному нами двухсубстратному механизму, здесь нет необходимости снова обращаться к допущению о рав- новесных последовательных реакциях. Если принять, что суб- Субстрат + Апофермент (белок) Фермент кофермент или ион металла Продукты реакции Свободный фермент Фермент - субстратный комплекс РИС. 3.12. Схематическое изображе- ние предполагаемого механизма фер- ментативного катализа с участием кофактора. страт связывается только апофермент-коферментным комплек- сом, то в конце концов мы получим v =------*£o£s---- (3.27) cs + Ks(c + Ke) где с — концентрация кофактора. Если считать концентрацию субстрата s постоянной, то это выражение преобразуется в уравнение Михаэлиса — Ментен, отражающее зависимость ско- рости реакции от концентрации кофактора с. Так, при невысо- кой концентрации кофактора (с<бйКс) реакция будет иметь пер- вый порядок по концентрации кофактора с. С другой стороны, при с^Кс мы получим уравнение скорости реакции с одним субстратом, которая не зависит от концентрации кофактора. Если Si и S2 или С и Si связываются с ферментом в строго определенном порядке, то соответствующее уравнение скорости процесса можно получить, приняв, что Kij запрещенной реак- ции приближается к бесконечно большой величине.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 149 3.3. Определение констант скоростей элементарных стадий ферментативной реакции В разд. 3.2.2 мы рассмотрели различные графические способы определе- ния параметров vmax и Кт, входящих в уравнение Михаэлиса — Ментеи. Как показывает анализ Бриггса — Холдейна, эти параметры определяются кон- стантами скоростей элементарных стадий реакции k\, k-i и k2. В то же вре- мя из уравнений (3.10) и (3.11) следует, что знания параметров Кт и vmaX еще недостаточно для определения скорости отдельных стадий реакции. Для оценки последних, очевидно, необходимо найти какие-то иные, независимые взаимосвязи между константами скоростей элементарных стадий и экспери- ментальными данными. Такие более фундаментальные кинетические параметры представляют ин- терес по меньшей мере по двум причинам. Во-первых, они дают углублен- ное представление о реальных процессах, происходящих в ходе катализируе- мых ферментами реакций. Мы можем узнать, например, насколько быстро субстрат взаимодействует с ферментом, и сравнить эти величины со скоростью обратного процесса диссоциации комплекса ES. Во-вторых, как мы уже ви- дели, упрощения, лежащие в основе уравнения Михаэлиса — Ментен, с до- статочной точностью оправдываются только при относительно невысоких кон- центрациях фермента. Если это условие не соблюдается, то изучение кинети- ки ферментативной реакции возможно только при учете данных материаль- ного баланса для s, р и (es), для чего в свою очередь необходимо знать константы отдельных стадий реакции &_] и k2. По указанным причинам нам представляется целесообразным рассмотреть здесь экспериментальные методы определения этих параметров и полученные с помощью таких мето- дов результаты. В методе кинетики предстащионарного состояния основное внимание уде- ляется короткому периоду (около 1 с или меньше) сразу после начала реак- ции, когда приближение квазистационарного состояния еще неприменимо. В течение этого периода концентрация субстрата изменяется незначительно, что позволяет приближенно решить уравнения материального баланса для (es) и р. Сравнение найденной таким образом зависимости р от t с экспери- ментальными данными, а также найденные значения vmax и Кт дают всю информацию, необходимую для расчета k-\ и k2. Экспериментальной ос- новой этого метода является методика остановленного потока, разработан- ная и развитая Б. Чансом с сотрудниками. Согласно этой методике, растворы фермента и субстрата быстро смешивают в кювете спектрофотометра; спект- рофотометрический метод позволяет контролировать изменения концентраций исходных веществ и продуктов реакции, осуществляющиеся в течение не- скольких миллисекунд. Разработанные и широко применявшиеся Эйгеном и сотрудниками ре- лаксационные методы дают возможность изучать реакции, завершающиеся в течение нескольких наносекунд. Существует несколько вариантов этого метода, но все они основаны на принципе возмущения равновесного (или стационарного) состояния реакционной смеси путем искусственного скачко- образного изменения некоторых условий реакции, например температуры, давления или напряженности электрического поля. Последующий отклик ре- акционной системы на это изменение регистрируют непрерывно. Как схема- тически показано на рис. 3.13, отклик на скачкообразное изменение условий реакции представляет собой не что иное, как переход в новое, почти рав- новесное или стационарное состояние. 3.3.1. Релаксационные методы изучения кинетики В этом разделе мы несколько подробнее остановимся на релаксационных методах, основанных на скачкообразном изменении условий реакции. Теория и практика релаксационных методов была разработана также в применении
150 Глава 3 Температура Наложение электри- ческого ноля или микроволнового импульса при в=О Реакционная смесь (вравно- весии при t<0) Время, ~ 70 6 с Концентрация РИС. 3.13. В релаксационных методах небольшое скачкообразное изменение условий реакции, например температуры, вызывает быстрый переход в новое равновесное состояние. к осциллирующим возмущениям условий реакций. Сначала рассмотрим рав- новесие только между субстратом, ферментом и фермент-субстратным ком- плексом: E-J-S <—> ES /Мы знаем, что для этой реакции s + (es) =s0 и е + (es) = е0 Поэтому для эффективно перемешиваемой реакционной смеси, находящейся в реакторе периодического действия, уравнение материального баланса для$ -^- = ^_1(es)—k^e (3.28) принимает форму -^- = ^1(s0—$)—^s(e0 + s—s0)= f(s) (3.29) Если мы символом s* обозначим концентрацию s в равновесном состоя- нии после скачкообразного изменения условий реакции, то $* можно опре-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 151 делить, решив уравнение f(s*)=O (3.30) где f(s)—правая часть уравнения (3.29), равная dsfdt. В любом релаксацион- ном эксперименте $ будет близко s*, и приближенно можно считать, что f(s) равно первым членам в разложении Тейлора типа df (s*) f(s) («*) +-----— (s—s*)-1-члены порядка (s—s*)2 и высших порядков. (3.31) Здесь f(s*), согласно уравнению (3.30), равно нулю. Обозначив символом % отклонение от равновесной концентрации %=s —s* (3.32) и принимая во внимание, что s* не зависит от времени, путем преобразова- ния уравнений (3.29) — (3.32) можно получить линейное уравнение следую- щего вида [если пренебречь членами второго и высшего порядков в уравне- нии (3.31)]: dt —R-i + ^т(ео — so_r2s*)lx (3.33) Если система сначала находится в состоянии исходного равновесия, ко- торое отвечает условиям, предшествующим скачкообразному возмуще- нию, то Х(О)=Дхо (3.34) а затем Х(/)=ДХов-^ (3.35) где =s k_± -|- k1(e0 — sQ -f- 2s*) =4 k_^ 1\(е* -{- s*) (3.36) V В уравнении (3.36) e* выражает концентрацию не связанного в комплекс фермента в состоянии конечного равновесия. Уравнение (3.35) свидетельст- вует о том, что т можно определить по наклону прямой, отражающей полу- логарифмическую зависимость X(f) от ДХо. Другими словами, т представляет собой время, в течение которого X(f) уменьшается до 37% от своего перво- начального значения. Определив т, %* и е* (или е0 и з0), далее по уравне- нию (3.36) можно найти взаимосвязь между kt и k-i, не зависящую от уравнения равновесия. Таким путем можно вычислить как kt, так и k-i. Этот метод нашел широкое применение в химической кинетике, в том числе и в кинетике рассматриваемого здесь ферментативного катализа. 3.3.2. Некоторые результаты изучения кинетики переходных состояний В табл. 3.5 приведены значения kx и fe-i для ряда ферментов и субстра- тов. Эти данные были получены с помощью описанных выше методов, а так- же ряда других специальных методик, описанных в приведенной в конце настоящей главы литературе. Нетрудно видеть, что константы скорости пря- мой реакции субстрата с ферментом kt почти всегда близки к теоретическо-
Таблица 3.5. Константы скорости некоторых элементарных стадий фермент-субстратных реакций3 Белок или фермент Субстрат fei, (М-с)-1 с-' Фумараза Фумарат L-Малат >109 >Ю9 >4,5-104 >4-104 Ацетилхолинэстераза Ацетилхолин >10э Уреаза Мочевина >5-10е Миозин (аденозин- АТР >8-10е трифосфатаза) Гексокиназа Глюкоза 3,7-10® 1,5-10® MgATP >4-10® >6-102 Р-Амилаза Амилоза >5,8-107 Алкогольдегидроге- NAD 5,3-10® 74 наза из печени NADH 1,1•107 3,1 NAD-Алкогольдегид- С2Н5ОН >1,2-104 >74 рогеназа из печени СН3СНО >3,7-103 >3,! Малатдегидрогеназа N.ADH 6,8-10® 2.4-108 Желтый старый фер- Флавинмононуклео- 1,5-10® ~10’4 мент Каталаза тид Н2О2 5-10® Н2О2-Каталаза Н2О2 1.5-107 Пероксидаза Н2О2 9-10® <1.4 Н2О2-Пероксида- Гидрохинон 2,5-10® за(П) Пероксидаза Цитохром с 1,2-10® Глутамат-аспартат- Глутамат 3,3-107 2,8-10® трансаминаза, Аспартат >107 >5-10® альдегидная форма NH2OH 3,7-10® 38 Кетоглутарат, >5-108 >5-104 Глутамат-аспартат- оксалоацетат Оксалоацетат 7-Ю7 1,4-10® трансаминаза, Кетоглутарат 2,1-Ю7 70 аминная форма Альбумин из сыво- I-Нафтол-4- (4'-азо- 2-10® 35 ротки быка бензолазофенил)- арсоновая кисло- та (I) [Нафтол-З-сульфо-4- 3,5-105 2,5 у-Глобулин кролика (4/-азобензолазо)]- фениларсоновая кислота (II) 1-Нафтол-4- (4'-азо- 2,2-Ю7 50 (антитела к I и II) бензолазофенил)ар - у-Глобулин кролика соновая кислота 2,4-Динитрофенил- 8,1-10’ 1,1 (антитела к III) Гемоглобин НЬ(О2)з лизин (III) о2 2-Ю7 36 Глобин Карбоксигем 7-107 а Воспроизведено из работы: Mahler Н. R., Cordes Е. Н„ Biological Chemistry, 2d ed., р. 322, Harper and Row, Publishers, Inc., New York, 1971. 152
Кинетика катализируемых ферментами реакций 153 му максимальному значению, составляющему для абсолютной скорости бимо- лекулярных соударений в растворе от 109 до 1011 [(моль-с)/л]-1. Напротив, обратный процесс протекает сравнительно медленно, и его скорость, как и скорость диссоциации промежуточного фермент-субстратного комплекса на продукт реакции и свободный фермент (см. значения k2 в табл. 3.4), в зна- чительно большей степени зависит от природы реагирующих веществ. Описанными выше методами была выявлена другая интересная особен- ность ферментативного катализа, заключающаяся в образовании нескольких промежуточных фермент-субстратных комплексов ES. В ряде случаев ком- плекс претерпевает ряд последовательных конформационных превращений, которые можно рассматривать как реакции изомеризации. Методами изуче- ния стационарных состояний невозможно установить, образуется ли одно или несколько промежуточных соединений, если скорость диссоциации по- следнего промежуточного комплекса (до конечных продуктов реакции) мала по сравнению со скоростью превращения комплексов, образующихся на пре- дыдущих стадиях. В таких случаях ценная информация может быть полу- чена релаксационными методами. 3.4. Другие типы зависимостей скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата Скорости не всех катализируемых ферментами реакций под- чиняются описанному в разд. 3.2 уравнению Михаэлиса — Мен- тен. В настоящем разделе мы рассмотрим некоторые наиболее типичные отклонения. Отклонение первого типа, характерное для регуляторных ферментов, можно объяснить связыванием с ферментом нескольких субстратов. Далее мы опишем второй тип отклонений от уравнения Михаэлиса — Ментен, когда суб- страт представляет собой смесь различных реагирующих с фер- ментом веществ, обладающих разными кинетическими свойст- вами. Анализ отклонений второго типа поможет выявить ряд проблем, с которыми приходится сталкиваться при работе с не- достаточно очищенными или плохо охарактеризованными сме- сями субстратов. 3.4.1. Активация и ингибирование ферментов субстратами Характерная для некоторых ферментов S-образная форма кривой зависимости скорости реакции от концентрации субст- рата свидетельствует об эффекте активации (рис. 3.14). При низких концентрациях субстрата связывание ферментом одной молекулы субстрата повышает скорость связывания следующей молекулы (с математической точки зрения это означает, что на этом этапе реакции dvlds возрастает). Моделью такого про- цесса может служить согласованное связывание субстрата субъединицами белка. Предположим, что фермент, например, олигомерной структуры имеет несколько связывающих субст- рат центров и что связывание первой молекулы субстрата с
154 Глава 3 РИС. 3.14. Активация (а) и ингибирование (б) ферментативной реакции суб- стратом. ферментом изменяет структуру последнего таким образом, что сродство оставшихся свободными центров по отношению к суб- страту увеличивается. Математический анализ такой модели аналогичен рассмотренному в упражнении 2.10 анализу модели гемоглобина, и поэтому мы не будем повторять его в основ- ном тексте. Иногда в присутствии большого количества субстрата ско- рость катализируемой ферментом реакции снижается при по- -3 -2 -1 bgs а РИС. 3.15. Экспериментальное обнаружение субстратного ингибирования. [Воспроизведено из работы: Laidler К. L, The Chemical Kinetics of Enzyme Action, p. 71, The Clarendon Press, Oxford, 1958. a — данные из статьи: Augustinsson К. D., Substrate Concentration and Speci- ficity of Choline Ester Splitting Enzymes, Arch. Biochem., 23, 111 (1949); 6 — данные из статьи: Lumry R., Smith E. L., Glantz R. R., Kinetics of Carbo- xypeptidase Action. I. Effect of Various Extrinsic Factors on Kinetic Parame- ters, J. Amer. Chem. Soc., 73, 4330 (1951).]
Кинетика катализируемых ферментами реакций 155 вышении концентрации субстрата (рис. 3.15). Это явление на- зывается субстратным ингибированием. Как показано на рис. 3.15, в таких случаях скорость реакции v по мере повыше- ния концентрации субстрата сначала возрастает, затем дости- гает максимума и, наконец, снижается. Если s больше, чем s, соответствующая итаХ) то снижение концентрации субстрата вызывает повышение скорости реакции. Автокаталитический характер реакций такого типа может оказывать существенное влияние на работу биохимических реакторов. Взаимосвязь между концентрацией субстрата и скоростью ингибируемой субстратом реакции можно оценить количествен- но с достаточно высокой точностью, используя подход Миха- элиса и Ментен- и допустив, что фермент может связывать и вторую молекулу субстрата, причем в результате присоедине- ния S к ES образуется нереакционноспособное промежуточное соединение. В этом случае в равновесном состоянии будут осу- ществляться следующие последовательные реакции: Константа диссоциации Е + S ES k-i ES + S ч—* ES2 k ES ----> Е + Р Ki например, (медленная стадия) (3.37) (3.38) На основе двух указанных равновесных реакций диссоциации с учетом уравнения материального баланса различных состоя- ний фермента, аналогичного уравнению (3.7), после неслож- ных алгебраических преобразований можно получить следую- щее выражение: (3.39) Экспериментальное определение параметров этого уравне- ния не вызывает затруднений. Так, сначала путем изменения е0 можно определить k, а затем, построив график зависимости 1/и от s, можно оценить тангенс угла наклона прямого участка кривой, при высоких концентрациях субстрата равный 1//C2^f?o (рис. 3.16). Наконец, Ki можно найти по уравнению (3.40); здесь smax удовлетворяет уравнению (3.39) при dv/ds = Q. $тах К К1К2 (3.40)
156 Глава 3 3.4.2. Взаимодействие одного фермента с несколькими различными субстратами Многие ферменты могут взаимодействовать с несколькими субстратами. В таких случаях различные субстраты конкури- руют за связывание с активным центром (здесь мы принимаем, что роль активного центра для различных субстратов выполня- ет один и тот же участок молекулы фермента). Наиболее из- бонцентрация субстрата Ю~3 РИС. 3.16. Способ определения константы К.2 по наклону прямой зависимости 1/у от s. Приведены данные для гидролиза этилбутирата карбоксипептидазой из печени овцы. (Из работы: Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, т. 1—3. — М.: Мир, 1982, т. 1, с. 99.) вестными примерами ферментов такого типа являются гидро- лизующие деполимеразы, которые расщепляют многие иден- тичные связи, часто независимо от длины гидролизуемого по- лимерного сегмента. В то же время кинетические параметры реакций такого фермента с димером, тримером или олигоме- ром могут заметно отличаться от параметров аналогичной ре- акции с достаточно высокомолекулярными полимерными цепя- ми. Примером таких ферментов может служить лизоцим, содер- жащийся в яичном белке, слизистых выделениях и слезах. Ли- зоцим гидролизует сложные мукополисахариды, в том числе и муреины клеточных стенок, вызывая гибель грамположитель- ных бактерий. Приведенные выше общие положения подтверж- даются экспериментальными данными (табл. 3.6), где указа- ны найденные скорости и константы диссоциации для каждого
Кинетика катализируемых ферментами реакций[57 субстрата лизоцима в отсутствие других субстратов. Нетрудно видеть, что наибольшие отличия характерны для мономерного и олигомерных субстратов. В приведенных выше и в последующих примерах каждую подвергающуюся гидролизу связь олигомера или полимера можно рассматривать как индивидуальный субстрат. Более то- го, полимерный субстрат типа крахмала на самом деле также Таблица 3.6. Кинетические параметры реакции лизоцима с компонентами клеточной стенки бактерий (сополимеры GlcNAc—MurNAc; GlcNAc— N-ацетилглюкозамин, MurNAc—N-ацетилмурамовая кислота)3 Реакция Тип реакции Kij 1. E+Sz < fe-Gry; /—0 t+1 Ассоциация S;= (GlcNAc—MurNAc), — олигомер из i звеньев kc 2. Сц —>• A/+Si-/; /=1, ..., i—1 Гидролиз комплекса hv 3. Си —>- А/+Н2О Диссоциация промежу- точного комплекса 4. Ai(+H2O) —>- E+S; Гидролиз промежуточ- ного комплекса 5. Ai+S/ —>- E + S/+/ Трансгликозилирование с образованием олиго- мера из i+j звеньев Кп=0,5 М-1; К21=6,3-10-4 М-1; К22=2000 М~'; К32=3,5-104 М"1; йс = = 1,75 с-1; 6, = 100 с-1; йг=2,77-105 (М-с)-1. а По данным работы: Chipman D. М., A Kinetic Analysis of the Reaction of Lyso- zyme with Oligosaccharides from Bacterial Cell Walls; Biochemistry, 10, 1714 (1971). представляет собой не индивидуальный субстрат в строгом смысле слова, а смесь полимеров различной молекулярной мас- сы, которые к тому же могут содержать мономер-мономерные связи разных типов (разд. 2.2.2). На рис. 3.17 отражены раз- личия в кинетике гидролиза разных крахмалов. Пример кине- тики ферментативного гидролиза более четко охарактеризо- ванной системы приведен на рис. 3.18. Такого типа реакции используются в промышленности для разжижения растворов крахмала амилазами. Аналогичные эффекты следует ожидать и в других подобных реакциях, например, в случае гидролиза белков протеолитическими ферментами. Прежде чем перейти к количественной оценке конкуренции между различными суб- стратами, следует подчеркнуть, что в приведенных выше при-
РИС. 3.17. Кривые зависимости скорости гидролиза различных фракций ами- лозы под действием амилоглюкозидазы от времени (25 °C; pH 4,6; So= =0,1 г/100 мл, ео=6,8-1О~8 М); молекулярные массы фракций амилозы около 1 650 000 (a), 1 100 000 (б) и 360 000 (в). [Воспроизведено с разрешения из статьи: Hiromi К. et al., A Kinetic Method for the Determination of Number- Average Molecular Weight of Linear High-Polymer by Using an Exo-Enzyme, J. Biochem. (Tokyo), 60, 439 (1966).] РИС. 3.18. Кривые зависимости скорости ферментативного гидролиза олиго- меров и полимеров глюкозы под действием амилоглюкозидазы от времени (15 °C; pH 5,15; s0 = 0,04 М; ео=2,82-10-7 М). [Воспроизведено из работы: Ono S., et al., Kinetic Studies of Gluc-amylase; J. Biochem. (Tokyo), 55, 315 (1964),]
Кинетика катализируемых ферментами реакций 159 мерах определенную роль могут играть и другие факторы, в частности различия в физических размерах и состояниях инди- видуальных субстратов, а также в числе поддающихся гидро- лизу связей в каждом из находящихся в реакционной смеси субстратов. Для некоторых гидролитических ферментов характерна се- лективность в отношении различных участков цепи биополиме- ра. Так, экзоферменты расщепляют концевые (или близкие к концевым) связи цепи, а эндогидролазы катализируют гидро- лиз внутренних связей цепей. При описании кинетики таких систем важно учитывать оба типа ферментативных реакций, а также «концентрации» концевых и внутренних связей в смеси биополимеров. С таким подходом мы встретимся в следующей главе при изучении ферментативного гидролиза целлюлозы. Ниже мы рассмотрим один простой, но показательный при- мер, иллюстрирующий некоторые типичные затруднения, кото- рые встречаются при описании кинетики ферментативных ре- акций со смесями субстратов. Пусть последовательности реак- ций (3.41) и (3.42) отражают взаимодействие двух различных субстратов с одним и тем же ферментом: E + St ч=ь ESi; константа диссоциации (3.41) E + S2 ES2; константа диссоциации Л2 Медленные стадии: ESx Е + Рг; ES2 ЕР2 (3.42) Здесь подразумевается, что каждый субстрат связывает какую- то часть фермента. Если мы далее, как и в наших предыдущих анализах кинетики ферментативных реакций, используем урав- нение общего материального баланса фермента и условия рав- новесия, то получим следующие выражения для скоростей ре- акций: — =-----MA//Q------- (3 43) d/ 1 + -(- s2//C2 — = =--------fe2gQS2/Kg-- ,344) 1 + Si/M 4- s2/^2 Из уравнений (3.43) и (3.44) следует, что если две реакции катализируются одним и тем же ферментом, то скорости инди- видуальных реакций в присутствии двух субстратов ниже, чем в присутствии только одного субстрата. Этот факт успешно ис- пользовался для идентификации ферментных препаратов; дей- ствительно, таким путем можно выяснить, действует ли на оба субстрата один и тот же фермент или же реакция каждого субстрата катализируется своим ферментом.
160 Глава 3 В экспериментах и в технологических процессах обычно трудно или даже невозможно определять и контролировать концентрации всех компонентов реакционной смеси. Например, изображенные на рис. 3.18 кривые отражают ход многих одно- временно протекающих реакций, в том числе гидролиза маль- тозы, мальтотриозы и т. д. Другими словами, в действительно- сти изучают не индивидуальную реакцию, а некоторую гипоте- тическую общую реакцию превращения полимеров глюкозы в мономерную глюкозу под действием фермента амилоглюкозида- зы: амилоглюкозидаза Полимеры глюкозы--------------► глюкоза В этой реакции все субстраты, построенные из остатков глюко- зы, объединены в некий воображаемый единый субстрат, кон- центрация которого может быть определена сравнительно лег- ко. Такого типа усреднение субстратов широко применяется во всех областях химической кинетики. Рассмотрим, например, каталитический крекинг газойля. В проектных разработках или при анализе работы реактора этот процесс для удобства часто изображают в виде следующей двустадийной реакции: Газойль ---> бензин ---> газы хотя в данном случае каждый из реагентов* очевидно, пред- ставляет собой смесь соединений. В научно-технической литера- туре по биологии и биохимической технологии при изучении и моделировании биологических реакций, а также при проектиро- вании соответствующих технологических процессов подобные усреднения, хотя и далеко не всегда столь очевидные, встреча- ются сплошь и рядом. В нашей книге мы постараемся тщатель- но анализировать обоснованность таких и подобных упроще- ний, применяющихся (обычно косвенным образом) при описа- нии биологических систем. Неоправданные упрощения могут привести к серьезным ошибкам как в теоретических исследо- ваниях, так и в проектных разработках. Приведем пример одной из таких ошибок. Предположим, что 5т представляет собой общую концентрацию всех субст- ратов в смеси: ~ st §2 (3.45) Тогда суммарная скорость превращения Vr будет определяться выражением у __ ds-p _______f dsl . dsz \ _ g0 (kis1IK1 4- zg dt \ dt dt J 1 -f- Si/Ki 4- Sn /Kt Очевидно, что скорость vT зависит от отношения величин Si и
Кинетика катализируемых ферментами реакций 161 $2. Например, если суммарная концентрация субстрата имеет определенную величину syo, то суммарная скорость Vt в об- щем случае не имеет определенного значения, а в зависимости от отношения si/s2 может изменяться в следующих пределах: ит sl=sTo S2=0 gpfelsro Ki + sTo уменьшение si ------------>- увеличение s2 VT Si=0 S2=STo ^0^2$ 7* 0 + ST0 (3-47) Отсюда следует, что определенные экспериментальным пу- тем кинетические параметры итах и Кт будут зависеть как от состава смеси (отношения Si/s2), так и от общей концентрации субстрата Sr. Точно так же параметры работы ферментативно- го реактора будут изменяться при изменении относительных количеств субстратов Si и S2, даже если общая концентрация вводимых в реактор реагентов будет поддерживаться па по- стоянном уровне. 3.5. Регуляция ферментативной активности Изменять, или модулировать, каталитическую активность ферментов могут не только субстраты, но и другие взаимодей- ствующие с ферментами вещества; их называют модулятора- ми, или эффекторами. Эффекторы могут быть обычными ком- понентами клетки, но могут и проникать в клетку из среды или действовать на изолированные ферменты. Основное внима- ние в этом разделе будет уделено ингибиторам — веществам, понижающим ферментативную активность. Следует, однако, иметь в виду, что известны и случаи активации ферментов суб- стратами. Взаимодействие фермента с эффектором представляет собой химическую реакцию и поэтому может быть полностью обрати- мым, частично обратимым или практически необратимым. К числу известных необратимых ингибиторов принадлежат яды, например цианидный ион, инактивирующий ксантинокси- дазу, а также группа соединений, называемых нервнопарали- тическими ядами-, последние необратимо инактивируют холин- эстеразы (ферменты, участвующие в системах передачи нерв- ных импульсов и, таким образом, в моторной активности). Если процесс ингибирования необратим, то кинетика ингиби- торзависимых ферментативных реакций не подчиняется урав- нению Михаэлиса — Ментен, основой которого является нали- чие равновесия между свободной и связанной формами фер- мента. Часто по мере полной инактивации все большего и большего числа молекул фермента процесс необратимого ин- гибирования прогрессирует во времени. В других случаях, труднее поддающихся выявлению, фермент инактивируется 11—537
162 Глава 3 лишь частично и сохраняет каталитическую активность, хотя и в меньшей степени по сравнению с чистым ферментом. В разд. 2.6 мы уже говорили о замечательной способности большинства микроорганизмов продуцировать множество раз- нообразных сложных соединений из относительно небольшого числа простых предшественников. Для достижения этой цели необходима некая система очень эффективного распределения поступающих предшественников по многим биосинтетическим путям, ведущим к различным конечным продуктам метаболиз- Z 'Треонин L-Изолейцин СН3 сн3 I £, Е3 Еа Ёь । неон ---------- > Рт ——> р2----> р3----> Р4--СН, I Г hcnh2 | НССНз соон I hcnh2 I I I соон. РИС. 3.19. Последовательность реакций биосинтеза L-изолейцина, ингибируе- мая по принципу обратной связи; здесь активность фермента Ei (L-треонин- дезаминазы) снижается в присутствии конечного продукта последовательно- сти— L-изолейцина. (Р1=а-кетобутират; Р2=а-ацетогидроксибутират; Рз= =аф-дигидроксиф-метилвалерат; Р4=а-кетоф-метилвалерат.) ма. В большинстве случаев принцип оптимального усвоения до- ступного исходного продукта требует синтеза любого из конеч- ных продуктов только в строго необходимом количестве. Если,, например, в клетке имеется достаточное количество данного мономера, то его дальнейшее накопление должно быть прерва- но, с тем чтобы ресурсы клетки могли быть направлены на син- тез других соединений, количество которых в этот момент от- носительно мало. Одним из регуляторных механизмов, используемых клеткой для достижения максимально эффективного усвоения питатель- ных веществ, является обратимая регуляция ферментативной активности. (Другой важный механизм управления будет рас- смотрен в гл. 6, разд. 1.) Наиболее интересные примеры регу- ляции ферментативной активности включают в себя сложную сеть реакций с несколькими регуляторными петлями; эти при- меры мы рассмотрим позднее, после того как изучим основы химии клетки (гл. 5). Сейчас же нам будет достаточно приме ра регуляции простой последовательности реакций. На рис. 3.19 изображена пятистадийная последовательность биосинтеза
Кинет ина катализируемых ферментами реакций 163 аминокислоты ь-нзолейцнна. Регуляция этой последователь- ности реакций осуществляется путем ингибирования по прин- ципу обратной связи, когда конечный продукт, ь-изолейцин, ин- гибирует активность фермента, катализирующего первую ста- дию последовательности. Таким образом, биосинтез конечного продукта последовательности реакций будет тормозиться по ме- ре его накопления. Таблица 3.7. Некоторые типы обратимого ингибирования1 Тип ингибирования Механизм ингибирования Ингибирующий эффект 1а. Полное кон- курентное Ингибитор сорбируется активным Увеличение ка- центром, связывающим субстрат жущегося зна- чения Кт б. Частичное конкурентное Ингибитор и субстрат связываются Увеличение кажу- различными центрами; связывание щегося значения ингибитора влияет на связывание Кт субстрата Па. Неконкурент- ное Связывание ингибитора не влияет на Снижение vmax сродство субстрата к ферменту, но без изменения фермент-субстрат-ингибиторный Кт комплекс устойчив и далее не дис- б. Неконкурент- ное социирует Тот же, что в ингибировании типа Снижение vmax Па, но фермент-субстрат-ингиби- без изменения торный комплекс распадается с об- Кт разованием нормального продукта реакции со скоростью, меньшей скорости диссоциации ES III. Смешанное Изменение как Кт, так и vmax а Из работы: Диксон М., Уэбб Э., Ферменты. — М.: Мир, 196S. Поскольку катализируемые ферментами Е2—Е5 реакции на- ходятся в состоянии равновесия, а первая реакция в клеточной среде «необратима», то быстродействие такой регуляторной системы очень высоко. По сути дела, большинство регулятор- ных ферментов катализирует именно такие «необратимые» ре- акции. С точки зрения биологии клетки очевидно, что такая «природная» регуляция ферментативной активности должна быть обратимой. Если, например, весь ь-изолейцин был израс- ходован в процессе белкового синтеза, то ингибирование фер- мента Е[ должно прекратиться и система вновь должна син- тезировать необходимое количество этой аминокислоты. В случае обратимого ингибирования изложенные в разд. 3.2 подходы к анализу кинетики оказались очень плодотворными. Поскольку многие изолированные фермент-субстратные систе- 11*
164 Глава 3 мы подчиняются кинетике Михаэлиса — Ментен, принято клас- сифицировать ингибиторы по их влиянию на параметры урав- нения Михаэлиса — Ментен ymax и Кт. Обратимые ингибиторы называют конкурентными, если в их присутствии повышается значение Кт, a ymax не изменяется. Вызываемый ингибиторами такого типа эффект можно частич- но или полностью подавить путем повышения концентрации субстрата. Неконкурентные ингибиторы, напротив, инактиви- руют фермент или фермент-субстратный комплекс путем умень- шения Утах фермента, но не влияют на величину Кт. В этом случае повышение концентрации субстрата до сколь угодно вы- сокого уровня уже не позволит повысить скорость реакции до величины, характерной для неингибированного фермента. Ти- пичными примерами неконкурентных ингибиторов являются ионы тяжелых металлов, обратимо реагирующие с сульфгид- рильными (—SH) группами цистеиновых остатков. Известны несколько сочетаний и вариантов этих двух ос- новных типов обратимых ингибиторов; некоторые из них при- ведены в табл. 3.7. Чуть позже мы рассмотрим эксперименталь- ные методы определения типа ингибирования, но прежде вкратце обсудим некоторые теории, объясняющие механизмы действия регуляторов ферментативной активности,, и соответст- вующие экспериментальные данные. 3.5.1. Механизмы обратимой регуляции ферментативной активности Многие из известных конкурентных ингибиторов по своей химической природе близки обычным субстратам; такие инги- биторы называют субстратными аналогами. Полагают, что по- добные ингибиторы имеют пространственную структуру типа ключа, который может входить в «замочную скважину» актив- ного центра фермента, однако «ключ» не вполне подходит к данному «замку» и реакция не идет. Рассмотрим, например, ингибирование процесса дегидрирования янтарной кислоты ма- лоновой кислотой: СООН СН2 СН2 СООН процесс катализируется сукцинилдегидр огеназой я конкурентно ингибируется малоновой кислотой янтарная кислота соон I сн II сн соон фумаровая кислота соон\ сн2 I соон / малоновая кислота В данном случае малоновая кислота может образовывать комплекс с сукцинилдегидрогеназой, но на этом процесс оста- навливается.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 165 Конкурентное ингибирование лежит в основе механизма действия одного из лекарственных сульфамидных препаратов — сульфаниламида (стрептоцида). Структура последнего очень близка структуре n-аминобензойной кислоты — важного вита- мина многих бактерий. Сульфаниламид ингибирует фермент, участвующий в превращении n-аминобензойной кислоты в фо- лиевую кислоту, тем самым блокируя биохимический аппарат бактерии, что приводит к ее гибели. л-амииобеизойная сульфаниламид кислота При другом механизме, называемом аллостерической регу- ляцией, поведение фермент-субстратной системы типично для неконкурентного ингибирования. Считается, что механизм алло- стерической регуляции вообще играет доминирующую роль в неконкурентном ингибировании и активации. Название аллосте- рический (имеющий другую форму) было дано этому механиз- му сначала на том основании, что по своему строению многие эффекторы ферментативной активности существенно отличают- ся от субстратов. Отсюда был сделан вывод, что регуляторное действие таких эффекторов основано на их связывании со спе- цифическим регуляторным центром фермента, отличным от ак- тивного центра, в котором осуществляется катализ превраще- ний субстрата. Соответственно ферменты, обладающие цент- рами регуляции и катализа, были названы аллостерическими ферментами. Аллостерическая регуляция может как ингибировать (сни- жать), так и активировать (повышать) каталитическую способ- ность фермента. Процесс аллостерической регуляции схемати- чески изображен на рис. 3.20. Обратите внимание на то, что фермент здесь изображен в виде двух субъединиц; известно, что многие аллостерические ферменты и на самом деле явля- ются олигомерными белками. Наиболее убедительным доказательством справедливости аллостерической теории ферментативной активности явилось экспериментальное изучение аспартилтранскарбамоилазы (АТС-азы). После разделения фермента на две субъединицы выяснилось, что на обладающую каталитической активностью
166 Глава 3 большую субъединицу ингибитор интактного фермента СТР (цитидинтрифосфат) не влияет. Напротив, меньшая субъеди- ница каталитически не активна, но связывает СТР. В отсутствие экспериментальных доказательств типа при- веденных выше для АТС-азы нельзя быть уверенным в том, что эффектор не связывается активным центром фермента. С кинетической точки зрения, однако, представляет интерес Каталитически активное состоя- ние (К форма) Связь/вание субстрата S и эффектора А стаби- лизирует каталити- чески активное состояние Аллостеричес- ка ингибирован- ное состояние Связывание алло- стерического инги- битора I стабили- зирует ингибиро- ванное состояние „Принцип симметрии’ исключает воз- можность смешанного T-R-состоя- ния РИС. 3.20. В симметричной модели аллостерической регуляции ферментатив- ной активности связывание активатора А и субстрата S приводит к каталити- чески активной R-форме фермента, а связывание ингибитора изменяет кон- формацию всех субъединиц в олигомерном белке таким образом, что молеку- ла белка принимает неактивную Т-форму. (Из работы: Лёви А., Сикевиц Ф., Структура и функция клетки. — М.: Мир, 1971, с. 306.] только влияние эффектора на ряд параметров, в том числе на сродство субстрата к ферменту, концентрацию несвязанного фермента и (или) скорость распада комплекса. В следующем разделе мы попытаемся найти математические выражения, ха- рактеризующие эти эффекты количественно. 3.5.2. Анализ влияния обратимой регуляции на кинетику ферментативных реакций Основная ценность подхода Михаэлиса и Ментен к анализу кинетики ферментативных реакций заключается в том, что он позволяет количественно описать влияние эффекторов. Преж- де всего допустим, что приведенная ниже последовательность реакций достаточно точно отражает механизм взаимодействия
Кинетика катализируемых ферментами реакций 167 ингибитора и субстрата с ферментом при (полном) конкурент- ном ингибировании. Здесь, как обычно, Е и S обозначают фер- мент и субстрат соответственно, а символами I и EI обозна- чены ингибитор и фермепт-ингибиторный комплекс соответст- венно. Равновесные стадии реакции: Константа диссоциации E + S ES Ks (3.48) E+I EI Ki Медленная стадия: k ES ----> E+P (3.49) В этом случае фермент может связывать или только субстрат, или только ингибитор. Поскольку часть фермента связана в комплексе EI, не весь фермент участвует в каталитическом превращении субстрата; следовательно, скорость реакции в присутствии ингибитора замедляется. На базе равновесных реакций (3.48) и уравнения общего материального баланса фермента е+ (es) 4- (ei) = (3.50) скорость реакции можно выразить через общую концентрацию фермента во и концентрации свободного субстрата и ингибито- ра (s и i соответственно): р == s .уд.) (полное) конкурентное ингибирование (3.51) Сравнение с исходной формой уравнения Михаэлиса — Ментен показывает, что параметр утах остался без изменений, а кажу- щаяся константа Михаэлиса Ктарр в присутствии конкурентно- го ингибитора возрастает: <3-52) \ Ki / Другими словами, обусловленное конкурентным ингибитором снижение скорости реакции может быть полностью компенси- ровано путем соответствующего повышения концентрации суб- страта; на максимально возможную скорость реакции конку- рентный ингибитор не влияет. Если последовательные реакции (3.48) и (3.49) дополнить равновесными реакциями (3.53а) и (3.536), то можно получить
168 Глава 3 полезную модель (полного) неконкурентного ингибирования: Константа диссоциации EI+S EIS к, (3.53а) ES + I =₽ь EIS Ki (3.536) Здесь ингибитор и субстрат могут одновременно связываться с ферментом, образуя тройной комплекс EIS (фермент-ингиби- тор-субстратный). В этой простейшей модели неконкурентного, ингибирования мы принимаем, что связывание ингибитора не влияет на сродство фермента к субстрату, а связывание субст- рата не сказывается на сродстве фермента к ингибитору. От- сюда следует, что Ks и Ki в уравнениях (3.53) идентичны со- ответствующим константам диссоциации в уравнении (3.48). Примем также, что комплекс EIS не диссоциирует с образова- нием продукта реакции Р. Используя уже известный нам прием выражения концентра- ций комплексов через е0, s и I, можно получить следующее вы- ражение для скорости реакции: t> = s£e0/(^-H//G) (полное) неконкурентное ингибирование (3.54) Нетрудно заметить, что в этом выражении константа Михаэли- са осталась без изменений, а максимальная скорость реакции снизилась до уЯрр _ ^go_______ max 1 + i/Ki (3.55) Отсюда следует, что в присутствии неконкурентного ингибито- ра добавление к реакционной смеси сколь угодно большого количества субстрата не позволит повысить максимальную ско- рость реакции до той величины, которая может быть достигну- та в отсутствие ингибитора. Конкурентное и неконкурентное ингибирование легко раз- личить по графикам зависимостей кинетических параметров в координатах Лайнуивера — Бэрка. В случае конкурентного ин- гибирования добавление ингибитора приводит к увеличению от- резка, отсекаемого прямой на оси 1/s, и не влияет на отрезок, отсекаемый на оси 1/щ Напротив, при неконкурентном ингиби- ровании возрастает только отрезок, отсекаемый на оси 1/v. Рассмотрим в качестве примера приведенные на рис. 3.21 дан- ные по гидролизу крахмала. Сравнивая графики зависимостей 1/у от 1/s в присутствии различных ингибиторов, а также без ингибитора, нетрудно видеть, что а-декстрин является конку- рентным ингибитором, а мальтоза и предельный декстрин представляют собой неконкурентные ингибиторы.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 169 РИС. 3.21. Конкурентное (а-декстрин) и неконкурентное (мальтоза, предель- ный декстрин) ингибирование а-амилазы. (Воспроизведено с разрешения из работы: Aiba S., Humphrey А. Е., Millis N., Biochemical Engineering, 2d ed., p. 101, University of Tokyo Press, Tokyo, 1974; есть перевод 1-го издания: Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н„ Биохимическая технология и аппаратура. — М.: Пищевая промышленность, 1975, с. 81.) Как мы указывали в табл. 3.7, существуют и другие типы ингибирования ферментативных реакций. Ниже мы в несколь- ких словах обсудим, как можно их описать путем видоизмене- ния рассмотренных выше моделей ингибирования. При частич- ном конкурентном ингибировании (тип 16 в табл. 3.7) ингиби- тор и субстрат соединяются с различными участками молекулы фермента и ингибитор влияет на сродство фермента к субстра- ту. Чтобы описать этот случай, добавим к последовательности
170 Глава 3 реакций (3.48) и (3.49) следующие стадии,. которые мы будем считать равновесными: Константа диссоциации EI + S EIS К* (3.56) ES + I EIS Ks{ и медленную стадию: k EIS ----> EI + Р (3.57) (Обратите внимание: можно показать, что Kis = KsKsi/Ki.) В другом случае неконкурентного ингибирования (типа Пб) описанная выше модель видоизменяется с учетом возможности образования продукта реакции из комплекса EIS; диссоциация последнего по сравнению с комплексом ES протекает с мень- шей скоростью: EIS EI+ р (3.58) Одну из моделей смешанного ингибирования, включающего в себя полный конкурентный и частично конкурентный типы, можно получить, опустив реакцию (3.57) в приведенной выше модели частичного конкурентного ингибирования. Результаты анализа всех этих типов ингибирования можно записать в фор- ме уравнения Михаэлиса — Ментен: vapp S V __----— s + C₽₽ (3.59) В этом уравнении кажущиеся параметры t'maxa₽₽ и Ктарр зави- сят от концентрации ингибитора и различных кинетических па- раметров (табл. 3.8). На рис. 3.22 схематически показано вли- яние разных типов ингибирования на различные формы графи- ческого выражения данных по изучению кинетики ферментатив- ных реакций. Один из типов активации фермента эффектором может быть описан моделью типа Пб при условии, что kl больше k. С точ- ки зрения механизма процесса это означает, что скорость обра- зования продукта реакции из комплекса EIS выше, чем из комплекса ES. Таким образом, здесь вещество I выполняет функцию активатора фермента.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 171 3.6. Другие факторы, влияющие на ферментативную активность Прежде чем приступить к изложению темы этого раздела, полезно напомнить, что основная цель настоящей главы заклю- чается в описании скорости катализируемых ферментами реак- ций с помощью математических выражений. Без последних мы не сможем разработать проект реактора или спланировать эксперимент с участием изолированных ферментов. Более того, когда мы приступим к изучению кинетики клеточного роста, мы узнаем, что и здесь приложимы различные аспекты кинетики ферментативного катализа. В этой связи становится очевидной Таблица 3.8. Параметры кинетики ферментативных реакций в присутствии ингибиторов различных типов; отрезки, отсекаемые прямыми на осях 1/ц и 1/s Тип ингибирования Отрезок на оси ординат Отрезок на оси абсцисс 1а. Полное конкурентное I 1 vmax Ks(l + */Ki) 16. Частичное конкурент- 1 1 + iKslKiKt» ное vmax Ks(l + UKi) Па. Полное неконку- 1 + i/Kj 1 рентное vmax Пб. Частичное некой- 1 + '4Ki 1 курентное vmax + Ks 16 и Па. Смешанное 1 + iKslKiKis 1 + iKsIKiKis vmax Ks(l + i/Kt) важность тщательного изучения различных факторов, влияю- щих на ферментативный катализ, в том числе количественной оценки степени их влияния. Мы уже знаем, что различные химические соединения, свя- зываясь с ферментами, могут изменять скорость катализируе- мых ферментами реакций, и в общих чертах представляем, как это происходит. На каталитическую активность ферментов вли- яют и многие другие факторы, которые могут изменять строе- ние или химическую природу фермента. К числу таких факто- ров относятся: 1. pH 2. Температура 3. Силы, действующие в текучих средах (гидродинамические силы, гидростатическое давление и поверхностное натяжение) 4. Химические агенты (например, спирт, мочевина или перок- сид водорода) 5. Облучение (свет, звук, ионизирующая радиация)
Неконкурентное Конкурентное Смешанное РИС. 3.22. Влияние типа ингибирования на различные формы графического выражения кинетики ферментативных реакций. Индексом i обозначены пара- метры реакции в присутствии ингибитора, (Из работы: Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 2, с. 498, — М.: Мир, 1982.]
Кинетика катализируемых ферментами реакций 173 Иногда снижение каталитической активности, вызванное, на- пример изменением pH, обратимо; в таких случаях возврат к первоначальным условиям сопровождается восстановлением активности фермента. В известном смысле такая ситуация ана- логична рассмотренному случаю обратимого ингибирования; небольшие изменения одного из перечисленных выше факторов, по сути дела, только слегка сдвигают равновесие (или квази- стационарное состояние), характерное для данной фермента- тивной реакции. В общем случае отклонение от условий, ти- пичных для биологического окружения нативного фермента, должно быть относительно небольшим (или кратковременным); в противном случае возрастает вероятность инактивации фер- мента. Многие из перечисленных выше факторов мы обсудим в следующем разделе, посвященном инактивации ферментов, здесь же основное внимание будет уделено «обратимому» вли- янию pH и температуры на каталитическую активность фер- ментов. Следует подчеркнуть, что граница между «обратимой» и «необратимой» инактивацией белков не всегда четко определе- на. Например, подвергнутый кратковременному нагреванию фермент при охлаждении до свойственной ему «рабочей» тем- пературы может полностью восстановить свою активность. С другой стороны, более продолжительное нагревание при той же температуре или столь же кратковременная термическая об- работка при более высокой температуре могут привести к то- му, что при последующем охлаждении активность фермента восстановится лишь частично. Такое поведение белков вообще и ферментов в частности становится понятным, если учесть связь между их строением и функцией, влияние молекулярной динамики на функцию белков и возможность разрыва некото- рых слабых связей при изменении условий среды. 3.6.1. Влияние pH на кинетику ферментативных реакций в растворах На рис. 2.15 приведены структурные формулы различных аминокислот, из которых построены все белки. Аминокислоты обладают основными, нейтральными и кислотными группиров- ками, поэтому интактный фермент при любом заданном pH может содержать как положительно, так и отрицательно заря- женные группы. Заряженные группировки часто входят в со- став активных центров ферментов, так как в основе целого ряда механизмов ферментативного катализа лежит катализ кислотного или основного типа. Необходимым условием для осуществления кислотного или основного катализа может быть наличие определенного заряда на ионизируемых группах ак-
174 Глава 3 тивного центра. Отсюда следует, что каталитически активная форма фермента существует только в одном строго определен- ном состоянии ионизации и в зависимости от pH в нее может превращаться большая или меньшая часть всего имеющегося в смеси фермента. На рис. 3.23 показано влияние pH на актив- ность некоторых ферментов; нетрудно видеть, что по мере по- вышения pH каталитическая активность фермента достигает максимума (при оптимальном pH) и затем снижается. РИС. 3.23. Зависимости актив- ности ферментов от pH и диа- пазона максимальной активно- сти фермента от его природы. (Воспроизведено с разрешения, из работы: Fruton J. S., Sim- monds S., General Biochemistry, p. 260, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1953.) Полезное математическое выражение, связывающее актив- ность фермента с pH, можно получить с помощью следующей простой модели ионизации активного центра: —н+ —н+ Е +=> Е- Е2- (3.60) +н+ +н+ Ki В этих кислотно-основных реакциях Е~ обозначает активную форму фермента, а Е и Е2~ — неактивные формы, образующие- ся соответственно при протонировании и депротонировании ак- тивного центра Е~. Константы равновесия указанных реакций обозначены символами К\ и Kz- Мы не будем здесь рассмат- ривать другие состояния ионизации фермента, поскольку пред- полагается, что депротопирование Е- уже полностью инактиви- рует фермент. Записав условия равновесия для двух ступеней ионизации в виде (3.6i>
Кинетика катализируемых ферментами реакций 175 Где /г+=[Н+], мы можем определить относительное количество фермента, находящегося в активной форме. Если обозначить общую концентрацию фермента через е0, так что е0=е+е~+е2~ (3.62) то активная фракция фермента у~ равна е~/е0 и определяется уравнением у~ =--------!------- (3.63) J 1 + h+/Kt + K2/h+ Уравнение (3.63) представляет собой одну из pH-функций Ми- хаэлиса. Две другие, у и у2", определяют относительные коли- чества фермента, находящегося в кислой и основной формах со- ответственно. Зависимость функции у~ от pH выражается кривой такого же типа, какие приведены на рис. 3.23 для экспериментально найденных зависимостей ферментативной активности от pH. Функция у~ имеет один максимум при следующем pH: h+opt = V^^2 или (pH)opZ = 1/2(pK1 + pK2) (3.64) где pKi = —IgKi. Функция у~ убывает равномерно и симметрич- но по мере удаления pH от оптимального значения. Реакции протонирования и депротонирования представляют собой очень быстрые процессы по сравнению со скоростями большинства других реакций в растворах. Поэтому можно при- нять, что фракция фермента, находящегося в активном состоя- нии, равна Г и в том случае, когда этот фермент выполняет функцию катализатора. Отсюда следует, что выражение для максимальной скорости реакции можно получить, взяв вместо общей концентрации фермента е0 общую концентрацию его ак- тивной формы еоу~: »тах = КУ~ =------------------ (3.65) ° l + h+/K1 + K2/h+ v 1 Располагая данными по ферментативной активности при различных pH, с помощью последнего уравнения можно опре- делить параметры К) и К2. Действительно, pH максимальной активности фермента связан с Ki и К2 уравнением (3.64). Оп- ределяемая экспериментальным путем зависимость фермента- тивной активности от pH устанавливает независимую взаимо- связь между Ki и К2, позволяя таким образом определить оба эти параметра. Согласно расширенному толкованию уравнения Михаэли- са—Ментен для случая простейшей катализируемой фермен- том последовательности реакций [уравнение (3.4)], pH может влиять и на константу Михаэлиса, Кот. В то же время если
176 Глава 3 субстрат не может существовать в нескольких ионизированных состояниях, характеризующихся различным сродством к фер- менту и если образование фермент-субстратных комплексов с каждой из форм фермента не влияет на Ki и Кг, то в таком случае можно показать, что Кт не зависит от pH. Эксперимен- тальные данные показывают, что, как правило, Кт очень слабо зависит от pH, поэтому на практике для выражения зависимо- сти скоростей катализируемых ферментами реакций от pH чаще всего пользуются только уравнением (3.65). Никогда не следует забывать, что все приведенные выше рассуждения могут оказаться несостоятельными, если речь идет о значениях pH, значительно отличающихся от оптимальных. В такой ситуации нарушение сил, стабилизирующих конформа- цию нативного белка, может привести к его денатурации, и тогда даже после восстановления оптимального (или близко- го к оптимальному) pH быстрая реактивация фермента стано- вится маловероятной или вообще невозможной. 3.6.2. Скорость ферментативных реакций и температура При изучении любых проблем химической кинетики одним из основных теоретических положений является уравнение Ар- рениуса, выражающее зависимость константы скорости реакции от температуры: k=Ae~E«/RT (3.66) где Еа — энергия активации реакции; R — газовая постоянная; А — предэкспоненциальный множитель; Т — абсолютная темпе- ратура. При графическом изображении зависимость 1п& от 1/Т вы- ражается прямой с тангенсом угла наклона — EaIR [конечно, если соблюдается условие уравнения (3.66)]. Аррениусовской зависимости константы скорости реакции от температуры под- чиняются и многие реакции, катализируемые ферментами; при- мером могут служить экспериментальные данные, представлен- ные на рис. 3.24. Следует подчеркнуть, однако, что температурный диапазон, в котором были получены приведенные на рис. 3.24 данные, очень узок. В этом эксперименте не рассматривались темпера- туры, значительно превышающие обычные в биологических ус- ловиях пределы. Что же произойдет, если мы попытаемся за- ставить фермент катализировать процесс еще быстрее, подняв температуру еще выше? Как показано на рис. 3.25, в большин- стве случаев результат окажется очень печальным. Денатурация большинства белков начинается в диапазоне температур от 45 до 50 °C и завершается очень быстро при
Кинетика катализируемых ферментами реакций 177- РИС. 3.24. Аррениусовская зависимость скорости ферментативной реакции (катализируемый миозином гидролиз АТР) от температуры. [Воспроизведено из работы: Laidler К. L, The Chemical Kinetics of Enzyme Action, p. 197, The Clarendon Press, Oxford, 1958; данные из статьи Quellet L., Laidler K. J., Morales M. F., Molecular Kinetics of Muscle Adenosine Triphosphate, Arch. Bio- chem. Biophys., 39, 37 (1952).] 55°C. Один из механизмов термической денатурации белков очевиден: по мере повышения температуры атомы в молекуле белка приобретают все более высокую энергию, в том числе ки- нетическую, и в конце концов становится возможным разруше- ние слабых связей, стабилизирующих глобулярную структуру белка, что и приводит к его инактивации. Термическая инактивация ферментов может быть обрати- мой, необратимой или смешанной. Зависимость скорости реак- ции ферментативного катализа от температуры в достаточно широком диапазоне температур может быть описана с помо- щью простой модели обратимой термической инактивации. Со- гласно этой модели, мы принимаем, что неактивная (i) и ак- тивная (а) формы фермента находятся в равновесии: Еа Ef (3.67) Константу равновесия этой реакции можно выразить следую- 12-587
178 Глава 3 РИС. 3.25. При высоких температурах, когда начинает доминировать процесс термической инактивации фермента, аррениусовская зависимость скорости реакции от температуры нарушается (приведен пример разложения H2O2 ка- талазой). Сплошная кривая вычислена по уравнению (3.73) при следующих значениях параметров: £=3,5 ккал/моль, A#d=55,5 ккал/моль, ASd= = 168 ккал/(моль-К), ^ = 258 мм3/мин. [Воспроизведено из статьи: Sizer I. W., Temperature Activation and Inactivation of the Crystalline Catalase-Hydrogen Peroxide System, J. Biol. Chem., 154, 461 (1944).] щим уравнением: — Kd = exp f- —=x exp f--~ exp ((3.68) ea \ RT ) 4 RT J \ R J В этом уравнении символами AGd, A//d и ASd обозначены сво- бодная энергия, энтальпия и энтропия инактивации соответст- венно. Хотя изолированные водородные связи сравнительно слабы (их энергия обычно изменяется в пределах от 3 до 7 ккал/ /моль), энтальпия инактивации ферментов A//d достаточно вы- сока, составляя, например, для трипсина и лизоцима белка куриных яиц соответственно 68 и 73,5 ккал/моль. Инактивация этих ферментов сопровождается изменением энтропии, равным + 213 кал/(моль-К). Благодаря высокой энтальпии денатура- ции уже небольшие изменения температуры существенно изме- няют относительное количество активной формы фермента.
______Кинетика катализируемых ферментами реакций 179- При таких высоких значениях AZZd фермент инактивируется практически полностью в диапазоне тридцати градусов. Поскольку весь фермент существует либо в активной, либо в неактивной форме, т. е. ea+ei = eo (3.69) из уравнения (3.68) следует, что е =____£о_ ° 1 + Kd (3.70) Согласно теории переходного состояния, скорость реакций (3.4) при высоких концентрациях субстрата может быть выра- жена следующим образом: Vmax = ва ' kiT} (3.71) где 4(Г)»а(^е45,/«ГВДГ (3.72) Здесь kB и h — константы Больцмана и Планка соответственно, а а — коэффициент. Из уравнений (3.68), (3.70) — (3.72) следу- ет, что Утах ~ д$ /я -bHjRT (3.73) 1 -f- е и е и В уравнении (3.73) коэффициент р включает се, kB, h, е0 и exp(AS*/Z?). Это уравнение и представляет собой математическое выра- жение, описывающее схематично изображенное на рис. 3.25 по- ведение систем фермент—субстрат. Показанная на этом рисун- ке сплошная линия, проходящая через экспериментально най- денные точки, фактически была вычислена по уравнению (3.73) после определения параметров р, Е, &Sd и AZZd на основе тех же экспериментальных данных. При больших значениях 1/7 тангенс угла наклона кривой приближенно равен —E/Z? (по- грешность равна Т (К) и обычно не вносит большого вклада). Тангенс угла наклона другого прямого участка кривой при более высоких температурах равен приблизительно (&Hd—Е)/ /Z?. Величину ASd можно определить, используя тот факт, что при температуре Ттах, когда lnumax принимает наивысшее зна- чение, х) = -.„£+/Гт”------ (3 74) &па с. К/ max [Это выражение легко получить, приняв <Z(ln vmzy^ jdT рав- ным нулю.] Поскольку Тщах известна из измерений, а величины Е 12*
180 Г лава 3 и мы уже определили, то не представляет труда вычис- лить правую часть уравнения (3.74). Теперь, зная величину Kd{Tmzx), возвратимся к уравнению (3.68) и найдем ASd. На- конец, подберем такое значение коэффициента 0, чтобы итах [Ттах в уравнении (3.73)] стало равным измеренной величи- не. При необходимости более точные значения параметров мож- но получить методом последовательного приближения. В част- ности, очень большое влияние на результаты может оказывать значение Ттах. Конечно, от температуры зависят и другие па- раметры уравнений скорости реакции, например константа Ми- хаэлиса или ингибиторная константа. Если эти параметры счи- тать константами равновесия, как это часто бывает в действи- тельности, то мы должны прийти к температурной зависимости типа той, которая выражается уравнением (3.68). Тогда гра- фик зависимости 1п/( (или рК) от 1/Т будет представлять со- бой прямую линию, по наклону которой можно определить стандартную свободную энергию. В некоторых случаях графическая зависимость в этих ко- ординатах изображается не прямой линией, иными словами, наклон линии меняется при изменении диапазона температур. Причиной подобных осложнений могут быть неоправданные упрощения в интерпретации Кт или Ki или даже в последова- тельности катализируемых ферментом реакций. Напомним, на- пример, что для случая простейшей последовательности реак- ций (3.4) Кт представляет собой не что иное, как отношение констант скоростей элементарных стадий реакции, выражаемое уравнением (3.5). Если каждую из этих констант элементарных стадий в свою очередь выразить в форме уравнения Аррениуса [уравнение (3.66)] или в форме уравнения теории переходного состояния [уравнение (3.72)], то получится весьма сложная форма зависимости от температуры. Другим возможным источ- ником затруднений в определении зависимости некоторых па- раметров скорости реакции от температуры может служить существование нескольких промежуточных фермент-субстрат- ных комплексов (или комплексов фермента с продуктом реак- ции). Подобные соображения были положены в основу полезного и довольно широко применяемого способа проверки корректно- сти кинетических моделей и соответствующих гипотетических последовательностей реакций. Если зависимость кинетических параметров в аррениусовских координатах выражается не пря- мой, то исходная модель или чрезмерно упрощена, или вообще неверна.
Кинетика катализируемых ферментами реакций 181 3.7. Инактивация ферментов Подавляющая часть опубликованных в литературе данных по кинетике ферментативного катализа посвящена изучению начальных скоростей реакций и обратимых изменений фермен- тативной активности. В то же время скорость снижения катали- тической активности является одной из основных характеристик ферментов при их практическом использовании. В первую оче- редь это относится к процессам, в которых фермент использу- ется в течение длительного времени, например , в проточных ре- акторах непрерывного действия (следующая глава будет по- священа в основном методам иммобилизации ферментов, пред- назначенным для их удерживания именно в таких реакторах). В подобных ситуациях полезное время жизни ферментного био- катализатора может определять экономическую целесообраз- ность всего процесса. Основное внимание в этом разделе будет уделено механиз- мам и кинетике процессов, при которых фермент теряет свою каталитическую активность; эти процессы, связанные с измене- нием структуры и функции белков, важны и с практической точки зрения. Так, например, белки часто осаждают из культу- рального бульона путем изменения pH или ионной силы, что сопровождается изменением конформации или химического со- стояния белка. На последующих стадиях очистки белков в ка- честве высокоспецифичных сорбентов иногда применяют анти- тела; инактивация последних сопровождается потерей способ- ности узнавать и адсорбировать определенный белок. К про- блемам разделения мы вернемся в гл. 11, а сейчас рассмотрим причины снижения ферментативной активности, кинетику этих процессов и сопровождающие их эффекты. 3.7.1. Механизмы денатурации белков и сопутствующие эффекты Как мы уже знаем, структура белков стабилизуется за счет слабых взаимодействий; таким путем обеспечивается функционально важная молекулярная подвижность. С другой стороны, слабость стабилизирующих сил предполагает, что с энергетической точки зрения белки могут сравнительно легко принимать несколько альтернативных и биологически менее активных конформаций. Иллюстрацией этого свойства белков могут служить приведенные на рис. 3.26 термодинамические характеристики различных состояний а-лактальбумина. Не- трудно видеть, что разность свободных энергий нативного и полностью денатурированного состояний этого белка составля- ет всего лишь 9,0 ккал/моль (хотя переход из одной конформа-
182 Глава 3 35 А 50 А РИС. 3.26. Схематичное изображение ступенчатого разворачивания белковой молекулы а-лактальбумина и соответствующие термодинамические данные. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Kuwajima К., A Folding Model of a-Lactalbumin Deduced from the Three-state Denaturation Mechanism; J. Molec. Biol, 114, 241 (1977).] Обозначения: N — нативная конформация; A* — критически активированное состояние; ID — частично неупорядоченная конформация; RC — неупорядо- ченный клубок (полностью денатурированное состояние), дни в другую может потребовать преодоления более значи- тельных энергетических барьеров переходных состояний). По- этому приходится признать, что стабильность нативной структуры белков крайне низка. В этой связи неудивительно, что сопровождающиеся сниже- нием активности нарушения природной геометрической и хими- ческой структуры белков могут быть вызваны множеством фи- зических и химических факторов (табл. 3.9). Установив инди- видуальные факторы, обусловливающие денатурацию белков, следует в то же время учитывать, что скорость денатурации белков определяется не каждым из этих факторов в отдельнос- ти, а их сочетанием. Например, склонность белка к денатура- ции при повышенных температурах может изменяться в очень широких пределах в зависимости от pH раствора, а совместное влияние определенных pH и температуры на белок в очень большой степени зависит от его природы.
Таблица 3.9. Факторы, вызывающие денатурацию белков, и сопутствующие денатурации эффекты* Фактор, иниции- Типы взаимодействий, связей и группи- рующий денату- ровок, подвергающихся действию данного Движущая сила процесса денатурации Результат денатурации рацию фактора Физические факторы Нагревание Водородные связи Повышение содержания денатурированных Высоконеупорядочен- конформаций благодаря усилению теп- ные конформации, аг- лового движения и разрушению структу- регаты ры растворителя Необратимые изменения ковалентных свя- зей (например, дисульфидный обмен) Охлаждение Гидрофобные связи, сольватирован- Нарушение структуры растворителя, дегид- Агрегаты, неактивные ные группы ратация мономеры Механические Сольватированные группы, пустоты Изменение сольватации, разрушение пус- Высоконеупорядочен- силы тот, разрыв связей ные конформации, не- ' активные мономеры Радиация Функциональные группы (например, Уменьшение числа структурообразующих Высоконеупорядочен- пептидные связи, группы SH остат- взаимодействий после фотоокисления или ные конформации, аг- ков Cys) атаки свободными радикалами регаты Химические факторы Кислоты Расположенные в глубине молекулы Снижение числа структурообразующих ион- Неупорядоченный клу- иезаряженпыс группы (например, ных взаимодействий бок His, пептидные связи) Основания Расположенные в глубине молекулы Снижение числа структурообразующих ион- Неупорядоченный клу- незаряженные группы [например, ных взаимодействий бок Туг, Cys, (Cys)2] органические Водородные связи Уменьшение числа структурообразующих Неупорядоченный клубок соединения, водородных связей между водой и натив- образующие ной конформацией 2 водородные w связи
Продолжение табл. 3.9 Фактор, иниции- Типы взаимодействий, связей и группи- рующий денатура- ровок, подвергающихся действию данного Движущая сила процесса денатурации цию фактора Результат денатурации Соли Полярные и неполярные группы Растворители Неполярные группы «Высаливание» полярных групп в раствори- тель с большей диэлектрической прони- цаемостью и обратный эффект в отноше- нии неполярных групп Сольватация неполярных групп Высокопеупорядоченные конформации Поверхностно- Гидрофобные участки (для всех ти- Образование частично нарушенных субст- антивные вс- пов ПАВ) и заряженные группы руктур, в том числе мицеллоподобных щества (для ионных ПАВ) участков Оксиданты Функциональные группы (например, Снижение числа структурообразующих в остатках Cys, Met, Try и др.) и (или) функциональных взаимодейст- вий Ионы тяжелых Функциональные группы (например, Маскирование групп, существенных для металлов в остатках Cys, His и т. д.) структуры или функции белка Хелатообразую- Катионы, необходимые для структу- Замещение лиганда или потеря катиона щие агенты ры или функции белка Высокоупорядоченная конформация пептид- ных цепей с преобла- данием спиральных участков Частично неупорядочен- ная конформация, значительные спираль- ные участки Инактивированный фер- мент, иногда неупоря- доченная структура Инактивированный фер- мент Инактивированный фер- мент Биологические факторы Протеазы Пептидные связи Гидролиз концевых или внутренних пен- Олигопептиды, тидных связей кислоты амино- в Воспроизведено с разрешения из работы: Schmid R. D., Stabilized Soluble Enzymes, Adv. Biochem. Eng., 12, 41 (1979).
Кинетика катализируемых ферментами реакций 185 Можно указать целый ряд различных, но часто взаимосвя- занных свойств белков, которые изменяются под воздействием перечисленных в табл. 3.9 физико-химических факторов. К внешним проявлениям денатурации белков относится изме- нение таких их свойств, как растворимость, тенденция к обра- зованию гелей или к кристаллизации, а также нарушение би- ологической активности (каталитической активности, способ- ности связывать антитела) растворов белков. Точно так же, как при денатурации важно прежде всего совместное действие различных факторов, так и в сопровождающих денатурацию эффектах главнейшую роль играет не каждый эффект в отдель- ности, а их комбинация. Например, если фермент выделяют осаждением, то существенно, чтобы условия осаждения не вы- зывали необратимой потери активности фермента. 3.7.2. Моделирование и кинетика процессов инактивации В простейшей модели инактивации молекулы активного фермента (Ея) претерпевают необратимые структурные или химические изменения, приводящие к неактивной форме (Ег): Еа ----> Ef (3.75) Скорость этой реакции Га пропорциональна концентрации ак- тивной формы фермента: rd = kdea (3.76) Следовательно, в закрытой системе при эффективном переме- шивании (примем, что в реакционной смеси нет ни субстрата, ни продукта реакции, ни ингибитора, ни иного эффектора) из- менение концентрации активной формы фермента во времени будет описываться уравнением ' (3-77) так что 1п[м^г]=-^ (3-78) С этим выражением согласуются, в частности, приведенные на рис. 3.27 экспериментальные данные по определению активно- сти аденозинтрифосфатазы в различных условиях. Зависимость константы инактивации kd от температуры может быть описа- на теорией переходного состояния [например, уравнением (3.72) при а=1] в форме, несколько отличающейся от урав- нения Аррениуса [уравнение (3.66)] для узкого температурно- го диапазона, представляющего интерес для биологических си-
186 Глава 3 стем. В табл. 3.10 приведены величины энергии активации Е и энтропии AS* для денатурации ряда распространенных фер- ментов. Как видно из приведенных в таблице данных, для про- цессов денатурации белков характерны очень большие энергии активации. В отсутствие ферментативной активности жизнедеятель- ность клетки невозможна. В некоторых случаях клетка поги- бает уже после разрушения очень небольшой части внутрикле- РИС. 3.27. Зависимость инактивации аденозинтрифосфатазы от времени при различных pH и температуре. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Pelle- tier G. Е., Quellet L., Influence of Temperature and pH on Myosin Inactivation; Can. J. Chem„ 39, 265 (1961).] точных ферментов. В этой связи становится понятным, почему для стерилизации (т. е. для уничтожения всех форм микроорга- низмов) газов, жидкостей или твердых тел можно использо- вать тепловую обработку. В гл. 7 мы узнаем детальнее, почему лишь немногие ферменты (и соответственно немногие микро- организмы) способны без вреда для себя переносить длитель- ное нагревание. Данные об инактивации ферментов обычно получают, вы- держивая фермент некоторое время в вызывающих денатура- цию условиях без субстрата, после чего действие денатурирую- щих факторов снимают, создают некоторые стандартные усло- вия, добавляют субстрат и определяют активность по начальной скорости ферментативной реакции. В присутствии субстрата скорость инактивации фермента может существенно отличаться от скорости, определенной описанным выше путем,, если, например, свободный фермент и фермент-субстратный
Кинетика катализируемых ферментами реакций 187 комплекс (или комплекс фермента с продуктом реакции) инактивируются с различными скоростями или если субстрат и (или) продукт реакции сами инициируют инактивацию фер- мента. Одну из возможностей анализа таких систем мы пока- жем на простом примере. Допустим, что связывание субстрата с ферментом стабилизирует последний (подобный эффект в из- вестной степени действительно наблюдался в ряде систем). Та- ким образом, в нашем примере инактивации будет подвергать- ся только свободный фермент. Таблица 3.10. Энергия активации и энтропия денатурации ферментов® Фермент pH Энергия актива- ции, ккал/моль Энтропия акти- вации AS*, э. ед./моль Панкреатическая липаза 6,0 46,0 68,2 Трипсин 6,5 40,8 44,7 Пепсин 4,83 56—147 Нет данных Аденозицтрифосфатаза 7,0 70 150,0 а Воспроизведено из работы: Laidler К. Bunting Р. S., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, 2d ed., p. 430, Oxford University Press, London, 1973. Комбинируя такую модельную систему инактивации с про- стой последовательностью элементарных реакций Михаэлиса и Ментен [уравнение (3.4)], получим Ea-f-S =Д±: ЕдБ Еа+Р (3.79а) kd Еа -Л Ег (3.796) Если мы далее достаточно обоснованно допустим, что процесс инактивации происходит значительно медленнее, чем реакции (3.79а), то, привлекая приближение квазистационарного состоя- ния для комплекса (EaS), получим следующее выражение для скорости реакции: k?ptot,as V== Km + S (3.80) где etot.a — общая концентрация активного фермента как в сво- бодной форме, так и в виде комплекса. Скорость изменения ^tot.a выражается уравнением (3.81) си>
188 Глава 3 Возвращаясь к расчетам кинетики квазистационарного состоя- ния, применявшимся при выводе уравнения (3.80), мы можем выразить еа через etot,a и параметры каталитической реакции; тогда уравнение (3.81) приобретет такую форму: de tot,a kdetot,a ~dT~ = 1 + s/Km (3.82) Из уравнений (3.80) и (3.82) следует, что скорости превраще- ния субстрата и инактивации фермента взаимосвязаны. В част- ности, скорость инактивации фермента зависит от концентра- ции субстрата. С другой стороны, если Еа и (EaS) инактивиру- ются с одинаковыми скоростями, то в условиях ферментативной реакции активность фермента будет снижаться точно так же, как и в отсутствие субстрата. Обобщая эти рассуждения, нетрудно прийти к выводу, что вследствие различия в скоростях инактивации разных форм фермента (свободного фермента, разнообразных комплексов, ионизированных состояний и т. д.) скорость общей реакции зависит от любого параметра (концентраций субстрата и ин- гибитора, pH и т. д.), влияющего на относительные количества разных форм фермента. В частности, для описания сложной зависимости скорости инактивации от pH была разработана следующая модель: -н+ —н+ -н+ —н+ р р р р ^01 -< — -Ьа2 ч Ьаз *-'а4 +н+ +Н+ г +н+ +н+ kd3,, kdi Kt Ef Ej На рис. 3.28 в качестве примера такого сложного процесса изображена зависимость скорости инактивации рицина от pH (рицин не является ферментом; содержание активной формы белка определяли путем измерения растворимой фракции бел- ка). Для некоторых других белков также наблюдался минимум скорости инактивации при определенном значении pH. Снижение ферментативной активности во времени не всегда соответствует реакции первого порядка, т. е. уравнению (3.78). Для ряда белков найдены нелинейные зависимости логарифма активности от времени, иногда на соответствующих кривых имеется по два различных прямых участка (рис. 3.29, а). Для объяснения и анализа таких систем предложен ряд моделей. Одна из них, включающая параллельные обратимую и необра-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 189 pH РИС. 3.28. Зависимость константы скорости реакции первого порядка инакти- вации рицина от температуры и pH. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Levy М., Benaglio. А. Е., The Influence of Temperature and pH upon the Rate' of Denaturation of Ricin, J. Biol. Chem., 186, 829 (1950).] тимую инактивации, нашла применение при объяснении и ана- лизе снижения активности некоторых ферментов: В частности, эта модель, предполагающая кинетику первого'- порядка для каждой из указанных элементарных реакций, ус- пешно использовалась для интерпретации результатов изуче- ния инактивации люциферазы, приведенных на рис. 3.29, а. Кривая процесса инактивации при 45 °C, например, была по- лучена расчетным методом с помощью параметров kdi=kd? = = 1,02 и &г = 0,02 ч-1. Потеря активности в растворах протеаз представляет собой более сложный процесс, поскольку протеазы катализируют ре- акцию собственного гидролиза. Эта особенность (автолиз)*
190 Глава 3 РИС. 3.29. а — инактивация препарата люциферазы при pH 6,8 и указанной температуре. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Chase А. М., Studies on Ceil Enzyme Systems. IV. The Kinetics of Heat Inactivation of Cypridina Luciferase, J. Gen. Physiol., 33, 535 (1950).] 6—инактивация а-химотрипсина в растворе при pH 7,8, температуре 40 °C, концентрации Са2+ 10-3 М и на- чальной концентрации фермента 7,3-10—7 М (Л), 3,65-10—6 М (Б), l,46-10-sM (В) и 2,92-10-5 М. (Г). [Воспроизведено с разрешения из статьи: Kawamu- га Y., Nakanishi К., Matsuno R., Kamikubo Т., Stability of Immobilized «-Chymo- trypsin, Biotech. Bioeng., 23, 1219 (1981).] должна учитываться и в соответствующей модели инактива- ции. Приведенная ниже модель инактивации протеазы а-хи- мотрипсина является вариантом модели (3.83), дополненной стадией автолиза: Еа Ег1 _^EZ2 к Еа 4- Ел ;—> (ЕдЕл) ---> Еа 4-неактивные продукты гидролиза (пептиды) (3.84) Некоторые особенности этой последовательности реакций были подтверждены химическими методами. Обратите внимание, в частности, на то, что только обратимо инактивированная фор- ма Е/l этого очень хорошо изученного фермента способна под- вергаться атаке и гидролизу активной формой протеазы Ея. Более глубокий анализ этой модели и ее применение для рас-
Кинетика катализируемых ферментами реакций 191 чета кривых, изображенных на рис. 3.29,6, предлагается в уп- ражнении 3.14. Завершая обзор кинетики инактивации ферментов, следует упомянуть о подходах к анализу необратимых реакций инакти- вации ферментов ядами. В простейшем случае имеем Ев+яд ----> Е</ rd = kd-ea-(nR) (3.85) Поскольку, однако, яды часто действуют на активный центр фермента, доступ к которому может быть блокирован связан- ным с ферментом субстратом, то в присутствии последнего ход анализа следует опять-таки видоизменить. Очевидно, нам нуж- но рассматривать процессы катализа, например реакцию (3.79а), и отравления фермента (3.85) совместно, причем в последнем уравнении Еа будет обозначать свободный, не свя- занный в комплекс фермент. Подобные видоизмененные моде- ли, которые мы не будем здесь рассматривать, могут быть соз- даны и для процессов инактивации, описываемых уравнениями (3.83) и (3.84). 3.7.3. Денатурация ферментов под действием механических факторов Механические воздействия могут нарушить сложную гео- метрию молекул ферментов вплоть до их полной денатурации. К числу таких воздействий относятся и гидравлические силы, возникающие при движении потока жидкости. Эксперименты,, позволяющие оценить влияние сдвига на ферме