Московский государственный университет
имени М.Н.Ломоносовя
Биологический факультет
Кафедра биохимии
М.И. Сафронова, Л.М. Рубцов,
А.С. Рыжавская, Н.Б. Гусев
ОСНОВЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ
БИОХИМИИ БЕЛКА
Учебно-методическое пособие для
практических занятий по биохимии
Москва
2017
УДК 81.33
ББК 81.165
0-75
Основы практической биохимии белка: Учебно-методичесед.
пособие. Авторы: М.И. Сафронова. A M. Рубцов. А.С. Рыжавская,
Н.Б. Гусев. - М.: Цифровичок, 2017. - 116 с.
'‘^"’'левицкий Дмитрий Иванович, доктор биологических наук,
профессор заведующий лабораторией структурной биохимии белка
Федерального исследовательского центра «Фундаментальные
основы биотехнологии» Российской академии наук.
Лопина Ольга Дмитриевна, доктор биологических наук,
профессор ведущий научный сотрудник кафедры биохимии
Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.
ISBN 978-5-91587-154-9
Рекомендовано к опубликованию решением Ученого и
Учебно-методического советов биологического факультета
Московского государственного университета имени М.В.
Ломоносова.
Второе дополненное издание пособия предназначено для
студентов 3 курса кафедры оиохимии биологического факультета
Московского государственного университета имени М.В.
Ломоносова, выполняющих практические работы в рамках большого
практикума по биохимии по разделу «Природные азотсодержащие
соединения». Возможно, это пособие может оказаться также
полезным для студентов других кафедр, осваивающих основы
практической химии и биохимии белков.
УДК 81.33
ББК 81.1.65
0-75
ISBN 978-5-91587-154-9
С М.И. Сафронова, А.М. Рубцов, А.С. Рыжавская, Н.Б. Гусев, 2017.
СОДЕРЖАНИЕ
।	МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО	ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА........................5
I С1ц.|(ТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД....................................................5
/ / Спекзпрофотаметрический мет°д определения концентрации белка по поглощению в ближней
^ыпрафиолетовой области (280 нм)..................................................J
/ 2 Спектрофотометрический метод определения концентрации белка по поглощению в далекой
Л.тзюФиантовой области (205-240 нм)...............................................7
2 БИУРЕТОВЫЙ МЕТОД..................................................................9
2	I. Макраметод.................................................................10
2.2	. Микрометод, вариант А......................................................10
2.3	Микрометод, вариант Б......................................................  //
3.	Метод Лоури.....................................................................12
3	). Стандартный метод. ......................................................  12
3	2. Ускоренный метод Лоури и соавторов.......................... ...................13
4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С БИЦИНХОНИНОВОЙ КИСЛОТОЙ.................................... 14
4	I. Стандартный метод..........................................................16
4	.2. Микрометод................................................................16
5.	Определение белка по связыванию красителей......................................17
5.1.	Определение белка по связыванию Кумасси (метод Бредфорда).................................................... 17
5.2.	Определение белка по связыванию амидового черного (метод Шаффнера и Вайсмана)....20
II.	ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................22
1.	Электрофорез в нативных условиях.....................................................23
1.1.	Нативный электрофорез при кислых значениях pH....................................23
1.2.	Нативный электрофорез при щелочных значениях pH.................................................................... 25
1.3.	Определение кажущейся молекулярной массы белка с помощью электрофореза в градиентном
полиакриламидном геле.................................................................30
2.	Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (метод
Леммли)............................................................................34
3.	Аналитическое изоэлектрофокусирование белков в полиакриламидном геле.................39
III.	ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
БЕЛКОВ.....................................................................................45
I Метод гель-фильтрации.................................................................45
2.	Ионообменная хроматография...........................................................50
IV.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ И
ПЕПТИДОВ...................................................................................58
Гидролиз белков и пептидов............................................................59
Разделение, идентификация и количественное определение некоторых аминокислот..........61
' определение свободных сульфгидрильных групп и остатков цистеина, участвующих в
I i ! АЗОВ АН И И дисульфидных связей...................................................65
3 / Определение свободных сульфгидрильных групп с помощью реактива Эллмана (5.5'-дитио-бис(2-
итробензойной кислоты). ДТНБ)....................................................66
3.2. Определение дисульфидных мостиков в белках..................................68
3 3 Прямое спектрофотометрическое измерение скорости восстановления дисульфидных мостиков
.................................................................................70
V. ВЫДЕЛЕНИЕ И	ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ...72
1 • Яичный альбумин................................................................72
-	Лизоцим из яиц кур...............................................................74
-	/. выделение лизоцима из яиц кур...............................................74
-	2. Опредезение ферментативной активности лизоцима турбодиметрическим методам............... 75
2 3. Измерение активности лизоцима в палиакризамиднам геле (методам зимографии). 77
3.	РИБОФЛАВИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК..................................................  78
3.	/ выделение рибофлавин-связывающего белка из белка яиц кур....................78
3.	2. Получение апобелка..............................................................80
3	3 Определение параметров свя зывания рибофлавина с рибофлавин-сня зывающим белкам..81
3
? 4 Исе гедхминие роли дисульфидных мостиков в поддержании структуры и рибофлавин-
СМЯМ4ЮМГМГ свойств мсг wtfvewrvr» .................................................
4.	фосвитнн hi  .....................................................................g
4 l Виде чет* фоевнтнна ui яиц кур.................................................
4 2 4мвш» rfr wi**' почуненных препаратов фосвитнна.............................. £
4 *< (Кронотанмс ппчтгк1тчаиидных ММЙ красите vm Stalna-All..................... JJ
5 ВЫД1 1IHHI HIMV4IHHI ('А-1Т1Я1ЫПАЮЩИЧ « ПОЙСТВ АЛЬФА-ЛАКГ АЛЬБУМИНА МОЛОКА КРУПН<НО 3
РОГАТОГО СКОТА.........................................................................
5	I Выдсченнс <i«^.r чактачьбумина измолока к/многорогатого скота....................
\ .' Нпмснмг Са-евв бывающих свойств альфа-лактальбумина путей окраски биотокрутениевым
красным .....................................................................    89
' ? I (Кртзмынне белков рутениевым красным на нитроцеллюлозе без предваритеявного
^'ктрофорсю (А*»-Люм)...............................................................
$ ? *' < Ъраиатание Са-связывакмцих белков рутениевым красным после предварительного
зчвктрофореза в почиакричаииднам геле..............................................9ц
6	ВЫД1 II НИТ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ КРИСТАЛЛИНОВ ХРУСТАЛИКА ГЛАЗА КРУПНОГО РОГА ГОТО
СКОТА..................................................................................—12
ft I Выделение и разделение кристаллинов.............................................9]
6.2 Измерение шаперззноподобной активности а-кристаллинов............................94
7	Выделение цитохрома с из сердца крупного рогатого скота и изучение некоторых его с войств
.......................................................................................-95
71	. Выделение цитохрома с...................................................  .....	95
7	2. Удаление гема из цитохрама с и определение сульфгидрильных групп цитохрама с....97
S Выделение и изучение некоторых свойств овотрансферрина из яиц кур.....................98
8	I. Выделение овотрансферрина.......................................................99
8	2. Удаление ионов железа и исследование связывания ионов метагза апо-овотрансферрино.м.100
9	Выделение и изучение некоторых свойств пероксидазы из корней хрена (Armoracia
RUSTINICANA)........................................................................   101
9.1.	Выделение пероксидазы из корней хрена......................................... 102
9.2	Измерение пероксидазной активности с пирогаллазам.............................. 104
9.3.	Измерение пероксидазной активности с о-дианизидином.........................   105
К Выделение и изучение некоторых свойств миоглобина....................................106
10.1 Выделение миоглобина.......................................................    106
. 2 Удаление гема из миоглобина.....................................................108
т'НИЕ........................................................................... 109
VI ГЕМЫ СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ................ПО
лнар Методы определения белка................................................  ПО
 iap2 Методы фракционирования белков и определения их молекулярной массы...111
vhha- Определение аминокислотного состава и первичной структуры белков........112
СТ иинАг Определение аминокислотной последовательности и функциональных групп в белках
и пептидах................................................................... ||4
4
I МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
БЕЛКА
1. Спектрофотометрический метод
11. Спектрофотометрический метод
концентрации белка по поглощению
ультрафиолетовой области (280 нм)
определения
в ближней
Прннпнп метода
Метод основан на способности остатков ароматических аминокислот
триптофана, тирозина и в гораздо меньшей степени фенилаланина
поглощать свет в длинноволновой ультрафиолетовой области спектра
(вблизи 280 нм). Незначительный вклад в поглощение при 280 нм вносят
также дисульфидные связи. В связи с тем, что белки довольно сильно
отличаются по содержанию ароматических аминокислот, величина
поглощения при 280 нм для раствора белка с концентрацией I мг/мл может
варьировать в диапазоне от 0 (для белков, не содержащих остатков
ароматических аминокислот) до 4,0 (для некоторых богатых тирозином
белков шерсти). В среднем поглощение белков с концентрацией I мг/мл
составляет от 0,5 до 1,5. Принято считать, что при концентрации 1 мг/мл
«усредненный» белок (или смесь белков) обладают при 280 нм
поглощением, равным 1,0. Теоретически рассчитанные величины
поглощения индивидуальных белков можно найти в базе данных Uniprot
(старое название SwissProt) (http://www.uniprot.org).
Неоспоримое преимущество спектрофотометрического метода
определения концентрации белка состоит в том, что в ходе определения не
происходит повреждения структуры белка и после измерения образец может
быть использован для дальнейшей работы. Недостатком этого метода
является то, что многие компоненты буферных растворов и многие
органические соединения (пигменты, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты и
другие) обладают очень сильным поглощением в этой области спектра, и
поэтому даже небольшие количества этих соединений могут значительно
искажать получаемые результаты.
Реактивы и материалы:
1	• K2SO4  0,1 М раствор.
2.	Казий-фосфатный буфер - 5 мМ расiвор pH 7,0.
3.	Фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
4.	Кварцевые кюветы.
5
оК провел*""* Р*”™
,1ор	„ „оде ИЛИ II буферном растворе, к<ттОрый
Белок P*crt?p*'°BM в качестве такого буферного раствора мо^
домотает при	ф или смесь равных объемов
’с ,01ьч>ва1>	Полученный раствор должен быть абсолют,,,,
mLm И сульфата калия . полностью растворился, то полученный
’Хачным Если обрати» <  фильтруют черет мелкопористый фильтр.
TtW «ен’1,"фУ’НР> ипнттся с тем. что при фильтровании часть Не
Пои этом приходите* "ИР	потеряна на фильтре. Необходимость
,, 'шостью растворенной) ос .	растворь, обладают сильным
ммх процедур «бУслоМС'*' ч;г0 измеренное при 280 нм поглощение
светорассеянием. ^""„пенным. В любом случае, даже после
«вывается сильно завыш	желательно записать спектр
пентрифхтирования или Ф^ьтров^	поглощение при 280 „ 3)0
поглощения полученного рас_₽	не ПОГЛОщают при 310 нм, поэтому
нм Белки, не содержащие х(юмофор	в	BKjW
оптическое поглощение при	„ при 3)0 нм обусловлено
светорассеяния. Если оптитеско	при 280 нм будет п
только рассеянием,	то	интенсивност	P	что	по	Ре1е,
в ь5 раза больше, чем при 3	иональНа четвертой степени
интенсивность рассеяния обрати Р	ить в кварцевЫх кюветах.
» Ь.т.Р-'—'рт-''1* А р"“
в М ГГ !.тиН7ФФИПИеН' ЧО-’”,рного поглощения, С- концентрация вещества
~т1То 0"П,ЧеСк<"° "У™ —ь. (обычно I см). Аналогично можно
А=С| С, •(,
С| KOHueHinanJL<	,Я " hUHOCTb’ Е| “ весовой коэффициент поглощения,
vj концентрация вещества в мг/мл.
по/лощения HJC|H|u 4 J бедует, что, зная поглощение, коэффициент
белка. На практике <э''1 *1,,ееК()Г0 ПУ™» можно определить концентрацию
поглощение 1% расгвопа л ИСПОЛЬЗУЮТ величину Е,%,см, отражающую
определенной (обычно при 280^	° °',ТИЧеСКИМ путем 1 ? ПрИ
используют весовой ко 280 АЛИНе ВОЛНЬ1 Как пРави;,°’ для оелкОВ
Данных UniProT или рассщнщтьпо т^м”"' К0Т°РЬ,Й М°*Н° и”*™ "
6
A280 (мг/мл)= (5690 • nw+1280 • ny+120 • nc)/M.
В этой формуле A280 (мг/мл) - весовой коэффициент поглощения (т.е.
поглощение раствора с концентрацией I мг/мл) для белка с молекулярной
массой М и содержащей nw остатков гриптофана, пу остатков тирозина и пс
остаток цистеина, а цифры, стоящие перед этими членами, соответствуют
молярным коэффициентам поглощения соответствующих аминокислот.
В том случае, если исследуемый образец белка содержит нуклеотиды
и/или нуклеиновые кислоты, то концентрацию белка можно определить,
измеряя поглощение при 280 нм (максимум поглощения белка) и при 260 нм
(максимум поглощения азотистых оснований) и используя эмпирическую
формулу
С (мг/мл) = 1,55 • А гм, - 0,76 • А26о,
где С - концентрация белка.
Для учета вклада нуклеиновых кислот и нуклеотидов можно
воспользоваться измерением поглощения при других парах длин волн,
например,
С (мг/мл) = 2,51 • (A2j5-A28o) или
С (мг/мл) = 0,183 • А2зо— 0,0758 • А200
Все измерения желательно проводить в интервале оптических
плотностей от 0,2 до 0,8. Следует избегать измерений при очень малых или
очень больших величинах поглощения, потому что в этих областях точность
измерения заметно уменьшается.
1.2. Спектрофотометрический метод определения
концентрации белка по поглощению в далекой
ультрафиолетовой области (205-240 нм)
Принцип метода
Пептидная связь обладает большим поглощением при 190 нм. К
сожалению, работа в этой области спектра требует спектральных приборов
очень высокого класса и усложняется тем, что в этой части спектра
поглощает большое количество различных соединений. Поэтому
предпочитают проводить измерения в более длинноволновой области
спектра, например, при 205 нм, когда поглощение пептидной связи
примерно в 2 раза меньше, чем при I90 нм. Для большинства белков с
концентрацией 1 мг/мл поглощение при 205 нм составляет 30-35, а при 210
нм - 20-24. Следует учесть, что поглощение при 205 нм определяется не
7
1ет°Вой
4И
1НИЙ
.......“° " — Т,Г' * Си- «• и ,,
таль А .тшня ИХ вклад»)*	_ м	1
(ПО мерс	и ,ме.,сНИя 1101 лощения я ближнеи ульграфИо
К"к " м 'тол не приводит к повреждению исследуемого обр^"
•«....	може- быть исполыОИЙ для дальнейших исследо^
м про и.мереной поглощения в далекой ульзраф„ол
Кроме '	,|е раздичия первичной структуры не играют
РО'Щ. как при измерении в ближней ультрафиолетоед
™"то позволяет С ВЬ1С0К°Й ЧУВСТВИ™ЬНОСТЬЮ лР°^ить П(И1
Уютные измерения концентрации белка. Очевидно, что при рабо1е ,
?Хй ультрафиолетовой области необходимо использовать прецизионные
Халыно откалиброванные спектральные приборы и р^
компоненты которых не поглощают в этой области спектра. Помимо этого,
необходимо добиваться, чтобы исследуемый образец не был загря3нен
пигментами, нуклеотидами, нуклеиновыми кислотами, а также был
освобожден от кофакторов и коферментов таких как гем,
пиридоксальфосфат, тиаминпирофосфат, которые сильно поглощают в этой
области спектра.
Реактивы и оборудование:
1.	K2SO4 - 0,1 М раствор.
2.	5 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,0.
3.	Гуанидин гидрохлорид - 6М раствор.
4.	Фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
5.	Кварцевые кюветы, пропускающие свет с длиной волны меньше 215 нм.
Порядок проведения работы
Ьелок растворяют в воде или в буферном растворе, не поглощающем при
-05 нм. Полученный раствор центрифугируют или фильтруют. Этот процесс
важен	по । ому, что вклад светорассеяния в далекой
ультрафиолетовой области возрастает и это может привести к значительным
пШИ0ТаМ< 3аТеМ измеряют оптическое поглощение при 205 нм и при 280 нм.
,/	~ нм 1,1,1	как пептидные связи, так и ароматические
ПпиТкп н1О1Ы ,ИС,ИДИН И В меньшей степени аргинин, метионин и цистеин.
IlnoiJ Я 10,113101 преимущественно ароматические аминокислоты,
эмпирический ?,мсри1ня при 215 и 225 нм, можно воспользоваться
эмпирический формулой
C(MKf/MJi)=144-(A215-A225),
где С - концентрация белка.
до 50 мкг/мл. Однако L' И ,Мерять конпентрацию белка в интервале от 1,5
’ как У*е отмечалось, для работы в далекой
я
ультрафиолетовой области необходимо использовать буферные растворы,
компоненты которых не поглощают в далекой ультрафиолетовой области
(например, хлорил натрия, борат, фосфат), а также высококачественные
оптические приборы и кварцевые кюветы.
Литература.
I. Практическая химия белка (под редакцией А. Дарбрс) Москва, Мир, с.
200-302. 1089.
2. Л. Aitken. М.Р. Lcarmonth, Protein determination by UV absorption. In
Protein protocols handbook, 2nd Edition Ed. J.M. Walker, Humana Press
Inc. Totowa, NJ. p. 3-6, 2002.
2. Биуретовый метод
Принцип метода
Этот метод основан на специфическом взаимодействии ионов меди с
пептидной связью при щелочных значениях pH. При щелочных значениях
pH ионы двухвалентной меди, находящиеся в комплексе с кислородными
лигандами цитрата или тартрата, образуют комплексы с
депротонированными атомами азота пептидной связи и подвергаются
восстановлению. Этот процесс сопровождается изменением окраски
инкубационной среды от синей до фиолетовой
R О	\
1 11	I
— CH-C-N—/
Н 4
+ Си+2
(Blue)
Метод прост в исполнении, мало зависит от состава инкубационной
среды, но отличается не очень высокой чувствительностью. Описано много
вариантов этого метода, позволяющих увеличить интенсивность или
стабильность окраски или исключить влияние различных компонентов
инкубационной среды. Различают гак называемый макро- и микрометоды.
Макрометод позволяет в зависимости от объема пробы определять от 0,4 до
10 мг белка в пробе, микрометод обладает большей чувствительностью (0,1-
2 мг белка в пробе).
9
2Д Млкр°мвтоД

1 <ъ«мпя1мнмй ржляор бСЯКЯ. НЯПрНМСр. бмчмНо СМн,^
Я^мш«я. писр*яптй 10 мг n I мл. Точную конг^?**'*
^мютя опрскляют спектроф<ггометрически. Прини 1
(мктипр зтспо бсзкя с концентрацией I мг/мл обладает ппглоще
при 2W нм. равным 0,66.	^*’’’*4
? Карстовый реактив: 0.15 r CuSO45H20 и 0,6 г NaKC,^ ,4
(нинтммслый натрий-калий или сегнетова соль) распора я 50 °
WO1W при интенсивном перемешивании. Приливают к этому раСг М'
то мл 10% раствора NaOH, свободного от NaiCO,, добавляют о |
и объем доводят водой до 100 мл. Хранят раствор в пластиковой (»
стеклянной) посуде.
Поряэок проведения работы
К I мл раствора, содержащего от 2 до 10 мг белка, добавляют 4 мл
ихретового реактива, оставляют при комнатной температуре на 30 минут я
колориметрируют при 540 нм. Если возникают проблемы с измерением
поглощения в образцах с малыми объемами, то используют следующую
модификацию К 200 мкл раствора, содержащего от 0,4 до 2 мг белка,
добавляют 800 мкл биуретового реактива, тщательно перемешивают и после
инкубации в вышеописанных условиях колориметрируют при 540 нм. В
обоих случаях содержание белка в исследуемом растворе рассчитывают по
калибровочному графику Определению белка по этому методу мешают
соединения, способные образовывать прочные комплексы с ионами меди,
такие как различные хелаторы (ЭДТА, ЭГТА) и высокие концентрашм
ионоь аммония.
2.2. Микрометод, вариант А
Реактивы:
' гандар 1иыи расгвор белка, например, бычьего сывороточного
альбумина, содержащий I мг в 1 мл.
I иг гни Бенедикта (биуретовый реактив для микроопределения К П,3 г
грех вмещенною nnipaia натрия (NajCJUO? 5,5Н2О) и Ю г NfcCO)
рас г моря вл при подогревании в небольшом объеме воды. К
полученному раствору добавляют 1,73 г CuSO4-5H2O, рас творенного в
10 МЛ ВОДЫ И ДОВОДЯ! водой до 100 МЛ.
3. NaOH - 6 и водный раствор
10
Порядок проведения работы
К 2 мл раствора, содержащего 0,1-2 мг белка, добавляют 2,0 мл 6%-
ного водного раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Пробы хорошо
перемешивают и через 15 мин фотомстрируют при 330 нм. Предварительно
строят калибровочный график по стандартному раствору белка.
2.3. Микрометод, вариант Б.
Реактивы:
1. СиБОд ^НгО - 0,21%-ный раствор в 30%-ном растворе NaOH. 21 мл
1%-ного (масса/объем) водного раствора CuSO4-5H2O добавляют к 75
мл 40%-ного NaOH, а затем доводят водой до 100 мл.
2. NaOH - 30%-ный водный раствор. Оба раствора могут храниться в
пластиковой посуде в течение 6 месяцев.
Порядок проведения работы
К 2 мл исследуемого раствора, содержащего от 0,04 до 1 мг белка,
добавляют 1 мл реактива 1. В параллельной точно такой же серии проб к 2
мл образца добавляют 1 мл реактива 2. Обе серии проб перемешивают и
оставляют при комнатной температуре на 5 мин. После этого измеряют
оптическое поглощение при 310 нм, используя в качестве контроля пробы,
не содержащие белка. Обозначим поглощение проб, содержащих раствор
белка с реактивом 1, как XI, поглощение пробы, не содержащей белка, с
реактивом 1 как Х2, поглощение проб, содержащих раствор белка с
реактивом 2 как Y1, и, наконец, поглощение пробы, не содержащей белка, с
реактивом 2 как Y2. Тогда для каждой пробы можно рассчитать величину,
равную (X1-X2)-(Y1-Y2). Отложив зависимость этой величины от
количества белка в растворе, можно построить калибровочный график,
который, как правило, линеен, мало зависит от первичной структуры белка и
не зависит от наличия в пробе даже сравнительно больших количеств
нуклеиновых кислот. Окраска развивается менее чем за 5 мин и стабильна
более 2,5 часов.
Литература.
1.	Практическая химия белка (под редакцией Л. Дарбре) Москва, Мир, с.
290-302, 1989.
2.	Практикум по биохимии (под редакцией С.Е. Северина и Г.А.
Соловьевой) Москва, Изд-во МГУ, с. 80-81, 1989.
11
3.	Метод Лоури
Принцип MCtn t*
Мсгол	"" овр«10,и"ии ‘WaumwiMx продукте,
„„„„„юн-. - реплмя» двух реакций. В ходе первой, биуреГопой ''"'Рц
„лны люхмлснпюй мели обралуют комплекс с пептидными «,?"*»•
до Си В холе второй реакции ионы Си’ окисл,^" •
„ одновременно с этим обеспечивают восстанов *
фосфомолибдатов. входящих в состав реактива Фoлинa-Чиoкa.^(^тey<:,,,*
молибденовой сини. Точный химический механизм этих реакций остаегс *
вполне понятным. Однако, в результате комбинации двух Чс
развивается синее окрашивание, интенсивность которого зависит^
концентрации белка. Эффективность восстановления ионов Меди
определенной степени зависит от аминокислотного состава белка. Потт 8
метод Лоури, также, как и большинство других колориметрических мето
не обеспечивает получения абсолютных значений концентрации белка Тем
не менее, метод высоко чувствителен и традиционно широко используется
биохимических исследованиях.
Метод зависит от величины pH, на развитие окраски влияют
компоненты буферных систем (трис, глицил-глицин, фосфат в высокой
концентрации), восстановители (дитиотрейтол, меркаптоэтаноз
аскорбиновая кислота, редуцирующие сахара), комплексоны (ЭДТА, ЭГТА)
детергенты, сернокислый аммоний, сахароза и многие другие соединения
Для того чтобы исключить влияние указанных веществ, контрольная проба
должна содержать эти соединения в такой же концентрации, как и опытные
пробы. В ряде случаев проще провести диализ (или гель-фильтрацию) и
таким образом избавиться ог низкомолекулярных компонентов, мешающих
определению белка. Можно осадить белок из раствора, например,
трихлоруксуснои (конечная концентрация 2,5-3%) или хлорной кислотой
(конечная концентрация 0,25-0,30 М), после чего растворить осадок белка в
r С / U , к .вор.п и провести его определение по методу Лоури.
80 ГЬОЧНЫИ ’^Фик лишь приблизительно линеен в интервале от Ю до
©о мкт оелка в пробе.
3.1.	Стандартный метод	j
Ь’еиктивы:
2.
3.
Стандартный раствор белка, например, бычьего сывоР0™^иИ1о
альбумина, содержащий 0,2 мт в I мл. Точную конпентран
альбумина определяю! спектрофозометри чески (см. выше).
NazCOj - 2%-ный pac t вор в 0,1 н растворе NaOH.
CuSO^SHjO - 0,5%-ный раствор в 1%-ном З'-замещенном пи
назрия (Na3C6H5O7 5,5Н2О).
12
4.	Рабочий раствор: 1 мл реактива 3 в день определения смешивают с 50
мл реактива 2.
5.	Реактив Фолина-Чиокальтеу. Используют коммерческий препарат (I н
по кислотности), хранимый в темной склянке. Процедура
приготовления реактива подробно описана в книге «Практикум по
биохимии» под редакцией С.Е. Северина и Г.А. Соловьевой,
(Издательство МГУ, Москва, с. 81-82, 1989).
6.	Трихлоруксусная кислота - 10% раствор.
7.	NaOH - 1 н раствор.
Порядок проведения работы.
К 0,4 мл исследуемого раствора, содержащего от 10 до 80 мкг белка,
приливают 2,0 мл рабочего раствора (реактив 4), перемешивают и оставляют
при комнатной температуре на 10 мин. Добавляют 0,2 мл реактива Фолина-
Чиокальтеу. Содержимое пробирок быстро и тщательно перемешивают и
через 30 мин колориметрируют при 750 нм. Содержание белка
рассчитывают по калибровочному графику. Если содержание белка в пробе
очень велико и калибровочный график начинает отклоняться от линейности,
то колориметрирование лучше проводить при 650 или 550 нм. В этом случае
чувствительность метода уменьшается, однако увеличивается область
линейности.
Если перед проведением опыта необходимо осадить белок, то к пробе
добавляют трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 3-4% и
пробу оставляют на льду на 10-20 мин. Осадок белка отделяют
центрифугированием, супернатант отбрасывают, а осадок промывают 2%-
ным раствором трихлоруксусной кислоты. Затем осадок промывают
ацетоном и высушивают на воздухе. Высушенный осадок растворяют в
минимальном объеме 1 н раствора NaOH, разводят водой до желаемой
концентрации и определяют содержание белка по методу Лоури.
3.2.	Ускоренный метод Лоури и соавторов.
Реактивы:
1.	Комплекс-образующий реагент. Готовят непосредственно перед
определением путем смешивания заранее приготовленных растворов
Л, Б и В в соотношении 100:1:1 по объему.
Раствор A: Na2CO3 - 2%-ный (вес/объем) водный раствор.
Раствор Б: CuSO4-5H2O - 1%-ный (вес/объем) водный раствор.
Раствор В: калий-натрий виннокислый - 2%-ный (вес/объем) водный
paci вор.
2.	NaOH - 2 н раствор.
3.	Реактив Фолина-Чиокальтеу (1 н по кислотности).
4.	Стандартный раствор белка с концентрацией 2,5 mi 7мл.
Порядок проведения работы
к 100 мкл образца, содержащего от 10 до 250 мкг белка
,00 мкл 2 .. раствора NaOH и нагревают при 100 «С в течение>%
Инкубацию можно проводит., либо на водяной бане, либо в твердJ %
термостате. Следует следить за гем, чтобы в ходе HarpeJ'X
происходило .вменения объема образца. Пробы охлаждают до к, и" не
температуры, добавляют I мл свежеприготовленного комплекс-обра
реагента и инкубируют 10 мин. На этой стадии pH инкубационной
должен быть в интервале от 10,0 до 10,5. Время инкубации не кпи СМсСи
может варьировать от 10 мин до нескольких часов. Затем k™4h°h
добавляют 100 мкл реактива Фолина-Чиокальтеу и сразу перемешиад^^
встряхивателе. Реактив Фолина-Чиокальтеу не стабилен при Ще На
значениях pH, поэтому добавление реактива и перемешивание Л°ЧНЫх
проводить быстро. Пробы инкубируют в течение 30-60 мин при ком ^^
температуре. Не желательно проводить инкубацию дольше 60
Оптическое поглощение измеряют при 750 нм, если конечная концен МИН
белка в пробе меньше 0,5 мг/мл или при 550 нм, если концентрация
пробе больше 0,5 мг/мл.	Ка в
В литературе описано много вариантов измерения белка по мп
Лоури. Эти варианты позволяют улучшить линейность, повысив
чувствительность или избежать влияния различных соединений
протекание реакции.	83
Литература.
'' ?о₽о.з(рЧС|Сп™ ХИМИЯ беЛКЭ <ПОД Редакцией А- Дарбре) Москва, Мир. с.
2. Практикум по биохимии (под редакцией С.Е. Северина и ГА.
Соловьевой) Москва, Изд-во МГУ, с. 80-81, 1989.
3. О.Н. Lowry, NJ. Rosebrough, A.L. Fan, RJ. Randall Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193,’ 26^5
4.
nrotem in ।'" ।,k n , '	lor Protein quantification. In The
""LX “1 *	-
ределение белка с бицинхониновой кислотой
Принцип MC I ода
ионы двухвалентной*м'е-ш\г МеТ0де J,°yPM при щелочных значениях pH
связью и подвеог сди образуют комплексные соединения с пептидной
одвергаются восстановлению до Си’. В методе Лоури ионы
14
одновалентной мели «телнзнруют обрй И1ва||ие молибденовой сини и тга
реакция протекут только при кислых или ней.ряльных и.ячеТиях pH Таким
„брахом. при определении белка „о методу Лоури необходимо по ведение
двухстеднйной реакции, сначала обрЯ,„впние биурег.жо... ,0МХса „ри
щелочных «наченнях pH. а итем обргомни* молибденовой сини
происходят*» при нейтральных или кислых течениях pH иТстно X
„нотис соединения мешают протеканию .гой реакции Ьициихониноиа.
кислота валяется специфическим хелатором ионов одновалентной мели
(рис. II и при .том образующийся комплекс бицинхониновой кислоты и
Bicinchoninic Acid
(ВСА) sodium salt
BCA-Copper
Reaction
Рис. 1. Схема реакции, используемой для определения концентрации белка с
бицинхониновой кислотой. ВСА - бицинхониновая кислота.
https:wwM.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Images/integration/BCA-Cu-
Rxn2.gif
ионов одновалентной меди стабилен при щелочных значениях pH, т.е. в
условиях протекания биуретовой реакции. По этой причине в отличие от
метода Лоури реакцию с бицинхониновой кислотой можно проводить в одну
стадию при щелочных значениях pH.
Помимо этого, оказалось, что многие соединения, мешающие
определению концентрации белка по методу Лоури, не влияют, или очень
незначительно влияют на определение концентрации белка с
би цинхониновой кислотой. Среди соединений, значительно мешающих
проведению реакции, следует упомянуть глюкозу, хелаторы и ионы
аммония. Глюкоза в концентрации 50-100 мМ завышает результаты
определения концентрации белка, а ЭДТА в концентрации 10-100 мМ и
ионы аммония в концентрации 10-20 мМ занижают результаты. Как и для
большинства других колориметрических методов, интенсивность окраски
довольно сильно зависит от аминокислотного состава белка и поэтому не
может использоваться для абсолютно точного определения концентрации
разных белков. В литературе описаны стандартный (чувс!ви1ельность 10-
100 мкг в пробе объемом 2 мл) и микрометод (0,5 10 мкг в пробе объемом
2 мл) определения белка с бицинхониновой кислоюй.
15
4.1 Стандартный метод
.«.пннноаоЛ кислоты - 0.1 г.
v dW”' *Х«	ч"’16 Г’N,OH • °*»
I	' \о1.Л’"мм П до 100 мл. После причло^,.
( ло»сс"’ "'(ОвестИегоЛоН.25Н|1(>НипиМ»Н((ь
S""' '	Пр1'*’"”’’ п д I В 10 МЛ ЛОЛЫ.
<*** к O.SO. М':О - О-4 ’ ’ знатной температур. неогрищ.^
Ге»'«мт*»	50 объемов реагента А и ।
. ssES	”р”	•
• ,<,««« рев**" Ь'
учение 1 нел^”-
Порядок проведения работы
К 100 мкл раствора, содержащего 10-100 мкг белка, добавляют ">
стандартного рабочего раствора и инкубируют при 60 °C в течение 30 мин
При увеличении времени инкубации интенсивность окраски увеличивает-^
После окончания нагревания окраска стабильна по крайней мере в течение
часа Измеряют поглощение при 562 нм и определяют количество белка по
калибровочному графику, полученному с использованием стандартного
раствора белка (например, бычьего сывороточного альбумина, точною
концентрацию которого определяют спектрофотометрически).
4.2 Микрометод.
Режкливы:
э
4
Реагент A. Na;CO Н2О - 0,8 г, NaOH - 1,6 г, двухводный гарграт
натрия - 1,6 г. Если необходимо, оттитровать pH до11.25 10 М
раствором NaOH и довести объем водой до 100 мл.
Heai сит Ь бицинхониновая кислота - 4,0 г в 100 мл воды.
cut В ( uS<). >11 о - 0,4 । в 10 мл воды.
Стандартный рабочий расiвор; смешать 1 объем реагента В с -
(/«ьсмами реагента Б и затем добавить 26 объемов реагенга А.
Порядок приведении рабо1ы.
К I мл рас (вора, содержащего от 0,5 до 10 мкг белка, добавить I *
стандартною рабочею рас i вора и инкубироват ь в течение 1 часа при 60 _
Остуди it и измерить оптическое поглощение при 562 нм. Опрсдсл
концен! рацию белка по калибровочному графику, полученному
16
использованием стандартного белка, например, бычьего сывороточного
альбумина.
Литература
I.	Р.К. Smith, R.l. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D.
Provenzano, E.K. Fujimoto, N.M. Goeke, В J. Olson, D.C. Klenk,
Measurement ol protein using bicinochoninic acid. Anal Biochem 150 76-
85, W85.
2,	J.M. Walker. The bicinochoninic acid (BCA) assay for protein
quantification. In The protein protocols handbook, 2nd Edition Ed. J.M.
Walker, Humana Press Inc. Totowa, NJ. p. 11-14, 2002.
3.	K.J. Wiechelman, R.D. Braun, J.D. Fitzpatrick, Investigation of the
bicinochoninic acid protein assay: identification of the groups responsible
tor color formation. Anal.Biochem. 175, 231-237, 1988.
5. Определение белка по связыванию красителей
5.1. Определение белка по связыванию Кумасси (метод
Бредфорда)
Принцип метода
Анионный краситель Coomassie G250 имеет несколько ионогенных
групп: две сульфогруппы с рК 1,15, 1,82, а также группу, содержащую
третичный атом азота с рК 12,4. При кислых значениях pH Coomassie G250
находится в виде двух протонированных форм с максимумами поглощения
при 470 и 650 нм. Анионная форма красителя, связывающаяся с белком,
• ст максимум поглощения при 590 нм. Таким образом, измеряя
ическое поглощение при 590-595 нм, т.е. количество красителя,
.няпегося с белком, можно определить концентрацию белка. Краситель
существенно связывается с положительно заряженными остатками
чина и лизина и вступает в гидрофобные взаимодействия с белком. По
и причине щелочные и гидрофобные белки будут лучше связывать
massie G250, чем кислые и полярные. Вследствие этого интенсивность
окрашивания будет довольно сильно зависеть от природы и
аминокислотного состава белков. В то же время метод Бредфорда имеет
чувствительность, сопоставимую, или даже несколько более высокую, чем
метод Лоури. Более того, многие соединения, мешающие определению белка
1,0 методу Лоури, не влияют на определение белка по методу Бредфорда. Все
по сделало метод Бредфорда очень популярным. Различают так называемый
с,анДартный (чувствительность 10 - 100 мкг белка) и микро
•чувствительность 1 - 10 мкг белка) методы.
17
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye
MW 854.02
Рис. 2. Анионный краситель Coomassie Brilliant Blue G250. (http://,^
img.com/show/bradford-assay-reaction.html).
Реактивы:
1.	Рабочий раствор: 10 мг Coomassie G250 растворяют с помощью
ручного гомогенизатора стекло/стекло в 5 мл 95% этанол!
Полученный раствор смешивают с 10 мл 85% раствора фосфорной
кислоты и доводят водой до 100 мл. Чистота и растворимость
препаратов Coomassie G250, выпускаемых разными фирмами,
довольно сильно разнится. По этой причине после приготовления
рабочий раствор красителя необходимо отфильтровать. Готовый
раствор хранят в темной склянке. Раствор стабилен при комнатной
температуре в течение нескольких недель. При длительном хранении
часть красителя может выпадать в осадок. В этом случае перед
использованием рабочий раствор необходимо отфильтровать.
2.	Стандартный раствор белка. В качестве стандарта рекомендуете!
использовать бычий сывороточный альбумин или овальбумин (1 мг/мл
для макро- и 0,1 мг/мл для микрометода). Концентрацию стандартного
раствора следует измерить спектрофотометрически, принимая, что
поглощение бычьею сывороточного альбумина и овальбумина при
концентрации I мг/мл и 280 нм составляют 0,66 и 0,75,
соот ветственно.
3.	( (еклянная и пластиковая посуда, используемая в работе, должна быть
абсолютно чистой и свободной от детергента. При проведении
и шерений не следует мыть кюветы водой, потому чт0
нейтральных pH большая часть красителя переходит в анионн
синюю форму, выпадает в осадок и сорбируется на стенках кюве^и
OciaiKH красителя лучше удалять либо этанолом, либо раствор3
детергента.
18
5.1.1. Стандартный метод
К 100 мкл образца, содержащего от in m inn .	<
мл рабочего раствор» Coomwfc 0230 ,1" 1?	' * "ба"Л,,К’Т 5
„збегая обрвзова. пены. Мере, 5-60 ZX встр"хивзтеле-
мин после смешивания ичмепяют
оптическое поглощение при 595 нм. Проба, содержащая |00 мктХкаХт
оптическое поглощение, равное около 0 4 Как	7
КРИВ.ТЯ не линейна, и величины оптич’еско™ ХщиияХХТ
длительности хранения реагента. По этой причине желательноXX
7—и белка.
кощ.чеетва свободного анионного кр7и^^
"™*п’ения А '?'ЧШИТЬ линейность желательно строить зависимость
отношения А^/Ащ, От количества белка, добавленного в пробу В этом
случае необходимо измерить оптическое поглощение при 595^450 нм для
проо. содержащих только краситель и смесь красителя с белком ™
пробы, содержащей только воду (т.н. абсолютные оптические поглощена)
кХХ ХХХпоеЛаТеЛЬН° Пользоваться одноразовыми пластиковыми
с“Хля °ПЫТа СЛеДУСТ °™ЫТЬ СПИРТОМ от	»а
5.1.2. Микрометод
100 мкл образца, содержащего 1-10 мкг белка, помещают в 1,5 мл
пластиковую пробирку Эппендорф, добавляют 1 мл рабочего раствора
Coomassie G250 и тщательно перемешивают. Измеряют оптическое
поглощение при 595 нм. Обычно величина оптического поглощения пробы,
содержащей 10 мкг овальбумина, составляет 0,45.
Jи тература.
1. М.М. Bradford, A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976.
2. N.G. Kruger, The Bradford method for protein quantification. In The
protein protocols handbook, 2nd Edition Ed. J.M. Walker, Humana Press
Inc. Totowa, NJ. p. 15-21, 2002.
19
нс
белка по связыванию амидового Че
" ВаЙСМаИа>
Оз
N
no2
Рис. 3. Анионный краситель Amido В.асй (Ь«ря://сотП.оп^Мп...1^
г ШяЛЛневом и Вайсманом метод позволяет определять
Разработанным Ш Фй Р белка наносят на нитроцеллюлозную
от 0,5 до 30 мкг белка в проб . Образец бел	кислоты. в этих услов У х
мембрану, КОТОР>* °™ на нитроцеллюлозе, а все низкомолекулярные
^mTohXL присутствующие в образце, удаляются в ходе отмывки. Такой
компоненты, при у Д	ь малые количества белка даже в
присутствии^высоких^концентраиия сахарозы, мочевины. ЭДТА „ли
тиоловых регентов. Следует, однако, помнить, что так же как в случае
окрашивания Coomassie G250. связывание амилового черного в заметок
степени зависит от физико-химических свойств белка и щелочные
гидрофобные белки связывают краситель лучше, чем кислые гидрофильные
белки.
Реактивы и материалы:
1.	Трихлоруксусная кислота - 20%-ная (масса/объем).
2.	Уксусная кислота - 7% (объем/объем).	й
3.	Раствор амидового черного - 0,1%-ный, приготовленный на 7®о-но
уксусной кислоте.	<
4.	Раствор для элюции красителя: NaOH - 25 мМ раствор, содержаШИ
0,05 мМ )ДТА и 50%-ный этанол.	опжиО
5.	Нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,4 мкм (мо*
использовать фильтры фирм Millipore или Synpore).
20
порялок проведения работы
Образен белка (это может быть индивидуальный белок или экстракт
,.1)И) наносят на нитроцеллюлозную мембрану. Желательно, чтобы Хм
^зиа был Не 0ЧС'"’ б0ЛЬШИМ ('°-30 MM)- В ходе нанесения
Тоопеллк’ЛО’нУ10 мембрану постоянно подсушивают феном. Если обратен
н'.' ик ПО объему. ТО образец вносят в одну и ту же точку несколько рат
"^стый Р»1 ™атсль"° ВЫСУШИ“" место нанесения. Желательно, чтобы
Ь\1Метр получающегося пятна не был больше 1 см. После нанесения всех
Л<‘.пцов нитроцеллюлозный фильтр помещают в 20%-ный раствор
( „‘х-юруксусной кислоты для фиксации белков и отмывания
’^.^молекулярных растворимых соединений. Удобно проводить эту
Терапию в чашке Петри. Через 5-10 минут фильтры отмывают 2-3 раза в
° створе 7%-ной уксусной кислоты и помещают на 1-2 минуты в раствор
' визового черного. Избыток красителя тщательно отмывают раствором
кехеной кислоты, а затем ополаскивают водой для удаления кислоты и
рысуишвают под феном в токе теплового воздуха. С помощью круглых
сверл для резиновых пробок вырезают равные по площади участки
нитроцеллюлозного фильтра, содержащие исследуемые образцы белка. В
качестве контроля используется участок фильтра, который прошел все
ышеописанные обработки, но на который не наносили образец белка.
Вырезанные участки нитроцеллюлозной мембраны помещают в пробирки
Утендорф на 1,5 мл и вносят в каждую пробирку по 1 мл раствора для
яюции красителя. Полученные пробы перемешивают и оставляют на 1-2
часа, периодически встряхивая для полной элюции красителя. Измеряют
оптическое поглощение при 630 нм. Количество белка определяют по
калибровочной кривой, построенной с использованием белков-стандартов,
например, бычьего сывороточного альбумина или овальбумина, точную
концентрацию	которых	предварительно	определяют
спектрофотометрически. Метод позволяет определить от 0,5 до 30 мкг белка
в пробе.
Литература
W. Schaflhcr, С. Weissmann, Л rapid, sensitive, and specific method for the
determination of protein in dilute solution. Anal. Biochem. 56, 502-514,
1973.
21
и -электрофоретические методы
" ЭЛ ИССЛЕДОВАНИЯ
I
Принцип МС10 I*
Рмлимные »нлы электрофора в полиакриламидном гелс
пппелсления чистоты полученных препаратов белка, Д**’
ИСПОЛЬЯуЮТ ДЛЯ ( | >	и-1лтпектпичес1гпй
,,, определения молекулярной массы и изоэлектрической точки '
Полиакриламид является одним из наиболее популярных носителей
различных видах электрофореза. Это обусловлено тем. что разработаииД'
настоящему времени методы позволяют получать гель с задан,-
механическими свойствами и с размером пор, необходимым х
оптимального разделения белков и пептидов различной молекуляРНой
массы. В общем виде подвижность белков в пористом носителе бу]е.
зависеть от нескольких факторов. При постоянной напряженности
электрического поля подвижность белка в полиакриламидном геле будет
зависеть как минимум от трех параметров - от величины заряда, размера и
формы молекулы белка. По этой причине для того, чтобы П(|
электрофоретической подвижности определить размер или молекулярную
массу белка необходимо создать такие условия, когда влияние двух других
параметров (форма и заряд молекулы белка) удастся нивелировать. Если же
по электрофоретической подвижности хотят определить заряд (или
изоэлектрическую точку белка), то желательно свести к минимуму влияние
размера (молекулярной массы) и формы белка.
Зачастую после электрофореза желательно не только локатизовать
полосу белка в полиакриламидном геле, но и установить, обладает ли
данный белок определенной ферментативной активностью. Очевидно, что в
этом случае в процессе электрофореза нельзя использовать реагенты,
которые бы нарушили структуру белка (например, различные детергенты и
мочевину), а сам процесс электрофореза желательно проводить при
пониженной температуре. Такие виды электрофореза в нативных условиях
не позволяют сделать сколько-нибудь однозначных заключений о
молекулярной массе или форме молекулы белка, но могут дать полезную
информацию о гомогенности или гетерогенности исследуемого обраш
ус а нови г ь, в какой области располагается изоэлектрическая точка бело,*
1акжс при необходимости провести специальное окрашивание геля дд*
определения ферментативной активности. В настоящее время предложен
огромное количество электрофоретических систем, позволяющих проводить
электрофорез при различных значениях pH. Очень условно все эти методы
можно разделить на электрофорез, проводимый при кислых, нейтрал^
или пк.ioчны\ шачениях pH. Электрофорез в присутствии додецилсульФ*
натрия а) позволяет определить кажущуюся молекулярную м -
22
отдельных полипептнлных цепей. Наконец, метол
„отволяет определить изоэлектрическую точку	Р°',’0"у'иро"ания
У следуемого белке.
1, Электрофорез в нативных условиях
1.1. Нативный электрофорез при кислых значениях pH
При и ним метод»
(«личных видов ЩМ^Тбадков" таГихИкак°™стеТСЯ "Р" исслеломиии
Г РНКаза и некоторых других ОчД	ЛИ1О,,ИМ- иктох₽ом
изоэлектрические точки при кислых значениях pH. ™ие"’ каГ бычий
или вовсе не будут проникать в полиакриламид,tT7e”" ПОДВИЖНОСТЫО
Реактивы:
1. Раствор мономеров для разделяющего геля: 60 г акриламида и 400 мг
метиленбисакриламида растворяют в минимальном объеме воды при
перемешивании и после растворения доводят объем до 100 мл. Раствор
мономеров фильтруют и хранят в темной склянке в холодильнике.
Внимание! Растворы мономеров акриаламида и
метиленбисакриламида нейротоксичны. Все операции с этими
соединениями следует проводить в резиновых перчатках и избегать
контактов с кожей и слизистыми. При попадании на кожу или в глаза
немедленно промыть большим объемом воды и при необходимости
обратиться к врачу.
2. Буферный раствор для приготовления разделяющего геля с pH 4,3: 48
мл 1 н раствор КОН смешивают с 17,2 мл ледяной уксусной кислоты,
добавляют 4 мл тетраметилэти лен диамина (ТЕМ ЕД) и доводят объем
до 100 мл. Раствор фильтруют и хранят в холодильнике.
Буферный раствор для приготовления концентрирующего геля с pH
6,7: 48 мл 1н раствор КОН смешивают с 2,87 мл уксусной кислоты и
0,46 мл ТЕМ ЕД, после чего доводят объем до 100 мл. Раствор
фильтруют и хранят в холодильнике.
4.	Электродный буферный раствор с pH 4,5: 31,2 г Р-аланина смешивают
с 8,0 мл ледяной уксусной кислоты и доводят до 100 мл. Перед
употреблением буфер следует развести в 10 раз.
5.	Раствор персульфата аммония в воде -	0,28%-ный
(свежеприготовленный).
б.	Лидирующий краситель метиленовый зеленый (0,1°о-ный водный
раствор) или краситель sunset yellow (0,1%-ный водный раствор).
23
7.	Сахароза, 40%-ный раствор.
8.	Фиксирующий раствор: уксусная кислота 7«/
9.	Распор для окрашивания гелей: 0,1% с ' '“'Ный расг
ной уксусной кислоте. После приготовл^** ^$0
хранят при комнатной температуре. ННя
op
ГТМ1
раствор фильт- '
Порядок прове с.... г
— чем проводить опыт, необходимо
^pmhS’ геля- пр0ВерИТЬ Г гермеТИЧНОСТЬ - °предели?>
^сРтZ мономеров, который необходим для заполнения камер,
f X смесь мономеров для полимеризации разделяющего геля.
X смешивают I часть буфера для разделяющего геля, 2 част„
а ризамила. 1 часть воды и 4 части раствора персульфата аммони.7^
,учае концентрация полиакриламида составит 15%. В том случае
необходимо использовать более крупнопористый гель, то уМе1)м*«
количество добавляемого раствора акриламида и заменяют его на рщ "
объем воды. Полученную смесь мономеров вносят в ячейку так, чтоб, ?
края пластины оставалось столько места, чтобы можно было встави"
«гребенку». На поверхность раствора мономеров пипеткой или капил,^
аккуратно без перемешивания наносят воду и оставляют до окончат,
полимеризации. После этого воду удаляют и на поверхность разделяющего
геля наносят раствор мономеров концентрирующего геля.
приготовления концентрирующего геля смешивают 1 часть буфера дц
концентрирующего геля, 0,7 частей раствора акриламида, 2,3 части воды и 4
части раствора персульфата аммония (в этом случае концентрации
концентрирующего геля будет равной 5,25%). Сразу после внесена
растворов мономеров концентрирующего геля вставляют «гребенку» и
оставляют до полной полимеризации.
После окончания полимеризации гребенку вынимают, образовавшиеся
«карманы» промывают водой и полностью собирают прибор дм
электрофореза. Если объем наносимых образцов не очень велик, то можно
отказаться от использования концентрирующего геля и проводить
электрофорез, используя только разделяющий гель. Перед нанесением
ращы белка следует утяжелить, смешав их с равным объемом раствора
KnacHf1-1 *i l0(”)dB,1H к пР°бам небольшое количество лидирующего
геля 1о<ш1М.т{Гпл-?Г”l,opei пР°и°Дят на пластинах полиакриламидного
белка. HaroviK' ’ " ’° ММ’ ™ На каждый трек наносят от 0,5 до 5 мкт
°бразеци от тою иаВИСН1 °Г Т°Г°’ насколько гетерогенен исследуемь,и
используемыми кпясит?' 11К0 х°рошо анализируемые белки прокрашиваются
несут положительный at'™*1 * Ис,|ользуемой системе большинство белков
судят по перемещению лггп *' "ерсмещаются к катоду. О ходе электрофоре33
После окончания Рующего красителя.
фиксируют В pacZ: ?ЛектРофореза гель извлекают из камеры н
- сусной кислоты. Гель окрашивают в рас1’*”*
Coomassie R250 в течение 15-2
промывая гель 7%.ной уксусной”'
дистиллированной воде.	и
после чего избыток краски удаляют,
кислотой или нагревая гель в
Литература
I. Г. Маурер, Диск-электрофорсз. Москва, Мир, 1971.
2 Практикум по биохимии (под редакцией С.Е. Северина и
Соловьевой) Москва, Изд-во МГУ, с. 94 - 96, 1989.

1.2.	Нативный электрофорез при щелочных значениях pH
Принцип метода
В литературе описано много систем для нативного электрофореза при
щелочных значениях pH. Все эти системы в основном используются для
разделения белков с изоэлектрическими точками при кислых значениях pH.
При работе с индивидуальными белками эти системы могут быть
использованы для изучения белок-белковых взаимодействий и для анализа
различных посттрансляционных модификаций (например,
фосфорилирования), сопровождающихся изменением суммарного заряда
белка.
1.2.1.	Нативный электрофорез в гомогенной системе но методу Шауба-
Перри
Реактивы:
1.	Буферный раствор, 0,8 М глицин-Трис с pH 8,6. Необходимую навеску
глицина растворяют в небольшом объеме воды и доводят pH до 8,6
сухим Трис.
2.	Раствор акриламида: 29,2 г акриламида и 0,8 г метиленбисакриламида
растворяют в минимальном объеме воды и доводят до 100 мл. Раствор
фильтруют и хранят в темной склянке в холодильнике.
3.	Буферный раствор для приготовления образцов: 40 мМ глицин-Трис,
pH 8,6, 30%-ный глицерин, 0.004%-ный бромфеноловый синий. Перед
употреблением добавляют меркаптоэтанол до конечной концентрации
4%.
4.	ТЕМ ЕД.
5.	Персульфат аммония (сухой) или свежеприготовленный водный
раствор.
6.	Уксусная кислота - 10%-ный раствор.
25
0.3%-ный Coomassie R250, прИгаг
7	PW1*>P rS* содержащем 20% изопропанола н 10%
КИСЛОТЫ
11«рл>йКил 15%-ного полиакриламидного
„пиготовления л Лева глицин-Трис pH 8,6, 5 мл pacnJ’
ДЛ’ г ' мл О.» М бу* полученной смеси добавляют TEmJ*
смешив»1" д мЛ воды- конпен грации 0,1% и смесь мономер
;’к1’"1;""ьзг аммония до конеЧоб° иную и герметизированную камеру. J
"е(К7'1Ь« в нрелварительН0 СО®Р То варьируют объемы воды и расг^
НХпмо изменить "Добьем добавляемого буфера. Сразу^
неСб ««за. оставляя неизменны. «гребенку» и дожидаются полно,
внесения раствора МОНОХ°аВзомвшиесяТ Тарманы» промывают X?
Го имсризаиии геля. O6£«» фореза и заполняют злектродин.
монтируют камеру в приборе ДЛ	8б приГ0Т0вления проб зд
камеры 80 мМ буфером Образцам добавляют 1/3 буфера зд
электрофореза к аналИЗХа оэтанХ. Об окончании электрофореза суад
образцов. содержащего мер^ красителя - бромфенолового синего. После
„о перемещению лидирующего г	R ]0о/о.ной уксуснои кислоте я
окончания электрофореза тел i ф РУ _ 2 ча(;ов ИзбытОк красителе
окрашивают Соотааые R	кислоте, либо нагревая гель.
чдаляют, промывая i ело
дистиллированной воде.
Литература
1 м С Schaub. S.V. Perry , The relaxing protein system of striated muscle.
Resolution of the troponin complex into inhibitory	u5
sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. Biochem. J. n*
993-1004,1969.
системе Дэвиса Натив,,Ь|” ^-’сктрофорез в гетерогенной буферной
Принцип метода
™па буферных рас,вор<’’
разделяющие и к,„,„РН' ’ систем™ и,стеме электрофореза при
°браэец белка с,,|риРУющие гели п Исп°льзуют так называемые
|10Авижностыо ()ка1ываегся зажатым входе в концентрирующий гель
подвижностью •замн!гИР^Ю,ЦИм и°ном Между обладающим высокой
кицим ионом. На гп^1 °бладающим очень низкой
анице между концентрирующим и
76
пазлсляк>|"им гслям" происходит пм
увеличению электрофоретической , иэмс„енис
Одновременно с чтим происходит „ л"и*«ости ЧТо "Риводит *
^условленное гем. что £ рс"‘°« замедлен "иы*“««1его иона
концентрирующего в мелкопористый „ "с1*»од»э ЛВИжемия белков
факторов приводит к тому. что „„ ра1л«ляющ„й ,ел, ,. "’’’"'"«пористого
концентрирование белков, и "осле ’.тогоМС*Л> --УМ
в виде узких юн (дисков). По этой	м"'РирУн„ „ „ "ми происходит
П’И> Р‘"ных ™"« '“ей и/илн буфСро;И"СсИст'мм. испол^Х»’"1'М
прерывистые системы электщ,,Ьп ст’'ю ««означай^ Л1М’"л"
разрешающую способность Г??* Рем Т««й поГ
бчнчкимн электрофоретическими РаЗДеля"ь белки V'°"M,"*r
сХ“:	г>т и
повыв,ение концентрации бел^ХХГ^ П₽0ИС«’^ХГрХ’
“Z Хе поводите Т ИЗМ~ РН^Х *	"
« Денатурации и атр^
Реактивы:
1. Раствор акриламида: 29,2 г акриламида и 0,8 г метиленбисакриламида
растворяют в минимальном объеме воды и доводят до 100 мл. Раствор
фильтруют и хранят в темной склянке в холодильнике.
Внимание! Растворы мономеров акриаламида и
метиленбисакриламида нейротоксичны. Все операции с этими
соединениями следует проводить в резиновых перчатках и избегать
контактов с кожей и слизистыми. При попадании на кожу или в глаза
немедленно промыть большим объемом воды и при необходимости
обратиться к врачу.
>\фер для приготовления разделяющего геля. 1,5 М Трнс-HCI буфер.
эН 8,8. Необходимую навеску Трис растворяют в небольшом объеме
воды и доводят pH до нужного значения соляной кислотой. После
по го объем раствора доводят до нужной величины. Хранят в
холодильнике.
Буфер для приготовления концентрирующего геля. 0,5 М Трис-НС I
буфер, pH 6,8. Необходимую навеску Трис растворяют в небольшом
объеме воды и доводят pH до нужного значения соляной кислотой.
После этого объем раствора доводят до нужной величины. Следует
учесть, что при pH 6,8 Трис-HCI буфер обладает достаточно малой
буферной емкоетью, поэтому нужно титровать раствор медленно
аккуратно. Хранят в холодильнике.
4.	Персульфат аммония - свежеприготовленный 10%-ный раствор в в
5-	ТЕМ ЕД.
27
образно»- Смешеть 15’5 «я(И,
прН^’Л „ 1% -ного бромфенолОВОГи ' М
а буфер ,и”., «с 1.5 мл использованием док. 11
ъ 5-М'!"',^буфсГ'"'' '\л>тср"”" ...ентрапии 5 мМ. Сухие
1P"V .и « М .пиенпо" к°" , рчстворы исследуемых б,.
*’JJnW3T»«on "u'Kp«”’oM 6у,''Ти соотношении 4:1. Желат^
" ?л'оатиым б>'',ср епдержми компонентов с 6оль "
Дша. екП)одный буфер- '• ворякя в минимальном
. Халмий 1П Lckv глииина- Р» После этого объем ра««
1 З^^ой ТРЙС "Буфер> хранят в холодильнике.
ВОДЬ' " ^1ХГвеяиЧн«ь> Л2 в ю раз________________________
^„ ДуферР^Г^тав^ R25°’ "₽и~тый ”
использованием УФ 0 3%.йН„ Со изопропаНола и 10 А уксусвм
Порядок проведения работы
Собирают и герметизируют гелевую ячейку. Определяют объе>
раствора мономеров, необходимых для заполнения камеры. Дц
приготовления 10 мл 7,5% полиакриламидного геля смешивают 2,5 мд
раствора акриламида, 2,5 мл буфера разделяющего геля, 4,92 мл воды и 80
мкл 10%-ного раствора персульфата аммония. После подготовки смеси
мономеров к ней добавляют 8 мкл ТЕМЕД и сразу переносят в гелевую
ячейку. Сверху раствора мономеров аккуратно наслаивают воду и оставляют
до окончания полимеризации, которая обычно (в зависимости от
температуры используемых реактивов) наступает через 15-20 минут.
11еред подготовкой геля следует решить, в каких условиях будет
проводиться разделение и какой концентрации гель предполагается
использовать. Концентрация полиакриламидного геля определяется
молекулярной массой белков, которые подвергаются электрофорезу
( читается, что белки с молекулярной массой более 100 кДа лучше делить на
! еля\ с концентрацией акриламида 3-5%, белки с молекулярной массой 20-
J кДа .1>чик ращелять на гелях с концентраций акриламида 5-104 и’
наконец, ос тки с молекулярными массами 10-80 кДа лучше разделять на
паетйлп5?°,11111,.1РаиИеЙ ° акриламида. Варьируя соотношение воды и
и оптимз?11'4МИ '' МО/КНО получать гели, различающиеся по размеру П°Р
массами	Разделения белков с различными молекулярнЫМ
поверхности удадяю^и ',ОЛИМеризации разделяющего геля ВОДУ с
1 1 елевую ячейку вносят раствор мономеров
28
'ХТ1еляк’“1ИМ ,'елем- ПОЭТОМУ *e'""e™'<' wpm)ec onpcne2MiXrO
I"2pob мономеров концентрирующего ,сл,. ;(л, „ри,,^,,^
|'ел" ‘ме»"’"7 '.3 мл раствора акриламида 2 5 мл
i конпе..1Г»Р>««о геля. 6.1 мл воды „ о.| мл расг1И)ра „ерсулыЬюа
Х'нн. К "денному Раст"°РУ Добавляют 10 мял ГЕМЗД и со^
““кат на поверхность уже «полимеризованного разлеляюшего ,т
^мяют «гребенку» и дожидаются полной полимеризации геля (обычно
- УХОДИТ 15-20 минут). «I ребенку» вынимают, промывают карманы
!нПОй и монтируют гелевую ячейку в приборе для электрофореза
Электродные камеры заполняют буфером (следует нс забыть развести 10-
крятный электродный буфер в 10 раз). Па гель наносят анализируемые
^разцы. приготовленные с использованием выше описанного буфера для
образцов. Обычно на i ель наносят 5 - 30 мкл образца так чтобы на каждый
трек пластины полиакриламидного геля толщиной 0,75-1,00 мм приходилось
0 5 ,5.0 мкг белка. Как уже отмечалось, нагрузка зависит от гетерогенности
наносимого образца и от эффективности прокрашивания разных белков
используемыми красителями. За процессом электрофореза следят по
движению лидирующего красителя. Обычно электрофорез проводят при
напряженности электрического поля 10-30 в/см. Однако, следует отметить,
что при проведении электрофореза при высоких напряжениях и высоких
си ;ах тока гели начинают сильно нагреваться. Вследствие этого может
происходить денатурация белков. Для предотвращения перегрева нативный
э лектрофорез можно проводить в холодной комнате или холодильнике и при
этом не следует использовать больших напряжений или токов. Обычно
сктрофорез проводят при напряжении 200 - 600 в. Это напряжение опасно
я жизни, поэтому при проведении электрофореза необходимо строго
л пять все правила техники безопасности__________при__работе—с
- . коволюными источниками тока.
После окончания электрофореза гели вынимают из ячейки, фиксируют
-ном растворе уксусной кислоты и окрашиваю! в лечение 1,5-- часов
в течение ночи) в растворе Coomassie R250. Избыток красителя
!ЯЮ1, нагревая гель в дистиллированной воде. Для ускорения процесса
авечивания в кювету часто помещают небольшие куски бумажных
1енец или фильтровальной бумаги, которые адсорбируют краситель
ряюз процесс обесцвечивания.
I. Практикум по биохимии (под редакцией О • Север
Соловьевой) Москва, Изд-во Ml У, с. 94	.	_	human
2. BJ. Davis, Disc-electrophoresis II -
scrum proteins. Ann. NY Acad. Sci. 121.	’
29
' J in pro'c'P P "	57.60> 2002.	4Л
proteins. |nc To(owa. NJ. P	«Ц
Human»1 ,x
кажущейся молекулярной массы 6.„
1.3.	Определение «- Ув градиентноМ полиакрИЛам*%
помощью элеми ч-	-чнч
геле
Прнн«и"метод*	„ общем виде подвижность белков
- б”-г:- =к ^х=-='"-
sss^-—„ кт
заРЯД	IgtHgUo'KfT’
гм 1»и электрофоретическая подвижность белка в
полиакриламидном геле, lgU„ электрофоретическая подвижность белка,
отсутствие геля (в буфере, не содержащем пористым носитель),
коэффициент задержки, зависящий от молекулярной массы белка и его
формы, и, наконец, Т, суммарная концентрация полиакриламидного геля.
Если формы молекул анализируемых белков не слишком отличаются друг от
друга, то можно заключить, что коэффициент задержки пропорционален
логарифму молекулярной массы белка. Если указанное допущение
приемлемо, то, определив Кг, можно определить молекулярную массу
исследуемого белка. Если указанное предположение недопустимо, то
следует проводить электрофорез в присутствии высоких концентраций
мочевины (6 - 8 М). В этом случае все белки приобретают форму
хаотического клубка, и тогда коэффициент задержки будет зависеть толью
о г молекулярной массы белка. Для того чтобы определить коэффициент
мдержки можно воспользоваться двумя методами. В первом случае следует
провести электрофорез белков-стандартов и исследуемого белка на
нескольких полиакриламидных гелях, отличающихся по концентрации (по
нелишне I, например, 6, 8, 10, 12%). Очевидно, что исследуемый белок и
нюбн	Д01Ж|1Ы впадать такими изоэлектрическими точками,
стандарты момУа",н,1Х Учениях pH и исследуемый белок, и белки
направлении. ПослеJ ''^м™1ат1>с" в полиакриламидном геле в одно"
'«лей определяют полн^ ДСНИ^ ,леет Р°Ф°Рсза на каждом иэ выбран^'
зоны белка) белков-cr ,кК1ь Фасс,ояние от места нанесения до середин
Фергюсона, по котором^Дар,ов и исслеДуемого белка и строят графи*
исследуемого белка. дАг1??Р^ЛСЛЯЮТ величину Кг для бел ков-с тандарто®
задержки от логарифма С1, °Я1 ,ависи,иость логарифма коэфф*цисн
кажущуюся молекулярную м^ЛЯРН°^ Массы и по этому графику определ|К
- Р«УЮ массу исследуемого белка.' Очевидно, что
30
этальный подход крайне трудоемок и TneCver и
иМсНТ __________________котип.," и испопмо*ания
концентрацией. Второй г~
^"^тью. Например, можно исполню»™ пол^Х^ХйТеТ"
b011lleinpauH" акриламида по зрастасг m <	-
I’fOP0* нии такого геля удается повысить р
'оЛ?" провести сразу электрофорез на нескольких
к»*	. ней акриламида. Построил
...,ПоиЧПИ'''1л{1
км-аР1"*"*'
к-гтивР0*1'
большого набора ге^сй с м,^М0|< и греб
в том. что используют олин ^ЦентР"«и«Й. ЙГ**»
^рис-т-ю. Например, можно исполь..*= "«"Но и"м™.^ОД
к<• -
испо
как
vONU*— -•
• -1 молекулярной
калибровочный график, по которой Удаетгв
...пекулярную массу исследуемого белка.
от 5 до 15%. При
разрешающую способность и
—Д гелях с разной
i зависимость подвижности от
массы белков стандартов, получают
определить кажущуюся
реактив*»1»
1. Раствор акриламида: 29.2 г акриламида и 0,8 г мегиленбисакриламила
растворяют в минимальном объеме воды и доводят до 100 мл Ра^
фильтруют и хранят в темной склянке в холодильнике ’
Внимание! Растворы мономеров акриаламида и
метиленбисакриламида нейротоксичны. Все операции с этими
соединениями следует проводить в резиновых перчатках и избегать
контактов с кожей и слизистыми. При попадании на кожу или в глаза
немедленно промыть большим объемом воды и при необходимости
обратиться к врачу.
2. Буфер для приготовления разделяющего геля: 1,5 М Трис-HCl буфер,
pH 8,8. Необходимую навеску Трис растворяют в небольшом объеме
воды и доводят pH до нужного значения соляной кислотой. После
этого объем раствора доводят до нужной величины. Хранят в
холодильнике.
буфер для приготовления концентрирующего геля: 0,5 М Трис-НС!
буфер, pH 6,8. Необходимую навеску Трис растворяют в небольшом
объеме воды и доводят pH до нужного значения соляной кислотой.
11осле этого объем раствора доводят до нужной величины. Следует
• честь, что при pH 6,8 Трис-HCl буфер обладает достаточно малой
буферной емкостью, поэтому нужно титровать раствор медленно и
аккуратно. Хранят в холодильнике.
- 11срсульфат аммония - свежеприготовленный 10%-ный расгвор в поде.
5.ТЕМЕД.
5-кратный буфер для приготовления образцов: смешать 7,5 мл 0,5М
Трис-НС!, pH 6,8 с 2,5 мл 1% -ною бромфенолового синего, мл
воды и 25 мл глицерина. Перед использованием добавить
меркаптоэтанол до конечной концентрации 5 мМ. Сухие paw“
растворяют в однократном буфере. Растворы исследуемых
смешивают с 5-кратным буфером в соотношении е -
чтобы исследуемые образцы не содержали компонентов
31
буферной емкостью, способных сильно изменить рН
7 ДХ.Й злекзродиый буфер: 1.92 М глицин-Трис, Х
7 'Хлнмук......... глицин., растворяют я миии»™^. >
НОДЫ и добавляют сухой 1рис до pl ,3. После этого ОбЬе м
доводят до »У*НОЙ ^личины. ЬуфсР *Р™ЯТ в ХолодильНи
иеполь юваннем буфер разводят водой в 10 раз.	ниКе Ь ,
PacW красителя: 0,3%-ный С oomassie R250, приГ0Т0й
водном растворе, содержащем 20% изопропанола и
кислоты. Желательно сначала растворить краситель в Спи°
после этого добавлять кислоту и воду. После пригоговле н
фильтруют и хранят при комнатной температуре.
Порядок проведения работы
Собрать гелевую ячейку и убедиться в ее герметичности п
магнитную мешалку и градиентатор на малые объемы. Подг °4Гот°^
мономеров для полимеризации геля, как это указано в таблиц °ВИТь СЧ
в них раствор персульфата аммония.	’ Не
lafi.iima 1. Состав растворов мономеров дЛЯ „
градиентного полиакриламидного геля (привезен...
заполнения большой электрофоретической камеры пп 'к'’еМы *
Hoeffer)	ватеры прибора фИр ’
Разделяющий гель
30%	АА+0.8%
[МБА_[мл)
5%
0,58
15%
1,80
Конц^р^ш
—_____гель
~~0^27 Ч
разделяющего геля
(1,5 М трис-НС1.
~РН 8.8) (мл)___
^Уфер '	|
J кониентрируЮщего
'°’5 М грис.
I пода (мл) ’ —+-
-I !«.,, 4-
10% '	~±.
«ерсульфа(ГТв°Р/
АММОНИЯ (MJon
(мюМаРН,:'®Бб^
0,87
0.87
3,50
2,05
12
	
	
	
10
0.83
0,5	
-J из	
1	3	
10
3,50
О
О
2
О
32
поставить градиентатор на магнитную мешалку, опустит». Л ™
I П°\..ное ближе к гелевой ячейке маленький мшииг.^ л иие'
I РасП0Л0.ть сообщающиеся сосуды градиентатора краном и
i ncPcKpl„on В последний момент добавить в оба 1ГГсека тип расг"оры
! м‘”Ямрс количество персульфата аммония, открыть'^ы
! <’иентап>ра и «полнить гелевую камеру градиентом мономов
1 4’:U иламида.
1 ""Я Наслоить па поверхность залитой смеси мономеров волу и дождаться
I имсг»<«пии разделяющего теля. Слить воду и наслоить на
I а0*"" рованный гель смесь мономеров концентрирующего геля. Срэту
| ттого вставить «гребенку». Нанести на готовый гель белки стандарты
j "^.лактальбумин (14 кДа), карбоангидразу (29 кДа), яичный альбумин
’ с '(а). бычий сывороточный альбумин (мономер - 68 кДа, димер - 132
i I-*?. уреазу (272 кДа - тримср, 545 кДа - гексамер). Приведенный набор
j К>3]’ в годится только для проведения электрофореза в нативных
! МЛ^ nuex (т е. в отсутствие мочевины). Это связано с тем, что некоторые из
| усЛОВИИл \
! ’ численных белков-стандартов являются олигомерами и в присутствии
\Г вины диссоциируют до соответствующих мономеров. Обычно на гель
I | М°Ч 5-30 мкл образца так чтобы на каждый трек пластины
полиакриламидного геля толщиной 0,75-1,00 мм приходилось 0,5 -5,0 мкг
j После окончания электрофореза гели вынимают из ячейки, фиксируют
" 10%-ном растворе уксусной кислоты и окрашивают в течение 1,5-2 чесов
щли В течение ночи) в растворе Coomassie R250. Избыток красителя
! чПЯПвЮт	_ J дистиллированной воде. Строят зависимость
подвижности от логарифма молекулярной массы
определяют кажущуюся молекулярную массу
j удаляют, нагревая гель в
: электрофоретической
I белков-стандартов и
; исследуемого белка.
I Литература
I
I
I
К. A. Ferguson, Starch-gel electrophoresis - application to the
classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13, 985-
1002,1964.
BJ. Davis, Disc-electrophoresis 11 - method and application to human
serum proteins Ann NY Acad. Sci. 121, 404-427, 1964.
3. Nondenatured protein molecular weight marker kit. Sigma technical
Bulletin MKR-137.
33
2. Электрофорез в полиакриламидное
присутствии додецилсульфата натри
Леммли)	я «
Принцип метод»
ае электрофоретическая подвижно^
в общем случае эл I факторов - молекулярной £.
„„лкрнламидном геле завис!	ставитСя мдача
’ и электрического Р метада электрофореза, то необ^/'
молекулярную массу с помош	на падвижность Ч
исключить влияние двух ДРУ пДдить электрофорез в прису,^
становится возможным,	Р льфаТа натрия (Ds-Na)
,.пюго детергента лод	с 6ольшинством белков [ц.у,
(CH-hoCH.OSOjNa), Ока1ал^’ло 13 -1,4 мг детергента на мг бел^
связывается в стехиометрии о	детергента приходите. Ч2
означает, что приблизитель	этого является то, что все
потипептидныс связи. Следе	ный отрицательныи заряд (т е. sj,,
становятся полианионами, прт J	м для всех белков. Собствен^
на единицу длины) °'нпыва*Х ,,,,щеСтвенной роли, потому что он мнет,
заряд белка при этом не игра . симого анионами Ds-Na. Так.,
меньше отрицательного заряд . к	на электрофоре™че«н
Образом, можно нивелироваль влия^	Ds.Na сопровождав
подвижность белка. Как У*°™	ных на поверхности белп
"""
Ds-Na «растягивают» полипептидную цепь, которая не может в этих
условиях сложиться в компактный клубок и приобретает структуру силы»
вытянутых палочек. При этом, чем больше длина такой палочкообразной
молекулы, тем с большим трудом она будет перемещаться в пори
полиакриламидного геля. Вследствие этого малые молекулы будут обладать
большей электрофоретической подвижностью, чем крупные молекулы. Ds-
Na разрушает все нековаленгные (водородные, ионные и гидрофобные!
связи в структуре белка. Однако он не способен разрушать дисульфидные
связи, которые могут сильно влиять на структуру полипептидной цепи
Поэтому перед проведением электрофореза в присутствии Ds-Na желательно
восстановить все дисульфидные мостики, добавляя большой избыв.’*
мерка!поэт анола.
меоЧЮ.°',рсде],ения м«лек\дяпно;'Хявляется простым и эффективны*
биохим . . l (Леммли) являем^1*4 беяков И неслучайно автор этогс
мето г И‘еской ли,сра|уре. тем .. СЯ () |ннм из классиков цитирования в
этому* с l<‘J-Ve’ помнить о upjjj.. .K,Ue’пРист>'пая »< использованию?^
COCTO С"еРИМеНтаЛЬНОМу Хдх аЛЬНЫХ шраничениях, свойственна
“ Н юм, что хотя стехиомр1/ ,,еРвое существенное ограничение
и|Рня связывания Ds-Na с различными
34
„ „-р или менее одинакова, нельзя быть
,е1каМИ б°, связывает детергент с одинаковой сгсХмТ’*,ТМ ’ ™м’
при 1,С"йся (аРРагеп0 молек*ляРнои мас« Для определения каадХ,
к»*У‘ лярной маССЫ На ГеЛЬ Pa4eU итслел~ белка^ “меся
мо-1^ маркеро» с *”вестными ««пекулярными массами. При -ном
6^*°’ Хгтся. что стехиометрия связывания Ds-Na с исследуемым белком
Предп ми маркерами одинакова. После окончания злеетрофорета строят
и бел*аМ.п> пробега белков-стандартов от логарифма их молекулярной
за8ИСиМ° калибровочной кривой определяют молекулярную массу
массЫ И ю белка. Второе существенное ограничение состоит в том, что с
иСслсДУеМ° )1ектрофореза в присутствии Ds-Na удается определить
lioMOulb‘° мо пекулярную массу отдельной полностью развернутой
каЖУ'и>ЮСЯ
й цепи. В том случае, если исследуемый белок состоит из
полипептидн° аковых (иди разных субъединиц), то электрофорез в
нескольких	позволит определить молекулярную массу каждой
„рИС/ГСТВИИ L"-
не тает ответа на вопрос о том, какова молекулярная масса
Субъелинииы’ , „ ' нативных условиях и сколько субъединиц входит в
исслеДУеМ0'°
олигомерного комплекса.
состав такого оли	?	высокой разрешающей способностью. Это
Метод Леммли оолад	присутствия Ds-Na подвижность
связано с тем, что,	их молекулярной массы, а, во-вторых,
бстковых молекул завис	ая выше прерывистая дисковая система
““ 
виде узких зон.
Рсак'1 ивы:
I ас I вор акриламида. 29,2 i акриламида и 0,8 г метиленбисакриламида
раечворяют в минимальном объеме воды и доводят объем до 100 мл.
Раствор фильтруют и хранят в темной склянке в холодильнике.
Внимание! Растворы мономеров акриаламида и
метиленбисакриламида нейротоксичны. Все операции с этими
соединениями следует проводить в резиновых перчатках и избегать
контактов с кожей и слизистыми. При попадании на кожу или в глаза
немедленно промыть большим объемом воды и при необходимости
обратиться к врачу.
- Буфер для приготовления разделяющего геля: 1,5 М Трис-HCI уфер,
PH 8,8, содержащий 0,4% Ds-Na. Необходимую навеску 1рис
растворяют в воде и доводят pH до нужного шачения•
кислотой. Затем объем раствора доводят до нужной велич
приготовления буфера добавляют необходимое кол
Хранят в холодильнике.	0 5 М Трис-НС1
• Буфер для приготовления концентрирующего i с ’ ю навеску
буфер, pH 6,8, содержащий 0,4% Ds-Na. ерут
35
4.
..«шного значения соляной кислое
. „ доводят р” ; нужной величины. После прИг
** ?5S
-Я»
.....: “ J--' ” ". гйЛ- UT5&
о^мфенол"""’" с""с'1’ „ может храниться в холодильник.
' ,«неявно синего нвет.	wrpeTb w того .побы И*,
употреблением раствгр	()ри охлаЖлении Ds-Na и мо^4
растворить выпавшие " *аД°* аликвоту этого буфера и
После' этого	1Н„й концентрации 4-5%.
меркапптттанолло кшш	| ,92 М глицин-Трис. рН ,
< Ю-кратный	Ьсрут необходимую навеску глииив, ,
содержащий 1%	1осле приготовления полученный р^
добавляют Трис до pH »• _ половину буфера добавляют Ib-Na £
делят пополам, и "С1 з	буфер П0СЛе разведения в щ
конечной концентрации * даого буфера передней (верад
используют в качеет кат0д. Во вторую часть буфера m<Wr,
камеры, в которую пом	разведения в 10 раз используют.
НХбве зле^ого'буфера для задней (нижней) камеры, в «пору,
помешают анод.
6.	ТЕМЕД.
7.	Персульфат аммония.	состоящая из 10% укусви
8.	Раствор для фиксации	раствор используют для фиксаши
' *Г=Х
кислоты. Желательно сначала рас р P приготовлення расти
посте этого добавлять кислоту и воду. После пр
фильтруют и хранят при комнатной температуре.
Порядок проведения работы
он н
Перед проведением опыта следует решить, KaK>j?K0B с
полиакриламида предполагают использовать в работе. /V использ^
молекулярными массами в интервале 10-50 кДа рекорд. е |5-70*Да
15%-ный гель, для белков с молекулярными массами в hi бел*оВ '
рекомендуется использовать 10%-ный гель, наконец, 5.7в/гиЫ
молекулярной массой 60-200 кДа лучше использо
полиакриламидный гель.
36
Перед опытом собирают и г
«амеРу „
растворения добавляют необхо^^,^ •
Т4блина 2. Состав смеси мо„омеро1|	П*л"го
' леляюшего и коН|,ентриру1О11, д,мУ‘ммх ,Ь1Я
’•и.к,рофоре>» в одной камере „риб £-«й
icie на Л»» геля)	р I,ni*rotean
11риППЛ,’И‘₽"«иии
	I аздсляющии гель						^""'"тРи^'аий  w 1 >
Процент акриламида	 'компоненты геля	7	10	12,5	15	ТГ"	1о~	"б	“— 	
Раствор акриламида (30%-ный акриламид, 0,8%- ный МБА), мл	2,7	3,8	4~		ТмГ		7	-—
[Буфер разделяющего геля (1,5 М Трис- НС! pH 8,8, 0,4%- ный Ds-Na), мл	2,8	2,8	2,8~	ТГ"	2ДГ		"о	’	
Буфер концентрирую- щею юля (0,5 М Три HCI pH 6,8, 0. • ный Ds-Na), м	0	0	0	0	0	0	1,3
Вида, мл	5,8	4,7	3,8	2,8	1,7	0,9	2,8
Персульфат аммония, мг	10	10	10	10	10	10	5
[ТЕМЕД, мкл	10	10	10	10	10		10	5	-
Щолньшобъем, мл	11,3	11,3	11,3	11.3	П7з|	11,3 Т	5,1	-1
й гелсвУю камеру и аккуратно
Полученный раствор переносят яЮ1иеГ0 геля вод> -даЛ*
наслаивают воду. После полимеризаци ят смесь мономеров
На поверхность разделяющего г еля^ концентриРУю^ончания
полимеризации концентрирующею	<<гребенку». Посл .<карманы»
Указан в табл. 2) и сразу вставляют «г^овавшиеся «««Р*
полимеризации «гребенку» вынимаю ,
37
прибор для электрофореза, в
водой и собир*	содержащий Ds-Na
"««“-г SS1S S
"ТЛСnue помешают буфер-' „фореза. Сухие образцы раст
°ТД 1 .„омт пробы явления образцов. Растворы анализ,^ >
1П„окрюном буфере ДI	приГОтовления образцов в
^емен'И“ю1 ^Тнцентрания белка в пробах составу >
м Желательно, чтобы ко. ИСПОЛЬЗОванием в буфер д,я
мл. Непосредственно J	„ концентрации 4-5%. Пара^
.сбавляют меркаптолад с известными молекулярными м
„повят образны белк0"'М^ Реров используют а-лактальбумин (ц* *
(часто в качестве елк битор трипсина (20 кДа), карбоангидр^ ?
лизоцим (Н кДа). с- б чий сывороточный альбумин (БСА) (67 кд,
кДа). овальбумин (43 кДа),	нагревают на водяной бане ,
фосфорилазу b (' Д 90»с в течение 3-5 мин. Подготовлен,^
твердотельном термоста р, сразу использовать для проведе,,,
таким образом прооь‘ н „мо„оженном состоянии.
электрофореза или хран	Робразиа, содержащего от 0,5 до 3-5 мв
На гель наносят 5-30 мкл	индивидуадьные
белка. Желательно н	при Этом количество каждого в
стандарты или смесь белков ста др (
белков должно со- •	движением образцов по перемещению
(O^mhhTUhpZ
"^Se^ со ZxhXX. После этого гель отмывают водой.
помешают на 1 5-2 часа (можно на ночь) в краситель. Избыток красите.),
омывают помещая гель в дистиллированную воду, и нагревая ооразецдо
Го“ Затем определяют электрофоретическую подвижно™
исследуемого белка и белков-маркеров. Для этой цели измеряют рте»
пройденное анализируемыми белками от границы между концен1Т’иР>н*
и разделяющим гелями, и строят зависимость подвижности от логар
молекулярной массы. По калибровочному графику опрел •
молекулярную массу исследуемых белков.
и Г А*
1.	11рак1икум по биохимии (под редакцией С.Е. Северина
Соловьевой) Москва, Изд-во МГУ, с. 121-122, 1989.	oftN
2.	U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assem .
head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, 1970.	. In -fix
3.	J.M. Walker, SDS polyacrylamide gel electrophoresis ot proteins^ press
protein protocols handbook, 2nd Edition Ed. J.M. Walker, Huma
Inc. Totowa, NJ. p. 61-67, 2002.
Аналитическое изоэЛвЮп
вп0лиакриламидном гвЛв Рофо*УсиРОва
и* ^лкое
Прихпн» мегода
Иэоэлектофокусирование (И')Ф>
нитсснительного злектрофорста. Ес'и * яарИантов
сформирован устойчивый градиент pH ’« гель. Вд0Л(,"
к пеп'ч.шку тока, то белки под	К^>
„умещаться по гелю до тех пор „ок ™Ием ^РичСС1(0Г0 ?****•
величина pH будет равна их изоэлектД"* -Дос™п<ут такой J”*
будут концентрироваться (фокуснн/ и т°чке. Таки,, _ ласти, Где
изоэлектрической точке, то они поипбТ 30ну’ соответст»^ "°л
что электрическое поле заставляет их J	’арад и это ппияпУЮШУЮ Их
заряд будет равен нулю. Такой И^рнуться в облает? к Т0»<У.
амфотерное соединение вытесняет соР ЦССС Прив°ДИт к тому У*'1арныЙ
Для создания устойчивые то рическои точке.	класть,
амфотерных соединений, поХХ^ ИС"ОЛИУ^’ сложные смеси
изготовителями (амфолиты, фармалиты ССоВа °бозначасмых фир^СнИ
как правило, представляют собой ? РВалиты и Т-Д )- Эти соединен^
содержащие карбоксильные, фосфатные и стл'^ РИЛИЧН0Й
имеют относительно малую молекулярную, ^ ^"Ы АмФ°™ты обычно
малым поглощением в ультрафиолетов^ ( °°'800 ««^ают
оотадать высокой буферной емкостью вблизи св^-С™ С"еК7ра и дол*«“
Общая формула амфолитов может быть	Т°ЧКИ
"Ил'’|,~(CH2)«~N-(CH2),-N-Ch2
R 1	I
R	(CHj). R
N
R R
1..с R может быть представлено
(СН2)РО3Н2.
как -Н, (СН2).СООН, -(CH2).SOAH,
могут леж*ть в
Величины и’отле^ичеС^ш.Г^*н«^ПеЧИ^Н
ипкрвале от 2,5 до II и » димом диапазоне ₽ ^«ции
буферную емкость на всем	используемых Д-1Я	ся смесь
добавляю! к смеси мономеров, испо^^ , находи^ геля.
полиакриламидного геля. После п еделенных по всем	авленный
различных амфолитов, равномерно рас"Р«1 содержашую ра*
Один ит концов геля помешают в
39
,vucb натрия, растворы гистидина), и „
яствор щелочи	ьНо заряженный электрод). Другой У
догружают катод (o'Р	а1бавленной кислоты (фосфорна, "Ч,,
омешах" в Р„" Аспарагиновая кислота) и в эту камеру
. пззвминовая кисло - енный здсктрОд).рН электродных ра^Ч
а,юл (положитьно	,1ТОб„, „ катодном отделении рН 6^^,
„олбнрасп’ таким <мТ	(<КИСЛЫх» амфОлитов. а в анодном <пд’>
„ц,мек.тической тош ТО,|КИ самых «щелочных» амфолитов п"*
«(елочнес июэлектр лагающиеся поблизости от катода, прИо6.
^Товиях амфолтпы, Р	к аноду> а амфолиты, располагав
питательный шрял	т положительный заряд и дви.^'
'’^"'ХчАзь'ные моменты времени все амфолиты активно перемер
K3WAne гол X Движение (и связанный с ним электрический W) 6
в толше ,еЛ". " " пор пока каждый из амфолитов не достигнет
"^еХч^кАй точки. Как только это произойдет и амфолиты высзр^
на £7согласно своим изоэлектрическим точкам электрический
протекающий через гель, заметно уменьшится и будет обеспечу,
Р'	!а счет диффузных колебании амфолитов вблизи областей Их
изоэлектрических точек. Накопление амфолитов, обладающих одним и тем
же р!. в одной зоне приводит к созданию мощного буфера, способного
поддерживать pH, равный изоэлектрической точке этой группы амфолитов.
После того, как все амфолиты достигнут соответствующих областей на геле,
создается устойчивый градиент pH, крутизна, форма и стабильность
которого определяется распределением, концентрацией и диапазоном р|
используемых амфолитов, а также составом и концентрацией анолита н
католита. Если формирование градиента pH происходит в присутствии белю
или белок наносится на уже сформированный градиент pH, то молекулы
белка ведут себя гак же как молекулы амфолитов. Вследствие этого после
окончания процесса фокусирования белки концентрируются в виде очень
узких зон, положение которых определяется значением их изоэлектрической
точки.
Аналитическое изоэлектрофокусирование можно проводить в трубках
• капиллярах), заполненных полиакриламидным гелем, а также в пластинах
полиакриаламида, а также в агарозных гелях. 11ри изоэлектрофокусировании
^пользуются высокие напряжения (до 1QQQ в), поэтому особые требования
х е,л,я вляюня к ciporoMv выполнению правил техники безопасности Ш
Е~~~7 с .электроприбрр^н В начальные периоды времени, когда ток.
.. .. la*3*?111411 ПО гелю’ ос°бенно высок, происходит значительное выделение
принудите иное желательно использовать приборы, обеспечивают*
позволяет получил,аЖбС,,Ие ГвЛЯ’ Охлаждение уменьшает дифф}™*’
изоэлектрофокусипонан1>° ,Сг УЗКИе И четкие белковые зоны. Р
предварительно сФопм <И ^Л°К можно наносить на любую т0
PH в присутствии^ белков™ Градиента РН или формировать градир
электроэндоосмоса пани' идеальном случае (отсутствие я в-
р номерное распределение амфолитов по всеМ-
40
г
«кпиламил  30/о-ный
' л ^пснбисакриламида.
Гмфолиты широкого диапазона pH.
Оголит. 20 мМ раствор NaOH.
анолит. Ю мМ раствор Н3РО4.
Персульфат аммония.
v»o /о
4
о
8.
ТЕМ ЕД-
Набор растворов красителей с известными знач^
малахитовый зеленый (pl 3,05), метиленовый синий ы зТ" р1:
красный (pl 5,8) с концентрацией 0,05 или I мг/мл. ₽ ’ ' <онго
Раствор для фиксации
8.1. 3,5%-ный раствор НС1О4.
8.2. Раствор для фиксации и вымывания амфолинов 12%
трихлоруксусная кислота, 30% этанол, 4% сульфосалицилош
кислота. Раствор для отмывания от фиксирующего оаствопа 4П®/
этанол, 10% уксусная кислота.
9. Буфер для приготовления образцов: раствор концентрированных
амфолинов, разведенный в 10 раз водой, 20%-ным раствором сахарозы
или 6 М мочевиной.
Ю.Красители
Бесфоновый краситель 0,075%-ный Coomassie G250,
приготовленный на 3,5%-ном растворе НС1О4. (Coomassie G250
р 1 оря ют в 3,5%-ной хлорной кислоте и фильтруют через бумажный
фильтр).
Краситель для гелей, из которых предварительно были удалены
амфолины: 0,25% кумасси R250 на 10% уксусной кислоте и 30 о
этаноле.
Как уже отмечалось, изоэлсктрофокусирование можно	и
'РУбках (капиллярах), а также в пластинах гелей (агаро
11,1 'Акриламидном). Ниже описан способ пРИГОТ<^^хокусирован>и
',0 ,иакриламидноГО геля (11,5%) и последующего изоэле^^7ютячейку для
’’Риборе MiniProtein фирмы BioRad. Собирают и геРм мономеров для
’МимеРизации полиакриламидных гелей. Готовят ированИе либо в
*1ИМсРИзации гелей (см. табл. 3). Можно проводить первом случае
с^УГСТВии сахарозы, либо в присутствии м0‘\евИ х зон. Во втором
Р°эа препятствует чрезмерной диффУзии е
41
г
хаоти
^ектроФ^'"--Гда еше и
мочевины	...
нзоэлекзрнческс - в гель не является обязательным
добавление красителе *
добавлении кра<
фокусирования. _
в виде очень узких
молекулярной массой
указанном в
аммония и после ei о
v-гствии мочевины) все белки приобрел	I
случае (в	что позволят исключить влияние фа1ст * U
^веского	подвИЖНОСТЬ. Одновременно с утИм >
е,арофоретич«кУ»	„ неИоннных детергентов) п
"у каждению белков вблизи их изоэлещрич^^Ч
° У  > гель не является обязательным. ОдНа X
01ситслей удается визуально следить м
,1 силу своего маленького размера красители фокуси X
-У ЗОН много быстрее, чем обладающие
„виой белки. Смешивают компоненты в coon, X
таблице 3. добавляют необходимую навеску >
растворения добавляют ТЕМ ЕД.	1
Т.ЛП.ШЯ 3 Состав смеси мономеров, используемых для шмимерт,
,екй мя изоэлектрофокусирования в присутствии мочевины*
расчете на 2 геля).
Компоненты	Гель для фокусирования с красителями	Гель для	" фокусирования в отсутствие красителей
Раствор акриламида (30%- ный акриламид, 0,8%-ный метиленбисакриламид), мл	3,75	3,75
Амфолины, мл	1,00	0,75 амфолины широкого диапазона pH, 0,25 амфолины щелочного диапазона pH
Коню красный, мл	0,0625	0
Метиленовым < инии •	0,0625	0
Малахитовый .с )сныи. мл	0,0625	0	'
Мочевина, г		4,33	4,33	
Персульфат аммония, мг	12	12		
11М1.Д, мкл 1 1 '	'		 		12	12	-
Вола	В мерной пробирке довести до объема 10 мл	В мерной пробирке довести до объема Ю мл 	-
11ОЛНЫЙ объем, мл	Цо	10
возрастает no-nnuv Мочевииы ск°рость полимеризации акриламида сильно
после добавления \ PdU Н°Р мономеРов заливают в гелевую ячейку срез)
Добавления всех компонентов. Сразу после заполнения ячейки в
42
„ономомеров вставляют «гребенку» д.,
^nbic будут вноситься образцы белков. Пос , ^ДаНИЯ «Аманов»
кот«Рь , гелем устанавливают в приб ' ПолимерИ)ации , “* в
Г0Тм^чНОСТЬ- В ВеРХНЮЮ Камеру Приб°Ра «носяТ?ЛЬН0 "Ронср*
<Н, в нижнюю камеру7 раств°Р Щелочи. СледуJ^80” ^Ьной
5>, что при этом в верхней камере должен находи^Ь"? ВДима^
катод (')•	,	' ,,а 8 нижней
' в качестве белков-маркеров можно использовать к -
.ьбтмин (Pl 4’6)> овальбумин (pl 4,6), каталазу (р| 5 7" Г‘,ИИ СЬ1в«Роточный
7 0) РНКазу (pl 7.8), цитохром С (pl 10,0), лизоцим (р| |^°Г»°бин <₽’ 6’8’
метода окраски на гель следует наносить 1-5 мк* гомо ен»ГИ^М<К™
белка при высокочувствительном методе окраски и 10-15 «^ Раад>в
бесфоновом окрашивании.	мкг белка при
За процессом фокусирования следят по концентрированию красителей
и по тому, как при постоянном напряжении уменьшается сиза тока S
фокусирование начинают при напряжении 100-200 в и силе тока ->0 мА П
мерс фокусирования напряжение повышают до 300-500 в при силе тока 2 3
мА. После окончания фокусирования от геля отрезают узкую полоску
шириной 1-1,5 см. Эту полоску геля помещают в специальный резак
состоящий из равномерно расположенных лезвий безопасной бритвь/
Полоски геля шириной 2-4 мм помещают в отдельные пробирки с пробками
и заливают 2 -3 мл предварительно прокипяченной дистиллированной воды.
Эти образцы оставляют на ночь для полной элюции амфолитов.
Существует как минимум два метода окраски гелей, полученных после
изоэлектрофокусирования. В первом случае гели фиксируют 0,5 - I час в
растворе 3,5% хлорной кислоты (раствор 8.1) и окрашивают коллоидным
раствором Кумасси G250, приготовленным на растворе хлорной кислоты
(раствор 10.1). В указанных условиях Coomassie G250 не связывается с
амфолитами (частично остающимися в геле), но образует прочные
комплексы с белком. Этот метод быстр, однако не отличается высокой
чувствительностью. После окрашивания в течение 2-3 часов (можно в
течение ночи) избыток красителя отмывают 3,5% раствором хлорной
кислоты и хранят в этом растворе. Полученный гель фотографируют или
сканируют.	8 ~
Во втором случае гель помещают в раствор для фиксации (рас™» р
11а ночь. В этом случае происходит не только фиксация Ot lkOB те1ем
/.^исходит удаление амфолинов, способных связыватьсяс~	КИСЛоту
и°Сле Фиксации гели отмывают раствором, содеРжаЩИ^^0'(ра'СГвор Ю.2).
Такой°Л (раств°Р 8-2> и окрашивают раствором Кумасси R--большей
Чувеч Метод окраски более трудоемок, од . ого окрашивания.
автельностью, чем описанный выше метод е,Ф и
Листа Меряют Рн ПР°6’ полученных при • от длины геля.
ПОл ялированн°й водой, и строят зависимость eeJ	можно определить
И30ЭУлЧИВ Так^ кривую и зная положение белков на геле,
ектРическую точку исследуемого белка.
43
ПОЛОСОК ГСЛ«
__________________ ю'.м . У**» »И» "РИ ЛЛИ1
,..КЬ	" покинуть ТОНЫ, соответствуй *4
К«к о™сЧЙ*и "с М‘2мепин’. используемые т,и х>
„.„•юна"" ’ i ..очке Н с0* „крилвмил обычно бывает
*"?,скЧ"’че<	.„ Н«»Р"мср. _„ц киелмм. Следствием этого ,	“
"“'.ржа’ пр"” честна»"’	,с такого процесса, при «пором „а
^шымн скЧ*""л‘ЧКМ'ий от •и«Да к каТ°ЛУ П<Л Г0К "°лы
^****'' £ты- н«"Р|Н'1’С"^ градиент pH от анода к
* vaen« т<* еформиро"-’""'	0 расширяться юна с кис,Мч
,,^мс«>«"- процесса мои* удочными значениями рН, р
Вследст»*	сокращаться »	перемещения сформировав,
«учениями яектрозндоосмосе скор	переМешения белков к СШ(
сильном ’л»^ ет превышав с	заметнь|м А1,
.радиента Р" Очкам. Это можс	и1ел0ЧНЬ1МИ изоэлектрическим,
изоздектриче»к ,кулярными мас ’ ическис точки «кислых» беги»,
большими м	этого изоэл Ркие точки ((Шелочных» белков. Д1я
ro4WMH;Jrc» точнее, чем "аоале^ желательн0 использовать в работ,
определяются ратить эти явлен	рование в крупнопористых
т,ор”' 
1.	П. Ригетт ,	Мир, 1986.	гических макромолекул
«.лчгчение, Москва, г»	биологических к
применен	Исследование 0	радиоактивными
2.	Л.А. Остер ’ ием иммунофорезом	Р
электрофокусированием,
элск и *	Наука, 1983.	гР Северина и I.A
методами, Москва, п j	редакцией C.t. VCB и
3.	практикум ™ И“ о МГУ, с. 98 - 101,1989.
I	Соловьевой), Москва, гид
1
44
в
иссл^о^ичеС((и Ч
^8анияЛИе меТЛл
HM-nWcc время	e/JKOB flb|
Широко ие.юльзуюп-я для	'"’'"Ые „
Н"" белков^ Ц„ ,П)М 2е''11’. <>чИ(
цепттами ионообменной Vn ,Слс ппНкг *и и ИСГ1 °*
\ yvJH'l рлфнн II
...... .................... .. . §*«
- OHPKVK0M руководстве	По	J*'*J*J
отнеся свойств пазпи	Лс^*атся ’
; Н'ХННКИ П|хтведения работ пп'’^ Хроматогпа2К°
наиот, процеду ^аФическиу	»
>РРегеиерацИИиС^
Ихра^и4’^
1	Метод гель-фильтрации
Принцип метода
Метод гель-фильтрации (гель-хроматографии) основан «.
! индивидуального белка или смеси белков чеоез «пп пр°П5'скаии"
i колонку, заполненную очень мелкими сферическими чТсгГцаммди^
I этих частиц может составлять 2-I00 мкм), имеющими норне™ cXZ
I с помощью специальных методов можно получать сферические частицы с
; различным диаметром пор. Разработаны методы сортировки частиц как по
I размеру, так и по диаметру пор. Если на такую колонку нанести смесь
I глобулярных белков различной молекулярной массы, то крупные по размеру
белки из-за своего размера не смогут «входить» внутрь гранул и будут
i дв, ся по колонке между гранулами сорбента. Малые молекулы белка
; см входить» внутрь частиц и поэтому, попадая внутрь гранул, будут
। ос . ься в колонке дольше, чем крупные белки, быстро покидающие
; г по самому короткому пути. Для средних по размеру глобул белка
устанавливаться определенное равновесие между молекулами,
; ь> ящими внутрь гранул, и молекулами, остающимися вне гранул
I носи;ия. Таким образом, процесс гель-фильтрации можно <’ра^™ца
использованием сита для разделения крупных и мелких молеку ,гия
состоит только в том, что при использовании си™ ^хти сита. В го
просыпаются мелкие частицы, а крупные остаются на |eKVlJipHOe сито
вРемя как при гель-фильтрации через такое н СИте дольше
"проваливаются» крупные частицы, а мелкие	после пропускания
и только спустя определенное время, или то
‘определенного объема элюента, покидают зерна »
45
1
.Льняного прчскяния процесса гель-фильтпа„И1,
Л '" кольт мжных греб<'"‘""'И Во-первых, иосите^Ч
выполнение 1)Ы 6ы)1, достаточно инертными „ „	г?'
ф,,тиранн" л	«немыми белками, ho требование оче'и
в,я":Х S...........' •™ел’смме м7,,,,"с",м fw сл^:>
к" то "««'«’ пропел* гель-фильтрации мы 6MeM Ч ,
н'4 * *	\ „о ппинпнпам алсорбниониой хроматографии и ,₽°Х,
’ючеч”’ о размере (и форме) исследуемых частиц.
с,‘тезы,о. чтобы частицы матрицы имели 0 ’
™чппе’ьно сферическую форму и были бы одинакового
мммяо ртеленн. будет гем лучше, чем меньше размер части,,
что К ’ТОМ случае процесс распределения исследуемого Z?1
„с*п буфером снаружи от геля (подвижная фата) и буфером внутри
н,кителя (неподвижная фаза) будет повторяться большее количество а?’
вследствие этого эффективность разделения заметно повысится. В-тр^'*
должен быть сведен к минимуму разброс размеров пор. Очевидно, что
меньше разница в размере пор, тем более успешным и точным буЛет
разделение исследуемых веществ. В-четвертых, используемые носители
должны иметь высокую механическую прочность и не подвергаться
деформации в ходе заполнения колонки или в процессе проведения
хроматографии. Наконец, в-пятых, желательно использовать такие носители
которые устойчивы при хранении и не разрушаются под действие
агрессивных химических соединений или бактерий.
В настоящее время описано огромное количество различных
носителей для гель-фильтрации. Они отличаются по своей природе
(декстрановые гели, гели на основе агарозы или полиакриламида,
смешанные гели на основе дестранов и полиакриламидов, пористые
стеклянные шарики и т.д.), по размеру пор и размеру частиц, по
механической прочности (сжимаемые и не сжимаемые гели), по своем
устойчивости к повышенной температуре или химическим соединениям.
Прежде чем приступать к экспериментальной работе, необходимо
|роана.1И1ировать свойства и выбрать наиболее подходящий носитель. Дм
ли! о необходимо обратиться к справочникам (например, А.А Лурье
Хроматографические материалы, Москва, Химия, 1978), ознакомиться с
информацией, предоставляемой фирмой-изготовителем данного сорбента,
и ни наконец, на странице фирмы-изготовителя носителя в Internet получить
"ьс!ы на следующие вопросы:
’ аков предел эксклюзии (предел исключения) данного сорбента
‘иными словами, начиная с какого размера или с какой молекулярно*
2	массы белки не CMoryi «входить» внутрь зерна носи геля).
-> Кяи*И Kdr °'° ,)а,мс1)а можно разделять на данном носителе.
»в ооьсм набухания данного носителя, в каких условиях и *аК
4 Каков п-10 ЩСС *ВЛЯ1Ь	л ого носи геля.
размепои час1иц носителя, насколько гомогенно распределен
размеров частиц и размеров пор данного носителя.
46
« Какое максимальное Гм
данный носитель. Др°Стати
6 Какова оптимальная ск	Чес*ос
7.' каковы условия экс„л	л
носителя.	Уатации *
Все эти сведения '
.|1(М1И)ЧНИ«’» ИЛИ	М<>Ж||0 , "т
хГ,>м.ч1'’' > - .	. СМа*<Ии,
. н-мв >СИ   вопросы, М(№1,	.. п‘
*---	'’'НО Пп,. *'п*() ,
-.... ,р^:^
Мо*ет ।
К(‘НСе?НН°М Нос
.«ль-филырации испол^	I/'**'"»'**
;исиием диамстр/высота, состава,* £мед)гр
1 ' , показывают, что при размере часто 1/10 - 1^** w,’~-
;„й в I М удается успешно разделить 5“бТИ™’2<М«
. ) •* можно примерно оценить размер I***»!*
Стелить объем сорбента, необходимого L, 1У'
" работе предполагают использовать XTLl""
‘Lgb его набухания и взвешивают коли2^,п
-1г;мсрн0 на 10-20"/» превосходит рассчитан!
' 'мчать в оуферном растворе, в котором X Гыь «^.кп
I Сромзтографин. Время набухания и условия Х'’5'"'" ------------
j .„тературе- Выбранную колонку устанавливают с ‘
I закрывают нижнюю часть колонки краном или спелым
I ка1оику вносят небольшой объем (5-10 мл) буфера для XL
I дно колонки помещают фильтр, размер которого соответсгатп '
I колонки, и из-под фильтра удаляют пузырьки воздуха. Проедят
____ НПО ГЫ ППЛСТЯТИЧРСКЛП ПЯйТРипр	___..
ситсля-
* эти
'«ле
***»
_ ’ »/20?т *°**”n< с
...... е°^чеГк
Мкм Иа „ ***
- Исха °***e
^ния^н^
• ои Илонки
К0ЛИЧеетво ИХ" °ПРСДел^
Ю Ьв_ *^4 ГОТорое
введение
^-ЬВО 7^
___	1 ^имом. В
хРоматографии. На
’ диаметру
 предельное гидростатическое давление выдерживает данный
, зависимости от этого устанавливают положение шланга на вызоле" *
I колонки. Открывают кран (или снимают зажим) и в колонку вносят
I достаточно густую суспензию носителя. Наблюдают, как идет постепенное
I заполнение колонки, и при этом постоянно подливают в колонку новую
। порцию i .спензии сорбента. Не следует допускать такого положения, когда
I предыду г ая порция сорбента уже плотно упакуется внутри колонки и над
I сорбен? юразуется прозрачный слой буфера уравновешивания. После
I заполнении колонки на вершину геля кладут диск фильтровальной бумаги,
защищающий верхний слой носителя от механических повреждений
I вводят адаптер, так чтобы между нижним краем(адаптера и
। оспвшюсь зазора. Колонку промывают 2-3 нл.игеЛя и
I Уравновешивания при скорости тока, оптимальной для Д'
1 Энного |ипа колонки.
I
 ^.ивь, и оборудование:
।	*• Хроматографическая установка, СОСТО^и1е1О измерять|10ГЛОШ
| насоса, проточного денситометра,|10^ фракций.
I при 26Q и 280 нм, самописца и колле
47
2.	Хроматографический носи гель (в данном случае .
Сефадекс (i 75).	°*Но Ис
3.	Буфер для хроматографии. Можно использовать
буферы. В качестве примера можно использовать P$nНМе n° п
буфер. pH 7.O-7.5. содержащий 100-150 мМ NaCI ’ ' Фос'^%
4.	I <упбой деке гран с молекулярной массой более 2-J О6
5.	Набор белков-стандартов молекулярных масс
величинами радиусов Стокса (приведены н С Из»ес7
сывороточный альбумин (68 кДа, 33 Л), овальбумин'^?**4 б^
химотрипсиноген (25 кДа, 22,5 Л), рибонуклеаза ^а’2б7?й
лизоцим (14,1 кДа, 15,6 А).	' 3,7 *Да,
ДЛЯ
Порядок проведения работы
Колонку диаметром 1,2-1,4 см и длиной 50-60 см закрепу
вертикально в штативе и заполняют хроматографическим носителем так
это было описано выше. Желательно проводить наполнение коло^
носителем, предварительно уравновешенным тем буфером, который буДс~
использоваться при хроматографии. Заполненную колонку подключа^ ..
перистальтическому насосу и уравновешивают 2-3 объемами буфера при
скорости тока, допустимой для данного носителя. После того, как колонка
подготовлена к работе, с помощью пипетки удаляют слой буфера над
носителем. При этом желательно не нарушать верхний слой носителя. На
колонку наносят образец голубого декстрана (2 мг/мл) объемом 0,5 мл и
дают впитаться образцу в гель. На носитель аккуратно наслаивают 2-3 мл
буфера элюции, колонку закрывают и подключают к перистальтическом}
насосу. При использовании колонок с адаптерами процесс нанесения сильно
упрощается и состоит в том, что исследуемый образец через
перистальтический насос напрямую наносится на колонку. При
использовании колонок с адаптерами и перистальтического насоса
становится возможным проведение восходящей хроматографии. В этом
случае образцы и буфер подаются не сверху вниз, а снизу вверх. В ряде
случаев это позволяет улучшить качество разделения.
С корость элюции должна быть заранее определена на основе данных
каждого конкретного носителя и колонки соответствующего сечения,
при этом желательно избегать как максимальных, так и минимальных
скорое!ей элюции. Сразу после подключения насоса начинают собирать
фракции с помощью коллектора фракций. Как уже отмечалось,
эффективность разделения зависит от качества заполнения колонки
носителем и от объема наносимого образца, который не должен превышать
о от объема колонки. Из-за своего большого размера голубой декстран
гожег входить в поры носителя и перемещается между гранулами
. , • Т С1И K()JI0HKa заполнена качественно, то зона голубого декстрана
колоики°Рц^г°КРаШе*|1НОГО диска’ Равномерно перемещающегося по Д-1Ине
ые дефекты нанесения образца или заполнения колон*
4й
искажению формы 10Ны
Х’Т .скстран* соотвстст.уег TnR Ж» о *
" >'"«,иному объему буфер., н.ход, * ""'м-м/
1 '*,>"•' того, как через колонку	"не грл.’^лжн,. **•*.
• SS.
xuhlil образец. При НОМ Н ним,. М°*»Ю	’ **^4 (п.
с наибольшей молекулярной,,С 0,,Мгй Ивм^01** сг1г ''п 2(к
У-ЯР-Н* массой'| ”a
;...^генынення молегуляр^хХ
(,к - дольше задерживается на кодо’
ши» белок-епндарт. Нанесение к Жл "	"й ***«
'<\ho "РйМДИТЬ ” т,’т мом=нт, когда nZ? ^Z^"^
‘v ’кгоре "l’1' ЭТОМ "собхоДимо записывав ЛН7 «** n
‘"1L <«,чнее- Н°МСР Фракции’ на котопТМеИТ
< .него образца). Концентрация наносимых нг> к ПР°НСХо^ „ "°**"
^„стаительноети детектора, спектральных
^емого белка. Обычно используемая
«г но может быть уменьшена до 0,5-1,0 Мг/мл	’ с«там^
* чжочуветвительных детекторов или белков 1	бо^
„оглашением при 280 нм. Если молекулярная масса hcc^’°U0*X
„звестиа. то его следует наносить на колонку в посл^^?""*0 **** *
„осле того как с колонки будет проэлюирован послед™^0^ W
минимальной молекулярной массой.	и оелок-маркер с
После окончания хроматографии определяют объем
исследуемых белков и для каждого белка рассчитывают велими?ЛЮЦИИ кех
Kav= (Ve-V0)/(VrV0),
где Ve - объем элюции данного белка, Vo - объем элюции такого
декстрана, V, - общин объем колонки. Строят калибровочную кпИ7ую
зависимости Kav от логарифма молекулярной массы белков-стандартов
Обычно эта зависимость имеет линейный характер. Зная объем элюции
исследуемого белка, и имея калибровочный график, можно определить
кажущуюся молекулярную массу исследуемого белка. Такой подход
справедли юлько в том случае, если все белки-стандарты и исследуемый
белок им одинаковую или сходную форму.
случае, если форма белков-стандартов и исследуемого белка
сильно отличаются друг от друга, то такой способ определения
>| ной массы может привести к ошибочным результатам. В связи с
410 зачастую форма исследуемого белка остается ней wet ней
’Р^ильнес использовать данные гель-фильтрации не для определения
°-1ек>лярной массы, а для определения так называемого радиуса <uT0Kt'a
бё?. "араметР отражает хроматографическое поведение i И1,^геги^Х1\ w
асим* сФерическ°й формы с радиусом, равным радиусу
•ЖачиМ1р1РИ ,,,Ь1Х ,1алочкообРазных (фибриллярных) белко^р^^^
массы1’г"° больше» чем для глобулярных белков ,aKl Ст0'КСа для
Начала строят зависимость (-Log(Kgv))0” от P‘vlMVta
49
мои имея такой калибровочный графИк
белков-е^дарт в.	белка, можно определить * %
величину д>	диУс Q*'
этого белка.
, „ д. Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых киСЛ01 м
, п^Хнкум' по биохимии (пол редакцией С.Е. Се8ер "
2. Ионообменная хроматография
Принцип метода
Метод ионообменной хроматографии позволяет разделять бе^
другие биологические молекулы по их заряду. В качестве носителей11 '
ионообменной хроматографии белков используют особым обра*^’
обработанные целлюлозы, декстрановые гели (Сефадексы), ага *
(обычные или «сшитые» Сефарозы), полиакриламидные гели (Trysacryl g-
Rex), или синтетические носители (Monobeads, Source). Все эти носите^
поставляются либо в виде мелких частиц неправильной формы (мн0Г1^
сорта ионообменных целлюлоз), либо в виде сферических частиц
определенного размера (ионообменные сефадексы, сефарозы,
полиакриламидные гели, большинство синтетических гелей). Используемые
носители обладают высокой пористостью и гидрофильностью. Гидрофобные
ионобменные носители, получаемые путем сополимеризации стирола и
дивинилбензола (такие как Dowcx, Amberlite и др.), широко используемые
для разделения низкомолекулярных соединений, неприемлемы щ
разделения белков из-за того, что белки прочно и зачастую необратимо
сорбируются на гидрофобной матрице. Перечисленные инертные
гидрофильные носи I ели подвергают химической модификации, в ходе
которой к матрице присоединяется ионообменная группа. Примеры таких
групп приведены в табл.4. Как видно из таблицы 4, в случае
аниоонобмеиников иммобилизованная группа в определенных интервалах
си/ГМ< /, и ,1^С1И положительный заряд, который компенсируется за счет
имм(уГш° оомениваи)щихся анионов, а в случае катионообменников
значениях ,пиаННаЯ *^ппа несет отрицательный заряд при определенных
катионов Рц ко,орь|И компенсируется за счет свободно обменивающих^
нонообменникиНЯ1 т ра*личать так называемые сильные и слабые
(например ЛЧлч ,>Н|сциональные группы слабых ионообменников
диапазоне pH и И *И КМ’носители) заряжены в сравнительно У,коМ
а*>не pH. Например, эффективное использование КМ-носн^и
50
,0*н» прИ  а Эффскти>ное
^:„опРиРн<9.
4. Некоторые ФункцИом
f>lH ..1 для ионообменной ,|>,е
сор6*'1 ческих макромолекул.	°Мн,°»
Исг,°ЛИ01.
* ДэА.
гРУпцм
•Фии 2 Исг,<Мьп,..
,бм.НКНК" II ИХ ч"" .llC н английские |”“\,,1.1ечения			
(И ’ *"		 1Гнламиноэтил- у;-"1™		———		И,"'Р>Пп, Н °~с'Н1-СНг-х‘/с'НгСН, 	~S'H2ch3 ~ _ 	С2н«	3
Че^,,НЬ1Й (Ч9ДЭ) аминоэ«л (ЧЭАЭ)	
^ствертичнь’й аммоний (ЧА) (Q)	
Катнонообменники и Их русские и английские обозначения	 'Карбоксймётил- (КМ) (СМ)		Функциональная группа -О-СН2-С00’ -О-СН2-СНОН<Н2-О-СНг-СНгСН^б<	
Сульфопропил- (СП) (SP)		
1 Метиле) льфонат- (С) (§)		-O-CHz-CHOH-CHz-O-CHz-CHOH-CHrSO,
Си гьные ионообменники могут быть использованы в более широком
pH, например, рабочий pH для современных Q- и S-носигелей
иапазоне 3-11. Важным параметром для ионообменных носителей
иля \ емкость. Этот параметр отражает количество ионо1енных групп
на мл (или г) носителя. Очевидно, что чем больше емкость носи геля,
ьшее количество исследуемых молекул может быть сорбирована >'
Приступая к проведению ионообменной хР°ма™^„^вышает
Убедиться, что количество наносимого на колонку раите1ьная часть
емкос|и используемого сорбента. В противном случае ителем. Следует
^^лизируемого образца просто не будет связыа^|Я не всегда является
ММетить, что большая удельная емкость	й удельной емкости
1)0•|ыним достоинством носителя. При чрезмерно
51
„1Н другие макромолекулы образуют с
носителя белки •' и	•	которые очень труДНо X
многпоточечные	омывается что сорбенты с очен^ <
невозможно. По	ктич«ки необратимо саязыаать Исс'X
еМК'7пнЫе единения. Прежде чем приступать к npW
ХХЗЛжелательн0 т'на
водрлы:	нонообмеиник (сильный или слабый) ж
' "Г кз а матрица ионообменника является прелпо^ Ч
исполиомть и к«каи r t	’м^
"«ченТрН следует проводить сорбцию исследу
на носителе. При ответе^^-ХГтХ^
эзектоический заряд, противоположный заряду исследуемого
Например. белки будут сорбироваться на катионообменнике в том My>
если значение pH используемого буфера меньше изоэлектрической то,,,
белка, и. наоборот, белки будут сорбироваться на анионообменнике при
больших изоэлектрической точки белка. В идеале желательно иметь так
называемые кривые титрования исследуемого оелка, т.е. зависимость
величины электрического заряда белка от pl I. К сожалению, при работе с
неизвестными белками или со сложными смесями белков это пожелание
оказывается трудно выполнимым.
3.	При какой ионной силе следует проводить сорбцию исследуемого
образца на носителе. При ионообменной хроматографии прочность сорбции
определяется не только значениями pH, но и величиной ионной силы. Если
исследуемый образец содержит большие количества соли, то даже при
оптимальных значениях pH низкомолекулярные катионы и анионы образца
эффективно конкурируют с белком за связывание с носителем, и поэтому
оелок не будет связываться с носителем. По этой причине pH и ионная сила
оораята оелка, наносимого на колонку up пл
соответствуй.,них параметров буферного раствооа кот"Ь' °1ЛНЧатЪСЯ ОТ
колонка. Для выполнения этого требования Я1°Р ТОрым Уравновешена
дназизуюз против буфера уравновешивания лХИР>еМЫН °бра3еЦ 1Нб°
образом, чтобы электропроводность обратич -РаЗВОДЯТ водой
элек 1 ропроводностью буфера уравновешивания	со,,оставимой с
4.	Каким образом можно элюиоовап
белки? Существуют два принципиально разлю1н^°ВДВШИеСЯ На носнтеле
первом случае десорбция белка достигается J* СПО€оба элюции. В
С|>,,снчатого) повышения концентрации соли W СЧСТ плавного (или
осуществляется за счет плавного (или ступенчатогТ4 СЛуЧае десоР6ция
этом изменение pll может быть направлено как И,Менен”* pH. При
так и на изменение заряда носителя. При элюции ^Нение 3aPW белка,
дует помнить о том, что белки имеют довольно УеМ Изменения pH
УЗКии оптимум pH.
52
I	от оптимальных значений pH м
tJX< „енатураиии белка и его необратим"Ри"°лип к
оптимальные объемы наносимого на
5	К«ентар"). иенолмусмого для ,л '"«Pania „	*»*.
; ....... при ионообменной хроматофД *** • «Й?***
, , ,, 'Р' „ „opaHia. Ьолсс того, рекомендустся ... 0гРа"Й2 „"7'^
;	...ле Р1,с1"орь1 бслв* Ъо позволяет
, л>,е изменение pH при сорбции белка Ре'101"Ра'”ггь «2, кн"
град,,снта позволяет добиться разделен^™' Испад^
^аами. однако, в этом случае происходит с "^0’ “ ««X
П ользовании крутого градиента все белки элюноХ	По"
, узких пиков. Однако в этом случае трудно ’ Малых об**« ,
Деления белков, обладающих сходными свойстммиТ <ачест*"нпго
'^обменной хроматографии используют градие™ npa“™- "Р"
оставляют 6-8 объемов занятых сорбентом хотя в J °^M“ Вдо₽“х
,iv4ae возможны изменения как объемов градиента ДОМ кон,Рет"о«
6.	Каковы оптимальные скорости нанесения " Спосооа ’л|°шт
ионообменной хроматографии? В отличие от геть^иТ"" °6pa3UOB ',ри
ионного обмена протекают очень быстро. По этой ппииии» Про“ессы
ионообменных носителях скорость элюции может с^тавлятадоТХ’
(для пересчета этой линейной скорости в объемную скорость «азХ’ю
величину линеинои скорости следует умножить на сечение колонюТсмН
Таким образом, для колонки сечением 2 см2, скорость элюции может
составить 300 мл/час. Следует подчеркнуть, что оптимальные скорости
элюции для разных сорбенюв могут довольно сильно отличаться и перед
проведением эксперимента необходимо ознакомиться с технической
документацией, предоставляемой фирмой-производителем.
7.	Каковы условия регенерации и хранения используемых сорбентов.’
От гы на эти вопросы можно получить из технической документации,
пр 'оставляемой фирмой-производителем, или из справочной литературы.
Только получив ясные ответы на поставленные вопросы, можно
нонетупать к выполнению опытов по ионообменной хроматографии.
Для ионообменной хроматографии используют колонки с
соотношением диаметр/высота, равным 1/4 - 1/6. Значительная часть
современных ионообменных носителей готова к упогреоленню и
поставляется в виде суспензии, содержащей набор консерванюв ( о ,
MonoS, Source, Q-Sepharose, SP-Sepharose). Ионообменные
поставляются в виде сухих препаратов, ^°Р“е	Д^шнваюи.
Должны быть уравновешены исходным оуф	ионообменных
Следует особо подчеркнуть, что сте"е”ь д;50) сильн0 ивисиг от
сефадексов (особенно сефадексов марок -	указанных носителей
ионной силы. Поэтому перед ис,|О'|Ь,.°ваН^ра|..рОй (например, А.А
необходимо ознакомиться со справочном	или технической
Лурье, Хроматографические ма1ериЮ’“й . ’ тавШИком.
документацией, предоставляемой фирмг
53
Таблица 5. Свойства некоторых ионообменников, преднц
колоночной хроматографии	а,,ецц
Ионообменные целлюлозы


фирман сорт Whatman	 '~СмТТ	Активная rpy”Iia	
				 Порошок
	Карбоьхимстил			Новый волокнистый сорт 22“—\
			__ -			улучшенный НОВЫЙ волокнистый^-^ ;
! “сШГ _	«	 «	—	— [У^крозернистый порошок~2222^ 			ыябухший мелкозернистыйпХ2>^
СМ32		 Г СМ52	«		1 отовый Kpaeorejiaojo^i^LJ^	 	Порошок	'Л
‘ Л5ЁП DE22	Диэтиламиноэтил_ «					ЁЬшлД волокнистый сорт	 	у^^ыйновыи волокнистый сорт^
- S m ml rj  "i	«	 «					“ Микрозернистый порошок ——--д—б^бетйй.микрозернистый njgjjjg-
DE52	«		
Bio-Rad			Волокнистые сорта	
lellex | SE P CM	Сульфонил Фосфо Карбоксиметил	Аналитически чистая целлюлоза	 	Аналитически чистая целлюлоза	 Аналитически чистая целлюлоза	 	 a.nnuTuuprwH чистая целлюлоза
D Sena Qervacel	Диэтиламиноэтил	Волокнистые сорта	
SE	Сульфоэтил	Аналитически чистая целлюлоза	
P	Фосфо	Аналитически чистая целлюлоза	
CM	>	1	 Карбоксиметил	Аналитически чистая целлюлоза	
DEAE-SN		I	 Диэтиламиноэтил	Аналитически чистая целлюлоза малая обменная 	емкость	
DEAE-SS	«	Авали 1ичсски чистая целлюлоза средняя обменная емкость
DEAE-SH	«	Аналитически чистая целлюлоза высокая обменная емкость
Ионообменные сефадексы		
Pharmacia	“Т"	
CM C25	Карбо кси метил	Приготовлен на основе Сефадекса G25
CM C50	1 _«		Приготовлен на основе Сефадекса G50
SE C25	1 ульфоэгил	Приготовлен на основе Сефадекса G25
SE C50	«	Приготовлен на основе Сефадекса G50
DEAE A25	Ди л илам и поэт ил		Приготовлен на основе Сефадекса G25
DEAE A50	«	Приготовлен на основе Сефадекса С. SO
QAE A25	Четвертичный амин	Приготовлен на основе Сефадекса G25
QAE A50	<<		Приготовлен на основе Сефадекса G50
Ионообменные целлюлозы поставляются в двух основных формах.
Полностью готовые к работе носители (например, Whatman СМ52 или
Whatman DE52) представляют собой влажные предварительно набухшие
микрогранулярные сорта ионообменных целлюлоз, специально
54
,.ачснные для колоночной
,Х' „релваритсльной обраб(п хРома„„
'W, '-м приблизительного Ра ' ^'Нп ,,/S |.
",ти сорта ««люлош Мп'Р" ч»стИц
1’Р" использовании Пи* и₽*иРУк><, *
>"",y4TenHC микро)ранулярным с,"'*^11Им'ч"'ич?
„чым сортам, лишенным ме„ки^"м или ,><*>£ **
<Н> волокнистых сортов И0||,)()б'"С'И1(. И '* Н»,
„рафии нежелательно. Перед и б‘Н|,ь,х '
сор*'" пеялюлоз следует пр0^10,<'>
Двойной литературы степень нвбХ?*^
•;; «ьсм колонки, который предноХ""’ланв^^и
Золимое количество сухого препарЛ’**" исЛо.1ь^”
подготовки сорбента неизбежны потери^
±шс сухого сорбента, чем то количХ^*»^'.^
Мнения колонки. Взвешивают необходим^’ ксггоРое
*"1Люлозы и заливают 5-10 кратным обСо’"^^^ *
^люлоза набухнет (обычно несколько часов) 2^ После
роц«М* Циклизации, целью которой
Примесей, оставшихся после модификации цел.1а 10 ^ен*
"едких частиц, мешающих проведению колоний" УДЗД* »**
Катионообменники сначала обрабатывают 0 5 М HCI ХрочатоП»Ф«»
начала обрабатывают 0,5 М NaOH или 0,5 М КОН B’rfZ?****
плотной набухшей массе ионообменника добавляют 540 Х’ “!™п ‘
ми шелочи, аккуратно перемешивают и оставляют на 30 мин при 12^
температуре. Полученную суспензию либо фильтруют черт,
Бтхнера. либо подвергают центрифугированию, и осадок
отмывают дистиллированной водой до нейтрального pH. На второй стадии
катионообменные носители обрабатывают 0,5 М раствором NaOH или 0.5 М
раствором КОН, а анионообменники обрабатывают 0,5 М раствором HCL
После этог о целлюлозы отмывают дистиллированной водой до нейтральных
значений pH. Описанная процедура приводит к получению
аииоиообменников в так называемой СГ-форме. а катиовообменняко.
называемой Na’- или К*-формах. Для освобождения от мало««
целлю.ю. < переносят в литровый цилиндр, переме	оссдаюш*
20-30 мин. Верхний слой, содержащий мел™ мют наколиР*310
частицы, аккуратно декантируют. Эту операции^
тех пор, пока в верхнем слое не останется “	НОСиге.™ “в*хЛ^е
Перед заполнением колонки ион . t исполыомти’ JusW«
перевести в ту форму, в которо они >5
хроматографии. Для этой цели н0 перемешиваЮТ' .Тпо^Р”01 л°
буфера уравновешивания, аккур»1 Такую рНоси*-1СМ’^
Декантируют и измеряют pH и ионн^ контактирУ^^м оуфе
тех пор, пока pH и ионная сила р у10щим п
^апуг идентичными соответству
$5
Как правило, для уравновешивания носИтеЛ),
зравповепп.ваннж •	|((.хол(,ого буферного раст„ 'е%
сравнительно ш ; происходит замегг» проти^^ оХ
если в ходе ММ»? N(|. |(fl ноны аммония или ионы тX '
ММеН’ ZL х^маю. рафии), зх. --ропелура урш,«оКИ1н Jc
мтионо.'бм'НН „„„^овдзъ больших объемов исходного к’К
ТзхнХш ^о^ носитель буферным раствором.
“X 4-Грат больше молярности буферного раствора, исп0% X
‘С юмзте-Н.н.1. ЭТО позволит ускорить процесс УравН0|)е,Х,
:a pil раствора, контактирующего с носителем, станет X
'Животе «Сфера, носитель отмывают буферным раствором,
£ ,С1 использоваться в холе .хроматографии. В любом случае сорбент №
считаться готовым к употреблению только тогда, когда pH и ионна, с„,
раствора. контактирующего с носителем, в точности равна соответствуй
параметрам исходного буфера уравновешивания.
После подготовки сорбента приступают
Техника заполнения колонки подробно описана
фильтрации».
к заполнению колоно,
в разделе «Метод гель
Реактивы и оборудование:
1.	Хроматографическая установка, состоящая из перистальтического
насоса, проточного денситометра, позволяющего измерять поглощение
при 260 и 280 нм, коллектора фракций и самописца.
2.	Готовый или специально подготовленный к работе
хроматографический носитель.
3.	Буфер для уравновешивания колонки.
4.	Буфер для элюции сорбировавшихся на колонке белков. Как правило,
буфер элюции отличается от буфера уравновешивания другим pH или
повышенным содержанием соли.
5.	Прибор. > . л тмя (радиента(градиентатор).
Гис. 4. llpocieMiuec устройство для соэданнн градиента (градиен
га>ор).
56
прибор состоит из двух
буфер уравновешивания, „, ",к""иХс, ,
X'-i помешают мешальник и Л*"1	»
присоединяют сосуд. №;|	г^, Ь Х>йч
..с""1 Этическому насосу „ |1Я	™•"Ниц	и"
,р,а-. ;1< ^ль урппнонеша,^ /'Ропес <£*< *
'-Р~ем "ЭТО, "с
<п.м происходит постепенное линейи^’1** < s>
">* иэменение pH.	"<* y<J'
!НН1	. ”,и» И
ь проведения работы
цорл1
При проведении ионообменной ХПом
вносят образец исследуемого белка. Как уж7”Графии снач11а u
^шнчен и может составлять несколЦ^-Ч
;11|11Итров. После нанесения образца ол «и д£***
довешивания (2-4 объема колонки или д"? "^«ют
Эзность элюента не станет равной оптич^ "°и
уравновешивания) и приступают к элюции белка
Пользуют градиентный способ элюции, Хм Т0М
составляет 6-8 объемов колонки, хотя этот „арам™u 'P’J"eHra <*"но
довольно широком диапазоне. В зависимости от нои В|*"Р0^ >
носителя скорость элюции может колебаться от 10 / ""aib’y'*ro
некоторых сортов целлюлозы до 150 мя/см2 час млсм’ 8 ’« да
ионообменных носителей. После окончания хроматогрХ С0*₽е-Ма",‘и
определить белковый состав и измерить проводимость или „Н
фракций. Ионообменные носители могут использоваться миогокрапю 1»
регенерации носитель обрабатывают буферными растворами, содержацимв
высокие концентрации соли (1,5-2,0 М растворами NaCI или КС1). Такая
обработка, как правило, позволяет удалить большую часть белков или
нуклеиновых кислот, сорбированных на носителе. Для более пашой
реген с рг ди и сорбент можно обработать 0,2-0,5 М раствором NaOH, после
чего о . гь водой до нейтрального значения pH. Ионообменные носители
можно хранить в виде густой суспензии в присутствии антисептиков, в
качесч  которых можно использовать 20% раствор этанола, 1,5-2,0 М Natl
И |И | оры, содержащие следовые количества толуола.
•lumepamypa
1	К Скоупс, Методы очистки белков, Москва, Мир- ют Москва.
2	- Л.А. Остерман, Хроматография белков и нуклеинов
Чаука, 1985.	„ Северина и f-A-
Практикум по биохимии (под Pe;ll,K1u,l7L iom __
Соловьевой) Москва, Изд-во Ml У.с- *	□ Jnethods- GE НеаК аге
Ion exchange chromatography. Princip es
1 Ю00421 C.
57
,v. определение
\мнномн'кмммй состяя н первичная сfрук гура опредСп
ХНМНЧЛКЧС V
СЛ'ТЯМ и I
мрмперисп№
1МННОКИС
nO1V4CHHN\
-------—	г.	___
, ,..г_.. ' ”----------и^сля^
т'1"1,,М-7л«я' НМС...Ш по^му определение «миищ, *4
.**i»<*" ж ямястс< одной н.,
'белков и пептидов. Для
. белки или пептиды подвергают гидрад^ X
^ехтам	с помощмо
„ -х “"’"Теппо, и определяют количественное со^
^мяпиркфических ,МИНОКИСЛ<П. В настоящее время опрзд
ь.кзой ил янжзнзируемых ‘	на автоматических анализу
аминокислотного состава «У сходит с использованием
•х разделение амино . атографии, а их идеитифи^
колоночной ионообменн	„ресцентных (о-фталевыи диальдегяд
пронзится либо с помтыоф. Р (нингидрин) методов. Одиаю
фпрам). либо с помошью к «^^ских амин0кислотных анализу
лаже при исполькваи	правильного приготовления образца,
перед эксперимента i р	понимание того, какие проблемы мог-
который подвергается анализу, и понимание тот ,	ю~
нотниигтть при оценке результатов проведенного исследования.
“л. "определения ' первичной структуры оелки подвергав
химическом' или ферментативному гидролизу. Полученную смесь пептиде.
nauellK.	ищенных пептидов секвенируют, используя
различные методические приемы. Наибольшее распространение получил
к.......................ТО Эдману, с помощью которого удаета
про. ить юшышии отщепление отдельных аминокислот с N-коица
1Ирч 1сптида В настоящее время созданы автоматические
aq- ,ч 4 .-наторы, позволяющие «прочитать» без ошибок около 50
ру la ipyioM остатков аминокислот. Определив первичную
сг.л .сю из полученных пептидов и собрав информацию о
icpb. оруктуре перекрывающихся пептидов, получаемых при
з. . .сини исследуемого белка другими ферментативными или
. t пми методами, можно реконструировать полную первичную
tip.oyvpy белка В последнее время большое распространение получили
мс-i ь <. 1|кдсления первичной структуры белка по первичной структуре
мИ Ц iHcc coolьстсзвующей ей кДНК, кодирующей исследуемый белок.
( у 1ьф|илрильныс ipyiniu цистеина играю! важную роль в активных
цензах мнем их белков и фермента Кроме того, дисульфидные мостики,
обраАющисся при окислении сульфгидрильных ipynn цистеина, играют
важную роль в создании и поддержании структуры белка. По этой причине
разработано большое количество различных методов опрелеп»*^-—
Катков
58
В ..рукгуре оелка. I некоторыми и,
.........
белков и пептидов
поЛМргакуг
'• либо КИСЛОТНЫЙ
1 гидроли3
црининп метол»
Для определения аминокислотного состава бе
--«noy. Д™ ЭТОЙ ЦвЯИ «ЯКМИуют либо Щелочной
1 ' п|13. При щелочном гидролизе, проводим™ »
^створах NaOH, LiOH или Ва(ОН)2 частично ра"пуНГ₽ИР°ЮННЫх ,4
серин. треонин и происходит рацемизация некоторых аминов Т'™
при щелочном гидролизе, удается количественно опрезХТ °лна“0-
триптофана, который полностью разрушается при кислотном гид^Т п"'
кислотном гидролизе, который в простейшем случае провозе .
растворе HCI, происходит полное разрушение триптофана ’А "
разрушаются тирозин, серосодержащие аминокислоты и оксиаминокислоты
в последние годы описаны методы кислотного гидролиза белков и пептидов
с добавлением к НС1 тиогликолевой кислоты, изи
меркаптоэтансульфокислоты, или р-толуолсульфокислоты, которые
позволяют избежать некоторых проблем, возникающих при использовании 6
н НС1. При использовании 6 н раствора НО степень разрушения
аминокислот зависит от чистоты используемой соляной кислоты. Поэтому
для гидролиза используют специально очищенную соляную кислоту.
Концентрированную НС1 (марки хч, химически чистая) разводят в два раза
водой и 2 часа кипятят с обратным холодильником над SnCU (3-4 г на I л
раствора). Полученный раствор перегоняют в аппарате со стеклянными
шлифами и собирают фракции, кипящие при 106-107 °C. Трижды
перегнанную кислоту используют для проведения гидролиза.
В ходе гидролиза в 6 н НС1 помимо полного разрушения триптофана и
частичного разрушения тирозина также частично разрушаются
серосодержащие аминокислоты. Если возникает задача более кчн''
определения тирозина, то до гидролиза к пробе добавляю! кри
Фенола. Если стоит задача определения серосодержащих dS?1Ht.K^’lkWedHMe
’ндролиза проводят их окисление надмуравьиной кислого окисленню
иадмуравьиной кислоты позволяет перевести склонны 0^раб0Тка
цистеин в стабильную цистеиновую кислоту. В то окислителем,
адмУравьиной кислотой, являющейся очень	(Ю тирозина и
уводит к частичному (или даже полному ра - 1МИ1кЖис
йРип,0Фана. Пептидные связи, образованные ^ИЧ^1ИЗу. Увеличение
вреРД,ЛИЧНой степени устойчивы к КИСЛО1И°М?|ОМУ гидр°лизу СВ*иТго
обоа^ин ГидРОлиза приводит к более 11	вследствие е
УвелИцВаННЫх гидрофобными амиНОК^Лдругой стороны У*”11
ивается выход этих аминокислот.
рпичением вероятности
дается Уве иИОКИслот. По этой Ч
юпиэ» conP°Saui«* и Личного времени^, 48 л S
.меии^ сеР^леР*.1»«че’'ЙСьэтических аминокиежи прв>
а11Ия алиф«* и1а, а для опр^*
Кислотный гидролиз
PMhTHCI-6K раствор (трижды перегнанная).
Порядок проведения работы.
, проводят в стеклянных ампулах в вакууМе
ВозможТдиспХоба внесения белков в ампулы. Вариант первыйL Точную
Хке 2 0-2 5 мг сухого препарата белка вносят в стеклянную пробирку. „
рой ’за™ гот'овят ампулу. Для этого пробирку вместе с белком
оттягивают на стеклодувной горелке так, чтобы в середине образовалась
узкая перемычка. После охлаждения с помощью капилляра в ампулу вносят
2,0-3.0 мл трижды перегнанной 6 н соляной кислоты. Вариант второй.
Препарат белка взвешивают в весовом стаканчике, растворяют его в грижды
перегнанной 6 н соляной кислоте и с помощью пастеровской пипетки
переносят в заранее подготовленную ампулу. Остатки белка в стаканчике
трижды смывают 6 н раствором соляной кислоты, которые также переносят
в ампулу. Общий об .см кислоты в ампуле для гидролиза составляет около
2,5 -3,0 мл.
Содержимое пробирки замораживают в жидком азоте. С помощью
масляного насоса из пробирки откачивают воздух и запаивают на пламени
стеклодувной горелки. Ампулы помещают в термостат при 110 °C на 24, 48
или 72 часа. Необходимо проверить установку температуры в термостате.
Превышение указанной температуры может привести к разрыву ампулы.
После гидролиза ампулу охлаждают и вскрывают. Для этой цели надфилем
на ампуле делают надпил. Стеклянную палочку разогревают в пламени
стеклодувной горелки и разогретой палочкой прикасаются к сделанному
заранее надпилу. Для защиты глаз все операции по запаиванию и вскрытию
ампулы следует проводить в защитных очках. Содержимое ампулы
с7шЧЛС1Ве,,Н° ПСреН0СЯТ В маленькие конические или круглодонные колбы
со ш Ифом, и соляную кислоту упаривают досуха на роторном испарите ле
при 40-55 С. В ампулу вносят 2-3 мл воды и опять количественно переносят
в ту же круглодонную колбу со шлифом. Операцию упаривания повторяют
~‘3 раза. Полученные сухие образцы хранят в колбах, закрытых притертыми
60
^ир
' ^6; рМвн, Хроматография белков и Му10|	'ч Мир.
П.Л( 1985.	,	,	""Ы”Исл^Ма,
; ’• iW**;, еская химия белка (под редакцией д Ла^_ ~"
прах™	 '“Pope) М
’ .kvm ио биохимии (под редакцией СР г
. ИГ0"''-вой) Москва. Изд-во МГУ, с. Ю1 _)08(эд<-енрИиа „
Цианов, Молекулярная биология. Сзру^
iредакцией акад' рина 1 ква’ Вы‘ии’
деление, идентификация и количесто
г. P^Sue некоторых аминокислот енное
полное количественное определение всех аминокислот, ww,TOx ,
аминокислотно*
со™1’ , ,пе представляющем собой достаточно сложный и дорогостоЗ
ан^"3 J т0 же время при анализе простых смесей аминокислот или то»
пр',6°р  щи количественного содержания только некоторых аминокислот
|оПр^еЛ^споЛЬЗоваТЬСЯ более простыми и дешевыми методами. Одним из
можно во является метод тонкослойной ионообменной хроматографии
таКИ\сти’нах «Фиксион 50*8».
иаПЯ I тины «Фиксион» представляют собой пластиковый носитель.
" К1 юнким слоем сильного катионообменника. В качестве
!,10кры",и1)МСННИКа используют ионит, полученный путем полимеризации
катионоот 1ИВИНИЛбензола и содержащий привитые к матрице
[стирола	сульфополистирольный носитель, (схожий по
сульфо! 1П,,’,Ь-	распространенным катионообменником Dowex 50*8)
Л в Na-форме. При кислых значениях pH все аминокислоты
постав м'юя ФР	д которых зависит от pH и рК
представ лены в вид ~	. Поэтому, если нанести на
ионогенных групп каждой амино .	аминокислоты
[пластину «Фиксион» смесь аминокислот р р „я‘элюции сорбированных
[окажутся прочно сорбированными на носи . ные растворы с более
аминокислот используют натрий-нитратные_	е NaCI. Повышение
щелочными значениями pH (pH 3.25-6.00),	постепенно
[pH и ионной силы приводят к тому,	еоемешаться ПО Н0С»П€Ш
[Десорбируются с катионообменика и начина зарядом аминокисл
11РИ этом прочность сорбции °преДеляе1С’\ к карбоксильных
(который в этих условиях определяется итаче матические aMHI^w)jia и
1ак и их гидрофобностью. Алифатические ми кольцами
^уют гидрофобные контакты с ароматически
61
дивинилбен’	,я1(Лючить. что щелочные аминокисл^ .
аминокиС*Т вИде можно »а« лсм и поэтому располагав, X
В обш*	свЯ1ыватьея <- яМИНОкислоты будут обладал,
наиболее про НейЛ^ьиыс
п величины рК карбоксильных rpv'"'6
от линиН стар • * 1авиС11мостн о щелочиых аминокислот на Пла'«
поДви*ностъю. полагаются	будуг обладать на(1МеМ| Ч
гидрофобно ^|(0ВНС аминоки	а „ силу своей
Наконеи.	доМ и по >тои । Р большей подвижностью
положительным I	«фиксион».
гидрофильно^;ографии на пласте . * тонкослойной хроматограф
тхткослойной ер ’ сов ионообмен	рюделения аминокисло,
С^выс<жую Р^^ того, в ходе довольно долгого
*’--------------- Ипоме 1 е составы элюирующих
улучшить разделение определенных
обеспечивает ь----_
на пластинах «Фиксион». Кроме
использования были разработаны
буферных растворов, позволяющих
групп аминокислот.
ацетоне.
Реактивы и материалы:
1.	Пластины «Фиксион 50*8».
2.	Лимонная кислота.
3.	NaOH.
4.	НС1 концентрированная.
5.	Этиловый спирт.
6.	Нингидрин - 0.1 % и I % раствор в __
7.	Смесь муравьиная кислота : уксусная кислота : вода (МУВ) в
объемных соотношениях 7: 5 : 13.
8.	Аминокислогы-«свидетели»: 50 мМ растворы, приготовленные на
реактиве 7.
Раствор уксуснокислого кадмия: 1 г уксуснокислого кадмия
растворяю! в смеси, состоящей из 50 мл ледяной уксусной кислоты и
100 мл воды.
Ю.Раствор для устойчивой окраски хроматограмм готовят путем
смешивания растворов 6 и 9 в отношении 5:1.
Порядок проведения работы:
Сухой гидролизат, полученный из 1-3 мг белка, растворяют в смеси
МУВ (реактив 7) гак, чтобы конечная концентрация исследуемых
аминокислот составляла 5 мМ. Если известно, какой белок подвергался
гидролизу, то, зная его молекулярную массу и содержание аминокислот,
можно точно рассчитать объем добавляемого к гидролизату реактива 7. Как
правило, определение аминокислотного состава проводят уже после того,
как определена молекулярная масса белка. Поэтому, даже работая с
62
белком И зная его молеку;1Я1,и,
„вес™ коЛичество (нмоли) белка, В,,УН) массу „
ную массу белка и полагая, что сп ° "а и.легко
КУ-1’"’,'гы составляет 100, можно легко	3«а„
аминокислот, входящих в состав д^а"‘	и’«»
>че^ое предположение, что все 20 аминокислот?
о-^^ены » с°ставе исслеДУемого белка,
следует растворять исследуемый гидро.^^''"^- ЛХом
. тпания усредненной аминокислоты составляла L/1" Тог». чт^
™я“ейсе операции с пластинами «Фиксион» пД М
„атках. Т аминокислоты и любые первичные ам^ныТ ’
"еР; пальиев. попадая на пластины «Фиксион», мот , Ч’*аш"'с’"а
Маемые результаты. Пластины «Фиксион» нолупроэ^”"0 Hc,aw">
,117кзаливая под пластину бумажный шаблон (трафа^Г “е’
рением линии старта и точек нанесения образцов,
Несения каких-то карандашных меток на самой пластине к° *aTb
ХХ самой пластины может привести к частнХ ' поХ^
сорбента и заметному ухудшению качества разделения. Образцы
линию старта, расположенную на расстоянии 2-3 см от нижнего ™
пластины. Расстояние между точками нанесения не должно быть меньше 08
См, а диаметр пятна не должен превышать 1 мм. Как правило, образцы
наносят автоматической пипеткой. Если объем наносимого образца очень
велик, то его наносят в несколько приемов, каждый раз подсушивая точку
нанесения феном. Желательно, чтобы в каждой точке содержалось от 5 до
15-20 нмолей каждой аминокислоты. На пластину наносят как образцы
полученных гиролизатов, так и образцы аминокислот-«свидетелей». Эго
необходимо для того, чтобы после проведения хроматографии стала
возможной идентификация всех полученных пятен. В выбранных условиях
удается достаточно качественно разделить все щелочные аминокислоты
(аргинин, лизин и гистидин), а также валин. Для того чтобы в дальнейшем
определить содержание каждой из указанных аминокислот в гидролизате,
необходимо нанести на пластину смесь указанных аминокислот*
«свидетелей». Для построения калибровочного графика зависим^
площади пятна аминокислоты от количества нанесенной	на
требуется не менее четырех-пяти экспериментальных точи
пластину «Фиксион» желательно нанести 4-5 про смеси аминокислот
аминокислот таким образом, чтобы нагрузка для к
Пировала от 5 до 15-20 нмолей.	из причины'
ни . '^ЛЯ нР°ведения хроматографии использую г буфера I уда»^*
*с буферных растВ0р0в (СМ табл. 6). При нс по ЛЬ	'напрнмФ *
амиемЦ,Н0 Р«Делять довольно сложные смеси ам некие	oh.)
окислоты, входящие в состав смеси А ( г&-	ог,т быть Л
Разд'МССИ Б (Lys, Phe, Leu, Met, Gly. Thr. Asp^
eHbI пРи хроматографии с использован
63
пшон камере при комнатной тем*
вводят в закры „ как фронт растворителя пощИм
паэДеление пР° е. Послетого, эт0 может занять 1,5-2
50 "С в «PM0Ct Лети от ^Гивают в токе воздуха. Х^>
и1"'!’озо см (в «виси„з камеры и вьО	0 1%.ным ра(.^
Наоматотра^ вьШ^0Гпамму о*РаШ^ специальной смесью, содержу
’‘’’ Генную кромато Т'	р 6) либо	(0) д,я окраски одим
ebicyuie , ацеТОне (Р	кадмии (РаС	пульверизатора наносят Иа
'"'ИГ1'поии И уксус»0*”'11 „омерно с пом»' обеспечивал получен*
'""'Г"нных раствоР”те1'Ср"зр|о чтобы пу№веР1скивании не проистод(ло
указанна. Р даателы . н при опр	высушивают «а
5Х1	„ss.	г s' "”*=£
*2£. -
фоне.
Таблица 6. Состав буферных растворов, используемых д,1я
тонкослойной хроматографии аминокислот на пластинах «Фиксион».
Состав буферного раствора	и температура, при которой проводят хроматографию.	Буфер 1 натрий- цитратный буфер (0.4 М по	ионам натрия) рП 3,3 Раствор общего назначения	Буфер 2 натрий-цитратный буфер (0,35 М по ионам натрия) pH 5,23 Раствор	для преимущественного разделения щелочных аминокислот	Буфер 3 натрий- цитратный буфер (1,5 М по ионам натрия) pH 6,0 Раствор для определения триптофана в щелочном гидролизате
Лимонная кислота X НгО	84.0 г	24,6 г	7,0 г
NaOH	16,0 г	14,0г	4,0 г
НС1 кон ценгрированная	5,9 мл	6,5 мл	нет
|NaCl	нет	нет	81,9 г
Вода	до 1 л	ДО 1 л	до 1 л
Температура проведения хроматографии	50 °C	Комнатная температура	50 °C
После окрашивания хроматограмму сканируют на сканере и
сохраняют в виде черно-белых изображений (градация серого) в формате tif.
Полученные сканы обрабатывают с использованием программы OneD Scan
или любой иной программы, позволяющей оперировать цифровыми
64
и определять интегральное пог
Хшть'- ДаЛеС T”T 'аВИСИМость интеГССНис пятНа г
нанесенной в пятно аминокислН°Го погл’, Э*Лой
’ Х1ному графику вычисляют	По °'*Ни’ от
юг » ,нл|юлизатс. Зная объем пани Р*ание аня, УЧенн°мУ
взятого ни анализ белка, определяю, '”7° » ""но
«’T " «целуемом белке.	““Ржаиис анализ й и
РУемых
jH***'**
1. т. Дэвени, Я. Гергей, Аминокислоты, пептиды и д
1976.	иды и белки. Москва м
. д.А. Остерман, Хроматография белков и и,	ИР'
Наука, 1985.	Уклеиновых кислот, Москва.
3. Практикум по биохимии (под
Соловьевой) Москва, Изд-во МГУ с ит > СевеРина и г А
4. Практическая химия белка под ре™ А
1989.	Редакцией А. Дарбре. Москва. Мир
1 Определение свободных сульфеоЛ,^,, „„„„
• остатков црсшооне. участвуй о6 “„'"™
дисульфидных связей
Сульфгидрильные группы белка обладают высокой реакционной
спос костью и вступают в многочисленные и разнообразные химические
1. Например, сульфгидрильные группы участвуют в формировании
во. иных связей, подвергаются обратимому окислению с образованием
ди ьфидных мостиков, образуют меркаптиды, полумеркаптали, а также
подвергаются ацилированию и алкилированию. Сульфгидрильные группы
входят в состав активных центров многих ферментов, относящихся к
классам дегидрогеназ, трансфераз и гидролаз. Сульфгидрильные группы
участвуют в связывании катионов металлов (железо, цинк). а г^ой
мостики играют важную роль в поддержании "	>тов 1|ричНне
структуры многих, в основном внеклеточных белков	ш
избирательная модификация сульфииряи'ьн _ ^^kob иисишиа,
реакционной способное™, а также опрел*
участвующих в формировании лисуль* ;	Н нас,ояшее
задачей, зачастую стоящей перед " „„редсення
описано огромное количество
реакционной способноеiи ^ фИЧНЫх и широк»	^го. метод
описании одного из наиболее Ф дисулыфндных м<к ц (реаКгива
определения »У"ьФ™^“ХУс(2-...........	«*-
С использованием 5,5 -дит
Эллмана).
65
3.1.	Определение свободных сульфгип
помощью реактива Эллмана ,"ЬнЫх г
нитробензойной кислоты), ДТНБ)	5’® 'Дити ",г
грУпп
J4.
Принцип MCI О l!«
В основе метода лежит реакция тиол-дисульфидного обМе
которой освобождается анион 2-нитро-5-тиобенюата, R
поглощением при 4I2 нм (см. рис. 5). Коэффициент молярного/<>Млаич,,ий
2-нитро-5-тнобензоата довольно сильно зависит от pH. По это^ Г>П,СИИя
реакцию обычно проводят при щелочных значениях pH (7,5- 8,5) п ,РИ ’ИИс
что в этих условиях коэффициент молярного поглощения при 412 Им ИМа’
14СЮ0 М см '. Описываемый метод высокочувствителен, строго специ^^
и может использоваться для определения количества сульфгидрил/'^
групп как в низкомолекулярных тиолах, так и в нативных
денатурированных белках.
+ RSH
Рис. 5. Схема реакции взаимодействия реакчива Эллмана (дигио-бис-
нитробен зойной кислоты, ДТП Б) со свободными SH группами.
66
|н’*ь1,
. IK'I буфер  SO mM pl I 8.0. солепм,
! I ич’ 5.5’ ........0 ('’,’1(2-,""Р»бС1П1,Е,"ИЙ 1 ММ')Лт
I1 1 .......- .......a so мМ Трис.) к5 ' ‘ ’ киСЛ(п ш,
! J.......г «мадушвГО белки и 'иР,1Н’О'^еП1'/,Т,,Б)-1о
I • • фщнеи«овмимхsn.lpv' ,'\И1|<"м<>ЛС|(’",емIммэл!!м-
S.................
к проведения работы:
I ЦН»*1
! освоение описываемого метода опп
I проводить с каким-то низкомолеГузяпим ’ Сво6о^и-х SH
| «мленным глутатионом цщ ВДСТеИНоХ М Напри^"
! ^„нення можно рассчитать, задавая желаем^"^0 аиал"С^
| „„.тностн и пользуясь формулой D=CC | " еТ «"’"""•У "ЛХ
I плотшкти. с - молярная концентрация uL? ’ ’еличина 0ГГП"««ой
коэффициент молярного поглощения, а I - Мииа"ДУ'М0Г0 Синения ,
I В двух параллельных пробах к 10 мх™ птнчес|(ого пути.
; мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), содержащего^ ,Л"50
I перемешивания вносят 50 мкл раствора ДТнЛь ММ ЭДГА- Пос'1'
I ставят контрольную пробу, не содержащую тиола. Р"ЛУ * °"“™ыми про6ами
I При раооте с белками в две пробирки (параллельные пробы) .носят
! анализируемым образец белка и добавляют 5-10-кратный
| раствора Д1НЬ, После перемешивания пробу инкубируют 5-10 чин при
! комм, ой температуре и спектрофотометрируют при 412 нм против
। гонтт ьной пробы такого же объема, в которую вместо раствора толов
I внос равный объем реактива 1 и такое же. как в опытной пробе.
ксjcctbo ДТНБ. При добавлении большого избытка ДТНБ реакция, кам
I пре л.ю, протекает очень быстро. Для того чтобы удостовериться, что
I кой инкубации достаточно для полной модификации сульфгидрильных
Ipynn, можно продлить время инкубации и измерить noi	41‘
I через определенные промежутки времени в течени* „„цгицщи
добавления ДТНБ. Описанную реакцию можно >чМ
денатурирующих агентов. В этом случае рас
гуанидин vH>pna
Трис-НС1, pH 8,0, содержащем помимо м liawwl ^раии»
или 6-8 М мочевину. В этих условия р 1ЫМК)11.м )КГ11мо.г>пны»« г
и все сульфгидрильные П>упп	чашФ-»*’
модификации ДТНБ.	। иол-дисульфидн011	'•-нитро-5'
В ходе протекания |>еам1(К1и)6ождСннем одного,
одной SH-групны сон^н^;
тиобензоага. Поэтому. . о||редели1ь	й реакции. >
молярного поглощения МО (
модифицировании »	'	й „робе.
концентрацию белка
С<-»1СРЖЯН|СМЧ
KONIKW
НЯ\О1ЯП|ИХСЯ В Г
течение 30-60 мин
мель «««>"’ KMlbU. ^yntt* ^С,,ЙЮ. то их определение Ч(£*
Н'(1СЙ ТВ*И*’ кя* меркаг,ТГггтанп,
Ч<ч((хть*' ” „И ш*«’»и”вИ .том случяс к ряспюру
с^4 ik в пгцс'л ипютрсйтол. ЛТНЬ гяк« ’гтобы конечИа_
"’"„оииклм. '^'"''""«ля коипсмгряпию ясех тип^
1И’М«	'	(ИКС'*" р1П преяып к()МНапюй температур, ,
n1”V После и'"1>'61:''“*фильтрянии на маленькой «плпи,е
144 Лх подверг ге»* ф белок от смеси интенсив
к....:«»«««< »«X
SSS-^SSS-**0*
т нобснзоата опрсдс.
Литература
1.	Ю.М. Торчинский. Сера в белках, Москва, Наука, 1977.
2.	Практикум по биохимии (под редакцией С.Е. Северина и Г.А.
Соловьевой) Москва, Изд-во МГУ, с. 159-161, 1989.
3.	G.L. Ellman. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77,
1959.
4.	F Fuchs The effect of Ca2t on the sulfhydryl reactivity of troponin,
evidence for Ca‘*-induced conformational changes. Biochim Biophvs. Acta
226. 453-459. 1971.
3.2.	Определение дисульфидных мостиков в белках
Принцип мег ода
ь<; и ные мостики играют важную роль в стабилизации
. ieiочных белков. Дисульфидные мостики образуются путем
гг. , > сближенных в пространстве остатков цистеина, и, как правило,
. > овольно высокой стабильностью. В связи с тем, что сктатки
1и «влеченные в образование дисульфидных мое тиков, находятся в
численном состоянии, методы, описанные для определения свободных SH-
групп неприемлемы для определения дисульфидных мостиков в белках. В
большинс1ве меюдов предполагается либо предваригельное восстановление
дисульфидных мостиков до свободных оста!ков цистеина с последующим
определением числа свободных SH-rpynii, либо расщепление дисульфидной
связи с помощью сульфита натрия, либо, наконец, дальнейшее окисление
дисульфидных мостиков с последующим определением образующейся при
этом цистеиновой кислоты.
J.
4.
5.
Г*’’ nd буфер - 50 мМ pH 8 0
I- Анилин гидрохлорид и 2 мМ ЭДТд^^аЩий 8 м
, '^гидрид натРия- СвежепРиготОВле' У*Я> А). М МоЧеВ11Ну
до мг/мл на иоде.	и раствор
Соляная кислота - 1 н раствор.	ргиДРида Нат_
диетой (марки хч или чда).	’'
Трис-HCl буфер - 1 М pH 8,5.
Раствор ДТНБ -10 мМ, приготовленим-
ННЫИ на 50 мм ТРИС.НС.
Порядок проведения работы:	Ll' PH 8,0.
Исследуемые белки растворяют в 6vA
концентрация белка составляла 1 5-2 ч . Уфере А так ч™к
исходном растворе определяют’ сХ*“ИНие****
смеси добавляют 0,5 мл свежеприготовленноПСРеМеШива|ОТ- К палу,евд
,, после перемешивания инкубируют в те^иЖ80* натР
бане. Добавление боргидрида может соп ® Г" ПрИ 40 °С т
большого количества пены. Реакцию ВТ£°ВОадаты;я образованием
мостиков останавливают добавлением 0 3 мП иип дис>’1ьФидвых
может приводить к преципитации	Н ”CL Давление кислоты
добавляют постепенно ппи ™ Р“Х 6елков- поэтом>
реакции и разложенияизбытка	перемешивании. Д» остановки
аие , мг, Л,.^	6 восстановителя к пробам добавляют по I мл
anemia. Добавление ацетона при кислых значениях pH может также
сопровождаться выпадением некоторых белков в осадок. Поэтому ацетон
лвляют постепенно и при постоянном энергичном перемешивании.
Из полученных проб отбирают аликвоты по 1-2 мл и добавляют такое
количество 1 М Трис-HCl, чтобы pH в конечной пробе стал равен 8,0.
Количество буфера, необходимое для достижения желаемого значения pH.
заранее определяют в предварительных экспериментах или путем расчета.
Как правило, для достижения необходимого pH достаточно добавить 0,4
0.6 мл 1 М Трис-HCl, pH 8.5 на пробу объемом 3 мл. (В ряд«
операция оказывается излишней, потому что при д добавления
избытка боргидрида натрия pH инкубационной ним^ сразу после
соляной кислоты оказывается дос’а™ча смешиВают со 100 мкл Ю «м
доведения pH отбирают аликвоты по “ Чсрез 10.20 мни инкубация
раствора дитио-бис-нитробенюинои	ощение при 412 нм. В “*
при комнатной температуре измеряк	6елка. но «»*₽**“**
контрольной использую, прочу,н и прошедшую такую *‘nWnouieHHi
компоненты реакционной смес ^„циент моляра» конечнук>
обработки, как и опытные пробы. Зная^	м см ) и
иона тионитробензоага при
Ьс	69
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
, «я в пробе С учетом всех добавок и Ра1.
конпентрапию белк.свободных сулм|>гилриЛМ1Мх
рассчитывают **	восста11овления белка избытком
рвавшихся шкле	определить суммарное кОл>.
Описанная п|Ю к Л * св()бод,|Ь|Х. так и вовлеченных в (|6ра
всех остатков инея*...	дмеНия количества доступных
дисхльфилных мостиюжм в отсутствие денатурирующих „ Ч
можно ПР"^'11’^ Ха натрия. Для определения всех SH-грунп^ ^
бе, добавления бор.илриД	мочевиНы. Но без предварите.,^
Литература
1.	Практическая химия белка (под редакцией А. Дарбре) Москва V
с.257-260, 1989.
2.	D. Cavallini, М.Т. Graziani, S. Durpe, Determination of disulphide grOu
in proteins. Nature 212, 294-295, 1966.
3.	A.F.S.A. Habeeb, Reaction of protein sulfhydril groups with Ellman’
reagent. Methods. Enzymol. 25, 457-464, 1972.
4.	A.F.S.A. Habeeb, A sensitive method for localization of disulfide
containing peptides in column effluents. Anal. Biochem. 56, 60-65, 1973
3.3. Прямое спектрофотометрическое измерение скорости
восстановления дисульфидных мостиков
Дисульфиды м- -г \ г быть восстановлены с помощью дитиотрейтола (I)
R 8 s - R + SH- СН,—(СНОН)}—СИг SH
//
при лом образуется окисленная форма дитиотрейтола (11), обладающая
поглощением в ультрафиолете. Максимум поглощения окисленной формы
дитиотрейтола лежит при 283 нм и при этом коэффициент экстинкции
составляет всего лишь 273 М 'см '. Измерение при 283 нм затруднено тем,
что у большинства белков максимум поглощения лежит в этой же области
спектра и помимо этого спектр белка может меняться при его
восстановлении. Поэтому предлагается измерять образование окисленной
I , tHTMOTpeni^.c ..r
К^.^г^стинкиииокислён^’ < „
^,. при определении дИсу”"°мУ	*4
*ч..имениях (таких. паприМсп ' ,,'1"’ДНых	°«hCji *ег0 ( М
н обычных буф^о,(ислен^иков * Ъо*о1> ф«р
, i.lll III. П'!/'..._'.. ' (pH 8-01 гР^^ер, '^>ти1?.Ч2с
..
И
Реактивы и материалы
’  ТрИС’ыг! «1ер' са ММ (рН 8’0)> “Держащий 1 мМ ЭЛТд
2. Трис-HCl буфер - 50 мМ (pH 8,0), содержащий I „М Ж и 8 М
мочевины.	"н * ЛЦ1А и в м
ЭДТМрнТоГ ’ °’1‘0’5 М СВеЖеПрИГОТО~й раствор „а , мМ
4. Раствор низкомолекулярного окисленного тиола (например
окисленный глутатион) с концентрацией bl04-5-104 М,
приготовленный на трис-HCl буфере (реактив 1).
5. Раствор белка, приготовленный на буфере, содержащем мочевину
(реактив 2) с концентрацией окисленных SH групп 1 10д-5Ю4 М.
] Порядок проведения работы

В кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см помещают
раствор окисленного тиола и измеряют оптическую плотность при 310 нм.
? завляют минимальный объем (10-30 мкл) концентрированного
< /Неприготовленного раствора восстановленного дитиотрегола и измеряют
рирост оптической плотности во времени. При анализе низкомолекулярных
юлов реакция обычно протекает за 20-30 мин, при анализе белков полное
«^становление дисульфидных мостиков может занять до часа.
11редлагаемый метод позволяет выявить практически все дисульфидные
мостики ц-лакл альбумина, бычьего сывороточного альбумина РНК-азы и
только около 40% дисульфидных мостиков лизоцима. Изменение
оптической плотности в данном методе очень небольшие, что уст
использования спектрофотометра, обеспечивающею полу зение с
сигнала.
Литература
K.S. Iyer, W.A. Klee, Direct spectrophotometric measurement of the rate of
reduction of disulfide bonds. J. Biol. Cheni. 248, 707-710, 1978.
71
V. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВойъ
НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ СТе
1. Яичный альбумин
Овальбумин (альбумин яиц, плакальбумин, идентификационный н<
в базе данных UniProt POf012) является основным компонентом белка,
используется для питания зародыша. На долю овальбумина прИход ''
окозо 64% от белка яиц. Молекулярная масса альбумина из ,И11
составляет около 43 кДа. Известно, что овальбумин подвергается рамц,^
посттрансляционным модификациям, таким как гликозилированИе
фосфорилирование и ацетилирование N-концевого остатка. Овальбумин был
одним из первых белков, полученных в кристаллическом виде еще в конце
XIX века, и с тех пор является одним из наиболее излюбленных объектов
исследований структуры и свойств белков.
Реактивы и оборудование:
1.	Яйца куриные - 1-2 штуки.
2.	Сульфат аммония - насыщенный раствор.
3.	Серная кислота - 0,5 М раствор.
4.	Трис-HCI буфер - 250 мМ раствор pH 7,5 (Буфер А).
5.	Трис-HCI буфер - 25 мМ раствор pH 7,5 (Буфер Б). Буфер Б готовится
путем 10-кратного разведения буфера А.
6.	Трис-HCI буфер - 25 мМ раствор pH 7,5, содержащий 0,7 М NaCI
(Буфер В).
7.	Колонка ДЭАЭ-целлюлозы объемом 60-80 мл.
Поря юк проведения работы
Раюиюют 2-3 яйца и отделяют белки от желтков. Общий объем
вора белков составляет около 40-50 мл. Полученный образец
сри носят в стакан, помещают стакан на магнитную мешалку и из
нон Воронки по каплям при постоянном перемешивании добавляют
ооьим насыщенного раствора сульфата аммония, pH которого
дельно доводят раствором аммиака до 7,5-8,0. После окончания
юоав1сния сульфата аммония полученную суспензию оставляют на I час
при комнатной температуре и центрифугируют при 10000g в течение 15
минут. Осадок глобулинов отбрасывают, а к супернатанту медленно в
1ечениеЮ-15 минут по каплям на pH-метре добавляют раствор 0,5 М серной
КИС.Ю1Ы так, чтобы конечный pH раствора стал равным 4,5-4,6. При этих
72
н происходит изоэлектрИЧе
,‘|^иЯ.к Дру°*х беЛК0В- соосаждающи ‘ ^ажден,,
’И.ч"1,р из I час на холоду и подвепгаиуг ’ с anJ H °8ал^
"Тит1’"'” 15 минут. Полученный Ос, ЦентРифуГи?'ИНоМ. СуХ и
X” | .2 л буфера Б на холоду. р к и дИалХ 'а Раст^Т0 8
Хдналидат центрифугируют при Юооо „	*
Jbiaa^-а н сУ|1СР|1атантс измеряют " Учение | <
‘"Jiцепрацию белка. В том случае, если ?ТР°Пров<>Ли<к,МИН>г «адок
^„эата выше электропроводности буфер?^"Ро-юдиосп
достижения электропроводной™ *’ Раств<>Р белка раз^Чев**<>
проводное™ буфера Б. Опирают али. Ра“Ной
•охраняют ес в холодильнике. Основной £ <У «бразца (2о.|7'НЫад
дЭАЭ-неллюлозы объемом 60-80 мл ^РМец наносят’^"
буфером Б. Желательно использовать к^^11"0 УРавновеСХо
С самого начала нанесения белка на колом. ки с ^метром гТ
объемом 3-6 мл. После полного нанесения "белкГ'СОбИрэт,>
буфером Б до того момента, пока оптическая К°ЛОН,[> лромыв^
равной оптической плотности буфера Б С 0СТЬ 1люента «е станет
элюируют линейным градиентом соли (0 0ТТГ’ На К0Л0Н|<е бе-1ки
приготовленного на буфере Б) общим объемом раХ?Я° №P’"'
колонки. Как правило, в ходе отмывания колонки буфХ Б и
начале градиента элюируются два небольших пика сод„
гомогенный лизоцим (кажущаяся молекулярная масса около N XX
электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфага
Hdi] ия) и кональбумин (кажущаяся молекулярная масса 77 кДа при
электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилс^льфата
пария). Основной, большой пик белка, содержащий гомогенный
о» (ьбумин, элюируется примерно в середине градиента соли.
Белковый состав фракций, элюированных с ДЭАЭ-целлюлозы,
анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле в
присутствии додецил сульфата натрия. Фракции, содержащие^ гомогенвые
овальбумин, лизоцим и кональбумин собирают и диализхют --3 раза ПР°™®
2-5 л воды на холоду. Диализат при необходимости '^нфугнр^
10000 g в течение 15 минут, супернатант лиофилит р>
выход белка.
Литература
P.R. Levison, SE. Badger. D.W. Toome
Economic considerations important in tnc su i	Chromatography
from hen egg-whole on the anion-exchange ce u < s
590, 49-58, 1992.
из яйЦ
2 Лизоцим
к-Ф 1 2 I • 17. идентификационный номер в г
Литоним	является гидролитическим ферм
.. UniPW Р00 ,u,.hvk> связь между М-ацетилмурам„
ХГенляюшим	мми„ом. указанный дисахарид яв М
кТсТопзй и N-aneT л лк к	еТС11КИ многих микроорганИ|^
Хменгом микянояой чаи гидр„лизовагь хитин, представляю
Помимо ззопз лгшим м^тилглюко,амина, в котором
собой "’«''"‘"..нены р(1-4)-гликозидиой связью. Ра
моносахаридов сосдин	. лизоцим вызывает лизис многих .
r’"k*W— нтельных бактерий и но этой причине ВЫполн^
основном грамположв.	предотврашая проникновение бактерий .
К,Ж"Ы;, жХЫых Лизоцим был открыт А. Флемингом в 1922 году, „ ,
Z™ro века был закристаллизован. Установлена трехмерна,
XZa ли“оцнма и подробно описан механизм каталитической
активности этого фермента.
2.1.	Выделение лизоцима из яиц кур
Реактивы и материалы:
1.	Яйца куриные - 3-4 штуки.
2.	Аммоний-карбонатный или аммоний-ацетатный буфер, pH 9,0, 0,1 М
3.	Аммоний-карбонатный или аммоний-ацетатный буфер, pH 9,0,0,4 М
4.	Колонка КМ-целлюлозы.
5.	Колонка Bio-Gel Р20.
Порядок проведения работы
Около 100 мл белка яиц смешивают с 0,1 М аммоний-карбонатным
(или аммоний ацетатным) буфером, pH 9,0 в соотношении 1:5, подвергают
ультразвуковой обработке или гомогенизируют в блендоре Уорринга и
фильтруют. Полученный
карбокси метилцеллюлозы.
перемешивания ославляю!
рай вор смешивают с 7-8 граммами
аммоний-карбонатным in и, ,и? 'Ва-ИТеЛЬН0 >Равн°вешенной 0,1 М
перемешивания оставляют . ацета™ь>м) буфером, pH 9,0 и после
последующего о„ре" беЛк"°"Ь ЛРИ 4 °С	"Р^У
полиакриламидном , ' в °ð состава методом электрофореза в
олученную суспензию по 1СТВИИ Додецилсульфата натрия.
^че||ие 15 МИ||у, „	' Р’ лю1 Центрифугированию при 10000 g в
бслковото состава образца, МШ,УЮ аЛИК80тУ для исследования
центпинаНИЯ Л0ВГ0Ря,от еще 2-З^ *aBwei ося с носителем. Процедуру
Жирования КМ-целлюпп' РЭЗа’ СобРаннУю после последнего
У переносят в колонку. Колонку
74
Г м аммонии кароонатным (и
4Г °' .юр пока оптическая плотное^ аМм0Ний
,><>» Юности буфера уравновешивания и*1** «е
/ И ит линейным градиентом 0.1 _ 01 ?,1a»uiHec., Ра»ной
<>......„««	Фр1кпн, "" '««.«,
/>» .,1 В полиакриламидном геле й „пи Нали1ирунп 300 Ил.
^’Х^кпии, содержащие гомогенный !?Ии
>’ к„ про™» дистиллированной воды и лиофи "Им X
X ,ом случае, если ионообменная хромД'
^генного препарата лизоцима, „	* «««^
<v методом гель-фильтрации. Д,,	Дополи^.^
С^а- Растворенный в минимальном объеме бу(^Г'НИЫЙ "Р^
> "а К°Т?М Х -’5 СМ) Bio.Gel^oyPrr,BeUI"^.
довешенную 0,1 М аммонии-ацегатным буфе J
Держащие гомогенный лизоцим, диали^
.„офилнзируют. Выход достигает 180 мг из 100 Р^ив “)лы "
куриных яиц.	100 мл исходного обрада
у. Определение ферментативной активности
гурбодиметрическим методом	’кюиима
Измерение активности лизоцима основано на том, что расщепление
полисахаридов приводит к разрушению оболочки бактерий. При
разрушении оболочки в гипотонической среде происходит осмотический
шок и вследствие этого светорассеяние суспензии бактерий уменьшаете!.
Светорассеяние можно измерять по кажущемуся поглощению при 450 нм
на спектрофотометре. Принято считать, что в определенных условиях (см.
ниже . \ меньшение поглощения при 450 нм на 0,001 за мин при 25 °C и при
pH .24 соответствует одной единице ферментативной активности при
использовании в качестве субстрата суспензии лиофилизированных
бакщрий Micrococcus lysodeikticus АТСС 4698 и при проведении реакцн
пробе объемом 2,6 мл.
Неак1нвы:
1.	Реактив А: 66 мМ фосфатный буфер.	О*"10"
2.	Реактив Б: 0,0.5%-ш-	-
лиофилизированных клеи	реакгивс \	^гн
Micrococcus aurum'^W^A^»uo H‘MC^uw единиц иа
3.	Раствор лизоцима. НешМ > конценгр*ии':И “
приготовит ь раст вор ли ниш
1 мл холодного реактива -
75
Порток провспсння
crnwfflio л*офили1Н|юминых бяггериц
ня |**т« л " м"нси*,кти w "ИЛЯ и
ммчя^^м ппспмчиов Листерий поглощение rtf
™*':гх	«.............
................... Г «•"“ —— Ы >
. ,vnX Ю1«"« «*”*	" Не ЖМЖ"Я С0ЛеР*^
отпита 1СЛИ при прип^влснии не уляетм получшя од^,’4”
ч\х пенсию, то полученный раствор следует тщательно перемешав R
юртой улыря1яукояой обработке В контроля^ *
Mkx-n 2.5 мл рсяклнм Л. а я опытную пробу вносят такой <е
суспензии бактерий. Обе пробы переносят в кюветы спектрофотометра и ,
каждую добавляют по 0.1 мл раствора лизоцима. Сразу после быстро^
перемешивания начинают регистрировать уменьшение поглощения при
450 нм в опытной пробе, измеряя ее против контрольной пробы. При
дпительной инкубации уменьшение оптической плотности суспензии
бактерий может быть обусловлено не только разрушением стенок бактерий
ю; действием лизоцима, но и просто оседанием бактерий. По этой
причине необходимо поставить дополнительный контрольный опыт В
зтом случае в контрольную пробу опять вносят 2,5 мл реактив А, а в
хпытную проб} вносят 2.5 мл суспензии бактерий. После перенесения проб
ь кюветы спектрофотометра в обе пробы добавляют по О, I мл реактива А.
При такой постановке уменьшение поглощения при 450 нм в опытной
пробе, если таковое происходит, обусловлено только медленным
оседанием бактерий и должно быть учтено при определении истинной
активности фермента.
емперазурный коэффициент данной реакции (Ql0) превышает 3. Эго
емпервтуры на 10 градусов сопровождается 3-
: меш;иявной активности. По этой причине
вес измерения в термостатируемых кюветах
контролировать температуру в контрольной и
ьно проводить измерения при разных конечных
Шример. от 0,50 до 2,5 мкг/мл, и проводить все
на линейном участке кривой изменения
HOI iutbc им <)J времени
। ,К1 иды (под ред. ц -j- цнажжа и ум ЛннкинаХ Москва.
Наука. 1995
V Ainhciin | м Prager, AC. Wilson, Immunological prediction oj^
sequence itlerenccs among proteins. Chemical comparison of chicken
quail and pheasant lysozy mes. J. Biol. Chetn. 244, 2085-2094, 1969.
76
p. shUgar. The measur
activation ol lysm.ytne. щ /y
'^5>*

,«ние активности лизоцима в полная
^:Р,имогРафии>	0ЛИ,^л.Мидном
ряде случаев удается измерить аткияНост.
1 |Я электрофореза в иолиакриламиднг
"ернзации геля в смесь мономеров вносят c’yfel?’
М которые каким-то nfino™.. J ^аты
лента*
нмсриюванного
^фореза гель вымачивают в смеси субстратов
5онх случаях на геле удается выявить полосу (или
„^аюших ферементативной активностью. Такой г -
„льзован и ДЛЯ выявления лизоцима на полиакриламид
делении электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия
..onwrb ферментоя г
з в полиакриламидном геле. В этом случае
эдсктр°Фор--
после
-J JO
НССЛСЛУ€МОГо
й слстэие
проведения
каким-то образом закрепляются
полиакриламида, либо „Г"
"Целуемого фермер"
аюших ферементативной активностью. Такой помоГ Х??"*
после
I KI ивы
1.	Реактивы для проведения электрофореза в полиакриламидном
геле по методу Леммли (см. стр. 36-37).
2.	Суспензия лиофилизированных бактерий Micrococcus aureus (50
мг мл), приготовленная на воде.
3.	Анализируемый препарат белка (изолированный лизоцим или
фра! ции, полученные в ходе очистки белка) с концентрацией 5-10 мг мл
прш отовленный на буфере для образцов без добавления
mi поэтанола. Лизоцим выдерживает обработку додецилсульфатом
на !я. но полностью или частично теряет свою ферментативнуцю
ак ность после восстановления дисульфидных мостиков. По пой
п,. ине образец нельзя обрабатывать избытком мерпкалтоэтанла или
ли нрейтола, как это делается обычно при проведении электрофорез
в фисутствии додсцилсульфата натрия.
4-	Фосфатный буфер - 50 мМ (pH 7,0)
я ,ок проведения работы
й „ль, соДФ‘““‘иИ
Приготовить 15% paw*1*’1""''
Ю мг/мл суспензии яиофили’Тв^^
аделяющего геля пригогови рецензии бакгер содер**111
Держащий закую же концентрацию с для o6Pa\U°* ю мкг лизоДима
'Разец белка, приготовленный на . 6bJJ|0 от
‘Ркаптоэтанола (желательно чтобы в
77
. по метолу Леммли. Разрезать гель На
Провести злектро<М* fi „фиксировать и окрасить так, как ч,.
(Тит -	лХ.ЫМИ гелями после злектрофореза
обычными полиак  Вторую (симметричную) часть теля^^^в^
додсинлсульфа1’1> н«Н н поМестить „ 50 мМ фосфатный буф^, / V
диспмлиром' НО" лизоцима выявляется в виде прозра!,, Ц '
2.24 мяса при  '	и зон. <
фойе матового гм«-	*
iHMi-po”"?'1
SSL? »* - •V* ” " **&
Secretions. Anal Biochem. 312, 73-70, ZWJ.
3, Рибофлавин-связывающий белок
Рибофлавин-связывающий белок - кислый термостабил
гликопротеид, связывающий рибофлавин с константой диссоциации
1,3 нМ. Этот белок экспрессируется в печени и яйцеводе Пт
обнаруживается как в белке, так и в желтке яиц. Рибофлавин-связыванТ ”
белок, циркулирующий в крови, отличается от рибофлавин-связываю
белка в белке и желтке яиц по степени гликозилирования и по
полипептидной цепи. Белок из яиц подвергается ограниченному проте1^
и укорочен на 11-13 остатков с С-конца. Рибофлавин-связывающий ’
имеет сложную доменную структуру и может
фосфорилированию. В структуре белка выявлено
фосфорилирования. Из-за многочисленных и
посттрансляционных модификаций гомогенный по данным электрофореза
полиакриламидном геле в присутствии попрпипришЛ^ __________________
рибофлавин-связывающий
изоэлектрофокусировании.
подвергаться
Д° 8 участков
разнообразных
. . . IB
присутствии додецилсульфата натрия
белок яиц дает несколько зон при
сииин™..,	Рибофлавин-связывающий белок может
Форме “Z ,KaK “ (С"0б0ДН0Й от Рибофлавина форме), так и в зато
связанногоР " е0Лсржащеи связанный рибофлавин). Удаление прочно
растворов Рс '-Г 7 1)ЫТЬ Достигнуто либо путем диализа против
хроматографии \	, 'синем pH, либо путем катионообменнон
используется 1пя	р1,00(1)лавин-евязывающего белка успешно
ь пищевых lint) 1 ,КС не,,ного определения рибофлавина (витамина В?1
3 I	' ах’а 1акже в крови и моче людей.
I ,ав,,|*-свя зывающего белка из белка яиц кур
Реактивы:
I- Фенол - 5%.> к -
1 полный раствор (не более 100 мл).
78
_,i фенол ядовит и вызывает ожоги .
°*и Pafim
Eii ТпиС-НС1 буфер - 0.5 М р|| 7,5	,	а71," "ер.„г,
IГ? лнетотный буфер - 100 мМ рц j 0 *"Лс' ’00 Мл). ”
’• ||С|. 6 мМ раствор (необходим дд, ’’°’* ’00Мл.
Ill \истатный буфер - 250 мМ рц 3 2 . ''к"'"и« «по-б,
111 Ацетатный буфер - 25 мМ рц 5>8 (*е /ол* ’Оо Чл)
11 7 pEAE-Sephadex А50	0;,Сс 200 Мл)
II )К проведения работы
I Белок 5 яиц гомогенизируют вручную в
.^о-тефлон) или подвергают ультразвуковой tZZ""1’™'* "«"«Ра
Военного раствора. К полученному раствору ™ Д°
Е^ешивании добавляют сухой NaCI до конечной JL янтен<:и’"»м
Еса,объем). Измеряют объем полученного раством "еКГра"ии Ж
нцпельной воронки добавляют равный объем 5%-ного " M'i1emo *
^ученную суспензию центрифугируют при 1500 е в
Ератпо удаляют верхнюю жировую пленку и оби
Созрачный желтоватый супернатант диализуют сначала против нес^^"
Кен дистиллированной воды, а затем против 2-3 л 50 мМ Трис-НСI. pH 7 Ч
Сние ночи.
Диализат подвергают центрифугированию при 10000 g в течение 15
L\t и удаляют образовавшийся осадок. В прозрачном супернатанте
предел я ют электропроводность и сравнивают ее с электропроводностью 50
iM Трис-НС1, pH 7,5. В том случае, если электропроводность диализата
цше электропроводности буфера, диализат следует развести водой и
Ьоверит ь pH. Полученный раствор наносят на колонку DEAE-Sephadex А50
бъемом 40-50 мл, предварительно уравновешенную 50 мМ Трис-HCL pH
р. После нанесения рибофлавин-связывающий белок виден в виде желтой
мы верхней части колонки. Колонку промывают буфером
равновеп 'вания до тех пор, пока поглощение элюата при -80 нм не станет
1Шше 1. Сорбировавшийся на колонке белок ыюирхют
шиензом NaCI (0-0,5 М, 6-8 объемов колонки). Фриши*. “•> f’
рофлавин-связывающий белок, обладают имген‘-‘'вн“‘1из «лм
•йлизирукп белковый состав всех фракции (ip> л гакже фраками.
Ми. диализата, фракций, не сорбирующихся наi колоик ’гр1Х|юреза “
коченных в ходе хроматографии) метод	* ^цим.
Риакриламидном геле в присутствии додециле)	н
Г0,аЩснные белком с кажущейся молек) 'яр'диа.|из\ю1 пр<1|ИН
радающие интенсивной желтой окраской, с .илизации. В ,оМ'’1У ’
после че1 о они могут быть подпер! н),ы 11р<)водяг довЩ,ни,е 1
п°лученный белок не достаточно очиш
ВМии очистки.
I
79
мп>) уравноъешицакп
белка диализуют «рт» ц*
OEM -""',"" о <Х'’'<"С’'но«<'Л»ос',к " ”вТ’г
Ркол0''*- £ром- г" L' L«'’-C’'’'W’'WW' °*
К .м ium^cV*' rt пнбоФпат u<v промывают и««опч<Им
**Х«’’«**е К,"”олер*втего W мМ ’***^Х>
"V" ,„е^’ "* ,«cW«**** ««c«”w* ’V	Nn«Wio«c»»'”'”''’' ** ***»
«Ч** „V""' «» M’1'’* Ллю»«е’е’ np"
<*'*’** „<*** ' „.«лс'"'"’1' «ч«й 6cl'	следи’ очисти не ттм^,
v	шии-с»*'^ Мм Л*П»"’ ’ можно прибежуп, , tMv
“М	о’оло '2° „1, бел*»- ’* ..1С11ной ИОмМ 1рис-НСЦИ
«.*’** . H»'V"’ ,п (Ч*”в' ,„ о чпвв«овС ,пя1Н белка (чисти» fon*
"^ч А50-
5.2.	Получение апобелка
Для получения апо-белка флавопротеид диализуют 24-48 часов
6-10 смен 40 объемов 6 мМ НС1. Полученный бесцветный образец
можно подвергнуть дополнительному диализу против воды, а
лиофилизировать. Если нужно сохранить раствор белка, то полученный
образец апобелка диализуют 24 часа против 40 объемов 50 мМ Трис-НСирН
".5 и хранят в замороженном состоянии при концентрации белка, равной
мг мл. Замороженный белок стабилен в течение 6 месяцев. Концентрацию
апо-белка определяют, используя коэффициент молярного поглощения 5-! О4
М см при 280 нм.
Для полного удаления рибофлавина проводят катионообменн'.ю
хроматографию на колонке карбоксиметилцеллюлозы. Образец белю.
- 13 ранних этапах выделения, титруют 10%-ой соляной кислотой
। ? >ж на колонку карбоксиметилцеллюлозы (Whatman, СМ-
. ‘ I’ мл), уравновешенную 25 мМ ацетатным буфером.pH
мывают буфером уравновешивания до тех пор. пока
♦ at < ла при 455 нм (максимум поглощения рибофлавина <
LTd.-,r' .к ь,и<. ot(j| I Ьраллельно с этим происходит обесцвечивание «лтен
ю.кхы холобелка, сорбированного на носи геле. Апобелок элюируют -м
aiiciaiKuw буфером, pH 5,8. Фракции, имеющие оптическую w0™'\g
более 0,1 при 280 нм, собирают, объединяют и диализуют
дистиллированной воды в течение ночи. Спектрофотометр*^
определяю! концен(рацию белка (см. предыдущий абзац). ра^ива
маленькие порции (I -2 мл) и хранят при -20 °C в течение года. Белок (
лвер1п\|ь лиофилизации. В этом случае активность белка сохр***^ мГ
тлении нескольких лет. Обычно из белка 2 яиц удается получиТЬ
апобелка.
80
.„слеинс параметров
. н1.цим белком	"’"Ив
>•*

' кзК правило. представлв^'^Чатн,
Л"У	бели."6”1' см?4,,”»ь
О^^томехримески путем	м '*
О ”",ло,пе""я 6*пка)
^к» «Ч* 280 "м «ставлиет 4 fc"**’ m^****J*
,,«mv поглощения рибофлавина IIDM ?">* !&*"
чп, рибофлавин обладает заметным5 "М ’» Wu’
' >) поглощения в удьграфи рвением
>вка. Необходимая поправка может бы^"
И«*	‘ЫЧИЗД"’ с С?
х* :8"	 1,55 • A4S5,
поглощения, обусловленная наличием
остатков белка, Ал |	-
_.д поглощения, обусловлена! <»
av «у
присутствием рибофлавина.
ЛИ»’ — —
де А:яо неправ истинная величина
ароматических аминокислотных
лхперимен 1 лльно определенная величина ।—
наличием ароматических остатков белка, так и
Определив поглощение при 280 и 455 нм и исптзпп^ ри6Ч1а""“
формулу, можно определить степень насыщения бета S""'’ *“*
каждой стадии выделения, а также следить да удалением ри^ХТм^
получения апобелка.
Апобелок может быть использован для количественного определении
рибофлавина в продукт ах питания или в экстрактах из различных органов к
тканей. Принцип метода состоит в следующем. Свободный рибофлавин
обладает высокой флуоресценцией (кех 465 нм, к™ 525 нм». Связывание
рибофлавина с белком приводит к практически полном) тушению
.-opecuc. 1 Поэтому, зная концентрацию рибофзавинчмвыи1Я^
, бепж и его емкость по рибофлавину и титруя
увеличивающимися количествами белка, можно опреллнт^ 1авии.у>.>ст
^•уоресцснция будет полностью потушена,1е’коиа ^^1авиНа > «Ч**4
связан с белком. Для определения конце» ipauHH t . ^ц^цню •
!|^вод>| следующий эксперимент.	НЬмер»»
Следуемой пробе (А), после чего дооав-^в ^нц^рши*
иТированною рибофлавина (обычно до кг» (^^ченн>ю	w
и Тжь измеряю! флуоресценцию (О-
'Наилям увеличивающиеся количесэна i	w.ipy'°M ‘\^pcKIMK}l
1	,110 момента, koi да две или три следу винi <• флуоресиеннив-
^'Ровождаю.ся дальнейшим уменьюе» ие> Имея ,Pp^i^
^’иимальную величину флуорес^1 ecTi»o
^ресценции (А, В и О и зная кол
Я!
добавленного в пробу (R), можно определить количество пИб ж
исследуемой пробе по формуле R • (Л-В)/(С-A-В).	0ФЛааина й
Литература
I ВМ Коденцом. О.Л. Вржссинскм. В.В. Рисник АЛСокольнике,
В Б Спиричев. Выделение рибофлавинов»,ыиающего белка и,
г«и„ых »иц И его использование для определения рибофлавина ,
биологических образцах. Прикладная биохимия и микробиология За,
, MS Miller. Н.В. White, Isolation of avian riboflavin-binding protein.
Meth Enzvmol. 122.227-234, 1986.	.	.
. l Весхзг G Palmer. The binding of flavin derivatives to the riboflavin,
л. J. Beevar. U •'аиле	5607.56|7> 1W
4	^Amoresano, A. Brancaccio, A. Andolfo, M_ Perduca, H.L. Monaco, 0.
Marino. The carbohydrates of the i«> of the three avtan nboflavin-
binding proteins. Eur. J. Biochem. 263.849-858, 1999.
3.4. Исследование роли дисульфидных мостиков в поддержании
структуры и рибофлавин-связывающих свойств исследуемого белка
Рибофлавин-связывающий белок содержит 18 остаток цистеина, все из
которых участвуют в образовании дисульфидных мостиков. Восстановление
даже небольшого количества дисульфидных мостиков дестабилизирует
структуру белка и сопровождается существенным нарушением связывания
рибофлавина.
Реактивы
Раствор апо-формы рнбофлавин-связывающего белка (3 мг/мл) в 50
м.М трис-НС1, pH 7,5.
Исак.ивы для определения параметров связывания рибофлавина с
ри' -офлавин-связывающим белков (см. предыдущий раздел).
3.	Реактивы для определения сульфгидрильных групп (см. раздел
«Определение свободных сульфгидрильных групп и остатков
цистеина, участвующих в образовании дисульфидных связей»).
4.	Реактивы для проведения нативного электрофореза (см. раздел
«Нативный электрофорез при щелочных значения pH»).
5.	Колонка NAP 10.
6.	Трис-HCl буфер - 50 мМ (pH 7,5).
Порядок проведения работы
Приготовить две пробы (опыт и контроль) каждая объемом I
содержащие раствор апо-рибофлавин связывающего белка (3 мг/мл)в -
82
деоаннп. n	Пробу М м,
,1 Т?- n,llW1)iwww н опытную "робы , ,1М, v .,'
\ сл^'>”а'" N 4V'" s" *м """
X"1'
\0Л, WVVCM onwnu'u nVof'w ил <оппн«е NAM к,
\ /X	.„„H. белок O' wtom мсспнммпм B,nwr,,„
' Vf* rf»ll'"\u'OJ'f'e' uHivavi. пробы	оГлема (100-300 *"" • •»• "*
I XX "\лслУс' 1 . ^метрически опрсдспип, конненгрвдил ,
\ X\p»U*" спек"""' )ьф)ИдрИПЫ)ых групп. (Хпллннио. пробы (тмм
'	,1ОрЫх „обол"^* Срепка Провести илмсрснис парачстрпп с»>ы»п»«.
\ #' ’tec'*0 \ео*»”"СМ	п о в предыдущем рачделе. и срнтилсмтыткие
X Л(М с° как "°01	. и предварительно восстановленным 6е«ом
с пптактпьт''	ф интактного и прелаар™>««.
А»*' нат"в"Ь'еПка тСравнить электрофоретические подвижности
^Х5С^вле'"'оГ°
белков-
juinepamyPa
A. Kozik A. Disulfide bonds in egg-white к n
Auction studies. EurJ Biochem. l2I,	Chnnica|
4	. фосвитин из яиц кур
Фосвитин вместе с липовителлином являются основными белками
желтка куриных яиц. Фосвитин богат остатками серина и греонина и
подвергается фосфорилированию под действием нескольких прогеинкиназ. в
частности казеинкиназы второго типа. Обилие остатков фосфорилированных
аминокислот делает возможным связывание различных ионов
двухвалентных металлов. Именно поэтому фосвитин играет важнхюроль в
транспорте и переносе ионов, например, ионов кальция, и важен как
источник фосфора для развивающегося организма.
4	.1.Выделение фосвитина из яиц кур
^активы:
2.
3.
4.
5 куриных яиц.
Сульфат магния - 0,4 М (200 мл
NaCl - 10% раствор (50 мл)	деН
Ацетат натрия -0,1 М (pH qnfA.
4,5), содержащий Ю М	щ»Р*"**’
приготовить минимальное - а затем Д1*
200 мМ) раствора ЭДТ А с р ченИем Р1*-
ацетатный буфер с желаемым
U1
5.	НС1-2н(50мл)
6.	Ацетон.
7.	Натрий-фосфатный буфер - 0,1 М, pH 6,8 (500 мл)
8.	Трис-HCl буфер - 50 мМ pH 7,5 (500 мл)
Порядок проведения работы
Все операции проводят при 4 “С. Желтки 5 яиц отделяют от белков
взвешивают и измеряют объем. Удобнее проводить все эти операции в
пластмассовом мерном стакане. Полученные желтки суспендируют в з
объемах 0,4 М сульфата магния. После тщательного перемешивания к
полученной смеси добавляют равный объем холодной воды и оставляют на
холоду на 40-60 мин. Выпавший осадок содержит 73% фосвитина, 12% у.
ливетина и 15% липовителлина. Полученную суспензию подвергают
центрифугированию при 10000 g в течение 20 минут. Осадок, полученный из
40 г желтков, суспендируют в 80 мл 0,4 М сульфата магния и переосаждают
так, как описано выше. Полученный осадок растворяют в 10 мл 10%-ного
раствора NaCI и подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в
течение 1 часа для того, чтобы флотировать липидные компоненты.
Субнатант аккуратно отделяют и разводят в 20 мл воды, после чего
диализуют против 0,1 М ацетата натрия, (pH которого доведен до 4,5
уксусной кислотой) и содержащий 10 мМ ЭДТА. На этой стадии удается
отделить следы липовителлина, который выпадает в осадок. Осадок
отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 20 минут и диализуют
против дистиллированной воды. Полученный раствор белка подвергают
изоэлектрическому осаждению, добавляя 1 М соляную кислоту, так, чтобы
конечный pH образца стал равным 1,8. Осадок собирают
центрифугированием, промывают 50%-ным ацетоном в воде, а затем
ацетоном и высушивают. Обработку ацетоном можно заменить
лиофилизацией. Выход обычно составляет 0,3-0,4% от веса взятых желтков.
4.2. Анализ белковою состава полученных препаратов фосвитина
Гель-фильтрацию проводят на колонке Сефадекса G100,
уравновешенной 0,1 М натрий-фосфатным буфером, pH 6,8. Для калибровки
используют набор белков-маркеров с известными молекулярными массами.
Фосвитин содержит небольшое количество ароматических аминокислотных
остатков, поэтому желательно наносить на колонку достаточно большие
количест ва белка.
Ионообменную хроматографию проводят на колонке Q-сефарозы или
ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешенной 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, содержащим
0,1 М NaCI, используя линейный градиент соли 0,1-0,5 М (обычно 4-6
объемов колонки).
84
помимо ^'vro-pa^-----------------------------------
„«о*"* "Р" исподьзовацииеНИе Фосвй
,М ТРисНС1. pH 8,о, со^оику д^й эл^
^на. который собнра Р*а'«им	на
^омендуется наносить окоЛ( Раздел, *’ мМ >. К,Ни
рд-у-целлюлозы с емкостью М| бел3 /Ь" э*5'-
росения белка колонку Про°*°Ро I *' м„	5
0-лошсние элюата не буДст .Мь,"ают б** «а г 1",">»ан/1’*1Ч|^'
«омывают 2-кратным объема Me,,bu,e OnotCp°M у/''*’
М NaCI " стирают фрак 'М Мера, 'Чи	<
фосвипша злюируюТСя при koJр*аШиек ’"‘"и 0э<	. **»
„ри этом пик. элюируемый при	К* "р£'
>ше пика. элюируемогоР ^ации
спержанию ионов металла и псо? *
оптическую плотность ппи 7»п ДеР*анию а \ Пики ог11л 3чР*й
хроматографии и с использование”'	"°
уводят линейным градиентом NaaTn^
объемов колонки.	ЛаС| (0-0,5 М мя,.,И' "Р* Ло» ,_**
Гидрофобную хроматографию „по ' <’б““М *“* '»
.'равновешенной 0,1 М фоеЛатнмм ^“°д’т на колонке
сульфат аммония. Элюцию белка п бУФер°М' рН « сод^И'1’Сефа₽О1и
“ ................
составляет 6-8 объемов колонки. Ф Ния)-Общий
г**	J
4.3. Окрашивание полиакриламидных гелей красителем Stxins-AIL
После проведения электрофореза в полиакриламидном геле s
присутствии юдеци л сульфата натрия гели фикхир>к i н< 6о1|ТЬ ct
растворе, содержащем 45%-ный метанол (^о*и"*йЯД)тано;1 и iovhw
всеми мерами предосторожности.) или	шим образом 20 иг
уксусную кислоту. Готовят раствор stains-al u.
4>асителя растворяют в 10 мл формами	трис-HCL pH - “
сиачхэа 50 мл изопропан<т После фиксирования
Дистиллированную воду ДО 	красителя	иаэп*>
предварительно отфильтрованный Р‘	фоп>я>*'з«
комнатой температуре на ночь мн01е. Окраи*1"* o|MUitn м0Ж''
желательно проводить все операпю	П|х,ис;1'7ели "'’мсШ41‘"„ые
в темною	дистиллированной	24 ча1о..	в -,
продолжаться достаточно	н‘ после *11’ "
освещаемую поверхность и	aUienHoro 4й
происходит обесцвечиванис *\ние
сканирование или фотографчр0
85
Литература
Процедура выделения
I FJ. Joubert. W.ll. Cook. Preparation and characterization of ph()Svif
hen egg yolk. Can. J. Biochem. Physiol. 36. 399-408. 1958. ,n fr°m
2.	T.A. Sundararjan. K.S.V.S. Kumar. PS. Sarma. A simplified proccd
the preparation of phosvitin and vitcllin. Biochim Biophys Acta ч11Гс
362. I960.	’’J«k
Анализ белкового состава
I R.C. Clark. The isolation and composition of two phosphoprotcin
hen’s egg. Biochem. J. 118, 537-542, 1970.	s
2.	C. Conelly. G. Taborsky, Chromatographic fractionation of phosvif
Biol. Chem. 236, 1364-1368, 1961.	m- J
3.	R. Shainkin, G.E. Perlmann, Phosvitin, a phosphoglycoprotein j n-
Chem. 246, 2278-2284, 1971.	’ ’ bl01
4.	R.A. Wallace, J.P. Morgan, Chromatographic resolution of chi к
phosvitin. Biochem. J. 240, 871-878, 1986.	en
Окрашивание гелей stains-all
R.A. Wallae, P.C. Begovac, Phosvitin in Fundulus oocytes and eggs I
Biol. Chem. 260, 11268-11274, 1985.	'
5.	Выделение и изучение Са-связывающих свойств
альфа-лактальбумина молока крупного рогатого
скота
а-Лактальбумин является регуляторной субъединицей
лактозосинтетазы (УДФ-галактоза:Э-глюкоза 1-галактозил трансфераза, КФ
2.4.1.22), фермента молока, обеспечивающего синтез лактозы из УДФ-
галактозы и глюкозы
УДФ-i алактоза + глюкоза => лактоза + УДФ.
Фермент состоит из двух субъединиц - собственно
галакзозилтрансферазы, обеспечивающей перенос остатка галактозы на
различные углеводы, и а-лактальбумина, повышающего сродство
галактозил грансферазы к глюкозе. а-Лактальбумин представляет собой
низкомолекулярный белок (молекулярная масса 14,2 кДа) с
изоэлектрической точкой при кислых значениях pH (pl ^,8)
(идентификационный номер в базе данных UniProt P0071I). Структура о
лактальбумина схожа со структурой лизоцима, при этом а-лактальбумин
способен связывать катионы кальция, магния, а также цинка. В силу
доступности а-лактальбумин является излюбленным объектом исследованн
86
Г"’’
X
„ропссс” сворачивания полииеп.Мл
и качеств» доступного C-ma-Map^'"'0*
|11ИС ,..|ьф.-.тк..льбумин» н,
,, оборулппйннс:
*Пи, ,


содержаний 5 «м
..„нрснное м,,ло*° <”(’рат) I л.
,х й сульФат «ммония-
2*сР А: -,5° мМ Грис-Н(.’1 буфер (pH 7,2)
*;Lr Ь: 10 мМ Трис-HCI буфер (pH 7,2).
ь,фср В: 20 мМ Трис-HCI буфер, (рН 74.
гористый магний.
Колонка ДЭАЭ-целлюлозы (DE32) (4-5 х 10-15 см)
nd - 0.4 М раствор.
Порядок проведения работы
В работе желательно использовать нестерилизованное обегжиренш
молоко, однако возможно использование и стерилизованного молокГ*
низким содержанием жиров (например, «Домик в деревне» 0Л% жирности t
К 1 л молока при 20-25° С медленно с перемешиванием в течение 15-20
mhhvt добавляют мелко растертый сульфат аммония из расчета 264 г на ।
обрата. Смесь выдерживают 2 часа при комнатной температуре,
центрифугируют при 10000 g в течение 15 минут, и осадок, содержащий
преимущественно казеин, отбрасывают. К супернатанту добавляют сухой
сульфат аммония до конечной концентрации 4 М и оставляют на ночь на
колоду я формирования осадка. Суспензию подвергают
центрифуги лнию при 10000 g в течение 15 минут. Осадок (которым
может бы , очень неплотным и подвижным) растворяют в ИЮ мл
дистиллиро. иной воды и выдерживают ночь на холоду. В холодный
я ют 0,4 М НС1 до pH 3,5 и оставляют на 2 часа (или напечь)
Rd холоду. Суспензию подвергают центрифугированию при 10000 ,
,СНИе |' минуз и собирают супернатант и осадок. Суверна гант ш
'‘Р^ило, обогащен 0-лактоглобулином, а осадок - а-лактад ум**®*
‘"tpnaiauf тачала диализуют ночь против дис1И.ииро*шноН1кд *
•'*ле диализа выпадает осадок, то его отделяют ценгрифу
‘Синяки с осадком, полученным при июыекгрическ»-	мнЯ е10
ыик?4 НиЙ сУ,,сРнатан1 диализуют против буфер* _ нмже).
fXji / <,1|роноДН‘>с । ь и проводят ионообменную хрома '	осааиеним,
Раст^И11СННие осадки, полученные при июыекци и1>юг проги*
в 30-50 мл воды, содержащей 5 мМ аммиак.
87
буфера Б, измеряют электропроводность и проводят ионообменную
хроматографию (см. ниже).
Перед ионообменной хроматографией вес образцы поднерг
центрифугированию при 15000 р в течение 20 минуг и осадки °тбрасыва10т
Измеряют электропроводност ь суперна i ан га.	ели »лекгропроводН()с.^
супернатанта выше электропроводноеiи буфера , то >елковый обра^..
pawo.w холодной полой п«. чтобы электропротодность образца
равной или меньшей электропроводности буфера Б. Полученные образцу
наносят на колонку ДЭАЭ-целлюлозы объемом 60-80 мл, предварительно
уравновешенную буфером Б. Колонку отмывают буфером уравновешивания
и белки элюируют линейным градиентом (10-350 мМ Трис-HCl, рЦ в
общем объеме 6-8 объемов колонки. Фракции собирают и анализируют их
белковый состав с помощью метода электрофореза в полиакриламидном
геле в присутствии додецил сульфата натрия. В приведенных условиях, как
правило, удается обнаружить 2 или 3 белковых пика. В этих пиках
элюируется в порядке повышения ионной силы сначала а-лактальбумин,
загрязненный в различной степени р-лактоглобулином (~ 120 мМ буфер),
затем р-лактоглобулин, загрязненный а-лактальбумином (~ 200 мМ буфер)
и. наконец, Р-лактоглобулин, содержащий незначительные количества а-
лактальбумина (~ 250 мМ буфер). Собирают фракции, обогащенные тем или
иным белком, и после диализа против дистиллированной воды подвергают
лиофилизации. Если лиофилизация не возможна, или желательно получить
концентрированный раствор, то белок высаливают сульфатом аммония (516
г/л) и полученные пробы растворяют в минимальном (2-3 мл) объеме буфера
Б.
Если с помощью ионообменной хроматографии не удастся разделить
а-лактальбумин и р-лактоглобулин, то проводят разделение этих белков с
пом<»шью метода гель-фильтрации. При этом удается достичь отделения
; мерно - р-лактог юбулина (молекулярная масса мономеров 18,3 кДа) от
а шкзальбумина (молекулярная масса 14,2 кДа). На колонку
Р'д л. и Сефадекса G50) объемом 200-300 мл, уравновешенную
2-3 мл предварительно отцентрифугированного
। различные по составу смеси а-лактальбумина и р-
....с, элюируемом с Биогеля РЗО в объеме,
С,23 - 0,42 объемов колонки, элюируется р-
ором, довольно хорошо отделенном пике, с объемом
гомогенный а-
Белковый состав фракций анализируют методом
присутствии додецилсульфаи
белки, объединяют, диализуют
мономерного
Ьио1еля 1
буфером В, наносят
рас I вора, содержащего
лактоглобулина. В первом пике
составляющем около 0,36
лактоглобулин, а во вк
элюции около 0,43 - 0,50 объемов колонки элюируется
лактальбумин.
элекгрофореза в полиакриламидном геле в
натрия. Фракции, содержащие гомогенные
против воды и лиофилизируют.
88
--------------------------
р0. Капланас,
лактальбумина- компонен^’49»^
1975-	Та ВМл
2. U- Br,x,be'k- W L Ocnton N т "Хз?
ami identificalion of (|tt, () ’ N- urn
Biol-Chcm. 242, I39|-|3',r<,|'in (
j p.Cervonc.J.D. Brito, G‘ di‘l967-
R. Zito. Simple procedure- Г'’с°. F. П»
Mhcs proteins Biochim. Bm„°J’’Potion °f”‘
4 |).V. Schmidt, К P pK Hbys. / n
—;  Lbner-isoiali
«НЩ н
''""хич"’ *
• 'r- ТЬпад <ц._
“•L-G No,^ . .
»«' *кт1йсМкЛ’12Пв*'Ь.
W5,555-563,1973	"**
....,soiauon and properties of а-|аи.1к
'• 7 4sources. Bioctum. Brophys. Ma243,273-283, W1	"""fmm
L 2 Изучение С а-связывающих свойств
,краски блогов рутениевым красным а">Фа л’1а’-^уч1,н,
тем
Чтобы определить способность белков свя
пони кальция, используют несколько подходов B“Wn,M
предварительный электрофорез исследуемых белков в	'«•<-
геле. После электрофореза белки на геле могут - ахр"-1ам1,а"««
специальными красителями (например, stains-alh „ °ЫТЬ "poit’>a‘"'">-
связывающие белки особым образом или могут	£*
(блоттированы) на нитроцеллюлозную мембрану и «окрашены^ГТ
мембране либо радиоактивными изотопами кальция (например. вСв;’г -
специфическими красителями такими, как рутениевый красный
(комплексное соединение ругения с аммиаком). Помимо Са-связывающих
белков рутениевый красный может окрашивать мукополисахариды, а также
кислые белки, с которыми этот краситель связывается электростатичахи.
Из-за не очень высокой избирательности при окрашивании рутениевым
красным желательно иметь как положительный контроль (настоящие С>
связывающие белки, такие как кальмодулин или тропонин С), так и
отрицательный контроль (кислые белки, неспособные с выюким ь^дстяом
связывать кальций, такие как бычий сывороточный а- )
овальбумин).
рениевым кр*“ым *
5.2.1. Окрашивание белков Р> (дог-®-101'
<*з предварительно! о .лектрофоре»
.	-	вй-**’
геакзивы и материалы.	дср*а1ииИ	х
1. Буфер А. 10 мМ Трис-HCl, pH С°	а. М*
MgCh.	(3о n₽ltf^
Раствор рутениевого крае
89
3. Полоска нитроцеллюлозы.
На узкую полоску нитроцеллюлозы в виде маленьких точек
интервалом 1.0 - 1.5 см наносят по 3-5 мкл образцов исследуемых белков
так. чтобы в каждом пятне было 5-10 мкг белка. В качестве исследуСМы
белков мот быть использованы бычий сывороточный альбуМин
овальбумин, тропонин С. кальмодулин и а-лактальбумин. Нитроцеллюлозу
высушивают и токе воздуха и погружают в раствор ру гениевого красного на
30 мин при комнатной температуре. После окрашивания полоску
нитроцеллюлозы отмывают в нескольких сменах буфера А. Белки
связывающие рутениевый красный, выявляются в виде розовых или красных
пятен на белом фоне. Для доказательства специфичности прокрашивания
можно провести дополнительный эксперимент. В этом случае блог
окрашивают в растворе рутениевого красного, содержащего в дополнение к
перечисленным компонентам хлористый кальций (50 мМ). Ионы кальция
конкурирузот с рутениевым красным и делают невозможным окрашивание
Са-связывающих белков.
5.2.2. Окрашивание Са-связывающих белков рутениевым красным
после предварительного электрофореза в полиакриламидном геле
В том случае, если необходимо ответить на вопрос, есть ли в сложной
смеси белки, способные связывать кальций, сначала проводят электрофорез
в полиакриламидном геле, затем переносят белки на нитроцеллюлозу и лишь
после этого проводят окрашивание рутениевым красным.
Реактивы:
1. Реактивы, необходимые для проведения электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия по
методу Лэммли (см. стр. 36 - 37).
Раствор для переноса (блокирования) белков: 25 мМ Трис, 192 мМ
и ин. pH 8.3, приготовленный на 20%-ном этаноле.
твор Понсе S (Ponceau S): 0,3%-ный раствор красителя.
<)гов.1снный на 1%-ный уксусной кислоте.
t i вор для отмывания Понсе С: 5 мМ раствор Трис в воде.
Pean ивы, необходимые для окрашивания белков на нитроцеллюлозе
(см. выше).
Обращу исследуемых белков или смеси белков подвергают
ыеырофоре^у в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата
натрия по методу Лэммли. Вырезают 4 листа плотной фильтровальной
бума!и (Whatman ЗММ), соответствующие размерам геля и такого же
90
I нитроиеллюлоты- Помещают ЛНст
между >™«м и листами фИЛи'	,Ис,л«
И лоз- -с образовывалось пузырей
в прибор ял» электрофореза, следя м **"*• Cj
И<|олоэы располагался со стороны Полож «*•	£
>‘11'’ прибор для электропереноса для охлаждения п«. ’*”'**’’
Ь>м Проводят электроперенос белков с полиакри,^ *аи"0Ч1>
о’ пюлозу. Обычно для этой процедуры достаточно |7^° ги’
И°иСЛЛ д и напряжении 100 в.	ОТН°14 "*<>» при силе
Р 2После окончания блокирования раскрывают камеру и извлекаии гель
нитроцеллюлозы. Для проверки полноты „ ™
и 'оиламидный гель окрашивают раствором красителя КумассиТио
Г	аз ЮЛ «Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии
И Р1СЧЛьфата натрия»). Если электроперенос прошел успешно, то на геле
ДоЛсЦ,,'1е’гСя белков и они все перемещаются на нитроцеллюлозу, где
не ' за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий.
сор°иР> Д- 1ЮЛ03у помещают на 3-5 мин в раствор Понсе, посте чего
Нитроне- кольКИМИ СМенами дистиллированной воды. Белки связывают
Г1Ь1ВаЮГ выявляются в виде четких красных полос на белом фоне.
Понсе и ов отмечают мягким простым карандашом, после чего
ПМ" отмывается щелочным раствором Трис. После полного
fc Тнвания блот отмывают водой и помещают в раствор рутениевого
^пвечива. ия ...... комнатНой температуре. После отмывания иэоыпо
^н.,,0 па I м нпр,	ВЬ1ЯВЛЯЮТСЯ в виде розовых щзи красных
красителя С а-связывдющг	элеюрофореграммы молт оыть
полос на белом фоне. У „ й предел чувствительности при
просканированы на денситометре.	„ около 2 мкг белка в полосе,
вшивании рутениевым красным составляет около
Humenatnvpu	.
.	•	infraction ot* ruthenium
I. N.M. Charuk, С.Л. Pirraglia. R A.F-	123-131. lku
red with Ca2+ -binding proteins. .	: finding proteins to ov‘
2. M.T. Itincke, Routine detectton of caiciumiBi0chem. 170.
adsorption to nitrocellulose mem rane
1988.
91
6. Выделение и изучение некоторых свойств
кристаллинов хрусталика глаза крупного рогатого
скота.
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
Кристаллины являются основными белками хрусталика глаза
животных При этом на долю этих белков приходился до 35/о влажного веса
хрусталика. Высокая концентрация кристаллинов обеспечиваег
прозрачность и придает хрусталику определенный коэффИЦИент
преломления. Окисление и химические модификации кристаллинов
приводят к помутнению хрусталика и развил иго катаракты.
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
Рис. 6. Разделение растворимых белков хрусталика глаза методом гель-
фильтрации на колонке Sepharose CL 6В (2,5 х 90 см). На колонку наносили 1
мл раствора, содержащего 90-100 мг белка, элюцию
0,4 мл/мин. Рисунок взят из работы Horwitz et all.
1998).
проводили со скоростью
(Methods in Enzymology,
ри основных группы кристаллинов. а-Кристаллины
1МИ 1вух генов (аД- и аВ-), каждый из которых кодирует
" '' ,lvl,h 1 «иной 173 и 175 аминокислотных остатков. Продукты
И рис lajunma преимущественно экспрессируются в хрусталике, а
проиумы 1сна оВ-крииаллина экспрессируются практически во всех
гетептюпиг ,КаНЯХ 11 хрусталике аА- и аВ-кристаллины образуют
комилексм >Ме,)1'' КаК ||ранило со стехиометрией 3:1, при этом олигомерные
“ Р в?ависимости условий и различных воздействий имел»
шаперонно^шаивно °* 6°° Д° 5000 к^а> а’кРисталлины обладают т.н.
шаперонной активностью и счкм'пАш,
и сооны защищать другие белки хрусталика от
92
рванной Денатурацией.
^СЙСТВ"еМ улк^*и«л<п0,2'’М’
хрусталика входят е111с	п!*1'"»».,
"’л’1*6 ... им у-крнсталлнны. п	, 4 'м»*
>^'b^eporeBHVK> группу бел^^^м
о1 ’’ ”” КДЯ h" «елки , '"•*1"kmh7'W’"'”i4 «
милов' <|Ч I. (МЛ) или болм11п,;*г «ллч,;
,и< ол«1 к»* н<и~ *И'"МХ (РА)< ",|U’>p»,m *
< р.п*,С""С МОЙ 'РУ""Ы долил'" "'С"”С -ч
< ч?я ми'Тв111ИН0В нрелставлена т.н у-«пи«^^£>’ Фт
.<- ,сны либо мономерами, либо малыми ro'”"”4" М <.’”•*
имеют « WP1^ массу около 20 n^1”^
,(1ъ смесь кристаллинов хрусталиков глаз». Р*п' "«2?*"'
;;................
! выделение и разделение кристаллинов
М|Тсрналы и реактивы:
1.	Гомогенизатор стекло-стекло на 10-20 мл
2.	Колонка 2,5 х 90 см, колонка 1,5 х 20 см
3.	Хроматографические носители: Сефадекс Ж *
Сефакрилы S300 или S400.	“ еФатхпа ьв,
4.	Буфер А: 20 мМ трис-HCl, 0.1 М NaCI, I мМ азида натри,. рН7Л
Порядок проведения работы
ж..™..»	.«»»—г™
Два хрусталика телят (весом около , РОмм пж-HCl o.i мм£1
шариковом гомогенизаторе в 4,8 мл буфера . (- ' К1 хрусталики г.1К»
им азида иирия, pH 7,9). Если в Р’6^
ФСШХ ЖИВОТНЫХ. ТО ^Г^цен^льной части
корковый слой хрусталика, i.k. в ц р частично	мниШы
накапливается довольно большое ^^0,. После
и-'1м химически модифицирована ение 20-^ миН н 1М)Д*Р‘*>|
жгракция может быть продолжен^
аккуратном перемешивании.	30 мин	&** ”
н«Фифугированию 12000 g "-еделямт хйН“*|^Х*’
’"фасываюг, а в супернатан1С ‘	сУПвРнаТ#И । югнл4* "р "цмини
Шираки очень маленькую вликж">
'вмогенизации в 100 ра* и иЗМСР10И 280 нм с<мП
1-ДИница оптической плозиоечн
о;
белка в 0,5 мг/мл. Обычно при такой процедуре экстракции суммап
выход белка на этой сталии составляет около 450 мг.	Нь*й
00-100 мг белка наносят на колонку Сефарозы CL-6H объемом 450
В качестве носителя могут быть использованы глюке ( ефакрил S300
S400, а также Сефадекс 0200 или BioOel А 1,5. Хроматографию проволг!
при 3-5 V. рекомендуемая скорость элюции (для Сефарозы 6В) состав/*
около 0.4 мл мни. объем фракций от 3 до 5 мл. Обычно на профиле элющ^
удается выявить 3 или 4 пика. В первом пике элюируется «-кристаллин **
втором и третьем (эти пики как правило плохо разрешаются) элюируете* r
кристаллин, и. наконец, в четвергом пике элюируется у-кристаллии
Белковый состав всех проб анализируют с помощью метола электрофореза R
полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракпии
содержащие очищенные кристаллины, концентрируют, концентрацию белка
определяют спектрофотометрически, полученные фракции разбивают На
маленькие порции и замораживают. Можно собрать интересующие
экспериментатора фракции, отдиализовать их против воды и
лиофилизировать. В этом случае при дальнейшей работе порошок белка
растворяют в буфере необходимого состава и центрифугирую при 11006g в
течение 5 мин для того чтобы удалить незначительное количество не
полностью растворившихся белков.
Если ставится задача получить гомогенные препараты аА- и аВ-
кристаллина, то полученную фракцию а-кристаллинов подвергают
ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе в присутствии высоких
концентраций мочевины. Для этого 300 мг фракции а-кристаллинов
растворяют (или диализуют) в 0,04 М ацетатном буфере (pH 5,0),
содержащем 7 или 8 М мочевины. Белок наносят на колонку (1,5 х 20 см)
СМ-целлюлозы (СМ52 Whatman) и после промывки от несвязавшихся
белков элюируют линейным градиентом (общий объем 500 мл) 0,04-0,20 М
ллетатчого буфера, приготовленного на 7-8 М мочевине. Скорость элюции
объем фракций 2-4 мл. Анализ белкового состава полученных
проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле в
1 и додецил сульфата натрия. Фракции, содержащие гомогенный
•и центрируют, диализуют против 10-20 мМ трис-НС1 (pH 7,51
* пего 5 мМ меркаптоэтанола и лиофилизируют.
‘•2‘	•"««ероиоиодовиой активности
нюни. । и а-кристаллинов
rruil
мг/мл а-крисгаллина и^) 15 м г/м МИКрокюветах (600 мкл), содержащих 0,015
- и J00 мМ NaCI. В качееп /  сграта u $0 мМ фосфатном буфере pH
кРисгаллин. Образцы нагоена»/, )с,ра,а используют -кристаллин или у-
з'Регацией субстраза но изм .. • "Омощь,° термостата до 60 °C и следят за
гмерения проводят при	О1Ническ°й плотности при 400 нм.
И ВаРьиРУемых концентрациях шщ^концентРаиии белка-субстрата и
94
’ I Hor*te ° L Din^ M.P ...
' tike proper"cs- Methods in cn/.ym0|,)gy .ад »<>ч. 1ЛВ,
Weinr«b. М.Л.М. van Hockcl, л. |>„vr®’	’С,ум"""’
1 м on the chapcrone-hkc properties of y ' " '‘^mend.1, P(fo, ,
,.V.A visual Sei. 41.191-198,2000.	* old
x ponce. 1- Takcmoto, Screening of crystallin,	*
’^equilibrium dialysis. Mol. Vis. 11, 752-757 г™0'”8"" ™"«*
₽< W *lk Jong’ F‘S M- Van KlefT’ H- BloeS5L_
. j degradation of ‘he aA chain of a-crystallin. Eu' в^'"^
4	Л ВюсГ*т. 4». 271-
' ' л Biswas, P. K. Das, Role of ATP on the interaction nf
. "tes and its implications for the molecular chaperone fi°'C?Mall'n Wl’h
its ^ 42648-42657,2004.	ChaperOne ^‘O"-1 Biol,
them-2
l выделение цитохрома с из сеоди*
рогатого скота и изучение некотооы^020
его свойств
Цитохром с является одним из компонентов а1л™ -
участвует в переносе электронов от бел дыхательнои цепи „
шггохромоксидазу. Белок имеет малую молекулярную м~от ’ “
своем составе гем. Являясь хромопротеидом, цитохвом	’
в качестве белка-стандарта при определении молекул,рнТмхГмХ”
фильтрации и при определении изоэлектрической точки V™
7.1.	Выделение цитохрома с
Реактивы и материалы
1.	Трихлоруксусная кислота (ТХУ) - 0,145 н (750 -1000 мл).
Внимание! Трихлоруксусная кислота крайне ядовита и вызывает
ожог ина коже. Работать только в перчатках.
2.	NaOH - 10% раствор (50 мл).
3.	Сухой сульфат аммония.
4.	Трихлоруксусная кислота - 20/о раств
5.	Фосфатный буфер -20 мМ, pH ,
NaCl, 0,5% раствор.
О’фм.юк приведения pa6o, bl
Замороженную или свеж>н
*ира и соединительной 1кан
ткань сердца (800-1000 г) очищакн от
и пропускают мере! мясорубку. К
95
ппи перемешивании добавляют раствор 0
полученному фаршу медлен . Р Р ( д кислоты на кг ткани Начальные
н трихлоруксуснои кислоты иэртс модифицированы. в этом случае '
стадии “Деления м уг лобавляют 800 мл воды и гомогенизируй
полученному фаршу (	полученной суспензии медленно „та.
ножевым гомогениХ^ют 200 мл концентрированного раствора
перемешивании Д< < '	чтобы конечный объем гомогенат
яд— - ->т- »». “s
бГмвжТо 145 н. Концентрация кислоты должна быть точно определена
зибГпХ, пирования, либо, если используется более концентрированная
кХта которая потом разводится, по измерению плотности раствора. (При
титровании в качестве индикатора можно использовать бромтимоловый
синий, область перехода окраски pH 5,8-7,6 желтыи-зеленый-синий.
Плотность 20% раствора ТХУ 1,1035 г/см , с 2,29 М). Через 3-4 часа
полученную суспензию подвергают центрифугированию и фильтрованию.
pH полученного фильтрата доводят до pH 7,3 104 NaOH и добавляют сухой
сульфат аммония из расчета 500 г/л. Через j0-60 мин полученную суспензию
центрифугируют. К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония
из расчета 50 г/л и оставляют на ночь при 0-5 С. Если при этом образуется
осадок, то его удаляют центрифугированием. К прозрачному супернатанту
добавляют 20% трихлоруксусную кислоту из расчета 25 мл/л. Осадок
выпавшего цитохрома собирают центрифугированием, суспендируют в 300
мл насыщенного раствора сульфата аммония и вновь центрифугируют.
Полученный осадок растворяют в 0,5% NaCI (или в воде) и диализуют либо
против 0,5% NaCI, либо против воды.
Дополнительная очистка цитохрома с может быть достигнута путем
проведения катионообменной хроматографии. В оригинальной методике в
качестве носителя использовался Amberlite 1RC-50, однако этот носитель
может быть заменен на КМ-целлюлозу. Колонку катионообменника
уравновешивают -0 мМ фосфатным оуфером pH 7,0. Связавшиеся с
катионитом белки элюируют линейным градиентом NaCI 0-1,1 М NaCI.
Полученный белок диализуют против воды и лиофилизируют.
R HM*Ic.ieHiiH желательно исследовать спектральные свойства
,\1ка ' ',я	' Г ‘;1ф\ ют спектры поглощения полностью окисленного
1	(елейного препарата белка) и полностью
в<) .	1 1И“ю,1И|ум ширил белка. Готовят раствор цитохрома с в
интервале Ж^Гнм И РегистРируют спектр поглощения в
поглощения в вилмм кисленная Ф°Рма белка имеет максимум
Форма цитохрома с - около 4МИ СП.С1КГра °К0Л0 406 нм’ а восстановленная
белка появляются mi нм- Помимо этого, у восстановленной формы
нм. Для получения 1юсем,Ь,Х "° амплитУДе максимума при 320, 520 и 550
в воде на кончике шп ановлс,,ног° препарата белка к раствору цитохрома
нагрия и инкубируют Un *14 до^авляют небольшое количество дитионита
- Р>ют при комнатной температ>ре |015 минут
96
jttrP0
E.F. Hartree. Purification and n,
Kel39,289-292. 1945.	^"Penie, ((f
^^"I’liash. J- Lustgarten, The chromato™ L cy,'lthft»>i, ,
MtfJU Sci. 94. 731-740. 1961.^"’^^
ill.	Ю	c
.„»» ”"..............."... ”
if'
мстоля
nr
I ;v.->
Обе сульфгидрильных группы
Поэтому ни одна из групп не JJoMa с „
: ^ть количество остатков u„cX^Л ’'***»»
! зрительно провести удаление гем» Нна » к™ т<*о тгпк
лепление тиоэфириой связи, обссоеГ^"
!^сгся с помощью обработки цит"п*Юи™ "p„x ‘^S^nn
/реакции остается не вполне понятным .	3 сод«*и се^ Ние '**.
। реакции образуется комплекс
I ,чтагков цистеина. Таким обр^ра С ^ДиашХ ’Оле
(жоэфирнои связи И удаления гем» ’ СразУ посте
] ^™ыми лля опред„я Позт °СТаткн нистеина оп,^‘иелк*>"
-проста отделение „опое серебр “ СЛедУ“Шем ттап’в^^
опредезениеосвободившихсяЗНгрупп. К° после Пото Х°Ммо
Провес I и
। Реактивы:
j I. Уксусная кислота - 0,1 и 0,2 н.
2.	Сульфат или нитрат серебра - 0,8% раствор
3.	Уксусная кислота-ледяная.
4.	Аммоний ацетатный буфер - 50 мМ раствор, pH 5,0.
Ацетатный буфер - 50 мМ раствор, приготовленный на 6 М г\анидин
I мюриде, содержащем 1 М дитиотрейтол (pH 5,0).
;	6 Колонки NAP-5 и NAP-10.
Порядок проведении работ ы
X	( () (
()q 'la,0,рафии / Мкм°ль) очищенного с помощью кагиоожмюменной
супа?УДОба«ЛЯ1о?л^РОМа С РаСТВ0РЯЮТ » I мл воды. К патученному
км ^а7а ^ли ш". ЧЛ лсдяноЙ уксусной кислоты и 1,5 ы.1 0,8% расгвора
це( ,,(,,е в lc1yXilll) cePc^pa. Полученную смесь инкубируют при 42 <- «
^АрРИФУ,иров1.еНае 4 час°н. Обраювавшийсм iwwok 1ч?ма уда-uuoi
Уравнп 1Ием' Учернатант подвергают гель-фильтрации на каюнке
Ве1ненной 0,1 н уксусной кислотой и собирают фракции.
97
... часть оста»”'«гос" " растворе гем,
В^^^опрслелакя КОШ’»"’?»’»"0 Энного
соМГ«*’“*^н.ине к’’-’0''»*Х ^РУ*" С"е,<ГР "™м" •
££»	«м *я* белок ЛН^ИЛИТИРУЮ» и растворяют .
—миис	iWiy*’”"’*" . , .„„.pwaiiiero 6 М гуанидин хлорила
noZ* >**"? "1 .не’»’* -монн Г (w
2 мяса при 25 Т я темнепе
^m1'CM'SXp’,5-° ’’’f'^aZ <"сР,’"'ИО> М*ртМГТИД '
, м ли"”"’4	„«.„„.-«ясный >кад" оП11Ием. Супернатант подвергают
'ла.л««’Т "''"Ж'^уравновещенной 50 мМ аммоний
,итмоП*#п'п' . колонке NAP ’• >’ содержащие апочитохром.
rew^’Kipan"' _п 5.0. Собираю’ *Р ом₽п,ически по поглощению при
’«^3,6Кониен1ранню cl’^*Cp*3’”” сульфгидрильных групп.
5SX-.........
подкисленного анетона (’мл
Литература
1.	W.R. Fisher. Н. Taniuchi, С.В. Anfinsen, In the role of heme in the
formation f the structure of cytochrome c. J. Biol. Chem. 248, 3)88-
23195. 1973.
2.	S. Sano, K. Tanaka, Recombination of protoporphyrinogen with
cytochrome c apoprotein, J. Biol. Chem. 239, PC3109, 1964.
3.	K.G. Paul, The splitting with silver salts of the cysteine-porphyrin bonds
in cytochrome c. Acta Chemica Scandinavica 4, 239-244, 1950.
4.	R.A. Peters. R.W. Wakelin, The splitting of some thio-ester linkages by
silver salts under mild conditions. Biochem. J. 41, 555-558, 1947.
8. Выделение и изучение некоторых свойств
оеотрансферрина из яиц кур
Овотрансферрин о
грансиорл	' большому классу белков, отвечающих за
" "»<нрансферрина приходится около 10-
кДа, имес| jb;i и..	’tl0K, имеющий молекулярную массу 80
сушсс!вснно в 1иис1	железа. Связывание ионов железа
на сю устойчивое и. ( . * 1 S И сво^ства °вотрансферрина, в частности
()вогрансфсрриц облаке? 111 ,):н *‘,ч,,ь,х нРотеолитических ферментов.
a,CIявностями.	сраженной антимикробной и антиоксидантной
9Х
gj. Выделение
овотрансферрина
реа**гГИВЬ1
1	4-5 куриных яиц.
2	FeClvdHiO - 0,5М раствор
3.	Лимонная кислота - 50 мМ раствор
4	Охлажденный этанол.
5.	Цитратный буфер - 10 мМ (pH 5,6)
6.	2 стакана на 400 мл.
7.	Стакан на 1л.
8.	Делительная воронка 300-500 мл.
9.	Центрифужные пробирки на 250 мл 4 шт
10.	Ионообменные носители (карбоксиметил-целлюлои,
карооксимстил Toyo-Pearl или аналогичный, QAE-Sephadex или О
Sepharose).
П. Хроматографическая колонка на 50 мл.
Порядок проведения работы
Отделяют белок от желтка и добавляют равный объем воды. Доводят
pH раствора до 8,0 с помощью 50 мМ лимонной кислоты. Для стабилизации
белка к 1,0 л полученного раствора добавляют 1,6 мл 0,5 М раствора
FeClv6H2O. Раствор перемешивают на магнитной мешалке 10 мин и
оставляют при комнатной температуре на час. После этого к раствору
медленно при перемешивании добавляют холодный .этанол до конечной
концентрации 43%. В приведенных условиях происходит осаждение
овальбумина и некоторых других белков яйца, а овотрансферрин,
насыщснн in железом, остается в растворе. Полученную суспензию
зодвср! • центрифугированию (3220 g, 40 мин). Супернатант собирают, а
кадок нюрно экстрагируют 250-300 мл 43% этанолом и подвергают
тентриф- ’рованию в прежних условиях (3220 g, 40 мин). Собирают
:уперн !н и смешивают его с супернатантом, полученным при первом
1ешри(] ировании. Объединенный супернатант фильтруют через
’ in фильтр. К полученному раствору медленно, при перемешивании
юбавляю! холодный 96% этанол до конечной концентрации 63% и
>С1ав. 1якл на холоду на некоторое время. Выпавший в осадок
Дялрансферрин собирают центрифугированием (3220 g, 20 мин).
Слученный осадок овотрансферрина растворяют в воде. Выход составляет
жоао 6-7 мг/мл из расчета на дважды разведенный раствор белка яиц.
Если степень очистки белка оказывается недостаточно высокой, го
1ап»нейшую очист ку можно проводить, используя метод ионообменной
<ро.маmi рафии. Возможна очист ка на анионообменных носителях. В этом
-1>1,ае препарат неочищенного овотрансферрина подвер! акт
1ен,рифугированию и образовавшийся осадок отбрасывают. Колонку
99
, ипавновешивают 50 мМ трис-HCl рН
логичного носите-1”1' двергаюшего«1 очистке белка
сефарозы (или а”^ГЙЧ0Т количества большую (50 мл) колонку
9,0. В	небольшую (30 мп>’	белка. отмывают колонку
используют либо носитепя. Нанос" Р буфера уравновешивания) и
хроматографии^	материала (4-6 о(*с ‘ ^емов колонки) буфером,
от несвязавшегот	здюциЮ (4 о	^б определяют методом
проводят гради У Белковый со сннь1С белки диализуют
свдерЖТХ, в полиакриламидном теле.
электрофореза
против воды и лиофилизируют.	кати0нообменниках. В этом случае
Возможна очистка белкаr qj м ацетатном буфере рН 5 , и
образец овотрансфсррин рпредварительно уравновешенную
наносят на колонку С - Ф- связь|вается с носителем, а примесные
тем же буфером. Овотрансф рр буфером уравновешения. Образец
белки удаляют промыванием кол Хцентрацию буфера до 0,5 М
белка элюируют, ступенчато повышая	Р Qenhadex G50 или
ацетатного буфера. Белок обессоливают на колонке Sephade. 0
диализуют против воды и лиофилизируют
8.2.	Удаление ионов железа и исследование связывания ионов металла
ано-овотрансферрином
Для удаления ионов железа и получения апоформы овотрансферрина
предлагается следующий подход. Раствор холо-овотрансферрина доводят до
pH 4,7 0,5 М лимонной кислотой. В этом случае образуется хелатный
комплекс цитрата с ионами трехвалентного железа. Этот комплекс
связывается с анионообменником, в качестве которого можно использовать
Dowex I или Serdolit (blue). К 100 мл раствора овотрансферрина (6 мг/мл)
при pH 4,7 добавляли около 1 г анионообменника и перемешивают в течение
часа, следя за тем. как исчезает оранжевая окраска, обусловленная наличием
комч 1екса цитрата с железом. Образец фильтруют, диализуют против воды и
лиофилизиру ют.
, . определения емкости по ионам железа или меди апобелок в 10 мМ
Н( . 1ержащсм 10 мМ N аНСОз (pH 8,0) или в 0,1 М NaHCO3 титруют
оч иаексов нитрилотриацетата с ионами двухвалентой меди или
к-1 ною железа. Связывание ионов железа или меди с апо-
' неферрином сопровождается появлением на спектрах поглощения
и леча при 330 нм и появлением дополнительного пика при 470 нм (для
ионов железа) и при 440 нм (для ионов меди). При этом 1% растворы
комплексон овозрансферрина с ионами трехвалентного железа обладают
поглощением 0,62 при 440 нм, а аналогичные комплексы овотрансферрина с
ионами меди обладают поглощением 0,57 при 440 нм. За связыванием ионов
металла с апо-овотрансферрином также можно следить измеряя
флуоресценцию. При этом связывание ионов металла сопровождается
1 лл
CBeTOM г
АПИНой вол
Лны 295 нм
АvopecueHmnrBO36y^aa17oft
^^’рв
V" .« Alshamman . S. Khan, A. Jawed, М. Adnan м кн
s Haque, Optimization of extraction
И >»> ° °' Д” ™~' “-Л
2- К large-scale production of ovotransferrin from egg white Рмл'
for'he,’a8r7S 1441-1450,2°°8.	“
Scie.vCM Keung, P. Azari, J. L. Phillips, Structure and function of
3- W ferrjn. J. Biol. Chem. 257,1177-1183, 1982.
ovotran8 Leboffe, G. Pitari, R. Ippoliti, G. Antonini, Physiological
4’F' fOvotransferrin. Biochim. Biophys. Acta 1820,218-225,2012.
roles of ov Wang, J. Wu, Co-extraction of egg white proteins using
5. D.A ma ‘ ’ hromatography from ovomucin-removed egg whites,
ion-exchange	(2010.
J.Chromat. В» • formation of iron-binding fragments of hen
totr Jrr'n by’	ii
;h;\wo Sending Sites of ovotransferrin. Biochem. J. 145,201-207,
1975.
9. Выделение и изучение некоторых свойств
пероксидазы из корней хрена (Armoracia rustinicana)
Пероксидаза широко распространенный фермент, относящийся к
класс) окси юредуктаз (ЕС 1.11.1.7) и катализирующий реакцию:
Юнор • 11гО2= окисленный донор+2Н?О,
"ри этом в качестве доноров могут выступать pai
(ароматические полиспирты, амины и другие соедиН^’|ОПрОТеИном, имеет
Пероксидаза хрена является глико- И'	слогНы\ остатков) и
Мп-текулирную массу около 40 кДа (305-35 а отличаюшихС1
•’Pcjciub лена в виде нескольких изоферм	и
аминокисло гному составу, изоэлектрическ В состав пер^жсил
^'исахарндов, связанных с полипептидно ц^одяшее также в ^мо
'°АИТ нротопорфнрин IX (соединение, паточно легко и низк0Й
Ч1ем°глобина). Протопорфирин может ы киСЛотой ацетона
>Дален под действием подкисленного соляной кисл
101
температуре. Ион железа координироввн четырьмя атомами
порфиринового кольца и одним лигандом н» состава поли пептидной (/<ГГа
Шестое положение могул га ни мять различные лиганды, такие как CN'
Н?О. Связывание некоторых лш видов (таких как цианид или суЛ|>фИЛи
используемых даже в очень низких концентрациях (10 -10АМ), приводи^’
ингибированию фермента. Образование комплекса между некеггор/ *
лнганламн и ионом железа можно обнаружить спектроскопически
например, пероксидаза хрена образует несколько разных соединений**’
перекисью водорода. Соединение I (зеленое) образуется при связывании i
моля перекиси водорода на моль фермента и имеет максимумы поглощен
при 658 и 407 нм. Это соединение неустойчивое и легко превращаете/*
соединение II (красное), в котором на моль пероксидазы связан один моль
перекиси водорода (максимумы поглощения при 530 и 417 нм). Зачастую
соединение II рассматривается как классический фермент-субстратный
комплекс. При действии большого избытка перекиси водорода образуется
соединение 111 (красное) с максимумами поглощения при 583, 545 и 417 нм
4.1.	Выделение пероксидазы из корней хрена
Реактивы:
1.	КН2РО4-0,1 М(0,6л)
2.	Сульфат аммония.
3.	Центрифужные стаканы на 250 мл (4 шт).
4.	Широкогорлая воронка.
5.	Фосфатный буфер - 10 мМ (pH 7,0), 1 л.
6.	Ацетатный буфер - 30 мМ (pH 4,7), 2 л
Ацетатный буфер - 100 мМ (pH 4,7), 700 мл
8.	Ацетатный буфер - 250 мМ (pH 4,7), 500 мл
9	Трис-HCl буфер - 5 мМ (pH 8,4), 1 л.
Трис-HCl буфер - 5 мМ (pH 8,4), содержащий 100 мМ NaCI.
Порядок проведении рабоид
Корни хрена ( 200 г) очищают, измельчают на мелкие кубики,
пропускаю! через мясорубку и гомогенизируют в —300 мл раствора К.Н2РО4
(paciвор I). Полученный гомогенат оставляют на механической мешалке на
2-3 часа и центрифугируют (14000 g, 15 мин), супернатант фильтруют.
Осадок повторно экстрагируют 300 мл раствора фосфата калия и оставляю’
на ночь на механической мешалке. Гомогенат подвергают
центрифугированию, как эго описано выше. Супернатант смешивают с
супернатантом, полученным на первой стадии экстракции. К полученном)
прозрачному раствору добавляют сухой сульфат аммония до ’- °
насыщения, оставляют на мешалке на 30 минут и центрифугируют
102
1ЯинЫХ условиях. Осадок OT6pacbIflni
Х’.'*3 ’фат аммония до 85% насыщения
"лн на "°..' ХОЛОДНОЙ «омнате	Раст2Л0ба"-”"»
l?-*'казан..... условиях и собираю, ос' лят ^ири!
, ^'"‘'.о-зелсный цвет. Растворяют осадок ’'Оторый Л,,"’***'*
‘ М фосфатного буфера pl I 7 0 и ли ИмимальнОм Им«ет
Р РН 7.0. а затем п^НвД&
Л- чГОбЫ Уб7"” СЛСЛ0ВЬ'С количсства судХаТН0Г°	Р ' "
‘ Р.;.к«т центрифугированию и собирают супео’ аММОНН" Ли«
<ат пероксидазы). После получения
^.„сида’Ы желательно определить так
|Hl?uгавлякнций собой соотношение оптической г- Мыи
для этого следует зарегистрировать спектр погадеии."
Препарата белка в воде при концентрации 0,5-1,0 мг/мл
^шейного фермента он может быть больше 3) дает п
гемина- Дальнейшую очистку фермента
^пользованием комбинации хроматографических методов.
изат
неочищенного” ±„еНИЫЙ
инде« Т/
"Лености при 403 И 27}
полученного
индекс (у
содержании гемина. Дальнейшую очистку ферментГ^Г с
использованием комбинации хроматографических методов
Неочищенный препарат пероксидазы титруют уксусной кислотой до
pH 4.5, проверяют электропроводность и pH. В том случае, если
электропроводность превышает электропроводность 30 мМ ацетатного
буфера с pH 4,7, то образец белка разводят водой. Полученный таким
образом образец белка наносят на колонку (2,5 х 20 см) СМ-целлюлозы.
предварительно уравновешенную 30 мМ ацетатным буфером pH 4,7. Не
сорбировавшийся на колонке белок собирают и измеряют величину RZ, а
также ферментативную активность. В «проскоке» с колонки карбоксиметил-
целлюлозы элюируются изоформы пероксидазы, имеющие изоэлектрические
точки при кислых значениях pH. Эти изоформы могут быть очищены с
помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (см. ниже). Отмываю i
колонка 4 объемами буфера нанесения. Проводят градиентную элюцию 500
мл ацетатного буфера pl I 4,7 (250 мл 30 мМ ацетатного буфера pH 4,7 и 250
мл 100 мМ ацетатного буфера pH 4,7). После окончания элюции промывают
колонку линейным градиентом ацетатного буфера общим ооъемом мл
(250 мл 100 мМ ацетатного буфера pH 4,7 и 250 мл 250 м	’ ие
РН 4.7). Анализируют профиль элюции и собирают фракци , сидазы
максимальным поглощением при 400 нм. Измеряют а*тив^ав получеНных
ь отобранных фракциях и анализируют оелковы * ПрИСуГа»ни
Фракций методом электрофореза в полиакриламидн рехроматографию
Додецил сульфата натрия. При необходимости про в вышеописанных
собранных фракций на карбоксиметил-иеллю.
Условиях.	диализую^ прогни 5 мМ
Не сорбировавшийся на КМ-целлюлою елок	дздэ-целлюло»ы,
W-HCl pH 8,4 наносят на колонку (2,5 х ’ Буферная емкость
чредварителыю уравновешенную этим y[J^ro4HO малы, поэтому
Указанною буфера и его концентрация времени. Для ускорен
)Равнове1нивание колонки может занять
103
uun колонку несколькими объемами
.„..ник мн*"”	50 мМ трис-НС1 pH Я.4), а
происсс» >^’"'Х.иш"” «У<*Р*	ЛИМОЙ коннсгтркнии. Пекле
бо^- мной-"” ”M(W„.y буфером Н Г ( белка, чромымкп 2-4
«тем 01ММН-	м,яоч«У ««нос сорбировав1пиес« на колонке
ур»"*’*’"” ' WTO буфер» " С,*'Р „инейным градиентом соли оба*
X—ми '"’X. <*'"<” ™’ИРУКЦС оН М " ’"° МЛ 5 ММ ГрИС-НС’ РИ
ГХомХ»	фpa,<,lИ,, и aHMOTWW их
белковый СОСТ*В
9.2. Измерение пероксида той активное! и с пирогаллолом
Реактивы:
Реактив А. Калий-фосфатный буфер - 100 мМ (pH 6,0 при 20 °C)
Реактив Б. Перкись водорода - 0,5% раствор (приготовить 50 мл на
дистиллированной воде, используя 30% исходный раствор перекиси).
Реактив В. Раствор пирогаллола - 5% (вес/объем) в воде (готовить
свежий раствор при каждом измерении активности, защищать от
света). Если коммерческий препарат пирогаллола окажется плохо
растворимым в воде, то полученную суспензию следует либо
отцентрифугировать, либо отфильтровать.
Реактив Г. Раствор пероксидазы (хранить на льду).
Проведение реакции
Состав проб (мл)	Опыт
Вода	2,1
Реактив А	0,32
Реактив Б (перекись водорода) 0,16
Исак।ив В (пирогаллол)	О Д'»
Контроль
2,1
0,32
0,16
0,32
11еремсша।ь тепм<м*т
°'"и'^кой плотности „рн 42о н°В,1.1>. ПРИ 2® Убедиться, что величина
Далее добавить к ош l luv '* °иастся постоянной.
плот?ФСРа (реак',ин A), iiepeMei^06^ 0,1 МЛ ФеРмента’ а в контроль - 0,1
плот/i° 1Н 1РИ 420 нм ь Учение 5 11 " измеРять изменение оптической
сги при 420 нм На линейном МИ” ()пРеделить изменение оптической
ЙН°М Участке измерения активности.
104
1.
;М;О
осн<
HfO>
сн>о
MH;
OxKftztd о dtani«>dm«
o-diantaKNne oxydi
P^rctKi»»»
p^tydM*

осн,
активы
Реактив А. Ацетатный буфер. 50 мМ
Реактив Ь. Псрексись водорода - n lu1 2 3 * 5
(готовится свежим из исходного 30% паства РасгвоР пеРекиси
Реактив В. Солянокислый о-дианазидин	°P°"
н“и’5/» раствор
Проведение реакции
К 2.75 мл ацетатного буфера добавляют 50 мкл раствора цианид
" JOO мкл О I М раствора перекиси водорода. Стартуют
давлением 100 мкл раствора фермента. Измерение активности пмвоТ
при 30 (, регистрируя изменение оптической плотности при 460 нм
Считается, что миллимолярный коэффициент экстинкции окисленной
формы о-дианизидина составляет 11,3 при 460 нм (см. описания Worthington
и Sigma-Aldrich) (Enzymatic Assay of Diamine Oxidase (EC No. I.4.3.6)
Peroxidase - Worthington Enzyme Manual)
I. L.M. Shannon, E. Kay, J.Y. Lew, Peroxidase isozymes from horsed
roots. J. Biol. Chem. 241, 2166-2172, 19 • y,..r^,-r>idish peroxidase by
2. II. Delincce, BJ. Radola, Fractionation ofh
and ion-exchange
preparative isoelectric focusing,
chromatography. Eur. J. Biochem. 52,	horseradish peroxidase
3. D. Keilin E.F. Hartree, Purification ofho^ ^htaemogk*»
comparison of its properties with those о c
Biochem. J. 49, 88-106. 1951. MeehrelIiehperoxidase. Acia
K.G. Paul, Die Isolierung von Meehremc I
Scandinavica 12, 1312- 1318,
5. UNIPROT PI5232, РОСЩЗ- U-1—
Q425I7.
•
ю. Выделение и изучение некоторых свойств
миоглобина
миоглобин «штяется гем-содержашим белком, участвуй,,||Им
емлымнии кислорода. Em содержание особенно высоко в мышцах мор«и
ж Хх. способных надоят погружаться в воду и
* пыгывакч.шх нехватку кислорода. Содержание миоглобина особенно
высоко в красных оксидативных мышечных волокнах, а также °
кардиомиоциатах. 11овреждение кардиомиоцитов сопровождается
освобождением миоглобина в кровеносное русло. Повышение уроВНя
миоглобина в крови может быть использовано для ранней диагностики
инфаркта миокарда.
10.1.	Выделение миоглобина
Материалы и реактивы
1.	Фосфатный буфер - 20 мМ (pH 6,0)
2.	Фосфатный буфер - 30 мМ (pH 7,0)
3.	Феррицианид калия
4.	Колонка (2,5 х 30 см) CM-Sephadex С25
5.	Колонка (2,5 х 40 см) Sephadex G100
6.	Сульфат аммония
7.	Ацетон
8.	НС1 - 2 н раствор
Порядок проведения работы
суспензии в
Начальные стадии выделения можно проводить, используя два
тошати ЬЗОоТГпп ” "еРВ°М МЫШЦЫ кр>'"ного РО^ого скота или
:лом с X n Т ЧЧ*’ МЯС0РУбКу и быть заморожены. В
X.	ФаРШ “«P-WOt равным
кевымгом<	Полученную суспензию гомогенизируют
на х.,,	„	-а механической мешалке на 30 мин
оте'“‘ пютому ди перенесения жа
широко!орлую ворот4111К сгаканы рекомендуется использовать
& 30 мин). Сунернатаж сХп\ыЮ	центрифугированию (11700
охлаждакл до 4 °с || фильтруют через бумажный фильтр и
Фракционирование сульЛа >КСфакта А°в0Д*т до pH 7,0 и проводят
После добавления суп . . аммония в интервале 0-60% насыщения.
40 мин и подвергают псп 1,т,О11ия °сгавляют суспензию на холоду на 30-
есцветный осадок ИФ^'иР°ванию. Образовавшийся практически
ЯЮ1 центрифугированием. Проверяют pH
106
и при необходимости Дов
•fi"1’ „ование сульфатом аммония „ „ 0 До РН 7 о п
ЛХ' ' к высокой концентрации рас	Р?°',*аки
ом) слслуа добавлять суль.КГЗ***	1 Ч*
лХ' „я преЛЫЛУ'НСН порции соли. ()бпа^ " Мелл''жо „ Чо',и"
' Vl* , и минимальном объеме 20 mVТ""'ийс" <к>алп/ Ила"С|>
йебо...........ос кот..ество ф^а	Л
и» *°лоду лиали,уют2о мм фох:ги: - 4, 2
ИН<,“ втором случае мышцы крупного рогатогоtX °	6Д*
1	1Н11 в мясорубке и смешивают с 300 мл 2, Или	( 300
й^цик, п экстрагируют в течение часа на * "°л“ Г|^>2
гомогенат центрифугируют Ц700 олад) на механичной
“‘;"Л через бумажный фильтр и диализуют Ппоти’ Л* с>пеРн»гаит
I* кк-фатного буфера pH 6,0. После иЕГТ*!***
проводность образца и, если они отличаются от	рН *
£2«ров буфера диализа, то образец либо разводГХГ?^
диализ. К полученному образцу неочищенной
мяо,добина добавляют небольшое количество K,Fe(CNk мя ТО^Х
псревести весь миоглобин в ферри форму. Для этого к образцу ZKa
добавляют 5-10 мг феррицианида калия и оставляют на час при 4-5 °C
Перед ионообменной хроматографией необходимо тщэтелыю
проверить электропроводность и pH полученного диализата. Необходимо,
чтобы pH и электропроводность диализата были бы равными
соответствующим параметрам буфера, используемого для уравновешивания
колонки. Колонку (2,5 х 30 см) CM-Sephadex С50 или С25 уравновешивают
20 мМ фосфатным буфером (pH 6,0) и наносят образец неочищенного
препарата миоглобина. Колонку тщательно промывают буфером
уравновешивания до тех пор, пока оптическая плотность элюата при 280 нм
не станс i б изкой к нулю (обычно для этого требуется 2 - 4 объема колонки).
Во фрак и. несорбирующейся на колонке (во фракции «проскока),
преимуш, с енпо элюируются различные белки, не содержащие гема, а гем-
содвржащие белки концентрируются на вершине колонки. Миоглобин
элюируни 30 мМ фосфатным буфером pH 7,0. В этих условиях гемоглобин и
цитохромы остаются связанными на вершине колонки. Образец миоглобина
диализуют против воды и лиофилизируют.
Дальнейшая очистка белка может быть достигнута путем гель
фильтрации. Для этого колонку 2,5 х 37 см заполняют ер *
Уравновешивают 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7,5). а	70
образец миоглобина и проводят изократическую элюцию . в
м 1 час. Белковый состав фракций анализируют методом।	натрия
--.„кр,,;,амидном ,е..е в присутствии	и
амогениые фракции обьслиияитг, диализуют
’Цофилизируют.	<шоло 550 мг на 200
( Читается, что содержание миоглобина сосгаш
скелетных мышц крупного рогатого скота.
107
,ем« и> миоглобин*
10.2.	Уд*леиие	м	рдетвора холомиоглобинд
апобелка ОЛИН ' ’ „вшивании добавляют к 20-30
Дя«	при сильном	Р, с(,держащего 3 мл 2н HCI на
медленно	охлажденного ДО J" „ри .20 "С на 10-20 мин „р11
объемам ансо ^„y» смесь о - ки бесцветный осадок белка
литр ацетона. -	,„„вании. ' Ч» 1() „с Ацетон удаляют, а белок
периолнчсем'	зднием при - водь| и диали1уют против воды
собираю’ "< бальном объеме ' в | ,6 мМ бикарбонат натрия и
^ТГчере’ 5 6 часов персн^^о’ка не образуется осадок
"^дклждют> ДО дХюЛи последней стни заменят
S3S= "”м	фн”“Г"~
Полученный апоми
лиофилизировать.
Литература
1.	А.Н.А. van den Oord, J J. Wesdorp, A.F. van Dam, J. A. Verheij,
Occurrence and nature of equine and bovine myoglobin dimers. Eur. J. Biochem.
10. 140-145, 1969.
2.	A. Akeson, H. Theorell, On the microheterogeneity of horse myoglobin.
.Arch. Biochem. Biophys. 91, 319-325, 1960.
3.	K.D. Hapner, R.A. Bradshaw, C.R. Hartzell, F.R.N. Gurd, Comparison of
myoglobin from harbor seal, porpoise, and sperm whale. J. Biol. Chem. 243, 683-
689, 1968.
4.	D. Puett. E. Friebele, R.G. Hammonds, A comparison of the
conformational stability of homologous hemoproteins. Biochim. Biophys. Acta
328. 261-277, 1973.
5.	A. Rossi-Fanelli, E.Antonini, A. Caputo, Studies on the structure of
hemoglobin. Biochim. Biophys. Acta 30, 608-615, 1958.
6	E.L.Malin, G Maerker, B.C.Stevenson, W. Sabato, Separation and
qualitative recover;. of ma;or proteins from single sample of skeletal muscle. Prep.
Biochem. 14, 281-302. 1984.
108
ПР^ЛО)к9Ни
lf гсорсгнчсски PiCC4HliHHw
смЫ' ” к>чсстве мяркгр()П
	Номер базе Данных 1 ^niProt	" Мол«Ул»р„л ма<:«белм или	tr субъединицы	"ригмп, 0 ’«"""РЛС ^ичентря!^ । мг/мл	И 1
1  v .s ю iaта и т мышц кролика	НЮ8ХГ	19212			1язГ	
f—д^ьфа-лактальбумин из	Р 00711*	'14186^	-		trj
1 молока крупного рогатого скота (Bos taurus)			1.99^~		4J
f	пи из яиц кур (Gallus	Р00698*	14313 ~		
1	gallus)				*932^"
Миоглобин крупного 1 рога: ого скота (Bos taurus)	Р02192	16946	0,825	1—-; ь.г
 Овальо} мин (альоумин из яиц кур Gallus gallus)	Р 01012	42750	0,707	^119
I	Овотрансферрин (из яиц кур Gallus gallus)	Р 02789 F1NVN3 Q92062 E1BVL8	75828 78820 78942 78906	Т169 1.300 1Л8 1335	6.69 5J2 537 Мб!
Соевый i ибитортрипсина	Р 25272*	22546**	0,856**	4,97**
	Р25273*	22800**	0,903**		♦
Сын очный альбумин крути •	л тазого скота (Bos taurus)	Р 02769*	66433	0,587	5,6 7-»
Фосфорилаза скелетных мышц кролика	Р 00489 Г	97158	1,182	с	1
Химотрипсиноген В	i поджелудочной железы крупною poi aroi о cKoia (Bos	Р00767*	’5755** "Ч	,94**	
taurus) • 		..	и пени	нЬикш»ионные	номера	
inc «дочками отмечены "^'данные,
предшественников указанных оелко |И.Н>| 4*jlk|M Vм
остальных сюлбиах таблицы» coot
белков.	привел*101**
’• Двумя звездочками отмечены вели	проиех**00
_ ..гм»игк1>ДХШС<v
шраниченного протеолиза, нр°и
109
VI. ТЕМЫ СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ
Семинар 1. Методы определения белка
I.	Методы осаждения белков.
2.	Биуретовый метод.
3.	Микробиуретовый метод.
4.	Метод Лоури и метод с бицинхониновой кислотой.
5.	Спектрофотометрический метод.
6.	Определение концентрации белка по азоту.
7.	Определение белка с Кумасси (метод Бредфорд) и другими красителями
Литература
I.	Р. Скоупс, «Методы очистки белков». Москва, Мир, 1985.
2.	Практикум по	биохимии под редакцией С.Е.	Северина и
Г.А.Соловьевой, Москва. Изд-во МГУ. 1989.
3.	Е.И. Акимова,	В.В. Асеев, «Физико-химические подходы к
количественному определению белка». Москва. Товарищество
научных изданий КМК. 2016.
4.	М.В. Медведева. Н.Б. Гусев, «Определение концентрации белква в
растворе». Москва. МАКС Пресс. 2010.
5.	A. Aitken, М.Р. Learmonth, Protein determination by UV absorption. In
Protein protocols handbook, 2",( Edition I d. J.M. Walker, Humana Press
Inc. Totowa, NJ. p. 3-6. 2002.
6.	M.M. Bradford, A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities ot protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal. Biochem. 72. 248-254. 1976.
7.	O.lI. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Fan, RJ. Randall, Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275,
1951.
8.	N.G. Kruger. Ihe Bradford method for protein quantification. In The
protein protocols handbook. 2nd Edition Ed. J.M. Walker, Humana Press
Inc. Totowa. NJ. p. 15-21. 2002
9.	P.K. Smith. R.l. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D.
Provenzano, E.K. Fujimoto. N.M. Goeke, BJ. Olson, D.C. Klenk,
Measurement ot protein using bicinochoninic acid. Anal Biochem. 150. 76-
85, 1985.
10.	J.M. Walker, The bicinochoninic acd (BCA) assay for protein
quantification. In The protein protocols handbook. 2nd Edition Ed. J.M.
Walker, Humana Presss Inc. Totowa, NJ. p. 11-14, 2002.
11.	J.H. Waterborg, The Lowry method for protein quantification. In Th^
protein protocols handbook, 2nd Edition Ed. J.M. W'alker. Humana Pkss
Inc. Totowa, NJ. p. 7-10, 2002.
110
1
, ^jechelman, R.D. Braun, j и
I 12—J.nchon’n’c ac’d Pr°tein assay- id- \-Patriot .
i formation-Anal-	* a,
ap 2. Методы фракци
Деления их молекулярной *'***** -
«ассы и’л*ов и
j |г1Ь.фильтраиия и определение молекулярной _
белк°в	.	И ралиУса Сто»г
1 Принцип гель-фильтрации.
Материалы для гель-фильтрации г
Представление о декстрановых, агарозных ‘итрии“
стеклянных и смешанных носителях Дос	|^1а*«иых,
различных носителей.	Д т°инства и недостатки
Параметры гель-фильтрации и техника пповепеи».
(Соотношение объемов колонки и пробы геомт СГКр"м'нта
техника заполнения колонки, требования к сорбеХ"
тока и оптимальные давления).	’
Определение молекулярной массы и радиуса Стокса методом гель-
фильтрации. Иные задачи, решаемые методом гель-фильтрации.
Определение молекулярной массы с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
Сопоставление различных методов определения молекулярной
массы.
э
2.3.
Ионообменная хроматография.
2.1.	Принцип ионообменной хроматографии.
У) Ионобменники для белков, природа матрицы привитые группы
Представление о слабых и сильных ионообмеинит. Кр«*
титрования ионообменников. Выбор
исследуемых белков. Обменная емкость	xHM геометрия
Техника проведения ионообменно Р - Требования к
колонки, соотношения объемов колон буфера (pH. ионная
образцу, -'ввергаемому Р“д"н (оупеич^ -
сила и природа буфера;.
элюция, различные виды градиенто
Электрофоретические методы иссл®л^”	.«.женилги
< । Основные принципы элекгроф^ подвижности 1,‘“^^дення об
3-2. Зависимость электрофорез ин	раствор* ^проведении
электрического поля, ионном сиды и pH Р ,.рн про
электроэндоосмосе. ТеллопроДУ
электрофореза.
хР°матографн.1СС|ГИм
11 Типы элекпюфоретнчкких меголоп разделения
“ носителей, хишльный электрофора иы тесним,ы^‘
электрофоре^)-	Мет°дм
U Электрофорез пл бумаге Исполмоввние иогп Мет
рачлетеиня белков, аминокислот и нуклесугидля	°Л| дл,
5 5 Нзснтнфнквцня исследуемых ветестя после электрофор
I Г Дстсрман. «Гсль-хромазография», Москва, Мир, 1970.
2 Т. Дэвсни. А. Гергсй, «Аминокислоты, пептиды, белки», Москв
1971.
5. О. Микст (рсд.) «Лабораторное руководство по
и смежным методам», Москва. Мир, 1982.
4	Г. Маурер. «Днск-элсктрофорез», Москва, Мир, 1971.
5.	Л.А. Остерман, «Методы исследования белков и нуклеиновых кис
Электрофорез и ультацентрифуг ирование», Москва, Наука, 1981.
6.	Л.А. Остерман, «Хроматография белков и нуклеиновых киску*-,
Москва. Наука, 1985.
7.	Э. Гааль. Г. Медьеши, Л. Верецкей, Электрофорез в разделении
биологических макромолекул», Москва, Мир, 1982.
8.	В. Уильямс, X. Уильямс, «Физическая химия для биологов», Москва
Мир. 1976.
9.	Ч. Кантор. П. Шиммел, «Биофизическая химия», Москва, Мир, 1984.
10.	Р. Скоупс, «Методы очистки белков», Москва, Мир, 1985.
Семинар 3. Определение аминокислотного состава
и первичной структуры белков
1	. Г идролиз белка до аминокислот.
Кислотный идролиз (различные кислоты, используемые для
|ир .I ; ir . соляная, муравьиная, уксусная, серная). Условия
ги р Ф.мисние отдельных аминокислот.
Щелочной и релиз. Сравнение с кислотным гидролизом.
Дос -икс и ; । целоезатки двух методов гидролиза.
2	Ограниченный и jpo.niз белков до пептидов.
2.1.	Фермсншинный i идролиз.	..
- I । Грипсин. Структура активного центра, механизм
гидролитической реакции, специфичность, возможное
зшрязнение химотрипсином, повышение специфичности
2.1.2.	Химотрипсин. Сходство и различие с трипсин»
специфичное! ь, возможное загрязнение трипсином.
-1.3. Пепсин. Аыивный центр, специфичность, оптимум pH
112
2.1.4-обшие "Радстаа,
протеолитических ф " *
стафилококка). РМентоц
Использование химичеСКНх ' <н %ги,
- специфичности и избирате"* Мплифик»„и,
22.|. Блокирование остатков	л'йстй, й
ангидриды).	ли’Ина (МаЛ1
2.2.2.	Блокирование
циклогександион) °СТатков
2.2.3.	Повышение специфичности
06
^Рмо^^ии
пР°теаза
'"’"РотеТт" """‘"“'ни,
"""оный и ИИт^
Ромовый
Минина
^Угамдиои,
изменения соотношения ферментХ^8"" ♦*₽*>"<*
Химические методы расщеп тения „ у6страт
2.3.1. Расщепление пептидной цепи no°S** Цепи.
2.3.2. Расщепление белков по остаткам цист?™?""0"""3
_ — w-ч	MnvicHHa.
Цепи по остаткам тиротииа и
расщепление белков по остаткам
2.3.3.	I идролиз полипептидной
триптофана.
2.3.4.	Избирательное
аспарагиновой кислоты и аспарагина
з.	Анализ белковых гидролизатов методом отпечатков пальце,
ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, высокоэффективной
жидкостной хроматографии и высоковольтного электрофореза.
Особенности разделения пептидов по сравнению с разделением белков.
4.	Разделение аминокислот на аминокислотном анализаторе, пластины
«Фиксион» и их использование для разделения аминокислот.
5.	Идентификация аминокислот (нингидриновая реакция, флуорескамин, о-
фтазевый диальдегид).
Литература
2.
4.
6.
7.
Белки и пептиды (под ред В.Т.Иванова и В.Липкина), Москва, На>ка,
1995.
Т.	Дэвени, А. Гергей, «Аминокислоты, пептиды, белки», . осква, р
1971
ДА. Остерман, «Методы исследования
Электрофорез и ультрацентрифу'ировании»н)1о|<М|Ю,ыч шк.юг».
Л.А. Остерман, «Хроматография
Москва, Наука, 1985.	й . Дарбрек Москм. Мир.
Практическая химия белка (под редакцией Д W
1989.	л П(|О1НЯ. Структур® и функция
В.М. Степанов, «Молекулярная	.„ешение.
белков», Москва, Высшая школа. чИМця», Москва, Р0*-
К).А. Овчинников, «Биоорганичес
1987.
113
Определение аминокислотн -
artLui
- J в
Семинар
последовательности и функциональных групп
белках и пептидах
1	Идентификация N-концсвых аминокислот.
1.1.	Mown Сэнгера (динитрофснилирование). Идентификаци
модифицированных аминокислот.
1.2.	Дансилированис. Сходство и различие с методом
динитрофенилирования. Идентификация модифицированных
аминокислот.
1.3.	Аминопептидазы. Классификация и использование ЛЛя
определения N-концевой последовательности.
1.4.	Использование фенилизотиоцианата для идентификации N-
концевой последовательности белков. Автоматический и ручной
методы деградации по Эдману.
2.	Определение С-концевой последовательности в белках и пептидах.
2.1.	Гидразинолиз. Идентификация свободных аминокислот и их
гидразидов. Ограничения метода гидраз и ноли за.
2.2.	Использование карбоксипептидаз для определения С-концевой
последовательности белков. Характеристика карбоксипептидаз.
Очистка карбоксипептидаз от эндопептидаз. Идентификация
образующихся аминокислот.
3.	Идентификация и специфическая модификация сульфгидрильных групп в
белках.
3.1.	Использование реакции тиол-дисульфидного обмена.
3.2.	Алкилирование и арилирование сульфгидрильных групп.
3.3.	Реакция сульфгидрильных групп с ионами тяжелых металлов и р-
хлормеркурибензоатом.
3.4.	Специфическое окисление сульфгидрильных групп.
Модификация сульфгидрильных групп соединениями с
активированной двойной связью (N-этилмалеимид, акриламид и его
производные).
3.6	Сравнение различных методов модификации сульфгидрильных
групп.
Роль сульфгидрильных групп в функционировании белков и
ферментов.
И кн । ификация остатков аргинина, лизина, гистидина,
и аспарагиновой аминокислот. Достоинства и
недосшки меюдов химической модификации аминокислот.
Литература
197^ <И ' еР,ей, «Аминокислоты, пептиды, белки», Москва, Мир
, овчинников, «Биоорганическа.
|0.А*	Химия» |^|
' '^ческая химия белка (под ре^ д' Прос^
’и^блема белка. Химическое строение к	М'>С'"Й' %-
4.	2кина) том I. Москва, Наука, 1995.	И|<а,> (п°л Релак,(ией „
{г Северин, С.Н. Курочкин, С.Н. Кочетков «и	*
5-	£ аКТИвных центров методом химической „S'"* ♦'PWo, „
Логической химии», 15, с.65-84,1974.	°ли*И|<»иии», «уСПехи
□ М- Степанов- «Молекулярная биология. Ст™
6’ Чалков»’ Москва, Высшая школа, 1996. РУ Тура и Функция
. |’о м. Торчинский, «Сера в белках», Москва, Наука 1977
х-Д. Як>бке- «Аминокислоты, пептиды и белки», Москва, Мир. 19J5.
115
Московский государственный университет
имени М. В. Ломоносова
Биологический факультет
Кафедра биохимии
САФРОНОВА Марина Иосифовна
РУБЦОВ Александр Михайлович
РЫЖАВСКАЯ Анна Станиславовна
ГУСЕВ Николай Борисович
ОСНОВЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ
БИОХИМИИ БЕЛКА
Учебно-методическое пособие для
практических занятий по биохимии
Подписано в печать 29.03.17. Формат 21x29,7/2. Усл. Печ.л. 5,8
Отпечатано с готового макета, предоставленного автором.
Бумага офсетная 80г/м2, печать цифровая, лазерная.
Заказ № 98-А/03/2017. Тираж 100 экз.
И мательство ООО «Цифровичок»
7149, г. Москва, ул. Азовская, д. 13
495)649-83-30, +7(495) 797-75-76
ww.cfr.ru; e-mail: info@cfr.ru
УДК 81.33
ББК 81.1.65
0-75
ISBN 978-5-91587-154-9
© М.И. Сафронова, А.М. Рубцов, А.С. Рыжавская, Н.Б« Г>ссв’