/
Text
Г ДЮГА, К ПЕННИ
БИООРГАНИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
SPRINGER ADVANCED TEXTS IN CHEMISTRY
CHARLES R. CANTOR, EDITOR
Hermann Dugas
Christopher Penney
BIOORGANIC CHEMISTRY
A CHEMICAL APPROACH TO ENZYME ACTION
Springer-Verlag
New York Heidelberg Berlin
Г ДЮГА. К. ПЕННИ
БИООРГАНИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
ХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МЕХАНИЗМУ
ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
»
Перевод с английского
канд. хим. наук Е. Ю. КРЫНЕЦКОГО
и канд. хим. наук В. Л. ДРУЦЫ
под редакцией
академика Ю. А. ОВЧИННИКОВА
Москва «Мир»
1983
ББК 28.072
Д95
УДК 571.1
Дюга Г., Пенни К.
Д95 Биоорганическая химия. Химические подходы к механиз-
му действия ферментов: Пер. с англ. — М.: Мир, 1983.—
512 с., ил.
Книга канадских авторов входит в серию учебных пособий для углубленного
изучения различных разделов химии. Посвящена биоорганической химии как дисцип-
лине, использующей химические методы для понимания биохимических процессов.
Особенность книги состоит в том, что биохимические процессы в ней трактуются с
точки зрения модельных реакций.
Предназначена для научных работников, специализирующихся в области биоорга-
ннческой химии, биохимии, энзимологии, преподавателей, аспирантов и студентов
старших курсов химических и биологических вузов.
1803000000-406
Д 041(01)-83
89—83, ч. 1
ББК 28.072
57.04
Редакция литературы по химии
Герман Дюга, Кристофер Пенни
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
К МЕХАНИЗМУ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
Научный редактор Т. И. Почкаева. Младший научный редактор И. А. Колчин
Художник А. Д. Смеляков. Художественный редактор М. Н. Кузьмина
Технический редактор Н. И. Манохина. Корректор В. И. Постнова
ИБ № 3401
Сдано в набор 01.02.83. Подписано к печати 16.08.83. Формат бОХЭО’/к. Объем 16,00 бум. л.
Бумага типографская № 2. Гарнитура литературная. Печать высокая. Усл. печ. л. 32,00.
Усл. кр.-отт. 32,00. Уч.-изд. л. 31,80. Изд. № 3/2040. Тираж 6 000 экз. Зак. № 549,
Цена 4 р. 50 к.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР» 129820, Москва, И-110, ГСП, 1-й Рижский пер., 2.
Ленинградская типография № 2, головное предприятие ордена Трудового Красного Знамени
Ленинградского объединения «Техническая книга» им. Евгении Соколовой Союзполиграфпрома
при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли.
198052, г. Ленинград, Л-52, Измайловский проспект, 29.
© 1981 by Springer-Verlag New York Inc. All Rights
Reserved. Authorized translation from English (or
German) language edition published by Springer-
Verlag Berlin — Heidelberg — New York
© Перевод на русский изык, «Мир», 1983
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА
Вторая половина XX столетия характеризуется резко возрос-
шим интересом к познанию механизмов жизнедеятельности. Эпоха
наблюдения и достаточно поверхностного анализа мира живот-
ных, растений и микроорганизмов сменилась периодом реши-
тельного проникновения на уровень молекулярных и межмолеку-
лярных взаимодействий в живых системах, вторжением в биологию
методов и подходов физики, химии и математики. Как след-
ствие этого процесса началась постепенная дифференциация наук,
изучающих материальные основы жизни; стали одна за другой
появляться новые дисциплины, отражающие различные уровни
исследования живой материи, различные углы зрения, различные
экспериментальные приемы и методологические концепции. Клас-
сическая биохимия, которой бесспорно принадлежит пальма пер-
венства в симбиозе биологии и точных наук, постепенно уступала
дорогу новым направлениям. Вначале, на волне революционных
событий в физике, возникла биофизика, значительно окрепшая
уже в предвоенный период. Конец этого этапа был ознаменован
и резкой активизацией исследований в генетике. Однако наибо-
лее серьезное наступление началось в начале 50-х годов, когда
возникли молекулярная биология, рождение которой часто отож-
дествляется с открытием двойной спирали ДНК, а также биоор-
ганическая химия, первые победы которой по праву связывают
с установлением структуры инсулина и синтезом первого пеп-
тидного гормона — окситоцина.
Биоорганическая химия, ставшая сейчас столь быстро разви-
вающейся перспективной областью физико-химической биологии
занимается исследованием структуры и функции биологически
важных соединений методами органической химии. Ее объектами
являются и биополимеры, и низкомолекулярные биорегуляторы
поэтому поле деятельности этой науки исключительно широко.
Однако проникновение строгих представлений и методов органи-
ческой химии в область, изучающую различные системы клетки
и различные уровни ее структурной организации, неодинаково
как с качественной, так и с количественной точки зрения: если
среди низкомолекулярных биорегуляторов, часто называемых
просто природными соединениями, позиции биоорганической хи-
мии прочны и действенны, то при исследовании биополимеров
6
Предисловие редактора перевода
она существенно продвинулась вперед лишь в сфере пептидов
и в меньшей степени белков (ферментов), а в самое последнее
время — олигонуклеотидов и простейших генов. Мир же гигант-
ских биомакромолекул, их комплексов, а также надмолекуляр-
ных структур типа рибосом, мембран и хромосом только начи-
нает раскрываться под настойчивыми ударами современного,
весьма мощного биоорганического арсенала, и именно сейчас
мы переживаем эти интересные, волнующие события.
В мировой литературе до сих пор нет монографий, руководств
или учебников, отражающих весь круг интересов биоорганиче-
ской химии. Но за последнее десятилетие появляется все больше
книг и обзоров, освещающих отдельные разделы этой науки и
дающих возможность читателю понять общие принципы и под-
ходы к анализу той или иной проблемы, характерные для биоор-
ганической химии сегодняшнего дня. Возникают новые журналы,
которые становятся главным печатным органом для публикации
важнейших результатов в области биоорганической химии:
«Bioorganic Chemistry» (США), «Биоорганическая химия»
(СССР) и др.
Среди книг, которые появились в печати уже в 80-х годах,
заметное место занимает учебное пособие молодых канадских
ученых Германа Дюга и Кристофера Пенни «Биоорганическая
химия: химические подходы к механизму действия ферментов»,
опубликованное в 1981 г. издательством «Шпрингер-Ферлаг».
Как отмечают сами авторы, книга посвящена обсуждению ’
лишь отдельных аспектов биоорганической химии. Однако рас-
смотренные проблемы анализируются достаточно глубоко и де-
тально, давая представление о границах и возможностях совре-
менной органической химии при изучении биологических процес-
сов и биоактивных молекул.
Главный акцент сделан на характеристику структуры белков
и нуклеиновых кислот — прежде всего в плане описания их хи-
мических свойств и методов химического синтеза. Хотелось бы
подчеркнуть, что рассмотрение проводится главным образом на
уровне первичной структуры, когда детально, шаг за шагом, ана-
лизируется множественная реакционноспособность этих биополи-
меров, объясняются их свойства на основе химических превра-
щений функциональных группировок и их ансамблей. Что же
касается проблемы химического синтеза, то она изложена весьма
полно и отражает сложившиеся сейчас подходы к искусственному
получению как олигомеров, так и достаточно крупных биополи-
меров этого типа.
Наиболее детально представлена в книге биоорганическая
химия ферментов, что и нашло отражение в подзаголовке. Авто-
ры старались показать химические основы высокой избиратель-
ности, селективности ферментативного катализа, проводя умест-
ные параллели со сравнительно простыми органохимическими
Предисловие редактора перевода
7
моделями типа краун-эфиров, криптандов или ионофоров. Инте-
ресно рассматриваются и вопросы регуляции в энзимологии,
прежде всего роль ионов металлов и других кофакторов.
Это своего рода очерки — с авторским стилем и определенной
позицией, написанные живо и заинтересованно; они не претен-
дуют на монографическую полноту, а представляют собой скорее
иллюстрации ряда важных проблем биоорганической химии. Ко-
нечно, можно пожалеть, что авторы в основном рассматривают
работы, выполненные на североамериканском континенте, и не
упоминают многих исследований, внесших фундаментальный
вклад в эти разделы биоорганической химии. Опущены ими и
практически все широко известные в мире работы советских ис-
следователей, в частности в области химической энзимологии,
изложение которых даже в самом сжатом виде значительно бо-
лее объективно отразило бы состояние этой области биооргани-
ческой химии, обогатило бы книгу и внесло бы нужные коррек-
тивы в некоторые порой спорные представления авторов. Мы соч-
ли неуместным делать соответствующие дополнения к переводу,
так как это нарушило бы стройность и оригинальность автор-
ского текста. Истинные ценности всегда пробьют себе дорогу
в науке и в конце концов преодолеют расстояния, разобщенность
и предубеждения.
Публикуемая книга, несомненно, окажется полезной специа-
листам в области органической и биоорганической химии, биохи-
микам и физиологам, преподавателям соответствующих курсов
в университетах и других высших учебных заведениях, а также
студентам старших курсов, интересующимся более углубленным
рассмотрением химических механизмов биологических процессов.
Ю. Овчинников
ПРЕДИСЛОВИЕ
В начале 60-х годов, когда я работал в университете в Отта-
ве, мои коллеги по химическому факультету сходились во мне-
нии, что будущее органической химии помимо усовершенствова-
ния теоретических представлений лежит в решении биохимиче-
ских проблем. Поэтому я приступил к подготовке лекций по общей
биохимии, специально предназначенных для студентов-химиков
старших курсов, не имеющих подготовки в области класси-
ческой, описательной биохимии. В методическом отношении я по-
ложил в основу своих лекций изучение тех химических реакций,
которые наилучшим образом отражают соответствующие биохи-
мические превращения. Следует заметить, что в этот период
эффективное химическое моделирование ферментативных реак-
ций только еще начинало развиваться; заметных успехов в раз-
работке биомоделирующих систем удалось добиться в последние
15 лет. Я как лектор был приятно удивлен значительным увели-
чением числа студентов старших курсов, специализирующихся
в области биохимии и биологии, так что иногда они по числен-
ности превосходили студентов-химиков. Выпускники-биохимики,
как оказалось, обнаружили, что полученные ими знания недо-
статочны для работы и что гораздо легче осмыслить фундамен-
тальные общие биохимические концепции, используя подходящие
модели. В 1971 г. я перешел работать в университет Мак-Гилла;
к этому времени лекции постепенно оформились в самостоятель-
ный курс, называемый в настоящее время биоорганической хи-
мией; этот курс читается студентам-выпускникам биологических
специальностей последние 10 лет. Большое число слушателей на
лекциях еще раз подтверждает необходимость этого курса.
Однако за все прошедшие годы я так и не сумел найти время,
чтобы на основе моих разрозненных записок, используя необхо-
димую литературу, написать учебник, отсутствие которого по-
стоянно остро ощущается студентами. К счастью, авторы настоя-
щей книги — Г. Дюга и К. Пенни также имели достаточный опыт
чтения этого курса (когда я был в отпуске или отсутствовал по
другим причинам); они нашли в себе силы приняться за герои-
ческую работу превращения моих «телеграфных» записей в осно-
ву учебника, который предлагается читателю. Их труд, несом-
ненно, оказался в высшей степени полезным: создан остро необ-
Предисловие
ходимый современный учебник для студентов, специализирую-
щихся в области химии, биохимии, биологии, а также для тех
специалистов, которые предполагают работать в области меди-
цинской химии и медицинских исследований. Биоорганическая
химия, однако, развивается так быстро, что совсем скоро потре-
буется пересмотр данного издания. Тем не менее в основном по
своему содержанию и избранному подходу, я надеюсь, эта книга
сохранит свое значение.
Монреаль
февраль 1981
Бернард Белло
Университет Мак-Гилла
ОТ АВТОРОВ
Биоорганическая химия для описания и изучения биологиче-
ских процессов использует понятия и методы органической химии.
Удивительное проникновение этой новой науки в органическую
химию за последние 10 лет создало еще одну проблему для пре-
подавания, особенно на старших курсах. Действительно, введе-
ние многих новых и важных биоорганических химических пред-
ставлений — непростая задача. В нашей книге изложены ос-
новные подходы при создании биоорганических молекулярных
моделей процессов жизнедеятельности с использованием методов
органической и физической химии.
Настоящая книга — это учебное пособие. В наши намерения
не входило дать полный обзор по всем проблемам биоорганиче-
ской химии. Мы считали правильным выделить наиболее важ-
ные моменты, подчеркивающие принципы построения органиче-
ских молекулярных моделей, и более подробно остановиться
лишь на некоторых общих и частных вопросах. По своему со-
держанию книга доступна студентам старших курсов и не тре-
бует обращения к элементарному учебнику биохимии; разумеет-
ся, студент должен иметь хороший багаж практических знаний
по органической химии. Следовательно, эта книга как учебник
адресована в первую очередь студентам последних курсов, спе-
циализирующимся в области химии, биохимии, биологии и фар-
макологии; кроме того в ней содержатся современные достиже-
ния, которые так необходимы студентам-выпускникам, в дейст-
вительности нередко совершенно с ними не знакомым.
Как правило, начальный курс биохимии чрезмерно велик по
объему, и многие студенты относятся к нему только как к пред-
мету заучивания. Надеемся, что нам удалось преодолеть подоб-
ный подход. С этой целью органохимические представления на
протяжении всей книги должны побудить студентов к «кванто-
вому скачку», необходимому, чтобы перейти от чистого запоми-
нания биохимических превращений на более высокий уровень
правильного понимания биохимических принципов, в основе ко-
торых лежит четкое химическое представление. Большинство глав
начинается с перечисления обсуждаемых в них проблем. Мы на-
деемся, что такая подача материала должна пробудить в чита-
теле любознательность.
От авторов
11
Профессор Б. Белло из университета Мак-Гилла сыграл роль
«катализатора», подав идею написания этой книги. Большая
часть материала была первоначально отобрана по его записям.
Авторы хотели бы выразить глубокую признательность за предо-
ставленную возможность изучить, расширить и переработать
его курс лекций в книгу. Именно поддержка и неиссякаемая
энергия профессора Белло постоянно вдохновляли нас и прида-
вали силы в ходе всей работы над книгой.
Цитируемая литература, подобно отобранным нами темам,
выборочна. Читатель легко сможет отыскать дополнительную ли-
тературу, поскольку мы часто ссылаемся на книги и обзоры.
Мы рекомендуем преподавателю подробно ознакомиться с лите-
ратурными источниками и быть готовым к детальному обсужде-
нию со студентами той или иной проблемы. Часто мы приводим
имя основного автора работ в рассматриваемой области, а иногда
и год опубликования работы. Таким образом, читатель узнает
ведущего специалиста в данной области, что облегчает задачу
найти соответствующие оригинальные работы. Однако мы при-
носим свои извинения всем, кого из-за недостатка места не упомя-
нули.
Книга гораздо шире программ обычных курсов биоорганиче-
ской химии, рассчитанных на три часа в неделю в течение одного
семестра. Однако в каждой главе есть материал, который можто
опустить без нарушения целостности изложения. Такой подход
позволит преподавателю выделить те или иные проблемы — в за-
висимости от того, предназначается ли курс для химиков или
биохимиков.
Мы благодарны нашим друзьям и коллегам, высказавшим
квалифицированные суждения о нашей работе и сделавшим ком-
ментарии, касающиеся изложения некоторых глав книги: это
П. Браунбридж, П. Делоншам, П. Гатри, Дж. Б. Джонс, Р. Клу-
гер и К- Липси. Большое спасибо К- Потвин из Монреальского
университета за ее помощь в подготовке рукописи.
Мы с благодарностью примем любые замечания и предло-
жения по улучшению содержания книги.
Герман Дюга
Монреаль, Канада Кристофер Пенни
январь, 1981
НЕКОТОРЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ,
ПРИНЯТЫЕ В ДАННОЙ КНИГЕ
АИБН — азабисизобутиронитрил
АНБК — 4-ацетокси-З-нитробеизойиая кислота
АНБС — 4-ацетокси-З-нитробензолсульфонат
АНТИ — З-ацетокси-И-триметилаланииа иодид
4-БИГ — бис [4 (5) -имидазолил] гликолевая кислота
ГАМК — у-аминомасляная кислота
ДАП — додециламмонийпропионат
ДБНО — ди-трет-бутилпероксалат
ДДХ — 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон
ДМСО — диметилсульфоксид
ДМФА — диметйлформамид
ДМЭ — диметоксиэтан
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОФА — диоксифенилаланин
Дфф — диизопропилфторфосфат
ДЦКГ — М.БГ-дициклогексилкарбодиимид
ДЦГМ — дициклогексилмочевина
-iW — молекулярная масса
ПАВ — поверхностно-активное вещество
ПНФА — п-нитрофенилацетат
РНК — рибонуклеиновая кислота
ТГП — тетрагидропиран
ТГФ —тетрагидрофуран
2-ТИК — трис [2-имидазолил] карбинол
4-ТИК — трис [4, (5) -имидазолил] карбинол
ЭЭДХ — 2-этоксиэтоксикарбинол-1,2-дигидрохинолин
Ad — аденин
ADP — аденозин-б'- дифосфат
АМР — аденозин-5'-монофосфат
АТР — аденозин-б'-трифосфат
GTP — гуанозин-5'-трифосфат
/-BDMS — трет-бутилдиметилсилильная группа
/-ВОС — трет-бутоксикарбонильная группа
CBz — карбобензоксигруппа
MS — мезитиленсульфохлорид (2,4,6-триметилбензолсульфо-
хлорид)
NAG — N-ацетилглюкозамин
NAM — ацетилмурамовая кислота
NBS — N-бромсукцинимид
S — растворитель
SAM — S-аденозилметионин
Z — защитная группа
Глава I
ВВЕДЕНИЕ В БИООРГАНИЧЕСКУЮ ХИМИЮ
Было бы полезно никогда не забывать, сколь
несовершенно наше понимание не только се-
бя самих как индивидуумов и как сообще-
ство в целом, но также понимание приро-
ды и мира, окружающего нас.
N. Hackerman, Science, 183, 907 (1974)
1
1.1. Основные положения
Биоорганическая химия — это новая дисциплина, изучающая
биохимические процессы с использованием химических методов
I и подходов, часто с помощью молекулярных моделей, которые
получают синтетическим путем в лаборатории. Это позволяет
рассматривать изолированно друг от друга параметры, в биоло-
гической системе находящиеся в едином целом.
Например, как узнать принципы работы биологической мем-
браны? Создают простую модель известного состава и изучают
какой-нибудь один процесс, например перенос ионов. А как ра-
ботает мозг? Это уже гораздо более сложная задача по сравне-
нию с предыдущей. Однако принципиально возможен тот же под-
ход: изучают отдельные синапсы и их компоненты, а затем с по-
мощью полученных данных строят теоретические модели.
Химики-органики развили методологию синтеза для того, что-
бы лучше понимать механизмы органических реакций и создавать
новые соединения. Биохимики в свою очередь изучают процессы
жизнедеятельности, применяя биохимические методы исследова-
ния (очистка и определение активности ферментов, метод ра-
диоактивных индикаторов в системах in vivo). Первые владеют
методами, позволяющими получать аналоги соединений, прису-
щих биологическим объектам, но часто затрудняются определить,
какой синтез был бы полезен. Вторые способны оценить, что
именно было бы полезно синтезировать в лаборатории, но не об-
ладают нужной квалификацией для решения этой задачи. Оче-
видна необходимость согласованного подхода, и химики-биоор-
ганики часто работают в двух лабораториях: в одной — синте-
зируя, в другой — изучая биологические объекты. В результате
переплетения химических и биологических подходов была выра-
ботана качественно новая концепция построения моделей для
изучения и разделения различных параметров сложного биоло-
гического процесса. Многие биологические реакции, а также дей-
ствие (специфичность и эффективность) участвующих в них
14
Глава 1
ферментов были воспроизведены в «пробирке» с использованием
простых органических моделей. Благодаря применению многих
таких моделей достигнуто довольно значительное понимание хи-
мических процессов, протекающих в биологических системах.
Научной базой при создании лекарственных препаратов слу-
жат представления о патологических состояниях организма, по-
лученные с использованием биоорганических моделей. Итак, хи-
мики-органики и фармакологи работают бок о бок, а биооргани-
ческая химия — это часть биохимии, равно как медицинская
химия — часть фармакологии.
Какие же инструменты нужны для проведения исследований
с помощью биоорганических моделей? Подходы, принятые в ор-
ганической и физической органической химии, уже сами по себе
обеспечивают наилучшие возможности построения моделей, т. е.
моделирования молекулярных событий, которые составляют ос-
нову жизнедеятельности. Весьма значительное направление клас-
сической органической химии посвящено природным соедине-
ниям. Химия природных соединений дала очень много сведений,
оказавшихся полезными при обнаружении и описании специфи-
ческих молекулярных процессов в живых системах. Достаточно
вспомнить, например, об антибиотиках, некоторых алкалоидах,
о создании новых лекарственных препаратов для медицины се-
годняшнего и завтрашнего дня.
Для любого процесса в живом организме необходима энергия,
которая получается при протекании химических реакций внутри
клетки. Основу биохимических процессов составляют химические
превращения, в частности реакции окисления и восстановления.
Биологическое окисление служит, таким образом, основным ис-
точником энергии для ряда внутренних биологических изменений.
Многие из протекающих при таком окислении реакции заключают-
ся в «сжигании» компонентов пищи, например сахаров или липи-
дов, что дает энергию, используемую затем для осуществления
таких важных процессов жизнедеятельности, как рост, размноже-
ние, поддержание гомеостаза, мускульная работа и выделение
тепла. Эти превращения включают также связывание кислорода:
дыхание — это биохимический процесс, в результате которого мо-
лекулярный кислород восстанавливается до воды. При метабо-
лизме энергия сохраняется аденозинтрифосфатом (АТР), богатым
энергией соединением, которое, как известно, служит универсаль-
ным переносчиком энергии.
Часть энергии «двигателя внутреннего сгорания» клетки ис-
пользуется для ремонта «машины». «Машина» состоит из струк-
турных компонентов, которые должны ею самовоспроизводиться.
Обычно в результате горения (окисления) выделяется только
тепло плюс свет и образуются продукты горения. Однако в ре-
зультате биологического окисления (сгорания) помимо простого
выделения тепла большое количество энергии используется для
Введение в биоорганическую химию
15
приведения в движение «молекулярного мотора», который синте-
зирует свои собственные копии, а также выполняет механичес-
кую работу. Поскольку эти превращения протекают при низкой
температуре (температура тела 37 °C) и в водной среде, то для
регулирования скорости высвобождения и передачи энергии не-
обходимы катализаторы. Следовательно, помимо структурных
компонентов «машина» клетки должна включать молекуляр-
ные катализаторы. Эти катализаторы должны проявлять высо-
кую эффективность (минимум непроизводительных затрат), спе-
цифичность, чтобы осуществлять вполне определенные превра-
щения.
Структурные компоненты не меняются; нас интересует в дан-
ном случае, что же участвует в превращении. Если необходимо
провести определенные реакции с образованием или разрывом
химических связей, исходя из конкретного соединения, то необ-
ходимо «сконструировать» подходящий специфический катализа-
тор, способный узнавать этот субстрат. Другими словами, в ос-
нове всех биохимических явлений лежит соответствие молекулы
субстрата и специфической реакции, которую он должен претер-
петь, другой структуре более высокого порядка, содержащей всю
информацию о планируемом специфическом превращении. Толь-
ко большие макромолекулы могут содержать молекулярную ин-
формацию, достаточную для узнавания субстрата, с одной сто-
роны, а с другой — для термодинамически эффективного превра-
щения. В роли таких макромолекул выступают белки. Они
должны обладать чрезвычайно гибкими физико-химическими
свойствами, поскольку их субстраты — огромное множество сое-
динений, весьма различающихся по своим физическим и химиче-
ским свойствам.
Следовательно, необходимо, чтобы состав белков мог менять-
ся в широких пределах, так чтобы они узнавали различные суб-
страты и взаимодействовали с ними. Для некоторых белков тре-
буется присутствие других соединений (небелковой природы)
для участия в процессах узнавания и превращения. Такие соеди-
нения называются коферментами. Поэтому можно заранее ска-
зать, что катализаторы белковой природы, или ферменты, долж-
ны обладать высокой степенью упорядоченности и организации.
Кроме того, вся необходимая информация должна быть записана
наиболее компактным образом. Такие упорядоченные биополи-
меры, с помощью которых работает и самовоспроизводится «дви-
гатель внутреннего сгорания» клетки, также должны совершенно
точно воспроизводиться. Было установлено, что действие фермен-
тов высокоспецифично структуре субстратов. Следовательно, ин-
формация о молекулярной организации белков (ферментов) долж-
на надежно храниться, будучи записанной на стабильном, относи-
тельно консервативном языке. И вот тут-то выходят на сцену
нуклеиновые кислоты. Значит, существует еще одно соответствие
16
Глава 1
структур биополимеров, при котором информация, содержащаяся в
белках и записанная в линейной молекулярной форме, может ко-
пироваться и передаваться другим клеткам.
Наилучший способ менять содержание информации, заложен-
ной в макромолекуле,— использование остова той или иной при-
роды, к которому присоединены различные наборы боковых це-
пей. Каждая из таких боковых цепей может нести сведения о том,
каким именно образом она должна взаимодействовать с другими
боковыми цепями или с соответствующим субстратом для осу-
ществления специфического разрыва или образования химиче-
ской связи. Следует вспомнить также о белково-нуклеиновых
взаимодействиях, принципиально важных для эволюции генетиче-
ского кода.
Вышеупомянутый остов — это не что иное, как полиамидная
цепь с боковыми цепями аминокислот. Почему именно полиамид-
ная цепь? Потому что она обладает способностью сохранять опре-
деленную трехмерную структуру биополимера в сочетании с не-
которой подвижностью цепи; последнее имеет существенное
значение в тех случаях, когда происходят конформационные изме-
нения (молекула «дышит»). Поэтому молекула субстрата может
меняться в пределах, предопределяемых конформацией белка.
Кроме того, таким образом создается возможность передачи ме-
ханической энергии.
Огромное многообразие структурных и функциональных свойств
белков обусловлено, таким образом, большим количеством извест-
ных органических структур. В воде, как реакционной среде, можно
иметь аминокислоты как неполярные (конформационнолабильные
или жесткие), так и неполярные (связанные водородными связями)
или ионные (сольватированные); как ароматические, так и али-
фатические; аминокислоты, обладающие как восстанавливаемыми,
так и окисляемыми группами. Таким образом, почти вся «энцикло-
педия» органохимических реакций может быть закодирована в
полипептидной цепи и ее третичной структуре. Наконец, поскольку
все аминокислоты существуют в ь (либо S)-конфигурации, понят-
но, что хиральность играет существенную роль в упорядочении
структуры.
1.2. Эффекты сближения в органической химии
Сближение реакционноспособных групп при химической реак-
ции приводит к поляризации связей, что в общем случае вызы-
вает ускорение реакции. В природе такая ситуация обычно дости-
гается строго определенным расположением специфических бо-
ковых групп аминокислот в активном центре фермента.
Изучение органических реакций помогает конструировать био-
модели ферментативных реакций и расширяет исследовательские
Введение в биоорганическую химию
17
возможности, например в медицинской химии в направлении ра-
ционального создания лекарственных препаратов. Поскольку ис-
черпывающее описание применения органических реакций для
биомоделирования — весьма трудоемкая задача, ограничимся в
настоящем обсуждении лишь несколькими существенными при-
мерами, которые помогут показать преимущества биоорганиче-
ских моделей, а также сформулировать проблемы, возникающие
при этом. В гл. 4 дается более полное представление о эффекте
сближения при внутримолекулярном катализе
В качестве первого примера рассмотрим гидролиз глюкозид-
ной связи. о-Карбоксифенил-Р-о-глюкозид (1-1) гидролизируется
со скоростью в 104 раз большей, чем соответствующий ?г-карбо-
ксифенильный аналог. Следовательно, карбоксигруппа в орто-по-
ложении должна участвовать или быть вовлечена в реакцию гид-
ролиза.
1-3
Это показывает, что подходящее расположение электрофиль-
ной или нуклеофильной группы может ускорить реакцию. Анало-
гичное явление имеет место в активном центре фермента, напри-
мер лизоцима. Конечно, важную роль играет и природа уходящей
группы, а также сольватация, особенно при протекании реакции
через переходное состояние. Реакции этого типа, называемые
сопряженным гидролизом, встречаются при внутримолекулярном
замещении; стерические факторы могут замедлять реакцию.
Рассмотрим другой пример. 2,2'-Толанкарбоновая кислота
(1-4) в этаноле превращается в 3-(2-карбоксибензилиден)фталид
(1-5). Скорость реакции в Ю4 раз больше, чем с соответствую-
щими 2-толанкарбоновой и 2,4'-толанкарбоновой кислотами. Следо-
вательно, одна из карбоксильных групп осуществляет общий кис-
лотный катализ (гл. 4) по механизму, известному под названием
комплементарный бифункциональный катализ.
18
Глава 1
Эфирная группа фенилового эфира 4-(4'-имидазолил) масляной
кислоты (1-6) гидролизуется быстрее, чем соответствующий фе-
ниловый эфир «-масляной кислоты. Если арильный остаток со-
держит «-нитрогруппу, скорость гидролиза при нейтральных зна-
чениях pH еще выше. Как и следовало ожидать, лучшая ухо-
дящая группа вызывает дальнейшее ускорение реакции. Эта
реакция протекает через образование тетраэдрического промежу-
точного соединения (1-7). Подробно такого рода промежуточные
1-6
соединения обсуждаются в гл. 4. В этом двустадийном превра-
щении имидазольная группа действует как нуклеофильный ката-
лизатор; ее сближение с эфирной группой и образование цикли-
ческого интермедиата — вот факторы, ответственные за ускоре-
ние реакции. Участие имидазольной группы в гидролизе эфирной
связи, возможно, представляет собой простейшую модель гидро-
литического фермента.
В разных случаях гидролиз амидной связи может также уско-
ряться. В приведенном ниже примере каталитический эффект
оказывает пиридиновое кольцо. Первая скоростьлимитирующая
стадия (медленная) приводит к образованию промежуточного
ацилпиридиния(1-11), напоминающего ацильное производное фер-
мента, обнаруживаемого во многих ферментативных реакциях.
Это промежуточное соединение затем быстро гидролизуется во-
дой.
Введение в биоорганическую химию
19
Последний пример взят из химии стероидов, он демонстри-
рует важное значение жесткой структуры. Сольволиз ацетатов
(1-13) и (1-14) в смеси метанола и триэтиламина проходит го-
раздо’быстрее, если они имеют p-OH-группу при 5-м атоме угле-
рода, причем скорость гидролиза увеличивается примерно в
300 раз.
цис-положение
1-13
1-14
Причины такого поведения становятся ясными, если изобра-
зить молекулу в трехмерном пространстве (1-15)- Жесткость сте-
роидного скелета обусловливает такое расположение двух
СН3
1-15
20
Глава 1
функциональных групп, при котором возможен внутри- и межмоле-
кулярный катализ. Ближайшая гидроксильная группа способна
участвовать в реакции гидролиза, образуя водородную связь при
взаимодействии с молекулами растворителя, и карбонильная
группа проявляет более высокую электрофильность. Такой меха-
низм реакции напоминает сольволиз эфиров по механизму об-
щего кислотно-основного катализа (гл. 4).
Приведенные примеры показывают, что многие основные реак-
ции, протекающие в активных центрах ферментов, можно моде-
лировать, используя взаимодействие обычных органических со-
единений в отсутствие белков. Роль последних заключается в уз-
навании субстратов и их ориентации, а сама химическая реакция
часто осуществляется под действием кофакторов (коферментов),
которые в свою очередь должны специфически узнаваться бел-
ками или ферментами. Последняя глава этой книги посвящена
химическим аспектам функционирования коферментов и их строе-
нию.
1.3. Молекулярная адаптация
При конструировании биомоделей также важны и должны
учитываться другие факторы наряду с эффектами сближения.
Например, в 1950 г. на Первом симпозиуме по химико-биологиче-
ской корреляции Фридман предложил концепцию биоизостериче-
ских групп [1]. В наиболее широком понимании этим термином
обозначают химические группы, обладающие близкими размера-
ми и формой и вследствие этого способные конкурировать за одну
и ту же биологическую мишень. Эта концепция имеет важное зна-
чение для молекулярной фармакологии, особенно для поисков но-
вых лекарственных препаратов методом вариации или молекуляр-
ной модификации [2].
Проиллюстрируем эту концепцию несколькими примерами из
фармакологии. Два нейромедиатора — ацетилхолин (1-16) и кар-
бахол (1-17) -- имеют сходное с мускарином действие (области
биоизостерической эквивалентности выделены). Мускарин (1-18) —
ацетилхолин 1-16
карйшл 1-17
мускарин 1-18
Введение в биоорганическую химию
21
алкалоид, ингибирующий действие ацетилхолина. Он обнаружен,
например, в Amanita muscaria (Fly Agaric) и других ядовитых
грибах. В соответствии с его структурой для блокирования дей-
ствия ацетилхолина на рецепторы клеток гладких мускулов и
клетки желез он должен присоединяться, как показано на схеме.
5-Фторцитозин (1-19)—аналог цитозина (1-20) и часто ис-
пользуется в качестве антибиотика при бактериальной инфекции.
М9 1-20
Одна из серьезных проблем при создании лекарственных препа-
ратов состоит в подборе условий лечения, при которых не по-
вреждались бы здоровые ткани, но разрушались бы инфициро-
ванные клетки или бактерии. Согласно новому подходу, лекарст-
во «маскируют», т. е. так химически модифицируют, чтобы при
проникновении в организм лекарство убивало вторгающиеся мик-
роорганизмы, не затрагивая здоровых тканей. Такой подход осно-
ван на использовании обычного для многих микроорганизмов
явления — транспорта пептидов. Соединение (1-19) через свою
аминогруппу химически присоединяется к небольшому пептиду.
Этот пептид содержит d-аминокислоты, поэтому он не гидроли-
зуется обычными ферментами и проникает в ткани человеческого
организма. Однако пептид с присоединенным к нему лекарствен-
ным препаратом проникает и в бактериальные клетки. Там он
утилизируется и освобождает активный антибактериальный пре-
парат, который убивает только чужеродные клетки. Такого рода
подходы разрабатываются группой Стейнфельда. Транспорт ле-
карственных препаратов с помощью пептидов оказался весьма
эффективным способом борьбы со многими болезнетворными ор-
ганизмами.
Аналогично 1-р-ц-2'~дезоксирибофуранозил-5-иодурацил (1-21)
является антагонистом 1-р-о-2/-дезоксирибофуранозилтимина, или
ОН
1-21
ОН
1-22
22
Глава 1
тимидина (1-22). Другими словами, он способен предотвращать
действие последнего в биологических системах, хотя и не обяза-
тельно выполняет его функции. Такой измененный метаболит на-
зывается антиметаболитом.
Еще одним примером молекулярной модификации служит
синтетический нуклеозид арабиноаденозин (1-23), который обла-
дает значительной активностью к вирусу герпеса и поэтому ши-
роко применяется в современной химиотерапии. Сходство этого
соединения с дезоксиаденозином (1-24), нормальным компонен-
том ДНК, поразительно (гл. 3). Молекулы этих соединений почти
идентичны и различаются лишь наличием или отсутствием 2/-гид-
роксильной группы. По сравнению с рибозным кольцом, прису-
щим РНК, эта группа имеет обращенную или эпимерную конфи-
гурацию и, следовательно, принадлежит к арабинозному ряду.
Интересно, что простое обращение конфигурации при С-2' придает
соединению антивирусные свойства. Механизм его действия
хорошо изучен. Оказалось, что после фосфорилирования оно дей-
ствует как мощный ингибитор синтеза ДНК (подробнее см. гл. 3).
Аналогично арабиноцитидин наиболее эффективен против острой
миелобластической лейкемии (разд. 3 5). Очень интересен и тот
факг, что этот противовирусный антибиотик (1-23) продуцирует-
ся бактерией Streptomyces antibioticus. Это дает возможность
производить большие количества препарата с помощью процесса
ферментации.
В качестве биоизостерических аналогов биологически важных
фосфатов нуклеозидов и других соединений был синтезирован ряд
органических фосфонатов [3] S-Энантиомер 3,4-диоксибутил-1-
фосфоновой кислоты (ДОБФ), например, получен как изостери-
ческий аналог sn глицеро 3-фосфата [4]. Полученное соединение
при низких концентрациях является бактериостатиком для неко-
торых штаммов Е. coll и В. Subtilus. Поскольку sn-глицеро-З-фос-
фат составляет основу фосфолипидов (важных компонентов кле-
точных мембран) и способен участвовать в метаболизме липидов
и в гликолитических превращениях, он чувствителен к ряду фер-
ментов, участвующих в этих процессах. Фосфоновая кислота так-
Введение в биоорганическую химию
23
же может участвовать в этих процессах, но только в определен-
ной степени. Например, она не гидролизуется до глицерина и
неорганического фосфата. Разумеется, /^-энантиомер лишен био-
логической активности.
У Ж®-Р°зна
НО—С—
НОСН£
•S-ДОБФ
1-25
У в|-рОзН*
HOCHf
sn- гпицеро-З-фосфорная кислота
1-26
Наличие атома галогена в молекуле иногда приводит к появ-
лению интересных свойств. Например, введение атома галогена
в 9а-положение кортизона (1-27) повышает активность гормона,
удлиняя его период полупревращения. Активность повышается
в следующем порядке: I > Br > Cl > F > Н. Эти аналоги кор-
тизона используются при диагностике и лечении расстройств коры
надпочечников и в качестве противовоспалительных средств [2].
Следующий пример: нормальная щитовидная железа отве-
чает за синтез и выделение необычной аминокислоты — тироксина
(1-28). Этот гормон регулирует скорость клеточных окислитель-
ных процессов [2].
Присутствие объемистых атомов иода препятствует свободному
вращению вокруг эфирной связи и вынуждает плоскости арома-
тических колец оставаться перпендикулярными друг другу. Следо-
вательно, можно сделать вывод, что такая конформация важна
для механизма действия гормона. Было высказано предположение
24
Глава 1
о том, что фенилаланиновое кольцо с двумя атомами пода участ-
вует во взаимодействии со связывающим центром.
Наличие алкильных групп или цепей также может влиять на
биологическую активность субстрата или лекарственного препа-
рата. Интересны в этом отношении антималярийные препараты —
производные 6-метокси-8-аминохинолина (1-29) (аналоги прима-
хина). Активность соединений, для которых п — любое число от
аналоги примахина
1-29
2 до 7, повышена. Следовательно, правильная укладка боковой
цепи в связывающем центре * или на белке каким-то образом
определяется размером и формой боковой цепи.
Наконец, следует упомянуть о молекулярной адаптации на
конформационном уровне. Действительно, можно привести много
примеров, один из них — распространенный наркотик фенцикли-
дин (1-30), известный как hog или «ангельский» порошок. Этот
сильный галлюциноген в то же время и эффективное обезболи-
вающее средство. Такие свойства можно объяснить соответствую-
фенциклиЗин морсрин
1-30
* Теория рецепторов — тема, более подходящая для обсуждения в книге по
медицинской химии. В широком смысле рецептор — это комплекс белков и ли-
пидов, которые при связывании с определенной органической молекулой (эффек-
тором, возбудителем нервного импульса) подвергаются физическому или конфор-
мационному изменению. Это изменение обычно вызывает серию последователь-
ных событий, приводящих к физиологическому ответу. В определенном смысле
можно провести аналогию между рецепторами и ферментами.
Введение в биоорганическую химию 25
щим пространственным расположением атома азота н фенильного
кольца, что делает это соединение удачным аналогом морфина
(1-31) на рецепторном уровне. Приведенный пример подчерки-
вает, что подходящая конформация соединения (иногда неожи-
данно) может обусловить очень необычное терапевтическое дей-
ствие из-за его сходства с другими соединениями.
Кроме стерических факторов и структурного сходства, о ко-
тором только что упоминалось, важное значение отводится вкла-
ду резонансных структур и индуктивному эффекту. Все эти фак-
торы следует принимать во внимание при планировании любой
молекулярной биомодели, которая должна обладать заранее за-
данными свойствами. Следовательно, небольшие направленные
изменения могут придать биомолекуле новые важные свойства.
Именно с этих позиций рассмотрены в следующих главах мно-
гие фундаментальные основы биоорганической химии.
Глава 2
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ АМИНОКИСЛОТ
Воображение важнее, чем знание.
А. Эйнштейн
Биоорганическая химия сблизила и переплела практическую
деятельность химика-органика и биохимика. В данной главе
авторы постарались показать взаимосвязи между органической
химией и биохимией, с одной стороны, и химией белка и меди-
цинской химией (фармакологией) — с другой. Как основной ис-
пользуется химический подход, и механизм биохимических реакций
описывается в сравнении с их синтетическими моделями. Органиче-
ский синтез и биосинтез пептидной и фосфоэфирной связи (гл. 3)
рассматриваются параллельно: таким образом выявляется уди-
вительный ряд сходных закономерностей. Каждая аминокислота
представлена как отдельное химическое соединение с уникальным
набором свойств. Способность аминокислот к диссоциации об-
суждается в терминах, принятых в органической химии для кис-
лот и оснований, и фундаментальные свойства аминокислот по-
даются читателю так, чтобы не было впечатления, будто амино-
кислота — это нечто совершенно особенное. Химия аминокислот
представлена как часть курса органической химии (реакции ал-
килирования, ацилирования и т. п.), а сведения по биохимии
рассмотрены с химической точки зрения.
2.1. Основные свойства аминокислот
Рассматривая белковый состав человеческого организма
(включая волосы, ногти, мышцы, соединительные ткани), мы
вправе предположить, что молекулы, составляющие сложный ор-
ганизм, имеют сложную природу. В таком случае необходимо
исследовать природу этих «молекул жизни». При обработке белка
раствором кислоты или основания вместо исходной молекулы
белка возникает раствор, содержащий много более простых, го-
раздо меньших по размеру молекул — аминокислот. Молекула
белка — высокомолекулярное соединение, или биополимер, в ко-
тором мономерные единицы — аминокислоты. Эти мономерные
единицы содержат аминогруппу, карбоксильную группу и атом
водорода, присоединенные к одному и тому же атому углерода.
Однако в различных аминокислотах образующий четвертую связь
с центральным атомом углерода атом (или группа атомов) не-
Биоорганическая химия аминокислот
27
одинаковы. Из этого следует, что мономерные единицы белка раз-
личны, а сами белки — сложные сополимеры. Напомним, что
в состав большинства полимеров, созданных человеком, входят
мономерные единицы лишь одного вида. Существует около двад-
цати аминокислот, из которых построены в природе все белковые
макромолекулы. Две из них не содержат пер-
вичной аминогруппы и представляют собой,
таким образом, а-иминокислоты. Эти амино-
кислоты — пролин и оксипролин — содержат
вторичные аминогруппы.
Поскольку в аминокислотах заместители R,
т. е. боковые цепи, различны, можно выделить
три группы аминокислот в соответствии с их
Н2ЬГ VOOH
Общая формула а-
аминокислот; четвер-
тый (R) заместитель
у тетраэдрического
полярностью.
Кислые аминокислоты можно узнать, на-
пример, по способности образовывать в спирте
нерастворимые кальцевые или бариевые соли.
атома углерода обес-
печивает разнообра-
зие этих мономерных
единиц.
Боковые группы таких аминокислот несут карбоксильную группу,
что обусловливает кислые свойства. К таким аминокислотам
R
относятся две:
а) Аспарагиновая кислота (Asp)
R = — СН2СООН; рКа (₽-СО2Н) = 3,86
б) Глутаминовая кислота (Glu)
R = — СН2СН2СООН; рКа (у-СО2Н) = 4,25
Основные аминокислоты можно отличить, например, по их
способности образовывать осадки с определенными кислотами.
В эту группу входят:
а) Лизин (Lys)
R = _(СН2)4—NH2: рКа (e-NH2) = 10,53
Можно предположить, что четыре метиленовые группы придают подвиж-
ность аминогруппе в белковой молекуле.
б) Оксилизин (Hylys)
R = —(СН2)2—CHOHCH2NH2; рКа (e-NHz) = 9,67
Эта аминокислота обнаружена только в структурном белке соединительных
тканей — коллагене.
в) Аргинин (Arg)
R = —(СН2)3—NHCNH2; рКа = 12,48
Гуанидиновая группировка этой аминокислоты придает ей сильноосновиые
свойства. Действительно, гуанидин — одно из самых сильных известных органи-
28
Глава 2
ческих оснований *, он сравним по силе с гидроксидом натрия. Следовательно,
при физиологических условиях (pH 7,35) эта группировка всегда ионизована.
Очень вероятно, что ее присутствие в аминокислотах обусловлено способностью
специфически взаимодействовать с фосфатными группами,
д) Гистидин (His)
R=—СН2
рА^б.ОО
TK /N—Н
Эта аминокислота содержит гетероциклическое имидазольное кольцо и об-
ладает уникальными химическими свойствами. Гистидин проявляет и слабокис-
лые и слабоосновные свойства; он также хороший нуклеофил и единственная
аминокислота, рХо которой близко к физиологическим значениям pH (7,35).
Следовательно, она может служить и как донор, и как акцептор протонов в хи-
мической реакции, связывая протон одним атомом азота и отдавая протон от
другого атома азота. Гистидин способен выполнять роль протонпереносящей
системы (разд. 4.4.1).
R
BeH-T-Nx^-N
Нейтральные аминокислоты содержат органические радикалы,
не способные ни принимать, ни отдавать протон. Простейшая и
единственная оптически неактивная аминокислота этой группы
а) Глицин (Gly), R = —Н.
Очевидно, эта аминокислота не проявляет особенно интересных химических
свойств, а ее биологическое значение сводится к роли структурного элемента в
тех случаях, когда важно расположить структуру в небольшом объеме (ком-
пактно). Структурные белки (коллаген, шелк, шерсть) содержат значительные
количества глицина.
Некоторые нейтральные аминокислоты проявляют гидрофоб-
ные свойства, обусловленные углеводородными боковыми цепями:
б) Аланин (Ala), R =—СН3.
* Сильноосновные свойства гуанидиновой группы объясняются тем, что про-
тонирование нминогруппы (> C=NH) приводит к образованию более стабиль-
ного катиона, чем протонпрованне первичной аминогруппы.
NH
н®
h2n—с—nh2
®
nh2
II
h2n—с—nh2
nh2
® I
h2n=c—nh2
гуаниЭин
nh2
I ®
h2n—c=nh2
NH3 NH®
аммиак.
Биоорганическая химия аминокислот
29
в) Валин (Vai), R =—СН(СН3)2.
г) Лейцин (Leu), R = —СН2СН(СН3)2.
д) Изолейцин (lie), R =—СНСН2СН3.
СН3
Боковые цепи в гидрофобных аминокислотах особым образом
взаимодействуют с окружающими молекулами воды, такие сое-
динения проявляют очень близкие свойства, которые лишь слабо
зависят от строения боковых цепей.
е) К нейтральным аминокислотам относятся также содержа-
щие ароматические радикалы в боковой цепи, например фенил-
аланин (Phe)
i< /=\
R = —СН2—Л™*- 259 нм
Отметим наличие в этой молекуле поляризуемого облака л-электронов.
ж) Гидроксилирование ароматического остатка фенилаланина
приводит к появлению еще одной функциональной группы —
оксигруппы, т. е. образуется тирозин (Туг)
R = —СН2——ОН 2mQx= 288 нм
Эта аминокислота содержит гидроксильную группу с р/< = 10,07, способ-
ную к диссоциации. Близость строения фенилаланина и тирозина обусловливает
способность первого превращаться во второй в организме. Отсюда следует, что
именно фенилаланин, а не тирозин, является незаменимой аминокислотой. Эти
аминокислоты — предшественники в синтезе гормона адреналина.
К нейтральным гидроксилсодержащим аминокислотам отно-
сятся также:
з) Серин (Ser), R =—СН2ОН.
Оксиметильная группа (рКо « 15) не диссоциирует при обычных физиологи-
ческих условиях. Однако серин играет важную роль в ряде биохимических ре-
акций благодаря способности своей первичной гидроксильной группы выступать
при определенных условиях в роли нуклеофила.
и) Треонин (Thr), R = —СНОНСН3.
Насколько известно, вторичная гидроксильная группа не участвует ни в од-
ной биохимической реакции.
Замена атома кислорода в серине на атом серы обусловли-
вает диссоциацию протона; образуется аминокислота цистеин.
к) Цистеин (Cys), R = CH2SH; р/(а = 8,33.
Атом серы с его поляризуемым (т. е. деформируемым) электронным обла-
ком — один из лучших нуклеофилов, которые только известны, и цистеин, по-
добно серину, может участвовать в некоторых биохимических реакциях. Кроме
того, сульфгидрильная группа цистеина легко окисляется с образованием дисуль-
фида — цистина.
к) Еще одна серосодержащая аминокислота — метионин (Met)
R = —(СН2)2—SCH3
30
Глава 2
В этой аминокислоте имеется высокополяризуемый центр в общем-то инерт-
ной боковой цепи. Нуклеофильная атака атома серы на переносчик биологиче-
ской энергии — адеиозиитрифосфат (АТР) — приводит к образованию донора ме-
тильной группы катионной природы, играющего важную роль в биохимических
процессах, — S-адеиозилметионина.
л) Другая аминокислота, содержащая индольную систему ко-
лец,— триптофан (Тгр)
—сн2
R =
max— 279 НМ
Обычный бактериологический тест — определение способности некоторых бак-
терий образовывать индол из триптофана. Индольное кольцо — прекрасный до-
нор л-электроиов. В присутствии акцепторов электронов оно способно образовы-
вать комплекс с переносом зарядов, или электронное перекрывание (очень сла-
бый вид связи с акцептором электронов).
В органической химии известно много примеров комплексов с переносом
зарядов. Наиболее простой из них — образование комплекса (1:1) между хло-
роводородом и бензолом при растворении НС1 в бензоле (так называемый п-ком-
плекс). При этом протон хлороводорода слабо взаимодействует с л-электропами
бензольного кольца.
Заметим, что именно аминокислоты фенилаланин, тирозин и
триптофан обусловливают спектры поглощения белков в ультра-
фиолетовой области спектра. Обычно считают, что максимум по-
глощения белков соответствует 280 нм.
При образовании первичных амидов аспарагиновой и глута-
миновой кислот образуются две нейтральные аминокислоты:
м) аспарагин (Asn), R =—CH2CONH2.
н) глутамин (Gin), R =—CH2CH2CONH2.
Превращение карбоксильной группы в амидную позволяет этим аминокис-
лотам участвовать в образовании водородной связи, что важно для выполне-
ния биологических функций.
Кроме того, к нейтральным аминокислотам относятся две
а-иминокислоты:
о) пролин (Pro)
п) оксипролин (Нурго)
НО,
...у—соон
N
н
соон
н
Именно вторичная аминогруппа придает жесткость и определяет направление
пептидной цепи, из которой построен белок. Так, например, направление спи-
рали коллагена (молекула коллагена построена как «тройная спираль» из трех
отдельных полипептидных цепей, переплетенных между собой) постоянно ме-
няется, что обусловлено содержанием в нем пролина и оксипролииа. Колла-
ген — единственный белок, в котором обнаружен оксипролин.
Биоорганическая химия аминокислот
31
Кроме этих обычных аминокислот, из которых построены бел-
ки, существуют и другие аминокислоты, не входящие в состав
белков, однако играющие важную биохимическую роль. Они
могут нести заместители по a-, (}-, у- или 6-положениям. Два
важных примера — это нейромедиатор у-аминомасляная кислота
(ГАМК) и предшественник гормона щитовидной железы (1-28,
гл. 1) 2,5-дииодтирозин. Из других можно назвать р-аланин
(предшественник витамина пантотеновой кислоты), р-цианаланин
(аминокислота, присутствующая в растениях) и пеницилламин
(используемый в клинической практике для образования хелат-
ных комплексов с металлами).
H2N—(СН2)3—соон
ГАМК
г.б-ЭциоЭглирозин
СООН
I
сн2
сн2
I
nh2
р-аланин
CN
СН
н2>г хсоон
р-цианаланин
Хотя все аминокислоты, входящие
сн3
СН3—С—SH
СН
h2n '"соон
пеницилламин
в состав белков, имеют
L-конфигурацию, некоторые аминокислоты, не участвующие в по-
строении белковых молекул, относятся к D-аминокислотам. Зна-
чение конфигурации для построения и функционирования белков
будет понятно при более подробном обсуждении биоорганиче-
ских процессов.
2.2. Кислотно-основные свойства
Аминокислоты представляют собой твердые кристаллические
вещества; в интервале температур 200—350 °C они обычно раз-
лагаются или плавятся, плохо растворимы в органических раст-
ворителях. Такие свойства говорят о том, что
аминокислоты — это органические соли, кри-
сталлическая решетка которых образована
биполярными ионами, или цвиттер-ионами,
т. е. протон карбоксильной группы протони-
рует аминогруппу той же молекулы. Такое
поведение — особенность не только аминокис-
лот, оно характерно для всех органических
солей (например, нуклеотидов — органических
одновременно могут содержать положительно
азота и фосфат-анион).
R
® А"Н
H3N 'COO®
Цвиттер-иоииая фор-
ма ь-аминокислот
(внутренняя соль).
молекул, которые
заряженный атом
32
Глава 2
Диссоциация всех аминокислот в растворе осуществляется по
двум возможных путям:
1) R~CI< гСООН СООе > p--CHZ + Н® рКа = 2,1±0,3 (для я, \хттт в большинства аминокислот) NH3® МН3
2) R—СН' ХСОО® ,СООе , > R—СРГ + Н® = 9’8 ± 9,7 (для m \хттт большинства аминокислот) INrlj INri2
Отсюда следует, что существует такое значение кислотности сре-
ды (pH), при котором аминокислота в растворе находится в виде
цвиттер-иона, т. е. суммарный заряд молекулы равен нулю. Зна-
чение pH, при котором это имеет место (вследствие определенного
положения протопа в молекуле), называется изоионной точ-
кой (р/t). Точно так же, если при определенных эксперименталь-
ных условиях молекула не несет электрического заряда (напри-
мер, не обладает электрофоретической подвижностью), значение
pH, при котором это происходит, называется изоэлектрической
точкой (р/е). Для водных растворов аминокислот
РЛ « РД (2-1)
Однако для белков такое соотношение не обязательно выполняет-
ся, поскольку они могут связывать и другие, помимо протонов,
ионы, которые вносят вклад в общий баланс зарядов (при ус-
ловии нейтральности молекулы белка). Можно ожидать, что
белки в изоэлектрической точке обладают меньшей раствори-
мостью, чем при меньших или больших значениях pH, и это дей-
ствительно имеет место. Поскольку в изоэлектрической точке мо-
лекула белка не обладает избыточным зарядом, в этих условиях
белок легче агрегирует и осаждается. Далее, поскольку амино-
кислотный состав разных белков различен, для каждого белка
существует характеристическое значение р/е. Это свойство яв-
ляется основой метода очистки белков путем изоэлектрического
осаждения (осаждения в изоэлектрических условиях): pH смеси
белков доводится до значения, равного значению р/е искомого
белка, так что последний осаждается из смеси. Значение р/е ами-
нокислот с нейтральной боковой цепью равно 5,6 ± 0,5; для ами-
нокислот, содержащих кислые группы, р/е ниже, а для амино-
кислот с основными группами в боковых цепях — выше. В то же
время для белков р/е может меняться от 0 до 11. Вывод формул
для расчета р/, аминокислот имеется в большинстве учебников
биохимии.
Отметим, что, так как аминокислоты обладают свойствами
кислот, интересно сравнить их с типичными органическими кис-
лотами и основаниями. Поскольку рКа — это значение pH, при
Биоорганическая химия аминокислот
33
Таблица 2.1. Значения рКа различных аминокислот (Л),
органических кислот и оснований (Б)
Соединение
А. Аминокислоты
(1) NH3®- СН2—СООН (СООН) = 2,34
глицин (NH2) = 9,60
(2) NH3®X (СООН) = 2,35
^сн—сн3 (NH2) = 9,69
ноос
аланин
(3) NH3®X /СН3 (СООН) = 2,32
сн—сн (NH2) = 9,62
ноос ^сн3
валин
(4) NH3®—СН2—СН2—СООН (СООН) = 3,60
А аланин (NH2) = 10,20
(5) NHj®—СН2—СН2—СН2—СООН (СООН) = 4,23
ГАМК (NH2) = 10,43
(6) NH3®~сн2—сн2—сн2—сн2—СООН (СООН) = 4,27
б-аминоеалериановая кислота (NH2) = 10,79
(7) NH3 ®~СН2—СН2—СН2—СН2—СН2—COOI ’ (СООН) = 4,43
е-аминокапроноеая кислота (NH2) = 10,79
м ? CH3CNHCH2—СООН (СООН) = 3,60
л- ацетилглицин
(9) NH3®—СН2—CONH2 (NH2) = 8,0
глициламиб
(10) NH3® (СООН) = 2,18
_СН—(СН2)4—NH3® (a-NH2) = 8,95
НООС (e-NH2) = 10,53
лизин
(11) н (СООН) = 1,82
NH ® л-N (Im) = 6,0
сн-сн2-О (NH2) = 9,17
НООС ge
гистиЭин
2 Зак. 549
34
Глава 2
Таблица 2.1. (Продолжение)
Соединение
(,2) NH3V V2
СН—(СН2)3—NHCNH -
НООС
аргинин
(13) NH®
/СН—сн2—соон
НООС
аспарагиновая кислота
(14) NH3®X
СН—СН2—СН2—СООН
НООС
глутаминовая кислота
(15) т О
NH ® ||
/СН—сн2—cnh2
НООС
аспарагин
(СООН) = 2,17
(NH2) = 9,04
= 12,48
(а-СООН) = 2,09
(/3-СООН) = 3,86
(NHJ = 9,82
(а-СООН) = 2,19
(у-СООН) = 4,25
(NH2) = 9,67
СООН) = 2,02
(NH2) = 8,8
<l6) NH,» J
/СН—сн2—сн2—cnh2
НООС
глутамин
(СООН) = 2,17
(NH2) = 9,13
(17) NH3®
/СН—СН2—СН2—СООН
EtOOC
а-этиловый эсрир
глутаминовой кислоты
о
(СООН) = 3,84
(NH2) = 7,84
(18)
• NH3®.
'СН—СН2—СН2—COEt
НООС
у-этиловый эсрир
глутаминовой кислоты
о
(СООН) = 2,15
(NH2) = 9,19
NH3®X
/СН—СН2—СН2—COEt
EtOOC
Зиэтиловый эсрир
глутаминовой кислоты
(NH2) = 7,03
Биоорганическая химия аминокислот
35
Таблица 2.1. (Продолжение)
Соединение
О
ОН
(20)
NH3®.
'CH—СН2—COEt
EtOOC
биэтилбеый эфир
аспарагиновой кислоты
(21) NH3®
)сн-сн2
ноос
тирозин
(22) NH®
\h~ch2sh
ноос
цистеин
(23) (CH3)3N®
•СН—СН2—SH
ноос
цистеин&етаиц-
(24) NH3®
\й—CH2—S—сн,
ноосх
•З-метилцистеин-
о
(25)
NH3®
ХСН2—С—NН—СН2- СООН
глицилглицин
Б. Органические соебинения
(1) СН3СООН
уксусная кислота
(2) НСООН
муравьиная кислота
(3) С1СН2СООН
хлоруксусная кислота
(4) С12СНСООН
бихлоруксусная кислота
(5) С13ССООН
трихлоруксусная кислота
(NHJ = 6,50
(СООН) = 2,20
(NHJ = 9,11
(ОН) = 10,07
(СООН) = 1,71
(SH) = 8,33
(NHJ = 10,78
(SH) = 8,65
(NH2) = 8,75
(СООН) = 3,06
(NH2) = 8,13
4,76
3,7?
2,85
1,зе
1,00
2*
36
Глава 2
Таблица 2.1. (Продолжение)
Соединение
(6) CF3COOH -0,25 трисрторуксусная кислота
(7) CH,NH3® 10,64 метиломин
(8) /"X 10,60 циклогексиломин
(9) ft \ 4,60 с V-NH3® анилин
(Ю) „ 5,17 С NH® пиридин
(И) /~\ » П>13 Он пиперибин
(12) /=\ 7,08 имийазол
(13) /=\ 2,50 Н н пиразол
(14) СН,—SH
метпилмеркаптан
тиодзенол
10,7
7.2
S.8
фенол
Биоорганическая химия аминокислот
37
Таблица 2.1 (Продолжение)
Соединение
рка
8,5
он
8,2
лг- хлорфЕнол
Л- ХЛОрфЕНОД
(20) С1
9,2
6,8
2,6-0ихлорфенол
(21) С1
CI
6,4
г.,4,6-трихлорфенол
п-нитрофенол
(23) СН3—ОН
метанол (метиловый спирт)
(24) о
НО—Р—ОН
он
фосфорная кислота.
16
2,12
7,21
12,32
38
Глава 2
Таблица 2.1 (II р одолжение)
Соединение
(25) О
II
но—сн2—сн2—о—р'
6,4
он
2>оксцэтилсрос(рат
(26) о о
, , ||/°
но—(сн2)3—о—рГ
хон
З-оксипропълфосфот
<27) 9 Да
6,5
6,7
ОН
Л-оксибутилфосфат
6,4
метил-р’-п-рибофуранозиВ-5-фосфат
котором половина всех молекул ионизована (см. в любом учеб-
нике биохимии уравнение Гендерсона — Хассельбаха, связываю-
щее pH и рКа), значение рКа любого соединения может служить
для оценки кислотных свойств этого соединения.
Сравним глицин и уксусную кислоту; первая кислота более
чем в сто раз сильнее второй (табл. 2.1), несмотря на сходство
их строения. Таким образом, наличие аминогруппы сильно влияет
на свойства карбоксильной группы. Ацетилирование аминогруппы
(устранение положительного заряда) понижает кислотность гли-
цина примерно в десять раз, но тем не менее карбоксильная
группа ацетилированного глицина проявляет свойства значитель-
но более сильной кислоты, чем уксусная кислота. Более высокая
кислотность глицина по сравнению с уксусной кислотой объяс-
няется двумя факторами. Индуктивный эффект положительно за-
ряженной аммонийной группы и ацетилированной аминогруппы
понижает электронную плотность на карбоксиле, так что протон
диссоциирует гораздо легче. Это влияние еще более усиливается
при наличии протонированной аминогруппы вследствие непосред-
Биоорганическая химия аминокислот
39
ственной близости положительного заряда к карбоксилу — так
называемый эффект поля.
Оба эффекта обычно наблюдаются при диссоциации большин-
ства органических кислот и оснований, и аминокислоты не ис-
ключение в этом отношении. Например, галогенирование уксус-
ной кислоты дает еще более сильную кислоту. Сила кислот по-
вышается в ряду: уксусная кислота < монохлор- < дихлор- <Z
<трихлоруксусная кислота. Такое изменение кислотных
свойств — следствие отрицательного индуктивного эффекта, т. е.
оттягивания электронной плотности от карбоксигруппы через ко-
валентные связи Молекулы кислоты (искажение или изменение
электронной плотности, передаваемое через о-связи) на электро-
отрицательный атом хлора. Отсюда следует, что замена трех
атомов хлора на три еще более электроотрицательные атома
фтора приведет к еще более сильной кислоте — трифторуксусной.
В то же время повышению кислотности карбоксильной группы
может способствовать влияние, передаваемое без посредства ко-
валентных связей (через пространство). Такие электростатиче-
ские эффекты называются эффектами поля. В качестве иллюст-
рации рассмотрим поведение малоновой и диэтилмалоновой кис-
лот при диссоциации. Отношение констант диссоциации и
в водных растворах для первого соединения равно 700, для вто-
рого — 120 000.
в
О. О
,с— сн2—сд
ст он
малоновая кислота
К,/Кг ~ 700
3, х>
° <кн, он
биэтилмалоновая кислота.
К,/К2 = 120000
Легко видеть, что в случае малоновой кислоты большая часть
пространства между двумя карбоксильными группами занята
молекулами воды, тогда как в случае диэтил малоновой кисло-
ты — двумя алкильными группами. Две этильные группы пред-
ставляют собой среду с низкой диэлектрической проницаемостью,
так что образование единичного отрицательного заряда на пер-
вой карбоксильной группе оказывает сильное влияние на пове-
дение второго карбоксила. Следовательно, при диссоциации
второго протона проявляется сильное электростатическое оттал-
кивание, что приводит к большому различию первой и второй
констант диссоциации диэтилмалоновой кислоты. Однако моле-
кулы воды сильно экранируют отрицательный заряд после дис-
социации первого протона малоновой кислоты, так что диссоциа-
ция второго протона приведет к более слабому электростати-
ческому отталкиванию. Отметим, что наличие в молекуле
40 Глава 2
положительно заряженного катиона аммония стабилизировало бы
образовавшийся отрицательный заряд карбоксильной группы.
Учитывая эти соображения, можно разобраться в поведении
аминокислот при диссоциации. Например, замещение а-протона
в глицине на метильную группу должно лишь незначительно по-
влиять на рКа карбоксильной группы. Это действительно выпол-
няется для аланина (табл. 2.1), а также для других аминокислот
с нейтральными боковыми группами. Однако в р-аланине, в ко-
тором аминогруппа отделена от карбоксильной уже двумя угле-
родными атомами, эти две функциональные группы оказывают
друг на друга меньшее влияние и значение рХй попадает в ин-
тервал между значениями р/(а глицина и рКа уксусной кислоты.
рКа карбоксигруппы нейромедиатора ГАМК, в котором амино- и
карбоксигруппы отделены тремя углеродными атомами, близко
по значению таковой в уксусной кислоте.
Сходная ситуация наблюдается и для дикарбоновых аминокислот. Аспара-
гиновая кислота несет в боковой цепи p-карбоксильную группу, которая, по-
добно а-карбоксильной группе, но в меньшей степени, испытывает влияние ами-
ногруппы, рКа = 3,86 (табл. 2.1). Глутаминовая же кислота несет в боковой
цепи у-карбоксильную группу, которая расположена на большем расстоянии от
аминогруппы, и едва ли последняя влияет на нее, р/С = 4,25. Следовательно,
помимо строения различие между аспарагиновой и глутаминовой кислотами за-
ключается в силе этих кислот, что может оказаться важным в биохимических
процессах.
Вернемся еще раз к свойствам аминогруппы глицина: она
проявляет более сильные основные свойства (более высокое зна-
чение рКа), чем обычный органический амин. Можно ожидать,
что единичный отрицательный заряд карбоксильной группы при-
ведет к повышению электронной плотности на аминогруппе и что
электростатическое притяжение (эффект поля) между аммоний-
катионом и карбоксилат-анионом затруднит отрыв протона от
аммонийной группы. Это действительно так, и оба эффекта иг-
рают важную роль. Тем не менее рКа аминогруппы глицина ра-
вен 9,60, тогда как у метиламина 10,64 (табл. 2.1). Это проис-
ходит потому, что наиболее важным, или определяющим, эффектом
является оттягивание электронов карбоксильной (карбонильной)
группой. Так, если нейтрализовать весь заряд карбоксиль-
ной группы путем превращения ее в амид, то рКа аминогруппы
глициламида равен 8,0, а для глицилглицина 8,13. При этом не
возможны ни повышение электронной плотности карбоксилат-ани-
оном, ни эффект поля (электростатическое влияние); единствен-
ным эффектом остается оттягивание электронов амидной карбо-
нильной группой. Отметим, что этерификация аспарагиновой и
глутаминовой кислот аналогичным образом влияет на свойства
полученных соединений (табл. 2.1). Аминогруппы диэтиловых
эфиров обладают кислыми свойствами.
Помимо индуктивного эффекта и эффекта поля важную роль
в определении силы органических кислот и оснований играют j
Биоорганическая химия аминокислот
41
резонансные эффекты. Например, рКа простого алкилового спир-
та равен ~ 15, а гидроксила тирозина 9,11. Аналогично, рКа гид-
роксильной группы фенола равен 9,8 (табл. 2.1). Это легко по-
нять, представив, что после ионизации фенолят-анион стабилизи-
рован путем образования резонансных структур:
ОН ое о
фенол
Такие же представления можно привлечь для объяснения еще бо-
лее низких значений рКа п-нитрофенола (рКа = 7,1) (для него
существует еще одна важная резонансная структура):
л-нитрофенол (оранжевый)
(бесцветный) (Лтах=^00нм)
Резонансный эффект не следует смешивать с понижением значе-
ния рКа, к которым приводит галогенирование фенола (табл. 2.1),
поскольку при этом вновь проявляется отрицательный индуктив-
ный эффект. Тем не менее резонансные эффекты могут быть по-
лезны при изучении других важных соединений, как, например,
при сравнении основности циклогексиламина и анилина. Цикло-
гексиламин характеризуется значением рКа, типичным для орга-
нического амина (табл. 2.1), а анилин проявляет значительно
более кислые свойства. Это происходит потому, что в любой дан-
ный момент времени электронная плотность на аминогруппе ани-
лина гораздо ниже, чем на аминогруппе циклогексиламина. Сво-
бодная пара электронов азота анилина сопряжена с электронами
ароматического цикла путем образования резонансных структур:
анилин
Хотя не существует аминокислот, производных анилина, в био-
логических системах можно найти примеры расположения экзо-
циклических аминогрупп на гетероциклическом ароматическом
кольце. Наиболее известны пурины (аденин и гуанин) и пирими-
дин (цитозин). Их свойства обсуждаются в гл. 3.
42
Глава 2
Три важных фактора — индуктивный эффект, эффект поля и
резонансный эффект — могут сильно влиять на поведение орга-
нических кислот и оснований, включая и биологически важные
а-аминокислоты. В водном растворе, обычной среде протекания
биологических реакций, эти эффекты обусловливают большое
разнообразие свойств, так что процессы диссоциации могут
происходить во всем диапазоне pH. Это важно, потому что бел-
ки, построенные из аминокислот, в зависимости от своего ами-
нокислотного состава могут принимать участие в кислотно-основ-
ных превращениях. Действительно, в упрощенном виде диссо-
циацию аминокислот можно рассматривать как миниатюрную
модель диссоциации белка. В биохимических реакциях важные
функции выполняют белки, и аналогия с аминокислотами может
служить основой для понимания процессов передачи протонов.
Однако такая модель слишком упрощена. Она не учитывает
кооперативные взаимодействия. Например, как поведет себя ли-
зин при диссоциации под действием линейно-расположенных по-
ложительно заряженных аминокислотных остатков, входящих в
состав белка? Далее, каким образом близко расположенная гид-
рофобная область белковой молекулы (т. е. область с более низ-
кой диэлектрической проницаемостью) влияет на ее диссоциацию
в данном химическом процессе? То, что в этом случае можно
ожидать значительных изменений, видно из поведения глицина
при диссоциации в среде с низкой диэлектрической проницае-
мостью; например, в 95%-ном этаноле (рДа карбоксильной груп-
пы глицина равен 3,8, а аминогруппы 10,0). Можно было бы
подумать, что в этом случае по кислотности глицин близок к ук-
сусной кислоте, но это не так, поскольку для последней рД„ ра-
вен 7,1.
На примере ионизации цистеина, выбранного в качестве про-
стой модели, можно проиллюстрировать, что диссоциация на по-
верхности белка отражает сложное взаимодействие мономерных
остатков аминокислот. Схему ионизации можно представить сле-
дующим образом:
CH2SH CH2SH CH2SH
и—с—соон н—с—СОО6 II с—соо°
- NH3® NH3® NH2
CH2Se
I
нс coo®
' I
nh2
где рД1 = 1,71, p/(2 и/или рД3 = 8,33
и/или 10,38 (табл. 24).
Биоорганическая химия аминокислот
43
Константа ионизации карбоксильной группы (p/Ci) мала, ее
легко определить. Однако аммонийная и тиольная группы имеют
близкие значения рК (ср. метиламин и метилмеркаптан,
табл. 2.1), так что не известно, которая из групп ионизуется
первой. Ki, /<2 и Кз — это макроскопические константы иониза-
ции, экспериментально найденные из кривых титрования. Т(2 и /<3
складываются из четырех микроскопических констант ионизации.
После отрыва протона от карбоксильной группы процесс иониза-
ции может протекать двумя путями:
CH,S9
I
н—с—coo®
кн2
CH,S®
I
н—с—coo®
CH2SH
н—с—coo®
I »
NH3®
CH,SH
I
Н—С—COO® Pfcz = 8-9
| pfc3 = 10,4
NH2 р/г4 = 10,0
Поскольку четыре микроскопические константы ионизации нель-
зя определить из кривых титрования, необходимо было исполь-
зовать спектрофотометрический анализ в ультрафиолетовой области
для группы R—S_. р/< = 8,65 бетаиновой структуры цистеина
(ионизация тиола в присутствии положительно заряженного
атома азота) и р/( = 8,75 S-метилцистеина (ионизация ами-
ногруппы в присутствии нейтрального атома серы) близки к зна-
чениям k\ и k2 для диссоциации по выше приведенным механиз-
мам и свидетельствуют, что эти величины должны иметь близкие
значения (табл. 2.1). Здесь надо вновь отметить важный вклад
индуктивного эффекта и эффекта поля, обусловливающих разли-
чие рКа этих соединений от р/<ы обычных алкилмеркаптанов и
аминов.
На основании известных фактов о том, что при любых pH
(скажем, при физиологическом значении 7,35), ионной силе и
даже диэлектрической проницаемости аминокислоты и белки мо-
гут существовать в различных ионизационных состояниях, можно
ожидать, что молекулы эти будут взаимодействовать с водной
средой благодаря образованию ионных (электростатических) и
водородных связей. Вот почему каждый белок обладает прису-
щей ему специфической степенью гидратации, или, другими сло-
вами, он должен связаться с определенным количеством воды
для того, чтобы сохранить свою целостную структуру. Молекулы
44
Глава 2
воды не только связываются, но и упорядочиваются, определен-
ным образом ориентируясь вокруг молекулы белка. Изучение
простых модельных систем (аминокислот и нейтральных анало-
гов) физическими методами (определение кажущегося моляльно-
го количества) указывает на возможность упорядочения молекул
растворителя (воды) на поверхности белка. Кажущееся моляль-
ное количество Фх определяется по уравнению
X - п,х'
Ф„ =---——
Л П2
где Х,— молярная характеристика чистого растворителя,
п2 — мольная доля растворителя и растворенного вещества. Фх
отражает вклад растворенного вещества в свойство «X» раство-
рителя, если рассматривать растворитель в отсутствие раство-
ренного вещества.
(2-2)
NH3®—СН2—СО2е
глицин
Фу = 43,5 мл/моль
Фс — 8,8 кил
СИ3
NH3®—СН—СО2е
аланин
Фу = 60,6 мл/моль
Фс = 33 кал
NH3—' СН2—СН2—СООе
/З-аланин
Фу = 58,9 мл/моль
Фс = 18 кал
но—сн2—conh2
амиЭ гликолевой
кислоты
Фу — 56,0 мл/моль
Фс = 36 кал
сн3
I
но—сн—conh2
амий молочной
кислоты
Фу = 73,8 мл/моль
Фс = 58 кал
Кажущиеся моляльные объемы Фу и теплоемкости Фс гли-
цина, аланина, р-аланина и их нейтральных аналогов ясно ука-
зывают на существование более плотной и более упорядоченной
упаковки молекул воды (гидратной оболочки) вокруг заряжен-
ных частиц. Метильная группа аланина — вот причина стериче-
ского отталкивания, которое мешает сольватированию. Однако,
как показывают данные для р-аланина, сольватация нарушается
при разделении зарядов, т. е. при ослаблении взаимного притя-
жения зарядов в цвиттер-ионе. Значения Фс согласуются с этим
объяснением; меньшие значения отражают существование более
упорядоченной системы или меньшую степень свободы, а следо-
вательно, меньшую способность поглощать тепло при увеличении
температуры.
Биоорганическая химия аминокислот
45
Вполне понятно, что процессы ионизации весьма разнообраз-
ны и играют важную роль в реакциях, протекающих в водной
(биологической) среде. Однако ионизация не единственный хими-
ческий процесс, который может иметь место в биологической си-
стеме (организме). Аминокислоты — органические молекулы, спо-
собные участвовать в реакциях, хорошо известных химику-орга-
нику. Можно поэтому ожидать, что подобные реакции протекают
и в биологических системах, знакомых биохимикам. Однако проб-
лема заключается в том, что обычные условия проведения хи-
мических реакций (высокая температура, безводные органические
растворители и т. д.) нельзя переносить на биохимические си-
стемы, где все процессы протекают в водной среде при темпера-
туре живого тела, с использованием биологических катализато-
ров— ферментов. Тем не менее для химика-биоорганика инте-
ресно сравнить пути реакций, протекающих in vitro, т. е. при
химическом синтезе, и in vivo, т. е. в организме. Различия и сход-
ство, преимущества и недостатки моделирования лучше всего
видны при параллельном рассмотрении этих процессов, начиная
с химии аминокислот и кончая органическим синтезом и биосин-
тезом белков.
2.3. Алкилирование
Благодаря тому что амины — хорошие нуклеофилы, алкилиро-
вание аминокислот представляет собой важную и широко рас-
пространенную реакцию и в органических, и в биологических си-
стемах. Простая реакция метилирования может протекать сле-
дующим образом:
Н3С—X + :NH2—R -> CH3NH2—R + X:9
где X — галогенид, сульфат и др.
б) ф
CH3NH2—R + :NH2—R^CHjNHR + NH3~ R-X:9
Реакция обычно не останавливается на стадии моноалкили-
рования, а продолжается путем нуклеофильной атаки моноалки-
лированной кислоты на другую молекулу алкилирующего агента.
Это в последнем случае приводит к образованию четвертичной
аммонийной соли аминокислоты, которая называется также бе-
таином. Отсюда следует, что при монометилировании глицина
образуется саркозин, участвующий в метаболизме мышечной тка-
ни, а триметилирование приводит к глицинбетаину. В число дру-
гих биологически важных четвертичных аминов входят ацетил-
холин (передатчик нервных импульсов) и карнитин (который, об-
разуя своей гидроксильной группой сложный эфир с ацильными
соединениями, переносит их через клеточные мембраны). Однако
46
Глава 2
бетаины аминокислот не выступают в качестве биологических
алкилирующих агентов или доноров метильных групп.
СН3
1е
СН3—N—СН2—СН—СН2—СООН
сн3 он
карнитин
сн3 о
I® II
СН3—N—сн2—сн2—о—с—сн3
сн3
ацетилхолин
Метилирование протекает нелегко как в органических (химиче-
ских), так и в биологических системах.
Nu:'+‘h3C7zN(CH3)2R Nu—СН3 +(H3C)2NR
где Nu: — нуклеофил. Однако сульфониевые соли могут высту-
пать в качестве доноров алкильных остатков. Кроме того, бла-
годаря высокой нуклеофильности атома серы такие соединения
легко получить, как видно из следующего примера:
РЧ /СНз «/СН3
S Ph—sf
Л сн3.--
+ сн3—I ---► ^:Nu
®
Ph—S—СН3 + СН3—Nu
В биологических системах универсальным донором метильных
групп является сульфониевое соединение S аденозилметионин
(SAM). В свою очередь SAM синтезируется из аминокислоты
метионина и другого биологически важного с( единения — адено-
зинтрифосфата (АТР), высокоэнергетического соединения (фор-
ма хранения биологической энергии). Как и йообще все химиче-
ские реакции, протекающие в организме, эта реакция также ка-
тализируется ферментом. Реакция термодинамически выгодна и
в отсутствие белкового катализатора, однако фермент катализи-
рует ее определенное направление. Без катализатора возможны
и другие реакции, например разрыв трифосфатной цепи; ката-
лизатор же связывает и ориентирует нуклеофильный атом серы
таким образом, что становится возможной атака только по ме-
тиленовому атому углерода. Позже подробно обсуждается важ-
ность такого связывания и эффектов сближения; сейчас следует
отметить, что, хотя аденозин в составе АТР и не участвует в хи-
мическом превращении, он служит для узнавания АТР фермен-
том Фермент узнает молекулу АТР и затем связывается с ней.
Биоорганическая химия аминокислот
47
Метионин — незаменимая аминокислота организма млекопитаю-
е е е НО ОН
АТР
После того как S-аденозилметионин теряет свою метильную
группу и образующийся S-аденозилгомоцистеин гидролизуется
молекулой воды, образуется аминокислота гомоцистеин. В орга-
низме млекопитающих гомоцистеин может превращаться в ци-
стеин, и поэтому последний не является незаменимой аминокис-
лотой; гомоцистеин может быть превращен также в метионин
при метилировании соединением, которое служит источником уг-
леродных фрагментов (метил, формил и др.) в биологических
системах,— тетрагидрофолиевой кислотой. В некоторых бакте-
риях гомоцистеин может превращаться в метионин при метили-
ровании метилкобаламином (метильным производным витамина
Bi2) в присутствии других необходимых соединений или кофакто-
ров. Последняя из описанных реакций метилирования представ-
ляет интерес, поскольку может протекать с низкой скоростью в
отсутствие ферментов, и на ее основе была создана простая мо-
дельная система (гл. 6).
Таким образом, алкилирование может проходить в условиях,
типичных для органических реакций с использованием таких
алкилирующих агентов, как метилиодид, диметилсульфат или
метилфторсульфонат, либо протекать в физиологических усло-
виях с помощью S-аденозилметионина и соответствующего фер-
мента. Однако, используя сильные алкилирующие агенты в из-
бытке, удается провести алкилирование аминокислот и белков и
при физиологических условиях (в отсутствие фермента). На этом
основаны некоторые важные биохимические тесты, а также при-
менение ряда лекарственных препаратов,
48
Глава 2
Сильные алкилирующие агенты — это азотистые или серни-
стые иприты. Они составляли действующее начало отравляющих
газов, применявшихся в первой мировой войне. В этих соедине-
ниях и нуклеофил, и уходящая группа входят в состав одной и
той же молекулы, что приводит к внутримолекулярной (а не
межмолекулярной) нуклеофильной атаке. Такое направление
реакции наиболее вероятно, т. е. более предпочтительно (в тер-
минах энтропии). В результате нуклеофильной атаки, проходящей
I
R
СН2—СН/ Вг
R—N:-^
рчалогеналкиламин
р-галогеналкипсупьфиа
азиридиновое кольцо R' зписулъфониевое кольцо
(азиривиний-ион) аминокислота (этиленсульфиаий-ион)
N— СН2—СН2—NH- R' R- S—СН2 - СН2—NH R’
алкилированная аминокислота
с высокой вероятностью, образуется напряженное азиридиновое
или эписульфониевое кольцо, представляющее собой сильный
алкилирующий агент. Вследствие более низкой нуклеофильности
атома кислорода аналогичное оксониевое кольцо не образуется
так легко, и поэтому |3-галогенэфиры не относятся к сильным
алкилирующим реагентам. р-Галогенакиламины имеют важное
значение в фармакологии, и лекарственные препараты на их ос-
нове, например феноксибензамин, используются в клинической
практике. Как недостаток таких соединений следует отметить от-
сутствие избирательности: они реагируют со всеми белками,
с которыми контактируют или связываются, вместо того чтобы
реагировать с конкретным белком.
.фенокси&нзамин
Биоорганическая химия аминокислот
49
Определенная специфичность действия была достигнута в случае противо-
опухолевого препарата — циклофосфамида. Действие этого препарата основано
на том, что в раковых клетках наблюдается повышенная дефосфорилирующая
активность (отщепление фосфата) по сравнению с нормальными клетками, по-
этому препарат взаимодействует преимущественно с ними.
ЦиКЛОфОСфамиЗ
Еще одна группа сильных алкилирующих агентов — а-гало-
генкетоны. Классический пример — это ТФХК (тозил-ь феиилала-
нилхлорметилкетон), специфически реагирующий с одним из hmi-
дазольных колец (остаток гистидина) в ферменте а-химотрипсине
(разд. 7.2.3). Эти соединения значительно более реакционноспо-
собны при 5.\|2-замещениях, чем галогеналкилы. Например, нук-
леофильная атака иодом хлорацетона протекает в 33 000 раз бы-
стрее, чем в случае н-пропилхлорида (растворитель— ацетон,
50°С). Следует ожидать, что отрицательный индуктивный эффект
карбонильной группы повышает электрофильность метиленовой
группы и стабилизирует приближающийся нуклеофил анионной
природы. сс-Галогенкислоты и их амиды проявляют аналогичный
эффект, так что и иодуксусная кислота, и иодацетамид получили
применение в качестве реагентов для алкилирования чистых фер-
ментов.
Бензилгалогениды также сильные алкилирующие реагенты
в реакциях Бн2-замещения. Следует напомнить, что Бм2-реакция
протекает через $р2-гибридизацию, при этом р-орбиталь связана
Стабилизация $р2-переходного состояния с помощью р-орбитален бензольного
кольца галогепбензила; L — уходящая группа, Nu — нуклеофил.
с атакующей и уходящей группами. Такая р-орбиталь сопряжена
с системой л-электронов бензольного кольца, что стабилизирует
переходное состояние.
2,4-Динитрофторбензол (реагент Сенгера) — алкилирующий
реагент, который нашел широкое применение в аналитической
практике (при определении последовательности аминокислот, об-
разующих белковый полимер).
50
Глава 2
R—NH2
R = остаток амино-
кислоты
Нуклеофильная концевая аминогруппа белка (остаток первой
аминокислоты или белкового мономера, аминогруппы остальных
аминокислот вовлечены в образование полимерной цепи, т. е.
образуют ненуклеофильные амидные связи) замещает атом фтора
по механизму присоединения—отщепления. Такая реакция про-
текает с образованием отрицательно заряженного промежуточ-
ного соединения.
Видно, что эта реакция легко проходит только при стабилизации
отрицательного заряда. Этим и вызвана необходимость присут-
ствия нитрогруппы. Соединение, содержащее фтор, более реак-
ционноспособно, чем соответствующий хлорированный аналог,
что может показаться удивительным, поскольку хлор считается
лучшей уходящей группой. Однако отщепление уходящей группы
не скоростьлимитирующая стадия. Кроме того, благодаря более
сильному индуктивному эффекту более электроотрицательный
атом фтора обусловливает большую стабилизацию промежуточ-
ного аниона, тем самым повышая электрофильность атома угле-
рода, по которому идет нуклеофильная атака.
Реагент Сенгера обладает характерными хромоформными свойствами (в УФ-
11 видимой области; Хтах = 350 нм), которые делают его еще более удобным при
Проведении анализа. 2,4-Динитрофенильные производные аминокислот окрашены
Биоорганическая химия аминокислот
51
в ярко-оранжевый цвет, что позволяет легко отличать их от остальных аминокис-
лот при хроматографическом разделении. Следовательно, после проведения реак-
ции с реактивом Сенгера белок можно гидролизовать в кислых условиях (алки-
лированная концевая аминокислота устойчива в 6 н. НС1, «анилиноподобный»
азот аминогруппы обладает слабоосновными свойствами) до мономерных амино-
кислот, так что концевую аминокислоту легко отделить и идентифицировать.
В качестве реагентов для биохимических тестов используются н другие ана-
логи реагента Сенгера. Такая возможность следует из того, что концевая амино-
группа не единственная нуклеофильная группа белковой молекулы, многие боко-
вые цепи аминокислот также несут нуклеофильные группы. Такне группы, как
4-<pmop-3-Humpo-
фенцлазиО
2,4-Зииитро-5-фторанилин
(реагент Бергмана)
1,5-Эифтор-2,4*
биншпробензол
Структура некоторых аналогов реагента Сенгера.
гидроксильная группа тирозина, сера в цистеине или метионине, е-аминогруппа
лизина или имидазольное кольцо гистидина, взаимодействуют с реагентом Сей-
гера или его аналогами. 2,4-Динитро-5 фторанилин реагирует с аминокислотами
с образованием производных, имеющих полосу поглощения в видимой области
(Хтах = 400—410 нм) и легко кристаллизующихся. Более того, аминогруппа
реагента может связываться с другими красителями, что приводит к более чув-
ствительному методу обнаружения малых количеств аминокислот. 4-Фтор-З-ни-
трофеиилазид можно использовать для фотоаффинного мечения белков. Другими
словами, белок алкилируют реагентом, затем облучают УФ светом, так что азид
превращается в реакционноспособный нитрен, который также ковалентно связы-
вается с белком в подходящем участке. 1,5-Дифтор-2,4-динитробензол может
служить бифункциональным агентом, образующим поперечные сшивки. Два ну-
клеофила, расположенные на поверхности белка вблизи друг друга, могут за-
мещать атомы фтора.
По реакциям алкилирования аминокислот можно сделать не-
которые выводы. Во-первых, хотя конечный продукт один и тот
же, методология его синтеза химическим путем и в живом ор-
ганизме существенно различны. Тем не менее они подчиняются
одним и тем же физическим законам: термодинамическим зако-
нам, законам сохранения вещества и энергии и др. Во-вторых,
применение химических методов при конструировании соедине-
ний, пригодных для биологических систем, составляет основу
подхода при разработке биохимических тестов (т. е. моделей, ко-
торые биологи могли бы использовать при изучении процессов
жизнедеятельности), а также при поиске соединений, обладаю-
щих фармакологическим действием (т. е. таких, которые эффек-
тивно действуют, направляя патологические химические процессы
в нормальное русло). Для достижения этих целей оказались
полезными не только реакции алкилирования, но и другие
реакции. Например, сульфонилирование концевой аминогруппы
52
Глава 2
диметиламинонафталин-5-сульфохлоридом (дансилхлоридом), т. е.
введение группы с сильными флуоресцентными свойствами, или
4-диметиламиноазобензил-4'-сульфохлоридом (дабсилхлоридом —
сильным хромофором) с последующим гидролизом белка (суль-
фамидная связь устойчива в 6 н. НС1) может быть использовано
вместо взаимодействия с реагентом Сенгера при определении
N-концевой аминокислоты со свободной аминогруппой белка.
Предложены и другие реагенты, специфически вступающие в
реакцию и изменяющие структуру и функциональные группы
в молекуле белка, что облегчает изучение белков. Более глубоко
такие реагенты обсуждаются в основном курсе химии белка,
а также в курсе органической химии.
СН3
SO2C1
бансилхлориб
ЭаБеилхлориб
Заслуживает особого внимания реакция ацилирования амино-
кислот. Другие реакции аминокислот также имеют важное био-
логическое значение. Например, как будет показано позднее,
в основе всех реакций витамина В6 лежит образование основа-
ний Шиффа (взаимодействие амино- и альдегидной групп; гл. 7).
Однако именно ацилирование аминогруппы одной аминокислоты
карбоксильной (активированной) группой другой аминокислоты
приводит к образованию пептидной связи и затем к образованию
полимерной молекулы — белка. Для химика-биоорганика весьма
интересно сопоставить синтез наиболее сложных макромолекул
в «пробирке» и в организме.
2.4. Ацилирование
Наиболее простой пример — бензоилирование метилового эфи-
ра глицина (в присутствии основания):
О О
РЬС-С1 + NH2CH2CO2Me °снов!."ие.> PhCNHCH2CO2Me
В результате реакции образуется стабильная амидная связь.
Ацилирование можно также проводить по классическим методи-
кам, например ацетилирование уксусным ангидридом. Как и для
других реакций, например для алкилирования, разработаны ме-
тодики, при которых ацилирование протекает в мягких условиях.
Примером этого могут служить реакции аминокислот с изоциана-
том и изотиоцианатом, протекающие с образованием гидантоинов
и тиогидантоинов.
Биоорганическая химия аминокислот
53
R Лн
FfOH
HNx/NH—Ph
карбамиловый
интермедиат
11“ -ц,о
R О^н®
4 'ОН
NH—Ph
S
HN
Y
R О
HN NH—Ph
Y
о
N-фенилгидантоин
R О
HN NH—Ph
N-фенилтиогиЭантоин
S
Следует отметить, что в кислых условиях (т. е. безводная
трифторуксусная кислота) гидроксил (протонированный) стано-
вится уходящей группой; аналогично ведет себя и амин (амид-
ная связь). Так, реакция фенилизотиоцианата с белком — важ-
ный метод определения N-концевой аминокислоты и последую-
щего определения первичной структуры белка. Напомнив, что
мономерные составляющие белка соединены амидными (так на-
зываемыми пептидными связями), покажем это на примере прос-
того дипептида глицилаланина.
Поскольку аланин — уходящая группа,
вой аминокислотой. Образующиеся аланин
глицин должен оказаться N-коице-
и тиогидантоин легко разделяются
С + H2N—СН2—с—NH—СН—СОО0
N глицилаланин
I
Ph
О Не СН3
II < I
СН2—C-NH-CH-COO0
HN NH
Il ”
S
СН;
е I
+ HjN—СН—СООН
54
Глава 2
хроматографически, причем последний можно легко обнаружить в УФ-области и
по флюоресценции. Заметим далее, что если бы в реакции участвовал трипептид,
то уходящей группой стал бы дипептид. После обработки дипептида феиилнзотио-
цнанатом вторую аминокислоту также удалось бы идентифицировать в виде тио-
гидантопиового производного. Таким образом удалось бы установить аминокис-
лотную последовательность трипептида. Такой прием можно распространить па
определение последовательности мономерных единиц (аминокислот) в небольших
белках, начиная с N-конца. Описанную .методику называют деградацией по Эд-
ману.
Другие реакции ацилирования также имеют важное значение
для защиты аминогрупп в процессе синтеза белка. Обсудим
вкратце такие реакции.
Амидная связь, образующаяся в результате ацилирования
аминокислоты, представляет собой планарную гибридную струк-
туру с приблизительно равным распределением между двумя ре-
зонансными формами. Вследствие доминирования формы
C=N®^ по сравнению с эфирами и формой С=О®— амидная
связь — более прочная связь. Как было указано, аминогруппа
одной аминокислоты может ацилироваться карбоксильной груп-
пой второй аминокислоты. Амидная связь, которая при этом по-
лучается, называется пептидной, а образовавшийся продукт —
дипептидом. Белки представляют собой полимеры, в которых
мономерные единицы соединены амидными (пептидными) свя-
зями. Амидная связь, образованная двумя аминокислотами,пред-
ставляет собой вторичный амид в транс-конфигурации. Свобод-
ное вращение вокруг С—N-связи затруднено, так как при этом
нарушается перекрывание л-электронов, существующее в резо-
нансных структурах, причем стерически предпочтительна транс-
конфигурацпя.
цис транс
Структура планарной хр’-гибридизованной амидной (пептидной) связи; свобода
вращения цис-транс-изомеров затруднена энергетическим барьером в
41,8 кДж/моль (10 ккал/моль)
Пептидная связь — прочная связь, и для ее образования не-
обходимо затратить энергию. Смешивание водных растворов
двух аминокислот — одной с пепротонированной (потенциально
нуклеофильной) аминогруппой и второй с протонированной кар
боксильной группой — при комнатной температуре привело бы
только к образованию соли. С химической точки зрения карбок-
сильную группу следует превратить в хорошую уходящую группу.
С энергетической точки зрения следует активировать карбоксиль-
ную группу для компенсации работы, затрачиваемой при образо-
Биоорганическая химия аминокислот
55
вании пептидной связи. Это находит отражение в величине сво-
бодной энергии гидролиза амидной связи, Л6П1ДР ш—12 кДж/моль
(от —3 до —4 ккал/моль). С другой стороны, для ацилхлорида
Д^гидр = —29,3 кДж/моль (—7 ккал/моль), причем хлор — хо-
рошая уходящая группа. Таким образом, можно превратить карб-
оксигруппу аминокислоты в ацилхлорид (с помощью тионилхлори-
да, пентахлорида фосфора) и провести реакцию с аминогруппой
второй аминокислоты, приводящую к образованию пептидной свя-
зи. На самом деле такой метод представляет слишком упрощенную
схему пептидного (белкового) синтеза, и позднее будет описана
более усовершенствованная методология. Интересно, однако, сна-
чала разобраться, как происходит синтез пептидной связи в биоло-
гической системе, обращая особое внимание на проблему актива-
ции карбоксильной группы. Напомним, что и при синтезе химиче-
ским путем, и при образовании в организме требуется затратить
одну и ту же энергию.
R—+ H2N—R' ---------> R—С—NH—R' + НС1
4—v—'
образование лептиЭной связи
С биологической точки зрения ангидрид — это структура
с высокой энергией, т. е. это форма храпения потенциальной
энергии. (Понятие об высокоэнергетических струк-
турах, а также основные представления о хи- 9 Z
мин ангидридов можно найти в гл. 3, посвящен- (—с—х—у—)
нои биологическим функциям фосфора.) Любое со-
единение, представляющее собой ангидрид, обладает AGrHflP >
>29,3 кДж/моль (7 ккал/моль). В качестве примеров можно
привести уксусный ангидрид, ацетилфосфат, ацетилимидазол.
О о
II I!
сн3—с—о—с—сн3
уксусный ангиЗриЭ
О
СН3—с—N
ацетпилфосфснтг
ацеттшлимиЗазол
АТР (форма хранения биологической энергии) также песет ан-
гидридную структур)7 в трифосфатпой боковой цепи.
АТР способен переносить энергию для активации карбоксильной группы, что
показано с помощью простого биохимического эксперимента. Инкубация гомо-
гената ткани печени (содержит свободные ферменты клеток печени) с глицином,
бензойной кислотой и АТР приводит к образованию N-беизоилглицииа (гпппу-
ровой кислоты). В действительности такая реакция представляет собой у млеко-
питающих механизм детоксикации, т. е. превращение ядовитого вещества (бен-
зойной кислоты) в безвредное путем присоединения к соединению, присутствую-
щему в клетках (глицину), и затем выведения его с мочой. Первая стадия_
ЭТО нуклеофичьпая атака бензоата по АТР с образованием активированцогр
56
Глава 2
бензоата (карбоксилата) и неорганического пирофосфата. Аминогруппа глицина
затем атакует этот промежуточный ангидрид с образованием N-беизоилирован-
ного продукта.
АТР
—РР;
гиппуроеая кислота
2.5. Биосинтез белков
Тот же самый принцип активации карбоксильной группы ис-
пользуется и в синтезе белков in vivo. Карбоксильная группа ами-
нокислоты активируется, реагируя с АТР с промежуточным
образованием ангидрида. Однако следующая стадия ие сводится
просто к атаке такого ангидрида второй аминокислотой, по-
скольку синтез белков включает строго определенное последо-
вательное присоединение многих (до нескольких сотен) амино-
кислот. Матрица, или «организующая поверхность», должна уча-
ствовать в этом процессе для того, чтобы обеспечить правильную
последовательность белковой молекулы. Макромолекулой, выпол-
няющей функцию такой матрицы, является полинуклеотидтранс-
портная рибонуклеиновая кислота (тРНК); строение полинуклео-
тидов описано в следующей главе.
Биоорганическая химия аминокислот
57
Активация аминокислоты с помощью АТР — это промежуточ-
ная стадия, катализируемая ферментом аминоацил-тРНК-сиите-
тазой. 3'- или 2'-гидроксил концевой адениловой кислоты моле-
кулы тРНК атакует промежуточный ангидрид с образованием
молекулы аминоацил-тРНК-
/СОО®
R СН^ + АТР +тРНК(3' ОН)
XNH3®
аминокислота
-FP II М,,+
I омииооцил- гРнк-синтетма
О
|| О-рО
HjN /О Т ПРакМгеи₽ЧИЪШ
\ е НО ОН
/ОН
тРНК.
I-”'
о
R\ JI
• .СН—С—О—тРНК
HjN
аминоацил-тРНК
Сложиоэфирпая связь с гидроксилом тРНК представляет со-
бой высокоэпергетическую связь (благодаря соседнему 2'-гидро-
ксилу и положительно заряженной аминогруппе), так что изме-
нение свободной энергии суммарной реакции, катализируемой
ферментом, близко к нулю. Каждая аминокислота имеет свою
специфическую тРНК и один специфический фермент аминоацил-
тРНК-синтетазу. В свою очередь каждая аминоацил-тРНК-син-
тетаза использует в качестве субстрата только свою специфиче-
скую аминокислоту. Удалось до некоторой степени модифициро-
вать природные аминокислоты, причем они продолжали служить
субстратами фермента. Например, n-фторфенилаланин способен
в определенной степени замещать фенилаланин.
После того как синтез аминоацил-тРНК завершен, аминокис-
лота больше не участвует в узнавании. Специфичность опреде-
ляется полинуклеотидной частью молекулы тРНК путем взаимо-
действия с генетической матрицей (мРНК), а также с другой
поверхностью, на которой происходит белковый синтез,— клеточ-
ной органеллой, называемой рибосомой.
Чтобы показать это, специфическую аминоацил-тРНК, несу-
щую остаток цистеина (цистеинил-тРНКСуБ — цистеин присоединен
58
Глава 2
к своей специфической тРНК), модифицировали, каталитически
восстанавливая боковую цепь аминокислоты до аланина. Нику-
О О
тРНК^ —О— —^тРНКСУ—О—(L JjHj
Ренея .|
CH2SH сн—н
Цистеинил-тРНК.0''5 аланил-тРНКсЬ’
бация in vivo такой модифицированной аминоацил-тРНК приво-
дила к включению аланина в те положения белка, которые нор-
мально содержали цистеин.
Синтез белка начинается и продолжается с N-конца. Изве-
стно, что в некоторых бактериях, дрожжах и высших организмах
первая аминоацил-тРНК представляет собой N-формилметнонин-
тРНК,Ме‘. Формилирование аминогруппы можно рассматривать
как введение защитной группы, чтобы предотвратить ее участие
в образовании пептидной связи. Таким образом, fMet-TPHKfMe*
первой связывается с рибосомой и мРНК. После того как синтез
белка закопчен, формильная группа удаляется ферментативно
(формилазой).
Рибосома — это крупная клеточная органелла, в состав кото-
рой входят РНК и несколько различных белков; она построена
из двух субъединиц. Рибосома обеспечивает в высшей степени
упорядоченную поверхность для синтеза белков, поскольку спо-
собна взаимодействовать с протяженными участками тРНК раз-
личных амнноацил-тРНК. Некоторые из рибосомных белков,
вероятно, обладают каталитической активностью, тогда как
остальные, как и рибосомные РНК (рРНК), принимают участие
в специфических конформационных взаимодействиях, происходящих
при белковом синтезе. Синтез белка — динамический процесс, од-
нако он происходит упорядоченно, путем последовательного при-
соединения аминокислот. Место присоединения fMel-TPHKfMet на
рибосоме называется пептидилсвязывающим центром. Теперь мы
подошли к непосредственному синтезу пептидной связи.
Вторая аминокислота (аминоацил-тРНК) также связывается
с рибосомой (в так называемом аминоацил-тРНК-связывающем
центре) в непосредственной близости от fMet-TPHKfMet. Хотя
никакой химической реакции еще не произошло, уже для связы-
вания требуется затратить работу: энергия поставляется молеку-
лой GTP (гуанозинтрифосфат; сходен с АТР, но вместо аденина
содержит гуанин). Аминогруппа аминоацил-тРНК атакует затем
f-метиоиин, при этом тРНК(Ме* становится уходящей группой и
образуется пептидная связь. Эта реакция катализируется фермен-
том, но для образования пептидной связи не требуется ни АТР,
ни GTP, поскольку энергия поставляется при расщеплении высо-
коэпергетнческого эфира тРНК(Ме‘. Образование пептидной связи
завершено, однако, видимо, должны произойти еще некоторые
Биоорганическая химия аминокислот
5Й
Поверхность рибосомы
S повоя
гептивноя
связь
Рис. 2.1. Образование пептидной связи в биологической системе. Весь процесс
происходит на рибосоме, в двух связывающих центрах: Р (пептидил) и А (амп-
ноацил). Реакция катализируется пептиднлтрапсферазным центром. Именно ин-
формация, переносимая мРНК (которая в свою очередь определяется генетиче-
ским материалом ДНК), определяет, какая из аминоацил-тРНК будет присоеди-
няться в Р- и А-центрах.
физические изменения для того, чтобы следующая аминоацил-
-тРНК могла присоединиться к дппептпду. Дипептидил-тРНК, на-
ходящаяся в аминоацил-тРНК-связывающем центре, физически
перемещается в пептидплсвязывающий центр, одновременно вы-
тесняя тРНК’Ме1. Очень вероятно, что этот процесс происходит
вследствие конформационных изменений рибосомы, на что опять
требуется энергия, доставляемая молекулой GTP. Аминоацил-
тРНК-связывающий центр теперь свободен, а мРНК сдвинута
(произошпа транслокация), так что она вновь определяет связы-
вание следующей аминоацил-тРНК в аминоацил-тРНК-связываю-
щем центре. Как только это произойдет, вновь образуется пептид-
ная связь (образуется трипептид). Далее вся описанная последо-
вательность событий повторяется (рис. 2.1).
60
Глава 2
Такова в общих чертах схема синтеза белка in vivo; некото-
рые детали, например роль белковых факторов элонгации, опу-
щены. Очевидно, что синтез белка — очень сложный процесс;
его основу составляет активация карбоксильной группы с после-
дующим упорядоченным присоединением аминокислот на направ-
ляющей (организующей) матрице, которая делает практически
невозможным образование неправильной последовательности или
другие побочные реакции. Важное значение этих соображений
станет ясным в дальнейшем, при кратком рассмотрении проблем
химического синтеза белков. Тем не менее, имея представление
о синтезе белка in vivo, можно оценить фармакологическое дей-
ствие лекарств или антибиотиков, которые нарушают белковый
синтез. Такие антибиотики, вообще говоря, токсичные соедине-
ния, поскольку нарушают синтез белка и у болезнетворных бак-
терий, и у пациента, однако и они могут оказаться весьма полез-
ными терапевтическими препаратами.
Рис. 2.2. Структура антибиотика пуромицина. Пуромицин прерывает синтез бел-
ковой цепи, имитируя аминоацил-тРНК и связываясь с рибосомой. Пуромицин
своей аминогруппой атакует пептидил-тРНК в Р-центре, но затем не подвер-
гается атаке аминоацил-тРНК, обрывая таким образом синтез. В верхнем пра-
вом углу показан концевой адениловый остаток тРНК.
Антибиотик пуромицин обладает структурой, весьма сходной с концевым
остатком адениловой кислоты в тРНК (рис. 2.2). Однако первичная 5'-гидро-
ксильная группа пуромицина не присоединена эфирной связью к молекуле тРНК,
аминогруппа аденина диметилирована. а З'-iпдрокснльная группа замещена пу-
тем образования амидной связи с карбоксильной группой л-метоксифеиилаланина
При синтезе белковой цепи молекула пуромицина может попасть в аминоацнл-
тРНК связ -лвающей-центр в тот момент, когда, например, тирозил-тРНКТуг дол-
Биоорганическая химия аминокислот
61
пептидная цепь не свя-
хпоромсреникол
жна входить в рибосому. После присоединения пуромицнн своей аминогруппой
способен атаковать пептидную цепь в пептидилсвязывающем центре Однако за-
тем он не будет реагировать с аминогруппой следующей аминоацил-тРНК, по-
скольку последняя не сможет разорвать более прочную пептидную связь в З'-по-
ложенпи антибиотика. Далее после транслокации такая
запа более с рибосомой посредством тРНК и диссоции-
рует с поверхности рибосомы, унося с собой частично
синтезированную полппептндную цепь. Пуромицнн с рав-
ной эффективностью влияет на синтез белка также
в организме .млекопитающих и поэтому ие относится
к действенным антибактериальным лекарственным пре-
паратам.
В то же время антибиотик хлорамфеникол связы-
вается с бактериальными рибосомами, но ие с более
крупными рибосомами животных, проявляя таким обра-
зом большую специфичность. Он ингибирует образова-
ние пептидной связи. Хлорамфеникол относительно мало
токсичен, однако его следует использовать с осторож-
ностью нз-за возможного побочного действия; например,
он может вызывать анемию. Среди других антибиотиков, ингибирующих бел-
ковый синтез, следует назвать тетрациклин, стрептомицин и цнклогексимид.
В некоторых микроорганизмах синтез пептидной связи проис-
ходит по более простому, примитивному, механизму. В этом слу-
чае пептидный синтез идет очень эффективно, хотя и в отсутст-
вие высокоупорядоченного синтезирующего аппарата, обеспечи-
ваемого структурами рибосомы и тРНК- Поэтому таким путем
синтезируются лишь короткие белки (полипептиды), например
грамицидин S [5]. Грамицидин S считается интересным антибио-
тиком по нескольким причинам. Во-первых, он содержит фенил-
аланин в D-конфигурации. d-Аминокислоты встречаются в природе
очень редко, а в белках присутствуют только ь-аминокислоты. Во-
вторых, грамицидин S содержит аминокислоту орнитин, которая
обычно не входит в состав белков.
Грамицидин S представляет собой циклический декапептид, выделяемый из
Bacillius brevis, его способность выступать в роли антибиотика связана со свой-
-Leu ®
н2щсн2)э-сн/
-Phe орнитин (Огл)
Структура антибиотика грамицидина S, декапептид состоит из двух комплемен-
тарных пеитапептидных цепей, молекула обладает осью симметрии второго
порядка.
ством образовывать комплексы с ионами щелочных металлов и транспортировать
их через мембраны *. Он действует подобно ионному каналу, что легко объяснить
формой декапептида, напоминающей бублик, благодаря чему он способен
D-Phe ----> L-Pro ----» L-Val ----> L-Orn ----> L
l.-Leu ♦—— L-Orn «----------- L-Val < L-Pro ♦--------------D
* По имеющимся данным грамицидин S не связывает ионов металлов и не
является их переносчиком. Вместе с тем антибиотик обладает чрезвычайно вы-
сокой поверхностной активностью, что и лежит в основе его биологического дей-
ствия [The Protein (Н. Neurath, R L Hill, eds.) 3rd ed , Academic Press, New
York, 1976, vol. 5, p. 310—387]. — Прим. ped.
62
Глава 2
заключить ион металла внутрь себя (разд. 5.1.3). К сожалению, такое действие
не ограничивается только бактериальными мембранами, поэтому грамицидин S
можно применять как лекарство только крайне редко *.
Рассмотрим, каким образом в природе несимметричный мак-
ромолекулярный белковый комплекс участвует в синтезе этого
циклического полипептида без помощи рибосом. Механизм син-
теза, присущий лишь простым организмам, подобным бактериям,
расшифрован биохимиком Липманом.
Липман обнаружил, что добавление АТР к сырому гомоге-
нату клеток и экстрактам из В. brevis приводит к синтезу гра-
мицидина S. Подобная активность, обнаруженная во фракциях
бесклеточного супернатанта, оказалась устойчивой к известным
ингибиторам белкового синтеза, а также к обработке рибонуклеа-
зой, что исключало участие в этом процессе молекулы РНК-
В этом биохимическом превращении АТР играл роль конденси-
рующего агента, подобного, например, карбодиимндной группи-
ровке (разд. 2.G.3).
В синтезе грамицидина S участвуют два фермента: легкий
(М = 100000) и тяжелый (М = 280000). Синтез начинается на
легком ферменте, который действует также как «рацемаза», пре-
вращая ь-фенилаланин в D-энантиомер. Нуклеофильная тиольная
Iруппа легкого фермента атакует активированный фенилаланин
(АТР и аминокислота реагируют с образованием ангидрида),
образуя (катализ основанием) высокоэнергетическин тиоэфир,
AG гидр ~ —38 кДж/моль (—8 ккал/моль). Различие свойств тио-
эфнров и ацильных эфиров связано с гораздо большей степенью
делокализации неспаренных электронов кислородом карбонильной
группы, чем атомом серы. Такая делокализация понижает электро-
фильность карбонильной группы. Кроме того, тиольная группа —
более хорошая уходящая группа, чем соответствующая гидроксиль-
ная. Напомним, что для меркаптана рКп ~ 10, тогда как для спир-
та рКа ~ 15 (табл. 2.1).
На следующей стадии пролин, присоединенный к тяжелому
ферменту тиоэфирной связью, атакует легкий фермент, перенося
О химическом синтезе грамицидина S см. работу [364].
Биоорганическая химия аминокислот
63
таким образом дипептид на тяжелый фермент. Функции легкого
фермента на этом заканчиваются.
Аналогичным образом на тяжелом ферменте аминогруппа ва-
лина, присоединенного тиоэфирной связью, атакует дипептид и
образует трипептид. Напомним, что энергия на образование пеп-
тидной связи выделяется при аминолизе тиоэфира.
тяжелый
фермент
С—Vai—Pro—Phc
о
тяжелый
фермент
Нсн2->
В следующем этапе участвует «рука» тяжелого фермента.
Эта «рука» «подхватывает», или, иначе, атакует, тиольную груп-
сн3
)—СН2—С СН—С— NH— СН2
1 I II
СН3ОН о
HS—СН2—СН2—NH—с—сн,
II
о
Структура «поворачивающейся руки» тяжелого фермента, содержащего тиоль-
ную группу; «рука» включает В-меркаптоэтиламнн и пантотеновую кислоту (важ-
ный компонент кофермента А); последняя соединена фосфодиэфирной связью
с сериновым остатком фермента.
пу трипептида. Затем орнитин атакует образующееся соединение
так, что получается тетрапептид; «рука» связывает тетрапептид
(по той же тиольной группе), и тетрапептид атакуется лейцином
64
Глава 2
Phe -» Pro -» Vai -» Orn -» Leu
Leu «- Orn <- Vai «- Pro «- Phe
грамицидин S
Puc. 2 3 Ферментативный синтез пептидного антибиотика грамицидина S по
Липману.
с образованием пентапептида. «Рука» вновь удерживает пента-
пептид, но теперь пентапептид взаимодействует с комплементар-
ным пентапептидом, присоединенным к другой «руке», с образо-
ванием циклического декапептида.
Короче говоря, взаимодействия между двумя ферментами
обеспечивают достаточное для образования пептидной связи
Биоорганическая химия аминокислот
65
сближение двух аминокислот. Процесс повторяется пять раз,
пока не образуются две половинки молекулы. В белковом комп-
лексе две идентичные цепи соединяются, и образуется цикличе-
ский пептид (рис. 2.3).
На рис. 2.4 показано, что только легкая цепь ответственна
за наличие D-Phe в последовательности. Остальная часть анти-
биотика синтезируется тяжелой цепью.
тяжелый фермент
легкий
«рермент
L-Pro -» L Vai -» L-Orn -» l Leu
D-Phe D-Phe
\ /
t-Leu «- L-Orn «- L-Val«- L-Pro
легкий
фермент
тяжелый фермент
Рис. 2.4. Аминокислотная последовательность грамицидина S. Указаны ферменты,
активирующие соответствующие аминокислоты.
В заключение следует отметить, что два фермента достаточно
строго ориентированы в пространстве, чтобы узнавать нужные
аминокислоты и соединять их в процессе синтеза определенной
асимметричной циклической молекулы. Именно наличие спе-
цифических белок-белковых взаимодействий обеспечивает эф-
фективный полипептидный синтез. Другими словами, вся инфор-
мация, необходимая для синтеза грамицидина S, позволяющая
узнать аминокислоты и осуществить синтез пептидных свя-
зей, содержится в макромолекулярном ферментативном ком-
плексе.
Такой внерибосомный пептидный синтез — замечательный
пример, показывающий важность хиральности (разд. 4 2.1). Мы
еще очень далеки от умения проводить пептидный синтез в ла-
боратории с такой же эффективностью даже с использованием
твердофазного метода Меррифильда (разд. 2.6.3). Однако ана-
логия здесь очевидна.
Группа Летсингера и Клотца разработала недавно метод син-
теза пептидов с использованием матриц; этот метод напоминает
природный механизм синтеза на рибосомах (рис. 2.1). В методе
используются полимерный носитель и полинуклеотидная матрица,
но отсутствует необходимость, как и в природных системах, вре-
менно защищать аминокислоты для образования правильных
связей. Такой подход назван методом комплементарного носителя
(рис. 2.5). Растущая полипептидная цепь связана концевой
карбоксильной группой с 5'-ОН-группой олигонуклеотида эфир-
ной связью. Новая поступающая аминокислота также присоеди-
нена эфирной связью, но с З'-ОН-группой второго олигону-
клеотида.
3 Зак. 549
66
Глава 2
При изучении стабильности спиральных структур оказалось,
что носитель длиной в 8 нуклеотидов достаточен для правильного
связывания с более длинной олигонуклеотидной матрицей благо-
даря образованию уотсои-криковскнх комплементарных пар
(разд. 3.2.2). Использование современных химических методов
образования пептидной связи позволяет удлинить полипептидную
аналогично
пептивил-тРНК,
присоеЗиненпой /////
К Р центру п95УУ;еР
рибосомы
NH
аналогично
аминоацил-тРНК.
присоейиненной
H-$-RnJuSoapy ш/L
NH
NH
JR.-C-H
о«с
с=о
о
соответствует
мРНК 4
/с=°
£оо/
Р
н2 [
R„—СН N—С—Н
Рис. 2.5. Схема пептидного синтеза с использованием комплементарных носите-
лей, предложенная Лентсингером и Клотцем, которая очень схожа с механизмом
рибосомного синтеза белков [6].
цепь на одну аминокислоту. Чтобы перейти к следующей стадии
конденсации, несвязавшиеся олигонуклеотиды просто смываются
с нерастворимого носителя в условиях, разрушающих спарива-
ние оснований, например при повышении температуры или пони-
жении ионной силы.
Эту последовательность реакций можно повторять, пока не
будет синтезирована желаемая полипептидная цепь. Отметим,
что на каждой стадии растущая полипептидная цепь переносится
на олигонуклеотидный носитель, а после окончания синтеза оли-
гонуклеотидный носитель отщепляют от нерастворимой матрицы.
Олигонуклеотид, прикрепленный к полипептидной цепи, облег-
чит хроматографическую очистку полипептида, а затем его мож-
но отщепить мягкой щелочной обработкой.
Важная особенность метода — специфичность образования
амидной связи строго определенным, направляемым матрицей
Биоорганическая химия аминокислот
67
переносом ацильной группы. Более того, правильное расположе-
ние пептидил- и аминоацил-олигонуклеотидов на полинуклеотид-
ной матрице контролирует полипептидный синтез. Именно этим
способом достигается правильное считывание при биосинтезе бел-
ков в природных объектах.
Каким образом олигонуклеотиды могут направлять синтез по-
липептидов в отсутствие белков или рибосом, ясно из рис. 2.5,
где представлена схема удачной биоорганической модели пребио-
тического синтеза белков (разд. 3.7.2.1). Действительно, пред-
ставляется в высшей степени вероятным, что примитивные биоси-
стемы использовали подобный механизм в примитивном белковом
синтезе, основу которого составляет уотсон-криковское взаимодей-
ствие оснований, обеспечивающее правильное копирование и кон-
троль белкового синтеза. С течением времени олигонуклеотидные
носители могли эволюционировать в более эффективные молекулы,
как, например, современные молекулы тРНК.
2.6. Химический синтез белков
Биохимический синтез белков — это сложный процесс, для ко-
торого необходимы организующая поверхность, белковые катали-
заторы, запас энергии и т. д. Уже само перечисление предъявляе-
мых требований показывает, что осуществление химического син-
теза белка — трудная задача. Следовательно, прежде чем при-
ступать к ее решению, следует принять во внимание некоторые
соображения.
Во-первых, необходимо добиться специфичности, или последо-
вательного присоединения аминокислот. Следует избегать неже-
лательных побочных реакций. Рассмотрим, например, синтез ди-
пептида глицилаланнна (Gly-Ala). Нельзя просто смешать две
аминокислоты, чтобы произошла реакция, так как искомая пос-
ледовательность окажется не единственным продуктом. Напри-
мер, вполне возможно, что глицин прореагирует сам с собой, об-
разуя дипептид глицнлглицин. На самом деле могло бы образо-
ваться четыре пептида (Gly-Gly, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala); из
них только один обладает правильной последовательностью. Син-
тез искомого пептида затрудняется по мере его удлинения Если
бы для синтеза последовательности, соответствующей половине
молекулы грамицидина S, использовалась статистическая полиме-
ризация (т. е. если пять аминокислот поместить в реакционный
сосуд и проводить реакцию между ними), то число образующихся
пентапептидов с различными последовательностями достигло бы
3125. Из них только один представлял бы продукт с искомой
последовательностью, остальные 3124 следовало бы отделить как
побочные.
8*
68
Глава 2
Отсюда ясно, что для успешного синтеза белков необходимо
последовательное присоединение аминокислот с малой степенью
образования побочных продуктов. Этого можно добиться, ис-
пользуя защитные группировки для аминогрупп, карбоксильных
групп и боковых цепей, потенциально способных участвовать в
реакции. В качестве примера вернемся к синтезу Gly-Ala; если
аминогруппа глицина защищена (превращена в химически не-
активную), то взаимодействие молекул глицина между собой не-
возможно. Далее, если карбоксильная группа аланина также за-
щищена, то единственная возможная реакция — взаимодействие
карбоксильной (активированной) группы глицина и аминогруппы
аланина с образованием искомого дипептида.
Конечно, после образования пептидной связи необходимо уда-
лить защитные группы в условиях, при которых продукт реакции
не разрушается. Следовательно, защитные группы должны легко
присоединяться к реагирующим соединениям и удаляться из ко-
нечного продукта в мягких условиях и достаточно полно. С уче-
том этих требований легко себе представить, что химия защит-
ных групп — важный раздел органической химии. Это замечание
справедливо не только для синтеза пептидов, но вообще для син-
теза любых сложных органических молекул, например синтеза
полинуклеотидов (разд. 3 6), строение которых предполагает воз-
можность протекания побочных реакций по нескольким реакцион-
носпособным центрам.
Поскольку каждая аминокислота присоединяется поочередно,
при химическом синтезе белков очень важен выход на каждой
стадии. Вновь обращаясь к синтезу Gly-Ala, отметим, что, если
синтез пептидной связи прошел на 90%, такой синтез может счи-
таться удовлетворительным. Однако, если те же условия исполь-
зованы для синтеза декапептида грамицидина S, то общий выход
составит 0,910 X Ю0% = 35%. При этом не учитываются потери
при введении и снятии защитных групп. Следовательно, при син-
тезе белковых макромолекул образование пептидной связи долж-
но проходить с высоким выходом.
Следует учитывать и другой фактор, присущий исключительно
биологическим системам,— оптическую чистоту. Белки состоят из
ь-аминокислот. Поэтому при химическом синтезе следует исхо-
дить из ь-аминокислот, а в процессе синтеза рацемизация должна
быть сведена к минимуму. В наибольшей степени это относится
к синтезу ферментов, каталитическая активность которых зави-
сит от оптической чистоты. Аминокислоты особенно легко под-
вергаются рацемизации, когда они ацилированы (т. е. когда ами-
ногруппа блокирована ацильной группировкой) через промежу-
точное образование азлактона. Такое превращение может про-
изойти, например, в процессе введения защитной группы или
в процессе образования пептидной связи:
Биоорганическая химия аминокислот
69
а-углеровный атом
Г.-аминокислоты
п Н q [уходящая группа
IлктиопппапииивВ
(активированный
карбонил или
пептидная связь)
основание
R4Q JD
Р
промежуточный азлактон
основание
Р [ацильная
< защитная
[группа
а-Протон азлактона лабилен в щелочных условиях (так как об-
разуется стабилизированный карбанион), так что протон может
оторваться, а затем вновь присоединиться с любой стороны плос-
кости кольца, что приводит к потере оптической чистоты. Более
того, азлактоны могут принимать участие в реакциях образова-
ния пептидной связи, так что в процессе синтеза они исчезают,
вызывая появление рацемических аминокислот в конечном бел-
ковом продукте.
70
Глава 2
2.6.1. Блокирование аминогрупп
трет-Бутоксикарбонильиая группа (/-ВОС)
Эта группа представляет собой ацильную защитную группу, предназначен-
ную для блокирования аминогрупп и легко удаляемую при мягкой кислотной об-
работке. После ацилирования аминогруппа становится химически неактивной, т. е.
теряет нуклеофильные свойства, в результате делокализации электронов по
амидной связи (карбамат). Эта группировка вводится при взаимодействии со-
ответствующего хлорида с аминокислотой. Хлорид синтезируют из трет-бутанола
и фосгена.
О О
f-Bu—ОН + Cl—С—С1 -------- t-Bu—О—С—С1
о (t-ВОС-С1)
z-\ II Л Л Л J
(СН3)2С—О—С-£С1 ----» (СН3)2С=СН2 + СО2 + НС1
сн^\
н
Хлорид — очень нестабильное соединение при хранении и использовании. Поэтому
вместо него применяют менее реакционноспособный трет-бутилазидоформиат. Та-
кой азид был до последнего времени широко распространенным реагентом, од-
нако недавно появилось сообщение о его взрывоопасности. В настоящее время
иаилучшими считаются «ВОС-ON» [2-(трет-бутоксикарбоиилоксиимиио)2-фенил-
ацетоиитрил] и ди-трет-бутилкарбонат. Оба позволяют получать /-ВОС-амиио-
кислоты с высоким выходом.
i-BOC-группировка устойчива в условиях, обычных для удаления других за-
щитных групп, например при гидрогенолизе, обработке натрием в жидком ам-
миаке, щелочном омылении (гораздо более устойчива, чем CBz-группа, см.
ниже).
/-ВОС-группа легко удаляется при мягкой кислотной обработке с образова-
нием газообразного изобутилена и углекислого газа (что еще больше сдвигает
равновесие в правую сторону). Для удаления защитной группировки можно ис-
Биоорганическая химия аминокислот
71
СН3 О Н®
СН3—С G'*- (t—NH—СН—СООе -Г
СН^ R
ЧН
СН
СН3
изобутилен
пользовать бромоводород в уксусной кислоте, хлороводород в уксусной кислоте,
теплую 80%-ную уксусную кислоту, безводную трифторуксусиую кислоту (три
последних реактива ие удаляют CBz-группу, см. ниже) и жидкий фтороводород.
Карбобеизоксигруппа (CBz)
Это также ацильная группа для защиты аминогрупп; она удаляется гидро-
генолизом либо кислотной обработкой. Соответствующий хлорид синтезируют,
проводя реакцию бензилового спирта с фосгеном:
О О
PhCH2OH + Cl—С—Cl ----» PhCH2O—С—Cl
Такой хлорид реагирует с аминокислотами в слабощелочных водных рас-
творах.
рьсн,о-с-а о
Т + основание PhCHaO_C—NH—СН^
\ /СООе К
H2R—СН, CBz-аминокислота
R
CBz-группа более устойчива в кислой среде, чем ЛВОС-группа (см. выше) и не
удаляется теплой уксусной кислотой за время, необходимое для удаления три-
тильной и n-метокситритильиой групп (см. ниже). Она также устойчива в ще
лочиой среде (разбавленный NaOH при комнатной температуре), но ие столь
устойчива, как t-BOC-группа, вследствие того что бензильная группировка яв-
ляется лучшей уходящей группой.
CBz-группа легко удаляется при гидрогенолизе:
, f .СООе /=\
снф)-с-кн-сн( -Ш ^/-сн3 +
И—н R
II /СОО®
+ н-гОт-c-rNH—сн;
u. \R
coo®
h2n—сн(
R
Гидрирование бензольного кольца происходит в заметной степени лишь при вы-
:оком давлении и в присутствии платины. Однако в присутствии серосодержа-
mix аминокислот может происходить отравление металлического катализатора.
В некоторых случаях это затруднение можно преодолеть, вводя избыток ката-
72
Глава 2
лизатора Бензильные группы (и в меньшей степени тритильные) также могут
быть удалены при использовании обычных условий гидрирования. CBz-rpynny
можно также удалить, проводя обработку НВг в безводной уксусной кислоте
(при комнатной температуре). Реакция протекает через отщепление алкила}
/ СН2Вг + С°2 + H3N—СН
ХСОО9
XR
С этой же целью можно использовать и другие кислоты, ио лишь при повышен-
ных температурах (например, кипящая трифторуксусная кислота, кипящий, на-
сыщенный метанольный раствор НС1) Восстановление натрием в жидком ам-
миаке— еще одни способ удаления CBz-группы. Однако при этом удаляются
также тозильные (см. ниже) и бензильные группы, а все метионины деметили-
руются с образованием гомоцистеина.
Для защиты аминогрупп используются также и другие производные CBz-
группы, например n-метоксикарбобензоксигруппа, удаляемая в безводной три-
фторуксусной кислоте В то же время n-нитрокарбобензоксигруппа гораздо более
устойчива к обработке НВг (электроноакцепторная нитрогруппа), чем CBz-rpyn-
па Поэтому CBz-группу можно удалить, сохранив п-нитроаналог. Кроме того,
л-нитро-СВг-амннокислоты гораздо легче кристаллизуются.
Фталильная группа
Ее можно рассматривать как ацилангидрид; эта группа удаляется при об-
работке гидразином или фенилгидразином.
Классическим методом синтеза N-фталиламинокислот является сплавление
смеси фталевого ангидрида и аминокислоты
м-фтпалиламимокнслота
Однако при нагревании пептиды могут разрушаться, а также в значительной сте-
пени претерпевать рацемизацию. Были исследованы и другие методы введения
фталилыюй защиты; например, обработка эфира аминокислоты о-карбоэтокси-
тиобензойиой кислотой н последующая реакция с водной НВг в уксусной кис-
лоте привела к получению N-фталиламинокислоты. Наиболее общий метод —
Биоорганическая химия аминокислот
73
взаимодействие аминокислоты с N-карбоэтоксифталимидом. Этот реагент синте-
зируют из фталимида и этилового эфира хлоругольной кислоты:
N - карбоэтоксифталимий
Реакция с аминокислотой проходит в разбавленной водной щелочи без нагре-
вания.
+ H2N—COOEt
Фталильная группа устойчива к каталитическому гидрированию, ие отщеп-
ляется при обработке аммиачным раствором натрия и кислотами (например,
НС1 или НВг в водной уксусной кислоте при комнатной температуре). Однако
эта группа щелочелабильиа. Соединение, образующееся при щелочной обработке,
расщепляется в слабокислых условиях с образованием свободной аминокислоты:
^.СООН
+ HSN—R
74
Глава 2
Классический метод удаления фталильной группы — обработка гидразиигид-
ратом в воде или этаноле. Побочный продукт, гидразид, отделяется при осажде-
нии. Гидразин — хороший нуклеофил (так называемый a-эффект), атакующий ан-
гидридоподобиую фталильную группировку в условиях, при которых ие затраги-
ваются пептидные связи. Тем ие менее при наличии эфирных связей существует
опасность гидразииолиза. На другие защитные группы обработка гидразином не
влияет. Обработка гидразином в гидроксилсодержащих растворителях может
быть заменена обработкой феиилгидразином в других органических растворите-
лях, причем в этом случае гидразид остается в растворе, а аминокислота выпа-
дает в осадок.
n-Толуолсульфогруппа (тозильная группа)
С помощью этой группы удается блокировать аминогруппы посредством
сульфирования, а ие ацилирования. Удаляется тозильная группа обработкой на-
трием в жидком аммиаке. Сульфирование проводят в водном растворе щелочи
или пиридина.
. СН
соов
R
Тозильная группа устойчива в условиях каталитического гидрирования, а
также при различных кислотных и щелочных обработках (например, НВг в ук-
сусной кислоте при комнатной температуре).
Для удаления тозильной группы растворяют защищенную аминокислоту или
пептид в жидком аммиаке и к этому раствору медленно добавляют натрий. По
окончании избыток натрия связывают, вводя хлорид аммония, иодид аммония
или уксусную кислоту.
Трифенилметильная группа (тритильная группа)
Эта группа используется для защиты аминогруппы, причем алкилирование
идет по Swl-механизму. Тритильная группа весьма кнслотолабильиа. Тогда как
ацильные и сульфогруппы защищают аминогруппу, уменьшая нуклеофильность
атома азота, тритильная группа ие влияет на его нуклеофильность (основность);
она блокирует аминогруппу, создавая стерические затруднения. На практике это
может оказаться недостатком, поскольку объемистая тритильная группа способна
также затруднять образование пептидной связи (активированной) карбоксиль-
ной группой.
Тритильную группу вводят обработкой тритилхлоридом эфира аминокислоты
в присутствии органического основания в органической среде. Эту реакцию
нельзя проводить в водной среде. Если необходимо получить аминокислоту, то
эфир гидролизуют горячей щелочью, поскольку объемистая тритильная группа
Биоорганическая химия аминокислот
75
снижает скорость гидролиза. Кроме того, используется бензиловый эфир, кото-
рый избирательно удаляют гидрогенолизом, так как о-бензильная группа отщеп-
ляется в этих условиях быстрее.
(Ph)3C—Cl
+ СО2Ме СООМе №0Н
(Ph)3C-NH-CH^ ----»
сна, R
сор®
---- (Ph)3C—NH—СН\
R
Тритильная группа устойчива к основаниям; ее можно удалить гидрогено-
лизом, но легче всего оиа удаляется при кислотной обработке. Тритильная груп-
па снимается в условиях, в которых /-ВОС- и CBz-группы устойчивы (например,
получасовая обработка 80%-ной уксусной кислотой при 30°С). Для отщепления
тритильной группы можно использовать различные кислоты, например уксусную
кислоту, водный раствор НС1, уксусную кислоту в метаноле и хлороформе, трн-
фторуксусную кислоту. Ацидолиз приводит к образованию стабилизированного
карбоииевого иона:
(Ph3)C—ОН
трифенилкарбинол
и т.Э
л-Метокснтритильная группа — еще более кислотолабильиый аналог тритиль-
ной группы, который иашел применение для защиты аминогрупп.
Формильная группа
Ее можно использовать в качестве простой ацильной защиты, как было по-
казано на примере N-коицевой аминокислоты прн биосинтезе белков. Эта группа
удаляется при мягкой кислотной обработке, ие затрагивающей пептидные связи.
Аминокислоты формилируют смешанным ангидридом муравьиной и уксусной
кислот (поскольку ангидрид муравьиной кислоты нестабилен). Формильная
76
Глава 2
защитная группа устойчива в условиях каталитического гидрирования и к дей-
ствию аммиачного раствора натрия, но выдерживает лишь мягкую щелочную об-
работку (например, условия омыления сложных эфиров; амиды относятся к ме-
нее хорошим уходящим группам, чем алкоксиды). Формильная группа легко уда-
ляется при обработке кислотой или гидразином (и СН3СООН) в спирте.
О О
X СООН . X m соон
Н'Ъ'Н~Сн( нс1/м,рн> 1ГПСН3 + HjN—сХ
R R
CBz-группа, фталильиая и тозильная группы при этом ие затрагиваются, ио
тритильная и /-BOC-группа в этих условиях отщепляются. Формильную группу
можно сиять также гидразином в этанольио-уксусном растворе (60% ЕЮН); из
белков и аминокислот оиа удаляется обработкой 15%-ной водной Н2О2 (60°С,
2 ч). Весьма вероятно, однако, что при такой обработке будут затронуты также
и эфирные группы.
Трифторацетильиая группа
Эту группу можно использовать в качестве ацильной защитной группы, ко-
торая удаляется при мягкой щелочной обработке. Ее можно ввести обработкой
аминокислоты трифторуксусным ангидридом или тиоэтиловым эфиром трифтор-
уксусной кислоты:
? СООе Y СООе
CF3—С—S—а + H2N—СН\ ----------------► CFj—С— NH—сн<
R R
Как недостаток этой защитной группировки следует отметить, что трифтор-
ацетильные производные аминокислот легко рацемизуются. Защита удаляется
обработкой гидроксидом натрия при комнатной температуре; в этих условиях
большинство остальных защитных групп не затрагивается.
Другие защитные группы
Были предложены и другие защитные группы, которые, однако, получили
меиее широкое применение. Многие из них обладают специфическими свойствами:
они уникальны либо по области применения, либо по методам удаления. Напри-
мер, производные о-нитробеизиловых эфиров используются в качестве фотола-
бильиых блокирующих групп для защиты амино- и карбоксильных групп. Такие
защитные группы удаляют при освещении (1 >• 320 нм).
Металлоорганическая защитная группа (пеитакарбонил{[метокси(фенил)кар-
беи]хром(0)}) была предложена для защиты аминогруппы. Она легко удаляется
обработкой трифторуксусной кислотой при комнатной температуре. Аминогруппу
можно блокировать также, сульфируя с помощью о-иитрофеиилсульфохлорида.
Деблокирование происходит под действием НС1, однако иитрофенилсульфопро-
изводиое аминокислоты следует хранить в виде соли, поскольку производное сво-
бодной кислоты нестабильно.
2.6.2. Блокирование карбоксильной группы
Если необходимо получить дипептид из двух аминокислот,
каждая из которых несет свободную и неактивированную кар-
боксильную группу, то обработка реагентом, одновременно ак-
Биоорганическая химия аминокислот
77
тивирующим карбоксил и вызывающим образование пептидной
связи, приведет к самокопденсации. Последнего можно избежать,
блокируя карбоксильную группу одной из аминокислот.
В общем случае это достигается этерификацией карбоксиль-
ной группы, подлежащей защите. Для получения метилового или
этилового эфира обрабатывают аминокислоту метанолом или эта-
нолом, насыщенным НО (этерификация по Фишеру). Однако
обычно предпочитают эфиры, гидролиз которых легко провести
в мягких условиях. Хотя эфиры омыляются основаниями гораздо
легче, чем пептиды (поскольку алкоксиды — лучшие уходящие
группы), используемые для этого щелочные условия нельзя при-
менять для деблокирования полипептидов. Использование бензи-
ловых эфиров позволяет удалять защитные группы при нейтраль-
ных условиях с помощью каталитического гидрирования. Бензи-
ловые эфиры синтезируют из кислоты и бензилового спирта в
присутствии кислоты или тионилхлорида (который переводит
спирт в сульфохлорид, и уже последний замещается кислотой),
СН2ОН
,О
R— С^
ОМе
R—
о—сн2
+ CHjOH
соли кислоты и бензилбромида, либо переэте-
использовании кислотного катализа или реак-
либо из цезиевой
рификацией. При
ции переэтерификации равновесие смещают в сторону образова-
ния желаемых продуктов, удаляя воду (азеотропная перегонка)
или отгоняя легкокипящий метанол. Использование трет-бутило-
вых эфиров, напротив, позволяет удалять защитные группы в сла-
бокислой среде, тогда как в щелочной среде эти группы устой-
чивы. Соответствующий эфир, который нельзя синтезировать пря-
мо из трет-бутанола из-за стерических затруднений, получают
с помощью газообразного изобутилена в присутствии кислоты
или путем переэтерификации (взаимодействие с трет-бутилацета-
гом).
О
II СН,
R—с—ОН + С=СН2 —
О СН
СН
R—С—О-С—CHj
СН3
О
С
R-C-0H + CH3-C - -O-С(СН3)3 ₽£±
о
R— с— О—I
О
С(СН3)3 + СН3—С—ОН
78
Глава 2
Недавно для блокирования карбоксильной группы была использована 2-три-
метилсилильная группа. Такой эфир получают, проводя реакцию кислоты с 2-три-
метилсилилэтаиолом и дициклогексилкарбо шимидом (ДЦГК; дегидратирующий,
или конденсирующий, реагент; см ниже):
.О /~\-n=c=n
R-C^ + (СН3)3—Si—СН2СН?ОН-----
ОН
П
R—
о—сн2—СН2—Si—(СН3)3
Такую защитную группу удаляют в нейтральных условиях обработкой эфира
фторидом. Как показано позднее, фторид широко используется для деблокиро-
вания углеводов, несущих силильные защитные группы В безводных средах фто-
рнд-пои — хороший нуклеофил.
О
R -С\ СН3
О-;СН2—СН2—Si^CHj ----»
[ СН3
Fe .О
--- R— + СН2—СН, + (CH3)3Si—F
Ое
В ходе пептидного синтеза защита амино- и карбоксильных
групп может оказаться недостаточной. В условиях образования
пептидной связи нуклеофильные и другие химически активные
боковые цепи аминокислот могут участвовать в нежелательных
побочных реакциях. Этого можно избежать, блокируя такие бо-
ковые цепи защитными группами, которые должны соответство-
вать общим требованиям, предъявляемым к защитным группам:
введение и удаление в мягких условиях и т. д.
Способы защиты боковых цепей различных аминокислот не
обсуждаются в настоящей книге, поскольку они подробно опи-
саны в учебниках и монографиях (см. цитируемую литературу).
Более важным представляется знакомство с химическими осно-
вами методов блокирования амино- и карбоксигрупп, что позво-
ляет сделать выводы о принципах блокирования боковых цепей.
Часто для этого используются одни и те же или весьма похожие
защитные группы. В качестве примера рассмотрим блокирование
тиогруппы цистеина и аминогрупп орнитина и лизина
Тиольная группа — сильный нуклеофил; она может быть окислена в дисуль-
фидную форму. Поэтому ее следует блокировать в процессе пептидного синтеза
С этой целью можно использовать бензилыцю защиту, которую вводят обработ-
кой тиола бензнлхлоридом (напомним, что бензильные группы очень легко под-
вергаются 5к2-замещению). Бензильные группы чувствительны к гидрогенолизу
(CBz-группа, тритильная группа), и поэтому деблокирование можно проводить
Биоорганическая химия аминокислот
79
с помощью натрия в жидком аммиаке. Менее желательно использовать каталити-
ческое гидрирование, так как катализатор будет отравляться серой, как указы-
валось ранее.
Та же защитная группа может быть использована для защиты а-, б- (орни-
тин) и е- (лизин) аминогрупп. Избирательное блокирование аминогрупп, находя-
щихся в боковых цепях, достигается путем предварительного образования хелат-
ного комплекса с ионами меди:
/ СО0®\
21H2N—(СН2)„—СН' + Си(И)
\ NH2 /
л = з орнитин
п = 4 лизин
Образование хелатных комплексов с ионами различных металлов — общее свой-
ство аминокислот. Поскольку несвязанные электроны а-аминогруппы образуют
с металлом координационную связь, лишь аминогруппа боковой цепи способна
реагировать с ацилирующим агентом. Затем а-амииогруппу можно освободить,
обрабатывая комплекс сероводородом.
2.6.3. Образование пептидной связи
Применение находят два подхода. Первый заключается в
переводе аминокислоты с блокированной аминогруппой в активи-
рованную форму и проведении реакции с аминогруппой второй
аминокислоты. Напомним, что на образование пептидной связи
затрачивается работа, поэтому необходима активация. Второй —
взаимодействие двух аминокислот (одной с блокированной ами-
но-, а другой — с карбоксигруппой) в присутствии конденсирую-
щего реагента, активирующего карбоксил in situ. Остановимся
сначала на первом.
Ацилхлориды
Аминокислоты можно превратить в соответствующие ацилхлориды:
SOCI2
R—СН—СООН ------—> R—СН—CO-CI + НС1 + SO2 или РОС13
। или РС15 ।
NH—Z NH—Z
Z = защитная группа
Полученный ацнлхлорид легко реагирует с аминогруппой второй аминокислоты
с образованием пептидной связи. Однако, поскольку хлор — хорошая уходящая
группа, ацилхлориды легко рацемизуются путем промежуточного образования
илактопов (разд. 2.6).
80
'лава 2
Ангидриды
Смешанные ангидриды менее реакционноспособны, чем ацилхлориды (худ-
шая уходящая группа), что приводит к меньшей степени рацемизации при их об-
разовании. Синтезировать такие соединения удается, проводя нуклеофильную
R—СН
Z
I1 I*
С О=с R—СН—С—О—С—R
О. , Н —;—• I
е V. у Cr -HNEi,ci’
EtjNH I
° L.
атаку карбоксилат-иона аминокислоты на ацилгалогеиид. Растворимость амино-
кислоты в органических растворителях увеличивается в присутствии органиче-
ских катионов. Образующийся ангидрид легко реагирует с аминогруппой второй
аминокислоты. Однако аминогруппа способна реагировать с одной из двух кар-
бонильных групп, так что может образоваться значительное количество побоч-
ного продукта. Этого можно избежать, если синтезировать смешанный ангид-
рид, нуклеофильная атака которого проходит предпочтительно по одному из двух
карбонилов. К образованию такого ангидрида приводит реакция аминокислоты
с этиловым эфиром хлоругольной кислоты. В этом случае атаке подвергается
только одна карбонильная группа как более электрофильная (ко второй карбо-
нильной группе с обеих сторон примыкают два атома кислорода, делокализую-
щих свои неподеленные электроны) и худшая уходящая группа Тем не меиее
может проходить рацемизация, а синтез ангидридов следует проводить при низ-
кой температуре, чтобы избежать их разложения.
r—сн—с:
NH
'О\
6 1
О
Z
C1J OEt
о
о
о
R—СН—С—О—С—OEt
NH
H2N—CH—R
II /R
--R—CH—C—NH—CH
I xcoo®
+ EtOH
NH
Z
z
COO®
Ацилазиды
Использование ацитазидов сопровождается меньшей (хотя и незначительно)
степенью рацемизации, чем использование ацилхлоридов или ангидридов. Азиды
можно синтезировать из ацилхлоридов:
О О
II II
R—СН—С—Cl + NaN3 ———> R—СН—С—N,
। -ЬаС1 ।
NH NH
Биоорганическая химия аминокислот
81
Одиако это потребовало бы превращения аминокислоты в нежелательный ацил-
хлорнд, что сделало бы такой синтез бессмысленным. Вместо этого используют
реакцию с эфирами аминокислот:
о О О
|| h2n-nh2 II hno2 II
R—СН—С—ОСН3 --------»- R—СН—С—NH—NH2 ------> R—СН—С—N3
I I I
NH NH NH
стабильный
(обычно кристаллический)
Азотистая кислота (источник азотистого ангидрида) — хорошо известный реа-
гент для синтеза азидов. Механизм превращения азидов сходен с механизмом
реакции диазотирования первичных аминов азотистой кислотой.
О < \ О ОН
II 1 II II 1л
R—С—NH—NH2 N-t—О— N R—С—NH—N—N=O
|| -НПО» I '
о I
О
R—С—N—N=N:
О
• II .. ф ..
R—С—N=N=N:e
^5- R—С—NH—N=N-^OH
Азиды трудно хранить, а всю работу с ними надо проводить при низких тем-
пературах, чтобы предотвратить перегруппировку Курниуса в изоцианаты:
О
R—
N3
промежуточный
реапционноспосо5ный
.нитрен
R—N-C-O
Азнды можно перевести в более стабильное соединение, работать с которым
удобнее, обработкой N-оксисукцинимидом:
Глава 2
В результате этой реакции получают устойчивый кристаллический «активирован-
иый эфир».
Активированные эфиры *
Аминолиз алкиловых эфиров — медленный, почти равновесный процесс. С тер-
модинамической точки зрения пептидная связь немного прочнее. С химической
точки зрения алкоксиды представляют собой ие очень хорошие уходящие груп-
пы. Однако существует возможность ускорить образование пептидной связи, ис-
пользуя эфир с лучшей уходящей группой, т. е. «активированный эфир». Амиио-
лиз активированного эфира обеспечит энергию, необходимую для образования
пептидной связи л-Нитрофеиол — гораздо более сильная кислота, чем метанол
(благодаря резоиаисной стабилизации аниона, см. выше), так что п-иитрофе-
ниловый эфир аминокислоты — это активированный эфир Такой эфир можно
синтезировать из кислоты и п-нитрофеиола в присутствии конденсирующего (де-
гидратирующего) агента, ДЦГК (см. ниже). Пеитахлорфеиол также более силь-
ная кислота, чем метанол (благодаря отрицательному индуктивному эффекту
хлора, см. выше), так что его можно использовать при получении активирован-
ных эфиров.
Активацию карбоксильной группы в присутствии нуклеофильной аминогруп-
пы in situ можно провести с помощью нескольких коидеиснрующих агентов.
К карбодиимидам относятся активирующие (дегидратирующие, конденсирую-
щие) реагенты с общей структурой:
|R— N==C N R
+а
Центральный атом углерода, окруженный с двух сторон атомами азота, имеет
электрофильный характер и поэтому способен атаковаться различными электро-
фильными агентами. Наиболее известны реакции карбодиимидов с кислотами.
Например, со многими слабыми кислотами карбодиимиды вступают в реакцию
* Непрерывно предлагаются новые методы синтеза «активированных эфи-
ров». Во время подготовки этой книги описан еще один такой метод [361].
Биоорганическая химия аминокислот
83
присоединения:
SH S
I II
R—N=C—NH—R R—NH—С—NH—R
тиоенолъная форма тиоуретан
S—Ph
R—N=i—NH—R
CN
I
R—N=C—NH—R
Безводный HC1 экзотермически присоединяется к карбодиимиду с образованием
дихлорпроизводиого, хотя минеральные кислоты катализируют гидратирование
карбодиимпдов. Наибольшее значение, во всяком случае с целью синтеза био-
С1
2HCI I
Ph—N=C=N—Ph ------> Ph—NN—С—NH—Ph
дифеиилкарбодиимид I
Cl
Ph—N=C—NH—Ph —> ph—HN—C—NH—Ph
дифенилмочевииа
OH
логически интересных соединений, имеют реакции с карбоновыми, фосфорными и
сульфокислотами. В соответствующих условиях эти соединения присоединяются
к карбоднпмнду с образованием промежуточных соединений ангпдридоподобной
структуры и затем ангидридов кислот. Схема такой реакции с карбоновой кисло-
той приведена ниже (в гл. 3 обсуждается реакция карбодиимида с фосфорной
кислоте#) в связи с проблемой нуклеотидного синтеза).
©
R—N=C=N—R + R—СООН ——♦ R—N—С—NH—R
R'—COO*
R-tN^C-r-NH—R
io;
......J | !
O=Cj-R-
нестабильная О-ацилмоч евина.
(ангивривопойобный промежуточный
продукт)
Нестабильное промежуточное соединение может претерпевать либо перегруппи-
ровку с образованием мочевины, либо атаку второй молекулы кислоты и обра-
зование ангидрида кислоты. Таким образом, реакция карбодиимида с кислотой
представляет собой способ синтеза биологических высокоэнергетических ангидри-
дов кислот. Это дает также потенциальную возможность использовать карбоди-
имид для синтеза пептидной связи. Например, ранее уже указывалось, что амины
। реагируют с ангидридами кислот с образованием пептидной связи. Кроме того,
I в мягких условиях, при которых карбодиимиды реагируют с карбоновыми кисло-
тами (т. е. комнатная температура), ие протекают побочные реакции. Например,
84
Глава 2
карбодиимиды вступают в реакцию нуклеофильного присоединения со спиртами
только при кипячении.
О
N'
С—NH—1
II
(продукт
перегруппировки)
? ? °
R—С—О—С—R' + R— NH—С—NH—R
Прежде чем использовать карбодиимиды в пептидном синтезе, следует уде-
лить внимание выбору заместителя R. Устойчивость алифатических и ароматиче-
ских карбоднимидов зависит от природы заместителей, так что при хранении
могут иметь место разложение или полимеризация. Длина алкильной цепи незна-
чительно влияет на устойчивость карбоднимидов. Напротив, разветвленность ал-
кильных заместителей при атомах азота существенно увеличивает стабильность
соединений. Так, если днэтилкарбодиимид полимеризуется при хранении в тече-
ние нескольких суток, то дициклогексилкарбодиимид может храниться месяцами.
Именно этот реагент и нашел наиболее широкое применение в белковом синтезе.
Дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК) можно использовать для синтеза пептидных
связей:
Вициклогексилмочееина (ДЦГМ)
NHi
R'—СН—СООМе
вторая аминокислота реагирует с промежуточным
ангиВриВом
В мягких условиях (при 0°С) вторая аминокислота с защищенной карбоксильной
группой реагирует не с ДЦГК, а только с аигидридоподобным промежуточным
соединением. Образующаяся дициклогексилмочевина (ДЦГМ) нерастворима в
Биоорганическая химия аминокислот
85
в
большинстве органических растворителей, поэтому наиболее часто ее отделяют
от продуктов реакции путем простого фильтрования. Однако полностью удалить
следы ДЦГМ иногда бывает трудно. Поэтому иногда необходимо использовать
карбодиимиды, растворимые в водных средах. Одни из таких карбодиимидов —
гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Уретановое произ-
водное, образующееся в результате реакции такого карбодипмпда, растворимо
воде
Н3С—СН2—N=C=M—(СН2)з—N(CH3)2 • НС1
Поэтому после завершения реакции в органической среде непрореагировавший
карбодиимид н мочевину удается просто отмыть водой. Следует отметить, что
вследствие образования азлактоиов из ангидридоподобных промежуточных со-
единений в довольно значительной степени при синтезе белков (пептидов) мо-
жет проходить рацемизация. Одиако при синтезе коротких пептидов эта помеха
минимальна.
Реагент Вудворда как дегидратирующий агент находит гораздо меньшее при-
менение, чем карбодиимиды. Вначале проходит реакция с карбоксильной груп-
пой после катализируемого основанием разложения изоксазолиевой соли:
Н
реакционно-
способный
____кетенопоЗобный
Н® углероЗ (+6)
изоксазолиевое
кольцо
о
О
R—СН—С
О
NH
амгиЗриЗопоЗобный
интермевиат
R
,)< NH—PG
(возможно nh \ р.
образование | •• /
азлактона) сн, H2N—СН
СООМе
Z
NH
А. реакционно-
3 способный
эфир енола
NH
I
сн.
HN—CH—СООМе
°ч I
^С—СН—NH— Z
R'
ЗипептиЗ
86
Глава 2
Присутствие основании в реакционной среде неблагоприятно’ могут иметь место
различные побочные реакции, включая рацемизацию.
ЭЭДХ, или реактив Белло (2-этоксиэтоксикарбоиил-1,2-дигидрохинои),— так-
же конденсирующий агент, нашедший применение в пептидном синтезе [7]. ЭЭДХ
легко синтезировать из хинолина и хлоругольиого эфира:
G
I
CI^'OEt
ElOH-C«H,
Et,N
-МНЕ1>*С1в
ЭЭДХ
ЭЭДХ не реагирует с аминами в мягких условиях (при комнатной температуре).
В гидроксилсодержащих растворителях не происходит алкоголиза карбэтокси-
группы, однако в присутствии следов кислот Льюиса (например, BF3) этокси-
группа замещается. Этоксигруппа — хорошая уходящая группа, отщепление ко-
торой происходит при протонировании. Протеканию этой реакции способствует
возможность образования ароматической системы:
Карбоксигруппа охотно присоединяется к катиону, после чего происходит обра-
зование смешанного ангидрида. Последний в свою очередь реагирует с амино-
группой второй аминокислоты с образованием пептидной связи. Кроме того, об-
разующийся таким образом смешанный ангидрид не накапливается в растворе
(его образование лимитирует скорость всего процесса), а сразу атакуется
амином. Поэтому образования азлактона не происходит и не происходит суще-
ственной рацемизации в процессе полнпептидного синтеза. Образовавшийся сме-
шанный ангидрид атакуется второй аминокислотой лишь по одной из двух
карбонильных групп с образованием диоксида углерода и этанола в качестве
побочных продуктов. Причина такого поведения обсуждалась ранее (см. образо-
вание пептидной связи через ангидриды кислот).
Избирательность ЭЭДХ к карбоксигруппе легко понять, если учесть, что
замещение этоксигруппы любым другим нуклеофилом (т. е реакция замещения
Биоорганическая химия аминокислот
S7
со спиртами или тиолами) приводит к соединению, по строению аналогичному
исходному. Напротив, замещение карбоксильной группой, протекающее через ше-
(не накапливается;
образование азлантомл
не происходит)
И /R
, К—СН—С—NH—СН\
I C'OOMe
1NH.
+ cof + Еюн
Z
стичлеиное переходное состояние, приводит к образованию стабильной аромати-
ческой структуры с 10 л-электронами.
Ангидрид Лейкса. Взаимодействие незащищенной аминокислоты с фосгеном
лежит в основе простого метода синтеза пептидной связи. Реакция начинается
с N-ацилирования аминокислоты и последующей циклизации с образованием
88
Глава 2
.реакционноспособного ангидридоподобиого интермедиата:
соо® о
R—СН\ ^11 ----♦
^NH2 ci (ЧЛ
хросген
ангиЗрив Лейксф
(карбаминовая кислота)
-со, |нв
О
R—СН—С—NH—СН
®NH3
zR/
хсоо9
ЗипептиЗ
Образовавшийся ангидрид подвергается нуклеофильной атаке по одной из двух
карбонильных групп, так как вторая карбонильная группа менее электрофильна
(окружена с двух сторон атомами азота и кислорода) и одновременно является
лучшей уходящей группой. Карбамат легко разлагается на пептид и диоксид
углерода. Фосген играет роль конденсирующего агента, так как после образова-
ния ангидрида происходит его замещение второй аминокислотой Ангидрид не
выделяется. Карбамат также не выделяется, и ход реакции сложно контролиро-
вать. Образующийся дипептид может снова вступать в реакцию N-ацилирования,
давая ангидрид, который затем атакует третья аминокислота н т. д.
Метод с использованием ангидрида Лейкса нанлучшим образом подходит
для синтеза гомополимеров. Однако тщательно контролируя условия реакции
(0°С, pH 10 2), удается остановить реакцию на стадии образования карбамата
и присоединить следующее мономерное звено, а затем продолжать реакцию, де-
блокируя аминогруппы. Этим способом были синтезированы длинные полипеп-
тидные цепи с заданной последовательностью.
Твердофазный синтез (метод Меррифильда) [8]
Этот метод можно рассматривать как комбинацию описанных выше методов
(использование защиты амино- и карбоксигрупп, конденсирующих агентов
и т д.), по с существенным упрощением, касающимся обработки промежуточных
соединений в классическом варианте синтеза. При применении твердофазного
синтеза устраняется необходимость выделять продукт каждой реакции в чистой
кристаллической форме, избыток реагентов и побочные продукты отделяют с по-
мощью простого фильтрования и отмывки соответствующими растворителями.
Биоорганическая химия аминокислот
89
Это равнозначно существенному снижению объема работы, особенно при синтезе
длинных полипептидов. В основе метода лежит использование нерастворимой по-
листирольной матрицы.
Реакционный центр вводится в полимерный носитель реакцией хлорметили-
рования. Выше уже отмечалось, что бензилхлорндный остаток принимает участие
в 5\2-замещенни и легко взаимодействует с карбоксигруппой, которую в свою
очередь нетрудно удалить (ацидолиз) на более поздних стадиях. Отметим, что
если бы в реакции замещения участвовала аминогруппа, то последующее снятие
90
Глава 2
аминокислоты с полимера было бы невозможным. После того как аминокислота
ковалентно закреплена иа полимере, можно удалить /-ВОС-группировку кислот-
ной обработкой, не затрагивающей бензильную связь. Деблокированная амино-
группа может теперь вступить в реакцию со второй аминокислотой ((-ВОС-за-
щищеиной) с образованием пептидной связи, затем /-ВОС-защита удаляется, и
дипептид, связанный с полимером, может вступить в реакцию с третьей амино-
кислотой и т. д. После каждой реакции требуется лишь отфильтровать продукт,
ковалентно присоединенный к полимерному носителю, и отмыть непрореагиро-
вавшие компоненты и побочные продукты. После окончания синтеза пептид за-
данной последовательности снимается с носителя обработкой НВг или HF в три-
фторуксусиой кислоте.
Можно использовать любой конденсирующий агент, хотя наиболее широкое
употребление получил ДЦГК. ДЦГК позволяет использовать для синтеза пеп-
тидов все аминокислоты, кроме аспарагина и глутамина (амндиые боковые цепи
которых дегидрируются до нитрилов). Интересно отметить, что при синтезе на
полимерном носителе механизм реакции с ДЦГК отличается от механизма реак-
ции в растворе [9]. Это вполне понятно, поскольку ДЦГК и растворенная амино-
кислота находятся в избытке по отношению к нуклеофильным аминогруппам,
ковалентно связанным с носителем. Поэтому реакция ангидридоподобного проме-
жуточного соединения с карбоксильной группой второй молекулы свободной ами-
нокислоты более вероятна, чем с аминогруппой, иммобилизованной на полимере.
HN
ангийриВопойвбный интермедиат
(ДЦГК и свободной аминокислоты)
с—о—с—сн;
R'
NH- Z
N
R'.
NH—Z
R'
NH—Z \
R',
СН
ос
/СНЧ
R' NH-' Z
+ N—СН
Н,
R
СН—С—NH—СН'
NH 9
ЗипептиВный
пройукт, связанный
с полимером
Хх полимерная
(^/матрица
/Л? полимерная
матрица
0=1
О
О
Поскольку обработка реакционной смеси после образования каждой после-
дующей пептидной связи (удлинения полипептида) очень упростилась, стало воз-
можным автоматизировать процесс синтеза, что, таким образом, привело к уско-
рению полипептндного синтеза. Таким методом был проведен первый химический
синтез фермента (панкреатическая рибонуклеаза быка, 124 аминокислотных
остатка).
Биоорганическая химия аминокислот
91
Следует указать, что с разработкой даже столь простой методики, как твер-
дофазный метод, удалось решить не все проблемы. Так, фермент рибонуклеаза,
синтезированный по методу Меррифильда, ие обладает той же биологической ак-
тивностью, что и природный фермент. Возможно, наиболее серьезна проблема
«пропусков», в результате чего аминокислоты могут быть пропущены или же мо-
гут занять неправильное место в полипептидной последовательности вследствие
92
Глава 2
неправильно прошедшей или вообще не прошедшей реакции образования пеп-
тидной связи. Нарушения пептидного синтеза могут быть обусловлены вкладами
различных факторов, большинство из которых имеет общую природу: при твер-
дофазном методе реакция проходит не в гомогенной среде. Например, при обра-
зовании пептидной связи ковалентно присоединенная к носителю нуклеофильная
аминогруппа полипептндной цепи может оказаться стернчески блокированной
полимером, не участвуя, таким образом, в реакции со свободной карбоксильной
группой до следующей стадии, когда в систему будет введена новая аминокис-
лота со свободной карбоксильной группой Однако другие полнпептндные цепи,
ковалентно закрепленные на носителе, возможно, не окажутся блокированными
в процессе реакции конденсации. Поэтому после завершения синтеза получается
смесь белковых продуктов, которые можно разделить методом колоночной хро-
матографии. Частично решить проблему направленного синтеза удалось путем
получения коротких полнпептндных цепей, которые затем снимают с носителя и
конденсируют в желаемый белок.
Были предложены и другие методы синтеза с использованием полимерных
носителей. Хотя нн один из них не получил такого широкого признания, как ме-
тод Меррифильда, некоторые из них успешно применялись для синтеза корот-
ких полипептидов, например полимер, полученный алкилированием полистирола
^-окси-3-иитробеизилхлорндом по Фриделю — Крафтсу [10]. Первая аминокис-
лота реагирует с ДЦГК и присоединяется к носителю с образованием активного
эфира. Вторая аминокислота затем реагирует с этим активным эфиром, давая
пептидную связь Полимер при этом является уходящей группой. Таким образом,
в противоположность методу Меррифильда после каждой реакции конденсации
продукт реакции переходит в раствор и при необходимости может быть очищен.
Исключаются «пропуски»; однако каждая стадия конденсации требует повтор-
ного присоединения полипептида к полимеру.
Следует обратить внимание на сходство твердофазного метода синтеза и био-
логического синтеза белков. В обоих случаях аминокислота присоединена своей
карбоксигруппой к обширной макромолекулярной поверхности, на которой про-
исходит последовательное присоединение других аминокислот и образование пеп-
тидной связи. В одном случае полимер, подобно молекуле тРНК в пептндилсвя-
зывающем центре, является уходящей группой, тогда как в другом случае поли-
мер, подобно тРНК в аминоацилсвязывающем центре, остается связанным с
цепью после образования новой пептидной связи. Конечно, комплекс тРНК—ри-
босома имеет более сложную природу, чем полистирольная матрица.
2.7. Асимметрический синтез а-аминокислот
В процессе химической эволюции природа должна была выб-
рать избирательные методы синтеза аминокислот и специфиче-
ского узнавания. В связи с этим интересно, какими же химиче-
скими методами синтеза аминокислот в оптически чистой форме
и разделения энантиомеров владеем мы сегодня? Ниже рассмот-
рены два подхода к асимметрическому синтезу аминокислот
с применением понятия асимметрической индукции и специфиче-
ского комплексообразования с ионами металлов
Общеизвестно, что одна из нерешенных задач органической
химии — проведение эффективного асимметрического синтеза из
прохирального предшественника точно так же, как это делают
ферменты. Как вариант, приводящий к желаемому результату,
можно использовать оптически активный реагент, который диасте-
реотопно взаимодействовал бы с реагирующей молекулой и при-
водил к получению асимметрического продукта.
Биоорганическая химия аминокислот
93
Тот факт, что а-аминокислоты суть составляющие белков,
придает им особое значение. Восемь аминокислот называют «не-
заменимыми», потому что млекопитающие не могут их синтези-
ровать и должны получать вместе с пищей. Это изолейцин, лей-
цин, лизин, метионин, валин, треонин, фенилаланин и триптофан.
Они все обладают ь-конфигурацией, и располагать способом
получения таких аминокислот весьма важно Десять лет назад
с этой целью использовали в основном биохимические методы,
основанные на разделении рацемических смесей.
2.7.1. Метод Кори
Группа французских химиков под руководством Кагана сооб-
щила о проведении асимметрического синтеза ь-аспарагиновой
киокюты, причем исходным соединением послужил оптически ак-
тивный аминоспирт [11]. Схема синтеза приведена на рис. 2 6.
Рис. 2.6. Синтез монометилового эфира
L-аспарагиновой кислоты по Кагану [11].
Оптически активное ненасыщенное циклическое исходное сое-
динение гидрировали с наименее стернчески затрудненной сто-
роны двойной связи, что приводило с очень хорошим выходом
к образованию нового асимметрического атома углерода. Стерео-
специфичность реакции восстановления обеспечена наличием
объемного фенильного кольца в псевдоаксиальном положении.
Полученный хлоргидрат монометилового эфира ь-аспарагиновой
94
Глава 2
кислоты характеризовался оптической чистотой 98% *. Как не-
достаток этого метода отметим утрату исходного асимметриче-
ского аминоспирта, превращающегося в дифенилэтан. Кроме того,
маловероятно, что этот метод окажется общим и для других
а-аминокислот.
Поэтому не исчезла необходимость в более общем методе,
в котором асимметрический реагент не тратился бы и который
обеспечивал бы регенерацию исходных продуктов. Таким требо-
ваниям соответствовал разработанный в 1970 г. Кори с сотр. [12]
X
RCOCOOH \ X
------* /N~Y\
< >
/С— гиЗразоно-
R лактон
Рис. 2.7. Схема синтеза по методу Кори [12]. Хиральиый центр показан звез-
дочкой.
новый метод (рис. 2.7). Предшественником а-аминокислоты яв-
ляется соответствующая а-кетокислота. а-Кетокислота реагирует
с хиральным реагентом и образует цикл минимального размера,
в который входит гидразон. Специфическое восстановление двой-
ной связи приводит к появлению хирального атома углерода в
соответствующей а-аминокислоте. В результате гидрогенолиза
этого промежуточного соединения образуются хиральная амино-
кислота и хиральиый вторичный аминоспирт, который можно
превратить в исходный хиральиый реагент.
В качестве исходного в этом методе был выбран хиральиый
реагент, представляющий собой бициклическое производное ин-
долина, синтез которого приведен ниже. Абсолютная стереохими-
ческая конфигурация этого бициклического производного была
определена путем коррелирования с l(—)-фенилаланином. Он
имеет простую жесткую структуру, необходимую для обеспече-
♦ Оптическая чистота соединения определяется следующим образом:
. специфическое вращение смеси энантиомеров , __
% оптической чистоты =-----£--------—=----------------------— X 100
специфическое вращение одного энантиомера
Согласно такому определению, рацемат, состоящий на 50% из R-изомера и на
50% из S-изомера, характеризуется 0% оптической чистоты; продукт, имеющий
90% оптической чистоты, соответствует смеси, содержащей 95% одного изомера
и 5% его антипода.
Биоорганическая химия аминокислот
95
разбеляется
с помощью
(5)(+)-минвальной
кислоты
ния стерического контроля при восстановлении двойной связи
C=N в процессе образования асимметрического центра.
Был проведен асимметрический синтез D-аланина (рис. 2.8).
На всех стадиях синтеза продукты получены с хорошими выхо-
дами; оптическая чистота аминокислоты составила 80% •
Рис. 2.8. Асимметрический синтез о аланина [12].
96
Глава 2
Эффективность этого метода синтеза можно увеличить, моди-
фицируя исходное соединение и используя более сложный реа-
гент с двумя центрами асимметрии:
Оптический выход реакции повышается до 90% для о-аланина
и до 97% для D-валина. Таким образом, дополнительная метиль-
ная группа соответствующего гидразонолактона благоприятствует
6c#iee специфическому восстановлению двойной связи с противо-
положной стороны трициклического промежуточного соединения.
Еще одно преимущество такого подхода — возможность сте-
реоспецифического синтеза серии (по желанию изменяя группу R
в кетокислоте-предшественнике) а-дейтерированных аминокислот,
просто восстанавливая соединение в тяжелой воде.
2.7.2. Родиевый(1) катализатор
Другой элегантный и полезный современный метод синтеза
оптически активных аминокислот заключается в гомогенном ката-
литическом гидрировании с использованием в качестве катализа-
тора комплексов родия(I). Действительно, открытие факта, что
комплекс [Rh (РНзР) 3С1] (катализатор Уилкинсона) и родствен-
ные соединения являются эффективными гомогенными катализа-
торами при гидрировании многих олефинов, дало в руки исследо-
вателей систему, которая могла бы быть использована при асим-
метрическом каталитическом синтезе.
Трудность состояла в том, чтобы найти катализатор, который
стереоспецифически восстанавливал бы алкен
R,-^ ^COOR,
R2^=*-NH-R4
Первые попытки осуществить такую реакцию с помощью мо-
нодентатных фосфинов привели лишь к низким оптическим вы-
ходам. Бидентатные системы более перспективны, но для них су-
ществует проблема подвижности и быстрого перехода:
Однако сочетание хирального бидентатного фосфина и фосфит-
ных лигандов может привести к нарушению такого перехода.
Например, если алифатическая связь замешена и вследствие
этого возник асимметрический атом углерода, хелатный цикл мо-
Биоорганическая химия аминокисло?
97
жет быть фиксирован в единственной статичной хиральной кон-
формации, причем заместители должны быть расположены эква-
ториально. Сходным образом хиральиый заместитель придаст
хиральность циклу, и, таким образом, вся структура примет един-
ственную хиральную конформацию. Прохиральный! олефин коор-
динирует этот хиральиый комплекс металла, предпочитая опре-
деленную ориентацию, что приведет к асимметрическому восста-
новлению двойной связи. Именно эти представления привели
Боснича [13] к синтезу хирального лиганда (25,35)-бис(дифе-
нилфосфино) бутана [(5,5)-хирафос]. Это соединение было ис-
пользовано для получения соответствующего хелатного цикла, в
котором в качестве металла М выступал ион родия.
хелатный катализатор (5,5)-хирафос
Две метильные группы ориентированы экваториально. При
фиксации цикла в одной определенной конформации возникает
хиральность цикла в расположении фенильных остатков, что при-
водит к образованию днастереотопного комплекса с олефинами.
Схема синтеза представлена на рис. 2.9.
,, \ / Т«С1
/ С "Н nVpUjUH
НО он
1) LlPPha
21 Niflll, NCS-
3) NaCN
i.V,S)-xupaqjoc
•n пл.109°с£«]о = -211
6ЫХО0‘~ЗО%
(2Д,зк)-БутанЭиол
Рис. 2.9. Синтез катализатора иа основе Rh(I) [13].
4 Зак. 549
98
Глава 2
Дифенилфосфнд лития замещает тозильную группу по 8н2-механнзму Ионы
двухвалентного Ni использованы для отделения искомого продукта от побочных
путем образования нерастворимого комплекса с Ni(II), а циапид-иопы— для от-
деления металла на последней стадии. (S, S)-Хирафос представляет собой твер-
дое вещество, образуется с 30%-ным выходом; в растворе он медленно окисляет-
ся воздухом. Поэтому сразу по получении его превращают в комплекс однова-
лентного родия реакцией замещения с ди-1,5-циклооктадиеном одновалентного
родия. Конечный продукт этой реакции — оранжево-красное твердое вещество,
стабильное при хранении под азотом при температуре 0—4°С. Именно это соеди-
нение способно гидрировать разнообразные олефины в каталитических условиях.
Реакцию проводят в атмосфере азота при температуре 25°С за 1—24 ч, причем
количества катализатора и субстрата относятся обычно как 1 : 100.
Цри получении а-аминокислот исходят обычно из ct-N-ацил-
аминоакриловых кислот и их эфиров. В табл. 2.2 приведены оп-
тические выходы полученных аминокислот. С помощью (S,S)-xn-
рафоса получаются только /?-аминокислоты. Вообще говоря, соот-
ветствующий антипод (Я,/?)-хирафос должен привести к получе-
нию природных S-аминокислот, как это в действительности и
происходит.
Таблица 2.2. Оптический выход 7?-аминокислот, полученных в работе [13]
Исходный олефин Аминокислота Оптический выход (%) ^-аминокислоты в растворителе
ТГФ этанол
СООН Phe 99 95
АЛ NHCO— COOEt Phe 83
nhco^O СООН *=\ Ala 88 91
'NHCOCHj СООН Leu 100 93
—\ 'nhcoch, СООН Leu 87 72
• \ ^NHCO—
Биоорганическая химия аминокислот
99
Из табл. 2.2 видно, что выход продуктов реакции зависит от
природы N-ацильного заместителя, 0-винильного заместителя и
полярности растворителя. Однако реакция стереоспецифнчна, и
всегда наблюдается только ^нс-присоединение водорода к олефи-
ну. Это было показано путем применения D2(2H2) вместо Н2.
Конечный продукт—(2R, зЛ-2Н2)-Й-бензилфенилаланнн (из соот-
ветствующего производного акриловой кислоты).
Предполагается, что такое асимметрическое дейтерирование
протекает в два этапа, причем вначале происходит присоедине-
ние гидрида к олефину, что приводит к образованию связи родия
с алкилом. Связь металла с алкилом быстро расщепляется при
Стереоспецифическое
связывание с катализатором
внедрении протона. Несмотря на двустадийный механизм, про-
цесс, по-видимому, полностью стереоспецифичен. Более того, если
предшественник лейцина дейтерирован аналогичным образом, дей-
терий оказывается только в а- и 0-центрах. В у-положении дей-
терия нет, что указывает на отсутствие миграции двойной свя-
зи при восстановлении. Важное достоинство, присущее такому
механизму,— взаимообусловленность оптической чистоты 0-центра
и а-центра.
Сформулируем четко причины, обусловливающие эффектив-
ность такого катализатора при асимметрическом титрировании
предшественников аминокислот! 1) конформационная жесткость
4*
100
Глава 2
хелатного лиганда, 2) асимметричная ориентация фенильных
групп, закрепленных в таком положении 5-членным искаженным
хелатным циклом. Это основные причины диастереотопных взаимо-
действий с прохиральными субстратами, которые приводят, во-пер-
вых, к quc-эндостереоспецифическому гидрированию с образова-
нием а- и 0-хиральных атомов углерода * с 2Нг и, во-вторых, неза-
висимо от растворителя только к /^-аминокислотам.
Данный подход оказывается успешным и при синтезе амино-
кислот, специфически дейтерированных по 0-положению.
Ниже приведена схема метода рацемизации а-углеродного
центра N-бензилфенилаланнна через оксазолиновые производные.
Два стереоизомера можно разделить обычными методами.
радзя-’н,]
Таким образом, в качестве дополнительного приложения, ме-
тод позволяет проводить избирательный синтез моно- или дидей-
терированных аминокислот и их аналогов. Такие хиральные
меченые молекулы можно использовать для более подробного изу-
чения биосинтеза, в котором участвуют предшественники амино-
кислот. С использованием этого подхода [14] недавно был осу-
ществлен синтез хиральной метилмолочной кислоты, в которой
три водорода метильной группы замещены дейтерием и тритием.
Стилл и сотр. предложили интересное развитие идеи асиммет-
рического синтеза с использованием родиевых комплексов путем
их присоединения к нерастворимой матрице [15]. Основное пре-
* Следует отчетливо представлять, что катализатор приближается к прохи-
ральной двойной связи с a-si- и 0-ге-сторон (о введении в номенклатуру, ис-
пользуемую для различия двух углеродных атомов, прохиральной двойной связи
см. разд. 4.2.1). Дейтерий 2Н и тритий 3Н — это тяжелые изотопы водорода, од-
нако для простоты структурных формул, в книге используются символы О и Т.
Ph2P PPha
Рис. 2.10. Синтез оптически активного катализатора иа основе Rh(IJ, присоеди-
ненного к полимерному носителю [15]. АИБН — азабнсизобутнронитрил, инициа-
тор свободно-радикальной полимеризации! 8 — растворитель.
102
Глава 2
имущество, получаемое при новом методе, — возможность регене-
рации оптически активного катализатора — фосфинродиевого ком-
плекса.
Важная и интересная проблема в катализе на полимерной
матрице — выбор подходящего полимерного носителя и синтез
каталитического центра па матрице. С этой целью используют
метод, заключающийся в введении реакционного центра в гранулу
сшитого полистирола с последующим взаимодействием оптически
активного лиганда, содержащего фосфин, с этим центром
(рис. 2.10). Реакция (—)-1,4-дитозилтреитола с 4-винилбензаль-
дегидом приводит к 2-п-стирол-4,5-бис (тозилоксиметил) 1,3-диок-
салану, который по радикальному механизму сополимеризуется
с оксиэтнлметакрнлатом (в образовании сшивок участвуют
8% (моль.) сополимера). Последующая обработка дифенилфос-
фидом натрия, реагирующим со всеми гидроксильными и тозиль-
ными группами, приводит после нейтрализации к получению
гидрофобного полимера, несущего оптически активный лиганд
4,5-бис (дифенилфосфинометил) 1,3-диоксалан. Замена лигандов ро-
дия (I) в [(C2H4)2RhCl]2 на полимерные приводит к катализатору,
связанному с полимером, который набухает в спирте и других по-
лярных растворителях, что позволяет молекулам субстрата прони-
кать к реакционным центрам.
Обычно каталитическое гидрирование проводят при темпера-
туре 25°С и давлении водорода 1—2,5 атм, причем отношение ко-
личеств олефина и родия равно -~50. В этих условиях a-N-ацил-
амнноакриловые кислоты превращаются в спирте в производные
аминокислот Оптический выход сравним с оптическим выходом
при использовании гомогенного катализатора. При этом наблю-
дается образование продуктов с той же абсолютной конфигура-
цией (/?). Основное преимущество — возможность многократного
использования нерастворимого катализатора. Его можно регене-
рировать из реакционной смеси фильтрацией в инертной атмо-
сфере, при этом не теряется каталитическая активность, а также
не снижается оптическая чистота продуктов гидрирования.
Еще один вариант такого подхода предложен Уайтсайдом и
сотр. [16, 17]. Он создал катализатор асимметрического гидри-
рования на основе ахирального дифосфинродиевого(1) комплек-
са, введенного в специфический центр фермента. В этом случае
третичная структура белка обеспечивает хиральность катализа-
тора, необходимую для энантиоселективного гидрирования.
Для этого использовали хорошо известный белок авидин, в
состав которого входят четыре идентичные субъединицы; каждая
связывает биотин и многие его производные. Поэтому биотип, мо-
дифицированный сукцинимидом, был превращен в хелатообра-
зующий дифосфип, который с родием (I) образует комплекс.
При такой обработке промежуточно образующийся дифосфип
служит исходным соединением для синтеза водорастворимого ка-
Биоорганическая химия аминокислот
103
Tf^-mpuq>namuoH(CFjSOj)
NBD —норборнайиен
тализатора для гомогенного гидрирования на основе родия. Энан-
тиоселективность катализатора была показана в реакции восста-
новления а-ацетамидоакриловой кислоты до N-ацетилаланина.
Наличие авидина привело к существенному повышению активно-
сти катализатора, и выход S-энантиомера (природной аминокис-
лоты) повысился на 40%.
/ MuBUH-EuonWH-RhNBD^TF® сн в /
' \ рН7,0,0.1М фосфолпныи 3
'NHCOCH3 буфер, ОЧ, 48ч н NHCOCHj
S-изомер
Присутствие других ферментов, например лизоцима или кар-
бонатангидразы, не оказывало существенного влияния на энап-
тиоселективность.
Таким образом, Уайтсайде показал, что в водной среде удает-
ся проводить гомогенное гидрирование с использованием катали-
затора дифосфинродия(1), ассоциированного с белком. Кроме
того, хиральность белка способна индуцировать значительную
энантиоселективность при восстановлении. Такой метод введения
переходных металлов в специфические центры белков может быть
использован в биохимии и клинической химии безотносительно
к проблеме асимметрического синтеза [16].
Глава 3
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ФОСФАТОВ
Целое — это нечто большее, чем сумма ча-
стей.
Аристотель
Очень часто при описании методов синтеза и свойств пепти-
дов не рассматриваются аналогичные методы синтеза и свойства
не менее важных соединений — фосфодиэфиров. Действительно,
стратегия синтеза и проблемы, которые при этом возникают (на-
пример, использование ДЦГК, защитные группы, синтез на поли-
мерном носителе и т. д.), весьма похожи, если не одинаковы,
хотя никогда не обсуждаются параллельно. Восполнить этот про-
бел— вот цель настоящей главы. При этом, как и ранее, прово-
дится сравнение с биосинтезом фосфатной связи. Следовательно,
в настоящей главе сравниваются химические и биологические
(биоорганические) свойства двух функционально важных классов
макромолекул белков и нуклеиновых кислот. Разумеется, мы до-
полним эту картину, рассмотрев свойства еще двух мононуклеоти-
дов, играющих важную роль в биологических процессах,— нук-
леозидтрифосфатов и циклических нуклеотидов. Это показывает,
что, подобно аминокислотам, для биологических систем важны
не только полимерные молекулы. Рассматривая этот вопрос, мы
вновь проведем сравнение химического и биологического путей
синтеза. Освещаются результаты исследований, опубликованные
в литературе, включая 1980 г.
Тем не менее в некоторых случаях при изложении материала
приходится вспоминать элементарную биохимию. Прежде всего
дано описание ДНК и РНК с привлечением только самых необ-
ходимых сведений и химических понятий, так что оно намного
короче тех, которые помещаются в обычных учебниках биохимии.
Заключение посвящено пребиотическому синтезу биополимеров.
3.1. Биологическая роль фосфатных макромолекул
Для продолжения жизни необходимо передавать определен-
ную информацию от одного поколения организмов к другому. Та-
кая информация жизненно важна, поскольку позволяет передать
по наследству те признаки или свойства, которые обеспечивают
выживание организма. Эту информацию надо сохранить до того
момента, когда ее нужно будет использовать (по аналогии можно
вспомнить звуковые записи на магнитофонной ленте). В таком
Биоорганическая химия фосфатов
105
случае хранение и реализация информации должны происходить
на молекулярном уровне. И действительно, не так уж трудно
представить себе некоторые свойства такой молекулярной биоло-
гической «магнитофонной ленты».
Учитывая огромный объем информации, подлежащий хране-
нию (например, тип организма, физические свойства, химические
превращения и т. д.), следует ожидать, что это будет биополи-
мер. Возможно ли, чтобы в качестве такой молекулы выступал
белок? Вероятнее всего, нет, поскольку белки и так играют важ-
ную роль структурных и функциональных (ферментативный ка-
тализ) компонентов клетки. Столь важная функция как хранение
информации должна выполняться уникальной макромолекуляр-
ной структурой, которая, скорее всего, не участвует в обычных
клеточных процессах. Можно ожидать, что этот специфический
биополимер имеет весьма однородную структуру, поскольку он
должен выполнять исключительно важную роль. Не следует ду-
мать, что для него характерно такое же структурное разнообра-
зие, как для белков, поскольку последние способны участвовать
в очень многих химических реакциях. В то же время он должен
состоять из разнородных компонентов, чтобы нести различную
информацию. Следует ожидать, что этот биополимер обладает
жесткой, вполне определенной структурой, так как он должен
взаимодействовать с клеточным аппаратом при передаче храни-
мой информации. «Свободно висящая» молекула, состоящая из
ациклических полимерных цепей и принимающая одну из мно-
жества возможных конформаций, вряд ли будет соответствующим
образом взаимодействовать, даже кооперативно, с упорядочен-
ными структурами клеточных компонентов. Специфическая ин-
формация должна передаваться совершенно точно. Напомним,
что синтез белков, например, происходит на «матрице» упо-
рядоченно и последовательно, а не статистически в растворе
(разд. 2.5).
Упорядоченная структура предполагает наличие пяти- и ше-
стичленных колец, а не цепей. Возможно, в качестве простейшего
предположения следует рассмотреть углеводороды, например бен-
зол, нафталин или индол. Однако эти соединения совершенно
гидрофобны, а такое свойство — недостаток, поскольку биологи-
ческие процессы проходят в водной среде. Кроме того, углеводо-
роды не способны участвовать в различных нековалентных взаи-
модействиях: в образовании водородных связей и в особенности
электростатических связей.
В роли мономерных единиц при хранении генетической инфор-
мации выступают молекулы азотистых оснований — производных
пурина и пиримидина. Полимерная молекула, осуществляющая
как хранение, так и передачу генетической информации,— это
дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Близкий ей по строе-
нию полимер, рибонуклеиновая кислота (РНК), помогает при
106
Глава 3
передаче генетической информации. Она действует как переносчик
определенного генетического «текста», переводя его в специфиче-
пиримидин пурин
TiupuOuH
урацил(сгг)
Н н
тимин (Th) цитозин(Су)
пиримиЭины
гуанин (Gu) аЗенин (Ad)
пурины
Рис. 3.1. Пурины и пиримидины моле-
кул наследственности ДНК и РНК
(приведены таутомерные формы, пре-
обладающие при pH 7).
скую аминокислотную последова-
тельность. Аденин и гуанин — пу-
риновые основания, общие для
ДНК и РНК- Пиримидиновые
основания, присутствующие в
ДНК, —- это цитозин и тимин
(5-метилурацил), тогда как в
РНК присутствуют цитозин и
урацил (рис. 3.1). Пурины и пи-
римидины присоединены к ано-
мерному атому углерода сахара
рибозы (в РНК) или дезоксири-
бозы (в ДНК). Гликозидная
связь образована с атомом азота
гетероциклического кольца: либо
N-9 в пуринах, либо N-1 в пири-
мидинах. Такое химическое со-
единение, образующееся из саха-
ра и основания (при отщеплении
молекулы воды), называется ну-
клеозидом (рис. (3.2); важное
исключение — нуклеозид псевдо-
уридин (обнаружен в тРНК), в
котором основание соединено с
рибозой через углеродный атом.
По правилам химии сахаров, нуклеозид аденозин называется так-
же 9-р-р-рибофуранозиладенином.
уриЗин (U) псевЭоурийин (^)
(0-ь-ри6Ь<руранозилурацил) (5-р-в-рибофуранозилурлцил)
В ДНК и РНК также присутствуют и другие основания, но
в гораздо меньших количествах. В их число входят, например,
5-метилцитозин (ДНК некоторых растений и бактерий), 5-окси-
метилцитозин (ДНК Т-четных фагов, бактериальных вирусов) и
4-тиоурацил (некоторые бактериальные тРНК) •
Гидроксильная группа сахарного остатка может быть этерифи-
цирована фосфорной, пирофосфорной или трифосфорной кисдд-
Биоорганическая химия фосфатов
107
4'V /гУглик.озийно.я
3\__/2. Связь
нд R
пуриновый нуклеозчЗ
3N^ J
.МУ связь
НО R
пиримиЗиновыц иуклеозчЭ
R Пуриновое или пиримидиновое основание Нуклеозид
ОН Цитозин Цитидин (С)
н > Дезоксицитидин
он Тимин Тимидин (Т)
н » Дезокситимидин
он Урацил Уридин (U)
н « Дезоксиурндин
он Аденин Аденозин (А)
н » Дезоксиаденозин
он Гуанин Гуанозин (G)
н х> Дезокснгуанозин
Рис. 8.2. Структура и номенклатура основных нуклеозидов.
той с образованием соответственно моно-, ди- или трифосфатов
нуклеозидов. Ранее нам уже встречался аденозинтрифосфат. Со-
единение, состоящее из основания, сахара и фосфата, называет-
ся нуклеотидом. Подобно аминокислотам — мономерным звеньям
белкового полимера, — нуклеотиды (нуклеозидмонофосфаты)
R О R'
I II Г-------, I
H2N—СН—С-фОН + H-I-NH—СН—СООН
R О R'
I II I
---- H2N—СН—С—NH—сн—СООН
пептиВная связь
(ЗипептиЗ)
В настоящей главе под основанием понимают пурины или пиримидины.
108
Глава 3
представляют собой мономерные единицы полимерных молекул
ДНК и РНК- Более того, подобно тому как мономерные амино-
кислоты соединены между собой амидными (пептидными) связями,
мономерные нуклеотиды соединяются фосфодиэфирными связями
(см. с. 107). И в ДНК, и в РНК нуклеозиды присоединены к не-
органическому фосфату своей З'-гидроксильной группой (а не
2'-гидроксильной) одного сахарного остатка и б'-гидроксильной
группой другого. Фосфат при этом существует в виде диэфира,
обладая только одним отрицательным зарядом (рКо ~ 2,0) при
физиологических значениях pH. Обычный партнер такой частицы —
катион металла (магния) или протонированного амина (полиами-
нов, гистоновых белков).
Важно уяснить, что именно основания, пуриновые или пири-
мидиновые, являются носителями генетической информации, по-
добно тому как боковые цепи аминокислот определяют химиче-
ские и функциональные свойства аминокислоты. Носитель наслед-
ственной информации — молекула ДНК — организована в клетке
в структурные единицы — гены. Эти последние в свою очередь
локализованы в особых структурах — хромосомах, которые нахо-
дятся в ядре животных или растительных клеток. Именно ген
содержит информацию, определяющую специфический признак:
цвет глаз и волос, рост, пол и т. д. Однако для описания на мо-
лекулярном уровне ген — довольно сложное образование, так как
число молекулярных стадий при реализации конкретного приз-
нака может быть весьма велико. Отметим, что любой генетиче-
ский признак реализуется с помощью белкового синтеза (струк-
турного белка либо фермента), и введем понятие более простого
элемента — цистрона. Цистрон определяют как часть ДНК, ко-
торая несет генетическую информацию (кодирует) о синтезе лишь
одной полипептидной цепи. Хромосома содержит много сотен
цистронов. Все количество ДНК, содержащееся в клетке, назы-
вается геномом.
Генетическая информация передается от родительской клетки
к дочерней путем репликации (синтеза) ДНК- Генетическая ин-
формация сохраняется в ДНК до тех пор, пока не понадобится,
а затем превращается в «инструкцию» по синтезу белка специфи-
ческой последовательности в процессе транскрипции. Генетиче-
ская «инструкция» переписывается на полимерную молекулу
РНК (мРНК). Она в свою очередь взаимодействует с соответ-
ствующими специфическими аминоацил-тРНК, в результате чего
происходит последовательное присоединение аминокислот. Пере-
вод генетической информации из РНК в специфическую амино-
кислотную последовательность называется трансляцией.
Термины репликации, транскрипции и трансляции можно понять, проводя
аналогию с процессом создания книги. Для набора в типографии готовят много
копий, или реплик (репликация). Если нз книги переписывают отрывок, это соот-
1Q9
1_
Биоорганическая химия фосфатов
ветствует транскрипции. Если книга написана на другом языке, ее переводят
(трансляция от нуклеотидов к аминокислотам).
Процесс передачи генетической информации можно изобразить
с помощью приведенной ниже схемы, к которой следует лишь
немногое добавить, чтобы получить представление о передаче
этой информации на молекулярном уровне.
репликация (синтез de novo)
ДНК -------------------------накопление ДНК
^транскрипция
трансляция
РНК--------------------------* накопление белка
3.2. Общие свойства компонентов нуклеиновых кислот
3.2.1. Пурины и пиримидины
Эти азотистые основания слабо растворимы в воде, однако
в составе нуклеозидов и нуклеотидов их растворимость увеличи-
вается. Они характеризуются высокой температурой плавления:
»300°С.
Кислородсодержащие основания способны к лактам-лактим-
ной таутомерии. В большинстве случаев резонансная энергия
амидной группы (или амидных групп) играет более значитель-
ную роль, чем резонансная стабилизация ароматического кольца,
так что превалирует лактамная форма, например:
А 1Н
"f 5 1
° N нсГаг
н
урацип урацил
(лактам) (лактим)
Пурины и пиримидины представляют собой слабые основания,
рКа «г 9,5 (для азота ароматического кольца). Например, значе-
ния рКа диссоциации протонов при N-1 или N-3 урацила (по
урацил
авенин
по
Глава 3
своему поведению при диссоциации эти протоны эквивалентны)
или N-9 аденина равны 9,5 и 9,8 соответственно. Такие основные
свойства можно объяснить резонансной стабилизацией аниона и
8р2-гибридизацией азота ароматического кольца. Напомним, что,
чем больше s-характер рассматриваемого атома, тем он более
кислый.
Значения рКа экзоциклических аминогрупп также отличаются
от соответствующих значений для обычных аминов. Так, эти ами-
ногруппы не протонируются при физиологических pH, и даже
протонируются не в первую очередь,— мнение, принятое в тече-
ние многих лет (табл. 3.1). Такие свойства уже обсуждались
(ср. анилин и циклогексиламин, табл. 2.1); они объясняются де-
Таблица 3.1. Значения рКа Для большинства основных пуринов и пиримидинов
рХ2=12,$
рК» = 3,63 (4,15 вля авенине)
рк, = 9,16 (9,2 а л я гуанина)
гуанозин
рК, = 4.11 (4.45'
Зля цитозина)
но он
цитиЭин
Биоорганическая химия фосфатов
111
локализацией не связывающих электронов азота в циклической
системе.
Наличие атомов азота как в кольцевой структуре, так и экзо-
циклических, конечно, влияет не только на диссоциацию, но и
на реакционную способность соединений. Присутствие атомов
азота определяет ход реакций электрофильного и нуклеофильного
замещения. Например, два гетероциклических атома азота в пи-
римидинах вызывают перераспределение электронной плотности
в ароматическом кольце, так что С-5 обладает повышенной
электронной плотностью по сравнению с остальными углеродными
атомами и легко подвергается атаке электрофилом. По этой же
причине С-8 в пуринах обладает повышенной электронной плот-
ностью по сравнению с С-2 и С-6 и, таким образом, легко уча-
ствует в реакциях электрофильного замещения. Очевидно, что
' оттягивание’
электронов
иг положения 8
только овним
.атомом азота.
в реакциях электрофиль-
С-4 и С-5 не могут принимать участие
ного замещения. Добавим, что эр3-гибридизация атома N-9 обес-
печивает подачу электронов к С-8:
Следовательно, путем электрофильного замещения можно полу-
чить ряд биологических аналогов пуринов и пиримидинов. Осо-
бенно следует отметить реакцию галогенирования, позволяющую
получать интермедиаты, которые способны превращаться в дру-
гие производные. Ниже приведены некоторые примеры.
Хлорирование уридина
R “рибоза
Бромирование аденозина
б-амино&Зенозцц 4
Биоорганическая химия фосфатов
113
Синтез тимидина из уридина
R = рибоза
н,/п
(-НгО|
Пуриновые и пиримидиновые основания сильно поглощают в
ультрафиолетовой области спектра благодаря наличию л-электро-
HOB, Хщах 260 НМ (в260 нм Л/ Ю^)* ДЛЯ беЛКОВ ^тах 280 Н-М.
Положение максимума поглощения зависит от структуры осно-
вания (отсюда следует, что и от pH раствора, поскольку с из-
менением pH преобладают различные таутомерные формы), от
введения в гетероциклическое ядро заместителей, но незначи-
тельно— от структуры сахарного остатка. Такие свойства полез-
но знать при синтезе пуриновых и пиримидиновых производных,
так как их можно характеризовать соответствующими максиму-
мами поглощения в ультрафиолетовых спектрах, а при хромато-
графическом определении также идентифицировать по поглоще-
нию в ультрафиолетовой области, например для N-бензоилгуано-
зина (синтезируемого бензоилированием основания и сахарного
остатка нуклеозида бензоилхлоридом в пиридине с последующим
удалением бензоильных групп с сахарного остатка гидроксидом
натрия):
гуанозин
в =254 нм
R-рибоза
УФ-спектры наиболее распространенных нуклеозидов можно най-
ти в большинстве биохимических учебников.
3.2.2. ДНК. и РНК
О ДНК и РНК говорилось как о высокомолекулярных соеди-
нениях, состоящих из мономерных единиц — нуклеозидов, соеди-
ненных между собой фосфодиэфирнымн связями. Такое опи-
сание может привести к представлению, будто бы это длинные
114
Глава 3
одноцепочечные молекулы. Однако ДНК и РНК могут образовы-
вать и двуспиральные структуры. Такая ситуация не является со-
вершенно необычной, поскольку структурный белок коллаген суще-
ствует в виде тройной спирали: трех полппептидных цепей, закру-
ченных одна вокруг другой и удерживаемых вместе водородными
связями между цепями. Две цепи ДНК, РНК или так называемого
N—С,
/
сахар О
сахар
тимин
аденин
Н\ _ /N Н.Ч _ /N4
/ \КоАН/С С\\ /С~Н
С N Н—N С—N
сахар
сахар
Н
цитозин
Н—N
гуанин
Рис. 3.3. Водородные связи, образующиеся между пуриновыми и пиримидино-
выми основаниями двутяжевой ДНК. Аденин всегда образует пару с тимином,
а гуанин — с цитозином.
ДНК-РНК-гибрида также удерживаются вместе водородными свя-
зями. Водородные связи возникают между пуриновыми и пири-
мидиновыми основаниями двух цепей очень специфическим обра-
зом. Другими словами, основания одной цепи совмещены с ос-
нованиями второй цепи таким образом, что пуриновое основание
всегда связано водородными связями с пиримидиновым основа-
нием и наоборот. Говоря более точно, аденин и тимин (урацил)
способны связываться друг с другом двумя водородными мости-
ками, образуя пару. Точно так же спариваются гуанин и цито-
зин, способные образовать три водородные связи друг с другом.
Такое специфическое образование водородных связей (уотсон-
криковские пары) важно при репликации, так как две цепи
Биоорганическая химия фосфатов
115
комплементарны друг другу* (рис. 3.3). Этот процесс обсуж-
дается позднее, в разделе, посвященном биосинтезу фосфоднэфпр-
ной связи.
Геометрия гликозидной связи С—N такова, что планарный
(«р2-гибридизацня) пурин или пиримидин направлен под углом,
близким к прямому, к почти плоскому сахарному кольцу
(рис. 3.4), благодаря чему основания в двойной спирали спо-
собны образовывать «стопоч-
ную» структуру, так что меж-
ду основаниями возникают ги-
дрофобные взаимодействия,
дополнительно стабилизирую-
щие спираль.
Опять-таки, сахарное коль-
цо можно приблизительно рас-
сматривать как плоское, или,
более точно, имеющее форму
«полукресла», в котором С-2'
и С-3' выведены из плоскости,
проходящей через фураноз-
ный атом кислорода и С-Г и
С-4'. Атомы С-1' и С-4' мо-
гут находиться в одной пло-
скости с фуранозным кисло-
Рнс. 3.4. Пространственное расположе-
ние фуранозного кольца и основания
(аденин) относительно гликозидной
связи.
; родом, поскольку несвязываю-
I щие электронные орбитали последнего слабо взаимодействуют
с ними.
Двойная спираль ДНК состоит из двух цепей ДНК, заверну-
тых одна вокруг другой, так что на один виток спирали прихо-
дится десять оснований, образующих стопочную структуру [18,
19]. Такое строение аналогично строению белковых молекул:
ядро ДНК имеет гидрофобную природу, тогда как фосфодиэфнр-
ный остов обращен наружу к растворителю. Разумеется, в про-
цессе синтеза ДНК необходимо распутать (расплести) эти цепи,
так чтобы участок молекулы, содержащий необходимую генетиче-
скую информацию, стал доступен. Цепи двойной спирали «анти-
параллельны»: направлены в противоположные стороны. Дру-
гими словами, на каждом конце двойной спирали находятся
З'-гидроксильная группа одной цепи и 5'-фосфатная группа дру-
гой цепи. Цепи, образующие двойную спираль, имеют значитель-
ную длину. Например, молекулярная масса ДНК фага Т2 равна
3,2-107, тогда как в Е. coli (бактерия, хромосома которой состоит
* Следует отметить, что нуклеотиды потенциально способны образовывать
гораздо больше водородных связей, чем только классические уотсон-крнковские
пары. Многие такие связи обнаружены в синтетических полинуклеотидах. Од-
нако неуотсон-криковское спаривание и водородные связи с участием сахарофос-
фатного остова играют важную роль в организации структуры тРНК.
116
Глава 3
из одной молекулы ДНК) молекулярная масса ДНК составляет
2,0-109. Двухцепочечная структура—наиболее распространенная
форма записи в ДНК генетической информации. Исключение со-
ставляет одноцепочечная ДНК фага ^>Х174 (который поражает
Е. соП).
Полинуклеотиды, подобно их мономерным единицам, погло-
щают ультрафиолетовое излучение. Для них характерно явление
гипохромизма-, раствор полинуклеотида имеет меньшую оптиче-
скую плотность, чем эквимолярный раствор мономерных единиц.
40 50 60 70 80 90 100
Температура, °C
Рис. 3.5. Кривая плавления ДНК.
Двухцепочечные полинуклеотиды
обладают еще меньшим поглоще-
нием, чем одноцепочечные. Это
явление просто отражает тот
факт, что, чем более упорядочен-
но расположены основания в рас-
творе (т. е. чем в большей сте-
пени они способны участвовать
в кооперативных взаимодей-
ствиях), тем меньше наблюдае-
мый коэффициент экстинкции.
Это позволяет наблюдать за ко-
оперативным расплетанием (раз-
рывом водородных связей), кото-
рое происходит при нагревании двухцепочечных полинуклеотидов,
при помощи «кривых плавления» (экспериментально наблюдают
зависимость поглощения от температуры; рис. 3.5). Середина ин-
тервала, в котором происходит переход к одноцепочечным по-
линуклеотидам, называется температурой плавления (Тпл). Тпл
зависит от соотношения содержания пар гуанин — цитозин к со-
держанию пар аденин — тимин, поскольку первая пара более
устойчива.
Хотя тРНК содержит значительное количество двуспиральных
участков, структура ее существенно отличается от структуры
двуспиральной ДНК или гибрида ДНК — РНК. Молекулярная
масса тРНК (~ 25 000) значительно ниже, чем у других поли-
нуклеотидов; она обладает структурой «клеверного листа» [20],
содержащей в заметной доле одноцепочечные участки. Четыре
«руки» молекулы образуют два двуспиральных участка, направ-
ленных друг к другу под углом 90°, а трехмерная структура по
форме напоминает букву L [21].
Кратко уже указывалось, что все молекулы тРНК имеют
сходную структуру, прежде всего одинаковую три нуклеотидную
последовательность на конце молекулы, содержащем З'-гидрок-
сильную группу (цитидин-цитидин-аденозин). Аминокислота об-
разует сложный эфир с 3'(2'-)-гидроксильной группой этого
остатка аденозина. На противоположном конце молекулы тРНК
(петля) находится нуклеотидный триплет, который служит уча-
Биоорганическая химия фосфатов
117
стком узнавания для связывания с мРНК на поверхности рибо-
сомы. Эта нуклеотидная последовательность различается во всех
аминоацил-тРНК- Отсюда следует, что если триплет нуклеотидов
в составе мРНК (синтезируемой в соответствии с генетической
информацией, содержащейся в ДНК) имеет последовательность,
комплементарную триплету нуклеотидов тРНК, то произойдет
связывание. Под комплементарностью здесь понимают образова-
ние водородных связей, как это было описано для двухцепочеч-
ных ДНК: аденин с урацилом и гуанин с цитозином. Триплетная
последовательность, кодирующая специфическую аминоацил-
тРНК и, следовательно, специфическую аминокислоту белка, на
молекуле мРНК, называется кодоном, комплементарный триплет
; в молекуле тРНК — антикодоном. Почти все молекулы тРНК со-
держат одну и ту же последовательность гуанозин-тимидин-псев-
доуридин-цптидин, которая служит местом связывания с рибо-
сомой.
3.2.3. Фосфаты
Ранее уже говорилось о важной роли фосфатной группы в ДНК
и РНК- Она служит составляющей частью молекулярного «осто-
ва», а также связующим звеном между мономерными единицами.
Фосфатная группа обладает важными связывающими свойствами
и способна принимать участие в сильных (электростатических)
связывающих взаимодействиях с катионами металлов и аминов.
Свободный неорганический фосфат можно представить как
тетраэдрическую структуру с тремя отрицательными зарядами,
распределенными между четырьмя атомами кислорода. Связы-
вание соответствующих лигандов локализует эти заряды. Тетра-
эдрическую структуру, равномерное распределение электронной
плотности (по атомам кислорода) и значе-
ния рКа при диссоциации протонов фосфор-
ной кислоты (для Н3РО4 рК] = 2,1; рК2 =
= 7,2; рК3 = 12,3) можно рассматривать
как следствие электростатического отталки-
вания между тремя зарядами анионной ча-
стицы. В этом случае фосфорильную группу
(Р=0) нельзя локализовать в составе
фосфатов или фосфорорганических соеди
нений, так как л-электроны могут мигриро-
вать между двумя или большим числом
атомов кислорода. Это явление сходно
с делокализацией электронной плотности
Структура неорганиче-
ского фосфата (РО®
или Pi).
карбонильной группы
по двум атомам кислорода в карбоновых кислотах, для кото-
рых также необходимо получить сложный эфир, чтобы локали-
зовать карбонильную группу. Как далее показано, производные
118
Глава 3
карбоновых кислог и фосфорной кислоты во многих отношениях
имеют похожие свойства.
Зелокализация
электронов карбонильной
грцлпы возможна
Со
сн3—с
Эелокалиъация
электронов карбонильной
группы невозможна
зтерификдциЯрл _
* 3 XO R
O?Na®
сн3-сГУ
о
ацетат натрия
til этери-
СН ,о—Р-4у Na® Фи*°Чия, сн,о—Р OR
b
:н3о-г-
сн3—о
e(j)Na®
СН3О—Р=О
сн3—А
Зиметилфоссрат
натрия
Однако в фосфорильной группе отсутствует зт-связь между
двумя р-орбиталями, как это имеет место в карбонильной группе.
Фосфорильная л-связь образуется при перекрывании р-орбита-
лей атома кислорода и d-орбитали атома фосфора. Такая связь —
это гибридная связь, даже если опа локализована, что можно
видеть на примере трифенилфосфпноксида:
® е
(Ph)3P=O<-^(Ph),P О (илиОная форма.)
Двойной связи в фосфорильной группе присущи в большей мере
характерные для нее свойства, однако нлидная форма также на-
кладывает свой отпечаток.
Фосфатная группа легко образует ряд ковалентных соедине-
ний от простых эфиров (триметил- или триэтилфосфаты) до
сложных макромолекул (ДНК или РНК). Многие из этих соеди-
нений важны в биологическом отношении, и их роль никак не
связана со структурой ДНК и РНК. Действительно, точно так
же, как ряд аминокислот не обязательно входит в состав белков
Биоорганическая химия фосфатов
119
для выполнения определенных биологических функций, многие
мономерные нуклеотиды также играют важную биологическую
роль. В качестве примеров приведем АТР и биологические ре-
гуляторные молекулы — циклические аденозин- и гуанозинмоно-
фосфаты (сАМР и cGMP) (разд. 3.4.2). Помимо этого, многие
фосфаты ненуклеозидной природы также важ-
ны в биологическом отношении, например са-
харофосфаты и креатинфосфат (еще одна
форма сохранения энергии в клетке; это со-
единение содержит кислотолабильную фосф-
амидную связь). Нуклеотиды представляют
для нас значительно больший интерес, а роль
фосфатов ненуклеозидной природы далее не
обсуждается, тем более что этот вопрос по-
СН3 /СН2— соое
ч
I е
_c=nh2
HN^ Ое
ст ое
креатинфосфат
дробно освещается во многих учебниках биохимии. Разумеется,
фосфатная группа легко образует неорганические соли, которые
могут быть важными составными частями биологической системы
(организма) (фосфор в крови и моче).
3.3. Реакция гидролиза
Большинство химических реакций, в которых принимают уча-
стие фосфатные группы в биологической системе, это реакции
либо присоединения (фосфорилирование), либо отщепления (гид-
ролиз) фосфата. При биологическом фосфорилировании источни-
ком, или донором, фосфатной группы служит АТР, форма хране-
ния энергии (более подробно см. разд. 3.4.1), причем эту реак-
цию катализирует фермент, называемый киназой. Как простой
пример такой реакции приведем фосфорилирование сахара глю-
козы:
a-D- глюкозе-6-сросфагп
120
Глава 3
Гидролиз эфиров карбоновых кислот, катализируемый кисло-
тами и основаниями, обычно проходит через стадию кислотного
расщепления-.
R— —
\о-сн3
расщепление связи С-0
ацильной группы
R—С' + HOCH,
О9
Однако известно несколько примеров алкильного расщепления.
Например, при реакции метилат-иона с метиловым эфиром бен-
зойной кислоты образуется диметиловый эфир.
,О JD
Ph—-------------------> Ph—С^ + СН3—О—СН3
Хотсн3*^еосп3 О®
(Кислотное расщепление лишь генерирует исходные соединения.)
Гидролиз трет-бутилацетата, катализируемый кислотой, проходит
по SnI-механизму (устойчивый промежуточный карбкатион)
с алкильным расщеплением.
О
о
СН
сн3
сн—с
От—с—сн
сн,—с.
+ но—с—сн,
сн,
сн3
Нейтральные фосфотриэфиры легко подвергаются гидролизу,
катализируемому кислотами или основаниями, с алкильным
и/или фосфорильным расщеплением. Например, гидролиз три-
метил- и триэтилфосфатов в нейтральных водных растворах про-
ходит по 8>\2-механизму с алкильным расщеплением. Гидролиз,
катализируемый кислотой, также протекает с алкильным рас-
щеплением.
О
EtO—Р—О^-СН
OEt
.СП3
-'•'он,
н,о
pH 7 t
-Е1ОН
EtOX XO®
Гидролиз триметилфосфата, катализируемый основаниями,
протекает с фосфорильным расщеплением; эта реакция исполь-
зуется как препаративный метод синтеза диметилфосфата.
О
СН,О—Р—ОСН3 24ч’гсРс
I д 1н. NaOH
QCH,
О
II
СН3О—Р—осн,
О Na*
*7
Биоорганическая химия фосфатов
121
Образующийся анион вызывает электростатическое отталкива-
ние приближающегося гидроксила, так что образование мономе-
тилфосфата затруднено. Период полупревращения для последней
реакции при 100°С составляет 16 сут, причем механизм этой реак-
ции сводится исключительно к алкильному расщеплению, по-
скольку атом фосфора менее доступен.
О
О
сн3о—Р—о—СН
I
о<>он
СН3О—
о9
з
в
При гидролизе дифенилфосфата, катализируемого основаниями,
может проходить только фосфорильное расщепление. Эта реак-
ция протекает очень медленно (период полупревращения при гид-
ролизе дифепилфосфата в воде при нейтральном значении pH и
температуре 100°С оценивается в 180 лет!), и лишь благодаря
тому, что фенокси-ион является лучшей уходящей группой, чем
алкокси-ион. Действительно, соответствующим образом замещен-
ный дифенилфосфат (например, бис-2,4-динитрофенилфосфат)
с более кислыми уходящими группами будет гидролизоваться со
значительно большей скоростью. Исходя из этих данных, можно
предположить, что ДНК, функции которой сводятся к хранению
генетической информации, устойчива к гидролитическому рас-
паду. В самом деле, деградация ДНК не наблюдается даже
после инкубации в течение 1 ч при 100°С в 1 н. NaOH.
В то же время 2-оксиэтилметилфосфат легко претерпевает
гидролиз в щелочных условиях: период полупревращения реакции
при 25°С в 1 н. NaOH составляет 25 мин. Это можно объяснить
образованием промежуточного напряженного пятичленного цикло-
фосфата вследствие нуклеофильной атаки вицинальной гидрок-
сильной группы (анхимерное влияние). На напряженность пяти-
НОе-'ч
напряженный || ''о9
пятичленный цикл О
членного циклофосфата указывает то, что скорость гидролиза
этиленфосфата в 106 раз выше, чем ациклического аналога —
диметилфосфата. Далее, гидролиз этого соединения — гораздо бо-
лее экзотермичный процесс вследствие напряжения циклической
структуры;
122
Глава 3
этпиленфосфатп
ЛН'= —26,8'к Дж/моль
(—6,4 ккал/моль)
О а
сн3о о
СН3О ое
сн3о—р'
ое
Виметилфосфатп
4Н = —7,5кДх/молъ
(—1,8 ккал/моль)
Из этих данных следует, что РНК, функции которой сводятся
к переносу генетической информации и скорость обращения ко-
торой высока, нестабильна и легко подвергается распаду. Дей-
ствительно, РНК распадается при инкубации в 0,1 н. NaOH при
комнатной температуре с образованием смеси 2'- и З'-фосфатов.
промежуточный
напряженный
пятичленный
циклофоссрат
3'-фосфат
ЙДфосфат
До сих пор механизм гидролиза описывался таким образом,
как если бы процесс протекал благодаря простым реакциям за-
мещения Однако, подобно тому как при гидролизе эфиров карбо-
новых кислот появляется тетраэдрический интермедиат (как уже
указывалось), гидролиз фосфоэфиров проходит через пентакоор-
динационный промежуточный продукт в Д5р3-гибридном состоянии.
Такой промежуточный продукт имеет геометрию, характерную
для пяти электронных пар, расположенных вокруг центрального
атома (фосфора), — геометрию тригональной бипирамиды. Дей-
Биоорганическая химия фосфатов
123
ствительно, многие стабильные пятикоордннацнонные соединения
фосфора принимают такую конфигурацию. Например, газообраз-
ный пентахлорпд фосфора имеет структуру тригональной бипира-
миды. Как мы вскоре увидим, важное значение имеет факт, что
хотя в таком соединении пять эквивалентных
лигандов — атомов хлора, при ^/^-гибридиза-
ции возникают пять неэквивалентных связы-
вающих орбиталей. При этом две из связей
между атомами хлора и фосфора длиннее
(апикальные связи; 0,22 нм), чем остальные
(экваториальные; 0,2 нм). Три экваториаль-
ных атома хлора находятся в одной плоско-
сти, тогда как два других апикальных атома
перпендикулярны этой плоскости.
В процессе реакции гидролиза фосфоэфи-
Г.1
Пентах.юрид фосфора
в газовой фазе имеет
стр}ктуру тригональ-
ной бипирамиды.
ра, первоначально имеющего тетраэдрическую
конфигурацию, атакующая группа приближается в направлении,
перпендикулярном трем лигандам, так что в образущемся пяти-
координационном комплексе эта связь будет перпендикулярна
плоскости экваториальных атомов. Этого можно ожидать, по-
скольку образующаяся связь, по крайней мере вначале, имеет при-
роду длинной связи, сходной с длинной связью апикального ли-
ганда. Эта стадия аналогична первоначальному образованию
длинной связи при 5н2-замещении. Сходным образом уходящая
группа отрывается, лишь заняв апикальное положение и уходя из
положения с удлиненной связью. Такой механизм показан на при-
мере гидролиза фосфомоноэфира:
тетраэдрический
фоаромоноэфир
оттягивание
электронной плотности
------------> R— ОН + НРО4г"
Изучение гидролиза метилэтиленфосфата показывает, что гид-
ролиз фосфорорганических соединений не обязательно протекает
по простому механизму замещения. Если бы это было так, нель-
зя было бы ожидать ничего другого, как только раскрытия на-
пряженного кольца:
124
Глава 3
Отметим, что пятичленный цикл в пента координационном про-
межуточном соединении представлен соединяющим апикальный
и экваториальный лиганды. Такая геометрия наиболее выгодна,
поскольку причиной напряженности пятичленного кольца являет-
ся искажение валентных углов. Пятичленный цикл, замыкающий
два экваториальных или два аксиальных лиганда, был бы слиш-
ком нестабилен.
В действительности гидролиз метилэтиленфосфата, катализи-
руемый кислотой, в значительной степени приводит к замещению
метоксигруппы:
Это явление объясняется псевдовращением [22, 23] — деформа-
цией связей атома фосфора с лигандами, происходящей в пента-
координационном комплексе, так что соответствующая уходя-
щая группа, которая без этого не могла бы оторваться, после
псевдовращения может уйти. Псевдовращение происходит, если
выполняются пять правил отбора:
1. Гидролиз фосфоэфиров проходит через образование пента-
координационного промежуточного соединения, имеющего гео-
метрию тригональной бипирамиды.
2. В процессе гидролиза группы могут приблизиться или ото-
рваться только из апикального положения.
3. Вследствие напряжения замыкание пятпчленного кольца не
может произойти через образование связи между двумя эквато-
риальными или двумя апикальными положениями, но только че-
рез связь между апикальным и экваториальным положениями.
4. Более электроположительные заместители стремятся за-
нять экваториальное положение, тогда как электроотрицатель-
ные лиганды — апикальное.
5. Лиганды могут менять свое положение в процессе псевдо-
вращения.
При псевдовращении два апикальных лиганда становятся эк-
ваториальными и одновременно два экваториальных лиганда —
апикальными. Движущей силой этого процесса является переход
хорошей уходящей группы из экваториального в апикальное по-
ложение и последующий ее уход. Такие искажения связей неуди-
вительны, если вспомнить, что ковалентные связи не абсолютно
жесткие; они способны участвовать в колебательных и враща-
тельных деформациях, что используется в инфракрасной спектро-
скопии. Можно представить, что во время псевдовращения две
апикальные связи «сближаются» и образуют две новые эквато-
Биоорганическая химия фосфатов
125
риальные связи, тогда как две из трех экваториальных связей
(третья остается «нейтральной», т. е. сохраняет постоянную дли-
ну в течение процесса; ее называют «осью вращения») «растал-
киваются» (удлиняются) и образуют две новые апикальные свя-
зи. Ниже изображена схема процесса (стрелки указывают удли-
няющиеся или укорачивающиеся связи):
метоксигруппа
Следовательно, вследствие псевдовращения
метилэтиленфосфата может оторваться и уйти.
Гидролиз фосфонатных аналогов проходит исключительно с
раскрытием кольца:
Такое направление реакции — следствие четвертого правила, уста-
навливающего, что электроположительные лиганды находятся
предпочтительно в экваториальном положении, ближе к атому
фосфора, а электроотрицательные лиганды предпочитают зани-
мать аксиальное положение, подальше от атома фосфора. Фос-
фор проявляет свойства неметалла, он обладает слабо выра-
женными электроноакцепторными свойствами и предпочитает
находиться на удалении от других подобных атомов. Поэтому
126
Глава 3
углеродный атом циклического фосфоната находится в эквато-
риальном положении, а кислородный атом — в апикальном.
После образования пентакоординацпонный промежуточный про-
дукт не способен подвергаться псевдовращенпю, так как при этом
атомы углерода и кислорода поменялись бы местами. В резуль-
тате псевдовращение не может происходить, и единственное на-
правление реакции — прямое замещение молекулой воды.
Ранее уже отмечалось, что гидролиз фосфорорганических со-
единений представляет собой важный метаболический процесс в
организме.
Уделив внимание некоторым механизмам гидролиза, интерес-
но сравнить их с механизмом реакции, происходящей в активном
центре некоторых ферментов, катализирующих подобные превра-
щения. Фермент бычья панкреатическая рибонуклеаза А (РНаза
А)* (Л1 = 13680, одна полипептидная цепь, состоящая из 124
аминокислотных остатков) катализирует деградацию РНК по дву-
стадийному механизму:
(переэтерификация с последующим гидролизом пятичленного цик-
лического промежуточного продукта). Фермент расщепляет не
каждую фосфодиэфирную связь полимерной молекулы РНК, а
атакует цепь лишь в определенных точках. Способность атома
фосфора подвергаться атаке ферментом зависит от того, пурино-
вое или пиримидиновое основание находится при сахарном остат-
ке, образующем фосфодиэфирную связь своей З'-гидроксильной
* Основы действия ферментов изложены в гл. 4. Для лучшего понимания
действия РНазы А уже на данном этапе можно ознакомиться с разд. 4.1 и 4.2.
Биоорганическая химия фосфатов
127
Рис. 36 Механизм гидролиза РНК, катализируемого рибонуклеазой [24] Номер
аминокислотного остатка указывает его положение в полипептнднон (белковой)
цепи относительно N-концевой аминокислоты.
группой. Кроме того, место атаки у того или иного основания
меняется для ферментов, выделенных из различных источников.
Например, бычья панкреатическая РНаза атакует фосфоэфирные
связи пиримидинового нуклеозида, присоединенного к остатку
фосфорной кислоты З'-связыо. В то же время РНаза из бакте-
рии В. subtilis атакует фосфоэфирную связь пуринового нуклео-
зида, присоединенного З'-связыо.
128
Глава 3
Данные, полученные с помощью различных методов исследо-
вания, указывают на участие по крайней мере трех аминокислот
в построении активного центра рибонуклеазы: двух остатков ги-
стидина и одного остатка лизина. Гидролиз РНК (рис. 3.6) про-
ходит в два этапа: переэтерификация и последующий гидролиз.
Отметим, что при физиологических значениях pH одно из двух
имидазольных колец протонировано, а второе—нет. Имидазоль-
ные кольца функционируют как общеосновной — общекислотный
катализатор, а положительно заряженный остаток лизина, ве-
роятно, стабилизирует пентакоординационный интермедиат.
Этот остаток лизина, по-видимому, не участвует в первона-
чальном связывании фосфоэфира с ферментом [24]. Вместо это-
го субстрат образует две водородные связи между атомами кис-
лорода фосфатной группы и водородным атомом амидной связи
в цепи, а также гидратированным остатком глутамина. Водо-
родные связи увеличивают также электрофильность атома фос-
фора. Еще одна водородная связь, имеющая важное значение
для реакции, образуется между протонированным имидазольным
кольцом и атомом кислорода субстрата, который далее отщеп-
ляется от атома фосфора. Образование этой водородной связи
приводит, помимо связывания, к поляризации электронного об-
лака в направлении, которое облегчит полный отрыв протона от
имидазольного кольца в процессе гидролиза субстрата (см.
ниже).
Сам механизм гидролиза прост и напоминает механизм гидро-
лиза РНК, катализируемого гидроксидом; отличие состоит в спе-
цифическом расщеплении фосфодиэфирных связей с образова-
нием 3' (а не 2')-монофосфатов (рис. 3.7). Однако (с учетом псе-
вдовращения) возможны два стереохимических механизма для
каждого этапа реакции, катализируемой ферментом.
Эти два механизма названы линейным и смежным: тип реак-
ции определяется относительной геометрией входящей и уходя-
щей групп в процессе замещения. Согласно положению замести-
телей относительно плоскости экваториальных заместителей, сте-
реохимический механизм называется линейным, если входящая
группа (нуклеофил) приближается по одну сторону этой плоско-
сти, тогда как уходящая группа удаляется от другой ее сторо-
ны. Напротив, если направление приближения входящей группы
(нуклеофила) находится вне плоскости, а уходящая группа рас-
полагается в плоскости, то механизм смежный. Согласно прави-
лам отбора, смежный механизм требует псевдовращения, чтобы
перевести уходящую группу из экваториального в апикальное
положение.
Переэтерификация начинается с того, что непротонированный
имидазол в активном центре отрывает протон от 2'-гидроксила
(общий основной катализ) субстрата (РНК). Как только обра-
зуется алкокси-ион, он становится тем нуклеофилом, который
Биоорганическая химия фосфатов
129
ОСН2 О основание
’ cf Ъ
Н,О: А -ОН,
О О
линейный смежный
в
Рис. 3.7. Различия между линейным и смежным механизмами гидролиза фос-
фодиэфирнон снязн. а — первая стадия (переэтерификация) гидролиза РНК, ка-
тализируемого РНазой; возможны два стереохимических пути: при линейном ме-
ханизме — прямое замещение, при смежном механизме — только псевдовращеиие;
б — вторая стадия (гидролиз) гидролиза РНК, катализируемого РНазой; также
возможны два стереохимических пути: вновь при линейном механизме образо-
вание З'-фосфата происходит путем прямого замещения, а при смежном меха-
низме только путем псевдовращеппя [26].
способен атаковать атом фосфора. Если уходящая группа нахо-
дится в апикальном положении, она может оторваться, причем
одновременно происходит протонирование уходящей группы вто-
рым имидазольным остатком (катионом имидазолин), располо-
женным под плоскостью трех экваториальных заместителей. Та-
кой линейный механизм предполагает участие двух остатков ги-
стидина, поскольку для имидазольного кольца, связывающего
протон 2'-гидроксилы1ОЙ группы, было бы физически невозможно
и располагаться под плоскостью, и протонировать уходящую груп-
пу (рис. 3.6). Если уходящая группа занимает экваториальное
положение, она должна вначале претерпеть псевдовращение, т. е.
изменить длину связи. Однако она все еще была бы располо-
жена достаточно близко к входящему 2'-гидроксилу, чтобы прото-
нпроваться после псевдовращения тем же остатком имидазола,
который отрывает протон 2'-гидроксильной группы от субстрата.
5 Зак 549
130
Глава 3
Такой смежный механизм требует дополнительной стадии (псев-
довращения), однако при участии только одного остатка гисти-
дина.
Точно такие же соображения применимы и для случая гид-
ролиза 2',3'-циклофосфата. При этом опять-таки имидазольное
кольцо выступает в роли общеосновного катализатора, отрывая
протон от молекулы воды, а уходящая группа протонируется тем
же самым (линейный механизм) или вторым (смежный меха-
низм) имидазольным остатком. Отметим, что после завершения
реакции гидролиза активный центр восстанавливает исходную
структуру п вновь получаются первоначально непротонирован-
ный и протонированный имидазольные циклы.
Серией элегантных экспериментов было показано, что оба эта-
па действия РНазы проходят по линейному механизму. Детально
этот механизм изучен Ашером [25, 26].
Ключом к решению этой проблемы явилось использование
двух диастереомеров уридин-2',З'-цпклофосфотпоатов. Оба изо-
мера подвергались гидролизу РНазой в среде Н2,8О. Ниже при-
изомер а
ведены схемы двух механизмов (смежного, пли с сохранением;
линейного, пли с инверсией) для изомера А. Поскольку изве-
стно, что последующее замыкание цикла с помощью дпэтилхлор-
фосфата в пиридине проходит с обращением, стереохимию пер-
вого шага (ферментативной реакции) можно определить, выде-
лив эпимерные циклические диэфиры и определяя содержание в
них изотопа ,8О. Как и ожидалось, 18О отсутствовал в изомере
А, использованном в ферментативной реакции, но обнаружен в
эпимере В. Следовательно, потеря ,8О нуклеотидом в реакции,
происходящей с инверсией, требует, чтобы введение ,8О происхо-
дило с инверсией. Эти результаты исключают псевдовращение
как стадию расщепления связи и помогают определить положе-
ние, которое Н2О может занять в моделях, полученных при кри-
сталлографических исследованиях РНазы А.
Аналогичным образом с использованием фосфотпоатных ана-
логов изучалась ДНК-зависимая РНК-полимераза из Е. coli [27].
Ряд других ферментов, катализирующих гидролиз фосфоэфи-
ров, также имеет важное биологическое значение. В их число вхо-
дят циклические пуриновые фосфодиэстеразы (в настоящее время
немногое известно о химических механизмах действия их актив-
Биоорганическая химия фосфатов
131
1ВОН2 линейный \
РН<на(о6ро1цение)\
igioijFoa.
изомер в изомер А
(основной
проЭукт)
них центров, ио биологической роли этих ферментов ниже уде-
лено достаточно внимания) и фосфатазы. Кислые и щелочные
фосфатазы катализируют гидролиз фосфомоноэфиров до соответ-
ствующих спиртов и неорганического фосфата. Оптимум pH
этих ферментов составляет 5,0 и 8,0 соответственно; отсюда и сле-
дуют их названия. Оба фермента образуют ковалентные фермент-
субстратные промежуточные соединения:
В кислой фосфатазе нуклеофилом является имидазол (промежу-
точный фосфамид лабилен при кислых pH), а в щелочной фосфа-
тазе— серии. Известно, что щелочная фосфатаза содержит атом
цинка, который, вероятно, играет роль центра связывания, а так-
же кислоты Льюиса — по отношению к фосфатной группе. Это
легко понять, припомнив, насколько трудно проходит гидролиз фос-
фомоноэфиров при щелочных pH.
132
Глава 3
В заключение отметим, что до сих пор не сообщалось о фер-
ментативных реакциях, для описания механизма которых требо-
валось бы привлекать псевдовращение [28].
3.4. Прочие нуклеозидфосфаты
Согласно вышеизложенному, значение нуклеозидфосфатов
(нуклеотидов) обусловлено ие только их ролью, которую они
играют в биополимерах. Некоторые мономерные нуклеотиды
весьма важны как форма хранения энергии (АТР), при регуля-
ции (циклические нуклеотиды) и в качестве кофакторов (NAD+
и NADP+; гл. 7).
3.4.1. АТР (аденозинтрифосфат)
Как уже указывалось, АТР выполняет роль хранилища био-
логической энергии, обеспечивая синтез ряда биохимически важ-
ных соединений. В качестве примера приводился синтез донора
метильной группы S-аденозилметнонина из АТР и метионина
ее е *
но он
АТР
(гл. 2). Ангидридная структура трифосфатной цепи обусловли-
вает «высокое содержание энергии», собственно нуклеозидная
часть молекулы служит для узнавания и связывания с различ-
ными ферментами, использующими АТР. Исходя из этих сообра-
жений, более простые производные фосфорной кислоты, имеющие
ангидридную природу (например, ацетилфосфат, пирофосфор-
ная кислота), также характеризуются повышенным содержанием
энергии. Реакционную способность и повышенную энергоемкость
ангидридов можно отнести за счет «конкурирующего резо-
нанса», т. е две группы (фосфорильная, карбонильная и т. д.)
конкурируют за несвязанные электроны одного и того же атома
£О Сн
еО—Р-^сР-Р—0е 2 еО—Р-^ЙН
l<" I I
О О о
е • • • • е е
кислорода. В результате гидролиза такая конкуренция ослаб-
ляется, что приводит к большей стабилизации. Следовательно,
Биоорганическая химия фосфатов
133
образование продукта реакции выгодно по отношению к исход-
ному ангидриду. Такая группа (карбонильная, фосфорильная
и т. д.) более электрофильна в ангидриде, чем в составе анало-
гичного эфира, и, следовательно, более реакционноспособна, по-
скольку в эфире один атом кислорода приходятся на одну такую
группу, а не на две. Для ангидридов фосфорной кислоты обра-
зование продуктов выгодно потому, что при этом уменьшается
электростатическое отталкивание в ди- или трифосфатной цепи и
несколько отрицательных зарядов более не связаны ковалентно
друг с другом.
При физиологических значениях pH (7,35) три из четырех про-
тонов, способных ионизироваться, диссоциируют. Для четвертого
протона рКа = 6,5, и поэтому он также в значительной степени
ионизирован. В клетках такой полианион связывается с ионами
магния и существует в виде магниевого комплекса 1:1. In vitro
АТР связывает и другие двухзарядные ионы металлов, напри-
мер ионы кальция, марганца, никеля. Помимо двух фосфатных
окси анионов в связывании иона металла может принимать уча-
стие остаток аденина (например, N-7 имидазольного кольца).
Ион металла может выступать в роли электрофильного катали-
затора (кислоты Льюиса) при гидролизе АТР. Разумеется, при-
сутствие иона металла, связанного с фосфатной цепью, частично
нейтрализует общий отрицательный заряд, облегчая тем самым
атаку отрицательно заряженного нуклеофила, например гидро-
ксид-иона.
При pH 7,0 ДДгидр гидролиза у- (концевого) и 0-фосфата рав-
на примерно —31,2 кДж/моль (—7,5 ккал/моль). АбГИдр зависит
от pH и определяется в стандартных условиях. Однако для
процессов в клетке эта величина приблизительно равна
—50 кДж/моль (—12 ккал/моль). Во всяком случае как компо-
нент химических реакций АТР в биологической системе пред-
ставляет собой высокоэнергетическое соединение, AGnljp которого
при физиологических значениях pH превышает —29,4 кДж/моль
(—7 ккал/моль) или ДДгидр превышает —25 кДж/моль
(—6 ккал/моль).
АТР способен переносить эту потенциальную энергию на мно-
жество других биологически важных соединений. Например, было
134
Глава 3
показано, что энергия образования пептидной связи (путем про-
межуточного образования ангидрида кислоты) обеспечивается
молекулой АТР. Сходным образом (см. ниже) синтез цикличе-
ских нуклеотидов, также высокоэнергетических соединений, осу-
ществляется из предшественника АТР (или GTP).
Гуанозннтрифосфат (GTP)—еще одно высокоэнергетнческое соединение,
структура которого аналогична структуре АТР, отличие заключается только в
том, что вместо аденинового основания в его состав входит гуаниновое. Хотя
GTP находит меньшее использование в биологических системах, чем АТР, тем не
менее это соединение участвует в некоторых процессах, требующих затраты
энергии, например при синтезе пептидной связи на рибосомах.
Биосинтез адеиозии- и гуаиозинтрифосфатов сводится к фосфорилированию
низкоэнергетических предшественников — соответствующих монофосфатов. На-
пример, GTP синтезируется из гуанозпимонофосфата GMP путем взаимодей-
ствия с двумя молекулами АТР:
GMP + АТР GDP + ADP
GDP + АТР GTP + ADP
Эти реакции катализируются ферментами — нуклеозидмоиофосфокнпазой и иу-
клеозиддифосфокиназой соответственно. Отметим, что реакции обратимы, так что
АТР может быть получен при использовании GTP или трифосфатов других ну-
клеозидов. Его предшественник ADP (адепозиндифосфат) может быть синтезиро-
ван при реакции АМР и АТР, которую катализирует фермент адепнлаткиназа.
АМР + АТР 7Z± 2ADP
Все вышеприведенные превращения термодинамически допустимы, поскольку
образование ангидрида совершается за счет энергии другого ангидридного соеди-
нения. Возможно, суммарная концентрация АТР, ADP и АМР в клетке не ме-
няется во времени. Следует отчетливо представлять, что АТР может синтезиро-
ваться путем фосфорилирования ADP также другими донорами фосфатной груп-
пы, помимо нуклеозидтрифосфатов, и что в клетке существуют метаболические
пути, благодаря которым для синтеза АТР используется энергия расщепления
сахаров (глюкозы).
Химический синтез аденозин- или гуанозинтрифосфатов мож-
но провести по аналогии с биосинтезом: путем фосфорилирования
низкоэнергетических предшественников, монофосфатов. Фосфори-
лирование проводят фосфорной кислотой и конденсирующим (де-
гидратирующим) реагентом — ДЦГК. Использование карбоди-
имидов уже обсуждалось в связи с проблемой синтеза пептидной
связи. Напомним, что реакция протекает через образование про-
межуточного ангидрида. В данном случае вместо карбоновой
кислоты к карбодиимиду добавляют фосфорную кислоту, как по-
казано на примере синтеза ADP из АМР. В присутствии избытка
фосфорной кислоты получающийся ADP будет далее фосфорили-
роваться с образованием АТР. Конечно, эта реакция протекает
не с такой избирательностью, как реакция фосфорилирования, ка-
тализируемая ферментом, так что даже в оптимальных условиях
Образуется смесь AMP, ADP, и АТР и некоторых высших поли-
Биоорганическая химия фосфатов
135
фосфатов, таких, как аденозинтетрафосфат. Тем ие менее основ-
ным продуктом реакции будет АТР, который затем можно очи-
стить методом ионообменной хроматографии.
ДЦГК. 20° с
АМР + Н3РО4 ------------- -» АТР + другие продукты
пиридин, NfCjHgJs
85%-ная
Причиной того, что АТР является основным продуктом реак-
ции, возможно, служит его превращение в реакционной среде в
циклический фосфат, разлагающийся при дальнейшей обработке:
АТР
Такой промежуточный продукт с трудом подвергался бы фос-
форилированию даже в присутствии ДЦГК. Действительно,
136
Глава 3
в присутствии ДЦГК АТР образует циклический интермедиат. Эта
реакция — способ синтеза аналогов АТР с модифицированной
у-фосфатноп группой.
Nu=хороший нуклеофил,
например амин или
алкоксид
Более избирательной и поэтому чаще используемой реакцией
является синтез нуклеозидтрпфосфатов путем конденсации нук-
леозидмонофосфата с неорганическим фосфатом [29].
Опять-таки гидроксильная группа нуклеозидмонофосфата —
это плохая уходящая группа, т. е. такая реакция термодинамиче-
ски невыгодна. Поэтому необходимо превратить уходящую груп-
пу в хорошую. Наиболее часто с этой целью применяют имид-
азолиды, получаемые реакцией нуклеозидмонофосфата с 1,1'-
карбонилдиимидазолом. Можно считать, что такая реакция про-
ходит через образование смешанного ангидрида, аналогичного
тому, который получается в пептидном синтезе с ЭЭДХ
(разд. 2.6.3). Получаемый ангидрид легко подвергается реакции
замещения пирофосфатом. К сожалению, в значительной степени
Биоорганическая химия фосфатов
137
образуется 2',3'-циклокарбонильное производное, вследствие того
что образующийся цис-диол энтропийно выгоден:
Такое направление реакции можно предотвратить, получив
имидазолид пирофосфата и проводя его реакцию с нуклеозид-
монофосфатом. Альтернативным путем является гидролиз цикло-
карбоната обработкой водным триэтилампном. В настоящее
время для синтеза аналогов АТР и GTP, модифицированных
по основанию или сахарному остатку, предпочитают использо-
вать именно имидазолидный метод. Один из примеров — синтез
133
Глава 3
трифосфата антибиотика кордицепина (З'-дезоксиаденозина) —
мощного ингибитора синтеза РНК.
Другой метод препаративного синтеза АТР разработан не-
давно Уайтсадсом: используется ацетилфосфат в качестве до-
нора фосфатной группы и иммобилизованный фермент (разд. 4.7)
в качестве катализатора [30]. Реакция проходит в мягких усло-
виях (при pH, близких к нейтральной среде, и комнатной тем-
пературе) ; относительные (к субстрату) количества нераствори-
мого полимерного катализатора незначительны; катализатор лег-
ко удаляется (центрифугированием), а реакция проходит более
специфично, чем при неэнзиматическом синтезе (например, адено-
зинтетрафосфат в качестве побочного продукта не образуется).
Суммарная реакция сводится к следующему:
3 Фермента,
pH t.7-6,9; 2СРС
3
/ О ’
I Не
\сн3—с—О
+ АТР
Предложена и детальная схема реакции!
аденозиикпназа
1) аденозин-]-АТР -----------------> АМР+ADP
адепплаткпиаза
2) АМР + АТР ------------------------ 2ADP
аденозин + 2 АТР ------------------ 3 ADP
ацетаткиназа
3) 3 ADP + 3 ацетилфосфат----------► 3 АТР + 3 ацетат
Хотя из уравнения реакции и нс следует, для инициации ре-
акции необходимо лишь небольшое количество АТР (меньше
чем 1/1000 по массе), поскольку реакция поддерживается обра-
зующимся АТР. Три фермента иммобилизованы на сшитом поли-
акриламидном геле путем взаимодействия их первичных амино-
групп с «активными эфирами» на поверхности полимера.
В заключение следует упомянуть о синтезе АТР, содержащем
хиральный у-атом фосфора; этот синтез был проведен недавно
Ноулсом [31]. Взаимодействие аденозиндифосфата ADP с фосфо-
Биоорганическая химия фосфатов
139
рилпрующим агентом, меченным изотопом, привело к образованию
[у-16О, 17О, 18О]-АТР:
(-)-ЭфеЭрин
|ц"он
Pd,fc
Реакция хлороксида фосфора, меченного изотопом 17О, с (—)-
эфедрином приводит к реакционноспособному пятичленному цик-
лическому соединению, атом хлора в котором с отличным вы-
ходом можно заместить при взаимодействии с |8О-меченым гид-
роксидом лнтпя. Образуется прекрасный фосфорилирующий агент,
пятичленный цикл которого напряжен и который содержит кис-
лотолабильную фосфамидную связь. Бензильная связь обра-
зующегося ациклического фосфомоноэфира чувствительна к ка-
талитическому гидрогенолизу, в результате которого образуется
хпральный АТР.
140
Глава 3
Синтезированный АТР весьма полезен при изучении стерео-
химических закономерностей и, следовательно, механизма реак-
ции фосфорилирующих ферментов (киназ) (разд. 3.3). Можно
представить по крайней мере два механизма, по которым фер-
мент катализирует передачу у-фосфатной группы от АТР к суб-
страту. Это может происходить, во-первых, прямым замещением
на поверхности фермента с обращением конфигурации хираль-
ного у-фосфата:
Нейтральный
субстрат
/°
R—О—Р'™«»О
X)
фосфорилированный
субстрат
Согласно второму механизму, фермент путем взаимодействия с
АТР сначала фосфорилируется, образуя переходный ковалентный
ферментсубстратный интермедиат, который затем претерпевает
замещение субстратом. В результате суммарного процесса кон-
фигурация сохраняется, т. е. имеют место два процесса обра-
щения:
ферменту
О О *d
£ я
2 е НО ОН
нуклеофий
на поверхности
фермента
О
н.
O—R
°
og^-o-b
фермент^ перехоЭный
интермейиат
фосфорилированный
субстрат
Биоорганическая химия фосфатов
141
Обращение конфигурации у хпрального у-фосфора наблюда-
лось в случае ферментов глпцеролкиназы, пнруваткиназы и гек-
сокпназы [32].
3.4.2. сАМР и cGMP
О основание
/ \ 7 основание=оЭенин
ер__р Y / или гуанин
4>н
Функция циклических нуклеотидов З'.б'-цпклоаденозинмоно-
фосфата (сАМР) и 3',5'-циклогуанозпнмонофосфата (cGMP) со-
стоит в регуляции межклеточных процессов коммуникации [33].
Межклеточная коммуникация осуществляется главным образом по
трем механизмам. Первый заключается в передаче электрических
импульсов в нервной системе. Во втором участвуют химические
медиаторы или гормоны. Третий сводится к белковому синтезу
de novo. Все три процесса возникают как реакция на раздражи-
тель, или стимул, и в их регуляции по крайней мере в некоторой
степени принимают участие циклические нуклеотиды.
На любой данный процесс сАМР и cGMP оказывают проти-
воположное действие. Так, например, если сАМР регулирует ка-
кой-то процесс, прекращая определенную реакцию синтеза, то
cGMP скорее всего будет эту реакцию стимулировать. Хотя та-
кая гипотеза («Yin — Yang»), кажется, оправдывает себя в уже
изученных случаях, следует заметить, что о cGMP меньше дан-
ных, чем о сАМР. Известно, что и сАМР, и cGMP выполняют роль
вторичных медиаторов в биохимическом ответе иа внешний (хи-
мический) раздражитель. Классический пример — выделение в
кровоток гормона адреналина при испуге. Это приводит к повы-
шению содержания сахара в крови, что невозможно без вторич-
ного медиатора сАМР.
Действующим началом, посредством которого циклические нук-
леотиды оказывают свое влияние, является определенный класс
ферментов — протеинкипазы. Как указывает название, эти фер-
менты катализируют фосфорилирование белковых субстратов
[ (обычно ферментов). Каким именно образом протеинкиназы кон-
’ тролируют различные процессы, можно понять, вернувшись к
проблеме секреции адреналина под действием страха.
Ферменты, синтезирующие сАМР и cGMP, — это аденилатцп-
клаза и гуаннлатциклаза соответственно. Ферменты включают
। две субъединицы: регуляторную, к которой присоединяются эф-
фектор (гормон, нейромедиатор) и гуанозпнтрпфосфат (GTP), ч
каталитическую, на которой собственно и происходит синтез цик-
лического нуклеотида. Эти ферменты присоединены к клеточной
мембране таким образом, что регуляторная субъединица способна
142
Глава 3
НО
ОН
СН—снг—NH—сн3
АТР
авенилатпциклаза,
[регуляторная)
айенилатциклаза
[каталитическая)
эпинефрин + GTP
клеточная мембрана
..........
-> (сАМР) + PPt
Рис. 3.8. Роль сАМР в качестве связующего звена между внешним раздражите-
лем (секреция гормона) и началом физиологического ответа. Адреналин и GTP
связываются с регуляторной субъединицей аденнлатциклазы, специфически при-
соединенной к мембране. Это вызывает конформационные изменения, приводя-
щие к активации каталитической субъединицы и стимулированию синтеза сАМР.
сАМР активирует протеиикиназу, вызывая ее диссоциацию и освобождение ак-
тивной каталитической субъединицы (R — регуляторная субъединица; С — ката-
литическая субъединица). Эта последняя в свою очередь катализирует фосфори-
лирование двух сериновых остатков неактивного фермента фосфорилазы Ь. Два
димера ассоциируют с образованием активного тетрамера — фосфорилазы а.
Фосфорилаза катализирует расщепление гликогена, представляющего собой спо-
соб хранения сахара, до глюкозо-1-фосфата (фосфоролиз).
связывать определенный эффектор, находящийся вне клетки,
а каталитическая субъединица синтезирует циклические нуклео-
тиды внутри клетки (рис. 3.8). Следовательно, при испуге и
выделении адреналина в кровоток этот гормон, циркулируя, мо-
жет связаться с молекулой аденнлатциклазы, регуляторная субъ-
единица которой специфически узнает данную молекулярную
структуру (например, на плазматической мембране клеток пе-
чени). После того как адреналин и cGTP связываются с субъ-
единицей, происходят конформационные изменения этой субъеди-
ницы, которые передаются каталитической субъединице и вызы-
вают на ней синтез сАМР. Эндогенный циклический нуклеотид
связывается затем с молекулой протеинкиназы. Описываемая
ниже последовательность событий общая для всех процессов, кон-
Биоорганическая химия фосфатов
143
тролируемых циклическими нуклеотидами, однако здесь особое
внимание уделяется частному случаю выделения адреналина.
Протеинкиназы также состоят из двух субъединиц: регуляторной,
связывающей молекулу сАМР, и каталитической, катализирующей
фосфорилирование специфического белкового субстрата *. Однако
связывание сАМР вызывает диссоциацию регуляторной и ка-
талитической субъединиц. Вероятно, вследствие того что ката-
литическая субъединица обращена в водную среду, или вслед-
ствие конформационных изменений, которые влияют на ее гео-
метрию подходящим для каталитического акта образом,— это
теперь активная частица. Она будет фосфорилировать специфи-
ческий белок. В этом случае фермент — это димерная частица
фосфорилаза Ь, обладающая низкой ферментативной актив-
ностью. Однако после фосфорилирования протеинкиназой (для
данного случая называемой фосфорилазой) димерный фермент
ассоциирует в активный тетрамер — фосфорилазу а. Тетрамер ка-
тализирует расщепление гликогена, в форме которого сохраняет-
ся сахар, в мономерную глюкозу. Следовательно, в ответ на
появление эпинефрина (адреналина) уровень сахара в крови по-
вышается. Тем нс менее это происходит вследствие непрямого
воздействия эпинефрина вместо вторичного медиатора — цикли-
ческого нуклеотида.
Существует много других процессов, регулируемых цикличе-
скими нуклеотидами; их можно разделить на следующие три ка-
тегории: секреция гормонов, передача нервных импульсов и бел-
ковый синтез. Например, сАМР, опять же посредством протеин-
кппазы, активирует фермент тирозингидроксилазу.
Реакция превращения аминокислоты тирозина в дпоксифенпл-
аланпн (ДОФА), катализируемая тнрозингидроксплазой, яв-
ляется стадией, определяющей скорость биосинтеза нейромедиа-
торов, дофамина и норэпинефрина. Нейромедиатором называется
соединение, выделяемое в точке соприкосновения двух нервных
клеток пли нервной клетки и мышечной клетки (так называемого
синапса) для передачи электрического (нервного) импульса от
одной клетки к другой. Такое химическое соединение служит для
передачи электрического разряда между двумя клетками, по-
скольку нейромедиатор выделяется лишь после того, как электри-
ческий импульс достигает синапса, и, как только нейромедиатор
связывается со второй! клеткой, возникает разность потенциалов,
* Последние нсстедовапия показали, что такое описание слишком упрощенно
[34]. сАМР-зависимая протепнкпназа представляет собой тетрамерный белок
R2C2, состоящий из двух каталитических и двух регуляторных субъединиц. Да-
лее, сЛМР-завнспмые протеинкиназы можно разделить на два типа: I и II. Ос-
новное различие между двумя этими типами заключается в способиости регуля-
торных субъединиц киназ типа II фосфорилироваться каталитической субъедини-
цей. В то же время cGMP-зависпмая протеинкиназа представляет собой димер-
ный белок, состоящий из двух идентичных субъединиц. Каждая субъединица
имеет cGTP-связывающпй и каталитический цеитры в одной полипептпдной цепи
144
Глава 3
которая приводит к возниковснию электрическою импульса
во второй клетке. Интересно, что возникновение такого потенциа-
ла действия в определенной нервной клетке, видимо, требует
присутствия протеинкпназы, зависимой от циклического нуклео-
тида.
\ тирозин
ДОФА
ОН
I ®
CHCH2NH
Эофамин-р-iuBpo-
ксилаза
э ’
норэпинефрин Зофамин
сАМР активирует также фермент РНК-полпмеразу I (млеко-
питающих) при помощи обычного фосфорилирования, осуществ-
ляемого протеппкииазой. Этот фермент катализирует синтез по-
лимера мРНК — процесс, необходимый в синтезе белков опре-
деленной аминокислотной последовательности. В число других
ферментов, активность которых регулируется циклическими нук-
леотидами, входят глпкогспспнтетаза (синтез гликогена), фос-
фофруктокнназа (фосфорилирование фруктозо-6-фосфата), орни-
тнндекарбоксплаза (декарбоксилирование аминокислоты орнити-
на) иАТРаза (гидролиз АТР).
Следует отметить, что цпклофосфатное кольцо в сАМР и
cGMP — высокоэнергетическая структура [35]. При pH 7,3
Абгидр этих соединений приблизительно на —12,5 кДж/моль
(—3,0 ккал/моль) больше, чем для АТР, который является фор-
мой хранения биологической энергии. Такое значение свободной
энергии объясняется главным образом вкладом энтальпии,
АДгидр, которая для сАМР и cGTP составляет — 59,2(—14,1) и
—44,1 кДж/моль (—10,5 ккал/моль) соответственно. В резуль-
тате гидролиза, конечно же, происходит превращение цикличе-
ского нукчеотида в 5'-а циклическую структуру:
основание = авенин или гуанин
Значение этих высокоэнергетпческпх циклических структур
для биологических функций циклонуклеотпдов еще не выяснено,
Биоорганическая химия фосфатов
145
Однако высказано предположение, что они необходимы для свя-
зывания циклических нуклеотидов с регуляторной субъединицей
протеинкиназы путем образования ковалентного промежуточно-
го соединения. Например, карбоксильная группа в составе регу-
ляторной субъединицы могла бы взаимодействовать с цикличе-
ским фосфатом так, чтобы в результате происходило раскрытие
цикла и образовалось высокоэнергетическое промежуточное сое-
динение. При этом могло бы нарушаться электростатическое
взаимодействие регуляторной и каталитической субъединиц, что
привело бы к их диссоциации:
основание= авенин или гуанин
Известно, что шестичлеппыс циклофосфаты обычно уже ие
высокоэнергетическпе соединения. Другими словами, в отличие
от пятпчлеииых циклов шестичлеиные циклофосфаты имеют не-
напряженную структуру (отсутствует искажение валентных уг-
лов). Это следует из сопоставления энтальпий для этилен-, три-
метилен- и тетраметиленфосфорной кислот:
О „
О
о—р.
он
•4^и«р= -26,9кДж/моль (-6,4 ккал/моль)
•^яги8о= ~ I2i6 к Дж/М°ль ('3.0 ккал/Моль)
, 21Ягивр=-9,2кДж/м1)ль (-1,2. кыш/магл)
116
Глава 3
Природа основания не определяет энергетические свойства со-
единения. Именно наличие эфирного кислорода рибофуранозпого
цикла в транс-положении к шестичленному циклофосфату счи-
тают ответственным за высокоэнергетичность цнклофосфата, а
замена фуранозного кольца на пиранозное (глюкоза) или цпкло-
пентановое (т. е. эфирный кислород заменен метиленовой груп-
пой) приводит к тому, что такой циклофосфат обладает значи-
тельно меньшей энергией.
Биосинтез сАМР и cGTP требует высокоэнергетического пред-
шественника: АТР или GTP. Ферменты, катализирующие эту
реакцию, аденил- и гуанилциклазы, уже списаны выше.
основание=аденин или гуанин
Химический синтез циклопуклеотпдов можно провести по ана-
логии с биосинтезом этих соединений: циклизацией ангидридного
аддукта аденозина. Поскольку цпклофосфат — это высокоэнерге-
тическпй продукт, использование промежуточного соединения ан-
гидридной природы, получаемого, например, при реакции с кар-
бодиимидом, приведет к тому, что циклизация будет термодина-
мически выгодна. Следовательно, при сильном разбавлении в при-
биоорганическая химия фосфатов
147
сутствии ДЦГК пройдет циклизация аденозин-5'-фосфата и
образуется сАМР. При этом, однако, в значительной мере может
пройти образование пирофосфата.
В другом варианте синтеза, позволяющем избежать образова-
ния пирофосфатов, циклизацию проводят с помощью сильного
нуклеофила — алкоксида. Для этого используют одно из самых
сильных оснований — трет-бутилат калия в диметилсульфоксиде.
Конечно, необходимо присутствие хорошей уходящей группы.
Сходный метод был использован для синтеза фенилфосфотриэфи-
ра уридинциклофосфата (cUMP):
\ \ / »iy>wn ВиРЧС*
О. J ДМС.О ’
\р О* bz
PhO? OPh
Z = защитная группа
Циклический продукт в высшей степени чувствителен к влаге
(гидролиз); гораздо легче выделяется циклический диэфир. На-
блюдалась интересная зависимость: фениловые трнэфнры высо-
коэпергетических циклофосфатов (циклонуклеотидов, этиленфос-
фата) весьма реакционноспособные, неустойчивые (легко разла-
гаются) соединения. В то же время фениловые триэфиры низко-
энергетических циклофосфатов — это стабильные кристаллические
соединения. Например, фениловый триэфир триметиденфосфор-
ной кислоты — кристаллический продукт, он получается легко и
с высоким выходом при взаимодействии 1,3-пропандиола с фе-
пилдихлорфосфатом
О получении фенилового трнэфира сАМР подобным методом не
сообщается.
148
Глава 3
3.5. Биосинтез полинуклеотидов
Синтез (репликация) ДНК должен происходить таким обра-
зом, чтобы образовались две новые цепи двухтяжевой ДНК
с той же самой последовательностью оснований, т. е. топ же ге-
нетической информацией, что и родительская. Благодаря такому
процессу из данной родительской клетки возникают две дочер-
ние. Репликация становится возможной потому, что двухтяжевая
родительская ДНК разделяется на отдельные нити, из которых
каждая служит матрицей для синтеза повой спирали. Если бы
две цепи были ковалентно связаны, энергия, необходимая для
разделения цепей, была бы весьма значительной. Сохранение
последовательности оснований в процессе репликации происхо-
дит благодаря высокой специфичности при образовании водород-
ных связей между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями.
Так что, например, аденин на одной цепи двойной спирали всегда
будет находиться напротив и образовывать водородные связи
с тимином во второй цепи. При разделении цепей аденин из од-
ной цепи всегда будет взаимодействовать с тимином в процессе
синтеза новой комплементарной цепи. Аналогичным образом ти-
мин, который находился напротив аденина в родительской двой-
ной спирали, после разделения цепей будет взаимодействовать
в процессе синтеза новой комплементарной цепи с аденином.
Следовательно, на каждой нз разделенных цепей родительской
двойной спирали, как на матрице, синтезируются две новые цепи
двухспиральной ДНК, обладающие совершенно одинаковой по-
следовательностью оснований с родительской молекулой. Такой
механизм синтеза ДНК называется полуконсервативным меха-
низмом репликации, поскольку исходная двойная спираль «напо-
ловину сохраняется» (рис. 3.9), т. е. каждая из двух образовав-
шихся двойных спиралей содержит одну цепь из родительской
молекулы.
Конечно, по мере того как новые основания сближаются
с матричной цепью, они должны вступать в реакцию полимери-
зации, давая комплементарную цепь. Для этого две мономерные
единицы образуют между собой 3',5'-фосфодиэфирную связь.
Ферментом, который катализирует такую реакцию полимериза-
ции, является ДНК-полнмераза. Как и в случае образования
пептидной связи, для образования фосфодиэфирной связи затра-
чивается определенная энергия. Следовательно, мономерные еди-
ницы нельзя последовательно присоединять в форме монофосфа-
тов, но следует сначала активировать, превратив в трифосфаты.
Для обеспечения правильной последовательной полимеризации
ферменту необходимо присутствие родительской цепи в качестве
матрицы. Помимо этого для фермента необходимо присутствие
затравки ДНК, с которой начинается синтез новой цепи. Следо-
вательно, имеет место не синтез совершенно новой цепи, а удли-
Биоорганическая химия фосфатов 149
некие цепи затравки. Это нетрудно понять, так как, если бы для
фермента требовалась только матричная ДНК, он мог бы начать
синтез новой цепи в любой точке матрицы, а не сначала (т. е. про-
должая затравку). Это имеет особое значение, поскольку фермент
полимераза связывает своим активным центром не всю молекулу
ДНК, а лишь ее небольшую часть. Ниже приведена катализи-
руемая ферментом реакция.
или
матрица
затравка
(затравка ДНК) + п (dATP, dGTP, dCTP. dTTP)
flHK noflHMepa3a|Mg2+, -nPP(
(затравка /(HK)-[(dAMP)n-(dGMP)„-(dCMP)„-(dTMP)n]
150
Глава 3
Рис. 3.9. Репликация ДНК.
З'-Гидроксил затравки атакуется а-гтомом фосфора соответ-
ствующего (определяемого затравкой) трифосфата, отщепляя
при этом пирофосфат и образуя фосфодиэфирную связь. З'-Гид-
роксильная группа вновь присоединенного мономера находится
теперь в положении, позволяющем атаковать следующую моле-
кулу трифосфата, так что полимеризация может продолжаться
вдоль матрицы. Матрица оканчивается 5'-фосфатом, а новообра-
зованная цепь — З'-гидроксильной группой.
ДНК-полимераза существует в различных формах в зависи-
мости от выполняемых ею функций. Хотя это кажется невероят-
ным, разнообразие форм ДНК-полимеразы обусловлено не субъ-
единичной структурой, по крайней мере в бактериальных фермен-
тах. Были охарактеризованы три различные формы фермента из
бактерии Е. coli, которые обозначили как полимераза I, II и Ш.
ДНК-полимераза I выполняет в основном репарирующпе функ-
ции, тогда как ДНК-полимераза III является ферментом репли-
кации. Функции ДНК-полимеразы II еще не ясны. Ферменты
млекопитающих также существуют во множественных формах.
В действительности процесс репликации ДНК более сложен,
чем описанный выше. Считается, что примерно двадцать белков
участвуют в процессе репликации, в том числе и такие, которые
разделяют родительские цепи, присоединяют и удаляют неболь-
шие фрагменты затравок, вырезают неправильно присоединив-
шиеся основания и исправляют поврежденные участки. Кроме
того, оказывается, что синтез новой цепи на матрице происходит
не как одна непрерывная стадия, но путем синтеза небольших
цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются друг
с другом с помощью фермента ДНК-лигазы. Затравкой этих
фрагментов могут служить короткие цепи РНК, позднее заме-
Биоорганическая химия фосфатов
151
пяемые на ДНК, которые синтезирует ДНК-полимераза 1. Сле-
довательно, хотя описанная выше картина в основном верна,
реакция нуклеофильного замещения между дезоксипуклеозплтри-
фосфатом и 3' гидроксильной группой растущей цепи ДПК, ка-
тализируемая ДНК-полимеразой III, на самом деле весьма упро-
щенно представляет довольно сложный процесс. Однако более
подробное описание выходит за рамки настоящей книги.
Тем не менее следует упомянуть о соединениях, способных ингибировать син-
тез ДНК, подобно тому как рассматривался вопрос об ингибировании белкового
синтеза. Эти соединения имеют большое значение, особенно при разработке проб-
лемы химиотерапии раковых заболеваний. Хотя они и обладают нежелательной
способностью неизбнрателыю ингибировать синтез ДНК как раковых, так н нор
мальпых клеток, их ценность обусловлена тем, что при многих формах рака (на-
пример, лейкозах) скорость размножения раковых клеток гораздо больше роста
нормальных клеток. Подобные препараты могут быть двух категорий: нуклео-
зидные и ненуклеозндные аналоги.
Возможно, наиболее известными нуклеозидными аналогами являются соедине-
ния на основе арабинозы: Лга(С) (цигозннарабпнознд, l-P-D-арабпнофуранознл-
цнтозин) п Ага (А) (аденннарабннозпд, 9-р D арабипофурапозпладенин). Оба со-
единения превращаются в трифосфаты [Ага (СТР) и Ara (АТР) in vivo] и затем
двояким образом воздействуют па ДНК-полнмеразу. Они способны ингибировать
ДНК-полнмеразу [например, Ага(СТР) ингибирует ДНК-полимеразы II и III], а
также могут включаться в новообразованную ДНК. На самом деле Ara (С), но
ие Ага(А), включается также в РНК. Такая замена в ДНК имеет летальные по-
следствия, поскольку в структуре ДНК возникают небольшие различия, в резуль-
тате того что цитозиновое основание имеет другой угол поворота вокруг глико-
зидной связи вследствие стернческого отталкивания от 2'-гпдроксильной группы.
О
Ara(C)(ecnu Ьснование= 5-иоа-5'-аминр-г',5’-
цитозин) ЭиЭеэоксиуривин
Дга(А)(если основание= (IAdU)
авенин)
Недавно был разработан высокоспецифичнын препарат* 5-иод-5'-амино-2',5'-
дидезоксиурнднп (IAdU). Он ингибирует репликацию ДНК в вирусе герпеса
(тпп-I), не затрагивая процесс репликации ДНК в клетках млекопитающих.
К сожалению, это соединение не проявляет своих противовирусных свойств к он-
когенным (вызывающим рак) вирусам. Тем не менее поиски препаратов со сход-
ной структурой [т. е. 5' аминоаналогов Ага(С)] могут привести к получению со-
единения, обладающего необходимой избирательностью действия, механизм ко-
торого, по видимому, функционирует на уровне синтеза трнфосфатов. Только
• Совсем недавно [36] был описан другой препарат — 9-(2-оксиэтоксиметнл-
гуаннн, ингибирующий репликацию вируса герпеса, не затрагивая никаких кле-
ток, инфицированных вирусом. Оказывается, в основе селективности лежит спо-
собность препарата фосфорилироваться (тпмпдинкиназой, кодируемой вирусом)
до соединений, токсичных к вирусному генетическому материалу.
152
Глава 3
клетки, зараженные вирусом, оказываются способными синтезировать lAdUTP,
который затем включается в вирусную ДНК. Такая ДНК будет содержать ла-
бильные фосфамидпые связи, которые, видимо, впоследствии нарушают процесс
репликации (возможно, понижая устойчивость фосфодиэфнрпого скелета).
В число примеров препаратов ненуклеозидной природы, ингибирующих син-
тез ДНК путем связывания с двойной спиралью, входят акридины (например,
профлавин) и различные антибиотики (например, мптоции С, адрпамицин, дау-
номицин). Способность акридинов связываться с ДНК и РНК вызвало их ис-
пользование в биологии в качестве биологических красителей этих молекул. Свя-
зывание осуществляется путем «интеркаляции»; плоская кольцевая система про-
флавина, например, интеркалнрует (протискивается) между парами оснований
двойной спирали, образующих стопочную структуру. Можно ожидать, что такой
«бутерброд» из ДНК и связанных с ней молекул красителя изменит свою гео-
метрическую структуру (удлинит двойную спираль), что и наблюдается в дей-
ствительности.
профлавин
митомицин
Сходным образом действуют и антибиотики. Поэтому все три антибиотика
обладают противоопухолевой активностью.
Синтез 3',5'-фосфодиэфирной связи в РНК осуществляется
так же, как и в ДНК. Опять З'-гидроксильная группа растущей
цепи (РНК) атакует соответствующий мономерный трифосфат,
как диктуется матрицей, образуя фосфодиэфирную связь с после-
дующим отщеплением пирофосфата. Эта реакция катализируется
ферментом РНК-полимеразой. В данном случае матрица — это
ДНК, так как генетическая информация, хранящаяся в форме
ДНК, передается полимерной РНК (так называемой мРНК).
В качестве матрицы служит лишь одна из двух цепей ДНК. Од-
нако для начала синтеза не требуется затравки РНК- Фермент
просто связывается с определенным участком цепи ДНК,- и от-
сюда начинается синтез РНК; этот участок называется промотором.
Происходящую при этом реакцию можно представить следую-
Биоорганическая химия фосфатов
!53
щнм образом:
ДНК-матрица + п (АТР, GTP, СТР, UTP)
РНК-полимсраза|мв2+, -nPPj
РНК-матрица • [(AMP)-(GMP)-(CMP)-(UMP)]n
В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза состоит из субъ-
единиц.
3.6. Химический синтез полинуклеотидов
Химический синтез полидезоксирнбо- или полирибонуклеоти-
дов— сложная задача [37—39]. Перед химиком снова встают те
же проблемы, с которыми он сталкивался в полипептидном син-
тезе. Необходимо разработать методы последовательного нара-
щивания цепи с исключением статистического присоединения мо-
номеров, а также методы введения защитных групп для предот-
вращения побочных реакций и достижения высоких выходов на
каждой из стадий введения защитных групп, конденсации и де-
блокирования. Проблема подбора защитных групп стоит в на-
стоящее время, да и раньше, наиболее остро, так как может
потребоваться избирательное блокирование одной из двух хими-
чески почти идентичных группировок. Это, в частности, касается
синтеза рибонуклеотидов, где часто требуется блокировать одну
из вторичных гидроксильных групп (2'-) так, чтобы стало воз-
можным избирательное фосфорилирование соседней вторичной
гидроксильной группы (3'-). В действительности положение за-
щитной группы после блокирования (1,2-ц«с-дполыюй группы)
может меняться. Вполне вероятно, что происходит изомеризация
искомого 2'-защищенного нуклеозида в нежелательный З'-защи-
щенный нуклеозид, особенно при использовании небольших за-
щитных групп.
2'-ацетил-изомер З'-ацетил-изомер
О: ОТ) О ОН
4_Si(CH3)3 (H3C)3S1
а'-триметипсилильный изомер З-щриметилсилилъный изомер
154
Глава 3
Напомним, что полимерные молекулы, как ДНК, гак и РНК, об-
ладают 3',5'-фосфодиэфирным остовом. Гидроксильные группы
сахара п экзоциклические аминогруппы оснований (если тако-
вые имеются) — вот два потенциально реакционноспособных цент-
ра, которые необходимо блокировать, чтобы образовалась только
искомая связь. Если такое блокирование проведено, то может
произойти образование желаемой связи:
Z —ОСН2 С
\ п основание
a H,PO<t
-н,о
Z—осн2
\ Q основание
о
но о—>z
о о—Z
ео'
з'- монофосфат
О О—Z
О=Р—О®
Z—б О—Z
Z= защитная группа
З'.З-фосфойиэфир
Конечно, как и в случае образования пептидной связи, затрачи-
вается определенная энергия, и поэтому необходима активация.
Синтез фосфодиэфирной связи был бы невозможен при простом
смешивании фосфорной кислоты с соответствующими защищен-
ными нуклеозидами. Наконец (см. ниже), может потребоваться
даже блокирование фосфатной группы. Хотя это не строго необ-
ходимо (и не применялось в первых нуклеотидных синтезах), та-
кой метод имеет свои преимущества и в настоящее время наи-
более распространен.
3.6.1. Защитные группы гетероциклических оснований
Блокирование аминогруппы аденина, гуанина или цитозина
может оказаться необходимым при фосфорилировании для пре-
дотвращения образования фосфамидов. В более редких случаях
(особенно для гуанина) оно также позволяет достигнуть боль-
шей гидрофобности слишком полярного нуклеозида.
Биоорганическая химия фосфатов
155
Ацильная группа
После ацилирования аминогруппа становится химически неактивной, или не-
нуклеофильной. Тем ие менее введение ацильной группы часто приходится осу-
ществлять в две стадии: полное ацилирование нуклеозида с последующим деаци-
лированием сахара. Вдобавок гликозидная связь N-ацильных производных обыч-
но менее устойчива к гидролизу. К типичным ацильным группам относятся аце-
/ ° X / ° \ / ^ох
тнльная! || |, бензоильная] || I, изобутирильная! (СНз)гСНС I
\СН3—С—/ <с6н5—с—/ \ \ /
и анизопльная^СНзО—J- Синтез N-бензоиладенознна, например,
проводится следующим образом:
О
л
гьс—а
Пирийин
абенозин
NHC— Ph
II
PhCOCH, J
о \_Jo
I Jell
Ph—С О ОС - Ph
тептрабензоилайенозин
НО ОН
Аналогично проводят и синтез N-бензоилгуанозина, но обработка гидроксидом
натрия заменяется на обработку метилатом натрия. Тем не менее N-бензонлци-
тидин можно синтезировать прямым бензоилированием основания в условиях, при
которых сахарный остаток не затрагивается. Это отражает большую нуклео-
фильность аминогруппы цитидина по сравнению с пуринами.
156
Глава 3
Удаление ацитьных групп обычно проводят концентрированным водным ам-
миаком или водным раствором гидроксида натрия. Бензоильную группу можно
также избирательно удалить с основания (не затрагивая бензоилированный оста-
ток сахара) в нейтральных условиях, используя гидразингндрат (NH2—NH2-
•0,5Н2О). Такое избирательное действие на бензоплированпое основание объяс-
няется сопряженным механизмом:
/-ВОС- и CBz-группы не нашли широкого применения для блокирования
аминогрупп оснований. Единственной блокирующей карбаматной группой, кото-
рая применяется, является нзобутнлоксикарбоппльная группа. Ее вводят реак-
цией нуклеозида с пзобутнлхтэрформиатом и последующим деацилированием
сахарного остатка:
Преимущество этой группы заключается в большей устойчивости карбамата (т. е.
меньшей электрофильности карбонильной группы), чем соответствующей амид-
ной связи, к действию гидразина. Деблокирование можно проводить также кон-
центрированным водным аммиаком.
N-Диметиламинометиленовая группа
Обработка экзоциклической аминогруппы диметилфОрмамиддиметилацеталем
в диметилформамиде приводит к получению N-диметиламинометиленового произ-
водного.
Биоорганическая химия фосфатов
157
НО ОН Й 5
цитидин 'сн
К(СН3)2
Механизм реакции включает нуклеофильное замещение, протекающее, как можно
предположить, через образование активного промежуточного соединения:
H2N:^ 1 Н3СО\ \ОСН3 Н3СОеОСН3 Н3СОеОСН3
1 R *с—н с—н ®с—н 1 —> II —> 1 N(CH3)2 ®N(CH3)2 К(СН3)2
,осн
HN—СН
I I
R N(CH3)2
-----> N=CH-N(CH3)2
-иосн, |
R
Удаление шиффова основания можно проводить обработкой в кислых или
щелочных условиях: обычно используют раствор аммиака в метаноле. 2',3'-О-Дн-
метнламииометиленовая группа сахарного остатка еще более лабильна н уда-
ляется при добавлении всего лишь воды. Тем не менее чувствительность шиф-
фовых оснований к кислотам и щелочам может стать недостатком, если в даль-
нейших операциях используется кислотная или щелочная обработка. Кроме того,
тимии и урацил (если оии входят в состав олигонуклеотида) могут подвергаться
метилированию, например:
Ьмет'илурацил
1,3-ЭиМётилурацил
Этой побочной реакции можно избежать, используя объемистый неопентильный
аналог.
158
Г лава 3
3.6.2. Блокирование сахарного остатка
Из трех групп, которые необходимо защищать (аминогруппа,
фосфатная и гидроксильная), блокирование гидроксила наиболее
важно для сведения к минимуму выхода побочных продуктов и
изомеров. Поэтому было предложено много защитных групп для
блокирования гидроксила. Такое разнообразие очень полезно, по-
скольку может возникнуть необходимость введения в одну моле-
кулу двух разных гидроксилблокирующих групп. Обычно это бы-
вает нужно при обработке 5'-гидроксильной (первичной) группы
отдельно от вторичных. В случае рибонуклеотидов избирательно
воздействовать на 2'- и З'-вторичные гидроксильные группы слож-
нее, так как они обладают подобными химическими свойствами.
Монометокситритильная группа
п-Метокснтритильная и несколько реже тритильная группы в настоящее вре-
мя— наиболее применяемые группы для блокирования первичных Б'-гидроксиль-
ных групп нуклеозидов. В мягких условиях происходит лишь незначительное три-
тилнроваиие вторичных гидроксильных групп пли гетероциклического азота осно-
вания. Если подобная пониженная реакционная способность экзоцнклическнх
аминогрупп в реакции тритилирования кажется неожиданной, следует вспомнить
о том, что аминогруппы гетероциклических оснований (свободные электронные
пары которых делокализованы) обладают значительно меньшей нуклеофнль-
НОСН, основание
MeOPh—С—Cl
I
________Ph
nupuSuHjXft:
но ОН
иостью, чем первичные алкпламины. Вторичный гидроксил (гидрокситы) реа-
гирует в значит тьной степени только в жестких условиях из-за объемистой
трифепплметилыюй группировки. Реакция идет по механизму SN1-замещения.
Скорость реакции защитной группы с нуклеозидами (равно как и кислотолабнль-
ность защитной группы) повышается при введении в нее метоксигрупп в соот-
ветствии с рядом: тритил < п-метокентрптнл < ди-п-метокситритил. Отсюда
следовало бы сделать вывод о том, что ди-и-метокситритильная группа наиболее
удобна, однако с повышением скорости реакции снижается избирательность к
первичным гидроксильным группам. Кроме того, дн-и-метокситрнтильная группа
настолько кислотолабильиа, что частично снимается во время обычных опера-
ций (например, очистка на силикагеле).
Как и в случае аминокислот, с нуклеозида тритильную группу можно уда-
лить кислотной обработкой (т. е. 80%-ной уксусной кислотой, смесью пиридин —
уксусная кислота). Реакция также проходит через образование промежуточного
(стабилизированного) карбониевого иона. Введение п-метоксигруппы дополни-
тельно стабилизирует такой ион. Поэтому кислотолабпльность тритилированного
биоорганическая химия фосфатов
159
нуклеозида повышается приблизительно в десять раз на каждую введенную
n-метокситритильиую группу. Удаление п-метокситритильной группы из нуклео-
зидов и нуклеотидов гидрогенолизом проходит медленно *. Кроме того, могут
иметь место такие нежелательные побочные реакции, как гидрирование пирими-
диновых оснований.
Ацильные группы
Ацилирование первичной н вторичной гидроксильных групп нуклеозидов
чаще всего проводят, обрабатывая нуклеозид ангидридом или хлорапгидридом
кислоты в пиридине. В зависимости от реакционной способности и условий про-
ведения реакции может также происходить ацилирование экзоцнклических ами-
ногрупп, если они присутствуют в гетероциклическом основании (см. выше). По-
мимо обычных ацильных групп (формильной, ацетильной, бензоильной, хлораце-
тнлыюй и т. д.), удаляемых чаще всего в щелочных условиях, предложен ряд
ацильных групп, условия удаления которых делают их пригодными для нуклео-
тидного синтеза.
С целью получения более лабильных защитных групп, чем исходная ацетиль-
ная, синтезированы замещенные ацетильные производные, например трпфтораце-
тнльная CF3C\ , феиокси а цетильная PhOCH2C^ и метоксиацетильпая
СН3ОСН2С\ группы. Введенные заместители повышают электрофильность кар-
бонильной группы благодаря отрицательному индуктивному эффекту.
Были предложены два ряда блокирующих групп, удаляемых в нейтральных
условиях при обработке гидразиигидратом. Эти группы представляют собой
* Во время подготовки к печати настоящей книги появилось сообщение [Сп-
ruthers М. Н et al.. Tetrahedron Lett., 3243 (1980)] о том, что тритильную группу
можно удалить в нейтральных условиях обработкой ZnBr2. Ион цинка, вероятно,
способствует лабилизацпи эфирной связи путем образования комплекса с 5'- и
циклофуранозным атомами кислорода.
160
Глава 3
остатки замещенных У‘кетокислот и производных акриловой кислоты. Механизм
удаления защиты гидразином ясен из приведенной ниже схемы:
1) R—С—(СН2)2— С—ОСЩ о основание
о о \ У
НО он
Например, З'-О-бензоилпропионилтимидин синтезировали следующим образом:
Ph
сн3орь-с^осн2О Th у
CH3OPh + PhC(CH^CO2H
Н(/
'ПД^ГК/пириВин
HOCH
но
тимибин
N—NH
+ Ph—C C=O
4,5-Эиг,иЗро-6-фенцЛ'
пириЗазон ’
Биоорганическая химия фосфатов
161
О
II
Левулинильная группа СН3С(СН2)2СО— еще более чувствительна к гидразину,
чем бензоильная. Это связано с тем, что в первом случае существует сопряжение
между фенильным остатком и карбонильной группой в переходном состоянии при
присоединении гидразина. Для метильной группы такое сопряжение отсутствует.
Из производных акриловой кислоты можно назвать следующие защитные
группы:
акриловая
кротониловая
метоксикротониловая
феноксикротониловая
( °
ксн3сн=сн^—)
/ о '
( 11
\СН3ОСН2СН=СНС—.
Г о \
I "
\PhOCH2CH=CHC—/
Для их введения используют обычно ангидриды соответствующих кислот.
Для защиты гидроксильных групп используют также реакцию образования
карбонатов. Например, изобутилхлорформиат предпочтительно реагирует с пер-
вичными гидроксильными группами тимидина:
о
II
НОСН2о Th О (СН3)2СНСН2ОСОСН2 0 Th
\/ \/ (сн,1,снсн,осд V/ \7
пиридин
НО
НС?
Образующийся карбонат устойчив в кислой среде, что позволяет избирательно
удалять л-метокситритильную группу. Поэтому синтез З'-О-л-моиометокситритил-
тнмидина проводят по следующей схеме:
и-Нитрофенилхлорформиат обладает меиьшей селективностью, но также на-
годит применение. В реакции с ццс-диолыюй группировкой хлорформиаты и
в Зак. 640
162
Глава 3
дифеиилкарбонаты образуют циклический карбонат:
Циклические карбонаты можно удалить мягкой щелочной обработкой
трет-Бутилдиметилсилильная группа
Первоначально силилирование углеводов и нуклеозидов использовали для
приготовления образцов в газовой хроматографии и масс-спектроскопии. Однако
в настоящее время силильные соединения, особенно трег-бутилдиметилсилиль-
ная группа (/-BDMS), используются для блокирования гидроксильных групп.
Обычно предпочитают объемистые группы благодаря их повышенной селектив-
ности к первичным гидроксилам и достаточной устойчивости к изомеризации
даже в случае рибонуклеозидов, обладающих 1,2-«ря--диольиой группировкой.
Ниже приведена реакция тимидина с некоторыми силильными реагентами.
Все силилирующие реагенты обладают свойствами, которые делают их удоб-
ными гидроксилблокирующими группами. Они проявляют разную реакционную
активность к первичным гидроксильным группам, но при избытке силилирующего
Биоорганическая химия фосфатов
163
реагента способны взаимодействовать с любыми вторичными гидроксильными
группами. Значительного силилирования гетероциклических оснований тем не ме-
нее ие происходит. Силильную группу можно удалить кислотным гидролизом
(80%-ная уксусная кислота) либо в нейтральных условиях обработкой фторид-
ионом (чаще всего в виде тетрабутиламмоиинфторида, реже — фторида цезия
или тетраэтнламмония). Силильные эфиры достаточно кислотолабильны. Помимо
этого, особенно при присоединении Z-BDMS, легче всего гидролизуются первичные
силильные эфиры. Таким образом, возможно синтезировать 3'- или 5' моноси-
ляльное производное дезоксирибонуклеозида лишь с небольшой примесью по-
бочного продукта.
Благодаря гидрофобности енлилированиых нуклеозидов любые побочные про-
дукты можно отделить с помощью обычных приемов органической химии (хро-
матография на силикагеле). Фторид-иои в безводных средах—хороший нуклео-
фил. Силильная группа устойчива к обработке основаниями и гидразингидратом.
I BDMS-группа оказывается полезной и для синтеза определенных защищен-
ных рибонуклеозидов При этом она также предпочтительно силилирует первич-
ную гидроксильную группу В присутствии избытка «лидирующего агента об-
разуется смесь 2',5'- и 3 5' диенлильных производных В зависимости от усло-
вий реакции и природы гетероциклического основания количество 2',5,-изомера
равно или больше, чем количество 3',5'-диснлильного производного. Такое на-
правление реакции полезно при синтезе рибонуклеотидов, для которых требуется
блокирование 2'-гидрок«льной группы, но наличие свободной З'-гндроксилыгой
группы для образования фосфодиэфнриой связи. Эти дна изомера можно разде-
лить хроматографией на силикагеле. Дополнительное введение силилирующего
164
Глава 3
агента приводит к полному снлилироваиию нуклеозида
НОСН2 основание
НО ОН
НО ОН
r-BDMSCl
UMudason/дмфа
или
пиридин
Учитывая, что первичная силильная группа легко гидролизуется, удается по-
лучить 5'-, 2'- или 3'-/-BDMS-нуклеозиды, а также 2',3'-, 2',5'- и 3',5'-диснлиль-
ные производные. На практике, поскольку п-метокситрптильная группа более
чувствительна к кислотному гидролизу, чем первичная силильная группа (помимо
прочих соображений), специально с этой целью в нуклеотидном синтезе полу-
чены 5'-О-п-метокситритил-2'-/-ВОМ5-защищенные нуклеозиды.
Очевидно, что для реакции силилироваиия необходимо не только наличие
основания для связывания кислоты, но и нуклеофильный катализатор. Скорость
реакции при этом меняется в следующей последовательности: триэтиламип < пи-
ридин < имидазол.
Тетрагидрапиранильная группа
Использование дигидропирана для блокирования спиртов хорошо известно.
Как блокирование, так и удаление защитной группировки происходит в присут-
ствии кислоты:
г.З-ЗигиВропиран
Эфир тпетрагивро
пирона
Эфир тетрагидропирана (ТГП) устойчив к действию оснований. ТГП-группу (см.
ниже) использовали для синтеза 2'-защишениых рибонуклеозидов. Как указы-
валось ранее, для синтеза З'.З'-фосфодиэфирной связи необходимо блокиро-
вать 2'-гидроксильиую группу. Однако наличие в ТГП-блокированном продукте
центра асимметрии может усложнить его выделение при различных процедурах:
в ходе обработки продукт ведет себя как два соединения, характеризующиеся
Биоорганическая химия фосфатов
165
различными Hf, температурами плавления и т. д. Этот недостаток был преодолен
использованием вместо 2,3 дигидропирана 5,6 дигидро-4-метокси-2Н-пираиа Со-
ответствующий эфирный продукт симметричен.
Был проведен синтез 2' защищенных нуклеозидов через промежуточные
2',3'-цпклические ортоэфнры. Ортоэфир блокирует 2'- п З'-гидроксилы, так что
при необходимости можно селективно защитить первичную гидроксильную группу.
Гидролиз полностью защищенного нуклеозида кислотой (например, муравьиной
или уксусной) приводит к образованию смеси 2'- и З'-ацилнрованных изомеров.
Для их разделения обычно используют перекристаллизацию или колоночную хро-
матографию Например, З'-О ацетнладенозин из горячего абсолютного этанола
кристаллизуется отдельно от 2'-О-ацетиладеиозниа. В выделенный З'-изомер
носн2
основание
/Ох /
НО ОН
I) RC(OMc),,
H*___________,
2) R— ,ангидриЗ или
кислота + ДЦГК, и т В.
R'OCH2
I основание
/Ох /
б Д
R =—Н.триметипортоформиат
R = —CHj, триметилортоацетат
R' = формил, метокси- или фенокси-
ацетат, левулинил ит.В.
иб 6
снз°1^1
1) н«
лкристаллизация
и/или
хроматография
. на силикагеле
2) NH, или
NaOCHj,
удаление
5'-заи;итной
группы
(если нужно)
£> ОН
О=С
R
можно ввести тетрагидропнранильную защиту (в том числе и по первичной гидро-
ксильной группе, если она ие блокирована) и затем удалить ацильную группу
щелочной обработкой с образованием 2'-защищенного нуклеозида со свободной
З'-гидроксильной группой. В зависимости от выбора защитной группы для пер-
вичного гидроксила он может оставаться блокированным (например, если защи-
щен левулинильной или тетрагидропираннльной защитой) или деблокироваться (на-
пример, при использовании формильной, метоксильной, феноксиацетильной групп).
Другие защитные группы
Для 1,2- и 1,3-цис-диолов можно сказать, что классической защитой являет-
гя изопроп1пиденовая (ацетонидная) группа. Кислотолабнльпый кеталь обра-
зуется при реакции рибонуклеозида с ацетоном в присутствии кислоты (НО,
166
Глава 3
л-толуолсульфоновой, H2SO4) и соединения для связывания воды (2,2 диметокси-
пропана, этилового эфира ортомуравьиной кислоты). К блокирующим группам
подобной природы относятся также бензилиденовая и циклогексилиденовая.
носн,
I * основание
осн,
I
н.с-ссн.
I
осн,
\—( + СН3ССН3
НО ОН
Предложены блокирующие группы, которые можно удалять ферментатив-
ным расщеплением. Преимущество таких групп состоит в том, что деблокирова-
ние происходит при очень мягких условиях (близкое к нейтральному значение
pH, 37°С) и с высокой специфичностью. Например, дпгидроцнаниамоильиая груп-
па (которую вводят в виде хлорида) может удаляться обработкой а-химотрип-
сином.
S-C1
дигидроциннамоил- бснзоилфор.иил-
хлорид хлорид
no2
2,4-динитробензол-
сульфснилхлорид
Из других защитных групп можно назвать бензоилформильную (которую
вводят действием бензоилформилхлорида и удаляют обработкой водным пири-
дином) и 2,4-динитробензолсульфенильную (которую вводят действием соответ-
ствующего сульфеиилхлорида и удаляют гпофеиолом). Фотолабильпая о-нитро-
бензильная группа о которой уже упоминалось как о группе для зашиты аминокис-
лот (гл. 2). находит применение для блокирования 2'-гидрокснльиой группы *.
3.6.3. Блокирование фосфатных групп
На основе сведений о различных защитных группах, пригод-
ных для блокирования гидроксильных и аминогрупп, можно
синтезировать защищенные нуклеозиды, в которых реакционно-
способные группы образуют только 3',5'-фосфодиэфирную связь.
Нежелательные продукты (3',3'- или 5',5'фосфодиэфиры, фосф-
амиды и т. п.), скорее всего не образуются. Показательный при-
* Новейший обзор, посвященный использованию фотоактивируемых защит-
ных ipynn в ор!аническом (аминокислотном, нуклеотидном) синтезе, см, работу
[362].
Биоорганическая химия фосфатов
167
мер — конденсация аденозина и уридина:
После завершения реакции защитные группы можно удалить в
мягких условиях, не затрагивающих фосфодиэфирной связи. На
этом основан фосфодиэфирный метод синтеза полинуклеотидов.
Продукт реакции — фосфодиэфир со свободной, потенциально
уязвимой для воздействия, отрицательно заряженной группой.
Далее, с увеличением длины полинуклеотидной цепи число от-
рицательных зарядов в соединении также будет увеличиваться.
Поэтому в зависимости от условий реакции эти потенциально
нуклеофильные центры могут участвовать в нежелательных по-
бочных реакциях. Кроме того, такое многозарядное соединение
слишком полярно, чтобы можно было проводить его очистку
обычными методами органической химии, например с помощью
хроматографии на силикагеле. Вместо этого необходимо исполь-
зовать хроматографию на ионообменных носителях, обладающих
меньшей емкостью (например, на ДЭАЭ-целлюлозе). Фосфоди-
эфирный метод пригоден для получения веществ лишь в неболь-
ших количествах. Однако нейтрализация зарядов путем этерифи-
кации подходящими защитными группами перед фосфорилирова-
нием нуклеозидов устраняет проблемы, упомянутые выше. В этом
случае продуктом реакции конденсации является фосфотриэфир.
| Фосфотриэфирный метод позволяет работать с большими количе-
ствами веществ. Ниже описаны некоторые защитные группы, ис-
пользуемые для блокирования фосфата.
168
Глава 3
2,2,2-Трихлорэтильная группа
Введение этой защитной группы в соответствующий фосфорилирующий агент
обычно проводят реакцией 2,2,2-трпхлорэтапола с хлорфосфатом пли хлорфос-
фнтом;
(С1)3С—СН2—ОН + С1—Р=О или Cl—Р:
(С1)3С—СН2—О—Р=О
или (С1)3С—СН2—О—Р:
Именно защищенный фосфорилирующий агент и реагирует с нуклеозидами с об-
разованием 3',5'-фосфодиэфирной связи. После завершения реакции трихлор-
этильная защитная группа может быть удалена несколькими способами; класси-
ческий — это обработка цинком, но можно использовать и фторид тетрабутил-
аммония:
О=р—о—СН *—С—С1
R
° /С1
---> О= Р 0е + сн2=с
I С1
о
"R'
3',5'-фос(ротриз(рирный продукт
R
О
I СН2С(С1)3
О-P—О
I . е
О -F
^R'
R
’ О""
I
O=P F
I
О
R'
промежуточный
(pmoptpoctpam
R
О
O-P-OH
I
О
R'
Напомним, что в неводных растворителях (например, в тетрагидрофуране) фто-
рид ион— хороший нуклеофил. Индуктивный (отрицательный) эффект трех ато-
мов хлора делает трпхлорэтильную группу хорошей уходящей группой. Высоко-
реакционноспособный промежуточный фторфосфат разлагается при хроматогра-
фии. Его также можно разрушить обработкой гидроксидом натрия.
р-Цианэтильная группа
Легкодоступная бариевая соль цианэтилфосфата — подходящий реагент дл»
фосфорилирования нуклеозидов После образования продукта реакции эту труп
можно удалить мягкой щелочной обработкой пли обработкой фторид-ионок
Биоорганическая химия фосфатов
169
Б обоих случаях происходит ^-элиминирование:
R XR
О О
I ~ ^CN |
0_ р-Дсн,-п/ -------------> о-p -ое + ch2=ch-cn
I I
О е е О
:ОН или :F R'
Следует заметить, что в безводных растворителях фторнд-ион является и хоро-
шим нуклеофилом, и сильным основанием.
Ароматические группы
Получившие широкое распространение ароматические защитные группы вво-
дились в соответствующий фосфорилирующий агент путем взаимодействия фе-
нола или о-хлорфенола с хлорфосфатом;
а-
ля
Как и в случае 2,2,2-трихлорэтпльной группы, удаления защитной группы можно
добиться обработкой фторидами или гидроксидом натрия. Очевидно, хлорфенпль-
ная группа является лучшей уходящей группой, чем фенильная. Атака фторид-
иоиом также протекает с промежуточным образование фторфосфата.
С1
О—
IP
о=р
| \:ОНе :Fe
О R
О—R
I
о=р—ое +
О —R'
Нежелательным побочным процессом, происходящим при полинуклеотидном
синтезе триэфирным методом (т. е. при синтезе более длинных, чем динуклеотид,
олигомеров), является расщепление межнуклеотндпых связей. Оно наблюдается
в значительной степени при удалении ароматических защитных групп обработкой
Ос
> О Р OPh + R—ОН
I
О R'
расщепление меэкнуклео*
тибной связи
эм. I
щелочью либо фторид-иопом:
ГО—R
| OPh
О=Р^
|\:ОН'
О—Р
170
Глава 3
Было замечено, что использование оксимов для удаления защитных групп умень-
шает расщепление межнуклеотидпых связей:
Реакция проводится в водном диоксане Напомним, что благодаря а-эффекту
альдоксимы — хорошие нуклеофилы. В последнее время стала применяться ме-
тильная группа, поскольку ее удаление вследствие алкильного расщепления прч
обработке сильными нуклеофилами (тнофеиоксид, бутиламнн) также уменьшает
расщепление межнуклеотидиой связи [365].
Анилидная группа
Исходя из кислотолабильности фосфамидов, можно предположить, что они
окажутся потенциально полезными в качестве защитных групп. И действительно,
хорошо известна анилидная защита, которую можно ввести и удалить:
О _ О
@У~НН„ДЦГК
RO Р— ОН . RO—Р—N
изоамипиитрит, I Н
О пириоин-уксусная кислота q
э
е
В другом варианте анилидная группа может вводиться в составе несимметрич-
ного фосфорилирующего агента. Синтез таких амидохлорфосфатов приобретает
К = H,NO2
С,Н,.2С,И,МН,
-CjHjNHjCI®
фосфорилирующий агент, который
может реагировать со свобовным
^ийроксилом нуклеотида.
Биоорганическая химия фосфатов
171
значение как способ получения нуклеотидов, меченных радиоизотопами, и диасте-
реомеров нуклеотидов *.
3.6.4. Образование фосфодиэфирной связи
Как уже отмечалось, для синтеза пептидной связи, цикличес-
ких нуклеотидов и нуклеозидтрифосфатов, а также фосфоднэфнр-
ной связи требуется совершение определенной работы и, сле-
довательно, затрата энергии. Это находит отражение в величине
свободной энергии гидролиза фосфомоио- и фосфодиэфиров, ко-
торая равна приблизительно —12,6 (—3,0) и —25 кДж/моль
(—6,0 ккал/моль) соответственно. Таким образом, как и в случае
аминокислот, возможны два общих подхода. Первый заключается
во взаимодействии активированного нуклеотида с соответствую-
щей гидроксильной группой нуклеозида, приводящем к образо-
ванию фосфодиэфирной связи. Второй основан па возможности
проведения реакции нуклеотида (нуклеозидмонофосфата) с нук-
леозидом в присутствии «конденсирующего агента», который ак-
тивирует фосфат in situ. Аналогичный подход может быть при-
менен для синтеза нуклеотида (нуклеозидмонофосфат, фосфомо-
ноэфпрная связь), который будет использован для образования
фосфодиэфирной связи. Чаще всего при образовании фосфоди-
эфирной связи исходят из нуклеозид-З'-фосфата и нуклеозида со
свободной б'-гидроксильиой группой. В этом случае фосфорили-
руется более реакционноспособная первичная гидроксильная
группа.
Хлорфосфаты
Фосфорилирование нуклеозида хлорфосфатом аналогично об-
разованию пептидной связи, происходящему при взаимодействии
амина с ацилхлоридом. Вероятно, один из простейших таких при-
меров— реакция рибонуклеозида с хлороксидом фосфора. В соот-
ветствующих условиях (трнметнл- или триэтилфосфат в качестве
растворителя, 0°С, а затем обработка смесью диоксап — пиридин,
комнатная температура) происходит фосфорилирование в основном
* Недавно появилось сообщение о синтезе двух диастереомеров защищен-
ного тимидин-З'-тиофосфата [366]. Ключевая реакция этого синтеза состоит в
следующем:
R = нуклеотий
К = сроссратзащитная зруппа
RO OR'
sz 6 "с
172
Глава 3
наиболее реакционноспособной (наименее стерически затруднен-
ной) б'-гпдрокснльной группы:
НОСН2 о основание
V V +РОС13
давление
боЗы после
реакции
но он
о
но—р—ОСН2О основание
ОН ХХ
НС) ОН
~90%
Конечно, при взаимодействии с соответствующим образом защи-
щенным нуклеозидом можно фосфорилировать и вторичную гид-
роксильную группу:
(Ph)3COCH2 о Th
1) POCI3 20°C
2) НаО
(Ph)3COCH2O
Th
о
nd
'P—о
HO
Замена двух атомов хлора на более объемистые заместители
приводит к еще большей избирательности фосфорилирующего
агента. Например, в условиях реакции, при которых хлороксид
фосфора дает смесь продуктов (пиридин в качестве растворите-
ля), дифенилхлорфосфат и ди-(2-трет-бутилфенил) хлорфосфат
приведут к фосфорилированию первичной гидроксильной группы
на ~90 и ~100% соответственно:
Такая специфичность к первичной гидроксильной группе показы-
вает, что получение желаемых З'-фосфатов может быть затруд-
нено. Например, дифенилхлорфосфат не реагирует с 2',5'-бис-О-
метокситетрагидропираиилуридином в пиридине при комнатной
температуре. Свободный З'-гидроксил в этом соединении слиш-
ком экранирован, чтобы реагировать с названным объемистым
фосфорилирующим агентом. Однако замена пиридина на более
эффективный нуклеофильный катализатор, например 5-хлор-1-
метилимидазол, приведет к образованию продукта реакции.
Для синтеза нуклеозидмонофосфатов были изучены и другие
дихлорфосфаты. 2,2,2-Трихлорэтнл-2-хлорфенилхлорфосфат на-
шел, по-видимому, наиболее широкое применение для синтеза
нуклеозид-З'-фосфатов. При проведении фосфорилирования в пн-
Биоорганическая химия фосфатов
173
ридине использование 1 -мстплимндазола обеспечивает высокую
скорость реакции Это обстоятельство весьма существенно для
олигонуклеотидного синтеза, где важное значение имеет быстрое
приготовление мономерных единиц. Ниже приведен пример фос-
форилирования б'-защищенного тимидина
НО
ROCH2Q Th
Трихлорэтильная группа можег быть избирательно удалена (об-
работка цинком) с образованием защищенного нуклеозид-З'-фос-
фата. Этот последний затем превращается в фосфодиэфир по
реакции с соответствующим нуклеозидом в присутствии конден-
сирующего (связывающего) агента:
174
Глава 3
Заметим, что образование фосфодиэфирной связи нельзя сво-
дить к простому взаимодействию хлорфосфата с 5'-гидроксилом
нуклеозида. Этот метод редко используется для образования
фосфодиэфирной связи, поскольку такие реакции протекают мед-
леннее, а сама методика синтеза сравнительно сложна. Ниже бу-
дет обсуждаться более удобная реакция хлорфосфата одного
нуклеозида со вторым нуклеозидом. Альтернативный подход за-
ключается в образовании фосфодиэфирной связи путем актива-
ции in situ нуклеотидов конденсирующим агентом. Некоторые
из таких агентов описаны ниже.
Карбодиимиды
Некоторые подробности реакции ДЦГК с органическими кис-
лотами, приводящей к образованию нх ангидридов, уже обсуж-
дались. По очень похожему механизму происходит и образование
фосфодиэфирной связи. Это показано па примере синтеза ди-
пуклеотнда тимидил-(З'-^-б')-тимидина:
Исходный тимидин-З'-фосфат может быть синтезирован обработ-
кой хлорфосфатом (см. выше) или с помощью ДЦГК- Последний
метод, однако, редко используется, хотя р-цианэтнлфосфат и лег-
Биоорганическая химия фосфатов
175
кодоступен. На практике, поскольку реакции с ДЦГК протекают
медленно, сопровождаются многими побочными процессами и мо-
гут быть использованы только для фосфодиэфирного метода
(фосфотрпэфирный метод не может быть применен, так как фос-
фодиэфиры ие реагируют с карбодиимпдамп), в настоящее время
такие реакции редко используются для синтеза полинуклеотидов.
Ниже приведены некоторые возможные побочные реакции, про-
текающие в присутствии карбоднимидов после образования ан-
гидрида:
промежуточный ангиЭриЭ
R—О—Р—О R'
О© Эизфир
О
II е
R—О—Р—
О®
О
II
R—О- Р—О—Р—О—R
ое ое
R_OJ> ДЦГК
°®.
V/OR
/Рч ООО
Л о ХО II II II
О. /О® « ROPOPOPO—R
RO О % еО OR Ое
Ароматические сульфохлориды
Для образования фосфодиэфирной связи эти реагенты более
эффективны, чем карбодиимиды. Сульфохлорпды более реакцион-
носпособны, дают более высокие выходы продуктов и могут быть
176
Глава 3
использованы в фосфотриэфирном методе полинуклеотидного син-
теза. Можно считать, что реакция протекает через образование
промежуточного продукта — ангидрида:
О Ph
II A"—-J
R—О—Р—О® + *SO2^C1 —
О.
нуклеозиЭманофосфат л-толуолсиль
грохлорио
1- Защитная группа
R—О—Р—О—СН2—R + Ph—SO3e
,0
Z
Первоначально использовали n-толуолсульфохлорид. Однако пер-
вичный гидроксил нуклеозида может атаковать либо атом фос-
фора, либо атом серы промежуточного ангидрида, так что в боль-
шой степени проходит сульфирование. Эта проблема была ча-
стично преодолена путем введения в орто-положение бензольного
кольца объемистых заместителей, так что атака по атому фос-
фора становится предпочтительней. Обычно используют мезитилен-
сульфохлорид (MS) и 2,4,6-триизопропилбензол'сульфохлорид
(TPS).
мезитиленсупырохлорий
(MS)
трииэопропилБензолсульфохлорцй
(TPS)
Так, первый препаративный синтез (в граммовых количествах) тимидилил-
(3'-*• 5')-тимидина осуществлен по фосфотрнэфнрнсму методу с использованием
TPS. Отметим стерпческую избирательность промежуточного ангидрида к пер-
вичной группе (образуется лишь 4% нежелательного (3'->-3')-изомера).
Биоорганическая химия фосфатов
177
Ph
Ctt3OPh—СОСН2 Th О
1 \/°х/ II
Ph \ / + ®О—р—O(CH2h-CN
1 ®О
он
MS/пириЭин
Ph
O(CH2)2CN
DTPS/пириЭин
2) 80%-ная AcOH
3)NH4OH
96%
4%
Даже при использовании TPS в небольшой степени наблю-
дается сульфирование. Кроме того, образование хлороводорода,
хотя и связывающегося пиридином, может вызвать нежелатель-
ные побочные реакции, особенно в присутствии кислотолабильных
групп. Эти проблемы удалось решить при замене атома хлора
на уходящую имидазольную, триазольную или тетразольную
группы. Таким образом, для образования фосфодиэфирной связи
применимы следующие сульфореагенты:
R
Н—
сн3—
(СН3)2СН-
X
N^N N^N
\='' iU=J
178
Глава 3
Скорость реакции конденсации меняется в соответствии
с обычной закономерностью: имидазол < триазол < тетразол *.
2,2,2-Трихлорэтнлдихлорфосфит I
Использование дихлорфосфитов — одно из последних достиже-
ний практического полинуклеотидного синтеза [40, 41]. При этом
применяется активированный фосфорилирующий агент и, таким
образом, отпадает необходимость в конденсирующем агенте.
Однако в качестве фосфорилирующего агента выступает не фос-
фат, а фосфит, повышенная реакционная способность которого
делает возможным одностадийное превращение in situ нуклеозида
со свободной З'-гидрокснлыюи группой в фосфомоноэфир, а за-
тем в фосфодиэфпр гцтем взаимодействия со свободной 5'-гид-
рокснльной группой второго нуклеозида, и наконец образуется
фосфат в результате быстро протекающего окисления иодом.
Реакционная способность хлорфосфита так велика, что обе реак-
ции фосфорилирования проводят при пониженной температуре.
Вся последовательность операций занимает меньше одного дня
(а время имеет большое значение при синтезе длинных полинук-
леотидов). Ниже приведена схема одностадийного синтеза защи-
щенного тпмндилил- (3'->5')-тимидина.
о
У
PhOCH2COCH2 о Th
и,с сн,
= -)8°С *
ОН
+
CI—р—С1
О(СН2)2С(С1)з
О(СН2)2С(С1)з
промежуточный пройукпг,
не выделяется
* Недавно появилось сообщение о том, что сульфотриазолиды могут приво-
дить к нежелательным побочным реакциям с защищенными гуанозином и ури-
дином [363].
Биоорганическая химия фосфатов
179
С\
(С1)3С(СН2)2-О/
MeOPh—С—О
И Ь/н.о
2) NH.OH
3) ао'.-наяАсОН
Ph
Синтез проводят п^тем добавления раствора первого нуклеозида в тетра-
гидрофурапе к раствору фосфорилирующего агента в лутпдине, выдерживания
смеси в течение короткого времени и затем добавления раствора второго нуклео-
зида в тетрагидрофуране. Только после завершения реакции приступают к окис-
лению, вводя кристаллический под, растворенный в смеси вода — тетрагидрофу-
раи. Окисление также проходит очень быстро. Конечно, такой порядок добавле-
ния реагентов приводит к образованию некоторого количества нежелательных
(3'-+3')- и (5'-»-5/)-изомеров. Например, если две молекулы первого нуклеозида
реагируют с хлорофоефнтом перед добавлением второго нуклеозида к реакцион-
ной смеси, произойдет образование (З'-^З')-изомера:
-78°С,лутидин
+ С1—Р—С1
I
О(СН2)2С(С1)3
(C1)3QCH2)2o-p:
Такие побочные продукты легко отделяются от искомого трнэфнра с помощью
хроматографии на силикагеле.
180
Глава 3
Аналогичный быстрый метод синтеза возможен также и для рибонуклеотидов,
как показано на примере образования урнднлнл-(3'->5')-уридина. В этом случае
как трпхлорэтнльная, так и силильная защитные группы могут быть одновремен-
но удалены при растворении триэфира в растворе фторида тетрабутиламмопия
в тетрагндрофуране.
Ph
Ph
MeOPh— С— ОСН
Ph
(С1)3С(СН2)2ОХ ХОСН
I -SiO OSi
I I
но он
Твердофазный синтез
Твердофазный синтез олигонуклеотидов не достиг такого же
высокого уровня, как твердофазный синтез пептидов. Оказалось
сложным подобрать подходящую нерастворимую матрицу и прео-
Биоорганическая химия фосфатов
181
долеть проблемы, связанные с нежелательными свойствами по-
лимеров п необратимой адсорбцией реагентов на матрице. Лишь
недавно* были описаны подходящие полимерные матрицы (на-
пример, силикагель для жидкостной высокоэффективной хрома-
тографии), пригодные для синтеза полимерных нуклеотидов.
Практическим стимулом, заставившим исследователей вплотную
заняться развитием твердофазного метода синтеза полидезокси-
рибонуклеотидов, послужило их промышленное использование
в «биотехнологии», или технологии рекомбинантных ДНК-
3.7. Химическая эволюция биополимеров
Белки (аминокислотные полимеры) и нуклеиновые кислоты (нуклеотидные
полимеры) —• это основа жизни. Ферменты — это белки, катализирующие хими-
ческие реакции, необходимые для процессов жизнедеятельности, тогда как ну-
клеиновые кислоты служат «банком» данных — хранилищем генетической инфор-
мации, сосредоточенной в клеточном ядре. В заключение этой главы мы кратко
рассмотрим происхождение этих биополимеров. С этой целью сформулируем не-
которые фундаментальные вопросы, на которых следует ниже остановиться
С чего начались химические процессы, необходимые для поддержания жизни,
или, другими словами, каким образом происходило образование пептидных свя
зей в пребиотпческин период? Как появились макромолекулы, имеющие важное
биологическое значение? Чем вызвана асимметрия и хиральность органических
молекул? На некоторые из этих вопросов хотя бы частично сумели ответить хи-
мики, пытавшиеся воспроизвести условия, которые существовали в примитивной
атмосфере Земли того времени.
3.7.1. Пребиотическое происхождение органических молекул
Химическая эволюция началась примерно 4,6 ±0,1 млрд, лет тому назад, и
лишь этот процесс, не считая биологической эволюции, занял примерно 1,5 млрд,
лет [42]. Пас особенно интересует тот период химической эволюции, во время
которого образовались сложные органические молекулы, «превратившиеся» затем
в живую материю.
Большинство ученых в настоящее время полагает, что эволюция жизни про-
шла через четыре стадии. Вначале происходило образование небольших моле-
кул (аминокислот, нуклеотидов, сахаров). Из этих строительных блоков образо-
вывались затем макромолекулы, такие, как белки и нуклеиновые кислоты. На
третьей стадии происходило образование клеточпоподобпой структуры, способной
к самовпспронзводству. На последней стадии эта примитивная клетка эволюцио-
нировала в современную клетку, содержащую генетическую программу синтеза
белка.
Полагают, что пребнотнческая, пли примитивная, атмосфера Земли в период
происхождения жизни обладала сильно восстановительными свойствами; кисло
род в атмосфере отсутствовал. Свободный кислород появился много позднее, в
основном как продукт фотосинтеза, проводимого зелеными растениями [42]. Эта
восстанавливающая атмосфера содержала такие газы, как СН4, NH3, N2, СО,
С02, Н2 п водяные пары. Сейчас существует много доказательств того, что реак-
ции между этими молекулами н неорганическими компонентами протекали под
воздействием энергии ультрафиолетовых лучей, электрических разрядов, тепло
вой, радиации, а также других форм энергии, таких как ударные волны
• Серия работ группы Карузерса открывается статьей, описывающей воз
нежности использования силикагеля в качестве нерастворимой матрицы дл
твердофазного синтеза олигонуклеотидов [367].
182
Глава 3
Такая носледовате шпость событий была впервые постулирована в 1921 г. со-
ветским ученым Л. И Опариным н английским ученым Дж. Холдейном. Химики
всегда желают экспериментального подтверждения любой теории. Возможно ли
это в данном случае? В 50-х гг Миллер с помощью сконструированной им уста-
новки попытался проверить обсуждаемое предположение. Была осуществлена
имитация примитивной атмосферы Земли (существовавшая 4 миллиарда лет тому
назад), для чего в качестве источника энергии использовалась электрическая
дуга. Удалось получить ограниченный набор соединений, половина из которых
представляла интерес с биологической точки зрения и ~1% составляла рацеми-
ческая смесь трех аминокислот — глицина, аланина и аспарагиновой кислоты. На
сегодняший день при дальнейшем развитии условий, предложенных Миллером,
уже получено семнадцать различных аминокислот. Вот лишь некоторые из тех
простых реакций, которые при этом происходят:
Н,
сн4 4- Н2О V=O + 2 Н2
Н
СН4 + NH3 Н—C=N + 3 Н,
Циановодород и формальдегид в свою очередь только предшественники более
реакционноспособных соединений, таких, как аминоацетоннтрил и амнноацето-
амид, взаимодействие которых может привести к аминокислотам, пуринам, пири-
мидинам и сахарам, например:
Н
^С=О + NH3 + HCN —H2N—СН2— CN + Н,0
11 оминоацетонитприл
нао
poly-GlyH3N— СН2— СООе H2N—СН2—
xnh2
йминоацетамиЭ
Это превращение напоминает хорошо известную реакцию синтеза аминокислот
по Штрекеру;
R-СНО + NH3 + HCN
R—СН—CN + Н,0
I
NH,
Гидролиз нитрила приводит к получению соответствующей аминокислоты
Оро впервые продемонстрировал синтез компонентов нуклеиновых кислот
[43, 44]. После кипячения концентрированного раствора цианида аммония в кол-
бе с обратным холодильником он получил с низким выходом аденин. Позднее
было обнаружено, что облучение ультрафиолетовым светом разбавленного рас-
твора HCN приводит к образованию аденина и гуанниа. Показано, что при этом
в качестве промежуточных соединений важную роль играют 4-амино-5-цнаноими-
дазол и 4-амннопмидазол-5 карбоксамид. Кроме того, из NH3 и HCN можно по-
лучить формамидин H2NCH = NH.
Крайне простой путь синтеза пурина (аденина) из HCN и NH3 состоит в сле-
ду ющем:
Биоорганическая химия фосфатов
183
CHN
2 HCN * N=C— CH-=NH N=C—С—МН2
I
Н
диншприл
аминомалоноеой
кислоты
Оргел п сотр обнаружили что в запаянной ампуле такое превращение про-
ходит с 40%-иым выходом [44]. Возможно, что адепнн был первым пурином,
образовавшимся на Земле, и интересно отметить, что именно этот компонент при-
сутствует в АТР и коферменте А. Оба соединения —необходимые участники мно-
гих биохимических реакций.
Следовательно, в отлнчие от ранее принятого мнения, что HCN играл да-
леко ие второстепенную роль при зарождении жизни, было постулировано, что
в водной среде протекает второй процесс, названный олигомеризацией HCN [45]:
2HCN
Н®
HN—СН—CN
HN=C^-CN
Н^е
:ОН
НМЛ'Ч'К
трине цис
Винитрил йиаминомалеинобой кислоты
184
Глава 3
H.N-CII=NH
гуанин
Согласно предложенной схеме, после образования из HCN тетрамера в ре-
зультате фотохимической реакции появляется кольцевая имидазольная струк-
тура. В отсутствие кислорода и в разбавленных водных растворах реакция про-
ходит с количественным выходом.
Цпановодород может также превращаться в цианацетилен и циановую кис-
лоту — предшественники пиримидинов. Этн реакции были воспроизведены в ла-
бораторных условиях. Ведь уже в 1828 г. Велер получил из циановой кислоты
н аммиака мочевину — первую «животную субстанцию», синтезированную из не-
органических соединений. Весьма вероятно, что все подобные процессы перво-
начально проходили в водной среде, причем ионы Н+ и 01k выступали в роли
кислотного или основного катализатора. Замечательно, что три основных класса
азотсодержащих бномолекул — пурины, пиримидины н аминокислоты — обра-
зуются при гидролизе олигомеров, которые непосредственно получены в разбав-
ленных водных растворах HCN. Синтез всех этих биомолекул на первобытной
Земле мог бы быть следствием постоянного образования HCN под действием
электрических разрядов и ультрафиолетового излучения. HCN, возможно, раство-
рялся в каплях дождя и переносился ими на поверхность Земли, где могла про-
исходить олигомеризация HCN с последующим медленным гидролизом; образую-
НС=С—C=N OCN—СН=СН—CN
цианацетилен
урацил
цитозин
Биоорганическая химия фосфатов
185
щиеся в результате биомолекулы использовались затем примитивными формами
жизни [369].
Для проведения лабораторных исследований необходимо знать условия реак-
ций, протекавших на первобытной Земле, причем следует отмстить, что ни бел-
ки, ни нуклеиновые кислоты ие образуются самопроизвольно в водных раство-
рах [47]. Самоконденсация формальдегида, другого возможного предшест-
венника живой материн, должна была бы привести к образованию сахаров
причем в присутствии СН< реакция протекает через стадию фотолиза воды
В общем пребиотнческая конденсация небольших молекул, таких, как Х’Н..
НгО, HCN, ЯСНО и HCs^C—CN, приводила к образованию строительных бло
ков для синтеза полиамннокислот, пли белков, а также полинуклеотидов, пли
нуклеиновых кислот. Оргел считает, что современное состояние живых организ-
мов определено непрерывностью процесса синтеза блоков, который проходил
на первобытной Земле. Ему удалось показать, что полнфосфаты, необходимые
для синтеза полинуклеотидов, могут образоваться при простом нагревании
ортофосфатов с мочевиной н ионами аммония [44]. С помощью современных
радиотелескопов большинство этих небольших молекул обнаружено также в
межзвездных облаках, что делает такие предположения более вероятными.
Однако еще до появления жизни на Земле должен был происходить процесс
саморепликацнп. Каким образом? Разумно предположить, что фундаментальное
значение для репликации нуклеиновых кислот н эволюции генетического кода
имели специфические нуклео-нуклеиновые и нуклео-белковые взаимодействия
[48]. Подобные процессы узнавания зависят от последовательности оснований и
аминокислот. Согласно Мак-Элрою [49], такие взаимодействия, вероятно, играли
ключевую роль при образовании белково-нуклеиновых комплексов н имели фун-
даментальное значение на ранних стадиях эволюции макромолекул.
Лишь недавно предложена [50] биоорганическая модель, которая может
объяснить «код», описывающий специфическое взаимодействие полинуклеотидов
и белков. При этом постулировано существование примитивного гибридного по-
лимера, или сополимера, содержащего рибонуклеиновую цепь (РНК), в 2'-поло-
жеииях которой ковалентно присоединены аминокислотные остатки. «Матрица»,
оргаиизоваиная таким образом, могла бы отвечать за специфическое полипептид-
полинуклеотидное узнавание, положившее начало современному генетическому
коду.
3.7.2. Концепция диссимметричного мира
Аминокислоты, полученные в экспериментах Миллера, представляли собой
рацематы. Более того, только рацемические аминокислоты были обнаружены в
Мерчисонском метеорите, упавшем в Австралии в 1969 г. Каким образом слож-
ные молекулы приобрели оптическую активность? Существует несколько различ-
ных гипотез по этому поводу. Акабори [46] предложил следующие превращения
при синтезе сложных полипептидов, которые были подтверждены эксперимен-
тально:
H,N—СН2—CN —(NH—СН2—С—NH—СН2—С)„—
|н3о» NH NH
н3о|х,мн.
H3N~ СН2 СООе —*-» —(NH—СН2—С—NH—СН2—От-
II II
О о
poly-Gly
|нсно
186
Глава 3
—(NH—СН—С—NH
-СН-С)-
СН2ОН
poly-Se'
СН2ОН
HjS
—(NH СН—С—NH
сн G-
CH2SH
poly-Cys
CHjSH
Важно отметить, что цианамид NH2—C=N, таутомерная форма карбодиимнда
HN=C = NH, мог бы играть роль примитивного конденсирующего агента в пер-
вых реакциях поллпептндного синтеза В высшей степени вероятно, что на пер-
вобытной Земле для реакций конденсации необходимы были высокореакционно-
способные соединения
Эти процессы приводят к образованию рацемических смесей. Однако счи-
тается, что при спонтанной кристаллизации происходило разделение смеси. Наи-
более вероятно, что разделение проходило случайным образом. Видимо, опреде-
ляющую роль в разделении оптически активных соединений путем селективного
комплексообразования одного определенного стереоизомера играли минералы,
как, например, природные асимметричные кристаллы кварца, и ноны металлов.
В конце концов, стереоселективная полимеризация олефинов на поверхности ме-
таллов (катализаторы Цнглера — Натта) представляет собой хорошо изученный
промышленный процесс для получения изотактических * полимеров. Известно
также, что связывание нонов металлов весьма важно для многих биохимических
превращений. Такое связывание существенно для поддержания нативной струк-
туры нуклеиновых кислот и многих белков и ферментов. Процесс отбора опти-
ческих изомеров мог происходить вследствие других физических явлений, напри-
мер взаимодействие с радиоактивными элементами, радиация или космические
лучи Недавно проведенные эксперименты с стропцнем-90 показывают, что D-th-
розпн быстрее разрушается, чем природный L-изомер. Весьма заманчиво при-
влечь эти факторы для объяснения происхождения диссимметричности в процес-
сах жизнедеятельности.
Оптическая активность считается необходимым условием при сворачивании
белковой цепи, и, вероятно, без днесимметричных молекул жизнь была бы невоз-
можна. Диссимметричными называются молекулы, не обладающие зеркальной
симметрией (нлн не имеющие плоскости симметрии). Следует отметить, что асим-
метричные молекулы (обладающие только одним элементом симметрии — осью
Ci) составляют особую группу диссимметричных молекул, хотя не все диссимме-
тричные молекулы являются асимметричными. Стереоизомеры имеют одинаковый
молекулярный скелет, однако различаются абсолютным пространственным рас-
положением атомов. Такне соединения оптически активны и характеризуются хи-
* Изотактические полимерные структуры возникают, если центр стернческой
изомерии в каждой повторяющейся единице полимерной цепи имеет одну и ту
же копфиг)рацню (гл. 4).
Биоорганическая химия фосфатов
187
ральностыо. Стереоизомеры, относящиеся как объект и его отражение в зеркале,
которые нельзя совместить наложением, называются энантиомерами. Стереоизо-
меры, не связанные такими отношениями, называются диастереоизомерами.
3.7.2.1. Матричный синтез
Можно ли с помощью химической реакции синтезировать полинуклеотид н
воспроизвести синтез ДНК? Да такую модель можно создать иа основе «прими-
тивных» матриц. Преобразованную нуклеиновую кислоту (матрицу) можно за-
тем использовать для направленного синтеза комплементарных молекул с приме-
нением хорошо изученной концепции Уотсона — Крика о спаривании оснований
(гл. 4). Оргел и сотр. [44] показали, что полиурпднловая кислота poly(U) мо-
жет выступать в роли матрицы в водных растворах, направляя конденсацию
5'активированного нуклеотида (АМР) в присутствии водорастворимого карбо-
диимида путем образования специфических комплементарных уотсон-крнковских
пар. GMP не принимает участия в синтезе, направляемом такой матрицей. Наи-
более удивительно, что комплементарный полинуклеотид, образующийся в этих
условиях, содержит только 2',5'-фосфоднэфирпые связи, тогда как все природ-
ные полинуклеотиды содержат 3',5'-фосфодиэфирные связи. Если использовать
2'дезоксинуклеотидпый аналог, чтобы избежать образования «неприродной»
связи, образуются 5',5'-связн, и лишь в специально подобранных условиях удает-
ся получить природные З'.б'-связи.
Если в матрицу, состоящую из пиримидинов poly (С), введено небольшое
количество пуринов (например, А), так что в некоторых районах имеется чередо-
вание пуриновых звеньев и пиримидиновых, то такая матрица более эффективно
нонуклеотидов GMP и димеров гуаниловой н уридиловой кислот) Следова-
тельно, полинуклеотиды способны к высокоспецнфнческому комплексообразова-
нию. Это наблюдение приводит к интересным предположениям относительно про-
исхождения генетического кода. Новообразованная комплементарная цепь содер-
жит преимущественно 2',5'-связи, тогда как ферментативная полимеризация с по-
мощью РНК-полнмеразы дает исключительно 3',5'-нзомер.
Эта проблема 2',5'- и 3',5'-связей элегантно решена Ашером [51] Фермен-
тативной деградацией длинных молекул poly (А) был получен додека нуклеотид
(рА)|2, содержащий только 3',5' связи, а с помощью химических методов — вто-
рой олигонуклеотид (рА)6-(рА)6, в котором лишь одна, центральная, связь пред-
ставляла собой 2',5'-связь. В растворе оба олигомера были в одинаковой сте-
пени устойчивы к щелочному гидролизу. Однако при прибавлении к ннм poly(U)
полимер, содержащий 2',5'-связь, быстро гидролизовался до двух молекул (рА)6.
Отсюда был сделан вывод, что в составе двойной спирали 2',5'-связь в 700 раз
менее прочна, чем природная 3',5'-связь.
На этом основано интересное предположение о том, что в процессе эволю-
ции молекул ДНК природные условия могли благоприятствовать 3',5'-связям.
На более поздних стадиях благодаря появлению ферментов такой процесс мог
стать определяющим, а таким образом, возможно, была вообще устранена потен-
циальная неоднозначность протекания реакции путем замены рибозы на 2'-дезо-
ксирибозу. К тому же образование двойных спиралей ДНК, как теперь известно,
способствовало сохранению наиболее прочных 3',5'-связей — пример дарвинского
отбора на молекулярном уровне. Эти наблюдения помогают также внести
188
Глава 3
ясность в вопрос о том, какая из молекул, ДНК или РНК, появилась первой.
Причины (с химической точки зрения), приводящие к большей прочности 3',5'-
связей по сравнению с 2',5'-связя:ин, понятны из сделанного ранее обсуждения
(разд. 3.3).
Наконец, можно задать вопрос: почему рибоза — единственный сахар, при-
сутствующий в полинуклеотидах? Ни один другой сахар не способен к столь
эффективной реакции конденсации соответствующих нуклеотидов, а З'-дезокси-
иуклеотиды не полимеризуются. Видимо, и 2'-ОН, и З'-ОН необходимы для про-
текания полимеризации. Причина этого заключается в образовании водородной
связи между обеими группами, которые только в рибонуклеотидах находятся в
цис-положении, что приводит к повышению кислотности
КО—ч о ОСНОбО-Ние Он-группы в 2'-положсппи. Еще одни важный факт
Vх состоит в том, что конденсация полинуклеотидов очень
специфична для нуклеотидов, рибозные остатки которых
/ % имеют D-конфигурацию. Оргел показал это экспернмен-
О Ое тально. Если смесь L- и D-рибочуклеотидов добавить
хН-‘ к poly(U) D-ряда, то участвовать в реакции полимери-
зации и образовывать комплементарную двухтяжевую
структуру способны только D-рибонуклеотпды. Это объясняется тем, что для
образования спирали пригодны полннуклеотидпые цепи одноименной ориента-
ции. Последнее замечание особенно важную в связи с рассмотрением проблемы
эволюции оптической активности в биологических системах.
3.7.2.2. Поздние стадии химической эволюции
Случайная ассоциация нескольких макромолекулярных структур, образован-
ных пребнотнческим путем, могла бы привести к благоприятной ситуации, обеспе-
чивающей повышенную выживаемость. Как только в реакцию вступила един-
ственная асимметрическая молекула, важное значение стали иметь стернческие
факторы. Таким образом, возник асимметрический синтез, а молекулярная эво-
люция привела ко все более сложным структурам. Первыми примитивными ка-
тализаторами могли быть короткие полипептиды. Появление длинных полипеп-
тпдпых цепей благоприятствовало образованию трехмерной глобулярной конфор-
мации, стабилизируемой как гидрофобными, так и электростатическими взаимо-
действиями между компонентами молекулы, и позднее онн эволюционировали в
ферменты. Такому макромолекулярному образованию требовалась молекулярная
информация для самовоспронзводства. Вот те минимальные требования, которые
должны были выполняться, чтобы появилась жизнь и возник примитивный мета-
болизм. Можно также представить себе, что подходящие неполярные взаимо-
действия липидов и жирных кислот привели к образованию мицеллоподобных
агрегатов (разд. 5.2), которые со временем превратились в мембраны примитив-
ных клеток. Опарин в своей теории происхождения жизни на Земле постулиро-
вал, что ассоциация основных химических структур привела к образованию по-
лимерных микросфер (названных им коацерватами) и такие обособленные ка-
пельки сыграли важную роль в возникновении жизни.
Позднее американский биохимик Фокс описал экспериментальные условия,
в которых термическая конденсация смеси аминокислот приводила к образова-
нию полимеров. Такие смеси полипептидов образовывали в соленой воде проте-
ноидные микррсферы и проявляли в присутствии АТР многие черты поведения,
характерного для клеток. Фактически «капли» Опарина и Фокса вели себя как
термодинамически открытые системы. Это составляет одно из фундаментальных
свойств живой материи.
Однако ответы на многие вопросы еще не найдены и потребуются совмест-
ные усилия специалистов в области полимерной, органической и биологической
химии, чтобы раскрыть тайну, окутывающую происхождение жизни на Земле
Глава 4
ХИМИЯ ФЕРМЕНТОВ
Воображение н проницательность — вот не-
дорогие и мощные средства научного по-
знания
Вант-Гофф
Для фермента характерна высокая степень специфичности и
эффективности реакции. Основная тема данной главы — особен-
ности реакций, катализируемых ферментами.
С этой целью при рассмотрении гидролитических ферментов
вводится понятие активный центр. Однако прежде всего следует
определить основные понятия катализа с привлечением теории
переходного состояния. Далее будет показано, что факторами,
определяющими ферментативную активность, являются сближе-
ние и соответствующая ориентация химических групп. Впослед-
ствии это поможет связать неферментативный гетерогенный ка-
тализ с ферментативным.
4.1. Введение в катализ
Ранее уже указывалось, что ферменты — это белки, выпол-
няющие роль катализаторов в биологических реакциях. Необхо-
димость таких катализаторов станет очевидной, если вспомнить,
что температура тела равна 37°С, а многие органические реакции
протекают только при более высоких температурах. Интересно
было бы понять, каким образом ферменты осуществляют свои
каталитические функции. Установление точного механизма дей-
ствия ферментов составляет фундаментальную проблему биоор-
ганической химии. Большая часть превращений происходит на
поверхности белкового катализатора на участке, обозначаемом
как активный центр, где химические превращения следуют основ-
ным закономерностям органической и физической химии. При
этом одновременно действуют несколько факторов, которые сле-
дует ограничить и исследовать отдельно с помощью специальных
моделей. Однако, чтобы оценить каталитическое превращение
реагента (субстрата) в продукт реакции, необходимо общее пред-
ставление о таком явлении, как катализ. Субстратом обычно на-
зывают химическое вещество, превращение которого катализи-
рует фермент.
Согласно определению, катализатор — это вещество, влияю-
щее на скорость химической реакции, но само при этом не из-
меняющееся. Именно таковы ферменты, которые до и после
190
Глава 4
пс
гО
реагенты
катализируемая
реакция
промежуточный продукт
(интермедиат)
} до0
продукты
Координата реакции
Рис. 4.1. Гипотетическая диаграмма измене-
ния свободной энергии реакции. ПС — пере-
ходное состояние.
Часто в ходе последующей реакции
каталитической реакции имеют одну и ту же форму (т. е. конфор-
мацию и химическую структуру). Это требование обязательно для
каталитической активности. Если бы катализатор менялся после
химической реакции с первой же молекулой субстрата, он был бы
затем не способен взаимодействовать со второй молекулой суб-
страта. Разумеется, необходимо присутствие лишь небольших ко-
личеств ферментов для осуществления катализа.
Катализатор способен и повышать, и понижать скорость хими-
ческой реакции. Однако обычно катализатором называют веще-
ство, ускоряющее реакцию; соединение, замедляющее реакцию,
называют ингибитором. Со-
гласно определению катали-
затора, он не тратится в
процессе реакции, а повтор-
но служит, способствуя пре-
вращению молекул. В био-
химии многие ферментката-
лизируемые реакции проте-
кают в присутствии других
соединений, которые также
можно считать катализато-
рами, но которые потреб-
ляются или изменяются в
ходе реакции, катализируе-
мой ими. Это коферменты.
коферменты вновь восстанав-
ливают исходную структуру, так что при рассмотрении суммар-
ного процесса их можно считать неизменяющимися. Подробно
химия этих соединений обсуждается в гл. 7.
Согласно Бендеру, роль катализатора сводится к обеспече-
нию нового пути реакции, в котором стадия, определяющая ско-
рость процесса (самая медленная), имеет более низкую свобод-
ную энергию активации, чем стадия, определяющая скорость
некатализируемого процесса. Далее, энергия для каждого пере-
ходного состояния катализируемой реакции ниже, чем самая высо-
кая энергия переходного состояния некатализируемой реакции
(рис. 4.1).
Согласно теории переходных состояний, процессы, происходя-
щие при столкновении реагентов, не учитываются. Считается,
что в реакции участвуют лишь два вида реагирующих веществ —
сами реагенты, находящиеся в основном состоянии, и крайне
неустойчивые частицы, проявляющиеся в процессе реакции,—
переходные состояния (ПС).
Теория переходных состояний связывает скорость реакции
с изменением свободной энергии Гиббса AG при образовании
переходного состояния из основного состояния. Эту теорию можно
использовать для количественной оценки реакционной способно-
Химия ферментов
191
сти компонентов ферментативных реакций и специфических взаи-
модействии, включая отдельные изменения в структуре субстрата.
Различают гетерогенный и гомогенный катализ. Типичный при-
мер гетерогенного катализа — гидрирование этилена в присутст-
вии металлического катализатора (например, палладия, платины
или никеля), который помогает сблизиться молекулам водорода
и этилена таким образом, чтобы они могли вступить в реакцию
друг с другом В то время как реагенты сорбируются на поверх-
ности металла благодаря наличию л-электронов в молекуле эти-
лена, продукт реакции (этан) десорбируется, освобождая место
для следующих реагирующих молекул.
При гомогенном катализе катализатор не образует отдельной
фазы. Например, кислотный гидролиз эсЬиров, в котором роль
О о
II м- II
Н2О + СН3—С—О R J==i СН3—С—ОН + ROH
катализатора выполняет протон и
с цианид-ионом как катализатором
бензоиновая конденсация
хО о
2 Ph——
Н
О ОН
II I
Ph—С—СН—Ph
Механизм катализа при кислотном гидролизе состоит в сле-
дующем-
О
сн3—с—OR + Н®
®он ОН
II I
СН3- С—OR •--» СН3—С—OR
ф
V:OH2
ROH +
®ОН
II
СН3-С
он
(VII
Ч н
СН3—С— OR 5==!
I ^®
ОН
он
СН3—С—OR
®ОН2
>0
сн3—c-f +н®
хон
Протонирование эфира делает карбонильный атом углерода бо-
лее электрофильным (обратите внимание на резонансные струк-
192
Глава 4
туры карбониевого иона), и, следовательно, он легче подвергается
нуклеофильной атаке молекулой воды.
Бензоиновая конденсация протекает следующим образом:
е
О
ОН
Г — :CN
Ph—С—CN
Ph—С—CN
е
:с=ео
Hz
G
CN
Н
Н
О ОН
Ph—С—С—Ph
Н
бензоин
,S
он
Ph—С—С—Ph
(CNH
е
ОНО
Ph—С—С—Ph
CNH
Альдегидный водород в бензальдегиде не проявляет кислотных
свойств, поэтому не происходит атаки второй молекулой бензаль-
дегида. Однако при присоединении цианид-иона и образовании
циангидрина тот же водород может диссоциировать, поскольку
карбанион стабилизируется цианогруппой из-за образования ре-
зонансной структуры, и происходит реакция.
Ферменты обладают свойствами, позволяющими им участво-
вать в обоих каталитических процессах (гетерогенном и гомо-
генном). Они способствуют взаимному приближению реагирую-
щих веществ на белковой поверхности либо экстрагируют их из
водной фазы внутрь гидрофобной полости. Они связываются с ре-
агентами, благодаря чему скорость химической реакции значи-
тельно увеличивается. Например, катализ гидролиза амидной
связи ферментом происходит не только благодаря протеканию
реакции на белковой поверхности, но и вследствие того, что
фермент химически взаимодействует с субстратом, образуя более
лабильный эфир, который затем и подвергается гидролизу
(см. ниже).
Для гомогенного катализа можно далее выделить специфиче-
ский кислотный, специфический основной, общий кислотный, об-
щий основной, нуклеофильный и электрофильный. В специфичес-
ком кислотном катализе как катализатор действует простой
протон, при специфическом основном — гидроксил-ион. При об-
щекислотном или общеосновном катализе действуют любые со-
единения кислотного или основного характера соответственно.
Ниже различные механизмы катализа показаны на реакции бро-
мирования ацетона. При специфическом кислотном катализе
Химия ферментов
193
реакция может протекать через еиолизацию [52]:
о II сн3-с—сн3 + н® <= ^ОН (ОН =* сн,—с^-сн, сн3—с=сн2 Vj г ( н ^Вг , Вг
О
СН3—С— СН2—Вг
При специфическом основном катализе она может проходить
через стадию енолизации: •
О
е
CHjC CIIj + он
о о
lie II
г=е СН3—С—СН2 =* СН3—с—СН2 + Вге
Т I
Br-.Br Вг
Реакция может также проходить по механизму общего кис-
лотного и/или общего основного катализа. Например, в буфер-
ном растворе, содержащем ацетат натрия, могут реализоваться
как общекислотный, так и общеосновной механизмы;
АсО®
НО
I
СН3—С=СН2 + АсОН
I*
пройукты
Нуклеофильный катализ можно определить как катализ хи-
мической реакции вследствие нуклеофильного замещения (ско-
ростьопределяющий процесс). Так, например, если какая-то реак-
ция нуклеофильного замещения проходит медленно, то реагент
может подвергаться атаке нуклеофильным катализатором и об-
разовывать промежуточное соединение, для которого нуклеофиль-
ное замещение в нужном направлении происходит легче, чем
для исходного реагента. Классический пример нуклеофильного
катализа — ацетилирование спиртов уксусным ангидридом в пи-
ридине:
О О о
и и U и
r он + сн3—с—о с—сн3 —» сн3—с—о—R + СН/ООН
1 Зик 549
194
Глава 4
На первый взгляд можно было бы подумать, что пиридин служи!
просто для связывания уксусной кислоты. Однако это не так
О _
+ СНзС0°в
R—ОН
продукты
отсутствие пиридина ацетилирование спирта шло бы
медленнее.
Другой хорошо известный пример нуклеофильного катализа
гидролиз /г-ннтрофенилацетата, катализируемый имидазолом:
СН3—СООН + HNX
Имидазол играет роль нуклеофильного катализатора,
в щелочной среде ОН~-ион способен выполнять роль акцептора
протонов, способствуя атаке нуклеофильного катализатора (ими-
дазола) на субстрат. Таким образом, ОН_-иои выступает как об-
щеосновной катализатор. В качестве переходного состояния мож-
но постулировать тетраэдрическое промежуточное соединение:
Н—ОН
тетраэдрический интермедиат
(переходное состояние)
Катализ имидазолом гидролиза /г-нитрофенилацетата — типич-1
ный пример нуклеофильного катализа; он может быть назван
Химия ферментов
195
также ковалентным катализом, так как субстрат подвергается
модификации, вступая в ковалентную связь с катализатором и
образуя промежуточный продукт.
Если при нуклеофильном катализе происходит подача электро-
нов от катализатора к субстрату, то при электрофильном ката-
лизе происходит оттягивание электронов, или перенос электрон-
ной плотности, от субстрата к катализатору. Ионы металлов —
отличные электрофильные катализаторы. Электрофильный ката-
лиз особенно существен для химии фосфатов, поскольку отрица-
тельные заряды атомов фосфора стремятся оттолкнуть нуклеофи-
лы. Например, синтез 3',5'-гуанозинциклофосфата (cGMP,
разд. 3.4.2) из гуанозинтрифосфата заметно ускоряется в при-
сутствии двухзарядных катионов металлов (например, Mg2+,
Мп2+, Ва2+, Zn2+, Са2+).
Катализ ионами металлов проявляется и в реакции гидролиза
АТР. В обоих приведенных примерах ион металла образует комп-
лекс, соединяясь через атомы кислорода трифосфатной группы,
и смещает электронную плотность от атома фосфора, делая его
более электрофильным.
При катализе ферментами химической реакции может реали-
зоваться любой из вышеприведенных механизмов катализа. На-
пример, имидазольное кольцо остатка гистидина в ферменте
а-химотрипснн (разд. 4.4) способно играть роль общеосновного
катализатора, тогда как в ферменте щелочная фосфатаза тот же
остаток может действовать в качестве нуклеофильного катали-
затора. Действительно, ферменты — это сложные катализаторы,
в ходе действия которых реализуется несколько механизмов.
Именно благодаря успешному сочетанию разных каталитических
процессов скорость катализируемой реакции повышается в 1014
раз (по сравнению со скоростью некатализируемой реакции). Бо-
лее того, именно такая комбинация факторов приводит к специ-
фическому катализу.
Для того чтобы полнее показать значение имидазола в ката-
лизе, рассмотрим его в роли основного катализатора, который
очень часто участвует в химических реакциях. Например, гидро-
лиз карбоновых кислот катализируется и по общекислотному, и
по общеосновному механизму.
7*
196
Глава 4
О
О
R—СН2—С—OEt
R—СН2—С—OEt
О
Н Н
N^NH
О.
Н "Н.
переходное состояние
HN^NH
R—СН2—СООН
R—СН2—С— OEt
EtOH
ОН
HN^NH
HN^N
тетраэдрический
интермедиат
Гидроксил-ноны и имидазол — акцепторы протонов; они мо-
гут принимать участие па стадии, определяющей скорость реак-
ции гидролиза эфиров путем общеосновного катализа.
Почему при участии основания скорость реакции возрастает?
Можно указать много причин. В основном это происходит благо-
даря тому, что основание (имидазол) связывает в переходном
состоянии (ПС) протон атакующей молекулы воды, так что на
атоме кислорода в составе последней сосредоточена повышенная
электронная плотность. Таким образом, этот атом кислорода
воды становится более отрицательно заряженным и возрастает
его способность передавать электронную пару карбонильной
группе. Суммарный результат — понижение свободной энергии
активации в присутствии основания. В отсутствие катализатора
протон акцептирует вторая молекула воды, которая обладает
меньшей основностью и, следовательно, является менее эффек-
тивным катализатором.
Важный вопрос при изучении механизма катализа состоит
в следующем: каким образом можно отличить общеосновной ме-
ханизм катализа от нуклеофильного?
Как видно из вышеприведенных реакций, переходное состоя-
ние включает молекулу воды. Таким образом, имеет смысл про-
водить реакцию в 2Н2О. Связь 2Н—О прочнее, чем связь Н—О,
так что энергия перехода дейтериевого иона выше. При основном
механизме катализа реакция в 2Н2О идет со скоростью в 2—3
раза меньшей, чем в Н2О.
В то же время при нуклеофильном катализе скорости реакций
в обоих растворителях одинаковы, например гидролиз ангидри-
1
1
т
I
г
т
Л
Л
г
Химия ферментов
197
дов в присутствии формиат-ионов. Формиат-ион проявляет менее
основные свойства, чем ацетат, ио представляет собой лучший
нуклеофил. Кроме того, при нуклеофильном катализе образуется
нестабильное промежуточное ацилыюе производное, которое при
избытке нуклеофила накапливается.
В менее полярных растворителях (вода плюс спирт) соеди-
нения менее сольватированы, и их активные группы охотнее взаи-
модействуют друг с другом. Такой пример относится к полифунк-
циональному катализу, при котором одновременное присутствие
кислоты и основания может оказывать больший (кооперативный)
эффект, чем просто сумма отдельных эффектов. Однако, для
того чтобы такой кооперативный механизм имел место, необхо-
димо, чтобы четыре частицы — субстрат, нуклеофил, общекис-
лотная и общеосновная группа — выстроились в определенном
порядке. Вероятность такой ситуации гораздо ниже, чем столкно-
вение трех молекул при реализации общеосновного или общекис-
лотного катализа.
Взаимодействие четырех частиц для осуществления коопера-
тивного эффекта возможно в нативном центре фермента, в кото-
ром одновременно присутствует несколько типов каталитических
групп. Это частично объясняет эффективность ферментов в роли
катализаторов.
В том случае, когда нуклеофил находится в составе той же
молекулы, говорят о внутримолекулярном катализе. Поясним это,
показав участие аминогрупп в гидролизе эфиров. Катализ может
проходить по четырем механизмам:
1) внутримолекулярный нуклеофильный катализ
<«
/С—OR
("
VN Н
I
ймииоэфир
если амин первичный
или вторичны^ то
лактам устойчив
СООН
NH
I
2) внутримолекулярный обшеосновной катализ
О'!
1г
С—OR
168
Глава 4
3) внутримолекулярный общекислотно-общеосновной (специфи-
ческий) катализ © . OR
ОН\|
(С—О участвуют противоположно
Ун заряженные частицы
®N-
4) электростатическое взаимодействие
е OR
НО\| о, ,
(С=о единственный механизм
в/' с участием четвертичною
N..R'" амина.
/\
R' R"
Первые три механизма кинетически неразличимы, однако вто-
рой и третий можно, вероятно, отличить от первого с помощью изо-
топного эффекта в дейтерпйсодержащем растворителе. Третий ме-
ханизм должен быть чувствителен к влиянию ионной силы, и таким
образом его можно отличить от второго, поскольку второй
механизм не предполагает участия электрически заряженных ча-
стиц. Два последних механизма сходны между собой, однако
третий предпочтительнее. При наличии хорошей уходящей груп-
пы, вероятнее всего, реализуется первый механизм [53].
До сих пор обсуждался только гомогенный катализ, при ко-
тором все реагирующие соединения и катализатор находятся в
одной фазе (в растворе). При гетерогенном катализе в реак-
ционной смеси присутствуют по крайней мере две фазы. Как
уже упоминалось выше, более обычны системы, в которых твердый I
катализатор находится в контакте с субстратами в газовой или!
водной фазе [356, 368].
Можно провести много аналогий между гетерогенным ката-1
лизом при полимеризации олефинов и тем способом, которым!
осуществляется катализ природных химических реакций, в ча-
стности ферментативный катализ. Действительно, гетерогенный
катализ во многих отношениях напоминает ферментативный. Мо-
лекула субстрата сталкивается с активным центром на поверхно-
сти твердого катализатора, образуя адсорбционный комплекс.
Адсорбированный субстрат реагирует в одну или несколько ста-
дий под влиянием каталитических групп активного центра. И на-
конец продукт десорбируется (или удаляется) из активного цент-
ра. Таким образом, и для ферментативного, и для гетерогенного
катализа говорят об активном центре и образовании комплекса
субстрата с активным центром. Осмысление этих понятий помо-
гает сопоставить неферментативный и ферментативный катализ.
Тем не менее существует и принципиальное различие, поскольку I
большинство ферментов несут только один активный центр на
молекулу, тогда как в гетерогенных катализаторах на одну ча-
с
т
(
к
т
о
Химия ферментов
199
опту приходится много активных центров. Кроме того, в гете-
рогенных катализаторах эти центры не обязательно идентичны.
Важное значение имеет также представление об упорядочен-
ной геометрии каталитического центра; именно благодаря такой
геометрии л-комплексы металлов и олефинов дают упорядочен-
ные структуры. Например, модель ннкельциклододека-
триена показывает, что атом никеля находится точно
в центре кольца: «ключ» подходит к «замку» очень
точно —вот еще одна аналогия с фермептсубстратпым
комплексом.
Гетерогенные катализаторы весьма широко распространены в нефтехимиче-
ской промышленности и в синтезе пластических масс. Хорошо известен катализа-
тор Циглера — Натта для полимеризации олефинов разработанный в 50-х гг.
Он образован парой Т1С14-А1Е13. Переходный металл Ti(IV) представляет собой
координирующий центр; металлорганическая часть молекулы выполняет роль ак-
тиватора (восстановителя), алкилируя активный центр (ион титана) и вытесняя
один лигандный атом хлора:
Cl—Ti—Cl + Al(Et):
Инициация:
C2HS
C2H5 •Al
I ..«Cl ]
Cl—Ti:---Cl
С2н,
Cl
Cl
с2н5
I-
Cl—TiO + Al(Et)2Cl
СГ I
Cl
Продолжение реакции:
а- СВЯЗЬ
CH2
I ...Cl
Cl-TiO + /
Cr I CH
С1
активный центр
Пс. С\ >Н
CI—Тг....II
С1 НН
л-комплекс
СН
CH
CH2
..Cl
Cl-TiO
сг
Cl
мгапаноаление
шейного активного
миграция
цепи
О 9^
' V..C1T.H
Cl—Ti. ir
cH ^^CH3
Cl
активный центр
(а-связь)
CH2
I >1-
Cl—Ti...
СН3 н
С1
перелойное
состояние
н 'н
Рис. 4.2. Структура поверхности решетки трнхлорнда титана, а — ион титана t
активном центре со свободным координационным местом; б — молекула пропи-
лена, связанная в комплекс с ионом титана в активном центре. Черный кружа
изображает растущую цепь полимера [54], © 1962 by the Chemical Society.
И---------------------------------------------’---------------
Химия ферментов 201
Собственно катализатор — это титан: алюминий лишь инициирует реакцию
путем алкилирования. Алкилированный комплекс на поверхности титана, обра-
зованный таким образом, обладает свободным «местом» для лиганда (свободной
орбиталью), ориентированным в направлении олефина (рис. 4.2 ).
Далее, ион титана обладает именно такой электронной структурой, которая
позволяет ему образовать прочную ковалентную связь с алкильной цепью, при-
чем эта последняя становится лабильной только в присутствии олефнна, обра
зующего л-связь, что и приводит к облегченной миграции лиганда. Этот переход-
ный комплекс затем образует новую Со-связь между Ti и олефином; дальней-
ший рост цепи происходит путем миграции цепи и присоединения следующего
олефина к первоначальному центру связывания.
Реакция стереоспецнфична, поскольку каждый новый непредельный мономер
всегда вступает в реакцию, находясь в качестве лиганда в одной и той же по-
зиции относительно активного центра титана. Образуется стереорегулярный по-
лиолефин, все заместители которого ориентированы в одном направлении. Это
изотактический полимер. Если группы последовательно меняют направление ори-
ентации, то это синдиотактический полимер. Если ориентация заместителей слу-
чайна, говорят, что соединение атактическое.
.... изотактичеслий
полипропилен
. = !« синЭиотактически
11= полипропилен
I . 1 = 1 атактический
1=1 полипропилен
Таким образом, под влиянием металлических катализаторов полимеризация
I олефинов может протекать с высокой степенью специфичности с образованием
I кристаллических полимеров, в которых все мономерные единицы расположены
I одинаковым образом. Для этого в процессе синтеза полимера необходимы регно-
I к стереоспецифические взаимодействия между растущей цепью полимера, ката-
I дозатором и реагирующим мономером.
Этот уникальный пример катализа на твердой поверхности имеет много об-
I щего с ферментативной реакцией. В частности, в определенной области на по-
I верхности металла находится активный центр, в котором происходит превраще-
I кие «субстрата», и реакция всегда стереоспепифнчпа.
I 4.2. Ферменты. Общие понятия
В самом широком смысле фермент — это белок, обладающий
I каталитической активностью. Более точно его можно определить
I как полипептидиую цепь или совокупность полипептидиых цепей,
I обладающих в нативной форме каталитической активностью Это
I сложный сополимер, состоящий из мономеров — аминокислот, на-
I холящихся в одинаковой конфигурации. Катализ происходит
I в специфической области фермента, которую называют катали-
I гическим центром или каталитической щелью. Активный центр
на в I №0ИТ из остатков аминокислот, которые участвуют в узнавании
>опи- I повязывании субстрата, а в каталитический центр входят только
ужок I остатки аминокислот, прямо участвующих в процессе катализа,
fty I Согласно существующему представлению об активном центре,
I лишь некоторые группы в составе ферментов вызывают его вы-
I сокую каталитическую активность, очень часто комплементарным
202
Глава 4
путем. Понятие «матрица», предполагающее неизменяемость!
«ключа» и «замка», служит для грубого приближения в попима-1
пни процесса связывания субстрата и фермента [55, 56].
Отличительное свойство фермента — специфическое связыва-1
пие субстрата; реакция ограничена ферментсубстратным комплек-1
сом. Таким образом, чтобы понять, как работает фермент, необ-
ходимо знать не только структуру нативного фермента, но также!
структуру комплексов, образуемых ферментом с субстратом, про-
межуточными соединениями и продуктами.
Последовательность аминокислот, пли первичная структура!
фермента, определяет вторичную и третичную (трехмерную)!
структуры, т. е. свертывание пептидной цепи в макромолекуляр-1
ную глобулу, имеющую некоторую определенную полость для!
взаимодействия с субстратом или, если необходимо, с кофермен-1
том. Ферменты обладают сложной и компактной структурой,!
в которой боковые цепи полярных аминокислот, находящиеся на
поверхности молекулы, направлены к растворителю, а боковые!
цепи неполярных в общем случае ориентированы внутрь молеку-
лы, от растворителя. Трехмерная структура поддерживается боль-
шим количеством внутримолекулярных нековалентных взаимодей-1
ствин аполярпоп, пли гидрофобной, природы, а также благодаря!
ионным взаимодействиям, дисульфидным мостикам, водородным!
связям, иногда солевым мостикам [57]. Гидрофобные взаимодей-1
ствпя имеют наиболее важное значение, поскольку они, вероятно,!
ответственны за большую величину свободной энергии связыва-|
нпя, которая наблюдается при ферментсубстратных взаимодей-1
ствиях.
Почему ферментами могут быть только высокомолекулярные!
соединения? Причина заключается в том, что активный центр!
должен иметь определенное, высокоупорядоченпое строение, по-1
скольку все аминокислотные остатки, ответственные за связыва-1
ние и каталитические превращения, должны располагаться вполне I
определенным образом, чтобы создать условия для оптимального I
катализа. Это накладывает на систему жесткие энтропийные тре-1
боваиия, которые могут быть компенсированы за счет другой,
уже упорядоченной области биополимера [58].
Наиболее очевидный способ, с помощью которого фермент |
увеличивает скорость бимолекулярной реакции,— способствовать!
простому сближению реагирующих молекул в активном центре I
фермента. В этой связи возникают два важнейших вопроса: во-1
первых, какого увеличения скорости можно ожидать при таком ]
сближении реагентов и, во-вторых, каков механизм этого увели-1 е
чения скорости. В настоящей главе мы постараемся прояснить I 1
эти вопросы. Изменение степени сольватации также способне I ,
вызвать значительный эффект увеличения скорости как в меж- £
молекулярных, так и в ферментативных реакциях. Неполярная [ п
внутренняя область фермента напоминает своей низкой дпэлект- | н
Химия ферментов
203
рической проницаемостью органический растворитель. Электроста-
тические взаимодействия более не затрудняются экранированием
молекулами растворителя и благодаря этому становятся сильнее.
Прежде чем установить факторы, ответственные за специфич-
ность действия ферментов, вновь следует подчеркнуть важность
хиральности.
4.2.1. Молекулярная асимметрия и прохиральность
Ферменты катализируют биохимические реакции стереоспеци-
фично. Вследствие этого асимметрический синтез в природе про-
исходит повсеместно и чаще всего в единственном направлении.
Следовательно, большинство природных соединений оптически
активно, потому что получены при каталитическом действии фер-
ментов, обладающих определенной трехмерной структурой. В са-
мом общем виде можно сказать, что между субстратом и актив-
ным центром фермента существует точное геометрическое соот-
ветствие. Например, фермент триозофосфатизомераза катализи-
рует превращение оптически неактивного дпоксиацетонмонофос-
фата до о-глицеральдегид-З-фосфата [59]. Субстрат имеет прохи-
ральный центр *, и один атом водорода специфически переносится
с одной стороны (ге-поверхности) двойной связи на карбонильную
* Понятие «прохиральность» и ранее предложенная номенклатура npo-S-,
npo-R-конфигураций были в окончательном виде разработаны Хансоном в 1966 г.:
«Если при замене точечного лиганда в конечной ахиральной совокупности то-
чечных лигандов новым лигандом образуется хпральная совокупность, то исход-
иая совокупность прохиральна». Точечные лиганды — это химические группы,
присоединенные к прохиральному центру. На.практике группу обозначают как
npo-fi(I[K)-заместитель, если при ее замене или модификации возникает хнраль-
ная молекула с ^-конфигурацией [60]. Хансон также предложил систематиче-
ский способ обозначения поверхности тригональных атомов, как, например, угле-
род в карбонильной группе С—О. Тригональный прохиральный центр планарен
и изображается следующим образом:
«У-конфигурация
ге-поверхность
атаки
Трем группам, окружающим атом углерода, приписываются приоритеты а, b и с
в соответствии с R, S номенклатурой Кана — Ипгольда — Прелога Если последо-
вательность приоритетов замещающих групп а, Ь, с расположена по ходу часо-
вой стрелки, то поверхность, обращенная к читателю, называется ге-поверхпостью
(от лат. rectus), если против часовой стрелки, то «(-поверхностью (sinister).
В случае необходимости учитывают атомы, присоединенные к С и О, чтобы при-
пасать приоритеты на основании атомных номеров атомов, окружающих карбо-
виаьную группу.
204
Глава 4
группу. Именно первоначальная хиральность фермента определяет
правильное направление реакции.
Приведем еще один пример — это предпочтительный обмен
с протоном молекулы воды протона Hs, а не НЛ в реакции обра-
зования дифосфата фруктозы, катализируемой альдолазой, если
в ней участвуют оба субстрата.
СН2ОРО32'
альволааа
-он
-он
CHjOPOj2-
Н*^ ХОРО32в
Зиоксиацетпон*
монофосфат
Н&, /ОН Ц»омера>а
D-глицералъбегиЗ-
3-фосфат
ФРуктомН,Б-Зифосфат
В основе этой стереоселектпвностн лежит специфическое яв-
ление, называемое эффектом Огстона [61]. В 1948 г. Огстон выд-
винул предположение о том, что фермент асимметрическим об-
разом взаимодействует с симметричным субстратом, если связь
с субстратом осуществляется по крайней мере в трех точках.
Только в этом случае возможно стереоселективное взаимодействие
или стереоселективная реакция синтеза. В общем виде для сое-
динения типа
фермент может выбирать между похожими группами х, посколь-
ку оба переходных состояния при атаке любого хирального реа-
гента по любому из х представляют собой стереоизомеры, и,
следовательно, скорости реакций, проходящих через эти состоя-
ния, различны. Эта гипотеза лежит в основе понятия «прохираль-
ность» и является отправной точкой в стереохимических иссле-
дованиях ферментативных реакций, проходящих в прохиральном
центре.
Например, алкогольдегидрогеиаза дрожжей YADH — первая алкогольдегнд-
рогеназа, которую удалось получить кристаллической и для которой было пока-
зано, что возможен прямой перенос атома водорода между субстратом и ко-
ферментом. В 1953 г. Вестхаймер [62] использовал этанол, меченный дейтерием,
чтобы показать, что процесс стереоспецифнчен и что только одни из энантиотоп-
них протонов, присоединенных к С-1 первичного спирта, переносится на С-4
3-ацетамидпиридиниевого цикла кофермента NAD+ (P.PPRA — остаток кофер-
Химия ферментов
205
пента). При использовании /М-дсйтероэтаиола весь дейтерий обнаруживается
на верхней стороне плоскости ароматического остатка кофермента (более по-
дробно об этом коферменте см. гл. 7). Новый асимметрический атом углерода
в NAD2H обладает ^-конфигурацией. Если вместо этого использовать S-1-дейте-
роэтанол, вся метка обнаруживается в ацетальдегиде, но не в восстановленном
коферменте. Эта реакция, когда кофермент и субстрат удерживаются в актив-
ном центре фермента специфическим образом, представляет собой особенно удач-
ный пример эффекта Огстона. Фермент способен однозначно делать выбор ме-
жду двумя идентичными атомами водорода, связанными с прохиральным угле-
родным атомом этанола. Обратная реакция, разумеется, также стереоспецнфпчна.
Еще более ярким примером асимметрического синтеза являет-
ся процесс фотосинтеза в растениях, где солнечная энергия пре-
вращается в химическую с помощью молекул хлорофилла. В этом
многостадийном процессе ахиральный диоксид углерода превра-
щается в конечном счете в в-глюкозу.
Суммируя сказанное, можно сделать вывод, что множество
природных соединении (гормоны, витамины, биополимеры и т. д.)
становятся хиральными вследствие диссимметрического воздейст-
вия, оказываемого па них ферментами и другими органическими
соединениями при биохимических превращениях.
’ | 4.2.2. Чувственное восприятие на молекулярном уровне
Все люди, в том числе и мы с вами, воспринимаем мир с по-
мощью пяти органов чувств: обоняние, вкус, осязание, зрение и
слух. Чувственное восприятие представляет собой хороший при-
», I мер адаптации па молекулярном уровне, и в этой связи рассмот-
i- | рим далее возможности первых двух видов восприятия. Запах,
как и вкус, возникает при прямом контакте молекул с обопя
206
Глава 4
тельным (или вкусовым) эпителием. На его мембране пли по-
верхности находятся хеморецепторы, при действии стимулирую-
щего вещества па которые развивается характерное органолеп-
тическое ощущение. Специфическое взаимодействие между не-
большими молекулами и рецепторами
I j I о связано с установлением равновесия
\ между процессами абсорбции и десорб-
LJ I к/* ции, которое химик может изучать, ис-
Т ! I пользуя модели.
I Например, /?- и S-карвон — энантио-
Л-карвон s-карвон меры; /?-изомер пахнет тмином, тогда
как у S-изомера запах мяты.
/?-Карвон можно химическим путем превратить в другой тер-
пен, встречающийся в природе, (+)-лимонен. Запах последнего
похож на запах апельсина. (-(-)-Лимонен можно восстановить
либо до цис-, либо до транс-л-ментена-8. Соединение с транс-кон-
фигурацией сохраняет запах, напоминающий запах апельсина,
цис
а цис-соединение обладает неприятным запахом, напоминающим
запах углеводородов. Эти примеры показывают, что запах зави-
сит от геометрии молекулы. Похожие запахи, вероятно, присущи
молекулам с близкими размерами, и эти размеры обусловливают
взаимодействие со специфическими рецепторами. Таким образом,
паша обонятельная система достигла такого уровня молекуляр-
ной сложности, что может «чувствовать форму молекул».
Вкус также «чувствует» различие в строении энантиомеров.
ь-Глутаминовая кислота придает вкус мяса и раньше использо-
валась для усиления вкусовых качеств мяса. В то же время D-изо-
мер почти безвкусен. Обнаружено, что белки таумалин (М»
« 21 000) и монеллин (М » 10 700) придают сладкий вкус. Еще
более сильнодействующее вещество, меняющее вкусовые ощуще-
ния,— миракулин (Л4« 44 000), найденный, как и первые два,
в африканских ягодах; это вещество меняет вкус кислот на слад-
кий. Монеллин содержит 92 аминокислотных остатка. Для того
чтобы вызвать ощущение сладкого вкуса, необходимо, чтобы ои
сохранял свою нативную третичную трехмерную структуру. На
Химия ферментов
207
самом деле этот белок построен из двух ковалентно-несвязанных
цепей, содержащих 50 и 42 остатка. Ни одна из них в отдель-
ности не вызывает сладкого вкуса. Это пример молекулярного
узнавания на конформационном уровне.
Важное значение геометрии молекул для процессов жизнедеятельности по-
кажем еще на одном, последнем, но красивом и практически важном примере.
Самки некоторых насекомых (а иногда и самцы) способны выделять несложные
органические вещества, например бомбикол (Bombyx tnori) или ювенильный
гормон из гемолимфы личинок Manduca sexta. Обычно эти вещества имеют изо-
преноидную структуру. Ювенильные гормоны служат для задержки развития
бомбикол
(10- транс-12- цис-гексадекадиено i-l
ювенильный гормон
насекомых па стадии личинки или препятствуют выведению насекомых из янц.
Эти гормоны продуцируются corpus aliatum и участвуют в регуляции морфоге-
неза и виталогенеза. Эти соединения — высокоактивные химические медиаторы.
С помощью некоторых подобных соединений осуществляется связь насекомых
между собой они могут восприниматься антеннами мужской особи того же вида
с очень большого расстояния и привлекать се с целью спаривания. Такого рода
половые аттрактанты, как, например, бомбикол, называются феромонами. Другие
геометрические изомеры не оказывают влияния на тех же насекомых. Найденные
закономерности помогают ученым в разработке биологических средств (биоселек-
тивиые инсектициды) борьбы с сельскохозяйственными вредителями, благодаря
чему можно отказаться от применения химикатов, которые более опасны для
здоровья животных и человека. Возможно также использование синтетических
аналогов, имитирующих подобное действие.
Ш. Факторы, определяющие специфичность ферментов [55, 56]
Известно, что ферменты проявляют три уровня специфичности:
аруктурную специфичность, региоспецифичность и стереоспеци-
фичность. Во-первых, фермент должен узнать некоторые общие
структурные свойства субстрата (и кофермента) для проведения
специфического катализа. Во-вторых, каталитический акт должен
произойти в определенном районе субстрата (или кофермента),
причем стереохимия изменения контролируется ферментом.
Удачным примером вновь может служить восстановление ке-
тонов коферментом никотинамидадениндинуклеотидом (NADH) и
мкоголь дегидрогеназой (см. в разд. 7.1.2 возможное использова-
208
Глава 4
ние в органическом синтезе).
NADH
гомотопные
атомы воЗороЗа
энантиотопные
атомы воЗороЗа
^-конфигурация
Карбонильная группа кетона имеет две поверхности, поэтому
говорят, что она энантиотопна. В присутствии фермента кофер-
мент NADH избирательно отрывает атом водорода Нд только
с задней стороны плоскости карбонильной группы, причем обра-
зуется хиральный спирт, в котором метиленовые атомы водорода
становятся диастереотопными. Однако метильные атомы водорода
неразличимы для фермента и называются гомотопными. В данном
примере атом водорода НА (npo-R) кофермента переходит к суб-
страту, а другие дегидрогеназы обладают иной региоспецифич-
ностью, так что мигрирует атом водорода Нв (npo-S).
Реакции, катализируемые ферментами, подчиняются принципу
микроскопической обратимости. Согласно этому принципу, меха-
низм любой обратной реакции соответствует лишь обращенному
механизму прямой реакции. Эта термодинамическая концепция
очень полезна при исследовании природы переходного состояния
на основании сведений об обратной реакции. Конечно, фермен-
ты — это наиболее специфичные и мощные катализаторы в при-
роде. Ни один из катализаторов, изготовленных человеком, не
обладает той огромной катализирующей способностью, которую
ферменты проявляют в мягких физиологических условиях. При
этом наблюдается повышение скорости реакции в 1010—Ю14 раз
по сравнению со сходными неферментативными реакциями.
Наиболее глубокое отличие ферментов от других катализато-
ров состоит в их способности связывать субстраты в непосредст-
венной близости друг от друга и от каталитических групп фер-
мента. Таким образом, ферменты ускоряют реакцию путем сбли-
Химия ферментов
209
жения реагирующих атомов (эффект сближения), а также благо-
даря соответствующей ориентации нужных химических групп. Ра-
зумеется, эффекты сближения и ориентации играют очень важ-
ную роль при катализе. Статистическое столкновение молекул —
слишком ненадежный процесс для того, чтобы прошел специфи-
ческий и эффективный катализ. Необходимо задать направление
взаимодействия. Это направление может быть определено путем
образования стереоспецифического комплекса с субстратом. Нуж-
ная стереохимическая ориентация катализатора и субстрата при-
ведет к выигрышу в энтропии активации, что способствует эффек-
тивности катализа.
Вообще говоря, возможны четыре типа факторов, определяю-
щих каталитическую активность фермента. Во-первых, необходим
химический аппарат в активном центре, способный деформиро-
вать или поляризовать химические связи субстрата, что делает
последний более реакционноспособным, во-вторых,— связывающий
центр, иммобилизующий субстрат в правильном положении к дру-
гим реакционным группам, участвующим в химическом превра-
щении, в-третьих,— правильная и точная ориентация субстрата,
благодаря которой каждая стадия реакции проходит с минималь-
ным колебательным или вращательным движением вокруг свя-
зей субстрата, и, наконец, в-четвертых, способ фиксирования суб-
страта должен способствовать понижению энергии активации
ферментсубстратного комплекса в переходном состоянии. Соот-
ветствующее распределение зарядов в активном центре и геомет-
рия активного центра входят в число факторов, определяющих
снижение суммарной энтропии переходного состояния. Все эти
факторы в той или иной степени влияют на структуру активного
центра фермента, и их нельзя рассматривать изолированно, вне
связи друг с другом. В совокупности они увеличивают скорость
ферментативной реакции и позволяют ферменту выступать в роли
мощного катализатора [77].
Влияние указанных факторов можно оценить экспериментально с помощью
модельных систем. В нескольких биохимических моделях удалось достигнуть уве-
личения скорости реакции примерно иа такой же порядок, что и в аналогичных
реакциях, катализируемых ферментами.
4.1.4. Внутримолекулярный катализ
Внутримолекулярный кислотно-основной катализ представляет
собой эффективный способ ускорения реакций в органических
системах. Однако было бы полезно оценить вклад этого вида ка-
тализа в ферментативный катализ. Существует принципиальное
различие между ферментативными химическими реакциями и
реакциями в растворе. Скорость каталитических реакций в рас-
творе описывается уравнениями второго порядка; скорость уве-
личивается с увеличением концентрации катализатора. Реакции
210
Глава 4
в ферментсубстратном комплексе — реакции первого порядка, а
кислотные и основные группы входят как составная часть в мо-
лекулу. Влияние кислотных и основных катализаторов на такую
систему можно оценить, синтезируя модельные соединения, так
чтобы каталитические группы входили в состав субстрата. В этом
случае можно сравнить скорости реакций со скоростями соответ-
ствующих межмолекулярных реакций. Рассмотрим две реакции:
При внутримолекулярной реакции наблюдается увеличение
скорости по сравнению с межмолекулярной реакцией в 1015 раз,
так что молекула образует лактон даже в щелочной среде! Аро-
матическая метильная группа располагается между геминальны-
ми метильными группами боковой цепи, что обусловлено стериче-
ским напряжением, и «запирает» систему. При циклизации устра-
няется также сильное напряжение, присущее молекуле. Кроме
того «эффективная концентрация» карбоксильных групп вблизи
гидроксильной группы, подвергаемой атаке, очень высока.
Ранее упоминалось, что высокая эффективная концентрация*
внутримолекулярных групп — одна из основных причин эффектив-
ности ферментативного катализа. Таким образом, функция фер-
мента прежде всего заключается в сближении субстрата с функ-
циональными группами фермента путем связывания с активным
центром. При этом происходит изменение энтропии системы. От-
сюда следует, что различие при катализе внутримолекулярной ре-
акции и межмолекулярной определяется энтропийным эффектом.
При межмолекулярной реакции происходит соединение двух или
большего числа молекул в одну, что вызывает увеличение «упо-
рядоченности» и, следовательно, уменьшение энтропии.
Следует учитывать и другие факторы, особенно влияние соль-
ватации. Внутримолекулярный нуклеофил в основном состоянии
меньше сольватирован, чем отдельная нуклеофильная частица в
* Эффективную концентрацию данной группы определяют путем деления
наблюдаемой константы скорости первого порядка внутримолекулярной реакции
на константу скорости второго порядка соответствующего межмолекулярного
процесса [349]. Для ферментативных реакций можно ожидать величин в интер-
вате от 10' до 109 моль/л-
Химия ферментов
211
разбавленном растворе. Кроме того, внутримолекулярный нукле-
офил более жестко удерживается относительно реакционного
центра. В существенной степени увеличению скорости реакции
может служить также снятие напряжения во внутримолекуляр-
ной реакции.
Поскольку энтропия молекулы слагается из суммы колебатель-
ной, вращательной и внутренней энтропий, Брюс предположил,
что увеличение скорости, наблюдаемое во внутримолекулярных
реакциях, видимо, обусловлено уменьшением количества возмож-
ных конформеров [63]. Чтобы доказать это положение, он ис-
следовал внутримолекулярное замещение n-бромфенола (с обра-
зованием промежуточного ангидрида) в зависимости от увеличе-
ния жесткости молекулы в следующей серии соединений;
относительная
скорость
образования
дикарбоновых
кислот
200
юзоо
53 000
Отметим, что уменьшение степеней свободы на единицу увели-
чивает скорость реакции в ~200 раз. В случае жестких молекул
реакционноспособные группы соответствующим образом распо-
ложены для реакции, и скорость реакции гораздо выше. В ре-
зультате ускорение реакции — прямое следствие эффекта сбли-
жения, т. е. пространственной близости реакционных групп. Это
приводит к выгодному изменению поступательной и вращатель-
ной энтропий активации. Брюс считает, что основным объясне-
нием эффективности ферментов служит «замораживание» внут-
реннего вращения субстрата, а также энтропийный эффект.
Напротив, Дженкс считает, что один из наиболее важных фак-
торов, объясняющих большое увеличение скорости во внутримо-
лекулярных реакциях,— уменьшение поступательной энтропии
(уменьшение числа степеней свободы) В ферментативных реак-
212
Глава 4
циях это уменьшение энтропии компенсируется выигрышем энер-
гии при связывании субстрата с ферментом, что является дви-
жущей силой катализа. Другими словами, Дженкс предполагает,
что, помимо уменьшения свободы вращения и снижения колеба-
тельной энтропии, за высокую специфичность и большую скорость
ферментативных реакций в значительной степени ответственна
внутренняя энергия связывания, выделяющаяся при образовании
выгодных нековалентных связей с субстратом в каталитическом
центре [64].
Изучая внутримолекулярную реакцию образования лактонов,
в которой наблюдается увеличение скорости на 3—6 порядков по
сравнению с бимолекулярной реакцией, Кошланд [65] предложил
новое понятие — орбитальное управление. Исходя из проведенных
экспериментов, он предположил, что управление реагирующими
атомами может вызвать (или объяснить) высокие скорости реак-
ции. Реагирующие группы не только должны быть сближены, но
и правильным образом ориентированы. При использовании таких
представлений важную роль играют эффекты и сближения, и
ориентации. В более жестких молекулах реакция идет с большей
скоростью. Согласно представлениям Кошланда, уменьшение по-
ступательной энтропии имеет не столь важное значение, как это
предполагал Дженкс.
СЩСН.ОН
+
CHjCOOH
413
относительная
скорость
лактонизации 1
В сущности, согласно гипотезе Кошланда, повышение скоро-
сти реакции образования лактонов во внутримолекулярной реак-
ции вызвано тем, что пути сближения реагирующих групп огра-
ничены некоторыми вполне определенными направлениями в про-
тивоположность статистической ориентации, наблюдаемой при
бимолекулярной реакции. Кошланд считает, что орбитальное уп-
равление способно объяснить, почему ферменты столь эффектив-
ны. Вероятно, ферменты выстраивают связывающие орбитали
реагирующих молекул и каталитических групп с точностью, не-
возможной при обычном бимолекулярном столкновении в рас-
творе. Фермент не только сближает субстраты (эффект сближе-
ния Брюса); существует еще фактор ориентации, связанный с
формой электронных орбиталей реакционноспособных атомов.
Это-то и должно вызывать уникальную каталитическую актив-
ность ферментов. Удивительная каталитическая активность фер-
ментов, следовательно, вытекает не только из их способности
приближать реагирующие атомы, но также и «направлять» орби-
Химия ферментов
213
тали этих атомов таким образом, чтобы они сближались под оп-
тимальным углом. На примере бициклического соединения вид-
но, каким образом «орбитальное управление» способно влиять на
образование химических связей.
изменение угла при
образовании улактона.
+ iop; ббльшие откло-
нения могут вызвать
значительное умень-
шение скорости.
Однако Брюс считает, что повышение скорости реакции, на-
блюдаемое для многих модельных соединений, гораздо больше,
чем этого можно было бы ожидать с учетом эффектов ориента-
ции. Например, «орбитальное управление» не может служить
объяснением повышения скорости реакции на 8 порядков.
Возражая Брюсу, Кошланд привел результаты, касающиеся
бициклических жестких молекул, содержащих атом не кислорода,
а серы в качестве нуклеофильного центра [67, 68].
относительная
скорость
лактонизации I
Приведенные выше результаты показывают, что полученные
константы скорости ие всегда согласуются со структурной
214
Глава 4
жесткостью, хотя группы находятся на одинаковом расстоянии
Большое различие в скорости (на ~102—104) наблюдается меж-
жду бпцпкло-[2.2.2] - и бпцпкло-[2.2.1]-системами, причем во вто-
рой нз них реакционноспособные группы находятся лишь несколько
дальше. Поэтому орбитальная ориентация должна быть различ-
ной и обусловливать различие в скоростях реакций.
Тиолактонизацня протекает с особенно низкой скоростью
В этом случае ориентация менее выгодна, чего п следует ожидать
из-за искажения электронных орбиталей. Сходным образом при
замене гидроксильной группы активного остатка серина фермента
субтилизпна на SH-группу активность этой протеазы существенно
уменьшается. Такая замена (0->-S) оказывает существенное влия-
ние (снижая) на константу скорости деацилирования ацплфермен-
та [69]. Кошланд считает, что подобного ингибирования можно
было бы ожидать в том случае, если орбитальная ориентация
имела бы важное значение.
Следовате.ьно «орбитальное управление» объясняет высокие
скорости некоторых*-внутримолекулярных реакций, используя по-
нятия благоприятной ориентации орбиталей, подвергающихся ре-
гибридизапни в переходном состоянии. Однако не очень понятно,
каким образом влияние этого фактора можно отделить от влия-
ния других структурных факторов. В настоящее время существует
больше аргументов против того, чтобы приписывать орбитальному
управлению решающее значение. Например, эффективная кон-
центрация соседних групп принимается равной 55 моль/л; это
соответствует концентрации чистой воды. Считают, что при этом
существенно недооценивается вклад поступательной энтропии (со-
гласно предположению Дженкса) в эффективную концентрацию
[70]. Хотя некоторое необходимое перекрывание орбиталей долж-
но происходить в переходном состоянии, оно соответствует из-
менению ориентации не больше чем на 10°. Такое искажение спо-
собно вызвать угловое напряжение (не больше 11 кДж/моль,
т. е. 2,7 ккал/моль) связи между углеродными атомами [58].
Вопрос о том, возникает ли эффект ориентации вследствие
орбитального управления или же благодаря устранению невы-
годных конформационных состояний, имеет значение лишь по-
тому, что, согласно первой концепции, орбитальное управление
влияет па переходное состояние, тогда как второй эффект возни-
кает вследствие ограничения возможных основных состояний. Из
полученных данных совершенно ясно, что сближение внутримоле-
кулярного нуклеофила с реакционным центром может привести
к значительному увеличению скорости реакции. Согласно точке
зрения Брюса, преимущество внутримолекулярных реакций имеет
энтропийную природу вследствие ограничения числа степеней
свободы в основном состоянии. Дискуссия Брюса и Кошланда
составляет часть более обширного вопроса о том, почему внутри-
молекулярные реакции столь выгодны. Истина, вероятно, заклю-
Химия ферментов
215
чается в сочетании этих и других эффектов. В разд. 4.6 мы уви-
дим, что соответствующая ориентация свободных орбиталей яв-
ляется важным стереоэлектронным требованием, позволяющим
объяснить увеличение скорости в реакциях гидролиза.
Помимо эффекта сближения и эффекта ориентации следует
учитывать также третий фактор — стерическое сжатие. Тем не
менее эти факторы не объясняют повышения констант скорости
реакций по крайней мере еще в 102—104 раз. Среди возможных
объяснений следует упомянуть электростатическую стабилизацию
переходного состояния и снятие напряжения в основном состоя-
нии. Следует учесть и такой фактор, указанный Бендером, как
«замораживание субстратной специфичности». Примером этого
служит «ароматическая полость» в а-химотрипсине (см. ниже),
создающая благоприятную стсрическую ситуацию для боковой
цепи аминокислоты субстрата.
В общем энтропия — один из важнейших факторов в фермен-
тативном катализе. Когда химическая реакция протекает в рас-
творе, катализатор и молекулы субстрата должны тесно сбли-
зиться, что приводит к большому уменьшению энтропии. Однако
можно считать, что для понимания химизма ферментативной ре-
акции можно ограничиться изучением ферментсубстратного ком-
плекса, в котором каталитические группы кооперативно действуют
на одну и ту же молекулу. Таким образом, в переходном со-
стоянии отсутствует потеря поступательной и/или вращательной
энтропии. Из этого следует, что эффективная концентрация ка-
талитических групп фермента очень высока по сравнению с би-
молекулярными реакциями в растворе, что приводит к выигрышу
энтропии, который компенсируется энергией связывания фермен-
та с субстратом. Другими словами, вращательная и поступатель-
ная энтропии уменьшаются при образовании ферментсубстратио-
го комплекса, а не во время последующих стадий каталитиче-
ского акта [58].
4.3. Полифункциональный катализ и простые модели
Для объяснения ферментативного катализа было использова-
но еще одно фундаментальное представление, а именно бифунк-
циональный или полифункциональный катализ. Другими словами,
с субстратом взаимодействуют несколько функциональных групп
активного центра, так что омеет место сопряженный катализ.
Одно из первых исследований такого катализа [71] в рас-
творах было посвящено изучению скорости мутаротации О-тетра-
метил-п-глюкозы в присутствии а-пиридона. Раствор а-пирндона
(10~3 моль/л) был в 7000 раз эффективнее, чем раствор фенола
и пиридина в эквивалентной концентрации.
Для объяснения этого явления был предложен сопряженный
механизм, при котором катализатор одновременно действует и
216
Глава 4
как основание, и как кислота:
При этом наблюдается характерное свойство ферментативного
катализа — регенерация катализатора путем обратимой реакции.
2-Ампнофенол, кислотные и основные свойства которого выражены
сильнее, чем у а-пиридона, не столь эффективно катализирует эту
реакцию. В присутствии 2-аминофенола сопряженный механизм
катализа невозможен.
Другой классический пример [72] полифункционального ка-
тализа— гидролиз моносукцинатного эфира гексахлорофена:
Эффект сближения и взаимодействие с гидроксильной груп-
пой значительно увеличивают скорость реакции. Точно так же
сравнение соответствующих моно- и диацетатов показывает, что
моноацетат гидролизуется в 500 раз быстрее, чем диацетат, при
pH < 5. Зависимость скорости реакции от pH изображается ко-
локолообразной * кривой, что указывает на протекание внутри-
молекулярного нуклеофильного и общекислотного гидролиза. Он
также указывает на участие ионных заряженных частиц с про-
тивоположными значениями р/<а при максимальной активности.
биацетпат
моноацетат
* Колоколообразная форма зависимости скорости реакции от pH характерна
для кислотно-основного сопряженного катализа.
Химия ферментов
217
Возможно, для понимания функций ферментов наиболее под-
ходит модель бифункционального катализа в водной среде. Одной
из первых реакций, для которых было показано значительное
увеличение скорости в воде, был гидролиз иминолактонов. Это
исследование выполнено Каннингхемом и Шмнром [73], которые
обнаружили, что фосфатный буфер по крайней мере в 200 раз
эффективнее имидазольного буфера (хотя оба буфера имеют при-
мерно одинаковое значение рКа) при каталитическом отщеплении
анилина.
При основных значениях pH можно ожидать предпочтитель-
ного образования амида, поскольку амидный атом азота — плохая
уходящая группа. Это и наблюдается в имидазольном буфере.
Однако в фосфатном буфере бифункциональный катализ приво-
дит к тому, что отщепление анилина становится более предпо-
чтительным.
Подобный катализ наблюдается и для бикарбонатного, и для
ацетатного буферов.
Позднее Ли и Шмир [74, 75] изучали похожий механизм би-
функционального катализа более детально на примере ацикличе-
ских имидоэфиров. И вновь процесс гидролиза проходил через
стадию образования тетраэдрического промежуточного продук-
та,—стадию, определяющую скорость всего процесса, с последую-
щим расщеплением до конечного амида или эфира:
II /Ph й Ph
СН,—С—N + EtQH СН,—О—OEt + HhQ
СН, ХН1
218
Глава 4
Таблица 4.1. Гидролиз ациклических нмидоэфнров в различных
буферных системах [74, 75)
Вуфер Исследуемый интервал pH Отношение скоростей а
нсо® N—ОН II 7,49—9,73 290
сн3с—сн3 7,73-8,85 8700
Очо N и Н 7,92—8,55 1460
НРО;® 6,96—9,11 52
HAsOj® 7,18-8,82 61
H2AsO® О° 7,42—8,99 150
CF3CCF3 1 ОН 7,13-8,90 47
а Отношение скоростей образования амина для бифункционального ката
лизаторз и его монофункционального аналога с тем же рКа=
В отсутствие буфера выход амида увеличивается с повыше-
нием pH. При pH 7,5 образуется 50% амида и 50% эфира. Од-
нако в присутствии различных бифункциональных катализаторов
предпочтительно начинает образовываться амин (табл. 4.1). За
исключением ацетоноксима, все бифункциональные катализаторы
содержат кислотные и основные группы в 1,3-положении. Цикли-
ческое переходное состояние, необходимое для сопряженного пере-
хода протона, должно включать восьмичлеиное кольцо, например
для фосфата:
СН3 О—Н О О
с
EtOx XN Н -ОХ ЧОе
/ \
Ph СН,
После образования переходного состояния происходит разрыв
связей с отщеплением анилина и образованием эфира, т. е. пу-
тем, аналогичным уже описанному для иминолактонов. Отметим,
что, хотя имидазол обладает и кислотными, и основными груп-
пами, находящимися в 1,3-положении, циклический переход про-
тона в них невозможен.
Дженкс [76] пришел к выводу, что сопряженный бифункцио-
нальный кислотно-основной катализ реализуется редко или во-
Химия ферментов
219
обще не происходит вследствие того, что такое столкновение реа-
гирующего вещества и катализатора маловероятно. Кроме того,
бифункциональный катализ не обязательно выгоден в водных
средах даже в том случае, когда вторая функциональная группа
находится в удобном положении, чтобы принять участие в реак-
ции. Поэтому следует подходить с осторожностью к предположе-
ниям о том, что большинство ферментов использует бифункцио-
нальный или полифункциональный катализ. Тем не менее эта
идея сыграла ведущую роль в развитии представлений о фермен-
тативном катализе.
4.4. а-Химотрипсин
Эффективность ферментативного катализа просто заворажи-
вает, особенно если удается получить кристаллографические дан-
ные о структуре и имеются достаточно полные физико-химиче-
ские сведения о ферментативном механизме действия. В этом от-
ношении наиболее изучен фермент группы сериновых протеаз —
а-химотрппсин. Термин сериновая протеаза своим происхожде-
нием обязан тому, что ферменты этого класса содержат в актив-
ном центре гидроксильную группу серина, которая проявляет не-
обычную реакционную способность к необратимому ингибитору —
диизопропилфторфосфату (ДФФ).
F\
СН3 Р' СН3
сн—о о—сн^
СНз СНз
ДФФ
Высокореакционноспособная связь Р—F легко участвует в ре-
акциях замещения с нуклеофилами, например гидроксилом се-
ринового остатка в активном центре протеолитических фермен-
тов. В эту же группу ферментов входят трипсин, тромбин и суб-
тилизин.
Механизм действия а-химотрипсина в настоящее время изучен,
вероятно, более подробно, чем любого другого фермента. Физио-
логическая роль этого фермента сводится к катализу гидролиза
пептидных связей пищевого белка в кишечнике млекопитающих.
Он выделяется поджелудочной железой в виде предшественни-
ка— зимогена (химотрипсиногена), состоящего из единственной
полипептидной цепи длиной 245 аминокислотных остатков. Такая
неактивная форма необходима, чтобы предотвратить «самопере-
варивание». Гидролиз трипсином (разрыв пептидной цепи) в двух
специфических участках активирует предшественник, приводя к
образованию активного а-химотрипсина, в котором три пептид-
ные цепи удерживаются дисульфидными мостиками. Трехмерная
структура фермента была определена методом рентгеноструктур-
ного анализа Блоу [77], а механизм действия установлен Харт-
, лн и Бирктофтом [78, 79].
220
Глава 4
Рентгеноструктурные исследования показали, что помимо се-
рина-195 в активный центр входят также остатки гистидина
(His-57) и аспарагиновой кислоты (Asp-102). Другой остаток ги-
стидина (His-40) не участвует в катализе. Фермент обладает спе-
цифичностью к ароматическим аминокислотам. Эфиры аромати-
ческих аминокислот — хорошие субстраты этого фермента, и для
большинства кинетических исследований в качестве субстратов
использовались такие эфиры. Фермент расщепляет пептиды, осво-
бождая карбоксильную группу ароматических аминокислот. После
образования комплекса Михаэлиса единственный реакционноспо-
собный Ser-195 вначале ацилируется, образуя ацилферментное
промежуточное соединение с субстратом. Превращение комплек-
са Михаэлиса в ацилфермент происходит сначала путем образо-
вания тетраэдрического интермедиата (разд. 4.4.1), и наконец
происходит гидролиз ацилфермента при атаке молекулой воды,
так что ацилированный продукт обычно не накапливается.
о
Еп—ОН + R—С—X [En-OH-R— СОХ]
тетраэйрический
интермедиат
x-or;nhr'
R = Phe, Trp, Tjr
номп.леко Михаэлиса
О
Еп—О—С—R
ацимрермент
О
Еп—О—R ------>
I
ОН
тетраэйрический
интермедиат
°Ч
Еп—ОН+ ^С— R
НО
Долгое время считалось, что остаток His-57, действуя как
основание, повышает нуклеофильность гидроксильной группы
Ser-195, выступая в роли общеосновного катализатора.
His-57
Ser-195
Однако на основе кристаллографических данных для а-химо-
трипсина был предложен новый механизм общего катализа, на-
званный системой с переносом зарядов. Он обусловлен взаиморас-
положением Asp-102, His-57 и Ser-195, связанных водородными
мостиками (рис. 4.3).
Полагают, что кислотная группа Asp-102 находится в глубине
молекулы, и, видимо, ее уникальное положение относительно не-
обычно поляризуемой системы имидазольного кольца His-57, ко-
торый в незаряженном состоянии способен нести протон на лю-
бом из двух своих атомов азота, является ключом к пониманию
активности этого фермента, а также и других сериновых протеаз
Химия ферментов
221
[80]. «Спрятанная» группа Asp-102 вызывает поляризацию ими-
дазольного кольца, так как такой спрятанный отрицательный за-
ряд приводит к появлению в соседнем положении положитель-
ного заряда. Это позволяет протону мигрировать вдоль водород-
ных связей, так что протон гидроксильной группы Ser-195
способен перейти к His-57. Активный остаток серина превращает-
ся в реакционноспособный нуклеофил, который может атаковать
расщепляемую пептидную связь.
/О—Н—
Asp-102—Ck
° His-57
/Ser-195
О
X = NHR', OR'
рХ, - 6,5 -7,0
Каталитическую активность а-химотрипсина нельзя приписать
исключительно наличию системы переноса зарядов. Из рентгено-
структурных исследований следуют многие другие факторы, от-
ветственные за каталитический процесс. Было обнаружено де-
вять видов специфических ферментсубстратных взаимодействий,
которые повышают эффективность а-химотрппспна. Например,
стабилизация тетраэдрического интермедиата, а следовательно,
понижение энергетического барьера переходного состояния, со-
провождается образованием водородной связи между карбониль-
ной группой субстрата и амидным атомом Ser-195 и Gly-193.
В химотрипсиногене эта водородная связь отсутствует. Действи-
тельно, уточнение структур химотрипсиногена и а-химотрипсина с
помощью рентгеноструктурного анализа показывает различия в
расположении каталитической триады в зимогене и ферменте. Это
конформационное изменение в общей трехмерной структуре фер-
мента, возможно, вызывает значительные изменения химических
свойств каталитического центра, что может играть важную роль
в увеличении ферментативной активности при активации зимогена.
Получены данные о том, что в процессе гидролиза «-анилид-
ных производных пептидов, катализируемом сериновой протеа-
зой из Myxobacter 495, которую называют а-лнтической протеа-
зой, возникает тетраэдрический интермедиат и происходит согла-
сованный переход протона от Ser-195 к His-57 и от His-57 к Asp-
102. В этом ферменте присутствует только один остаток гистидина
|82, 83]. Стадией, лимитирующей скорость гидролиза, является
разложение тетраэдрического интермедиата на ацилфермент и
л-нитроанилнн. Экспериментальные данные говорят в пользу того,
что два перехода протонов осуществляются согласованно, а не
последовательно.
К удивлению, работы по |3С-ЯМР-спектроскопии [84] показа-
ли, что группой, р/<0 ионизации которой равна ~7, является
спрятанная Asp-102, а не His-57, как ожидалось, т. е. при pH 7—8
Ser-195
His-57—!д
H—Ne,.N—H
pK = 6,7
^Ser-195
I гидрофобной карман,
I обеспечивающий
проЭуктивное
Н X связывание субстрата-
Ser-195
О
он
х о5 ч
щилуермент, который
не накапливается,
а легко гивролизуется-
войой -
Ser-195
второй тетраэйрический
•интермевиат
.С—R2
П
ое
Рис. 4.3. Система «с переносом зарядов» а-химотрипсииа (положение 3 имида-
зольной группы часто называют N61 или л, а положение 1—Ne2 или т).
Химия ферментов
223
.Ser-195
’His-57-
,О
о®
N Nn-H*-7
0-Н
+ R2—СООН
ионизуется и ухойит
из полости срермента
Ser-195
имидазольное кольцо при катализе остается непротопирован-
иым. Однако подробные исследования химотрипсиногена, «-химо-
трипсина и трипсина методом 'Н-ЯМР-спектроскопии, проведен-
ные Маркли и сотр. [85], говорят в пользу первоначального пред-
положения Робиллара и Шульмана [86] о том, что р/(а His-57
выше, чем для Asp-102 как в зимогене, так и в ферменте. Осно-
вываясь на этом и других доводах, Маркли склоняется в пользу
следующего механизма образования тетраэдрического интерме-
диата, который является вариантом механизма, приведенного на
рис. 4.3:
His-57.
/° \ Г
Asp-102—\ О
О- -Н—N .N>-HZ
® 6^,
Ser-195
R — NH—С— R,
О
His-57
О
Asp-102—
.Ser 195
ида-
_HN— С— R
r;
Oe
224
Глава 4
Кроме того, данные 'Н-ЯМР ясно указывают на существова-
ние ионной пары His-57—Asp-102 [86], что делает маловероятным
согласованный переход двух протонов.
Последние работы [87] по рентгеноструктурным исследова-
ниям а-литической протеазы показали, что Asp-102 находится в
сильно полярном окружении и имеет рА0 = 4,5. Далее, с помощью
гистидинового ауксотрофа Myxobacter 495 [88] в состав а-лити-
ческой протеазы был включен гистидин, обогащенный l5N Изме-
нение спектров 15М-ЯМР такой а-литической протеазы, меченной
по «каталитической триаде», в зависимости от pH ясно указало
на существование водородной связи между NH-группой в 3-по-
ложении гистидина (N61) и соседней спрятанной карбоксильной
группой аспарагиновой кислоты.
Впоследствии Комияма и Бендер [92] выдвинули предполо-
жение, что протон, оторванный от гидроксильной группы серина
имидазольной группой гистидина, переходит к атому азота ухо-
дящей группы амида, прежде чем завершается образование связи
между карбонильным углеродным атомом амида и атакующим
атомом кислорода серина.
Было бы крайне интересно знать значение рАо для His-57
активного центра в переходном состоянии реакции, катализируе-
мой а-химотрипсином. В этом направлении вновь сосредоточила
усилия группа Маркли [90]. Они изучали зависимость химиче-
ских сдвигов ряда диизопропилфосфорилсериновых (ДФФ-сери-
новых) протеаз от pH методом 31Р-ЯМР-спектроскопии. Значения
рАа, полученные в процессе такого титрования, согласуются со зна-
чениями рАа, полученными ранее из данных 'Н-ЯМР-спектроскопи-
ческих исследований для пиков, отнесенных к атому водорода в
положении Cel-H (С-2) His-57 каждого из этих ДФФ-производ
ных. Интересно, что рКа трех изученных ферментов (а-химотрип-
син, трипсин и а-литическая протеаза) повышается (до двух единиц
в случае а-литической протеазы) при образовании производного |
по остатку Ser-195. Поскольку сериновые протеазы, ингибирован
ные с помощью ДФФ, можно рассматривать как аналоги пере-
ходному состоянию [91], Маркли предположил, что более высо
кие рКа для His-57, которые при этом наблюдаются для его
производных, могут приблизительно соответствовать рКп в пере-
ходном состоянии. Более низкое значение pAfl His-57 в свободных
ферментах подтверждает, что остаток имидазола при физиологи-
ческих значениях pH находится в непротонированной форме [90].
После того как образуется ферментсубстратный комплекс и до-
стигнуто переходное состояние, pAfl His-57 повышается, что делает
имидазол более сильным основанием при связывании протона
гидроксильной группы Ser-195. Здесь хорошо видно, как биофи-
зические методы ('Н-, 15N-, |3С- и 31Р-ЯМР-спектроскопия) сы-
грали ключевую роль в установлении истинного механизма дей-
ствия сериновых протеаз. Было показано, что механизм действия
Химия ферментов
225
трипсина, протеазы млекопитающих, и субтилизина, бактериаль-
ной протеазы, сходен с механизмом действия а-химотрипсниа. Хотя
полнпептндные цепи а-химотрипсина и субтилизина свернуты со-
вершенно различными способами, аминокислотные остатки, уча-
ствующие в катализе (серин, гистидин и аспарагиновая кислота),
располагаются в пространстве одинаково. Такое сходство актив-
ных центров представляет собой первый пример конвергентной
эволюции в геометрии активных центров ферментов [77].
4.4.1. Тетраэдрические интермедиаты
Установление существования тетраэдрического интермедиата
в реакциях эфиров и амидов, катализируемых ферментами, дол-
гое время оставалось одной из основных задач при изучении ме-
ханизма действия ферментов. Поэтому большое внимание уде-
лялось механизму катализа сериновых протеаз, основанном на
большом количестве данных, полученных при химических и рент-
геноструктурных исследованиях. В 1979 г. [89] были выявлены
тетраэдрические интермедиаты фермента млекопитающих эласта-
зы. Тетраэдрические интермедиаты были обнаружены, наработа-
ны и стабилизированы при высоком значении pH (10,1), отри-
цательных температурах (—39°С) в жидких водно-органических
криорастворителях с использованием в качестве субстрата п-нит-
роаннлидов ди- и трипептидов. Принимая во внимание темпера-
турные условия и состав растворителя, можно утверждать, что
скорость образования интермедиата находилась в хорошем со-
ответствии с результатами, полученными при 25°С в водных рас-
творителях методом остановленного потока Эти данные необхо-
димы для будущих кристаллографических крноферментативных
исследований. Участие имидазольной группы в механизме дей-
ствия сериновых протеаз вызвало усиленное изучение реакции
гидролиза эфиров, катализируемой имидазолом. Например, изу-
чение многих модельных соединений показывает, что гистидин
способен выступать в качестве нуклеофила во внутримолекуляр-
ных реакциях. Один из первых примеров — гидролиз п-нитрофе-
иилового эфира в присутствии у-(4-имидазолил) масляной кисло-
ты [93]:
аналог ацалфермента
8 Зак 549
226
Глава 4
При pH 7, 25°С константа скорости этой реакции (200 мин-1)
сравнима с константой для расщепления и-нитрофенолята а-хи-
мотрппснном (180 мин-1). Стадией, определяющей скорость ре-
акции, является ацилирование (kz). В первом приближении это
удовлетворительная модель для имитации образования промежу-
точного ацплфермента, хотя His-57 в а-химотрипсине действует
как общеосновной — общекнслотный, а не нуклеофильный ката-
лизатор.
Как указывалось в предыдущем разделе, близкое геометри-
ческое расположение триады Asp-His-Ser в активном центре се-
риновых протеаз называлось системой с переносом зарядов. Эти
группы находятся в гидрофобном окружении во внутренней обла-
сти фермента, и атаке гидроксильной группой серина способ-
ствует отщепление протона по механизму общеосновного ката-
лиза имидазольным кольцом остатка гистидина. Это приводит к
частичному образованию сильного (не-
/=\ сольватированного) нуклеофила — ал-
н кокси-иоиа.
J Роджерс и Брюс проделали обшир-
ные исследования с использованием
J модельных соединений, чтобы оценить
вклад системы с переносом зарядов
R = H,sO;,e [94—97]. Для модельного соединения
скорость гидролиза ацетильной группы
была в Ю4 раз выше, чем в смеси фенилацетата и имидазола.
В зависимости от условий эксперимента предложены три схемы
механизма катализа:
1) при низких pH
Атака 112О ускоряется по механизму обще-
кислотиого катализа.
2) при нейтральных pH
Атака Н2О ускоряется по механизму обще'
основного катализа.
Химия ферментов
227
3) при высоких pH
Нуклеофильный катализ.
I
ь
в
в
л
I.
я
При высоких pH переход ацильной группы O-^-N к имидазо-
лид-аниону происходит по нуклеофильному механизму. После-
дующий гидролиз ацилимидазольного промежуточного производ-
ного происходит благодаря тому, что скорость гидролиза пре-
вышает скорость термодинамически невыгодного перехода N->O.
Такая модель действительно имеет определенную аналогию с дей-
ствием сериновых протеаз, хотя механизмы сходны лишь при
нейтральных pH. Однако введение карбоксильной группы при-
водит к более точной аналогии системы с переносом зарядов:
Введение карбоксильной группы, образующей водородную
связь, действительно увеличивает катализ соседним имидазоль-
ным остатком и обеспечивает согласованный общеосновной гид-
ролиз. Однако скорость гидролиза эфиров повышается все еще
незначительно (только в три раза), так что, говоря о фермента-
тивном катализе, таким изменением скорости можно пренебречь.
В чем заключается влияние растворителя? Участвуют ли мо-
лекулы воды в реакции гидролиза?
Эксперименты с менее полярными растворителями не обна-
руживают влияния их природы на функцию карбоксильной груп-
пы. Следует ожидать образования водородной
связи между карбоксильной группой и нмпдазо- 4®^н
лнй-ионом. Действительно, для цвиттер-иона од- сн3*'1'1 9;
позначно показано существование водородной свя-
зи Оказалось, что реакция ОН~ с протоном, уча- I J О
ствующим в образовании водородного мостика,
протекает в 103 раз медленнее, чем контролируемая диффузией
реакция с анилпний-иоиом [96J. Так что с понижением концен-
трации воды в среде (понижение диэлектрической проницаемости)
8»
228
Глава 4
можно ожидать как усиления дипольных взаимодействий, так и
повышения тенденции к образованию водородных связей, чего
не было показано для модельного соединения Брюса.
Тем не менее модель Роджерса и Брюса поддерживает гипо-
тезу переноса зарядов, поскольку имеются данные о существен-
ном ускорении реакции в случае использования почти безводного
ацетонитрила или толуола. В этих условиях система водородных
связей «замкнута» внутри молекулы и не обменивается со сре-
дой, т. е. возможна реализация механизма при нейтральных pH:
атака молекулой воды, сопровождающаяся общеосновным ката-
лизом, причем диполярное переходное состояние образуется из
нейтрального основного состояния. В ацетонитриле это могло бы
произойти только в присутствии находящегося рядом карбокси-
аниона.
Как достоинство предложенной модели можно отметить то,
что она позволила впервые выделить тетраэдрический интерме-
диат в реакции переноса ацетильной группы [94]. Ниже приве-
б = химический сЗвиг (в м.вд
Химия ферментов
229
репа схема реакции. Превращение 4-1->-4-3 протекает через про-
межуточный N-ацилимидазол. В пользу этого свидетельствует
следующее. Согласно экспериментам по конкуренции в присут-
ствии амина, выполняющего роль основания, атака карбоксиль-
ной группы соединения 4-1 приводит к соответствующему амиду
(4-3). Исследования методом ЯМР-спектроскопии показывают не-
эквивалентность двух геминальных метильных групп в 4-1, но не
в 4-2 или 4-3. Это вызвано жесткостью структуры и асимметрией
тетраэдрического интермедиата. Далее, восстановление 4-1 до 4-4
боргидрпдом указывает на наличие лактоновой группировки. Вос-
становления соединений 4-2 или 4-3 не происходит.
Образование 4-1 из 4-2, вероятно, происходит вследствие атаки
карбоксильной группой по N-ацетилпиридиниевой соли с образо-
ванием промежуточного ангидрида с последующим замещением
имидазолом. Таким образом удалось впервые выделить и одно-
значно охарактеризовать лабильный ацильный тетраэдрический
интермедиат 4-1, миграция ацильной группы в котором приводит
к образованию продукта 4-3*.
Комияма и Бендер [98] также изучали системы с переносом
заряда в сериновых протеазах. В качестве модельной системы
они исследовали реакцию гидролиза этилхлорацетата, катализи-
руемую 2-бензимндазолуксусной кислотой по механизму общего
основного катализа.
По сравнению с самим бензимидазолом наблюдается восьми-
кратное увеличение скорости гидролиза, что указывает на общеос-
новной катализ с участием карбоксильной группы.
бензимийаэол
р-нафтилуксусная N-метилимиЭазол
кислота
Однако одна только карбоксильная группа, как, например,
в р-нафтилуксусной кислоте, не способна обеспечить такой
• Недавно были выделены и охарактеризованы тетраэдрические аддукты
свльноэлектрофильных кетонов и третичных аминов [358].
230
Глава 4
каталитический эффект. Поэтому в реакцию вовлечены совместно
карбоксильная и имидазольная группы и молекула воды.
N-Метилимидазол также использовали в этой системе в каче-
стве модели метилированного а-химотрипсина. Оказалось, что
в этом случае полностью отсутствует гидролиз этилхлорацетата,
согласно чему в системе с переносом зарядов оба атома азота
имидазольного цикла должны быть свободны для участия в ре-
акции.
Исследовались также свойства а-химотрипсина, метилирован-
ного по His-57, для объяснения механизма действия этого фер-
мента. Метилированный а-химотрипсин примерно в 105 раз актив-
нее а-химотрипсииа [99]. Результаты исследований говорят о том,
что общеосновпой катализ остается составной частью механизма
гидролиза модифицированным ферментом.
Хотя при метилировании His-57 в активном центре происходят
лишь небольшие изменения, переходное состояние и тетраэдриче-
ский интермедиат дестабилизированы по сравнению с нативным
ферментом. Участие гидроксильной группы в гидролизе эфиров и
амидов также включает образование тетраэдрического интерме-
диата.
е
ООО
е || образование | расщепление || Q
RO + R—С—OR' R—C—OR' =± R—C—OR + OR
*-i । *-»
OR
тетраэврЕческий
интермедиат
В зависимости от значения
два переходных состояния:
р/Са уходящей группы образуются
о
-I |, -г
RO С- OR'
I
R
переходное состояние’
(схоЗно с продуктом)
R
переходное состояние
(схоЗно с исходным соединением;
Если переходное состояние тетраэдрического интермедиата
сходно с продуктом реакции, то стадией, лимитирующей скорость,
является расщепление тетраэдрического интермедиата, или k2 <
< k-i (k2 для заторможенного процесса, a для быстрого). Та-
кая ситуация реализуется, если RO- — хороший нуклеофил или
если его рКа меньше, чем рДа для RzO--rpynnbi.
Если же переходное состояние напоминает реагент, то стадией,
определяющей скорость, является образование тетраэдрического
интермедиата, причем k2 > £-i для медленной реакции).
В этом случае RZO_— хорошая уходящая группа и ее р/(а меньше,
Химия ферментов
231
чем рКа
для
R0-
лать,
рассматривая
(нуклеофила). Эти же рассуждения
гидролиз п-нитрофеннловых эфиров
легко сде-
в присут-
ствии
метокси-аниона.
Такой процесс протекает быстро, если
нуклеофил
сопряженное основание слабой
кислоты
(метанол),
сопряженное основание
уходящая группа —
сильной кислоты (pA'i
е
мало). Следовательно, обратная реакция сн3о
сильно заторможена.
Таким образом, при хорошей уходящей группе (слабое
сопряженное основание) стадией, определяющей скорость (мед-
ленной) при гидролизе эфиров, является образование тетраэдри-
ческого интермедиата, а при плохой уходящей группе другая ста-
дия-расщепление тетраэдрического интермедиата.
Конечно, действие гидроксильной группы при катализе в опре-
деленной степени аналогично функции остатка серина в сериновых
протеазах. Поэтому были синтезированы и исследованы модельные
а
соединения.
Например, рассмотрим следующее внутримолекулярное пре-
вращение:
Скорость этой реакции в 105 раз больше, чем в случае этилбен-
зоата. При этой реакции имеет место основной катализ, и в при-
сутствии 2Н2О вместо Н2О, как и ожидалось, ее скорость пони-
жается по крайней мере в два раза (Лн/^о = 3,5). Таким образом,
переход протона осуществляется в переходном состоянии, так что
аналогия с а-химотрипсином очевидна.
Перейдем к другой интересной и простой модели амидного
аналога [100]:
При низких pH происходит протонирование азота и —NHg
становится хорошей уходящей группой. При высоких pH,
однако, гидроксильная группа тетраэдрического интермедиата
232
Глава 4
превращается в лучшую уходящую группу. Была
стабильной имидной формы:
реакция
изучена
с
прибл
Синтезированы и Другие модельные соединения
иженнои
аминогруппой. Ожидалось, что в положении 6 аминогруппа деста
билизирует тетраэдрический интермедиат и, следовательно,
чит скорость реакции. Однако наличие аминогруппы в
увели
этом
положении приводит к снижению скорости
реакции
в 10 раз
паре
Вероятно, силы притяжения в ионной
эдрический интермедиат, замедляя его расщепление.
стабилизируют
тетра-
Что же произойдет, если аминогруппа будет находиться в по-
ложении 3? Скорость реакции возрастет в 103
по сравнению
раз
с б-аминоаналогом. В 2Н2О отношение kn/ko достигает 2,82, что
предполагает внутримолекулярный катализ с участием раствори-1
теля.
Химия ферментов
233
4.4.2. Абсолютная конформация связанного субстрата
Какова точная ориентация субстрата в активном центре?
Каково положение расщепляемой связи относительно каталитиче-
ских групп? Вот некоторые из тех вопросов, которым посвятили
свои работы Ниман и Белло.
Один из возможных путей для получения ответа на поставлен-
ные вопросы, вероятно, состоит в использовании простых модель-
ных субстратов фермента а-химотрипсина. С этой целью Хейн и
Ниман [Ю1] впервые попытались выяснить конформацию некото-
рых субстратов, присоединенных к а-химотрипсину, используя
молекулы с фиксированной конформацией, для моделирования
конформации, которую принимает в активном центре типичный
ациклический субстрат метиловый эфир N-ацетил-ь-фенилаланина
(l-APME). Для этого Ниман изучал кинетические свойства d- и
l 1-кето-3-карбометокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (KCTI). Это
кстг
(соединение Нимана)
соединение представляет собой жестко закрепленный аналог
l-АРМЕ, а также метилового эфира N-формилфенилаланина
(t-FPME) и метикового эфира N-бензоил-ь-аланина (ь-ВАМЕ),
каждый из которых — хороший субстрат а-
лимотрипсина. I/
Хотя а-химотрипсин стереоспецифичен I] / 'мц
к к-изомерам большинства аминокислот-суб-
стратов, Ниман показал, что в случае K.CTI ^'С СН3
наблюдается обратная стереоспецифичность. н II
о-Изомер этого копформацнонно закреплен-
ного эфира гидролизуется со скоростью, о-ксп
сравнимой со скоростью гидролиза метилового эфира N-ацети-
мрованпого l фенилаланина, тогда как ь-изомер гидролизуется
I очень медленно. Такое аномальное поведение соответствует требо-
I ранию для карбоксильной группы d-KCTI занимать аксиальное
234
Глава 4
положение, т. е. положение, соответствующее возможному распо-
ложению ациклических субстратов — эфиров ь-аминокислот [101,
102J.
Субтилизин, сериновая протеаза бактериального происхождения,
также проявляет, подобно а-химотрипсину, обращенную специ-
фичность к d-KCTI [103]. Это предполагает, что оба фермента
обладают сходной специфичностью к конфигурации их субстратов.
Такая общая специфичность ясно подтверждает близкую струк-
турную аналогию первичных связывающих центров обоих фермен-
тов, и, более того, она отражает эту аналогию. Близкая структур-
ная аналогия объясняет, каким образом а-химотрипсин и
субтилизин, имеющие абсолютно разное филогенетическое проис-
хождение, в действительности «замораживают» свои субстраты
в одинаковой активной конформации.
Работы Силвера и Соуна [104] указывают, однако, на пред-
почтительность экваториальной ориентации эфирной группы. Таким
образом, результаты этих исследований привели к существенно
различным взглядам на ориентацию (аксиальную или экваториаль-
ную) карбометоксигруппы d-KCTI и, следовательно, связанного с
ферментом ь-АРМЕ [104, 105]. Вопрос о том, является ли ориен-
тация этой эфирной группы аксиальной или экваториальной, не
был однозначно решен в исследованиях Нимана и сотр. Причина
этого, вероятно, заключается в том, что в большинстве использо-
ванных соединений характерные элементы структуры нормальных
субстратов а-химотрипсина так сильно изменены, что это вызы-
вает серьезные сомнения в применимости моделей.
R = Cl
R’ = СН
R' = СН;
'2
XCN
R = С—NHAc
XCO2Et
R => СН—NH,®
^CO4e
а
н н
BiPhME \
(соединение \
Белло) выделенная
^-конфигурация
R'= Н
Химия ферментов
235
Однако в 1968 г. Белло и Шевалье синтезировали из дифеиового
ангидрида уникальный фиксированный субстрат 3-метоксикарбо-
нил-2-дибензазоцинон-1 [106]. Это бифенильное соединение с 2,2'-
мостиком представляет собой аналог метилового эфира N-бензоил-
фенилаланина (ВРМЕ).
Было показано, что а-химотрипсин обладает так называемой
первичной оптической специфичностью к этому бифенильному
модельному соединению, т. е. только энантиомер, родственный
t-фенилаланину, гидролизуется ферментом.
Вообще говоря, существуют еще три уровня специфического
узнавания субстратов в ферментативном катализе. Давайте рас-
смотрим пептидную связь в полипептидной цепи. Боковая цепь R2
определяет нормальную специфичность фермента. Для а-химотрип-
сина R2 — это ароматическая боковая цепь, а гидрофобная полость
(ароматическая щель) в активном центре предназначена для взаи-
модействия с аминокислотой, узнаваемой ферментом. Такую изби-
рательность называют первичной структурной специфичностью.
расщепляемая
связь
О
--NHCH с—
первичная оптическая
специфичность (п или о)
вторичная
структурная
специфичность
NH C C : NH R
з /-^вторичная
^структурная
специфичность
7/77/
первичная
структурная
специфичность
о
н
Влияние соседних аминокислотных остатков R] и R3 на опреде-
ленные участки активного центра также играет важную роль для
осуществления необходимых взаимодействий и правильной ориен-
тации субстрата. Это влияние ответственно за вторичную струк-
гурную специфичность фермента. Наконец, существует еще третич-
I ный уровень структурной специфичности, который кратко ниже
обсуждается.
Удивительное свойство бифенильного модельного соединения
I состоит в том, что в растворе оно существует в двух медленно
I взаимопревращающихся формах, в которых эфирная группа зани-
I мает либо внешнее (экваториальное), либо внутреннее (аксиаль-
I вое) положение относительно бифенильной системы. а-Химотрипсин
I проявляет существенную специфичность к 5,5Экв-конформеру, тог-
I да как остальные конформеры существенно инертнее к ферменту.
I Скорость гидролиза и константа Михаэлиса для активного кон-
I фермера фактически идентичны аналогичным величинам соответ-
I ствующего нормального субстрата — метилового эфира N-бензоил-
I фенилаланина.
236
Глава 4
S S3KB
R— S
UK.C
BiPhME
(соединение
Белло)
Если с химотрипсином инкубировать раствор чистого акс’КОН"
формера (в смеси диоксан — вода, 5:95), никакого гидролиза не
происходит. Однако в диоксановом растворе этот же конформер
через некоторое время под действием а-химотрипсина легко гидро-
лизуется. Следовательно, при растворении кристаллов R, 5акс-кон-
формера в органическом растворителе происходит постепенная
изомеризация в ферментативно активный конформер.
Из тщательного сопоставления молекулярных моделей мож-
но сделать вывод, что соединения Нимана (d-KCTI) и Белло
(5,5экв-конформер) подходят как ключ к замку только в том слу-
чае, когда эфирная группа d-KCTI ориентирована аксиально, нахо-
дясь в связанном с а-химотрипсином состоянии (рис. 4.4). По-
этому, если эфирная группа в соединении Нимана ориентирована
аксиально, соединения Белло и Нимана идентичны па молекуляр-
ном уровне. Способность существовать в различных формах делает
соединение Белло лучшей моделью при анализе конформации суб-
стратов, связанных с а-химотрипсином.
Важное значение имеет также факт, что R, 5аКс-конформер не
только устойчив к действию а-химотрипсина, но он также не спосо-
бен ингибировать гидролиз активного 5,5экв-конформера. В про-
тивоположность этому было показано, что l-KCTI сильно ингиби-
рует химотриптический гидролиз d-KCTI. Подобное конкурентное
ингибирование продемонстрировано также и для других энантио-
мерных пар субстратов химотрипсина. Чтобы понять такое пове-
дение, следует уяснить, что два конформера соединения Белло раз-
личаются в двух важных аспектах: ориентацией карбоксиметиль-
ной группы и хиральностью бифенильной системы. Следовательно,
Химия ферментов
237
надо сделать вывод о том, что в реакциях с фиксированными
субстратами а-химотрипснп проявляет способность к специфиче-
скому узнаванию молекулярной асимметрии. Это называется тре-
тичной структурной специфичностью. Таким образом, специфич-
ность бифенильных соединений служит развитию представлений
о том, что соответствующие субстраты, обладающие жесткой кон-
формацией, могут быть весьма полезными инструментами.
Рис 4.4. Стереомодели Драйднпга, показывающие, что соединение Нимана в D-
конфигурацпи может быть совмещено с бифенильным модельным соединением
Белло.
Одинакова ли «молекулярная хиральная специфичность» фер-
ментов, имеющих столь различное филогенетическое происхожде-
ние, как папаин (тиольная протеаза растений) и субтилизин
(сериновая протеаза бактерий)? Фиксированное бифенильное
соединение, естественно, весьма удобно для решения этого вопроса,
потому что оно представляет собой молекулярный асимметричный
аналог ВРМЕ—хорошего субстрата всех трех протеаз. Оказы-
вается, что субтилизин ведет себя с бифенильными изомерами
точно так же, как а-хнмотрипснн. Однако к папаину и R, SaKC-, и
$,5Экв-конформеры неактивны. Неактивность соединения к па-
паину обусловлена цис-конфигурацией ацила мидиой части суб-
страта. Для папаина, вероятно, требуется трансоидная конфигура-
ция вокруг амидной связи, чтобы прошел гидролиз субстрата.
Однако ситуация не столь проста, поскольку при изучении
синтезированных цисоидного и трансоидного 9- и 10-членных лак-
тамных аналогов субстрата обнаружено [107], что транс-изомеры
ие проявляют заметной субстратной активности к трем изучен-
I ним протеазам.
238
Глава 4
Хотя эти отрицательные результаты несколько разочаровывают
(что часто бывает при использовании модельных соединений), они
тем не менее позволяют предположить, что реакционная способ-
ность отдельного субстрата, видимо, определяется в основном
конфигурацией расщепляемой связи относительно общей формы
молекулы субстрата и решающий фактор для катализа — ориента-
ция расщепляемой связи.
Как уже упоминалось, существует значительная перекрестная
специфичность для а-химотрипсина, папаина и субтилизина. Ре-
зультаты подобных исследований хиральной специфичности, види-
мо, прольют свет на новые аспекты эволюционной дивергенции
протеаз млекопитающих, бактерий и животных. Кроме того, акти-
вация зимогена, как правило, — это промежуточный этап как
в биосинтезе протеаз, так и в самых разнообразных биологических
процессах, например коагуляция крови, комплементарные реакции,
выработка гормонов, фибринолиз и т. д. Такой точный и ограничен-
ный протеолиз ферментами с широкой первичной специфичностью
также показывает решающую важность третичной структурной
специфичности протеаз в их взаимодействиях с природными суб-
стратами [107].
Следует отметить, что параллельно в молекулярной фармако-
логии существует одна из ее ключевых проблем — перекрестная
специфичность различных классов рецепторов. Лекарственные
препараты, обладающие структурными особенностями, необходи-
мыми для действия па определенный рецептор, часто вызывают
нежелательные побочные эффекты вследствие взаимодействия
с другими сходными участками рецептора. Знание хиральной спе-
цифичности отдельного рецептора (где это возможно) помогло бы
конструировать лекарственные препараты с повышенной специфич-
ностью к данному рецептору. А1ожно надеяться, что систематиче-
ское изучение хиральной специфичности протеаз поможет обеспе-
чить на более простом уровне более рациональную основу для
разработки эффекторов, специфичных к определенным рецепторам,
потому что ферментсубстратные взаимодействия в принципе имеют
ту же природу. Преимущество протеаз состоит в том, что они
менее сложны и более доступны, чем другие, часто трудноулови-
мые рецепторы.
4.5. Другие гидролитические ферменты
В число наиболее известных гидролитических ферментов, для
которых получены сведения о структуре и механизме действия,
входят экзопептидаза карбоксипептидаза А (гл. 6), рибонуклеаза А
(гл. 3) и лизоцим. В настоящей главе мы рассмотрим химию по-
следнего.
Лизоцим — важный белок, катализирующий гидролиз полиса-
харида, входящего как основной компонент в клеточные стенки
Химия ферментов
239
некоторых бактерий. Лизоцим состоит из Р(1-> 4)-сшитых чере-
дующихся звеньев N-ацетилглюкозамнна (NAG) и N-ацетилмура-
мовой кислоты (NAM) (рис. 4.5).
Молекула этого фермента не очень большая: его полипептидная
цепь включает 129 аминокислот. Лизоцим — первый фермент,
структура которого была установлена в 1967 г. с помощью рентге-
ноструктурного анализа [108]. В отличие от а-химотрипсина по
одной стороне эллипсоидальной молекулы лизоцима проходит глу-
бокая щель для связывания субстрата. Щель разделена на 6 участ-
ков ABCDEF. Остаток NAM может связываться только в участ-
ках В, D и F, тогда как остатки NAG синтетического субстрата
могут связываться со всеми участками. Связь, которая подвер-
гается расщеплению, находится между участками D и Е.
Карбоксильная группа Glu-35 в моноионизованнон форме и
карбоксильная группа Asp-52 в ионизованной форме—именно они
участвуют в работе активного центра.
Glu-35 выполняет роль общскислотпого катализатора, а
Asp-52 путем электростатического взаимодействия стабилизирует
240
Глава 4
промежуточный оксокарбопиевый нон, который помогает образо-
ванию положительного заряда па аномерном атоме углерода. Ин-
тересно, что интермедиат принимает конформацию полукресла,
чтобы устранить напряжение, возникающее в переходном состоя-
нии, имеющем характер «/Агибридного состояния (двойная связь
в цикле). Такое структурное изменение субстрата дает возможность
уходящей группе оторваться (кольцо Е) при стереоэлектронном
контроле (разд. 4.6). Механизм действия лизоцима также хорошо
иллюстрирует концепцию, выдвинутую в 1948 г. Полингом: «Ак-
тивный центр фермента комплементарен переходному состоянию
NAG
NAM
лизоцим
NAM NAG NAM
Рис. 4.5. Структура гсксасахарида, связывающегося с активным центром лпзо-
цима. При связывании с ферментом происходит искажение сахарного кольца D
в субстрате п катализу способствует образование оксокарбониевого иона. Это
приводит к образованию полярного переходного состояния. Тем не менее важное
свойство фермента заключается в его способности стабилизировать (нейтрализо-
вать) фермеитсубстратный комплекс путем электростатического взаимодействия
~~~с аминокислотными остатками в активном центре.
реакции, которую он катализирует», т. е. фермент приспособлен бо-
лее эффективно связывать промежуточное соединение при пере-
ходе между субстратом и продуктом реакции, чем сам субстрат
в основном состоянии [349] -
Выполнено очень много теоретических работ с целью оценки
энергии связывания субстратов с ферментами. Многообещающие
результаты получили Шерага н сотр. [110]. Вычисляя конформа-
ционную энергию, они находили наиболее выгодные модели свя-
зывания олигомеров p-D-N-ацетилглюкозамина (NAG) с активным
центром лизоцима. Для этого при минимизации энергии учитыва-
лись конформационные изменения и взаимные перемещения суб-
страта н боковых цепей фермента. Было обнаружено, что лизоцим
связывает левой частью щели активного центра преимущественно
два последних остатка (NAG)6, что согласуется с ранее получен-
ными рентгеноструктурными данными [109]. Вычисления показали
также, что N-ацетильная группа в NAG-олигомере играет важную
роль, обеспечивая достаточное взаимодействие с ферментом; таким
образом объясняется и факт, что олигомеры глюкозы связываются,
проявляя гораздо меньшее сродство.
Изучение искажений субстратов может, разумеется в модельных
соединениях, привести к важным выводам как о механизме, так и
Химия ферментов
241
о скорости реакции. Например, изучена реакция гидролиза следую-
щих ацеталей [111]:
Наличие о-карбоксифенильной группы увеличивает по сравне-
нию с пара-изомером скорость реакции гидролиза в К)4 раз в ряду
глюкозы и в 600 раз в ряду других, более простых молекул. Однако
роль карбоксильной группы в механизме последней реакции
остается неясной. Опять-таки изучение реакции в 2Н2О показывает,
что в переходном состоянии имеет место миграция протона.
При этом возможны три внутримолекулярных механизма: два
из них включают нуклеофильную атаку капбоксилатом и один —
внутримолекулярный общекислотный катализ.
242
Глава 4
3)
Однако первый механизм не реализуется, потому что цикличе-
ский промежуточный продукт, синтезированный другим способом,
стабилен в условиях реакции. +
Второй механизм включает миграцию СН2ОСН3. Однако
в ультрафиолетовых спектрах не наблюдается изобестнческих то-
чек *, что должно бы иметь место при таком механизме.
Последний, третий, механизм наиболее предпочтителен. До
известной степени он сходен с механизмом действия лизоцима,
потому что карбоксильная группа ведет себя как общекислотный
катализатор (Glu-35) и СН3О-группа соответствует кислороду
глюкозного кольца.
Наконец, следует упомянуть, что участие соседних карбок-
сильных групп в гидролизе амидов также имеет значение для
понимания ферментативного гидролиза амидов. Один из таких
ферментов — кислая протеаза пепсин из желудочного сока; ме-
ханизм ее действия включает общекислотный катализ. Клюгер
и Лам синтезировали фиксированные модельные соединения, что-
бы изучить участие карбоновой кислоты в гидролизе амидов
[112]. Они обнаружили, что аниловые производные эндо-^ис-б-
норборнепа соответствуют критериям жесткого геометрического
сближения взаимодействующих функциональных групп.
CONHR
R = CGII5
= С6Н4—4—OCHj
- С€Н4—4—CI
= С6Н4—3’— NOZ
= С6Н4—4’—NOZ
Это фиксированные субстраты, поэтому энтропийный барьер об-
разования промежуточного продукта минимален. Для этих со-
единений легко можно наблюдать и общеосповиой, и общекислот-
ный катализ в широком диапазоне pH.
* Изобестические точки — это точки равной амплитуды при данной длине
волны, которые появляются при наложении трех или большего числа спектров
системы, полученных для разных концентраций. Изобестические точки наблю-
даются только для систем, в которых существует равновесие между двумя спек-
трально различными состояниями при изменении относительного количества мо-
лекул в этих состояния^.
Химия ферментов
243
Поскольку в кислой протеазе пепсине возможно возникнове-
ние ковалентной связи между группой аспарагиновой кислоты,
находящейся в активном центре, и пептидным субстратом, можно
предположить образование реакционноспособного ангидрида.
В активном центре доступна вторая карбоксильная группа [113],
поэтому, по-видимому, имеет место механизм, подобный приве-
денному выше.
4.6. Стереоэлектронный контроль в реакциях гидролиза
После предпринятого обсуждения примеров гидролитических
реакций и гидролиза ацеталей ферментами можно только удив-
ляться, насколько важную роль в этих превращениях играет сте-
реохимия продуктов и реагирующих соединений.
Именно этой проблеме посвящен настоящий раздел, где за
основу принята сравнительно новая концепция органической хи-
ни, стереоэлектронного контроля, предложенная Делоншамом
|Н4, 115]. Эта концепция учитывает свойства правильной ориен-
тации орбиталей при расщеплении тетраэдрического интермедиа-
та в гидролитических реакциях и совершенно отличается от ги-
потезы «орбитального управления» Кошланда, в которой пра-
вильное расположение орбиталей способствует образованию тет-
раэдрического интермедиата. Обсудим с этих позиций расщеп-
ние тетраэдрического интермедиата при гидролизе эфиров и
амидов
Считается, что обычный механизм гидролиза эфиров и ами-
дов проходит через образование тетраэдрического интермедиата,
гонтам предположил, что конформация этого тетраэдриче-
ского интермедиата (гемиортоэфир из эфира и гемиортоамид из
амида) весьма важна для понимания реакции гидролиза.
244
I
Глава 4
О
ОН
О
R—С—X
Н OR'
R—С—X
R-C—OR' + Н—X
X = ок"
или
NR,"
С 1971 г.
OR' _
тетраэдрический
интермедиат
R' = Н-
UIU
алкил
Делоншам
рию, в которой точная
диата играет основную
развивал новую стереоэлектроппую тсо-
конформация тетраэдрического интерме-
роль. Другими словами, стереохимия и
ионное состояние тетраэдрического интермедиата, ориентация сво-
бодных электронных пар и относительные энергетические барье-
ры расщепления и молекулярного вращения являются ключевыми
параметрами в стереоэлектропио-контролируемом расщеплении
тетраэдрического интермедиата, образующегося при гидролизе
амидов и эфиров. Постулировано, что точная конформация тет-
раэдрического интермедиата передается продукту реакции и что
специфическое разложение такого интермедиата контролируется
ориентацией свободных электронных пар гетероатомов.
х = or", nr2" транс гош.
трпнс-Коиформер (две группы R направлены противоположно
друг другу), участвуя в реакции, требует более низких энерге-
тических затрат, чем гош-конформер, который не может эффек-
тивно конкурировать в процессе расщепления. Следовательно,
расщепление проходит под стереоэлектронным контролем тогда
и только тогда, когда два гетероатома промежуточного соедине-
ния, каждый из которых обладает одной свободной электроннсп
парой, ориентируются антиперипланарно к уходящей О-алкильной
или N-алкильной группе.
Этот постулат получил экспериментальные доказательства
при изучении четырех видов реакций, а именно: окисления аце-
талей озоном, кислотного гидролиза циклических ортоэфиров,
конкурентного углеродно-кислородного обмена и гидролиза эфи-
ров с использованием ,8О-метки и, наконец, основного гидролиза
Ь1,Ы-диалкилировапных солей иминоэфпров основаниями. Рас-
смотрим кратко результаты трех последних экспериментов. За-
тем мы постараемся использовать эту концепцию при рассмотри
нии гидролиза эфирных и амидных субстратов сериновыми про-
теазами.
1
I
I
г
f
г
4
к
Э1
Э.
ж
Щ
с/
те
С
зь
во
де
вы
ЭТ1
Tai
спс
атс
пре
Химия ферментов
245
46.1 Гидролиз ортоэфиров
Кислотный гидролиз ортоэфиров приводит к промежуточному
гемиортоэфпру, который расщепляется па эфир и спирт.
OR' ОН
R'O—С- OR' --» R'O—С- OR' ---♦ R—COOR' + R OH
R R
+
ROH
Для циклического ортоэфира можно написать похожее урав-
нение:
Промежуточный гемиортоэфир разлагается совершенно спе-
цифическим образом, с образованием оксиэфира, так что не об-
наруживается никаких следов лактона. Чтобы объяснить этот
результат, мы должны рассмотреть все возможные конформеры
промежуточного соединения. Теоретически существуют девять
различных гош-конформеров тетраэдрического промежуточного
гемиортоэфира. На рис. 4.6 представлены девять возможных кон-
I фермеров циклического ортоэфира.
I Следовательно, задача заключается в том, чтобы определить,
I какой из конформеров позволяет объяснить образование окси-
I зфира как единственного продукта гидролиза Согласно стерео-
I «тройной теории, продукт реакции должен иметь точно такую
I же конформацию, что и тетраэдрический интермедиат, и рас-
I Нетление алкильной связи С—О может произойти только в том
I случае, если орбитали двух других атомов кислорода этого ин-
1термедиата ориентированы аптнперппланарпо к алкильной связи
|С-0, подвергающейся расщеплению.
Итак, при детальном рассмотрении каждого конформера ока-
1’чвается, что пять из них-—б, г, ж, з и и — можно не принимать
к, внимание вследствие сильных 1,3-снн-перипланарных взаимо-
действий между двумя этильными или циклическими метилено-
ети группами. Поскольку в состоянии равновесия содержание
11 х соединений очень мало, ими можно пренебречь. Конформер в
Iчкже следует исключить нз рассмотрения в качестве реакционно-
сособного конформера просто потому, что орбитали двух его
Bidmob кислорода направлены таким образом, что не способны
I, ввести расщепление связи С—О третьего атома кислорода.
246
Глава 4
В трех оставшихся конформерах а, д и е отсутствует какое-либо
сильное стеричсское взаимодействие, и каждый из них обладает
двумя атомами кислорода с соответственно ориентированными
орбиталями для расщепления С—О-связи третьего атома кисло-
рода.
Расщепление каждого из этих трех конформеров приведет
к образованию соответствующего диоксолений-иопа, согласно
только что упомянутому правилу соответствия ориентации ор-
биталей. Теперь (при рассмотрении относительной стабильности
каждого из этих диоксолепий-ионов для конформеров а, д и е)
очевидно, что структура д обладает zpzc-конформацней, а а и е —
транс. Известно, что транс-диоксоленнй-ион устойчивее, чем цис-
изомер, по аналогии с более стабильными тронс-эфирами. Следо-
вательно, расщепление конформера д — более высокоэпергетиче-
скнй процесс, и эту структуру также можно исключить (см.
рис. 4.6):
Труднее найти аргументы, чтобы сделать выбор между кон-
формерами а и е. Из общих соображений образование цикли-
ческого диоксолений-иона предпочтительнее образования ацикли-
ческого, если исходный ортоэфир циклический. Далее, при рас-
щеплении конформера а образуются две молекулы, тогда как из
конформера е образуется только одна молекула. Взятый отдель-
но этот энтропийный фактор говорит в пользу конформера а по
сравнению с конформером е как с реакционной частицей. От-
сюда следует заключить, что циклический ортоэфир гидролизует-
ся преимущественно через конформер а, даже если он существует
в быстро устанавливающемся равновесии с конформерами е и
д [114].
Был исследован большой набор ацеталей, эфиров н солей иминоэфиров, об-
ладающих различной степенью подвижности структуры, причем всегда наблюда-
лось согласие с этой теорией. Например, реакцией конформацнонно-жесткого би-
Химия ферментов
247
Рис. 4.6 Возможные, конформеры циклического ортоэфира [114]. Воспроизведено
с разрешения. © 1975 by Pergamon Press Ltd.
тлического лактона с триметилоксоннйтетрафторборатом можно синтезировать
лиллактопиевые соли:
Мадия с метилатом натрия приводит к образованию днметокснэфпра. В при-
отствии дейтерированного метилата натрия с выходом > 90% был получен
шешаииый циклический ортоэфир, содержащий дейтерированную метоксигруппу
к.->ко в аксиальном положении. Гидролиз ортоэфира в водной среде в присут-
евян n-толуолсульфокислоты приводит к образованию только недейтернроваи-
! I оксиэфира. Эти результаты подтверждают, что гидролиз циклических орто-
г ров проходит с отщеплением аксиальной алкоксигруппы, а также служит еще
ни доказательством того что конформер е следует исключить из рассмотре-
как возможный активный конформер и, следовательно, гидролиз цпклпче-
ю диалкоксиортоэфира происходит через конформер а
Дальнейшее доказательство стереоэлектроппого контроля при гидролизе эфи-
j амидов получено в экспевиментах по конкуренции реакций обмена кисло-
248
Глава 4
рода карбонильной группы и гидролиза эфиров с использованием соединений, ме-
ченных |8О [116].
О*
II
R—С—OR + Н2О
*он
о
R—С—ОН + ROH
он
or + н2о*
,8О = о*
Если при стереоэлектронпо-коитролнруемом расщеплении действительно не про-
исходит конформационных изменений в тетраэдрическом интермедиате, то кон-
курентный обмен кислорода карбонильной группы в процессе гидролиза можно
использовать, чтобы подтвердить и отсутствие конформационных изменений, и
стереоэлектронную теорию. Выдвинутые предположения позволяют сделать сле-
дующие предсказания: (Z)-эфиры могут участвовать в обмене кислорода карбо-
нильной группы, а (Е)-эфиры — пет*. Примером (Е)-эфира может служить
|8О-мечспый 6-лактон. Реакция с гидроксид-ноном приводит к образованию те-
траэдрического интермедиата, обладающего необходимой ориентацией электрон-
ной пары чтобы расщепление прошло только в одном из двух направлений, либо
с образованием исходного меченого эфира, либо продукта реакции.
* Z- п Е-иомепклатура для двойных связей и карбонильных групп молекул
основана па приложении правил приоритета Кана — Ингольда — Прелога. Если
две группы наибольшего приоритета на концах двойной связи расположены по
одну сторону двойной связи (цис), конфигурация двойной связи обозначается Z
Если две группы наибольшего приоритета расположены по разные стороны двой-
ной связи (транс), конфигурация двойной связи — Е. Эти правила можно также
применять для обозначения конформации эфиров, рассматривая С—О-связь По-
скольку свободная пара электронов имеет низший приоритет, конформация обо-
значается как Z, если алкокенгруппа Е расположена по ту же сторону, что п
кислород карбонильной группы. Если опа расположена по другую сторону, как
В случае лактонов, конформация обозначается Е.
Химия ферментов
249
Поскольку тетраэдрический интермедиат ие способен образовать немеченый
эфир обмен кислорода в карбонильной группе не имел места в (Е)-эфире Ре-
зультат этого эксперимента находится в соответствии с ранее описанными в ли-
тературе данными, показывающими, что обмен кислорода карбонильной группы
в лактонах не происходит В то же время при гидролизе (2)-эфиров всегда про-
исходит обмен кислорода карбонильной группы с растворителем
Результаты экспериментов с лактонами можно также объяснить, используя
кинетические представления. Действительно, степень обмена в карбонильной груп-
пе меняется в зависимости от относительных величин k3 н k2. Если k3/k2 > 100,
происходит очень медленный обмен, который трудно обнаружить. Это соображе-
ние согласуется с экспериментальными данными для (Е)-эфиров.
4.6.2. Приложение к сериновым протеазам
Было бы разумно рассмотреть, насколько такие представле-
ния применимы для понимания механизма ферментативных реак-
ций. Похоже, что стереоэлектронная теория, разработанная Де-
лопшамом и сотр., особенно подходит для случая гидролиза
пептидной связи сериновыми протеазами. Для иллюстрации это-
го подхода рассмотрим сначала гидролиз эфиров.
Промежуточный гемиортоэфир расщепляется с образованием
двух эфиров, каждый из которых имеет либо (£)-, либо (Z)-кон-
формацию.
да да
В соответствии с принципом микроскопической обратимости,
при образовании гемиортоэфира атака алкокси-ионом на эфир
также должна происходить под стереоэлектронным контролем.
Поскольку трансоидный (2)-эфир в общем более стабилен,
чем соответствующий цисоидный (£)-эфир, используем этот при-
мер, чтобы проанализировать атаку гидроксильной группой
250
Глава 4
серина в активном центре. Можно ожидать, что остаток серина
приблизится к эфиру, ориентируясь в противоположную от более
объемистой R-группы субстрата сторону.
Однако присоединение остатка серина к тетраэдрическому
интермедиату приведет к возникновению значительного стериче-
ского напряжения (~33,4 кДж, или ~8 ккал) из-за взаимодей-
ствия с алкоксицепью. Чтобы устранить это напряжение, в ак-
тивном центре должно произойти изменение конформации путем
поворота вокруг связи С—О, соединяющей тетраэдрический уг-
лерод с сериновой ОН-групной, па 120°.
(£),unu цисоидный, (Z) или трансоидный.
ацилсрермент ацигкрермент
Этот Новый тетраэдрический интермедиат в конечном счете
приведет к образованию цисоидного промежуточного ацилфер-
мента, который, видимо, и будет основным продуктом.
Возможен также поворот на 120° группы —ОСНз. В этом слу-
чае эфирная группа меняет конформацию по отношению к группе
R с транс- на гош-. Этот новый тетраэдрический интермедиат,
а также исходный приводят к образованию трансоидного проме-
жуточного ацплфермента после отщепления —ОСН3-групны, ко-
торому способствует взаимодействие с орбиталями.
Третий возможный конформер следует исключить из рас-
смотрения, поскольку его расщепление не может иметь места
Химия ферментов
251
даже после поворота —ОСН3-группы. Он представляет собой не-
продуктивный связывающий интермедиат.
Однако, если трансоидно-цисоидная изомеризация эфирного
субстрата под действием фермента происходит до атаки серино-
вым остатком, образуется другой тетраэдрический интермедиат:
(Z),unu трансоидный,
ацилфермент
В этом случае стерическое напряжение не столь велико, как
к предыдущем, и такой интермедиат расщепится с преимущест-
рнным образованием трансоидного ацилфермента.
I Гидролиз М,1Ч-алкилированных солей иминоэфиров также про-
шит под стереоэлектронным контролем, и эта реакция была
пользована для изучения механизма гидролиза амидов. Воз-
игано отщепление или ROH, или R2NH.
or
R—с; + еон
^nr2
® 2
OR
I
R—С—ОН
I
NR2
R'COOR + HNR2
R CONR2 + ROH
В этом случае опять-таки для отщепления остатка иеобхо-
№ участие двух антиперипланарных свободных орбиталей
252
Глава л
остающеюся гетероатома в образующемся амиде. Если потен-
циально доступна только одна электронная пара, расщепление
проходит без затруднений только после переориентации связей
1Н7].
Эта модель приложима к случаю гидролиза амидных связен
протеазами, и было бы удивительно, если бы ферментативный
гидролиз не подчинялся этим принципам.
Данный простой пример приводит к интересным предположе-
ниям относительно механизмов ферментативных реакций. Проис-
ходит ли конформационное изменение субстратного тетраэдриче-
ского интермедиата или остатка активного центра фермента?
Очевидно, для решения этой проблемы необходимы биоорганиче-
ские модели. Такие модели, которые еще только будут созданы,
дадут возможность определить механизм действия протеаз ис
ходя из тетраэдрического интермедиата с относительно фикси-
рованной конформацией.
Далее предполагается, что принцип стереоэлектронного конт-
роля при гидролизе эфиров и амидов можно широко применял
и в других областях энзимологии, и, следовательно, некоторые
общепринятые принципы катализа потребуют пересмотра.
В работе [118] предпринята попытка объяснить, почему оста
ток пролина в составе пептидной связи устойчив к гидролиз}
а-химотрипсииом. Цель исследования состояла в том, чтоб!
выяснить, является ли отсутствие реакционной способности еле;
ствием неблагоприятного взаимодействия метиленовых групп
пролинового кольца с активным центром фермента, или же г*
образовании фермептсубстратпого комплекса, так же как а
время последующих стадий изменения структуры связи, имеют
место стерические затруднения, и связаны ли эти стерически
затруднения со структурой пролинового кольца или просто с за
Химия ферментов
253
мешением амидного атома азота. Чтобы ответить на эги вопро-
сы, были синтезированы дипептиды — амиды М-ацетпл-ь-фенил-
аланил-ь-пролина и N-ацетил-ь-фенилаланилсаркозина и изуча-
лось их поведение в качестве субстратов а-химотрипсина.
Обнаружено, что оба соединения иереакциоииоспособны, но
они оказались хорошими конкурентными ингибиторами специ-
фического субстрата N-Ac-L-Phe-OMe. Это показывает, что они
254
Глава 4
образуют фермептсубстратпые комплексы нормальной стабильно-1
сти и что причину отсутствия реакционной способности следует I
искать в природе ферментсубстратных взаимодействий, имеющих ’
место при последующих изменениях структуры связи. Другими
словами, отсутствие реакционной способности можно попять, рас-
сматривая стереоэлектроиные превращения, приводящие к проме-
жуточному ацилферменту.
Три
Рис. 4.7. Механизм стерсоэлсктропного контроля по Делоншаму прн гидро;
вторичных амидов а-хнмотрнпснном.
сте;
орб
ант
и к
стот
в тс
лещ
цент
соот
(зат
Химия ферментов
255
Рнс. 4.7. Продолжение.
I Атака транс-пептидной связи гидроксилом Ser-195 а-химо*
штейна приведет к пространственному расположению, изобра-
рыному на с. 253 (внизу).
I Исходя из принципа микроскопической обратимости, теория
рреоэлектронного контроля предсказывает, что образующиеся
витали свободной электронной пары rerepoafOMOB должны быть
иперипланарпы новой связи углерод—кислород (из Ser-OH
карбонила амидной группы) или углерод — азот. Важное об-
мтельство, которое следует учитывать в этом случае, состоит
гом, что несвязывающая пара электронов атома азота направ-
ив сторону растворителя, a N—Н-связь — внутрь активного
вира фермента. Чтобы облегчить пространственное восприятие,
Ьветствующие атомы совмещены с контурами транс-декалина
Ввезенная область).
(.релизе
256
Глава 4
Если водород в связи N—Н замещен иа алкильную группу,
как в случае остатка пролина, этот заместитель слишком близко
подходит к имидазольному кольцу His-57. Следовательно, дипеп-
тид, содержащий остаток пролина, не гидролизуется «-химотрип-
сином, потому что стерические затруднения препятствуют обра-
зованию тетраэдрического интермедиата.
Что касается механизма реакции ацилирования, стереоэлект-
рониые требования при расщеплении связи углерод—азот и об-
разовании ацилфермента выполнены, однако для расщепления
необходимо, чтобы прошло протонироваипе атома азота. Обще-
принято, что имидазольное кольцо в His-57 играет роль прото-
нирующего агента; ситуация, показанная выше, не может реали-
зоваться, поскольку свободная орбиталь уходящего азота направ-
лена в другую сторону.
Считая, что растворитель не участвует в протопировании —i
депротонированпи, для образования нового интермедиата, в ко-
тором ориентация связи N—Н и ориентация свободной орбитали
поменялись бы местами, необходимо предположить инверсию ухо-
дящего атома азота.
Такая инверсия ие только сделает возможным прямое про-
тонирование уходящего азота в His-57, но и стабилизирует связи
С—О (Ser-195), так как последняя будет теперь антиперипла>
парна связи N—Н, а не свободной электронной паре. Такое кон-
формационное изменение, вероятно, ие может произойти в при-
сутствии остатка пролина.
Делоншам любезно сообщил нам свои собственные взгляды
на механизм, по которому «-химотрипсин и другие сериновые
протеазы могут гидролизовать вторичные амины при стереоэла
тронном контроле (рис. 4.7). Петков и др. [119], изучая влияние
уходящей группы на реакционную способность анилидов при гид-
ролизе, катализируемом а-химотрипсином, пришли к подобному
же заключению. Кроме того, теория стереоэлектронпого контрол
была использована в приложении к механизму действия рибо
нуклеазы А, нуклеазы стафилококков и лизоцима [120].
Химия ферментов
25?
Наконец, следует указать, что принцип углового напряжения
амидных связей развит также Моком в 1976 г. и использован
в приложении к механизму действия карбоксипептидазы А [121].
Он включает поворот амидной связи таким образом, чтобы стало
возможным цис- или транс-присоединение нуклеофила и протона
по образующимся орбиталям в переходном состоянии. Этот прин-
цип дополняет теорию (Делоншама) оптимальной геометрии тет-
раэдрического интермедиата в переходном состоянии.
4.7 Иммобилизованные ферменты и ферментная технология
Закончим эту главу примерами из развивающейся технологии, использую-
щей ферменты, присоединенные к твердой матрице, которые применяются для
проведения специфических превращений биоматериалов. Используемый фермент
присоединяется к полимерному носителю с помощью «мостиковой» молекулы.
Ь-
1И
о-
про-
вязь
1пла-
кон-
при-
ляды
[овые
элек-
ляние
[ гид-
эному
троля
рибо-
Инертный носитель может быть полиуретаном нлп полимером другого типа
ибо природным полимером (например, коллаген, легко выделяемый из шкур жи-
ви). Подвижный «мостик» присоединен к функциональной группе на поли-
керном геле. Длина мостика — важный параметр, так как свободный конец дол-
ин быть способен образовать ковалентную связь с функциональной группой
фермента, не влияя на ферментативную активность. Такой фермент, пришитый
f матрице, обычно называют иммобилизованным ферментом [122—125]. В отли-
ву от широко распространенного метода аффинной хроматографии * в данном
иучае фермент, а ие субстрат ковалентно сшит с твердым носителем. Однако
нршцнп биоспецифического узнавания тот же.
В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в ка-
честве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшиваю-
щее агента обычно выступает BrCN, а мостик образован a.w-диамином. Эти
| кишеахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органн-
1*ские полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более
I лоннй набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-
| дса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых ор-
l-amecHiix полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот
I' вд превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации
1 поентельно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого
| шера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых фер-
1г ами.
I Во-первых, путем нагревания акриламида и N-акрилоксисукцинимида с нни-
штором радикальной полимеризации азобиензобутиронитрилом (АИБН) сипте-
Нцупся несшитый водорастворимый сополимер, несущий активные эфирные
I угон Реакция этого полимера с а,<о-диамииом, выступающим в роли сшиваю-
1.0 агента, и с ферментом, который должен быть иммобилизован, приводит к
I -Прим. ред.
‘См. книгу Туркова Я. Аффинная хроматография. Пер. с англ. — М.: Мир,
| Зак. 649
258
Глава 4
фермента и образованию геля. Реакцию с участием ферментов
к присутствию кислорода, проводят в атмосфере аргона. В конце
разрушения оставшихся активных групп добавляется лизин.
иммобилизации
чу вствительных
обработки для
Важная особенность этого метода состоит в том, что добавление фермента
в реакционную смесь во время образования геля сводит дезактивацию фермента
к минимуму. Далее, ковалентное присоединение фермента к гелю обеспечивает
в некоторой степени защиту от протеаз. Эта процедура проста и универсальна;
опа может быть прямо использована для многих ферментных систем, а также
для иммобилизации целых клеток н органелл. Наконец, гель может быть при-
способлен для магнитной фильтрации, если при образовании геля использовать
железосодержащую жидкость.
Необходимо представлять, что одной из основных задач в этой области яв-
ляется развитие методов стабилизации фермента в нативной форме [123]. Зна-
чительный прогресс в этой области достигнут путем использования бифункцио-
нальных реагентов для сшивания пептидных цепей, определяющих третичную
структуру фермента.
Венатурцровдннйя форма
(неактивна)
/
Сшивание предотвращает денатурацию в жестких условиях обработки и со-
храняет неизменным активный центр. Наиболее широко используются в качестве
сшивающих агентов имипоэфиры Реагируя с доступными боковыми rpynnaui
Химия ферментов
259
лизина, они образуют амидные связи между двумя участками полппентидпой
цепи.
Однако число атомов углерода между реакционноспособными имипоэфир-
иыми группами должно быФь невелико. В противном случае начнут образовы-
ваться также и межмолекулярные сшивки.
Такая техника иммобилизованных ферментов соединяет уникальные возмож-
ности двух видов катализаторов специфичность ферментов со стабильностью,
простотой в обращении и хранении гетерогенных катализаторов иа подложке,
более того, иммобилизованные ферменты можно использовать повторно, а также
применять для синтеза в потоке. Поэтому оии находят все более широкое приме-
кине в различных областях анализа и в медицине.
Полезное применение нашла такая техника и в промышленности; она полу-
щи название инженерная энзимология или ферментная технология Фермеит-
иую технологию назвали «решением для еще не найденных проблем» [122]
В действительности этот метод еще должен оправдать многие из тех ожиданий,
вторые ее сторонники считают уже осуществленными. Тем не менее надо знать
;ее возможностях и подготовиться к применению этой технологии завтрашнего
ня.
Давайте рассмотрим несколько примеров нз конкретной области производ-
им — производства продуктов питания. Одна из разработок посвящена улуч-
«ешю качества пищевых продуктов. Иммобилизованную fi-галактозидазу теперь
фоизводят, присоединяя полнизоцпанатный полимер к магнитному стер/кню-ме-
илке. Фермент, удерживающийся между волокнами, используют для понижения
•держания лактозы в молоке, чтобы решить проблему повышенной чувствитель-
и к лактозе. Кроме того, после такого процесса молоко можно хранить
В*
260
Глава 4
в замороженном виде более длительное время, не опасаясь его загустевания и
свертывания, вызываемого кристаллизацией лактозы в молоке.
Иммобилизованные ферменты получили и другие применения в пищевой про-
мышленности. Одно из них заключается в утилизации целлюлозы из макулатуры,
древесных стружек, сахарного тростника, ее деградации до глюкозы и превра-
щения глюкозы в крахмал — пищевой продукт. Все эти процессы проводятся с
помощью ферментов и могут быть использованы ферментной технологией.
Более впечатляющий пример — возможность превращения производных, по-
лучаемых из жидкого горючего (нефти), в пищевые углеводы. Для такого пре-
вращения необходимо промышленным способом расщепить нефтепродукты до
глицеральдегида. Затем глицеральдегид можно ферментативным путем превра-
тить во фруктозу, глюкозу и крахмал.
К высшему достижению ферментной технологии будущего в области
синтеза углеводов относится моделирование природного процесса фиксации СО2.
Для этого необходимы кроме иммобилизованных ферментов еще и иммобилизо-
ванные коферменты В этом направлении предпринимается много усилий [124]
Например, при создании ферментативного электрода и модельного фермен-
тативного реактора [127] использован аналог NAD+, присоединенный к водорас-
творимому декстрановому полимеру. Очевидны возможности приложения дости-
жений в этой области для медицины
Покажем принцип метода на одном примере. Реакция окисления — восстанов-
ления NAD++ субстрат-> NADH + Н+продукт может быть сопряжена с им-
мобилизованными'ферментами. В такой модельной системе субстрат подается на-
сосом в камеру, содержащую связанный с декстраном NAD+ и две NAD+ зави-
симые дегидрогеназы. С противоположной стороны продукт реакции удаляется
с той же скоростью методом ультрафильтрации. Таким образом, процесс может
быть непрерывным.
Реальность такого реактора была показана на примере получения аланина
из молочной кислоты Смещение равновесии в нужную сторону в таком реак-
торе, содержащем лактатдегидрогеназу, достигается использованием высокой кон-
центрации субстрата и быстрой утилизацией пировиноградной кислоты вторым
ферментом. Стоит отметить, что подобная система служит также моделью воз-
можного применения в лечебных целях, в которой ферменты и коферменты, им-
мобилизованные вместе, могут функционировать как самостоятельная единица
для коррекции метаболического дисбаланса.
Некоторые из приведенных здесь примеров могут быть встречены скептиками
как нереальные. Однако мы верим, что в недалеком будущем эти проекты так
или иначе будут разработаны в виде, пригодном для практического применения.
Как сказал Мосбах, приведенные выше примеры можно рассматривать в каче-
стве первых шагов в области синтетической биохимии [124].
Химия ферментов
261
В настоящее время в фармацевтической промышленности нашли практиче-
ское применение два процесса. Первый из них — это синтез аналога кортизона,
преднизолона, который используется в качестве лекарственного препарата для
лечения ревматоидных артритов. Предшественник стероида, соединение Рейх-
штейна, пропускают последовательно через две колонки, каждая из которых со-
держит специфический фермент, присоединенный к полиакриламидному полимер-
ному носителю [128]. При этом происходит реакция гидроксилирования прохи-
рального С-11, причем конфигурация сохраняется.
ОН
кортизол
преВнизолон
Такой метод синтеза быстр, регпо- и стереоселективен и экономичен. В не-
юторой степени благодаря подобному синтезу цена на кортизон снизилась с
? долл США за 1 г в 50-х гг. до нескольких центов за 1 г в 70-х годах.
Еше один пример, который также находит повседневное применение, касает-
ц специфического гидролиза пеиициллинамндазой природного пенициллина G
в препаративных количествах, при этом опять-таки используется хроматографи-
ями процесс [129]. В результате образуется чистый продукт гидролиза —
бдаииопенициллановая кислота, свободная от примесей, которая затем может
5ыть использована для синтеза всех видов полу синтетических производных пе-
цкллина. В противоположность нестабильному растворимому ферменту фер-
I rm, переведенный в нерастворимое состояние, не проявляет потери активности
262
Глава 4
даже при постоянном использовании в течение 11 педель при 37°С. Кроме того,
при такой обработке не образуются возможные аллергены (как примеси).
Н Н
о
СООН
Б-аминопеницилланоеая
кислрто.
Поскольку ценность ферментов заключается не столько в их чисто катали-
тической активности, сколько в избирательности их действия в процессе реак-
ции, ферментная технология предоставляет много возможностей для синте-
тической химии и привлечет внимание химиков-органиков к ферментам с целью
синтеза биологических молекул.
Е
«
F
Д
Д
т
т.
С'
с
С(
к;
П
ai
че
Bi
по
фс
ле
в
СТ]
ио
сто
Глава 5
МОДЕЛИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СИСТЕМ
Мы ходим вокруг да около и гадаем, а Ис-
тина сидит рядом и помалкивает!
Р. Фрост. Скрытая Истина
В качестве моделей ферментов, как правило, используют син-
тетические органические молекулы, обладающие характерными
особенностями ферментативных систем. Они меньше ферментов
по размеру и проще по структуре. Следовательно, моделирование
ферментов — это попытка воспроизвести на гораздо более про-
стом уровне некий ключевой параметр ферментативной функции.
Выявление определенного фактора, ответственного за каталити-
ческую активность фермента в биологической системе, является
трудоемкой задачей, требующей ясного представления о роли
^каждого компонента в катализе. Но, располагая подходящими
моделями, мы можем оценить относительную важность каждого
каталитического параметра в отсутствие других, не рассматри-
ваемых в данный момент. Главное преимущество использования
«искусственных структур» для моделирования ферментативных
реакций состоит в том, что вещества можно создавать именно
для изучения определенного конкретного свойства. Структура мо-
дели в дальнейшем может быть усовершенствована путем соче-
тания таких особенностей, которые дают наибольший вклад в ка-
тализ, и создания таких моделей, которые по своей эффективно-
сти действительно приближаются к ферментам. Таким образом,
с помощью методов синтетической химии становится возможным
создание «миниатюрного фермента», который лишен макромоле-
кулярного пептидного остова, но содержит активные химические
группы, правильно ориентированные в соответствии с геометрией
активного центра фермента. Этот подход называют биомимети-
ческим химическим подходом к изучению биологических систем *.
Биомиметическая химия — это та область химии, где делается
попытка имитировать такие характерные для катализируемых
ферментами реакций особенности, как огромная скорость и се-
лективность [350, 351]. Хочется надеяться, что такой подход
в конце концов позволит установить связь между сложными
структурами биоорганических молекул и их функциями в живом
* Слово «биомиметический» впервые было введено Бреслоу в 1972 г. и обыч-
но используется в любом случае, когда биохимический процесс моделируется про-
стой химической реакцией [197].
264
Глава 5
организме или по крайней мере приблизит нас к пониманию
этой связи. Для этого необходимо располагать множеством дан-
ных, касающихся механизма действия определенного фермента
Назовем только наиболее важные: а) структура активного цент-
ра и ферментсубстратного комплекса; б) специфичность фермента
и его способность связывать субстрат; в) кинетика различных
стадий и возможные промежуточные продукты, образующиеся
в процессе реакции.
Ферменты — это очень сложные соединения, и до сих пор де-
тально изучены механизмы действия лишь некоторых из них.
Именно поэтому возникает необходимость в модельных системах.
К функциональным группам полипептидных цепей, участвующим
обычно в каталитических процессах, относятся имидазольный
остаток, алифатические и ароматические гидроксильные группы,
карбоксильные группы, сульфгидрильные группы и аминогруп-
пы.
Каким образом такое ограниченное число функциональных
групп участвует в разнообразных ферментативных реакциях и
каким механизмом можно объяснить огромную скорость фермен-
тативных реакций? Такие фундаментальные вопросы должны
быть поставлены при проектировании биоорганической модели
фермента [130J.
В общем к модели фермента предъявляют два требования:
а) она должна в значительной мере воспроизводить механизм
ферментативной реакции и б) помогать объяснить возрастание
скорости реакции на основе структурных представлений и меха-
низма. Естественно, что все сведения, полученные с помощью
моделей, должны быть в конечном счете сопоставлены с поведе-
нием изучаемой ферментативной системы in vivo для того, чтобы
приблизить биоорганические модели к существующим в природе
системам.
Однако модельное соединение может обладать общими свой-
ствами, присущими более чем одному ферменту! В таком случае
требования, предъявляемые к созданию хорошей модели фермен-
та, могут быть обобщены в виде следующих пяти критериев:
1) поскольку в основе биологической подвижности и специ-
фичности лежат нековалентные взаимодействия, то модель долж-
на обладать хорошим (гидрофобным) участком связывания суб-
страта;
2) модель должна обеспечивать возможность формирования
электростатических и водородных связей, чтобы надлежащим об-
разом связывать субстрат;
3) каталитические группы должны быть тщательно выбраны
и надлежащим образом расположены в модели, для того чтобы
проходила каталитическая реакция,
4) структура модели должна быть жесткой и строго соответ-
ствовать ориентации и структуре субстрата;
Моделирование ферментативных систем
265
5) желательно, чтобы модельное соединение было водорас-
творимым и каталитически активным при физиологических зна-
чениях pH и температуры.
Эти критерии весьма условны, однако в них в неявной фор-
ме выражена мысль, что только путем правильного выбора мат-
рицы, способствующей сближению каталитических групп с суб-
стратами, может быть сконструирован эффективный катализатор.
Матрица не участвует активно в катализе, а только сближает и
жестко закрепляет субстрат и каталитическую группу (или груп-
пы) и правильно их ориентирует относительно друг друга. Есть
^надежда, что матрица, подобно ферменту, будет в процессе связы-
вания субстрата увеличивать энергию его основного состояния бла-
годаря увеличению жесткости и искажению связи. К тому же пра-
вильное геометрическое соответствие между модельным катализа-
S тором и субстратом приведет к повышению специфичности и эф-
фективности реакции. Эти соображения имеют фундаментальное
значение в данной главе.
В заключение отметим: чтобы модель фермента была дейст-
вующей, она должна отвечать ряду критериев, характерных для
ферментативного катализа, в том числе обладать субстратной
специфичностью, т. е. селективно связывать субстрат. Каталити-
| ческая реакция, моделирующая ферментативный процесс, должна
также подчиняться кинетике Михаэлиса — Ментен (явление на-
сыщения субстратом); при этом должна увеличиваться скорость
I реакции и осуществляться би- и/или полифункциональный ката-
лиз [348].
К настоящему времени удалось промоделировать в основном
В только гидролитические ферментативные процессы, но вполне
реально, что в скором будущем станет возможным ступенчатый
* синтез макромолекул, таких, скажем, как белки и нуклеиновые
кислоты. Например, если вещества со структурой, напоминаю-
v. щей рецепторы для лекарственных препаратов, удастся включить
в синтетические мембраны, то станет возможным изучение этих
рецепторов без каких-либо осложнений иммунологического и
-токсикологического характера. Кроме того, способность мембран
^разделять заряженные частицы может найти промышленное при-
менение в системах для накопления энергии или производства
Sводорода.
Начнем эту главу, посвященную моделированию ферментов,
с описания свойств, в том числе химических, некоторых синтети-
ческих органических акцепторных молекул, обладающих способ-
, ностью различать энантиомеры. В последующих главах рассмат-
риваются еще шесть подходов к моделированию ферментов,
а также приведены интересные и перспективные модели фермен-
тов и коферментов (особенно это касается гл. 7, посвященной
Созданию и функционированию коферментов).
266
Глава 5
5.1. Донорно-акцепторное комплексообразование
(химия комплексов типа «хозяин — гость»)
Установленный Педерсеном [132, 133] факт, что краун-эфиры
обладают уникальной способностью образовывать стабильные
комплексы с ионами металлов и алкиламмониевыми катионами
первичных аминов, открыл новые горизонты в органической хи-
мии [362—354] *.
12.-краун-4-эсрир
Используемая для краун-эфиров сокращенная номенклатура
довольно проста: первое число означает общее число атомов в коль-
це, а второе — общее число гетероатомов. Легко усмотреть анало-
гию между такими комплексами, имеющими «полость» для связы-
вания лиганда L, и активным центром фермента, специфически
узнающим свой субстрат. Размер макроцикла может меняться и
тем самым обеспечивать связывание лигандов разных размеров.
Циклические полиэфиры типа «краун» сравнительно легко можно
получить и подвергнуть разнообразным структурным модифика-
циям. Эту область химии Крам предложил назвать химией до-
норно-акцепторного комплексообразования** [134—136]. Напом-
ним также о гипотезе «замка и ключа», предложенной Фишером
в 1894 г. для описания структурного соответствия между фермен-
том и его субстратом в ферментсубстратном комплексе. Помимо
ферментативного катализа и ингибирования комплексообразова-
ние играет первостепенную роль в таких биологических процес-
сах, как репликация, хранение и передача генетической инфор-
мации, иммунный ответ и транспорт ионов. В настоящее время
накоплено уже достаточно сведений о структуре таких комплек-
сов, чтобы подтолкнуть химиков-органиков к созданию высоко-
структурированных молекулярных комплексов и к изучению специ-
фического химизма процессов комплексообразования.
Высокоструктурированный молекулярный комплекс состоит по
меньшей мере из одного донорного («гостя») и одного акцепторно-
го компонента («хозяина»). Акцепторный компонент можно опре-
делить как органическую молекулу или ион, связывающие группы
* Недавно были опубликованы две книги по синтезу и применению краун-
эфиров: R. М. Izatt, J. J. Christensen (Eds.). Synthetic Multidentate Macrocyclic
Compounds. Academic Press, New York, 1978; R. M. Izatt, J. J. Christensen
(Eds). Progress in Macrocyclic Chemistry, Vol. 1. Wiley, New York, 1979.
** Можно использовать также название рецептор-субстратное комплексооб-
разование.
Моделирование ферментативных систем 267
которого в составе комплекса направлены навстречу друг другу.
Донорный компонент можно определить как молекулу или ион,
I связывающие группы которого направлены в разные стороны.
Донорами могут быть органические соединения или ионы, ионы
металлов или координационные соединения металлов. Обычно
I простые доноры доступны, в то время как акцепторы необходимо
получать сложным синтетическим путем *.
Донорно-акцепторное взаимодействие подразумевает компле-
ментарную пространственную упорядоченность центров связыва-
»ния в доноре и акцепторе. Поэтому в любом синтетическом до-
1норно-акцепторном комплексе центры связывания (полярные и
дипольные) и стерические барьеры должны быть локализованы
определенным образом, чтобы структуры обоих компонентов соот-
ветствовали друг другу. Свойства существующих в природе ак-
цепторов, мицелл и циклодекстринов рассмотрены в следующих
разделах данной главы. Простетические группы гемоглобина,
хлорофилла или витамина Bi2 также принадлежат к этой ка-
тегории, поскольку селективно связывают ионы железа, магния
и кобальта.
На рис. 5.1 приведены некоторые доступные синтетические
f акцепторные соединения. Можно ли использовать такие органи-
ческие краун-эфиры в качестве аналогов ферментов для разделе-
jf ния энантиомеров (или рацемических смесей)? Крам и др. со-
общили, что хиральные комплексы краун-эфиров действительно
обладают этим удивительным свойством селективно связывать
один из антиподов аминокислотных производных [134—136]. При
создании акцепторных молекул неоценимую помощь оказывают
J молекулярные модели Кори — Полинга — Колтуна [137, 138].
1 [Пространственные модели дают возможность находить акцептор-
ные структуры, способные связывать в качестве доноров определен-
I ные аминокислоты. Например, главное при создании акцептора —
это вопрос влияния взаимного расположения центров связыва-
ния на их связывающую способность. Другая проблема заклю-
I чается во введении заместителей в такие положения, которые
I направлены к функциональным или связывающим центрам до-
норных соединений [137].
После многочисленных попыток создать хиральные краун-
I эфиры оказалось, что желаемые свойства появляются при введе-
I нии в качестве заместителя в 2,2'-положения макроцикла 1,Г-би-
I нафтильной группы. Нафталинсодержащая система, выбранная
из практических и общих соображений, придает обычным цикли-
ческим полиэфирам жесткость и липофильность. Синтез такого
акцептора приведен на рис. 5.2.
* Константы ассоциации простых алкиламмониевых солей с 18-краун-б-эфи-
’ Ром в CDCh при 25°С равны ~106 л/моль, что соответствует свободной энергии
Процесса комплексообразования AG° tv —33,5 кДж/моль (—8 ккал/моль).
268
Глава 5
R, = СН3
= сн2—О—СН2—СООН
r2 = h
= Вг
Рис. 5.1. Примеры акцепторных молекул.
Это хиральный акцептор с осью симметрии С2, в котором
двугранный угол между плоскостями соединенных друг с дру-
гом нафталиновых колец может варьировать от 60 до 120°. Вве-
дение бинафтильной системы в краун-эфир приводит к наруше-
нию планарности макроциклического кольца и скручиванию его
подобно спирали. Известны как (S, S)-, так и (R, R) -конфигура-
ции. Будучи оптически активными, они могут использоваться для
разделения рацемических солей первичных аминов и амино-
эфиров.
Образующиеся при этом диастереомерные «активированные
комплексы» высокоструктурированы, и различия между ними ле
жат в основе так называемого хирального узнавания (термин
предложен Крамом). Система жидкостной хроматографии для
разделения рацемических солей аминов и аминоэфиров на опти-
ческие изомеры, будучи основанной на использовании хиральных
^ох^Ох~^°'^ч'С1 И4]* раствор бисросфата z-х СНз/"*'£' \ ptr С\ Гр о-?3 /> | Т т ХХД A<\s - г^А<< сн3 ci^ lLAj< R йи&инафтил-22-к.раун-6-зфир и™ Рис. 5.2. Синтез хирального акцептора. xOx^'^o-'^x^OR к = тгп R = H R = Ts (тозил) конденсация с исходным бинафтпильным производным тпой экр конфигурации 00>XjO Ly°\_j°XjO R unu S'
270
Глава 5
акцепторов, моделирует стереоспецифичность ферментов. Такой
метод разделения оптически активных соединений (путем про-
пускания их рацемических смесей через колонки с оптически ак-
тивными комплексообразователями) может иметь промышленное
значение.
На практике такое разделение осуществляется следующим образом. Носи-
тель— силикагель или цеолит — насыщают водным раствором NaPFe или LiPF6
В качестве подвижной фазы используют раствор оптически чистого акцептора в
хлороформе. Затем рацемическую смесь наносят на колонку, дают установиться
Рис. 5.3. Хроматографическое разделение
на оптические изомеры рацемического гек-
сафторфосфата метилового эфира фенил-
глйцина с йомощью (R, R) -акцептора [136].
равновесию и проводят «селективное элюирование» диастереомерных «активиро-
ванных комплексов». Появление соли в элюате тестируют по изменению электро-
проводности. На рис. 5.3 приведена кривая элюирования, полученная для раце-
мического метилового эфира фенилглицина.
После нейтрализации чистые вещества, соответствующие каждому пику, вы
деляют и их конформацию устанавливают путем измерения оптического враще-
ния и сравнения со стандартными образцами.
С помощью метода ЯМР была определена предположитель-
ная структура комплексов двух диастереомеров.
($)-аонор в мойели
трехцентрового связывания
R-Вонор в моВели
четырехцентрового связывания
Моделирование ферментативных систем
271
Термины «трехцентровое связывание» и «четырехцентровое
Связывание» используются для обозначения конфигурации взаим-
ного расположения донора и акцептора. Названия не совсем пра-
вильны и недостаточно полно отражают суть дела, но удобны и
Коатому широко используются [136]. В то же время они уста-
навливают наиболее стабильный диастереомер и указывают на
возможную главную структурную особенность, обусловливающую
различия в стабильности двух диастереомеров. Приведенные
проекции Ньюмена показывают, что в обеих моделях донорная
молекула связывается с (S, S)-акцептором тремя водородными
связями между NH-группами и эфирными кислородами макро-
цикла. Три заместителя (малый, средний и большой) у асиммет-
рического атома углерода распределены в пространстве таким
образом, чтобы свести к минимуму влияния стерических факто-
ров. Модель четырехцентрового связывания включает дополни-
тельное диполь-дипольное взаимодействие с эфирной группой
в результате стэкинга ароматических колец донора и акцептора.
Тем не менее модель трехцентрового связывания стерически бо-
лее устойчива. Причина заключается в том, что введение заме-
стителей в 3- и З'-положения делает комплекс более громоздким,
а систему более селективной, благоприятствуя реализации модели
трехцентрового связывания. Другими словами, когда комплекс
становится более «тесным» из-за увеличения стерической затруд-
ненности донора или акцептора, комплексообразование становит-
ся более стереоселективным. Вследствие этого (S, S) -акцептор
[склонен к выбору в качестве донорной молекулы S-изомера. От-
ношение констант ассоциации диастереомеров может доходить
до 18.
Преимущества системы 1,1'-бисбинафтил-22-краун-6-эфира
можно сформулировать так: 1) бинафтильная группа имеет же-
сткую структуру, благодаря чему представляет хороший хираль-
ный барьер; 2) структура этой группы такова, что заместители
в 2,2'-положениях ориентированы навстречу друг другу, а в 3,3'-
положениях — в разные стороны; это обеспечивает более высо-
кую степень стереоселективности; 3) функциональная группа
в 6- или б'-положении не мешает образованию комплекса между
донором и акцептором, но дает возможность закрепить акцептор
на твердом носителе.
Нафталиновое кольцо выступает в роли «прокладки» между
поверхностью твердофазного носителя и акцептором. Таким об-
разом удалось ковалентно закрепить оптически чистый (R, R)-
акцептор на силикагеле и полученный твердофазный носитель
использовать для разделения солей первичных аминов и амино-
эфиров с помощью жидкостной хроматографии. Такой метод мож-
но назвать аффинной хроматографией, специфичной к энантио-
Этот подход был распространен на синтез макроциклических
эфиров (псевдокраун-эфиров), включенных в макромолекуляр-
ную сетку (сополимера стирола и дивинилбензола), в резуль-
тате чего получались полимеры, обладающие высокой коорди-
национной способностью к различным ионам [139]. Комбиниро-
вание макроциклических структур с полимерными позволит
в ближайшем будущем разработать новые катализаторы, обла-
дающие наряду со способностью к специфическому связыванию
высокой каталитической активностью [348].
Кроме того, углеводородные растворы некоторых 1,Г-бинаф-
тильных макроциклических эфиров растворяют кальций в ре-
зультате комплексообразования. Поскольку такое поведение на-
Моделирование ферментативных систем
273
(оминает перенос кальция через углеводородный слой клеточных
Мембран, эти соединения могут быть важны для изучения меха-
низмов функционирования нервной и мышечной систем.
В других исследованиях, направленных на более детальное
изучение структурных элементов, которые участвуют в процессе
комплексообразования, были получены следующие акцепторные
оединения:
•В состав соединений включено пиридиновое кольцо. Акцептор,
[содержащий три пиридиновых цикла, прочно связывает тиоциа-
нат трет-бутиламмония. Смешанный акцептор, 5,5-дипиридинил-
[динафтиловый эфир, выступая как аналог полиэфиров, также
^преимущественно комплексует метиловый эфир 5-фенилглицина.
^Опять-таки формирование трех водородных связей и наличие
трех N® • • • О ион-дипольных взаимодействий, по-видимому, необ-
ходимое условие сильного и эффективного связывания [138].
В 1977 г. группа английских ученых под руководством Стод-
Дарта предложила использовать для синтеза новых акцепторных
[соединений производные сахаров [140, 141]. Углеводы и их произ-
водные достаточно обогащены замещенными бисметилендиокси-
группами и удобны для образования 18-краун-6-эфиров. Кроме
того, углеводы можно рассматривать как сравнительно недоро-
гие источники хиральных соединений; обычно они проявляют XQ-
'рошие функциональные свойства,
274
Глава 5
НО^СООН rv^COOR
j ->-*-> ph—С j
Н(Г "'С(Х)К O>"COOR
L-винная кислота ' -
CH2OH
НО-
НО-
-он
—он
СН2ОН
D-маннит
пребшественники
акцептора
Исходя из l-винной кислоты или D-маннита был получен ряд
18-краун-6-эфиров. Используемый в качестве предшественника
D-маннит облегчает сближение объемистых заместителей с краун-
эфиром и в то же время удваивает число хиральных центров
(от 4 до 8) в молекуле краун-эфира.
1Д.-акцептор из L- винной кислоты ц.п-акцептор из D-маннита
R = СН2ОН
R = СН2—ОСРЦ
R = CONHRt
Эти акцепторы обнаруживают способность разделять энан-
тиомеры алкиламмониевых солей первичных аминов путем комп-
лексообразования. С помощью проекций Ньюмена удалось пред-
сказать, что (/?)-донорно-(d, d) -акцепторный комплекс более
устойчив.
Далее, для ускорения комплексообразования важна также
природа аниона. Мягкие анионы*, такие, как SCN’, ClOi и PFe.
* Согласно Пирсону, жесткость нона обусловлена высокой электроотрица
тельностью и малым размером. В то же время в мягком основании донорный
атом обладает высокой поляризуемостью и низкой электроотрицательностью, а
также легко окисляется. Общин критерий жесткости и мягкости кислот и осно-
ваний заключается в том, что жесткие кислоты преимущественно взаимодей-
ствуют с жесткими основаниями, а мягкие кислоты — с мягкими основаниями
[144, 145].
Моделирование ферментативных систем
275
склонны к комплексообразованию, а жесткие анионы, такие, как
ОН", С1“ и Вг~, образуют очень устойчивые соли и противодей-
ствуют образованию донорно-акцепторных комплексов.
, Развитие представлений о донорно-акцепторном комплексооб-
разовании (комплексы типа «хозяин» — «гость»)—хороший при-
мер давнего стремления строить аналоги ферментов на основе
краун-эфиров но принципу «ключ — замок». Естественно, соответ-
ствие размеров, объемов и электронных свойств связывающих ча-
стей донора («гость») и акцептора («хозяин») — необходимое усло-
вие сильного связывания. Поэтому углеводы и их производные —
своего рода «подарок» для хирального синтеза, так как на их осно-
ве может быть получен структурный остов соединений неуглевод-
ной природы [142]. В ближайшие годы эти идеи должны получить
более широкое распространение и развитие.
। Не так давно Мураками и сотр. [146, 147] предложили мак-
.роциклическую систему, моделирующую фермент. Они обнару-
жили, что 11-амино-[20]парациклофанол-10 катализирует деаци-
лирование н-нитрофенил пальмитата со скоростью в 1000 раз
большей, чем 2-аминоциклодеканол.
[20]по.р(щикло(рановое
кольцо
2-амицоциклоЭеканол
Более высокая эффективность парациклофанового кольца по
сравнению с циклодеканоловым связана с более высокой гид-
рофобностью макроцикла по сравнению с молекулой циклодека-
нола, не способной включать субстрат в свою полость. Кроме
того, функциональная группа макроцикла должна быть ориен-
тирована таким образом, чтобы содействовать протеканию псев-
Довнутримолекулярной реакции с эфирной группой связанного
субстрата. Легко могут быть получены замещенные парациклофа-
[ны (R=/=H). По этой причине, а также благодаря своим гидрофоб-
ным свойствам парациклофаны относятся к простейшим моделям
ферментов.
5.1.1. Хиральное узнавание и катализ
В предыдущей главе показано, что, будучи акцепторами,
хиральные макроциклические полиэфиры различают энантиомеры
[солей аминоэфиров, выступающих в качестве доноров, в процес-
се комплексообразования в хлороформном растворе. Можно ли,
опираясь на эти результаты, пойти еще дальше и промоделировать
276
Глава 5
каталитический центр? Приведем пример создания акцептора,
который при комплексообразовании с солями а-аминоэфиров об-
разует промежуточное соединение, соответствующее реакции
переацилирования (тиолизу) между каталитической группой
(тиольной) хирального акцептора и энантиомерными солями до-
нора [143]. Однако сразу же следует учесть, что эти модельные
системы имитируют только одну стадию, катализируемую сери-
новой протеазой,— стадию ацилирования. До сих пор для ста-
дии деацилирования не наблюдали увеличения скорости. Был по-
лучен изображенный ниже циклический хиральиый акцептор, и
его сравнивали по способности к комплексообразованию с ана-
логичным «линейным» акцептором.
С этой целью данные акцепторы изучены при гидролизе л-нит-
рофениловых эфиров ь- и D-аминокислот. Реакцию проводили
в смеси ЕЮН — СН2С12 (1:4), насыщенной буфером, содержа-
щим 0,2 моль/л СНзСООН и 0,17 моль/л CH3COONa (pH 4,8).
Выделение n-нитрофенола сопровождалось образованием этило-
вого эфира аминокислоты.
Наблюдения показали, что эфиры ь-аминокислот реагируют
с циклическим полиэфиром в 102—103 раз быстрее, чем с его
разомкнутым аналогом. Очевидно, вынужденное сближение цент-
ров связывания в значительной степени способствует комплексо-
образованию. В то же время пролиновые эфиры реагируют с
обоими акцепторами с одинаковой скоростью. Следовательно, как
было показано ранее, для эффективного комплексообразования
Моделирование ферментативных систем
277
Необходимо наличие трех протонов на а-атоме азота. В более
Полярном растворителе (40% Н2О — CH3CN) скорость умень-
шается в 10 раз. Это говорит о том, что молекулы воды обра-
Вуют водородные связи с a NH3- группами и тем самым создают
Конкуренцию молекулам акцептора. Во всех случаях 5-акцептор
(быстрее реагирует с природными ь-аминокислотами, чем 7?-акцеп-
тор. Отношение их каталитических активностей зависит от размера
Заместителя R в глициновом остатке.
R t(S) lkR кат/ кат
СН3—СН— 9,2
СН3
Ph—СН2— 8,2
(СН3)2—снсн2— 6,0
СНз— 1,0
I Эти реакции напоминают переацилирование, при котором син-
яезированный акцептор обладает некоторыми свойствами трип-
сина (узнает NH3-rpynny) и папаина (имеет остаток цистеина
в активном центре).
I Следующие структурные формулы демонстрируют взаимную
ориентацию S-акцептора и донора (эфира ь- или D-аминокислоты)
в состоянии, подобном «переходному» [143].
взаимная ориентация .^-акцептора
и ь-аминокислоты, более стабильная
структура
взаимная ориентация '^-акцептора
и D-аминокислоты, менее стабильная
структура
] Теперь довольно легко понять, почему предпочтительно «от-
вирается» и гидролизуется 5-изомер. Удаленность боковой цепи
К от хирального барьера сводит к минимуму стерические фак-
торы и приводит к образованию более устойчивого интермедиата.
. Руководствуясь такими соображениями, Лен и Сирлин [148]
Ролучили хиральный макроциклический молекулярный катализа-
И'ор, несущий цистеиновые остатки. Катализатор связывает ал-
Киламмониевые соли, вызывает увеличение скоростей внутримо-
лекулярного тиолиза связанных с ним субстратов, обнаруживая
структурную селективность к эфирам дипептидов, и обладает
ярко выраженной тенденцией к хиральному узнаванию ь-энан-
278
Глава 5
тиомера (в 70 раз большей, чем для D-энантиомера) в рацеми-
ческой смеси п-нитрофениловых эфиров глицилфенилаланина.
Ниже приведен комплекс, образованный хиральным краун-эфи-
ром и солью п-нитрофенилового эфира глицилглицина. Благодаря
субстрат связан путем
ион-Виполъных езаимоВейстеий
(еоЭороЭные связи)
ROOC,,„
О.
нукпеофип закреплен
на хиралъном
носителе (рецепторе)
SH
L ^COOR
®g
о...
н
• €>
СТ NH
,о А
RO0C
'""COOR
SH SH
связыванию алкиламмониевой соли в полости краун-эфира и
участию SH-группы цистеиновых остатков в образовании S-ациль-
ного интермедиата происходит возрастание скорости реакции
(в 103—104 раз). Эта модель «искусственного фермента» обна-
руживает свойства образовывать молекулярные комплексы, уве-
личивать скорость реакции, осуществлять аналогично природным
биологическим катализаторам структурное и хиральное узнава-
ние.
5.1.2. Стереоселективный транспорт
После открытия краун-эфиров высказывались предположения,
что хиральные носители могут обеспечивать хиральную специфич-
ность при переносе доноров через жидкие мембраны. Действитель-
но, Крам и сотр. обнаружили разделение энантиомеров при пере-
носе солей аминоэфиров (донорных соединений) из одного водного
раствора через слой хлороформа в другой водный раствор, что до-
стигалось с помощью синтетических нейтральных липофильных и
хиральных акцепторов [136].
Был взят бинафтильный асимметричный (R, R)-акцептор,
а в качестве донорной молекулы — рацемический метиловый
эфир фенилглицина:
Моделирование ферментативных систем
279
В качестве ячейки служила U-образная трубке (рис. 5.4). Ра-
створ акцептора в хлороформе помещают на дно трубки. Донор
аходится в a-колене. В p-колене можно измерять УФ-поглоще-
|иие и удельное вращение (через различные промежутки вре-
мени). Таким методом были определены константы скорости
р-колено
водный раствор
0,1 М НС1
акцептора, в CHCU
Рис. 5.4. Ячейка для изучения хирального узнавания в процессе транспорта.
Средняя длина пути составляет 6,5 см [136]. Воспроизведено с разрешения
Techniques of Chemistry (1976).
переноса подвижных и малоподвижных энантиомеров. Через 12—
119 ч 7?-изомер (оптическая чистота 80%) оказался селективно
I «перетянут» в p-колено. Энтропия разбавления и изменения энер-
гии сольватации, связанные с «высаливанием» органической соли
[ из исходного хлороформного раствора неорганической солью,
[обеспечивали термодинамическую движущую силу переноса.
Благодаря введению дополнительной мостиковой связи моле-
кула краун-акцептора приобрела «трехмерную» структуру; такие
Молекулы Лен назвал криптандами [149]. Подобные соединения,
Имеющие макроциклическую структуру с внутримолекулярной
280
Глава 5
пОллстэЮ («криптом»), были недавно использованы для се-
лективного переноса катионов щелочных металлов через жидкую
мембрану [150].
Криптанды образуют комплексы включения криптатного типа (криптаты)
с пикратами щелочных металлов (Na+, К+ или Cs+). Криптанды функционируют
как переносчики катионов, растворяя пикрат щелочного металла в жидкой хло-
роформной мембране в виде ионной пары криптат — пикрат (1 : 1), а затем осво-
бождая его в интерфазу наружного водного слоя [149]. Путем сравнения уста-
новлено, например, что 5-4 переносит Na+ и К+ гораздо быстрее, чем 5-1. Это
означает, что в результате удаления двух кислородсодержащих связывающих
центров криптанд превращается из специфического рецептора К+ (5-1) в спе-
цифический переносчик К+ (5-4). Работа Лена по криптатам позволила создать
лиганды, которые в зависимости от структуры могут быть либо рецепторами,
либо переносчиками катионов. Например, для 5-1 как переносчика эффективность
Pro -> Ala -> Phe -> Phe -> Pro
1 I
Pro <- Vai <- Phe Phe <- Pro
антпамсьниЭ
Циклический пептид, нейтрализующий действие токсина фаллииа В (также цик-
лического пептида) из ядовитого гриба Amanita phalloides.
Рис. 5.5. Структура некоторых ионофоров.
Моделирование ферментативных систем
281
1 2
11
алйметицин
H0HQKmunR1=R2=R3=R4=CII3
монактин r'=r2=r3=ch3, r4=c2h5
Винактии R*=r3=ch3, R?=R4=czHi
Рис. 5.5. Продолжение.
Взеличивается в ряду К+ < Na+ Св+, в то же время стабильность комплек-
сов меняется в обратном порядке: Cs+ Na+ < К+. Аналогично и для 5-2 ряды
Жлективности для комплексообразования Na+ < К+, Cs+ и переноса Cs+, К+ <
< Na+ обратны друг другу, тогда как 5-3 и для комплексообразования, и для
Иреноса имеет один ряд: Na+ < К+, Cs+. Причина таких различий в поведении
Кшных соединений как рецепторов и как переносчиков связана с уровнем насы-
Юения переносчика; наиболее устойчивые криптаты, такие, как 5-1, имеют низ-
скорости диссоциации катионов. Таким образом, можно достичь превраще-
Иря рецептора катионов в переносчик катионов путем простейших структурных
"вменений, например заменой одного или двух кислородсодержащих центров свя-
зывания несвязывающими СН2-группами.
I Эту новую область координационной химии можно распространить на анио-
•Bt( И другие органические лиганды. Криптанды обладают интересным свойством
282
Глава 5
преимущественно связывать один какой-нибудь ион. По желанию полости можно
сделать любой формы — сферической или цилиндрической. Поэтому такой боль-
шой набор макроциклических и макрополициклических комплексов катионов ме-
таллов перспективен для конструирования специфических рецепторов при ион-
ном и молекулярном узнавании, а также для создания молекулярных катализа-
торов и селективных переносчиков. Это позволит создавать минимолекулы (ми-
ниатюрные катализаторы), обладающие свойствами белков, молекулы которых
намного крупнее.
Все эти примеры служат иллюстрацией пассивного, но стереоселективного
переноса, когда органические модельные системы осуществляют асимметричное
узнавание. Однако можно провести аналогию между этими результатами и про-
цессом опосредованного переноса через биологические мембраны. Все липидные
мембраны практически непроницаемы для внутриклеточных белков и высокоза-
ряженных органических и неорганических ионов, находящихся с обеих сторон
мембраны. Диффузия Na+ через клеточную мембрану из клетки и К+ в клетку
происходит в направлении отрицательного градиента химического потенциала и
называется' пассивным переносом. Пассивный перенос ионов через мембраны мо-
жет быть вызван ионофорами [см. разд. 5.1.3]. К счастью, концентрации катио-
нов по обе стороны мембраны различные, и такое состояние поддерживается ак-
тивным переносом, который зависит от метаболической энергии. Механизм этого
процесса известен под названием натриевый насос, функция которого сводится
к поддержанию высокой внутриклеточной концентрации К+ и низкой концентра-
ции Na+. Кальций, по-видимому, также активно выводится из клеток. В этих
случаях энергия для переноса обеспечивается за счет гидролиза АТР. Однако
диффузия сахаров и аминокислот к важнейшим клеточным объектам — пример
простого опосредованного пассивного переноса.
5.1.3. Ионофоры
Теперь можно будет упомянуть о важной роли некоторых природных хела-
тообразующих агентов — ионофоров. На рис. 5.5 приведены некоторые примеры
таковых. Все они — полимерные соединения, содержащие амидные, простые эфир-
ные и сложноэфирные связи, причем большинство этих соединений циклические
Ионофоры обладают свойством селективно связывать ионы металлов и осуществ
лять перенос через мембраны [1511-
Ион (катион) слишком гидрофилен, чтобы эффективно проникать через тол-
стый (~10 нм) гидрофобный слой липидов и липопротеинов, входящих в состав
природных и искусственных мембран. Однако селективно связываясь с полярными
группами, находящимися внутри макроциклического кольца, катион оказывается
покрытым гидрофобной оболочкой, что позволяет ему легче проходить через
мембрану.
Природные ионофоры найдены в основном в микроорганизмах, и многие из
них используются как антибиотики. Образуя комплексы с ионами металлов, они,
очевидно, нарушают систему контроля ионной проницаемости в биологических
мембранах. Например, антибиотик нонактин переносит ионы натрия в бактерии
до тех пор, пока создающееся осмотическое давление не вызовет разрушения
клеточной стенки. Валиномицин селективно связывает ионы К+, для которых
клеточные мембраны обычно непроницаемы. В отличие от валиномицина анта-
манид — декапептид, содержащий только L-аминокислоты, — имеет полость свя-
зывания другой геометрии, и он преимущественно связывает ионы Na+, а не К+.
Нигерицин также вызывает эффект, противоположный действию валиномицина п
его аналогов, причем при связывании ионов металла происходит обратимое за
мыкание кольца. Помимо переноса ионов ионофоры, по-видимому, участвуют и
в других ингибиторных процессах в клетке, таких, как контроль переноса гормо-
нов через мембраны, регуляция метаболических процессов и проникновение ней
ромедиаторов в нервные клетки.
Интересно, что некоторые ионофоры содержат аминокислоты с D-конфигура-
цией. Такого не было обнаружено в высших организмах.
Моделирование ферментативных систем
283
цикло-(L-Pro-Gly)4 с
Рис. 5.6. Комплекс i ' "
эфиром аминокислоты [152].Воспроизведено
с разрешения. © 1974 by the American
Chemical Society.
| Вдохновленные открытием в 60-х годах природных ионофоров, химики с ус-
Иехом синтезировали ряд соединений, состоящих из природных фрагментов, спо-
обных связывать неорганические и органические ионы. Приведем лишь один при-
Кер. Блаут [152] сообщил о разделении энантиомеров солей D- и L-аминокислот
комплексах с цикло-(L-Pro-Gly) „-пептидами (п = 3, 4) (рис. 5.6). (±)-Рго-
BBz-HCl, Phe-OMe-HCl или
L’al-OMe-HCl смешивали в хло-
Иоформе с циклопептидом и полу-
Ннные комплексы анализировали
Ветодом 18С-ЯМР. Образовывались
диастереомерные пары комплексов,
наблюдаемые резонансные сиг-
аЛЫ были приписаны различным
ьйёнтационным эффектам, связан-
Квдм с комплексообразованием D-
BjiH L-аминокислот.
I На рис. 5.6 показано, что свя-
зывание происходит с участием
Игетырех карбонильных групп гли-
Кииовых остатков, ориентирован-
Еых внутрь кольца и образующих
(водородные связи с а-МНз-группой
дОиорной молекулы, находящейся
центре полости. Соединения
Блаута, хотя и напоминают по
структуре ионофоры, функцио-
Вально ближе к соединениям
Крама.
Заканчивая обсуждение систем
будущем подобные системы найдут применение в синтезе диссимметричных моле-
ВуЛ Путем асимметрической индукции прохиральных молекул.
Крама и Блаута, отметим, что в ближайшем
5Л. Мицеллы
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) представляют собой бифильные
оединения, т. е. они обладают гидрофобными и гидрофильными свойствами (пре-
красный пример — моющие средства). В растворе такие низкомолекулярные элек-
ролиты образуют ионные пары с противоионами. По мере увеличения концен-
трации мономера образуются кластеры, а затем и низкомолекулярные агрегаты.
В конце концов возникают крупные агрегаты, называемые мицеллами [153—
158]. Мицеллообразование мономерных поверхностно-активных веществ наблю-
haetCH, когда концентрация их превысит так называемую критическую кон-
центрацию мицеллообразования [ККМ]. В общем случае ККМ варьирует от 10-г
до 10-4 моль/л, и при повышении концентрации проводимость раствора резко
меняется.
Чаще всего мицеллы имеют сферическую форму. В полярном растворителе,
Жаком, как вода, гидрофобные углеводородные цепи поверхностно-активных ве-
Иаств сосредоточены внутри сферы, по поверхности которой распределены по-
ирные или ионные «головки», ориентированные в направлении противоионов,
Находящихся в водном растворе. Объединяясь вместе, гидрофобные группы обес-
"печивают благоприятное изменение энтропии, так как при этом молекулы воды
Уходят» из водноорганической интерфазы и гидрофобные группы приобретают
Значительную свободу движения внутри мицеллы. Именно это увеличение энтро-
пии приводит к благоприятному изменению свободной энергии при мицеллообра-
*овании.
На рис. 5.7 приведена идеальная сферическая модель мицеллы. В результате
(мицеллообразования с помощью такого ПАВ, как додецилтриметиламмонийбро-
284
Глава 5
мид, возникают положительно заряженные поверхности, образованные катион,
ными «головками» ПАВ. Под действием кулоновских сил притяжения ионы бр0.
ма собираются вблизи четвертичных атомов азота. Вокруг мицеллы формируется
так называемый слой Штерна, где и проявляются наиболее интересные особенно,
сти химии мицелл. Внутри мицелла содержит очень мало молекул воды и обра.
зует углеводородное ядро. Именно это различие в полярности между внутренней
частью н поверхностью делает мицеллы сходными с глобулярными белками. По.
лярность мицеллярных поверхностей в общем случае близка к полярности белков
и занимает промежуточное положение между водой и этанолом. Поскольку ак-
тивный центр фермента, очевидно, вовсе не полярен, даже когда фермент раство-
рим в воде, весьма полезно и необходимо изучение мицелл [154, 155].
соЭержсиций „несвязанные"
противоионы
Рис. 5.7. Идеальная сферическая модель ионной мицеллы в поперечном сечении
[156]. Воспроизведено с разрешения. © 1977 by the Chemical Society.
Хорошо известно, что органические соединения, особенно неполярные, моют
абсорбироваться иа поверхности или внутри мицелл. Это приводит к увеличе-
нию их растворимости в водных растворах и часто к изменению химической ак-
тивности. В то же время именно мицеллы, а не индивидуальные молекулы от-
ветственны за изменение скорости органических реакций в водных растворах,
содержащих ПАВ. Следовательно, удачный выбор поверхностно-активного веще-
ства может способствовать увеличению скорости в 5—1000 раз по сравнению со
скоростью реакции, протекающей в его отсутствие. В зависимости от типа ми-
целл создается повышенная концентрация ионов Н+ или ОН- в слое Штерна,
что и обусловливает увеличение скорости реакции. Другие основные или нуклео-
фильные группы в мицелле также должны оказывать каталитическое действие.
Гораздо более слабые взаимодействия между мицеллой и противоионами суще-
ствуют в более широком слое Гуи — Чепмена, ширина которого (от поверхности
мицеллы) составляет несколько сотен ангстрем; в этом слое содержание ионов
меняется плавно( плавный градиент ионов).
Увеличение скорости наблюдалось для катионных, анионных и неионных ми-
целл.
Например, бис-2,4-динитрофенилфосфат быстро гидролизуется при pH 8 в
присутствии катионных мицелл. Анионные мицеллы ингибируют эту реакцию
из-за отталкивания отрицательно заряженным продуктом и конкуренции с отри-
цательно заряженным ионом ОН-, который участвует в реакции,
Моделирование ферментативных систем
285
С другой стороны, цвиттер-ионные мицеллы (обычно неэффективные катали-
заторы) оказываются эффективными в следующей реакции декарбоксилирования
[154]:
С» \ /CN /CN /==Ч
/>—СН< ----------> 4 У-СНе ( /У-СН,—CN
/ ХСООе У_____________? + быстро V_/
со2
Объяснить это можно следующими благоприятными кулоновскими взаимодей-
ствиями:
Следовательно, многие особенности кинетики реакций в мицеллярных систе-
мах сближают их с реакциями, протекающими в монослоях и на поверхности
оолиэлектролитов.
[ Широкоизвестное поверхностно-активное вещество додецилсульфат натрия
СН3(СН2)ц50зКа+ (ДСН) образует сферы, содержащие от 50 до 100 молекул.
Лотенциал между мицеллой и раствором составляет ~ 50—100 мВ, и важ-
нейшими факторами, обеспечивающими стабильность мицелл, оказываются силы
электростатических и гидрофобных взаимодействий.. ДСН часто используют для
Денатурации белков, у которых аналогичные электростатические и гидрофобные
взаимодействия участвуют в формировании третичной структуры.
Ниже приведены мицеллообразующие системы, в которых по-
верхностно-активное вещество опосредует катализ, но само по себе
284
Глава 5
мид, возникают положительно заряженные поверхности, образованные катион,
ными «головками» ПАВ. Под действием кулоновских сил притяжения ионы бр0.
ма собираются вблизи четвертичных атомов азота. Вокруг мицеллы формируется
так называемый слой Штерна, где и проявляются наиболее интересные особенно,
сти химии мицелл. Внутри мицелла содержит очень мало молекул воды и обра.
зует углеводородное ядро. Именно это различие в полярности между внутренней
частью н поверхностью делает мицеллы сходными с глобулярными белками. По.
лярность мицеллярных поверхностей в общем случае близка к полярности белков
и занимает промежуточное положение между водой и этанолом. Поскольку ак-
тивный центр фермента, очевидно, вовсе не полярен, даже когда фермент раство-
рим в воде, весьма полезно и необходимо изучение мицелл [154, 155].
соЭержсиций „несвязанные"
противоионы
Рис. 5.7. Идеальная сферическая модель ионной мицеллы в поперечном сечении
[156]. Воспроизведено с разрешения. © 1977 by the Chemical Society.
Хорошо известно, что органические соединения, особенно неполярные, моют
абсорбироваться иа поверхности или внутри мицелл. Это приводит к увеличе-
нию их растворимости в водных растворах и часто к изменению химической ак-
тивности. В то же время именно мицеллы, а не индивидуальные молекулы от-
ветственны за изменение скорости органических реакций в водных растворах,
содержащих ПАВ. Следовательно, удачный выбор поверхностно-активного веще-
ства может способствовать увеличению скорости в 5—1000 раз по сравнению со
скоростью реакции, протекающей в его отсутствие. В зависимости от типа ми-
целл создается повышенная концентрация ионов Н+ или ОН- в слое Штерна,
что и обусловливает увеличение скорости реакции. Другие основные или нуклео-
фильные группы в мицелле также должны оказывать каталитическое действие.
Гораздо более слабые взаимодействия между мицеллой и противоионами суще-
ствуют в более широком слое Гуи — Чепмена, ширина которого (от поверхности
мицеллы) составляет несколько сотен ангстрем; в этом слое содержание ионов
меняется плавно( плавный градиент ионов).
Увеличение скорости наблюдалось для катионных, анионных и неионных ми-
целл.
Например, бис-2,4-динитрофенилфосфат быстро гидролизуется при pH 8 в
присутствии катионных мицелл. Анионные мицеллы ингибируют эту реакцию
из-за отталкивания отрицательно заряженным продуктом и конкуренции с отри-
цательно заряженным ионом ОН-, который участвует в реакции,
Моделирование ферментативных систем
285
С другой стороны, цвиттер-ионные мицеллы (обычно неэффективные катали-
заторы) оказываются эффективными в следующей реакции декарбоксилирования
[154]:
С» \ /CN /CN /==Ч
/>—СН< ----------> 4 У-СНе ( /У-СН,—CN
/ ХСООе У_____________? + быстро V_/
со2
Объяснить это можно следующими благоприятными кулоновскими взаимодей-
ствиями:
Следовательно, многие особенности кинетики реакций в мицеллярных систе-
мах сближают их с реакциями, протекающими в монослоях и на поверхности
оолиэлектролитов.
[ Широкоизвестное поверхностно-активное вещество додецилсульфат натрия
СН3(СН2)ц50зКа+ (ДСН) образует сферы, содержащие от 50 до 100 молекул.
Лотенциал между мицеллой и раствором составляет ~ 50—100 мВ, и важ-
нейшими факторами, обеспечивающими стабильность мицелл, оказываются силы
электростатических и гидрофобных взаимодействий.. ДСН часто используют для
Денатурации белков, у которых аналогичные электростатические и гидрофобные
взаимодействия участвуют в формировании третичной структуры.
Ниже приведены мицеллообразующие системы, в которых по-
верхностно-активное вещество опосредует катализ, но само по себе
286
Глава Б
не участвует в реакции. Например, N-ацетилгистидин может
осуществлять гидролиз /г-нитрофениловых эфиров через образе-
вание ацилимидазольного интермедиата.
Нуклеофильность имидазольного кольца относительно эфир-
ной группы увеличивается, если система находится в мицелляр-
ной форме, т. е. в присутствии додецилсульфата натрия, что
связано с благоприятной повышенной концентрацией катализа-
тора и субстрата в мицелле.
Известно, что цианид-ионы реагируют с н-алкилпиридиние-
выми солями:
Однако скорость этих реакций значительно возрастает в при-
сутствии катионных ПАВ: чем длиннее алкильная цепь, тем выше
екорость. Это означает, что в данной реакции увеличение ско-
рости замещения обусловлено в основном гидрофобными взаимо-
действиями.
Цианид-ионы также могут присоединяться к 3-карбамоилпи-
ридинийбромиду (аналогу NAD+).
R = с16н„
При содержании цетилтриметиламмониевых солей [СНз-
(СНг)15—№+(СНз)з] 0,02 моль/л константа скорости присоеди-
нения CN- к N-гексадецильному (R = С16Н3з) субстрату увели-
чивается в 950 раз, а соответствующая константа ассоциации—•
в ~ 25 000 раз [159]. Отметим, что в ходе реакции заряженный
Моделирование ферментативных систем
287
Вубстрат становится нейтральным, так что продукт реакции бу-
ет переориентирован и втянут в объем мицеллы. Гидрофобные
Взаимодействия делают реагент менее устойчивым, чем продукт,
есть основание полагать, что сильное увеличение скорости атаки
^№'Ионом вызвано присутствием поверхностно-активного веще-
ства. В результате в мицеллярной системе равновесие смещается
ш сторону образования продукта.
I Следует также упомянуть об обращенных мицеллах [160].
Вульф осукцинатные ПАВ, растворенные в октане, образуют обра-
Венные мицеллы, в объем которых может включаться довольно
большое количество воды (50 молей на 1 моль растворенного
‘ 0и-2.-этпилгексилсульфосукцинат натрия
| Мейджер [160] для описания природы образующейся внутри
[обращенных мицелл полости выдвинул концепцию «водных пу-
лов». При добавлении /г-нитрофенилацетата в присутствии ими-
дазола к такой мицеллообразующей системе происходит 53-крат-
ное увеличение скорости гидролиза ацетата по сравнению с той
же реакцией в воде. Очевидно, имидазол, находясь в мицелле,
способен очень близко подходить к субстрату и катализировать
его гидролиз. Следовательно, удивительное свойство обращенных
мицелл увеличивать скорость реакций может быть приписано
благоприятной ориентации субстрата в объеме мицеллы; при
этом перенос протона может содействовать разрыву связи.
Додециламмонийпропионат (ДАП) в бензоле при концентра-
ции 0,10 моль/л также образует обращенные мицеллы, причем
(концентрация воды в объеме мицелл может достигать 0,55 моль/л.
На этой системе Фейдлер изучал протонирование пирен- 1-карбо-
новой кислоты, используя метод флуоресценции с наносекундным
Временем разрешения [161]. Самым поразительным среди наблю-
давшихся явлений оказалась необыкновенно высокая константа
скорости протонирования карбоксильной группы в водном пуле
(~ Ю_ 12 л-моль_1-с-1)> образованном поверхностно-активным ве-
ществом. На рис. 5.8 приведена модель такой системы сверхбыст-
рого переноса протона в обращенной мицелле, возможного толь-
ко в том случае, если донор и акцептор расположены очень
близко друг к другу. ДАП частично гидролизуется до пропионо-
Вой кислоты, которая втягивается в водный пул, а перенос
288
Глава 5
протона происходит в гидратной оболочке поверхностно-активноп
вещества.
Предполагается, что каталитическая эффективность фермен-
тов связана с передачей заряда и протона через водородные
связи; в этом отношении обращенные мицеллы являются подхо-
дящей моделью для установления влияния подобных факторов на
Рис. 5.8. Предполагаемая модель сверхбыстрого переноса протона в гидратной
оболочке, образованной головками ПАВ, обращенной мицеллы ДАП в бензоле.
Поскольку ПАВ присутствует в концентрации, значительно превышающей кон-
центрацию субстрата, перенос протона должен происходить от додециламмоний-
пропионовой кислоты к пирен-1-карбоксилату. Для наглядности изображены два
пиреновых остатка в одной мицелле. На самом деле в среднем на одну мицеллу
приходится гораздо меньше, чем одна молекула субстрата. Затененная область —
водный слой, гидратирующий головки ПАВ [161]. Воспроизведено с разрешения.
© 1978 by the American Chemical Society.
активный центр фермента. Поверхности мицелл обеспечивают
также удобное средство ограничения пространства, что способ-
ствует увеличению скорости реакции. Они также служат хоро-
шими моделями для демонстрации возможности сверхбыстрого
переноса протона в условиях, когда реагенты находятся в соот-
ветствующем окружении, таком, как поверхности мембран и дру-
гие сложные биомакромолекулы.
Известны также мицеллы с «привязанными» к ним каталити-
ческими группами; такие мицеллы могут действовать как ката-
лизаторы. Например, сложные эфиры и эфиры угольной кислоты
Моделирование ферментативных систем
289
могут гидролизоваться поверхностно-активными веществами, про-
изводными N-ацилгистидина [162].
Вге
субстрат (карбонат)
I Ион И-додецил-И'.Ы'-диметиламиноэтилкарбоната гидроли-
зуется в 2240 раз быстрее в присутствии изображенного ниже
иоверхностно-активного вещества, чем в присутствии N-ацилги-
Ьтидина.
катализатор (Л/-ацилгисти0ин)
В связи с этим упомянем, что получены многочисленные мй-
Целлярные аналоги сериновых протеаз [131]. Однако цистеино-
вые протеазы, такие, как папаин и фицин, смоделированы лишь
недавно [163].
н ®
н 2 Cl®
О
ПАВ с каталитической тиольной группой
Приведенная выше содержащая цистеин длинная углеводород-
ная цепь образует мицеллы при содержании 0,003—0,05 моль/Л;
[константа скорости гидролиза n-нитрофенилацетата в присутствий
этого ПАВ соответствует реакции псевдопервого порядка. Это по-
верхностно-активное вещество в 180 раз активнее, чём цетилтрй-
I МетиЛаммонийхлорид— мицеллообразующая система, не содержа-
щая каталитических групп.
Наглядным примером мицеллярного катализа [164] служит
[ацилоиновая (бензоиновая) конденсация в присутствии N-лауриЛ-
1тиазолийбромида (разд. 7.3):
Если R — бутил, реакция не идет; если R — додецил, образуются
1 Мицеллы, молекулы бензальдегида интеркалируют в них и выход
г Продукта достигает 95%.
10 Зак 540
290
Глава 5
Подводя итоги, скажем, что значительные каталитические эф.
фекты наблюдаются при включении реагентов в мицеллы, тем
самым увеличивается эффективная концентрация реагентов и
уменьшаются энтропийные потери в переходном состоянии благо-
даря улучшению условий протекания реакции. Из других полезных
свойств мицеллообразующих систем можно отметить следующие:
а) благоприятные гидрофобные взаимодействия;
б) моделирование в определенном приближении процессов
с участием ферментов и мембранных процессов (каталитического
эффекта фосфолипидных везикул);
в) силы, удерживающие мицеллы, аналогичны силам, стаби-
лизирующим третичную структуру белков;
г) увеличение локальной концентрации ионов усиливает ката-
литический эффект;
д) скорость реакции в присутствии ПАВ в некоторых случаях
увеличивалась в 1000 раз по сравнению с контрольной.
Однако достичь большего увеличения скорости реакции с по-
мощью мицелл трудно из-за неопределенности структуры их реак-
ционного центра. Поэтому их применение как биохимических мо-
делей ограниченно, что объясняется следующим:
а) структура мицелл недостаточно известна;
б) структура зависит от концентрации поверхностно-активного
вещества и субстрата;
в) нельзя ожидать жестких ориентационных эффектов, если
только не будут получены поверхностно-активные вещества, иммо-
билизованные на полимерном носителе;
г) ничего не известно об относительной ориентации активных
Групп.
Таким образом, мицеллы в настоящее время остаются очень
несовершенными Моделями ферментов,
5.2J . Стереохимическое узнавание
Что можно сказать о стереохимическом узнавании? До сих пор
Мицеллы лишь нескольких оптически активных ПАВ были исполь-
зованы в качестве катализаторов в некоторых реакциях с хираль-
ными субстратами, но в общем эффекты оказывались небольшими.
Приведем здесь два примера, когда хиральные мицеллы могу?
стереоселективно катализировать гидролиз хиральных эфиров.
Катионные ПАВ, полученные из аналогов d(—)-эфедрина,
обнаруживают различную каталитическую эффективность при
гидролизе «-нитрофениловых эфиров о- и ь-миндальной кисло-
ты [165]. Для d(—)-изомера ПАВ гидролиз рацемической смеси
протекает медленнее, чем гидролиз энантиомеров; можно предпо-
ложить, что в каждую мицеллу включается больше одной молекулы
субстрата. Следовательно, энантиомерная молекула субстрата
нарушает мицеллярную структуру и образующийся комплекс
Моделирование ферментативных систем
291
Проявляет уже существенно различную активность к каждому из
двух энантиомеров.
о(-)-зфир минбальной кислоты
1(+)-эфир минбальной кислоты
субстраты
сн3
I ®
СН—сн—N—R
i = I
ОН сн3 сн3
Вге
R — С10Н21
= СцН25
d(-> изомер
ПАВ
За освобождением /г-нитрофенола при 25°С, pH 9,0 в 0,01 М.
боратном буфере, содержащем 0,5% диоксана, и концентрации
субстрата 10-3 моль/л можно наблюдать спектрофотометрически
(рис. 5.9).
Концентрация ПАВ* 10s, моль/л
Рис. 5.9. Селективный гидролиз эфира миндальной кислоты хиральной мицеллой
[165].
Происходит стереоселективный гидролиз эфира d(—)-миндаль-
ной кислоты в смеси с ь(+)-энантиомером. При высокой концен-
трации ПАВ наблюдается некоторое ингибирование, вероятно из-за
присутствия противоионов (солевые эффекты).
Еще более наглядные результаты (вновь исследования Бантона)
| [166] получены при использовании оптически активной ь-гистидил-
катионной мицеллы. При этом для гидролиза аминокислотных
10*
292
Глава 5
производных наблюдалась еще большая стереоселективность
(в ~3 раза выше, чем в предыдущем примере).
С выходом 33% образуется один энантиомер этого ПАВ, кото-
рый действует как мощный катализатор реакции деацилирования
/г-нитрофенил-2-фенилпропионата в 0,02 М фосфатном буфере при
pH 7,4 и 25°С:
Скорость реакции зависит от pH; это говорит о гом, чго участвую-
щая в катализе группа имеет р/\ в диапазоне 6,4—7,5. Для 7?- и
S-изомеров наблюдается увеличение скорости в 260 и 283 раза
соответственно по сравнению со скоростью реакции в буфере, не
содержащем катализатора, но константы связывания одинаковы
для обоих изомеров.
Еще большая стереоселективность наблюдается для N-ацетил-
фенилаланиновых эфиров:
S-Изомер деацилируется быстрее, причем отношение констант ско-
ростей реакций энантиомеров составляет 3:1 ]рис. 5.10]. Констан-
Моделирование ферментативных систем
293
ты связывания опять оказались одинаковыми для обоих энантио-
меров, так что различие в скоростях объясняется, по-видимому,
значениями AG стадии образования переходных состояний для
энантиомеров эфира аминокислоты.
Поскольку начальные скорости одинаковы, стереоспецифичность
реакции зависит от переходного состояния, а не от взаимодействий
s-изомер
R- изомер
2 4 6
Концентрация ПАВхГО, моль/л
Рис. 5.10. Селективный гидро-
лиз N-ацетил-РЬе-эфира ка-
тионной ь-гистидиловой мицел-
лой [166].
[исходных реагентов. При добавлении
конкурентных поверхностно-активных
веществ, таких, как цетиламмониевые
ксоли, отношение скоростей реакций
для S- и R-изомеров также сохраня-
ется равным 2—2,5 в зависимости от
концентрации ПАВ. Следовательно,
именно функциональные группы в ми-
целле, а не молекулы поверхностно-ак-
тивного вещества, как таковые, обеспе-
чивают наблюдаемую селективность,
причем остаток имидазола функциони-
рует как нуклеофильный катализатор.
В таком случае структуру гипоте-
тического промежуточного соединения,
образуемого хиральной мицеллой и S-изомером, можно предста-
вить следующим образом:
В случае /?-изомера будет наблюдаться сильное отталкивание
между имидазолом и фенильным остатком (кольцом).
Этот подход, основанный на использовании мицеллярной сте-
реоселективности, создаваемой функциональными ПАВ, был
распространен на случай расщепления дипептидных диастереомер-
ных субстратов [167].
В заключение отметим, что изменение степени сольватации и
Уменьшение энтропии при образовании переходного состояния —
'вот два важнейших фактора, ответственных за катализ и возраста-
ние скорости в мицеллярных системах. В этом отношении послед-
ние напоминают ферменты. Другое формальное сходство между
Ферментативным и мицеллярным катализом заключается в сильном
294
Глава 5
гидрофобном связывании с субстратом. Однако oi раниченная жест-
кость мицелл приводит к низкой специфичности катализа и даже
достигаемое увеличение скорости весьма умеренно.
Тем не менее мицеллярные системы нашли применение в фар-
макологии и промышленности, в частности при эмульсионной поли-
меризации. Более того, химики-органики, занимающиеся синтезом,
часто сталкиваются с проблемой осуществления реакции между
нерастворимым в воде органическим соединением и водораствори-
мыми реагентами (ОН’> MnOi, Ю7, OCI" и др.). Использование
поверхностно-активных веществ может облегчить решение этой
проблемы: с помощью двухфазных реакций, в которых поверхно-
стно-активное вещество диспергирует органическую жидкость
в воде, обеспечиваются более высокие выходы и более короткие
времена протекания реакций [157].
5.3. Полимеры
Ферменты — это сополимеры, состоящие из различных амино-
кислотных мономеров. Поэтому легко понять, почему использова-
нию синтетических органических полимеров для воздействия на
активность низкомолекулярных соединений уделяется в последнее
время все большее внимание [168]: эти реакции могут служить
в качестве моделей для более сложных ферментативных процес-
сов. Хотя полимерные катализаторы значительно менее эффек-
тивны, чем ферменты, обнаружено некоторое сходство между
природными и синтетическими макромолекулярными системами.
В частности, полимер с заряженными группами склонен концент-
рировать и/или отталкивать находящиеся вблизи него низкомоле-
кулярные ионные реагенты и продукты, и, следовательно, он будет
функционировать как ингибитор или ускоритель реакции, проте-
кающей между двумя молекулами. Однако если к такому поли-
меру присоединить еще и каталитически активные группы, то уже
сама молекула полимера, а не его противоионы, будет принимать
участие в катализе [169, 170].
Приведем здесь некоторые примеры высокомолекулярных сое-
динений-катализаторов, в частности содержащих имидазол, кото-
рые обладают омыляющей способностью и во многом напоминают
сериновые протеазы.
Ранее проведенные исследования с полиметакриловой кислотой
показали, что этот полимер может катализировать нуклеофильное
замещение иона брома в а-бромацетамиде.
полимер gj—СОО6 + Вг—CH2CONH2 ---> =§J-COOCH2 НЛ
CONH2
----- Ц)~Соон + НО—ch2conh2
Моделирование ферментативных систем
295
Однако с увеличением степени ионизации этой поликислоты
каталитические свойства полимера заметно ухудшаются.
полимеризация
СООН
метакриловая
кислота
он®
Й®
СООН
лолиметакрилоеая
кислота
Поли-4-винилпиридин обладает способностью ускорять сольво-
лиз 2,4-динитрофенилацетата, но константа скорости реакции уве-
личивается лишь с увеличением числа нейтральных пиридиниевых
остатков. Для катализа, по-видимому, необходимы и нейтральные,
и ионизированные частицы, причем последние обеспечивают элект-
ростатическое связывание.
Из двух этих примеров следует, что для функционирования
[полимера как эффективного катализатора должно соблюдаться
определенное соотношение между нейтральными и ионизованными
группами в полимере. Полиметакриловая кислота и поли-4-винил-
пиридин можно рассматривать соответственно как анионную и
катионную смолы (по аналогии с ионообменными смолами). Лет-
цингер одним из первых нашел применение способности субстрата
связываться с полимерным катализатором, пользуясь концепцией
электростатического взаимодействия.
Овербергер с сотр. [170] показал, что виниловые полимеры, со-
держащие имидазол и бензимидазол, осуществляют кооперативные
поливинилимийазол
296
Глава 5
На
полифункциональные взаимодействия, что также ведет к возрас-
танию каталитической активности полимеров по сравнению с
низкомолекулярными предшественниками.
Однако эти полимеры отличаются своеобразным поведением,
рис.
5.11 приведено
Рис. 5.11. Сольволиз ПНФА, ка-
тализируемый поливинилимид-
азолом (7) и имидазолом (2)
(28,5% этанол — вода, ионная
сила 0,02, 26°С) [170].
изменение константы скорости сольволиза
л-нитрофенилацетата (ПНФА) в вод-
но-этанольном (28% С2Н5ОН) раство-
ре поливинилимидазолом и имидазо-
лом в зависимости от степени диссо-
циации а функциональных групп. При
низких значениях pH имидазольное
кольцо протонировано и а мало.
Ясно, что протонированное имида-
зольное кольцо (низкое значение а)
не участвует в катализе. Очевидно, что
полимерный катализатор менее эффек-
тивен при а <0,8, но более эффекти-
вен при а>0,8. Однако поскольку рК
образования аниона имидазола ~ 14,
то невозможно на этом полимере изу-
чать поведение каталитической систе-
диссоциации в гидроксилсодержащей
использовать поливинилбензимидазол,
12,2. Скорость гидролиза
того же субстрата
г
з
4
а
5.12. Сольволиз АНБК (2 и
Рис. 5.12. Сольволиз АНБК (2 и
4) и АНБС (7 и 3), катализируе-
мый поливинилимидазолом (7 и 2)
и имидазолом (3 и 4) (28,5% эта-
нол — вода, ионная сила 0,02,
26°С) [170].
мы как функцию (полной)
системе. Для этого лучше
для которого рК
действительно резко возрастает при
щелочных значениях pH. Интерес-
но, что полимер N-винилимидазола,
который не может перейти в анион-
ную форму, гораздо менее эффек-
тивный катализатор.
При использовании анионных
субстратов, таких, как 4-ацетокси-
3-нитробензойная кислота (АНБК)
и 4-ацетокси-З-нитробензолсульфо-
нат (АНБС), наблюдаются другие
кинетические зависимости (рис.
5.12). Для обоих субстратов с по-
ливинилимидазолом как катализа-
тором получены колоколообразные
кривые с максимальной активно-
стью, когда 75% имидазольных ос-
татков не ионизованы (а = 0,75). .Эти результаты лучше всего
объяснимы, если предположить, что для связывания субстрата
необходимо достаточное количество катионных центров (25%),
но в то же время большая часть остатков в полимере должна
быть неионизованной (75%). Именно неионизованные имидазоль-
ные кольца, по-видимому, способствуют гидролизу эфиров.
Моделирование ферментативных систем
297
Если при нейтральных или близких к нейтральным значениях
pH имеет место бифункциональный катализ, т. е. взаимодействие
между незаряженными имидазольными группами, то для описания
взаимодействий между полимерным катализатором и субстратом
можно предложить три механизма.
Первый из них — общий основный нуклеофильный катализ;
Механизм общего основного катализа.
Он не может реализоваться при слишком малых pH, так как
первое имидазольное кольцо будет протонировано и не будет дей-
ствовать как нуклеофил.
Второй вероятный механизм — общий кислотный нуклеофиль-
ный катализ-, однако из общих соображений вызывает сомнение
возможность депротонирования имидазола с помощью RO~:
Механизм общего кислотного катализа.
Наконец, третий возможный механизм заключается в стаби-
лизации тетраэдрического интермедиата:
Оснований для опровержения предложенных механизмов пока
нет. Однако, чтобы объяснить каталитическую роль полимера, сле-
дует учитывать два обстоятельства. Во-первых, возрастание прото-
298
Глава 5
нирования имидазольных остатков приводит к уменьшению гидро-
фобных взаимодействий с нейтральными и заряженными субстра-
тами. Во-вторых, следует ожидать, что с увеличением степени
протонирования полиионная частица будет находиться в более
развернутой конформации из-за отталкивания зарядов. Это за-
трудняет взаимодействие двух имидазольных остатков. Следова-
тельно, эффективность катализа, по-видимому, зависит от коопе-
ративного действия двух имидазольных колец, а не одного отри-
цательно заряженного кольца. Более того, в высокополярном
растворителе важная роль отводится молекулам воды, которые
каким-то образом могут способствовать кооперативному функцио-
нированию имидазольных колец. Действительно, значение &кат
реакции в воде больше, чем в среде, содержащей 30% спирта.
Было показано, что синтетические сополимеры также проявляют
каталитические эффекты, сравнимые с ферментативным катализом.
С целью выяснения возможности кооперативного взаимодействия
имидазольной и гидроксильной групп получен сополимер винил-
имидазола и винилового спирта. Он напоминает фермент а-химо-
трипсин. Однако сополимер лишь немногим более активен, чем
поливинилимидазол в реакциях гидролиза эфиров.
сополимер винилимиЗазоло, и винилового спирта
Возможно, более четким указанием на бифункциональный ка-
тализ является сольволиз положительно заряженного субстрата
иодида З-ацетокси-М-триметиланилина (АНТИ) сополимером ви-
нилимидазола и акриловой кислоты.
АНТИ
сополимер винилимиЭазола
и акриловой кислоты
Очевидно (рис. 5.13), что при высоком содержании имидазола
в сополимере не хватает анионных центров для связывания поло-
жительно заряженного субстрата. Однако при низком содержании
имидазола полимерная молекула начинает вести себя как поли-
анион. Как и ожидалось, полимерный катализатор оказался
гораздо менее эффективным с нейтральными субстратами.
Моделирование ферментативных систем
299
Каталитическая селективность сополимера к положительно
заряженному субстрату объясняется электростатическим притя-
жением между субстратом и аниона-
ми карбоксильных групп полимерной
матрицы, что создает высокую локаль-
ную концентрацию субстрата вблизи
руклеофильных имидазольных групп.
Этот тип кооперативности может моде-
лировать работу фермента нервной си-
стемы ацетилхолинэстеразы. Фермент
катализирует гидролиз положительно
заряженного субстрата — ацетилхо-
лина.
§ 20 -
Состав сополимера,
% (моль.) винил ими!) азола
Рис. 5.13. Сольволиз АНТИ, ка-
тализируемый . сополимерами
винилимидазола и акриловой
кислоты (pH 9,0, 28% этанол—
вода, ионная сила 0,02, 26°С)
[170].
Было установлено, что синтетичес-
кий полимер, содержащий длинные
боковые алкильные цепи (10 мол. %),
способен сильно увеличивать скорость
реакций. Клотц и сотр. [171] созда-
ли такую систему. Они присоединили
додецильные цепи к небольшой сшитой растворимой в воде поли-
этилениминной матрице (средняя степень полимеризации 600).
лаурилэамещенная
полиэтилениминная
матрица
Взаимодействие этого полимера с метиленимидазолом (или
хлорметилимидазолом) приводит к 15%-ному включению имида-
зола в полимерный остов. Был изучен O2N о
гидролиз фенольных сульфоэфиров (ка- /’Х И
техинсульфата). Скорость гидролиза ока- 4 /—°-?—OR
залась в 1012 раз больше, чем в случае '—\
несвязанного имидазола! Значения ка- он
талитических констант для этого заме- ^-ншпрокатпеэшнсульфат
Нательного макромолекулярного катализатора, обладающего вы-
сокой локальной концентрацией связывающих и каталитических
300
Глава 5
групп, приближаются к значениям, наблюдаемым для гидролиза
нитрофениловых эфиров а-химотрипсином. Более того, скорости,
наблюдаемые для сульфоэфиров в присутствии полимерного ка-
тализатора, в 100 раз превышают скорость гидролиза этих соеди-
нений в присутствии фермента арилсульфатаза типа ПА (хотя
надо отметить, что эти соединения не являются природными суб-
стратами данного фермента).
Предложенная Клотцем и сотр. [171] жесткая макромолеку-
лярная матрица, обладающая каталитическими имидазольными
группами и мицеллообразующими гидрофобными участками,—
самый близкий к ферментам синтетический полимер из всех полу-
ченных до сих пор. Клотц назвал его «синзимом» (синтетическим
энзимом), так как его активность близка (того же порядка) к ак-
тивности ферментов.
Естественно, что не все полимерные катализаторы способны
в такой же степени увеличивать скорости реакций, но за последнее
десятилетие работы по моделированию ферментов существенно
продвинулись вперед. В ближайшие годы следует ожидать значи-
тельного развития этой области, кульминацией которого будет
получение моделей, обладающих специфичностью и скоростью,
присущими ферментам.
Другой изящный пример моделирования свойств биополимеров
с помощью синтетических полимеров взят из работы Байера [172].
Для разделения оптических антиподов были получены хиральные
полисилоксановые полимеры. В качестве прохирального полимер-
ного остова взят сополимер поли-2-карбоксипропилметилсилоксана,
октаметилциклотетрасилоксана и гексаметилдисилоксана. Чтобы
создать хиральную поверхность, к этому полимеру были ковалентно
пришиты аминокислоты или короткие пептиды. Для этого прово-
дили реакцию между свободными карбоксильными группами поли-
мера и ь-аминокислотой в присутствии ДЦГК (гл. 2). Между от-
дельными хиральными центрами (аминокислотами) на поверхно-
сти полимера находились силоксановые цепи определенной
длины; задача состояла в создании оптимального сочетания таких
свойств полимера, как вязкость и способность взаимодействовать
с субстратом. Г1апример, весьма ценным для оптического разделе-
ния является хирасил-VaI, содержащий 0,86 ммоля N-трет-бутил-
ь-валинамида на грамм полимера (рис. 5.14).
Полимер-субстратные взаимодействия были изучены методом
газовой хроматографии; данные использованы для определения
степени рацемизации аминокислот и других природных соединений.
Во всех случаях D-энантиомер рацемической смеси аминокислот
элюировался из ь-аминокислотной (полимерной) фазы раньше
ь-формы. Из рис. 5.14 следует, что преимущественно взаимодейст-
вует один энантиомер. Такой благоприятный стэкинг между «ак-
цепторной» поверхностью полимера и субстратом невозможен, если
субстрат имеет D-конфигурацию. Значение диметилсилоксановых
Моделирование ферментативных систем
301
Рис. 5.14. Хирасил-Val, диастереомерный ассоциированный комплекс с N-цикло-
ексил-О-пентафторпропионил-ь-лактамидом [172]. Воспроизведено с разрешения.
© 1978 by Verlag Chemie GMBH.
групп также очевидно, так как они удерживают молекулы ь-вали-
намида на некотором расстоянии друг от друга и предотвращают
образование внутримолекулярных водородных связей, что могло бы
придать полимеру квазикристаллическую структуру.
В качестве другого примера применения таких полимеров мо-
жет служить разделение оптических антиподов антибиотиков,
энантиомерный состав которых легко и быстро может быть уста-
новлен методом газовой хроматографии. Усилия Байера и сотр.
приблизили химиков-органиков еще на один шаг к синтезу
хиральных матриц с заранее заданными свойствами. Как и белки,
они могут активно взаимодействовать с энантиомерами самых раз-
ных соединений.
В заключение еще раз перечислим требования, которые предъ-
являются к полимерам, функционирующим как катализаторы.
Такие катализаторы должны:
1) создавать высокоэффективную концентрацию каталитиче-
ских групп на полимерном остове;
2) создавать мицеллоподобный участок связывания за счет
присоединенных к полимеру гидрофобных боковых радикалов;
3) обеспечить электростатическое связывание с высокой плот-
'ностью заряда благодаря присоединенным к полимеру ионным
боковым цепям.
302
Глава 5
В то же время как основные недостатки полимерных катализа-
торов можно выделить их ограниченную растворимость в воде и
беспорядочное расположение полимерных цепей. Кроме того, кине-
тические кривые имеют более сложную форму из-за многоцентро-
вой природы полимера в отличие от фермента, который обычно
имеет только один активный центр.
5.4. Циклодекстрины
ч
1
а-Циклодекстрин — это существующая в природе акцепторная
молекула, состоящая из шести остатков ь-глюкозы, связанных
«голова к хвосту» а(1->4)-гликозидной связью и образующих
кольцо, называемое циклогексаамилозой (рис. 5.15). Молекула
а-циклодекстрина обладает относительно негибкой тороидной (на-
поминающей «бублик») структурой, с одной стороны которой на-
ходятся 12 гидроксильных групп, присоединенных по 2- и 3-поло-
жениям d-глюкозных единиц, а с другой — 6 первичных гидро-
ксильных групп, присоединенных по 6-положению, так что
молекулы а-циклодекстрина имеют снаружи гидрофильные гидро-
ксильные группы, в то время как в своем объеме — основной остов,
включающий связи С—Н, С—С и С—О, достаточно гидрофобные
по своей природе. Таким образом, принцип, на котором основана
их структура, противоположен наблюдаемому для краун-эфиров,
Рис. 5.15. Схематическое изображение структуры
а-циклодекстрина.
Моделирование ферментативных систем
303
имеющих довольно гидрофильные полости [173]. а-Циклодекстрин
I может образовывать нерастворимые кристаллические комплексы
^включения с самыми разнообразными донорными молекулами.
Обычное соотношение донорной и акцепторной молекул в этих
комплексах составляет 1:1, а фактором, определяющим комп-
лексообразование, является размер донора. Внутренний диаметр
полости а-циклодекстрина (6 глюкозных единиц) равен 0,45 нм.
Бензольное кольцо достаточно мало и способно проникать в цик-
1лоамилозные циклы, составленные из 6, 7 и 8 звеньев. Что же
касается антрацена, то только 8-членный цикл может разместить
1эту ароматическую систему. По-видимому, наиболее вероятно об-
разование комплекса включения в результате гидрофобных взаимо-
действий. Кроме того, определенную роль могут играть водородные
связи, вандерваальсовы силы и дисперсионные силы Лондона.
Использовать циклодекстрины для биомиметической химии
предложил Крамер (в 1965 г.), а также Летцингер, Моравиц и
Бендер; эта идея получила дальнейшее развитие благодаря рабо-
там Бреслоу и Табуши. Бреслоу [174] первым показал, что в си-
‘ стеме, содержащей а-циклодекстрин, может происходить селектив-
ное замещение в ароматическом кольце. Он обнаружил, что обра-
1ротка водного раствора анизола (0,1 ммоль/л) при комнатной
температуре НОС1 (0,01 моль/л) в присутствии избытка а-цикло-
I декстрина приводит к 96 %-ному хлорированию анизольного коль-
1 ца в пара-положении.
Эти результаты свидетельствуют о том, что циклодекстрин не
только блокирует все, кроме одного, положения ароматического
Вкольца, но и активно катализирует замеще-
1ние в незащищенном положении. На схеме
показана молекула анизола, находящаяся в
юлости циклогексаамилозы. Превращением
одной или более гидроксильных групп в ги-
похлориты можно объяснить возрастание ско-
рости хлорирования в комплексе. Это — один
из примеров нековалентного катализа (клас-
|К:ического связывания Михаэлиса — Ментен),
при котором акцептор предоставляет свою
полость для протекания реакции без образования ковалентного
промежуточного соединения.
Аналогично и ароматические эфиры быстро гидролизуются
а-циклодекстрином. В катализе участвуют, по-видимому, вторич-
ные гидроксильные группы, но не известно, сколько и какие
именно. При перемещении ацильной группы к акцепторной моле-
куле циклодекстрина образуется интермедиат. Эта ситуация фор-
мально аналогична механизму действия гидролитических фермен-
тов, таких, как сериновые протеазы, и может служить в качестве
модели фермента, поскольку перед началом реакции образуется
Комплекс с субстратом. Такое превращение можно рассматривать
304
Глава 5
как катализ с образованием ковалентного продукта (ковалентный
катализ). Следует отметить, однако, что вторая стадия гидролиза
эфира циклодекстрином протекает очень медленно, так что для
этих реакций циклодекстрины не истинные катализаторы.
В группе Бендера [175] исследовали гидролиз лг-трет-бутил-
фенилацетата в присутствии 2-бензимидазолуксусной кислоты и
а-циклодекстрина с целью изучения системы с переносом заряда
при ферментативном катализе сериновыми протеазами. В присут-
ствии катализатора наблюдалось 12-кратное ускорение расщеп-
ления эфира, связанное с образованием комплекса между суб-
стратом и а-циклодекстрином. Это наблюдение согласуется с
образованием ферментсубстратного комплекса в ходе фермен-
тативных реакций. Однако пространственное расположение ими-
дазольной, карбоксильной и алкоксильной групп, по-видимому,
отличается от их расположения в сериновых протеазах. Серино-
вые протеазы функционируют, используя в качестве нуклеофила
алкокси-ион, в то время как в данной модели нуклеофил — имида-
зольная группа. Усовершенствование этой системы стало возмож-
ным благодаря селективному превращению одной из вторичных
гидроксильных групп в гистаминовый остаток. К сожалению, серь-
езное неудобство циклодекстринов заключается в том, что они
недостаточно активны при нейтральных pH, а действуют только
в щелочных условиях, так что кинетические данные, полученные
при pH 13, нельзя сравнивать непосредственно с данными, полу-
ченными, например, для а-химотрипсина при pH 8. Молекула
акцептора устойчива в щелочном растворе, но такие условия могут
нарушить структуру субстрата. В то же время следует учитывать
чувствительность акцептора к кислой среде.
Отметим также, что одна из главных проблем состоит в свя-
зывании субстрата; сорбционная полость недостаточно аполярна,
открыта с обеих сторон и константы диссоциации циклодекстрино-
вых комплексов больше, чем ферментсубстратных. Иммобилиза-
ция субстрата не всегда отвечает предъявляемым требованиям;
обычно необходима высокая концентрация циклодекстрина,
а конформация субстрата с наиболее низкой энергией можег
Моделирование ферментативных систем
305
цикло -5-5 -ОН
цикло-5-6 -OTs
цикло -5-7 -NHCH3
цикло-5-8 -NHCH2CH3
цикло-5-9
^СНО
-N=C
^~СН2СН3
цикло-5-1О
Рис. 5.16. Синтез «экранированных» молекул циклодекстрина [176].
оказаться не самой оптимальной для катализа. Чтобы обойти
такого рода трудности, Бреслоу [176] привязал объемистую
группу к более активным первичным гидроксильным группам
с одной стороны молекулы а-циклодекстрина (циклогептаами-
лозы с внутренним диаметром 0,7 нм) (рис. 5.16).
В результате полость акцептора оказывается с одной стороны
«экранированной» и по этой причине более гидрофобной и не-
глубокой, т. е. образуется ацилциклодекстрин с «дном», которое
рбеспечивает более мелкое погружение субстрата при связыва-
нии. Далее были изучены следующие превращения (табл. 5.1):
цикло-5-5, 5-9 ипи5-10 +
R = -NO2
= —/Ви
комплекс
ацетилцикло-5-5, 5-9 или 5-10 + R
ОН
Реакции подчиняются кинетике Михаэлиса — Ментен. Цикло-
5-9 (экранирование метильной группой) обеспечивает 10-кратное
306
Глава 5
Таблица 5.1. Константы скорости и константы диссоциации для реакций
производных циклогептаамилозы с л«-нитро- и л-трет-бутилфенилацетатом [176]
Субстрат R Цикло- ^внутр’103, с ^внутр/^он" ^дисс’104’ моль/л
—no2 5-5 11,9±0,05 64 57±7
—no2 5-9 123±5 660 51 ±7
—no2 5-10 210±40 1140 260±50
—трет-Ви 5-5 4,13±0,25 365 1,9±0,2
—трет-Ви 5-10 37 ±5 3300 4,6±0,9
увеличение скорости, а цикло-5-10 (экранирование этильной
группой) еще большее. Сравнивались константы скоростей реак-
ций в присутствии (/гВнутр) и в отсутствие (/гон-) акцептора. Обра-
зование комплекса Михаэлиса — Ментен —• одна из причин, оправ-
дывающих использование катализируемых циклодекстрином
реакций для моделирования реакций гидролитических ферментов
Интересно, что наличие трет-бутильной группы в субстрате резко
снижает константу диссоциации; это означает, что он лучше свя-
зывается; трет-бутилфенильная группа полностью заполняет цик-
логептаамилозную полость. Следует также отметить, что если
субстрат выталкивается «дном» из полости, то, как правило,
СООН
аЗамантанкарЗоновая
кислота
константа диссоциации меняется пропор-
ционально скорости. В отсутствие «дна»
субтрат располагается слишком глубоко и
эффективного катализа не наблюдается
Адамантанкарбоновая кислота, которая
прочно связывается с а-циклодекстрином,
закрывая вход в полость, — великолепный конкурентный ингибитор
комплексообразования.
При исследовании гидролиза замещенных фенилацетатов а-
или p-циклодекстринами установлено, что жета-замещенные фе-
ниловые эфиры гораздо быстрее гидролизуются, чем соответст-
вующие пара-изомеры,— явление, названное жета-селективностью.
Эти наблюдения говорят о том, что способ связывания субстра-
тов, по-видимому, асимметричный. Такой эффект, очевидно, за-
висит от глубины полости, и Фудзита и сотр. [177] показали, что
соответствующие простые модификации p-циклодекстрина, такие,
например, как «экранирование» акцептора, могут менять селек-
тивность и превращать обычную лгета-селективность в пара-селек-
тивность.
Комияма и Бендер [178] представили еще одно эксперимен-
тальное доказательство важности гидрофобного связывания при
комплексообразовании а- и p-циклодекстринов с 1-адамантанкар-
Моделирование ферментативных систем
307
лбоксилатом. Гидрофобное (неполярное) связывание характери-
зуется благоприятным изменением энтропии, которое можно объ-
яснить переносом донорной молекулы из водной среды в более
Ущолярную, какую представляет собой полость циклодекстриновой
Ьолекулы. Такой перенос требует разрушения слоя структуриро-
ванной вокруг донора воды, что приводит к большому благо-
приятному изменению AS и небольшому неблагоприятному изме-
нению А/У. Важность гидрофобного связывания в комплексооб-
разовании циклодекстринов также согласуется с наблюдением,
•что «экранированный» циклодекстрин связывается с донорами
ильнее, чем обычный циклодекстрин. Наконец, Бендер и
сотр. [178] показали, что именно благоприятное изменение энтро-
пии в результате гидрофобного связывания обусловливает ста-
билизацию комплексов циклодекстринов с аполярными донор-
ными соединениями.
Г Далее, комплексообразование циклодекстринов с донорными
Соединениями, такими, как антибиотики и инсектициды, вызвано
появлением у этих соединений новых физико-химических свойств.
Это приводит к новым интересным практическим применениям и
еще раз доказывает, что циклодекстрины — подходящие системы
для моделирования ферментативного связывания и ферментатив-
ных реакций.
Здесь целесообразно отметить, что в группе Бреслоу [179]
синтезирован |3-циклодекстринбисимидазол для моделирования
рибонуклеазы А (РНаза А) (гл. 3). В основе использованного
подхода лежит синтез «экранированного» дисульфонатного произ-
водного, полученного ранее Табуши и сотр. [180, 181].
Модельное соединение селективно гидролизует циклические
фосфаты, производные 4-трет-бутилкатехина, путем кооператив-
ного катализа нейтральным имидазолом и имидазолий-ионом.
При обычном химическом гидролизе должна была бы обра-
зоваться смесь двух продуктов в произвольном соотношении, в то
308
Глава 5
время как гидролиз «искусственным ферментом» приводит к на-
коплению только одного изомера м- фосф ат а.
Реакция идет гораздо медленнее, чем в случае РНазы
(в 17 раз), но селективность ее соответствует механизму «атаки
с тыла» без псевдовращения, что характерно и для фермента
(разд. 3.3). Как и в случае хлорирования анизола в пара-поло-
жение, данная реакция, катализируемая циклодекстрином, дает
только один из двух возможных продуктов.
При обработке иодидом калия обсуждавшийся выше «экрани-
рованный» p-циклодекстриндисульфонат может быть легко пре-
вращен в соответствующий дииодид. Табуши и сотр. [182] был
разработан новый метод получения бис(Ы-имидазолил)-|3-цикло-
декстрина и бис(М-гистамино)-(3-циклодекстрина с использованием
подходящих нуклеофилов. В присутствии Zn(II) оба циклодекст-
рина с региоспецифически введенными двумя функциональными
группами гидратируют СО2 и, таким образом, представляют со-
бой первые удачные модели карбоангидразы. Zn(II) связывается
с имидазольными кольцами, расположенными снаружи у входа
в циклодекстриновую полость, а присутствие добавочной основ-
ной группы, как в случае бис(гистамино)-циклодекстрин-гп(П),
увеличивает активность катализатора. Следовательно, данные мо-
дели показывают, что все три фактора: Zn (II)-имидазол, гидро-
фобное окружение и присутствие основания,— по-видимому, спо-
собствуют появлению карбоангидразной активности [182]. Меха-
низм действия этого фермента обсуждается в разд. 6.2.
Интересна также модель, разработанная Бреслоу и Оверма-
ном [183], где ион металла входит в состав циклодекстринсуб-
стратного комплекса. Если в качестве субстрата используется
n-нитрофенилацетат, то присутствие Ni(II) в циклодекстринсуб-
стратном комплексе приводит к дальнейшему увеличению скоро-
сти гидролиза (в 1000 раз).
Этот новый комплекс может быть получен следующим обра-
зом:
Моделирование ферментативных систем
309
а-циклойекстприн
2.,5-0UKap6OKCUnupU0UH
образование з<рира
на циклоЗекстрине
Ni(ll)
+
Б Циклодекстриновая полость удерживает молекулу эфира, в то
время как ион металла закрепляет другие группы в положении,
благоприятном для атаки. Если в раствор добавить циклогекса-
нол, то он конкурирует с субстратом и каталитический эффект
Уменьшается на 60%. Каталитические свойства системы в значи-
тельной степени можно объяснить связыванием субстрата цик-
лбдекстриновым фрагментом комплекса. В отсутствие циклодек-
стрина скорость возрастает лишь в 350 раз. Таким образом, со-
гласованные действия циклодекстрина и иона металла порождают
более эффективную каталитическую систему, моделирующую
свойства фермента.
В В поисках хорошо охарактеризованных полифункциональных
Жиклодекстринов был разработан [184, 185] изящный подход
(см. с. 310).
Применение этого подхода делает доступными самые разные
*Воизводные циклодекстринов и позволяет синтезировать даже
более замысловатые модельные системы с региоспецифиче-
W1 расположенными функциональными группами на одной
810
Глава 5
а-циклоЗекстрин
РЬ,СС1 смесь ач-.п>рч-
3 з-и тетратри-
тильных
производных
симм- три тритил-
oi цикл о секс трин
(охарактеризован
с помощью 13С ЯМР)
ОСН3 ОСН3ОСН3
CHjO \ i /Рснз
снэо.
►осн3
D
2)
Ph5P
nh4oh
CH3I,NaH
д три-
5ЯеекиЛ' <2) CH3S°2Cl
стрин 3) NaN3
3) Н3О®
осн,
NH3
©
®/Ч>с
NH,
осн3
CU.MM- триаммонии пероксимЕтил-
а циклобекстрин
(охарактеризован с помощью ЭС-ЯМР)
О ОСМзРСНз
стороне циклодекстриновой полости и возможными дополнитель-
ными функциональными группами на другой ее стороне.
Этот симметричный полифункциональный акцептор обладает
способностью связывать комплементарные доноры. На рис. 5.17
показано связывание бензилфосфата внутри полости.
Потенциометрическое титрование аммонийных групп акцепто-
ра дает значения кажущейся рКа 7,42; 8,02 и 8,79. Значения рКа
слишком низки для аминогрупп первичных аминов, но это может
быть связано с их неполярным окружением. При pH 7 акцептор
пребывает главным образом в виде полностью протонированных
молекул, и наблюдаемая при этом константа диссоциации дтя
бензилфосфата (0,031 ммоль/л) почти на три порядка меньше,
чем для бензилового спирта (24,3 ммоль/л). Таким образом, син-
тезированное соединение — хороший акцептор для бензилфосфата.
Более того, константа диссоциации комплекса бензилфосфата
зависит от pH. Это означает, что донор связывается в полости
циклодекстрина путем сильного взаимодействия атомов кислорода
фосфатной группы (при pH 7) с тремя асимметрично располо-
женными протонированными аминогруппами. Интересно, что не-
органический фосфат не связывается такими циклодекстриновыми
производными и не вытесняет бензилфосфат из полости, что
опять-таки свидетельствует о важности гидрофобного связывания
между донором и акцептором.
Моделирование ферментативных систем 311
Вс. 5.17. Комплекс симметричного триаммонийпероксиметил-а-циклодекстрина
Вензилфосфатом (атомы водорода опущены) [185]. Воспроизведно с разреше-
ния © 1979 by the American Chemical Society.
Следовательно, в водном растворе как гидрофобные, так и
^кктростатические взаимодействия участвуют в специфическом
шорно-акцепторном комплексообразовании, что может служить
Моделью широко распространенного в биологических системах
«ногоцентрового узнавания».
I Построенные из d-глюкозных единиц циклодекстрины хи-
ральны, и для них в ходе реакций наблюдалось проявление хи-
Ральных свойств к субстратам [173]. Эти свойства использованы
1 работе Бреслоу и сотр. [186]; на основе циклодекстрина, кова-
лентно связанного с коферментом, они синтезировали «искусст-
венный фермент». Он состоит из |3-циклодекстринпиридоксамина
(разд. 7.2), который способен селективно осуществлять реакцию
>ереаминирования, превращая фенилпировиноградную кислоту
[[природный ь-энантиомер фенилаланина с выходом 52%.
312
Глава 5
Сенгером и сотр. [187] получены данные о том, что циклодек.
стрины могут гораздо лучше моделировать ферменты, чем эт0
до сих пор считалось. Было показано, что при связывании суб.
стратов с акцептором происходят конформационные изменения
последнего. Такая ситуация аналогична поведению ферментов
для которых характерно явление «индуцированного соответствия»’
фермента с субстратом.
Другие интересные системы с участием циклодекстринов ис-
пользовал для моделирования ферментов Табуши с сотр. Это
специфическое аллилирование — окисление гидрохинона [188],
при котором циклодекстрин через аминогруппу соединен с рети-
налем, моделируя родопсин, а также специфический катализ
включения p-циклодекстрином при одноступенчатом синтезе ана-
логов витамина Ki и Кг [190].
Каталитическую эффективность всех рассмотренных до сих
пор моделей ферментов, по-видимому, можно объяснить дейст-
вием трех основных факторов:
1) гидрофобные взаимодействия обеспечивают эффективное
связывание;
2) влияние среды (или свойств полости), полярность которой
благоприятствует протеканию реакции;
3) ориентационный эффект, который ограничивает набор кон-
формаций и обеспечивает большое увеличение скорости.
5.5. Моделирование ферментов с использованием стероидной
матрицы
Длинные алкильные цепи с каталитической группой на одном
конце могут обеспечить достаточное количество гидрофобных
центров связывания с такими субстратами, как эфиры жирных
кислот, чтобы увеличивать скорость их реакций (наблюдалось
10-кратное увеличение скорости при pH 8 в трис-буфере и 25°С).
Образуются мицеллы, но при этом не происходит большого уве-
личения скорости при ассоциации алкильных цепей с мономерным
участком связывания в соотношении 1:1. Следовательно, серьез-
ная проблема заключается в том, что эти молекулы мало раст-
воримы в воде, а потому имеют тенденцию агрегировать с об-
разованием мицелл. Работы следует вести при концентрации
значительно ниже ККМ, которая для данной системы равна
~ 10~4 моль/л. Кроме того, конформация цепи меняется даже
в вытянутом состоянии. Поскольку алкильные цепи очень гибкие
и никогда пе образуют сильно гидрофобной области, необходимо
Моделирование ферментативных систем
313
[править поиски на создание более конформационно жесткой
[тки.
[Чтобы обойти подобного рода трудности, предложено [191]
Ьюльзовать плоский, длинный и жесткий гидрофобный остов
Ьроидной молекулы. Для этого синтезирован стероид адростан-Зр,
-диамино-17р(4) -имидазол.
Наличие двух аммонийных групп делает молекулу достаточно
Ждорастворимой, чтобы ингибировать мицеллообразование в ус-
Квиях проведения эксперимента. Напомним, что желчные кис-
Игы растворимы в воде, однако образуют мицеллы.
I В отличие от циклодекстрина, молекула которого трехмерна,
данная система плоская. Это вполне подходящая модель для
шенки гидрофобных и электростатических взаимодействий при
вестной геометрии. Наличие имидазольной группы в 17|3-поло-
жении обеспечивает каталитический эффект, наблюдаемый при
Идролизе эфиров.
Г Изучен ряд ароматических эфиров с возрастающей степенью
гидрофобности. Для соединений с п = 2 или 3 относительная
скорость гидролиза вдвое больше, чем для п — 1:
СООН
(CHJ —
314
Глава 5
Обнаружено, что с увеличением размера гидрофобной группы
в молекуле эфира скорость катализируемого гидролиза также
возрастает. Однако эти эфиры, по существу, обнаруживают одц.
наковую активность к имидазолу как нуклеофилу. Следовательно,
опираясь на пространственные модели, можно предположить, что
две СН2-группы между системой ароматических колец и эфирной
группой необходимы для обеспечения гидрофобного контакта
с a-поверхностью стероидной молекулы, а гидрофобные взаимо-
действия между субстратом и катализатором благоприятствуют
протеканию катализируемого имидазолом гидролиза эфиров.
Наблюдаемая скорость характерна для реакции истинно вто-
рого порядка, что указывает на стехиометрию 1:1. Из-за пло-
хой растворимости кинетика насыщения не измерялась; ни kKaT>
ни Кт не были установлены; удалось оценить лишь константы
скорости второго порядка. Пространственная структура обра-
зующегося в результате продуктивного связывания тетраэдриче-
ского соединения свидетельствует о том, что между субстратом
и стероидными кольцами возможно эффективное гидрофобное
связывание. Достоинством этой системы является малая конфор-
мационная подвижность как субстрата, так и катализатора.
Еще один пример применения такого Стероидного катализато-
ра можно встретить при изучении общего основного катализа Р-эли*
минирования Р-ацетоксикетонов [192].
О О
Ar—СН—СН2—С—СН3 Ar—СН—СН—С—СН3
ОАс
Скоростьлимитирующей стадией в этой реакции является ка-
тализируемая основанием енолизация кетона. Если Аг = фенил,
нафтил и фенантрил, скорость возрастает благодаря гидрофоб-
ным взаимодействиям в 9,0, 27 и ПО раз соответственно.
Поскольку для имидазола р/С = 7,1, а для соответствующего
стероидимидазола рК = 7,2, то основность катализатора, по-вп-
димому, не относится к тем факторам, которые ответственны за
Моделирование ферментативных систем
315
взрастание скорости. Результаты показывают, что все три суб-
{•рата обнаруживают одинаковый характер кинетики гидролиза.
I принципе образование стероидимидазольного комплекса долж-
1 скорее замедлять, чем ускорять, реакцию. Следовательно, раз-
iep арильной группы должен вызывать противоположный эф-
1кт, обеспечивая лучшее структурное соответствие. Другими
ьовами, должны существовать какие-то благоприятные некова-
Ьнтные взаимодействия между субстратом и остальной частью
|ероидной молекулы. Фактически конформация переходного
стояния должна быть такой, чтобы при взаимодействии стероид-
Lx и субстратных колец «нижняя» сторона стероидной структу-
В была защищена от воды. Следовательно, сильное и благо-
юиятное гидрофобное связывание — главная причина возраста-
ем скорости, наблюдаемого в случае производных фенантрена.
Вязанное иллюстрируется следующей схемой:
I Некоторые исследования проведены также с анионными и
катионными ацетильными субстратами [193]. Обнаружена общая
закономерность: для катионных субстратов наблюдается замед-
Дение скорости, а для анионных — возрастание. Однако анионная
группа в .мета-положении вызывает большее увеличение скоро-
сти, чем в пара-положении. Здесь мы впервые сталкиваемся с
катализом как результатом электростатического взаимодействия
Удаленных от реакционного центра заряженных групп с доста-
очно точно установленной геометрией.
I Из приведенных ниже структур видно, что СОО’ и NH3-
ВРуппы в составе тетраэдрического промежуточного соединения
316
Глава 5
могут приходить в близкий контакт друг с другом без напряже-
ния. Контакт между 11-аммониевым ионом и п-карбоксилатом
субстрата возможен, но только после десольватирования ионных
групп без образования компенсационной водородной связи, в т0
время как 11-аммониевый ион и n-карбоксилат могут прийти в
контакт без вмешательства воды и образовать хорошую водород,
ную связь. Другими словами, близкий контакт необходим для
сильного электростатического взаимодействия, но возможен лишь
в том случае, если потеря сольватной воды компенсируется об-
разованием новой водородной связи. Присутствие С-18 метиль-
ной группы не стерическое препятствие.
В заключение отметим, что стероидная система вполне при-
годна для моделирования ферментов, поскольку в ней происхо-
дит связывание катализатора с субстратом и существует опре-
деленная селективность к некоторым субстратам. Чтобы заста-
вить субстрат связываться только одним способом, необходимо
увеличить связывающую способность стероидимидазольной си-
стемы.
С этой целью в группе Гутри планируется синтезировать сте-
роидимидазольный димер путем соединения двух кетонных ана-
логов ароматическим диамином. Предполагается, что в полученной
трехмерной молекуле субстрат будет «проглочен» димерным ката-
лизатором, в пасти которого гидрофобное связывание возникает
уже с двух сторон реакционного центра субстрата. Пока получе-
но бис(11)-кетопроизводное, и для него наблюдалось 1000-крат-
ное увеличение скорости по сравнению со скоростью реакции, ка-
тализируемой имидазолом.
Моделирование ферментативных систем
317
5.6. Реакции селективной функционализации
I Способность природных катализаторов осуществлять селек-
тивную функционализацию простых субстратов основана на хо-
роШо работающем принципе, к которому до недавнего времени
химики не обращались [194]. Например, ферментативные систе-
мы, такие, как десатуразы, могут окислять единственную неак-
Эивированную углеводородную связь в специфическом месте ал-
кильной цепи стеариновой кислоты и превращать ее в олеиновую
кислоту, имеющую только цнс-конфигурацию.
ОН
стеариновая кислота
I Следовательно, огромное увеличение скорости и образование
в ходе реакции только одного продукта, когда возможно образо-
вание множества,— вот характерные особенности ферментативных
318
Глава 5
процессов. Бреслоу и сотр. [194, 195] впервые продемонстриро.
вали этот принцип селективной функционализации в обычной хи.
мической реакции, осуществив избирательное окисление алкиль-
ных цепей. Для того чтобы реагент атаковал неактивированную
СН2-группу, была использована фотохимическая активация бен-
зофеноновым триплетом (триплетная реакция Янга) и исследо-
вано внутримолекулярное внедрение бензофенонкарбоксиэфиров в
алканолы (рис. 5.18).
Радикальная реакция протекает с образованием ковалентного
промежуточного соединения. После озонолиза бензофенон реге-
нерируется, а ковалентно связанная алкильная цепь (субстрата)
селективно окисляется с выходом до 66% (табл. 5.2).
Таблица 5.2. Наблюдаемая степень окисления алкильной цепи [194]
Место окисления Степень окисления (%) алкильных цепей различной длины а
Сн С« Сао
С-8 — — — —
С-9 — — — —
С-10 — 8 8 5
С-11 11 10-12 17 15
С-12 49 8—13 21 20
С-13 22 3—10 18 19
С-14 — 56—66 12 19
С-15 — 7—10 5 13
С-16 — — 13 8
С-17 — — 6 ы—
а Прочерк означает, что продукт не обнаружен.
Алкиловые эфиры бензофенон-4-карбоновой кислоты способны
включаться в мицеллы, образованные, например, додецилсульфа-
том натрия или лецитином, и могут быть использованы как фото-
химические зонды для моделирования мембранных структур [196].
Итак, налицо возможность использования принципа функцио-
нализации для разработки различных специфических реакций.
В частности, соответствующим образом сконструированные же-
сткие модельные системы, такие, как стероидные матрицы, были
использованы для разработки новых подходов к химическому син-
тезу гормонов, при которых может быть достигнута повышенная
селективность. Например, путем присоединения бензофенонового
хромофора в За-положение стероидной молекулы [197] при раз-
личных экспериментальных условиях был получен ряд селективно
функционализированных производных (рис. 5.19),
Рис. 5.18. Подход к реакциям селективной функционализации, разработанный Бреслоу.
Ц Зак. 549
322
Глава 5
Было также показано, что ковалентная связь между субстра-
том и «катализатором» не всегда необходима В приведенном
ниже примере вполне достаточно электростатических взаимодей-
ствий для сближения двух молекул настолько, чтобы произошла
реакция внедрения по связи с удалением атома водорода.
Один из вариантов селективной функционализации — исполь-
зование эфира n-дихлориодбензойной кислоты для проведения ре-
акций внутримолекулярного галогенирования и элиминирования
Такой подход применен при создании
гормона надпочечников кортизона [199]:
I Н
R' 43%
нового метода синтеза
Моделирование ферментативных систем
323
। В различных матрицах атаке подвергаются различные положе-
ния стероидной молекулы. Это скорее напоминает геометрический
контроль процесса функционализации, присущий ферментам, а не
(+)-винная
кислота
О
11*
324
Глава 5
обычный, характерный для хи-
мических реакций контроль
активностью групп. Эти мат-
ричные реакции галогенирова-
ния обнаруживают и катализ,
и специфичность, и они дей-
ствительно биомиметические
[350].
Недавно в группе Шенвэ
путем сочетания принципов
донорно-акцепторного компле-
ксообразования и селективной
функционализации создана
интересная модель фермента
десатуразы. Был синтезирован
краун-эфир, имеющий боко-
вые цепи с бензофеноновым
остатком. Исходным соедине-
нием служила оптически ак-
тивная форма винной кисло-
ты.
Гидрофильная полость кра-
ун-эфира может связывать
алкиламмониевые соли, и при
облучении система должна се-
лективно создавать в присо-
единенной к ней алкильной це-
пи двойную связь путем от-
рыва атомов водорода. Такое
;нает ферментсубстратный ком-
плекс, где геометрия структуры позволяет региоспецифически
вводить двойную связь в алкильную цепь амина. Эта система
действительно в упрощенном виде моделирует фермент десату-
разу, которая превращает стеариновую кислоту в олеиновую пу-
тем введения цис-двойной связи в положение 9—10 алкильной
цепи.
5.6.1. Примеры других реакций, близких к биосинтезу
Примерами биосинтетических реакций могут служить реакции
превращения алкалоидов, в которых фенольные кольца соеди-
няются орто-орто-, орто-пара- или napa-napa-положениями по ме-
ханизму одноэлектронного окисления металлнезависимыми фер*
ментами. Окислительное соединение фенолов в течение долгого
времени признавали важнейшим биосинтетическим процессом,
характерным не ТОЛЬКО для алкалоидов, НО В некоторых случаях
Моделирование ферментативных систем
325
также для таннинов, лигнинов и растительных пигментов. Что
касается химических методов, то различные окислители [Fe3+,
Fe(CN)g', PbO2, Ag2O] могут осуществлять «сшивание» фенолов, и
Недавно для стимулирования протекания такой реакции при син-
тезе морфина была использована система с участием таллия(III)
[200]:
морфин
Механизм включает образование и димеризацию феноксирадика-
лов.
В настоящее время известно множество стабильных радикалов.
Промышленное использование затрудненных фенолов, таких, как
2>4,6-три-трет-бутилфенод или 2,5-ди-трет-бутилокситолуол (БОТ),
326
Глава 5
в качестве антиоксидантов в пищевых продуктах и аналогичная
функция витамина Е (а-токоферола) в клеточных тканях основа-
ны на их способности образовывать стабильные свободные ради-
калы такого же типа, что и в реакциях окислительной рекомбц-
2.14,6-mpu-z7Jww- витамин Е
бутитренол
Другое практическое применение химического окисления сле-
дует искать в биосинтезе простагландинов [201, 202]. В природе
они синтезируются путем селективного окисления предшествен-
ника — жирной кислоты Сго, содержащей три или четыре двойные
связи. Полиненасыщенная жирная кислота в присутствии фер-
мента циклооксигеназы окисляется молекулярным кислородом пу-
тем двух последовательных реакций радикальной циклизации с
образованием бициклического промежуточного продукта — эндо-
пероксида. Разлагаясь, он образует различные простагландины, в
том числе PGFz и PGFza, а также тромбоксан Аг и простациклин
(рис. 5.20).
модифицированный
участок^ ,...1^
природный
эндопероксид
некоторые
синтетические
аналоги
относительная
активность
4 -7
24
~0,1 -0,1 2 — 3 3—4
Простагландины открыты в 30-х годах. Как показали наблюдения, они участ
вуют во многих физиологических процессах, воздействуют на активность многих
клеток, в которых синтезируются. Молекулярная основа различных способов дей-
ствия простагландинов пока не известна, но они, по-видимому, контролируют
действие гормонов, а не действуют как гормоны.
Позднее особый интерес к простагландинам был вызван их ролью в воспа-
лительных процессах и иммунном ответе, поскольку онн стимулируют синтез ги-
стаминов. Широко используемый аспирин (ацетилсалициловая кислота) обладает
противовоспалительным и антипиретическим (жаропонижающим) действием
В настоящее время есть основание предполагать, что механизм действия этого
Веаэкды аллильный про-&-
атом водорода селективно
удаляется ферментом
некоторые фосфорилированные
Липиды многих клеточных мембран
фОСфОЛЦПаЗО. А
HR,„ Hs
СООН
цис-л\л\л1 ,4- эйкозате тра,-
еновая (арахидоновая) кислота
простациклин (PGIa)
Рис. 5.20. Биосинтез простагландинов и их производных.
328
Глава 5
лекарства заключается в прекращении синтеза простагландинов путем ингибиро-
вания циклооксигеназы, которая ответственна за образование промежуточного
продукта — эндопероксида. Эндопероксид и тромбоксан Аг, продукт непроста-
гландиновой природы, являются мощными физиологически активными агентами,
которые, как известно, стимулируют агрегацию тромбоцитов и сужение сосудов.
Оказалось, что синтетические аналоги эндопероксида, в которых пероксидная
группа замещена, обладают аналогичными свойствами. Некоторые из них даже
более активны.
Другое производное, простациклин, обладает противоположным действием,
растворяя агрегаты тромбоцитов. Это самый мощный среди всех известных анти-
агрегирующих агентов. Открытие этих двух новых классов соединений, тромбо-
ксанов и простагландинов, их противоположное действие на сердечно-сосуди-
стую систему и ингибирование их синтеза определенными противовоспалитель-
ными агентами, — все это позволит по-новому взглянуть на возможность предот-
вращения и лечения атеросклероза [ЕОЗ]. Есть надежда, что другие синтетиче-
ские аналоги этих новых соединений найдут интересное терапевтическое приме-
нение для контроля тромбоза и других нарушений сердечно-сосудистой системы
в целом.
Кроме того, синтетические модифицированные аналоги простагландинов мо-
жно рассматривать как потенциальные контрацептивы. В небольших дозах они
вызывают искусственное прерывание беременности.
Большой вклад в описание свойств и синтез производных простагландинов
сделали Самуэльсон н Кори [201].
Поскольку циклизация пероксидного радикала занимает важ-
ное место в процессах биологического окисления, то для объяс-
нения механизма реакции были использованы простые органиче-
ские модели. Такие модельные исследования помогают химикам
также понять общие принципы активности радикалов.
Портер и сотр. [204] сообщили о методе получения опреде-
ленных ненасыщенных пероксидных радикалов. Самое главное в
этом методе то, что атомы водорода в пероксидной функции (ROOH)
гораздо легче отрываются трет-бутоксильными радикалами, чем
атомы водорода, присоединенные к углероду. Ди-трет-бутилпер-
оксалат (ДЕПО) генерирует пероксидные радикалы, способствуя
протеканию двух последовательных реакций радикальной цикли-
зации.
аналогично:
Моделирование ферментативных систем
329
Следовательно, эти модельные системы пригодны для систе-
матического изучения радикальной циклизации, приводящей к об-
разованию эндопероксидов, промежуточных продуктов биосинтеза
простагландинов.
Вполне приемлем следующий механизм, согласующийся с экс-
периментальными данными:
+ ROO-
Кроме того, были получены другие простаноидные эндопер
оксидные модельные соединения. Очень важна реакция гидропер
1оксибромирования циклопропанов
бромидов в 1,2-диоксоланы [205].
Из приведенной схемы синтеза
видно, что циклопропановые
кольца могут также служить как
эффективные и удобные синтоны
и циклизация у-гидроперокси-
для получения модельных соеди-
нений эндопероксидов.
Наконец, следует упомянуть
о попытке синтезировать не-
сколько производных 2,3-диокса-
бицикло [2.2.1] гептана, напря-
женного бициклического перок-
сидного ядра простагландинового
эндопероксида [206]. Эти произ-
H,O,/NBS
водные получаются из 2,3-диоксабицикло [2.2.1] гептена-5 селек-
тивным восстановлением диимидом или хлорированием.
Следует учитывать, что исследования Портера и сотр. по внутри-
молекулярному катализу проводились с целью выявления раз-
личных аспектов функции ферментов, а не с целью воспроизведе-
ния ферментативного катализа. Тем не менее иногда именно
330
Глава 5
такого рода задачи следует решать прежде, чем переходить к соз-
данию «искусственных ферментов».
5.7. Биомиметические реакции полиеновой циклизации
Биомиметический синтез можно определить как планирование
и проведение в лабораторных условиях реакций, в основе которых
лежат уже установленные или предполагаемые биохимические
процессы. Это подразумевает создание новых для небиологиче-
ских систем химических превращений и разработку изящных ме-
тодов полного синтеза предшественников различных природных
соединений. В этом направлении были сконцентрированы усилия
Ван Тамелена и сотр. [207] и Джонсона и сотр. [208, 209].
5.7.1. От сквалена до ланостерина
Сквален — предшественник стерннов и полициклических три-
терпенов. В 50-х годах Сторк и Эшенмозер предположили, что био-
генетическое превращение сквалена в ланостерин включает син-
хронную окислительную циклизацию. Процесс катализируется кис-
лотой и протекает через образование ряда карбониевых ионов,
обеспечивающих замыкание всех четырех колец. В настоящее
время существует убедительное доказательство того, что первой
стадией является селективное эпоксидирование двойной связи с
образованием сквален-2,3-оксида (рис. 5.21).
Ранние исследования Ван Тамелена [210] показали, что сква-
лен может быть превращен химическим путем в 2,3-бромгидрин
обработкой бромноватнстой кислотой в водном растворе глима.
Кроме того, при обработке сквалена N-бромсукцинимидом
(NBS) в воде селективно образуется желаемый конечный бром-
гидрин. Обработка основанием в этаноле приводит к образованию
рацемического сквален-2,3-оксида. При использовании гомогената
крысиной печени в стандартных аэробных условиях рацемический
сквален-2,3-оксид в конечном счете дает стериновые фракции, ко-
торые могут быть очищены хроматографически.
Более того, было показано, что сквален-2,3-оксид синтезирует-
ся непосредственно из сквалена в стеринобразующей системе кры-
Рис. 5.21. Химический синтез сквален-2,3-оксида и его биохимическое превращение в холестерин.
332
Глава 5
синой печени и служит предшественником стеринов; он го-
раздо эффективнее, чем сквален, участвует в процессах, проте-
кающих в анаэробных условиях. Следовательно, весьма вероятно,
что именно промежуточный сквален-2,3-оксид циклизуется под дей-
ствием фермента, что приводит к образованию ланостерина, пред-
шественника холестерина и других стероидных гормонов. Есте-
ственно, что при ферментативном процессе образуется только
один изомер эпоксида — 3-8-изомер.
Более детальное изучение структуры сквален-2,3-оксида по-
зволило обнаружить наличие трех различных л-электронных си-
стем, обозначенных как а-, р- и у-участки [210, 211].
Для осуществления циклизации ферментом циклазой необхо-
дим a-участок. р-Участок надлежащим образом ориентирует Д14-
двойную связь относительно образующегося карбониевого иона и
таким образом контролирует вторую ферментативную стадию. Ре-
акция, судя по всему, протекает без остановки до тех пор, пока
не образуется тетрациклическая система. Роль скваленоксидцик-
лазы заключается в удерживании углеродной цепи в конформации
с максимальным перекрыванием орбиталей, что способствует воз-
никновению о-связей в молекуле стерина.
Трехмерное изображение структуры молекулы демонстрирует
три важнейшие системы перекрывающихся орбиталей. Первая
система перекрывающихся орбиталей эпокси-Д6, где происходит
8к2-реакция по С2, далее перекрывание Д6 — Д10, которое макси-
мально в конформации «ванны», и, наконец, системы перекрываю-
щихся орбиталей Д10—Д14 и Д14—Д18, в которых л-плоскости ориен-
тированы перпендикулярно друг другу. Отметим, что кольцо В
находится в конформации «ванны». Очевидно, биологическую цик-
лизацию сквалена можно объяснить со стереоэлектронных пози-
ций. Такая «спиралевидная» конформация в переходном состоя-
нии, по-видимому, благоприятствует процессу согласованной цик-
лизации. Процесс циклизации очень сложен, и только в работе
[212] впервые был затронут вопрос о том, каким образом ини-
Моделирование ферментативных систем
333
I циируется циклизация сквалена. В этом процессе селективно ак-
' тивируется только одна из шести возможных двойных связей.
В организме животных сквален принимает приведенную выше
I конформацию «кресло» — «лодка» — «кресло» для того, чтобы об-
разовалась трициклическая структура с той же конформацией,
I в которой затем происходит ряд согласованных перемещений во-
I дорода и метильной группы и наконец потеря протона. В расти-
Н тельных стеринах, однако, реализуется механизм с участием толь-
ко конформации «кресло» — «кресло» — «кресло».
Особенно интересен механизм, согласно которому перемеще-
ния водорода и метильной группы в процессе перегруппировки Ваг-
нера — Меервейна приводят к образованию ланостерина. A priori
возможны два типа миграции метильной группы: одно 1,3-смеще-
ние или два 1,2-смещения. Чтобы различить эти два типа мигра-
ции, Блох и Вудворд [213] предложили провести оригиналь-
ный эксперимент. Исходя из двух селективно меченных изотопом
14С ф-иононов, они получили четыре различным образом меченных
молекулы сквалена путем конденсации со сдвоенным реагентом
Виттига.
334
Глава 5
Ферментативная циклизация этих меченых скваленов А, В, С
и D приводит к образованию фрагментов структуры ланостерина
А', В', С' и D' (рис. 5.22).
Ланостерин, полученный из смеси меченых скваленов, рас-
щепляли до ацетата окислением по Куну — Роту [обработка
8(|, 2-смещение)
1,5-смещение
2(1,2-смещение)
1Ькисление
по Куну-Роту
сн2=сн2«— сн3—соон
Рис. 5.22. Доказательство Блоха и Вудворда двух 1,2-миграций метильной груп-
пы в процессе биосинтеза ланостерина.
смесью хромовой и серной кислот], а ацетат в свою очередь раз-
лагали до этилена для масс-спектрометрического анализа. Рас-
смотрение введения метки для всех механизмов позволило уста-
новить, что только структура D способна образовывать этилен,
в котором оба атома углерода мечены изотопом 14С. Поскольку
такой дважды меченный этилен действительно был обнаружен,
был сделан вывод, что в природных системах происходят две 1,2-
миграцни метильной группы.
Теперь после обсуждения ферментативного превращения сква-
лена в ланостерин можно разработать стратегию полного синте-
Моделирование ферментативных систем
335
за полициклических природных соединений в лаборатории. Эта
[область биоорганической химии названа Джонсоном биомимети-
|вескими реакциями полиеновой циклизации.
*5.7.2. Биомиметический подход
Какие из биосинтетических операций можно воспроизвести в
[условиях лаборатории органической химии? Первые исследова-
?ния, направленные на осуществление неферментативной реакции,
подобной биогенетической полиеновой циклизации, больших на-
Ьежд не подавали. Однако Ван Тамелен [207] обнаружил, что
•если предварительно получить D-кольцо, то изоэуфенольную си-
стему можно получить с хорошим выходом при обработке эпок-
сидного предшественника кислотой Льюиса.
изоэуфенольный остов
выход 35%
При такой циклизации одновременно образуются пять асим-
метрических атомов углерода по механизму замыкания циклов,
находящихся только в конформации «кресла». Естественно, сна-
нала должен быть получен предшественник (рис. 5.23).
Ван Тамелен [207] считает, что выбранный ключевой интер-
медиат, такой, как предварительно полученное D-кольцо, дей-
ствует как «изолятор», предотвращающий взаимодействие л-связи
роковой цепи с образующимся в процессе циклизации карбо-
ниевым ионом. Он также предотвращает образование пятичлен-
ного С-кольца, что было одной из самых серьезных трудностей
при более ранних попытках проведения такой циклизации.
Биомиметический подход Джонсона, как и Ван Тамелена, также
предполагает стереоспецифический синтез ряда колец в одну ста-
Дию путем замыкания в кольца ациклической цепи, имеющей рас-
положенные напротив друг друга транс-олефиновые связи [208].
[Подход сам по себе весьма систематичен. Содержащие транс-ояе,-
финовые связи предшественники с постепенно усложняющейся
структурой использованы для изучения образования одно-, двух-
8,9-вигивро-
(SH-)-лимонен
Рис. 5.23. Синтез эпоксидного предшественника изоэуфенольной системы, осуще-
ствленный Ван Тамеленом [207].
Моделирование ферментативных систем
337
L трехкольцевых продуктов только (природной) транс-конфигу-
|рации.
|л7рал'г-йекалиноеая
система
I Например, сульфированные эфиры диенов-1,5 подвергаются
Процессу циклизации — сольволиза с образованием транс-декали-
Ьовой системы. Основным бициклическим компонентом является
ранс-сын-декалол-2.
I Хотя выход оказался низким, тем не менее описанная реакция
по своей стереоспецифичности — первый простой пример системы,
которая соответствовала теоретическим предсказаниям о стерео-
Влектронном контроле синхронной циклизации.
I Более высокие выходы получаются, если в качестве инициато-
ров циклизации используются ацетальные, а также аллильные
спиртовые группы. Например, следующий транс-диеновый ацеталь
количественно превращается в транс-бициклическое соединение:
I Изомерный олефиновый предшественник с «{ас-конфигурацией
внутренней связи дает только ^ыс-декалиновое производное в со-
(+)-гийринЗамон
92%
8%
338
Глава 5
ответствии с предсказываемыми ориентацией и перекрыванием
орбиталей. Важно отметить, что продукты всех этих биомимети-
ческих циклизаций — рацемические смеси. Интересно, однако, что
при использовании оптически активного диенового ацеталя про-
исходит в высшей степени асимметричный синтез.
В этом случае наблюдается соотношение энантиомеров 92:8
и основной продукт превращается в (+)-гидринданон, оптическая
активность которого коррелирует с дисперсией оптического вра-
щения (ДОВ). Причина столь высокой активности не ясна.
Другая цель состояла в изучении возможности образования
трех колец из триеновых ацеталей в качестве предшественников.
Некоторые удачные примеры приведены ниже:
44%
Удивительно, что, когда ацеталь циклизуется в присутствии
хлорида олова в нитрометане (условия, оказавшиеся благоприят^
ными в случае диенового ацеталя), реакция полностью протекает
Моделирование ферментативных систем
339
по другому, неосновному, пути, включающему перегруппировку,
рсновной продукт — трициклическое соединение. Этот продукт
Lor возникнуть путем последовательных 1,2-смещений гидрида и
етильной группы в бициклическом катионном интермедиате:
По-видимому, в данном случае происходит несогласованная
[клизация и имеет место ступенчатый процесс, ведущий к об-
1зованию смесей продуктов.
L Наконец, использование этого подхода для синтеза четырех-
!льцевой системы позволяет получить с 30%-ным выходом D-ro-
ютероидные эпимеры только транс-стереохимического ряда.
I Отметим, что при такой циклизации с исключительной стерео-
рлективностью возникает семь асимметрических центров, при
том образуются только два из 64 возможных рацематов. Это со-
гласованное превращение с образованием продуктов только с
И>анс-конфигурацией наиболее близко к ферментативным процес-
сам среди всех реализованных до сих пор неферментативных под-
Ходов. Без сомнения, превращение тетраолефинового ацеталя с
разомкнутой цепью, не имеющего хиральных центров, в тетрацик-
лическое соединение, имеющее семь таких центров и образующее
|олько два из 64 возможных рацематов, является замечательным
вкладом в метод биомиметической циклизации Джонсона.
I Поскольку пятичленные циклы широко распространены среди
Природных соединений, в частности в D-кольцах стероидов, осо-
бый интерес представляет поиск систем, которые обеспечивали бы
Замыкание пятичленного цикла в биомиметических процессах,
г результате многочисленных экспериментов Джонсон и сотр.
Установили, что введение концевой метилацетиленовой группы —
Удобный метод замыкания пятичленного цикла:
340
Глава 5
прогестерон
ДДХ-а13'йихлор-5,б-Зиц,иано-<,4-6ензо)!инон
(окислитель)
В этом примере предварительно образуется кольцо А, а цик-
лизация дает цис-соединение колец А и В. Продукт затем легко
превращается в природный гормон прогестерон. Таким образом,
ацетиленовые группы — прекрасные терминаторы полициклизации.
В другом случае также было установлено, что концевая сти-
рильная группа благоприятствует образованию пятичленного цик-
ла из-за относительно высокой стабильности образующегося ал-
лильного карбониевого иона:
/пдаяс-б/З-кольцевое
соединение
транс-^Ь- кольцевое
соединение
Эта реакция в CF3COOH/CH2C12 при —50°С протекает с 70%'
ным выходом с образованием исключительно транс-6/5-кольпе-
вого соединения.
Моделирование ферментативных систем
341
В заключение скажем, что определенные полиеновые соеди-
нения, имеющие транс-олефиновые связи в 1,5-положениях и об-
ладающие эффективными инициаторными и терминаторными функ-
циями, можно заставить участвовать в реакциях стереоспецифи-
ческой, неферментативной катионной циклизации. Они образуют
|олициклические физиологически активные продукты, имеющие
[олько транс-конфигурацию [208, 209].
I Механизм биомиметических реакций циклизации и их фермен-
тативных аналогов пока еще неясен, но подавляющее большин-
Нгво данных говорит в пользу синхронного процесса, а не сту-
пенчатого. Изучение таких неферментативных систем, моделирую-
Ицих биосинтез стеринов, имеет фундаментальное значение, так
йсак оно помогло бы яснее представить процессы, которые, воз-
Ложно, действуют со времен возникновения жизни на Земле.
Глава 6
ИОНЫ МЕТАЛЛОВ
Самое ценное то, что еще сокрыто.
ПаскцЛь
В этой главе будут изложены основные представления о функ-
ционировании биологических систем с участием ионов металлов.
Хотя N, S, О, Р, С и Н — это основные элементы, участвующие
в формировании строительных блоков биологических соединений,
живым организмам необходимы также некоторые ионы металлов.
Далее мы увидим, что взаимодействия ионов металлов с моле-
кулами природных соединений имеют, как правило, координа-
ционную природу, и в первую очередь роль ионов состоит в под-
держании нейтральности зарядов. Кроме того, эти ионы нередко
участвуют в каталитических процессах. Таким образом, предмет
обсуждения данной главы находится на грани органической и не-
органической химии.
6.1. Ионы металлов в белках и других природных соединениях
Многие ионы металлов необходимы клеткам живых организ-
мов. Это Na, К, Mg, Са, Мп, Fe, Со, Си, Mo, Zn. Они составляют
~3% массы человеческого тела. Na(I), К(1) и Са(П) особенно
важны как участники так называемого «ионного насоса», который
сопровождается активным транспортом метаболитов и энергети-
ческими процессами. Другие металлы, такие, как Zn(II) и Со(II),
обнаружены в различных металлоферментах, где они координи-
руются с аминокислотами и ускоряют реакции, происходящие в
активном центре [214]. Они выступают как сверхкислотные ката-
лизаторы, оказывающие прямое или матричное действие. В то
же время ионы Fe(II) и Си (II) предпочтительно связываются с
простетическими группами порфиринового типа и участвуют во
многих системах электронного переноса.
Такие элементы, как Hg, Cd и As,— сильные хелатирующие
агенты тиольных групп и, следовательно, эффективные ингиби-
торы ферментов. Токсичные металлы отличаются от органических
ядов тем, что они не'могут быть превращены в безвредные ме-
таболиты. Например, чрезвычайно ядовитый газ люизит, пред-
ставляющий собой органическое соединение мышьяка, может
воздействовать на легкие, кожу или другие органы [214]. За по-
следние 30 лет создание специфических конкурентных хелатирую-
Ионы металлов
343
,С1
< сн2-сн-сн2
ХС1 । ।
SH SH он
BAL
г,3-Зимеркапто-
- пропанол-1
хелатирующих агентов
и механизма действия
^их агентов обеспечило значительные успехи лечения большин-
ства типов отравления тяжелыми металлами. Одно из таких про-
Кщоядий в случае отравления мышьяком — 2,3-димеркаптопропа-
Mfvi-L предложенный вс
Время второй мировой вой-
Кц Р. Петерсом. ЭДТА и С1—СН=СН—/
Жкоторые его аналоги так-
Ке имеют большое значе-
»ие: они используются для люизит
выведения, например, плу-
Жния из организмов жертв
Ждиоактивного облучения.
I Есть надежда, что разработка новых
В основе более четкого понимания роли
рнов металлов в биосистемах приведет к созданию в ближайшем
Идущем гораздо более селективных и эффективных агентов для
Куществления терапевтического контроля присутствия ионов ме-
вллов, как токсичных, так и необходимых организму [215, 216].
I За последние годы наблюдается быстрое развитие представ-
лений о механизме функционирования металлоферментов, а имен-
И: удалось установить место и последовательность протекания
реакций в активном центре, а также найти «ключи» к понима-
нию некоторых механизмов. Важное место занимает гидролиз
(или гидратация) субстратов карбонильного и фосфорильного
Ипа, таких, как СО2, эфиры карбоновых кислот, эфиры и ангид-
риды фосфорной кислоты и пептиды. По-видимому, не вызывает
удивления тот факт, что для функционирования большинства та-
ких систем требуется ион двухвалентного металла. Гораздо уди-
вительнее то, что такими ионами обычно оказываются Zn(II)
или Mg(II) (в ферментах действующих на ДНК, РНК, сАМР
или cGMP). Так, например, цинк по своему содержанию в орга-
низмах млекопитающих (в организме человека 2,4 г на 70 кг)
уступает лишь железу (5,4 г на 70 кг), и большая часть его не-
обходима для функционирования ферментов [215].
| Ионы цннка играют важную роль в различных биологических процессах,
Например служат в качестве стабилизаторов инсулина — гормона, который обес-
Печивает перенос глюкозы в клетку. Они являются также жизненно важными
Компонентами сперматозоидов; их присутствие способствует заживлению ран и
Переработке белковой пищи в кишечнике. Ионы цинка участвуют также в одной
Из ключевых реакций зрительных органов.
6.2. Карбоксипептидаза А и роль цинка
Ферменты, гидролизующие амидные и эфирные связи, можно
Разделить на три класса: 1) требующие для каталитической ак-
тивности наличия тиольной группы, такие, как папаин, фицин и
Другие растительные ферменты, 2) ингибируемые диизопропил-
й>торфосфатом (ДФФ), такие, как а-химотрипсин, трипсин,
344
Глава 6
субтилизин, холинэстераза и тромбин, 3) такие, для каталитиче-
ской активности которых необходим ион металла. Этот послед-
ний класс включает дипептидазы и экзопептидазы, такие, как
карбоксипептидаза и лейцинаминопептидаза. Ион металла уча-
ствует в стабилизации тетраэдрического промежуточного соеди-
нения (разд. 4.4.1).
Другой важный фермент — карбоангидраза, катализирующая
превращение диоксида углерода в бикарбонат-ион. Это цинкзави-
симый фермент, необходимый для проникновения СО2 в кровь
С02 + Н2О НСО^ + Н®
и последующего освобождения его в легких. По-видимому, коор-
динированный гидроксильный ион действует как нуклеофил при
О=С=0
ОН
I
Zn
His-93///1 "His-95
His-117
гидратации CO2, и предполагается, что подоб-
ная структуре льда упорядоченная структура
воды в активном центре способствует иониза-
ции [217].
Рентгеноструктурные исследования карбо-
ангидразы свидетельствуют о том, что активный
центр состоит из трех имидазольных лигандов,
которые искажают тетраэдрическую координа-
цию иона Zn(II). Среди предложенных молеку-
Zn связан с тремя
гистидиновыми ос-
лярных моделей следует отметить аналогичную
геометрию для производного трис-(имидазолил)-
татками метана. Бреслоу и сотр. [218] синтезировали
трис[4(5-имидазолил] карбинол (4-ТИК) и
трис [2-имидазолил] карбинол (2-ТИК) в качестве моделей цинк-
связывающего центра в карбоангидразе и щелочной фосфатазе.
НО соон
4-БИГ
Аналогично бис[4 (5)-имидазолил] гликолевая кислота (4-БИГ)
была синтезирована для имитации цинксвязывающего центра
карбоксипептидаз и термолизина.
Сравнение различных моделей ясно показало, что 4-ТИК ведет
М2+ себя как тридентатный лиганд, способный ис-
пользовать все три имидазольных кольца для
координации Zn(II), Со(II) или Ni(II).
Однако комплекс Со с 4-ТИК или 4-БИГ в
водном растворе, не содержащем основания, от-
личается по окраске от комплекса тетракоорди-
ОН
Комплекс металла с 4-ТИК (М— ионы Zn, Со или Ni),
Ионы металлов
345
нированного Со(П) [например, карбоангидразный или карбокси-
пептидазный комплекс Со (II)], для которого характерна голубая
окраска. Размер модельных молекул, по-видимому, настолько мал,
что более предпочтительно образование октаэдрических комплек-
сов. Следовательно, спектроскопические исследования и данные
по связыванию позволяют предполагать, что геометрия 4-ТИК не
совсем удачна для моделирования карбоангидразы. Можно наде-
яться, что какой-нибудь больший по размеру лиганд, похожий на
4-ТИК, будет лучше моделировать спектроскопическое поведение
карбоангидразы и ее необыкновенное сродство к Zn(II).
В этой главе остальное обсуждение посвящено карбоксипеп-
тидазе А. Это цинкзависимый фермент, который катализирует гид-
ролиз С-концевых аминокислотных остатков пептидов и белков,
а также гидролиз соответствующих эфиров; М — 34 600. Кар-
боксипептидаза А обладает специфичностью к ароматическим ами-
нокислотам в ь-конфигурации. Карбоксипептидаза А относится
к тем ферментам, для которых большая часть подробных сведений
о структуре получена с помощью рентгеноструктурного анализа
[219]. Единственный атом цинка расположен почти в центре моле-
кулы и координируется с His-69, Glu-72, His-196 и молекулой воды.
Рентгеноструктурный анализ также проведен в присутствии связан-
ного с активным центром субстрата Gly-Tyr. Основные особен-
ности способа связывания заключаются в том, что С-концевая
карбоксильная группа субстрата взаимодействует электростатиче-
ски с гуанидиновой группой Arg-145. Карбонильный кислород
амидной связи субстрата вытесняет молекулу воды, координиро-
ванную Zn(II). Кроме того, существует электростатическое взаи-
модействие между NH3- концевой группой субстрата и Glu-245.
При добавлении субстрата наиболее важно перемещение Туг-248
на '-—1,2 нм со своего первоначального положения, в результате
чего расстояние между OFI фенола и NH расщепляемой пептидной
связи станет на ~0,3 нм меньше. Это указывает на эффект инду-
цированного соответствия при образовании ферментсубстратного
комплекса (концепция предложена Кошландом).
346
Глава 6
Наконец, карбоксильная группа Glu-270, по-видимому, участвует
в катализе, действуя как нуклеофил, образующий ангидридное
промежуточное соединение:
-Rj
X CnH—СЩ 2+, П—Г'—о
—Zn2,»™O=C^ ХСООЭ /Zn I 1
7 7r’ ___, о +hn-ch/!
С°°е + 2N C4oos
Ч?^-27С 7^-270
"-К
*1
олгибрибное промежуточное
соебинение
12Н2О или пептиб
(ресинтез)
-~Zn21111111OH2 + R,—COO®
+ соое
'I^GIu-270
V
ч
Приведенный выше механизм включает две стадии и предпола
гает образование одного ангидридного промежуточного продукте
(ацилфермента). На первой стадии Zn(II) в ферменте электро
фильно активирует карбонил субстрата, облегчая нуклеофильную
атаку остатка глутаминовой кислоты. Уход алкоксигруппы (в слу-
чае эфирных субстратов) или аминогруппы ( в случае пептидных
субстратов) приводит к образованию ангидридной связи между
остатком глутаминовой кислоты фермента и образовавшейся при
расщеплении карбоксильной группой. На второй стадии гидролиз
этого ангидрида могут катализировать только ионы Zn(II) как
единственная оставшаяся каталитическая группа. Хотя при прове-
дении реакции в Н218О происходит включение 18О в карбоксильную
группу глутаминового остатка, предложенный механизм пока еще
не доказан, так как промежуточное ангидридное соединение ни-
когда еще не было зафиксировано с помощью реакции с нуклео-
филом, например с гидроксиламином.
Следовательно, можно усомниться в правильности этого меха-
низма. Для решения подобной проблемы следует ответить на сле-
дующие три главных вопроса, касающиеся механизма действия
карбоксипептидазы и металлоферментов в широком смысле.
1. Каким образом ионы металла влияют на гидролиз эфиров
и амидов?
2. При каких условиях соседняя карбоксильная группа уча-
ствует в гидролизе эфиров и амидов и каков механизм такого
участия?
3. Каково влияние иона металла на участие внутримолеку-
лярной карбоксильной группы в гидролизе эфиров и амидов?
Ионы металлов
347
Ответы на эти вопросы можно получить, изучая модельные си-
стемы. Уже получена значительная информация по первому и
второму вопросам; однако третий вопрос вызывает g
затруднения, связанные с поиском такой системы,
где возможно участие карбоксильной группы, с
(которой ион металла не связан.
Чтобы ответить на эти вопросы, Бреслоу и сотр.
предложили интересные системы, гораздо лучше
(моделирующие действие карбоксипептидазы [220,
221]- Они изучали гидролиз ангидридных мо-
делей в присутствии ионов Zn(II) и определили
константы скорости гидролиза псевдопервого
х = соон, н
порядка при pH 7,5 (табл. 6.1). Следовательно, в присутствии
Zn(II) скорость гидролиза падает в том же диапазоне pH, что и
Таблица 6.1. Константы скорости гидролиза ангидридных
модельных соединений при pH 7,5 в предположении реакции
псевдопервого порядка [220]
Модельная система ^набл' с %тн
Х = СООН -Zn(II) 2,7- 10~3 1.0
+ Zn(II) 3,0 103
Х = Н -Zn(II) 5,5-10-3 2,0
+ Zn(II) 1.5 5-102
шля карбоксипептидазы; в таком случае расщепление ангидридной
[связи может быть вполне возможной стадией при катализе этим
йерментом. Как и в случае карбоксипептидазы А, ион Zn(II)
о
о
координируется с двумя атомами азота и
[ одной карбоксильной группой. Исследова-
аНия расщепления ангидридной связи (X =
в ==СООН) гидроксиламином показали, что в
отсутствие Zn(II) гидроксиламин является
• эффективным нуклеофилом, способным атако-
• вать ангидридную группу, но атака не ката-
лизируется Zn(II). Напротив, характер зави-
| си мости скорости гидролиза от pH указывает
на то, что Zn(II) катализирует атаку ангид-
I рида ОН-ионом, а не молекулой воды, и что
(этот процесс гораздо быстрее, чем некатали-
I зируемая атака гидроксиламином. Следова-
тельно, связывание Zn(II) с ОН- (из Н2О) делает ион ОН- чрез-
вычайно эффективным нуклеофилом, с которым не может конкури-
• ровать даже такой хороший нуклеофил, как гидроксиламин. На-
Помним, что на первой стадии действия карбоксипептидазы Zn(II)
348
Глава б
катализирует образование ангидридной связи между Glu-270 и
субстратом, действуя как кислота Льюиса. Данная модель де-
монстрирует, что он может также катализировать и вторую ста-
дию, доставляя специфический нуклеофил к промежуточно обра-
зовавшейся ангидридной связи. Несмотря ни на что, предпола-
гаемый двухступенчатый механизм для карбоксипептидазы А оста-
ется наиболее удовлетворительным объяснением всех имеющихся
данных.
Вполне возможно, что ионы цинка и другие ионы в металле-
протеинах несут двойную функцию. Первая из них — ориентаци-
онный, или матричный, эффект, а вторая-—эффект концентриро-
вания (нуклеофила) на участке протекания реакции.
Основываясь на своих собственных исследованиях модельных
соединений, Бреслоу предложил второй механизм гидролиза пеп-
тидов карбоксипептидазой А, не включающий образования ацил-
ферментного промежуточного соединения [221, 222]. По существу,
в гидролизе пептидной связи участвуют ион цинка, карбоксильный
ион и гидроксильная группа тирозина. Zn(II) по-прежнему иг-
рает роль кислоты Льюиса, координируя карбонильный кислород,
а карбоксильная группа действует скорее как общее основание.
Это можно утверждать, поскольку в присутствии СН3ОН (вместо
воды) метанолиз пептидного субстрата не наблюдался из-за не-
благоприятной константы равновесия. Таким образом, фермент
не может включать метанол в переходное состояние (в реакции,
катализируемой в обоих направлениях) ни в случае эфирных, ни
в случае пептидных субстратов. Это означает, что для протекания
гидролиза необходимо удаление в переходном состоянии обоих
протонов молекулы воды.
Итак, согласно предположенному механизму, карбоксильная,
группа Glu-270 действует как общее основание, доставляющее
нуклеофил — молекулу воды — к карбонилу. В присутствии ме-
танола первая стадия протекала бы просто в обратном направле-
нии. Следовательно, только второе депротонирование может сдви-
нуть реакцию в прямом направлении, и этот перенос протона
должен происходить с участием гидроксильной группы Туг-248,
выступающей в качестве мостика между ОН~-группой и азотом
расщепляемой амидной связи. Этот механизм дает объяснение
упомянутому ранее эффекту «индуцированного соответствия».
Наконец, наиболее дискуссионный вопрос: что является цент-
ром связывания С-концевой карбоксильной группы субстрата:
Arg-145 или Zn(II)? Механизм Бреслоу допускает, что верно и то,
и другое [222]. Действительно, ион Zn(II) связывает карбоксиль-
ную группу гидролизованного продукта, которая становится суб-
стратом в обратной или в последующей реакции. Таким образом,
можно ожидать, что экзопептидазы имеют два различных центра
связывания, находящиеся на расстоянии, соответствующем одному
аминокислотному остатку в субстрате,
350
Глава 6
Из этих исследований механизма действия карбоксипепти-
дазы А можно сделать следующие два вывода: 1) Zn(II), по-види-
мому, связывается с карбонильной группой эфирных и амидных
субстратов и 2) Glu-270 — также участник процесса, причем пред-
полагается механизм как общего основного, так и нуклеофильного
катализа. Существует также строгое доказательство того, что для
эфиров и амидов механизмы различны. Следует обсудить также
другой возможный механизм действия карбоксипептидазы А,
включающий нуклеофильную атаку эфирной или амидной связи
субстрата гидроксильным ионом, координированным цинком(II)
Такая возможность тщательно изучена [223], в частности, на гид-
ролизе карбоксилзамещенного эфира 8-оксихинолилглутарата в
присутствии Zn(II).
Обширные кинетические исследования показали, что при
pH > 6 Zn(II) катализирует гидролиз эфира путем внутримоле-
кулярной атаки связанным с металлом гидроксильным ионом или
путем ускоряемой ионом металла атаки свободным гидроксилом.
Однако при pH < 6 стимулируемая ионом металла ОН_-атака,
хотя происходит со значительной скоростью, все же не может
конкурировать с внутримолекулярной атакой карбоксильным
ионом, приводящей к выделению связанного с ионом цинка 8-окси-
хинолина [223].
Что касается механизма действия карбоксипептидазы А, то
вопрос заключается в следующем: может ли соседняя карбоксиль-
ная группа (Glu-270), действуя как нуклеофил, конкурировать
с атакой гидроксилом, катализируемой ионом металла? Приве-
денная модель по-видимому, свидетельствует о том, что для эфир-
ных субстратов оба механизма могут иметь место при соответст-
вующих значениях pH.
Ионы металлов
351
В связи с этим главный вопрос относительно предполагаемого
ферментативного механизма действия карбоксипептидазы А состоит
в стерической возможности и способности карбоксильной группы
Glu-270 эффективно участвовать в нуклеофильной реакции. Фак-
тически доказательство ее участия сейчас уже получено в спект-
роскопических исследованиях при температурах <0°С (—60°С)
ковалентного ацилферментного промежуточного соединения, полу-
ченного при гидролизе субстрата О-(транс-л-хлорциннамоил)-
L-0-фениллактата карбоксипептидазой А [224]. Более того, резуль-
таты свидетельствуют о том, что деацилирование промежуточного
смешанного ангидрида катализируется связанной с цинком гид-
роксильной группой.
6.3. Гидролиз эфиров аминокислот, амидов и пептидов
Общеизвестно, что переходные металлы имеют d-орбитали, ко-
торые лишь частично заполнены электронами. В растворе поло-
жительно заряженные ионы этих металлов могут легко соеди-
няться с отрицательно заряженными ионами или другими неболь-
шими электронодонорными химическими группами, называемыми
\лигандами, с образованием сложных ионов. Геометрия комплекса
лиганд—металл зависит от природы иона металла. Комплекс мо-
жет иметь структуру тетраэдра, плоского квадрата, тригональной
бипирамиды или октаэдра. При обсуждении комплексов образо-
ванных ионами переходных металлов с лигандами, следует обра-
щать внимание, во-первых, на природу связи лиганд — металл и,
во-вторых, на геометрию образовавшегося комплекса. Именно эти
факторы влияют на стабильность ионных комплексов.
Во многих реакциях, катализируемых ионом металла, роль
металла гораздо значительнее, так как он может иметь более вы-
сокий заряд и довольно высокую концентрацию в водном растворе.
.Экспериментально установлено, что концентрация ионов металлов
в водных растворах может достигать 0,1 моль/л, в то время как
[Н+] в нейтральных условиях составляет только 10'7 моль/л. Кро-
Че того, процесс энергетически более выгоден, так как ион металла
образует с субстратом комплекс, который более устойчив, чем сво-
бодные его компоненты, поскольку AG образования комплекса и
AG* образования переходного состояния имеют более низкие зна-
чения.
Например, если молекула щавелевоуксусной кислоты связы-
вается с ионом Си (II), то легко происходит декарбоксилирование:
352
Глава 6
Ион металла может образовывать множество связей с субстратом
и оттягивать на себя их электронную плотность. Таким образом,
он ведет себя как сверхкислота. Более того, такие лиганды, как
СНзСОО- или ОН- (по сравнению с Н2О) способны увеличивать
электроположительный характер металла и повышать его эф-
фективность. к тому же, например, Fe(III) —более эффективный
катализатор, чем Fe(II), так как имеет добавочный положитель-
ный заряд.
Фермент благодаря своей жесткой трехмерной структуре об-
разует каталитический центр, в котором и осуществляется катали-
тическая реакция. В то же время небольшой по размеру пептид
имеет слабожесткую структуру и не обладает каталитическими
свойствами. Интересно, что если ион металла связан с пептидом,
то может происходить гидролиз амидной связи, аналогичный гид-
ролизу, наблюдаемому в присутствии гидролитических ферментов.
Таким образом, гидролиз амидов (и эфиров) подвержен катали-
тическому действию различных ионов металлов, поскольку «-ами-
ногруппа и кислород карбонильной группы — два хороших потен-
циальных лиганда при комплексообразовании. Другими словами,
координированные лиганды (пептид) приобретают удивительную
активность благодаря эффекту оттягивания электронной плотно-
сти положительно заряженными ионами металла.
Со (II) и Си(II) могут инициирвать гидролиз этиловых эфиров
глицина при pH 7—8, 25°С, т. е. в условиях, при которых послед-
ние обычно стабильны. Комплексообразование происходит между
ионом металла М2+ и эфиром аминокислоты с образованием пяти-
членного хелата. Затем, как результат координации иона металла
с аминной или эфирной группами аминокислоты, происходит уже
и каталитическая реакция. В любом случае ион металла может
увеличивать полярность карбонильной группы, вызывая тем са-
мым атаку ОН~. Скорость гидролиза увеличивается с возраста-
нием pH, что говорит об участии в механизме гидроксил-иона. С
термодинамической точки зрения гидролиз, по-видимому, проис-
ходит из-за того, что образующийся карбоксильный анион дает
R ,OEt R о
zR /СН-Ч илц усн-с;
м2+ + h2n- сн( «h2n; V H2NzZ OEt
соов \ Z \ /
GIy:R = H M2+ M2*
OH’
H2N
+ EtOH
R
H2N
<OH
ГН—C-rOEt
Ионы металлов
353
с катионом металла более прочную координационную связь, чем
исходный эфир.
Экспериментально установлено, что ионы металла не катали-
зируют гидролиз эфиров, если только молекула эфира не содер-
жит второй координационный центр помимо карбонильной груп-
пы, однако при гидролизе эфиров аминокислот такой каталити-
ческий эффект проявляется.
Рассуждая с термодинамических позиций, можно сказать, что
энергия переходного состояния комплекса металл — аминокислота
благодаря стабилизации зарядов значительно понижена по срав-
нению с энергией переходного состояния при гидролизе свободной
аминокислоты. Кроме того, на стадии катализа металлом состав-
ляющая AS*, связанная с перегруппировкой растворителя, по-ви-
димому, небольшая величина. Следовательно, важна именно мат-
ричная роль иона металла при связывании с субстратом. Ионы
металла ускоряют также гидролиз ряда амидов, но каталитиче-
ский эффект не столь велик, как для соответствующим образом
связанных эфиров. Причина этого — различия в природе уходящей
группы. Худшая уходящая группа, амидная, нарушает контроль
скорости реакции тетраэдрическим промежуточным соединением.
Рассмотрим несколько моделей. Скорость гидролиза эфирной группы в фе-
ниловом и салициловом эфирах пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты значительно
возрастает при комплексообразовании с ионами Ni(II) или Zn(II) [225].
В присутствии Ni(II) скорость гидролиза фенилового эфира увеличивается
в 9300 раз, а салицилового — в 3100 раз. В последнем случае скорость меньше,
по-видимому, из-за того, что два анионных центра кон-
курируют за связывание с катионом металла. Но ско-
рость реакции повышается почти вдвое, если вторая
карбоксильная группа ионизована. Это означает, что
карбоксильная группа проявляет слабые каталитические
свойства.
Комплекс пиридинкарбоксальдоксим — Zn (II) — ве-
ликолепный катализатор деацилирования 8-ацетоксихи-
нолин-5-сульфоната. Здесь опять важнейшую роль иг-
рает двойственная функция иона Zn(II) [226, 227].
Аналогично фосфорилированию 2-оксиметилфенант-
ролина с помощью АТР благоприятствует образование
комплекса с Zn(II).
Этот пример иллюстрирует каталитическое влияние
хелатированного иона металла. Металл оказывает на-
правляющее, или матричное, действие, как это видно
из одновременного связывания АТР и фенантролина. К тому же он выполняет
Функцию нейтрализации заряда, уменьшая электронное отталкивание между
12 Зак. 648
354
Глава 6
атакующей оксиметильной группой и фосфатом АТР. Естественно, что для фикса-
ции расщепляемой связи важна и природа металла. Комплекс также снижает
рКо спиртовой группы фенантролинового остатка до 7,5, так что ОН~-группа в
значительной степени ионизована в условиях эксперимента. Далее электронная
делокализация в системе ароматических колец при комплексообразовании с
ионом металла значительно увеличивает кислотность спиртовой группы.
Итак, можно сказать, что ион металла облегчает гидролиз или
нуклеофильное замещение какими-нибудь другими группами, в
сущности, двумя путями: прямой поляризацией субстрата, который
затем атакуется нуклеофилом извне, или генерацией (путем иони-
зации) особенно активного (основного) реагента. Таким образом,
одна из первостепенных функций иона металла в любой биоло-
гической системе состоит в обеспечении необходимой концентрации
сильного нуклеофила при биологически приемлемых значениях pH.
Ионы кобальта также могут проявлять интересные каталити-
ческие свойства при гидролизе эфиров и амидов. Например,
Со(Ш) гораздо более эффективен, чем Zn(II), при поляризации
карбоксильной группы пептидной связи. Однако было установлено,
что карбоксипептидаза А катализирует гидролиз бензоилглицил-
ь-фенилаланина в ~ 104 раз быстрее, чем это могло бы обеспе-
чивать присутствие Со(III). Следовательно, в случае фермента
должен проявляться дополнительный эффект.
Бекингэмом и сотр. [228, 229], а затем в лаборатории Австра-
лийского национального университета был получен ряд устойчи-
вых комплексов Со(III) с аминокислотами и пептидами, причем
Ионы металлов
355
в качестве лигандов обычно использовали этилендиамин и три-
этилендиамин. Здесь приведен пример с участием этилендиамино-
вого комплекса, причем реакция активируется с помощью Hg(II).
В присутствии комплексного ионного катализатора цис-р-гидроксоаквотри-
этилентетраминкобальта(Ш), сокращенно (Co(trien) (Н2О)ОН]2+, гидролиз пеп-
тидной связи в дипептиде L-аспартилглицине происходит, но только при продук-
тивном связывании.
[Co(irten)(H2O)OH]1+
комплекс
непродуктивное связывание
+
О
H,N—CH—Or-NH—CH—СООН
I
' сн2
СООН
L-Asp-Gly
сн—СН2—СООН
_____С^ + Gly
О
гидролизованный
дипептид
356
Глава 6
Первая скоростьлимнтирующая стадия включает замещение координирован,
иой молекулы воды концевой МН2-группой пептида. Затем оставшийся ОН-ли-
ганд действует как нуклеофил, инициирующий гидролиз. Такая внутримолеку-
лярная атака координированной водой или гидроксогруппой очень распростра-
нена в координационной химии.
Со(Ш)-триеновые системы удобны тем, что обмен и замещение воды в ко-
ординационной сфере иона металла — всегда очень медленный процесс (П/2 от
минут до часов), т. е. кинетические параметры можно легко оценить. Медленный
обмен лигандов в водном растворе позволяет использовать изотопную метку 18О
для прослеживания реакционного пути координированной молекулы воды или
гидроксогруппы и, таким образом, дает возможность различить прямой нуклео-
фильный и общий основной механизмы гидролиза. Однако помимо указанных
преимуществ у этих систем имеются и очевидные недостатки, если рассматри-
вать соответствие их (или отсутствие такового) ферментативным процессам. На-
пример, Со(Ш)-триеновые комплексы, инициирующие реакции, находятся в сте-
хиометрическом, а не каталитическом соотношении с продуктом гидролиза или
гидратации, который остается прочно связанным с находящимся в комплексе
металлом. По этой причине комплексы Со(III) не столь пригодны, как могли бы
быть, для моделирования ферментов. Тем не менее нз-за благоприятного пони-
жения AS* (А//* практически не меняется) при комплексообразовании с подхо-
дящими лигандами наблюдалось увеличение скорости в ~ I04 раз. Несмотря ни
на что, обсуждаемая здесь система все же неплохая модель, что обусловлено
способностью металлов поляризовать прилегающие молекулы субстрата и акти-
вировать координированные нуклеофильные группы.
Рассмотрим другой пример: гидролиз глицил-L-аспарагиновой кислоты в при-
сутствии [Co(trien) (Н2О)ОН]2+.‘Ситуация немного сложнее, чем в предыдущем
случае, так как можно представить себе существование трех структур:
NH'
СН—СООе
сн2—соое
6-2 '
6-3
Ионы металлов
357
Структура 6-1 предпочтительнее, как следует из данных ЯМР и изотопного
обмена протон — дейтрон, и гидролиз протекает с выходом ~20%. Опять-таки
о ионом кобальта связывается сначала N-конец, а затем карбонил амидной связи.
у-Карбоксильная группа аспарагиновой кислоты может участвовать в гидро-
лизе, способствуя стабилизации комплекса.
В общем для пептида, ие имеющего полярных боковых цепей, возможны два
механизма гидролиза металлсубстратным комплексом. Молекула воды извне ак-
тивирует карбонил амидной группы или прилегающая координированная ОН-
группа действует на амидную группу как нуклеофил. Этот процесс соответствует
внутримолекулярному гидролизу комплексом металл—лиганд. Другими словами,
процесс а включает промежуточную координацию карбонильной группы, а в про-
цессе б происходит атака карбонила координированным гидроксилом. За проте-
канием обоих процессов можно следить с помощью воды, обогащенной изото-
пом 18О.
[Co(HI)(trien)(H2O)OH]2 + + H2N CH—С—NH—CH—С— ПептиЗ
розовая окраска I I
Следовательно, в процессе а вода и гидроксил — два лиганда, замещаемые
концевой группой аминокислоты. В процессе б в роли сильного нуклеофила вы-
ступают координированные гидроксильная группа или молекула воды, располо-
жение которых благоприятно для атаки амидной связи путем образования тетра-
эдрического промежуточного соединения, за которой следует освобождение
пептида без последнего N-концевого аминокислотного остатка. Этот случай
358
Глава 6
особенно интересен, поскольку имеет место селективный гидролиз только N-koh-
цевой аминокислоты пептидной цепи. Результирующий комплекс Со(III) —амино-
кислота может быть разрушен в присутствии восстанавливающего агента. Сле-
дует помнить, что ион металла в данном гидролизе не истинный катализатор,
поскольку требует регенерации. Его роль сводится скорее к роли промотора гид-
ролитической реакции.
В присутствии таких Со(III)-комплексов скорость гидролиза
амидной связи увеличивается в 108 раз по сравнению со ско-
ростью щелочного гидролиза. Подобное ускорение реакций срав-
нимо со скоростями, полученными для карбоксипептидазы А и
ее субстратов. Отметим, что в процессе а, который, по-видимому,
предпочтительнее процесса б в случае иона Со(III), карбониль-
ная группа поляризуется и гораздо легче атакуется молекулой
воды извне, чем в отсутствие комплекса. Таким образом, ион
металла опять-таки играет роль сверхкислоты. Другими словами,
прямая поляризация карбонильной группы ионом металла соз-
дает более электрофильный центр на атоме углерода. Естест-
венно, различные ионы металла в этом отношении обладают раз-
личными свойствами, зависящими в основном от их общего
заряда, размера, координационного числа и легкости замещения
(обычно) координированной молекулы воды.
Эти данные были использованы для ступенчатого последова-
тельного гидролиза и анализа пептидов с N-конца, что сравнимо
с действием аминопептидазы. Для большинства аминокислот вы-
ход реакции гидролиза составляет 30—50% Для повышения вы-
хода предложен другой подход с использованием твердофазного
носителя. В щелочном буфере при 60°С только N-концевой оста-
ток остается связанным с твердофазным носителем, а остальные
непрореагировавшие вещества могут быть отмыты и использо-
ваны вновь [230].
Н
NH2
2
нЧ
nh2 ch—R
Q7l
tnenmufl
coo® Q \
со° cob®
он
(межмолекулярная
атака)
///// ///// 77"7‘>—«(внутримолекулярная
/ амберлит *''////// атака)
IRC-50 (катионит/Х/Лу
Ионы металлов
359
6.4. Железо и транспорт кислорода
Железо функционирует как основной переносчик электронов
в биологических реакциях окисления — восстановления [231].
Ионы железа, и Fe2+, и Fe3+, присутствуют в человеческом орга-
низме и, действуя как переносчики электронов, постоянно пере-
ходят из одного состояния окисления в другое. Это можно
проиллюстрировать на примере цитохромов *. Ионы железа так-
же служат для транспорта и хранения молекулярного кисло-
рода — функция, необходимая для жизнедеятельности всех поз-
воночных животных. В этой системе работает только Fe(II)
[Ре(Ш)-гемоглобин не участвует в переносе кислорода]. Чтобы
удовлетворить потребности метаболических процессов в кисло-
роде, большинство животных имеет жидкость, циркулирующую
по телу; эта жидкость и переносит кислород, поглощая его из
внешнего источника, в митохондрии тканей. Здесь он необходим
для дыхательной цепи, чтобы обеспечивать окислительное фос-
форилирование и производство АТР. Однако растворимость кис-
лорода в воде слишком низка для поддержания дыхания у жи-
вых существ. Поэтому в состав крови обычно входят белки,
которые обратимо связывают кислород. Эти белковые молекулы
способствуют проникновению кислорода в мышцы (ткани),
а также могут служить хранилищем кислорода.
Молекулярная структура кислородпереносящих белков удиви-
тельна; в процессе биологической эволюции природа создала
несколько типов молекул для переноса кислорода. Все они ярко
окрашены. Кислородпереносящие белки можно разделить на три
больших семейства: гемоглобин, хорошо знакомое красное веще-
ство в крови человека и многих других животных; гемоцианин,
голубой пигмент в крови многих моллюсков и членистоногих;
гемэритрин**, белок вишневого цвета в физиологических жидко-
стях организмов некоторых мелких беспозвоночных. Все они от-
носятся к металлопротеинам. Гемоглобины содержат железо
в составе гема; гемоцианины имеют в активных центрах два
атома меди (разд. 6.5), а гемэритрины — два атома железа. Ге-
моглобин — это красный белок красных кровяных телец, который
переносит кислород из легких к тканям; на долю гемоглобина
крови приходится примерно три четверти содержания железа
в человеческом теле [232].
Молекула гемоглобина построена как тетрамер из двух ана-
логичных глобинов (полипептидных цепей) неодинаковой длины.
В центре белка находится простетическая группа, образованная
* Цитохром — белок-переносчик электронов, который содержит простетиче-
скую группу — гем, ковалентно связанный с пептидной цепью.
** Общий префикс гем обязан не наличию гема (железопорфирина IX), ко-
торый имеется только в гемоглобине; он возник от греческого слова, обозна-
чающего «кровь».
860
Глава 6
порфириновым ядром. Ядро функционирует как тетрадентатный
лиганд для иона железа. Железопорфириновый комплекс назы-
вается гемгруппой. Ассоциат белковой молекулы с гемом назы-
вается гемопротеином.
Гемопротеины, встречающиеся повсеместно среди растений и
животных, выполняют по крайней мере четыре важные функции
в отношении кислорода и выработки энергии: 1) перенос кисло-
рода в тканях, 2) каталитическое окисление органических сое-
динений, 3) разложение пероксида водорода, 4) перенос элек-
тронов.
Гемоглобин обратимо связывает кислород, так что в условиях
повышенного парциального давления кислорода, которое суще-
ствует в легких, предпочтительна ассоциация кислорода с бел-
ком. Напротив, в тканях, которым необходим кислород, кисло-
родгемоглобиновый комплекс диссоциирует, и кислород переносит-
ся к другому кислородсвязывающему гемопротеину — миоглобину,
белковая часть которого состоит из одной полипептидной цепи.
Миоглобин содействует переносу кислорода крови в клетки мышц,
которые затем запасают кислород как источник энергии [233].
Следует учитывать, что способность обратимо связывать кислород — уни-
кальное свойство, обнаруженное в природе только у железопорфириновых, же-
лезосодержащих и медьсодержащих белков. Однако другие малые молекулы, та-
кие, как СО, СОг или CN~, также могут взаимодействовать с этими металлопро-
теинами. Например, СО связывается с гемоглобином даже еще активнее, чем
кислород, создавая дефицит кислорода в клетках (отравление угарным газом).
В обоих белках (гемоглобине и миоглобине) гем прочно свя-
зан с белковой частью (глобином) с помощью ~80 гидрофобных
взаимодействий и одной координационной связью между имид-
азольным кольцом так называемого «проксимального гистидина»
и атомом железа. Несмотря на многочисленные различия в их
аминокислотных последовательностях, миоглобин и гемоглобино-
вые субъединицы имеют сходную третичную структуру, включаю-
щую восемь спиральных участков. Гем вклинивается в щель
между двумя спиральными участками; кислород связывается по
одну сторону порфирина, в то время как гистидиновый остаток
координируется по другую. По-видимому, уникальное свойство ге-
моглобина связывать кислород зависит от структурных особен-
ностей всей молекулы гемоглобина или миоглобина.
В дезоксигемоглобине Fe(II) находится в высокоспиновом со-
стоянии и расположен вне плоскости порфиринового кольца. Од-
нако при связывании О2 Fe(II) переходит в низкоспиновое со-
стояние и возвращается в плоскость. Это, очевидно, приводит к
смещению проксимального имидазольного кольца на 0,06 нм, что
вызывает конформационные изменения в структуре' белка; в ре-
зультате сродство тетрамерной формы молекулы белка к
кислороду О2 становится выше. Это структурное изменение ле-
Ионы металлов
361
жит в основе молекулярной модели Перутца, объясняющей коопе-
ративность гемоглобина.
Действительно, к наиболее замечательному свойству гемогло-
бина относится его способность кооперативно связывать кисло-
род, т. е. сродство тетрамера к кислороду возрастает по мере
насыщения кислородом. Концепция аллостерии, выдвинутая Моно
и сотр., была создана в процессе изучения свойств этого белка.
Кооперативность необходима для переноса кислорода от носи-
теля гемоглобина к акцептору миоглобину, а также для выпол-
нения других физиологических функций.
Наконец, следует напомнить, что железо, связанное с порфи-
рином (гем), находится в ферросостоянии. Процесс связывания
кислорода гемоглобином обратим, причем молекула кислорода и
атом железа находятся в стехиометрическом соотношении 1 : 1 и
не происходит окисления Fe(II) до Fe(III). Исследованию такого
обратимого связывания молекулярного кислорода с Fe(II) в геме
уделено очень большое внимание. Способность гема обратимо
связывать кислород, проявляется при его включении в большую
белковую структуру. Однако если гем извлечь из белка и поме-
стить в раствор при комнатной температуре, молекулярный
кислород необратимо окисляет железо до феррисостояния
Fe(III).
Для выявления деталей механизма регулирования гемоглоби-
ном и миоглобином своего сродства к кислороду были предпри-
няты модельные исследования [237], при этом поставленные за-
дачи формулировались следующим образом: 1) Как предотвра-
тить окисление до Fe(III) во время физических исследований
гемоглобина, например при рентгеноструктурном анализе? 2) Ка-
кова детальная молекулярная геометрия гема и комплексов
гем — СО и гем — О2? 3) Каким образом сродство к кислороду и
скорость окисления контролируются в гемопротеине?
Показано, что органический комплекс железа поглощает (аб-
сорбирует) кислород из воздуха, включая в свою молекулярную
структуру только один атом кислорода [234]. Включение кисло-
рода происходит в процессе реакции трифенилфосфина с
(Ви4К)2{Ре2[52С2(СРз)2]4}-Рентгеноструктурный анализ показал,
что молекулярный кислород «проскальзывает» между ато-
мами железа и фосфора, давая окисленный аддукт
(Bu4N) {(С6Н5)зРОРе[52С2(СРз)2]2}- При получении этого комп-
лекса Эпштейн и Бернал, а также Бэлч обнаружили, что он бо-
лее устойчив, чем полученные ранее аналогичные комплексы ко-
бальта.
Естественно, что исследования были направлены в основном
на синтез комплексов, которые более точно моделировали гемо-
глобин и миоглобин, а также на создание кислородактивирующих
агентов вообще. В 1973 и 1974 гг. было создано несколько модель-
ных систем. Таким образом, ниже обсуждаются взаимодействия
362
Глава 6
молекулярного кислорода (двухатомного) и монооксида углерода
с металлопорфириновыми комплексами, моделирующими биологи-
чески важные гемопротеины.
Болдуин с сотр. [235] первыми синтезировали порфиринопо-
добную структуру, окружающую Fe(II), которая в растворе об-
ратимо связывает кислород. Однако связывание происходит
только при —85°С. Позже ими же предложен простой метод по-
лучения порфирина, молекула которого «перекрыта» и напоми-
нает клетку. Они надеялись, что при связывании О2 не будет
протекать необратимый процесс Fe(II)->Fe(III) и О2 будет обра-
тимо связываться с модельной молекулой при комнатной темпе-
ратуре [236].
С целью получения «перекрытых» порфиринов была изучена
прямая конденсация подходящих тетраальдегидов с пирролом-
Необходимый тетраальдегид получали из салицилового альдеги-
да и вводили в реакцию конденсации с пирролом (рис. 6.1).
Соответствующий «перекрытый» комплекс порфирин—Fe(III)
затем восстанавливался бисацетилацетонатом двухвалентного
хрома в бензоле до кристаллического ферропорфирина, который
обратимо связывается с кислородом в растворе при комнатной
Ионы металлов
363
температуре. Кинетическая устойчивость растворов, содержащих
этот кислородный комплекс, зависит от многих факторов, таких,
как температура, природа и координационная способность пор-
фирина и аксиального основания (1-метилимидазол значительно
превосходит в этом отношении пиридин), парциальное давление
кислорода и полярность растворителя.
Трейлор и сотр. [237—239] использовали другой подход. Они
ввели Fe(II) в модифицированное порфириновое кольцо, имею-
щее на конце определенным образом построенной боковой цепи
имидазольную группу, моделирующую проксимальные гистидино-
вые остатки в гемопротеинах. Такой искусственный активный
центр миоглобина имеет теперь проксимальный гистидиновый
остаток, ковалентно присоединенный к порфириновому ряду. Это
соединение было получено из природного хлорофилла а путем
ряда химических превращений (рис. 6.2). Имидазольная группа,
помещенная в стратегически важное место, способствует обра-
тимому связыванию кислорода (но только при —45°С) с синте-
тической молекулой (протогемом) примерно так же, как это де-
лает природная молекула. В СН2С12 при —45°С модель обнару-
живает почти такую же константу связывания с кислородом, что
и миоглобин кашалота при комнатной температуре. Этот резуль-
тат показывает, что белок не так уж важен для формирования
активного центра, как это считали ранее, хотя современные тео-
рии объясняют эффективное связывание кислорода с гемоглоби-
ном наличием каких-то благоприятных взаимодействий между че-
тырьмя субъединицами. Отметим, что эта ионная селективность
порфиринового кольца аналогична донорно-акцепторному узнава-
нию (гл. 5).
При замещении имидазольной группы на молекулу пиридина
соединение перестает связывать кислород, а железо в нем не
окисляется до трехвалентного состояния. Основность имидазоль-
ного кольца и его расположение относительно Fe(II) в составе
гема приводят к уникальной способности связывать кислород.
Это модельное соединение связывает СО гораздо сильнее, чем О2.
Способность данной модели эффективно связывать кислород проявляется
также в твердом замороженном состоянии и при растворении ее в полистироль-
ной пленке. Практически уже сейчас возможно получение синтетических активных
центров, которые можно встроить в полимерную пленку, чтобы обеспечить пере-
нос кислорода в искусственных легких. Естественно, что создание искусственных
легких может стать реальностью только с разработкой новых моделей, которые
будут более эффективно связывать кислород при комнатной температуре без
, окисления. До 1975 г. обратимое оксигенирование модельных комплексов, содер-
жащих гем, наблюдалось только при низких температурах или в нефизиологиче-
ских средах.
Близость порфириновой системы к определенным остаткам
пептидной цепи гемоглобина может стерически препятствовать
связыванию СО или О2 с Fe(II). Чтобы оценить влияние такого
стерического эффекта, Трейлор и сотр. разработали два варианта
Рис. 6.1. Синтез «перекрытого» порфирина, осуществленный Болдуином [236]. Воспроизведено с разрешения. © 1975 by the
American Chemical Society.
Рис. 6.1. Синтез «перекрытого» порфирина, осуществленный Болдуином [236]. Воспроизведено с разрешения. © 1975 by the
American Chemical Society.
366
Глава 6
пиропорфирин XV
Рис. 6.2. Синтез активного центра миоглобина по Трейлору [237].
только что рассмотренной модельной системы [240]. На рис. 6.3
приведена схема синтеза этих молекул, называемых циклофан-
порфиринами.
В этих двух новых, более сложных моделях гема боковая
цепь создает значительную стерическую затрудненность, так как
расстояние между антраценовым и порфириновым кольцами
равно <0,5 нм. В результате превращения антраценовой си-
стемы в систему типа «пагода» по реакции Дильса — Альдера
происходит дальнейшее ограничение пространства и сужение
«кармана». При добавлении 1-метилимидазола (в метиленхлори-
де) образуются модельные соединения с характерными для пен-
такоординационных комплексов спектрами в видимой области,
подобными спектрам «перекрытого» гема. Был получен также со-
ответствующий комплекс с СО; реакцию проводили в сухом бен-
золе. Структура этого комплекса отвечала монокарбонилу ге-
ма. Следовательно, антраценовое кольцо, расположенное над
порфирин типа „пагода"
антраценгемциклофан
Рис. 6.3. Синтез антраценгем[6,6]циклофана и порфирина типа «пагода» 1240].
368
Глава 6
порфириновым, сильно снижает сродство второй молекулы СО.
Связывание СО этим соединением уменьшается в 103 раз по
сравнению со связыванием хелатными гемами, не содержащими
пространственно-затрудненных групп. Наличие добавочного стери-
ческого фактора в молекуле типа «пагода» приводит к дальней-
шему уменьшению скорости ассоциации СО в 10 раз. Таким
образом, эти динамические модели показывают, что сильное
Рис. 6.4. Гемополнмер Бейера [241].
Воспроизведено с разрешения.© 1977
by Verlag Chemie GMBH.
щими общими с гемоглобином
уменьшение скорости связыва-
ния СО может быть приписано
пространственным препятствиям
в «кармане» синтетического ге-
ма [240.]
Бейер и сотр. [241] впервые
получили включенный в поли-
мерную сетку гем (рис. 6.4).
Исходными веществами служи-
ли полиэтиленгликольбисглици-
новый эфир и полиуретаны на
основе полиэтиленгликолей и ди-
изоцианатов. Гемополимер был
получен методом жидкофазного
пептидного синтеза *. К концу
синтеза железо оказывается в со-
стоянии Fe(III) и поэтому перед
оксигенированием должно быть
восстановлено дитионитом нат-
рия.
Полученное высокомолекуляр-
ное соединение обладало следую-
и миоглобином свойствами: а) хо-
рошей растворимостью в воде, необходимой для достижения
высокой концентрации О2; б) способностью благодаря наличию
функциональных групп мешать необратимому окислению кисло-
родного комплекса; в) служить моделью дистального имида-
зола.
Далее, путем модификации остатка пропионовой кислоты
в боковой цепи порфиринового кольца был введен второй имид-
азольный лиганд, соответствующий проксимальному гистидину
природных переносчиков кислорода. Интересно, что все структур-
ные элементы активного центра миоглобина или гемоглобина,
которые существенны для связывания кислорода, присутствуют
* Жидкофазный пептидный синтез похож на твердофазный метод (гл. 2)
тем, что синтез происходит на полимерном носителе (т. е. полиэтиленгликоле).
Однако полимер растворим в используемой системе растворителей, так что про-
текает гомогенная реакция. Этот метод не нашел столь широкого применения,
как аналогичный твердофазный синтез,
Ионы металлов
369
в этом соединении, хотя и в другом порядке [241]. В частности,
центр координации кислорода защищен как гистидином, так и
^синтетическим полимером. Кривая абсорбции кислорода для
^комплекса при 25°С хорошо согласуется с коэффициентами аб-
сорбции для миоглобина (0,2—1,2 мм рт. ст.). КР0Ме того, сиг-
моидный вид кривой говорит о кооперативности при связывании
•кислорода, как это имеет место в случае гемоглобина.
Следовательно, синтетический гемополимер проявляет свой-
ства, близкие к свойствам природных переносчиков кислорода,
несмотря на то что имеет совершенно иной полимерный остов.
ИЬ-го говорит о том, что специфичность и каталитическая актив-
ность отнюдь не «привилегии» природных полимеров. Такой вы-
1вод оказался возможным только в результате модельных иссле-
дований.
В биоорганическое моделирование кислородсвязывающих
центров в гемопротеинах значительный вклад сделали работы
Кольмана и сотр. [242, 243]. Согласно используемому в этих ра-
ботах подходу, предполагалась такая модификация пространст-
венной структуры порфирина, чтобы процесс окисления железа
был стерически затруднен и сведен к минимуму. Усилия были
направлены на создание порфиринового кольца с четырьмя объ-
емистыми о-пиваламидофенильными группами, расположенными
по одну сторону плоскости кольца. Другую сторону оставляли
веэкранированной в надежде, что она будет закрыта объемистой
(аксиальной имидазольной группой (рис. 6.5). Несмотря на то
что соединение хуже моделирует гемоглобин, чем сам протогем,
?оно все же предотвращает гем-гемовое сближение и образование
iFe—О—О—Fe [237]. Дольман назвал эту модель «огороженным»
|порфирином. Он действительно обратимо связывает кислород при
(комнатной температуре, и образующийся дикислородный комплекс
является кристаллическим. Эта модельная система обнаруживает
значительную кооперативность при связывании кислорода, но
только в твердом состоянии. При низком давлении О2 существует
•форма, обладающая низким сродством к О2, а при высоком дав-
лении О2 возникает форма с высоким сродством к О2. Такая спо-
собность проявлять высокое сродство при высоких значениях пар-
Циального давления О2 (как в легких) и низкое сродство при
низком давлении О2 (как в мышцах и других тканях) — важней-
, Шее условие эффективного транспорта О2. В этом отношении дан-
ная модель количественно имитирует гемоглобин [243].
При определении физических параметров связи кислород —- железо в мо-
тальном соединении обнаружено, что молекула кислорода связана с атомом же-
леза одним «концом» (модель Полинга), а не «боком», как это предполагается в
некоторых теориях (модель Гриффита). Действительно, способ связывания мо-
лекулярного кислорода в некоторых железосодержащих биологических молекулах
|Рставался предметом серьезных теоретических дискуссий в течение последние
Рис. 6.5. Модель «огороженного» железопорф ирина по Кольману [243]. Воспро
изведено с разрешения. © 1977 by the American Chemical Society.
Ионы металлов
371
gO лет. И только с помощью рентгеноструктурного анализа модели Кольмана
было получено доказательство предполагаемого Полингом (еще в 1948 г.!) спо-
соба связывания кислорода в гемоглобине. .
мойель Полингсь
I Дольфин и сотр. [244] разработали новый подход к созданию
молекулярных моделей, имитирующих обратимое связывание мо-
лекулярного кислорода гемом. Им удалось ввести рутений(II)
мезо тетрафенилпорфириновую и октаэтилпорфириновую систе-
мы. Они обнаружили, что эти порфириновые системы образуют
комплексы с двумя молекулами растворителя, но только одна
молекула кислорода связывается с рутением (при 25°С и 1 атм,
ГДМФА). В полярных апротонных растворителях наблюдалось об-
ратимое связывание СО и N2. Следовательно, эти новые системы
ведут себя аналогично соответствующим системам, содержащим
Fe(II), но процессы в них проходят при более приемлемых темпе-
ратурах.
1 Получены гемоглобины, содержащие цинк, марганец, медь и никель, и их
Свойства сопоставлены со свойствами природных железопротеинов. Однако эти
'искусственные системы не способны к обратимому связыванию кислорода. В то
.Же время кобальтзамещенные гемоглобин и миоглобин могут связывать кисло-
род, хотя их сродство к кислороду в 10—100 раз меньше, чем у природных пере-
Нэсчиков. Вообще, еще в 30-х гг. было известно, что некоторые синтезированные
Комплексы Со(II) обратимо связывают кислород. Кобальт — сосед железа по
[периодической системе элементов, и предполагалось, что оценив поведение ко-
бальтовых комплексов, можно будет расширить понимание поведения гемогло-
бина и других природных переносчиков кислорода, т. е. комплексы Со (II) рас-
сматривались как возможные модели гемоглобина и других природных перенос-
чиков Os. Еще одна причина внимания к комплексам кобальта заключается в
ом, что в литературе имеются достаточно подробные термодинамические данные
Для родственных кобальтсодержащих систем.
Синтезированная недавно модель кобальтзамещенного гемоглобина приве-
дена иа схеме 6.1 [245]. Длинная боковая цепь обеспечивает координацию пири-
Дннового кольца с центральным атомом кобальта. Комплекс Со(II) и этого так
Вызываемого «петлеобразного порфирина» обратимо реагирует с молекулярным
аслородом при низких температурах (от —30 до —60 °C), но боковая цепь лишь
* незначительной степени увеличивает сродство кислорода к таким модельным
Соединениям по сравнению с железопорфириновыми системами.
Кольман и сотр. исследовали связывание кислорода с «огороженными» ко-
»5альтпорфириновыми комплексами жзо-тетра- (а1а,а,а,-о-пиваламидофенил)пор-
соон
Ионы металлов
373
фиринаткобальт(П)-1-метилимидазола с 1,2-диметилимидазолом [246].
Схема 6.1.
В — основание, например N-мети-
лимидазол или 1,2-диметилимида-
зол; В' — положение, в котором
может связываться Оз.
I Интересно, что эти комплексы связывают кислород с тем же самым срод-
ством, что и кобальтзамещенные миоглобин и гемоглобин в твердом состоянии и
в виде раствора в толуоле. Более сложные модели можно получить синтезом
«огороженных» порфиринов с другими стерически затрудненными группами.
[ Несмотря на то что это и не имеет прямого отношения к транспорту железа
и кислорода, следует упомянуть также о получении синтетических биомиметиче-
ских моделей особого парного бактериохлорофилла а [247], поскольку в процессе
фотосинтеза при первичном поглощении света фотореакционными центрами мо-
лекулярных ассоциатов хлорофилла зеленых растений и фотосинтезирующих бак-
терий, по-видимому, происходит окисление особых парных молекул хлорофилла.
Димерные производные хлорофилла, изображенные на рис. 6.6, в которых пор-
фириновые макроциклы связаны простой ковалентной связью, проявляют некото-
рые фотохимические свойства, моделирующие in vivo особый парный хлорофилл.
М=2Н, Мдг+
Рис. 6.6. Биомиметическая модель парного бактериохлорофилла а [247]. Вос-
। произведено с разрешения. © 1978 by the American Chemical Society.
J Помимо железопорфириновых соединений существует большое
число не содержащих гем белков, участвующих во многих окисли-
®льно-восстановительных процессах. Они содержат относительно
^ного серы и железа, и поэтому получили еще название железо-
Серопротеины [248]. Эти соединения широко распространены в при-
роде, встречаясь во всех живых организмах, и их физиологиче-
ская функция заключается скорее в переносе электронов, чем в
374
Глава 6
катализе химических превращений. Это рубредоксины, адренодо-
ксины и ферредоксины.
Эти соединения — наиболее распространенные переносчики электронов в био.
логических системах; они прямо или косвенно участвуют во многих метаболиче.
ских реакциях, особенно в фотохимических процессах и фиксации СОг и N2 в
бактериях и растениях. Первый ферредоксин был выделен и очищен из Clostri-.
dium pasteurianum и шпината (1962 г.). Эта нефотосинтезирующая анаэробная
бактерия — одна из древнейших бактерий, существующая на Земле более
3,1 млрд. лет.
Наличие хромофорной группы Fe—S и относительно низкая
молекулярная масса (~ 6 000—12 000) делают эти белки удобным
объектом исследований. В то же время о механизме их действия
известно немногое. Они функционируют как сильные восстанав-
ливающие агенты.
Для них также характерно выделение H2S в кислых растворах (кислотола-
бильная сера). По-вндимому, примитивная восстановительная атмосфера, господ-
ствовавшая на стадии появления первых органических молекул на Земле, обязана
в значительной степени таким превращениям. Следовательно, исследования фер-
редоксина должны способствовать пониманию происхождения жизни на Земле.
Эти железосеропротеины, способные участвовать в окислитель-
но-восстановительных реакциях, содержат напоминающую по
расположению атомов «клетку» группу атомов железа и серы,
связанных с цистеиновыми остатками полипептидной цепи.
Группировка, напоминающая клетку, — предполагаемый активный центр ферред-
оксина.
Именно мостики металл — сера ответственны за биологические
свойства таких центров. Сера в качестве лиганда делает состоя-
ние Fe(II) очень неустойчивым, чем объясняются сильные восста-
навливающие свойства этих белков в различных биологических
процессах. Такие напоминающие клетку группировки ведут себя
как катализаторы одноэлектронного окисления — восстановления
Fe(II)4^Fe(III) (окислительно-восстановительные реакции прохо-
дят как бы внутри клетки).
В настоящее время известно лишь несколько синтетических
аналогов Fe—S-кластеров, и изучение их химических свойств на-
Ионы металлов
375
годится пока на стадии развития. Так, Холм [249] получил ряд
Синтетических аналогов с целью изучения активных центров неко-
торых железосеропротеинов и ферментов [355].
6.5. Ионы меди
। ДОелт, в состоянии окисления I и II выполняет важные биологи-
ческие функции. Она, по-видимому, стабилизирует стенки некото-
рых кровеносных сосудов, в том числе аорты, и оболочки спинного
мозга. Ионы меди участвуют в процессе выработки организмом
цветных пигментов кожи, волос и глаз, а также в синтезе in vivo
гемоглобина [232, 250].
I В определенных медьсодержащих белках как, например, в ци-
*охромоксидазе, медь, по-видимому, служит в основном для пере-
носа электронов; при этом не наблюдалось взаимодействия Си—О2.
Тем не менее очень важно, что многие медьсодержащие белки и
ферменты участвуют в реакциях, в которые так или иначе вовле-
чена молекула кислорода.
I Примером служит гемоцианин — переносчик кислорода в крови некоторых
морских животных, например моллюсков и ракообразных. Оксигенированный ге-
моцианин синего цвета, и поэтому цефалоподы (крабы и устрицы) — единствен-
ные представители животного царства, обладающие в буквальном смысле слова
олубой кровью. Гемоцианины — это гигантские молекулы (М > 106), которые
могут существовать в свободном состоянии в растворе.
| Действие как гемоцианина, так и тирозиназы — фермента, активирующего
молекулярный кислород при окислении тирозина, основано на прямом кова-
шентном взаимодействии Cu(I) и Ог, в результате которого образуется аддукт
юлекулярного кислорода. Гриб Gyroporus cyanescens, который при прикоснове-
нии тотчас синеет, также содержит медьсодержащий белок, или, как его еще
называют, «голубой», белок.
I В основном известны три типа медьсодержащих центров [251].
Первый — «голубая» медь — встречается в голубых переносящих
электроны белках, таких, как стеллацианин, пластоцианин и азу-
рин. Спектрофотометрическое обнаружение «голубой» меди очень
удобно для характеристики окружающих ее лигандов и установле-
ния типа координации. Существует также второй тип медьсодер-
жащих центров — «неголубая» медь, не детектируемая методом
В>ПР, третий тип медьсодержащих центров, по-видимому, содержит
Кару смежных атомов Си. Второй тип обычно находится в комби-
Иации с первым и третьим, но в галактозидазе представлен в чи-
Втом виде. Первый также сосуществует со вторым и третьим, на-
ример, в голубых оксидазах, лакказе, церулоплазмине и аскор-
Иатоксидазе. В частности, известно, что лакказа — это белок, со-
держащий четыре атома меди, связанные ковелентно с молекуляр-
ным кислородом.
I Аминокислотный анализ различных гемоцианинов свидетельст-
вует о том, что на одну пару атомов меди приходится большое
1нсло остатков гистидина и метионина, а также цистеина, хотя
376
Глава 6
число последних, участвующих в образовании дисульфидных мо-
стиков, не установлено. Из общих соображений можно предполо-
жить, что в состав этих белковых комплексов входит три типа
донорных атомов, а именно кислород (карбоксилат- и фенолят-
ионы и вода), азот (амин, амид-анион, имидазол) и сера (тиоэфир
и тиоанион). Далее, медь(П) может иметь квадратноплоскост-
ную, квадратнопирамидальную, тригональнобипирамидальную,
октаэдрическую и тетраэдрическую конфигурации заместителей.
До настоящего времени было создано несколько биомоделей
медьсодержащих белков, в которых структура и лигандное окру-
жение медных центров устанавливались с помощью электронных
спектров.
Руководствуясь высказанными выше соображениями, Босних
и сотр. исследовали набор лигандов [251]. Некоторые из них при-
ведены на рис. 6.7.
Этот обширный ряд лигандов и их комплексов с Си (II) был
получен в качестве спектроскопических моделей (наблюдаемых
Предполагаемая структура и координация лигандов «голубых» (Си-содержащих)
белков первого типа;
Предполагаемое окружение медного центра в оксигемоцианине; третий тип мед-
ных центров может иметь аналогичную молекулярную архитектуру.
в видимой и ближней ИК-областях) для установления геометри-
ческого расположения координационных групп вокруг атома меди
в белках. Исходя из полученных результатов, можно предполо-
жить следующее расположение лигандов в координационной обо-
Ряс. 6.7. Некоторые медьсодержащие биомодели [251]. Воспроизведено с разрешения. © 1977
by the American Chemical Society.
378
Глава 6
лочке медьсодержащих (голубых) белков первого типа, а также
структуру медьсодержащего центра в оксигемоцианине [251].
С той же целью установления геометрии активного центра и ме-
ханизма действия медьсодержащих белков были получены и ис-
следованы и другие модели [252].
выи оксимныи водород замещают
Рис. 6.8. «Огороженный» порфирии [253].
Воспроизведено с разрешения. © 1978 by
the American Chemical Society.
Чтобы ингибировать связывание второго атома меди и предот-
вратить возможные реакции переноса атома водорода, мостико-
BF2 путем обработки эфи-
ратом BF3 (в диоксане).
Комплекс Сц(1) реагирует
с монодентатным лигандом
(СО, 1-метилимидазол, аце-
тонитрил), давая пентакоор-
динационные аддукты. Ес-
тественно, что такая модель
не совсем точно имитирует
активные центры медьсодер-
жащих белков, но из нее
следует, что при обсужде-
нии строения Си (I)-содер-
жащих центров должна учи-
тываться возможность обра-
зования пентакоординаци-
онных структур.
Поскольку многие фер-
менты имеют два иона ме-
талла в своем активном
центре, здесь уместно упо-
мянуть о получении соеди-
нений, моделирующих диме-
таллические активные цент-
ры. В основе метода синтеза лежит идея «перекрытого» или «ого-
роженного» порфирина [253]. Приведенная на рис. 6.8 структура
модели включает тетрапиридиновую координационную оболочку,
присоединенную жесткими связями к тетрафепилпорфирину. Эта
оболочка, способная к значительной модификации, способствует
Ионы металлов
379
включению одинаковых или различных ионов металла в два раз-
личных координационных центра. На рис. 6.9 изображена эта
оболочка, где М и М' — ионы железа, меди или никеля. Взаимные
превращения структур повторяются, однако ион металла остается
в порфириновом ядре.
Рис. 6.9. Модель активного центра с двумя атомами металла, предложенная Бе-
жингэмом [253]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the American Chemi-
cal Society.
I Спектры ЭПР свидетельствуют о сильных взаимодействиях
между двумя металлическими центрами, и для бис-Си-системы
расстояние Си—Си оценивается в ~0,59 нм. Эта очень наглядная
интетическая модель, по-видимому, может быть значительно рас-
ширена.
' Разработаны также другие новые модели, включающие два
атома меди и основанные на макроциклических комплексах
[254, 255J. Был синтезирован следующий удлиненный макроци-
клический лиганд, который может связываться с двумя ионами
или Cu(I), или Си (II).
^Штрихованы области, занимаемые ионами меди. S — участок связывания суб-
•Ратов [254]. Воспроизведено с разрешения. © 1979 by the American Chemical
Society,
380
Глава 6
Возможно включение линейных двух- и трехатомных субстра-
тов, таких, как СО, NO, О? или N3- Ионы металла находятся
внутри макроциклического лиганда, причем каждый из них связан
с несколькими донорными группами NS2, а также с расположен-
ным в центре макроцикла субстратом (4 молекулы в случае N3).
Поскольку некоторые металлопротеины используют двухъядерные
металлические центры для осуществления каталитической функ-
ции, то данная модель имитирует медные пары третьего типа
в медьсодержащих ферментах. В двухъядерном Си(П)-комплексе
расстояние Си—Си оценивается в 0,52 нм. Интересно, что этот
комплекс обнаруживает антиферромагнетизм и является диа-
магнитным при комнатной температуре.
Известен и другой подход к этой проблеме [255], хотя отправные позиции
аналогичны вышеизложенным. Был синтезирован связанный имидазолидными мо-
стиками двухьядерный [2Си(П)] макроцикл циклического криптата (разд. 5.1.3).
В основе подхода лежит идея получения связанного имидазолидными мостиками
диметаллнческого центра, который будет препятствовать удалению друг от друга
двух ионов металла при разрушении мостиков. Это подразумевает синтез двухъ-
ядерных криптатных макроциклов, содержащих два атома Cu(II), в которых мо-
жет связываться субстрат, например имидазолид натрия.
макроцикл А
1) Си(М0Щ-ЗН2О
в сн,он
90%-ныйСН3ОН
3) NaCIO,/CH ,OH
ТЗ
[Cu2(ImH)2(Im)c= А]3®
К...Н
hn\7 -Nh с<
И <
NH
N.
Н
н
О
знак, используемый вля обозначения
комплексообразования с макроциклом А
синие листочки
с алмазной гранью
Рентгеноструктурный анализ показал, чю ион Cu2(Im)3+ включается в
циклическую криптатную полость путем связывания с двумя остатками диэтп-
лентриамина на каждом конце макроцикла. Далее, каждый ион Си(П) коорди-
нирует нейтральный имидазольный лиганд ImH, достигая полной пентакоорди-
нации. Синтез такого диметаллнческого комплекса дает возможность имитировать
4-Си(П)-форму суперокснддисмутазы из эритроцитов быка и открывает путь
к получению селективных корецепторов, а также к созданию бионеорганических
моделей металлопротеинов.
Ионы металлов
381
6.6. Кобальт и витамин Bi2
В природе ионы кобальта встречаются в степени окисления
II и III, однако наиболее важное биологическое соединение ко-
бальта— это витамин Bi2, или кобаламин, в котором присутствует
Со(П1) [256] (рис. 6.10). Кобаламин и близкие к нему вещества
выполняют разнообразные биологические функции, особенно это
касается бактерий. Он необходим для человеческого организма и,
вероятно, для большинства животных и растений. Важную роль он
играет в реакциях с участием остатков углеводов, жиров и бел-
ков для выработки in vivo. Пернициозная анемия — тяжелое забо-
левание, встречающееся у пожилых людей. Эта болезнь у млеко-
питающих обычно сопровождается повышенным выделением с мо-
чой метилмалоновой кислоты. В настоящее время эту болезнь ус-
пешно лечат инъекциями витамина Bi2.
Витамин В12 (цианокобаламин, R = CN) — одно из самых
сложных существующих в природе координационных соединений
и, конечно, самое сложное неполимерное соединение, найденное
в природе. В 50-х гг. Баркер продемонстрировал участие произ-
водного витамина Bi2 в следующей реакции:
глутаминовая кислота
глутамат-
мутаза
ноос
р-метиласпарагиноваяг кислота
Затем было установлено, что биохимически активной формой ко-
баламина является кофермент Bi2, содержащий аденозиновый
остаток, связанный через 5'-углерод ковалентной связью с цент-
ральным атомом кобальта витамина Bi2. Превращение витамина
Bi2 (цианокобаламина) в аденозил-В12 (кофермент), по-видимому,
включает замещение СЫ_-группы аденозильной группой АТР. Од-
нако было установлено, что ферментативный путь такого превра-
щения достаточно сложен.
Одно из удивительных свойств Bi2 состоит в способности обра-
зовывать алкильные производные [256]. До открытия Баркером
[Витамина Bi2 считалось, что связь Со — Со должна быть непроч-
ной, если вообще существует. Это первый и единственный пример
остойчивого в воде природного металлорганического соединения.
►Его полная структура установлена в 1956 г. на основании кристал-
лографических работ Ходжкин и более ранних химических иссле-
дований Тодда и Джонсона. Полный синтез этого соединения осу-
ществлен в начале 70-х гг. общими усилиями Вудворда и Эшен-
' Мозера.
Центральная часть молекулы напоминает железопорфирино-
вую систему; кольцо называемое коррином, содержит два (из
382
Глава 6
четырех) модифицированных пиррольных кольца, связанных непо-
средственно (Ci — С19-связью). Все боковые цепи состоят из аце-
тамидных и/или пропионамидных групп. Одна из них связана с
изопропанолфосфатным остатком, присоединенным к рибозе, и,
наконец, через диметилбензимидазольное кольцо с Со (III) *.
Интересно, что ион кобальта может иметь степень окисления +l(Bis«),
+2(В12г) или -ЬЗ(В12а). Действительно, одно из поразительных свойств алкилко-
баламинов состоит в том, что возможны три пути расщепления Со—С-связи:
R—Со(Ш) —> R--bCo(II)
R—Co(III) —> R®+Co(I)
R—Co(III) —> Re + Co(III)
(называется В12г-формой)
(называется В125-формой)
(называется В120-формой)
Форма BI2S — мощный нуклеофил (а также восстановитель); кофермент Bi2,
по-видимому, образуется из нее в результате нуклеофильной атаки АТР. В при-
сутствии диазометана форма B12s превращается в метилкобаламин (R=CHs,
рис. 6.10). Следовательно, при химических превращениях В12 могут образовы-
ваться и карбокатион, и карбанион. И в бактериях, и в печени наиболее рас-
пространенная форма витамина В12 —б'-дезоксиаденозилкофермент, правда, в
меньших количествах присутствует также и метилкобаламин.
Перегруппировка Баркера, описанная выше, с использованием
кофермента В12-зависимого фермента глутаматмутазы — удиви-
* Найдены природные аналоги витамина В12, в которых бензимидазольное
кольцо замещено пуринами (аденином, гуанином и т. д.).
Ионы металлов
383
+ rs2 + нго
o|Qp3h2C “ основание
но он
н|—Ан
+ r с SH )г —
леи г 0 основание
°юрзнгс
(6-1)
(6-2)
(6-3)
(6-4)
(6-5)
((6-6)
5(6-7)
(6-8)
(6-9)
(6-10)
Рис. 6.11. Десять различных реакций, для протекания которых необходим ко-
фермент В12.
тельная реакция. До недавнего времени не было известно анало-
гичной химической реакции. Фактически расшифровка структуры
коферментной формы витамина Bi2 не помогла формированию
более четкого представления о механизме. Помимо этого прев-
ращения известно еще девять различных ферментативных реак-
ций, требующих участия кофермента Bi2 в качестве кофактора
(рис. 6.11). Большинство из них беспрецедентно и не имеет ана-
логов в классической органической химии. При выборе производ-
ных витамина В(2 в качестве коферментов ферменты, по-видимому,
Достигают вершины химической «утонченности», которую трудно
смоделировать химику.
Интересно, что все упомянутые реакции могут быть сведены
к миграции водорода от одного атома углерода к соседнему с
384
Глава 6
сопутствующей миграцией группы X от последнего к первому:
Н* Н
II II
—С,—С2—Y —С|~С2—У
। 1 । 1
X Н Н* X
Эта уникальная перегруппировка углеродного скелета была
довольно подробно изучена для большинства В12-зависимых фер-
ментов. Естественно, решающий вопрос, касающийся механизма,
заключается в следующем: каким образом происходит 1,2-мигра
ция? Прежде чем детально рассматривать механизм, остановимся
на некоторых фактах.
В результате наблюдений установлено, что для метилмалонил-СоА [реакция
(6-2)] группа X (—COSCoA) перемещается внутримолекулярно, причем водород-
ные атомы не обмениваются с водой (растворитель) во время процесса. То же
самое наблюдается при дегидратации пропандиола [реакция (6-4] и превраще-
нии глутаминовой кислоты в метнласпарагиновую кислоту [реакция (6-1)]. Од-
нако в двух последних случаях происходит обращение конфигурации у атома
углерода, к которому мигрирует водород. Но в случае метилмалонил-СоА атом
водорода, который мигрирует от метильной группы к положению С-3 сукци-
нил-СоА, занимает пространственное положение, которое ранее было занято груп-
пой — COSCoA. Миграция происходит с сохранением конфигурации. В этом
СО—S—СоА н* со—S—СоА
I /Н* N
ноос—с—с^-н* —> ноос—с—сн2
I н- <6-10
прохиральный центр
(сохранение конфигурации)
ноос н
сн2—с—сн
юоо.®
И*
‘NH3®
СООН
I соое
сн2—с—сн;
I /I XNH,® С642)
(обращение конфигурации у этого центра.
H
н
.он
сн3—с—сн'
I он
н*
сн3—с—сно
У\
/ н*
прохиральный центр
(обращение конфигурации)
(6-13)
последнем случае было показано, что мигрирующий атом водорода не обмени-
вается с растворителем, но обменивается с аналогичными атомами водорода в
других молекулах субстрата. Следовательно, и окисление, и восстановление осу-
ществляются одним и тем же соединением, но процесс протекает, по-видимому,
Ионы металлов
385
не только внутримолекулярно.
СН3—CH—cd2 —-
I I
но он
ЛЭ ЛЭ ЛЭ
— СНз-СН2-С^ ,СНз-СН-< ,СНз-СН-(Г (6-14)
d н ь °
Т Т Z’
СНз—с—с—ОН + сн2—СН2 -—> CHj—G. + СНз—сн2—Сх
1111 Т т
но т но он „
Таким образом, стереохимические превращения, осуществляе-
мые В(2-зависимыми ферментами, весьма привлекательны для хи-
миков как объект исследования [256] Например, фермент про-
пандиолдегидраза катализирует также дегидратацию дейтериро-
ванных аналогов 1,2-пропандиола [реакции (6-16) и (6-17)].
Миграция атома дейтерия наблюдается только для одного изомера.
Эти начальные эксперименты показали, что дегидратация проте-
кает путем 1,2-миграции.
(6-16)
Н мигрирует с образованием
[1-гН] пропионового альЭегиВа
н он
V \ лэн
'ЛХ
H D
(1К,25)-[1-2н] ТфопанВиол
(6-17)
(1«,2«)-изомер 2Н мигрирует с образованием
[2-4IJ пропионового альЭегиВа,
с ЙЗ'-конфигурацией
Аригони и сотр. [257] использовали в качестве субстрата 25- и
2/?-1-[18О] пропандиол-1,2, чтобы получить еще одно изящное до-
казательство 1,2-миграции ОН от С-2 к С-1, (для водорода от С-1
к С-2). Более интересно наблюдение Абелеса, что водород у С-5'
кофермента также замещается тритием, когда в качестве субстрата
используют [1-3Н]пропандиол-1,2, и тритий может затем перено-
ситься к продукту. При этом предполагается, что три неэквива-
лентных атома водорода 5'-дезоксиаденозинового остатка характе-
ризуются совершенно одинаковой вероятностью переноса обратно
к субстрату. Следовательно, фермент не делает различий между
Двумя прохиральными атомами водорода у С-5'. Это говорит о том,
что роль кофермента Bi2 сводится в основном к роли переносчика.
13 Зак. 549
386
Глава 6
Очевидное отсутствие стереоселективпости означает, что расщепле-
ние кобальт-углеродной связи происходит гомолитически (см.
ниже).
На основании имеющихся экспериментальных данных можно
предположить, что на начальной стадии некоторых катализируе-
мых коферментом В12 перегруппировок должно существовать свя-
занное с коферментом промежуточное соединение, например для
этиленгликоля в качестве субстрата:
сн2—сн2 +
ch2r
носн—СН2ОН
г-I---7 + СНз—R
но он [J
корин-система,
или биомоЭелирующий
аналог, (R=a<JeHoiuo)
/ прочно связан
с апоферментом
I и не обменивается
t с растворителем
+ CHjCHO
Подробный механизм этого ‘ интересного биохимического превращения уста-
новлен в основном в работах [256—262, 264]. Для упрощения были использованы
различные биомодели корин-системы (рис. 6.12). Наиболее широкое применение
нашел комплекс бис-(диметилглиоксимато) — Со (кобалоксим), который обла-
дает многими свойствами корин-кольца.
Если кобалоксим координируется с подходящей основной группой (В) в од-
ном из аксиальных положений, то его поведение во многом напоминает витамин
В12. Восстановленный кобалоксим [Со(П)] реагирует с галогеналкилами с об-
разованием алкилкобалоксима, аналогичного по многим свойствам и химической
активности коферментной форме витамина В12.
Как показано ранее, расщепление связи Со—С кофермента
В12 — необходимая стадия в каталитическом цикле. Есть основа-
ние предполагать, что расщепление происходит гомолитически и
в результате образуется В12г-радикал [Со(Н) -содержащие струк-
туры и С-5'-метиленовый радикал дезоксиаденозина]. Для хими-
чески родственных кобалоксимов это расщепление может быть
также индуцировано не ферментативным путем, а термическим или
фотохимическим.
Гомолитическое расщепление приводит к образованию актив-
ного промежуточного соединения, которое может отрывать атом
водорода от субстрата, давая СНз—С-5'-аденозильное промежуточ-
Ионы металлов
387
Рис. 6.12 Некоторые биомодели корин-системы [259]. Воспроизведено с разре-
шения. © 1976 by Verlag Chemie GMBH.
ное соединение (СН3—R) и радикал субстрата:
Присоединение этого радикала к структурам типа Bi 2г создает
новый алкилкобаламин, в котором лигандом является субстрат.
При этом осуществляется переалкилирование атома кобальта.
Каким образом связь Со—С активируется для гомолитического
расщепления? Предполагается, что присутствие и надлежащая ори-
ентация пропионамидных боковых цепей в корин-кольце облегчает
18*
388
Глава б
работу ферментативной системы, возможно, путем некоторого
нарушения корин-системы [269]. Данная гипотеза * подтверждает-
ся тем, что гидролиз боковой цепи до соответствующей аминокис-
лоты приводит к образованию неактивной молекулы кофермента
В12. Непонятно, почему природа пошла по пути гомолитического
разрыва. Этот случай уникален в химии коферментов!
Теперь о самом важном. Каким образом происходит перегруп-
пировка?
Поскольку уходящей группой должна быть гидроксильная
группа ОН-, то можно представить себе три предельные электрон-
ные структуры:
/а
СН2. „ /ОН
' сн
Со3 +
первичный
кармниетый ион
f
I I
Со
Белокилизованный
карБониевый ион
ОН
f О. /
снл— сн
\’®7
Со
тг-комплекс
Модельные исследования показали, что сольволиз 13С-меченого
2-ацетоксиэтилпиридинкобалоксима в метаноле дает равные коли-
чества двух 13С-меченых продуктов.
* Согласно частному сообщению (N. Т. Anh, Orsay, France), с помощью
реитгеноструктурного анализа кофермента В)2 установлено, что угол связи Со—
—СН2—СН в метилен-б'-аденозильном остатке необычайно велик. Такой необыч-
ной гибридизацией этого углерода можно объяснить легкость разрыва связи Со—С.
Ионы металлов
389
Это наводит на мысль, что простейший путь перегруппировки —
образование промежуточного л-комплекса. Следовательно,
енольный
интермеЭиат
Эиольный
интермеЭиат
Поскольку гидроксильная группа а-углерода стабилизирует
образующийся положительный заряд, то нуклеофил (НгО или
ОН-) скорее всего будет атаковать это положение, создавая новый
о-комплекс иона кобальта с 0-углеродом субстрата.
Подводя итоги, можно предположить следующую последова-
тельность событий: уход 0-заместителя из о-комплекса кобальта,
затем образование л-комплекса и, наконец, присоединение уходя-
щей группы к л-комплексу с образованием нового о-комплекса
с субстратом.
Процесс завершается вторым переалкилированием, которое ре-
генерирует исходный кофермент Bi2 и дегидратированный продукт.
сн2—сно ch2r ch2r
+ кофермент В1г_
' сн3—СНО
Следовательно, важнейший промежуточный продукт в химии
кофермента Bi2 — л-комплекс Со(III)—олефин. Образование этого
интермедиата химически обосновано, так как енол является элек-
тронообогащенным компонентом, а металл (трехвалентный Со) —
электронодефицитным.
Аналогичные этому процессы обнаружены при гетерогенной
полимеризации олефинов (разд. 4.1), где хорошо доказано сущест-
вование о-л-комплекса между металлом (Т1С13) и двойной связью.
Еще одно доказательство о-л-перегруппировки в модельной
системе кобалоксима получено с помощью электронообогащенных
олефинов, таких, как виниловые эфиры [261, 262]. Как и ожида-
лось, атака л-комплекса нуклеофилом происходит по наиболее по-
ложительному углероду (рис. 6.13).
390
Глава 6
он
СН2СНСН20Н
NaIO4^o0K NHj
1. NaBH4
2. С1СН2СНСН2ОН
ОН
95^-w«EtOH
Рис. 6.13. Четыре различных пути синтеза формилметилкобаламина [263]. Вос-
произведено с разрешения. © 1974 by American Chemical Society.
Согласно этой схеме, образование формилметилкобаламина,
промежуточного соединения при ферментативном превращении
этиленгликоля в ацетальдегид, может происходить четырьмя раз-
личными путями.
Для более сложных систем, таких, как превращение р-метил-
аспартата в глутамат [реакция (6-18)] и метилмалонил-СоА
в сукцинил-СоА [реакция (6-19)], было доказано, что мигрирует
самая большая группа:
(6-20)
Ионы металлов
391
В первом случае миграция происходит с обращением конфигу-
рации, в то время как во втором случае — с сохранением конфигу-
рации.
Для системы превращения метилитаконата в а-метиленглутарат
[реакция (6-20)] предложена интересная модель с целью демон-
страции миграции акрилатного фрагмента в процессе перегруппи-
ровки углеродного скелета, приводящей к образованию а-метилен-
глутаровой кислоты [264].
Модельное промежуточное соединение кофермента синтезиро-
вано в результате реакции витамина Bi2s[Co(I)] с бис-(тетр агид-
ропиранил)бромметилитаконатом. При выдерживании в водном
растворе модельное соединение образует перегруппированную
сс-метиленглутаровую кислоту наряду с неперегруппированной
метилитаконовой кислотой и бутадиен-2,3-дикарбоновой кислотой.
^СОО(ТГП) ^хСОО(ТГП)
(СН2; СОО(ТГП) Вш (СН2;'СОО(ТГ’П)
Вг
ТГП -тетрагидролиранил
Zn/Acoo
соон
соон
СООН
СООН
*И,0
И* с, в темноте
отмос<р.Ка, 300ч,pH 5-9
а-метиленглутаровая кислота
(перегруппированный продукт)
(25%)
бутадиен-2,3-
Эикардоновая
1 кислота
(50%)
(нелерегрулпированный
продукт)
(25%)
Сппи использован
идентификации
перегруппированного
_хСООН продукта
Вг
Поскольку модельная реакция не отводит никакой роли дезо-
ксиаденозину, а его 5'-метиленовая группа осуществляет перенос во-
дорода во всех кофермент-В12-зависимых миграциях углеродных ато-
мов, то важно установить источник вводимого в продукт водорода.
392
Глава 6
Это осуществляли проведением реакции в 2Н2О и анализом про-
дуктов методами ЯМР и масс-спектрометрии. И перегруппиро-
ванные, и неперегруппированные продукты содержали дейтерий,
а бутадиен-2,3-дикарбоновая кислота не содержала. Местонахож-
дение метки было затем определено восстановлением исходного
вещества цинком в АсО2Н.
Таким образом, с помощью этих экспериментов установлено,
что связь С—Со в модельных системах гидролизуется путем пере-
носа протона из водного раствора. Следует напомнить, что в соот-
ветствующем ферментативном процессе при перегруппировке
водородный обмен с водой не происходит из-за присутствия
5'-дезоксиаденозинового остатка. Однако если предположить, что
положение дейтерия указывает на местонахождение кобальта до
гидролиза, то наличие дейтерия исключительно у у-углеродного
атома в этом модельном соединении означает, что мигрирующей
группой в реакции перегруппировки должен быть остаток акрило-
вой кислоты [264].
Таким образом, на основании полученных результатов следует
ожидать, что в процессе катализируемой ферментом перегруппи-
ровки мигрирует более сложная группа.
Остается выяснить, действительно ли реализуется этот меха-
низм в природном ферменте. Салем и сотр. [265] предположили,
что в перегруппировках кофермента В12 преимущественно мигри-
рует более электроотрицательная группа, что согласуется
с изложенным выше [264].
Известно также, что малоновый эфир, замещенный в [3-положе-
нии кобальтом, может перегруппировываться в соответствующий
сукциновый эфир. Чтобы изучить возможную роль металла и
дучше смоделировать ферментативный процесс, синтезировали
[266] следующий кобальтсодержащий комплекс, в котором «суб-
страт» ковалентно прикреплен двумя метиленовыми мостиками
к плоскому кобалоксиму:
Облучение метанольного раствора этого комплекса и последующая
обработка кислотой привели к продукту перегруппировки с хоро-
Ионы металлов
393
щим выходом. Это наблюдение дает веские основания предпола-
гать, что гомолитическая перегруппировка связанного субстрата
в продукт инициируется атомом кобальта.
Описанные всесторонние модельные исследования биохимиче-
ских реакций, катализируемых коферментом В12, позволяют сде-
лать следующие выводы. Во-первых, кофермент B[2 внедряется
в неактивированную связь С—Н субстрата. В результате адено-
зильная группа кофермента теперь несет атом водорода субстрата,
а метиленовая группа субстрата (в случае превращения метил-
малонил-СоА в сукцинил-СоА) оказывается связанной с кобальтом
кофермента В12 взамен первоначальной связи Со—С в адено-
3ИЛ-В12. Во-вторых, перегруппировка происходит внутри молекулы
кофермент-В^-субстрата с образованием кофермент-В12-продукта.
Наконец, происходит реакция, эквивалентная обратной первой
реакции, в процессе которой снова образуется аденозил-кобальто-
вая связь кофермента Bi2 и освобождается продукт реакции, несу-
щий один из атомов водорода.
Бреслоу и Кханна исследовали [267] различные системы, которые в общих
чертах моделируют гомологический распад В12-систем, и обнаружили простые хи-
мические превращения, которые достаточно надежно подтверждают наличие ста-
дии с внедрением по неактивированному атому углерода. Они получили дифенил-
кобалоксимное соединение, которое при облучении генерирует ожидаемый бен-
зильный радикал.
Однако образовавшийся радикал димеризовался без переноса водорода от со-
седней метильной группы. Тогда внимание было обращено к циклододецильному
радикалу — системе, в которой внутримолекулярный перенос водорода к угле-
роду свободного радикала уже был продемонстрирован. В качестве маркера опять
использовался дейтерий.
Поскольку Bi 2s [Со(1)] —мощный нуклеофил, он быстро реагирует с алки-
лиодидом, давая циклододецилкобаламин. При бромировании он образует цик-
лододецилбромид с дейтериевой меткой, распределенной по нескольким углерод-
ным атомам в кольце.
Таким образом, происходит трансаннулярный перенос водорода вдоль всего
остова молекулы. Поскольку реакцию циклододецилиодида с В12 действительно
нельзя рассматривать как простое замещение у атома углерода (она включает
также трансаннулярный перенос водорода путем гомолитической фрагментации),
то в данном случае мы имеем хороший химический аналог реакций внедрения^
общих для всех процессов, катализируемых коферментом Bi2 [267].
394
Глава 6
Однако убедительного прямого доказательства образования
промежуточных углеродных радикалов при химических превраще-
ниях кофермента В12 в природе все еще нет. По этой причине Кори
предложил другой интересный механизм, согласующийся с совре-
менными представлениями о металлорганических реакциях [268].
Главная особенность этого механизма — электроциклическое рас-
крытие корин-кольца кофермента, расщепление единственной ко-
валентной связи, соединяющей кольца А и D (рис. 6.10), что, таким
образом, объясняет роль боковой цепи корин-системы. Кори счи-
тает, что созданная природой такая ковалентная связь в корин-
системе вовсе не случайна. Наиболее вероятное гипотетическое
объяснение происходящей перегруппировки включает образование
кобальт-карбенового комплекса с субстратом.
Подробное изложение и обсуждение этого интересного предпо-
ложения выходит за рамки данной книги, однако следует заметить,
что если это действительно так, то надо заново переосмыслить су-
ществование зт-комплекса Со при перегруппировках кофермента Вi2.
Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента В)2, достаточно
сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В ^-зависимых
ферментов или В|2-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, об-
ладающих сродством к витамину Bi2. Фактически для очистки ферментов или
белков аффинная хроматография широко используется как один из наиболее
привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза
нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель исполь-
зован для очистки N-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеинкобаламинметилтранс-
феразы из Е. coli.
Здесь метиониисинтетаза (апофермент *) связывается с сорбентом и может
быть получен в виде холофермента путем элюирования после расщепления угле-
* Согласно классической терминологии, полный комплекс фермент — кофак-
тор называется холоферментом, а белковый компонент без кофактора — апофер-
ментом. Апофермент обычно каталитически неактивен-
Ионы металлов
395
Рис. 6.14. Получение нерастворимого носителя кобаламинсефарозы для очистки
Bij-зависимых ферментов с помощью аффинной хроматографии [270].
род-кобальтовой связи световым облучением:
До настоящего времени аффинный сорбент не использовали повторно, но
К если разработать метод элюирования белка без фотолиза, так чтобы сорбент
можно было снова использовать, то это откроет путь широкому применению
этому адсорбционному методу для очистки В^-зависимых ферментов.
Наконец, из-за все возрастающего ртутного загрязнения окружающей среды
Д следует сказать несколько слов о метилировании ртути и связи этого процесса
с функционированием витамина В|2. Вуд [271] одним из первых детально изу-
I чил механизм метилирования ртути. Его исследования показали, что биосинтез
[ метилртути может происходить в анаэробных условиях. Тот факт, что ртуть мо-
жет алкилироваться с образованием иона метилртути в природных системах,
I определяет серьезность проблемы ртутного загрязнения. Ион ртути — чрезвы-
I чайно сильный акцептор метильной группы, и его монометильное производное
[ устойчиво в водном растворе. Ион метилртути может затем поглощаться в вод-
!ir ных растворах одноклеточными организмами, включаясь таким образом в вод-
I ную пищевую цепь. Концентрация ртути возрастает вдоль цепи, достигая высо-
котоксичных уровней в рыбе, и сильнее всего воздействует на виды, питающиеся
рыбой. Вуд сделал вывод, что ферментативные системы, содержащие В12, должны
№ быть способны к синтезу метилртути в биологических системах путем перемети-
Р лирования. Это означает перенос метильной группы от одного субстрата к дру-
ж [ тому, который является компонентом биохимической реакции. Такой процесс на-
| зывается также биологическим метилированием. В природе существуют три глав-
I иых кофермента, осуществляющих такие реакции переноса метильной группы в
1 биологической системе: S-аденознлметионин, производные N-5-метилтетрагидро-
I фолата и метилкорриноидные производные (метилкобаламин). Первые два
396
Глава 6
переносят метильную группу в виде карбонпевого иона. Что касается метилкор
риноидов, то Вуд считает их особенно эффективными переносчиками, так как они
способны переносить метильную группу в виде карбанионов, карбокатионов или
радикалов (разд. 6.6).
К ферментам, участвующим в метилировании ртути, относятся метионинсин-
тетаза, ацетатсинтетаза и метансинтетаза. Последняя — чрезвычайно широко рас-
пространенный фермент в анаэробных экосистемах, таких, как озерные и речные
отложения. Во время таких ферментативных процессов могут образовываться
ионы СН| и СНз, при этом производные витамина В|2 действуют как посред-
ники при метилировании Hg(II).
Кроме того, на модельных системах показано, что при фотолизе метилкор-
ринондов в анаэробных условиях может также происходить гомолитическое рас-
щепление связи Со—С с образованием Со(П) и метильных радикалов:
В таком случае диметилртуть, по-видимому, также синтезируется путем при
соединения метильного радикала к металлической ртути. Действительно, кажется
вполне вероятным, что в определенных организмах Hg(II) транспортируется че-
рез клеточные мембраны, восстанавливается до металлической ртути, а
затем метилируется. Будучи летучим соединением, диметилртуть должна легко
диффундировать из клеток микробов наружу и освобождаться в воду. При кис-
Ионы металлов
397
лых значениях pH она превращается в монометилртуть и метан:
CH3-Hg-CH3 + н® ------> CH3Hg + сн4
летучее растворимое
соеЭинение соединение
Ь
C2H4 + CH4 + Hg(0)
Очевидно, летучая метилртуть в атмосфере под действием радиации разру-
шается до этана, метана и Hg(0). Затем металлическая ртуть возвращается в
почву и озера, и описанный круговорот ртути повторяется [272].
Таким образом, витамин В12 и его производные — это замечательные ката-
лизаторы, обладающие разнообразными функциями и участвующие в многочис-
ленных необычных биохимических процессах в различных организмах. Превра-
щения ртути в окружающей среде — только один из многих примеров действия
витамина Bi2.
В заключение следует отметить, что в этой главе представлены
различные модели ферментативных механизмов, в которых участ-
вуют ионы металлов. Показано, что реакции, катализируемые ме-
таллоферментами или ферментами, активированными ионами ме-
таллов, удивительно разнообразны по типам. Естественно, что
многие аспекты, такие, как необычайно высокая скорость и специ-
фичность ферментативного катализа, не получили полного объяс-
нения на основании исследования модельных систем. Однако не-
достающее звено, возможно, как раз и удастся найти там,
где структура биологических молекул отклоняется от модельных
систем. Возможно, что при этом будут обнаружены наиболее хи-
мически интересные явления [258, 259].
Глава 7
ХИМИЯ КОФЕРМЕНТОВ
... мы доказываем с помощью логики, а де-
лаем открытия с помощью интуиции.
Пуанкаре
Клеточный метаболизм находится под контролем ферментов,
а ферментам для проявления каталитической активности, как пра-
вило, необходимо особое вещество, или кофактор. В таких системах
белковая часть фермента называется апоферментом, и она обычно
неактивна. Кофактор — это или ион металла, или органическое
вещество небелковой природы. Многие ферменты даже требуют
присутствия обоих кофакторов. Прочно связанный кофактор на-
зывается простатической группой. Однако если органический ко-
фактор начинает действовать только во время каталитического
процесса, то он называется коферментом. Комплекс, образую-
щийся в результате присоединения кофермента к апофер-
менту, называется холоферментом (или, для краткости, фер-
ментом).
Некоторые коферменты служат переносчиками химических
групп, атомов водорода или электронов. Другие, такие, как АТР,
участвуют в энергетических процессах внутри клетки и часто рас-
сматриваются скорее как субстраты, а не как коферменты. Извест-
ны коферменты и с более сложной структурой, которые относятся
к производным витаминов. Они действуют в активном центре фер-
мента, соединяясь с субстратом и облегчая таким образом проте-
кание реакции. Витамины не могут синтезироваться в организме
животных и, следовательно, должны поступать с пищей. Таким
образом, их наличие необходимо для нормального развития здоро-
вого организма, а их отсутствие вызывает специфические болезни,
или, иначе, витаминную недостаточность.
Как это часто случается, изучение биохимических свойств ко-
ферментов привело к выделению весьма необычной области орга-
нической химии. Коферменты — это природные соединения, однако
вполне определенные представления о их структурах делают ко-
ферменты идеальными объектами исследования при разработке
идеи структурно-функционального соответствия с помощью мето-
дов биоорганической химии [273]. В данной главе мы уделим вни-
мание прежде всего этой проблеме и особо созданию систем, мо-
делирующих действие коферментов.
Химия коферментов
399
7.1. Реакции окисления — восстановления
Последовательности ферментативных окислительно-восстанови-
тельных реакций лежат в основе клеточного метаболизма энергии.
Энергия, освобождаемая при окислении восстановленных органи-
ческих или неорганических соединений, запасается с различной
эффективностью в виде таких удобных форм, как АТР, мембран-
ные потенциалы или восстановленные коферменты. Механизм
действия ферментов, катализирующих процессы электронного пе-
реноса, активно изучается, что связано с их важной физиологиче-
ской ролью.
Следует напомнить, что ферменты, участвующие в процессах
окисления — восстановления, или оксидоредуктазы, подразделяют-
ся на четыре главные группы:
1) Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие перенос во-
дорода от одного субстрата к другому. Для нормального функ-
ционирования этой обратимой системы требуется никотинамидный
кофермент, например NAD+, Таким путем из соответствующих
кетонов и альдегидов образуются хиральные спирты. Некоторые
дегидрогеназы содержат в качестве необходимого компонента
Zn(II) [280].
2) Оксидазы — ферменты, катализирующие перенос водорода
от субстрата к молекуле кислорода. Для этого обычно требуется
флавиновый кофермент FAD. В зависимости от специфичности
фермента конечным продуктом может быть вода или пероксид
водорода.
3) Оксигеназы катализируют включение в субстрат кислорода
из молекулярного кислорода. Монооксигеназы включают один
атом молекулярного кислорода в субстрат; другой атом при этом
высвобождается в виде Н2О2 или Н2О. Диоксигеназы вводят
в субстрат оба атома кислорода.
4) Пероксидазы и каталазы катализируют реакции, протекаю-
щие с участием пероксида водорода как окислителя. В качестве
восстановленной формы образуется вода. Для каталитической
активности этих ферментов требуются ионы железа и/или меди.
7.1.1. NAD+, NADP+
Никотинамидадениндинуклеотид NAD+ и никотинамидаденин-
динуклеотидфосфат NADP+ относятся к пиридиннуклеотидам,
впервые они идентифицированы Варбургом в 1935 г. NAD+ —
это кофермент, участвующий в дегидрогеназных реакциях и вос-
станавливающийся при этом до NADH.
400
Глава 7
О
ФАС
\ л
NH2 в е
О о
офофа
NH2
I не теряет
активности,
I если связь
. осуществляется
мерез этот атом
О
нО он
в NADP® зЭесъ
Фосфатная группа
но
NAD®
н
/>~™.
° г Л
йегиЭро-
генаэа
(атака
с тыла)
Н
\-СН3 + NAD®
н" ОН
(О)
rppra = рибоза-фосфат- фосфат-рибоза- авенин
Реакция стереоспецифична, и образуется только один изомер
(в приведенном примере а- или /?-изомер). Известно, что дегид-
рогеназы с другой специфичностью дают стереоспецифично |3-изо-
мер, а не а-изомер.
Теоретические расчеты плотности заряда на атомах никотин-
амидного кольца, проведенные Пюльманом, согласуются с гид-
ридной атакой положения С-4. Экспериментальное доказатель-
ство получено в реакции с дейтерированным спиртом путем вы-
деления пиридиниевой соли. Метилирование и окисление происхо-
дят без потери дейтерия. Это доказывает, что метка находится
только у атома С-4.
Кроме того, и другие реакции присоединения показывают, что
хороший нуклеофил, такой, как цианид-ион, может присоединять-
ся к NAD+. Затем при разбавлении он может быть потерян с об-
разованием исходного ароматического продукта. Щелочная об-
работка в DjO дает 4-[2Н] -аналог NAD+
Химия коферментов
401
Специфический синтез дейтерированного аналога демонстри-
рует электрофильность атома С-4. В связи с этим при pH 7
легко происходит бисульфитное присоединение, а обработка
NAD+ дитионитом приводит к реакции восстановления у атома
С-4.
При щелочных значениях pH наблюдалось также нуклеофиль-
ное присоединение пирувата к NAD+. Присоединение, по-видимо-
Му, происходит через образование енола (или соответствующего
402
Глава 7
енолята), в результате чего образуется восстановленный и окис-
ленный аддукты [274].
восстановленная
форма
окисленная
форма
Эти данные наводят на мысль о существовании следующего рав-
новесия:
Какие же есть доказательства прямого переноса гидрид-иона
в реакции NADH NAD+ -{- Н~?
В 1971 г. удалось создать первую модель алкогольдегидро-
геназы [275]. Для катализа реакции восстановления 1,10-фенан-
тролин-2-карбоксальдегида N-пропил-1,4-дигидроникотинамидом
(простое соединение, моделирующее NADH) вводили ион цинка.
Интересно, что в ацетонитриле при 25°С присутствие Zn(II)
весьма важно для эффективного катализа этой реакции. Таким
образом, координация иопа металла с субстратом — вот движу-
щая сила реакции восстановления. Эта реакция стала первым
примером восстановления альдегида аналогом NADH в нефер-
Ментативной системе. Использование 1-пропил-4,4-дидейтериони-
Химия коферментов
403
котинамида приводит к получению монодейтерированного 1,10-
фенантролин-2-карбинола. Следовательно, продукт образуется
путем прямого переноса водорода от восстановленного аналога
кофермента; кроме того, координация или близость карбонила
к иону цинка, по-видимому, имеют особое значение при фермен-
тативном катализе. Известно, что Zn(II) необходим для катали-
тической активности алкогольдегидрогеназы из печени лошади
[280]. Интересно, что переноса не происходит, если для модели-
рования восстановления NAD+ используется следующее соедине-
ние:
Хотя налицо все факторы, благоприятствующие изменению струк-
туры, система предпочитает сохранить ароматичность. Следова-
тельно, образование NADH должно управляться конформацион-
ными изменениями, которые смещают равновесие в сторону не-
ароматической системы. Однако внутримолекулярный перенос
гидрида наблюдался [276] в присутствии лактатдегидрогеназы из
сердца свиньи с использованием кофермент-субстратного кова-
лентного аналога, состоящего из лактата и NAD+.
Это — два синтетических диастереомерных производных нико-
тинамидадениндинуклеотида, в которых лактат присоединен через
метиленовый мостик в положение 5 никотинамидного кольца. Толь-
ко S-изомер подвергается внутримолекулярному гидридному пере-
носу с образованием соответствующего пируватникотинамидного
аналогии и NADH. Однако две специфические к (R)-лактату дегид-
рогеназы не катализируют подобную реакцию ни с одним из двух
Диастереомеров Следовательно, можно сделать предположение о
404
Глава 7
возможном расположении субстратов (лактата и пирувата) в
активных центрах этих ферментов:
возможное положение пиру-
вата в активном центре (S)-
лактатспецифической деги-
дрогеназы, обеспечивающее
перенос про-7?-водорода от
дигидропиридинового коль-
ца; эта ориентация согла-
суется с данными рентгено-
структурного анализа для
тройных ингибиторных ком-
плексов
это расположение не-
благоприятно, так как
не происходит гидрид-
ного переноса с (/?)-
лактатспецифической
дегидрогеназой
С2—Сз-врашение дает
эту новую ориента-
цию пирувата; такое
расположение посту-
лируется для (7?)-лак-
татспецифической де-
гидрогеназы
Сделаны попытки моделировать обратную реакцию (NADH -*
—>-NAD+). Интересный пример — следующий краун-эфир, модели-
рующий NAD(P)H [277]:
В присутствии сульфониевых солей перенос гидрида происхо-
дит в 2700 раз быстрее, чем с соответствующим аналогом без
краун-эфира.
Химия коферментов
405
Очевидно, присутствие краун-эфира обеспечивает надлежащее
комплексообразование катиона.
Другая модель разработана Леном и сотр. [278]. Они полу-
чили комплекс между пиридиниевым субстратом и акцепторной
молекулой хирального краун-эфира, имеющей в качестве боковых
цепей четыре дигидроникотинамидных производных (рис. 7.1).
X = mjinh/i-bu)
Рис. 7.1. Краун-эфир Лена, моделирующий NADH [278]. Воспроизведено с разре-
шения. © 1978 by the American Chemical Society.
В этом комплексе наблюдается повышенная скорость переноса
Н к пиридиниевой соли субстрата. Это первый пример ускорен-
। него Н-переноса (транс-восстановления) от 1,4-дигидропиридина
к пиридиний-иону в синтетическом молекулярном макроцикли-
| ческом рецептор-субстратном комплексе. Значит, такой синтети-
I ческий катализатор обнаруживает некоторые характерные свой-
I ства, присущие ферментам. Он обеспечивает как акцепторный
Центр для связывания субстрата, так и активный центр для пре-
I вращения связанного субстрата. Следовательно, он интересен и
как ферментативная модель, и как представитель нового типа
эффективных и селективных химических агентов [278].
При создании моделей коферментов необходимо изучить струк-
I ТУРУ соответствующих ферментов. Трехмерная структура алко-
I гольдегидрогеназы определена с разрешением в 0,24 нм [280];
она согласуется с данными ряда физических и химических
406
Глава 7
исследований в растворе. Активный фермент (Л1 = 80 000) пред-
ставляет собой димер, составленный из двух идентичных субъеди-
ниц. Каждая субъединица образована одной полипептидной цепью,
включающей 374 аминокислотных остатка. Далее, каждая субъ-
единица подразделена на два домена, несущих определенную
функцию. Один домен связывает кофермент NAD+, в котором
адениновая часть ориентирована в сторону гидрофобного «кар-
мана»; другой, каталитический, домен связывает молекулы раз-
личных субстратов. Три остатка Cys-46, His-67, Cys-174, входящие
в этот домен, формируют лиганды, которые координируются
вокруг атома цинка, участвующего в катализе. Интересно, что
в этом районе имеется и второй атом цинка, для которого
лигандами являются четыре других цистеиновых остатка.
Функция этого «лишнего» атома цинка пока не выяснена, но
предполагается, что он необходим для поддержания стабильной
структуры фермента. Сходство с ферредоксином (разд. 6.4) также
наводит на мысль, что этот район может быть каталитическим
центром окислительно-восстановительного процесса, возможно,
с одним или двумя цистеиновыми лигандами в качестве катали-
тических групп [280]. Наконец, два домена субъединицы разде-
лены «щелью», которая имеет широкий и глубокий гидрофобный
«карман» с каталитическим атомом цинка на дне этого кар-
мана.
Очевидно, система гораздо сложнее, чем ранее предполагали,
так как кофермент и субстрат связаны с различными доменами
в ферменте. Таким образом, в будущих моделях ЫАО+-зависимых
ферментов эти наблюдения следует принять во внимание.
И последнее: давайте обсудим возможность другого механизма
функционирования NAD+, не включающего перенос гидрид-иона.
Так, Гамильтон считает, что если в дегидрогеназных реакциях
происходит процесс непосредственного переноса гидридного иона,
то этот процесс является уникальным в биологии, так как более
благоприятен перенос протона [279]. Однако различить эти две
возможности нелегко. В общем, проще сказать, что реакция вос-
становления аналогична переносу двух электронов, чем постули-
ровать существование гидрид-иона. К этой проблеме мы еще вер-
немся в разд. 7.1.3 в связи с флавиновым коферментом.
7.1.2. Неферментативная регенерация коферментов и некоторые
примеры использования коферментов в органическом синтезе
В последние годы значительно возросла потребность химиков-
синтетиков в реагентах, способных к эффективным селективным
или асимметрическим превращениям. В этом отношении фермен-
ты предоставляют уникальные возможности, поэтому исследова-
нию их свойств как хиральных катализаторов уделяется огромное
Химия коферментов
407
внимание. Конечно, главная привлекательность фермента с точки
зрения синтетика состоит в том, что различные аспекты его спе-
цифичности могут давать ему возможность воздействовать одно-
временно на тщательно контролируемые и селективные превра-
щения [281].
В настоящее время наиболее широкое применение получила
оксидоредуктаза алкогольдегидрогеназа из печени лошади
(HLADH). Изучена возможность использования ее для стерео-
селективного окисления спиртов и восстановления кетонов. Од-
нако проведение реакции в препаративном масштабе (~5г) ока-
залось экономически неосуществимым, так как фермент требует
присутствия весьма дорогостоящего кофермента NAD+.
Для решения этой проблемы были разработаны методы ре-
генерации этого кофермента. Один из них — неферментативный
метод [282—-284] непрерывной регенерации каталитических
количеств никотинамидного кофермента. (Следует напомнить, что
в разд. 4.7 уже уделялось внимание ферментной технологии и
использованию ферментов в химии и медицине).
В вышеупомянутом методе для регенерации NADH из NAD+
используется дитионит натрия. Показано, что он вполне пригоден
для препаративного проведения (с высокими выходами) HLADH-
катализируемых реакций восстановления большого набора альде-
гидов и кетонов.
кетон
спирт
R.
R'
ферментативный путь химический путь
(HLADH) (S2O?e)
R. .OH
NADH
NAD®
HSO3e + SO2
S2O42e OHj
R H
FMN
R OH
fmnh2»-^ -—►NAD® —спирт
R H
химический путь ферментативный пить
(флавин) (HLADH)
NADH
R/=o кетон
Чтобы осуществить противоположное действие (окисление
спирта в кетон) система должна быть дополнена флавиновым
[Кофактором (FMNH2~> FMN), где кислород восстанавливается
До Н2О2. Целесообразность использования HLADH в качестве хи-
рального окислительно-восстановительного катализатора были
408
Глава 7
продемонстрирована неоднократно. Вот два примера:
HLADH, 20°С, pH 7
регенерация
NADH,46 %-ное
восстановление,
5ч
(±)-2- нонборнанон
только(+)-(15,2/г,4/г)-энЭо <-)-(1я,4$)
оптическая оптическая
чистота 64% чистота 47%
еыхоЗ 39% еыхоЗ 3f%
HLADH, 20°С, pH 7
25%-ное восста-
новление, Ич
( + )-.5ициКЛ0 [3.2.1]- (-)-(15.2S,5S)-3K30 (-Н1Я.5Л)
октанон-2, (труЗно получить .оптическая
йругим путем) чистота 17%
оптическая чистота 83% выхой 58%
выхой 36%
Обе реакции проходят с высокой степенью стереоспецифичности.
Такую стереоспецифичность можно объяснить, если применить
Экваториальный
еойороО Востаеляется
за счет Н® приближа-
ющегося с ге-сто-
роны кетона, в
(в-ге-направление
действия HLADH)
• запрещенные позиции
0 нежелательные позиции
О неуйовлетворительные позиции
Рис. 7.2. Модель алмазно-кристаллической решетки для HLADH, впервые разра-
ботанная Прелогом [282]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the Ameri-
can Chemical Society.
модель алмазно-кристаллической решетки Прелога (рис. 7.2)
[285].
Совмещая циклогексанон с алмазной решеткой, Прелог разработал ступен-
чатый анализ катализируемого HLADH восстановления. Позиции от А до D «за-
прещены»; окислительно-восстановительная реакция не происходит, если при свя-
Химия коферментов
409
Рис. 7.3. Анализ с помощью модели алмазно-кристаллической решетки стереохи-
мии восстановления энантиомеров 2-норборнанона, катализируемого HLADH.
Считается, что указанные ориентации относятся к «спиртоподобным» переходным
состояниям, которые, по-видимому, реализуются; при этом Н приближается со
стороны е-ге (рис 7.2). Неблагоприятных решеточных взаимодействий не суще-
ствует, если расположение (+)- или (—)-изомеров соответствует а и б. Реакции
восстановления до (+)- или (—)-эндо-спиртов, таким образом, — разрешенные
процессы. Образование в основном (+)-энантиомера, по-видимому, происходит
благодаря тому, что С-4 предпочитает находиться в незатрудненном положении
типа а, а не в положении типа б, где он приближается к запрещенному району
решетки А, I, С. Противодействие HLADH образованию экзо-спиртов объясняет-
ся неблагоприятными взаимодействиями С-6 с решеточными позициями Jul (со-
ответственно в и г) [282]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the Ameri-
can Chemical Society.
зывании потенциального субстрата его группа попадает в одно из этих положе-
ний. Позиции от Ё до G «нежелательны»: если часть групп субстрата занимает
эти позиции, то реакция, возможно, будет идти, но с очень малой скоростью.
Позиции за пределами решетки (U) также относятся к нежелательным. Поло-
жение I, как было недавно установлено, «неудовлетворительно». По возможности
следует избегать размещения в нем группы, однако, если оно все же занято, ре-
акция будет идти, но медленно.
Вернемся к предыдущим двум примерам. Ориентация энантио-
меров в более предпочтительных «плоских» позициях алмазно-
кристаллической решетки HLADH позволяет легко объяснить
наблюдаемую стереоспецифичность (рис. 7.3 и 7.4).
Исследовано [282—284] также окисление диоксициклопентена
й обнаружено, что HLADH обладает способностью сохранять
свою энантиоселективность, осуществляя региоспецифическое
410
Глава 7
Рис. 7.4. Схематическое изображение ориентаций энантиомеров бицикло [3.2.1]-
-2-октанона в их предпочтительных «плоских» позициях внутри алмазно-кристал-
лической ячейки HLADH. Приближение Н к карбонильной группе со стороны
е-ге обеспечивает образование экзо-спиртовой группы, а — ни один из замести-
телей (+)-изомера не занимает нежелательных позиций. Таким образом, вос-
становление до (—) -продукта облегчено, б — соответствующая ориентация
энантиомерного (—)-кетона. Здесь С-7 вынужден располагаться вблизи неблаго-
приятной позиции I, и восстановление по этой схеме не является главным. Об-
разование (+)-продукта, следовательно, —- относительно медленный процесс
[282]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the American Chemical Society.
—>• —>-(+)-!/?, 2S
Рис. 7.5. Анализ с помощью алмазно-кристаллической решетки региоспецифично-
сти циклопентендиола. Решетка, включая нежелательные позиции А, В, G, I и LT,
изображена штриховыми линиями. Оксиэтильные группы (+)- и (—)-соединений
ориентированы так, что уход npo-R-водорода может происходить со стороны
е-ге и неблагоприятных взаимодействий с решеткой можно полностью избежать,
реакция приводит к наблюдаемым продуктам для (+)-изомера (а) и для (—)-
изомера (б), в и г — вторичная спиртовая группа исходных (+)-и (—^соеди-
нений препятствует до некоторой степени уходу водорода в направлении е-ге,
метиленовая группа оксиэтильной функции должна атаковать позицию В (+)-
изомера (б) или А (—)-изомера (г). При этом окисление гидроксильных групп
в положении С-1 невозможно для обоих энантиомеров [283]. Воспроизведено
с разрешения. © 1977 by the American Chemical Society.
Химия коферментов
411
окисление только одной из двух незатрудненных гидроксильных
групп молекулы.
(+)
HLADH, 20°С, pH 9
40%-ноя *
регенерация
окисленного
NAD®,4ч
(+)-(!«, 2S)
оптическая
чистота 49%
выход 48%
(-Н15.2Л)
оптическая
чистота 83%
выход 35%
Это создает выгодную для синтеза комбинацию свойств, ко-
торые не могут быть воспроизведены в одну стадию традицион-
ными методами химического окисления. Из рис. 7.5 следует, что
наблюдаемая региоспецифичность соответствует тому, что пред-
сказывает модель алмазно-кристаллической решетки активного
центра.
Судя по всему, при анализе или интерпретации поведения
субстрата в терминах алмазно-кристаллической решетки следует
обращаться к жестким молекулярным моделям. Есть надежда,
что применение таких моделей для изучения реакций, протекаю-
щих в присутствии других ферментов и коферментов, привлечет
еще большее внимание химиков к использованию ферментов на
трудных стадиях сложного органического синтеза.
7.1.3. Химия флавинов
Многие процессы гидрирования — дегидрирования осуществ-
ляются коферментом флавинадениндину клеотидом (FAD); при
этом два электрона (по аналогии с гидрид-ионом) переносятся
от NADH по дыхательной цепи [357]. Флавины — это соедини-
тельное звено между одно- и двухэлектронными окислительно-
восстановительными системами и цитохромами в дыхательной
цепи, где кислород в конечном счете восстанавливается до воды.
FAD — кофермент, который, как и NAD+, переносит электроны
рибофлавин (витамин Вг)
FMN ДМР
FAD
412
Глава 7
от субстрата, но гораздо более замысловатым путем. Структура
FAD была определена в 1935 г. Куном. Впервые механизм его
действия был предложен в 1938 г. Варбургом, а его полный син-
тез осуществлен в 1954 г. Тоддом и сотр. Гидрофильность заме-
стителя у N-10 обеспечивает растворимость FAD в водном раст-
воре белка.
Предполагается, что центром фиксации гидрид-иона (или двух
электронов) из NADH является электрофильный азот N-5 фла-
винового ядра.
NADH + FAD NAD® + FADH2
Сигман показал, что непосредственный гидридный перенос мо-
жет происходить от NADH (или 4-[2H]-NADH) с использованием
ароматического аналога (N-метилакридиниевой соли) [286].
Была также проведена реакция с восстановленной молекулой
никотинамида, имеющей боковую пропильную цепь. Однако об-
ратная реакция не идет. Реагенты, ингибиторы свободных ра-
дикалов, не влияют на скорость реакции; это говорит о том, что
механизм скорее ионный, чем радикальный. Однако изотопные
эффекты с дейтерированным NADH показывают, что в отсутст-
вие фермента реакция с FAD — не простой бимолекулярный
процесс.
Н Н
X^CONH,
/(лноль'|-с‘') I
Эля потери С3Н7
гийриЙ-ионц
при С-4 : 2040
1620
Химия коферментов
413
Из приведенных выше результатов можно найти, что вторич-
ный изотопный эффект составляет 0,74. Поскольку хорошо из-
вестно, что переход углерода из «/^-гибридизации в sp2 должен
давать значительно более высокий вторичный изотопный (дей-
терия) эффект, чем наблюдается в данном случае, то простой
бимолекулярный процесс невозможен. Следовательно, для объ-
яснения экспериментальных данных необходимо постулировать
образование кинетически важного промежуточного соединения.
Единого механизма для реакций с участием флавина пока еще
не существует. Нельзя исключить образование комплекса с пе-
реносом заряда, но свободнорадикальное промежуточное соеди-
нение также возможно. Следует напомнить, что для флавиновых
ферментов обычно требуются ионы металлов, и они могут играть
большую роль в механизме. Фактически промежуточное положе-
ние, которое флавиновые ферменты занимают в биохимических
процессах дыхательной цепи, после никотинамидных кофермен-
тов (двухэлектронный процесс) и перед цитохромами * (одно-
электронный процесс) может быть вызвано сложностью флави-
новой структуры, допускающей как ионный, так и свободноради-
кальный механизмы.
Свободнорадикальные реакции возможны благодаря тому, что
система может легко окисляться или восстанавливаться по меха-
низму одноэлектронного переноса с образованием стабильного
промежуточного соединения, называемого семихиноном (стабили-
зированного десятью резонансными формами). В этцх планарных
структурах одно кольцо всегда остается полностью ароматичес-
ким. В то же время, если промежуточные соединения имеют не
радикальную природу, то реакции должны включать гидридный
перенос или протекать по механизмам ППК или ППМ. Эти два
механизма предложены Гамильтоном [279]: ППК (протон, про-
гон, ковалентное соединение) — для систем, не требующих
* Цитохромы — это переносчики электронов в процессе окислительного фос-
форилирования, суть которого состоит в образовании АТР при переносе электро-
нов от NADH или FADH2 к молекулярному кислороду. Весь процесс включает
окисление субстрата (например, глюкозы). При этом поток электронов прохо-
дит через компоненты дыхательной цепи (цитохромы) к молекулярному кисло-
роду, который в конечном счете восстанавливается до воды.
414
Глава 7
присутствия иона металла, и ППМ (протон, протон, металл) — для
систем, включающих ион металла. Таким образом, флавиновое
ядро и по своей структуре, и по электронному строению способ-
ствует стабилизации как одно-, так и двухэлектронных перено-
сов в окислительно-восстановительных реакциях.
возможные электрофильные
центры
изоаллоксазиновая
система
।--------1
положение £ (тип мочевины)
положение 4 (амиЗный тип)
положение 1Оа(амиЗиновый тип)
положение 4а (углерод шиффова
основания)
Для осуществления механизма ППК необходимо образование
ковалентного соединения между флавиновым коферментом и суб-
стратом для того, чтобы стал возможным перенос электронов от
одной молекулы к другой. Поскольку это ионная реакция, то мо-
лекула флавина должна иметь электрофильный центр, легко ата-
куемый нуклеофильным субстратом. При исследовании флавино-
вого ядра обнаружены четыре центра, способных подвергаться
атаке, среди которых положение 4а, по-видимому, является наи-
более электрофильным. Действительно, реакционноспособность
возрастает в какой-то степени благодаря индуктивному эффекту
прилегающих амидной и амидиновой групп.
Ниже приведено только два примера хорошо изученных реак-
ций с целью показать, что эти превращения происходят по ме-
ханизму Гамильтона.
Пример 1: превращение спирта в кетон
Химия коферментов
415
Пример 2 превращение NADH в NAD+
NADH
винилогичный
амиЗиний-ион
облаЗает
значительной
резонансной
стабилизацией
FADHj
NAD®
Ясно, что никакого гидридного переноса не происходит, смещается только
протон и образуется ковалентное промежуточное соединение между субстратом
и положением 4а FAD. Гамильтон считает, что биологические окислительно-
восстановительные реакции (дегидратации) редко протекают с участием гидрид-
чионов (если вообще такой механизм возможен), так как протоны н₽ имеют
Влектронной оболочки и поэтому движутся гораздо быстрее и более эффективны
в биологических средах [279].
Здесь опять для прояснения ситуации необходимы модельные исследования.
Модель 1. Первые доказательства существования 4а-аддукта получены
>на следующем модельном соединении [290]:
Это соединение было получено путем фотоиндуцированного бензилирования
флавина феннлацетатом. Образующийся продукт медленно реагирует с кисло-
родом воздуха. Можно предположить, что активность атома N-5 важна для
416
Глава 7
катализа флавопротеинами и что кислород может легко присоединяться по по-
ложению 4а, если положение N-5 замещено или протонировано, как это могло бы
быть в ферменте.
Несмотря на то что многие модели свидетельствуют об активности поло-
жений 4а и атома N-5, на вопрос, где точно находится электрофильный центр
во флавинах, пока нет удовлетворительного ответа.
Модель 2. Предполагается, что между NADH и FAD образуется ковалент-
ная связь, а предварительно проведенные исследования свидетельствуют о том,
что, во-первых, по-видимому, образуется предравновесный комплекс с флави-
нами. Во-вторых, согласно теоретическим расчетам, положение N-5 должно быть
хорошим электрофильным центром. Поэтому, согласно Брюису [287], замена
атома N-5 на углерод также должна приводить к возникновению мощного
электрофильного центра с тем преимуществом, что образующаяся новая
С—Н-связь более устойчива и не способна обмениваться водородом с раство-
рителем.
Синтезировано следующее флавиновое модельное соединение, которое было
введено в реакцию с NADH (в D2O, в течение трех суток, в темноте, в атмо-
сфере аргона).
дейтерий совсем
не включается
В результате получен продукт восстановления, не содержащий в положе-
нии 5 дейтерия. Отсюда ясно, что осуществляется прямой перенос водорода
(двухэлектронный перенос) к положению 5 и что в предравновесном комплексе
молекула NADH, вероятно, не располагается вблизи положений 1, 9 и 10. Эти
данные противоречат предположению Гамильтона, что такой аналог FAD Дей-
ствует как гидридный акцептор.
Модель 3. По аналогии был синтезирован 5-деазарибофлавин, которыи
реагировал в присутствии NADH : FAD-оксндоредуктазЫ [288]. Показано, что
этот 5-деаза-аналог функционирует как кофермент, подвергаясь восстановлению
в результате прямого переноса водорода от NADH.
рибитол
5-Зеазарибофлавин
NADT
Скорость восстановления аналога составляла 0,3% скорости восстановления
рибофлавина. Несмотря на то что реакция не была абсолютно стереоспецифич-
ной, оксидоредуктаза все же отдавала предпочтение /^-изомеру [4-3H]NADH,
атакуя 5-деазарибофлавин с re-стороны Оказалось, что производное 5-деаза-
FAM (называемое кофактором F42o) встречается в качестве природного кофак-
Химия коферментов
417
тора в анаэробных бактериях, которые образуют СН4 из СО2 [289]; это обстоя-
тельство делает исследование аналогичных модельных систем еще более важным.
Модель 4. Сейер и сотр. [291] использовали в качестве модели флавина
1,3-диметил-5-(п-нитрофенилимино) -барбитуровую кислоту, и им удалось выде-
лить ковалентное промежуточное соединение при восстановлении этого высоко-
активированного иминного субстрата тиолом (метилтиогликолятом или меркап-
тоэтанолом).
ROn^SH
R = CHjCO, Н
R = СН2—СН2ОСО—СНЭ
R = СН2—СН2ОН
Продукт присоединения тиола детектировался спектрофогометрически, а
промежуточное соединение (R=CH2CH2OH) было выделено, и структура е^о
доказана методом 'Н- и ,3С-ЯМР-спектроскопии. Промежуточное соединение
может быть превращено в дигидропроизводное. Это свидетельствует о том,
что присоединение должно происходить по углеродному атому в положении 4а,
а не по атому N-5. Таким образом, эти исследования доказывают существова-
ние промежуточного продукта присоединения тиола по С-4а—N-5-связи при
ферментативном восстановлении флавинов и их аналогов тиолами.
7.1.4. Реакции оксенов
Многие оксидазы (монооксигеназы) являются FAD-зависи-
мыми и катализируют окисление различных субстратов молеку-
лярным кислородом. Следовательно, FAD-коферменты способны
переносить кислород к органическому субстрату. Это еще оддо из
Многочисленных свойств этого кофактора, отсутствующее у NAD+.
Флавинзависимые монооксигеназы связывают и активируют
Кислород, перенося в конечном счете один атом кислорода к суб-
страту и освобождая второй атом в виде молекулы воды. К реак-
циям, катализируемым флавинмонооксигеназами, относятся
.гидроксилирование и-оксибензоата, окислительное декарбоксилиро-
вание салицилата и ряд реакций окисления аминов, осуществляе-
мых посредством аминооксидазной системы со смешанной функ-
14 Зак, 649
418
Глава 7
NADH
(uiiuNADPH)
NAD ~
(unu NADP*)
FMNHa
OHOHOH
R=-CHaCHCHCHCHaOPOj для, FMN u
° °
R=-CH,CH СНСНСН2ОРОРОСНг _
г| II 2 I I I >O'
OHOHOH О О к
аля Fad
u FADHj
ОН ОН
Рис. 7.6. Цикл оксигенации для флавопротеид-зависимых монооксигеназ [293].
Воспроизведено с разрешения D. Dolphin.
цией [292]. Очевидно, названные реакции включают «оксеновый»
механизм. Этот термин образован по аналогии с реакциями
с участием карбенов и нитренов — двух других электрофильных
частиц.
R- C R R—N R—О
кар&ен нитрен оксен
Одни ферменты в этих реакциях требуют присутствия иона
переходного металла, а другие — нет. Упростим нашу задачу и
остановимся только на механизмах без участия иона металла.
Одна группа монооксигеназ, для которых точно известно, что
ион металла не нужен, требует присутствия в качестве кофак-
тора флавина. Отсутствие потребности в ионах металла означает
также, что некоторые стадии реакции с кислородом могут проте-
кать по свободнорадикальному механизму. Однако, поскольку
радикалы субстрата очень неустойчивы, то кажется более вероят-
ным, что кислород реагирует с восстановленной формой флавина
с образованием промежуточного соединения, которое затем реа-
гирует с субстратом по ионному механизму. В этом случае спи-
ны свободных электронов кислорода сохраняются. Цикл оксиге-
нации для флавинмонооксигеназ приведен на рис. 7.6.
В этих аэробных, связанных с флавином монооксигеназах вос-
становленный флавин FADH2 сначала реагирует непосредственно
с кислородом, давая аддукт FADH2O2. Этот аддукт, по-видимому,
Химия коферментов
419
затем перегруппировывается во флавин-4а-гидропероксид — хоро-
ший окислитель, более сильный, чем Н2О2.
Каким образом молекула флавина активирует молекулярный
кислород? Следует понимать, что в данных превращениях кисло-
род участвует в виде молекулы в основном, триплетном, состоянии,
в то время как органические молекулы (флавин) обычно находятся
в синглетном состоянии. Однако реакция синглета с триплетом
с образованием синглетного продукта — спинзапрещенный процесс!
Тем не менее ионная реакция кислорода может протекать без об-
разования синглетного кислорода, если он связан в комплекс
с ионом переходного металла, который имеет неспаренные элект-
роны. Поскольку для функционирования многих оксидаз не тре-
буется иона металла, то пока ничего нельзя утверждать оконча-
тельно, кроме того что радикальный процесс для флавинов прин-
ципиально возможен. Фактически присоединение кислорода к
восстановленному флавину аналогично реакции кислорода с заме-
щенным тетрааминоэтиленом, имеющим сильную электронодонор-
ную двойную связь.
Зиоксетан тип мочевинм
Далее, ароматические соединения (фенол) могут гидроксили-
роваться под действием кислорода в неферментативной системе,
содержащей различные восстановленные флавины. Предпола-
гается, что гидроксилирующим агентом является флавингидропе-
роксид, который перегруппировывается путем протонного
переноса, давая действительно гидроксилирующий агент — карбо-
нилоксид. Аналогичные промежуточные соединения известны для
14*
420
Глава 7
реакций озона с соединениями, содержащими двойные связи.
Поскольку карбен и нитрен — электрофильные агенты, конце-
вой кислород должен стать более электроположительным за счет
стабилизации отрицательного заряда остальной частью молекулы.
Этот механизм, предложенный Гамильтоном [279], имеет недо-
статки, так как подразумевает существование открытой формы
флавинового кольца.
Могут действовать также другие ионные механизмы. Перенос
кислорода может происходить путем переноса радикального типа,
а не по ионному механизму (см. с. 424). Тут уместен вопрос: по-
чему природа выбрала флавиновый, а не никотинамидный кофер-
мент для переноса кислорода на субстрат? Ответ, по-видимому,
Химия коферментов
421
заключается в том, что NAD+ может только переносить электроны
через гидрид-ион, в то время как FAD обладает свойством превра-
щаться в промежуточный кислородный аддукт, который затем реа-
гирует с субстратом, так что прямого переноса кислорода к субст-
рату не происходит.
Чтобы устранить недостаток механизма Гамильтона, Дольфин
предложил интересный альтернативный механизм [293], согласно
которому не образуется промежуточного продукта с разомкнутым
кольцом. Этот механизм включает образование активного оксази-
ридин-4а,5-флавина, получаемого из флавингидропероксида *,
Предположение об образовании оксазиридина основано на мно-
гочисленных химических примерах **, к которым относится и при-
веденный ниже, демонстрирующий электрофильный характер окса-
зиридиновой системы.
* Как уже упоминалось ранее (разд. 7.1.3), 5-деазафлавиновые аналоги бо-
лее чувствительны к нуклеофильной атаке, которая обычно происходит по по-
ложению 5 с образованием 1,5-дигидроаддуктов. В связи с этим следует упомя-
1нуть о недавнем сообщении, где описано получение 4а,5-эпокси-5-деазафлавино-
вого производного в результате реакции 5-деазаизоаллоксазина с Н2О2, трет-бу-
[тилгидропероксидом или ж-хлорпербснзойной кислотой [294].
** Недавно появилось сообщение о синтезе нового класса оксазиридинов
(аренсульфонил-3-арилоксазиридинов). Эти устойчивые соединения были полу-
чены окислением сульфониминов, и они, как было замечено, могут служить окис-
лителями [359].
Лг
.N=c'
r— so; н
422
Глава 7
Поэтому можно предположить следующий механизм гидрокси-
лирования фенола:
Интересно, что перенос кислорода от оксазиридинового агента
приводит к образованию бензолэпоксидного промежуточного сое-
динения.
Биткоп и сотр. [295] еще в 1969 г. высказали предположение,
что эпоксиды являются промежуточными соединениями в ряде
реакций окисления ароматических соединений, катализируемых
монооксигеназой. Например:
Здесь опять-таки флавиновый кофактор — эпоксидирующий
агент.
Флавингидропероксидаза также участвует в окислительном
декарбоксилировании:
Химия коферментов
423
FADH,
+
Окисленный
субстрат
+ н2е2
1-н»
о
а И
•2Н® + R—С—СООе
I а-кето-
кислотный
♦ субстрат
*>н2
• ,8О
+ со2 + н2«
С использованием 18О2 было показано, что только один из двух
атомов кислорода оказывается в итоге в карбонильной группе.
Интересным примером такого процесса является превращение
п-оксифенилпировиноградной кислоты в гомогентизиновую кислоту
под действием диоксигеназы:
о
"/СН2—с—соон
но
НО
л-оксифенилпироеиноградная
кислота
сн2—соон
он
гомогентизиновая
кислота.
Биткоп первым предложил следующий механизм:
fiUDKCU'
геназа.
424
Глава 7
При перегруппировке происходит миграция боковой цепи в орто-
положение [296]. Однако такой механизм вызывает сомнение, так
как реакция все еще протекает с фенилпировиноградной кислотой
(ОН-группа в пара-положении отсутствует). Более вероятным ка-
жется механизм, включающий участие иона переходного металла
с образованием сначала перкислоты, которая затем подвергается
превращениям по «оксеновому» механизму через образование
эпоксидного промежуточного соединения;
Предположение Дольфина об оксазиридиновом механизме окис-
лдерия, осуществляемого флавином, было подвергнуто критике
[292], так как включение кислорода в процесс ферментативного
окисления не индуцируется фотохимически. Однако удалось
показать только, что N-5-оксифлавин (нитрон) способен влиять на
К(5)-оксифлавин
(нитрон)
Химия коферментов
425
неферментативное окисление. Методом ЭПР-спектроскопии обна-
ружено, что при облучении в присутствии фенола образуются фла-
виннитроксильный радикал и фенокси-радикал. Соединение этих
двух частиц приводит к образованию флавина и гидрохинона.
Возможно, что флавиннитроксильный радикал играет важную
роль в химии флавоферментов; предполагается также, что проме-
жуточный нитроксильный радикал может образовываться из свя-
занного с ферментом флавин-4а-гидропероксида.
R
4а-гиЗропероксиЗ
нитроксильный
радикал
Такой механизм, включающий образование радикальных пар,
позволяет избежать постулирования «оксена» как промежуточного
продукта в процессе переноса кислорода флавоферментами, и в то
же время он способствует снятию напряженности оксазиридиновых
циклических структур.
Годдарт [297] предложил другой механизм гидроксилирования
фенольных соединений; при этом он попытался показать, каким
образом флавиновые коферменты осуществляют такое окисление.
Построение выполнено теоретически и основано на применении вол-
новых функций, квантовой механики и обобщенной теории валент-
ных связей к биологическим проблемам.
На рис. 7.7 приведен пример окисления фенола в катехин. На
первой стадии этого окислительного процесса триплетный кислород
атакует флавин, образуя бирадикал. Флавин в какой-то степени
помогает активировать кислород. При этом один из неспаренных
электронов бирадикала стабилизируется флавиновым кольцом, а
другой остается связанным с атомом кислорода, который реагирует
с фенолом на второй стадии. Образуется промежуточное соединение,
426
Глава 7
Рис. 7.7. Механизм окисления фенола флавиновым коферментом [297].
где флавин и фенол соединены друг с другом посредством двух
атомов молекулярного кислорода. Протекание следующей стадии
облегчено, так как в образующемся промежуточном соединении
флавина положительный заряд стабилизируется свободными па-
рами электронов у атомов азота в положениях 5 и 1. Согласно
Годдарту, атомы азота в молекуле флавина способствуют разрыву
кислород-кислородной связи, самой энергоемкой стадии реакции.
Интересно, что предлагаемый механизм включает атаку фе-
нольного кольца атомом кислорода по углероду, связанному с гид-
роксильной группой. Согласно энергетическим расчетам, этот ра-
дикальный промежуточный продукт, по-видимому, имеет более
низкую энергию, чем продукт, содержащий кислород у соседнего
атома углерода в кольце. Позже кислород мигрирует в результате
перегруппировки. На этой стадии образуется катехин, но флавин
все еще содержит лишний кислород. Последний, по-видимому, уда-
ляется из флавина путем присоединения протонов и образования
воды. Естественно, процесс должен осуществляться с помощью
фермента. Для подтверждения этого предположения необходимы
модельные исследования.
Среди разнообразных происходящих в природе процессов, связанных с
окислением — восстановлением, испускание видимого света живыми организ-
мами — одно из наиболее таинственных природных явлений. Люминесцирующие
бактерии, черви и изумительные по красоте светлячки всегда были объектом
пристального внимания биохимиков. Возникает естественный вопрос: какой тип
Химия коферментов
427
химических реакций может вызывать излучение энергии в видимой области
спектра? Было обнаружено промежуточное производное АМР, но для испуска-
ния света нужна гораздо большая энергия, чем это может обеспечить только
гидролиз АТР. Ответ был найден, когда заметили, что хемилюминесценция
чаще всего наблюдается, если в качестве окислителя выступает О2. Кроме
того, исследование экстрактов люминесцентных веществ из организмов свет-
лячков показало, что свечение обусловлено люциферином. Это соединение де-
карбоксилируется ферментом люциферазой [298].
о3 +остаток,
основания
влюциферазе
люццсрерин
из светлячков
а-пероксилактон
электрояновоз&ужЭениый
окси люцифер и н
После активации АТР люциферин, по-видимому, превращается в а-перокси-
лактон путем дегидратации — циклизации. Это промежуточное соединение слу-
жит хемивозбудителем образования электроиио-возбужденного оксилюциферина
при декарбоксилировании.
Такая ферментативная оксигенация, происходящая в результате атаки мо-
лекулы О2 карбанионом с последующим декарбоксилированием, происходит без
помощи сопряженного кофактора. Тем самым ферменты, обеспечивающие этот
процесс, отличаются по механизму действия от бактериальной люциферазы,
флавинзависимой монооксигеназы [299]. В бактериальной системе 4а-флавин-
гидропероксид участвует в хемилюминесцентной реакции в присутствии аль-
дегида.
Б настоящее время получено простое модельное соединение для
изучения последовательности реакций окисления — декарбоксили-
рования [300]. Дегидратация следующих очень активных сс-перо-
ксикислот в присутствии ДЦГК дает соответствующий сс-перокси-
лактон (диоксетанон).
’Ч СООН rJ1/> Кк
R2/O—ОН * 0-0 р /°+ с°2
R, = R2 = СН3
Ri = R2 = /Ви
Ra =s /Ви,’К4 ч CHj
428
Глава 7
Инкубация а-пероксилактона в СН2С12 при 25°С приводит к ко-
личественному образованию кетона и сопровождается испусканием
света. Декарбоксилирование, по-видимому, происходит на первой
О1
' +активатор
г электрона q q
х L • ©
активатор
активатор
Чэ
свет
активатор* +
активатор=перилен
или 9,10-Зифенилантрацен
стадии путем одноэлектронного переноса от присутствующего
в растворе в каталитических количествах ароматического актива-
тора [300]. Следующая стадия процесса хемилюминесценции —
быстрая потеря СО2 восстановленным диоксетаноном. И наконец,
последняя стадия всей цепи — излучение возбужденного актива-
тора, которое обнаруживается в виде хемилюминесценции. По-ви-
димому, главная особенность реакций хемилюминесценции — обра-
зование анионного радикала.
7.1.5. Липоевая кислота
Липоевая кислота (1,2-дитиолан-З-валериановая кислота) широко распро-
странена в микроорганизмах, растениях и животных. Она относится к группе
кофакторов, содержащих серу, и в природе действует в паре с тиаминпиро-
фосфатом (разд. 7.3). Однако по своему действию липоевая кислота принад-
лежит к другому классу переносящих электроны кофакторов, основная окис-
лительно-восстановительная функции которых заключается в воспроизводстве
АТР. Кофактор необходим дли синтеза жирных кислот и метаболизма угле-
водов.
Действительно, в течение долгого времени было общепризнанным, что ли-
поевая кислота представляет интерес как фактор роста, обнаруженный в ряде
микроорганизмов. В соответствии с химическими свойствами она может легко
восстанавливаться, а восстановленная форма — снова легко окисляться до ли-
поевой кислоты.
S—S
NaBH«unu ттс
СООН &/“а
СООН
липоевая кислота
Вигийролипоевая кислота
Дигидролипоевая кислота — эффективный реагент, восстанавливающий
сульфат-ион до сульфит-иона. Сульфат сначала активируется путем образова-
ния аденилсульфата, называемого также аденозин-б'-фосфосульфатом (APS).
Химия коферментов
429
Образование липоевой кислоты — энтропийно выгодный процесс, так как оба
атома серы находятся в одной и той же молекуле.
ноос
высокоэнергётический
ангидридный
интермедиат
Следует учитывать, что пятичленное кольцо липоевой кислоты не планарно,
а имеет двугранный угол С—S—S—С, равный 26°. Обычно дисульфиды не
окрашены, а липоевая кислота желтого
цвета, что объясняют напряжением кольца
Такое напряжение вызвано отчасти от- (Л
талкиванием электронных пар смежных
атомов серы, что делает липоевую кислоту р. уу \\
лучшим окислителем, чем ее менее напря- / \iy( ,
женный аналог с шестичленным кольцом. НООС^_g< )26°
Таким образом, валицо структурно-функцио- # /\ ’
нальное соответствие между липоевой кис Н (J
лотой и ее биологической функцией
[301].
Наконец, в полиферментном комплексе, осуществляющем окислительное
декарбоксилирование а-кетокислот, липоевая кислота находится не в свободной
форме, а ковалентно связана с остатком лизина амидной связью (рис. 7.8).
Свободно поворачивающаяся «ножка» этой простетической группы координи-
руется с другими центрами комплекса, так что эффективность процесса свя-
зана с уникальной химической организацией на субклеточном уровне.
В клетке тиоэфир дигидролипоевой кислоты не накапливаетси, но суще-
ствует в виде соединения с другим серосодержащим коферментом — кофермен-
том А (СоА—SH)—универсальным переносчиком ацильных групп.
пантотеновая
кислота
§ S
.О он
ИО—
е° ° СоА—SH
430
Глава 7
Рис. 7.8. Схематическое изображение ферментного комплекса при окислительном
декарбоксилировании пировиноградной кислоты.
Ацетил-СоА — это реально существующая форма «активированного ацета-
та», при гидролизе которого освобождается 36,9 кДж/моль (8,8 ккал/моль)
(гл. 2). Восстановленная липоевая кислота заново окисляется коферментом FAD,
присутствующим в комплексе.
+ CoAS—SH
= СН3—с—s—СоА + HS SH
+ fadh2
7.2. Пиридоксальфосфат
Пиридоксин, или витамин В6, — важнейший компонент пищи. Альдегидная
форма называется пиридоксалем, а его фосфатный эфир участвует во многих
катализируемых ферментами реакциях аминокислот и аминов. Число таких ре-
Химия коферментов
431
акций огромно, и пирндоксальфосфат (пиридоксаль-Р), несомненно, одни из
наиболее многосторонне действующих коферментов.
В активном комплексе
фосфорилирован этот гидроксил
пириОоксаль
пиривоксамин
пиривоксин
(пириЗоксол)
Производные витамина В6.
Главная особенность механизма действия этого кофермента, которую сле-
дует подчеркнуть. — это протонный перенос. При переаминировании [реакция
(7-1)], важнейшем процессе метаболизма азота, пиридоксаль превращается в
пиридоксамин.
R—С—СО2® + R'—СН—СО2®
11 J
О ®NH3
R—CH—СО2® + R'—С—СО2е
лереаминироеание
(7-1)
НОСН2—СН—СО2® -----> СН3—С—СО2® (7-2)
®NH3 &
серин пируват
элиминирование—гиЗратация
ОН
эе „ I
но3ро-сн2сн2—сн—со2е —> сн3—сн—сн—
®NH3 ®NH3
гомосеринфосфат треонин
элиминирование - гиЗратация
(7-3)
' но2с—СН2СН2—сн—со2®-------> НО2С—СН2СН2—СН2—NH2 -I- СОг
®NH3 (7-4)
глутаминовая кислота у-аминомасляная кислота
декарбоксилирование ^ГАМК^
нх
НОСН2—СН—СО2®----> /С=О + СН2—С’О2® (7-5)
®NH3 Н ®NH3
серин глицин
обратная конденсация
432
Глава 7
Л JH .СО2е
R— С-«СО2е <=* R— сАС02е + R— С—II (7-6)
I I 1
®NH3 ®NH3 ®NH3
ацемизация
иноол серин триптофан
синтез триптофана
(7-7)
Фактически кофермент пиридоксаль-Р катализирует по крайней мере семь
чрезвычайно разных реакций, в которых полностью проявляются его кислотно-
основные свойства и способность к таутомеризации.
Может показаться удивительным, что приведенные выше разнообразные
реакции требуют присутствия одного и того же кофактора, однако это легко
понять, если учесть, что такие реакции обладают определенными общими свой-
ствами. Все они включают образование имина (шиффова основания) между
карбонилом альдегидной группы кофактора и аминогруппой субстрата. Пири-
доксальфосфат становится электрофильным катализатором, или «стоком» элек-
тронов, так как электроны способны смещаться от аминокислоты к кольцевой
структуре. Именно такое направление делокализации электронов определяет тип
реакции, а в модельных системах часто наблюдается протекание реакции в не-
скольких направлениях. Таким образом, фермент не только увеличивает ско-
рость, но и задает направление реакции (разд. 7.2.1).
процесс а-, приводит к декарбоксилированию
процесс Ь: приводит к переамипнрованню
процесс с: приводит к альдольной конденса-
ции и ретроконденсации
В процессе переаминирования пиридоксаль превращается из промежуточ
кого фермент-имина в субстрат-имин. Доказательством сушествования имино-
группы служит восстановление пиридоксаля боргидридом, которое не дает пи-
ридоксина, а указывает на образование ковалентной связи с лизиновым остат-
ком фермента. Для катализа существенно также протоннрование пиридинового
кольца.
Какой выигрыш энергии (если он есть) обеспечивает образование шиффова
основания между ферментом н коферментом? Связанный с ферментом имин
должен обеспечить более быстрый путь протекания реакции, чем связанный с
субстратом имин [301]. Таким образом, именно структура определяет более
высокую активность иминов по сравнению с соответствующими альдегидами,
ролее основный азот образует более прочную водородную связь (с подходящим
Химия коферментов
433
донором водородной связи на поверхности фермента) и протонируется гораздо
сильнее, чем кислород. Кроме того, имннный углерод более электрофилен, чем
карбонильный углерод; следовательно, он легче атакуется нуклеофилами.
Таким образом, промежуточный фермент-имин способствует быстрому об-
разованию ковалентного промежуточного соединения между субстратом и ко-
ферментом.
Роль фосфата заключается в связывании кофермента с соответствующим
рпоферментом. В работе [301] выдвинута интересная гипотеза (рис. 7.9), со-
гласно которой фосфатная и метильная группы служат своего рода осью,
434
Глава 7
Рнс. 7.9. Гипотетический механизм действия пиридоксальфосфата Взято с изме-
нениями из работы [301]; разрешение получено
вокруг которой пиридоксаль может поворачиваться, образуя фермент-иминные
илн субстрат-нмннные ковалентные структуры.
Поскольку в природе все разумно, то такой механизм действительно может
иметь место [301].
7.2.1. Биологическая роль пиридоксальфосфата
Пиридоксальфосфат обладает рядом особенностей, которые де-
лают его великолепным катализатором реакций переаминирования.
Во-первых, гидроксильная группа идеально расположена для того,
чтобы осуществлять общий кислотный и основной катализ. Будучи
внутримолекулярным, такой катализ особенно эффективен. Во-вто-
рых, положительно заряженный азот пиридинового кольца дейст-
вует как «сток» (акцептор) электронов, понижая свободную энер-
Химия коферментов
435
гию таутомеризации С—Н-связи. Наконец, все его функциональные
группы необходимым образом ориентированы относительно фер-
мента.
Добавление иона металла, такого, как А1(Ш), к нефермента-
тивной системе значительно увеличивает каталитическую актив-
ность [302]. Ион металла образует комплекс с имином и действует
как общий кислотный катализатор.
Было показано, что Си (II) и Fe(III) также могут в значитель-
ной степени благоприятно влиять на скорость реакции; выделены
даже реально существующие хелатные промежуточные соединения.
На модельных системах удалось воспроизвести все реакции, ката-
лизируемые Be-ферментами (за исключением реакций декарбокси-
лирования): переаминирование, окислительное дезаминирование,
элиминирование 0- и у-заместителей и т. д. Синтезированы и
изучены в биологической системе многие аналоги пиридоксаля.
Следующие соединения оказались неэффективными:
Эффективные катализаторы приведены ниже:
5‘-йезокси аналог
пиридоксаля
Таким образом, важное значение имеет правильная электронная
Делокализация. Кроме того, необходимо, по-видимому, присутствие
гидроксильной группы для хелатирования ионов металлов. Инте-
ресно, что в случае а-фенил-а-аминомалоновой кислоты в
о
Рис. 7.10. Превращение гомосеринфосфата в L-треонин [301].
о
Рис. 7.10. Превращение гомосеринфосфата в L-треонин [301].
438
Глава 7
присутствии Си (II) и соответствующих модельных соединений (см.
ниже) происходит реакция окисления, не имеющая аналогий в
биологических системах [303].
Следует отметить, что роль иона металла в пиридоксаль-Р-за-
висимых ферментах часто переоценивалась, поскольку большинство
из них не являются металлоферментами. Напротив, роль иона ме-
талла в данных реакциях играет сам фермент.
Чтобы лучше понять механизм действия пиридоксаль-Р, оста-
новимся подробно на реакции (7-3): превращение гомосеринфос-
фата в треонин. Это реакция элиминирования—гидратации. Первый
процесс (рис. 7.10) включает альдимин кетиминную таутоме-
рию — объект внутримолекулярного общего кислотного катализа
близлежащей оксигруппой, за которым следует медленное расщеп-
ление С—Н-связи. Определяет скорость последняя стадия.
Наличие отрицательного заряда на p-углероде может быть про-
демонстрировано улавливанием аниона N-метилмалеинимидом по
реакции присоединения Михаэля. Интересно, что пиридоксальфос-
фат помогает стабилизировать отрицательныай заряд (анионную
форму) на а, р- и у-атомах углерода. Отрицательный заряд в а- и
у-положениях стабилизируется благодаря сопряжению с кольце-
вым атомом азота, в то время как иминный азот стабилизирует
отрицательный заряд в p-положении. В присутствии D2O положе-
ния а и у могут дейтерироваться. Эта характерная последователь-
ность реакций протонирования демонстрирует, что роль пири-
доксальфосфата как электронного стока заключается в стабили-
зации карбанионных промежуточных соединений путем делокали-
зации избыточной электронной плотности [315].
Химия коферментов
439
Следует учитывать, что, поскольку пиридоксаль превращается
в пиридоксамин или соответствующее фермент-иминное промежу-
точное соединение, то он не истинный катализатор! Это скорее
обычный реагент.
Наиболее важная проблема в процессах переаминирования —
выяснение стереохимии. В зависимости от типа реакции и фермента
фермент-коферментный комплекс может удалять из аминокислоты-
субстрата R-группу, карбоксильную группу или водород при «-уг-
лероде. От каких именно структурных особенностей зависит место
разрыва связи? Это, так же как и скорость реакции, определяется
ферментом. Решающий фактор при этом заключается в выборе
наименее энергоемкого пути образования переходного состояния,
ковалентного промежуточного соединения, т. е. наибольшее влия-
ние должна оказывать правильная конформация в ферменте свя-
занного с коферментом субстрата [301].
е н -
ОгСч1^
I
трансаминаза
альЗолаза
соое
ЗекарВоксилаза.
Ориентационная зависимость реакций, катализируемых пиридоксальфосфатсодер-
жащим ферментом.
Лабильная связь всегда перпендикулярна плоскости пириди-
нового кольца, и совокупность ионных, полярных и гидрофобных
взаимодействий в ферменте определяет, какой из конформеров
будет преобладать. Это легко показать, например, с помощью нью-
меновской проекции процесса ферментативного декарбоксилирова-
ния. В конформации, необходимой для декарбоксилирования, кар-
боксильная группа в значительной степени выходит из плоскости
конъюгированной системы. Следовательно, специфичность реакции
определяется главным образом этой стадией. Так, ферментативное
декарбоксилирование аминокислот идет с сохранением конфигура-
ции и обеспечивает, таким образом, синтез оптически чистых «-дей-
терированных аминов, если реакцию
Де [304].
Проекция Ньюмеиа для переходного со-
стояния при декарбоксилировании, ката-
лизируемом пиридоксальфосфатсодержа-
щим ферментом.
проводят в тяжелой во-
440
Глава 7
Связывание металла, если оно происходит, может обеспечивать
различные пути протекания реакций. Интересный пример такого
влияния наблюдается для ь-серилгидроксиметилтрансферазы, ко-
торая может также катализировать переаминирование п-серина.
Центр связывания тот же, но продукты образуются другие:
Ориентация карбоксильной группы, таким образом, определяет
ся здесь структурой связывающего центра [301]. Это демонстри-
рует также важную роль витаминов, поскольку избыток глицина и
серина в системе может оказывать токсичное действие, если вита-
мин В6 присутствует в недостаточном количестве.
Ясно, что помимо протонного переноса пиридоксальфосфат уча-
ствует также в реакциях, включающих образование карбанионов.
При формировании отрицательного заряда на а-углероде амино-
кислоты-субстрата возникает новая проблема — стереохимическая.
Протонируется ли в конечном счете карбанион (несущий отрица-
тельный заряд) в составе комплекса с ферментом путем обмена
протонов со средой или это происходит в результате, таутомерного
превращения кофермента? Какой тип модельных соединений можно
рыбрать для лучшей имитации таких процессов?
Химия коферментов
441
7.2.2. Модельные системы
Данные, приведенные ниже, получены на модельных соедине-
ниях. Они подтверждают существование карбанионных промежу-
точных соединений в пиридоксальзависимых ферментах. Например,
jlMP-исследования в 2Н2О [302] на пиридоксамине в присутствии
Zn(II) или А1(Ш) при pH 1—13 продемонстрировали конденса-
цию субстрата (пирувата) с витамином В6 (пиридоксамином).
Скорость обмена атомов водорода возрастает с увеличением pH.
+
пириВоксамин
Ранее наблюдалось, что комплекс пиридоксамина, этилпиру-
1вата и А1(КЮз)з в метанольных растворах поглощает при 488 нм.
442
Глава 7
Эта полоса в видимой области соответствует наличию карбанион-
ного промежуточного соединения, которое исчезает через несколько
часов, образуя продукты переаминирования.
Следует обсудить и Другие данные. Например, пиридоксамин
в присутствии а-кетокислоты и подходящего фермента дает пири-
доксаль и соответствующую ь-аминокислоту. Если реакцию прово-
дят в D2O, то половина метиленовых атомов водорода в пиридокса-
мине обменивается и образуется только один монодейтерированный
изомер пиридоксамина.
nupuBOKCCLMUH
Imo. же самая
реакция е Da0
,СНО +
'"//г, nh2'h
v аминокислота.-
овин энантиомер (/г-изомер)
та же самая
реакция
е н2о ’
другой энантиомер
(S’-изомер)
Если использовать дважды дейтерированный пиридоксамин для
проведения той же реакции в воде, то половина дейтерия теряется
и получается другой монодейтерированный энантиомер пиридокса-
мина. Кроме того, если используется «-дейтерированная ь-амино-
кислота, то дейтерий переносится стереоспецифически, давая только
один из двух возможных стереоизомеров монодейтерированного
пиридоксамина.
1КхС02Н
Z4D
NH2
+ .сно
только /?-изомер
Имеющиеся сведения [305, 306] относительно этих процессов
в значительной степени дополнены в результате изучения меха-
низма и стереохимии реакций переаминирования. При решении
Химия коферментов
443
проблемы были выделены три главных стереохимических центра:
41/с-н* конформация
X. неизвестна
транс-И*
«/И'
С.соое
4R
абсолютная
конфигурация
известна
предположительно транс
конфигурация
Н*неиэвестна
В = основной остаток
в ферменте
R = боковая цепь
аминокислоты
,СООе
'R
Следовательно, процесс таутомеризации может быть представ-
лен либо как внутримолекулярный (под действием фермента) цис-
перенос, либо как тримс-перенос водорода. Такая перегруппировка
называется таутомерным 1,3-прототропным смещением; известны
попытки с помощью модельных исследований решить стереохими-
ческую неоднозначность:
н*
со2®
и,Л
гр/с-перенос
о
е
т/юм>перенос
ИШ
Биохимические наблюдения [306] привели к гипотезе, что про-
тотропное смещение стереоспецифично и сопряжено с внутренним
цис-переносом. Если это так, то основная группа в апоферменте
должна участвовать в процессе, при котором образуется азаал-
лильное анионное промежуточное соединение (рис. 7.11).
Катализируемая основанием метилен-азаметиновая перегруп-
пировка была подробно исследована [307—310].
I
V-N-С—R'"
I
444
Глава 7
^-изомер
азааллильный анион
(симметричный)
Рис. 7.11. Внутреннее цнс-1,3-прототропное смещение в реакции, катализируемой
пиридоксальфосфатзависимым ферментом. Ру — остаток молекулы кофермента
Для такой карбанионной перегруппировки в растворе, содер-
жащем ЕЮ~—EtOH, можно предложить два механизма: односта-
дийный согласованный механизм
11 ! 1 I хг ।
—С—N=C— т=± —С—N—С— «=* —C=N— С—
I Г" П I
Н + RO—Н НО—R -р Н
RO® НО—R переховное R—ОН eOR
состояние
и двухстадийный, или анионный, механизм
II II
—С—N=C— ?=» —С—N—С—
1 е
' азааллильныи
н _|. анион
RO® ROH Т
eOR
Проведение процесса изомеризации в дейтерированном раство-
рителе позволяет установить механизм, действующий в модельной
системе. Например, в’случае согласованного механизма, протекаю-
щего через симметричное переходное состояние, должна происхо-
дить изомеризация любого дейтрона, включенного из растворителя.
В то же время в случае азааллильного промежуточного соединения
возможно включение дейтрона без последующей изомеризации.
Химия коферментов
445
Наблюдалось именно последнее. Это еще одно доказательство су-
ществования азааллильного промежуточного соединения [307, 308].
Поскольку кинетика этой реакции изучалась в D2O и Н2О, то
следует сделать несколько замечаний относительно Н** D-обмена.
Если исходное соединение имеет «кислый» водород в хиральном
центре, то возможно образование через карбанионное промежуточ-
ное. соединение трех различных продуктов [307]:
<4 с„ сохранение
b»^C—Н *ор’*°а, ь-^С—Н конфигурации
/ без обмена
<4, сохранение
-------» Ь->С—D конфигурации
с обменом -
инверсия
с обменом
инверсия
без обмена
(изоцюерсйя)
। Инверсия (рацемизация) без обмена называется изоинверсией.
Механизм этого процесса подразумевает образование ионных пар.
Действительно, в присутствии краун-эфира, способствующего обра-
зованию ионов, выход рацемата увеличивается [307]. На практике
стереохимический путь многих реакций, катализируемых алкокси-
дами металлов в неполярных растворителях, может быть в корне
изменен при добавлении в среду каталитических количеств краун-
эфиров. По этой причине в средах с низкой диэлектрической про-
ницаемостью ионные пары с карбанионом как отрицательным
ионом играют необычную роль промежуточных соединений. Напри-
мер, изучена скорость обмена kO6n и рацемизации йрац как функция
^обм/^рац
Растворитель—основ ание
ОД (обмен с инверсией)
1 (обмен с рацемизацией)
>1 (обмен с сохранением
конфигурации)
<0.5 (изоинверсия)
МеОН—N(Pr)3
(BuOH—(BuO'K+
СвНв- СвН5ОН - С6Н6О'К+
«ВиОН, ТГФ—N(Pr)3
заместителей в меченном дейтерием 9-метилфлуорене. [309]. Наи-
более интересен случай, когда ko6lll/kvza < 0,5, т. е. случай рацеми-
®ации без обмена. Это имеет место, если X — диметиламид в при-
тствии основания м-пропиламина в смешанном растворителе
446
Глава 7
трет-бутанол — тетрагидрофуран (вместо метанола).
На основании этих результатов сделан вывод, что дейтерий от-
щепляется амином и образующийся аммоний-ион остается спарен-
ным с карбанионом ионной связью. Катион необязательно должен
оставаться в исходном положении, так как резонанс кольцевой
системы обеспечивает делокализацию отрицательного заряда по
всем атомам вплоть до кислорода заместителя. В таком случае
ионная пара, которая теперь лежит в плоскости кольца, может
скользить вдоль планарной структуры или возвращаться в исход-
ное положение, не обменивая дейтерий на протоны растворителя.
Для данного процесса Крам предложил название механизм на-
правленной миграции (основание мигрирует вдоль молекулы),
чтобы объяснить явление изоинверсии. Заметим, что в метаноле
(более сильная кислота, чем трет-бутанол) карбанион гораздо
легче протонируется и поэтому его период полупревращения не
достаточно продолжителен, чтобы обеспечить процесс направленной
миграции.
Следует отметить, что изоинверсия может также происходить
не по механизму направленной миграции. Это наблюдалось опять-
таки в случае 9-метилфлуорена и трет-бутанола в качестве раство-
рителя, однако вместо м-пропиламина как основания в систему
включен пентаметилгуанидин. В пользу другого механизма гово-
рит и тот факт, что нет необходимости в присутствии такого заме-
стителя, как диметиламид. Основание может обеспечить возмож-
ность делокализации зарядов при перемещении дейтрона с одной
стороны плоской кольцевой системы на другую без обмена с раст-
ворителем. Таким образом, дейтрон может присоединяться с любой
стороны плоскости, как это показано ниже:
Химия коферментов
447
После такого короткого экскурса в химию карбанионов можем
теперь приступить к рассмотрению моделей, которые Крам и сотр.
использовали для изучения стереохимического выхода на стадиях
переноса протона при биологических реакциях переаминирования,
осуществляемых пиридоксалем [310]. Были изучены следующие
модельные системы [311]:
(5)-(-)-7-1 i«)-(+)-7-2
W-(-)-7-5 (S)-(-)-7-6.
Как можно видеть, все процессы изомеризации стереоспеци-
фичны. Проведение реакции в [О2Н]-трет-бутаноле способствует
изотопному обмену и дает возможность контролировать направле-
ние реакций.
Например, если исходным соединением является чистый
(S)-(—)-7-5, в присутствии основания диазобицикло [4.3.0] нонена
‘(ДБН) после уравновешивания в течение 811 ч остается <0,5%
|Оптически чистого 7-5, а 30—60% его превращается в (£)-(—)-изо-
мер 7-6. Этот результат свидетельствует о том, что внутренняя
конверсия стереоспецифична и что изомеризация 7-5 ->7-6 «с фрон-
та» преобладает над изомеризацией «с тыла». Объемистые пири-
диновое кольцо и трет-бутильная группа усиливают конформацион-
ную однородность азааллильной системы. Хиральный центр 7-5
рацемизируется без обмена с растворителем. Это соответствует
явлению изоинверсии по механизму направленной миграции. Ин-
версия, по-видимому, происходит через образование мостика между
ДБН и пиридиновым ядром:
448
Глава 7
Хиральный центр 7-6, однако, обменивается с сохранением кон-
фигурации; из-за его большого размера обращение невозможно
В заключение отметим, что таутомеризация происходит внутри-
молекулярно и что 1,3-смещение протона с «фронта» происходит
через азааллильный анион. Однако модель немного отличается от
биологической системы тем, что в ней могут протекать конкурент-
ные стереохимические и изотопные реакции. Таким образом, сте-
реоспецифичность ферментативных реакций, протекающих с уча-
стием коферментов, достигается благодаря апоферментам, в то
время как неферментативные модельные реакции не столь стерео-
специфичны [310].
Это стереоспецифическое превращение может быть выгодно
использовано в случае объемистой аминокислоты, такой, как
ь-треонин, для преимущественно асимметрического синтеза моно-
дейтерированного пиридоксамина:
ь-аминокислота.
5-изомер
Для d- и ь-треонина два продукта пиридоксамина дают разные
первичные изотопные эффекты в присутствии глутаматоксалоаце-
таттрансаминазы.
7.2.3. Самоуничтожающиеся инактиваторы ферментов
и аффинные метки
В широком смысле ферменты специфически ингибируются
тогда, когда их активный центр блокирован физически и/или хи-
мически без значительного изменения остальной молекулы. С це-
лью такого блокирования было разработано множество типов кова-
Химия коферментов
440
лентных ингибиторов. Основная задача заключается в проведении
химической модификации аминокислотного остатка в активном
центре фермента, приводящей к потере каталитической активно-
сти. Наиболее общий подход состоит в синтезе соответствующих по
структуре и химически активных аналогов субстрата изучаемого
фермента. Такие ингибиторы называются необратимыми ингибито-
рами, специфичными к активному центру, или аффинными метками
[312, 313]. В общем случае аффинная метка имеет активный элект-
рофильный заместитель, который может давать устойчивую кова-
лентную связь с нуклеофильной группой активного центра. С по-
мощью таких реакций можно идентифицировать важную для ка-
тализа нуклеофильную группу.
Принципы метода можно проиллюстрировать на примере одного
из первых экспериментов по введению аффинной метки — реакции
N-тозил-ь-фенилаланипхлорметилкетона (ТФХК.) с «-химотрипси-
ном [314].
Тозилфенилаланиновый остаток моделирует такой субстрат, как
метиловый эфир N-тозилфенилаланина, а хлоркетонная группа
(разд. 2.3) действует как электрофил, в котором ион хлора заме-
щается на His-57 активного центра фермента. Аналогично хлорме-
р'илкетонный аналог лизина ингибирует трипсин.
Диизопропилфторфосфат (ДФФ, разд. 4.4) — также необрати-
мый ингибитор активного центра, который блокирует активный
Ьстаток серина в сериновых протеазах. Легко показать, что инги-
бирование необратимо, поскольку после исчерпывающего диализа
Ьермент по-прежнему неактивен.
Напротив, субстраты, производные диазометилкетона, могут
эффективно использоваться как специфичные к активному центру
Ингибиторы тиоловых протеаз. Например, карбобензоксифенилала-
[Ниновый аналог реагирует стехиометрически с остатком цистеина
15 Зак. 549
450
Глава
в активном центре папаина.
II в ®’ II в II
R—С—CH==N=N ----> R— С—CH2-.N=N---> R—С—СН2 + N2
папаина в активном
центре
Однако специфичные к активному центру ингибиторы имеют
два недостатка. Во-первых, это активные молекулы и значительная
часть их просто гидролизуется в водной среде. Во-вторых, они
могут реагировать неспецифически с другими активными остатками
на поверхности белка.
В опубликованных недавно книгах и обзорных статьях можно
найти множество примеров ингибиторов, специфичных к активному
центру [312, 313, 315]. Помимо химической модификации фермента
и аффинного мечения за последние десять лет разработано еще
несколько новых методов. Хотя эти методы и не имеют прямого
отношения к биоорганическому моделированию ферментов, о них
все же следует упомянуть, так как в приложении к биологическим
системам с их помощью можно получить полезную информацию
К ним относятся введение фотоаффинной метки [316] и использо-
вание флуоресцентной спектроскопической линейки [317]. Эти
разработанные недавно методы включают в основном биофизиче-
ские приемы, обсуждение которых выходит за рамки данной книги,
но которые важны для лучшего понимания биологических процес-
сов. Получаемая информация может быть ценным руководством
к планированию и созданию новых биоорганических моделей био-
логически важных макромолекул.
В 70-х гг. стало очевидно, что необходимы новые типы ингиби-
торов с повышенной селективностью. Например, в течение долгого
времени считали, что реагенты на карбонильные группы, такие, как
гидроксиламин и гидразин, в то же время пред-
| ставляют интерес как ингибиторы пиридоксальфос-
СЦ-NH фатзависимых ферментов. Хорошо известный при-
мер — это изоникотинилгидразид (изониазид), один
из наиболее эффективных лекарственных препара-
11 J тов против туберкулеза. Очевидно, это соединение
конкурирует с пиридоксалем за образование гид-
изони зи разона, который блокирует соответствующий фер-
мент киназу. Последний катализирует биосинтез пиридоксальфос-
фата из пиридоксаля и АТР.
Существует также много природных необратимых ингибиторов
ферментов, называемых токсинами. Хорошо известен как токсин
ризобитоксин— р,у-ненасыщенная аминокислота, продуцируемая
Химия коферментов
451
Rhizobium japonicum. Этот природный метаболит — высокоспеци-
фичный необратимый ингибитор пиридоксальзависимой р-циста-
тионазы из бактерий и растений [318].
транс
носн2—сн—сн2—о—сн==сн—сн—СО2Н
nh2 nh2
ризобитоксин
но2с—СН—СН2—S—сн2—сн,—сн—СО2Н
I I
NH2 NH2
цистатионин
Роль р-цистатионазы заключается в деградации цистатионина!
н
в /с°2
еоос—с—сн2д-8—сн2—сн2—аг ф.
1 NH3
сн3—с—со2®
II
о пируват
лО2в
+ СНО + HS—СН2—СН2—СНГ®
NH3
11^1 гомоцистеин
Ингибитор связывается аналогично, но дальнейшие химические
превращения совершенно иные. Введение конъюгированной системы
значительно облегчает атаку соседнего нуклеофила на апофермент.
При этом образуется новая стабильная ковалентная связь, что при-
водит к необратимому ингибированию фермента и препятствует
нормальному метаболическому функционированию системы.
15*
452
Глава 7
Важно понимать, что природный токсин устроен таким образом,
что нуждается в химической активации со стороны фермента. В ре-
зультате активации между ингибитором и ферментом протекает
реакция, которая приводит к необратимому ингибированию послед-
него. Таким образом, фермент благодаря специфичности своего
действия катализирует собственную инактивацию, или «самоунич-
тожение».
На практике многие хорошо известные лекарственные препа-
раты обладают свойством ингибировать тот или иной фермент, но
только некоторые из них предназначены именно для этой цели.
Познание структуры и механизма действия ферментов заметно
продвинулось вперед за последние два десятилетия. В связи с этим
поиск специфических ингибиторов ферментов с целью их использо-
вания в фармакологии стал еще более заманчивым. Чтобы такие
поиски увенчались успехом, необходимо получить по возможности
больше сведений о специфичности фермента, а также о второсте-
пенных центрах связывания вблизи его активного центра, если
таковые существуют. Интенсивные исследования в этом направле-
нии привели к разработке новой интересной группы необратимых
ингибиторов ферментов: активируемых ферментом необратимых
ингибиторов, или, как их иначе называют, самоуничтожающихся
инактиваторов ферментов [313, 318, 319]. Смысл выражения «са-
моупичтожающийся инактиватор» не совсем определен, но тем не
менее это выражение используется.
Этот тип ингибиторов очень перспективен, так как потенциаль-
но активная группа в присутствии некоторых ферментов или
in vivo может быть достаточно безвредной до тех пор, пока нужный
фермент не активирует ее. При изучении таких процессов исследо-
ватель должен быть вооружен знаниями органической и физиче-
ской химии ферментов [315].
Идея самоуничтожающихся ингибиторов или инактиваторов
ферментов может получить широкое распространение, если хими-
кам-органикам удастся синтезировать правильно спроектирован-
ные аналоги субстратов определенных ферментов. Естественно, что
создание новых самоуничтожающихся инактиваторов ферментов
подразумевает все более высокий уровень химических знаний.
В основном работы по самоуничтожающимся ингибиторам выпол-
нены на непротеолитических ферментах, в частности на пиридок-
саль- и флавинзависимых ферментах.
Паргилин является мощным необратимым ингибитором флавин-
зависимой моноаминоксидазы. Он уже применяется в клинической
практике. Фермент катализирует инактивацию биологически важ-
ных катехоламинов. Паргилин образует ковалентную связь с фер-
ментом через флавиновый кофактор; предполагаемый механизм
его действия изображен на схеме 7.1.
В то же время р,у-ненасыщенные аминокислоты, у-ацетилен-
аминокислсты или аминокислоты, имеющие в р-положении
Схема 7.1.
454
Глава 7
хорошую уходящую группу, являются потенциальными ингибито-
рами пироксальзависимых ферментов, участвующих в метаболиз-
ме аминокислот. Первые два типа аминокислот активируются
либо благодаря образованию карбаниона вблизи ненасыщенной
связи, либо благодаря двухэлектронному окислению до связан-
ного конъюгированного кетимина.
Для галогенсодержащих соединений катализируемое ферментом
отщепление НХ дает аминоакрилат шиффова основания. Во всех
случаях активированные электрофилы атакуются нуклеофильными
группами ферментов в активном центре или вблизи него.
Нет необходимости доказывать, что создание таких ингибиторов
имеет важное терапевтическое значение. Для успешного конструи-
рования их необходимо выполнить три условия:
1) фермент или фермент-коферментный комплекс должны
превращать химически неактивную молекулу в активную;
2) активная молекула должна возникать вблизи самого важ-
ного остатка в активном центре, располагаясь на расстоянии длины
связи;
3) конструируемые активные частицы должны быть таковы,
чтобы реакция могла протекать в основном с группой в активном
центре, а не с внешним нуклеофилом.
Таким образом, безвредное соединение должно превращаться
в мощный ингибитор, при этом фермент служит орудием своего
собственного разрушения. Приведем несколько примеров *.
* Совсем недавно разработан галогенсульфоксидный ингибитор, который в
присутствии некоторых пиридоксальфосфатзависимых ферментов превращается
в активный аллилсульфенат [360].
R'
активный
аллилсульфенат
Nu
/ (нуклеофил
/ на поверхности
I фермента)
R-s'0
Химия коферментов
456
Пример 1. Серин-О-сульфат и p-хлораланин оба ингибируют действие ас-
партатаминотрансферазы [320] и аспартат-р-декарбоксилазы [321].
Обычный процесс:
Процесс в присутствии ингибиторов:
В — основная группа в ферменте; Nu = нуклеофильная группа в ферменте;
R = —Cl, —SO4"; Ру = пиридоксалевое ядро.
Пример 2
СН3О___л
н^сн-соон
nh2
2-амино-З-метокси-
транс- 3-бутановая
кислота (замещенный
винилглицин) - анти-
биотик, ингибирующий
асцартаттрансами-
назу [315]
С
Пример 3.
Н
С
^со2®
н—С
I®
NH3
у-ацетиленовый
аналог ГАМК,
который блокирует
ГАМК-трансаминазу
в мозгу [322]
СН2 S
н
с
IIH
с
н
с
со,е
.Nu
сн2
„алленовый тип
(акцептор в реакции
присоебинения)
- _СО2е
со2е
Химия коферментов
457
Приведенный в примере 3 аналог у-аминомасляной кислоты (ГАМК) [322],
по-видимому, чрезвычайно перспективен для клинического использования в ка-
честве антиэпилептического средства.
Пример 4.
Пример 5
производное
а,а- дихлорпируеагпа
458
Глава 7
Большинство приведенных примеров показывает, что в основе
механизма действия самоуничтожающихся ингибиторов ферментов
лежит отщепление протона. По этой причине пиридоксальзависи-
мые ферменты являются наиболее вероятными объектами такого
ингибирования. В будущем можно ожидать появления еще боль-
шего числа ингибиторов пиридоксальзависимых ферментов, меха-
низм действия которых основан на инактивации функциональной
группы, обусловленной карбанионной природой промежуточных
соединений [315]. Весьма вероятно, что именно создание более
селективных ингибиторов активного центра продвинет вперед раз-
работку самоуничтожающихся ферментативных ингибиторов, или
инактиваторов. По сравнению с рассмотренными ранее специфич-
ными к активному центру необратимыми ингибиторами преиму-
щество самоуничтожающихся ингибиторов состоит в том, что,
будучи относительно нереакционноспособными, они становятся
активными после взаимодействия с остатками в активном центре
фермента. Активная форма зависит от каталитических особенно-
стей конкретного активного центра. Таким образом, ингибирование
катализируется самим ферментом. Однако оба типа ингибирования
позволяют вводить метку и идентифицировать группы активного
центра и функциональные группы ферментов.
7.3. Тиамин
Как видно из разд. 7.1, суть большинства химических реакций,
протекающих в биологических системах, заключается в окислении
или восстановлении одного или более реагентов. Однако особенно
важный тип реакций, к которому, очевидно, относятся многие фер-
ментативные реакции, не связанные с окислением — восстановле-
нием,— это реакции, включающие перенос протона и сопровождаю-
щиеся общим основным или кислотным катализом. Естественно,
многие из этих ферментативных превращений осуществляются
с помощью небелковых кофакторов или коферментов. К таким
коферментам относятся некоторые серосодержащие коферменты,
среди которых тиаминпирофосфат (часто называемый витамином
Bi) имеет наибольшее значение. Сейчас уже очевидно, что ме-
ханизм действия тиаминпирофосфата включает участие карбанио-
на в качестве промежуточного соединения. Правда, некоторые
особенности этого процесса еще недостаточно изучены.
Кофермент участвует в реакциях, в результате которых образуются и раз-
рушаются углерод-углеродные связи, непосредственно прилегающие к карбо-
нильной группе. В качестве примеров служат реакции неокислительного и окис-
лительного декарбоксилирования и альдольной конденсации, например неокис-
лительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты до ацетальдегида:
,О
сн3—С—соон сн — cf + со,
бекар бо- 3 \ 2
Q ксилоза, Н
пировиноградная ацетальбе&иЗ
кислоту
Химия коферментов
459
Он также участвует в образовании ацетилфосфата:
СН2ОН
НО— + Pj «=± —он
-он
СН2ОРО326
5-фосфоксилулоза
СН2ОРО326
3-фосфоглицер-
алъЗегий
JjH3
(УОРО|е
ацетил-
tpoctpam
а также в следующей конденсации:
СН2ОН
СН2ОН
=о
но-
оксиацетальвегиЗ
—он
СН2ОРО326
5-фосфоксилулоза
— +
СНО
|—он
СН2ОРО32®
З-фосфоглицеральЗегиЗ
Для понимания механизма этих конденсаций стоит провести простейшую
аналогию между поведением тиамина и механизмом действия цианид-иона при
катализе бензоиновой конденсации [301]:
с№ /Ов /°Н
R—С^ =4 R—СН R—С® ^212
XCN XCN
е Н ,НЧ
О "О ,С’О' О О'' О
"’ll Ч I II I
R—С---С—R 5=t R—С--С—R R—С--С—R
II Я I I
CN Н 4CN Н + Н
R =С6Н<; Зензоин CN®
Чтобы объяснить такое поведение тиамина, обратимся к его структуре.
Кофермент тиаминпирофосфат (тиамин-РР) содержит тиазолиевую кольцевую
систему:
тиамин-РР (трр)
Бреслоу [324] первым установил на основании данных ЯМР-спектроскопии,
что тиазолий-ион обладает кислотными свойствами и что водород при С-2
460
Глава 7
может обмениваться на дейтерий в тяжелой воде при щелочных значениях pH
сильная кислота
илиб (биполярный ион)
В чем состоит роль пиримидиновой части кофермента’ Можно лишь только
предполагать, что аминогруппа при атоме С-4' достаточно близко подходит к
водороду у С-2 и действует как слабое основание, облегчающее образование
биполярного тиазолий-иона. Проведенные недавно 13С-ЯМР-исследования солей
тиамина свидетельствуют о том, что это действительно имеет место, а рентгено-
структурный анализ показал, что в кристаллических соединениях тиамина вза-
имная ориентация двух колец благоприятствует выполнению этой функции
[325]. Такой процесс мог бы осуществляться с помощью фермента, и прото-
нирование N-1' содействовало бы протеканию процесса. В самом деле, при на-
личии метильной группы у атома N-1' пиримидинового кольца в нем возникает
положительный заряд, который придает этому производному тиамина более
сильные каталитические свойства, чем у тиамина, участвующего в ферментатив-
ных реакциях [326]. Положительный заряд на пиримидине, по-видимому, уско-
ряет образование илида, декарбоксилирование и образование ацетоина по срав-
нению с тем, что происходит в случае природного витамина.
Весьма вероятно [273], что фермент может стабилизировать минорный
таутомер аминопиримидинового кольца. -При этом образуется система переноса
заряда, в которой азот (в иминоформе) пиримидинового кольца способствует
удалению атома водорода при С-2 тиазолиевого кольца.
Одно из удивительных свойств тиамина состоит в том, что тиазолиевое
кольцо образует ковалентное промежуточное соединение с субстратом и может
действовать либо как электрофил, либо как нуклеофил. Таким образом, этот
катализатор способен выполнять двоякую функцию. Другими словами, элек-
тронная плотность может сдвигаться от расщепляемой связи к структурным
Химия коферментов
461
элементам кофермента (в направлении к группе — N—), а затем обратно к
I
образующейся вновь связи. Например, илид имеет нуклеофильный карбанион,
который может конденсироваться с пировиноградной кислотой и другими а-ке-
токислотами
Тиазолий-ион ведет себя как «хранилище электронов», или электрофил, и
1происходит декарбоксилирование. В то же время енольное промежуточное со-
единение действует как нуклеофил и может протонироваться Это промежуточное
(соединение удалось выделить. Наконец образуется ацетальдегид и одновре-
менно регенерируется кофермент (в форме нлида) Освобождение ацеталь-
дегида — вот скоростьлимитирующая стадия механизма действия пируватде-
карбоксилазы.
Следует ясно понимать, что нуклеофильное енольное промежуточное со-
единение (оксиэтилтиаминпирофосфат)— именно та форма, в виде которой ко-
[фермент, как правило, встречается в природе; эта форма может реагировать
с другими нуклеофилами, такими, как ацетальдегид (альдольная конденсация)
(см с. 462)
Промежуточное соединение, таким образом, является мощным нуклеофилом
и присоединяется по карбонильной группе с образованием углерод-углеродных
.связей. Среда должна быть щелочной, чтобы обеспечить достаточное количество
илида, но в то же время и не слишком щелочной, иначе в значительной сте-
пени произойдет раскрытие тиазолиевого кольца.
Вторая молекула пировиноградной кислоты также может присоединяться
к этому же промежуточному соединению, давая после декарбоксилирования
молекулу ацетоина. Как сообщалось, в процессе реакции, катализируемой фер-
ментом пируватдекарбоксилазой, обнаруживаются лишь следовые количества
[ацетоина.
462
Глава 7
ОН
оксизтилтиаминпиро-
фосфцт (биологический
„активный альвегиЗ")
нуклеофила и в реакциях
действует в паре с тиамин-
Оксиэтилтиаминпнрофосфат выступает в роли
с липоевой кислотой. В природе липоевая кислота
пирофосфатом. Это превращение соответствует восстановительному ацилирова-
нию липоевой кислоты и впервые было постулировано Ингрехемом [327].
Интересной особенностью механизмов этих реакций является превращение
\6- \
пировиноградной кислоты (тип /C=OJ в ацетилтиоэфир липоевой кислоты
(тип С=о ]. Такое превращение необычно для классической органической
Химия коферментов
463
химии. Оно объясняется тем, что сера в тиоэфире может использовать при обра-
зовании связей свои вакантные орбитали *.
липоееая кислота
(ковалентно присо-
единена к субъеЗинице
фермента)
* Синтондитиан — один из ближайших органических аналогов, в котором
соединение типа ^С=О превращается в соединение типа ^С=О
В органической химии известны и другие аналогичные примеры:
тпип
r8o
тип RCO
И—СООН
СН,—С—СООН
NalO,
CH}-COQH
9
464
Глава 7
При рассмотрении механизма действия липоевой кислоты следует упомя-
нуть о соединениях мышьяка — древнейших, хорошо известных ядах. Совсем
недавно органические соединения мышьяка стали использоваться как фунги-
циды и инсектициды Наибольшее значение как токсичные вещества имеют со-
единения трехвалентного мышьяка Например, арсенит (O=As—О-) известен
своей тенденцией быстро реагировать с тиольными группами, и особенно с ди-
тиолами, такими, как восстановленная липоевая кислота. В результате, бло-
кируя окислительные ферменты, которые нуждаются в липоевой кислоте, ар-
сенит вызывает накопление пирувата и других а-кетокислот.
R СООН
Рис 7.12. Аналогия между цианид-ионом и тиазолий-ионом в тиамин-РР.
Описанные выше превращения тиамина ясно показывают аналогию ти-
амина с цианид-ионом, поскольку образующийся анион сравнительно устойчив
благодаря частичной делокализации отрицательного заряда атомами углерода
и азота (рис. 7.12). Поскольку атом азота в тиазолиевом кольце уже имеет
положительный заряд, то он, по-видимому, еще в большей степени, чем цианид-
ион, стабилизирует отрицательный заряд. По этой причине его можно назвать
«биологическим цианидом» [301].
Кроме того, аддукты, образующиеся между тиамин-РР и субстратами,
можно сравнить с Р-кетокислотами и (З-кетоспиртами, которые легко подвер-
гаются Р-расщеплению:
соответствует
Химия коферментов
465
7.3.1. Конструирование моделей тиамина
Имеются сообщения о создании лишь нескольких биомоделей
тиамина, в числе которых N-бензилтиазолий-ион. При pH 8,0 и
25°С он легко может декарбоксилировать пировиноградную кис-
[.лоту и модифицировать другие субстраты:
Эти реакции подчеркивают роль активной части тиамина как кон-
денсирующего агента.
При изучении других тиазолиевых соединений, участвующих
в катализе ацетоиновой конденсации, было обнаружено, что бло-
кирование положения 2 объемистым заместителем (изопропилом)
или введение метильной группы в это положение лишает тиазолие-
вую соль каталитических свойств [328].
активное соединение
неактивное соединение
неактивное соединение активное соединение
Кроме того, большая эффективность катализа в случае N-бен-
зилового аналога по сравнению с N-метиловым аналогом заставила
Бреслоу предположить, что бензильная группа благодаря индук-
тивному эффекту увеличивает активность катализатора. Аналогич-
ная роль постулируется для пиримидинового кольца тиамина,
466
Глава 7
Вот другая интересная модель:
Здесь тиаминовый аналог, являясь хорошей уходящей группой,
ведет себя как «высокоэнергетический» ацилирующий агент [327].
Недавно с помощью другого подхода была исследована актив-
ность полученных из тиазолиевых солей ациланионных соединений
(биологический «активный альдегид») по отношению к содержа-
щим серу электрофилам. При этом была построена модель стадии
образования тиоэфиров, катализируемой содержащими липоевую
кислоту ферментами. Результаты заставляют предполагать, что
биологический синтез тиоэфиров кофермента А из а-кетокислот
происходит путем прямого восстановительного ацилирования свя-
занной с ферментом липоевой кислоты «активным альдегидом»
(разд. 7.3).
Чтобы определить химическую основу связывающей способно-
сти тиаминзависимых ферментов, была изучена [337] реакция тиа-
мин-РР и метилацетилфосфоната в водном растворе карбоната
натрия. Этот субстрат — аналог пировиноградной кислоты — свя-
зывается с пируватдегидрогеназой, но не может участвовать во
всех многостадийных ферментативных процессах.
О О
II 11/0®
СН3—С—Р^
осн3
!Н
сн3-с
'С2Н4Р2О7зе
В самом деле, фосфатный аддукт напоминает активное проме-
жуточное соединение а-лактил-ТРР (см. обычный процесс в
Химия коферментов
467
разд. 7.3), но реакция не может идти дальше, поскольку уходящей
группой должен был бы стать метилметафосфат, а это, естествен-
но, подразумевает преодоление большого энергетического барьера
[337]. Кроме того, в процессе реакции возникает хиральный центр,
и образующийся аддукт представляет собой рацемическую смесь.
Кинетические данные показали, что оба энантиомера связываются
с апоферментом, но при этом только один из них превращается
опять в тиамин-РР, хотя, конечно, его истинная конфигурация не
известна. Этот пример иллюстрирует возрастающее значение для
биоорганической химии теории образования генерируемых фермен-
том активных «аналогов переходного состояния».
Весьма вероятно, [301], что в результате химической эволюции
тиамин-РР должен был структурно «приспособиться» к своей био-
логической роли. Например, алкилированное шиффово основание
шиффово
основание
R—N
является недостаточно основным, чтобы выступать в качестве ка-
тализатора в бензоиновой конденсации.
В то же время циклическая форма тиоамида (енольная форма)
в принципе могла бы быть катализатором, но, как оказалось, она
слишком неустойчива в воде и реагирует подобно
шиффову основанию с образованием системы с ра-
скрытым кольцом.
Возможно, если серу заменить на азот, то по-
ложительный заряд будет стабилизироваться обо-
ими атомами азота и водород останется достаточно
кислым, чтобы соединение действовало как
if
циклический
тиоамиЗ
катализатор. Оказалось, что такое соединение устойчиво в воде
и водород достаточно лабилен, чтобы обмениваться с D2O. Кис-
лотность приписывается карбеновой резонансной структуре, ко-
илиЭ
Ph
карбен
торая помогает стабилизировать промежуточный карбанион. Од-
нако это соединение не обладает каталитической активностью к
бензальдегиду. Вместо этого образуется продукт присоединения,
468
Глава 7
что можно объяснить таким механизмом [301]
Следовательно, промежуточный карбанион недостаточно нук-
леофилен, чтобы реагировать с другой молекулой бензальдегида.
Из него в основном образуется кетон. Для протекания бензоино-
вой конденсации необходимо соединение, образующее менее ста-
билизированный карбанион. Если резонансная стабилизация
слишком велика, то хороший нуклеофил не образуется, а внутри-
молекулярно идет процесс образования кетона. Очевидно, реше-
ние проблемы заключается в частичной реализации ароматиче-
ской системы. Атом серы, практически не пре-
доставляя свои электроны для л-связей, затрудняет
ароматизацию кольца. И таким образом, един-
ственная возможность для таких структур — обра-
тиазолий-ион зование тиазолий-иона.
О синтезе подобных соединений уже упоминалось ранее. Напри-
мер, было синтезировано соединение с R-бензилом, и оказалось,
что это прекрасный катализатор бензоиновой конденсации. Инте-
ресно, что хорошо известные химикам-органикам оксазолиевые
соли обменивают протоны быстрее, чем тиазолиевые соли. Оба
эффекта — л-перекрывание, стабилизирующее катион, и оттяги-
вание Q-электронов (индуктивный эффект), стабилизирующее
анион,— сильнее у кислорода, чем у серы.
R
оксазолий- ион
В таком случае, не ошиблась ли природа, выбрав тиазолие-
вую кольцевую структуру, а не оксазолий-ион? Естественно ответ
отрицательный, поскольку оксазолиевые соли просто не катали-
Химия коферментов
469
зируют бензоиновую конденсацию. Продукты не образуются, по-
тому что система слишком устойчива и потому неактивна к бен-
зальдегиду. Другими словами, неустойчивость оксазолиевой си-
стемы слишком незначительна, чтобы она реагировала с карбо-
нильной группой. Следовательно, тиамин-РР — тщательно отоб-
ранный природой катализатор, и его структура оптимальна для
проведения реакций подобного рода. Такой анализ «адаптации»
тиамин-РР к его роли должен помочь понять, как в общем случае
фланировать и создавать будущие биоорганические модели ко-
ферментов.
7.4. Биотин
Биотин был впервые выделен и идентифицирован как фактор
роста дрожжей в 1935 г. Вопреки наблюдавшемуся в 40-х гг. бы-
строму прогрессу в области изучения водорастворимых витами-
нов функция биотина оставалась тайной до 1959 г., когда Линен
и сотр. заметили, что бактериальная р-метилкротонил-СоА-кар-
роксилаза осуществляет карбоксилирование свободного (+)-био-
гина в отсутствие своего природного субстрата СоА-тиоэфира.
В то же самое время с помощью рентгеноструктурного анализа
Ьктивной (+) -формы было обнаружено, что два кольца соеди-
нены и находятся в г{цс-конформации и атомы водорода при
трех асимметричных атомах углерода находятся в ^цс-положении.
Из структуры видно, что N-3' уреидогруппы не может вступать
в реакцию, так как этому препятствует пятиуглеродная боковая
Цепь валериановой кислоты. Расстояние между N-3' и С-6 со-
ставляет всего лишь 0,28 нм. И только затем прояснился меха-
низм действия биотина; реакция переноса СО2 осуществлялась
путем обратимого образования l'-N-карбоксибиотина.
Сера в биотине может легко окисляться до сульфоксида или
(сульфона, причем оба этих соединения биологически активны.
Дезтиобиотин, биосинтетический предшественник биотина, в ко-
тором сера отсутствует и ее место занимают два атома водо-
рода, и оксибиотин, в котором атом серы замещен кислородом,
также оба биологически активны во многих организмах. Следо-
вательно, наличие серы, по-видимому, не обязательное условие
биологической активности соединения.
470
Глава 1
Биотин (или витамин Н, когда речь идет о человеческом ор-
ганизме) является необходимым кофактором ряда ферментов,
которые несут различные метаболические функции. Более десятка
различных ферментов используют биотин. К наиболее известным
относятся ацетил-СоА-карбоксилаза, пируватдекарбоксилаза, про-
пионил-СоА-карбоксилаза, карбоксилаза мочевины, метилмало-
нил-СоА-декарбоксилаза и оксалоацетатдекарбоксилаза. Биотин
служит ковалентным переносчиком СО2 в реакциях, в которых
СО2 фиксируется на акцепторе с помощью карбоксилаз. Затем
карбоксильная группа в независимой реакции переносится транс-
карбоксилазами от одного акцепторного субстрата к другому или
же может удаляться в виде СО2 под действием декарбоксилазы.
Позже Линен показал, что 14С-бикарбонат-ион является луч-
шим субстратом, чем свободный 14СО2, так как включается в про-
дукт гораздо быстрее. Для протекания реакции необходимы также
АТР и Mg(II). В настоящее время существуют убедительные до-
казательства того, что весь процесс, катализируемый биотинил-
ферментным комплексом, протекает в две стадии (Е — фермент):
Е-биотин + АТР + НСО^ Е-биотии—СОр + ADP + Pf (7-8)
Е-биотин—СОР + акцептор Е-биотин + акцептор—COf* (7-9)
ATP + НСО® + акцептор ADP + Р,- + акцептор—СО® (7-10)
Начальная стадия включает образование карбоксибиотинил-
фермента. На второй стадии происходит перенос карбоксильной
группы от карбоксибиотинилфермента на подходящий субстрат-
акцептор, причем природа этого акцептора зависит от участвую-
щего в реакции фермента. Короче говоря, функция биотина за-
ключается в осуществлении сопряжения между расщеплением АТР
и карбоксилированием. Это достигается двухстадийным процессом,
в ходе которого образуется промежуточное соединение — кар-
боксибиотин. При перекарбоксилировании АТР не нужен, по-
скольку субстратом служит «активированный карбонат», а не
НСОз’.
Такие биохимические превращения происходят в полифермент-
ном комплексе, включающем по крайней мере три различных
белка: биотинпереносящий белок (Л! = 22 000), биотинкарбокси-
лазу (АТ = 100 000) и биотинтрансферазу (Л! = 90 000). Каждый
процесс, катализируемый своим белком, входящим в состав поли-
ферментного комплекса, специфически протекает в своем актив-
ном центре, а биотин ковалентно связан амидной связью с е-ами-
ногруппой остатка лизина в белке-переносчике [338, 339]. Мосс
и Лейн предложили модель ацетил-СоА-карбоксилазы из Е. coll,
в которой основная роль биотина в процессе катализа заключа-
лась в обратимом переносе фиксированного СО2 или карбоксиль-
Химия коферментов
471
ной группы между двумя активными центрами. Следовательно,
реакции, катализируемые биотинзависимой карбоксилазой, проте-
кают через промежуточный карбоксилированный ферментный
комплекс, в котором ковалентно связанная биотиновая простети-
[ческая группа действует как мобильный переносчик карбоксиль-
|Рис. 7.13. Схематическое изображение ацетил-СоА-карбоксилазы из Е. coli [338].
ных групп между удаленными друг от друга каталитическими
|центрами (рис. 7.13).
В основном биотин ведет себя как переносчик СО2 между двумя центрами.
{Схематически это можно представить следующим образом: биотпнкарбокси-
азный активный центр катализирует карбоксилирование биотиновой простети-
ческой группы в переносящем белке. Вслед за транслокацией карбоксилирован-
кой функциональной группы от активного центра карбоксилазы к активному
►центру карбокситрансферазы происходит перенос карбоксильной группы от
[СОг-биотииа к ацетил-СоА. По-видимому, свободный (+)-биотин может иметь
[доступ к центру карбоксилирования, поскольку простетическая группа присо-
единена к белку посредством боковой цепи (длина этой «ножки» 1,4 нм) и
(Может удаляться от активного центра и приближаться снова. Однако тщатель-
ные биофизические исследования транскарбоксилазы, которая катализирует пе-
ренос карбоксильной группы от метилмалоиил-СоА к пирувату, показывают, что
карбоксибиотин перемещается во время переноса СО2 не более чем на 0,7 нм
340]. Таким образом, роль длинной «ножки» (1,4 нм), по-видимому, сводится
[к присоединению переносимой карбоксильной группы к концу длинного «зон-
да». При этом карбоксильная группа получает возможность поворачиваться
вслед за «отверстием», образующимся на стыке трех субъединиц, и распола-
гаться между центрами связывания кофермента А и пирувата.
Каким химическим механизмом можно объяснить две неза-
висимые реакции карбоксилирования и перекарбоксилирования,
(о которых уже упоминалось? Биотин — это активатор СО2, в ко-
кором молекула СО2 ковалентно связана с енольной формой ко-
фактора. Каков бы ни был механизм, он должен согласовываться
с экспериментальными данными, свидетельствующими о том, что
при использовании 18О-меченого бикарбоната две трети введенно-
го кислорода обнаруживается в карбоксилированном биотине,
9 одна треть — в неорганическом фосфате, отщепляемом от АТР,
472
Глава 7
Известны три гипотезы, согласующиеся с описанными выше наблюдениями.
В 1962 г. Очоа впервые предложил двухступенчатый механизм, который вклю-
чает активацию бикарбоната с помощью АТР с образованием карбонилфосфата.
О • о • ьысокознерге-
II й II -очень и и " тический
Adp—о—р—о с ео—р 'w с— «н интеРмевиот
Mg2+ О4"-*?7 Х>Н П Vo карбонил-
ов е % V фосфат
HnAnH
R
форма) через нуклео-
фильную атаку
Затем этот активированный бикарбонат реагирует со связанным с ферментом
биотином, давая l'-N-карбоксибиотин — другое активированное карбонатное
производное. Эти два процесса могут происходить согласованно, что в течение
некоторого времени было общепринятой концепцией. Промежуточный l'-N-кар-
боксибиотин устойчив в щелочных условиях, но легко декарбоксилируется в
кислой среде. В приведенном выше примере карбоксибиотин реагирует с еноль-
ной формой ацетил-СоА, давая малонил-СоА и регенерированный биотин. Как
и ожидали, один атом кислорода бикарбоната появляется в фосфат-ионе, а
два других — в карбоксильной группе малонил-СоА.
Клугер и Адавадкар [341] предложили интересный вариант механизма,
согласно которому первая стадия включает образование О-фосфобиотина, ана-
логичного по структуре аддуктам фосфатов с карбодиимидом (рис. 7.14). По-
добные аддукты О-фосфорилмочевины уже обсуждались в гл. 3.
Изоимидный интермедиат (О-ацилмочевина) реагирует с бикарбонатом, а
затем разлагается, образуя l'-N-карбоксибиотин и фосфат-ион. Чтобы подтвер-
дить существование этого интермедиата, было синтезировано интересное модель-
ное соединение (разд. 7.4.1).
Наконец, Сталлингс [342] предложил третий механизм, основанный на
изучении образования водородных связей в кристаллической структуре био-
тина (рис. 7.15). По его мнению, биотин и бикарбонат образуют комплементар-
ные водородные связи и дают «устойчивый» интермедиат. Приближение АТР
инициирует карбоксилирование путем поляризации связи и кето-енольной тауто-
меризации уреидогруппы, что увеличивает нуклеофильность положения N-1'.
Участие енольной формы биотина подтверждается кристаллографическими ис-
следованиями биотина. Заметим, что предыдущий механизм такж^ подразуме-
вает образование енольного промежуточного соединения.
Химия коферментов
473
ангийрийный интермеЭиат
„карбоЭиимибного" шила
ср.с
активированная
с ломоцью ДЦГК
кислота
Рис. 7.14. Возможный механизм действия биотина [341].
Следовательно, участие АТР смещает равновесие в сторону енольной фор-
мы. Этот последний механизм — пример активации субстратом Связывая би-
карбонат, данный субстрат увеличивает нуклеофильность биотинового кофак-
Рис. 7.15 Другой гипотетический механизм действия биотина [342].
тора. Однако нельзя исключить образования активированного бикарбоната, как
предполагает первый механизм. Во всех трех рассмотренных случаях роль
ионов Mg(II) может заключаться в связывании ADP. Интересно также, что
во всех трех случаях действие биотина состоит в активации путем фосфори-
лирования, что напоминает многие реакции, приведенные в гл. 3.
связанный с ферментом биотин
НСО,в + ЛТР
свобойный биотин
|нсо3в+лтр
З'-N с выходом 6%
Рис. 7.16. Идентификация центра карбоксилирования в свободном и связанном
с ферментом биотине [343].
Химия коферментов
475
Теперь, объективно рассмотрев все три механизма, которые
согласуются с экспериментальными данными, коснемся наиболее
важной проблемы функционирования биотина. В последние годы
i возникли противоречия относительно локализации в нем центра
(связывания карбоксильной группы. При выделении и идентифи-
кации сравнительно неустойчивого, особенно при кислых значе-
ниях pH,'свободного карбоксибиотина установлено, что при об-
работке диазометаном он превращается в более устойчивый ди-
метиловый эфир [343, 344]. Это производное впоследствии было
идентифицировано как Г-Ы-метоксикарбонил-(+)-биотинметило-
вый эфир. Тот же самый продукт был также получен в резуль-
’ тате протеолитического расщепления связанного с биотином фер-
। иента. На рис. 7.16 показаны некоторые из подобных превра-
щений.
На основе описанных экспериментов с использованием различ-
имых биотинзависимых ферментов можно сделать вывод, что центр
карбоксилирования в биотине—l'-N-атом уреидогруппы, что со-
гласуется также с другими наблюдениями [344]. Однако Брюис
и Хегарти [330] показали, что приписываемая l'-N-карбоксилу
роль активной группы весьма сомнительна. Они считают, что
сначала происходит карбоксилирование 2'-О-атома уреидогруппы,
но при метилировании, применяемом для выделения карбоксибио-
гина, О-карбоксилированный продукт может перегруппироваться
путем перемещения карбоксильной группы в более термодинами-
чески устойчивое замещенное при l'-N-атоме уредогруппы произ-
водное биотина.
Вопрос состоит в том, что происходит в первую очередь:
N-карбоксилирование [344] или О-карбоксилирование [330] по
наиболее нуклеофильному центру, кислороду мочевины, за кото-
вым следует миграция к азоту? Очевидно, для понимания функ-
циональной роли уреидогруппы необходимо использование био-
юрганических моделей.
\7.4.1. Модельные исследования
Поскольку биотин участвует в реакциях карбоксилирования,
ро-видимому, как нуклеофильный катализатор, Каплоу и Ягер
[[331] использовали в качестве аналога биотина имидазолидон-2.
^Исследования декарбоксилирования М-карбокси-2-имидазолидона
476
Глава 7
показали, что имидазолидон-анион — плохая уходящая группа.
Ионы металлов, таких, как Си (II) или Mg(II), предотвращают
декарбоксилирование. Чувствительность карбоксиимидазолидона
О к специфическому кислотному катализу является
II по-видимому, наиболее удивительным свойством
HNNH этого соединения, которое могло бы объяснить
\! тот факт, что карбоксибиотинферментные про-
ими0азоли0он-2. меЖуТОчные соединения неустойчивы. Нейтраль-
ная форма, однако, может декарбоксилироваться внутримолеку-
лярно через шестичленное переходное состояние.
СО2 + HN № плохо
СО2 + HN N
Хорошо
Неудачные попытки ацилировать модельное соединение п-нит-
рофенилацетатом, ацетилимидазолом или хлоридом ацетил-3-ме-
тилимидазолия также свидетельствует о том, что N-атом уреидо-
группы биотина недостаточно сильный нуклеофил. Тем не менее
внутримолекулярная модельная реакция, при которой взаимодей-
ствующие функциональные группы располагаются рядом друг
с другом надлежащим образом, должна гораздо лучше соответ-
ствовать ферментативному процессу.
Например, изучена внутримолекулярная нуклеофильная атака
нейтральной или отрицательно заряженной уреидогруппы по ацил-
содержащим субстратам с уходящими группами разной основно-
сти [330]. Было установлено, что, если имеется хорошая уходя-
О
О-атака'»
N-атака
Химия коферментов
477
щая группа, 0-атака предпочтительнее N-атаки. Эти результаты
подтверждают предположение об О-карбоксилировании биотина,
при котором образуется сначала «высокоэнергетическое» соеди-
нение типа карбодиимида (изоимид или изомочевина), а затем
оно быстро перегруппировывается в более устойчивую N-ациль-
ную форму.
изоимиЭ (О-ацилмочевина
или изомочевина)
X = металл,
связанный
с субстратом
Однако, поскольку неизвестна степень участия фермента в ста-
билизации уходящей группы аниона X в биотинзависимых реак-
циях карбоксилирования, нельзя сказать заранее, что произойдет:
О- или N-атака. Ясно, что простые модельные соединения не
всегда надежные индикаторы активности моделируемых групп
в составе фермента [343]. Возможно, связанный с ферментом био-
тин реагирует в форме высокоэнергетической изомочевины, по-
скольку при этом нуклеофильность атома азота повышена.
к' =сросфо.т или аТР
х =электрофил
(н® или ион.
металла)
Вернемся к исходному вопросу относительно того, является
ли постулированный О-карбоксибиотин истинным промежуточным
соединением на первой стадии реакции, протекающей с уча-
стием биотина. Получены весьма убедительные доказательства,
что на самом деле истинное биохимическое промежуточное сое-
динение— l'-N-карбоксибиотин [332]. С использованием двух
субъединиц ацетил-СоА-карбоксилазы из Е. coli, биотинкарбокси-
лазы и карбокситрансферазы* было доказано, что l'-N-карбокси-
биотин действует как донор карбоксильной группы (рис. 7.17).
Синтезирован Г-Ы-метоксикарбонил-(+)-биотинилацетат (он
* Каждая субъединица полиферментного комплекса может использоваться
Отдельно в модельных исследованиях.
ADP + Pi
ATP. + HuC03®
биотинкарбоксилаза
при R = COOH
О
JH HN NH
CH? S—СоА +
14СО2® /
E.cnli ацетил-Сол-
R карбоксилаза
(карбокситранс-
фераза)
О
СН3 S—СоА +
о
О2С14—N NH
R
малонил-СоА (+)-6uomun(R = СООН)
(•f-btamuHiuraqewamtR “ СН2ОАс)
(+)-5iiominm(R *» СНгОН)
ацетил-СоА
1-N-P‘C] -карбоксипроизооВное
О
x
ci oaij
при R=»CHaOAc
он”
при R « CH2OAc
получен ^рментативно
и служил субстратом
Зля карбокситранс-
феразы из Е. coli
l'.N-Г ,4С]харбокси - (+) -
биотинол
получен
только
прооукт
4'-N-ацили-
рования
(о^аракте-
риэован
wacc-cnexmpo-
скопичвски;
ПМР а адмр)
о
СН3О2С—N NH
OAc
он®
получен синтетгюееки
и служит бонором
карбоксильной группы
Зля катализируемого
карбокси трансфераз ой
перекарбоксилирования
ацетил- со А в мало-
нил-СоА
1-М-карБокси-[+)-5иотияол
1'-1М-метоксикар6онил-(+)-
биотинилацетат
Рис. 7.17. Подход, использованный для доказательства карбоксилирования биотина по положению N-Г [332].
Химия коферментов
4?9
охарактеризован химически, масс-спектрометрически, а также мето-
дами ПМР и 13С-ЯМР). Щелочной гидролиз дает l'-N-карбокси-
(4-)-биотинол. Установлено, что биотинол, восстановленная фор-
ма (спирт) остатка валериановой кислоты в биотине, гораздо
более эффективен, чем биотин. Авторы также показали, что реак-
ция, осуществляемая карбоксилазой, протекает в сторону обра-
зования АТР в присутствии полученного синтетически l'-N-кар-
бокси-(-)-)-биотина. Кроме того, синтетический l'-N-карбокси-
(-}-)-биотин по своей устойчивости не отличается от карбоксибио-
тина, полученного ферментативно.
Эти данные показали, что l'-N-положение уреидогруппы био-
тина служит центром переноса карбоксильной группы в биотин-
зависимых ферментах. Лейн также правильно указал на то, что
О-> N-миграция должна была бы предшествовать участию карбо-
ксибиотина в ферментативном процессе. Однако хорошо установ-
ленная термодинамическая и кинетическая стабильность N-ациль-
,ных и К-карбоксил-2-имидазолидоновых производных делает та-
кую возможность маловероятной. Кроме того, карбоксилаза моче-
вины, входящая в состав АТР-амидолиазы, — также биотинзави-
симый фермент — обратимо карбоксилирует мочевину с образова-
нием N-карбоксимочевины. Это довольно известный пример кар-
боксилирования по N-положению уреидогруппы [333].
о
h2n
О
н2 + нсо3е
АТР
кар&окси*
паза
мочевины
Н2ЬГ ^NH—СОО&
N-кирбоксимоче-
8UHQ (аллофснатп)
Н2О
аллофанапь
смиоолиаза
----- 2 НСО3е + 2 NH4®
Лейн и сотр. высказывали также различные соображения от-
носительно того, почему карбоксибиотиновая простетическая
группа в таких ферментативных процессах выбирает в качестве
карбоксилирующего агента Г-N-, а не более активный 2'-О-атом
уреидогруппы. Они предполагают, что, возможно, последующее
экспонирование подвижной переносящей карбоксильную группу
цепи в растворителе приведет к понижению способности карбо-
ксилата к переносу. Это должно предотвращать О-> N-миграцию
в процессе переноса.
Вернемся к нерешенной проблеме выявления способов акти-
вации биотина и карбоксибиотина. Ранее в этой главе приве-
дены три возможных механизма карбоксилирования субстрата
биотином. Один из них, выдвинутый Клугером и Адавадкаром
[341], предполагает существование О-фосфобиотинового промежу-
точного соединения. В настоящее время Клугер разработал инте-
ресную модель такого механизма, в которой фосфорильная группа
через метиленовый мостик связана с атомом азота уреидогруппы.
480
Глава 1
Исходное вещество было синтезировано из диметилмочевины, а
его гидролиз в присутствии LiOH приводит к образованию мо-
дельного соединения, обладающего активными фрагментами мо-
лекулы биотина и АТР, соединенными тем же способом.
интермедиат карбоЭиимиЗного
типа. (О-фосфорилироранный
оксиамиЗиний-ион)
В водном растворе, содержащем кислоту, продукт очень бы-
стро гидролизуется, и гидролиз протекает через образование цик-
лического промежуточного соединения — фосфомочевины. На ос-
новании данных по гидролизу и других свойств родственных сое-
динений Клугер предположил, что остаток мочевины в биотине —
выступает как нуклеофил по отношению к фосфатным производ-
ным. Таким образом, АТР, НСОз и биотин могут связываться
вблизи карбоксилирующей субъединицы, Давая О-фосфобиотин —
подобный карбодиимиду дегидратирующий агент,— который мо-
жет конденсироваться с НСОз и перегруппировываться в l'-N-
карбоксибиотин (рис. 7.14). Возможность О-фосфобиотинового
механизма впервые предполагалась Калвином в 1959 г. Однако
эти новые данные интересны тем, что они демонстрируют нукле-
Химия коферментов
481
офильные свойства 2'-О-атома уреидогруппы биотина к фосфору.
Келлог [347] синтезировал интересное соединение для моде-
лирования важной особенности второй стадии реакции — пере-
носа карбоксильной группы от атома азота в биотине на акцеп-
торную молекулу. Он обнаружил, что литиевое производное N-
метилэтиленмочевины (или тиомочевины), моделирующее изомо-
чевинную форму биотина, способно вызывать перегруппировку
1-метил-4-метиленбензоксазин-3,1-она-2 в 4-окси-1-метил-2-хино-
лин. N-Метильное производное N-метилэтиленмочевины улуч-
шает растворимость компонентов реакции в ТГФ и способствует
отщеплению только одного атома водорода. Такой изомеризации
не происходит в случае органических оснований, таких, как
R4N+OH- и пиридин, а также LiOH. Но если изомочевину акти-
вировать с помощью BuLi, реакция протекает со степенью пре-
вращения 49% (при кипячении в ТГФ в течение 15 мин) и выде-
ляется с выходом 10% аддукт:
Весьма вероятен следующий механизм этого кооперативного
процесса:
16 Зак. 649
482
Глава 7
В некотором смысле это превращение моделирует карбоксилиро-
вание биотина по азоту и последующий перенос карбоксильной
группы к атому углерода, связанному с карбонильной группой
Клугер и сотр. подробно исследовали механизм участия мочевины в гидро-
лизе фосфоэфиров [334]. Помимо получения дополнительного доказательс ва
возможного участия О-фосфобиотина в ATP-зависимых реакциях карбоксилиро
вания в ферментативных системах они также рассмотрели стереохимию путей
карбоксилирования О-фосфобиотина в ферментативных реакциях, приводящих
к образованию N-карбоксибиотина и фосфат-иоиа. Возможны два механизма
с участием пеитакоординационного промежуточного соединения (см. замечания
о псевдовращенин в гл. 3): механизм «атаки с фронта», не подразумевающий
образования карбоксифосфата, и механизм «атаки с тыла» с образованием сво-
бодного карбоксифосфата.
Механизм «атаки с фронта» ведет к сохранению конфигурации у атома
фосфора:
Химия коферментов
483
В случае атаки с тыла бикарбонат атакует О-фосфобиотин по транс-поло-
жению относительно биотиноеой уреидогруппы. Если это имеет место, то со-
гласованная атака с тыла, сопровождаемая карбоксилированием, стереохими-
чески невозможна. Следовательно, при таком механизме должен образовы-
ваться карбоксифосфат. В то же время механизм атаки с фронта обеспечивает
протекание реакции без образования карбоксифосфата из-за более благоприят-
ного пространственного расположения бикарбоната. Хотя этот механизм соот-
ветствует ранее предполагаемому [341], необходимы дополнительные исследо-
вания для решения неопределенности, касающейся стереохимии карбоксилиро-
вания О-фосфобиотина в ферментативных процессах. Эту проблему можно
решить с помощью структурного анализа биотинзависимого фермента.
В заключение скажем, что образование О-фосфобиотина из
АТР, по-видимому, происходит с обращением конфигурации у
у-фосфора. Поскольку последующий перенос к бикарбонату мо-
жет происходить с сохранением конфигурации или инверсией,
то путь через О-фосфобиотин может объяснить результирующую
Рис. 7.18. Согласованный механизм карбоксилирования пропионил-СоА.
инверсию (инверсия и сохранение конфигурации) или результи-
рующее сохранение конфигурации (инверсия плюс инверсия)
у атома фосфора [334].
Наконец, следует сказать о стереохимии реакции карбоксили-
рования. Аригони и сотр. [335] первыми показали с помощью
тритиевой метки, что карбоксилирование пропионовой кислоты
происходит с сохранением конфигурации.
СН3
н
сн3
пропионил СоА-
карбоксилази.
НООС-— н
соон
2s-[2-JH] пропионовая
кислота
СООН
метилмалоновая
кислота
Как и другие биотинзависимые реакции карбоксилирования,
эта реакция включает отщепление а-протона (здесь трития) и
замещение его на СО2. Предполагается [336, 345], что отщепле-
ние протона и карбоксилирование проходят согласованно
(рис. 7.18).
16*
484
Глава 7
Однако согласованный механизм, хотя и мог бы объяснить
сохранение конфигурации в процессе переноса карбоксильной
группы, стереохимически маловероятен.
Происходящие в процессе реакции превращения означают, что
карбонильная группа биотина служит акцептором протонов в од-
ном случае и донором протонов в другом. Более вероятный ме-
ханизм предполагает наличие внешнего основания. Таким обра-
зом, альтернативой согласованному механизму служит ступенча-
тый процесс, включающий отщепление а-протона с последующим
карбоксилированием. Чтобы показать возможность такого меха-
низма, было исследовано [346] действие пропионил-СоЛ-карбо-
Рис. 9.13. Механизм отщепления
Химия коферментов
485
ксилазы на р-фторпропионил-СоА. Этот субстрат особенно удо-
бен для изучения возможности отщепления протона в отсутствие
карбоксилирования, так как: 1) фтор — это небольшой атом, и
его присутствие не приводит к стерическим затруднениям, 2) ко-
гда карбанион возникает в p-положении к углероду, несущему
атом фтора, последний элиминируется. Таким образом, отщепление
фтора служит доказательством образования карбаниона.
быстро (через промежуточный
карбанион, связанный с ферментом;
43екарбоксилироеание,
ускоряемое в присутствии
акрилил-СоА
сн2=сн—
S—СоА
Тора из фторпропионил-СоА [346].
со2е
1^0
+ сн2—сн—+ н®
I S—СоА
F ।
। неферментативное
;бекарбоксилирование
!(побочная реакция)
X)
СН2=СН^С^ + СО2 + Fe
XS—СоА
486
Глава 7
При инкубации р-фторпропионил-СоА в присутствии HCOi,
АТР и Mg(II) и добавлении этой смеси к ферменту образуется
ADP и освобождается F-. Однако скорость освобождения F-
в 6 раз превышает скорость образования ADP, и доказательства
образования фторметилмалонил-СоА не удалось получить. Осво-
бождение F- — доказательство отщепления а-протона от субст-
рата, а образование ADP соответствует образованию биотин-СО2.
Следовательно, эти результаты свидетельствуют о том, что от-
щепление водорода может не сопровождаться переносом СО2 от
биотин-СО2 на субстрат. Выдвинутый ранее согласованный меха-
низм, таким образом, неприменим, в случае действия пропионил-
СоА-карбоксилазы на р-фторпропионил-СоА. Предполагается так-
же, что несогласованный процесс должен происходить с «нор-
мальными» субстратами и что активный центр фермента должен
содержать группу, которая функционирует как акцептор протонов.
Более того, было показано, что этот центр не обменивает про-
тоны с растворителем.
Короче говоря, можно предположить, что осуществляется ме-
ханизм (рис. 7.19) элиминирования F- из Р-фторпропионил-СоА
[346], согласно которому основание В в ферменте отщепляет
а-протон субстрата с образованием связанного с ферментом кар-
баниона. Отщепление происходит гораздо быстрее, чем перенос
СО2 от биотина к карбаниону. После процесса элиминирования
комплекс может разлагаться несколькими возможными путями,
такими, как декарбоксилирование и освобождение акрилил-СоА.
Хотелось бы напомнить интересные соображения, высказанные Виссером
и Келлогом [347], о происхождении биотина и других коферментов. Во-пер-
вых, модельные исследования показали, что биотинподобные молекулы не об-
ладают каталитическими свойствами при карбоксилировании, если только они
не активируются сначала путем превращения в высокоэнергетическую тауто-
мерную форму, обладающую более сильными нуклеофильными свойствами. Сле-
довательно, биотин, по-видимому, действует только как переносчик СОа, свя-
зывая между собой две различные активные субъединицы. В противополож-
ность другим коферментам-переносчикам он не вносит непосредственный вклад
в понижение энергии активации реакции. Во-вторых, что еще более удивитель-
но, биотин и структурно родственная ему связанная с ферментом липоевая
кислота не имеют никакого сходства с нуклеотидом. Молекулы всех других
коферментов содержат по крайней мере пуриновое илн пиримидиновое кольцо.
В гипотезах о ранних стадиях зарождения жизни (разд. 3.7) предполагается,
что самовоспроизводящиеся системы состояли из молекул, подобных нуклеино-
вым кислотам, которые выполняли также функцию ферментов, при этом соб-
ственно белки не играли большой роли. Согласно Келлогу, современные ко-
ферменты— это остатки, сохранившиеся с того времени, когда ферменты были
полинуклеотидами. По этой причине они все еще обладают каталитическими
свойствами в реакциях переноса групп. Однако биотин и липоевая кислота не
способны действовать как коферменты, если они не связаны ковалентно с бел-
ком-носителем, и поэтому они ведут себя как транспортные агенты в поли-
ферментных комплексах. Это наводит на мысль, что как простетические группы
они могли возникнуть в процессе эволюции гораздо позже.
ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА
Barker R. Organic Chemistry of Biological Compounds. Prentice-Hall, Englewood
Cliffs, New Jersey, 1971.
Bender M. L. Mechanisms of Homogeneous Catalysis from Protons to Proteins.
Wiley-Interscience, New York, 1971.
Bender M. L.. Brubacher L. 1. Catalysis and Enzyme Action. McGraw-Hill, New
York. 1973.
Bruice T. C., Benkovic S. Bioorganic Mechanisms, Vols. 1 and 2. Benjamin, New
York, 1966.
Fersht A. Enzyme Structure and Mechanisms. Freeman, San Francisco, 1977.
Handlik R. P. Inorganic Aspects of Biological and Organic Chemistry. Academic
Press, New York, 1976.
Jencks W. P. Catalysis in Chemistry and Enzymology. McGraw-Hill, New York,
1969.
Janes J. B., Sih C. J., Perlman D (Eds.) Application of Biochemical Systems in
Organic Chemistry, Vol. 10, Parts I and II. Techniques of Chemistry Se-
ries. Wiley-Interscience, New York, 1976.
Kopple K- D. Peptides and Amino Acids Benjamin, New York, 1971.
Lawe J. N., Ingraham L. L. An Introduction to Biochemical Reaction Mechanisms.
Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1974
Metzler D. E. Biochemistry, The Chemical Reactions of Living Cells. Academic
Press, New York, 1977.
Ochai E. Bioinorganic Chemistry, an Introduction. Allyn and Bacon, Boston, 1977.
van Tamelen E. E. (Ed.) Bioorganic Chemistry, Vols. I—IV. Academic Press, New
York, 1977.
Walsh C. Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco, 1979.
Watson J. D. Molecular Biology of the Gene, 3rd ed. Benjamin, New York, 1976.
ЛИТЕРАТУРА
1. Schatz V. B. Isosterism and bio-isosterism as guides to structural variations.
In: Medicial Chemistry (A. Burger, Ed.), 2nd ed., pp. 72—88. Interscience,
New York, 1960.
2. Korolkovas .4. Essentials of Molecular Pharmacology, pp. 55—59. Wiley-In-
terscience, New York, 1970.
3. Engel R. Phosphonates as analogues of natural phosphates. Chem. Rev. 77,
349—367 (1979).
4. Tang К. С., Tropp В. E„ Engel R. The synthesis of phosphonic acid and phosp-
hate analogues of glycerol-3-phosphate and related metabolites. Tetrahedron
34, 2873—2878 (1978)’.
5. Lipmann F. Nonribosomal polypeptide synthesis on polyenzyme templates.
Acc. Chem. Res 6, 361—367 (1973).
6. Walder J. A., Walder R. Y., Heller M. J., Frier S. M., Letsinger R. L.,
Klotz I. M. Complementary carrier peptide synthesis: General strategy and
implications for prebiotic origin of peptide synthesis. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 76, 51—55 (1979).
488
Литература
7. Belleau В., Malek G. A new convenient reagent for peptide synthesis. J. Amer.
Chem. Soc. 90, 1651 (1967).
8. Stewart J. M., Young J. D. Solid Phase Peptide Synthesis. Freeman, San
Francisco, 1969.
9. Rebek J., Pettier D. Mechanism of the carbodiimide reaction. II. Peptide syn-
thesis on the solid phase. J. Amer. Chem. Soc. 96, 1606—1607 (1974).
10. Ralir R., Fridkin M., Patchornik A. (4-Hydroxy-3-nitro) benzylated polysty-
rene. An improved polymeric nitrophenyl derivative for peptide synthesis.
Eur. J. Biochem. 42, 151—156 (1974).
11. Vigneron J. P., Ragan H., Horeau A. Synthese asymetrique de 1’acide asparti-
que optiquement pur. Tetrahedron Lett. 5681—5683 (1968).
12. Corey E. J., McCattlly R. J., Sachdev H. S. Studies on the asymmetric synt-
hesis of a-amino acids. I. A new approach. J. Amer. Chem. Soc. 92, 2476—
2488 (1970).
13. Fryzuk M. D., Bosnich B. Asymmetric synthesis. Production of optically active
amino acids by catalytic hydrogenation. J. Amer. Chem. Soc. 99, 6262—6267
(1977).
14. Fryzuk M. D., Bosnich B. Asymmetric synthesis. Preparation of chiral methyl
chiral lactic acid by catalytic asymmetric hydrogenation. J. Amer. Chem. Soc.
101, 3043—3049 (1979).
15. Takaishi N., Imai H., Bertelo C. A., Stille J. R. Transition metal catalyzed
asymmetric organic synthesis via polymer-attached optically active phosphine
ligands. Synthesis of R amino acids and hydratopic acid by hydrogenation
J. Amer. Chem. Soc. 100, 264—267 (1978).
16. Wilson M. E., Whitesides G. M. Conversion of a protein to a homogenous
asymmetric hydrogenation catalyst by site-specific modification with a dip-
hosphinerhodium (I) moiety. J. Amer. Chem. Soc. 100, 306—307 (1978).
17. Wilson M. E., Nuzzo R. G., Whitesides G. M. Bis(2-diphenylphosphinoet-
hyl) amine. A flexible synthesis of functionalized chelating diphosphines. J.
Amer. Chem. Soc. 100, 2269—2270 (1978).
18. Feughelman M, Langridge R., Seeds W. E., Stokes A. R., Wilson H. R.,
Hooper C. W., Wilkins M. H. F., Barclay R. R., Hamilton L. D. Molecular
structure of deoxyribose nucleic acid and nucleoprotein. Nature 175, 834—838
(1955).
19. Watson 7. D., Crick F. H. C. The structure of DNA. Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol. 18, 123—131 (1973).
20. Dube S. R., Marker R. A. The nucleotide sequence of N-formyl methionyl
transfer RNA. Partial digestion with pancreatic and T| ribonuclease and deri-
vation of the total primary structure. Eur. J. Biochem. 8, 256—262 (1969).
21. Rich A., Rim S. H. The three-dimensional structure of transfer RNA. Sci
Amer. 238, 52—62 (1978).
22. Singleton R., Jr. Bioorganic chemistry of phosphorus. J. Chem. Educ. 50,
538—544 (1973).
23. Westheimer F. H. Pseudo-rotation in the hydrolysis of phosphate esters. Acc.
Chem. Res. 1, 70—78 (1968).
24. Deakyne C. A., Allen L. C. Role of active-site residues in the catalytic me-
chanism of ribonuclease A. J. Amer. Chem. Soc. 101, 3951—3959 (1979).
25. Usher D. A., Erenrich E. S., Eckstein F. Geometry of the first step in the
action of ribonuclease A. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 115—118 (1972).
26. Usher D. A., Richardson D. I., Jr. Absolute stereochemistry of the second step
of ribonuclease action. Nature 228, 663—665 (1970).
27. Yee D., Armstrong V. W., Eckstein F. Mechanistic studies on deoxyribo-
nucleic acid dependent ribonucleic acid polymerase from E. coli using pho-
sphorothioate analogues. I. Initiation and pyrophosphate exchange reactions.
Biochemistry 18, 4116—4120 (1979).
28. Burgers P. M. J., Eckstein F., Hunneman D. H. Stereochemistry of hydrolysis
by snake venom phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 254, 7476—7478 (1979).
29. Hoard D. E., Ott D. G. Conversion of mono- and oligodeoxyribonucleotides
to 5'-triphosphates J. Amer. Chem. Soc. 87, 1785—1788 (1965).
Литература
489
30. Baughn R. L., Adelsteinsson O., Whitesides G. M. Large-scale enzyme-cataly-
zed synthesis of ATP from adenosine and acetyl phosphate. Regeneration
of ATP from AMP. J. Amer. Chem. Soc. 100, 304—306 (1978).
31. Blattler W. A., Knowles J. R. The stereochemical course of glycerol kinase-
phosphoryl transfer from chiral [y—(S)—16O, 17O, ,8O] ATP. J. Amer. Chem.
Soc. 101, 510—511 (1979).
32 Blattler W. A., Knowles J. R. Stereochemical course of phosphokinases. The
use of adenosine [y — (S)—leO, 17O, 18O] triphosphate and the mechanistic
consequences for the reactions catalyzed by glycerol kinase, hexokinase, py-
ruvate kinase and acetate kinase. Biochemistry 18, 3927—3933 (1979).
33. Greengard P., Nathanson J. A. «Second messengers» in the brain. Sci. Amer.
237, 108—119 (1977).
34. Lincoln T. M., Flockhart D. A., Corbin J. D. Studies on the structure and
mechanism of activation of the guanosine 3',5'-monophosphate-dependent
protein kinase. J. Biol. Chem. 253, 6002—6009 (1978).
35. Gerlt 1. A., Gutterson N. L, Dalta P., Belleau B., Penney C. L. Thermochemi-
cal identification of the structural factors responsible for the thermodynamic
instability of 3',5'-cyclic nucleotides. J. Amer. Chem. Soc. 102, 1655—1660
(1980).
36. Fyfe I. A., Keller P. M., Furman P. A., Miller R. L., Elion G. B. Thymidine
kinase from herpes simplex virus phosphorilates the new antiviral compound,
9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine. J. Biol. Chem. 253, 8721—8727 (1978).
37. Amarnath I'., Broom A. D. Chemical synthesis of oligonucleotides. Chem.
Rev. 77, 183—245 (1977).
38. Slotin L. A. Current methods of phosphorylation of biological molecules.
Synthesis 11, 737—752 (1977).
39. Ikehara M., Ohtsuka E., Markham A. F. The synthesis of polynucleotides.
Advan. Carbohyd. Chem. 36, 135—213 (1979).
40. Letsinger R. L., Lunsford W. B. Synthesis of thymidine oligonucleotides by
phosphite triester intermediates. J. Amer. Chem. Soc. 98, 3655—3661 (1976).
41. Ogilvie K. K., Schifman A. L., Penney C. L. The synthesis of oligoribonucleo-
tides. III. The use of silyl protecting groups in nucleoside and nucleotide
chemistry. VIII. Can. J. Chem. 57, 2230—2238 (1979).
42. Lehninger A. L. Biochemistry, Chapter 37, Worth, New York, 1975.
43. Calvin M. Biopolymers: Origin, chemistry and biology. Angew. Chem., Int.
Ed. Engl. 13, 121—131 (1974).
44. Orgel L. E., Lohrmann R. Prebiotic chemistry and nucleic acid replication.
Acc. Chem. Res. 7, 368—377 (1974).
45. Elias W. E. The natural origin of optically active compounds. J. Chem. Educ.
49, 448—454 (1972).
46. Abernethy J. L. The concept oi dissymetric worlds. J. Chem. Educ. 49,
455—461 (1972).
47. Kuhn H. Self-organization of molecular systems and evolution of the genetic
apparatus. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 11, 798—820 (1972).
48. Helene C. Specific recognition of guanine bases in protein-nucleic acid com-
plexes. FEBS Lett. 74, 10—13 (1977).
49. MacElroy R. D., Coekelenbergh Y., Rein R. Macromolecular simulations as
an approach to the study of the origins of self-replicating systems. Biosy-
stems 9, 111—119 (1977).
50. Fox J. L. Copolymer proposed as vital to evolution. Chem. Eng. News
July 3, pp. 17, 18 (1978).
51. Usher D. A. Early chemical evolution of nucleic acids: A theoretical model
Science 296, 311—313 (1977).
52. Hine I. Bifunctional catalysis of a-hydrogen exchange of aldehydes and ke-
tones. Acc. Chem. Res. 11, 1—7 (1978).
53. Bruice T. C., Benkovic S. Bioorganic Mechanisms, Vol. 1, p. 134. Benjamin
New York, 1966.
54. Cossee P. Stereoregularity in heterogeneous Ziegler-Natta catalysis Trans
Faraday Soc 58, 1226—1232 (1962).
490
Литература
55 Cleland IF. W. What limits the rate of an enzyme-catalyzed reaction? Acc.
Chem. Res. 8, 145—151 (1975).
56. Hanson K. R-, Rose I. A Interpretations of enzyme reaction stereospecificity.
Acc. Chem. Res. 8, 1—10 (1975).
57. Schulz G. E., Schimer R. H. Principles of protein structure, Springer-Verlag,
New York, 1979.
58. Ferscht A. Enzyme Structure and Mechanism, pp. 44—48. Freeman, San
Francisco, 1977.
59. Knowles J. R.. Albert/ IF. J. Perfection in enzyme catalysis: The energetics
of triosephosphate isomerase. Acc. Chem. Res. 10, 105—111 (1977).
60. Alworth IF. L. Stereochemistry and Its Application in Biochemistry, Chap. 3.
Wiley-Interscience, New York, 1972.
61. Ogston A. G. Interpretation of experiments on metabolic processes, using
isotopic tracer elements. Nature 162, 963 (1948).
62. Loewus F. A., Westhelmer F. H., Vennesland B. Enzymatic synthesis of
the enantiomorphs of ethanol-l-d. J. Amer. Chem. Soc. 75, 5018—5023
(1953).
63. Brulce T. C., Pandit V. K. The effect of general substitution ring size and
rotamer distribution on the intramolecular nucleophilic catalysis of the hydro-
lysis of monophenyl esters of dibasic acids and the solvolysis of the inter-
mediate anhydrides. J. Amer. Chem. Soc. 85, 5858—5865 (1960).
64. Jencks IF. P. Binding energy, specificity, and enzymic catalysis: The circle
effect. Adv. Euzymol. 43, 219—410 (1975).
65. Storm D. R., Koshland D. E., Jr. A source for the special catalytic power of
enzymes: Orbital steering. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 66, 445—452 (1970).
66. Brulce T. C., Brown A., Harris D. C. On the concept of orbital steering in
catalytic reactions. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68, 658—661 (1971).
67. Storm D. R., Koshland D. E., Jr. An indication of the magnitude of orien-
tation factors in esterification J. Amer. Chem. Soc. 94, 5805—5814 (1972).
68. Storm D. R., Koshland D. E., Jr. Effect of small changes in orientation on
reaction rate. J. Amer. Chem. Soc. 94, 5815—5825 (1972).
69. Philipp M., Tsai I. H., Bender M. L. Comparison of the kinetic specificity
of subtilisin and thiolsubtilisin toward n-alkyl p-nitropheny] esters. Bioche-
mistry 18, 3769—3773 (1979).
70. Page M. I., Jencks IF. P. Entropic contributions to rate accelerations in en-
zymic and intramolecular reactions and chelate effect. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 68, 1678—1683 (1971).
71, Swain C. G., Brown J. F. Concerted displacement reactions. VII. The mecha-
nism of acid base catalysis in non-aqueous solvents. J. Amer. Chem. Soc.
74, 2534—2537 (1952).
72. Higuchi T., Takechi H., Pitman J. H., Fung H. L. Intramolecular bifunctional
facilitation in complex molecules, combined nucleophilic and general acid
participation in hydrolysis of hexachlorophene monosuccinate. J. Amer. Chem.
Soc. 93, 539—540 (1971).
73. Cunningham B. A., Schmir G. L. Iminolactones. II. Catalytic effects on the
nature of the products of hydrolysis. J. Amer. Chem. Soc. 88, 551—558
(1966).
74. Lee Y N., Schmir G. L. Concurrent general acid and general base catalysis
in the hydrolysis of an imidate ester. 1. Monofunctional catalysis. J. Amer.
Chem. Soc. 100, 6700—6707 (1978).
75. Lee Y. N., Schmir G. L. Concurrent general acid and general base catalysis
in the hydrolysis of an imidate ester 2. Bifunctional catalysis. J. Amer.
Chem. Soc. 101, 3026—3035 (1979).
76. Jencks IF. P. Requirements for general acid-base catalysis of complex reac-
tions. J. Amer. Chem. Soc. 94, 4731—4732 (1972).
77. Blow D. M. Structure and mechanism of chymotrypsin. Acc. Chem. Res. 9,
145—152 (1976).
78. Blow D. M., Birktoft J. J., Hartley B. S. Role of a buried acid group in the
mechanism of action of chymotrypsin. Nature 221, 337—340 (1969).
Литература
491
79. Sigler Р. В., Blow D. М., Matthews В. W., Henderson R. Structure of cry-
stalline a-chymotrypsin II. A preliminary report including a hypothesis for
the activation mechanism. J Mol. Biol. 35, 143—164 (1968).
80. Garavito R. M., Rossmann M. G., Argos P., Eventoff W. Convergence of
active center geometries. Biochemistry 16, 5065—5071 (1977).
81. Wright H. T. Activation of chymotrypsinogen-A. An hypothesis based upon
comparison of the crystal structures of chymotrypsinogen-A and a-chymo-
trypsin. J. Mol. Biol. 79, 13—23 (1973).
82. Hunkapiller M. W., Forgac M. D., Richards J. H. Mechanism of action of
serine proteases: Tetrahedral intermediate and concerted proton transfer.
Biochemistry 15, 5581—5588 (1976).
83. Kaplan H., Symonds V. B., Dugas H., Whitaker D. R. A comparison of pro-
perties of a-lytic protease of Sorangium sp. and porcine elastase. Can. J.
Chem 47, 649—658 (1970).
84. Hunkapiller M. W., Smallcombe S. H., Whitaker D. R., Richards J. H.
Carbon nuclear magnetic resonance studies of the histidine residue in a-lytic
protease. Implication for the catalytic mechanism of serine proteases. Bio-
chemistry 12, 4732—4743 (1973).
85. Markley J. L., Ibanez I. B. Zymogen activation in serine proteinases. Proton
magnetic resonance pH titration studies of the two histidines of bovine
chymotrypsinogen A and chymotrypsin Aa. Biochemistry 17, 4627—4639
(1978).
86. Robillard G., Shulman R. G. High resolution nuclear magnetic resonance
study of the histidine-aspartate hydrogen bond in chymotrypsin and chymo-
trypsinogen. J. Mol. Biol. 71, 507—511 (1972).
87. Brayer G. D., Delbaere L. T. j., James M. N. G. Molecular structure of the
a-lytic protease from Myxobacter 495 at 2.8 A resolution. J. Mol. Biol. 131,
743—775 (1979).
88. Bachovchin W. W, Roberts J. D. Nitrogen-15 nuclear magnetic resonance
spectroscopy. The state of histidine in the catalytic triad of a-lytic protease.
Implications for the charge-relay mechanism of peptide bond cleavage by
serine proteases. J. Amer. Chem. Soc. 100, 8041—8047 (1978).
89. Fink A. L., Meehan P. Detection and accumulation of tetrahedral interme-
diates in elastase catalysis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 1566—1569
(1979).
90. Porubcan M. A., Westler W. M., Ibanez I. B., Markley J. L. (Diisopropylphos-
phoryl) serine proteinases. Proton on phosphorus-31 nuclear magnetic reso-
nance-pH titration studies. Biochemistry 18, 4108—4115 (1979).
91. Kraut J. Serine proteases: Structure and mechanism of catalysis. Annu. Rev.
Biochem. 46, 331—358 (1977).
92. Komiyama M., Bender M. L. Do cleavages of amides by serine proteases
occur through a stepwise pathway involving tetrahedral intermediates? Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 76, 557—560 (1979).
93. Bruice T. C., Sturtevant J. M. Imidazole catalysis. V. The intramolecular
participation of the imidazolyl group in the hydrolysis of some esters and
the amide of y-(4-imidazolyl) -butyric acid and 4-(2'-acetoxyethyl)-imidazole.
J. Amer. Chem. Soc. 81, 2860—2870 (1959).
94. Rogers G. A., Bruice T. C. Isolation of a tetrahedral intermediate in an
acetyl transfer reaction. J. Amer. Chem. Soc. 95, 4452—4453 (1973).
95. Rogers G. A., Bruice T. C. Control of modes of intramolecular imidazole
catalysis of ester hydrolysis by steric and electronic effects. J. Amer. Chem
Soc. 96, 2463—2472 (1974).
96. Rogers G. A., Bruice T. C. Synthesis and evaluation of a model for the
so-called «charge-relay» system of the serine esterases. J. Amer. Chem. Soc.
96, 2473—2480 (1974).
97. Rogers G. A., Bruice T. C. The mechanisms of acyl group transfer from
a tetrahedral intermediate. J. Amer. Chem. Soc. 96, 2481—2488 (1974).
98. Komiyama M., Bender M. L. General base-catalyzed ester hydrolysis as
a model of the «charge-relay» system. Bioorg. Chem. 6, 13—20 (1977).
492
Литература
99. Byers L. D., Koshland D. E., Jr. On the mechanism of action of methyl chy-
motrypsin. Bioorg. Chem. 7, 15—33 (1978).
100. Belke C. J., Su S. С. K-, Shafer J. A. Imidazole catalyzed displacement of
an amine from an amide by a neighbouring hydroxyl group. A model for
the acylation of chymotrypsin. J. Amer. Chem. Soc. 93, 4552—4561 (1971).
101. Hein G. E., Niemann C. Steric course and specificity of a-chymotrypsin-
catalyzed reactions. I. J. Amer. Chem. Soc. 84, 4487—4494 (1962).
102. Hein G. E., Niemann C. Steric course and specificity of a-chymotrypsin-cata-
lyzed reactions. II. J. Amer. Chem. Soc. 84, 4495—4503 (1962).
103. Dugas H. The stereospecificity of subtilisin BPN' towards l-keto-3-car-
bomethoxy-l,2,3,4-tetrahydroisoquinoline. Can. J. Biochem. 47, 985—987
(1969).
104. Silver M. S., Sone T. Stereospecificity in the hydrolysis of conformationally
homogenous substrates by a-chymotrypsin. J. Amer. Chem. Soc. 90, 6193—
6198 (1968).
105. Cohen S. G., Schultz R. M. The active site of a-chymotrypsin. J. Mol. Biol.
243, 2607—2617 (1968).
106. Belleau B., Chevalier R. The absolute conformation of chymotrypsin-bound
substrates. Specific recognition by the enzyme of biphenyl asymmetry in
a constrained substrate. J. Amer. Chem. Soc. 90, 6864—6866 (1968).
107. Elie P. Ph. D. Dissertation, McGill University, Montreal, Canada, 1977.
108. Phillips D. C. The hen egg-white lysozyme molecule. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 57, 484—495 (1967).
109. Dickerson R. E., Geis I. The Structure and Action of Proteins, p. 71. Harper
and Row, New York, 1969.
110. Pincus M. R., Scheraga H. A. Conformational energy calculation of enzyme-
substrate and enzyme-inhibitor complexes of lysozyme. 2. Calculation of the
structures of complexes with a flexible enzyme. Macromolecules 12,
633—644 (1979).
111. Capon B., Smith M C. Intramolecular catalysis in acetal hydrolysis. Chem.
Comm. 523—524 (1965).
112. Kluger R., Lam С. H. Carboxylic acid participation in amide hydrolysis. Ex-
ternal general base catalysis and general acid catalysis in reactions of nor-
bornenylanilic acids. J. Amer. Chem. Soc. 100, 2191—2197 (1978).
113. Hsu I., Delbaere T. J., James M. M. G., Hofmann T. Penicillopepsin from
Penicillium janthinellum. Crystal structure at 2.8 A and sequence. Homology
with porcine pepsin. Nature 266, 140—145 (1977).
114. Deslongchamps P. Stereoelectron ic control in the cleavage of tetrahedral
intermediates in the hydrolysis of esters and amides. Tetrahedron 31,
2463—2490 (1975).
115. Deslongchamps P. Stereoelectronic control in hydrolytic reactions. 26th
IUPAC, Tokyo, Japan, 1977.
116. Deslongchamps P. Stereoelectronic Control in Hydrolytic Reactions. Hetero-
cycles 7, 1271—1317 (1977).
117. Deslongchamps P., Cheriyan U. O., Pradere J.-P., Soucy P., Taillefer R. J.
Hydrolysis and isomerization of syn unsymmetrical N,N-dialkylated immi-
date salts. Experimental evidence for conformational changes and for stereo-
electronically controlled cleaves in hemi-orthoamide tetrahedral intermediates.
Nouv. J. Chim. 3, 343—350 (1979).
118. Bizzozero S. A., Zweifel В. O. The importance of the conformation of the
tetrahedral intermediate for the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of pep-
tide substrates. FEBS Lett. 59, 105—108 (1975).
119. Petkov D., Christova E., Stoineva I. Catalysis and leaving group binding
in anilide hydrolysis by chymotrypsin. Biochim. Biophys. Acta 527, 131—141
(1978).
120. Gorenstein D. O.. Findlay J. B., Luxon B. A., Kar D. Stereoelectronic control
in carbon-oxygen and phosphorus-oxygen bond breaking processes. Ab initio
calculation and speculations on the mechanism of ribonuclease A, staphylococ-
cal nuclease and lysozyme. J. Amer. Chem. Soc. 99. 3473—3479 (1977).
Литература
493
121. Mock 117. д. Torsional-strain considerations in enzymology. Some applications
to proteases and ensuing mechanistic consequences. Bioorg. Chem. 5, 403—414
(1976).
122. Hudson B. J. F. Immobilized enzymes. Chem. Ind. pp. 1059—1060 (1975).
123. Skimer K. J. Enzymes technology. Chem. Eng. News. August 18, pp. 23—42
(1975).
124. Mosbach K. Applications of biochemical systems in organic chemistry. In:
Techniques of Chemistry Series (J. B. Jones, C. J. Sih, D. Perlman, Eds.),
Vol. 10, Part II, Chap. 9. Wiley-Interscience, New York, 1976.
125. Sucking C. i. Immobilized enzymes. Chem. Soc. Rev. 6, 215—233 (1977).
126 Pollak A., Baughn R. L., Adalsteinsson O., Whitesides G. M. Immobilization
of synthetically useful enzymes by condensation polymerization. J. Amer.
Chem. Soc. 100, 302—304 (1978).
127. Guilbault G. G., Sadar M. H. Preparation and analytical uses of immobilized
enzymes. Acc. Chem. Res. 12, 344—359 (1979).
128. Mosbach К, Larsson P. O. Preparation and application of polymer-entrap-
ped enzymes and microorganisms in microbial transformation processes with
special reference to steroid 1 l-|3-hydroxylation and A'-dehydrogenation. Bio-
technol. Bioeng. 13, 19—27 (1970).
129. Suf P. A., Kay S., Lilly M. D. The conversion of benzyl penicillin to 6-ami-
nopenicillanic acid using an insoluble derivative of penicillin amidase. Bio-
technol. Bioeng. 12, 337—348 (1969).
130. Fife T. H. Intramolecular nucleophilic attack on esters and amides. In: Bio-
organic Chemistry (E. E .van Tamelen, Ed.), Vol. 1, Chap. 5, pp. 93—116.
Academic Press, New York, 1977.
131. Bender M. L., Komiyama M. In: Bioorganic Chemistry (E. E. van Tamelen,
Ed.), Vol. I, Chap 2, pp. 19—57. Academic Press, New York, 1977.
132. Pedersen C. J. Cyclic polyethers and their complexes witb metal salts. J.
Amer. Chem. Soc. 89, 2495—2496 (1967).
133. Pedersen C. L, Cyclic polyethers and their complexes with metal salts. J.
Amer. Chem. Soc. 89, 7017—7036 (1967).
134. Cram D. J., Cram I. M. Host-guest chemistry. Science 183, 803—809 (1974).
135. Cram D. J., Cram J. M. Design of complexes between synthetic hosts and or-
ganic guests. Acc. Chem. Res. 11, 8—14 (1978).
136. Cram D. J. Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry. In:
Techniques of Chemistry Series (J. B. Jones, C. J. Sih, D. Perlman, Eds.),
Vol. 10, Part II, Chap. 5, pp. 815—874. Wiley-Intersciense, New York,
1976.
137. Cram D. J. et al. Host-guest complexation. 1. Concept and illustration
J. Amer. Chem. Soc. 99, 2564—2571 (1977).
138. Cram D. J. et al. Host-guest complexation. 3. Organization of pyridyl bin-
ding sites. J. Amer. Chem. Soc. 99, 6392—6398 (1977).
139. Warshawsky A., Kalir R., Deshe A., Berkovitz H., Patchornik A. Polymeric
pseudocrown ethers. 1. Synthesis and complexation with transition metal
anions. J. Amer. Chem. Soc. 101, 4249—4258 (1979).
140. Curtis IV D., Laidler D. A., Stoddard I. F. To enzyme analogues by lock
and key chemistry with crown compounds. I. Enantiomeric differentation by
configurationally chiral cryptands synthesized from L-tartaric acid and D-man-
nitol. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1756—1769 (1977).
141. Stoddard J. F. From carbohydrates to enzyme analogues. Chem. Soc. Rev.
18, 85—142 (1979).
142 Hanessian S. Approaches to the total synthesis of natural products using
«chiral templates» derived from carbohydrates. Acc. Chem. Res. 12, 159—165
(1979).
143. Chao Y., Cram D. J. Catalysis and chiral recognition through designed com-
plexation of transition states in transacylations of amino ester salts. J. Amer.
Chem. Soc. 98, 1015—1017 (1976).
144 Pearson R. G. Hard and soft acids and bases, HSAB, Part I. J. Chem. Educ
48, 581—587 (1968).
494
Литература
145. Pearson R. G. Hard and soft acids and bases, HSAB, Part II. J. Chem.
Educ. 48, 643—648 (1968).
146. Sunamoto J., Kondo H., Okamoto H., Murakami Y. Catalysis of the deacyla-
tion of p-nitrophenyl hexadecanoate by 1 l-amino[20]paracyclophane-10-ol in
neutral and alkaline media. Tetrahedron Lett. 1329—1332 (1977).
147. Murakami У., Aoyama Y., Kada M., Kikuchi J. I. Macrocyclic enzyme model
system: Catalysis of ester degradation by a [20]paracyclophane bearing nuc-
leophilic and metal-binding sites. Chem. Commun. 494—496 (1978).
148 Lehn J. M., Sirlin C. Molecular catalysis: Enhanced rate of thiolysis with
high structural and chiral recognition in complexes of a reactive receptor
molecule. Chem. Commun. 949—951 (1978).
149. Lehn I. M. Cryptates: The chemistry of macropolycyclic inclusion complexes.
Acc. Chem. Res. 11, 49—57 (1978).
150. Kirch K-, Lehn J. M. Selective transport of alkali metal cations through a
liquid membrane by macrobicyclic carriers. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 14,
555—556 (1975).
151. Vogtle F., Weber E. Multidentate acyclic neutral ligands and their comple-
xation. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 18, 753—776 (1979).
152. Deber С. Л1., Blout E. R. Amino acid-cyclic peptide complexes. J. Amer.
Chem. Soc. 96, 7566—7368 (1974).
153. Menger F. M. On the structures of micelles. Acc. Chem. Res. 12, 111—117
(1979).
154. Bunton C. A. Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry.
In: Techniques of Chemistry Series. (J. B. Jones, C. J. Sih, D. Perlman,
Eds.), Vol. 10, Part II, Chap 4, pp. 731—814. Wiley-Interscience, New York,
1976.
155. Cordes E. H., Dunlap R. B. Kinetics of organic reactions in micellar systems.
Acc. Chem. Res. 2, 329—337 (1969).
156. Fisher L. R., Oakenfull D. G. Micelles in aqueous solution. Chem. Soc. Rev.
6, 25—42 (1977).
157. Menger F. M. In: Bioorganic Chemistry (E. E. van Tamelen, Ed.), Vol. Ill,
Chap. 7, pp. 137—152. Academic Press, New York, 1977.
158. Fendler J. FL, Fendler E. J. Catalysis in micelles and macromolecular sy-
stems. Academic Press, New York, 1975.
159. Baumucker J., Calzadilla M., Centeno M., Lehrmann G., Urdanela M., Lind-
quist P., Dunham D., Price M., Sears B., Cordes E. H. Secondary valence
force catalysis. XII. Enhanced reactivity and affinity of cyanide ion toward
N-substituted 3-carbamoylpyridinium ions elicted by ionic surfactants and
biological lipids. J. Amer. Chem. Soc. 94, 8164—8172 (1972).
160. Menger F. M., Donohue ]. A., Williams R. F. Catalysis in water pools.
J. Amer. Chem. Soc. 95, 286—288 (1973).
161. Escabi-Perez J. R., Fendler J. FL Ultrafast excited state proton transfer in
reversed micelles. J. Amer. Chem. Soc. 100, 2234—2236 (1978).
162. Shorenstein R. G., Pratt L. S., Hsu С. I., Wagner T. E. A model system for
the study of equilibrium hydrophobic bond formation. J. Amer. Chem. Soc.
90, 6199—6207 (1968).
163. Moss R. A., Mahas R. G., Lukas T. L. A cysteine-functionalized micellar
catalyst. Tetrahedron Lett. 507—510 (1978).
164. Tagaki W., Hara H. Acyloin condensation of aldehydes catalyzed by Л'-lauryl-
thiazolium bromide. Chem. Commun. 891—892 (1973).
165. Bunton C. A., Robinson L., Slam M. F. Stereospecific micellar catalyzed
ester hydrolysis. Tetrahedron Lett. 121—124 (1971).
166. Brown J. M., Bunton C. A. Stereoselective micelle-promoted ester hydrolysis.
Chem. Commun. 969—971 (1974).
167. Moss R. A., Lee Y. S., Lukas T. i. Micellar stereoselectivity cleavage of
diastereometric substrates by functional surfactant micelles. J. Amer. Chem.
Soc. 101, 2499—2501 (1979).
168. Imanishi Y. Intramolecular reactions on polymer chains. J. Polym. Sci. Ma-
cromo. Rev. 14, 1—205 (1979).
Литература
495
169. Manecke G., Storck W. Polymeric catalysis Angew. Chem., Int. Ed. Engl
17, 657—670 (1978).
170. Overberger C. G., Salamone j. C. Esterolytic action of synthetic macromole-
cules. Acc. Chem. Res. 2, 217—224 (1969).
\l\r Kiefer H. C., Congdon IF. /., Scarpa I. S., Klotz I. M. Catalytic accelerations
of 1012-fold by an enzyme-like synthetic polymer. Proc. Nat. Acad. Sci. USA
69, 2155—2159 (1972).
172. Frank H., Nicholson G. C., Bayer E. Chiral polysiloxanes for resolution of
optical antipodes. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 17, 363—365 (1978).
173. Bender M. L., Komiyama M. Cyclodextrin Chemistry, Springer-Verlag, Ber-
lin and New York, 1978.
174. Breslow R., Campbell P. Selective aromatic substitution within a cyclodex-
trin mixed complex J. Amer. Chem. Soc. 91, 3085 (1969).
175 Komiyama M., Breaux E. L, Bender M. L. The use of cycloamylose to probe
the «charge-relay» system. Bioorg. Chem. 6, 127—136 (1977).
176. Emert J., Breslow R. Modification of the cavity of p-cyclodextrin by flexible
capping. J. Amer. Chem. Soc. 97, 670—672 (1975).
177. Fujita K., Shinoda A., Imoto T. Hydrolysis of phenyl acetates with capped
P-cyclodextrins: Reversion from meta to para selectivity. J. Amer. Chem. Soc.
102, 1161—1163 (1980).
178. .Komiyama M., Bender M. L. Importance of apolar binding in complex for-
mation of cyclodextrins with adamantanecarboxylate. J. Amer. Chem. Soc. 100,
2259—2260 (1978).
179. Breslow R., Doherty J. B., Guillot G., Lipsey C. P-Cyclodextrinylbisirnidazole,
a model for ribonuclease. J. Amer. Chem. Soc. 100, 3227—3229 (1978).
180. Tabushi /., Shimokawa K-, Shimizu N., Shirakata H., Fujita K. Capped
cyclodextrin. J. Amer. Chem. Soc. 98, 7855—7856 (1976).
181. Tabushi /., Shimokawa K., Fujita K. Specific bifunctionalization on cyclodex-
trin. Tetrahedron Lett. 1527—1530 (1977).
182. Tabyshi L, Kuroda Y., Mochizuki A. The first successful carbonic anhydrase
model prepared through a new route to regiospecifically bifunctionalized
cyclodextrin. J. Amer. Chem. Soc. 102, 1152—1153 (1980).
183. Breslow R., Overman L. E. An «artificial enzyme» combining a metal cata-
lytic group and a hydrophobic binding cavity. J. Amer. Chem. Soc. 92,
1075—1077 (1970).
184. Boger J., Brenner D. G., Knowles I. R. Symmetrical triamino-per-O-methyl-
a-cyclodextrin: Preparation and characterization of primary trisubstituted
a-cyclodextrins. J. Amer. Chem. Soc. 101, 7630—7631 (1979).
185. Boger J, Knowles !. R. Symmetrical triamino-per-O-methyl-a-cyclodextrin:
A host for phosphate esters exploiting both hydrophobic and electrostatic
interactions in aqueous solution. J. Amer. Chem. Soc. 101, 7631—7633
(1979).
186. Breslow R., Hammond M., Lauer M. Selective transamination and optical
induction by a P-cyclodextrin-pyridoxamine artificial enzyme. J. Arner. Chem.
Soc. 102, 421—422 (1980).
187. Saenger N., Noltemeyer M., Manor P. C., Hingerty B., Klar E. B. «Induced-
fit»-type complex formation of the model enzyme a-cyclodextrin. Bioorg.
Chem. 5, 187—195 (1972).
188. Tabushi I., Kuroda Y., Fujita K., Kawakubo H. Cyclodextrin as a ligase-
oxidase model. Specific allylation-oxidation of hydroquinone derivatives in-
cluded by p-cyclodextrin. Tetrahedron Lett. 2083—2086 (1978).
189. Tabushi L, Kuroda Y., Shimokawa К Cyclodextrin having an amino group
as a rhodopsin model. J. Amer. Chem. Soc. 101, 4759—4760 (1979).
190. Tabushi I., Yaniamura K., Fujita K., Kawakubo H. Specific inclusion cataly-
sis by P-cyclodextrin in the one-step preparation of vitamin Ki or Ka analo-
gues. J. Amer. Chem. Soc. 101, 1019—1026 (1979).
191. Guthrie I. P. Application of Biochemical Systems in Organic Chemistry. In:
Techniques of Chemistry Series (J. B. Jones, C. J. Sih, D. Perlman, Eds.),
Vol. 10, Part II, Chap. 3, pp. 627—730. Wiley-Interscience, New York, 1976.
496
Литература
192. Guthrie J P., O’Leary S. General base catalysis of p-elimination by a steroi-
dal enzyme model. Can. J. Chem. 53, 2150—2156 (1975).
193. Guthrie I. P., Ueda У. Electrostatic catalysis and inhibition in aqueous solu-
tion. Rate effects on the reactions of charged esters with a cationic steroid
bearing an imidazolyl substituent. Chem. Comm. Ill—112 (1974).
194. Breslow R., Winnick M. A. Remote oxidation of unactivated methylene
groups. J. Amer. Chem. Soc. 91, 3083—3084 (1969).
195. Breslow R., Rothbard J., Herman F., Rodriguez M. L. Remote functionaliza-
tion reactions as conformational probes for flexible alkyl chains. J. Amer.
Chem. Soc. 100, 1213—1218 (1978).
196. Czarniecki M. F., Breslow R. Photochemical probes for model membrane
structures. J. Amer. Chem. Soc. 101, 3675—3676 (1979).
197. Breslow R. Biomimetic chemistry. Chem. Soc. Rev. I, 553—580 (1972).
198. Breslow R., Corcoran R. J., Snider В. B. Remote functionalization of ste-
roids by a radical relay mechanism. J. Amer. Chem. Soc. 96, 6791—6792
(1974).
199. Breslow R., Snider В. B., Corcoran R. J. A cortisone synthesis using remote
oxidation. J. Arner. Chem. Soc. 96, 6792—6794 (1974).
200. Schwartz M. A., Maini I. S. A biologically patterned synthesis of the mor-
phine alkaloids. J. Amer. Chem. Soc. 97, 1239—1240 (1975).
201. Samuelsson B., Paoletti R. Advances in Prostaglandin and Thromboxane
Research, Vols. 1 and 2. Raven Press, New York, 1976.
202. Nicolaou К. C., Gasic G. P., Barrette W. E. Synthesis and biological proper-
ties of prostaglandin endoperoxides, thromboxanes and prostacyclins. Angew.
Chem., Int. Ed. Engl. 17, 293—312 (1978).
203. Bailey J. M. Prostaglandines, thromboxanes and cardiovascular disease.
Trends Biochem. Sci. 4, 68—71 (1979).
204. Funk M. O., Isaac R., Porter N. A. Free radical cyclization of unsaturated
hydroperoxides. J. Amer. Chem. Soc. 97, 1281—1282 (1975).
205. Adam N., Birke A., Cadiz C., Diaz Sv., Rodriguez A. Prostonoid endopero-
xide model compounds: Preparation of 1,2-dioxolanes from cyclopropanes.
J. Org. Chem. 43, 1154—1158 (1978).
206. Coughlin D. J., Brown R. S., Salomon R. G. The prostaglandin endoperoxid
nucleus and related bicyclic peroxides. Synthetic and spectroscopic studies.
J. Amer. Chem. Soc. 101, 1533—1539 (1979).
207. van Tamelen E. E. Bioorganic chemistry; Total synthesis of tetra- and penta-
cyclic triterpenoids. Acc. Chem. Res. 8, 152—158 (1975).
208. Johnson W. S. Biomimetic polyene cyclizations. Angew. Chem., Int. Ed.
Engl. 15, 9—17 (1976).
209. Johnson W. S. Biomimetic Polyene Cyclizations. Bioorg. Chem. 5, 51—98
(1976).
210. van Tamelen E. E., Willett J. D., Clayton R. B., Lord R. E. Enzymic conver-
sion of squalene 2,3-oxide to lanosterol and cholesterol. J. Amer. Chem. Soc.
88, 4752—4754 (1966).
211. van Tamelen E. E., Freed J. H. Biochemical conversion of partially cyc-
lized squalene 2,3-oxide types to the lanosterol system. Views on the
normal enzymic cyclization process. J. Amer. Chem. Soc. 92, 7206—7207
(1970).
212. Corey E. J., Russey W. E., Ortiz de Montellano P. R. 2,3-Oxidosqualene,
an intermediate in the biological synthesis of sterols from squalene. J. Amer.
Chem. Soc. 88, 4750—4751 (1966).
213. Woodward R. B., Bloch K. The cyclization of squalene in cholesterol synthe-
sis. J. Amer. Chem. Soc. 75, 2023—2024 (1953).
214. Vallee B. L., Williams R. J. P. Enzyme action: Views derived from metallo-
enzyme studies. Chem. Br. 4, 397—402 (1968).
215. Jones M. M., Pratt T. H. Therapeutic chelating agents. J. Chem. Educ. 53,
342—347 (1976).
216. Ainscough E. W., Brodie A. M. The role of metal ions in proteins and other
biological molecules. J. Chem. Educ. 53, 156—158 (1976).
Литература
497
217. Packer У., Bjorkquist D. W. Comparitive studies of bovine carbonic anhy-
drase in H2O and D2O. Stopped-flow studies of the kinetics of interconver-
sion of CO2 and HCO3. Biochemistry 16, 5698—5707 (1977).
218. Tang С. C., Davalian D., Huand P., Breslow R. Models of metal binding
sites in zinc enzymes. Synthesis of tris[4(5)-imidazolyl]carbinol (4-TIC),
tris (2-imidazolyl)-carbinol (2-TIC), and related ligands and studies on metal
complex binding constants and spectra. J. Amer. Chem. Soc. 100, 3918—3922
(1978).
219. Quiocho F. A., Lipscomb W. N. Carboxypeptidase A: A protein and an en-
zyme. Adv. Prot. Chem. 25, 1—78 (1971).
220. Breslow R., McClure D. E., Brown R. S., Eisenach I. Very fast zinc catalyzed
hydrolysis of an anhydride. A model for the rate and mechanism of carboxy-
peptidase A catalysis. J. Amer. Chem. Soc. 97, 194—195 (1975).
221. Breslow R., McClure D. E. Cooperative catalysis of the cleavage of an
amide by carboxylate and phenolic groups in a carboxypeptidase A model.
J. Amer. Chem. Soc. 98, 258—259 (1976).
222. Breslow R., Wernick D. On the mechanism of catalysis by carboxypeptidase
A. J. Amer. Chem. Soc. 98, 259—261 (1976).
223. Fife T. H., Squillacote V. L. Metal ion effects on intramolecular nucleophilic
carboxyl group participation in amide end ester hydrolysis. Hydrolysis of
IV-(8-quinolyl) phthalamic acid and 8-quinolyl hydrogen glutarate. J. Amer.
Chem. Soc. 100, 4787—4793 (1978).
224. Makinen M. W., Kuo L. C., Dymouski J. J., Jaffer S. Catalytic role of the
metal ion of carboxypeptidase A in ester hydrolysis. J. Biol. Chem. 254,
356—366 (1979).
225. Breslow R., McAllister C. Intramolecular bifunctional catalysis of ester hydro-
lysis by metal ion and carboxylate in a carboxvpeptidase model. J. Amer.
Chem. Soc. 93, 7096—7097 (1971).
226. Lloyd G. J., Cooperman B. S. Nucleophilic attack by zinc(Il)-pyridine-2-car-
baldoxime anion on phosphorylimidazole. A model for enzymatic phosphate
transfer. J. Amer. Chem. Soc. 93, 4883—4889 (1971).
227. Sigman D. S., Jorgenren С. T. Models for metalloenzymes. The zinc(II)-ca-
talyzed transesterification of A'-((5-hydroxyethyl)ethylene-diamine by p-nitro-
phenyl picolinate. J. Amer. Chem. Soc. 94, 1724—1730 (1972).
228. Buckingham D. A., Collman J. P. Hydrolysis of N-terminal peptide bonds
and amino acid derivatives by the P-hydroxoaquotriethylenetetramine co-
balt(III)ion. J. Amer. Chem. Soc. 89, 1082—1087 (1967).
229. Buckingham D. A., Keen F. R., Sargeson A. M. Facile intramolecular hydro-
lysis of dipeptides and glycinamide. J. Amer. Chem. Soc. 96, 4981—4983
(1974).
230. Kimura E. Sequential hydrolysis of peptides with [5-hydroxoaquotriethylene-
tetraminecobalt(III)ion. Inorg. Chem. 13, 951—954 (1974).
231. Frieden F. Non-covalent interactions. J. Chem. Educ. 52, 754—761
(1975).
232. Hendrickson W. A. The molecular architecture of oxygen. Carrying proteins.
Trends Biochem. Sci. 2, 108—111 (1977).
233. Kendrew J. C. The three-dimensional structure of a protein molecule. Sci.
Amer. 205, December, 96—110 (1961).
234. Epstein E. F., Bernal L, Balch A. L. Activation of molecular oxygen by a
metal complex. The formation and structure of the anion
[Ph3POFe(S2C2{CF3}2)2J®. Chem. Comm. 136—138 (1970).
235. Almog J., Baldwin J. E., Dyer R. L, Peters M. Condensation of tetraaldehy-
des with pyrrole. Direct synthesis of «capped» porphyrins. J. Amer. Chem
Soc. 97, 226—227 (1975).
236. Almog J., Baldwin J. E., Huff J. Reversible oxygenation and autooxidation
of a «capped» porphyrin iron (II) complex. J. Amer. Chem. Soc. 97, 227—228
(1975).
237. Traylor T. G. Bioorganic Chemistry (E. E. van Tamelen, Ed.), Vol. IV,
pp. 437—468. Academic Press, New York, 1978.
498
Литература
238. Chang С. К., Traylor Т. G. Synthesis of the myoglobin active site. Proc. Nat
Acad. Sci. USA 78, 2647—2650 (1973).
239. (a) Chang С. K., Traylor T. G. Solution behavior of a synthetic myoglobin
active site. J. Amer. Chem. Soc. 95, 5810—5811 (1973). (b) Chang С. R.,
Traylor T. G. Neighboring group effect in heine-carbon monoxide binding
J. Amer. Chem. Soc. 95, 8475—8477 (1973). (c) Chang С. K., Traylor T. G.
Proximal base influence on the binding of oxigen and carbon monoxide to
heme. J. Amer. Chem. Soc. 95, 8477—8479 (1973).
240. Traylor T. G., Campbell D., Tsuchiya S. Cyclophane porphyrin. 2. Models
for steric hindrance to CO ligation in hemoproteins. J. Amer. Chem. Soc. 101,
4748—4749 (1979).
241. Bayer E., Holzbach G. Synthetic homopolymers for reversible binding of
molecular oxygen. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 16, 117—118 (1977).
242. Cottman J. P. Synthetic models for the oxygen-binding hemoproteins. Acc
Chem. Res. 10, 265—272 (1977).
243. Cottman J. P., Brautnan J. L., Rose E., Suslick K. S. Cooperativity in
O2 binding to iron porphyrins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 1052—1055
(1978).
244. Farrell H., Dolphin D. H., James B. R. Reversible binding of dioxygen to
ruthenium(II) porphyrins. J. Amer. Chem. Soc. 100, 324—326 (1978).
245. Molinaro F. S., Little R. G., Ibers 1. A. Oxygen binding to a model for the
active site in cobalt-substituted hemoglobin. J. Amer. Chem. Soc. 99, 5628—
5632 (1977).
246. Cottman J. P., Brauman J. I., Doxsee К. M., Halbert T. R., Hayes S. E.,
Suslick K. S. Oxygen binding to cobalt porphyrins. J. Amer Chem. Soc. 100,
2761—2766 (1978).
247. Wasielewski M. R., Svec W. A., Cope В. T. Bis (chlorophyll) cyclophanes, new
models of special pair chlorophyll. J. Amer. Chem. Soc. 100, 1961—1962
(1978).
248. Malkin R. Iron-Sulfur Proteins, Vol. II, Academic Press, New York, 1973.
249. Holm R. H. Synthetic approaches to the active sites of iron-sulfur proteins.
Acc. Chem. Res. 10, 427—434 (1977).
250. Eichhorn G. L. Inorganic Biochemistry, Vols. 1 and 2, Elsevier, New York,
1973.
251. Amundsen A. R., Whelan J., Bosnich B. Biological analogues. On the nature
of the binding sites of copper-containing proteins. J. Amer. Chem. Soc. 99,
6730—6739 (1977).
252. Gagne R. R., Allison J. L., Gall R. S., Koval C. A. Models for copper-con-
taining proteins: Structure and properties of novel five-coordinate copper (I)
complexes. J. Amer Chem. Soc. 99, 7170—7178 (1977).
253. Buckingham D. A., Gunter M. J., Mander L. N. Synthetic models for bis-
metallo active sites, A prophyrin capped by a tetrakis(pyridine) ligand sy-
stem. J. Amer, Chem. Soc. 100, 2899—2901 (1978).
254. Agnus Y., Louis R., Weiss R. Bimetallic copper(I) and (II) macrocyclic
complexes as mimics for type 3 copper pairs in copper enzymes. J. Amer.
Chem. Soc. 101, 3381—3384 (1979).
255. Coughlin P. K-, Dewan J. C., Llppard S. J., Watanabe E., Lehn J.-M. Synt-
hesis and structure of the imidazolate bridged dicopper (II)ion incorpo-
rated into a circular cryptate macrocycle. J. Amer. Chern. Soc. 101, 265—266
(1979).
256. Abeles R. H., Dolphin D. The vitamin Bt2 coenzyme. Acc. Chem Res. 9,
114—120 (1974).
257. Retey J., Dlmani-Ronchi A., Seibl J., Arigoni D. Zum mechanismus der Pro-
pandioldehydrase-Reaktion. Experentia 22, 502—503 (1966).
258. Schrauzer G. N. Organocobalt chemistry of vitamin BI2 model compounds
(cobaloximes). Acc. Chem. Res. 1, 97—103 (1968).
259. Schrauzer G. N. New developments in the field of vitamin B12: Reactions
of the cobalt atom in corrins and in vitamin B12 model compounds. Angew
Chem., Int. Ed. Engl. 15, 417—426 (1976).
Литература
499
,260. Schrauzer G. N. New developments in the field of vitamin Bi2: Enzymatic
reactions dependent upon corrins and coenzyme B[2. Angew. Chem., Int. Ed.
Engl. 16, 233—244 (1977).
261. Silverman R. B., Dolphin D. A direct method for cobalt-carbon bond forma-
tion in cobalt(III)-containing cobalamins and cobaloximes. Further support
for cobalt(fll) л-complexes in coenzyme Bi2 dependent rearrangements.
J. Amer. Chem. Soc. 95, 1686—1688 (1973).
262. Silverman R. B., Dolphin D. Reaction of vinyl ethers with cobalamins and
cobaloximes. J. Amer. Chem. Soc. 96, 7094—7096 (1974).
263. Silverman R. B., Dolphin D., Carty T. J., Krodel E. K., Abeles R. H. Formyl-
methylcobalamin. J. Amer. Chem. Soc. 96, 7096—7097 (1974).
264. Dowd P., Trivedi В. K., Shapiro M., Marwaha L. K. Vitamin B12 model stu-
dies. Migration of the acrylate fragment in the carbon-skeleton rearrangement
leading to a-methyleneglutaric acid. J. Amer. Chem. Soc. 98, 7875—7877
(1976).
265. Salem L., Eisentein O., Anh N. T., Burgi H. B., Devaquet A., Segal G., Veil-
lard A. Enzymatic catalysis. A theoretically derived transition state for coen-
zyme B12-catalyzed reaction. Nouv. J. Chim. 1, 335—347 (1977).
266. Flohr H., Paunhorst N., Retey J. Synthesis, structure determination, and rear-
rangement of a model for the active site of methylmalonyl-CoA mutase with
incorporated substrate. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 15, 561—562 (1976).
267. Breslow R., Khanna P. L. An intramolecular model for the enzymatic inser-
tion of coenzyme B12 into unactivated carbon-hydrogen bonds. J. Amer. Chem.
Soc. 98, 1297—1299 (1976).
t?68 . Corey E. J., Cooper N. Green M. L. H. Biochemical catalysis involving
coenzyme Bi2: A rational stepwise mechanistic interpretation of vicinal inter-
change rearrangements. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 811—815 (1977).
269. Toraya T., Krodel E., Mildran A S., Abeles R. H. Role of peripheral side
chains of vitamin B12 coenzymes in the reaction catalyzed by dioldehydrase.
Biochemistry 18, 417—426 (1979).
270. Sato K., Hiei E., Shimizu S., Abeles R. Affinity chromatography of A5-methyl-
tetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase on a cobalamin-Sepharose.
FEBS Lett. 85, 73—76 (1978).
271. Wood J. M. Biological cycles for toxic elements in the environment. Science
183, 1049—1052 (1974).
272. Thayer I. S. Teaching bio-organometal chemistry. II. The metals. J. Chem.
Educ. 54, 662—665 (1977).
273. Metzler A. E. Biochemistry, The Chemical Reactions of Living Cells, Chap. 8.
Academic Press, New York, 1977.
274. DiSabato G. Adducts of diphosphopyridine nucleotide and carbonyl compo-
unds. Biochemistry 9, 4594—4600 (1970).
275. Greighton D. J., Sigman D. S. A model for alcohol dehydrogenase. The zinc
ion catalyzed reduction of l,10-phenanthroline-2-carboxaldehyde by IV-pro-
pyl-l,4-dihydronicotinamide. J. Amer. Chem. Soc. 93, 6314—6316 (1971).
[276 . Grau U., Kapmeyer H., Trommer W. E. Combined coenzyme-substrate analo-
gues of various dehydrogenases. Synthesis of (3S)- and (3R)-5-(3-carboxy-
3-hydroxypropyl) nicotinamide adenine dinucleotide and their interaction with
(S)-and (R)-lactate-specific dehydrogenases. Biochemistry 17, 4621—4626
(1978).
1277. van Bergen J. T., Kellogg R. M. A crown ether NAD(P)H mimic. Complexa-
tion with cations and enhanced hydride donating ability toward sulfonium
salts. J. Amer. Chem. Soc. 99, 3882—3884 (1977).
1278. Behr J. P., Lehn J. M. Enhanced rates of dehydropyridine to pyridinium
hydrogen transfer in complexes of an active macrocyclic receptor molecule.
Chem. Comm. 143—146 (1978).
279. Hamilton G. A. Progress in Bioorganic Chemistry (E. T. Kaiser, T. J. Kezdy,
Eds.), Vol. 1, pp. 83—137. Wiley-Interscience. New York, 1971.
1280. Eklund H., Nordstrom B., Zeppezauer E., Soderlund G., Ohlsson L, Boiwe T.,
Soderberg В. O., Tapia O., Brdnden С. I. Three-dimensional structure of
500
Литература
horse liver alcohol dehydrogenase at 2.4 A resolution. J. Mol. Biol. 102,
27—59 (1976).
281. Suckling C. J., Wood H. C. S. Should organic chemistry meddle in bioche-
mistry? Chem. Br. 5, 243—248 (1979).
282. Irwin A. J., Jones J. B. Stereoselective horse liver alcohol dehydrogenase
catalyzed oxidoreductions of some bicyclic [2.2.1] and [3.2.1] ketones and also-
hols. J. Amer. Chem. Soc. 98, 8476—8482 (1976).
283. Irwin A. I., Jones J. B. Regiospecific and enantioselective horse liver alcohol
dehydrogenase catalyzed oxidations of some hydroxycyclopentanes. J. Amer.
Chem. Soc. 99, 1625—1630 (1977).
284. Jones J. В, Beck J. F. Application of Biochemical Systems in Organic Che-
mistry, In: Techniques of Chemistry Series (J. B. Jones, C. J. Sih, D. Perlman,
Eds.), Part I, pp. 107—401. Wiley, New York, 1976.
285. Prelog V. Specification of the stereochemistry of some oxidoreductases by
diamond lattice sections. Pure Appl. Chem. 9, 119—130 (1964).
286. Creighton D. J., Hajdu J., Mooser G.t Sigman D. S. Model dehydrogenase
reactions. Reduction of N-methylacridinium ion by reduced nicotinamide
adenine dinucleotide and its derivatives. J. Amer. Chem. Soc. 95, 6855—6867
(1973).
287. Brilstlein M., Bruice T. C. Demonstration of a direct hydrogen transfer bet-
ween NADH and a deazaflavin. J. Amer. Chem. Soc. 94, 6548—6549 (1972).
288. Fisher J., Walsh C. Enzymatic reduction of 5-deazariboflavine from reduced
nicotinamide adenine dinucleotide by direct hydrogen transfer. J. Amer. Chem.
Soc. 96, 4345—4346 (1974).
289. Eirich D., Vogels G., Wolfe R. Proposed structure of coenzyme F42o from
Methanobacterium. Biochemistry 17, 4583—4593 (1978).
290. Hemmerich P., Massey V., Weber G. Photo-induced benzyl substitution of
flavins by phenylacetate: A possible model for flavoprotein catalysis. Nature
213, 728—730 (1967).
291. Sayer J. M., Conlon P., Hupp J., Fancher J., Belanger R., White E. J. Reduc-
tion of l,3-dimethyl-5-(p-nitrophenylimino) barbituric acid by thiols. A high-
velocity flavin model reaction with an isolable intermediate. J. Amer. Chem.
Soc. 101, 1890—1893 (1979).
292. Rastetter W. H., Gadek T. R., Tane J. P., Frost J. W-. Oxidations and oxygen
transfer effected by a flavin N (5)-oxide. A model for flavin-dependent mono
oxygenases. J. Amer. Chem. Soc. 101, 2228—2231 (1979).
293. Orf H. W., Dolphin D. Oxaziridines as possible intermediates in flavin mono
oxygenases. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 2646—2650 (1974).
294. Vargo D., Jams M. S. Synthesis of a 4a,5-epoxy-5-deazaflavin derivatives
J. Amer. Chem. Soc. 101, 7623—7626 (1979).
295. Jerina D. M., Daly J. W., Witkop B., Zaltzman-Nirenberg S., Udenfriend S.
1,2-Naphthalene oxide as an intermediate in the microsomal hydroxylation
of naphthalene. Biochemistry 9, 147—156 (1969).
296. Guroff G., Daly J. W., Jerina D. M., Rensen J., Witkop B., Udenfriend S
Hydroxylation-induced migration: The NIH shift. Science 157,1524—1530 (1967)
297. Fox J. L. Chemists attack complex organic mechanisms. Chem. Eng. News
May 22, pp. 28—30 (1978).
298. Adam W., Alzerreca A., Liu J. E., Yany F. a-Peroxylactones via dehydrative
cyclization of a-hydroperoxy acids. J. Amer. Chem. Soc. 99, 5768—5773
(1977).
299. Kemal C., Bruice T. C. Simple synthesis of a 4a-hydroperoxy adduct of
1,5-dihydroflavine: Preliminary studies of a model for bacterial luciferase
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 995—999 (1976).
300. Schmidt S. P., Schuster G. B. Dioxetanone chemiluminescence by the chemi
cally initiated electron exchange pathway. Efficient generation of excited
singlet states. J. Amer. Chem. Soc. 100, 1966—1968 (1978).
301. Lowe J. N., Ingraham L. L. An Introduction to Biochemical Reactions Mecha-
nisms, Chap. 3. Foundation of Molecular Biology Series. Prentice-Hall, Eng-
lewood Cliffs, New Jersey, 1974.
Литература
501
302. Gansow О. A., Holm R. Н. A proton resonance investigation of equilibra,
solute structures, and transamination in the aqueous systems pyridoxamine-
pyruvate-zinc(II) and aluminium (III). J. Amer. Chem. Soc. 91, 5984—5993
(1969).
303. Blum M., Thanassi J. W. Metal ion induced reaction specific in vitamin B6
model systems. Bioorg. Chem. 6, 31—41 (1977).
304. Belleau B., Burba J. The stereochemistry of the enzymic decarboxylation of
amino acids. J. Amer. Chem. Soc. 82, 5751—5752 (1960).
305. Dunathan H. C., Davis L., Kury P. G., Kaplan M. The stereochemistry of
enzymatic transamination. Biochemistry 7, 4532—4536 (1968).
306. Dunathan H. C., Voet I. G. Stereochemical evidence for the evolution of
pyridoxal-phosphate enzymes of various function from a common ancestor.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, 3888—3891 (1974).
307. Roitenan J. N., Cram D. J. Electrophilic substitution at saturated carbon. XLV.
Dissection of mechanisms of base-catalyzed hydrogen-deuterium exchange of
carbon acids into inversion, isoinversion, and racemization pathways. J. Amer.
Chem. Soc. 90 ,2225—2230 (1971).
308. Roitenan J. N., Cram D. J. Electrophilic substitution at saturated carbon.
XLVI. Crown ethers’ ability to alter role of metal cations in control of ste-
reochemical fate of carbanions. J. Amer. Chem. Soc. 90, 2231—2241 (1971).
309. Cram D. J., Ford W. T., Gosser L. Electrophilic substitution and saturated
carbon. XXXVIII. Survey of substituent effects on stereochemical fate of
fluorenyl carbanions. J. Amer. Chem. Soc. 90, 2598—2606 (1968).
310. Broadhurst M. D., Cram D. J. A model for the proton transfer stages of the
biological transaminations and isotopic exchange reactions of amino acids.
J. Amer. Chem. Soc. 96, 581—583 (1974).
311. Jaeger D. A., Broadhurst M. D., Cram D. J. Electrophilic substitution at satu-
rated carbon. 52. A model for the proton transfer steps of biological trans-
amination and the effect of a 4-pyridyl group on the base-catalyzed racemi-
zation of a carbon acid. J. Amer. Chem. Soc. 101, 717—732 (1979).
312. Baker B. R. Design of Active-Site-Directed Irreversible Enzyme Inhibitors.
Wiley, New York, 1967.
313. Abeles R. H., Maycock A. L. Suicide enzyme inactivators. Acc. Chem. Res. 9,
313—319 (1976).
314. Schoellmann G., Shaw E. Direct evidence for the presence of histidine in
the active center of chymotrypsin. Biochemistry 2, 252—255 (1963).
315. Walsh C. Chemical approaches to the study of enzymes catalyzing redox
transformations. Annu. Rev. Biochem. 47, 881—931 (1978).
316. Chowdhry V., Westheimer F. H. Photoaffinity labeling of biological systems.
Annu. Rev. Biochem. 48, 293—325 (1979).
317. Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev.
Biochem. 47, 819—846 (1978).
318. Rando R. R. Mechanisms of action of naturally occuring irreversible enzyme
inhibitors. Acc. Chem. Res. 8, 281—288 (1975).
319. Rando R. R. Chemistry and enzymology of kCat inhibitors. Science 185,
320—324 (1974).
320. Fasella P., John R. Substrate analogues as specific inhibitors of pyridoxal-
dependent enzymes. Proc. 4th Int. Congr. Pharmacol. 5, 184—186 (1969).
321. Morino Y., Okamoto M. Labeling of the active site of cytoplasmic aspartate
amino transferase by P-chloro-L-alanine. Biochem. Biophys. Res. Commun.
50, 1061—1067 (1973).
322. Jung M. J., Metcalf B. W. Catalytic inhibition of y-aminobutyric acid a-keto-
glutarate transaminase of bacterial origin by 4-aminohex-5-y’noic acid, a sub-
strate analog. Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, 301—306 (1975).
323. Rando R. R., de Mairena J. Propargyl amine-induced irreversible inhibition
of non-flavin-linked amine oxidases. Biochem. Pharmacol. 23, 463—466
(1974).
324. Breslow R. On the mechanism of thiamine action. IV. Evidence from studies
on model systems. J. Amer. Chem. Soc. 80, 3719—3726 (1958).
502
Литература
325. Gallo A. A., Sable Н. Z. Coenzyme interactions. VIII. 13C-NMR studies
of thiamine and related compounds. J. Biol. Chem. 249, 1382—1389 (1974).
326. Jordan F., Mariam Y. H. tV'-Methylthiaminium diiodide. Model study on the
effect of a coenzyme bound positive charge on reaction mechanism requiring
thiamine pyrophosphate. J. Amer. Chem. Soc 100, 2534—2541 (1978).
327. White F., Ingraham L. L. Mechanism of thiamine action: A model of 2-acyl-
thiamine. J. Amer. Chem. Soc. 84, 3109—3111 (1962).
328. Bruice T. C., Benkovic S. Bioorganic Mechanisms. Vol. 2, Chap. 8, p. 217.
Benjamin, New York, 1966.
329. Rastetter W. H., Adams J., Frost J. W., Rummy L. J., Frommer J. E., Ro-
berts К. B. On the involvement of lipoic acid in a-keto acid dehydrogenase
complexes. J. Amer. Chem. Soc. 101, 2752—2753 (1979).
330. Bruice T. C., Hegarty .4. F. Biotin-bound CO2 and the mechanism of enzyma-
tic carboxylation reactions. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 65, 805—809 (1970).
331. Caplow M., Yager M. Studies on the mechanism of biotin catalysis. II. J. Amer.
Chem. Soc. 89, 4513—4521 (1976).
332. Guchhait R. B., Polakis S. E., Hollis D., Fenselau C., Lane M. D. Acetyl
coenzyme A carboxylase system of E. coli. Site of carboxylation of biotin
and enzymatic reactivity of l'-M-(ureido)-carboxybiotin derivatives. J. Biol
Chem. 249, 6646—6656 (1974).
333. Whitney P. A., Cooper T. G. Urea carboxylase and allophanate hydroxylase
Two components of ATP: Urea-lyase in S. cerevisiae. J. Biol. Chem. 247,
1349—1353 (1972).
334. Kluger R., Davis P., Adawadkar P. D. Mechanism of urea participation in
phosphonate ester hydrolysis. Mechanistic and stereochemical criteria for
enzymic formation and reaction of phosphorylated biotin. J. Amer. Chem
Soc. 101, 5995—6000 (1979).
335 Arigoni D., Lynen F., Retey J. Stereochemie der enzymatischen Carboxylie-
rung von (2R)-2-3H-Propionyl-CoA. Helv. Chim. Acta 49, 311-—316 (1966).
336. Retey J., Lynen F. Zur biochemischen Funktion des Biotins. IX Der steri-
sche Verlauf der Carboxylierung von Propionyl-CoA. Biochem. Z 342, 256—
271 (1965).
337. Kluger R., Pike D. C. Chemical synthesis of a proposed enzymegenerated
«reactive intermediate analogue» derived from thiamine diphosphate. Self-acti-
vation of pyruvate dehydrogenase by conversion of the analogue in its com
ponents. J. Amer. Chem. Soc. 101, 6425—6428 (1979).
338 Moss J., Lane M. D. The biotin-dependent enzymes. Adv. Enzymol. 35,
321—442 (1971).
339. Wood H. G., Barden R. E Biotin enzymes. Annu. Rev. Biochem. 46, 385—413
(1977).
340. Mildvan A. S. Magnetic resonance studies of the conformations of enzyme-
bound substrates. Acc. Chem. Res. 10, 246—252 (1977).
341. Kluger R., Adawadkar P. D. A reaction proceeding through intramolecular
phosphorylation of a urea. A chemical mechanism for enzymic carboxylation
of biotin involving cleavage of ATP. J. Amer. Chem. Soc. 98, 3741—3742
(1976).
342. Stallings W. C. The carboxylation of biotin. Substrate recognition and acti-
vation by complementary hydrogen bonding. Arch. Biochem. Biophys. 183,
179—199 (1977).
343. Wood H. G. The reactive group of biotin catalysis by biotin enzymes. Trends
Biochem. Sci. 1, 4—6 (1976).
344. Lynen F., Knappe J., Lorch E., Jutting G., Ringelmann E. Die biochemische
Funktion des Biotins. Angew. Chem. 71, 481—486 (1959).
345 Rose J. A., O’Connell E. L., Solomon F. Intermolecular tritium transfer in
the transcarboxylase reaction. J. Biol. Chem. 251, 902—904, (1976).
346. Stubbe J., Abeles R. H. Biotin carboxylations concerted or not concerted?
That is the question. J. Biol. Chem. 252, 8338—8340 (1979).
347. Visser С. M., Kellogg R. M. Mimesis of the biotin mediated carboxyl transfer
reactions. Bioorg. Chem. 6, 79—88 (1977).
Литература
03
348. Wharton С. №. Synthetic polymers as models for enzyme catalysis — a re-
view. Int. J. Biol. Macromolecules I, 3—16 (1979).
349. Fersht A. R., Kirby A. J. Intramolecular catalysis and the mechanism of en-
zyme action. Chem. Br. 16, 136—142 (1980).
350. Breslow R. Biomimetic control of chemical selectivity. Acc. Chem. Res. 13,
170—177 (1980).
351. Breslow R. Biomimetic chemistry in oriented systems. Isr. J. Chem. 18,
187—191 (1980).
352. Gokel G. W., Durst H. D. Prircples and synthetic applications in crown
ether chemistry. Synthesis, 168—184 (1976).
353. Newkome G. R., Sauer J. D., Roper J. M., Hager D. C. Construction of syn-
thetic macrocyclic compounds possessing subheterocyclic rings, specifically
pyridine, furan, and thiophene. Chem. Rev. 77, 513—597 (1977).
354. Bradshaw J. S., Stott P. E Preparation of derivatives and analogs of the
macrocyclic oligomers of ethylene oxide (crown compounds). Tetrahedron 36,
461—510 (1980).
355. Ibers J. A., Holm R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules
Science 209, 223—235 (1980).
356. Sleight A. W, Heterogeneous catalysis. Science 208, 895—900 (1980).
357. Walsh C. Flavin coenzymes; At the crossroads of biological redox chemistry.
Acc. Chem Res. 13, 148—155 (1980).
358. Schiling M. L., Roth H. D., Herndon W. C. Zwitterionic adducts between a
strongly electrophilic ketone and tertiary amines. J. Amer. Chem. Soc. 102,
4271—4272 (1980).
359. Davis F. A., Lamendola J., Jr., Nadir U„ Kluger E. W., Sedergran T. C.,
Panunto T. W., Billmers R., Jenkins R., Jr., Turchi I. J., Watson W. H.
Chemistry of oxaziridines. 1. Synthesis and structure of 2-arenesulfonyl-
3-aryloxaziridines. A new class of oxaziridines. J. Amer. Chem. Soc. 102,
2000—2005 (1980).
360. Johnston M., Raines R., Walsh C., Firestone R. A. Mechanism-based enzyme
inactivation using an allyl sulfoxide-allyl sulfenate ester rearrangement.
J. Amer. Chem. Soc. 102, 4241—4250 (1980).
361. Ogura H., Nagai S., Takeda K. A novel reagent (N-succinimidyldiphenylphos-
phate) for the synthesis of activated ester and peptide. Tetrahedron Lett.
1467—1468 (1980).
362. Pillai V. N. R. Photoremovable protecting groups in organic synthesis.
Synthesis 1—26 (1980).
363. Reese С. B., Ubasawa A. Reaction between l-arenesulfonyl-3-nitro-l,2,4-tri-
azoles and nucleoside base residues. Elucidation of the nature of side-reac-
tions during oligonucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. pp. 2265—2268
(1980).
364. Minernatsu Y., Waki AL, Suwa K., Kato T., Jzumiya N. Facile synthesis of
gramicidin S via cyclization of a linear pentapeptide. Tetrahedron Lett
2179—2180 (1980).
365. Smith D. J. H., Ogilvie К. K., Gillen M. F. The methyl group as phosphate
protecting group in nucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. 861—864 (1980).
366. Niewiarowski W., Stec W. J., Zielinski W. Synthesis of 4-nitrophenyl esters
of thymidine З'-phosphate and З'-phosphorothioate using a new phosphoryla-
ting agent Chem. Comm. 524—525 (1980).
367. Matteucci M. D., Caruthers M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on
a polymei support. Tetrahedron Lett. 719—722 (1980).
368 Parshall G. W. Organometallic chemistry in homogeneous catalysis Science
208, 1221—1224 (1980).
369. Ferris J. P., Joshi P. C., Lawless J. G. Chemical evolution XXIX. Pyrimidines
from hydrogen cyanide. BioSystems 9, 81—86 (1977).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА *
Мусил Я-, Новикова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах: Пер. с
англ. — М.: Мир, 1981.
Основы биохимии: В 3-х томах. Пер. с англ./Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э.
и др. — М.: Мир, 1981.
Шредер Э., Любке К. Пептиды: В 2-х томах. Пер с англ. — М.: Мир. Т. 1,
1967; Т. 2, 1969.
Пептиды: Пер. с англ./Под ред. Гросса Э., Майенхофера И. — М.: Мир, 1983.
Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функции клетки:
Пер. с англ. — М.: Мир, 1976.
Молекулярные основы действия антибиотиков: Пер. с англ./ Гейл Э. и др.: —
М.: Мир, 1975.
Бернхард С. Структура и функция ферментов: Пер. с англ.—М.: Мир, 1971.
Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов: Пер. с англ. — М.:
Мир, 1965.
Шабарова 3. А., Богданов А. А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. —
М.: Наука, 1978.
Органическая химия нуклеиновых кислот/Под ред. Кочеткова Н. К., Будовско-
го Э. И.—М.: Химия, 1970.
Защитные группы в органической химии: Пер. с англ./Под ред. МакОми Дж. —
М.: Мир, 1976.
Брюс Т., Бенкович С. Механизмы биоорганических реакций: Пер. с англ. — М.:
Мир, 1970.
Ландау М. А. Молекулярные механизмы действия физиологически активных со-
единений.— М.: Наука, 1981.
Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции/Под ред. Севери-
на С. Е., Кочеткова Г. А. — М.: Изд-во МГУ, 1981.
Биохимия гормонов и гормональной регуляции/Под ред. Юдаева Н. А. — М.:
Наука, 1976.
Уэситпи Дж. Ферментативный катализ: Пер. с англ. — М.: Мир, 1972.
Мецлер Д. Биохимия: В 3-х томах. Пер. с англ.—М.: Мир, 1980. Новые методы
синтеза аминокислот, пептидов и белков: Пер. с англ./Под ред. А. Нидер-
вайзера, Г. Патаки. — М.: Мнр, 1974.
Дэвани Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки: Пер. с англ. — М.: Мир,
1976.
Финеан Дж., Колмэн Р., Мичелл Р. Мембраны и их функции в клетке.—М.:
Мир, 1977.
Биологические мембраны; Пер. с англ./Под ред. Д. Парсонса. — М.: Атомиздат,
1978.
Биохимическое исследование мембран: Пер. с англ./Под ред. А. Мэдди. — М.:
Мир, 1979.
Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. — М.: Мнр, 1979.
Крепе Е. М. Липиды клеточных мембран. — Л.: Наука, 1981.
Евстигнеева Р. П., Звонкова Е. Н., Серебренникова Г. А., Швец В. И. Химия
липидов. — М.: Химия, 1983.
Овчинников Ю. А., Иванов В. Т., Шкроб А. М. Мембранно-активные комплек-
соны.— М.: Наука, 1974.
Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт: Пер. с англ. — М.: Мир, 1980.
Джекобсон М. Половые феромоны насекомых: Пер. с англ.—М.: Мир, 1976.
Хефтман Э. Биохимия стероидов. Пер. с англ. — М.: Мир, 1972.
Барбье М. Введение в химическую экологию: Пер. с франц. — М.: Мир, 1978.
Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: междисциплинарный
подход/Под ред. Р. Штрауб, Л. Болис — М.; Медицина, 1983.
Кочетков Н. К., Бочков А. Ф., Дмитриев Б. А., Усов А. И., Чижов О. С., Ши-
баев В, Н. Химия углеводов. — М.: Химия, 1967.
Представлена редактором,
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Абсолютная конформация связанного суб-
страта 233
Адамантанкарбоновая кислота 306
Аденилаткиназа 138
Аденилатциклаза 141
Аденил-(3'->5')-уридин 167
S-Аденозил метионин (SAM) 46, 395
Аденозиндифосфат (ADP) 134
Аденозинкиназа 138 (ADP) 134
Аденозннтрифосфат (АТР) 134, 195
высокоэнергетнческое соединение 46, 55,
132, 466
синтез 134, 137, 138
хиральный *у фостат 138
Аденозин-5'-фосфосульфат (APS) 428
Адриамнцин 152
Азааллильный анион 444
Азабисизобутнронитрил (АИБН) 102
Азиридиновое кольцо 48
Азлактои 69, 85, 87
Акридин 152
«Активированный ацетат» 430
«Активированный карбонат» 470
Активированные эфиры 82, 138
«Активный альдегид» 462
Активный центр 189, 198, 201
Акцептор 280
Аламетицин 281
Аланил-тРНК 58
D-Аланин 95
L-Алании 260
(5-Алании 31, 44
Аланиндегидрогеназа 260
Алкильное расщепление 72, 120
Алкогольдегидрогеназа 204, 207, 403
Аллостерия 361
Альдольная конденсация 432, 461
8-Амниоаденозии 112
Аминоацетамид 182
Аминоацетоиитрил 182
Аминоацилолигонуклеотиды 67
Аминоацилсвязывающий центр 58, 92
Аминогруппы, блокирование 70 и сл.
трег-бутоксикарбонильиой группой
f-ВОС) 70
карбобензоксигруппой (CBz) 71
тозильной группой 74
тритильной группой 74
трифторацетильной группой 76
формильной группой 75
фталнльной группой 72
4-Аминоимидазол-5-карбоксамнд 182
Аминокислоты 26 н сл., 61
алкилирование 45, 47
ароматические 29
ацилирование 52
гидролиз эфиров 351
гидрофобные 28
дейтерированные по ^-положению 100
кислотно-основные свойства 31, 42
кислые 27
незаменимые 93
нейтральные 28
рК 38
цвнттер-ион 31
Аминомалоиовая кислота, дииитрил 183
2-Амино-З-метоксн-транс-З-бутаиовая кислота
456
6-Аминопеннциллановая кислота 261
4-Амиио-б-цианоимидазол 182
Анилидная группа 170
Антагонист 21
Антикодон 117
Ант а нам ид 280
Анхимерное влияние 121
Антиметаболит 22
Апикальные связи 123
Апофермент 394, 398
Арабиноаденозин 22, 151
Арабиноцитидин 22, 151
Ареноксид 421
Арилсульфатаза 300
Арсенит 464
Асимметрический синтез а-аминокислот 92
и сл.
Кагана метод 93
Кори метод 93
на катализаторе 6noiHH-Rh(I) 103
на родиевом катализаторе 96
на полимерном носителе 102
L-Аспарагиновая кислота, монометиловый
эфир 93
Аспартатаминотрансфераза 454
Аспартат-(3-декарбоксилаза 454
Аспаргаттрансаминаза 456
Аффинная хроматография 257, 272, 394
Аффинные метки 448 и сл.
Ацетаткиназа 138
Ацетил-СоА 430, 478
З'-О-Ацетиладенозин 165
Ацетил имидазол 55
Ацетил-СоА-карбоксилаза 470
Ацетиллипоамид 463
А цетил фосф ат 55
Ацетилхолин 20, 45
Ацетоин 462
Ацетонидная группа 161
a-N-Ациламииоакриловая кислота 98
Бактериохлорофилл а 373
Белло соединение 234
Бензофлавин, аналоги 416, 421
Бензилформильная группа 166
N-Беизонладенозии 155
N-Бензоил глицин 55
Бензоин 192, 289, 459
Бергмана реагент 51
Бетаин 45
Биоизостернческне группы 20 и сл.
Биологическая роль фосфатных макромоле-
кул 104
Биологическая эволюция 181
Биологический активный альдегид 462
«Биологический цианид» 464
Биологическое метилирование 395
Биомиметические реакции полиеновой цик-
лизации 330, 335
Биомиметический подход 263, 335 и сл.
Биосинтез
аналогов 324
белков 56 и сл., 92
полинуклеотидов 148 и сл.
Биотин 469 н сл.
карбоксилированный 476, 484
механизм действия 472
модельные исследования 475
псевдовращение 482
Блокирование фосфатных групп 166
анилидной группой 170
ароматическими группами 169
2,2,2-трихлорэтильной группой 168
6-цианэтнльной группой 168
8-Бромадеиозин 112
Бромбикол 207
трет-Бутилдиметилсилильная группа 162
2-(трет-Бутоксикарбоиилоксинмнно)2-фенил-
ацетонитрнл (BCO-ON) 70
506
Предметный указатель
Валином нцнн 280
Вирус герпеса 151
Витамин Bj 458
Витамин В2 411
Витамин Вб 52, 430, 440
Витамин В12 47. 381 и сл
бномодели 389
гомологическое расщепление 383
1,2-миграция 384
модель Бреслоу 393
— Кори 394
Витамин Е 326
Витамин Н 470
Витаминная недостаточность 398
Витамины 398
Внерибосомный пептидный синтез 65
Внутренняя энергия связывания 212
Внутримолекулярный катализ 209
Вторичный медиатор 141
Высокоэнергетическое соединение (АТР) 46,
55, 138
как ацилирующий агент 466
р-Галактозидаза 259
fl-Галоген алкилам ины 48
Р-Галогеналкилсульфид 48
Галогенсульфоксидный ингибитор 454
ГАМК 31. 40
•у-Ацетиленовый аналог 456
ГАМК-трансамииаза 456
Гамильтона механизм 413
Гексокиназа 141
Гемоглобин 359
Гемопротеин 360
Гемоцианин 359
Гемэритрин 359
Гены 108
Гендерсона — Хассельбаха уравнение 38
Генерируемые ферментом «активные аналоги
переходного состояния» 467
Генетическая информация 108
Генетический код 185
Геном 108
Гетерогенная полимеризация 199, 389
8-Гидразиноаденозин 112
Гндразонолактон 94
Гидролиз
пептидов в присутствии ионов металлов
351
эфиров аминокислот 351
Гидрофобные взаимодействия 202
Гипохромизм 116
Гиппуровая кислота 55
Гликолевая кислота, амид 44
Глицеролкииаза 138
sn-Глицеро-З-фосфат 22
Глнцилаланин 53, 67
Глутаматмутаза 381
Глюкокиназа 119
Годдарда модель 425
Гомолитическое расщепление 386
Гомотопные группы 208
Грамицидин S 61, 67
Гуанидин 27
Дабсилхлорид 52
Данснлхлорид 52
Дауномицнн 150
Двойная спираль 114, 187
ДДХ 340, 365
Дезоксиадеиозин 22
Декстраи-NAD4' 260
Десатураза 317
модель 324
Детоксикация 65
1 - Р -D-2'- Д ез оксирибоф > р а ноз ил-5- иодур а
цил 21
Диастереоизомеры 187
Диастереотопиое взаимодействие 92, 208
Ди-трег-бутилкарбонат 70
4,5-Дигидро-6-феннлпнрндазон 160
Дигидроцнннамоилхлорид 166
2,5-Дииодтирозин 31
2',3'-О-Диметиламинометилеиовые производ-
ные 157
Диметил ртуть 396
1,3-Днметнлурацнл 157
Диметилфосфат 118, 120, 122
Динактин 281
2,4-Динитробензолсульфохлорид 166
2,4-Динитро-5-фторанилин 51
2,4-Диннтрофгорбеизол 49
3,4- Дноксибутил-1 -фосфоновая кислот а
(ДОБФ) 22
1,2- цнс-Диол 137, 153, 161, 162, 165
1,3- цпс-Диот 165
Днпептнд 54, 88, 91
1,5-Дифтор-2,4-динитробеизол 51
Диссимметричный мир 185
Ди-1,5-циклооктадиенродий(1) 98
ДНК 105, 152
двойная спираль 114
затравка 148
интеркаляция красителей 152
кривая плавления 116
полимераза 148
промотор 152
репликация 108, 150
Додецил сульф ат натрия (ДСН) 285. 307
Донорио-акцепторное комплексообразование
266 и сл.
ДОФА-декарбоксилаза 144
Дофамин 143
ДФФ 219, 224, 449
Дыхательная цепь 413
Железо
в белках 359 и сл.
— ферредоксине 374
Жесткие и мягкие кислоты и основания 274
Жидкофазный пептидный синтез 368
Защитные группы гетероциклических осно-
ваний 154 и сл.
ацильная 155
N-диметиламннометиленовая 156
Зимоген 219
Изобутилоксикарбоннльная группа 156
Изобутилхлороформиат 156
Пзоинверсия 445
Изоиоииая точка 32
Изоксазолиевое кольцо 85
Изониазид 450
Изопропилнденовая группа 165
Изотактические полимеры 186
Изотиоцианат 52
Изоцианат 42
Изоэлектрическая точка 32
Изоэлектрическое осаждение 32
Изоэуфеиол 335
Имидазолидон 475
4-(4’-Имидазолил)масляная кислота, фенило-
вый эфир 18, 225
Иммобилизованные коферменты 260
Иммобилизованные ферменты 138. 257 и сл.
Индуктивный эффект 38
Индуцированное соответствие 345, 348
5-Иод-5'-амино-2',5'-дидезоксиуриднн 15)
Предметный указатель
507
Ион меди 375
биомоделн 378 и сл.
Ионный насос 282. 342
Ионофоры 282
Ионы металлов 342
в роли промотора 358
«Искусственный фермент» 278. 308, 311, 330
Кажущееся моляльное количество 44
Кажущийся моляльный объем 44
Кана — Ингольда — Прелога правило приори-
тетов 203, 248
Карбанионная химия 458, 467
Карбаход 20
Карбоангидраза 341
циклодексгриновая модель 308
Карбодиимидные интермедиаты 473, 480
Карбодиимнды 174
N-Карбоксиииотнн 469 и сл.
Карбоксилирование 470
Карбоксильная группа, блокирование 76
2-тримегилсилильной группой 78
Карбоксипептидаза А 257, 343 и сл.
биомодели 346
О-Карбоксифенил-(3-И-глюкозид 17
Карбонилднимндазол 136
Карбонилфосфат 472
N-Карбоэтоксифталимид 73
Карвон 206
Кариитин 45
Катализ 189
внутримолекулярный 197, 209
гетерогенный 191, 198
гомогенный 191
ковалентный 195
общий кислотный или основной 192
полифункциональный 215
сопряженный 215
электрофильный 195
Катехинсульфат 299
Коацерваты 188
Кобаламинсефароза 395
Кобальт
в катализе 343 и сл.
— молекуле витамина В12 381 и сл.
Ковалентный катализ 195
Кодон 117
Колоколообразные кривые 216, 296
л-Комплекс 30, 199
Комплексы включения 303
Комплементарный бифункциональный ката-
лиз 17
Комплементарный носитель, метод пептид-
ного синтеза 65 и сл.
Конвергентная эволюция 225
Конденсирующий агент 79
Кооперативность 361
Кордицепин 138
Корин 381
Кортизол 261
Кортизон 23, 261, 323
Коллаген 30
Кофермент А 429
Коферменты 20, 190, 398 и сл.
иеферментативная регенерация 407
связанные с циклодекстрииом 311
эволюция 486
Крауи-эфиры 266 и сл.
в катализе 276
полимерные 272
углеводородные предшественники 274
Креатннфосфат 119
Крноэнзимологня 351
Криптанды 279
Критическая концентрация мицеллообразо-
ван ня (ККМ) 283
Курциуса перегруппировка 81
Лактатдегндрогеиаза 260
Ланостерин, биосинтез 330
Лейкса ангидрид 87
Лигаиды 351
Лизоцим 238 и сл., 256
Лимонен 206
Линейный механизм 128
Липоевая кислота 428
а-Литическая протеаза 221
Люизит 343
Люциферин 427
Макроскопические константы ионизации 43
Малонин-СоА 472, 478
Малоновая кислота 39
Матричный синтез 187
Матричный эффект 56, 148, 185
нонов металлов 345, 353, 438
Мезитилеисульфохлорид 176
Меррифильда метод 88
пропуски 92
Метилкобаламин 47, 382
N-Метилмалеинимид 438
N-Метилтетрагидрофолат 395
Метилурацил 157
Метильная защитная группа 170
Метионин 47
8-Метоксиаденозин 112
6-Метокси-8-аминохолин 24
п-Метоксикарбобензоксигруппа 72
н-Метокснтритильная группа 71
Микроскопическая обратимость 208, 249, 255
Миллера эксперимент 182
(+)-Миндальиая кислота 95
эфир 291
Миоглобин 360
модель Бейера 368
— Болдуина 362
— Кольмана 369
— Тейлора 363, 366
Митом нции С 152
Михаэля присоединение 438
Мицеллы 188, 283
«водные пулы» 287
критическая концентрация мицеллообразо-
вания 283
мембранная модель 318
стереохимическое узнавание 290
обращенные мицеллы 287
хиральиые 290
цвиттерионные 285
Модели ферментов 263 и сл.
Молекулярная адаптация 20
Молекулярная асимметрия 203
Молекулярная информация 15, 188
Молочная кислота 260
амид 44
Монактии 281
Мон ел л ии 206
Моиоаминоксидаза 452
Монооксигеназы 399
Морфин 25
биосинтетическая модель 325
Мускарин 20
Направленная миграция, механизм 446
Направляющее действие 353
Натриевый насос 282, 342
Нейромедиаторы 20, 31, 143
Необратимые ингибиторы, активируемые
ферментом 452
Необратимые ингибиторы, специфичные к
активному центру 449
Неуотсои-криковское спаривание 115
Нигериции 280
Нимана соединение 233 и сл.
4-НитрсбеНЗ альдоксим 170
508
Предметный указатель
О-Ннтрофенилсульфохлорнд 76
п-Нитрофенилхлорформнат 160
п-Ннтрофеиол 41, 82, 147, 231, 276, 476
Е- и Z-Номенклатура 4S
Нонактнн 281
Норэпинефрин 143
Нуклеозиды 107 и сл.
Нуклеотиды 107
биосинтез 148
химический синтез 153
Нуклеофильный катализ 193
NAD+ 195, 198, 388 и сл.
в мицеллах 286
модели 404
модель краун-эфира 404
на твердом носителе 260
структура 400
NADP+ 399
Огстона эффект 204
Оказаки фрагменты 150
Окислительное декарбоксилирование 422, 458
Окислительное «сшивание» 325
Окислительное фосфорилирование 413
Оксазиридии 421 и сл.
Оксазолий-ион 468
Оксидоредуктазы 399
5-Оксиметилцитозии 106
4-Окси-З-иитробензилхлорид 92
N-Оксисукципцмид 81
N-5-Оксифлавии 424
8-Оксихинолииглутарат 350
Олеиновая кислота 317
Олигомеризация 183
Олигонуклеотид 66
Онкогенные вирусы 151
Опарина гипотеза 182, 188
Оптическая чистота 68, 94
Орбитальное управление 212 и сл., 243
Ориитин 61, 79
Ориитиндекарбоксилаза 144
Ортоэфиры 245
Отравление угарным газом 360
Папаии 237
аналоги 277
арациклофаи 275
Паргилин 452
Пеницилламин 31
Пенициллин 264
Пента карбонил {[метокси (фенил) кар беи)]-
хром (0)1 76
Пепсин 242
Пептидилсвязывающнй центр 58, 66
Пептидная связь 54
образование 79 и сл.
— по методу Меррифильда 88
— с использованием активированных эфи-
ров 82
------—- ангидрида Лейкса 87
------ангидридов 80
------ ацилазидов 80
------ ацилхлоридов 79
------карбодиимидов 82
------ реагента Вудворта 85
------ЭЭДХ 86
Пептид с присоединенным лекарственным
препаратом 21
Перенос 282
активный 282
заряда 30
пассивный 282
протона 204, 208, 402
Переносчик ионов 280
Переходное состояние 189
краун-эфиры 278
Пиридоксальфосфат 430 и сл.
азааллильиый анион 444
биологическая роль 424
биомодели 446
механизм направленной миграции 446
способ действия 433
Пиридоксамин 431, 442
Пиримидиновые основания 106, 109 и сл.
Пировиноградная кислота 260, 401, 404, 431
неокислительное декарбоксилирование 458
Пируваткиназа 141
рКа 109
Поверхности полнэлектролитов 285
Поверхностио-активные вещества 189, 190,
283
Поверхность рибосомы 59
Полимеры 294
атактические 201
изотактические 186, 201
поливиннлбеизимндазол 295
поливинилимидазол 295
полиэтиленимин 299
родий(1) на полимерном носителе 102
синдиотактические 201
хирасил-Val 301
Полинуклеотиды 148 и сл.
биосинтез 148
химический синтез 153
Полипегпид-полинуклеотидное узнавание 185
Полуконсервативный механизм 148
Порфирины 362 и сл.
«огороженный» 370, 371, 378
«перекрытый» 362, 365
цнклофан 366
Построение моделей 13
Потенциал действия 144
ППК-механизм 413
Пребиотический синтез органических моле-
кул 67, 181 и сл., 374, 486
Преднизолон 261
Примахин 24
Пролинамид 253
Пропаргиламин 557
Пропиоиил-СоА-карбоксилаза 469, 483, 484
«Пропуски» 92
Простагландины 326 и сл.
эндопероксидная модель 328
Простетическне группы 267, 398
Протеинкииаза 141, 142
Протеноидные микросферы 188
Противовирусная активность 22, 151
Противовоспалительные средства 23
Противомалярийные препараты 24
Противоопухолевый препарат 49, 152
Протоиосвобождающая система 28
Профлавин 152
Прохиральность 203 и сл.
Псевдовращение 124. 129, 308
бнотина 482
Псевдокраун-эфиры 272
Псевдоуридин 106
Пуриновые основания 106 и сл., 109
Пуромицин 60
Расщеплеине связи С—О ацильной группы
120
Резонансные эффекты 41
Рейхштейна соединение 261
Рекомбинантная ДНК 181
Репликация 108, 148, 150
Рибонуклеаза А 126, 256
циклодекстринова я модель 307
Ризобитоксин 451
РНК 105, 116, 117, 126
мРНК 108, 153
тРНК 56, 67, 92
полимераза 144, 152
Предметный указатель
509
1 транскрипция 152
f-Met-TPHK^^ 58
Ртуть, метилирование 396
Сам ©уничтожающиеся инактиваторы фермен-
тов 448
। примеры 454
Саркозинам ид 253
Сахарный остаток, блокирование 158 и сл.
| ацильной группой 159
трет-бутилметилснлильной группой 162
монометокситритильной группой 158
I тетрагидропиранильной группой 164
Сверхкислоты 342, 352, 358
Свободная энергия гидролиза 55
Связывающий центр 24
Селективное окисление 318
модель десатуразы 324
Семихиноновый радикал 413
'енгера реагент 49
Сериновые протеазы 219
стереоэлектронный контроль 249
ЯМР 221, 223
грин-О-сульфат 454
иликагель 181
инапс 143
Снизим 300
интондитиан 463
истема с переносом зарядов 220 и сл.
циклодекстрины 304
Сквален 318 и сл.
Смежный механизм 128
Сопряженный гидролиз 17
Специфичность 207 и сл.
вторичная структурная 235
первичная оптическая 235
первичная структурная 235
региоспецнфичность 207
стереоспецифичность 207
структурная 207
третичная структурная 235, 237
/гафило кокковая нуклеаза 256
Стеариновая кислота 317
Стереоселективное окисление и восстанов-
ление 407 и сл.
Стереоселективный транспорт 278
Стереоэлектронный контроль 243 и сл.
при гидролизе ортоэфиров 245
херическое сжатие 215
Стероидная матрица 312 и сл.
Стероиды 312. 321, 332
как модель ферментов 312
селективная функционализация 321
«Сток электронов» 432, 438, 461
Стрептомицин 61
Субстрат 189
Субтилнзнн 234, 237, 344
Сульфониевая соль 46
Твердофазный синтез 88, 180
Теплоемкость 44
Тетрабензоиладенозин 155
Тетрагидропиранильная группа (ТГП-груп-
па) 164
Тетраметиленизопропилсилильиая группа 162
Тетрациклин 61
Тетраэдрический интермедиат 220, 222, 225,
244
Тиазол и евое кольцо 459 и сл.
Тиаминпирофосфат 458 и сл.
I построение моделей 465
[производные 461, 462, 466
Тим нд ил ил (3'-*5')-тим идин 174, 176, 178
Тимидин 22
Тирозингндроксилаза 144
Кироксин 23
Тозил-Ь-фенилаланилхлорметилкетон (ТФХК)
49, 449
Токсины 450
2,2'-Толанкарбоновая кислота 17
Транскрипция 108
Трансляция 108
Транспорт кислорода 359
Треонин 431, 448
Третичная структура 285
2,4.6-Триизопропилбензолсульфохлорид (TPS)
176
Триизопропилсилильная группа 162
2-Тримегнлсилилэтанол 78
Триозофосф а тиз ом ер аз а 203
Трипсин 225, 343
аналог 277
Тритильная группа 74
Трифенилкарбинол 75
Трифлат-ион 103
Тройная спираль 30
Угловое напряжение 257
Уилкинсона катализатор 96
Уотсон-криковское взаимодействие 66, 114,
187
Уридилил-(3'->5')-уридин 180
Уридннциклофосфат (с UMP) 147
Фаг Т2 115
Фаг фХ 174 116
FAD 411 и сл.
Гамильтона механизм 413
Годдарта механизм 425
оксазиридин 421
реакции оксенов 417
флавиннитроксильный радикал 425
N-Фенилгидрантоин 53
N-Фенилтиогидантоин 53
Феноксибензамин 48
Фенциклидин 24
Ферментная технология 259, 407
Ферменты 15, 189, 201
активный центр 189, 198, 201
ингибитор 190
каталитический центр 201
кофермент 190
модели 263
связывающий центр 209
специфичность 207
субстрат 189
ферментативный реактор 260
ферментативный электрод 260
Феромоны 207
Ферредоксин 374
Фишера этерификация 77
Флавины 411 и сл.
Флуоресцентная спектроскопическая линейка
450
Формамид 183
Формилметилкобаламин 390
Фосфаты 117 и сл.
апикальные связи 123
креатинфосфат 119
реакция гидролиза 119
хиральный v-фосфат 138, 139
экваториальные связи 123
О-Фосфобиотин 472, 479, 480, 482
З-Фосфоглицеральдегид 459
Фосфодиэфирные связи, образование 171
и сл.
ароматическими сульфохлоридами 175
карбодиимидами 174
2,2,2-трихлорэтилдихлорфосфитом 178
хлорофосфатами 171
Фосфодиэфирный метод 167
Фосфоксилулоза 459
510
Предметный указатель
Фосфорилаза а и b 142
Фосфорильное расщепление 120
Фосфотрнэфирный метод 167
Фосфофруктокиназа 144
Фотоаффинная метка 450
Фотолабильная защитная группа 166
N-Фталиламинокислота 72
4-Фтор-З-нитрофенилазид 51
р-Фторпропионил-СоА 485
/з-Фторфенилаланин 57
5-Фторцитозин 21
Хелатный комплекс с ионом меди 79
Хемилюминесценция 427
модели 428
Хемиотерапня раковых заболеваний 151
Химическая адаптация 20, 467
Химическая эволюция 181, 188
Химический синтез
белков 67 и сл.
нуклеотидов 153 и сл.
ос-Химотрипсин 343
модель циклодекстрина 303
полнимидазольная модель 297
связанный субстрат 233
стереоэлектронный контроль 252
Хиральная специфичность 237
акцепторов 268
хнральиое узнавание 268, 275
Хиральность 16, 187, 203
Хирасил-Val 300
(S.SJ-Хирафос 97
Хлорамфеникол 61
5-Хлоруридин 112
Холофермент 394, 398
Хромосомы 108
А-Центр 59, 66
Р-Центр 59, 66
р-Циаиаланин 31
Цнанацетнлен 183
Циглера — Натта катализаторы 185, 199
и сл.
2',3'-Циклические ортоэфиры 165
Циклические пуриновые фосфодиэстеразы
130
3',5'-Циклоадеиозинмонофосфат 141, 144
Циклогексимид 61
Циклогуанозиимонофосфат 141, 195
Циклодекстрины 302 и сл.
модель карбоангидразы 208
— рибонуклеазы А 307
— родопсина 312
пиридоксаминная связь 311
мета-пара-селективность 306
симметричнозамещенные 310
хиралыюе действие 311
экранированные 305
2'.3/-Циклокарбонат 137, 162
Циклофосфамид 49
Цинк в катализе 343
двойная функция 348
Цистатионин 451
Цистеинил-тРИК^У5 58
Цистрон 108
Цитозии 21
Цитохромы 359, 413
Чувственное восприятие 205
вкус 206
запах 205
Эдмана деградация 54
Электростатическое взаимодействие 203, 239
240, 295, 345
Электрофильный катализ 195
Энантиомеры 187
разделение 278
различие 265
Энантиотопная группа 208
Энтропия 210, 211, 215
Эпинефрин 142
Эписульфониевое кольцо 48
ЭПР 375
медьсодержащих ферментов 379
1 -Этил-3- (3-дим ети л ам иноп ропил) к а р боди-
имид 85
Этиленфосфат 122
Эфедрин 139
а-Эффекг 170
Эффективная концентрация 210
Эффект ориентации 209, 215
Эффект поля 39
Эффект сближения 16, 209, 212, 215
ЭЭДХ 86, 136
Ювенильные гормоны 207
ЯМР 221
донорно-акцепторных комплексов 270
сериновой протеазы 223
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие редактора перевода . .... ... 5
Предисловие................ ... ... .... .8
От авторов .... .............. ...... .10
Некоторые сокращения и обозначения, принятые в дайной книге . . 12
Глава 1. Введение в биоорганическую химию . . ... 13
1.1. Основные положения . . ........... 13
1.2. Эффекты сближения в органической химии . . . . . 16
1.3. Молекулярная адаптация............. . 20
Глава 2. Биооргаиическая химия аминокислот ........................... 26
2.1. Основные свойства аминокислот . . .26
2.2. Кислотно-основные свойства . .... 31
2.3. Алкилирование . . 45
2.4. Ацилирование . . . . . . . . 52
2.5. Биосинтез белков............................................ .56
2.6. Химический синтез белков ... .67
2.6.1. Блокирование аминогрупп ... . .70
2.6.2. Блокирование карбоксильной группы 76
2.6.3. Образование пептидной связи .... 79
2.7. Асимметрический синтез а-аминокислот ... . 92
2.7.1. Метод Кори....................... . . 93
2.7.2. Родиевый (I) катализатор.................... . .96
Глава 3. Биооргаиическая химия фосфатов ... .104
3.1. Биологическая роль фосфатных макромолекул................... 104
1 3.2. Общие свойства компонентов нуклеиновых кислот . . 109
3.2.1. Пурины и пиримидины..................... . . 109
3.2.2. ДНК и РНК.............................................. ИЗ
3.2.3. Фосфаты..................................... . . .117
3.3. Реакции гидролиза........................................ .119
3.4. Прочие иуклеозидфосфаты . . ................ . 132
3.4.1. АТР (аденозинтрифосфат)............................ . 132
3.4.2. сАМР и cGMP ... ........... ... .141
3.5. Биосинтез полинуклеотидов ... . . 148
3.6. Химический синтез полинуклеотидов............. . 153
3.6.1. Защитные группы гетероциклических оснований . 154
3.6.2. Блокирование сахарного остатка . . 158
3.6.3. Блокирование фосфатных групп . . . . 166
3.6.4. Образование фосфодиэфирной связи . 171
3.7. Химическая эволюция биополимеров............................ 181
3.7.1. Пребиотическое происхождение органических молекул . 181
3.7.2. Концепция диссимметричного мира................ . . 185
З.7.2.1. Матричный синтез............................... 187
3.7.2.2. Поздние стадии химической эволюции . . . 188
Глава 4. Химия ферментов . .............. 189
4.1 Введение в катализ................................ .... 189
4.2. Ферменты. Общие понятия............................. • 201
4.2.1. Молекулярная асимметрия и прохиральность . • 203
4.2.2. Чувственное восприятие на молекулярном уровне . 205
4.2.3. Факторы, определяющие специфичность ферментов . 207
4.2.4. Внутримолекулярный катализ..................... 209
4.3. Полифункциональный катализ и простые модели..................215
512
Содержание
4.4. а-Химотрипсин . ............. 2191
4.4.1. Тетраэдрические интермедиаты.............. - 2251
4.4.2. Абсолютная конформация связанного субстрата . . . 233
4.5. Другие гидролитические ферменты.................... ... 238
4.6. Стереоэлектронный контроль в реакциях гидролиза . 243
4.6.1. Гидролиз ортоэфиров.............................. .... 245 ।
4.6.2. Приложение к сериновым протеазам .... 249 |
4.7. Иммобилизованные ферменты и ферментная технология . . . 257
Глава 5. Моделирование ферментативных систем . . . . 2631
5.1. Доиорио-акцепториое комплексообразование . .... 266
5.1.1. Хиральное узнавание и катализ . ............275
5.1.2. Стереоселективный транспорт . .... .... 278
5.1.3. Ионофоры.............................. . ... 282
5.2. Мицеллы................................................... 283
5.2.1. Стереохимическое узнавание.......................... . 290
5.3. Полимеры........................ . . . . 294
5.4. Циклодекстрины..............................................302
5.5. Моделирование ферментов с использованием стероидной матрицы 312
5.6. Реакции селективной функционализации .... ..........317
5.6.1. Примеры других реакций, близких к биосинтезу . . . 324
5.7. Биомиметические реакции полиеновой циклизации............... 3301
5.7.1. От сквалена до ланостерина ... .............. 3301
5.7.2. Биомиметический подход ... ....................... 3351
Глава 6. Ионы металлов...............................................342
6.1. Иоиы металлов в белках и других природных соединениях . . . 342
6.2. Карбоксипептидаза А и роль цинка ... ..... 343
6.3. Гидролиз эфиров аминокислот, амидов и пептидов . . . 351
6.4. Железо и транспорт кислорода . ............................359
6.5. Ионы меди................................. .375
6.6. Кобальт и витамин В12 . .............. . 381
Глава 7. Химия коферментов........................ . 398
7.1. Реакции окисления — восстановления .... . 399
7.1.1. NAD+, NADP+.......................................... 3991
7.1.2. Неферментативная регенерация коферментов и некоторые
примеры использования коферментов в органическом синтезе 406
7.1.3. Химия флавинов.............. . . 411
7.1.4. Реакции оксенов ....... ... 417
7.1.5. Липоевая кислота . . 428
7.2. Пиридоксальфосфат.......................................... 430
7.2.1. Биологическая роль пиридоксальфосфата . . . . 434
7.2.2. Модельные системы.....................................441
7.2.3. Самоуничтожающиеся инактиваторы ферментов и аффинные
метки............................ . . .... 448
7.3. Тиамин................................. . . 458
7.3.1. Конструирование моделей тиамииа ... ... 465
7.4. Биотин.......................................................469
7.4.1. Модельные исследования........................... . 475
Общая литература ... . .... ....................487
Литература......................................................... 487
Дополнительная литература ......................................... 504
Предметный указатель............................................... 505