..
-: 5·:·:-
.'.
,l:-
'
•
.
.
-~·-
,·.
· Транспорт ионов
через
-·
биологические
мембраны.
::,;~---- и '
механизм
..,
деист.вия _
физиологически
активных
веществ

А КАДЕМИ Я НАУК УЗБЕКСКО Й ССР
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ
Т РАНСПОРТ ИОНОВ
Ч ЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ
М ЕМБРАНЫ И МЕ Х АНИЗМ
.Д ЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛ О Г И ЧЕСК И
А КТИВНЫ Х ВЕЩЕСТВ
Под редакцией члена-корреспондента
АН УзССР Б. А . Таи.t-11уха,11едова
ТАШ КЕНТ • ИЗДАТЕЛЬСТВО <ФАН» УЗБЕ КСКОЙ ССР, 1982

~: дк 577.11
Транспорт ионов через биолоrические мембраны и механизм действия
физиологически активных веществ. Ташкент, «Фан» УзССР, 1980, с . - 232.
В сбор нике с,тражены результат ы исследования структуры и функциir
биологических мембран и специфических мембранных о бразований , вл ия­
ния различных физиологичесю-1 активн ых соединенн11 на транспорт 11онов
через мембраны. Биологические мем браны и их физико-химическое состоп­
ние определяют большинство клеточных функций. Состояние мембран ре­
гули рует возбуд~,;мость ~< ле ток, определяет энергетик у 1<.11еш и, ио нныii
состав, мышечное сокращение и т . д. Реализацип эффектов многих био­
лс.гически активных веществ осуществляется через взаимодействие их ,:
мtмбранами . или специфическими мембра нными образ о ваниями .
д .~я биологов, химиков и ыедик ов.
Рецензенты: докт. биол. нау к А. К Мирахл1ед ов, докт . биол. нау к
К Р. Рахи,иов
21055-1690
Т М 355 (04)-81 51-82 2001010000
© Издательово "Фан" Узбекской ССР, 1982 г .

ПРЕДИСЛОВИЕ
Исследование механизмов активного транспор т а ионов через
биоло гические мембраны - одна из проблем, от успешно го реше ­
ния кото,рой в значительной степени зависят многие т еоретические
и прикладные направления современной биологии и медицины.
Мембраны занимают центральное место в регуляции клеточ•ных
функций. Поддержание нормальной клеточной асимметрии между
клеткой и оредой обеспечивается работой ионных н а сосов, лока­
лизованных в плаз~1ати ч еск их (Na, К-АТФаза и Са -АТ Фаза)
и внутриrклеточных мембранах (каль·циевые нас осы м итохондрий:
и эндоплазматического ретикулума). Функционирование ионных
насосов регулируется различными факторами, с,реди к оторых сле­
дует отметить гормоны, метаболиты, некоторые ионы , эволюцион ­
но обусловленные о·собенности минерального обмена и т. д. Необ­
ходи:vю, однако, подчеркнуть, что многообразные с п особы и ,vrе­
ханизмы регуляции а,ктивно,сти ионных насосов исследованы не­
достаточно, хотя эти аспекты универсального явлени я транспорта
ионов п~ре:дставляют не меньший интерес ; чем выя сне ние м о леку­
лярного устро йства ионны х насосов в живой клетке.
Наряду с регуляцией ионного баланса •На уровне отдельных
клеток и клеточных органелл транспорт ионов и в одно - солевая
регуляция в пределах цел,оло организма у . позвоночных осуществ­
ляются специализированным органом - почкой. Исследование
транспорта ионов в клетках нефрона представляет значительный
интерес в связи с тем, что его сегменты обладают различной функ­
циональной активностью, которая наХJодит от,ражение в кинети­
ческих и термодинамических характеристика,х сист е м активного
транспорта Na+ и К+. Кроме того, • существенным критерием,
определяю щим особ,енности функционирования Na, К - насоса
в нефр,оне, я·вляются видовые и экологические х,ар~ш теристики ми­
нерального о.бмена различны х животных.
Неясным в настоящее время представляется комплекс физио­
логических систем и механизмов, регулиру'ющих внут,риклеточный
уровень Са 2+. Известно, что ионы Са 2+ участвуют в к ачестве вто­
ричн1ого посред-ни1ка, активатора или ингибито,ра в осу ществлении
3

мног оч и,сленных клеточных процессов и реакций. На пути иден ­
тифи кащ-ш механизмов, контролирующих обмен ионо·в Са 2 + в
клетке , большое значение придае-гся исследованиям действия раз ­
личных физиологически а ,ктивных соединений, способньiх модифи ­
циров а ть активность систем аккумуляции и в ы свобожде н ия Са 2+,
локал из ованных в мембранах м~похондри ·й и ли эндоплазмат и ­
ческо го ре т икулуу1а.
В наст оящ_ее время разра,ботаны определенные экс п еримен ­
тальные подходы, позволяющие у,ста ,новить молекул' ярную орга ­
низа •цию и У1 еханизмы .регуля ц ии активности ионных насо·,:<ов био­
логи ческих мембран. Сред.и них прежде всего следует отмети т ь
различные методы разделения и последующей реконстру,к,ции сис ­
тем транспо рта ионов, широ~ое использование селекти ·в ных ионо ­
фор ов, токсинов и фосфолипаз . В исследовании Nэ, К-насосэ
важн ую роль играет применение сердечных гликозидов и родст­
венны х соединений, избирательно блокирующих транспортный
фермент.
Поиск и хараппер,истика новых эффективных «инструментов»
исс"1 едов ания биологических мембрая, способных обеспечить про­
гресс л1но гих научных и прихладных дисциплин, является актуаль ­
ной зад ачей современной мем,бранологии . У•спехи в этом направ -­
ле н ии несо:-шенны (см. Ю. А. Овчинни1,ов, В. Т . Ивано,в,
А. Jvl. Шкроб
-
«Мембрана - активные комплексоны», 1974;
Ю. А . Овчинников (,ред.) - «Итоги и перспе;кт,ивы развития био ­
орга ю1°,ес кой хи:v~ии и молекулярной биологии» , 1978) . В русле
эт.их исс ледований находится оригинальное н аучное направление,
сложи ,вшеес я в нашей республике с середины 60 - х годов на стыке
мем·б ран ,ое"юrин , физи оло гии и биоорганической хи_v1,ии . В отделе
би1офизиrш Института биохимии АН УзССР и в ТашГУ ю1.
В. И . Ле нина интенсивно ис,следуется проблема активного транс­
лорта r,он ов че!Jез раз JJи чные типы биологических мембран, осу ­
щестз"1яется ,выделение функщионально значимых компонентов
ме:\f бран и реконструк,ция ионных нас,осов, больш ое вни:-1ание уде ­
ляет ся выяснению механизмов регуляции систем транспо,рта ио­
нов. Широ·кую известность приобрели достижения научных кол ­
лективов респу,блики, связанные с по.иском, выделение~•! и хара 1к ­
теристикой своtkтв новых «инст,рул,rен-гов» исследования: из·би ­
ратедыю действу 16щих зоо- и фитотоксино·в, различных фо•сфоли ­
паз, си ·нте ти с~ еских и природных ионофоров, сердечных гJJикозидов
ит.Д.
В настояще:vr сбор н ике представлены обзоры, отражающие
осно вные успех,и и пер,сгtектшзы ,р,аз-вития биофизического направ ­
ления исследований в Ув,бекистане. Книга представляет ин терес
для спсuиат1стов в области биофизики и биохимии ионного транс ­
порта, физиоJJо гии 1,леточных про ц ессов, механизма действия б и о ­
,логичес1ш ак т ивных соед .инен•ий. Сборник рассч ит ан на н ау ч н ы х
_работ ни ков, преподавателей вузов и а•спирантов.
Чл. - корр. АН УзССР Б. А . Ташмухамедов.
.4

ТРАНСПОРТ ИОНОВ
ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ И ЕГО
РЕГУЛЯUИЯ
А. И. ГАГЕЛЬГА!-!С, Б. А. ТАШМУХАМЕДОВ, Х. МЛ.МАТ КУ ЛОВ
МЕХАНИЗМ ИОННОЙ СЕЛЕКТИВНОСТИ КАЛЬЦИЕВЫХ
НАСОСОВ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ И
ОСОБЕННОСТИ ТРАНСПОРТА ИОНОВ СТРОНЦИЯ
ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
Исследование механизма транспорта ионов через би оло ги­
ческие мембраны и систем его регуляции - одна из н аибол ее
актуальных проблем современной биохимии, биофизики ,i био­
логии в целом. Поддержание внутренней ионной среды клетtж ,
отJшчающ1;йся по составу от внеклеточного пространств а, - об­
щебио Jiо гическое явление. Активный транспорт ионов при сущ
клеткам бактерий, простейших, одноклеточных и многоклеточных
водорослей, высших растений и жwвотных. Неравномерное рас­
пределение ионов, их активное и па ссивное пере ме щени е меж ду
клеткой и средой, а также между различными клеточны м и эле­
ментами представляет собой важное звено в регуляции функ­
ционального состояния кJiеток различных тканей.
Особое место в интегральной системе клеточных меха низм ов,
рег ули рующих ионный состав, занима_ет митохондри аль ный
транспорт ионов, интенсивно исследующийся в течение по след них
20 лет. Вывод о важной роли митохондрий в регуляции ион ного
гомеостаза клеток следует из детал. ь ного анализа многочислен­
ных экспериментальных данных, приведенных в ряде исчер пы ваю­
щих обзоров (Lehninger, 1966, 1970, 1972; Rasшussen, 19 66; Leh-
ninger et а! . , 1967; Мооге, 1972; Carafo1i, 1973, 1974, 1975, 1977,
1979; Bygrave, 1977) и специальных монографи й (Ле нинджер,
1966; Скулачев, 1969, 1972; Ташмухамедов, Гагель ганс, 1973; Ов­
чинников, Иванов, Шкроб, 1974). В основе таких предст авле ний
лежит обнаруженная в начале 60-х годов способность изо лирован­
ных митохондрий эффективно акку му лировать ионы двухв аJJен т­
ных мета.~лов, калия и натрия, раз л ичные а нионы и т. д. и ана­
J1из этого фено ме на.
Большое число работ по митохондриальному. транспорт у и онов
посвященр и сследо ванию механизмов аккумуляции и выс в о бож­
дения ионов Са 2+, являющихся компонентом множества функцио­
нальных и регуляторны х систем клетки. Предполагается, что ми­
тохондриальный механизм транспорта Са 2+ является пер вич ным
среди механ из мов, использijемых клеткоi1 в процессе эв олю цин
для модиф и ка ции внутриклеточного распределения это го катиона

(Bygrave, 19 77). Подобная модификация, или регуляция, может
быть связа на , в свою очередь, с длительными или преходящими
изменениям и в клеточном метаболизме.
И с следо ва ние транспорта Са 2+ в митохондриях может быть
разделено на несколько этапов (Bygrave, 1977; Carafoli, l 979) .
На п ерво м этапе не придавалось должного внимания явлению
акку м уляц ии Са 2+ в митохондриях. Среди наиболее ранних работ
этого периода · следует отметить исследование Slater, -Clelaпd
(1953 ) , кото р ые обнаружили аккумуляцию Са 2+ в митохондриях,
но со чли несу щественной ее биологическую роль, тр.к как она
наб людала сь и при 0°С. Несколько ранее было показано, что Са 2 +
мож ет сти мул ировать АТФазную активность интактных мито­
хон др ий (Pot ter, 1947; Siekevitz, Potter, 1953; Potteг et al., 1953)
и что эти ион ы обладают способностью разобщать окисление и
фосф о рили ро в а ние (Lel1hiпger, 1949). Позднее появились работы,
свид етельст вую щие о накоп J1ении в изолированных митохондриях
двух в алентн ых катионов против концентрационного градиента с
пом_о щью э нер гозависимого процесса (Bartley, Amoore, 1958), о
стим ул ирующем эффекте Са 2 + на дыха·ние (,митохо,ндрий, 1Проде­
м-он•с 11рирона1н но м п:ри п,0 Jшрографичес1 1шй 1регистра,ции дыхания
(Чане, 1962).
На вто ро м этапе получены прямые доказательства «массив­
ного » накопления Са 2 + в изолированных митохондриях почки
(Vas i п gtoп , Murphy, 1962) . Внимание биоэнергетиков в этот пе­
риод было сос редоточено на подборе условий, способствующих
макс и мальн ой «нагрузке» митохондрий ионами 1,альция (Lehniп ­
ger, 1966; Ra snшssen, 1966). Электронномикроскопические иссле­
дова ни я «на г руженных» таким образом митохондрий позволили
выяв и т ь н ал ичие в их матриксе электронноплотных гранул, ко­
торы е был и ид ентифицированы по химическому составу как гид­
рокс иа пати т , :1л и фосфат кальция (Lelшinger, 1970). Подобная
«ма сси вная » а,шумуляция ионов
кальция получила название
«наг рузки м а т рнкса» (Lehniпger et al., 1969; L.elшiпger, 1970). В
этот ж е п ер иод была установлена способность изолированных
мито хо ндри й накапливать с п омощью аналогичного механизма
зна чит ельн ое количество стронция (Mraz, 1962; Carafoli et а!.,
1965; Carafoli , 1965а, Ь; Vап der К!ооt, Glovsky, 1965; Сарlап, Ca-
rafol i, 1965 ), м арганца (Chappell et al., 1963; Сl1апсе, Mela, 1966 ;
Dгah ot a et а! ., 1969), а также магния - в случае митохондрий
серд ца (Bri e rley et al., 1963).
•
В исс ледованиях этого периода (Виноградов, Евтодиенко,
1967) поми мо выяснения селективности митохондриального меха­
низм а тран с порта ·двухвалентных катионов существенное внима­
ние у,, елял ось установлению места и роли процесса транспорта
ионо в в сист ем е других эндэргонических функций митохондрий
(синт ез АТФ, обратный перенос электронов, трансгидрогеназная
реак ция и т. д .) . В связи с тем, что разобщающие агенты и инги­
бито ры ды хани я в равной мере влияли как на транспорт двухва-
6

.пен тн ых катион ов , так и на окислительное фосфорилирование,
,было п риз нано , что оба процесса пОддерживаются одним и тем же
звеном ил и од н им и тем же состоянием, генерируемым в мито­
хо ндри ях (Сhапс е, 1965; Rasmusseп, 1966). Значительные усилия
исследователей н а этом этапе были направлены на измерение
ст ех ио мет рически х коэффициентов, характеризующих транспорт
ион ов в ми тохон дриях, и анэ.лиз причин расхождений в их вели­
чин ах, ПОJ1у ченных в различных лабораториях . Эти несоответст­
вия н аблю даются в исследованиях последнего времени, в част­
ности при из мерении стехиометрии переноса электрических за ­
ряд ов в пр оцессе транспорта Са 2+ (Azzone et а!., 1977; Reyпafarje,
Le hпinger, 1977; Моу!е, Mitchell, 1977; Akermaп, 1978; Carafoli,
l979; Dеапа et а!., 1979).
Н а тр етье м этапе исследования транспорта Са 2+ в митохонд­
риях , охва тывающе м и настоящий период, анализируется его ме­
ха низм пр еимущественно в условия х «ограниченной» нагрузк и
ил и так наз ывае >vюй « нагрузки мембран». Эти исследования по д'
твердил и предположение о наличии в митохондриях мобильного
кал ьци евог о переносчика (Lehпinger , 1970; Bygгave , 1977), были
об нар уже ны специфические ингибиторы транспорта двухв а лент ­
ных к атион ов, каковыми являются лантаниды (Ме!а, 1968), ко:Vfп ­
Jiекс ны е катионы рутениевый красный (Moore, 1971) и гексами­
нокоб алы (Tashmukhamedov, Gagelgans et а!·., 1972), взаимодей­
ствующие с глиr,опр отеидами или мукополисахаридами. Одновре­
менно был о доказа но , что митохон дри альный транспорт двухва ­
Jiен тны х к атионо в може т быть описан в рамках хемиосмотиче­
ской теор ии Митчела (Mitchell, 1966): ионы акку мул ируются в
митохондриях за счет электрохимического потенциа ла, генери руе ­
мог о на в нутренней мембране дыхательной цепью или Н+-АТФ­
азой, и ра спределяются на внутренней мембране, достигая равн о ­
вес ия с ним (Lehпiпger, 1970; Скулачев, 1972). В 70-е го д ы был и
пр ед пр инят ы попытки разделения и последующей реконструкции
на модельных системах (бис.пои, липосомы) митохондриа ль но й
сис темы транспорта Са 2+ (Shamoo, Craldstein, 1977) . Эта пробле­
м а, одн ак о, не разрешена и до настоящего времени.
В современных исследованиях транспорта Са 2+ в мит о хо нд ­
риях большое внимание уделяется анализу механизмов регуляци и
не то лько входа Са 2 + в митохондрии, но и систем его выхода,
выясне н и ю фи зиологич еской сущности этого процесса , соотноше­
ния акт ив ностей двух противоположно направленны х потоков
Са 2 + , иду щих чере з внутреннюю ме м брану митохондрий, особе н­
ностей эл ектрофоретической и электронейтральной систем пере­
носа С а 2+ . в различных тканях . Итогом эти х исследований яви- ·
Jiac ь разработка Carafoli ( 1979) концепции «кальциевого цикл а »,
соедин ив шей воедино путь электрофоретического переноса Са 2+
вну трь м итохондрий и электронейтральный обмен Са 2+/Н+ (ил и
об мена Ca2+/Na+ в мит охондриях во збудимых тканей) как взаи ­
мосвязанн ый физиоло гически рег улируемый меха ни зм . Измене-
7

ние активности любого из «полуциклов» (соответствен но отра­
жающего путь входа Са 2+ или его выхода) позволяет · тонко регу­
лировать внутри - и внемитохондриальную концентраци ю Са 2+ .
Наличие подобного цикла было описано и в некоторых ран ни х
исследованиях (Ташмухамедов, Гагельганс, 1973; Dгah ota et а!.,.
1965; Lehninger, 1966). Следует отметить, что присутств ие в ми­
тохондриях более одной системы переноса Са 2+ через вну трен­
нюю мембрану несколько усложняет пробле ~1 у 11х ра зделения и
реко н струкции.
Существует . несколько механизмов тонкой регуляци и у ровн я
и распределения в клетке Са 2+ (Ташмухамедов , Гагельг анс, 1973),
у ч аст вующего в качестве регулятора во многих био логи ческих
процессах (мышечное · сокращение, секреция, фоторе цеп ция Ji
т. д . ), активатора или ингибитора ряда фер м е н тов, « мессе н дже ­
ра» некоторы х сложных регуляторных цепей (на п ри мер, с:1ст ема
регуляции уровня цАМФ). Кроме механиз ма трансп орта Са 2+
в м ито х ондриях, имеются «кальциевые насосы» в плаз :,;ати ческих
м ембранах и в мембранах саркоплазматического ретик улума, ко ­
торые, по - видимому, действуют параллельно с м 1~тохо1-щриальн ы м
механизмом, обеспечивая внутриклеточный го меостаз С а 2+. Поми­
мо насосов, локализованных в мембранах, имеются неме мбран ные
лиганды, выполняющие ·роль внутриклеточных «кальциев ых б уфе ­
ров» (адениннуклеотиды, тропонин С, парвальбу ми ны, фосфат , ор­
г аническне кислоты и т . д.). В частности, связыв ан ие Са 2+ с нем ем­
бранными компонентами обеспечивает концентр ац ию с вобод ного
Са2+ (1- 10-6
-1 - 10-7 М/л), которая существенно ниже уров ня об­
щего Са2+ в цитозоле. В по сл еднее время выявлена еще одна функ ­
ция цитоплазматических кальцийсвязывающих белков, закл ючаю­
щаяся в непосредственной регуляции активности АТФ - зависимых
кальциевых насосов плазматической мембраны и сар 1юплазмати ­
ческого ретикулума.
Представляет интерес сопоставление двух типов 1, аль циевых
на сосов, которыми располагают внутриклет оч ные д еп о ка льция
(митох0ндрии и саркоплазматический ретикулу м) . В ос нове Са 2+~
насоса ФСР лежит Са 2+-активируемая А ТФаза (Hassel bac]1, M a-
kiпose, 1961; 1962, 1963; Хассе л ьбах, Вебер, 19 64; Бенд ол, 1970;
Ташмухамедов, Га г елr,ганс, 1973; Ритов, 1977; Болдыр ев, 1977) _
Встраивание очищенной Са -АТФазы, выделенной из ФСР, в мем­
браны ли посо м из фосфолипидов сои оказало сь единстве нн ым и
до статочным условием успешной реконструкци н м ехани зма т ран ­
с порта Са 2+ (Rackeг, 1972).
В отличие от митохондрий, поляризация мем бран ФС Р не
игр ает существенной роли в движении Са 2+ через мемб ран у и ли
·же
сам факт поляризации признается спорным (Болды рев, 1977;
Вееlег, Martonosi, 1979). Об этом же сви де тельству ют отсу тстви е
эффекта р азобщите ле й - протонофоров типа ДНФ, ТТФ Б, FCCP
на количество аккумул 'ированноrо в ФСР Еал ьци я (Та шму хаме­
дов, Гагельганс, 1973; Madeira, 1978). Нако пленный в ФСР ил и
8

в ре~онструированных протеолипосомах кальций выс воб ожда ет-·
ся в среду при добавлении кальциевы х ионофоров А 231 87 и
Х - 537 А (Cas,1ve ll, Pressшan, 1972; Racker, 1972; Madeira, 19 78) ,.
т. е. аналогично тому, как эти соединения действ у ют в ми тохон д­
риях. В м есте с тем показано, что пере но с Са 2+ через ме .-.1·бр ану
ФСР или протеолипосом со встроенной Са - АТФазой ген ер'иру ет
ра з ность потенциалов на мембране со з наком «плю с » внут р и в е­
зикул, т . е . механизм транспорта Са 2+ является электрог ен н ым
(Ziшпiak, I~ackeг, 1978; Пе:чатни1<ов и д р., 1979). По д анн ым др у­
гих авторов (Вееlег, Martoпosi, 1979), !1 рямы х д ока за тельст в элек­
трогенности транспорта Са2+ в ФСР нет, и электроней тр альность
этого процесса в целом обеспечивается одноврем енным с перено­
сом Са 2+ погJiощением анионов или п ротивотран с порто м Mg2+
(или других катионов). Селективный к ан а л для С а 2 +, котор ый
«пронизывает» фосфолипидны й бислой мем браны ФСР, в ид им о ,
являетс я сост а вной частью Са-АТФа зы и может быть в ыявл е н
при встраивании триптического фраг ме н т а э того ферм е н та в · б и­
слойные фосфолипидные мембраны (Shaшoo, Golds tei п, 1977 ) .
Транспорт ионов кальция в митохондриях осуществляется
против концентрационного градиент а , н о по э л е кт рохим и чес ко му
потенциалу, который генерируется на в н утренне й мембр ан е д'ы ха ­
тельной цепью илн Н+-АТФазой. АТФ-зависимый перенос Са2+
внутрь фрагментов ретикулум а идет не только против концентра ­
ционного градиента, но и против электрох и м ичес 1<0го п отенци а л а ,
т. е. является истинно активным транспортом. В результате ак­
тивной аккумуляции Са2+ его концентрация внутри везикул рети­
кулума повышается примерно в 10 00 раз п о сра внени ю с о кр у ­
жающей средой, где концентрация Са2+ понижа ется до 1- 10- 7
-
1- l0-6 М (Ташмухам едов, Га гелыанс, 1973; Ритов, 1977; Болды­
рев, 1977), т. е. ниже пороговых вел ич и н мышечн ого р асслабле­
ння. Расщепление АТФ и транспорт Са2+ протекают одновремен­
но и в одинаковой степени зависят от рСа в инкубац1юнной среде
(Hasselbacl1, 1964). В то же время эти процессы могут зависеть
от уровня уже связанного в везикулах кальция (\VеЬег et al.,
1966).
Кальциевый насос плазматических мембран, основой которо­
го также явJн1ется Са-АТФаза, имеет много общего с системой
транспорта Са2+ в ФСР (Ташмухамедов, Гаге,JJыанс, 1973). Более
того, активность обоих насосов модулируется специальными фи­
зиологическими регуляторами, которыми являются цнтоплазматн­
чес ки е к альцийсвязывающие б елки, получ ивш и е н азван ие «каль­
м одул инов» . В частности, белок - регулятор, выд еленный и з гемо ­
лизата . эритроцитов человека, активировал транспорт Са2+ не
только через мембр>ану эритроцитов, но и в ФСР скелетной мыш­
цы кролика. Кальмодулин нз саркоплаз1v1ы та 1<же был активен
в •обо11х с1-1стем:1х (Pl1ilipsoп, 13aнmgaгtner, i979) . Подобный «пе­
рекрест», несомненно, свидетельствует о бо:1ьшом сходстве систем

:а ктивного транспорта Са 2 + через плазматические мембраны и
мембраны ФСР и их регуляции.
Как и при изучении транспорта Са 2+ в митохондриях, основ­
ное внимани е и сследователей в области аккумуляции Са 2+ в ФСР
уделялось преимущественно выяснению закономерностей, харак ­
· тер из ующих аккумул яцию, или вход этого катиона в цистерны ре­
тикулума, вопросам стехиометрии транспорта, сопряжения гидро­
. лиза АТФ с меха низмо м аккумуляции Са 2+, механизму гидролиза
АТФ, ка т ализируем ого Са - АТФазой, ре1<0нструкции системы
транспорта Са 2+ и регуляции ее активности в физиологических
у сJi овиях (Nlartonos i, 1972; Ритов, 1977; Болдырев, 1977). Меньше
и зучены. механизмы, управляющие выхо д ом Са 2+ из ретикулума,
хот я не вызывает сомнения реальность этого процесса в живой
клетке и его важн ость дл я отправления многих клеточных функ­
циiJ:. Иными сл овами, в «кальциевом цикле» саркоплазматическо ­
го р етикулу ма, ~<ак и в митохондриальном, отмечается известная
_дисп ропор ция в изученности д в ух полуциклов, соответствующи х
путям входа и выхода Са2+.
В настоящем обзоре наряду с характеристикой механизмов
транспорта ион ов кал ьция через различные типы биологических
ме мбран (п реимущественно митохондриальные) специальное
вни мание уд е ле но анализ у · использования их кальциевых насосов
как своеоб р а зн ых «каналов», по которым м ожет происходить на­
копление и распр еделение в ~,летке ионов стронция. Несмотря на
н еко то р ые n:инетиче ские отличия в транспорте ионов кальция и
стро нц ия, осущ е с твляемом разлисшыми типами кальциевых на­
- сосов, в целом он обеспечивается теми же механизмами (Cara-
foli et а!., 1965; Carafoli, 1965а,Ь; Vап der Юооt, Glovsky, 1965;
О!sоп, Cazo rt .,
1969; Mermier, Hasselbach, 1976). По - видимому,
на определенных этапах эволюции ( м оллюски, ракообразные)
· тра н спор т стро нция в митохондриях и эндоплазматическом рети­
кулуме может вовлекаться в физиологические механизмы, исполь­
зующие у бо ле е высокооргани з ованных форм животных в кач е ­
- с тве состав ного элемента транспорт ионов кальция.
Интерес к аккумуляции ионов стронция объясняется и тем,
_ что стронци й, в отличие от кальция, не обладает повреждающим
действием на митохондрии и, более того, стабилизирует струк ­
туру их ме мбр ан (Сар!ап, Carafoli, 1965; Greena,1/alt, Carafoli,
1966). В частности, именно при использовании стронция как а на-
. л ога ~,:альц ия со стабилизирующим эффектом появилась возмож­
ность м оделиров ать длительные устойчивые колебания ионного
состава и метаболизма в митохондриях (Холмухамедов, Гюльхан­
д анян , 1976; l1ylkl1andany,ш et а!., 1976), по-видимому, отражаю ­
щие определе нные физиологические состояния или механизмы
регуляци и.
«Строн ци фикация» тканей, очевидно, может детерминиро ­
.ват ь ся как эволюционно, так и особенностями минерального сос ­
т ава пищ и, нсп ользуемой животными. В зависимости от этих, а

·также от ряда других факторов аккумуляция ионов стронция в
клетках животных тканей может рассматриваться в одних слу­
qаях как явление физиологическое, а в других - нежелательное,
· требующее специального внимания и контрол я ( «Метаболизм
стронция», 1971).
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РАЗЛИЧНЫЕ КОНЦЕПЦИИ
ТРАНСПОРТА ДВУХВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ
В МИТОХОНДРИЯХ ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ
Наиболее общие свойства транслокаци и в митохондриях
ра з.1 ич ны х двухвалентных катионов (Ме2+) м о г ут быть охарак­
теризованы следующим образом (Lehninger,
1966 ; 1970; 1972;
Moore, 1972; Ташмухамедов, Гагельганс, 19 73; Carafoli, 1974,
1975, 1979; Bygrave, 1977).
1. Транспорт Ме2+ зависит от энергии и о б еспе чивается окис­
л ением субстратов или гидролизом АТФ.
2 . Транспорт Ме 2+ ингибируется дыхательны ми ядами (при
.использовании энергии , дыхания), олигомицино м ( при использо­
вании АТФ как источника энергии), разобщителя м и (при АТФ­
з ависимом и зависимом от дыхания транспорт е М е2 + ) .
3. Система транспорта Ме 2+ избирательно блоЕ1rруется низки­
ми концентрациями лантанидов, рутениевого красного, гексами­
н о1юбальтохлорида и д р.
4 . Транспорт Ме 2+ осуществляется электрофоретически при
.п омощи специфического переносчика, локализов а нн о го во внут­
ренней мембране митохондрий.
5. Накопление в митохондриях Са 2+ или S r 2+ с оп р озождает­
,ся в зависиМ<~сти от источника энергизации митохо н д рий стиму­
.л яцией дыхания (стехиометрия Ме2+(О) либо АТ Ф аз ной актив­
ности (стехиометрия Ме 2+/АТФ) .
6. Движение Ме2+ через мембрану митохон дрий, идущее с пе­
;рено со м двух положительных зарядов, сопровож да ет с я противо­
ЛО JJО Ж НО направленным движением (антипортом ) ионов водорода
(стех и ометрия Н+/Ме2+) или калия. Стехио м ет ри ческие коэффи­
циенты Н+/Са2+ или К+/Са2+ равны 2.
7. Транспорт Ме 2+ ускоряется в присутств ии проникающи х
. анионов, таких как ацетат, фосфат, арсенат. Уст а н о в л ена стехио­
метри я однонаправленного движения (симпорт а) Ме 2+ и фосфата
(Ме2+/Фн), равная 1,67 для Са2+ и 1,2-1,4 для Sr2+.
8. Концентрационная зависимость скорост и тр а н спорта Ме2+
характеризуется 1шнетикой насыщения · (сигмо ид ны е или гипер­
б0 Jн1ческие кривые в зависимости от источника вы д ел ения мито­
хондрий, наличия магния в среде и других усло в и й инкубации).
9. Трэнспорт Ме~+ с описанными выше при зна ка м и отсутст­
вует у некоторых так называемых «кальций-не г ат и вных» мито­
хон д рий из дрожжей, мышц мухи .
В литературе существует несколько концеп ций, объясняющих
активный транспорт двухвалентных катионов в с о ответствии с
11

решением основной идеи трансформации энергии в митохонд р ия х .
При нципиальное различие эти х схем заключается в оц е нке при­
роды движущих сил, обеспечивающи х перемещение ион ов' чер ез.
внутре ннюю мембра ну митохондрий (Скулачев, 1969; 1972; Leh-
n iпger, \970; L ibe rmaп , S !ш l acl1ev, 1970; Skulache,, , 1971 ; Bygraye,
1977).
Приводим · схе~1у, показывающую движущие силы транспор т а
С а 2+ в ра мках ряд а принципиальных теорий трансф орм ации
энергии в митохонд риях. ЭГП - электрохимичес1шй град иент
протон ов, р авный ЛрН +Л'\\J (мембранный ' потенциал) . (по Bygгa-
v e, 1977).
•
Те ория ,
ос новоп о ложник
Эта пы 1 1рсвращения э не р гии
II
Образование
богатого
III
Дыхани е ,-- энергией <'- - --
интермеди а та
--+С•ш тез АТ Ф
Хим1 1ческа >1
(Slater, 1953)
t
J,
Са 2+ -транспорт
1,о нформацнон - Дыхание~-+ ' У стан ов ление
нан (Воуег,
высоI<оэнергети-
I::!65, ]975)
ч есl(О ГО с остояния
мембра нного к ом ­
понента п у тем
конформационных
изменений
t
J,
1 Са2+ -транспорт
~- -> Г енера1шя Э ГП
+--__ --+
Синтез АТФ
<с- - -'> эr п на внутренней
м ембран е
Хемио смотическа я
(N\ itc hell , 1961 ,
196ti, 1972)
11а вн у тренн ей
+---~Сннтез АТФ
.То чки прилож ения•
ин г 1iб нторов и раз­
о бщи'гелей
ыембра н е, .м111-1ус"
пнутрн митох о ндри й
t
J,
Са~+ -траIIспо р т
t
1
1
Ингибиторы
электрон­
транс портн о i•i
це шI
t1
1
1
1
Р а Jо бщ1пели
t
Инг11 6 иторы
синте за
АТФ
Сог лас но схеме, предл оженной Сhапсе (1965 ), аккумуляция
и онов в митохщщриях происходит в результате их стехи о·метри­
ч еского взаимо де йствия с пром ежу точным высокоэнергетическнiч
и нт срм сд и атОl'v! (Х~У ), которы й образуется за счет ра боты ре-
12

до ке- це пи или ги др олиза АТФ. Такое взаимо д ействие вы з ывает
расще п ле ние гип0тетического интермедиата на исходные компо­
не нт ы ( Х + У) с пассивным высвобождением Н+ во внешнюю ср е ­
ду и п ере нос Са 2+ внутрь митохондрий. Ингибирующее действие
разоб щи тел ей на аккумуляцию ионов объясняется гидролизо м
этог о и нт ермедиата с рассеянием его энергии .
В с хем е Chappell, Crofts ( 1966) предполагается существова­
ние в ме мбране м итохон д рий водородной помпы, функционирую­
щей з а с чет редокс-превращений в дыхательной цепи ил·и ги др о­
л из а АТ Ф. При этом д вухвалентные катио ны распредел яются п о
элект р ич е с кому полю и аккумулируются внутрь митохондрий .
Дейст вие разобщителей увеличивает проницаемость мембран длн
ионов Н + и соответственно предотвращает аккумуляцию ионов в
~- iiITO X Ot;дp ияx.
Е сли в схеме Ci1app el l, Cгofts энергия оки сле ния и АТФ сна ­
чала ун и ф ицир уется в фор ме одног о и того же высокоэнергетиче ­
ского и нт ермедна т а и лишь за те м, с помощью специальной «про­
тонно й пом пы» , превращ аетс я в мембранный пот ен циал, то , сог ­
лас н о хем и осмотической концепции Mitci1ell (1961 , 1966) , перенос
элект роно в непосредственно генерирует электрохимический по­
тенци ал Н+, состоящий и з электрического (Л1р) и химического
(ЛрН) ко м поненто в . Иными словами, у Mitci1ell перемещение Н+
слу;,1шт пр ичиной, а у Chappel, Crofts - следствием накоплени я
энерr !iи в Х~ У. Как отмечает В. П. Скулач ев (1972), в ра м ках
кон ц е пц н и Mitcl1 ell вопрос о движущих силах транспорта Са 2+
в митохо нд риях решает ся автоматически : Са 2+ накап ливается с
помо щ ью переносчика в • результате электрофореза этого иона,
т. е. движ ения по электрическому гра д иен ту (знак «минус» внут ­
р и м и тохо ндрий, « п люс»- снаруж·1:).
В соо тветствии с теорией Mitci1el l, 1<атионы находнтся в элек ­
триче ском равновеси и, а связь между метаболизмом и тр анс п ор ­
том и оно в осуществ ляется чере з мембранный потенциал. Ге ­
нера ц ия последнего м ожет осущес тв лятьсн любым способом: за
счет мета бол и зма ИJJИ п у те м индукции оттока К+ из митохондрий,
однако ,во всех случая х удается наглядно продемонстрировать
.элект роф орез ионов кальция (Sсагра, Azzone, 1970) .
Кри тически й анали з ра зличных концепций и т еори й трансфор­
маци и э н ергии приводится в работа х В . П . Ску .~ачева (1969,
1972 ) . По -ви д и м ому, тольк о хемиосмотическая теория Mitcl1ell
ок а з алzс ь наибо лее «жизнеспособной» и корректной.
Ко нц еп ция переносчика длн транслокации двухвале нтны х ка­
-т ио нов I} митохондриях была вы дв инута в разJJичны х лаборато­
риях на основании , анали за ингибиторноrо эффекта лант ани доrз
на аэ ро бн ое поглощение катионов, а также на их транслокацию
в деэнерrизова нны х ми тохондрия х (L ei1niпgeг, 1970; Sel,,тyn et al.,
1970) . Нал ичие лантанидчувствительноrо транспорта дву хв а ле нт­
Rых катио нов в д еэнергизованных митохондрия х (Sel wy n at al.,
1970 ), т. е. в ус.~овиях, препятствующи х синтезу в ысокоэнерrет и -
13

ческого инте рмедиат а, противоречит постулированному в рамках .
«химичесюн» концепций (Cl1ance, 1965) участию Х ~ У в перено- ­
се. Ме2+ через мемб рану .
КИНЕТИК А И СТЕХИОМЕТРИЯ ЗАВИСЯЩЕЙ
ОТ ДЫХАНИЯ АККУМУЛЯЦИИ Sr2 + В МИТОХОНДРИЯХ
Многочисл енные данные позволяют считать, что транспорт
различных двухвал ентных катионов в м'итохондриях об ес печи­
вается идентичным мех·анизмом, который в зависимости от ряда
специфических пар аметров транспортируемого катиона (р адиус­
иона, плотность заряда и т. д.) допускает широкую вар и ацию •
функциональн ых о тветов митохондрий в процессе трансл о кацин.
В целом нзбирателы-юсть митохондриальной системы т ранс порт а
для отдельных двухвалентных катионов может быть пред ст ав ле ­
на следующи м о бразом: Са 2+~Sг 2+>Мп2+~Ва 2+ (C a rafoli,
1965 Ь; Drahota et ai., 1969) .
Сро дств о митохо н д рий к различным катионам можно оц енить
по эффе кту 0,2 мМ Ме 2+ на скорость потребления кислоро да (Ca-
rafoli, 1965 Ь), при этом оказывается, что Са 2 + стимулиру ет ды­
хание на су1щинате в 7,3 .раза, Sг2+ - в 5,6, Мп2+ и Ва2+ - в 1,3
μ·аза, Ве2+ не 01,азывает какого-либо эффекта. При окисл ении м 1 1 -
тохондрия ми f, - гид роксибутнрата или смеси r лутамат+ мал ат
Sг2+, как и Са 2+, вызывает 10-кратную стимуляцию дыхан ия, в .
то время как Мп 2+ или Ва 2+ - примерно двукратную. А нал огич ­
ная и з бирательность наблюдается при моделировании сис темы
транспорт а двухвёле нтных катионов на бислойных мем бр ана х,
сформиров ан ны х из митохондриальных фосфолипидов (К уд зина
и др., 1977 ), которые , по - в идим ому, содержали в своем составе
переносчик д в ух в але нтных катионов. О наличии общего мех аниз­
ма для транспорта различных щелочно з емельных катионов с ви д е­
тельств у ет также конкурентное торможение стронцием т ранс пор ­
та кальция (Carafol i, 196Ба) и специфическое ингиби ро вание
энергозависи м ой ил и пассивной транслокации двухвалент ных к а ­
тионов лант ани дам и, рутениевым красным или гексамино ко ба ль ­
тохлоридо м (N\.ela, 1968; Moore, 1971, 1972; Tashmukhamedov et al .,
1972). Все это позволяет использовать применительно к ст ро нцие­
вому тран с порт у част ь информации общего характера, rr o.r1ylreн­
нoй с использованием кальция, как наиболее изученного и «фи­
зиологичного» аналога в отношении действия на митохондрии.
В серии работ, опубликованной Carafoli et al. (Carafoli et al.,
1965; CarafoJi , 1965а, Ь; Caplan, Carafoli, 1965; Greenawalt, Caгa­
foli, 1966), бы ла впервые достаточно полно описана эне ргоз ави­
симая акку муля ция Sr2+ в митохондриях печени крыс. Нек о торые
стехиометрические, кинетические и ф у нкциональные характери­
стики тран с порта Са 2+ и Sr2+, представленные в этих, а та кж е не­
которых д ругих работах (Ташмухамедов, Гагельганс, 1973 ; Gеаг
et а!., 1967), приведены ниже (условия аэробные, среда содержит
фосфат и сукцинат).
14

Параметр тра.чспорта Ме 2+
Скорость транспорта, нr-ион / мин•
мг бел!<а
Кт аккумуляции, мМ
Максимальная аккумулирующая
емкость, Нг- ион J\lle 2 + / мг белка
Стимуляция дыхании s присутствии
0,2 мМ Ме2+
н+ /мен •• ,,,
Ме2+ /О
Стехиометрия Ме 2+ / участок
сопряжения
Ме2 + /Ф,,
К; ионами лантана в среде без
фосфата
Состоnние Ме 2 + в матрнксе м1по­
хондрий (пассн s ная аккумуляция)
Состояние ,, кнслнтелыюга фосф о­
оилирования в митохондрия х ,
нагруженных i\\e+
* Субстрат окисления ~-окс11бутнр;н.
Среда без ф осфата .
Са2+
!ООО
0,04
650--1900
7
2,0
2,65-4,4
1 7-2,0
1,67
5,10-S М
Гидрокси-
а~атит
Ра z общен-
ное
Sr2+
5)0,
О. 1*
2.'>00
5- 6 разе
3.8
1,8-2,01
1,2-1,4
1х10-7м
Гидрокси-
апа тит и
фосфат
с трон ция
С 1 пря жен-•
ное
Как видно из приведенных данн ых, ~ , итохо нд р ии аккумули­
руют около двух ионов Ме2+ при пере:юсе пары э.1ектрон ов через
оди н участок сопряжения; стехиометрия антипорта Н+ и Ме2+
равна 2 в условиях, исключающих движение фо сфата через внут­
реннюю мембрану митохондрий_, Величин а макси,,1альной аккуму­
л ирующей емкости соответствует усло вия м «массивного» накоп­
л ения Ме2+, т . е . среда содержит наряду с субстрато'V! окисления
фосфат, Mg2+ и АТФ. Условия инкубации в знач!!Те..-1ьной мере
влияют на аккумулирующую «емкость» митох ондрий, в ча стности,
исключение Mg2 + из инкубационной сред ы уменьшает аккумуля ­
цию Sr2+ примерно в 2,5 раза, а в отсутствие фосф а та она сни ­
жается бо ле е чем в 5 раз (Caгaf.oli et a l., 1965). В бесфо с фатной
среде процесс аккумуляции, по-ви д и мому, лимитируется числом
м е м бранных анионных групп, участв ую щи х в фиксаци и Са 2+ и
Sr2+ во внутреннем компартменте мит о х ондрий . Не исключено,
однако, что даже в среде, не содержащей добавленного извне
фосфата, в движении Ме2+ через м ито хо ндриа льную мем бр а ну
участвует эндогенный фосфат.
Согласно данным Moyle, Mitchell ( 1977), сим порт двух ио нов
фосфата - обязательное условие транслокации 1 иона ка ль ция
или стронция. Такое «жесткое» сопряжение трансп орта Ме2+ и
фосфата , по мнению авторов, обуслов ле но наличие м в м и т охонд ­
риях ингибируемого ланта ном кальций -ф осфатного п орт ера , бо-
15,

.
-
?
лее то чно о пи сываемого как « (Са) 2+-НРO 4 - - симпортер». Сте-
хио метрия Sr 2+/Фн, по наблюдениям этих авторов, равна 2,04-
2,1 0 , т. е. несколько отлична от данных, представленных выше.
Это, во зможно, объясняется либо тем, что весь добавленный Sr2+
аккумул ируется, либо условиями эксперимента. Мож н о полагать,
что отн ошение Sг 2 +/Фн или Са 2+/Ф ,., отражает только химиче­
ски й сос тав фосфатных соединений, в виде которых Sr+ или Са 2+
сек вестр ируются в матрик с е митохондрий, , но не работу более чем
гип отети чного «Ме2+-фосфатноrо портера» во внутренней мем ­
бр ане. В исследованиях других авторов (Reynafa rj e, Lehn i ngeг,
1977; Аk еrшап, 1978; Carafoli, 1979; Deana et а! . , 1979) четко по ­
к азано, что Са 2+ транспортируется через мембрану митохон дрий
д а же пр н блокировании переносчика фосфата N - этилмалеимидом;
пр и это м сте х иометри я пе р еносимого электрического заряда со с ­
тавила не 1 «плюс» на 1 транспортированный Са2+, как предпо­
лаг али Moyle,Nlitcl1erl (1977), а 2 «плюса» на 1 Са 2+. Предполо­
же ние о существовании « кальций - фосфатного симпортера» воз­
н икло в результате так на з ываемых «термодинамических затруд­
нен ий» теории Mitcheil, к оторые выводились на основании ряд а
коэ ффнц иентов сте х иоме тр ии или ложных посылок о характер е
рас пред ел ения Са 2+ на · внутренней мембране митохондрий, не
уч итыва ющих равновесной природы этого процесса. При этом
тр адици онная после д овательность выкладок выглядела следую ­
щи м о бразом. Если полагать, что на мембране энергизованны х
мит охо ндрий имеется разность потенциалов ( «м и нус» внутри)
велЕчин ой 180 мВ (Mitchell, 1966) и что электрофоретический пе­
р еносчи к Са 2+ перемещает 2 заряда во время одного «оборо т а»,
то мо:,юю на о с новании уравнения Нерн с та ожидать, ч то гра ­
ди ен т а ктивностей Са 2+ на внутренней ме м бране должен быть
ра вен 1 - 106 , что нереально. Косвенные из м ерения этого гра д иен­
та, в с илу невозможности прямых, д ают существенно меньшне
величин ы - от О до 1- 10 3 (Carafoli, 1979).
ЕсJш бы предпо JIОжение Nloy le, Mitcl1 e ll (1977) о «жестком»
си мпорт е Са 2+ и фосфат а оказаJiось корректным (чего, однако,
не про, ·rзош Jю), то нернстовское равновесие достигалось бы на
ме мбра не энергизованны х митохондрий при градиенте активнос­
те й Са 2+, равном 1 , 103 . Тем не менее, реально наблюдаемые гра­
. ди енты Са 2+ на внутренней мембране митохондрий, никак не
вступая в конфликт с теорией Mitchell, 111огут быть объяснены
нал ичи ем в матриксе митохондрий равновесного уровня Са 2+, кото­
рый о беспечивается электрофоретическим входом (унипортом)
С а 2+, з ависящим от мембранного потенциала, и выходом Са 2+ и з
ми тохо ндрий через систему электронейтраJiьного обмена (анти ­
пор т) Н+/Са 2+ или Na+/Ca2 +, не зав и сящего от мембранного по ­
тенц иа Jiа. В резуJiьтате такого «кальциевого цикJiа» (Carafoli,
1979) в ответ на мембранный потенциал веJiичиной 180 мВ в ми­
тохо н д риях могут накапливаться различные количества Са 2+ и
16

:н а и х ме мбр ане могут поддер:>киваться любые гра дие1-iты актив­
н ости Са 2+ (0-103 или выше) в зависимости от интенсивности
поток ов С а 2+ внутрь и наружу митохондрt1й.
Пр одол жая изло:жение данных о со'путстJзующем: транспорту
Ме 2+ п ере носе фосфата, следует отметить, что образо'вание в мат­
р иксе ~~ тохондрий электронноплотных гранул фосфата стронция
бы л о отrм ечено. в условиях iп Yitro при инкубации изолированных
мито хон др ий печени с возрастающими концентрациями Sг 2+
( Gree пaw ·alt, Caгafoli, 1966) и iп situ пр~r экспозиции гладких
м ышц в Sr 2+-содержащих растворах (Somlyo, Somlyo, 1971; Som-
lyo, S orn!y o, 19У.1). Количество электронноплотных гранул фос­
фата стро нция размером до 70 нм в матриксе мйтохондрий дос­
тигае т 200 -400, в последующем они сливаются в длинные тяжи
(Gre eп aw alt, Carafoli, 1966) . Накопление в матриксе митохондрий
д вух вален тных катионов в виде фосфатов, по-видимом у , являет­
·с я до ста точно физиологичным процессом и определяется функ­
циоы альн ыми особенностями ткани (Lehn in geг, 197{),; Carafoli,
1974.) .
А кку м ул яция Са 2+ и Sг 2+ сопровождается стимуляцией д ыха­
н ия, кото рая обычно прекращается с з авершением переноса r< а­
тион а чер ез внутреннюю мембрану. Циклический характер фун:,­
ц и о н алы-iЫ Х ответов митохондрий на добавление Са 2+ или Sг 2+
им еет и р я д д ругих параметров: редокс-состояние дыхательны х
пе ре но счи к ов, объе м митохондрий, распределение Н+, К+ и дру­
ги х и онов на внутренней мембране И · т. д . Такие циклические от­
в еты на бл юдаются в пределах аккумулирующей «емкости» ми­
тох он др ий для соответствующего вида катиона.
П ри и с следовании кинетики активного транспорта Са 2+ и Sг 2+
мы нсполь зовали од новременную регистрацию: скорости потреб­
ле ни я юкл оро д а, сдвигов рН среды, обусловленных движением
Н + ч ерез внутреннюю мембрану митохондрий, уровня восстанов­
ле н но сти НАД (Ф) и светорассеяния . суспензии, характери з ующе­
го нзменения объем а митохондрий вследствие переноса ионов как
<ОСМОТ Н '!СС КИ 3 !<ТИВНЫ х в еществ (рис. 1).
И оны кальция и стронция в использованных количествах вы­
.з ы вают ст им ул яцию дыхания мито х ондрий соответственно в 7,2 и
.З , 1 ра за . Стиму л яция потребления кислорода коррел ирует со ско­
р ость ю а к кум уляции д анных ионов, которая может быть рас с чи­
та н а по дл ительности каждого цикла и з менений функциональных
пара метр ов.
По с;пе наЕоплення критических количеств Са 2+ (80-100 нг­
ион С а 2+/ м г бе.rща) происходит высокоамплитудное набухани е
м ито хонд рий (рис . 1), в частности, уже вторая добавка Са 2+ вы­
з ывает Н -кратное ускорение набухания; необратимое окисление
НАД (Ф) • Н, нецй1<лr1ческое, длител ьйое увеличение скорости д ы­
х ания и характерный во з врат рН суспензии к исходному значе­
нию, что к1нrепiсrески соо\ве'гствует потере митохон дриями акку -
1\1у.r1 нрова нного кальция. В этйх усл овr1ях наблю д ается полно е
2 -156
17

разобщение окислительного фосфорилирования. При накоплении
меньших количеств Са 2+ изменения функциональ ных параметров
носят циклический, обратимый характер, митохонд рии сох ра­
няют способность к синтезу АТФ.
В отличие от Са 2+, аккумуляция ионов стронция сопр ов ож:­
дается стабилизацией структуры митохондрий (рис . 1) . Возмож ­
но, что именно поэтому функциональные ответы митохондрий, вы­
зываемые транспортом Sr2+, имеют обратимый характер да же прн
использовании этого катиона в количествах, вдвое пре выш аю щих
Са 2+-а ккумулирующую емкость.
Сопоставление эффекта различных двухв алентных кат ио нов,
способных аккумулироваться в митохондриях, показ ыва ет, чт G
Ca 2 +12s;,1M
D.П
1
510/!М
\
Dг
1
sонг-атом
1
Yseлuqe,
/JlЛУОдесценца
lfA,!f(Ф) ·
1
ол~j j
О, 38 О.о о.Т-------------
2"' 1
О.!
!40
39
1
!iАЩ
j/'"\"
f]H
130
t~1
]~о tмин
j!50г.]=
f
\
зsLi?? {
'--
\·-
Рис. 1. Эффект последовател ьных добавок ионов к ал ь ция и ст ронц и :-1 на:
некото р ые функциональные параметры митохондрий п ече ни кры с. У кр иво й
О . П. ука зана относительная скорость набухания . Uифры у к ри во~1 0 2 озна­
ч ают скорость п о тре5ления кислорода митохондриямн (нмоль 02 / мин) . Инку­
бационна ;~ ср е да содержала 120 мМ KCJ, 5 мl\1 трис- хлорица ( р Н 7,4 ) , 5 мМ
су кцината, 2,5 мМ КН 2 Р O 4 : ыитохондриальный белок-2,4 мг/мл ; объе м ячей-
ки4мл.
только Са 2+ обладает повреждающим действ ием в от но сительно,
высоких концентрациях (рис. 2). При регис трации тран с п орт а
и онов по сдвигам рН установлено, что вслед за фазо й нако пле­
ния Са 2+ в митохондриях (подкисление среды ) следу ет его само­
п роизвольный выброс в среду (:зозврат рН к исход ному з наче­
нию), связанный с повреждением структуры митохондрий. П о доб­
н ый выброс отсутствует при замене Са 2+ на Sr2+, Mn2+ ил и Ва 2+
и может быть инициирован добавлением разоб щителя 2 ,4-ди нит­
рофенола (рис. 2). Стабилизирующее действие ионо в стр о нция
на митохондрии проявляется и в его способно сти п редотвращать
Са 2+, тироксин- или олеатиндуцированное набу ха ние, а т~юк е
1
~
.
.
18

обращать это набухание, если оно .произошло (Caplan, Carafoli,
1965) .
-
По предположению Сарlап, Caгafoli (1965), в основе такого
стабилизирующего эффекта ионов стронция лежит формирование
с их помощью «мостиков» между отрицательно заряженными
участками, представленными остатками сиаловых кислот. Эти
мостики, повышая жесткость митохондриального каркаса, пре­
пятствуют увеличению объема органелл в присутствии некоторых
индукторов набухания.
С другой стороны, повреждающий эффект Са 2+ и стабилизи­
рующий Sr2+, возможно, обусловлен неодинаковым действием
этих катионов на митохондриальную фосфолипазу. Известно, что
многочисленные типы повреждения митохондрий (аноксия, ста-
Рис. 2. !(инети1,а движения н+ IЗJ время тран сл о кации 0,68 мМ различных
двухвалентных катионо в через мсыбрану митохо ндрий. Среда ИН'(убации во
всех случаях содер,кала 120 мМ KCI, 3 мМ сукцнната, :2,5 мМ КН 2 РО 4
(р · · : -7,4); конечна :-1 к с нuентрация ДН Ф составляла 5Х 10- 4 М.
рение органелл, олеат- или Са 2+-индуцированное набухание) свя­
заны в конечном счете с активацией фосфолипазы А2 , локализо­
ванной в наружном «отсеке» митохондрий и активируемой ионами
кальция или жирными кислотами (Сороковой, Владимиров, 1975).
Локальные анестетики ингибируют митохонд риа льную фосфоли­
пазу, конкурируя с Са 2+ (Scarpa, Liпdsay, 1972; Sherphof, 1973), и
вместе с тем оказывают выраженный стабилизирующий эффект
на суспензию органелл. Механизм повреждающего действия Са 2 +
на структуру и функции митохондрий проявляется, видимо, в тех
случаях, когда происходит насыщение внутримитохондриальных
кальциевых «депо» (рис. 1) и концентрация этого катиона в на­
ружном компартменте возрастает. При этом ионы кальция акти­
вируют фосфолипазу А2 , а дальнейшая стимуляция этого фермен­
та обеспечивается Са 2+, поступающим из внутримитохондриаль­
ных участков связывания, и жирными кислотами, высвобождае­
мыми . при гидролизе фосфолипидов (Scarpa, Liпdsay , 1972), т. е.
реакция в целом ищ~ет характер автокаталитического процесса.
Расщепление фосфолипидов, а также появление лизофосфолипи­
дов с детергентными свойствами приводят к уменьшению «жест­
кости» митохондриального каркаса, увеличению проницаемости
мембран и их лизису. Для восстановления функцион:эльного сос-
19

тоян ия митохондрий после Са 2+-индуцированного набухания
обычно требуется сложный набор компонентов: ЭГТА, Mg2+, бы­
чий сывороточный альбумин (Crofts, Chappel, 1965). Предпола­
гает ся, что некоторые нарушения, относящиеся к мембранной па­
толог ии , включают описанный выше механизм (Сороковой, Вла­
димир ов, 1975).
Ионы стронция, по-видимому, являются достаточно удобным
инстр ум ентом для выяснения вклада митохондриальной фосфо­
липа зы в развитие патологий как на субклеточном, так и на бо­
лее сло жно организованном уровнях. С одной стороны, Sr2+ мо­
жет рассм атриваться как аналог Са 2+ в отношении транспорта
в мито х ондриях, с другой стороны, этот катион, очевидно, являет- .
ся конкурентным по Са 2+ ингибитором митохо1-щриальной фосфо­
липа зы. Такой вывод возможен на основе аналогии с панкреати­
ческо й фосфолипазой (Pieterson et al.,
1974) и фосфолипазами
змеины х ядов (Strong et а!., 1976), где Sr2+ оказывает ингиби'­
рующ ий эффект, конкурируя с Са 2+ за участ1ш его связывания .
Выя снение эффекта Sr2+ на митохондриальную фосфолипа зу А 2 ,
несо мне нно, требует специальных исследований.
КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ КОЛЕБАТЕЛЬНЫХ СОСТОЯНИИ.
ИН ДУЦИРУЕМЫХ Sr2 + В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ
Од на из интересных особенностей трав. с порт а Sr2+ в мито ­
хон дри ях - _-возможность демонстрации его колебательной кине­
тикн (Та шмухамедо в , Гагельганс, 1970 ; Gylkhandanyan at а!.,
1976 ; Холмух амедов, Гюльханданян, 1976; Холмухамедов, 1979).
Ран ее в лаборатории Ленинджера было продемонстрировано на­
ЛI-IЧне од иночных «всплесков» в кинетике аккумуляции Са 2+ 1-i:
Sr2+, но не Nln 2+ (Carafoli et a l., 1966), и подробно рассмотрены
услови я их возникновения при по глощении Са 2+ . Характерно, что
«вспл ес ки» наблюдают с я в гипоосмотической солевой среде, не
соде ржа щей проникающих анионов, таких как ацетат, фосфат.
По мнению других авторов (Сl1апс е , Yosl1ioka, 1966), демонстра ­
ция о д иночного «всп J1е с ка» не является убедительным аргумен­
том для причисления указанного процесса к колебательным, по­
скольк у одиночный колебательный цикл не позволяет · рассчитать
ни фа кто р затухания ( соотношение амплитуд двух последователь­
ных щ1 1<J1ов), ни другие специфические параметры осцилляций.
Накопле ние одновалентных ионов, в отличие от двухвалент­
ных кат ионов, сопровождается устойчивым колебательнь,1м сос­
тояние м в кислой с реде рН 6,0-6,5 (Chance, Yoshioka, 1966) или
сильн о з атухающими коJiебаниями при нейтральных значениях
рН (Packer et а! . , 1966; Utsumi, Packer, 1967). Характер осцил­
ляци й принимает не только кинетика транспорта К+ или Na+, но
и уровень восстаноrзленности НАД, структурные и з менения и т. д.
Указа н ные колеба-ния происходят лишь в присутствии проникаю­
щих анионов в инкубацион,i-юй среде и тормозятся двухвалентны­
ми катионами.
:20

Механизмы транслокацни одно- и двухвалетных катионов об­
ладают некоторыми общими закономерностями, включающими за­
висимость от мембранного потенциала и системы обратной с вязи.
Можно предположить по аналогии с одновалентными катионами,
что обнаруженный в лаборатории Ленинджера (Carafoli et а!.,
1966) феномен «всплеска» в кинетике аккумуляции кал ь ция и
стронция является, вероятно, первым циклом затухающего коле­
бательного процесса, обнаружение которого представляет н есом­
ненный интерес для понимания принципов регуляции акт и вного
транспорта в митохондриях и их функционального состо ян ия в
целом.
С целью дальнейшего выяснения факторов, влияющих на амп­
литуду и период «всплеска», мы (Ташмухамедов, Гагельганс,
1970) нсследова.~и кинетику транслокации ионов стронция. Ис­
j
\[\_
---- ---
Рис. 3. Вли~нне условий инкубации на про­
явление килебательной кш1етики транспорта
стронция в митох о ндриях печени кrыс.
А-среда ннкубаu.нн та ж:, УТО указ.,на r< рве. 2;
В-~- 1 з ср. •д ы исключен фосфат; С - из среды исключ ,.: н
фосфат, концентрацнs KCI ум е ньшена до 30 мМ.
пользование этого кати .о­
на более предпочтительно
по сравнению с Са 2+, ко­
торый, как было отмече ­
но, оказывает поврежда­
ющее действ ие на струк­
туру митохондрий и свя­
занные с ней функции.
Рис. 3 иллюстрирует воз­
никновение «всплеска» в
кине тике
транслокации
' Sr2+ в митохондриях, ин ­
кубированных в бесфос­
фатной среде. Уменьше­
ние концентрации К.С! в
среде до 30-40 мМ при-
вод ит к затухаю ще му колебател ь но.'.iу процессу в кинетике акку­
муляции Sr2+, регистрируемой по изменению рН суспензии. Ука­
занная концентрация К.С! является оптимальной, так как л юбое
ее увеличение или уменьшение препятствует проявлению кол еба­
ний. Несмотря на отчетливую зависимость осцилляций, инду­
цированных Sr2+, от содержания К+ в среде, по-видимому, и мен­
но перемещение Sr2+, а не К+ является звеном, ответственным з а
колебания, так как колебательные процессы, обусловленные дви­
жением одновалентных катионов через мембрану митохо нд рнi'i,
ингибируются в присутствии двухвалентных катионов. Ра сс мот­
ренные выше данные позволяют считать, что «всплески» в i< ИНе­
тике аккумуляции двухвалентных катионов, впервые оп иса нные
Ленинджером с сотр., по-видимому, представляют собой н ачаль­
ную фазу затухающе'го колебательного процесса. Для дем онстра­
ции этого процесса необходим учет таких факторов, как н а чаль­
ная юшлитуда, период «всплеска», оптимальное соотношен и е ко­
личества митохондрий и концентрации отдельных 1<0мп оне нтов
реакционной смеси и т. д .
21

Возможная схема генерации колебательных состояний пред­
ложена Utsumi, Packer (1967) для системы с одновалентными ка­
тионами. Индукция колебательной кинетики аккумуляции катио­
нов, по мнению авторов, обеспечивается за счет обратной связи
между состоянием проницаемости мембран митохондрий, с одной
стороны, и изменением их способности аккумулировать катионы­
с др у гой . При этом высокой проницаемости мембраны соответст­
вует отток ионов наружу, после чего мчтохондрии сокращаются,
восстанавливая исходную низкую проницаемость и способность
акк ум улировать ионы.
В лаборатории Евдотиенко (Евдотиенко, 1979; Gylkhandanyan
et а!. , 1976; Холмухамедов, 1979) были подобраны условия (спе­
цифические концентрации Sr2+ или Са 2+, валиномицина, ротенона,
К+ и Н+), при которых Sr2+ индуцировал хорошо выраженные,
устойчивые в течение нескольких часов осцилляции с периодом
2-1 5 мин в зависимости от состава среды. Колебательный режим
приобретали потоки К+, Н+, Sr2 + или Са 2+, компенсирующим
анио н ом при этом является, видимо, сукцинат (Холмухамедов ,
1979) . В одной из схем авторы предполагают участие митохонд­
риальной фосфолипазы, а также систем ресинтеза фосфолипидов
и ж ир ных кислот в регуляции циклических изменений проницае ­
мост и внутренних мембран митохондрий (Гюльханданян, 1977).
В др угой схеме (Холмухамедов, 1979) наиболее существенная
роль в регуляции автоколебаний отводится вариациям активности
мито х ондриальной системы электронейтрального обмена Н+/Ме 2+
и ко м пенсации суммарного потока п оложительных зарядов пото­
ком сукцината, также имеющим колебательный характер.
К а к уже было отмечено, стронций, в отличие от кальция, вы­
зыва ет в митохондриях в основном обратимые изменения, поэтому
испо л ьзование Sr2+ как аналога Са 2+ создает предпосылку для
выя вл ения важного механизма регуляции транспорта ионов и
друг и х зависящи х от мембранного потенциала функций мито­
хонд р ий, которые в физиологических условиях могут контроли-
роваться кальцием.
•
ОСОБЕННОСТИ АТФ-ЗАВИСИМО Г О ТРАНСПОРТА
В МИТОХОНДРИЯХ
Ионы стронция, аналогично ионам кальция, транспортируют­
ся примерно с одинаковой начальной скоростью как при функ­
цион и ровании дыхательной цепи, так и за счет гидролиза АТФ
(Car a foli et а!., 1965; Vasington, 1966). В условиях накопления
мито х ондриями эквивалентных I<оличеств Са 2 + или Sr2+ расход
АТФ в случае Sr2+ намного ниже (Caplan, Carafo!i, 1965). При ­
чины этого были изучены нами в специальной серии эксперимен­
тов ( Ташмухамедов, Гагельганс, 1973).
При исследовании АТФазной активности митохондрий мы оп­
редел или (рис . 4), что с riовышением концентрации Са 2+ проис-
22

ходит скачкообразное увеличение скорости гидролиза АТФ с по­
~rrумакс имумо м при 90 нг-ион Са 2+/мг белка. Sr2+ и Mn2+, в от­
личие от Са 2+, не индуцируют подобного «скачка» АТФазной ак­
ти вно сти. На мито хондриях, состаренных при 37°С в течение
45 мин и не облад ающих ион - транспортирующей функцией, са2+
и Sr2+ не стимулируют АТФазную активность, однако Mn2+ уве­
л ичи вает ее в 4-5 раз, действуя как аналог Mg2+. Са 2+-индуци­
р ова нны й ги дролиз АТФ отражает энергетические затраты на ак-
1'Ивный транспорт Са 2+ внутрь митохондрий, однако при опреде­
,rrе нн ой степен и «нас ыщения» митохондрий кальцием наступает
их н абух ание и (или) активация системы обмена Н+/Са 2+, вслед­
,с твие чего воз р астает утечка Са 2+ нар ужу. В свою очередь, уве-
Со
2-r
Мп2'
,----. ?
/
/;
!
=-------..__,. 2
~
/
J
2
О
1
2
О
KOflЦPHmf}OЦUЯ котиоНО8 ,tAM
2
Рис. 4. Эффе кт двухв алентных катионов на А ТФазную активность инта~,:тных
(}) и состаренны х (2) митохондрий. Сред а инк уб ации содержала 100 мГv\ с а ­
хар,)ЗЫ, 75 мМ I<Cl. 15 мМ трнс - хлорила (рН 7,7), 7,5 мМ А ТФ; температ ура
ЗО' С , время инкубацин 15 мин. объем прGбы 2 мл. Р е а1шию останавлива,1и
до б а вленне м трих л орук сусной кисл о ты д о конечной концентрации 3,5%.
личение внемитохондриальной концентрации кальция является
причиной стимуляции АТФ-зависимого транспорта Са 2+, т. е.
происходит своеобразная рециклизация потоков данного катиона
между вн утр и - и внемитохондриальны м пространством («каль­
циев ый цикл» ) , кот орая вызывает истощение энергетических ис­
точников при низкой концентрации Са 2+ внутри митохондрий. Т а ­
I<ая си туация , воз ~1ож но, приводит к рассмот ре нно му выше акти­
в иро ван ию 1,альuием митохондриальной фосфошшазы, лока ли зо ­
ва нн ой во внешне м отсеке. Продукты гидролиза фосфолипидов яв­
л яют ся эффект ивны:v~и агентами, нар ушающими структуру мито ­
хон д ри й и увеличива ющими проницае м ость внутренних мем бран .
В результа т е такого шунта на мембране наблю да ется резкое уве­
личение АТФ азной активности .
И о н ы стронция а ктивно тормоз ят описанную выше Са 2+-инду­
цированную АТФазную активность митохондрий (рис. 5), что
с огласуется с н а б.1юде ниями др угих автор ов (Caplan, Carafoli,
23

I 965). Эффективным1,1 ингибиторамн я. вляются и и оны лан тана .
В основе этого явления, видимо, лежит, с одной стороны, ко нку­
ренция Са2+ и Sг 2+ или La3+ за общую систем у трансп орта и, с
другой стороны,- ингибирующее действие Sг 2 + на ilнrтох ондр иаль­
ную фосфолипаз у . В рез ул ьтате стабилизации стронцие м · в н ут ­
ренней мембраны (прямо или косвенно - через торможение фос-
фолипа з ы), очевидно, происхо­
дит , снижение обме на Са2+
межд у внутренним и н аруж­
ным «отсеками» ми тохонд ри й
11 соответ ствен но с ниж ается
гидролиз АТФ.
При АТФ - зависим ом транс­
порте Sг2+, как показали Caгa­
foli et аl. (!965), наблюдаются
!Фнцентроци,r; сmр:;нцш:. м.N
:о- быстрая и медл енная фаз ы ак­
кумулядни, прн чем первая не­
ингибируетс я ОJI ИГО МИЦИ НОМ .
Эти данные не позволяют ра с -
2
Рис. 5. Ингибирующий эффект строн ­
ция на Са2 + -индуцир о ванну ю АТФаз­
ную активность митохондрий печени
крыс . АТФазнан а к тивность стнмул:1-
ро .ава J мiVl CaCI2 . J'слог,ия инкуба-
ции те же, что указаны к рис. 4.
сматривать АТ Ф - зав ис имый
быстрый перенос Sr2+ чере з.
мем брану митох онд рий как
сл едствие пр остого о браще ни я
механизма
тра нсф орм аци и
энергин. На это же указывают
и результаты иссл едо ваний Va-
siпgtoп (1966) , изу чавшего ак­
ку мул яцию Са'+ и Sг 2+ в интактных и отмытых водой митохондриях.
В препарате отмытых органелл сохранялась сукци натз ависимая
аккумуляция Sr2+ и Са 2+, а также АТФ-завr-rсr1мое на копл ение
Са 2+, однако существе нн о повреждалась АТФ-за виси мая акк уму­
.т1яция Sг2+.
ИНГИБИТОРЫ ТРАНСПОРТА Ме2 + В МИТОХОНДРИЯХ
Важная информация о с исте м е транспорт а дву хвален тных
ка ти онов в митох ондриях получена с помощ ью н нrиби тор ного
анализа . В эr<спериментах Mela (1968) про демонстри ров ана . спо­
со бность ни зк и х концентраций лантанидов ( 10-7 М/л) специфи ­
чески ингибировать тран слок ац и ю ионов Са 2+ 11 Мп 2+ . Ана .1ю гич­
ным образом тормо з ится и транспорт стронц ия (рис . 6) , пр ичем
ингибирование лантаном переноса двухвалентных к атио нов и дет
по конкур ентно му механизму { Ташмухамедо в, Г агел ьганс, 1973;
Lelшiпger, Caгafoli, 1971) с К;~~5- J0-8 М.. Вместе с тем , л антаниды
даже в относительно высоких концентрациях (около 1· l0-4 М)
практически не влияют на друг ие энергозависим ые пр оцесс ы в.
м ито хондр иях. L a 3+ оказывает только тор мозящее действие на
транспорт ио но в кальция ил и стро нция, однако при ис сл едова н ии

аккумующии Mn2+ небольшие концентрации ланта на (5• 10-8 М}
вызывают трехкратную стимуляцию скорости акк умул яци и , а ин­
гибирую щ ий эффект достигается при концентрациях La3 + в ыше·
2· 10-7 М (рис . 6). Аналогичн_о лантанидам, стим ул яцию 1:ра нс­
порта Mn2+ вызывают К+, Mg2+, Са 2+, гексаминокобальт о хлор ид
и некоторые другие соединения (Mel a, 1968; Vaiпio et а!. , 19 70~
Ташмухамедов, Гагельганс, 1973). Причиной этого, по - вид f!МО~1у ,
является «бивалентность» переносчика двУ,хвалентных к атио нов
(VinogгadoY, Scarpa, 1973; Reed, Bygrave, 1975; Неаtоп, Nicholls ,
1976), причем один участок связывания является «ре гулято р1iыlv1»
и после взаимодействия с лигандо м (Са 2+, La3+, ГАК и др . ) обес-
JDD,~\
M,,
240
IB!J
llO~
от\- \
!-~
___J_ _ __~
Рис. 6. Эффект различны х концентраций лан т а н а на
скорость ак1(умуляции ионов кал ь ция, стронция и мар ­
ганца в митохондриях nе•rени к рыс. Сре д а инкубации
та же, что указана к рис. 2, но не содержит фосфата .
печивает, по - видимому, эффективную фиксащrю и о на ма р ганца
во втором участке связывания с последующи м тр анспо рто м через.
мем брану митохондрий. Наличие двух участков связывания в м и­
тохондриальном переносчике двухвалентных кат ионов находит­
свое отражение в сигмоидной зависимости скорости транспорта
от концентрации Са 2+.
Ингибирующий эффект La3+ на транспорт Са 2+ в митохонд­
риях и других структур-ах, вероятно, обусловлен те м , что La 3+
и м еет примерно одинаковый с Са 2+ радиус ги д ра тиро ван н ого
иона (0,31 и 0,28 нм соответствен но ), но з начит ельно более вы­
сокую плотноть заряда и, следовательно, большее сродс тв о к от­
рицательно за ряженным Са 2+ - связывающим участкам би омемб ­
ран (Lett,lv' in et а! . ,, 1964). Эти участки могут ю1 еть фосфолишr д­
ную , белков у ю или гликопротеидну ю природу.
Вз а и м одействие ионов лантана с кальци евьш переносчи ком
митохондрий сопровождается их медленной акку м ул яцией внутри
митохондр ий, в р езул ьтате ингиб ирую щи й эффект со вреl\,;!енем
убывает (Bygrave, 1977).
2Ь

Показано, что комплексное соединение рутения - р·утениевый
-красн ый, широко используемый в цитохимических исследованиях
для идентификации мукополисахаридов, в концентрации 4-
6 н молей/мг белка эффективно подавляет транспорт Са 2+ и обу­
словленную им стимуляцию д ыхания, не влияя на фосфорилиро­
вание (Мооге , 1971, 1972) . В отличие от лантана, рутениевый
I< расн ый не взаим оде йс твует с фосфатом и не аккумулируется в
митохо н дриях (Bygrave, 1977), что являе,гся преимуществом при
использовании его в биологическ и х экспериментах. Исследования
других авторов в ыявили тормозящее действие этого красителя на
митохо ндриальный транспорт Sr2+ и Мп 2+ (Vasiпgton et а!., 1972)
и неко нкурентный характер торможения кальциевого насоса ми­
то хондр ий (Reed, Bygrave, 1974а).
Была про демонстрирована
неоднородность комм ерче ск ого препарата рутениевого красного,
содержащего в р яде случаев до 9 компонентов (Reed, Bygrave,
1974 Ь), способность его взаимодействовать с широким спектром
соеди нений, в час тности с фосфолипидами, а так.же некоторые
. другие побочн ые эффекты. Тем не менее, этот краситель, ставший
популярным не только в цитохимин, но и в мембра нолоrии, яв­
ляется наибо л ее избир ател ьным инстру м ентом для блокирования
м итохондриальног о транспорта Са 2+, не затрагивающим другие
· типы кальциевых насосов (Ас!1, Bigгave, ·1977).
Мы опр еделили, что комплексное соединение ГАК, такж е в заи ­
модейс твующ ее с анионными группами гликозаминrликанов, ана­
.лоrичн о рут ениевому красном у спе ц ифически тормозит митохонд­
ри ал ьный т ранспор т Са 2+ (полумаксимальное ингибирование в
пр исутствии 6 нм о лей Г АК/мr белка) и Sr2+ (полумаксимальное
торможение в прису тствии 30 нмолей ГАК/мr белка). Тор м оже­
ние транспо рта Са 2+ имеет конкурентную природу с константой
.ин гиби рован ия 6-10-6 М ГАК В концентрациях 3-120 мкМ это
соединение не влияло на дыхание, окислительное фосфорилиро­
вание и другие эЕергозависимые функции митохон д рий.
На ряду с селе ктивнымй ингибиторами системы транспорта
.двухва лентн ых к атионов в митохондриях, описанны м и выше,
:имеются и неспецифические аге нты, действие которых направле­
но на цеп ь пере носа электронов или механизм трансформации
энергии. Ниже представлена схема де йствия некоторых инrиби­
·то ров на транспорт двухвалентных катионов. Ингиби.рующий эф ­
-фе1п обозначен п ункти рными стрелками.
ДНФ и другие разобщители-прото нофоры (FCCP, ТТФБ) ин­
дуцируют протонную проводимость мембраны митохон д рий, вы­
·зывая сниж ение м ембранного потенциа ла и торможение все х за ­
висящих от него функций: транспорта ионов, синтеза АТФ, об­
рат н ого пере носа электронов и т. д. (Liberшan, Skulacl1ev, 1970).
Меха низ м дейст ви я олигомицина з аключается в блокировании
АТФазного комплекса митохондрий, в результате чего тормозит­
•ся как синтез, так и ги дрол и з АТФ. Использование соединений
этого типа в сочет ани и с ингибиторами пер еноса электронов -

Сукцинат
Антимицин А
1
1
с r.Г
1
_[
Ротенон
02----s ,I
Дыхател ', ная цепь
\,-Малат
--- ------ ------
Разоб щи тели
ШНФ, ТТФ Б, ---
FCCP и др.)
Мембра нный
потенциал
t
1
1
t
АТ Фазный
компле~;с
i
_[
АТФ
Меха низм
транспорта Ме 2+
т1
1
La 3+,
i
i
1
1
1
РК ГАК
е-- -- -.-Оли гомнцин
Елассический прием идентификации механизма энергизации ион­
ных насосов . С помощью инъекции животным разобщающих
агентов (ДНФ, пентахлорфенол) получены данные об энергоза­
висимом характере аккумуля ции Са 2+ и Sг 2+ в интактных клет­
ках и <<предоминантной» роли митохондрий в регу ляции внутрн­
хлеточного кальция (Carafo li , 1967; Patriarca, Carafoli, 1969; Ca-
rafoli, et а ! ., 1969). Другие авторы (Shaffer et al., 1972) для выяв­
.ления рол и митохонд рий в Са 2+-цикле изо л ированного функцио­
нирующего сердца использовали олигомицн н, ингибирующий
.АТФ - зависимый транспорт Са 2+ в митохондриях, но не влияющий
на кальциевые насосы ретикулума и плаз матических мембран.
ДНФ и олигомицин были использованы также пр и изучении роли
ою-rслительного фосфорилирования в процессе в са сывания Са 2+
и Sг 2+ в желуд очно - кишечном тракте (Тейлор , 1971) и при ис­
следова нии «массивной» аккумуляции стронция в изолированных
митохондриях (Caгafoli et а!., 1965; Carafoli, 1965а, Ь).
ОСОБЕННОСТИ АККУМУЛЯЦИИ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ
111 СТРОНЦИЯ В €АРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОМ РЕПll(УЛУМЕ
Электрофоретический механизм транспорт а двух валентных
катионов в митохондриях, как отмечалось во введении, является
одним из элементов интегральной системы, регулирующей внутри­
клеточный ионный состав и, в частности, уровень Са 2+. К настоя-
27

щему времени доказано существование Са 2+-насосов в эндо пла з ­
матическом р'етикулуме и плазматических мембранах, п риче :vr
главным элементом этих насосов является Са 2 + -акт ив и ру ема я
АТФаза (\Veber et al ., 1966; Martoп<::>si, 1972; Ташмуха медов , Га­
г ел ьганс, 197 3; МасLеппа п, Hollaпd, 1975). Соотношение в кл адо в..
м итохон д риа л ьного и немитохо н дриальных механизмов т ран спор­
та Са 2+ в регуляцию внутриклеточного уровня этого ка тион а за ­
в исит от ткани и органа, эволюционного ~;~оложения орг анизм а 11 , .
п о-ви д имо му, д ругих факторов.
.
Транспорт Са 2 + в ретикулуме и плазматических м ембр ана х.
обеспечи в ается, очевидно, ферментативной системой пер_енос а
( Са 2+-А ТФа з а), циклически изменяющей сро д ство к Са ~+ в про­
цессе фосфори л ирования - дефосфорилирования молекул ы АТФ­
а з ы. Этот _ мех анизм, в отличие от митохондр и ального, не явл яетс я
электрофоретическим и не связан с мембранным потенц и а JlО ivl .
Наряду с этим, в л итературе имеются данные, свидетельст ву ющие
о формировании мембранного потенциала (положител ьная по­
лярность внутри везикул) · в процессе транспорта Са 2+ через ме м ­
браны саркоплаз м атическо го ретикулума (Аkегтап, Wolf, 1979 ;
Печатников и д р . , 1979) или протеолипосом, в котор ые встр оен а
Са - АТФа з а ФСР (Zimпiak, Racker, 1978). В последне м сл уча е
при генерации внутри протеолипосом более отрицательно го по тен ­
ц иала (в норме +60 мВ) в результате индукции отток а К+ и.зс
ве з икул или внесения в среду жирорастворимых анион ов по гл о ­
щение Са 2+ у вел ичивалось. В отличие от протеолипосом , мем бр а ­
н ы фрагментированного саркоплазматического ретикулум а о бл а ­
да ют более высокой проницаемостью ,и ля ионов К+ и ани оно в,
хлора, поэтом у не исключено, что положительный пот ен циа л
вн у три ве з икул ФСР, генерируемый во время транспорт а. Са 2+
или в отсутствие транспорта (Печатников и д р., 1979), кщш енси­
р уется одновре м енным входо м хлора или выходом к+ И ЛИ Mg2+
(Beeler, Martonosi, 1979). Тем не менее, первичный электро ге нный
характер транспорта Са 2+, осуществляемого Са - АТФазой ретику ­
л ума , гю-ви д н м о i\1у, можно считать доказанны м ( Аkеr шап .
Wolf, 1979).
Менее ясны эксперименты, продемонстрировавшие АТ Ф - з ави­
с имую генерацию градиента рН на мембране саркоплаз ма тrrче­
с кого ретикулу ма (.Мadeira, 1978). Этот градиент Н+, на пра в л е н ­
ный наружу везик у л, Madeiгa расценива ет как движущую си л у
транспорта Са 2+ в ФСР, однако эта точка ·з рения не подтв ерж ­
дается рез ультат а :v1и его собственных и литерату рных дан н ых о
неэффективности разобщителей -протонофоров на: акку мул яци ю
С а2+ в этой мем бранной системе.
Пред полагается, что кальциевый насос ретикул у ма сост ои т из·
кана л а, обеспеч и вающего трансмембранный перенос кати онов ,
к омпонента, прид а ющего насосу высокую ионн у ю селект и в н ост ь,
и системы эн е ргизации кальциевого насоса (Sl1a11100, Gol ds teiп ,
1977) . Опыты п о реконструкции мех анизма транспорта С а 2+, пр о -
28

в ед ен н ые в лабораторйи Racker (Rack er, 1972; Ziпшiak, Racker ,
1978) , n'Ьз воляю'т считать, что основные функции насоса могут обес­
печив атьс я молекулой Са-А ТФазы, поскольку встраивание этого
фер мент а в мембраны лнпо ;:: ом - достаточное условие реконструк­
ции к а JJ Ьц иевого насоса.
М~хс1н и зм транспорта Са 2+ в ретикулуме обладает высоко й
,с електи в н о стью: среди многочисленных двухвалентных катионов,
по - ви дим ·Ьм у, то л ько Sr2+ может аккумулироваться в ретикулуме
, с по м ощью кальциевого насоса (Mermier, Hasselbach, 1976).
В перв ы е феномен аккумуляции ионов стронция в саркоплаз­
ы ати чес к о м ретикулуме исследовали Van der К!ооt, Glovsky,
(1965) , а также Weber et а! . (1966) . Наряду с секвестрацией это­
г о к а тион а в цистерна х ретикулума, авторы установили наличие
С а 2+/ Sг 2+- о бмена (Weber et а!., 1966) и торможение стронцие м
.акку мул я ц ии Са 2+ (Van der К!ооt, G lovsky, 1965) . Отложение
с тро нци я в саркопла з матиче с ком ретикулуме спонтанно сокр а ­
щаю щихся гла д ких мышц было зафиксировано с помощью э л'е к ­
тронн оми к роскопической техники (Somlyo, Somlyo, 1971) . Вы со ­
r, ая элект р онная плотность стронция делает его удобным инстр у ­
ментом для исследования кальций-аккумулирующих систем в тех
типах кл(:ток, где Са2+ выполняет важную регуляторную функ­
цию.
По данным Mermier, Hasselbach (1976), аккумуляци я Са2+
.в ретикулуме проходит 2 фазы - быструю и мед,J1енную. АТФ­
зависимЬе накопление стронция в ФСР является однофазным и
п ро ходи т с большей скоро с тью, чем быстрая фа з а поглощен ия
·Са 2+ . Эф ф ективность насоса при транспорте ионов с тронция с о с ­
тавляет 1 Sr2+ на 1 молекулу гидролизованного АТФ. В случае
·Са2+ эта величина равна 2. Другое отличие заключается в том ,
ч то аккум уляция стронция в ретику л у ме пропорцион аль н а rюн ­
центр,щи11 наружного Sr2+ даже в миллимошiрной области, тогда
I<ак ионЬ1 кальция в концентрации выше 1·10- 5 J\1 тормозят а1,­
тивностЬ Са2+-насоса. Этот эффект ионов Са2+, очевидно, объяс­
няет ся их тормо з ящим д ействием на скорость распа д а фосфори ли ­
р ов ан ного интермедиата (ЕР) - промеж у точной ста д ии процес са
гидр ол и за АТФ Са 2+-АТФа зой (Yamada, Toпomura, 1972) . Как
показали эти авторы, Sг2+ в 79 раз менее эффективен, чем Са2+
при а кти вации АТФазы; имеш-iо по этой причине С а 2+-АТФа з а
~а л е е ус tойчива к высоким концентрациям стронция.
А кку м уляция стронция в са ·ркоплазматическом ретик ул ум е
1,1 м ее т , riО -видимому, специальную роль в фи з иьлогии мышц ра­
кооб раз н ых (Van der К!ооt, Clovsky, 1965), о д нако исследование
погло щ't~1;1 ия Sr2+ представляет интерес и при выяснении актив­
ности отдельных. С,а 2+-транспортирующи х сист е м в условиях i п
vivo ( Ca :Г afo li , 1967) или iп situ (Somlyo, Somlyo, 1971), кинетик и
и механи зма Са+2 - насоса ретикулума из тканей млекош-1тающи х .
Sr2+ может активно трансnорtироваться и с помощью другог о
Са 2+- насЬ са, локализованного в пла з матических м ембранах, ai< -

тивируя скорость гидролиза АТФ мембраносвязанной С а-АТФ­
азой и прояв,1яя одинаковую с Са 2+ чувствительность к ингиби то ­
рам транспорта (\\l ins, Sc!юffeпieis, 1968 ; Olson, Cazort, 19 69) _
Таким образо м, все типы кальциевых насосов: митохондр ий, ре­
тикулума, плазматических мембран,- обладают сродством к
стронцию как аналогу кальция. Примерно такое же отношение
к Sr2+ наблюдается У · некоторых Са 2+-связывающих белков и ино­
форных соединений, изолированных из митохондрий, с аркоплаз­
матического ретикулума, микроорганизмов и т. д .
.
1
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДВУХВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ
С ИЗОЛИРОВАННЫМИ КОМПОНЕНТАМИ
Са2 -1- - ТРАНСПОРТИРУЮЩИХ СИСТЕМ МИТОХОНДРИИ
И САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА
В литературе высказывались различные предполо жения от-·
носительно участия анионных групп белков, гликопротеи дов и фос­
фолипидов в связывании и транспорте двухва.1ентных ка тионов.
( Ташмухамедов, Г агельганс, 1973; Tyson et al.,
1976; S!1а шоо ,
G oldstein, 1977). Применительно к митохондриям одним из пер вых
у казаний на существенную роль гликопротеидов в тра нсл ок ащш
С2 2+ яви ло сь обнаружение ингибирующего эффекта н и зких кон­
центраций рутениевого красного на энергозависи ~vшй тр 2. нс порт
Са 2+ или Sr 2+. Селективность этого красителя, использу ем о го для:
гистохимического выявления: мукополисахаридов, позвол ила выд­
винуть предположение о гликопротеидной природе мито хо н д ­
р иального переносчика двухвале нтны х катионов (Moore, 1971 ,
1972; Vasington et al., 1972). Действител ьно, в ряде лабо ра торий
вс лед за этим были изолированы факторы, связывающне С а 2+
п о механизму высокого сродства (константа стабильно сти комп­
л екса с Са 2+ составляет 1-106 -1 -107 М- 1 ) и имеющие гликоп ро­
теидную или гликопептидную природу (Tashшukhaшe d o ,т et а! .,
1972; Sottocasa et al.,
1972; Goшez-Puyou et al.,
1972) .. Важ ной
характеристикой этих компонентов является чувстви тельн ость
Са 2+ -связыв ающих центров к действию лантанидов, р утение вог о
красного или ГАК в концентрациях, сопоставимых для интактных
митохондрий. Существенно, что гликопротеиды с подоб ным с род ­
ством к Са2+ отсутствуют в митохондриях, генетис1ески лише нных
с истемы транспорта Са 2+ с характеристиками, описан ными для
митохондрий печени крыс, как наиболее типичного случа я (Cara-
foli, 1974, 1975). Ионы стронция и марганца (но не маг ния) кон­
курируют с Са 2+ за участки связывания высокого срод ства, ло­
кализованные в гликопротеидах; наряду с этим обнаружены коti­
формационные изменения Са 2+-связывающих факторов •при взаи­
модействии с двухвален тными катионами (Panfili et .a l., , 1974).
Недавно в лаборатории Sottocasa (Panfili et а!., 1976 ;. ;Sottocasa
et а!., 1977) было показано, что антитела к Са 2+-связь1вающему
30

гликопротеиду блокируют транспорт Са 2+ в изолир ован ных мито ­
хондриях. В пере~ чете на 1 мг белка митохондрий 50 % тормо­
жение транспорта Са 2+ в интактных митохондриях достигалось ­
в присутствии 12 мкг антител, в то время как при использовании:
митопластов - митохондрий, лишенных наружн ой мембраны.­
аналогичный эффект обеспечивали 1,5 мкг антител (Sottocasa et
al .,
1977) . По-видимому, нар у жная мембрана яв.1яетс я своеоб ­
разным «барьером», препятствующим ·взаимодействию гл икопро ­
теидных антител с внутренней мембраной, в которой локаJiизова ­
на система транспорта Са 2+. Этот факт м ожно расцен ива ть ка к
дополнительное доказательство важной роли гл икоп ротеидов в
м итохондр11альном транспорте двухвалентных катионов. Однако
более важное значение имеют, по-видимом у , эксп еримен ты с ре­
конструкцией ка л ьциевого транспорта как на модельных системах,
т ак и на некоторы х типах митохондрий, не имеющих «ортодок-­
с ального» Са 2+-насоса .
Prestipiпo et а!. (jl974) установили, что в прис утст вии милтr­
м о ля рных концентраций Са 2+ или Sr2+ кальций-связывающий гли ­
копротеид в концентрации 1,48· 10-7 М/л вызы вает увеличение
прово дим ости бислойных фосфолипи д ны х мембран, причем р уте -.
ниевый красный ( 1 · 10-6 М) снимает э ффект гликопротеида . В от -­
сутствие добавленных извне двухва ленпrых катионов или при ис­
пользовании д руги х г л и к опротеидов изменения сопротивлени я би ­
слоев не наблюдалось. Вм есте с тe ivl, не бы .10 заф иксировано
потенциала при д есятикр а тно м гра диенте Са2 + на бисл ойн ой
м ем бране (Prestipino et al., 1974) или индукции потока Са 2+ че-­
рез мембраны липосом, обработанны х гликопротен доч (Ка раф о­
ли , 1977, у стное сообщение). Гiо - видимому, в использов::~.нн ых
этими авторами условиях вы деле ния гликопротеи да и тестиро- .
в ания его мембранной активности ко мплекс Са 2+ - гл икопротеи д
_
формир ует в бислоя х малоизбирательный канал пр оводи мости . .
Сомнение относительно функционирован ия гликоп ротеида в ка ­
честве переносчика двухвалентных катионов возникает также при ·
а нализе величин кажущейся Км по кальцию. В случае интактной.
с истемы транспорта Са 2+ в м итохондри я х эта ве.1ичина состав­
.·,яет око л о 4 М!{!'Л. Са 2+ (Reed, Bygтave, 1975), в то время как в мо­
дел ьной системе бислой-гликопротеид - около 1 м М Са2+. Та­
ки м образо м , интактный механиз м транспорта Са 2+ в митохонд­
риях в 100-1000 раз более чувствителен к Са 2+, чем е го модель ,
на л ецитиновы х мембранах, описанная Prestipiпo et а!. (1974) .
О дна ко в экспериментах, выполненны х в ла бор а тор ии Ю. В . Ев~ ..
дотиенко (Азарашвили и др . , 1978) при процедуре выделен ия
гликопротеида из митохондрий, неско лько отличной от ране е оп и- .
са нной, удалось провести более успешную реконструкцию систем ы
транспорта Са 2+ на б'ислойных л ипидны х мем брана х . В модель-.
ной системе, как и в нативной, перенос Са 2+ через мембрану был
электрогенным и подчинялся уравнению Нернста; градиент' KCl, .
в отличие от СаС\ 2 , не приводил к генерации потенциа ла . • •
31_

Приiоди м сх ему выделения Са2+- связывающего гликопротеида
(ГП ) и его связь с механизмом транспорта Са 20+ в митохондрйя х .
БФ М --'- бислойная фосфолипидная мембрана, МП - мем'бранный
по тенци ал, ПААГ - полиакриламидный гель, А50- - полу.макси­
м а л'Ьн2я акт и вно с ть, Мх - митохондрии.
t
Экстракция 0,3 М йод­
с али циDат ом литиn (илн
осмотический лизис Мх в
т рис-фос ф ате)
1
t
Очи стка электр о фор ез ом в
свободной фазе и препара­
т ивн ый элект ро форез в
ПААГ
1
t
Мито хо ндрии
t
1
Экс тра1щия 80%
этанолом
1
t
Очистка rельфил,,-
трацией на 1соJ1"11ке
с сефад~ 1<сом G-15
н электрофорезом
в ГIААГ
1
t
t
Выделещ,1е олиrомицин­
чувствительной А ТФазы
(или осмотический л и-
зис Jvl x в тр1-1с­
хлорид е )
1
t
о,шстка электроф о -
резом в ПЛАГ
Са~+ -с вюы сающий гликопротенд (~ , . в . 35 - 40 пrс.), содержащ11й
бел ок и углеводы (и ф6сфолипид , 1)
t
·Са2+ или Sr2+-зав11симая ин­
ду1щ 11я проводимости БФ N\ ,
чvnствительная к рутение­
F.ОМ у крас ному. Отсутствие
МП пр11 градиенте кальцнн
на БФМ (Prestipiпo et а! . ,
1974). Ан rитела к ГП торыо­
зил и тра н сr10рт кальция в
интактных Мх (А50-12 мкг/мг
бел к а 'Мх ) и митопластах
(А00-1 ,5 i1кr/мr белка мито­
пластов) (Sottocas a et al.,
1977)
У велич е 11ие проводи­
м о сти БФМ в присут­
сн. ии 5 мМ СаС!п.
Генерацнн М 11 пр-и гра ­
диенте ка л ьцин , соглас­
но уравнению Нер н ста.
Б локирование ти оловы х
групп ГП снимает erJ
мембран~активные свой­
ства (Мироно ,, а и др.,
19, 9)
t
Увеличение про­
водимости БФМ
в присутств1111
СаС/2, но не
I,CI. Г~нерацни
МЛ при нали,rии
градиента ка-
j1ьция 23- 25 мВ
(Азарашвилн и
др., 1978)
Миро нова и др . ( 1979) выделяли гликопротеид из мито хон дрий
сер дца путем спиртовой экстракции с последующей гельфильтра­
цие й и электрофорезом. Очищенный гликопротеи д имел м. в. око­
ло 40 т ыс., содержал серу и в концентрации J. 10__: 6 М/л и з бира ­
тел ьно транспортировал Са 2+ через бислойные липидные мем ­
бр аны , причем перенос Са 2+ также был электрогенным. Не исклю­
чен о, что ранее описанны~ этой группой исследователей (Миро·но­
ва и др., 1976) низкомолекулярный серусодержащий пептид
(табл. 1) является фрагментом гликопротеида. Таким образом,
мем бра ноактивные свойства митохондриального гликоп'ротеида
как индуктора проницаемости для Са 2+ существенно за:~tисят от
.32

процедуры вы дел е н ия этого компонента внутренних м ембран м и ­
тохон др и й. Те м не менее, его функциональная роль в митохон д -
Таблица
Ка.11ьци й связывающий "иоtrофорныА" материал, выделенный
из мито хондрий в различных лабораториях ,
Ио1-1офор и его характер11сн,1\а
Низкоll':Олекулярный гидро­
фобный и о·н офор дв ух валеfп­
сн ых катио но в (Blondin ,
1974 г. Махм удова II д р.,
1975). М. в. 600-800. Трип­
тический гидролиз М х , эк ­
•Стра1щи я смесью бутанол:
уксусная кислота: вода, о<ш­
стка хроматографией 11а ко­
лонке .
Серусодержащий пептид
'(Миронова и др., 1976). Эк­
стракция Мх этанолом . очи­
стка б у ма ж ной и колоночной
хроматографией. М. lJ. о;<оло
1500.
Л11п и д ный ком11онент мем ­
•бран Мх (Кудзина и др.,1977) .
.Э1iстракция Мх хл0роформ­
метан оло м по Фолчу.
Пеп т ид из 17 амино101с­
.ло т11 ыv о статков (Blondin et
а !., 1977). Э1<стра 1щ ю1 лио­
филюнрованных Мх хлоро ­
.форм-метанслом, 1ыделение
• ионоФ,о р оnротенн а· (м. в.
!О тыс. дальтон), гидролиз
,его трипсином и в,-,,деленне
• ионофоропеnтида • (м . в.
5100). в ыделенне из н е го
. ионофора· (м. в. 1600). .
•Кальцифорин"-углевод­
содержащиii пептид (м. в.
3000) (Jerig et а!., 197К).
Экстракци я · МИТОПЛ J СТОJJ де ­
зоксихолато:\1, разделение
·экстракт,а ·· на ·ко.аонке с се-
фаде1,сом 0 -50.
'
Снстема тсст:1рооа;1ш1 11
HO!IJlaя C:..' Jl ~ I\TIIU110CTI .,
И н дук ц ия переноса
ci+ и N\g2+ через
мем ,браны Мх, БФМ
и в ячей1<е Г/рессма 11 а
Эффекты на БФМ пред ­
отIJращаются La 3+ .
La 3+ -'lувств ите Jrь­
ное сниж е ние сопро­
тнвлени я БФМ в прн-
сутстIJни Са2+ , ;v\g2+ .
La 3 + снимает прово­
днм о сть БФМ , инду-
цированную Са 2+ .
Избирательност1, ;
Са2+ >Sr2+ > fllg2+ >
>К+.
УIЗеличение прони ­
цаемости мембран для
CaL+ илн· К + . Измене­
ни е флуоресценции
А 1-i С в комплексах
ионофор-катион
(Ca:Na:MgX=
1-n f;.I) 'Jf:Л 'J I \
,1.. v,v.v,'-v, v 1;;:.,, 1 J
Э 1(стра1щня · ;(ву х­
ВjлентныХ катионов
в орrаническую фа з у ,
перенос 45 Са2+ п ячеr1-
к~ Прессмана. Селек­
тивность : Zn : Sr: Са:
:Mn:.Na:Rb =
1,9: 1,3: 1,0:0,2 :0 ,17::J,02.
Примеча1-1ия
Обмен Са2+ /н+
Мембранны [\ по­
тенциал подчиня­
етсн уравн е нию
Нернста .
IО - 1<ратныi'1 гра д и ­
ент кальция ин д у­
цирует мембранны й
потенциал 27 мВ .
Электроге11н·,1 й
ме;:низм переноса
Са·• или к +.
Обмен Ca2+/ r:+,
нейтрал ь ный комп ­
лекс белок-Са.
риаль ном транспорте Са 2+ в настоящее время недостаточно ясн а .
Возмо жн о, он выполняет функцию рецептора и примембранного
3-156
33

« накопителя» двухвалентных катионов, в то в ремя ка к гидро фоб­
н ый домен этой молекулы или какие - либо прочн о св язанные с ней
гидрофобные компоненты сл ужат каналом, об еспечивающи м
т рансмембранный эл,ектрофорез двухвалентных катионов .
Из митохондрий выделены и другие соедине ния , по-вид им о му,
т акже имеющие непосредственное отношение к механизму транс­
п орта ионов Са2+ (табл. 1). В частности, Blond in ( 1974, 1975) из
митохондрий сердца быка из олировал липоф ильну ю фр а кцию ,
ко торая индуцировала увеличение проницаемо сти м ембра н мито-
Таблица 2
Эффект ионов лантана на кальциевую пров одимо сть
бислойных фосфолипидных мембран, индуцированную
митохондриальным ионофоро,1 двухвалентных катионов*
l{он ц~нтраur•я
~, дельн ая
No
г.роrод 11r.1 r~с ть
ЭКСiН:· ри-
.:.аз +-
Б Ф.М, Go,
:"1 1ен ти
Са2+ , ыМ llдl,, ~11..:г/:-.-1л
]\Jl{J\"\
ом-1-см-2
(ХНО')
1
О* ';,
о
о
3.5
2
u
2,7
u
8
3
о
54
о
:20
4
0,33
54
о
50
5
3,3
54
о
]50
6
3,3
54
3,3
5
* Среда, омывающая мембраны , содержала 25 мМ трис­
хл орида, рН = 7,0. N\ембраны форш~ровали из суммарных
фосфолипид о в мозга быка.
*''' Имеется в виду доб а вленный извне С а 2 + , пр имесь
Са 2+ в растворах (около 5-10·· 6 М) не учит ывалась .
хо ндрий для ионов магния и кальция, а также стимулиро ва л ~
с корость переноса 45 Са 2+ через слой четыреххл ори ст ого угле ро да.
В нашей лаборатории (Махмудова и др., 1975 ) вп ервые бы ло
п оказано, что эта фракция со свойствами ио нофор а двухвалент­
ны х катионов (ИДК) вызывает в присутствии Са 2+ ла нта нид ч ув ­
ствительное снижение сопротивления бислойны х м ембран , сфор­
мированных из фосфолипидов мозга (табл. 2) . Пр и 10 - кр атно м
ко нцентрационном градиенте Са 2+ на мембран е (0,36 и 3,6 мМ
Са С1 2 соответственно) наблю д алась генерация мембран но го п отен­
ц иала lБ-17 мВ. Анализ ИК-спектров комплек сов ИДК с ио нами
л антана и кальция по казывает, что положительн ый з аряд лантан а
экранирует диполи полярных групп ИДК, уча ствующ их в комп­
л ексообразовании с Са 2+.
Позднее в лаборатории Ю. В . Евдотиенко ( Кудзи н а и д р . ,
19 77) исследованы свойства бислоев, сформир ованных из л ипи д -
34

ных компонентов митохондрий пеt1ени крыс. Эта м о д ел ьна я сис­
тема проявлял;:~ селективность, которая была представлена р ядом:
Ca2+>Sr2+?-,Mg2+ >K+, причем лантан (5-10-5 М/л) и нгиби ро вал
увел и чение проводимости, индуцированное ионами ка л ьци я. Де­
сятикратный градиент Са 2+ на мембране генерировал ра зно сть
потенциалов величиной 29 мВ, т. е. близкую к теорети чес кой.
Таким образом, эта система воспроизводила избирательнос т ь ис ­
ходного механизма . транспорта двухвалентных катионов и ег о ч ув­
ствительность к действию лантанидов, однако, как и в други х рас­
смотренных выше работах, для демонстра ции эффекта Са 2 + и ли
Sr2+ н а проводимость мембран требовались концентрации к а тио­
нов, в тысячи раз превышающие кажущуюся Км интактно й с ис­
темы . Аналогичная ситуация, ви димо, сложилась и в м од ел ь ны х
экспери м ентах по инд у кции переноса двухвалентны х к атион ов ч е ­
рез слой орга н ического растворителя в пр и сутств и и оч ищ е н н ого
к ар д иолипина (Tyson et al., 1976), который рассматр ив а л с я не ко ­
торы м и авторами (Saris, 1972) как переносчик Са 2 + ч ере з м ем­
браны мито х он д рий. Кардиолипининдуцированный пер ено с Са 2+
в _ячейке Прессмана тормозился рутениевым кр а сны м и ли с т рон­
цием как конкурентом Са2+. Однако наличие такого переноса в.
мито х ондриальной мембране с п орно. Во всяком случ ае , ус та нов­
л ено, что антитела к кардиолипину не влияют на тр а нспор т двух-­
валентных катионов (Saris, 1972; выступление Lelшinger в дис­
куссии к докладу) .
По данным Blondiп (1975) , роль ионофора двухвалентных ка­
тионов выполняют окси- и кетопроизводны е о кт а д ек а д и ено во й:
кислоты, а также метиловые эфиры эти х произво д н ы х. Н е ис кл ю ­
чено , что липидные соединения с ионофорными свой с твам и в о з ­
никают в результате жесткой обработ к и митохон д р иал ьно го м а­
териала . Несмотря на исчерпывающую химическ у ю хара кт е ри сти­
ку ионофорного материала, представленную Bloпdiп, и развитую
не с колько по з днее ко н цепцию об «ионофоропрот е ин ах» , в ко то­
рой ионофор представлен не жирноки с лотной с у бст анц ией , а не й­
тра л ьным пептидом (Blondin et а!. , 1977), пробле ма ра здел е ния
и реконструкции механизма транспорта двухвалентных катионов
в митохондриях фактически остается нерешенной. Отчасти это,
ви д и м о, обусловлено в озможной поликомпонентност ью и о нт р а нс ­
портирующих систем с высокой избирате ль ност ь ю , а т акже нал и ­
чием в мем бране митохондрий нескольких механи змов перенос а
Са 2+ (с м . введение). Некоторые варианты устрой ства по до б ны х
систем обсуждаются в обзорах В. П. Скулачева (1 974 ), Ю. А. Ов­
чинюшова ( 1978) , Shaшoo, Goldstein ( 1977) .
В 70-х годах достигнут существенный прогресс в реконструк­
ции Са 2+ - насоса саркоплаз м атического ретикулума . R acker ( 1972 )
осуществил встраива'ние очищенной Са - АТФазы в липосом ы ,
сформированные из фосфолипидов соевых бобов, в резул ьтате чего
бы л а реконструирована АТФ - зависимая аккумуляц ия Са 2+ с п ри з ­
наками , с войственными интактной системе транспорт а. Неск ол ько

.Jieт спустя Si1Jп100, МасLеппап ( 1974) обнаружили «ионофор­
ные» с войства водорастворимой сукцинилированной Са - А ТФазы
,рети ку лума при использовании бислойных фосфолипидных мем­
-бран. Относительные изменения проводимости мембран, модифи­
цированных ионофорам, могут быть представлены последователь­
ност ью : Ba 2+>Ca 2+>Sr2+>Mg2+>Zn2+> Na+, К+, Cs+, · Li+ и RЬ+.
За исключением бария, селективность · этой модель н ой системы
и ин та ктного кальциевого насоса ФСР совпадают и близки к ион­
ной из бирательности карбоксилатного , ионофора Х - 53Т А (Cas-
\,Vell, Pressman, 1972). Проводимость, инду ци рованная двухва - '
лентными катионами в присутствии сукцинилированной Са-АТФ­
азы, блокировалась лантаном и рутениевым крас н ым (Sl1amoo,
МасL е пnап, 1974; Shamoo, Go ldstein, 1977). Эти результаты были
воспр оиз веде ны в нашей лаборатории (Tashm ukhamedov et а!.,
1975). С J1 едует отметить, что препарат сук ц и н или р ованного фе р­
мент а не проявляет АТФаз н ой активности, а для индукции им
мембранных эффектов требуются миллимолярные концентрации
д ву хвал ентных катионов, что в J03 - 104 раз выше концентра ц ий,
активнрующих Са 2+ - насос ретикулума. Одна ко наиболее важ н ым
в ис с :, едованиях Shamoo, Go ldste in (Jl 977) являет ся демонстрация
ионо фо рного, гидрол итического и «каналь н ого» фрагментов в
молеl\ у ле Са - АТФазы · с молекулярным весом 20 тыс., 30 тыс. и
45 ты с. дальтон соответственно, причем ион н ую селективность
насоса регулирует фрагмент с моJ1екулярным весом 20 тыс., а
кана л, формируемый участком в 45 тыс., малоизбирателен. В це­
лом это т подх од , наря ду с реконструкцией кальциевого насоса на
липо сомах, можно рассматривать как обоснованную пред п осьи1ку
расш ифровки не только молекулярного механизма работы Са·
А ТФ азы саркоплазматнческого ретикулума, но и выявления наибо ­
л ее об щих принципов ио н ного транспорта через различные типы
бно J10гических мембран .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследование особенностей транспорта ионов кальция или
стронция через биологические мембраны представляет интерес не
то J1ько при оценке селективности тех или иных ка J1ьциевых на ­
сосов, локализованных в соответствующих мембранных системах ,
но и при выявлении наиболее существенных канi!лов и механиз ­
мов, с помощью которых стронций про н икает в организм живот­
ных и вовлекается в биологические цели.
Анализ взаимодействия щеJJО':J Н Оземельных мет аллов с различ -
1-lЫМН типами 1<альцие13ых нщ:осов показывает, что стронций яв­
.ляет ся ближайшим, весьма конкурентоспособным · аналогом Са 2+.
Sг 2+ может заменять Са 2+ и вести себя подобно ·ему при аккуму ­
ляции в митохондриях, саркоплазм .ати ч еском ретикулуме, при
транспорте через плазмати<iеские мембраны. Сходство механиз­
мов транспорта ионов кальция и стронция, а также некоторые
.36

кинетические константы активного транспорта этих ионов в тех.
случаях, когда они измеримы, являются в основном величинами
одного порядка лля обоих ионов. Более того, слабо дискримини ­
руют Са 2+ и Sr2+ изолированные компоненты кальциевых на сос ов.
и реконструированные на их основе модельные системы .
В поведении Са 2+ и Sг 2+ при взаимодействии с секвестрнрую­
щими мембранными системами наблюдают с я существенные раз­
личия. Наиболее важным следует признать стабилизир ую щий
эффект стронция на структуру и функцию митохондрий, прот иво­
положный тому, который оказывает на них кальций . Существуют
и другие отличия в кинетике транспорта Са 2 + и _Sr2+ в митохонд-­
риях и саркоплазматическом ретикулуме; они р· ассмотрены в со­
ответствующих разделах настоящего обзора .
В связи с существенной ролью эндогенных фосфолипаз в ре­
гуляции структурного и функционального состояния митохондрий,
особенно при экстремальных воздействиях, предс тав ляет интерес
специфика влияния ионов кальц ия и стронция на . активност ь это­
го . фермента. Активирующее действие Са 2+ на митохондриа л ьную
фосфоJ1ипазу в настоящее время доказано, вместе с тем, некото­
рые косвенные да нные и аналогии с фосфолипазами из дру гих
и.сточников свидетельствуют об ингибирующем эффекте ио нов
стронция. Прямая демонстрация тормозящего де й ствия S r2+ на
фосфолипазу митохондрий, по - видимому, необходима при р еше­
нии вопроса о механизме стабилизирующего эффекта этого ка тио-
на на структуру митохондрий .
•
Физиологическое значение транспорта Са 2+ в митохон д ри ях,
по мнению многих авторов (Rasmussen, 1966; Lehпinger, 1970;
Ташмухамедов, Гагельганс, 1973; Carafoli, 1974, 1975; By grave,
1977), з аключается не только в регуляции мышечного сокращения
или в контроле активности некоторых клеточных фермен тов и
ферментных систем, но и в термогенезе, биологической к ал ьци­
фикации тканей, наблюдающейся как в норме, так и при не ко­
торых спонтанных и экспериментальных патологиях, и т. д. При
доста точно высоком уровне стронция в пище митохондриа ль ный
и друг ие типы кальциевых насосов, а также некоторые Са 2+ - свя­
зывающие беJ1ки могут вовлекаться в «стронцификацню» н:а ней.
Это явление, очевидно, имеет характер фи з иологического про­
цесса у ряда эволюционно древних организмов, и в дан ном слу чае
взаимодействие Sг 2+ с мембранными структурами предст ав .пяет
самостоятельный интерес.
Однако и в случае эволюционно более высоких фо рм ор rа ннз ­
мов стронций может б,,1ть использован как аналог Са 2 +, нап ри­
мер для :мектронномикроскопической маркировки внутрикл ето ч­
ных кальциевых депо', при изучении механизма · автоколебаний
ионных потоков в митохондриях, в экспериментах по изу ч ению
механизма транспорта Са 2+ в митохондриях и т. д. Несом не нно,
что со временем перечень примеров использования стронция в ка­
честве инструмента исследования внутриклеточно го обмен а кал ь­
ция существен но расширится.

ЛИТЕРАТУР А
А зар ашв или Т., Лукьяненко А. И, Евтодиенко Ю. В. 1978. «Био­
х имия », 43 , 1139-1142 .
Б е н д ол Д ж . 1970. Мышцы, молекулы и движение. М.
Б о л д ы р е в А. А. 1977. Биохимические аспекты электрохимического сопряже ­
ния. М.
Виноградов А. Д., Евтодиенко Ю. В. 1967. Митохондрии. Биохимия
и морфо л огия. М., 5-18.
'
Г ю л ь хан дан я н А. В. , 1978. Исследование автоколебаниi1 ионных потоков
в митохондриях. Автореф. канд. дне. Пущино-на-Оке.
Ев т о д иен к о Ю. В. 1979. Механизмы и регуляция транспорта ионов в м~по ­
х ондриях. Автореф. докт. дне. Пущино-на-Оке.
Кудзин а Л. Ю. и др. 1977. «Биофизика», 22, 362-364.
Л е н и н дж е р А . Д . 1966. Митохондр ия. Молекулярные основы структуры и
фу нкции. М.
Ма х м уд о в а Э. М. и др. 1975. «Биофизика», 20, 225-227.
Ми р оно в а Г. Д. и др. 1976. Биохимия мнтохоидрий. М., 143.
Ми р о и о в Г. П. и др. 1979. Тезисы докл. I Советско-швейцарского симпозиума
« Биологические мембраны. Структура и функции». Тбилиси, 78.
Ов ч и нни ко в Ю. А., Иванов В. Т., Шкроб А. М. 1974. Мембраноактив­
ные компле1,соны. М.
Ов чи нни к о в Ю. А. 1978. Итоги и перспективы развития биоорганической
х имии и "ю л екулярной . биолоrии. М., 128-169.
Пе чат ни к о в В. А. и др. 1979. Тезисы докл. I Советско - швейцарского сим­
п озиу м а «Биологические мемб р аны, структура и функции». Тбилиси, 10 5.
Ри т о в В. Б. 1977. Молекуляоная орга ни зация и механизм функционирования
С а 2 + - з ависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума . «Итоги науки
и техники. Биологическая химия». XI, М. , 5-77 .
С к у.п аче в В. П. 1969. Аккумуляция энергии в клетке. М.
С к у.п аче в В. П. 1972. Трансформация э н ергии в биомембранах. М.
С к у.па че в В. П. 1974. «Успехи совр. биологии», 77, 125.
Сороковой В.И.,ВладимировЮ.А. 1975. Молекулярная патология
мембр анных структур. «Биофизика». 5, 1l-55.
ТашмухамедовБ.А.,Гаге.пьrансА.И.1970.Околебательномхарак­
те ре вы х о да Н+ из митохондрий во ьремя аккумуляции стронция. «Био­
ф изика », 15, 443 - 446.
ТашмухамедовБ.А.,ГагельrансА.И. 1973. Активный транспорт
и оно в ч е рез биологические мембраны. Ташкент.
Тей л о р Д. М . 1971. Метаболизм строн11ин. М ., l 70-175.
Хо л м у х а мед о в Э. Л. 19 79. Количес тв енный анализ и изучение механизма
а втоко ле баний ионных потоков в ми т охондриях. Автореф. канд. дне. П у ­
щ ино-н а -Оке.
Хо л м у ха ме дов Э . Л., Гюльханда,-rян А. В. 1976. В кн. «Биохими я
митохондрий». М., 147.
Ха ссе ль б а х В., В е б ер Г. l 964. Мошкулярная биология. Проблемы и
п е рсп е ктивы. М., 237.
Ча н с Б. 1962. Регуляция клеточного обмена. М., l l l- 153.
А k е r ша п К Е. О. 1978. FEBS Letters, 93, 293-296.
АkеrmапК.Е.О. 1979. FEBSLetters, 100,291-295.
АshG.R., В уgrа\1еF.L.1977,FEBSLetters,78,166-168.
Az zoп e G. F . 1977. FEBS Letters, 78, 21-24 .
ВаrtеуW., А гп о оrеJ.Е.1958.Вiосhегп.J., 69,348-360.
Be el e r Т ., M a rtoпosi А. 1979. FEBS Letters, 98, 173-176.
В 1 о п d i n G. А . 1974. Biochem. Biophys. Res. Comгпuns, 56, 97- 105.
Bl ond in G. А. 1975. Апn. N. У Acad. S-::i, 264, 98-lll.
ВlоndinG.А.,Кеss1егR.J., GrеепО.Е. 1977.Proc. Natl. Acad.Sci.
U SA, 74 , 3667-367(1.
38

В о у е r Р. D. 1965. Oxidases and related Redox Systems (Т. Е. Юng, Н. S. Mason ,
a nd М. Morriso n , eds), 1, 994-1008, Wiley, New York.
ВоуеrР.D. 1975. FEBSLetters, 58, 1-6.
Вriеr1еу G.Р et al. 1963.J.Biol.Chem., 238,3482- 3489.
В у g r а v е F. L . 1977. Current Topics in Bioenegretics, 6, 259-318 .
Сарlап А. 1., С аrаfоli Е. 1965. Biochim. Biophys. Acta, 104, 317-329.
С а r а fо1i Е. 1965а. Biochim. Biophys. Acta, 97, 99---il06.
С а r а fо1i Е. 1965Ь. Biochim. Biophys. Acta, 97, 107-117.
С а r а fо 1i Е. J. 1967. Gen Pl1ysiol. , 50, 1849-1864.
Саrаfо1i Е. 1973.Biochimie, 55, 755-762.
Са rа fо1i Е. 1974. Biochem. Soc. Symp., 39, 89-109.
СаrаfоIiЕ. 1975. Mol. Cell.Biochem., 8, 133-140.
С а r а f о 1 i Е. 1977. Li\ling Systems as energy con\lerters, 153-174.
Саrа fо1i Е. 1979.FEBS Letters, 104, 1-5.
СаrаfоliЕ.,WеilапdS., LеhпiпgеrА. L. 1965. Biochim. Biophys. Acta,
97, 88 -98.
Саrаfо1iЕ.,GаmЬiе R.L., LеhпiпgеrА.L. 1966,J.Biol. Chem., 241,
2644-2652 .
Саrаfо1iЕ.,РаtriаrсаР.,Rоssi С.S. 1969.J.Cell.Physiol., 74, 17-29.
СаswеllА. Н.. РrеssmаnВ. С. 1972. P.iochem. Biophys. Res. Commtшs,
•
49, 292-298 .
С 11 а n се В. ,1965. J . Biol. Chem., 240, 2729-2748.
СhапсеВ.,МеlаL. 1966. Biochemistry,5,3220-3223.
·СhаnсеВ., Уоshiоkа Т..1966. Arch. Biochem. Biophys., 117, 451-465.
СhарреllJ.В., Соhп N1., Grеvi11еG. D. 1963. Energy-linkecl fllnctions
of Mitocho ndr ia (В. Chance, ed.), Acad. P r ess, Ne,\I York, 219-231 .
·С11арреllJ. В., Сгоfts А. R. 1966. Regul8tion of MetabolicProcesses in Mi-
to chondri a (J. М. Tager. et al ., eds), ВВА Library, 7, Elseyie r, Am sterdam,
293.
Сrоfts А.R..СhарреllJ.В. 1965.Biocl1em. J., 95,387-392.
D е а па R. et al 1979. FEBS Letters, 106, 231-234.
Dга11 оtа Z. et al. 1965. J. Biol.Chem., 240, 2712-2720.
D r а !1 о t а Z. et аl. l969. Arch. Biochem. Bioor1ys., 130, 267.
G е а г А. L. et al. 1967. J. Biol. Chem., 242, 3403-3413.
G о mе z-P u у о u А. et al. 1972. Biochem. Bicphys. Res. Communs, 47, 814-819.
GrеепаwаItJ.W,Саrаfо1iЕ. 1966.J.Cell.Biol., 29,37-61.
GуIkhапdапуапА.V. et а!. 1976. FEBS Letters, 66,44-47.
Наssе1Ьасh1964.Proc. Roy.Soc., 160,501.
Наssе1Ьасh \V., М аkinоsеМ. 1961. Biochem. Z., 333, 518-528.
Наssе1Ьасh\V.,
М а kin о s е М. 1962. Biochem. Biophys. Res. Commu11s,
7,132.
H ass e lbach W, Makinose М . 1963. B iochem. Z, 339, 94-111.
Неаtо11G.М,Niсhо11sD.G. !976.Biochem. J., .156,635-646.
JепgА.У.,RуапТ.Е.,ShаmооА.Е.1978.Proc. Natl.Acad.Sci.USA,75,
2 125-2129.
Lеhni11gеrА. L. 1949.J. Biol. Chem., 178, 625-644.
Le hninger А. L. 1966. А11п. N. У. Acad. Sci., 137, 700-707 .
Le hni11ger А. L. !970. Biochem. J ., 119, 129-138.
-
L е h 11 i 11 g е г А. L. 1972. The molecular Basis of Flectron Trnasport. Acacl. Pre ss,
N. У.- Londo11 , 133-151.
Le hn i 11ger А . L., C a rafo li Е., Rossi С. S. 1967. AdY. E11zymol., 29,
253-320.
L е 11 п i 11' g е r А. L. et , al. 1969. Mitochondia . StrL1ct. Fu11ct. Eed. Eur. Biochem.
Soc. Meet. 5Н1, 1968 . FEBS Symp., 17, 369-377 .
'Lеh11i11gегА. L., С аrаfо1iЕ. 1971.Arch. Biochem. Biophys., 143,506-515.
Lеttvi11 J.V et al.1964.Nature, 202, 1338-1339.
LiЬегmапЕ.А., Sku1асhеvV. Р. Biochim. Biophys. Acta, 216,30-42.
,'11асLе11пап D.Н., Ноllа11d Р. С. 1975. А11п. ReY. Biophys. a11d Bioenerg.,
4, 377-404 .
Ма dеir а V. М С 1978. Arch. Biochem. Biophys. , 185, 316-325.
39

Маг t о n о s i А. 1972. Metabolic Pathways. 6 . Metabolic Transport, 317 -349.
М е I а L. 1968. Arch. Biochem. Biophys. , 1 23, 286-293.
Мегmiег Р., Наssе1Ьасh\V. 1976. Eur J. Biochem., 69, 79-86:
Mitchell Р. 1961. Natшe (London), 191, 144 --; -- !48.
М i t с h е 11 Р. 1966. Cl1emios1110tic Coupli11g in Oxidati\1 e a nd Photosy11tl1eti c·
Phosphorylation. Glynn. Ress. Bodm in , Corn\vall, E11gl a nd.
Мit <; h е11 Р 1972. Bioenergetics, 3, 5-24.
М. о о г е С. L. 1971. Biochem. Biophys. Res. Communs, 42, 298-305.
М о о г е С. L. Metabolic Path,.. ·ays. Metaboli c: Transport (L. Е . Hokin, Ed.) . 6-
573-626 .
,
J\11оуIеJ., М.itс11е11Р. 1977. FEBS Letters, 77, 136-140.
М.оуIеJ., М.itсhе11Р.1977.FEBSLetters, 73, 131-136.
Mra z F. R . 1962. Ргос. Soc.. Exptl. Bio l. М.еd., 111, 429-431 .
О1sоnЕ.J., С а zогtR.J. 1969.J.Cen. Pl1ysiol., 53,311-322.
Расkег L.,
UtsumiК.,М.LIstаfаМ.. G. 1966. Arch. Biochem. Biophys.,
117, 381-393.
РаnfiIiЕ.,Sа11dгiG., Sоttосаsа G. L. 1974. Acta Vita111i11. Enzymol.,
28, 323- 330.
Ра11fiIiЕ. et а!. 1976. Natшe,5582, 185-186.
РаtгiагсаР.,СагаfоIiЕ.1969.J.GenPhysiol., 72,29-37.
Р!1iIiрsо11 D. D.,
Ваu111gагtnег F. 1979. Biochim. Biophys. Acta, 567,.
523-528.
Pieteгso n \V. А., Vo l,ver k J. J ., De Haas G. Н. 1974. Biochemistry, 13, .
1439-1445.
РоttеrР Р. 1947.J.Biol.Chem., 169, 17-37.
РоttегV. R., S iеkеvitz Р,,Si111оnsо11Н.С. 1953. J.Biol.Chern.,
205 ,.
893-908.
Ргеstiрi11оG. et al.1974.FEBSLetters, 45,99-103.
R а сkег Е. 1972. J. Biol. Chem., 247, 8198-8200.
Ras 111u sse11 Н. 1966. Fed . Ргос., 25, 903-911 .
RееdКС.,ВуgrаvеF.L., !974а.Biocl1ern. J., 140,143~155.
RееdК.С.,ВуgrаvеF.L.!974!J.FEBSLetteгs,46, 109-114.
RееdК.С.,ВugrаvеF.L.1975.Biochern. J., 55,497-504.
Rеупаfагjе В., Lеh11ingег А. L. 1977. Bioche111. Biophys. Res. Com111uns,.
?7, 1273 - 1279.
S а r i s N. Е. L. 1972 . Biochemistry a11d Biopl1ysics of mitochondrial МеmЬ гапеs.
(G . F . Azzone et al., eds) 641-652.
SсаrраА.,АzzопеG.F.1970.EL11·.
J. Biorhem. , 12 , 328-335.
SсаграА.,LindsауJ.G.1972.Еш.J.Biochem., 27,401-407.
SсhаffеrS., SаfеrВ.,Wi11iаmsо11J.R.1972.FEBSLetters,23,125-130.
S с !1 е гр 11 о f G. L . 1973. Abstгacts of р арегs presented at the Simposium . «Cal-
cium IJindi11g Protei11s», JaЫonna 11ear \\.'a r s aw.
S с u I а с h е v V. Р. 1971. Cшrent Topics i11 Bioe11ergetics, 4, 27-190.
SеIwу11М.J., Dа\Vsо11А.Р.,Du1111еttS.J. 1970.FEBSLetters, 10,1-5.
ShаmооА.Е.,МасLе1111а11 D. Н. 1974. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 71,
3522-3526.
Shа111оо А. Е.,GоIdstеi11 D. А. 1977. Biochi111.Biophys. Acta, 472,13-55.
SiеkеvitzР.,РоttегV.R. 1973.J.Biol.Chem., 200,187-196.
S I а t е r Е. С. 1953. Natuгe (Lo11 don), 172, 975-978.
SIаtегЕ.С.,СIеIа11dК\V. 1953.Biochem. J., 55,566-580.
SоmIуоА.\Т.,SоmIуЬА.Р 1971.Scie11ce, 174,955-958.
S о 111 1у о А. Р. et а!. 1974. J. Се!!. Biol., 61, 723-742.
S о t t оса s а G. !__ et al. 1972. Biochem. Biophys. Res. Commu11s, 47, 808-813.
Sottocasa G. L .,
P a 11fil i Е., Sa11dri G. 1977. Calcified T i ssues 1976,
Leeds, 497-499.
S t r о 11 g Р. N. et а!. 1976. Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 73 , 178-182.
Таsh111LIk11аmеdоvВ.А. etа1.1972.FEBSLetters, 28,239-242.
Та s h m u k h а m е d о v В. А. 1975. Vtl1 i11ter11at. Biophys. Co11gress, Copenhagen,
De11mark, 174 .
•
Туsо11С.А.,Zа11dеН.V.GгееnD.Е.1976.J. Biol.Chem., 251,1326-1332.
4:)

UtsumiК., Расkег L. 1967.Arch. Biocl1em. Biophys.,
120, 404-412.
Vаiniо Н., МеIа L., СhаnсеВ. 1970. Eur. J. Biochem., 12,387-391.
V а s i n g t о n F. О. 1966. Biochem. Biophys. Acta, 113, 414-416.
VаsingtоnF.О.,МuгрhуJ. V. 1962.J.Biol.Chem., 237,2670-2677.
V а s i п g t оп F. О. et al. 1972. Biochiп1. Biopl1ys. Acta, 256, 43-54.
VапdегКIооtW.G.,
G I о v s k у J. 1965. Соп1р. Biochem. Physiol., 15,
547-567.
Viпogradov А. О., Sсагра А. 1973. J. Biol. Chem. ,
248, 5527-5531.
WеЬегА.,НегzR., Rеiss!.1966.Biochem. Z., 345,329-369.
Wiпs Р., Schoffeпiels Е. 1968. Life Sci., 7, 673-681.
УаmаdаSh., ТоnоmurаУ.1972.J. Bio·2hem., 72,417-425.
ZimniаkР.,RасkеrЕ. 1978.J. Biol.Chem., 253,4631-1637.
3. У. БЕКМУХАМЕТОВА, А. К. КАСЫМОВ
О МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА
ИОНОВ В ПОЧКАХ
· транспорт ионов и водно-солевая регуляция в пр еделах ор­
ганизма у позвоночных осуществляются почкой, к отор ой принад-­
лежит исключительная роль в минеральном обмене у выс ших о р­
ганизмов. В связи с многообразием и сложностью поч ечных функ­
ций ее деятельность находится под контролем боль шого Ч:и сла
гормонов, которые тонко регулируют водно - солево й баланс в ор­
ганизме. Хорошо известны физиологические эффекты го рмон ов
надпочечников и нейрогипофиза, однако молекулярные механизмы
действия этих биологически активных веществ изучены недоста­
точно. Значительный интерес представляет исследов а ние механиз­
мов транспорта ионов в почечной ткани, так как сегменты нефро­
на обладают различной функциональной активно сть ю. Особе н­
ности транспорта ионов в почке, по-видимому , свя заны со с пеци­
фикой Na, К-АТФазы отдtльных сегмен.тов нефрона.
ТРАНСПОРТ ИОНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ЗОНАХ ПОЧКИ
Функциональной единицей почки является нефро н, к ажд ый
сегмент которого выполняет специфические функц ии в процессе
реабсорбцни натрия. Визуально в почке различают корко вую,
мозговую и сосочковую зоны. В корковом с л ое ра с положены клу­
бочки, проксимальные и дистальные отделы; в мозговой зо н е -
тонкие и толстые восходящие участки петли Ген.1 е; в сосочковой
зоне находя тся тонкие отделы петли Генле и соб иратель н ы е тру ­
бочки .
Поскол ь ку прямая зависимость между активно стью тра нспор т­
ных , процессов и уровнем транспортной АТФазы уста нов JJена на
примере самых разнообразных тканей (Skou, 19 57, !962; Wblttam,
1962; Bontiпg, 1970), мы иссJ1ед овали активност ь Na, К - АТФазы
в поверхностном слое коры, а также в м озгово й н сосо чко вой зо ­
нах почки крыс.
41

На ши данные показали, что разные зоны почки обладают как
о б щей, так и транспортной АТФазной активностью. Одновременно
<: нам и ана лог ичные данные были получены Schшidt, Dubach
(1969), Nechay et al. (1971).
Максима ль ная суммарная активность фермента наблюда ется
в мо зговой зоне . Наибольшая активность транспортной А ТФазы
,о б наружив ается в мозговой и сосочковой зонах, наименьшая -
в корково й.
,
П аралле л ьно с распределением АТФазной акти·вности мы ис ­
,следовали внутр иклеточную концентрацию электролитов в каждой
зоне п очк и путем пересчета общей концентрации ионов натрия
и ка лия с с оо тветствующей поправкой на внеклеточное (инули­
но вое) прост р анство, которое составляло для корковой зоны
24,5 ± 0,57, для мозговой - 25,2 ± 1,08 и для сосочковой -
29,6 ±0,89 %.
К.летки сосо чковой зоны . содержат максимальное количество
.на три я . Здес ь его концентрация в несколы,о раз выше, чем в
клетках ко р ко во й зоны . При этом внутриклеточная концентрация
натрия по вышается от корковой к мозговой и сосочковой зонам,
· тогда как конце нтрация калия уменьшается . Увеличение внутри ­
кл еточ ной конце нтраций ионов натрия от коры к папилле приво­
дит к значительному нарастанию натриевого градиента между на ­
ча лы-1ыми сегм ентами нефрона, локализоеанными в основном в
ко рко вой зоне , и те м и сегментами, которые состаы1яют сосоч1,о­
.вую зону - тонк ими канальцами петли Генле и собирательными
тр убоч ка ми.
Н а ри с. 1 представлено распределение ионов натрия и калия
в клетках разл ичных сегментов нефрона. При составлении этой
схемы мы испо льзовали также литературные данные (Burg,
Gr an thaш , 19 71) о внутриканальцевом содержании ионов натрия,
полученные мето дом микропункции и остановленного мочеотде ­
.ления на изол и р ованных нефрона х . Анализ схемы пока з ывает ,
чт о , в проксимал ьной части нефрона ионы натрия входят из про ­
света кан альц е в через апикальн у ю мембрану в клетку пассивно
ло концен траци онному градиенту. На противоположных базаль ­
:ны х мемб ранах клеток этого отдела нефрона ионы натрия выхо ­
дят а ктив но против высокого концентрационного градиента. Сле­
_дует учит ывать, что трансцеллюлярная ра з ность потенциала в
.проксималь ном отд еле нефрона чрезвычайнq низка и поэтому не
мо же т ока зывать какого - либо влияния на реабсорбцию натрия.
В клетках д истальных канальцев, а в еще большей степени
в клетках канальцев петли Генле и в собирательных трубочках,
ко нце нтра ция на трия выше, чем в просвете канальцев, поэтом у
вход нат рия через апикальную мембрану в этих зонах нель з я
,об ъяснить просто й диффузией. Если натрий активно реабсорби­
р уется н а протяж ении всего нефрона, то следует ожидать наличия
·различных натри евых насосов в почке . Данные по этому вопросу
в ли тера туре д овольно противоречивы, а экспериментальные ма-
42

териалы требую т дальней шей проверки (Наточ ин , 1969-1976;
\Vhittembury, 1970, 1972; Necl1ay et а!., 1971; Torretti et а!.,
1972; и др.) .
В сосочковой зоне почек на апикальных мембранах может на­
ходиться натриевый насос, который аккумулирует ионы натрия в
I<летки из внутриканальцевого пространства (Pitts, 1964). Удель­
ная активность Na, К-АТФазы в сосочковой зоне выше, чем в
корковой, хотя основная масса натрия реабсорби руется в прокси­
мальной час ти нефрона. Общий уровень трансп ортно го фермента
( без пересчета на мг белка) существенно выше именно в корко-
А
la
]]
ш
J-
6
3
_а_ __;
-
--
J------
~i
'
~
140 J5MM ~ 1::1
мм
-
мм
140
мм
240
мм
(j
30-50 '
ммi
1
---- +
--
8
1-fO
мм
Р ис. 1. Распределение ионов натрrrн (м :v\) п клетках
(а, 6, в) корково й (fa, [). мозгопrй (ff) и сосоч ко в з й (!ff)
зон почки интактных крыс.
А-сх е ма строения нефрона (Наточин. 1974): 1-клубоч~к. 2-пр о к­
си\1альный сеrм~нт, з,~ '4, 5-н нсх одпщ?е, посходящее, толстое, колРна
петли Ген .1е соответственно, 6-дистальны i'1 сеп1 Е' нТ, 7-со6ирательная
трубочка; Б- интерсти11иальное 11ростμанство; В-просв ет канальца.
'БОЙ зоне почек"'. Вместе с тем, препараты Na, К - АТФазы, выде­
ленные из проксимальных канальцев, содержат белок апикаль­
ных мембран, в которых отсутствует Na, К-АТФа за и площадь
1шторых очень велика за счет щеточной каемк и. Это обстоятель­
ство может сущестIJенно снижать удельную активность фермента.
Д ля вы яснения особенностей работы натрий-ка лиев ого насоса
в ка ждой зоне почки мы исследовали влияни е состава ионной
* В мо з говой зо не расположены ра з личные отделы нефрона , поэтому ак­
ти в ность Na, !<-А Т Фаз:,1 не может полностью отражать особенности тран­
•спо рта ионов в толстL>IХ от :tелах пет ли Генле и дистальных канальцах .
43

среды и те м пературы инкубации на внутриклеточную концентрu­
цию натрия и калия в срезах, приготовленных из корковой, моз-
говой и сосочковой зон.
.
При инкубации срезов почек при 18°С в бескалиевом раство­
ре, содержащем 150 мМ натрия, или при охлаждении до 0°, т. е.
в условиях, при которых сопряженный натрий-калиевый насос не-·
функционирует, концентрация ионов натрия внутри клеток кор­
ковой зоны увеличивается , тогда как в кл,етках сосочковой зоньi, .
наоборот, уменьшается .
Ниж:е предс тавлены данн ые по распределению эле ктрол ита ~.
при различных состоян ия х ионных насосов почки.
Натр111i
(
ll
ш
Калий
l
1(
111
Внутриклеточная концентрация uоно в, .мМ (М ±т)
в различных зонах поч.1си
кор1со вая
M03208afl
сосо•rковая
35.:но. а 1
8) 0+2 10
218. 0±6, 91
88,0 ± 2,86
Ю,1±1.92
9.5,8 ±2. 12
73,4 ±2, 83
t4,3 ± 3,05
163,8±4. 0 t
109,0 ±1 .23
96,5z:2,39
81,5±1 4)
39.5 .:.:U,83
27 4 ±U,93
23. 9 ±U .1:54
69,4 ± 1.31
~8 .4::tl ,0O
Gб, 1± 1,80
Пр им е •1 ан и е . Услов ия эксперимента : ! -концентрации ионов н се­
жих срезах, 11 •·· через 30 мин выдержи ания в среде без калия или при О' С;
![[--послед у ющая инкубация 30 м нн в среде, содержJще й 145 м М натр11я и
ь мм кал11я, при 37сс.
•
Концентрация внутриклеточного калия снижается во всех зо­
нах почки интактных крыс. При последующем перенесении срез ов.
в среду, содержащую 150 мМ натрия и 5 мМ калия, и и нкубации
в течение 30 мин при 37° наблюдаетс я некоторое снижени е , кон­
центрации внутриклеточного натрия в корковой зоне, в то время
как в клетках сосочковой зоны содержание натрия значител1,но
возрастает. Содержание внутриклеточного калия пов ышаетс я в о
вс ех зонах.
Описанные опыты показывают, что удаление калия из внешней
с реды, прекращение аэрации и охлаждение пода вляют работу на­
соса, локализованного на базальной мембране ~<леток коркового
слоя, что приводит к накоплению внутриклеточного натри я. Экс­
перименты свидетельст вуют, что в эпителиальных клетк ах прок­
симальных канальцев, расположенных преимущественн о в корко­
в ой зоне, функционирует · «обычный» Na, К-насос , локализованный
в базальны х мембранах, характерный для мног их эпи телиальны х
тканей. В то же время ион н ый насос сосочковой зоны является
« необычным», так как при его выключении содер жан ие внутри ­
клеточного натрия уменьшается, а при стимуляции - увеJ1ичи­
ва ется. По-видимому, единственно удовлетворите.ТJьным объясне-
44

·нием эт ом у может быть допущение, что в папиллярных клетках
почечной ткани дополнительно к N а, К - А ТФазе базальных мем ­
•сбр·ан имеется натриевый насос, локализованный в апикальных
мембранах, который, в противоположность всем известным насо­
сам, аккумулирует натрий из мочи в клетку .
.Таким
о бразом, экспериментально подтверждено предположе­
ние о сущ ествовании активной аккумуляции натрия через апи­
кальные - мембраны сосочковой зоны. Следует признать несомнен­
ной б иоJJогическую целесообразность такого насоса, изымающег о
натри й и з мочи на последнем этапе мочеобразования.
В связи с тем, что транспорт ионов вдоль нефрона на каждом
его у частк е имеет свои особенности, а распределение ионов и
. актив ности А ТФаз также неравномерно, возникла необходимость
детал ьного кинетического исследова н ия свойств транспортного
ферме нта н з раз Jшчно функционирующих сегментов нефрона. С
этой цель ю изу ч ены актив н ость транспортного фермента в зави­
симости от рН и температуры среды преинкубации микросомаль-
1-1ь1х п репара тов, выделенных из корковой, мозговой и сосочковой
· зон п очек и нтактных крыс.
Оп ыты показали, что оптимум рН для Na, К - А ТФазы всех з он
находи тся в области 7,5, а для Мg - АТФазы - 8,5. При исследо ­
вании те мп ературной зависимости Na, К-А ТФазы не обнаружено
раз личий в свойства х ферментов, принадлежащих различным сег­
мента м н еф рона. Энергия активации, рассчитанная по фор мул е
Аррен иуса , составляла 9-12 ккал, что соответствует литератур­
ным данным для АТФазы други х органов (Саггаhап, G l упп, 1967).
Оптим ум температуры для транспортного фермента корковой ,
мозгово й и сосочковой зон почки находится в области 50 ° С. Вы ­
- сокое зна чение температурного максимума свидетельствует о дос­
таточн ой термостаб и льности Na, К - А ТФазы. Для Mg -AТФазы оп ­
тимум температуры во всех исследованных зонах почки набJ1Iо­
дается в области 40°С, повышение температуры до 50°С быстро
1-1нактив и"рует этот ферме н т .
Варьируя рН и температуру, не удалось выявить различий
в сво йств ах ферментов, локализованных в различных зонах поч­
ки. Те м не менее, при таком подходе обнаруживается связь меж­
ду ак тивностью и термостабильностью фермента корковой и со­
•Сочковой зон почки интактных крыс. Фермент корковой зоны бо­
лее те р мо стабилен и о(Sладает меньш~й удельной активностью,
фермент с осочковой зоны, наоборот, характеризуется наибольшей
-скорос,:тью гидролиза АТФ при тех же концентрациях активаторов
и наимен ~е т ермостабилен.
.
_
• Зав1J,fJ;! МОсть активности фермента . от концентрации субстрата
-мы изучали в 2 вариантах: на фоне 100 . мМ , Nа++20 мМ _к+ и на
фоне ЗЬ мМ Nа++З мМ К+. Установлено, что Na, К-АТФаза кор­
, ковой ! ; 'зqны .реар.ирует. .. на и;зме}i~ни~ ион .ной <;1;1лы среды . инкуба­
щiи И~q Ч€, чем , мозювой, И <;Q .СОЧКОВQЙ. Графическое изображен~1е
-скорости реакции по Лайнуиверу-Берку (рис. 2) таюке пока з ы-
45

вает, что макс им а л ьная скорость (Vмакс . ) ги д ролиза АТ Ф низкая
в корковой зоне, а в сосочковой ~ наиболее высокая . . Низ ко е
з начение Кт, хар актерное для · сосочковой зоны, может указ ывать
н а отличие в с вязывании субстрата и фермента в этой зоне . О д­
н ако различия в доступности субстрата нельзя объясн ить тальк~
D
JS1
2
tiV
г
-
1-
-'1
7, /д
З
·•~/
~~
_/
"1
/.,v
1
~.· t:..
J,.
2
б
0.5
rJ
0.5
з
2
!
2
2
е
()5
1!]
Рис . 2. Графи к Лайнуивера-Берка дли Na, f< - А ТФаз ы
корковой (а . z), мозговой (б, д) и сосочковой (в, е) за.н
почек 11нтактных крыс.
а,б, в-н'!_фоне 100 мМ Na+ +20 мМ 1,+; г, д, е-г.а фоне
30 мМ Na+ +3 мМ к+; \7-Сl(орость гидролиза А1Ф (,11,Jv\ Рн/мг
белка /мин) , S - кон ц ентраuи я субстрата (АТФ, мМ); J-бе з ннгибитор а;·
2, 3, 4-в п рисутстви11 0,1, 0,5 н 1 мМ олиторI,Iзнда соответственно.
р азницей в п.1отности структуры мембран сосочковой, м озгово (I
и корковой зон почки, так как ход реакции описываетс я ур авне­
нием Михаэлиса , несмотря на то, что субстрат и АТФ аза лока­
лизованы в различных фазах* . М.ож но п олагать, что проц ессы,
* При гетерогенном ферментативном катализе лимитир у ющей с тадией о бы ч ­
но является сrа дия проник н овения в0д ораство р имо г о компонента реа кции в гид­
' р офобную зону и последующая активация фермента.
,46

протекающие на границе раздела фаз, не являют ся л имитирую­
щими, а определяются кинетикой связывания субстрата и фер­
мента в этих зонах. Характерно, что в сосочковой зоне почки
наблюдается большая доступность субстрата для свя зывания с
ферментом, что косвенно указывает. на различия в свойств ах N а,
К-АТФазной системы вдоль нефрона. Эти различи я могут бы п,
связаны с локализацией нескольких АТФазных систем в э той:
зоне.
Правомерность такого предположения подтвер)!-,д_ ается и сследо­
ванием кинетики транспортно г о фермента при раз л ичны х кон­
центрациях субстрата (0,25-6,0 мМ АТФ) в при сутств и и пере­
менных концентраций ингибитора Na, К-АТФазы
-
сер дечного
гликозида (олиторизид) . Ингибирование фермента пр отекает по
неконкурентному механизму, а характер торможен ия в сосочков оf1
зоне резко отличается от характера ингибировани я в корков оfг
и м озговой зонах почки.
Пред ставленные результаты показывают, что свойс тва АТ Ф­
азных систем микросомальных фракций в исследован ных зо нах
почки не идентичны. Остается открытым вопрос, наскол ько гид­
ролиз АТФ в сосочковой зоне связан с существован ием более чем
одной АТФазной системы . Для доказательства этого пр едположе­
ния было предпринято изучение кинетики актив а ц ии фермента в
присутствии переменных концентраций АТФ и ингиб ито ра на фо ­
не различных концентраций одновалентны х ионов .
Предварительные опыты, проведен ные IЗ среде инку бац ии, со­
д ержащей 100 мМ. Na++20 мМ К+ и 30 мJ\il Na++ 3 м М К+, так­
же показали, что АТФазные систеыы корковой и сосо чков ой зон
почки существенно различаются. Тем не менее, одног о факта свя ­
зыван ия субстрата с ферментом недостаточно для ре шения воп­
роса, происходит ли из ме нение связывания из-за различий в ф ер­
ме нтных смстемах указанных зон или за с чет р аз н ой скоро сти
диффузии субстрата в пределах мембраны. Во злюжно, сущест­
вуют отличия и в ферментных системах и в их м икроокр ужен ин .
При использовании варьирующих количеств натрия и калия
как активаторов удалось получить более определенные резул ьта­
ты. Было исследовано влияние раз лич ных концент ра ций натр ия
(от 4 до 200 мМ) на активность транспортного фермента в при ­
сутствии калия в какой - либо постоянной концентрации ( 1-
80 мМ ), и наоборот. Эксперименты показали, что в присутствии
1-3 мМ калия активность фермента резко возра с тает п ри по­
вышении концентрации натрия от 4 до 30 мМ. Бо л ее вы со кие
концентрации натрия на фоне 1 мМ калия ингибир у ют АТФаз у
во всех зонах. По-видимому, это объясняется те м , что вы со к ие
концентрации натрия подавляют эффект калиевой активации. Ха­
рактер ингибирования ионами натрия, однако, различаетс я при
изучении АТФазы корковой и сосочковой зоны. Во- первых, уд ею) ­
ная активность транспортного фермента в сосочковой зон е на­
много выше, чем в корковой зоне, во-вторых,- Na, К -АТФ азн ая
4i

сис тема в со сочковой зоне имеет 2 пика активации при 2 раз л ич­
ны х ко нцентрациях ионов натрия и калия: для 1-го максимума
с активностью 0,66 мкМ Фн/мг белка/мин при 3 мМ калия и 30 мМ
нат р и я , ДJJЯ 2-ro максимума с активностью 0,85 мкМ Фн/мг белка /
мин при 20 мi\'\ калия и 30 мМ натрия . Напротив, в корковой зоне
наб люда ется лишь 1 максимум активности, обычный для Na, К ­
АТ Фазн ых систем из других источников (Schwartz et а! ., 1975).
Ук азанн ые максимумы выявляются и в мозговой зоне, однако там
он и· мен ее выражены. По - видимому, это объясняется тем, что в
мозговую зону входят одновременно ра'зличные учрстки нефро на .
Таки м обра з ом, при из учении кинетики активации Na, К - АТФ­
азы разл ичными концентрациями натрия на фоне возрастающих
конц ент раций каJJия, т. е. при изучении ее чувствительности к ка ­
ли ю в ыя влены 2 зоны связывания калия: 1 - й пик в области 1-
3 мМ К+ и 2-й - при 20 мМ К+. Эти пики наибоJiее четко прояв­
ляю тся в сосочковой з оне и менее выражены в мозговой; в кор­
ков ой зо н е они отс у тствуют. Прн более высоких концентрация х
нат рия (120-200 мМ) пики, соответствующие 1-3 и 20 мМ ка ­
ли я, сли ваются . с обра з ованием плато (рис . 3).
В на стоящее время накопилось до с таточное коJi ич ество фактов
о сущест вовании 2 АТФа з ных систем в эпителиальных тканях. В
эксп ерим ентах Ka v\1 ado et al. (1969), Phi lippot et al. (1972) также
вы явлен ы 2 максимума активации Na, К-А ТФазы у плеопод на
фон е 30 и 100-120 мМ натрия, есю1 в сред е присутствуют 7,5-
12,5 мМ калия; при д руги х концентрация х калия (выше и ниже)
обн аруж ивается только 1 пи к активации. Эти данные, по мнению
авторов, свидетельствуют о существовании 2 различных фермен­
то в , требующих присутствия натрия и калия, и о принадлежн ос ти
этих фер :,1ентов к 2 различным насосам, один из которы х JJокаJJи­
зов ан н а муко з ной стороне мембраны, другой - на серо з ной .
Сл едует отметить, что до настоящего времени не было данны х
об од но временном существовании 2 Na, К-А ТФазных систем в со ­
соч ково й з оне почек.
Разн ый характер активации ионами натрия и калия транс­
пор тного фермента · в исследованных зонах, очевидно, отражает
неодина ковые свойства Na, К-А ТФазных систем вдоль нефрона,
а т акж е может указывать на значительные различия в области
бли жай ше го мнкроокружения фермента. В сосочковой зоне отме­
чается более высокая чувствительность к ионам, тогда как Na,
К - А ТФа за корковой зоны бoJJee резистентна к высоким концен­
тра циям ионов .
Т аки м образом, иссJJедование кинетических характеристик
тра нсп ортного фермента из различно функционирующих зон п оч ­
ки к ры с свидетеJJьствует о его функциональной неоднородности
вдоль н ефрона. Поскольку транспортные функции, осуществляе­
мые в каждом сегменте нефрона, различны, можно у тверждат1,,
что гетерогенность Na, К-АТФазных систем имеет физиологиче­
с.кую основу. Подтверждением такого выnода могут служить дан -
48

н ые Whittembury (1960-1972) о существовании 2 натриевых на­
со сов в база л ьных мембранах эпителиальных клеток почки и На ­
точ ина ( 1969--1976) о различных насосах на протяжени и не ­
фрона.
Вы явлен и е активации с различными опт и мумами для ионов
в иссл едованных нами зонах почки такж е позволяет заклю ч ит ь,
Фн1
А
f,O
0.5
f.O
05
1,0
0,5
1,0
osr------
1,0
05-
"
f.0
0,5
204080
Б
6
в
!О
20,
3()
4()
f2{)
2040-во 2040ммк+
Рнс. 3. Кинетика активации Na, К-АТФа з ы кор ­
ков о й (А). , мозговой (Б) и сосочко в ой (В) зон
почки ионами калия на фоне различных коr-щен-
траций натрии.
ч то сущ ествуют 2 различные транспортные ферментные системы ,
акти вир уемые натрием и калием . Обнаружение АТФаз с различ ­
ны ми ки нетическими характеристика м и, видимо, имеет суще стве н -
4- 156
49

ное знач ение для объяснешrя м олекулй рных механизмов зда п·г а­
ции живо тi1ых к различн ым водно-солевым режимам. · Мно гие ис­
следователи (Taylor et al.,
1967; Jampol, Epsteiп , 1970; ZaLigg,
McLain , 1971; и др . ) отмечают, что прн росте, разв нтнr-1 и ли ф­
ференцировке тканей свойства ме м бран изменяются в С""оро ну
увеличения транспортных функций .
На основании данн ых , представ ленных в это •v1 разделе , можно
сделать в ы вод, что специфика ·транспорта ионов в отдельн ых с ег ­
ментах нефрона опред еляется наличием фун кцион альной г ете ро­
генноста тра н спортных АТФаз, которая в зна чи тельной сте пени
может зависеть от фосфолипидноrо состава АТФазного компл ек­
са и дру г их структурных компонент ов мембран в сегмент ах неф­
рон а н ~.rн кроокру:1,енн и А ТФазных систем. Такое предполож ение
вполне допустнм о, так как хорошо известно, что замена неко то ­
рых фосфолипидов, прочно связанных в моле куле фермент а, соп­
ровождается существенным изменен и ем АТФ азноГ, акт нвнос тн
(Dahl, Hokin , 1974; Швец и др . , 1974) .
ВЛИЯНИЕ ТОР;'\'Н)НОВ НА ·т-р·дlКПОРТ Ио-I-ЮВ
И УРОВЕНЬ Na, К -АТФа зы
Оди н из основных · вопро со в физ·иолоrии по чкн -- вы яснение
механизмов действи я • минер·ал·кортнкоидов на транспор т и онов
в поч1<ах. При нарушений функции надпочечни1<0в происх одя т из­
мене ния важных процессов в организме, и, в первую оче редь , ре­
абсорбирующей способr-fости · почечных канальцев. После двус то­
рон ней адреналэ ктомии У. крыс снижа~тся фильтрация и реабсорб­
ция натрия. ПJ)и этом многие авторы отмечают падение актив­
ности Na, К-АТФазы в _ rypeпap ·atax мик росо м почек (Chig nel, Ti-
tus, 1966; Lantioh e t ·а! . , 1966: Katz, Epsteiп, ;1967; Jorgens eп, 1972;
Кр естинская , Манусова , ·1973). Альдостерон, введенный адре нал­
эктомированным крысам в физиологических дозах, нор мализу ет
экскрецию натрия и од\ювремённо ·несколько повышает актив­
ность микросd ~-i"альной АТФазы, но не , восст'анавл ива ет ее д о ис­
ходных величин .
Для вьrясr.Уе ния роли кopti:rIZDcr·epoидoв в рег уляцин тр анспо рта
ионов мы исследовtаfrи а'ктивность N-a, К-А ТФазы, внутр икле точ ­
ное распределение ионов натрия и калr!"я, -работу н·атрий-к алие во­
го насоса, а также кинетику активации транспортного фермента
через 7 дней иЬсле двусторонй'ей •адрен·а J1 э'1<'томии. Опыты пока ­
зали, что при удалении надпочечников внутриклеточная кон цен­
трация натрия снижается во всех зонах: в · ~юре · незначит ельн о, в
мозговой зоне почти в 2 раза, а в сосочке - бDлее чем в 4 раза .
Одновременно в сьiворотке · крови понижается уровень на три5!
и увеличивается концентрация кали·я, в моче, наоборот, содержа ­
ние натрия резко возрастает .
Для выявления эффективности рабо'!'ы натрий-ка~иевого на ­
соса срезы различных зон почек интактных и адреналэктомн ро-
50

ванных крыс выдерживали в течение 30 мин при 0°-С и затем ин•
-кубировали их при 37°, после чего определяли внутриклеточную
концентрацию ионов . Эти экс п ерименты показывают, что адренаJl ­
эктомия вызывает нарушение работы натрий - калиевого насоса
в почке. Наибольшие изменения проявляются в сосочковоh зоне,
где существенно снижается спосооность к аккумуJ1яции натри.я
в клетки из внутриканальцевого пространства. Внутриклеточное
пространство при этом заметно не меняется.
Падение уровня натрия в сосочковой зоне почек вследствие
адреналэктомии было отмечено также в работах Kessler et al.
( 1~64) и др. Однако данные литературы по вопросу о содерж ан ии
ионов в зонах почки после адреналэктомии весьма противоречи­
вы; Platts (1964), Ni.ariani, М.a l vin ( l9b5) не смогли обнаружить
·каких - либо изменений в электролитном составе клеток сосочковой
зоны при адренаJ1эктомии. Противоречивы таI<же дан ные относи­
тельно изменения активности транспортного фермента при адре ­
налэктомии (Ebel et ai., 1971; Sch,vartz et al., 1975).
Наши опыты показали, что после удаления надпочечников уро­
вень транспортного фермента и М.g - АГФазы в различных зонах
почки снижается неодинаково. В корковой зоне уменьшается ак­
тивность и N а, К-АТФазы и М.g-А ТФазы, при этом их отношение
не · отличается от контрольных величин (0,42). В мозговой зоне
падает активность также оЬе и х А ТФаз, однако уровень транс­
портного фермента снижается Ьыстрее . ·ь сосочковой зоне актин'­
ность Мg - А'!'Фазы не меняется, а транспортная АТФаза сущест­
венно ингибируется. Следовательно, при недостатке кортикосте•
роидов преимущественно подавляется акпшность транспортного
фермента в со<.:очко в ой зоне. Iаким образом, при кортикостероид­
ной недостаточности в сосочковой з_оне одновременно уменьшает­
ся и активность транспортной АТФазы и уровень внутриклеточ­
ного натрия.
· Очевидно, отмеченные нами изменения содержания натрия в
~различн ы х 011Делах нефрона имеют раз,ную при.роду. В начальных
сегментах нефрона, где и оны натрия поступают из просвета ка­
нальца в клетки по концентрационному градиенту, адренаJ1экто­
мия, по~в ид и мому, уменьш ает п ассивный вход натрия. Вместе с
тем, при адр еналэктомии снижается уровень функционально ак­
тивной Na, К - АТФазы и это в большой степени отражается на
распределени и ио н ов натрия в конечных сегментах нефрона, где
имеется до п олнительный Nа - К-насос на апикальных мембранах.
Для .выяснения молекулярных аспектов действия кортикосте­
роидов, пр и в одя щего к нарушению натрийзадерживающей функ­
ци~и ~почек, .необходо1мы .более детальные свед.ения о ,свойствах
Na, К - АТФаз каждой зоны при отсутствии или недостатке стероид­
ных гормонов. С этой целью мы исследовали влияние темпера­
туры, ,различных концентраций субстрата, ингибиторов и актива­
торов на активность Na, К,А ТФазы корковой, мозговой и сосоч­
ковой зон п очек крыс через 7 дней после удаления обоих надпо-
51

чечни,ко,в . В атих опытах сущест,венных раз.личий 1в энергии ак­
тивации ферментов из разных зон почек интактных и адреналэк­
томированных крыс, также как и оптимумах рН, не обнаружено .
Чувствительность Na, К-АТФазы к су6с11рату и и.нгибитору
микросомальных препаратов почек адреналэктомированных крыс
определяли путем инкубации ферментативного препарата с раз­
личными концентрациями АТФ (0,5-3,0 мМ) и олиторизида
(10-8
- 10-3 М) при постоянном уровне натрия и калия и постоян­
ном отношении J\lg/A ТФ, равном единице. Анализ кинетики актива­
ции транспортной АТФазы показал, что после удален·ия надпочеч­
ников увеличение концентрации ингибитора оказывает более
сильное торможение, чем в ферментативных препаратах, выде­
ленных из интактных почек. Отчетливые сдвиги, характерные для
сосочковой зоны, в корковой зоне не выражены. Более того, чув­
с твительность АТФазы к олиторизиду повышается, следователь­
но, при патологии облегчается доступ ингибитора к участку свя­
зывания с ферментом. Это однозначно свидетельствует о «раз­
_рыхлении» АТФазной системы при адреналэктомии.
При изучении кинетики активации ионами Na, К-А ТФазы по­
чек адреналэктомированных крыс выявлены значительные из ­
ме нения. Повышенные концентрации калия заметно угнетают
активность транспортного фермента корковой зоны. В сосочковой
зоне уменьшает,ся ·пик актиrва1ции, соответствующий 3 мМ ,кал1ия,
и исчезает 2 - й пик активации по калию (рис. 4). При низких
коннентрациях натрия общий уровень активации снижается во
всех зонах. Увеличивающиеся концентрации калия не ингиби­
руют активность Na, К - А ТФазы сосочковой зоны в отличие от
ферментативного препарата, выделенного из почек интактных
крыс. Все эти да. нные указывают на понижение чувствительности
транспортного фермента к низким концентрациям моновалент­
ных ионов.
Факты, полученные в экспериментах с адреналэктомией, еще
раз под11верждают лредположение о ,существовании в со,со,чковой
зоне двух типов Na, К-А ТФазных систем, различающихся по чу1;3-
ств ительности к ионам. Активация ионами Nc;!, К-АТФазы в раз­
ных зонах почки при удалении надпочечников происходит, по - ви­
димому, неодинаково. Это косвенно может указывать на измене­
ние соотношения транспортных систем при адреналэктомии.
Для выявления локализации действия гормонов на транспорт
ионов вдоль нефрона адреналэктомированным крысам в течение
5-6 дней после операции вводили различные дозы альдостерона,
дезоксикортикостерона (ДОКА) и гидрокортизона с последую­
щим определением активности Na, К-АТФазы и распределения
-ионов натрия и калия по зонам почки. После инъекции ДОКА
и альдостерона увеличивается активность транспортой АТФазы
в мозговой и сосочковой зонах, одновременно повышается внут­
риклеточная концентрация натрия; в корковой зоне существенных
сдви гов в активности фермента не наблюдается.
52

Инъекция гидрокортизона оказывает действие на активность
ферментов корковой и мозговой зон (рис. 5). Одновременно нор­
мализуется ионный состав клеток этих зон. Увеличение внутрикле­
точной концентрации натрия в корковой зоне при введении кор-
Фнj
f.O (-
0,5
f,O
!,О
0,5
f.0
0,5
!,О
0,5
1,0
0,5
А
Б
---- ---. .
20 40
во
20 40
в
4мММ/
б
в
fO
--.
... ___
20
~
;
ЗD
40
120
80
20 40 мМК
Р1:с. 4 . В лиян ие а д ренал,ктоыии на кwнепшу актива­
ции Na, К - А ТФазы корковой (А), мозговой ( Б) и
сосочковой (В) зон поч1<и иона~ш калия н а фоне раз-
' личных
концентраций натрин.
тикостероидов обусловлено повыше нием проницаемости апикаль­
ных мембран клеток проксимальных кан-альцев.
Адреналэктомия снижает уровень натрия в крови в резуль­
тате его экскреции с мочой . При этом экскреция калия падает ,
а его уровень в крови повышается. После введения ДОКА и аль-
/з

достерона адреналэктомированным крысам содержание нат,рия
в сыворотке крови и его экскреция нормализуются. Гидрокорти­
зон восстанавливает экскрецию калия, повышает уровень натрия
в сыворотке и несколько снижает его содержание в моче. Как
следует из приведенных данных, минералкортикоиды эффективно
восстанавливают натриевый баланс в организме, нарушенный ад­
ренаJJэктомией, и оказывают регуляторное действие на транспорт­
а
!,О
ав
as
0.4
D.2
tJ
8
ный фермент в дистаJ1ы-1ых , каналь­
цах и в сегментах нефрона, локали­
зованных в сосочковой зоАе.
Гидрокортизон, относящийся к
глюкокортикоидам, обладает менее
выраженным на т рийзадерживаю ­
щим эффектом по сравнению с ми­
нералкортикоидами, однако значи­
тельно влияет на активность АТФаз
корковой зоны и на калиевый ба­
ланс. Возможно, увеличение актив­
ности Na, К - А ТФазы корковой и
мозговой зон почки после введения
гидрокортизон а
адреналэктомиро ­
ва н н ым крысам связано с усилени­
ем биосинтетических процессов (Lu-
kгsc et a l. , 1967; Grant, 1969).
Таким _образом, как минерал­
кортикоиды, так и глюкокортикоиды
L-1_UlJ::.±=1..__L.l].l.!ALL--'-1....ш.2c...3cL...>4 влияют на работу натрий - калиевого
t2З4
f234
насоса в клетках нефрона. Эффект
Рис. 5. Влияние гормонов на ак ­
тивность Na. К-АТФазы (мкМФ 11 /
/ мr белка / мин) корковой (А) . моз­
говой ( Б) и сосочковой ( В) ЗОН
почки.
минералкортикоидов
проявляется
преимущественно на уровне дис­
тальных канальцев, толстого и тон ­
кого колен петли Генле и в собира­
тельных трубочках, а гидрокорти-
1 - контроль; 2-и.1р:11а .,эпош1н; 3- зон воздействует В основном на . от ­
адреналэюомнн+ ДО КА; 4 - адреналэкто-
мия+ги1tро1<о~т 11зон.
делы нефрона, локализованные В
корковой и мозговой зонах.
Нарушение натрий - задерживающей функции почек у адренал­
эктомированных крыс можно объяснить изменением свойств Na,
К - АТФазного комплекса в сосочковой зоне. Вместе с тем, как от ­
мечено выше, ·в ,сосочко1вой з,оне -изме.няет-ся ,соо тношение 2 транс­
портных систем переноса ионо,в. 1К1инет,ичес1vи:й ан;ализ ~по казывает,
что в результате адреналэктомии снижается чувствите л ьность
Na, К-АТФазы к ионам, поэтому в нисходящем и восходящем
коленах петли Генле и в собирательных трубочках низкие кон ­
центрации ионов натрия перестают реабсорбироваться и натрий
выводится из организма.
•
Для объяснения механизма действия кортикостероидов н а ак­
тивность Na, К-А ТФазы почек дополнительно было исс л едовано
54

вли яни ~ гор м онов iп vitro. В опытах с определением А ТФазной
активности м~мб ранной фракщш . по чек не было выявлено влш1-
ние Д О КА, введенного in vitro в широком диапазоне конце н тра­
ций ( 10-6
- 10-3 М). Гормон не действов_ ал таюке н а пр епараты
АТФ азы , выделенные из почек адреналэктомированных крыс . · Ин­
куба ци я ферментативного преш1рата Na, К-АТФ.азы из различ­
ных зон почки с друrими гор монами - альдостероном, гидрокрр­
ти зо1-ю м и питуитрином. - также не из м_еняла . активности Na, К ­
АТФ азы . Дл я выявления возможного участия системы цАМФ в
реали з ации гор.м:ональщ,1 х эффекто)З на транспорт ионов прецар а~
ты АТФазы од,нов,ремею-ю ,бьщи ин,кубиро)'!аНчI с •различ11;Iыми
конц ен тра циями гормонрв и цАj\1.Ф. В эт.i-~х УGЛовиях также не
было о бн.аружено стимулирующего дейст,вия на АТФазу. Таким
образ о м, активацию трав.спорта натрия нещ,зя объясни;rь щ~по­
средст.в е1щ:t11м, влиянием гормонов щ1, т,ранспрр:гную АТФ.азу.
Д в е цротивщюл,011рще no1н.!PXI-;Ior::ти Na, К-А.Т<I?.азьJ, , а _1-р,rзщ,ро11-
но в кJi юче1щой в мембрану, также ка.к и молеку:.11яр,ный механизr.~:
активного тра нспорта. ионоJЗ . в целоJ.:I, обладщот раз,11ич,ныl'4 ср9д­
ст•во м к натр ию и ,калию: увеличение содержания ,нат,])НЯ ,и ум,ень­
шение I<З Л)'I Я внутри . клетки активируют А1;ф.азу, а вне клет,к,и­
тор .мозя.т. ее актив};!рсть (Glynп, 1962; \У~Шаm, 196~; и др.) . .Мы
пред пол.Qщ:нли, что активация перенрса ио,нов 1;1ри действии ми­
нер аJiко рти коидов объясняется изменением внутриклеточной кон,­
центрацид иQнов в результате изме1:1ен ,ия пяоницаемости . q.Пи.каль­
ных мембран п.о,чечного эпитещш и r;~Qя.влею;я,. опт11мальны,.1~ ион­
ных у1.с.1цжий дл1я а1ктивац1ии транспQрТI-/•ОЙ АТФ.азы. Поэтому '6:Ь!JJO
предприн ято исследование внутрию;r ето,ч,ных, конден:г.раци.й 1--1щю~
нат р11я и, калия. в срезах почки в н.ррм,е u пр.и, д.е~ст~1-щ гoplVj p!jo~,-
П.p.и инкубации срезов поч1щ . в течение часа при 37°С в норме
и ПР.И LП.ейст·вии. ;гормона (ДОКА) оп1ределе1;IО, что мине,ралкорти­
коид вызы вает заметное увеличение к9нцент.рацщ1 ~ нутриЕ:л,еточ_­
ного н;атрия кор ковой зоны. Очевидно, в результате взаr~модейст.­
вия минералк.ортикоида с апикально.й мембраной по,чечн о~:о эшi­
те лия проис ходи т ув.еличение проница е мости для ионов, всл .едст­
вие чего. f!a этой мембране возрастают диффузио нные поток и по
градиентам концентраций. Именн.о эти м можно объяснить уве­
личен~е ко нцентр ации натрия и уменьшение калия в клетках ,
выстилающих п очечньJе кащ1льцы, расположенные в кор1щвой
зоне.
Представленна я сх ема гормональной регуляции активного
транспорт1: н атрия удовлетворительно объясняет механизм стиму­
ляции реабсорбции натрия минералкортикоидами в эпителии по ­
ч ечных канальце в даже при одинако вом характере дей ствия этих
гормо,н;о~ на обе (апикальную и базальную ) мембраны клеток
по чечной ткани. В отличие от клеток диста льно го отдела, свобод ­
ная поверхность эпителиальных клеток пр оксимального участка,
обращенная в про свет канальца, покрыта щеточной каемкi;>й, сос­
тоящей из ми кроворсинок, благодаря которым на апикальной по -
55

верхности общая площадь в несколько десятков раз превышает
площадь базальной мембраны клеток. В силу разницы площадей
увеличение внутр:иклеточной концентрации натрия почти пол ­
ностью происходит за счет притока натрия из просвета прокси ­
мального канальца через апикальную мембрану.
Указанные изменения внутриклеточных концентраций ионов
натрия и калия создают условия для стимуляции транспо рт ной
АТФазы, локализованной в базальных мембранах . Это вызывает
активацию переноса натрия из клетки в окружающую среду про­
тив градиента концентрации. Описанная схема гормональной ре ­
гуляции объясняет один из механизмов активации реабсорбции
натрия минералкортикоидами в почечной ткани.
В основе активного трансцеллюлярного переноса ионов через
клетки мочевого пузыря, кожи, слизистой кишечника и других
эпителиальных тканей лягушки, также как и механизма Na, К­
н асоса вообще между клеткой и средой, лежит транспортная АТФ­
аза, активируемая ионами натрия и калия и угнетаемая сердеч ­
ными гликозидами. Поэтому описанная выше схема гормональной
регуляции транспорта ионов п рименима и для других активно
секретирующих эпителиальных тканей, в частности, для кожи и
слизистой кишечника лягушки (Ташмухамедов, Далимо в а, Бек­
муха метова, 1969; Ташмухамедов, Бекмухаметова, Ниязметова,
1970, 1971; и др.).
Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод,
что минералкортикоиды оказывают свое действие на транспорт
ионов двумя различными путями. Один из путей регуляции на ­
чинается взаимодействием минералкортикоидов с апик а льной
мембраной эпителиальных клеток проксимальных канальцев и за ­
вершается стимуляцией анизотропной АТФазы, локализ ова нной
на базальной мембране. Другой путь регуляции связан со стиму ­
ляцией биосинтетических процессов в клетках, вследств ие кото­
рой увеличивается синтез ферментов, в частности Na, К - А ТФазы,
участвующей в активном транспорте ионов. На это указывают
значительный латентный период, необходимый для проявления
эффектов минералкортикоидов, действие многих ингибиторов био­
синтеза белка и нуклеиновых кислот на транспортные процессы
(Edelman et а!., 1972-1974; и др.) и представленные нами: дан­
ные об отсутствии эффектов гормонов in vitro на активност ь Na,
К-АТФ азы.
ЛИТЕРАТУРА-
Б е к м ух а мет о в а 3. У. 1975. Гор ~iональная регуляция транспорта ио н ов.
Ташкент.
Крестинская Т. В., Манусова Н. Б. 1973. Проблемы эндокринологии,
19, 94.
Нат очи н Ю. В. 1969. «:Журн. эвол. биох. и физиол.», 5, No 2, 241.
Нат очи н Ю. В . 1976. Ион -ре гулирующая функция почки. Л.
Ташмухамедов Б. А., Далимова Д. С., Бекмухаметова 3. У.
1969. «Биофизика», 14, No 6, 1032 .
56

Туракулов Я. Х., Бекмухаметова 3. У., Ниязметова Н.
· 197!.
ДАН УзССР, вып. 5, 48.
Швец В. И., Глебов Р . Н . , Толстикова Г. В . 1974. ДАН СССР, 217 ,.
No 3, 733.
В о n t i n g S. L. 1970. Membrane and Ion transport, 1, 257.
ВurgМ.В.,GrапthаmJ.J. 1971. Membrane and Ion transport, 3,49.
ВurgМ.В.,Оr1оffJ.1970.Am. J.Physiol., 219,No6,1714.
Сhignе11С.F., Тitus Е. О.1966.J.Bicl.Chem., 241,5083.
Dаh1J. L., Ноkiп L.Е. 1974, Ann. Rev. Biochem., 43, 327.
Ebel Н . , De Santo N. G ., Hierholzer К:. 1971. Pfliigers Arch ., 324, 1.
GаrrаhаnР.J., G 1уnnI.М. 1967.J. Physiol., 192,217.
G1у nn I. М. 1962. J. Physiol., 160, 18Р.
Grа nt J. К. 1969. EssaysBiochem., 5, 1.
Jаmро1L.М.,ЕрstеinF.Н.1970.Am. J.Physiol., 218, 607.
JоrgеnsеnР. L. 1972. J. Steroid.Biochem., 3, 181.
КаtzА.I., ЕрstеinF.Н.1967.J.С1in. Invest., 46,1999.
КаwаdоJ., Та у1оr R. Е., Ваrkеr S. В. 1969. Comp. Bioschem. Physiol.,
30, 965.
Кеss1еrЕ. et al.1964.Am. J. Physiol., 207,No1, 109.
LаndоnЕ.J., JаzаЬN., FоrtеL.1966.Am. J.Physiol., 211,No4,1050.
·Lukасs I., SеkeirisС.Е. 1967. Biochim. Biophys. Acta, 134,85.
МаriаniТ.,Ма1vinR.L. 1965. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 119,881.
NесhауВ.R.etа!.1971.Fed.Proc., 30,332А.
Рhi1iрроtJ., ·тhuеtМ.,ТhuеtР. 1972.Comp.Biochem. Physiol., 41В,231.
Р i t t s R. F. 1964. Physiology of the Юdney and Body fluids. N . У.
SсhmidtU., DuЬасhU.С.1969.Europ.J.Physiol., 306,219.
Sсhwаrtz А., Lindеnшауеr G. Е., А11еn J. С. 1975. Pharmacol. Rev.,
27, 3.
S k о u J. С. 1957. Biochim. Biophys. Acta, 23, 392.
S k о u J. С. 1962. Biocl1im. Biophys . Acta, 58, 314.
Тау1оrR.Е.,КаwаdоJ., В аrkеrS.В.1967.Fed.Proc., 26,No2,659.
ТоrrеttiJ. 1972.Am. J. Physiol., 222,No 6, 1398.
Whittаm R. 1962. Biochem..J., 84, 160.
WhittеmЬurуJ. 1960.J.Gen. Physiol., 48,No5,43.
WhittеmЬurуJ., ProverbloF. 1970.PfliigersArch., 316, 1.
Zаugg W. S., МсZаin L. R. 1971. Comp. Biochem. Physiol., 38В, 501.
М. В. ЗАМАРАЕВА, А. И. ГАГЕЛЬГАНС, Б. А. ТАШМУХАМЕДОВ
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПЕРЕНОСА Са2 +
ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСl(ОГО
РЕТИКУЛУМА
Саркоплазматический ретикулум (СР) - слож: ная система
цистерн и трубочек, выполняющая роль регулятора концентрации
ионов Са 2+ в мышечном волокне. СР принимает участие в сок­
ращении мышечного волокна, · высвобождая ионы Са 2+ под дейст­
вием электрического сигнала. Реаккумуляция ионов Са 2+, вызы­
вающая расслаблеi-ше мышцы, происходит против электрохими­
ческого градиента за счет работы С а -АТФазы, утилизирующей
энергию АТФ (Бендолл, 1970). В настоящее время этот процесс
интенсивно изучается. При исследовании транспорта Са 2+ через
мембраны СР предст а вляет интерес установить роль белок-липид­
ных взаимодействий, влияние состояния липидной м атрицы на
57

транспортные функции СР , а та;<:же возможные физиологичес кие
пути регуляции как поглощения Са 2+ в_ СР, так и его высвобожде­
ния в среду. По-видимому, регуляция транспорта Са 2+ возможн а
-двумя путями. Первый путь - изменение сопряженности тр анс ­
порта Са2+ и гидролиза АТФ за счет увеличения или уменьше­
ния проницаемости мембран; второй путь - ингибирование или
активация АТФазной активности.
Система транспорта Са 2+ в СР чувствительна к изменению
конце:~трации АТФ, ионов Са 2+, Mg2+, Na+, К+, к разобщающему
-действию жирных кислот и т. д. Обсуждается рол4 ИJV!идазолсо­
держащих дипептидов анзерина и карнозина, присутствующ их в
высоких концентрациях только в скелетных мышцах (I?итов,
1977). В литературе рассматривается родь цик,пичес1юй АМФ
(дАМФ) в регуляции тр.анспорта cai+ в сердечной мышце (Tada
•et al ., 1974), а также роль белко~щх активаторов Са - АТФазы,
Qбнаруженных в гемqли.зате эритроцитов и супернатанте r;омоге­
.ната скелетной мышцы, так называемых «калмодущшов» (I?hilip-
son, B.aщ11garJner, 1979). Предложенные механизмы вы0роса Са 2+
вследствие уве_личения прониццемости ме!\fбран С.Р под дей.ствием
высоких концент,раций ш1ру:жного с_а 2+ (Ka.tz et а1., 1977}, обра -
••
зова.н ия тидро:фильногq .каш~ла ,в ·'результ 4.т,е а.гре,гации -молекул
А:ТФазы (JШ<а, Martonosi, . 1977) и -оозд,ания к,рапшв.ремеююго
диффузионного потенциала. (Kasai, Miyaщqto, 1973) по ка не вы ­
д ерживают критики. Таким образом, очевидно, что поиск регуля ­
торш,1:х; си.стем, упра:Вляющих. •движентте_м_ С<! 2+ ч_ерез мембрану
СР, а также изучение транспорта Са 2+ в СР при различных функ­
циональных состоянш1х организма является актуальной проб ­
.лемой .
РОЛЬ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ
ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАН САJ:>КОПЛАЗМАТИЧЕСl{ОГО
РЕТИКУЛУМА И РЕКОНСТРУКЦИЯ Са-НАСОСА
Известно, что саркоплазмап1чес1<:_ий ретикулум обладает низ­
кой проницаемостью для ионов Са 2+ в покоящейся мышце. Меха ­
низм резкого увеличенття прони цаемости СР в процессе высвобож­
дени я Са 2+ до настоящего времени неиэвестен. В последние годы
в литературе появляется инфо рмация о ролтт белков и липидОI!
в регуляции Са - проницаемости. С~юрость выхода Са2+ из липосом,
приготовленных из общих фосфолипидов СР, составляет 1- 10-16
-
1• Ю- 18 моль/см 2/с (Vand erko oi. Martonosi, 1971; Martoпosi et а1.,
, 1974). Эта скорость на несколько порядков меньше скорости пас­
•си вной утечки Са 2+ в СР in vitro, которая лежит в области
1. 10-12
-
1- 1О- 13 моль/см 2/с (DeBoJand et а!., 1975).
Встраивание очищенной Са - АТФазы в липосомы, приготовлен­
ные из фосфолипидов СР, увеличивает пассивную проницаемость
до величины, сравнимой с пронттцаемостью СР in v,itro (Jilka et а1.,
1975, 1977). Следует отметить, что при этом увеличивается про-
58

ницаемооь для Na+, холина, so; - ,с 1 -, а,цетата, ,саха,розы. Таким
о бразом , встраивание Са-АТФазы нарушает пJJотну ю упаковку
бислоя, создавая неспецифические гидрофиJJьные поры И JJИ зоны
утеч ки в местах контакта беJJка и JJипида . Интересным фактом,
явJJя.ется увеличение пассивной проницаемости СР при функцио­
н ировании Са-А ТФазы по мере накопления ионов Са2+. Этот воп ­
р ос подробно рассмотрен в работе Ритова ( 1977 б), где обсуж ­
д ается явление обратного переноса Са 2+ и (или) ос лабление бе­
Jl ОК - JJип идных взаимодействий на одной из стадий гидродиза
АТФ.
П ро ницаемость мембран СР, нагруженного Са 2+ ка к в при­
с утствии. АТФ, так и простой диффузией, также очень низка. При
.с оздании градиента концентраций Са 2+ на_ мембране СР хед. ати­
р ованием наружного Са 2+ ЭГТА высвобождение внутреннего Са 2+
п роисходит с незначитеJJьной скоростью. В этом cJJyч.ae проницае­
м ость зависит от концентрации Са 2+ внутри и снаружи • везикул
и от присутствия АТФ и Mg2+. Изменение константы скорости для
в ыхода Са 2+ и обмена происходит приблизитеJJьно в пределах
од.нога . порядка (\\.'еЬег, 1971 а, Beirao et а ! ., 1976).
Таким образом, ,созда,ние концентра1Ц,ионного ,rрадиента на
м ембране СР не увеJJичивает существенно ее проющаемости . С
другой. стороны , добавJJение АДФ, ортофосфата и Mg2+ к нагру­
женным везикулам резко. увеJJичивает выход Са2+, сопровождаю­
щийся образованием АТФ. Это показывает, что потенциальная
энергия трансмембранного градиента Са 2+ может быть исполь­
зована для фосфорилирования АДФ (Barlogie et а!.., 1971; Maki.-
nose, Hasselbach, 1971; Masuda, de Meis, 1974; Vale et aJ., 19:76').
А налогичные результаты получ.ены Rackeг и на реко н струирован-­
н ы.х. пр(щ,аратах СР (К:nowles, Racker, 1975). Высокая с!{орость
с интеза АТФ свидетельствует о том, что значительное количество
Са 2+, высвобождаемого из СР, в этих условиях проходит через
Са - насос (Panet, Selinger, 1972). ФосфориJJированне Са-АТФазы
л роисходит и в случае активного транспорта, и в случае в ыхода
Са 2+ в этих условиях (Makinose, 1972; Yamamoto, Tonomura, 1-967;
·Yamada, Tonomura, 1973; de Meis, Carvalho, 1976} .
Достаточный экспериментальный материал, обобщенный в об ­
з оре Hasselbach ( 1978), свидетеJJьствует, что высвобожде ние Са2*
в эт и х условиях .связано с обращением Са-насоса . Однако число
о боротов фермента в процессе аккумуляции ( 100 г 1 ) н амного
бо льше, чем при обратном процессе (3 г 1 ) при той же степени
с опряжения Са/АТФ (Hasselbach, 1974). Мало вероятно, чтобы
такой механизм вычща Са 2+ играл физиологическую роль в соп­
р яжении возбуждения и сокращения, так как скорость выхода
слишком мaJJa, чтобы обеспечить достаточное коJJичество Са2+
в миопJJазме в течение короткоrо времени электро механическоrо
сопряжения (Hassclbach, 1974).
М етод реко нструкции транспортной функци и протеолипосом,
лриго товJJен ных из липидов и очищенной Са -АТФазы, позволил
59

сделать вывод, что основным, а возможно и единственным к ом­
понентом Са-насоса СР является Са-АТФаза. Низкая величин а
тра нс портного отношения Са 2+/АТФ в реконструированны х вези­
кулах, получ енных как без детергентов, так и с их использова ­
нием, характ еризующая эффективность работы Са - насоса, не ис­
ключает существования какого-либо сопрягающего фактора, рол ь
которого в опытах Racker была отведена протеолипиду (Racker ,
Еуtап, 1975).
В работе Комарова ( 1978) предложен метод реконс трукции
трансп,о,ртны х свойств мем6р ано,связа,нной Са -АТФ азы, -пр актиче,ж и
лишенной протеолипида и других белковых загрязнений, с ис поль­
/}/!/АТФ
zo
1.0
зованием длинноцепочечны :Х угле­
водородов . Полученные пр отео ли ­
посомы были способны активно на­
капливать Са 2+. Таким образ'ом, бы­
ла подтверждена роль Са -АТ Фазы
как единственного белкового ко мпо­
нента Са - насоса. Сопрягающ ая роль
'----'-------::3----;5:с,д"'м;;;;;со.% у г леводорода объяснялась увеличе­
нием об ъ ема углеводородно й фазы.
Высокая проницаемость ме Мбр 3но­
связанных препаратов Са -АТФаз ы ,
по-видимому, действительно обу с­
ловлена дефицитом гидрофобного
окружения, а не увею-iчеi-ше м под ­
вижности бислоя и ослаблением бе­
лок-липидных связей. На это·, в
частности,
указывают о пы ты с
применением диметилсульфоксид а
(ДМСО), способного сопрягать
«разобщенный» ретнкулум (ри с. 1) .
ДJ\llCO, однако, не был эфф ективе н
Рис. 1. Влияние ДМСО на 1:ели­
чииу Са/ АТФ саркопл а зматичес ­
кого ретикvлума. СР выделяли
по методу Рит ова (l\J77a) . Тран -
спорт Са2+ и Са-АТФазную ак­
тивность опnеделяли
методом
рli-метрии. · С реда инкуба1tии:
2,5 м.ТV\ имидазол. р Н 7,U, 100 мМ
I<CI,4мМ MgCl2. 2 мМ АТФ,
5 мМ !( 2 С_О,. Объе~, пробы
4 мл. П робы содержали 200-
- 300
мкг белка СР. Реакцrно
начинали добавлением 200 нМолей
СаС12.
п ри попытке заменить им длинно­
цепочечный углеводород в процессе реконструкции . Его эф ф ект н а
·р азоб щ енном ретикулуме, вероятно, обусловлен уменьшением те­
кучести мембр аны , так как ранее было показано, что он увеличи-
• вает температуру фазового перехода липидов мультислой н ых ве­
зикул (Uman et а!. , 1976).
Маловероятно, что эффект ДМСО связан с сорбцией или экс­
тракцией жирных кислот, которые, как известно, нак ап лива ютс я
в препаратах СР при длительном хранении, и это на коп лен ие
коррелирует со снижением величины Са/АТФ (DraЬikowski, 1969) .
Добавление ол еиновой кислоты к препаратам СР вызывает не­
большое увелич ение скорости выхода Са 2+ из везикул , но резк о
снижает величин у Са/АТФ (Козлов и др. , 1973). При взаимодей­
ствии Са - АТФаз ы с АТФ увеличивается подвижнос ть жирнокис­
лотных цепей фосфолипидов, поэтому, возможно, внедрение олеи­
новой кислоты в зону гидрофобных контактов между белком и
липидам спос обствует образованию дополнительных м ест утечки
.Са 2+ (Ритов, 19 776).
60

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО
РЕТИКУЛУМА И НЕКОТОРЫЕ ГИПОТЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ -
ВЫСВОБОЖДЕНИЯ са2+
Суммарная фракция СР гетерогенна по морфологическим ха­
р актер истикам и, по-видимому, функциональным свойствам. Ме ­
тодом дифференциального центрифугирования в градиенте плот­
ности сахарозы были получены 2 фракции СР - «легкая» и «тя­
желая». «Легкая» фракция характеризуется высоким содержа­
нием Са-АТФазы, отсутствием электронноплотного материала,
« тяж елая » фракция - наличием электронноплотного материала
и меньшим содержанием Са-АТФазы (Meissner, 1975).
Эл ектронная микрофотография среза мышцы показала нали­
ч ие электронноплотного материала только в терминальных цис­
т ер нах. Это явилось основой предположения, что пузырьки, им е19 -
щие . электронноплотный материал, представленный, по-видимому,
кальсеквес трином и белком с молекулярным весом 55 тыс., обра­
зованы терминальными цистернами, в то время как «легкая»
фракция образована из продолговатых трубочек ретикулума
(Mei ss пer, 1975). Методом авторадиографии установлено , что в
со стоя ни и покоя весь Са 2+ находится в терминальных цистернах
и что во время расслабления мышцы поглощение Са2+ идет через
продолговатые трубочки, из которых Са 2+ диффундирует затем
в терминаль ны е цистерны (Winegrad, 197-0). Имеется также и
биохимическая гетерогенность СР по чувствительности к кофеину.
Так как ранее было показано, что кофеин инициирует мышечное
со кра ще ние одиночных и демембранированных волокон (Gebert,
1968; L йttgan, Oetliker, 1968; Endo, Blinks, 1973; Huddart, Syson,
1975 ), то естественно было предположить, что его действие на­
nрав.лено на высвобождение Са 2+ из терминальных цистерн, пред­
ста·вленных «11яжелой» фраюцией С1Р (Ogawa, 1970 ; Thorpe, 1973;
Huddart, Williams, 1974).
Изуче ние эффекта кофеина на высвобождение Са 2+ из тяже­
л ой _фракции СР, по мнению Алексеевой, Ритова ( 1979), может
с пособ ст вовать выяснению механизма выброса Са 2+ в процессе
в озбу жде ния. Авторы на высокоочищенной «тяжелой» фракции
СР пока зали, что кратковременная обработка трипсином и 5,5 -
д ити об'ис нитробензоатом (ДТНБ) полностью снимает эф'фект
коф еина . Эти данные подтверждают взаимодействие кофеина с
б ел ковым и структурами, которое ранее было показано методом
ЯМР (Konya et а!., 1976).
Реконструк ция транспортной функции у ме мбран ного препа ­
р ат а ко феинчувствиtельной Са-АТФазы с сохранением эффекта
кофеина предполагает, что этой белковой единицей является сам.а
Са-АТФаза. Различное электрофоретическое поведение Са-АТФ­
азы и з «л егкой» и «тяжелой» фракции СР при электрофорезе в
дигитони не предполагает существование 2 изоформ фермента и
подтвержда ет биохимическую гетерогенность СР (Алексеева , Ри.-
61

т ов , 19 79 ) . Гипотеза о ~существовании ,опецифического ,бе лuюв о г о
р егуля тор а , р асположенного на мембране Т-систем ы и о бла даю­
щего кофеин-подобным действием при взаимодействии с терми­
наль н ыми цистернами в процессе возбуждения, интересна , одн ако
низкая в ел ичи на «разобщающего» эффекта кофеина вряд ли мо­
жет ,обе,сп еч ить требуемую кон,центра,цию Са 2+ ,в с ар,копла зм е з а
коро т кое вр е м я электромеханического сопряжения.
Из С Р был выд елен гликопротеи д с молекулярным в есо н
30 тыс. , к о то ры й , по м нению авторов, расп ;:JJ10жен в зонах ко нтак­
та между ме мбраной СР и Т-системой (Ikeшoto et а\.., 1976 ) , од­
нако его физиологическая роль в настоящее время неизвестн а .
Нел ьзя исключ ить и существование других неидентифицирован­
ных до сих пор регуляторов, расположенных в зонах контаrпа.
Предста вляется возможным существова ни е какого-либо синергиз ­
ма или до полнительного регуляторного механиз м а со с тор он ы
Са2+ . И меется определенная аналогия между кофеин-инд уц ируе­
мым и С а 2+ -индуцируемым высвобождением Са 2+ из СР . (I пesi ,
A'laiaп, 1976 ) . Ф е номен пысвобождения Са 2+, индуцируемого внеш­
ни м С а 2+, изучен на демембранированных мышечны х фиб р и л лах ,
а такж е ,на п,репа·ратах СР, предварительно на1груженных Са 2+
(Fo~d , P odols ky , 1975 а , 'Ь; Епс\о, 1975; Iпesi, Ma\an, 1976; K atz et
а ! . , 19 77; Duппett, Nayler, 1978).
Ув ел ичение градиента концентраций Са 2+ на мемб.ра не СР
в 3 ты с. раз приводило к 1000 - кратному повышению пр они цае­
мос т и по Са 2+ (Katz et al., 1976, 1977). Однако скорость выс во­
б ож дения Са 2+ на 1 порядок ниже значения, вычисленно го для
с кор ости выхода Са 2+ в нативной мышце (Katz et а!. , 1976). Кон­
,ц еJ!т рация ·:внешне.го Са 2+ •(0,5 l\'DM), 1необход,имая длл индукции:
в ы хода Са 2+ из СР, на 2 порядка выше концентрации, ,необходи­
мой дл я ра з вития сокращения, поэтому вряд ли такой механизм
им еет фи зиологическое значение (Епdо, 1975). Нельзя исключить
су щ ествование такого механизма в случае СР сердечной мышцы
или -при каких-либо друtих обстоятельствах, например в· присут­
ствии ,кофеина (Iпes i , Malan, 1976). Аналогия между кофе1Ин - инду­
цир у емым и . Са - индуцируемым высвобождением Са заключается
в f0;\1, что в обоих -случа,ях ,вьк:вобождеюrе Са 2+ уси,тшвает,ся
понижением уровня ·мg2+ и увеличивается при повышении кон­
ц ентрации Са2+. Кроме того, оба агента (Са 2+ и кофеин) усили­
в ают э·ффекты друг друга и оба э'ффекта ингибируются прокаи ­
ном . Очевид·но, что в 1физио.tюгических условиях · кофеин облег­
ч ает Са 2+-индуцируемое высвобождение Са 2+, которое в резуль ­
тате такого tинергизма может происходить д·аже nри низ.ких кон­
центрациях Са 2 + •(1lпesi, Ma'lan, •1'°976').
' Связывание и высв6божд:е'йие ионов Са 2+ в СР, регулируемое
и зменением рН, изучено Nakamary et а!. у1972). Процесс высво­
"бождения · Са2+ •был показан как функция изменения рН. Резкое
и з м енение 'рН от '6,46 до 7;8 вызывает выброс из СР аккумулиро­
ванного Са2+. Уменьшение рН с 7,56 до 6,46 приводит к связы-
62

ванию Са2+. Эксперименты по прецнпитэ:ции актомиозина показали,,
что СР ингибирует этот процесс при рН 6,5 и не предотвращает еrо­
прп рН 7,3. Считается, что ингибирующее влияние СР на преци­
питацию актомиозина обусловлено аккумуляцией Са2+ в СР. В.
более поздних работах на клетках сердца, лишенных сарколеммы,
показано, что влияние рН реализуется путем изменения чувстви­
тельности миофибрилл к Са2+, а не выбросом Са2+ из сердечного
ретикулум а (FaЬiato, FaЬi ato, 1976, 1979).
рН-зависимое изменение сродства к ионам Са2+ было проде-­
монстрировэно и для парвальбуминов (ПА), содержание кото­
рых в скелетных мышцах достигает 1 мМ (Бурштейн и др., 1977).
Измерение изометрического напряжения rлицеринизированных
мышечных волокон в присутствйи ПА показало возможность регу­
лирования сокращения - расслабления изменением рН (Бурха­
нов и др., 1978). Предполагается, что ПА могут играть роль рН­
реrулируемого депо Са2+. Однако остается неясным, могут ли та-­
кие изменения рН происходить в саркоплазме и какие биохими­
сrеские механизмы вовлечены в этот процесс сдвига рН.
Кратковременная экспозиция СР при рН 5,5 - 6,0 вызывает
инактивацию аккумуляции Са2+ без потери АТФазной активности
и увеличения пассивной проницаемости (Berшann et а!., 1977).
Предполагается, что инактивация транспорта Са2+ в области рН
5,5-6,0 вызвана разобщением конфор мационно го сопр яжения
между каталитической и ионофорной частflми ·и что такой меха­
низм может происходить при снижении рН до критического уров­
ня во время тканевой аноксии или при других состояниях, в ре-­
зультате которы х происходит н ео бы ч а й но быстрый гл икогено ли ~:
(Betшann et а!., 1977).
Введение Са2+-нагруж:енных везикул СР, уравновешенных с·
к алий м етансульфонатом, в изоосмоти ч ес кий раствор KCl выз ы ­
вает бьrсtрое высвобождение ионов Са 2+ (Kasai, Miyaшoto, 1973;
Miyamoto et а!., 1979). Аr-rалогичные эффекты наблюдались прк
и сследовании ра з вития напряжен и я мышцы на демембранизиро ­
ванньrх волокна,х скел~тной -мышцы и механически разрушенных
·клетках сердца · (Nakaj ima, Endo, 197'3; Kerrick et а!., 1974 ) .
Pat-1ьiue это т эффект приписывали внугреннему отриц а тель н ом у
м ембра н ному потенциалу, генерируемdМу быстрым входом С J ­
в ве,зr,rкул ы GP, в более поздних ра· ботах - осмотическим явл е -­
нйям (Meissn er, McIOn ley, 1976; Beeler, Matt onosi, 1979) . При
по·мощи •потенщиалчувс11вите:льной юраски (м ероцианинок:сазо ­
лон) показано, что изменения ·в ·абсорбции красителя одинаково ,
индуцир,уiотся диффу'зионным потоком ' Cl-1 внутрь ·в·ез икул при
замене ·п р о п ионата ' Калия н·а -хлористый · калriй, увеличением ·кон­
центрации на р ужного · са 2+ или добавлением ·кофеина на демем­
бранир ованных волокнах сердечной и скелетной мышц (FaЬiato ,.
FaЬiato, 1977) . В работе Russell et а! . ' т·аюке было · показано, что.
ийт'ерпрет ация р ·езультатов, полученных , с · помощью флуоресцент­
·нЫх ·зондов, чувствительных -к пьтенциалу, несколько з атруднена ,
63,

так как некоторые эффекты, полученные на нативных мембранах
СР !В ~присутствии л:и,гандо~ (Са 2+, АТФ ,и др.), наблюдаются и ва
солюбилизированном дезоксихолеатом натрия препарате СР (Rus-
sell et а!., 1979 а, Ь). Эти эффекты, очевидно, обусловлены неспе­
цифическим взаимодействием флуоресцентных потенциалзависи ­
м ых зондов с поверхностным потенциалом мембран СР или с мем­
браносвязанным Са 2+. В целом механизмы генерации потенциала,
регистрируемого на мембране везикул СР в различных условиях,
его природа и роль в регуляции цикла вход-выход Са2+ в нас­
тоящее время недостаточно ясны и требуюr дальнейших иссле ­
дований.
Поиск регуляторных механизмов проницаемости биологических
мембран представляет интерес для понимания общего принцю1 а
функционирования биологических мембран, а также возможности
их изменения при различных патологических состояниях.
В литературе высказывалось предположение, что уровень окис­
.ленности и восстановленности НАДН может регулировать про­
ницаемость биологических мембран. Azzone et al. ( 1966) опреде­
лили, что аминазин, действующий в митохондриях и микросомах
.на уровне флавиновых ферментов, эффективно тормозит аккуму­
J1яцию Са 2+ в СР. Производные аминазина, а таже 2,6 -дихлорфе­
нолиндофенол (ДХФИФ), проявляющий электронно - акцепторное
действие, и.Н1гибируют Mg, 1Са - АТФазу эритроцитов (Wins, Schof-
feniels, 1968) и снижают АТФ-зависимый выход Са 2+ из «теней»
эритроцитов (Ташмухамедов и др., 1969). Ингибирование акку ­
муляции Са2+ в СР ДХФИФ снимается добавлением НАДН (Az-
zone et al., 1966). Окисление эндогенного НАДН специфическими
ферментными системами митохондрий приводит к увеличен и ю
выхода Са 2+, а восстановление НАДН - к его реаккумуляции
(Lehninger et al., 1978) . Преинкубация микросом мозга с НАДН
вызывает ингибирование Na, К - АТФазы (Кометиани, Шамкулаш­
вили, 1969). Авторы предположили, что присутствие НАДН сдви­
гает окислительно - восстановительную це п ь, существование кото­
рой в микросомах предполагалось ранее, в сторону восстановлен­
ности, и это приводит к изменению сродства фермента к ионам ­
активаторам. Таким образом, высказывается мысль об универ ­
~альной регуляции проницаемости биологических мембран редокс ­
состоянием пиридиннуклеотидов, которая может происходить. при
различных функциональных состояниях клетки. Изучение эффекта
аминазина и ДХФИФ на транспорт са·2+ в СР методом рН-метрии
позволяет разграничить влияние этих агентов на активность тран - _
спортного фермента и проницаемость мембран, а также проана­
лизировать эти эффекты в связи с .наличием флавопротеида в
мембранах СР. ДХФИФ в концентрации 7,5 - 10-4 М увеличивает
проницаемость мембран СР для Са2+, снижает величину Са/АТФ
(рис. 2, цифры у кривых), характеризующую эффективность Са­
насоса, и не влияет на активность Са - АТФазы. НАДН в концен­
трации 5- 10-3 М снимает этот эффект. Эти данные хорошо сог-

ласуются с результатами, полученными ранее Azzone, а также с
наличием флавопротеида (ФП) в мембране СР, которое было
продем онстрировано по способности СР восстанавливать ДХФИФ
за счет добавленного извне НАДН (рис. 3) .
В случае аминазина, известного в литературе не только в ка­
честве лок ального анестетика и антиоксиданта, но и ингибитора
ФП , умен ьшаются Са -АТФазная активность и величина Са2+/АТФ
в ф ра гме нтах СР (рис. 4). Следует отметить, что аминазин в тех
же концентра,циях иН1гибlирует актив н ость ,солюбил,изиро,ванной,
о чищен но й Са-А ТФазы, не способной восстанавливать ДХФИФ
(рис. 4). Очевидно, двойной эффект аминазина на функции СР
~,яfo 6
.~
;:т -ион н'
IMUH
/.15
Со
Со
8~
1
Г~It,52
15/Со
о/
Со
\
1
\___
,.,,,
Рис. 2.' В лияние ДХФИФ и
НАД/-/ н а аккумуляцию Са 2 + саркопла з мати­
ческим ретикулумом. Услошн1 экспе р имента те же, что указаны к рис . 1.
Uифры у крнв ых-величинз. Са / АТФ .
А-I<он.троль, Б-ДХФИФ 7,5-10 - 4 М, В-НАД!-! 5.10-З М, Г-НАДН 5-!о-3 М, ДХФИФ
7,5 -10-4 м.
к ак дополнительный пример его множественного действия м ожно
объя снить изменением проницаемости СР за счет регулирующего
эфф екта на уровне ФП, в то время как ингибирование Са-АТФ­
азной активности связано с его непосредственным взаимодейст­
вием с ферментом за счет связывания с отрицательными группа­
ми Са -АТ Фазы или ее микроокружения.
Отдель ные психотропные агенты, к которым относится и ами­
назин , действуют на целый ряд ферментов, функциональна я ак­
тивн ость которых регулируется белковыми регуляторами - «кал­
модулина ми» (фосфодиэстераза, миозиновая АТФаза, Са - АТФ­
аза ), и не влияют на такие ферменты как Mg-AТФаза и протеин­
кин аза (Kobayashi et al., 1979). Предполагается, что аген т, взаи­
модействуя с м одуля;горным белком, ингибирует активность Са­
АТФ азы и мешает образованию бело к -белкового комплекса меж­
ду ферме нтом и Са-модуляторным комплексом. 50% ингибиро ­
ва ние Са -АТФазы СР достигается при концентрации ам инази на
8,5• 10- 5 М (рис. 4). Эта величина находится в области концентра­
ци й псих отропных агентов, вызывающи х 50 % ингибирование ак-
5-156
65

тивации калмодулинами Са-АТФазы эритроцитов (Kobayasl1i et
а!., 1979). В настоящее время такой белок-активатор обнару,кен
в суnернатанте го~юrената скелетной м ышцы (Phi]ipsoп, Baum-·
gагtпег, 1979) , поэтому можно предположить, что действие ами­
назина опосредовано скорее через эндогенный белковый актшза-
!IАдН
!00
2.0
•
~
~
•
,. __
i'З
............
\;?
......
«;
~,
1:).
..................
~
~
...... контроль
"3
i
... ...
"'
§.
..... .
•;:,
~
~
... ...
~
!50
!, Ое,
~
""
i
к.
::,
""
:,.
;§
НАдН
~
~ :::,
,;;
1
1
~
-~
•
'1:3
~~
С>:)
~
~
§
<f'.
l/0
S·IO-s
з -,о-4
/(Of!f/l]Hmpol/Ufl оминозию. М/Л
Рис. 3. Восстановление ДХ ФИФ НАДН в присутствии саркоплазматическоrо
ретикулума (/) и из ·Jл11рованн,Jй Са- АТФазы (2). Среда И!il{убации 2,5мМ ими­
дазол, 4 мМ MgCl2
,
5 мМ К2С204, дХФИФ-3-1u- 4 М, рН 7,0; 230 мкг белка
СР и л и Са-АТФазы. Реакцию 1, о сстановления ДХФИ Ф начинали вв ед ение м
НАДН 5.10 - 4 М. l{инепщу изменения оптическо:1 плотн о сти ДХФ ИФ
ре1·истрировали на фотометре ЛМФ-69 при длИliе волны-630 нм.
Рис. 4. Действие амина з 1ша на транспортное отн о шение Са / АТФ, А ТФ а зную
акти в ность изолированно й Са-.-\ Т Фа з ы и сарк о плаз1-1атическоrо ретикулума
(кри в ые соответствеши сниз у вверх) . Условия экс11еримента те же, ч то ука-
заны к рис. 1.
тор Са-АТФазы, чем на уровне флавопротеидов, наличие кото рых
в мембране СР продемонстрировано косвенными метод ами (A zzo-
ne et а!., 1966) (рис . 3).
Са-АТФаза И ПРОБЛЕМА КАЛЬЦИЕВОГО «КАНАЛА"
В МЕМБРАНЕ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА
Экстракция мембран СР ЭДТА (Meissner, 1975) или низки-
ми концентрациями детергента приводит к тому, что все белки,
за искJiючением белка с м. в. 100 тыс., переходят в растворимую
форму (Ритов, 1977 в). На этом основании его м ожно рас с мат •
ривать как интеграJiьный белок. Опыты по . контроJiируемому
триптическому перевариванию Са-АТФазы в мембранах СР т акже
позволяют предположить, что часть белка проникает в гидр о фоб­
ную обJiасть мембран, оставаясь недоступной для трипси н а (Mi -
gala et а! . , 1973; Louis et al., 1974; Thor l ey-Lawsoп, Green, 1975 ;
МасLеппап, 1977).
Реконструкция транспортной функци_и у препаратов очи щен­
ной Са-АТФазы при слиянии с липидами свидетельствует, что Са-
66

АТФ аза и м еет как ги д ролитический, так и ионофоретический
участок, прошивающий толщу мембраны и обеспечи ваю щий пере­
.нос Са 2+ на другую ~сторону •мем,браны. В,страиван.ие неактивной ,
сук цинилированной, делипидированной Са - АТФазы, а также ее
тр иптических фрагментов в черную плос1<ую мембрану вызывает
резк ое увеличение проводимости бислоев с относительным рядо м
селек ти,внюсти: Ва++> , Ca++> Sr++>, Mg++>, Mn++> , K+,Cs+, Li+,
RЬ+ (Shaшoo, MacLenпan, 1974) . Ингибирование пр овод и мости п о
Са 2+, индуцированное препаратом сукцинилированной Са-АТФазы,
ио нами La3+, Hg2+ и rрутен·иевым к1расным 1в тех же 1к онц е н11раци,ях,
ч то и ингнбироIЗанне транспорта Са 2+ в СР (рис. 5), позволяет
А
: .. ,: 'J.,,
., ,:-;
101
t0
7
~
'
'
107
,о:,
КонцентμоцШI :ta ,м/л
107
в
/0-7 10-&
fO-S
конщнтrю1,1J,? рутение­
впго КООСН030, 1,1/Л
Рис. 5. Действие La3+ (А) и рутениевого J(расного (Б)- на кальциевую про ­
в одимость БФМ, нндуцироuанную су1щинилированной Са - А ТФазой . Моди­
фицированную Са - АТФазу полу ча ли методом Sliainoo, МасLеппап (1974) -
llроводимо сть БФ ,\\, П ,Jлуче 1ты х из р аствора фосфол и пидов, Быделенных из
белого вещества мозга и погруженных в раствор 5 мМ трис-НСI рН 7,0 i1
30 мМ СаС1 2 в присутствии 0,6 мкг сукцннилированно11 Са - А ТФазы, оценива­
л и по падению напряжения . регистрируемого электрометром ОР-205 (Вен-
грнн).
предположить, что данная ионофорная активность наблюдается и
при аккумуляuии Са 2 + в СР (Shaшoo, M2cLennan, 1975; Shamoo
et al., 19 75; Tas!1 111L1kh amedov et а ! ., 1975). Более весомые доказа­
тельства в пользу такого пред п оложения в настоящее время отсутст-·
вуют. Неясным остается вопрос о молек улярном механизме индук­
ции проводимости по Са 2+. Встраивание Са-А ТФазного, липопро­
теидного комплекса в плоскую фосфолипидную мембрану сопря ­
ж ено с некоторыми трудностями. Однако водорастворимая сук­
цини л ированная Са -АТФаза, а также ее водорастворимые трипти ­
ческие фрагменты легко встраиваются в толщу гидрофобного би ­
слоя мембраны, создавая проводимость .
Встраивание активной Са-АТФазы в липосомы увеличивает их
пассивную проницаемость. В противоположность активному транс­
порту Са 2+ и Са - АТФазной активности, такая пассивная прони­
цаемость нечувствительна к изменению жирнокислотното соста­
в а липосом. Предполагается образование каналов в результате
об ратимой ассоциации нескольких АТФазных молекул в цилинд­
ри ческие олигомеры, «пронизывающие» мембраны и создающие
6.7

гидрофильную область - пору (Jilka, Martonosi, 1977). АТФазные
олигомеры стабилизированы белок - белковым взаимодействием, и
если они составляют структурную основу Са-канала, то стано­
вится понятной нечувствительность л.роницаемо·сти к изменению
жирнокислотного состава.
Возможность существования Са-АТФазы в виде 2 форм - оли­
гомерной и мономерной - и процесса агрегации
-
дезагрегации
молекул АТФазы может иметь физиологическое значение в регу­
ляции сродства фермента к субстрату, числа его «оборотов» или
и м еть отношение к высвобождению ионов Са 2+ из цистерн СР
в результате образования гидрофильных каналов. Основой для
предположения о возможности существования Са - АТФазы в оли ­
гомерной форме послужили работы по образованию полимерных
форм iCa -A ТФазы в ·присутст,в.ии бифункщ1иональных «,сшивающих»
,реа1генто·в (Murphy, 1976; Louis et а!., 1977; Cl1yn, Martonosi, 1977),
.а также электронномикроскопические данные замораживания-­
скалы1вани,я мем,бран СР (Маlап et а!., 1975; Jilka et al., 1975, Sca-
Jes, Inesi, 1976).
Расчет количества полипептидных цепей на единицу площади
мембран СР показал, что это значение превышает • плотность
о
:S5 А-частиц на поверхности скола мембраны (Malan et а!., 1975).
Плотность поверхностных частиц в 4,0 нм, выявляемых при нега ­
тивном контрастировании, в 3-4 раза больше внутримембранных
ча,с11и,ц, ,обнаруживаемых на 1повер ХJности ,скола (Jilka et а!., 1975;
Scales, Ines, 1976). Основываясь на этом, авторы предполага ют,
что гидрофобные части молекулы Са-АТФазы объединяются в
тетрамеры, образуя частицы в 9,0 нм в то время как гидрофиль­
щ,1е концы (4,0 нм-'Частицы) распола,гаются на на·ружной поверх­
ности мембраны отдельно друг от друга. Исследование седимен­
тации Са-АТФазы в неионном детергенте Твин - 80 показало, что
наименьшей активной формой солюбилизированного фермента
Са - АТФазы является олигомер с м. в. 400 тыс. (Le Maire et а!.,
1976). Методом изоэлектрической фокусировки Са-А ТФаза была
разделена на 4 субъединицы с изоэлектрической точкой в области
рН от 6 до 5. Индивидуальные пептиды имели м . в. 100 тыс . (Ma-
detra, Madeira, 1977).
•
Использование различных бифункциональных реагентов, «сши ­
вающих» молекулы бедков на определенном расстоянии, и изме ­
рение при этом транспортных свойств СР, казалось бы, могло
представить прямые доказательства возможности существования
Са-канала. Однако плотность Са-АТФазных молекул в мембране
СР столь высока, что образование полимерных форм, обнаруж:ен­
ное некоторыми авторами (Murphy, 1976; Louis et а!., 1977; Chyh,
Martonosi, 1977), может ·быть ,овязано и со случай,ным столкнове­
нием молекул белка в результате теплового движения в плоскости
мембраны. С другой стороны, • применение агентов для химиче­
ской «сшивки» приводит к неспецифической модификации Са­
АТФазы в результате образования полимерной сетки в случае

использовани,я глута.ральде,ги1да (Cl1yn, Martonosi, 1977), требует
в ысоких значений рН при использовании имидатов (Louis et al .•
1977), а также не исключает модификацию липидного окружения
фермента при использовании фенантролина меди (Murphy, 1976).
Перечисленные выше моменты, несомненно, затрудняют объек­
тивную оценку функциональной роли образованных олигомеров и
нативного характера этих образований. Понижение температуры
до 4°С, приводящее к замедлению латеральной диффузии белко­
вых молекул, выявляет образование в присутствии фенантролина
меди только димеров даже при длительной экспозиции, в то вре­
мя как при 22° происходит образование вначале димеров, а затем
тримеров, тетрамеров и олигомеров (Baskin, Stephen, 1979). При
- 10° степень «сшивки» значительно меньше, и количество обра­
зованного олигомера ·тем меньше, чем больше его размеры. Авто­
ры полагают, что образование олигомеров определяется не четвер­
тичной структурой Са-АТФазы, а случайным столкновением мо­
лекул фермента (Hebdon et а ! , 1979). Вместе с тем, понижение
температуры, в свою очередь, уменьшает проницаемость мембран,
что может быть объяснено не только изменением физического сос ­
тояния липидов, но и ,невозможностью ,образования ,ол.игомер.ных
каналов в том случае, если этот процесс является обратимым.
Изучение переноса энергии между двумя популяциями АТФ­
азных мoлerкyill, меченых донором (N -шода1цетил-N - (5 - сульфо - 1-
нафтил) - этилендиамин) и акцептором (йодацетамидофлуоресцин)
энергии в реконструированных везикулах, показало, что увеличе ­
ние липидной фазы, вызывающее снижение концентрации белко­
вых молекул на единицу площади мембраны и таким образом
уменьшающее вероятность столкновений в результате диффузии
молекул в плоскости мембраны, не приводит к уменьшению ин ­
тенсивности переноса (Vaпde r kooi et а ! ., 1977). Эти данные гово ­
рят в пользу существования олигомерных комплексов Са - АТФ­
азы. Более бы строе образование олигомеров при старении пре­
паратов СР (Сl1уп, Martoпosi, 1977), имеющих более высокую
проницаемость, а также возможность полимеризации белков при
появлении диальдегидов в результате индукции перекисного окис­
ления липидов (ПОЛ) в мембранах СР, имеющих также высокую
проницаемость (Каган и др., 1977), находится в определенном
соответствии с представлением, что агрегация молекул АТФазы
может быть связана с образованием гидрофильных каналов для
Са2+.
РОЛЬ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
И ЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН
В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА Са2+
Увеличение проницаемости мембран СР при индукции пе­
рекисного окисления липидов (ПОЛ) рассматривается также с
точки зрения создания «перекисных кластеров» липидов. Переки­
си липидов являются более полярными соединениями, чем неокис-
69

JJенные липиды. В процессе латеральной диффузии может проис­
ходить объединение фосфолипидов, содержащих НОО--группи­
ровки, в гидрофильные каналы, проницаемые для и онов Са 2+
(Каган и др., 1977). Ингибирование АТФазной активности при
ПОЛ может быть связано с полимеризацией молекул АТФазы,
а также с уменьшением содержания неокисленных полиеновых
жирных кисJ10т (К:аган и др., 1977) или с появлением продуктов
окисленной деструкции липидов мембран, так как промывка мик­
росом раствором альбумина восстанавливает АТФазную актив-
1-юсть (Player, Н u ltini, 1978).
В более поздних работах показано, что введение экзогенной
гидроперекиси JJинолевой кислоты не влияет ни на какие парамет­
ры транспорта Са 2+ вследствие низкого уровня включения ее во
фрагменты СР, в то время как гидроперекись фосфотидилэтано­
ламина (ГПФЭА) оказывает слабое активирующее действие на
активность Са -АТФазы и увеличивает проницаемость вези ~<ул
только при работе фермента (К:аган и др., 1979). Предполагается,
что в этом случае функционирование насоса обеспечивает высо­
кую скорость обмена экзогенно введенной ГПФЭА между моно­
слоями мембран СР и способствует образованию «перекисных ка­
налоВ>>. Вместе с тем, при индукции ПОЛ как in vi t ro, так и iп
vivo (ишемия, Е - авитаминоз) эндогенная ГПФЭА образуется в
обоих монослоях; выс,окая 1пр -оницаемость СР в данном случае,
по-видимому, связана с образованием гидроперекисями фосфоли­
пидов «перекисных каналов» (Каган и др., 1979).
Регуляция проницаемости мембран, а также фушщионат,н ой
активности мембранных ферментов часто осуществляется на уров­
не липидов. У гибернирующих животных при переходе в состоя ­
ние спячки повышается уровень _ ненасыщенных жирных кислот
в мембране, что позволяет поддерживать «текучее» состояние
мембраны, обеспечивающее ее нормальное функционирование при
низких температурах тела (Hulbert, 1978). С другой стороны, до­
вольно часто при различных миопатиях изменение проницаемости
мембран СР и активности ферментов бывает связано с изменения­
ми в липидной матрице. Изменение белок-липидного взанмодейст-
. вия,
коррелирующее с изменением функции мембран при различ ­
ных патологических состояниях, представляет собой новую модель
для изучения этих взаимодействий в мембране, недоступную при
изучении in vitro. Так , установлено, что увеличение содержания
холестерина в 1v1ембране СР при выраженном атеросклер озе вы­
зывает изменение физико - химических свойств мембраны и пони ­
жение способности СР аккумулировать Са 2+ (Стойда, Болдырев,
1978). У мышей с наследственной дистрофией увеличение коли­
чества фосфатидилэтаноламина и сфингомиелина наряду с резким
-снижением уровня фосфатидилхолина в мембране СР сопровож­
дается изменением ацетилхолинэстеразной активности (Северина
и др., 1974) . При Е-авитаминозной мышечной дистрофии нару­
шается механизм активного транспорта Са 2+ и увеличивается про-
70

.111щ а е м ость СР (Курс1шй и др., 1978). Изменение жирнокнслотно-
1'0 со ста ва в сторону ненасыщенноспi при эксперименталь н ой уре­
м 1-11-1 при водит к увеличению проницаемости мембран СР (Heim-
b c г g et а!., 1976). Увеличение илй уменьшение активности Са­
А ТФа зы СР скелетной (Fanbuгg, 1968; Asl1 et а!., 1972) и сердеч-
11ой ~1 ышцы (Sнko, 1973; Lirnas, 1978), наблюдаемое соответствен­
но пр и пониженном или повышенном уровне тиреоидных гор­
монов в организме, может
быть обусловлено влиянием Тcio'1r:
их на уровне биосинтеза
белков, липидов и струк­
турной организации мем­
бран в целом.
Достоверно определено,
что активация кальциевого
насоса при гипертиреоидиз­
ме сопровождается увели­
чением количества Са -АТФ­
азы
и предотвращается
введением актиномицина D,
цикJюгексимида и пуроми-
цина. Незначительное уве­
.тичение пассивной прони­
цаемости мембран для Са 2+
объясняется увеличением
фосфолипидного содержа­
ния, а также насыщенных
жирных кислот (Limas,
18
2
15
19
. J.2
з.з
З,4
JS
Рис . 6. Зависимость времени корреляции
гидрсфобного зонда, внедренного в СР,
выделе н ного нз белых мышц нормальных
(]) и тиреотоксикозных (2) животных . от
температуры. С п иртовый раствор гидро­
фо~ного зонда вводили в суспензию СР.
::)П!-'-с п ектры сн и мали на приборе Varian-4.
1978). Введение животным боль ш их доз тиреоидных гормо­
нов приводит к резкому нарушению Са -транспортирующей функ­
ции СР, проявляющемуся в ингибировании Са -АТФазы в сред­
нем на 30%, а также в снижении величины Са 2+/АТФ, которая
составляет 75± 14% от контроля. Так называемая «базальная»,
или Mg-AТФаза при этом изменяется незначительно. Эти эффекты
могут быть обусловлены непосредственно «мембранным» воздей­
ствием тиреоидных гормонов, так как ранее в опытах in vitro
было показано, что в присутствии высоких концентраций тиреоид­
ных гормонов (50-100 мкМ) наблюдается уменьшение скорости
транспорта Са2+ вследствие ингибирования Са-АТФазы (Зама­
раева и др., 1979). Вместе с тем, они могут быть результатом на­
рушения белок-липидных взаимодействий, модификацией липпд­
ного и жирнокислотного состава и др.
В настоящее 1врем,я в литерату,ре обсуждается ретулирующая
роль тиреоидных гормонов в воздействии на клеточные мембра­
ны посредством увеличения уровня ненасыщенности жирных кис­
.пот и вследствие этого модификации мембранной функции (Hoch,
1977; Hulbert, 1978) . Исследование температуры фазового пере­
хода мембран СР с помощью парамагнитных гидрофобных зон-
71

дов показало, что в случае препаратов, выделенных из м ышц нор ­
мальных животных, фазовый переход наблюдается при 20°С , од­
нако при тиреотоксикозе перегиб на графиках Аррениуса сме­
ща ется на 4°С в область низких температур (рис . 6). Т аки м об­
разом, тиреотоксикоз вызывает увеличенную подвижно сть, и ли
«текучесть», липидного бислоя, которая определяется ка к физ ико­
химическим состоянием липид н ого каркаса, так и бел ок -л ип ид­
ны м и взаимодействиями.
Результаты изучения жирнокислотного состава мем бран СР '
из тиреотоксических животных показали сниже н ие уров ня не на ­
сыщенности жирных кислот мембранных липидов за счет у мен ь­
шен и я олеиновой (на 21,8%) и арахидоновой (на 40,5%) кисл от
на фоне увеличения содержания пальмитиновой кислоты в 1,4
раза. Эти данные позволяют объяснить факт ингибиро в а н и я Са­
АТФазы, работа которой зависит от жесткости ее мик роокруже­
ния (Warreп et al ., 1974). Снижение величины Са 2+/АТФ при ти­
реото ксикозе может быть обусловлено увеличением прони цае­
мости мембран СР для Са 2+, например, за счет увелич ения об­
щего содержания липидов, холестерина или ослабл'ени я бел о к ­
липидных связей, в результате чего происходит «рецикл изация»
процесса аккумуляции Са2+ и наблюдается кажущееся уменьше­
ние эффективности работы Са-насоса. С другой стороны, уме нr,­
шени е величины Са 2+/АТФ может происходить и в результ а те
разобщения транспорта Са 2+ и гидролиза АТФ, например , при де ­
натурационных изменениях в ферменте .
С ПЕЦИАЛЬНЫЕ БЕЛКОВЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ
КАЛЬЦИЕВОГО НАСОСА САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО
РЕТИКУЛУМА
:Как отмечалось выше, один из путей регуля ц ии тр ан спорта
Са2+ в СР - специфическое ингибирование, ил и активаци я Са­
АТФазной активности . Для ретикулума сердечной мышцы уста ­
новлено, что транспор т Са 2+ увеличивается п ри фосфорил ир ова ­
нии белка с м. в . 22 тыс. (фосфоламбан) в присутствии цикл иче­
ского аденозинмонофосфата (цАМФ) и цАМФ~зависимой пр отеин ­
киназы (Tada et а! ., 1974). Schwartz et al. (1976) уст ановили
цАМФ - зависимое фосфорилирование мембран сердечного р етику ­
лума, опосредованное киназой фосфорилазы и увел ичивающ ее ак ­
кумушщию ·кальци,я . 1По - ви.дим,ому, такой механизм регуля~ци,и
транспорта Са2+ является специфичным для сердечной мыш цы .
В настоящее время в литературе обсуждаетс я существова ние
низко м олекулярных белков (или белка), выделенных и з мозга
(Kobayashi , Field, 1978) , iс е м енников (Dedman et а !. , 1977), сердц а
(Ав донин, Ткачу к, 1978), эрrпроцитов (Jarrett, Penniston, 1978),
скелетны х м ышц (Philipson, Ba umgartner , 1979) и регул ирующи х
активность целого ряда ферментов в присутствии ионов к аль­
ция: фосфодиэстера з ы циклических нуклеотидов, аденилатцикла-
72

зы, Са, Mg-AТФазы. Их регулирующее действие осуществляется
только на таких ферментных системах, активность которых зависит
от присутствия ионов Са 2+, и таким образом белки-модуляторы
обладают определенной специфичностью, не проявляя своего дей­
ствия на Mg-AТФазу , Na, К - АТФ азу, протеинкиназу (Gopinath ,
Vincenzi, 1977; J arrett, Penniston, 1978; К.obayashi et al., 1979).
Активация ферментов происходит при образовании комплекса
между ферментом и белком-активатором в присутствии Са 2+. В
присутствии активатора фосфодиэстеразы из мозга и активатора
из гемолизата эритроцитов резко меняется зависимость Са , Mg-
AТФазы теней эритроцитов от концентрации ионов Са2+ (Gopi-
nath, Vincenzi, 1977), обеспечивая наличие только Са-связываю­
щих участков с высоким сродством (Кдис. = 4,3 · 1О-6 М), в то вре­
мя как при отсутствии активаторов имеются участки как с высо­
ким (К.дис. =1,8,1О -6 М), так и с низким (К.дис.1=1,7-1О-5 М) срод­
ством к Са 2+. Наличие участков с высоким сродством в нативных
мембранах авторы объясняют присутствием эндогенного актива­
тора (Gopinath, Vincenzi, 1977). Отделение активатора аденилат­
циклазы сердца от фермента также лишает ее чувствительности
к Са 2+ (Ав д онин, Ткачук, 1978).
Интересным фактом является и возможность перекрестной ак­
тивации, Таи:, определено, что Са, Mg-A ТФаза эритроцитов может
активироваться модулятором из гемолизата эритроцитов, семен­
ников крыс (Kobayashi et а!., 1979), фосфдиэстеразным актива­
тором из мозга, троnонином С, парвальбумином (Gopinath, Vin-
cenzi, 1977), а также белком, выделенным из супернатанта гомо­
гената скелетной мышцы (Philipson, Baumgartner, 1979). В свою
очередь, Са - А ТФа~а скелетной мышцы активируется модулятором
из гемолиза та эритроцитов (Philipson, Baumgartner, 1979). Фос­
Фодиэстеразный активатор активирует аденилатциклазу (Gopinath,
Vincenzi, 1977), в то время как активатор из гемолизата эритро­
цитов стимулирует фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов
(Jarrett, Penniston, 1977). Модуляторные белки из мозга и семен­
ников могут отчасти заменить тропонин С в регуляции актомио­
зиновой АТФазы (J arrett, Pennist on, 1978).
Известная универсальность белков-активаторов, а также близ­
кие физико - химические свойства многих из этих белков (модуля­
тор из мозга, семенников, активатор из гемолизата эритроцитов),
такие как одинаковые спектры поглощения, изоэ лектрические
точки, молекулярный вес, близкий аминокислотный состав, вклю­
чая присутствие редкой аминокислоты триметиллизина, позво ­
ляют предполагать, что они являются функциональными эквива­
лентами (Jarrett, Penniston, 1978). Вместе с тем, в гемолизате
эритроцитов свиньи наряду с активатором найден также т ерм а­
лабильный ингибитор Са-АТФазы, подавляющий также актив­
ность фосфодиэстеразы и аденилатциклазы (Au , 1978) . Таким об­
разом, предполагается существование регуляторов: активаторов и
ингибиторов целого ряда ферментов, однако остаются неясными
73

nусковые механизмы такой регуляции. Наличие м одуля тора в ске­
.летной мышце предполагает, что есл и активатор является Са - свя­
зыва ющим белком, то увеличение уровня Са2+ в миоплазме в
процеосе сокращениrя .перевсщит -его в а,кти1вное состояние, в ре­
зульта те проя вля ется его стимулирующий эффект на Са - АТФа ."V
СР (PhiJipson, Ba ttm gartner, 1979).
ЛИТЕРАТУРА
АвдонинП.Б.,Т1сачук В.А.1978,ДАНСССР,238,726-729.
Алексеева О .М . , Рит о в В . Б. 1979. Биохим ия, 44, 1582-1593.
Бен долл Дж . 1970 . Мышцы, молекулы и движение. М.
Буршт.ейнЭ.А.,БурхановС.А.,ПермяковЕ.А.1977.«Биофизика»,
_
22, 946-948.
Бу р ха но в С. А и др. 1978. Биофизика , 23, 734-735.
Гольбер Л . М., Кандрор В. И. 1972 . Тиреотоксическое сердце. М.
3амараеваМ.В., ГагельгаисА.И.,ТашмухамедовБ.А. 1979.
«Воп. мед химии», No 1, 78-82.
К а га н В. Е. и др. 1977. Биофизика, 22, 625-630 .
I< а r ан В. Е. и др. 1979. «Б.юлл. эксп. биол. и мед.», 87, 145-149.
J<озловЮ.П.,РитовВ.Б.,К:аrанВ.Е.1973.ДАНСССР ,212, 1239-
1242.
1< ом ар о в П. Г. 1978. Роль гидрофобных белок-липидных взаимодействий в
регуляции транспорта ионов Са 2+ через мембрану саркоплазматического
ретикулума . Автор.еф. канд. дисс. М.
,Кометиани 3. П . , Шамкулашвили Г. Т. 1969. «Биофизика», 14,
846-851.
К урс кий М. Д. и др. 1978. «Укр. биохим. журн . », 50, 85-90 .
Рит о в В. Б . 1977а. Молекулярная организация и механизм функционирования
Са - зависцмой АТФазы саркоплазматическоrо ретукулума. «Итоги науки
и техники» , Биологическая хим ия, т . 11. М . , 5-77 .
Рит о в В. Б. 19776. Биохимия человека и животных, No 1, 53-83.
Рито в В. Б. и др. 1977в. ДАН СССР, 233, 730- 733.
СеверинаВ.А.,ХайтииаС.3., Добрынин а О. В. 1974. «Вопр. •мед.
хим.», ХХ, 309-313.
СтойдаЛ.В.,БолдыревА.А.1978.«Бюлл.эксп.биол.имед.»,86, 32-35.
Ташмухамедов Б. А., Мирсалихова Н.М., 3амараева М. В.
1969. Материалы симпозиума «Биофизнка мембран», 14-21 июня. Па­
ланга, 262-263.
АshА.S.F., В еsсhН.В.,НаrigаvаS.,
Zаimis Е. 1972. J. Physiol.,
224, 1-19.
А в К S., 1978, Int. J . Biochem. 2, 477-480.
АzzоnеG. F., АzziА.,RоssiС.,МiliсG. 1966. Biochem., 5,322-328.
ВаrlоgiеВ.,Н,рsеlЬасhW.,
Маkinоsе М. 1971. FEBS Le'tt., 12,
267-268.
Ваskin R. J ., StерhеnН. 1979. Biochim. Biophys. acta, 576, 61-70.
·ВееlеrТ., МаrtоnоsiА.1979,FEBSLett., 98,173-176.
Веirао Р., DеМеis L. 1976. Biochim. Biophys. acta, 433, 520-530.
ВеrmаnМ.С.,МсIntоshD. В., Кеnс!1J.F. 1977. J. Biol. Chem., 252,
994-1000.
СhуnТ., МаrtоnоsiА. 1977. Biochim. Biophys. acta, 468, 114-126.
DеВоlапdА.R., JilkаR., М аrtоnоsiА.1975.J.Biol.Chem. 250,7501-
7510.
DеdmаnJ.R., РоttеrJ.D., МеаnsА.R.1977.J.Biol.Chem.252,2437-
2440 .
DrаЬiko,vski W., S аrzаIаМ.G., GrуnЬIаtА.G. 1969. Procccding of
the Symp. оп Biol. Membranes : «B iochemistry of intrac ellular structures:
mitochondria an d endop lasmic reticulвm», Warsaw, December 10-11, 1968.
74

DunnеttJ., Nау1ег\V. 1978.J.Mol. and Се!!.Cardiol., 10,487-498.
ЕпdоМ.,ВlinksJ.R
.1973. Natuгe New Biol., 246, 218-221 .
Е п d о М. 1975. Ргос. Jap. Acad., 51 , 467-472.
•
FаЬiаtоА.,FаЬiаtоF.1976.Biopl1ys.J., 16,72.
FаЬiаtоА.,FаЬiаtоF.1977.J.Gen. Physiol., 70,А6.
FаЬiаtоА., FаЬiаtоF. 1979.АпnRev.Phys., 41,473-484.
Fа nЬ u rg В. J. 1968. J. Clin. Invest., 47, 2499-2505.
FогdL. Е.,Рос!оlskуР.J. 1972а.J. Physiol., 223,21-33.
FогdL.Е.,Роdо1skуR.J.1972Ь.J.Physiol., 223,1- 19.
G е Ь е г t G. 1968. Аmег. J. Physiol., 215, 296-298.
Gорinаth R.М., VinсеnziF.F. 1977. Biocl1em. Biophys. Res. Comm., 77,
1203-1209.
На s s е 1 Ь а с h \V. 1978. Biocl1im. Biophys. acta, 515, 23-53 .
На s s е 1Ь а с h W. 1974. 26. Int. Congr. Physiol. Sci. 10, New De lhi, 182-183.
НеЬdоnМ., C'uпninghаm L., Grееп N. 1979. Biochem. J., 179, 135-139.
НеimЬеrgК.\V. et al. 1976, Eur. J . .Biochem., 61, 207- 213.
Но с h F., 1977. Arch. Bi 0c l1 em. Biophys ., 178, 535-545.
Н LI 1Ь еr t А. J. 1978. J. Theor. Biol., 73, 81-100.
Нuс!dаrt Н., Wi11iаmsА. J. 1974.J. Сотр. Physiol., В94, 331-338.
НuddаrtН.,SуsonА.1975.J.Ехр.Biol., 63, 131-142.
IkеmоtоN., СuссhiаrоJ., G а гсiаА.М. 1976. J. Cell. Biol.70,290а.
IпеsiG., М аlапN.1976. LifeSciences, 18,773-780.
Jаггеtt Н.W., РеnnistоnJ.Т.1977. Biochem. Biophys. Res. Comm., 77,
1210-1216.
Jаrrеtt Н.\V., Реп п istоп J.Т.1978.J. Biol.Chem., 253,4676-4682.
Ji lk a R., Maгtonosi А., Tillack Т. 197 5. J. Biol. Chem., 250, 7511-7524.
JiIkа R., М а rtопоsi А. 1977. Biochim. Biophys. acta~466, 57-67.
КаsаiМ.,МiуаmоtоН.1973.FEBSLett., 34,299-301.
К: а t z А. М. et al. 1976. FEBS Lett., 67, 207-208.
К а t z А. М . et а!. 1977. «Myocard ial Failшe», Berlin еа, 72-79.
КеггiсkW., GlееnL., В еstPh.1974.Science, 183,435-437.
К.nоw1еsА. F., RасkеrЕ. 1975.J. Biol.Cl1em., 250, 1949-1951.
J<:оЬауа shi R., Fiе1d J. В. 1978. Biochim. Biophys. acta, 539, 411-419.
КоЬауаshi R., Та\Vаtа М.;Нidаkа Н. 1979. • Biochem. Biophys. l<es. •
Comm. , 88, 1037-1045.
К6nуа L., КбvеrJ.!., Szi1аguiL. 1976.Stud. Biophys., 56, 39-40.
Lе11пingеrА. L., VегсеsiА., ВаЬаЬuпmiЕ.А. 1978. Proc. Nat. Acad.
Sci. 79, 1690 - 1694.
L i m а s С. J. 1978. Аmег. J. Physiol., 235. I-1745 - H752.
Lоt1isС. F., Вuоnаffinа R., ВinksВ., 1974.Arch. Biocr1em. Biophys., 161,
83- 92.
LоuisС.F., S а'uпdеrssМ.J., Но1rоуdJ.А.1977 Biochim. Biophys. acta,
'193, 78-92.
Li.ittgаt1 Н. С., Оеt1ikеrН.1968.J.Physiol., 194,50-74.
Lyщa n G . Н., Papah_adjopo ul os D.,
Preis l er Н. D. 1976. Biochim .
Biophy s . acta, 448, 460-473.
МасLеnnаnD.Н.1977.J.Gen. Physiol., 70,А22.
МаdеirаV.М.С.,МаdеirаМ.С.Experientia, 33,188-190.
LеМаirеМ.,Мо11еrJ. V., ТаnfоrdС. 1976. Biochemistry, 15,2336-2342.
N\а1аnN. J., SаЬЬаdiniR., Sса1еsD., IпеsiG.1975. FEBS Lett., 60,
122-125.
Makinose М . , Hasselbach W. 1971. PEBS Lett., 12, 271-272.
МаkinоsеМ. 1972.FEBS Lett., 25, 113-115.
-1\1аrtоnоsiА.,Ji1kа R., Тоrtiеr F. 1974. In: «MembraneproteinsTransp.
and Phosphoryl», Amst erdam, с . а., 11 3-124 .
Маst1dа Н., FеМеis L. 1974. Biocr,im. Biophys. acta, 332, 313- 315.
DeMeis L ., Carvalho М. G. С . 1976 . J . Biol. Chem., 251, 1413-1417.
М е i s s n е r G. 1975. Biochim. Biophys. acta, 389, 51-68.
МеissnеrG., Мс Кin1еу D. 1976.J. Membran. Biol., 30, 79-98.
75

МigаIа А., Аgоstini В., НаssеIЬасhW. 1973. Z. Naturforsch., 28с,
178-182 .
Miyamoto Н . , К:ometani Т. К:asai М. 1979. «Сейбуuу буuури» N 1, 1-10.
М u r р h у А. J. 1976 . Biochem. Biophys. Res. Comm., 70, 160-166 .
NаkаjimаУ.,ЕndоМ. 1973.Nature New Biol., 246,216-218.
NakаmаrуУ.,SсhwаrtzА.1972.J.Gen. Physiol., 59,22-32.
О g а w а У., 1970. J. Biochem., 67, 667-683.
Раnеt R., S еIingеr Z. 1972. Biocl1im. Biophys. acta, 255, 34-42.
РhiIiрsоn К:. О., Ваumgаrtnеr F. 1979. Biochim. Biophys. a!ta, 567,
523-528 .
РIауеrТ.J., НuItiniН.О.1978.Biochc:m. J ., 174, 17-22.
RасkегЕ.,ЕуtаnЕ.,1975.J.Biol.Chem., 250,7533-7534.
Rusе11J., ВееIегТ.,МаrtоnоsiА. 1979а.J.Biol.Chem., 254,2040-2046.
Rusе11J., ВееIеrТ.,МаrtоnоsiА. 1979Ь.J. Biol.Cl1em., 254,2047-2052.
SсаIеsО.,IпеsiG.1976.BiophysJ., 16,735-751.
S с h \V а г t z А. et al. 1976. Biochim. Biophys. acta, 426. 57-72.
•
ShаmооА.Е.МасLеnпаnD. Н. 1974. Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 71,3522-
3526.
ShаmооА.Е.,МасLеnпапО.Н. 1975. J.Memb. Biol., 25,65-74.
S h а m о о А. Е. et al. 1975. J. Biol. Chem., 250, 8289-8291.
S и k о J. 1973. J. Physiol., 228, 563-582.
Tada М . et al. 1974. J . Biol. Chem., 249, 6174-6180 .
Таshmиkhаmеdо,, В. А. et а!. 1975. A!)str., V Iпter. Biophys. Congr. Co-
pe11l1agen, Deпmark. 174.
Тhоr1еy-LаwsоnО.А.,GгееnN.М. 1975.Eur. J. Biocl1em., 59, 193-200.
Тhо r ре W. R. 1973. Сап. J. Physiol. and Pi1aгm., 51, 499-502.
V а Iе М. G. Р. et al. 1976. Biochem J., 156, 239-244.
VаndегkооiJ. М., Магtоnоsi А. 1971. Arch. Biochim. Biophys.,
147 ,
632-646 .
VапdеrkооiJ. М. et al. 1977. Biocl1emistry,16, 1262-1267.
WаггеnG.В. et al.1974.J.Biochemistry.,
13, 5501--5507.
W е Ь е r А . 1971Ь . J. Gerier. Physiol., 57, 64-70.
W е Ь е r А. 1971а. J. Gen. Physiol., 57, 50-63.
,vinеg rаd. 1970. J. Gen. Physiol., 55, 77-80.
WinsР.,SсhоffепiеIsF. 1968.LifeScience, 7, 673-681.
УаmаdаS., Тоnоmurа У., 1973.J.Biochem., 74,1091-1096.
УаmаmоtоТ.,Тоnоmurа У. 1967.J.Biochem., 62,558-575.
Т . Ф. ЮРАСОВА, 3. У. БЕl(МУХАМЕТОВА, Э. ТАШПУЛАТОВ
СВОЙСТВА ТРАНСПОРТНОЙ Na, К-АТФазы ПОЧЕК
РАЗЛИЧНЫХ ЖИВОТНЫХ
i
Наличие ионного гомеостаза - одно из наиболее важных
условий существования живого организма при взаимодействии с
внешней средой. Реализация ионного гомеостаза как на уровне
- отдельных
клеток, так и на уровне целого организма происходит
при участии ионных насосов. Nа-насос является молекулярной
машиной, превращающей химическую энергию в электроосмоти­
ческую работу. Активный противоградиентный транспорт ионов
натрия и калия через плазматические мембраны осуществляется
натриевым насосом за счет сопряжения ионообменных процессов
с ферментативным гидролизом АТФ. Na, к~АТФаза - фермент,
которому в настоящее время придают ведущее значение в транс­
мембранном переносе натрия.
76

В по следнее время появились обзоры, в которых достаточно
полно из ложены свойства натриевого насоса (Бекмухаметова,
1975; Ли шко, 1977; Болдырев, Твердислов, 1978; Веренинов, 1978).
Свойства Мg-зависимой, Na, К-активируемой АТФазы во многом
совпадаю т со свойствами системы активного транспорта натрия:
обе систем ы локализованы в мембране, ингибируются сердечными
глiшозид ами, обладают сходным сродством к ионам-а ктиваторам
(причем ионы натрия активируют изнутри клетки, а ионы калия­
с на ружи ), требуют присутствия макроэрга АТФ и т . д.
Впервые АТФаза, активируемая ионами натрия и калия, была
выделена Skou в 1957 г . из нервной ткани краба. Описаны ее
свой ст ва . Впоследствии Na, К-АТФаза была обнаружена в мем­
бранн ых препаратах, выделенных из многих органов и тканей
животного и растительного происхождения.
Непременным усJ_ювием причастности Na, К-АТФазы к актив­
ному транспорту ионов является корреляцмя между активностью
фермента и скоростью переноса ионов в ткани, т. е. чем интен­
с ив нее в ыкачивание ионов натрия из клетки, тем больше должно
быть в клеточной мембране центров Na, К - А ТФазы. Этот вывод
подтв ерд или Boпtiпg et а ! . ( 1961, 1963) после сравнительного
анализа различных органов или тканей у одного или разных ви ­
дов животных. Наибольшая активность Na, К-АТФазы отмечена
tВ нервной ткани и тка,ни, имеющей секреторную функцию.
На ряду с регуляцией ионного баланса на уровне отдельных
клеток транспорт ионов и водно-солевая регуляция в пределах
целог о • организма у позвоночных осуществляется почками. В ре­
гуляц ии ионного гомеостаза могут также принимать участие ки­
шечник ; мочевой пузырь, кожа, жабры рыб, ~ олевые железы птиц
и т . д, Почечная ткань заслуживает особого внимания в связи с
исклю чи тельно высокой интенсивностью процессов активного
транспорта, так как трансцеллюлярный перенос ионов в клетках
поч ечного эпителия ,являе11ся основной функщией почки. Ввиду
неодинаковой функциональной роли разных участков нефрона
в пр оце сса х реабсорбции ионов можно ожидать разной актив­
ности Na, К-АТФазы. Доказана более высокая активность фер ­
м ент а в красной медулле почек по сравнению с корой и папиллой
(Mart inez -Ma ldonado et а!., 1969; Gutman et а!., 1973; Юрасова,
1973) , ч то объясняется важной ролью этого фермента в транспор­
те ионов натрия клетками восходящих отделов петли Генле при
осмотическом концентрировании мочи.
Транспортная N а, К-активируемая АТФаза почек уча ств ует
в адаптации организма к различным факторам внешнеи среды
(температурный, водный, пищевой и др.), следовательно, распре­
д еление активности этой ферментной системы вдоль нефрона у
разных видов животных зависит от ф у нкциональной активности
транспор тных процессов в почк е . Мы изучали ра с пределение ак­
тивности транспортной АТФазы в почках ра з ных видов животных,
о битающих в различных условиях и имеющих неодинаковое строе-
тt

. ние
нефрона. Кроме того, был проведен кинетический ан аюi з
свойств ми кросомалыюй Na, К-АТФазы коры, медуллы и п апи лл ы
почек кро ли ков .
Объектом и с следования служили самцы белы х беспо род ны х:
крыс и кро л иков, желтые суслики, лягушки, черепа х и. П ос л е з а ­
боя ж ивотны х почки погружали в ледяной раств о р, сод ер ж ащи й
0 ,25 М са х аро з ы, 0,05 М этилендиаминтетраацетата (ЭДТА ) ,
0,10% дезокси х олата натрия (ДОХ), 0,03 Ni трис - НСI буфе ра, рН
7,6. ПocJie уда ле ния капсулы из почек крыс, кроJiиков и сусл и ко в
виз у ально вы д еJ1ЯJIИ З зоны: поверхностную (корков у ю), крас н у ю
мозговую ( м едуллу) и бледный сосочек (пaпиJIJI Y ). Почки ляг у­
шек и черепах использовали целиком . Одинаковые навески ткан и
гомогенизировали на холоду и центрифугировали при 10000 X g
в течение 30 мин. Надосадочную жидкость вновь центрифугнро­
ва Ji и при 30000Xg в течение часа. Осадок ресуспен д ировали в сре­
де, отличающейся от первой отсутствием ДОХ и меньшей к онцен­
трацией ЭДТА - 0,01 М . Концентрированный ферментный пре ­
парат хранили при -10°С. Для работы ферментный матер иал до­
водили до конечной концентрации белка - 10-20v в 0, 1 мл .
Стандартная среда инкубации (конечный объем 1 мJI) содержаJJа
100 м М NaCI , 20 мМ К.С!, 30 мМ трис-НС! буфера, 0,1 м л фер­
ментного препарата, рН 7,5. Соотношение между ионами мапаrя
и АТФ 1:1 (по 2 мМ). Реакцию после 15 мин преинкуба ци и при
40° начинали введением в реакционную смесь динатриевой coJiи
АТФ и через 5-15 мин прерывали 0,1 мл 50% ТХУК.
Для выявления активности Na, К-А ТФазы в реакционную
смесь вводили сердечный rликозид - олиторизид в конечной
концентрации 10-3 М, Na, К-АТФазу определяли
как разниц у
между количеством отщепленного от АТФ неорганического фос­
фора в присутствии гликозида и без него. Неорганический фос­
фат определяли по методу Туракулова и др. ( 1967), белок - по
методу Lowry et а!. 111951) .
При исследовании кинетики гидролиза АТФ Na, К-активируе­
мой АТФазой меняли состав с реды инкубации для выявления
влияния субстрата - АТФ, ио нов-активаторов
-
натрия и ка­
лия, гJJикозида, рН среды и температуры инкубации. РезуJiьта­
ты выражали в микромолях неорганического фосфата, рассчи­
танного на мг беJiка в час.
Данные по распределению АТФаз в различных зонах почек
кроликов, крыс и сусликов, а также активности АТФаз в почках
лягушек }: черепах представлены в табJJице. В почке кролика
наибоJJьшая актiшность транспортной А ТФазы наблюдается в
мозговой зоне, а активность в корковой и сосочковой зонах почти
• одинакова. Процент соде р жания Na, К-АТФазы от общей актив­
ности фермента высок в мозговой и корковой зонах и несколько
ниже в сосочковой.
В почке крысы наименьшая активность фермента отмечается
в коре. В мозговой и сосочковой зонах активность почти одина-
78

кова. В 1процент,но~ отношении -сос очек обладает наибольшим со­
де ржанием транспортной АТФазы.
Транс портные АТФазы во всех зонах поче к сусликов, забитых
непос редственно в местах обитания, имеют очень высоки е зна­
чения как в отношени и удельной активности фер мента, так и в:
процентном содержании Na, К-А ТФа зы. Активность транспорт­
но го фермента в мозговой зоне поч ти в 2 раза, а в сосочковой -
в 3 ра за выше, чем в корковой. При сравнении активности Na, К-
Р аспределею1е А ТФазных активностей в почках
Активност1) A'JФаз, ,,11<моль Ф1-1 /мг б~л~<а/ч
Коркован
М озговая
Со сочковая
Корковая
Мозговая
Сосочковая
Корковая
Мозговая
Сосочковая
Вся почка
Вся почка
общая АТФаза
91,9±+ .72
164,4±6,07
97,3±5.98
104, 6±4,22
166, 9-t 4, 90
141 ,9±4,52
147, 7±1 ,89
92,0*±9,00
316, 1 ±29 36
166,5* ± 8.86
360,4±19 72
95,6*::t:7,70
129, 0±6,36
Мg-А'J'Фаза
Кролик
25.4±3,27
'16.0±2,84
35,3±1.34
Крыса
45,7±3,24
55,8±3.13
37,4±3,64
Суслик
28 2+2 29
35:4±9:15
l :3, 2:t_l,13
56,2± 7,26
16,3±1 89
38,7±13,16
Черепаха
1 55,8±3.55
Лягушка
98,8±2 .93 1 43,5±3,01
Na, К-А ТФаза
66,5±1,68
118 Б±.S ,50
62,0± 5 ,56
58.9±3,20
1i1,1±4,65
104,5± !,17
119 ,6±0,90
56,7±2 ,33
303. 0±30. 00
110,2±7 .63
344,2±21, 11
57 ,0±6, 18
73 ,2±6,4S
55 3±4,32
Содержа~J11с
Na, 1{-АТФазы,.
%
72, 3
72, 1
63,7
81 ,О
62,9
95,8
66 ,J
95,4
60,9,
56,7
56,0
* Отмечены активности фермента, выделенного
из П()чек сусликов, со­
державшихся в виварии в течение 10 дней после отлова; без отметки-ак -•
тивности фермента, выделенного из почек суслика ;, забит~1х в местах оби ­
тания .
АТФазы почек сусликов, содержавшихся в стационарных усло­
виях вивария в течение 10 дней пс.еле отлова, отмечается резкое­
снижение активности общей и транспортной АТФазы, наиболее·
выраженное в сосочке. В этом случае распределение активности,
Na, К-АТФазы в разных зонах почек сусликов почти такое же,.
как у кроликов.
Удельная активность транспортной АТФазы почек черепах
почти в 1,5 раза выше, чем почек лягушек, хотя процент содержа--

ния Na, К,АТФазы от общей активности фермента у них почти
одинаков.
Для животных, находящихся в условиях дефицита воды, от
концентрирующей способности почек, связанной с реабсорбцией
воды в нефронах, во многом зависит возможность сохранения
жизнеспособности. Процесс интенсивной реабсорбции воды в по­
чечных канаJiьцах в значитеJiьной мере обусловлен структурными
особенностями выделительного аппарата.
Характер общего функционального состояния выделительной
системы позвоночных животных находит отражение в размерах
почек Почечный индекс у грызунов аридной зоны выше, чем у
непустынных млекопитающих. По данным Щегловой ( 1976), у
большой песчанки из Каракумов этот индекс равен 4,61, у белой
крысы - 3,76.
Функ,циональные особенности почек ~разных животных обна1ру­
живают свою морфолоtическую основу в деталях тонкой внутрен­
ней дифференцировки их структуры. Это выявляется уже в соот­
носительном развитии главных структурных образований почек­
коркового и мозгового отделов.
Изучение анатомической структуры изолированного нефрона
показало, что как у низших, так и у высших позвоночных нефрон
имеет клубочек, проксимальный, тонкий (промежуточный) и дис­
тальный сегменты (Гончаревская, 1976, 1978). Относительная дли­
на проксимального сегмента не увеличивается у речной миноги,
.европейского керчака, травяной лягушки, агамы, домашней ку­
рицы и белой крысы. Сравнение скорости проксимальной реаб­
сорбции у миноги и крысы показало более высокий уровень реаб­
.сорбционной способности проксимального канальца крысы. Рост
проксимальной ,р.еа,бсо1рбции ,в 'П1р,оцеосе :э,в0:лю ци.и ·почки ~позвоноч­
ных обусловлеrI интенсификацией канальцевого транспорта, а не
увеличением длины проксимальных сегментов. У рептилий услож­
нение мочевых канальцев сопровождается возникновением неоди­
накового расположения популяций нефронов в почке. Содержание
ионО1в и мочевины повышается от корковой :к мозговой част,и почк~и .
.Этот процесс создается главным образом противоточной поворот­
ной множительной системой мозгового вещества и обеспечивается
либо длиной мозгового конуса, либо количеством петель в нем.
Sperber ( 1944) показал корреляцию между длиной петель,
ст,роением :почек млекопитающих и ,степенью засушливости мест
, обитания. Он исследовал почки 139 видов млекопитающих с тща­
тельными микродиссекциями, с изоляцией отдельных нефронов
и измерением их частей . У 7 видов пустынных грызунов обнару­
жен очень длинный сосочек, свисающий в мочеточник. Эти живот­
ные продуцировали исключительно концентрированную мочу.
У животных, обитающих в условиях достаточного обеспечения
водой, усиленного развития дос'!'игает кора почек с фильтрующим
аппаратом, а также наружная зона мозгового вещества, где про­
исходит обратное всасывание солей. У представителей аридных
80

о бластей наибольшее значение приобретает внутренняя зона моз­
г о в ог о в ещества с очень крупным сосочком .
Ко нцентрирующая - способность почек свойственна только мле­
КО'пит.ающим и -отча,сти п11ицам, у которых в петлях Генле ,и ,со­
б ират ельных канальцах нефронов происходит реабсорбция воды
н электролитов (Гончаревская, 1976). Этот аппарат сосредоточен
в о сн о вн ом в мозговом веществе почек, степень развития которого
з а в и сит от приспособленности животных к дефициту воды. По­
вер хн о с тные, короткопетельные нефроны достигают наружного
м о з гового слоя . Юкстамедуллярные, длиннопетельные нефроны
с о зд ают противоточную множительную систему. Петля Г енле
предст ав лена в основном тонким сегментом, вершина которого
о пускается в сосочек почки.
Определено, что у песчанки степень васкуляризации сосочка
в 2,5 раза выше, чем ·коры (Гетманова, 1976). У ондатры сосочек
васкуляризирован в 3 раза ниже, чем кора. Белая крыса занимает
промежуточное положение. Обнаруженные различия автор объяс­
няет экол огической специализацией исследованных видов, свиде­
тельств ующей о важной роли сосудистой системы почек в обеспе­
чении в ысокой концентрирующей способности. В ряду песчанка ­
белая крыса - ондатра степень васкуляризации сосочка сни­
жается более чем в 4 раза, что соответствует уменьшению в том
же ряду концентрирующей способности почек (осмолярность мочи
у этих видов равна 5,5; 2,9; 1, 1 осм соответственно).
В многочисленных работах Ю. В. Наточина и др. (Наточив,
1969, 1972, 1975, 1976; Наточин и др., 1975) представлены данные
о структурном, функциональном и биохимическом развитии почек
в эволюционном аспекте. Отмечается, что у1ювень реабсорбции
натр ~;я в почках теплокровных животных значительно выше, чем
в почках холоднокровных . Повышение функциональной нагрузки
клеток проксимальных канальцев сопровождается увеличением
площади базальной мембраны вследствие увеличения ее складча­
тости. Транспорт натрия в дистальном канальце, в отличие от
прокс имального, происходит против большого градиента, что тре-_
бует более существенных энерготрат . У крыс в просвете прокси­
малыюr о канальца концентрация натрия может снижаться до
108 мэ кв/л по сравнению с 140 мэкв/л в плазме крови, в дисталь­
ном к ан альце концентрация натрия падает до 30-48 мэкв/л, в ко­
неч н ы х отделах собирательных трубок она может уменьшаться до
1 мэкв/л и меньше . У млекопитающих в проксимальном канальце
около 2/3 профильтрованного натрия всасывается и 1/4 реабсор­
бирует ся в петле Генле, 8-10% всасывается в конечных частях
неф р он а и собирательных трубках; почки выделяют лишь менее
1% пр оф ильтровавшегося натрия.
Возмо жность раздельной обработки воды и натрия в дисталь­
но м сегм енте нефрона и собирательных трубках позволяет в ши­
роки х п ределах регулировать выделение воды почкой при одном
и то м ж е количестве экскретируемого натрия . Ввиду того, что в
б-156
81'

почках млекопитающих проr~сходи т нарастание кортика - па пи л л яр­
ного натриевого градиента , реабс орбц ия на три я в дистально м сег­
м еiпе нефрона и конечных его частях происходит проти в з на чи ­
тельно го трансканальцевого градиента.
Манусова (1973) отмечает, что в процессе эволю ци и в ряду
позвоночных увел и чиваетс я коли'-rество нат рия, реабсор б и р у ем ого
в почке, а в клетках канальцев возрастает активность Na, К-АТФ­
азы, являющейся важным компонентом · снс т емы актив н ого тран с­
порт а. Обнаружена более высокая а1,тивность д егндроге наз су r, ­
цината и а-кетоглютарата в клетках прокси rлаль н ы х и д истJJr: , ­
н:ых канал ьцев . У м :1е:;о;~:пающих активность энз имов ц~; кj,а
Кребса в Елеп.:а х прокошалыrых и диста.льн ых ка нальцев зн ачн ­
телы-ю выше, че r,1 у друг и х классов позвоно 1:r1-r ых . Высок ая акт нв ­
ность большей части оъ:ислителы-1ых ферментов в по,rках млеI(О­
питающнх обусловлена резким увеличен и ем объема реа 6сорб цин
нзтрия в Е ефроне.
По данны м Wind!ы. ger, GieЬiscl1 ( 1965), средняя разн и ца по­
тенциаJJа через сте:тку про кс им ал ьного канальца нефрона крыс
равна - 20 мV . Наиболее глубокий электрохимический гр ад и~нт
найден в эпителии дисталь но го канальца, он равен пр иб лиз и те,'JЬ ­
но ~ 35-60 м\1 . В тонкой ч асти петли Ге н ле обнаружена н изкая
разница потенциала - 1- -3 мV, в собирательных тр убка х о на
з начитеJ1ы-1а - 14- -16 мV. Авторы пред полагают, что натр и й ак­
тивно транспортируется эпителиальными клетками терм и нальных
собирательных трубок.
Сегменты н ефрона, входящи е в состав тQй или иной зоны по­
чек м лекопитающи х, обладают неодинаковой транспорт ной и
АТФазной активностью, что имеет важное ·фун к циональн ое з наче ­
ние. В процессе эволюции поt1ек позвоночны х отмечаетс я резко е
увеличение •реабсорбции натрия и способность продуцировать
гипертоническую мочу, что связано с появлением петли Генле и
увеличением толщины медуллярного слоя, поэтому в это й з оне
почек обнаруживается наибольшая акти:вность Na, К-АТФа зы. Вы­
сокая активность транспортной АТФа.зы во внеш1•iей медулле
обусловлена наличием толстой в_осходящей части ди стальн ого ка­
нальца, в которой реабсорбция r-щтрия осуществляется п·ротив глу­
бокого электрохи ·мнческого гради.ен,та (M,a.rt iдez -Maldonado ~t а ! . ,
l9i69; Jorgense n, S~ou, 1969,; Hendler, Toпetti, Epsteiл, 1971 ; Gu.t -
шan et а ! : , 1973; Юрасова, 1973; Epsfein, Si.l ,v~ 1 1974). Акти :щюст1 ,
транспортной АТ<f?аз .ы в. мозго130 11{ I! ~ществе в средн.ем, в 2-4. р аз~
выше, чем 'в кор _ковой: зоне.
'
•
Совершенствуя т,ех/rику биохими ,ческого анали за, Scllшidt et
а 1.,
( 197-4), Schшidt , Hors.ter ( 1978.) , rv1 op1и прQв ~сти опред ~л еюrе
активности Na, К-АТФазы на отдельнь1х изqлирова1щых участках
почечных канальцев. Результаты этих эк,сп~риментов подтв ерди­
ли наличие наибольшей активности фермента в. клетках восхо­
дящего отдела . петли Геf!.Ле и. ди,сталь,но:м, к'аналь,це ,и :меньшей
а'ктивности в_ KJ1erкax проксимального . I-Р)')1'/ТОГО и, особенно, пря .­
мого канальца.
--82ti· .

Конечная реабсорбция натрия из канальцевой мочи происхо­
дит в конечных отделах собирательных трубок, здесь же про·ис­
ходит концентрирование мочи. Наличие активности Na, К-А ТФазы
в сосочковой зоне почек, . которая включа ет тонкую часть петли
Ге нле и собирательные трубочки, до сих пор оспаривается некото­
р ы м и исслед ова телями . Однако в последнее время появнлись дан­
ные , свидетельст ву ющи е, что и в этой зо не почек присутст вует
активно сть транспортной АТФазы, сравнимая с акт ивност ью в
корко вой з оне (S cl1шidt, DLtbacl1, 1969; GLttman e t al., 19 73; Wald
et а!., 197-4).
В канальцевой моче в конечных отделах нефрона содержится
мен ьше натрия l2--3 мМ на литр), чем в клетках папиллы ( до
218 мМ на 1 кг сырого веса т ка ни почек крыс) (Юрасова, 1973) ,
поэтому н атрий, по-видимому, активно накачивается и з каналь­
цевой ж идкости в кл етки собирате льных трубок, пр ичем, против
з начительного конце нтра ционного градиента. Вполне оправдано
п рисутств ие в этой з оне почек довольно в ысокой активности тран с­
портной АТФа з ы.
Таким обра з о м , данные по распределению Na, К - АТФазы в.
по ч к а х исследованны х нами животных в основном совпадают с
результатами других исследо ват елей . Транспортная А ТФаза моз­
говой зоны почек почти в 2 ра за активнее фермента корковой
зоны . Исключение составляют почrш сусликов-, за биты х в местах
о битания, у которых отношение м ежду активностью Na, К-АТФ­
азы медуллы и коры равно почти 3 . Активность транспортной
АТФазы коры и папиллы почек кроликов почти одинакова. В то
же время активность ферментной системы папиллы почек крыс
и, в ещё большей степени, сусликов ближе к _ активности фермент а
мозговоt1 зоны. В этих экспериментах видна роль почечной Na, К­
дТФазы в процессах адаптаций орган изма к условия-м среды и к
величине почечной реабсорбци-и.
Как было сказано выше, почки сусликов, живущих в аридных
,и высокогорных зонах, имеют хорошо раз1витую зону моз:гового
ввщества с ,к·рупным сосочком, и эта -особенность ст.роения паче-к
позволяет им продуцировать мочу, более концентрированную, чем
плазма крови. Возможно, этим и объясняется присутствие такой
высоr<ой активности транспортной АТФазы в почках сусликов ,.
взятых на анализ непосредственно в местах • обитания животных_
При изменении условий, а именно, при содержании сусликов в
виварии, наблюдалось значительное сниж:ение активности Na, К­
АТФазы во всех зонах почек: в коре - в 2 раза, в мозговой зо­
не - почти в 3'; наибольшее снижение активности отмечалось в
сосочке - почти в 6 раз.
Относительно низкая активность транспортной АТФазы сосоч­
к а . почки кролика, возможно, связана с тем, что почки кролика:
продуцируют мочу гипотоничную по сравнению с почками крыс
(у крыс - 2560-3000 моем, у кроликов -" -- 1502.,--1910 моем; ц+1ф­
ры взяты из «Сравнительной физиологии животных», 1977).
83.

Активность почечной Na, К-АТФазы у холоднокровных живот­
ных ниже, чем у теплокровных (Наточин, 1976). Увеличение ак­
тивности транспортной АТФазы у теплокровных коррелирует с
200
:;,-
~1 50
~
i 100
r:J
10 20
40
80
120
Рис. I . Зависимость активност и Na, К-А ТФазы
корко tюr1 (1), мозговой • (2) и сосочковоi1 • (3) зон
11Очек кролика о т концентрации и онов на т рия в
присутствии 10 мМ к+.
более высоким уровнем клубочковой фильтрации и большей ин­
тенсивностью работы клеточных систем транспорта натрия, что
проявляется в возрастании реабсорбции этого иона из канальце­
вой мочи и способностью продуцировать концентрированную мочу.
20D
.
,,-----•-
----,,-Lx
/
_ _ __ ,,.__!_.
/~~
Рис. 2. Зависимость а 1<пmности Na. К-А ТФазы
корковой (/), м о зговой (2) и С О СО'!КОВОЙ (3) зо н
почек кролика от концентрации ионов калия в при-
сутствии 120 мМ Na+.
И:зв естно, что рептилии и земноводные неспособны выделять ги-
пертоническую мочу .
•
Таким образом, существует тесная взаимосвязь между уровнем
реабсорбции натрия и активностью транспортной Na, К-А ТФазы
84

вдоль нефрона, что отражает характер общего функционального
состояния выделительной системы позвоночных и находится в не­
посред,ственной связи ,с зкологиче,ской и водно-,с.о:ле,вой а,даптацией
организма.
Активация АТФазы натрием. На фоне постоянной концентра­
ции калия ( 10 м,М) исследовали !Влияние переменных концентра­
ций натрия - от ,2 до 200 м:М (рис. 1). Мак;симальная активность
Na, К-А ТФазы мозговой и ,сосочковой зон почек .кролика на6лю­
~далась при 80 мМ натрия, в ,корк,овой - при 120 мМ. Дальнейшее
d
вo.J ~~
j о-~·'
о~ о~4
}
j,
t/Sм!ИATQ..
повышение концентрации нат­
рия в среде ингибировало фер­
мент. Полумаксимальная ак­
тивация Na, К-А Тфазы (Ko,s)
натрием отмечена при 9; 6 и
5 мМ натрия для коры, медул­
лы и сосочка соответственно .
7
б
5
4
З
top м олитодизи{l[J
Рис . 3. Графики Лайнуивера-Берка длн Na, К - А ТФазы коμковой (а), моз­
говой (6) и сосочковой (в) зон поче1< t<ролина .
1-10-6 м, 2- 10-s
.
з-10-4 . 1-10-·з ,\\.
Рис. 4. Ингибирование Na, К-А ТФазы корковой (1), мозговой (2) и сосочка•
вой (3) зон почек кроJ1ика олиторизад о м.
Активация Na, К·АТФазы калием. На фоне постоянной кон­
центраци-и нат1рия (120 мМ) ,исоледовали 1влияние возрастающих
конце нтр аци,й калия (от 0,5 до 10 мМ) (рис. 2). Максимальная
·активность фермента достигалась при 3 мМ калия в ,сосоч1юв,ой
зоне, при ,5 мМ - в медулле . Активность фермента коры прогрес­
сивно нарастала. Полумак-симальна ,я актива,ция Na, К-АТФазы
(.Ko.s) калием дости,галась пр,и 1,4; 0,8 ·И 1,2 мМ для ,к,оры, медул­
лы и ·сосо,чка соответственно. Транспорт-ная А ТФаза мозг,овой
зоны проя,вляет н,аибольшую чув,ствительность как к ионам нат-
85

рия, так и к ионам 1ка.лин, ,в то время как фермент .папиллы обла­
дает высокой чувствительностью к нонам натрия, н о i\1еньшей к
ионам калия.
Влия.ние субстрата на активность Na, К-А ТФазы. Ми1<1юс о ­
мальные препараты инкубировали в ,среде, ,содержащей 100 мМ
натрия ;и 20 мNl калия, а также п е рем енные э·квимолярные кон­
центрации ионов магния ,и АТФ (от 0,6 до 2,5 мLi\'l) (рис. 3). По
,гра,фи!):ам Лайнуивера-Берка рж:очитывали з 1шч ения Км дл я
АТФ: ,0,408; 0,47,6 и 0,444 мМ для 1юры, медуллы и • :::осочка шот-
ветс:твенно.
.
Иrнибирование олиторизидом. Ис·следовали влияние разных
1юшцентраций олитори .зида (от 10- 7 до 5- 10-4
. 7vl) на степень ин-
{J
8
f{} 2fJ304050fi0t0
З.2 З.З 34 З.5 З.51/lif{J(J{
40зо20
10 s'
Рис. 5. Влияние температуры инкубации (а) и
rpa фики А рреннуса (б) Na. К-А ТФаз , .,, корl(о­
вой (]), мозговой (2) и сосочко ь ой (3) зон по-
чек кролика .
rибиро.вания мик.росомальной Na, К-А ТФазы 1ко,р1~овой, мозговой
,и ·сосочковой .зон. Концентрация олитори.зида, необходимая д,пя
50% интибирования транспортной АТФазы (К;), для всех зон
оказалась почти од~наковой: для коры и сосочк·а - 7 • 10-6 М,
для фермента мо:зговой зоны - 6- 10-6 М (рис. 4).
Эффект рН среды инкубации. Ферментный 1П1репарат ИНJкубн­
ровали ,в стандартной ,среде с переменным значением ,р Н (,от 4,0
до 9,0). Оптимум рН ,для Na, К-А ТФазы всех з,он почек о_тмечал ,с я
:при 7, .5, для Мg-АТФа~зы - при щелочных значениях рН
-
от
8ДО9.
Влияние температуры инкубации на активность Na, К-А ТФ~зы.
Ма1ксимальна,я акти:вность тран,спортной АТФ азы во ,в,:::ех зонах поч ­
ки отмечалась при .50°С (рис . .5). По трафикам Аррениуса были
вычислены кажу щиеся ·величины энергии а•кти•ваци.и дш~ ,Na, К­
АТФазы. Еа2О-4О " равны 13840±4tIO; 12710±500 и 13490±480кал/
мо.дь в корко,в,ой, моз•говой и сосочковой зонах соотве11ст!!енно,
Eas -!5'
-2 4700±.18'20; 2746:0±990 и 27840±2,600 ка,л/моль. Изло-
86

мы на г,рафиках температурной зав исимо сти оюрости гидролиза
АТФ набл iодаЛI-IiСЬ в ,области ,19° для фер мента коры, 18° д.пя моз­
гов ой ЗОН Ы И l'6°C ДЛЯ. ,с,осоiша.
Таким обра,зом, ,абна,ружены не1юторы е различия в чувстви­
тельнос ти i< ионам натрия и кал.ия транспор т ной А ТФазы, выJJ,е­
ленной из коры, медул л ы и сосочка почки кролика. Наи,большая
чувствительность 'К ионам проявлялась у фер м-ен та мозговой _зоны .
Ко. 5 для натрiiя у Na, К-А ТФ азы сососiка име ла низкое ~н а _чение,
е ще меньшая ,чувст,вительность отмечалась k ионам калия . Что
J<асается влияния субстрата, тли козида, рН ,среды и температуры
инkу~ба;ции, то здесь не было обi-rаружено ,сколько-нибудь сущест-
венньrх отлиiч,и й iз ,поведении ферм е нта .
.
.
,Ки нет11ческие овойст,ва транспо.рп-ю й Nа, К-активцруе:vrой АТ~­
азы п·dчек изучались м-ногими исследователями. Nechay et а!.,
(i971), ikслед,овав,шие фермент йз почк:и че.irове1~а, указывают, что
Км для к+ ,равна 1,1 м~М в прису_тствии 100 мМ натрия, к~r для
натрия - 7,9 мМ в присутствии 20 м:М ка .n ия, кон,центра,ция для
лолумаксима.пЬньто инtибиро,:вания фермента оуаб,а,1:1ном 2,3. l О-6 М.
BгaL1~hler, ~ord~r ·. (1977), рпределили, ЧТО к~I ,для ' натрия .при
20 м.Nl ка.iшя :равна 16 мМ (т. е. почти 'В 2 раза выше,, чем у пре­
дыдущих: , автор,ов), а К1'1 для, 'Кал,ия 'В присутст,вии 100 мМ наt,рия
1,5 мМ, Kioyaбar-iнoм=l ,8 - 10-6 M.
.
..
_
.
К,l,ine et aJ ,. ( 1971), работая на ферменте из мозга рыка, нащщ1,
что Км для АТФ равна 0,4 мМ, Ki iмrя оус~баина - 8-80- 10- 6 М,
т. е . инти~бирЬiзание проис;юди.irо при гораэдо больших концентра-
uиях гликозида .
'
'
'
Geerihg, Rbssier {1979), изучая к,инетику Na ; К-АТФазы, вы1де­
леннdй iiз пь:~ши . жа~бь1, 1riрй,iл,ли к заключению, ·что , Ко,5 для натр1;1я
составляет 12,29 м!J\'l, длiя ,кал1ия - Ц4 мМ, Км АТФ
-
0,40 мМ,
Ki дJнi. оуа6аина - 35 мк. ·Они отмечали ~ лика ?КТИВЩИИ при
температуре 37 и 50°iC. Излом на графике Аррениуса наблюдал-ся
при 15°С. .
.
,
Wald et а!. (1974) про,вели исследова1;1ие 'Кинетических ,свойств
Na, к-АТФазы ПО З'ОНа!V! ,ПОЧКИ к,рысы: :Ко,5 дл,я натрия,=9; 7,1 и
7,5 мМ в пршсутстюiи 10 м1М калия ,в ·кор~1ювой, мо_зтовой и ,сосоч-
1<0вой зонах ,с оответсТ'Вено. Ko,s для .калия=О,75 ; •0, ,67 и 0,93 в пр,и­
·сут-стви.и 100 мМ натрия. Эти а,вторы выявили ,большую чувс'i'ви­
т ельн о:сть фермента мозговой зоны почек крыс ·к ионам натри я
и калия, тогда как фермент ,е,осо·чка проявлял высокую -чувстви­
тельно сть к ионам натрия, но меньшую - к ионам кал,ия. Na, К­
А ТФаза папил л ы оказалась более чув.::твительной к АТФ (Км, =
r0,55, в отличие от 1,34 мМ для медуллы и 1,21 м,М для фермента
коры) и 1к ингибитору (Kii= ·l,64- ,l!0- 4 М •прот,ив 2,95 и 2,45- ·Ю-4 М
в м-едулле и '!('О ре сооriзетст,венно). На основании полученных ре­
зульт атов авторы высказали предположе ние о функциональном
различии м,икросом альной N а, К- АТФазы из ,разных зон почек
1,рыс.
87

Для ,сравнения приведем данные кинетических параметров
Na, К-АТФазы плазматических мембран щитовидной железы
свиньи (YukifLш1i, Toicl1iro, 1977), подтвердившие, что свойства
этого фермента из щитовидной железы ,схожи с характеристиками
Na , К-АТФазы др у гих органов: Км для калия в пр·нсутствии 100 мМ
натрия,= , 1,6 мМ, для натрия в присутств.ии 5 м.М кали,я - 12 мМ,
Км для АТФ - 0,14 мМ. График температурной зависимости ак­
тив-ности фермента в аррениусовых кривых имел излом ,в области
22°, знер,гия активации = 24,.2 ккал/моль ·пр.и 5-•22° и 19,0 при
22-40°.
Ранее мы сообщат,, (Юрасова и др., 1979) о влиянии АТФ и
олиторизида на активность Na, К-А ТФазы почечных зон кролика и
крыс. Км для АТФ лишь для фермента сосочк,овой зоны почек
крыс ,была ,в 2 раза ниже, чем для •всех остальных зон почек кро­
ликов и крыс (0,238 м.М против 0,408-0,'470 мМ). В то же время
фермент почек крыс оказался менее чувствительным к ингиби.ро­
ванию олиторизид·ом по сра,внению с ферментом почек к,рОJ!Иiка
(Ki1=I0-4 M пр,от,ив 6-7-I0-6 M). Был ,сделан ,вывод, что выяв­
ленные особенности Na, К-АТФазы из раз.личных зон :почек ука­
зывают на функ,циональную неоднородность етой ферментной сис­
темы вдоль нефрона.
Таким ·обра,зом, основные свойства, присущие трансп,ортной
Na, К - акти.вируемой АТФазе, незначительно отл,и,чают·ся у разных
видов животных, из тканей которых была ·выделена ферментн.ая
система . По мнению Хочачка и Сомеро (1977), специфические
свойст.ва фермента (в.ектор.иальный компонент, кон,станты сроiд­
ст,ва, потребность в противоион,ах) магут быть у разных ·видов ,раз­
личными, но общая стехиометрия, последо.вательность связыва­
ния ,нат,рия и друлих веществ, т. е . обща,я пр1ир -ода активных
участко'в на .белк,овой молекуле, ,согла·сно принятым представле­
н,иям, в основе овоей одина,кова у нсех жи,вотных, у которых
:имеется Na, К-АТ1Фаза.
Изучение кинетики поведения транспортного фермента почек
разно.го вида животных с разным уровнем т.ран ,спортных m.р,оцес­
•сов ,в почке позволяет выявить некоторые осо·бенности Na, К-АТФ­
азы вдоль нефрона, что может указывать на их кор,реляцию с
фушщиональными различиями разных -сетмент,ов нефр,она.
Основываясь на приведенных выше данных, можно сделать сле­
дующие выводы.
Наи,большая активно,сть Na, К - АТФазы отмечаетс,я 1в моз-го,вой
зоне всех исследованных животных. Активность транспортной
АТФазы s сосочков,ой з,оне ·почек крысы и суслика, забитых непо­
средствешю в местах обитания, так же ·велика, как и ,в мозгов·ой
зоне. По - в,идимому, ,высокая активность фермента в этих зонах
обусловлена реа-бсорбцией начия против глубокот к-он,цент.ра­
ционного градиента, который у • этих животных нарастает по на­
правлению от коры к папилле. Наименьшая активность транспорт-
88

ной АТФазы отмечена в почках черепахи и лягушки. Эт.и жив-от ~
ные неспособны продуцировать .концентрированную мочу, и по,ч,ки
их характеризуются низким уровнем ф,ильтра,ционно - реа,бсорб­
· ционных процессов.
Существует корреля:ция между уровнем реабсорбции натрия
и концент,рированием мочи, с одной стороны, ,и активностью Na ,
К-А ТФазы вдоль нефрона - с другой , что за,висит от общег о
функщионального со·стояния выделительной ,системы позвоночных .
При изучении кинет.ики Na, К-АТФазы м,и 1кро-сом, выделенных
из ·разных зон почек к.ролика, получены следующие характеристи- .
ки фермента: ' Ko,s для натрия в присутствии 10 мМ калия,=9; 6
и 5 мМ для коры, м,о.зговой ,и сосочковой зон соответст,венно; Ко, 5
для ,калия в присут,ствии 120 мМ натрия, = 1,4; 0,8 и 1,2 мМ ;
Км АТФ дл.я фермента •коры, мещуллы и сосочка =0,408; 0,476 и
0,444 м.М; Ki для олиторизида ра,вно для фермента м.озтовой зоны
6 • 1О- 6 М, для коры и сосочка - 7 • 1О-6 М. Фермент мозговой тка­
ни -проявляет высокую чу,вствительн,ость к ,ионам натрия и калия ,
Na, К-А ТФаза папиллы имеет низкое значение Ko,s для натрия и
обладает меньшей чунствительностыо к ионам калия.
Эти данные ,свидетель,ствуют о наличии функциональных ,осо-
6енностей транспортных процессов и о неоднородности транспорт­
ной Na, К - актию1руемой А ТФазы вдо л ь нефрон<!.
ЛИТЕРАТУРА
Б е км ух а м е то в а 3. У . 1975. Гормональная регуляция транспорта ионов .
Ташкен т.
Болдырев А. А., Тверд и слов В. А . 1978 . Моле!;}улярная организация и
механизм функционирования Nа-насоса. «Биофизика» . Итоги науки и
техники . ВИНИТИ АН СССР, т. 10 . М .
В ер е н ин о в А . А . 1978. Транспорт ионо~з через клеточную мембрану. Л .
Ге т м а но в а Т. Н. 1976. «)!<.урн. эволюи.. биохнм. н фнзиол . », XI 1, 128.
Го н чар ев с к а я О. А. 1976 . «Журн. эволюц. биохим. и физиол.», XII, 113 .
ГончаревскаяО.А.,АмановаМ.А.,БахтееваВ.Т.1978.«Физиол
журн . СССР», 64, 405.
Л и шк о В. К. 1977. Натриевый насос биологических мембран. Киев.
М ан у с о в а Н. Б. 1973. «Журн. эволюц. биохим. и физиол.», 9, 209.
Нат очи н Ю. В. 1969 . «Журн. эволюц . биохим. и физиол.», 5, 240 .
Нат очи н Ю. В . 1972 . «)l(.урн . эволюц. биохим. и физиол.», 8, 289.
Нат очи н Ю. В. 1975. Структура и функция биологических мембран. М., 307.
Нат очи н Ю. В . 1976. Ионорегулирующая функция почки . Л.
Нат очи н Ю. В. 1975. «Журн. эволюц. бисхим. и физиол.», XI, 45.
Сравнительная физиология животных . 1977. 1 . М .
Туракулов Я . Х . , Кургульцева Л. И., Гагельганс А. И. 1967. «Био ­
химия», 32, 106.
Хо чач к а П., С оме р о Дж. 1977. Стратегия биохимической а да птации. М.
Щ е г л о в а А. И . 1976. Физиологические п риспособления м л е копитающих
пустыни. Л .
Ю р а с о в а Т. Ф. 1973. Исследование особенностей транспорта ионов в раз­
ных зонах почек крыс. Автореф. канд. дисс., Ташкент.
Юрасова Т. Ф., Бекмухаметова 3 . У., Ташпул_ атов Э. 1979,
«Узб. биол. журн.», No 5, 9.
Вопting S. L., С аgаvаggiо L. L. 1963. Агсh. Biochem. Biophys.,. 1.01, 37.
89

l3оntingS.L., S imоnК.А.К., НаwkinsN.М. 1~65. Arcl1. BibcJ1em.
Biopl1ys., 95, 416.
,
Вгаugh1еr J. М., Соrdеr С. N. 1977. Biochirn. Biophys.
Acta, 481,
N° 2, 313.
ЕрstеinF.Н.,SiIvаР.1974.Ann. N.У.Acad.Sci., 242,519.
GеегiпgК.,RоssiегВ. С.1979. Biochim..Biophys. Acta, 566, 157.
'GutmаnУ.,WаIdН.,Сzасzkеs 'v'/. 1973.PfliigersArch., 345,81.,
,
Неnd1еrЕ.D., То г г еttiJ., ЕрstеinF.Н.1971.J. c!in. Invest..50,1329.
.JоrgеnsеnР. L., S kоuJ. Chr. 1969. Biochem. Biophys. Res. Corninuns,
37, No 1, 39.
.
К 1 i n е М. Н. et al. 1971. Arch. Biochem. Biophys ., 147, 781.
LоwrуО.Н. etа!.1951.J.Biol.Chem,, 193,265.
,
. М аrtinеzМаIdоnаdоМ.et.al.1969.Sci~nce, 165,807.
Nесhау·В.R. et al. 1971. Feder. Ргос.,Abs., 30;No2, .332А.
Sс11midtU., DuЬас11U.С.1969.PflugersАrсН.,,306,219.
SсhmidtU. et al. 1974.АrщN..У.Acad.Sci., 242,489.
S с h m i_d t U., Ног s t е r М. 197~. Me,thods iп Phi!rmacol., 413, 259.
SkоUJ.Chr. _1
_
957. Biochim . Blophys. Аёtа, 23, 394. , .
,._
Sф е r Ь е r I. 1944. Zoologiska Ьidrad friin., Upsalii, _22, 249. .
.
,,
..
WаIdН.,GutrnаriУ., СzасzkеssW. 1974: PflugersАгсh.,352,47:
Wind_hаgеrЕ.Е.,GiеЬisс1:iG.1965.' Physiol., Rev., 45,No2,214.
·уukifurniN., ТоiсhirоН. 1977.J. Biochem., 81,721.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
_i\1ЕМБР АНОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
А. В. ШКИНЕВ, А. И. ГЛГЕЛЬГАНС, Б. А. ТАШМУХАМЕДОВ
Л1[ЕМБРАНОАl(ТИВНЫЕ СВОЙСТВА
СИНТЕТИЧЕСКИХ ИОНОФОРОВ И ПЕРСПЕКТИВЫ
их ПРАктичЕского исnользовлния
В 1-rа~стоящее время не вызывает сомнений важная -структур­
но,фунюцИ1:;)Нальная роль мем,бранных си·стем клетки . Фот,6синтез,
транофо рма~ция зне ргйи , пе,редача информации и другие прсщес­
с ы, необходимые для жизнедеянтьности клетки, осуществляют,ся
би омемЛ5ранам .и и а,сс·оциираванными с ними по,.r:шферментнвrм:и
с истемами. Одной и:з 1ведущих проблем комплексног,0 исследова­
ния организации и п ринципов функционирования биомембраМ яв­
ляется проблема ионного транспо рт а, т-ак как он - илрает ключевую
рол ь ,в механизмах функ,ционирования клеточных систем.
Оооб!:}нно важна ро ль мем,браноа,ктивных соединений. Как от ­
;v1ечают Ю. А. Овчинника.в и др. (197•4), «не будет ·преувеличением
-сказать, что пр.огресс, достигнутый в последн,ие годы в изучении
мем,бранных явлений, в значительной мер е овя.зан с ши,рЬким
использованием антибиотиков, изб»рательi-i-о уве.пичивающих ка­
т.ионную ~проницаемость биологических ме\1бран». Соединения
;v1 икр.обного происхождения имеют т,ото,вую макроцикли,ческую
с1)руктур у или образуют её ,с помощью водородных •связей (.Овчин­
ников ,f! др . , 197•4; Maier, Pau l, 1971; Truter, 1976; Овчиннико!!;
1978). К.роме антибиот,ико,в в настоящее время в исследованиях
;-,,1ем6ранного т1ранспорта широко применяются -синтетические мак­
.роциклические ,с,оединен.ия (Caroni et а \ ., 1977; Wun, Bittman,
1977; Harris et а!., 1977; Wun et а!., 1977; Deber et а!., 1978; Ов­
чинншков, 1978 ; Та1шмухамедов и др., 1979). Особый интерес в свя­
.з. и с ,доступностью, широ·кими возможностями применения и ана­
лиза структурно-фующиональных ,взаимо~вязей предст,авляют
макро;циклические nолиефиры (иногда их называют краун-эфира­
ми или :!Qраун - соединениями), синтез rюторых впервые ,осуществил
Pedersen ( 1967).
Соединения лриродного или ,синтетическ ого происхождения, об­
Jlегчающие тран,смем б,ранную диффузию ионов, с молекулярной
м ассой в пр еделах 2·00 -2000 дальтон получили название ионофо ­
р ов (Tru ter, 1976; Shamoo, Goldstein, 1977). Термин / «ионофор»
вв ед е н Moore, Pressman ( 1964) после открытия феномена стиму­
Л Я'ции некоторыми антибиотиками .поглощения ионов К+ ,суспен-
9,1

зией метаб.олизирующих митохондрий. Ионофоры увеличиваю т по­
токи или включение какого-либо иона (в основном это ионы ще­
лочных или щелочноземельных металлов) из ,водной фазы в гид­
рофобную (Truter, 1976; Shamoo, Goldstein, 1977) и облегчаю г
транспорт ,ионов через природную или искусственную бислойную
липидную мембрану (БЛМ) (Truter, 1976). Это не означает, од­
на1ко, обязательного участия ионофора в транспорте ионо,в че,ре з
биологичеекие мембраны или БЛJ\ii; т:ранспортные функдии могут
подразумеваться лишь в том случае, к,огд,а ионофор выделяет,с я
из природной ионтранс·по.ртирующей системы. Большинство же из­
вестных антибиотиков, а также краун-ефиры и другие -синтетиче­
ские мем,браноактивные комплекс,оны, как известно, не играю т
-какой-ли,бо роли в биологических системах тран,сп,0,рта ионо в
(Shamoo, Goldstein, 1977).
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИОНОФОРОВ
И ДРУГИХ ИНДУКТОРОВ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАН
По •01пределению Truter (1976), ионофоры характеризуютс я
следующими особенностями: а) наличием в молекуле достаточно­
го количества атомо,в кисло.рода (или, реже, азота) для· о,браз о ­
вания ,сольватной оболоч1ки комплексируемого катиона; б) присут­
ствием определенных радикалов для придания липофильности на­
ружной поверхности комплекса ионофор-катион. Образующийс<~
комплекс может быть заряжен положительно, т. е. молекула ,соб­
ственно ионофора нейт.р,альна по суммарному заряду (группа не{r­
тральных ионофоров), или не несет заряда, в этом с.1учае сач
ионофор представляет собою анион и относится к г.ру1Пле карбок­
силатных ,ионофоров (Truter, 1976; Pressmaп, 1976; Gomez-Puyou ,
Gomez-Lojero, 1977).
Для ионофоро,в характерна высокая селективность про:це,сс а
образования комплекса с ионом и его транспорта через ме м-бран у ,
что обусловлено осо.бенностями ,строения ионофо'РОВ. Ошределяю­
щими параметрам,и -этих активно-стей являются динамические
конформационные характеристИlки соединения (Shemyakin et al. ,
1969; Pressman, 1976). Часто высокая избирательность обеспечи ­
вается образо,ванием неэ1шим,олярных комплексов типа «-сэндви­
ча» ионофор:катион (2:1, 3:1, 3:2), наиболее часто встречающихся
в ионных комплексах краун-эфиров (Pedersen, 1970).
Ионофоры обеспечивают -оптимальную кинетику процесс а
транслока,ц.ии иона: -эффективный транопорт п,редполагает доста ­
точно высокую ско.рость движения переносчика в мембране - д о
1;05 ионов/с (Pressmaп, 1976; Овчинников, .1978) . .Константа сsя­
зывания должна ,быть оптимальной по величине, так ~как образ о ­
lJ3ание и ,ра,спад 1ком1плекса ионофор:ка11ион ,на ,соответствующи х
сторонах мембраны .цолжны п.роисходить с максимальной ско­
ростью. Таким образом, ионофоры обладают уник.альными свой­
ствами.
92

Кроме 1v1обильных переносчиков (ионофоров) в исследованиях
н а мембранах различного происхождения широко используются
м олекулы, ассоциирующие друг с другом или взаимодействую­
щие ,с липидами мемб1Раны, формируя 'Водные ,поры ,или каналы,
пригод ные для св,абоsдной диффузии иона, так называемые «ква­
зи» -ионофоры (Pressman, 1976), «каналоф,о,рмеры» (Gomez-
Puyou, Gomez -Lojero, 1977), или «ионопроводы» (Овчинников,
1978) .
Каналоформеры отличаются от .ионофоров следующи ми осо­
бе н нос тями. Проводимость БЛМ в ,присутств,ии каналоформе,ров
п р опо рциональна n-й -степени концентрации соединения; имеет
вел ичину для грамицидина - 2 (Tosteson et al., 1968), для мо­
назо мицина - 5 (Mueller, Finkelstein, 1972), для а ламети цина -
6 (Mueller, J<нdin, 1968) и для нистатина - до 12 (Finkelstein,
Cass, 1968), что, по -видимому, объясняет,ся ассоциацией несколь­
ких мономеров в один фующионально активный канал. В фор ­
м ировании некоторых каналов участвуют и липиды мем,браны,
что усi'ановлено, например, .при образ·о,вании каналов полиеновы­
ми ;, нтиби-отиками (Борисова, 1979). При формировании канала
в .БЛМ наблюдаю т ся дискретные ска,чки проводимости (Gordon,
Haydon, 1972; Eisenberg et а ! ., 1973; Bean, 1978; Борисова, 1979),
об усл о вленные, вероятно, как образ ·ованием и распадом ин ,див.и­
дуальных лор, так и их переходами между «открытым» и «закры­
тым» состояниями в зависимост,и от -ориентации относительно
пло:к о сти мембраны.
С увеличением р.адиу,са Сто!<'са уменьшается mр·оницаемость ка­
налов для неэлект,ролитов (Finkelstein, Cass, 1968; Finkelstein,
1970).
.
,
При использовании «замороженной» мембраны ионофоры ре­
активны, т.огда ,как еффект грамицидина А ,в этих условиях ме­
няется незначительно (Krasne et a l ., 1971). Однако в слу,чае эф ­
фектов вал~иномицина на БЛМ из пальмитоиллец,итина э тот ,вы­
вод, по -видимому, неверен, так как при снижении температуры от­
м ечен о значительное уменьшение коэффициента распределения
:ионофора в системе БЛМ - вода (Benz et a l ., 1973) .
НЕЙТРАЛЬНЫЕ ИОНОФОРЫ
Валиномицин впервые был выделен Brockmann, Shmidt-
Kastner ( 1955), его структура установлена ,с применени ем опти­
ческих · •спект.ральных методов Шемякиным и др. (1963) и затем
подтверждена рентгенос~руктурным анализом (Nawata et al.,
• 1975) . .Валиноми,цин ,разобщает окислительное фосфорилиро,вание
(McMurray et а!., 1959), однако мех,анизм действия антибиотика
как к а лиевого ионофора был выяснен значительно по зже (Moore,
Pressman, 1964). Из ·в,сех существующи х ионофоров только ,ва­
л ин ом ~щин ,проявляет высочайшую К+/Nа+-из,6.ирательность (104),
что обусл овлено его уникальной пространственной • структур·ой
93

(Овчинников, 197,8). Синтезированы также многочис.11енны е ана­
логи ваiIИI-юмицина, позволившие установить связь между erG
химическим строениеи и биологическими :воuсл вами , дета.1ь н о
рассмотренными в ряде монографий (Овчинников и др . , 1'974; О в­
чинник ов , 1978) и обзоров (Pressman, 1976; В akker, 1979).
Группа эняиатица. Энниатины А, В и С -состоят из оста тк он
ок,сииз-овалер.и ановой кислоты, и, соответственно из ОС"Fат ков N -
метил-L,изолей,цина, N-метил,валина и метиллей,цина (Gaumaпп
et а !., 1947; Plattneг et а!., 1948). Впоследствии энниатино м С был
назван сннтетj,1ческнй цик ло г ек са п еп тид (М ихалева и др. , 1968;
Овчин ник ов, 197 4 ). Со всем,и ко~шлек:нруемы ~,rи кат ионам.и эн­
ниати ны 0:бразуют ,комплексы состава 1:1, однако по устой,чивостн
ка лиевы х комплексов значительно уступают друг ю-1 ме та ллсвязы­
вающим макро циклам, для них также характерна низкая ,К,+/Nа+­
из-бирательнос ть (Овчинников, 1978).
1\\аr<ротетралидны е нактины - ци, кл,ические 110 ;1иэфи,ры, 1ша ·с­
сиф,и,цируе~1ые по чис л у э т ильных радикальных т.рупп (Beck et а!. ,
1902) . Нактины
-
,первые полие·фи.ры с большим кол ь,цо :VI (32 ат о ­
:v1а), д.'IЯ которых -была определена конформа ,ция молекул ( Кi l­
bourn et a l. , 1967). ,В серии нактинов при переходе к высш им го­
МО J1огам ол,rечается у,величение антибиотической активности
(Меуегs et ai., 1965), к·онстант комплексообразования (Пресс~,1ан ,
1978), К+/Nа+-селективности, -что подтверждается повышением
способаости акти,вировать АТФазу :vштохондрий (Gгaven e t al.,
1966) . Установлена способность тетр ан актина (Oisl1i et а!., 1970)
це реносить Na+ из водной фазы в органи че скую (Ando, Na,v-ata,
1978). Пр .именение нактинов как ионофоров от.ра ниченно (Овчин­
ников, 1978).
М~1ф ощ11';лич~~1ще полиэ.фир;ь1<. Реа,1щия конденса ,ции э·покси­
этилена- с р.езорциноло:V1 в. п.ри.сутствии К:,ОН как к,онденои1р-ующег о
аге нта при1;1одит к образованию ,К+ - селективно,го ионофюра., наз­
ванного дибензо-l 8-короной-16 (рис. 1); 18 обозначает чнс,110 ато -·
мов в коль,це, 6 - число литандных атмомов кислород·а (Pedersen,
1967) (та,бл. l). К настоящему в.р.емен,и синтезировано более 200
представителей э1юго пер ,спективного класс,а нейтральн.ых ионофо··
ров, различающихся размерами ,цикла, природой лигандных ато ·
мо в и за,,1естите.1ей, комплексонными ,свойствами и биол0тическоii
акт.ивностью (C l1r i s t eпse n et а ! ., 1974; Pressm an, 1976; Harris et
al.,
19}7; ТаJщ,,1уха:v1.едов и др., 1979; Tasl1m u khamedov et al. ,
1980).
Работы , проводимые ,в нащей лаборатории (Ташм:ухамедов• и
др., 1979; Ш..кинёв и др . , 1979 а , б) показали, что модифи.ка1ция 15-
и 1Кчленных ма.кроциклов существенно уJ;1еличива,ет мембр.анную
акти,в.ность этих краун -эфи,р,ов.
Мы исследовали различные диа,циллроизводные дибенз0- 1l 8-ко­
ро ны-6 (соединения 1-9, табл·. 1) на м,ем,бранах митохо.ндрий и
саркоплазматнческого ретикилума (СР). Синтез диа,ц.и.11ы1ых
п рои:зводных описан ранее (Ташмухамедова .и др., ,197:8 <1, б).
94

Митохондриальные мем6раны - классический объ ект для ис­
следования ионофо,рных св:ойств раз л и чных соединений (Овчинни­
ков, 1974) . В та<бл . 1 при.ведены данные по влиянию различных
д иащ\лп:роизrводных дибензо - 18 -
кор оны-6 (соединения 1-9) на
проницаемость в1нутренних м~е1м­
бран м~итохо1нд:рий для нитратов
,различных одно- 1и дву хв,алент-
. ных
кати.онав. Пос кольку нитрат
я,в ляеrоя пр -о никающим ,а1нионо:1,1
(Brierley, 1974), э нергонезави­
симое набухан ие митохондрий ли ­
ми тируется только скоростью
трансмембранного переноса ис­
сл,едуе,мого ка11tюна.
Ри с. 1. Структурная формула диб ен­
з о- 8 - короны-6 (Pederseп , 19 67). В
cn учае ацильн , п прои з водных цикло ­
полиэфира !~1 =l{2 и означает аце­
тил-, пропионил-, бутнрил- и т. д.
Ис ходные ,циюrопо,лиэфиры - 18- ко.рона-6 и диlбензо-18 - коро­
н а-6 в конце нтрации 5 мкМ прак тиче,ски не ,влияют на проница е ­
мость митохондрий, в то время как исследо ван ные диа .ци лпроиз-
Таблица
Влияние различ1-,ых диаци лп роизв одны х дибензо-18-к о ро н ы-6
1·5 х 10 - 5 М) на скорость эн ер го не зависи мо го набухании митохондрий
(ЛЕ520/ми н) в различных солевы х средах
N
соедr-111е 1-11!я
1
2
3
4
4а
5
(j
7
8
9
Контроль
Ацетил
Пропи онил
Бутирил
Бутирил (цис)
Бутирил (транс)
Валерид . (транс)
Гексанои-л.
Геп;галоил
Октаноил
Бен-зоил
15.4
15,1
19,0
39,5
36, 1
48.9
60!.О
30,8
21.,4.
15,8
15·,i'
0.5
0,5
6,0
10,0
9,3
20,0
25,0
27
2:0
0,6
0;_52
2,2
2,9
7,3
15,2
13,9
15.8
44,0
14 ,9
9,8
2,7
2,2
4,5
4,6
6,8
6,7
7.1
6,8
47,2
14,8
10 ,3
4,9
4.6·
Na+
1,6
2,0
1,7
1,8
1,8
2О
9;5.
2,3
1,8
1,8
1',6
Пр им е чан и е. Вр всех случаях_ , к,ро"(е оговоренных особо, исполь­
зовались смеси изомерq.в (R 1 -за,местит,ель в пqложении- 4', R 2---,-в положени н
4" и;ли , 5" бензольного к<>л ,ьца, см . T<JK)ICe - рис. 1).
водные юФензо-1.S-~юроны-6 обладают значительным ионофорным
эффекта~. Наибольшее увеличение прqницаем'Ости вызывают диа ·
~и:лп_Rqцзводные, со·держащие цепочку из 4--15 атомов углерода
при бензолью:JIХ колр,цах (соединения 3--,5). При этом ,соедине­
ние 5,, обладающее максимальнq1,м. вффектом, пра,ктически не про ­
являет селективности по отношению , к одновалентным катионам .
95,

Соединение 4а ,существенно увеличивает проницаемость .для Са 2+
и Mg2+ уже ,в концентрации 10 мюМ. Повышение концентрации до
50 мюМ вызывает ,резкое увеш1,чение проницаемост.и для ионов
,са 2+ и более слабое - для Mg2+; проницаемость для одновалент­
ных катионов при этом практически не изменяется (рис. 2).
Укорочение или дальнейшее увеличение (,соответственно соеди­
нения 1,2 и 6-'8) углеводородной цепочки ацильной группы, а так­
же .замена ее на бензоил ( соединение 9) приводит к снижению
эффективно,сти действия комллексона. Следует ,отметить, ,что все
диацильные ,произвО'дные индуцируют значительную проводи­
мость по водороду.
Изменение прони,цаемости мем.бран митохондрий ,в присутствии
диаци.льных про.изводных может быть продемонстрировано также
LJE520/MU/lxf{l{J
ct1• о
JO
20
!О
12,5
25
37,5
50
Концентрация полизФUJJD, мкм,
Рис. 2. Влияние соединения 4а на набухание мито­
хондрий в присутствии одно- и двухвалентных
катионов,
в опытах на энергизованных митохондриях ,в условиях транспор­
та Са 2+. На добавление небольших количеств Са 2+ энергизованные
митох,ондрии отвечают кратковременной ,стимуляцией дыхан,ия
(,рис. 3). Циклы активации дыхания, которые могут быть повторе­
ны несколько раз, обусловлены использованием энергии мембран­
ного потенциала на транспорт ионов Са 2+ внутрь митохондрий с
помощью эндогенного кальциевого ,переносчика. В присутствии не­
которых :комплексонов (А 23,187, Пiро,ста,гландины) доба·вление Са 2+
к энергизо.ванным митохондриям вызывает не циклическую, а дли·
тельную стимуляцию дыхания (Reed, Lardy, 1972; Malmstrom, Ca-
rafoli, 1975). Причиной этого является 1индуцирован,ный ком[1лексо­
ном циклический обмен содержащегося внутри митохондрий Са2+
на на1ружный Н+, Аналогично действуют соединения 4а и Б мень­
шей степени - 2 и 5, что коррелирует с влиянием исследованных
,циклополиэфир·ов на проницаемость митохондрий .
·Об

Система транспорта двухвалентных катионов в митохондриях
пе чен.и не ,взаимодействуе, ,с ионам,и магния, поэтому дыхание ми­
тох ондрий при добавлении этого катиона, в отличие от Са 2+, не
акт ивируетоя · (1рис. 4), однако 1в пр,исутствии 50 мкМ соединения 4а
до бавление Mg2+ вызывает 6 - кратную стимуляцию дыхания ми­
тохо нд,рий. Таким же эффектом обладают, как и в других 0П1исан­
ных выше экспериментах, то.лько соединения 2 и 5.
Генера~ция на внутренней мембране митохондрий электриче­
ской разности потенциалов со знаком «минус» .внут.ри органелл
\1'
1\\\\;
!..
'
\1
1\1
lLl
(Mitchell, 1968) позволяет использо­
вать их как идеа льную систему для
исследования электрофоретическо­
го перемещени я катионов с по­
мощью нейтральны х ионофоров, в
частности валиномицина (Овчин­
ников и др., 1974), линейного
кальциевого комплексона (Саго-
Рис. 3. Действие диацнлпроизводных ( 1-9) дибензо - 18-кr>р о ны-6 (5- 10 -5 М)
на дыхание митохондрий печени крыс в присутствии 200 нМоль Са 2+ .
0-контролu; стрелн:ами обозначен момент доб авлешнr Са2+ .
Рис. 4. Действие диацилпроизводи:,1х: днбензо-18-корJны - 6 (5 - 10 - 5 М) на ско­
рость дыхани я митохондрий в присутст в ии 5 мМ Mg2+ (момент добавления
показан стрелкой). Обозначения те же , что и на рис. 3. Цифрами у поляро-
грамм отмечена скорость дыхания. нг-атомы кислорода/мин• мг белка.
ni et а ! ., 1977), митохондриального переносчи ка двухвалент­
ных катионов. Рис. 5 (а, 6) демонстрирует способность соединения
4а пр ,омотировать транспорт Са 2+ в митохондриях, собственная
систе ма переноса двухвалентных катионов которых заблокиро.ва­
н а рутениевым 1<.ра,сным. В присутствии дибутирилпроизводного
митох ондр и и транапортируют Са 2+ даже на фоне ингибитора, од-
7-156
97

нак·о с меньшей скоростью, :чем интактные орг анел лы. Рутение­
в ый храсный не ·влияет на кальциевую пр ,они,цаемость митохонд­
рий, и,ндуциро~ванную ,соед,инением 4а (р ис. 5, в). П ри использо­
вании более ·высоких концентраций циклополиэфира описа1нный
выше индуци,рованный транспорт Са 2+ в митохон·дриях не пр о ис­
х од1ит, оче,видно, из - за индукции суще,ствен,ной пров одимости по Н+.
Характерно, что ·нейтральный кальциевый ио:нофор, иссл е;Д о,ван -
FССР
1
Мх
1
Флvо!Нilенц11я а --
хлортет1хш11кшна \
ЗS5/520НМ RR
: IMllH •jj
1
о - \ ~ ,кцuют Ди{fутuрил
2+ у,
са
RP
f!IШH.
1 диоутuрил
1
AJA0
0.2
S!J ШО
200
ЗОО
400
концентщщия циклополиэrриро,мкМ
Рис. 5. Блиянпе соед и нения 4а на Кiiнеп1"у эн е ргозависи м ого по г лощения
Са2+ митохондриями (а, б) и кннетиl{у энергонезависимого пабухания мито­
хондрий в 0,08 М нитрат"е Са 2+ {в) 13 п рисутствии рутен и евого красного (РК).
а-J<онтроль; nуюпиро.'1 показан хо д кр 1 1 0ой в отсутств :,~ е ц нклоп олнэф ,:ра. стрелками-мо­
менты .1обае л ения соединений.
Рис. 6. Влия н ие циклополнэфира 4а на пел11чину отн ос ительн ,, rо изменения·
Са - зависимой А ТФазiiой а:пивностн (/) и ~ о зффициента Са 2+ / АТФ сарко ­
плазматнческого ретн;;улума мышц крол;1ка ' (2).
ный Caгafoli (Сагопi et а!., 1977), и ндуцирует JJр ово ди мость
меУ1,бран митохо ндрий по Н+ .
И ндукция циклополиэфирами на16ухания деэне рти зованных ш1-
тохондрлй в растворах нитратов :двухвалентных ка тионов свиде­
тельствует об «электрогенном» характере осуществляемог о ими
пере н оса катионов. Вместе с тем, способность етих со единений вы­
зывать лроницаемость по Н+ п,ри,водит в случае энертизованных
митохондрий к более слож,ным функциональным эффекта·м , •кото­
рые в знач .ителыной мере зависят от кон;центр .аци и полиэфира.
Кальциевые ионофоры, описанные ·в литературе (т абл. 2 ) , к ак
правило, ингибируют аккумуляцию · -С а 2+ в са р1< оплаз матиче:к о м
28

~·
Некоторые характеристики ионофоров для двухвалентных катио :1ов
Сое~11не11ие
Нейтральные
ионофоры
Авеиациол1щ
Бове рицин
Нейтральный ко~ш­
лексон
Нейтральный ком­
nлексон
Диамидные ли­
ганды
Дициклогексил-18-
корона - 6
Дибутирил-ди ­
бензо-1?-коро~чН,
Источн11к выдел е ния
Beauveria l)ass ia-
пa
Синтетическ1111
аналог
Синтетический
-
-
-
~" -:: -•'
-
/\'\ехэнизм 11н11укции
проницаемости
Ионная селект11вност~ и с~1стема
т ~ сп1ровання
Электроrенный J са2+ > Mg 2 + > к+ (дву-
nеренос, сим порт А - фа з ная система)
Э лектроrенный
перенос
-·-
.
o:::w-· ~
Са2+>!(+>с,+>Li+>
> Na + (дв у фазная с11стема)
Ва2+>Са2+ >Rb+=
=К+ > Na+ > Li+ (двуфазная
система)
Са2+ >рь+ >к+>Ба2+>
>Cs+>Sr2+>Na+>Li+>
> Mg2+ (электрод)
Са2+ > к+ > н+ (мито­
хо ндрии)
Na+>к+;са2+>sr2+>
' > Ва2+ > Mg2+ (комплек­
сообразование)
дg+>к+>Rb+>NH,+>
Cs+>Na+ >Li+;Ва2+ >
>sг2+ >Са2+>Mg2+
(,комплсксообразование)
Са2+>Mg2•1->н+>
> к+ > Nil+ <~щтохо11дрии)
Таб лица 2
Ссылка
Truter, 1976; Harr i , ,
Wiml1ur s t , 1973
Priпce, Crofts, St eiп ­
rauf, 1974
Roeske et а1., 1974
А111 111ап et al., 1972
Сагопi et al. , 1977
Wuп et al ., 1977
Pre ss maп , 1976
Ташму Хq l,Jедов и др. ,
1979

~
.••· О
··. О
Соединени~
Гликопротеид
Нарбоксилатные
ионофоры
А 23187
Лазалоцид А
(Х-537 А)
Иономицин
Антибиотик 6016
Лизоциллш1
Источниi< выделения
А ТФаза мито ­
хондрий
Механизм: инду!{ции
проницаемости
Каналоформер
Stгeptomyces I Ме2+ / н+-обмен
c l1artreuseп s i s
Streptomyces Ias 11- 1 Ме2+ /н+-обмен,
Iieпsis
протонофор в вы­
соких концентра­
ция х
Streptoшyces J Ме2+/н+ -обмен
conglobatus А ТСС
31UU5
Streptomyces s p . 1 Ме2+ /н+-обмен
Streptomyces
I Ме 2+/ н+ -обмен
cacaoi v. asoensis
ПродолжеЬltе 'tiloJHiцы 2
Ионная селеюивность и система
тест1-_1рования
CcыJ11< ii
Са2+>Sr2+>Ва2+>
1 Лукьяненко и др. ,
> Mn2+ > Mg2+ > к+ >Na-1- 1980
(БФМ)
Mg2+ > Са2+ > S1'2+
(комnлексообразование)
i;Li+> Na+ > к+;мп2 +>
>Са2+>Mg2+>S1"2+ >
> Ва2 + (комплексообра зо­
вание)
н+>cs+>Rь+>к+>
.Na+ > Li+;Ва2+ >са2+ >
>Mn2+>Sr2+>Mg2+
(комплексообразование)
Са2+>Mg2+>Sr2+ >
Ва2 + (комплексообра зова- •
ние)
NHJ =к+> Rь+ =Na+>
Li+= cs+;Mg2+ > Мп2+=
= Са2+ >Sг2+=Ва2+
(комплексообразование)
Rь+>к+>Na+ > NHt>
Li+ > cs+;Ва2+>Mg2+=
Mn2+ > Sr2+ > Са2+
(комплексообразование)
Caswell, Pressmaп,
1972
Pfeiffer, Lal'dy, 1976
Celis et а!., 1974
Patel, Shen, 1976
L iu , Неrmапп, 1978
Otake, Mitani, 1979
Mitani et а!., 1977

Соединение
Салиномицин
Кальцифорин
Децил-2
Другие соедине­
ния-ионофоры
двухвалентных
катионов
Виридотоксин
Простагландины,
Е1,
В2, Е2 и водо­
растворимое про 11 з с
во,1\ное Вх •
Источник выделения
Streptoшyces
albus
Внутренняя мем­
брана МИТОХОН·
дрий сердца те­
ленка
Синтетический
циклопептид
Aspergilllls v iridi-
шнtans
Предстате л ьная
железа
Механизм индукции
проницаемости
Ме 2+ / н+-обмен
Ме2+ / 1-1 +-об~1ен
Ме2+/ н+ - обмен
Предполагается,
что атомы кисло­
рода выстраиваются
внутри мембраны
и служат ионооб­
менником для каль­
ция
Ме2+/н+ -обмен
Продолжение таблицы 2
Ионная селе1<тивность и система
тестирования
к+>Rь+>Na+ >Cs+=
= Li+; Mg2+= Са2+ (мито­
хондрии)
Са2+>Sr2+>Mn2+ >
Mg2+ (комплексообразова ­
ние)
Са2+ > Mg2+ (двуфазные
системы)
Са2 + , Mg2+ (комплексо­
образование)
Са2+ > Sr2+> Mg2+
Са2 + (двуфазные сие ,
темы )
Ссылка
Mitani et а!., 1975,
1976
Jeng et а]., 1978
Deber et al. , 1978
Wong, Hami!I, 1976
Kirtland, Ваuш , 1972;
Carafol J, Crovetti
1973
Cars tein, Muller,
..
1978; Olшishi et al . ,
1979

.102
ё
:s::
:,:
:т
о,- .
u
:s::
i
~о
u
.s
'О
с::
о
с:о
:с
OJ
::;;
\О
<?
+
:с
------
:,: :,:
=:с
а. OJ
ее; ::r
:,:: OJ
о t::
><
о-
,-.
"'
:,: .::f
~ ci.
OJ
u
,:,;:
:з
:с
:,::
OJ
'-
о
а.
,-.
u
:,: о
OJ :,::
1=; OJ
(!) а.
:,:
:,:
а.
ос(
:,::
о
OJ
t::
><
о"'
,-.
::f
= ос(
~ а.OJ
u
'u
u
t + .,...,_
~ СtЗ:а
u z::.
:,:
<IJ
:с
::.
OJ
\О ::;;
о\О
+'9
:r: +
------
:i::
+ ------
""
+
OJ
OJ
~~
OJ
,-.
ретикулуме, вызывая утечку
Са+2 наружу по концентраци­
онно му градиенту (Cas,vell,
Pressman , 1972; Caroni et al .,
J977 ). В интактном ретикулуме
АТФ - зависимый
Са 2+-насос
поддерживает примерно 1000-
I<рат ный градиент ионов Са2+.
Энергетическая эффективность
насоса характеризу ется отно­
шением Са 2+/АТФ, равным 2 в
оптимальных условиях (Бен­
долл, 1970).
Диацилпроизводные дибен­
зо - 18-короны-6 снижали вели­
чину Са+2/АТФ на СР с той же
зависимостью от длины заме­
стителей в боковых цепях, что
и на митохондриях, т . е. наи ­
более активными были соеди­
нения 4а и 5.
Действующие концентрации
циклополиэфиров в экспери­
ментах на СР были в несколь­
ко раз выше по сравнению с
таковыми на митохонд рия х. На
рис. 6 показана концен тра ­
ционная зависимость эффектов
соединения 4а на величину
Са 2+/АТФ и АТФазную актив­
ность СР. Из представ ленны х
данн ых следует , что Са 2+/АТФ
уменьшается на 50 % в присут­
ствии О, 15-0,17 мМ соедине­
ния 3, с увели чением концен­
трации комплексона снижается
АТФазная активность. Это тор­
можение имеет неспецифичес­
кий характер и отмечается да­
же в случае· малоактивных про­
изводных 7 и 8.
Относительно низкая эф­
фективность на СР исследован­
ных производных дибензо - 18-
короны-6, по - види мому, обус­
ловлена физико-химическими
особенностями его мембран, в
результате чего может сни-

жаться как коэффициент распределения ионофора в системе мем­
брана-вода, так и скорость его диффуз ии внутри мембраны .
Интересно й особенностью ,соединения 4а является то, что ег о
действие ,на -Са-,насос СР полностью пр едотвращается .гидрофоб ­
ным анионо м тет.р афени лборатом (ТБ), доба·вленным до ионоф о ­
ра (,рис . 7, в) . Эфф ект ТБ не проявляется при другой послед о ­
вате льност и дабавок (рис. 7, 6 ). Аналогичн о ТБ действуют 2 ,4 -
динитрофенол и FCPR (п -трифторм етоксифенилгидразон динитри­
ла мезо:к;салев ой кислоты). Влияни е гидр офобны х анионов не
проявляется в ,случае А 23·187 (рис. 7, г, д ), с другой стороны, их
лрис,утствие в среде необходимо для ,реализации эффек та н ей -
:tA оУ'
А Ctl' Б са''
~~~т-;
20онмолеин
АВ
1!
\ fMUН.
Рис . 7. В лн,нше Т Б на ин д уцированное ионофорами сни­
жение коэф фициента Са2+/ АТФ саркоплазматического ре-
,
тикулума.
добавки: А-ТБ (2-!о-6 М), Б - uш,ло11оrи,,lн1р 4а (1 ,5 -10
--4.М),
В-sсоссофор А 23!37 (9-10 - 3 М). Циф ры у К[н1в1,1~-тр; нсп ортное отно­
шею,е Са2+ /АТФ.
трального кал ьциевого комплексона (Caroni et а!., 1977) . Сущес т ­
вует несколь,к о путей ·влияния ТБ на инду,uированную провод и ­
мость ·м ембр ан, в частности компенса1ц:ия диполыной составляюще й
грани~чного скачка потенциала мембраны, титрование комплексо в
ионофор-к ат.ион в водном растворе, ведущее к ингибирован,и ю
проводимости , ней трализаци я положительного заряда комплекс а
в гидрофобн ой зоне мемб.раны, ускоряющая его диффузию (Ов­
чинни:к;ов и др., 1974; Caroпi et а!., 1977) и т. д. Эффект ТБ на
ионофорную ак тивность диацилпроизводных не может •быть ,одн о ­
з· начно инте рпретирован в ~рамка х этих механизмов и требуе т
дальней ши х и сследований .
.Анализ ионофор ны х свойств произ водных бе нзо-15- короны - 5
( Шк и нёв и др., 1 979а) по каз ал, что алкильные ,производные, п о
сравнен ию с аuильн ым и, обла,д ают более -высокой мембранн ой
активность ю. А~шл - и гексаноилпроиз1водные этого циклополиэфи­
ра инду~ци.ру ют прон ицаемос ть мемб ран митохондрий в ос1-ювно:УJ.
для ионов Na +. Отн осителы но ·высокая селективность по К+ отме -
103

чена у бензо-15-короны - 5 и её валерил- и бутирилпроизводных. Ге к ­
саноилбензо-15-корона-5 промотирует также прон и цаемость по
двухвалентным катионам, т. е. селективность его низка .
.Среди ацил1производ~ных бензо-18 - короны-6 (Шкинёв и др.,
1979 6) наиболее активными были пропионил - и валерилпроиз1в од ­
ные, од,нако мембранные эффекты последнего малослецифичны. В
целом исследованные лолиэфиры были в lб--,20 раз менее актив­
ны, чем их симметричные анал01ги . (та1бл. 1). Эти ;ра зл и ч,ия, по- ю1 -
димому, обусловлены изменениями ,элект.ронной плотности на ли ­
гандных кислородах «полости» несиммет,ричных бензо - 15 - коро·н ы -5
нмеменEt н .Ме
'
~t
он
НО
нонь нoWEt
и бензо - 18 -короны-6 н
связанной с этим неста­
бильной фи ксацией ка -
А тиона внутри ее.
ме
'ме
в
Рис. 8. Формулы природных кальциевых •
ионофоров: Х - 537 А (лазало ц ид) А, А 23187,
авенацнолида (по Truter, 1976).
Таким о бразом, пред-
ставленные нами данные
свидете льств уют, что не ­
которые из исследован­
ных нами производных
бензо-15-короны-5, бензо­
и
дибенз о - 18-короны - 6
промот ируют перенос од -
но - и двухвал ентных ка ­
тионов через мембраны
митохон дрий . и сарко-
плазмати ческ ого ретику-
лума и могут применять­
ся в исследо ваниях тран ­
спортных
систем этих
органел л.
Другие нейтральные
ионофор ы , применяющие­
ся в биологических экспериментах, представлены в табл. 2.
Авенациолид представляет собой фунгицид (рис . 8). При дей­
•ств:ии 'На митохонщри,и он высвобождает Са 2+ и незначительные
количества Mg2+, в модельных эксперимент.ах пока зана его .спо­
собность переносить Са 2+, Mg2+ и К+ из водн ой фазы в органиче ­
скую (Harris, Wimhurst, 1973, 1974).
Боверицин, относящийся к группе энниатинов ых ан11ибиот.иков,
но отличающийся наличием ,в своем со•ставе остатков N - ме т ил - L-
• фенилаланина (Hamill et al.,
1969), в двуфазн ых с истема х свя­
зывает Са 2+ (Prince et al., 1974). ,Нейтральные комп лексоны, диа­
мидные лиганды и гликопротеид из митохонд,риалыной А ТФазы
ис,пользуют,ся ·в .исследованиях Са - насоса.в кле тки, а также в опы­
тах по реконст.руwции Са 2+-тра 'f\1Спортирующих систе м (Caroпi et
al., 1977; Bakker, 1979; Лукьяненко, ,}980).
•
104

l(АРБОI(СИЛАТНЫЕ ИОНОФОРЫ
В отличие от нейтральных, ион офоры карбоксилатного тила
(та,бл. 2) характеризуются ациклическим строением и нали чием
терминального кар,боксила (пр,и связывании двухвалентного ка­
тиона (Ме 2+) они образуют циклическую структуру с помощью
Н+-связи между карбоксильной и спиртовой г,руппами по типу
«голова» к «хвосту»), tдиосоц,иирующего при нейтральн ых рН
(Truter, 1976; Gomez-Puyou, Gomez-Loj ero , 1977; Bakker, 1979) .
В прирмных и искусственных мембранах эти ионофоры катали­
зируют электринейтральный обмен катионов на протоны (Bygra-
ve, 1977).
Лазалоцид А ,с •О1'Носительно низкой селективностью ,связывает
и пер ,еносит одно- и . двухвалентные катионы, а также биогенные
амины, что опредеJJяет широкий спектр его биологических эффектов
(Pressman, 1973; Schv.rartz, Entman, 1973; Юtа, vап der Юооt, 1974;
Gomez-Puyou, Gomez-Lojero, 1977; Bakker, 1979).
А 23187. ФундаментаJJьное ,отличие А 23187 от лазаJJоцида А
заключается :в том, что в его молекуле и:vrеются 2 атома азота
(\\Ton g et а!., 1973), уча,.::твующие 1в -связывании ,катиона, что обу­
словливает высокую -селективность по дву.хсв· алентным катионам
(Pfeiffer, Deber, 1979), тогда как Х 537 А не содержит в молекуJJе
атомов азота (Jolшson et а!., 1970). Reed, Lardy, (1972) пока заJJи,
что А 23187 п,роникает в мембрану митохондрий и фунюционирует
как мобильный переносчик Са2+ и Mg2+, вырашшвая концентра­
цио нные градиенты этих ,катионов на мем;бране . Исследования про­
цессов окислительного фосфорилирования и тра.нспорта Са 2+ в ми­
то хондриях показали (Wong et а!., 1973), что эффекты ионофора
:в значительной мере зависят от присутствия .в среде Mg2+, ко~ш­
лексируемоrо значительно легче, чем Са 2+. Этим и -объясняется
об.ращение эффекта ионофора при добавлении ионов Mg2+. В
б иологических 01<1спериментах А 23187 используетс5;1 как Са 2+-,се­
лективный ио·нофор, однако недавние сообщения Hovi et al.,
(1975) об экстр -акции им аминокислот в неполярную фазу, а так­
же F!atman, Lew ( 1977) о спосо,бности ,промотировать тра1нспорт
Na+ в эритроцитах указывают на необходимость б олее внима­
тельного .подхода п.ри отнесении наблюдаемых биологических эф­
фектов только как к следств,ию исключителыно т,ранспорта катио­
но,в.
По-видимому , эту задачу помогут разрешить ионофоры, более
специфичные g отношении транспортируемых катионов. Исполь­
зован и е антибиот,ика 6016, имеющего в св оей структу,ре дополни­
тельную ОН-группу и углевод ный остаток, что, по мнению Ogita
et а!. (11979), определяет его .Мg 2+-с п ец:ифичность, иономи,цина,
селективность которого по Сг 2+ превышает таковую для А 23187,
и синтетического Са 2+ - связываю щего ионофора деци л - 2 (табл. 2),
вероятно, поз,волит более однозначно .интер,претироват ь б иолог иче­
ские эффекты ка.рбок,силатных ионофоров в целом.
105

Влия.ние пр иведен н ых в табл . 2 карбоксилатных ионофоров ,на
мета'6 о лиз ,v1 субклетачн ых компонентов , отдельных клеток, тканей
и цел ьlх ор ганизмов детально обсуждено в ряде обзоров (P ress-
ma n , 19 76; Bygrav e, 1977; Bakke г, 1979) .
К роме ,ра ссмот.ре нных 1выше соединений, в литера туре описана
сер ия др уги х поте н циал ь н ых индукторов п роницаемости мемб р ан
дл я д,ву~вале н тных катио но в. В о с-}ювнс}м это соед,инения прир од •
ног о происхо жден и я, однако и х мемб.раноактивные свойства ох а ­
рактериз о ваны недостаточно полн о. Низ~юмолекуля:,рны й гидр о­
фобный и о н офор двухвалентных ка тионов из м-итохондрий, оп и ­
са нн ый в лаборато р иях Blondin (1974 ) и Ташмухамедова (Мах­
муд ова и д р ., 1976 ), по-в ид имому, я-вляет,ся: с остав-ной часть ю
Са 2+- т,р анспор тирующей системы эт.их органе л л. Позднее Bloп diп
(1975) подверг эту жирорастворимую мембранную фракцию
фр а к ц.и они~р о ва,нию, ,в ,результате че ю ~бь!Лlи идентиф ициро'ваны
10 1п р оизв од н ых октадекадиенов ых кислот с ионофорными -:вой ст ­
в ам,и (табл. 2 ) . Однак о э т и исследования Blondin ( 1975) не наш ли
продолжения и н е имеют резо нанса ·в литературе.
Зн а чите л ьный интер1ес пред ставляют мембраноакти~вные свой ­
ства пр остагланд инов - -в ы сокоэффективных .ре гулятор-ов клеточ­
ного мет або лизма и ,Са 2+- з а ви-симых процессов. ~Сущес тве нно, что
пр ост агланд и ны вл·ияют на а ккумуляцию Са 2+ в изолирова!нных
:ми тох онд риях ( Carafoli, C r o ve tti, 1973), по-видим-ому, стимулируя
ТJ. роцеос обмена Н+/Са 2+. В связи с этим необходимо отмет ить
структурное схо дств о п рост агла,ндинов и в ыделе нных из митохонд ­
р ий про изв одных окт а1декащие новых кислот.
ПРИМЕНЕНИЕ ИОНОФОРОВ И ПЕРСПЕl(Т И\3Ы
ИХ ПРАКТИЧЕСКО ГО :НС!ГЮЛЬЗОВАНИЯ
В насто яще е -в.р,емя со единения с ион оф о рными с,вой-ствами
находят широкое применение как в биологии, так и при решении
некоторых п рикла дн ых зад ач, связанных с проблема м и мед и•ЮНiЫ ,
сельского хозя,йства ,и некоторых техн ологических п ро-це.:::сов . В
частности, с прим-енением ионо фор ов быпи оценены в ажные · каче ­
ст в ен ные и количе стве н,ные ,пар а метры функци о ни,р-ования- мем ­
бран (Овчинников и др., 1974) , исс лед ованы основ ные постулаты
хе м и ос мотической теории Ми-гч ела (Скулачев , 197.2). Рассматри­
вая приклад,ные а:::пекты испол ьзова ния ионофоров, пр,ежде вс его
следует отметить фармак ол огически е эффекты лазалоцида А и
А 23 1'87 (P r essman, 1973, 1976; Bygrave , 1977; Bakker, 1979), при­
м ен ение нон офо ро в в качестве акт,ивных компонентов ионсе лек­
тивных эле кт р одов (Sch ol e r, Simon, 19 70 ; Rechnitz, Eyal, 1971;
L eB lanc Yr., Gr ubb , 1976), или биодег.рад ируемых селективных
пестицидов с низкой токсичностью для теплокровных (Ando, Na-
,vata, 1978) .
С инте тические ионофоры - мак,ра,циклическ.ие полиэфиры, в
-отличие от ионофо ров ми~роб ного прои:::r-ожден ия, характери -
106

зуются относительно высокими эффективными концентрациями
и другими свойствами, неблагоприятным и для мембранной актив­
ности, в связи с 'Чем в биологических экоп ериNoентах соед,инения
этого типа п оначалу использовались отранич.енно (Tosteson, 1968;
Lardy , 1968; Estrada -O, CaraЬez , 1972). Основное применение wш
было на й дено в химии и технике (Овчинников и др . , 1974). Так,
с пом о щью полимерны х производных бензо - 18-короны-6 получены
перспективные твердые и жидкие комплексаны - ионоо.бмешшки, со ­
чета ю щие в •Себе свойства катио н итов и анионитов C'vVoлg et а!.,
1974). Ма1~роциклические полиэфиры используются в •Насто ящее
время для экст ра кции некоторых металлов, активац ии анион ов
в ,реа1щиях органического синтеза, перевода солей металлов в ор­
ганич е скую фазу, стабилизации не обычных ,состояний окисления
и т . д. (Овчинников , 1978).
К настоящему времени офера применения син11етических мак­
роцикличеоких соединений значительно расширилас ь. Полуrчены
так называемые кри п танды, способные переводить в водную или
органическую фазу труд,нораств,оримые соли ,некоторых металло в,
связывать анионы и друлие молекулы, а также катионы перехо д ­
ных и тяжелых металлов. Лиганды етого т ипа представляют зна­
чительны й интерес как агенты, . пр игод ные для регуляции уров ня
токсических катионов в биосфере (Овчиннико·в, 1978). Представи­
тель кр а ун - эфиров - 24 - корона - 8 примерно в 200 раз увеличивает
растворимость радиоактивно го стронция в органической фаз е,
что позв оляет с п омощью этого циклополиэфира удалять до 99,9%
90 Sr из яд,ерных отходов (Gerow, Davis, 1978).
Чехослова,Цкие и·сследователи ,разработали серию мембра н ных
электродов на основе мак,роциклических пол.иэ-фиров с 18 - и 30 -
членным 1юльцом, 1юторые обладают К/Nа - из'6ирательность ю
ниже, ч ем ЭJ 1 ект,рО1ды •С вал,иномицином, •НО тем н е менее мо,гут при­
меняться на практиwе благодаря ряду специфических свойств
(Petraлek, Ruba, 1974). Способность макроциклических полиэфи­
ров связывать катионы органических аминов используется также
в эн зи молоrических и мем-бр анологи ческих ~исследованиях (Cram ,
Cram, 1974; Izatt et а!., 1978).
,Опюсительно простые по сравнению с природными комплек ­
сонами си,нте тические соединения с ионофорныlVнI свойствам.и ус­
пешно применяются в ряде ла,борато,рий для анализа взаимосвязи
экст.рак;ционнай или м1емб.ранной актиВ'ности и особенностей хими­
ческ о й ст,руктуры . Использовав эт от подход для «проектирования» ·
мо.л екул ма1к·роцикли·ческих полиэфиро в, Крам ,и др. (1975) оинте­
зировали опт имальные по строен ию макрсщиклы, позволивши е
осуществи ть полное раз деление энан ти ом еров рацеми ,ческих сме­
сей ам и нокислот мето1дом жидкостн ой хроматографии. Интерес ­
ным с точки зрения анализа ~структурно-функциональных свойст в
явилось также ком,плексное иссJТ. ед ов ание ацильных, алкильны х
и а - оксиалкильных произ1во дных бензо,15 - короны-5, бензо- и ди ­
бенз о - 18 - короны - 6, дибензо-24 - короны- 8 и дибензо-30 - кор_оны-1 О
107

(Т ашмухамедов и др., 1978; 1979; Tashmukhamedov et al., 1980),
выпол,ненное в нашей лаборатории. В результате были идентифи­
циро.ваны соедине ния , обладающие свойствами ионофоров, селек­
тив,ных по одно- и двухвалентным катионам на биологических
:v~:ем,бранах и моа:~,ельных систе?11ах.
Л ИТЕРАТУРА
Бен дол .п Дж. «Мы шцы , молекулы, движение» . 1970, М.
Б_ ори с о в а fl ·'l. П. 1979. «Свойства ионных каналов, образуемых полиеновыми
ан тибиотиками». Автореф. канд. дисс., М.
Крам Д. Дж. и др . 1975. «Химия гетероциклич. соед . » 10, 1299.
Лев А . А. 1976 . Моде.пировани е ионной избирательности клето чны х мем­
бран" Л .
Лукьянен1,оА. И.,Берестовский Г. Н., ЕвтодиенкоЮ.А. 1980.
«Биофизи!(а», 25, !, 82.
Ма хмуд о в а Э. М. и др. 1975. «Биофизика», 20, 225.
Мих ал ев а И. И. и др. 1968. «Журн. общей химии», 38, 1229.
Овчинник о в Ю. А.. И ван ов В. Т., Шк роб А. М. 1974. Мембраноактив­
ные комп лексоны. J\'1..
Овчинник о в Ю. А. 1978. В кн.: «Итоги и перспективы развития биоорга-
нической химии и молекулярной биологии», 128.
П ре сс м ан Б. К. 1978. В кн .: «Неорганическая биохимия», т. 1, 246.
С 1, ул а ч ев В. П. 1972. Трансформация энергии в биомембранах . М .
ТашмухамедовБ.А.идр.«Биоорган.химия»,5,429.
Та ш мух а мед о в Б. А. и др . Авт. свидет . 1978. 2609466/23-04.
ТашмухамедоваА.К.идр.1978а.«Биоорган.химия»,4,806.
Та ш мух а медов а А. К . и др. 19786. «Биоорган. химия», 4, 1232.
ШкинёвА.В.идр.1979а.ХПС,2,242.
Шкннёв А . В., Гагельганс А. И. , Ташмухамедова А. К. 19796.
хпс, 2, 243.
Аmmаnn D., РrеtsсhЕ.,Simоn W. 1972.TetrahedronLett., 2473.
Аndо К. А., NаwаtаУ. 1978. In «Mater. of 2nd Int. Symp. опMacrocycl.
сотр. Brigham У. Univ., USA, 1, 48.
ВаkkегЕ.Р. 1979.Antiblotics, 5,р. 1,67.
В е а n R. С. 1972., In «Membranes. А . Series of Advances» (Eisenman G., ed.).
2, 409.
Вес k J. et а!. 1952. He!v. Chim . acta, 45, 620.
Веnz R. et а!. 1973. J. Membrane Biol., 14, 339.
В 1о n d i n G. А. 1974. Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 97.
В1оndinG.А.1975.Ann. N.У.Acad.Sci., 264,98.
Вriеr1еуG. Р.1974.Ann. N. У.Acad.Sci., 227,398.
Brockmann Н., Scl1midt-K as tner G. 1955. Chem. Вег . , 88, 5, 57.
В у g r а v е F. L. 1977. Curr. Тор. Bioenerget., 6, 259.
СаrаfоIiЕ., СrоvеttiF. 1973.Arch. Bic'chem. апd Biophys., 154, 1, 40.
С а r о n i Р. et al. 1977. Biochim. Biophys. acta 470, 437.
•
СаrstеinМ. Е.,Мu11еr J. D 1978.Arch. Biochem. апd Biopl1ys., 185, 1,282
Саswе11А.Н.,РrеssmаnВ.С. 1972.Bioc!1em. and Biophys.. Res. Com-
•
muns, 49, 292 .
СеIisН.,Еstrаdа-OS., М оntа1М.1974.J.Membr. Biol.,
18, 188.
СhаnеуМ.О. et al. 1974.J .Amer. Chem. Soc., 96, 1932.
СhгistеnsеnJ.J.,
Dе1Ьеrt I. Е., Izаtt R. М. 1974. Chem. Rev.,
74,8,351.
СгаmD.J ., С гаmJ.М.1974.Science,,183,803.
DеЬегС.М.,АdаwаdkагР.D., Тоm-KunJ. 1978, Biochem. Biophys. Res.
Communs, 81, 4, 1357 .
Eisenman G., Krashe S. , Ciani S. 1976. In «Io n S elective and Enzyme
Electгodes in Mediciпe a nd Bjology». Kessleг М . , Clark L.,
Lйbbers Р .,
108

Silver I., Siпюп W. (Eds.) . Munich-Vienna: Urban and Schwarzenberg, 3.
ЕisепЬеrgМ.,Наll.J .Е.,МеаdС.А.1973.J.MembraneBiol., 14,143.
Еstrаdа-O.S., С ага Ь еzА.1972.J.Bioeпerg.,3,429.
FiпkеIstеiпА. 1970. Bicichim. Biophys. Acta, 205, 1.
Fiпkе1stеinА.,СаssА.1968.J.Gen. Physiol., 52,1455.
FlаtmаnР.LеwV.L.Nature,270,5636,444.
Giiumапn Е. et al. 1947. Experientia, 3, 202.
GеrоwI. Н.,DаvisМ.W. 1978.ln: «Seco!idSymp.Macr. Comp.» Aug., 1,3,9.
Gоmеz-PuуоLI А.,Gоmеz-LоjеrоС. 1977. Current. Тор. Bioenerg., 6, 221.
Gоrdоn L.G. М., Науdоп D. А. 1972. Biochim. Biophys. acta, 255, 1014.
G га v е n S. N. et al. 1966. Biochemistry, 5, 1729.
На m i 11 R. L. et al. 1969. Tetrahed ron Letteгs, 4255.
НаrrisЕ.J., WimhurstJ.М.1973.NatureNewBiol., 245,271.
Наггis Е. J., Wi111hurst J.М. 1974.Arci1. Biochem. and Biophys., 162,426.
На r r i s Е. J. et al . 1977. Агсh. Biochem. Biopl1ys. 182, 311 .
НоviТ.,Wi11iаmsS.С., А11isоnА.С. 1975. Nature, 256, 70.
1 z а t t R. М. et al. 1978. Science, 199, 4332, 994.
JеngА.У.,RуаnТ.Е.,ShаmооА.Е. 1978. Ргос. Nat. Acad. Sci. USA
75, 5, 2125.
JоhnsоnS.М.,НеrrinJ., LiuS.J., РаulI.С.1970.J.Amer.Chem.Soc.,
92, 4428.
К:iIЬоurпВ.Т. etal.1967.J.Mol.Biol., 30,599.
КirtIаndS.J ., В аLImН.1972.NatureNe,vBiol., 236,63,47.
К:itаН.,vапdеrК:lооtV-.
1. 1974. Federat. Proc., 33, 3, р. 1, 449.
L а r d у Н. А. 1968. Federat. Proc., 27, 1278.
LеВIаnсО.Н.Уr., GruЬЬW.Т.1976.Anal.Chem., 48,12,1658.
LiuС.-М.,НеrmаnпТ.Е.1978.J.Biol.Chem., 253,17,5892.
Maier S . J., Paul I. С. 1971 . Chem. Comm, 181.
М а 1111str6111 К, С ага f о I i Е. 1975. Агсl1. Biochem. and Biophys., 171, 418 .
МеуеrsЕ. et al.J.AntiЬiot.,18,128.
МсМurrау W., В еgg R. М. 1959.Arch. Biochem. and Biophys., 84, 546.
МitаniМ., Уа111апishiТ., МiуаzаkiУ. 1975. Biochem. Biophys. R.es.
Com111 .,
66, 4, 1231.
М i t а п i М. et al. 1976. Anti111icrob. Agents and Che111otl1er., 9, 4, 655.
МitаniМ. et al. 1977. J. AntiЬiot.,30, 186.
М i t с h е 11 Р. 1968. Ch e111 io s111otic coupling vnd energy transduction . Glinn. R .e -
search., Bod111in. Cor11wa ll.
Мооrе С., Р rеs s111ап В. С. 1964. Bioche111. Biophys, R.es, Со111111., 15, 562.
Мuе11егR..V., FinkеIstiепА.1972.J.Ge11.Physiol., 60,263.
Mueller Р., R.udin D . О. 1968. Natшe, 217,713.
NаwаtаУ.,SаkаgаmiТ.,IitаkаУ.1975.Chem. Lett., 151.
Оgit а Т. et al. 1979. Agric. a11d Bioi. Ciem., 43, 7, 1537.
Оh11ishi S. Т., DеvIi11 Т. М. 1979. Biochem. Biophys. R.es. Commun., 89,
1, 240.
Оi s h i Н. et al. 1970. J. A11tiЬiot., 23, 105.
РаtеID.J., S hепС.1976.Proc. Natl.Acad.Sci.U. S.А.,73,6, 1786.
РеdеrsепС.J. 1967.J.Amer. Chem. Soc., 89, 7017.
РеdеrsеnС.J.1970.J.Amer. Cl1em. Soc., 92,386.
Реtrаnеk1., R.uЬа О.1974.Analyt.Chim. Acta, 72,2,375.
РfеiifеrD.R.., DеЬеrС.М.1979.FEBSLett., 105,2360.
РfеiffеrD. R.., LаrdуН.А.1976.Biocherпistry,15,935.
РinkеrtоnМ.,Stеi11rаufL.К,DаwkinsР.1969,35,512.
РIаtt11еrPl.А.,NаgеrU. 1948ВН,Hel11.Cl1im. Acta, 31,2203.
Р r е s s 111 а 11 В. С. Bio logical Application of lo11ophores . Palo Alto, Calif.
Р r е s s m а 11 В. С. 1973. !11: «Inorga11ic Biochetnistry. Eichlюrn (Ed.) », 203 .
РrinсеR.С.,СrоftsА.R.., Stеi11rаufL. К1974.Bioche111.Biophys. R.es.
Commun., 59, 2, 697.
R.есh11)tz G.А.,Еуа1.Е. 1971.A11alyt. Chem., 43, 1090.
RееdР.Wl, LаrdуН.А.1972.J.Biol.Chem., 247,6970.
R. о е s k е R. \V. et al. 1974. Bioche111 . Biophys. Res. Co111mun ., 57, 554.
109

SсhоIегR. Р.,Simо11W.1970.Chimia, 24,372.
Sсi1wагtzА., ЕntmаnМ.L., 1973.Abstr. Symp.Calciu111Bi11d. Ргоt.,Yab-
lo1111a near Warsaw, Warsaw е. а., 26.
Shа111ооА:, Gо1dstеi11D. А. 1977. Biochim. Biopl1ys. Acta, 472, 13.
Shе111уаkiпМ.М.et al. 1969.J.Membr. Biol., 1,402.
Таsh111 uk11аmеdоv В.А. et а\. 1980. Fгontiers of Bioorgan. Che111. апd Мо-
\ес. Ьiо\., Pergamon Press, Oxford а. N. У. , 439 .
ТоstеsоnD. С. 1968.Federat. Ргос.,27, 1269.
Tostes 'on D .С. et. al. 1968, J. G e n. Pl1ysiol., 51, 3735.
Т г Ll t е г М. R. 1976. In: «Calcium in Biol. Syst. 30 Sy111p. Soc. Expt1.·
Biol .
Enfelgield Green, 9-10 S ept. 1975, Cambridge е . а. , Ca111br. Uni , · .
Press,
VIII, 19 .
W оп g D. Т., На m i 11 R. L. 1976. Biochem. Biophys. Res. Communs, 71 , 332.
W о n g D. Т. et .a1. 1973. Arch. Bioche111. Biophys., 156, 578.
WопdК.Н.,УаgiК.,SmiclJ.1974.J.Membr.Biol., 18,379.
W Ll п Т.-С., В i t t 111 а п R. 1977. Bioche111istry, 16, 2080.
\VLIпТ.-С.,Вiоtt111апR.,
В ого w i t z !. J. Bioche111istry, 1977, 16, 2074.
О. В. КРАСИЛЬНИКОВ
ДЕЙСТВИЕ ЦИТОТОКСИНА И ФОСФОЛИП АЗЫ А
ЯДА СРЕДНЕАЗИАТСl(Ой l(ОБРЫ НА ЕСТЕСТВЕННЫЕ
И ИСКУССТВЕННЫЕ МЕМБРАНЫ
Исследован.ия ядов змей семейства ,элапидов. ,свя занн ы е с
в ыделение.\1 в чистом виде с оставляющих эти яды в еще ст в, б и о ­
л оп,·ческим т,естирова,ние:v1 их и изучением особеннос те й дей ствия ,
показали, что большинство биологич еских эффектов я дов элапи­
дов реализуется на урО'вне мем,б ран. В соста ве ядов, п ом имо ней­
ротоксинов , специфически модифи•цир ую.щих ,свой с т ва п остси.нап­
ти.ческих мембран, обнар ужены ве щ ества , неп оср едств е нн о дейст ­
-ву ющие на фосфолипидный оста.в ме,1'6ран: фосфо .1ипаза А и кюr­
поненты яда , изве1стные в лите.рату ,ре п од назв а ю1 е,,1 « мембрана~
актив,ные полипептиды» (С о пdгеа, 1974), которые по тен цирую т
деструктивное де,й ствие фос фолипазы А на мембранные фосфоли­
пиды . В синергично,,r взаимодействии мем6ран оакти вны е по липеп ­
тиды и фосфолипаза А ра зрушают практичес ки любые би о л оги че­
ские мембр,аны и , таю1 :v1 об,разом, дейст,вуют токсичес•к,и , вызыsая
разнообразные биологи ,ческ ие эф фе юы. ареди кот орых наиболее
исследованы ,rе.\1олиз и 1ка·рдио -,uитоток,сичес кое действие. Благо­
даря этому, :v1ем ,браноакти .в,ные полJ11пепти ды описа ны в литера ­
ту,ре под различ,ньвш трив иальн ым н ,назван иями (п ,рям ые ге ,,r о -
_ лизины; карди о ток с ины; факторы, деполяр изующ ие скелетные
мышцы; гемоцитокардиоток,сины), в том ч исле и ка к ци тотокс и­
ны- ЦТ.
Фосфолипаза А и ЦТ образуют в ядах э.1апидов мощную сис­
тему «структурных», или «мембранных» , т о ксинов дес т ру ктив,ного
действия . Глубокий ана лиз свой 1ств и о собенностей дей стви ,я на
мем6ра,ны составляющих э ту систему ко мпо нентов, взят ых ,в от ­
дельности или совместно, в а ·Жен не только для по•н имани я меха-
110

низма ток-::ическото действия цельных ядо:а, но и в связи с воз­
м ожностью использования этих веще-:тв в прак т иr< е науч ны х и с ­
следований в ка1чес тв е инструментов изучен и я ст ру1пуры и функ­
ции биологических мембран.
Фосфолипаза А и ЦТ выделены в чистом виде из ядов раз­
личных коб.р, в то м числе из ,яда ореднеазиатокой ко бры Na ja oxi a-
na Eich"vald (Сахибов и др. , 1970; Юкельсон и д,р. , 19 74) . О днак о
особенности действия ЦТ и фо:сфолипазы А на биол оп~'"!еск ие ме,л ­
браны исследованы не.достаточно. В после днее вр емя при изуче ­
н .н и механизма действия некоторых физиол огически актив ны х ве ­
ществ, напр,имер ант ибиотиков, широко ис пользуют ся моде ли био ­
логических мем·бран - искусст·венные фо сфолипидн ые ме мбран ы
(ИФМ) (Овчинников и др., 1974; Лев, 1975) . В лите р атур е н ет
данных о действии ЦТ и фосфолипазы А ядо в элап идов н а И Ф М.
Между •тем, сопоставление эффектов этих ко мпонен тов :! а б иоло ­
гических мембрана х и ИФМ представ ляе тс я в ес ьма целе сооб ­
ра з.ным.
Фосфолипаза А и ЦТ выделены и з яда ср едне азиатской 1, обр ы
Naja oxiana Eichwald, полученного из фрунз енс кого з оо к ом-бин а ­
т а. Чистоту препа,ратов фосфоли1пазы А и ЦТ (ши фр \7 : 5) оп р е ­
деляли горизонтальным и ди,сковым э лектрофо ре з ом, рех ро мато ­
графией, анализом N - и С-концевых а.миноки слот. Мол о;у ля рн ый
вес фосфолипазы А 12843, ЦТ - 6631. Следу,ет от~1 е т ить вари а ции
удельной активности компонентов в зави с им ости от партии яд а .
Общие фосфолипиды мозга быка и ар ит ро,uит о в ра зли чн ых
видов животных получали по методу Фолча -Мюл л ера (Folch et
а!., 1957; Mue11er et al., 1963). Холесте ри,н про изводс тва Ленинлр ад­
ского мясокомбината окисляли по ме тол.у Т ин. (Тiеп et al ., 1966).
В ,работе использовали яичный лецит ин фи рмы 1\1\er ck ( ФР Г) и
производства Олайн ·ского завода; ч и с тый л ецит и н получал и .из
яичных желтков по Синтельтону (SingeJton et а1., 1965 ) . Чис то т у
полученных липидов проверяли тонк ослойной хром атографие й на
' с иликагеле в системах р а·створителей: 1) хлороф о р м : м ета нол :
а ммиак; 2) хлороформ: м етанол : укс у1сная к ислота: вода, 3) хл о­
р оформ: метанол : во да. Остальные реактив ы имелн ква лиф ик а­
ци ю «ХЧ» и «ЧДА».
Фосфолипидные моно слои пол уча ли нан есе.нием ~ра с тво ра яи ч ­
н о го лецитина в гептане ,на субфаз у, сод ержащу ю иссл ед уе,,rы е
к о~шон е нты. Плотность мО'нослоя регули ровали ,нанесе ние.м на
субфазу различного кол ичества фосфол ип.идов в постоянн ом объе­
м е гептана. Пов ерхн остное на11яжени е измер яли мет одом от рыв а
п "1атин о во г о кольца (Г ар кинс, 19.50) , ,соед нн е нноrго ,с торс ионными
весами. Стеклянн у ю и змерительн у ю ячейку те р м ос,тат иро ва.1 и
п ри 37°С.
Для определения по в е рх.ностной активност и ма т,ерчала 25 м л
раствора ис,следуемото вещества, взя того в оп ред е ле нно й кон це н­
т1ра;ции в 1'рис-·буфере (О,б-5,0 мМ ), в•нос11.ли в измери тель ну ю
те рмостатированную яче й1< у . Поверх ностное н атяж ение нзмер ял и
111

через каждые 30 мин в течение 3-4 ч. Величина ошибки
± 1 ди н/0,1.
Для получения плоских «черных» фосфолипидных мембран
(ИФМ) раствор общих фосфолипидов высу,шивал.и в вакууме и
растворяли в дека.не (50 мг/.мл). ИФJ\'1 формировали методом пу­
зырька -на отверстии тейланового стаканчика, помещенного в стек­
лянную ячейку с сол,евым ра,створом. Процесс образов.ания «чер­
ных» мем,бран наблюдали в -отраженном свете . Для измерения
электропроводно-сти ИФМ применяли обычную электрическую схе ­
му (Либерман, 1970). За,ряженные би1слой·ные мембраны получа ли
ло мето ду Корепановой ( 1975).
Взаимодейств,ие двух ИФМ исследовали методом Либермана
тт Ненашева ( 1970). Раствор фосфолипидов в декане наноси.ли на
отверс тие тефлоновы х стаканчиков с плоской стенкой, полученные
липидн о-дека•новые пленки раздували до полусфер. Через 20 с об ­
разующиеся «.цветные» м1ембра ны приводились в соприкосновение
на постошшой площади, однов ременно включали ,секундомер. Ис ­
след-овали слипание то лько «~цветных» мем·бран, это явление фик ­
сировали визуалЬ'но в проходящем свете.
Для определения гемолитической активности использовали
свежую кровь, стабилизированную консервантом 76. Эритроциты
отмывали трижды 5-6-кратным объемом изотонического раствора
(150 м,М NaC! или 300 мМ сахарозы в 5 мМ трис-,буфере, рН 7,5) .
К объему 50% ,суспензии 1меток приrбавляли объем раств,ора , со­
держа щего исследуемое _ nещество, смесь перемешивали и термо­
стати.ровали. Количество -освобождешrого гемоглобина определяли
спектр,офотометрически по поглощению при 540 нм. Количе-ство
гемоглобина, соо тветствующее полному лизису эритроцитов, оп­
ределял и после осмотического гидроли за. Триnсиниза1цию (240
мк г/ мл ) проводили в течение 30 мин с последующей 3-кратной от-1
мывкой клет,ок 10 объемами :изотонического раствора.
Электрофорез I{Лt~ток проводили в специальной ячейке, выпол ­
;-1енной на основе камеры Горяева, при комнатной тем•пературе.
Перед определением дзета-потенциала отмытые эритроциты ( 106
клеток/мл) и.нку.бировали 30 мин с различными концентра,ция ми
Са 2+ и (или) ЦТ. Эле~трокин етический по11ен:циал клеток при гра­
диенте потенциала 3 В/см рассчитывали по формуле Смолухов­
ского:
,
4пV·~
l,=
ДЕ,
- гд е 71 - коэффициент вязкости среды;
V - скорость перед виже ния клеток;
Д - диэлектричесю1я проницаемость среды;
Е - градиент потенциала.
Иодирование белков осуществляли в гли,циновом буфе'Ре (рН
9,0) по Condrea et al. (1965).
'
Для получения нагруженщ,rх ионами калия липосом 15 мг су ­
хих фоофолипидiов диспергировали в 1 мл раствора KCl ( 150 мМ
112

KCI, 5 мМ трис -НСI, 1РН 7,5). Для освобождения от наружного
KC I полу,ченные многослойные липосомы 1пропускали чер,ез 1,0-
лОI-шу с сефадексо::vr G,=25, уравновешенную 150 м,М NaCl, 5 !11Nt
три•с -НСI, ,рН 7,5 (среда l).
Для регистра1Ции выхода калия аликвоту липосо:vr или отмытых
средой 1 эритроцитов вносили в термостатированную ячейку, со ­
держ ащую 2 мл такой же среды. Регистрацию осуществляли с по­
мощь ю самодельного валаномицинового электрода на рН-метре
ЛПУ-01 с подключенным к нему самописцем, шкалу которого ка­
либ ровали методом стандартных добавок В качестве элек,трода
~.ТЕНИ N
ЗРИJРDЦf!ТЫ
--------- L_.
'----2,L'{J-4..!...D--б.-'-'[}--80~-100 Т
4
КОНЛ)J]ОЛЬ
105 мЦТ
Рис. I. Связыванне 1 з1 ' -U T с мембранами эритр о цит ов чел овека . i1спол1,зова­
лась [ 0% суспензия эритроцитов в физиологическом растворе No;CI; концен­
трация IЗL[ - UT=2· 10-5 М.
Рис. 2. Активапия uнтотоксином связывани,r i-ЧСА с мембранами эритроци­
тов челове ;{ а. Количество связавшегося 1-ЧСА определ,rли активационным
анализом.
срашrения использовали хлорсеребряные электроды ЭВЛ-IМЗ,
::ообщающиеся через ага1ровый мостик с из.меритель ной ячейкой.
Ц,ело,стность мем·бран эритроцитов регистрирова ли по светорассея­
нию суспензии (530 нм) под углом 90° ФЭУ-20, связанным с рН­
метром, к выходу которото подключен самопис ец.
Мн оже ственность и разнообразие биологических эффектов ци­
тотоксина (Юкельсон и др., 1973, 1974) позволяют предп олож ить,
что в основе этих эффектов лежит взаи м о,дей::: тв ие ЦТ с мембра­
н ам и. Прямые доказателыства этого получены нами с помощью
м,еченого 131 !-ЦТ (,О,2,5 мкКюри/мг). На суспензии трижды отм ы ­
тых физиололическим раствором и затем обра,ботанны х 131 1-ЦТ
эритроцитов человека установлен.о, что 131 1-ЦТ связывается с ин­
тактными клетками, однако в меньшей степени, ч ем ,с «тенями»
(рис. 1). Такие же данные получены Condrea et а!. (1956), ис­
пользовавшими 131 1 - ЦТ из яда кобры Н. ]1aemachates .
.Все цитотоксические полипептиды яда элапидов способны по­
тенц-ирьвать действие на мембраны кислы х фосфолипаз А яда,
8-156
113

которые саУiи по себе на мембраны ( и"1 и мем бранн ые фосфоли­
пи ды) дейс т вуют слабо (Lee, 1972; Coпdrea, 1974). По -в ид имому,
эт о обусловлено уча,с тие м цитотокс 1ш ов в с вязыва нии фосфолипаз
А с от,рицательно заряженными цитоплазмат ически.:v1и ые:v16рана ­
ми . Для проверки этого пр:едположения мы и::следовали св языва -
1-iН е I-меченого сыворо т Qч1юго эльбумина человека (1 - ЧСА ) с
изоэлектрической точ11шй ('pl) 4,8, который в наших оп ы та\: ~-10,:J,е ­
лировал кислую фосфолипазу А с pI 5,1, на nр едваритепь но об ­
ра ботанных ЦТ эритроцитах человека ( рис. 2). Результаты по­
к азывают, что связываю-1е мембранами кислы х белк ов действ и ­
тел ьно стимулирует,ся ЦТ.
Причиной такого эффекта цитотоксинов могут ,б ыть о с о,бен ­
ности их химического строения : все о ни являютс я по липептидами
с ,сильно выраженными основными свойствю,ш ( Lee , 1972; Юкель­
сон и д,р., 1973, 1974; Coпdrea, 1974 ; Crisl1in et al., 1974 ) . С,1едует
о жидать, что ЦТ должен -вызвать ум еньшени е :э.1е1-тр оотрица те,1ь ­
ност и поверхности клеточных мембран. Дей,ств ительн о, мы опре­
делили, что •при эл,ектрофорезе эритроцитов в п•рисутств ии ЦТ •ск о ­
ро сть миграции клеток к аноду уменьшается, более то ю, п оя в­
ляются клетки, мигрирующие в обратном напра влении - «ревер ­
т анты». Адсорtбци,я на пл азматиче ::кой мембра ·не ЦТ ·начиная
с 1х , 10- 7 М сопровождается н е тольк о снижением, но и р еверсией
элект,рокинетиче1Ского потенцлала эри-гроцитов. Лри этом ,не .наб­
людается •синхронного изменения потенциала пове рх нос ти всех
кле ток: отмечается п.рисутствие клеток как с по-ни женн ым, так
и с ревертированным дзэта - потен,ш1алом. Воз можн,о, это связано
с различ,ной адсорбцией ЦТ в гетерогенной по;~уля ции эрит ро ­
цитов. Не исключено, что резертанты представлены «теня:v1и»
эритро~ци т ов, св.язывающи:vш, как показывают наши опы т ы , ЦТ
более интенсивно, чем инта1пны е клетки . В от.1нчие о т ЦТ, ионы
каль ция, хотя и сниж:али электрокинетический поте н,циа л эрит ­
роцитов , но не ,способ .ств ов али появлению клеток-реве,рт ан тов; при
сов.местном введении ЦТ и Са 2+ влияние ЦТ на дз ет а-потенц иал
поверх нос ти ме~•rбра · н тормозилось .
Списобность UT из~•lенять поверх ностн ый заряд ме ~16раны под­
т верждена нами в опытах на модельной системе при иссл едова ­
нии «слипания» двух полусфер 1Цв етных ИФ]vl. С увели чением кон ­
центра,ции ЦТ у меньшается время и х сл ипа•ния. Ана ло ги чно
влияют на слипан,и е ИФМ ионы кальция (,ри,с. 3). ,
Мак,си.мальное время слипания ,ИФ J'Л онlечено прн рН 6,0 - 6,5 .
(р ис . 4). Эти результа ты в отношении эффекта Са 2+ 1юрр елируют
с данными литературы (ЛиберУ1ан, Ненашев , 1970), ;v10г ут ,быть
ин терпретир ован ы как влияние ЦТ ,н а поверхно:тный п отенциал
мембраны и подтверждают электроста т ический хара:пер происхо ­
дя щего при этом взаимодействия.
Таким образом, полученные нами данные показывают, что ЦТ
адсорбируется на мембране, .вызывая и з.менение по ве,рхн остно•о
заряда мембраны , и одноврб1енн о облегч ает связыва ние на ней
114

юrслых фосфолипаз А, кото.рые сами по ,себе вследствие элект ро~
статического отталкивания 1сла1бо взаю,rодействуют с :v1е:v16р анами.
О::о.беююстью химического стр_о ения всех цит-отоксинов из ядов.
эла пидов является ,сочетание в их :vюлекул ах электропо"1ож итель­
но го заряда высокой плотности с гидрофобными ,свойствами. На­
ли-чие тид,рофобных свойств постулируется на основании из у, ченюr
строения ЦТ, выявившего высокое со д ержа ние в их :vrоле кулах
неполя.рных аминокислот (Lee 1972; Condrea, 1974; Gгis l1in et а1.,.
197 4 ) . В связи с этим пред~ставл я ло интерес оценить гид,роф об ны е
свойства ЦТ в эксперименте из:vr ерением его по верхност н о(r ак­
тивно:.:ти ( ПА) 1-1а ,nанице раздела вода - воздух и в фосф оли--
Т,с
100}
80•
80
40
20
Рис. 3. Вл ияние UT н Са2+ на время слипа­
ния ИФЛ\. Среда: 5 мМ трн с- НСI, рН-7,4; при
исс ледован и и ЦТ в среде прнсутствуе т I м J\l
ЭДТА.
п идных монослоях. В наших эк1спериментах установлено (ри с. 5) ,.
что уже в кон,цент.ра ции 4,3· 1,О- 7 М цитотоксин снижает поверх­
ностное натяжение (ПН) 0, 5 мМ трис - буф ера (рН 7,4) с 70 д о
55 дин /см; у величение кон ц е нтра!ЦИИ по липе пт·ида не п рив одило
к дальнейшему уменьше нию ПН. Бычи й сывороточный альбумин
( БСА) мак,симально снижал ПН до S0 дин/см, но лишь в ко н­
ц ентрации выше 2- 10-5 М.. Таким образом, макси м альное и зме не­
н и е ПН, вызывае:v10е БСА, в 1<0J1 ичестве нном выражени и на
5 дин/с.м больше, ·чем в слу чае ЦТ. ~В ероя тно, именно это послу -­
жило основанием для от рИlцан,ия выраженной ПА у 1цито ток ошов
(Vogt, 1970). Однако эта «б о.1ьшая» ПА · БСА становит,оя кажу­
щейся при ее оценке по отношению .наи,болышего понижения ПН
( а , дин/см) к той наимен ьш ей ко1-щент,ра;uии, при которой он о дос­
тигается (Cmin, .М/см3), т. е. в гиббсах (Нейман и др., 1972). Эта
ве"1ичина для ЦТ составила 3- 1010 , для БСА
-
только 9"1 08 , а
!15,

,-цля мел:иттина, важ,ность ПА которого в механизме действия приз­
.нае'I'СЯ в,семи исследователями,- 2,6 . l 0 10 гиббс.
Налич ие выраженной ПА у ЦТ позволило предположить, что
'JiD.Н може т внедрятьоя в г и дрофоб ны е области биологических мем ­
бран. Для п роверки ,такой возможности мы исследовали влияние
ЦТ на монослои яичного лецити н а фирмы Merck с поверхностным
давлением 2,8 дин/см при рН 6,0, что примерно соответствует ве­
.,шчине площади, приходящейся на одну молекулу фосфолипида
2
f{} с
7
-
5
3
2
о
3
4
5
8
7
8f]H
~~
~70
~
'Ь"
:,:J
~~о~Q.o
';,!
~50
';::
;;...
~t5
r::::_40
10 5 моль;л
Рис. 4. Влияние ЦТ и ионов Са2+ на время слипания ИФМ ,
]-контроль; 2 - 2 -1 0 - 7 М ЦТ; J-1-10- 4 М са2+ (Л1,берман, Ненашеа, 1970) .
Рис, 5. Поверхно с тная активность мелиттина (1 ), бычьего сывороточного аль­
бумина (2) и цитотоксина (3). Среда: 0,5 мМ трис-НС!, р. : -7,4; 3 7 с с.
в естественных мембра.нах (Бабаков и др., 1972). В такой системе
ЦТ ( 1 • 1О- 6 М) .значительно ,снижал ПН м,онослоев, ,причем эффект
рос с увеличением рН субфазы; аналогично действо,вали на мо­
нослой ионы калыция (1- ,10-4 М) (рис . 6).
Взаимодействие ЦТ с монослоями достаточно высок ого поверх ­
ностного давления позволяет предполагать, что он :\ЮЖет вызы ­
вать усиление проницаемости ио н ов через гидрофо бну ю область
мембран. В литературе имеются косвенные данные, подтверждаю-
• щие это предположение (Lee, 1972; Chang et al., 1972) . Мы уста ­
.навили, ч то ЦТ (2 мкг/мл), действительно , значительно у,силивает
пасси вный выход К+ из эри'I'рсщитов, су:::пендированных в физио­
логическом растворе NaCl, инициирует набухание клеток -без их
ге молиза и лишь при дальнейщем увеличении концентра-ции ток­
сина происходит лизис клеток (,рис. 7). Аналог.ичный эффект ЦТ
,выявлен на ИФМ. Установлено, что с увеличением концентрации
ЦТ снижается сопротивление ИФМ и их стабильность (.рис. 8).

Эффект ЦТ на про вод имо,сть ИМФ растет с у ве ли чением р Н сре-
ды (рис . 9).
·
Имелись противор ечивые сведения о ~селективности модифици­
рованных ЦТ ИФМ ( Юкельсон и др., 1974; Ксенжек и др., 1978).
Мы устано ,вили , ч т,о се11Iективность таких мембран ,сильно за,висит
от рН среды . (рис . .10) . При рН~4,О селективность только ан И(l'"! ­
ная, поскольку практически полно'Стью прото.нированы его кар бок­
сильные группы . В пределах 'РН 5,0-8,0 ИФМ могут облад ать.
как анионной, та1i' lif катионной селективностью. Это, возмож но,
tJ!JH/CM ..- , .
50
з
5
7
s
он
.
!:r
/2NКГ/МЛ!/Т
1j
2
j
Er
301.ШН
5МКГ/МЛ!/Т
1
5МКГ/Млl{Т
/5k!ЛТ);и if,,
1;
К,
j {·!ОтJ,,&;
Рис . 6. Влияние ЦТ и ионов Са 2 + на зависимость поверхностного натя­
жения фосфолипидньц монослоев от рН субфазы.
]-контроль, 2- 1•10-4 М са2+ , З-1·10-6 М ЦТ.
Рис. 7 . Влияние ЦТ на набухание (2) и выход К + (J) из эритроцитов чел о-
века. Среда: 150 мМ NaCI, 5 мМ трис-НСI, рН 7,5. Е750 суспензии-0 , 07 .
обу~словлено появлением и количественным увели ч ением ио н и зи­
рованных к арбоксильных групп токсина . С ростом величин ы рН
вклад эти х г,рупп ЦТ в селективность ИФМ становится преобл а ­
дающим, хотя сумма,рный заряд молекулы токсина во все м ис­
следованном диапазоне рН положителен (pl~ 10) (Salacl1 et al., .
1971) . По- ви димо му , не молекулы фосфолипиД;о в и 1не общ ий за­
р яд мол е кул ы ЦТ, а ли шь часть его ионизированных групп опре •
деляет селективность модифицированных им ИФМ. Испо льзуя
методику фиксации потенциала, мы установи.ли, что в при1сутс тви и
ЦТ можно ,наблюдать флуктуации проводим,ости дис:юретной , но
различной амплитуды. Пример таких флуктаций тока представлен
на рис. 11.
!17

.
В связи с фактом синергизма ЦТ и фосфолипазы А на естест­
венных мембра нах представляло интерес исследовать их совмест­
ное действие на ИФМ.
Варианr12
Минуты ом-1 ·СМ-2
. 10-9
I. К он троль
2. 7,7 •10- 7 !li Фл-А
3. 3,85-10- 5 М Фл-А
-4. 3,85-10- 6 М Ф.1-А+1-10-7М ЦТ
5.I· J0- 7 MЦT
6. 3,85·10- 5 М Фл-А+4-10-3М Са2+
7. 3,85-10-6М Фл-А+I .10-7М ЦТ+
+4-10-З М Са2+
150
102
27
11
11О
50
21
UT ,существенно не изменяет ореднего време ни
тогд а как фосфолипаза А значительно уменьш ает
ИФЛ!i. практически .не изменяя их пр,оводи!Vюсти.
(jf/JН
ъ
МО/СМ 1
R
t
\
.....
ю•
150
[._
'<:) t0-7
-
<::
1{}7
<,
"'
~
"~ 1§•1
JOO
'! -t
ш'
!О
10
ш-
!О-,· мцт
fi.O
3,3
1. 75
4, 45
30
33
8.3
18
жизни И ФМ,
стабильност ь
Добавка ЦТ
\
\
7,0
о.о рн
Рис. 8. Влияние Ц Т на стабильность ( Т) и сопрот11вл енf! е (R) БФМ. Среда:
150 мМ КС! ; 5 мМ трис-НС!, р !-1 7 .4; х-ко н тр оль. Использованы общи е ф о с­
фолипиды из мембран эритроциТ<..в человека.
Рис. 9. Зависимость провод'имости БФМ , индуц ирова нной ЦТ, от рН среды,
Среда: 5 мМ трис-Н С !; концентрация ЦТ 1-10 - 6 М. Использованы общие
ф осф олипиды из мембра н эритроцитов человека.
усилив ает дестабилизирующее действ ие фо сфолитrа зы А на мем­
. браны; а ионы калыция т ормозят этот процесс. Таким образом,
:результатом взаимодей,ствия ЦТ с мембраной является увеличе­
ние па,с сивно й проницаемости 'ее и, вероятно, как следств ие,­
набухание клеток ,с пос ледующим их лизисом . Эффект ЦТ на пр о ­
ницаемость биоло г.иче с ки х мем,бран моделируется на ИФМ. Фос-
118

фолипаза А снижает только ,с табильность ИФМ; для сов:Уiестног о
действия ,о бо их ингредиентов характерно увеличение п роницае ­
мости и более значительное сни жение среднего в ремен и жизни
(,·
ЦТ ИФJ\1. Среда: 5 мМ трис-НС\ или 5 мМ
~1.
гицин-N,,ОН. С оздав ался трехкратный гра-
~
диент I\CJ-20 мМ/60 м М. С ростом рН ере- О.ь'
ды для достижения ра вного уровня про5оди -
1
Рнс. 10. С елект и вно ст ь модифицированных ав л
~
мости ИФМ применялись б олее низкие кон -
45s?в910ph'
центрании ток сина. i-; a о си абсцисс - вели -
ft
"'",'_::м,~:~,~.:::::,:::::;:;:::::::,:. :.:.~,: "f I
го я ;-: чно1·0 лецит,tна; 2-ИФМ сформ~t IJОАани I з о(Jш: х 0.2 ~ Т
фuсфою1 11 ,;дов ыозга быка. I\аждая точка - среднее бо~
_,;; !
.
лее 30 мембран со средне;,:вадрат:.чнuй ow11GJ~oй.
/11
•
о-1 •-2
ИФМ, т. е . .синергизм, постоянно демонстрируемый на биологиче­
с ких мембранах (Lee, 1972; Condrea, 1974).
Представляется возможным, что благодаря комбинации в :vr о ­
лекулах вс ех цитотоксинов яд,ов элапидов элек1:_ропол ожительноrо
1
1
__J'
'l,
Рис. 1I. Флуктуацин проводимости ИФМ в присутс,·ваи 2· 10 - 6
,\\
ЦТ . Среда : 10v мМ KCI , 10 мМ трис-Н С!, pH-07,;"j; напряжение
фш,сац и11 5,) мВ; проводимость контрольных мембран;:::;4 pS.
заряда выс оЕо,й пло1'ности с гид,рофобными свойствам и они э.,1ек ­
тростатичео::н взаим оде й ст вуют с мембраной , ,пос1е чего прони ­
кают в ее липидный остов , ин ду; цир уя пр.оницаемость и посл едую ­
щие эффеi(ТЫ . При . исследовании влияния ионной силы и рН ере-
119

ды доказано электростатическое взаимодействие цитоток с ина -::
мембранами. Так, мы определили, что гемолитическое действие
ЦТ в изотоническ,ом растворе ,сахарозы (.300 м.М саха,розы, 5 мМ.
трис-НСI, рН 7,5) значитель,но выше, чем в изотоническо м раст ­
воре хлорида наТiрия (150 м~М NaCI, 5 м~М трис-НС!, рН 7,5)
(рис . 12). Наши данные, демонстрирующие увеличение индуцир о ­
ванной ЦТ проницаемости
ИФМ с ростом рН (рис. 9), JqG
коррелируют с результатами,
показывающим. и рост гемо-
литн ческого эффекта ЦТ -в.о
при подщелачивании среды
от рН 6,0 до 8,0 (Юкель-
сон и др., 1975). Можно по­
лагать, что положительно
заряженный ЦТ реагирует
20
2
16
4
?.О
-7,О
-в.о
2
t
-4,5
-4,О
Рис. J2. Прямой гемолитический эффект ЦТ (1-10 - 5 М) .
l!JC ДДС
- З,О
1 - сре.а:а:150 мМ NaCI, 5 мМ трис-НС I , рН-7 , 5, З7°С; 2 - среда:300 мМ сахарозы , 5 "М
трис - НСI, рН-7,5 . 37 ° С. 20% суспензая эр , процитов человека перед опытом проrμета 30 м н н.
при 37°С.
Рнс. 13 . Влияние додецилсульфата натрия на проводимость Б Ф М, индуциро­
ванную ЦТ. Среда: 150 мМ NaCI. 5 мМ три с, рН - 7,4. Мембранообразуюший
раствор содержал хроматографически чистый яичный лецитин и холестерин
(I/J; W/W) .
J-ддс+2-10- 7 М ЦТ; 2- -контроль ддС; ордин а та - логарифм п рово дим ости ( 0-ом - 1-см - 2) ,
абсцисса-логарифм концентрации ДДС (мо л ь /л) .
с отрицательно заряженными группа ми на поверхн ости мем браны ,
ионизация которых возрастает с подщелачиванием сред ы, что об-
•легчает с в язывание ЦТ и способств ует усилению ег о эф фект ов .
Для более прямого доказательства электростатического взаи ­
модействия мы изу,чали* влияние ЦТ на лецитин-холе.ст-ерин овые
мембраны, отрицатель.вый заряд которых индуциро ва л ся дод ецил­
сульфат,ом натрия (ДДС). Установлен о , что пр и ю1зких концен-
* Исследования проводились совместно с Р. И. Труф ановым.
120

т,рациях ДДС (2- ,10-5
- 1 • 10-4 М) проводимость ИФМ., индуциро­
ванна1я ЦТ, несколько увеличивается, что подтверждает первона­
ча льно электростатический механизм взаимодействия токсина с
мембранами (рис. 13, 1). Резкое увеличе.ние проводимости в при­
сутовии ЦТ наблюдае11ся в диапазоне 1,5~3,О- 10-4 Nl ДДС, даль­
нейшее повышение концентрации детергента приводит к уменьше­
нию эффекта ЦТ, т. е. влияние ЦТ на проводимость бислоев наи- •
б олее ярко проявляет,ся в области ее структурной неустойчивости
JO
10
?О
30
Рис. 14. Температурная зависимость прямого
гемолитического эффекта цитотоксина : Среда:
300 мМ сахарозы. 5 мNl трис, рН-7,4. Использо-
вались 30% эритроциты морской свинки.
/-нонтроль; 2-1-10-5 М UT; сплошн ы е шIни11-ивну ­
бацня 2 ч; пунктирные - эритроциты, предварительно про­
гретые 30 м н н Пр!i 40°С, инкубаuия 35 мин.
(-рис. 13, 2). Чувствителыность гемолитических (рис. 14) и други х
эффектов ЦТ ' (В отличие от такого извест.ного токсина как мелит­
ти.н) ,к структурному ,сост0:я,нмю мем'61ра,н позволяет рекомендо­
вать его в качестве ,своего рода «зонда» п.ри исследовании кон­
форма,ционных ,переходов различных биом,емiбран.
Если ,элект ростатическая природа первой фазы взаимодействия
цитотоксинов ,с мембранами ,не вызывает сомнений, то по вопросу
о значении гидрофобных взаимодей.сгв,ий в механизме их ВJlИЯНИЯ
на мембраны в литературе имеются ,разногласия (Vogt et al., 197-0;
Condrea, 1974; Юкельсон и др., 1974) . Точка зрения Vogt et а! .
( I 970), с,огласно которой в механизме действия цитотоксююв на
мембра'ны в дополнение к электростатическим силам важную роль
играют -S -S- -SН-взаимодей,ствия, уже '6ыла подвергнута серьез­
н ой критике Condrea (i1974). В своем отрицании значения гидро­
фобны х свойств ,цитотоксинов Vogt et al. о сновывают,ся на том,
121

что известны химические мод ификации цит,о токсинов , сохраняю ­
щие ПА, но полностью потерявшие биологическую эффективность
(Vogt et а!., 19 70; Habermann, Zenner, 1971). При этом не учи ­
тывается, что в процеосе модификации ( сукц инилир ование, вос ­
с т анов лен ие -S - S -1связей и др.) изменя ется активная конформа­
uия м олекул uито т,ок,синов и, что крайне важно, може т умень­
ши ть: я основность полипептида.
В наши х опытах ЦТ подвергали нагреванию на кипящей водя­
но й ба не в течение 30-180 ~.шн в за виси мости от величины рН. ПА
токсин а при этом почти не изменялась и даже несколько увели ­
чивалась , т огд а как биологическа я ак тивн ость изменял ась значи ­
т ельно ; ге молитнч сское действие стан овилось стати чн ым, а с пособ-
1-юс ть пот енцирова ть литическое действие фосфолипазы А пол­
ьо::- ть :о ,терялась.
Вар11ант
1. Контро,1ь
2. 17 мкг/мл н ативного ЦТ
3. 17 мкг/мл прогретого UT
4. 20 мкг/м11 Фл-А
5. 20 мкr/мл Фл-А+17 м:<r/мл
тивного цт
6. 20 мкг/мл Фл-А+17 м,т/мл
прогре того ЦТ
на-
%
45 мин
6.75
14.8
14.0
10,3
31О
11,8
zе.молиза за
90 .ми н. ]35 ,l{UH
7. 10
R,50
30, 2
37.5
14,5
15. r
10 ,6
11,0
48,2
54.0
12 ,8
14,0
С помощью диск-электр офорез а в ПААГе и гельфильтр а,ции
на .сеф ад ексе G -7-5 мы установили, чт,о при теп ловой обработке
,уrол е;· улы ЦТ агрег.ируют до ди - и тримеров, электроф оретич еская
подви жн ость ко торых ум еньшается (воз можно, не только вслед­
-стви е уве личе ния размеров, но и из - за уменьшения основности
i\IOJi eк yл ЦТ). В этой ситуаuии вполне возможно ,со ;хjранение ПА
при л о т ере биоло гической активнос ти.
Отр иц ательно зар:яженные гру ппы мембраны, взаим одействую ­
щи е с Ц Т, п ок а не у,становлены. П о - видимому, ими являются по ­
лярн"'1е г,ол овкн не1юторых фосфо липидов (B гaganca, Patel, 19,2).
В пол ьз у этого п редп оложени я сви детельств у ет установ.ленный
нами ф акт, что осн о.вной эффект токсина - увеличение пассив­
ной п ро ни1Цаемос ти мем6ра'Н - може т ·быть смоделирован на
ИФМ. Од на~ю иск.1ючить роль белк,ово го компонента мембран в
.
про яв лении повр еждающего м ембрану действия ЦТ невозможно.
Эту то чку зрения подтверждает темпер3турная зависимость ге­
моли,ичес кого эффекта токсина ; ~~роме того, в ,отл1,чие от данных
Coпdrea et а l. (1971), мы уст а нов.или, что 30 - минутная трипсин и -
. зация,
п риводя щая к 2б-ЭО% -ном у умею,шению остатков сиало­
во й кисл оты на поверхн ости эр11 троц ит,ов, определенной по методу
vV апеп ( 1959) , значителыю • сн ижает их чувствительность к ЦТ
( рис. 15). Влияние трипсинизации пр оявлялось зна·чителыю более
ч етк,о в сахароз' НОЙ среде.
122

Важным признаком цитотоксического действия ме м браноак­
·тивных поли пептидов являе11ся избирательность, продемонстриро­
ванная при исследовании их действия на различные клетки (Bra-
ganca et а!., 1967), в том числе на эритроциты различньrх живот­
ных (L ee et а!., 1971; Юк ельсон и др . , 1975) . Установлен сл ед ую­
щий ряд чувстuнтельности эритроцитов к п ря мом у гемо.питич е ­
.скому действию цитоток сино,в (в изотон ичес ком растворе NaCl):
морс кая ,свинка>кр олик >кр ыса (Сопdгеа et a l., 19 64 ; Lee et а!.,
1971).
Предс:гавляло инте,рес 1солоставить э т и результ аты с данными
по вы х оду ионов К+ из указанны х эритр,о цит,ов в присут,ствии ЦТ.
50
50
/00
З51JМl.ff
Рис. 15. Влияние трипсинизац н и и сахароз а~ на гемолитически11 эффект цито­
токсина . Исп о льзовались эритр :щ ит ь1 ,,еловека . Трипсиниза ц ия (240 мп на мл
среды) в сахарозно й среде 30 мин 11ри 37 ° С.
С11лошные ли н н ~r -отмыв ка от трнпс ,~н а сахарозной c peд o fr , в не~°~ ;1..:е пров одш1 11 гемолиз при
20°С; пу.нкт ирные-ОТ.\•1ы !З1<а от трипсина ф . ~з 1-1 0 .-1 о гн ч ескнм rнн:тн оμо.\r \.iCJ , в н е .\ 1 же прово д11 л 11
гемош• з nprr 20°С; /-норм. эμлроаиты+ uт (1-10-5 М ); 2 - трип с . эритроцнты + ЦТ; 3 - ii О НТ­
роль, нормальные эр и троциты; 4- r<о~проль , т рипс . э р и троциты.
Рис. 16. Индуцированный ЦТ (l - 10 -6 М) B hr x oд к+ и з эр итроцитов различ­
н ы х животных. Среда: ]!)0 мМ NaCI, 5 мМ трис, p !i -7 ,5; Е,:.о суспензии-0,065.
/-эритроuиты морст,,;оИ свин1Си, 2-!<ролика, J-крысы.
Пр.и этом обнаружена полна я кор,реляция: и-нд у1цированный Ц Т
выход К+ бы.п наиболее интенсивен из эритроцитов морской -сви н ­
ю1, в ме ньшей степени из эри т роци11ов крол ика и крысы (рис. 16 ).
Полученные данные показывыот, что эффективность действия ЦТ
на клетки определяется его .спос-о-бно,стыо увеличивать пассивную
прон и цаемость мембра н этих кл еток, и подтверждают наше пред ­
полож е ние о важности этог,о эфф ек та в механизме действия ЦТ.
Существует точка зрения, ,согласно которой избирательност ь
цитотоксинов обусловлена· фоофо.пипидным составом мембран,
приче м резистентность отдельных клеток некоторые авторы связы­
ва ют с повышенным ,содержанием -сфин.гомиелина в их мембра-
123

на х (Tur ne r et а 1 ., 1958). Однако мы не нашли корреляции :,,-rежду
чувствитель но стью эритро.цитов к токсину и проводимостью ИФМ,
которые ф ормировали из общих фосфолипидов этих клеток, в
присутствии ЦТ .
ИФМ и з фосф олилидо в
С оотношение
Проводи.мость, .мо[с.м2 , • 10 - 8
л ецитин: сфинго­
.мие л ин*
контроль
0,5
0,67
0,66
2-10-7 М цт
13
Эритр о цито в ч еловека
Кроли:, а
1 ,2:1-3:2
2,2:1 - 3:
12
Крысы
Морско~r свиНJ(И
Мозга быка
Л ецитина \ О ла йнскиr,
завод)
Окнсле1-1но1· 0 х олес­
терина
4:1
4:1
1,7:1
0 '17
o: 4s
0,77
1,3
20
23
15
14
6,2
* По Ger :< c n , Brockшann (1969), Coпdrea et а! , (1964), Nelson ( 1967)
Zwaal et а !. (l~i3).
Ввиду т,о го, чт о сост'ав ИФМ может значительно отличаться от
фосфолипи д н о г о с остава мембра•нообразующего раст,вора, полу-
ченные данные не дают основания
отрицать предположение Turпer
et а!. Лишь на ИФМ из окисленно­
го х олестерина эффект ЦТ был зна­
чительно ниже . Поэтому можно
предположить, что различная чув­
ствител ьность клеток к ЦТ опреде-
2 ляется содержанием х олес т ерина . в
свободных от белка участках по­
ве р хности их мембран.
Мы провели ряд экспериментов*
по д ействию ЦТ на лецитин - холес-
10
50
70 т е р и новые ИФМ. Установлено (рис.
соlJержание хшrестерино, % 17), что проводимость контрольных
Рис. 17. Влияние цитотокснна на
леци т ин - холестериновые бислой­
ные мембраны . С р еда: 150 мМ
NaCI, 5 мМ трис, рН-7,4. Кон-
центрации ЦТ-1 - 10-6 М.
]-проводимость ИФМ. в nрисутстя ии
UT, 2- проводимость контрольных ИФМ,
- на оси о рдинат-логарифм провод 11 м:ости
ИФМ (О -о м- 1 ·СМ-2),
ИФМ во з растает с у величением
конце н тр ации холест е рина в бислое:
м ин имал ь н ая прово д имость отмече­
на у ме мбран, содержащих 10% хо­
лестерин а, наибольшая - при 70% ,
промежуточная - при 30 и 50%,
что согласуется с данными литера­
ту ры (Кimelberg, Papal1adjopo ulos,
19 73) по влиянию хол естерина на
подвижно сть жир·нокислот ны х цепей фосфолипидо в . При добавле ­
нии ЦТ в концентрации 10-6 .М проводим.ость ИФМ увеличивалас ь
более выраженно у би,слоев, содержащих 10 и 70% холестерина ,
* Совместно с Р. И. Труфановым.
124

в то время как проводимость мембран, содержащих 30 и 50% хо·
лестерина, изменялась незначительно. Вероятно, такая зависи­
lVЮсть объя,сняется «уравновешивающим» (Boggs, Hsia, 1972)
влия-нием холестерина на структуру мембран . Да1нные Эiкс перимен­
тов показывают, что действие ЦТ ярко проявляете,я лишь на
«жидких» ме~16,ранах. Следовательно, холестерин, действ.ительно,
может играть регулирующую роль в действии ЦТ на различные
естественные мембраны.
Резюмируя, можно заключить, что имеет,ся 2 этапа в меха­
низме взаимодействия ЦТ и фоофолипазы А яда кобры с мембра·
нами: l) адоорбция ЦТ на поверхности мембран, обусловленная
электростатическими силами и приводящая к активац,ии .св1язы­
iзания с ними фосфолнпазы А; 2) гидрофобное взаимодействие ЦТ
с фосфолипидным остов,ом мембран, сопровождающееся лабили­
зацией их структуры и повышением доступности мембранных фос­
фолипидов для действия фосфолипазы :А.
Результаты, полученные на ИФМ, позволяют . предполагать,
что взаимодействие ЦТ с фосфолипидным бислоем мембран мо­
жет •приводить к образ,ованию доменов в ИФМ, которые могут
проявлятыся как флуктуации проводимости с фик,сирова'нными
амплитудам.и тока. ,Величины амплитуд этих ,каналов, возlVЮЖJЮ,
зависят от количества фосфолипидов в доменах. -
По аналогичному механизму, по-видимому, действует а-ста­
филотоксин (Beгnheimeг, 1974; ,Красильников и др., 1980 а), а так­
же другие токсические белки растительног,о и животного проис­
хождения, для которых установлены разнообразные био.лолические
эффекты, сочетание в структуре молекул гидрофобных свой,ств с
положительным зарядом, спос,обность к потенцированию эффек­
тов фосфолипазы А и влияние на проницаемость мембран (Habeг­
mann, 1972; Hessingeг, Lenhoff, 1973; Samuelson et а!., 1974). Не-
1юто·рые различия в ·шинет.:ике действия этих веществ могут быть
обусловлены ,особенностями их химичеокого -строения, не нару­
шающими общего принципа - ком·бинации гидрофобности с ос­
новностью, что лод'nверждено и изучением х,имически мадифици­
р,ованного ЦТ (Красильников, 1980 6). Благ,одаря атому они реа­
лизуют свои эффекты по механизму, описанному выше.
ЛИТЕРАТУРА
Баб а к о в А. В. И· др. 1972 Исследование скачка электрическог о потенциала
для фосфолипидных монослоев на гранпце раздела вода-воздух и физико­
хим ические свойства фосфолипидных мембран. «Биофизика», 17, 34 7-350.
Га р к ин с В. Д. 1950. Измерение поверхностного натяжения. Исследование
свойств монослоев. - В кн. «Физичес1ше методы в органической химии» ,
т. I. N\.., 163-269.
К о реп ан о в а Е. А. 1975. Взаимодействие основных молекулярных белков
с заряженными модельными и биологическими мембранами. Автореф.
канд. дис., М.
Кр а с иль ни к о в О. В. и др. 1980а. Влияние токсина стафил ококка на прово­
димость бнслойных фосфолипидных мембран. ДАН УзССР , No 7, 66-68.
125

Красильни к о в О . В . 198 06 . Влиян и е химических мод и фикаций ц итотокси- 1
ческого п ол и пе пт ида яда среднеазиатской 1юбры на ег о мембран н ую актив -·
ность. «Узб. биол. журн.», No 4, 8-10.
К се н же к О. С. и др. 1978. Взаимодейспие кардиотоксина из яда кобры
Naja naja ox ia n a с модельными фосфолипидными мем бр анамн . «Малек.
биология», 12, 1057- 1065.
Л ев А. А. 1975. Ионная избирательность КJ,еточных мембран. Л.
Л и б ер м ан Е . А. 19 70. Мембраны (ионная проницаемост ь , возбудимость,
управлени е) . « Б иофизика», 15, 287-297.
Либе р ма н Е . А ., Ненашев В . А. 1970. Моделир ов а ние взаимодействия
клеточных мембра н на искусственных фосфолипидных мембрана~;. «Био­
физика», 15, 1014- 1021.
Не й ы а н Р. Э. 1972. Практикум по колло;:дной химии . латексов и поверх-
1юстно-активных веществ. J\'\..
Овчинников Ю.А.,ИвановВ.Т.,ШJ<роб А. М. ]974.Мембраноактив­
ные комплексоны. М.
Сах и бо в Д. Н., Сорокин В. И., Ю]( ельс о н Л. Я. 1970. Выделенiе фос­
фол ип аз ы А и з яда среднеазиатской кобры. «Биохим и я», 35, 13- !6.
Юкельсон Л. Я., Сады ков Э С., Соро1,ин В. М. 1973. Прямой ге;10-
л 11тич ес кий фа к тор яда среднеазиатскоii кобры . «Узб . биол . жу р н.:>, No 4, .
12-15.
Ю к ел ь с он Л . Я . и др . 1974. Влияние «пряАюго» гемолитического mактора
яда н а пр оводимос т ь бимоле](улярных фосфо липидных ~ 1емб ра н. «Хю 1 ия
ПТJирод. соединений», No 5, 688.
Юке1,ьсон Л. Я., Сады1;ов Э. С., Сорокин В. М. 1974. Выделение
и ха ракт е р ис тик а «прямог о» гемолитического фа ктора яда средн са ~иа тской
кобры. «Биохимия», 39, 816-821 .
Вег n h е i m е r А. 1974. Biochem. et Biophys. Acta, 344, 1, 27-50.
Воggs J. М., Нsiа J. С. 1972. Biochem. et Biophys. Acta, 290, 32-42.
ВгаgаnсаВ.,Раtel.Т.N.1972.Biochem.J,187,46.
Bгaganca В., P atel Т. N., Bad r inath Р. G. 1967. Biochem. et Б[opJ1ys.
Acta, 136, 3, 508-520.
Сhа n gС. et al. 1972. Brit. J. Pharmacol, 44, 4, 752-764.
Соndгеа Е. 1974. Experientia, 30 (2), 121-129
Соnс!геаЕ.,Кеndzегskу1., VгiсsА. de1965.Expe1·ientia, 21, 461-467.
Соndrеа Е., Вагzi1ау М., Vгiеs А. de 1971. Naunyn-Schmiedebeгgs
Arch. Pharmak., 268, 458-461 .
Соndгеа Е. et а!. 1964. Biochem. et Biophys. Acta, 84, 4, 365-375.
Folch J., LeesМ., Sloane-Stanley G. Н. 1957. J . Biol Chem.. 226, 1,
497-509.
GеrсkепG., Вrосkmаnn U 1969. EurQpean. J.Biochem.,
8, 4, 489-494.
Gгishin Е. V. et а1. 1974. FEBS Lett., 48, 2, 179-183.
На р еrm а n n Е., Zеп nег G. 1971. Nainyn-Schmieclebergs A,ch Pharmacol.,
270, 1, 1--9 .
На!Jе г111а пn Е. 1972. Scieпc e, 117, 314-322 .
Неssingег D. А., Lеnhоff Н. М. 1973. Biochem. Biophys. Res. CommL1ns.
53 , 2, 475-48 1.
.
КimеIЬегgН.К.,Рараhаdjоро111оs. D. 1973.9-thInt.Conг.B[oche111..,
S to cklюlm, 1973, Abs tг. Book, 257.
L ее С. У. 1972. А nп. Rev. PharmacoJ., 12, 265-281.
Lее С. У., LinJ. S., \\1еiJ. W .1971, in: «Toxin of animal апd plant origin.
vo l. 2» E cls. Vries А. cle, Kochva Е. Goгdon antl Breach Science PнЫisheгs,
Ne\v-York - L o n doп
-
Paris.'
М.LJе11ег Р et а1. 1963. J . Phys. Chem., 67, 2, 534-535.
N е Is оп G. J. 1967. Biochim. et Biophys. Acta., IФI, 2, 221 -232 .
SаIасhJ.1. et al. 1971.J .Biol.Chemistry246,2,331-339.
SаmLIеIssопG., Jауа\VагdепеА.,Lаkhsmаn. ]974.Acta Phaгm. succ.,
11 , 2, ]975-184 .
.
Singе1tоnW.S .etа1.1965.J.Аmег.Chem. Soc., 42,53.
126

Tien Н . Т, Са гЬоnе S., Dawic1owicz Е. А. 1966. Nature, 212, 5063,
7!&-719.
ТuгnегJ.С., АndегsоnН.М.,Gаndа1Ch. Р. 1958. Бiocl1im. et Biopl1ys.
Acta, :щ 1, 130-134 .
V о g t W. et a l. 1970 . Naunyn-Schmiec1ebergs Агсh, Pharmak., 265, 442-445.
Warren L. !959. J . Biol. Chem., 234, 1971.
ZwааIR.F. А.,Rое1оfsеnВ.,С011еуС.М. 1973. Biochim. et Biophys.
Acta , 300, 2, 159-182.
М.У. ТУйЧИБАЕВ, ~А.МУКСИМОВ
ЯДЫ ПЕРЕПОНЧАТОКРЫЛЫХ (HYMENOPTIERA)
Я. ды живо тного происхождения ~содержат ,разлнчн ые фа р­
мак ологическ и и биологиrчески активн ые вещества по лил елти ,J,­
-ног о характера. Интерес к · этим яда м и их комп,онен та111 об услов ­
лен .возмож ностью их использован ия п ри изучении с тр оен ия,
ст,руiктуры биологических мембран в цело м, nолифер ме нтных
систем, встроен ных в мембраны, ней роре цепторов , ионн ых Е ана­
лов и т . д. Так, с помощью а--бунг ар,отоксИ'на из воз будимых
мем бран электри1ческо го оката был выделен в чис том ви де хол и­
нореu епто,р (Chang eux et al ., 1970; Miled i et al., 1971). В п о1след­
ни е год ы широr<о •примен , яются токс ины ядо в с_кор ·пиона и неко ­
торых змей для изучения Na+, К+ и Са 2+-к а налов в возбу димых
мембранах (Remey et а! ., 1975; Nar ahashi, 1975; Catteral, !975).
К наст,о ящему времени ком,пон ен т ы ядов разли ч,ных з ме й и
с1<орпио.нов изу чены хорошо. Выд елены в высокоочищенно:м сос ­
тоянии и оп ределены стру ктуры (а ми нок ислотная послед ов атель­
ность) не к,ото,рых н ейротоксИ'нов, ,ц итотокс-инов , фос ф олипаз
( Slott a , Vick, 1969; Coпdrea et al., 1970; Takechi et а !., 1972 ; Zlot-
kiп et а!., l972a, б, 197.5; Carlsoп, 1974; Louv-1, 1974а, ,б; Grishiп et
а !. , 1974; Юкель,сон и др., 1975; Joub er t , 1975; Гришин и др., 19 76).
Я ды пе репончатокрылых (Hymeno ptera) п одо·б:10 другим яд ам,
в частн.о,сти ядам змей , содер жат в ~с воем составе ферме нты , ток­
сичные бел1к и и полипептиды неЭ'нзи матиче:кот о хара кте ра. Вм ес ­
те с тем , я ды перепончатокрылых отличаютс я от других яд ов ог ­
рани,ченным ,числом компсте нтов, чт о облегчает более по лн ое их
изучение .
Среди ядов различных представи телей .п ерепон чатокры лы х хо ­
рошо изуч ен яд п челы (Apis me]li fer a) . Яд пчелы предс та вляе т
соб о й сме сь нескольких б иогенных ам и~но в, цито - и не,йроток синов,
ферментов ( Н аЬегтапn, 1972). По составу он близок к яд ам ос
и шершней .
П'lе ла
Гистамин
Допамнн
Норадре налин
{Оwеп, 1971)
Оса
Биогенные амины
Г истамин
Серото нин
Допам ин
Норадре1 1 алин
(Оwе п, 1971)
Шерш е нь
Гистамин
Сер атонин
Ацетилхолин
127

Токе и чес :те белки и пеr,т:~ды
1\/tелнтин
\Vаsр-киннн
Ноrпеt - кинин
Арамин
МСД-пептид
Минимин (Le,vy et
al., 1971)
Фосфолипаза А
Фосфоли;1аза В(?)
Гиалуронидаза
Ферменты
Фосфолипаза А
Фосфолипаза В
Гиалуронндаза
Фосфолипаза А
Фосфuлипаза В
В составе яда пчелы ,среди биогенных аминов по количествен­
ному содержанию преобладает _гистамин. Его количество варьи­
рует в различных препаратах яда от 0,2 до 1,7% (Neuшann, Haber-
шann, 1954; Russell, 1967). Допа~1Ин и норадреналин обнаружены
в ядовитых мешочках in vivo и отсутствуют в составе высушен ­
ных препаратов ядов пчел и ос (Haberшann, 1954). Все эти био­
генные амины не определяют токсич>ности цельного яда.
Токсический эффект цельного яда пчелы приписывают его фос­
фолипазной активности, хотя главным :rюмпонентом яда является
низкомол~улярный пептид мелитин (Haberшann, 1972). По - види­
мому, токсиче-ский эффект яда пчелы обусловлен прямым гемо­
литическим эффектом его главного компонента мелитина. С при­
менением .комплексных методов и,сследования ( •гельфильтр ация,
хроматография, элект,рофорез, фармаколотичеокие и биохи миче ­
ские анализы) из ,цельного яда выделены в очищенном виде 2 фер­
мента - фосфолипаза А и гиалур ,онидаза, цитотокси,н мелитин,
нейротоксин апамин, МСД - пептид, минимин, секапин, тертиапин
и пептид 401 (Haberшann, Reiz, 1964; 1965а,6; Fredholш, 1966;
НаЬегшаnn, 196R; Lowy et al., 1971; Gauldie et al., 1976).
Молекулы низкомолекулярных пептидов яда пчелы состоят из
18-26 аминокислотных остатков . СJ1едовательно, их мол е кул ,яр ­
ные веса на ходятс я в пределах 2000-3000 дальт.он (табл. 1).
Основной компонент пчелиного яда - щелочной пептид мели­
тин, содержа•ние которого превышает 40-50 % от ве~са сухого ве­
щества цельного яда. Молекула мелитина сост,оит из 26 аминокис­
лотных остат ков с молекулярным весом 2817 (НаЬегшаnn, 1972;
Gauldie et al., 1976). Методом гельфильтрации и ультрацент,рифу­
гирования установлено, что молекулярный вес мелитина равен
прим е,р но 12080-12500 (Haberшann, Kowallek, 1970; Cauldie et
.
а!., 1976). По - видимому, мел итин в растворах представлен форм.ой
агрегата, состоящей из 4 или 5 мономеров. Впервые бы ла уста­
новлена аминокислотная последовательность молекул мелитина
европеik•кой домашней пчелы Apis шeili fera (Haberшan, J entsch,
1967).
В работах Kreil, Юss ( l 967~, Lubke, Matthes, Юoss, ( 1971 а)
полн.остью подтверждена .ст,руктура мелитина, установленная Ha -
berшann et al. (1967). Более того, Lubke et al. (1971 а, б) уда­
.лось синтезировать 4 аналога природного мелитина, которые по
128

токсичности на мышах и сшщифической а1ктивности не уступали
мелитину, выделен1ному из яда пчелы. В дальнейшем была у,ста­
,новлена аминокислотнабI по с ледовательность еще двух мелитинов,
изолированных из ядов Apis cerana и Apis fl orea (Kreil, 1973) . Ока­
залось , что молекулы мелитинов, полученных из ядов А. mellifera
и А . cerana, полностью идентичны. Молекулы же мелитина из яда
Таблица
Аминокислотный состав и N-концевые аминокислоты пептидов яда
пчелы (по Gauldie et а!., 1976)
Ам ин о1mслота
l Апамин I Се1Саm1н IТерт11апин I П~3i''д 1 ~~-~~\: \ Мел11т11н
----------,--
--
--,-----
--
-------
Аспарагиновая
к-та+ аспарагин
TpeOHllii
Серин
Глутамин. к-та
+глутамин
Пролин
Гл шнш
Аланин
Валин
Uистеин
Метионин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин
Фенилаланин
Лизин
Гистидин
Аргинин
Триптофан
Сумма
N- 1(01ЩЫ
3
3
4
1
]
~
18
Uис
2
5
I
3
2
3
1
I
2
3
24
Тир
2
1
1
l
4
I
2
1
4
1
1
1
20
Ала
2
1
4
4
5
2
2
22
Иле
2
1
2
1
I
1
1
2
3
2
2
1
19
Вал
2
1
2
1
3
2
2
3
4
3
2
]
26
Гли
А. florea з1нач,ительно отличаются от них (схема 1). Так, в моле­
куле мелитина А. flerea в 5 - м положении .валин заменен изолей­
цином, в 10-м - триптофан-аланином, в 15-м
-
аланин - триптофа­
ном, в 22-м а,ргинин-аспара г ином и в 25 - м - глутамин-лизином
(,Kreil, 1973; Haberm a n n, 1974).
Биохимии и фармакологии мелитина и других пептидов ядов
перепончатокрылых посвящены обзорные работы Habermann
( 1972, 1974); R11ssell , (1967). Мелитин, вызывая лизис фосфоли­
пидног,о состава биомем'бран, повреждает структу,ру и функцио­
нальное состояние клет-ок и субклеточных компонентов, а также
липосом (Sessa et al., 1969; Olson et а ! ., 1:974; Шкинев и др.,
1978). Его мембранная активность, по-видимому, обусловлена та­
кой последовательностью аминокислот, где 1-20-я аминокислоты
имеют преимущественно гидрофобный характер, тогда как 21-26-я
9-156
129

аминокислоты: -L .ys-Arg-Lys-A rg-G1n-G ln-GlnNH2 - гид рофильны
( Sessa et а] ., 1969).
J\!1 ел итин в н.изких концентрациях в несколько раз у величивает
скорос ть переноса ионов Н+, К+ , Na+, три1са+ и в меi-lь:шей степе ­
ни - двухвалентных катионов, а также Cl-, но не сахароз ы (Шки ­
нев и др., 1978) . Высокие его концентрации вызыв ают на р ушение
механизма трансформации э1нергии в мит-охондри,ях, приводят к
полно~1у разобщению ,окислительного фо.сфорили ровани я (O l soп
А. 111ellifeu1
Gly-!le - Gly-Ala - Val - Leu-Lys- Val- Leu -Т!н -T!1r- Gly-Leu- Pro
А. сеrапа
Cly-!Ie- Gly-Al;i - \fa! -Leu-Lys-Val- Let1-Tl1r -Tlн-Gly-Leu-Pro
А. florea
Gly- l l e- Gly-Лl;i -\ !e -Leu - Lys- \i;iJ-Leu - Лlа -Thr-Gly-Leu-Pro
Схема 1. Первичная ст рукт ур а ме л итнна
et в! . , 1974; Haberшann, 1954 ~б). Мелити н, подоб но цитоток сюr ют,
выделе нным из ядов зме й, усиливает актив н ость фосфол иn азы А2.
(Haberшann, 1974; Юкельс,он и др. , 197,5; К,раси льни1ков, Юкель­
сон, Т,аш:11ухамедов, 1976). ,К1ром е 1цит отокои ч еского действи я мели ­
тин в концентраrциях 0,05-2% ,обладает антибактериа л ьным и ан­
ти,грибковы м ,свой с твами (Dеrшап, Maгkl ey, 1971).
Путем гельфильтрации на сефа дексе G-50 была выделен а
фракция п е птида, абладающая н ейрот оксическо й акт ивн ос ть ю.
Этот нейротоксин в дальнейшем был очищен хро :vrатографией н а
КМ-цел люлозе и назван апамином. Его Лдsо при мерн о 4 мг /кг
в-еса м ышей (НаЬеrшапп, Reiz, 1964, 1965а,~б) . Ап а >.шн. в отличн е
от других н ей р-от,оксинов, выделенных ,из ядов скорпио1нов (Zlot -
kiп et al.,
1972а, б; 1975) и нек,оторы х зме й (Ch anda ux
et al.,
1970; Con dr e a, Barrilav, 1970; Miledi et а!., 1971) не отли ч ается
• высоко й и з бирательностью. Аnамин вызывае т у животных некоор ­
дин ированные движения, сп азмы и суд,ороги (Hab e rшann, 1972).
М,олекула апамина состоит из 1,8 аминО'кисл отных ос та тков
и имеет ~юлекуляр1ны(! ве1с 2036 . Известна е г,о аминок ис ло т1на я
после-дова'Гельность (Shipolini et, al., 1967; Haux et al ., 1967; Cal-
leu\vaert et а!., 1968). По данным Calleu\vaert et а]. ( 1968) , в мо-
130

лекулrе :апамина 4 молекулы цистеина, связываясь между с об ой,
образуют 2 дисульфидных мостика, цистеин соедин ен в п о п о же­
ниях .З-.м и 15-м, l-м и 11-м, что определяет пространств енну ю
конфигурацию молекулы (схема 2).
При хроматографии 1на КМ-целлюлозе апамин с колонк и вы­
ходит в 2 фр акциях (Habermann, 1972). Апамин является ней р о ­
токсич·есqшм rюлипептидом центрального действия, обра зую щим
достаточ_но стабильную св,язь с мишенью в организ:Vrе .
-A la ;-Le11-IJe-Ser-Trp-l l e- Lys -Arg -Lys-Arg -Оlп - OlnNH 2
-А!а. - Lea.1 - lle-Ser-Trp -- ll e-Ly s -Агg - Lys --Arg -Оlп - G lпNHe
-
Thr - Leu.-- i le-- Ser-Trp-Ile-Ly s -Аsп --Lys - Лrg -Lys - GlпNI-/ 2
( по J-!аЬеrшапп. 1974) .
Другие нейротоксины - скорпамин яда с корпиона Anclг o cte­
nus a istralis, кротам·ин яда Cгotalus terrificus и нейр -отокси н ы я да
Naja species (Breithaupt, Habermann, 1968; Haux, 1969; Hab e г-
mann, 1972) содержат около 60 амина,кислот. Нейрот о к си ны .
влияют избирательно ,на нервно-мышечные синапсы . Оба ап а :vr и­
на и в-се перечисленные нейротоксины характери з уются с иn ь ной
щелочностью и высоким содержа·нием се-ры. Содержание апами ­
на в яде пчелы невелико, примерно 2-3 % цельн-ого яда (G aL1ldie
et al., 1976) .
Из яда пчелы А. mellifeгa был выделен также МСД-пептид .
Назван,ие объя,с,няется его биолог ической фунiкцией - mast cell
destroying (Breithaut, Habermann, 1968). МСД-пептид со с т о и т и з
22 амИ1нокислотных остатков. Установлена его первичная ст.р у к­
тура (Haux, 1969) (рис. 2). МСД - пептид при внутривенном вве­
дении мышам пра 1ктически не токсичен (Лдsо 40 мг/кг). Однако
высокие дозы его вызывают к-ор-отко - постоянное возбужде н ие и
спазмы . МСД-пептид , в отличие от мелитина, вызывает дегра1н у ­
лирова ни е толыко интактных клеток.
Яды других пре,II:ставителей перепончатокрылых, в частности
ос и шершней, изучены недостаточно. По-видим.ому, это объяс-
131

....
~
1•
s
s--
1
Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glt1- TI1r-AI:1-Le11-Cy s -A\ г, -Лrg-Cy s __ Gln-Gln-J -\isNJ-1 2
1_____s _ _ _s ____ ____1
Apamin(Shipolin i
1967; Нанх, Sa\verthal, Habermann, 1967; Callewaert, Sl1ipolini, Vernon, 1?- 6S)
Asn-Cys-Lys - ! le
1
Cys-Lys-Arg-His-Val - !le-Lys-Pгo-His-lle- - Cys-Arg-Lys - Jle-Cys-- Gly-Lys-Asn N J-1 2 MCD-
peptide (Нанх, 1969)
Tyr-Tl1r- Asn - Lys- Lys- Lys - Leн-Mg-Gl y -Arg- Pr o -- P1c-Gly-P l· e- Ser - Pro-Т!н-Arg Wasp kin in
(Hilbermaпn, 1972)
Схема 2 . Аминоки с лотная nос л едовател1, ность апа м ина, NСД-r:еnт11да и \,Vasp кинина .

няется тем, что ~ почти невозможно собрать достаточное количество·
яда для структурных исследований. Поэтому многие исслед о вате­
л,и о.г,ранич1ивают,ся изучением только фа,рмакологичеокого эффекта,
(O'Conner, Rassubгook, 1963; Fischl et al ., 1972; Edery et al. , 1972;
Isay et а!., Sandbank et al., 1973; Laplinsky et а! . , 1974; Магr , Bex-
ter, 1974).
По данным Jaques и Scl1achter (1954), в ядах осы (Ves pa vul-
garis) и шершня (Vespa Crabro) присутствуют из биогенны х а!Уrи­
нов сrеротон·ин и гистами~н. В яде шершня в значительно м коли­
честве с,одержатся 3 амина (до 5 % от сухого веса яда), и з кото­
рых наибольшее количе,ство приходится на долю ацети лх олина
(Bhoula et al., 1961). В экстрактах ядовитото мешочка Vespula
masculata и Vespula maculifrons обнаружены гистам,ин, допа мин
и норадреналин. Состав экстрактов ядовитого мешочка у обоих
организмов сходен, но ,не идентичен яду ос, пчел и других ш е рш­
ней (Geller et al., 1976).
Цитотоксины и нейротоксины, такие как меJштин, МСД- пе птид,
апамин, минимин, те-ртиапин, присутствующие в яде пчелы , не
были о-бнаружены в составе ядов ос и шершней. Вместо ни х най­
дены кининоподобные пептиды, названные Wаsр - кинин и Ноrпеt­
J;<Инин. Так, из яда V. Vulgaris и V. polistes выделены 3 фр а кции,
обладающие киннноподобной активностью (Scl1achter, 196 3) . Ки­
ниноподобные пептиды обнаружены также в яде Vespula maoulif-
roпs (Geller et al ., 1976). Только Wаsр-1кинин был выделен в очи­
щенном состоянии и установлена его перв,ичная структура (Ha-
bermanп, 1972) (схема 2).
При триптическом гидролизе из молекулы Wаsр - кинин а обра­
зуется глицил -,брадикинин и щелочной пептид из 8 амино к ис л от­
ных остатков. Фармакологическим тестом для кининов сл ужат
обычно гладкие мышцы животных.
Ферменты являются обязательным компонент,ом всех ядо в жи­
вотного ,происхождения ,и насекомых. Яды могут различать с я каче­
ственным и количественным наборами ферментов. Напрю 1ер , яды
перепончатокрылых содержат очень ограниченное число фе рмен­
тов по сравнению с ядами животных, в частности, з?11еины ми яда­
ми . В змеиных ядах идентифицированы около 20 фермент ов : фос­
фолипазы А и В, протеиназа, трансаминаза, гиалурони да за , L-
аминооксидаза, фосфатаза, холинэстераза, рибонуклеаза , фосфо­
м.оноэстераза, фосфодиэстераза, гиалуронидаза, 5 1 -нуклео т идаза,
А ТФаза и др. (Russell, 1967; Mebs, 1970; Сорокин, Ниrматов,
Юкельсон, 1972), тогда как в ядах пчел, ос и шершней обнару­
жены лишь 3-4 фермента: фосфолипазы А и В, гиалур он идаза
и гистидин-декарбоксилаза (Habermann, 1972; Geller et al. , 1976) .
В яде пчелы гиалуронидаза содержит·ся в очень малы х коли­
чествах - около 2-3 % от сухого вещества яда (Haber mann,
1957). Она выделена в очищенном виде и частично оха р а,ктери­
зована. Определены ,рН-оптимум, N-концевая аминокислота и a:vrи-
133

но1@слотный -соста,в (Krysteva et al., 1973). Гиалу,ронидазы .в сос•
таве яда шершней не обнаружены.
Фосфолипаза В п рисутствует почти во в-сех изученных ядах пе­
реп-о н чатокрылых, однако она не выделена в очищенном &Иде. О
ее присутствии в составе тех или иных ядов судят по фермента ·
тивной актив,ности .цельного яда или его фосфолипазной А
фра •1щии.
Ф осфолипаза А~ как по количественному содержанию,. так и
по т оксичности для организма является -одним из главных токси ·
ческих компонентов яда сем. перепончатокрылых. Некоторое ис­
ключ е ние составляет яд п ч елы, где гемолити ч еокая активность яда
лимитиру,ется прямым гемолитическим эффектом мелитина. Од ­
нако з присутствии м,елитина литическая активнос ть фоофолипазы
резко увеличивае т ся (Красильников, Юкельсон, Ташмухамедов,
1976 ) . В ядах ос и шершней, в составе которых отсутствуют цито -
и нейротокси,1еские пептиды, токсичность, по-в,идимому, опреде­
.nяет фосфолипаза А 2 (Туйчибаев и др . , 1976, 1977). Все свойства
этог о ферм ,ента (х и мия, биохимия, фармакология) подробно опи­
саны в обзорах Meldп1111 (1965), Сопd г еа, de Vгies (1-965), Vап ·
Dеепеп, de Haas (1966), Брокерхофа и Дженсена ( 1978).
В пчелином (Apis шellifeгa) яде присутствует 1-rес1-::олько форм
фермента . S hi po li ni et а ! . (1971 а, 6) описали выделение большин ­
ства из них. С помощью гельфильтрации и последующей хрома­
тографии н а колонке с SЕ-сефадексом п ри 3 разлИ'чных значеJ1иях
рН а в торы выделили высокоочи щ енную фра•rщию фосфолипазы А2.
Подр о бно изучены физико - химические свойства и установлена
аминокислотная последовательность молекулы. Молекулярный вес
фер ме нта, определен·ный методом гельфильтрации и ультрацент­
риф уго вания, составляет около 19 ООО . Однако :v1олекулярный вес
бел ка, рассчитанный с учетом аминокислотной последовательности,
равен 14 629. Эти различия объясняются содержанием у глеводов,
кова ле нтно привязан,НЫХ к молекуле фермента. Например, конец
амин о кислотной цепи от изолейцина (1) до J1изина (14) содер­
жит глюкозамин, маннозу, галактозу и фукозу (Shipolini et al .,
1971 б ), следовательно, фосфоли п аза А2 яда пчелы являет,ся гли ­
копр о теи н ом. Ее белковая молекула состоит из 129 аминокислот­
ных о с:татков . N-концевая аминокислота - изолейци ,н, а с - кон­
цева я - тирозин; в молекуле имеется 4 дисульфидных м-остика.
Фосф о липаза А 2 встреч ·ается в составе яда в виде мономера или
диме р а с молекуJ1ярными весами 19000 и 40000 соответ,ственно.
Имеет по крайней мере 5 изомеров . Оптимум рН действия широ-
1шй:от7,5до9,0.
Таюим образом, на основании изложенных выше литературных
данных можно заключить, что яд пчелы подвергнут более подроб­
ному хи:v~ическому, био·хииическому и фармакологическому ана­
лизу, чем яды других предст·авит·елей семейства перепончатокры ­
лых ( Hyшenoptera), в частности -ос и шершней. В составе яда пче,

.'ТЫ (Apis meilifer a) идентифицированы 3 группы токсически х ком­
понентов: l ) ферменты - фосфолипазы А и В и гиалуронидаза;
2) низ•комолекулярные полипептиды - нейро- и цитотоюсины (апа­
мин, мелитин, М СД-пеп тид , минимин, секапин, тертиапин); 3) био ­
генные ам,ины - ,гистами-н, до-па:wи.н, но,рад.реналин. В отличие от
п ч елино го яда , в составе яда осы и шершня отсутствуют нейро­
л цитото1кические пептиды, но найдены киюшоподобные пептиды.
Если осно·в н ы~r токсическим компонентом яда пчелы явля ется ци­
тотокс ин мелитин, то в ядах ос и шершней этим компонен то:w, по ­
видим-ому, являе тся фосфолипаза А . У.становл·ена первичная
-ст р уктур а фосфол ипазы А2, :wелитина, апами,на и МСД-п,ептида
яда п челы; из компонентов яд а ос и ш ер ш не й выделен в чистом
Рис. 1. Гельфнльтрацr1я целы,сго нда шершт1
на кол о нке с сефадексом G-50.
1- Е:!1,); 2- Е~1.11;,
виде т оль к о один кининоподобнь1й пеп11ид и определена его амино­
хислотн ая пос.'Iедовательность. Поэт-ому подробное ис следов,ани~
тобого яда предст авшrет большой инт е р,ес в связи с п оиском но­
вых мем:бра,ноак тив•ных агентов.
Мы исследов али яд большого шершня (Vespa oгieпta lis), р ас­
прост,раненного в основном в республик ах Ср ед не й Азии , Афга­
нистане, Пак и,ст ане и Индии. Имеющие ся в литературе данные по
это:v1у яд у ограничиваются лишь изучением фармакологич еских
эфф ек тов це.1ьного яда и его отдельны х ,н еоч ищ е нных фракций
(Edery et а!., 1972; Isay et а ! ., 1973; Saпdbank e t а ! ., 1973; Kapliп ­
sky et а !. , J 974). В этих работах исследовано содержн:vrое яд ов.и ­
того м ешоч ка ил и его экстракты. В на,ruих экспериментах исполь ­
зован ли о·фиnьно высушенный яд, полученный методом электро ­
сти,-1уляции посл едних чл,еников брюшка в области ядовитой же ­
лезы ( Туtl'ч ибаев и др., .1977).
П р и гельфильтр.а ции цельного яда на коло нках с се ф адексом
G -50 получены 12 фракций (рис. 1). Первые 4 им е ют молекуляр ­
ный вес в пред елах 10000-40000, последующие 3 - около 2000-
5000, а асталь-ные компоненты представляют собой низко~1олеку­
лярные вещ ества с молекулярны~1 весом не более 2000. В отличие
от пчелиног о яда , где около половины бе лк ов ого соде-ржания при-
135

ходитоя на долю мелитина, в яде шершня о:новным по УФ-погло­
щению компонентом является фрак,Ция XII, содержащая, по-види­
мому, очень низкомолекулярные пептиды, биогенные амины, сво­
бодные аминоки-слоты и другие вещества, имеющие поглощение в
УФ - ча,сти спектра. На электр,офореграмме этой фра1кц,ии отсут­
ствуют белковые полосы. Фр,акция XJ.I не оказывает действия на
мембранные системы.
Количественное содержание фра1кций I-IV составляет при­
мерно2:5% от сухого веса яда (I~ 1%; II~5%; III+IV~ 19%).
Из сравнения оптического поглощения при 206 и 280 нм можно
заключить, что для фракций III-IV характерно высокое содержа­
ние триптофана и тирозина, а
пептидные компоненты фрак­
ции VI практически лишены
этих компонентов.
При анализе цельного яда
и его компонентов методом
1 дискэлектрофореза на ПААГ в
J цельном яде выявляются все­
,
го 6-8 компонентов в зависи­
мости от партии яда. Во фрак­
ции I, элюированной на колон­
ке с сефадексом G = 50, обна-
. Рис. 2. Изменение скорости в:,1хода ио­
нов к+ из эритроцитов под де:iствием
цельного яда шершня и его фракций.
руживается 1 юш 2 электро­
форетических компонента, не
проявляющиеся в электрофо­
регра мме цельного яда, по-ви-
J-цельныii яд; 2-6 - 11 -VI фра«ци11 соответст-
венно.
димому, из - за малого коли-
чества. Остальные фракции
также электрофоретически неоднородны. На электрофореграм­
мах фракции \/III- .X II белковые компоненты не обнаруживаются .
По аналогии с ядами ос и других шершней (Schachter, 1963; Ha-
bermann, 1972; Geller et а!., 1976) именно в этих фракциях, по - ви­
димому, присутствуют биогенные амины. В первых четырех фрак­
циях (I-IV). главным образом во фракции III + IV, сосредо т очена
активность фосфолипазы А. Во фракциях V-VII, также как в
ядах других шершней, содержатся, видимо, кининоподобные пепти­
ды. Так, S(J1achter ( 1963) выделил из яда V. v ul garis и V. polister
3 фракции, обладающие кининоподобной активностью.
Мы исследовали действие цельно.го яда и его фракщий на био­
логические (эритроциты, митохондрии) и искуствен,ные би,слойные
фоофолипидные мем·браны (БФМ). Результаты показ ывают
(рис. 2), что цельный яд в низких концентрациях (10 мкг/мл)
вызывает резкое увеличение пассивного выхода ионов К+ во внеш­
ний раствор с последующим tемолизом эритро1Цитов. Кривые
изменения скорости ,выхода ионов К+ из эритроцитов во вреу1е,н,и
ю,1юот вид, характерный для д,ействия фосфолипазы А2, выделен­
ной нюш в чистом виде из яда шершней. Фракции II, bll и IV ,
136

фосфолипазная активность которых ,соста·вляет соот ветс т в е нн о ·
520, 1600 и 183 мкмоль/мг бел.ка, имитируют эффекты це л ь но го,
яда и их действие проявля1ется в более низких конц е:нтрация х ( 1О ,
О, 4 и 1,0 М'КГ/мл). Фраюции V и VI также вызывают силь,н ый ге­
молиз мембран эритроцитов, однако этот эффект кинет иче ск и от­
личается от действия цельного яда и фракций Il-IV и .в зна чи­
тельной •степени имеет сходство с эффектами, вызываемым.и ц,ито-
Таблица 2
Влияние цельного яда шершня и его франций на некоторые
параметры окислительного фосфорилирования митохондрий печен и
крыс
Коы1Jо1 1 е11т
Цельный яд
Фракции яда
11
111
][[
IV
V
VI
I<онц е н­
траuия ,
мкг/ы г
0,5
!,О
0,5
1,0
1.75
3,5
0 ,07
0,7
3,5
?,3
3,5
7.0
10,5
3,5
5.25
7,0
Субстрат
Су1щ11нат
-
-
-
-
а -!{етог лу-
тарат
"
-
-
"
-
---
Су!{ШШ3Т
"
-
-
"
-
-
.
-
-
"
-
-
.
-
--
"
-
-
.
-
-
.
-
-
"
-
--
.
-
-
"
-
-
-
-
-
--
-
---
Скорость дых а1-11rf!
1·1а атом, 0/~,г бе;11,а
В ЫHl·I
25 75
22
30 70
44.
28 58
4'5
21 60
20
224630
224444
21 47
]У
.
-
54 34.
.
-
53 .53
.
56.Б 56 :5
"-
12 ,5 12,8
.
-
2,8 2,8
.
-
64
64
"-
4'2
18,5
-
-
~1
26
-
"-
51
51
-
"-
40 25,3
57 47
--"-
58,5 58,5
дк
АДР/0
3, 10
1,80
1,59
1,43
128
1,40
3 ,00
3,20
1 ,53
2,40
Полно е разоб щен и е·
2,47
1
1,90
1. 58
1.60
По лное разобщениес
-
-
"
-
--
--
-·-
228
1
1.89
1 ,56
1,58
Полное разобщение·
1,55
1
1,70
1 ,20
1.24
Полное раюб щен ие·
токсином яда кобры (Юкельсон, Красильников , Ташt.1ухам едов,.
1976).
Низк·ие концентра1ции (0,5 мкг/мг белка митохондрий) яда
шершня не оказывают заметного влиян ·ия на скорость окисления
сукцината в -состоя,ниях 2 и 3, но значительно повЬ!iшают интен ­
сивность дыхания в состоянии 4. При этом снижаются зна че ния
ДК и АДР/O. Увеличение концент,рации яда вдвое в еще бо льш ей
степени ум еньшает ДК, а таюк,е ско,ро с ть окисления в состоянии
2. Аналшичные ,результаты получены и с а -к етогл у тар ат ом , но
эффек т яда в этом случае выражен более значите~1ьно; пр и 1<0н ­
центращии яда 1 мкг/мг белка митохондрий наст у пает полное­
разобщение (табл. 2).
137

Наиболее сильное действие оказывает фракция III. Даже при
1шнце нтрации 0,07 М'кг/мг белка добавление ее приводит к полно­
му р азобщ ению, а ско.рость окис ления в состоянии 4 значительно
увеличива ется. В высоких дозах она полностью ингибирует дыха­
ние. Дейст,вие фракций II и IV аналогично преды~ущему, но •п ро ­
является при более высоких концентрациях. Низкомо л екулярн ые
фр·а·кц ии V и V I повышают скоро -сть окисления не только в со::­
тоя ни и 4, но и в ,сост,оя,нии 3. При низк,их кон,центра,ци,ях этих
фр акций пр оисходит уменьшение ДК: при сохранении значения
АДР/ O, а при в ысоких наступает полное разобщение, однако и н ­
гибирован,ия дых ания при действии фракции VI не наблюдает,ся.
Цельный яд шершня и его фрокции II-VII вызывают быстрый
разрыв БФМ . Исключением является фракция VI, кот ор ая при
концентрации 1,5 мкr/:v1л увеличивает проницаемость БФМ ( от
2,1О-9 до 5-1 О-7 ом-1- см2). Однако и в этом случае разрыв мем­
бра н на -ступает быстро, через 45-50 с.
Та ки м образом , эффект цельного яда и фрак;ц-ий II-IV в ос­
нов но м обуслов лен фосфо л ,и,nа з а,ш; ,вклад низко:лолекулярных
ком п онентов незначителен, и природа их пока не изучена.
Для выделе ния фосфолипазы А фрющии III + IV, которые пло­
хо отделяютс я друг от друга при первичной гельфи л ьт,рации на
сефаде ксе G-50, хроматографировали на колонках с карбоксиме­
ти л -целлю:1озо й (СМ-32). Получ ено 6 фракций . Фракция С-4 , яв­
ляющаяся основной по выходу белка, оказалась гомогенной при
электрофорезе на полиакриламидном геле. Аналогичный резуль­
тат п олу чен и при электрофорезе на ПААГе в присутствии доде­
цильсулыфат, а яатрия и дитиот,ритола (рис. 3). Этот электрофоре­
тически гомогенный бело~, снижает оптическую плотность при
925 нм с успенз ии яичн,ого желтка (.рис 4) аналогично фо сф олипазе
А2 , в ыделенной из ·змеиных ядов ( M ariпetti, 1965), и специфичее~ки
рас ще пляе т лецити,н на ,сво,б од ную жирную к,и,слоту и лизолеци­
тин. Мож-но сделать вывод, что выделенный нам ,и гомоге нный пре­
пар ат белк а яв .;шет,ся фосфолипазой А 2 .
При из уче нии действия фоофолипазы А2 яда · V. ori entalis на
мембр аны уст ановлено, что этот фермент вы з ывает д ест рукци ю
био ме м, бран (эритроциты, митохондрии) и разрыв БФМ. Во в:ех
случа я х она действует в значительно более низких концентрациях
по сра вне ни ю с фосфолилазой А2 , выдел е нной из других ядов, в
час тн ости, из яда с,р,еднеазиатской кобры и пчелы (Туйчиб аев и
· др., 19 76, 1977).
.
Nlолекулярный вес фо афолиnазы А2 яда шершня, определен­
ный м·е тодо м гельфильтрации на сефадексе G -75 и электрофоре­
з о м н а ПААГе в присутствии 1 % дод ецильсульфата нат рия, ра вен
пр име рно 26000. Однако фосфо ,п илазы А2, выделенны е из ядов
различного происхожд,ения, имеют молеку л я.рные веса почти всег­
да ниж е 15000 (Брокерхоф, Дженсен, 1978). Некоторы е исключе­
ния из этого правила объясняют с я тем, что моно~1ерны е ферменты
из Crotalus имеют о,бычно низкий молекулярный вес, но стабиль-
138
/

ной формой очн щенног о фермента является димер (\л/e ll s, 1971;
Hach iшor i, 1971). В пчелином яде димер прис утствует только в
концентрированных растворах при щелочных значениях рН. Срав­
нит ел ьно высокий молек уля рный вес мономера объясняется нали­
чием в ферменте око л о 23% углеводного компо-нента (Shipolini et
al ., 1971 а). Высокие моле ,куля рные ве с а некоторых фосфол ила з
2
з
4
Рнс. 3 . Элс,стрnфоrеграмма ; е; 1 1, ,ого ~1да,
фр<1;;ции 111 и фосtj олипазы Лё шер11нн:.
1-г..е ! 1,11ый ·нл . 2-фp::i:ct · 11 т;:+ ·\' . J- Фосфот 1п ,1: 1 а
А'!_, 4-фuсфолнrхаза А;~ в пр11сун:л,1-1,, i ~"
:~uл.е,н I JI ы..:у.1ь ­
,фат.iJ натμнs1 в 1 · епе .
А2 из ядов Naja naja и
\/iрега гu ss ellii, без услов ­
но, представJJяют исклю­
чение (Salach et а!., 1971).
В нашем случае в моле ­
куле фосфолипазы А2
ш е ршня при качествен ­
ном анализе у глево дный
компонент не обнаружен.
5
10
!5
2025
Bllf:MJI 1/HKVOOUUU. MIIH
Р:1с . 4. Деi1 ствне цельного лда.
фра 1щ и11 111 11 фосфолипазы
i\ё 11а суспензию яичного
>келтка.
/ - иJ1 1т1юль, 2 -цельный п:( , 3-
ФJ)::~ !-: шн, i!! , .f- rJ) tJC:фoл : пciJa А:!. шер­
l!!Н9 (\ . {) rleпtall s), :J- ф ос фол11: 1 а з;~
А:!. 1.:oOtJi): {N . N . uxiana).
П о нalliHM предвари тельн ым данны м, в яде ше-ршня, п омН'\-IО
фосфол,ип азы А 2 , сод ержи тся дру,гой фе р"~еtп - л изофосфолипаза
А,. Тан:, при испол ьз ов,ании метода Mariпelti (1965) измерения
активности для цельного яда и фракции I II по:1учаются необыч­
ные кривые при измерени и фосфолипазной акт ивности: вмест о
снижения опти ческой плотности, что обычно прои,сходит при до­
баЕ- лени.и истинно й ф осфо,11ипазы А2 (рис. 6, кривые 4 и 5), ваблю-
!ЗJ

дается ее возрастание (рис. 6, кривые 2, 3) . Э т о м ожно объяс­
нить, лишь предположив, что в ходе реакции лизолецитин при фер­
ментативном расщеплении лецитина подвергается дальнейшему
распаду до образован ,ия свободных жирных кислот и глицеро - 3-
фосфохолина. Появление большого количеС'тва жирных кислот ,
кото•рые, ка1к известно, образуют аг,ре,гаты в раство р е , содер жа ще~1
0,9 % N aC l (условия измерения активности по M"arinetti), прив о ­
дит к ув,еличению светорассеяния системы . Действительно, с по­
мощью метода тонкослойной х,роматотрафии конечных продукто в.
реакции было определено, что цельный яд и фракция III могут
ускорять ,гид,роли.з как лец.итина, так и лизолецитина. В обои х ,слу ­
чаях при полном гидролизе продуктами реакции были только сво­
бодные жирные к•ислоты.
Таким образом, из изложенных выше экспери:v~:ентальны х дан ­
ных следует, что гемолитическая активность яда б ольшого шерш ­
ня Vespa orientalis обу~сло,влена присут,ств.ием в н и х по мен ь шей
мере двух липолитических ферментов, различающ и хся своей суб­
с тратной специфичностью - фосфолипазы А2 и л изофосфоли­
пазы А1.
ЛИТЕРАТУРА
Бр оке рхо ф Х., Дженс ен Р. 1978. Липолитические ферменты. М.
Г риш ин Е. В. и др. 1976 . «Биоорганпч еская х имия» , 2, 1018.
Красильников О. В., Юкельсон Л. Я., Ташмухамедов Б. А.
1976. ХПС, No 1, 127.
Со р окин В. М., Нигматов 3.,
Юкельсон Л. Я . 1972. «Био х имия »,
37, 112.
.
Т у й ч и бае в М. У. и др. 1976. «Биохимия митохондрий», 1\11., 146 .
ТуйчибаевМ.У.идр. 1977. «Биохимия»,42,2160.
Шкинев А. В. и др. 1978 . «Биохимия», 43, 1452 .
ЮкельсонЛ.Я.идр.1975.«Биохимия»,40,698.
Юкельсон Л. Я., Красильников О. В., Ташмухамедов Б. А.
1976. хпс, No !, 128 .
Bhoola К. D. , Call e J., Scl1acl1ter М. 1961. J . Ph ysiol., 159,167.
Вгеit11аuрt Н., НаЬегIllапп Е. !968. Nauпyn-Schшiedebergs Arch. Ехр.
Patlюl. Phar111 2col. , 261, 252 .
Са11еWаегtG., S h iроIiпiR., VеrпоnС.А. 1968,Fed. Eur. Biocheш.
Soc. Lett ., 1, III.
С а r 1s s о 11 F. Н. Н. 1974. Biocheщ Biophys. Res. Colll!llllll" 59, 269.
C atteral l W. А. 1975. Proc . Nat. Acad. Sci. USA , 72, 1782.
Сhа11dеuхJ.R., К аsаiМ.,LееСh.
-
У. 1970, Proc. Na t. Acad. Sci. USA.
67, 1241.
C oпdrea Е., de Vri es А. 1965, Тохiсоп , 2,26 1.
C oпdrea Е., Barzilav М., Mager J. 1970. ВВА, 210, 65 .
Dorllla11 L. С., Markl ey L. D. l97l. J. Med. Сhеш., 14, 5.
ЕdеrуJ. et al.1972.Тохiсоп, 10,13.
F is с 111 J. et al. 1972. Acta рагтасоl et toxicol., 31, 65.
F r е d h о 1т В. 1966. Biocheщ Phormacol., 15, 2037.
GаuIdiеJ. et al., 1976, Еш J. Biocheш., 61,369.
Gе11еrR.G. et al. 1974. FEBS Lett., 48,179.
Н е Ь е r тап 11 Е. 1954а. Nau11yп-Schiпiedebergs Arch. Ехр. Pathol, Pl1armacol.,
222, 173.
На Ь е r Ill а п п Е. 1954Ь. Na tuгwisseпscl1 a ffen, 41, 429.
140

НаЬеrmаnnЕ.1957.Biochem. Z., 329,1.
H aberm ann Е. 1972. Science, 177,314.
НаЬеттаnnЕ. 1974. Pharm. UnsereгZeit., 3, 145.
Hab erm ann Е., Reiz К. G. 1964. Natuгwissenschaften , 51, 61.
НаЬеrmаnnЕ.,RеizК.G. 1965а.Biochem. Z., 341,451.
Habermann Е . , Reiz К. G. 1965Ь. Nat uпvissenschaften , 343,192.
НаЬеrmаnn Е., Jеntsсh J. 1967. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.,
348, 37 .
НаЬеrmаnn Е., Ко,vа11еk Н. 1970. Hopp-Seyler's Z. Physiol. Chem.,
351, 884.
Has hi mori У., \Vells М. А., Hanah3n D. J .,
1971. Biochemistry, 11,
4084 .
Н а u х Р. Hoppe-Sey\er's L. Physiol. Chem ., 350, 536.
НавхР.,SаwеrthаIН.,НаЬеrmаnnЕ. 1967. Hoppe-Seyler's Z. Phy-
sio1 . Chem., 348, 737.
IsауJ., NаdЬеrЕ.Z., G ittеrS.1973.Acta Pl1armacol ettoxicol., 33, 157.
JаguеsR., SсhасhtегМ.1954.Bгit.J.Phaгmacol.,9,53.
J о tt Ь е г t F. J. 1975. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 53.
I<:ар1inskуЕ.,IsауJ., G ittегS.1974.Texicon, 12,69.
КrеiIG.1973. FEBS Lett., 33,241.
Кгеi1G., Кrеi1-Кiss G. 1967. Biochcm. Biophys. Res. Com111tшs, 27, 275.
I<:rуstеvаМ.А. etа\.1973.ДоI<л.Болг.АН,26,917.
L о u w А. J. 1974 а. Biochem. Biophys. Res. Com muп s, 58, 1022.
LовwА.J.1974Ь.ВВА,336,481.
Lowy Р . Н., Sarmieпto L., Mitchell Н . К. 1971 . Arch. Biochem., 145,338.
Liib ke К., Matthes S ., Kloss G. 1971 . Experientia, 27,765.
J\1\.а гinеttiG.V.1965.ВВА,98,554.
МаrrА.G., ВехtеrВ.Н. 1974,Texicon, 12,443.
М е Ь s D. 1970. Int. J. Biochem, 1, 335.
МеIdrum В. S. 1965. P11armacol. Rev., 17, 393.
Mi1 edi R., Moliпoff Р., Potter L. Т. 197 1. Nature 229, 554.
N а r а h а s h i Т. 1975. 6th Congr. Pl1armacol., He1siпki, 1975, Abstгs, 1, 214.
Nеumаnn W.,
На Ь е r m а 11 n Е. 1954. N2uny11-Scl1iniedebeгgs Агсh . Ехо .
Pat. Но1. Pharmacol. , 222, 367.
О'Соnnег R., RаssuЬгооkW. 1963. Сапаd. J .Bioc11em. апс! Physiol., 41,
]943.
O1s 011 Е. С., J'll.uпj a 1 G., Ma1viya А. N. 1974. Тохiсоп , 12,419.
Ow en М . D. 1971. Expe rientia, 27,544 .
R о m е у G. et al. 1975. Biochem. Biophys. Res. Commuпs, 64, 115.
R u s s е11 F. Е. 1967. Fecler. Proceed., 26, 1206 .
Sa1 ach J. I . et а!. 1971. J; Biol. Chem., 2461, 331 ..
SаndЬэnkU. et а1. 1973.Acta Pharmacol. et Tox1col., 33,442.
Sс11асhtеrJ'I\.1963.Апn.N.У.Acad.Sci,164,108.
Sсhrоdеr Е. etа!.1971.Ехрегiепtа,27,764.
SеssаG. et al.1969.J.Biol.Chem., 244,3575.
S11iроIiniR.А. et а\. 1967. Chem. Commuп., 1967,679.
Sl1i poli ni R. А. et а!. 1971а. Eur. J. Biochem., 20,459.
Shi pol ini R. А. et a l. 1971Ь, FEBS Lett, 17, 59.
SIоttаК.Н.,VlсkJ.А.1969.Texicon, 6,167.
Ta kech i М., Hayash i К., Sasali Т. 1972 . Mol . Pl1armacol ., 8,446.
VаnDееnеnL.L.М., cleНааsG.Н.1966.Апn.Rev. Bioche111,35,157..
W е 11 s М . А. 1971. Biochemistry, 10, 4078.
ZIоtk nЕ. et а!. 1972. Toxicon, 10,207.
ZIоtk n Е. et а!. 1972Ь. Toxicon, 10,211.
ZIоtk nЕ. et al.1975InsectBiochem., 5,243.
141

1-1. М. МИРСАЛИХОВА
ФОСФОЛИПАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Na, i(-АТФа:щ МЕМБРАН
Транспорт ,ионов против градиента концентра i.I,ий ч ере з кл е­
точные Уl'еУI-браны имеет первостепенное значение в свя зи с его
участием в биологически важных процес с ах. Огро м,ный пр о гр е сс
в понимании этого процесса был дост и гнут бла год аря откр ы тию
SkOLt ( 1957) в микросомальной фракции нервов ~< раб а Na+, К+­
А ТФазы, от 1<0торой зависит ионная асимметрия .
К настоящему времени собран б о гатый матер иал о тка не в о й
и субклеточной локализации этого фер·мента, молекуля рной орга­
низации, функциональной роли белок- л ипидного взаим одейс т вия,
очистке , -реконструюции на бислойных м ембранах, роли л ипи дно,го
о,кружения в проявлении активности и др. (Кирсе ю; о, 1971, 1976;
Ташмух·а:vtедов, Гагельганс, 1973; Dal1l, Hokiп, 197 4; Ta na ka, 1974;
Sch,Naгtz et al.,
1975; Рож :vrанова, 1976; КогеnЬго t, ]977 ; Б р.1ды­
рев, Твердислов, 1978 ; Robinson, Fla s hп e r, 1979; Бо лдыр ев , 1979).
Дальнейшее и c cJ1 eд o ca 1 1 r r e м еханизмов J?аботы Na+, К+ -А ТФазы
позволит активно ю1ешиваться в эти про цессы и управл ять и:vш.
Na+, К+-А ТФ, аза
-
:11е:v~,бранный ли п о пр о т еидный фер мент ,
для проявления актив н ости которого н еоб ходимы .1ии2щы . И спо.1ь­
зуя фосфолипазы в качестве и.нст.р у м ента иссл е;.J.ования, мо жно
дать u:енную информацию о роли фосфол ипидов в функц ион и рова ­
нии транспортной А ТФазы (Мирсали х ова, 1969; Ro elof sen et а!.,
1973; Dal1!, Hokin, 1974; Tanaka, 1974; Мирсалихо ва и др., 1975;
Мирсалих,ова, Рахимов, 1977; Болдырев, 1979; Is e rп de Cald entey,
Wheeler, 1979). По сравнению с опытами по реко н с трук ции дели­
пидированной с помощью органичес ки х ра створит елей ф ерментной.
системы это:т м-етод обл,ада -ет тем пр е и:v1у щест,вом, что позволяет
изучать кинетику инактивации Na+, к+..,___,\ ТФазы б ез по лного раз­
рушения тонкой структуры мембран. Kp oYI 'e того , исп о л ьзуя суб ­
стратную специфичность фосфолипаз, мо жно изуча,ть р оль отдель ­
ных специфических фосфолипидов в фу нкционир овани и Na+, К+­
АТФазы .
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МОДЕЛИ МЕМБРАНЫ
И О РАСЩЕПЛЕНИИ ФОСФОЛИПИДОВ РАЗЛИЧНЫМИ
ФОСФОЛИПАЗАМИ
Согласно современным представлениям, в моде ли мозаичной
· мемб.ра ны фосфолипиды орг.а.низованы в виде д войн ого сло я с
трановер -сальным ,раоположение"1 жирн о кислотных це почек и до­
вольно плотной упаковкой бислоя за счет полярных к-ислых фос ­
фолипидов. Периферические белки ра с п о ложены на одной и з по­
верхностей бислоя с незначлтельным в него п огруж ением, интег­
ральные пронизывают мембрану ' наск-возь. Эта модел ь предусмат ­
ривает возможность образования олиг о меров, пере ходы белков и
142

липидов из од'ного слоя в другой, вращательную подвижность, пе­
ре~1ещение белков 1в латеральном напра,влении и т. д , Лrипщц,ный
бислой несимметричен, характеризуется неодинаковым со·ставом.
Большая · часть липидных молекул не связана с белка~1и, хотя не ­
которые входят в состав л:ипопротеинов (Kabak et. а! ., 1975; Ко-·
tyk, 1977).
Ниже представлено взаимодействие фосфолипидов с фосфоли­
пазами А, С, D и сфингомиелиназой.
Фосфог лицериды
о
11
О-Р--0-Х
i1 '1'
н
о-
Ф осф оли паза С Фосфоли;1аза D
Фосфатидилэта ноламиа х= - СН 2 --С Н2 -.\"н ,;1-
+
Фосфатиди.1хол1ш х=-СН2-С :2-1'>;(С !3 ) 3
н
1
Фосфат11д11лсер ин х=-С ,- 1 2 -C --N н j-
1
соо
Сфингомиел и н
Сфингом1_1елиназа
Фосфолипаза А2 (фосфатил - ацилгидролаза, КФ 3.1 .1 .4 .) най­
дена в ядах зУtей, пч,ел и ос, а также в некоторых тканях живот­
ных ; изв,естны случаи определения их в растениях и бактериях.
Она расщепляет ~80 -90% всех мем,бранных фосфолипидо в, от­
щепляет жирную кислоту в положен,ии 2 и приводит к образова­
нию лизосоедин ений.
Фосфолипаза С (фосфатидилхолин-холинфосфогидро лаза, КФ
3.1 .4 .3 .) из ВасШнs cereus и C lo stгidium welchii способствует гид­
ролизу связ·ей между L - а-фосфатидной кислотой и азот1истым о,с­
,нованием, наблюдается расщепление ~ 80-90% фосфолипидов
до диглицеридов и церамидов, которые остаются в мембране, в то
время как хорошо растворимые этаноламинфосфат и серинфосфат
удаляются из нее.
143

Фо сфолипаза D (фосфатидилхолин-фосфатидогидролаза, :КФ.З .
1.4 .4 .) гидролизует 70% фосфатидилхолина до холина и фосфатид­
ной к ислоты м ежду а, В-диглицеридом и фосфо,рилированным ос­
нов ан ием.
Сф ингомиелиназа (сфингоми·елин-холинфосфогидролаза) рас­
щеп ля ет сфингомиелин. Холинфосфат, образующийся под действием
это го ферМ'ента, хорошо растворим в воде и удаляется из мем­
б р аны, диглицериды и церамиды остаются .
ПРИМЕНЕНИЕ СУБСТРАТНОИ СПЕЦИФИЧНОСТИ
ФОСФОЛИПАЗ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОПОГРАФИИ
ФОСФОЛИПИДОВ В АТФазе
Для правилыного представления о молекулярной организа­
ции и функционировании Na+, :К+-АТФазы нео·бходимо изучить
лок али за.ц,ию составляющих ее ,компо.нентов. Na+, :К+-АТФаза -
один из наиболее изученных препаратов ср•еди ферментных сис­
тем , для проявле.1шя активност.и ·кото•рых необходимы фосфол1ипи­
ды. Однако до сих пор нет единого мнения о том, с каким липи­
дам св язан этот фермент . Результаты работ по исследованию роли
бело к - липидного взаимодействия с помощью различных фосфоли­
паз, к сожалению, не идентичны из-за использования фосфолипаз
из р азл ичны х источников, а также прим1енения неочищенных пре ­
пар ато в . Получению более или менее однозначных результатов
спос обс твовало успешное применение в последнее время высоко­
очищен ных пр·епаратов фосфолипаз . :Кроме того, э-ксп•ерименты с
испол ьзованием фосфолипаз дают нередко противоречивые дан­
ны е и з - за нестандартных условий экспериментов. При этом сле­
дует у читывать по крайней мере 4 нажных фактора (Цваал , Рое­
лоф сен , 1979).
1. При подборе фосфолипаз для исследования ферментов еле.с
дует принимать в-о вн.имание прежде всего особенности их субст­
ра тной специфичности, так как идентичные фосфолипазы из раз­
ны х ис точншюв различаются по скорости гидролиза одних и тех же
фос ф о л ипидов . Важно также учитывать свойства продуктов гид ­
роли за, образующихся под действием фосфолипаз, которые сами
по с ебе могут обл.адать мембраноа,ктивным действием.
2. Неравномерность распределения фосфолипидо-в между внут­
ренней и на-ружной поверхностями мембраны также играет су­
щест ве нную роль при действии фосфолипаз . Необходимо ра·ботать
с м•е мбранами всецело замкнутыми или незамкнутыми. В случае
_смеси этих двух ти,пов могут быть ·получены 111,ротиворечивые
данны е .
3. Следует учитывать компактность липидного слоя мембраны .
4. В биомембрану, кроме липидов , включены и белки, которые
мог ут влиять на скорость гидролиза липидов фосфолипазам,и , эк­
рани ·руя их . Возможны 2 варищпа экранирования: а) белки не­
поср едстsен,но С1вяза-ны с .лиПlщцом; б) п~ри отоут,ствии непосредст-
1-44

венн ого контак т а с липидами белки из-за определенн.ого располо­
жени я м ешают их контакту с фосфолипазами .
С у,ч етом этих факторов при использовании .различных фосфо­
липа з и сследовано расположение фосфолипидов в препар.атах
мемб ра н а~ритроц.итов (рис . 1) . Если исходить из предположений ,
что липиды представлены в мембране двойным слоем, то в состав
внеш него слоя мем,бран эритроцитов чел.ов-ека входят 2 основны х
х олин содержащих фосфолипида ( фосфатидилх,олин и сфингомие­
лин), а фосфатидилэта,ноламин ,со-ставляет 1/5 общего количества .
Внут ренний ,слой представ­
л ен фос фапrдилэтан•ола.ми ­
ном 1и фосфа'Гидил1сери:ном
,с,о следо выми количествами
хол,1,шсодерж:ащих фосфоли­
пидов ( Цваал, Роелофсен,
1979).
С ;пrQrм,ощью фосфол1иnа­
зы А2 из яда Najа najа на
су6кл етючных
фракциях
:м,емб ра,н печени крыс (мю<­
р,о,с,о,мы, мем,браны Гольджи,
,ннутр ,енн ие 1м1ито ·хондриаль­
ные и я дерные мембраны)
лосле д:о,в ана трансме,м6ра11 -
на1я а си,м метр,ия фосфолипи­
д:01в ( Na ll ss:oп, Dallner,
1977). О бнаружено, что фос­
фа11и д:илх ол:ин, сфишгомие­
.л. ин
·И ка рдИ 'ОЛИЛ'ИН находят­
ся н а .в:нут·р енней •по в•е1рхно­
сп1 везикул, образ,ованных
:мембр алными фратментам ,и.
Снаруж{,,
{'lHV/ТJ/JU
Рис. 1 . Возможное нахождение фосфоли­
пидов между внутренней н наружной по-
13ерхностя~ш мембран эритроцитов челове-
l{а (Uваал, Р<:>елофсен, 1979) .
/ - с у i\lмарная фран:u·1я фосфолнпидов, !f - сф11 н ­
rо:'.1Иелин, J{l -фосфаТ!! д н л холин, / V - фосфат н днлэт а ­
нола :,шн, V - фосфатr1лнлсер11н.
Д ейст в.не фосфолипаз обусловлено поверхностным натяжение}!
(Цва ал, Роелофсен, 1979). Как правило, фоофолипазы должны
облад ать определенным оптимумом поверхностного натяжения для
прояв лен ия максимальной активности и, следовательно, скорость
г!Ид,р оли за липидов определяется плотностью их упаковки.
Ch ap et al. ( 1977) на свиных и человеческих интактных тром­
боцит ах с помощью фосфолипаз (фоофолипаза А2, фосфолипаза
С, сф ин гомиелш-1с1за) обнаружили, что липиды на наружной по­
верхн ост и м•е:Vrбран упакованы с поверхностным натяжением
34 ди н/ см 2 и соде ржа т Ф6 % фосфолипидов плазматических ме:vr­
бран (91 % сфин гоми елина, 40 лецитина, 34 фосфатидилэтанола­
мина и ~,rенее 6% фосфатид.илсерина). Кроме того, фосфолипазы
исполь зо вали для исследования топографии фоофолилидных вези­
кул (Suпd l er et al., 1978), состоящих из фосфатидилэтаноламина
и фо Jфатидилхолина. Обнаружено , что фосфошшаза А2 из яда
Naja naja, crotal11satr ax и Bungaн1s multicinetнs гидролизует до
]0- 156
145

лизофосфолипид,ов и жирных кислот около 80 % фосфолипидов.
на внешней поверхности липосом, не проникая • во внутренний
слой. Фоофолипаза С из Bacillus cereus, Clostri diu ш welcl1 ii и
фосфолипаза D из арахиса расщепляют фосфо липиды на обеих
поверхностях липосом.
В связи с тем, чт,о работа натриевого насоса непо средственно
связана с обеими поверхностями :,,rем·браны, н·еобходимо иvrеть
представление о пространственной локализации активных uентров
фермента. В настоящее в,ремя существуют доказа тел ьства того ,
что Na+, К+-АТФаза «пронизывает» мембраны. В сво е время Кер­
пег, Масеу ( 1.968), основываясь на данных молекуля рного ве са
Na+, К+-А ТФазы из мембран эритроцитов, вьюказа л и пр едполо­
женне, что ее размер соответствует 8,5 нм, в то время, ка к Kyte
(1971), основываясь на молекулярном весе бо.1ьшоi': субъ€.JИНИ­
цы Na+, К+ - А ТФазы почки 98 ООО, оценил ее разм ер :а 3,5-4.0 нм.
Deguchi et а! . (1977) при изучении субъединиц Na+, К+ - АТФазы
из почек с по;vющыо электронной ,шкроскопии с негати вным КОJ!­
трастирова ни ем обнаруживали, что препараты предс тавляют со ­
бой ДJ+скоподобные фрагменты ,,rем,бран с внутриме:v~браннычи
частицами диаметром 4,0-5,0 н м .
И :1сv1 унолоrические работы показали наличие на внут рен ней по­
верхности мембраны о-сновного количес тва антнгенных мес т в
большом лелтиде (Kyte, 1974). Изучая действ ие анти тел .разных
полипептидов на функцию Nа+ - насоса, удалось определ ить лока ­
лизацию су,бъединиц в мем-бране (Jеап, Albers , 19 77). Мал ан
суб ъединица, ответственная за связ ывание о у а баи:1а, рас п о.1nжЕ>
на на внешней поверхности, а большая, ответс твенная за фосфо ­
рилнро.вание,- на внутренней по,верх,но,сти мембр аны. Это согла­
суется с данным.и многих авторов по специфичес кому фосф орил и­
рованию именн,о большой цели (JUesugi et а!. , 1971; Kyte, 1971;
Нагt, Titus, 1973) и локализации в ней субстратн ,ого центра и
N а+-связывающих усrастков.
С помощью фоофолипаз удалось показать нали чие ф осф ати­
дилсерина и а,ктивного центра Na+, К+-А ТФ азы на внут ре нне (r
поверхности мем•браны эритроцитов. Для мем.бран освяз анно й Na+,
К+ - А ТФазы характерна несимметричность ра~спо ложения липида ;
с внешней стороны мембраны ра -сположены пре нмущественно фос­
фатидилхолин, есфинтомиелин и холестерин, а с внут рен ней -
фосфатидилсерин и фосфачщилэтаноламин (Emme!o+, 1977: Na1s-
son, Dallпer, 1977).
При правильной о,ценке данных субстратно 11 специ фичностн
-
фосфолипаз и ф ерме нтативной активности А ТФ а з ~,ож но опред е ­
лить необходимость тех или иных фосфолипи J.оз для р а ,боты
фермента.
Roelofsen, van Deeneп ( 1973), используя эту 1,оррел яцию с по­
мощью фо,с фолипаз А2 , С и сфингомиелиназы, поhазали необхо ­
димость фосфатидилсерина для проявления Na+, К +-с~ ТФазно й
активности из мембран эритроцитов . Для этой цели тени эр итр о-
146

цитов человека обрабатывали различными фосфолипазами с пос­
ледующим определением гидролиза фосфолипидов, выраж ен ны х
в % к контролю , и Na+, К+-А ТФазной активности из :м е:vrб ра н
эритроцитов.
Фер.мент
Число Сфинго- Фосфа- Фосфа- Фосфа- АТФаз-
опытов миелин тидил- тидuл- т и дил- н ая ак-
холин
этана-
сери н
ти в-
лам.ин
ность.
Панкреати • rес-
кая фосфолипаза
100
А2
12
о
о
о
о
Фосфолипаза с
(В. cereus)
19
]00
о
о
0-5
о
Сфинrомиели-
наза (S. auгeL1s)
з
о
100
100
!00
120- 14 0
Таким ,образ о м, панкреатическая фосфолипаз а А 2 и ф осфо ли­
паза С из Baci ll us c ereus ин активируют Na+, К+-А ТФа зу; с фин­
гоми елиназа, кота.рая расщ е пляет только сфинго:vш е л ин, не и н ги­
биру е т транспортный фермент . С л едовательно, при п олн о~r р а с­
щеплении фосфолип ·идов (фосфатидилхолин, фо vфатидил эт ан о ла­
мин, фо.сфатидилсерин) наблюдается инактив,а,ция ферме н та тив­
ной активности. Для ,определения потр еб но ст и транс по ртн ого ф е р­
мен т а в индив·идуальных фосфолипидах после о б ра бот ки сjюс фо­
липазой С из Bacil\•1s cereus и удаления образо1Завшихся диглице­
р идов Na+, К+-АТФазу реа,ктивировали фосфолипи д ам .и. Ус т а нов­
лено во с станонление активности после добавления фосфа т и д ил­
серина и ее отсутствие после добавок фосфатидил хо лина . В с л у­
чае обра,ботки мембран эритроцитов ф осфатидилсериндек арбок-с и­
лазой из Е. coli наблюдается инактивация Na+, К+ - А ТФ аз ы за
счет превращения фосфатидилсерина в фосфатидил э тан олам ин
(Roe lofsen, van Deenen, 1973; Цваал, Р о елофсен, 1979 ).
Необходимость фосфатидилсерина для проявлен и я ак т ив ности:
транспортного фермента подтверждают также данны е, по лу ч е н ные­
на Na+, К+-АТФазе из мембран эритроцитов и моз г а пос ле 06ра ­
ботю1 фосфолипазой D ((Roelofsen, van D eenen, 1973 ; Мир салихо ­
ва, Рахимов, 1977; Рахимов и др . , 1978).
На рис. 2 показаны результаты ·модельных опы та.в по ~гидро ­
л изу очищенных фосфолипидов фосфолипазой А 2 из яда к о бр ы
Naja naja oxiana и фосфолипазой D из с емян хлопчатник а в ср а в ­
нимых условиях (Мирсалихова, Рахимов, 1977) . Пока з ан о, чт о
фосфолипаза А2 яда кобры ра,сщепляет все 3 подо бр а н ных для
опыта фосфолипида (фосфатидил с ерин, фосфатидилэтан олам ин ,
фосфатидилхолин). С наибольшей скоро стью расщепляется фосфа­
тидилсерин, затем фо,сфатидилэтаноламин, и уже с меньш ей с ко ­
ростью - фоофатидилхолин . Фоофалипаза D из семян х лопчат ­
ниха, в отличие от фосфолипазы А2, с наибольшей скоростью г,и д­
ролизует лецитин, с меньшей - фо-сфатидилэтаноламин , а фос­
фатидилсерин даже в течение 5 ч гидролизуется толь1ко на 1О %
, (рис. 2). Несколько другой эффект обнаружен при исследовании
147"

су бстратной ,специфичности фосфолипазы D из арахиса и капусты
(ри с . 3) . В этом случае наблюдалось значительное расщепление
фосфатидилсерина, фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина.
s
fOO
а
о L__ __j__ _
-' --- ~-~
2
з
4
tJ
2
о
з
2
з
4Ч
Рис. 2. Исследование субстратной специфичности фосфоли п аз А" и D .
а -фосфоли 11 аза А,. 6-фосфолипаза D; 1-фосфатиднлсерин, 2-фосфат " дилэтанолам ,-ш, З­
фосфати д 11лх0Jн1н; S- негидролиэопанный субстрат. Конuе1, т1Jация фосфолипазы А'2-1 · 10- 5 М, фас
фолипазы D-5,6· 10-5 М.
Активирующий эффект фосфолипазы D из семян хлопчатника
в концентрации 5-1О-6 М на Na+, К+-АТФазу из микросом мозга
о
о
GO у• -•--•
40/
,,_~-а
...._~---o---tl25
1
~==::i"
2
4
Ei
8
IРОС{{}ОЛUППЗО (L'(U/мг tJслл:7)
Рис . 3. И<;следование субстратной специфичностн фосф:JЛипаз ы D из арахиса
(а) и капуст"1 (б) (Roe\ofseп et al,. 1973).
1-Фосфатидн_.~холин, 2-фосфатиднлэтанола\1.1н, З-фосфап1д1-1а,1 кислота, 4 -сфннrо мнелин ,
• 5-фосфатидилсерин.
сс,ставляет 125 %, почек ,свиньи - 138 %. Ингибирующее влияние
ф01сфолипазы А2 при концентрации 1-10-5 М на Na+, К+-АТФазу
из мозга быка составляет 56%, а на очищенную Na+, К+-АТФазу
{ ~ 90 % чистоты по белку) из · мозгового слоя почек свиньи -
57 ,3%.
148

Активирующий эффект фосфолипазы D, возможн о, объ ясняет­
ся тремя причинами : 1) появлен,ие фосфатидиловой кислоты при­
водит к возникновению отрицательных , з арядов на пове рхности
мембран (при этом происходит разры хле ние мем·бран) и увеличе­
нию гид1рофо6rюго объема; «раз,ры хление» си,сте ;vrы сjюсфолипа­
зой D улучшает диффузию одновалентных катио,нов ; 2) ф осфати­
диловая кислота - продукт распада фосфолипидов
-
о бладает
активирующим дей1ствием за счет детергентных свойств; 3 ) фос ­
фолипаза D из семян хл опчатника расщепляет фосфа тидилсери н,
необходимый для проявления активности Na+, К+-АТФазы , с не­
зн ачительной скоростью. Активирующий эффект фосфолип азы D
проявляется независимо от внутриви д овой специфичности фосфо -
ff
::.:с=
r,ог--- ~---~
2
4
6'3
Фосщолиrшзо fJ (u1~ .1i Оё/.i::.1
Рис. 4. Активность N a+ , к+ - АТФазы мембран
теней эр ич: оцитов после обработки фосфолипазо :1
D нз арахиса (а) и капусты (б) (i<oelofseп et а!.,
1973).
липищов в ,различных тканях в мембранах э,ритроцитов (R oelofsen
et al., 1973) (рис. 4), микросомах мозга (Мирсалихова, Р ахимов,
1977; Рахимов, и др., 1978; Болдырев, Твердислов , 1978)
и в очищенной Na+, К+ - АТФазе (~90% чистоты по белку) из
мозгового слоя почек свиней. При сравнении данны х, пол ученных
после обработки фосфолипазами D из различных источни ков, об­
наружена наилучша ,я активация при обработке Na+, К+- А ТФа зы
из микросом мозга фосфолипазой D из семян хлопчатника (рис. 5),
которая возрастает во времени. Этот эффект, возможно , объя с ­
няется сохранением фосфатидилсерина ( см. рИ!с. 2) и по дтверж ­
дается данными Roelofseп et al . (1973) об уменьшении акти вирую ­
щего эффекта фоrсфолипазы D при снижении уровня фосф атидил­
серина. Кроме того , исследования Roelofseп et а!. (1971) на мембра­
нах человеческих эритроцитов показали отсутствие инактивации
Na+, К+ - АТФазной активности после удаления эфиром с ла бо свя­
занных фосфолип-идов, включающих 25% фосфатидилсери н а . Од ­
на ·ко инактивация наблюдалась после удаления прочносвя занных
липидов бо ле е полярными раствори телями.
С ле доват е льно, ингибирование наблюдается пр и уд ален ии
прочносвязанных фоrсфолипидов, которые экранированы фермен­
том благодаря его определенному расположению , Б елк и т ранс­
портного фермента, по -видимом у, могут тормозить фер :v~е нтатив-
149

ное ра сщепление липида •не только за счет его экранирования, но
и благодаря конкуренции · Na+, К+-АТФазы с фосфолипаз,ами за
,фосф о липиды, с которыми они образуют комплекс. В результате
разр у шения этих фосфолипидов сильными органическими ра,ство ­
рите л ями нарушается белок -•белковое и белок-липидное взаимо ­
дейс т в и е и наступает необратимое ингибирование транспортного
фер ме нта.
П ри действии фоiсфолипазы А2 инактивирующий эффект на
Na+, К+ - А ТФазу из микросом мозга возрастает с увеличением ее
концент рации (рис. 6). При -сравнении данных, полученных пос i,е
обра б о т ки фосфошшазой А2 Na+, К+-АТФазы из ;vшкросом :v1озга
и о чищ енного преп-арата фермен т а из мозгового с.1оя почек сви ­
__ ней,
ва жно онr етить ,сох ран ение инактивирующего эффекта н е за •
4
з
//
~
2
ш~
1 ,о,--,о;----с,------о--
2
Jч
'1/Ао
(О
D,5
: рис , 5. Дейст в ие фосфолипазы D из сем,1н хлопчатннк;:~ на Na+, к+_ АТФ-азу·
микросом мозг,!. Среда юшубации : 5 ыN\ трис-!- CI (рН-6,0, температура 20:'С).
1-в отсутспн:е фосфоюшазы D, 2-фосфол~:.па::а n- 10 м1<r/мг ()ел~,а м111,росом1 3-40 м·1<г/:\•1г
бет,а, 4 - 80 м1.:г/:\!Г бе,11<,1; А-уделыIая и~.:тнвность фер:-,1ента 1.3 !iр · :сут спшн Na+ , к+- АТФазыJ
А 0 -у де л ы-i ая шп11в rюсть н начальный момент .
.Ри с. 6. Влия1ые разли•шых кон:\ентраниi i фосфолипаз ~,1 А~ из пда кобры на
Na+, к+-дтФазу мнкр::>сом мозга. Врем;~ инкубации 30 мин, t-37°C .
ви :имо от источ ника мембран и чистоты препарата. Это позволяет
дума ть о ~-Jепосредс11в е нн ом дей,с т в,ии фосфоли:nазы А2 на фосфо л и ­
пиды Na+, К+-АТФ,азы.
-В
связи с тем, что основными компонентам.и яда. кобры, дейст ­
вующи:\ ги в «синергизме» (Ю,келысо н и др., 1974), яв ля ются фос ­
фо л и па за А2 и прямой гемолитический фактор (ПГФ), для нас
пред ст авляло интере,с исследовать отдельное и 1,0:v~бинированное
дей с т ви е этих компонен то в. Мы И1спользовали фосфо л ипазу А2 и
ПГФ , п олуч е нные в чистом виде из яд,а средн е азиатской к о бры
Naj a ла j а oxiana (Сахибов и др., 197•0; Юкельсон и др . , 1974:) .
Чи стоту препарата контролировали электрофор е тически.
1.'.50

\ ПГФ, или цитотоксин,- это полипептид с молек·улярным весоУI
'6500 и резк о в ыраженными щелочными свойствами за счет диа­
мино м онокар бонов ы х и гидрофобных аминокислот (Юкельсон и др. ,
1974). Благ одаря этим особенн остям ПГФ может внедр,пься в
мемб ра ну и со о тве11 ствующим образом изменять ее поверхностный
заряд.
М ы исс ледо вал и влияние различных концентраций фосфолипа­
зы А2 и ПГФ на Na+, К+-АТФазную активность из микросом
мозг а.
Ф о сфол ипаза А2 и ПГФ, взятые в отдельности , тормозят Na +,
К+-А ТФазу в зав исимости от концентр-аци,и и исследуемого веще­
ст ва ( Мирс алихов а , 1969; Мирсалихова, Юкельсон, 1973).
Ко .мпонент
з.меuного яда, М
Ф:)Сфолипаза А2
ПГФ
1-10- 5
i·10-G
1.10- 7
J.10- 4
5,10- 5
i.,о-5
Фосфошi п аза А 1
1-10-6 -1-ГIГФ
,5 .10- 5
1·10-5
АТФазна п.
активность, ?о
56±2.9
70±3.1
Ь2±5,О
68±4, 1
99±8,О
100
45±3,5
56±4, 1
При высоких концентрациях ПГФ (1•1О-4 М) наблюдается
инактивация Na+, К+4АТФазы на 25-,30 %. Низкие концентрации
в оп ределен ной степени да-же активируют фермент. При изучении
влия ни я ПГФ в концентрации 1 · 10-7 М на ферментативную ак­
тив1юсть б ыла о бнаруж·ена зависимость эффективности действи я
цитот ок син а от взятого в опыт ферментативного препарата (Мир­
сали хо ва и др . , 1974). Неодноз н ачность полученных результато в
объя с няла сь ра зличным состоянием его мем1 бранной структуры ,
в ча ст ности ве,1 ичиной мембранных . фрагментов. Для контроля
влия н ия по ли диспер1сности ферментного препарата на эффект
ПГФ микр осом ы обрабатывали ультразвуком (15 кГц, 40 Вт,
60 с). Пр и этом наблюдалось снижение исходной активности н а
22 %, однак•о а,ктивация после обра,ботки ПГФ усиливалась д о
32% и ста ·б илизи.ровалась в отличие от не обработанных ультра­
звук ом пре паратов , . активированных только на 7 %. Подобный
эфф ект, воз можно , объясняется дезорганизацией фосфолипидной
части моле кулы ( Ташмухамедов, Гагельганс, 1973). Не исключе-
!51

на также конкуренция за участки связывания ~,1ежд у одно ва лент­
ными катионами Na+ и К+ и ПГФ, обладающими харак те рны:vrи
поликатионными свойствами. По - видимому, это объясня·ет его ак­
тивирующий эффект при низких к•он,центрациях .
В механизме деikтвий ПГФ , возможно, существенн ую роль
играет положительный заря'д. Это подтверждают ана логич ные
данные, полученные с использов-анием гистонов (Пи1сарева и др. ,
1970; Писарева, Парфенова, 1973). Пр и совместном действии
фосфолипазы А2 и цитотоксина на Na+, К+-А ТФаз у мембр ан кле­
ток мозга обна .ружен интересный факт усиления инак тива ции
транспортно г о фермента (Мирсалихова и др . 1974 , 1975). Это де­
монстрирует синерг,изм фосфолипазы А2 и ПГФ относител ьно Na+,
К+ -АТФазы . Позднее идентичные данные были пол\1чены Zа 11еег
et а!. (1979) на Na+, К+-АТФазе из клеток саркомы Иосид ы и го­
ловного мозга. Фосфолипаза А2 и цитотоксин был и выде лен ы из
яда кобры Naja naja. При подпороговых концентрациях (1 мкг/
1мл белк·а) п:итотоксин усиливал эффект фосфоли паз ы А2 (.20 м кг
белк,а/мл) на Na+, К+ - АТФазу из мозга до 82% , из клеток сар­
ко:У1ы - до 100%. Нек·оторые от л ичия межд у этими и наш и ми
данными объясняются, по - видимому, различной у дельной актив ­
но с тью использованных цитотоксинов. Если в опытах Zaheer et а].
(1979) цитотоксин инактивирует на ~ 40% Na+, К + -АТФ а зv из
мозга при концентрации 1 :v1кг/мл, то в наших опы тах это т эф­
фект получен только при концентрации 650 мкг /:v1 г . Фосфолипазы
обладают иденти ч ным действие~1 .
Трудно объяошть собственно инактивирующий эффект фосфо­
липазы А2 отдельно или совмеrстно с ПГФ . До сих пор неизв ес тно,
происходит ли это за счет нарушения пространственной о рие нта­
ции фермента в мем,бране или же за счет действия продуктов рас­
пада фосфолипидов (лизосоединений и жирных к ис ло т).
Первые попытки исследовать влияние жирных кислот н,а Na+,
К+ -А ТФазу предприняты Skou (1965) . Автор и,ссле3-овал жирные
ки слоты т,ипа олеиновой. Обна•ружена ин31кти.ва1ция фер ·мента тив­
ной активности под дейrствием олеинов·ой кислоты, стеариновая
кисл ота была неэффективна. При из учении дейс тв.ия жирны х кис­
лот с короткой цепью (4~12С) на Na+, К+ - АТФаз у мо зга наблю ­
дали ингиби,рован.ие Na+, К+-А ТФазной активнос ти, ко рр ели р ую ­
щее с длиной цепочки жирных кислот. Жирные кислоты с длин­
ной .цепью также у,гнетали Na+, К+ - А ТФазу мем1бран мозrг а (Al1-
med, Thomas, 197 1) с аналогичной зависимооью от длины у гле­
родной цепи, причем угнетение наиболее выраж ено у нена сы щен­
ных ж:ирных кислот.
Для выяснения роли жирных ки1слот в ина ктивиру ющ ем эф­
фекте фо офолипазы А2 из яда кобры Naja naja охiапа мы (М ир ­
салихо ва и др . , 1975) детально и сследовали д ействие ненасыщен­
ных и насыщенных жирных кислот в конц ентрациях 1 • 10- 3
-
1 • 1О- 5 N\. на Na+, к+-tА ТФазу из мик росомальн ой. фра 1щии мозга
б ыка.
152

Концентрация
:жирных кислот, М
Лауриновап (С, 2)
1- 10-З
5.10- 4
5.10- 5
1.10- 5
Миристино з ап (С 11 )
1-10-З
5.10-4
5.10- 5
1,10-5
Пальмитиновая (С 1 , ;)
].]0-З
5.10-4
5-10- S
1· 10-5
Стеариновая (С 18 )
1- 10-З
5.10- 4
5.10-5
1-10-5
Бегенопая (С,2)
J.1о-З
,5 .10-4
1-10-5
Олеиноuая (Ci s)
]-]0-З
5.10- 4
5·]0-S
1.10- 5
Арахидоновап (С 2о )
]·10-З
5.10- 4
5.10- 5
J.10-5
АТФазнал активность,
% От К01-l17Zр0 ЛЛ
42±2,3
53±3,2
70±2, 1
75±3,0
45±3, 1
45±3 ,3
62±3,5
87±4,0
54±3.5
53± 5.1
63±2,5
67 ±2.9
43±3,4
55±3, 1
75±4,1
77i,2,7
38±3 4
51 ±4,1
60±3,0
45±4.0
55±2,3
57±4.0
67±-З,1
51±3, 1
53 ±2,8
60±3,2
80±-1 - .0
Наи1больший инактивирующий эффект жирных кисло т наблю-­
дался в концентра ции 1 · 10- 3
-5 -10-4 М. Наиболе е силь ным инги­
битором из исследованных жирных кв1слот окюа лась бегеновая
! SЗ,

1<ис л ота (С22 ) . В отлич11е от данных Skou (1957), стеариновая
кисл ота вызывала заметную инактивацию фермента. Среди нена­
• с ы ще нных кислот лучшими ингибиторами оказалась олеиновая
кисл ота, а и з полиненасыщенных - арахидоновая . Это соответ­
,ствует резул ьтатам, полу ченным Mil1er, Woodhouse
(1977) на
Na +, К+ - АТФаз е из сердца крысьr. Ингибирование ферментатив­
но й активност и при концентрации жирных ки~слот 1-10-4 М яв­
.ля ет ся обра т.и м ~1м процессом. После их удаления отмыванием
. акт и вн1ость во сстанавливается до 99 %, а после вто р·ой отмывки -
до 11 6,5% о т исходных величин (Milleг, Woodhouse, 1977) .
Та ким об р а з ом, и1-1,активирующи,й эффект жирных кислот, по­
вид и мому , об условлен нарушением конформации Na+, К+ - А ТФазы
в рез ультат е внедрения жирной кислоты в молекулу фермента
ил и з а счет воздей1ствия на мембрану клеток, в которую вмонти­
рован этот фер'v1ент.
И нгибиру ющий эффе1<т проявляется только при достаточно вы ­
сок и х концентрациях жирных кислот. Кроме того , их инактиви­
рующее действие при концентрациях 1·10-4 М и ниже является
об ра тимым. По-видимо"1 у , в физиологических условиях жирные
кислоты н е влияют на Na+, К+-А ТФазу. Нак•опление количества
жи р ных кисл о т, до .:: таточно г о дл .я ингибирования фермента, про- ·
и-с хо дит в ми о 1<арде при ишемической болезни ·сердца (Miller,
Woodh ouse, 1977) . Возможность регуляции жирными кислотами
активности транспортной А ТФазы вытекает из наличия в препс1 -
рат,ах Na+, К+ - А ТФазы из 111иокарда соба 1ки, обработанных пред­
вари те льно NaJ , фосфо л ипазы А1 , А2 и лизофосфолипазы , которые
бла г одаря деаuилированию мембранных фосфоmшидов могут при­
ним ать уча ст ие в регулировании активности транспортного фер­
мен та (Weglicki et al., 1972).
При и с сл едовании влияния проду1 ктов гидролиза фо,сфолипи­
до в, освобо ж дающих,ся после обра,ботки фосфолипазой А2 препа­
ра та Na+, К + - А ТФазы, а именно лизосоединений, ина ·ктивации
фе рме нтативной активности не об н ару:rкено (Hokin, H e xum, 1972).
В наши х и с следованиях на очищенной Na+, К+ - АТФазе из моз­
го во го сло я п о чек свиней эффект л из·осоединений такж е не был
обнаружен.
Не скол ыко иные 1резу,лыаты получены Ta ugn er, \,Vahleг (1974),
К ОТО1рые п о казали, что Na+, к+ - АТФаза ,из мозгов-ото слоя ,над­
поч ечн иков после обработки фосфолипазой А2 инактивировалась
то ль ко после у даления проду~ктов гидролиза.
Т аким о бразом, инактивирующее действие • фосфолипазы А2,
п о - в идимом у, являет,ся следстю1 ем разрушения фосфолипидов, не­
об ход_.имы х дл я проявлен и-я чувствительности Na+, К+А ТФазы к
од нов алентН Ы _\1 ионам и сердечным г л и1козидам, при э т ом какую ­
то роль, оч ев идно , играют и жи,рные кислоты. Вклад лизосо еди­
н е н ий в инги б ирующий эффект вероятно, несущественный.
Сопоста вля я данные по ,субстратной специфичности и влиянию
фосфолип аз А2 и D на Na+, К+ -АТФазу, можно подтвердить н е об -
154
/
1

.ходимость определенных количеств фосфа т идилсерина для прояв ­
Jlения ферментативной активности транспортного фер~,rе н та. Ра ­
нее необходимость в этом фосфоJ1ипиде была показана путем вос ­
становления Na+, К+,А ТФазы при добавлении фосфатидилсерина
к микросомальной фрак,ции, ,обработанной для делиnидизации ор ­
гани ч ескими ра:створителями или фосфолипазами (Nagнc]·1i, Freed,
1971; Кирсенк о, 1971, 1976; Walker, \,Vhee ler, 1975; Goodman,
\,Vl1e ele r, 1978 ; Болдырев, 1979).
Данные п о резюивэции Na+, К+ - АТФаз ы раз л ичными фосфою1 -
пида м и в :штературе противоречивы . Основываясь на большом
коли ч естве раб о т по реактивации Na+, К+ - А ТФазы, удалось выяс ­
нить необходим о сть для этого процесса холестерина (D u c k -Cho п g,
Таблица 1
Влиянце обработки фосфоли rr азой А , на Na+, к + - .д.тФазу
из мин росомаль н оii фракции поч~н нролина ( по Mandersloot et а!., 1978)
Остаточ~1ы;:! фосфол!1П!'л., ?О
"
КО!!Тj)ОЛЮ
Na+, I\.+ - АТФзз-
-
1:ия a 1a1 : rJ:!OCTI, ,
Э1..:с11с> -
обш -,е
фосфа-
фосфа -
фосф<1 -
.\JI\ i\'\oлr) Рr-icopcf:-.1r
рI -: .,1 ::нт
сф11н 1·0-
фосфа-
т:·д JI-
Тi:Дl,Л -
фосфо-
бел1са/l ч.
>J i::'-1 :Н
т·дл-
э·1 ;.i:JOЛ-
г1днл-
i· 1;u-
JIИ fi !!Д bl
:--: OJJHi-1
.J..\·/';iJ
С-' р;1Н
З П0Jl
1
-
I\O!!TfJOЛb
ОГJЫТ
-
'
1
44
100
о
о
о
о
22,6
-0 .7
2
51
100
()
о
о
о
21,2
2,l
3
62
100
81
16
35
о
27,8
(). 4
4
74
100
48
о
100
J
20 ,0
1.6
1976), офингом ие.пина и фосфатидrной ю1с.1юты (Stah l, 1973) , фосфа­
тиди лх олина (Hildeп , H okiп, 1976) . Бош,шинство работ посвящ е н о
реак тив а ц и и фосфатидилсерином (Good m aпп, \1/l1eele r , 1978; Pa -
la ti ni et а !. , 1977; Sta hl , 1973). Некоторые авт о ры припи:::ывают
фосф а тидилсерину роль специфис1еского участни1ка белок-липид ­
ного комплекс а трансп о ртного ферме нт а. ОднаJ<о есть данны е ,
указ ы в а ющие на отсу т с т вие активирующего эффекта фосфатиди л ­
-сери на на Na+, К+ - А ТФазу из почек, обработанную предваритель­
но луGроло,,т {Sood et а!., 1972).
Р а схождени е данных, п о - видимому, объяо~яется v1етодически­
ми т р удно стями. П ри удалении липидов, вероятно, п роисходят
необ ра тимые изменения белковой молекулы фермента за сче 1
труд,но удаляе м ых продуктов липолиза, или же фер:vrент по каки:-.1 -
то п ри чинам н е :v1 ожет вст р оиться в мицеллы добавляемого лиnи ­
да. С е л ективная обработка микросом мозга (De Ропt et al., 1973),
очищенно го ф ер:v1ента из мозгового слоя почек свиньи (De Pon t
et al., 1978), а т акже Na+, к+ - А ТФазы из микрОСО'v!3ЛЬНОЙ фрак ­
ции п очек кр о лика (Maпdersloot et a l. , 1978) различными фосф о ­
липаз а м.и оп ро вергае т необходимост ь присутствия фосфатнди л ­
сери на дJlя к ап1 .1итической активности Na+, К+ - АТФазы. В табл. 1
]53

и 2 представлен сравнитель ный анализ литературных да,нных п о
фосфолипидному составу и ферментативной активн,ости пре пара­
т а в зависимости от обработки фосфолипазами .
Та блица2
Влияние обработок фосфолипазами на фосфолипидное содержание
и активность очищенной Na-' --, к+-АТФазы из наружной
медуллы
почек кролика (r,o De Pont et al.. 1978)
Фсры~11т
1. Контроль
2. Фос фатидилсе­
риндекарбокси­
лаз а
3. Фосфатидилино­
зитолспецифичес­
к ая фосфолипаза
4. Фосфолипаза С
(Clostгidium \V e l-
cl1 ii)
5. Фосфатидилино­
зитолспецифичес-
кая фосфолипа за
С+фосфолипаза
С (Clostridium
Welchii)
6. Фосфолнпаза С
(ClosUidit1m
Welcl1ii)
7. Фосфолипаза С
(Clos tridiuш
\Vеlсhii)-фос­
фатидилсерин­
декарбоксилаза
8. Фосфа тндилино­
зит ~•лспецифи че с -
% общ1!х фосфолнпидоо в !·1еобр~бот аш1ых
11rн~rаратах
17,9±0 635,6 ± 0,713,1±0,9\ 5.5 ±0.327.9±1,О
,1s О±I . б 39.О±О,8 o,o±o.ol .s.1 ± О,3 137.7±2,о
Na+, !{+-
А ТФазнап
актив­
ность
100
8i ±6,8
17,2±0.9 37,3:t: 1.4 10,8±0, 7 0,0±0.5 27,8±1 ,4 10 1±2. 8
1
6.5±0.6 1,7±0. 2 12,7±1.0 6 .6±0.4 9. G±0.8 80 ± 5. 6
9,0±1,7 2,8±1,215,7±1.2 0,2±0 ,4 5,9±1,0 82±6,1
6,5 ± 0. 6 1.7±0 . 2 12,7±1.0 6,6±0,4 9.6±0.8 100
6, 6±0,7 3 ,1±0 ,9 0.2±0.2 9±0 7 20 :1 ±2.0 90± 14. 5
ка я фссфоли п аза С 17,2 ±0 937,3±1,410,8±0,7 0,0±0,527,8 ±4
100
9. Фосфатидилино­
зитолспецифичес­
кая ф осфол ипаз а
С+ фосфатидил­
сериндекарбокси-
1
18 9 ± 0.939,0±1.Б 0,6±0,5 0,2.::!::О 3/36.3±1,2_ 56±2. 4
!Тримечание. Длп варигнтов1-5Na+. к+
- А ТФазная
активность да­
на в процента х 1{ контролю, для 6-9--в процентах к ф осфол ипазе (о б раб о тк а
п репарата).
Как следует из табл. 1 (экспери менты 1 и 2) , посл е обраб о пш
микросомальных мембран панкреатической qюсфолипазо й А2
,с виньи происх,одит заметное ра з рушение гли церофосф,о лип идов.
156

и од новре менная ина"Ктивация Na+, К+-А ТФазы , а в эксперимен­
тах 3 и 4 полная; инактивация наблюдалась даже при большом
1,оличе стве остаточного фосфатидилсерина. Это противоречит дан­
ным Roel ofsen (1973), полученным на тенях эритроцитов, где
посл е о бр аботки фосфолипазой С из Clostridium vvelchii наблю­
далось сох ранение фоофатидилсерина и не происходило и,накти­
ва,ци и Na+, К+-А ТФазы. Это согласуется с данными De Pont et
а!., ( 19 78 ), полученными в результате обработок фосфолипазами
Na+, К+- АТФазы (та,бл. 2).
Обр а бо тка очищенных препаратов Na+, К+-А ТФаз из медуллы
поче к кро лика фосфатидилсериндекар,боксилазой при полном
превр аще нии фосфатидилсерина в фоофатидилэтаноламин не вы ­
зывал а замеТrI-юго снижения АТФазной а1пивн,ости. Полное уда~
ление ф осфатидили1юзитола с сохранением других фосфолипидов
благ од а ря обработ,ке фоофолипазой С, специфичной к этому фос­
фоли пиду, не влияло на Na+, К+-АТФазную активность. Обработ­
ка д ругой фосфолипазой С (C lostrid ium vvelch ii) способствует уда­
лени ю фос фатидилхолина с сохранением сфингомиелина и фосфа­
тидилэтаноламина (30-40 %). Од,нако несмотря на присутстви е
фосф а т ид илсерина и фосфатидилинозитола активность Na+, К+­
А ТФа зы падает до 20 % от контроля. После удаления фосфати­
дилин о з:rп ола и нейтральных липидов за счет комбинированного
дей-ст.вия фосфатиv:~.илин,озитолrспецифической фосфолипазы С ,и
фосф олип азы С из ClostridiLJm welchii Na+, К+ -АТФаза ,инакт,иви­
руе11ся до 82 %.
В п осл едующих вариантах препараты Na+, К,+ -А ТФазы обра­
батыв ал и вначале фосфолипазой С, а затем фосфатидилсери,нде ­
карбоксилазой . В этом эксперимент е фосфатидилсерин поююстыо
превра щ ался в фосфатидилэтаноламин без заметной инактивации
Na+, К+ -А ТФазной активности. И, наконец, препараты транспорт­
ного ферм ента обра:батывали фосфатидилинозит,олспецифичной
фосфолипазой С, а затем фосфатидилсери,ндекарбоксилазой . За
счет э т ого комбинированного эффекта происходит практичеоки
полно е пре вращение фосфатидилсери н а и фосфатидилинозитола , а
Na+, К+ -А ТФаза сод,ерж.ит в основном нейтральные липиды, од ­
на1'"0 сохр аняет около 44% активности.
Та ким образом, доказано отсутствие необходимости •в фосфа ­
тидил ино зитоле, фоофатидилсерине в отдельности, но не при их
совмес т н,о м полном гидролизе. Показано, что Na+, К+ -,АТФаза
может фу нк•ционировать без .кислых фосфолипидов.
РОЛЬ ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ
В ПРОЯВЛЕНИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Na+, к+-дтФазы
Все чаще появляются работы, посвященные исследованию
влияния отрицательно заряженных фосфолипидов на делипидиро­
ванную АТФазу (Palat ini et а! . , 1977; Isern de Caldentey, Wheeler,
1977, 1979).
157

De Ропt et а!. (1978) пров ,адили и·сследования н а высокоочи­
щенных препаратах из наружной медуллы почек ·кролика , полу­
ченных по ,,1етоду Jorgeпseп (1974). Для определения специфич­
ности фосфолипидов использовали,сь различные комбинации фос­
фолипаз . Эти ,ра•боты 6ыли под,робно описаны ,выше (табл. 1 и 2).
Сохранение А ТФазной активности авторы объяоняют наличием ос­
таточного додецилсульфата натрия, который используется в 1,0-
JJичестве 7 моль/мuль А ТФазы . Многократные отмывки не могут­
исключить о,ста т очных количеств детергента, находящихся в пре­
парате и до1стато ч ных для ооздан.ия отрицательного заряд а, необ­
ходимых для проявления АТФазной активности.
Данные, получе н ные De Pont et а!. (1978), противоре ч а т мно­
гим данным по реактива,ции транспортного фермента фос фат идил­
серином и _другими кислыми фосфолипидами (Fenster, Сор еп]1а ­
vег, 1967; Hokiп, Hexum, 1972; Roe lofsen, \тап Deeпen, 1973; Pa-
latini et а!., 1977 и др.).
DL1ck-. Ci10ng ( 1976) предположил, что делипщдизация при водит
к образованию неактивных белковых агрегатов. связыван и.е отри ­
uателы-ю заряже,нного фосфатидилсерина способств у ет п о явле нию
гидрофобных ,связей между белками и лишща:\н, .
TanigLishi, Yida (1971) определ1!ЛИ, что (!-I3)-оуабаи н с вязы­
вае'!'ся с Na+, К+-АТФазой после 15-минутной пр е инкубац и и с фос­
фолипазоii А и С: О д нако не наб л юдается реактивации ф о с фати­
дилсерино,1 у препаратов, предварит(; л ьно обработанных (Н 3 ) - оуа­
баином. Это, по - видимому, ,сви1детельствует о том, что ф о сфоли ­
пиды не нуж,ны для связывания сердечн,ого гликози да с Na +, К+­
А ТФазой, а придают ферменту отрицательный заряд .
С помощью комплексной обработки Na+, К+ - А ТФазы и з мик­
росом почек кролика фО1сфолипазами С (Bacillus c e reus) и сфин­
гомиелиназой С (StaphylococcL1s auгeus) _ было уд алено 95 % об­
щей массы JJипн дс)в с сохр а н е нием в мембране лишь фос фа тидил­
инозитоJJа (ivlaпdersloot et а!., 1978). Несмотр я на о тсутствие
других JJ·ипидов фермент сохранял БО-100 % п ервонач а льной
актив,ности.
Принимая во внимание необходююсть отрицательно зар яжен­
ных фосфолипидов для проявления активности фермент а, м о жно
сделать вывод, что эта потребность полностью удовлетв ор яе 11ся
фосфатидиJJинозитолом, составляющим только 5 % от все х фос ­
фолипидов мем-браны . Обнаружена связь между о статочн ой ак­
тивно::тью фер~1ента и фосфатидилинозитолом, кото рая, п о -види-
- м -ому,
овидетель,ствует 1в пользу того, что эт,от фосфо .1J1И1пид яв ляет ­
ся эндогенны м активатором Na+, К+ - А ТФазы .
Из этих работ следует, что состояние А ТФазы посл е делипи­
дизации путем экстракции незначительно отличается от ф ермен­
та, делипидированного фосфолипазой А2. По данным нек о торых
авторов (Palatini et a l ., 1977; Isern de Caltentey, \Vheeier, !979),
о трицательно заряженн ы е фосфоли 'пиды ма1ксимально связ ывают­
ся с делилидированной Na+, К+ - АТФазой. Эт·о является ва жным
!58

фактором в регуляции белок - липидного взаимодействия. Уч а,ст и е
отрицательных зарядов непосредственно в белок-липидном взаи мо­
действии в опытах с фоофатидилсеринде карбоксилазой (De P ont
et а!., 1978) можно объяснить двояко. Отсутствие инактивации
АТФазной а1ктивности при 80%-ном пр евращении фо·сфатидилсе­
рина в фосфатидилэтаноламин указывает на необходимост ь фо с­
фатидил,серина для осуществления липид-белкового взаимодейст­
вия или .непоср едстве нно для ·проявле.ни я ферментативно й а,ктив ­
ности. Оставшаяся незначительная часть фосфатиди ,1се рин а, воз­
можн-о, связана с белком через п-олярные гр 'у ппы, и доступ к н им
фосфатидилсериндекарбоксилазы затрудн е н.
В работах Mandersloot et a l. (1978), De Pont et а!. (1978) п ро­
демонстрирована необходимость фо,сфолипидов для Na+, К +-АТФ­
азы из почек к,р,олика (мик·росомаль,ная фра,кция и высо1коо ч ищен­
ный препарат фермента). Получены неоднозначные данные: сог­
лас110 одни;vr из них, Na+, К+ -А ТФаза проявляет специфичн ость к
фосфати1дилинозитолу, а в соо тв етс твии с други'У! и - не от мечает ­
ся абсо .1ютной 1спЕщ.иф,ично,сти ни к фосфатиди ли н озито лу , -ни к
фосфатидил·серину.
При предположен·ии, что следовые количества доцецилс уль фа­
та натрия были недостаточны для пр оявления Na+, К+ - :А ТФазной
а,ктивности по:сле полного удаления фосфа ти дилс ерин а и фосф а­
тисдилинози тола (De Pont et а!., 1978) и что суJiьфатиды п рп этом
отсутствовали (Karls soп et а!., 1974), правиль-н ее звучит предп о­
ло:жение, что отр И'цательный заряд не об яза т елен для проя влен ия
А 'FФазной реакции. Однако, соглас но д анны м D e Pont e t a l.
( 19 78), наблюдается $Нач,ите .1ьное из мене ние А ТФаз-ной аюи в ­
ности (1до 44 % ) Пl])И ,совместном удален и и фосфа ти ди л с е.рина и
фосфатид,ил ,и,нозитола. В то же время Palatiпi et а! . (1977 ) уда­
лось по, казать улучшение связывания Na+, К+-А ТФазы с ис,кусс т­
венным ,и липид,ными мембра.на,:v~и за ,сч ет фо~сфатидилсери н а .
Следовательно, можн-о предположить, что эти от риu ательно
заряженные фоофолипиды расположены довольно близко от АТФ­
азы в мем•бране и, возможно, in vivo включен ы в о взаим оде ikт ­
вне между белком А ТФазы и J1ипи д ны м бислоем, спос обств уя
встраиванию белка в с-оответствующую ча ст ь меУiбраны. Таки :v~
образо.vr, эти да-нные при подобной инт е рпретации так же могли
бы подт~вердить необходимость для ,реактивации Na+, К+-А ТФаз ы .
отрицатель но заряженных фосфолипидов.
Возможно, при этом происходит вначале образование белок­
липидного ком,плекса в воде (Hilden, Hokin, 1976) за счет фос фа­
тидил,се рина или других кислых фо сфолипидов, например фоофа­
тидной кислоты (Palatiпi et а!., 1977; Roelofseп, 1977). В это ,1
,случае дан ные, полученные нами по с-овместному синерr ично м у
эффекту фосфолипазы А2 и ПГФ (Ми рсалихова и др., 1974, 19 75;
Zaheer et а!., 1979), могут быть объяснены не то лько улучшение::v1
доступности фермента к дей~ств:ию фо сфолипазы А2, _но и не й тра­
лизацией заряда фосфолипидных молекул, которые необх-одимы
159 ,

для Na+, К+-АТФазы, так как цитотоксин связывается с кислыми
фо,сфолипидами и некоторыми другими отрицательно заряжен­
ным ·и ком пон ентами мембран (Zaheer et а!., 1979).
Решаю щую роль в проявлении активирующего эффекта на
Na+, К+ -АТФ азу фосфолипазы D, по-видимому, играет увеличение
отри ц ател ьного заряда на повер хности мембраны за счет фосфа­
тидиловой кислоты, так как по данным De Ропt et а!. ( 1978),
дост а точно незначительных количеств дадецилсульфата (7 моль/
моль фермента) для проявления А ТФазной а"Ктивности.
Т а ким образом, вся совокупность приведенных выше данных
показывает необходимость отр.ицательных зарядов для проявле­
ния активности делипидированной АТФазы, для соответствующего
конт а1к та между белком и липидам, но, к сожалению, не объя,с­
няет п отреб но сти в зарядах для протекания самой реак,ции. Срав­
нител ь ный анализ дей,ствия фосфолипаз на наруж,ные и внутрен­
ние пове р хности мембран наряду с исследованиям·и ферментатив­
ной активности Na+, К+-А ТФазы с посо бlствовал бы правильном у
решению вопроса относительно модели функционирования насо­
са, о т ношения фермента к липидам и т . д. Применение различных
методов исследования Na+, К+ - АТФазы и различных комбинаций
высо к оочищенных стандартных фосфолипаз с определенной суб­
стра т ной специфичностью помогут ,существенно углубить сведения
о р ол и липидов в проявлении активности этого фермента.
Сл·едовательно, при правильном методичеоком подходе фосфо­
л ип азы могут быть использованы в качестве уникальных природ­
ных инструментов для изучения Na+, К+-А ТФазы без глубокого
разр у шения тонкой структуры фермента, которая наблюдается
при удалении фсюфолипидов органическими растворителя'УIИ. Бла­
годаря химнчески чистым препаратам фосфолипазы А 2 и ПГФ
подт ве рждена необходимость для работы Na+, К+ - А ТФазы опре­
делен н ой пространств е нно й о риентации фермента в мембране, при­
чем н е·маловажную роль играют липиды и пов ерхностный заряд.
ЛИТЕРАТУРА
Бо лд ырев А. А. 1979. Роль липидов в функционировании N а+, К +-активи­
р у емой аденозинтрифосфатазы. «Б иол()I·иче с 1ше на уки», No 3, 5-17 .
Болдырев А. А., Тверд и слов В. А. 1978. Молекулярная организация и
м еха ни зм функционирования N а+-насоса. Итоги науки и техники. «Био ­
физика», 1О .
Кир с е нко О. В., Вавилова Г. Л. 1971, Роль фосфолипидов в проявл ении
Na+, К+ - АТФазной активно,: ти. «Укр. биох. журн.», 43, No 1, 25-34 .
КирсенкоО.В.,Вавилова Г.Л. 1976. О роли липидов вструктуре
Na+, К+-АТФазы. «Малек . биол.», вып. 13 , 44-57.
Мир с ал их о в а Н. М. 1969. О действи и фосфолипазы А на АТФазу мембран
эрит роцито в. Тез. докл. на 11 Всесоюзн. биохим. съезде. Ташкент, 51.
Мирсалихова Н. М., Зиямухамедов Р . А., Юкельсон Л . Я. 1974.
Функциональное состояние N а+, К+-А ТФазы при взаимодействии с пря­
мым гемолитически м фактором яда кобры. Матер. симп. «Физико-химич .
. ос новы
функционирования надмолекулярных структур клетки». М. 34-36.
МирсалиховаН.М.,3иямуха_медовР.А.,ЮкельсонЛ.Я.Эффект
фосфолипазы А и «прямого» гемолитического фактора яда среднеазиат-
]60

ской кобр ы на активнос ть Mg2+, Na+-K +-А ТФазы клеток коры мозга.
«Узб. биол журн.», No 3, 65-66.
Мирсалихова Н. М., Юкельсон Л. Я., 3иямухамедов Р. А.
19 75. Участие ионов каль ция и жирных кислот в торможении Mg2+ и
Na + , К+-А ТФазы «nрям ым» гемолизином и фосфолиnазой А яда кобры.
«Укр. биохим. журн.», No 1, 61-64.
МирсалиховаН.М.,РахимовМ.М.1977.ДействиефосфолиnазАиD
на M g2+ и Na+, К+ - АТФазы микросо,1 мозга. ДАН СССР, 233, 5, 981-
984 .
М.ирсалиховаН.М.., Ю к ел ь с о н Л. Я. 1973.Действиеяда кобры иего
фра кций на аденозинтрифосфатазы мембран эритроцитов. «Узб. биол.
журН.)), No 2, 6-8.
ПисареваЛ.Н,КомковаА.И.,ДаниловаЕ.В.1970.Взаимодействие
г истон ов с мембра нной адеиозинтрифосфатазой . «Цитология>). 12, 11 ,
1405-1411 .
Писа ре в а Л. Н., П а р фен о в а Е. В. 1973. Влияние исходного состояния
мембр анного препарата Na+, К+-АТФа зы на взаимодействие его с ги сто­
нами . - В кн. «Биоф и з ика мембран». I<аунас , 614 - 517.
Рахи мов М. М. и др. 1978. Влияние ионов кальция на ферментативный гид ­
ролиз фосфолипидов в зависимости от фи з ического состояния субстрата .
«БИОХ ИМИЯ>), 43, 3, 433-445.
Рож м ан о в а О . М. 1976. Исследование молекулярной структ у ры Na+, К+­
А ТФа з ы. «Молекул . биология>), вып . 13, 74 .
Сахибов Д. Н., Сорокин В. М., Юкельсон Л. Я. 1970. Выделение
ф осфо липазы А из яда сред н еазиатской кобры. «Биохимию>, 35, 1, 13-1 6 .
Таш му х а мед о в Б. Л., Та гель га нс А. И. 1973. Активный транспорт ~юное
через биологические мембраны. Ташкент.
Цв а а л Р., Р о ул о ф с ен Б. 1979. Применение чистых -фосфолипаз для изуче­
fШЯ м ембран. - В кн. «Биохимическое исследование мемб раю>. М. 3 13-
333.
Юке льсо н Л. Я-, Садыков Э., Сорокин В. М. 1974. Выделение и ха рак­
терист ика «прямого>) гемолитического фактора яда среднеазиатской кобры.
«Биохимия», 39, 4, 816-821.
А11lllеdК,ТhоmаsВ. S. 1971. The effectsof longcl1G1in fatty acids оп sodiLIП1
plus potassium ioп -s timulat ed acl eпos in e triphosphatase
of rat brain .
J. Biol. Cl1 em., 246, 1, 103--109.
С11арН.J., Zwаа1R.F.А., vаnDееnепL.L.М.1977.Actionof highly
purifie d pl10sphol ipases оп Ыооd platelets. Evidence for ап asymmetri,;
distrib utioп of phospholipid s in the s urface mеmЬгапе. Biochim. B iop hys.
Acta , 467, 146 -164.
D а 11 1 J. L . Но k i п L. Е. The sodiL1m-potassiuш adenosiпe tripпosphatase. Аnп.
Rev Biocl1eш., 43, 327-356.
•
DеgLIсhi N., JоrgепsепР.L., М аuпshЬасhА. 1977.UltrastructL1reof
sodiu m ршnр. J. Ce ll . Biol., 75, 619-634 .
DеРоntJ.J.Н.Н.М,VапЕеdепР.А.ВопtingS.L.1973.Studiesоп
(Na +-K+) activatecl ATPase XXXIV Pliosphatidylserine not essential for
(Na +-K+) ATPase activity. Biochim. Riophys . Acta, 323, 3, 487-494.
DеРоntJ.J.Н.М.,VапЕеdепР.А.,ВопtingS.L.1978.Role ofпega­
tiv ely, charged pho spholipids in higпly pшified (Na+-K+)-ATPase fгош
r abbi t kiclne y OLl!er meclL1ll a. Sшdies оп (Na++K+)-activated ATPase,
XXX IX. B iochim. Bioph ys, Acta. М 508, No 3, 464-477.
D LI с k- C h о п g С. О. 1976. А reassessmeпt of the phospholipid dependence of
memb rane-bound eпzymes with spec ial reference to glucose-6-phosphatase
and Na. K -dependent adenosine triphosphata se . Eпzyme. 21, 174-192.
Е ш ш е I о t Р. 1977. The organization of the pl asma membrane of mamшalian
cel ls : structш e in relation to function. In: Mammalian Се!! J\llembrane. 2,
Butterwo rth.
FепstеrJ. L., С о репhаvеrJ.Н. 1967.Phosphatidyl serinerequi.гement of
(Na+-K+)-activated adenosine triphosphatase from rat kidney and Ьгаiп .
Bioc hiш. Biophys. Acta, 137, 406.
11-156
161

Gооdmап S. L., Whее1еrК.Р. 1978.OuabainЬinding to phosph(\lipid de-
pendeпt a deпosine triphosphatase. Biochem . J . , 169, 2, 313 -320.
На r t W. М. , Т i t u s Е. О. 1973. Sulfhydril groups of sodium-po tassi щn tran-
sport adenosin e triphosphatase. J. Biol. Chem., 248, 13, 4674-468 1.
Н i1с! е n S. , Но k i n L. 1976. Coupled Na, K-transport in vesicles contaiпiпg а
pur ifi ecl Na, K-ATPase and only phosphatidylcholine. Biochim, B ioph y s .
Res. Commuл, 69, 521-527.
Ноkin L.Е., НехumТ. D. 1972.Studiеs оп tl1e characterization of tl1e
sodium, potassium transport adenos iлe triphosphat ase, IX . O n t he ro le of
pl10sp holipids in th e e л zyme . Arch. Biochem . Bioph ys ., 151, 2, 453-464.
IsеrпDe СаIdеntеу М. I., Whее1еrК.Р. 1977. Iлteractions ofphospl10-
lipicls ,v ith sodi um-plu s-potassiL1m ion-dependent adenosine triphospl1 a-
tase . Biochem . Soc. Trans., 5, 1, 107-108 .
IsеrnDeСа1dеntеуМ.,Whее1еrК.Р. 1979. Requirement for пegati­
ve l y charg ed dispersions of phospholipids for interaction witri Iipid-
depleted a denosiпe triphosph a tase. Biochem. J., 177, 265-273.
J е а n D. Н., А I Ь е r s R. \V. 1977. Molecular organizatioл of subunits of electrop-
lax (sodium plus potassium) - activated adenosine t r ipho sphatase . J . Bio l.
Chem. 252, No 7, 2450-2451 .
J о r g е n s е n Р. L. 1974. Puri_fication ап d characterizatioп of (Na++K+) -ATP ase
111 Purificatioп from the oute r mecl ulla of mamm a li an ki d пe y after sele-
ctive remova l of me llllJГ ane со111ропеп t s Ь у sodium dqdecy lsulph ate. Bi o-
cl1 im. Biophys . Acta . 356, 36-52 .
К а Ь а k Н. R. et al (ecls.). 1975. Molecular aspects oi membra ne рl1епо 111еп а.
Beгlin-Heide l berg, 19 75.
КаrIssопК.А.,SатuеIssопВ.Е.,StееnG.О.1974.Thelipid composi-
tio п апd Na+, К-tч!ерепсlе п t АTPase activity of tl1e salt (n a sal) gla nd of
e ider cluck апd Herriпg gL1ll. Europ . Biochem., 46, 243-258 .
Кер л еr G. R., М а се у R. J. 1968. Molecular weight estimation of mеmЬгапе
bou п d АTP ase IJy in vacuo ra cl i a tioп iпactivatioп. Bioche m. Biophys , Res.
Communs, 30, 582.
К о r е п IJ r о t J. 1. 1977. Ion transport iп membraлes: iпcorporatioп of Ьiological
ion -tr aлs loc a tiпg proteiлs in mo del m embrane systems Ann. Re v . Physiol .,
39, 19-49.
•
К о t у k А., 1977. Membraп es апd traпspo rt . Acta Biochim. Bi o phys Acad. Sci .
Hu п gg, 12, 135-146 .
К у t е J . 1971. Pl1osphorylation of а purified (Na++K+) adenosin e tгip\10 s­
phatase. Biocl1em. Biophys . Res. Com mLш . , 43, 1259-1265 .
К у t е J. 1974. The reactioпs of sodi um а пd potassiu m ioп- a ctiva ted adeпosi­
пetriphosphatase "''ith speci fi c aп tibodi es . lmplications for t he m ecl1a пi sm
of active transport. J . Biol. Cl1e m ., 249, 3652.
МапclеrsIооt J. G., RоеIоfsen В., Сiеr Dе 1. 1978. Phosphatidyliпo­
sitol as tl1e eпdogenous activator of the \Na+ + К+) -АTPase iп microsom б
of ra bЬi t kidney. Biochim. Biophys. Acta, М 508, No 3, 478-485 .
М.i11ег Н.М., Wооdhоusе S. Р. 1977. Long chain fatty acid inhiЬitioп of
s odium plu s potassium-activated ade no s ine tri p l1ospl1at a s e from r at !1 ea rt.
Austra l. J . Ехр. Biol. a nd . .Мес! Sci., 1977, 55, No 6, 741-752.
N а g и с h i Т., F г ее с! S. 1971. Dissociation lipid compoпeпtes апd recoпstitution
at-75°C of Mg2+ cle pen dent, Na+ a nd К+ stimulated adenosine triphospha-
tase iп rat brain. Nature Ne,v Biol ., 230, No 13, 148-150 .
•
N а 1s s оп О. S., D а 11 п е г G. 1977. Traпs,erse asymmetry of phospholipicl iп
subce l1ul a r membranes of гаt liver. Biocllim . Biophys . Acta, 464, No 2, 453-
458 .
Р а I а t i п i Р. et а! 1977. Activation of (Na++K+)-depeпdent ATPase Ьу lipicl
ves icl es of negative phospholipids. Biocl1im. Biophys. Acta , 466, 1-9 .
Rob iп soп J. D., Flashпer М . S. 1979. The (Na++K+) activated ATPase.
Е п z у m а t i с апd traпsport properties. Bioc11im. Biophys. Acta, 549, 2, 14 5-17 6.
R о е 1о f s е п В. 1977. The role of acidic phospholipids iп process of recoпstru-
ct ion of Na+, K+-ATPase, lп: 11 th FEBS Meeting Copenhagen.
162

RоеIоisеnВ, van DееnеnL L М.1973.Lipidrequirement of membrane-
bound АTPase. Stud1es оп human erythrocyte ghosts. Еuг. J. B ioch em .,
40, 1, 245 -257.
R o e lofsen В., Z,vaal R. F. А., Van Deenen L. L. М. 1971. Lipoprotein
integrity and enzymatic activity of erythrocyte membгan e . In G. P o r ce llati
а. F. De Jeso (eds.) Membrane Bound Enzymes, Plenum Press. Ne w York,
р. 209, ]97 1.
Sсhwаrtz А., LindепmауеrG. Е., А11еnJ. С. 1975. Thesodium-po-
tassium adenosine triph osp l1atase: phгrmacological, ph y siologica l
and
Ьiochemica l aspects. Pharmaco l . Rev. , 27, N \ , 1-134.
S k о u J. С. ]957. Tl1e influence of some cations iп t l1e adenosinetri- phosphatase
from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta , 23, 394-401 .
S k о u J. С. 1965. Enzymatic basic for active transport of Na + a nd К+ across
c e ll membrane. Physiol . Rev., 45, 596-617.
SооdС.К.,S,vееtС., ZullУ. 1972.Interaction ofkidney Na+, K+-ATPase
\1/ith phospholipid шodel шеmЬгапе s y stem. Biochim. Bio ph y s. A cta, 282,
429-434. •
S t а h l W. Z. 1973. Role of pl1ospholipids in the Na+, K+-stimulated adenosine
triphosphatase system of \Jгаiп ш i crosomes . Arch. Bioch e m. B iophy s .,
154 ,
56- 57.
Su11clIеrR., АIЬеrts W., VаgеlоsР. R. 1978. Pl10spholipases as probes
for mem lJГanes sicledness. S e lective ana ly sis of the ou ter mon olayer of
asymmetric Ьi l ayer vesicles. J . Bio l . Ch e 111. , 2 5 3, 15 , 5299-5304.
Та n а k а R. 1974. Ro le lipids in activation of Na+, K+-depend e nt ATPase a11d
K+-dependent phosphatase of the Ьгаiп. Rev . Neuгoscie11ce, !, 181-230 .
Тапig исhi К., Уidа S. 1972. The effect о[ phospholipids оп the aparent acti-
v a tion energy of Na+, K + -ATPase. Biochim. Biophys. Ac ta , 274, 536-541 .
Та u g п е г G., W ii h Iеr А. 1974. Effects of lipid- modification оп the isolated
membrane of catecholamine storage v es icles. Naunyn -Sch mied eberg's Arch.
Phaгm., 282, 279.
U е s u g i S. et al. 1971. Studies оп tl1e cliaracleгizatio11 о[ tl1e sodiшn-potassiшп
transport adenosi11e tr ipl1osphatase. VI . Large s ca le parti a l p urificatio11 a11d
properties of а l ubro l- so l ublli z ed IJOviпe brai11 епzуш е J. Biol. Chem. ,
246, 531.
WаIkег J. А., W11ееlег К. Р. 1975. Роlаг l1ead-group. ancl асу\ sidechai11
r e quirements for phospl1ol i pid - depeпcle11t (N а++ К+) - А TPa se. Bioc!1i:11
Biopl1ys . Acta, 394, 135-144 .
WеgIiсkiW. В., Wаitе В. М., StamА. С. 1972. Association of pl10spholipas~
А with myocardia l membra11e preparatioн coпt a i11i11g tl1e (Na+ +K+) -Mg2 + -
ATPase. J . Mol. a11d Се\\ . Cardiol. , 4 , 195.
ZаhееrА. 1уеr Sh.S., Вrаgа11саВ.М. 1979. lnflue11ce oi charge011 tl1e
i11act iv aton шешЬгап е bound (Na + +K+)-ATPa s e of Yoshi da sarco ma ce lls
Ь у inl1ibltor protei11s fгош cobra v e11om. Cancer B i ocheш. Biophys. ,
3, 3,
123-127.
Л . .Я. ЮКЕЛЬСОН, Б. У. АТАКУЗИЕВ
Яд СКОРПИОНА.
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
И МЕХАНИЗМ ИХ ДЕЙСТВИЯ
Биологически а1ктивные вещества широко испо J1ь зуют ся при
и з~чении ....молекулярных основ различных физиологи ч еских фу нк­
ц ии. Наиоолее эффективно применение веществ аб солютно инди­
видуальных, с хорошо изученными физико-химическ им и сво йства­
ми и меха·низмом действия . К их числу можно отнес ти токси чес кие
163

.компоне нты из ящов животного ;происхождения (Mebs, 1973). Опыт
успешно го применения в научной практике некоторых из них уже
освещ ал ся в ли тературе (Hahn von, Honegg,er, 1974; Narahashi,
197 4; Albuquerque et а!., 1979).
В на стоящем обзоре рассмотрен состав и свойства яда скор­
пион а, основные способы получения из него чистых тоюсических
комп оне нтов, а также строение, физико-химичеокие свойства и ме­
ханиз м действия этих компонентов. Приведенные данные могут
быть по лезны при исследовании механизмов реализации нервной
функ ци и и синаптиче.ской передачи, а также связанных с ни·ми
проц есс ов ионного транспорта через воз,будимые мем-браны.
О БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕЛЬНОГО ЯДА СКОРПИОНА
Нативный яд пред,ставляет собой бесцветную, слегка оп а­
лесц иру ющую тягучую жидкость. При растворении в дистилли­
рова нно й воде или в присутствии солей он образует раствор вяз-
1юй конс истенции, мутный из-за слизистых микросгу,ст:ков. Раст­
вори мщ:ть яда во многом зависит от характера ра,створителя, его
реаыц ии и присутствия солей. Я1д не растворяется в органических
соль вент ах: спиртах, эфирах, хлороформе, ацетоне, бензине . Креп ­
кие кисл оты, щелочи, хлороформ, марганцевокислый калий и йод
разр уша ют яд (Пигулевский, 197.5) . В водных сольвентах раство­
римость яда снижается в следующей последовательности: 0,4 М
ацет ат аУiмония (рН 6,5), 0,1 М бикар,бонат аммония, физиоло­
гиче ский раствор, вода (Орлов и др., 1977) . Удельный вес яд а
1092 , р еакция обычн•о кислая (Пигулевский, 1975). Раствор яда
скор пио на Buthнs енренs в дипиллированной воде имеет реак­
цию , б лизкую к нейтральной,- рН 6,45 (~Атакузиев и др., 1974).
В н атив ном яде содержится д,о 75-77% воды, 17-20% сухо1Го
остатк а и 5-6% золы; обнаружены углерод, водород, аз•от, сера
и хло р (Пигулевокий, 1975).
Со:тав, свойства и биологиче,ская активность яда скорпиона в
значи тельной степени определяются способом ею получения . В
неко тор ых эюспериментальных иоследованиях в качестве то,кси­
ческо го материала использиваны экстракты или гомогенаты ядо­
витой же лезы или тельсона. Естественно, что так•ой материал со­
держит много балластных компонентов. Так, велич1ина ЛД50 яда
и эк стр акта ядов·итой железы скорпиона Buthus eupeus равна со­
ответс тве нно 3 и 4,5 мг на 1 кг веса тела белых мышей. Для до­
бычи цел ьного яда скорпиона используют также методы механиче ­
окой и электр1ической стимуляции тельсона. Механическая стиму­
ляци я п озволяет получить активный материал, -но с небольшим
выход ом . При электриче,ской стимуляции выход яда повышается,
одна ко токсичность его падает, по - видимому, за счет увеличения
соде ржа ния мукопротеинов, которые м •огут нейтрализовать ток­
сические начала или просто являются балластом (Lissitzky et а!.,
1956). По этим же причинам менее токсичен, не стабилен .и быст-
164

ро ин~ктивирует,ся при комнатной температуре мате риал , полу ­
ченныи пр1и эюстра 1кции растертых тельсонов (Nitzan, 1970 ) . По­
лагают (Орлов и др., 1977), что в эт·ом случае ток,сины не йтр али­
зуются еще и антителами против собственного яд а, поп ад ающ им,и
в эк1стракт из гемолимфы.
•
В наших исследованиях в качестве и•сходного материа ла ис­
пользованы яды, полученные мехашiческой и эле ктрической ст иму­
ляцией, а также экстршкты ядовитой железы и тельсона . Вы х-од
я1да зави,сел от многих у,словий (видовая пр1инадлежнос ть , раз ме­
ры особи, сезонность взятия яда, ча1с тота доения и т. д.) , но во
всех ,сJiу чаях при электричеокой стимуляции был больше, чем при
механической. Яды более активны по сравнею1ю с экстр а ктами,
од нако мы не смогли подтвердить данные литературы (L issitzky
et al., 1956) о более высокой токсичности яда, полученног о элек ­
т ростимуляцией. Можно · предполО)юить, чт,о при механическ ой ст и­
муляции или получении яда естественным ужалением в гидрофоб­
ные пл енки (Zlotkin, Shulov, 1969) выделяет-ся токсичный сек рет,
по составу и свойствам на 1иболее близкий к нативном у яду. Од на­
ко крайне низкий выход материала по массе препятс твует широ ­
кому использованию э тих способов. Метод э лектрос ти му л я ци1и
применяе11ся наиболее широко, так как позволяет полу чат ь б оль­
шие кол1ичества яда, брать яд неоднократно и не о казыв ает су­
щественно.го влия-ния на его свойства и состав.
По дан.ным Пи,гулев,жого (1975), в зав~исш1юсти ,о т р азмеров
о соби от одного скорпиона у,дается пол учить до 3 мг сухог о яда,
но в среднем кол1ичество яда не пр евы шает 0,5 мг ; то лько в слу ­
чае кру пных троличеюких видов око рпи,онов количе,с т во яд а дост и­
гает 30-40 мг в ра .счете на жидкий •яд. По нашим да нным, в
среднем для пол учения 1 г яда ск-орпиона Buthus eupe us необх о­
д1имо д'о 4000-5000 животных, а выделение 1 г я да скорпиона
Ortoc l1irus scroblculosus требует е ще больше го чи ,сла о,соб ей. Эти
результаты получены при использовании ме1'ода элек т рическо й
с тимуляции и подтверждены литерату,р,ными дан ным и ( M ir a пda
et а!., 1970), которые показывают, что максимальный вы ход яда
при электрическом доении каждую четвертую недел ю достиг ает
1,5 -2,0 мг сухого остатка от каждой особи.
Зависимость количества яда ·от ча-стоты его взя тия вп олне
объя'снима, если предположить, что синте11иче,окая деяте льн ость
ящ овитой железы носит циклический ха1рактер и пр.и наполн е,н ии же ­
лезы продук,цей регул,ируется химическими аге нтами . Эт о поло ­
же ние было эксперимента .льна доказано для ядовит ой железы
змей (Bdola\1, 1979). Возможно, по этим же при чинам сез онно-с ть
взятия яда и физиологическ,ое состояние ж,ивотны х пр и этом оп­
ределяют мшссу добываемого яда и его биологиче,ские сво й,ства .
Токсичность цел ьных ядов или эк'стракт-ов ядовитой желез ы
и тельоона в большой степени зависят от способ о·в ,их дал ьней шей
обр або 11ки и хранения. Рекомендуют (Пигулев,ски й, 19 75) сушить
я д в вакууме, затем помещать его в стеклянные ампу лы, за паи-
165

вае мые п осле полного удаления воздуха, и хранить :8 темном и
про хла дном м есте . В этих у,словиях матер,иал сохраняе т сво и
свой1ства в те чение нескольких лет. При лиофильном высушива­
нии п роисх оди т некота~рая 1Потер,я токсичности (Miranda et al.,
1964, 1970), ,при чины которой будут обсуждены ниже при ,расс:vют ­
рен ии физик о - хим ически х -свойств чистых то~синов. Следует за ­
метить, чт о ниЗ1кие температуры (до ___,30°С) не влияют на ток,си ­
ческ ую акти вно сть яда (Nitzan, 1970; Пигулевский, 1975), более
того, л иоф~ильно высушенный яд обычно , хранят при -5°С над
хло р идом кальция (О рлов и др., 1977) . Достаточно удовлетв о ­
рител ь·н о переносит яд и высокие температуры: он выдерживае т
1~рат-ко1в.ре менное ,на,гре.вание до l00°C (Пигулевский, 1975) и ,не­
ско л ько сн ижае т токсичность лишь при выдерживании в течение
5-6 ч при температуре 86° (Nitzan, 1970).
Доказаны ,видовые отличия в составе и токсических свойства х
ядов с корпи о нов. По нашим данным, величина ЛД 50 лиофильно
выс уше нных я,дов Butlшs eupeus и Ortochiпts scroЬicu l osus сос­
тав ляет со отв етственн-о 3 и 1 мг/кг веса тела белых мышей. Т а ­
к,им об разо м , клиннка и прогноз отравлений ядами скорпион ов
опр еделяютс я не только количеством введенного яда, но и спе­
цифическими особе }шостями их состава. Здесь прежде в, сего иг ­
рае т роль с оде ржание отдельных токсинов, которые в ядах раз­
личных в1идов ,акорпионов могут существенно различаться по
стр оени ю и ле тальной активн,ости. Естественно , что в экстра ,кта х
или гомогенат ах я,довитой железы и тельсона содержание эти х
токсинов понижено ,из - за nрисутС'гвия большой ма,ссы ба лласт ­
ных ком понентов; тем не м.енее, наши исследовани,я nиказывают,
чт-о экстракты или гомогенаты вполне могут быть использован ы
в к аче~стве ре зервного исходною материала в работах по выде­
лению ч,ист ых токсинов.
Пос ледовательно ра,ссматривая химиче,ский состав 51да ,с;Е ор ­
пио на, мож но отметить присут-ствие неорганиl1еских и органиче ­
ск-их ве щест в. Неорганическая часть яда nредста1влена различны­
ми м икроэлементами (Пигулевский, 1975; Орлов и др., 1977),
одна ко ее дет альные характеристики и соответствующие коли­
чественные измерения в литературе не пред-ставлен ы . Из ортани ­
че оких ,веществ обнаружены ,мо но- и полисахариды, липиды, 6ио­
ло1гичеоки а,ктивн ые амины, св-ободные аминокислоты, ,но в основ­
н ом бе лки и пептиды.
Наряду с простыми моносахаридами - гексозами
-
в яде
выя вле ны их ам ,ин,опроиз1во,дные: глюкозамин и галактозами н .
По лисахариды - глюкозамингликаиы или му,кополи1саха,риды
-
воо бще характерны дл,я вязких -секретов различных ядови тых
желез . Он1и м огут находиться в связи с белкам•и, образуя муко ­
nро теины. Та 1ше мукопротеиновые микросгустки, 1<ак и вязкие
сво й,ст ва сек рета, из - за присутствия му.кополисахарид,ов значи ­
тел ьно затрудняют работу по фракционированию яда. В яде
ско рпи она преи мущественно содержатся юkлые мукополисахари-
166

ды и их прои зводные : гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты
А, В и С , гепа ринсул ьфат (Bhaskaran, Kurup, 1973 а, б). Углевод ы
в бол ыu\ом колиqеств е входят в ,состав белкавы х компон е нтов яд а,
и об р азов анные таким образом тлшюпротеины хорошо обнаружи­
ва ютс я пр,и э лектрофо резе яда в основном в его главной альбу­
мин п одо бной фракции (\Veissmaпn et al., 1958; Oomm en, Kurup,
1964). Л ипопр отеины на элект,рофореграммах яда не найд ен ы или
идентифи1Цир ованы 1в ,следовых ;количествах.
Би огенные амины непременно присутству ют в большинстве
ядо'в ж ивотного пр·ои1сх ождения : змей, пчел , ос, па уков и т. д. В
. этом
отношени и яды скорпионов не составляют исключения. В
яд ах ра зличных о~юр пионов выявлены гистамин и серотон·ин (5-
гидроок:си три птамин), с действ•ием котор·ого связывают болевые
о щущения при попад ании яда в организм (Adam , Weiss, 1956,
195 8; Welsh , Batty, 1963; Bhaskaran, Kurup, 1975; Ismail et а\. ,
19 75) . Тр иптофан идентифицирован в ядах скорпионов в свобод­
ном в иде (Blыs kar an, Kurup, 1975) .
.
Та ким образ ом, мюжно отметить , что в лите,ратуре недостаточ­
н о сведений, характе ризующих не'белкавые органиче с ки е в е щ ест ­
ва , составляющие яд скорпиона. На протяжении посл ед них лет
более детальны м иссл едованиям были подвергнуты белково-пеп­
ти дные к омп оненты яда.
Спек'Грофотометрические из ;v~ер е ния и метод определения бел­
ка по Ло ури позволил н нам установить, что д о 80 % вс е. й массы
яда скор пион а В.uthus eupeus составляют белки и пептиды. П о
да нны м литер атуры (D iniz, Goncal ves , 1956 , 1960; Weissmann et
э l., 19 58; Russ ell et al., 1968), в ядах различных ни,дов скорпионов
,содерж ится 50- 60% бел,ка. Поглощающая спо со бность растворо в
ядов различн ых ок орпионов при спектрофотомет,риро<вании пр и
280 и 260 нм не име ет существенных отличий (Russell et al ., 1968 ;
Атакузи ев и др., 1974).
В свя зи ,с идент ифш<Jа,цией фа·рма,кологически акти .в,ны х и ле ­
та ль но действу ю щих компонентов яд'ОВ скорпион,ов прод елана зна­
чи тельна я ра бота по 'из у чению их д иа л изуемости. Результаты этих
исследов аний имеют ограниченное значение из-за отсутствия дос ­
товерной инф орма ции отно;оительн,о разм е ров пор в диализаr.щон­
ных ме мбрана х и, следо'вательно, моле куля рн ых размерав ве­
ще,с т в, проходящ их через эти мембраны , одна1,о они представляют
опр еделенный инт ерес, так как характеризуют· химический состав
яда, а также при роду и нек,оторые свой1ства оодержащихся в нем
физ и о.пагичеок и ак тивных веществ. О сравнительно низкомолеку­
л ярном сос,та ве яда скорпиона можно судить н а т а~1 осно вани и ,
что цельный яд свобо дно прох,одит через фи льтры Шамберлена и
Беркенфе Лiо;д а (Пигуле вюкий, 1975).
П р·о ведение ди ализа яда св,язано с определенными трудностя ­
ми . Прежде нсего, у станО'влено , что степень диализуемо:сти ядов
зав и: ит от ха рактера растВ"о,рителя и состава яда (Bolivar, Rodri-
guez, 1953 а, Ь; Орлов и др., 1977). Против воды и раствора Рин-
167

гера диализ яда скорпиона протекал малоэффективно, в ходе диаа
лиза яд не терял активности (Diniz, Goncalves, 1956; Adam, Weiss,
1959). Считают, что при таком диализе через мембрану диффун­
дирует до 12-20% всей массы цельного яда, причем белк,и и пеп­
тиды не обнаружены, а диффузат не обладал то]{iсическими свой­
ствами (BaЬin et al., 1971; Zlotkin et al., 1974) . С другой ,сто,р·оны ,
при изменении условий диализа ,и, преж,де всего, хара1ктеристик,
используемых для диализа мембран, наблюдается выход ·ве ществ
с положительн,ой реакцией Фол,ина, обладающих активностью
цельно.го яда (Nitzan et al., 19,63; Kapadia e,t al., 1964; Osma n et
а!., 1972; El Asmar et а!., 1972; Watt, 1974). В ещества диализую­
щейся фрахции (диализата) оказались термоста ·бильными, пол ­
ностью раствор,ялись в раз-бавленных кИJслотах, щел ·очах и воде ,
но не ра :створялись в органичес,ких сольвентах, что свидетельство­
вало об ,о тсутствии в диализате липи,дов и гетероцикличес,ких сое­
динений (Nitzan et а!., 1963). Диализат, под обно цельному яду,
ст имулиро ,вал ,мышечную деятельность препа ,ра та ма11ки крысы, при
введении животным вызывал болевые ощущени я и действовал ле ­
т ально, причем эффективнее, чем недиализую щая1ся ча,сть яда.
(Nitza n et а!., 1963; El Asmar et а!., 1972). Болевые ощущения
могли объясняться действиеУI серотонина (\Velsh, Batty, 1963),
однак,о летальные свойства диализата должны быть обусл овле ны
присутств1ием других компонент•ов, так как показано (Adam, \,\!e iss,
1956, 1958), что полное удаление серотонина прн эк,страк~ци и аце­
тоном не изменяет токсичности материала. Ясно , ч то диа лизую ­
щаяся фракция яда представлена низкомоле куляр ными ·ко:vшо ­
нентами. Размеры пор в диализационных мембранах и ,сво й,ства
раство,рителей определяют, нас:кольк·о компонен ты яда с ле та ль­
ной: активностью буду,т проходить через ~•1емб раны; во вс яко:vr
слу чае, изучение диализатов показывает бе;11, овую или пеп ти дную
природу этих ко;vшонентов.
В многочисленных электрофоретических ис,следо вани,я х оха­
рактериз-ован белк•овый состав ядов скорпи онов, чт о по зво ляет
п ровести предварительную идентwфикацию токси ч есжих компонен­
тов яда ((Joncalчes, 1960; Master et а!., 1963; Oommen, Кuп,1.р, 1964 ;
Russel l, 1967, 1968; Babu et а!., 1971; El Asmar et а!., 1972) . Ре­
зультаты 'ВО многом зави,сят от условий электр офорез а и, в~1·есте
с · те~•r, свидетельс-гвуют о межвидовых различия х в со•става х бел­
ков ядов различных скорпионов. Ниже приведены данные зару­
бежных и.сслед·ователей в сравнении с наши ми резулыата:11-и.
Электрофорез проводили на ватмане 3 ММ, верона ловый буфер
рН 8,6, ионная сим1 Q,05, сила тока 10 мА, время 14 -18 ч)
Образеи,
Leiurus quinqцes triatu s Н et Е
Buthus occitanus ssp.
Pri:Jпuгus bicolor i-I et Е
168
Количество ко.мпонентов
анодных
3
3
3
катодных
3
3
3
всего
6
6
6

Prioпurus crassicaudэ 01
Orthochirus i1111esi Е. Sim. ssp.
Nebo hiericl1011t i cus Е. Sim.
Buthofus j u da icus
Buthus eupeus'''
Ortl10c l1irus scroblculosus''
2
3
3
3
3
5
I
3
9
12
5.
8
4
6
9
I2
*Электрофорез ядов среднеазиатски х скорпионов в ели в 15% полиакри­
л амидн~м геле. ~-аланиновый буфер рН 4,3, ионная сила 0,4, с ила ток а 7 мА
на трубочку, время 130- 140 мин.
При электрофорезе в щелочных буферных средах общее число
анодных фракций равно коJшчеству катодных, в кислых буферн ых
средах катодных ф,ракций больше. Вне за1вис,ююсти от рН среды
катодные ко м поненты по ма -ссе превалир у ют над ано дны м1и (Nit-
zan, Slшlov, 1966; Rosin, 1969) . При электрофорезе на полиакри­
ламидном геле в кислой буферной среде мы не см огли обна ру­
жить в ядах сж,орпионов Butlшs eupeus и Oгtocliirus scroblculosш;
анодных _ фракций, тогда как число катодных достига ло 9 и 12 со­
ответственно. Интересно, Ч1'О -именно ,среди этих главн ых по массе
и мигрирующих к катоду фра,кций найдены то;ксич еские комп·онен ­
ты яда (Mclntosh, Watt, 1967) .
Разрешающая спо-собность электрофоретич еского метод а зав и­
сит от носителя и других условий опыта. Поэт ому приведенные
выше данные не ·отражают сложного со:с та•ва белков в яд ах скор ­
пионов. Значительно большее число отдельных белковых ком по­
нент-ов выявляется с помощью иммуноэлектроф орез а (Mcintosh ,
\1/att, 1967). В наших исследованиях электроф о,куси рован ие на
ПААГ с амфолином в интервале рН 3,0-9,0 по звол ило обна ру ­
жить в составе яда ок;орпиона Buthus eupeus до 22 бе лков ых ком­
понентов, что также явл ,яетlС'я минимальным .
Некаторые из содержащижя в ядах скорпионо•в бел к о в п ред ­
ставлены ферментами (Орлов и др., 1977). Ср еди них в связи с
гем олитическим действием яда наибо льший ин те р ес п -редста в ляет
фо·сфолипаза А2.
Тривиальное название
Фосфолипаза А 2
Фосфолипаза В (лизофос-
фолипаза)
Ацетилхолинэстераза
Кислая фосфата з а
5-нуклеотидаза
Фосфодиэстераза,
Гиал ур о нида за
Ри бо нуклеаза
Шифр
Гидр о лазы
3.1.1 .4
3.1. ' .5
3.1.1.7
3.1.3 .2
3.1.3 .5
3.J.4. 1
3.2.1.
Трансферазы
2.7 .7 .16
С исте.м атu •tеское название
Фосфатидацилгидролаза
Л изолеци т ин - а цилг идрол аза
Л цетилхол ин-ацет и лгидрол аза·
Фосфогидрола з а моноэфиров
ортофосф о рн ой нислоты
5-рибо1-iук л еотидфосфогидро­
лаза
Фосфогид ;юла з а орт офосф -:>рны х
д иэфиров
Г иал урона т-г ли ка Н')ГИ д?олаза
П ол~ 1рибонук л еотил: -2-олwго-
н у клеот идтра нсфераза (ци кли­
зирующая)
169

Сведения о содержани•и фосфолипазы А2 в ядах различны х
· с,к орпи,оно в отл ичаются крайней противоречивос тью. Наряду с ре ­
зуль т атами, свидетельствующими о полном 011сутствии фермента
в я да х скорпионов (Master et al ., 1963; lbrahiш 1967), в литера­
тур е имеют:ся данные о высокой активности фермента в яде (Ba-
Io ze t , 1956; N\ohaш ed et al., 1969; Bhaskaran, K urup, 1973). Ана­
логл ч ные пр оти в оречия •были от м ечены шр,и реги,с11рации гемолити­
ч еской активности ядов •различных видов с~юрпионов . В связи
с этим необходи м о указа т ь, что в ряде работ тестом для обнару­
же ния фосфо ли пазы А 2 -служ ит измерение ' ге~1олитиче~ кой актив ­
нос ти яда в присутствии экзогенных фосфолипидов . Пр>ичины
расхождения данных ,о содержании фосфолипазы А 2 в ядах раз ­
л ич н ых скорпи о нов по,ка не ясны. Не исключено, что это отражает
межвидовые отли чия в составах яд·ов скорпионов . · Кроме того,
следует учитывать м ног очисле нные ;vrетодические трудности при
опреде лени и а:ктив ~юсти фосфолипазы А 2 в ядах . Та,к, основу ге ­
мол итичеок о г о теста составляет образование под влиянием фос ­
фолипазы А2 гемоли тич еоки активных J1и зо соединений, одна1ю они
могут раз,рушатыся до гемолит>ически неактивного глицерофосфо­
рил х олина содерж ащейс я в ядах скорпионов фосфолипазой В (ли­
з,офоофолипазой) , активность к·от-ор·ой в цельно ~1 яде высока (Мо­
!1аш еd et al., 1969).
М огут пред!ставить интерес наши данные, ~в идетелыствующие,
ч то я ды скорпионов В. eupeus, В. caucasicus и О . scroЬiculosus
выз ывают нарушение энер,гетическ1их пр оцесс ов и набу х ание изо ­
л и рованн ы х митох ондрий , сопровождающееся увеличением прони ­
ца ем<ости их мемб ран для и·онов и уменьшение стабильности ис­
и,усствен,ных бислой ных фо,:фолипидных мем-бран . Гемолитиче­
ска.я ак тинность ядов индуцируется в при;сутствии цитоток1сина
(«прямого» гемолизина) из яда 1шбры. Описанные эффекты яв­
ляю тс я неп ременн ым атр-и.бутом сме:ей , со,держащих фосфолипа ­
.зу А2 , кото рую м ы не сумели обнаружить пр,ямыми измерения'Ми
в перечшслен ных выше ядах окорпиона,в .
И,с следо вания других фермент,ов из приведе,нных выше прак ­
тически олраничивались их иде.нт,ификацией в ядах ,различных
с ко рпион ов. Считаю т (SaraЬini - Coste l lani , 1938; Diniz, Gon.calves,
· 1960 б; Bhas karan, Kuгup, 1975), что гиалуронидаза играет су ще­
ственную ро ль в распроiстранении полипептидных токсинов яда в
организме. Холинэс тераза ядов скорпионо'в ,гидролизует ацетил ­
х,ол и н акти внее, чем бу:тирилхолин, на ,основании чего ее относят
к «ис тинны м» ацети лхолинэстеразам (Bhaskaran, Kurup, 1973).
Есл л пола-гать, что ,впрыс к и,вае,мый в тело жертвы яд одновремен­
н о участвуе т в ее пере·вариван ·ии, то стано-ви ,т•ся вполне понятным
прису11ствие в яде названных гид'ролаз, а также раз .л ичных фосфа ­
таз (B haskaran, Кшuр, 1975). Вместе •с тем, обращает в1+имани е
факт отсутст вия в ядах скорпионов протеолитиче,ских ферментов;
н е я:сны пр ичин ы и би·ологический смысл сод ер жания в яде ри-
170

, бону1клеазы с трансферазными свойствами (Bhaskaraп, Kurup,
1975) .
Глаiзный ТОК!сический эффект ядов окорпионов , заключающий­
ся в л о·ражении нер.вной . системы, по-видимому, не связан с при­
сут,ствующим,и в яде фермента'МИ и другими выс о1ко ;v!,ол~кулярны ­
ми белками . Это хорошо демонстрируют пер 1вы е опьrrr ы по выде ­
лению из ядов скорпионов ток,сического начала, в которых очист­
ка т оК'с ина доm'и1галась за счет ,осаждения бо,льш еi'! части бал л а ­
стны х бе.iпюв этиловым спиртом (Орлов и др., 1977). Анализ био­
логического дейrств•ия белковых фра1щий, получае '11ых п,ри диализе
яда , т а1кже овидетельствует о низкомолекулярной природе содер­
жащегося в яде ток·сина ('или токсинов). Основы ва яс ь на этом ,
можно за,ключи-ть, что токс.ичеокие компоненты яда яв ля: ют.ся по­
липептидами. Ниже буv:Lут описаны основные сп ос о,бы выдел е нин
этих т аксичесю1х полипептидов и представлены данные о их строе­
нии и физико-хюшческих ,свой,ствах.
RЬЩЕЛЕНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ ПОЛИПЕПТИДОВ ЯДОВ
С~ОРПИОНОВ И ИХ ПЕРВИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИК А
Р азвитие совреме нных методов препаративн ой биохимии (хро­
:матография, электрофорез, гельфи.лырация, изоэ :1ектриче ское фо ­
Еуси ро вание и др.) позволило успешно решать задачи, св,я.занные
с вы де лением чи с тых ток,си нов из разных ядов . Однак,о в случае
ядов окорпионов существуют значительные трудности , обуrслов­
.ленные плохой рас-гворю10стью исх•Qдного материа ла - яда неза ­
вrи·си мо от ·способа его полу,чения. Плохая растворимость и «тягу­
чая» к·онсистенция водных ра,створов яда скорпио на обънсняюТ1ся
лри сут ств~ием мукопр_отеино,в (Miranda et al.,
'1970), которые
дол жн ы быть предварительно удалены.
С у ществует несколыко споообов удаления мук опро теинов: диа­
лиз, обря6от,ка яда ацетоном и, наконец, водная экстракция с пос ­
ледующим центрифу1гир·ованием. Последний сп особ уrспешно ис ­
польз ован нам·и при подготовке к хро:vrат,ог,рафии ядов скор п ио­
нов В. eupeus и О. scrobiculosus, од нако, так как ,проэ· кстрарги­
ро.ва,нн ый водо й и отцентрифугированный ,яд .вс е же сохранял дос­
таточно •густ ую консистенцию, мы дополнили у, 1 ,азанную ,выш е
прсщ еду,ру ,водной экстра1щии гельфи"1ьт,р ,ацией на сефаде ксе G -50.
А,Н аJi: Из ,со.става , свойств rи биолагич.еско,го действия 0'1~дельных
част ей яда ск·орпиона позво.ляет че11ко сфор мул и ров ать химиче ­
ские заv:Lачи, связанные с выделением из яда ч и стых токсинов.
В о б:оо щенном виде они сводили:сь к фраыцио н и ровани ю низко ­
~юл екулярных положитель-но за:ряженных 6е11r1,ов (или полипепти ­
дов), '-!'ТО предпола,гало предва,рительное по лучение 1су,ммар,ной
!·
фра1щии таких полипептидов . Решен1ие этих задач ;у1ожно проил ­
люст р ировать на примере выделения чистых токсинов из ядов
среднеазиатских окорпионов В. eupe us и О . scrobiculosus.
171

Яд В. eupeus, прещварительно пмвергнутый экстракции водой
и центрифугир ,ованию, хрома;тографировали на последовательно
соединенных колоН1ках с сефадеwсо,м G -50 и биогелем Р -1 0. При
эт,ом до•стигалось не только полное уда,ление :1,rукопроте,инов, но
и отделение некоторых ВЬ!lсоко- и низ,н:омолекуля,рных компонен­
тов яда. В результате уда,лось получить суммарную фракцию А,
.содержащую веще,ства с молекуля.рными весами в пределах
5000---115'000 и дейютвующую токсически на таракан·о,в (на•секо­
мые), мокриц (ракоо,бразные) и мышей (млекопитающие). Эта
сум-марная фраыция А послужила исходным У~атериало.м , д,ля пос­
ледующего п,олучения чистых ,селе1ктивно дей·ствующих токсинов_
С помощью гелыф,ильтрации с ·рециклизацией на биогеле Р-1 О ис­
ходный материал разделен на 7 фра,кций, каждую из которых в
дальнейшем подвергали ионообменной хроматографии на КМ-цел­
люлозе. Уже на этом э,тапе были получены в сiи,стом виде 5 то,к­
синов для млекоп-итающих и 1 для наrсек·омых. Заюлючительная
хроматография чао.и фракций на ДЭАЭ--сефаде,ысе А - 50, прове­
денная с рециклизацией и в ра1вн-овесных условиях, позвол 1ила по­
луч-ить в гомогенном состо1яниrи еще 3 ток1сина для млеко питаю ­
щих и 3 инсектот,01к,сина. Таким образом, из цельноtrо яда В. eu-
peus всего получено 8 тоК~синов для млекопитающи х и 4 для на•се-
комых (табл. 1).
.
По электрофоретиче~скому со-ставу и то,к,сичности для теп"10-
кровных и насе.комых яд скорпиона О. scroЬiculosus не,скольк,о от­
личается от я,да В. eupeus. Тем не менее, при его фра,кционирова­
нии мы дейсгвовали аналогично, дополняя в ряде случаев об щую
процедуру очиrотк,и ток1сино1в (табл. 1) хроматографией ,отде,;тьных
фракций на ионообменной смоле Вiогех-7O или КМ - сефаде1<се
С-25. К настоящему времени из этого яда мы получили в чистом
виде 1 то1<,син для м.лекопитающих и 1 ин,сек тотокrсин и обнару­
жили б,ольшое чис:ло фракций, летальных д::'!я тешюкровных, на­
секомых и ракоо-бразных .
Использова,ние комбинации гельфиль'r.рации и х,р ома·юграфии
на катионообrменни,ках я1вляет,ся традиционньп:vr пр и выделении
токоинов из ядов ско,рпионо,в (Miranda et al., 1960) и .вполне оп­
рав,дано ,св,ойствами исходно,го материала. Это хорошо доказы­
вают итоги много.летних ис-следований группы француз,ских у че­
ных (Мiгапdа, Lissitzky, 1958; Miгanda et al.,
1960, 1962, 1970,
1972; Rocl1at et al., 1966, 1967; Zlotkin et al., 1971, 1972, 1975), вы­
деливших а,налогчным способом большое число ,различных селек­
тивно дей,ст-вующих токсинов и.з ядов скорюионов А . austгalis,
В. occitaпus и L. quiпquestriatus. Для выделен·иrя токсинов из ,яда
е,1юрпиона Т. serrulatus разные г, рулпы ис,следователей использо­
вали незави 1симо дру,г от друга 2 способа, один из которых за,к­
лючался в ,гельфильтрации яда на сефадеысе и после.дующей хро­
матографии активных фраащий на КМ - целлю лозе (Gomez, D iniz ,
1966; Freire-Maia et al., 1970), другой - в гельфильтрации яда
]72

на биог ел е и хроматографии на катионнообменной смоле Biorex-
70 (Linden, Raftery, 1976), в обоих случаях получены 2 токсина.
Примене ни е храма1тографии без предварительной гельфиль­
тра:ц.ии •яда оказлось менее эффективным. Так, ·только по ощному
токсину было выделено при непосредственной хроматографии ядов
скорлион,ов на катионообменной смоле амберл·ит CG-50 (Catterall ,
Таблица 1
Выделение токсинов из яда среднеазиатского скорпиона Buthus eupeus
Выход нз
лд,а
ДLОО
Выход
А1пнвные
ПО ТО!(-
Стал. н я раздсш.•1н1Я
фраюJ,1-11-1
сырого
(мкг/ кг)
(м 1<r iта- сн~шости,
яда, вес %
МЫШИ
ракана)
%
Центрифугирование
Цельный
яд-------- -- с
91 ,67
3000
25
Гел 1фиiьтрация на
38_58
биогеле Р-1 О
с ------ - -----А
Г ельфильтраци я с
\
[
3,50
250
рециклиз а цией на
1[
5,62
2000
биоrеле Р-10
1\1
8,24
300
А---+ !~
0,71
600
2_85
750
VI
5,00
-
VII
6,32
1700
Хроматография на
1 ---------- ---М1
0,77
250
9,24
КМ-целлюлозе СМ-32
[[ ----- М -1
О,10
75]
0 ,40
111
{КМ1
0,47
1000
I<M1
0,4[
500
IV ------- ---Ms
0,51
300
5, 10
{
J'v\ 5
0 ,54
100
1,62
V -------- КМ 0
0,36
150
И2
0 ,58
I
14 ,50
VI ------------- I<И 1
2,80
V II --- -----Щ,з
1,23
1000
3,62
--·
0_35
1.75
Хроматограф и я с
КМ1 ------ - -- - --М1
О, 11
150
2 .20
рециклизацией на
КМ 2 ------- --- J\tl2
О, 14
600
0.70
ДЭАЭ-сефадексе
I<M6 .... . .... Мв
0,20
200
3,00
А-50
КИг · ... {~~
206
3
17. 10
0,57
3
4,75
Пр им е ч а ни е . М-токсины длн млекопитающих, И-токсины для н а
<:екомых.
1976) жли анионоо.бменнике ДЭАЭ-цел,люлозе (Watt, 1964;
Mclntosh, W att, 1973). Возможно, токсичность отчасти теряет.с я
вследст вие прочной адсорбции то~синов на ионообменнике или в
резул ьтате денатурации молекул т.аюсинов в ,процессе ионообмен­
ной хрома-юг.рафии (Zlotkin et а!., 1975). При хромато:графии цель­
ного яда на КМ-цел,люлозе о:тмечено распределение токсичности
по большому чи1С.л у фракций, из которых при последующей хрома -
173

тог.рафии на ю16ерл ите CG-50 или ДЭАЭ -·сефадек1се А-бО полу ­
чены в чисто•'v! юще 8 токсинов, названных «токсичными в_ариан­
тами», или изото,ксин а,'v!•И (Mcintosh, \,Vatt, 1972; Watt et al., 1974;
Babln et al.,
1974, 1975). Причины такого «раз'v!ывани.я» токсич ­
ности по ходу хромато.грам'v!ы не вполне ясны. Они мотут быть
связаны •с п·рисут,ствием в одном яде м,ножествен-ных ф о,рм токси­
нов, дейс'ГВующих на животных одного класса, так называемых
изотоксинов, или тоюсичных ва1риантов, ко:торые отличаю·гся друг
от друга хи,мически за,менам •и аминокислотных о-ста-г1<,ов в о т,дель­
ных позициях пол ипептидной цепи. Boз'vlOЖtrы ассоциация моле ­
кул ток,синов друг с другом и.ли их ком1плексирование ,с друпши
1<.омпонентами яда, например гликопротеинами (Miran da .et а!.,.
1966; Rocl1at et а!., 1966, 1967). Не исключено, что существование
подобных аберрантн ых фо.рм ток·синов и:v~еет физиоло.ги ч ес,кое
значение, так как известно, что с увеличению,~ степени ч и1стоты
тоюсинов летальное действие их разбавленных растворо1в ослаб ­
ляется, но •:,,10жет быть сохранен .о при добавлен ·и·и · посторонних
белков, например альбумина или сыворотки крови человека (Roc-
hat et а! ., 1967; Miгanda et al., 1970; Karlssoп, 1973). По л агают
(Rochat et а!., !967; Miranda et al., 1966, 1972), что хроматогра ­
фшя на анионооб1,,1еннике ДЭАЭ-сефадек,се А-50 способству ет дис­
социации агрегатов И,1И ионных !ЮМП ,,ИК!СОВ ТО!(IСИНОВ С д р уПI'v! И
белками яда, и потому при очистке то ксинов она вводится в ~,а­
чесгве обязательного этапа, nре;J.шествующего хрО'матог,ра ф ии на
катионоо·бменни,ках (Rochat et al., 1967; Miгanda et a l .,
1970 ,
1972; Zlotkin et а!., 1971), или на заключительной стад,ин, ·как и
при выделении токсинов из яда среднеазиатских скорпионов
В. eupeus и О. sc roblculosus (табл. 1).
В ядах некотор ых скорпионов (L. quiпquestгiatus) ча,ст ь ток ­
синов находит-с.я в прочной связи с кислыми ка:vrпонента,м и , воз ­
мощ:но, му1копротеина:vrи. «Ки,слые фракции» таких тоI<сино·в необ ­
рати~м ,о ад,сорбируютоя на анионооб,:vrенниках (ДЭАЭ-сефадексе
А - 50), а таюке на катионообменниках при рН ниж:е 6,7. При более
высоких значениях рН эти фракции вообще не вступают ,в обмен
с карбаI<силсодбржащими ионообменниками (Орлов и др., 1977).
Поэтому при разщелении этих токсинов использовал ,и мини:vrаль ­
ные раз,личия в ,размерах их м,олекул и способность а,дсорбйро­
ватьоя на сефадек~се, однако отделения тоI<синов дру,г от друга
уда.лось добиться только за 15 циклов гельфильтрации, при ч е,r
выделенные токсины не были гомогенными и :получе ны ,с ,к1райне
низ1ким выходюr (Miгanda et а!., 1970) .
В заключение следует оста·новить·ся на вопросе о гомоге ннос т и
полученных препаратов ток•с инов. Ее установление затруднено
из - за присутстви,я в ощно·м Я\де множественных форм тоrксинов, а
та~кже ,спосо,бно1сти токси.нов агрегировать или обра.зо~ыват ь ко:v~n ­
лексы с дру,ги,м•и компонентами яда. Одинаковая скорость . ми гра­
ции изотоксинов в электрическам поле приводит к ошибка_ м при
использовании м_ етода электрофореза (Mi.randa et al.,
1970; Zlot-
174

kin et а!., 1972; BaЬin et а!., 1974). Электрофоретичес ки ,г омотен;ны е
преша1раты некоторых токсинов на самом деле оказались комплек­
са·ми токсинов и гликопротеинов (Rochat et а!., 19 67). Бли зост ь
м,олекулярных весов ток'Синов снижает разрешающ ую спо,со:бность
аналитичеокото ультрацентрифугирования (Rochat et al., 1967) и
гельфилырации, а сходство N- и С-концевых у ча ,стков полипеп­
тидных цепей обу1Словливает непримени:vюсть анализа к онцев ых
а:vrинокислотных остатков в качестве критерия rо,л,югеннос.ти ток­
синов . Из-за высоких значений .pl токсинов неп ригоде н и метод
изоэ,лектрического фоку~сирования . Более успешно при•:v1ен:яю11ся
методы иммунодиффузии и имуноэлеюрофореза с использованием
антисыворот,ок к цельному яду скорпиона, а также к отдельным
токсинам (Mcintosh, Watt, 1970, 1973).
СТРОЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
ток;синов ЯДА СКОРПИОНА
Фракци·онироваюrе ядов скор~шюнав и оценка летального
дей1ствия полученных фракций на жив отных различных система­
тическ•их групп позволили устаноВ'ить при,сутс,в ие в яде веществ.
с избирательной токсично,стью для :vrлекопитающих, н асекомых и
ра1кообразных. Полагают, ч то прису:тствие в яде селективных ток­
синов отражает адаптацию окорлионов к из меняющи1лr ·ся ус лов, ия:vr
питани,я и окружающей среды в процессе эволюции (как известно,
окорпи,оны - одни из -наиболее древних ж,иво11ных).
Наличие полипептидны х токсин ов с селекти.вной акт ив нос тью
в ' о:тн·ошении разных животных П1ред•ста,в,ляет суще,ственный инте­
рес в связи с возможностью исп ользова ·ния этих т,ок,си нов при ре­
шении ряда фундамента,льных вопросов сравнительной и эволю-
ционной физиологии и биохими•и.
.
Токсины для млекопитающих (mammal toxiпs). Эти токси ны
являются простыми полипептидами из 57-78 юшнокислотных о·с ­
татков с молекуляр,ными весами в п,ределах 6000-8000 далыон.
Приведенные ·в литературе (Miraпda, Lissitzky, 1961; Mir anda et
а!., 1961 , 1964) более высокие значения :vюлекул ,ярных ве:с ов · ток­
,с,инов (от 11000 до 18000 далыон) объя·сняются •способн о стью
токсинов агрегировать с ,образов,ание:vr ди- и три~1еров ил и ко:1ш ­
лекс111рован ием с гликопрот еи на ми (Rochat et al.,
1966, 1967) .
Токсины для :vIЛекопитающих - сильноосн6вные полипешг иды,
которые в зави:сю1ости от рН среды могут при1сутствова'r-ь в раз­
личных .молекуля рных фор-мах. Одна из та,ких форм , преобладаю­
щая при рН 4,0-9,0, термостабильна и устойчива к денатурирую- .
щим воздейш,iшям (Chicheportiche, Lazd uпski, 1970).
В та,бл. 2 показан аминокислотный состав ток•синов, по1луче н­
ных из яда скорпиона В. eupeus. Представленные в табл. 2 дан­
ные .могут также хара1ктеризовать аминокwслотный со став токси­
нов для теплО1Iqро•вных из ядов других окор пионов . Обращает вю1-
ма ·ние полное от:су.тствие в этих тоКJсинах метионина и одинаковое
175

оодержание остатков ,полуцистина . Та,к как сущес'Гвование свобод­
ны х суль фгидрильных групп в токсинах не установлено, можно
по лагать, что в1се обнаруженные в их .с о,отаве 8 остатков полуцис­
тин ов зам кнуты четырьмя дисульфидными связями. В тоюсина х
отмечено высокое содержание положительно заряженных амино­
кислотных остатков - 9 -18% от общего числа. Обнаружентт е
бол ьшого числа остатков дика·рбоно.вых ам,инокислот с учето.м
сильно й основности .молекул токсинов поз-воляет за,ключить, что
часть а,с парагинов-ой и глутаминовой аминокислот находит~ся в
Таблица 2
Аминоки слотный состав токсиr.ов для млеко•итающих из яда
скорпион а Buthus eupetts
AMH liOl( HCЛOтa
1/2
Asp
Thr
Ser
Glu
Рго
Gly
Ala
Cys
Val
Met
lle
Leu
Tyr
Pl1e
1iis
Lys
Arg
Trp
Всего
N-концевая
11 ·1О
9
1О
2
2
1
2
4
3
3
3
б
4
5
6
6
3
4
5
6
5
6
6
·7
4
5
5
8
8
8
8
2
3
2
4
2
2
3
3
2
1
2
4
3
б
4
1
1
2
3
4
5
5
8
5
2
3
2
2
3
3
4
2
75
61
68
70
Ala Ala Val Ala
11
9
13
10
2
2
2
1
3
3
4
3
4
2
4
3
6
3
4
5
8
6
9
7
6
4
6
6
8
8
8
8
2
3
1
1
4
4
2
2
2
3
2
2
5
4
4
4
2
2
2
2
2
2
9
5
3
5
2
2
2
2
4
2
5
3
78
64
73
64
Ala Ala Ala Ala
амидной форме. Следует от,метить 011су Т1ствие или незнаrчительны е
'
коли чест ва фенилаланина при высоком содержан.ии другой аро­
ма "Гиче-ско й аминокиюлоты - тирозина.
Небо льшие по размеру молекулы ток·синов характеризуются
отн оситель но высоким со:деjржанием глицина, аланина, пролина,
что в со вокупнооти с у1становленными в них четырьм,я дисульфид­
ными мостиками может об'l>яснить их вькок,ую стабильность. Дей­
стви тельно , установлено, что тоюсины для млекопитающих пол­
ностью с охр,ан1яют ак"гивность в течение 5 ч ,при обрабоп<е их 8 М
моч евино й при 20°С, и только после инкубации в течение 18 ч при
50°С инактивируются на 82% (Rochat et а!., 1967) .
На N -1концах полипептидных цепей ток·синов я.да В. eнpeus
иден тифицирован аланин, и только в одном токсине М3 на N,кон­
це у,стан овлен валин . В т~оюси·нах из ядов других скорпионов в ка-
176

f\:)
1
-
ел
а,
Структурные группы
А
А!'
А III
АII
в rII'
вIU
LV
Amif
в!'
в!"
в11
L III
ВрI
ВрII
токсинов
K RDGYIVYPN -NCVYHCVPP-----GDGLCKKN -GGSSGSSCFLV- PCGLACWC-KDLPDNVPIKDTSRKCT
KRDGYIVYP N- N CV YJ-ICIPP - ----CDGLCKK N-GGSSG SS CFLV - PCGLAC'NC-KDLPDNVPIKDTSRKCT
VRDGYIVNSK - NCVYI-ICVPP - ----CDGLCKK N-GASSGSSC ..... .
VKDGYIVDDV -NCТYFCGR- - -NA YCNEECTl<L-KGESG-YCQW ASPY G:-JACYCYK-LPDI-IVRTK GPGR-CI-I
LKDGYIVDDR-NCТYI~coт---NA YCNEECVKL-KGE ....
VKDGYIVDDR-NCТYFCGR----NA YCNEEC. . . . . .
.
.....
.
LKDGYIVDDK-NCTFFCGR---NAYCNNEC ............. . .
LKDGYIIEDI- N CVFFCGR---NAYCDXXC .............. .
\I RDAYIAQNY-NCVYТCFK - --NEYCNDLCXXN- G.
GRDAY I AQPE-N CVYECAK .... . .............. . .. .
GRDAYIAQPE-NCVYECAK--- NVYCND ... ·............ .
VRDAYIAKNY-NCVYECFR- - -DSYCNDLC .............. . . . . .
GГ~ CVYIADIA-NCA У ....... . ...... . .... . ......... .
GR DAYIADDX-NCA YXCAL- --XX YCN ...... . ... .. ....... .
Cs I - KEGYLVSKSTGCKYECLKLGD;'-. JDYCL ..... . ...... . ........ .
Cs III - KEGYLVSKSTGC KYECLKLGDN DYCl.RECKQQYGKSSGGYCY AF-----ACWC-EALPDI -ITQVW-VPNKCT
11
111
Cs VI-KEGYLVKKSDGCKYDCF\VLGKNEHNTCECI<AKNQGGSYGYCYAF----- --ACWC--EGLPESTPТYPLP;~кcss IV
Cs VII -KEGYLVNKSTGCKYGCLKLGENEGNKCECKAKJ\:QGGSYGYCYAF- -----ЛCWC-EGLPESTPТYPLPNKCSS
Cs VIII -KEGYLVKК:SDGCKYGCLKLGENEGNTCECK А KNQGGSYGYCYAF-----ACWC-EGLPESTPIYPLPNKCSS
СI
- KDGYLVEK- ТGCIO<TCYKLGENDFCNRECKWK!i IGGSYGYCYGF---,- - -
- GCYC-EGLPDSTQTWPLPNKCT
Схема I. Аминокислотные последовательн о сти токсиноа для млекопитающих из ядов различных скор r ионов (Гochat,
Sampier i, 1976). Аминокислотные остатки обозначены однобуквенным кодоы I UP АС.
_
Токсины ядов скорпионов: А-А. austra1is; В-В. о. tuneatanus; L-L . qнinquestriatus; Вр-В. о. paris; C-
::::J С , sculpturatнs; Cs-C . s. suffusus.

честве N -,ко trцев ых ам ш-1 ок и,слотн ых ост а тко•в идентифици,рованы
лизин, валин, лейцин и глутаминовая 1011слота.
Несм,отря на отличия в N-концевых а минокислотных сстат1,ах
и в ыраж ен ную -С Т•Р-УКту рн ую г ет ер ог еш-юст ь «ско р пио но•вых>-' т,0,1< ­
си нов, в целом о'Г'меча е'flся выс о к а,я сте-п ень гомол ог,ии. N-конце13ых
по·следовательностей этих токсинов (Rocl1at et al. , 1970 а, 6; Zlot-
kiп, 1973) . Так, Орлов и д'Р- (1977) обращают в,1-шмание на пос­
тоянное по.ло ж е н•ие в то.1 <1 си нах -след у ющи х аминс,;ш 1слотных о,с:­
татко•в: Asp (3), Gly (4), Туг (5), Asx (11) и Туг (14), сос1редо­
точенных в N-ко·нцевой части мо,лекул тотvсинов (схема 1) . В боль­
ш~шстве 11ок:син::: •в полност ыо инвари ан тны п озиции •д•вух перв ы х
и трех последних. остатков полуцистинов. ПредпоJ1агается (Кu­
реуап et al ., 1974; Rochat et а!., 1976), что в токсинах для млеко­
п итающих то п О'Г:рафи,я ди•су,л ьфидн ых св я зе й один акова (схе м а 2) .
Схема. 2 . !(ов~л (;' нтная струюура токсI-111а А 11 нз яд а скор ­
нiона , A n_droctonus austгali s (KupeyJп et al _. , I V74) .
.Структурное схощ~тво выдел~нны ;,с к на1стоящеыу врем е~и ток­
сд но~ . д.ля млеыопитающих, дос,татоqliо •выражено , а чи·сло з амен
0 1\дел!>,н,ых а•миtiокислоrных остатк_ов не превышает 14 % и п.ред ­
·С '11.авля ~ т,ся ~11лосrущ~с'llв, енным. Так~ие то1кины, оцределя емые как
«изотщvеины» , или токсиче(жце варианты, различают•оя по ·ст е[1ени
а мидирuвщшя дикарбонов_ых амино!\_Ислотцых остатков и ли д аже
единственныri1 аминокислотным · остаткqм в опред{;ленной . поз иции.
Т,а1к, о:пи1саны цреп ар а·:гы тощс~f!О~., пред,ста-вля1ощие соqой . с~месь
двух изото:кси}\qв , отличщощих~ся щру,г от друга при ·сут·ств ие м в
положении 17 ващ1на и изолейцина (Miraлda et al., 19:ТО; R.ochat
et , al., 1970) . В то же время сравнительный анализ п е рвичной
структуры такси.нов дл я млекопитающих ВЫlявляет более глубокие
.,.178

отли чия, что :позволяет разделить ,все из,вестные ,к настоящему
време ни то.ксины на 4 г,руп1пы (Орлов и др. , 1977) .
Первую группу образуют пол ипептиды, х ара кт еризую щи еся на ­
личи ем аминО1кИ1слотных остатков между 2-м и 3-м полуцистинами
и И1меющие 'В Ысоху ю летальную активность.
Токонны второй г,р уп пы тоже достаточно акиrв-ны и приме,рно
на 50% гомюлоги ч.ны пощшептидным ток-син,ам п ервой г~ру пп ы.
Ток·сины треть.ей гр упп ы обладают заметно ,1еньшей летальной
ак т ивность ю и в меньшей степени го м ологичны поJiипептидам из
двух пер вы х групп.
Наконец, то~«сины чет,вертой груп,пы наименее а, ктивны и обн а­
ружива ют небол ьшое структу.рное сходство ·с друг1ими ток,синами
из ,ядюв скорпионов.
Перечи,сле нны е группы токсинов показаны на сх,еме 1. Пока
невоз,мож но судить о принадлежности тсж·синов из ядов средне­
азиа11с~ких скорпионо'В к ,одной из четыр ех перечи·сJrенных выше
г ру пп . Одна к о анализ их аминокис.лотн10,го со•става указывает н а
р,я,д осо,беююстей, позволяющих предпо ложить, что ло структуре
они должны отличаться от известных полипептидных ток·синов и з
ядов дру,гих видJов ск,орпионов. Изоморфизм токсинов может быть
использован в т акоономичеоких целях: так, отличrия в аминокис­
ло тных послед,овательно·стях таrксинов яда скорпиона А . australis
вызнали предположение о существовании 2 подвидюв этого в•ида
ско,р1пионов, что впоследствии нaшkllo по,д'Г'верж'дение в морфоло­
г ических наблюдениях, прове д енны х с целr:ю систематики (Zlot-
ki n , 1973).
Опыты по нап,рав ленной модификации молекул т,окс ин.ов окор­
пиона с целью выясненшя функционально и ,структурно сущ ес твен­
ных групп пока не.мното 1численны, а их результаты трудно интер­
претировiJ.ТЬ. Дл,я физиологов большой интерес П1рещст,авляют спо­
собы введения ·в тю.к1с ию,1 метки. Показано (Rochat e t а!., 1972),
что при йодировании остатков тирозина ток:: ины скорпиона не т е ­
ряют акгивности. Дру~гой .вариант представ,лен ра·ботами Ismail et
а!. (1974), в которых предварительно получали меченый по 125 1
или по 131 I яд, а затем выделяли из негю соответственно меченые
то к·сины.
Токсины для . насекомых; (1insect toxins). Обна,ружешrе 1В я,дах
скорпионов токсинов с селеJI,тивной акти·вностью дл,я насекомых
представляет ,сущщт:венный инт,ерес щш ср-авяител ьной ; физиоло­
гии, занимаю щей1ся изучением- особенност~й ,офrанизации и фун,к­
ционирования, нервной системы у живот ных разJ).ичных си1стема:ти~
ческих групп. Определено . (Z-lotkiг.· et al., 1972) ,, что яд скорпищrа
вызывает контрак,турнь;й п.а,ралич . личинок на,.секо1мых и ик ги-.
бель, причем, суд~я ,по результата-м электрофореза-, комп;щнен'ТЫ:, с
которыии . связаны . 2 _э тих эффекта яд1а, могут. быть дифференци.­
рованы и, не:сомненно, оnп:ичают:ся- от полипептидов, то[{jсиrчески
действующих на теплокровных. Паrка не ЯJсно, содержатс1я, ли в
яде скорпионов ток,сины для на1секомы х, рсiаличающиеся по спо -
179

собу дей,ствия и конечному эффекту, однако отличия в физико­
химических свойс т,вах и с11роении инсектотоыс и нов, присут:ствую­
щих в одном яде, уже зафиксированы и могут быть подробно
р аосмотрены на прИiмере яда среднеазиатского скорпиона Buthus
eupeus.
Ниже ,сообщаются результаты работы, выполненной в Ин,сти­
туте биоорганиче1с1юй химии им. М. М. Шемякина АН СССР
(Солдатова, 1977; Атакузиев, 1978) . Этапы выделения чисты х ток­
синов для насекомых из цельного яда скорпиона показаны в
Таблица 3
Аминокислотный состав токсинов для насекомых из ядов
скорпи оно в В. e11peus и А. australis Н. (по Z 1otkin et al.,
1971; Солдатов а, 1977)
.,:\мн НОl{ '< СЛОТЫ
1/2
Asp
Thr
Sег
Glu
Pro
Gly
Ala
Cys
Va1
Met
11е
Leu
Tyr
Phe
His
LYS
Arg
Trp
Всего
N-концевая
А. aнstra -
11s Н.
AL
11
4
6
3
]
4
3
8
3
2-3
5-6
5
1
1
7
1
1
67
Lys
TOI\CHJ-lbl ИЗ ЯДО В CKOJHIИO !i OB
В. eupet1s
и,
и,
Из
и,
2
11
3
5
2
2
3
2
6
3
1
2
1
3
2
1
2
4
7
5
4
2
2
1
1
8
8
8
8
1
3
2
3
3
1
3
1
l
4
1
2
1
2
2
1
1
2
8
1
3
3
5
2
3
36
62
-)6
35
Met
Ala
M.et
Met
та,бл. 1 Полученные иноект,оток,сины вызывали у насе,комых па­
,ралич и в с,овокупно,сти обладали только 26% общей активности
, яда к насекомым. По молекул,я,рным размерам они относятrс,я
к 2 ,группа1м : 3 инсектотокюина (И 1, Из и И4) с молекулярным ве­
с-ом около 4000 дальтон и 1 (И2) с 7000. В та'бл. 3 аминокислот­
ные составы «коротких» и «длинного» токсинов из яда скор­
пиона Buthus eupeus • сопос11авлены ,с состав,ом инсектотоысина
яда скорпиона Androctonus australis Н. (Zlotkiп et al., 1971) .
Подобно ток1синам для тепло,кровных, инсектот,оысины содер­
жат по 8 остат,ков 1полуцистинов, замкнутых четырьмя дису,nь-
180

....
CIJ
. ....
-,,
И 1 MCMPCFПRPDMAQQCRACCKGRGKCF0PQCLC0YD
И2 AD0Y\f l(QKS0CIO SCFLDNDXCNADCKYY00K~GYCWCPNK ~LNSWCIPDK, 0WBSIKSEТ"ПC ......... .
И 4 МСМРСFТТВВХRАСК ........... .
AL KKN0YAVDSSKKAPE . . . . ..... . . .
А I KRD0YIVYPNNCVYI-ICVPP .
А III VRDGY IVNSKNCVYJ-ICVPP .
Схема 3. Амюю•<ислоп1ые последовательности инсектот о ксинов (И 1 , И,, И,) из яда среднеаз11атского скорпиона В . eupeus,
инсектотоксина (AL) и токсинов для мле к опитающих (А 1, А 111) из яда скорпио:1а А. australis Н.
Аминокислот ные ос-га тки о 5 ол1ачены однобу1<Венным кодом IUPAC . Подчёркнуты участки предполо:кительной
"стыков 1 :и" пептидов. Х- н еидентифицированные остаткt1. ];,алее пощ1ые ам11н с 1шсл , ; тные последовательнJСти токсинов
AI и AIII цоказань1 на схеме 1,

фидными ~связями. Т,ака,я же ст,руктурна,я оообенность характер ­
на для нейро- и ·цитотокк:ич еских !Полипептидов из яд ов э.лапидо­
вых змей (Туракулов и др., 1971; Юке л ь·сон и др., 1974; l_<arls-
son, 19 79) . Коро11кие то:к,сины отличают,оя от дл инны х , -содержа­
щи х:я в ядах скорпионов В. eupeus и А. australis Н., низким со­
держанием ти!розина, ·серина, остатков гидр,офобных а1мино1кислот
(валина, ле йцина , изо.ле й'ци на) , полным от1сутствие;v1 т1риптофана
и наличие.м мет ионина. От,сутствие триптофана и содержание ме­
тионина сб лижа ют коротки е инсектотоксины с цитотоксинам и из
ядов аспидовых змей (Юкельсон, 1977; Karlsson, 1979). •
Сраrвнительный а,нализ аминок,ислот.нюго ,ооста ,в,а ,позволяет зю<­
лючить, что короткие инсектоток, :1ины я,да В . eupeus представляю т
новые -структурные ва,рианты полИ1пептидов -с ана.лотичной функ­
цией, причем в,се они, по - вид,имому, я1вл.я-ют:ся изот а~ксинами (Сол­
датова, 1977). Длинные токсины И 2 из яда В. e u peus и AL из яда
А. australis Н. обнаруживают большое сх-о;JJ:тво в амю-юкислот ­
ных составах ; незначительные вариации в числе отдельных ами­
нокислотных оста11ков могут ,быть обу,с,лс1в..rт ены разной длиной их
полишептидных цепей (62 и 67 остатков соответственно). На схе­
ме 3 ко1р,от,кие и длинные инсектот,ок~сины ядов -скорпионов В. eu-
peus и А. australis Н. со~поста1влены по а-м.'И1-юки1слот,ным последо-
1вательност,ям ,с то1кинами для мле-1юпи11ающих из яда скорпиона
А. australis Н. Уже сравнение N-концевых участков полипептид ­
ных цепей указьшает на весьма отдал,енное сх,одство сравнивае­
мых селектив.ных токс·ИНО\В . Этот вывод находится в ,с оответ1ствии
с 1р езуJ1 ыата,м·и, 06наруживающим1и отличия в физи1ко - хими'ЧеС1ких
свой-с 11вах токсинов д.r:rя мле1юопит1ающих и на,се1юмых: т1ак, в отvш-
. чие
от ос1-ювных тою.::инов д,ля млекопитающих, инсектотоI<сины
х а1рактери зуют,:я слабой катодной подвижностью при электрофо ­
резе в щелочных буфе'Рных средах и им ,еют pl около 7,0 (1Zlotkin
e t а!., 1974; Ор,лов и др., 1977).
Токсины для ракообразных ( crustat.i on toxins). Я,д с ыорпи он а
эффективно парализует р,акообразных, од.на1ю этот эфф еЕ т пра1к­
тически не воопроиз1водят чистые токсины для млекопитающих и
1-шсекомых. П редположение о существовании :в яд е ск,орпионов
.сам ,01сто1Ятельного тоюоина для ,ракообр,азных было подтвер ждено
выд,елением та;ко1го тоюсина с ло:мощью рециклическо.й ,гельфиль ­
тра1ции на сефа,дек- .::е G-50 (Zlotkin et al., 1972). Т,оксин д.тыJ рако­
образных тоже О1казался полипептидам с молекуляр.НЫ1\1 вэсом
около 8000 дал_ыон . Он состоит из 69 аминокислотных оста тков,
в нем отч,'тс11вуют метионин, фенила л анин, гистидин, но содер­
житiся значительное число остатк-ав артини на . В 00011вет1ствии с
этим молекул:а токсина для ра,к ообраз ных характеризует- .::я ярко
выр,аженными осн6вным1и свой<ств-а1ми. Предпола,гают, что с тру к ­
туру тт~сина стабилизируют 5 дисулыфидных связей (Zlotkin e t
al., 19 75).
182

,Д етальный физиологический анализ действия яда скорпио­
ноrВ (О рлов и др., 1977) позволяет за;ключить, что в ,разнообраз­
ных фар мак,олотИ!ческих эффектах цельных яд ов пу1 :1ковым момен ­
том являе т,с я де поля1ризация .возбудимых мем<бран из -за вызван­
ного ядам:и увеличения вх,од,ящего .натриевого тока . В связи ,с об­
нар ужени ем в ядах . скорпионов селе1~тивных то1кинов возншкает
вопрос , на~с'kолько та,1юй механизм действия унИ1вер,сал,ен и при­
сущ всем токсина,м. В литерат у ре при,вощятся данные, что токсин
дл я теплокровных .не блоки,рует синаптическую передачу в брюш ­
но.й не-,р.в'ной цепоч.ке тар ·а ,кана, тогда ·ка·к иikектотою::ин дей1ст:вует
с а ктпвн ость·ю, в 267 раз превышающей акт·ивность цельного яда
(D,Aje ll o et а] . , 1972). С .д,ру,гой -стороны, токсины для на1секомых
и мл екопитающих оказались не эффективными на 1рецепторе ра1с -
11яженйя рака, тогда как то'к1си.н для ракообразных rioлi:IOCTЫO
во·спроизв9дил на этом препарате ,I\'о:З,буждаюiций и тормозной эф ­
ф'е'ктьr ц·е:11ьного яда скор п иона (Pansa e't а ! ., 1973). Летальная
а кти1вность инсектоток,сино·в не реализует,ся ,в отношении пrау.коiв
(Zloi:ki•n et а1 . , 1971), тогда ка1к ,Ра 1злrичнi1е т'окiсиЮ,r д.irя млекопи­
тающи х и ТОК!СИН дл,я р·а,коо1браз'н'1,r х пр\~1{ра1сно дей1ствуют .на 'нерв­
но - мышечные црепа1раты та,ра'нтул-ов {Орлов и др., 1977).
Ruh]and ·et а] . (цит. по Орлову и д,р., 1977), количественно
О Це'!'J:~ив эффектrrвно;сть ЦбЙIСТВЙrЯ селектнвных ток,сийов 'на нервно­
мышечные препараты ж1ивотных из р·аз:ных -систе~1атичеtких ,гру1пп,
показали ,относительность самюго понятия оелекти1вности в при­
ложении к тоN:::Иlна,м скорпионов: а,бсолютной из-б'иратель1-юстыо
ш о тн ошени:и на1секомых обла,дают только ин1се1<тот0Nсиньr, кото­
rрые не :п;ейству,ют .на р акообразных, пa•Y,J<iOB И м.irеrшпи11ающих; ();С­
тал ьны е тоК!оины (для млекопи11ающих и ракооб-разных) дейrство­
вали :i:ю всеместно, включа,я и на1се1юмых, . 1-to с большей актив­
ностью в отношении животных из С{Jответствующих им систем ати­
ческих групп.
Прrиведенн ое выше предста1вление о ,влиянии на нат,риевый ка­
н,ал воз·будимы х мем,б,ран как м,олекул,я,рной основе механизм·а
действия в оюно.нном б1аз·ирует.ся на ,результа11ах , 1пол')лченных при
ислользованИ1и цельных яд•ов окорлионов или выделеннь1х из н·их
токсинов для млек-опитающих ( Koppen]16fer, Schmidt, 1968 а, б;
Gomes et а]., 1973; Narahashi, 1974; Romey et al., 1975). Указ ы­
ваеюя также, что -в предс11авляющей канал молекуле пр остра Н1ст ­
,вею-rо разнесены у,частюи -овязыва~ни·я ток·синов скор ·п ионов и дру ­
гих ,в заимодействующих ,с н,атриевым кана ,по м аг енто в, например
ако н итина, , те1;ро д,окси.на и т. д. (Орлов и д·р., 1977 ; Можаева и
др., 1978) . Бла•г,одар~я эт,ому токсин ,скорпиона Jiюжно призн ать со­
вер ш енно ,само,стоrятельш'ым и абсолют.но уни1Кальным «инстру мен ­
т·оы>> дл,я изучения на11риевого канала. Бели же признат ь , что
описанны й механиз;м действия -свойственен воем еодержащим1ся
в яде скорпионов то:к;синам, а а'61солютна:я н.1 :и относительная се-
183

лектив.но~сть этих т,оКiсишов обусл,овлена только структурными осо­
беннос11ями т,каней .или ра1сположенного в них ионофора у разных
жив-отных, то и1сш-о.льзование токсинош скорп~ионов для целей срав­
нительной и эволюционной физиологии ,нер1вной системы приобре­
тает особе~шо большие пер,слек11ивы.
ЛИТЕРАТУРА
Ат а к уз и ев Б. У. 1978. Исследование токсинов для млекопитающих в яде
среднеазиатского скорпиона Buthus eupeus. Автореф. канд. дис . Ташкент.
АтакузиевБ.У.,ЮкельсонЛ.Я.,ТашмухамедовБ·.А.1974.ХПС,
No 4, 540-541.
О р л о в Б. и др. 1977. «Механизм действия зоотоксионов», вып. 5. Горький, 3.
Пи гуле в с кий С. В. 1975. Ядс,витые животные. Токси1<ология бе спозвоноч­
ных. л.
С о л д а то в а Л. 1977. Структурная характеристика инсектотоксинов из яда
скорпиона Buthus eupeus. Автореф. канд. дис. М.
ТуракуловЯ.Х.,СорокинВ.М.,НиurанходжаеваС.А.,Юкель­
с он Л. Я. 1971. «Биохимия», 36, No 6, 1282-1287.
Юкельсон Л. Я., Садыков Э. С., Сорокин В. М . 1974. «Биохимия»,
39, No 4, 816-821.
Ю к ель с он Л. Я. 1977, Мембраноактивные ко м поненты яда среднеазиатской
кобры: цитотоксины и фосфолипазы А2. Автореф. докт. дис. Ташкент.
АdаmК.R., WеissС. 1956.Nature. 178,4530,421.
АdатК.R., WеissС.J.1958.J .Ехр.Bio1., 35,39.
АdаmКR., WеissС.1959.Brit.J.Pharшacol.,14,334.
А1ЬuquеrquеЕ.Х., Е1dеfrаwiА. Т., Е1dеfrаwiМ.Е. 1979.Iп:
«Shake Venoms» (Ch. У u. Lee ed.). Handbook of Experimental Pharmaco-
logy, v. 52 . Springer - Verlag . 377-402 .
В а Ь i n D. R. et al. 1974. Arch. Biophys., 164, 694-706.
В а Ь i n D. R . et al. 1975. Агсh. Biochem. Biophys., 166, 125-134.
ВаЬuS., К:rishnаDаssК.Р.М.,VеnkаtасhаriS.А.Т.1971.Toxicon,
9, 119-124.
В а 1о z е t L. 1956. In : «Venoms» (Е. Е. Buck1ey, N. Porges eds.). AAAS,
\Vashington D . С., 441, 44-46.
В d о 1 а h А . 1979. In: «Snake Venoms» (Ch. Yu. Lee eds.) . Handbook of Expe-
rimental Pharmacology, v. 52. Springer-Verlag, 41 - 60.
ВhаskаrаnNаirR., К:11ruр Р. А.1973. Ind.J.Biochem. andBiophys., 10,
230-231.
В11аskаrаnNаirR., КuruрР.А. 1973. Ind. J. Biochem. and Biophys.,
10, 133-134.
Вhаskаrаn NаirR., К:LIruр Р. А. 1975. Biochim. Biophys. Acta, 381,
165-174.
Во1ivаrJ., RоdriguеzG.1953.J.CienciaMexica, 12,277.
Во1ivаrJ., RоdriguеzG. 1953.Chem. Abstr., 48,468-474.
Саttеrа11W.А. 1976.J.Biol.Chem., 251,5528-5536.
Chicheportiche К. , Lazdunski М. 1970. Eur. J. Biochem., 14,549.
D'A j е 11 о V. et а!. 1972. Тохiсоп, 10, 399-404 .
.
DinizС.R., Gоnса1vеsJ.М. 1956.In: «Venoms» (Е. Е.Buckley,N.Porges
eds.), AAAS, \V,ashington D. С. 131-139.
Diniz С. R., Gоnса1vеs J. М. 1960. Biochim. Biophys. Acta, 41, 470-47'7.
Е1АsmаrМ. F., IЬrаhim S. А., RаЬi~F. 1972. Toxicon, 10,73-77.
Frеirе-МаiаL., RibеirоR.М., Веrа1dоW.Т. 1970.Toxicon" 8,307-310.
GотеzМ.V., DinizС.В.1966.Мет.Iпst.Butantan,33,899.
Gomez М. V. , Dai М. F. М., Diniz С. R. 1973. J. Neurochem., 20, 1051-1061.
НаhnН.Р. vоп,НоnеggеrС.G. 1974.Experientia, 30,2-7.
IЬrаhimS.А. 1967.Toxicon, 5,59-60.
184

IsmаiIМ.,К:еrtеsz G., ОsmanО.Н.,SidrаМ.S. 1974. ToxicGn, 12,
209-211 .
1smаiIМ.,ElАsmаrМ. F., ОsmаnО.Н. 1975.Toxicon, 13,49-56.
На n d Ь о о k of Experimental P l1armacology, v. 52. Springer-Verlag. 159-212. .
К: а r 1 s s on Е. 1973. Experientia, 29, 1319.
К:аr1s s о n Е. 1979. In: «Snake Venoms» (Ch. Yu Lee ed.).
Корреn116fеrЕ.,SсhmidtН. 1968. Experientia, 24,41.
К:oppenhбfer Е., Schmidt Н. 1968. Pfli.igers Arch ., 303, 133(а), 150(Ь).
К uреу а n С. et al. 1974. Eur. J. Biochem., 47, 483-489.
Lindоn С. D., Rаftеrу М. А. 1976. Biochem. Biophys. Res. Commun., 72,
646-653 .
LissitzkуS. et al. 1956. Compt. Rend. Sc. Paris, 150, 741-743.
МаstеrR.W.Р.,RаоS.S.,
S о m а n Р. D. 1963. Biochim. Biophys. Acta,
71, 422-428 .
МсIпtоshМ.Е.,WаttD.D.1967.Iпstint.Symp.Toxicon, 4,297.
МсIпtоshМ.Е.,WаttD.D. 1970.Toxicon, 8,142.
МсIntоshМ.Е.,WаttD. D. 1972. Iп: «Toxins ofAпima1 and Plant Origin»,
v . 2 (Vгies А. de , К:ochwa Е. eds.). Gcгdon and Breach Sci РuЫ. N. У.
е. а. р. 523-544.
МсIntоshМ.Е.,WаttD. D. 1973. In: «тoxins ofAnima1 andPlantOrigin», _
v. 3 (Vries А. de, Kochwa Е . eds .) . Goгdon. and Breach Sci РuЫ. N. У .
е ·а. р. 529.
М е b.s D . 1973. Experientia, 29, 1328-1334 .
Мirаndа F., LissitzkуS. 1958. Biochim. Biophys. Acta, 30,217-218.
Мirаndа F., Rосhаt Н., Lissitzkу S. 1960. Bull. Soc. Chim. Biol.,
42, 379.
Miranda F., Liss i tzky S. 1961. Nature, 190, 443.
Miranda F ., Rochat Н., Lissitzky S. 1961. Bull. Soc . Cl1im. Biol., 43,
Q45-952.
МiгаndаF., RосhаtН., LissitzkуS. 1962.J. Cl1romatogr., 7, 142.
Miranda F. , Rochat Н. , Lissitzky S. 1964. Toxicon, 2, 51-69, 123 .
Мirапdа F. et al. 1966.Toxicon, 4, 123-144.
MirаndаF. et al.1970.Eur.J .Biochem., 16,514-523.
Мirа ndа F. et al. 1972. Iп: «Toxiпs of Anima1 and P1ant Origin», v. 2,
(Vгies А. de, К:ochwa Е. eds.) . Cordon and Breach Sci. РuЫ. N. У., е. а .
251.
Мо11аmеdА.Н.,Каmе1А.,АуоЬеМ.Н. 1969. Toxicon, 6,293.
N ага с 11 а s h i Т. 1974. Pl1ysio1. Rev., 54, 813-889.
NitzаnМ.,Мi11ег-ВепShаu1D., S hu1dvА. 1963. Isгae1 J. ехр.Med.,
11, 54.
Nitzan М . , Shu1ov А. 1966. Toxicon, 4, 17.
N it z а п М. 1970. Toxicon, 8, 245-246.
ОотеnР.Н.,КuгuрР.А.1964.Ind.J.Ехр.Bio1., 2,78-80.
Osman О. Н. et al. 1972 . Toxicon, 10, 363 - 366.
Pansa М., Natalizi G. , Bettini S. 1973 . Toxicon, 11,283.
RаоS.S., КараdiaZ.S., МаstеrR.W. Р.Ind.J.Ехр.Bio1., 2,75.
R о сhа t С. et а!. 1967. Biochemistгy, 6, 578-585.
Rо с hа t Н. et а!. 1970. Eur. J. Biochem., 17, 262-266.
Rос11а1Н.et а1.1970.FEBSLett., 10,349.
R о с h а t С. et al. (1972. Biochimie, 54, 445-±49.
Rосhаt (Habersetzeг) С., Sаmрiеri F. 1976. Biochemistry, 15, 2254-2261 .
Romey G . et al. 1975. Biochem. Biophys. Res. Commun., 64, 115-121 .
RоsinR. 1969.Toxicon, 7,75.
Russе11F.Е.,А1епdеrS.В.1967.Fed.Pr·oc ., 26,321.
R usse11 F. Е., А1епdег ' С. В., Buess F. W. 1968. Science, 159, 90.
ТагаЬiпi-Cаstе11аniG.1938.Агсh.На!.Med.Sper., 2,969,
'vVatt D. D. 1964. Toxicon , 2, 171-180.
WаttD.D., В а ЬinD., М1еjnеkR. 1974.J.Agr. Food.Chem., 22,43.
Weissmann А. , Shu1ov А. , Shafгir Е. 1958. Experienti a , 14, 175-176.
185

Wеls·l1J., В аttуС.1963.Toxicon, 1,165.
ZlоtkiпЕ.,ShuIоvА. 1969. Toxicon, 7, :031....:..332.
Z1о t kiп Е. et al. 1971. Biocl1imie, 53, ГО73-!078.
.Zlotkin Е . , Miranda F., Lissi"tzky S . 1972 . T oxi con , 10, 207 - 209.
ZlоtkiпЕ.,МiгапdаF., LissitzkуS.1972.Тохiсоп,1О,211.
Z 1о t k iл Е. 1973. Expeгientia, 29, 1453.
Z 1о t kiп Е. et al. 1975. Insect Biochem., 5, 243-250.
М. М. РАХИМОВ, Ш. Р. МАДЬЯ РОВ
'
РОЛЬ ФА3013ЫХ -СОСТОЯНИ,И ФО·СФОЛИПИДО"В
В РЕГУЛИРОВАНИИ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ЭФ'ФЕ·КТОВ
ФОСФОJO1ПА З В И'СКУССТ1В.ЕННЫХ И МEMБPAH'li~IX
СИСТЕМАХ
В последние го1ды воз!рос интере,с к изучению ли·п олитиче­
ских ферментов, особенно фосфолипаз. Это объясн,яет1 :;я · тем, что,
во -1Перв'ых, фосфолипазы, пре,ц~ставляющие большую группу фер­
'\1ентав, учжт1вующих в каталитических превращени,ях фосфоли­
пидов, играют важную роль ,в кантрол,е биосиrнтеза праст-а1гланд1и­
r1ов, во-1вторых, фасфолипазы катал"изируют превра щ ение своих
су6стратов на границе раздела фаз и могут поэтому служить хо ­
ро,mей м.оделъю для изучен:ия за,1юнамернос;rей гетерО1генных фер ­
ментативных процео:ов - на 1иболее широко распространенного,
но наименее изусiенного вид-а .каталитических процеооов в биоло,ги ­
ческих системах. В качест11е третьей причины мож,но наз;вать ro,
что фосфолипазы могут . .изменять овою каталитическую актив­
ность, -а ·иногд·а й специфичность в з·ависимости от ф'изического
состояния субстратной фаз'ы. Это ИМ(:ет важное значение, так как
изменение состояния су>бс11рата (подавляющее кол:ичес11во ,субстра­
тов ф,асфолипаз локализовано в мембранах) может актиВ1но ре­
гулиро·вать каталитичесжую ак11ивность мемrбра:нных ферментов.
Кроме того, фосфолипазы са.ми а•ктивно ,воздействуют на биоло­
гичеокие мембраны :и могут попользоваться 1в качес11ве своеобраз­
ных <~инструм,ентов» для выяrснения iВЗаи:м -освязи «1стр укту,ра -,-
фу1жция» при и•сслед,овании фунхций мемiбраrн, мембраюшrх фос-
фолипидзави,оимых фе~рментов и полифермент;ных систе~1. •
• Большой -интерес пред~:::тавляет также вьшснение роли эндоген­
ных фосфолилаз в регуля1ции мембранной целостности. Наконец,
еще один аспе,кт в ттзучении фосфолипаз - это их спос,сjбностъ
катализ•ир-овать пр.ацес,сы трансацилиравания и тра,нсалкилирова­
ния. Детальное исследование этой функции фосфолипаз позволит
раз,рабо-гать ферментати~в,ный синтез фосфолишидов, в том чи,с.ТJе
и не 1в1стречающихоя в реальных биологи1ческих системах. Это осо­
бенно актуа л ьно в связи с тем, что их химический синтез мrног,о­
стадийный и доволь:но трудоемок.
186

XAl-'Al:\I 1:.1 -' ИL 111 К.А (l)ULФUJI 11 IIA.j
Фосфолипазы кат, ализируют гидрол из водон ера:: т в,о1рИ1мых
субстратю в - фосфолипид ов и 1предста1вля ют ,собой 01собую группу
в многоо бразии липол,итических ферментов , разл,ичающих,ся физи -
1<0 - х ruми ческим,и с,во йствам,и и ,специфичноrстью. В за·ви:сим ,01сти от
то го , кака я из с л ожноэфирны х связей ,суiбl: трата подJвер г ается
г идролизу, сjюсфолипазы разделяют на 4 т ипа - А, В, С и Д
-
(Van
Deenen et а!., 1966; Lo,venstein, 1969; Haпahan, 1971 ) . Ниже схе­
·111 ати че оки показано, J{'а,к им образом раз Jr-ичаютсtЯ ф осф олилазы
:з реакции гидролиза лещитина и лизолецитина.
П ЕЦИ'FИН
Гидролиз сложноэфир,ной авязи 'В а - и -(или) в ,~-положении
.в мюлекулах фосфолипидов катализИ,рует,ся фосфолилазой А ,(фос­
ф атидилхолин-ацилгидролаза КФ 3 .1 . -
1.4). -В ,ре зул ьтате реакции
от ' м·олекулы фоофолипид•а отщепля,е'!1ся жирна1я •к,ислот а и об]Уа­
зу ются соотве11:твующие лизофО1сфолилиды (Kat-es, 1960) . Ф<J.сфо­
ли,п аза А в,стречает,ся преимущественно в · объект -а х ж,и,вотнО1го про­
нсхожденпя (Scher phof, Van Dеепеп, 1965; Gallai -Hatchard, Tomp-
son, 1965; Natter, Privet, 1966; De Haas et ·а!., 1968) и ·м,ик,роорга­
низмах (Ono, Nojima, 1969 а, Ь) . Различают 2 раз-нов щдн ос1' ифос ­
фолипазы А •В за1вис,имос1'и от положения отщепляемых аци'льных
остатко,в ,в фо ;:1ф оJ11ипидах : фю офолИJnаза А 1 про,я1вляет ,апеiцифич ­
нос ть к ги дролиз у сложноэфирной связ и :в а~положен1ии (Fting,
Ргон!х; 1969; Scandel \a , КогпЬегg , 1971; Rayblп et a l,, 1972; Van
Den Bosch et al ., 1974), а фосфолипаза А2 опещифи11-1еским обра­
зо м отщепляет жирно.кисло 11ный ос1'аток в ~-пол,ожен ии (We!l s,
Hanahan, 1969; Wu, Tinker, 1969; Wa it·e, Sisson , 197 1). Фо,~фоли ­
паза А2 обладает более высокой оп,ец1ифичностыо по от~-юшеН!fю
к р асщ еп л яе мой связи в фосфоглнцер идах, чем фосфолипаза
А 1 . Некоторые из ,преюарат о1В фоюфолипазы А 1 я1вляют1ся более а:к­
тивными ло отношению к l - лизофосфо,глиц ерида1м, чем по отноше­
нию к диацильным оо-единениям, и п оэт,ому мо,гу1' та ,кже назы­
ва тЬ1ся .лиз-оф оофолип,аз1ам·и (Van Den Вosch, 1974) .
Наим еньшей специфичностью к положению ли )\ролиз уемой
ац илыной ,связи обладае1' фосфолишаза -В (КФ 3.1 .1 .5) , которая
полностью деацилирует диацилфосфоглицериды и мон.оацилфос ­
фоглицери:Д ы (Hayaishi, Cornberg, 1954; -Вanham, Da\v son, 1959;
187

Beare, Kates, 1967). Фосфолипаза В , также как и фосфолипаза А,
распространена в жи,вотном ~,и~ре и микроорганизмах . В литера­
туре в,ст,речаютоя ,и другие названия этих ферментов (лизолеци­
тиназа, лизофо,офолипаза, фо,офатидг.идролаза и т . д.), чт-о иногда
iВЫЗывает оп,р,еделенные трудности при интерпретации результат,ов
и отнесении о,пределенной фосфолипазы к тому или другому виду
(Brockerhoff, Jensen, 1974). Различия между фосфо.липазой В и
лизофосфоли·пазам,и описаны в о,бз,оре Van Den Bosch (1974) .
Фоофолипаза С (Pastan et а!., 1968; Lo,\Тe nstein, 1969; Юeiman ,
Lands, 1969; Doy, No_iima, 1971; Gatt, Barenholz, 1973) (фосфати­
дилхол~ин-фосфохолинтидролаза КФ 3.1 .3 .4) и фо,ссЬоли-паза D
(Hanahan, Chaikoff, 1947; Kates, 1954; Da\Тidson, Long, 1958; Ka-
tes, 1960; Lowenstein, 1969) ( фосфатидилхолин - холи нгидролаза
КФ 3.1 .4.4) •спос,обны осуществлять гид·ролиз как фо::фолипидо,в.
так и л1изофосфолипидов и различаются между собой тем, что
пе~р1в,ая ГИlдрол'изует ,связь ,между глицеридной частью и остатко"v!
фо::фо~рилирова;нного основания (на1пDиме,р, фоюфюхолина в моле­
куле лецитина), а втора1я образует фо:фа11идиловую кислоту, от ­
щепляя от молек,улы фосфолипида соотве11ствующий спирт,овый
остаток (.на1п1ример, холи1н от леци11ина) . Иоследо1ванные до rих
пор п,репараты фо,сфолипазы С выделены из мнкр,оорганизмов. Од­
нако не,льз,я считать, что .011::v тс11вие фермента в ра ,стен ия х и ор­
ганах животных докаэано . По - в1идимому, недостаток эксперимен­
тальны х данных не позволяет сделать этот ,вывод. Фосфолипаза D
до ,недав.него вр,емени также считалась ферментО1м, ттри,::ущи~1
только растительным .объектам , однако появились соо.бщения о
при~су'!'ствии этого фермента в некоторых микроор1ганизмах и клет­
ках животных (Ono, Wh it e, 1970; Sousek et а! . , 1971; Saito, Kan-
fer, 1973; Wykle et а!., 1974, 1980).
Овойства фо,сфолипаз А, В и С и их функциона льная харак­
теристи ка оттиоаны в мноточиrсленных обзорах. В то же время ис­
следования по фосфолипазе Д .нещоста:то-ч1но освещены в литера­
туре. В шоследнее ,В1р 1емя лоя,вились новые ,сведения, в значитель­
ной степен·и иЗ1менившие наши представления об этом ферменте ,
по1этому необх,од-и.мю 060:бще;ние достижений в области изучения
фосфолилазы D.
Ферментатив.ный ·гидролиз лецитина с образ,овани,ем фосфати­
дило1вой кислоты и азоти1:того основания впервые обнаружен в
1947 г. Hanahan, Chaikoff (1947 а, Ь). Они показали, что водные
ЭrК!стракты •корнеплода мор·кови и ли·стьев капу1сты ,спосо,бны ус­
к.арять гид1р,олиз фосфолипидов. Поэднее эти результаты были
подтверждены ра·бютам·и Dttcet ( 1949), Rose ( 1950), Acker et а 1.
( 1952) и Smith ( 1954). Авторы определи ли, что фосфоли-паз,а это­
го ти,па широко расп,ространена в ра,стениях. Бо лее си,стематиче­
ские и.сслЕ\дования проводили,сь начи.ная с 1954 г., когда Kates
опубликовал да1нные о вну11р·иклет,очной локализации леuи-гиназы
(фосфол~ипаза D) некоторых растений. Он у,становил, ч то фермент,
гидролизующий лецитин в ра ,сти тельных эк•страктах, те,сно св'язан
188

с лла,стидными фра.~щиЯJми и полностью 011сут,ствует в цитоmлаз­
матичеок,их фракциях. Несколыко ,позЖJе Tookey, Balls (1956) сооб­
щили ,о получ:ен·ии вощорастворим,ой фосфолипазы Д из обезжи-
р.енной муки семян хлошчатни·ка.
•
При,с,ут1ствие ра,ст,воримой фор.мы фоюфюлипазы f) в ли,стьях
капусты и ор,ла, нах 1ря,да дру,гих ра,стений определили Davidsoп,
Long ( 1958). С,реди исследо,ванных им:и объектов наиболее высо­
кое содержание фо,сф,олипазы обнаружено в ли,стьях сав.ойокой
и побегах брюсселыокой капу,сты. В этих растениях наряду ,с водо­
раствО'римой фо,рмо,й при,су'I'ствовала и ча ·стичная фо•рма фермен­
та, описа нная Kates ( 1954).
Einset, Clark ( 1958) ,выделили растворимый фермент из мор­
ко~и.
Heller et а 1. ( 1968) установили высокую активность фосфоли­
пазы D в семенах арах,иса ,и изучили ди,намику превращения од­
ной формы ( св,яз,анной с .м'ИтохондJриями) ,в дру,гую (ра,створимую
фосфолицазу D). Более детальное ис·следование этих взаимопрев­
ращений прове~цено Talwalkar et al. (1969) при изучении фосфо­
ли·п а зь1 D из ,сем,ян кофе. По дан:ным этих автор~ов, фосфолипаза
D локализо~ва.на !В ча,стичной фр,а11щии, осаждаемой при 18000 об/
мин. Некоторое количество овязанrног.о ,с ча,стицами фермента (до
50% ,по активности) м-ожет быть оолюбилизир,овано эюст,ра·кцией
rюдным буферо.м при рН 7,2 .после обработки семян ацетоном или
обработкой у1Jiьт·раз·вуком водной ди:шерсии час11иц, ,соде1ржащих
.фосфолипазу D. В этих же условиях возможна солюбиJiизация
фо,сфолипазы fJ в э1юст1ра1кте из моркови. Авторы пришли к выво­
ду, что растворима,я фосфолипаза D предстаrвляет собой ,солюби­
лиз·и·р-01Ванную фо,рму фермента из хлорапла,ст,ов.
Quarles, Davvson ( 1969), изуч,а.я ,распределение этого фермен­
та в разлиЧ1ных ор1ганах ра,с11ений, сделали вывод, что фосфоли­
паза D я,вляет,оя всщора•створимым фер.м,ентом. Растворима,я фо·р­
ма фо,сфоли1ызы D выделена и из семя.н хлопчатника (Мадьяров,
1976, 1977). Показ,ано 011сут,ствие фермента во фракциях мито ­
хондрий , хлоропластов и микросом (Рахимова и др., 1976, 1970).
Гом о,генная ра~ство,римая фосфолипаза D из савойской капусты
получена Allgyer, vVells ( 1979). В последнее время появились ра­
боты ( Rouqhan, Slack., 1976; Р .ах,имо1в, Мадья-ров, 1977), авторы
которых склонны считать водорастворимую фосфолипазу D арте ­
фактом ( обсуждение этого .волро,са ом. ниже).
Сущесrгвование 2 форм ферм,ента - раств,оримой и св,яза.нной
с клет,очными ча,стица~ми - устано~влено также для фосфолипа­
зы D низших ,ра-стений и микроорганизмов. Т,ак, фосфолшпаза D
к1ра1сн ы х в.одо•рослей прочно связана с мемб.ра1на1ми клетки и не
может быть солюбилиз·ир'ована д,аже обра,60111юй ультраз1вуком
(Ant ia et а!., 1970). Фосфолипаза D в мик,роор;гализмах Haemophi-
lus p a r ainfluenzae (;Опо, Wl1ite, 1970), Physarum policephalum (Со­
шеs , Юeinig, 1973) и Esheгishia coli (Cole et al., 1974) локализо­
вана в ча-стицах, а фосфолипаза D Corynebacterium Ovis (Sousek
189

et а ,!., 1971), Streptomices t1a cl1io11sis (Oka,1/a , Y-amagllchi , 1975)
и. S.treptom ices chromofllSCLlS (Imamura, Horiuti, 1979) в ы1делена
в рз,ст,во,ри.мой форме (табл. 1).
.
При•сут,ств ие фосфо л ипазы D в 1ж а,нях животно ,го nро и,схож­
дения. обн.аруже но относительно ,нед,авно. Taki, N\. a tsumot o (1 973) •
обн.аружили э1ют фер м е нт ,в микросш•rах пече ни, а Saito, Kaпfe t·
(1973) - в микроrс омах клеток :vrозга . В первой раб,оте не был о
уrстанов..:тено, я,вл·яется ли ф осфоли·паза D печени растворимым ИJ1И
•+а•стичным фермент-о:vr, так как вывод о существова,ни и фо·сф о лн ­
пазы D был сделан на ,осно,ванrии ис,сл едования :1,1 ече нны х in vi ,:o
фо,сфо.:тип ид,ов. В ис следо вания х Saito e t al. (1973 , 1975 а, Ь) по­
каза.но, что для солюбилиза•ци•и сtю:::фолипазы D из ,,1е:vrбр ан необ ­
х,одима обр або тка детер1Iiе нта У1и и что связь ф ер:11ент,а с фо сфо­
ли1пида:1ш :v1 ем,б ран явля ется про ч;ной (Saito et al., !975 Ь ) . 1:3 м ик­
росомах м,оз1га т акж е обна,ружена л изофО1сф ол ипа за D, овя.занная
с лишr,дной фра•кцией (Wykle , Schraemmer, 1974). В,полн е вер оят­
но, что этот фермент также является фосфо лип аз о й D, та к как
известно, что фосфолилаз а D обладае т значитель.ной лиз оф,о сф о ­
лилазшой аrк ти,вн,остью (Long et al., 1967 а, Ь). Таким образо:vr ,
мш~шо счи 11ать установл .е нны м, что ф осфолипаз а D широrко ра,с­
простра нена не только в расти1ельно м мI1р е, но и в микроорганиз­
мах и. объек тах жи,вотн о,r,о П'рО'Иiсх,ождения. В та•бл. 1 су!lвш·рова­
ны дан1н ые о наиболее изученных фосфо л и-пазах D.
Очище.нные -суб,страты гидролизуютоя фо•сфолипазой D с не зна .­
чительн,ой , с,ко·ростыо, сравнимой со скоростью нефе,р:11ен тати,в.tюго
nидролиза фосфолипидов. Как видно из данных "Габл . 1, поч т и все
изученные фосфолиrпазы D, за исключени,е-м фермента из - Coryne-
ba cteriшn o vis, требу10т для проявления - каталитической- активностн
о,пределенных активатор ,о в, ке>торы'l!и :vrогут служить ,ор ,ган иче-с 1<и е
растворители; детергенты, си ,JНшагель, ионы металлов.
Диsт,иловый эфи,р - один- из наиболее широко исполь зуем ых
а ,<т.ива1'0,ров фер,иен:га. Фоrсфоли·паза D из мозга крысы являет,ся:
единст,венным фермент-ом, тюторый и1нгибирует,ся диэтило,вым эфи 0
ром (.Saito et a l., 1975 , Ь ),. Остальные известные до CJIX по·р препа­
ра·н~r , фосфолилазы D i незав'исимо от источника выделения, м оле­
кул я•р ного веса и , дру~ги сХ параметров аirпивируются в - водны х ра-с:т­
ворах. в при .:у т,ствии . дпв:гил овоrr-о эф,ира ·. Способность эфир а ини­
циировать реакцню гидролиза • лецитина в системах, содержащих
фо,сфолипазу D, у.ста,но,влен . а blanahan ( 1952) ·.
Kates ( 1.95:3 ; 1954) подробно изу ч ил активацию д,иэт4fловьР,1:
эфrи,ром . фо сфолипазы D, св,язанной с хлоро,плао'ами ·, и по,казал ,
чrо _ существует. ол:гимальное соотношение водной · и ор,ганической
фаз-, П'ри ,ютором . скор ·о : ть гидролиза субстрата маюсю,1а л ьна . D·a -
vidsoп, 4опg, (1958-), а также Eiпset, Clarli (1 '958), по·ка-зали, что
ана.1юги.чная зави,симо,сть наблюдаекя , и д.rуя в,одораст1во;р~имой
ф,о,сфолипа з ы D. Значительно по.зже Heller et а!. (1968) П'Ред,ста­
вили да,нные, что - метанол и ацетон также могут быть акт:и вато­
рами фосфолипазы . D · арах,иса.
190

с.о
,.,,
, Ц_е,которые свойства фосфолипазы U из Р,аз:11ичных источников
Ис·Jочш-1к фосфолш : азы D
Растею1я
,Морковь (кор11ешiод)
Капуста (листья)
Шпинат (листья)
Форма ферм е нта
Растворимая
Связанн.,ая с
п л астидами
Растворимая
СRнэанная с
пластидами
Раствор11мая
СJJязанная с
п л ~стид_а_ми
Сахарная свекла (лнстья) '1 Р;с.творимая
Хлопчатник (семена)
, С ,вяз_анн.аJ! с
пластида, м11
Раст13ор1н1аJJ
Снецнф::ч.
субстрат
Лецитин,
?Золектин
Лецитщ1
1
Онтимум
pf-I
5,5
5,8
5,6
5,5
4,7
4,7
5,6-6,0
5,6-7,4
Актноаторы
ф:-рм..-нта
Эфир, са+2
Э фир
са+2 ' эфир,
ДДС-i\'а
Фосфатид11л­
ин -:>з ит , эфпр
са+ 2 , эфир,
д ГlС-Nа
Эф:tр
са+2 , эфир,
Л дС-Nа
Эфир
NaCI
Органи чес!( и е
раст_ворители,
дете рге нты,
силикагели
Таблица 1
Л "г е ратур1-1ыl1 :1сточн:11..:
Einset, Cla!"k, 1958; Tal-
\valkar et al,, 1969
Каtes, 954; Kates, 1955;
T,:lwalkaг et г l., 1969
Davidsoп, Lo11g, 19 58 ; Daw -
son, Hc111ingto11, 1967; Qt1ai--
les, Dav✓Son, 1969 (~):
К:ates, 1904, 19-1 5; Weis
et а 1., 19:,9
Quarl es, Dawson, ! 969 (а) ;
Kates, 1 9А ; Kates, 1955
Qt1ar le s, OJ\vsoп, 1969 (а);
K ate s, 195 4; Kates, 1955;
Tool(ey, Balls, 1956
Рахимов и др. , 1970; Ра -
химо·.: и др., 1976а , Рахимов
и др, 1977а; Рахi1мов и др.,
19766; Ра химов и др ,, 1976в;
Рахимов и др., 1976г , Ра­
химоР. И др. l9 7f,Ц.

-
"°
!-:)
Источн и" фосфот1па зы D
Кофе (семена)
Арахис (семена)
Красн ые водоросли
porphyl'idium creintum
Микроорганизмы
Haemophilus par a iп ­
fluenzae
Coryne bact e ri u m ovis
Pl1ysaru m polycephal uш,
Мсз V
Esher icl1 ia col i, В,
(АТСС 11 303)
Streptomyces l1acl1 ij ons is
Streptoшyces chromo-
fuscus
Форма фермента
Растворимая
Связа нн ая с
ми тохондриями
Связанная с
митохондриями
и микросомами
РаствQримая
Нерастворимая
Специф 1-1 ч.
субстрат
Фосфатиды
кофе
Лецитин
Нерастворимая I Кардиоли­
пин
Раст во римая \ Лизолеци-
тин, сфин­
rомиелин
Нерастворимая\ Эндогенные
фосфолипиды
Гомогенат
Растворимая
Растворимая
Кардиоли­
пин
Фосфати­
дилэтаноламwн
Сфин го ­
миелин, ле­
цитин, лизо­
лецитин
1
Опп1мумp!i
5,8
5,8
5,7
5,7
7,0
7,8
8,0
7,3
7,5
8.0
А~..:т;:вато ры
фермента
са+2 ' эфир
Са +2 , эфир,
ацетон, детер­
генты
са+ 2
мg+ 2 , тритон
Х-100
Без активато-
ров
Эф ир, дllC-Na
Mg+2 , АТФ
Са+2, мп+2.
Са +2 , тритон
Х-100
са+2 , мg+2
эфир, тритон
Х-100 и др.
Пр одолже ние таблицы
ЛитЕратурный ИСТОЧНИI(
Ta lwa lkar et а!., 1969
Talwalkar et а!. 1969
l·'eller et а!, 1968
Heller et a l, 1975
Aпtia et al., 1970
О па , Wl1ite, 1970;
V
Sot1cek et а!., 1971
Co111es, Кleiпig, 1973
Cole e-t а!., 1974
Okawa, Yamaguct1 i, 1975
Jmaшur a, J-loriuti, 1979

:а
:::(
:,:
~
\О
"'
....
<1)
:,;:
:,:
<1)
"~
о
"'1:
о
о..
t:
13-156
""
+
"'
u
QJ
.r:
""
+
"'
u
N
t-
:,-
а.,
r::;
~
с.о
t-
Ci)
"'
!.Q
/.()
"'
о
"'
~1
:,с:
<1)
"'о
~
::т
Недавf-!о были опубликованъJ раба~
ты (Рахимов и др., 1976 а, 1977 а;
Мадьяров, Р;:~химов, 1977), в которых
пре д ставлены резул ь таты изучения по­
веде н ия фосфолипазы D хлопчатника
n присутствии органически х раствори­
телей ра з л и чной природы: угл еводоро­
дов, простыл и сложных эфиров, аро­
матичесюJх соединений и др. Установ­
ле но, 1;то с1ктивирование фосфолипазы
D практически не происходило при ис-
1юльзовг.нии растворителей, смешиваю­
щ их ся с в одой (ацетон , метанол, диок­
са н). Повышенные концентрации этих
соединений ингибировали реакци ю. В
то же время большинство соедттнений,
не с м ешивающихся с водой (гексан,
бе нз ол, циклогексан, толуол, октанол,
х л орбе/{з.ол, юrтробензол, метилоле­
ат, этилац,етаrг и др.), приводили к
активированию реакции, скорость ко­
торой иногда значительно превышала
скорость реакции, достигаемой с ди­
этиловым эфиром в качестве а .ктива­
тора.
ГазJ 1 ичные детергенты также
о ка :; ; ;;ныот актiiвирующее влиян 11 е на
фосфо.1ипа зу D. Показано, что в боль­
ш:-ш стве С.:J\' 1 1аев по в ышение активно ­
сп1 свя :з а-нь с :щспергированием суб­
ст рат .1 1, уве л ичение r1J вследст-в и е это­
го rюзс1нности субстратной фазы, не­
обходимой д ля адсорбции фермента
(Da\vson, Hemington, 1967; Ра химов
ia д р., 1970) . Из у чено влияние доде­
ц илсульфата натрия, солей д езо ксихо­
.' !евой и таурохолевой кислот, фосфа­
тидиJювой, моноцетил- и дицетилфос­
фоr н ой кислот, фосфатидилэтан олами­
н а, фосфатидили нозита, кардиолипи­
нэ, санонина, тритона Х - 100, бро м ис­
того це1илтр и метилам м ония, стеарил­
амина и пальмитоилхолина на ак тив­
t-юс1, фосфолипазы D (Da\vson, He-
mington, 1967; Cl1 en, Barton,
1971) .
Ср еди перечисленны х соединен ий, до­
децилсульфат натрия (ДДС) является
не только наиболее эффектuвным ак-
193

тиватором, но и имеет некоторые отличительные особенности, обус­
лов'и,вшие повышенный интереrс к этому активатаrру.
Уже в ранних работах Kates (1954) показал, что ДДС, подобно
д1иэти ло,в о:му эфиру, опособен актИiВИ'ровать фо:::фолипазу D. П о
его данным, ДДС менее эффективен, чем д,иэтиловый эфир, в оп ы­
тах с частичной формой фосфолипазы D из капусты. Поз днее , i,ри
изу чении в,одо,растворимой фо:офол,ипазы D из т о-го же объекта
Dawson, I--Ieгnington (1967) наШ JlИ, что ДДС значит ел ьно прево,с­
х,од,ит по акти,вирующему дей,ствию диэтиловый эфир и является
самым эффект 1шным активатором среди и tследов аннч1х ими сое­
динений. J\ктпвнос ть фер:vrент,ов 'В п,рисутст.вии ДДС -превышала
более чe:vi в 2 рг за активно:::ть фер:v~ента с дизти ,.1овы~-1 эфшро:vr;
наибольшая активность достигалась при молярном соотношении
суб:::трат: а1<тиватО'Р 2: 1. В эти,х условиях скорость реакщш оста ­
валась по стоянно й до лидролиза приблизительно 20 % взятого в
реакцию субст,р ата.
Близки:е данные получены лри изучении .влня,ния ДДС на фос­
фолипазу D хлопчатника (Рэхимо& и др . , 1976 а, в). Активация
ДДС, по-Вlидимому, не -с,вязана с диопер,гир,01вание:м су,б,:::трата.
Та 1к, при измерении :мутности лецити,нов-ой суопензии при _.различ­
ных кон·цен11ра,циях ДДС определено, что колцентра,ци,я детертен­
та, необход1имая д•ля актив·ации реакции , недо,статочна для диспер­
ги,рования -субстра та (Dawson, Hemington, 1967). С другой сто­
роны, тритон Х-100 и цетилтри:метиламмоний бромид (ЦТМАБ),
способные диспер ,гир-овать лЕщи11ин, не могут быть а 1ктиватора·:vrи
фооф,оюшазы D из семян Х\Лопчат,ника (Рах,и:мов и др., 1976). Для
фосфолипазы D из Streptomices Cl1romofuscus (Imaшura, Horiuti,
1979) о-б~наруже,на сложная зави:оимость активности фе.рмента от
концентра,ц1ии тритона X1I00 и дезоксих,олата натр 'ИIЯ. При низ,ких
концентрациях эт,и детергенты были ин,ги~биторами, а при более
высоких - активаторами :микробной фо·сфолипазы, ДДС в кон­
центра-ци1и 4 м.М полностью блокиронал фе~р:мент.
Акти,ви,рующее действие на фосфолипазу D оказывают та,кже
фоофат,идило1ва-я и м,оноцетилфо,сфар ,ная кислота, причем акт,и­
,вирующая с~посо:бность фосфати 1диловой кислоты и ДДС идентмч­
ны. Дру;гие дет-ер1генты, такие ка~к ди,цетилфо1сфорна1я кислота,
фо·сфатидиж:ерин, карди-олипин, сапонин, дезо,к·си,холат натрия,
таурохолат натр ,и1я, фосфатищилэта,н,оламин, фосфатидилинозитол,
н-е активировали реакцию (Da\vsoп, Hemington, 1967). В м,ссле­
довании Weis et а!. (1959) однозначно показано, что фосфатидил­
инозитол является эффективным активатором фосфолипазы D.
Подо-бные пр,отиворечия вс11реч,ают,оя в ллтер ,атуре и .при ис­
следовании акт,ив,ирующего действшя катионных дете,р,генто,в . Т,ак,
сообщало1сь, что гидролиз лецитина ин,гиби.ру,етсrя в пр~ису-гс1шии
бромисто,г,о цетилтримет,ила:м:мони,я, стеар 1ила:ми,на или пальмит,о­
илхолина п,ри концентрации этих детергентов до 1 мМ (Dawson ,
Hemingtoп, 1967). Противоположные результаты получены пр~и
изучении фосфол,ипазы D а1рахиса и хлопчат-ника. В пе,р,вом случае
194

( Heller et al.,
1968) бромистый цетилтриметиламмоний (цета·в­
л он) вмест,о интибИ!ранания !П1роЯ1вля.л акпnв,ир1ующее деи,с-гвие
а налопrчно ДДС. Во втором случае (Рах:ттмов и др . , 1976) обна­
р ужено лишь ,незначительно е- активи.рующее дейст,вие цетавлона .
Фосфолилаз,а D нуж:дае11оя при фун1кционировании . в ионах
к а л ьощия. Этот во:пр ,о,с неоднок·ратно обсуждался в лит ератур е и
п о.ка нет единаrо мнеН1ия о м•еханиз·ме дiей1ст·вия Са 2 + и д,ругих ио ­
нов мета л.Jюв .на каталитическую а,ктиБность ферме,нта.
О СОБЕННОСТИ П Р ОТЕКАНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
Р ЕАКЦИЙ НА ГРАН И ЦЕ РАЗДЕЛА ФАЗ
Подавляющ е е большин·ство клеточных ферм .ентов или поли­
ф ерментных систем локал1изовано в мем:б,ранах. С д1ру,г.ой стороны ,
м нО1гие химические соединения, которые должны rюдв ер ,гать~ся
действию ферменто:в, не я,вл.яютоя водQра,створюvrыми и обrразуют
отдель,ную фазу в водном растворе. Таким образ,ом, больша я
часть ·огром.1ю1го числа фер1м ентати:вных реакций протекает Б клет ­
к е на границе раздела фаз. Оитуация, .с.ложившая1ся в экзимол о ­
ги ·и в н. астоящее время, такова, что мы ра·спола1гаем отно •сительно
п о л ными сведениями для случая, когда фермент и вещество, под-­
вер ,гающеес,я превращению, я,вляют,ся водорастворимыми. Создан
богатый ар ,се~нал ,методо,в и разлиrч1ных подхо,дош для юоли ,че1с твен­
наго ,описа,ния ·катал1иза в таких гомо,ген,ных ферм.ентати:вных си с ­
темах. ЭтО1го, однако, нельз,я оказать отн,01сительно фермент,атив­
ных реа,к,ци.й, протекающих на границе р,аздела фаз. Такие реак­
ци,и можн,о разбить на 2 большие г,руппы: к лер ,в-ой относятся
ферментативные процессы, в которых у,ча1ствуют водораствор~имые
ферменты и нер,а,ст,воримые ,субстраты в ,вид,е гидрофобных ~капель ,
мицелл, пленок , везикул или различных структурированных клеточ­
ных образований, ко второй - процеосы, в которых фе,р,м е нты
представляют собой нераст:в,о·римую фазу, оНrи л1и,бо в1строе.н ы
в мем~браны, либо на,х,од!ятся в ,связанном ,с различными клеточ­
ными компоне.нт,ами сост,оянии, а их субстраты представляют со­
бой водо1раство,р,имые молекулы или ко1мпшж-сы.
Имее·юя целый ряд иосле.цований, в кот,орых ферменты связа­
ны с неводной фазой, но они иску,оственно солю61илизир ,ованы и
механиз·м их действи,я изучен в гомогенных услови ,ях . Т1ак·ие феrр­
менты с лол.ным оонов.анием можно ,ра:ссмат,ривать как артефак­
ты. Общим для обоих переч:и,сленных выше случаев я,вляе'l!ся то .
что для пр ,отекани,я фер1ментатив.ных реакций необходима л,ока­
лизация обоих компонентов (фермента и субстрата) на границе
раздела фаз. Следователъно, одной из основных задач пр.и ис,сле­
дова1нии мех,а.низ1ма гетерО1генного ферментати1вн,о,го каталшза яв­
ляе'l!;:JЯ изучение с п ецифической локализации ферм,енто,в 1или суб ­
с11р ,атов на межфазных поверхност,ях и её влия,н.ие на протекан,ие
последующих стаJ}.ИЙ энз1иматичес,ких реа,]{IЦИЙ.
195,

Хоро,шей моделью для изучения п~роц,ессов, Ьтне-сенных '!1'ам-и
к первой лру1ппе, я,вляется ферментативный липолиз, осущест,вляе­
мый ли1паз-ами -и фосфолипаза,ми. В этом случае JЧеобх-одим:а n;ред ­
вар~ителына-я адсор,бци,я водораствор,имого фермента на поверх­
-но:·ти ,су~бпратной фазы. Фосфолипаза D, а,налогично другим ли­
по:питичес~ким ферментам, осуще:твляе'Г гидр,олиз сложноэфи,рной
связи в гетер,огенных условиях . Возможно, в данноl\11 случа·е фо,с ­
фол,иnид .выступает не только !В рол1и субстрата ферментативной
реанщии, но и создает а,ктивную конформ,ацию фермента и необ­
ходимого гидрофобно,го окружения, ,как это происходит в случае
некот ор ых других ферментов, когда фо сфолипиды не я·вляЮ'I'СЯ
их субст.ратами: цитохромок1сидаза и дру,гие дыхательные фермен ­
ты, Na+-, К:+-,
Са+2 -А ТФазы (Fourcans, Jain, 1974; Рэкер, 1979),
липаза печени (Okuda et а! . , 1969), триацетиназа семян хлопчат­
ника (.Землянская, 1979). Неrсм:,отря на то, что такая веро.ят,ность
существует, л.илол,итич,е,ские ферменты, в том числе и ф,осфолипаза
D, вп .iют ь до настоящего времени не иопо.льзовал·и,сь в качестве
лrрос1' ых моделей ка,k для такого и,сследо1ван,ия . та,к и для выяс­
:нени .я общих прiнЩйлов гетерогенног-о ферментативног-о катализа.
Некоторые попы1жи ,в этом напра,влении предприня т ы л,ишь не ­
д а!3но CQuar les, Da,\1son, 1969 Ь; 'Рахимов_ и др., 1972; Ve1ger -et а ! .,
1·97.З; Wells, 1974; Ра·х.и,мов, Мадьяро,в, 1977) .
С kиfiетической тЬчк,и з,рения катализ с нерастворимыми су-6::т ­
,р атами должен протекать с менышей скоростью, поск-ольку суб­
tтраtньlе мЬле-кулы о-бъедrинены в а,г.реrаты, предстшвляющие со-бой
малоподвижньlе липидные о!бразования, и -процесс может лимити - •
ровать,с·я ·tюдвижно,ttью таiюг-о агрегата. :Вслед!сТrв и е этого л~шоли­
т,И:1tJес.к.ие ферменты должны обладrать значительно меньшей .гидро­
.tiиt1ическ-ой актив;нос·тью по сравнению ,с д,рутими эсте~разами .
Им·еется ·,боль,I.iюе число исследований, в которых показано, · что
:уве.irичения око·рос·ти липолиза мож1-ю достичь, создавая условия
для лучшей ад,сор-бции водораствор ,и,м-ог-о фермента на поверх ­
·:н:ос·ти ,субс'т.ратной фазы. Обычно для этого используют дисперги ­
рование, ми1целирование, эмуль•гирование, меха-нические ,1юздейст ­
вия и т. д. (Desnuelle, 1972). Экспериментальные фа~кты, о,дrнако,
. овидетельствуют, что липолиз может протекать .в ряде случаев с
д-остат-Ьчно высокой скоростью и 1иног.да даже с ,гораздо большей,
чем гидJрол:из сложно0ф:и1рной ;свя·зи в гомогенно·м ра,ст.во·ре '(Bro -
cke·гlюff, 1969). Следовательно, имеются какие -то особенности та-
ких реакций, повышающие эффективность катализа.
.
При рассмот,рении меХJа·низма липолиза можно предлол,ожить
:2 -вариа,нта. Пер,вый заключается в том, что липол,из протекает
как обычна,я ферментат.и1вная реакция в водном растворе при дей­
ствии фермента на те молекулы субстрата, которые переходят из
.липидн,ои фазы ,в вод~ную ,в ,соответств,ии ,с ра~с'Гворимостью ~субст­
рата. Второй предусмат,ривает щшо,средственную адсорбцию фер ­
м~ю' а на поверхности су6ст,ратн,ой фазы, :когда тидрол,из может
осуществляться соглаоно· пока неиз,вестному механизму, который
,1 96

м.nжет аыть обшим n,ля в.сех лицолитиче.оких ферментов, либо спе­
ц~,фiчы~rм ДЛЯ определенной липаз!;,! :И фосфо.л.илазы ИЛИ IГ•руппы
лип.аз и фосфолипаз. Bi;ockerhoff ( 1969, 1973,) и другие исследова­
тели (Р2.химов и др., 1972; Verg~г et al., 1973; Wells, 1974) пред­
ста ,вили убед,ителы-1ые доказатедь,с11в,а в пользу вт,о.рого .ва1рианта.
В ,настоящее времн предложено нес1<'олько моделей для о.бъя,с ­
нения кинетических закономерно,стей · ферментати,вного лш10лиза
(Bгockerhoff, 1973, 1974; Verger et а!., 1973; Wells, 1974; Slotboom
et а!., 1978). Вепzопапа, Degnuelle ( 1965) впервые показали, что
необычные зависимости активности от концентра,ци,и субст·рата,
подучающиесrя ,в экспе~риме.нтах с липол,итическими ферментами,
могут все же быть линеа,рлзи,рова,ны, если в качестве меры «~кон­
центрации» ,субст•рата выбрать тюверхность субстратной фазы,
доступной для ад'сорбци,и фермента. Используя эмульсии субст­
ратов, образуемые желчными солями в присутст,вии хлористог•о
натрия, они устано1вили, ЧТ>о активность ~пропорциональна о-бщему
объему эмульсии, а площадь .межфазной по,верх,ности может иг ­
рать роль ко,н:центрации субст,р а 11а. Замена объемной концент,ра­
ции субстрата площадью межфазной поверхно,сти, хотя в нехо­
торых случаях ,и оп,равдывает се,бя (Ory et а!., 1967), в сущности
не может быть применена для описания ки,нетики в,сех липолити­
чеоких фе1рментов. Существуют данные, показывающие, что ад ­
сорбция липазы и:л,и фосфолипазы на по.верхности раздела фаз,
образуемой субст,ратом и водой, еще недостат,оч,на дл,я осущест­
вления реакции (Dawson, Hemington, 1967; Okuda, Fujii, 1968; Ор
den Kamp et al., 1974). Кр •оме то·го, даже е,сли адсорбция бывае :г
продуктивной ( т. е. сопр·овождается :гидрол,изом субстрата), за­
частую юшетиче,ски е к1ри~вые имеют периоды индукции, ,в тече,ние
кютор1:,1х реакция ·не протекает в.ов1се или протекает ,с малой· спю­
ростью (Quarles, Dawson, 1969 Ь; Rosental, Shing-Hsien Нап, 1971;
Verger et а!., 1973). Более т,ого, ,В случае п:анюреат,ичес·кой липазы
невозможно объяснить изменение механизма решк,ции при тидро­
•1шзе длинноцепочечных три.глиuеридов, так же как и аномальное
увеличе,ние активности пр,и компле~ксовании с колипазой (Seme-
riva, Desnuelle, 1976). Исследовате.1щ, раб:отающие с ,различными
.тrиполиrическиt,11-1 ферJr1ента11.и, обна1ружи.пи, что .в составе моле ­
кул ферменто,в суще,ствуют особые груП1пы - «к·онтактные груп­
пы» (Papahadjoupoulos et al., 1973), «якорный центр» (Pieterson,
1973), «адсо,рбционно~комплектарный участок» (Рах,имов и др.,
1972), <щент1р узна•вани,я» п,о,ве~рхно:сти раздела липид
-
вода
(Pieterson et а!., 1974; и д1р.), ·ко·то:рые ,от.в,етст,венны за ,авязыва,ние
фермента с поверхr-юстными молекулами субстрата в липи;11.ной
фазе и активацию фермента.
Модель для опи-::ани5' ориента.ц,ии фе.рмен11а на межфазной по­
верхности липид - вода и меха,низм его действи1я на примере
панкреатичес1<0й липазы были предложены Brockerhoff (1973).
Со,глаоно этой модели, л,ипаза должна ориентирюваться на по­
верхности раздела фаз таким о,браз,ом, чтобы об1разовался комп-
197

лек,с масло-энзим •С у частием гищрофо6ной «голов.ки» фермента ,
к оторая в дюстаточной степени ус тойчива к ра зворач и ванию . Меж ­
фазная ориентация липазы возУiожна в это м случае блатод,а,ря
наличию ПОIJЮжительно за,ряженного «основа , ни я» энзи~1а и отри­
цательно заряжен н·ого углеводн,ого «хвоста». Автор считает , что
такие «•головк и», «основания» и «хвосты» должны быть при.сущ и
и дру гим лип олитическ ю,1 фе,рме,нтам. Эта модель учит ывала то.1ь­
ко т о, чт,о по садк а фер мента на поверх,ность ,дю лжна быть слец,и­
фичной, однако Л1роя.в,1ение слецИ'фичности .е,вязыва .10::ь и,сключи­
тельно с гидрофо·бным .взаимодей с т.виеУI одного из аминО1Ки•слот ­
ны х остатко в (например, лейцина) в м ол ек уле панкrJе атической
липазы с любой из 1гищр офо бных групп липид,ного матри1кса, ло­
кализованных на поверхности субстратной капли. Тем не менее,
в опытах с фторчувствитель·ной трибутир,иназой (РахиУ!ов и др.,
1972) показано, что у ферм ента имеется прост,ра нс твенно протя­
женный участюк ГИ:11Jрофобной лри1роды, который при ад,сор,б. ции
на повер х ности субстрата образует локально олраниченную от
водной среды полость, в которой в сущности и протекает энзима­
тический липолиз. К,ро:м е того, предлож е н;-;ая модел ь тюлька 1<а­
чест,в~нно описывала стадийно,сть липолиза и не !УЮrла быть .в ыра­
жена к оли чес т венно ,из - за некоН1кретности от д ел ьных стадий фе,р­
м ен тативной реакции. В частности, такая Уi одель не объясняла
периоды индукции при ферментативн,ом г,идр олизе липидов и с
ка1коJ1 -ста:дией ,вз,аимодействия фермента и субстрата они связаны.
,
Veгger et al . ( 1973), из~у,чая 1кинети1<у ,гидролиза мон оол оев ле ­
цит,ина паш-1реа•тиче ской фосфолипазой А2 , у,ста,нови ли , что пе­
риоды индук,ции связаны с процеосом п,роникновени,я фермента
в м•онослюй и последующим его активированием. Модель, пр едло ­
ж,енна,я а:в1'орами, :предпола -гает обратимость адс о,рбции и и,ск л ю­
чает ,воз·мож,но::ть денатурации фермента. Пр оникший ,в мо нослой
энзим акти:ви1руется (Е-Е'"; где Р' - активированный фермент,
способный об·разовывать п:роду~ктивный комплек,с Михаэл ·иса) и
об.разует ,с субст,ратом «п·о,верхностный» комтлекс Михаэлиса .
После каталитической стадии фосфолипаза высвобождается в
форме Е* с одновременным удалением продуктов реакции в вод­
ную фазу (имеет с я .в виду гидролиз ко,роткоцепочечных лецити-
11ов, у котор ых продукты гндролиза во дорастворимы) (Zografi
et al., 1971).
Процесс «п р-оник·новения» отличается от не специ фической ад­
,с орбции, которая преД;шествует «проникновению». Равно,весие
Е :;= Е '", согласно этой -мо.:дели, .являетоя лимитцрующим прюцес­
сом в •осуществл е нии ферментати,вной реакци,и и хара ктери зует ся
периодом инД;укции. Не исключен·о, что и процесс Е,;, + S ~ ES
та1юке м,ожет быть лимитирующим.
Определено, что и,ндук~ционный перио д з ависит от температу­
ры, поверх-ност,ногю натяжения в лецитино,вых пленках, р Н среды
и хонцентрации ионов ,Са+2 . Р.езу:льтаты, полученные ,при •изучении
влияния этих физических и химических фак1'аров на индукцио~Нные
198

периоды реакцнн, указывают на возможность существования
специального участка ,на фе\рменте (центра узнав1ания межфаз­
ной п оверхности), прост,ранствен,ню отделенного от акти,вно,го
центра энзима и ответственного за пр·оцесс пр ,оникновения в мо­
нос лой су,бст,рата. Основным пре,имуществом рас,сматриваемой
моде л и является то, 1что о,на может 1объяонить происхожден,ие ~пе­
риода индукции и с ее по мощью может быть созда,н математиче­
ский аппарат JJ.ЛЯ расчета к·о-н.станты проникновения, кажущей,ся
константы Миха0,лиса и в1ремени пронипшовения (и,ндукцион,ный
период).
Приведенный ,выше механизм активации пан~щреатической фос­
фолипазы А2 не реализуется в случае исследюван.ия мех,а,низма
поверхнос11ной а1пива,щии фосфо :~ипазы А2 из яда •гремчей змеи
(Wells, 1974). При эт,ом ,реак ция не лимитируется гидрофо,б,ным
взаимодеfктвием фермента с пов е рхностью ,раздела лиrпид - ,вода,
как от м ечалось для фосфолилазы А2 ,из панкреатической железы
свиньи. Физическое состояние ,субстрата, тем не менее, в значи­
тельн,ой степени определяет активность фосфолипазы из ма, кото­
рая таюке являет,ся фу,Нlк.цией рН , и0tН1ной ,СИIЛЫ и ,прис,ут~е-nвия
ионов дву:х:валентных металлов. Более того, в ,работе Wells ( 1974)
показано, что энт~ропия актива,ции для ферментативн,ого гид,роли­
за коро·nкоцепочечных лецит,инов ,ниже для агрегир~о,ва~нной формы
субст,рата, чем для м,ономерной. Это понижение энт,рошии а1кти­
вации при переходе от мономерной формы субстрата к агрегиро­
ванной автор обънсняет тем, что ,на поверхности раздела моле1Ку­
лы лецитина о,риент,и1рованы благоприятным образом для продук­
тив,ного с,вязывания -с ферментом. Действительно, в большинст,ве
с лучаев может оказаться, что естеств'ен,ная локализа,ция субст,ра ­
та на межфазной границе уже достат,очна для такого св,язывания.
Так , .в случае большинства липаз г,ид1ролиз не сопровождает,ся
периодом индукции и достаточн-о гидрофоб,ног,о взаимодействия
молекулы фермента и субстр,аТtной фазы для активирова,ния фер­
мента (Garner, Smith, 1970; Джанбаева и др., 1972).
Фосфолипаза D, в отJ1ичие от ,других липолитиче-с-ких фермен­
тов, в ра,ссматриваемом аапекте практически не исследовалась.
В ка ч естве исключения можно отметить 1ра,боту Quarles, Dawson
( 1969 Ь), по.священную гид,ролизу м·онослоев лецитина . Авторы
о п,ределили, что некоторые особенности фующиюнирования фе,р­
ментов на границе ;раздела фаз прис ущи и фосфолипазе f) при
гидролизе нераств-оримото субстра,та. Нап~ример, а1ктивность этого
фермента во многом зависит ,от величины поверх,ностното натяже ­
ния пленки . При исходном значе нии поверхностно·го на11яжения
12--25 дин/см -гид,ролиз осуществляется ,в 2 стади,и: начальный,
с ла<бый гидролиз переходит в по.следующий бы:::трый. При значе ­
нии ниже 3 д,ин/см и выше 28 дин/,см не ·обнаружено ферментатив­
ного гидролиза манослое,в чистого лецитина. Одна1ко и ,при вы­
соких значениях поверхностного натяжения (40 дин/см) может
п1роисход1ить интенсивный ,гидролиз, если в монослой, помим-о ле-
199

циtина, в,несеша фосфатидиJiо,вая кисл,ота в соо.тношении ( i: 1).
При этом инициированию гидролиза фосф-атидилс:Jiзой кислс:Jтой спо­
соб1с11во1Вал,о дО1ба,влени-е вЬl,соких кон,ц-ентр,аций ио·нов Са+2 -и не­
кот:орых карбоксильных -кислот в субфаз-у .
В свете этих ,результатов могут быть объя,снены д.1ительные
пе-ри'Оды акти.ва,ции и авtокаталит,ическое уско.решие .гидролиза в
м он ослоях. Воз·можно, что гидролизуемая эфи,рна;я связь, со1;ди ­
няющая 2 заряженные группиро.вки молекулы лец,итина (ф,о-сфат ­
ну!Ь отрицательн-о заряженную и положительно заряженн ый оста ­
ток азотистого -основ,ания), ,находится непоаредствеНlно ·на поверх­
но,сти раздела фаз и ,пj:щцук т j}еа1к,ции - фО1сфат,идил ,овая кисло ­
та, оставаясь 1на поверхности раздела, выступает в качестве а·кти­
ватора реакции анало-гично ДДС,
Осно:вы:ва ,ясь на п1редставленных выше данных, мо)юно предпо ­
ложить, что образо.вание ,продукти:вното фермент-субстратного
комплекса с единичной молекулой субстрата при гетероген,ном
ферментати.вном катализе в з1начительной степени зави,сит от ста ­
дий, предшествующих этому процессу. В частности, ·неправлльн.ая
ариента·ция фермента или ,неподготовленность субстра т,ной -по верх ­
ности к соеди-нению с ферменто-м могут привес т и к тому, что реак ­
ция не произойдет. Логично заключить, что ферменты, фун кци-он и­
руfОщие ,в гетерогенных условиях, могу т иметь «участки», ответст ­
вен ные за связывание -с поверхJНостью. С д,рутой .сто.р,оны, посколь ­
ку .тшпиды и фосфолипиды могут суще-ст:венно менять ,свое фазо ­
вое состояние в за.висимости от внешних условий и сост а ва сре­
ды, to -естественно цре,д1положить, 1ч1ю п1р·одукти1вный липолив будет
протекать толыко в том случа'е, когда поверхность ,субст,ратн ой
фазы «компJiементарно>-, подогнана . к таким участкам фер м ентов.
Иными словами, ловерхно1стный Jiiшидный ,слой с ег,о динамиче­
ской <<архитекту1р6й» rvroжeт ра,ссматриваться -как тонча й ш ий ре­
гул:Ятор каталитических п-роцессо.в при гетеJроген1ном фе.рментати.в­
н·ом катализе " Поскольку такое специфичес1J<Ое взаи-модействие
должно сопровождать.ся о:бразованием большого числа слабых
с,вязей .как гидрофо,бноtо, та;к и ион1ного характера (в сущно,сти,
слйпа·ние двух пове,рхн-остей, имеющих группы, предопре:делённые
к такому взаимод'ействию), то это должн0 з,1-rа,чительао снижать
эМ~ф'rию активации ,си,стемы и по,вышать вероrятностъ взаимодейст ­
вия гру,пш акт':й,в'Ного цент,ра -ферме.н та и ,м-олекулы ,с,у,бстрата, не­
пос.р едс лве~нно ттодве,ргаiощего ся ката,литическому щревращению,
п'О 'сра,внению с реакцией, протекающей в :гомогенных уСJrовиях.
Поэтому можно ожи,дать, что ферментативrные реакции в гетеро­
ген·ных услови ях долж1ны о ·гл-ич-аться въrс-окими скороrстя.м,и, что
ч,а 'ст'о ·и наблюдается в 'реальных клеточных и су:бк.л еточ,ны х про­
цес,tах.
ПриведеР1ные выше р•ассужде~н,ия подкреплены серией исс:педо ­
,:в:аний (Рахимов и др . , 19:Jба, д; 19i17 а,, I9i78; Мадьяров, 1977).
}°l'е'<'iбходю,10 отметить ,ьд'носторонний характер большинст,ва ра­
б(@t, ·поtвящен1ных об.су:жд-а'емому воп,р· осу. В оюtювн,ом исследова-
200

т,ели уделяют большое внимание роли липидной фазы : стру,ктуре
липидного ,слоя, ее плотности, текучести, величине .поверхности на
межфазн,ой границе липид - ,вода, ее кривиз,не, локализации и
· «геоме'I'рии» зарядов на этой · поверхности , адсорбционным свойст ­
вам липид1ных образо.ваний, ,роли температурных фазовых пере ­
ходов iз •липидных фазах, роли полярной «головки» и гидрофоб-­
ных ацильных групп и ,д р.
Подчерки,вая важ,ную роль указанны х иоследова,ний и отм,ечая, .
что поставленная задача далеюа от окончательноr,о решения , необ­
:,юдимо отметить, что имеются еще 2 аспекта, изучению которых
в настоящее врем.я ,по,чти не уделяе11ся В'Нимани~я. Это, ,во - пе-рвых ,.
роль фермента в обеспечении комплементарности. В н ас тоящее
в,ремя со-верше1нно не ясно, •на ка1ких уро.внях ортаниза,ции белко­
sой структуры обе,спечивается форми;ро,вание «участка узна,ва­
ния»; ,нет ответа на ,во.пр,ос, может ли фермент играть регулятор­
ную роль при гетерогенном катализе, т. е. могут ли определенные
конформа~ционные перех.оды, на,блюдающиеся при адсо·рбu,ии фер­
мента на межфазной гр,анИ1це, или .какие - нибудь другие факт,оры,
приводящие к изменению структур1ной ,ор ганизации или конфор ­
мации фермента, опр,еделять екор ,ость ферментатиsного пра~цесса
и •с пецифичность реа·юции в гетерогенных условиях. Другой ас­
пект - это роль интерм ·едиато.в, которые мо гут в.сту1Пать во взаи­
модейс"nвие ка1к с ферментом, та1к и с nруппами, локалиэо.ван,ными
в липидной фазе или одновременно и с тем и другиын, модифици ­
руя 1вэаим,одействующие 1п,о,верХJно,сти, оlбеопечш·вать 1при этом необ­
ходимую ~комплементарность фе;рмента и ,су,бстрата, т. е. высокую
стюрость и селективность гетерогенных ферментати•вных реакций.
В 1качест,ве таl]{ИХ инте,рмедиатов (не о:бязательно к,оферментов)
rvюгут выступать специальные со еди нен ия, например ц,итотокси1ны
из ядов змей, ио~ны м еталлов (преимущественн•о ионы кальция),
фосфолипиды и ли1пиды, не я.вляющиес я субстратами в исследуе­
мой реа1щи,и, ,а в :реJ:Qких ,с,лу,чаях и ,сами · ,су,бстр аты ил1и субстрат­
ные обр ,азо·ва·ния.
Та·к и м образом, можно выделить 3 задачи, решение к;оторых
приблизит ·нас к пониманию оонов1ных при1нцип·о,в гетерогенного
ферментати.вного катам~за и поз.валит обсуждать пр,И'L',JШЫ, опр е ­
деляющие ,необычайно высокую ско1р ,ость и уникальную селектив­
но,сть, в первую очередь 1в отношении вида субстратов и гид•роли­
зу,е,мых связей, реакц,ий, уоко,ряемых ферментами на гра1нице раз­
дела фаз.
11. Выяонение роли физического со,с1'ояния субстрата на меж­
фазной границе в регуляции ско·р·остей протекания и спеuифич­
нисти ферментативных ,реа1щю1 с ,нераст.в.ор,имыми ,субсnратами.
2. Выясн,е iше в.л·ияни15,1 ,с11ру1ктур1ных особен ност ей биО1ка тализа­
тор.а и его состоякия в растворе на специфичность взаимодействия
ферме1Нт --:- субстратная фаза.
, -3. Исследование катали11ической и н,жаталитической роли и~н­
термедиато,в.
201'

В настоящей статье рас,смот,ре·ны в-се 3 поставленные задачи.
При решении пер•вой зщдачи мы огрмшч1ились лишь фосфоли,п1и,д­
ными субстратами, шр,еимущес'Гвенно лецитином. В э-кспер,имен­
тах -с 6иологическ,ими мембранами тракто;вка iрезультатов не так
ко1нк·ре11на в связи •С возникн•о,вением новых слож·ных вошросов, в
частност,и с ;наличием в биомембра~нах эндогенных фосфолипаз.
Лри решении вт,орой зада;чи мы .выбрали объекты изучения, наи ­
более отчетли.во выявляющие роль структурных факторов в регу­
..п,яц,ии
слещифич-ности и каталитической а,ктивяости ферменте.в, а
именно, ограничились v.сследованием фосфЬлипазы D, .
по мере
необходимости привлекая данные с другими фосф.олипазами. На ­
кО1нец, при .решении третьей задачи наши исследования по·свяще ­
ны в основно:vr каталитическим и некаталитическим функциям
ионов кальция, как ~наиболее расп1рост·ра1ненных интермедиатов
ре::~кций, катализируемых липазами и фосфолипазам•и .
Дальнейшее изложение проведено в порядке 'Возрастан~я
- слож1ности систе,мы: ламеллы ,В воДJно - органи ч еских с,редах, липо­
сомы и мицеллы, слои фосфолипидов на .поверх,ности т,вердой
фазы, би,слои фосфолип,ид.ов, мем•бранные системы, преимущест­
венно полифермент~ные системы мембра1н митохондрий .
РЕАКЦИИ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ
Водораство1римые фер,менты обычно деста ,билиз,ируются и.пи
инг,ибирую'Гся Г!lри их функционирова:нни в вод1но - органичес1к•их
смесях (Тап, Lowien, 1972). Акт,ив-ирование фермента в водно­
органической среде происходит оч,ешь редко . . Фосфолипаза D яв ­
л,яется од,ним из при,ме,ров, когда активиро.ва,н и е ;возможно ,в вод ­
но - органической ,среде. Показано, что диэтиловый эф,и,р может ,по ­
,вышать активность фосфолипазы D (Hanahan, 1952; Ka t es, 1953;
Da,vson et al., 1967; Jain, Cordes, 1973; РаХ<им,ов и др. 1976 а, в, г,).
Имеют,ся также сведения, что а,цето:н и метанол могут ·выступать
в качестве акти.ваторов этого ферм,ента (Heller et а !. , 1968). В не ­
давних ;работах (Рахимов, Мадьяро,в, 1977 а; Мадьяров, Рахимов,
1977), проведенных ,с целью выяонить природу активации фе,рме-н ­
та органичес1шми ра,ст:ворите.лям,и, был исследован целый ряд ор ­
г_а1Нических соединений, различающихся физически-ми и химич·е:жи­
ми св.ойствами.
Не все испытанные органические раствар·ители ,способ:ны были
акти.в,ировать фосфолипазу D. Диэтиловый эфир, этила1Цетат, ме­
ти,лолеат, гекса1н, циклогексан, бензол, толуол, нитробензол и
хлорбензол при добавлении ,в реа,кщионную среду .вызывают акти ­
вацию. Ра•ствоiрители, ,смешивающиеся с в.одой, не приводят как­
ти1вации фосфолипазы D. Ортаничес1ше растворители, не раство­
римые в воде (1н-бута1нол, бензиловый спирт, .циклогексанол), тем
не ,менее, не во в,сех ,случаях инициировали реаю.1,ию. Следо,ва­
тельно, образ,ова1ние гетерог,енной еистемы - нео.бходим,ое усло­
:вие, 1но не достаточное. Для актив,ирования фермента, по - видимо­
му, важна не только локализация фермента и субстрата на гра -
202

нице раздела водной и ,органической фаз, но и определенная ориен­
тац.ия субс1'ратн ых м,ол,екул на этой nранице. Бол ее ,подробное ,изу ­
че ние акт ивации фосфолипа зы D (1на примере диэтилового эфи'Ра
и этила~цетата) показало, что актИJВация действительно связа,на
с фазовыми со~стю,яниями в гетер,огеннюй •системе. На рис. 1 а, 6
предст а,влены за.ви:::имости удель·ной активности фосфолипазы D
о т параметра
i,=('V /V ):(V /l/)
ор,· I 1,0
ор,· I-1,0 ма1<с'
'
rде
V0 p,·
--
rJбъем добавлен ~юго органического раствори-
теля;
Vн,о - объем водного раствора, содержащего все
не обходимые для реакции компоненты;
( Vорг/ Vн,о),.,.,,,с - значение отношения укязанных объемов,
при котором наблюдается наибольшее акти­
вирующее действие.
При • небольших значениях 'А
про исхо дит незначительная акти ­
вация (рис. 1). При более высоких
1сонцентра циях органического раст­
ворителя активность значительно
возрастает, достигая максимальной
величины при 1, = 1. Точка пересече­
ния касательных, проведенных для
обоих участков, в случае диэтило ­
в ого эфира соответствует л0 =0,68
независимо от концентрации субст­
ра та в реакционной системе. ло, в
св ою очередь, соответствует раство­
римости диэтилового эфира в воде
при температуре опытов (4,8 % при
30°). Активация в случае этилаце ­
тата происходит начиная с ло=О,81,
что соотве тствует значению, сов па­
дающему с растворимост ью его в
в оде (5,8% при 30°). Участки кри­
вых, заклю ченные между значения ­
ми л0 и л=1, во всех случаях ха­
р актеризуются тем, что в реакцион­
ной системе образуется устойчивое
ла меллярное· состояние и получен-
а
t5
А
А
2д
1.0
5
1,0
J
t/A
8
t/A
г
lS
!О
1,0 15
8·
6'
4
Рис. 1. Зависимость у дельн о й ак­
тивности фосфолипазы D от па­
ра~1етра л (а, б) и е= представ­
ление в ко о рдинатах 1/А от
1 /л-ло (в, г).
ные реЗуJJЬТqТЬ! УКЛаДЫВаЮТСЯ На
й, 8-Л"ЭТliЛОВЫЙ Эфир; 6, Z- ЭТliЛЗ-
/А 1/
11етат (uифрами указана концентрация
лрямую В КООj)ДИНатах 1, ОТ Л- леuнтина в мМ).
-ло (рис. 1 в, г).
Точки пересечения прямой с осью ординат позволяют опреде­
.'lить величи;н у Амакс - скорость реакции ПiрИ л-ло
-
оо, которая
со,о тве1'ству,ет скорости ферментати~вной реа11щии пр,и бесконечно
203

большом числе точек за,рождешия оргашической фазы с раст.sорен- •
•ным су:бст,ратом в водной дисперсии фосфолишида в случае, если
бы ламеллярное состояние си·стемы могло сох,ран~яться при уве­
ли,чении количеств.а орга1ничес1юг,о раство.рителя. Значение Аман с
при а,ктивации реакции диэтиловым эфиром не зависит от кон­
цештр,а,ции ,субстрата. Результаты, л;редста,в.ленные на рис. 1 в, г .
подчи,няются урав,нению:
1
1
к,
1
-=- -+-- ·-
А Ама1<с А,11акс Л - i,O'
Из отрез1ков, отсекаемых на ос и абсцисс, можно вы ч и -с л ип,
величину К.л - к о нстанты, которая не зависит от количества ак­
тивато,ра, ,но является функцией ,объемной кояцентрации субс11ра­
та. Число.вое з·начение ко.нстанты К, раВIНО той величи~н,е л- л 0 ,
при которой окорость реакции равна :половине м аксимальной , т. е .
являетоя в определенной степени мерой того, нас1юльк,о тот или .
иной активатоiр способен ,созда !вать ламеллярную с,исте м у. Че м
ме1Ньше К ),, тем лучшим активатором фосфолипазы являет ся да,н-
ный раство·ритель. В случае этилацетата !( не зависит от кон­
центрации субстрата, а з·начение А м акс растет с увеличением ко­
личества лецитина 1в системе. ТакиУI образом, а;к ти,ва,ция фосф о ­
ли.пазы D органическими ,ра.створителями связана с о-б~разовани,ем
устойчи.вого ламеллярного состояни,я в ре3Jкцион ,н о й сре де .
Ст абилыность субст,ратаюй фазы, как упоминалось .выше, яв­
ляет·ся необходи,мым, 1но не достаточным условием для активаци и
реакции . ,З,начения активности во многом зависят от химическо й
природы и физических ,свойств ,и,спол ьзуемых для а,ктива,ции ор­
ганических раст,во1рителей, а также от кон,ц,ентрации ионо1В двух­
валентных м еталлов (Рахимов и др . , 1976а, 1977а, 1978; Ма дь я ­
ров, 1977). Это п,оз,воляет считать, что основ1ными факторами ,
о-пределюощими скорость ферментативного п1роцесса в присут­
ствии органических · растворителей, являются ориентация групп
полярной части су6страт,ной молежулы, подвижность м ош есr<ул
субстрата и образование ,слож'Ной систе,мы за,ряд,о·в на м,ежфаз,:ной.
границе. Дополнитель ные подтверждения важности указанны х
факторо1в для фермештати,в1ного гидролиза фосфолипидов ,были по ­
лучены гьри изучении пром оти,рующето действия дете·ргент,о-в, ад­
сорбентов и ультр •аз;Ву'\Ка.
РЕАКЦ И И В МИЦЕЛЛЯРНЫХ СИСТЕМАХ
При изучении действия д,етергенто!в на ферментативную ак ­
тивность ф0rсфолипазы D определено, что эффект акти.ва,ции свя ­
зан не с простым дисперги,рованием субст,рата детергентами, пр и
катаром увеличивается площадь кО1нтакта ферме,нта ;: субстра т ной
фазой, а со специфичеакой модифика,цией контактируемой пiшерх­
ности раздела фаз (Рахимов и д1р., 1976 а, в; 1977а, 1978) .
204

Наибольшей активи-рующей сrюсобностью -обладает анио1п-1ый
де,ге~ртеит додецилсу.льфат нат,риrя - ДДС. Другие детергенты
-
тритон Х - 100 ( неионный детергент) и цетилтриметиламмоний
броми,стый (катИОIНIНЫЙ детергент) слабо актИ!ви,ро,в,али фермента­
тив•ный гидролиз лецитина, хотя при используемых концентра­
щ1я х д,остигалась .высоrкая степень диоперсности суб:.:тrрата. В сие­
теме, ,е,одержащей лецитшн, ио.ны Са+2 и ДДС, в этих условиях
о бразу,ется устойчивая гетерогенная сист,ема, -состоящая из во;П,­
но й фазы с растворенными ионами кальция и смешаН1ных мицелл
ДДС ,и лецитина . В та-
кой системе состав невод- А
ной фазы .зависит от ко- м
л и ч ества добавленного
_
ДДС, концентрации ле- ,а
цитин а и от их молярного tв
соотнош ения а = :[ДДС],/ t.2
/1[SJ.
[/
о
бО
о
аБ
ш
концент;лцш; 1/leJJMШIЛll.Mtj!IИ
Рис. 2. Гидролнз смешанных мицелл лец11тина
и ДДС ф о сфолипазой D
На рис. 2, а представ­
· .пена з ависимость актив­
ности фосфолипазы D от
концентрации СаС 1 2 при
различ н ых концентраци­
ях ДДС. Увеличение а,
введением возрастающих
J(ОЛИЧеСТВ ДД С ПРИВОДИТ
а - З3В " С11"!0СТЬ удеЛЬНОЙ аКТИВНОСТИ ОТ !(ОНЦеtl'Гра-
ЦИИ са:2 + ( 1"1.11фрамн ука :iнюt кш-щентрация ДДС и мN\),
К ПОВ Ы ШеНИЮ OТрИЦаТеЛЬ- 6-зав>1снмост;- [Са2+ ] от 1(0!Ще1прации rhep-
.
опт.
•
наrо заряда на л0верх - ,., ш,,,
нос'Т и .смешанных мицелл
с убстрата и анионного детергента. При (S]=З мМ повыше­
ние концентрации ДДС в составе смешанных мицелл до 1,i! мМ
выз ыва'ет уменьшен.пе -оnтимальн·ой конценrr1рации ионо'В кальция,
нео б ходимьй для мак:.:и;мальной а1кти,В1ности фо-сфолилазы D. На­
чин а я с [ДДС] =0,7 мМ добавление определенного количества
CaCi2 ·не активирует фермент . .На начальном уча-стке кривой в
эти х с Ui учаях скорость реакции низка или равна нулю, несмотря
н а то , что ,в среде иrнку,баци:и присутствуют ИОIНЫ металла . Сле­
дов ател ьно, повышение отрицательного заряда на поверхности
с убсТlр атной фазы увеличением соотн,ошения а тр ебует н епроиз­
водительных затрат катионов Са+2 . При этом количество CaCl2,
непо,средствен1но обеспечи,вающее активацию фермента ('[Са+2]ман с­
[С а+2] 0), с ростом а у,меньшается, достигаrя пост-оянного знач,е1ния
~ 2r0 ,м~м (Рахимов и др., 1978). Роль и,онов кальция в этом слу­
ч ае за,ключilется в гашении изrбыточного отрицат е льного з аряда
(р•ис . 2, а).
'
Потребность в ионах к•альц,ия различна и ,в том случае, если
и з мен я ть ,в реакциоrн~ной среде концентрацию фермента , оставляя
з на ч ени я других параметров реакции постоянными: она увеличи­
в а е 'Гс-я с рост.ом конценТlрации фе;рмента (рис. 2, 6).
205

Пом1имо э тих резул ьтатов , можно ,привести данные, пол у че,н­
ные в основном путем ингибиторного анализа с помощь ю ряда
специфических и,нгиб ит о р о,в, с вщде тельству ющие о пол ифушщио ­
нальности ионов кальция в исс ледуемой реакции.
Ин г иби рование ионами лантана. Ионы ла нтана я·вляю т,ся эф­
фектив1ными и~н гибитора ми да,н·ной реакции (рис. 3). Для ,п о л ног о
и·нги,6ирования реапщии, неза1висимо ст концент,рации ионов каль­
ция, достаточно всего лишь 4 ::viM La +3 . Добав ,1ение ,1анта :на не из­
меняет характер зави-симости с%оро ,сти •реа1щии от концен тр ацн н
ионов кальция, онижает,ся л ишь з, на чение ~1акси:мально· достип1е-
(J
t5
8
ij~ td
2
L05
fO
LL-L--~o_-?-~0.4 о
f //S},,1 1i ,(1
]50%
~
1/V
{}4
?Д
0.2
0.J
о2040БD80-02
о
[Со').мЛ1
Рис. ?. И11гиб11рсваi1не фосфол11пазJ1 D лантаном.
а-вJШЯ! ие rсн2 г ] ' б-зав11симосп1 \/ от [Sj в 1-:оордннатах Лай~
ну11Рера н Берка (шнР1 .1;.1н y 1u1 :1;1 1:i:i к u1-ще ~. трJuш1 [La+ 3 ] в }.!М), о­
запнс!·мость J(i от [t.а+З ] .
м ой ска~рости ~реакции . Ингибирование ионами ла,нтана тем эффек­
тив1нее , чем выше концентрация ионов кальция ,в реа1щ ио1н но й
среде.
В координатах Лайнуивера - Берка, отрез-кн, отсека ,емые на
о с,и ордИ1нат (1 /К:нат• Е) и ,оси аб с цисс ( - 1/,К: м ), позвол,яют оце­
нить величины К:т,ат и К:м, ,которые в дан,ном случае являют1ся ка­
жущимися константами. Если провод.ить изм е,рения в присутствии
переменных ко,нцентраций ионов ла,нтана, то к,ривые пере~сек•а1от­
ся в точке на оси ординат, соотв,е'I'ствующей l/Vrnax=8- l0-2
.
Из
этого можшо заключить, чт,о присутст,вие и,нгибитора (La+3) не
влияет на каталитическую хо1нстанту ,реакции . В то же вре,мя от­
резки, отсекаемые на оси а,б1С,цисс, уменьшаются; это свидетельст­
вует о то м, что присут,ствие ингибитора тормоз·ит процесс связы­
ва1Ния биополимера и су,6с11рата. С по·вышением концентрации
La+3 Км у,веJIИ'Ч ·и,ваетоя.
Осн.овываясь на из.тrоженном, м,ожно сделать вывод, что ионы
ла1ктана не влияют на протекание каталитической -стадии реак­
ции, ПJрепятствуя о·бразованию ,про:\'rежуточного фермент -·субстрат­
ного компле:кса фосфолипазы D с едЮIИЧIНОЙ моле1кулой ле~цити,на.
При этом К:i=О,2 мМ . Это означает, что лишь н еб.ольшая ча,сть
-1
иона.в кальuия уча,ст,вует в образовании комплекса Михаэлиса .
Замена Са+2 в промежуточном ферме:нт-субст1ра11Ном комплексе
на L,a+3 делает фермент ката.тrитически неакти ·вным.
206

Ингибирование ионами фтора. Добавление F- в ,реакционну]()•
среду торм,озит ,реа~кцию в иссле1дуемой ,системе. Поскольку про­
цесс торможения :каталитиче1ской реа ;кции является результатом
взаииодейс т,вия ингибитора ,с н екоторыми из ,к,омпо1ненто,в, при ­
нимающих у,частие в кат•ализе , ,воз,мож• ны 3 ruричины, вызывающие
тор м ожен,ие реа~ции ио1на м и фтО1ра: 1) оrбразова ·ни е нераст,во,ри ­
м,ого ,CaF2, в результате чего возникает д,ефицит в ионах кал ьц и я
д л я образова1ния пр·омежуточ•ного к о мш л екса ; 2) ,в з аимодействие,
F- с функциональными группами а к ти,в1ното це1пра ф ерм е нта, чт о.
д олжно предотвратить либо связьиза•ни е с убстрата , л и,бо его к а -..
а
?О
о"----'----'----"~~~~
О
20
40
80
D
0.2
{}, ✓:--
,'{онцштроцил[Сп'2;,м1.1
Рис. 4. Инги бнроuан 11е фосфо:~ 1н1 аз1,1 ионами фтора.
а-за~·и:нмость [ г·-}. требуечо(1 для полного и1ir1_бi-1рооанйп, от
[са+~], 6-то же, ат iE]-
талитическое превращение; .3) F- заним а ет од·но из коор д и1национ ­
ных мест в .пром,ежуточном комплек( е с у частием субстрата, фер ­
мента и ио~нов кальция.
При ра,ссмотрении зависимо,сти глубю:iы инги6ИJр о,ва,ния от к он­
центрации ио1нов кальция -было за мечено, что ,возрастающи е
концештра1Ции и.о-нов металла снижают эффект ингибирования.
Полное ингибироваюrе наступает при эквимолярном соотношени и
ионов кальция н фтора, что однозначно исключает первую из пере ­
численных причин (рис . 4, ;з). Аналогичный эффект наблюдается и
при изменении концентрации фермента: с увеличением концентра ­
ции фосфолипазы D в реакционной среде скорость ингибирования
уменьшается (рис. 4, 6) . Это означает, что ионы F - ингибируют ре­
акцию и в этом процессе принимают уч а стие молекулы фермента .
Концентрация ингибитора, вызывающая полную потерю каталити ­
ческой активн.ости, также коррелирует с изменением концентрация
субстрата.
Из приведенных данных следует, что ингибиро,вание, деikтви ­
тельно, обу1словлено тем, что ионы фтора внедряются в шроме­
жуточный rюмnлек,с, об~разующийся в реа·юции с участием Са+2 , .
фосфол.и1паэы D и смеша1н,ных мицелл субстрата. Вледрение о т-
20 7)"

:рицателыного заряда (F-) ,в состав ком.плекса делает невозrvюж­
ным щротекание каталитической реакции в изучаемой системе.
И нrибирование этилендиаминтетраацетатом натрия ( ЭД ТА).
ЭДТА опе;цифически ов1язывается ,с ионами .кальция с образова­
нием хела11ното ,ком,плекса. Инг и>бирую щий ~эффект ЭДТА ·на фос­
фолшпазу D также можно было бы ,объяонить его хелати,рующими
свойствами. ДейС'гвительно, при малых ко·нце1нтрациях ионов каль­
ция в реа1кционной ,ореде для такого ингибиро·вания требуется эк­
вимолярное количество ЭДТА (рис. 5). Однако с у~•еличением
ко1н.цен11ра1ции металла это соо11Ношение ,нарушается, снижается
Л'JдТА},l!О"/.,
мм 20
а
[ЗДТАJ:;,,
M~f
'
•20
1
--------
о (L__, _
,
_.. .!''-----'- - -'-
17
20
4!J
б,7 80
KOH!JfHЛlf]0ЦШ![Сr/2;,мм
О.,.с:::_----'----~-~
!]
D,I
0,2
ЦJ
/(0HЦfHЛI/JOЦIJ!l rjJepмeнm,;,;,711 ·
Рис. 5. 1/,нг иби рование ф о сф оли па з ы ЭДТА,
а-зав»симость ЭДТА !ОИ% от [ са2+ ], 6-то же от [E J пμи
[са2+ ]=5 мМ (/) и Са~+ =~О мм (2),
.скорость инrибирова1ния, уменьшается концентраци1я ЭДТА , необ­
ходимая для 100% инrиби;Р .Q!В-ания (цри 100 мм Са+2 расходуется
л,ишь 16 мМ ЭДТА). Это, в свою очеред,ь, исключает механизм
ингибирования за счет хелатирую щего действия ЭДТА по отно ­
шен.ию к ионам ~кальция.
То, что эффект ЭДТА связа1н не с хелатир,ова1нием кадьдия, а
с определенным воздейств,ием 1-ra промежуточный комплекс, под­
тверждает и другой э,юсперимештальный факт: при иссле,д,овании
за,висимости интибированшя от концен т,ра1ци,и фермента об1наруже­
. на ,Пlрямая пропорциональная за1виоимость между ко~нцентраци~ей
. фосфолипазы и ЭДТА, вы.зывающим ,uощюе торможение :р .еqкции.
Тwкая завис·имость сох,ра•няется для ,всех рассм·отренных кон,це1н­
траций кальция, что с1в•идетельствует о непосредственном связыва­
.нии ЭДТА и фосфолипазы f).
Активирующее действие магния на гидролиз лецитина. Ио.ны
ма,гния ,н,е могут заменить Са+2 в исследуемой ,систе,ме : даже п,р ·и
больших концентрациях Mg+ 2 (до 100 мМ) реющия 1не протекает
(Ра х имов и др., 197,6) . Одна1ко е~ли вносить в реакцио•нную среду
Mg+2 на фоне ио·но,в Са+2 , то он может по,высить катали'I'ический
эффект (Календарева и др., 1978). Эт_и данные можно о-бъяонить
лишь предположением, что только ~небольшая. ча,сть ионов Са+2
принимает уча,стие н,епооред~ственн.о ,в каталитичеокой ста1дии ,реак-
208

ции .в 1шчес1'ве двухваJ1ентного катио-на, создающего необходимую
ион.ную силу. Ионы магния не способ1ны заменить Са+ 2 в его ка­
т алитичеакой роли, но заменяют его •некаталитические ф унк ции ,
поэтому доба1вление Mg+2 на ф,оне .мал ых количеств Са+2 так ж е,
повыша ,ет скорость реа11щии.
Суммируя ,приведенные •выше данные, мож~но сделать вывод ~
что роль кальция неоднозначна. Кальций участ,вует в сле,дующих
ре акциях:
1. Взаимодейст,вие с ферментом: Са+ 2 + Е ;;::::- Са+2 • Е.
О взаимодейст.вии фосфолнпазы D с ионами ,каль:uия ,свиде­
тел ь с твуют да ,нные .рис. 2, 6, а также ум еньшение интенси В1ности
полосы поглощения в области 1600- 1700 см- 1 ИК-спектров фос­
фолилазы D при добавлении ионов Са.
2. Овязыва·ние Са+2 с субстратом: Ca+2 +S ~ Ca+2 -S.
Способность .ионо·в Са+2 образовывать ,соединения ,с леци т ином
и другими :фосфолипидами доказана ЯМР и ИК -·спектроскопи­
чески (Yabusaki et а!., 1975; Кален,дарева и др., 1978).
3. Образование к.ом1плек1са со смешанным.и мицеллами:
Об1разова~ние 11рой 1ного комплекса, -включающего активатор и
субст-рат, видно на рис. 2, а. Избыток ДДС, равно как и избыток
субстрата, приводит к уменьшению скорости Q)еакции.
4. Образование ,смеша·нных 1юм1плексов Са+ 2 с ферментом,
субстратом и детерген т.ом:
Образование каталитичеоки актив1ных коМ'плексов происходи т­
именно по этой реакции. При отсутствии •любого из компонентов ,_
вход,ящих в соста,в этого комплекса , каталитический процесс
ста~новится н,евозможным.
5. Нейтрализация из,быточного отрицатель-нота заряда н а по­
верхности субст1ратных мицелл: у,величение концентрации ДДС
в реа~щионой системе при S =coпst требует непроизводительных :
за1'рат •кальция (рис. 2, а).
6. Оп:ределенная избыточ~ная концентрац,ия иона.в Са+2 необхо - ­
ди'vrа для создания соотве'Гст.вующей ио,нной силы раствора не.по­
средственно на границе раздела фаз. Эту фун:кщию Са+2 м огут ­
выпол~нять И ионы Mg+2 .
14-156
209 ;

Среди перечисле!llНых видов взаимодейс~ия только один -
образова1ние комшлек.сов типа
-
сопровождается ка-
талитической реакцией.
Из приведенных выше эк;спериментальных данных н,ельзя сде­
лать вывод о-6 отно.сительно точном со,ста,ве и стехиоме11р -ии это­
го кюм1плекса. Од1на1ко яоно, что э11а ,стехиоме11рия досtат,очно точ­
на и любая модификация такого номнлекса сопровождается ин­
rибирова,нием процесса . Напрй'мер , введение отрицател ьного за-
Fе
ряда-избыток ДДС или присутстви,е ионо,в фтора: ';(...,___Е
\/
с,а'2-А
или увеличение положительного заряда - замена двухвалентного
.,-
с
са+ 2 на трехвалентный ион La+ 3 :
/\"-.с
A"-J / ~ , модифукация био-
Lа-;-3
полимера ЭДТА приводят к тому, что каталитический процесс
становится невозможным.
В .некаталитических стадиях наn:болъшие затраты ио1н0,в Са+2
св>1заны •С созда·ние:м необходимой ионной силы непос,редст.ве,НIНО
на границе раздела фаз. Этот процесс, по-видимому, достаточно
сложен. Получе'Нlные 1на,ми ,результаты свидетельствуют, что имен ­
но ионы Са+2 , способные модифи:ци1ровать поверхн,ость субстрат­
·ной фазы, ,со~ают более строгую ориентацию ком,ттонентов на
границе раздела фаз, более ,высокую степень улорядоч,енности .сис­
темы. Исслед,ова1ния эт,ого процесса в системах с орга1ни,ческими
_растворителями, на твердых сорбентах , при действии ультразвука
и не.посредот,вен1но на ,биологических мембранах (Рах,имов и д1р.,
1978) показа,ли, что чем в бол,ее орга·низованном ,состоянии на­
хадикя ,субстрат, т ем меньше необ х оди м о ионо:в Са+2 ,ДJI • Я 1ини;ц1ии ­
•рова1ния реа1кции.
Обычная схема ги1д1ролитичес1кот 6 действия фосфоли'Пазы D
может быть описана как:
Е+S_к, -tES)~- PhE+rк\_Е+Pl10H+н+,
(1)
K_J
,_'ол и н
'
тде
Pl1E - фосфатид и лф е рмент,
Pi10H - фосфатиди,10Gая кисл ота,
Кр К _ !' К2, К3 - константы скvростей соответствующих стадий
реакций .
210

В этой схеме реа1щии, одн;:1кр, совершен~но не учтена роль ио ­
нов кальция и субс11ратr1,ой фазы, состояние которой важно для
протека1ния ката-лл.п1ческой реа~КJции. С другой с11оро,ны, д,анная
схема п1редполагает , что в актив,ном центре фермента имеется
толькр 2 участка: с,щJзЫВЩQЩИЙ, от,ветС'тве~нн1>1й за о6разова,ние
фермент-субстратного 1юм,плекса (Ks К _ 1К~ К2 ), и каталитичес­
кий, непщ:редственно ускоряющий процесс гидролиза (К 3 ).
Неда1вно бьшо ло·казано, что у фе-рментов, катализИ1рующих
реа~щи,и с нерас·11ВоримьJJми ,суботратам~и, 1В ча,стности у ли,п,ол1ити­
ческих ферментов, имеет,ся участок, ответ,ствен1ный за «уз•нава,ние»
субстратной фазы. Толыко при наличии ком ,плементар1ности меж­
ду учас т ком узнавания 1и ,тто:верХJНостью субстратной фазы возмож­
на специфическая адсорбция ферм,ента на межфазной г-ранице и
последующая перес11ройка адсорбц,rюн1но го ком:плек1са в комшлЕжс
Михаэлиса.
Выще . .от-мечало,сь, что лец11тин и мо,п;едулы а·нионноrо детер­
гента образуют в воде смещащ-1J::i1е мицелщ,r и в связывании
с фосфощшазоf1 D мржет участ&Q:вать лищь часть молекул
субс11рата, им,ею-10 та, которая: локализована на ·гра1JI:и,це разде.п:а
Ф<!з лщтид -1вода. Бо.щ,ща.fl часть моле!l{ул находится в объеме ли­
пидной фазы и 1не принимает участия в ферментатив1ном процес­
се. При изменении объемной кон,центрации субстрата S.v его по-
, вер}Gнос11ная концентрация S0 меняется не пропо~р,ционалыно, так
как ,тт ри этом меняются разм(:Jры и форма миц,елл. Величи1ну по­
верХJности ,раздела фаз вода-фо,сфолишид мощ:н,о варьировать пу­
тем изменения концентра1ции лецитина в системе.
Реа1кцИ1я 1не может протекать с мономерным субстратом. Необ­
ходимо нал,ичие элементарной площадки ,f:!a границе раздела фаз,
состоящей как минимум из 5 молекул лецитина и 1 молекулы
ДДС (имеется 1в ви:ду ,стихи,ометрия - размер площадки опреде­
ляется размерами фосфол.ипазы D), т. е. роль су6'ст~рата в да,н­
ном случае вместо еди,ничной молекулы ,выполняет некоторый
«ансам,бль» из молекул лецитина и ДДС. Из этого следует, что
ура 1в,нение ( 1) !Необходимо представить ,следующим образом:
к.,
к,
.
.-- \
E+S 0 -Sv-к ➔ ~ ES 0 )-Sv-к ➔ (E'''S')m·Sv·S 2 ~-(PhE)·
-3
-1
_\_ t ХОЛIIН
• S0 ·Sv '""Т~:'5 ➔ (E*-S 2 )·S .1 + PhOH,
(1'},
где
Е - фермент;
S0 • Sv - субстр~т (такое обозначение применено, чтобы
разrраничип, молеку4ы субстрата, локализован­
ные ~--щ rр1:1нице раздела фаз S0 , т. е. доступных
для связывания с ферментом, и Sv- молекулы (
субстрата, локализованные в объеме субстрат--
211

ной фазы, r-:оторые не могут непосредственн о
взаимодействовать , с ферментом);
Е" - активированная · форма фермента, означающая ,
что образованию комплекса Михаэлиса пред­
шествует стадия адсорбции и конформационной
перестройки фермента;
.
S'-
единичная молекула с у бстрата, которая экстра­
гируется в глобулу фермента и подвергае тся
энзиматическому расщеплению;
.
(ГS ' ) - комплекс Михаэ л иса, образованный в локально
ограниченной полости, создаваемо й поверх­
ностью смешанных мицелл и "участком узна-
вания" фермента; ••
Pl1 - фосфатиди л ;
.
Ка и К-а - константы адсорбции и десорбции фермента на
поверхности субстратной фазы.
При это.м не обязательно, чтобы прои,сходила десорбtция фер­
мента после каждого элемента1р.ного цИJкла р,еакции (рис. 6). Ес­
теств енно, чт,о стадии, лредшест.вующие о6разованию комплекса
Миха э ли.са , должны .влиять на общую кинетику процесса. При
этом можно считать, что юз.рящу с оан-овfl.ой реакцией могут ~пiроис­
ходить реа_к,ци:и: Е + са+2 ;::::': са+2 • Е
(2)
(3)
(4)
где под Sm+t и An+t обозначены юбыточные мо,ле1~улы с)liбСТ~рата
и активатора относительно стехиом,етр .ического со-отношения .
Эти уравнения означают, что в лрисутст,вии ионов кальция из­
быток субстрата (а<О,2) :или и збыт ок ДД С (а>О , 2) приводят к
ингибирова,нию ос1Новной р еа1кци1и н езависи мо .от их абсолютной
212

концентрацИ'и. При
участия ,в реакции
(уравнения 3, 4 ).
эт,ом част ь ф .ермента не может rr,ринима·ть
и з --за образовани я неактивных · ,комплексов
Р. ,~~-
п~
-
-
~
-- ----- --
~
(О}
C't>"?х;5.:]/ОЩ1: ii
участ о1,
Noтолиnлескшi'­
у<ЮсffШ<
ЦtHlll.й
, узнавания"
(о)
,,д,,,
( 1+2\
1са-Е
'-1
/
s,:;_1
+Р, +Р2
Рис. 6. Схематическое представление механизма дейст­
вия фосфолипазы D на границе раздела фаз и влияние
ионов фтора (а), ЭДТА (6) и ионов лантана (в).
РЕАКЦИИ НА ПОВЕРХНОСТИ ТВЕРДОЙ ФАЗЫ
А1кти.вированное состояние фермента созда е тся ,на хорош о
развит,ой границе ·раздела фаз, однако существуют, по-видимому ,
некоторые ограничения свойств этой межфазной границы. Можно
nредполагать, что межфазная: поверхность ·нуж,на для имм0<били­
заци:и фермента, ,следствие.м чего являетоя изменение конформа-
213

ции фосфолип.азы D и пi:;p~x,QJJ. ее :е актиащро,вщшое состояние.
Дейст•вительно, акти:ва,щ1я ф_е,рм~щта tна,блюдается Ji на поверх­
ности т,вердой фазы. На ло.вер~ности си..rшкагеля, оилох,ромов,
бентонита и гищроксила1патита фосфолишаза D может осуществ­
лять катализ даже в отсутствии иона.в кальция, а ЛР'И добавле­
ни,и Са.С1 2 скорость увел.ичи.вается (табл. 2).
На •рис. 7 пред,ста;влены результаты более детального ис,сл е ­
дова1ния а,кти,ва,ции ферментатиrв,но:го про:цесса на гр~шице раз­
дела фаз вода -,силикагель. Каrк следует из , ри•су1н1<а, увеличение •
концентрации фосфолилазы D требует в этом случае, бо,п ьшей
Таблица 2
Влияние СаС1 2 Jja активацию фосфолипазы D некоторыми
адсорбе,. там и
Кою ~ чz"
У дельная активность
Адсорб , нт
,С7В0
рН 5,6
рН' 7,2
адсорбента,
мг
б
б
а
а
Силикагель
.so
1.1
4.1
0,7
3.1
С 11л о хром СХ-1.5
200
О.:с
1.о
Силохром СХ-3
200
0,2
1,0
О4
I.1
Активированны11 уголь
100
о
о
о
о
Бентонит
50
0,3
1.1
0,2
0,7
ДЭ А Э-целлюлоза
50
о
о
о
о
КМ-целлюлоза
5)
о
0.3
о
о
Гидроксил апатит
50
0.7
0,7
0,4
1,2
Пр им е чан 11 е . а -в отсутствии СаС12 , 6-в присутствии 20 м:М
СаС1 2 в среде измерения активности.
площащ,и ,межфазной границы для ее адс01р6ции, причем эффек­
ти1В1ность адоорб:ции, .сопровождающейся акти,ва,цией фер1мента,
выше из раз·ба.вленных 1раствО1ров. С увеличением концентрации
су6с11рата скорость реакции повышается и для достижения ее
максимального з1Начения требуется м,еньшее количество оилика­
геля .
.
Результаты, предста.аленные на р,ис. 7 а, получены в усло­
виях, когда а1кти.вация была выявлена при до6ав,лении ·к навеске
силикагеля эаран,ее при,гот·о,вленной субстратной смеси [систе­
ма 1 - (S+E) +Si02']. В э·юм случае .нельзя устаrновить, ка.кой
из возможных 3 •случа,ев реализует,оя: 1) на ,силикагеле ад•сор­
би,руется фермент, в результате ,чего он становится сrпособным
образо,вывать с .субстратом лроду1ктив,ный комплекс, в этом слу­
чае а1ктива,ция фе\рмента долж1на полностью о,п,ре:деляться его
адсорб:ци,ей на с•иJiикагеле; 2) на ловерх,ности силикагеля адсор ­
б,и1руется суб:страт и активаu,ия определяется тем, что фер:мент­
субстра11ные взаимодействия про,исход1ят с ориентированн ыми на
поверхности ад,сор6ента молекулами .субстрата, аналогичJНо опи­
санной в литерату,ре активации ферментов на монослоях леци-
214

тнна (Лолторак, Чух,рай, 1970); 3) активация я~вляет~ся ~резуль­
татом адсорбции неак'rивных комплексов ' типа фермент-субстрат,
которые могут распадаться с образова1нием пр,одукт0tв реа,кции
лишь ,в а1дсорбиро·ван1ном состоя1нии.
С целью ,выrбо.ра ,наиболее ;пр1авилыного варианта про•ведены
следующие э·коперименты . К навеске силикагеля добавляли пере­
мешные количества ,суопен~иро,ва,нного леuитина. После 30-ми­
нут,ной и1НJКу1бации при перемешивании 1в систему добавляли фер­
мент. Результаты изме-
рения активности в та­
кой системе [систе ма
о
'8,
2-(S +Si02) + EJ приве­
дены на рис. 7, 6. Видно,·
что активация фермента 1
происходит и в этом
случае. Абсолютные зна­
чения активности в сис­
теме 2 вдвое выше значе-
ний аr<'Тивации в системе O о,г
1. Более того, если в сие -
t/A
iJ
fO
to
8
-2О246'
Рис. 7. Активания фосфолипазы D сили­
кагелем.
a-1E+S1+s10,; 6-(S+SIO,) + E (Е указаны цифра­
ми), в-(E+SIO,)+S; /-до адсорб,ши, 2-а растворе по­
с л е адсор6L1ин, 3-иммобилизованный фермент; г , д­
зависимости 1 / А от l (с: 1: ликаrель) п ри ра з личны х 1.;:он~
uентранию.: лец 1 тю-!"а и фосф о липазы D (указаны uиф­
рами) соответственно.
теме 1 активация пр и
увеличении
количества
сишrкагеля резко снижа ­
ется после достижения
определенного максиму­
ма, то в системе 2 удель ­
ная активность возраста­
ет до некоторого предела
и существенно не изме­
няется при дальнейшем
увеличе нии
количества
силикагеля. Эти разли­
чия более четко проявля­
ются при работе с низки­
ми концентрациями фер­
м ента и высокими кон­
центрациями субстрата.
На рис. 7, в приведе,ны данные, 1полу;ченные в результат е пред­
ваlри11ель.ной адсорбции фер-мента на силикагеле [система 3-(Е+
+ Si02) + S'). Р1аствор фермента добавляли к навеске силикателя,
инкубировали 15 МИIН при 30°,С и центрифугировали. В надо-садоч ­
ной жидкости определяли количество неадсорбирова1нного фермен­
т а, из:Vrеряя . его а·ктивность. Ка1к и в системах 1 и 2, в си,ст еме 3
наблюдается активация , фосфолипазы D силикагелем . Однако зна­
чени,е максимальной актнв.ности в этом случае нам~ного ниж е , чем
в указ- а1нных ,еноте.мах .
Активность значитель~но онижа,ет,ся при увели,че,нии концентра-
ции фермента. По-видимому, молеку.пы фермента опособны акти -
215

вироваться толыш1 ' ПРИ м; алых степен я х · запо .1нени , я :rювер хно сти
силикагеля, . а , снижение акт,ив,ност и с,вяза но с взаимодействием
мол,екул фермен:га на ловерх:ности (По.по1рак , Ч у х ра й, 1971) . Дей ­
ствитель•но, при низк их концентра,циях фо·сфоли,пазы D актива­
ция, обусловленная адсорбцией на силИJкагеле, в 2-3 раза пре ­
вышает активацию на границе ·разде J1а ф аз диэтиловый эфи,р -
вода.
Описа 1нные выше опыты о;тличались тем, что локализаuия фер­
ме,н т,а и субстрата на ]lранице раздела ч1ли,кагель-вода была
осу щ ествлен,а различ,ными способа-ми. В си,стем ,е 1 на пове,рх ности
силикагеля под,вергались адсорбции жсоциаты фермента с субст­
ратом .. В системе 2 1П1роисхощило связывание фе,рмента с с убпр а ­
том . на модифициро,ванной лецитином ,'Гiо верхности тве рдой фазы .
И, наконец, в системе 3 удалось проС Jlед ить активацию ад сорб­
ционно-,им ,мобилизова 1нной фосфолипазы D.
Из пред,ста,вл,енных р,езулыатов мож11ю сделать ,В ЫIВОд, что ак ­
тиваци,я фо•сфоли1пазы D происходит незавсимо от того, к аки'\i
способом лоКiализова •ны фер'\iент и субстрат на г.ран ице разде .1а
фаз, хотя величина а·ктивнос,ти и хара ,ктер активации в каж д о~-1
конкре11ном случае различны. Если к адсо рбирован :но у~у н а сили­
кагеле ,су6с'Грату tдобавляют фермент ( система 2) , ,по лученные ре­
зультаты у~кладывают,ся в . прямую линию ,в коо рдин атах 1/А от
1/ [а] (рис. 1, г, д), гд е [а] - концентрация адсорбента. Констан ­
та Ка, определенная по точке пересечен ия прямых с ось ю аб-:щис,с,
не зависит от концентрации ферме.нт,а и субстрата. Это оз,начает ,
что на поверхности силикагеля имеется с11рого о:пред,еленн,ое кол1-
чес11вю центров , на которых воз-можна ад,сорб,ция фермента и суб­
страта, приводящая к активации фосфол ипазы D. Совп а дение
ко,нстант Ка, -вычислен,ных из ·рис. 7, г, д, свидетельст,вует, что
центры для ад•сорбции фермента и субстрата яв ляют ся одними и
теми же. Константа Ка аналоги·чно 1юн,ста.нт,е К 1, ха ракт ер из ует
а,ктиви,рующую апособность сили ·каг еля ,п ри гидро ли зе фосфоли­
пидов на г~ранице раздела фаз в при,сутс11вии фосфолипазы D.
Та~ш~1 образо:v~, можно констатиро.вать, что активация фо сфо­
липазы D возм,ожна не толь·ко ,на гр а н ице раздела ж идкость-
. жид1кость
(вода - ор га ,нический раuтворитель), но и на гра1Нице
раздела жидкость - твердое тело (~воща
-
сили к агель). Однако
и в этом случае не в1с якая 11верда ,я пов,ерхность способна вы з ывать
активацию фер ,мента. Та,к, в системе ,в-ода - активирю ва ·нный
уголь адсорбция фермента или субстрата на поверхности твер­
дой фазы ,не ,приводит к активаuии фооф оли,пазы D (табл. 2,
рис. 8). По -в идимому, сильное ,гидрофо бное овязыва1Ние с поверх­
ностью угля делает невоз:v1ож,ным образование прюду,кти,вных фе р ­
мент-1субс11ратных к,омпле;ксов. Более того , добавление активиро­
ванного уг,ля .в сиеnему , в кота-рой фосфо лишаз у D ак тиви р о,вали
диэтиловым эфир,ом или ДДС, снижает ско рость ре,ах,ции (рис . 8).
Этот факт означае т, что адсорбция фо,с фоли1пазы D 1на т.ве.рдой
поверхности предпочтительней ее адсорбции на слоях ле цитина,
216

лаюализова -нн о г о на грани,це ра;здела фаз двух несмешИ1вающихся
жидкос тей или мицелл, образо.ва1нных ,су,бстратам и ДДС. Этю
подтш~рж дается и тем, Ч'ГО при за , м,ене активированного угля си­
лика •геле :vr в аналогичных опытах также на-блюдае11оя ум,еньшение
скор ости реа,1щии, и1н,ицищрова1нн,ой диэти,ловым эфиром или ДДС ,
но пр и у,величении количеств ,а силикагеля скор ·о·сть реа ,кции вновь
ржте т из -за активации фер,мента, обу,словленной сили1каг,е;JJем .
Т а·ким образом, исследования с органическими ра1ств-орителя ,ми
и -силикагел,ем пО'казыв,ают, что кинетические эффекты .в т,аких
,си.сте ма,х полно:стью связа 1ны с адсор6цией фос ­
фолип а1з ы D на м·ежфазной поверхности и при­
всщ.ят к выводу, что каталити:чеокая акти~вность
фе:рмента дел,ик_ом определяется его адсорб.цrион ­
ной иrМмо,6,или 1зацией. Дейс11вительно, на поsерх­
но,с ти с·иликагеля, си:лохромов, бентонита и гид ­
ро,ксил а патrита фосфолипаза D может осуществ ­
лять ка·тали-з даже в отсу11Ствии ионов калыц,ия
(та,б.л. 2); при до,бавлении CaiCl2 скоро,сть реа ·к ­
ции ув,елич:ивается. Это, по-вщцимому, объяс­
няегс я т ем, что ионы ка.ль,1..щя создают упорядо­
ченны е сгруктуры на границе раздела фаз в
оистеме субстрат-активатор-водный рао1вор (Ja-
0,5
4
о
о
:':б..!~_J
о
200 400
.iш1-о,1 ou1copoe;r!i7o,мr
cobso n, Papahadjopo ulos, 1975; Yabusaki, Wells, Рис. 8. Влияние
1975), способству,я лучшей адсорбu,ии ф0rсфоJ1 и­
па1зы D. В полызу этого с·видетелыствует и тот
фаrкт, что мицеллы лЕщити,на, обраrботанные уль­
т,ра.з :вуком, могут пмвер 1гатыся гидролизу под
действ и ем фоофолипавы D и в отсутств,ии акти­
ватор ов; достаточно присутствия ионов Са+2
• (Daws o п, Hemington, 1967).
Пр едс тавленные выше р езул ьтаты п о казы­
вают, чт,о LВО()].орастворимая фосфо,л.ипаза D мо­
жет акти вироваться соединения~1и, знач,ителыно
силикагеля и ак­
тивированного уг­
ля на фосфолнriа-
зу D.
J - СИ Л НJ<Згель, 2-
сll(ТI-IВИРОВЗННЫЙ уголь ,
3 -CИJll-lf(3Г e.ilь с диэти­
ловым эф:-~Jюы, 4 - ак ­
т11оиро13;знный уголь С
Jt JIЭ T l tJIOBЫM эфиром,
5-с нл икаге ль с ДДС,
6-активированный
у голь с ддс.
различ а ющимися по физико - химическим свойствам . Это позво­
ляет пон ять, почему основные характеристики фосфолипа з ы D,
изучен н ые в опытах in vitro, противоречивы и за висят в зна­
чит ельно й степени от вида лри,м.еняе м ого активатора. Можно
nр ед:пола гать , что ,в э,к,сперим ентах ,с ,различными актиrваторами
физич е-ское оос тояrние пО1верхности раз1дела фаз, содержащей ,суб­
страт , и раопределение функциональных np yпn на 1по,вер х ности
неоди на ковы. Поэтому, естественно, каталитическая активность
фО'сф оли пазы D п:роя,вляется лишь в тех ,олуча.ях, 1югда состоя1ние
повер хно,сти. субстрат.ных образова,ний «1оконструирю•ва ,но» опре­
делен н ым образ,ом. Так,, предпочтительн,ее актива~ция фермента на ·
монослоях лецити~на, а.дсарбиро,ванного на .силикагеле (рис. 7, 6),
а .м,о но-сл ой из молекул лецитиrНа, ориентирова ·нных прютиво:полож­
ным об разом (на по.вt:1рхнюсти активированного угля - рис . 8,
табл. 2), не,опасобны придrать фосфолипазе а,ктивную конфо;р-
:ма,ци ю.
*156
217

Актшвация наблюдается ,на .nеци тино,вых с "1 оях, .пю,кализ о вал­
ных на гра,нице раздела фаз, образованн ы х нес меш ивающи.мися
с водой жидкос11ям,и (рис. 1), но не,возм,ожн,о пр отек ание ре а кц и и
в аналогичных условиях в гетероген·ных систем,а х , о6разов а н,ных
водой- и нера,створимыми опиртами (поми?1,ю октан ола) . Нек о т орые
низшие спирты, ,нап,риУiер н-бутанол, ;.ютя и о б р азуют нес ме ши ­
вающиеся с водой ,си,стемы, неспособны быть а ктиват о,рами фер­
мента. Гищролиз лецити1на не происходит на пов ерх,н ости ДЭАЭ­
целлюлозы, ДЭАЭ - сефадек1са А -50 , К:М-сефадекс а С-.50, 11вердого
додеци,лсулыфата кальция и ,окиси алюминия, а на ~цеол итах реа х ­
ция протекает со ,скорiОстью нес1юлько меньшей, ч е м с силикаге­
лем. Для цеолита NaA удельн,ая активность соста,в ляет 0,47 ед/\11·,
для ,цеолита СаА - 0,27, NaX - 0,29, СаХ - 0,59. В некоюры х
случаях ,на .блюдается неоколько экстремумов а кпшн о·сти ( Ра х и­
мов, Мадьяр о-в, 1977), соютветств у ющ и х н,еrско ,1 ы~ 11,; (1а 3 о в ыы ;,:,о с ­
тояниям в системе: органический растворите ль - ле ци ти н
--
вод,ный ,рас11вор.
Та!КЮ1 образом , ката л итически активное состоqние фо сфо"1и- .
пазы с,ледует расо1а11ри:вать ка,к адсорбционно - ю1,?1•!0 бил изо.в аннюе ..
Можно считать , что водора1ст,воримая сjюсфо ;ш паза D я,в j;яе т ся ,
скорее всего, артефактом выделения , а iB усл овиях in v iYo о на
связа,на с V,,e,1161paнa:vrи кл,ета,чных ча·стиц и Ф У'НIШИ·J•,Е1ру е т .в а ;1. ­
аорбир о•в,а1нно:v1 сюстоянии. Об это1:v1 косвенно овид етелыствуе т и то,
ч то .в некоторых исследованиях, в которых авто ры из у ч а ли t:с:о ч и ­
щенную фосфоли1пазу D, уда ,валось провести гид роли з ,в m р и,су т ­
ст.вии двух1валентных катионов без ,каких - ,1ибо а ктиватор~0в, а т ак­
же то, что, в,арьнруя услювия экстракции, ,1ожн о 'JЫ.n.o по луч ит ь
фосфолипазу D ка,к в ра1ство1рим -ой, так и ,в ,нерас тв-01ри мой ф ор~1 е
(Tal,valkar et а!., 1969 ) . Изучая ди,на·мику акт и в а,ц ии фос ф оJ1И­
пазы D при разрушении мембранных структур , Rou ghan, Slack
(1976) пришли к выводу, что фосфолипаза D пр едставл яет собо(r
структурный белок и не я,вля,ется ферменто:\1, а ее Еатал ити че-ск,а я
активность вюзни,кает лишь при на ,рушении стр укту,ры мем,бра ,н.
Это ,согласуе тся с утверждением, что фО1сфолилаз у D сл едуе т рас ­
сма тривать ,в ~роли ,своеобраз,ного «санитара» :--.-1ем6ргнн ых сис теч
(Dhaгшalingam, Jayaraman, 1972) .
Несмо11ря на то, что водо·раств орима,я ф,о,сфол: ш аза D н е о б ­
л·ад!ает каталитическюй активностью, изучение ее а,кти,:аации -в раз ­
лшч ,ных у,словиях :\1ОЖет дать ценную инфо1рмаци ю о ф,е р ,•rе-нтатив­
ных процесса х, протекающих на границе разде .~а фzз, и п;с,,ото ­
рых закономерностях гетерогенного ферментативн ого ка тализа. Не
исключ,ено, что чи1сл:о Фе1Рменто,в, кюторые теря ют i1.iJ И изм е няют
свои каталитические свойс 11в,а при переходе из м ем,6,ра ,нной фазы
в ,водную , не огра,ничивается фосфолюпазой D.
218

ДЕИСТВИЕ ФОСФОЛИПАЗ НА МЕМБРАННЫЕ СТРУЮ У IР'Ы .
РО'ЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ
Химические соединения, исn~ользуемые для и1н,и1ци ирования:
ферментатJI1В1НОЙ ,реаюции, модифицируя поверхно,сть суб,ст,рапюй
•
фазы, могут 11а 1кже влиять на каталит,иче,с,кую актив но,ст ь фоюфо­
липазы и активирующее действие ионов кальция и т ем самым
искажать резу,ль11аты. В ,овязи с этим изучено действ ие фосфоли­
пазы D на мем•бр,аны о•бработан:ных ультразву~кам л и п осом , ис-­
кусст,венные ,бис•л,ойные фо1сфюлипидные мембtра,ны ( БФМ), •мем­
браны ,митохонд,рий и м.икросом, не требующие П!р и,с у тст,вия в
реакцио,нной среде и~нициаторав химиче;с1юй юрирод ы ( Рахимов
и д,р_, 1978).
•
Как следует из предыдущих разделов, водные ди сперс ии л еци­
тина, не подвергавшиеся действию ультразвука, не расщ епляются
фо,сфолипазой D даже в ,присутствии ионю.в кальци я . О бработка ,
субстрата ульт,разву1юм изменяет свойст,в,а бимол е,к у .1я1р но го слоя
липосом ; модифицируя их размеры и кривизн у по,в ерхн о,ст и, и тем
- самым делает в-031:vrожным ферментати,в1ный гидро .1 из ,на их по­
верх,но.сти. В от,сутст1вие Са+2 гид1ролиз фосфолипид ов липос о м н,е ·
наблюдал,ся, а п:ри доба 1влении ионов кальция их ,оп ти мальная ,
хонцен11рация за1висит от в р е.ме,ни обработ ю1 л 1ш ос о \ r у л ьтр аз ву­
ком. Для лишосо~-r, облученных .в течение 5 'II ИH, опи чал ь ная к о н­
центрация ионов Са+2 составляет 4-14 мМ, в 110 в рЕУ\1 Я как по,сле ·
ТО-минутшой обработки ультраз,вуком фосф ол ипиды л и,пос о м р ас­
щепляли1сь фосфолип,аз о й D с махси:vrальной ск ор о с ть ю пр и 20-
3:Q мМ CaCl2. При исследова,нии влияни.~ ионов ка л ь ция при раз ­
личных ыонцентрациях субстрата на скорость гидр о .1иза о з ву чен ­
ного лецитина фосфолипазой D были определены па р аме тры этого ,
•
мкмолей холI;1ы ·
пр одеоса: максимальная скорость A~r a"c = 0 ,45------- и кон­
мин-,1г
станта а1{тивацш1 К,,= 9,9 м lVl, характеризу ю щая акт 1ш ирующую,
спосо бность са + 2.
.В случае действия фосфо.липазы D на БФМ с ти1мул ирующий:
эффект ионов ка,льция также цроЯiвляется и зависит о т р Н среды.
Бели время ,раз•рЫlва БФМ (тр) в о-псут,ствие Са+2 равн ,о 90 мин,
то время, необход,имое для разрыва би;слоя, зна'Чи тель но сохра­
щаетоя при ,в,вед,ении ионов калыция ,в субфазу. На1n~р имер , 10 мМ
CaCl2 снижает тр до 12 .ми1н при ,рН 5,6 и до 40 мин при рН 7,0,
а 20 мМ Ca.Cl2 - до 2 и 20 м·ин, 1соо11ветс11венно. Т ак и 'М 1об,разом,
фосфолиn,аза D ахтивирует1ся ионами кальция и при де йс т·вии на
фо1сфолшшщы, упорядоченные в бислойные мембраны.
•
Не,околько иные ,результаты получ,ены при изучении дейст,вия
фосфолипазы D ,на фосфолилиды биюлогичеоких мем бр ан. Из,ме­
нение активности некоторых ме.м6ра,нных ферментов митохондрий
и ми1кро;сом . является чу,вс11витель:ным тестом д,ля об наружения:
действия фосфолипаз на фосфолипиды этих органелл. В работах
Рахимова и др , (1977 Б, 1978) 1по1каза,ны из,мен,ения акт и~Вно_стей.

НАД . Н - 0 1~с ид азы, сук ци,нато1кидазы ·и цитохром с-оксидазы при
дейс тви и фосфолипазы D на митохондрии. НАД.Н - окси даза и сук­
цин ато ксидаза инактиви1р у ютrоя •Пlод ;дейст,ви,ем фер1мента и в от­
-су т с твие ио,нов Са+2 , в то время ыа,к ц,итохром с - оiксидаза в этих
услав и ях не лодверже,на дейс 11ви ю фосфолипазы D . Добавление
в c иc,c :vry инкуба!Ции только 2 м,М CaJC \2 значительно повышает
,окор о,с ть инактшвации в1сех трех ферментных систем. Дальнейшее
пов ы ше ние ыон,цен-граци,и ионов Са+2 (5 мМ, 10 :VI ·M и т. д.) не­
знач ите ль,но изменяет ,скорость инактИlва;ции в изучаемых си,сте­
мах, но одновремен,но с р,остом конценnра,ци-и кальция прlQисход,ит
стаби л из ация инакти~вирующего действия фо~сфоrли~пазы D (осо­
бенн о .при вре,мени инкубации больше 1 ч).
П ри действии фосфолипазы . D на АТФазную систему микросом
мозг а о бнаружено, что р,а,сщепление фосфолипидов этих 01ртанелл
П1рои1схо дит и в отсу nст~вие ионов Са+2 (Рахимов и др., 1978) . Этю
дейст ви е сопровождается уме н ьшением (30 %) активности Mg+·i
АТФ аз ы и у,величением а1ктивности Na+, К+ - АТФазы в 1,3 раза.
При чин а увеличения а,кти1в,но-ст,и этого фермента при гид,рол'изе
фо·сф ол И'п,идю,в :vшкроюа~м заключается в то.м, что фосфолипаза D
н е сп о со бна расщеплять фо офагидил серин, необходимый для функ ­
цион ирования Na+, К+ - АТФазы (Burs t ein et а !. , 197 1). В при,сутrст ­
в ии 1 мМ Са,С\ 2 эфф е ктивность дейсгвия фосфолипазы D н,а АТФ­
азну ю с и,стему у м еньшается, а до·ба1вление 1О мМ СаС \ 2 1Тюлно,стью
сни ма,ет эффе1кт этого фермен'Га. В этrом случае ,ионы кальц'Ия
высту;па ют как ингибиторы фосфо·липазы D. Да.иные о дей1стr.вии
фосфол ипаз Д;ругих тишав на мембран ные А ТФазы ,приве1дены в
ста тье Н. М. Ми1рсалиховой дан.наго абор-ника.
Т аюю1 -образом, эффекты, по лу чаемые при дейст:вии фосфоли­
па з на :v1е:vr,б1ранные ,с истемы, в значите.ль,ню й степени за;висят от
вида :vre :vrбpaн и т ести·руеУiых акпшно,стей ,полиферме;нтных систе.УI.
В ,св язи •с э т им 1в дальнейше111 изложе.нии мы ограничились лишь
:мемб р а·нами митохондрий и ис1след0~ва ли ,дей,ствие фосфоJiи,па з
~разл ич ного лроис х-ождения (фоофолипаза А2 яда кобры и фю,с фо ­
JIИпаз а D) на шолиферментны е ,системы дыхательной це,п,и мит.сJ ­
,хонд рий . При вrведении очищен.ной фо1сфолипаз ы А2 яда кобры
неп оср,ед1с11венно ,в ,поля,рографичес,кую ячейку сниж,ается ,ско1рюсть
1пот ребле н·ия кислор,ода интакгными 1мит,охондри,ями П1ри окисле -
1нии 1су16:стратов. Величина еффек т а зави-сит ,о т ,концент,рации фе-р ­
:м ента и не з1а1ви1сит от ,вида ,су-б~стrрата (сукци,нат , а -кетоглута:р•ат).
С ~п овышением ·количества фосфолипазы А2 1до 1,6 - 2,0 'МiК•г/мг
б елка ~,rитюхондрий 1скоро1сть ,окисления ,суыцината снижается. Ба ­
.лее выс о11ше концентра,ции фермента, на1пр,оти1в, ,повышают ою ­
рост ь ок исления ,су1юцината ,к,ислюродом . .В то же ·время :с,коро,сть
,окис ления ш п ри,су тств,и·и АДФ и .пО1сле его исчерпа,ния mродол­
·жает ум еньшаться при тех же кон ц ентрациях фермента, что сви­
дете льс твует о ,снижении дых, а11ельнюго ·контроля и от н ошения
:A.DP /0, ,которое ,выше ,кон1цент•рации 1,6 мкг/1мг 1белка м.итохо нд ­
рий п1р а1ктически ,равно ,ну.лю. ,Следовательно, ,при дей1стшии на
.2 20

.инт:акт,ные :vштохо,ндрии фоюфо.ли,пазы А2 прои1сходит разо бщен ие·
окислителыюго фоюфюрилИ1ров1ан.и,я и и,нгибир,овани ,е ,проце.с,са пе­
рено,са электронов !ПО дыхат~ель·ной ,ц,щи.
Если осущес'flвлять 1предвари тель,ную инку,бацию :vштох онд рий
с ферментом rщри 2°С, можно наблюдать кинети1ку разобщ ающ его•
действия фо,сфо,лишазы из яда 11юбры. Уже лри ,1юнцен тр а,ции
0,004 мкт/мг бел~ка скюрость окислен,ия ,су1щината .в нач аль·ныи:
период растет ,из-за ~разобщения дыхания и фоюфорили ро1ва ния
(зна,чения ДК и ADP/:0 ,ум,ен ьшаюТ1ся), а затем ,скорость окисле ­
.ния ·С'нижа1е11ся по сра~вне,нию ,с .максимальной. При 1повы ше,нии
температуры инкубации (20°1С вместо 2°С) 1все эффы<ТЫ у~с кор,яю т­
ся. Полученные данные ,свидетел ь,ст1вуют, что •в результа те ката­
литическоло дейс11вия фосфолипа-зы А2 на гидра,ли.з фосфю mшидоJз.
в мемб~ранах митохондрий пrротекают ,процеосы разобщени я о ки,с­
ли телыюго ф оюфо,рилирова,ния и ,ингибнрова,ние ,пер,еноса э лектро­
но•в пю •сукцина11оксидазной ~системе. Эти за1ключен-ия в цел ом ,сог­
ла•суются ,с ,вьшодами ,суще,ствующих 1пу,бликапий 1по де йс11вию
фосфолипаз на интактные митохондрии (Кхолэ и д р . , 1980).
Инкубиrрование с фоофолишазой А2 по,лно,стью разоб щенн ых
митохонд,ри.й. та1кже ,при1водит к уменьшению акти1вности с уюц :ина­
токсидазы и ротенончувствительной НАД. Н -·оксидазы (ды хатель ­
ная цепь). Чем ,выше ,1юнцентра,ция фер,мента, тем ,бы:,:трее под ав­
ляе11ся акти,вность этих фер1ментных систем, а 1в ана,лопгч ных у,с­
лов,иях изv,ерени ,я повышается а1ктивность ротеноннечув-ст вител ь ­
ной НАД. Н-ок'сидазы (че~рез цитохром вs) и цитох,ром с-01~сид,аз ы .
На рис. 9 показrа,ны из,менения суwцинат - .и НАД. Н-О1к•с ищазно й
актишюстей миТ1охондрий 1п од дей~ст:вием фюсфолипазы D 1в отс ут­
ствие ио,1-юв кальция. ,С ,по1вышени,ем дозы фосфолиrпазы D су кци­
натоксидазная активность юнижается, чт•о ,св.идетель:ствует ,в iПОл ь­
зу того, что фосфолипаза способна функционировать и в отс утств и е
добавлен.ных и-з·вне ионов кальция.
Во-змож,но, для активации достаточно присут,с11вия эндогенных
ио,нов @алы ция, ,JJО'Каль:ная концентр, а1 ци я ,ыоторых 1 на лра н ице раз­
двла фаз может отли1чатыоя от 1оредней ,концентраци и . НАД. Н - Оlк ­
сщдаза в 1при,су11ствии т,ех же ко1личес11в фосфюлипазы D .н ескю:лык о
актшвируе11ся, но с увели1чение.м ,времени инкуrбации (от 30 до
60 мин) или ,ка,нцентрации фер1мента эта активация исчезае т. Ф ос­
фолипаза D -вызывает инактив,ацию .и 1В случае ·сукцинатокс ида зы .
В при,сут,с11вии 50 мМ СаС1 2 в среде и,нку,бации эффект фосфо ли­
пазы D из·меняетtся, причем ,су1~цииатоксидаза и,на к тив и1рует, ся
ферментом 1с ме.ньшей 1с'КО/j)Остью. ,У.велиrчение 1концентра1цн и фос ­
фолипа:зы D rпра~ктичес.ки не 1прювод,ит 1к в·озр1жта1нию ин акти, ви­
рующего эффекта.
Прежде чем -предста'1вить ,да,нные о ,со.вместНОУI влиш-r ии С а+ 2
и фо·сфоли1пазы D, :приведем результаты ,по иона.:vr Са+2 . Низ кие
ко,нцен11рации Са+2 (до 0,6 1м.М) ·влияют ,на акти1в,ность у,казанн ы х
полиферме,нтных систем (ри1с. 10). Увеличение ~о,нцентра1ци и Са +2
до 8 мМ 1при,вощит к ~повышению , активности НАД. Н- о к,еи дазы и
221

-с нижению а·ктивности ,сукщинатоксидазы. Бели увеличить концен- j
трацию ,Са+2 до 60 ·мМ, проиiсходит общее пюдаrвление а,ктивн-ости
указа,нны х полиферментных ,с истем. Ио·ны ·Са+2 у,лучшают вклю­
чение цит охро'V! а с в мембраны митохондрий при невысоких кон­
центрация х, высокие же концентрации ионов кальция препятст­
вуют свя зыван ию цитохрома с с мембранами (за меру включения
цитохрома с принимается прирост НАД · Н - или сукцинатоксидаз-
ной активностн·). Если оценивать включение цитохрома с п о изме­
; нению НАД• Н - оксидазной активности, СаН в широком диапазоне
~ c.._1__1_, ~
~_......,_J_ J_,,,r.__j
о22•4DШJО2?40S'O
0.04
О.Б 4 В2(J40
[оiJим
,Рис, 9. О1(Исле1ше НАД• Н и сукцнната шIт о хо1-Iдрипми JJ ,1рисутствни фос­
фолипаз ;,1 1),
а - без ио нов_ са+~, 6-с S() ыМ СаС!:.!; !, 2 -сую~11 1 1ат, J,4 -"!IAД,H . Вре:-..tн и:1:<убаuии 30 м нн
(/,З)и60мин(2,4)прн20°С.
Р ис, 10. Влияние [са + 2 ] на НАД - Ни су;;н_;IнатоI,сидазу.
а-у л.е льная а1п Рн ность, 6- прирост э:сrивностн при до6а11лен11и ц11т ох роыа с; 1- НАД- Н - 01< ­
с11дзза~ 2 - сук ци1-1атокс1r даза .
концентра ций практически не оказывае:г влияния, а при концентра ­
ция х от 4 д о 5,0 мМ наблюдае11ся небольшое увеличение ЛА. Важ ­
ню отмети ть, что а·ктив,ность шолифермент,ных систе:vr ~1итохонLПJрий
и •процесс ~вкл ючения ,цитохрО1ма с после 1введе.ния Са+2 ,разви ­
ваются rво ,вре:v1ени. Та1к, ·в течение 30 ,мин прирост сукцинатоюси­
д,азной , а,кти вности, ~вызываемый добавлением :цитохрома с, по,вы­
шает,ся в 3 раз а, а бо,лее щлительная и-нку,ба·цля митохо,ндрий 1соп­
ровождаек:я ~потерей ,апосrо.бности их мем:бра,н 1овязывать цито­
х1ром с.
Фосфо липаз а D разрушает участки мембран, способные вклю­
чать цит охром с. Ио.ны .Са+2 .повышают каталитическую а,кти.в­
но,сть фо,сфолилrаз ы D ,в начальный период инкубации, а затем
222
/

фосфолИ1па за D -;перестает дей1с11вошать на П1роцеос ,включ,ения ци­
тюхрома с. С дру гой ·стороны, 1по мере уrвеличения време-ни инку­
ба ц ии ,с фое1фоли п1а:зой D И1нтен~сив,ность расщепления у~ча,стков, от­
ветственны х за вк,юочение цитохрома с, ,становится ,более ,чувс11ви­
телын,ой ,к ионам кальция. П:ри неJбольшой продошжите.льно,сти ин­
кубации ,н изкие конце нтрации ,Са+2 (2-.5
м-М) ~предохраняют эти
уча,стки от дей1ствия фосфюл иrпаз ы D, однап<о те же уча,стrки меУiб ­
ран ми·юхонд1ри й, подвеrрга.вшихся д.лительной тепловой дегр ·ад,а­
ции, ра,сщепляюгся фоrсфолиrпазой D .при любых ,концентра ц иях
Са+2 , особен но при ~высоких (30 м·М). В эт,ом -отношении 1н-абшо­
да,е11:я ана логия •с дейстшием фосфолишазы D 'На с11рукту,рно ,неор­
ганизоrванн ые си-стеt:vr ы фо1сфошшидо1в в опытах in vitro (см. шыше),
к,отд а опти мальн ая концентра:ция Са+2 ,состаВЛЯIЛа 30~50 ,мм.
В митох он.1ри ях НАД.Н. окисляется кислородом двумя неза­
:виси м ыми пут,ями, каждый из которых является цитохро:vr с-зави­
симым. Один из этих путей юкисления ингибируе11ся ротеноном
(внутренний путь окисления). На рис. 11 представлены резуль­
т,атЬl разд ел ыного ОП!ределения 1с1щростей окисл,ения НАД. Н по
в.-rут реr-шем у и в;rс шнему путям с различными концентрациями
Са+2 , а также влияние ф.осфолиюазы на лрощесrс термодеградации.
Вид.но, чт о П1ри инку~бации .митохонщрий rпри 20° их НАД. Н-ок,си­
дазная а,к ти- вность несколь,ко повышается, а затем ~Происходит
мед.:,енная 1-ша·кти1ваци,я этой по.r~ифе,рм,ентной ,системы. Бели про­
води т ь измерен и я 1в лрис у11ствии ротенона, аналогич,ные за 1виси­
мост и носят иной характ ер: НАД.Н - окси дазная активность пос­
·тепе,н но п,овыша ,ет1ся ,по ·мере инкубации. Такие же за,ви1си:v1юсти
с 2 мМ Ca,C l2 отличаются ,лишь тем, что воЗ1растание ,ско1рости
оки,сле н ия ,п о внешнем:у .пути становиТlся более интен -с и:в1ны :vr , а
внутрен.ни й 1луть окИ1сления ,нарушается в большей ,степени, пo1cJie
того 'к ак д ост~иается эюстремаль, ное зна , чение сКJор:о сти ок иi с л ения
НАД.Н. У1ве~.rшчЕ1н ие !(Оли1чества СаС12 до 30 мМ вызывает юроти­
,встоложный •эффект : фаз.а акти1вации ,сохраняе11ся , окоро·сть ина ·к ­
тивации юн.иж,ае тся. При этом а1кти1вация ПJроцесса -оки1сления
НАД .Н по ,внешнему пути 1ста,навит1ся более з•н,а ,читель.ной. Ха1ра'К ­
тер кр ивы х : практи чески -не изменяе11ся в тюм 1с1лучае, е1сли у.к , аз,ан­
ные эксш~ри,мент ы лр,овести :в 1присутс11ви.и фосфолипазы D. Бе з
и онов Са+2 фоофолилаза D 1неок10лыко ·у~ силивает а,ктивацию п о
внешнему ~пути ок исления на ,нача,ль,но:м уча1стке ·кривой, 'НО зате:,1
на-блюда ет ся мед ,1енна,я и-накти.вация.
При ра1с:::м1От•р енш,г о·ки1сления 1по ,вну11рен1нему rпути 1вид,но, чт о
ф осфо липа з-а D :в ю11су 11сnвие Са+ 2 увеличи1вает юко1расть акти.ва,ци и
дыхателЬ'НIО,Й цепи и последующей ее и,на,ктиваrц·ии. ,В присутст,ви и
2 :viM Са-С 1 2 фаз.а ·актшва:ции исчезает и .проиrсх,одит и.нтенси,вная
пот еря митох он,д риями ,с1пособно'сти окислять НАД.Н по внутрен­
не,1у шути. Пр·оцессы -а·ктиваuии, вызываемые инкуба1цией :vшт о ­
хонд р ий с ионам и кальция, в основном происходят за счет изме­
нения. 1скорО1с ти тш :ления НАД .Н ло в·нешнему ~пут и, а м,е<сто дей­
-с т,вия 1деr~р ад~ти-вв ых 1п,роцессо,в - ~внутренний ~путь окислею+я
223

НАД.Н в ~митох ондриях. Та,ким образом, фоюфолипаза D, ,не из­
меняя .с,ущео1венно хара,ктера процесаав делрада,ции, уюко•ряет и х.
Тепловая денатурация сукцинатоксидазы с 2 мМ СаС 1 2 про ­
текает в 2 эта:па (1ри,с. 12): на п,ер,вом шроисхrодит ,отнО1сительно
бьгстрая ина-кти1в,ащия до 40% от ~перво начальной а'КТИВНОIСТИ, а 01с-
11авшийся уровень сукцинатаксидазной а,ктив,но-::ти 1пр,акти1чеоки
не изменяе11оя, и ,лишь пю,с,ле 2,5 rч насту1пает и,нактивация. 1В ,при­
с'у11ствии ,3:0 ·мМ 1СаС 1 2 инакти1вация 1на шер,во;vr эташе 1пр оисходит
быстрее, а :на •в110,ро,м за,медляет,ся . Ионы к,альция при низкой
о1020•зоО
[Со+2;мм
10 20 J(,
Рис. 11. Действие фосфолипазы D на активность Н АД• Н- о к сида з ,1 митохон­
дрий ll ри разjjичных к с, нцентрациях ион ов ка ль ция.
n, г-без добавок, 6 д-с 2 мкг ротенона, в. е-разн· ца между -а· (.z") и .6" (,д"); /-до­
нача .1I а 1ншубацнн , 2 -ч ерез 1 ч, 3-3, ч, а, и, в- без фосфоли ~н1зы, .:, u, е-с фосфолипuзой.
Р ис. 12 . Действие фосфолнпазы на апивность су 1щ ннат о ксидазы митох онд рий .
а, в-нзменен1iе скорост и 01<ислен1ш сукшн1ата при ию.;убацин ~што :-.: о :1др ий при 20°С, 1-без
нонов са+2 , 2-с 2 м1\-\ CaCJ 2, 2-с 30 мJ\\ CaCI']; 6, г- влияние ннкубани 11 митохондрий на ха­
рактер заонси1'.•1ост1! а!п и оности су1ащи а токс , , да:1 i,I от /CaCJ:?], j-:) ~1; :н ш--:1 .;:уба щш при 2осс, 2-
2U I-.t:iH, J-l ч, 4-2 ч, 5-Э ч, 6- 4 ч, 7-5 ч; а, 6 - без фосфо.,н111аэы; в, г-с фосфол~шазой.
1шнцентращии (2-·1О мМ) деста,билизируют :су1щинато.к-::идаз1ную
си1стему, с у1вели,ч,ением же 1концен1'ра:ции выш е 10-,15 м,М ,сни­
жают ,степень делрада,ции . В лрисутс1шии фосфолН1пазы D ина:кти­
вация без СаС1 2 ускоряется; то же происходит и при наличии в.
ере.де 2 или 30 ,мсМ OaCl2, но 1на ,начаm ьном участке кр и•вой . Фер­
мент активщруе11ся малыми ·коН1центрация·м,и rCa+ 2, . а высопше дюзы
Са+2 ,снимают .литичеrский еффект фосфо.ли1пазы D.
На 01сновании •при~веденных резул ьтатов ,~1ожн-о сделать O1е­
дующие ВЬJВIОДЫ.
Низ1кие 1юнцентрации Са+2 ,не из.меняют слоrс обности ,щпо х1ро ­
ма с включатьоя :в мембра,ны митохО1ндрий, не ,под:вергавшихся
тепловому вюз,дейо1вию. Более 1выrсокие ктщент,рации с1по1с'обст-

вуют л,учшему ~включению цитохрома с, что, 1по -1ви:димюму, •связано,
с действием эндогенных фосфолипаз на мембраны митохондрий.
Экзогенные фоюфолипа,зы А2 и D также оrюсабст,вуют IВКлю чен ию­
цитох:рома с.
Инкубация митохондрий при 20° вызывает потерю и ми спо ­
со·бtню.::ти включать цитохром с. Ионы Са+2 предохр ,аняют ми110-
хондрии от деград,ации, ~приводящей к ,потере способности ~вклю­
чения цитохрома с. _
Расщепrление фоофоли•пидов мембран митохюнщрий обус лов ли­
вает потерю ими ·апособности 1в'ключать ,ци11ох1ро:М с ,как в ,при­
сут,ствии, 11а'к и в от,су11сгвии ноно1в ,кальция. Вкюочение ·В Н АД.Н­
оксидазную систему в отсутствии Сп.+ 2 теряется не п~:>Лно сть ю, а
включение в сук,ци,наток,сидазную .си,стему - прак тич ески до
~юнца.
Пара,ллелыно ,с потерей митохощдр.иями •СПОlсобно·сти включать.
ци·юх,ром с падает ,спо,собность митохон,11.риальных ~,~ем,б1р ан свя - •
зы,ваться ,с ·э.кзогенными фосфолилазами, вследствие чего длитель ­
на,я · иН11<1уба,ция митохондрий с фосфолилаза,ми ,соmро,вожд,ает,ся
«1са,моин,гиби·рованием», ч110 -пр и 1в ыс01ки х 1<1он,щен11рациях С а+2 ,вы ­
ражается •В лож.ной ,стабилизации 1по1Лифермент ных систем .
Раз,лич1ные фрагменты цепи ,пер,еноса э.лею1ронов об лада ют
неодинаковой чувствительностью к модификации химической струк- _
туры фосфоли пидо1в. Та·к, д,ля ,сукциона11окси:дазной и НА Д.Н -,ок­
си1Дазной цепи важна ,целост,ность в1сей фоофолипи,д.ной молеку лы :
отщепл,е.ние спи1ртового остатка (фоофолипаза D), фос фат нюй
груллиров1ки ·оо с1пи,ртовым ост,атком (фо,сфоли,паза ·С) и ли жир­
нокнслот,но го ,о,ст,ат,ка (фосфоли,па,за А2 ) в одина,ковой степе ни
при1водят к ингибирова1нию фун1к,ции переноса электро·но1в ,от у,ка­
занных ,су~бстраш1в к молекулярному ,кислороду (Рахимов и дtр . ,
1981). Меньшая подверженно,сть дегрiiдации НАД.Н-окс ид'аз н:ой:
функции по сравнению с сукцинатоксидазной объясняется тем, что­
НАД.Н О'Кисляет1с я ми ·гохондри,ями шо ,внеШlнему и вну1iренне:v1у
путям . Действительно, ротенончувствительный (вн у тренн ий) путь.
01шсления ингибиру.ет,ся фосфолипазой А2, а скор,о,сть переноса
электронов 1по ,ротено.ннечувrствителыному лути окисления лри ог­
рани,ч енном ,гидролизе ф,о.офоли;пи,11.ов во31ра1стает, так .к ак •при
этом у1вели чи,в ае11ея окюр,01сть ~наиболее медлен,ной стадии - 1 п·ере­
н О1с электj)'ОНОIВ через цитох,ром bs.
Для цитохром с-окси~азы важно нали~чие 1в ,~1олекулах фо:фо ­
лиш-щов именно фсюфат1ной группировки, та'К как ,при действии
фоrофолипазы А2 и фоофюлипазы D активность ,цитохро м с--окс и­
дазы .не уме:ньшается, а фоюфолилаз-а С приводи т к ее ин а·кти ва­
ции. Повышение · акт.иВ1но,сти, наблюдаемое в некоторых эн~спе,р и­
ментах, связано с условиями измерения активности, так как при
ограниченном ги д ро лизе фосфолипидов улучшается включение и
диффузия цитохро,1а с в мембранах митохондрий .
Образо1ва·1-ше ко:v,~;плек,сов ти,па ,фосфолипаза-Са- фо,сф оли пид яв­
ляе11ся ,одним из н,еобхо'димых условий для вз,аи,-,юдей .стви,я этих
15 -156
225-

ма к,ро;vюл е к у,1 ,с биолюгическими мем~брана>v1и. Не исключе,но, что
в т а ·к,ом ко мплеt!(1Сообразова,нии уча ствуют и некоторые ,щругие
1юм1по ненты самих мем•бран .
Из экспе р именталь·ного м·атериала, ,при1веденного выше, с,ле­
ду,е т , что 1В на 1стоящее ,вipe:vrя уже и:v1ею11ся д., а,Нtные , ,которые поз ­
вюл яю т решить не,1юто,рые ,вопросы общих проблем ме.м6ранного
катализа, ,в ча,с1шости эк~слериментальнот о обоонования возмож ­
н ости рег ул яци и ,скор ос ти •пр-отекания фер ,ментативных про1це,ссов
пут е м из Уiен ений фаз 01вых ,с остоя1ний нерастворимых - ,субс11ратов.
С р еди пол у ченных рез ультатов, которые имеют общий харак ­
тер и •пред с тав щ1ют -це н·ность при решени и воП1р,осов мем·бра,нного
кат али за, .не о бх0~ди1м,о выделить данные ,по -активации фо,сфолипаз
на пов ерхно с ти 11вердой фозы и 1возмож1ности фуНJ1(1ционирю.в,ания
фе рл1 ента в в,од н о - орга 1-шче,ск·ой среде , по пов,едению фосфолипаз
в :v1ембра,нных и ,1оде,1ь·ных системах.
Сле циф и че с 1,ая л о1ка :шза•ция фер.,vrентов на гра1н ице ~раздела
фаз, ·ючнее, на молекул ах ,субст,рата , образующих структурирю­
ва1нн ы е ф о~оф ол и1пид1ные к ом1п л,ексы или ,1е,1браны, явшяется необ­
ход и м ы1м эта по.~1 оiсущ е-:.: т1в~1 бн и я фер,1ентативного ,процесса , ,в ко ­
т о ро м моrу т у ча1ст1в,о в ать и ионы каль,ция. Вы сокая скорюсть реа •к­
ции и из-бират елЬ'н о сть .в отнош ении ,с ос то я,ния су,б стр,ата, дости ­
га емые в ,си.с те "v11ах ,с ,ра з.в и той границ е й ~раздела фаз, сшидетель­
ст1В'у ю т о 1ю ,шле:vrентарности фер;v1,ент- суб~стратных ,взаимодеt11ст­
nи й. Пр и 1г о;уюген1ном фер,м е,нтатиJЗ1ню~1 ката л изе у-с1овие 1ко:vшле ­
ме нт а р ности •пред,усм а три,вает юоотв е тс твие
св,язывающего и
1, ат ал и тическо го уча,стков а1кти1нного ,центра фермента ,и химиче ­
•ск ой с т,р унп у ры субс nрата. При ра.со1отр,ении гетерогенных фер­
м ен т а ти вны х реакций решающ,1ми яв л яются первые стадии про­
цес с а, коrща п р ои,с х од и т ,вз,аимод е й,ст,в ие водюраст,воримого фер ­
ме нт а с повер х ность ю н ер а створимо й субстратной фазы или,
напроти.в, 1ад,с01р6ция и ,п р·он И1к н овение В С\,:J,О•ра.ств оримого ~субстрата
в водо нерастворнмую фа зу , в которой локализован фермент.
Мо жно юре,щположить, что тр,ебование комплементар,н о1сти ,в
сл уч а е липолитиче~ски х ферментов nр еду смат1рнвает не тольк•о' ,со ­
о тве 11ст,вие х им ичеспюй. структуры ,субстрата и у,част1ко1в актив11юго
• цен тр а фермента, но и сою 11ве'Гствие ,струкуры ферм .ента и ,пове,рх­
нос ти ,су6стра11ной фазы. Дей,ст,вительно , в состав,е мо.лекул, ли1паз
и ф о,сфолил.аз обна1руж е,ны специа ,льные уча1с11ки («·контактны е
груп п ы », «я·к·ор-ный центр», «.центр узна,ва,ния ,межфазной п ове1рх ­
ности», «адсор.б~цию.нный уча стою>), •от,ве11ствен1ные за «узна 1вание>>
со стоя,ния 1пюверхно1сти 1су6'страт,ной фазы, которые :ттро,стра·н1ст,вен ­
но отд елены от св,я.зыва ю щ е го и ката ,литичео~ого у,ча ,стк о,в акти :в­
ного ц,ентра. ТакИlм об р азом, требова ·ние 1,0 ,vшл емента ,рности ,пред­
пол ага ет •воэ :vюж1ность р егуляции каталитич еской 3iктивности ф е р ­
м е н то1в , ф ун к,ционирующих в гетер огенных условиях, с одной ст о ­
рон ы - ,пут е :vr измен ения с11ру,кту1ры фер:vrента, а с друг ой
-
пу­
т ем изм енения фазового ,состоя·ния •субстрата .
Сос тоя.ни е субстратной фазы ,при в,сех ,прочих р,а1вных у,сл о­
вия х - оди1н из ,наи·более важ·ных факто1ров, определяющих ос-
226

tv
'"'
-1
,,
Таблица 3
Некоторые параметры реакцин гидролиза лецитина, I{аtализируе мой фосфолиnазой D (Мадьяров, 1977)
Акт1-;сnтор
Д11эт и лов, 1 й эфир
~,т ила1\ етат
11 итробе11зол
Бс1-1зол
DDC
С 1-1л11кагел 1,
Без активатора
Субстрат 11 его состоя~1 11е
Лецити н , ламелярное сос­
топнне
Лецит1111, смешанные "и­
целлы
Лец11тин. адсор С. 1111 0 1-1н о-
11~1"1Об11лизJваш11,1i-i
Лец1"1т1-111 , липосо~11.1, rб­
работанные ультра з оу~ом
Фосфоли1111д:,1, БФМ
Фосфолип1 1 д:,1, мем6ра11ы
l,!11'i'O\OliД!)11(r
/ Фосфолнпнды, ыембраны
M111 ( pJ COM
1
J' Д Е' ЛЬ1-18Я
аIпиоI - Iо с1ъ,
.
ед/мг
0,7
0,34
2.0
1 ,36
3,7
2,2
1,4
1
Конuентрацая 1
1,:or-1O0 1.;а ль~
ц1,1я, ыМ
1 60- I00
1
50
1
50
1
5')
40
1
2()
1
о
8
4
2
Ингибнт о р
Темnературны~"1 оптимум не определен из-за летучест,и ,ll{Тиватор , в,
рl-l-0 1 , тимум
5,6 прн 26°
5,0 и 6,0 при 31}0
5,5 11р11 30°
6,4 при 45°
5,5при30°и45°·
5,5 и 7,0 при 30°
и 45°
6,4 при 3()0
5,G и 7,2 1ри 45°
5,6 7,5 11р11 3ij 0 11
45°
5,7 11 7,0
5,6 и 7,2 при 30°
56117Апри30°
6,0
7,2
Теьiпературный
оптимум
*
*
*
*
45°
30° при рН 5,6
4;:;0 пр11 рН 7,5
36°

но,вные ,пара'v1е11ры фер,ментативной р,еакщии (табл . 3). Скорость.
реа·кц ии за:висит от 1сост,оя,ния субстрата, на'при:v~ер, .в прису11ствю1
различ,ных органичеоких 1ра1створителей, при обработке ,су~слензии
ультразвуко:vr, доде,цил,сульфа11ом натрия ил и •при ад,с орбц ии на
поверхности твердой фазы и локализаци и в мембранах конкр етных
типов (бислои, ,мембра,ны ми1юрО1сом и ми тохО1ндрий). В се :rюказа­
тели фер:1.1ентати1В.ной .р,еак,ции з,аuш,сят от факторов, контролирую­
щих ф изиче,ское состояние субстр а та: раз.мер и юривизну поверх­
ности липо•СО'\1, локализа·цию и ·о ри ен т,ацию мрлекул ,субстрата, а
также их подвижность и поверхн о стную концентрацию н а границе­
раздела фаз.
ЛИ Т ЕРАТ УРА
Джанбаева Н.Р., Рахимов1v1. /1'1.,
ЮлдашевП. Х. 1972. ХПС.
No 2, 222.
Джан бае в а Н. Р. 1976 . «Биохимия», 41, 114 .
З ем л я нс к а я Н. Р. 1979. Исследование ~;екоторых свойств щелочных липаз
в растворимо м и иммобилизованном ссстояниях. Автореф. канд. дне . Nl .
КалендарёваТ.И.,РашидоваС.Ш., РахимовМ.М. 1978. «Узб.
хим. журн.», No 5, 36.
КхолэВ.идр.1980.ДАНУзССР,No2,57.
Мадьяр о в Ш. Р . ]976. «Биохимия», 41, 255 .
Мадьяр о в Ш. Р., Рахимов м: М. 1977. «Узб. биол. журн.», No 1, 7.
Мадьяр о в Ш. Р . 1977. Изучение действия фосфолипазы D на г ранице раз-
дела фаз . Автореф. канд . дис. Ташкент .
Мирсалихова Н . М . , Рахимов М . М. 1977. ДАН СССР . 233, 981.
Полтора к О. М., Чух рай Е. С. 1970. «Вестник МГУ», сер . хим., 41, 133..
Полтора к О. .М., Чух рай Е. С. 1971. Физико-химические основы фермента-
тивного катализа. М.
РахимовМ.М.ид.р.1970.ХПС,No6,738.
РахимовМ.М.идр.1972.ХПС,No2, 228.
РахимовМ.М.,МадьяровШ.Р.,АбдумаликовА.Х. 1976а.«Био­
химия», 41, 452.
РахимовМ.М., Джанбаева Н. Р., Абду,rаликов А. Х. 19766.
«Биохимия», 41, 289 .
РахимовМ..М., МадьяровШ. Р., Абдума
.1иковА. Х. 1976в_
«Прикл. биохим. и микробиол.», 12, 30.
Рахимов М. М. и др. 1976 г. «Узб. биол. жур н .», No 1, 7.
Рахимов М. М., Мадьяров Ш. Р., Абдумаликов А. Х. 1 976д.. «Био-
хим и я», 41, fi69.
Ра· химов М" М . , Мадьяров Ш . Р 1 977а. «Био!;юrия», 42,622 .
Рахимов Nl. М., Джа н баева Н. Р ., 19776. «Биохш111я» 42,971 .
Ра химов М. М., Алматов К. Т. 1977в. «Биохимия», 42, 1852.
Рахимов 1\1\. М. и др. 1978. «Биохимия», 43, 433.
Рахимов М. М. и др . 198 1. «Биохимия», 46. No 2.
Р экер Э. 1979 . Биоэнергетическ и е механизvrы: н овые взr.1яд ы. М"
ТуйчибаевМ.У.идр.1977.«Биохимия»,42,2160.
АсkегL., D iеmаiгW., JаgегR. 1952.Biochern. Z., 322,472.
А11gуегТ.Т.,Wе11sМ.А. 1979, Biochernistгy, 18,5348.
АntiаN.J., ВiIinskуЕ.,LаuJ.С.1970.Canad.J.Biochem, 48,643.
ВаnhаmА.D., DаwsоnR.М.S.1959.Biochem,J.72,486.
ВеагеJ.L., К аtеsМ.,1967.Canad.J.Biocheш,45,101.
Веnsопапа G., Dеsnuе11еР. 1965.Biochim. et Biophys. acta, 105, 121.
В го с kе г 11 о f f Н. 1969. Агсh. Biocl1ern. Biophys., 134, 366.
Вгосkег11оffН. 1973.Cl1em. Pl1ys. Lipids, 10, 215.
228

Вгосkеr11оffН..1974.Bioorg.Chem., 3, 176.
ВrосkеrhоffН., Jеnsеn R. G. 1974. Lipolitic Enzymes. Acad. Press. New.
Yor k San Fraпcisco, Lопdоп.
-В L1гst ei n С., Layteг А., Racker Е. 1971. J . Biol. Chem. , 24 6, 4075.
СhепJ.-Sh., В аrtоп Р.G. 1971.Сап.J.Bi,)cl1em., 49,1362,
Со1е R., Б еnпsС.,РrоuIхР. 1974 Biocliim. et BiophysActa, 337, 325.
СотеsР,КIеiпig Н. 1973. Biochim. etBiophys. Acta, 316, 13.
DауidsопF.М.,LопgС.1958.Biochem. J ., 69,458.
Dа'"sоnR.М.С.,НеmiпgtоnN.1967.Biochem. J.,
102, 76 .
Dеsп uе11е Р. 1972. «The Enzymes», ed. Boyer, Р. D., New York, Loпdon, 7,
575.
D11аrmаIingа111К., Jауаrаmаn J. J. 1972.Biochem. J.,
128, 45 р.
D о у О., N о j i m а S11. 1971. Biochim. et Biopr1ys. Acta, 248, 234.
D LI s е t G. 1949. Ann. agron., 19, 184.
ЕiпsеtЕ,СIаrk'vV.L.1958.J.Bio\.Chem., 213,703.
FоuгсаnsВ.,JаinМ.К.1974.Adv.Lipid.Res., 12,147.
FLIпgС.К.,РгоLIIхР.1969.Canad.J.Bi•)Chem., 47,371
Gа11аi-HаtсhагdJ.J ., ТhоmрsопR. Н.S., 1965. Biochim. et Biophys.
Acta, 98, 128.
,GаrnегС. W., Smith L. С. 1970.Biochim. Biophys. Res. CommL111s., 39, 672.
Gаt( Sh., В аrеп11оIzУ. 1973. А1111. Rev. Biochem., 42, 61.
D е.Н а s s G. Н. et а!. 1968. Biochim. et Biophys. Acta, 248, 197.
На11аhаnD.J ., С11аikоff!.L.1947а.J.Biol.Chem., 168,233.
Hana h a n D. J., Chaikoff I. L. 1 947Ь. J. Biol. Chem. 169,699.
НапаhаnD.J .1952.J .Biol.Chem., 195,199.
На n а h а п D. J . 1971. «The Eпzymes», ed Boyer Р. D., Acad. Press, Ne,v York,
Lo11do11, 5, 71 .
НауаishiО., СоrпЬегg. 1954.J. Biol.Cl1em., 206,647.
Не11егМ,АIаdiе111 Е., S!1арirо В. 1968. Bull.Soc. Chim. Biol. 50, 1395.
Не11еrМ., Мо zеs N., Мае s Е. 1975., Methods i11 Eпzymology, 35, 226.
I111а111urаS., НоriutiУ.1979.Biochem., 85,79.
Jacob so11 К. , Papal1adjopou l os D. 1975. Biochem istry, 14 ,152.
Jaiп М. К., Cordes Е. Н. 1973. J . Membrane Bio l. , 14 ,119.
1<: a пf e r L. А., Goetzl Е. J., AL1ste11 К. F. 1976, J. Cliп. Jnyest., 57, 1173 .
J<: а t е s м.· 1953. Natшe, 172, 814.
I< а t е s М. 1954. Ca11acl. J . Biochem. Physiol., 32, 571 .
К а t е s М. 1955. Сапасl. J. Biochem. Physiol., :ц, 575.
К а t е s М . 1960. «Lipid Metabolism», ее!. К. Bioch., Wiley, New York, 165.
К1еiпmап J. Н., Lа11dsW. Е. М. 1969. Biochim. et Biophys. Acta, 187, 477.
Lo11g С., OdaYic R., Sa r geпt Е. J., 1 967а. Biochem. J . 102,216.
l-011g С. , Odav i c R., Sarge11t Е. J. 1967Ь. Biochem. J. , 102,221.
L о ,v е 11 s t е iп J. М. ecl. !969. «Metlюds i11 E11zymology», 14, 133.
NаttегL.J., РriУеtО.S.1966. «Lipicls», 1,258.
Оkа,vа У., Уа111аguсhiТ.,1975.J.Biocl1em., 78,363.
ОkudаН.,FL1jiiS., !968,J.Biocl1em., 64,377.
ОkL1dаН., FujiiS.1969,Shikoki.Acta М.еd., 25, 192.
О11о J., Nоjimа Sh. 1969а. Biochim. et Biophys. Acta, 176, 111.
О11оJ., Nоjimа Sh. 1969 Ь. Biocl1im. et Biophys. Acta, 176, 120.
О11оJ., WhitеD., 1970.BacterJ. 103,111.
Орdе11КаmрJ.А. F., DеGiеrJ., Vаn Dее11еп L. L. М.. 1974. Biocl1i111.
et Biophys. Acta, 345, 253 .
О г у R. L. , et al. 1967. Ca11ad. J. Biochem. 45, 1445.
Рара11аdjоuроL11оs D. et al. 1973, Biochim. et Biophys. Acta, 311, 330.
Раstе11J., МассhiаV., К аtrе11R.,
1968. J. Biol. Сhеш., 243, 3750.
Рiеtегsо11 W. А. et al. 1974. Biocl1e111istry, 13, 1455.
Pi е t е г s о 11 W. А., Ph. D. Thesis. 1973. Ri jksL111iversitat, utrecht, The Nether-
la 11ds .
QLIаrIеsR.Н.,Dа,vsо11R.М..С.1969а.Biochem.J., 112,787.
QuаrIеsRН.,Dа,vsо11R.М.С.1969Ь.f',iochem.J ., 113,697.
Raybi11 D . М.., B e rtsc h L. L. , Kor11berg А. 1972. Biocheшistry, 11, 175 4.
229

R о s е W. G. 1950. Food. Теспоl., 4, 230.
Rоsепtа1А. F., S h i11g-HsiепHanS. 1971. Biochi111. et Biophys. Acta_
218, 213 .
Rоug11а11R G,S1асkС.R.,. 1976. Biocl1i111. et Biophys. Acta, 431,86.
SаitоМ., КапfегJ. 1973. Eiocl1.Bioph.Rcs. Commu11s., 53,321.
SаitоМ., Воuгс1LIеЕ., Ка11fегJ. 1974. Агсh. Biochem. Biophys.,
164, 420 .
SаitоМ.,Ка11iегJ. 1975а.Агсh. Biochem. Biophys. 169,318.
SаitоМ.,ВоuгquеЕ.,Ка11fегJ.·1975Ь. Агсh. Bio.chem. Biophys., 169, 304.
Sса11clе11аС.J.Коr11ЬегgА.1971.Biochemistry,10,4447.
SсhегрhоfG. L., Vа11 Dеепеn L. L. М. 1965. Biochim. et Biophys. Acta,
98, 204 .
1
Sеmегivа М., Dеs11 uе11еР. 1976. Horiso11s. Biochem. Biohys., 2,,32.
SmithR. Н. 1954. Biochem. J., 56,240.
Soucek А., Micl1ales С . , Souckova А. 1971. Biochim. et Biophys. Acta,
227, 116.
S 1о t Ь о о m А. J. et al. 1978. Enzymes Lipid Metab. Ргос. Colleg. Strasbourg
(1977). 137 .
ТаkiТ.,МаtsLImоtоМ.1973.Jap.J.Ехр.Med., 43,219.
Та1wаIkагR.Т.,GагdN. К,Кгishnа-МurtiС.R.l11dianJ.Biocl1e111.
6, 228
ТапКН.,Lоwiе11R 1972,J. Biol.Cl1e111., 247,3273.
ТооkеуН.L,Ва11sА.К.1956.J.Biol.Oem., 218,213
VапDее11еnL. L. М., DеНааsG.Н. 1966.А1111.Re\1. Biochem., 35,157.
Vа11Dе11ВоsсhН.,Аагs111а11А.J., Vа11Dеепе11L. L. М. 1974. Bio-
cl1i111. et Biopl1ys . Act a, 248, 197.
Vа11Dе11ВоsсhН.1974.А1111.Rev. Biochem., 43,243.
VeгgегR., М.iеrаsМ С.,DеНааsG.Н.1973.J.Biol.Chem., 248,4023.
\VаitеМ..Sissо11Р. 1971. Biocl1e111istry, 10,2377.
WeisН.,SрiеgеIЕ.,ТitusЕ.1959.Natuгe.Lo11do11,183,1493.
\Ve11s М А., На 11аhа11 D. J. 1969. Biochemistгy, 8, 414.
\V е 11 s М. А. 1974. Biochemistry, 13, 2248.
\VuТ.W., Тi11kегD. О., 1969. Biochemistry,8, 1558.
\VykIеR.L., Sсhrаеm111еrJ.М.1974.J.Biol.Cl1e111., 249,1742.
\Vуk1еR. L., Кrае111еrW. F .,
SсhгаеmmегУ. М. 1980. Biochim. et
Biopl1 ys. Acta, 619 , 57.
УаЬusаkiК,\\1е11sМ.А. 1975. Bioche111istry,14, 162.
Zograf i G., Verg e r R., De Haas G. Н. 1971. Che111 . Phys. Lipids, 7,185.

l
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие .
Транспорт ионов через биологические ме~1браны и его регуляuня.
А.И. Гагельганс,Б.А.Ташмуха11.едов, Х. Маматку­
л о в . Механи з м ионной селе 1<тивности каль циевых насосов I<ле­
ток животных т1,аней и особенности транспорт а нонов строн ци я
через биологические мемб раны
3.У.Бекмухаметова,А.ККасымов.Омеханиз,1ахрегу­
ляuии транспорта ионов в почке.
М.В.3амараева,А.И.Гагельганс,Б.А.Ташмvхаме­
д о в. Механизмы регуляции переноса Са 2 + через ~1ембрану саrко­
плазматичес1<ого р е т икулума.
Т.Ф.Юрасова,3.У.Бекмухаметова,Э.Ташпулатов.
Свойства транспортной Na, К-А ТФазы поч ек различных живот­
ных.
Механизм действия мембраноактивных соединений.
А.В.Шкинёв,А.И.Гагельганс,Б.А.Ташмухамедов.
Мембраноактивные свойства си нт етических ионофоров н перспеI<ти,
вы их практического использования .
О. В. Кр асил ьн ико в. Действие цитотоксина и фосфолипазы
А яда с р еднеазиа т ской кобры на естественные 11 искусственные
мембра ны. . .
.
.
•
М. У. Туйчибаев, Ф. А. Муксимов. Яды перепончатокрылых
(Нуmепо рt ега).
Н. М . Мир с ал их о в а. Фосфолипазы и их использование для
исследования Na , К-АТФазы мембран.
Л.Я.IOкельсон, Б.У.Атакузиев. Ядскорпиона. Физиологи­
чески активные компоненты 11 механизм их действия.
/1'1. М. Рахимов, Ш. Р. Мадьяр о в. Роль фазовых состояний
фосфолипидов в рег ул ир овании каталитических эффектов фосфо­
липаз в искусственных и мембранных системах .
3
5
41
57
76
91
91
110
127
142
163
186,.

ТРАНСПОРТ ИОНОВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Утвер.ж: дено к печати Ученым советом И нети тута биохилти,
Отделениел~ биологических наук АН :>1зССР
Редактор Т. А. Шур
Художник А. М . Расулев
Технический редактор В. М. Тарахович
Корректор Т. В. Корл,у1ии11а
ИБ No 1675
Сдано в набор 23.07 .82 . Подписано к печати 21.09.82 . РО5339. Формат 60Х90 1 / 16 • Бу•
мага типографская No 1. Гарнитура литературная. Печать высокая. Усл. печ. л. 14,5.
Уч.-изд. л. 15,1. Тираж 1000. Заказ 156. Цена 2 р . 40 к.
•
Адрес Издательства: 700047. Ташкент, ул. Гоголя, 70.
Типография Издательства «Фан» УзССР, Ташкент, проспект М . Горького, 7~ .

:,,_: .t:..: ..
:::&
ф.
.:\~
···. ,., =
·
,.
':.,_":;·· ~
~:
У,~