Text
                    Эпигенетические механизмы,
действующие у разных модельных организмов
		5. cerevi- siae	S. pombe	N. crassa	C. elegans	Drosophila	Млекопита- ющие	A thaliana
	ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМА							
	Размер генома	12 Mb	14 Mb	40 Mb	100 Mb	180 Mb	3,400 Mb	150 Mb
	Число генов	6,000	5,000	10,000	20,000	14,000	-25,000	25,000
	Средний размер генов	1.45 kb	1.45 kb	1.7 kb	2 kb	5 kb	35-46 kb	2 kb
	Среднее число интронов/ген	<1	2	2	5	3	6-8	4-5
	% Генома, кодирующий белки	70	60	44	25	13	1-1.5 (Hs)	26
	ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ							
вкл	Ацетилирование гистонов	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
вкл	Метилирование НЗК4	4-	+	+	+	4-	+	4-
вкл	Метилирование H3K36	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
вкп	Метилирование НЗК79	4-	4-	4-	4-	4-	+	4-
вкл	Гистоновый вариант НЗ.З	4-	4-	4-	4-	4-	+	4-
вкл/ выкл	Комплексы SWI/SNF АТФаза	4-	4-	4-	4-	4-	+	4-
вкл	Семейство CHD1 АТФаза	4-	(+)•	(+)»	(+)»	4-	4-	4-
вкл	SWR1 АТФаза	4-	(+)"	(+)"	(+)*	4-	4-	(+)a
вкл/ выкл	ISWI АТФаза	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
вкл/ выкл	INO80 АТФаза	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	MI-2 АТФаза	-	(+)a	(+)a	4-	4-	4-	4-
выкл	Вариант центромерного гистона							
	CENP-A	4-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	Метилирование НЗК96	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	HPI-подобные белки	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	РНК-интерференция	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	Н4К20в	-	4-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	Метилирование НЗК27	-	-	4-	4-	4-	4-	4-
выкл	Репрессивные комплексы Poly- comb	-	-	-	4-	4-	4-	4-
выкл	Метилирование ДНК	-	-	4-	-	(+)'	4-	4-
выкл	Белки, связывающие метилиро- вание ДНК	-	4-д	4-	4-e	4-ж	4-	4-
выкл	Импринтинг	-	-	-	-	4-3	4-	4-	1
Сокращение* (Hs) — Homo sapiens.
а Эпигенетическая особенность считается имеющейся на основе гомологии последовательностей, но не функциональных дан-
ных.
6 Имеются данные, что метилирование НЗК9 обнаруживается в районах активного хроматина; однако функциональное значение
этого не известно.
в Триметилирование Н4К20 у S. cerevisiae отсутствует, тогда как у многоклеточных организмов имеются все три состояния метили-
рования Н4К20.
1 У Drosophila уровни метилирования ДНК очень низкие.
л Мутантный Dnmt2.
е Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки (Се, СЬ, Рр).
ж Dnmt2 и MBD-доменные белки (Dm).
3 Хромосомный или геномный, а не ген-специфичный.

Издание осуществлено при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований по проекту № 09-08-07118 УДК 575 ББК 28.04 Э71 Э71 Эпигенетика Под ред. С.Д. Эллиса, Т. Дженювейна, Д. Рейнберга Москва: Техносфера, 2010. - 496 с. ISBN 978-5-94836-257-1 Книга ярко и наглядно повествует о новой науке общебиологического значения - эпигенетике, а также об ее отдельных областях. В издании представлено детальное описание разных эпигенетических сигналов и механизмов их реализации, а также собственно феномен, история и концепции эпигенетики, ее отдельные механизмы и пути реализации эпигенетических сигналов в клетке. Авторы различных глав данной книги — ведущие в мире специалисты в области эпигенетики, являющиеся, как правило, и основоположниками ее отдельных областей. Издание будет полезно широкому кругу читателей, интересующихся коренными проблемами живого мира, сущности жизни и молекулярных механизмов ее проявления. УДК 575 ББК 28.04 EPIGENETICS Ен>т|Р в у С David Allis f - . Ч* *** Thomas Jenuwem вадаЛ feeraw iHUnubr - ыг ww Danny Retnberg - Mane-Laure Caparros ©Cold Sprsnc Harbor Laboratory Press С- Ш Sp »n, Н» Dor, N«w York • hup //www «hlpt.ss -om Originally published in English as Epigenetics edited by C. David Allis, Thomas Jenuwein, Danny Reinberg and associate editor Marie-Laure Caparros. © 2007 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA ©2010, ЗАО «РИЦ «Техносфера», перевод на русский язык, оригинал-макет, оформление Официальный русский перевод английского издания © 2007 Cold Spring Harbor Laboratory Press. Перевод издан и распространяется с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press, владельца всех прав, уполномоченного выдавать лицензии, издавать и продавать их ISBN 978-5-94836-257-1 ISBN 978-087969724-2 (англ.)
ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие к русскому изданию...................................................................12 Глава 1 Эпигенетика: от явления к области науки..........................................................13 Daniel Е. Gottschling 1. Введение......................................................................................13 2. История эпигенетики на симпозиумах Колд Спринг Харбор.........................................14 3.69- й симпозиум................................................................................19 3.1. Гипотеза гистонового кода................................................................19 3.2. Динамический «молчащий» хроматин.........................................................20 3.3. Ядерная организация......................................................................20 3.4. Прионы...................................................................................21 3.5. Новое явление............................................................................21 4. Заключительные соображения....................................................................21 Благодарности....................................................................................22 Литература.......................................................................................22 Глава 2 Краткая история эпигенетики......................................................................26 Gary Felsenfeld 1. Введение......................................................................................26 2. Ключи от генетики и биологии развития.........................................................27 3. Во всех соматических клетках организма ДНК одинакова..........................................27 4. Роль метилирования ДНК........................................................................28 5. Роль хроматина................................................................................28 6. Все механизмы взаимосвязаны...................................................................30 Литература..............................................w.........................................31 Глава 3 Общий обзор и основные понятия...................................................................33 С. David Allis, Thomas Jenuwein и Danny Reinberg Общее резюме.....................................................................................33 1. Генетика vs. эпигенетика......................................................................34 2. Модельные системы для изучения эпигенетики....................................................36 3. Определение эпигенетики.......................................................................38 4. Хроматиновая матрица..........................................................................39 5. Более высокие уровни организации хроматина....................................................40 6. Различие между эухроматином и гетерохроматином................................................44 7. Модификации гистонов и гистоновый код.........................................................46 8. Комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина, и варианты гистонов...........................49 9. Метилирование ДНК.............................................................................50 10. РНКи и сайленсинг генов, направляемый РНК....................................................51 11. От одноклеточных систем к многоклеточным.....................................................53 12. Polycomb и Trithorax.........................................................................55 13. Инактивация Х-хромосомы и факультативный гетерохроматин......................................57 14. Репрограммирование клеточной судьбы..........................................................58 15. Рак..........................................................................................60 16. В чем же в действительности заключается эпигенетический контроль?............................62 17. Основные вопросы в эпигенетических исследованиях.............................................64 Литература.......................................................................................65 Глава 4 Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae.....................................................71 Michael Grunstein и Susan M. Gasser Общее резюме.....................................................................................71 1. Генетические и молекулярные методы исследования дрожжей.......................................72 2. Жизненный цикл дрожжей........................................................................73
*4 Оглавление 3. Гетерохроматин у дрожжей находится в «молчащих» локусах типов спаривания НМ и теломерах......74 4. Гетерохроматин отличается репрессивной структурой, которая распространяется на весь молчащий домен.75 5. Отдельные этапы сборки гетерохроматина.......................................................77 5.1. //Л/ гетерохроматин.....................................................................77 5.2. Теломерный гетерохроматин...............................................................78 6. Деацетилирование гистонов белком Sir2 обеспечивает сайты связывания для распространения SIR-комплексов..............................................................78 7. Sir2 деацетилирует гистон Н4 по 16-му остатку лизина.........................................79 8. Ацетилирование гистонов в эухроматине ограничивает распространение SIR-комплексов............80 9. Образование теломерных петель ...............................................................80 10. Нарушение непрерывности репрессии естественных субтеломерных элементов теломерными петлями...81 11. Взаимодействие теломер in trans и перинуклеарное прикрепление гетерохроматина...............81 12. Наследование эпигенетических состояний......................................................82 13. Старение и Sir 2 связаны нестабильностью повторов рДНК......................................83 14. Резюме......................................................................................84 Литература......................................................................................84 Глава 5 Эффект положения мозаичного типа,формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila....87 Sarah C.R. Elgin и Gunter Reuter Общее резюме....................................................................................87 1. Гены, оказывающиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином, обнаруживают мозаичный фенотип.... 88 2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEV позволил идентифицировать хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков................................................................90 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом позволило идентифицировать белки, специфически ассоциированные с гетерохроматином..................................................93 4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина......................95 5. Хромосомные белки образуют взаимозависимые комплексы для поддержания и распространения гетерохроматиновой структуры...............л....................................................96 6. Как формирование гетерохроматина «нацеливается» у Drosophila?.................................97 7. Не весь гетерохроматин идентичен............................................................100 8. PEV, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у различных организмов.................101 9. Подведение итогов: мы не знаем о гетерохроматине очень многое...............................102 Благодарности..................................................................................102 Литература.....................................................................................103 Глава 6 Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe и Neurospora crassa..................................................106 Robin С. Allshire и Eric U. Selker Общее резюме...................................................................................107 1 Schizosaccharomyces pombe\ организм.........................................................107 1.1. Сайленсинг хроматина у 5. pombe отличается от такового у 5. cerevisiae.................108 1.2. Гены, помещенные в центромеры дробянковых дрожжей, сайленсированы......................108 1.3. Центромеры дробянковых дрожжей состоят из разных гетерохроматиновых и центральных кинетохорных доменов..........................................................109 1.4. Центромерные внешние повторы без посторонней помоши делают возможной сборку «молчащего» хроматина..................................................................111 1.5. РНК-интерференция направляет сборку «молчащего» хроматина..............................112 1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК-полимеразой II связывает RNA1 с модификациями хроматина...................................................................113 1.7. «Молчащий» хроматин в центромерах необходим для опосредования когезии сестринских центромер и нормальной сегрегации хромосом......................................113 1.8. Эпигенетическое наследование функционального состояния центромеры........................114 1.9. Различные механизмы сайленсинга у грибов...............................................115 2. Neurospora crassa: история и особенности организма..........................................116 2.1. Метилирование ДНК у Neurospora...........................................................117 2.2. RIP — система защиты генома, имеющая как генетические, так и эпигенетические аспекты...119 2.3. Исследования реликтов RIP позволило проникнуть в контроль метилирования ДНК............120 2.4. «Подавление» (quelling)................................................................121 2.5. Мейотический сайленсинг, осуществляемый неспаренной ДНК (MSUD).........................122
Оглавление 5 2.6. Вероятные функции и практическое использование RIP, «подавления» и MSUD................123 3. Заключительные замечания....................................................................124 Благодарности..................................................................................125 Литература.....................................................................................125 Глава 7 Эпигенетика инфузорий..........................................................................129 Eric Meyer и Douglas L. Chalker Общее резюме...................................................................................130 1. Инфузории: одиночные клетки с двумя разными геномами........................................131 2. Конъюгация: реципрокное оплодотворение обнаруживает неменделевскую наследственность.........131 3. Цитоплазматическая наследственность у инфузорий.............................................132 4. Кортикальное паттернирование: случай структурной наследственности...........................133 5. Макронуклеусы и микронуклеусы: модель активного и «молчащего» хроматина.....................135 5.1. Разделение микро- и макронуклеарных гистонов выявляет различную роль вариантов гистонов.135 5.2. Модификации хроматина коррелируют с состояниями активности.............................135 6. В ходе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки...........................136 6.1. Внутренние делеции ДНК: точные (внутригенные IES) и неточные (межгенные повторы) события.....................................................................................137 6.2. Фрагментация хромосом..................................................................138 7. Механизмы перестроек генома.................................................................138 8. Зависящий от гомологии сайленсинг генов у инфузорий.........................................139 8.1. Сайленсинг, индуцируемый трансгенами...................................................139 8.2. Сайленсинг индуцируется двуните вой РНК............................................... 139 9. Перестройки генома направляются зависящими от гомологии механизмами........................ 140 9.1. Экспериментальная индукция специфических делеции в развивающемся макронуклеусе........ 140 10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического............................................................................... 141 10.1. Парадигма d48: эпигенетическое наследование альтернативных перестроек................ 141 10.2. Эпигенетическое наследование экспериментально индуцированных делений................. 141 10.3. «Спонтанная» элиминация чужеродных последовательностей, интродуцированных в микронуклеарный геном.....................................................................142 10.4. Экспериментальное «спасение» наследуемых макронуклеарных делений......................142 10.5. Экспериментальное подавление элиминации IES в развивающемся макронуклеусе.............143 11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опосредованное РНК-интерференцией................144 11.1. Связь коротких РНК с элиминацией ДНК..................................................145 11.2. Транспорт РНК из материнского в зиготические макронуклеусы у Paramecium...............145 12. Заключение: элиминация ДНК как механизм защиты генома......................................146 13. Будущий вклад исследований на инфузориях в эпигенетику.....................................149 Литература.....................................................................................149 Глава 8 RNAi и сборка гетерохроматина..................................................................153 Robert Martiensser и Danesh Moazed Общее резюме...................................................................................153 1. Обзор RNAi-пути.............................................................................154 2. Ранние данные, позволяющие предполагать, что РНК является посредником в транскрипционном сайленсинге.................................................................156 3. RNAi и сборка гетерохроматина у 5. pombe....................................................156 4. Малые РНК инициируют сборку гетерохроматина в связи с эффекторным комплексом RNAi...........158 5. Синтез dsRNA и образование siRNA............................................................159 6. Модели распознавания РНК-РНК versus РНК-ДНК.................................................160 7. Как RNAi рекрутирует энзимы, модифицирующие хроматин?.......................................161 8. Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi..............................162 9. Консерватизм модификаций хроматина, опосредованных RNAi, у животных.........................164 10. Заключительные замечания...................................................................165 Литература.....................................................................................165 Глава 9 Эпигенетическая регуляция у растений...........................................................169 Marjori Matzke и Mittelsten Scheid
Общее резюме................................................................................ 1. Преимущества использования растений в эпигенетических исследованиях...................... 1.1. Сходство растений и животных по организации (эпи)генома............................. 1.2. Растения предоставляют дополнительные направления эпигенетических исследований...... 1.3. Растения лучше выносят некоторые методологические манипуляции, которые очень трудно применимы к млекопитающим........................................... 1.4. Исследование растений внесло самый значимый вклад в эпигенетику .................... 2. Молекулярные компоненты хроматина у растений............................................. 2.1. Регуляторы метилирования ДНК у растений............................................. 2.2. Ферменты модификации гистонов....................................................... 2.3. Другие белки хроматина.............................................................. 3. Молекулярные компоненты путей опосредованного PH Ki сайленсинга ......................... 3.1. Выработка PHKi-зависимого сайленсинга у растений.................................... 3.2. Путь 1: связанное с трансгенами посттранскрипционное и индуцированное вирусами замалчивание генов (PTGS/VICS)........................................................... 3.3. Путь 2: регуляция развития растений miPHK и транс-действуюшими siPHK................ 3.4. Путь 3: связанный с трансгенами транскрипционный сайленсинг, направляемое РНК метилирование ДНК и образование гетерохроматина......................... 4. Эпигенетическая регуляция без участия РНК ............................................... 5. Перспективы.............................................................................. Литература.................................................................................. WWW источники............................................................................ Глава 10 Модификации хроматина и механизм их действия................................................ Топу Kouzarides и Shelley L. Berger Общее резюме................................................................................ 1. Гистоны и ацетилирование играют регуляторную роль в транскрипции......................... 2. Ацетилирование и деацетилирование....-................................................... 3. Фосфорилирование......................................................................... 4. Метилирование............................................................................ 4.1. Метилирование лизинов............................................................... 4.2. Деметилирование лизинов............................................................. 4.3. Метилирование аргининов............................................................. 5. Деиминирование........................................................................... 6. Убиквитилирование/деубиквитилирование и сумоилирование................................... 7. Темы в модификациях...................................................................... 7.1. Гистоновый код...................................................................... 7.2. Паттерны модификаций................................................................ 7.3. Изменения в структуре хроматина, связанные с активацией транскрипции и элонгацией... 8. Заключительные замечания................................................................. Литература.................................................................................. Глава И Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb......................... Ueli Grossniklaus и Renato Paro Общее резюме................................................................................ 1. Введение................................................................................ 1.1. Концепция клеточной памяти.......................................................... 1.2. Генетическая идентификация группы Polycomb.......................................... 2. Установка меток сайленсинга на хроматин................................................. 2.1. Компоненты PRC2 и его эволюционный консерватизм..................................... 2.2. Модифицирующая хроматин активность PRC2............................................. 2.3. Динамическая функция PRC2 в развитии................................................ 3. Поддержание транскрипционного сайленсинга............................................... 3.1. Компоненты PRC1..................................................................... 3.2. «Нацеливание» PRC1 на сайленсированные гены......................................... 3.3. Установление репрессивных функций с помощью PRC1.................................... 3.4. Предотвращение наследуемой репрессии антисайленсингом............................... 4 Репрессия PcG в развитии млекопитающих.................................................. 4.1. От репрессии гена к репрессии хромосомы.............................................
Оглавление 4.2. Последствия аберрантной активации транскрипции........................................224 4.3. Поддержание судьбы стволовой клетки...................................................225 5. Заключение и перспективы...................................................................226 Литература....................................................................................226 Глава 12 Регуляция транскрипции белками группы Trithorax...............................................230 Robert Е. Kingston и John W. Таткип Общее резюме..................................................................................230 1. Введение...................................................................................231 1.1. Идентификация генов, участвующих в поддержании детерминированного состояния...........232 1.2. Белки trxG у других организмов........................................................233 1.3. Белки trxG играют разные роли в эукариотической транскрипции..........................235 2. Связи между белками trxG и хроматином......................................................236 2.1. Белки trxG, участвующие в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина.....................236 2.2. Белки trxG, ковалентно модифицирующие нуклеосомные гистоны............................240 3. Связи между белками trxG и общей транскрипционной машинерией...............................242 4. Биохимические функции других белков trxG...................................................242 5. Функциональные взаимодействия между белками trxG...........................................242 6. Белки trxG: активаторы или антирепрессоры?.................................................243 7. Выводы и перспективы.......................................................................243 Литература....................................................................................245 Глава 13 Варианты гистонов и эпигенетика................................................................247 Steven Henikoff и Mitchell Smith Общее резюме..................................................................................247 1. У всех организмов ДНК упаковывается архитектурными белками..................................248 2. Эукариотические коровые гистоны развились из гистонов архей................................249 3. Основная масса гистонов откладывается после репликации ДНК.................................250 4. Варианты гистонов откладываются на протяжении всего клеточного цикла.......................251 5. Центромеры идентифицируются специальным вариантом НЗ.......................................252 6. Замещение гистоновым вариантом НЗ.З обнаруживается в активном хроматине....................254 7. Фосфорилирование Н2АХ функционирует в репарации двунитевых разрывов ДНК....................255 8. H2AZ играет роль в регулировании транскрипции..............................................257 9. Белковые комплексы для откладки и замещения вариантов Н2А..................................258 10. Другие варианты Н2А дифференцируют хроматин, но их функции все еще неизвестны.............259 11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК....................259 12. Заключение и перспективы исследований.....................................................260 Литература....................................................................................261 Глава 14 Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования...........................................263 Gary Н. Karen и R. Scott Hawley Общее резюме..................................................................................264 1. Введение...................................................................................264 1.1. Как осуществляется хромосомная наследственность?......................................264 1.2. Какие элементы требуются для хромосомной наследственности?............................264 2. Эпигенетическая регуляция репликации ДНК, репарации и теломер..............................266 2.1. Инициация репликации ДНК контролируется эпигенетическими механизмами..................266 2.2. Репарация ДНК включает эпигенетические изменения в структуре хроматина................267 2.3. Эпигенетический контроль структуры и функции теломер..................................268 3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функции центромер.................................269 3.1. Структура и функция центромеры у разных эукариот......................................270 3.2. Центромерные последовательности не являются необходимыми или достаточными для формирования и функционирования кинетохора.............................................271 3.3. Необычный состав центромерного хроматина..............................................272 3.4. Модели структуры , функции и воспроизведения центромеры...............................275 3.5. Эпигенетика и эволюция центромер......................................................276 4. Гетерохроматин и мейотическое спаривание / расхождение.....................................277 4.1. Обнаружение сайта гетерохроматинового спаривания у самцов Drosophila..................278
4.2. Спаривание гетерохроматина облегчает расхождение у самок Drosophila................... 4.3. Роль центромеры в облегчении ахиазматической сегрегации у почкующихся дрожжей......... 4.4. Ассоциированный с гетерохроматином локус Phi у кукурузы и его роль в опосредовании гомологичного versus негомологичного спаривания............................................ 5 Гетерохроматин и мейотический драйв........................................................ 5.1. Нарушитель сегрегации (Segregation Distorter) у самцов Drosophila..................... 5.2. Утеря отцовской хромосомы у Sciara и картирование реагирующего элемента............... 5.3. Утеря отцовских хромосом у Nasonia.................................................... 5.4. Вздутие 10 у кукурузы — роль последовательностей, соответствующих гетерохроматиновым «вздутиям», в облегчении расхождения хромосом в мейозе I................................... 6. Сайленсинг генов неспаренными ДНК в мейозе................................................. 6.1. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК в мейозе у Neurospora......................... 6.2. Сайленсинг асинапсных хромосом у мыши................................................. 6.3. Дисфункция половой хромосомы у Drosophila............................................. 7. Перспективы и выводы....................................................................... Литература.................................................................................... Глава 15 Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans............................................. Susan Strome и William G. Kelly Общее резюме.................................................................................. 1. Дисбаланс половых хромосом у С. elegans.................................................... 2. DDC похож на комплекс конденсина........................................................... 3. Оценка отношения Х:А....................................................................... 4. Рекрутирование и распространение DCC....................................................... 5. Эффекты DCC: даун-регуляция сцепленных с X генов и аутосомного гена her-1.................. 6. Регулирование Х-хромосом в зародышевом пути................................................ 7. Развитие зародышевого пути и сайленсинг Х-хромосомы........................................ 8. Единственная Х-хромосома у самцов обнаруживает метки гетерохроматина....................... 9. Влияние MSUD на паттерны экспрессии генов в зародышевом пути............................... 10. Регуляция сайленсинга Х-хромосомы модификаторами гистонов MES............................. 11. Х-хромосома спермия импринтирована........................................................ 12. Заключительные замечания.................................................................. Литература.................................................................................... Глава 16 Компенсация дозы у Drosophila................................................................. John С. Lucchesi и Mitzi I. Kuroda Общее резюме.................................................................................. 1 Явление компенсации дозы было открыто у Drosophila......................................... 2. Компенсация дозы связана с модификациями хроматина........................................ 3. Регулирование компенсации дозы начинается с измерения отношения Х:аутосомы................. 4. Некодирующие РНК гоХ облегчают сборку и «нацеливание» комплекса MSL на Х-хромосому........ 5. Балансировка между антагонистическими активностями ремоделинга хроматина................... 6. Перспективы................................................................................ Литература.................................................................................... Глава 17 Компенсация дозы у млекопитающих.............................................................. Neil Brockdorff и Bryan М. Turner Общее резюме.................................................................................. 1. Введение................................................................................... 1.1. Преимущества полового воспроизведения................................................. 1.2. Способы определения пола.............................................................. 1.3. Хромосомные способы детерминации пола создают необходимость в компенсации дозы........ 1.4. Идентификация неактивной Х-хромосомы у самок млекопитающих............................ 2. Ключевые концепции........................................................................ 2.1. Инактивация X регулируется в ходе развития............................................ 2.2. Сайленсинг хромосомы включает множественные уровни эпигенетической модификации........ 2.3. Некоторые гены избегают Х-инактивапии ................................................ 2.4. Х-инактивация регулируется главным локусом-переключателем — центром Х-инактивации.....
Оглавление 3. Инициация Х-инактивации...................................................................317 3.1. Импринтированная versus случайная Х-инактивация......................................317 3.2. Регуляция импринтированной Х-инактивации.............................................318 3.3. Регуляция случайной Х-инактивации — счет.............................................319 3.4. Регуляция случайной Х-инактивации — выбор............................................321 3.5. Способы переключения инактивации в раннем эмбриогенезе...............................322 4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния.......................................322 4.1. Xist-PHK, сайленсинг генов и сборка гетерохроматина..................................322 4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы..................................323 4.3. Энзимология модификаций гистонов на Xi...............................................325 4.4. Последовательность событий, приводящих к Х-инактивации; ES-клетки как модельная система.326 4.5. Распространение «молчащего» хроматина................................................327 4.6. Уход от инактивации Х-хромосомы......................................................327 4.7. Х-инактивация у сумчатых млекопитающих...............................................328 5. Реактивация и репрограммирование Х-хромосомы..............................................328 5.1. Стабильность Х-инактивации в соматических клетках....................................328 5.2. Реактивация Х-хромосомы в нормальном развитии........................................329 5.3. Реактивация Х-хромосомы в ходе экспериментального репрограммирования.................329 5.4. Уроки из опытов с индуцибельными трансгенами Xist....................................329 6. Резюме и направления будущих исследований.................................................330 Литература...................................................................................330 Глава 18 Метилирование ДНК у млекопитающих............................................................333 Еп Li и Adrian Bird Общее резюме.................................................................................334 1. Механизм клеточной памяти.................................................................334 1.1. Гипотеза.............................................................................334 1.2. Данные о наследуемых паттернах метилирования.........................................334 1.3. Поддерживающая ДНК-метилтрансфераза млекопитающих....................................335 2. Происхождение паттернов метилирования ДНК.....7...........................................335 2.1. De novo метилирование ДНК у ранних эмбрионов.........................................335 2.2. Открытие de novo метилтрансфераз.....................................................336 2.3. Островки CpG и паттерны метилирования ДНК............................................336 2.4. Динамические изменения в паттернах метилирования ДНК в ходе развития.................337 2.5. Активное деметилирование зиготического отцовского генома.............................338 2.6. Что защищает островки CpG от метилирования ДНК?......................................339 2.7. Переключается ли метилирование ДНК структурой хроматина?.............................339 2.8. Роль SWl/SNF-подобных белков ремоделинга хроматина...................................340 3. Регуляция экспрессии генов метилированием ДНК.............................................340 3.1. Ранние данные........................................................................340 3.2. Интерференция со связыванием транскрипционного фактора...............................340 3.3. Притяжение белков, связывающихся с метил-CpG.........................................341 3.4. МеСР2 и синдром Ретта................................................................342 3.5. MBD2 опосредует зависящую от метилирования репрессию транскрипции.......................343 4. Метилирование ДНК, мутации и стабильность хромосом........................................343 4.1. Метилирование ДНК и мутации.............................................................343 4.2. Метилирование ДНК и нестабильность хромосом..........................................344 5. Будущие направления исследований.............................................................344 5.1. Факторы внешней среды, индуцирующие эпигенетические изменения........................345 5.2. Эпигенетическая нестабильность и комплексные заболевания.............................345 5.3. Модуляция обратимых эпигенетических состояний........................................345 Литература...................................................................................346 Глава 19 Геномный импринтинг у млекопитающих..........................................................349 Denise Р. Barlow и Marisa S Bartolomei Общее резюме.................................................................................349 1. Исторический обзор........................................................................350 2. Геномный импринтинг — эпигенетическая система регуляции генов.............................353 3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга.........................................355
10 Оглавление 3.1. Импринтированные гены контролируют эмбриональный и неонатальный рост................355 3.2. Функция геномного импринтинга у млекопитающих.......................................355 3.3. Импринтированные гены собраны в кластеры и контролируются импринтными контрольными элементами .................................................................357 3.4. Кластеры импринтированных генов содержат по меньшей мере одну ncRNA.................359 3.5. Роль метилирования ДНК в геномном импринтинге.......................................360 3.6. Два типа czs-действующего сайленсинга, идентифицированного в кластерах импринтированных генов.......................................................362 4. Геномный импринтинг — модель эпигенетической регуляции у млекопитающих...................364 5. Направления будущих исследований.........................................................365 Благодарности...............................................................................365 Литература..................................................................................365 WWW-ресурсы..............................................................................367 Глава 20 Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки..............................................368 М. Azim Surani и Wolf Reik Общее резюме................................................................................369 1. Введение. Жизнь млекопитающих: генетическая и эпигенетическая непрерывность..............369 2. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие спецификацию половых клеток (от раннего эмбриона к половым клеткам)......................................372 2.1. Принципы развития половых клеток в различных группах животных.......................372 2.2. Раннее развитие линии половых клеток у млекопитающих................................372 2.3. Роль Blimp 1 в спецификации PGC.....................................................374 2.4. Репрессия соматической программы в половых клетках — явление, эволюционно консервативное.374 2.5. Регуляция эпигенетической программы у мышей после спецификации PGC..................375 2.6. Линия половых клеток и стволовые клетки — обратимый фенотип.........................376 2.7. Развитие половых клеток из плюрипотентных ES-клеток.................................376 2.8. От примордиальных половых клеток к гаметам..........................................376 3. От ооцитов к раннему эмбриону.................................................................377 3. 1. Материнская наследственность и потенциальное асимметрическое распределение?........377 3.2. Эпигенетические события при оплодотворении..........................................378 3.3. От зиготы к бластоцисте.............................................................379 4. От плюрипотентных клеток к соматическим клеткам и обратно к половым клеткам..............379 4.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток...........................................379 4.2. Эпигенетические свойства плюрипотентных стволовых клеток............................380 4.3. Способность стволовых клеток к репрограммированию ..................................381 5. Перспективы..............................................................................382 Благодарности...............................................................................383 Литература..................................................................................383 Глава 21 Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза.....................................................387 Meinrad Busslinger и Alexander Tarakhovsky Общее резюме................................................................................387 1. Введение.................................................................................388 2. Коммитирование линий в раннем лимфопоэзе.................................................390 2.1. Внеклеточные сигналы................................................................390 2.2. Транскрипционные факторы ...........................................................390 2.3. Эпигенетический контроль экспрессии генов...........................................392 3. Эпигенетический контроль разнообразия рецепторов антигенов...............................392 3.1. Регуляция перестроек генов рецепторов антигенов в процессе развития.................392 3.2. Субъядерное перемещение генов иммуноглобулинов......................................395 3.3. Сокращение локуса генов иммуноглобулина.............................................395 3.4. Контроль аллельного исключения в локусах IgHu Ig&...................................396 4. Конечная дифференцировка зрелых В-клеток.................................................398 4.1. Дифференцировка плазматических клеток...............................................398 4.2. Пластичность зрелых В-клеток в процессе развития....................................400 5. Заключительные замечания.................................................................401 Литература..................................................................................401
Оглавление Глава 22 Трансплантация ядер и репрограммирование генома..............................................405 Rudolf Jaenisch и John Gurdon Общее резюме.................................................................................405 1. История...................................................................................406 2. Процедуры пересадки ядер..................................................................406 2.1. Амфибии..............................................................................406 2.2. Млекопитающие...........................................................................40& > 3. Фенотип клонированных животных............................................................409 3.1. Амфибии..............................................................................409 3.2. Млекопитающие........................................................................410 3.3. Получение клонированных млекопитающих из терминально дифференцированных клеток.......411 4. Изменения, связанные с репрограммированием ядра...........................................414 4.1. Амфибии..............................................................................414 4.2. Млекопитающие........................................................................416 5. Эпигенетическая память....................................................................417 6. Значение ядерной трансплантации для медицины..............................................418 6.1. Репродуктивное клонирование..........................................................419 6.2. Применение ядерной трансплантации в терапии..........................................420 6.3. Репродуктивное versus терапевтическое клонирование: в чем разница?...................421 Литература...................................................................................421 Глава 23 Эпигенетика и болезни человека...............................................................424 Huda Y. Zoghbi и Arthur L. Beaudet Общее резюме.................................................................................424 1. Введение..................................................................................425 2. Исследования болезней человека вскрывают роль эпигенетики в биологии......................426 3. Заболевания человека......................................................................427 3.1. Нарушения геномного импринтинга......................................................427 3.2. Нарушения, влияющие на структуру хроматина в trans-конфигурации......................431 3.3. Расстройства, влияющие на структуру хроматина в сА-конфигурации......................435 3.4. Взаимодействие эпигенетики и окружающей среды........................................438 4. Глядя в будущее...........................................................................439 Благодарности................................................................................439 Литература...................................................................................439 Глава 24 Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях........................................445 Stephen В. Baylin и Peter A. Jones Общее резюме.................................................................................445 1. Биологическая основа раковых заболеваний..................................................446 2. Значение хроматина для раковых заболеваний................................................447 3. Роль метилирования ДНК при раковых заболеваниях...........................................448 4. Гиперметилированные промоторы генов при раковых заболеваниях..............................449 4.1. Гены, участвующие в процессе.........................................................449 4.2. Поиск новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке..........................451 4.3. Определение функциональной важности генов, гиперметилированных при раковых заболеваниях.452 5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака — значение для ранних стадий развития опухоли...........................................................452 6. Молекулярная анатомия эпигенетически сайленсированных раковых генов.......................455 7. Резюме главных результатов исследований по осмыслению эпигенетического сайленсинга генов при раке .. 458 8. Выявление рака посредством метилирования ДНК..............................................459 9. Эпигенетическая терапия...................................................................459 Литература...................................................................................461 Приложение 1 WWW-ресурсы..................................................................................465 Приложение 2 Модификации гистонов и литература............................................................468
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ Глубокоуважаемый читатель! Перед Вами русскоязычное издание первой в мире обстоя- тельной научной книги об эпигенетике. Под эпигенетикой обычно понимают область знаний о совокупности свойств организма, которые не прямо, а опосредованно закодиро- ваны в геноме и, по определению, должны передаваться по наследству. По сути дела в первую очередь эта наука имеет дело с механизмами, контролирующими экспрессию генов и клеточную дифференцировку. У организмов существуют мощные регуляторные элементы (в самом геноме и даже целые системы в клетках), которые контролируют работу генов, в том числе и в зависимости от разных внутренних и внешних сигналов биологической и абиотической при- роды. Эти сигналы накладываются на генетику и часто по-своему решают коренной вопрос — быть или не быть? Действительно, даже самая отличная генетика может вовсе и не реализоваться, если эпигенетика неблагополучна. По образному выражению Нобелевского лауреата П. Медавара «генетика полагает, а эпигенетика располагает» Долгое время эпигенетику многие не признавали со- всем, а часто стыдливо или даже намеренно умалчивали о ней. В основном, это происходило потому, что знания о природе эпигенетических сигналов и путях их реализации в организме были очень расплывчатыми. Сегодня стало ясно, что одним из таких эпигенетических сигналов в клетке яв- ляется энзиматическая модификация (метилирование) са- мой генетической матрицы, то есть метилирование ДНК. С раскрытием и описанием исключительной роли метили- рования ДНК в жизни организмов, по сути дела, впервые по-настоящему произошли становление и материализация эпигенетики как науки. Именно в России были открыты тканевая и возрастная специфичность метилирования ДНК у эукариотических организмов, в том числе у животных и высших растений, и было впервые обоснованно заявлено, что эта энзиматическая модификация генома может быть одним из механизмов регуляции экспрессии генов и кле- точной дифференцировки. Здесь же были получены первые данные о том, что метилирование ДНК контролируется гор- монально, а искажение метилирования ДНК — путь к раку. Набор и природа эпигенетических сигналов в клетке весьма разнообразны, таких сигналов много и сегодня они разделяются, по крайней мере, на несколько групп — мети- лирование и деметилирование ДНК, «гистоновый код» (эн- зиматическая модификация гистонов — ацетилирование, метилирование, убиквитинирование, фосфорилирование и другие), транскрипционное и трансляционное замалчи- вание генов малыми РНК, позиционирование элементов хроматина. Любопытно, что многие из этих процессов пе- реплетены между собой и взаимозависимы. Это во многом обеспечивает и гарантирует надежность эпигенетического контроля за избирательным функционированием генов. Детальное описание разных эпигенетических сигналов и механизмов их реализации можно найти в соответствующих главах этой любопытной книги. В ней детально описаны собственно феномен, история и концепции эпигенетики, ее отдельные механизмы и пути реализации эпигенети- ческих сигналов в клетке Особое место занимают главы, описывающие роль малых РНК в замалчивании генов, ре- моделирование хроматина, его разные энзиматические мо- дификации, транскрипционное замалчивание генов белка- ми групп поликомб и триторакс, инактивацию X хромосом и половую дифференцировку у нематод и млекопитающих, механизмы дозовой компенсации генов у дрозофилы и мле- копитающих, метилирование ДНК и механизмы геномного импринтинга у млекопитающих, эпигенетические механиз- мы дифференцировки стволовых клеток, эпигенетический контроль за лимфопоэзом, пересадку ядер и репрограмми- рование ядра, эпигенетику рака, эпигенетические болезни человека. По отдельности в соответствующих главах до- вольно детально рассматривается так называемая частная эпигенетика разных групп организмов: дрожжей и других грибов, насекомых (дрозофила), реснитчатых простейших (Ciliata), высших растений. Каждая из глав этой книги написана крупными, веду- щими в мире специалистами в эпигенетике, которые, как правило, являются и основоположниками ее отдельных об- ластей К сожалению, работы наших соотечественников, внесших достойный вклад в становление и развитие эпигене- тики, остались практически без внимания. Жаль также, что в этой книге не приняли участие и такие всемирно известные родоначальники эпигенетики, как Робин Холлидей, Артур Риггс, Вальтер Дерфлер и другие. Эта многообещающая об- ласть знаний развивается очень быстро и бурно, и уже сегод- ня эта книга могла бы быть изрядно дополнена принципи- ально новыми и важными научными сведениями. Книга дает очень хорошее и обширное представление об эпигенетике в целом, ее отдельных областях и молеку- лярных механизмах. Наука эпигенетика уже успела основательно прорасти в технологии. В одном из последних бюллетеней (Technol- ogy Review) Массачуссетского технологического института (США) эпигенетика названа среди десяти важнейших тех- нологий, которые в ближайшее время могут изменить мир и оказать наибольшее влияние на человечество. И это дей- ствительно так. С ней безусловно связан прогресс биологии, медицины, сельского хозяйства и разных биотехнологий. Разумеется, эта книга, ярко и наглядно повествующая о новой науке нашего века общебиологического значения — эпигенетике, очень полезна для широкого круга читателей, интересующихся коренными и острыми современными про- блемами живого, сущности жизни и молекулярных механизмов ее проявлений. Поэтому появление этой книги в России следу- ет всячески приветствовать, она не только пробудит интерес к эпигенетике, расширит и углубит наши знания, но и послужит развитию этой важной научной дисциплины в стране. Книга переведена на русский язык и издана по инициа- тиве известного российского ученого — Николая Викторо- вича Томилина. Перевод сделан к.б.н. В.В. Ашапкиным (глава 4), чл.-кор. РАН Б.Ф. Ванюшиным (глава 9), к.б.н. Ю.И. Подлипаевой (главы 21, 23 и 24), к.б.н. И.И. Фрид- лянской (глава 20) и д.б.н. А.Л.Юдиным. Член-корреспондент РАН Б.Ф. Ванюшин
ГЛАВА I ЭПИГЕНЕТИКА: ОТ ЯВЛЕНИЯ К ОБЛАСТИ НАУКИ Daniel Е. Gottschling Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington 98109 Содержание: 1. Введение 2. История эпигенетики на симпозиумах Колд Спринг Харбор 3. 69-й симпозиум 3.1. Гипотеза гистонового кода 3.2. Динамический «молчащий» хроматин 3.3. Ядерная организация 3.4. Прионы 3.5. Новое явление 4 Заключительные соображения Благодарности Литература 1. Введение Состоявшийся летом 2004 года 69-й симпозиум (Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology) был по- священ теме «Эпигенетика» и многие авторы этой книги были в числе его участников. Как наблюдатель на этом симпозиуме я знал, что это должна была быть интерес- ная встреча. Совещание началось достаточно просто — с попыток определения эпигенетики. После недельных распросов участников на эту тему стало ясно, что задавать такой вопрос — все равно что просить кого-то определить, что такое «семейные ценности»: каждый знает, что это такое, но для каждого это имеет разный смысл. Как объ- яснил Дэвид Хейг [David Haig], отчасти причину такого широкого спектра мнений можно понять исходя из эти- мологии слова «эпигенетика»: это слово имеет двойное происхождение в биологической литературе прошлого века, и значение этого термина продолжает эволюцио- нировать. Уоддингтон [Waddington] первым изобрел этот термин для обозначения исследований «каузальных меха- низмов», посредством которых «гены генотипа осущест- вляют фенотипические эффекты» (см. Haig, 2004). Позже Нэнни [Nanney] использовал этот термин для объяснения своих представлений о том, как клетки с одним и тем же генотипом могут иметь разные фенотипы, сохраняющиеся на протяжении многих поколений. Я определяю эпигенетическое явление как измене- ние в фенотипе, которое является наследуемым, но не связано с мутацией в ДНК. Более того, это изменение в фенотипе должно быть похожим на переключение типа «ВКЛЮЧЕНО» или «ВЫКЛЮЧЕНО», а не градуаль- ной реакцией, и оно должно наследоваться даже если первоначальные условия, вызвавшие это переключе- ние, исчезают. Таким образом, в число эпигенетических явлений я включаю переключение между лизисом и ли- зогенией у бактериофага лямбда (Ptashne, 2004), пере- ключение пилей у уропатогенной Escherichia coli (Нет- day et al., 2003), эффект положения нестабильного типа у Drosophila (Henikoff, 1990), наследуемые изменения в кортикальном паттерне у Tetrahymena (Frankel 1990), прионные болезни (Wickner et al., 2004) и инактивацию Х-хромосомы (Lyon, 1993). 69-й симпозиум состоялся в 100-ю годовщину ге- нетики как области исследований в Лаборатории Колд Спринг Харбор, что делает очень своевременным рас- смотрение эпигенетики. Учитывая этот исторический контекст, я счел уместным рассмотреть изучение эпиге- нетики в свете предыдущих симпозиумов Колд Спринг Харбор Хотя 69-й симпозиум был первым, посвящен- ными специально этой теме, эпигенетические явления и их изучение оказались представленными на протя- жении всей истории этой выдающейся серии симпо- зиумов. Предлагаемая мною история сужается далее моими собственными ограничениями и предпочтения- ми. Для более полной и академической картины я могу порекомендовать свыше 1000 обзоров по эпигенетике, написанных за последние пять лет. Представляя этот хронологический отчет, я надеюсь передать свое ощущение от того, как коллекция внеш-
не несопоставимых явлений слилась воедино в область исследований, затрагивающую все разделы биологии, а также показать, что изучение эпигенетики основывает- ся на стремлении объяснить неожиданное — возможно, в большей степени, чем любая другая область биологи- ческих исследований. 2. История эпигенетики на симпозиумах Колд Спринг Харбор В 1941 году, во время 9-го симпозиума, великий генетик- дрозофилист Герман Меллер (H.J. Muller) описал резуль- таты дальнейшей разработки явления, первоначально названного им «eversporting displacement», — явления, когда крупные хромосомные перестройки приводили к мутантной мозаичной экспрессии генов вблизи точ- ки разрыва (Muller, 1941). Ко времени симпозиума он называл это «мозаицизмом, обусловленным эффектом положения» («position effect variegation»). Было надежно установлено, что затрагиваемые гены были перенесены «в соседство с гетерохроматиновым районом», что пере- несенные эухроматиновые участки «были частично, но в разной степени, трансформированы в состояние гете- рохроматина — ‘гетерохроматинизированы’» и что добав- ление экстракопий гетерохроматиновых хромосом «по- зволяло затронутому гену становиться более нормальным в своем функционировании». В то время это последнее наблюдение вызывало недоумение и было неожиданным, хотя теперь мы знаем, что это результат титрования ли- митирующих компонентов гетерохроматина. На 16-м симпозиуме (1951) высший приоритет име- ло детальное понимание гена. Этим можно объяснить, почему в понимании мозаицизма, обусловленного эф- фектом положения (PEV), имел место незначительный прогресс, хотя и были открыты новые примеры этого явления. Однако первый докладчик отметил, что PEV станет захватывающей областью будущих исследова- ний (Goldschmidt, 1951). Барбара МакКлинток отме- тила, что хромосомные эффекты положения являются основой различий в «мутабильных локусах» кукурузы, и высказала предположение, что наблюдавшаяся ею изменчивость мутабильности, возможно, коренится в тех же механизмах, что лежат в основе PEV у Drosophila (McClintock. 1951). Ко времени 21-го симпозиума идеи МакКлинток о «контролирующих элементах» получили дальнейшее развитие (McClintock, 1956). Две из них имели особо близкое отношение к эпигенетике. В системе контро- лирующего элемента Spm она обнаружила варианты, позволившие ей различать trans-действующие факторы, которые могут «подавлять» ген (уменьшать или устра- нять его фенотипическое выражение), а не заставлять его мутировать. Она также отметила, что некоторые контролирующие элементы могли подавлять действие гена не только в том локусе, куда они вставлены, но и в локусах, которые расположены на некотором расстоя- нии с той или другой стороны от него. Другие исследо- ватели также обнаруживали этот «эффект распростране- ния». Шульц представил биохимические и физические характеристики целых Drosophila, содержащих разные количества гетерохроматина (Schultz, 1956) Хотя эта работа была весьма примитивной, а сделанные на ее основе выводы имели ограниченное значение, она яви- лась примером первых попыток расчленить структуру гетерохроматина и продемонстрировала, насколько трудной окажется эта проблема. Два сообщения на 23-м симпозиуме явились вехами в свете нашего сегодняшнего симпозиума. Во-первых, Бринк описал свои ошеломляющие наблюдения «пара- мутаций» в локусе R у кукурузы. Если две аллели (Rst и Rr) с разными фенотипами в гомозиготном состоянии комбинируются и образуют гетерозиготу, и это растение Rst/Rr, в свою очередь, снова скрещивается, получающе- еся в результате потомство, которое содержит аллель Rr, всегда будет иметь фенотип Rst, хотя аллель Rst больше не присутствует (Brink, 1958). Однако этот фенотип яв- ляется метастабильным — в последующих скрещивани- ях он ревертирует к нормальному фенотипу Rr. Бринк предполагал, что слово «парамутация» «должно исполь- зоваться в этом контексте в своем буквальном смысле, как указывающее на явление, отличное от мутации, но и не полностью непохожее на нее». Во-вторых, Нэн- ни пошел очень далеко в попытках сформулировать «концептуальные и операциональные различия между генетическими и эпигенетическими системами» (Nan- пеу, 1958). По существу он определил эпигенетику иначе, чем первоначально предполагалось Уоддингто- ном (Waddington) (детали см. Haig, 2004). Он счел не- обходимым поступить таким образом, для того чтобы описать явления, наблюдавшиеся им у Tetrahymena. Он получил данные о том, что происхождение цитоплазмы конъюгирующих родительских клеток влияет на детер- минацию типа спаривания получающегося потомства. Данное им определение охватывало и наблюдения, сделанные другими исследователями, включая работу Бринка по локусу R и работу МакКлинток, отмеченную на 21-м симпозиуме. На 29-м симпозиуме значительный интерес вызвала гипотеза инактивации Х-хромосомы у самок млекопи- тающих, незадолго до этого предложенная Мэри Лай- он (Lyon, 1961). Гартлер, Бойтлер и Нанс представили новые данные в ее поддержку (Beutler, 1964; Gartler and Linder, 1964; Nance, 1964). Бойтлер дал обзор многочис- ленных примеров мозаичной экспрессии сцепленных с X генов у женщин, которые свидетельствовали в пользу случайной природы Х-инактивации. Основываясь на тщательном количественном анализе продукта гена, сцепленного с X, Нанс заключил, что инактивация Х-хромосомы происходит до наступления 32-клеточной стадии эмбриона. 38-й симпозиум на тему «Структура и функция хро- мосом» явился возвратом к изучению эукариотических хромосом — к этому времени значительный прогресс был достигнут в изучении прокариотических и фаговых систем, и, как следствие, в расцветающей области мо- лекулярной биологии в мышлении в основном домини- ровала экспрессия бактериальных генов. Однако росло и понимание роли хроматина (ДНК с гистонами и не-
2. История эпигенетики на симпозиумах Колд Спринг Харбор гистоновыми белками) у эукариот, но было неясно, свя- зана ли его роль со структурой хромосомы, с ее функци- ями или же и с тем, и другим (Swift, 1974). Тем не менее, несколько групп начали высказывать предположения, что с транскрипцией генов или с общей структурой хромосом связана посттрансляционная модификация белков хроматина, в том числе гистонов (Allfrey et al., 1974; Louie et al., 1974; Weintraub, 1974). В воздухе витал лишь намек на эпигенетические явления. Высказыва- лись гипотезы о том, что у эукариот большинство генов регулируются повторяющейся ДНК — отчасти исходя из того факта, что открытые МакКлинток контролиру- ющие элементы повторены в геноме. Сообщалось, од- нако, что большая часть повторяющихся нуклеотидных последовательностей ДНК не сцеплена с генами (Pea- cock et al., 1974; Rudkin and Tartof, 1974). С учетом этих наблюдений идея о том, что повторяющиеся элементы регулируют экспрессию генов, в значительной мере утратила поддержку со стороны присутствовавших. Что, однако, более важно, в этих же самых исследова- ниях обнаружилось, что большая часть повторяющейся ДНК локализована в гетерохроматине. 42-к симпозиум продемонстрировал, что за четы- \ разительное количество технических и ин- теллектуальных достижений полностью преобразили изучение эукариотических хромосом (Chambon 1978). К их числу относились использование ферментов ре- стрикции ДНК, разработка технологии рекомбинант- ных ДНК, рутинное разделение белков и нуклеиновых кислот, возможность проведения Саузерн- и Норзерн- анализа, быстрое секвенирование ДНК и РНК и имму- нофлуоресценция на хромосомах. Была представлена нуклеосомная гипотеза и был открыт сплайсинг и РНК. Основной интерес на этом симпозиуме привлекли био- химические и цитологические различия в структуре хроматина, особенно между активно транскрибируе- мыми и неактивными генами. Если, однако, говорить о том, что имело наиболее близкое отношение к эпиге- нетике, то Вайнтрауб с сотрудниками представил свои соображения относительно того, каким образом хрома- тин может обусловливать мозаичную экспрессию генов у организма (Weintraub et al., 1978). 45-й симпозиум явился торжеством открытий Бар- бары МакКлинток — подвижных генетических элемен- тов (Yarmolinsky, 1981). Выполненные в механистиче- ском плане исследования бактериальной транспозиции продемонстрировали чрезвычайный прогресс и вполне оправданно составили около половины всех представ- ленных сообщений, в то время как другие доклады со- держали данные о том, что транспозиция и регулируемая реорганизация генома происходят не только у кукуру- зы, но и у других эукариот, в том числе у мух, львино- го зева, трипаносом, гриба Ascobolus и почкующихся дрожжей. В контексте этого совещания все наблюдав- шиеся случаи мозаичной экспрессии были отнесены на счет транспозиций. Более того, имела место скры- тая тенденция всерьез считать, что контролирующие элементы ответственны за большую часть регуляции генов (Campbell, 1981), что привело некоторых участ- ников к предположению, что «единственной функцией этих элементов является стимулирование генетической изменчивости». В сущности, идея о том, что за регули- руемую экспрессию в мозаицизме, обусловленном эф- фектом положения, ответствен гетерохроматин, была поставлена под сомнение. По отношению к будущим эпигенетическим исследованиям, вероятно, наиболь- шее внимание заслуживало твердое обоснование нали- чия «молчащих» кассет типов спаривания («silent mating cassetttes») у Saccharomyces cerevisiae (Haber et al., 1981; Klar et al., 1981; Nasmyth et al. 1981; Rine et al., 1981). В порядке подготовки к 47-му симпозиуму у позво- ночных была установлена общая корреляция, согласно которой общий уровень метилирования цитозинов в ДНК-последовательностях CpG ниже для генов, кото- рые транскрибируются, чем для тех, которые не транс- крибируются. Однако имелись исключения из этого общего правила, и более детальный анализ показал, что наиболее важным является метилирование специфиче- ских участков промотора гена (Cedar et al., 1983; Doerfler et al., 1983; La Volpe et al., 1983). Базируясь на системах рестрикции-модификации у бактерий, полагали, что метилирование ДНК предотвращает связывание клю- чевых регуляторных белков. К тому же было показано, что паттерны метилирования ДНК у позвоночных мо- гут наследоваться через митоз, что приводило к гипоте- зе о том, что метилирование ДНК может служить сред- ством транскрипционной «памяти»в процессе деления клеток в ходе развития (Shapiro and Mohandas, 1983). Еще одним главным открытием, имеющим отношение к эпигенетике, была идентификация нуклеотидных по- следовательностей ДНК по ту или другую сторону от «молчащих кассет типов спаривания» у почкующихся дрожжей, которые отвечают за транскрипционную ре- прессию генов, находящихся внутри этих кассет; они, таким образом, оказались первыми нуклеотидными по- следовательностями ДНК, необходимыми для хромо- сомных эффектов положения (Abraham et al., 1983). «Молекулярная биология развития» была темой 50-го симпозиума, и на нем тоже был представлен ряд важных достижений. Возможно, одним из самых вол- нующих успехов было осознание всеми того факта, что фундаментальные молекулярные свойства являются консервативными в ходе эволюции — например, RAS человека функционирует в почкующихся дрожжах, го- меобоксные белки консервативны у мух и человека (Ru- bin et al., 1985). Новые попытки понять хромосомный импринтинг начались с разработки техники ядерных пересадок у мышей (Solter et al., 1985). Эти исследова- ния показали, что в отцовском и материнском геномах новой зиготы хранится информация о происхождении от того или другого родителя; важна не просто ДНК сама по себе; хромосомы содержат дополнительную информацию, через кого из родителей они прошли, и эта информация необходима для успешного развития эмбриона. Полагали, что частично ответ лежит в том факте, что от происхождения хромосомы от того или другого родителя зависит дифференциальная экспрес- сия генов (Cattanach and Kirk, 1985). Имелся ряд исследований, направленных на пони- мание сложной регуляции комплекса bithorax; особен-
!/ от явления к области науки но следует отметить сообщение Льюиса, который спе- циально остановился на странной природе известных /гаи5-регуляторов этого локуса; почти все они являют- ся репрессорами данного локуса (Lewis, 1985). Таким образом, поддержание гена в «молчащем» состоянии на протяжении многих клеточных удвоений является обязательным для нормального развития. Это противо- речило весьма распространенному в то время мнению, согласно которому там, где будут приниматься крити- ческие регуляторные решения, касающиеся развития, имеет место активация/индукция гена. К тому времени для ряда организмов была разрабо- тана техника ДНК-трансформации и инсерционного мутагенеза. Один из примеров особенно продуктивного и имеющего отношение к эпигенетике использования этой технологии был получен на Drosophila. Был создан транспозон P-элемент с геном white (цвет глаз) на нем и он «прыгал» по всему геному (Rubin et al., 1985). Это дало возможнсть картировать во всем геноме Drosophila сайты, где мог происходить PEV. Этот симпозиум высветил также первые генетические подходы к расчленению (dissection) явлений детермина- ции пола и компенсации дозы половых хромосом у Dros- ophila (Belote et al., 1985; Maine et al., 1985) и Caenorhabdi- tis elegans (Hodgkin et al., 1985; Wood et al., 1985). 58-й симпозиум отвел главное место празднованию 40-й годовщины открытия, сделанного Уотсоном и Криком. Частью этого торжества была выездная^<тусов- ка», посвященная эпигенетическим явлениям: говори- лось об идентификации новых явлений, начале моле- кулярного анализа других явлений, на ряде систем был достигнут существенный прогресс, позволяющий пред- лагать гипотезы и тестировать их. У трипаносом гены семейства Генов Вариабельных По- верхностных антигенов (VSG — Variable Surface antigene Genes), локализованных возле теломер, в основном «мол- чат», и в каждый данный момент экспрессируется только один VSG. Хотя этот организм, по-видимому, не содер- жит метилированной ДНК, сообщалось, что «молчащие» гены VSG содержат новое минорное основание, 0-D- глюкозилгидроксиметилурапил (Borst et al., 1993). Это основание, по-видимому, занимает в ДНК место тими- дина. Нетрудно провести параллели между этим основа- нием и метилированием цитозина у других организмов — эти модификации важны для поддержания «молчащего» гена. Но как это основание вводится в ДНК или как оно осуществляет такую функцию, было неясно. Прогресс был также достигнут в изучении эпигенети- ческих явлений у позвоночных, в том числе хромосом- ного импринтинга и инактивации Х-хромосомы (Ariel et al., 1993; Li et al., 1993; Tilghman et al., 1993; Willard et al., 1993). К этому времени стало ясно, что у млекопитающих многие локусы подвержены импринтингу; в диплоидных клетках экспрессируется лишь одна аллель, и экспрессия зависит от ее происхождения от того или другого родителя. Особый интерес представлял локус Igf2-H19, главным об- разом потому, что он содержал два соседних гена, которые регулировались противоположным образом, /^экспрес- сируется в отцовской хромосоме, тогда как материнская копия репрессирована; в то же время отцовская аллель Н19 репрессирована, а материнская аллель этого гена экспрессируется. Интересно, что метилированные CpG наблюдались на отцовской хромосоме непосредственно «вверх по течению» от обоих генов Предположили, что дифференциальное метилирование регулирует доступ этих двух генов к близлежащему энхансерному элемен- ту — этот энхансер расположен ближе к Н19 и непосред- ственно «вниз по течению» от него (Tilghman et al., 1993). Можно было представить себе взаимоисключающую кон- куренцию между этими двумя генами за энхансер; когда ген Н19 метилирован, энхансер свободен и активирует бо- лее удаленный ген Igf2. В пользу идеи, что метилирование ДНК играет регуляторную роль в этом процессе, свиде- тельствовали эксперименты с мышами. Мутация первого гена позвоночных, кодирующего 5-метилцитозин-ДНК- метилтрансферазу в ES-клетках, показала, что по мере развития эмбрионов отцовская копия Н19 становилась гипометилированной, и этот ген становился транскрип- ционно активным (Li et al., 1993). Важным шагом в расшифровке того, как 5MeCpG опосредует свои эффекты, явилась очистка первого комплекса, связывающегося с 5MeCpG в ДНК (MeCPl — 5MeCpG DNА-binding complex) (Bird 1993). MeCPl не только связывается с ДНК, но и, связавшись «вверх по течению» от репортерного гена, вызывает репрессию этого гена. Хотя это и не объясняло регуляцию в локусе Igf2-H19, но давало возможный механизм для объясне- ния общей корреляции между метилированием ДНК и репрессией гена. Генетическое картирование на протяжении ряда лет позволило идентифицировать ту часть Х-хромосомы человека, которая является критичной для инакти- вации Х-хромосомы. Исследования этого центра X-инактивации с использованием молекулярного кло- нирования привели к открытию гена Xist (Willard et al., 1993), некодирующей РНК размером ~17 т.о., который экспрессируется только на неактивной Х-хромосоме. Мышиная версия Xist оказалась на удивление гомоло- гичной по структуре и нуклеотидной последовательно- сти и обещала стать прекрасной модельной системой для «расчленения» того пути, на котором эта РНК функци- онирует и репрессирует большую часть Х-хромосомы. Два заслуживающих внимания открытия были опи- саны у Neurospora (Selker et al., 1993). Во-первых, было показано, что метилирование цитозинов в ДНК не огра- ничено динуклеотидами CpG, а может происходить как будто бы в любом ДНК-контексте. Вторым открытием стало описание удивительного явления индуцируемых повторами точечных мутаций (RIP — repeat-induced point mutation). Когда в гаплоидном геноме имеется ду- пликация некой последовательности (сцепленная или несцепленная), и этот геном посредством конъюгации проводится через половой цикл, нуклеотидные после- довательности становятся «К1Рованными». Происходят два события: обе копии дуплицированной ДНК приоб- ретают мутации типа G:C А:Т, а ДНК в пределах не- скольких сотен пар оснований «КХРованных» последо- вательностей становится метилированной. Эта двойная атака на геном весьма эффективна — 50 % неспеплен- ных локусов подвержены RIP, тогда как тесно сцеплен-
2. История эпигенетики на симпозиумах Колд Спринг Харбор ные локусы достигают 100 % — и легко подавляет функ- цию генов. Ген brown у Drosophila, будучи транслоцирован в со- седство с гетерохроматином, демонстрирует доминант- ный PEV; транслоцированная копия может вызвать ре- прессию копии дикого типа. В ходе поисков энхансеров и супрессоров этого явления trans-инактивации Хени- коф (Henikoff) открыл, что дупликация гена, локали- зованного вблизи гетерохроматина, повышает уровень репрессии на нормальной копии (Martin-Morris et al., 1993). Хотя механизм, лежащий в основе этого события, оставался загадочным, постулировали, что это явление могло бы быть аналогичным RIP у Neurospora, хотя оно должно происходить в отсутствии метилирования ДНК, которое у Drosophila не происходит. Пол Шедл (Paul Schedl) изложил концепцию хромо- сомных «граничных элементов» (Vazquez et al., 1993). Первые такие элементы были локализованы с той или другой стороны района «пуфа» в локусе теплового шока у Drosophila и определены по необычной структуре их хроматина — устойчивому к нуклеазе кору величиной ~300 п.н., ограниченному гиперчувствительными к нуклеазе сайтами. Постулировали, что такие элемен- ты разделяют домены хроматина вдоль по длине хро- мосомы. Два теста in vivo свидетельствовали в пользу этой гипотезы: (1) Ограничивая ту или другую сторону репортерного гена, граничные элементы эффективно устраняли хромосомные эффекты положения, когда этот конструкт случайным образом вставлялся в ге- ном. (2) Граничный элемент определялся также по его способности блокировать функцию энхансера. Будучи вставлен между промотором гена и его энхансером, гра- ничный элемент блокировал экспрессию данного гена. Хотя и не в столь определенном виде, эта концепция граничных элементов была разработана и для других организмов, особенно на глобиновом локусе у млеко- питающих (Clark et al., 1993). Исследования на почкующихся дрожжах высветили развивающийся механистический подход [a mechanistic inroad] к связанным с хроматином эпигенетическим яв- лениям. Было уже установлено, что сайленсеры в «мол- чащих» локусах типа спаривания являются сайтами для нескольких связывающихся с ДНК белков. Их связыва- ние оказалось зависимым от контекста, примером чего может быть белок Rapl, который не только играет важ- ную роль в сайленсинге, но и связывается «вверх по те- чению» от ряда генов, активируя транскрипцию (обзор см. Laurenson and Rine, 1992). На протяжении ряда лет были установлены много- численные связи между репликацией ДНК и транс - крипционно «молчащими» районами генома. Неак- тивная Х-хромосома, гетерохроматин и «молчащие» импринтированные локусы — все они, как сообщалось, поздно реплицируются в фазе S по сравнению с транс - крипционно активными районами генома. Кроме того, было показано, что установление сайленсинга в «мол- чащих» локусах типа спаривания требует прохождения через фазу S, что заставлет предполагать, что «молча- щий» хроматин должен быть построен на недавно ре- плицированной ДНК. Так, огромный интерес вызывал тот факт, что один из сайленсеров оказался точкой на- чала репликации ДНК («ориджином»), а его активность в этом качестве нельзя было отделить от функции сай- ленсинга (Fox et al., 1993). Более того, мутанты в не- давно идентифицированном комплексе распознавания «ориджина» (ORC — origin recognition complex) «порти- ли» сайленсинг (Bell et al., 1993; Fox et al., 1993). Еще один подход к «расчленению» структуры гетеро- хроматина и ее влияние на экспрессию генов обусловило открытие, показавшее, что теломеры у Saccharomyces cer- evisiae приводят в действие PEV, аналогичный наблюдае- мому у Drosophila. Репортерные гены, вставленные около теломер, обнаруживают мозаичную экспрессию в коло- нии дрожжей. Репрессированное состояние зависит от многих генов (SIR2, SIR3, SIR4) из тех, что необходимы для сайленсинга в «молчащих» локусах типа спаривания. Были описаны несколько ключевых аспектов, касаю- щихся структуры «молчащего» хроматина и регуляции мозаичной экспрессии. Заслуживает упоминания тот факт, что цитологически гетерохроматин определяется как конденсированный хроматин, но «молчащий» хро- матин у S. cerevisiae никогда не удавалось визуализиро- вать таким образом. Тем не менее, из-за сходства с PEVу Drosophila «молчащий» хроматин у дрожжей всегда были склонны рассматривать как функциональный эквива- лент гетерохроматина (описано в Weintraub, 1993). На основе исследований на дрожжах начал форми- роваться ряд фундаментальных концепций. Во-первых, стало очевидным важное значение гистонов НЗ и Н4. В частности, аминотерминальный «хвост» гистонов НЗ и Н4 оказался непосредственным участником формиро- вания «молчащего» гетерохроматина (Thompson et al., 1993). Специфические мутации в «хвостах» этих гисто- нов облегчали или портили сайленсинг и позволяли ду- мать, что и общий заряд остатков на «хвостах», и специ- фические остатки в составе «хвостов» вносят вклад в сайленсинг. Кроме того, на заре использования имму- нопреципитации хроматина (ChIP) было продемон- стрировано, что лизины в аминотерминальном «хвосте» гистона Н4 гипоацетилированы в районах «молчащего» хроматина по сравнению с остальной частью генома. Более того, одна из гистоновых мутаций позволила идентифицировать Н4К16 гистонов (который может быть ацетилирован) как критичный для формирования «молчащего» хроматина Теломеры оказались простейшей системой для бо- лее глубокого понимания того, каким образом белки Sir опосредуют сайленсинг. Была разработана концепция рекрутирования белков сайленсинга. Говоря коротко, оказалось, что белок Rapl, связывающийся с теломер- ной ДНК, взаимодействует с Sir3 и Sir4 двугибридным способом (by two-hybrid methods — описано в Palladino et al. 1993). Таким образом, Rapl может «рекрутировать» эти белки Sir к теломерному району генома. Имелись данные о том, что Sir3 и Sir4 могут связываться друг с другом и что (и это особенно важно) Sir3 и, возможно, Sir4 взаимодействуют с «хвостами» гстонов НЗ и Н4 (Thompson et al., 1993). Более того, сверхэкспрессия Sir3 заставляет его «распространяться» по хроматино- вой фибрилле внутрь от теломеры, позволяя предпо-
l от явления к области науки лагать, что он является лимитирующим компонентом «молчащего» хроматина и может «полимеризоваться» вдоль хроматина (Renauld et al., 1993). Все вместе по- казывало, что существует, оказывается, обширная сеть взаимодействий, важная для сайленсинга, — белки Sir инициируют сборку на теломерной ДНК, благодаря их взаимодействию с Rapl, а затем полимеризуются от теломеры вдоль хроматинового волокна, предположи- тельно связываясь с «хвостами» гистонов НЗ и Н4. Переключение между транскрипционными состоя- ниями при мозаичной теломерной экспрессии оказа- лось результатом конкуренции в отношении экспрес- сии между «молчащими» и активными генами (Aparicio and Gottschling, 1994; описано в Weintraub, 1993). Если транскрипционный активатор для теломерного гена де- легирован, базовый механизм транскрипции этого гена оказывается недостаточным для экспрессии, и этот ген оказывается конститутивно сайленсированным Нао- борот, сверхэкспрессия активатора заставляла теломер- ный ген экспрессироваться постоянно — это ген никог- да не был сайленсирован. В отсутствие SIR3 (или SIR2 или SIR4) базальная экспрессия гена была достаточной, тогда как увеличенная доза SIR3 повышала долю кле- ток, которые были сайленсированы. Хотя транскрип- ционный активатор мог преодолеть сайленсинг на протяжении всего клеточного цикла, он был наиболее эффективным, когда клетки были остановлены в фазе S — предположительно, когда хроматин реплицируется и, отсюда, оказывается наиболее чувствительйым к кон- куренции. Несколько удивляет, что клетки, остановлен- ные на G2/M, также можно было легко переключить, что заставляло предполагать, что «молчащий» хроматин еще не был полностью собран к этому времени. Было показано, что «молчащий» хроматин у дрож- жей не поддается действию нуклеаз и ферментов мо- дификации ДНК; это позволяет предположить, что ле- жащая в его основе ДНК гораздо менее доступна, чем большая часть генома (описано в Thompson et al. 1993). Оказалось также, что имеет место иерархия сай- ленсинга в геноме дрожжей: наиболее чувствителны к пертурбациям теломеры, затем идет HML, а наименее чувствителен HMR. Действительно, когда ген SIR1 му- тировал, локусы НМ, в норме полностью сайленсиро- ванные, обнаруживали мозаичную экспрессию (Pillus and Rine, 1989). Наконец, Sir3 и Sir4 были локализованы на пери- ферии ядра, как и теломеры. Предположили, что ядро организовано таким образом, что ядерная оболочка обеспечивает специальную среду для сайленсинга (Pal- ladino et al., 1993). Schizosaccharomyces pombe тоже имеют «молчащие» кассеты типов спаривания, которые, как подозревают, ведут себя аналогично кассетам типов спаривания у S cerevisiae. Однако у S. pombe в истории с переключе- нием типов спаривания был дополнительный поворот. В элегантной серии экспериментов Эймар Клар (Amar Klar) выдвинул предположение о том, каким образом в клетке «метка» импринтируется на одной нити ДНК (Klar and Bonaduce, 1993). Эта метка проявляется, после двух клеточных делений, в одной из четырех «внучатых» клеток как двунитевой разрыв, облегчающий переклю- чение типа спаривания У этих дрожжей отсутствуют какие-либо известные модификации ДНК (метилиро- вание и т.п.); отсюда постулируется, что на нити ДНК оставляется метка какого-то иного типа. Темой 59-го симпозиума была «Молекулярная гене- тика рака». Концепция эпигенетической регуляции в онкогенезе начала развиваться после того, как утверди- лась идея генов-супрессоров опухолей. Была опублико- вана пара исследований в пользу таких представлений, но интересный поворот в этой истории возник в иссле- дованиях пациентов с синдромом Бэквита-Видеманна и опухолями Уилмса. Мутации у пациентов обоих ти- пов были картированы в локусе, включавшем имприн- тированные гены H19-IGF2 Фейнберг с соавторами (Feinberg et al., 1994) открыл у таких больных «утрату импринтинга» (LOI — loss of imprinting) для этих генов — материнский локус утрачивал свой импринт, Н19 был репрессирован, a IGF2 — экспрессирован. Таким обра- зом, LOI, которая в принципе могла бы происходить в других местах генома, могла вызывать либо биаллель- ную экспрессию, либо исчезновение генов, критичных для онкогенеза, либо и то и, другое. Через пару лет на пути к 63-му симпозиуму на тему «Механизмы транскрипции» произошли важные со- бытия, которые впоследствии повлияют на понимание молекулярных механизмов нескольких эпигенетиче- ских феноменов. Были идентифицированы ферменты, модифицирующие гистоны, а именно, ацетилазы и деа- цетилазы гистонов Некоторые из этих энзимов играли критическую роль в регулировании экспрессии генов и позволили подойти к генным продуктам, непосред- ственно влияющим на PEVи сайленсинг. На симпозиуме была представлена верхушка этого айсберга (см. Losick, 1998). Молекулярное «расчленение» сайленсирующих белков Sir3 и Sir4 у дрожжей выявило поливалентную природу их взаимодействий и показало, каким образом сеть взаимодействий между всеми белками Sir, гистона- ми и разнообразными факторами, связывающимися с ДНК, формирует «молчащий» хроматин. Кроме того, были показаны молекулярные детали того, как разно- образные локусы (теломеры, рДНК, локусы НМ и дву- нитевые разрывы) могут конкурировать за ограничен- ные ресурсы белков Sir. При нарушении способности специфического локуса рекрутировать факторы сай- ленсинга уровни содержания белков Sir в других локусах повышались (Cockell el al., 1998). Это прямо доказыва- ло, что работает принцип действия масс и что сайлен- синг в одном локусе может влиять на эпигенетический сайленсинг в других локусах (идея, первоначально вы- двинутая в исследованиях PEV у Drosophila, но все еще не проверенная) (Locke et al., 1988). Еще одно открытие позволило объяснить, каким образом метилирование ДНК может регулировать экспрессию генов через хро- матин. Были идентифицированы белковые комплексы, состоящие из МеСР2, которые связываются и с мети- лированной ДНК, и с деацетилазой гистонов (Wade et al., 1998). Метилированная ДНК могла служить точкой рекрутирования деацетилаз к локусу и таким образом облегчать сайленсинг близлежащих генов.
3. 69-й симпозиум Концепция граничных элементов была распростра- нена с Drosophila на млекопитающих (четкие данные были получены на локусе Р-глобина), показывая таким образом, что границы хроматина, вероятно, действи- тельно консервативны у многоклеточных и. возможно, у всех эукариот (Bell et al., 1998). На 64-м симпозиуме, темой которого был «Сигна- линг и экспрессия в иммунной системе», были приве- дены данные о том, как возникает моноаллельная экс- прессия. и о том. что она может быть распространена более широко, чем думали раньше. Моноаллельная экс- прессия в локусах иммуноглобулинов на протяжении некоторого времени была очевидна для лимфоцитов — она гарантировала продукцию единственного типа ре- цепторов в каждой лимфоидной клетке (Mostoslavsky et al., 1999). Аллель, которая будет экспрессироваться, вы- бирается на ранних стадиях развития, очевидно, случай- ным образом: обе аллели вначале находятся в репресси- рованном состоянии, но через некоторое время одна из них деметилируется. Было неясно, как происходит вы- бор одной из аллелей, но это явление обнаруживается и в других локусах, где необходимость моноаллелизма была не столь очевидна. Например, экспрессируется только одна аллель генов, кодирующих цитокины 1L-2 и IL-4 (Pannetier et al., 1999). Наиболее значительное сообщение на 65-м симпо- зиуме, имеющее отношение к эпигенетике, касалось открытия того, что белок Sir2 является деацетилазой ги- стонов (Imai et al., 2000). Это был единственный белок Sir, у которого были очевидные гомологи у всех других эукариот и который регулировал PEV Создавалось впе- чатление, что этот фермент в основном отвечает за уда- ление ацетильных компонентов гистонов в «молчащем» хроматине. Кроме того, поскольку это был фермент, за- висимый от NAD, он связывал регуляцию сайленсинга (гетерохроматина) с клеточной физиологией. 68-й симпозиум на тему «Геном Homo sapiens» явился важной вехой в генетике, и хотя все еще остается про- делать большую генетическую работу, полное секвени- рование этого и других геномов означало, что пришло время переходить на «надгенетический» уровень — в буквальном значении слова «эпигенетика». Этот исторический отчет высвечивает несколько тем, общих со многими другими областями исследо- вания. Во-первых, он демонстрирует эпизодическую природу достижений в эпигенетике. Во-вторых, по мере постижения молекулярных механизмов, лежащих в основе эпигенетических явлений, стало легче связы- вать эпигенетику с биологической регуляцией в целом. В-третьих, он показал, что исследователи, которых мы в настоящее время считаем корифеями науки, устано- вили эти связи очень рано — потребовалось лишь неко- торое время, чтобы большинство остальных «увидели» очевидное. 3. 69-й симпозиум С годами выявилось несколько универсальных прин- ципов, общих для всех эпигенетических явлений, и эти принципы определяют экспериментальные подходы в наших попытках понять детали. Во-первых, различия между двумя фенотипическими состояниями («ВКЛЮ- ЧЕНО» и «ВЫКЛЮЧЕНО») всегда коррелируют с со- ответствующим различием структуры в ключевой ре- гуляторной точке — форма транслируется в функцию. Отсюда, основная задача заключается в идентификации этих двух различных структур, компонентов, из которых эти структуры состоят, и композиционных различий между ними Во-вторых, эти различающиеся структуры должны обладать способностью поддерживать и вос- производить себя в окружении конкурирующих факто- ров и сил энтропии. Таким образом, каждая структура нуждается в самоусилении, или в контурах положитель- ной обратной связи, обеспечивающих ее поддержание и воспроизведение на протяжении многих клеточных делений; в некоторых случаях, таких как инактивация Х-хромосомы, это время оказывается сравнимым со вре- менем жизни На 69-м симпозиуме продолжалось уточнение мно- гих механистических принципов, установленных на предыдущих симпозиумах, но были и новые разработ- ки. Чтобы поместить эти новые разработки в наш кон- текст, важно отметить, что важное влияние на эпигене- тику оказали еще два открытия. Одним было открытие РНК-интерференции и родственных, базирующихся на РНК, механизмах регуляции. Другим было открытие механизмов, лежащих в основе гипотезы прионов. За последнее десятилетие обе эти области быстро развива- лись, и некоторые из этих исследований внесли вклад в наши знания об эпигенетике, базирующейся на хрома- тине, тогда как другие наметили новые перспективы в проблеме наследственной передачи фенотипов. Многие достижения, представленные на этом сим- позиуме, детально описываются в разных главах этой книги, поэтому я воздержусь здесь от обсуждения этих тем Однако я затрону несколько успешных и перспек- тивных исследований, которые привлекли мое вооб- ражение и которые не освещаются на этих страницах В конце я попытаюсь сформулировать наиболее важные концепции, вынесенные мною из этого симпозиума. 3.1. Гипотеза гистонового кода В ходе рассмотрения модификаций гистонов и их по- тенциального информационного содержания состоялось много дискуссий относительно «гипотезы гистонового кода» (Jenuwein and Allis 2001). Большинство этих споров, в которых я принимал участие или о которых мне расска- зывали, были неформальными и довольно оживленны- ми. Сторонники «кода» приводили такие примеры, как триметилирование гистона НЗ по К9 и его повышенное сродство к классу НР1 белков гетерохроматина (Jenuwein and Allis, 2001). Их противники приводили биохимиче- ские и генетические данные о том, что на связывание с ДНК или на фенотип существенно влияет суммарный заряд на аминотерминальном «хвосте» гистона Н4, не- зависимо от того, где этот заряд расположен (Megee et al., 1995; Zheng and Hayes, 2003) Грюнштейн (Grunstein) представил данные, вклю- чавшие анализ модификаций (ацетилирования) гисто-
Глава 1. Эпигенетика, от явления к области науки нов и связанных с хроматином белков во всем геноме S. cerevisiae с использованием специфических антител и метода ChlP-Chip (Millar et al., 2004). Он сделал акцент на ассоциированном с ацетилированием Н4К16 эпиге- нетическом переключении к связыванию или несвязы- ванию определенных белков хроматина, поддерживая таким образом гипотезу гистонового кода. Некоторые из его данных, хотя они и не обсуждались, по-видимому, свидетельствуют в пользу сообщений других исследова- телей о том, что для большой части генома нет корреля- ции между специфичесикми модификациями гистонов и экспрессией генов (т.е. все активные гены имеют оди- наковые метки, и эти метки отсутствуют на неактивных генах) (Schubert et al., 2004; Dion et al., 2005). Учитывая всю совокупность этих результатов, я подозреваю, что в качестве механизмов регулирования структуры хрома- тина и экспрессии генов обычно используются и спец- ифические модификации, и влияние общего заряда 3.2. Динамический «молчащий» хроматин Я должен признаться, что, основываясь на статических изображениях гетерохроматина и на рефрактерной природе «молчащего» хроматина, я был убежден, что, однажды установившись, гетерохроматиновое состояние остается прочным, как гранит. Только когда наступает время репликации ДНК, эта непробиваемая структура становится релаксированной. Думая таким образом, я не- разумно игнорировал принципы равновесной динамики, с которыми познакомился в курсе химии. Однако к этим урокам заставили возвратиться исследования «молча- щего» хроматина и гетерохроматина, где было показано, что белки сайленсинга у дрожжей (Sir3) и белки гетерох- роматина в клетках млекопитающих (НР1) находятся в состоянии динамического равновесия — эти белки быстро обмениваются между гетерохроматином и растворимым компартментом—даже когда хроматин находится в своем наиболее непроницаемом состоянии (Cheng and Garten- berg, 2000; Cheutin et al., 2003). Осознание динамических качеств хроматина вынудило меня иначе взглянуть на то, каким образом поддерживается и воспроизводится его эпигенетическое состояние. Этот взгляд предполагает, что в некоторых системах эпигенетическое состояние может быть ревертировано в любое время, а не только в ходе репликации ДН К. Отсюда мы можем заключить, что для «молчащего» хроматина механизмы усиления и вос- произведения должны функционировать постоянно. Широко распространено мнение, что метилирование гистонов является модификацией, накладывающей на хроматин «перманентную» метку (обзор см. Kubicek and Jenuwein, 2004). В противоположность всем другим мо- дификациям гистонов (например, фосфорилированию, ацетилированию, убиквитинированию) нет известных ферментов, которые могли бы обратимо удалять метиль- ную группу с аминогруппы лизина или аргинина. Более того, считается, что удаление метильной группы про- стым гидролизом в физиологических условиях невыгод- но и, таким образом, вряд ли происходит спонтанно. Несколько сообщений слегка поколебали систему верований тех, кто думал, что метки метилирования являются перманентными. Во-первых, было показано, что ядерная пептидиларгининдеиминаза (PAD4) мо- жет удалять монометилирование с остатков аргинина (R) гистона НЗ (Cuthbert et aL, 2004; Wang et al., 2004). Хотя результатом этого процесса удаления метильного компонента является конвертация остатка аргинина в цитруллин, и, следовательно, это не является истин- ной реверсией данной модификации, он, тем не менее, представляет собой механизм элиминации перманент- ной метильной метки. Робин Олшайр (Robin Allshire) привел провоцирую- щий генетический аргумент, согласно которому ген tis2 из S. pombe ревертирует диметилирование по К9 в ги- стоне НЗ (R. Allshire, личное сообшение). Возможно, он был на верном пути, поскольку через несколько меся- цев после симпозиума было показано, что неродствен- ный фермент LSD1 из млекопитающих специфически деметилирует ди- и монометилы на гистоне НЗ по К4 (Shi et aL, 2004), ревертируя «активную» метку хромати- на. Весьма интересно, что LSD1 не работает на триме- тилированном НЗК4 — таким образом, метилирование может быть ревертировано в ходе процесса маркиров- ки, но реверсия невозможна, коль скоро метка полно- стью созрела. Однако Стив Хеникоф (Steve Henikoff) описал спо- соб, которым могла бы элиминироваться перманентная триметиллизиновая метка Он показал, что вариантный гистон НЗ.З может замещать канонический гистон НЗ независимым от репликации и сопряженным с транс- крипцией образом (Henikoff et al., 2004). По существу гистон, содержащий метильные метки для сайленсинга, мог бы быть удален и заменен гистоном, более подходя- щим для транскрипции. Когда был изолирован суммар- ный хроматин, оказалось, что гистон НЗ.З имел на себе намного больше меток метилирования хроматина (на- пример, К79ше), чем канонический гистон НЗ. При рассмотрении всех этих результатов создается впечатление, что может и не быть простой молекуляр- ной модификации гистонов, которая служит как метка памяти для воспроизведения состояния «молчащего» хроматина в холе клеточного деления. Скорее, должен иметь место тонкий набор взаимодействий, увеличи- вающих вероятность того, что «молчащее» состояние будет поддерживаться, хотя и не гарантирующих это. 3.3. Ядерная организация Корреляции между ядерной локализацией и экспрессией генов были установлены уже много лет назад (Mirkovitch et al., 1987). На основе этих наблюдений начало формиро- ваться мнение, что в клетке имеются специальные ком- партменты, которыми ограничены экспрессия генов или сайленсинг. Приводили доводы в пользу того, что такая организация необходима для поддержания сложности генома и его регуляции в работоспособном состоянии. Эта идея была поддержана исследованиями на S. cer- evisiae, где теломеры преимущественно локализовались на периферии ядра, как и ключевые компоненты ком- плекса сайленсинга, такие как Sir4 (Palladino et al., 1993). Результатом мутаций, высвобождающих теломеры или
4. Заключительные соображения Sir4 с ядерной периферии, является утрата теломерного сайленсинга (Laroche et al., 1998; Andrulis et al., 2002). Более того, искусственная привязка частично сайленси- рованного гена к этой периферии делала его полностью сайленсированным (Andrulis et al.. 1998). В очень информативном эксперименте Гассер по- казал, что если теломеры и сайленсирующий комплекс высвобождаются с периферии и могут свободно пере- мещаться по всему ядру, легко устанавливается тело- мерный сайленсинг (Gasser et al., 2004). Таким образом, по-видимому, нет особой нужды локализовать локусы в компартменте. Это в большей мере согласуется с данны- ми о том, что быстрое перемещение белков хроматина на хромосомы и с хромосом может, кроме того, опосре- довать такую эффективную регуляцию, как сайленсинг. Возможно, чтобы поддерживать высокие локальные концентрации связанных с этим факторов в специ- альных (стрессовых?) условиях, какая-то локализация и необходима. Или же это может быть комбинацией доменов, собранных вместе в ходе эволюции, которая давно работает без всякой конечной цели. 3.4. Прионы Викнер дал обзор прионов и критерии для их опреде- ления, и из его описания становится ясным, что они (прионы) — это часть эпигенетического ландшафта (Wickner et al., 2004a,b). В простейшем молекулярном смысле прионы — это белки, которые могут вызывать наследуемые фенотипические изменения, действуя на родственный этим белкам генный продукт и изменяя его. Никаких изменений нуклеотидной последователь- ности ДНК не происходит; скорее, прион, в общем случае, навязывает своему субстрату некое структур- ное изменение. Прионы, относящиеся к лучше всего изученному и понятому классу, заставляют растворимые формы белка преобразовываться в амилоидные волокна. Во многих случаях эта амилоидная форма снижает или вовсе устраняет нормальную активность данного белка, вызывая таким образом изменение в фенотипе. Викнер определил еше один класс прионов, которые не форми- руют амилоидных нитей. Это ферменты, для активации которых требуется своя же ферментативная активность. Если клетка обладает лишь неактивными формами этого энзима, тогда необходим внешний источник активного энзима, чтобы положить начало тому, что затем станет самовоспроизводящимся признаком, пока по крайней мере одна активная молекула передается каждой клетке. Он привел два примера и выразил уверенность в том, что этот класс белков составит новую группу эпигенетиче- ских механизмов для исследования. Ши представил предварительные данные о том, прионная модель может объяснить научение и память у Aplysia (Si et al., 2004). В нейрональных клетках этого моллюска трансляция ряда запасенных и PH К в белки важна для поддержания кратковременной памяти. Он обнаружил, что регулятор белковой трансляции, СРЕВ, может существовать в двух формах и что активирован- ная форма СРЕВ действует доминантно, воспроизводя себя. Проверка этой идеи все еще находится в самом начале, но обещает фантастические новые подходы на тему о том, каким образом мы помним. 3.5 Новое явление Описание нового и неожиданного феномена всегда по- ражает наше воображение. Одно сообщение в особен- ности занимало мои мысли на протяжении нескольких недель после симпозиума Стандартный генетический анализ мутантных аллелей гена HOTHEAD, регулирую- щего слияние органов у Arabidopsis, показал, что обычные правила менделевской генетики здесь не выполняются (Lolle et al., 2005). Оказалось, что если гетерозиготные (HOTHEAD/hothead) растения самоопыляются и произво- дят гомозиготное растение hothead/hothead, а затем этому гомозиготному растению hothead/hothead дают самоопы- литься, потомство от этого гомозиготного родителя ревертирует к генотипу HOTHEAD/hothead с частотой до 15 %. Этот потрясающе высокий уровень реверсии к дико- му типу давал, на нуклеотидном уровне, точный дубликат гена дикого типа, наблюдавшегося в предшествующих поколениях. Эта реверсия не ограничивалась локусом HOTHEAD — несколько других локусов обнаруживали сходные частоты реверсии к аллелям дикого типа. Однако для всех этих реверсий требовалось, чтобы родитель был гомозиготным hothead/hothead. Продукт гена HOTHEAD не дает никакого очевидного объяснения, как такое мо- жет происходить, но прошедшие обсуждения определен- но заставляют предполагать, что некая архивная копия гена дикого типа передавалась в ряду последовательных поколений, возможно через РНК. Хотя можно возра- зить, что это явление лежит вне сферы «эпигенетики», — поскольку связано с изменениями в нуклеотидной по- следовательности ДНК, — наследственная передача этой предполагаемой архивной копии не подчиняется нормальным генетическим правилам. Так или иначе, этот феномен чреват огромными последствиями для генети- ки, особенно в области эволюционного мышления. 4. Заключительные соображения Итак, что еще нужно сделать, чтобы понять эпигенетиче- ские механизмы? По большей части мы все еще собираем (открываем) их отдельные компоненты. Точно так же, как полная последовательность генома чрезвычайно об- легчила прогресс в области генетики, так и более ясное понимание эпигенетики придет, вероятно, тогда, когда станут известными все составные части. Успехи, достиг- нутые за последнее десятилетие, очень вдохновляют. Признаюсь, я не в состоянии различить, близки ли мы или далеки от точного, в механистическом плане, понимания того, каким образом поддерживаются и воспроизводятся эпигенетические состояния. Первым, возможно, придет понимание феноменов, базирую- щихся на прионах; те же явления, которые базируются на хроматине, по-видимому, наиболее далеки от это- го. Поливалентная природа взаимодействий, которые, по-видимому, необходимы для установления сайлен- сированного состояния на хромосоме, увеличивает
сложность проблемы. Последняя еше более усложня- ется динамической природой «молчащего» хроматина. Возможность узнать больше о движении компонентов в хроматиновые структуры и из них требует для окон- чательного понимания применения усовершенствован- ных или совсем новых методов. Иммунопреципитация хроматина, оказавшаяся важной в установлении того, какие компоненты находятся в составе структуры, вре- менно заслонила от нас динамику. Я подозреваю, что, учитывая эту сложность, простое измерение констант связывания и равновесия для всех компонентов и попытки получить систему дифферен- циальных уравнений для имитации эпигенетических переключателей могут оказаться неэффективной тратой ресурсов и не обязательно приведут к лучшему понима- нию. Скорее, я предполагаю, что потребуется разработ- ка математического подхода нового типа в комбинации с новыми экспериментальными методами измерения для окончательного понимания эпигенетических со- бытий. В частности может потребоваться разработка систем in vitro, надежно воспроизводящих эпигенети- ческое переключение между состояниями. Идея конкуренции между двумя состояниями в боль- шинстве эпигенетических явлений, вероятно, отражает «гонку вооружений», происходящую на многих уровнях клетки, за которой следуют попытки исправить «сопут- ствующий ущерб». Например, белки сайленсинга воз- никли, возможно, для зашиты генома от транспозонов Однако, поскольку белки сайленсинга работают через по- средство вездесущих нуклеосом, становятся репрессиро- ванными некоторые критичные гены. Чтобы преодолеть это, возникли модификации гистонов (например, мети- лирование НЗК4 и НЗК79) и замещение вариантными гистонами, чтобы предотвращать связывание белков сай- ленсинга с критичными генами. В зависимости от после- дующих событий эти изменения могут быть кооптированы для других процессов — например, может стать полезной репрессия некоторых генов белками сайленсинга («мол- чащие» локусы типа спаривания). Механизмы сайленсин- га могут кооптироваться и для других функций, таких как стимуляция расхождения хромосом. И так далее... Я жду секвенирования геномов новых организмов, поскольку это может привести нас к пониманию по- следовательности эволюционных событий, приведших к возникновению эпигенетических процессов, которые мы наблюдаем сегодня. Например, у S. cerevisiae отсут- ствует аппарат RNAi, но у многих других грибов он есть. Заполняя некоторые филогенетические пробелы между видами, мы можем выяснить, какие события привели к тому, что S. cerevisiae больше не «нуждаются» в этой си- стеме. Изучение эпигенетики, возможно, более, чем какая- либо другая область биологических исследований, основывается на стремлении понять неожиданные на- блюдения, начиная с мозаицизма, обусловленного эф- фектом положения, до полярной сверхдоминантности в фенотипе callipyge (Georges et al., 2004). Надежда по- нять что-то необычное служит для нас приманкой, но скоро мы приходим в восторг при виде разумности ис- пользуемых механизмов. Этим можно объяснить, по- чему эта область привлекла непропорционально много веселых и светлых умов Я подозреваю, что так и будет продолжаться по мере достижения нами более высоко- го уровня мастерства и открытия новых и неожиданных эпигенетических явлений. Благодарности Я благодарю моих коллег в Университете Чикаго и Раковом исследовательском центре Фреда Хатчинсо- на, которые сделали мои собственные исследования по эпигенетике столь приятными; я благодарен также Национальным институтам здоровья за финансовую поддержку. Литература Abraham J., Feldman J., Nasmyth К.A., Strathem J.N., Klar A.J., Broach J.R., and Hicks J.B. 1983. Sites required for position- effect regulation of mating-type information in yeast. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 989-998. Allfrey V.G., Inoue A., Karn J., Johnson E.M., and Vidali G. 1974. Phosphorylation of DNA-binding nucle- ar acidic proteins and gene activation in the HeLa cell cycle. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 785-801. Andrulis E.D., Neiman A.M., Zappulla D.C., and Ster- nglanz R. 1998. Perinuclear localization of chromatin faci- litates transcriptional silencing. Nature 394: 592-595. Andrulis E.D., Zappulla D.C., Ansari A., Perrod S., Laiosa C.V., Gartenberg M.R., and Stemglanz R. 2002. Escl, a nuclear pe- riphery protein required for Sir4-based plasmid anchoring and partitioning. Mol. Cell. Biol. 22: 8292-8301. Aparicio O.M. and Gottschling D.E. 1994. Overcom- ing telomeric silencing: A trans-activator competes to establish gene expression in a cell cycle-dependent way. Genes Dev. 8: 1133-1146. Ariel M., Selig S., Brandeis M., Kitsberg D., Kafri T., Weiss A., Ke- shet I., Razin A., and Cedar H. 1993. Allele-specific structures in the mouse Igf2-H19 domain. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 307-313. Bell A., Boyes J., Chung J., Pikaan M., Prioleau M.N., Recillas F., Saitoh N., and Felsenfeld G. 1998. The establishment of active chromatin domains. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 63: 509-514. Bell S.P., Marahrens Y, Rao H., and Stillman B. 1993. The replicon model and eukaryotic chromosomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 435-442. Belote J.M., McKeown M.B., Andrew D.J., Scott T.N., Wolfner M.F., and Baker B.S. 1985. Control of sexual differentiation in Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 50: 605-614. Beutler E. 1964. Gene inactivation: The distribution of gene products among populations of cells in heterozygous humans. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 29: 261-271. Bird A.P. 1993. Functions for DNA methylation in vertebrates. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 281-285. Borst P., Gommers-Ampt J.H., Ligtenberg M.J., Rudenko G., Kieft R., Taylor M.C., Blundell P.A., and van Leeuwen F. 1993. Con- trol of antigenic variation in African trypanosomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 105-114.
Brink R.A. 1958. Paramutation at the R locus in maize. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 23: 379-391. Campbell A. 1981. Some general questions about movable elements and their implications. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 1-9. Cattanach B.M. and Kirk M. 1985. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice. Nature 315: 496-498. Cedar H., Stein R., Gruenbaum Y, Naveh-Many T, Sciaky-Gallili N., and Razin A. 1983. Effect of DNA methylation on gene ex- pression. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 605-609. Chambon P. 1978. Summary: The molecular biology of the eukaryotic genome is coming of age. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 42:1209-1234. Cheng TH. and Gartenberg M.R. 2000. Yeast heterochromatin is a dynamic structure that requires silencers continuously. Genes Dev. 14: 452-463. CheutinT, McNaim A.J., Jenuwein T, Gilbert D.M., Singh Р.В., and Misteli T. 2003. Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HP1 binding. Science 299: 721-725. Clark D., Reitman M., Studitsky V, Chung J., Westphal H., Lee E., and Felsenfeld G. 1993. Chromatin structure of transcriptionally active genes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 1-6. Cockell M., Gotta M., Palladino P, Martin S.G., and Gasser S.M. 1998. Targeting Sir proteins to sites of action: A general mecha- nism for regulated repression. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 63:401-412 Cuthbert G.L., Daujat S., Snowden A. W.. Erdjument-Bromage H., Hagiwara T, Yamada M., Schneider R., Gregory P.D., Tempst P, Bannister A.J., and Kouzarides T. 2004. Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell 118: 545-553. Dion M.F., Altschuler S.J., Wu L.F., and Rando O.J. 2005, Genomic characterization reveals a simple histone H4 acetylation code. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 5308-5309. Doerfler W., Kruczek I., Eick D., Vardimon L, and Kron B. 1983. DNA methylation and gene activity: The adenovirus system as a model. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 593-603. Feinberg A.P., Kalikin L.M., Johnson L.A., and Thompson J.S. 1994. Loss of imprinting in human cancer. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 59: 357-364. Fox C.A., Loo S., Rivier D.H., Foss M.A., and Rine J. 1993. A transcriptional silencer as a specialized origin of replication that establishes functional domains of chromatin Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 443-455. Frankel J 1990. Positional order and cellular handedness. J. Cell Sci. 97:205-211. Gartler S.M., and Linder D. 1964. Selection In mammalian mo- saic cell populations. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 29: 253-260. Gasser S.M., Hediger R., Taddei A., Neumann F.R., and Gartenberg M.R. 2004. The function of telomere clustering in yeast: The circe effect. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 327-337. Georges M., Charlier C, Smit M., Davis E., Shay T, Tordoir X., Takeda H., Caiment R, and Cockett N. 2004. Toward molecular understanding of polar overdominance at the ovine callipyge locus. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 477-483. Goldschmidt R.B. 1951. The theory of the gene: Chromosomes and genes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 16: 1-11. Haber J.E., Weiffenbach B., Rogers D.T, McCusker J., and Rowe L.B. 1981. Chromosomal rearrangements accompanying yeast mating-type switching: Evidence for a gene-conversion model. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 991-1002. Haig D. 2004. The (dual) origin of epigenetics. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 67. Henikoff S. 1990. Position-effect variegation after 60 years. Trends Genet. 6: 422-426. Henikoff S., McKittrick E., and Ahmad K. 2004. Epigenetics, histone H3 variants, and the inheritance of chromatin states. Cold Spring Harbor Symp Quant. Biol. 69: 235-243. Hemday A.D.. Braaten B.A., and Low D.A. 2003. The mechanism by which DNA adenine methylase and PapI activate the pap epigenetic switch. Mol. Cell 12: 947-957. Hodgkin J., Doniach T, and Shen M. 1985. The sex determination pathway in the nematode Caenorhabditis elegans: Variations on a theme. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 585-593. Imai S., Johnson F.B., Marciniak R.A., McVey M., Park P.U., and Guarente L. 2000. Sir2: An NAD-dependent histone deacetylase that connects chromatin silencing, metabolism, and aging. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 65: 297-302. Jenuwein T. and Allis CD. 2001. Translating the histone code. Sci- ence 293: 1074-1080. Klar A.J., and Bonaduce M.J. 1993. The mechanism of fission yeast mating-type interconversion: Evidence for two types of epigenet-ically inherited chromosomal imprinted events. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 457-465. Klar A.J., Hicks J.B., and Strathem J.N. 1981. Irregular transposi- tions of mating-type genes in yeast. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 983-990. Kubicek S. and Jenuwein T. 2004. A crack in histone lysine methyla- tion. Cell 119: 903-906. La Volpe A., Taggart ML, Macleod D., and Bird A. 1983. Coupled demethylation of sites in a conserved sequence of Xenopus ribosomal DNA. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 585-592. Laroche X., Martin S.G., Gotta M., Gorham H.C., Pryde F.E., Louis E.J., and Gasser S.M. 1998. Mutation of yeast Ku genes disrupts the subnuclear organization of telomeres. Curr. Biol. 8: 653-656. Laurenson P. and Rine J. 1992. Silencers, silencing, and heritable transcriptional states. Microbiol. Rev. 56: 543-560. Lewis E.B. 1985. Regulation of the genes of the bithorax complex in Drosophila. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 155-164. Li E., Beard C, Forster A.C., BestorTH., and Jaenisch R. 1993. DNA methylation, genomic imprinting, and mammalian development. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 297-305. Locke J., Kotarski M.A., and Tartof K.D. 1988. Dosage-dependent modifiers of position effect variegation in Drosophila and a mass action model that explains their effect. Genetics 120: 181-198. Lolle S.J., Victor J.L., Young J.M., and Pruitt R.E. 2005. Genome- wide non-mendelian inheritance of extra-genomic information in Arabidopsis. Nature 434: 505-509. Losick R. 1998. Summary: Three decades after sigma. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 63: 653-666. Louie A.J., Candido E.P, and Dixon G.H. 1974. Enzymatic modifi- cations and their possible roles in regulating the binding of basic proteins to DNA and in controlling chromosomal structure. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 803-819. Lyon M.R. 1961. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Musmusculus L.). Nature 190: 372-373. Lyon M.R. 1961. Epigenetic inheritance in mammals. Trends Genet. 9:123-128.
: от явления к области науки Maine Е.М., Saiz Н.К., Schedl Р., and Cline T.W. 1985. Sex-lethal, a link between sex determination and sexual differentiation in Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:595-604. Martin-Morris L.E., Loughney K., Kershisnik E.O., Poortinga G., and Henikoff S. 1993. Characterization of sequences responsible for trans-inactivation of the Drosophila brown gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 577-584. McClintock B. 1951. Chromosome organization and genic expres- sion. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 16: 13-47. McClintock B. 1956. Controlling elements and the gene Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 21: 197-216. Megee P.C., Morgan B.A., and Smith M.M. 1995. Histone H4 and the maintenance of genome integrity. Genes Dev. 9: 1716-1727. Millar C.B., Kurdistani S.K., and Grunstein M. 2004. Acetylation of yeast histone H4 lysine 16: A switch for protein interactions in heterochromatin and euchromatin. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 193-200. Mirkovitch J., Gasser S.M., and Laemmli U.K. 1987. Relation of chromosome structure and gene expression. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 317: 563-574. Mostoslavsky R., Kirillov A., Ji Y.H., Goldmit M., Holzmann M., Wirth T., Cedar H., and Bergman Y. 1999. Demethylation and the establishment of к allelic exclusion Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 64: 197-206. Muller H.J. 1941. Induced mutations in Drosophila. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 9: 151-167. Nance W.E. 1964. Genetic tests with a sex-linked markerGlucose- 6-phosphate dehydrogenase. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 29: 415-425. Nanney D.L. 1958. Epigenetic factors affecting mating type expres- sion in certain ciliates. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 23:327-335. Nasmyth K.A., Tatchell K., Hall B.D., Astell C., and Smith M. 1981. Physical analysis of mating-type loci in Saccharomyces cerevisiae. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 961-981. Palladino F., Laroche T., Gilson E., Pillus L., and Gasser S.M. 1993. The positioning of yeast telomeres depends on SIR3, SIR4, and the integrity of the nuclear membrane. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 733-746. Pannetier C., Hu-Li J., and Paul W.E. 1999. Bias in the expression of IL-4 alleles: The use of T cells from a GFP knock-in mouse. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 64: 599-602. Peacock W.J., Brutlag D., Goldring E., Appels R., Hinton C.W, and Lindsley D.L. 1974. The organization of highly repeated DNA sequences in Drosophila melanogaster chromosomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38:405-416. Pillus L. and Rine J. 1989. Epigenetic inheritance of transcriptional states in S. cerevisiae. Cell 59: 637-647. Ptashne M. 2004. A genetic switch: Phage lambda revisited, 3rd edi- tion. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Renauld H., Aparicio O.M., Zierath P.D., Billington B.L., Chhablani S.K., and Gottschling D.E. 1993. Silent domains are assembled continuously from the telomere and are defined by promoter distance and strength, and by SIR3 dosage. Genes Dev. 7:1133-1145. Rine J., Jensen R., Hagen D., Blair L., and Herskowitz I. 1981. Pattern of switching and fate of the replaced cassette in yeast mating-type interconversion. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 951-960. Rubin G.M. 1985. Summary. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 905-908. Rubin G.M., HazelriggT, Karess R.E., Laski F.A., Laverty T, Levis R., Rio D.C., Spencer F.A., and Zuker C.S. 1985. Germ line specificity of P-element transposition and some novel patterns of expression of transduced copies of the white gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 329-335. Rudkin G.T. and Tartof K.D. 1974. Repetitive DNA in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 397-403. Schubeler D., MacAlpine D.M., Scalzo D., Wirbelauer C., Kooper- berg C, van Leeuwen R, Gottschling D.E., O’Neill L.P., Turner B.M., Delrow J., et al. 2004. The histone modification pattern of active genes revealed through genome-wide chromatin analysis of a higher eukaryote. Genes Dev. 18: 1263-1271. Schultz J. 1956. The relation of the heterochromatic chromosome regions to the nucleic acids of the cell. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 21: 307-328 Selker E.U., Richardson G.A., Garrett-Engele P.W, Singer M.J., and Miao V. 1993. Dissection of the signal for DNA methylation in the £-T| region of Neurospora. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 323-329. Shapiro L.J. and Mohandas T. 1983. DNA methylation and the control of gene expression on the human X chromosome Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. \T. 631-637. Shi Y, Lan E., Matson C., Mulligan P, Whetstine J.R., Cole P.A., and Casero R.A. 2004. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953. Si K„ Lindquist S., and Kandel E. 2004. A possible epigenetic mechanism for the persistence of memory. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 497-498. Solter D., Aronson J., Gilbert S.F., and McGrath J. 1985. Nuclear transfer in mouse embryos: Activation of the embryonic genome. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 45-50. Swift H. 1974. The organization of genetic material in eukaryotes: Progress and prospects Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 963-979. Thompson J.S., Hecht A., and Grunstein M. 1993. Histones and the regulation of heterochromatin in yeast. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 247-256. Tilghman S.M., Bartolomei M.S., Webber A.L., Brunkow M.E., Saam J., Leighton PA., Pfeifer K., and Zemel S. 1993. Parental imprinting of the H19 and Igf2 genes in the mouse. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 287-295. Vazquez J., Farkas G., Gaszner M., Udvardy A., Muller M., Hag- strom K., Gyurkovics H., Sipos L., Gausz J., Galloni M., et al. 1993. Genetic and molecular analysis of chromatin domains. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 45-54. Wade P.A., Jones P.L., Vermaak D., Veenstra G.J., Imhof A., Sera T, Tse C., Ge H., Shi Y.B., Hansen J.C., and Wolffe A.P. 1998. Histone deacetylase directs the dominant silencing of tran- scription in chromatin: Association with MeCP2 and the Mi-2 chromodomain SWI/SNF ATPase. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 63: 435-445. Wang Y, Wysocka J., Perlin J.R., Leonelli L., Allis C.D., and Coonrod S.A. 2004. Linking covalent histone modifications to epigenetics: The rigidity and plasticity of the marks. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 161-169. Weintraub H. 1974. The assembly of newly replicated DNA into chromatin. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 247-256
Weintraub H. 1993. Summary: Genetic tinkering local problems, local solutions. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 58: 819- 836. Weintraub H., Flint S.J., Leffak I.M., Groudine M., and Grainger R.M. 1978. The generation and propagation of variegated chro- mosome structures. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 42: 401-407. Wickner R.B., Edskes H.K., Ross> E.D., Pierce M.M., Baxa U., Brachmann A., and Shewmaker F. 2004a. Prion genetics: New rules for a new kind of gene. Annu. Rev. Genet. 38: 681-707. Wickner R.B., Edskes H.K., Ross E.D., Pierce M.M., Shewmaker P., Baxa U.. and Brachmann A. 2004b. Prions of yeast are genes made of protein: Amyloids and enzymes Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 489-496. Willard H.F., Brown C.J., Carrel L., Hendrich B., and Miller A. P. 1993. Epigenetic and chromosomal control of gene expression: Molecular and genetic analysis of X chromosome inactivation. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 315-322. Wood W.B., Meneely P., Schedin P, and Donahue L. 1985. Aspects of dosage compensation and sex determination in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 575-583. Yarmolinsky M.B. 1981. Summary. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45'. 1009-1015. Zheng C., and Hayes J.J. 2003. Structures and interactions of the core histone tail domains. Biopolymers 68: 539—546.
ГЛАВА 2 КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ЭПИГЕНЕТИКИ Gary Felsenfeld National Institute of Diabets and Digestive and Kidney, National Institute of Heath. Bethesda, Maryland 20892-0540 СОДЕРЖАНИЕ: 1. Введение 2. Ключи от генетики и биологии развития 3. Во всех соматических клетках организма ДНК одинакова 4. Роль метилирования ДНК 5. Роль хроматина 6. Все механизмы взаимосвязаны Литература 1. Введение История эпигенетики связана с исследованиями эволю- ции и развития. Но за последние 50 лет значение самого термина «эпигенетика» претерпело эволюцию, сопоста- вимую с резко возросшим пониманием молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции экспрессии ге- нов у эукариот. Наше современное рабочее определение выглядит следующим образом: «Изучение митотически и (или) мейотически наследуемых изменений в генной функции, которые нельзя объяснить изменениями в ну- клеотидной последовательности ДНК» (Riggs et al., 1996). Однако до 1950-х годов слово «эпигенетика» использова- ли в совершенно другом смысле — для обозначения всех событий развития, ведущих от оплодотворенной зиготы к зрелому организму, то есть всех регуляторных процессов, которые, начиная с генетического материала, формируют конечный продукт (Waddington 1953). Эта концепция берет свое начало в гораздо более ранних исследованиях в области клеточной биологии и эмбриологии, начиная с конца XIX столетия, которые заложили фундамент наше- го сегодняшнего понимания взаимоотношений между ге- нами и развитием. Долгое время среди эмбриологов шли горячие споры о природе и локализации компонентов, ответственных за реализацию плана развития организма. В своих попытках осмыслить большое число остроумных, но в конечном счете противоречивых экспериментов по манипулированию с клетками и зародышами эмбриологи разделились на две школы: на тех, кто думал, что каждая клетка содержит преформированные элементы, которые в ходе развития лишь увеличиваются в размерах, и тех, кто полагал, что этот процесс включает химические реакции между растворимыми компонентами, которые и реализуют сложный план развития. Эти воззрения сфокусировались на относительном значении ядра и цитоплазмы в процессе развития. Вслед за открытием существования хромосом, сделанным Флемингом в 1879 году опыты, проведенные многими исследователями, в том числе Вильсоном и Бовери, дали надежное до- казательство того, что программа развития находится в хромосомах. В конечном счете, Томас Гент Морган (Mor- gan, 1911) привел наиболее убедительные доказательства этой идеи, продемонстрировав генетическое сцепление нескольких генов Drosophila с Х-хромосомой. Начиная с этого момента, был достигнут быстрый прогресс в создании линейных карт хромосом, в кото- рых отдельные гены были локализованы в специфиче- ских сайтах на хромосомах Drosophila (Sturtevant, 1913). Конечно, оставались без ответа классические вопросы «эпигенеза»: какие молекулы внутри хромосом несут генетическую информацию, каким образом они на- правляют программу развития и как эта информация передается при клеточном делении. Было известно, что в хромосомах присутствуют и нуклеиновая кислота, и белки, но их относительный вклад не был очевиден; ко- нечно, никто не верил, что нуклеиновая кислота одна может нести всю информацию о развитии. Более того, оставались более старые вопросы о возможном вкладе цитоплазмы в процессы развития. Данные генетики Drosophila (см. ниже) заставляли считать, что насле- дуемые изменения в фенотипе могут происходить без соответствующих изменений в «генах». Характер этих дискуссий резко изменился, когда ДНК была иден- тифицирована как основной носитель генетической информации. В конечном счете оказалось полезным
3. Во всех соматических клетках организма ДНК одинакова переопределить эпигенетику таким образом, чтобы раз- личать те наследуемые изменения, которые возникают в результате изменений в нуклеотидной последователь- ности ДНК, и те, которые с ними не связаны. 2. Ключи от генетики и биологии развития Что бы ни происходило с этим определением, с начала 20-го столетия неуклонно накапливались идеи и научные данные, лежащие в основе современного понятия «эпиге- нетика». В 1930 году Герман Меллер (Muller, 1930) описал у Drosophila класс мутаций, которые он назвал «eversport- ing displacements» («eversporting» в данном случае обозна- чает высокую частоту фенотипического изменения). Эти мутанты были связаны с хромосомными транслокациями (displacements), но «даже тогда, когда все части хромати- на, по всей видимости, были представлены в нормальной дозе, — хотя и были ненормально расположены отно- сительно друг друга, — фенотипический результат не всегда был нормальным». В некоторых из этих случаев Меллер наблюдал мух, у которых были пятнистые глаза. Он думал, что это, вероятно, обусловлено «генетическим разнообразием различных клеток, формирующих глаз», но дальнейший генетический анализ привел его к тому, чтобы связать необычные свойства с хромосомной пере- стройкой; он сделал вывод, что «с этим как-то связаны, скорее, хромосомные участки, влияющие одновременно на различные признаки, чем отдельные гены или гипо- тетические ’’генные элементы”». На протяжении после- дующих 10—20 лет убедительные данные, полученные во многих лабораториях (см. Hannah, 1951), подтвердили, что эта пятнистость, мозаичность возникает тогда, когда перестройки ставят рядом ген белых глаз и гетерохрома- тиновые районы. В течение этого периода хромосомные перестройки всех типов были объектом огромного внимания. Было очевидно, что гены не являются полностью независи- мыми сущностями; на их функционирование может влиять их локализация в геноме — как было многократ- но продемонстрировано на многих мутантах Drosophila, которые приводили к мозаицизму, а также на других му- тантах, связанных с транслокациями в эухроматиновые районы, у которых можно было наблюдать эффекты положения более общего типа (не мозаичного). Стала также ясной — главным образом благодаря работам МакКлинток (McClintock, 1965) — роль перемещаемых элементов в генетике растений. Вторая линия доказательств берет свое начало в ис- следованиях процессов развития. Было очевидно, что во время развития имеет место дивергенция фенотипов сре- ди дифференцирующихся клеток и тканей, и оказалось, что такие различные особенности фенотипа, однажды установившись, могут клонально наследоваться делящи- мися клетками. Хотя на этом этапе стало понятно, что существует клеточноспецифичное программирование и что оно может быть передано дочерним клеткам, было не столь очевидно, каким образом это происходит. Был придуман и рассмотрен целый ряд механизмов В частности, для исследователей-биохимиков клетка характеризовалась многочисленными взаимозависи- мыми биохимическими реакциями, которые поддер- живают ее идентичность. Например, в 1949 году Макс Дельбрюк (Delbrbck, цит. в Jablonka and Lamb, 1995) предположил, что простая пара биохимических цепей реакций, каждая из которых продуцирует в качестве промежуточного вещества ингибитор другого пути, могла бы в результате давать систему, способную пере- ключаться между двумя устойчивыми состояниями. Несколько позже были обнаружены реальные примеры таких систем — в Lac-опероне Escherichia coli (Novick and Wemer, 1957) и в переключении фага между лизоген- ным и литическим состояниями (Ptashne, 1992). Функ- ционально эквивалентные модели можно придумать и для эукариот. Предметом живого интереса и дискуссий был, конечно, сравнительный вклад ядра и цитоплазмы в передачу дифференцированного состояния в развива- ющемся эмбрионе; самостабилизирующаяся цепь био- химических реакций предположительно должна была поддерживаться при делении клетки. Второй тип эпи- генетической передачи был четко продемонстрирован у Paramecium и других инфузорий, у которых картина расположения ресничек могла варьировать у отдельных особей и наследоваться клонально (Beisson and Son- nebom, 1965). Результатом изменения этого кортикаль- ного паттерна с помощью микрохирургии была пере- дача нового паттерна последующим поколениям. Было высказано предположение, что сходные механизмы ра- ботают и у многоклеточных организмов, у которых ло- кальные цитоплазматические детерминанты влияют на организацию клеточных компонентов таким образом, что эта организация может передаваться при клеточном делении (Grimes and Aufderheide, 1991). 3. Во всех соматических клетках организма ДНК одинакова Хотя морфология хромосом показывала, что все сома- тические клетки обладают полным набором хромосом, было далеко не очевидно, что все соматические клетки сохраняют полный набор ДНК, присутствующий в оплодотворенном яйце. Не было даже ясно, вплоть до работ Эвери, МакЛеода и МакКарти в 1944 году (Avery et al., 1944) и Херши и Чейза (Hershey and Chase, 1952), что свободная от белков молекула ДНК может нести генетическую информацию; последний вывод получил очень сильную поддержку, когда в 1953 году Уотсон и Крик (Watson and Crick, 1953) расшифровали структуру ДНК. Работы Бриггса и Кинга (Briggs and King, 1952) на Rana pipiens и Ласки и Гердона (Laskey and Gurdon, 1970) на Xenopus продемонстрировали, что результатом введения ядра из ранних эмбриональных клеток в дену- клеированные ооциты может быть развитие эмбриона. Но даже в 1970 году Ласки и Гердон могли говорить, что «предстоит еще доказать, что соматические клетки взрос- лого животного имеют гены помимо тех, которые необ- ходимы для их собственного роста и дифференцировки». В статье, содержавшей это утверждение, они продолжали показывать, что в первом приближении ДНК ядра со- матической клетки при введении в денуклеированную
Глава 2. Краткая история эпигенетики яйцеклетку способна направлять эмбриогенез. Теперь было ясно, что программа развития и специализация репертуара экспрессии, наблюдаемая в соматических клетках, должны включать сигналы, которые не являются результатом какой-то делении или мутации в нуклеотид- ной последовательности ДНК зародышевого пути, когда эта ДНК передается соматическим клеткам. Конечно, существуют способы, посредством кото- рых ДНК соматических клеток может стать отличаю- щейся от ДНК зародышевого пути с соответствующими последствиями для фенотипа клетки: например, как показали работы Барбары МакКлинток и других гене- тиков растений, мобильные элементы могут изменять картину экспрессии в соматических клетках. Аналогич- ным образом, генерация разнообразия антител связана с перестройками ДНК в линии соматических клеток. Эта перестройка (или, точнее, ее последствия) может рассматриваться как своего рода эпигенетическое со- бытие, сопоставимое с ранними наблюдениями эффек- та положения мозаичного типа, описанного Меллером. Однако значительная часть работ по эпигенетике в по- следние годы была сосредоточена на системах, в кото- рых не происходило никаких перестроек ДНК, и, следо- вательно, акцент делался на модификациях оснований и на белках, образующих комплексы с ДНК в ядре. 4. Роль метилирования ДНК Инактивация Х-хромосомы явилась одной из первых моделей эпигенетического механизма этого рода (Ohno et al., 1959; Lyon, 1961); в соматических клетках «молчащая» Х-хромосома явно выбиралась случайным образом, и не было никаких данных об изменениях в самой нуклеотид- ной последовательности ДНК. Отчасти для объяснения этого типа инактивации Риггс (Riggs, 1975) и Холлидей и Пью (Holliday and Pugh, 1975) предположили, что в качестве эпигенетической метки могло бы выступать метилирование ДНК. Ключевыми моментами этой моде- ли были представления о том, что сайты метилирования являются палиндромными и что за метилирование не- модифицированной ДНК и ДНК, уже метилированной по одной нити, отвечают разные ферменты. Постули- ровали, что первое событие метилирования происходит значительно труднее, чем второе; однако, коль скоро первая нить модифицирована, комплементарная нить будет быстро модифицирована в том же палиндромном сайте. Метильная метка, имевшаяся на родительской нити, после репликации могла бы копироваться на до- чернюю нить, и в результате происходила бы надежная передача метилированного состояния следующему поко- лению. Вскоре после этого Берд воспользовался тем, что главной мишенью метилирования у животных является последовательность CpG (Doskocil and Sorm, 1962), для того чтобы предложить использовать чувствительные к метилированию ферменты рестрикции как способ вы- явления метилированного состояния. Последующие ис- следования (Bird, 1978; Bird and Southern, 1978) показали затем, что эндогенные сайты CpG были либо полностью неметилированы, либо полностью метилированы. Пред- сказания, сделанные на основе этой модели, были, таким образом, подтверждены: тем самым был установлен механизм эпигенетической передачи метильной метки посредством полуконсервативного воспроизведения картины метилирования. В годы, последовавшие за этими открытиями, огром- ное внимание было уделено эндогенным паттернам ме- тилирования ДНК, возможной передаче этих паттернов через зародышевый путь, роли метилирования ДНК в сайленсинге генной экспрессии, возможным механиз- мам инициации или ингибирования метилирования в полностью неметилированном сайте и идентификации энзимов, ответственных за метилирование de novo и за поддержание метилирования на уже метилированных сайтах. Хотя значительный объем метилирования ДНК, наблюдаемый у позвоночных, связан с повторяющими- ся и ретровирусными последовательностями и может служить для поддержания этих последовательностей в перманентно «молчащем» состоянии, не может быть никаких сомнений в том, что во многих случаях эта мо- дификация обеспечивает основу для эпигенетической передачи состояния генной активности. Наиболее четко это продемонстрировано на таких импринтированных локусах (Cattanach and Kirk, 1985), как локус Igf2/H19 мыши или человека, где одна аллель маркирована мети- лированием ДНК, которое в свою очередь контролирует экспрессию с обоих генов (Bell and Felsenfeld, 2000; Hark et al., 2000). В то же самое время было ясно, что это не может быть единственным механизмом для эпигенети- ческой передачи информации. Например, как отмечено выше, эффект положения мозаичного типа наблюдали за много лет до этого у Drosophila —организма, который обладает крайне низким уровнем метилирования ДНК. Более того, в последующие годы генетики, работавшие с Drosophila, идентифицировали группы генов Polycomb и Trithorax, которые, по-видимому, участвуют в посто- янном «запирании» («locking in») состояния активности кластеров генов в холе развития (либо «выключеного», либо «включенного», соответственно). Тот факт, что эти состояния стабильно передавались в ходе клеточного деления, позволял предполагать, что в основе этого ле- жит эпигенетический механизм 5. Роль хроматина Многие годы признавалось, что белки, связанные с ДНК в эукариотномядре. особенно гистоны, могут участвовать в модификации свойств ДНК Задолго до начала работ по метилированию ДНК Стедман и Стедман (Stedman and Stedman, 1950) предположили, что гистоны могут дей- ствовать как общие репрессоры экспрессии генов. Они писали, что поскольку все соматические клетки организ- ма имеют одно и то же число хромосом, они имеют оди- наковый генетический набор (хотя, как отмечается выше, это оставалось не доказанным еще несколько лет). По- нимание тонкой природы модификаций гистонов было в далекой перспективе, так что Стедманы оперировали предположением, что разные типы клеток в организме, чтобы генерировать наблюдаемые различия в фенотипе, должны обладать различными типами гистонов. Гистоны действительно могут снижать содержание транскриптов
5. Роль хроматина до уровней гораздо ниже тех, что наблюдаются для не- активных генов у прокариот. Последующая работа была направлена на способность хроматина служить матрицей для транскрипции и на решение вопроса о том, ограни- чена ли эта способность специфичным для клеточного типа образом. В работе 1963 года Боннер (Bonner et al., 1963) приготовил хроматин из продуцирующей глобулин ткани растения гороха и показал, что, когда добавляли PH К-полимеразу из Е. coli и получающийся в результате транскрипт транслировали в системе in vitro, можно было выявить глобулин Такой результат был специфичен для данной ткани. С пришествием методов гибридизации в таких экспериментах in vitro можно было исследовать популяции транскриптов (Paul and Gilmour, 1968); они оказались специфичными для той конкретной ткани, из которой был получен хроматин. Другие результаты позволяли предполагать, что эта специфичность от- ражает ограничения в доступе к сайтам инициации транскрипции (Cedar and Felsenfeld, 1973). Тем не менее, был период, когда все полагали, что гистоны являются супрессорными белками, которые пассивно подавляют экспрессию генов. С этой точки зрения, активация гена означает просто «сдирание» с него гистонов; считалось, что коль скоро это сделано, транскрипция будет осущест- вляться почти как у прокариот. Имелись, однако, неко- торые данные о том, что в эукариотических клетках нет более или менее протяженных районов открытой ДНК (Clark and Fesenfeld, 1971). Более того, даже если модель «голой» ДНК является правильной, было неясно, каким образом принимается решение о том, какие из покрытых гистонами участков должны быть очищены. Решение этой проблемы началось еще в 1964 году, когда Олфри (Allfrey et al., 1964) высказал спекулятив- ное соображение, что с активацией генов могло бы кор- релировать ацетилирование гистонов и что «активный» хроматин не обязательно должен быть лишен гистонов. В последующее за этим десятилетие наблюдался огром- ный интерес к изучению взаимоотношений между мо- дификациями гистонов и экспрессией генов. Были идентифицированы иные, чем ацетилирование, моди- фикации (метилирование и фосфорилирование), но их функциональное значение оставалось неясным. Иссле- довать эту проблему стало гораздо легче после откры- тия Корнбергом и Томасом (Kornberg and Thomas, 1974) структуры нуклеосомы, фундаментальной субъедини- цы хроматина. Определение кристаллической струк- туры нуклеосомы, сначала с разрешением 7 Е, а потом с разрешением 2.8 Е также дало важную структурную информацию, в частности данные о вытягивании ами- нотерминальных «хвостов» гистонов за пределы кора «ДНК — белковый октамер», что делало очевидной их доступность для модификаций (Richmond et al., 1984; Luger et al., 1997). Начав в 1980 году и продолжив свои исследования на протяжении еще нескольких лет, Грун- штейн (Grunstein) и его сотрудники (Wallis et al., 1980; Durrin et al., 1991), применив генетический анализ на дрожжах, смогли показать, что аминотерминальные «хвосты» гистонов имеют важное значение для регуля- ции экспрессии генов и для формирования «молчащих» доменов хроматина. Окончательная привязка к детальным механизмам началась с того, что Эллис (Allis) (Brownell et al., 1996) показал, что ацетилтрансфераза гистонов из Tetrahyme- па гомологична регулятору транскрипции у дрожжей, белку Gcn5; это явилось прямым доказательством того, что ацетилирование гистонов связано с контролем экс- прессии генов. С тех пор, конечно, произошел букваль- но взрыв открытий модификаций гистонов, а также пе- реоценка роли тех из них, которые уже были известны прежде. Все это еще не было ответом на вопрос о том, каким образом сайты для модификации выбираются in vivo. Было показано, например (Pazin et al., 1994), что Gal4- VP16 может активировать транскрипцию с реконструи- рованной хроматиновой матрицы зависимым от АТФ образом. Активация сопровождалась репозициониро- ванием нуклеосом, и было высказано предположение, что это является критическим событием в обеспечении доступности промотора. Для более полного понимания значения этих открытий потребовалась идентификация АТФ-зависимых комплексов ремоделинга нуклеосом, таких как SW1/SNF и NURF (Peterson and Herskowitz, 1992; Tsuiyama and Wu, 1995), и понимание того, что в подготовке хроматиновой матрицы к транскрипции участвуют и модификации гистонов, и ремоделинг ну- клеосом. Оставалось неясным, каким образом, с использова- нием этих механизмов, информация о состоянии актив- ности могла бы передаваться при клеточном делении; была, таким образом, неясна их роль в эпигенетической передаче информации. Следующим важным шагом стало понимание того, что модифицированные гисто- ны рекрутируют специфичным в отношении данной модификации образом белки, которые могут влиять на локальные структурные и функциональные состояния хроматина. Было, например, обнаружено, что метили- рование лизина 9 в гистоне НЗ приводит к рекрутирова- нию белка НР1 гетерохроматина (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001; Nakayama et al., 2001). Более того, HP1 мог рекрутировать энзим (Suv39hl), отвечающий за метилирование. Это привело к созданию модели вос- произведения сайленсированного состояния хроматина по всему данному участку посредством процессивно- го [processive] механизма (рис. 2.1а). В равной степени важно, что это обеспечило разумное объяснение того, каким образом это состояние может быть передано и сохранено в цикле репликации (рис. 2.16). Были пред- ложены аналогичные механизмы для воспроизведения активного состояния, включающие метилирование ли- зина 4 в гистоне НЗ и рекрутирование белков группы Trithorax (Wysocka et al., 2005). Были предложены различные типы механизмов вос- произведения, которые зависели не от модифициро- ванных, а от вариантных гистонов (Ahmad and Henikoff, 2002; McKittrick et al., 2004). Гистон НЗ включается в хроматин только во время репликации ДНК. Напротив, вариант этого гистона, НЗ.З, отличающийся от НЗ че- тырьмя аминокислотами, включается в нуклеосомы не зависящим от репликации образом и имеет тенденцию накапливаться в активном хроматине, где он обогащает-
эпигенетики ся «активными» модификациями гистонов (McKittrick et aL, 2004). Предположили, что для поддержания ак- тивного состояния достаточно присутствия НЗ.З и что после репликации остается достаточно НЗ.З для под- держания активного состояния, хотя он и разбавляется вдвое. Последующая транскрипция приводила бы к за- мещению нуклеосом, содержащих НЗ, вариантом НЗ.З, воспроизводя таким образом это активное состояние в следующем поколении. 6. Все механизмы взаимосвязаны В этих моделях в конечном счете начала замыкаться связь между модифицированными или вариантными гистона- ми, активацией специфических генов и эпигенетикой, хотя, конечно, многое еще остается сделать. В то время как эти механизмы дают нам какие-то представления о том, как состояние гетерохроматина может поддер- живаться, они не объясняют, каким образом структуры «молчащего» хроматина устанавливаются впервые. Лишь недавно стало ясно, что это связано с продукцией РНК-транскриптов, особенно с повторяющихся по- следовательностей, которые подвергаются процессингу в малые РНК благодаря действию таких белков, как Dicer, Argonaute и РНК-зависимая РНК-полимераза. Впоследствии эти РНК рекрутируются в гомологич- ные сайты ДНК как часть комплексов, включающих компоненты группы белков Polycomb, инициируя та- ким образом формирование гетерохроматина. Сейчас имеются также данные о том, что для поддержания по крайней мере некоторых гетерохроматиновых районов требуются те же механизмы. В известном смысле эти устойчивые циклические цепи реакций напоминают предложенную Дельбрюком модель 50-летней давности — модель устойчивого биохимического цикла, поддержи- вающего данное состояние организма. Мы знаем теперь бесчисленные примеры эпиге- нетических механизмов, работающих в организме. Кроме импринтинга во многих локусах и описанной выше аллель-специфичной и случайной инактива- ции Х-хромосомы существуют эпигенетические явле- ния, связанные с экспрессией антител, где селективно подавляется перестройка генов иммуноглобулина в одной хромосоме, и с выбором для экспрессии генов рецепторов индивидуальных одорантов в обонятель- ных нейронах (Chess et al., 1994; Shykind et al., 2004). У Drosophila гены группы Polycomb ответственны за установление домена «молчащего» хроматина, кото- рый поддерживается на протяжении всех последующих клеточных делений. Эпигенетические изменения от- вечают также за парамутации у растений, при которых одна аллель может вызывать наследуемое изменение в экспрессии гомологичной аллели (Stam et al., 2002). Это пример эпигенетического состояния, которое наследуется как митотически, так и мейотически — феномен, хорошо документированный у растений, но лишь изредка встречающийся у животных (Jorgensen, а Нить А Нить В I Репликация I ДНК Нить А Рис. 2.1. Механизмы поддержания паттерна метилирования ДНК и модификаций гистонов в ходе репликации ДНК (а) механизм поддержания паттерна метилирования ДНК в ходе репликации ДНК. Во время репликации отдельные нити ДНК, со специфическим паттерном метилирования в остатках CpG или CpXpG, спариваются с нитью вновь синтезированной, не- метилированной ДНК. CpG на одной нити имеет соответствующий CpG на другой. Поддерживающая ДНК-метилтрансфераза распознает полуметилированный сайт и метилирует цитозин на новой нити, так что паттерн метилирования не нарушается; (б) общий механизм для поддержания модификаций гистонов в ходе репликации. Модифицированный гистоновый «хвост» (ш) взаимодействует с белком-связкой (pb — a protein binder), имеющим сайт связывания, специфичный для данной модификации, pb. в свою очередь, имеет специфический сайт для энзима (е), который выполняет эту модификацию гистона, т.е. в свою очередь, может затем модифицировать соседнюю нуклеосому. Во время репликации вновь откладывающиеся гистоны, которые переме- жаются с родительскими гистонами, могут таким образом приобретать данную родительскую модификацию. Сходный механизм мог бы обеспечить воспроизведение, распространение модификаций гистонов с модифицированного на немодифицированный участок на любой стадии клеточного цикла
Литература 1993). Значительная часть доказательств существова- ния описанных выше механизмов получена в работах по сайленсированию локуса типа спаривания и цен- тромерных последовательностей у Schizosaccharomyces pombe (Hall et al., 2002). Кроме того, было показано, что структура конденсированного хроматина, характерная для центромер у таких разных организмов, как мухи и люди, может быть передана через ассоциированные с центромерой белки, а не через нуклеотидную последо- вательность ДНК. Во всех этих случаях нуклеотидная последовательность ДНК остается интактной, но ее способность к экспрессии подавляется. Весьма вероят- но, что во всех случаях это опосредуется метилировани- ем ДНК, модификациями гистонов или обоими этими механизмами; в некоторых случаях мы уже знаем, что это действительно так. Наконец, представление об эпигенетической передаче кортикальных «паттернов», описанных выше для парамеций, распространилось те- перь на прионные белки, которые поддерживают и вос- производят свое альтернативное состояние фолдинга в дочерних клетках Хотя все это было представлено в виде последова- тельного рассказа, более правильным был бы взгляд на эти события, как на ряд параллельных и перекрываю- щихся попыток определить и объяснить эпигенетиче- ские явления. Определение термина «эпигенетика» изменилось, но вопросы относительно механизмов развития, поставленные более ранними поколениями ученых, остались прежними. Современная эпигенети- ка все еще обращается к этим центральным вопросам. Семьдесят лет прошло с тех пор, как Меллер описал явление, называемое сейчас эффектом положения мо- заичного типа. Доставляет удовольствие проследить этот медленный прогресс от наблюдения фенотипов, через элегантные генетические исследования, к совре- менному анализу и решению проблем на молекулярном уровне. Вместе с этими знаниями пришло понимание того, что в действительности эпигенетические меха- низмы могут отвечать за значительную часть фенотипа сложных организмов. Как нередко случается, наблюде- ние, показавшееся вначале хотя и интересным, но, воз- можно, маргинальным по отношению к главным про- блемам, оказывается центральным, хотя для осознания этого может понадобиться много времени. Литература Ahmad К. and Henikoff S. 2002. The histone variant H3.3 marks ac- tive chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Mol. Cell. 9: 1191-1200. Allfrey V.G., Faulkner R., and Mirsky A.E. 1964. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 51: 786-794. Avery O.T., MacLeod CM., and McCarty M. 1944. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J. Exp. Med. 79: 137-158. Bannister A., Zegerman P, Partridge J.. Miska E., Thomas J.. Allshire R., and Kouzarides T. 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-124. Beisson J. and Sonnebom T.M. 1965. Cytoplasmic inheritance of the organization of the cell cortex in Paramecium aurelia. Proc. Natl. Acad. Sci. 53: 275-282. Bell A.C. and Felsenfeld G. 2000. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the lgf2 gene. Nature 405:482-485. Bird A. P. 1978. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation. II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J. Mol. Biol. 118:49-60. Bird A.P. and Southern E.M. 1978. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation. I. The methylation pattern in nbosomal DNA from Xenopus laevis. J. Mol. Biol. 118: 27-47. Bonner J., Huang R.C., and Gilden R.V. 1963. Chromosomally directed protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 50: 893-900. Briggs R. and King TJ. 1952. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’ eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. 38: 455-463. Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T, Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymenahistone acetyltrans- ferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851. Cattanach B.M. and Kirk M. 1985. Differential activity ot maternally and paternally derived chromosome regions in mice. Nature 315: 496-498. Cedar H. and Felsenfeld G. 1973. Transcription of chromatin in vitro J. Mol. Biol. 77: 237-254. Chess A., Simon I., Cedar H., and Axel R. 1994. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell 78: 823-834. Clark R.J. and Felsenfeld G. 1971. Structure of chromatin. Nat. New Biol. 229: 101-106. Doskocil J. and Sorm F. 1962. Distribution of 5-methylcytosine in pyrimidine sequences of deoxyribonucleic acids. Biochim. Bio- phys. Acta 55: 953-959. Durrin L.K., Mann R.K., Kayne P.S., and Grunstein M. 1991. Yeast histone H4 N-terminal sequence is required for promoter activa- tion in vivo. Cell 65: 1023-1031. Grimes G.W. and Aufderheide KJ. 1991. Cellular aspects of pat- tern formation: The problem of assembly Monogr. Dev. Biol. 22: 1-94. Hall 1.М., Shankaranarayana C.D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., and Grewal S.I. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2215-2218. Hannah A. 1951 Localization and function of heterochromatin in Drosophila melanogaster. Adv. Genet. 4: 87-125. Hark A.T., Schoenherr C.J., Katz D.J., Ingram R.S., Levorse J.M., and Tilghman S.M. 2000. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. Nature 405: 486-489. Hershey A.D. and Chase M. 1952. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J. Gen. Physiol. 36: 39-56. Holliday R. and Pugh J.E. 1975. DNAmodification mechanisms and gene activity during development. Science 187: 226-232. Jablonka E. and Lamb M.J. 1995. Epigenetic inheritance and evolu- tion: The Lamarckian dimension Oxford University Press, New York, p. 82. Jorgensen R. 1993. The germinal inheritance of epigenetic infor- mation in plants. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 339: 173-181.
эпигенетики Kornberg R.D. and Thomas J.0.1974. Chromatin structure; oligom- ers of the histones. Science 184: 865-868. Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T. 2001. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120. Laskey R.A. and Gurdon J.B. 1970. Genetic content of adult somatic cells tested by nuclear transplantation from cultured cells. Nature 228:1332-1334. Luger K., Mader A. W, Richmond R.K., Sargent D.F., and Rich- mond T.J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 E resolution. Nature 389: 251-260. Lyon M.E 1961. Gene action in the X-chromosome of the mouse. Nature 190: 372-373. McClintock В. 1965. The control of gene action in maize. Brookhaven Symp. Biol. 18: 162-184. McKittrick E., Gafken P.R., Ahmad K., and Henikoff S. 2004. His- tone НЗ.З is enriched in covalent modifications associated with active chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 1525-1530. Morgan T. 1911. An attempt to analyze the constitution of the chro- mosomes on the basis of sex-linked inheritance in Drosophila. J. Exp. Zool. 11: 365-414. Muller H.J. 1930. Types of visible varia- tions induced by X-rays in Drosophila. J. Genet. 22: 299-334. Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.I. 2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292: 110-113. Novick A. and Weiner M. 1957. Enzyme induction as an all-or-none phenomenon. Proc. Natl. Acad. Sci. 43: 553-566. Ohno S., Kaplan W.D., and Kinosita R. 1959. Formatipn of the sex chromatin by a single X-chromosome in liver cells of Rattus norvegicus. Exp. Cell Res. 18: 415-418. Paul J. and Gilmour R.S. 1968. Organ-specific restriction of tran- scription in mammalian chromatin. J. Mol. Biol. 34: 305-316. Pazin M.J., Kamakaka R.T., and Kadonaga J.T 1994. ATP-dependent nucleosome reconfiguration and transcriptional activation from preassembled chromatin templates. Science 266: 2007-2011. Peterson C.L. and Herskowitz 1.1992. Characterization of the yeast SWI1, SWI2, and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription. Cell 68: 573-583. Ptashne M. 1992. A genetic switch: Phage X and higher organisms, 2nd edition. Blackwell Science, Maiden, Massachusetts and Cell Press, Cambridge, Massachusetts. Richmond T.J.. Finch J.T, Rushton B„ Rhodes D., and Klug A. 1984. Structure of the nucleosome core particle at 7 E resolution. Nature 311:532-537. Riggs A.D. 1975. X inactivation, differentiation, and DNA methyla- tion. Cytogenet. Cell Genet. 14: 9-25. Riggs A. D. and Porter TN. 1996. Overview of epigenetic mechanisms. In Epigenetic mechanisms of gene regulation (ed. VE.A. Russo et al.), pp. 29-45. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Riggs A.D., Martienssen R.A., and Russo VE.A. 1996. Introduction. In Epigenetic mechanisms of gene regulation (ed. VE.A. Russo et al.), pp. 1-4. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Shykind B.M., Rohani S.C., O’Donnell S., Nemes A., Mendelsohn M., Sun Y, Axel R., and Bamea G. 2004. Gene switching and the stability of odorant receptor gene choice. Cell 117: 801 -815. Stam M., Belele C, Dorweiler J., and Chandler V. 2002. Differential chromatin structure with a tandem array 100 kb upstream of the maize bl locus is associated with paramutation. Genes Dev. 16: 1906-1918. Stedman E. and Stedman E. 1950. Cell specificity of histones Nature 166:780-781. Sturtevant A. 1913. The linear arrangement of six sex-linked factors in Drosophila, as shown by their mode of association. J. Exp. Zool. 14: 43-59. Tsukiyama T. and Wu C. 1995. Purification and properties of an ATP- dependent nucleosome remodeling factor. Cell 83: 1011-1020. Waddington C.H. 1953. Epigenetics and evolution. Symp. Soc. Exp. Biol. 7: 186-199. Wallis J.W, Hereford L., and Grunstein M. 1980. Histone H2B genes of yeast encode two different proteins. Cell 22: 799-805. Wysocka J., Swigut T, Milne T Dou Y, Zhang X., Burlingame A., Roeder R., Brivanlou A., and Allis CD. 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for НЗ K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872.
ГЛАВА 3 ОБЩИЙ ОБЗОР И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ С. David Allis, Thomas Jenuwein, and Danny Reinberg The Rockefeller University, New York;'Research Institute of Molecular Pathology, Vienna, Austria; ‘UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, New Jersey СОДЕРЖАНИЕ Общее резюме 1. Генетика vs. эпигенетика 2. Модельные системы для изучения эпигенетики 3. Определение эпигенетики 4. Хроматиновая матрица 5. Более высокие уровни организации хроматина 6. Различие между эухроматином и гетерохрома- тином 7. Модификации гистонов и гистоновый код 8. Комплексы, осуществляющие ремоделинг хро- матина, и варианты гистонов 9. Метилирование ДНК 10. РНКи и сайленсинг генов, направляемый РНК 11. От одноклеточных систем к многоклеточным 12. Polycomb и Trithorax 13. Инактивация Х-хромосомы и факультативный гетерохроматин 14. Репрограммирование клеточной судьбы 15. Рак 16. В чем же в действительности заключается эпи- генетический контроль? 17. Основные вопросы в эпигенетических исследо- ваниях Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Секвенирование ДНК генома человека и геномов многих модельных организмов вызвало в последние несколько лет значительное возбуждение в биомедицинском со- обществе и среди обычной публики. Эти генетические «синьки», демонстрирующие общепринятые правила менделевской наследственности, оказываются теперь легко доступными для тщательного анализа, открывая дверь для более глубокого понимания биологии челове- ка и его болезней. Эти знания порождают также новые надежды на новые лечебные стратегии. Тем не менее, многие фундаментальные вопросы остаются без ответа. Например, как осуществляется нормальное развитие, при том что каждая клетка обладает одной и той же ге- нетической информацией и все же следует своим особым путем развития с высокой временной и пространствен- ной точностью? Каким образом клетка решает, когда ей делиться и дифференцироваться, а когда сохранять не- изменной клеточную идентичность, реагируя и проявляя себя согласно своей нормальной программе развития? Ошибки, случающиеся в вышеупомянутых процессах, могут вести к возникновению таких болезненных состоя- ний, как рак. Закодированы ли эти ошибки в ошибочных «синьках», которые мы унаследовали от одного или обоих родителей, или же имеются какие-то другие слои регуляторной информации, которые не были правильно считаны и декодированы? У человека генетическая информация (ДНК) орга- низована в 23 пары хромосом, состоящих из примерно 25 000 генов. Эти хромосомы можно сравнить с библио- теками, содержащими разные наборы книг, которые в совокупности обеспечивают инструкции для развития целого человеческого организма. Нуклеотидная по- следовательность ДНК нашего генома состоит из при- мерно 3 х 109 оснований, сокращенно обозначаемых в этой последовательности четырьмя буквами А, С, Си Т, которые образуют определенные слова (гены), пред- ложения, главы и книги. Однако чем же диктуется, ког- да именно и в каком порядке эти разные книги нужно читать, остается далеко не ясным. Ответ на этот экстра- ординарный вызов заключается, вероятно, в том, чтобы выяснить, каким образом клеточные события скоор- динированы в процессе нормального и ненормального развития. Если просуммировать все хромосомы, молекула ДНК у высших эукариот имеет длину около 2 метров и, следовательно, должна быть максимально сконденси- рована — примерно в 10 000 раз, — чтобы поместиться в клеточном ядре — том компартменте клетки, в котором хранится наш генетический материал Накручивание 2 Эпигенетика.
и основные понятия ДНК на «шпульки» из белков, так называемых гисто- новых белков, обеспечивает элегантное решение этой проблемы упаковки и дает начало полимеру, в котором повторяются комплексы бел ок: ДНК и который изве- стен как хроматин. Однако в процессе упаковки ДНК для лучшего соответствия ограниченному пространству задача усложняется — во многом так же, как при расста- новке слишком большого числа книг на библиотечных полках: становится все труднее и труднее найти и про- честь книгу по выбору и, таким образом, становится не- обходимой система индексирования. Такое индексиро- вание обеспечивается хроматином как платформой для организации генома. Хроматин не однороден по своей структуре; он выступает в различных формах упаковки — от фибриллы высококонденсированного хроматина (известного как гетерохроматин) до менее компакти- зированной формы, где гены обычно экспрессируются (известной как эухроматин). В основной полимер хро- матина могут вводиться изменения путем включения необычных гистоновых белков (известных как вариан- ты гистонов), измененных структур хроматина (извест- ных как ремоделинг хроматина) и добавления хими- ческих «флажков», меток к самим гистоновым белкам (известного как ковалентные модификации). Более того, добавление метильной группы непосредственно к цитозиновому основанию (С) в матрице ДНК (извест- ное как метилирование ДНК) может создавать сайты для присоединения белков, чтобы изменить^состояние хроматина или повлиять на ковалентную модификацию резидентных гистонов. Полученные в последнее время данные позволяют предполагать, что некодирующие РНК могут «направлять» переход специализированных участков генома в более компактные состояния хро- матина. Таким образом, на хроматин следует смотреть как на динамический полимер, который может индек- сировать геном и усиливать сигналы, поступающие из внешней среды, определяя в конечном счете, какие гены должны экспрессироваться, а какие нет. В совокупности эти регуляторные возможности наде- ляют хроматин неким организующим геномы началом, которое известно как «эпигенетика» и которое является предметом этой книги. В некоторых случаях паттерны эпигенетического индексирования оказываются насле- дующимися в ходе клеточных делений, обеспечивая тем самым клеточную «память», которая может расширять потенциал наследуемой информации, заключенный в генетическом (ДНК) коде. Таким образом, в узком смысле слова эпигенетику можно определять как из- менения в транскрипции генов, обусловленные моду- ляциями хроматина, которые не являются результатом изменений в нуклеотидной последовательности ДНК. В этом обзоре мы объясняем основные концепции, связанные с хроматином и эпигенетикой, и обсуждаем, каким образом эпигенетический контроль может дать нам ключ для решения некоторых давнишних тайн — таких как клеточная идентичность, опухолевый рост, пластичность стволовых клеток, регенерация и старе- ние. По мере того, как читатели будут «продираться» через последующие главы, мы советуем им обратить внимание на широкий спектр экспериментальных мо- делей, которые, по-видимому, имеют эпигенетическую (неДНКовую) основу. Выраженное в механистических терминах понимание того, как функционирует эпиге- нетика, будет, вероятно, иметь важные и далеко идущие последствия для биологии и болезней человека в эту «постгеномную» эру. 1. Генетика vs. эпигенетика Определение структурных деталей двойной спирали ДНК явилось одним из ключевых открытий всей биологии. ДНК является главной макромолекулой, хранящей гене- тическую информацию (Avery et al. 1944), и она передает эту запасенную информацию следующему поколению че- рез зародышевый путь. На базе этого и других открытий возникла «центральная догма» современной биологии. Эта догма в краткой форме выражает процессы, связан- ные с поддержанием и транслированием генетической матрицы и необходимые для жизни. Существенными этапами являются (1) самовоспроизведение ДНК путем полуконсервативной репликации; (2) однонаправленная (от 5’ - к 3’-концу) транскрипция — матричный процесс, определяемый генетическим кодом (ДНК); образование промежуточного соединения — информационной РНК (иРНК); (3) трансляция иРНК и образование полипепти- дов, состоящих из линейных (от амино- к карбоксильной группе) цепочек аминокислот, колинеарных с 5’—3’- последовательностью ДНК. Говоря простыми словами: ДНК “РНК -> белок. Центральная догма обеспечивает обратную связь от РНК к ДНК на основе процесса об- ратной транскрипции, сопровождающейся интеграцией в существующую ДНК (что демонстрируется ретрови- русами и ретротранспозонами). Однако эта догма не признает наличие обратной связи от белка к ДНК, хотя новым поворотом в судьбе генетической догмы явился тот факт, что редкие белки, известные как прионы, могут наследоваться в отсутствие матриц ДНК или РНК. Таким образом, эти специализированные самоаггрегирующиеся белки обладают свойствами самой ДНК, в том числе ме- ханизмом репликации и хранения информации (Cohen and Prusiner, 1998; Shorter and Lundquist, 2005). Кроме того, новые данные заставляют предполагать, что очень большая часть нашего генома транскрибируется в «не- кодирующие» РНК. Функция этих некодирующих РНК (т.е. не кодирующих белки, не считая tRNAs, rRNAs, snoRNAs) интенсивно исследуется и лишь начинает про- ясняться в ограниченном числе случаев. Происхождение эпигенетики берет свое начало в давнишних исследованиях внешне аномальных (т.е. неменделевских) и ни с чем не сравнимых паттернов наследования у многих организмов (см. исторический обзор в главах 1 и 2). Классическое менделевское на- следование фенотипических признаков (например, окраски горошин, числа пальцев или недостаточности гемоглобина) является результатом аллельных разли- чий, вызываемых мутациями в нуклеотидной после- довательности ДНК. В совокупности мутации лежат в основе определения фенотипических признаков, ко- торые вносят вклад в детерминацию видовых границ. Эти границы затем формируются давлением естествен-
1. Генетика vs. эпигенетика ного отбора, как объясняет дарвинова теория эволю- ции. Подобные концепции помещают мутации в самую сердцевину классической генетики. Напротив, не- менделевское наследование (например, изменчивость эмбрионального роста, мозаичная окраска меха, слу- чайная инактивация Х-хромосомы, парамутация у рас- тений) (рис. 3.1) может быть, например, проявлением экспрессии только одной (из двух) аллелей в одном и том же ядерном окружении. Важно, что в этих обстоя- тельствах нуклеотидная последовательность ДНК не изменяется. Это отличается от другого паттерна, так- же относимого к неменделевской наследственности, который является результатом материнского наследо- вания митохондрий (Birky, 2001). Потребность в эпи- генетическом исследовании возникает в связи с изби- рательной регуляцией одной аллели внутри ядра. Чем различаются две идентичные аллели и каков механизм, посредством которого это различие устанавливается и поддерживается в последовательных клеточных поко- лениях? Что лежит в основе различий, наблюдаемых у монозиготных («идентичных») близнецов и делающих их не полностью идентичными? На эпигенетику иногда ссылаются как на одно из возможных объяснений раз- личий во внешних признаках за счет перевода влияния внешней среды, диеты и других внешних источников влияния в экспрессию генома (Klar, 2004; см. главы 23 и 24). Выяснение того, какие компоненты затрагиваются на молекулярном уровне и как изменения в этих компо- нентах влияют на биологию и заболевания человека — главный вызов для будущих исследований. Другой ключевой вопрос в этой области заключается в следующем: насколько эпигенетическая информация важна для нормального развития? Каким образом на- рушается функционирование нормальных путей раз- вития, приводя к аномальному развитию и неопласти- ческой трансформации (т.е. раку)? Как упоминалось выше, «идентичные» близнецы обладают одинаковой нуклеотидной последовательностью ДНК, и их фено- типическая идентичность как таковая часто использу- ется для того, чтобы подчеркнуть определяющую силу генетики. Однако даже такие близнецы могут обнару- живать внешние фенотипические различия, вероятно обусловленные теми эпигенетическими модификация- ми, которые имели место на протяжении жизни этих индивидуумов (Fraga et al., 2005). Таким образом, нам еще предстоит понять всю степень важности эпигене- тики в определении судьбы, идентичности и фенотипа клеток. В случае регенерации тканей и старения остает- ся неясным, диктуются ли эти процессы изменениями в генетической программе клеток или же эпигенетиче- скими модификациями. Интенсивность исследований, ведущихся в мировом масштабе, подтверждает мнение, что в эту постгеномную эру эпигенетика представляет собой новый важный рубеж. Говоря словами других исследователей, «мы — нечто большее, чем просто сумма наших генов» (Klar, 1998); или: «вы можете наследовать нечто помимо нуклеотид- ных последовательностей ДНК. Вот где сейчас действи- тельно волнующая проблема в генетике» (Watson, 2003). Важнейшим мотивом для решения издавать эту книгу была общая вера в то, что мы (редакторы) и все авторы этого тома могли бы передать это волнение будущим поколениям студентов, ученых и врачей, большинство • из которых обучалось в свое время генетическим, но не эпигенетическим, принципам, управляющим наслед- ственностью и расхождением хромосом. Тельце Бара Клонированная кошка ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ Типы спаривания у дрожжей Мутантное растение Опухолевая ткань Мазок крови Рис. 3.1. Биологические примеры эпигенетических фенотипов Эпигенетические фенотипы у широкого круга организмов и типов клеток; все они могут быть связаны с негенетическими различиями. Близнецы, легкие изменения, которые частично можно связать с эпигенетикой (©Randy Harris, New York). Тельце Бара: Эпигенетически сайленсированная, «заглушен- ная» Х-хромосома в клетках самок млекопитающих, видимая цитологически как конденсированный гетерохроматин. Поли- тенные хромосомы: гигантские хромосомы в слюнных железах Drosophila, идеально подходящие для установления корреляции генов с эпигенетическими метками (воспроизведено из: Schotta et al. 2003 [©Springer]). Тип спаривания у дрожжей: пол опреде- ляется активным локусом МАТ, в то время как копии обоих генов, кодирующих типы спаривания, эпигенетически сай- ленсированы, «заглушены» (©Alan Wheals, University of Bath). Мазок крови: гетерогенные клетки одного и того же генотипа, но эпигенетически детерминированные для выполнения разных функций (с любезного разрешения проф. Christian Sillaber). Опухолевая ткань: клетки метастазов (слева), демонстри- рующие повышенные уровни эпигенетических меток на срезе ткани (воспроизведено, с любезного разрешения, из Seligson etal. 2005 [©Macmillan]). Мутантное растение: эпифенотипы цветков Arabidopsis, генетически идентичные, с эпигенетически индуцированными мутациями (воспроиведено, с любезного разрешения, из Jackson etal. 2002 [©Macmillan]). Клонированная кошка: генетически идентичная, но с варьирующим фенотипом по окраске меха (воспроизведено, с любезного разрешения, из Shin et al. 2002 [©Macmillan])
36 Глава 3. Общий обзор и основные понятия 2. Модельные системы для изучения эпигенетики Изучение эпигенетики обязательно требует наличия хороших экспериментальных моделей, и, как часто случается, эти модели, на первый взгляд, кажутся очень далекими от исследований, проводимых на клетках че- ловека (или других млекопитающих). В совокупности, однако, результаты, полученные на многих системах, дали богатые знания. Авторы исторических обзоров (главы 1 и 2) ссылаются на несколько важных, ключевых открытий, которые явились плодом ранней цитологии, роста генетики, появления молекулярной биологии и сравнительно новых успехов в изучении регуляции генов, опосредованной хроматином. Различные модельные ор- ганизмы (рис. 3.2) сыграли решающую роль в постановке и решении разнообразных вопросов, выдвигаемых эпиге- нетическими исследованиями. В самом деле, сделанные на различных модельных организмах и как будто бы несо- поставимые эпигенетические открытия сыграли важную роль в объединении исследовательского сообщества Задача данного раздела — осветить некоторые из этих главных открытий, которые более детально обсуждаются в последующих главах этой книги. По мере знакомства с этими открытиями читателям следует сосредоточиться на фундаментальных принципах, выявленных в иссле- дованиях с использованием этих модельных систем; в совокупности они чаще указывают на общие концепции, чем на разобщающие их детали. Одноклеточные и «низшие» эукариотические орга- низмы — Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Neurospora crassa — позволяют проводить де- тальный генетический анализ, отчасти облегчаемый их коротким жизненным циклом. Переключение типов спаривания (МАТ), случающееся у S. cerevisiae (глава 3) и S. pombe (глава 6), дало весьма демонстративные при- меры, показывающие значение контроля генов, опо- средованного хроматином. У почкующихся дрожжей S. cerevisiae было показано, как уникальные белки — регуляторы «молчашей» информации (SIR — silent in- formation regulator) привлекают специфические моди- фицированные гистоны. Этому предшествовали эле- гантные эксперименты с использованием генетики для обоснования активного участия гистоновых белков в регуляции генов (Clark-Adams et al., 1988: Kayne et al., 1988). У дробянковых дрожжей S. pombe паттерны мо- дификаций гистонов, действующие как активирующие и репрессирующие сигналы, замечательным образом сходны с таковыми у многоклеточных организмов. Это открыло путь для использования мощных генетических фильтров в поисках генных продуктов, которые супрес- сируют или усиливают сайленсинг генов. Совсем не- давно для дробянковых дрожжей был предложен целый ряд механистических моделей, связывающих механизм PH К-интерференции (RNAi) с индукцией модифика- ций гистонов, репрессирующих экспрессию генов (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002). Вскоре после этого был сделан вывод об участии механизма RNAi и в транс- крипционном сайленсинге генов у растения Arabidopsis thaliana. что подчеркнуло потенциальное значение ре- гуляции этого типа у широкого круга организмов (см. раздел 10). Другие нетрадиционные организмы также внесли несоразмерно большой вклад, вначале казавшийся не- обычным, в расшифровку эпигенетических путей. Гриб N crassa продемонстрировал необычный неменделев- ский феномен индуцируемых повторами точечных му- таций (RIP — repeat-induced point mutations) как модель для изучения эпигенетического контроля (глава 6). Поз- же этот организм был использован для демонстрации первой функциональной связи между модификациями гистонов и метилированием ДНК (Tamaru and Selker 2001); это открытие впоследствии было распростране- но на «высшие» организмы (Jackson et al. 2002). Такие ресничные простейшие, как Tetrahymena и Paramecium, обычно используемые в биологических лабораториях в качестве удобных объектов для микроскопирования, весьма способствовали важным эпигенетическим от- крытиям благодаря своему уникальному ядерному ди- морфизму. Каждая клетка несет два ядра: транскрип- ционно активный соматический макронуклеус и ядро зародышевого пути — микронуклеус, который является транскрипционно неактивным. Используя макронукле- усы в качестве источника, богатого «активным» хромати- ном, исследователи смогли выполнить биохимическую очистку первого гистон-модифицирующего фермента— ацетилтрансферазы гистонов или HAT (Brownell et al., 1996). Инфузории хорошо известны также благодаря характерному для них особому явлению запрограмми- рованной элиминации ДНК в ходе их полового жиз- ненного цикла, включаемой малыми некодируюшими РНК и модификациями гистонов (глава 7). У многоклеточных организмов размер генома и сложность организма в целом возрастают в ряду от бес- позвоночных (Caenorhabditis elegans, Drosophila mela- nogaster) или растений (A. thaliana) до «высших» и, так сказать, «имеющих к нам более прямое отношение» позвоночных организмов (млекопитающих). Растения, однако, сыграли более важную роль для всей эпигенети- ки, оказавшись богатейшим источником эпигенетиче- ских открытий (глава 9) от перемещающихся элементов и парамутаций (McClintock, 1951) до первого описания некодирующих РНК, участвующих в транскрипцион- ном сайленсинге (Ratcliff et al., 1997). Исследования, выполненные на растениях, обнаружили важные связи между метилированием ДН К, модификациями гистонов и компонентами механизма RNAi. Открытие эпиалле- лей растений, получивших такие комические названия как SUPERMAN и KRYPTONITE (например, Jackson et al., 2002), и нескольких генов яровизации (Bastow et aL, 2004; Sung and Amasino, 2004) создало далее целую область исследований по выяснению роли эпигенетики в развитии и клеточной памяти. Меристемные клетки растений обусловили также возможность изучать такие ключевые вопросы, как соматическая регенерация и пластичность стволовых клеток (главы 9 и 11). Что касается понимания развития у животных. Drosophila с давних пор была и остается постоянным генератором генетической энергии Основываясь на
2. Модельные системы для изучения эпигенетики Млекопитающие Рис, 3,2. Модельные организмы, используемые в эпигенетиче- ских исследованиях Drosophila ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ ' S. pombe Кукуруза Arabidopsis Схематическое изображение модельных организ- мов, используемых в эпигенетических исследованиях. S. cerevisiae: переключение типов спаривания для изуче- ния эпигенетического контроля на уровне хроматина. S. pombe: мозаичный сайленсинг генов, проявляющийся как секторирование колонии. Neurospora crassa: эпигене- тические системы зашиты генома связаны с точечными мутациями, индуцированными повторами, подавлением [quelling] и мейотическим сайленсингом неспаренных ни- тей ДНК; все это выявляет взаимодействие между путями РНК-интерферениии, ДНК и метилированием гистонов. Tetrahymena: Хроматин в соматических ядрах и ядрах зародышевого пути различается эпигенетически регули- руемыми механизмами. Arabidopsis: модель для репрессии с помошью механизмов сайленсинга ДНК. гистонов и сайленсинга, направляемого РНК. Кукуруза: модель для импринтинга, парамутации и сайленсинга, индуцируемого транспозонами. С. elegans: эпигенетическая регуляция в за- родышевом пути. Drosophila: обусловленный эффектом по- ложения мозаицизм проявляется в виде клональных пятен экспрессии и сайленсинга гена белой окраски глаз (white). Млекопитающие: инактивация Х-хромосомы. пионерской работе Меллера (Muller, 1930), было полу- чено множество мутаций, влияющих на развитие, в том числе мутации, вызывающие гомеотические трансфор- мации и эффект положения мозаичного типа; эти мута- ции описываются ниже (глава 5). Мутации, вызываю- щие гомеотические трансформации, привели к мысли, что могли бы существовать регуляторные механизмы для установления и поддержания клеточной идентич- ности/памяти; позже было показано, что они регулиру- ются системами Polycomb и tnthorax (главы 11 и 12). Что касается эффекта положения мозаичного типа (PEV), то активность гена диктуется структурой окружающе- го хроматина, а не нуклеотидной последовательностью ДНК. Эта система оказалась особенно информативной для выявления факторов, участвующих в эпигенетиче- ском контроле (глава 5). Полагают, что свыше 100 су- прессоров мозаичности \Su(var)\ кодируют компонен- ты гетерохроматина. Без фундамента, созданного этими имеющими важное значение исследованиями, были бы невозможны открытие первых метил трансфераз лизи- нов в гистонах (HKMTs) (Rea et al. 2000) и вытекающие из него достижения в области метилирования лизина гистонов. Как нередко случается в биологии, у дробян- ковых дрожжей и у растений был проведен сравнитель- ный скрининг, выявивший мутанты по сайленсингу, которые оказались функционально консервативными с генами Su(var) у Drosophila. Применение методов обратной генетики с исполь- зованием библиотек RNAi у червя-нематоды С. elegans внесло существенный вклад в наше понимание эпи- генетического регулирования в ходе развития много- клеточных. Здесь исследования, в которых тщательно прослеживалась судьба клеток и которые позволили детализировать все пути развития для каждой клетки, позволили высветить тот факт, что системы Polycomb и tritorax, вероятно, возникли одновременно с появлени- ем многоклеточное™ (см. разделы 12 и 13). В частно- сти, эти механизмы эпигенетического контроля имеют существенное значение для регуляции генов в зароды- шевом пути (глава 15). Роль эпигенетики в развитии млекопитающих в основном была выяснена на мышах, хотя ряд иссле- дований был распространен на разнообразные линии клеток человека и первичные клеточные культуры. Тех- нологии нокаута и направленных вставок («knock-out» и «knock-in») оказались мощным инструментом для функционального расчленения ключевых эпигенети- ческих регуляторов. Например, мыши, мутантные по метилтрансферазе ДНК, Dnmtl, позволили выяснить функциональную роль метилирования ДНК у млекопи- тающих (Li et al., 1992). Эта мутация является эмбрио- нальной деталью и демонстрирует нарушение имприн- тинга (глава 18). Было также показано, что нарушение метилирования ДНК вызывает нестабильность генома и возобновление активности транспозонов, в частно- сти в зародышевых клетках (Walsh et al., 1998; Bourc’his and Bestor, 2004). Охарактеризовано приблизительно 100 факторов, регулирующих хроматин (т.е. ферменты, модифицирующие гистоны и ДНК, компоненты ком- плексов ремоделинга нуклеосом и механизма РНКи), которые повреждены у этих мышей. Мутантные фено- типы затрагивают пролиферацию клеток, коммитиро- вание клеточных линий, пластичность стволовых кле- ток, стабильность генома, репарацию ДНК и процессы сегрегации хромосом, как в соматических клетках, так и в зародышевом пути. Неудивительно, что большинство этих мутаций связаны также с развитием заболеваний и рака. Таким образом, многие из этих ключевых успе- хов в изучении эпигенетического контроля были до- стигнуты с использованием тех преимуществ, которые обеспечивались уникальными биологическими особен- ностями, свойственными многим, если не всем, вышеу-
и основные понятия помянутым модельным организмам. Без этих биологи- ческих процессов и их тщательного функционального анализа (генетического и биохимического) многие из недавних успехов в области эпигенетического контроля оставались бы труднодостижимыми. 3. Определение эпигенетики Из вышеприведенного обсуждения вытекает один острый вопрос: какова та обшая нить, которая свя- зывает разнообразные эукариотические организмы с фундаментальными эпигенетическими принципами? Различные эпигенетические явления объединены, главным образом, тем обстоятельством, что у всех организмов, обладающих настоящим ядром (эука- риоты), ДНК не является «голой». Напротив, эта ДНК существует в виде тесного комплекса со спе- циализированными белками, и вместе они составляют хроматин. В своей простейшей форме хроматин — т.е. ДНК, накрученная вокруг нуклеосомных единиц, состоящих из небольших гистоновых белков (Kornberg, 1974), — первоначально рассматривался как пассивная упаковочная структура, служащая для сворачивания и организации ДНК. Однако с помощью разнообразных ковалентных и нековалентных механизмов, выявляемых в настоящее время с большой быстротой, возникают разные формы хроматина (см. раздел 6). В число этих механизмов входит множество посттрансляционных модификаций гистонов, энергозависимые процессы ремоделинга хроматина, мобилизующие или изменяю- щие структуру нуклеосом, динамические вставка новых гистонов (вариантов) в нуклеосомы и выход из них, а также направляющая роль малых некодирующих РНК. Сама ДНК у многих высших эукариот также может ковалентно модифицироваться путем метилирования цитозиновых остатков (обычно, но не всегда в дину- клеотидах CpG). В совокупности эти механизмы соз- дают набор взаимосвязанных метаболических путей, которые все вместе порождают вариации в полимере хроматина (рис. 3.3). Многие, хотя и не все из этих модификаций и из- менений хроматина, являются обратимыми и, следова- тельно, вряд ли воспроизводятся в зародышевом пути. Временные метки привлекательны потому, что они вы- зывают изменения в хроматиновой матрице в ответ на внутренние и внешние стимулы (Jaenisch and Bird. 2003) и тем самым регулируют доступность для транскрипци- онной машины и (или) возможность ее работы, необ- ходимые для того, чтобы «прочесть» лежащую в основе хроматина матрицу ДНК (Sims et al., 2004; Глава 10). Не- которые модификации гистонов (такие как метилиро- вание лизинов), участки метилированной ДНК и изме- ненные нуклеосомные структуры могут, тем не менее, оставаться стабильными на протяжении нескольких клеточных делений. Благодаря этому возникают «эпи- генетические состояния», обеспечивающие клеточную память, которые до сих пор остаются недооцененными и малопонятными. С этой точки зрения, «сигнатуры» хроматина могут рассматриваться как высокоорганизо- ванные системы хранения информации, которые могут ГЕНЕТИКА WWW Мутации Наследуются зародышевый путь, вид ЭПИГЕНЕТИКА | Изменения remodeler ncR.:\s Стабильны? сома изменчивость Рис, 3,3, Генетика vs. эпигенетика ГЕНЕТИКА: мутации (красные звездочки) в матрице ДНК (зеленая спираль) наследуются соматически и через зародыше- вый путь. ЭПИГЕНЕТИКА: изменения в структуре хроматина модулируют использование генома с помощью (1) модифика- ций гистонов (mod), (2) ремоделинга хроматина (remodeler), (3) вариантного состава гистонов (желтая нуклеосома), (4) метилирования ДНК (Me) и (5) некодирующих РНК. Метки на хроматиновой матрице могут наследоваться при клеточных делениях и в совокупности вносят вклад в детерминацию кле- точного фенотипа индексировать отдельные участки генома и обеспечи- вать ответ на сигналы, поступающие из внешней среды и диктующие программы экспрессии генов. Значение хроматиновой матрицы, способной реали- зовать генетическую информацию, заключается в том, что она обеспечивает многомерность уровней считыва- ния информации с ДНК. Возможно, это действительно необходимо, учитывая огромные размеры и сложность эукариотического генома, особенно у многоклеточных организмов (см. детали в разделе 11). У таких организ- мов оплодотворенное яйцо претерпевает развитие, на- чиная с единичного генома, который становится эпи- генетически запрограммированным на образование множества различных «эпигеномов» в более чем 200 разных типов клеток (рис. 3.4). Было высказано предпо- ложение, что эта запрограммированная изменчивость составляет некий «эпигенетический код», существенно расширяющий информационный потенциал генетиче- ского кода (Strahl and Allis, 2000; Turner, 2000; Jenuwein and Allis, 2001). Несмотря на всю привлекательность этой гипотезы, мы подчеркиваем, что для ее проверки и проверки других соблазнительных теорий требуется еще поработать. Выдвигаются и альтернативные точки зрения, согласно которым в гистонах чисто комбина- торные «коды», подобные триплетному генетическому коду, мало вероятны или, во всяком случае, далеко еще не установлены (Schreiber and Bernstein, 2002; Henikoff, 2005). Несмотря на такую неопределенность, мы скло- няемся к общему мнению, что комбинация ковалентных и нековалентных механизмов действует таким образом, что создаются состояния хроматина, которые могут ма- трицироваться [be templated] при клеточных делениях и в процессе развития с помощью механизмов, которые
4. Хроматированная матрица 1 геном ДНК WWW ин~ия Организованная информация эпигеномы >25,000 генов, идентичная нуклеотидная последователь- ность ДНК >200 различных типов клеток Рис. 3.4. ДНК V5. хроматин Геном: инвариантная нуклеотидная последовательность ДНК (зеленая двойная спираль) особи. Эпигеном: общий состав хрома- тина, индексирующий весь геном в любой данной клетке. Он варьирует в зависимости от типа клетки и реакции на внутренние и внешние сигналы, которые он получает. (Нижняя часть рисунка) эпигеномная диверсификация у многоклеточных организмов происходит в ходе развития по мере того, как дифференцировка прогрессирует от единичной стволовой клетки (оплодотворенный эмбрион) к более коммитированным клеткам. Реверсия дифференцировки или трансдифференцировка (голубые линии) требует репрограммирования эпигенома клетки только еще начинают выясняться. Вопрос о том, каким именно образом эти измененные состояния хроматина надежно воспроизводятся при репликации ДНК и в ми- тозе, остается одной из фундаментальных проблем для будущих исследований. Фенотипические изменения, происходящие в ряду клеточных поколений в ходе развития многоклеточного организма, были описаны Уоддингтоном как «эпигене- тический ландшафт» (Waddington, 1957). Тем не менее, весь спектр клеток, от стволовых до полностью диффе- ренцированных, обладает идентичными нуклеотидны- ми последовательностями ДНК, но заметно различается по профилю генов, которые реально экспрессируются этими клетками. Исходя из этого, позднее пришли к определению эпигенетики как «ядерной наследствен- ности, которая не основывается на различиях в нуклео- тидной последовательности ДНК» (Holliday, 1994). Со времени открытия двойной спирали ДНК и ран- них трактовок эпигенетики наши знания об эпигене- тическом контроле и лежащих в его основе механизмах существенно возросли, заставляя некоторых описывать эти знания в таких более «возвышенных» терминах, как «область науки», а не просто «феномены» (см Wolfe and Matzke, 1999; Roloff and Nuber, 2005; глава 1). За послед- нее десятилетие значительный прогресс был достигнут в отношении многих семейств энзимов, активно модифи- цирующих хроматин (см. ниже). Таким образом, исполь- зуя современную терминологию, эпигенетику можно в молекулярном (механистическом) плане определить как «сумму изменений в хроматиновой матрице, которые в совокупности устанавливают и воспроизводят различ- ные паттерны экспрессии генов (транскрипции) и сай- ленсинга на основе одного и того же генома». 4. Хроматиновая матрица Нуклеосома является фундаментальной повторяющейся единицей хроматина (Kornberg, 1974). С одной стороны, эта базовая единица хроматина состоит из белкового октамера, содержащего по две молекулы каждого кано- нического (или корового) гистона (Н2А, Н2В, НЗ и Н4), вокруг которого накручены 147 п.н. ДНК. Детальные межмолекулярные взаимодействия между коровыми гистонами и ДНК были определены в выдающихся ис-
и основные понятия следованиях, приведших к получению рентгеновской картины (с атомным, 2.8 Е, разрешением) нуклеосомы, собранной из рекомбинантных частей (рис. 3.5) (Luger et al., 1997). Картины мононуклеосом, а также возникаю- щих структур более высокого порядка (тетрануклеосом), имеющие более высокое разрешение (Schalch et al., 2005), продолжают привлекать наше внимание, обещая по- мочь в объяснении физиологически важного субстрата, на котором развертывается действие если не всего, то большей части ремоделинга хроматина и механизма транскрипции Коровые гистоновые белки, составляющие нуклео- сому, являются очень небольшими и сильно основными. Они состоят из глобулярного домена и гибких (относи- тельно неструктурированных) «гистоновых хвостов», торчащих с поверхности нуклеосомы (рис. 3.5). Судя по аминокислотной последовательности, гистоновые белки крайне консервативны в диапазоне от дрожжей до человека. Такая высокая степень консервативности подкрепляет общий взгляд, согласно которому эти бел- ки, даже неструктурированные хвостовые домены, ве- роятно выполняют критичные функции. Хвосты, осо- бенно хвосты гистонов НЗ и Н4, в действительности содержат важный ключ к изменчивости нуклеосом (и, отсюда, хроматина), поскольку многие из остатков яв- ляются объектами экстенсивных посттрансляционных модификаций (см. стандартную номенклатуру, исполь- зуемую в этом руководстве, на обратной стороне задней части переплета и список известных модификаций ги- стонов в Приложении 2). Ацетилирование и метилирование коровых гисто- нов, особенно НЗ и Н4, были одними из первых опи- санных ковалентных модификаций, и долгое время предполагалось, что они коррелируют с положительны- ми и отрицательными изменениями в транскрипцион- ной активности. Со времени пионерских работ Олфри и сотрудников (Allfrey et al., 1964) были идентифици- рованы и охарактеризованы многие типы ковалентных модификаций гистонов; в их числе — фосфорилиро- Рис. 3.5. Структура нуклеосомы (Слева) Модель нуклеосомы с разрешением 2.8 Е. (Справа) Схематическое представление организации гистонов внутри октамерного кора, вокруг которого обернута ДНК (черная линия). Образование нуклеосомы происходит сперва через откладку на ДНК тетрамера НЗ/Н4. а затем двух наборов ди- меров Н2А/Н2В. Неструктурированные аминотерминальные гистоновые хвосты выпячиваются из нуклеосомного кора, со- стоящего из структурированных глобулярных доменов восьми гистоновых белков вание, убиквитинирование, сумоилирование, АДФ- рибозилирование, биотинилирование гистонов, изоме- ризация пролина и другие вероятные типы, ожидающие своего описания (Vaquero et al., 2003). Эти модифика- ции происходят в специфических сайтах и остатках, не- которые из них изображены на рис. 3.6 и перечислены в Приложении 2. Эту ковалентную маркировку катали- зируют специфические ферменты и ферментные ком- плексы, часть которых описывается далее в этом обзоре и в отдельных главах. Поскольку в ближайшие годы эти перечни будут продолжать расти, нашим намерением было упомянуть лишь отдельные метки и энзимы, ко- торые могли бы проиллюстрировать то, что, как нам ка- жется, является общими понятиями и принципами. В определенных районах хроматина нуклеосомы могут содержать вариантные гистоновые белки вместо какого-нибудь корового (канонического) гистона. Те- кущие исследования показывают, что это различие в со- ставе способствует выполнению специализированных функций этими маркированными районами хромосом. В настоящее время известны вариантные белки для ко- ровых гистонов Н2А и НЗ, но не известно ни одного для гистонов Н2В и Н4. Мы подозреваем, что вариан- ты гистонов, хотя они нередко являются минорными в смысле их количества и потому более трудными для ис- следования, весьма богаты в отношении содержащейся в них информации и играют весьма существенную роль в отношении их вклада в эпигенетическое регулирова- ние (детали см в разделе 8 и главе 13). 5. Более высокие уровни организации хроматина Хроматин, этот состоящий из ДНК и нуклеосом поли- мер, является динамической молекулой, существующей во многих различных конфигурациях. Ранее в течение длительного времени хроматин разделяли на эухрома- тин и гетерохроматин, исходя из картины окрашивания ядра красителями, которые цитологи использовали для визуализации ДНК. Эухроматин представляет собой де конденсированный хроматин, хотя он может быть активным или неактивным в отношении транскрипции. Гетерохроматин можно определить в широком смысле как высококомпакгизированный и «молчащий» хрома- тин. Он может существовать как постоянно «молчащий» хроматин (конститутивный гетерохроматин), где гены организма лишь изредка экспрессируются в клетках любого типа, или как хроматин, репрессированный в некоторых клетках в ходе специфического клеточного цикла или на специфической стадии развития (факуль- тативный гетерохроматин) Таким образом, имеется спектр состояний хроматина, и накопленная за многие годы литература позволяет предполагать, что хроматин является высоко динамичной структурой, склонной к ремоделингу и реструктурированию по мере получения физиологически релевантных сигналов, поступающих по «идущим вверх» (upstream) сигнальным путям. Однако лишь недавно достигнут значительный прогресс в рас- крытии молекулярных механизмов, управляющих этими процессами ремоделинга.
5. Более высокие уровни организации хроматина лс Ацети и эв.. ь Фосфорилиро- вание 135 аминокислот Ме Метилирование IVLRDNIQGITKPAIRRLAR -| гистон Н4 102 аминокислоты Т Метилирова- ние (активный лизин) Метилирование (репрессивный лизин) ;QGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNY -{ гистон Н2А | 119 129 аминокислот иь Убиквитиниро- вание PEPMSAPAPKKgJkKAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSV 4 гистон Н2В 120 125 аминокислот Рис. 3.6. Сайты, по которым происходят модификации гистоновых «хвостов» Аминотерминальные «хвосты» гистонов составляют четверть массы нуклеосомы На них находится огромное большинство из- вестных сайтов, по которым происходит ковалентная модификация и которые изображены на рисунке. Модификации происходят также и в глобулярном домене (заключено в прямоугольнику некоторые из них указаны на рисунке. В целом в число активных меток входят ацетилирование (бирюзовый флажок Ас), метилирование аргинина (желтый шестиугольник Ме) и метилирование некото- рых лизинов, таких как НЗК4 и H3K36 (зеленый шестиугольник Ме). Функция НЗК79 в глобулярном домене — антисайленсинг. В число репрессивных меток входят НЗК9, НЗК27 и Н4К20 (красный шестиугольник Ме). Зеленый цвет — активная метка, красный — репрессивная метка Фигурирующая в учебниках 11-нанометровая матри- ца типа «бусинок на нити» представляет собой актив- ную и в основном «развернутую» интерфазную конфи- гурацию, в которой ДНК периодически оборачивается вокруг повторяющихся единиц — нуклеосом (рис. 3.7). Однако эта хроматиновая фибрилла не всегда состав- лена из нуклеосом, расположенных на регулярном рас- стоянии друг от друга. Нуклеосомы могут быть упако- ваны нерегулярно и могут сворачиваться в структуры более высокого порядка, анализ которых при атомном разрешении еще только начинается (Khorasanizadeh, 2004). Характерные конформации хроматина более вы- сокого порядка возникают в разных районах генома во время спецификации судьбы клеток или на разных ста- диях клеточного цикла (интерфазный vs. митотический хроматин). Расположение нуклеосом на 11-нанометровой ма- трице может быть изменено в результате cis-эффектов и trans-эффектов ковалентно модифицированных «хво- стов» гистонов (рис. 3.8). С/5-эффекты возникают в ре- зультате изменений в физических свойствах модифи- цированных хвостов гистонов, таких как модуляции в электростатическом заряде или в структуре «хвостов», которые, в свою очередь, изменяют межнуклеосомные контакты. Хорошо известным примером может слу- жить ацетилирование гистонов, которое, как давно по- дозревали, нейтрализует положительные заряды сильно основных гистоновых «хвостов», порождая в результате локальное растяжение хроматиновой фибриллы и тем самым обеспечивая лучший доступ транскрипционной машины к двойной спирали ДНК. Фосфорилирование, благодаря добавлению суммарного отрицательного за- ряда, может создавать «очажки зарядов» [charge patches] (Dou and Gorovsky, 2000), которые, как полагают, из- меняют упаковку нуклеосом или экспонируют амино- концы гистонов, изменяя у хроматинового полимера состояние сворачивания более высокого порядка (Wei Нуклеосомы Длина: 2 м Модификации гистонов гистон Н1 Доменная организация 30 нм 300-700 нм Митотическая конденсация Длина: 10 мкм 1 5 мкм Рис. 3.7. Структурирование хроматина более высоких порядков 11-нанометровая фибрилла представляет собой ДНК, накручен- ную вокруг нуклеосом 30-нанометровая фибрилла компактизи- рована далее во все еще неподтвержденную структуру (изображена здесь как соленоидная конформация), включающую линкерный гистон Н1. 300—700-нанометровое волокно представляет собой динамическое «выпетливание» более высокого порядка, которое обнаруживается как в интерфазном, так и в метафазном хрома- тине. 1,5-микрометровая конденсированная хромосома пред- ставляет собой наиболее компактизированную форму хроматина, которая обнаруживается только во время ядерного деления (ми- тоза или мейоза). Еще не ясно, каким образом картины бэндинга (те. G- или R-бэндинга) митотической хромосомы коррелируют с конкретными структурами хроматина
и основные понятия Cis-эффекты Лг*'-’ связка мод. Модифицирующий фермент Trans- ki $4 kk эффекты \ \ < Л ч Рис. 3.8. Переходы в хроматиновой матрице (cis/trans) cis-эффекты: ковалентная модификация остатка гисто- нового «хвоста» приводит к изменению структуры или заряда, проявляющемуся как изменение в организации хроматина, trans-эффекты: ферментативная модифика- ция остатка гистонового «хвоста» (напр., метилирование НЗК9) приводит к возникновению сродства к ассоцииро- ванному с хроматином белку (modbinder, напр., НР1). Ас- социация mod binder (или комплексов ассоциированных белков) вызывает изменения в структуре хроматина «вниз по течению». Замещение гистонов: ковалентная модифи- кация гистонов (или другой стимул) может послужить сигналом для замещения какого-то корового гистона вариантным гистоном с помощью комплекса-обменника, осуществляющего ремоделинг нуклеосом et al., 1999; Nowak and Corces, 2004). Считается, что во многом таким же образом линкерные гистоны (Н1) сти- мулируют упаковку фибрилл более высокого порядка, экранируя отрицательный заряд линкерной ДНК меж- ду соседними нуклеосомами (Thomas, 1999; Khochbin, 2001; Harvey and Downs, 2004; Kimmins and Sassone-Cor- si, 2005). Добавление таких объемистых аддуктов, как убиквитин и АДФ-рибоза, также может индуцировать разное расположение гистоновых «хвостов», и откры- вать группы нуклеосом. В какой мере гистоновые «хво- сты» могут индуцировать компактизацию хроматина посредством механизмов, зависящих от модификаций и не зависящих от них, — еще не ясно. Модификации гистонов могут также вызывать то, что мы обозначаем как ^гаш-эффекгы, рекрутируя в хро- матин связанные с модификацией молекулы-партнеры. Это может рассматриваться как «считывание» конкрет- ной ковалентной метки гистона зависимым от контекста образом. Некоторые партнеры по связыванию обладают особым сродством и поэтому говорят, что они «помеща- ются как в док» («dock») на специфические «хвосты» ги- стона и нередко делают это, играя роль хроматиновой «застежки-липучки» («Velcro») для одного полипептида в составе значительно более крупного ферментатив- ного комплекса, которому нужно связаться с хромати- новым полимером. Например, бромодомен — мотив, распознающий ацетилированные остатки гистона — часто, хотя и не всегда, является частью фермента аце- тилтрансферазы гистонов (HAT), функция которого — ацетилирование гистонов-мишеней (см. рис. 3.10 в раз- деле 7) и который существует как часть более крупного комплекса, осуществляющего ремоделинг хроматина (Dhalluin et al. 1999; Jacobson et al. 2000). Аналогичным образом метилированные остатки лизина, встроенные в гистоновые «хвосты», могут считываться хромодо- менами (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001; Na- kayama et al., 2001) или сходными доменами (например, МВТ, tudor) (Maurer-Stroh et al., 2003; Kim et al., 2006) и облегчать модуляции хроматина, происходящие «ниже по течению». В некоторых случаях, например, ассоциа- ция хромодоменных белков ускоряет распространение гетерохроматина путем катализируемого гистоновой метилтрансферазой (НКМТ) метилирования соседних гистонов, которые затем считываются хромодоменны- ми белками (глава 5). Модификации как «хвостовых» участков, так и гло- булярного корового участка гистонов (Cosgrove et al., 2004) могут также «нацеливать» зависимые от АТФ ремо- делирующие комплексы на 11-нанометровую фибриллу, необходимую для перехода от готового к действию эух- роматина к транскрипционно активному состоянию. Эта мобилизация нуклеосом может происходить путем скольжения октамера, изменения структуры нуклеосо- мы в результате выпетливания ДНК (детали см. в главе 12) или замещения специфических коровых гистонов гистоновыми вариантами (глава 13). Зависимые от АТФ ремоделеры хроматина (такие как SWI/SNE — истори- чески важный пример!) путем гидролиза высвобожда- ют энергию для того, чтобы осуществить значительные изменения в контактах гистон:ДНК, приводящие к выпетливанию, скручиванию и скольжению нуклео- сом. Как было показано, эти нековалентные механиз- мы имеют критически важное значение для событий регуляции генов (Narlikar et al., 2002) в такой же мере, как и механизмы, связанные с ковалентной модифика- цией гистонов (глава 10). Тот факт, что специфические зависимые от АТФ ремоделеры могут перетасовывать варианты гистонов, включая их в хроматин и выводя их из него, дает возможность связать вместе cis-, trans - механизмы и механизмы ремоделинга. В свою очередь, понимание того, как эти взаимосвязанные механизмы действуют согласованным образом, варьируя эпигене- тические состояния в хроматине, все еще остается да- леко не полным. Более компактные и репрессивные хроматиновые структуры более высокого порядка (30-нанометровые) могут быть также получены в результате рекрутирования линкерного гистона Н1 и (или) зависящих от модифика- ции, или «архитектурных», факторов, связанных с хро- матином, — таких, как белок 1 гетерохроматина (НР1) или Polycomb (PC). Хотя обычно считают, что компак- тизация нуклеосомного хроматина (11-нанометрового)
5. Более высокие уровни организации хроматина в 30-нанометровую транскрипционно некомпетент- ную конформацию осуществляется путем включения линкерного гистона Н1 в интерфазе, функциональное и структурное расчленение этого гистона до недавнего времени было затруднено (Fan et al., 2005). Одна веро- ятная проблема, связанная с этими исследованиями, заключается в том, что гистон Н1 существует в виде разных изоформ (около 8 у млекопитающих), затрудняя проведение детального генетического анализа. Таким образом, имеет место дублирование между некоторы- ми изоформами Н1, тогда как другие изоформы могут выполнять тканеспецифичные функции (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005). Интересно, что сам Н1 может быть ковалентно модифицирован (фосфорилирован, мети- лирован, поли(АТФ)рибозилирован и т.д.), создавая возможность того, что cis- и /га«5-механизмы, проана- лизированные в настоящее время на коровых гистонах, вполне могут быть распространены и на этот важный класс линкерного гистона, а также на негистоновые белки (Sterner and Beiger, 2000). Значительные споры имели место по вопросу о де- талях того, каким образом организована 30-нанометро- вая фибрилла хроматина. В целом были описаны либо «соленоидные» (одностартовая спираль) модели, в ко- торых нуклеосомы постепенно сворачиваются вокруг центральной оси (6—8 нуклеосом на один оборот), либо более открытые модели типа «зигзага», предполагаю- щие самосборку более высокого порядка (двухстарто- вая спираль). Новые данные, в том числе данные рент- геноструктурного анализа с использованием модельной системы, содержащей четыре нуклеосомы, позволяют предполагать такую организацию фибриллы, которая в большей мере согласуется с двухстартовой, зигзаго- образной конформацией линкерной ДНК, соединяю- щей две стопки нуклеосомных частиц (Khorasanizadeh, 2004; Schalch et al., 2005). Несмотря на этот прогресс, мы отмечаем, что линкерный гистон не присутствует в дей- ствительно существующих [current] структурах и даже если бы он там присутствовал, 30-нанометровая хро- матиновая фибрилла компактизирует ДНК всего лишь примерно в 50 раз. Таким образом, в организации хро- матина существует значительно больше уровней более высокого порядка, которые еще предстоит различить за рамками свето- и электронно-микроскопического исследования и которые обусловливают либо интер- фазное, либо митотическое состояния хроматина. Не- давние результаты, полученные на живых клетках, не- смотря на некоторую структурную неопределенность, уже выявили в интерфазных хромосомах существова- ние множественных уровней сворачивания хроматина выше уровня 30-нанометровой фибриллы. Заслужи- вающим внимания достижением было развитие новых подходов, позволяющих метить специфические ну- клеотидные последовательности ДНК в живых клетках, что создает возможность изучать динамику «открытия» и «закрытия» хроматина in vivo в реальном времени. Интересно, что эти результаты выявляют динамическое взаимодействие позитивных и негативных факторов ремоделинга хроматина в установлении хроматино- вых структур более высокого порядка для состояний, в большей или меньшей мере совместимых с экспресси- ей генов (Fisher and Merkenschlager, 2002; Felsenfeld and Groudin, 2003; Misteli, 2004). Имеет место организация в более крупные петле- видные хроматиновые домены (300—700 нм), возмож- но путем заякоривания хроматиновой фибриллы на периферии ядра или на других ядерных скаффолдах (остовах) с помощью таких ассоциированных с хро- матином белков, как ядерные ламины Остается не- ясным, в какой степени эти ассоциации дают начало значимым [meaningful] «хромосомным территориям», но многочисленные сообщения показывают, что эта концепция заслуживает серьезного внимания. Напри- мер, наблюдали образование кластеров множественных сайтов активного хроматина с транскрипционными факторами РНК-полимеразы II (RNA pol II); анало- гичные концепции, по-видимому, приложимы к обра- зованию кластеров вокруг реплицирующейся ДНК и ДНК-полимеразы. Напротив, образование кластеров «молчащего» гетерохроматина (в особенности перицен- тромерных фокусов) и генов, локализованных в trans- положении, также было документировано (главы 4 и 21). Каким образом эти ассоциации контролируются и насколько ядерная локализация хроматиновых доме- нов затрагивает регуляцию генома — еще не ясно. Тем не менее, все большее количество данных показывает наличие корреляций активной или «молчащей» конфи- гурации хроматина с определенной ядерной территори- ей (Cremer and Cremer, 2001; Gilbert et al., 2004; Janicki et al., 2004; Chakalova et aL, 2005). * Наиболее конденсированная структура ДНК на- блюдается на стадии метафазы митоза или мейоза. Это делает возможным надежное расхождение, с помощью хромосом, точных копий нашего генома (одной или двух копий каждой хромосомы, в зависимости от на- блюдаемого типа деления) в каждую дочернюю клетку. Эта конденсация связана с серьезным реструктуриро- ванием ДНК из состояния двухметровой, полностью растянутой молекулы в состояние дискретных хромо- сом размером в среднем 1,5 мкм в диаметре (рис. 3.7). Это не меньше, чем 10 000-кратная компактизация и она достигается путем гиперфосфорилирования лин- керного (Н1) и корового гистона НЗ и зависящего от АТФ действия конденсиновых и когезиновых комплек- сов и топоизомеразы II. Остается еще определить, как конкретно негистоновые комплексы затрагивают ми- тотический хроматин (или модификации хроматина фазы М) и по каким правилам происходит (зависимым от клеточного цикла образом) их ассоциация с хрома- тином и высвобождение из него (Bernard et al., 2001; Watanabe et al., 2001). Здесь может оказаться важным хорошо известное митотическое фосфорилирование гистона НЗ (т.е. серинов 10 и 28) и членов семейства Н1, но полного понимания того, в чем заключается функ- ция этих митотических меток, предстоит еще достичь в генетических и биохимических экспериментах. Ин- тересно, что была предложена формальная теория, со- гласно которой специфические метки, обусловленные метилированием, при сочетании с более динамичными и обратимыми метками, обусловленными фосфорили-
и основные понятия рованием. могут действовать в гистоновых белках как «двоичный переключатель», управляя связыванием и высвобождением эффекторов, находящихся «вниз по течению» и затрагивающих хроматиновую матрицу (Fischle et al., 2003а). Используя связывание НР1 с ме- тилированным по лизину 9 гистоном НЗ (НЗК9те) и митотическое фосфорилирование серина 10 (H3S10ph), недавно получили данные в поддержку митотического «метил/фос-переключателя» (Daujat et al., 2005; Fischle et al., 2005: Hirota et al., 2005). Такие специализированные хромосомные домены, как теломеры и центромеры, выполняют другие функ- ции, направленные на динамику хромосом как тако- вую. Теломеры действуют как хромосомные концы, обеспечивая защиту и уникальное решение проблемы репликации самых кончиков молекул ДНК. Центро- меры обеспечивают места прикрепления для микро- трубочек веретена во время деления ядра. Оба этих специализированных домена играют фундаментальную роль в событиях, приводящих к надежному расхожде- нию хромосом. Интересно, что и теломерный, и цен- тромерный гетерохроматин отличается от эухроматина и даже других гетерохроматиновых районов (см. ниже) присутствием уникальных хроматиновых структур, ко- торые в основном оказывают репрессивное действие на активность генов и рекомбинацию. Перемещение экспрессируемых генов из их нормального положения в эухроматине в новое положение в центромерном и теломерном гетерохроматине или поблизости от него (главы 4—6) может заставить эти гены «замолчать», соз- давая возможность описанного ранее скрининга для поиска и идентификации супрессоров или энхансеров эффекта положения мозаичного типа (PEV) или эффек- тов прителомерного положения (ТРЕ, telomere-position effects; Gottschling et al., 1990; Aparicio et al., 1991). Цен- тромеры и теломеры имеют молекулярные сигнатуры, в том числе, например, гипоацетилированные гистоны. Интересно, что центромеры «маркированы» также при- сутствием гистонового варианта CENP-A, играющего активную роль в сегрегации хромосом (глава 14). Таким образом, правильная сборка и поддержание различаю- щихся центромерного и перицентромерного гетерохро- матина являются критичными для завершения митоза или мейоза и, отсюда, для жизнеспособности клеток. В дополнение к хорошо изученным центромерной и перицентромерной формам конститутивного гете- рохроматина успешно исследуются механизмы эпиге- нетического контроля центромерной (и теломерной) «идентичности». Остроумными экспериментами уда- лось показать, что вместо нормальных центромер могут функционировать «неоцентромеры», демонстрируя тем самым, что идентичность центромер не диктуется ну- клеотидными последовательностями ДНК (главы 13 и 14). Вместо этого данный специализированный хромо- сомный домен маркируют эпигенетические особенно- сти [hallmarks], в том числе паттерны специфичных для центромер модификаций и варианты гистонов. В во- просе о том, каким образом другие кодирующие, не ко- дирующие и повторяющиеся участки хроматина вносят свой вклад в эти эпигенетические сигнатуры, достигнут значительный прогресс. Как те или иные из этих меха- низмов соотносятся (если соотносятся вообще) с пат- тернами бэндинга хромосом — неизвестно, но остается интригующей возможностью. Необходимо достичь по- нимания того, как эпигенетически регулируются эти части уникальных хромосомных районов, особенно в свете того, что многочисленные виды рака у человека характеризуются геномной нестабильностью, которая является маркером прогрессии некоторых заболеваний и неоплазии. 6. Различие между эухроматином и гетерохроматином В этом обзоре эухроматин и гетерохроматин обсуждались раздельно, хотя мы признаем, что существуют множе- ственные формы хроматинов обоих классов. Эухрома- тин, или «активный» хроматин, состоит в основном из кодирующих последовательностей, составляющих лишь небольшую долю (менее 4 %) генома млекопитающих Какие же молекулярные сигналы маркируют тогда ко- дирующие последовательности, обладающие потенциа- лом для продуктивной транскрипции, и каким образом структура хроматина вносит свой вклад в этот процесс? Обширная литература позволяет предполагать, что эух- роматин существует в «открытой» (декомпактизирован- ной), более чувствительной к нуклеазам конфигурации, делающей его «готовым» к экспрессии генов, хотя и не обязатаельно транскрипционно активным. Некоторые из этих генов экспрессируются повсеместно (гены «до- машнего хозяйства»); другие регулируются ходом разви- тия или индуцируются в ответ на внешние стрессорные факторы. Транскрипцию генов включает совместное действие избранных czs-действующих нуклеотидных последовательностей ДНК (промоторов, энхансеров и участков контроля локусов), связанных с комбинациями Ггаму-действующих факторов, вместе с РНК-полимеразой и ассоциированными факторами (Sims et al., 2004). В со- вокупности эти факторы подверглись жесткому отбору в ходе эволюции, чтобы инструментовать сложные ряды биохимических реакций, которые должны происходить в «правильной» пространственной и временной по- следовательности. Обеспечивает ли хроматин «систему индексирования», гарантирующую, что вышеописанная машинерия сможет получить доступ к своим целевым по- следовательностям в клетках соответствующего типа? На уровне ДНК соседние с промоторами области, богатые АТ, часто лишены нуклеосом и могут существо- вать в жесткой, неканонической конфигурации ДНК (В-форма), способствующей размещению транскрип- ционного фактора (TF) (Mito et al., 2005; Sekinger et al., 2005). Однако размещения TF недостаточно для обе- спечения транскрипции. Рекрутирование механизмов [machines] ремоделинга нуклеосом посредством индук- ции активирующих модификаций гистонов (например, ацетилирование и метилирование НЗК4) облегчает вза- имодействие с механизмами транскрипции; в настоя- щее время определяют, каким образом это происходит
6. Различие между эухроматином и гетерохроматином (рис. 3.9 и глава 10). Замена вытесненных гистонов ги- стоновыми вариантами, после того как механизм транс- крипции распутал и транскрибировал хроматиновую фибриллу, обеспечивает целостность хроматиновой ма- трицы (Ahmad and Henikoff, 2002). Однако образование полностью созревших иРНК также требует протекания посттранскрипционных процессов, в том числе сплай- синга, полиаденилирования и экспорта из ядра. Таким образом, собирательный термин «эухроматин» скорее всего обозначает сложное состояние (состояния) хро- матина, охватывающее динамичную и сложную смесь механизмов [machines], тесно взаимодействующих друг с другом и с хроматиновой фибриллой и предназначен- ных для осуществления транскрипции функциональ- ных РНК. Выяснение «правил», определяющих, каким образом, в самом общем смысле, эти «активирующие механизмы» [«activating machinery»] взаимодействуют с аппаратом транскрипции, а также с хроматиновой ма- трицей — волнующая область современных исследова- ний, хотя в силу динамичной природы матрицы эту об- ласть, строго говоря, можно относить не к эпигенетике, а, скорее, к исследованиям динамики транскрипции и хроматина. Что же тогда обозначает термин «гетерохроматин»? Хотя в исторической ретроспективе он изучен хуже, чем эухроматин, новые открытия заставляют считать, что гетерохроматин играет критически важную роль в организации и правильном функционировании ге- номов, начиная с дрожжей и кончая человеком (хотя у S. cerevisiae особая форма гетерохроматина). Его по- тенциальное значение подчеркивается тем фактом, что 96% генома млекопитающих состоит из некодирующих и повторяющихся последовательностей. Новые откры- тия, касающиеся механизмов формирования гетерох- роматина, выявили неожиданные вещи. Например, транскрипция, неспецифичная по отношению к после- довательности и дающая двуспиральную РНК (dsRNA), подвержена сайленсингу по механизму, подобному РНК-интерференции (RNAi) (см. раздел 10). Образо- вание таких dsRNAs действует как «сигнал тревоги», отражая тот факт, что соответствующая нуклеотид- ная последовательность ДНК не может генерировать функциональный продукт или инвазирвана РНК- транспозонами или вирусами. Эта dsRNA подвергается затем процессингу с помощью Dicer и нацеливается на хроматин комплексами, предназначенными для ини- циации каскада событий, ведущих к формированию гетерохроматина. В результате использования ряда мо- дельных систем был достигнут заметный прогресс в ана- лизе того, что, по-видимому, является высококонсерва- тивным метаболическим путем, ведущим к «запертому» [«locked-down»] состоянию гетерохроматина. Хотя точ- ная последовательность и детали событий могут варьи- ровать, этот общий путь включает деацетилирование гистоновых «хвостов», метилирование специфических остатков лизина (например, НЗК9), рекрутирование ас- социированных с гетерохроматином белков (например, НР1) и метилирование ДНК (рис. 3.9). Вполне вероят- но, что секвестрирование отдельных участков генома в репрессивных ядерных доменах или территориях может усилить формирование гетерохроматина. Интересно, что все большее количество данных позволяет предпо- лагать, что гетерохроматин может быть «состоянием по умолчанию», по крайней мере у высших организмов, и что присутствие сильного промотора или энхансе- ра, продуцирующего эффективный транскрипт, может «пересилить» гетерохроматин Общие концепции сбор- ки гетерохроматина приложимы, по-видимому, даже к низшим эукариотам. В число основных особенностей входят гипоацетилированные «хвосты» гистонов, что сопровождается связыванием чувствительных к ацети- лированию белков гетерохроматина (например, белки SIR; детали см. в главе 4). В зависимости от вида грибов (например, почкующиеся vs. дробянковые дрожжи) на- блюдаются различные объемы метилирования гистонов и HP 1-подобных белков. Даже при том, что эти геномы в большей степени настроены на общее, «по умолча- нию», состояние готовности к транскрипции, имеются некоторые гетерохроматин-подобные районы генома (локусы спаривания, теломеры, центромеры и т.д.), ко- торые способны супрессировать транскрипцию генов и генетическую рекомбинацию, когда тестируемые гены оказываются в этом новом соседстве. Какие полезные функции мог бы обслуживать гете- рохроматин? Определение центромер, участка консти- тутивного гетерохроматина, хорошо коррелирует с не- ким наследуемым эпигенетическим состоянием и, как полагают, эволюционно направляется самым крупным объединением в кластеры повторов и повторяющихся элементов на хромосоме. Это разбиение [partitioning] обеспечивает крупные и относительно стабильные ге- терохроматиновые домены, маркированные репрес- сивными «эпигенетическими сигнатурами», облегчаю- щими сегрегацию хромосом в митозе и мейозе (глава 14). Здесь стоит заметить, что центромерные повторы и соответствующие эпигенетические метки, ассоци- ирующиеся с ними, дуплицировались и переместились на другие хромосомные плечи для создания «молча- щих доменов» у таких организмов, как дробянковые дрожжи. Конститутивный гетерохроматин в теломерах (защитных концах хромосом) аналогичным образом обеспечивает стабильность генома, выступая в роли хромосомных «кэпов». Наконец, известно, что форми- рование гетерохроматина является механизмом защи- ты от инвазивной ДНК. В совокупности эти открытия подчеркивают тот общий взгляд, что гетерохроматин обслуживает важные функции по поддержанию генома, которые могут соперничать даже с функциями самого эухроматина. Подводя итог, можно сказать, что широкие функ- циональные различия между эухроматином и гетеро- хроматином в настоящее время можно приписать трем известным характеристикам хроматина. Во-первых, это природа нуклеотидной последовательности ДНК — например, содержит ли она обогащенную АТ «жест- кую» ДНК поблизости от промоторов, повторяющие- ся последовательности и (или) последовательности, связывающие репрессоры, которые сигнализируют об ассоциации фактора. Во-вторых, качество РНК, про- дуцируемой в ходе транскрипции, определяет, будет
и основные понятия ЕДИНИЦА ТРАНСКРИПЦИИ (ГЕН) ПОВТОРЫ ДНК (НЕКОДИРУЮЩИЕ) информационная РНК Связывание транскрипционного фактора Рекрутирование ремоделирующего комплекса Активирующие модификации гистонов варианты гистонов t Некодирующие dsPHK Рекрутирование комплекса RITS Репрессирующее метилирование гистонов Метилирование ДНК i Рис. 3.9. Различие между эухроматиновыми и гетеро- хроматиновыми доменами Рисунок, суммирующий различия между эухрома- тином и конститутивным гетерохроматином. В их числе — различия в типе продуцируемых транс- криптов, в рекрутировании связывающихся с ДНК белков (т.е. транскрипционного фактора [TF]), в ас- социированных с хроматином белках и комплексах, в ковалентных модификациях гистонов и в составе вариантных гистонов Доступная информация Эухроматин Ограниченная информация Гетерохромати н ли она полностью подвергнута процессингу в иРНК, которая может быть транслирована, или же эта РНК будет деградирована или помечена для использова- ния механизмом RNAi в целях гетерохроматинизации. В-третьих, пространственная организация в ядре может играть существенную секвестрирующую роль в поддер- жании локальных конфигураций хроматина. 7. Модификации гистонов и гистоновый код Мы рассмотрели, каким образом модификации гистонов могут изменять хроматиновую матрицу посредством cis- эффектов, изменяющих межнуклеосомные контакты и промежуточные расстояния, или же Zraws-эффектов, вызываемых ассоциациями гистоновых и негистоновых белков с матрицей. Каков же вклад и биологический результат модификаций гистонов? Типы структуры хроматина, коррелирующие с модификациями гисто- новых «хвостов», выявились в результате исследований, в которых использовалась основная масса гистонов и которые позволили предположить, что эпигенетические метки могут обеспечить сигнатуры «ВКЛЮЧЕНО» (т.е. активно) или «ВЫКЛЮЧЕНО» (т.е. неактивно). Это вы- яснилось в результате длительных исследований большей частью коррелятивного характера, которые показали, что определенные модификации гистонов, в особенно- сти их ацетилирование, связаны с доменами активного хроматина или с участками, в целом пермиссивными для транскрипции В противоположность этому другие мет- ки, такие как некоторые фосфорилированные остатки гистонов, давно ассоциировались с конденсированным хроматином, который, в целом, не поддерживает транс- крипционную активность. Модификации гистонов, приведенные в Приложении 2, суммируют известные в настоящее время сайты модификаций Здесь мы под- черкиваем, что приведенный материал отражает моди- фикации и сайты, которые не обязательно характерны для любого организма. Прежде всего, обсудим, каким образом производят- ся или удаляются модификации гистонов. Большая ра- бота, проведенная в области исследования хроматина, позволила предположить, что модификации «хвостов» гистонов образуются («записываются») или удаляются («стираются») в результате каталитического действия ас- социированных с хроматином ферментативных систем. Однако исследователям годами не удавалось идентифи- цировать эти ферменты. За последнее десятилетие было идентифицировано очень большое число модифици- рующих хроматин энзимов из различных источников; большая часть этих данных собрана в Приложении 2. Этот успех был достигнут в результате многочислен- ных биохимических и генетических исследований. Эти ферменты часто входят в состав крупных, состоящих из многих субъединиц комплексов, которые могут ка- тализировать включение или удаление ковалентных модификаций как в гистоновых, так и в негистоновых мишенях. Более того, многие из этих энзимов катали- зируют свои реакции с замечательной специфичностью по отношению к остатку-мишени и к клеточному кон- тексту (т.е. в зависимости от внешних или внутренних сигналов). Для ясности, а также в качестве примера, мы кратко обсудим четыре главные ферментативные системы, которые катализируют модификации гисто- нов, вместе с ферментативными системами противо- положного действия, обеспечивающими реверсию этих модификаций (рис. 3.10) (Vaquero et al., 2003; Holbert and Marmorstein, 2005). В совокупности эти антагони- стические активности управляют устойчивым балансом каждой рассматриваемой модификации. Ацетилазы гистонов (HATs) ацетилируют остатки специфических лизинов в гистоновых субстратах (Roth
7. Модификация гистонов и гистоновый код et al., 2001); реверсия обеспечивается действием деаце- тилаз гистонов (HDACs) (Grozinger and Schreiber, 2002). Ферменты семейства гистоновых киназ фосфорилиру- ют остатки специфических серинов или треонинов, а фосфатазы (РРТазы) удаляют метки, созданные фос- форилированием. Особенно хорошо известны мито- тические киназы, такие как циклин-зависимая киназа или киназа «aurora», катализирующая фосфорилирова- ние корового (НЗ) и линкерного (Н1) гистонов. Менее очевидны в каждом из этих случаев противостоящие РРТазы, действие которых ревертирует результат этого фосфорилирования, когда клетки выходят из митоза. Были описаны два общих класса метилирующих фер- ментов: PRMTs (protein arginine methyltransferases — ме- тилтрансферазы аргининов белка), субстратом которых является аргинин (Lee et al., 2005), и HKMTs (histone lysine methyltransferases — метилтрансферазы лизинов ги- стонов), действующие на остатки лизина (Lachner et al., 2003). Метилирование аргининов косвенным образом ревертируется действием дезиминаз, которые конверти- руют метиларгинин (или аргинин) в остаток цитруллина (Bannister and Kouzarides, 2005). Метилированные остат- ки лизина оказываются химически более стабильными. Было показано, что метилированный лизин существует в моно-, ди- и триметилированном состояниях. Несколь- ко триметилированных остатков на аминоконцах НЗ и Н4, по-видимому, обладают возможностью стабильно воспроизводиться в ходе клеточных делений (Lachner et al., 2004), как и метка H4K20mel в имагинальных дисках Drosophila (Reinberg et al., 2004). Недавно была описана лизин-специфичная «деметилаза» (LSD1) как аминоок- сидаза, способная удалять метилирование НЗК4 (Shi et al., 2004). Этот энзим действует путем FSD-зависимой окислительной дестабилизации аминометильной свя- зи, что приводит к образованию немодифипированного лизина и формальдегида. Было показано, что LSD1 дей- ствует избирательно в отношении активирующей НЗК4 метки, созданной метилированием, и может дестабили- зировать только моно- и ди-, но не триметилирование Эта деметилаза является частью большого репрессивного белкового комплекса, который содержит также HDACs и другие энзимы Другие данные позволяют предполагать, что LSD1 может соединяться в комплекс вместе с ре- цептором андрогена в локусах-мишенях и деметилирует репрессивную гистоновую метку НЗК9ше2, внося вклад в транскрипционную активацию (Metzger et al., 2005) Другой класс гистоновых деметилаз, согласно данной ему храктеристике. работает с помощью более мощно- го механизма, механизма радикальной атаки, известно- го как гидроксилазы или диоксигеназы (Tsukada et al., 2006). Одна из них дестабилизирует только H3K36me2 (активная метка), но не триметилированное состояние. Эта новая гистоновая деметилаза jumonji (JHDM1) со- держит консервативный домен jumonji, которых в геноме млекопитающих известно около 30; это позволяет пред- полагать, что некоторые из этих энзимов, может быть, могут атаковать и другие остатки, так же как триметиль- ное состояние (Fodor et al., 2006; Whetstine et al., 2006). Значительный прогресс был достигнут в анализе си- стем ферментов, управляющих устойчивым балансом этих модификаций, и мы подозреваем, что в этой увле- кательной области будут достигнуты гораздо большие успехи. Остается понять, как регулируются эти фермен- тативные комплексы и как становятся мишенями их физиологически релевантные субстраты и сайты. Кро- ме того остается неясным, как ковалентные механизмы влияют на эпигенетические явления. Модификации гистонов происходят не изолирован- но, а на основе комбинирования, как это предполагается - для модификационных кассет (те. ковалентных моди- фикаций в соседних остатках определенного гистоново- го «хвоста», например НЗК9ше и H3S10ph или H4Slph, H4R3me и Н4К4ас) и trans-гистоновых путей (ковалент- ных модификаций между разными «хвостами» гистонов или нуклеосомами; рис. 3.11). Интригует тот факт что почти все известные модификации гистонов коррели- руют с активирующей или репрессивной функциями, в зависимости от того, какой аминокислотный остаток (лизин) (серин,треонин) (аргинин) (лизин) нкмт (цитруллин) Аминооксидаза гидроксилаза Рис. 3.10. Энзимы, модифицирующие гистоны Ковалентные модификации гистонов трансдуцируются ферментами, модифицирующими гистоны («писателями»), и удаляются активностями противоположного действия. Они делятся на классы в соответствии с типом ферментативного действия (напри- мер. ацетилирование или фосфорилирование). Белковые домены со специфическим сродством к модификации гистонового «хвоста» называются «читателями» (HAT) ацетилтрансфераза гистона; (PRMT) протеин-аргинин-метилтрансфераза; (НКМТ) метилтрансфераза лизина гистонов; (HDAC) деацетилаза гистонов; (РРТаза) протеинфосфатазы; (Ас) ацетилирование; (Р) фос- форилирование; (Me) метилирование
и основные понятия (остатки) в аминоконце гистона модифицирован Опи- саны как синергистические, так и антагонистические пути (Zhang and Reinberg, 2001; Berger, 2002; Fischle et al., 2003b), которые могут постепенно индуцировать комбинации активных меток, одновременно противо- действуя репрессивным модификациям. Неизвестно, однако, сколько разных комбинаций модификаций по различным аминотерминальным позициям гистонов существует для любой данной нуклеосомы, потому что большинство исследований было выполнено на препа- ратах суммарных гистонов. Недавно было показано, что на структуру и сборку хроматина влияют, кроме амино- концов, модификации в глобулярных доменах гистонов (Cosgrove et al., 2004), регулируя тем самым экспрессию генов и репарацию повреждений ДНК (van Attikum and Gasser, 2005; Vidanes et al., 2005). Стоит также упомянуть, что несколько модифицирующих гистоны энзимов изби- рают своей мишенью и негистоновые субстраты (Sterner and Berger, 2000; Chuikov et al., 2004). Рисунок 11 иллю- стрирует два примера установленных иерархий гистоно- вых модификаций, которые, по-видимому, индексиру- ют транскрипцию активного хроматина или, напротив, определяют рисунок гетеро-хроматиновых доменов. Эти исследования ставят вопрос о том, существует ли «гистоновый код» или даже «эпигенетический код». Хотя эта теоретическая концепция оказалась весьма стимулирующей, и было показано, что в некоторых своих предсказаниях она правильна, вопрос б том, дей- ствительно ли существует некий код, остается в значи- тельной степени открытым. Для сравнения скажем, что генетический код оказался крайне полезным ввиду воз- можности делать предсказания на его основе и благо- даря его почти полной универсальности Он использует в основном «алфавит» из четырех оснований в ДНК (т.е. нуклеотидов), образуя в целом инвариантный и почти универсальный язык. В противоположность этому со- временные данные заставляют считать, что картины гистоновых модификаций значительно варьируют от организма к организму, особенно между низшими и высшими эукариотами, например дрожжами и чело- веком. Таким образом, даже если гистоновый код и су- ществует, он, вероятно, не универсален. Эта ситуация становится еще более сложной, когда учитывается ди- намическая природа гистоновых модификаций, варьи- рующих в пространстве и во времени. Более того, хро- матиновая матрица вовлекает в процесс ошеломляющее количество факторов ремоделинга (Vignali et al., 2000; Narlikar et al., 2002; Langst and Becker, 2004; Smith and Peterson, 2005). Однако анализ с использованием имму- нопреципитации хроматина (ChIP) в масштабах целого генома (ChIP on chip) начал выявлять неслучайные и в какой-то мере предсказуемые паттерны в нескольких геномах (например, S. pombe, A. thaliana, клетки млеко- питающих) — такие как сильные корреляции НЗК4теЗ с активированными участками промотора (Strahl et al. 1999; Santos-Rosa et al., 2002; Bernstein et al., 2005), a также метилирования H3K9 (Hall et al. 2002; Lippman et al., 2004; Martens et al., 2005) и H3K27 (Litt et al., 2001; Ringrose et al., 2004) с «молчащим» гетерохроматином. Возможно, ограничением гистонового кода является то обстоятельство, что одна модификация не транслиру- ется неизменно в один биологический выходной сиг- нал. Однако действуя в комбинации или кумулятивным образом, модификации, по-видимому, действительно определяют биологические функции и вносят свой вклад в них (Henikoff, 2005). СИ ГНАЛЫ НЗКЭас ь— НЗКЭте \ НР1 —< H3S1 ✓ Н4К16ас •— Н4К20те метилирование ДНК Рис. 3.11. Координированная модификация хроматина Переход не подвергавшейся воздействию хромати- новой матрицы в активный эухроматин (слева) или образование репрессивного гетерохроматина (справа), включающие ряд скоординированных модификаций хроматина. В случае активации транскрипции это сопровождается действием комплексов ремоделинга нуклеосом и замещением коровых гистонов гистоно- выми вариантами (желтый цвет, а именно НЗ.З) H2BK123ub H3K79me \ H?K4me —1 НЗКЭте НР1 I— НЗК9-- \ H3Rl7me Н4К16ас —• Н4К20те Активный Репрессированный
8. Комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина. и варианты гистонов 8. Комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина, и варианты гистонов Другим важным механизмом, посредством которого индуцируются переходы в хроматиновой матрице, явля- ется выработка сигналов [signaling] для рекрутирования комплексов «ремоделинга» хроматина, использующих энергию (гидролиз АТФ) для изменения хроматина и со- става нуклеосом нековалентным образом. Нуклеосомы, особенно когда они связаны репрессивными факторами, ассоциированными с хроматином, нередко «навязывают» транскрипционной машине состояние значительного подавления. Отсюда лишь некоторые транскрипционные факторы и регуляторы, специфичные к определенным последовательностям (хотя и не базовая транскрипцион- ная машина), способны получать доступ к сайту (сайтам) своего связывания. Эта проблема доступа решается, хотя бы отчасти, белковыми комплексами, которые моби- лизуют нуклеосомы и (или) изменяют нуклеосомную структуру. Ремоделинг хроматина часто функционирует совместно с ферментами, активирующими модификации хроматина, и связанные с ним активности в целом можно разделить на два семейства: семейство SNF2H, или ISWI, и семейство Brahma, или SWI/SNF. Семейство SNF2H/ ISWI мобилизует нуклеосомы вдоль ДНК (Tsukiyama et al., 1995; Varga-Weisz et al., 1997), тогда как Brahma/SWI/ SNF на время изменяет структуру нуклеосомы, экспо- нируя контакты ДНК:гистон с использованием меха- низмов, которые только сейчас начинают раскрываться (глава 12). Кроме того, некоторые из гидролизующих АТФ ак- тивностей схожи с «обменными комплексами», которые сами предназначены для замещения обычных коровых гистонов специализированными «вариантными» гисто- новыми белками. Эта осуществляемая с затратами АТФ перетасовка в действительности может быть средством замещения существующих модифицированных гисто- новых «хвостов» новым, свободным от старого, набо- ром вариантных гистонов (Schwartz and Ahmad, 2005). Альтернативная возможность заключается в том, что рекрутирование таких комплексов ремоделинга хро- матина, как SAGA (Spt-Ada-Gcn5-ацетилтрансфераза), может быть также усилено пред существующими моди- фикациями гистонов, чтобы обеспечить транскрипци- онную компетентность промоторов-мишеней (Grant et al., 1997; Hassan et al., 2002). В дополнение к инициации транскрипции и уста- новлению первичного контакта с промоторным районом прохождению РНК-полимеразы II (или РНК-полимеразы 1) во время происходящей в ходе транскрипции элонгации препятствует, сверх того, присутствие нуклеосом Поэтому требуются механиз- мы для обеспечения завершения образующихся транс- криптов (особенно с длинных генов). В частности, ряд гистоновых модификаций и докинг-эффекгоров дей- ствуют совместно с такими комплексами ремоделинга хроматина, как SAGA и FACT (для облегчения транс- крипции хроматина) (Orphanides et al., 1998), обеспе- чивая прохождение РНК-полимеразы II через нуклео- сомные порядки. Эта совместная активность обычно индуцирует, например, увеличенную мобильность нуклеосом, смещает димеры Н2А/Н2В и стимулирует обмен коровых гистонов на гистоновые варианты. Как таковая, она дает прекрасный пример тесного взаимо- действия между модификациями гистонов, ремоделин- гом хроматина и обменом на гистоновые варианты для облегчения инициации транскрипции и последующей элонгации (Sims et al., 2004). Были охарактеризованы и другие комплексы ремоделинга, такие как Mi-2 (Zhang et al., 1998; Wade et al., 1999) и INO-80 (Shen et al., 2000), участвующие в стабилизации репрессированного, а не активного хроматина. Композиционные различия хроматиновой фибрил- лы, которые возникают благодаря присутствию гистоно- вых вариантов, вносят вклад в индексирование участков хромосом для специальных функций Каждый гистоно- вый вариант представляет собой замену для конкретного корового гистона (рис. 3.12), хотя гистоновые варианты часто составляют малую долю от всей массы гистонов, в силу чего их труднее исследовать, чем регулярные ги- стоны. Возрастающий объем литературы (обзор см.: Henikoff and Ahmad, 2005; Sarnia and Reinberg, 2005) сви- детельствует, что гистоновые варианты обладают своей собственной характеристикой восприимчивости к мо- дификациям, вероятно определяемой небольшим чис- лом аминокислотных замен, отличающих их от членов их семейства. С другой стороны, некоторые варианты гистонов имеют отличающиеся амино- и карбокситер- минальные домены с уникальной, в отношении регуля- ции хроматина, активностью и различным сродством к связывающимся факторам. В качестве примера можно привести транскрипционно активные гены, у которых гистон НЗ заменен вариантом НЗ.З, в связанном с транс- крипцией механизме, который не требует репликации ДНК (Ahmad and Henikoff, 2002). Замещение корового гистона Н2А вариантом H2A.Z коррелирует с транс- крипционной активностью и может индексировать 5 -конец свободных от нуклеосом промоторов. Однако H2A.Z был ассоциирован также и с репрессированным хроматином. CENP-A, специфичный для центромеры вариант гистона НЗ, существен для центромерной функ- ции и, отсюда, для сегрегации хромосом. Н2А.Х, вместе с другими гистоновыми метками, ассоциируется с выяв- лением повреждений ДНК и, по-видимому, индексиру- ет повреждение в ДНК для рекрутирования комплексов репарации повреждений ДНК. МакроН2А — вариант гистона, специфически ассоциирующийся с неактивной Х-хромосомой (Xi) у млекопитающих (дальнейшие дета- ли по вариантам гистонов см. в главе 13). Важно отметить (и это противоречит обычно встре- чающемуся в учебниках утверждению, что гистоны синтезируются и занимают свое место только во время S-фазы), что синтез и замещение многих из этих гисто- новых вариантов происходят независимо от реплика- ции ДНК. Следовательно, замещение коровых гисто- нов гистоновыми вариантами не ограничено стадиями клеточного цикла (т.е. S-фазой), но может немедленно вступать в силу в ответ на действующие в данный мо-
Глава 3. Общий обзор и основные понятия Рис. 3.12. Варианты гистонов Доменная структура белка для коровых гистонов (НЗ, Н4, Н2А, Н2В), линкерного гистона Н1 и вариантов гистонов НЗ и Н2А. Показаны свернутый домен гистона (HFD — histone fold domain), где происходит димеризация гистона, и участ- ки белка, отличающиеся у гистоновых вариантов (показаны красным цветом) мент механизмы (например, транскрипционную актив- ность или напряжение кинетохора во время клеточного деления) или стрессовые сигналы (например, повреж- дение ДНК или голодание). Элегантные биохимические исследования позволили документировать ремоделинг хроматина или обменные комплексы, специфичные для замещения отдельных гистоновых вариантов, таких как НЗ.З, H2A.Z или Н2А.Х (Cairns, 2005; Henikoff and Ah- mad, 2005; Sarnia and Reinberg, 2005). Например, заме- щение НЗ вариантом НЗ.З опосредуется действием об- менного комплекса HIRA (регулятор гистона A) (Tagani et al., 2004), а Н2А замещается H2A.Z благодаря актив- ности обменного комплекса SWR] (связанная с Swi2/ Snf2 АТФаза I) (Mizoguchi et al., 2004). В совокупности эти замещения позволяют вариантным нуклеосомам строить особенно активный хроматин. Для некоторых других гистоновых вариантов механизм «нацеливания» и обмена еще остается определить; они осуществляются либо через зависимый от АТФ комплекс обмена гисто- нов, либо через шаперонный белок гистонов Сейчас даже постулировали, что обменные комплексы могут существовать для замещения модифицированных ги- стонов их ^модифицированными партнерами как ме- ханизм для стирания более прочных эпигенетических меток, размещенных в аминоконцах гистонов. 9. Метилирование ДНК Метилирование ДНК — эпигенетический механизм, о котором раньше других стало известно, что он корре- лирует с репрессией генов (Razin and Riggs, 1980). В той или иной степени оно имеет место у всех эукариот за исключением дрожжей. Эта модификация заключается в добавлении метильной группы к цитозиновым остаткам матрицы ДНК. У млекопитающих она происходит по динуклеотидам, тогда как у N. crassa и растений известны другие паттерны метилирования, симметричные, асим- метричные и не по CpG. Распределение метилированной ДНК по геному показывает ее повышенное содержание в некодирующих районах (например, центромерном гетерохроматине) и в рассеянных (interspersed) повто- ряющихся элементах (транспозонах), но не в островках CpG активных генов (Bird, 1986). Действительно, по- вышенные уровни метилирования ДНК коррелируют с относительным увеличением содержания некодирующей и повторяющейся ДНК в геномах высших эукариот (рис. 3.15 в разделе 11). Экспериментальные данные показы- вают, что это происходит потому, что метилирование ДНК служит главным образом как защитный механизм, чтобы подавлять значительную часть генома чужеродного происхождения (т.е. реплицированные перемещающиеся элементы, вирусные последовательности и другие по- вторяющиеся последовательности). ДНК-метилтрансферазы (DNMTs) являются «эф- фекторами» метилирования ДНК и катализируют либо метилирование de novo (т.е. в новых сайтах), либо под- держивающее метилирование полуметилированной ДНК после репликации ДНК (глава 18). Утрата спо- собности поддерживать метилирование ДНК может приводить к некоторым заболеваниям, таким как ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial abnormalities — иммунодефицит, центромерная неста- бильность и лицевые аномалии) (главы 18 и 23) Дере- гуляция в уровнях метилирования ДНК вносит вклад и в прогрессию рака (глава 24). Что представляют собой сигналы, направляющие DNMTs для метилирования определенных участков ДНК? В настоящее время известно, что для того, чтобы «направить» метилирование ДНК de novo, высокопо- вторяющиеся тандемные последовательности в геноме (например, перицентромерный хроматин) «опираются» на репрессивные метки метилирования по НЗК9, как это показано у N. crassa и растений (главы 6 и 9). Рассеянные (interspersed) повторы также могут сигнализировать о ме- тилировании ДНК de novo, как это описано в контексте RIP у N. crassa (Tamaru and Selker, 2001) и сайленсинга ретротранспозонов в зародышевом пути у самцов млеко- питающих. Отвечающий за это белок идентифицирован (Dnmt3L) и мог бы функционировать путем сканиро- вания генома для отыскания высоких уровней границ «гомология—гетерология», служащих сигналом о необ- ходимости метилирования ДНК (Bourc’his and Bestor, 2004). У растений сигнал для метилирования ДНК de novo обеспечивают РНК посредством уникального ме- ханизма, названного РНК-зависимым метилированием ДНК (RdDM; глава 9). Имеются данные о том, что для глобальных паттернов метилирования ДНК почему-то необходимы комплексы, осуществляющие ремоделинг хроматина и относящиеся к семейству SWI/SNF, как это показано на растениях (Jeddeloh et al., 1999) для белка DDM1 и на млекопитающих с помощью гомолога Lshl
10 PHКи и сайленсинг генов, направляемый РНК (Yan et al. 2003). Наконец, белок EZH2 (относящийся к HKMT-PcG) тоже может участвовать в «направлении» метилирования ДНК в некоторых промоторах у млеко- питающих (Vire et al., 2005). Способ, посредством которого установившееся ме- тилирование ДНК может обусловливать сайленсинг хроматина, выяснен еще не полностью, хотя данные указывают на /гаия-регуляцию. Белки, связывающиеся с метилированными цитозинами и названные домен- ными белками, связывающимися с метил-CpG (MBD), могут рассматриваться как основанный на метилиро- вании ДНК эквивалент элементов связывания [binders] (или «считывателей») модифицированных гистоновых мотивов (рис. 3.13). Например, белок, связывающийся с метил цитозином (МеСР2), связывается с метилиро- ванными CpG и рекрутирует HDACs, служа связующим звеном для репрессивных гистоновых меток (глава 18) Известно также, что метилирование ДНК нарушает сайты распознавания регуляторов транскрипции (на- пример, СЕСА), участвующих в геномном импринтин- ге (глава 19). Наличие метилированной ДНК в импринтированных локусах, обусловливающей сайленсинг либо материн- ской, либо отцовской аллели у растений и плацентарных млекопитающих, позволяет предположить, что в ходе эволюции эти организмы уникальным образом приспо- собили этот эпигенетический механизм для стабилиза- ции репрессии генов. Интересно отметить, что у сумча- тых метилирования ДНК в импринтированных локусах нет, что указывает на то, что вовлечение этого механизма в импринтинг у млекопитающих является относительно недавним эволюционным событием (главы 17 и 19). На- против, у таких двукрылых насекомых, как Drosophila, метилирование ДНК как функциональный эпигенети- ческий механизм в основном утрачено (Lyko, 2001). Высокоповторяющиеся участки генома млекопита- ющих, обычно метилированные, становятся все более мутагенными, когда они не метилированы, — до такой степени, что вызывают глобальную геномную неста- бильность (Chen et al., 1998). В результате возникают хромосомные аномалии, являющиеся главной при- чиной многих болезней и прогрессии рака (см. раздел 15). Это подчеркивает решающую роль метилирования ДНК в обеспечении целостности генома. С другой сто- роны, отдельные метилированные остатки цитозинов весьма предрасположены к спонтанному мутированию. Таким образом, со временем в результате реакции де- заминирования возникают транзиции С-Т (рис. 3.13), но полагают, что эта характеристика благоприятна для защиты хозяйского генома, потому что она постоян- но дезактивирует такие паразитические нуклеотидные последовательности ДНК, как транспозоны. В ином контексте эта же самая химическая реакция активно катализируется дезаминазой, индуцируемой активаци- ей, или AID (activation-induced deaminase). Экспрессия этого энзима в В- и Т-клетках вызывает «соматические гипермутации» в иммуноглобулиновом локусе (1g). Это важный механизм расширения репертуара рецепторов антигенов и, отсюда, усиления иммунитета у млекопи- тающих (Petersen-Mahrt, 2005; Глава 21). Экспрессия МВ * Регуляция Мутация 5-метил цитозин Дезаминирование Тимин Рис, 3.13. Метилирование и дезаминирование ДНК Метилированные (Ме) цитозиновые нуклеотиды могут быть связаны с метилДНК-связывающимися белками (MBD) Не- связанный 5-метилцитозин склонен спонтанно мутировать в результате дезаминирования (реакция, изображенная в нижней части рисунка); в результате в нуклеотидной последовательно- сти ДНК происходит транзиция 5-метил-СрС в ТрА AID, наблюдаемая в раннем развитии млекопитающих, привела к предположению, что она может обеспечивать альтернативный путь к деметилированию ДНК, хотя это происходило бы на фоне риска повышенной часто- ты точечных мутаций. Метилирование ДНК и метилирование гистонов являются известными механизмами эпигенетической регуляции генома Некодирующие РНК, как описано в следующем разделе, являются важными первичны- ми триггерами для индукции «молчащего» хроматина. Известно также, что молекулы РНК могут быть интен- сивно метилированы по сахарному или нуклеозидно- му скелету. Более того, показано, что метилирование малых некодирующих РНК на З’-конце стабилизирует эти молекулы (Yu et al., 2005). Любопытно, что Dnmt2 недавно была идентифицирована как метилтрансфера- за тРНК (Goll et al., 2006). Поэтому похоже, что РНК- метилтрансферазы, подобные DNMTs и HKMTs, могут существовать как «считыватели» эпигенетической ин- формации, хотя прямых данных, подтверждающих это, нет. Однако метилирование РНК, по-видимому, «чув- ствуется» определенными Toll-подобными рецепторами (трансмембранными рецепторами, которые распозна- ют молекулярные мотивы обычных патогенов), чтобы опосредовать врожденный иммунитет (Ishii and Akira, 2005), что говорит в пользу такой гипотезы. Возникает интересная возможность, что метилирование РНК мо- жет все же быть эпигенетической модуляцией на основе третьей формы метилирования 10. РНКи и сайленсинг генов, направляемый РНК Сведения о том, что конститутивный гетерохроматин в центромерах и теломерах играет инструктивную роль
и основные понятия в обеспечении целостности генома, способствовали сдвигу парадигмы во взглядах на повторяющуюся не- кодирующую «мусорную» ДНК. Возможно ли, что эти повторяющиеся последовательности служат каким-то «незряшным» целям, которые еше только начинают проясняться? Не может ли даже быть так, что эти нуклео- тидные последовательности ДНК не являются полностью «молчащими»? Такая возможность вытекает из фундаментальной серии открытий, связывающих РНКи с образовани- ем «молчащего» хроматина (гетерохроматина). РНКи является защитным механизмом организма-хозяина, который разбивает dsRNA на мелкие молекулы РНК (известные как короткие интерферирующие РНК или siRNA). Этот процесс в конечном счете приводит к де- градации РНК или к использованию этих малых РНК для подавления трансляции, известного как посттран- скрипционный сайленсинг (PTGS). Открытый поз- же механизм транскрипционного сайленсинга генов (TGS), ведущего к образованию гетерохроматина, был обнаружен в результате конвергенции независимых линий исследования хроматина и механизма РНК- интерференции. С одной стороны, многое известно о репрессивном метилировании ДНК (у грибов, расте- ний и млекопитающих), модификациях хроматина (на- пример, НЗК9теЗ) и ассоциированных с хроматином факторах (НР1), характерных для доменов гетерохро- матина. С другой стороны, исследователи преуспели в идентификации факторов механизма РНКи (например, Dicer, Argonaute, РНК-зависимой РНК-полимеразы, или RdRP). Наиболее убедительный прогресс, связав- ший вместе эти вроде бы разные области, был достигнут в элегантных исследованиях на S. pombe, в которых му- тации любого компонента механизма РНКи приводили к дефектам в расхождении хромосом (Hall et al., 2002; Reinhart and Bartel, 2002; Volpe et al., 2002). Это было вы- звано неспособностью стабилизировать центромерный гетерохроматин и подчеркивало, по-видимому, широко распространенную роль механизмов, опосредованных РНКи, в образовании доменов «молчащего» гетерох- роматина. Это также высветило значение гетерохрома- тина помимо транскрипционного сайленсинга генов — его роль в поддержании целостности генома и, отсю- да, жизнеспособности, как показывает необходимость центромерного гетерохроматина для процесса расхо- ждения хромосом. Появляющиеся данные позволяют также предполагать, что siRNAs требуются для опреде- ления других специализированных районов функцио- нального гетерохроматина, таких как теломеры. Транскрипция с обеих нитей ДНК прицентромерных районов у S. pombe и выявление прошедших процессинг дериватов siRNAs явились сильным доказательством того, что дериват dsRNA был важнейшим субстратом для «нацеливания» комплекса RITS на центромеры для сайленсинга (рис. 3.14) (Verdel et al., 2004). Более того, мутанты clr4 (имеющийся у S. pombe ортолог Suv39h НКМТ млекопитающих) были не способны процесси- ровать dsRNA до siRNAs, усиливая тем самым доводы в пользу взаимосвязи между механизмом РНКи и сбор- кой гетерохроматина (Motamedi et al., 2004). Каким именно образом siRNAs, генерируемые механизмом RNAi (т.е. Dicer, Argonaute, RdRP), инициируют сборку гетерохроматина или направляют ее на соответствую- щие локусы в геноме, все еще неизвестно Была предло- жена модель, в которой сложное взаимодействие между входящим в состав механизма RNAi комплексом RITS и центромерными повторами ведет к самоусиливающе- муся циклу формирования гетерохроматина, включаю- щему Clr4, HDACs, Swi6 (ортолог НР1 млекопитающих) и когезии, вероятно через направляемый Ago отжиг ги- бридов РНК:РНК до образующегося транскрипта (рис. 3.14) (главы 6 и 8). У Tetrahymena аналогичный механизм «нацелива- ния», опосредованного РНК, направляет уникаль- ный процесс элиминации ДНК в соматическом ядре. В этом случае на соответствующей стадии полового процесса происходит, с обеих нитей, транскрипция внутреннего элиминируемого сегмента (IES — internal eliminated segment) в «молчащем» геноме зародышево- го пути (микронуклеарном геноме) (Chalker and Yao, 2001; Mochizuki et al., 2002). Аналогично модели TGS, зависимого от RNAi, была предложена модель скани- рующей РНК (scnRNA) для объяснения того, как ну- клеотидные последовательности ДНК в родительском макронуклеусе могут эпигенетически контролировать геномные изменения в новом макронуклеусе с участи- ем малых РНК (детали см. в главе 7). Эти волнующие результаты впервые демонстрируют RNAi-подобный dsPHK Рис. 3.14. Направляемое РНК формирование гетерохроматина Комплементарные транскрипты dsRNA, получающиеся путем транскрипции обеих нитей ДНК или складывания на себя транскриптов с инвертированных повторов, приводят к об- разованию siRNAs благодаря действию Dicer (верхняя часть рисунка). Включение этих siRNAs в комплекс RITS посред- ством связывания с белком Argonaute (Ago) активирует этот комплекс к «нацеливанию» его на комплементарную ДНК или вновь образующуюся РНК. Этот комплекс привлекает С1г4. который трансдуцирует гистон НЗК9те2. Специфичный для этой модификации «связыватель», Swi6, связывается с этими модифицированными гистонами, облегчая распространение репрессивного хроматинового домена. Действие RdRP ампли- фицирует уровни содержания siRNAs, используя существующие siRNAs в качестве праймеров и усиливая тем самым способ- ность комплекса RITS «нацеливаться» на специфические участки ДНК
11. От одноклеточных систем к многоклеточным процесс, непосредственно изменяющий соматический геном. Возникает любопытная возможность, что меж- генные РНК, продуцируемые в локусе V-DJ (Bolland et al., 2004), потенциально могут направлять элиминацию нуклеотидной последовательности ДНК в ходе V-DJ- рекомбинации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) в В-клетках и локусов Т-клеточного рецептора (TCR) в Т-клетках. У растений имеется ряд ортологов для многих ком- понентов RNA1, обусловливающих разнообразие путей РНК-сайленсинга, которые могут действовать с боль- шей специфичностью по отношению к конкретным нуклеотидным последовательностям ДНК, хотя имеет место некоторая избыточность между факторами. Ис- следования TGS, опосредованного RNA1, выявили но- вый класс РНК-полимераз — РНК-полимеразу IV (или RNA pol IV), — которые могут транскрибировать ДНК исключительно в гетерохроматиновых районах (Herr et al., 2005; Pontier et al., 2005). Опять-таки только для растений характерно, что пути RNAi непосредственно влияют на метилирование ДНК (Chan et al., 2004) (де- тальные объяснения в главе 9). RNAi-подобные хроматиновые эффекты были так- же обнаружены у Drosophila и млекопитающих. На- пример, обработка пермеабилизированных клеток млекопитающих РНКазой А быстро удаляет гетерох- роматиновые метки НЗК9теЗ, что позволяет предпо- лагать, что часть молекул РНК могут быть структурным компонентом околоцентромерного гетерохроматина (Maison et al., 2002). У позвоночных удаление факто- ров, процессирующих siRNA, нарушает метилиро- вание НЗК9 и связывание НР1 в перицентромерном гетерохроматине (Fukugawa et al., 2004). Любопытно, что у мутантов, лишенных Dicer, эмбриональные ство- ловые (ES) клетки все еще пролиферируют, но не мо- гут дифференцироваться (Kanellopoulou et al., 2005), что заставляет предположить существование сегодня еще непонятной связи между механизмом RNAi и раз- витием млекопитающих. У Drosophila сайленсинг тан- демных наборов гена mini-white, подверженных PEV, также оказывается зависимым от механизма RNAi (Pal-Bhadra et al., 2004). В совокупности эти исследования указывают на ключевую и, вероятно, первичную роль некодирующих РНК в переключении эпигенетических переходов и на- следственно поддерживаемых специфических состоя- ний хроматина хроматиновой матрицы. В самом деле, эти некодирующие РНК дали ответ на вопрос о том, как различные повторяющиеся последовательности у разных организмов достигают состояния гетерохрома- тинизации посредством механизма, «нацеливаемого» с помощью РНК. Стремясь идентифицировать новые мишени для RNAi, обнаружили, путем секвенирования малых РНК, что у растений, Drosophila, млекопитающих и других организмов они в основном транскрибируют- ся с эндогенных транспозонов и других повторяющихся последовательностей (Almeida and Allshire, 2005; Bern- stein and Allis, 2005). В совокупности эти результаты показывают, что RNAi эволюировала, отчасти, в целях поддержания стабильности геномов посредством сай- ленсирующих мобильных элементов ДНК и вирусов и у большинства эукариотических видов представляет собою консервативный механизм. Сейчас, однако, ока- зывается, что не только РНК-сайленсинг репрессирует инвазивные последовательности, но что, кроме того, этот базовый механизм был использован клеткой для гетерохроматинизации центромер, обеспечивая тем са- мым корректное расхождение хромосом и целостность генома. Все приведенные выше примеры показывают удиви- тельное изменение центральной догмы контроля генов, формулировка которого начинает выглядеть следую- щим образом: ДНК -► некодирующие РНК -► хроматин -► функция гена. Никто не предвидел появление пред- ставлений о том, что некодирующие РНК активно уча- ствуют в работе RNAi-подобных механизмов, которые также «нацеливают» локус-специфичные домены на ремоделинг хроматина и сайленсинг генов. 11. От одноклеточных систем к многоклеточным 5000—6000 генов, содержащихся в геномах почкующих- ся и дробянковых дрожжей, достаточны для регуляции основных метаболических процессов и процессов клеточного деления. Здесь, однако, нет потребности в клеточной дифференцировке, поскольку эти однокле- точные организмы в основе своей являются клональ- ными и, как таковые, многократно повторяющимися «бессмертными» существами. В противоположность им млекопитающие кодируются приблизительно 25000 генами, требующимися в клетках примерно 200 разных типов. Понимание того, каким образом с одной и той же генетической матрицы генерируется и координируется связанная с многоклеточностью сложность организма, является ключевым вопросом в эпигенетических ис- следованиях. Сравнение размеров генома у дрожжей, мух, расте- ний и млекопитающих показывает, что размер генома существенно растет с увеличением сложности соответ- ствующего организма. Имеет место более чем 300-крат- ное различие между размерами геномов у дрожжей и у млекопитающих, при том что общее число генов воз- растает всего в какие-нибудь 4—5 раз (рис. 3.15). Од- нако показателем сложности генома может служить отношение кодирующих последовательностей к неко- дирующим и повторяющимся: в основном «открытые» геномы одноклеточных грибов имеют сравнительно мало некодирующей ДНК по сравнению с высоко гете- рохроматинизированными геномами многоклеточных организмов. В частности, млекопитающие накопили значительное количество повторяющихся элементов и некодирующих участков, которые составляют большую часть их нуклеотидных последовательностей ДНК (52% некодируюшей и 44% повторяющейся ДНК). Таким об- разом, лишь 4% генома млекопитающих кодируют бел- ковые функции (включая интронные последователь- ности) Эта массивная экспансия повторяющихся и некодирующих последовательностей у многоклеточных организмов, вероятнее всего, обусловлена включением
Глава 3. Общий обзор и основные понятия 2,4 Gb 3,2 Gb 14 млн н. 13,8 млн н. 5 CEREVISIAE S POMBE ~ 6000 генов - 5000 генов 16 хромосом 3 хромосомы 125 млн н. ARABIDOPSIS >25000 генов 5 хромосом 180 млн н. МЫШЬ >25000 генов 20 хромосом ЧЕЛОВЕК >25000 генов 23 хромосомы ген (2 тыс. н.) ген (2 тыс н.) DROSOPHILA >14000 генов 4 хромосомы ген (5 тыс н.) повторы простая и сложная организация гена Рис. 3.15. Круговые диаграммы, характеризующие организацию генома у разных организмов Над каждой диаграммой указаны размеры генома для основных модельных организмов, используемых в эпигенетических иссле- дованиях. Увеличение размеров генома у более сложных многоклеточных организмов коррелирует со значительной экспансией некодирующих (т.е. интронных, межгенных и рассеянных повторяющихся последовательностей) и повторяющихся (например, сателлитной. LINE, SINE ДНК) нуклеотидных последовательностей ДНК Эта экспансия сопровождается увеличением числа эпигенетических механизмов (в особенности репрессивных), регулирующих геном Расширение генома коррелирует также с увеличением размеров и сложности единиц транскрипции, за исключением растений; эти последние выработали механизмы, не допускающие вставок или дупликаций в транскрипционной единице. Р — промоторный элемент ДНК инвазивных элементов, таких как ДНК-транспозоны, ретротранспозоны и другие повторяющиеся элементы. Хотя эти последние и представляют собою нагрузку для программ координированной экспрессии генов, они в то же время делают возможной эволюцию генома и обусловливают его пластичность, а также некоторую степень стохастической регуляции генов. Экспансия повторяющихся элементов инфильтрировала даже транскрипционные единицы генома млекопитающих. Результатом явились транскрипционные единицы, не- редко гораздо более крупные (30—200 т.н.) и обычно со- держащие множественные промоторы и повторы ДНК внутри нетранслируемых интронов. В противополож- ность этому растения, обладающие такими же больши- ми геномами, обычно обладают меньшими транскрип- ционными единицами с меньшими интронами, потому что у них развились защитные механизмы, не позволя- ющие «терпеть» вставку транспозона в пределах транс- крипционной единицы. Существуют важные различия между организмами, проявляющиеся в типах эпигенетических путей, ис- пользуемых, несмотря на высокую степень функцио- нального консерватизма, во многих механизмах у раз- ных видов. Полагают, что эти различия отчасти имеют отношение к величине генома. Широкая экспансия в геном некодирующих и повторяющихся ДНК у высших эукариот требует наличия более экстенсивных эпигене- тических механизмов сайленсинга. Это коррелирует с тем фактом, что млекопитающие и растения использу- ют весь диапазон репрессивного метилирования лизина гистонов, метилирования ДНК и механизмов сайлен- синга посредством RNAi. Другим вопросом, связанным с многоклеточностью, является вопрос о том, каким об- разом могут координироваться и поддерживаться мно- жественные клеточные типы (клеточная идентичность) Для регуляции генома имеет место тонкое равновесие с участием групп белковых комплексов Polycomb (PcG) и Trithorax (trxG). С появлением многоклеточности в осо- бенности коррелируют белки PcG (см. раздел 12). Клетки в многоклеточном организме по своим функциям могут быть разделены на два основных компартмента: зародышевые клетки (тотипотентные и требующиеся для передачи генетической информа- ции следующему поколению) и соматические клетки (дифференцированная «силовая станция» организма). Существуют важные вопросы относительно того, как компартмент зародышевых клеток поддерживает то- типотентность своего эпигенома и какие механизмы вовлечены в стирание, установление и поддержание клеточной судьбы (клеточная память) Поскольку одна зародышевая клетка дает начало другой зародышевой клетке, она в сущности обладает неограниченным про- лиферативным потенциалом, подобно одноклеточным «бессмертным» организмам. Однако для того чтобы вы- полнять эту роль, зародышевые клетки находятся по большей части «в покое» и не реагируют на внешние стимулы, так что целостность их эпигенома может быть защищена. Действительно, ооциты млекопитающих могут сохраняться в покоящемся состоянии более 40 лет. Аналогичным образом, взрослые стволовые клет- ки (мультипотентные) представляют собой в основном популяцию «спящих» клеток, пролиферирующую (и самовозобновляющуюся) только тогда, когда они. эти клетки, активируются митогенными стимулами и про- ходят ограниченное число клеточных делений. Таким образом, на состав и структуру эпигенома влияют мно- гие внутренние (например, транскрипция, репликация ДНК, расхождение хромосом) и внешние (например, цитокины, гормоны, повреждение ДНК или общая ре- акция на стресс) сигналы, в особенности если сомати- ческая дифференцировка вынудила клетки покинуть среду, защищающую зародышевые и стволовые клетки.
12. Polycomb и Trithorax 12. Polycomb и Trithorax К числу основных эффекторов, способных передавать сигналы к хроматиновой матрице и участвовать в под- держании клеточной идентичности (т.е. обеспечивать клеточную память), относятся члены групп генов PcG и trxG (Ringrose and Раго 2004). Эти гены были открыты у Drosophila благодаря их роли в регуляции кластера генов Нох в ходе развития и регуляции гомейотических генов. С тех пор было показано, что PcG и trxG являются клю- чевыми регуляторами пролиферации клеток и клеточной идентичности у многоклеточных эукариот. Кроме того, эти группы генов участвуют в нескольких сигнальных каскадах, которые реагируют на митогены и морфогены; регулируют идентичность и пролиферацию стволовых клеток, яровизацию у растений, гомеотические транс- формации и трансдетерминацию, коммитирование линий в ходе дифференцировки В- и Т-клеток и многие другие аспекты развития Metazoa (главы 11 и 12). Теперь мы обратимся вкратце к тому, что известно о том, как семейства PcG и trxG превращают связанные с развитием сигналы в «эпигенетическую память» через посредство структуры хроматина. Группы белков PcG и trxG функционируют по боль- шей части антагонистически: семейство белков PcG устанавливает «молчащее» состояние хроматина, а се- мейство белков обычно способствует генной активно- сти. Молекулярная идентификация гена Рс, о котором известно, что он стабилизирует паттерны репрессии ге- нов на протяжении нескольких клеточных генераций, обеспечила первые данные о молекулярном механизме клеточной или эпигенетической памяти Равным об- разом РС явился примером белка, содержащего хромо- домен с высокой степенью сходства с хромодоменом ассоциированного с гетерохроматином белка НР1 (Раго and Hogness, 1991). Как упоминалось выше, хорошо до- казано, что хромодомены являются специфическими модулями, связывающимися с метил-лизином гистона (изображено на рис. 3.10). У Drosophila идентифициро- ваны 20 генов PcG и, по меньшей мере, 15 разных ге- нов trxG. Функциональные анализы показали, что эти группы генов составляют спектр разных белков, но, тем не менее, они высококонсервативны у эукариот. Гены PcG кодируют продукты, в число которых входят бел- ки, связывающиеся с ДНК (например, YY1), энзимы, модифицирующие гистоны (например. EZH2), и другие репрессивные ассоциированные с хроматином факторы, которые содержат хромодомен, обладающий сродством к НЗК27шеЗ (например, РС). Гены группы trxG кодиру- ют транскрипционные факторы (например, GAGA, или Zeste), энзимы АТФ-зависимого ремоделинга хроматина (например, Brahma) и HKMTs, такие как Ash 1 и Тгх (или его гомологи у млекопитающих, MLL, Set 1 и семейство MLL). В большинстве случаев семейства белков PcG и trxG функционируют как компоненты разнообразных комплексов, устанавливая стабильные хроматиновые структуры, которые облегчают экспрессию или сайлен- синг генов, регулируемых в развитии (главы И и 12). Несмотря на успехи последнего времени механизм, посредством которого комплексы, содержащие PcG или trxG, «нацеливаются» на регулируемые в развитии районы хроматина, еще не вполне выяснен У Drosophi- la наследуемая репрессия гена требует рекрутирования белковых комплексов PcG к элементам ДНК, называе- мым «элементы ответа polycomb» (PREs, polycomb re- sponse elements). Эквивалентные последовательности у млекопитающих установить не удалось. Неясно, каким образом белковые комплексы PcG вызывают протяжен- ный сайленсинг зависимым от PRE образом, потому что PREs обычно локализованы на расстоянии килобаз от сайта старта транскрипции генов-мишеней. Можно постулировать, что отталкивание или, наоборот, рекру- тирование комплексов PcG могут дискриминировать- ся изменениями в транскрипционной активности или различиями в продуктивном versus непродуктивном процессинге иРНК (Pirrotta, 1998; Dellino et al., 2004; Schmitt et al., 2005). В современных моделях поддержи- вается представление о связывании PcG через взаимо- действие с белками, связывающимися с ДНК, и срод- ство хромодомена в белке PcG к модифицированным гистонам (H3K27me3) (Cao et al., 2002). Однако ком- плексы PcG могут также ассоциироваться in vitro с ну- клеосомами, лишенными гистоновых хвостов (Francis et al., 2004) и, более того, элементы PRE имеют снижен- ную плотность нуклеосом (Schwartz et al., 2005). Наи- более логичное объяснение некоторых из этих не со- гласующихся друг с другом наблюдений заключается в том, что обычно связывание PcG in vivo первоначально нуждается во взаимодействии с факторами, связанны- ми с ДНК, которое затем стабилизируется ассоциацией - с нуклеосомами и модифицированными НЗК27шеЗ в прилегающем участке хроматина. Очевидно, необхо- димы дальнейшие исследования для того, чтобы свя- зать существующие данные о том, как комплексы PcG «нацеливаются» на участки хроматина, и о том, каким образом они опосредуют репрессию. Вполне вероятно, что Зто зависит от организма, поскольку имеет место большая гетерогенность комплексов PcG (глава 11). Белки группы Trithorax поддерживают обычно ак- тивное состояние генной экспрессии в генах-мишенях и преодолевают сайленсинг, опосредованный PcG (или предотвращают его). Этот переход еще менее понятен, но последние данные позволяют предполагать, что не- кий, базирующийся на РНК, механизм мог бы служить триггером для рекрутирования Ashl к промоторам- мишеням (Sanchez-Elsner et al., 2006). Полагают, что в результате может происходить ряд временных и ста- бильных изменений в структуре хроматина, которые мо- гут облегчаться межгенной транскрипцией, способной устанавливать открытый хроматиновый домен и опо- средовать активное замещение гистонов В число доку- ментированных изменений хроматина входят вставка «активных» метильных меток по лизинам гистонов с помощью таких trxG HKMTs, как Тгх и Ashl, и считы- вание этих меток (например, распознавание НЗК4те с помощью WDR5; Wysocka et al., 2005). Требуется так- же действие зависимых от АТФ факторов ремоделин- га хроматина, таких как Brahma, хотя еще предстоит определить, каким именно образом взаимосвязаны эти механизмы (детали см. в главе 12).
и основные понятия Многие белки PcG и trxG действуют кооперативно, поддерживая в нормальной клетке жестко контроли- руемый уровень репрессированного гетерохроматина по отношению к активному эухроматину. У млекопи- тающих в соматических интерфазных ядрах морфо- логия ядер показывает, что конститутивные домены околоцентромерного гетерохроматина сгруппированы в 15—20 фокусов (рис 3.16). Дерегуляция клеточной судьбы и контроля пролиферации, приводящая к ано- малиям развития и раку, нередко проявляется в ано- мальной морфологии ядер. Например, ядерная органи- зация в клетках больных PML-лейкемией (родственной смешанной лимфоцитарной лейкемии [MLL]) демон- стрирует отсутствие перицентромерных фокусов (Di Croce, 2005). В противоположность этому стареющие (непролиферирующие) клетки обнаруживают ядерную морфологию с крупными эктопическими кластерами гетерохроматина (Narita et al., 2003; Scaffidi et al., 2005). Таким образом, морфология ядер оказывается хоро- шим маркером, позволяющим различать нормальные и аберрантные клеточные состояния; это показывает, что архитектура ядра может, помимо всего прочего, играть регуляторную роль в поддержании специализирован- ных доменов хроматина. Изучение уровней модификации гистонов является еще одним индикатором нормальности или ненормаль- ности клеток. Многие из этих изменений приписыва- ются дерегуляции HKMTs группы PcG (например, Ezh2) или trxG (например, MLL), что вносит вклад в про- грессию и даже метастатический потенциал опухолей (см. раздел 15). Действительно, увеличение общих уров- ней содержания любого из вышеупомянутых белков связано с повышенным риском возникновения рака простаты, рака груди, множественной миеломы или лейкемии (Lund and van Lohuizen, 2004; Valk-Lingbeek et al., 2004). В других случаях неопластической трансфор- мации имеют место явное снижение уровня репрессив- ных гистоновых меток и увеличение общего ацетили- рования (Seligson et al., 2005), вызывающие повышение уровня транскрипции генов и нестабильности генома. Очевидно, что изменения в глобальном контроле хро- матина, может быть через нарушение работы энзимов, модифицирующих гистоны, влияют на функциональ- ность генома и нарушают специфический профиль экс- прессии генов в нормальной клетке. В случае клеточного старения увеличение уровня реперессивных меток гистонов также является инди- катором клеточной дисфункции. Такое увеличение, со- провождаемое сниженным выявлением ацетилирова- ния гистонов, может укрепить и даже повысить уровни «молчащего» хроматина, блокируя клеточную пластич- ность и направляя клетки в антипролиферативное со- стояние (Scaffidi et al., 2005). Это в значительной мере связанный с возрастом эффект, хотя особое болезнен- ное состояние, прогерия, может преждевременно уско- рять старение. Напротив, когда у мутантов, не имею- щих трансдуцирующего энзима (Suv39h), снижается уровень репрессивных перицентромерных метильных меток, клетки обнаруживают повышенные скорости иммортализации, отсутствие старения и повышенную Оплодот- воренный ооцит «Защищено» Покоя- щаяся стволовая клетка Соматические ___ клетки Зародышевые клетки КЛЕТОЧНАЯ ИДЕНТИЧНОСТЬ Polycomb и Trithorax «Стресс» • «Стресс» - «Стресс» Стареющая клетка Опухолевая клетка Рис. 3.16. Клеточная идентичность, определяемая белками PcG и trxG В ходе эмбриогенеза устанавливаются два клеточных компартмента, различающихся по своему дифференцировочному потен- циалу: это зародышевые клетки (тотипотентные) и соматические клетки (включая стволовые клетки) с ограниченными диффе- ренцировочными потенциями. Пластичность потенциала экспрессии генома зародышевых или стволовых клеток отражается в сниженных уровнях репрессивных гистоновых меток, которые больше не видны в околоцентромерных фокусах. Нормальные пролиферирующие клетки обычно обладают ядерной морфологией с 15—20 гетерохроматиновыми фокусами. Комплексы, со- держащие Polycomb и Trithorax, действуют, определяя эпигенетическую и, отсюда, клеточную идентичность разных линий. Они функционируют также в ответ на внешние «стрессорные» воздействия, стимулируя клеточную пролиферацию и соответствующую экспрессию генов. В стареющих клетках происходит утрата пластичности генома и пролиферационного потенциала, что находит свое отражение в аномально крупных гетерохроматиновых фокусах и в общем повышенном уровне репрессивных гистоновых меток. Однако интенсивно пролиферирующие опухолевые клетки обнаруживают изменения в балансе репрессивных и активи- рующих гистоновых меток через дерегуляцию модифицирующих гистоны энзимов PcG и trxG. Это сопровождается нарушениями ядерной морфологии
13. Инактивация Х-хромосомы и факультативный гетерохроматин нестабильность генома (Braig et al., 2005). Эти примеры являются иллюстрацией того, что дерегуляция хрома- тина, которая проявляется в уровнях характерных ги- стоновых меток, часто трансдуцируемых энзимами PcG и trxG, и ядерная морфология оказываются важным ин- дикатором прогрессии болезни. 13. Инактивация Х-хромосомы и факультативный гетерохроматин Сайленсинг генов, опосредованный PcG, и инактивация Х-хромосомы являются лучшими примерами регулируе- мых в развитии переходов между активным и неактивным состояниями хроматина (рис. 3.17), часто называемого факультативным гетерохроматином. Он назван так в противоположность конститутивному гетерохроматину (например, в околоцентромерных доменах), который, по умолчанию, может быть индуцирован в некодирующих и высокоповторяющихся районах. Факультативный ге- терохроматин встречается в кодирующих районах генома, где сайленсинг генов зависит от принимаемых в ходе развития решений, определяющих различные клеточные судьбы (а иногда и ревертируется этими решениями). Один из лучше всего изученных примеров образо- вания факультативного гетерохроматина — инактива- ция одной из двух Х-хромосом у самок млекопитаю- щих для выравнивания дозы экспрессии сцепленных с Х-хромосомой генов с самцами, обладающими только одной Х-хромосомой (и гетероморфной У-хромосомой) (глава 17). Здесь сайленсинг генов по всей неактивной Х-хромосоме (Xi) индуцирует высокую степень ком- пактизации Xi, которая видна как тельце Бара, локали- зованное на периферии ядра клеток у самок млекопи- тающих. Как подсчитываются две аллели Х-хромосом и каким образом одна определенная Х-хромосома выби- рается для инактивации — эти вопросы стоят на повест- ке дня сегодняшних эпигенетических исследований. Инактивация Х-хромосомы происходит с участием большой (~17 т.н.) РНК, Xist, которая, по-видимому, действует как первичный триггер ремоделинга хрома- тина в Xi. Хотя существует возможность образования dsRNA между Xist и антисмысловым транскриптом Tsix (экспрессируемым лишь до начала инактивации X), нет никаких сколько-нибудь убедительных доказательств участия зависящих от РНКи механизмов в инициации инактивации X. Центр инактивации X (XIC, X inactiva- tion center) и вероятные сайты «вхождения» или «докин- га» в ДНК (постулируется, что это специализированные повторяющиеся элементы ДНК, которыми обогащены Х-хромосомы) играют роль в ассоциации AZtf-PHK и функционирования ее в качестве молекулы-скаффолда, декорируюшей Xi в cis Xist стимулирует рекрутирова- ние, а также действие и комплекса PRC 1 (репрессивный комплекс polycomb), и комплекса PRC2, участвующих в образовании стабильной неактивной Х-хромосомы. В число компонентов PRC2 входит, например, мо- дифицирующий хроматин фермент EZH2 из группы НКМТ, который катализирует НЗК27теЗ. Связыванию комплекса PRC1 могут способствовать и НЗК27теЗ, и механизмы, не зависящие от модификации гистонов, Репрессия эухроматинового гена (напр.. Polycomb) Аберрантная РНК ??? I Неправильно процессированная РНК Факультативный гетерохроматин Конститутивный гетерохроматин dsPHK | Dicer Дисперсное распределение в ядре Тельце Бара клетки женского организма Фокусы гетерохроматина Рис. 3.17. Индукция репрессированных состояний хроматина, направляемая РНК Разные формы «молчащего» хроматина имеют различные первичные сигналы, но многие из них, вероятно, связаны с РНК- транскриптами (от аберрантных транскриптов к Xist-PHK и, далее, к dsRNAs), в зависимости от природы соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Это включает установление набора изменений хроматина, в том числе комбинации модификаций гистонов (метилирование НЗК9, НЗК27 и Н4К20), связывание репрессивных белков или комплексов (напри- мер, PC или НР1) с хроматином, метилирование ДНК и присутствие вариантов гистонов (например, макроН2А на неактивной Х-хромосоме) Факультативный или конститутивный гетерохроматины образуют видимые кластеры в ядре Эухроматиновую репрессию по картинам ядерной морфологии определить нельзя
Глава 3. Общий обзор и основные понятия тогда как другие компоненты этого комплекса, такие как белки Ringl, убиквитинируют Н2А. Гетерогенность комплексов PcG такова, что различные его компонен- ты могут действовать независимо от других компонен- тов комплекса. Модификации хроматина, связывание комплекса PcG, последующее включение гистонового варианта макроН2А вдоль Xi и экстенсивное метили- рование ДНК — все эти процессы вносят вклад в об- разование структуры факультативного гетерохроматина во всей хромосоме Xi. Коль скоро стабильная гетерох- роматиновая структура установлена, для ее поддержа- ния ЛА/-PH К больше не нужна (Avner and Heard, 2001; Heard, 2005). Аналогичной формой моноаллельного сайленсинга является геномный импринтинг, также ис- пользующий некодирующую или антисмысловую РНК для сайленсирования одной аллельной копии в зависи- мости от того, от кого из родителей эта копия проис- ходит (глава 19). В настоящее время неясно, влияют ли ES-клетки от мутантных по Dicer мышей на процессы инактивации X или на геномный импринтинг и, если влияют, то каким образом. Общая парадигма компенсации дозы — классиче- ского эпигенетически контролируемого процесса — была также исследована у других модельных организ- мов, в особенности у С. elegans (Meyer et al., 2004; глава 15) и Drosophila (Gilfillan et al., 2004; глава 16). Пока что неясно, происходит ли компенсация дозы у птиц, не- смотря на тот факт, что они являются гетеросаметными организмами. У Drosophila компенсация дозы между по- лами происходит не за счет инактивации Х-хромосомы у самки, а путем двукратного усиления [up-regulation] работы единственной Х-хромосомы самца. Любопыт- но, что существенными компонентами являются, как известно, две некодирующие РНК, гоХ1 и гоХ2, и их экспрессия специфична для самцов. Хотя и существу- ют, вероятно, аналогичные механистические различия в каких-то деталях между мухами и млекопитающими, ясно, что активирование ремоделинга хроматина и мо- дификаций гистонов, в особенности зависящее от MOF ацетилирование Н4К16 на Х-хромосоме самца, играет ключевую роль в компенсации дозы у Drosophila. Каким именно образом энзимы, модифицирующие гистоны, такие как MOF-ацетилтрансфераза гистонов, «наце- ливаются» на Х-хромосому самца, остается предметом будущих исследований. Более того, полагают, что такие зависящие от АТФ энзимы ремоделинга хроматина, как фактор ремоделинга нуклеосом (NURF, nucleosome-re- modeling factor), являются антагонистами активностей комплекса компенсации дозы (DCC, dosage compensa- tion complex). В совокупности в этом разделе и в разделах 10 и 11 дано описание механизмов для модификаций хромати- на, направляемых РНК, в том виде, как это происходит с конститутивным гетерохроматином, хромосомой Xi и, возможно, также и сайленсингом генов, опосредо- ванным PcG. Исходя из этих любопытных параллелей, можно постулировать, что часть РНК или неспаренных ДНК могли бы обеспечить привлекательный первич- ный триггер для стабилизации комплексов PcG в PREs или «компрометированной» промоторной функции, где они могли бы «чувствовать» качество транскрип- ционного процессинга. Аберрантная или блокирован- ная элонгация и (или) ошибки в сплайсинге могли бы стимулировать взаимодействие между PcG, связанным с PRE, и промотором, приводя к выключению транс- крипции. Таким образом, инициация PcG-сайленсинга индуцировалась бы переходом от продуктивной транс- крипции к непродуктивной. Сейчас только лишь начи- нает проясняться, в какой мере комплексы trxG могут использовать контроль качества РНК и (или) процес- синг первичных РНК-транскриптов как часть поддер- жания «включенных» транскрипционных состояний (Sanchez-Elsner et al., 2006). 14. Репрограммирование клеточной судьбы Вопрос о том, каким образом можно изменить или ре- вертировать судьбу клетки, давно интересовал ученых. Зардышевая клетка и ранние эмбриональные клетки отличаются от других клеточных компартментов как «конечные» [«ultimate»] стволовые клетки свойственной им тотипотентностью. Хотя спецификация клеточной судьбы у млекопитающих допускает около 200 разных клеточных типов, в принципе существуют два главных дифференцировочных перехода: от стволовой (тоти- потентной) клетки к полностью дифференцированной клетке и между покоящейся (quiescent, или Go) и про- лиферирующей клеткой. Эти типы представляют собой крайние конечные точки среди множества промежуточ- ных состояний, согласующихся с множеством различных компоновок эпигенома в развитии млекопитающих. В ходе эмбриогенеза динамическое увеличение эпиге- нетических модификаций проявляется в переходе от оплодотворенного ооцита к стадии бластоцисты и затем в имплантации, гаструляции, развитии органов и росте плода. Большинство этих модификаций или импринтов может быть стерто путем переноса ядра дифференциро- ванной клетки в цитоплазму денуклеированного ооцита. Однако некоторые метки могут сохраняться, ограни- чивая тем самым нормальное развитие клонированных эмбрионов, а некоторые из них могут даже наследоваться как модификации зародышевого пути (g-mod) (рис. 3.18), которые у млекопитающих, вероятно, включают метилирование ДНК. Регенерация печени и репарация мышечной клетки представляют собою исключения среди тканей млеко- питающих, поскольку эти органы могут регенериро- вать в ответ на повреждение, хотя большинство других тканей не способны к репрограммированию. У других организмов, таких как растения и Axolotl. некоторые соматические клетки могут действительно репрограм- мировать свой эпигеном и вновь вступать в клеточный цикл, чтобы регенерировать утраченную или повреж- денную ткань (Tanaka, 2003). В целом, однако, репро- граммирование соматических клеток невозможно, если они не подвергаются клеточно-инженерным манипу- ляциям с целью рекапитулировать раннее развитие по- сле пересадки ядра (NT, nuclear transfer) в денуклеиро- ванный ооцит. Впервые это было продемонстрировано
14. Репрограммирование клеточной Эмбриональное g-mod — mod------ mod — mod--- mod--- - g-mod NT Дифференцированное Рис. 3.18. Репрограммирование путем пересадки ядра В течение жизни особи в разных клеточных линиях приоб- ретаются эпигенетические модификации (mod) (левая часть рисунка}. Пересадка ядра (NT) соматической клетки приводит к реверсии процесса терминальной дифференцировки, уни- чтожая большинство эпигенетических меток (mod); однако некоторые модификации, которые обычно присутствуют и в зародышевом пути (g-mod), не могут быть удалены. В ходе неопластической трансформации (из нормальной клетки в опухолевую), вызываемой серией генетических мутаций (крас- ные звезды}, накапливаются эпигенетические нарушения. Эти эпигенетические нарушения (mod), но не мутации, могут быть стерты в процессе репрограммирования после NT. Этот подход позволяет оценивать взаимодействие между генетическим и эпигенетическим вкладами в генез опухоли (из R.Jaenisch, с изменениями) клонированием лягушек (Xenopus), а в более недавнее время — созданием Долли, первого клонированного млекопитающего (Campbell et al., 1996; глава 22). У млекопитающих были идентифицированы три основных препятствия для эффективного соматического репрограммирования. Во-первых, некоторые соматиче- ские эпигенетические метки (например, репрессивные НЗК9шеЗ) стабильно передаются в ряду делений сома- тических клеток и устойчивы к репрограммированию в ооците. Во-вторых, ядро соматической клетки не спо- собно рекапитулировать асимметрию репрограммиро- вания. возникающую в оплодотворенном эмбрионе как следствие дифференциальных эпигенетических меток, унаследованных мужским и женским гаплоидными ге- номами (см. Mayer et al., 2000; van der Heiden et al., 2005; глава 20). В-третьих, передача импринтированных ло- кусов, которые особенно важны на стадии фетального и плацентарного развития, недостаточно надежно поддер- живается после NT (Morgan et al., 2005). Большинство клонированных эмбрионов абортируют, и это заставляет предполагать, что нарушение эпигенетических имприн- тов является основным узким местом для нормального развития и может быть причиной низкой эффективно- сти вспомогательных репродуктивных технологий (ART, assisted reproductive technologies) и ухудшенного физиче- ского состояния клонированных животных. Использование эмбриональных стволовых клеток вместо соматических демонстрирует значительно уве- личенные возможности репрограммирования. Демон- страция того, что покоящиеся клетки (частая характе- ристика стволовых клеток) обнаруживают снижение уровня состояний НЗК9шеЗ и Н4К20 шеЗ, могла бы указывать на увеличенную пластичность эпигенома (Baxter et al., 2004). Это согласуется также с тем фак- том, что у «бессмертных» одноклеточных организмов (например, дрожжей) с их открытым, в значительной степени, и активным геномом отсутствуют несколько репрессивных эпигенетических механизмов Другой особенностью нормального эпигенетиче- ского репрограммирования у млекопитающих после оплодотворения является его отчетливая асимметрия. Это можно приписать прежде всего различным про- граммам эпигенетической спецификации в мужских и женских зародышевых клетках (главы 19 и 20). Геном спермия в основном составлен из протаминов, хотя имеется и остаточный, но достоверный уровень CENP- А (вариант гистона НЗ) и другие предполагаемые эпи- генетические импринты (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005), тогда как ооцит состоит из регулярного хромати- на, содержащего нуклеосомы. После оплодотворения гаплоидные геномы спермия и ооцита проделывают еще один цикл репрограммирования, включающий де- метилирование ДНК и обмен гистоновых вариантов. В первом клеточном цикле эти модификации могут либо усиливать, либо уравновешивать эпигенетические раз- личия двух родительских геномов перед слиянием ядер. В ходе дифференцировки эмбриональной (внутренняя клеточная масса [ICM, inner cell mass]) и экстраэмбрио- нальной (трофэктодерма [ТЕ] и плацента) тканей между линями устанавливаются различные профили метили- рования ДНК и модификации гистонов (Morgan et al., 2005). Соматическое клонирование не может надежно рекапитулировать эти паттерны репрограммирования, демонстрируя быстрое, но менее экстенсивное деме- тилирование в первом клеточном цикле и нарушенное метилирование ДНК и метилирование лизинов гисто- нов при сравнении клеток ICM и ТЕ. С проблемой репрограммирования соматических клеток тесно связана судьба импринтированных ген- ных локусов. Для нормального эмбрионального раз- вития требуется правильная аллельная экспрессия в импринтированных локусах (глава 19). Это было про- демонстрировано оригинальными экспериментами по получению однородительских эмбрионов (Barton et al., 1984; McGrath and Solter, 1984; Surani et al., 1984). Ah- дрогенетические эмбрионы (оба генома которых имеют отцовское происхождение) обнаружили замедленное эмбриональное развитие, но гиперпролиферацию экс- траэмбриональных тканей (например, плаценты). У гино- или партеногенетических эмбрионов (оба генома которых имеют материнское происхождение) плацен- та недоразвита. Следовательно, после стирания пред- существовавших меток в зародышевой клетке должен быть установлен специфичный по отношению к роди- телю импринт (глава 20). Полагают, что это происходит приблизительно для 100 или даже большего числа им- принтированных генов, в основном участвующих в си- стемах обеспечения ресурсами эмбрионального и пла-
и основные понятия центарного развития (например, ростовой фактор Igf2). Любопытно отметить данные о том, что импринтинг может быть нарушен во время культивирования in vitro эмбрионов, полученных с помощью ART или пересад- ки ядра (Maher, 2005). 15. Рак Существует тонкое равновесие между самообновлением и дифференцировкой. Неопластическая трансформация (называемая также туморогенезом) рассматривается как процесс, посредством которого клетки претерпевают изменения, включающие бесконтрольную клеточную пролиферацию, утрату checkpoint-контроля, делающую возможными накопление хромосомных аберраций и геномную анеуплоидию, и неправильно регулируемую дифференцировку (Lengauer et al., 1998). Обычно по- лагают, что эти изменения вызываются по крайней мере одним генетическим повреждением — точечной мутацией, делепией или транслокацией, разрушающими либо ген-супрессор опухоли, либо онкоген (Hanahan and Weinberg, 2000). В опухолевых клетках гены, супресси- рующие опухоль, становятся «молчащими». Онкогены активируются посредством доминантных мутаций или сверхэкспрессии нормального гена (протоонкогена). Важно, что с опухолевыми клетками связано также на- копление аберрантных эпигенетических модификаций (глава 24) Эти эпигенетические изменения включают измененные паттерны метилирования ДНК, моди- фикации гистонов и структуру хроматина (рис. 3.19). Таким образом, неопластическая трансформация — это сложный, многоэтапный процесс, включающий случайную активацию онкогенов и (или) сайленсинг генов-супрессоров опухоли и осуществляемый посред- ством генетических или эпигенетических событий Все это называют «двухударной теорией Кнудсона» (Feinberg, 2004; Feinberg and Tyko, 2004). Проиллюстрируем это следующим образом Сайленсинг гена ретинобластомы (Rb) — гена-супрессора опухоли — вызывает утрату checkpoint-контроля, что не только обеспечивает про- лиферативное преимущество, но и стимулирует «второй удар», влияя на функции «ниже по течению», связанные со структурой хроматина, поддерживающие целостность генома (Gonzalo and Blasco, 2005). Сходный эффект может давать несвоевременная активация онкогенного продукта, такого как ген тус, (Knoepfler et al., 2006). Один из вопросов, порождаемых современными ис- следованиями, заключается в следующем: до какой сте- пени аберрантные эпигенетические изменения способ- ствуют возникновению опухоли и определяют ее общее поведение? Этот вопрос был исследован в опытах по пересадке ядер с использованием клеток меланомы в качестве донора ядер (Hochedlinger et al., 2004). Любые генетические повреждения донорской клетки сохра- няются; однако NT стирает эпигенетический «грим». Затем исследовали возникновение опухолей у клони- рованных зародышей мышей; выяснилось, что спектр опухолей, возникших de novo, сильно варьировал в соответствии с различным вкладом эпигенетических модификаций в разных тканях, в которых включалась неопластическая прогрессия. Гипометилирование ДНК (в противоположность гиперметилированию) может происходить в отдель- ных локусах или на протяженных участках хромосомы. Гииометилирование ДНК было, по сути, первым типом эпигенетического перехода, который удалось связать с раком (Feinberg and Vogelstein, 1983). Оно оказалось ши- роко распространенным фенотипом раковых клеток На уровне индивидуальных генов гипометилирование ДНК может быть неопластическим благодаря актива- ции протоонкогенов, дерепрессии генов, вызывающих аберрантные функции клеток, или биаллельной экс- прессии импринтированных генов (что также называ- ется утратой импринтинга, или LOI — loss of imprinting) (главы 23 и 24). В более глобальных масштабах, масшта- бах всего генома обширное гипометилирование ДНК, особенно в участках конститутивного гетерохроматина, обусловливает предрасположение клеток к хромосом- ным транслокациям и анеуплоидии, способствующим раковой прогрессии. Этот эффект рекапитулируется у мутантов по Dnmtl (Chen et al., 1998). Геномная не- стабильность, возникающая в условиях гипометили- рования ДНК, обусловлена, вероятно, мутагенным эффектом реактивации транспозонов. Когда обратили а Норма Онкоген ВЫКЛЮЧЕН Супрессор опухоли ВКЛЮЧЕН Опухоль Онкоген ВКЛЮЧЕН Супрессор опухоли ВЫКЛЮЧЕН Супрессор опухоли ВЫКЛЮЧЕН Супрессор опухоли ВКЛЮЧЕН Рис. 3.19. Эпигенетические модификации при раке (а) аберрантные эпигенетические метки в локусах, вы- зывающих рак, как правило, вызывают дерепрессию онкогенов или сайленсинг генов-супрессоров опухоли В число эпигенетических меток, о которых известно, что они изменяют нормальную клетку, входят метилирование ДНК, репрессивное метилирование гистонов и деацети- лирование гистонов; (б) использование эпигенетических терапевтических агентов для лечения рака имеет свои последствия на уровне хроматиновой матрицы, показан- ной на примере локуса-супрессора опухоли Воздействие ингибиторами Dnmt приводит к потере метилирования ДНК, а воздействие ингибиторами HDAC — к приоб- ретению ацетильных гистоновых меток и последующим модификациям «вниз по течению», включая активные метильные метки гистонов и включение гистоновых вариантов. Эти кумулятивные изменения хроматина приводят к возобновлению экспрессии гена
15. Рак внимание на существенную роль репрессивных моди- фикаций гистонов в поддержании гетерохроматина в центромерах и теломерах, появились данные о том, что если эти метки утрачиваются, возникает также неста- бильность генома, вносящая свой вклад в раковую про- грессию (Gonzalo and Blasco, 2005). Напротив, гг/яерметилирование ДНК при многих раковых заболеваниях сконцентрировано в промо- торных участках CpG-островков. Сайленсинг генов- супрессоров опухолей посредством такого аберрантного гиперметилирования ДНК имеет особо важное значе- ние в раковой прогрессии. Недавние исследования по- казали, что имеет место существенное взаимовлияние [cross-talk] между модификациями хроматина и мети- лированием ДНК, показывающее, что в сайленсинг гена-супрессора опухоли может быть вовлечен не один эпигенетический механизм. Приведем пример: извест- но, что гены-супрессоры опухолей, р16 и hMLHl, сай- ленсируются при раке как метилированием ДНК, так и репрессивным метилированием лизинов гистона (Mc- Garvey et al., 2006). Предполагается, что при многих формах рака име- ет место дерегуляция модификаторов хроматина. Не- которые энзимы, модифицирующие гистоны, — на- пример, белок EZH2 группы PcG и белок MLL группы trxG — становятся онкогенными и действуют, нарушая эпигенетическую идентичность клетки, вследствие чего возникает либо транскрипционный сайленсинг, либо активация «несоответствующих», «не тех» генов (Schneider et al., 2002; Valk-Lingbeek et al., 2004). Ясно, что эпигенетическая идентичность является ключевым фактором для клеточной функции. Действительно, ри- сунок глобальных ацетильных и метильных меток ги- стонов оказывается признаком, имеющим важное зна- чение для прогрессии некоторых раковых заболеваний, как показывают исследования прогрессии опухоли про- статы (Seligson et al., 2005). Разработка мишеней для лекарственных агентов с целью подавления функции эффекторных энзимов, модифицирующих хроматин, открыла новые горизон- ты для лечения рака (рис. 3.19). Использование инги- биторов DNMT и HDAC находится на наиболее про- двинутой стадии клинических испытаний этого нового поколения противораковых терапевтических средств. Двумя такими ингибиторами являются, соответствен- но, Зебуларин и SAHA. Они особенно эффективны по отношению к раковым клетам, у которых имеются ре- прессированные гены-супрессоры опухолей (J.C. Cheng et al., 2004; Garcia-Manero and Issa, 2005; Marks and Ji- ang. 2005), потому что воздействие ими приводит к стимуляции транскрипции. Основная доля репрессив- ного метилирования лизинов гистонов утрачивается в ходе воздействия, скорее всего благодаря сочетанному с транскрипцией обмену гистонов и замещению ну- клеосом; однако эти ингибиторы не изменяют сколько- нибудь существенно НЗК9шеЗ в промоторных участках, являющихся мишенями (McGarvey et al., 2006). Остает- ся выяснить, могут ли сохраняющиеся репрессивные метки индуцировать последующий ресайленсинг генов- супрессоров опухоли, когда воздействие временно пре- рывается, противодействуя тем самым пользе «эпигене- тической терапии». Возможно, что стратегия двойной эпигенетической терапии, использующая ингибиторы DNMT и HDAC, может обеспечить более благоприят- ный прогноз в клинических испытаниях. Идентификация ингибиторов для других классов модификаторов гистонов, а именно HKMTs и PRMTs, находится в настоящее время на стадии разработки. В геноме млекопитающих имеются приблизительно 50 одних только HKMTs с доменом SET. Большин- ство хорошо охарактеризованных энзимов, таких как SUV39H, EZH2, MLL и RIZ, уже связывали с развити- ем опухолей (Schneider et al., 2002). Так, используются методы высокопроизводительного скрининга (HTS) в надежде идентифицировать низкомолекулярные инги- биторы, которые можно было бы использовать в иссле- довательской работе и, в конечном счете, в противора- ковой терапии. Для такого подхода годятся все классы энзимов, модифицирующих гистоны, поскольку их специфические сайты связывания с субстратом (т.е. ги- стоновыми пептидами), в противоположность сайтам связывания общего кофактора (например, СоАи SAM), позволяют разрабатывать лекарственные препараты бо- лее селективного действия. HTS оказался успешным в случае HDACs (Su et al., 2000), PRMTs (D. Cheng et al., 2004) и HKMTs (Greiner et al., 2005). Для того чтобы произошел переход знаний из фун- даментальных исследований в прикладные, требуют- ся как основанные на гипотезах, так и эмпирические подходы, чтобы окончательно определить эффектив- ность и полезность какого-нибудь ингибитора энзима, модифицирующего гистоны. Например, селективные ингибиторы НКМТ против MLL или EZH2 могут быть ценными терапевтическими агентами против лейкемии или рака простаты. В качестве альтернативы исполь- зование НКМТ-ингибитора SUV39H (что интуитивно кажется неправильным из-за потребности в этом энзи- ме для поддержания конститутивного гетерохроматина и стабильности генома) могло бы все же избирательно сенсибилизировать опухолевые клетки. Кроме того, анализ HDAC-ингибитора SAHA показал, что он может действовать через дополнительные пути, не связанные с реактивацией транскрипции (Marks and Jiang, 2005). Например, HDAC-ингибиторы могут также сенсибили- зировать повреждения хроматина, подавляя эффектив- ную репарацию ДНК и делая возможным возникнове- ние геномной нестабильности, которая может включить апоптоз в опухолевых клетках. Эти наблюдения необ- ходимо будет проконтролировать при оценке эффек- тивности двойной комбинационной терапии. Однако, судя по результатам, имеющимся на сегодняшний день, можно себе представить, что комбинационная терапия с использованием HDAC- и НКМТ-ингибиторов мо- жет быть более избирательной в уничтожении пронео- пластических клеток, переводя их в состояние инфор- мационной избыточности и катастрофы с хроматином. Можно надеяться, что продолжение исследований по- зволит идентифицировать жизнеспособные кандидату- ры для эффективной эпигенетической противораковой терапии.
и основные понятия 16. В чем же в действительности заключается эпигенетический контроль? В транскрипции или регуляции хроматина играют роль приблизительно 10 % пула белков, закодированных в геноме млекопитающих (база данных Swiss-Prot). Ис- ходя из того, что геном млекопитающих состоит из 3 х 109 п.н., он должен вмещать ~ 1 х 107 нуклеосом. Это дает начало огромному разнообразию возможных регуляторных сигналов, включая взаимодействия при связывании с ДНК, модификации гистонов, варианты гистонов, ремоделинг нуклеосом, метилирование ДНК и некодирующие РНК. Один только процесс регуляции транскрипции весьма сложен и часто требует сборки крупных мультипротеиновых комплексов (>100 белков), чтобы обеспечить инициацию, элонгацию и правильный процессинг информационной РНК с одиночного вы- бранного промотора. Если уж регуляция, специфическая по отношению к нуклеотидной последовательности ДНК, столь сложна, можно ожидать, что еще сложнее окажутся характеризующиеся низким сродством ассо- циации вдоль динамического полимера, состоящего из ДНК и гистонов. Исходя из этих соображений, можно ожидать, что лишь изредка какая-то одна модификация будет коррелировать с одним каким-то эпигенетическим состоянием. Более вероятно (и в пользу этого говорят экспериментальные данные), что эпигенетические со- стояния стабилизируются и воспроизводятся опреде- ленной комбинацией или кумулятивным влиянием не- скольких (возможно, многих) сигналов на протяженном участке хроматина (Fischle et al., 2003b; Lachner et al., 2003; Henikoff, 2005). По большей части, связывание транскрипционного фактора является временным и утрачивается в после- дующих клеточных делениях. Для сохраняющихся пат- тернов генной экспрессии транскрипционные факторы нужны при каждом последующем клеточном делении. Как таковой, эпигенетический контроль может усили- вать первичный сигнал (например, стимуляцию про- мотора, сайленсинг генов, определение центромеры) в последовательных клеточных генерациях (но не бес- конечного их числа) путем наследственной передачи информации через хроматиновую матрицу (рис. 3.20). Интересно отметить, что у S. pombe эпигенетический мозаицизм, зависящий от Swi6, можно репрессировать на много клеточных делений во время как митоза, так и мейоза (Grewal and Klar, 1996) модификациями гисто- нов (вероятнее всего, НЗК9те2). Аналогичные исследо- вания были выполнены на Drosophila с использованием импульса некоего активирующего транскрипционного фактора для передачи клеточной памяти об экспрессии гена Нох в зародышевом пути самок (Cavalli and Раго, 1999). В обоих этих примерах эпигенетическая память опосредуется изменениями хроматина, в том числе от- дельными модификациями гистонов и, вероятнее все- го, включением гистоновых вариантов. Если модификации гистонов функционируют со- вместно, импринт может остаться на хроматиновой ма- трице, что поможет маркировать нуклеосомы, в особен- ности если сигнал восстанавливается после репликации ДНК (рис. 3.20). Для еще более стабильного наследова- ния сотрудничество между модификациями гистонов, включением гистоновых вариантов и ремоделингом хроматина может превратить протяженный участок хро- матина в устойчиво измененные структуры, которые затем будут воспроизводиться на протяжении многих клеточных делений. Хотя это объяснение относится к наследованию состояний «включения» транскрипции, аналогичный синергизм между репрессивными эпиге- нетическими механизмами будет более устойчиво закре- плять «молчащие» участки хроматина, и это далее будет усилено дополнительным метилированием ДНК. Двойная спираль ДНК может тогда рассматриваться как самоорганизующийся полимер, который, через его упорядочивание в хроматин, может реагировать на эпиге- нетический контроль и усиливать первичный сигнал, пре- вращая его в более долговременную «память». Кроме того, многие модификации гистонов, вероятно, развились в от- вет на внутренние и внешние стимулы. В соответствии с этим энзимы, модифицирующие хроматин, нуждаются в кофакторах, таких как АТФ (киназы), ацетил-СоА (HATs) и SAM (HKMTs), уровни которых диктуются изменения- ми внешних условий (например, диетой). Таким образом, измененные условия могут транслироваться в более дина- мичный или более стабильный полимер из ДНК и гисто- нов. Прекрасным примером этого является зависящий от NAD Sir2 (группа HDAC), который действует как «сенсор» для пищевых веществ и веществ и клеток на протяжении их жизни или уже стареющих (life-span/aged клеток) (Guarente and Picard, 2005; Rine, 2005). Понимание того, как эти сигналы из внешней среды превращаются в био- логически значимые эпигенетические сигнатуры и каким образом они прочитываются, транслируются и наследу- ются, находится в центре современных эпигенетических исследований. Важно, однако, подчеркнуть, что эпигене- тический контроль требует сложного равновесия между многими факторами и что функциональное взаимодей- ствие не всегда надежно восстанавливается после каждо- го клеточного деления. В этом состоит функциональный контраст с генетикой, которая имеет дело с изменениями нуклеотидной последовательности ДНК, всегда стабиль- но воспроизводящимися в митозе и мейозе, если эти му- тации происходят в зародышевом пути. Важным вопросом, вытекающим из рассмотренного выше материала, является вопрос о том, каким образом информация, содержащаяся в хроматине, поддержи- вается при передаче от материнской клетки дочерним клеткам. Если клетка утрачивает свою идентичность в силу заболевания, неправильной регуляции или репро- граммирования, сопровождается ли эта потеря идентич- ности изменениями в структуре хроматина? Основной синтез большинства коровых гистонов очень сильно регулируется на протяжении клеточного цикла. Транс- крипция генов коровых гистонов происходит обычно в S-фазе, на стадии, когда реплицируется ДНК (т.е. свя- зана с репликацией). Эта «координация» гарантирует что с удвоением количества ДНК в клетке имеется до- статочное количество коровых гистонов для связыва-
16 В чем же в действительности заключается эпигенетический контроль ? Повторяющийся сигнал Временный сигнал ВЫКЛЮЧЕНО ВКЛЮЧЕНО ВЫКЛЮЧЕНО ВКЛЮЧЕНО ВЫКЛЮЧЕНО сигнал Маркировано ВКЛЮЧЕНО Первичный сигнал Вторичный Первичный сигнал ВКЛЮЧЕНО Эпигенетическая программа ВЫКЛЮЧЕНО ВКЛЮЧЕНО Первичный сигнал ВКЛЮЧЕНО Частичная утрата Рис. 3.20. Эпигенетическое усиление первичного сигнала (память/наследование) Классическая генетика предсказывает, что экспрессия гена зависит от наличия и связывания соответствующего набора транскрип- ционных факторов (TF). Удаление таких факторов (т.е. первичный сигнал) приводит к утрате экспрессии гена и, таким образом, составляет преходящий активирующий сигнал (верхняя часть рисунка). Структура хроматина вносит свой вклад в экспрессию гена: здесь некоторые конформации являются репрессивными, а другие активными. Активация локуса может поэтому происходить посредством первичного сигнала и приводить к изменению в структуре хроматина «вниз по течению», включающему активные ковалентные гистоновые метки (mod) и замещение коровых гистонов их вариантами (например, НЗ.З). При клеточном делении эта структура хроматина может быть восстановлена в присутствии активирующего сигнала (обозначается как «повторяющийся сигнал»). Результатом эпигенетической памяти оказывается поддержание состояния хроматина при клеточном делении, даже в отсутствие первичного активирующего сигнала. Такая система памяти не является абсолютной, но включает множественные уровни эпигенетического регулирования для ремоделинга структуры хроматина. Динамическая природа хроматина означает, что хотя состояние хроматина может быть митотически стабильным,-оно тем не менее склонно к изменению, влияя тем самым на продолжительность эпигенетической памяти ния со вновь реплицированной ДНК; таким образом, упаковка ДНК происходит одновременно с ее репли- кацией. Как показано выше, различные участки хрома- тина могут иметь отчетливые различия по гистоновым модификациям, программирующим данный участок в отношении того, будет ли он транскрибироваться или нет. Каким образом домены вновь синтезированно- го дочернего хроматина сохраняют эту информацию, ключевую для экспрессии соответствующих генов? Каким образом эта программа надежно реплицируется от одного клеточного поколения к следующему или же проходит через мейоз и формирование зародышевой клетки (спермия или яйца)? Эти центральные вопросы ожидают будущих исследований. Хотя первоначальные исследования указывали на полуконсервативный процесс, в ходе которого откла- дывается новый тетрамер НЗ/Н4, вслед за чем инкорпо- рируются два новых димера Н2А/Н2В, данные послед- него времени подвергли эту гипотезу сомнению. В этой недавней модели «новые» полипептиды НЗ и Н4, кото- рые уже могут нести несколько посттрансляционных модифкаций, включаются как вновь синтезированные гистоновые димеры НЗ/Н4 вместе со «старыми» диме- рами НЗ/Н4, расходящимися между материнской и до- черней ДНК. Если это так. тогда эти модифицирован- ные, родительские димеры НЗ/Н4 также присутствуют теперь вместе с вновь синтезированными димерами на одной и той же ДНК. Их совместное присутствие могло бы тогда диктовать, какие «правильные» модификации должны размещаться на вновь добавленных димерах (Tagami et al., 2004). Эта модель выглядит привлекатель- ной и может помочь объяснить наследование гистоно- вых модификаций и, таким образом, воспроизведение эпигенетической информации в ходе репликации ДНК и при клеточном делении. Однако необходимы новые данные в поддержку этой или других моделей, предна- значенных для объяснения передачи хроматиновых ме- ток в ходе клеточного деления. Заканчивая эту главу, мы задаем вопрос: отлича- ется ли эпигенетический контроль сколько-нибудь фундаментальным образом от основных генетических принципов? Хотя мы можем захотеть рассматривать «эпигенетический ландшафт» Уоддингтона как раз- граниченные участки активирующих и репрессивных гистоновых модификаций на континууме хроматино- вого полимера, этот взгляд легко может оказаться чрез- мерной детализацией. Ведь только в последние голы мы узнали об основных ферментных системах, посред- ством которых могли воспроизводиться модификации гистонов. Это оформило наши современные представ- ления о стабильности и, отсюда, наследовании некото- рых гистоновых меток. Кроме того, это подчеркивается
и основные понятия недавними исследованиями, которые показывают, что мутации по активностям, модифицирующим хрома- тин, таким как ремоделеры нуклеосом (Cho et aL, 2004; Mohrmann and Verrijzer, 2005), DNMTs (Robertson, 2005), HDACs или HMKTs (Schneider et al., 2002), поскольку они часто обнаруживаются при ненормальном разви- тии и неоплазиях, являются красноречивыми приме- рами конечного могущества генетического контроля. Как таковое, возникновение опухоли у этих мутантных мышей обычно рассматривается как генетическое за- болевание. В противоположность этому изменения в структуре хромосом, метилировании ДНК и профилях модификаций гистонов — которые не вызываются му- тировавшим геном — обычно классифицируются как «истинные» эпигенетические аберрации. Превосхо- дными примерами этих более пластичных систем явля- ются стохастические «выборы» в раннем эмбриональ- ном развитии, репрограммируемые пересадкой ядра, транскрипционная память, геномный импринтинг, мозаичная инактивация Х-хромосомы, центромерная идентичность и прогрессия опухоли. Генетика и эпиге- нетика, таким образом, оказываются тесно связанными явлениями, и обеим им присуще их воспроизведение в ходе клеточных делений, которое, в том что касается генетического контроля, охватывает также и зароды- шевый путь, если мутации возникают в зародышевых клетках В случае других — часто слишком легко клас- сифицируемых — эпигенетических модификаций мы не знаем, являются ли они лишь отражением мелких и преходящих реакций на изменения во внешней среде или же вносят существенный вклад в фенотипические различия, которые затем могут поддерживаться на про- тяжении многих делений соматических клеток, хотя и не бесконечного их числа, и иногда могут затрагивать зародышевый путь. Даже при наших весьма продвину- тых сегодня знаниях об эпигенетических механизмах какие-либо новые доводы в пользу ламаркизма отсут- ствуют или почти отсутствуют. 17. Основные вопросы в эпигенетических исследованиях В этой книге обсуждаются фундаментальные концепции и общие принципы, объясняющие, как происходят эпи- генетические явления, какими бы загадочными они не казались. Наша конечная цель — представить читателю современные представления о механизмах, направляющих и формирующих эти концепции, на фоне разнообразных биологических данных, из которых они возникли. Всего лишь за несколько лет эпигенетические исследования дали интригующие и замечательные сведения и револю- ционные открытия; тем не менее, многие давно постав- ленные вопросы остаются без ответа (рис. 3.21). Хотя и соблазнительно набросать широкими мазками выводы и предложить на обсуждение общие правила, основы- вающиеся на этом прогрессе, мы предостерегаем от этой тенденции, подозревая, что будут обнаружены многочис- ленные исключения из этих правил. Например, ясно, что имеют место значительные различия между организмами. В особенности степень и тип гистоновых модификаций, варианты гистонов, метилирование ДНК и использование механизма РНКи существенно варьируют от одноклеточ- ных до многоклеточных организмов. Имеются, однако, множество оснований с новой энергией взяться за исследовательские программы, на- целенные на молекулярный анализ эпигенетических явлений. Элегантные биохимические и генетические исследования уже позволили успешно и беспреце- дентным образом проанализировать многие функцио- нальные аспекты этих путей. Поэтому можно было бы предсказать, что тщательный анализ эпигенетических переходов в разных типах клеток (например, стволо- вые versus дифференцированные; покоящиеся versus пролиферирующие) выявит ключевые признаки плю- рипотентности (Bernstein et al., 2006; Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006). Весьма вероятно, что это окажется цен- ным в определении того, какие изменения хроматина существенны во время нормальной дифференцировки в сравнении с болезненными состояниями и туморо- генезом. Например, ожидается, что использование та- ких подходов, как крупномасштабное картирование на нормальных, опухолевых или ES-клетках — получение «эпигенетического ландшафта» вдоль по длине целых хромосом (Brachen et al., 2006b; Squazzo et al., 2006; Epig- enomics AG, ENCODE, GEN-AU, EPIGENOME NoE) - позволит получить сведения, которые могли бы быть использованы для новых подходов в области терапевти- ческого вмешательства и способствовали бы созданию всемирного консорциума для картирования всего эпи- генома человека (Jones and Martienssen, 2005). Можно себе представить, что различия в относительных коли- чествах разных гистоновых модификаций, такие на- пример, как явно слабая представленность репрессив- ного триметилирования лизинов в гистонах у S. pombe и A. thaliana, могут отражать больший пролиферативный и регенераторный потенциал у этих организмов по срав- нению с более ограниченными программами развития многоклеточных систем. Кроме того, функциональные связи между механизмом РНКи, метилированием лизи- нов гистонов и метилированием ДНК по-прежнему бу- дут дарить нам интригующие сюрпризы относительно сложных механизмов, необходимых для детерминации клеточной судьбы в ходе развития. Аналогично этому многое в этом отношении даст углубленное понимание динамики и специфичности механизмов ремоделинга нуклеосом. Мы предсказываем, что будут открыты но- вые «экзотические» энзиматические активности, ката- лизирующие эпигенетические переходы посредством модификаций гистонов и негистоновых субстратов. Может оказаться, что изменения хроматина, индуциру- емые вышеперечисленными механизмами, действуют в значительной степени как фильтр реакций на внешние воздействия. Таким образом, есть надежда, что эти зна- ния в конечном счете можно будет применить к стра- тегиям интенсивной терапии с целью «перенастройки» некоторых эпигенетических реакций индивидуума, связанных со старением, заболеваниями и раком Сюда входят регенерация тканей, терапевтическое клониро-
ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА Рис. 3.21. Основные вопросы в эпигенетических исследованиях Многие экспериментальные системы, используемые в эпигенетических исследованиях, вскрыли многочисленные пути и новые механизмы эпигенетического контроля Однако многие вопросы, как показано на этом рисунке, все еше остаются без ответа и нуждаются в дальнейшем выяснении или в подтверждении с использованием новых и уже существующих систем и методов вание (использование ES-клеток и их дериватов) и те- рапевтические стратегии с использованием стволовых клеток взрослых организмов. Предполагается, что такие стратегии увеличат продолжительность жизни клеток, позволят модулировать стрессовый ответ на внешние стимулы, вызывать реверсию прогрессии заболевания и улучшить вспомогательные репродуктивные техноло- гии. Мы предсказываем, что понимание «хроматиновой основы» плюрипотентности и тотипотентности окажет- ся в центре понимания биологии стволовых клеток и ее возможностей для терапевтического вмешательства. Остается еще много фундаментальных эпигенетиче- ских вопросов. Например, что отличает одну нить хро- матина от другой, аллельной, хотя обе содержат одина- ковые нуклеотидные последовательности ДНК в одном и том же ядерном окружении? Что определяет механиз- мы, обеспечивающие наследование и воспроизведение эпигенетической информации? Какова молекулярная природа клеточной памяти? Существуют ли эпигенети- ческие импринты в зародышевом пути, которые служат для удержания этого генома в тотипотентном состоянии? Если да, то как эти метки стираются в ходе развития? До- бавляются ли в ходе развития новые метки, которые слу- жат для «запирания», фиксации дифференцированных состояний? Мы предвкушаем появление следующего поколения исследований (и исследователей), достаточ- но смелых, чтобы попытаться ответить на эти вопросы со всей страстностью, свойственной предшествующему поколению исследователей-генетиков и эпигенетиков. Подводя итог, можно утверждать, что генетические принципы, описанные Менделем управляют, вероятно, огромным большинством характеристик нашего раз- вития и нашего внешнего фенотипа Однако исключе- ния из этого правила могут иногда обнаружить новые принципы и новые механизмы, обеспечивающие на- следование, которые ранее недооценивались и в некото- рых случаях были малопонятными. Цель этой книги — представить читателю новую оценку основ фенотипиче- ской изменчивости, лежащих за пределами изменений в ДНК. Мы надеемся, что системы и концепции, описан- ные в этой книге, заложат полезный фундамент для буду- щих поколений студентов и исследователей, таких же, как те, кого увлекли странности эпигенетических явлений. Литература Ahmad К. and HenikofTS. 2002. The histone variant НЗ.З marks ac- tive chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Mol. Cell 9: 1191-1200. Allfrey VG., Faulkner R., and Mirsky A.E. 1964. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc. Natl Acad. Sci. 51: 786-794. Almeida R. and Allshire R.C. 2005. RNA silencing and genome regulation. Trends Cell Biol. 15: 251-258. Aparicio O.M., Billington B.L., and Gottschling D.E. 1991. Modi- fiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S cerevisiae. Cell 66: 1279-1287. Avery O.T., Macleod C.M., and McCarty M. 1944. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a desoxy- ribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus Type III. J. Exp. Med. 79: 137-158. Avner P. and Heard E. 2001. X-chromosome inactivation: Counting, choice and initiation. Nat. Rev. Genet. 1:59-67. Bannister A.J. and Kouzarides T. 2005. Reversing histone methyla- tion. Nature 436'. 1103-1106. Bannister A. J., Zegerman P., Partridge J.E, Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C, and Kouzarides T. 2001. Selective recognition of
и основные понятия methylated lysine 9 on histone НЗ by the HP1 chromo domain. Nature 120-124 Barton S.C., Surani M.A., and Norris M.L. 1984. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature 311: 374-376. Bastow R., Mylne J.S., Lister C, Lippman Z., Martienssen R.A., and Dean C. 2004. Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation. Nature 427: 164-167. Baxter J., Sauer S., Peters A., John R., Williams R., Caparros M.L., Arney K., Otte A., Jenuwein T, Merkenschlager M., and Fisher A.G. 2004. Histone hypomethylation is an indicator of epigenetic plasticity in quiescent lymphocytes. EMBO J. 23: 4462-4472. Berger S.L. 2002. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 142-148. Bernard P, Maure J.E, Partridge J.F., Genier S., Javerzat J.P., and Allshire R.C. 2001. Requirement ofheterochromatin for cohesion at centromeres. Science 294: 2539-2542. Bernstein B.E., Kamal M., Lindblad-Toh K., Bekiranov S„ Bailey D.K., Huebert D.J., McMahon S., Karlsson E.K., Kulbokas E.J., III, Giti-geras T.R., et al. 2005. Genomic maps and com- parative analysis of histone modifications in human and mouse. Ce//120: 169-181. Bernstein B.E., Mikkelsen T.S., Xie X., Kamal M., Huebert D.J., Cuff J., Fry B., Meissner A., Wemig M., Plath K., et al. 2006. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125: 315-326. Bernstein E. and Allis C.D. 2005. RNA meets chromatin. Genes Dev. 19: 1635-1655. Bird A.P. 1986. CpG-rich islands and the function of DNA methyla- tion. Nature 321: 209-213. Birky C.W., Jr. 2001. The inheritance of genes in mitochondria and chloroplasts: Laws, mechanisms, and models. Annu. Rev. Genet. 35:125-148. Bolland D.J., Wood A.L., Johnston CM., Bunting S.F., Morgan G., Chakalova L., Fraser P.J., and Corcoran A.E. 2004. Antisense inter-genic transcription in V(D)J recombination. Nat. Immunol. 5:630-637. Bourc’his D. and Bestor TH. 2004. Meiotic catastrophe and ret- rotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature 431: 96-99. Boyer L.A., Plath K., Zeitlinger J., Brambrink T, Medeiros L.A., Lee T.I., Levine S.S., Wemig M., Tajonar A., Ray M.K., et al. 2006 Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature 441: 349-353. Bracken A.P., Dietrich N., Pasini D., Hansen K.H., and Helin K. 2006. Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes Dev. 20: 1123-1136. Braig M., Lee S.. Loddenkemper C, Rudolph C. Peters A.H., Schlegelberger B., Stein H., Dorken B., Jenuwein T, and Schmitt C.A. 2005. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature 436: 660-665. Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T, Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltrans-ferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851. Cairns B.R. 2005. Chromatin remodeling complexes: Strength in diversity, precision through specialization. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 185-190. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., and Wilmut 1.1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64-66. Cao R., Wang L., Wang H., Xia L., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Jones R.S.,and Zhang Y. 2002. Role ofhistone H3 lysine 27 methy- lation in Polycomb-group silencing. Science 298:1039-1043. Cavalli G. and Paro R. 1999. Epigenetic inheritance of active chro- matin after removal of the main transactivator. Science 286: 955-958. Chakalova L., Debrand E., Mitchell J A., Osborne C.S., and Fraser P. 2005. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6: 669-677. Chalker D.L. and Yao M.C. 2001. Nongenic, bidirectional transcrip- tion precedes and may promote developmental DNA deletion in Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 15: 1287-1298. Chan S.W, Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington J.C., and Jacobsen S.E.2004. RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303: 1336. Chen R.Z., Pettersson U., Beard C., Jackson-Grusby L., and Jae- nisch R. 1998. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature 395: 89-93. Cheng D., Yadav N., King R.W., Swanson M.S., Weinstein E.J., and Bedford M.T. 2004. Small molecule regulators of protein arginine methyltransferases. J. Biol. Chem. 279: 23892-23899. Cheng J.C., Yoo C.B., Weisenberger D.J., Chuang J., Wozniak C., Liang G., Marquez V.E., Greer S., Omtoft ТЕ, Thykjaer T, and Jones P.A. 2004. Preferential response of cancer cells to zebularine. Cancer Cell 6: 151-158. Cho K.S., Elizondo L.I., and Boerkoel C.F. 2004. Advances in chromatin remodeling and human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 308-315. Chuikov S., Kurash J.K., Wilson J.R., Xiao B., Justin N., Ivanov G.S., McKinney K.. Tempst P, Prives C., Gamblin S.J.. et al. Regulation of p53 activity through lysine methylation. Nature 432:353-360. Clark-Adams C.D., Norns D., Osley M.A., Fassler J.S., and Winston F. 1988. Changes in histone gene dosage alter transcription in yeast. Genes Dev. 2: 150-159. Cohen F.E. and Prusiner S.B. 1998. Pathologic conformations of prion proteins. Annu. Rev. Biochem. 67: 793-819. Cosgrove M.S., Boeke J.D., and Wolberger C. 2004. Regulated nu- cleosome mobility and the histone code. Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 1037-1043. Cremer T. and Cremer C. 2001. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat. Rev. Genet. 2: 292-301. Daujat S., Zeissler U., Waldmann T, Happel N., and Schneider R. 2005. HP1 binds specifically to Lys26-methylated histone Hl.4, whereas simultaneous Ser27 phosphorylation blocks HP1 bind- ing. J. Biol. Chem. 280: 38090-38095. Dellino G.I., Schwartz Y.B.. Farkas G., McCabe D.. Elgin S.C.. and Pirrotta V. 2004. Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol. Cell 13: 887-893. Dhalluin C, Carlson J.E., Zeng L., He C., Aggarwal A.K., and Zhou M.M. 1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature 399: 491-496. Di Croce L. 2005. Chromatin modifying activity of leukaemia associated fusion proteins. Hum. Mol. Genet. 14 Spec. No. 1: R77-R84. Dou Y. and Gorovsky M.A. 2000. Phosphorylation of linker histone Hl regulates gene expression in vivo by creating a charge patch. Mol. Cell b: 225-231. Fan Y, Nikitina T, Zhao J., Fleury T.J., Bhattacharyya R., Bouhas- sira E.E., Stein A., Woodcock C.L., and Skoultchi А.1. 2005.
Histone Hl depletion in mammals alters global chromatin structure but causes specific changes in gene regulation. Cell 123:1199-1212. Feinberg A. P. 2004. The epigenetics of cancer etiology. Semin. Cancer Biol. 14: 427-432. Feinberg A.P. and Tycko B. 2004. The history of cancer epigenetics Nat. Rev. Cancer 4: 143-153. Feinberg A.P. and Vogelstein B. 1983. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 89-92. Felsenfeld G. and Groudine M. 2003. Controlling the double helix. Nature 421: 448-453. Fischle W, Wang Y., and Allis C.D. 2003a. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature 425: 475-479. Fischle W, Wang Y, and Allis C.D. 2003b Histone and chromatin cross-talk. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 172-183. Fischle W, Tseng B.S., Dormann H.L., Ueberheide B.M., Garcia B.A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Funabiki H., and Allis C.D. 2005. Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature 438: 1116-1122. Fisher A.G. and Merkenschlager M. 2002. Gene silencing, cell fate and nuclear organisation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 193-197. Fodor B.D., Kubicek S., Yonezawa M., O’Sullivan R.J., Sengupta R., Perez-Burgos L., Opravil S., Mechtler K., Schotta G., and Jenuwein T. 2006. Jmjd2b antagonizes H3K9 trimethylation at pericentric heterochromatin in mammalian cells. Genes Dev. 20: 1557-1562. Fraga M.F., Ballestar E., Paz M.E., Ropero S., Setien E Ballestar M.L., Heine-Suner D., Cigudosa J.C., Urioste M., Benitez J., et al. 2005. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 10604-10609. Francis N.J., Kingston R.E., and Woodcock C.L. 2004. Chromatin compaction by a polycomb group protein complex. Science 306: 1574-1577. Fukagawa T, Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki T, Takami Y, Nakayama T, and Oshimura M. 2004. Dicer is essen- tial for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 6: 784-791. Garcia-Manero G. and Issa J.P. 2005. Histone deacetylase inhibitors: A review of their clinical status as antineoplastic agents. Cancer Invest. 23: 635-642. Gilbert N., Boyle S., Fiegler H., Woodfine K., Carter N.P., and Bickmore WA. 2004 Chromatin architecture of the human genome: Gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers. Cell 118: 555-566. Gilfillan G.D., Dahlsveen I.K., and Becker P.B. 2004. Lifting a chromosome: Dosage compensation in Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 567: 8-14. Goll M.G., Kirpekar E., Maggert K.A., Yoder J.A., Hsieh C.L., Zhang X., Golic K.G., Jacobsen S.E., and Bestor TH. 2006. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase ho- molog Dnmt2. Science 311:395-398. Gonzalo S. and Blasco M.A. 2005. Role of Rb family in the epigenetic definition of chromatin Cell Cycle 4: 752-755. Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., and Zakian V.A. 1990. Position effect at 5. cerevisiae telomeres: Reversible repres- sion of Pol II transcription. Cell 63: 751-762. Grant P.A., Duggan L., Cote J., Roberts S.M., Brownell I.E., Candau R., Ohba R., Owen-Hughes T, Allis CD., Winston E, et al. 1997. Yeast Gcn5 functions in two multisubunit complexes to acetylate nucleosomal histones: Characterization of an Ada complex and the SAGA (Spt/Ada) complex. Genes Dev. 11: 1640-1650. Greiner D., BonaldiT, Eskeland R., Roemer E., and Imhof A. 2005. Identification of a specific inhibitor of the histone methyltrans- ferase SU(VAR)3-9. Nat. Chem. Biol. 1: 143-145. Grewal S.I. and Klar AJ. 1996. Chromosomal inheritance of epi- genetic states in fission yeast during mitosis and meiosis. Cell 86: 95-101. Grozinger C.M. and Schreiber S.L. 2002. Deacetylase enzymes: Biological functions and the use of small-molecule inhibitors. Chem. Biol. 9: 3-16. Guarente L. and Picard E 2005. Calorie restriction — The SIR2 connection. Cell 120:473-482. Hall I.M., Shankaranarayana G.D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., and Grewal S.I. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237. Hanahan D. and Weinberg R.A. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70. Harvey A.C. and Downs J .A. 2004. What functions do linker histones provide? Mol. Microbiol. 53: 771-775. Hassan A.H., Prochasson P., Neely K.E., Galasinski S.C., Chandy M., Carrozza M.J., and Workman J.L. 2002. Function and se- lectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes. Cell 111: 369-379. Heard E. 2005. Delving into the diversity of facultative heterochro- matin: The epigenetics of the inactive X chromosome. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 482-489. Henikoff S. 2005. Histone modifications: Combinatorial complex- ity or cumulative simplicity? Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 5308- „ 5309. Henikoff S. and Ahmad K. 2005. Assembly of variant histones into chromatin. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 21: 133-153. Herr A.J., Jensen M.B., DalmayT, and Baulcombe D.C. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308:118-120. Hirota T, Lipp J.J., Toh B.H., and Peters J.M. 2005. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora В causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature 438: 1176-1180. Hochedlinger K., Blelloch R., Brennan C, Yamada Y, Kim M., Chin L., and Jaenisch R. 2004. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes Dev. 18: 1875-1885. Holbert M.A. and Marmorstein R. 2005. Structure and activity of enzymes that remove histone modifications. Curr. Opin. Struct. Biol. 15: 673-680. Holliday R. 1994. Epigenetics: An overview. Dev. Genet. 15: 453-457. Ishii K.J. and Akira S. 2005. TLR ignores methylated RNA? Im- munity 23:111-113. Jackson J.P., Lindroth A.M., CaoX., and Jacobsen S.E. 2002. Con- trol of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416: 556-560. Jacobson R.H., Ladumer A.G., King D.S. andTjian R. 2000. Struc- ture and function of a human TAFII250 double bromodomain module. Science. 288: 1422-1425. Jaenisch R. and Bird A. 2003. Epigenetic regulation of gene expres- sion: How the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet, (suppl.) 33: 245-254. Janicki S.M., Tsukamoto T, Salghetti S.E., Tansey W.P., Sachidanan- dam R., Prasanth K.V., Ried T, Shav-Tal Y, Bertrand E., Singer R.H., and Spector D.L. 2004. From silencing to gene expression: Real-time analysis in single cells. Cell 116: 683-698.
и основные понятия Jeddeloh J.A., Stokes..L., and Richards E.J. 1999. Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein. Nat. Genet. 22: 94-97. Jenuwein T. and Allis C.D. 2001. Translating the histone code. Sci- ence 293: 1074-1080. Jones P.A. and Martienssen R. 2005. A blueprint for a Human Epigenome Project: The AACR Human Epigenome Workshop. Cancer Res. 65: 11241-11246. Kanellopoulou C, Muljo S.A., Kung A.L., Ganesan S., Drapkin R., Jenuwein T, Livingston D.M., and Rajewsky K. 2005. Dicer- deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentia- tion and centromeric silencing. Genes Dev. 19: 489-501. Kayne P.S., Kim U.J., Han M., Mullen J.R., Yoshizaki E, and Grunstein M. 1988. Extremely conserved histone H4 N terminus is dispensable for growth but essential for repressing the silent mating loci in yeast. Cell 55: 27-39. Khochbin S. 2001. Histone Hl diversity: Bridging regulatory signals to linker histone function. Gene 271: 1-12. Khorasanizadeh S. 2004. The nucleosome: From genomic organiza- tion to genomic regulation. Cell 116: 259-272. Kim J., Daniel J., Espejo A., Lake A., Krishna M., Xia L., Zhang Y, and Bedford M.X. 2006. Tudor, МВТ and chromo domains gauge the degree of lysine methylation. EMBO Rep. 4: 397-403. Kimmins S. and Sassone-Corsi P. 2005. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature 434: 583-589. Klar A. J. 1998. Propagating epigenetic states through meiosis: Where Mendel’s gene is more than a DNA moiety. Trends Genet. 14: 299-301. Klar A. J. 2004. An epigenetic hypothesis for human brain laterality, handedness, and psychosis development. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 499-506. Knoepfler P.S., ZhangX.-Y, Cheng R.E., Gafken P.R., McMahon S.B., and Eisenman R.N. 2006. Мус influences global chromatin structure. EMBO J. 25: 2723-2734. Kornberg R.D. 1974. Chromatin structure: A repeating unit of his- tones and DNA. Science 184: 868-871. Lachner M., O’Sullivan R.J., and Jenuwein T 2003. An epigenetic road map for histone lysine methylation. J. Cell Sci. 116: 2117-2124. Lachner M., Sengupta R., Schotta G., and Jenuwein T. 2004. Trilo- gies of histone lysine methylation as epigenetic landmarks of the eukaryotic genome. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 209-218. Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T. 2001 Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120. Langst G. and Becker P.B. 2004. Nucleosome remodeling: One mecha- nism, many phenomena? Biochim. Biophys. Acta 1677: 58-63. Lee D.Y, Teyssier C, Strahl B.D., and Stallcup M.R. 2005. Role of protein methylation in regulation of transcription. Endocr. Rev. 26: 147-170. Lee T.L, Jenner R.G., Boyer L.A., Guenther M.G., Levine S.S., Kumar R.M., Chevalier B., Johnstone S.E., Cole M.E, Isono K., et al. 2006. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125: 301-313. LengauerC., Kinzler K.W., and Vogelstein B. 1998. Genetic instabili- ties in human cancers. Nature 396: 643-649. Li E., Bestor TH., and Jaenisch R. 1992. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915-926. Lippman Z., Gendrel A.V., Black M., Vaughn M.W, Dedhia N., McCombie W.R., Lavine K., Mittal V, May B., Kasschau K.D., et al. 2004. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature 430: 471-476. Litt M.D., Simpson M., Gaszner M., Allis C.D., and Felsenfeld G. 2001. Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293: 2453-2455. Luger K, Mader A. W, Richmond R.K., Sargent D.F., and Richmond TJ. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 E resolution. Nature 389: 251-260. Lund A.H. and van Lohuizen M. 2004. Polycomb complexes and silencing mechanisms. Curr. Opin. Cell Biol. 16: 239-246. Lyko F. 2001. DNA methylation learns to fly. Trends Genet. 17: 169- 172. Maher E.R. 2005. Imprinting and assisted reproductive technology. Hum. Mol. Genet 14 Spec. No. 1: R133-R138. Maison C., Bailly D., Peters A.H., Quivy J.P., Roche D.. Taddei A., Lachner M., Jenuwein T, and Almouzni G. 2002. Higher-order structure in pericentric heterochromatin involves a distinct pattern of histone modification and an RNA component. Nat. Genet. 30: 329-334. Marks P.A. and Jiang X. 2005. Histone deacetylase inhibitors in pro- grammed cell death and cancer therapy. Cell Cycle 4: 549-551. Martens J.H., O’Sullivan R.J., Braunschweig U., Opravil S., Radolf M , Steinlein P., and Jenuwein T. 2005. The profile of repeat- associated histone lysine methylation states in the mouse epig- enome. EMBO J. 24: 800-812. Maurer-Stroh S., Dickens N.J., Hughes-Davies L., Kouzarides T, Eisenhaber R., and Ponting C.P. 2003. The Tudor domain ‘Royal Family’: Tudor, plant Agenet, Chromo, PWWP and МВТ domains. Trends Biochem. Sci. 28: 69-74. MayerW, Niveleau A., Walter J., Fundele R„ and HaafT. 2000. Dem- ethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403: 501-502. McClintock B. 1951. Chromosome organization and genic expres- sion. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 16: 13-47. McGarvey K., Fahmer J., Green E., Martens J., Jenuwein T, and Baylin S.B. 2006. Silenced tumor suppressor genes reactivated by DNA demethylation do not return to a fully euchromatic chromatin state. Cancer Res. 66: 3541-3549. McGrath J. and Solter D. 1984. Completion of mouse embryogenesis re- quires both the maternal and paternal genomes. Cell 37:179-183. Metzger E., Wissmann M., Yin N., Muller J.M., Schneider R., Pe- ters A.H., Gunther T, Buettner R., and Schule R. 2005. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen- receptor-dependent transcription. Nature 437: 436-439. Meyer B.J., McDonel P., Csankovszki G., and Ralston E. 2004. Sex and X-chromosome-wide repression in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 71-79. Misteli T. 2004. Spatial positioning; a new dimension in genome function. Cell 119: 153-156. Mito Y, Henikoff J.G., and Henikoff S. 2005. Genome-scale pro- filing of histone НЗ.З replacement patterns. Nat. Genet. 37: 1090-1097. Mizuguchi G, Shen X„ Landry J., Wu W.H., Sen S., and Wu C. 2004 ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science 303: 343-348. Mochizuki K, Fine N.A., Fujisawa T, and Gorovsky M.A. 2002. Analysis of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome rearrangement in tetrahymena. Cell 110: 689-699. Mohrmann L. and Verrijzer C.P. 2005. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling com- plexes. Biochim. Biophys. Acta 1681: 59-73.
Morgan H.D., Santos F, Green K., Dean W., and Reik W. 2005. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum. Mol. Genet. 14 Spec. No. 1: R47-R58. Motamedi M.R., Verdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.P., and Moazed D. 2004. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Ce//119: 789-802. Muller H.J. 1930. Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila. J. Genet. 22: 299-334. Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.I. 2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292: 110-113. Narita M., Nunez S., Heard E., Narita M., Lin A.W., Hearn S.A., Spector D.L., Hannon G.J., and Lowe S.W. 2003. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell 113: 703-716. Narlikar G.J., Fan H.Y., and Kingston R.E. 2002. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and tran- scription. Cell 108: 475-487. Nowak S.J. and Corces V.G. 2004. Phosphorylation of histone H3: A balancing act between chromosome condensation and tran- scriptional activation. Trends Genet. 20: 214-220. Orphanides C., LeRoy G., Chang C.H., Luse D.S., and Reinberg D. 1998. FACT, a factor that facilitates transcript elongation through nucleosomes. Cell 92: 105-116. Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., and Elgin S.C. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-672. Paro R. and Hogness D.S. 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 263-267. Petersen-Mahrt S. 2005. DNA deamination in immunity. Immunol. Rev. 203: 80-97. Pirrotta V. 1998. Polycombing the genome: PcG, trxG, and chromatin silencing. Cell 93: 333-336. Pontier D., Yahubyan G., Vega D., Bulski A., Saez-Vasquez J., Hakimi M.A., Lerbs-Mache S., Colot V, and Lagrange T. 2005. Reinforcement of silencing at transposons and highly repeated sequences requires the concerted action of two distinct RNA polymerases IV in Arabidopsis. Genes Dev. 19: 2030-2040. Ratcliff R., Harrison B.D., and Baulcombe D.C. 1997. A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558-1560. Razin A. and Riggs A. D. 1980. DNA methylation and gene function. Science 210: 604-610. Rea S., Eisenhaber E., O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., and Jenuwein T 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599. Reinberg D., Chuikov S., Farnham P, Karachentsev D., Kirmizis A., Kuzmichev A., Margueron R., Nishioka K., Preissner T.S., Sanna K., et al. 2004. Steps toward understanding the inheritance of repressive methyl-lysine marks in histones. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 171-182. Reinhart B.J. and Bartel D.P. 2002. Small RNAs correspond to cen- tromere heterochromatic repeats. Science 297: 1831. Rme J. 2005. Cell biology. Twists in the tale of the aging yeast. Sci- ence WP. 1124-1125. Ringrose L. and Paro R. 2004 Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins. Annu. Rev. Genet. 38: 413-443. Ringrose L., Ehret H., and Paro R. 2004. Distinct contributions of histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes. Mol. Cell 16: 641-653. Robertson K.D. 2005. DNA methylation and human disease. Nat. Rev. Genet. 6: 597-610. RolofTT.C. and Nuber U.A. 2005. Chromatin, epigenetics and stem cells. Eur. J. Cell Biol. 84: 123-135. Roth S.Y., Denu J.M., and Allis C.D. 2001. Histone acetyltrans- ferases. Annu. Rev. Biochem. 70: 81-120. Sanchez-Eisner T, Gou D., Kremmer E., and Sauer F. 2006. Non- coding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to ultrabithorax. Science 311: 1118-1123. Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzarides T. 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 419: 407-411. Sarma K. and Reinberg D. 2005. Histone variants meet their match. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 139-149. Scaffidi P., Gordon L., and Misteli T. 2005. The cell nucleus and aging: Tantalizing clues and hopeful promises. PLoS. Biol. 3: e395. Schalch T, Duda S., Sargent D.E, and Richmond T.J. 2005. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chro- matin fibre. Nature 436: 138-141. Schmitt S., Prestel M., and Paro R. 2005. Intergenic transcription through a polycomb group response element counteracts silenc- ing. Genes Dev. 19: 697-708. Schneider R., Bannister A. J., and Kouzarides T. 2002. Unsafe SETs: Histone lysine methyltransferases and cancer. Trends Biochem. Sci. 27: 396-402. Schreiber S.L. and Bernstein B.E. 2002. Signaling network model of chromatin. Cell 111: 771-778. Schwartz B.E. and Ahmad K. 2005. Transcriptional activation trig- gers deposition and removal of the histone variant НЗ.З. Genes Dev. 19: 804-814. Schwartz Y.B., Kahn T.G., and Pirrotta V. 2005. Characteristic low density and shear sensitivity of cross-linked chromatin containing polycomb complexes. Mol. Cell Biol. 25: 432-439. Sekinger E.A., Moqtaderi Z., and Struhl K. 2005. Intrinsic histone- DNA interactions and low nucleosome density are important for preferential accessibility of promoter regions in yeast. Mol. Cell 18: 735-748. Seligson D.B., Horvath S., Shi T, Yu H., Tze S., Grunstein M., and Kurdistani S.K. 2005. Global histone modification patterns pre- dict risk of prostate cancer recurrence. Nature 435: 1262-1266. ShenX., Mizuguchi G., Hamiche A., and Wu C. 2000. A chromatin remodeling complex involved in transcription and DNA process- ing. Nature 406: 541-544 Shi Y, Lan E., Matson C, Mulligan P., Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., and Shi Y. 2004. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953. Shorter J. and Lindquist S. 2005. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat. Rev. Genet. 6: 435-450. Sims R.J., III, Belotserkovskaya R., and Reinberg D. 2004. Elonga- tion by RNA polymerase II : The short and long of it. Genes Dev. 18: 2437-2468. Smith C.L. and Peterson C.L. 2005. ATP-dependent chromatin remodeling. Curr. Top. Dev. Biol. 65: 115-148.
и основные понятия Squazzo S.L., O’Geen Н., Komashko V.M., Krig S.R., Jin VX., Jang S.W., Margueron R., Reinberg D., Green R., and Famham P.J. 2006 Suzl2 binds to silenced regions on the genome in a cell- type-specific manner. Genome Res. 16: 890-900. Sterner D.E. and Berger S.L. 2000. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 435- 459. Strahl B.D. and Allis C.D. 2000. The language of covalent histone modifications. Nature 403: 41-45. Strahl B.D., Ohba R., Cook R.G., and Allis C.D. 1999. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14967-14972. Su G.H., Sohn T.A.. Ryu B., and Kern S.E. 2000. A novel histone deacetylase inhibitor identified by high-throughput transcription- al screening of a compound library. Cancer Res. 60: 3137-3142. Sung S. and Amasino R.M. 2004. Vernalization in Arabidopsis thaliana is mediated by the PHD finger protein VIN3. Nature 427: 159-164. Surani M.A., Barton S.C, and Norris M.X. 1984. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 308: 548-550. Tagami H., Ray-Gallet D., Almouzni G., and Nakatani Y. 2004 Histone H3.1 and H3.3 complexes mediate nucleosome as- sembly pathways dependent or independent of DNA synthesis. Cell 116: 51-61. Tamaru H. and Selker E.V. 2001. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414: 277-283. Tanaka E.M. 2003. Regeneration: If they can do it, why can’t we? Ce//113: 559-562. Thomas J.O. 1999. Histone Hl: Location and role. Curr. Opin. Cell Biol. 11:312-317. Tsukada Y, Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borch- ers C.H., Tempst P., and Zhang Y. 2006. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. Nature 439: 811-816 TsukiyamaT, DanielC.,Tamkun J., andWuC. 1995. ISWI, amem- ber of the SWI2/SNF2 ATPase family, encodes the 140 kDa sub- unit of the nucleosome remodeling factor Cell 83: 1021-1026. Turner B.M. 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bio Essays 22: 836-845. Valk-Lingbeek M.E., Bruggeman S.W, and van Lohuizen M. 2004. Stem cells and cancer; the polycomb connection. Cell 118: 409-418 van Attikum H. and Gasser S.M. 2005. The histone code at DNA breaks: A guide to repair? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 757-765. vanderHeijdenG.W, Dieker J.W, DerijckA.A., Muller S., Berden J.HBraat D.D., van der Vlag J., and de Boer P. 2005. Asymmetry in histone H3 variants and lysine methylation between paternal and maternal chromatin of the early mouse zygote. Meeh. Dev. 122: 1008-1022. Vaquero A., Loyola A., and Reinberg D. 2003. The constantly changing face of chromatin. Sci. Aging Knowledge Environ. 2003: RE4. Varga-Weisz P.D., Wilm M., Bonte E., Dumas K., Mann M., and Becker P.B. 1997. Chromatin-remodeling factor CHRAC contains the ATPases ISWI and topoisomerase II. Nature 388: 598-602 Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T, Gygi S., Grewal S.L, and Moazed D. 2004. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303: 672-676. Vidanes C.M., Bonilla C.Y, and Toczyski D.P. 2005. Complicated tails: Histone modifications and the DNA damage response. Cell 121: 973-976. Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L.. 2000. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol. Cell. Biol. 20: 1899-1910. Vire E., Brenner C., Deplus R., Blanchon L., Fraga M., Didelot C., Morey L., Van E.A., Bernard D., Vanderwinden J.M., et al. 2005. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation Nature 439: 861-874. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng C., Grewal S.L, and Mar- tienssen R.A. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837. Waddington C.H. 1957. The strategy of the genes. MacMillan, New York. Wade P.A., Gegonne A., Jones P.L., Ballestar E., Aubry E., and Wolffe A.P. 1999. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodeling and histone deacetylation. Nat. Genet. 23: 62-66. Walsh C.P., Chaillet J .R., and Bestor TH. 1998. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat. Genet. 20: 116-117. Watanabe Y, Yokobayashi S., Yamamoto M., and Nurse P. 2001. Pre- meiotic S phase is linked to reductional chromosome segregation and recombination. Nature 409: 359-363. Watson J.D. 2003. Celebrating the genetic jubilee: A conversation with James D. Watson. Interviewed by John Rennie. Sci. Am. 288:66-69. Wei Y, Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1999. Phos- phorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99-109. Whetstine J.R., Nottke A., Lan R., Huarte M., Smolikov S., Chen Z., Spooner E., Li E., Zhang G., Colaiacovo M., and Shi Y. 2006. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases. Cell 125: 467-481. Wolffe A.P. and Matzke M.A. 1999. Epigenetics: Regulation through repression. Science 286: 481-486. Wysocka J., Swigut T, Milne T.A., Dou Y, Zhang X., Burlingame A.L., Roeder R.G., Brivanlou A.H., and Allis C.D. 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for НЗ K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872. Yan Q., Huang J., Fan T, Zhu H., and Muegge K. 2003. Lsh, a modulator of CpG methylation, is crucial for normal histone methylation. EMBO J. 22: 5154-5162. Yu B., Yang Z., Li J., Minakhina S., Yang M., Padgett R.W., Steward R., and Chen X. 2005. Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis. Science 307: 932-935. Zhang Y. and Reinberg D. 2001. Transcription regulation by histone methylation: Interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15: 2343-2360. Zhang Y, LeRoy G., Seeiig H.R, Lane W.S., and Reinberg D. 1998. The dermatomyositis-specific autoantigen Mi2 is a component of a complex containing histone deacetylase and nucleosome remodeling activities. Cell 95: 279-289.
ГЛАВА 4 ЭПИГЕНЕТИКА ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Michael Grunstein1 и Susan М. Gasser2 ’University of California, LosAngeles, California 90095-1570 2Fried rich Miescher Institute for Biomedical Research, 4058 Basel, Switzerland Содержание Общее резюме 1. Генетические и молекулярные методы исследо- вания дрожжей 2. Жизненный цикл дрожжей 3. Гетерохроматин у дрожжей находится в «молча- щих» локусах типов спаривания НМ и теломерах 4. Гетерохроматин отличается репрессивной структурой, которая распространяется на весь «молчащий» домен 5. Отдельные этапы сборки гетерохроматина 5. 1. НМ гетерохроматин 5. 2. Теломерный гетерохроматин 6. Деацетилирование гистонов белком Sir2 обе- спечивает сайты связывания для распростране- ния SIR-комплексов 7. Sir2 деацетилирует гистон Н4 по 16-му остатку лизина 8. Ацетилирование гистонов в эухроматине огра- ничивает распространение SIR-комплексов 9. Образование теломерных петель 10. Нарушение непрерывности репрессии естественных субтеломерных элементов теломерными петлями 11. Взаимодействие теломер in trans и перинукле- арное прикрепление гетерохроматина 12. Наследование эпигенетических состояний 13. Старение и Sir2 связаны нестабильностью повторов рДНК 14. Резюме Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ В ядре эукариот фракция хроматина, содержащая ак- тивные гены, называется эухроматином. Во время ми- тоза она подвергается конденсации, чтобы обеспечить сегрегацию хромосом, а в интерфазе клеточного цикла снова деконденсируется, чтобы сделать возможной транскрипцию. Цитологическими методами было обна- ружено, что некоторые хромосомные домены остаются конденсированными и во время интерфазы. Эти консти- тутивно компактные участки хроматина и были названы гетерохроматином. С развитием новых методов эту часть генома стали определять по молекулярным, а не цитоло- гическим критериям: было показано, что конститутивно компактный хроматин в области центромер и теломер содержит тысячи копий простых повторяющихся по- следовательностей. Такой гетерохроматин, как правило, реплицируется на поздних этапах S-фазы клеточного цикла и образует скопления по периферии ядра и вблизи ядрышка. Существенной чертой гетерохроматина яв- ляется способность к стохастичному распространению своей характерной, устойчивой к действию нуклеаз, структуры и связанной с нею репрессии транскрипции на соседние гены. Например, в случае гена white дро- зофилы, детерминирующего красный цвет глаз, такая эпигенетическая репрессия проявляется в появлении
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae чередующихся красных и белых участков глаза. Это яв- ление получило название «мозаичность, обусловленная эффектом положения» (position-effect variegation — PEV) В его основе — узнавание метилированной по 9-му остатку лизина формы гистона НЗ (НЗК9) гетерохроматиновым белком 1 (heterochromatin protein 1 — НР1) и распростра- нение этой метки вдоль хромосомы. У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ходе эволюции возник другой механизм образования гетерохроматина, но приводит он к очень похожему результату. S. cerevisiae — микроорганизм, широко используе- мый при производстве пива и в хлебопечении. Однако, в отличие от бактерий, это — эукариот. Хромосомы у пекарских дрожжей, как и у более сложно организован- ных эукариот, связаны с гистонами, заключены в ядро и реплицируются в ходе S-фазы клеточного цикла с ис- пользованием множественных точек начала реплика- ции (ориджинов). Тем не менее, геном у дрожжей очень маленький: всего 14 миллионов пар оснований ДНК на 16 хромо- сом. Это ненамного больше, чем геномы некоторых бактериофагов. Всего в геноме дрожжей около 6000 довольно тесно расположенных генов: промежутки между ними обычно составляют не более 2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Подавляющее большинство генов у дрожжей находится в хроматине открытой конфигура- ции, обеспечивающей их активную транскрипцию или возможность ее быстрой индукции. Это обстоятельство и очень небольшое количество простых повторяющих- ся последовательностей ДНК делает практически не- возможной детекцию гетерохроматина у дрожжей ци- тологическими методами. Тем не менее, с помощью молекулярных методов было показано, что у дрожжей имеются четко выделяю- щиеся гетерохроматиновые участки по соседству с тело- мерами всех 16-ти хромосом, а также в двух «молчащих» локусах типов спаривания III хромосомы. Репрессия транскрипции этих двух локусов существенна для под- держания компетентного к спариванию гаплоидного состояния. И субтеломерные области, и «молчащие» локусы типов спаривания репрессируют интегрирован- ные репортерные гены позиционно-зависимым эпи- генетическим механизмом, реплицируются во время поздней S-фазы и расположены по периферии ядра. Таким образом, эти локусы имеют все характерные для гетерохроматина черты, за исключением цитологически наблюдаемой конденсации в интерфазе. Для ученого, изучающего гетерохроматин, дрожжи сочетают преи- мущества малого генома, возможности использования генетических и биохимических методов исследования микроорганизмов и важные аспекты организации хро- мосом высших эукариот. 1. Генетические и молекулярные методы исследования дрожжей Дрожжи представляют собой гибкую и быструю гене- тическую систему для изучения клеточных процессов. При времени клеточной генерации около 90 мин. всего за два дня можно вырастить колонии, содержащие мил- лионы клеток. К тому же дрожжи можно поддерживать в гаплоидной и диплоидной формах, что резко упрощает их генетический анализ. Как и бактерий, гаплоидные клетки дрожжей можно использовать для получения аук- сотрофных мутантов со специфическими требованиями к составу питательной среды. Рецессивные летальные мутации можно поддерживать в культуре гаплоидных клеток в виде условных летальных аллелей (например, температуро-чувствительных мутантов) или в культуре гетерозиготных диплоидных клеток (содержащих и аллель дикого типа и мутацию). Наличие высокоэффек- тивной системы гомологичной рекомбинации у дрожжей позволяет произвольно изменять любую выбранную хромосомную последовательность ДНК. К тому же, можно осуществлять манипуляции с участками хромосом в составе рекомбинантных плазмид, которые стабильно поддерживаются в делящихся клетках дрожжей, благо- даря включению в них коротких последовательностей центромеры и ориджина репликации ДНК. В дрожжах стабильно поддерживаются даже линейные плазмиды (минихромосомы), содержащие теломерные повторы по концам. Явление мозаичности, обусловленной эффектом положения, на модели репортерного гена white дрозо- филы сыграло важную роль в изучении эпигенетиче- ской регуляции генов, а также генов, влияющих на эту уникальную форму репрессии (см. более детально в главе 5). Открытию и изучению аналогичного явления в области теломер у дрожжей, теломерного эффекта положения (telomere position effect — ТРЕ) помогло ис- пользование в качестве репортерных генов Ura3 и Ade2 (рис. 4.1). В присутствии 5-фтороротовой кислоты (5-fluoroorotic acid-5-FOA) продукт гена Ura3 превра- щает ее в 5-фторурацил (5-fluorouracil-5-FU) — инги- битор синтеза ДНК, вызывающий гибель клеток. Од- нако, при интеграции в область гетерохроматина ген Ura3 оказывается репрессированным в части клеток, и именно эти клетки оказываются способными расти на среде с 5-FOA. Таким образом, определяя эффек- тивность роста на среде с 5-FOA с помощью серийных разведений культуры клеток дрожжей (рис. 4.1а), мож- но количественно измерять степень репрессии репор- терного гена в очень широких пределах (например, в 10—106-кратных). Более того, мутации, нарушающие ТРЕ, могут быть легко идентифицированы по повы- шению чувствительности к 5-FOA. Аналогично, при интеграции гена Ade2 в область гетерохроматина происходит его репрессия, и в клетке накопливается предшественник биосинтеза аденина, окрашивая ее в красный цвет Существенно, что эпи- генетическая природа репрессии Ade2 видна в пределах одиночной колонии генетически идентичных клеток. Ген может быть «включен» в некоторых клетках и «вы- ключен» в остальных. Внешне это проявляется как на- личие красных участков на фоне белой колонии или наоборот (рис. 4.16). В отличие от теста с использова- нием Ura3, селекции против клеток, в которых остался не репрессированным ген Ade2, не происходит, поэтому
2. Жизненный цикл дрожжей a ТРЕ экспрессии URA3 у 5. cerevisiae Теломера игаЗ~ URA3 ТРЕ экспрессии ADE2 у 5 cerevisiae Теломера Красные и белые секторы acte2';ADE2-TelVR Мозаичная репрессия Рис, 4.1. Сайленсинги ТРЕ у дрожжей (а) Ген Ura3, встроенный рядом с простыми TG-богатыми теломерными повторами в левом плече VII хромосомы, под- вергается сайленсингу теломерным гетерохроматином в данном штамме дрожжей. При выращивании на обычной богатой среде (YPD) не наблюдается различий между клетками дикого типа (wt), клетками с репрессированным субтеломерным геном Ura3 и мутантами по сайленсингу, у которых теломерный ге- терохроматин утрачен, а ген Ura3 экспрессируется. На среде, содержащей 5-FOA (нижняя панель), с другой стороны, клетки с репрессированным геном Ura3 (например, клетки дикого типа) могут расти, а клетки, экспрессирующие его (sir2viyku70 мутанты), не могут. Это объясняется тем, что продукт гена Ura3 превращает 5-FOA в токсичный интермедиат 5-фторурацил. Тест с серийными разведениями позволяет детектировать со- бытия сайленсинга даже при частоте 1 на 106 клеток. (б) Клетки, содержащие ген Ade2 дикого типа, дают «белую» колонию, а клетки с мутантным ade2 — красную, что связано с накоплением красного интермедиата биосинтеза аденина. При встраивании гена Ade2 рядом с теломерой в правом плече V хромосомы происходит его эпигенетический сайленсинг. И «молчащее», и активное состояния гена Ade2 наследуются в генетически идентичных клетках, в результате чего образуются колонии с белыми и красными секторами (весьма похоже на картину, наблюдаемую при PEV) фенотип клеток с интегрированным в субтеломерный гетерохроматин геном-репортером можно использовать как показатель скорости переключения и наследования эпигенетического состояния. Цветной тест с использо- ванием Ade2 представляет собой удивительную иллю- страцию полустабильной природы репрессированного и дерепрессированного состояний. Вместе с описанными генетическими подходами к протеазо-дефицитным штаммам, растущим в син- хронных и асинхронных крупномасштабных культурах, вполне применимы биохимические методы. В послед- ние годы арсенал доступных средств расширился изо- щренными методами анализа с помощью микрочипов и белковых сетей, легко охватывающих весь небольшой геном дрожжей. Эти методы позволяют осуществлять полногеномный анализ транскрипции, связывания факторов транскрипции, модификации гистонов и белок-белковых взаимодействий. Этот широкий арсе- нал изощренных методов позволил ученым исследовать механизмы регуляции формирования гетерохроматина и его физиологическую роль в клетках дрожжей. Одна- ко, прежде чем описать эти открытия, необходимо бо- лее детально рассмотреть жизненный цикл дрожжей. 2. Жизненный цикл дрожжей Дрожжи S. cerevisiae размножаются путем митотических делений в гаплоидном или диплоидном состоянии, обра- зуя почку, которая постепенно увеличивается и в какой- то момент отделяется от материнской клетки (рис. 4.2а). Гаплоидные клетки дрожжей могут спариваться друг с другом (конъюгировать), поскольку существуют в виде одного из двух типов спаривания, обозначаемых как а и а, напоминающих два пола у млекопитающих. Клетки каждого типа образуют свой феромон, привлекающий клетки противоположного типа: клетки типа а синтези- руют 12-членный пептид, называемый а-фактор, кото- рый связывается мембранным рецептором а-фактора на поверхности клеток типа а. И наоборот, клетки типа а синтезируют 13-членный пептид . который связывается рецептором a-фактора на поверхности клеток типа а. Эти взаимодействия приводят к остановке клеток на стадии от средней до поздней Gj-фазы клеточного цикла. При этом клетки приобретают грушевидную форму, назы- ваемую «шму» (shmoo) по имени персонажа известного мультфильма (рис. 4.26). Клетки противоположных типов сливаются своими выпячиваниями, образуя диплоидную клетку a/а. В диплоидных клетках способность к спари- ванию репрессирована: они размножаются вегетативно (т.е. путем митотических делений), как и гаплоидные клетки. С другой стороны, в условиях голодания в них индуцируется мейотическая программа, приводящая к формированию аска (сумки) с четырьмя спорами, по две каждого типа спаривания. При поступлении достаточно- го количества питательных веществ гаплоидные споры превращаются в клетки, способные к спариванию, т.е. возобновляется нормальный жизненный цикл. Хотя в лабораторных условиях гаплоидные клетки дрожжей обычно маркируются одним из двух типов спаривания, в естественных условиях они переключают
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae а Мейоз Митоз (диплоид) Рис. 4.2. Жизненный цикл почкующихся дрожжей (а) Клетки дрожжей митотически делятся в гаплоидной и ди- плоидной формах. Голодание индуцирует споруляцию дипло- идных клеток, а при сближении гаплоидных клеток противо- положных типов происходят спонтанные скрещивания. Это является результатом секреции феромонов, вызывающих в клетке противоположного типа остановку клеточного цикла на стадии G1 и, после достаточно продолжительного действия феромона. — индукцию пути спаривания. Диплоидное состоя- ние репрессирует путь спаривания. (б) В ответ на действие феромона гаплоидные клетки «выпя- чиваются» по направлению клеток противоположного типа Получающаяся форма называется «шму» (по имени известного мультипликационного персонажа) Ядерная оболочка видна как флюоресценция зеленого цвета свои тип спаривания практически с каждым клеточным циклом (рис. 4.3а). Такое переключение индуцируется эндонуклеазной активностью (НО), осуществляющей сайт-специфический двунитчатый разрыв в области ло- куса МАТ. Происходящий затем процесс конверсии ге- нов переносит информацию о противоположном типе спаривания из конститутивно «молчащего» донорского локуса НМ La или HMRa, в активный локус МАТ. Такие штаммы называют гомоталлическими (homothallic). Это означает, что вегетативно растущая клетка типа МАТа быстро даст МАТа потомство и наоборот. В условиях лаборатории удобно использовать клетки со стабиль- ным типом спаривания, поэтому лабораторные штам- мы конструируют с дефектным геном эндонуклеазы НО, что исключает расщепления локуса МАТ и. соот- ветственно, переключение типов спаривания. В резуль- тате образуется гетероталлический штамм Такие штам- мы содержат «молчащие» локусы НМ и активный локус МАТ стабильно а- или a-типа. Два «молчащих» локуса типов спаривания (рис. 4.36), по одному для каждого «пола», поддерживаются в конститутивно «молчащем» эпигенетическом состоянии и стали классической мо- делью для изучения гетерохроматина 3. Гетерохроматин у дрожжей находится в «молчащих» локусах типов спаривания НМ и теломерах У дрожжей информация, детерминирующая типы спари- вания (а или а), находится в трех локусах, НМ La, МАТ, и HMRsl, III хромосомы. Локусы HMLa (~11 т.п.н. от левой теломеры) и HMRsl (-23 т.п.н. от правой теломеры; рис. 4.36,в) расположены между короткими элемен- тами ДНК, называемыми сайленсерами Е и I. Только когда любая из двух «молчащих» кассет копируется и интегрируется в активный локус МАТ, она приобретает способность транскрибироваться в нормальной клетке. Перенос информации из локуса HMLa в локус МАТ приводит к образованию клетки с типом спаривания а (МАТа), а перенос информации из локуса HMRa. в локус МАТ — клетки типа а (МАТъ) (рис. 4.36). Это показывает, что гены и промоторы в локусах //Л/ невредимы, но на- ходятся в стабильно репрессированном состоянии до тех пор, пока остаются в этих локусах. Это — существенное для поддержания способности к скрещиванию обстоя- тельство, поскольку одновременная экспрессия в одной и той же клетке транскриптов обоих типов (а и а) приводит к возникновению не способного к скрещиванию сте- рильного состояния. Регистрация стерильного фенотипа оказалась весьма полезной для идентификации мутаций, нарушающих сайленсинг локусов НМ. Белки-регуляторы сайленсинга (silent information regulatory proteins — S/Rs) SLR1, SLR2, SLR3 и SIR4 были обнаружены именно как необходимые для полной репрессии «молчащих» локусов НМ (см. обзор Rusche et al., 2003). Мутации sir2, sir3, wsir4 приводят к полной утрате сайленсинга, в то время как при мутациях sirl лишь часть клеток МАТъ утрачивает способ- ность к спариванию из-за нарушения репрессии локуса НМ. Благодаря частичному фенотипу sirl-дефектных клеток удалось показать, что альтернативные состояния (спаривающееся-неспаривающееся) могут наследоваться в последовательных поколениях делящихся генетически идентичных клеток (Pillus and Rine 1989). Это послужило ясной демонстрацией того, что репрессия типов спари- вания обладает характерными чертами эпигенетически контролируемого процесса. Кроме того, в других иссле- дованиях было показано, что в образовании структуры гетерохроматина участвуют N-концевые участки молекул гистонов НЗ и Н4, белок-активатор репрессора 1 (repres-
4. Гетерохроматин отличается репрессивной структурой, которая распространяется на весь а Жизненный цикл дрожжей Q а гаплоид Переключение Z7 а гаплоид типа L спаривания у '\ Г4* ® ® ® ® (§><§) Конъюгация a/а диплоид в. Транскрипционно «молчащие» домены и элементы-сайленсеры HMLa MATa HMRa R - сайт связывания Rapl А - сайт связывания Abf 1 О - ORC-консенсус район «молчащего» хроматина Рис. 4.3. Переключение типов спаривания у дрожжей (а) Гомоталлические штаммы дрожжей способны переключать тип спаривания с каждым клеточным циклом. Переключение происходит до репликации ДНК, поэтому и материнская, и дочерняя клетки приобретают новый тип спаривания. (б) Показано положение «молчащего» и экспрессирующе- гося локусов типа спаривания на III хромосоме. Активный локус МАТ может переключаться посредством конверсии генов примерно один раз на каждый клеточный цикл, благодаря двунитчатым разрывам ДНК эндонуклеазой НО. Указанные проценты показывают частоту, с которой события конверсии переключают локусы МАТ между про- тивоположными типами. Направленность переключения обеспечивается энхансером рекомбинации (RE) на левом плече III хромосомы. (в) Репрессия «молчаших» локусов типов спаривания HMR и HML происходит под действием двух сайленсеров, флан- кирующих эти гены. Они называются Е (от essential) и I (от important) (Brand et al., 1997) и содержат участки связывания белков Rapl (R), Abfl (А) и ORC (О). Комбинируя такие сайты связывания в разных комбинациях, можно созда- вать искусственные сайленсеры, хотя их эффективность ниже, чем у природных. НМ La. и HMRa. расположены на расстоянии 12 и 23 т.п.н. от теломеры III хромосомы, со- ответственно. Домены теломерного гетерохроматина III хромосомы репрессируются независимо от локусов НМ процессом, инициируемым множественными сайтами связывания Rapl (R) sor activator protein 1 - Rapl) и комплекс узнавания орид- жинов репликации (origin recognition complex — ORC) (см. обзор Rusche et al., 2003). Гетерохроматин присутствует также непосредствен- но по соседству с повторами теломерной ДНК дрожжей (С13A/TGt 3). Как упоминалось выше, при интеграции репортерных генов, таких как Ura3 или Ade2, рядом с теломерными повторами происходит их репрессия по мозаичному и эпигенетическому типу (Gottschling et al. 1990) Этот эффект (ТРЕ), как и сайленсинг локусов НМ, зависит от Rapl, Sir2, Sir3, Sir4 и N-концевых участков молекул гистонов (Kayne et al., 1988; Aparicio et al., 1991). Генетические исследования свидетельствуют о том, что, за исключением Sirl, близкие механизмы обеспечивают сайленсинг в области локусов НМ и в примыкающих к теломерам участках. Более того, учитывая способность репортерных генов в субтеломерных участках доста- точно часто переключаться между «молчащим» и экс- прессирующимся состояниями, данный тип репрессии, по-видимому, весьма близок явлению мозаичности, обу- словленной эффектом положения (PEV) у дрозофилы. У дрожжей четыре белка Sir, осуществляющих репрес- сию, не имеют существенной взаимной гомологии. Белки Sirl, Sir3 и Sir4 консервативны только у самих S. cerevisiae и близких им видах почкующихся дрожжей. Sir2, на- против, является родоначальником большого семейства НАД-зависимых деацетилаз гистонов, консервативного от бактерий до человека (рис. 4.4). Роль 8й2-подобных деацетилаз гистонов в репрессии транскрипции обнару- жена даже у организмов, не имеющих других Sir белков, таких как делящиеся дрожжи и двукрылые. У дрожжей Schizosaccharomyces pombe активность Sir2 необходима для сайленсинга транскрипции вблизи теломер, а у дро- зофилы она влияет на стабильность эффекта PEV (см. обзор Chopra and Mishra, 2005). Сопряженный с деаце- тилированием гидролиз НАД белком Sir2 приводит к об- разованию О-ацетил-АДФ-рибозы, интермедиата, воз- можно имеющего свою собственную функцию (Tanner et al. 2000; также см. раздел 13). Важно отметить, что по- мимо гистонов ферменты семейства Sir2 модифицируют множество других субстратов, причем имеется обширная ветвь этого семейства, состоящая из цитоплазматических ферментов (рис. 4.4). Разнообразие функций Sir2 можно проиллюстрировать тем, что у млекопитающих фермен- ты этого семейства деацетилируют факторы транскрип- ции FOXO и р53 в ответ на стресс и повреждение ДНК, изменяя тем самым их взаимодействие. У почкующихся дрожжей Sir2 имеет важную роль помимо участия в сай- ленсинге, а именно подавляет нереципрокную рекомби- нацию высокоповторяющихся генов рДНК локуса в об- ласти ядрышка (Gottlieb and Esposito 1989) 4. Гетерохроматин отличается репрессивной структурой, которая распространяется на весь «молчащий» домен Репрессия активности генов в эухроматине может проис- ходить вследствие связывания репрессорного белка или
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae IV Рис. 4.4. Семейство деацетилаз Sir2 Sir2 является прототипом большого семейства НАД-зависимых деацети- лаз. Семейство белков Sir2 необычно консервативно и найдено у организмов от бактерий до человека Его эволю- ционное древо содержит как ядерные, так и цитоплазматические ветви. Это филогенетическое древо без корня было построено с помощью программ CLUSTAL W® и TREEVIEW® для сравнения последовательности коровых доменов гомологов, идентифицирован- ных в библиотеках кДНК и уникальных генов. Шесть подклассов и несвязанная группа описаны в работе Фрая (Frye 2000). Гомологи млекопитающих обо- значены как SirTl-7 жирным шриф- том, а белки почкующихся дрожжей подчеркнуты Остальные обозначены названием вида (модифицировано с разрешения из Frye 2000 [©Elsevier]) комплекса, узнающего определенную последователь- ность в промоторе гена и препятствующего движению или посадке аппарата транскрипции. Репрессия в области гетерохроматина достигается другим способом, который не является промотор-специфичным. Она начинается с определенных участков, от которых распространяется непрерывно по всему домену, репрессируя все промото- ры, находящиеся в соответствующей области (рис. 4.5) (Renault! et al., 1993). Наиболее четко это было показано с помощью метода иммуно-преципитации хроматина: оказалось, что белки Sir2, Sir3 и Sir4 физически связаны с хроматином по всему «молчащему» субтеломерному домену (Hecht et al., 1996; Strahl-Bolsinger et al., 1997). Доказательства, что такая связь приводит к формиро- ванию менее доступной репрессивной структуры были получены в других экспериментах. Например, ДНК «молчащих» доменов хроматина плохо метилировалась экспрессируемой в дрожжевых клетках бактериальной метилазой dam, тогда как последовательности ДНК вне этих доменов метилировались вполне эффективно. По- видимому, гетерохроматин затрудняет доступ к ДНК та- ким молекулам как dflw-метилтрансфераза (Gottschling. 1992). Аналогично, 3-т.п.н. локус HMR избирательно устойчив к действию определенных рестрикционных Теломерный гетерохроматин Повторы TG13 Ku70/Ku80 О Rap1 RNA Pol II /TBFB Edam- метилаза эндонуклеаза НО ферменты рестрикции Rap1 -----------/v-------------------____________) Сайленсер Репрессированный Сайленсер домен Комплекс SIR ацетильная группа Гетерохроматин НМ нуклеосома Рис. 4.5. Модель гетерохроматина дрожжей в теломерах и локусах НМ Для распространения SIR-комплексов механизмы сай- ленсинга и теломер, и //Л/-локусов используют Rapl, Sir2, Sir3 и Sir4, но они различаются тем, что теломерный зависит также от уКи, в то время как ЯМ-сайленсеры используют факторы ORC, Abfl и Sirl. Предполагается, что теломерный гетерохроматин образует обратную петлю сам на себя. В результате получается структура, защищающая теломеру от деградации. Ее конденсация и сворачивание приводят к сайленсингу генов. В случае ЯЛ/-гетерохроматина репрессированный домен между сайленсерными элементами состоит из тесно располо- женных нуклеосом, образующих конденсированную структуру И теломерные, и НМ «молчащие» области недоступны аппарату транскрипции и деградирующим ферментам
5 Отдельные этапы сборки гетерохроматина эндонуклеаз в изолированных ядрах (Loo and Rine, 1994), а нуклеосомы между двух сайленсер-элементов в «мол- чащих» локусах НМ расположены близко друг к другу, образуя нуклеазо-резистентный домен, отсутствующий в активных локусах (Weiss and Simpson, 1998). Итак, гетерохроматин у дрожжей имеет особую структурную организацию. Не столь ясен вопрос о степени гиперконденса- ции гетерохроматина у дрожжей и многоклеточных организмов, и обусловленного ею затруднения до- ступа факторов транскрипции к ДНК. Репрессивный комплекс, образующийся при взаимодействии белков Sir с гистонами, оказался неожиданно динамичным: эти белки могут включаться в хроматин «молчащего» локуса НМ даже при остановке клеток в фазе клеточ- ного цикла, в которой образования гетерохроматина обычно не происходит (Cheng and Gartenberg, 2000). Возможно, именно этим обстоятельством объясняется способность Sir-содержащего хроматина связываться с определенными факторами транскрипции даже в ре- прессированном состоянии (Sekinger and Gross, 1999). Тем не менее, хотя эти исследования и свидетельствуют о том, что гетерохроматин не является механическим препятствием для связывания с ДНК всех негистоно- вых белков, в нем не обнаруживается транскрипцион- ной активности и связанных РНК-полимераз. Судя по результатам экспериментов Чена и Видома (Chen and Widom, 2005), специфически подавляемым гетерохро- матином процессом является связывание с промотором комплексов РНК-полимеразы II и транскрипционных факторов TFIIB и TFIIE. Итак, хотя «молчащий» хро- матин дрожжей является динамичным образованием, допускающим обмен белков SIR и, возможно, некото- рых факторов транскрипции, он избирательно препят- ствует связыванию основного аппарата транскрипции и тем самым блокирует синтез мРНК (более детально см. главу 10). 5. Отдельные этапы сборки гетерохроматина Формирование гетерохроматина у всех видов включает несколько молекулярных этапов, некоторые из кото- рых были найдены и у почкующихся дрожжей. Один из наиболее изученных из них — сайт-специфическая нуклеация гетерохроматина, требующая участия сайт-специфических ДНК-связывающих факторов. Затем гетерохроматин распространяется из сайтов инициации. Распространение ограничивается спе- циальными пограничными механизмами, которые у дрожжей хорошо изучены. Наконец, дрожжи успешно использовали для демонстрации роли субъядерных компартментов в опосредованной гетерохроматином репрессии. Формирование гетерохроматина в области теломер несколько отличается от его формирования в локусах НМ, но в обоих случаях действует общий принцип, что специфические ДНК-связывающие факторы инициируют распространение репрессоров общего назначения. В деталях эти механизмы описаны ниже (рис. 4.6). ЭТАП 1. Рекрутирование Sir4, затем Sir2 и Sir3 к связанному с теломерой Rap1 Сайты связывания Rap1 Субтеломерные районы ЭТАП 2. Опосредованное Sir2 деацетилирование гистона Н4К16 ЭТАП 3. Распространение комплекса SIR по нуклеосомам ЭТАП 4. Складывание «молчащей» теломеры в структуру более высокого порядка Рис. 4.6. Этапы сборки теломерного гетерохроматина ЭТАП 1. Рекрутирование Sir4, затем Sir2 и Sir3 связанным с те- юмерами Rapl. На теломерах Rapl и у Ku рекрутируют Sir4 даже в отсутствии Sir2 и Sir3. Только Sir4 может быть рекрутирован в отсутствии остальных Sir-белков, причем его связыванию препятствуют Rifl и Rif2 (Mishra and Shore 1999). ЭТАП 2. Опосредованное Sir2 деацетилирование гистона Н4К16 Sir4-Sir2 и Sir4-Sir3 активно взаимодействуют, образуя Sir- комплексы по длине TG-повторов. НАД-зависимая гистон- деацетилазная активность Sir2 стимулируется образующимися комплексами и деацетилирует К16 остаток гистона Н4 в близ- лежащих нуклеосомах. ЭТАП 3. Распространение SIR-комплекса по нуклеосомам. SIR- комплексы распространяются по нуклеосомам, возможно, с использованием О-ацетил-АДФ-рибозных интермедиатов, об- разующихся в результате НАД-гидролиза (Liou et al. 2005). Sir3 и Sir4 связываются с деацетилированными хвостами гистона Н4. Хотя деацетилированный N-концевой хвост гистона НЗ также связывает белки Sir3 и Sir4, он не показан. ЭТАП 4. Свертывание «молчащей» теломеры в структуру более высокого уровня. «Молчащий» хроматин «созревает» в конце М-фазы с образованием недоступной структуры. Этот процесс может включать более высокие уровни свертывания и связы- вание с ядерной оболочкой. 5. 1. НМ гетерохроматин «Молчащие» локусы типов спаривания HML и HMR ограничены по бокам короткими последовательностями ДНК — сайленсерами, обозначаемыми как Е (essential — существенный) и I (important — важный; рис. 4.36, в).
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae Сайленсеры содержат участки связывания, как минимум, двух полифункциональных ядерных факторов, а именно Rapl и Abfl, а также ориджин-узнающего комплекса (ori- gin recognition complex — ORC) (Brand et aL, 1987). Хотя деления HMR-E, содержащего все три участка узнавания, гораздо сильнее влияет на сайленсинг, чем деления HMR-1, содержащего лишь два из них, каждый из сайленсеров в локусах HMR и HML может служить специфическим сайтом нуклеации для связывания репрессирующего Sir- комплекса и последующего распространения белков Sir на лежащие между сайленсерами нуклеосомы. Показано, что между молекулами Rapl, ассоциированными с раз- ными участками связывания in vitro, существуют непо- средственные физические контакты. Это свидетельствует о том, что факторы, ассоциированные с сайленсерами Е и I, могут взаимодействовать друг с другом путем «вы- петливания» лежащего между ними репрессированного домена. Такая модель легко объясняет наличие коопе- ративного эффекта этих сайленсеров на инициацию репрессии (Hofmann et al., 1989). Избыточность функции сайленсерных элементов является характерной чертой гетерохроматиновой ре- прессии и наблюдается также внутри самих сайленсе- ров. Факторы транскрипции общего назначения Rapl и Abfl, а также ориджин-узнающий комплекс ORC, обе- спечивающий посадку пререпликативного комплекса на ориджины репликации, функционально дублируют друг друга. Как показали эксперименты с делециями, сайтов связывания любых двух из этих факторов достаточно для сайленсинга (Brand et al., 1987), хотя сколько-нибудь су- щественного структурного сходства между Rapl, Abfl и ORC не обнаружено. Их функциональная избыточность объясняется рекрутируемыми (вовлекаемыми) ими бел- ками. Например, Rapl рекрутирует белок Sir4 в области сайленсеров НМм теломер, Abfl взаимодействует с Sir3, а ORC имеет высокое сродство к Sirl, специфическому для репрессии локусов ЯМ фактору SIR (см. обзор Rusche et al., 2003). Сам Sirl непосредственно взаимодействует с N-концом Sir4, образуя мостик между ORC и комплек- сом SIR2-3-4. Таким образом, разные связывающиеся с сайленсерами факторы приводят к рекрутированию Sir4, а затем и комплекса SIR2-3-4. необходимого для репрес- сии во всех случаях. Видимая избыточность между Rapl, Abfl и ORC (в сайленсерах), а также гетеродимера Ku (в области теломер, см. ниже), может быть связана с их спо- собностью инициировать репрессию с помощью прямых контактов с разными компонентами комплекса SIR. Следует заметить, что Sirl участвует скорее в форми- ровании гетерохроматиновой репрессии, чем ее поддер- жании. После установки репрессированного состояния участия Sirl уже не требуется (Pillus and Rine, 1989). Его важная роль в установке репрессии была показана пу- тем пришивки к нему ДНК-связывающего домена Gal4 При замещении сайленсера HMR-Е сайтами связывания Gal4 такой химерный GBD-Sirl белок эффективно ини- циирует репрессию в отсутствии самого сайленсера и узнающего его фактора (Chien et al., 1993). Однако такая репрессия все равно требует участия остальных белков Sir и сохранности гистоновых хвостов. Следовательно одной из основных функций сайленсер-связывающих факторов является рекрутирование белка Sirl, который, в свою оче- редь, инициирует репрессию, рекрутируя другие Sir-белки во взаимодействия с близлежащими нуклеосомами. Это подтверждается и данными о том, что, в отличие от других Sir-белков, Sirl не распространяется с комплексом SIR за пределы сайленсеров (рис. 4.5) (Rusche et al., 2002). 5.2. Теломерный гетерохроматин В области теломер РНК-содержащий фермент теломераза поддерживает простую, но не регулярную TG-богатую повторяющуюся последовательность длиной в 300-350 н.п. Она содержит 16—20 сайтов связывания белка Rapl. Этот набор Rapl-связывающих сайтов образует не- нуклеосомный «колпачек» на конце хромосомы и играет критическую роль в поддержании длины теломеры (Маг- cand et aL, 1997). По длине теломерных повторов Rapl связывается центральным ДНК-связывающим доменом со своими сайтами узнавания и С-концевым доменом с Sir4. Последнее происходит даже в отсутствие других SIR-белков и N-концов гистона Н4. Поскольку дефекты Sir4 нарушают связывание других белков с теломерным хроматином (Luo et al.. 2002), он, по-видимому, служит главным звеном между этапами нуклеации и следующим за ней формированием репрессированной структуры хроматина (рис. 4.6). Связывающийся с концевыми участками ДНК ком- плекс yKu70/yKu80 помогает белку Rapl рекрутиро- вать Sir4 на концы хромосом. И действительно, утрата уКи резко уменьшает степень теломерной репрессии, а химерный белок GBD-yKu эффективно инициирует репрессию репортерных генов с поврежденными сай- ленсерными элементами. Необходимость уКи можно преодолеть элиминацией Rapl-связывающего фактора Rifl, конкурирующего с С-концевым доменом Rapl за связывание с Sir4 (рис. 6) (Mishra and Shore, 1999). О кооперативных эффектах у Ku и Rapl в нуклеации гете- рохроматина свидетельствует наблюдение, что 600-п.н. повторяющейся последовательности ДНК теломеры, содержащей более 30 сайтов связывания Rapl, недоста- точно для нуклеации репрессии во внутренних локусах хромосом, хотя инсерции 900-п.н. последователности, содержащей около 45 сайтов связывания Rapl, может быть достаточно (Stavenhagen and Zakian, 1994). Следует заметить, что в промоторах по всему геному дрожжей Rapl служит транскрипционным фактором общего на- значения. участвующим в активации многих генов, на- пример, кодирующих белки рибосом. Почему в этих промоторах Rapl рекрутирует факторы активации, а не нуклеации гетерохроматина, пока неизвестно. 6. Деацетилирование гистонов белком Sir2 обеспечивает сайты связывания для распространения SIR-комплексов Молекулярные взаимодействия белков SIR хорошо изучены. Белок Sir4 играет роль ключевого «скелетного»
7. Sir2 деацетилирует гистон Н4 по 16-му остатку лизина фактора для их сборки. Sir4 и Sir2 активно взаимодей- ствуют in vitro. Sir4 также независимо взаимодействует с Sir3, в то время как Sir3 и Sir2 взаимодействуют слабо (Moazed et al., 1997; Strahl-Bolsinger et al., 1997; Hoppe et al., 2002). Sir3 и Sir4 образуют также и гомодимеры (Moretti et al., 1994). При коэкспрессии в клетках на- секомых Sir2, Sir3 и Sir4 образуют стабильный 360-kD комплекс, содержащий эти SIR-белки в стехиометри- ческом соотношении 1:1:1 (Cubizolles et al.. 2006). С моделью функционального гетеротримерного комплек- са SIR2-3-4 согласуются и результаты исследования распределения этих трех белков в гетерохроматиновых доменах с помощью метода иммунопреципитации хро- матина. Оказалось, что их содержание в разных участ- ках гетерохроматиновых доменов одинаково (Hecht et al., 1996; Strahl-Bolsinger et al., 1997). Тем не менее, вполне очевидно, что белок Sir3 играет особую роль в распределении гетерохроматина. При суперэкспрессии Sir3 наблюдается расширение «молчащего» домена, совпадающее с распространением самого Sir3 за свою обычную границу в положении ~3 т.п.н. до ~15 т.п.н. (Renauld et al., 1993; Hecht et al., 1996). Несбалансиро- ванная экспрессия одиночных Sir2 и Sir4 или даже их субдоменов имеет прямо противоположный эффект в виде нарушения ТРЕ, хотя скоординированная эктопи- ческая экспрессия Sir3 и Sir4 противодействует дисба- лансу и восстанавливает сайленсинг (Maillet et al., 1996). Все это иллюстрирует важное значение дозы белков комплекса SIR для его репрессорной функции, анало- гично ситуации с комплексами Polycomb у дрозофилы. Уникальная способность Sir3 распространяться вдоль доменов хроматина при суперэкспрессии коррелирует с наблюдением, что in vitro он образует стабильные мультимеры (Liou et al., 2005). Основа, по которой распространяется SIR-комплекс, представляет собой нуклеосомы с деацетилированными по N-концевым участкам гистонами НЗ и Н4 (Braun- stein et al., 1996; Suka et al., 2001). Механизм распро- странения можно объяснить способом взаимодействия SIR-белков с гистонами (рис. 4.7). Белки Sir3 и Sir4 свя- зываются с деацетилированными N-концами гистонов НЗ и Н4 in vitro и in vivo (Hecht et al., 1995, 1996), причем участия хвостов H2A и Н2В для этого взаимодействия не требуется. Наиболее важная в этом отношении об- ласть гистонов — 16—29-й аминокислотные остатки ги- стона Н4, среди которых 16-й остаток лизина, в част- ности, должен быть деацетилирован (положительно заряжен) для связывания Sir3 (Johnson et al., 1990,1992). В отличие от мутаций по другим сайтам ацетилирова- ния, даже консервативные мутации по остатку Н4К16 полностью нарушают теломерный сайленсинг. Хвосты гистонов НЗ/Н4, и особенно область 16—24-го остатков Н4, способствуют компактизации нуклеосомных це- пей in vitro, а деацетилирование Н4К16 в этом случае, вероятно, регулирует наднуклеосомные уровни свора- чивания нуклеосомной цепи. Как же регулируется само деацетилирование Н4К16 in vivo? 7. Sir2 деацетилирует гистон Н4 по 16-му остатку лизина Sir2 является НАД-зависимой деацетилазой гистонов, активность которой возрастает при ассоциации с Sir4. Активность Sir2 сопрягает деацетилирование с превра- щением НАД в О-ацетил-АДФ-рибозу с использованием АДФ-рибозил-трансферазной активности (Tanner et al., 2000). Учитывая, что положительно заряженный остаток Н4К16 играет ключевую роль в формировании гетерох- роматина, удивительно, что Sir2 может деацетилировать его in vitro и in vivo, хотя он также деацетилирует другие остатки лизина в N-концевом участке Н4 и остатки К9 и К14 гистона НЗ (Imai et al., 2000; Suka et al., 2002; Cu- bizolles et al., 2006). Все эти сайты-мишени расположены в доменах гистонов НЗ и Н4, необходимых для сайлен- синга. Интересно, что О-ацетил-АДФ-рибоза сама по себе способствует не только мультимеризации Sir3, но также и взаимодействию Sir3 и Sir4-Sir2 in vitro (Liou et al.. 2005). В совокупности эти данные показывают, что деацетилирование гистонов белком Sir2 способствует формированию и мультимеризации Sir-комплекса, а также подготавливает деацетилированные сайты на со- седних нуклеосомах к связыванию с SIR-белками Различные этапы инициации и распространения гетерохроматина в теломерных областях и локусах НМ показаны на рис. 4.6. В теломерах Rapl и уКи рекрути- руют Sir4, a Sir4 рекрутирует Sir2 для деацетилирования N-концевых доменов гистонов Н4 и НЗ. Sir4 также ре- крутирует Sir3. Деацетилирование гистоновых хвостов приводит к образованию сайтов связывания Sir3/Sir4 и запускает процесс нуклеации комплексом SIR2-3-4. Взаимодействие Sir3 и Sir4 друг с другом и N-концами гистонов, как считается, стабилизируют SIR-комплексы Рис. 4.7. Пограничные функции гетерохроматина у почкую- щихся дрожжей Распространение гетерохроматина посредством деацетили- рования белком Sir2 гистона Н4 по остатку К16 ограничи- вается конкурирующей активностью гистоновой ацетил- трансферазы Sas2, ацетилирующей Н4К16 в прилегающем эухроматине, тем самым предотвращая связывание Sir3. Метилирование НЗК79 в прилегающем эухроматине также влияет на распространение гетерохроматина. Пограничные функции могут иметь и такие факторы как Rebl, Tbfl и белки млекопитающих и вирусов Ctf 1 и VP 16, прикрепле- ние к ядерным порам и присутствие генов тРНК. Вполне возможно, что некоторые из них действуют, рекрутируя гистоновые ацетилтрансферазы
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae на нуклеосомной фибрилле, что позволяет им распро- страняться по гистоновым хвостам. Наконец, репрес- сированное состояние может стабилизироваться свер- тыванием хромосомной фибриллы (обсуждается ниже). Большинство этих процессов очень сходным образом протекает в области локусов НМ, хотя исходное рекру- тирование Sir4 опосредовано Rapl, Abfl, ORC и Sirl Что же останавливает процесс распространения? 8. Ацетилирование гистонов в эухроматине ограничивает распространение SIR-комплексов Поскольку деацетилирование гистона Н4 по 16-му остат- ку лизина белком Sir2 критично для формирования ге- терохроматина, не удивительно, что модификация этого сайта также играет ключевую роль в ограничении распро- странения гетерохроматина. Интересно, что из всех сай- тов ацетилирования гистонов в моноацетилированных молекулах гистона Н4 в эухроматине модифицирован только Н4К16 (Clarke et al., 1993). Одним из ферментов, участвующих в ацетилировании Н4К16 в субтеломерных областях, у дрожжей является Sas2, член консервативного класса MYST гистоновых ацетилтрансфераз (HATs — his- tone acetyltransferases). При делециях Sas2, предотвра- щающих ацетилирование Н4К16, и при мутациях Н4К16 в аргинин, имитирующих деацетилированное состояние, SIR-комплекс распространяется на нижних уровнях в правой теломере VI хромосомы примерно в пять раз дальше, чем в клетках дикого типа. Это показывает, что распространение субтеломерного гетерохроматина кон- тролируется, как минимум отчасти, противоположными активностями Sir2 и Sas2 в отношении Н4К16 (рис. 4.7) (Kimura et al., 2002; Suka et al., 2002). В области локусов НМ ограничение распростра- нения «молчащего» хроматина, возможно, еще более важно, чем в теломерных участках, поскольку по ходу соответствующего плеча III хромосомы расположе- ны существенные для роста гены, а сайленсеры имеют бидирекциональную активность, то есть репрессиру- ют соседние последовательности ДНК с обеих сторон. Одной из границ, предотвращающих дальнейшее рас- пространение сайленсинга, в направлении теломеры от локуса HMR служит ген тРНК (Donze and Kamakaka, 2001). Его пограничная функция зависит от HAT актив- ности и связана с его транскрипционным потенциалом. Существенно, что одной из таких HAT является Sas2, хотя и ацетилтрансфераза гистона НЗ, Gcn5 также спо- собствует пограничной функции генов тРНК. Это по- зволяет предположить, что активаторы транскрипции в целом могут ограничивать распространение SIR- комплексов, рекрутируя гистоновые ацетилтрансфе- разы. И действительно, пограничные активности были обнаружены у факторов транскрипции Rebl и ТЬП, фактора млекопитающих CTCF, а также кислого транс- активирующего домена вирусного фактора VP16 (Fourel et al., 1999, 2001). Каждый из них способствует гипер- ацетилированию гистонов и тем самым препятствует распространению SIR-комплексов, ослабляя их связь с нуклеосомами (рис. 4.7) Наконец, было показано, что ограничению распро- странения «молчащих» доменов хроматина, помимо вы- шеописанного механизма, способствуют присутствие в эухроматине гистона H2A.Z и ассоциированного с РНК-полимеразой фактора Bdfl (Meneghini et al., 2003), метилирование гистона НЗ по 79-му остатку лизина (van Leeuwen et al., 2002) и присоединение ДНК к ядерным порам (Ishii et al., 2002). И хотя механизмы действия этих факторов неизвестны, интересно отметить, что не- которые активные гены ассоциированы с ядерными по- рами (Ishii et al., 2002; Brickner and Walter, 2004). Итак, обшей чертой пограничных факторов у дрожжей может быть сильная стимулирующая транскрипцию или ре- моделирующая нуклеосомы активность, которая прямо или опосредовано нарушает взаимодействие гистонов с белками гетерохроматина. 9. Образование теломерных петель Существует ряд данных, свидетельствующих о возможно- сти образования петель по концам хромосом, в результате которого теломеры могут преодолевать пограничные эле- менты и стабилизировать репрессивную структуру хро- матина в субтеломерных генах (рис. 4.5,4.6). Например, несмотря на то, что сайты связывания Rapl присутствуют только в пределах первых 300 н.п. повторяющихся TG- богатых последовательностей ДНК на концах теломер, с помощью иммунопреципитации хроматина обнару- жено присутствие Rapl в нуклеосомах на расстоянии до ~3 т.п.н. от TG-повторов (Strahl-Bolsinger et al., 1997). Аналогично, yKu обнаружен на расстоянии ~3 т.п.н. от нормальных сайтов своего связывания на конце хромо- сомы (Martin et al., 1999). Более того, при нарушении сайленсинга мутациями генов SIR происходит потеря Rapl и yKu во внутренних последовательностях при их полной сохранности в области концевых TG-повторов (Martin et al., 1999). Для объяснения распространения содержащего белки Rapl и yKu гетерохроматина на расстояние около 3 т.п.н. даже в препаратах хроматина фрагментированного на куски <500 н.п. была предло- жена модель петлеобразования по концам хромосомы, в которой связанные с TG-повторами молекулы Rapl и yKu взаимодействуют с SIR-белками более внутренних областей in trans (рис. 4.5, 4.6). Такая структура, воз- можно, участвует в реализации «кэпирующей» функции связанных с теломерой белков. Результаты в пользу модели петлеобразования тело- мер были получены в работе де Брюна и соавторов (de Bruin et al., 2001), которые использовали неспособность таких активаторов транскрипции как Gal4 осуществлять свою функцию, когда они находятся ниже активируе- мого гена. Были сконструированы штаммы, в которых верхняя активирующая последовательность (upstream activating sequence — UAS) Gal4 помещалась ниже гена- репортера, и вся рекомбинантная конструкция встав- лялась во внутренние локусы хромосом или вблизи теломеры. Оказалось, что во внутренних локусах эта
11. Взаимодействие теломер in trans и перинуклеарное прикрепление гетерохроматина конструкция не способна к галактозо-индуцибельной транскрипции, а в субтеломерных участках Gal4 UAS элемент может активировать промотор, расположен- ный в 1.9 т.п.н. выше, Sir3-зависимым механизмом. Ве- роятно, в присутствии Sir3 теломерный конец образует обратную петлю, позиционирующую Gal4 UAS в непо- средственной близости от промотора активируемого гена (de Bruin et al., 2001). 10. Нарушение непрерывности репрессии естественных субтеломерных элементов теломерными петлями Выше мы нарисовали упрощенную картину образова- ния непрерывных участков «молчащего» хроматина, начинающихся с теломерных сайтов связывания белка Rapl. В действительности в природных теломерах все происходит более сложным образом в значительной степени из-за наличия пограничных элементов в области субтеломерных повторяющихся последовательностей. В большинстве экспериментов по включению в эту область репортерных конструкций для изучения теломерной репрессии субтеломерные повторяющиеся элементы X и Y’ удаляют. В результате репортерный ген оказывается непосредственно по соседству с TG-повторами. С другой стороны, все природные теломеры содержат субтело- мерный повторяющийся элемент X, расположенный между TG-повторами и самым близким к теломере ге- ном. Около 50—70% природных теломер содержат также не менее одной копии более длинного субтеломерного элемента Y’ (рис. 4.8). И X, и Y’ элементы содержат сайты связывания регуляторов транскрипции Tbfl и Rebl, ограничивающие распространение «молчащего» хроматина (Fourel et aL, 1999). Однако, X элементы со- держат также каноническую последовательность ORC и сайты связывания Abfl, действующие противоположным образом. Они реинициируют или усиливают репрессию репортерных генов, находящихся с внутренней от них стороны. В результате сайленсинг в природных теломерах приобретает прерывистый характер, что отличает его от модели непрерывного распространения, изображенной на рис. 4.6. Для объяснения такого несовпадения Прайд и Луис (Pryde and Louis, 1999) также предложили модель петлеобразования в области теломеры, в которой область не репрессированного хроматина оказывается между двумя репрессированными доменами. Тем самым пре- рывистый характер «молчащих» доменов объяснялся без отказа от представлений о нуклеации и распространения гетерохроматина от TG-повторов. 11. Взаимодействие теломер in trans и перинуклеарное прикрепление гетерохроматина Одной из наиболее консервативных черт гетерохрома- тина является его локализация в дискретных ядерных субкомпартментах. Это верно и для почкующихся дрожжей, у которых теломеры во время интерфазы об- разуют кластеры и остаются тесно ассоциированными с ядерной периферией. Такие кластеры были впервые об- наружены методом иммунно-окрашивания как фокусы локализации белков Rapl и SIR на фоне их диффузного распределения по всему ядру (рис. 4.9). Подавление сайленсинга мутациями по остатку Н4К16 или наруше- XY'-концы Х-концы Y* X Повторь TG STAR Y’ ORF1 Y’ ORF2 STR корХ Профиль сайленсинга STR корХ репортер URA3 Искусственные теломеры Рис. 4.8. Организация природных тело- мер и характер их сайленсинга Показаны субтеломерные элементы и содержащиеся в них сайты связыва- ния белков. Теломеры деляться на два основных класса: с Х-содержащими и X+Y’-содержащими концами. Элементы STAR и STR подавляют распространение репрессии и остав- ляют область сниженной репрессии внутри Y’- и Х-элементов. Этого не наблюдается в искусственно уко- роченных теломерах, в которых присутствует градиент репрессии, распространяющийся на 3—4 т.п.н. от TG-повторов. Предполагается что природные теломеры образуют петли, аналогичные изображенным на рис. 4.6, в результате чего репрес- сированные области контактируют друг с другом, а не репрессированные остаются между областями контакта, (адаптировано из работы Pryde and Louis, 1999)
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae Рис. 4.9. SIR-белки и Rapl образуют кластеры по периферии ядра На панели a, Rapl {зеленый) указывает на семь кла- стеров, представляющих все 64 теломеры данной диплоидной клетки Они расположены либо по периферии ядра, либо по соседству с ядрышком (голубое, помечено антителами к Nopl). ДНК по- мечена красным красителем. На панели б теломер- ная ДНК (красная) идентифицирована с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), а HML помечен зеленым красителем. Они имеют одинаковую локализацию примерно в 70% случаев и находятся рядом с ядерной оболочкой (синяя) (Heun et al. 2001). Панель в показывает фокальное распределение Sir4 (зеленый) рядом с ядерной обо- лочкой (помечена МаЬ414, красная). Такой характер распределения утрачивается в штамме с делецией уКи 70, что совпадает с утратой теломерного сайлен- синга (Laroche et al. 1998) ниями в активности белков Rapl и уКи сопровождается диспергированием белков SIR из этих кластеров (Hecht et al., 1995; Laroche et al., 1998). Позже было показано, что с ядерной оболочкой связаны не только теломеры, но и локусы HML и HMR Эта связь осуществляется несколькими дублирующими друг друга механизмами, зависящими либо от ассоциированного с теломерой фактора уКи, либо от формирования «молчащего» хро- матина как такового (Hediger et al., 2002). В «молчащем» хроматине функция прикрепления к ядерной оболочке приписывается субдомену белка Sir4, который связы- вается с белком ядерной оболочки Escl (enhances silent chromatin 1; Taddei et al., 2004). Взаимодействия Sir4-Escl прикрепляют SIR-репрессированные домены хроматина к участкам ядерной оболочки, отличным от ядерных пор. Даже в отсутствии прикрепления с помощью уКи- механизма ассоциация теломер с ядерной мембраной может поддерживаться посредством комплекса Sir4-Escl до тех пор, пока сохраняется сама репрессия. Более того, участки репрессированного хроматина, отделившиеся от теломер в результате рекомбинации, сохраняют SIR- зависимую ассоциацию с ядерной оболочкой (Gartenberg et al., 2004). Исходно прикрепление теломер к ядерной оболоч- ке, вероятно, происходит посредством уКи-зависимого пути, поскольку он работает даже в отсутствии сай- ленсинга. Благодаря этому прикреплению и взаи- модействию между теломерами in trans происходит формирование ядерного субкомпартмента, который в свою очередь связывает SIR-белки (рис. 4.10). Этот компартмент имеет ключевое значение для образова- ния градиента сайленсинга в области теломер. Даже фланкированные сайленсерами конструкты локуса НМ более эффективно репрессируются, когда интегриру- ются вблизи теломер (Thompson et al., 1994; Maillet et al., 1996) или когда они искусственно прикрепляются к ядерной оболочке трансмембранным фактором (Andru- lis et al., 1998). Существенно, что способность усиливать репрессию за счет близости к теломерам утрачивается, когда Sir3 и Sir4 перестают захватываться кластерами или суперэкспрессируются (Maillet et al., 1996; Marcand et aL, 1996). Это показывает, что градиент концентра- ции SIR-белков является той самой характеристикой теломерных кластеров, которая важна для усиления ре- прессии. Наконец, предполагается, что захват репрес- соров общего назначения, присутствующих в лимити- рующих концентрациях, помогает клетке обеспечить эпигенетическое наследование молчащего состояния, как показано на рис. 4.10. Вкратце, предложенная мо- дель предполагает, что сборке вновь реплицированной ДНК в гетерохроматиновую структуру способствует ее локализация в субкомпартменте, обогащенном факто- рами сайленсинга. 12. Наследование эпигенетических состояний Универсальной характеристикой гетерохроматина явля- ется передача «молчащего» состояния по наследству. Это означает, что формирование гетерохроматина на дочер- них цепях происходит вскоре после репликации. Пио- нерское исследование вопроса о наследовании состояний хроматина в клеточном цикле принадлежит Миллеру и Насмиту (Miller and Nasmyth, 1984), изучавшим возник- новение и потерю сайленсинга на термочувствительных мутантах sir3. Изменение температуры с пермиссивной на непермиссивную приводил к немедленной утрате сай- ленсинга, что доказывает необходимость продукта гена 57г5для поддержания репрессированного состояния. Од- нако в обратных экспериментах при переходе от непер- миссивной температуре к пермиссивной немедленного восстановления репрессии не происходило: требовалось прохождение клеточного цикла. Авторы сделали вывод, что для установления наследуемого репрессированного состояния хроматина требуется некое событие в S-фазе клеточного цикла. Позднее было показано, что в действи- тельности требуются события, происходящие в фазах S и G2/M (Lau et al., 2002).
13. Старение и Sir2 связаны нестабильностью повторов рДНК Рис. 4.10. Спонтанное формирование субкомпартментов сайленсинга Показана простая модель формирования субъядерных компартментов. (1) Сначала происходит рекрутирование Sir4 в центры нуклеации ДНК-связывающими белками, способными связывать Sir4. В их число входят Rapl, ORC, Abfl и yKu. (2) Присутствие Sir4 в определенном локусе в свою очередь приводит к его перемещению на ядерную периферию посредством одного из двух Sir4- зависимых путей (уKu или Escl). (3) Высокая локальная концентрация SIR у ядерной оболочки способствует сборке и распространению комплексов сайленсинга. (4) Способность «молчащих» локусов оставаться связан- ными с периферией повышает локальную концентра- цию SIR-белков и усиливает сайленсинг других локусов в этой области. Важно, что связанный с теломерами yKu может независимо рекрутировать теломеры к ядерной оболочке также как Sir4 рекурутирует сайленсерные последовательности Вначале предполагалось, что для установления и на- следования «молчащего» хроматина существенно ис- пользование ориджинов репликации из связанных с сайленсерами ARS элементов. Однако, на ориджинах локуса HML инициации репликации не наблюдалось, поэтому это объяснение сочли маловероятным. И дей- ствительно, в экспериментах по замене ORC химер- ным белкос GDB-Sirl было окончательно доказано, что срабатывание ориджинов репликации не имеет су- щественного значения для наследования «молчащего» хроматина. С другой стороны, исследования в несколь- ких направлениях показывали, что прохождение через S-фазу необходимо для формирования гетерохромати- на. Это широко трактовалось как необходимость в ре- пликации ДНК и связанной с нею пересборке нуклео- сомной структуры. Однако недавние эксперименты показали, что установка репрессированного состояния может происходить и в отсутствие репликации ДНК (Kirchmaier and Rine, 2001; Li et al., 2001). Следователь- но, искомыми факторами, необходимыми для форми- рования репрессированного хроматина, могут быть какие-то белки, специфически активируемые во время поздней S-фазы или играющие специфическую роль на границе S-G2 фаз. Таковыми могут быть вновь синте- зируемые гистоны или модифицирующие их ферменты. Также среди них могут быть шапероны, такие как CAF1 (chromatin assembly factor 1), обеспечивающие критиче- ские этапы сборки гистонов. Другие исследования показали, что устойчивый сайленсинг достигается не ранее телофазы, то есть су- щественно позже периода сборки нуклеосом в S-фазе. По-видимому, субъединица когезина Sccl ингиби- рует стабильную репрессию до тех пор, пока не раз- рушается на границе метафазы и анафазы (Lau et al., 2002). Это согласуется с данными о том, что факторы транскрипции могут успешно нарушать или противо- действовать установке «молчащего» хроматина в G2/ М-фазе, но не после того, как клетки прошли М-фазу и вступили в Gj-фазу (Aparicio and Gottschling, 1994). В совокупности эти данные показывают, что помимо какого-то критического компонента или события в S-фазе, необходим дополнительный этап, включаю- щий прохождение митоза и прямо или опосредованно зависящий от утраты сцепления между сестринскими хроматидами. 1X Старение и Sir2 связаны нестабильностью повторов РДНК У дрозофилы активные повторы рДНК расположены по соседству с центромерным гетерохроматином, а у многих высших эукариот ядрышки и конденсирован- ный гетерохроматин расположены рядом друг с другом. Следовательно генетическая и физическая ассоциация белка Sir2 с активно транскрибирующимися повторами рДНК, не зависящая от других SIR-белков, у дрожжей имеет существенное функциональное значение (Gotta et al., 1997). И действительно, Sir2 подавляет рекомбинацию рДНК (Gottlieb and Esposito, 1989) и репрессирует транс- крибируемые PH К-полимеразой II гены-репортеры, встроенные в область рДНК-повторов. Из-за своей тандемно повторенной организации рДНК склонна к процессам неэквивалентной рекомбинации, приводя- щим к изменению числа ее повторов. С такой нестабиль- ностью связаны и процессы возникновения кольцевых внехромосомных молекул рДНК (рис. 4.11) (Sinclair and Guarente, 1997). Sir2 требуется и для репрессии репортер- ных генов, встроенных в рДНК, и для предотвращения аберрантной рекомбинации, ведущей к потере повторов рДНК. Вероятными механизмами его действия являются позиционирование нуклеосом (Fntze et aL, 1997) и вы- равнивание сестринских хроматид относительно друг друга, предотвращающее события неравного обмена (Kobayashi et al., 2004).
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae Наиболее неожиданным фенотипическим эффектом нуль-мутаций Sir2 является уменьшение продолжитель- ности жизни, которое у дрожжей не связано напрямую с нарушением теломерной репрессии и уменьшением длины области TG-повторов. Короткоживущий фено- тип дефектных по Sir2 дрожжей проявляется в том, что они проходят в среднем менее 12 клеточных делений по сравнению с 20—25 у дрожжей дикого типа (Kaeberlein et al., 1999). В настоящее время твердо установлено, что образование и накопление внехромосомных кольцевых молекул рДНК (ERC) в результате неэквивалентной ре- комбинации у дрожжей коррелирует со старением (рис. 4.11). Важно отметить не только то, что при потере Sir2 уменьшается продолжительность жизни дрожжей, но и что при суперэкспрессии Sir2, сопровождающейся увеличением количества его комплексов с рДНК, про- должительность жизни увеличивается. Другие мутации, уменьшающие эффективность вырезания рДНК, на- пример элиминация барьерного белка репликативных вилок Fobl (Defossez et al., 1999), также увеличивают продолжительность жизни дрожжей, также как ис- кусственная продукция ERC достаточна для индукции клеточного старения (Sinclair and Guarente, 1997). Итак, у дрожжей нестабильность рДНК явно коррелирует со старением, хотя ее роль в старении может быть и непря- мой. Согласно одной из моделей высокое содержание ERC «вытитровывает» белки репарации и репликации ДНК из других участков генома и тем самым приводит к накоплению повреждений и/или уменьшению репли- кации генома. Так как Sir2 является НАД-зависимой деацетилазой, а уровни НАД действуют как метаболический термостат, предположили, что влияние Sir2 на продолжительность жизни у дрожжей может быть связано с эффектами огра- ниченного питания, которое, как известно, замедляет старение у многих видов. Однако, хотя это предположе- ние и подтверждается данными об увеличении актив- ности Sir2 у дрожжей, дрозофилы и млекопитающих в условиях ограниченного питания, продолжительность жизни у дрожжей, выращиваемых в условиях понижен- ного уровня глюкозы (ограниченного питания), уве- личивается механизмом, не зависящим и аддитивным по отношению к эффектам Sir2 (Kaeberlein et al., 2004). Следовательно, Sir2 и ограниченное питание повышают продолжительность жизни независимыми путями. Накопление вырезанных колец рДНК не было обнаружено у каких-либо других видов. Однако для Caenorhabditis elegans и грызунов предполагалось, что уменьшение продолжителности жизни связано с други- ми видами нестабильности генома. Аналогично эффек- ту потери Sir2, приводящей к неравным обменам между сестринскими хроматидами, у дрожжей, возможно, что нарушения теломерного гетерохроматина у млекопита- ющих приводят к слиянию хромосом «конец-в-конец», тем самым нарушая способность клеток к делениям. И хотя пока неизвестно, влияет ли на эти механизмы белок Sir2 у млекопитающих, тем не менее роль геном- ной нестабильности как общего фактора старения весь- ма вероятна, как и специфическая роль нарушений в структуре гетерохроматина. 14. Резюме С помощью генетических, биохимических и цитологи- ческих методов при исследовании почкующихся дрож- жей были установлены фундаментальные принципы репрессии (сайленсинга) генов при формировании гетерохроматина. Они включают механизмы инициа- ции, распространения и ограничения распространения гетерохроматина, баланс факторов гетерохроматина и их распределение на уровне субъядерного пространства, образование петель гетерохроматина и роль клеточного цикла в его формировании. Более того, разрабатывают- ся системы реконструкции гетерохроматина дрожжей in vitro. Эти исследования in vivo и in vitro представляют надежную механистическую основу для нашего пони- мания принципов формирования гетерохроматина из хроматиновых фибрилл у всех эукариот. Литература Andrulis E.D., Neiman А.М., Zappulla D.C., and Stemglanz R. 1998 Perinuclear localization of chromatin facilitates transcrip- tional silencing. Nature 394: 592-595. Sir2 Репликация Рекомбинация, Асимметричная Фрагментация ядрышка Релокализация сегрегация белков SIR Смерть Рис. 4.11. Рекомбинация рДНК приводит к старению клеток у дрожжей рДНК организована в массив из 140—200 прямых повторов 9.1-т.п.н. единицы (красный блок). Они кодируют 18S, 5.8S, 25S и 5S рРНК и содержат два Sir2-чувствительных элемента ниже гена 5S и внутри гена 18S. рДНК повторы имеют склонность вырезаться в стареющих клетках дрожжей и накапливаться в материнских клетках в виде кольцевых молекул (Kaeberlein et al., 1999). Это явление коррелирует с преждевременным старением. Sir2 препятствует ему, подавляя процессы неравной рекомбинации и вырезания
Aparicio O.M. and Gottschling D.E. 1994. Overcoming telomeric silencing: A trans-activator competes to establish gene expression in a cell cycle-dependent way. Genes Dev. 8: 1133-1146. Aparicio O.M., Billington B.L., and Gottschling D.E. 1991. Modi- fiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in 5. cerevisiae. Cell 66: 1279-1287. Boscheron C., Maillet L., Marcand S., Tsai-Pflugfelder M., Gasser S.M., and Gilson E. 1996. Cooperation at a distance between silencers and proto-silencers at the yeast HML locus. EMBO J. 15:2184-2195. Brand A.H., Micklem G., and Nasmyth K. 1987. Ayeast silencer con- tains sequences that can promote autonomous plasmid replication and transcriptional activation. Cell 51: 709-719. Braunstein М.» Sobel R.E., Allis CD., Turner B.M., and Broach J.R. 1996. Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern. Mol. Cell. Biol. 16: 4349-4356. Brickner J.H. and Walter R 2004. Gene recruitment of the activated INO1 locus to the nuclear membrane. PLoS Biol. 2: e342. Chen L. and Widom J. 2005. Mechanism of transcriptional silencing in yeast. Cell 120: 37-48. Cheng TH. and Gartenberg M.R. 2000. Yeast heterochromatin is a dynamic structure that requires silencers continuously Genes Dev. 14: 452-463. Chien C.T, Buck S., Stemglanz R., and Shore D. 1993. Targeting of SIR1 protein establishes transcriptional silencing at HM loci and telomeres in yeast. Cell 75: 531-541 Chopra VS. and Mishra R.K. 2005. To SIR with Polycomb: Linking silencing mechanisms. Bioessays 27: 119-121. Clarke D.J., O’Neill L.P, and Turner B.M. 1993. Selective use of H4 acetylation sites in the yeast S. cerevisiae. Biochem. J. 294: 557-561. Cubizolles E, Martino E, Perrod S., and Gasser S.M. 2006. A homotrimer-heterotrimer switch in Sir2 structure differentiates rDNA and telomeric silencing. Mol. Cell 21: 825-836. de Bruin D., Zaman Z., Liberatore R.A., and Ptashne M. 2001. Telomere looping permits gene activation by a downstream UAS in yeast. Nature 409: 109-113. Defossez P.A., Prusty R., Kaeberlein M., Lin S.J., Ferrigno P, Silver P.A., Keil R.L., and Guarente L. 1999. Elimination of replication block protein Fobl extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell 3:447-455. Donze D. and Kamakaka R.T. 2001. RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in S. cerevisiae. EMBO J. 20: 520-531. Fourel G., Revardel E., Koering C.E., and Gilson E. 1999. Cohabi- tation of insulators and silencing elements in yeast subtelomeric regions. EMBO J. 18:2522-2537. Fourel G., Boscheron C., Revardel E., Lebrun E., Hu Y.E, Simmen K.C, Muller K., Li R., Mermod N.. and Gilson E. 2001. An activation-independent role of transcription factors in insulator function. EMBO Rep. 2: 124-132. Fritze C.E., Verschueren K., Stnch R., and Easton Esposito R. 1997. Direct evidence for SIR2 modulation of chromatin structure in yeast rDNA. EMBO J. 16: 6495-6509. Frye R.A. 2000. Phylogenetic classification of prokaryotic and eu- karyotic Sir2-like proteins. Biochem. Biophys. Res. Comm. 273: 793-798. Gartenberg MR., Neumann F.R., Laroche T, Baszczyk M., and Gasser S.M. 2004. Sir-mediated repression can occur inde- pendently of chromosomal and subnuclear contexts. Cell 119: 955-967. Gotta M., Strahl-Bolsinger S., Renauld H., Laroche L, Kennedy B.K., Grunstein M., and Gasser S.M. 1997. Localization of Sir2p: The nucleolus as a compartment for silent information regulators. EMBO J. 16:3243-5503. Gottlieb S. and Esposito R.E. 1989. A new role for a yeast transcrip- tional silencer gene, SIR2, in regulation of recombination in ribosomal DNA. Cell 56: 771-776. Gottschling D.E. 1992. Telomere-proximal DNA in Saccharomyces cerevisiae is refractory to methyltransferase activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4062-4065. Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., and Zakian VA. 1990. Position effect at S. cerevisiae telomeres: Reversible repres- sion of PolII transcription. Cell 63: 751-762. Hecht A., Strahl-Bolsinger S., and Grunstein M. 1996. Spreading of transcriptional repressor SIR3 from telomeric heterochromatin. Nature 383: 92-96. Hecht A., Laroche T, Strahl-Bolsinger S., Gasser S.M., and Grunstein M. 1995. Histone H3 and H4 N-termini interact with SIR3 and SIR4 proteins: A molecular model for the formation of heterochromatin in yeast. Cell 80: 583-592. Hediger E, Neumann F.R., Van Houwe G., Dubrana K., and Gas- ser S.M. 2002. Live imaging of telomeres: yKu and Sir proteins define redundant telomere-anchoring pathways in yeast. Curr. Biol. 12: 2076-2089. Heun P, Laroche T, Raghuraman M.K., and Gasser S.M. 2001. The positioning and dynamics of origins of replication in the budding yeast nucleus./. Cell Biol. 152: 385-400. Hoppe G.J., Tanny J.C., Rudner A.D., Gerber S.A., Danaie S., Gygi S.P., and Moazed D. 2002. Steps in assembly of silent chromatin in yeast: Sir3-independent binding of a Sir2/Sir4 complex to silencers and role for Sir2-dependent deacetylation. Mol. Cell. Biol. 12:4167-4180. Imai S.I., Armstrong C, Kaeberlein M., and Guarente L. 2000. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD- dependent histone deacetylase. Nature 403: 795-800. Ishii K., Arib G., Lin C, Van Houwe G., and Laemmli U.K. 2002. Chromatin boundaries in budding yeast: The nuclear pore con- nection. Cell 109: 551-562. Johnson L.M., Fisher-Adams G., and Grunstein M. 1992. Identifica- tion of a non-basic domain in the histone H4 N-terminus required for repression of the yeast silent mating loci. EMBO J. 11: 2201-2209. Johnson L.M., Kayne P.S., Kahn E.S., and Grunstein M. 1990. Genetic evidence for an interaction between SIR3 and histone H4 in the repression of the silent mating loci in S. cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6286-6290. Kaeberlein M„ McVey M., and Guarente L. 1999. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in S. cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13: 2570-2580. Kaeberlein M., Kirkland K.T., Fields S„ and Kennedy B.K. 2004. Sir2-independent life span extension by calone restriction in yeast. PLoS Biol. 2: 296-307. Kayne P.S., Kim U.J., Han M., Mullen J.R., Yoshizaki E, and Grunstein M. 1988. Extremely conserved histone H4 N terminus is dispensable for growth bul essential for repressing the silent mating loci in yeast. Cell 55: 27-39. Kimura A., Umehara T, and Horikoshi M. 2002. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p
Глава 4. Эпигенетика дрожжей Saccharomyces cerevisiae functions as a shield against gene silencing. Nat. Genet. 3: 370-377. Kirchmaier A.L. and Rine J. 2001. DNA replication-independent silencing in S. cerevisiae. Science 291: 646-650. Kobayashi X, Horiuchi T, Tongaonkar P., Vu L., and Nomura M. 2004. Sir2 regulates recombination between different rDNA repeats, but not recombination within individual rRNA genes in yeast. Cell 117: 441-453. Laroche T, Martin S.G., Gotta M., Gorham H.C., Pryde RE., Louis E.J., and Gasser S.M. 1998. Mutation of yeast Ku genes disrupts the subnuclear organization of telomeres. Curr. Biol. 8: 653-656. Lau A., Blitzblau H., and Bell S.P. 2002. Cell-cycle control of the establishment of mating-type silencing in S. cerevisiae. Genes Dev. 16: 2935-2945. Li Y.C., Cheng Т.Н., and Gartenberg M.R. 2001. Establishment of transcriptional silencing in the absence of DNA replication. Science 291: 650-653. Liou G.G., Tanny J.C., Kruger R.G., Walz T, and Moazed D. 2005. Assembly of the SIR complex and its regulation by O-acetyl- ADP-ribose, a product of NAD-dependent histone deacetylation. Cell 121: 515-527. Loo S. and Rine J. 1994. Silencers and domains of generalized repres- sion. Science 264: 1768-1771. Luo K., Vega-Palas M.A., and Grunstein M. 2002. Rapl-Sir4 binding independent of other Sir, yKu, or histone interactions initiates the assembly of telomeric heterochromatin in yeast. Genes Dev. 12:1528-1539. Maillet L„ Boscheron C, Gotta M., Marcand S., Gilson E., and Gasser S.M. 1996. Evidence for silencing compartments within the yeast nucleus: A role for telomere proximity and Sir protein concentration in silencer-mediated repression. Genes Dev. 10: 1796-1811. Marcand S., Gilson E., and Shore D. 1997. A protein-counting mechanism for telomere length regulation in yeast. Science 275: 986-990. Marcand S., Buck S.W., Moretti P, Gilson E., and Shore D. 1996. Silencing of genes at nontelomeric sites in yeast is controlled by sequestration of silencing factors at telomeres by Rapl protein. Genes Dev. 10: 1297-1309. Martin S.G., Laroche T, Suka N, Grunstein M., and Gasser S.M. 1999. Relocalization of telomeric Ku and SIR proteins in response to DNA strand breaks in yeast. Cell 97: 621-633. Meneghini M.D., Wu M., and Madhani H.D. 2003. Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell 112: 725-736. Miller A.M. and Nasmyth K.A. 1984. Role of DNA replication in the repression of silent mating type loci in yeast. Nature 312: 247-251. Mishra K. and Shore D. 1999. Yeast Ku protein plays a direct role in telomeric silencing and counteracts inhibition by Rif proteins. Curr. Biol. 9: 1123-1126. Moazed D., Kistler A., Axelrod A., Rine J., and Johnson A.D. 1997. Silent information regulator protein complexes in S. cerevisiae: A S1R2/SIR4 complex and evidence for a regulatory domain in SIR4 that inhibits its interaction with SIR3. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2186-2191 Moretti P, Freeman K., Coodly L., and Shore D. 1994. Evidence that a complex of SIR proteins interacts with the silencer and telomere-binding protein RAPE Genes Dev. 8: 2257-2269. Palladino E, Laroche X, Gilson E., Axelrod A., Pillus L., and Gasser S.M. 1993. SIR3 and SIR4 proteins are required forthe position- ing and integnty of yeast telomeres. Cell 75: 542-555. Pillus L. and Rine J. 1989. Epigenetic inheritance of transcriptional states in S. cerevisiae. Cell 59: 637-647. Pryde F.E. and Louis E.J. 1999. Limitations of silencing at native yeast telomeres. EMBO]. 18: 2538-2550. Renauld H., Aparicio O.M., Zierath P.D., Billington B.L., Chhablani S.K., and Gottschling D.E. 1993. Silent domains are assembled continuously from the telomere and are defined by promoter distance and strength, and by SIR3 dosage. Genes Dev. 7:1133- 1145. Rusche L.N., Kirchmaier A.L., and Rine J. 2002. Ordered nucleation and spreading of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 7: 2207-2222. ------- . 2003. The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Biochem. 72: 481-516. Sekinger E.A. and Gross D.S. 1999. SIR repression of a yeast heat shock gene: UAS and TATA footprints persist within heterochro- matin. EMBO J. 18:7041-7055. Sinclair D.A. and Guarente L. 1997. Extrachromosomal rDNA circles—A cause of aging in yeast. Cell 91: 1033-1042. Stavenhagen J.B. and Zakian VA. 1994. Internal tracts of telomeric DNA act as silencers in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 8: 1411-1422. Strahl-Bolsinger S., Hecht A., Luo K„ and Grunstein M. 1997. SIR2 and SIR4 interactions differ in core and extended telomeric heterochromatin in yeast. Genes Dev. 11: 83-93. Suka N., Luo K., and Grunstein M. 2002. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine 16 and spreading of heterochromatin. Nat. Genet. 3: 378-383. Suka N., Suka Y, Carmen A.A., Wu J., and Grunstein M. 2001. Highly specific antibodies determine histone acetylation site usage in yeast heterochromatin and euchromatin. Mol. Cell 8: 473-479. Taddei A.. Hediger E, Neumann F.R., Bauer C, and Gasser S.M. 2004. Separation of silencing from perinuclear anchoring func- tions in yeast Ku80 Sir4 and Escl proteins. EMBO J. 23: 1301- 1312. Tanner K.G., Landry J., Stemglanz R., and Denu J.M. 2000. Silent information regulator 2 family of NAD-dependent histone/ protein deacetylases generates a unique product, 1-O-acetyl- ADP-ribose. Proc. Natl Acad. Set. 97: 14178-14182. Thompson J.S., Johnson L.M., and Grunstein M. 1994. Specific repression of the yeast silent mating locus HMR by an adjacent telomere. Mol. Cell. Biol. 14: 446-455. van Leeuwen R, Gafken PR., and Gottschling D.E. 2002. Dotlp modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core. Cell 109: 745-756. Weiss K. and Simpson R.T 1998. High-resolution structural analysis of chromatin at specific loci: S. cerevisiae silent mating type locus HMLa. Mol Cell. Biol. 18: 5392-5403.
ГЛАВА 5 ЭФФЕКТ ПОЛОЖЕНИЯ МОЗАИЧНОГО ТИПА, ФОРМИРОВАНИЕ ГЕТЕРОХРОМАТИНА И САЙЛЕНСИНГ ГЕНОВ У DROSOPHILA Sarah C.R. Elgin1 и Gunter Reuter2 1 Department of Bilogy, Washington University, St. Louis, Missouri 63130 2 Institute of Genetics, Biologicum, Martin Luther University Halle, D-06120 Halle, Germany Содержание: Общее резюме 1. Гены, оказывающиеся в ненормальном сосед- стве с гетерохроматином, обнаруживают моза- ичный фенотип 2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEV позво- лил идентифицировать хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание политен- ных хромосом позволило идентифицировать белки, специфически ассоциированные с гете- рохроматином 4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Гены, оказавшиеся в ненормальном соседстве с гете- рохроматином в результате либо перестройки, либо транспозиции [transposition], обнаруживают мозаичный фенотип, показывая тем самым, что данный ген оказался сайленсированным в некоторых клетках, в которых в норме он активен (эффект положения мозаичного типа — PEV, position-effect variegation). Сайленсинг, происходя- щий при PEV, можно приписать упаковке репортерного гена в гетерохроматиновой форме; это показывает, что формирование гетерохроматина, будучи однажды инициировано, может распространяться и охватывать близлежащие гены. На Drosophila melanogaster возможен генетический, цитологический и биохимический анализ, 5. Хромосомные белки образуют взаимозависи- • мые комплексы для поддержания и распростра- нения гетерохроматиновой структуры 6. Как формирование гетерохроматина «нацели- вается» у Drosophila? 7. Не весь гетерохроматин идентичен 8. PEV, формирование гетерохроматина и сайлен- синг генов у различных организмов 9. Подведение итогов: мы не знаем о гетерохро- матине очень многое Литература и в этой главе мы показываем, как эти разные подходы в совокупности помогли идентифицировать многих по- тенциальных участников этой системы, позволив в ре- зультате охарактеризовать несколько белков, играющих ключевую роль в установлении и поддержании гетеро- хроматина. Формирование гетерохроматина решающим образом зависит от метилирования гистона НЗ по лизину 9, с сопутствующей ассоциацией Белка Гетерохроматина 1 (НР1 — Heterochromatin Protein 1) и других взаимодей- ствующих белков, в том числе НЗК9-метилтрансфераз; множественные взаимодействия этих белков необходимы для поддержания и распространения гетерохроматина. «Нацеливание» на гетерохроматин, в том числе нако- пление НЗК9ше, происходит, по-видимому, с участием машинерии РНК-интерференции (RNAi), хотя играют
положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila роль и специфические ДНК-белковые взаимодействия. Хотя гетерохроматиновые районы (перицентромерные районы, теломеры и маленькая четвертая хромосома) обладают общей биохимией, каждый из них отличает- ся от других, а перицентромерные районы мозаичны. Гетерохроматин у Drosophila беден генами, но не лишен их вовсе, и гены, находящиеся в гетерохроматине, за- висят в своей экспрессии от этой среды. Окончательная модель формирования и поддержания гетерохроматина (включая «нацеливание» и распространение) должна будет принять в расчет различные реакции разных генов на это хроматиновое окружение. 1. Гены, оказывающиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином, обнаруживают мозаичный фенотип Большие сегменты эукариотического генома, в основ- ном повторяющиеся последовательности, упакованы в постоянно неактивной форме как конститутивный гетерохроматин. Эта фракция хроматина была исходно идентифицирована как та часть генома, которая остается конденсированной и интенсивно окрашивающейся (ге- теропикнотической), по мере того, как клетка переходит от метафазы к интерфазе; такой материал обычно ассо- циирован с теломерами и перицентромерными районами хромосом. Гетерохроматиновые районы обнаруживают тенденцию к поздней репликации и демонстрируют лишь незначительную мейотическую рекомбинацию или даже вовсе никакой. Эти районы бедны генами, но не лишены их вовсе, и те гены, которые там есть, для своей опти- мальной экспрессии часто зависят от этой среды. Около одной трети генома Drosophila считается гетерохрома- тиновой, включая целую Y-хромосому, большую часть маленькой четвертой хромосомы, перицентромерные 40 % Х-хромосомы и перицентромерные 20 % больших аутосом. На протяжении нескольких последних десяти- летий мы узнали очень многое о биохимии гетерохро- матина, и многие из этих сведений получены в наших исследованиях, проведенных на Drosophila (Richards and Elgin, 2002; Schotta et al., 2003). Одной из первых мутаций, идентифицированных у D. melanogaster, была мутация white — мутация, резуль- татом которой оказывается белая окраска глаз мухи, а не характерная для них красная пигментация. Исполь- зуя Х-лучи в качестве мутагена, Меллер (Muller, 1930) наблюдал необычный фенотип, при котором глаз был мозаичным, с участками красных и участками белых фасеток (рис. 5.1). Этот фенотип заставлял думать, что сам ген white не поврежден — в конце концов, некото- рые фасетки оставались красными, и даже можно было получить мух-ревертантов с полностью красными гла- зами, вновь используя Х-лучи как мутаген. Однако ген white был несомненно сайленсирован в некоторых клет- ках, в которых он экспрессируется в норме Последую- щие исследования политенных хромосом (представле- ние. 5.1. Схематическое изображение мозаичности white в инвер- сии In( l)wm4 в Х-хромосоме Локус white, в норме расположенный в дистальном эухрома- тине {синий цвет), теперь помещен в пределах 25 т.о. от точ- ки разрыва в перицентромерном гетерохроматине {розовый цвет) Х-хромосомы благодаря индуцированной Х-лучами инверсии. Распространение гетерохроматиновой упаковки в эухроматиновый район приводит к сайленсингу; утрата сай- ленсинга в некоторых клетках в ходе дифференцировки дает мозаичный фенотип. Используя мух, обнаруживающих PEV, можно отселектировать мутации во втором сайте, которые либо супрессируют этот фенотип (мутации Su(var); приводят к утрате сайленсинга), либо усиливают фенотип (мутации E(var)', вызывают усиление сайленсинга) ны ниже, см. рис. 5.4) показали, что такие фенотипы были следствием инверсии или перестройки, когда одна точка разрыва находилась в пределах перицентромер- ного гетерохроматина, а другая — вблизи гена white (см. рис. 5.1). Поскольку причина такого мозаичного фе- нотипа — в изменении положения гена в пределах хро- мосомы, это явление называется эффектом положения мозаичного типа (PEV) У Drosophila было показано, что по существу каждый ген, который был изучен в соответ- ствующей перестройке, проявляет мозаипизм, и пере- стройки, включающие перицентромерный гетерохро- матин любой хромосомы, могут приводить к PEV. PEV наблюдали у ряда организмов, в том числе у дрожжей, мух и млекопитающих, но как инструмент для изучения формирования гетерохроматина он был использован в основном у Drosophila. PEV показывает, что такие перестройки позволяют упаковке в гетерохроматиновую конфигурацию «рас- пространяться» вдоль по длине хромосомы Все вы- глядит таким образом, как если бы перестройка удали- ла существующий в норме барьер или буферную зону. Следствием этого является измененная упаковка и сайленсинг генов, в норме организованных в эухрома- тиновой форме. Визуальное обследование политенных хромосом личинок, несущих такую перестройку, пока- зывает, что район, несущий репортерный ген, упакован теперь в плотный блок гетерохроматина, но только в тех клетках, в которых этот ген неактивен (Zhimulev et al., 1986). Картина, наблюдаемая вследствие перестройки
1. Гены, оказывающиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином, обнаруживают мозаичный тип white, может варьировать по числу пигментированных клеток, величине пигментированных пятен и уров- ню содержания пигмента в наблюдаемых двух разных клеточных типах (рис. 5.1). В системе, использующей в качестве репортера индуцибельный ген lac-Z, иссле- дователи наблюдали, что сайленсинг происходит в эм- бриогенезе (когда впервые цитологически наблюдается гетерохроматин) и эпигенетически наследуется как в соматической, так и в зародышевой линиях; мозаич- ный фенотип был определен в ходе дифференцировки по мозаичной релаксации сайленсинга у личинок тре- тьего возраста (Lu et al., 1996). Однако не все гены, об- наруживающие мозаицизм, остаются «молчащими» до периода после дифференцировки, и для разных генов баланс факторов, приводящий к решению «включить/ выключить», несомненно различен (дополнительное детальное обсуждение см. Ashburner et al., 2005b). При наличии мух. имеющих PEV-фенотип, доволь- но просто провести скрининг на доминантные мутации во втором сайте (индуцированные химическими мута- генами, вызывающими точечные мутации или мелкие инсерции/делеции), которые либо являются супрес- сорами PEV (обозначаются Supressor of variegation, Su [var]) и приводят к утрате сайленсинга, либо являются энхансерами PEV (обозначаются Enhancer of variegation, EfvarJ), приводящими к усилению сайленсинга (рис 5.1) Изолировали и охарактеризовали около 30 моди- фикаторов PEV, но на основе такого скрининга мож- но предсказать существование значительно большего числа кандидатов на эту роль. Там, где такой ген был клонирован, а его продукт охарактеризован, обычно обнаруживают хромосомный белок или модификатор хромосомного белка (см. ниже). Небольшая выбор- ка этих локусов вызывает как гаплоаномальный, так и триплоаномальный фенотип; т.е. если одна копия гена приводит к супрессии PEV, три его копии приводят к усилению PEV. Идентификация таких локусов приве- ла к предположению, что белковые продукты этих ге- нов играют структурную роль в гетерохроматине и что распространение гетерохроматиновой упаковки может управляться дозой этих белков в стохастическом режи- ме (рис. 5.2) (Locke et al., 1988). Однако «распростра- нение» является не простым линейным континуумом, а сложным процессом, который, вероятнее всего, за- висит от организации ДНК в том районе, который сай- ленсирован (см. ниже). Результаты, наблюдаемые по перестройкам хромо- сом, заставляют предполагать, что эухроматиновый ген, в результате транспозиции вставленный в гетерохрома- тиновый район, также будет обнаруживать мозаичный фенотип. Так оно и оказалось. Для этой цели можно под- вергнуть генноинженным манипуляциям Р-элемент — ДНК-транспозон, обнаруживамый во многих природ- ных линиях Drosophila. Природный Р-элемент имеет на каждом конце особые инвертированные повторяющиеся последовательностиикодируетвсеголишьодинфермент— P-специфическую ДНК-транспозазу Репортерные кон- структы, лишенные ДНК-транспозазы, но содержащие другие гены, представляющие интерес для исследова- теля, можно вставить в геном Drosophila в присутствии Влияние модификаторов PEV на мозаичность проявления white Рис. 5.2. Зависимые от дозы эффекты некоторых модификаторов PEV Полагают, что модификаторы PEV, обнаруживающие за- висимый от дозы эффект, являются структурными белками гетерохроматина. В то время как в присутствии двух копий гена-модификатора дикого типа наблюдается мозаичный фенотип (обнаруживаемый здесь репортерным геном white', средняя хромосома, средний глаз мухи), присутствие трех копий гена-модификатора дикого типа обычно обусловливает более экстенсивное формирование гетерохроматина, что приводит к усилению сайленсинга репортерного гена {нижняя хромосома, нижний глаз мухи). Наоборот, присутствие только одной копии гена-модификатора дикого типа обычно приводит к пони- женному формированию гетерохроматина и к повышенной экспрессии репортерного гена {верхняя хромосома, верхний глаз мухи) активной транспозазы путем их совместной инъекции в эмбрионы Drosophila. Мобильный элемент на основе Р (такой, как показано на рис. 5.3а), несущий управляемую hsp70 копию white, можно использовать в мухах, лишен- ных эндогенной копии white, чтобы идентифицировать домены гетерохроматина Когда P-элемент вставляется в эухроматин, муха имеет красные глаза. Когда же этот Р мобилизуется (путем встраивания в ген, кодирующий транспозазу), приблизительно 1 % выявляемых линий обнаруживают мозаичный фенотип глаз. Гибридизация in situ показывает, что в этих случаях P-элемент пере- скочил в перицентромерный гетерохроматин, теломеры или небольшую четвертую хромосому (Wallrath and Elgin, 1995). Эта идентификация гетерохроматиновых доменов согласуется с более ранними цитологическими исследо- ваниями. Использование таких P-элементов позволило срав- нить упаковку одного и того же репортерного гена в гетерохроматиновом и эухроматиновом окружении. Гетерохроматин относительно устойчив к расщепле- нию нуклеазами, как неспецифическими (например, ДНКаза 1), так и специфическими (рестрикционные энзимы), и менее доступен для других экзогенных зон- дов, таких как метилтрансфераза dam Анализ одного и того же трансгена hsp26 (маркированного фрагментом уникальной растительной ДНК, рис. 5.3а) в эухрома- тине и в перицентромерном гетерохроматине с исполь- зованием микрококковой нуклеазы (MNase) выявил сдвиг в сторону более упорядоченного расположения
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila нуклеосом в гетерохроматине (рис. 5.36, в). Фрагменты, полученные путем расщепления ферментом MNase, четко определены, что позволяет предполагать наличие меньшей, чем обычно, мишени для MNase в линкер- ном районе. Упорядоченное расположение нуклеосом простирается на весь 5’-регуляторный район гена; этот сдвиг несомненно обусловливает наблюдаемую потерю 5’-гиперчувствительных (HS) сайтов (Sun et al., 2001). Действительно, хотя механизм сайленсинга понят еще не полностью, имеются многочисленные данные о транскрипционной репрессии сильно мозаичных ге- нов, включая утрату связывания TFIID и других транс- крипционных факторов (Cryderman et al., 1999b). 2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEV позволил идентифицировать хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков PEV можно модифицировать различными факторами. Температура во время развития и количество гетерохро- матина в геноме были первыми факторами, влияющими, как было показано, на степень мозаицизма. Как правило, повышение температуры во время развития (£ 25 до 29 °C) приводит к супрессии мозаицизма (утрате сайленсинга), тогда как более низкие температуры (например, 18 °C) вы- зывают усиление мозаицизма (увеличение сайленсинга). Другие изменения в условиях культивирования, ускоряю- щие или замедляющие скорость развития, могут давать похожие эффекты. Сильная супрессия обнаруживается у мух, несущих дополнительную Y-хромосому (самки XXY и самцы XYY), тогда как у самцов без Y-хромосомы (Х0) обнаруживается значительное усиление В целом дупликация гетерохроматинового материала подавляет, а делециии гетерохроматинового материала усилива- ют мозаицизм. Эти эффекты могут быть обусловлены титрованием фиксированного количества ключевых белков, необходимых для упаковки гетерохроматина. Первые мутации во втором сайте, супрессирующие или усиливающие PEV, были идентифицированы Шульцем (Schultz, 1950) и Споффордом (Spofford, 1967). В настоя- щее время приблизительно 150 генов предположительно рассматриваются как модификаторы локусов PEV Мутации Su(var) и E(var) идентифицируют гены, причинно связанные с началом сайленсинга гетеро- хроматиновых генов при PEV [with the onset of hetero- chromatic gene silencing in PEV]. Молекулярный анализ этих генов сыграл существенную роль в углублении по- нимания механизмов, приводящих к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов В большинстве случаев модифицирующее влияние мутаций на PEV является доминантным, и гетерозиготы Su(var)/+ или E(var)/+ демонстрируют фенотип с подавленным или усиленным PEV (рис. 5.1). Эффективное выделение и детальный генетический анализ мутаций Su(var) и E(var) зависят от наличия подходящей для эксперимен- а Перемещаемый элемент Р hsp26- растение hsp70-white ~ЖР б Эухроматиновая Гетерохроматиновая вставка вставка HS-2 — п МЫаза 39С-Х Гел ь - электрофорез Эухроматин ।—► Сайт DH Сайт DH Рис. 5.3. Гетерохроматин упакован в регулярный нуклеосомный порядок Мобильный элемент (а), несущий маркированную копию гена теплового шока для исследования и Й8р70-управляемую копию white в качестве визуального маркера, можно использовать для изучения одного и того же гена в разных хроматиновых доменах. Ядра эмбрионов Drosophila из линии, несущей этот трансген в эухроматиновом домене (39С-Х; красные глаза), и из линии, несущей тот же самый трансген в гетерохроматиновом домене (HS-2; мозаичный глаз), были переварены возрастающими количествами фермента MNase, ДНК очистили и разогнали в агарозном геле, а Саузерн-блот гибридизировали с зондом, уни- кальным для трансгена (б). Линкерные сайты, расщепленные MNase, отмечены стрелками, (в) Сравниваются денситограммы последней дорожки каждой пробы (сверху вниз — слева на- право). В гетерохроматине можно видеть набор 9—10 нуклеосом (красная линия} по сравнению с 5—6 нуклеосомами в эухрома- тине (синяялиния), что показывает наличие более регулярного «шага» в первом случае, (г) Схематическое представление этих результатов (б,в — с любезного разрешения из Sun et al., 2001, с изменениями [©American Society for Microbiology])
2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEVпозволил идентифицировать хромосомные белки та PEV-перестройки. Хотя было описано большое чис- ло PEV-перестроек (Flybase, 2005), лишь немногими из них можно легко воспользоваться для эффективно- го генетического скрининга и изоляции доминантных мутаций-модификаторов. Одна из наиболее полезных для такой экспериментальной работы PEV-перестроек— Infljw”14 (Muller 1930). Эта перестройка обусловлива- ет мозаицизм по white — фенотип, легко различимый на глазах взрослых мух, как показано на рис.5.1. Пе- нетрантность мозаицизма по white у w"14 является 100 %-ной, так что каждая муха в исходном штамме [the starting stock] имеет глаза с белой пятнистостью. Инак- тивация гена white не влияет на жизнеспособность или фертильность, что обусловливает возможность неогра- ниченной работы с мухами, гомозиготными по w"14. В перестройке w"14 ген white в результате инверсии оказывается в непосредственной близости с гетерохро- матиновым материалом Х-хромосомы, локализован- ным на дистальной границе ядрышкового организатора (Cooper, 1959). Этот район содержит тандемные поряд- ки мобильных элементов типа R1; гетерохроматино- вая точка разрыва 1п(1)м^4 находится внутри единицы повтора R1 (A. Ebert and G. Reuter, неопубликовано) После воздействия Х-лучами или EMS (этанметилсуль- фонат, химический мутаген) были изолированы ревер- танты w"14, имеющие фенотип w+ (Tartof et al., 1984; Reu- ter et al., 1985). Анализ более 50 ревертантных хромосом w+ (все они обнаружили реинверсию или транслокацию гена white в соседство с эухроматином) позволил пред- положить, что гетерохроматиновый материал, флан- кирующий непосредственно точку разрыва, вызывает инактивацию гена white у w”14. Большинство ревертантов снова обнаруживают белую пятнистость, если вводятся сильные мутации E(var), что заставляет предполагать, что некоторые гетерохроматиновые последовательно- сти после перемещения остаются ассоциированными с геном white. Эти исследования позволяют считать по- вторяющуюся ДНК (в данном случае повторы R1) ми- шенью для формирования гетерохроматина. Большинство известных мутаций-модификаторов PEV были изолированы с использованием сенсибили- зированного генетического фона. Для изоляции доми- нантных супрессорных мутаций тест-генотип содержит доминантный энхансер, тогда как в схемах для изо- ляции энхансерных мутаций используется доминант- ный супрессор (Dorn et al., 1993b). Если тест-генотип содержит энхансер мозаичности, все мухи w"14 имеют белые глаза, и исключения, имеющие пятнистые или красные глаза, указывают на вновь индуцированные мутации Su(var). Соответственно, в тест-линии с до- минантным супрессором все мухи w”14 имеют красные глаза, а исключительные мухи с мозаичным фенотипом указывают на вновь индуцированные мутации E(var). Эти сенсибилизированные генетические схемы благо- приятствуют изоляции сильно доминантных мутаций Su(var) и E(var), которые оказались очень полезными для детального генетического анализа. С использованием этого подхода в разных опытах по скринингу просмотрели более миллиона мух, и были изолированы более 140 мутаций Su(var) и 230 мутаций E(var) (Schotta et al., 2003). Мутации были индуцирова- ны EMS, Х-лучами или ремобилизацией элементов Р. Еще один набор мутаций Su(var) был изолирован в ходе прямого скрининга с w"14 (Sinclair et al., 1983). Скри- нинг с хромосомой Df(l'J), демонстрирующей силь- ный мозаицизм по гену yellow (маркер, желтая окраска тела), привел к изоляции 70 мутаций-модификаторов PEV (Donaldson et al., 2002). Кроме того, скрининг на доминантные модификаторы экспрессии транспозон- ного репортерного гена позволил идентифицировать несколько мутаций с эффектом Su(var) (Birchler et al., 1994). Известно, что выборка критических регулятор- ных генов даун — регулируется генами группы Polycomb (PcG) и ап — регулируется генами группы trithorax (trxG). В прямых тестах относительно немногие мутации в ге- нах PcG модифицируют PEV (например, Sinclair et al., 1998). Напротив, многие мутации в генах trxG являются энхансерами PEV (Dorn et al., 1993а; Farkas et al., 1994). В совокупности этот скрининг позволил идентифи- цировать большое число доминантных мутаций Su(var) и E(var). По данным выполненного к настоящему време- ни генетического анализа общее число мутаций Su(var) и E(var) можно оценить как приблизительно 150. Боль- шое число генов Su(var) и E(var) с почти идентичными фенотипическими эффектами иногда приводит к несо- ответствиям в генетической номенклатуре. Чаще всего символы генов Su(var) и E(var) комбинируются с циф- рами, указывающими хромосому, в которой локализо- вана данная мутация, с номером гена и номером аллели Так, символизиРУет аллель 17 девятого гена Su(var), идентифицированного в третьей хромосоме. В настоящее время были тщательно картированы лишь около 30 соответствующих генов и идентифицирова- ны соответствующие аллели (табл. 5.1). Зависящие от дозы эффекты наблюдались для примерно одной трети идентифицированных генов, с использованием серии перекрывающихся нехваток и дупликаций. В этих слу- чаях уменьшение количества генных продуктов из-за утери одной копии гена неизменно приводит к моди- фикации мозаичного фенотипа. Делеции этих локусов Su(var) или E(var) супрессируют или, соответственно, усиливают сайленсинг генов. Исследования с исполь- зованием дупликаций позволили идентифицировать новые локусы-модификаторы, которые обнаруживают противоположное (антиподное) влияние на PEV, если путем дупликации или с помощью инсерции трансге- на вводится лишняя копия данного гена. Общее число генов-модификаторов PEV, обнаруживающих завися- щие от дозы эффекты, оценивается примерно в 15—20 (Schotta et al., 2003). Если утрата одной копии гена приводит к супрессии PEV, а присутствие трех копий гена ведет к усилению PEV, это позволяет предполагать, что для установле- ния гетерохроматина требуется, в стоихиометрических количествах, продукт, кодируемый этим геном, с со- путствующим сайленсингом гена (рис. 5.2). Были де- тально охарактеризованы три таких локуса, Su(var)2-5 (кодирующий НР1), Su(var)3-7 (кодирующий белок типа «цинковых пальцев») и Su(var)3-9 (кодирующий метилтрансферазу лизина гистонов). Su(var)2-5 был
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila Таблица 5.1. Генетически установленные гены Su(var) и E(var) и их молекулярные функции Ген Su(var)/E(var) Цитологическое положение Молекулярная функция, распределение белка и фенотипические эффекты Suv4-20 [Su(var)] X; 1B13-14 НКМТ, триметилирование Н4К20 гистонов SW5[Su(var)] 2L; 21B2 5-аденозилметионинсинтетаза chm (chameou) [Su(var)] 2L; 27F3-4 HAT с доменом Myst; подавляет PEV, но усиливает мутации группы Polycomb 5w<W)2-5(HPl) 2L; 28F2-3 Гетерохроматиновый белок НР1, связывающийся с ди- и тиметил- НЗК9; связывание с SU(VAR)3-9 Su(var)2-HP2 2R;51B6 Ассоциированный с гетерохроматином белок, связывается с НР1 Su(var)2-I0 2R; 45A8-9 Белок PIAS, негативные регуляторы пути JAK/STAT Su(var)3-64B (HDAC1=RPD3) 3L; 64B12 Деацетилаза гистонов HDAC1, деацетилирование НЗК9 E(z) [Su(var)] 3L; 67E5 НКМТ, моно-, ди- и триметилирование НЗК27; экстра-копия гена усиливает PEV; в случае нуль-мутации все эухроматиновое и гетеро- хроматиновое метилирование НЗК27 утрачивается, метилирование НЗК9 не затрагивается SuUR [Su(var)] 3L; 68A4 Подавляет недорепликацию гетерохроматина; ассоциированный с гетерохроматином белок Su(var)3-1 (JTL1) 3L; 68A5-6 Антиморфные мутации ]IL1, карбоксилтерминальные усечения белка не затрагивают киназную функцию; блокирование распространения гетерохроматина Dom (Domina) [Su(var)] 3R; 86B1-2 Белок “fork head winged-helix” (FKH/WH): ассоциирован с гетеро- хроматином Su(var)3-6 3R; 87B9-10 Белок РР1 серин/треонин-фосфатаза Su(var)3-7 3R; 87E3 Белок типа «цинковый палец», ассоциирован с гетерохроматином; взаимодействует с НР1 и SU(VAR)3-9 Su(var)3-9 3R; 89E6-8 НКМТ, метилирование НЗК9 гистонов, ассоциирован с гетерохрома- тином, взаимодействие с НР1 mod (modulo) [Su(var)] 3R; 100E3 Белок, связывающийся сДНКиРНК, фосфорилированный Mod связывается с rRNA E(var)3-64E/ Ubp64Evarl} 3L; 64E5-6 Предполагаемая убиквитин-специфичная протеаза (Ubp46) Tri (Trithorax-like) [E(var)] 3L; 70F4 Фактор GAGA, связывающийся с повторяющимися нуклеотидными последовательностями ДНК Mod(mdg4)/E(var)3-93D 3R; 93D7 Регулятор транскрипции, более 20 изоформ белка продуцируются путем /га/гь-сплайсинга E(var)3-93E 3R; 93E9-F1 Транскрипционный фактор E2F, гаплоэнхансер и триплосупрессор См. оригинальное цитирование во Flybase. клонирован путем скрининга библиотеки экспрессии кДНК с помощью моноклонального антитела, рас- познающего гетерохроматин (James and Elgin, 1986). Кодируемый белок, ассоциированный с гетерохрома- тином, был впоследствии обозначен НР1 (белок гете- рохроматина 1) Гибридизация in situ с использованием выделенной клонированной ДНК позволила иденти- фицировать ген в районе 28—29 полигонных хромосом.
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом позволило идентифицировать белки где ранее был картирован Su(var)2-5 Анализ нуклео- тидной последовательности ДНК мутантных аллелей подтвердил, что локус Su(var)2-5 в положении 28F1-2 на хромосоме кодирует НР1 (Eissenberg et al., 1990) НР1 содержит два консервативных домена, аминотерми- нальный хромодомен и карбокситерминальный домен «chromoshadow» (Paro and Hogness, 1991), и взаимодей- ствует с несколькими другими хромосомными белками Su(var)3- 7 был сперва цитогенетически картирован (с помощью серии перекрывающихся делеций и дуплика- ций) в районе 87Е1-4 в третьей хромосоме. Этот район был проанализирован на уровне ДНК как часть первой «прогулки по хромосоме» [chromosomal walk], выпол- ненной у Drosophila (Bender et al., 1983). С помощью се- рии перекрывающихся геномных клонов Su(var)3- 7был определен в пределах фрагмента ДНК величиной 7.8 т.о., который обладал трипло-энхансерным влиянием на репортер, обнаруживающий мозаичность (Reuter et al., 1990). Su(var)3-7кодирует белок с семью регулярно расположенными [regularly spaced] «цинковыми пальца- ми» — доменами, которые, как было показано, функци- онируют в связывании с ДНК (Cleard and Spierer, 2001). Su(var)3-9 был клонирован с помощью таггирования транспозоном P-элементом (Tschiersch et al., 1994). Ген Su(var)3-9 у Drosophila (и у всех других голометаболи- ческих насекомых, изученных к настоящему времени) образует бицистронную единицу с геном, кодирующим e!F2y (Krauss and Reuter, 2000). Поскольку транскрип- ционная единица Su(var)3-9 не имеет интронов, впол- не вероятно, что Su(var)3-9 был вставлен в интрон гена eIF2{ путем ретротранспозиции. Белок SU(VAR)3-9 содержит хромодомен в своем аминотерминальном участке и домен SET (идентифицированный впервые в белках SU(VAR)3-9, ENHANCER OF ZESTE [E(Z)] и TRITHORAX) (Jones and Gelbart, 1993; Tschiersch el al., 1994) на своем карбоксильном конце. Этот белок явля- ется метилтрансферазой гистонов, специфически мо- дифицирующей гистон НЗ по лизину 9. Были описаны семь разных мутантных аллелей Su(var)2-5, в том числе миссенс-мутации в хромодомене, преждевременные стоп-кодоны и ошибки сплайсинга (Eisenberg et al., 1992). Мутации Sufvar) 3-7 были получе- ны с помощью гомологичной рекомбинации (Seum et al., 2002); дополнительные аллели были выявлены как су- прессоры сайленсинга, зависимого от Р-эле мента (Bush- ey and Locke, 2004). Сорок мутантных аллелей Su(var)3-9 были выявлены и определены на молекулярном уровне (Ebert et al., 2004). Иммуноцитологический анализ с ис- пользованием специфических антител или химерных белков слияния, экспрессируемых трансгеном [trans- gene-expressed fusion proteins], показал, что все три белка преимущественно ассоциированы с гетеро-хроматином (см. ниже и рис. 5.4) (James et al., 1989; Cleard et al., 1997; Schotta et al., 2002). Сильная колокализация особенно очевидна для НР1 и SU(VAR)3-9. Эти белки также свя- зываются с теломерами и в ряде эухроматиновых сайтов (Fanti et al., 1998; Schotta et al., 2002). Несколько инсерций P-элемента, несущих репор- терный ген w+ в теломерные районы, обнаруживают белую пятнистость. Этот феномен называется тело- мерным эффектом положения (ТРЕ). Упаковка, по- добная гетерохроматину, наблюдается в ассоциирован- ных с теломерами сателлитных последовательностях (TAS), кластерах повторяющейся ДНК, расположен- ных проксимально по отношению к ретровирусным элементам НеТ-А и TART, составляющим теломеры Drosophila (Cryderman et al., 1999a). В целом, не было обнаружено модификации ТРЕ мутациями в извест- ных генах-модификаторах, хотя НР1 важен для це- лостности теломер. В клетках с недостаточностью по этому белку хромосомы часто сливаются в области своих теломер (Fanti et al., 1998). У Drosophila в ходе недавнего скрининга не было обнаружено никаких Zra/is-действующих доминантных модификаторов ТРЕ (Mason et al., 2004), что заставляет предполагать, что эти участки сайленсированы двумя (или несколькими) независимыми механизмами. 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом позволило идентифицировать белки, специфически ассоциированные с гетерохроматином Одним из преимуществ работы с Drosophila является возможность изучения политенных хромосом, дающая визуальную «дорожную карту» генома. На стадии ли- чинки хромосомы во многих терминально дифферен- цированных клетках реплицируются, но не проходят через митоз; нити хроматина остаются спаренными, в состоянии совершенного синапсиса, и все копии выравнены друг с другом. Наиболее крайний случай имеет место в слюнных железах, где эухроматиновые плечи хромосом претерпели 10 раундов репликации, дав в результате около 1000 копий. Однако репликация не является однородной; многие повторяющиеся по- следовательности недореплицируются, а сателлитные последовательности ДНК не реплицируются вовсе Все хромосомные плечи сливаются в общем хромо- центре. Таким образом, у D. melanogaster наблюдаются пять длинных плечей (X, второе левое [2L], второе правое [2R], третье левое [3L], третье правое [3R]) и короткое плечо четвертой хромосомы, выступающее из конденсированного хромоцентра, состоящего из перицентромерного гетерохроматина (рис. 5.4а) (обзор см. Ashburner et al., 2005) Хотя генетический анализ позволил идентифициро- вать многие локусы, необходимые для формирования гетерохроматина, сам по себе он не позволяет опреде- лить, играет ли продукт данного локуса прямую или же косвенную роль. Специфическая ассоциация белка с гетерохроматином первоначально наблюдалась при скрининге моноклональных антител (полученных с использованием прочно-связывающихся ядерных бел- ков, где анализировали паттерны распределения на по- литенных хромосомах. Антитела, специфичные к белку
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila б ДНК HP1-EGFP ДНК SU(VAR)3-9-EGFP Рис. 5.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом позволяет идентифицировать белки, преимущественно ассоции- рованные с гетерохроматином (а) Политенные хромосомы, на фиксированных и давленых препаратах слюнных желез (микроскопия с фазовым контрастом, слева) «окрашены» с помощью инкубирования сначала с антителами, специфичными к данному хромосомному белку, а затем со вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой. НР1 {справа) и НР2 (в центре) имеют сходный рисунок распределения, демонстрирующий бросающуюся в глаза связь с перицентромерным гетерохроматином, маленькой четвертой хромосомой {врезка, стрелка) и небольшой группой сайтов в эухроматиновых плечах. Обратите внимание на то, что на эффектив- ность любого антитела может влиять выбор протокола фиксации (см. Stephens et al. 2003). (б, в) Ассоциация НР1 и SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой. Мутации в Su(yar)3-9 приводят к потере НР1 из перицентро- мерного гетерохроматина (но не четвертой хромосомы; см. текст) (б), тогда как мутации в Su(var)2-5 приводят к делокализации SU(VAR)3-9 (в) (из: Shatter et al. 2002, с изменениями) 22 кДа, впоследствии обозначенному как НР1, давали иммунофлуоресцентное «окрашивание» перицентро- мерного гетерохроматина, теломер и бэндированной [banded] части маленькой четвертой хромосомы, т.е. из- вестных сайтов гетерохроматина (рис. 5.4а) (James and Elgin, 1986). Последующий анализ (описанный выше) показал, что белок НР1 кодируется Su(var)2-5, извест- ным супрессором PEV(Eissenberg et al., 1990). Изучение хромосомной локализации специфическими антите- лами с использованием либо митотических хромосом (Fanti and Pimpinelli, 2004), либо политенных хромосом (обеспечивающих большее разрешение, но недостаточ- ных по центромерному гетерохроматину) (Silver and El- gin 1976) остается наилучшим способом демонстрации того, что продукт локуса Su(var) кодирует хромосом- ный белок. Были идентифицированы приблизительно 10 таких специфичных для гетерохроматина белков; если есть мутации в генах, кодирующих эти белки,
4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина часто наблюдают доминантную супрессию PEV (см. табл. 5.1) (Ashburner et al., 2005b). Эти белки, в том числе недавно идентифицированный НР2 (рис. 5.4а) (Shaffer et al., 2002), являются кандидатами на роль структурных компонентов гетерохроматина 4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина Анализ SU(VAR)3-9 позволил идентифицировать клю- чевую функцию, необходимую для сайленсинга гетеро- хроматиновых генов (Tschiersch et al., 1994). Этот белок содержит домен SET, функционирующий как фермент в метилировании НЗК9 гистонов. То, что этот белок яв- ляется метилтрансферазой лизина гистонов (НКМТ), «нацеленной» на НЗК9, было впервые показано в ходе изучения гомологичного белка человека, SUV39H1 (Rea et al., 2000). У Drosophila SU(VAR)3-9 является главной, но не единственной НКМТ НЗК9 (Schotta et al., 2002; Ebert et al., 2004). SU(VAR)3-9 контролирует диметилирование НЗК9в основной массе перицентромерного гетерохроматина, но не в четвертой хромосоме, теломерах или эухроматиновых сайтах. Триметилирование НЗК9, которое у Drosophila на- блюдется, главным образом, во внутреннем хромоцентре, также контролируется SU(VAR)3-9. Диметилирование этого внутреннего района не зависит от SU(VAR)3-9, как и монометилирование НЗК9 в перицентромерном гете- рохроматине (Ebert et al., 2004). HKMTs, ответственные за эти модификации, все еще неизвестны. Важное значение диметилирования НЗК9 в сайленсинге гетерохроматино- вых генов демонстрируется сильным зависящим от дозы влиянием SU(VAR)3-9 на PEV (обсуждается выше), атакже тем фактом, что супрессия сайленсинга генов мутациями Su(var)3-9 коррелирует с активностью их НКМТ Фермен- тативно гиперактивная мутация Su(var)3-9*n является силь- ным энхансером PEV и вызывает повышенное содержание НЗК9те2 и НЗК9теЗ в хромоцентре, а также порождает за- метные сигналы НЗК9те2 во многих эухроматиновых сай- тах (эктопический гетерохроматин). S-Аденозилметионин функционирует как донор метильной группы для всех этих реакций метилирования; следовательно, мутации в гене, кодирующем S-аденозилметионинсинтазу, Su(z)5, являют- ся доминантными супрессорами PEV (Larsson et al., 1996). Исследования с использованием генов Su(var) на- чали вскрывать последовательность молекулярных реакций, необходимых для установления гетерохро- матиновых доменов. Связывание SU(VAR)3-9 в гете- рохроматиновых нуклеотидных последовательностях зависит как от его хромодоменов, так от SET-доменов (Schottaet al., 2002). Как контролируется SU(VAR)3-9 — все еще неизвестно. Метилирование НЗК9 белком SU(VAR)3-9 устанавливает сайты связывания для НР1. Хромодомен НР1 специфически связывается с НЗК9ше2 и H3K9me3 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Что SU(VAR)3-9 связывается с HP1, было показано двугибридными тестами на дрожжах [yeast two-hybrid tests] и иммунопреципитацией (Schotta et al., 2002). Рай- он SU(VAR)3-9, аминотерминальный по отношению к его хромодомену взаимодействует с доменом «chromo- shadow» НР1. Этот район SU(VAR)3-9 взаимодействует также с карбокситерминальным доменом SU(VAR)3-7. SU(VAR)3-7 взаимодействует в трех разных сайтах с до- меном «chromoshadow» НР1 (Delattre et al., 2000). При таком паттерне взаимодействий можно предположить, что эти три белка — НР1, SU(VAR)3-7 и SU(VAR)3-9 — физически связаны в мультимерных белковых комплек- сах гетерохроматина. Ассоциация SU(VAR)3-9 и НР1 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой (Schotta et al., 2002). SU(VAR)3-9 вызывает диметилирование НЗК9, который специфически узнается хромодоменом НР1 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Следовательно, у личинок нуль-ЛУ/тяг^-Р связывание НР1 с перицен- тромерным гетерохроматином нарушено (см. рис. 5.4b). Это отражает специфическую активность НР1, который связывается с НЗК9те2, но не с H3K9mel; SU(VAR)3-9 не затрагивает монометилирование (Ebert et al., 2004). Диметилирование НЗК9 во внутреннем хромоцентре, четвертой хромосоме в теломерах и в эухроматиновых сайтах не зависит от SU(VAR)3-9, и, следовательно, в мутантных линиях НР1 продолжает обнаруживаться во всех этих сайтах. В клетках дикого типа SU(VAR)3-9 свя- зывается с этими сайтами, но, по-видимому, неактивен; неизвестная НКМТ контролирует метилирование НЗК9 в этих районах. Напротив, если НР1 не присутствует (устранен му- тациями), SU(VAR)3-9 больше не связывается с пери- щентромерным гетерохроматином, но обнаруживается также по длине эухроматиновых хромосомных плечей (рис. 5.46). Теперь он виден почти во всех бэндах, где он вызывает эктопическое моно- и диметилирование НЗК9 (H3K9mel и НЗК9те2) (рис. 5.5). Таким образом, НР1 существен для ограниченного связывания SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином. Эти данные по- зволяют представить себе последовательность реакций, начинающуюся со связывания SU(VAR)3-9 с гетеро- хроматиновыми доменами и последующего образова- ния НЗК9ше2. Эта метка распознается хромодоменом НР1; связывание SU(VAR)3-9 с доменом «chromoshad- ow» белка НР1 обеспечивает его ассоциацию с гетерох- роматином. Был создан химерный белок НР1-РС, в котором хромодомен НР1 был заменен хромодоменом белка Polycomb (PC) (Platero et al., 1996). Хромодомен PC прочно связывается c H3K27me3 (Fischle et al., 2003). Химерный белок HP1-PC узнает, следовательно, сай- ты связывания H3K27me3 Polycomb в эухроматиновых плечах; в присутствии такого химерного белка НР1-РС белок SU(VAR)3-9 также обнаруживается в сайтах свя- зывания РС, демонстрируя свою сильную связь с доме- ном «chromoshadow» белка НР1 (Schotta et al., 2002). В клетках Hynb-SU(VAR)3-9 сильно уменьшено содер- жание еще одной гетерохроматин-специфичной метки метилирования — триметилирования Н4К20 (Н4К20шеЗ) (Schotta et al., 2004). Было показано, что взаимозависи- мость между диметилированием НЗК9 и триметилиро- ванием Н4К20 отражает взаимодействие между белками SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20. SUV4-20 является НКМТ,
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila Рис. 5.5. Взаимодействие SU(VAR)3-9 и НР1 в установлении паттерна распределения НЗК9те (a) SU(VAR)3-9 отвечает за деметилирование НЗК9 (НЗК9те2); утрата энзима приводит к утрате этой модификации в перицен- тромерном гетерохроматине. как показывает утрата окрашива- ния антителами политенных хромосом (сравни среднюю панель с верхней панелью). Утрата НР1 приводит к утрате «нацеливания» SU(VAR)3-9; высокие уровни НЗК9те2 видны теперь на всех хромосомных плечах (нижняя панель), (б) YH1 взаимодействует с НЗК9те2 через свой хромодомен, а с SU(VAR)3-9 — через домен «chromoshadow». Узнавая и модификацию гистонов, и фермент, отвечающий за эту модификацию, НР1 обеспечивает механизм распространения гетерохроматина и эпигенетиче- ского наследования контролирующей метилирование Н4К20 в гетерохромати- не. Это гетерохроматин-специфичная метка метилирова- ния сильно ослаблена в нуль-клетках по SU(VAR)3-9, как и по НР1, заставляя предполагать ассоциацию SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20 в комплекс взаимно зависимых белков. Мутации в гене Suv4-20 вызывают сильную супрессию индуцированного PEV сайленсинга генов, показывая, что для этого процесса требуется метка Н4К20теЗ. Третья метка метилирования гистонов, функцио- нально связанная с формированием гетерохроматина, — это метилирование НЗК27, катализируемое НКМТ E(Z). У Drosophila E(Z) контролирует все моно-, ди- и триметилирование НЗК27 и в эухроматине, и в гетеро- хроматине. Следовательно, в нуль-клетках по E(z) все метилирование НЗК27 утрачивается (Ebert et al., 2004). На функцию метилирования НЗК27 в сайленсинге ге- терохроматиновых генов указывает как Su(var)-эффект мутаций E(z) типа утраты функции, так и энхансерный эффект дополнительных копий гена E(z) (Laible et al., 1997). Неясно, является ли этот эффект прямым или косвенным. Метилирование НЗК27 является критиче- ским для системы сайленсинга Polycomb, которая дей- ствует в эухроматиновых доменах. Между паттернами распределения и функциональными ролями PC и НР1 наблюдается относительно небольшое перекрывание. Каким образом могла бы осуществляться подгонка ме- тилирования НЗК27 к зависимым от НР1 гетерохрома- тиновым комплексам — еще предстоит выяснить. Бе- лок НР1 выполняет центральную линкерную функцию в формировании гетерохроматина и ассоциированном сайленсинге генов, связывании НЗК9ше2 и НЗК9теЗ и взаимодействии непосредственно с SU(VAR)3-9 и не- сколькими дополнительными белками. Учитывая чис- ло идентифицированных локусов Su(var), эта модель определенно становится более сложной. У млекопи- тающих и растений метилирование НЗК9 гистонов и метилирование ДНК представляют взаимосвязанные метки репрессированного хроматина (Martienssen and Colot, 2001; Bird, 2002). Происходит ли вообще мети- лирование ДНК у Drosophila или нет, многие годы было предметом полемики Недавние сообщения о низком уровне метилирования ДНК у ранних эмбрионов вновь подогрели эту дискуссию (Kunert et al., 2003). Анализ генома показывает, что единственная имеющаяся раз- личимая ДНК-метилтрансфераза — это Dnmt2. Мута- ции в этом гене мало влияют на организм. Тем не менее, его роль в раннем эмбриогенезе исключать нельзя. 5. Хромосомные белки образуют взаимозависимые комплексы для поддержания и распространения гетерохроматиновой структуры PEV отражает изменение в экспрессии гена вследствие генетической перестройки, а именно утрату экспрессии репортерного гена в некоторых клетках, в которых он в норме активен. Для объяснения PEV предложено не- сколько разных моделей; не все из них являются взаимо- исключающими. Одна из возможностей, рассмотренная исходно, — это случайная потеря гена, возможно вслед- ствие поздней репликации (Karpen and Spradling, 1990). Анализ с помощью количественного Саузерн-блоттинга показал, что это объяснение в общем виде неприменимо; гены, обнаруживающие мозаицизм, обычно полностью
6. Как формирование гетерохроматина «нацеливается» у Drosophila? реплицируются в диплоидной ткани (Wallrath et al., 1996). Другие модели делают акцент на ассоциации гена, обна- руживающего мозаицизм, с гетерохроматиновым компо- нентом ядра и (или) на распространении гетерохрома- тиновой структуры с гетерохроматина, оказавшегося по соседству. Эта модель распространения, базирующаяся на многочисленных генетических и цитологических данных, объясняет сайленсинг как следствие распро- странения гетерохроматиновой упаковки через точку разрыва в эухроматиновые в норме районы. В нормаль- ных хромосомах эухроматиновые и гетерохроматиновые районы, по-видимому, изолированы [insulated] друг от друга специфическими последовательностями или бу- ферными зонами. Поскольку эти «изолирующие после- довательности» [«insulating sequences»] (которые никогда не были полностью определены у Drosophila) отсутствуют в местах соединения эухроматина и гетерохроматина при PEV-перестройках (см. рис. 5.1), гетерохроматинизапия эухроматиновых последовательностей индуцируется с переменным успехом. Эту гетерохроматинизацию можно видеть на цитологическом уровне в политенных хромо- сомах как сдвиг от бэндированной к аморфной структуре в основании хромосомных плечей (Hartmann-Goldstein, 1967); степень этого изменения можно модифицировать мутациями Su(var) и E(var) (Reuter et al., 1982). Инактивацию эухроматиновых генов на расстоянии вдоль по длине хромосомы можно продемонстриро- вать генетически (Demerec and Slizynska, 1937). Затро- нутые районы становятся связанными с НР1 (Belyaeva et al., 1993) и обнаруживают H3K9me2, типичную мет- ку гетерохроматина Drosophila (Ebert et al., 2004). По- скольку модель распространения постулирует конку- ренцию между упаковкой в эухроматин и упаковкой в гетерохроматин, гены-модификаторы PEV могли бы кодировать функции контроля либо формирования гетерохроматина, либо формирования эухроматина Обнаружение зависимых от дозы модификаторов, как обсуждается выше, свидетельствует в пользу такой мо- дели (Locke et al., 1988; Henikoff, 1996). И действитель- но, недавно были идентифицированы мутации Su(var), контролирующие баланс между эухроматином и гете- рохроматином (Ebert et al., 2004). PEV-перестройки позволили нам визуализировать и изучить случаи, где гетерохроматиновая упаковка распространяется на фланкирующий эухроматиновый домен. Этот эффект распространения несомненно зависит от ряда молеку- лярных реакций в эухроматиновых районах. Известны несколько модификаций гистонов, которые являются взаимоисключающими и которые определяют эти аль- тернативные хромосомные состояния. Ацетилирова- ние НЗК9, метилирование НЗК4 и фосфорилирование H3S10 — типичные метки активного эухроматина, тог- да как метилирование НЗК9, НЗК27 и Н4К20 являет- ся специфической меткой «молчащих» районов. Сле- довательно, гетерохроматинизапия эухроматиновых районов требует специфических реакций деацетилиро- вания, деметилирования и дефосфорилирования в эух- роматине, как это изображено на рис. 5.6. Этот переход исходно зависит от деацетилирования НЗК9 ферментом HDAC1 Мутации в гене rpd3, кодирующем специфиче- скую для НЗК9 деацетилазу гистонов HDAC1, являются сильными супрессорами PEV(Mottus et al., 2000), высту- пая антагонистами эффекта SU(VAR)3-9 в сайленсинге генов (Czermin et al., 2001). Как было показано, HDAC1 in vivo ассоциирован с комплексом SU(VAR)3-9/HPl; эти два энзима работают кооперативно, метилируя пре- дацетилированные гистоны. Недавно наблюдали, что распространение гетерохро- матина в эухроматин полностью блокируется у мутантов Su(var)3-1 (Ebert et al., 2004). Мутации Su(var)3-1 явля- ются мутациями сдвига рамки считывания в гене, коди- рующем киназу JIL1; они приводят к экспрессии усечен- ного белка JIL1, не имеющего карбокситерминального района. Белок JIL1 содержит два киназных домена и ка- тализирует фосфорилирование H3S10 в эухроматине. Мутации JILlSu(var)31 не влияют на фосфорилирование H3S10, но, вероятно, нарушают дефосфорилирование H3S10, эффективно подавляя метилирование НЗК9. Это заставляет предположить участие фосфатазы. Неизвест- но, участвует ли энзим РР1 (который был идентифици- рован с помощью мутаций Su(var)3-5) (Baksa et al., 1993) непосредственно в этой реакции. Деметилирование НЗК4 является, по-видимому, еще одной предпосылкой для гетеро-хроматинизации эухроматиновых районов. Недавние работы показали, что аминооксидаза LSD1 функционирует у млекопитающих как деметил аза НЗК4 (Shi et al., 2005). Предполагаемый гомолог LSD1 у Droso- phila, SU(VAR)3-3, облегчает распространение гетерох- роматина в эухроматиновые районы во всех испытанных PEV-перестройках (S. Lein et al., неопубликовано). В соответствии с этим в нуль-клетках по Su(var)3-3, у ко- торых нет LSD1, приобретение метилирования НЗК9 в эухроматине, фланкирующем точку разрыва, отменяет- ся, хотя конститутивно гетерохроматиновые районы не затрагиваются. Эти открытия показывают, что для удале- ния специфических для эухроматина меток модифика- ций гистонов необходима координированная функция нескольких энзимов, прежде чем может иметь место переход к гетерохроматиновой упаковке (см. рис. 5.6). Вполне вероятно, будет обнаружено, что эти необходи- мые энзимы образуют комплексы с SU(VAR)3-9/HPl, как это было уже показано для HDAC1. 6. Как формирование гетерохроматина «нацеливается» у Drosophila? Хотя мы многое узнали о механистических аспектах и биохимии структуры гетерохроматина, как это описано выше, остается открытым вопрос о том, каким образом формирование гетерохроматина «нацеливается» на из- бранные районы генома в его нормальной конфигурации. Все гетерохроматиновые домены обладают некоторыми общими чертами, и две такие особенности признаны существенными входными сигналами [inputs] для сборки гетерохроматина на данной нуклеотидной последователь- ности ДНК: положение локуса относительно простран- ственно обособленных [distinct] субдоменов гетерохрома- тина в ядре и присутствие повторяющейся ДНК
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila Добавление «репрессивных» гистоновых меток а Удаление «активных» гистоновых меток Эухроматин Гетерохроматин Рис. 5.6. Переход из эухроматинового состояния в гетерохроматиновое состояние требует ряда изменений в модификациях гистонов (а) Активные гены маркированы НЗК4те2 и теЗ; эта метка, если присутствует, предположительно должна быть удалена LSD1 (у Drosophila пока еше не охарактеризован). В эухроматине НЗК9 в норме ацетилирован; эта метка должна быть удалена деаце- тилазой гистонов, HDAC1 Фосфорилирование H3S10 может интерферировать с метилированием НЗК9; дефосфорилирование, по-видимому, происходит с участием фосфатазы, «нацеливаемой» взаимодействием с карбоксильным концом киназы JIL1 Эти переходы создают обстановку для приобретения модификаций, связанных с сайленсингом (показано на б), в том числе мети- лирования НЗК9 белком SU(VAR)3-9, связывания НР1 и последуюшего метилирования Н4К20 белком SUV4-20, ферментом, рекрутируемым НР1. Может также происходить метилирование НЗК27 энзимом E(Z) В целом гетерохроматиновые массы видны на пери- ферии ядра и вокруг ядрышка. У эмбрионов Drosophila эта тенденция выражена еще более отчетливо. Гетеро- хроматиновые массы впервые видны в раннем эмбри- огнезе, когда ядра перемещаются к периферии яйца. Раннее развитие у Drosophila является синцитиальным вплоть до 14-го цикла ядерных делений, когда обра- зуются клеточные стенки между ядрами, и образуется типичная бластула (шарик из клеток). Гетерохромати новый материал (центромеры, четвертая хромосома) концентрируется на одной стороне ядра, ориентиро- ванной в сторону внешней поверхности яйца (Foe and Alberts, 1985). Такое пространственное подразделение ядра сохраняется в ходе развития, приводя к концепции [the concept] гетерохроматиновых «компартментов» в ядре. Эти компартменты могут поддерживать высокую концентрацию факторов, необходимых для формиро- вания гетерохроматина (таких как НР1 и HKMTs), и в то же время могут быть лишены факторов, необходи- мых для сборки эухроматина и экспрессии генов (таких как HATs и RNA pol II). Действительно, было показано, что близость к гетерохроматиновым массам, как по по- ложению вдоль по длине хромосомы, так и в трех изме- рениях, является одним из факторов в PEV. Было показано, что близость к массе центрического [centric] гетерохроматина влияет на мозаицизм как для эухроматиновых генов (примером которых является white*, см. выше), так и для гетерохроматиновых генов (наиболее изученными примерами которых являются light и rolled). Можно наблюдать, что гетерохроматино- вые гены, картированные в эти домены, обнаруживают мозаичность, когда перестройка помещает их в непо- средственной близости от эухроматина; обычно они демонстрируют противоположную зависимость, требуя для полной экспрессии нормальных уровней HP 1 и по- казывая усиление мозаичности, когда количество НР1 мало. Мозаицизм light зависит не только от его близости к эухроматину, но и от положения точки разрыва, а имен- но от расстояния от гетерохроматина, измеряемого по длине хромосомного плеча (Wakimoto and Hearn 1990). Аналогичные данные были опубликованы для rolled. Исследования brown dominant {bw°), эухроматинового гена, мозаицизм экспрессии которого был индуциро- ван вставкой повторяющейся ДНК, показали, что сдвиг в степени близости этого локуса к центрическому гете- рохроматину может приводить к усилению сайленсинга (если ближе) или подавлению сайленсинга (если даль- ше) (Henikoff et al., 1995). Аналогичным образом транс- локация четвертой хромосомы, несущей репортер white, в дистальную половину хромосомного плеча 2L или 2R приводит к резкой утрате сайленсинга; в ядрах слюнных желез это коррелирует с изменением во внутриядерном расположении, вплоть до того, что часто оказываются занятыми сайты, удаленные от хромоцентра (Cryder- manetal., 1999а). В недавнем исследовании с использованием микро- скопии высокого разрешения изучали как активность гена (используя антитела, специфичные к продук- ту), так и ядерную локализацию репортера (используя FISH — fluorescence in situ hybridization) в одной и той же клетке в нормальных временных рамках экспрес- сии. Инверсия, вызывающая мозаицизм white, а также bwD и трансген lacZ с мозаичной экспрессией изучались
6. Как формирование гетерохроматина «нацеливается» у Drosophila ? в дифференцирующихся глазных дисках или в глазах взрослых мух. В этом исследовании обнаружили силь- ную корреляцию между положением репортерного гена в клеточном ядре по отношению к перицентро- мерному гетерохроматину и уровнем экспрессии, что говорило в пользу существования гетерохроматиново- го «компартмента» и корреляции между положением в этом компартменте и сайленсингом гена (Harmon and Sedat, 2005). Однако эта корреляция не является абсо- лютной. Это неудивительно, при том что исследования с репортером white указывают на присутствие как эухро- матиновых, так и гетерохроматиновых доменов, чере- дующихся в маленькой четвертой хромосоме (которая всегда располагается вблизи массы перицентромерного гетерохроматина). Эти последние наблюдения указыва- ют на другие локальные детерминанты, вносящие вклад в упаковку хроматина в той или в другой форме. У D. melanogaster, согласно оценке по цитологическим критериям, одна треть генома является гетерохромати- новой. Сюда входят крупные блоки, которые фланки- руют центромеры, более мелкие блоки, связанные с те- ломерами, вся Y-хромосома и большая часть маленькой четвертой хромосомы. Центромерные районы состоят из крупных (0,2—1 млн о.) блоков сателлитной ДНК, чере- дующихся с «островками» сложных нуклеотидных по- следовательностей, обычно мобильных элементов (Le et al., 1995). Эти районы, хотя и бедны генами, не лишены их вовсе; согласно современным оценкам, в перицен- тромерном гетерохроматине находятся несколько со- тен генов (Hoskins et al., 2002). Теломеры Drosophila не содержат типичных повторов, обогащенных G, кото- рые наблюдаются в других местах, но состоят из копий ретротранспозонов НеТ-А и TART. Ассоциированные с теломерами последовательности (TAS — telomere-associ- ated sequences), блоки из повторов 102—103 нуклеотидов, обнаруживаются в проксимальном положении, и транс- генные репортеры white, вставленные в эти районы, де- монстрируют мозаичный фенотип. Хотя У-хромосома и несет гены для ряда факторов мужской фертильно- сти, основная масса этой хромосомы составлена из са- теллитной ДНК, и она остается конденсированной во всех клетках за исключением мужской зародышевой ли- нии. Размеры маленькой четвертой хромосомы порядка 4,3 млн о., в том числе около 3 млн о., состоящих из са- теллитной ДНК. Дистальные 1,2 млн о. могут считаться эухроматиновыми в том отношении, что они политени- зированы в слюнной железе (см. рис. 5.4), но, судя по их поздней репликации, полному отсутствию в них меио- тических обменов и по их связи с НР1, НР2 и НЗК9те2, они, по-видимому, являются гетерохроматиновыми (рис. 5.4). Плотность фрагментов транспозонов в этом районе в шесть—семь раз выше, чем в эухроматиновых плечах, по- добно участкам на границе между центрическим гетерохро- матином и эухроматином на других хромосомах (Kaminker et al., 2002). Интересно, что в исследованиях четвертой хро- мосомы с помощью P-элемента с репортером white, обсуж- давшегося выше (рис. 5.3а), обнаружили чередование как эухроматиновых доменов (приводящих к «красноглазому» фенотипу) так и гетерохроматиновых доменов (приводя- щих к мозаичному фенотипу) (Sun et al., 2004). Эти данные заставляют предполагать присутствие локальных элементов в ДНК, способных управлять формированием гетерохроматина или эухроматина. Ге- нетический скрининг на переключение фенотипа (с красной окраски на мозаичность и наоборот) показал, что локальные делеции или дупликации 5—80 т.о. ДНК, фланкирующей транспозонный репортер, могут при- водить к утрате или приобретению мозаичности, ука- зывая на наличие ^-действующих (на короткие рас- стояния) детерминантов сайленсинга (рис. 5.7). Этот сайленсинг зависит от НР1 и коррелирует с изменени- ем в структуре хроматина, как показывает изменение в доступности для нуклеаз; все это указывает на сдвиг от эухроматинового к гетерохроматиновому состоянию. Данные по картированию в одном из районов четвер- той хромосомы позволяют предполагать, что транспозон 1360 является мишенью для формирования гетерохро- матина, и показывают, что, коль скоро формирование гетерохроматина начинается в диспергированных по- вторяющихся элементах, оно может распространять- ся вдоль по длине четвертой хромосомы примерно на 10 т.о. или пока не столкнется с конкуренцией со сторо- ны эухроматинового детерминанта (Sun et al., 2004). На- блюдения, показывающие, что тандемные или инверти- рованные повторы репортерных Р- элементов приводят к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов, также позволяют предполагать наличие действующих на короткие расстояния czs-активных детерминантов, свя- занных с числом копий (Dorer and Henikoff, 1994). Такие ш-активные элементы в ДНК могли бы функ- ционировать посредством сиквенс-специфичного свя- зывания белка, способного включать формирование гетерохроматина Были идентифицированы белки, спец- ифически связывающиеся с некоторыми из сателлитных ДНК (например, DI — Aulner et al., 2002). Вывод о важ- ности этих взаимодействий был сделан, исходя из влия- ния специфичных для сателлитной ДНК веществ, связы- вающихся с ДНК и способных подавлять PEV (Janssen et al., 2000). Однако данные, полученные на дрожжах и рас- тениях (Elgin and Grewal, 2003; Matzke and Birchler, 2005; см. Главы 8 и 9), позволяют предложить другую модель, а именно, что некий основанный на RNAi механизм мог бы использоваться для «нацеливания» формирования ге- терохроматина на повторяющиеся элементы. Работы из нескольких лабораторий показали, что система RNAi у Drosophila имеется и играет важную роль в регуляции в ходе развития посредством посттранскрипционного сай- ленсинга генов (PTGS). D. melanogaster обладает двумя ге- нами, кодирующими белки DICER, и многочисленными генами (aubergine, AGO1, AGO2, spindle [известный также как homeless}, vasa intronicgene [E/G], armitage, FmrT), ко- дирующими компоненты или белки, необходимые для сборки индуцируемого РНК сайленсирутощего комплек- са (RISC) (Sontheimer, 2005). Участие этой системы пред- положили в PTGS повторяющихся последовательностей, особенно тандемно повторяющихся генов Stellate, не- скольких ретротранспозонов и трансгенов Alcohol dehy- rogenase (Adh) и в транскрипционном сайленсинге (TGS) трансгенов Adh (Aravin et al., 2001; Pal-Bhadra et al., 2002). Пал-Бхадра с соавторами (Pal-Bhadra et al, 2004) обнару-
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila Гетерохроматин Эухроматин Гетерохроматин Рис. 5.7. Возможная модель гетерохроматинового «нацеливания» dsRNA с повторяющихся последовательностей процессируется с помощью RISC и генерирует гипотетический «комплекс на- целивания», который управляет либо модификацией гистонов, либо ассоциацией с НР1 как начальным этапом в сборке гетеро- хроматина в сайте, идентифицированном малой ssRNA. Данные, полученные на четвертой хромосоме, позволяют предположить, что фрагменты ДНК-транспозона 1360 (оранжевые полосы) являются мишенью для формирования гетерохроматина: локальные делеции или дупликации, которые сдвигают положение репортера P-элемента (треугольник) в сторону от элемента 1360, ведут к утрате сайленсинга (красный треугольник обозначает красный глаз), тогда как близость к 1360 приводит к сайленсингу (треугольник с точками обозначает мозаичный глаз) (на основе данных Sun et al., 2004) жили при прямом тестировании, что мутации вpiwi (член семейства домена PAZ) и homeless (DEAD-боксовая гели- каза) подавляют PEV, связанный с тандемными порядка- ми гена white, и что мутации в piwi, aubergine и homeless подавляют сайленсинг трансгена white P[hsp70-w\ в пе- рицентромерном гетерохроматине или четвертой хромо- соме. Эта супрессия PEV была связана со значительным снижением уровня метилирования НЗК9. Связанные с повторами малые интерферирующие РНК (rasiRNAs) были идентифицированы с 40 % известных мобильных элементов (включая 1360) и других повторяющихся по- следовательностей (Aravin et al., 2003). В совокупности эти обсуждавшиеся выше результа- ты заставляют предполагать, что формирование гетеро- хроматина может зависеть как от ядерной локализации (возможно, создающих богатый пул требующихся бел- ков), так и от специфического «нацеливания» на основе RNAi-распознавания и процессинга двунитевой РНК с повторяющихся элементов, в особенности некоторых из ДНК-транспозонов. Такое «нацеливание» посред- ством RISC могло бы привлечь либо метилтрансферазу гистона НЗ, либо комплекс, включающий НР1 (либо и то, и другое) к сайту для включения процесса сборки, обсуждавшегося в разделе 4. 7. Не весь гетерохроматин идентичен Хотя в общих терминах гетерохроматин был описан выше, ясно, что гетерохроматиновые домены варьируют в деталях. Все гетерохроматиновые домены характери- зуются повторяющейся ДНК (см. выше), но это может варьировать от тандемных последовательностей корот- ких повторов (сателлитная ДНК), обнаруживаемых в блоках в центромерных районах, до высокой плотности перемежающихся повторяющихся последовательностей, что наблюдается в четвертой хромосоме. В то время как все гетерохроматиновые районы, по-видимому, ассо- циированы с НР1 и НЗК9ше2, ясно, что связанные с этим белковые комплексы должны отличаться в иных отношениях. Исследование влияния 70 разных модифи- каторов на разные гены, демонстрирующие мозаицизм (в том числе w"14, bwD, репортеры P-элемента в перицен- тромерном гетерохроматине или в порядке [array] TAS), показало, что на фоне существенного перекрывания в мишенях модификаторов имеет место удивительная сложность С помощью использованного набора тестов эти модификаторы разделили на семь разных групп с точки зрения их способности влиять на сайленсинг в данном компартменте (Donaldson et al., 2002). Интерес-
8. PEV, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у различных организмов но, что единственным модификатором в этой группе, влияющим на сайленсинг в порядке TAS, была новая аллель Su(var)3-9. Эти различия несомненно отражают изменения в локальной биохимии или в энзимах, используемых для этого. Например, цитологические результаты показыва- ют, что в то время, как НЗК9те2 сильно концентрирует- ся вдоль по длине четвертой хромосомы, ответственный за это энзим — это не SU(VAR)3-9 (Schotta et al., 2002; К.A. Haynes et al., неопубликовано). Даже в пределах перицентромерного гетерохроматина следует ожидать мозаицизм, принимая во внимание различия в состав- ляющих его основу блоках ДНК, которые варьируют от сателлитной ДНК до кластеров перемежающихся по- второв (Le et al., 1995), которые могли бы использовать разную смесь гетерохроматиновых белков. Последствия были видны в исследованиях, где изучали влияние раз- ных блоков перицентромерного гетерохроматина на экс- прессию с репортера, и можно было наблюдать, что сте- пень выраженности [severity] фенотипа зависит не просто от количества гетерохроматина в сА-конфигурации, но варьирует в зависимости от локального гетерохро- матинового окружения (Howe et al., 1995). Связанные с гетерохроматином белки, которые могут играть роль в специфических субдоменах, включают AT-hook бе- лок D1, преимущественно связанный с сателлитом III с плотностью 1,688 г/см3 (Aulner et al., 2002), и DDP1, мульти-КН-доменный белок, гомологичный вигилину, который связывается с богатой пиримидинами С-нитью додекасателлита (Cortes and Azonn, 2000). 8. PEV, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у различных организмов Явление мозаицизма, обусловленного эффектом положения (PEV), первоначально было установлено mDrosophla просто потому, что это был один из первых организмов, на которых для получения мутаций было использовано Х-излучение. Х-излучение с гораздо большей вероятностью, чем другие обычно используемые мутагены, индуцирует хромосомные перестройки, результатом которых может быть PEV. Сходные мутации были изолированы у мышей, где пятнистая окра- ска меха указывает на PEV Генетический анализ выявил вставку аутосомного района, несущего аллели дикого типа генов окраски меха, в Х-хромосому (Cattanach, 1961; Russel and Bangham, 1961). Мозаичность наблюдается только у самок, несущих эту вставку в сочетании с гомо- зиготной мутацией в исходных генах окраски меха. У этих самок аллель дикого типа становится инактивированной вследствие Х-инактивации путем гетерохроматиниза- ции (глава 17). У растений единственный несомненный случай PEV был описан у Oenothera blandina (Catcheside, 1939). В этих случаях, как и у Drosophila, PEV-сайленсинг эухроматиновых генов связан с перемещением этих генов в новое гетерохроматиновое окружение. Транскрипционный сайленсинг генов наблюдали так- же для повторяющихся последовательностей (RIGS; re- peat-induced gene silencing), особенно у растений. Анализ затрагиваемых последовательностей обнаружил появление эпигенетических меток (метилирование гистонов и ДНК), аналогичных тем, которые обнаруживаются в гетерохро- матине и в районах, сайленсированных PEV. Если ввести в Arabidopsis фрагменты ДНК, содержащие тандемно рас- положенные гены люциферазы, наблюдается мозаичная экспрессия люциферазы. Опять-таки, за наблюдаемый сайленсинг генов отвечает формирование гетерохромати- на. Лежащие в основе этого молекулярные механизмы кон- сервативны у высших эукариотических организмов. Центральной особенностью сайленсинга гетерохро- матиновых генов у Drosophila является взаимодействие НР1 с НЗК9те2 и НКМТ SU(VAR)3-9. НР1 консерва- тивен от дрожжей Schizosaccharomyces pombe до чело- века и неизменно связан с перицентромерным гетеро- хроматином. Гены НР1 человека можно использовать для «спасения» нехваток [deficiency] у Drosophila (Ma et al., 2001). Однако у растений НР1 как таковой не был идентифицирован. SU(VAR)3-9 представлен еще бо- лее широко, будучи идентифицирован у дробянковых дрожжей (Clr4), Neurospora (DIM5), Arabidopsis и мле- копитающих (SUV39H). Все эти гомологи (SU(VAR)3-9 катализируют метилирование НЗК9 и функционируют в формировании гетерохроматина. Опять-таки, транс- ген SUV39H1 человека может полностью компенси- ровать утрату эндогенного белка в мутантных линиях Drosophila (Schotta et al., 2002). У высших растений (Ara- bidopsis, рис и кукуруза) обнаружено несколько белков (SUVH), гомологичных SU(VAR)3-9 (Baumbusch et al., 200*1). Большое число HKMTs может отражать пластич- ность развития у растений или необходимость реаги- ровать на факторы внешней среды (см. дальнейшее обсуждение в главе 9). Четыре белка SUVH — SUVH1, SUVH2, SUVH 4 (КУР) и SUVH6 - были изучены де- тально (Jackson et al., 2002; Naumann et al., 2005). Bee они оказались метилтрансферазами H3K9 гистонов. SUVH2 играет центральную роль в контроле состояний гетерохроматина, обнаруживая зависимое от дозы влия- ние на формирование гетерохроматина, подобное тому, что сообщалось для SU(VAR)3-9 Drosophila (Naumann et al., 2005). Утрата функции SUVH2 сильно подавляет зависимый от повторов сайленсинг, а сверхэкспрессия вызывает значительное усиление такого сайленсинга у растений с люциферазными трансгенами. Другие гены, идентифицированные с помощью му- таций Su(var) Drosophila, кодируют белки с консерва- тивными функциями НКМТ SUV4-20 была охаракте- ризована у млекопитающих и у Drosophila (Schotta et al., 2004). У этих организмов она контролирует триметили- рование по Н4К20. Деметилазы гистонов, ацетилазы и деацетилазы также являются консервативными (Т. Ru- dolph et al., неопубликовано). Эволюционный консер- ватизм многих ключевых энзимов, контролирующих модификацию гистонов, говорит в пользу идеи гисто- нового кода (Jenuwein and Allis, 2001). Однако изучение специфичных для хроматина меток модификации ги- стонов, наблюдающихся у Drosophila, млекопитающих и растений (Arabidopsis), выявляет и некоторые специ- фичные для рода элементы.
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila В число существенных признаков конститутивного гетерохроматина у млекопитающих входят НЗК9шеЗ, H3K27mel и H4K20me3 (Peters etal., 2003; Rice etal., 2003; Schotta et al., 2004). Гетерохроматин Drosophila характери- зуется H3K9mel/me2, H3K27mel/me2/me3 и H4K20me3 (Schotta et al., 2002, 2004; Ebert et al., 2004). В противо- положность млекопитающим у Drosophila НЗК9шеЗ не- допредставлен. У млекопитающих H3K9mel не является меткой гетерохроматина. У Arabidopsis, как у Drosophila, H3K9mel/me2 — метки гетерохроматина, тогда как НЗК9шеЗ — эухроматиновая метка (Naumann et al., 2005). H3K27mel и H3K27me2 являются гетерохромати- новыми метками у Arabidopsis, тогда как эти же метки у Drosophila обнаруживаются в эухроматине и гетерохро- матине. НЗК27теЗ — исключительно эухроматиновая метка у Arabidopsis. H4K20mel у Arabidopsis является ге- терохроматиновым, но Н4К20те2 и Н4К20теЗ — эух- роматиновыми. Еще одно бросающееся в глаза различие между Arabidopsis и животными касается хромосомного распределения фосфорилирования H3S10. Эта метка яв- ляется гетерохроматиновой у Arabidopsis (A. Fischer and G Reuter, неопубликовано), но эухроматиновой у Droso- phila (Wang et al., 2001; Ebert et al., 2004). Сходство и раз- личие в специфичных для гетерохроматина метках моди- фикации гистонов между млекопитающими, Drosophila и Arabidopsis несомненно указывают на то, что гистоновый код не является полностью универсальным, а, скорее, существует в виде разных диалектов. • 9. Подведение итогов: мы не знаем о гетерохроматине очень многое Хотя PEV предоставил нам чрезвычайные возможности для изучения формирования гетерохроматина и сай- ленсинга генов, сам этот фенотип остается загадочным. Почему мы наблюдаем мозаичный паттерн сайленсинга? Что нарушает равновесие, приводя к переключению с активного состояния в «молчащее» или наоборот? По- чему этот эффект оказывается клонально наследуемым? PEV обычно анализируется как проблема поддержания репортерного гена в состоянии «ВКЛЮЧЕНО» или «ВЫКЛЮЧЕНО», но во многих случаях (особенно при использовании репортеров на базе Р- элемента) наблюда- ются красные фасетки на желтом или бледно-оранжевом фоне, заставляя предполагать, что экспрессия генов была снижена единообразно, но что в некоторых клетках эта даун-регуляция была утрачена Тщательный анализ таких линий мог бы привести к идентификации состояний хроматина с промежуточным влиянием на экспрессию генов. Хотя эти данные свидетельствуют в пользу грубой модели утраты или поддержания сайленсинга на основе действия масс, окончательная модель будет сложной, включающей многочисленные взаимодействующие белки (см., например, предложения Henikoff, 1996) Соблазнительно рассматривать нуклеосому как сумми- рующее устройство, собирающее модификации и вы- дающее результаты в терминах как конкретных паттернов связывания белков, так и возможности ремоделинга в этом районе. Состояние хроматина могло бы тогда отра- жать результаты конкуренции за достижение различных модификаций. Такая модель могла бы быть полезной в рассортировке отмеченных выше эффектов. Она также совместима с наблюдениями, показывающими, что частота сайленсинга репортера, зависимого от GAL4, чувствительна к уровню содержания GAL4 (Ahmad and Henikoff, 2001). Система RNAi обеспечивает правдоподобный механизм «нацеливания» формирования гетерохроматина предполо- жительно путем «нацеливания» комплекса, включающе- го НР1, НКМТ НЗК9 или оба этих белка. Однако многие вопросы остаются открытыми. Каков источник dsRNA? Должна ли эта РНК продуцироваться в ^-конфигурации (на что указывают результаты, полученные на S. pombe) или же она может действовать в /тага-конфигурации (что заставляют предполагать результаты, полученные на рас- тениях); т.е. может ли образование dsRNA с одного сайта 1360 привести к «нацеливанию» на все сайты 136(Р. Явля- ются ли все повторяющиеся элементы потенциальными мишенями? Это кажется маловероятным, если учесть опи- санные выше данные анализа четвертой хромосомы. Если ключевую роль играет выборка повторяющихся элементов, что определяет этот выбор? Результаты, полученные на четвертой хромосоме, свидетельствуют, что плотность и распределение критичных повторяющихся элементов бу- дет влиять на экспрессию генов, находящихся поблизости Это говорит о необходимости выявлять этот признак при секвенировании генома. Каким образом осуществляется распространение ге- терохроматина и что является нормальными барьерами для такого распространения? Отметим, что нет никаких данных в пользу транзитивной RNAi у Drosophila, т.е. распространения сайленсинга на мишени в транскрип- те, лежащие «вверх по течению» от последовательности dsRNA (Celotto and Gravely, 2002). Это согласуется с от- сутствием доказательств в пользу какой-либо зависимой от РНК РНК-полимеразы в этой системе. Система сбор- ки на основе взаимодействий НР1, НЗК9те2 и НКМТ вполне могла бы объяснить распространение гетерохро- матина приблизительно на 10 т.о., как это наблюдается на четвертой хромосоме; этот тип распространения мог бы ограничиваться сайтом ацетилирования гистонов. Но что можно сказать о распространении, происходящем в пере- стройках, которое, как оказалось, простирается на сотни тысяч оснований? Эта форма распространения не являет- ся непрерывной [contiguous], но, опять-таки, критически зависит от белков хроматина, в особенности от JIL-1, вы- ступающего в роли, которая не зависит от его киназной активности. Эти и другие вопросы остаются без ответа. Благодарности Мы благодарим Gabriella Farkas за создание используе- мых здесь рисунков, Anja Ebert за иммунопитологические фотографии и членов наших исследовательских групп за критический просмотр этой главы. Наша работа под- держана Deutsche Forschungsgemeinschaft и Epigenome Network of Excelelnce of the European Union (G.R.) и грантами National Institutes of Health (S.C.R.E.).
Литература Ahmad К. and Henikoff S. 2001. Modulation of a transcription fac- tor counteracts heterochromatin gene silencing in Drosophila. Cell IM: 839-847. Aravin A.A., Numova H. M., Tulin A. V., Vagin, V.V, Rozovsky Y.M., and Gvozdev V.A. 2001. Double-stranded RNA-mediated silenc- ing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11: 1017-1027. Aravin A. A., Lagos-Quintana M.. Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder B., Gaasterland T., Meyer J., and Tuschl T. 2003. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev. Cell 5: 337-350. Ashbumer M., Golic K.G., and Hawley R.S. 2005a. Chromosomes. In Drosophila: A laboratory handbook, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 24-57. Ashbumer M., Golic K.G., and Hawley R.S. 2005b. Position effect variegation. In Drosophila: A laboratory handbook, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 1007-1049. Aulner N., Monod C, Mandicourt G., Jullien D., Cuvier O., Sall A., Janssen S., Laemmli U.K, and Kas E. 2002. The AT-hook protein DI is essential for Drosophila melanogaster development and is implicated in position-effect variegation. Mol. Cell. Biol. 22: 1218-1232. BaksaK., Morawietz H., Dombradi V, Axton M., Taubert H., Szabo G., Torok L, Gyurkovics H., Szoor B., Gloover D., et al., 1993. Mutations in the phosphatase 1 gene at 87B can differentially affect suppression of position-effect variegation and mitosis in Drosophila melanogaster. Genetics 135: 117-125. Bannister A.J., Zegermann P., Patridge J.E, Miska E.A., Thomas J.O., Allshire T.C., and Kouzarides T. 2001. Selective recogni- tion of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-124. Baumbusch L.O., ThorstensenT, Krauss V, Fischer A., Naumann K., Assalkhou R., Schulz L, Reuter G., and Aalen R. 2001. The Arabidopsis thaliana genome contains at least 29 active genes encoding SET domain proteins that can be assigned to four evo- lutionary conserved classes. Nucleic Acids Res. 29: 4319-4333. Belyaeva E.S., Demakova O.V., Umbetova G.H., and Zhimulev I.F. 1993. Cytogenetic and molecular aspects of position-effect variegation in Drosophila melanogaster V. Heterochromatin- associated protein HP1 appears in euchromatic chromosomal regions that are inactivated as a result of position-effect variega- tion. Chromosoma 102: 583-590. Bender W., Spierer P, and Hogness D.S. 1983. Chromosome walk- ing and r jumping to isolate DNA from the Ace and rosy loci and the bithorax complex of Drosophila melanogaster. J. Mol. Biol. 168:17-33. Birchler J.A., BhadraU., Rabinow L., Linsk R., andNguyen-Huyuh A.T. 1994. Weakener of white (Wow), a gene that modifies the expression of white eye color locus and that suppresses posi- tion effect variegation in Drosophila melanogaster. Genetics 137: 1057-1070. Bird A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16: 6-21. Bushey D. and Locke J. 2004. Mutations in Su(var)205 and Su(var)3-7 suppress P-element-dependent silencing in Droso- phila melanogaster. Genetics 168: 1395-1411. Catcheside D.G. 1939. Aposition effect in Oenothera. J. Genet. 38: 345-352. Cattanach B.M. 1961. A chemically-induced variegated-type position effect in the mouse. Z. Vererbungsl. 92: 165-182. Celotto A.M. and Graveley B.R. 2002 Exon-specific RNAi: A tool for dissecting the functional relevance of alternative splicing. RNA 8: 718-724. Cleard F. and Spierer P. 2001. Position-effect variegation in Droso- phila: The modifier Su(var)3-7 is a modular DNA-binding protein. EMBO Rep. 21: 1095-1100. Cleard E, Delattre M., and Spierer P. 1997. SU(VAR)3-7 ^Drosophila heterochromatin-associated protein and companion of HP1 in the genomic silencing of position-effect variegation. EMBO J. 16: 5280-5288. Cooper K.W 1959. Cytogenetic analysis of major heterochromatic elements (especially Xh and Y) in Drosophila melanogaster and the theory of “heterochromatin”. Chromosoma 10: 535-588. Cortes A. and Azorin F. 2000. DDP1, a heterochromatin-asociated multi-KH-domain protein of Drosophila melanogaster, interacts specifically with centromeric satellite DNA sequences. Mol. Cell. Biol. 20: 3860-3869. Cryderman D.E., Morris E.J., Biessmann H., Elgin S.C.R., and Wallrath L.L. 1999a. Silencing at Drosophila telomeres: Nuclear organization and chromatin structure play critical roles. EMBO J. 18: 3724-3735. Cryderman D. E., Tang H., Bell C, Gilmour D.S., and Wallrath L.L. 1999b. Heterochromatic silencing of Drosophila heat shock genes acts at the level of promoter potentiation. Nucleic Acids Res. 27. 3364-3370. Czermin B., Schotta G., Hblsmann B.B., Brehm A., Becker P.B., Reu- . ter G., and Imhof A. 2001. Physical and functional interaction of SU(VAR)3-9 and HDAC1 m Drosophila. EMBO Rep. 2: 915-919. Delattre M., Spierer A., Tonka C.H., and Spierer P. 2000. The ge- nomic silencing of position-effect variegation in Drosophila mela- nogaster. Interaction between the heterochromatin-associated proteins Su(var)3-7 and HPL J. Cell Sci. 113:4253-4261 Demerec M. and Slizynska H. 1937. Mottled white 258-18 of Droso- phila melanogaster. Genetics 22: 641-649. Donaldson K.M., Lui A., and Karpen G.H. 2002. Modifiers of terminal deficiency-associated position effect variegation in Drosophila. Genetics 160: 995-1009. Dorer D.R. and Henikoff S. 1994. Expansion of transgene repeats causes heterochromatin formation and gene silencing in Droso- phila. Cell 77: 993-1002. Dorn R., Krauss V., Reuter G., and Saumweber H. 1993a. The enhancer of position-effect variegation E(var)93D, codes for a chromatin protein containing a conserved domain common to several transcriptional regulators. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11376-11380. Dorn R., Szidonya J., Korge G., Sehnen M., Taubert H., Archouk- ieh L, Tschiersch B., Morawietz H., Wustmann G., Hoffmann G., and Reuter G. 1993b. P Transposon-induced dominant enhancer mutations of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Genetics 133: 279-290. Ebert A., Schotta G., Lein S., Kubicek S., Krauss V, Jenuwein T, and Reuter G. 2004. Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila. Genes Dev. 18: 2973-2983. Eissenberg J.C., Morris G.D., Reuter G., and Hartnett T. 1992. The heterochromatin-associated protein HP-1 is an essential protein
Глава 5. Эффект положения мозаичного типа, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у Drosophila in Drosophila with dosage-dependent effects on position-effect variegation. Genetics 131: 345-352. Eissenberg J.C., James T.C., Foster-Hartnett D.M., HartnettT, Ngan V., and Elgin S.C.R. 1990. A mutation in a heterochromatin- specific chromosomal protein is associated with suppression of position effect variegation in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9923-9927. Elgin S.C.R. and Grewal S.LS. 2003. Heterochromatin: Silence is Golden. Curr. Biol. 13: R895-R898. Fanti L. and Pimpinelli S. 2004. Immunostaining of squash prepara- tions of chromosomes of larval brains. Methods Mol. Biol. 247: 353-361. Fanti L., Giovinazzo G., Berloco M., and Pimpinelli S. 1998. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Droso- phila. Mol. Celli. 527-538. Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., and Krach F. 1994. The trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. Nature 371: 806-808. Fischle W., Wang Y. Jacobs S.A., Kim Y, Allis C.D., and Khorasani- zadeh S. 2003. Molecular basis for the discrimination of repres- sive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev. IT. 1870-1881. Flybase 2005. The Drosophila database. Available from World Wide Web at the URLs http://morganZharvard.edu and http://www. ebi. ac. uk/flybase; Foe V.E. and Alberts B.M. 1985. Reversible chromosome con- densation induced in Drosophila embryos by anoxia: Visual- ization of interphase nuclear organization. J. Cell Biol. 100: 1623-1636. Harmon B. and Sedat J. 2005. Cell-by-cell dissection of gene ex- pression and chromosomal interactions reveals consequences of nuclear reorganization. PLoS Biol. 3: e67. Hartmann-Goldstein I. J. 1967. On the relationship between hetero- chromatization and variegation in Drosophila, with special refer- ence to temperature sensitive periods. Genet. Res. 10: 143-159. Henikoff S. 1996. Dosage-dependent modification of position-effect variegation in Drosophila. BioEssays 18: 401-409. Henikoff S., Jackson J.M., and Talbert P.B. 1995. Distance and pairing effects on the brownDominant heterochromatic element in Drosophila. Genetics 140: 1007-1017. Hoskins R.A., Smith C.D., Carlson J.W, Carvalho A.B., Halpern A., Kaminker J.S., Kennedey C, Mungall C.J., Sullivan B.A., Sutton G.G., et al., 2002. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biol. 3: RESEARCH0085 Howe M., Dimitri P, Berloco M.. and Wakimoto B.T 1995. c£s-effects of heterochromatin on heterochromatic and euchromatic gene activity in Drosophila melanogaster. Genetics. 140: 1033-1045. Jackson J.P., Lindroth A.M., CaoX., and Jacobsen S.E. 2002. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPONITE histone H3 methyl -transferase. Nature 416: 556-560. James TC. and Elgin S.C.R. 1986. Identification of a nonhistone chromosomal protein associated with heterochromatin in Droso- phila melanogaster and its gene. Mol. Cell Biol. 6: 3862-3872. James TC, Eissenberg J.C, Craig C, Dietrich V, Hobson A., and Elgin S.C.R. 1989. Distribution patterns of HP1, a heterochro- matin-associated nonhistone chromosomal protein of Drosophila Eur. J. Cell Biol. 50: 170-180. Janssen S., Cuvier O., Muller M, and Laemmli U.K. 2000. Specific gain- and loss-of-function phenotypes induced by satellite-spe- cific DNA-binding drugs fed to Drosophila melanogaster. Mol Cell 6: 1013-1024. Jenuwein T. and Allis CD. 2001. Translating the histone code. Sci- ence 293: 1074-1080. Jones R.S. and Gelbart WM. 1993. The Drosophila Polycomb-group gene Enhancer of zeste contains a region with sequence similarity to trithorax. Mol. Cell. Biol. 13: 6357-6366. Kaminker J.S. Bergman CM., Kronmiller B., Carlson J., Svir- skas R., Patel S„ Frise E., Wheeler D.A., Lewis S.E., Rubin CM., et al., 2002. The transposable elements of the Drosophila melanogaster genome: A genomics perspective. Genome Biol. 3: RESEARCH0084. Karpen G.H. and Spradling A.C. 1990. Reduced DNA polyteniza- tion of a minichromosorne region undergoing position-effect variegation in Drosophila. Cell 63: 97-107. Krauss V. and Reuter G. 2000. Two genes become one: The genes encoding heterochromatin protein SU(VAR)3-9 and translation initiation factor subunit elF-2y are joined to a dicistronic unit in holometabolic insects. Genetics 156: 1157-1167. Kunert N., Marhold J., Stanke J„ Stach D., and Lyko F. 2003. A Dnmt2-like protein mediates DNA methylation in Drosophila. Development 130: 5083-5090. Lachner M., O’Carrol] D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T. 2001. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120. Laible G., Wolf A., Dorn R., Reuter C, Nislow C, Lebesorger A., Popkin D., Pillus L., and Jenuwein T 1997. Mammalian homo- logues of the Polycomb-group gene Enhancer of zeste mediate gene silencing in Drosophila heterochromatin and at S. cerevisiae. EMBO J. 16: 3219-3232. Larsson J., Zhang J., and Rasmuson-Lestander A. 1996. Mutations in the Drosophila melanogaster S-adenosylmethionine synthase suppress position-effect variegation. Genetics 143: 887-896. Le M.H., Duricka D., and Karpen G.H. 1995. Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochromatin. Genetics 141: 283-303. Locke J.. Kotarski M.A.,and Tartof K.D. 1988. Dosage-dependent modifiers of position effect variegation in Drosophila and a mass action model that explains their effect. Genetics 120: 181-198. Lu B.Y, Bishop C.P., and Eissenberg J.C 1996. Developmetaltiming and tissue specificity of heterochromatin-mediated silencing. EMBO J. 15: 1323-1332. Ma J., Hwang K.K., Worman H.J., Courvalin J.C, and Eissenberg J.C. 2001. Expression and functional analysis of three isoforms of human heterochromatin-associated protein HP1 in Drosophila. Chromosoma 109: 536-544. Martienssen R.A. and Colot V. 2001. DNA methylation and epige- netic inheritance in plants and filamentous fungi. Science 293: 1070-1074. Mason J.M., Ransom J., and Konev A.Y. 2004. A deficiency screen for dominant suppressors of telomeric silencing in Drosophila. Genetics 168: 1353-1370. Matzke M.A. and Birchler J.A. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6: 24-35 Mottus R., Sobels R.E., and Grigliatti T.A. 2000. Mutational analysis of a histone deacetylase in Drosophila melanogaster: Missense mutations suppress gene silencing associated with position effect variegation. Genetics 154: 657-668. Muller H.J. 1930. Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila. J. Genet. 22: 299-334.
Naumann К., Fischer A., Hofmann I., Krauss V., Phalke S., Irmler K., Hause G., Aurich A.C., Dorn R., Jenuwein T, and Reuter G. 2005. Pivotal role oL4rSUVH2 in control of heterochromatic histone methylation and gene silencing in Arabidopsis. EMBO J. 24: 1418-1429. Pal-Bhadra M., Bhadra LL, and Birchler J.A. 2002. RNAi related mechanisms affect both transcriptional and post-transcriptional transgene silencing in Drosophila. Mol. Cell 9: 315-327. Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., and Elgin S.C.R. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-672. Paro R. and Hogness D.S. 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 263-267. Peters A.H.F.M., Kubicek S., Mechtler K., OSullivan J., Derijck A.A.H.A., Perez-Burgos L., Kohlmaier A., Opravil S., Tachibana M., Shinkai Y., et al., 2003. Partitioning and plasticity of repres- sive histone methylation states in mammalian chromatin. Mol. Cell 12: 1577-1589. Platero J.S., Sharp E.J., Adler P.N., and Eissenberg J.C. 1996. In vivo assay for protein-protein interaction using Drosophila chromo- somes. Chromosoma 104: 393-404. Rea S., Eisenhaber R, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z-W, Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., and Jenu- wein T. 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599. Reuter G., Werner W, and Hofmann H.J. 1982. Mutants affecting position-effect heterochromatinization in Drosophila melano- gaster. Chromosoma 85: 539-551. Reuter G., Wolff I., and Friede B. 1985. Functional properties of the heterochromatic sequences inducing w™4 position- effect variegation in Drosophila melanogaster. Chromosoma 93:132-139. Reuter G., Giarre N., Farah J., Gausz J., Spierer A., and Spierer P. 1990. Dependence of position-effect variegation in Drosophila on dose of a gene encoding an unusual zinc-finger protein. Nature 344:219-223. Rice J.C, Briggs S.D., Ueberheide B., Barber CM., Shabanowitz J., Hunt D.F., Shinkai Y., and Allis CD. 2003. Histone methyltrans- ferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains. Mol. Cell 12: 1591-1598. Richards E.J. and Elgin S.C.R. 2002. Epigenetic codes for het- erochromatin formation and silencing: Rounding up the usual suspects Cell 108: 489-500. Russel L.B. and Bangham J.W 1961. Variegated type position effects in the mouse. Genetics 46: 509-525. Schotta C., Ebert A., Krauss V, Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T, and Reuter G. 2002. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. EMBO J. 21:1121-1131. Schotta C., Ebert A., Dorn R., and Reuter G. 2003. Position-effect variegation and the genetic dissection of chromatin regulation in Drosophila. Semin. Cell Dev. Biol. 14: 67-75. Schotta G., Lachner M., Sarma K., Ebert A., Sengupta R., Reuter G., Reinberg D., and Jenuwein T. 2004. A silencing pathway to induce H3-K9 and H4-K20 trimethylation at constitutive het- erochromatin. Genes Dev. 18: 1251-1262. Schultz J. 1950. Interrelations of factors affecting heterochromatin- induced variegation in Drosophila. Genetics 35: 134. Seum C., Pauli D., Delattre M., Jaquet Y, Spierer A., and Spierer P. 2002. Isolation of Su(var)3- /mutations by homologous recombi- nation in Drosophila melanogaster. Genetics 161: 1125-1136. Shaffer C.D., Stephens G.E., Thompson B.A., Punches L., Bemat J.A., Craig C.A., and Elgin S.C.R. 2002. Heterochromatin pro- tein 2 (HP2), a partner of HP1 in Drosophila heterochromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 14332-14337. Shi Y, Lan E., Matson C., Mulligan P, Wlietstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., and ShiY 2005. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953. Silver L.M., and Elgin S.C.R. 1976. A method for determination of the in situ distribution of chromosomal proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 423-427. Sinclair D.A.R., Mottus R.C, and Grigliatti TA. 1983. Genes which suppress position effect variegation in Drosophila melanogaster are clustered. Mol. Gen. Genet. 191: 326-333. Sinclair D.A.R., Clegg N.J, Antonchuk J, Milner T.A., Stankunas K., Ruse C, Grigliatti T.A., Kassis J., and Brock H.W 1998. En- hancer of Polycomb is a suppressor of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Genetics 148: 211-220. Sontheimer E.J. 2005. Assembly and function of RNA silencing complexes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 127-138. Spofford J.B. 1967. Single-locus modification of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. I. white variegation. Genetics 57: 751-766. Stephens G.E., Craig C.A., Lr'Y, Wallrath L.L., and Elgin S.C.R. 2003. Immunofluorescent staining of polytene chromosomes: Exploiting genetic tools. Methods Enzymol. 376: 372-393. Sun F.-L., Cuaycong M.H., and Elgin S.C.R. 2001. Long-range nucleosome ordering is associated with gene silencing in Droso- phila melanogaster pericentromeric heterochromatin. Mol. Cell. Biol. 21: 2867-2879. Sun F.-L., Haynes K., Simpson C.L., Lee S.D., Collins L., Wuller J., Eissenberg J.C., and Elgin S.C.R. 2004. czs-acting determi- nants of heterochromatic formation on Drosophila melanogaster chromosome four. Mol. Cell. Biol. 24: 8210-8220. Tartof K.D.. Hobbs C., and Johnes M. 1984. A structural basis of variegating position effects. Cell 37: 869-878. Tschiersch B., Hofmann A., Krauss V, Dorn R., Korge G., and Reuter G. 1994. The protein encoded by the Drosophila position effect variegation suppressor gene Su(var)3-9cowMmes domains of antagonistic regulators of homeotic gene complexes. EMBO J. 13: 3822-3831. Wakimoto B.T. and Heam M.G. 1990. The effects of chromosome rear- rangements on the expression of heterochromatic genes in chromo- some 2L of Drosophila melanogaster. Genetics 125: 141-154. Wallrath L.L. and Elgin S.C.R. 1995. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev. 9: 1263-1277. Wallrath L.L., Gunter V.P., Rosman L.E., and Elgin S.C.R. 1996. DNA representation of variegating heterochromatic P element inserts in diploid and polytene tissue of Drosophila melanogaster. Chromosoma 104:519-527. Wang Y, Zhang W, Jin Y, Johansen J., and Johansen K.M. 2001. The JIL-1 tandem kinase mediates histone H3 phosphorylation and is required for maintenance of chromatin structure in Drosophila. Cell 105: 433-443. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Fomina O.V, Protopopov M.O., and Bolsh- kov VN. 1986. Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. Chromosoma 94:492-504.
ГЛАВА 6 ГРИБЫ КАК МОДЕЛЬНЫЕ ОРГАНИЗМЫ ДЛЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ: SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE И NEUROSPORA CRASSA Robin С. Allshire1 и Eric U. Selker2 ’ Wellcome Trust Center for Cell Biology, The University of Edinburgh, Edinburgh E119 3JR, Scotland, United Kingdom institute of Molecular Biology, University of Oregon, Eugene, Oregon 97403-1229 Содержание: Общее резюме 1. Schizosaccharomyces pombe: организм 1.1. Сайленсинг хроматина у S. pombe отличает- ся от такового у S. cerevisiae 1.2. Гены, помещенные в центромеры дробянко- вых дрожжей, сайленсированы 1.3. Центромеры дробянковых дрожжей состоят из разных гетерохроматиновых и централь- ных кинетохорных доменов 1.4. Центромерные внешние повторы без посто- ронней помощи делают возможной сборку «молчащего» хроматина 1.5. РНК-интерференция направляет сборку «молчащего» хроматина 1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК- полимеразой II связывает RNAi с модифика- циями хроматина 1.7. «Молчащий» хроматин в центромерах необ- ходим для опосредования когезии сестрин- ских центромер и нормальной сегрегации хромосом 1.8. Эпигенетическое наследование функцио- нального состояния центромеры 1.9. Различные механизмы сайленсинга у гри- бов 2. Neurospora crassa: история и особенности орга- низма 2.1. Метилирование ДНК у Neurospora 2.2. RIP — система защиты генома, имеющая как генетические, так и эпигенетические аспекты 2.3. Исследования реликтов RIP позволило про- никнуть в контроль метилирования ДНК 2.4. «Подавление» (quelling) 2.5. Мейотический сайленсинг, осуществляемый неспаренной ДНК (MSUD) 2.6. Вероятные функции и практическое исполь- зование RIP, «подавления» и MSUD 3. Заключительные замечания Благодарности Литература
1. Schizosaccharomyces pombe: организм ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Грибы дают нам превосходные модели для понимания структуры и функции хроматина как в активно транскри- бируемых районах (эухроматин), так и в транскрипционно «молчащих» районах (гетерохроматин). Почкующиеся дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, явились бесценной эука- риотической моделью для изучения структуры хроматина, связанной с транскрипцией в эухроматиновых районах, и для создания парадигмы для «молчащего» хроматина. С другой стороны, дробянковые дрожжи Schizosaccharomyces pombe и нитчатый гриб Neurospora crassa явились эффек- тивным средством для исследования форм сайленсинга, более тесно связанных с таковыми у высших эукариот. У этих грибов гетерохроматиновые районы сравнительно малы и несущественны для жизнеспособности, что делает их более легкими для расчленения [to dissect] и манипу- лирования. Наше понимание гетерохроматина вокруг центромерных и теломерных районов достигло наиболь- ших успехов в работе с дрожжами S. cerevisiae и S. pombe; однако механизм сайленсинга хроматина, используемый S.pombe, демонстрирует особенности, консервативные и у этих дрожжей, и у гетерохроматиновых районов выс- ших эукариот. Действительно, оба гриба, обсуждаемые в этой главе, — N. crassa и S. pombe — контрастируют с S. cerevisiae в том отношении, что они используют РНК- интерференцию (RNAi), метилирование гистона НЗ по лизину 9 и белки типа белка 1 гетерохроматина (НР1) для формирования «молчащего» гетерохроматина способом, который консервативен или сходен с таковым у растений и многоклеточных животных. Кроме того, N. crassa широко использует метилирование ДНК, являющееся характер- ной чертой гетерохроматина у многих высших эукариот и классическим эпигенетическим феноменом. Сначала об- суждаются природа и функции гетерохроматина у S. pombe после краткого знакомства с этим организмом. Затем мы обратимся к N. crassa, чтобы продемонстрировать вклад этого нитчатого гриба в эпигенетические исследования. 1. Schizosaccharomyces pombe: организм Дробянковые дрожжи, 5. pombe, обнаружены при броже- нии, связанном с производством пива в субтропических регионах; «pombe», в сущности, и означает «пиво» на язы- ке суахили. 5. pombe, в основном, являются гаплоидными (1N) одноклеточными организмами. В богатой питатель- ными веществами среде клетки дикого типа претерпева- ют митотическое деление приблизительно каждые 2 часа. Но можно использовать целый ряд условий или условных мутантов, чтобы заблокировать клетки на разных стади- ях клеточного цикла или синхронизировать клеточные культуры в G/S, G2 или в метафазе. Это особенно полез- но, поскольку фаза G( у быстро растущих культур очень короткая, и клетки почти немедленно переходят после цитокинеза в фазу S; основная часть клеточного цикла приходится на G2 (рис. 1) (Egel, 2004). Подобно S. cerevisiae, S. pombe может переключать- ся с одного из противоположных типов спаривания на другой; эти типы спаривания называются Плюс (+) и • Конъюгация Ш| о П о 1 Л \ Слияние ядер, ; \ репликация, Прорастание j рекомбинация О О О О I* Q ] [(о о\о\ оч|] [ О ] Мейоз II Споруляция *4_____ [ о о о о 1 Рис. 6.1. Жизненный цикл дробянковых дрожжей S. pombe Дробянковые дрожжи имеют короткую G1, занимающую менее 10 % клеточного цикла (покрытая пунктиром площадь расширена для облегчения восприятия). В богатой питательными веществами среде клетки, находящиеся в фазе G1, переходят в фазу S, за ко- торой следуют длительная G2 (~70 % клеточного цикла), митоз и цитокинез. В условиях азотного голодания клетки противо- положных типов спаривания (+ и -) конъюгируют после чего ядра сливаются в процессе, называемом кариогамией. Пре- мейотическая репликация и рекомбинация делают возможным прохождение мейоза I и II; в результате образуются четыре ядра, которые обособляются в четыре споры, заключенные в аск. Перенос в среду, богатую питательными веществами вызывает прорастание спор и возобновление вегетативного клеточного цикла Минус (-). Типы спаривания эквивалентны диморфным полам у высших эукариот, хотя они гаплоидны. Инфор- мация для обоих типов спаривания находится в геноме в виде эпигенетически регулируемых «молчащих» кас- сет — локусов mat2-P(+} или mat3-M(~). Эти «молча- щие» локусы обеспечивают генетическую матрицу для идентичности по типу спаривания, но сам тип спари- вания определяется тем, какая конкретная информация (+ или -) находится в активном локусе matl Переклю- чение информации в активном локусе matl (и, следо- вательно, типа спаривания) происходит путем реком- бинации между «молчащим» локусом и локусом matl в соответствии со строгим паттерном (Egel, 2004). В усло- виях азотного голодания клетки перестают делиться и останавливаются в G . что активирует половую фазу
108 Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований. Schizosaccharomyces pombe жизненного цикла — конъюгацию пар клеток + и — с образованием диплоидных зигот (рис. 6.1). После спа- ривания и слияния ядер происходит премейотическая репликация (увеличивающая содержание ДНК с 2N до 4N). затем происходят спаривание и рекомбинация го- мологичных хромосом, и за этим следует редукционное деление мейоза 1 и эквационное деление мейоза II. Это дает четыре отдельных гаплоидных ядра (1N), которые инкапсулируются в споры, заключенные в аск. По- следующее предоставление богатого источника пита- тельных веществ делает возможным прорастание спор и возобновление вегетативного роста и митотического деления клеток. Были изолированы или сконструированы непереклю- чающиеся дериваты, у которых все клетки относятся либо к «+»-, либо к «-»-типу спаривания. Это облегчает кон- тролируемое спаривание между штаммами разных гено- типов. Хотя в норме S. pombe гаплоидны, можно отселек- тировать диплоидные штаммы Такие диплоидные клетки могут затем делиться митозом в ходе вегетативного роста до начала азотного голодания, когда они также претерпе- вают мейоз и образуют «азиготические аски» (рис. 6.1). 1.1. Сайленсинг хроматина у S. pombe отличается от такового у S. cerevisiae Дробянковые дрожжи являются очень полезным модель- ным организмом для изучения «молчащего» хроматина и связанных с этим эпигенетических эффектов. Они непохожи на 5. cerevisiae, но более сходны с N. crassa, рас- тениями и многоклеточными животными в отношении механизмов, которые они используют для достижения сайленсинга через гетерохроматин. И у S. cerevisiae, и у S. pombe теломеры и районы локусов типа спаривания в геноме подвержены сайленсингу, и, кроме того, у S. pombe сайленсинг обнаруживают центромеры. Однако, как описано в главе 4,5. cerevisiae используют для достижения сайленсинга хроматина уникальный набор белков — белки Sir. С другой стороны, дробянковые дрожжи и другие эукариоты, по-видимому, используют сочетание различных модификаций гистонов (в частности, мети- лирование гистона НЗК9) и белки РНК-интерфернции (RNAi) для того, чтобы сайленсировать хроматин. Как детально обсуждается ниже, в исследованиях на S. pombe обнаружили, что этот «молчащий» хроматин имеет су- щественное значение для функционирования каждого специализированного района гетерохроматина (т.е. центромер и локусов типа спаривания). В центромерах гетерохроматин необходим для обеспечения нормаль- ного расхождения хромосом (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1995), тогда как в локусах типа спаривания он облегчает и регулирует переключение типа спаривания (обзор см. Egel, 2004). Кроме того, «молчащий» хроматин формируется по соседству с теломерами, хотя для этого теломерного «молчащего» хроматина еще нужно найти функцию (Nimmo et al., 1994; Kanoh et al., 2005). Мар- керные гены, вставленные в рДНК, тоже сайленсируются (Thon and Verhein-Hansen 2000; Cam et al., 2005). В отличие от N. crassa и высших эукариот, у S. pombe, по-видимому, отсутствует сколько-нибудь заметное ме- тилирование ДНК (Wilkinson et al., 1995) — обычный механизм, используемый для сайленсирования хрома- тина у многих эукариот (главы 9 и 18); так, сайленсинг у дробянковых дрожжей опосредован главным образом модификациями хроматина. Как обсуждается ниже, для установления этих модификаций и, таким образом, «молчащего» хроматина используется машинерия RNAi. 1.2. Гены, помещенные в центромеры дробянковых дрожжей, сайленсированы Формирование гетерохроматина в центромерах дробян- ковых дрожжей важно для обеспечения нормального расхождения хромосом при делении ядра. Исследования показали, что центромера в действительности состоит из двух различных хроматиновых структур: гетерохроматина и содержащего CENP-Акинетохорного хроматина Это было продемонстрировано путем изучения варьирующе- го сайленсинга репортерных генов, вставленных в разные центромерные участки. На уровне ДНК центромерные районы у дробянковых дрожжей состоят из внешних [outer] повторов (подразде- ленных на элементы, известные как dg и dh, или К и L), которые фланкируют центральный домен, включающий внутренние [inner] повторы (imr, или В), и центральный кор (ent, или СС) (рис. 6.2а). Три центромеры, cenl, сеп2 и сепЗ, занимают ~40, -60 и -120 т.о. на хромосомах I, II и III, соответственно (обзоры см. Egel, 2004; Pidoux and Allshire, 2004). Повторяющаяся природа центромерной ДНК у дробянковых дрожжей напоминает более круп- ные, более сложные повторяющиеся структуры, связан- ные с центромерами многих многоклеточных животных, но с ними легче манипулировать (Takahashi et al., 1992; Steiner et al., 1993; Ngan and Clarke, 1997). Поскольку у других эукариот повторяющаяся ДНК часто коррелиру- ет с присутствием гетерохроматина (см. также главу 5), наличие повторяющейся ДНК в центромерах дробян- ковых дрожжей позволяет предполагать, что они могли бы обладать такими свойствами гетерохроматина, как способность препятствовать экспрессии генов. Как опи- сывается ниже, два блока гетерохроматина фланкируют центральный домен каждой центромеры дробянковых дрожжей. Сам этот центральный домен собран в хрома- тин другого типа (CENP-A-хроматин), который отлича- ется от соседнего гетерохроматина. Хорошо известно, что тип хроматина, окружающего ген, может сильно влиять на его экспрессию. Первона- чально это было продемонстрировано у плодовой мушки Drosophila melanogaster, где хромосомные перестройки, перемещающие ген white в соседство с центромерным ге- терохроматином, приводят к его варьирующей экспрес- сии в глазных фасетках и, таким образом, к мозаичной окраске глаза (см. рис. 5.1 в главе 5). Сейчас очевидно, что трансгены у многих организмов могут испытывать влияние того окружения, в котором они оказались. У дробянковых дрожжей сайленсинг генов можно отслеживать с помощью фенотипических тестов, подоб- ных тем, которые используются у S. cerevisiae и оцени- вают экспрессию репортерных генов. Например, когда
1 Schizosaccharomyces pombe: организм б Внешний повтор Центральный домен Внешний повтор Г Mis 12 MistT Misw j Рис. 6.2. Отличающийся гетерохроматин внешних повторов и центральные кинетохорные домены в центромерах дробянковых дрожжей (а) Изображение центромеры дробянковых дрожжей. Центральный домен (розовый цвет, кинетохор) состоит из элементов imr и ent, внешние повторы содержат транскрибируемые повторы dg и dh (зеленый цвет, гетерохроматин) Все три центромеры имеют сходное общее устройство; однако число внешних повторов различается: cenl (10 т.о.) имеет два, сеп2 (65 n/j/) имеет три и сепЗ — приблизительно тринадцать. Кластеры генов тРНК (двойные концы стрелок) находятся в районе imr и на концах всех трех цен- тромер. Транскрипция маркерных генов, помещенных внутрь внешних повторов или в центральный домен, сайленсируется. (Ь) Гетерохроматин', внешние повторы упакованы в нуклеосомы, которые метилированы по НЗК9те2, что делает возможным связы- вание хромодоменных белков Chpl, Chp2 и Swi6. Центральный «кинетохорный» хроматин'. CENP-A обнаруживается в центральном домене, где он, вероятно, замещает большую часть НЗ, чтобы сформировать специализированные нуклеосомы (розовые квадра- тики). Было показано, что, в дополнение к CENP-A, несколько кинетохорных белков (указаны) связываются с нуклеотидными последовательностями центрального домена, но не с внешними повторами. Сборка кинетохора в центральном домене опосредует прикрепление к микротрубочкам после образования веретена и расхождение хромосом. Мутация компонентов гетерохроматина облегчает сайленсинг маркерных генов во внешних повторах, но не в центральном домене. Дефекты в некоторых компонентах кинетохора делают возможной экспрессию маркерных генов в центральном домене, но не во внешних повторах репортер ига4+ сайленсирован, формируются колонии, резистентные к 5-фтороротовой кислоте. Другой при- мер: сайленсинг репортера ade6+ приводит к образова- нию красных, а не белых колоний (рис. 6.3а). Переме- щение нормально экспрессирующегося гена, такого как ига4+ или ade6*> внутрь центромеры (что определяется по элементам внешних повторов и центрального доме- на) приводит к его транскрипционному сайленсингу. Сайленсинг во внешних повторах очень прочный — такой, что большинство клеток формируют колонии, в которых стабильно поддерживается репрессия марке- ров (т.е. в случае репортера ade6* формируются красные колонии). Однако в центральном домене сайленсинг ade6+ сравнительно нестабилен, результатом чего яв- ляются мозаичные колонии, выглядящие как секгори- рованные колонии с красными, белыми либо красно- белыми секторами (рис. 6.3а). Однако на расстоянии всего 1 т.о. дистально от внешних повторов никакого сайленсинга не происходит (Allshire et al., 1994, 1995), показывая тем самым, что эта репрессия транскрипции ограничена центромерой, определяемой центральным доменом и фланкирующими внешними повторами. 1.3. Центромеры дробянковых дрожжей состоят из разных гетерохроматиновых и центральных кинетохорных доменов У дробянковых дрожжей разница в качестве сайленсинга по длине центромер отражает тот факт, что репрессия транскрипции является результатом разных хроматино- вых структур, включая ассоциации различных негистоно- вых белков, во внешних повторах и в центральном домене (Partridge et al., 2000). Имеются две разные хроматиновые структуры, которые были охарактеризованы в центро- мерных районах дробянковых дрожжей: гетерохроматин над участками внешних повторов и хроматин «CENP-А», покрывающий центральный домен, где собирается кине- тохор. В этих двух доменах с сайленсингом репортерных генов связаны (и для него требуются) разные белки. Гетерохроматин В хроматине аминотерминальные «хвосты» гистонов НЗ и Н4 подвержены ряду посттрансляционных модифи-
Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe Ген ade6+( вставленный в центральный домен центромеры 1 б wtade6+ wt swi6& dcrlb Ген ade6+, вставленный во внешние повторы центромеры 1 Рис. 6.3. Мозаицизм и облегчение сайленсинга маркерных генов (а) Экспрессия ade6+ из центрального до- мена носит мозаичный характер, давая в результате красные, белые и секторирован- ные колонии. Клетки, экспрессирующие ade6\ образуют белые колонии; когда же ade6" репрессирован, образуются красные колонии, (б) adeff, вставленный во внешние повторы, накрепко сайленсирован, что в результате дает однородные красные коло- нии. Для этого сайленсинга требуются белки гетерохроматина, такие как Swi6 (который связывается с метилированным НЗК9), и компоненты RNAi, такие как Dcrl (Dicer, РНКаза-Ш-рибонуклеаза) каций, которые обычно коррелируют с активными или репрессивными состояниями (глава 3). Центромерный гетерохроматин во внешних повторах ассоциируется с ди- и триметильными состояниями гистона НЗ по лизину 9 (НЗК9те2 и НЗК9теЗ) (Nakayama et al., 2001; Yamada et al., 2005). Для формирования центромерного гетерохроматина требуется действие нескольких белков, модифицирующих хроматин и, тем самым, стимулирую- щих связывание других факторов. Для формирования ге- терохроматина сначала требуются деацетилазы гистонов (HDACs; такие как С1гЗ, С1г6 и Sir2), чтобы деацетили- ровать гистон НЗ. Это впоследствии позволяет метил - трансферазе лизина гистонов (НКМТ) С1г4 метилировать гистон НЗ по лизину 9 над центромерными внешними повторами. Эта модификация создает специфический сайт связывания, который распознается хромодоменным мотивом, присутствующим в Swi6 и Chp2 (гомологах ге- терохроматинового белка 1 [HP 1 ], описываемого в главе 5) и в еще одном хромодоменном белке Chpl (рис. 6.26). Все эти белки вносят вклад в формирование «молчащего» хроматина над внешними повторами (Allshire et al., 1995; Cowieson et al., 2000; Partridge et al., 2000; Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001; Shankaranarayana et al., 2003; Sadaie et al., 2004). Хроматин, ассоциированный co вставками репортер- ного гена во внешние повторы (например, гена ига4+), заметно обогащен белками НЗК9те2 и Swi6. Это пока- зывает, что модификация хроматина и Swi6 могут распро- страняться из соседней центромерной повторяющейся ДНК в вклинивающиеся [interposing] последовательно- сти (Cowieson et al., 2000; Nakayama et al., 2001). Лока- лизация Swi6 и сайленсинг зависят от метилирования НЗК9, что иллюстрируется нарушением локализации Swi6 в клетках, у которых нет специфичной для НЗК9 НКМТ, С1г4, или у мутантов по НЗ, где лизин 9 замещен аргинином (Ekwall et al., 1996; Mellone et al., 2003). Белок Swi6 димеризуется через свой «chromoshadow»-flOMeH (Cowieson et al., 2000) и это, вероятно, облегчает его рас- пространение вдоль хроматиновых фибрилл, которому способствует последовательное действие HDACs и спе- цифичной для НЗК9 НКМТ С1г4. Кроме Swi6, с хроматином внешних повторов в цен- тромерах ассоциируются также хромодоменные белки Chpl и Chp2 путем связывания гистона НЗ, метилиро- ванного по лизину 9. Было показано, что Chpl являет- ся компонентом эффекторного комплекса RNAi. RITS (глава 8), и необходим для полного метилирования ги- стона НЗК9 над внешними повторами и вставленными репортерными генами (Partridge et al., 2002; Motamedi et al., 2004; Sadaie et al., 2004). Хроматин центрального кинетохорного домена Прежде чем обсуждать детали формирования гетеро- хроматина на внешних повторах в центромерах, важно принять во внимание, что хроматин центрального домена, где собирается кинетохор, очень отличается от гетерохро- матина, фланкирующего внешние повторы, потому что именно там собирается кинетохор. В противоположность сайленсингу во внешних повторах сайленсинг репортер- ных генов в центральном домене cenl (имеющем длину приблизительно 10 т.о.), по существу, не зависит от С1г4 и поэтому не связан с метилированием гистона НЗ по лизину 9. Действительно, было показано, что централь- ный домен обладает отличающимся составом хроматина. Первоначально это было продемонстрировано в ходе ана- лиза с использованием микрококковой нуклеазы, MNase (объяснение ее действия см. в главе 5), когда обнаружили «мазок» [smear] в противоположность регулярной «лесен- ке» с интервалом 150 п.н., характерной для хроматина фланкирующих внешних повторов (Polizzi and Clarke, 1991; Takahashi et al., 1992). Этот особый паттерн отли- чает хроматин центрального домена от гетерохроматина и эухроматина и имеет отношение к его сборке в особом CENP-A-хроматине и сборке кинетохора над этим райо- ном. У всех изученных эукариот с активными центроме- рами специфически связывается белок, подобный гистону НЗ и известный как CTNP-A (или сепНЗ), (Cleveland et al., 2003), а CENP-A-хроматин играет решающую роль в определении места сборки кинетохора (рис. 6.26). В хроматине центрального домена центромер у дро- бянковых дрожжей большая часть гистона НЗ замеще-
1 Schizosaccharomyces pombe: организм на ортологом CENP-A, известным как Cnpl (рис. 6.46) (Takahashi et al., 2000). Откладка CENP-ACnpl может про- исходить зависимым от репликации образом в фазе S или независимым от репликации способом в G2 (допол- нительные детали см. в главе 13). Кинетохорные белки сами управляют локализацией и сборкой CENP-ACnpl специфически в пределах центрального домена центро- меры (Goshima et al., 1999; Takahashi et al., 2000; Pidoux et al., 2003). Ams2 (фактор GATA), например, управляет связанной с репликацией откладкой CENP-ACnpl в фазе S. В его отсутствие независимая от репликации откладка с помощью Mis6 в G2 может обеспечивать компенсацию, доводя уровни CENP-ACnpl до максимума в интерфазе (Chen et al., 2003; Takahashi et al., 2005). Если структура хроматина CENP-ACnpl разрушается (как в случае му- тантов cnpl, mal2, mis6, sim4 и других), специфический «смазанный» паттерн, получаемый при обработке ми- крококковой нуклеазой, превращается в паттерн, более типичный для основной массы хроматина (т.е. в нуклео- сомную «лесенку»). Мутанты, затрагивающие хроматин центрального домена, не оказывают никакого заметного влияния на сайленсинг во внешних повторах (Cowieson et al., 2000; Jin et al., 2002; Pidoux et al., 2003; Hayashi et al., 2004) Более того, тот факт, что CENP-ACnpl, Ма12, Mis6, Sim4 и другие кинетохорные белки связываются только с центральным доменом, показывает, что центральный кинетохорный домен является структурно сложным и функционально отличается от «молчащего» хроматина внешних повторов (рис. 6.26). Были протестированы не все белки кинетохорно- го домена, но создается впечатление, что сайленсинг в центральном домене является результатом сборки интактного кинетохора, который, как и у S. cerevisiae, включает по меньшей мере 50 белков (Measday and Hieter, 2004). Этот крупный комплекс белков предпо- ложительно ограничивает доступ РНК-полимеразы II к репортерным генам, помешенным в этот район, и тем самым тормозит их транскрипцию. У таких му- Рис. 6.4. «Молчащий» хроматин в ядрах S. pombe Два интерфазных ядра с гетерохроматином (центромеры, тело- меры и «молчащие» локусы mat2-mat3), декорированных красной флуоресцентной иммунолокализацией Swi6, и кинетохорный хроматин (только центромеры), декорированный зеленой флуо- ресцентной иммунолокализацией CENP-ACnpl. Красные сиг- налы не в самом соседстве с зелеными представляют теломеры или mat2-mat3. Все центромеры собраны в кластер на периферии ядра рядом с организующим центром митотического веретена тантов, как cnpl, mat2, mis6 и sim4. при пермиссивной температуре целостность кинетохора, несомненно, частично нарушена, и >то делает возможной увели- ченную транскрипцию репортерных генов. Побочный результат этого состоит в том, что в норме «молчащий» репортерный ген был использован для тестирования дефектов в хроматине центрального кора, что привело к идентификации новых кинетохорных белков (Pidoux et al., 2003). Центромерные районы не полностью лишены ге- нов, и любопытно, что несколько генов тРНК находят- ся между внешними повторами и центральным кинето- хорным районом (рис. 6.2а) (Kuhn et al., 1991; Takahashi et aL, 1991). Недавно было показано, что они действуют как барьер, предотвращая вторжение гетерохроматина в центральный домен (Scott et al., 2006). 1.4. Центромерные внешние повторы без посторонней помощи делают возможной сборку «молчащего» хроматина Зависимый от С1г4 «молчащий» хроматин собирается не только в центромерах, но и над районом размером около 20 т.о., содержащим «молчащие» локусы типа спарива- ния (mat2-mat3) (Noma et al., 2001) и соседствующим с терминальными теломерными повторами (консенсус TTACAGG), добавляемыми теломеразой (Nimmo et al., 1994, 1998; Allshire et al., 1995; Kanohetal., 2005). Район cenH (т.е. гомологичный центромере), который находит- ся'Между mat2 и mat3, имеет большое сходство, свыше ~7 т.о., с внешними повторами, обнаруживаемыми в цен- тромерах (Grewal and Klar, 1997). Кроме того, по крайней мере 0.5 т.о. нуклеотидных последовательностей ДНК, имеющих >84 % идентичности с повторами сепН, могли бы действовать в czy-конфигурации, осуществляя сборку «молчащего» хроматина. Сборка зависимого от С1г4 «молчащего» хроматина происходит даже на соседних маркерных генах, ког- да центромерный внешний повтор (dg) или нуклео- тидные последовательности mat2-mat3 (сепН) встав- ляются в районы генома, где в норме сайленсинг не происходит («эктопический» сайленсинг; рис. 5) (Ay- oub et al., 2000; Partridge et al., 2002; Volpe et al., 2003). Простое объяснение могло бы заключаться в том, что связывающиеся с ДНК белки узнают эти повторы и, когда связываются, эти белки рекрутируют HDACs и НКМТ С1г4, результатом чего является метилирование НЗК9, связывание хромодоменных белков и форми- рование гетерохроматина. Однако ситуация на самом деле еще более сложная. Теперь известно, что центро- мерные внешние повторы транскрибируются. Замеча- тельно, что эта транскрипция приводит к образованию двухнитчатой РНК (dsRNA) — субстрата для RNA1- машинерии, — а она затем рекрутирует С1г4 НКМТ для включения сборки «молчащего» хроматина (Volpe et al., 2002; Sadaie et al., 2004). RNAi также действует на родственные повторы сепН, обнаруживаемые в райо- не mat2-mat3 и в повторах TAS в теломерах (Cam et al , 2005; Kanoh et al., 2005).
Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe Рис. 6.5. Нуклеотидные последовательности центромерных повторов опосредуют сайленсинг Вставка фрагментов (1—2 т.о.) рядом с экспрессируемым геном ига4+ в локусе, который в норме не склонен к сайленсингу, приводит к метилированию НЗК9, связыванию Swi6 и Chpl и транскрипционному сайленсингу Однако картина еше более усложняется тем обстоя- тельством, что в mat2-mat3 RNAi действует, устанавли- вая «молчащий» хроматин, в то время как связываю- щиеся с ДНК белки Arfl и Perl связываются вблиз сепН и поддерживают «молчащий» хроматин над mat2-mat3 даже в отсутствие ключевых компонентов RNAi (Jia et al., 2004; Kim et al., 2004). Аналогично этому, пере- крывающиеся механизмы сайленсинга действуют и в теломерах; терминальные повторы без посторонней помощи могут рекрутировать С1г4 НКМТ и. таким об- разом, Swi6 через связывающийся с теломерными по- вторами белок Tazl, но RNAi действует также через сепН-часть элементов TAS, формируя расширенный район «молчащего» хроматина в теломерах (Nimmo et al., 1994: Allshire et al., 1995; Kanoh et al., 2005). Суще- ствует ли сравнимый перекрывающийся механизм для поддержания «молчащего» хроматина в центромерах? Хотя в клетках, лишенных RNAi, сайленсинг репор- терных генов внешних повторов и самих транскриптов центромерных внешних повторов является дефектным, НЗК9те2 сохраняется на хроматине внешних повторов в отсутствие компонентов RNAi (Sadaie et al., 2004). Ка- кие факторы отвечают за поддержание этого метилиро- вания? Одна возможность заключается в том, что белки, родственные CENP-B (Abpl, Cbhl, Cbh2), содержащие консервативный связывающийся с ДНК домен, связы- ваются с ДНК центромерных повторов и являются не- обходимыми для эффективного формирования «мол- чащего» хроматина (Irelan et al., 2001; Nakagawa et al., 2002) Другие наблюдения показывают, что HDAC С1г4 также действует независимо от RNAi, поддерживая це- лостность гетерохроматина (Yamada et al., 2005). 1.5. РНК-интерференция направляет сборку «молчащего» хроматина Феномен RNAi был впервые открыт у Caenorhabditis elegans, где было найдено, что результатом экспрессии dsRNA является утрата экспрессии гомологичного гена. Вскоре стало очевидным, что эта форма RNAi связана с процессом транскрипционного сайленсинга генов (TGS), описанного у растений, и подавлением [quelling] у N. crassa (описывается ниже) У растений и многоклеточных животных извест- но, что dsRNA, будучи подвергнута процессингу с по- мощью машинерии RNAi, дает малые РНК, которые осуществляют модификации ДНК и (или) хроматина на гомологичном хроматине. Наличие у дробянковых дрожжей ортологов основных компонентов пути RNAi, т.е. Argonaute (Agol), Dicer (Dcrl) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (Rdpl), стимулировало их исследо- вание у этих организмов (Volpe et al., 2002), что привело к значительным успехам в понимании опосредованных RNAi модификаций хроматина и сайленсинга. Фенотипические последствия утери функции Agol, Dcrl или Rdpl сходны с таковыми у мутантов swi6\ по- ниженное содержание НЗК9те2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер (рис. 6.36). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискрет- ной величины, происходящие с центромерных внеш- них повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs; ~21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002; Cam et al., 2005). Эти siRNAs генерируют- ся Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепле- ния двунитчатых дериватов гомологичных некодирую- щих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts]. Хромодоменный белок Chpl также оказывается компонентом машинерии RNAi. Chpl связывается с хроматином НЗК9те2 и необходим для сайленсинга репортерных генов во внешних повторах центромер, но он также требуется и для генерации siRNAs, гомологич- ных центромерным повторам (Noma et al., 2004), и для нормальных уровней метилирования НЗК9 на центро- мерных повторах (Partridge et al., 2002; Sadai et al., 2004). Роль Chpl была далее подтверждена идентификацией эффекторного комплекса RITS (RNA-induced transcrip- tional silencing), который содержит Chpl, Agol, Tas3 и siRNAs, гомологичные центромерным внешним повто- рам (Motamedi et al., 2004). Кроме RITS был идентифи- цирован комплекс, содержащий Rdpl (RDRC — RNA- directed RNA polymerase complex), который содержит предсказанную РНК-геликазу (Hrrl) и предполагае- мую поли (А) полимеразу (Cid 12). Эти компоненты, по-
1. Schizosaccharomyces pombe: организм видимому, также являются важной составной частью процесса RNAi и сборки интактного «молчащего» хро- матина на внешних повторах в центромерах (рис. 6.6) (Motamedi et al., 2004). Наличие независимого от RNAi (и зависимого от Atfl/Pcrl) механизма сайленсинга, действующего в «молчащем» локусе типа спаривания для поддержки гетерохроматина, было обнаружено путем обработки клеток без RNAi ингибитором HDAC трихостатином А (TSA). Результатом этого явилась полная утрата «мол- чащего» хроматина из района mat2-mat3, имитирующая эффект делегирования atfl или perl у мутантов по RNAi (Hall et al., 2002; Jia et al., 2004). Однако, как отмечалось выше, для формирования «молчащего» хроматина в центромерных внешних повторах Atfl и Perl не требу- ются (Kim et al., 2004). Кратковременное воздействие TSA также вызывает утрату сайленсинга в центромерах, приводя к гиперацетилированию гистонов, сопряжен- ных с дефектной функцией центромеры (Ekwall et al., 1997). Хотя это индуцированное TSA «эписостояние» является метастабильным, оно может воспроизводить- ся в нескольких циклах клеточного деления и даже в мейозе Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что гетерохроматин трудно установить заново, коль скоро достигается это аномальное гиперацетили- рованное состояние. Эписостояния могут также уста- навливаться в нарушенном (compromised) локусе mat2- mat3, и они тоже воспроизводятся в мейозе (Nakayama et al., 2000). 1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК-полимеразой II связывает RNAi с модификациями хроматина В предыдущем разделе было показано, что RNAi и мо- дификации гистонов необходимы для сборки центро- мерного гетерохроматина, который может распростра- няться на соседние вставленные репортерные гены. Эти наблюдения поднимают такие очевидные вопросы, как вопрос о том, каким образом RNAi связана с ковалентной модификацией гистонов в формировании «молчащего» хроматина, и вопрос о том, как конкретные районы ге- нома становятся мишенью для такой направляемой RNAi модификации хроматина и сайленсинга. У многих организмов экспрессия специфических dsRNA, гомологичных рассматриваемому гену, приво- дит либо к транскрипционному (модификация ДНК/ хроматина) сайленсингу гена (TGS), либо к посттран- скрипционному (деградация иРНК) сайленсингу гена (PTGS). Может ли любая dsRNA у дробянковых дрож- жей процессироваться так, что образует siRNAs, и ин- дуцируют ли такие siRNAs только посттранскрипци- онный сайленсинг (РНК-нокдаун) или же они могут осуществлять также и модификации хроматина (напри- мер, НЗК9те2), которые сайленсируют транскрипцию с гомологичного гена? Экспрессия dsRNAs, гомологич- ных репортеру GFR, продуцирует siRNAs, которые вы- зывают редукцию транскриптов GFP, но транскрипци- онная активность репортерного гена GFP не снижается Таким образом, хотя GFP-siRNAs понижают уровни иРНК GFP, они не способны осуществлять модифика- ции хроматина, которые приводят к транскрипционно- му сайленсингу. Эти GFP-siRNAs должны, следователь- но, действовать лишь посттранскрипционно, разрушая иРНК GFP (Sigova et al., 2004). Неясно, почему GFP- siRNAs не индуцируют модификацию хроматина на го- мологичном гене, но это может быть связано с природой синтезирующегося транскрипта или с силой промотора RNA pol II, приводящей в действие экспрессию GFP. Какая РНК-полимераза отвечает за транскрипцию центромерных повторов? Мутация любой из двух субъ- единиц RNApol II (Rpb2 и Rpb7) приводит к дефектному сайленсингу центромер (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005), хотя эти мутации демонстрируют очень разные фенотипы. У мутанта грЬ7-1 обнаруживаются понижен- ные уровни транскрипции центромерных повторов, что приводит к меньшему образованию ncRNA и, следова- тельно, меньшему образованию siRNA и утрате «молча- щего» хроматина. Это означает, что RNA pol II необхо- дима для транскрипции центромерных повторов, чтобы обеспечить первичный субстрат для RNAi. Напротив, у мутанта грЬ2-т203 центромерные транскрипты образу- ются, но они не процессируются в siRNA, и содержание НЗК9те в центромерах уменьшается. Эти исследования показывают не только то, что для RNAi требуется транс- крипт RNApol II, но и что, подобно другим событиям процессинга РНК, образование центромерной siRNA может быть сопряжено с транскрипцией через взаимо- действия между машинерией RNAi, хроматином, мо- дифицирующими ферментами и RNA pol II (рис. 6.6). Возможно, что ассоциированные с RITS siRNAs могут «наводиться» на синтезируемые транскрипты по мере того, как они появляются из RNA pol II, занятой го- мологичным локусом. Коль скоро происходит узнава- ние, комплекс RITS-siRNA мог бы стабилизироваться на этих транскриптах, результатом чего могло бы стать рекрутирование таких модифицирующих хроматин ак- тивностей, как С1г4 Удивительно, что центромерные siRNAs также исчезают в клетках, лишенных актив- ности НКМТ С1г4 (Noma et al., 2004; Hong et al., 2005). Возможно, что отсутствие С1г4 влияет на продукцию siRNA путем дестабилизации связей между различны- ми компонентами в интерфейсе между транскрипци- ей, RNAi и модификацией хроматина (Motamedi et al., 2004). Альтернативная возможность сводится к тому, что метилирование НЗК9 может быть необходимо для того, чтобы сделать возможным генерацию siRNAs в cis- конфигурации посредством действия различных актив- ностей, осуществляющих процессинг РНК (например, RdRP), на первичные центромерные транскрипты (рис 6.6) (Noma et al., 2004; Sugiyama et al., 2005; глава 8). 1.7. «Молчащий» хроматин в центромерах необходим для опосредования когезии сестринских центромер и нормальной сегрегации хромосом Как гетерохроматин центромерных внешних повторов и CENP-ACnpl-xpOMaTHH кинетохора влияют на общую
Глава 6 Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe RITS: Agol Tas3 Chpl RDRC: Rdpl Cid 12 Hrr1 Puc. 6.6. Транскрипция центромерных повторов связывает RNAi, образование гетерохроматина и когезию Транскрипция внешних повторов с помощью RNA pol II обе- спечивает первичный субстрат для RNAi и зависимого от Dicer образования siRNA. Загрузка Agol в комплексе RITS (Agol, Tas3, Chpl) молекулами siRNA делает возможным «нацелива- ние» гомологичного транскрипта. Действие RDRC (Rdpl, Cid 12 и Нгг1) делало бы возможной продукцию dsRNA, обеспечивая большее количество субстрата для Dcrl для производства siRNA и, возможно, усиления сигнала. Взаимодействия между транс- криптом, субъединицами RNA pol И и компонентами RNAi рекрутируют С1г4, который метилирует гистон НЗ по лизину 9, делая возможным связывание хромодоменных белков, рекру- тирование когезина и когезию сестринских центромер функцию расхождения хромосом? Зависимый от С1г4 «молчащий» хроматин собирается на внешних повторах в центромерах, в родственном повторе в локусе типа спаривания и по соседству с теломерами Эксперименты с «голыми» плазмидными ДНК-конструктами [naked DNA plasmid constructs] показали, что внешние повторы каким-то образом вносят свой вклад в сборку функцио- нальной центромеры, наделяя эти Cen-плазмиды способ- ностью сегрегировать на митотическом и мейотическом веретене. Но ни внешних повторов, ни центрального домена самих по себе недостаточно для сборки функцио- нальной центромеры (Clarke and Baum, 1990; Takahashi el al., 1992; Baum et al., 1994; Ngan and Clarke, 1997; Pidoux and Allshire, 2004). Мутанты, вызывающие утрату сайленсинга во внешних повторах (т.е. дефектные по С1г4, компонен- там RNAi или Swi6), повысили частоту утери хромо- сом в митозе и встречаемость отстающих хромосом на веретенах поздней анафазы (рис. 7а) (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1996; Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002; Hall et al., 2003; Volpe et al., 2003). Клетки без Swi6 дефектны по когезии в центромерах, но сохраняют когезию вдоль хромосомных плеч (Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002). Формирование должным образом би-ориентированного веретена требует, чтобы сестрин- ские кинетохоры прикреплялись к микротрубочковым фибрилам, отходящим от противоположных полюсов веретена. Силы, прилагаемые к би-ориентированным кинетохорам, требуют, чтобы сестринские кинетохоры прочно удерживались вместе (рис. 6.76). Swi6 необходим для рекрутирования когезина к хроматину внешних по- второв и, тем самым, опосредует прочную физическую когезию между сестринскими центромерами (рис. 6.6). Таким образом, одна из функций «молчащего» хрома- тина в центромерах — быть посредником в когезии. Когезин также прочно ассоциирован с теломера- ми и районом mat2-mat3 (Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002). Кроме того, когезин также рекрутируется к «молчащему» хроматину, сформированному на гене ига* в ответ на расположенный рядом эктопический центромерный повтор (рис. 6.5), подчеркивая связь между «молчащим» хроматином и когезией (Partridge et al., 2002). Таким образом, рекрутирование когезина, по- видимому, является общим свойством ассоциирован- ного со Swi6 «молчащего» хроматина. Каким образом Swi6-хроматин осуществляет рекрутирование когези- на — неизвестно, но Swi6 взаимодействует с субъеди- ницей Psc3 когезина (Nonaka et al., 2002). Кроме того, Dfpl, регуляторная субъединица консервативной кина- зы Hskl (Cdc7), взаимодействует с Swi6 и требуется для рекрутирования когезина к центромерам (Bailis et al, 2003). Эта функциональная связь между гетерохромати- ном и когезией хроматид, по-видимому, сохраняется и у других организмов, поскольку уменьшение содержания компонента RNAi, Dicer, по-видимому, влияет на це- лостность гетерохроматина и когезию сестринских цен- тромер в клетках позвоночных (Fukagawa et al., 2004). 1.8. Эпигенетическое наследование функционального состояния центромеры Интересное эпигенетическое явление было описано в от- ношении сборки функциональных центромер у дробян- ковых дрожжей на плазмидах, содержащих минимальные участки для центромерной функции. Хотя конструкты, сохраняющие лишь часть внешнего повтора и большую часть центрального домена, собирают функциональную центромеру неэффективно, но, как это ни удивительно, коль скоро это активное функциональное состояние центромеры установлено, оно может воспроизводиться в ряду многих митотических делений и даже в мейозе (Steiner and Clarke, 1994; Ngan and Clarke, 1997). Одно из объяснений этого сводится к тому, что внешние повторы обеспечивают среду, благоприятную для сборки кинето- хора (Pidoux and Allshire, 2005), но, будучи собранным, CENP-ACnpl-хроматин (и, следовательно, кинетохор) вос- производится в этом положении с помощью матричного механизма, который может быть сопряжен с репликаци- ей (Takahashi et al., 2005). Возможно, что гетерохроматин каким-то образом индуцирует откладку CENP-ACnpl в центральном домене или способствует ей (рис. 6.8) и что один только блок гетерохроматина не обеспечивает эффективную сборку кинетохора. Альтернативное объ- яснение заключается в том, что один внешний повтор не достаточен для рекрутирования достаточных количеств когезина, и это приводит к дефектной центромерной когезии и повышенным частотам утери хромосом. Такие
1. Schizosaccharomyces pombe: организм Рис. 6.8. Установление и поддержание хроматина CENP-A ДНК центрального домена сама по себе не способна устанав- ливать функциональную центромеру; необходимы внешние повторы. Утрата гетерохроматина из установленных центромер не влияет на сборку CENP-ACnpl или кинетохора на централь- ном домене. Это позволяет предполагать, что гетерохроматин каким-то образом указывает сайт CENP-ACnpl-хроматина и, тем самым, сборки кинетохора. Неизвестно, как CENP- ACnpl-хроматин откладывается в нуклеосомах или каким образом этот специализированный хроматин поддерживается в центральном домене Дикий тип Биориентированнные сестринские центромеры Дефектный гетерохроматин Меротелически ориентированная одиночная центромера Рис. 6.7. Утрата гетерохроматина приводит к дефектному рас- хождению хромосом (а) Клетки, лишенные RNAi или компонентов гетерохромати- на, обнаруживают увеличенную частоту хромосомных потерь и отстающих хромосом на веретенах в поздней анафазе, (б) Отстающие хромосомы в клетках с дефектным гетерохромати- ном могут быть результатом дезорганизации кинетохоров, так что одна центромера может прикрепляться к микротрубочкам от противоположных полюсов. Такая меротелическая ориен- тация могла бы сохраняться при переходе в анафазу; разрыв прикрепления к одному или другому полюсу приводил бы к случайной сегерегации, результатом чего были бы случаи потери-приобретения хромосом центромерные конструкты после нескольких клеточных делений могут стохастически накапливать достаточные количества когезина, результатом чего оказывается увеличенная митотическая стабильность. Однажды до- стигнутое, это стабилизированное состояние должно каким-то образом дуплицироваться на дочерних моле- кулах, чтобы сделать возможным его воспроизведение в последующих делениях (рис. 6.8). Как упоминалось выше, TSA также может устанав- ливать дефектное по центромере состояние, вызывае- мое утратой сайленсинга (Ekwall et al., 1997). С учетом связи между формированием «молчащего» хроматина и когезией в центромерах представляется вероятным, что индуцированное TSA гиперацетилирование блокирует эффективную реконструкцию «молчащего» хроматина посредством RNAi и что дефектная функция центро- меры воспроизводится благодаря утрате сайленсинга и, таким образом, когезии сестринских центромер (до- полнительные детали см. в главе 14). 1.9. Различные механизмы сайленсинга у грибов В первой половине этой главы мы описали, как у одно- го, относительно простого эукариотного организма, дробянковых дрожжей S. pombe, репортерные гены сайленсируются двумя разными типами хроматина в центромерах. Хроматин CENP-A расположен в середи- не центромеры и фланкирован с обеих сторон блоками гетерохроматина. Хроматин CENP-A маркирует район,
Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe над которым формируется кинетохор. предположи- тельно прикрепляющийся к микротрубочкам. RNAi используется при формировании фланкирующего гетерохроматина для «нацеливания» некодирующих транскриптов, получаемых с внешних повторов, и по- ставляет модифицирующие хроматин энзимы, такие как С1г4 (НЗК9-метилтрансфераза гистонов), которая создает сайты связывания для хромодоменных белков и, тем самым, прочного сайленсинга. Этот гетерохро- матин участвует в центромерной функции, обеспечивая плотную физическую когезию и, возможно, способ- ствуя организации кинетохора. Использование RNAi в формировании «молчащего» хроматина в центромерах может быть производным от ее роли в защите генома от РНК-вирусов и мобильных элементов, как это было описано у растений. В самом деле, возможно, что сами центромерные повторы являются остатками древних мобильных элементов. В пользу этой возможности говорят ранние иссле- дования центромер нитчатого гриба N. crassa — объ- екта второй половины этой главы. Хотя у пары разных грибов, представленных в этой главе, работают несо- мненно общие эпигенетические механизмы, ясно, что эти грибы демонстрируют серьезные различия, как это описано ниже. Например, в отличие от хорошо изу- ченных почкующихся и дробянковых дрожжей Neuro- spora использует метилирование ДНК — классический эпигенетический процесс, общий для таких высших эукариот, как млекопитающие и цветковые растения Кроме того, исследования на Neurospora вскрыли не- сколько независимых систем сайленсинга, действую- щих на разных стадиях ее жизненного цикла. Первый такой механизм, названный механизмом точечных му- таций, индуцируемых повторами (RIP — repeat-induced point mutation), имеет как эпигенетические, так и ге- нетические аспекты и несомненно служит в качестве системы защиты генома. Второй механизм, названный механизмом подавления (quelling), представляет собой основанный на RNAi механизм, который приводит к сайленсингу трансгенов и их нативных гомологов. Тре- тий, названный мейотическим сайленсингом с помо- щью неспаренной ДНК (MSUD — meiotic silencing by unpaired DNA), также базируется на RNAi, но отлича- ется от подавления (quelling) временем своего действия, мишенями и предполагаемой целью. Хотя мы все еще находимся в начале эпигенетических исследований у всех организмов, включая модельные грибы, представ- ленные в этой главе, уже ясно, что S. pombe и N. crassa будут по-прежнему служить богатым источником ин- формации по эпигенетическим механизмам, действую- щим у эукариот. 2. Neurospora crassa: история и особенности организма Нитчатый гриб Neurospora crassa (рис. 6.9 и 6.10) впервые сделан экспериментальным организмом Доджем (Dodge) в конце 1920-х годов и примерно 10 годами позже при- способлен Бидлом и Тейтумом (Beadle и Tatum) для своих знаменитых исследований в рамках концепции «один ген — один белок», связывающих биохимию и генетику (Davis, 2000). Бидл и Тейтум выбрали Neurospora отчасти потому, что этот организм быстро растет и легко раз- множается на ростовых средах определенного состава, а также потому, что на Neurospora просто выполнять такие генетические манипуляции, как мутагенез, тесты на комплементацию и картирование. Neurospora, хотя и не столь широко используется, как некоторые модельные эукариоты, продолжает привлекать исследователей в силу ее умеренной сложности и потому, что она хорошо подходит для разнообразных генетических, эмбриоло- гических [developmental] и субклеточных исследований (Borkovich et al., 2004). Neurospora оказалась особенно по- лезной для исследований по фотобиологии, циркадным ритмам, популяционной биологии, морфогенезу, мито- хондриальному импорту, репарации и рекомбинации ДНК, метилированию ДНК и другим эпигенетическим процессам. Жизненный цикл N. crassa проиллюстрирован на рис. 6.9. Вегететивная фаза начинается, когда либо по- ловая спора (аскоспора), либо бесполая спора (кони- дий) прорастают, давая начало многоядерной клетке, которая формирует разветвляющиеся нити (гифы; рис. 6.10В). Два типа спаривания (Л и а) морфологически неразличимы (рис. 6.1 ОБ). Для прорастания аскоспор требуется тепловой шок, что удобно, тогда как конидии прорастают спонтанно. Система гиф быстро распро- страняется (линейный рост >5 мм в час при 37 °C), об- разуя «мицелий». После того как мицелий хорошо раз- вился, образуются воздушные гифы, продуцирующие многочисленные оранжевые конидии, характерные для этого организма (рис. 6.10А, Б). Конидии, содержа- щие от одного до нескольких ядер каждый, могут либо служить началом новых вегетативных культур, либо осуществлять оплодотворение в скрещиваниях. Если питательные вещества ограничены, Neurospora готовит- ся вступить в половую фазу своего цикла, продуцируя заново образующиеся плодовые тела («протоперите- ции»). Когда специализированная гифа («трихогина»), выступающая из протоперитециума, контактирует с тканью противоположного типа спаривания, ядро под- хватывается [is picked up] и транспортируется обратно в протоперитеций. Половая фаза Neurospora и других нитчатых аскомицетов отличается от таковой у дрож- жей тем, что имеет продолжительную гетерокариоти- ческую фазу между оплодотворением и кариогамией (слиянием ядер). Гетерокариотические клетки, полу- чающиеся в результате оплодотворения, разрастаются в развивающийся перитеций. При конечных делениях эти клетки двухъядерные и содержат по одному ядру каждого типа спаривания. Эти клетки изгибаются, об- разуя крючковидные клетки («crozier» — «епископский посох»), происходит последний митоз, дающий четыре ядра, и создаются септы, давая одну двухъядерную клет- ку в крючке «посоха». Эта клетка дает начало аску. Гене- тический анализ показал, что, в целом, —100 асков (или более) перитеция происходят от одного материнского и одного отцовского ядра. Когда происходит кариогамия, получающееся диплоидное ядро немедленно вступает в мейоз. Таким образом, диплоидная фаза жизненного
2. Neurospora crassa. история и особенности организма МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК; ПОДАВЛЕНИЕ MSUD Rip Рис. 6.9. Жизненный цикл N crassa Указываются стадии, на которых происходят эпигенетические процессы, описанные в тексте (с любезного разрешения, из: Shiu et al. 2001, с изменениями) цикла непродолжительна и ограничена одной клеткой. Продукты мейоза претерпевают одно митотическое де- ление, а затем упаковываются в аскоспоры и в развива- ющихся аскоспорах проходят дополнительные митозы (см. рис. 6.9 и Davis, 2000). Геном N. crassa (~40 млн о.) состоит из семи хромо- сом с примерно 10000 предсказанными генами, коди- рующими белки (Galagan et al., 2003), и общей длиной генетической карты, равной, огрубленно, 1000 едини- цам (Perkins et al., 2001). Лишь около 10 % этого генома состоят из повторяющейся ДНК, и, помимо тандемно- го порядка из ~70 копий сегмента рД НК длиной ~9 т.н., кодирующего три большие рРНК, большая часть по- вторяющейся ДНК состоит из инактивированных пе- ремещающихся элементов. Тот факт, что большинство штаммов Neurospora не имеет активных транспозонов и имеет очень мало близких паралогов, почти наверняка отражает действие RIP, первой открытой у эукариот си- стемы защиты генома, зависящей от гомологии (Selker, 1990). Мы знаем, что у Neurospora имеются по крайней мере три процесса сайленсинга генов, которые должны служить для консервации структуры генома: RIP, пода- вление (quelling) и MSUD (Borkovich et al., 2004). У всех этих процессов имеются эпигенетические аспекты и все они имеют прямые или косвенные связи с метилирова- нием ДНК — базовым эпигенетическим механизмом, обнаруживаемым у Neurospora и многих других эукари- от. Мы обсудим метилирование ДНК, а затем RIP, по- давление (quelling) и MSUD. 2.1. Метилирование ДНК у Neurospora Со времени своего открытия десятилетия тому назад ме- тилирование ДНК у эукариот остается в высшей степени загадочным. Все еще вызывают споры такие базовые во- просы, как вопрос о том, что определяет, какие именно хромосомные районы метилируются, и какова функция метилирования ДНК. Neurospora проявила себя как пре- восходная система для изучения контроля и функции метилирования ДНК. У некоторых модельных эукариот, в том числе нематоды С. elegans и дрожжей S. cerevisiae и S. pombe, сколько-нибудь заметное метилирование ДНК отсутствует, а сообщения о метилировании ДНК у еще одного модельного организма, D. melanogaster, остаются спорными. У некоторых организмов, таких как млекопи- тающие, метилирование ДНК имеет существенное значе- ние для выживаемости, усложняя некоторые анализы. В ДНКNeurospora около 1,5 % цитозинов метилированы, но
Глава 6 Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований' Schizosaccharomycespombe Рис. 6.10. Изображения N. crassa (А) Вегетативный рост в природных условиях на сахарном тростнике (фото D.Jackobson; Stanford University) (Б) Агаровые «косяки» с вегетативны- ми культурами N. crassa в лаборатории (фото N.В.Raju, Stanford University) (В) Гифы TV. crassa. окрашенные DAPI, чтобы показать многочисленные ядра (фото М. Springer, Stanford University). (Г) Розетка созревающих асков, демонстрирующая разные паттерны аскоспор. (Г перепеча- тано, с любезного разрешения, из: Raju, 1980 [©Elsevier]) этим метилированием можно пренебречь, что облегчает генетические исследования. Хотя следует быть осторож- ным при экстраполяции с одной системы на другую, по крайней мере некоторые аспекты метилирования ДНК оказываются консервативными. Например, все извест- ные ДНК-метилтрансферазы (DMTs), включая DMTs и прокариот, и эукариот, обнаруживают поразительную гомологию в своих каталитических доменах (Grace Goll and Bestor, 2005). Полученные за последнее десятилетие данные по Neurospora, Arabidopsis, мышам и другим си- стемам выявили как важное сходство, так и интересные различия в контроле и функциях метилирования ДНК, демонстрируя ценность проведения исследований на многих модельных системах. Открытие метилирования ДНК у Neurospora перво- начально вызвало интерес в связи с тем, что оно не было ограничено симметричными сайтами, такими как динуклеотиды CpG или тринуклеотиды CpNpG. Риггс (Riggs), а также Холлидей и Нью (Holliday и Pugh), пред- ложили привлекательную модель для «наследования» или «поддержания» паттернов метилирования, бази- рующуюся на симметричной природе метилированных сайтов у животных. Хотя результаты разнообразных ис- следований in vitro и in vivo были в пользу модели «под- держивающей метилазы» (глава 18), можно представить себе и механизмы поддерживающего метилирования, которые не основываются на точном копировании в симметричных сайтах; такие механизмы могут дей- ствовать у ряда организмов (см., например: Selker et al., 2002). Вероятность того, что наблюдаемое метилирова- ние в асимметричных сайтах представляло собой «ме- тилирование de novo», казалась очень привлекательной, потому что механизмы, слепо воспроизводящие паттер- ны метилирования, могут усложнять определение ну- клеотидных последовательностей, метилируемых изна- чально [in the first place]. Действительно, проведенные на Neurospora исследования с ДНК-опосредованной трансформацией и ингибиторами метилирования про- демонстрировали воспроизводящееся метилирование Предмейотический синтез ДНК Рис. 6.11. Индуцированная повторами точечная мутация (RIP) Для упрощения показаны лишь две хромосомы. Пустой пря- моугольник представляет ген или любой хромосомный сегмент, который во время дупликации (например, в штамме, показан- ном наверху справа) подвержен R1P (символизируется знаком молнии) между оплодотворением и кариогамией. Результаты генетических экспериментов показывают, что дупликации могут повторно подвергаться залпам транзиций С в Т (символи- зируются заполненными прямоугольниками) на протяжении этого периода времени, равного ~10 митозам, как раз к конечному премейотическому синтезу ДНК [right up to the final premeiotic DNA synthesis] (Selker et al., 1987; Watters et al., 1999). Показа- ны четыре возможные комбинации хромосом в потомстве, и красное «т» изображает метилирование ДНК, которое часто (хотя и не всегда) связано с продуктами RIP
2. Neurospora crassa. история и особенности организма de novo (см., например: Singer et al., 1995). Дополни- тельные исследования определили, отчасти, основные сигналы для метилирования de novo (см., например: Tamaru and Selker, 2003). Первым метилированным пэтчем, охарактеризован- ным в деталях, был участок ^-т| длиной 1,6 т.о., кото- рый состоит из дивергировавшей тандемной дуплика- ции сегмента ДНК длиной 0,8 т.о., включающего ген 5S рРНК. Сравнение этого участка с соответствующим хромосомным районом таких штаммов, у которых этой дупликации нет, первоначально привело к идее, что по- вторяющиеся последовательности могут каким-то об- разом индуцировать метилирование ДНК, и в конце концов привело к открытию системы защиты генома, названной R1P. Расшифровка RIP показала, что повто- ряющиеся последовательности не могут прямо вклю- чать метилирование ДНК, по крайней мере у Neurospo- ra', вместо этого повторы включают RIP, который тесно связан с метилированием ДНК, как описано ниже. И район ^-г|, и район \|/63, второй метилированный рай- он, открытый у Neurospora, являются продуктами RIP Более того, последующие анализы метилирования ДНК по всему геному обнаружили, что большинство мети- лированных участков у Neurospora являются реликтами транспозонов, инактивированных RIP (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Действительно, единственное метилирование ДНК у Neurospora, которое , возможно, не является результатом RIP, — это метилрование в тан- демных порядках рРНК (Perkins et al., 1986). 2.2. RIP — система защиты генома, имеющая как генетические, так и эпигенетические аспекты RIP был открыт в результате детального анализа потом- ства от скрещиваний трансформантов Neurospora (Selker 1990). Обратили внимание на то, что дуплицированные последовательности — как нативные, так и чужеродные, как сцепленные, так и несцепленные — подвержены многочисленным поляризованным мутациям типатран- зиций (G:C в А:Т) в гаплоидных геномах специальных двухъядерных клеток, получающихся в результате опло- дотворения (рис. 6.12). Эксперименты, в которых ста- бильность гена тестировали, когда он был один в геноме или в комбинации с несцепленным гомологом, показали, что R1P не просто ассоциирован с повторами; он действи- тельно индуцируется повторами. В дуплицированных последовательностях в одном пассаже с половым циклом могут мутировать примерно до 30 % пар G:C. Нередко (но не всегда) последовательности, измененные RIP, становятся метилированными de novo. Вполне вероятно, что мутации, индуцированные RIP, происходят путем ферментативного дезаминирования 5-шеС или путем дезаминирования С, сопровождающегося репликацией ДНК (Selker, 1990). Метилирование цитозинов включает образование промежуточного соединения, склонного к спонтанному дезаминированию; это заставляет пред- полагать, что этап RIP, связанный с предполагаемым дезаминированием, мог бы катализироваться DMT или —। ч (• ни пиши II inn и и-------------------- а-"ига—t „iiiiihi ii ।—ин и и инти'нт it нт «^1Р6-------и т । нтни и ни ihi in minium in— эт«'р?—41—Illi III I Ilin IIHIIHItt HHHIIH" HIIHH III I- --------iii iii iiiiiiii iiiiiiiiiHHiMiiWHHit тнимин i' i д— В------ЮОп.н В Рис. 6.12. Мутации от RIP и статус метилирования восьми аллелей ат Вертикальными линиями обозначены мутации. Аллели, изображенные черным цветом, были неметилированными, аллели, изо- браженные синим, были первоначально метилированными, но, после того, как с помощью 5-азацитидина или путем клонирова- ния и замещения гена была индуцирована утрата метилирования, не стали реметилированными. Аллели, изображенные красным цветом, были не только изначально метилированы, но и включали метилирование de novo (из Singer et al., 1995, с изменениями)
Глава 6 Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований' Schizosaccharomycespombe DMT-подобным энзимом С этой возможностью согла- суется тот факт, что один из двух гомологов DMT, пред- сказанных по геномной последовательности Neurospora, участвует в RIP (Freitag et al., 2002). Потомство от гомози- готных скрещиваний мутантов с дефектами в этом гене, rid (RIP defective), не дает новых случаев RIP Мутанты rid не обнаруживают сколько-нибудь заметных дефектов в метилировании ДНК, фертильности, росте или развитии. Напротив, второй гомолог DMT у Neurospora (DIM-2), который был идентифицирован генетически и который, как было показано, необходим для всех известных видов метилирования ДНК, не требуется для RIP (Kouzminova and Selker, 2001). Все указывает на то, что каждая дупликация доста- точной величины (больше чем ~400 п.н. для тандемной дупликации или -1000 п.н. для несцепленной дупли- кации) подвержена RIP в некоторой доле специальных двухъядерных клеток. Тем не менее, дупликации с не- которой частотой (обычно менее 1 % для тандемной дупликации или -50 % для несцепленной дупликации) избегают RIP Даже дупликации хромосомных сегмен- тов, содержащих многочисленные гены, чувствительны к RIP (Perkins et al., 1997; Bhat and Kasbekar, 2001). Хотя RIP ограничен половой фазой жизненного цикла, су- ществование этого процесса ставит вопрос о том, может ли Neurospora использовать дупликации генов для эво- люции. В геномной последовательности обнаружили семейства генов, но практически все паралоги, как ока- залось, достаточно дивергировали, чтобы не включать RIP (Galagan and Selker, 2004). Мы приходим к заклю- чению, что RIP действительно может ограничивать эво- люцию у Neurospora. Интересно, что некоторые грибы демонстрируют то, что, по-видимому, является мягки- ми системами защиты генома, сходными с RIP. Наибо- лее заметный пример — премейотически индуцируемое метилирование (MIP), процесс, выявляющий сцеплен- ные и несцепленные дупликации последовательностей в период между оплодотворением и кариогамией по- добно RIP, но зависящий для инактивации исключи- тельно от метилирования ДНК; в последовательностях, инактивированных MIP, не было обнаружено никаких свидетельств мутаций (Rossignol and Faugeron 1994). 2.3 Исследования реликтов RIP позволило проникнуть в контроль метилирования ДНК Неканоническое поддерживающее метилирование Обнаружение того, что одна DMT, а именно DIM-2, ответственна за все выявляемое метилирование ДНК, было столь же удивительным, как и первоначальное обнаружение безудержного [rampant] метилирования в несимметричных сайтах у Neurospora, поскольку ни для одной ранее идентифицированной DMT не было известно, чтобы она метилировала цитозины в разно- образных по последовательности контекстах. Очевидный, но важный вопрос заключался в следующем: обязательно ли метилирование в несимметричных сайтах отражает потенциальную способность соответствующих после- довательностей индуцировать метилирование de novo? Ранние опыты по трансформации не противоречили такой возможности; метилированные последовательно- сти, лишенные их метилирования (например, с помощью клонирования), вновь обретали свое нормальное мети- лирование, будучи реинтродуцированы в вегетативные клетки. С сюрпризом столкнулись, однако, когда восемь аллелей гена ат, сгенерированных RIP, были протести- рованы на их способность индуцировать метилирование de novo (Singer et al., 1995). Некоторые продукты RIP с относительно немногочисленными мутациями (рис. 6.12, атЮРЗ и атЮР4) не сделались реметилированными, даже в своем нормальном локусе; это позволяло предпо- ложить, что наблюдаемое метилирование представляло собой воспроизведение метилирования, установленного ранее. Важно отметить, что их метилирование, подобно другому метилированию, наблюдаемому у Neurospora, не было ограничено симметричными сайтами, не рас- пространялось сколько-нибудь существенно с течением времени и было «гетерогенным» в том смысле, что пат- терн метилированных остатков не был инвариантным в пределах клональной популяции клеток. Таким образом, это метилирование, хотя и зависимое от предшествовав- шего метилирования, установленного в половой фазе (вероятно, с помощью RIP), могло не отражать дей- ствие «поддерживающей метилазы» того типа, который предполагался в оригинальной модели наследования паттернов метилирования. Заслуживает внимания, что MIP у Ascobolus, результатом которого также является гетерогенное метилирование, представляет первое до- казательство воспроизведения метилирования ДНК у грибов (Rossignol and Faugeron, 1994). Способность Neu- rospora осуществлять поддерживающее метилирование была подтверждена экспериментально (Selker etal., 2002). Интересно, что воспроизведение метилирования оказа- лось сиквенс-специфичным (т.е. оно работает не на всех последовательностях), что добавляет новое измерение к концепции поддерживающего метилирования Хотя можно представить себе ряд возможных схем, резуль- татом которых будет воспроизведение метилирования ДНК, действительный механизм, работающий у Neuro- spora, остается неизвестным. В принципе, поддержание метилирования в несимметричных сайтах могло бы за- висеть от метилирования близлежащих симметричных сайтов, но наблюдаемое гетерогенное метилирование, включая сайты CpG, делает этот вариант маловероят- ным. Механизмы обратной связи с участием белков, ассоциированных с метилированной ДНК, могли бы приводить к метилированию, зависящему от предсу- ществующего метилирования, т.е. к поддерживающему метилированию. Как обсуждается ниже, данные, полу- ченные на Neurospora (и других организмах), означают участие модификаций гистонов в контроле метилиро- вания ДНК, указывая тем самым на возможную роль гистонов в поддерживающем метилировании Участие гистонов в метилировании ДНК Первым указанием на роль гистонов в метилирова- нии ДНК было наблюдение, что обработка Neurospora
2. Neurospora crassa: история и особенности организма ингибитором деацетилазы гистонов трихостатином А (TSA) снижала уровень метилирования в некоторых хромосомных районах (Selker, 1998). Селективность де- метилирования под воздействием TSA могла бы отражать дифференциальный доступ к ацетилтрансферазам гисто- нов, но это не было достаточно тщательно исследовано (Selkeret al., 2002). Благодаря исследованиям с мутантом dim-5 у Neurospora хроматин был однозначно связан с контролем метилирования ДНК. Этот мутант, подобно штаммам dim-2, обнаруживает полную утрату метили- рования ДНК. SET-доменный белок DIM-5 оказался метилтрансферазой гистона НЗ, которая специфически триметилирует лизин 9 (Tamaru and Selker, 2001; Tamaru et al., 2003). Подтверждение того, что гистон НЗ является физиологически релевантным субстратом DIM-5, дали два наблюдения: (1) замещение лизина 9 в НЗ другими аминокислотами вызывает утрату метилирования ДНК и (2) триметил-лизин 9 обнаруживается специфически в метилированных участках хромосом. Открытие того, что метилирование гистонов кон- тролирует метилирование ДНК, по крайней мере у Neu- rospora, привело к постановке двух важных вопросов: (1) Что говорит белку DIM-5, какие нуклеосомы надо метилировать? (2) Что считывает триметильную метку и передает эту информацию к DMT, DIM-2? Факто- ры, контролирующие DIM-5, не были определенным образом идентифицированы, но имеются серьезные предположения, что он контролируется одним или не- сколькими белками, распознающими продукты RIP, и состоянием модификации аминокислотных остатков по соседству с местом его действия (Selker et al., 2002). Последнее должно давать возможность DIM-5 инте- грировать информацию о том, должна ли быть метили- рована ДНК в определенном участке, и дает возможное объяснение наблюдению, что TSA может ингибировать метилирование ДНК в некоторых районах. Данные, полученные на других системах, привели к открытию того, что считывает триметильную метку на лизине 9 гистона НЗ у. Знания о том, что НР1, белок, впервые идентифицированный у Drosophila (глава 5), связывается с метилированным лизином 9 гистона НЗ in vitro, стимулировали поиски гомолога НР1 у Neuro- spora. Вероятный гомолог был найден, и его участие в метилировании ДНК было протестировано методом дизрупции гена (Freitag et al., 2004а). Ген, названный hpo (НРопе), действительно оказался существенным для метилирования ДНК. Для еще одной проверки того, считывает ли НР1 у Neurospora метку, сгенерирован- ную DIM-5, изучили его субклеточную локализацию у штаммов дикого типа и dim-5 У дикого типа HP1-GFP локализовался в гетерохроматиновых фокусах, но эта локализация была утрачена у dim-5', это подтверждало, что НР1 Neurospora рекрутируется меткой (триметилли- зин 9), сгенерированной DIM-5 Данные о том. что РНК-интерференция (RNAi) игра- ет важную роль в формировании и поддержании гете- рохроматина у S. pombe, ставят вопрос о том, участвует ли машинерия RNAi у Neurospora в локализации НР1 и (или) метилировании ДНК. У Neurospora есть гомологи ряда генов, участвующих в RNAi (Borkovich et al., 2004). Исследования мутантов с нуль-мутациями во всех трех генах РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), в обо- их генах Dicer или в других генах, предположительно от- носящихся к RNAi, не обнаружили никаких свидетельств того, что RNAi участвует в метилировании НЗК9. фор- мировании гетерохроматина или метилировании ДНК у Neurospora (Chicas et al., 2004; Freitag et al., 2004c). Однако, как обсуждается ниже, гены RNAi у Neurospora принима- ют участие, по крайней мере, в двух других механизмах сайленсинга, имеющих эпигенетические аспекты: в «по- давлении» (quelling) и в мейотическом сайленсинге. 2.4. «Подавление» (quelling) Вскоре после того, как для Neurospora были разработаны методы трансформации, исследователи в нескольких лабораториях заметили, что заметная доля (например, ~30 %) трансформантов Neurospora обнаруживают сай- ленсинг трансформирующей ДНК и, что еще более уди- вительно, сайленсинг нативных последовательностей, гомологичных последовательностям трансформирующей ДНК. Эта последняя форма сайленсинга в вегетатив- ной фазе была названа лабораторией Макино (Macino) «подавлением» («quelling»). К настоящему времени эта лаборатория выполнила большую часть исследований этого феномена (Pickford et al., 2002). Подавление выгля- дит наиболее демонстративно с видимыми маркерами, такими как гены albino, которые кодируют ферменты, необходимые для биосинтеза каротиноидов (рис. 6.13). Полагают, что оно сопоставимо с «косупрессией» или посттранскрипционным сайленсингом генов (PTGS) у растений. Интересно, что гены, по-видимому, варьируют по своей чувствительности к подавлению. Для генов, кото- рые чувствительны, подавление кажется самым обычным у трансформантов, несущих множественные копии транс- формирующей ДНК, расположенные компактно. Ядра свободно плавают в гифах Neurospora, создавая ситуации «гетерокариоза», в которых генетически различающиеся ядра находятся в общей цитоплазме. Таким образом, легко показать, что «подавление» является «доминантным»; т.е. трансформированное ядро может сайленсировать гомо- логичные последовательности в соседних ядрах (Cogoni et al., 1996). Это предполагает наличие цитоплазматиче- ского фактора сайленсинга, возможно какой-то РНК. В согласии с этой возможностью идентификация генов, участвующих в «подавлении», показала, что «подавле- ние» тесно связано с RNAi в других системах (Pickford et al., 2002). Говоря конкретно, qde-1, qde-2, qde-3, dcl-1 и dcl-2 кодируют, соответственно, RdRP, белок, подобный белку “Argonaute”, который, как полагают, участвует в на- правляемом малыми интерферирующими РНК (siRNA) расщеплении иРНК (Baumberger and Baulcombe 2005), RecQ-подобную презумптивную ДНК-геликазу (йву-3) и два «Dicer», которые предположительно участвуют в образовании siRNA (Catalanotto et al., 2004). Хотя крити- ческие детали пока отсутствуют, разрабатываемая модель сводится к тому, что в некоторых случаях трансформирую- щая ДНК генерирует «аберрантный» транскрипт, который каким-то образом включает машинерию RNAi, что ведет к деградации гомологичных иРНК. Хотя метилирование
Глава 6 Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomycespombe Рис. 6.13. Подавление (quelling) Для простоты изображены лишь две из семи хромосомы (отрезки прямых линий в серых кругах, представляющих ядра). Нативный ген albino (аГ) показан темно-оранжевым прямоугольником на верхней хромосоме; другой (темно-оранжевый или желтый) пря- моугольник представляет эктопические последовательности al, введенные путем трансформации. Поскольку трансформированные клетки часто являются многоядерными, трансформанты, как показано, часто бывают гетерокариотическими. Независимо от того, включает ли трансформирующая ДНК весь кодирующий район или нет, у некоторых трансформантов он сайленсирует («пода- вляет») нативный ген аГ как в трансформированных, так и в ^трансформированных ядрах посредством неидентифицированной Ггал^-действующей молекулы (красные линии, отходящие от трансформирующей ДНК, обозначенной желтым прямоугольником). Результатом этого оказывается слабопигментированная или альбинотическая (А1) ткань у некоторых трансформантов, как это показано на рисунке ДНК часто связано с трансформирующей ДНК, ни метил- трансфераза ДНК, DIM-2, ни метилтрансфераза лизина 9 гистона НЗ, DIM-5, для подавления не нужны (Cogoni et al., 1996; Chicas et al., 2005). 2.5. Мейотический сайленсинг, осуществляемый неспаренной ДНК (MSUD) MSUD, самое недавнее добавление к списку механиз- мов сайленсинга, действующих у Neurospora, был от- крыт Метценбергом и его сотрудниками (Aramayo and Metzenberg, 1996: Shiu et al., 2001: Shiu and Metzenberg, 2002) в ходе анализа любопытного наблюдения, за- ключавшегося в том, что мутация типа делеции в гене Asm-1 (созревание аскоспор) является функционально доминантной. Серия элегантных экспериментов, изо- браженная на рис. 6.14, привела к выводу, что после- довательности, лишенные партнера по спариванию в мейотической профазе, вызывают мейотический сай- ленсинг идентичных или почти идентичных последо- вательностей. Наблюдение, что деления Ами-/является
2. Neurospora crassa: история и особенности организма доминантной (рис. 6.146), могло объясняться тем, что остающаяся единичная доза гена продуцирует неадек- ватный генный продукт, но эту возможность сделало маловероятной наблюдение, что функциональная копия этого гена в эктопическом положении не может компле- ментировать дефект (рис. 6.14в). Напротив, только одна функциональная копия этого гена требовалась в мейозе, если у функциональной аллели был партнер по спари- ванию, т.е. ее партнер мог нести мутации, делающие его неспособным производить функциональный продукт (рис. 6.14г). Нормальная мейотическая экспрессия этого гена наблюдалась у штамма, имеющего спаренные эктопические аллели и делеции нативного гена на обо- их гомологах, что свидетельствовало о том, что сама по себе делеция не была «токсичной» и что эктопические копии действительно были функциональными (рис. 6.14д). Интересно, что некоторые аллели, индуциро- ванные RIP, вызывают (elicit) MSUD, если эти штаммы способны к метилированию ДНК. но не могут вызвать MSUD в штаммах dim-2', это заставляет предполагать, что метилирование ДНК, нередко ассоциированное с такими аллелями, может подавлять спаривание (сравни рис. 6.14 г и 6.14 е) (Pratt et al., 2004). (Кстати говоря, это наблюдение дает нам также первое доказательство того, что DIM-2 является функциональным в половой фазе Neurospora.) Аллели с высокой плотностью мутаций, индуцированных RIP, оказались, подобно делециям, доминантными (рис. 6.14ж) (Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002; Pratt et al., 2004), что согласуется с гипотезой о том, что они не способны спариваться с аллелью дикого типа. Для того чтобы разграничить две возможности — что MSUD обусловлен отсутствием спаривания и что он обусловлен присутствием неспа- ренной аллели, — исследователи проанализировали скрещивание, в котором мейотическое ядро имело три копии гена: две аллели дикого типа (которые должны спариваться) и эктопическую копию (которая должна быть неспаренной). Наблюдался сайленсинг, что озна- чало, что MSUD является результатом присутствия не- спаренных аллелей, а не отсутствия спаренных аллелей (рис. 6.14з). MSUD можно наблюдать цитологически в скрещиваниях, гетерозиготных по гену, кодирующему белок, меченный [таггированный — tagged] GFP, как это показано на рис. 6.15. Охота за мутантами, дефектными по MSUD, привела к идентификации эффективного [telling] члена маши- нерии MSUD. Ген Sad-1 (Supressor of ascus dominance — супрессор доминантности асков), идентифицирован- ный путем отбора мутантов, способных проходить че- рез скрешивание, в котором asm-1 не спарен, кодирует RdRP (Shiu et al., 2001). Это позволяло предполагать, что MSUD родствен «подавлению» (quelling) у Neuro- spora и, в целом, RNAi. Интересно, что геном Neurospora содержит гены, которые, согласно предсказанию, коди- руют три предполагаемых RdRP (одна, необходимая для «подавления», одна — для MSUD и одна с неизвестной функцией), два белка, подобных Argonaute (один для «подавления» и один для MSUD) и два белка, подобных Dicer Было бы замечательно, если бы удалось выяснить детальный механизм MSUD Рис. 6.14. Мейотический сайленсинг вызываемый неспаренной ДНК (MSUD) Изображение тестов, проведенных в лабораториях Метценберга и Арамайо (Aramayo and Metzenberg, 1996; Shiu et al., 2001; Pratt et al., 2004), описавших это явление Показаны только две из семи хромосомы Neurospora’, их нуклеотидные последователь- ности изображены, соответственно, зеленым и синим цветом Прямоугольником показан ген, нормально функционирующий в мейозе. Вертикальными линиями показаны мутации, а мети- лирование ДНК показано красным цветом. Делеции изображе- ны в виде пустых промежутков. Пояснения см. в тексте 2.6. Вероятные функции и практическое использование RIP, «подавления» и MSUD RIP, по-видимому, «изготовлен по специальному заказу», чтобы ограничить экспрессию «эгоистичной ДНК», такой как транспозоны, которые управляют производством собственных копий в геноме. В соответствии с этой воз- можностью, огромное большинство реликтов RIP облада- ет очевидным сходством с транспозонами, известными у других организмов, а большинство штаммов Neurospora не имеют активных транспозонов (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Тем не менее, поскольку RIP ограничен пре- мейотическими двухъядерными клетками, этот процесс не должен ни предотвращать распространение нового (на- пример, «горизонтально» приобретенного) транспозона в вегетативных клетках, ни препятствовать дупликации однокопийного транспозона в мейотических клетках.
Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe Рис, 6.15. Neurospora crassa Флуорограмма розетки созревающих асков от гетерозиготного скрещивания трансформанта, сконструированного таким об- разом, что он экспрессирует гистон Н1, меченный (tagged) GFP Четыре аскоспоры в каждом аске обнаруживают светящиеся ядра (Freitag et al., 2004b) (фото любезно предоставлено N.B. Raju, Stanford University) Однако с такими возможными ситуациями должны справ- ляться механизмы «подавления» и MSUD. Хотя «подавле- ние» не полностью супрессирует распространение транс- позонов в вегетативных клетках, о чем свидетельствует пролиферация интродуцированной копии транспозона Tad, подобного LINE, оно («подавление») действительно частично сайленсирует такие транспозоны (Nolan et al., 2005). Информация о действии MSUD позволяет считать, что этот процесс будет сайленсировать любую транспози- рованную последовательность в мейотических клетках, даже если она присутствует лишь в виде единственной копии в геноме (Shiu et al., 2001). Кроме борьбы с блуж- дающими транспозонами в мейозе MSUD, по-видимому, играет также важную роль в процессе видообразования, как показывает наблюдение, согласно которому мутанты, дефектные по MSUD, ослабляют стерильность штаммов, несуших большие дупликации хромосомных сегментов, и создают возможность скрещивания близкородственных видов с N. crassa (Shiu et al., 2001). Хотя RIP, «подавление» и MSUD могут быть помехой в некоторых генетических экспериментах, все эти явле- ния были использованы для исследовательских целей. RIP дал первый простой способ нокаута генов у Neu- rospora и все еще остается предпочтительным методом получения мутантов с частичной функцией. «Подавле- ние» тоже было использовано для уменьшения, если не полного устранения, функции гена — во многом так же, как была использована RNAi у целого ряда организмов. A MSUD дает простой способ протестировать, требу- ются ли те или иные конкретные гены для функциони- рования в мейозе (или сразу после него): если оказы- вается, что ген, будучи дуплицирован или находясь в эктопическом положении, вызывает стерильность, и эта стерильность устраняется мутацией, блокирующей MSUD, можно с уверенностью принять, что он играет важную роль в мейозе. Кроме этих эволюционных ролей, постулированных для RIP, «подавления» и MSUD, а также их полезно- сти в лабораторных исследованиях следует рассмотреть возможность того, что эти процессы используются и иным образом. Например, тот факт, что функция Sad-1 необходима для полной фертильности, позволяет пред- полагать, что MSUD, прямо или косвенно, необходим для мейоза (Shiu and Metzenberg, 2002). В случае RIP (хотя этот процесс и не является существенным) рас- пределение продуктов RIP в геноме Neurospora позво- ляет предполагать, что «мусорные» (junked) транспозо- ны могут служить организму в качестве субстрата для формирования кинетохоров — во многом так же, как служат повторяющиеся последовательности у S. pombe и других организмов. Анализ нуклеотидных последо- вательностей ДНК хромомосмы 7 показывает, что по- следовательности вокруг генетически картированных центромер Neurospora состоят в основном из остатков транспозонов, интенсивно мутировавших в результате действия RIP (рис. 6.16). Реликты RIP обнаруживаются также по соседству с теломерными последовательно- стями Neurospora. Интересно, что транспозоны и остат- ки транспозонов обычно обнаруживаются и в гетерох- роматиновых последовательностях других организмов, таких как Drosophila (глава 5), млекопитающие (глава 17), растения (глава 9) и другие грибы 3. Заключительные замечания Грибы S. pombe и N. crassa оказались мощными системами для обнаружения и объяснения эпигенетических явле- ний. Эпигенетика как область науки все еше находится в стадии младенчества, и эпигенетические механизмы про- должают появляться на свет. Поэтому не удивительно, что глубина и широта нашего сегодняшнего понимания таких эпигенетических процессов, как те, что описаны в настоящей главе, варьируют от организма к организму. Еще слишком рано судить о том, насколько общими яв- ляются описанные эпигенетические механизмы. Напри- мер, возможно, что для сайленсинга и формирования ге- терохроматина некоторые организмы, подобно S. pombe, базируются главным образом на RNAi, тогда как другие, такие как N. crassa, основываются в большей степени на метилировании ДНК. Уже ясно, что даже эти два этих модельных эукариотных организма обладают и важными различиями, и существенным сходством. Оба организма используют метилирование гистона НЗК9 и RNAi, при том что ни один из этих механизмов не обнаружен у почкующихся дрожжей, S. cerevisiae. Из этих трех грибов, однако, только Neurospora практикует метилирование ДНК. Стоит также заметить, что данный процесс может быть функционально довольно различным у этих двух ор- ганизмов. Например, у Neurospora участие компонентов RNAi предполагается в «подавлении» и мейотическом сайленсинге, но не в формировании гетерохроматина, тогда как у дробянковых дрожжей компоненты RNAi вносят вклад в формирование гетерохроматина, но дру- гие их роли не установлены. Наконец, следует отметить, что даже такие обшие черты, как гетерохроматин, ассо- циированный с центромерами, у дробянковых дрожжей
5- 4J Соотношение 3 2 I 1-» 0J Гены Повторы TA/AT (CA+TG)/(AC+GT) -w-тHh-r-r Реликты ТЕ О 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1*4 млн. н. Рис. 6.16. Организация района центромеры 7у N. crassa Были собраны контиги 249,255 и 21 релиза 7.0 геномной последовательности (http://yvyvyv.broad.mit.edu/annotation/fungyneurospora_ crassa_7/index.html) и все кроме первых 400 т.о. последовательности контига 10, и этот объединенный файл последовательностей был проанализирован с инкрементом 200 п.н. на «индексы RIP» (ТрА/АрТ [синий цвет} и CpA+TpG/ApC+GpT [красный цвет}) (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003; Galagan and Selker, 2004). Район длиной ~360 т.о. с высокой плотностью перемещаемых элементов (ТЕ), инактивированных RIP (остатки ретротранспозонов — синий цвет, остаток ДНК-транспозона — фиолетовый цвет), был обнаружен между маркерами, фланкирующими центромеру, которая была картирована генетически. Изображенный сегмент длиной ~1.5 млн о. включает 383 аннотированных гена (над линией и под ней, чтобы показать гены в противоположных ориентациях), из которых только 20 коротких предсказанных гена находятся в пределах предсказанного центромерного района. Размеры перерывов в последовательности [sequence gaps] между контигами (позиции 0.5466, 0.6956 и 0.9058 млн о. на рисунке) неизвестны и у Neurospora могут обладать важными различиями. Важная цель на будущее состоит в том, чтобы открыть, в какой степени информация, собранная на одном ор- ганизме, приложима к другим объектам. Дальнейшие исследования эпигенетических процессов у различных модельных организмов, в том числе S. pombe и N. crassa, дадут эту информацию. Мы надеемся, что грибы как чрезвычайно разнообразные организмы будут продол- жать служить полезными системами для эпигенетических исследований на многие годы. Благодарности R.C.A. благодарит Alison L. Pidoux и Sharon A White за Рис. 4 и Рис. 3, соответственно; а также Alison L. Pidoux и Elizabeth Н. Bayne за замечания по рукописи. Иссле- дования в лаборатории Allshire поддержаны the Wellcome Trust, MRC, и the EC FP6 Epigenome Network of Excellence. R.CA. является a Wellcome Trust Principal Research Fellow. E.U.S. благодарит N.B. Raju за помощь в подборе рисун- ков по Neurospora и Robert L. Metzenberg за замечания по рукописи. Исследования в Selker-лаборатории поддер- живаются U.S. Public Health Service grant GM35690 от the National Institutes of Health и National Science Foundation grant MCB0131383. Литература Allshire R.C., Javerzat J.P., Redhead N.J., and Cranston G. 1994. Position effect variegation at fission yeast centromeres. Cell 76: 157-169. Allshire R.C., Nimmo E.R., Ekwall K., Javerzat J.P., and Cranston G. 1995. Mutations derepressing silent centromeric domains in fission yeast disrupt chromosome segregation Genes Dev. 9: 218-233. Aramayo R. and Metzenberg R.L. 1996. Meiotic transvection in fungi. Cell 86: 103-113. Ayoub N., Goldshmidt L, Lyakhovetsky R., and Cohen A. 2000. A fission yeast repression element cooperates with centromere-like sequences and defines a mat silent domain boundary. Genetics 156: 983-994. Bailis J.M., Bernard P, Antonelli R., Allshire R.C., and Forsbuig S.L. 2003. Hskl-Dfpl is required for heterochromatin-mediated cohesion at centromeres. Nat. Cell Biol. 5: 1111-1116. Bannister A. J., Zegerman R, Partndge J.F., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C., and Kouzarides T 2001 Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature Ш'. 120-124. Baum M., Ngan VK., and Clarke L. 1994. The centromeric K-type repeat and the central core are together sufficient to establish a functional Schizosaccharomyces pombe centromere. Mol. Biol. Cell 5:747-761.
Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe Baumberger N. and Baulcombe D.C. 2005. Arabidopsis ARGO- NAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits micro RNAs and short interfering RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11928- 11933. Bernard P, Maure J.E, Partridge J.F., Genier S., Javerzat J.P., and Allshire R.C. 2001. Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres. Science 294: 2539-2542. Bhat A. and Kasbekar D.P 2001. Escape from repeat-induced point mutation of a gene-sized duplication in Neurospora crassa crosses that are heterozygous for a larger chromosome segment duplica- tion. Genetics 157: 1581-1590. Borkovich K.A., Alex L.A., Yarden O., Freitag M., Turner G.E., ReadN.D., Seiler S., Bell-Pedersen D., PaiettaJ., PlesofskyN., et al., 2004. Lessons from the genome sequence of Neurospora crassa: Tracing the path from genomic blueprint to multicellular organism. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: 1-108. Cam H.P., SugiyamaT, Chen E.S., ChenX., FitzGerald PC, and Grewal S.I. 2005. Comprehensive analysis of heterochroma- tin- and RNAi-mediated epigenetic control of the fission yeast genome. Nat. Genet. 37: 809-819. Catalanotto C., Pallotta M., ReFalo P, Sachs M.S., Vayssie L., Macino G., and Cogoni C. 2004. Redundancy of the two dicer genes in transgene-induced posttranscriptional gene silencing in Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol. 24: 2536-2545. Chen E.S., Saitoh S., Yanagida M., and Takahashi K. 2003. A cell cycle-regulated GATA factor promotes centromeric localization of CENP-A in fission yeast. Mol. Cell 11: 175-187. Chicas A.. Cogoni C., and Macino G. 2004. RNAi-dependent and RNAi-independent mechanisms contribute to the silencing of RIPed sequences in Neurospora crassa. Nucleic Acids Res. 32: 4237-4243. Chicas A., Forrest E.C., Sepich S., Cogoni C., and Macino G. 2005 Small interfering RNAs that trigger posttranscriptional gene silencing are not required for the histone H3 Lys9 methylation necessary for transgenic tandem repeat stabilization in Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol. 25: 3793-3801. Clarke L. and Baum M.P. 1990. Functional analysis of a centromere from fission yeast: A role for centromere-specific repeated DNA sequences. Mol. Cell. Biol. 10: 1863-1872. Cleveland D.W., Mao Y, and Sullivan K.E 2003. Centromeres and kinetochores: From epigenetics to mitotic checkpoint signaling Cell 112: 407-421. Cogoni C., Irelan J.T, Schumacher M., Schmidhauser T.J., Selker E.U., and Macino G. 1996. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic ef- fector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15: 3153-3163. Cowieson N.P., Partridge J.F., Allshire R.C., and McLaughlin P.J. 2000. Dimerisation of a chromo shadow domain and distinctions from the chromodomain as revealed by structural analysis. Curr. Biol. 10: 517-525. Davis R.H. 2000. Neurospora: Contributions of a model organism. Oxford University Press, New York. Djupedal L, Portoso M., Spahr H., Bonilla C., Gustafsson C.M., Allshire R.C., and Ekwall K. 2005. RNA Pol II subunit Rpb7 promotes centromeric transcription and RNAi-directed chro- matin silencing. Genes Dev. 19: 2301-2306. EgelR. 2004. The molecular biology of Schizosaccharomyces pombe: Genetics, genomics and beyond. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany Ekwall K.. Javerzat J.P., Lorentz A.. Schmidt H.. Cranston G., and Allshire R. 1995. The chromodomain protein Swi6: A key com- ponent at fission yeast centromeres. Science 269: 1429-1431. Ekwall K., Nimmo E.R., Javerzat J.P, Borgstrom B., Egel R., Cr- anston G., and Allshire R. 1996. Mutations in the fission yeast silencing factors clr4' and rikT disrupt the localisation of the chromo domain protein Swi6p and impair centromere function. J. Cell Sci. 109: 2637-2648. Ekwall K., Olsson T, Turner B.M., Cranston C., and Allshire R.C. 1997. Transient inhibition of histone deacetylation alters the structural and functional imprint at fission yeast centromeres. Cell 91: 1021-1032. Freitag M., Hickey PC., Khlafallah T.K., Read N.D., and Selker E.U. 2004a. HP1 is essential for DNA methylation in Neurospora. Mol. Cell 13: 427-434. Freitag M., Hickey PC., Raju N.B., Selker E.U., and Read N.D. 2004b. GFP as a tool to analyze the organization, dynamics and function of nuclei and microtubules in Neurospora crassa. Fungal Genet. Biol. 41: 897-910. Freitag M., Lee D.W., Kothe C.O., Pratt R.J., Aramayo R., and Selker E.U. 2004c. DNA methylation is independent of RNA interference in Neurospora. Science 304: 1939. Freitag M., Williams R.L., Kothe G.O., and Selker E.U. 2002. A cytosine methyltransferase homologue is essential for repeat- induced point mutation in Neurospora crassa. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 8802-8807. Fukagawa T, Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki T, Takami Y, Nakayama T, and Oshimura M. 2004. Dicer is essen- tial for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 6: 784-791. Galagan I.E., Calvo S.E., Borkovich K.A., Selker E.U., ReadN.D., Jaffe D., FitzHugh W., Ma L.J., Smirnov S., Purcell S., et al., 2003. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa. Nature 422: 859-868. Galagan J.E. and Selker E.U. 2004. RIP: The evolutionary cost of genome defense. Trends Genet. 20: 417-423. Goshima G., Saitoh S., and Yanagida M. 1999. Proper metaphase spindle length is determined by centromere proteins Misl2 and Mis6 required for faithful chromosome segregation. Genes Dev. 13: 1664-1677. Grace Goll M. and Bestor TH. 2005. Eukaryotic cytosine methyl- transferases. Annu. Rev. Biochem. 14: 481-514. Grewal S.I. and Klar A. J. 1997. A recombinationally repressed region between mat2 and mat3 loci shares homology to centromeric repeats and regulates directionality of mating-type switching in fission yeast. Genetics 146: 1221-1238. Hall I.M., Noma K., and Grewal S.L 2003. RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 193-198. Hall I.M., Shankaranarayana G.D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., and Grewal S.L 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237. Hayashi T., Fujita Y, Iwasaki O., Adachi Y., Takahashi K., and Yanag- ida M. 2004. Misl6 and Misl8 are required for CENP-A loading and histone deacetylation at centromeres. Cell 118: 715-729. Hong E.-J.E., Villen J., Gerace E.L., Gygi S., and Moazed D. 2005 A cullin E3 ubiquitin ligase complex associates with Rikl and the Clr4 histone H3-K9 methyltransferase and is required for RNAi-mediated heterochromatin formation. RNA Biol. 2: 106 111.
Irelan J.T, Gutkin G.L, and Clarke L. 2001. Functional redun- dancies, distinct localizations and interactions among three fission yeast homologs of centromere protein-B. Genetics 157: 1191-1203. Jia S., Noma K., and Grewal S.I. 2004. RNAi-independent heterochromatin nucleation by the stress-activated ATF/CREB family proteins. 5с/еисе304: 1971-1976. Jin Q.W., Pidoux A.L., Decker C., Allshire R.C, and Fleig U. 2002. The mal2p protein is an essential component of the fission yeast centromere. Mol. Cell Biol. 22: 7168-7183. Kanoh J., Sadaie M., Urano T, and Ishikawa F. 2005. Telomere bind- ing protein Tazl establishes Swi6 heterochromatin independently of RNAi at telomeres. Curr. Biol. 15: 1808-1819. Kato H., Goto D.B., Martienssen R.A., UranoT, Furukawa K., and Murakami Y. 2005. RNA polymerase II is required for RNAi- dependent heterochromatin assembly. Science 309: 467-469. Kim H.S., Choi E.S., Shin J.A., Jang Y.K., and Park S.D. 2004. Regulation of Swi6/HPl-dependent heterochromatin assembly by cooperation of components of the mitogen-activated protein kinase pathway and a histone deacetylase Clr6. J. Biol. Chem. 279: 42850-42859. Kouzminova E.A. and Selker E.U. 2001. Dim-2 encodes a DNA- methyl-transferase responsible for all known cytosine methylation in Neurospora. EMBO J. 20: 4309-4323. Kuhn R.M., Clarke L., and Carbon J. 1991. Clustered tRNA genes in Schizosaccharomycespombe centromeric DNA sequence repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 1306-1310. Measday V. and Hieter P. 2004. Kinetochore sub-structure comes to MIND. Nat. Cell Biol. 6: 94-95. Mellone B.G., Ball L., SukaN., Grunstein M.R., Partridge J.E, and Allshire R.C. 2003. Centromere silencing and function in fission yeast is governed by the amino terminus of histone H3. Curr Biol 13:1748-1757. Motamedi M.R., Verdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.P., and Moazed D. 2004. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Ce/Z 119: 789-802. Nakagawa H., Lee J.K., Hurwitz J., Allshire R.C, Nakayama J., Grewal S.L, Tanaka K., and Murakami Y. 2002. Fission yeast CENP-B homologs nucleate centromeric heterochromatin by promoting heterochromatin-specific histone tail modifications. Genes Dev. 16: 1766-1778. Nakayama J., Klar A.J., and Grewal S.L 2000. A chromodomain protein, Swi6, performs imprinting functions in fission yeast during mitosis and meiosis. Cell 101: 307-317. Nakayama J., Rice J.C, Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.L 2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292: 110-113. Ngan V.K. and Clarke L. 1997. The centromere enhancer mediates centromere activation in Schizosaccharomyces pombe Mol. Cell. Biol. 17:3305-3314. Nimmo E.R., Cranston C, and Allshire R.C 1994. Telomere-associ- ated chromosome breakage in fission yeast results in variegated expression of adjacent genes. EMBO J. 13: 3801-3811. Nimmo E.R., Pidoux A.L., Perry P.E., and Allshire R.C. 1998. Defective meiosis in telomere-silencing mutants of Schizosac- charomyces pombe. Nature 392: 825-828. Nolan T, Braccini L., Azzalin G., De Tom A., Macino G., and Cogoni C. 2005. The post-transcriptional gene silencing ma- chinery functions independently of DNA methylation to repress a LINEl-like retro-transposon in Neurospora crassa. Nucleic Acids Res. 33: 1564-1573. Noma K., Allis C.D., and Grewal S.L 2001. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293: 1150-1155. Noma K., SugiyamaT, Cam H., Verdel A., Zofall M., Jia S., Moazed D., and Grewal S.L 2004. RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat. Genet. 36: 1174-1180. Nonaka N., Kitajima T, Yokobayashi S., Xiao G., Yamamoto M., Grewal S.L, and Watanabe Y. 2002. Recruitment of cohesin to heterochromatic regions by Swi6/HPl in fission yeast. Nat. Cell Biol. 4: 89-93. Partridge J.F., Borgstrom B., and Allshire R.C. 2000. Distinct pro- tein interaction domains and protein spreading in a complex centromere. Genes Dev. 14: 783-791. Partridge J. E, Scott K.S., Bannister A. J., KouzaridesT, and Allshire R.C. 2002. cis-acting DNA from fission yeast centromeres medi- ates histone H3 methylation and recruitment of silencing factors and cohesin to an ectopic site. Curr. Biol. 12: 1652-1660. Perkins D.D., Margolin B.S., Selker E.U., and Haedo S.D. 1997. Occurrence of repeat induced point mutation in long segmental duplications of Neurospora. Genetics 147: 125-136. Perkins D.D., Metzenberg R.L., Raju N.B., Selker E.U., and Barry E.G. 1986. Reversal of a Neurospora translocation by crossing over involving displaced rDNA, and methylation of the rDNA seg- ments that result from recombination. Genetics 114: 791-817. Perkins D.D., Radford A., and Sachs M.S. 2001. The Neurospora compendium; Chromosomal loci. Academic Press, San Diego, California. -Pickford A.S., Catalanotto C., Cogoni C., and Macino G. 2002. Quelling in Neurospora crassa. Adv. Genet. 46: 277-303. Pidoux A.L. and Allshire R.C. 2004. Kinetochore and heterochro- matin domains of the fission yeast centromere. Chromosome Res. 12:521-534. Pidoux A.L. and Allshire R.C. 2005. The role of heterochromatin in centromere function. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 360:569-579. Pidoux A. L., Richardson W., and Allshire R.C. 2003. Sim4: A novel fission yeast kinetochore protein required for centromeric silenc- ing and chromosome segregation. J. Cell Biol. 161: 295-307. Polizzi C. and Clarke L. 1991. The chromatin structure of centrom- eres from fission yeast: Differentiation of the central core that correlates with function. J. Cell Biol. 112: 191-201. Pratt R.J., Lee D.W., and Aramayo R. 2004. DNA methylation af- fects meiotic trans-sensing, not meiotic silencing, in Neurospora. Genetics 168: 1925-1935. Raju N.B. 1980. Meiosis and ascospore genesis in Neurospora. Eur. J. Cell Biol. 23: 208-223. Reinhart B.J. and Bartel D.P. 2002. Small RNAs correspond to cen- tromere heterochromatic repeats. Science 297: 1831. Rossignol J.-L. and Faugeron G. 1994. Gene inactivation trig- gered by recognition between DNA repeats. Experientia 50: 307-317. Sadaie M., lida T, Urano T, and Nakayama J. 2004. A chromodo- main protein, Chpl, is required for the establishment of hetero- chromatin in fission yeast. EMBO J. 23: 3825-3835. Scott K.C., Merrett S.L., and Willard H.E 2006. A heterochromatin barrier partitions the fission yeast centromere into discrete chro- matin domains. Curr. Biol. 16: 119-129.
Глава 6. Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований: Schizosaccharomyces pombe Selker E.U. 1990. Premeiotic instability of repeated sequences in Neurospora crassa. Annu. Rev. Genet. 24: 579-613. Selker E.U. 1998. Trichostatin A causes selective loss of DNA methy- lation in Neurospora. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 9430-9435. Selker E.U., Cambareri E.B., Jensen B.C., and Haack K.R. 1987. Rearrangement of duplicated DNA in specialized cells of Neu- rospora. Cell 51: 741-752. Selker E.U., Freitag M., Kothe G.O., Margolin B.S., Rountree M.R., Allis C.D., and Tamaru H. 2002. Induction and maintenance of nonsymmetrical DNA methylation in Neurospora. Proc. Natl. Acad. Sci. (suppl. 4) 99: 16485-16490. SelkerE.U., TountasN.A., Cross S.H., Margolin B.S., Murphy J.G., Bird A.P., and Freitag M. 2003. The methylated component of the Neurospora crassa genome. Nature 422: 893-897. Shankaranarayana G.D., Motamedi M.R., Moazed D., and Gre- wal S.I. 2003. Sir2 regulates histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in fission yeast. Curr. Biol. 13: 1240-1246. Shiu P.K. and Metzenberg R.L. 2002. Meiotic silencing by unpaired DNA: Properties, regulation and suppression. Genetics 161: 1483-1495. Shiu P.K., Raju N.B., Zickler D., and Metzenberg R.L. 2001. Meiotic silencing by unpaired DNA. Cell 107: 905-916. Sigova A., Rhind N., and Zamore P.D. 2004. A single Argonaute protein mediates both transcriptional and posttranscriptional silencing in Schizosaccharomyces pombe. Genes Dev. 18: 2359- 2367. Singer M.J., Marcotte B.A., and Selker E.U. 1995. DNA methylation associated with repeat-induced point mutation in Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol. 15: 5586-5597. Steiner N.C. and Clarke L. 1994. A novel epigenetic effect can alter centromere function in fission yeast. Cell 79: 865-874. Steiner N.C, Hahnenberger K.M., and Clarke L. 1993. Centromeres of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe are highly variable genetic loci. Mol. Cell. Biol. 13: 4578-4587. SugiyamaT, Cam E.L., Verdel A., Moazed D., and Grewal S.I. 2005. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 152-157. Takahashi K., Chen E.S., and Yanagida M. 2000. Requirement of Mis6 centromere connector for localizing a CENP-A-like protein in fission yeast. Science 288: 2215-2219. Takahashi K., Murakami S., Chikashige Y, Funabiki E.L, Niwa O., and Yanagida M. 1992. A low copy number central sequence with strict symmetry and unusual chromatin structure in fission yeast centromere. Mol. Biol. Cell 3: 819-835. Takahashi K., Murakami S., Chikashige Y, Niwa O., and Yanagida M. 1991. A large number of tRNA genes are symmetrically lo- cated in fission yeast centromeres. J. Mol. Biol. 218: 13-17. Takahashi K., Takayama Y, Masuda E, Kobayashi Y, and Saitoh S. 2005. Two distinct pathways responsible for the loading of CENP-A to centromeres in the fission yeast cell cycle. Philos. Trans. R. Soc. bond. В Biol. Sci. 360: 595-607. Tamaru H. and Selker E.U. 2001. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414: 277-283. Tamaru H. and Selker E.U. 2003. Synthesis of signals for de novo DNA methylation in Neurospora crassa. Mol.Cell. Biol. 23: 2379-2394. Tamaru E.L., Zhang X., McMillen D., Singh P.B., Nakayama J., Grewal S.I., Allis C.D., Cheng X., and Selker E.U 2003. Trim- ethylated lysine 9 of histone H3 is a mark for DNA methylation in Neurospora crassa. Nat. Genet. 34: 75-79. Thon G. and Verhein-Hansen J. 2000. Four chromo-domain proteins of Schizosaccharomycespombe differentially repress transcription at various chromosomal locations. Genetics 155: 551-568. Volpe T, Schramke V, Hamilton G.L., White S.A., Teng G., Martiens- sen R.A., and Allshire R.C. 2003. RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast. Chromosome Res. 11: 137-146. \blpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I., and Mar- tienssen R.A. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837. Watters M.K.. Randall T.A., Margolin B.S., Selker E.U., and Stadler D.R. 1999. Action of repeat-induced point mutation on both strands of a duplex and on tandem duplications of various sizes in Neurospora. Genetics 153: 705-714. Wilkinson C.R., Bartlett R., Nurse P, and Bird A.P. 1995. The fission yeast gene pmtl+ encodes a DNA methyltransferase homologue. Nucleic Acids Res. 23: 203-210. YamadaT, Fischle W, SugiyamaT, AllisC.D., and Grewal S.I. 2005. The nucleation and maintenance of heterochromatin by a histone deacetylase in fission yeast. Mol. Cell 20: 173-185.
ГЛАВА 7 ЭПИГЕНЕТИКА ИНФУЗОРИЙ Eric Meyer1 и Douglas L. Chalker2 1Laboratoire de Cenetique Moleculaire, CNRS UMR 8541 Ecole Normale Superieure, 75005 Paris, France department of Biology, Washington University, St. Louis, Missouri 63130 Содержание Общее резюме 1. Инфузории: одиночные клетки с двумя разными геномами 2. Конъюгация: реципрокное оплодотворение об- наруживает неменделевскую наследственность 3. Цитоплазматическая наследственность у инфу- зорий 4. Кортикальное паттернирование: случай структур- ной наследственности 5. Макронуклеусы и микронуклеусы: модель актив- ного и «молчащего» хроматина 5.1. Разделение микро- и макронуклеарных ги- стонов выявляет различную роль вариантов гистонов 5.2. Модификации хроматина коррелируют с со- стояниями активности 6. В ходе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки 6.1. Внутренняя делеция ДНК: события, связан- ные с точными (внутригенные IES) и неточ- ными (межгенные повторы) делециями 6.2. Фрагментация хромосом 7. Механизмы перестроек генома 8. Зависящий от гомологии сайленсинг генов у ин- фузорий 8.1. Сайленсинг, индуцируемый трансгенами 8.2. Сайленсинг индуцируется двунитевой РНК 9. Перестройки генома направляются зависящими от гомологии механизмами 9.1. Экспериментальная индукция специфических делеций в развивающемся макронуклеусе 10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического 10.1. Парадигма d48: эпигенетическое наследо- вание альтернативных перестроек 10.2. Эпигенетическое наследование экспери- ментально индуцированных делеций 10.3. «Спонтанная» элиминация чужеродных по- следовательностей, интродуцированных в микронуклеарный геном 10.4. Экспериментальное «спасение» наследуе- мых макронуклеарных делеций 10.5. Экспериментальное подавление элимина- ции IES в развивающемся макронуклеусе 11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опо- средованное РНК-интерференцией 11.1. Связь коротких РНК с элиминацией ДНК 11.2. Транспорт РНК из материнского в зиготи- ческие макронуклеусы у Paramecium 12. Заключение: элиминация ДНК как механизм за- щиты генома 13. Будущий вклад исследований на инфузориях в эпигенетику Литература 5 Эпигенетика.
Глава 7. Эпигенетика инфузорий ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Наверняка любой наблюдавший инфузорий под микро- скопом был поражен этими сложными маленькими животными, использующих свои волосковидные рес- нички для плавания, питания и поисков партнера. Вегетативно растущие клетки удваиваются путем про- стого бинарного деления; тем не менее, периодически инфузории спариваются с партнерами или, у некоторых видов, претерпевают самооплодотворение, в результате чего получается половое потомство с иным генотипом. Уникальной отличительной чертой этих одноклеточных эукариот является то, что они поддерживают в общей цитоплазме два функционально различающихся гено- ма, содержащихся в отдельных ядрах. Меньшее из них, микронуклеус, содержит геном зародышевой линии. Он транскрипционно «молчит» в ходе роста, но сохраняет генетическую информацию, которая передается потом- ству в каждом половом поколении. Более крупное ядро, макронуклеус, осуществляет соматические функции, поскольку отвечает за всю экспрессию генов и таким об- разом управляет фенотипом клетки. Он элиминируется в конце каждого вегетативного цикла, когда из зароды- шевой линии дифференцируется новый макронуклеус. Во время развития макронуклеуса в результате мас- сивных перестроек ДНК создается отредактированная версия генома, готовая для экспрессии. Часть генома зародышевой линии, включая всю повторяющуюся ДНК, долгое время считавшуюся «мусорной», элимини- руется, тогда как все гены, необходимые для выживания организма в жизненном цикле, амплифицируются до высокого уровня плоидности. Генетические странности инфузорий сделали их очень полезными модельными организмами для обна- ружения и понимания эпигенетических механизмов. У некоторых видов два потомка-сибса, развивающиеся после спаривания, начинают свою жизнь с идентичны- ми геномами, но их соматические ядра дифференциру- ются в контексте двух разных родительских клеток. Это позволяет легко выявлять наследственные признаки, которые не детерминируются исключительно ядерным геномом. Генетические эксперименты, проведенные с Paramecium tetraurelia, прежде всего эксперименты, проведенные Треси Соннеборном, дали одно из самых ранних описаний неменделевского наследования у эу- кариот вообще. Среди случаев, в которых генетически идентичные сибсы экспрессировали разные варианты специфических признаков, некоторые были истинны- ми примерами цитоплазматической наследственности (материнского наследования ДНК органелл), но дру- гие. такие как наследование типов спаривания особи, были случаями иного рода. Тип спаривания потомка не определялся его генотипом; скорее, он специфициро- вался предсуществующим типом родительской клетки, в которой развивался его соматический геном. Выража- ясь простыми терминами, можно сказать, что разные внешние условия (родительская цитоплазма) направ- ляют экспрессию альтернативных признаков, исходя из идентичных наборов ДНК. А это является отличитель- ной чертой эпигенетики. Особая генетическая организация инфузорий предполагает также наличие механизмов, дифферен- циально регулирующих гомологичные последователь- ности, содержащиеся в разных ядрах. Ранние иссле- дования имели целью выяснить способы, которыми зародышевая линия поддерживалась «молчащей», а соматический геном — транскрипционно активным. Компартментализация состояний генной экспрессии дала исследователям возможность изучать роль бел- ков хроматина и их модификаций в эпигенетической регуляции. Они могли легко соотносить специфиче- ские гистоны и их модификации с транскрипционной активностью или стадией клеточного цикла. Напри- мер, в результате сравнения белков хроматина из ядер зародышевой линии и соматических ядер Tetrahymena thermophila были идентифицированы некоторые из первых вариантов гистонов. Далее у этой инфузории были идентифицированы такие новые регуляторы хроматина, как первая ацетилтрансфераза гистонов (HAT) — отчасти за счет использования того факта, что только макронуклеус содержит ацетилированные гистоны. Хотя генетика инфузорий может показаться не- стандартной, лежащие в ее основе механизмы широко используются для эпигенетической регуляции у эу- кариот, что иллюстрирует роль РНК-интерференции в перестройках целого генома. Степень и формы этих перестроек удивительно разнообразны у разных видов инфузорий, однако одна общая черта заклю- чается в том, что они в норме направляют элимина- цию транспозоноподобных элементов и других по- вторяющихся последовательностей. И у Paramecium, и у Tetrahymena с генома зародышевой линии во вре- мя мейоза генерируются короткие РНК. Обнаруже- ние этих малых РНК, тот факт, что для перестроек ДНК у Tetrahymena требуются гомологи Argonaute и Dicer, позволили осознать, что здесь действует ме- ханизм, подобный РНК-интерференции. Полагают, что малые РНК нацеливают метилирование гистона НЗ по лизину 9 на гомологичные последовательно- сти, маркируя их для элиминации. Таким образом, с механистической точки зрения перестройки ДНК у инфузорий сходны с более широко используемым РНК-направляемым формированием хроматина. Использование RNAi для элиминации перемещае- мых элементов еще более подчеркивает важность этого пути как механизма защиты генома. Далее, многие эксперименты показали, что паттерны пере- строек ДНК не строго детерминированы геномом зародышевой линии, но контролируются — по край- ней мере отчасти — предсуществующими перестрой- ками в родительском соматическом геноме. Отсюда следует, что геномы зародышевой линии и сомати- ческий сравниваются друг с другом в ходе ядерной дифференцировки; это сравнение опосредуется, ве- роятно, зависящими от гомологии взаимодействия- ми между РНК зародышевой линии и соматически- ми. Полное понимание этого процесса несомненно позволит глубже проникнуть в роль РНК в эпигене- тическом программировании генома.
2. Конъюгация: реципрокное оплодотворение обнаруживает неменделевскую наследственность 1. Инфузории: одноклеточные с двумя разными геномами Инфузории, образующие монофилетическую группу, воз- никшую около одного миллиарда лет тому назад (Philippe et al. 2000), были среди первых одноклеточных эукариот, использованных в качестве генетических моделей. В конце 1930-х годов, когда Т.М.Соннеборн открыл типы спари- вания у Paramecium aurelia (Sonnebom 1937), хромосомная теория наследственности, разработанная Т.Х.Морганом, всё еще не удовлетворяла многих исследователей, в осо- бенности эмбриологов (исторические детали см. в главе 2). Будучи не способны представить себе, как такие ста- тичные сущности, как гены, могут быть единственной основой наследственности, они полагали, что цитоплазма должна участвовать хотя бы только в координации дей- ствия генов (см. Harwood 1985). В то время как генетики в основном были сосредоточены на действии генов, ранний генетический анализ, выполненный Соннеборном, пока- зал, что передачу многих наследуемых признаков нельзя было полностью объяснить менделевскими законами. Изучение инфузорий, благодаря их уникальной биоло- гии, позволило обнаружить некоторые первые примеры цитоплазматической наследственности и продолжает обеспечивать новые возможности проникновения в эпи- генетические механизмы. Одной из наиболее заметных черт инфузорий яв- ляется ядерный диморфизм. Каждая клетка содержит ядра двух типов, различающихся по структуре и функ- ции. Диплоидные микронуклеусы являются транс- криппионно «молчащими» во время вегетативного ро- ста, но содержат геном зародышевой линии. Эти ядра претерпевают мейоз и дают гаметические ядра, которые передают менделевский геном следующему полово- му поколению (рис. 7.1). В противоположность этому, высокополиплоидные макронуклеусы ответственны за экспрессию генов во время вегетативного роста и таким образом управляют фенотипом клетки, но они утрачиваются во время полового развития и могут, сле- довательно, рассматриваться как эквивалент сомы (рис. 7.1). Число ядер каждого типа варьирует у разных видов. Например, виды Р. aurelia имеют два микронуклеуса и один макронуклеус, тогда как у Tetrahymena thermophila лишь по одному ядру каждого типа. Макро- и микронуклеусы делятся с помощью разных механизмов. Микронуклеусы делятся путем обычного закрытого митоза. Макронуклеусы, напротив, делятся с помощью все еще недостаточно изученного механиз- ма. который не связан с образованием веретена или с видимой конденсацией не имеющих центромер сома- тических хромосом. После синтеза ДНК макронуклеус просто расщепляется на две приблизительно равные части. Какой-нибудь механизм, обеспечивающий рав- ное распределение макронуклеарных хромосом в два дочерних ядра, по-видимому, отсутствует. Вместо этого, вероятно, высокий уровень плоидности (~800и у Р tet- raurelia, ~45п у Т. thermophila) предотвращает летальную утрату генов на протяжении ряда вегетативных делений. Большинство видов обладают конечной продолжитель- ностью вегетативной жизни, и клональные клеточные линии в конечном счете погибают, если не принимают участие в половом воспроизведении, прежде чем станут старыми. 2. Конъюгация: реципрокное оплодотворение обнаруживает неменделевскую наследственность Инфузории являются гермафродитными линиями, спо- собными к конъюгации — процессу спаривания, вклю- чающему перекрестное оплодотворение между двумя ро- дительскими клетками. Зрелые клетки соответствующего клонального возраста, обычно после легкого голодания, становятся сексуально реактивными и спариваются с клетками совместимых типов спаривания, чтобы начать конъюгацию. Если совместимый партнер отсутствует, не- которые виды обычно претерпевают процесс самоопло- дотворения, называемый автогамией. В обоих случаях за этим следует ядерная реорганизация, начинающаяся с мейоза микронуклеусов. Последовательность ядерных событий сходна у всех видов (хотя и имеются некоторые вариации) и изображена на рис. 7.1 для видов Р aurelia и Т. thermophila. (см. Sonnebom 1975). Постмейотическое развитие начинается с выбора единственного гаплоидного ядра в каждой клетке для передачи генома. Выбранное ядро претерпевает допол- нительное деление, дающее два генетически идентич- ных гаметических ядра. В случае конъюгации два пар- тнера обмениваются одним из двух своих гаплоидных ядер, и поэтому последующая кариогамия (т.е. слияние двух гаплоидных ядер) формирует в каждом конъюган- те генетически идентичные зиготические ядра (стадии 3—5 на рис. 7.1). При автогамии два гаметических ядра в одной клетке сливаются и образуют полностью гомо- зиготный диплоидный геном. В обоих случаях полу- чающееся в результате диплоидное зиготическое ядро (стадия 5) делится еще два раза, и четыре продукта этих делений дифференцируются: два — в новые микро- нуклеусы, а два — в новые макронуклеусы (стадии 6 и 7). По завершении развития ядерного аппарата в но- вых вегетативных клонах сохраняются либо оба новых микронуклеуса, как это имеет место у видов Р aurelia, либо одно из двух ядер деградирует, как у Т. thermophila. У обоих видов два новых макронуклеуса при первом клеточном делении не делятся (стадия 9), а распреде- ляются в две дочерние клетки; они начинают делиться только при втором вегетативном делении. В то время как родительские микронуклеусы дают начало новым микро- и макронуклеусам следующего поколения, родительский макронуклеус утрачивается. У Р. aurelia он фрагментируется примерно на 30 кусков, в которых репликация ДНК быстро подавляется, хотя транскрипция активно продолжается на протяжении периода дифференцировки новых макронуклеусов. Когда вегетативный рост возобновляется, эти фраг-
Глава 7. Эпигенетика инфузорий Paramecium Жизненные циклы инфузорий Рис. 7.1. Жизненные циклы Paramecium (вверху) и Tetrahymena (внизу) (Стадия 1) Вегетативные клетки размножаются бинарным делением. Половое развитие (стадии 2—8) обычно начина- ется после конъюгации двух клеток или автогамии (только у Paramecium). (Стадии 2—3) Мейоз микронуклеуса заканчивается выбором одного из гаплоидных продуктов на роль гаметического ядра и дегенерацией остальных ядер. У Parmecium родительский макронуклеус начинает формировать лопасти. (Стадии 4—6) Формирование зиготы. Дополнительное деление выбранного ядра дает два генетически идентичных гаплоид- ных ядра. В ходе конъюгации одно из этих двух идентичных гаметических ядер обменивается на такое же ядро между двумя партнерами, и последующая кариогамия дает диплоид- ное зиготическое ядро (красный цвет). В ходе автогамии два идентичных гаметических ядра просто сливаются вместе. Два дополнительных постзиготических деления (6) дают недиффе- ренцированные микро- и макронуклеусы. (Стадии 6-8) Ядерная дифференцировка. После второго пост- зиготического деления из получившихся в результате ядер два становятся новыми микронуклеусами, тогда как два других на- чинают дифференцироваться в новые макронуклеусы (розовый цвет). У Paramecium материнский макронуклеус фрагментиру- ется. У Tetrahymena он пикнотизируется. У Tetrahymena же один из новых микронуклеусов дегенерирует. (Стадия 9) Карионидное деление: Это первое вегетативное деление является особым, поскольку новые макронуклеусы распределяются в дочерние клетки без деления, тогда как ми- кронуклеусы расходятся в клетки-потомки путем митоза. На- конец, фрагменты родительского макронуклеуса у Paramecium не делятся, но сохраняются до тех пор, пока не утрачиваются в результате случайного распределения при последующих делениях Tetrahymena менты распределяются случайным образом в дочерние клетки, пока не остается ни одного (стадия 9). У Т. ther- mophila родительский макронуклеус не фрагментирует- ся, но пикнотизируется и деградирует по апоптозопо- добному механизму до первого вегетативного деления (Davis et al. 1992) (стадии 7 и 8). 3. Цитоплазматическая наследственность у инфузорий Биология конъюгации Р. aurelia чрезвычайно благо- приятна для выявления эпигенетических явлений, связанных с влиянием цитоплазмы В то время как реци- прокное оплодотворение генерирует в двух конъюгантах генетически идентичные зиготические ядра, между ними почти не происходит обмена цитоплазмой, что позволяет эффективно различать действие ядерных генов от дей- ствия наиболее влиятельного фактора внешней среды — цитоплазмы материнской клетки (рис. 7.2). Каждое генетическое скрещивание поэтому эквивалентно изуче- нию монозиготных близнецов, рожденных разными матерями. Исследования Соннеборна показали, что фенотипические различия между двумя родительскими клетками могут поддерживаться у потомков каждой из них даже несмотря на то, что эти потомки обладают идентичными генотипами. Позже оказалось, что в ряде
4. Кортикальное паттернирование: случай структурной наследственности а. Менделевское расшепление пары аллелей 6. Материнское наследование типов спаривания Рис. 7.2. Менделевская vs. цитоплазматическая на- следственност ь (а) Конъюгация и автогамия иллюстрируются скрещиванием между двумя клетками Paramecium, каждая из которых гомозиготна по разным аллелям, М или т. Конъюгация включает реципрокный об- мен одним из двух идентичных гаметических ядер. В результате этого образуются клетки-эксконъю- ганты F1 с идентичными гетерозиготными геноти- пами. Автогамия (процесс самооплодотворения) генерирует полностью гомозиготный генотип всего в одном половом поколении, так что особи F2 имеют 50 %-ную вероятность стать М/М или m/m. (б) Фенотипическое различие между клонами F1 вы- являет цитоплазматически наследуемые признаки. У Paramecium тип спаривания (О или Е) необратимо детерминируется в ходе развития соматического макронуклеуса (большой кружок) из тотипотентно- го микронуклеуса зародышевой линии (маленький кружок); однако родительский макронуклеус на- правляет дифференцировку каждого эксконъюганта в направлении сохранения существующего типа спаривания случаев эти фенотипические различия детерминируются экстрануклеарными генами и сегодня не должны квали- фицироваться как эпигенетические явления. Например, смертоносные свойства киллерных штаммов Р aurelia обусловлены обитающими в цитоплазме эндосимбиоти- ческими бактериями рода Caedibacter, которые выделяют токсин, убивающий чувствительные штаммы (обзоры см. Ргеег et al., 1974; Pond et al., 1989). Другие случаи, такие как материнское наследование серотипа, которое требует взаимно исключающую экспрессию одного из нескольких паралогичных генов поверхностных анти- генов, являются четкими случаями цитоплазматического влияния на активность генов. Как и серотипы, два комплементарных типа спа- ривания у Р tetraurelia, которые обозначаются как О и Е, демонстрируют цитоплазматический паттерн на- следования. Признаки О и Е являются терминально дифференцированными фенотипами, которые детер- минируются в ходе развития соматического макрону- клеуса из тотипотентной зародышевой линии. После конъюгации вегетативный клон, происходящий от ро- дителя О, почти всегда демонстрирует тип спаривания О, тогда как клон, происходящий от родителя Е, почти всегда относится к типу Е, несмотря на то, что оба этих эксконъюганта развиваются из идентичных зиготиче- ских геномов (рис. 7.26). Более того, когда между двумя конъюгируюшими клетками образуется большой цито- плазматический мостик, обусловливающий существен- ный обмен цитоплазмой, потомство обоих родителей обычно развивается как тип Е (Sonnebom, 1977). Таким образом, должен существовать некий цитоплазматиче- ский фактор, который направляет развитие типа Е. Как описывается ниже, геном зародышевой линии во время развития макронуклеуса подвергается мас- штабным перестройкам ДНК, и хотя предполагаемый ген типа спаривания все еще не идентифицирован, было показано, что одна менделевская мутация, влияю- щая на детерминацию типа спаривания, нарушает эти перестройки генома в других локусах (Meyer and Keller, 1996). Если тип спаривания определяется регулируе- мыми геномными перестройками, этот цитоплазмати- ческий фактор, определяющий тип Е, должен обладать способностью направлять альтернативную перестройку гена типа спаривания и давать в результате макрону- клеарную форму этого гена, специфицирующую тип Е. В ходе конъюгации эта форма должна также произво- дить цитоплазматический фактор, определяющий тип Е и необходимый для дальнейшего наследования. Как описывается в разделе 10, паттерны альтернативных перестроек могут передаваться от материнских макро- нуклеусов к зиготическим макронуклеусам в результа- те т/га/ус-нуклеарного влияния, которое по-видимому опосредуется молекулами РНК, действующими завися- щим от гомологии образом. Таким образом, цитоплаз- матический фактор, ответственный за неменделевское наследование, является, вероятно, молекулой РНК, контролирующей «мутацию» развития в гене типа спа- ривания. 4 Кортикальное паттернирование: случай структурной наследственности Исследования сложной архитектуры клеточного кор- текса обнаружили еще одну форму неменделевской на- следственности. Клетка Paramecium покрыта примерно 4000 ресничками, расположенными в виде продольных рядов заякоренных ячеек (рис. 7.3а). Каждая ресничка коренится в базальном тельце, или кинетосоме, — сложной структуре, обладающей и передне-задней, и лево-правой асимметрией. Когда клетки делятся, структура цилиарных ячеек накладывает определенные
Глава 7. Эпигенетика инфузорий IN I I N N N N Рис. 7.3. Структурное наследование полярности кортикальной ячейки у Paramecium (а) Иммуномечение базальных телец и корешков реснички выявляет регулярную организацию параллельных кортикальных рядов у клеток дикого типа. Показаны вентральный (слева) и дорзальный (справа) виды. (6) Дорзальная сторона клетки, демонстрирующей нарушение этой регулярной организации благодаря обращенной переднее-задней полярности нескольких рядов кортикальных ячеек. Базальные тельца изображены красным цветом, цилиарные корешки — зеленым, (в) Увеличенный вид участка кортекса показывает обращенную ориентацию инвертированных рядов (I) по отношению к нормальным рядам (N). (г) Схематическое изо- бражение дупликации базальных телец (зеленые кружки) в процессе роста; показано, что каждое тельце фланкировано с правой стороны переднее-ориентированным цилиарным корешком (пурпурный цвет) и двумя микротубулярными лентами. Дупликация происходит с фиксированной геометрией: каждое новое базальное тельце позиционируется спереди от своего родительского тельца, обеспечивая тем самым идентичную полярность, (д) Повторная дупликация базальных телец в пределах каждого ряда поддерживает однородную ориентацию бесконечно долго (фотографии любезно предоставлены Janine Beisson) ограничения на дупликацию базальных телец, так что новые базальные тельца остаются в той же самой ори- ентации (рис. 7.36). Однако хирургическая пересадка небольшого участка кортекса в перевернутой ориента- ции (с обращенной полярностью) по мере дупликации пересаженных базальных телец приведет, в конечном счете, к образованию полностью перевернутого рес- ничного ряда (рис. 7.Зв). Эта передне-задняя инверсия будет воспроизводиться в неограниченном числе ве- гетативных клеточных делений и будет наследоваться по материнской линии в ходе конъюгации (Beisson and Sonnebom, 1965). Эти опыты с пересадками показали, что гены не от- вечают за наследование таких структурных вариаций, и вскрыли существенную роль предсуществующих струк- тур для правильной сборки новых структур. Ориентиро- ванная дупликация центриоли (Beisson and Wright, 2003) и воспроизведение формы жгутика при клеточном де- лении трипаносом (Moreira-Leite et al., 2001) представ- ляют собой другие примеры этого явления. Прионы — еще один пример самовоспроизводящихся конформа- ций белков, которые ответственны за цитоплазматиче- скую наследственность у дрожжей и млекопитающих (Shorter and Lindquist, 2005). Даже центромера эука- риотических хромосом ведет себя как самореплици- рующийся белковый комплекс, который находится на ДНК, но не детерминируется ею (Cleveland et al., 2003; см. Главу 14). Эти эпигенетические явления говорят нам, что не все клеточные структуры могут быть собра- ны de novo простым считыванием информации, содер- жащейся в генах. В более широком смысле репликация самой ДНК есть случай структурного наследования, но геном наверняка не является единственной структурой, которую делящиеся клетки вынуждены дуплицировать. Таким образом, «эпигенетическая» структурная наслед- ственность, вместо того чтобы быть редким курьезом, может рассматриваться как один из наиболее фунда- ментальных механизмов жизни
5. Макронуклеусы и микронуклеусы: модель активного и «молчащего» хроматина 5. Макронуклеусы и микронуклеусы: модель активного и «молчащего» хроматина Одна из основных концепций в эпигенетике заключается в том, что индивидуальные копии некоей нуклеотидной последовательности ДНК могут обладать различными активностями и что эти дифференцированные состояния могут стабильно поддерживаться (сохраняться). Ядерный диморфизм инфузорий — это естественный (природный) пример гомологичных последовательностей, которые находятся в общей цитоплазме и, тем не менее, обладают противоположными состояниями активности. Макро- нуклеус служит моделью транскрипционно активного состояния, а микронуклеус — репрессированного, или «молчащего» состояния (рис. 7.4). Ранние биохимиче- ские и иммуногистохимические исследования, главным образом на Tetrahymena, имели целью сравнить свойства этих различных ядер как в вегетативных клетках, так и в ходе полового развития, для того чтобы определить, каким образом эти разные состояния активности могут детерминироваться, в частности, на уровне структуры хроматина. 5.1. Разделение микро- и макронуклеарных гистонов выявляет различную роль вариантов гистонов Выделение гистоновых белков отдельно из макрону- клеуса и микронуклеуса Tetrahymena привело к открытию специфических вариантов гистонов. Варианты гистонов hvl и hv2, которые, как теперь известно, аналогичны ва- риантам H2A.Z и НЗ.З других эукариот, соответственно (глава 13), обнаруживаются исключительно в макрону- клеусах, что явилось одним из самых ранних указаний на то что эти варианты важны для поддержания транскрип- ционной акивности (Allis et al., 1980; Hayashiet al., 1984). Было показано, что вариант hv2 (НЗ 3) экспрессируется конститутивно — свойство, критичное для отложения этого варианта в хроматине вне фазы S, что позволяет этой изоформе гистона НЗ служить в качестве гистона замещения (Yu and Gorovsky, 1997). В дополнение к различным наборам вариантов ко- ровых гистонов макронуклеус и микронуклеус содержат различные линкерные гистоны. Макронуклеарный Н1 имеет аминокислотный состав и биохимические свой- ства, сходные с таковыми линкерных гистонов других эукариот, но у него отсутствует центральный глобуляр- ный домен (Wu et al. 1986; Hayashi et al., 1987). Ни один ген линкерного гистона не является существенным для жизнеспособности клетки. Интересно, что нокауты по любому из них вызывают увеличение объема соответ- ствующих ядер, показывая, что оба они играют роль в общей компактизации хроматина, возможно путем стабилизации структуры хроматина более высокого по- рядка (Shen et al., 1995). Утрата макронуклеарного Hl- подобного белка также приводит к ген-специфичным изменениям в экспрессии, позволяя думать, что этот линкерный гистон поддерживает должную регулировку транскрипции (Shen and Gorovsky, 1996). 5.2. Модификации хроматина коррелируют с состояниями активности Ацетилирование Типерацетилирование гистонов в макронуклеусе и от- сутствие этой модификации в микронуклеусе дали новые данные, позволяющие связать эту посттрансляционную модификацию с активацией генов (Vavra et al., 1982). Ферменты, осуществляющие ацетилирование гистонов у любого организма, оставались неизвестными до середи- ны 1990-х годов, когда С. Дэвид Аллис и его сотрудники очистили первую гистоновую ацетилтрансферазу (HAT) типа А (ядерную) (Brownell and Allis, 1995; Brownell et al., 1996) Эти исследователи начали с высокоочищенных Состав гистонов молчащее» - Н2А, Н2В, НЗ, Н4 диплоидное -micHI конденсация хромосом H3S10ph micHtph активное . Н2А, Н2В, НЗ, Н4 -полиплоидное -macHI - варианты hvl (Н2А Z) hv2 (НЗ.З) развивающийся mac - H3K4me - H3K9me,H3K27me (H2A,H2B,H3,H4)ac - H3K4me - (H2A,H2B,H3,H4)ac - (H2A, macH1)ph Puc. 7.4. Ядерный диморфизм у инфузорий Микронуклеус (зародышевая линия), развивающийся макронуклеус и соматический макронуклеус содержат разные наборы гистонов и их модификаций. Перечислены те из них, о которых известно, что они специфически локализованы в ядрах каждого из этих типов или в развивающемся соматическом геноме
Глава 7. Эпигенетика инфузорий макронуклеусов для того, чтобы отделить эту активность от активности цитоплазматической HAT типа В, и про- должили очистку с помощью тестирования в геле (in-gel assay). Для этого метода очищенные гистоны были запо- лимеризованы в полиакриламидную матрицу геля, ис- пользуемого для разделения фракций очищенных белков. После электрофореза эти белки были ренатурированы и проинкубированы с ацетил-СоА, несущим радио- активную метку, для того чтобы выявить полипептид с кажущейся молекулярной массой 55 kD. который мог бы включить эту метку в гистоновый матрикс. Действительный прорыв произошел после микро- секвенирования этого очищенного белка и клонирова- ния гена. Эта HAT, выделенная из Tetrahymena, оказалась гомологичной хорошо охарактеризованному регулято- ру транскрипции пекарских дрожжей — белку Gcn5. До этого открытия думали, что активаторы транскрипции в основном действуют, рекрутируя РНК-полимеразу к промоторам, но эта работа показала, что активаторы транскрипции могут также обладать ферментативной активностью, модифицируя хроматин или другие регу- ляторы транскрипции и меняя таким образом состоя- ние матрицы. Дверь была открыта, и вскоре после этого было показано, что многие известные регуляторы дей- ствуют как HATs. Метилирование Ядерный диморфизм инфузорий еще раз доказал свои преимущества в выяснении роли метилирования гисто- нов. Эта модификация у растущих клеток Tetrahymena ограничена макронуклеусами (рис. 7.4). Активность ме- тилтрансферазы лизина гистонов (НКМТ), очищенная из этих ядер, специфически модифицировала гистон 3 по лизину 4 (НЗК4ше), установив тем самым одну из первых корреляций между этой специфической модификацией и транскрипционной активностью (Strahl et al., 1999). Метилирование гистона НЗ по лизину 9 у вегетативно размножающихся клеток отсутствует, но специфически происходит во время развития макронуклеусов на огра- ниченных зародышевой линией последовательностях, которые элиминируются из соматического генома (Tav- ema et al., 2002). Регулируемое развитием установление H3K9me2 (диметилирование) на этих специфических последовательностях дает нам полезную модель для вы- яснения нацеливания этой модификации на эквивалент гетерохроматина (в деталях описывается ниже) Фосфорилирование Очистка меченных Р32 гистонов из микро- и макрону- клеусов показала, что НЗ, Н2А и линкерные гистоны сильно фосфорилированы (Allis and Gorovsky, 1981). Фос- форилированы множественные сайты макронуклеарного Н1, и эта модификация, как было показано, участвует в регулировании транскрипции специфических генов (Mizzen et al., 1999). С помощью мутационного анализа Доу и Горовски [Don and Gorovsky] обнаружили, что эту потребность в фосфорилировании можно было имитиро- вать добавлением в Н1 заряженых аминокислот (Dou et al., 1999). Однако эти заряженные остатки не обязательно должны находиться в соответствующих позициях фос- форилированной аминокислоты; для комплементарного эффекта требуется наличие кластера заряженных сайтов (Don and Gorovsky, 2000,2002). Эти исследования показа- ли, что само по себе фосфорилирование не требовалось, но что соответствующая транскрипция стимулировалась критической плотностью зарядов. В гистоне НЗ фосфорилирована единственная по- зиция. серин 10 (H3S10ph) (Wei et al., 1998). Эта моди- фикация зависит от клеточного цикла и коррелирует с митозом у многих эукариот. У Tetrahymena в ходе митоза и мейоза она ограничена микронуклеусами. Замещение нормального гена гистона НЗ мутантной формой, со- держащей замену серина 10 аланином (S10A), вызыва- ет дефекты в делении микронуклеуса, результатом чего оказывается отставание хромосом и анэуплоидия (Wei et al., 1999). Однако амитотическое деление макронуклеу- са не затрагивается. Эти результаты демонстрируют, что фосфорилирование НЗ играет важную роль в конден- сации и (или) сегрегации хромосом Уникальный ядер- ный диморфизм инфузорий опять позволил получить ключевые данные о роли модификаций хроматина. 6. В ходе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки Секвенирование соматических (макронуклеарных) геномов Р. tetraurelia и Т. thermophila обнаружило очень большое число генов (~40 000 и ~27 000, соответственно) несмотря на относительно небольшие размеры геномов (~72 Мб и ~ 104 Мб, соответственно). Эта организация согласуется с геномом, оптимизированным для эффек- тивной экспрессии генов (сравнение с другими эукари- отными организмами см. на рис. 3.15). Это «упрощение» («streamlining») соматического генома достигается за счет массивных перестроек ДНК хромосом, происходящих из зародышевой линии, которые имеют место на специфи- ческих стадиях макронуклеарного развития (обзоры см.: Prescott, 1994: Coyne et al., 1996; Klobutcher and Herrick, 1997; Jahn and Klobutcher, 2002). Таким образом, ядерная дифференцировка генома зародышевой линии и генома соматического включает физическую реорганизацию хромосом в дополнение к установлению только что опи- санных различных состояний хроматина. Обычно наблюдаются два типа перестроек, кото- рые поистине уникальны для всех инфузорий, которые только были исследованы: внутренние делеции ДНК и фрагментация хромосом (рис. 7.5). Примеры этого у других эукариот могут быть представлены локализован- ной рекомбинацией локуса VDJ в лимфоцитах млеко- питающих (глава 21). В зависимости от вида инфузории из каждого вновь формирующегося генома в результа- те этих событий элиминируются от 10 до 95 % генома зародышевой линии Элиминируются фактически все повторяющиеся последовательности, включая переме- щаемые элементы, что частично объясняет наблюдае- мую высокую плотность генов в макронуклеусах. Число
6. Входе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки точные и неточные делеции Tetrahymena: неточные делеции и фрагментация хромосом Рис. 7.5. Перестройки ДНК у инфузорий В ходе развития нового макронуклеуса происходят широкомас- штабные фрагментация хромосом и элиминация ДНК. (Вверху) Перестройки ДНК, происходящие у Paramecium, включают как точные делеции IESs, ограниченных нуклеотидами ТА (цветные прямоугольники, находящиеся в кодирующих (стрелка) и не- кодирующих районах), так и неточные делециии (оранжевые прямоугольники), дающие в результате либо делецию ДНК. либо фрагментацию (G4T3). (Внизу) У Tetrahymena неточная деления IESs (цветные прямоугольники) происходит примерно в 6000 локусов, а фрагментация хромосом детерминируется консервативной последовательностью длиной 15 пн — CBS (звездочка) сайтов перестроек также варьирует у разных видов, от примерно 6 000 у Tetrahymena до, вероятно, 100 000 у брюхоресничных инфузорий. Распределение по всему геному этих высоко регулируемых и воспроизводимых событий дает возможность исследовать, каким образом клетки идентифицируют конкретные сегменты ДНК и направляют свое действие на них. Изучение перестроек ДНК у инфузорий уже позволило вскрыть уникальные особенности эпигенетических механизмов, в частности относящихся к зависящим от гомологии процессам. Нижеследующее описание событий, связанных с пере- стройками ДНК, должно дать достаточную основу для последующего обсуждения связанной с этим эпигене- тической регуляции. 6.1. Внутренняя делеция ДНК: события, связанные с точными (внутригенные IESs) и неточными (межгенные повторы) делециями или интронных районах хромосом зародышевой линии (рис. 7.5). Точно вырезаемые IESs ограничены короткими прямыми повторами, которые, как правило, различаются по последовательности у разных видов. Заметный класс так называемых “ТА”-IESs, обнаруживаемых у Parame- cium и некоторых спиротрих, таких как Euplotes crassus, идентифицируется как обладающий инвариабельными повторами 5’-ТА-3’ на их границах, одна копия которых остается в макронуклеарном локусе после эксцизии (Betermier, 2004). Немногочисленные нуклеотидные позиции, внутренние по отношению к динуклеотидам ТА, не являются случайными и образуют вырожденный консенсус, напоминающий концы транспозонов Тс1/ mariner. Таким образом, эти IESs эволюционно могут быть производными древних инсерций таких мобильных элементов (Klobutcher and Herrick, 1997). Тем не менее, концы многих IESs плохо соответствуют этой консен- сусной последовательности, тогда как многие хорошие соответствия можно обнаружить в макронуклеарных последовательностях, которые не вырезаются, что указы- вает на то, что этот консенсус не содержит достаточной информации для того чтобы специфицировать выреза- ние приблизительно 60 000 IESs на гаплоидный геном Р. tetraurelia. Возникает вопрос, каким же образом они распознаются. Удивительное варьирование точного вырезания на- блюдается у стихотрих (подгруппа спиротрих), у кото- рых удаление IES происходит одновременно с «упо- рядочиванием» («unscrambling») генов (Prescott, 1999). В микронуклеарной версии «перетасованных» генов последовательности, предназначенные для оставления в макронуклеусе (MDSs, т.е. ДНК-«экзоны») не только разделяются IESs, но и «перетасованы» относительно линейного порядка, обнаруживаемого в реорганизо- ванной макронуклеарной последовательности. В заро- дышевой линии две MDS, которые окажутся соединен- ными, чтобы образовать экспрессируемый ген, могут быть локализованы далеко друг от друга, иногда даже в несцепленных локусах (Landweber et al., 2000), и могут даже находиться в инвертированной ориентации от- носительно друг друга. Точность упорядочивания, по- видимому, направляется относительно длинными (в среднем 11 пн) гомологичными повторами, общими для родственных MDS-концов, которые не родственны по последовательности повторам на концах других MDS Хотя эти длинные повторы наверняка вносят вклад в точное упорядочивание, остается неясным, достаточно ли их; это привело к предположению, что здесь возмож- но участие предсуществующей матрицы (Prescott et al., 2003). Точные делеции Неточные делеции Точные делеции — это такие делеции, которые проис- ходят в одних и тех же позициях нуклеотидной после- довательности во всех копиях макронуклеарных хромо- сом. Внутренние элиминируемые последовательности (IESs) — это короткие, однокопийные сегменты ДНК, которые удаляются главным образом из кодирующих последовательностей, но обнаруживаются и в межгенных Хотя IESs эффективно и воспроизводимо удаляются из соматического генома, в некоторых случаях границы делеции, формируемые независимыми событиями вы- резания в полиплоидном ядре, варьируют по своему по- ложению (рис. 7.5). Эта гетерогенность распространяется на десятки пар оснований у Tetrahymena и до нескольких килобаз у Paramecium. Неточная делеция характерна для
Глава 7. Эпигенетика инфузорий всех исследованных IESs у Tetrahymena и в первую очередь ответственна за удаление повторяющихся последователь- ностей, таких как межгенные транспозоны или мини- сателлиты у Paramecium (Le Mowil et al., 2003). Подобно точной эксцизии IESs эти делении в норме происходят между короткими прямыми повторами, один из которых сохраняется в макронуклеарной последовательности У Tetrahymena повторяющиеся последовательности очень вариабельны среди известных IESs, тогда как у Parame- cium эти повторы всегда содержат по крайней мере один динуклеотид ТА; это позволяет предположить, что соот- ветствующий механизм может быть связан с механизмом точного вырезания IES. 6.2. Фрагментация хромосом Во время развития макронуклеуса хромосомы, проис- ходящие из зародышевой линии, фрагментируются на более короткие молекулы, которые кепируются добав- лением de novo теломерных повторов (рис. 7.5). Полу- чающиеся в результате этого макронуклеарные хромо- сомы, по всей видимости, не имеют центромер, и таким образом хромосомная фрагментация может облегчать равное распределение этих молекул при амитотических делениях макронуклеуса. Степень фрагментации широко варьирует у разных видов. У спиротрих фрагментация достигает крайней степени, давая крошечные «нанохро- мосомы», обычно содержащие по одному гену, тогда как у Paramecium и Tetrahymena макронуклеарные хромосомы варьируют по размеру от 20 Кб до более чем 1 Мб и со- держат по много генов. У большинства инфузорий этот процесс является неточным, так что точное положение добавления те- ломерных повторов оказывается гетерогенным и часто приводит к некоторым потерям последовательностей зародышевой линии. Одно из исключений — Euplotes crassus, у которого теломеры всегда добавляются в од- них и тех же нуклеотидных позициях (Klobutcher, 1999). У Tetrahymena консервативная последовательность хро- мосомного разрыва длиной 15 пн (CBS), обнаруженная в 280 локусах хромосом зародышевой линии (Cassidy- Hanley et al., 2005; Hamilton et al., 2005), является и не- обходимой, и достаточной для направления фрагмен- тации и добавления новых теломер (Fan and Yao, 1996). Напротив, у видов Р. а иге На никаких аналогичных CBS не было идентифицировано. Скорее, все данные пока- зывают, что фрагментация хромосом является альтер- нативным результатом неточных делеций (рис. 7.5); при таких делениях элиминация ДНК залечивается либо путем воссоединения фланкирующих последователь- ностей, либо путем добавления теломер (Le Моил1 et al., 2003). 7. Механизмы перестроек генома Хотя геномные перестройки инфузорий исследуются бо- лее 30 лет, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий, остаются в основном неизвестными (Yao et al., 2002). Частично задачей, стоящей перед исследо- вателями, было объяснить разнообразие событий, кото- рые наблюдаются у разных инфузорий. Для нескольких инфузорий были описаны эксцизионные интермедиаты, а также (побочные) продукты циркулярной эксцизии (Jaraczewski and Jahn, 1993; Klobutcher et al., 1993; Wil- liams et al., 1993; Saveliev and Cox, 1995, 1996; Betermier et al., 2000; Gratias and Betermier, 2003). Эти данные не позволяют вывести единый механизм эксцизии даже для тех IESs разных инфузорий, которые имеют на своих концах сходные консенсусные последовательности (см. Klobutcher and Herrick, 1995; Gratias and Betermier, 2001; Betermier, 2004). Несмотря на разнообразие механизмов эксцизии может все же иметь место значительное перекрывание в событиях, направляющих перестройки ДНК. Одной из общих черт является то, что транспозоноподобные и повторяющиеся последовательности элиминируют- ся, по-видимому, преимущественно. Как описывается в этой книге, одна из ролей эпигенетических механизмов заключается в том, чтобы подавлять активность этих потенциально вредоносных ДНК-элементов. Разре- шение для транспозона переместиться из «молчащей» зародышевой линии в высоко активный макронуклеус является потенциально гибельным для соматического генома. Многие и разнообразные данные указывают на механизмы, связанные с RNAi и формированием гетерохроматина, как на участников этих процессов перестроек ДНК (Mochizuki and Gorovsky, 2004; Yao and Chao, 2005). У большинства эукариот гистон НЗ, метилирован- ный по лизину 9 (НЗК9те), в значительной степени ассоциирован с репрессированной ДНК, вычленяе- мой в ядре как гетерохроматин (см. раздел 7 главы 3). У Tetrahymena эта модификация не обнаруживается в транскрипционно «молчащем» микронуклеусе, как можно было бы предположить, но обнаруживается ис- ключительно в развивающихся макронуклеусах непо- средственно перед перестройками ДНК или одновре- менно с ними (Taverna et al., 2002). Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показали, что этой модификацией обогащены гистоны, связанные с IESs. Элиминация ДНК и формирование гетерохроматина были первоначально сцеплены друг с другом в резуль- тате идентификации хромодоменсодержащего белка (Pddl — Programmed DNA Degradation 1 protein) — обильно представленного, экспрессируемого в ходе развития белка, колокализующегося в фокусах, содер- жащих ДНК, ограниченную зародышевой линией и подлежащую элиминации (т.е. IESs) из соматического генома (Madireddi et al., 1994, 1996) Хромодомены — это белковые мотивы, обладающие сродством, спо- собностью связываться с некоторыми остатками метилированных гистонов. Возможно, что архети- пическая модель участия хромодоменного белка в регуляции хроматина — это связывание гетерохрома- тинового белка 1 (НР1 — содержащий хромодомен) с метилированным НЗК9 у Drosophila, играющее роль в формировании гетерохроматиновых доменов (дета- ли см в главе 5). Хромодомены Pddl и Pdd3, два бел- ка, требующихся для перестроек ДНК (Coyne et al, 1999; Nikiforov et al., 2002), связываются с пептидами
8. Зависящий от гомологии сайленсинг H3K9me2 (Taverna et al., 2002). Для того чтобы про- демонстрировать, что эта модификация хроматина требуется для перестройки ДНК, Лиу, Мочицуки и Горовски [Liu, Mochizuki and Gorovsky] использовали методику гомологичного замещения гена, чтобы за- менить гены основного гистона НЗ копиями, содер- жащими мутацию, поменявшую лизин 9 (K9Q) (Liu et al., 2004). Эти клетки не могли эффективно удалять IESs в ходе развития несмотря на тот факт, что Pddl локализовалась соответственно в предшественниках макронуклеусов, показывая тем самым, что НЗК9ше2 требуется для элиминации ДНК. Из-за того, что уста- новление состояний хроматина является ключевым детерминантом эпигенетической регуляции, важ- ный вопрос заключается в следующем: каким обра- зом метка НЗК9те2 специфически нацеливается на сегменты ДНК, обреченные на элиминацию? Как описывается ниже, несколько экспериментов проде- монстрировали, что в направлении перестроек ДНК участвуют гомологичные РНК. 8. Зависящий от гомологии сайленсинг генов у инфузорий Зависящие от гомологии, опосредуемые РНК механиз- мы сайленсинга широко используются эукариотами для эпигенетической регуляции. Данные о том, что такие механизмы активны у инфузорий, впервые были получены на Paramecium после трансформации вегета- тивного макронуклеуса неэкспрессибельными транс- генами, которые производят фенокопию менделевских мутантов в эндогенных генах. Сходные эффекты были затем воспроизведены у Paramecium и спиротрих при скармливании клеткам двунитевых РНК, что позволяло предполагать участие механизмов RNAi. Один из этих механизмов ведет к крайней форме сайленсинга генов — элиминации ДНК. 8.1. Сайленсинг, индуцируемый трансгенами Макронуклеус Paramecium легко трансформировать с помощью микроинъекций, потому что любой введен- ный в него фрагмент ДНК может поддерживаться в широком диапазоне числа копий, реплицируясь авто- номно без потребности в каком-либо специфическом ориджине. Трансформация высококопийными, не- экспрессибельными трансгенами может переключить посттранскрипционный сайленсинг эндогенных генов, обладающих достаточным сходством по последователь- ности (Ruiz et al., 1998; Galvani and Sperling, 2001). Сай- ленсинг не наблюдается, если в трансгене присутствует 3’UTR гена (Galvani and Sperling, 2001), что заставляет предполагать, что регуляторные сигналы, присут- ствующие в РНК, влияют на способность конструкта индуцировать сайленсинг. Впоследствии оказалось, что сайленсинг коррелирует с накоплением гомологичных коротких РНК длиной приблизительно 23 нуклеотида (н) (Garnier et al., 2004); это указывает на связь с путем RNAi. Эти короткие РНК длиной ~23 н, по-видимому, ответственны за прицельную деградацию гомологичных mRNAs и могут быть поэтому названы siRNAs (short interfering RNAs — короткие интерферирующие РНК). Сходный класс РНК длиной 23—24 н был также иденти- фицирован в вегетативных клетках Tetrahymena, и хотя какие-либо данные об их возможной роли отсутствуют, вполне вероятно, что они представляют собой эндоген- ные siRNAs (Lee and Collins, 2006). 8.2. Сайленсинг индуцируется двунитевой РНК Двунитевая РНК (dsRNA) является вероятным первич- ным триггером для индуцируемого трансгеном сайлен- синга, наблюдаемого у Paramecium. Сайленсирующая эффективность трансгенов коррелирует с образованием аберрантных молекул РНК, соответствующих как смыс- ловой, так и антисмысловой нитям инъецированной последовательности. Более того, способность dsRNA стимулировать сайленсинг гена была продемонстриро- вана путем скармливания клеткам Paramecium бактерий Escherichia coli, экспрессирующих dsRNA клонированно- го гена, с использованием методологии, разработанной для Caenorhabditis elegans (Timmons and Fire, 1998; Tim- mons et al., 2001). Сайленсинг эндогенного гена можно наблюдать фенотипически спустя всего три вегетатив- ных деления, т.е. меньше чем через 24 часа (Galvani and Sperling, 2002). Скармливание убитых нагреванием Е coll цнфузориям-спиротрихам, в норме питающимся водо- рослями, также индуцирует генный сайленсинг (Pashka et al, 2003), заставляя предполагать, что многие разные инфузории обладают этим механизмом. У Paramecium мо- лекулярный анализ показал, что кормление dsRNA при- водит к накоплению таких же ~23-нуклеотидных siRNAs, какие наблюдаются после сайленсинга, индуцируемого трансгеном (Nowacki et al., 2005); это указывает, что оба эти явления базируются на общем RNAi-пути. Сайленсинг, индуцируемый у Paramecium скармли- ванием dsRNA, может быть немедленно ревертирован замещением E.coli в культуральной среде нормальными пищевыми бактериями; аналогичным образом прямая микроинъекция dsRNA в цитоплазму индуцирует лишь временный, преходящий сайленсинг гомологичных ге- нов, предположительно потому, что инъецированная dsRNA быстро разбавляется в ходе вегетативного роста (Galvani and Sperling, 2002). Эти наблюдения позволя- ют предположить, что молекулы dsRNA не могут быть амплифицированы до сколько-нибудь значительного уровня в цитоплазме вегетативных клеток, в отличие от судьбы dsRNA в С.elegans, где это может приводить к наследуемому сайленсированному состоянию. Это, далее, предполагает, что RNAi у Paramecium не приво- дит к установлению стабильного транскрипционного сайленсинга гена в макронуклеусе. Наследуемый сай- ленсинг, вероятно, требовал бы метилирования гисто- на НЗК9. А, как упоминалось выше, эта модификация, очевидно, отсутствует в вегетативном макронуклеусе, по крайней мере у Т. thermophila.
Глава 7. Эпигенетика инфузории 9. Перестройки генома направляются зависящими от гомологии механизмами Во время развития инфузории три разных генома долж- ны различаться и канализироваться по трем раздельным направлениям: микронуклеарный геном зародышевой линии должен сохраняться интактным, в то время как развивающийся соматический геном в новом макрону- клеусе направляется таким образом, чтобы подвергнуться экстенсивной реорганизации; материнский же соматиче- ский геном обречен на разрушение. В этих более широких рамках цель исследователей, работающих на инфузориях, заключалась в том, чтобы понять воспроизводимость пат- тернов ДНК-перестроек. Первоначальные усилия были направлены на то, чтобы идентифицировать сА-активные мотивы ДНК-последовательностей, которые могли бы рекрутировать рекомбинационные белки, но поиски дали мало четких результатов (см.: Yao et al., 2002; Betermier, 2004). Первичная ДНК-последовательность определенно не является единственным детерминантом, направляю- щим реорганизацию макронуклеарного генома, — вывод, подкрепляемый данными о том, что НЗК9-метилирование маркирует сегменты ДНК для элиминации. Более того, многие паттерны перестроек, какописано ниже, чувстви- тельны к зависящим от гомологии эффектам, что делает возможным наследование альтернативных паттернов по материнской линии в последующих половых поколениях, независимо от Менделевской передачи генома дикого типа зародышевой линии Наследование паттернов перестройки удовлетворяет, следовательно, определению эпигенетического явления. а. Аутогамия у дикого типа Рис. 7.6. Индуцированные трансгеном делеции у Paramecium (а) У дикого типа ген А (красные стрелки) расположен вблизи гетерогенных концов макронуклеарной хромосомы: розовые прямоугольники = макронуклеарные теломеры. Паттерн пере- строек макронуклеарной хромосомы надежно репродуцируется в ряду поколений, (б) Введение большого числа копий транс- генов А в материнский макронуклеус может индуцировать полную делецию эндогенного гена А в половом потомстве, когда новый макронуклеус развивается из производного за- родышевой линии дикого типа. Новые макронуклеарные теломеры располагаются непосредственно «вверх по течению» от гена А 9.1. Экспериментальная индукция специфических делеции в развивающемся макронуклеусе Еще до того как посттранскрипционный сайленсинг генов был описан у Paramecium, было обнаружено, что введение клонированных последовательностей в большом числе копий в вегетативный макронуклеус изменяет ДНК- перестройки в половом потомстве трансформированных клонов. Удивительно, что последовательности, гомологич- ные трансгену, специфическим образом делегировались по неточному механизму, в то время как микронулеарный геном оставался интактным (рис. 7.6) (Меуег, 1992). Это явление, по-видимому было весьма общим, поскольку все испытанные фрагменты ДНК могли производить делеции (Меуег et al., 1997). Эти эксперименты показывали, что в ходе половых событий сиквенс-специфичная инфор- мация передается через цитоплазму из трансформиро- ванного материнского макронуклеуса в развивающийся зиготический макронуклеус. Эта всеобщность данного эф- фекта говорила не в пользу тех трактовок, в которых роль отводилась сиквенс-специфичным ДНК-связывающим белкам, продуцируемым или титруемым инъецирован- ными трансгенами. Наиболее экономное объяснение, согласующееся с наблюдаемой специфичностью, пред- полагает, что нуклеиновые кислоты, предположительно молекулы РНК, переносятся между ядрами и распознают свои мишени на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании. Конструкты, которые эффективно индуцируют постзиготические делеции, являются неэкспрессибель- ными трансгенами, такими как трансгены, содержащие мутации типа сдвига рамки считывания или усечения 5’ или 3’ UTRs (Garnier et al., 2004). Те из них, которые могут продуцировать стабильные, способные транс- лироваться иРНК, не стимулируют элиминацию гомо- логичных генов из развивающихся макронуклеусов. Те же конструкты, которые стимулируют делецию ДНК, вызывают также сайленсинг эндогенных материнских генов в ходе вегетативного роста трансформирован- ных клонов. Таким образом, постзиготические делеции коррелируют с презиготическим сайленсингом и с на- коплением ~23-нуклеотидных siRNAs. Эти siRNAs, как было показано далее, сохраняются в клетках на протя- жении всего развития, что заставляет предполагать, что они могут отвечать за включение этих делеций. Если ассоциированные с сайленсингом siRNAs на- правляют ДНК-перестройки, тогда введение dsRNA до начала или во время развития должно стимулировать элиминацию гомологичной последовательности в по- томстве. Чтобы это проверить, клеткам Paramecium, ко- торым скармливались E.coli штамма, продуцирующего
10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического dsRNA, гомологичную кодирующей последовательно- сти ND7 — гену, участвующему в регулируемом экзоци- тозе секреторных пузырьков, называемых трихоциста- ми, — дали возможность пройти автогамию и развить новые макронуклеусы из микронуклеусов дикого типа. Некоторое число поставтогамных потомков продемон- стрировали мутантный фенотип ND7благодаря элими- нации этого гена из их макронуклеусов (Gamier et al., 2004). Даже потомство фенотипически дикого типа по- казало частичную элиминацию копий гена ND7, Как и~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с трансген- индуцированным сайленсингом, ~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с кормлением dsRNA, сохранялись, как было показано, в этих клетках на протяжении всей аутогамии (Nowacki et al., 2005), подтверждая их участие в «нацеливании» постзиготических делеций. Явление индуцированной ДНК делеции, направляемой dsRNA, не ограничивается Paramecium. Микроинъекция конъ- югирующим Tetrahymena смысловой и антисмысловой РНК, транскрибированной in vitro и гомологичной ге- номным локусам, в норме сохраняющимся в макрону- клеусе, приводит к неточной делеции этих последова- тельностей (Yao et al., 2003). 10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического 10.1. Парадигма d48: эпигенетическое наследование альтернативных перестроек Хотя перестройки, индуцируемые трансгенами и dsRNA, иллюстрируют эпигенетическую природу процесса элими- нации ДНК, возможно еще более удивительными являются наблюдения, что паттерны индуцированных перестроек могут наследоваться в последовательных раундах макро- нуклеарного развития. Первое доказательство эпигене- тической регуляции перестроек было обнаружено, когда аберрантная деления из макронуклеуса гена, кодирующего у P.teiraurelia поверхностный антиген А, оказалась цито- плазматически наследующейся в скрещиваниях с диким типом (рис. 7.7) (Epstein and Forney, 1984). В макронуклеусах дикого типа ген А локализован вблизи конца хромосомы на расстоянии 8,13 либо 26 тн от теломеры, что диктуется тремя альтернативными сайтами фрагментации. Было обнаружено, что вариантная клеточная линия, называемая d48, не экспрессирует ген А, потому что сам этот ген был утерян вместе со всеми последовательностями «вниз по течению», когда формировалась его теломера на 5’-конце этого гена (Forney and Blackbum, 1988). Эксперименты по трансплантации ядер подтвердили, что микронуклеус за- родышевой линии d48 несёт ген А дикого типа. Например, замена микронуклеуса d48 микронуклеусом штамма дикого типа не предотвращает материнской передачи делеции гена А половому потомству; и наоборот, микронуклеус d48, бу- в. «Спасенный» d48 Рис. 7.7. Эпигенетическое наследование и экспериментальное «спасение» делеций макронуклеарного гена А (а) Штамм дикого типа, (б) У штамма d48 нет гена А в его макро- нуклеусе, но его микронуклеус — дикого типа. Ген А воспроиз- водимо делегируется в ходе развития макронуклеуса в каждом поколении, (в) Трансформация макронуклеуса штамма d48 последовательностями гена А специфически восстанавливает амплификацию гена А зародышевой линии в развивающемся макронуклеусе полового потомства дучи трансплантирован в клетку дикого типа, давал начало после автогамии новому макронуклеусу, который содержал ген Л (Harumoto, 1986; Kobayashi and Koizumi, 1990). Сход- ные эксперименты, сфокусированные на поддержании или делеции еще одного проксимального по отношению к теломере гена поверхностного антигена, гена В, показали, что такие материнские эффекты могут наблюдаться и в других районах генома (Scott et al., 1994). В совокупности эти исследования заставляют предполагать, что некий геномный район должен присутствовать в материнском макронуклеусе для того, чтобы эффективно сохраняться и амплифицироваться в развивающемся макронуклеусе до числа копий, характерного для дикого типа. 10.2. Эпигенетическое наследование экспериментально индуцированных делеций Материнское влияние на перестройки ДНК, подобное тому, как это наблюдалось для d48, по-видимому кон-
Глава 7. Эпигенетика инфузорий тролирует развитие многих, а возможно и всех, районов макронуклеарного генома Paramecium. В самом деле, макронуклеарные делеции, создаваемые эксперимен- тально в половом потомстве, могут «спонтанно» вос- производиться в последующих половых поколениях, по материнскому типу наследования. Это наблюдали и для делений гена G, индуцированных у P.primaurelia высоко- копийным трансгеном, для другого субтеломерного гена поверхностного антигена (Меуег, 1992), и для макрону- клеарных делеций гена ND7, которые превоначально были индуцированы скармливанием dsRNA (Garnier et al., 2004). В любом случае индуцирующий трансген или введенная dsRNA не были больше необходимыми для воспроизведения данной делеции в половом потомстве У d48 и в этих индуцированных вариантных клеточных линиях данное состояние соматического генома может время от времени после автогамии ревертировать к перестроечному паттерну дикого типа, подтверждая тем самым, что этот ген все еще наличествует в микронукле- арном геноме, и высвечивая эпигенетический способ наследования. Замечательно, что сайленсинг гена и получающаяся в результате делеция ДНК могут «запоминаться» в по- следующих поколениях; при этом целевой геномный район обрабатывается в ходе развития макронуклеуса так же, как транспозоны и IESs. Рекуррентная делеция гена в каждом половом поколении, по-видимому, не ин- дуцируется ~23-нуклеотидными siRNAs, поскольку эти РНК выявлялись лишь тогда, когда сайленсинг экспе- риментально индуцируется в первом поколении. Более того, генетический анализ таких клеточных линий по- казал, что этот микронуклеарный ген не несет никакого постоянного импринта, поскольку он может нормально амплифицироваться в ходе макронуклеарного разви- тия, когда он переносится при конъюгации в клеточ- ную линию с макронуклеусом дикого типа. Создается, следовательно, впечатление, что этот ген делегируется в развивающемся макронуклеусе просто потому, что он отсутствует в материнском макронуклеусе. 10.3. «Спонтанная» элиминация чужеродных последовательностей, интродуцированных в микронуклеарный геном Воспроизведение материнских перестроечных состояний позволяет предполагать, что геном зародышевой линии, которому предстоит реорганизация, сравнивается с су- ществующим перестроенным геномом, и последователь- ности, отсутствовавшие в предшествующем поколении, делаются целевыми для удаления из вновь формирующе- гося соматического генома. Если бы это действительно было так, то можно было бы предсказать, что трансгены, интродуцируемые в микронуклеус зародышевой линии, часто делегировались бы в ходе развития нового макро- нуклеуса. У Tetrahymena, где была разработана транс- формация микронуклеуса, исследователи наблюдали, что интегрированные маркеры лекарственной устойчивости, используемые для исследований с дизрупцией генов, могут делегироваться из макронуклеарного генома в ходе последовательных раундов конъюгации (Yao et al., 2003; Liu et al., 2005). Геномная локализация трансгена, а также число копий, вводимых в геном зародышевой линии, существенно влияли на эффективность элимина- ции (Liu et al., 2005), что указывает на то, что индукция данного явления у этой инфузории носит менее общий характер. Тем не менее, эти результаты демонстрируют, что чужеродная последовательность, бактериальный неоген, может распознаваться клеткой как IES. 10.4. Экспериментальное «спасение» наследуемых макронуклеарных делеций Является ли простое отсутствие некоего геномного района в материнском соматическом макронуклеусе достаточным для направления его будущей элимина- ции? Если это так, тогда повторное введение гена А в макронуклеус d48 должно было бы «спасать» этот дефект в воспроизведении гена Л в ходе развития. Сначала было показано, что инъекция либо макронуклеоплазмы дикого типа в вегетативный макронуклеус d48 (Harumoto, 1986), либо цитоплазмы от автогамных клеток дикого типа в клетки d48 в раннем развития (Koizumi and Kobayashi, 1989) приводили к перманентной реверсии d48 к дикому типу. Впоследствии прямая микроинъекция нескольких неперекрывающихся фрагментов гена Л, распространяю- щихся на большую часть ~8-тн кодирующей последо- вательности, в макронуклеус d48 продемонстрировала, что последовательность гена Л сама по себе достаточна для восстановления макронуклеарного перестроечного паттерна дикого типа (рис. 7) (Koizumi and Kobayashi, 1989; Jessop-Murray et al., 1991; You et al., 1991). Влияние материнского генома на перестройки ДНК показывает заметную специфичность по последова- тельности. Кодирующие последовательности генов Л и В в целом идентичны на 74 %. Тем не менее, инъекция последовательностей гена Л в макронуклеус клеточной линии, несущей макронуклеарные делеции обоих ге- нов, могла лишь предотвращать делению гена Л из но- вого макронуклеуса; и сходным же образом, инъекция гена В могла лишь препятствовать своей собственной делеции (Scott et al., 1994). Кроме того, макронуклеар- ную делению d48 нельзя было «спасти» трансформаци- ей геном Got P.primaurelia. на 78 % идентичным с геном Л. С другой стороны, макронуклеарная делеция гена Л могла быть «спасена» трансформацией другой аллелью гена Л, демонстрирующей 97%-ную идентичность (For- ney et al., 1996). Таким образом, материнское «спасе- ние» макронуклеарных делеций является зависящим от гомологии процессом, который не нуждается в какой- либо специфической последовательности внутри генов, но требует некоего минимального уровня идентичности последовательностей Этот материнский эффект «спасения» d48, на пер- вый взгляд, выглядит как не согласующийся с индуци- рованными трансгеном делециями, поскольку в этих экспериментах инъекция последовательностей гена Л в материнский макронуклеус имела в точности противо-
10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического положные последовательности в зиготическом гене А. Этот кажущийся парадокс был разрешен, когда было показано, что постзиготический эффект делеций за- висит от установления зависяшего от гомологии сай- ленсинга в трансформированных клонах (Garnier et al., 2004). Наоборот, эффект «спасения» наблюдается лишь в условиях трансформации, которые не вызыва- ют сайленсинга (т.е. лишь умеренные числа копий для неэкспрессируемых конструктов или любое число ко- пий для экспрессируемых трансгенов) (Garnier et al., 2004). Таким образом, оказывается, что накопление ~23-нуклеотидных siRNA может предотвратить эффект «спасения» последовательностей гена А в материнском макронуклеусе, который стимулирует амплификацию гена А в развивающемся макронуклеусе. Это является сильным доводом в пользу того, что цитоплазматиче- ским фактором, опосредующим Аирщ/с-ядерный эф- фект, является транскрипт гена А. Однако это не обя- зательно должна быть полноразмерная mRNA, потому что даже фрагменты кодирующей последовательности обладают, как было показано, «спасающей» активно- стью. Более того, клоны, содержащие целый ген, часто экспрессируют эту mRNA на протяжении всего вегета- тивного роста, тогда как продукция «спасающего» ци- топлазматического фактора ограничена, как было по- казано, периодом ядерной реорганизации 10.5. Экспериментальное подавление элиминации IES в развивающемся макронуклеусе Зависящее от гомологии подавление IES у Paramecium Если делеция или сохранение клеточных генов контро- лируются путем сравнения содержания соматического генома и генома зародышевой линии, тогда даже эф- фективная в норме эксцизия IESs могла бы, возможно, нарушаться, когда копии присутствуют в материнском макронуклеусе. Изучение менделевской мутации, mtFE, обладающей плейотропными влияниями на развитие макронуклеуса, в том числе влиянием на детерминацию типа спаривания (Brygoo and Keller, 1981a,b), дало воз- можность проверить это предсказание. Оказалось, что эта мутация, будучи в гомозиготном состоянии, отменяет вырезание IES-последовательности, локализованной в гене поверхностного антигена G. Удивительно, но когда аллель дикого типа гена mtF была реинтродуцирована в мутантный штамм в результате конъюгации, эта IES все еще не вырезалась в ходе последующего развития макронуклеуса (Meyer and Keller, 1996). Генетический анализ получившегося в результате вариантного штамма, названного штамм IES4, подтвердил, что генетически он является диким типом и что специфическое сохранение этой IES наследуется по материнской линии в половом потомстве (Duharcourt et al., 1995). Является ли эксцизия IES в развивающихся макро- нуклеусах индуцированной материнскими копиями корректно перестроенного гена G или же ингибирован- ной материнскими копиями сохраняющего IES гена G? Чтобы ответить на этот вопрос, макронуклеусы клеток IES+ или IES были трансформированы с помощью пря- мой микроинъекции плазмид, содержащих фрагмент кодирующей последовательности G в ее микронукле- арной (IES+) или макронуклеарной (IES ) версиях (рис. 7.8) (Duharcourt et al., 1995). После автогамии транс- формированные клоны, содержавшие плазмиду IES , дали линии потомков, которые сохранили IES в своих вновь сформировавшихся макронуклеусах, тогда как клетки IES+, трансформированные плазмидой IES , оказались неспособными индуцировать эксцизию, и их потомство оставалось в состоянии IES+. Плазмида, со- державшая только IES, без каких-либо фланкирующих последовательностей, также вызывала сохранение IES. показывая тем самым, что одни только материнские ко- пии IES подавляют эксцизию из материнских макрону- клеусов (Duharcourt et al., 1995). «Матерински контролируемые» versus «не матерински контролируемые» IESs у Paramecium Может ли вырезание других IESs контролироваться по- добными материнскими влияниями? Для ответа на этот вопрос макронуклеусы клеток дикого типа трансформи- ровали большими сегментами микронуклеарной ДНК (IES), содержащими гены поверхностных антигенов либо G, либо Л (Duharcourt et al., 1998). Эти инъецирован- ные сегменты содержали, соответственно, шесть и девять IESs. Изучали эксцизию 13 из этих IESs, и оказалось, что пять IESs сохранялись в макронуклеусах поставтогамных потомков этих трансформированных клеток. Инъекция плазмид, содержащих одиночные IESs, показала, что по- давление было строго специфичным: каждая из этих пять IESs индуцировала сохранение только гомологичной зиготической IES, но не влияла на какие-либо другие. Контрольный фрагмент ДНК, содержавший большую часть макронуклеарного (IES) гена G, не оказывал ника- кого влияния на любую из тестируемых IESs. Среди 13 испытанных IESs Paramecium не было сколько-нибудь очевидных различий в величине, составе оснований или в положении внутри генов между этими пятью, которые продемонстрировали материнский эффект, и восьмью, которые его не обнаружили (Duharcourt et al., 1998). Зависящее от гомологии подавление элиминации IES у Tetrahymena Эксперименты, аналогичные проведенным на Parame- cium, показали, что содержание ДНК родительского макронуклеуса Tetrahymena может регулировать эли- минацию гомологичных последовательностей из раз- вивающегося соматического генома Две хорошо оха- рактеризованные IESs, делеционные элементы М и R, были введены путем микроинъекций в макронуклеусы штаммов дикого типа таким образом, что они поддержи- вались на высококопийных векторах. Когда у этих клеток была индуцирована конъюгация, потомство клеток, содержащих материнские копии элемента М, оказалось неспособным эффективно элиминировать соответствую- щие IESs во время развития макронуклеуса (Chalker and
Глава 7. Эпигенетика инфузорий Yao, 1996). Подобным же образом клетки, родительские макронуклеусы которых содержали копии элемента R, оказались неспособными вырезать гомологичную IES. Существенное подавление эксцизии негомологичных элементов не наблюдали. Таким образом, подавление элиминации ДНК было специфичным в отношении по- следовательности. Последовательности, гомологичные самой IES, были достаточны для этого подавления, а непосредственно фланкирующие ДНК таким эффектом не обладали. Важно отметить, что эта индуцированная неспособность к элиминации ДНК была наследуемой, поскольку последующие поколения также сохраняли геномные копии этой IES в своих макронуклеусах. Поскольку у Tetrahymena в конъюгирующих парах во время развития происходит интенсивный обмен ци- топлазмой, исследователи имели возможность наблю- дать, что это подавление передавалось через цитоплаз- му таким образом, что лишь один из партнеров должен был нести эту IES в своем родительском соматическом геноме для того, чтобы были затронуты гомологичные последовательности во всех развивающихся ядрах в паре, включая ядра в партнере дикого типа. Следова- тельно, состояние перестройки ДНК, характерное для родительских ядер, передается через цитоплазму и регу- лирует события, происходящие во время формирования нового соматического генома следующего поколения. Никакого обмена ядрами зародышевой линии не тре- буется для передачи состояния одного партнера псгспа- риванию другому; это наблюдение исключает возмож- ность того, что передача происходит путем наложения импринта на зародышевую линию в ходе нормального клеточного роста до вступления в развитие (Chalker et al., 2005). Действительно, путем физического разделе- ния конъюгирующих пар, состоящих из клетки дикого типа и ее партнера, содержавшего копии элемента М в своем материнском соматическом ядре, было показано, что передача происходит после мейоза и очень близко к тому моменту, когда развивающиеся ядра впервые на- чинают дифференцироваться в новые макронуклеусы и микронуклеусы. Следовательно, влияние материнского соматического генома активно устанавливается в ходе развития. Биологические следствия материнского контроля Способность инфузорий изменять перестройки ДНК таким образом, чтобы отражать материнский паттерн, дает клеткам простой способ передавать альтернативные соматические версии генома половому потомству. Эта динамическая регуляция означает, что стабильное равно- весие между двумя альтернативными генетическими со- стояниями, например IES+ (100 % эксцизии) и IES (0 % эксцизии) может достигаться и поддерживаться на про- тяжении многих половых поколений. Это было показано по крайней мере для одной IES Paramecium, для которой такое материнское влияние достаточно для того, чтобы превратить меньшую долю макронуклеарных копий IES+ в большую фракцию в макронуклеусе следующего поколения (Duharcourt et al., 1995). Такое влияние парал- лельно стабильному, материнскому наследованию типов спаривания О и Еу P.tetraurelia. Сопоставимая асимме- трия обнаруживается в обеих системах, потому что и эксцизия IES, и детерминация О-типа, по-видимому, являются путями развития «по умолчанию», тогда как и сохранение IES. и детерминация Е-типа нуждаются в некоем цитоплазматическом сигнале из материнского макронуклеуса для изменения этих своих путей развития. Эти системы вполне могут быть родственными, потому что менделевская мутация mtFE, нарушающая эксцизию одной IES гена G независимо от родительского состоя- ния, сходным образом делает детерминацию к Е консти- тутивной — наблюдение, связывающее альтернативные состояния обоих примеров. Выяснение механизма (ме- ханизмов), лежащего в основе этих явлений, несомненно вскроет новые способы материнского наследования эпигенетической информации. 11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опосредованное РНК-интерференцией Зависящие от гомологии эффекты, описанные выше, де- монстрируют существование «переговоров» [a cross talk] Рис. 7.8. Зависимое от гомологии подавление эксцизии IES материнским макронуклеусом В ходе нормального развития IESs (красные и зеленые прямоугольники} эффективно вырезаются. Однако трансформация материн- ского макронуклеуса данной IES (исходные трансформанты = поколение t) может подавить элиминацию гомологичной IES во время последующих (поколение t + 1) (b будущих) раундов дифференцировки нового макронуклеуса
11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опосредованное РНК-интерференцией между материнским соматическим геномом и геномом зародышевой линии в процессе ядерной дифференци- ровки, которые могут существенным образом менять паттерны перестройки ДНК. Тот факт, что затрагиваются только высоко гомологичные последовательности, явля- ется сильным аргументом в пользу предположения, что эти «переговоры» опосредуются нуклеиновыми кислота- ми. В этом регуляторном механизме могли бы, возможно, участвовать транскрипты из материнского макронуклеу- са, экспортируемые в развивающийся макронуклеус, где, в случае, если они содержат IES, они предотвращали бы элиминацию гомологичных последовательностей. Одна- ко было показано, что эти предполагаемые материнские транскрипты не участвуют в качестве донорских матриц в ходе репарации двунитевых разрывов, индуцируемых конститутивной эксцизией IES (Duharcourt et al., 1995). Если материнские защитные транскрипты существуют, эти ~23-нуклеотидные siRNAs, которые диктуют сайлен- синг генов, могут косвенным образом «нацеливать» деле- нию ДНК, стимулируя разрушение тех из них, которые идентичны по последовательности. Сама по себе эта роль siRNAs не может объяснить материнское наследование перестроечных паттернов в последовательных поколени- ях. Как это обсуждается ниже, возможно, что в конечном счете реорганизацией генома управляет взаимодействие между материнскими макронуклеарными транскрипта- ми и новым классом коротких РНК, происходящих из мейотического микронуклеуса. 11.1. Связь коротких РНК с элиминацией ДНК У Tetrahymena каноническая модификация гетерохро- матина, НЗК9-метилирование, маркирует хроматин, связанный с IESs, непосредственно перед их выреза- нием. Каким образом эта модификация осуществляет специфическое «нацеливание» на эти сегменты ДНК, предназначенные для элиминации? Был описан RNAi- подобный путь, который использует RNA-гиды, чтобы направить ее на соответствующие локусы (обзор см. Mochizuki and GorovskY, 2004; Yao and Chao, 2005). Перво- начальным указанием на то, что делеция ДНК использует молекулы гомологичных РНК, явилось наблюдение, что у Tetrahymena IESs двунаправлено транскрибируются на ранних этапах конъюгации (Chalker and Yao, 2001). Реальный прорыв случился, когда Mochizuki и др. (2002) идентифицировали белок семейства PIWI/Argonaute, ко- дируемый геном TWI1, который экспрессируется в ходе развития и необходим для перестройки ДНК (Mochizuki et al., 2002) Поскольку белки Argonaute являются клю- чевыми игроками в процессах, включаемых RNAi, эти исследователи искали и нашли такой класс эндогенных малых (~28 нуклеотидов) РНК, которые предпочтительно комплементарны к последовательностям, ограниченным зародышевой линией. Деструкция гена TWI1 дестаби- лизировала эти короткие РНК и ликвидировала мети- лирование НЗК9 в развивющемся соматическом ядре. Эта работа, опубликованная в 2002 году, в совокупности с экспериментами на Schizosaccharomyces pombe (главы 6 и 8) утвердила новую парадигму, согласно которой гетерохроматин генерируется действием гомологичных РНК, «нацеливающих» метку сайленсинга (НЗК9) на специфичные локусы. Характеристика гена DCL1, кодирующего рибону- клеазу Dicer, осуществляющую процессинг двусторон- них транскриптов в ~28-нуклеотидные малые РНК, обеспечила еще более глубокое проникновение в об- щую регуляцию этого процесса (Malone et al., 2005; Mochizuki and Gorovsky, 2005). Этот белок экспрессиру- ется на высоком уровне на ранних этапах конъюгации и локализуется в премейотических микронуклеусах, что указывает на то, что генерация малых РНК компар- тментализована во времени и пространстве в пределах этого ядра зародышевого пути. Разрушение гена DCL1 вызывало утрату способности производить малые РНК, аккумуляцию транскриптов зародышевой линии и, в конечном счете, неспособность к вырезанию IES. Ин- тригующим моментом является то, что утрата малых РНК не ликвидирует метилирование НЗК9, как это на- блюдалось в линиях с нокаутом по TWI1. Тем не менее, анализ с помощью иммунопреципитации хроматина показал, что эта модификация больше не является обо- гащенной на IESs; таким образом, малые РНК необхо- димы для того, чтобы «нацеливать» эту модификацию хроматина на нужные локусы (Malone et al., 2005). Чтобы объяснить роль материнского генома в регу- ляции этих событий, была предложена модель скани- рующей РНК (Mochizuki et al., 2002). В варианте этой модели, изображенном на рис. 7.9, 28-нуклеотидные «сканирующие» РНК, генерируемые в микронуклеусе, связываются с RISC-подобным комплексом в цито- плазме, содержащим Twil, и изначально направляются в материнский макронуклеус. Здесь они сканируют су- ществующий перестроенный геном на наличие гомоло- гии. Те scnRNAs, которые спариваются с материнскими последовательностями, удаляются из пула активных комплексов. Остающиеся scnRNAs, ассоциированные с Twil, транспортируются затем в развивающийся макро- нуклеус, где они «нацеливают» метилирование НЗК9 на гомологичные последовательности, маркируя их для вырезания с помощью механизма перестройки ДНК. Эта модель подкрепляется далее наблюдением, соглас- но которому Twil локализуется в материнском макро- нуклеусе на ранних этапах развития после образования основной массы малых РНК. но до появления пред- шественников новых макронуклеусов. Таким образом, регулируемый трафик комплексов малых РНК и белков облегчает сравнение соматического генома и генома за- родышевой линии. 11.2. Транспорт РНК из материнского в зиготические макронуклеусы у Paramecium Для сравнения последовательностей зародышевой линии и соматических в масштабах всего генома был бы необ- ходим весьма сложный механизм, как для обеспечения массивного транспорта молекул РНК между ядрами, так и для осуществления очень большого числа взаимодей- ствий по механизму спаривания, которые предполага-
Глава 7. Эпигенетика инфузорий ются в модели сканирования. Участником этих транс- нуклеарных «переговоров» у Paramecium оказался новый белок, Nowal, связывающийся с нуклеиновой кислотой (Nowacki et al., 2005). Nowal синтезируется незадолго до мейоза и сначала аккумулируется в материнском макро- нуклеусе, а затем, подобно Twil Tetrahymena, релокали- зуется в развивающийся зиготический макронуклеус. Мечение Nowal фотоактивируемым GFP позволило исследователям убедительно продемонстрировать, что этот белок транспортируется из ядер одного типа в ядра другого. Один домен этого белка может связывать РНК, а второй домен необходим и достаточен для межъядерного транспорта; таким образом, Nowal может быть транс- портером РНК. Nowal является существенным для развития жиз- неспособного нового макронуклеуса, в том числе для элиминации транспозонов зародышевой линии и под- группы IESs. Удивительно, но только те IESs, которые подвержены материнскому контролю, затрагиваются нокдауном Nowal; это позволяет предполагать, что этот белок участвует в trans-нуклеарном сопоставлении. Те IESs, которые нечувствительны к присутствию гомоло- гичных последовательностей в материнском макрону- клеусе, не зависят в своей эксцизии от Nowal, что под- тверждает существование механистически различных классов IESs у Paramecium. Хотя нуклеиновые кислоты, связываемые Nowal in vivo, пока еще не известны, эф- фекты удаления Nowal согласуются с предлагаемой мо- делью сканирования (рис. 7.9) и позволяют предпола- гать, что этот белок может нести РНК, отобранные для «нацеливания» элиминации находящихся под материн- ским контролем IESs и транспозонов в развивающемся макронуклеусе 12. Заключение: элиминация ДНК как механизм защиты генома Исследования RNAi, в особенности у растений и не- матод, привели к гипотезе, что этот путь развился как защитный механизм, позволяющий клеткам контро- лировать пролиферацию вирусов и транспозонов путем разрушения mRNAs и «нацеливания» формирования гетерохроматина на этих геномных паразитах (Matzke and Birchler, 2005). Как уже упоминалось, перемещающиеся элементы, присутствующие в геноме зародышевой линии инфузорий, элиминируются в ходе развития соматиче- ского макронуклеуса, что эффективно сводит на нет их влияние. Сделанное на Tetrahymena наблюдение, что Производство сканирующих РНК Сравнение геномов Метилирование НЗК9 Делеция ДНК Рис. 7.9. Модель сканирования РНК, объясняющая контроль делеции ДНК Двунаправленная транскрипция большой части генома зародышевой линии происходит на ранних этапах развития и приводит к продукции scnRNAs Эти РНК затем транспортируются в материнский макронуклеус, где любая встреча с гомологичной по- следовательностью включает их удаление из активного пула. Остающиеся, микронуклеус-специфичные РНК перенаправляются в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» НЗК9-метилирование на гомологичные последовательности, создавая сигнал об их удалении из генома. Модель адаптирована из: Mochizuki et al. (2002)
12. Заключение: элиминация ДНК как механизм защиты генома метилирование НЗК9 маркирует геномные районы для делеции ДНК в ходе развития, заставляет предполагать, что использование RNAi у инфузорий в основе своей сходно с его ролью в формировании гетерохроматина у других эукариот: инфузории лишь продвинулись на шаг дальше и элиминируют гетерохроматин из своего сома- тического генома. Тем не менее, одним оригинальным вкладом, полученным в исследованиях на инфузориях, является идея о том, что специфические последователь- ности, «предназначаемые» RNAi для формирования (элиминации) гетерохроматина в ходе раннего развития, селектируются с помощью глобального сопоставления материнских соматического генома и генома зароды- шевой линии, начинающегося во время мейоза. Этот механизм эффективно защищал бы от вредоносных влияний транспозиции в зародышевой линии: любой новый транспозон, интегрирующийся в материнскую зародышевую линию, распознавался бы как чужеродный путем сравнения с соматическим геномом в ходе по- лового воспроизведения, что вело бы к его удалению из транскрибированного соматического генома потомков, ограничивая тем самым его будущее распространение. У Tetrahymena scnRNAs, которые «нацеливают» эли- минацию ДНК, весьма вероятно опосредуют trans- нуклеарные «переговоры» между геномом зародышевого пути и соматическим геномом. Неясно, весь ли микро- нуклеарный геном производит scnRNAs, но неопубли- кованные данные, полученные на Paramecium, позволя- ют предполагать, что по крайней мере большая его часть делает это. Анализы с помощью Норзерн-блоттинга вы- явили мейоз-специфичные, эндогенные короткие РНК, соответствующие клеточным генам, а также транспозо- нам и IESs (M.Nowacki et al., неопубликовано). Эти ко- роткие РНК имеют длину ~25 нуклеотидов и четко отли- чаются от ~23-нуклеотидных siRNAs. По-видимому, они функционально эквивалентны scnRNAs Tetrahymena, потому что инактивация специфических Dicer- подобных генов у Paramecium супрессирует их образование во вре- мя мейоза и устраняет элиминацию транспозонов и на- ходящихся под материнским контролем IESs, а также материнское наследование делеций макронуклеарных генов (V. Serrano et al., неопубликовано). Оригинальная модель сканирования генома пред- полагала, что scnRNAs сравниваются с перестроенной ДНК в материнском макронуклеусе, инактивируя те из последовательностей, которые соответствуют макро- нуклеарным последовательностям, и отбирая для пула, специфичного для микронуклеуса (рис. 7.10а). Однако несколько линий доказательств заставляют предпо- лагать. что scnRNAs могут сравниваться с происходя- щими из макронуклеуса транскриптами, а не с самой ДНК. Это освобождало бы от необходимости открывать ДНК-дуплекс по всему геному, чтобы провести испыта- ние на комплементарность. Те из введенных в материн- ский макронуклеус Tetrahymena IESs, которые интерфе- рируют с делецией ДНК, транскрибируются, допуская такую возможность (Chalker and Yao, 2001; Chalker et al., 2005). Транскрипты, возникающие с какой-то IES в материнском макронуклеусе, защищали бы зиготи- ческую IES от элиминации, как изначально постулиро- валось для объяснения IES-подавления у Paramecium. путем титрования гомологичных scnRNAs. Данные в пользу цитоплазматического фактора, который может «спасать» делецию гена А в штамме d48, также говорят в пользу существования протективных транскриптов и позволяют также предполагать что в цитоплазме, как и в материнском макронуклеусе, мог бы происходить от- бор scnRNAs Наконец, это объясняло бы, каким обра- зом посттранскрипционный сайленсинг данного гена у Paramecium может вызывать его делецию в следующем поколении: если транскрипты из материнского макро- нуклеуса разрушаются, 23-нуклеотидные siRNAs, гомо- логичные scnRNAs, смогут свободно «нацеливать» де- леции в новом макронуклеусе, несмотря на присутствие этого гена в материнском макронуклеусе. Один интересный аспект этой модифицированной гипотезы, которую можно назвать моделью сканирова- ния транскриптома, заключается в том, что все взаимо- действия типа образования пар могут происходить меж- ду молекулами РНК. Если scnRNAs в конечном счете «нацеливают» формирование гетерохроматина путем взаимодействия с вновь возникающими транскрипта- ми в гомологичном локусе, как это предполагается у S. pombe и растений, эти более поздние взаимодействия по типу образования пар не обязательно должны фун- даментально отличаться от взаимодействий, происхо- дящих на этапе селекции. scnRNAs могут просто спа- риваться с любой доступной РНК после того как они покинут мейотический микронуклеус. Спаривание с многочисленными макронуклеарными транскриптами, присутствующими в клетке на ранних этапах развития, эффективно удаляло бы гомологичные scnRNAs из пула путем их секвестрации или разрушения. К тому време- ни, когда зиготический макронуклеус формируется и начинает транскрипцию своего неперестроенного ге- нома, для спаривания с образующимися транскриптами оставались бы лишь специфические для микронуклеуса scnRNAs. Эти взаимодействия по типу спаривания мо- гут вести к делеции ДНК, потому что они происходят в развивающемся макронуклеусе или потому, что они происходят на правильной стадии развития. В этой модели распознавание «своего» (макронукле- арных последовательностей) и «не своего» (геномных паразитов в зародышевой линии) достигается простым онтогенетическим переключением, изменяющим исход простых взаимодействий по типу спаривания. Концеп- туально это похоже на процесс, посредством которого иммунная система позвоночных научается различать «свое» и «не свое». Изначально генерируется огромный репертуар лимфоцитов, экспрессирующих различные антитела, но на ранних этапах развития все те из них, которые узнают имеющиеся антигены (наиболее веро- ятно, «свои» антигены), элиминируются из будущего пула. Коль скоро эта стадия пройдена, узнавание сход- ного антигена (который на этот раз, скорее всего, явля- ется чужеродным) ведет к клональному росту соответ- ствующих лимфоцитов. Геномная иммунная система инфузорий, использующая RNAi, обнаруживает, таким образом, поразительный параллелизм с клеточной им- мунной системой позвоночных животных.
Глава 7. Эпигенетика инфузорий б а 1. Геномная транскрипция (w/siPHK PTGS) 2. Сравнение sPHK зародышевой линии/Материнских транскриптов 3. Транспорт sPHK, специфичных для зародышевой линии 4. HYR-направляемая перестройка ДНК Рис. 7.10. Модель сканирования транскриптома для сравнения соматического генома и генома зародышевой линии (а) Регулирование «по умолчанию». (1) После начала мейоза большинство или даже все макронуклеарные и микронуклеарные геномы транскрибируются; штриховые линии в макронуклеусе представляют неохаракгеризованные транскрипты. В микронуклеусе транскрипция является двунаправленной и приводит к образованию scnRNAs (коротких двунитевых молекул) для последователь- ностей всех типов (клеточных генов, светлорозовые стрелки’, транспозонов, оранжевая двойная стрелка'. IES, зеленые прямоуголь- ники). Эти scnRNAs экспортируются в материнский макронуклеус, где они могут спариваться с гомологичными соматическими транскриптами. Спаривание может происходить и в цитоплазме. scnRNAs, спаривающиеся с гомологичными транскриптами, секвестрируются или разрушаются, тогда как scnRNAs, специфичные для микронуклеуса, реэкспортируются в развивающийся зиготический макронуклеус, где они спариваются с гомологичными последовательностями (ДНК или только что образовавшимися транскриптами), «нацеливая» таким образом метилирование по НЗК9 на специфичные для микронуклеуса последовательности (транспозоны и IESs) (4) Маркированные последовательности элиминируются, (б) Эффекты постгранскрипционного сайленсинга гена в материнском макронуклеусе Экспериментальная индукция постгранскрипционного сайленсинга многокопийными транс- генами или dsRNA приводит к образованию двунитевых siRNAs, гомологичных этому гену (показано красным цветом). Эти siRNAs разрушают гомологичные материнские соматические транскрипты, так что гомологичные scnRNAs не будут инактивированы и смогут «нацеливать» делецию данного гена в развивающемся зиготическом макронуклеусе
13. Будущий вклад исследований на инфузориях в эпигенетику Недавнее секвенирование макронуклеарных геномов Tetrahymena и Paramecium сделает эти простые клеточные модели еще более полезными для исследований эпигене- тических механизмов. Биология ядерного диморфизма облегчила открытие регуляторов хроматина и останется по-прежнему перспективной системой для новых от- крытий. Обладая двумя разными путями RNAi — одной, используемой для посттранскрипционного сайленсинга генов, и другой, используемой для эпигенетической мо- дификации генома, — инфузории также уникально сба- лансированы для раскрытия сложности направляемых РНК, зависящих от гомологии регуляторных процессов, участвующих в развитии. Рибонуклеазы, родственные Dicer, Argonaute-подобные белки и их партнеры уже идентифицированы или будут идентифицированы, а исследования, ведущиеся в настоящее время, обещают расшифровать их функциональную специализацию. Учитывая филогенетическое положение инфузорий на древе жизни, такая информация без сомнения прольет свет на эволюцию этих механизмов у эукариот. Именно исследование множественных эпигенети- ческих явлений привело к признанию широкого рас- пространения и использования РНК-опосредованной регуляции у эукариот. Тем не менее, даже до того, как это поняли, наблюдение, что ДНК-содержимое одного ядра оказывает влияние на гомологичные последова- тельности в другом ядре, заставило исследователей ин- фузорий постулировать существование Ггаяз-активных молекул РНК, направляющих зависимые от гомологии «переговоры». Открытие RNAi и ее роли в перестройках ДНК подтвердило эту спекуляцию. Какие же будущие сведения, имеющие общее значение, могли бы быть получены в результате раскрытия механизмов, опосре- дующих /гаия-ядерные «переговоры»? Если гипотеза «транскрипционного сканирования» (рис. 7.10) верна, материнские соматические транскрип- ты защищают зиготические ДНК-последовательности от элиминации. Если приравнять элиминацию ДНК формированию гетерохроматина, тогда материнские транскрипты усливали бы, путем блокирования эли- минации, эухроматин-специфичные модификации на гомологичных последовательностях. Предполагаемая позитивная роль этих транскриптов на гомологичных генах является, таким образом, непрямой, возникая из их способности инактивировать гомологичные sc- nRNAs, которые в противном случае «нацеливали» бы формирование гетерохроматина. Тем не менее, этот эффект материнских транскриптов, которые, как за- ставляют предполагать некоторые эксперименты, не обязательно являются кодирующими белки mRNAs, представлял бы новый механизм, при том, что все из- вестные РНК-опосредованные, зависящие от гомоло- гии механизмы ведут к даун-регуляции гена-«мишени». Деградация или секвестрирование коротких РНК длин- ными транскриптами является, по существу, оборотной стороной продемонстрированных механизмов, бази- рующихся на RNAi, где короткие РНК инактивируют длинные. Если длинные и короткие РНК могут выступать как антагонисты действия друг друга, их взаимодействие должно направлять систему в сторону одного из двух альтернативных состояний, в зависимости от их отно- сительного количества. Это позволяет предполагать, что наследование экспрессионного статуса генов могло бы зависеть от постоянной обратной связи из пула РНК, а не исключительно от механизмов полуконсервативной репликации хроматина. Соблазнительно думать, что та- кой опосредованный РНК, /rans-активный механизм от- ветствен за стабильность экспрессии генов поверхност- ных антигенов в ходе вегетативного роста у Paramecium, потому что это объясняло бы также, каким образом, по- сле полового воспроизведения, развивающийся макро- нуклеус может наследовать материнский серотип через цитоплазму. Таким образом, эпигенетическое наследо- вание паттернов геномных перестроек может быть лишь частным аспектом всеобъемлющей системы наследова- ния у инфузорий, базирующейся на РНК. По мере того, как будущие исследования на инфу- зориях будут высвечивать опосредующих такую регуля- цию игроков (РНК и белки), должно будет выявляться ее существование у других организмов и ее дальнейшая связь с известными эпигенетическими механизмами. Вполне вероятно, что базирующаяся на РНК наслед- ственность, в ее базовой форме, широко распростране- на. Недавние исследования транскриптомного выхода у многоклеточных организмов обнаружили неожидан- лое обилие и сложность некодирующих транскриптов (Mattick, 2004; Meyers et al., 2004; Suzuki and Hayashizaki, 2004; Cheng et al., 2005; Claverie, 2005), а также частую встречаемость коротких РНК, совпадающих по после- довательности с геномными районами всех типов (Lu et al., 2005). Многие зависимые от гомологии эффекты, в том числе мейотический сайленсинг у грибов и параму- тация у растений (главы 6 и 9), остаются не до конца понятыми. Только комплексная картина, которая будет получена в будущих экспериментах на всех эукариотах, включая инфузорий, даст нам полное представление об эпигенетических процессах. Литература Allis C.D. and Gorovsky M.A. 1981. Histone phosphorylation in macro- and micronuclei of Tetrahymena thermophila. Biochem- istry 3828-3833. Allis C.D., Glover C.V, Bowen J.K., and Gorovsky M.A. 1980. His- tone variants specific to the transcriptionally active, amitotically dividing macronucleus of the unicellular eucaryote, Tetrahymena thermophila. CelllQ: 609-617. Beisson J. and Sonnebom T.M. 1965. Cytoplasmic inheritance of the organization of the cell cortex in Paramecium aurelia Proc. Natl. Acad. Sci. 53: 275-282. Beisson J. and Wright M. 2003. Basal body/centriole assembly and continuity. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 96-104. Betermier M. 2004. Large-scale genome remodelling by the devel- opmentally programmed elimination of germ line sequences in the ciliate Paramecium. Res. Microbiol. 155: 399-408.
Глава 7. Эпигенетика инфузорий Betermier М., Duharcourt S., Seitz Н., and Meyer Е. 2000. Timing of developmentally programmed excision and circularization of Paramecium internal eliminated sequences. Mol. Cell. Biol. 20: 1553-1561. Brownell J.E. and Allis C.D. 1995. An activity gel assay detects a single, catalytically active histone acetyltransferase subunit in Tetrahymena macronuclei. Proc. Natl. Acad. Sci.A 92: 6364- 6368. Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T, Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltrans- ferase: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851. Brygoo Y. and Keller A.-M. 1981a. A mutation with pleitropic ef- fects on macronuclearly differentiated functions in Paramecium tetraurelia. Dev. Genet. 2: 23-34. Brygoo Y. and Keller A.-M. 1981b. Genetic analysis of mating type differentiation in Paramecium tetraurelia. III. A mutation restricted to mating type E and affecting the determination of mating type. Dev. Genet. 2:13-22. Cassidy-Hanley D., Bisharyan Y, Fridman V., Gerber J., Lin C, Orias E., Orias J.D., Ryder H., Vong L., and Hamilton E.P. 2005. Genome-wide characterization of Tetrahymena thermophila chromosome breakage sites. II. Physical and genetic mapping. Genetics 170: 1623-1631 Chalker D.L. and Yao M.C. 1996. Non-Mendelian, heritable blocks to DNA rearrangement are induced by loading the somatic nucleus of Tetrahymena thermophila with germ line-limited DNA. Mol. Cell. Biol. 16: 3658-3667. Chalker D.L. and Yao M.C. 2001. Nongenic, bidirectional transcrip- tion precedes and may promote developmental DNA deletion in Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 15: 1287-1298. Chalker D.L., Fuller P, and Yao M.C. 2005. Communication between parental and developing genomes during Tetrahymena nuclear differentiation is likely mediated by homologous RNAs. Genetics 169: 149-160. Cheng J., Kapranov P., Drenkow J., Dike S., Brubaker S., Patel S., Long J., Stem D., Tammana H., Helt G., et al. 2005. Transcrip- tional maps of 10 human chromosomes at 5-nucleotide resolu- tion. Science 308: 1149-1154. Claverie J.M. 2005. Fewer genes, more noncoding RNA. Science 309: 1529-1530. Cleveland D.W., Mao, Y, and Sullivan K.F. 2003. Centromeres and kinetochores: From epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Ce//112: 407-421. Coyne R.S., Chalker D.L., and Yao M.C. 1996. Genome downsizing during ciliate development: Nuclear division of labor through chromosome restructuring. Annu. Rev. Genet. 30: 557—578. Coyne R.S., Nikiforov M.A., Smothers J.E, Allis C.D., and Yao M.C. 1999. Parental expression of the chromodomain protein Pddlp is required for completion of programmed DNA elimination and nuclear differentiation. Mol. Cell4\ 865-872. Davis M.C, Ward J.G., Herrick G., and Allis C.D. 1992. Programmed nuclear death: Apoptotic-like degradation of specific nuclei in conjugating Tetrahymena. Dev. Biol. 154: 419-432. Dou Y. and Gorovsky M.A. 2000. Phosphorylation of linker histone Hl regulates gene expression in vivo by creating a charge patch Mol. Cell 6: 225-231. Dou Y. and Gorovsky M.A. 2002. Regulation of transcription by H1 phosphorylation in Tetrahymena is position independent and requires clustered sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 6142-6146. Dou Y. Mizzen C.A., Abrams M., Allis C.D., and Gorovsky M.A. 1999. Phosphorylation of linker histone Hl regulates gene expres- sion in vivo by mimicking Hl removal. Mol. Cell4: 641-647. Duharcourt S., Butler A., and Meyer E. 1995. Epigenetic self-regula- tion of developmental excision of an internal eliminated sequence on Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 9: 2065-2077. Duharcourt S., Keller A.M., and Meyer E. 1998. Homology-depen- dent maternal inhibition of developmental excision of internal eliminated sequences in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 18: 7075-7085. Epstein L.M. and Forney J.D. 1984. Mendelian and non-Mendelian mutations affecting surface antigen expression in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 4: 1583-1590. Fan Q. and Yao M.-C. 1996. New telomere formation coupled with site-specific chromosome breakage in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 16: 1267-1274. Forney J.D. and Blackbum E.H. 1988. Developmentally controlled telomere addition in wild-type and mutant paramecia. Mol. Cell. Biol. 8: 251-258. Forney J.D., Yantiri E., and Mikami K. 1996. Developmentally controlled rearrangement of surface protein genes in Paramecium tetraurelia. J. Eukaryot. Microbiol. 43: 462-467. Galvani A. and Sperling L. 2001. Transgene-mediated post-transcrip- tional gene silencing is inhibited by 3’ non-coding sequences in Paramecium. Nucleic Acids Res. 29: 4387-4394. Galvani A. and Sperling L. 2002. RNA interference by feeding in Paramecium. Trends Genet. 18: 11-12. Gamier O., Serrano V, Duharcourt S., and Meyer E. 2004. RNA- mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 24: 7370-7379. Gratias A. and Betermier M. 2001. Developmentally programmed excision of internal DNA sequences in Paramecium aurelia. Biochimie 1009-1022. Gratias A. and Betermier M. 2003. Processing of double- strand breaks is involved in the precise excision of Paramecium internal eliminated sequences. Mol. Cell. Biol. 23: 7152-7162. Hamilton E., Bruns P., Lin C., Merriam V., Orias E., Vong L., and Cassidy-Hanley D. 2005. Genome-wide characterization of Tet- rahymena thermophila chromosome breakage sites. I. Cloning and identification of functional sites. Genetics 170: 1611-1621. Harumoto T. 1986. Induced change in a non-Mendelian determinant by transplantation of macronucleoplasm in Paramecium tetrau- relia. Mol. Cell. Biol. 6: 3498-3501. Harwood J. 1985. The erratic career of cytoplasmic inheritance. Trends Genet. 1: 298-300. Hayashi T, Hayashi H., Fusauchi Y, and Iwai K. 1984. Tetrahymena histone H3. Purification and two variant sequences. J. Biochem. 95: 1741-1749. Hayashi T, Hayashi H., and Iwai K. 1987. Tetrahymena histone HL Isolation and amino acid sequence lacking the central hy- drophobic domain conserved in other Hl histones. J. Biochem. 102:369-376. Jahn C.L. and Klobutcher L.A. 2002. Genome remodeling in ciliated protozoa. Annu. Rev. Microbiol. 56: 489-520. Jaraczewski J.W. and Jahn C.L. 1993. Elimination of Tec elements involves a novel excision process. Genes Dev. 7: 95-105. Jessop-Murray H., Martin L.D., Gilley D., Preer J.R., and Polisky B. 1991. Permanent rescue of a non-Mendelian mutation of Paramecium by microinjection of specific DNA sequences. Genetics 129: 727-734.
Klobutcher L.A. 1999. Characterization of in vivo developmental chromosome fragmentation intermediates in E. crassus. Mol. Cell 4: 695-704. Klobutcher L.A. and Herrick G. 1995. Consensus inverted terminal repeat sequence of Paramecium IESs: Resemblance to termini of Tel-related and Euplotes Tec transposons. Nucleic Acids Res. 23:2006-2013. Klobutcher L.A. and Herrick G. 1997. Developmental genome reorganization in ciliated protozoa: The transposon link. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 56: 1-62. Klobutcher L.A., Turner L.R., and LaPlante J. 1993. Circular forms of developmentally excised DNA in Euplotes crassus have a het- eroduplexjunction. Genes Dev. 7: 84-94. Kobayashi S. and Koizumi S. 1990. Characterization of non-Mende- lian and Mendelian mutant strains by micronuclear transplanta- tion in Paramecium tetraurelia. J. Protozool. 37: 489-492. Koizumi S. and Kobayashi S. 1989. Microinjection of plasmid DNA encoding the A surface antigen of Paramecium tetraurelia restores the ability to regenerate a wild-type macronucleus. Mol. Cell. Biol. 9: 4398-4401. Landweber L.F., Kuo T.C., and Curtis E.A. 2000. Evolution and assembly of an extremely scrambled gene. Proc. Natl. Acad. Sci. 97:3298-3303. Le Mouel A., Butler A., Caron F, and Meyer E. 2003. Developmen- tally regulated chromosome fragmentation linked to imprecise elimination of repeated sequences in Paramecia. Eukaryot. Cell 2:1076-1090. Lee S.R. and Collins K. 2006. Two classes of endogenous small RNAs in Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 20: 28-33. Liu Y., Mochizuki K., and Gorovsky M.A. 2004. Histone H3 lysine 9 methylation is required for DNA elimination in developing macronuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 1679- 1684. Liu Y, SongX., Gorovsky M.A., and Karrer K.M. 2005. Elimination of foreign DNA during somatic differentiation in Tetrahymena thermophila shows position effect and is dosage dependent. Eu- karyot. Cell 4: 421-431. Lu C., Tej S.S., Luo S., Haudenschild C.D., Meyers B.C., and Green P.J. 2005. Elucidation of the small RNA component of the transcriptome. Science 309: 1567-1569. Madireddi M.T, Davis M., and Allis D. 1994. Identification of a novel polypeptide involved in the formation of DNA-containing vesicles during macronuclear development in Tetrahymena. Dev. Biol. 165:418-431. Madireddi M.T, Coyne R.S., Smothers J.F., Mickey K.M., Yao M.C, and Allis CD. 1996. Pddlp, a novel chromodomain-containing protein, links heterochromatin assembly and DNA elimination in Tetrahymena. Cell 87: 75-84. Malone C.D., Anderson A.M., Motl J.A., Rexer C.H., and Chalker D.L. 2005. Germ line transcripts are processed by a Dicer-like protein that is essential for developmentally programmed genome rearrangements of Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 25: 9151-9164. Mattick J.S. 2004. RNA regulation: A new genetics? Nat. Rev. Genet. 5:316-323. Matzke M.A. and Birchler J.A. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6: 24-35. Meyer E. 1992. Induction of specific macronuclear developmental mutations by microinjection of a cloned telomeric gene in Para- mecium primaurelia. Genes Dev. 6: 211-222. Meyer E. and Keller A.M. 1996. A Mendelian mutation affecting mating-type determination also affects developmental genomic rearrangements in Paramecium tetraurelia. Genetics 143: 191- 202. Meyer E., Butler A., Dubrana K., Duharcourt S., and Caron F. 1997. Sequence-specific epigenetic effects of the maternal somatic genome on developmental rearrangements of the zygotic genome in Paramecium primaurelia. Mol. Cell. Biol. 17: 3589-3599. Meyers B.C., Vu TH., Tej S.S., Ghazal H., Matvienko M., Agrawal V., Ning J., and Haudenschild C.D. 2004. Analysis of the tran- scriptional complexity of Arabidopsis thaliana by massively paral- lel signature sequencing. Nat. Biotechnol. 22: 1006-1011. Mizzen C.A., Dou Y, Liu Y, Cook R.G., Gorovsky M.A., and Al- lis C.D. 1999. Identification and mutation of phosphorylation sites in a linker histone. Phosphorylation of macronuclear Hl is not essential for viability in Tetrahymena. J. Biol. Chem. 274: 14533-14536. Mochizuki K. and Gorovsky M.A. 2004. Small RNAs in genome rearrangement in Tetrahymena. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 181- 187. Mochizuki K. and Gorovsky M.A. 2005. A Dicer-like protein in Tetrahymena has distinct functions in genome rearrangement, chromosome segregation, and meiotic prophase. Genes Dev. 19: 77-89. Mochizuki K., Fine N.A., Fujisawa T, and Gorovsky M.A. 2002. Analysis of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome rearrangement in Tetrahymena. Cell 110: 689-699. Moreira-Leite F.F., Sherwin X, Kohl L., and Gull K. 2001. A trypano- some structure involved in transmitting cytoplasmic information during cell division. Science 294: 610-612. -Nikiforov M.A., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 2000. A novel chro- mo-domain protein, pdd3p, associates with internal eliminated sequences during macronuclear development in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 20: 4128-4134. Nowacki M., Zagorski-Ostoja W., and Meyer E. 2005. Nowalp and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr. Biol. 15: 1616-1628. Paschka A.G., Jonsson E, Maier V., Mollenbeck M., Paeschke K., Postberg J., Rupprecht S., and Lipps H.J. 2003. The use of RNAi to analyze gene function in spirotrichous ciliates. Eur. J. Protistol 39: 449-454. Philippe H., Germot A., and Moreira D. 2000. The new phylogeny of eukaryotes. Curr. Opin. Genet. Dev. 10: 596-601. Pond F.R., Gibson L, Lalucat J., and Quackenbush R.L. 1989. R- body-producing bacteria. Microbiol. Rev. 53: 25-67. Preer J.R., Jr., Preer L.B., and Jurand A. 1974. Kappa and other endosymbionts in Paramecium aurelia. Bacterial. Rev. 38: 113- 163. Prescott D.M. 1994. The DNA of ciliated protozoa. Microbiol. Rev 58:233-267. Prescott D.M. 1999. The evolutionary scrambling and developmental unscrambling of germline genes in hypotrichous ciliates. Nucleic Acids Res. 27: 1243-1250. Prescott D.M., Ehrenfeucht A., and Rozenberg G. 2003. Template- guided recombination for IES elimination and unscrambling of genes in stichotrichous ciliates. J. Theor. Biol. T2T. 323-330. Ruiz E., Vayssie L., Klotz C., Sperling L., and Madeddu L. 1998. Homology-dependent gene silencing in Paramecium. Mol. Biol. Cell9: 931-943.
Saveliev S.V. and Cox M.M. 1995. Transient DNA breaks associated with programmed genomic deletion events in conjugating cells of Tetrahymena thermophila. Genes Dev. 9: 248-255. Saveliev S.V. and Cox M.M. 1996. Developmentally programmed DNA deletion in Tetrahymena thermophila by a transposition-like reaction pathway. EMBO J. 15: 2858-2869. Scott J.M., Mikami K., Leeck C.L., and Forney J.D. 1994. Non- Mendelian inheritance of macronuclear mutations is gene specific in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell. Biol. 14: 2479-2484. Shen X. and Gorovsky M.A. 1996. Linker histone Hl regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell 86: 475-483. ShenX., Yu L., Weir J.W, and Gorovsky M.A. 1995. Linker histones are not essential and affect chromatin condensation in vivo. Cell 82: 47-56. Shorter J. and Lindquist S. 2005. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat. Rev. Genet. 6: 435-450 Sonnebom T.M. 1937. Sex, sex inheritance and sex determination in Paramecium aurelia. Proc. Natl. Acad. Sci. 23: 378-385. Sonnebom T.M. 1975. Paramecium aurelia. In Handbook of genetics (ed. R. King), pp. 469-594. Plenum, New York. Sonnebom T.M. 1977. Genetics of cellular differentiation: Stable nuclear differentiation in eucaryotic unicells. Annu. Rev. Genet. 11: 349-367. Strahl B.D., Ohba R., Cook R.G., and Allis C.D. 1999. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14967-14972. Suzuki M. and Hayashizaki Y. 2004. Mouse-centric comparative transcriptomics of protein coding and non-coding RNAs Bioes- says 26:833-843. Taverna S.D., Coyne R.S., and Allis C.D. 2002. Methylation of histone h3 at lysine 9 targets programmed DNA elimination in Tetrahymena. Cell 110: 701-711. Timmons L. and Fire A. 1998. Specific interference by ingested dsRNA. Nature 395: 854. Timmons L., Court D.L., and Fire A. 2001. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic inter- ference in Caenorhabditis elegans. Gene 263: 103-112. Vavra K.J., Allis C.D., and Gorovsky M.A. 1982. Regulation of histone acetylation in Tetrahymena macro- and micronuclei. J. Biol. Chem. 257: 2591-2598. Wei Y, Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1999. Phos- phorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99-109. Wei Y, Mizzen C.A., Cook R.G., Gorovsky M.A., and Allis C.D. 1998. Phosphorylation of histone H3 at serine 10 is correlated with chromosome condensation during mitosis and meiosis in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7480-7484. Williams K., Doak T.G., and Herrick G. 1993. Developmental pre- cise excision of Oxytricha trifallax telomere-bearing elements and formation of circles closed by a copy of the flanking target duplication. EMBO J. 12: 4593-4601 Wu M., Allis C.D., Richman R., Cook R.G., and Gorovsky M.A. 1986. An intervening sequence in an unusual histone HI gene of Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8674-8678. Yao M.C. and Chao J.L. 2005. RNA-guided DNA deletion in Tet- rahymena. An RNAi-based mechanism for programmed genome rearrangements. Annu. Rev. Genet. 39: 537-559. Yao M.C, Duharcourt S., and Chalker D.L. 2002. Genome-wide rearrangements of DNA in ciliates. in Mobile DNA IJ (ed. A. Lambowitz), pp. 730-758. Academic Press, New York. Yao M.C., Fuller R, and Xi X. 2003. Programmed DNA deletion as an RNA-guided system of genome defense. Science 300: 1581-1584. You Y, Aufderheide K., Morand J., Rodkey K., and Forney J. 1991. Macronuclear transformation with specific DNA fragments con- trols the content of the new macronuclear genome in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell Biol. 11:1133-1137. Yu L. and Gorovsky M.A. 1997. Constitutive expression, not a particular primary sequence, is the important feature of the H3 replacement variant hv2 in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 17: 6303-6310.
ГЛАВА 8 RNAi И СБОРКА ГЕТЕРОХРОМАТИНА Robert Martiensser1 и Danesh Moazed2 1Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 11724 2Departament of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115-5730 Содержание: Общее резюме 1. Обзор RNAi-пути 2. Ранние данные, позволяющие предполагать, что РНК является посредником в транскрипционном сайленсинге 3. RNAi и сборка гетерохроматина у S. pombe 4. Малые РНК инициируют сборку гетерохроматина в связи с эффекторным комплексом RNAi 5. Синтез dsRNA и образование siRNA 6. Модели распознавания РНК-РНК versus РНК- ДНК 7. Как RNAi рекрутирует энзимы модифицирующие хроматин? 8. Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi 9. Консерватизм модификаций хроматина, опосре- дованных RNAi, у животных 10. Заключительные замечания Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Пересечение РНК-интерференции (RNAi) и формиро- вания гетерохроматина свело вместе две области регуля- ции генов, которые, как считалось прежде, используют разные, возможно даже неродственные механизмы. На основе цитологических методов окрашивания гетеро- хроматин был первоначально определен — почти 80 лет тому назад — как те районы хромосом, которые сохра- няют конденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла. Ранние исследователи, изучавшие взаимоотношения между структурой хромосом и экс- прессией генов, заметили, что некоторые хромосомные перестройки приводят к распространению гетерохро- матина на соседние гены, которые затем становятся «молчащими». Но стохастическая природа такого рас- пространения давала начало генетически идентичным популяциям клеток, которые имели разные фенотипы, давая тем самым поразительный пример эпигенетиче- ской регуляции. Термин «RNAi» был впервые исполь- зован для описания сайленсинга генов, когда нематоде Caenorhabditis elegans вводили гомологичную антисмыс- ловую или двунитчатую РНК (dsRNA). Вскоре выяснили, что аналогичный механизм объясняет посттранскрипци- онный сайленсинг трансгена (PTGS — posttranscriptional transgene silencing), описанный ранее у петунии и других растений. Напротив, согласно широко распространенно- му мнению, гетерохроматин действует непосредственно на уровне хроматина, вызывая репрессию транскрипции с помощью механизма, называемого транскрипционным
Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина сайленсингом генов (TGS — transcriptional gene silenc- ing). В этой главе мы сосредоточим наше внимание на взаимоотношениях между механизмом RNAi и форми- рованием эпигенетически наследуемого гетерохроматина в специфических хромосомных районах. Мы восполь- зуемся недавними примерами, демонстрирующими эти отношения у дробянковых дрожжей Schizosaccharomyces pombe и растения Arabidopsis thaliana [резушка Таля]. Ядерный геном дробянковых дрожжей состоит из трех хромосом величиной от 3,5 до 5,7 млн. о. Каждая хромосома содержит, особенно в центромерах, боль- шие блоки повторяющейся ДНК упакованные в ге- терохроматин. Кроме того, локусы типа спаривания (контролирующие тип клетки) и субтеломерные участ- ки ДНК также содержат повторяющиеся последова- тельности, упакованные в гетерохроматин. Мы знаем теперь, что сборка ДНК в гетерохроматин играет и регуляторную, и структурную роль. В случае локусов типа спаривания у дрожжей регуляция генной транс- крипции гетерохроматином важна для идентичности клеточного типа. В случае теломер и центромер гетеро- хроматин играет структурную роль, которая важна для правильного расхождения хромосом в ходе клеточного деления. Более того, повторяющиеся последователь- ности ДНК и перемещающиеся элементы составляют большую долю (в некоторых случаях более половины) генома многих эукариотных клеток. Гетерохроматин и связанные с ним механизмы играют ключевую роль в поддержании стабильности генома, регулируя актив- ность повторяющихся последовательностей. Недав- ние исследования вскрыли удивительную потребность в компонентах RNAi-пути для процесса образования гетерохроматина у дробянковых дрожжей и позволи- ли выяснить, каким образом эти два пути могут рабо- тать совместно на уровне хроматина. Говоря коротко, молекулы малых интерферирующих РНК (siRNA), являющиеся сигнатурами RNAi и других механизмов сайленсинга на основе dsRNA, собираются в комплекс индуцируемого РНК транскрипционного сайленсинга (RITS — RNA-Induced Transcriptional Silencing) и «на- правляют» эпигенетические модификации хроматина и формирование гетерохроматина в комплементар- ных участках хромосом. RITS использует зависимое от siRNA спаривание оснований для того, чтобы направ- лять ассоциацию либо с ДНК, либо с последователь- ностью вновь синтезируемой РНК в локусе-мишени, который должен быть сайленсирован, — ассоциацию, которая стабилизируется непосредственным связыва- нием с метилированным гистоном НЗ. Присутствие этих двух активностей в RITS включает формирование гетерохроматина совместно с хорошо известными, ас- социированными с гетерохроматином факторами и непосредственно связывает РНК-сайленсинг с моди- фикацией гетерохроматина. У A. thaliana и других эукариот (за исключением Sac- charomyces cerevisiae) участки центромерной ДНК также состоят из повторяющихся элементов. Эти и другие по- вторяющиеся последовательности, такие как ретроэле- менты и другие транспозоны, являются источниками siRNAs, привлекая метилирование НЗК9 и ДНК. Здесь, опять-таки, несколько компонентов пути RNAi необ- ходимы для инициации и поддержания этих событий репрессивного метилирования. В этой главе мы обсуж- даем, как образуются гетерохроматиновые siRNAs и как они опосредуют модификации ДНК и (или) хроматина у дробянковых дрожжей и A. thaliana. 1. Обзор RNAi-пути Хотя термин «RNAi» первоначально использовался для описания сайленсинга, который опосредуется экзо- генной dsRNA у С. elegans (Fire et al., 1998), сейчас он в широком плане обозначает сайленсинг генов, включае- мый dsRNA того или иного рода. Этапы RNAi включают образование dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, как, например, вирусная РНК), её процессинг в siRNA и «нацеливание» этих молекул либо на nRNAs (PTGS), либо на участки хроматина (TGS), чтобы вызвать сайленсинг. Поэтому, прежде чем пред- ставить компоненты механизма RNAi, специфичные для TGS, мы обсудим источник dsRNA, запускающих механизм RNAi. dsRNA могут образовываться в результате двунаправ- ленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, спсобных к спари- ванию оснований внутри себя с образованием сегмен- тов dsRNA (рис. 8.1, а и б, соответственно) Например, транскрипция с участков инвертированных повторов дает молекулы РНК, складывающиеся сами на себя с образованием шпилечных структур. Затем dsRNA рас- щепляются ферментом Dicer — рибонуклеазой класса RNase III, которая генерирует siRNAs. siRNAs — это комплементарные дуплексы величиной 21—27 нуклео- тидов, обладающие характерным «свисающим концом» Loverhang] длиной 2 нуклеотида на каждом 3’-конце дуплекса (Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001: Hannon. 2002; Zamore, 2002; Bartel, 2004; Baulcombe, 2004). Эти дуплексы раскручиваются в однонитевые siRNAs, ко- торые действуют как «проводники», взаимодействуя на основе спаривания оснований с комплементарными последовательностями-мишенями. Они являются, сле- довательно, факторами специфичности и играют цен- тральную роль во всех механизмах сайленсинга, опо- средованных RNAi. На данный момент идентифицированы два род- ственных комплекса, включающие siRNA: RISC и RITS. В комплексе RISC (RNA-Induced Silencing Com- plex) siRNAs распознают hRNAs-«мишени» и иниции- руют их деградацию путем эндонуклеолитического расщепления в пределах участка nRNA, спаренного с siRNA (Hannon, 2002; Bartel, 2004). Этот первоначаль- ный акт расщепления выполняет PH Каза-Н-домен белка семейства Argonaute/PIWI (субъединица RISC). В ядерном комплексе RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), сходном c RISC, siRNAs «нацеливают» этот комплекс на хромосомные участки для модификации хроматина (Verdel et al., 2004; Buhler et al., 2006). Это и есть RITS-опосредованный РНК-путь — центральная тема этой главы.
а Двунаправленная транскрипция 6. Транскрипция инвертированных повторов 1. Обзор RNAi-пути dsPHK ................... siPHK Рис. 8.1. Источники dsRNA, являющихся субстратом для образования siRNAs рибонуклеазой Dicer и триггером РНК-сайленсинга (а) У 5. pombe двунаправленную транскрипцию наблюдали в центромерных районах и районе сепН «молчащего» локуса типа спа- ривания. (б) Транскрипция инвертированных повторов, обнаруживаемых в клетках многих растений и животных, потенциально может производить dsRNA. (в) Транскрипция аберрантных РНК, которые могут не иметь соответствующих сигналов процессинга, может включать синтез dsRNA с помощью RdRPs Для механизма PH К-сайленсинга дополнительного типа с участием микроРНК (miRNA) требуются ключе- вые белки Argonaute и Dicer. HYR, транскрибированная с эндогенных некодирующих генов и исходно образую- щая шпилечные РНК-структуры благодаря растянутым dsRNA-участкам, в несколько этапов процессируется в miRNA (Bartel, 2004; Filipowiicz et al., 2005). Подобно siRNAs, miRNAs имеют размеры 21—24 нуклеотида и образуют часть RISC через посредство белков Argonaute для «нацеливания» на специфические иРНК. Резуль- татом этого «нацеливания» может быть расщепление посредством PIWI/RNaseH-домена и репрессия транс- ляции, включая взаимодействия с кэпом 7meG на 5’- конце иРНК. Это может сочетаться с секвестрировани- ем иРНК в цитоплазматических PH К-процессирующих органеллах, известных как Р-тельца (Processing bodies). Таким образом, к образованию siRNA или miRNA при- водят по крайней мере два разных пути процессинга dsRNA; тем не менее, эти РНК используют сходные средства для инактивации сходных иРНК. Путь miRNA отличается, поскольку все miRNAs производятся эндо- генными некодирующими генами, которые в основном регулируются процессами развития и, в свою очередь, обычно «нацеливают» и регулируют в развитии сайлен- синг гомологичных генов. Хотя dsRNAs могут образовываться путем отжи- га прямонаправленной и инверсной РНК, получаю- щихся в результате двунаправленной транскрипции, или присутствуют в виде шпилечных структур, в не- которых клетках для RNAi требуется дополнительный энзим для образования dsRNA. Этот фермент — РНК- направляемая РНК-полимераза (RdRP), обнаруженная у растений и у С. elegans (Dalmay et al., 2000; Sijen et al., 2001). Он использует siRNAs в качестве праймеров для генерации большого количества dsRNA, которые за- тем могут процессироваться Dicer в дополнительные siRNA. Таким образом, считается, что первичная функ- ция RdRP — амплификация RNAi-ответа, но, как мы обсудим позже, RdRP может играть и более специфиче- скую роль в инициации синтеза dsRNA (раздел 5). Дей- ствительно, она, по-видимому, участвует в процессе, приспособленном для формирования лучшей защит- ной реакции хозяина в ответ на введение экзогенной dsRNA. Эта идея подкрепляется тем фактом, что RdRPs не являются участниками путей сайленсинга с помо- щью miRNA (Sijen et al., 2001). Интересно, что в гено- мах насекомых (в том числе Drosophila) и позвоночных (включая млекопитающих) отсутствуют распознавае- мые RdRP-подобные последовательности, но остается возможность, что у этих организмов синтез dsRNA вы- полняют другие полимеразы. Какова же тогда функция этих разнообразных меха- низмов РНК-сайленсинга? Они весьма консервативны у широкого круга организмов, от дробянковых дрож- жей и растений до человека, и они играют централь- ные роли в регуляции экспрессии генов и стабильности генома (через формирование стабильного гетерохро- матина в центромерах и теломерах). Кроме того, эти механизмы сайленсинга принимают участие в защите против транспозонов и РНК-вирусов путем разруше- ния их РНК-транскриптов (Plasterk, 2002; Li and Ding, 2005). Наконец, транскрипция с некоторых транспозо- нов приводит к образованию аберрантных РНК, вклю- чающих RNAi с помощью механизма, конвертирующе- го, как полагают, аберрантные транскрипты в dsRNA с помощью RdRPs (рис. 8.1) (Baulcombe, 2004).
2. Ранние данные, позволяющие предполагать, что РНК является посредником в транскрипционном сайленсинге Прежде чем обсуждать лучше изученные примеры мо- дификаций хроматина, базирующихся на RNAi, у дро- бянковых дрожжей и Arabidopsis, мы кратко рассмотрим ранние эксперименты, предполагающие участие РНК как посредника в модификациях хроматина и ДНК. Самое раннее свидетельство роли РНК как промежуточного звена в TGS было получено в исследованиях вироидов растений. Вироид веретеновидности клубней у картофеля (PSTV—potato spindle tuber viroid) состоит из РНК-генома величиной 359 nt и реплицируется по механизму РНК- РНК. Введение PSTV в геном табака приводит к метилиро- ванию ДНК гомологичных ядерных последовательностей, хотя и трансгенных по происхождению (Wassenegger et al., 1994). Однако эти и интегрированные копии ДНК PSTV становятся метилированными только у растений, которые поддерживают транскрипцию вироидной РНК, что заставляет предполагать участие PH К-посредника, «направляющего» метилирование ДНК (Wassenegger et al., 1994). Далее, у Arabidopsis производство аберрантных транскриптов каким-то образом приводит к метилиро- ванию ДНК всех гомологичных премоторных участков и к транскрипционному сайленсингу генов (Mette et al., 1999). Этот факт, вместе с открытием, что репликация вирусных геномов у растений ведет к образованию малых РНК размером 22 нуклеотида, позволяет предполагать, что механизмы, родственные RNAi, опосредуют метили- рование ДНК (Mette et al., 2000). Эти наблюдения, а также индуцированный повторами сайленсинг, вызываемый трансгенами, который впервые был обнаружен у петунии и у табака, сейчас широко признаны как самые ранние примеры сайленсинга с помощью RNAi (Napoli et al., 1990; обсуждается в главе 9). Дальнейшие доказательства связи между RNAi и TGS были получены на Drosophila в исследованиях сайленсин- га генов, индуцируемого повторами (глава 5). Введение множественных тандемных копий трансгена приводит к сайленсингу как этого трансгена, так и эндогенных ко- пий (Pal-Bhadra et al., 1999). Этот сайленсинг нуждается в хромосомном белке Polycomb, который также участвует в упаковке гомеотических регуляторных генов в подоб- ные гетерохроматину структуры за пределами их соб- ственных доменов действия (Francis and Kingston, 2001). Кроме того, для этого индуцируемого повторами сайлен- синга генов требуется Piwi — свойственный Drosophila член семейства Argonaute, необходимый для RNAi (Pal- Bhadra et al., 2002) У Tetrahymena другой член белкового семейства Piwi, Twil, необходим для накопления малых РНК и массивной элиминации ДНК, наблюдающейся в соматических ядрах простейших (глава 7). Эти и более поздние результаты, обсуядаеъ >ые в разделе 8 яозво чяют предполагать, что RNAi-путь участвует в сборке структур репрессивного хроматина у мух. Другие механизмы сайленсинга, индуцируемого повторами, описаны у нитчатых грибов; сюда относят- ся индуцируемые повторами точечные мутации (RIP — Repeat Induced Point mutation) у Neurospora crassa и npe- мейотически индуцируемое метилирование (MIP — Metylation Induced Pre-meiotically) у Ascobolus immer- sus, которые, по-видимому, осуществляются без уча- стия РНК-посредника, поскольку они происходят независимо от транскрипционного состояния локуса (Galagan and Selker, 2004). Вместо этого в RIP и MIP участвуют спаренные локусы, где (например) две из трех копий гена сайленсированы, что заставляет пред- полагать какого-то рода механизм взаимодействия ДНК-ДНК, включающий гомологичные локусы для индукции сайленсинга. Напротив, для сайленсин- га неспаренной ДНК в мейозе (MSUD — silencing of unpaired DNA in meiosis), который также происходит у Neurospora, требуется RNAi-путь (Shiu et al., 2001; обсуждается в главе 6); возможно, параллели MSUD имеются и у других организмов, в том числе С. elegans (Maine et al., 2005; глава 15). 3. RNAi и сборка гетерохроматина у S. pombe Хромосомы S. pombe содержат в центромерах и «мол- чащих» локусах типа спаривания (mat2/3) обширные участки гетерохроматиновой ДНК. ассоциированные с лежащими в их основе повторяющимися элементами ДНК (Grewal, 2000; Pidoux and Allshire, 2004). Каждая центромера дробянковых дрожжей содержит уникаль- ный центральный коровый район (ent), который флан- кируется повторами двух типов, называемыми самыми внутренними (imr — innermost) и самыми внешними (otr — outermost) повторами (рис. 8.2). Район о/r сам состоит из повторов dh и dg. Формирование гетерохроматина у 5. pombe включает совместное действие ряда /гаия-действующих факторов Сюда входят деацетилазы гистонов (HDACs), С1г4, ме- тилтрансфераза лизина 9 гистона НЗ (НКМТ) и белки, связывающиеся с НЗК9-метилом гистона, Swi6 (гомо- лог НР1) и Chpl. Предполагается, что первоначальное рекрутирование Swi6 и Chpl к хроматину приводит к распространению метилирования НЗК9 и формирова- нию гетерохроматина через последовательные циклы катализируемого С1г4 метилирования НЗК9, сопряжен- ного с опосредуемым Swi6 распространением на сосед- ние нуклеосомы через его самоассоциацию (Grewal and Moazed, 2003). Мутация в компонентах пути RNAi приводит, как это ни удивительно, к утрате центромерного гетеро- хроматина и накоплению некодирующих «прямых» и «реверсных» транскриптов с двунаправленных промо- торов в пределах каждого повтора dgvtdh (рис. 8.2) (Volpe et al., 2002). У дробянковых дрожжей есть единствен- ный ген для каждого из белков RNAi, Dicer, Argonaute и RdRP (dcrl+, agoI+M rdpl+, соответственно). Удаление побого из этих генов приводит к утрате метилирования НЗК9 гистонов, и мутанты обнаруживают дефекты в расхождении хромосом, которые обычно связаны с де-
3 RNAi и сборка гетерохроматина у S pombe Центромера S. pombe dsPHK «Молчащий» тип спаривания S. pombe сепН dsPHK Atfl/Pcrl Центромера A. thaliana повторы 180 п.н. »►►»►►►►►► LTR повторы 180 п.н. dsPHK =========== Рис. 8.2. Организация гетерохроматиновых районов хромосомы у S. pombe и A. thaliana В качестве примера показана центромера хромосомы 1 S. pombe. Уникальный центральный коровый район (cntl) фланкирован «самыми внутренними» (imrL и imrR) и «самыми внешними» (otrL и otrR) повторами. Район otr транскрибируется в обоих направ- лениях, давая начало прямым (синий) и обратным (красный) транскриптам. Участок между генами mat2 и mat3 содержит домен, который гомологичен центромерным повторам dg и dh (сепН) и также транскрибируется в обоих направлениях. Aft 1 и Perl — это связывающиеся с ДНК белки, которые действуют параллельно с RNAi, обеспечивая сайленсинг типа спаривания. Центромеры Arabidopsis состоят из повторов длиной 180 п.о. (зеленый), перемежающихся с элементами типа ретротранспозонов (желтый). По- казаны прямые транскрипты, инициирующиеся в пределах длинного терминального повтора (LTR), и обратные транскрипты, инициирующиеся в пределах повторов длиной 180 п.о. фектами в сборке гетерохроматина (Provost et al., 2002; Volpe et al., 2003). Более того, секвенирование библио- теки малых РНК дробянковых дрожжей выявило РНК длиной ~22 нуклеотида, которые картировались исклю- чительно в районах центромерных повторов и повторов рибосомной ДНК, позволяя предполагать, что сеиРНК могут образовывать dsRNAs, которые процессируют- ся в siRNA (Reinhart and Bartel, 2002. Таким образом, было высказано предположение, что путь RNAi может рекрутировать Swi6 и С1г4 к хроматину для того, чтобы инициировать и (или) поддерживать формирование гетерохроматина в каждом из вышеуказанных локусов (рис. 8.3) (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002). Интересно, что и механизм TGS, и мехнизм PTGS, по-видимому, вносят вклад в даун-регуляцию сем-РНК. Транскрипт с «прямой» нити в основном сайленсиро- ван на транскрипционном уровне, как это видно на му- тантах по RNAi (Volpe et al., 2002). Однако «обратная» нить транскриптов сеп не затрагивается мутантами Swi6 (Volpe et al., 2002), и сайленсинг этого «обратного» сеп- транскрипта происходит главным образом на посттран- скрипционном уровне. RNAi играет также роль в сайленсировании локуса типа спаривания (mat2/3) (Hall et al., 2002). mat2/3 пре- рывается участком ДНК, который в высокой степени го- мологичен центромерным повторам (называется сепН— cenHomology) (рис. 8.2). Подобно повторам сеп, район сепН транскрибируется дивергентно, образуя «прямые» и «обратные» РНК (Noma et al., 2004). Эти транскрип- ты сепН у мутантов по RNAi накапливаются до высоких
Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина уровней. Напротив, RNAi не является необходимой для сайленсинга репортерного трансгена, вставленного в mat2/3, если сайленсинг не был сначала как-то нарушен. Причина этого различия в том, что частично избыточ- ный механизм сайленсинга, включающий два связываю- щихся с ДНК белка, Perl и Atfl, которые связываются с mat2/3, рекрутирует гетерохроматиновую машинерию независимо от RNAi (Jia et al., 2004). Этого достаточно для сайленсирования репортерного гена в отсутствие RNAi, но недостаточно для предотвращения накопления некодирующих транскриптов сеиЯ(рис. 8.2). 4. Малые РНК инициируют сборку гетерохроматина в связи с эффекторным комплексом RNAi В связи с открытием, что путь RNAi участвует в форми- ровании гетерохроматина у дробянковых дрожжей и в транскрипционном сайленсинге генов в других системах возник вопрос о том, каким образом этот путь может непосредственно регулировать структуру хроматина. Очистка Chpl, хромодоменного белка, являющегося структурным компонентом гетерохроматина, привела к идентификации комплекса RITS (Verdel et al., 2004). RITS, кроме Chpl, содержит белок Agol, характерный для дробянковых дрожжей, и Tas3, белок с неизвестной функцией. Он также содержит центромерные siRNAs, Активный хроматин Машинерия RNAi «Молчащий» хроматин Рис. 8.3. Сборка гетерохроматина включает совместное действие модифицирующих гистоны энзимов (HDACs и С1г4) и связывающих- ся с гистонами белков (например, Swi6) и может направляться механизмом КТФш Деацетилирование HDACs сопровождается рекрутированием С1г4 и метилированием НЗК9 гистонов. Swi6 связывается с метилированными по НЗК9 «хвостами» гистонов, и в результате последовательных циклов метилирования НЗК9, сопряжен- ных с олигомеризацией Swi6 происходит распространение гетерохроматина которые создаются рибонуклеазой Dicer, и, что важно, RITS связывается с районами центромерных повторов зависимым от siRNA образом. Поэтому предположили, что RITS использует центромерные siRNAs для «на- целивания» на специфичные хромосомные районы для инактивации, и это обеспечивает прямую связь между RNAi и сборкой гетерохроматина (рис. 8.4). Подобно RISC, опосредующему PTGS, RITS ис- пользует siRNAs для прицельного распознавания. Од- нако в отличие от RISC RITS связывается с хроматином и инициирует формирование гетерохроматина в про- тивоположность инактивации иРНК. Каким образом siRNAs могут «нацеливать» на определенные, специ- фичные хромосомные участки? Предложены два воз- можных механизма. Согласно первой модели, siRNAs, связанные с Agol в комплексе RITS, должны как-то соединяться с нераскрученной двойной спиралью ДНК за счет спаривания оснований. Во второй модели свя- занные с RITS siRNAs должны спариваться основания- ми с некодирующими РНК-транскриптами в локусе- мишени (рис. 8.4) Согласно любой из этих моделей, в результате ассо- циации RITS с хроматином посредством siRNAs рекру- тируется НКМТ С1г4 с последующим метилированием гистонов по НЗК9. За этим следуют связывание Swi6 и распространение метилирования НЗК9 и гетерохро- матина. Однако для ассоциации RITS с хроматином требуется также С1г4, позволяя предполагать, что это обеспечивает метилированные НЗК9, к которым мо- жет присоединяться комплекс RITS, стабилизируя тем самым свою связь с хроматином. Уже известно, что хромодомен Chpl специфически связывается с мети- лированными остатками НЗК9 (Partridge et al., 2002), а мутации в С1г4 или хромодомене Chpl, участвующие в этом взаимодействии, приводят к утрате связыва- ния RITS с хроматином (Partridge et al., 2002; Noma et aL, 2004). Более того, RITS может также связываться с доменами хроматина, покрытыми метилированным НЗК9, через хромодомен Chpl в mat2/3 и теломерных районах в отсутствие siRNAs (Noma et aL, 2004; Petrie et aL, 2005). Подводя итог, можно сказать, что комплекс RITS обнаруживает сродство с хроматином через свя- зывание Chpl с метилированными НЗК9 и через спа- ривание оснований siRNA либо с ДНК, либо с транс- криптами РНК. Недавно полученные данные являются сильным свидетельством в пользу роли RITS и siRNAs в инициа- ции сборки гетерохроматина. Бюлер и соавторы (Buhler et aL, 2006) использовали сайт-спепифичный белок, связывающийся с РНК, чтобы искусственно привя- зать комплекс RITS к РНК-транскрипту активного в норме гена ига4 . Замечательно, что результатом такой привязки стала генерация siRNAs ига4' и сайленсинг этого гена ига4* по типу, требующему как RNAi, так и компоненты гетерохроматина. Кроме того, эта систе- ма позволяла прямо оценивать способность вновь воз- никших siRNAs инициировать метилирование НЗК9 и связывание Swi6, которые являются молекулярными маркерами образования гетерохроматина. Интересно, что вновь образовавшиеся siRNAs ига4+ оказались под
5. Синтез dsRNA и образование siRNA Рис. 8.4. RNAi и siRNA-направляемая сборка гетерохроматина у S. pombe Для образования siRNA требуются и Dicer, и RDRC. Предпо- лагается, что первоначальное «нацеливание» включает опосре- дованное RITS и siRNA распознавание похожих транскриптов. Связывание RITS стабилизируется связыванием хромодомена Chpl с метилированным по НЗК9 гистоном. Рекрутирование С1г4 и Swi6 опосредует распространение метилирования по НЗК9 негативным контролем со стороны консервативной siRNA-рибонуклеазы, Eril, которая ограничивает их тем локусом, с которого они были произведены. Одна- ко, когда ген, кодирующий Eril, делегируется, siRNAs ига4+ способны действовать в trans-конфигурации и сайленсировать вторую копию гена ига4 , вставленную в другую хромосому той же клетки. Этот эксперимент демонстрирует, следовательно, что siRNAs могут дей- ствовать как факторы специфичности, направляющие RITS и сборку гетерохроматина на прежде активный район генома. Способность siRNAs инициировать сайленсинг у 5. pombe была также исследована другим методом, ба- зирующимся на экспрессии шпилечной РНК для про- изводства siRNAs, гомологичных трансгену GFP (Sigova et aL, 2004). В этой системе шпилечные siRNAs стиму- лировали сайленсинг репортерного гена GFP на уровне PTGS, но не TGS (Sigova et al., 2004). Неясно, почему эти шпилечные siRNAs не могут индуцировать TGS и сборку гетерохроматина в хромосомной копии GFP Одно из возможных объяснений заключается в том, что гетерохроматин собирается в специфических субнукле- арных местах, а сборка вне этих мест происходит неэф- фективно (Gasser et al., 2004; Глава 4). 5. Синтез dsRNA и образование siRNA Двунаправленная транскрипция центромерных ДНК- повторов в принципе могла бы обеспечить первона- чальный источник dsRNA у дробянковых дрожжей (Volpe et al., 2002). dsRNA, получающиеся в результате отжига «прямых» и «обратных» транскриптов, могли бы затем стать субстратом для рибонуклеазы Dicer. Однако РНК- направляемая PH К-полимераза (Rdpl) и связанные с нею кофакторы, а также НКМТ С1г4, также необходимы для производства siRNA рибонуклеазой Dicer (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Эти наблюде- ния показывают, что образование гетерохроматиновых „ siRNAs рибонуклеазой Dicer сопряжено с событиями, зависящими от хроматина и Rdpl (рис. 8.4). Фермент Rdpl находится в мультипротеиновом ком- плексе, который содержит также Hrrl, РНК-геликазу, и Cidl2, члена [3-семейства ДНК-полимераз, включаю- щего поли(А)полимеразные ферменты (Motamedi et al., 2004). Этот комплекс был назван комплексом РНК- направляемой РНК-полимеразы (RDRC — RNA-direct- ed RNA polymerase complex), и для формирования гете- рохроматина в районах центромерной ДНК требуются все его субъединицы (Motamedi et aL, 2004). Как ожида- лось, на основании присутствия Rdpl RDRC обладает активностью PH К-направляемой РНК-полимеразы in vitro, и мутации, устраняющие эту активность, устра- няют и зависимый от RNAi сайленсинг in vivo (Mot- amedi et al., 2004; Sugiyama et aL, 2005). Активность RDRC, обусловливающая синтез РНК in vitro, не требу- ет siRNA-праймера (Motamedi et aL, 2004). RITS может, следовательно, обеспечить in vivo специфичность путем рекрутирования RDRC к выбранным РНК-матрицам посредством siRNA. В согласии с этой гипотезой, субъ- единицы RDRC необходимы для генерации siRNA, а комплексы RITS, изолированные из клеток, не имею- щих ни одной субъединицы RDRC, лишены siRNAs (Motamedi et aL, 2004; Li et aL, 2005; Sugiyamaet aL, 2005; Buhler et aL, 2006). Присутствие Cid 12 в RDRC интригует и ставит вопрос о возможности участия еще одной полиме- разной активности в связанном с хромосомой РНК- сайленсинге Поскольку некоторые члены этого семей-
Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина ства обладают активностью поли(А)полимеразы. одна из возможностей заключается в tow что ние dsRNA, произведенной Rdpl, может иметь важное значение для их дальнейшего Интересно, что Cid 12-подобные белки консервативны у всех эукари- от (табл. 8.1); результатом мутаций в Rde-З, характерном для С. elegans члене этого семейства, является дефектная RNAi (Chen et al., 2005), что подтверждает консерватив- ную роль этих ферментов в RNAi-пути. Имеются данные по синтезу и процессингу dsRNA, связанному с образованием гетерохроматиновых siR- NAs, происходящим на хромосоме, в сайтах транскрип- ции некодирующих центромерные РНК (рис. 8.4). Сре- ди них, во-первых, данные о том, что Rdpl может быть присоединена поперечными сшивками к центромер- ным ДНК-повторам (Volpe et al., 2002; Sugiyama et al., 2005) и к «прямым» и «обратным» РНК-транскриптам, происходящим из этих районов (Motamedi et al., 2004). Как и в случае поперечных сшивок с ДНК, присоеди- нение поперечными сшивками к центромерным РНК требует участия Dicer и С1г4 и, следовательно, является зависимым от siRNA и хроматина. Во-вторых, для про- изводства siRNA требуются компоненты хроматина, в том числе Clr4, Swi6 и РВФС Sir2 (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Наконец, ассоциация RDRC c RITS зависит от siRNAs, а также от С1г4, что заставляет предполагать, что она происходит на хроматине (Mot- amedi et al., 2004). Таким образом, образование dsRNA вание RDRC к связанным с хроматином вновь синтези- рующимся пре-иРНК-транскриптам, как это показано на рис. 8.5 (Martienssen et al., 2005; Verdel and Moazed, 2005) Тот факт, что транскрипция и образование siRNA происходят, вероятно, одновременно, усиливает раз- личие между механизмами РНК-сайленсинга, опосре- дующими модификации хроматина, и PTGS. Однако маловероятно, чтобы это различие было абсолютным. Например, у С. elegans мутации в нескольких компонен- тах хроматина, подобные мутациям у S. pombe, приво- дят к дефектам в RNAi и индуцируемом транспозона- ми РНК-сайленсинге (см. табл. 8.1) (Sijen and Plasterk, 2003; Grishok et al., 2005; Kim et al., 2005), и возникает возможность, что в некоторых случаях синтез и процес- синг dsRNA могут происходить на хромосоме незави- симо от того, происходит ли сайленсинг на уровне TGS или же PTGS 6. Модели распознавания РНК-РНК versus РНК-ДНК Крайне важным вопросом при разработке роли RNAi в сборке гетерохроматина является вопрос о том, связы- вается ли RITS/RDRC с ДНК или же с вновь образую- щейся РНК. Наблюдение, что компоненты механизма Таблица 8.1. Консерватизм RNAi и белков гетерохроматина [перевод] S. pombe A. thaliana C. elegans Drosophila II. sapiens Dcrl DCL1-4 Dcr-1 Dcrl и 2 DCR-1 Agol AGO1-10 Rde-1, Alg-1 и-2 Agol—3, Piwi AGO-1—ACO-4 PRC-1 и 2, и 19 других Aubergine/Sting Piwi-1 — Piwi-4 PIWI-1—PIWI-4 Chpla СМТЗ — — — Tas36 — — — — Rdpl RDR1-6 Ego-1, Rrf-1—3 — — Hrrl SGS2/SDE3 ZK1067.2 GH20028p KIAA1404 Cidl2 в Rde-3, Trf-4B CGI 1265 POLSB Swi6 LHP1 (TFL2) Hpl-1, Hpl-2, F32E10.6 HP1 HPloc, ₽,y Clr4 SUVH2-6 г Su(var)3-9 SUV39Hln2 RikP DDB1 M18.5 Ddbl DDB1 Cul4 CUL4 Cul4 Cul4 CUL4 Sir2 SIR2 Sir2-1 Sir2 SIRT1 Eril ERI1 Eri-1 CG6393 THEX1 а Очевидный ортолог хромодоменного белка, Chpl, не был идентифицирован у других модельных организмов, перечисленных здесь, но большинство эукариотических клеток содержит множественные хромодоменные белки. СЬЕЗ у Arabidopsis является хромодоменной ДНК-метилтрансферазой, которая работает в том же пути, что и AGO4, и может быть аналогичной Chpl. 6 Никакие очевидные ортологи Tas3 не были идентифицированы, но имеет место слабое сходство по аминокислотной последова- тельности с белком, специфичным для яичника и семенника мыши (NP 035152). в Cid 12 относится к большому семейству консервативных белков, имеющих сходство по аминокислотной последовательности с классической поли(А)полимеразой, а также с 2’-5’-олигоаденилатными энзимами. г С. elegans обладает примерно 20 доменными белками SET, но НЗК9 НКМТ не была еще идентифицирована у этого организма. д 5. pombe содержит другой Rikl-подобный белок, Ddbl, который участвует в репарации повреждений ДНК, но неизвестно, уча- ствует ли он и в формировании гетерохроматина.
7. Как RNAi рекрутирует энзимы, модифицирующие хроматин 7 RNAi, связывающиеся с транскриптом гена, могут индуцировать зависимый от хроматина сайленсинг генов в cis-положении, ясно демонстрирует, что этот процесс может стимулироваться посредством перво- начальных взаимодействий с вновь синтезируемыми РНК-транскриптами (Buhler et al., 2006). Важно, что ш-ограничение исключает возможность того, что на- чальные события синтеза dsRNA и образование siRNA происходят на зрелых транскриптах, где nRNA, по- лученные с разных аллелей, нельзя различить. Более того, модель РНК-РНК-взаимодействия прямо пред- сказывает, что для сборки гетерохроматина, опосредо- ванной RNAi, должна быть необходимой транскрипция в локусе-мишени. Хотя эта потребность в транскрип- ции и не была непосредственно проверена, мутации в двух разных субъединицах РНК-полимеразы II (RNA pol II), обозначаемых Rpb2 и Rpb7, характеризуются специфическими дефектами в образовании siRNA и сборке гетерохроматина, но не в общей транскрипции (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005). Это заставляет вспомнить мутанты Rbpl, которые характеризовались дефектами в модификациях гистонов (т.е. метилирова- нии НЗК4 иубиквитинировании Н2В), сопряженными с элонгацией при транскрипции (Hampsey and Reinberg, 2003), и создает прецедент для предположения о том, что опосредованное RNAi метилирование по НЗК9 и формирование гетерохроматина могли бы быть со- пряжены с транскрипционной элонгацией через ас- социацию комплексов RNAi с РНК-полимеразой II. В действительности, в противоположность широко принятому мнению о том, что гетерохроматин является недоступной структурой, подавляющей транскрипцию, опосредованная RNAi сборка гетерохроматина очень мало влияет или вовсе не влияет на ассоциацию РНК- полимеразы II с центромерными повторами у S. pombe (Volpe et al., 2002; Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005; Buhler etal., 2006). Следовательно, вновь синтезируемые РНК-транскрипты, действующие как матрицы для RITS в модели РНК-РНК-распознавания, присутствуют в гетерохроматиновых доменах (рис. 8.4). В пользу модели РНК-РНК-«нацеливания» гово- рит также наблюдение, что компоненты комплексов как RITS, так и RDRC могут быть локализованы в не- кодирующих центромерных РНК в экспериментах по поперечным сшивкам in vivo (Motamedi et al., 2004). Эта локализация зависит от siRNA, что позволяет предпо- ложить участие в ней взаимодействий с некодирующей РНК на основе спаривания оснований. Кроме того, она требует НКМТ С1г4, что позволяет предполагать, что она сопряжена со связыванием RITS с метилирован- ными НЗК9 и происходит на хроматине. Тем не менее, нельзя исключить, что siRNAs могут также распозна- вать ДНК непосредственно, на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании оснований. Например, у растений siRNAs, комплементарные к премоторным районам, которые (предположительно) не транскриби- руются, все еше могут направлять метилирование ДНК, которое является еще одной модификацией, проис- ходящей в ходе формирования гетерохроматина в этих районах (глава 9). 7. Как RNAi рекрутирует энзимы, модифицирующие хроматин? Рекрутирование С1г4 и Swi6 является ключевым этапом в инициации метилирования по НЗК9 и сборки гетерох- роматина в модели авторегуляторной модификации- связывания (рис. 8.3 и 8.4) (Grewal and Moazed, 2003). Однако, поскольку связь RITS с хроматином и катализи- руемое С1г4 метилирование гистонов по НЗК9 являются взаимозависимыми процессами, оказалось трудным определить событие, обеспечивающее первоначальное переключение зависимой от RNAi сборкой гетрохро- матина. Одно из решений этой проблемы «курицы и яйца» заключается в том, что первоначальный сигнал для сборки гетерохроматина мог бы быть обеспечен зависи- мыми от siRNA взаимодействиями на основе спаривания оснований (рис. 8.4). В соответствии с этой гипотезой генерация de novo ura4+ siRNAs стимулирует сайленсинг прежде активной копии гена ига4\ сопряженный с ре- крутированием RITS и Swi6 к хроматину (Buhler et al., 2006). Исходное связывание RITS может, однако, быть преходящим и трудным для регистрации; стабильное связывание RITS с хроматином требовало бы двойных взаимодействий между (1) связанными с RITS siRNAs и вновь синтезируемым транскриптом и (2) связыванием хромодомена Chp 1 с метилированными НЗ К9 В этой мо- дели сам RITS непосредственно рекрутирует С1г4. Альтер- нативная возможность заключается в том, что С1г4 может рекрутироваться по параллельному пути с участием одного или нескольких белков, связывающихся с ДНК, как это имеет место в районе «молчащего» типа спаривания и в теломерных районах (Jia et al., 2004$ Kanoh et al., 2005). В любом сценарии опосредованное С1г4 метилирование НЗК9 было бы необходимо для стабилизации связи RITS с хроматином, что затем ведет к рекрутированию RDRC, синтезу dsRNA и образованию siRNA (рис. 8.5). Недавно обнаружили, что С1г4 является компонен- том мультипротеинового комплекса, который содержит белок Rikl гетерохроматина. СиШпЕЗ-убиквитинлигазу Рис. 8.5. Модель котранскрипционного образования dsRNA и siRNA и рекрутирование комплекса С1г4-К1к1-Си14-метилтрансферазы гистонов у S. pombe
Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина и несколько других белков (Hong et al., 2005; Hom et al., 2005; Jia et al. 2005; Li et al., 2005). Далее эти ассоции- рованные с С1г4 белки усиливают связь между РНК и формированием гетерохроматина. Белок Rikl являет- ся членом большого семейства белков типа [3 propeller WD repeat, участие которых в связывании с РНК или ДНК предполагалось. Среди членов этого белкового семейства — фактор CPSF-A (Cleavage Polyadenylation Specificity Factor А), участвующий в сплайсинге пре- иРНК, и белок Ddbl (DNA damage binding 1), участвую- щий в связывании с поврежденной УФ ДНК. Особый интерес представляет CPSF-A, поскольку Rikl схо- ден по последовательности со своим предполагаемым связывающимся с РНК доменом, участвующим в рас- познавании последовательностей полиаденилирова- ния иРНК (Barabino et al., 2000). Белок Ddbl, подобно белку Rikl, является компонентом комплекса Си14-Е3- убиквитинлигазы и участвует в распознавании и репа- рации ДНК, поврежденной УФ (Higa et aL, 2003; Zhong et al., 2003). Весьма интригующая возможность заклю- чается в том, что Rikl действует похожим на действие CPSF-A и Ddbl образом, связываясь во время сборки гетерохроматина с продуктом, произведенным RNAi (рис. 8.5). 8. Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi Механизм, посредством которого RNAi направляет мо- дификации гетерохроматина у растений, сходен с тако- вым у дробянковых дрожжей, хотя имеются и многочис- ленные отличия. Наиболее важное отличие заключается в том, что у растений метилированная ДНК имеется во многих репрессивных районах гетерохроматина: в этом отношении они напоминают позвоночных, но отличают- ся от червей и Drosophila (Lippman and Martienssen, 2004). Четыре цикла генетического скрининга, направленного на отбор мутантов с ослабленным TGS, опосредованным РНК, выявили мутантов по HKMTs, специфичным к НЗК9, и по компонентам RNAi, но они также вскрыли необходимую функцию ДНК-метилтрансфераз, SWI/ SNF-комплексов ремоделинга и новую РНК-полимеразу (Baulcombe, 2004). Этот скрининг детально описан в главе 9, но здесь мы кратко сравним этот механизм у дробянковых дрожжей и у растений. Для каждого скрининга на мутанты сайленсинга ис- пользовались инвертированные повторы, введенные в Ггаия-конфигурации, чтобы индуцировать сайлен- синг эндогенных или трансгенных репортерных генов. Ослабление сайленсинга указывает на мутацию, воз- никшую в некоем необходимом компоненте пути, ве- дущем к сайленсингу. Использованными при этом эн- догенными генами были PAI2 (участвует в биосинтезе аминокислот) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN (транскрипционный фактор, регулирующий разви- тие цветка) (Chan et al., 2004), и эти репортерные гены управлялись либо сильным вирусным промотором, либо сильным промотором, специфичным для семени (Matzke et al., 2004). В каждом случае промотор был ми- шенью для сайленсинга, в некоторых случаях вместе с остальной частью данного гена. Ряд генов, найденных в результате этих экспериментов по скринингу, про- иллюстрирован на рис. 8.6 (см. также табл. 9.1). Был идентифицирован лишь один мутант по RNAi (в одном из циклов скрининга), и это был ген AGO4 (аргонавт). Однако в трех циклах скрининга были обнаружены му- танты по ДНК-метилтрансферазам, в том числе МЕТ1 и СМЕТЗ. Третья ДНК-метилтрансфераза, родствен- ная DNMT3 млекопитающих, была идентифицирована методом обратной генетики, поскольку эта активность кодируется DRM1 и DRM2, двумя избыточными гена- ми, которые невозможно определить в ходе скрининга одиночных мутантов (глава 9). И в самом деле, избы- точность может объяснить невозможность обнаружить дополнительне компоненты аппарата RNAi: например, хотя DCL3 (DICER-LIKE 3) и RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDRP) преимущественно требуются для производства siRNA размером 24 нуклеотида, ассо- циированной с транспозонами и повторами, по мень- шей мере два других гена DCL у Arabidopsis могут в не- которой степени замещать DCL3 (Gasciolli et al., 2005). Среди других мутантов, обнаруженных при скри- нинге PAI2, были мутанты по гену KYP/SUVH4 (гену НЗК9-метилтрансферазы) и содержащему хромоломен н е ны Vi ь ИЛИ Рис. 8.6. Белки RNAi и хроматина, необходимые для метилирова- ния ДНК и гистонов, опосредованного RNAi, у Arabidopsis Синтез dsRNA с повторяющихся элементов ДНК обеспечивает субстрат для опосредованного Dicer расщепления и производ- ства siRNA (DCL3 и другие белки типа Dicer) Направляемые FHK РНК-полимеразы (RdRp, RdR2) и РНК-полимераза IV (RNA Pol IV) могут непосредственно участвовать в синтезе dsRNA или ее амплификации. siRNAs затем грузятся на белки Argonaute (напр., AGO4), что, вероятно, в ассоциации с другими факторами помогает «нацелить» похожие повторяющиеся по- следовательности для метилирования ДНК и НЗК9
8. Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi гену СМТЗ (гену ДНК-метилтрансферазы). Параллели с дробянковыми дрожжами в этом случае поражают, по- скольку комплекс R1TS содержит как белок Argonaute, так и хромодоменный белок Chpl, который для своей ассоциации с хромосомой зависит от метилирования НЗК9. Однако, в отличие от дробянковых дрожжей, у Arabidopsis утрата СМТЗ или НЗК9те2 не приводит к потере siRNA (Lippman et al., 2003), и еще неясно, фор- мируют ли эти белки комплекс с AGO4. У Arabidopsis имеются, однако, несколько других HKMTs, специ- фичных к НЗК9; по крайней мере три из них обладают генетической функцией, так что и здесь избыточность может частично объяснять ситуацию (Ebbs et al., 2005) Мутанты по другим ДНК-метил трансферазам, МЕТ1 и DRM1/2, в противоположность мутантам по СМТЗ, приводят к утрате накопления siRNA, по крайней мере, с некоей подгруппы транспозонов и с тандемных по- второв, которые обычно продуцируют siRNA, если они транскрибируются (Martienssen, 2003). В этих случа- ях утрата siRNA скоррелирована с потерей НЗК9те2 (Cao et al., 2003; Lippman et al., 2003). Мутанты по AT- Фазе DDM1 (decreased DNA methylation) SWI2/SNF2- ремоделинга хроматина также ликвидируют накопле- ние siRNA и H3K9me2 с большой группы транспозонов, хотя в тех случаях, когда siRNA сохраняется, сохраняет- ся и H3K9me2 (Lippman et al., 2003). Возможно поэтому, что siRNA у растений связана с хромосомой через мети- лированную ДНК вместо связывания (или в дополне- ние к связыванию) через метилированные гистоны, как это имеет место у S. pombe (рис. 8.7). DDM1 обладает сильно выраженной специфично- стью к транспозонам и повторам и должна как-то распо- знавать их как последовательности, отличные от генов. siRNA, возможно связанная с хромосомой с помощью метил-связывающих белков, могла бы обладать необ- ходимой специфичностью для такого разграничения. В соответствии с этой идеей, транспозоны и повторы у Arabidopsis являются основным источником siRNA раз- мером 24 нуклеотида и некоторых siRNA размером 21 нуклеотид (Lippman et al., 2004). Центромерные сател- литные повторы, расположенные в виде десятков тысяч тандемных копий по обе стороны каждой центромеры, также транскрибируются И процессируются RNAi (рис. 8.6). Этот процессинг зависит от DCL3, RDR2 и DDM1. Сайленсинг также зависит от НЗК9те2 и СМТЗ. Одна- ко сайленсинг здесь более сложный, чем у дробянковых дрожжей, поскольку ретротранспозонные вставки в эти повторы могут сайленсировать их, а это зависит от дру- гих механизмов с участием МЕТ1, DDM1 и деацетила- зы гистонов HDA6 (May et al., 2005). Как упоминалось выше, у дробянковых дрожжей субъединицы РНК-полимеразы II (RNA Pol II) необ- ходимы для сайленсинга и производства siRNA, что го- ворит в пользу идеи, согласно которой аппарат RNAi и модификации хроматина рекрутируется к хромосомам с помощью вновь синтезируемых транскриптов (рис. 8.5). У Arabidopsis две субъединицы новой РНК-полимеразы (RNApol IV) были обнаружены в ходе одного из четырех выше упоминавшихся скринингов (Kanno et al., 2005), но сначала были изолированы как слабые мутанты по 6 ______ RdR2 Рис. 8.7. Гипотетические модели относительно роли RNA pol IVв метилировании ДНК и (или) гистона НЗ, направляемом RNAi (a) RNA pol IV транскрибирует метилированную ДНК; КвК2 синтезирует dsRNA, используя продукт, производимый RNA pol IV. Затем siRNAs «направляют» метилтрансферазный ком- плекс к хромосоме, (б) RNA pol IV использует матрицу dsRNA, синтезированную RdR2, для производства большего количества матриц ssRNA PTGS, наряду с мутантами по РНК-зависимой РНК- полимеразе (Herr et al., 2005). Пока еще не известно, какая матрица используется RNA pol IV, но предполо- жили (Vaughn and Martienssen, 2005), что это могут быть и метилированная ДНК (Onodera et al., 2005), и лвуни- тевая РНК. Только самые крупные субъединицы уни- кальны для RNA pol IV, которая, как предполагается, использует тот же набор малых субъединиц, что и RNA pol II Дополнительные SWI2/SNF2-peмoдeлepы хро- матина, которые также были обнаружены в ходе этих опытов по скринингу, могут изменять локальную струк- туру хроматина и облегчать процессивность RNA pol IV (Kanno et al., 2004). Сходную роль можно предположить для DDM1, хотя потребность для DDM1 (которая также является ремоделером хроматина) в сайленсирующих транспозонах гораздо более жесткая, чем у RNA pol IV или других белков SWI2/SNF2. Гены могут быть эпигенетически сайленсированы близлежащими транспозонами; важным примером этого
Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина у Arabidopsis является импринтированный гомеобоксный ген FWA (Kinoshita et al., 2004). Первые два экзона этого гена являются некодирующими и образуют тандемный повтор благодаря древней вставке элемента SINE в этот сайт (Lippman et al., 2004). У мутантов по metl (т.е. ДНК- метилтрансферазе) siRNAs, синтезированные с элемента SINE, утрачены, и этот ген в меристеме соцветия обнару- живает сильную ап-регуляцию, что приводит к позднему цветению Такой фенотип не наблюдается у мутантов по RNAi, даже тогда, когда siRNA утрачены. Вместо этого RNAi может играть роль в инициации сайленсинга FWA, потому что трансгены FWA быстро сайленсируются, ког- да впервые вводятся в растение, и этот сайленсинг зави- сит от DCL3, RDR2и AGO4(Chan et al., 2004). Сайленсинг мог бы затем поддерживаться метилированием ДНК, ре- гулируемым МЕТ1. Подобным же образом аллели FWA, характеризующиеся поздним цветением, стабильно на- следуются в бэккроссах после удаления с фона мутантов metl или ddml, поскольку поддержание эпиаллелей яв- ляется наследуемым (Soppe et al., 2000). Наконец, возможно, что при некоторых обстоятель- ствах miRNA могут направлять метилирование ДНК ге- нов. У Arabidopsis miRNA 165 и 166 делают иРНК с гена PHABULOSA мишенью для расщепления, и сам этот ген метилируется «вниз по течению» от участка, который со- ответствует miRNA по последовательности. Интересно, что это соответствие распространяется на место присо- единения экзона, так что сплайсированная РНК должна взаимодействовать с miRNA, если она «направляет» ме- тилирование (Bao et aL, 2004). Однако другие члены того же семейства генов не метилируются таким образом, как и большинство других генов, являющихся «мишенями» для miRNA (Martienssen et al., 2004; Ronemus and Mar- tienssen, 2005). Наоборот, метилируются несколько дру- гих генов в геноме Arabidopsis, обычно на их 3’-конце, с помощью механизма, для которого нужен МЕТ1, но не нужен DDM1 (Lippman et al., 2004: Tran et al., 2005). Остается посмотреть, участвует ли в этих случаях РНК. 9. Консерватизм модификаций хроматина, опосредованных RNAi, у животных ’ Возможно, наиболее всесторонне изученные примеры эпигенетического сайленсинга мы находим у животных, в том числе у Drosophila и С. elegans, а также у мыши. Роль РНК и РНК-интерференции в транскрипционном сайленсинге и модификациях гетерохроматина оказыва- ется консервативной у некоторых модельных животных, как и у протистов и растений. У Drosophila и PIW1, и Aubergine (Sting), гомолог Argonaute класса PIWI, не- обходимы для эпигенетического и гетерохроматинового сайленсинга (глава 5) Ретротранспозоны Gypsy являются «мишенью» сайленсинга в клетках фолликулов яичника и женских гонадах со стороны самого PIWI (Sarot et al., 2004). Это опосредуется гетерохроматиновым геном Flamenco (со всё еще не известной функцией) и требует 5 UTR полипротеинового гена Gypsy Выявление малых РНК размером 25—27 нуклеотидов из этого района за- ставляет предполагать, что это происходит с помощью механизма, опосредуемого RNAi. ДНК-транспозоны типа «cut-and-paste» также подвержены влиянию RNAi Например, некоторые теломерные P-элементы (один из типов ДНК-транспозонов) могут супрессировать перемещение в другое место в геноме, когда они уна- следованы через женский зародышевый путь, давая в ре- зультате сильно репрессивный «цитотип». Эта репрессия полностью зависит от гомолога PIWI, Aubergine, а также от гомолога Swi6, НР1 (Reiss et al., 2004). Однако не все Р-репрессивные цитотипы — например, цитотипы, опо- средуемые другими, не теломерными Р-элементами, — зависят от Aubergine или НР1. У Drosophila несцепленные трансгены сайленсиру- ются посттранскрипционно, если они присутствуют во многих копиях (Pal-Bhadra et al., 1997, 2002). Сайлен- синг связан с большими количествами siRNa размером 21 нуклеотид и зависит от PIWI. Трансгенные слияния могут тоже сайленсировать друг друга транскрипни- онно, способом, требующим хроматиновый репрессор Polycomb. Этот сайленсинг не связан с повышенными уровнями siRNA из транскрипта трансгена, но (в основ- ном) зависит от PIWI. Участие Polycomb в этом примере зависимого от PIWI сайленсинга и НР1 в других приме- рах указывает на путь RNAi и метилирование гистонов в процессе сайленсирования. У Drosophila тандемные порядки трансгенов также обнаруживают эффект по- ложения мозаичного типа, и эта мозаичность сильно подавляется мутантами по HP 1, а также по piwi, auber- gine и предполагаемой PH К-геликазе Spindle-Е (horn- less) (Pal-Bhadra et al. 2004). Трансгены, вставленные в центрический гетерохроматин, также испытывают влияние, и в клетках, мутантных по Spindle-E, уровни НЗК9те2 гетерохроматина снижены. Эти наблюдения убедительно свидетельствуют в пользу роли как белков хроматина, так и компонентов RNAi-пути в сайленсин- ге генов, находящихся в гетерохроматине Drosophila. В мужском зародышевом пути Drosophila гетерохро- матиновые повторы Supressor of Stellate (Su(ste)), локали- зующиеся на Y-хромосоме, транскрибируются во время развития сперматоцитов сначала на антисмысловой нити, а затем на обеих нитях, возможно, после встав- ки близлежащего транспозона (Aravin et al., 2001). Эти ядерные транскрипты требуются, чтобы сайленсировать смысловые транскрипты близкородственного гена Stel- late, сцепленного с X. сверхэкспрессия которого приво- дит к дефектам в сперматогенезе. Хотя здесь участвуют гетерохроматиновые последовательности, сайленсинг в этом случае является, по-видимому, посттранскрипци- онным, связан с siRNA размером 25—27 нуклеотидов и зависит как от Aubergine, так и от Spindle-E. У С. elegans были опубликованы примеры TGS в со- матических клетках. Это зависит от генов RNAi-пути rde-1, dcr-1, rde-4 и rtf-1, а также от гомологов НР1 и аппарата модификации гистонов (Grishok et al.. 2005). Соматический гетерохроматин не очень широко рас- пространен у С elegans, но в зародышевом пути опи- сан пример естественно происходящего зависимого от RNAi гетерохроматинового сайленсинга (Sijen and Plasterk, 2003). Во время мейоза неспаренные после-
довательности. такие как Х-хромосома у самцов, сай- ленсируются посредством НЗК9те2, и этот сайленсинг зависит от РНК-зависимой РНК-полимеразы (Maine et al., 2005; глава 15), что напоминает о мейотическом сай- ленсинге неспаренной ДНК (MSUD) у Neurospora (см. Shiu et al., 2001; глава 6). Однако другие компоненты аппарата RNAi не связывали с этим процессом и неиз- вестно, связано ли это механистически [mechanistically] с опосредованной RNAi сборкой гетерохроматина у дробянковых дрожжей. Наконец, как и у Drosophila, у клеток млекопитающих нет генов, родственных генам РНК-зависимых РНК- полимераз, найденных у растений, червей и грибов. Тем не менее, участие антисмысловой РНК предполагалось в большинстве лучше всего изученных эпигенетических явлений — импринтинге и инактивации Х-хромосомы (главы 19 и 17, соответственно). В случае инактивации Х-хромосомы сплайсированная и полиаденилирован- ная некодирующая РНК размером 17 тыс. о., известная как Xist, необходима для сайленсирования неактивной Х-хромосомы, с которой она экспрессируется. Напро- тив, на активной Х-хромосоме сайленсирована сама Xist\ этот процесс отчасти зависит от антисмысловой РНК Tsix Сайленсинг сопровождается модификаци- ей гистонов, ассоциированных с участками хроматина «вверх по течению», которые маркированы НЗК9те2 и НЗК27теЗ (глава 17). Сайленсинг других импринти- рованных локусов у мышей, в том числе Igf2r и райо- на Dlkl-Gtl2, также поддерживается антисмысловыми транскриптами с отцовской или материнской аллели, соответственно. В случае Dlkl-Gtl2 эта некодирующая РНК специфически процессируется в miRNA, «нацели- вающую» антисмысловой транскрипт с отцовской ал- лели, кодирующей ретротранспозон класса sushi (gypsy) (Davis et al., 2005). Хотя видны многочисленные параллели с «прямой» и «обратной» транскрипцией с гетерохроматиновых повторов у 5. pombe, роль самой RNAi в импринтинге и инактивации Х-хромосомы до сих пор оказывалась неуловимой. Тем не менее, введение siRNA в клетки раковых линий могло приводить к тому, что хроматин оказывался маркированным НЗК9те2 в гомологичных промоторах (Ting et al., 2005). В некоторых случаях это могло приводить и к метилированию ДНК (Morris et al., 2004), опосредованному, возможно, прямым свя- зыванием малых РНК с ДНК-метилтрансферазами и белками, связанными с метилированием ДНК (Jeffery and Nakielny, 2004). Наконец, клеточные линии позво- ночных, нокаутных по Dicer, демонстрировали дефекты расхождения хромосом (напоминающие те, которые были обнаружены у мутантов дробянковых дрожжей), сопровождаемые изменениями в морфологии гетерох- роматина, в экспрессии сателлитных повторов и нару- шениями в локализации когезина (Fukagawa et al., 2004; Kanellopoulou et al., 2005). 10. Заключительные замечания Предположение, что гены могут регулироваться моле- кулами малых РНК. было высказано более 40 лет тому назад (Jacob and Monod, 1961), так же как и представление о том, что «контрольная РНК» может иметь отношение к повторам (Britten and Davidson, 1969). Со времени идентификации репрессоров лямбда и lac как сайт- специфичных связывающихся с ДНК белков у Escherichia coli и инфекционного бактериофага lambda (Gilbert and Muller-Hill, 1966; Ptashne, 1967) исследования регуляции генов были сфокусированы почти исключительно на роли связывающихся с нуклеиновыми кислотами белков как факторов специфичности. Открытие молекул малых РНК как агентов специфичности в разнообразных ме- ханизмах РНК-сайленсинга четко устанавливает теперь роль РНК как сиквенс-специфичного регулятора генов и их РНК-продуктов. Исследования, проведенные на дробянковых дрожжах, Arabidopsis и других модельных организмах вскрыли удивительно непосредственную роль малый РНК в опосредовании эпигенетических модификаций генома, «направляющих» сайленсинг генов и вносящих вклад в гетерохроматиновые домены, необходимые для стабильности генома и деления ядер Многочисленные важные механистические вопросы остаются открытыми, и будущие исследования, вероят- но, принесут много сюрпризов относительно того, как РНК регулирует экспрессию генов. Литература Aravin А.А., Naumova N.M., Tulin А. V., Vagin V.V., Rozovsky Y.M., and Gvozdev V.A. 2001. Double-stranded RNA-mediated silenc- ing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11: 1017-1027. Bao N., Lye K.W., and Barton M.K. 2004. MicroRNAbinding sites in Arabidopsis class III HD-ZIP mRNAs are required for methyla- tion of the template chromosome. Dev. Cell 7: 653-662. Barabino S.M., Ohnacker M., and Keller W. 2000. Distinct roles of two Ythlp domains in З’-end cleavage and polyadenylation of yeast pre-mRNAs. EMBO J. 19: 3778-3787. Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281-297. Baulcombe D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356- 363. Bernstein E., CaudyAA., Hammond S.M., and Hannon G.J. 2001. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409: 363-366. Bntten R.J. and Davidson E.H. 1969. Gene regulation for higher cells: A theory. Science 165: 349-357. Buhler M., Verdel A., and Moazed D. 2006. Tethering RITS to a na- scent transcript initiates RNAi- and heterochromatin-dependent gene silencing. Cell 125: 873-886. CaoX., Aufsatz W., Zilberman D., Mette M.F., Huang M.S., Matzke M., and Jacobsen S.E. 2003. Role of the DRM and CMT3 methyltrans-ferases in RNA-directed DNA methylation. Curr. Biol. 13: 2212-2217. Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington, J.C., and Jacobsen S.E. 2004. RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303: 1336. Chen C.C., Simard M.J., Tabara H, Brownell D.R., McCollough J. A., and Mello C.C. 2005. A member of the polymerase 0 nucle- otidyltransferase superfamily is required for RNA interference in C. elegans. Curr. Biol. 15: 378-383.
Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина Dalmay Т., Hamilton A., Mueller Е„ and Baulcombe D.C. 2000. Potato virus X amplicons in Arabidopsis mediate genetic and epigenetic gene silencing. Plant Cell 12: 369-379. Davis E., Caiment E., Tordoir X., Cavaille J., Ferguson-Smith A., Cockett N., Georges M., and Charlier C. 2005. RNAi-mediated allelic trans-interaction at the imprinted Rtll/Pegll locus. Curr. Biol. 15: 743-749. Djupedal I., Portoso M., Spahr H., Bonilla C., Gustafsson C.M., Allshire R.C., and Ekwall K. 2005. RNA Pol II subunit Rpb7 promotes centromeric transcription and RNAi-directed chro- matin silencing. Genes Dev. 19:2301-2306. Ebbs M.L., Bartee L., and Bender J. 2005. H3 lysine 9 methylation is maintained on a transcribed inverted repeat by combined ac- tion of SUVH6 and SUVH4 methyltransferases. Mol. Cell. Biol. 25: 10507-10515. Elbashir S.M., Lendeckel W, and Tuschl T. 2001. RNA interfer- ence is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15:188-200. Filipowicz W., Jaskiewicz L., Kolb F.A., and Pillai R.S. 2005. Post- transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr. Opin. Struct. Biol. 15: 331-341. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., and Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811. Francis N.J. and Kingston R.E. 2001. Mechanisms of transcriptional memory. Nat. Rev. Mol. Biol. 2: 409-421. Fukagawa T, Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno М.» Okazaki T, Takami Y, Nakayama T, and Oshimura M. 2004. Dicer is essen- tial for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 6: 784-791. Galagan J.E. and Selker E.U. 2004. RIP: The evolutionary cost of genome defense. Trends Genet. 20: 417-423. GasciolliV, Mallory A.C., Bartel D.P., and Vaucheret H. 2005. Par- tially redundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing /rans-acting siRNAs. Curr. Biol. 15: 1494-1500. Gasser S.M., Hediger E., Taddei A., Neumann F.R., and Garten- berg M.R. 2004. The function of telomere clustering in yeast: The circe effect. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 327-337 Gilbert W. and Muller-Hill B. 1966. Isolation of the Lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. 56: 1891-1898. Grewal S.I. 2000. Transcriptional silencing in fission yeast. J. Cell. Physiol. 184:311-318. Grewal S.I. and Moazed D. 2003. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science 30: 798-802. Grishok A., Sinskey J.L., and Sharp P.A. 2005. Transcriptional si- lencing of a transgene by RNAi in the soma of C. elegans. Genes Dev. 19: 683-696. Hall I.M., Shankaranarayana G.D., Noma K., Ayoub N.. Cohen A., and Grewal S.I. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237. Hamilton AJ. and Baulcombe D.C. 1999. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286: 950-952. Hampsey M. and Reinberg D. 2003. Tails of intrigue: Phosphoryla- tion of RNA polymerase II mediates histone methylation Cell 113: 429-432. Hannon G.J. 2002. RNA interference. Nature 244-251. Herr A. J., Jensen M.B., Dalmay T, and Baulcombe D.C. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308:118-120. Higa L.A., Mihaylov I.S., Banks D.P., Zheng J., and Zhang H. 2003. Radiation-mediated proteolysis of CDT1 by CUL4-ROC1 and CSN complexes constitutes a new checkpoint. Nat. Cell Biol. 5:1008-1015. Hong E.E., Villen J., Gerace E.L., Gygi, S.P., and Moazed D. 2005. A Cullin E3 ubiquitin ligase complex associates with Rikl and the Clr4 histone H3-K9 methyltransferase and is required for RNAi- mediated heterochromatin formation. RNA Biol. 2:106-111 Hom P.J., Bastie J.N., and Peterson C.L 2005. A Rikl-associated. cullin-dependent E3 ubiquitin ligase is essential for heterochro- matin formation. Genes Dev. 19: 1705-1714. Jacob F. and Monod J. 1961. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3: 318-356. Jeffery L. and Nakielny S. 2004. Components of the DNA methyla- tion system of chromatin control are RNA-binding proteins. J. Biol. Chem. 279: 49479-49487. Jia S., Kobayashi R., and Grewal S.I. 2005. Ubiquitin ligase com- ponent Cul4 associates with Clr4 histone methyltransferase to assemble heterochromatin. Nat. Cell Biol. 7: 1007-1013. Jia S., Noma K., and Grewal S.I. 2004. RNAi-independent hetero- chromatin nucleation by the stress-activated ATF/C REB family proteins. Science 3^’. 1971-1976. Kanellopoulou C., Muljo S.A., Kung A.L., Ganesan S., Drapkin R., Jenuwein T, Livingston D.M., and Rajewsky K. 2005. Dicer- deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentia- tion and centromeric silencing. Genes Dev. 19: 489-501. Kanno T, Huettel B., Mette M.F., Aufsatz W, Jaligot E.. Daxinger L., Kreil D.P., Matzke M., and Matzke A.J. 2005. Atypical RNA polymerase subunits required for RNA-directed DNA methyla- tion. Nat. Genet. 37: 761-765. Kanno T, Mette M.F., Kreil D.P., Aufsatz W, Matzke M., and Matzke A.J. 2004. Involvement of putative SNF2 chromatin remodeling protein DRD1 in RNA-directed DNA methylation. Curr. Biol. 14: 801-805. Kanoh J., Sadaie M., Urano T, and Ishikawa F. 2005. Telomere bind- ing protein Tazl establishes Swi6 heterochromatin independently of RNAi at telomeres. Curr. Biol. 15: 1808-1819. Kato H., Goto D.B., Martienssen R.A., Urano T, Furukawa K., and Murakami Y. 2005. RNA polymerase II is required for RNAi- dependent heterochromatin assembly. Science 309: 467-469. Kim J.K., Gabel H.W., Kamath R.S., Tewari M., Pasquinelli A., Rual J.F., Kennedy S., Dybbs M., Bertin N., Kaplan J.M., etal. 2005. Functional genomic analysis of RNA interference in C. elegans. Science 308:1164-1167. KinoshitaT, Miura A., Choi Y, Kinoshita Y, CaoX., Jacobsen S.E.. Fischer R.L., and Kakutani T. 2004. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Sci- ence^. 521-523. Li E. Goto D.B.. Zaratiegui M., TangX., Martienssen R., and Cande W.Z. 2005. Two novel proteins, Dosl and Dos2, interact with Rikl to regulate heterochromatic RNA interference and histone modification. Curr. Biol. 15: 1448-1457. Li H.W and Ding S.W. 2005. Antiviral silencing in animals. FEES Lett. 579: 5965-5973. Lippman Z., Gendrel A.V., Black M., Vaughn M.W., Dedhia N., McCombie W.R., Lavine K., Mittal V, May B., Kasschau K.D., et al. 2004. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature 430: 471-476.
Lippman Z. and Martienssen R. 2004. The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature 431: 364-370. Lippman Z., May B., Yordan C., Singer T., and Martienssen R. 2003. Distinct mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small interfering RNA and histone modification. PLoS Biol. 1: E67. Maine E.M., Hauth J., RatliffT, Vough V.E., SheX., and Kelly W.G. 2005. EGO-1, a putative RNA-dependent RNA polymerase, is required for heterochromatin assembly on unpaired dna during C. elegans meiosis. Curr. Biol. 15: 1972-1978. Martienssen R.A. 2003. Maintenance of heterochromatin by RNA interference of tandem repeats. Nat. Genet. 35: 213—214. Martienssen R.A., Zaratiegui M., and Goto D.B. 2005. RNA in- terference and heterochromatin in the fission yeast Schizosac- charomyces pombe. Trends Genet. 21: 450-456. Martienssen R., Lippman Z., May B., Ronemus M., and Vaughn M. 2004. Transposons, tandem repeats, and the silencing of imprinted genes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 371-379. Mathieu O. and Bender J. 2004. RNA-directed DNA methylation. J. Cell Sci. 117:4881-4888. Matzke M., Aufsatz W, Kanno T, Daxinger L., Papp L, Mette M.F., and Matzke A. J. 2004. Genetic analysis of RNA-mediated transcriptional gene silencing. Biochim. Biophys. Acta 1677: 129-141. May B.P., Lippman Z.B., Fang Y, Spector D.L., and Martienssen R.A. 2005. Differential regulation of strand-specific transcripts from Arabidopsis centromeric satellite repeats. PLoS Genet. 1: e79. Mette M.F., van der Winden J., Matzke M.A., and Matzke A.J. 1999. Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans. EMBO J. 18:241-248. Mette M.F., Aufsatz W, van der Winden J., Matzke M.A., and Matzke A.J. 2000. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J. 19: 5194-5201. Morris K.V., Chan S.W., Jacobsen S.E., and Looney D.J. 2004. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science 305: 1289-1292. Motamedi M.R., Verdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.P, and Moazed D. 2004. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Ce//119: 789-802. Napoli C., Lemieux C., and Jorgensen R. 1990. Introduction of a chimeric chaicone synthase gene into Petunia results in revers- ible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-289. Noma K., Sugiyama T, Cam H., \brdel A., Zofall M., Jia S., Moazed D., and Grewal S.L 2004. RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat. Genet. 36: 1174-1180. Onodera Y, Haag J.R., ReamT, Nunes P.C., Pontes O., and Pikaard C.S. 2005. Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell 120: 613-622. Pal-Bhadra M., Bhadra U., and Birchler J.A. 1997. Cosuppression in Drosophila: Gene silencing of Alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent. Cell 90: 479-490. Pal-Bhadra M., Bhadra LL, and Birchler J.A. 1999. Cosuppression of nonhomologous transgenes in Drosophila involves mutually related endogenous sequences. Cell 99: 35-46. Pal-Bhadra M., Bhadra LL, and Birchler J.A. 2002. RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila. Mol. Cell. 9: 315-327. Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra LL, Birchler J.A., and Elgin S.C. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-672. Partridge J.F., Scott K.S., Bannister A.J., Kouzarides T, and Allshire R.C. 2002. czs-acting DNA from fission yeast cen- tromeres mediates histone, H3 methylation and recruitment of silencing factors and cohesin to an ectopic site. Curr. Biol. 12: 1652-1660. Petrie V.J., Wuitschick J.D., Givens C.D., Kosinski A.M., and Partridge J.F. 2005. RNA interference (RNAi)-dependent and RNAi-independent association of the Chpl chromodomain protein with distinct heterochromatic loci in fission yeast. Mol. Cell. Biol. 25: 2331-2346. Pidoux A.L. and Allshire R.C. 2004. Kinetochore and heterochro- matin domains of the fission yeast centromere. Chromosome Res. 12: 521-534. Plasterk R.H. 2002. RNA silencing: The genome’s immune system. Science 296: 1263-1265. Provost P, Silverstein R.A., Dishart D., Walfridsson J., Djupedal L, Kniola B., Wright A., Samuelsson B., Radmark O., and Ekwall K. 2002. Dicer is required for chromosome segregation and gene silencing in fission yeast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 16648-16653. Ptashne M. 1967. Specific binding of the lambda phage repressor to lambda DNA. Nature 214: 232-234. Reinhart В J. and Bartel D.P. 2002. Small RNAs correspond to cen- - tromere heterochromatic repeats. Science 297: 1831. Reiss D., Josse T, Anxolabehere D., and Ronsseray S. 2004. aubergine mutations in Drosophila melanogaster impair P cytotype deter- mination by telomeric P elements inserted in heterochromatin. Mol. Genet. Genomics. 272: 336-343. Ronemus M. and Martienssen R. 2005. RNA interference: Methyla- tion mystery. Nature 433: 472-473. Sarot E., Payen-Groschene G., Bucheton A., and Pelisson A. 2004. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166: 1313-1321. Shiu P.K., Raju N.B., Zickler D., and Metzenberg R.L. 2001. Meiotic silencing by unpaired DNA. Cell 107: 905-916. Sigova A., Rhind N., and Zamore P. D. 2004. A single Argonaute pro- tein mediates both transcriptional and posttranscriptional silenc- ing in Schizosaccharomycespombe. Genes Dev. 18:2359—2367. Sijen T. and Plasterk R.H. 2003. Transposon silencing in the Caenorhab-ditis elegans germ line by natural RNAi. Nature 426: 310-314. Sijen T, Fleenor J., Simmer E., Thijssen K.L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R.H., and Fire A. 2001. On the role of RNA ampli- fication in dsRNA-triggered gene silencing. Cell 107: 465-476. Soppe W.J., Jacobsen S.E., Alonso-Blanco C., Jackson J.P., Kakutani T, Koomneef M., and Peeters A.J. 2000. The late flowering phe- notype offwa mutants is caused by gain-of-function epigenetic alleles of a homeodomain gene. Mol. Cell 6: 791-802. Sugiyama T, Cam H., Verdel A., Moazed D., and Grewal S.L 2005. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 152-157.
Ting А.Н., Schuebel K.E., Herman J.G., and Baylin S.B. 2005. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation. Nat. Genet. 37: 906-910. Tran R.K., Zilberman D., de Bustos C., Ditt R.F., Henikoff J.G., Lindroth A.M., Delrow J., Boyle T, Kwong S., Bryson T.D., et al. 2005. Chromatin and siRNA pathways cooperate to maintain DNA methylation of small transposable elements in Arabidopsis. Genome Biol. 6: R90. Vaughn M.W. and Martienssen R.A. 2005. Finding the right tem- plate: RNA Pol IV, a plant-specific RNA polymerase. Mol. Cell 17: 754-756. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T, Gygi S., Grewal S.I, and Moazed D. 2004. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303: 672-676. Verdel A and Moazed D. 2005. RNAi-directed assembly of hetero- chromatin in fission yeast. FEBS Lett. 579: 5872-5878. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Xeng G., Grewal S.L, and Mar- tienssen R.A. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837 Volpe T, Schramke V, Hamilton G.L., White S.A., Teng G.. Mar- tienssen R.A., and Allshire R.C. 2003. RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast. Chro- mosome Res. 11:137-146. Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., and Sanger H.L. 1994. RNA- directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 16'. 567-576. Zamore P.D. 2002. Ancient pathways programmed by small RNAs. Science 296: 1265-1269. Zamore P.D., Tuschl T, Sharp P.A., and Bartel D.P. 2000. RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101: 25-33. Zhong W, Feng H., Santiago F.E., and Kipreos E.T. 2003. CUL-4 ubiquitin ligase maintains genome stability by restraining DNA- replication licensing. Nature 423: 885-889.
ГЛАВА 9 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ У РАСТЕНИЙ Marjori Matzke и Mittelsten Scheid Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology, Austrian Academy of Sciences. A-1030 Vienna, Austria Содержание Общее резюме 1. Преимущества использования растений в эпи- генетических исследованиях 1.1. Сходство растений и животных по органи- зации (эпи)генома 1.2. Растения предоставляют дополнительные направления эпигенетических исследова- ний 1.3. Растения лучше выносят некоторые мето- дологические манипуляции, которые очень трудно применимы к млекопитающим 1.4. Исследование растений внесло самый зна- чимый вклад в эпигенетику 2. Молекулярные компоненты хроматина у расте- ний 2.1. Регуляторы метилирования ДНК у растений 2.2. Ферменты модификации гистонов 2.3. Другие белки хроматина ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Растения — мастера эпигенетической регуляции. У них имеются все основные эпигенетические механизмы, свойственные эукариотам, и часто они даже более со- вершенны, чем у представителей других царств живого мира. Цитозиновое метилирование ДНК, связанное в основном с инактивацией (замалчиванием) генов, про- исходит в CpG, CpNpG и CpNpN нуклеотидных после- 3 Молекулярные компоненты путей опосредо- ванного RNAi сайленсинга 3.1. Выработка PHKi-зависимого сайленсинга у растений 3.2. Путь 1: Связанное с трансгенами посттран- скрипционное и индуцированное вирусами замалчивание генов (PTGS/VICS) 3.3. Путь 2: Регуляция развития растений miPHKs и транс-действующими siPHK 3.4. Путь 3: Связанный с трансгенами транс- крипционный сайленсинг, направляемое РНК метилирование ДНК и образование гетерохроматина 4. Эпигенетическая регуляция без участия РНК 5. Перспективы Литература WWW источники довательностях растительных геномов и осуществляется специфичными растительными белками, некоторые из которых обладают деметил азной активностью Гистон- модифицирующие ферменты, модулирующие структуру хроматина у растений, имеют в основном консерватив- ные каталитические домены и часто кодируются многими семействами генов, обеспечивающих исключительную диверсификацию и обилие генетических функций. Обу- словленное малыми интерферирующими РНК (siPHK) замалчивание генов предназначено для борьбы с вируса-
(Г170 Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений ми, инактивации транспозонов, регулировки развития и организации генома. Несмотря на то, что существование взаимосвязи между метилированием ДНК и модифи- кацией гистонов уже признано, тем не менее, недавние сведения о том, что с участием siPHK эти модификации могут происходить в определенных областях генома, при- вносят много нового в эпигенетические исследования. Взаимодополнения и перекрывание путей замалчивания генов лежат в основе сложных многослойных схем и представлений об эпигенетике растений. Сложная картина эпигенетической регуляции у рас- тений отражает историю их эволюции, характер их раз- вития и «образ жизни». Полиплоидизация — увеличение числа хромосомных наборов — условие возникновения линий растений, амплификации семейств генов и функ- циональной специализации дуплицированных генов. В отличие от млекопитающих, у которых образо- вание органа или ткани в основном заканчивается во время эмбрионального развития, растения растут путем непрерывного образования над- и подземных частей из популяций самодостаточных стволовых клеток мери- стемы. Тем самым, постэмбриональное развитие рас- тений определяется средой и характеризуется высокой пластичностью и вариабельностью. Поскольку растения не могут убежать из своего окружения, они вынуждены как-то справляться с изменяющимися и часто небла- гоприятными условиями среды. Врожденная гибкость регуляторных эпигенетических механизмов может об- легчать быстрые перемены в генетической активности и тонко настраиваемой экспрессии генов так, чтобы растения могли выживать и успешно размножаться в непредсказуемых условиях среды. Исторически растения предоставили нам отличные системы для открытия и анализа эпигенетических фе- номенов. Переход от билатеральной к радиальной сим- метрии у некоторых линий растения Linaria vulgaris, который наблюдал Карл фон Линней в 18 столетии, ука- зывал на эпигенетическую модификацию гена cycloidea, который регулирует развитие цветка. Значительный прогресс в эпигенетике достигнут за последние пять лет благодаря расшифровке нуклеотидной последователь- ности генома арабидопсиса («полезный сорняк», широ- ко используемый в генетическом анализе) и синергизму результатов параллельных исследований эпигенетиче- ских феноменов у животных и грибов. 1. Преимущества использования растений в эпигенетических исследованиях 1.1. Сходство растений и животных по организации (эпи)генома Как только биология сформировалась как наука, жи- вотные и растения были разделены на два царства, и это деление традиционно утвердилось при обучении биологов зоологии или ботанике. Для такого разделения нашлись и подходящие аргументы, такие, например, как гетеротрофная (нуждающаяся в органической материи) выработка энергии у животных против автотрофной у растении, подвижность по сравнению с неподвижным образом жизни растений, потенциально мигрирующие и эластичные клетки животных против неподвижных и жестких клеток растений. Однако за последние десяти- летия генетики и молекулярные биологи обнаружили существенные сходства между животными и растениями, которые оказались весьма удивительными в свете долго- го эволюционного размежевания между ними Общими для тех и других являются половое размножение путем мейоза или оплодотворения и регуляция индивидуаль- ного развития некоторыми главными генами, которые контролируют деление и размножение клеток некими родственными факторами, а также восприятие факторов среды с помощью сходных сигнальных каскадов. Это сходство распространяется и на многие черты органи- зации генома и эпигенома. Поразительное сходство выявляется между теми растениями и животными, которые сравнимы по раз- меру и степени сложности организации генома и по доле гетерохроматина. Как и у многих других эукари- от, эу- и гетерохроматин характеризуются специфиче- ским ацетилированием и метилированием гистонов, кроме того в гетерохроматине животных и растений ДНК еще значительно метилирована. При сравнении геномной организации и эпигенетической регуляции у разных модельных систем (организмов) выяснилось, что у растений и животных существует гораздо больше общих черт, чем у разных животных (табл. 9.1). Поэто- му с антропоцентрической точки зрения адресованные животным и растениям вопросы могут быть очень сход- ными, а полученная базовая информация часто может быть обоюдно использована и для тех, и для других. 1.2. Растения предоставляют дополнительные направления эпигенетических исследований Наряду с общими для животных и растений элемен- тами растения приобрели некие особенности, относя- щиеся к эпигенетическим феноменам. В то время как у животных оплодотворение осуществляется путем слияния двух гаплоидных клеток, которые возникли в результате непосредственно предшествующего мейоза, у растений существует гаплоидная (гаметофит) фаза роста между мейозом и оплотворением (рис. 9.1). Га- метофит представляет собой прорастающее пыльце- вое зерно (мужская линия) и эмбриональный мешок (женская линия), каждый из которых имеет несколько гаплоидных ядер, которые образуются из мейотических продуктов вследствие двух или трех последовательных митозов, соответственно. На стадии гаметофита утрата генетической или эпигенетической информации не может компенсироваться информацией на гомологич- ных хромосомах или аллелях. Хотя исчерпывающие исследования в этой области знаний еще не проведены, тем не менее доказательств массивной утраты эпигене- тических признаков во время гаметогенеза у растений,
1. Преимущества использования растений в эпигенетических исследованиях Таблица 9.1. Сведения о геномных и эпигенетических компонентах у используемых эпигенетических модельных систем Свойства Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Neurospora crassa Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Млекопитающие Растения Размер генома 12 Mb 14 Mb 40 Mb 100 Mb 180 Mb 3,400 Mb 150 5,000 Mb Число генов 6000 5000 10000 20000 14000 25000-30,000 25000-40000 Средний размер гена 1.45 kb 1.45 kb 1.7 2 kb 5 kb 35-46 kb 2 kb Среднее число интронов в гене < 1 (4% генов с интронами) 2 (40% генов с интронами) 2 5 3 6-8 4-5 % генома, коди- рующего белки 70 60 44 25 13 4(Hs) 26 (At) 10 (Os) Замалчивание транспозонов (+) + + (+ RIP)a + + + + Импринтинг - - - - + 6 4- 4- RNAi механиз- мы - 4- 4- 4- + 4- + Репрессивное метилирование гистонов - H3K9 + H3K9 + H3K27 + H3K9 + H3K27 + H3K9 + H3K27 4- H3K9 (+) H3K27 + H3K9 + H3K27 + ДНК метилиро- вание в сайтах CG hCNG/ CNN - - + + - (+) + (-) + (+) Гены узнавания и метилирова- ния ДНК - 4-B 4- 4-r +д + 4- НР1-подобный белок - + 4- 4- 4- 4- 4- Белки группы Polycomb - - - + + 4- 4- (At) Arabidopsis thaliana, (Cb) Caenorhabditis briggsae, (Ce) Caenorhabditis elegans, (Dm) Drosophila melanogaster, (Hs) Homo sapiens, (Os) Oryza saliva, (Pp) Pristionchus pacificus. a Repeat-индуцированная точечная мутация, см. главу 6. 6 Хромосомная или геномная специфичность. в Мутированная Dnmt2. г Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки (Се. СЬ, Рр). д Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки. в отличие от животных, еще нет. Это может объяснить, почему у растений эпигенетические изменения часто передаются в результате мейоза. Другая определенная отличительная черта растений — менее четко очерченная зародышевая линия и ее отде- ление от соматических клеток только на поздней стадии развития (рис. 9.1). У растений в точках роста на кончи- ках побегов и корней имеются апикальные меристемы, из которых образуются новые ткани и органы. Апи- кальная меристема побега дает начало цветкам, кото- рые образуют гаметы для полового размножения, могут вырастать и дополнителные латеральные меристемы и образовывать цветы У многих растений появились спе- циализированные органы — ризомы, клубни или луко- вицы, которые имеют меристемы. Эти механизмы веге- тативного размножения могут быть даже более общими и эффективными, чем размножение семенами. Зароды- ши могут образоваться не только в результате развития оплодотворенной яйцеклетки, но и из соматической ткани (соматический эмбриогенез). В тканевой культуре некоторые дифференцированные соматические клетки могут дедифференцироваться и перепрограммироваться
Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений Рис. 9.1. Особенности жизненного цикла растения Растения могут размножаться половым путем (образование гамет, оплодотворение и образо- вание семян (правая часть рисунка) и бесполым (соматическим) путем (вегетативное размноже- ние, де- и редифференцировка или эмбриогенез (левая часть рисунка). Тело высшего растения (корни, стебель, цветок) — диплоидный споро- фит. При мейозе число хромосом уменьшается вдвое. Если у животных продукты мейоза об- разуют гаметы без дальнейшего деления и они сливаются с образованием диплоидного ядра, то у растений образуются гаплоидные мужской или женский гаметофиты в результате двух или трех митотических делений, соответственно. В конечном итоге пыльцевая трубка содержит одно вегетативное (белое) и два генеративных (черные) ядра. Два генеративных ядра оплодотворяют яйцеклетку (черная) и формируется центральная клетка с диплоидным ядром, произошедшим в результате слияния двух полярных ядер (желтые) Таким образом, в результате этого двойного опло- дотворения и образуются диплоидный зародыш и триплоидный эндосперм, который снабжает развивающийся зародыш питанием. После про- растания семени зародыш дает начало новому спорофиту. Кроме того, большинство растений способны размножаться вегетативно благодаря активации покоящихся латеральных меристем, выросту специализированных корневых структур (клубни), амплификации в тканевых культурах или даже регенерации из индивидуальных со- матических клеток после удаления клеточной стенки (протопласты). У растений часто наблю- дается эндоредупликация, которая приводит к образованию полиплоидных клеток или тканей Химерные растения можно получить с помощью прививки. Поэтому генетическая и эпигенети- ческая информация у растений проходит гораздо меньше четко определенных путей развития за- родышевой линии, чем у животных в сторону альтернативной дифференцировки. Поэтому соматическое клонирование, пока еще мало эффектив- ное у животных, широко распространено у многих видов растений, и с годами могут быть воспроизведены бесчис- ленные «зеленые Долли». Однако у клонированных каза- лось бы генетически униформных популяций растений набюдается выраженная фенотипическая изменчивость. Эта так называемая «сомаклональная вариабельность» имеет четкую эпигенетическую основу и потенциально может быть использована в селекции и адаптации рас- тений (см обзор Kaeppler et al., 2000) Еще одна отличительная черта растений — суще- ствование плазмодесм (цитоплазматические мостики между клетками), которые проницаемы для небольших молекул, некоторых белков, РНК и вирусной геномной информации. Несмотря на большую взаимосвязан- ность, побеги растений можно срезать и привить на генетически отличные подвои (рис. 9.1). Это приведет к образованию химер, у которых вегетативные и гене- ративные ткани генетически различны. Поэтому хотя эпигенетические признаки и передаются по зародыше- вой линии, у растений они более изменчивы и обрати- мы, чем у животных. Растения более толерантны к полиплоидии (умно- жение полного хромосомного набора), чем животные. У растений встречается множество диких и культур- ных полиплоидных видов (пшеница, хлопчатник, кар- тофель, арахис, сахарный тростник, табак и другие). Полиплоидность дает им некоторые преимущества. При исследовании нуклеотидных последовательностей многих растительных геномов, включая маленький ге- ном Arabidopsis thaliana, получены четкие доказатель- ства дупликации исходного генома и генов. Даже ди- плоидные растения могут иметь полиплоидные клетки, которые возникают гораздо чаще, чем некоторые вы- сокоспециализированные полиплоидные клетки у мле- копитающих. Образование полиплоидов часто связано со значительными генетическими и эпигенетическими изменениями (см. обзор Adams and Wendel, 2005). Не- которые из этих изменений могут произойти на протя- жении одного или нескольких поколений и они важны для быстрой адаптации и эволюции растений.
1. Преимущества использования растений в эпигенетических 1.3. Растения лучше выносят некоторые методологические манипуляции, которые очень трудно применимы к млекопитающим У животных генетические манипуляции ограничены из-за процедур, требующих генерацию мутаций и спаривание для получения гомозиготных генотипов, которые обяза- тельны для проявления рецессивных признаков. Напро- тив, у растений возможен эффективный мутагенез путем химических или физических обработок или в основном с помощью хаотичных вставок помеченных трансгенов или транспозируемых элементов. Вследствие самоопыления в последующем поколении легко появляются потомки с гомозиготными мутациями растения и расщеплением признаков по закону Менделя. Поиск мутаций в эпиге- нетических регуляторах основан на восстановлении экс- прессии у эпигенетически инактивированных маркерных генов или снижении активности стабильно активных репортерных генов. В дополнение к такой прямой объек- тивной методологии, быстро растущие коллекции инсер- ционных мутантов с определенными сайтами интеграции позволяют осуществлять обратный генетический анализ мутационных эффектов в избранных определенных ге- нах - ортологах эпигенетических регуляторов у других модельных организмов (табл. 9.2). Рис. 9.2. Изучение эпигенетического контроля у растений Гены, кодирующие окраску тканей у растений, позволяют довольно просто и недорого анализировать экспрессию генов in vivo (fl) Экспрессия гена дигидрофлавонолредуктазы (DFR) отвечает за темнопурпурную окраску цветков петунии, а при замалчивании промотора этого гена цветки становятся пестрыми, светлоокрашенными (любезно предоставлено Kooter) (б) У Arabidopsis с экс- прессией гена (CHS) халконсинтетазы семена имеют темную оболочку, а после замалчивания этого гена в результате интеграции гомологичного трансгена они становятся желтыми (любезно предоставлено lan Fumer). (в) Растения кукурузы с В-1 геном имеют пурпурную пигментацию, а растения с парамутагенным инактивированным В' геном зеленые, (г) Початок кукурузы с сегреги- рованной вставкой транспозона (Spm) в гене В-Peru, необходимом для образования антоцианового пигмента. Пурпурные зерна представляют собой ревертанты, у которых в гене зародышевой линии вырезан Spm элемент. Сильно пятнистые зерновки содержат активный Spm элемент, который часто индуцирует соматическое вырезание соответствующих секторов при созревании зерновки. Зерна с редкими небольшими пурпурными участками представляют собой зерновки, у которых Spm элемент эпигенетически зарепрессирован (любезно предоставлено Vicky Chandler), (д) Темная окраска соевых бобов (в середине рисунка) уменьшается у культивируемых разновидностей сои (слева) в результате природного посттранскрипционного сайленсинга CHS гена, она может частично восстанавливаться при заражении родительского растения вирусом с PTGS супрессорным белком, обусловливающим пеструю окраску (справа), (е) Эпигенетическая регуляция может отражаться и в морфологии растений: сниженное функциони- рование субъединицы фактора сборки хроматина приводит к образованию «сросшегося» стебля у Arabidopsis, (ж) реактивация (снятие сайленсинга) трансгенного маркера устойчивости у Arabidopsis может быть выявлена по росту растения на селективной среде (с, перепечатано с разрешения Chandleret al., 2000 [Springer Science and Business Media]; д перепечатано с разрешения Senda etal., 2004 [©American Society of Plant Biologists].)
Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений Таблица 9.2, Компоненты эпигенетической регуляции у модельного растения Arabidopsis thaliana, выявленные при прямом и обратном скрининге Ген или мутант Название гена или мутанта Тип белка, установленная или предполагаемая функция Скрининг мутантов Метилирование ДНК МЕ1 DDM2 Метилтрансфераза Уменьшенное метилирование ДНК ДНК-метилтарнсфераза (CG) Реактивация эндогенных повторов Реактивация трансгенов Интерференция с RdDM Гипометилирование центомерных повторов СМТЗ Хромометилтрансфераза ДНК-метилтрансфераза (не CG) Реактивация SUP-clk Реактивация PAI DRM1 Метилтрансфераза с реаранжированным доменом De novo ДНК- метилтрансфераза Поиск инсерционных мутантов DRM2 Метилтрансфераза с реаранжированным доменом De novo ДНК- метилтрансфераза Поиск инсерционных мутантов HOG1 ROS1 DME Гомологично зависимый сайленсинг генов Репрессор сайленсинга Деметер S-аденозил-Е-гомоцистеин гидролаза Белок с доменом ДНК- гликозилазы Белок с доменом ДНК- гликозилазы Реактивация повторенного трансгена Инактивация трансгена Нет семян Модификации гистонов HDA1 Гистоновая деацетилаза Гистоновая деацетилаза Поиск инсерционных мутантов Экспрессия антисенса HDA6 Гистоновая деацетилаза Гистоновая деацетилаза Реактивация повторенного трансгена SIL1 Модификатор сайленсинга АХЕ1 Репрессия гена ауксина Интерференция с RdDM RTS1 РНК-опосредованный транскрипцион- ный сайленсинг SUVH2 Su(var)3-9 гомолог Гистоновая метилтрансфераза Поиск инсерционных мутантов Экспрессия антисенса SUVH4 Su(var)3-9 гомолог Гистоновая метилтрансфераза Реактивация PAI Реактивация SUP-clk Образование и ремоделирование хроматина DDM1 Уменьшенное метилирование ДНК SWH/SNF2 АТФаза Гипометилирование центромерных повторов SOM Somnipherous Реактивация повторяющегося транс- гена DRD1 Дефекты управляемого РНК метилиро- вания ДНК SWH/SNF2 АТФаза Интерференция с RdDM SPD Splayed SWH/SNF2 АТФаза Сохранение измененной меристемы PIE Независимое от фотоперида раннее цветение АТФ-зависимый ремодели- рующий хроматин белок Измененное время зацветания PKL Pickle CHD3 хроматин- ремоделирующий фактор Ненормальное развитие корня FAS1 Сросшийся Субъединица фактора сборки хроматина Измененная морфология FAS2 Сросшийся Субъединица фактора сборки хроматина Измененная морфология
1. Преимущества использования растений в эпигенетических Таблица 9.2. Компоненты эпигенетической регуляции у модельного растения Arabidopsis thaliana, выявленные при прямом и обратном скрининге (продолжение) Ген или мутант Название гена или мутанта Тйп белка, установленная или предполагаемая функция Скрининг мутантов BRU1 Brushy Неохарактеризованный белок Чувствительность ДНК к поврежде- ниям LHP1 Белок, подобный гетерохроматиновым Образование репрессирован- ного хроматина Раннее зацветание и измененная морфология М0М1 Молекула Морфея Неполная SWI1/SNF2 АТ- Фаза Реактивация повторенного трансгена RPA2 Репликативный белок А Субъединица белкового репликативного комплекса, связывающая однотяжевую ДНК Супрессор скрининг в rasl Реактивация повторенного трансгена PHKi-опосредованный сайленсинг DCL1 Dicer-подобный РНКаза III (ds-РНКаза) Поиск инсерционных мутантов CAF1 Carpel factory Ненормальное развитие цветка SIN1 Короткие интегументы Ненормальное развитие семяпочки ЕМВ76 Дефектный зародыш Арест развития зародыша DCL2 Dicer-подобный РНКаза III (ds-РНКаза) Поиск инсерционных мутантов DCL3 Dicer-подобный РНКаза III (ds-РНКаза) Поиск инсерционных мутантов AG01 Аргонавт PAZ-PIWI-доменный белок Измененная морфология Реактивация трансгена AG04 Аргонавт PAZ-PIWI-доменный белок Реактивация SUP-slk AG07 Аргонавт PAZ-PIWI-доменный белок Время и тип развития трихом ZIP Zippy AGO10 PNH/ ZL1 Аргонавт PAZ-PIWI-доменный белок Дефекты меристемы RDR1 РНК-зависимая РНК-полимераза РНК-зависимая РНК- полимераза Поиск инсерционных мутантов RDR2 РНК-зависимая РНК-полимераза РНК-зависимая РНК- полимераза Поиск инсерционных мутантов RDR6 РНК-зависимая РНК-полимераза РНК-зависимая РНК- полимераза Реактивация трансгена SDE1 Дефектный сайленсинг Образование измененных трихом SGS2 Супрессор сайленсинга генов NRPDla РНК-полимераза IV субъединица РНК- полимеразы Реактивация трансгена SDE4 Дефектный сайленсинг NRPDlb РНК-полимераза IV субъединица РНК- полимеразы Интерференция с RdDM
Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений Таблица 9.2. Компоненты эпигенетической регуляции у модельного растения Arabidopsis thaliana выявленные при прямом и обратном скрининге (окончание) Ген или мутант Название гена или мутанта Тйп белка, установленная или предполагаемая функция Скрининг мутантов DRD3 Дефективное РНК-направляемое мети- лирование ДНК NRPD2a РНК-полимераза IVсубъединица РНК- полимеразы Поиск инсерционных мутантов DRD2 Дефект в управляемом РНК метилирова- нии ДНК Интерференция с RdDM SDE3 Дефект сайленсинга РНК-хеликаза Реактивация трансгена SGS3 Супрессор гена сайленсинга Сворачивающийся белок Реактивация трансгена Измененное развитие трихом HEN1 HUA энхансер Связывание двутяжевых РНК, метилтрансфераза Реактивация трансгена Измененная морфология HYL1 Листья с загнутыми вверх краями Белок, свзывающий ядерную двутяжевую РНК Измененная морфология Поиск инсерционных мутантов WEX Синдром Вернера-подобная экзонуклеаза РНК-аза D экзонуклеаза Поиск инсерционных мутантов XRN4 XRN гомолог Экзонуклеаза Поиск инсерционных мутантов HST Hasty Рецептор экспорта микроРНК Время и тип образования трихом Белки группы Polycomb МЕА Medea Белок группы Polycomb Дефект образования семян FIS1 Образование семян без оплодотворения Формирование семян без оплодот- ворения CLF Курчавость листьев Белок группы Polycomb Измененная морфология листа FIE Независимое от оплодотворения образо- вание эндосперма Белок группы Polycomb Образование семян без оплодотво- рения FIS3 Образование семян без оплодотворения MSI1 Мультикопийный супрессор IRA гомо- лога Белок группы Polycomb, субъединица фактора сборки хроматина Поиск инсерционных мутантов Дефекты формы эндосперма SWN Swinger Белок группы Polycomb Поиск инсерционных мутантов EMF2 Зародышевый цветок Белок группы Polycomb Отсутствие вегетативной стадии VRN2 Яровизация Белок группы Polycomb Позднее цветение несмотря на яро- визацию Число членов в семействе гомологичных генов может быть весьма различным у животных и растений. Вслед- ствие функциональной избыточности некоторые мута- ции могут быть не столь серьезны как у животных, так и у растений. Это важно, если потеря функции сопрово- ждается утратой индивидуума до анализа в раннем раз- витии. Экспрессию относительно мало значимых генов, например, отвечающих за окраску растительных тканей, можно просто и недорого выявлять in vivo (рис. 9.2а—д). К тому же тысячи растений могут быть проанализирова- ны в селекционных опытах путем выявления экспрессии эндогенных или трансгенных черт (рис. 9.2ж). Знание нуклеотидной последовательности генома A. thaliana, наряду с анализом некоторых больших кол- лекций инсерционных мутантов, и простой мутагенез сделали это растение прекрасной моделью для изуче- ния эпигенеза у растений. Последующие рассуждения касаются эпигенетических модификаторов, функции которых стали известны в результате анализа мутантов, дефектных по трансгенному сайленсингу (замалчива- нию генов) и благодаря биоинформационной иденти- фикации гомологии с генами, необходимыми для сай- ленсинга у других организмов, и обнаружению сходных фенотипов развития у других дефектных по сайленсин-
2. Молекулярные компоненты хроматина у растений гу мутантов Arabidopsis в результате прямого и обрат- ного скрининга (табл. 2). Для ознакомления с полным перечнем хроматиновых генов Arabidopsis, риса и куку- рузы читатель может быть адресован к Plant Chromatin Database (http://www. chromdb. org). 1.4. Исследование растений внесло самый значимый вклад в эпигенетику Самый ощутимый вклад в эпигенетику при исследова- нии различных растительных моделей внесли сведения из семеноводства. Определенные данные о различии организации эу- и гетерохроматина были получены в результате цитологического анализа мхов (Heitz, 1928). Первым доказательством так называемой неменделев- ской генетики (см. обзор Chandler and Stam, 2004) было обнаружение наследуемой, но обратимой экспрессии генов при взаимодействии аллелей у томатов и кукуру- зы, позднее названной парамутацией; это же выявлено теперь и у млекопитающих. Постоянное появление у растений цветков с измененной симметрией («peloria» или монстры) описано еще Карлом Линнеем; сегодня это могло бы объясняться образованием эпиаллели — ста- бильной эпигенетической модификацией регуляторного гена с такой же нуклеотидной последовательностью, как и у экспрессируемого гена (Cubas et al., 1999). В ре- зультате цитологического анализа растений выявлены существенные изменения во вторичной организации хромосом, которые оказались связанными с ядрышко- вым доминированием, с замолканием одного из наборов родительских генов рибосомных РНК у межвидовых гибридов, что определяется эпигенетической регуляцией (Pikaard, 2000). Пионерские исследования лауреата Но- белевской премии Барбары МакКлинток и других уче- ных транспозиции генетических элементов у кукурузы выявили множественные связи между генетикой и эпи- генетической регуляцией (Fedoroff and Chandler, 1994). На самом деле именно анализ теперешних транспозонов и их дегенерированных останков послужил основанием для выявления эпигенетических модификаций в рас- тительных геномах (раздел 3.4). Когда техника трансгеноза стала уже рутинной в конце 1980 годов, благодаря использованию генетиче- ских маркеров были неожиданно достигнуты значи- тельные успехи в исследовании эпигенетики табака, петуньи и арабидопсиса (Jorgensen, 2003; Matzke and Matzke, 2004). Была сформулирована концепция гомо- логичного замалчивания генов, когда стало ясно, что замалчивание генов часто коррелирует с наличием мно- жественных копий связанных или несвязанных трасге- нов. Разные случаи гомологичного замолкания генов обусловлены либо усиленным обменом мРНК (пост- транскрипционное замалчивание генов, ПЗГ, PTGS) или репрессией транскрипции (транскрипционное за- малчивание генов, ТЗГ. TGS). Оба эти процесса корре- лировали с увеличением цитозинового метилирования молчащих генов. Наиболее яркий пример ПЗГ у транс- генной петунии вначале был назван «косупрессией». Были осуществлены попытки изменить окраску цвет- ков путем усиления экспрессии генов халконсинтазы (CHS), определяющих пурпурную окраску лепестков, от пестрой до почти полностью белой. Потеря окраски была обусловлена скоординированным замалчивани- ем CHS трансгена и эндогенного CHS гена (Jorgensen, 2003). ПЗГ связано с интерферирующими РНК (PHKi), которые позже выявлены у Caenorhabditis elegans и дру- гих организмов (раздел 3.2). В середине 1990-х годов была выявлена связь между ПЗГ и устойчивостью к вирусам. ПЗГ оказалось при- родным механизмом зашиты растений от несанкцио- нированной репликации вирусов, которые могут быть как индукторами, так и мишенью для ПЗГ. Это было установлено в опытах по замалчиванию генов у рас- тений путем использования специально сконструиро- ванных вирусных векторов с последовательностями, гомологичными генам-мишеням, что и приводило к ин- дуцированному вирусом замалчиванию генов ((VIGS; Burch-Smith et al., 2004). Наряду с этим было открыто метилирование ДНК, направляемое РНК (RdDM) у зараженных вироидами растений. Это послужило пер- вым указанием на то, что РНК, воздействуя на ДНК по принципу обратной связи, может вызывать эпигене- тические модификации (Wassenegger et al., 1994). Этот принцип был успешно использован для транскрипци- онной инактивации и метилирования промоторов с помощью специальных двутяжевых РНК (раздел 3.4, Управляемое РНК метилирование ДНК). 2. Молекулярные компоненты хроматина у растений Ранее мы уже упоминали многие компоненты систем эпигенетической регуляции у растений, которые были выявлены в результате анализа мутаций у арабидопси- са (табл. 9.2). Однако результаты скрининга мутантов могут выявлять не все эпигенетические модификаторы из-за функционального разнообразия больших семейств генов или летальных последствий утраты существенных генетических компонентов. 2.1. Регуляторы метилирования ДНК у растений Метилирование 5-го углеродного остаткав цитозине ДНК- признак эпигенетической инактивации и гетерохроматина у растений и животных (табл. 18.1). Однако у растений метилирование ДНК имеет ряд уникальных черт в от- ношении характера (профиля) метилирования ДНК. ферментов ДНК-метилтрансфераз и возможности об- ратимости метилирования в недедящихся клетках (Chan et al., 2005). В этом разделе мы описываем белки, необ- ходимые для генерации, поддержания, интепретации и «стирания» картины метилирования ДНК Специальные компоненты для PH К-направляемого метилирования ДНК представлены в разделе 3.4. ДНК-метилтрансферазы Различают de novo и поддерживающее метилирования ДНК De novo метилирование осуществляет модифика-
(Г17 8 Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений цию прежде неметилированных последовательностей ДНК (рис. 18.1). У растений это метилирование может затрагивать CpG, CpNpG и CpNpN последовательности (где N - А, Т или С). В отличие от растений у животных метилирование ДНК, в основном ограничивается CpG динуклеотидами и пока нет сведений о существенном метилировании цитозиновых остатков в асимметричных CpNpN сайтах. Хотя природа сигналов, запускающих de novo метилирование ДНК, в основном пока еще неизвест- на, однако у растений эту роль могут выполнять двутяже- вые РНК (раздел 3.4). Поддерживающее метилирование сохраняет картину (pattern) метилирования генома при репликации ДНК и особенно эффективно затрагивает CpG и CpNpG нуклеотидные последовательности, обла- дающие палиндромной симметрией. Поддерживающему метилированию подвержены полуметилированные ДНК после репликации или репарации, у которых «гидом» для узнавания метилируемых сайтов в новообразованной цепи служат метилированные цитозиновые остатки в ма- теринской цепи. Хотя считается, что у растений de novo и поддерживающее метилирования ДНК осуществляются разными ферментами, тем не менее, есть мнение и о том, что ферменты с различной сайтовой (CpG или не CpG) специфичностью могут часто делать то и другое. У растений имеются три консервативных семейства ДНК-метилтрансфераз. Ферменты из семейства МЕТ1 ДНК-метилтрансфераз — гомологи животных ДНК- метилтрансфераз типа Dnmtl (глава 18) в основном являются поддерживающими CpG метилирование ДНК ферментами, хотя одна из них участвует в de novo CpG метилировании при направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4). Класс Dnmt2 ферментов, из которых один закодирован в геноме арабидопсиса, представлен семейством наиболее широко распространенных и высоко консервативных ДНК-метилтрансфераз (табл. 9.2), функция которых все еще не известна. Раститель- ные DRM (domains rearranged methyltransferases) ДНК- метилтрансферазы и их гомологи ферментов (группа Dnmt3) млекопитающих обычно рассматриваются как de novo метилтрансферазы. Эти ферменты катализируют метилирование цитозиновых остатков во всех контекстах и участвуют в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 4). Как это следует из названия, домены в этих ферментах реаранжированы: в отличие от Dnmt3 у DRM белков домены I-V следуют за доменами VI-X. Это может придавать этим ферментам способность метилировать асимметричные CpNpN нуклеотидные последователь- ности, которые в клетках млекопитающих не метилиру- ются. Специфичная для растений хромометилаза СМТЗ модифицирует цитозиновый остаток в тринуклеотиде CpNpG. Подобно ферменту МЕТ1 эта метилтрансфераза участвует как в de novo, так и в поддерживающем мети- лировании ДНК. Истинная функция СМТЗ все еще не совсем ясна, хотя известно, что утрата ее активности у со- ответствующих мутантов сопровождается реактивацией некоторых молчащих транспозонов (Chan et al., 2005). В отличие от млекопитающих, у которых dnmtl и dnmt3 мутанты погибают во время эмбрионального раз- вития или сразу же после рождения животного, рас- тительные мутанты metl, cml3 и drm жизнеспособны и обычно даже фертильны. Такая жизненность дефект- ных по ДНК-метилтрансферазам растительных мутан- тов позволяет более экстенсивно анализировать роль таких мутаций во время развития и половой репродук- ции растений, что вообще невозможно сделать в отно- шении млекопитающих (Chan et al., 2005). Активное CpG деметилирование и ДНК-гликозилазы Эпигенетическая регуляция свидетельствует о том, что активное или неактивное состояния генов потенцильно обратимы. Метилирование ДНК разрешает такую об- ратимость, потому что оно может пассивно или активно утрачиваться. Пассивная утрата происходит, когда мети- лирование невозможно в течение нескольких раундов репликации. Напротив, активное деметилирование может протекать в неделящихся клетках при наличии соответствующих энзиматических активностей. От- носительно недавние сведения из биохимии животных указывают на то, что активное деметилирование может осуществляться под действием ДНК-гликозилаз, кото- рые обычно участвуют в эксцизионной репарации ДНК путем выстригания оснований (Kress et al., 2001). Интерес к этому механизму вспыхнул вновь после открытия у арабидопсиса Demeter (DME) и репрессора сайленсинга (ROS1), которые представляют собой крупные белки с ДНК-гликозилазными доменами. ROS1 ген был иден- тифицирован при скрининге мутаций, приводящих к эпигенетической down-регуляции и гирперметлирова- нию стабильно экспрессируемого репортерного гена (Gong et al., 2002). ROS1 белок гидролизовал (пикиро- вал) метилированную, но не неметилированную ДНК, что совпадало с его ролью в удалении метилированных цитозиновых остатков из ДНК путем выстригания основания при эксцизионной репарации ДНК. ROS1 экспрессируется конститутивно и поэтому в принципе может участвовать в утрате метилированных оснований у ДНК в неделящихся клетках на всех этапах развития (Ka- poor et al., 2005а). Напротив, DME активность выявлена только в женском гаметофите, где она активирует фактор импринтинга Medea (МЕА) в зависимости от активно- сти ДНК-гликозилазного домена (Choi et al., 2002). CG метилтрансфераза MET1 является антагонистом DME. Это указывает на то, что DME белок на самом деле ну- жен для деметилирования CG динуклеотидов (Hsieh and Fisher, 2005). У Arabidopsis имеются еще два уникальных для растений ^охарактеризованные пока представителя семейства DME/ROS1. Такая своеобразная экспансия генов этого семейства указывает на то, что обратимое замалчивание генов путем активного деметилирования ДНК важно для физиологии растений, для их развития или адаптации к условиям среды. Метил-ДНК связывающие белки Считается, что MBD белки с метил-ДНК связывающим доменом участвуют в трансдукции собственно характера метилирования ДНК в измененную транскрипционную активность. У млекопитающих MBD белки связывают-
2. Молекулярные компоненты хроматина у растений ся с метилированной ДНК и рекрутируют деацетилазы гистонов для усиления сайленсинга транскрипции Ara- bidopsis имеет 12 MBD-содержащих генов по сравнению с 11 генами у млекопитающих, пятью генами у Drosophila, двумя генами у С. elegans и с отсутствием их в геномах гри- бов (Hung and Shen, 2003). Несмотря на то, что еще мало известно о функциях MBD белков у Arabidopsis, тем не менее нокдаун с помощью PHKi одного из них, AtMBD 11, связан с плейотропными эффектами при развитии расте- ний (Springerand Kaeppler, 2005). Ни один из MBD белков Arabidopsis не идентифицирован при генетическом скри- нинге, возможно из-за функциональной избыточности. Кроме того, несмотря на консерватизм аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз у растений и животных, MBD-содержащие белки у представителей этих двух царств дивергировали целиком вне метил-CG- связывающего домена. Тем самым, хотя животные и рас- тения используют для создания и поддержания картины метилирования генома родственные ферменты, они могут иметь возникшие в эволюции разные пути интерпрета- ции этих картин с помощью определенных MBD белков (Springer and Kaeppler, 2005). Компоненты системы синтеза донора метильных групп Метилирующие ферменты нуждаются в активированных метильных группах обычно в виде S-аденозилметионина. Поэтому удивительно, как это ранее биохимические пути образования этого кофактора рассматривались вне связи с эпигенетической регуляцией. Только недавно выявле- но, что мутация (hogl) гена арабидопсиса, кодирующего S-аденозил-Т-гомоцистеингидролазу, отвечает за опреде- ленные эпигенетические дефекты (Rocha et al., 2005). 2.2. Ферменты модификации гистонов Подобно другим организмам (табл. 9.1), растения имеют ферменты, которые посттрансляционно модифицируют аминоконцевые хвосты гистонов, что предполагает су- ществование гистонового кода (Loidl, 2004). У растений модифицирующие гистоны ферменты часто кодируются относительно большими семействами генов. Полезная информация о большинстве этих генов все еще очень мала. Существуют, по крайней мере, две известные моди- фикации гистонов — ацетилирование/деацетилирование и метилирование. Гистоновые деацетилазы и ацетилтрансферазы гистонов Разнонаправленное действие гистоновых ацетилтранс- фераз (HATs) и деацетилаз (HDACs) обеспечивает обратимость этой модификации гистонов, т.е. их эпи- генетического маркирования. Такая обратимость мо- дификаций часто усиливается и тем, что в дополнение к гипоацетилированию гистонов молчащие гены еще и метилированы по CpG сайтам, из которых метилирован- ные остатки цитозина потенциально могут быть удалены под действием ДНК-гликозилаз (раздел 2.1, подраздел «Активное CG деметилирование и ДНК-гликозилазы»). У Arabidopsis имеется 18 предполагаемых HDACs и 12 пред- полагаемых HATs (Pandey et al., 2002). Это больше, чем у других нерастительных эукариот; примерно такое же количество таких ферментов выявлено у млекопитающих. Эти ферменты консервативны у всех эукариот. У растений имеется одно из специфичных для них семейств белков, функциональная роль которых не известна. При гене- тическом скрининге обнаружены только два гена этого консервативного семейства: HDA1 и HDA6 (табл. 9.2). HDA6 участвует в поддерживающем CpG метилировании, индуцированном РНК, и модификации повторяющихся последовательностей, но почти не влияет на развитие. На это указывает нормальный фенотип у соответствую- щих дефектных мутантов. В отличие от этого сниженная экспрессия HDA1 сопровождается плейотропными эф- фектами при развитии. У Arabidopsis ни одна из HAT не найдена при генетическом скринировании, что могло бы указывать на функциональную их избыточность или участие в активации молчащих генов. Метилтрансферазы гистонов Белки, метилирующие лизиновые остатки в гистонах (упоминающиеся в этой книге как гистоновые лизин метилтрансферазы или HKMTs) и другие, содержат об- щий SET домен (SU(VAR)/E(Z)/TRX). Благодаря тому, что они обладают способностью метилировать гистон НЗ или Н4 по разным лизиновым остаткам, различные комплексы белков с SET доменами играют заметную роль в промотировании или ингибировании транскрипции специфических генов и формировании гетерохроматина. Некоторые белки с SET доменом являются членами так называемых групп поликомб (PcG) и триторакс (trxG), они соответственно поддерживают транскрипционно неактивное или активное состояние гомеотических ге- нов при развитии растений и животных (главы 11 и 12). Другие SET доменные белки, такие как SU(VAR)3-9, участвуют в поддержании конденсированного состояния гетерохроматина особенно часто в областях повторяю- щихся последовательностей ДНК путем метилирования гистона НЗ по лизину 9 (НЗК9). В геноме Arabidopsis закодировано 32 SET доменных белка, из которых экс- прессируются 30. Они могут быть сгруппированы в виде четырех консервативных семейств: E(Z), TRX, ASH1 и SU(VAR)3-9: имеется также небольшое пятое семейство белков, которое выявлено только у дрожжей и растений (Baumbusch et al., 2001; Springer et al., 2003). Число экс- прессируемых SET доменных белков у Arabidopsis отно- сительно велико по сравнению с 14 белками у Drosophila и четырьмя белками у делящихся дрожжей. У мышей насчитывается 50 SET доменных белков. В дополнение к экспансии SET доменных белков в результате полиплои- дии, у Arabidopsis существенную роль в амплификации членов группы SU(VAR)3-9 играет ретротранспози- ция. Вне SET домена соответствующие растительные и животные белки не всегда уж столь консервативны. Дивергированные области белков предназначены для белок-белковых взаимодействий, это указывает на то, что растительные SET доменные белки могли бы функ-
(Г180 Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений ционировать в других белковых комплексах, отличных от комплексов животных белков. Хотя и неполная, доступная функциональная ин- формация о SET доменных белках Arabidopsis указывает на то, что эти белки участвуют в регуляции активности хроматина и в эпигенетической наследственности. Пер- выми двумя генами SET доменных белков, идентифиро- ванными при генетическом скринировании, оказались Curly leaf ген (CLF) и ген Medea/независимое от опло- дотворения образование семян (MEA/FIS1), которые яв- ляются негативными регуляторами, родственными гену E(Z) Drosophila. Будучи SET доменными белками, МЕА, CLF и E(Z) заодно являются также и PcG белками (раз- дел 2.3. Другие белки из группы polycomb). Мутации гена CLF приводят к изменению морфологии листа и гомео- тическим изменениям в развитии цветка. MEA/FIS1 ре- гулирует гаметофит-специфическую экспрессию генов и служит фактором импринтинга, который ингибирует развитие эндосперма без оплодотворения (Schubert et al., 2005). Наоборот, ген trithorax 1 (АТХ1) у Arabidopsis рабо- тает как активатор цветочных гомеотических генов, по- видимому, вследствие его способности катализировать метилирование четвертого лизинового остатка в гистоне НЗ (НЗК4), а это часто служит признаком транскрипци- онной активности хроматина (Hsieh and Fischer, 2005). Криптонит/гомолог 4 супрессора 3-9 пестролист- ности (Suppressor of variegation 3-9 homolog 4 (KYP SUVH4) идентифицирован как супрессор эпигенети- ческого сайленсинга двух эндогенных генов (Jackson et al., 2002; Malagnac et al., 2002). KYP/SUVH4 катализи- рует моно- и диметилирование гистона НЗ по остатку лизина 9 (H3K9me2/me3) и действует вместе с ДНК- метилтрансферазой СМТЗ для поддержания CpNpG метилирования ряда последовательностей в геноме Arabidopsis. KYP/SUVH4 играет небольшую роль в об- разовании гетерохроматина (Chan et al., 2005). В отли- чие от этого гомолог 2 супрессора пестрелистности 3-9 (SUVH2), идентифицированный при скрининге ком- понентов реактивации молчащего трансгена, обладает главной метилирующей активностью, модифицирую- щей гистон НЗ по 9 (НЗК9) и 27 (НЗК27) остаткам лизи- на в гетерохроматине Arabidopsis (Naumann et al., 2005). Лизиновые остатки в гистонах НЗ’и Н4 могут быть моно-, ди- и триметилированными. Это сильно уве- личивает комбинаторную сложность этих модифика- ций, определяет состояние гетерохроматина у разных организмов. Например, НЗК9теЗ служит отличитель- ной чертой гетерохроматина у животных и грибов, а у Arabidopsis это — эпигенетический маркер эухроматина. Наоборот, H3K9mel и НЗК9те2 — преимущественные маркеры неактивного хроматина у Arabidopsis, а у мле- копитающих это показатели эухроматина. Происхо- ждение этих различий и как они соотносятся с постули- рованным гистоновым кодом следует еще определить. Кроме этого, еще предстоит расшифровать и сильно взаимно перепутанные связи между специфическими модификациями гистонов и характером метилирова- ния (Tariq and Paszkowski, 2004). В отличие от ацетилирования гистонов, которое может динамично регулироваться противоположными активностями HDACs и HATs, метилирование гистонов до недавнего времени рассматривалось как перманент- ный эпигенетический маркер. Однако недавно у млеко- питающих была найдена деметилаза метилированного лизина, LSD1, которая может деметилировать H3K4mel и НЗК4те2, но не НЗК4теЗ (глава 10). В геноме Arabi- dopsis закодированы четыре предполагаемые LSD гомо- лога. Это указывает на то, что по-крайней мере неко- торые метилирования гистонов у растений могут быть обратимыми. 2.3. Другие белки хроматина Другие белки группы Polycomb PcG белки сначала были идентифицированы у Drosophila как факторы, необходимые для поддержания репрессии гомеотических генов (глава 11). У животных экспрессия генов подавляется структурно иными PcG белками, объединенными в мультибелковый комплекс. У растений и нематоды С elegans нет комплекса PRC1, он имеется у Drosophila и млекопитающих. У растений и животных най- ден комплекс PRC2, он осуществляет преимущественно метилирование 27-го лизинового остатка у гистона НЗ (НЗК27) с помощью гистон-метилтрансфразной актив- ности SET домена и PcG белка E(Z). У Arabidopsis гомологи основных компоннтов PRC2 найдены путем скринирования мутантов, полученных для анализа механизмов развития растения У Drosophila PRC2 компоненты закодированы в виде единичных ге- нов. Наоборот, у растений арабидопсиса эти гены соде- жатся по крайней мере в составе трех PRC2 комплексов - FIS (fertilization independent seeds, образование семян без оплодотворения), EMF (embryonic flower, эмбрио- нальный цветок) и VRN (vernalization, яровизация), все они различаются по специфичности мишеней их воз- действия (Schubert et al., 2005: рис. 11.2). FIS гены идентифицированы при скрининге таких мутантов, у которых происходит частичное развитие семян независимо от оплодотворения. У них основ- ной мишенью является MADS-box, содержащие транс- крипционный фактор PHERES (Kohler et al., 2005). Компоненты EMF комплекса выявлены по их общей способности подавлять экспрессию таких цветочных гомеотических генов, как Agamous и Apeiala. Ген VRN2 из семейства VRN идентифицирован по его участию в эпигенетической памяти яровизации, которая опреде- ляется как выход семян из состояния покоя под воздей- ствием холода. Растения вынуждены программировать свою репро- дукцию во время соответствующего сезона, и в областях с умеренным климатом это осуществляется вследствие зацветания только после продолжительного холодового периода. Такая эпигенетическая память зимы нуждается в VRN2, который поддерживает индуцируемую холодом репрессию транскрипции гена, кодирующего ингиби- тор цветения FLC в последующие периоды при более высоких температурах. У мутантов vm2 в FLC отсутству- ет НЗК27ше2, что согласуется с ролью комплекса PRC2 в метилировании гистонов (Schubert et al., 2005).
2. Молекулярные компоненты хроматина у растений Компоненты импринтинга Родительский импринтинг свойствен лишь цветковым растениям и млекопитающим (табл. 9.1), этот эпигене- тический феномен характеризуется тем. что материнские и отцовские гены экспрессируются по-разному. С учетом теории родительского конфликта в эволюции имприн- тинга (глава 19) импринтинг у цветковых растений и животных, по-видимому, отражает тот факт, что у этих организмов существует специфическая материнская ткань, которая поставляет питание для развивающегося зародыша. У млекопитающих это — плацента, а у растений триплоидный эндосперм — дифференцированная ткань, которая содержит один отцовский и два материнских генома (рис. 9.1). Явление родительского импринтинга одного гена впервые было выявлено в эндосперме куку- рузы (Alleman and Doctor, 2000). В эндосперме Arabidopsis импринтирована экспрессия двух генов — МЕА и FWA (контролирует время цветения). В этих случаях активи- руются две материнские копии, по-видимому, вследствие катализируемого DME активного деметилирования CpG сайтов в женском гаметофите (см. раздел 2.1, подраздел «Активное деметилирование CpG и ДН К гликозидазы»), в то время как отцовская копия неактивна (Autran et al., 2005). Удивительно то, что хотя у животных и растений импринтинг эволюционировал независимо, тем не менее, у тех и у других организмов для импринтинга необходимы метилирование ДНК и PcG белки (Kohler et al., 2005). Ремоделирующие хроматин белки Switch2/caxapo3y неферментируюшие факторы 2 (SWI2/ SNF2) из консервативного семейства АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин факторов способны сдви- гать нуклеосомы или уменьшать прочность контактов между гистонами и ДНК. При генетическом скрининге получены данные примерно о 40 SWI2/SNF2 гомологах, закодированных в геноме Arabidopsis ((Plant Chromatin Database). Два из них — фактор 1 уменьшения метили- рования ДНК (DDM1, Jeddeloh et al., 1999) и фактор 1 дефекта управлямого РНК метилирования ДНК (DRD1, Kanno et al., 2004) участвуют в регуляции метилирования ДНК. Дефектные по DDM1 мутанты с глобальным умень- шением степени метилирования геномной ДНК и транс- крипционной реактивацией определенных молчащих транспозонов и повторяющихся последовательностей обнаруживают ряд серьезных нарушений в морфологии и развитии растений. Это выявляется после нескольких поколений инбридинга гомозиготных ddml растений вследствие накопления эпимутапий и инсернионного мутагенеза реактивированными у мутанта транспозона- ми. DDM1 ортолог имеется у млекопиающих (Lymphoid- Specific Helicase (L5H), он важен для глобального CpG метилирования и эмбриогенеза. DRD1 уникален для мира растений и, по-видимому, играет специфическую роль в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4). Мутации в молекуле Морфея {MOM, Amedeo et al., 2000), специфического для растений гена с неполным мотивом АТФ-завимой хеликазы, активируют некото- рые повторяющиеся последовательности и не вызывают другие фенотипические изменения МОМ функциони- рует синергично, но независимо от DDM1 метилирова- ния ДНК. Это указывает на множественность путей ре- гуляции транскрипции у растений (Tariq and Paszkowski, 2004). Участие в специфических модификациях хроматина трех других белков с предполагаемой функцией ремо- делирования хроматина — Splayed (SPD), фактор фото- периодически независимого раннего цветения (PIE) и Pickle (PKL), идентифицированых по их влиянию на развитие соответствующих дефектных мутантов, пока еще не установлено (Wagner, 2003). Факторы сборки хроматина В то время как SWI2/SNF2 белки, возможно, действуют на собранном хроматине, другие белковые факторы необходимы для восстановления структуры хроматина после репликации и репаративного синтеза ДНК. Ком- плекс факторов сборки хроматина (CAF), состоящий из трех субъединиц, помогает разместить полусобранные нуклеосомы у репликативной вилки. У Arabidopsis му- тации (fasl,fas2) в генах двух больших CAF субъединиц вызывают характерные морфологические аномалии (фасциация, рис. 9.2е), дефекты в репарации ДНК и дерепрессируют повторяющиеся последовательности (Takeda et al., 2004). Это указывает на то, что правильное расположение нуклеосом в хроматине существенно для нормального развития растения и эпигенетического кон- троля. В то время как утрата CAF субъединиц не нару- шает поддерживающее метилирование ДНК, она может приводить к стиранию других эпигенетических сигналов, таких как модификации гистонов. Снижение уровня со- держания третьей CAF субъединицы MSI1 не вызывает фасцинирование, но приводит к нарушению формиро- вания семян и различным фенотпическим изменениям (Hennig et al., 2005). Мутация в BRU гене, который не от- носится ни к одному из генов, кодирующих белки сборки хроматина, приводит к возникновению фенотипа, очень сходного с фенотипом fas мутантов. Возможно, что в со- хранении эпигенетической информации и генетической целостности при пострепликативной сборке хроматина участвуют и другие дополнительные факторы (Takeda et al., 2004). Наконец, утрата RPA2, субъединицы белка А репликативного комплекса, вызывает увеличение чув- ствительности ДНК к повреждениям, транскрипционной дерепрессии и изменение модификации гистонов, но не влияет на характер метилирования ДНК (Elmayan et al., 2005; Kapoor et al., 2005b). Подобные гетерохроматиновым белки HP1 (гетерохроматиновый белок 1) у Drosophila и млекопитающих и его гомологи у грибов являются компонентами молчащего гетерохроматина. Присоеди- нение НР1 его хромодоменом к метилированному по 9-му лизиновому остатку гистона НЗ (НЗК9те) спо- собствует распространению состояния замалчивания генов и формированию гетерохроматиновых доменов В геноме Arabidopsis закодирован один-едиственный
Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений белок, гомологичный белку НР1 Drosophila. Мутации в этом гене, называемом LHP1 (Gaudin et al., 2001), или Terminal flower 2 (TFL2) (Kotake et al., 2003) приводят к изменению строения растения, развития листа и ран- нему зацветанию. Хотя фенотип этого мутанта указы- вает на важную роль в регуляции экспрессии гена, все же мало вероятно, что LHP1 действует на образование репрессированных комплексов хроматина подобно действию НР1 у других организмов. LHP1 у Arabidopsis регулирует функционирование локусов в хроматине, которые не являются мишенями для метилирования ДНК (Kotake et al., 2003; Tariq and Paszkowski, 2004). Таким образом, в результате эволюции LHP1 у растений и НР1 у других организмов выработались разные пути действия этих белков. 3. Молекулярные компоненты путей опосредованного PHKi сайленсинга Современные эпигенетические исследования традици- онно сфокусированы на изучении метилирования ДНК и модифицирования гистонов За последние несколько лет стало очевидно, что эти изменения в специфических областях генома могут происходить в результате интефе- ренции РНК. Действительно сегодня уже невозможно рассматривать эпигенетическую регуляцию у. многих организмов без участия компонентов аппарата инте- ферирующих РНК (PHKi) (Matzke and Birchler, 2005). Особенно это касается растений, у которых вклад работы этой машинерии в замалчивание генов гораздо выше, чем у всех других организмов. 3.1. Выработка PHKi-зависимого сайленсинга у растений PHKi и сходные типы замалчивания (сайленсинга) генов представляют собой ответ клеток на двутяже- вые РНК (dsPHK). dsPHK гидролизуется РНКаза 111- подобной эндонуклеазой (Dicer) с образованием ма- леньких РНК, которые и обеспечивают специфичность сайленсинга, комплементарно связываясь с соответ- ствующей последовательностью-мишенью нуклеи- новых кислот. Маленькие РНК включаются в мульти- белковые эффекторные комплексы, осуществляющие непосредственно деградацию информационных РНКи подавляют трансляцию (PTGS) или индуцируют мо- дификации хроматина (TGS) в области определенных нуклеотидных последовательностей ДНК. Ключевой компонент этого эффекторного комплекса сайленсин- га — белок по названию аргонавт, который связывает маленькие РНК с помощью своего PAZ домена. Ин- дивидуальные белки из семейства белков аргонавтов, которое представляет собой самую большую группу белков, важных для PHKi-направляемого сайленсинга, сообщают функциональную специфичность разным эффекторным (исполнительным) комплексам (Саг- mell et al., 2002). РНК-направляемое замалчивание генов участвует в защите от вирусов, контролирует транспозоны и играет существенную роль в развитии растений и животных. Выработка PHKi-направляемого сайленсинга у растений отчасти отражает их коэволюцию с патоге- нами (РНК-содержащие вирусы, вироиды), которые образуют двутяжевые РНК (dsPHK) при репликации На самом деле они наряду с транс генами (другой тип «чужеродных» нуклеиновых кислот) оказались бес- ценными для выявления и изучения разных форм PHKi-направляемого замалчивания генов у расте- ний. Разные пути PHKi-направляемого замалчивания ге- нов продемонстрированы в результате 1. широкого выявления и функциональной диверси- фикации семейств генов, кодирующих основные компоненты для продуцирования PHKi: в геноме Arabidopsis закодированы четыре DICER-подобные (DCL) белка и десять белков аргонавтов (AGO); 2. обнаружения разных по длине и функционированию маленьких РНК, включая короткие, состоящие из 21 нуклеотидного остатка, интерферирующие РНК (siPHK), образующиеся из вирусов и трансгенов, и несколько типов эндогенных маленьких РНК (21-24 нуклеотидные микроРНК; 21-нуклеотидные транс- действующие siPHK и 24—26-членные гетерохрома- тиновые siPHK; 3 выявления разных типов генного сайленсинга, осу- ществляемого разными маленькими РНК: 1) PTGS (посттранскрипционный сайленсинг) по механизму деградации информационных РНК или путем по- давления трансляции; 2) TGS (транскрипционный сайленсинг) связан с такими модификациями, как цитозиновое метилирование ДНК и метилирование гистонов; 4. обнаружения важной роли PTGS в защите от ви- русов, это связано с разными вирусными белками, подавляющими разными способами замалчивание генов; 5. обнаружения таких процессов, как не клеточно- автономный сайленсинг и транзитивность (раздел 3.2, подраздел «Не клеточно-автономный сайленсинг и транзитивность»), которые обусловлены РНК- зависимыми РНК-полимеразами, шесть из которых закодированы в геноме Arabidopsis. Все это обсуждается при рассмотрении трех основ- ных путей РНК-направляемого замалчивания генов у растений (рис. 9.3а-в). Следует иметь в виду, что эти пути взаимно перекрещиваются друг с другом. Их функцио- нально различные компоненты приведены в табл. 9.2. 3.2. Путь 1: связанное с трансгенами посттранскрипционное и индуцированное вирусами замалчивание генов (PTGS/VICS) Направляемое PHKi замалчивание генов, индуциро- ванное трансгенами и вирусами, изначально функцио- нировало как защитная система хозяина от чужих и ин- вазивных нуклеиновых кислот в виде соответствующих вирусных компонентов, транспозонов и трансгенов
3. Молекулярные компоненты путей опосредованного PHKi сайленсинга Рис. 9.3. Пути РНК-обусловленного сайленсинга у растений Несмотря на то, что отдельные элементы и пути сайленсинга могут перекрываться или быть общими, все же различают три основных пути сайленсинга, они отличаются по источникам двутяжевых РНК, классу маленьких РНК, природе мишеней-последовательностей и характеру сайленсинга. На рисунке эффекторные комплексы сайленсинга, содержащие белки аргонавты, показаны в виде светлосерых шариков. Желтыми прямоугольниками помечены процессы, протекающие в ядре. Детали и названия регуляторных элементов описаны в тексте и табл. 9.2. Специфические растительные белки отмечены зеленым. PTGS — посттранскрипционное замалчивание генов, VIGS — индуцированное вирусом замалчивание генов, TGS — транскрипционное замалчивание генов, RdDM — направляемое РНК метилирование ДНК, IR — инвертированные повторы, AS — антисенс, антисмысловая последовательность, vRdRP — вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза, аРНК — аберрантная РНК, siPHK — короткая интерферирующая РНК, RISC — РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (взято с изменениями из работы Meins et al., 2005) Происхождение и процессирование двутяжевых PHK(dsPHK) Трансгенные конструкции можно ввести в растительный геном в смысловой или антисмысловой ориентации или в виде инвертированных повторяющихся последователь- ностей ДНК. Вирусы могут иметь геномы, представлен- ные одно- или двутяжевыми ДНК или РНК. Поэтому dsPHK могут возникать разными путями. В принципе антисмысловые транскрипты могут комплементарно спариваться с информационными РНК-мишенями с образованием двутяжевых РНК. Транскрипция инвер- тированных повторов ДНК может приводить к образо- ванию шпилечных РНК. Вирусные РНК, кодирующие собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу (vRdRP) и реплицирующиеся с образованием двутяжевых интер- медиатов РНК, включаются в игру прямо на уровне дву- тяжевых РНК. Наоборот, смысловые трансгены и ДНК- содержащие вирусы как, например, джеминивирусы, для образования двутяжевых РНК нуждаются в клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразе RDR6 и других гене- тически идентифицированных факторах (SDE3. SGS3 и WEX; табл. 9.2). При образовании субстратов для RDR6 транскрипты или смысловые трансгены и вирусные ДНК должны быть в известном смысле аберрантными, например, без 5’ cap или полиаденилатного хвоста (Meins et al., 2005). Активность DCL, необходимая для процессирова- ния dsPHK с образованием siPHK при PTGS, еще не идентифицирована (DCLX). Анализ dell мутантов с частично утраченными функциями показал, что DCL1, по-видимому, не вовлечен в эту стадию процессинга. Специфический растительный белок HEN 1 метилирует 3’-нуклеотид у маленьких РНК, защищая их от уриди- лирования и последующей деградации (Li et al., 2005). DCL2 участвует в образовании siPHK из некоторых, но не всех, вирусных РНК (Xie et al., 2004). PTGS и VIGS приводят к образованию двух разных по величине и функциональному значению классов siPHK, состоящих из 21-22 нуклеотидов и 24-26 ну- клеотидов, соответственно (Baulcombe, 2004). В целом,
184 Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений считается, что 21-членные siPHKs участвуют в расте- плении иРНК, а 24-26-членные, называемые гетерох- роматиновыми siPHK, вызывают эпигенетические мо- дификации в гомологичных последовательностях ДНК (TGS; см. раздел 3.4). Вслед за осуществленным DCL процессингом ду- плекс siPHK раскручивается и антисмысловая цепочка взаимодействует с одним из белков из семейства арго- навтов с образованием комплекса индуцированного РНК сайлесинга (RISC). RISC, запрограммированный siPHK, может затем эндонуклеолитически гидролизо- вать мРНК-мишени в одном единственном месте при- мерно в середине комплементарного комплекса siPHK- мРНК. У животных это расщепление катализируется Ago2 «slicer» (см. главу 8). У Arabidopsis эту функцию в трансгенном PTGS выполняет белок AGO1 (Baumberger and Baulcombe, 2005). Вслед за нуклеолитическим рас- щеплением отдельный З’-фрагмент мРНК деградирует- ся в направлении от 5’ к 3’ концу экзонуклеазой A1XRN4 (Souret et al., 2004), а 5’-фрагмент, по-видимому, гидро- лизуется экзосомой в направлении от 3’- к 5’-концу. Не клеточно-автономный сайленсинг и транзитивность PTGS у растений обладает двумя особенностями, кото- рые обусловлены активностью РНК-зависимой РНК- полимеразы RDR6: не клеточно-автономным сайлен- сингом и транзитивностью (рис. 9.3а). В первом случае индуцирующие PTGS сигнальные РНК перемещаются из клеток, в которых они возникли, в соседние через плазмодесмы или, как это изначально было показано в опытах с прививками, по сосудистой системе и вызыва- ют специфичное к нуклеотидной последовательности замалчивание генов в довольно отдаленных местах (Voinnet, 2005). Небольшие мобильные РНК, являющиеся системными сигналами замалчивания генов, могли бы выполнять двойственную функцию в развитии растения: осуществлять коммуникацию между клетками и коорди- нировать их активность в разных, в том числе и отдален- ных частях растения. Это предположение подкреплено открытием микроРНК (miPHK; важны для развития, раздел 3.3) и небольшого связывающего Маленькие РНК белка в соке флоэмы, который служит основным транс- портером метаболитов по сосудистой системе растения (Yoo et al., 2004). Транзитивность представляет собой образование вто- ричных siPHK, соответствующих определенным нукле- отидным последовательностям, локализованным вне пер- вичных мишеней. В этом случае РНК-зависимая РНК- полимераза катализирует синтез вторичных двутяжевых РНК на трансгенных или вирусных матричных РНК с ис- пользованием в качестве праймеров первичных siPHK. В результате действия дайсера образуются вторичные siPHK, которые преумножают реакцию сайленсинга и, когда речь идет о вирусных РНК, увеличивают устойчивость расте- ний к вирусной инфекции (\binnet, 2005). Другим единственным организмом, у которого выяв- лены не клеточно-автономное замалчивание генов и тран- зитивность. является нематода С. elegans (глава 8), имею- щая предполагаемую РНК-зависимую РНК-полимеразу, которой нет у млекопитающих и Drosophila Вирусные супрессоры замалчивания генов Растительные вирусы — не только индукторы и мишени замалчивания генов, у них есть белки, которые могут по- давлять сайленсинг (Voinnet, 2005). Это укрепляет идею о том, что PTGS служит природной защитой от вирусов, эти супрессорные белки стоят на вооружении контрза- щитной «стратегии» патогена. В геноме большинства вирусов закодирован, по-крайней мере, один белок, подавляющий замалчивание генов, который работает на определенном этапе PTGS после процессинга двутяже- вых РНК. Подавление PTGS вирусом четко наблюдается у крапчатой сои, у которой темная окраска есть результат обратимости естественного PTGS, т.е. реактивации гена, отвечающего за образование пигмента (рис. 9.2д) (Senda et al., 2004). Вирусные супрессоры PH Ki недавно найдены также у вирусов насекомых и животных ретровирусов (Lecellier et al., 2005; Voinnet, 2005). 3.3 Путь 2: регуляция развития растений miPHK и транс-действующими siPHK Открытие эндогенных популяций miPHK у растении и животных знаменовало новую эру в исследовании био- логии развития и обусловленного PH Ki замалчивания генов (Bartel, 2004). miPHK замалчивают экспрессию генов путем комплементарного спаривания с информа- ционными РНК-мишенями и индукции расщепления мРНК или ингибирования трансляции. На важную роль miPHK в развитии растений указывает и тот факт, что многие необходимые для биогенеза ппРНК и сай- ленсинга гены (в том числе DCL1, AGO1, HEN1, HYL1 и HST) были обнаружены при скринировании мутантов с дефектами развития, у них и было выявлено накопле- ние miPHK. Фенотипы мутантов, дефектных по этим белкам, указывали на разнообразную роль miPHK в функционировании меристемы, полярности органов, развитии сосудистой системы, структуре цветка и ответах растения на стресс и гормональное воздействие (Kidner and Martienssen, 2005). Недавно установлено, что miPHK участвуют в биогенезе новых типов маленьких РНК и транс-действующих siPHK. Роль и биогенез микроРНК МикроРНК изначально были получены при клонирова- нии разделенных по размеру маленьких РНК, содержащих 18-28 нуклеотидных остатков. Их высокая степень ком- плементарности к мРНК-мишеням у растений заметно облегчила идентификацию дополнительных микроРНК при компьютерном анализе. Таким путем у арабидопсиса найдены 92 локуса, в которых закодировано 27 опреде- ленных микроРНК, примерно столько же выявлено и у риса. Экспрессия многих микроРНК регулируется средой и программой развития растения Примерно 50% их мишеней у арабидопсиса — факторы транскрипции, многие из которых являются модуляторами образования
3. Молекулярные компоненты путей опосредованного PHKi сайленсинга меристемы и идентичности. Это было установлено еще до их идентификации в качестве мишеней микроРНК В отличие от этого, у животных микроРНК не всегда адре- сованы мишеням, кодирующим факторы транскрипции, а регулируют разные гены в клетке. Два важных белка микроРНКового пути у арабидопсиса, DCL1 и AGO1, саморегурегулируются с помощью микроРНК с участи- ем негативной модуляции по принципу обратной связи (Kidnerand Martienssen, 2005). У эукариот многие микроРНК эволюционно кон- сервативны (Axtell and Bartel, 2005). Примечательно, что у цветковых, голосеменных и более примитивных растений мРНК группы факторов транскрипции, регу- лирующих образование меристемы и асимметрию лате- ральных органов, сохранили совершенную комплемен- тарность к узнающим их микроРНК. Эта особенность сохранена по-крайней мере в течение 400 миллионов лет (Floyd and Bowman, 2004). МикроРНК закодированы в таких зонах генома, ко- торые расположены между генами, кодирующими бел- ки, или в интронах. Они возникают из несовершенных шпилечных предшественников РНК размером от 70 до 300 и более пар оснований, которые транскрибируются ДНК-зависимой РНК-полимеразой II. Процессинг пред- шественников растительных микроРНК в ядре происхо- дит в несколько этапов. Сначала концы пре-микроРНК удаляются ядерной DCL1. Для этого необходим связы- вающийся с двутяжевыми РНК белок HYL1, который был выделен при анализе фенотипических мутантов с дефектным гормональным ответом (Han et al., 2004; Vasquez et al., 2004a). Затем микроРНК дуплекс (miR/ miR*, рис. 9.36) высвобождается под действием DCL1 и его З’-конец метилируется с помощью HEN 1 (раздел 3.2, подраздел «Происхождение и процессинг двутяжевых РНК»). Для транспорта дуплекса miR/miR* из ядра в ци- топлазму нужен HASTY (HST), гомолог животного экс- портина 5 (Park et al., 2005). Зрелые микроРНК найдены также и в ядерной фракции, может быть в ядре некоторые из них могут осуществлять эпигенетические модифика- ции. МикроРНК к сплайсированным растущим цепям транскриптов транскрипционных факторов индуцируют неким неизвестным путем цитозиновое метилирование ДНК в последовательностях, расположенных ниже гена- мишени (Schubert et al., 2005). Биогенез микроРНК у животных происходит ина- че, у них есть только один дайсер, который локализо- ван в цитоплазме, и вторая РНК-аза Ш-типа, Drosha, в ядре. Drosha вместе со связывающим двутяжевые РНК белком Pasha (у растений их гомологов нет) отщепляет концы от пре-микроРНК. Затем такие пре-микроРНК перемещаются в цитоплазму экспортином 5 и процес- сируются окончательно дайсером с образованием зре- лых микроРНК (Du and Zamore, 2005, Kim, 2005). Растительные микроРНК направляют расщепление мРНК В целом, животные микроРНК неполностью комплемен- тарны к мРНК-мишеням, и они подавляют трансляцию, связываясь с многими сайтами в З’-нетранслируемых областях (UTR) В отличие от этого почти совершенная комплементарность растительных микроРНК к коди- рующим участкам мРНК-мишеней способствует рас- щеплению мРНК, по-видимому, подобно siPHK. Однако существуют исключения из этих «правил». Так, например, растительная miR172 способна блокировать трансляцию, а некоторые животные микроРНК могут участвовать в расщеплении мРНК-мишеней (Du and Zamore, 2005). AGO 1 — главный белок из семейства белков арго- навтов и нарезающий (слайсер) мРНК компонент в программированном микроРНК RISC у арабидопсиса (Baumberger and Baulcombe, 2005). AGO1 был найден еще до открытия микроРНК при скрининге мутантов Arabidopsis с дефектным развитием листьев (Carmell et al., 2002). Название аргонавты было инспирировано фенотипам agol мутантов, которые были похожи на не- больших кальмаров из-за их узких нитевидных листьев. У agol мутантов в апикальной меристеме побегов обна- руживаются такие же дефекты, как у дефектных мутан- тов PNH/ZLL/AGO10 (табл. 9.2), они сходны с AGO1, но еще неизвестно, нужны ли они для PTGS (Vaucheret et al., 2004). В меристемах растений белки AGO играют существенную роль в поддержании «стволовости» кле- ток (Carmell et al., 2002; Kidner and Martienssen, 2005). Транс-действующие siPHK Эндогенные транс-действующие siPHK (ta-siPHK) — новый тип маленьких РНК, которые недавно были открыты у Arabidopsis. ta-siPHK, гидролизующие свои мРНК-мишени, обладают свойствами как siPHK, так и микроРНК. Подобно siPHK синтез двутяжевых РНК- предшественников ta-siPHKs зависит от RDR6 и SGS3. Как и микроРН К, ta-siPH К образуются в таких участках генома, которые мало сходны с их мРНК-мишенями. Для образования правильных ta-siPHK, комплементар- ных мРНК-мишеням, микроРНК настраивает фазовое расщепление предшественников двутяжевых РНК с помощью DCL4 (рис. 9.36) (Allen et al., 2005; Gasciolli et al., 2005). ta-siPHK приписывают регуляторную роль в опреде- лении времени развития растения. Побег цветкового растения во время развития проходит две фазы пере- мен: вегетативную фазу с переходом от молодого в зре- лое состояние побега и репродуктивную фазу, которая сопровождается ростом цветочных ветвей вместо веге- тативных (рис. 9.1). В то время как индукция цветения изучена генетически довольно хорошо, вегетативная фаза перемен в побеге исследована гораздо хуже. Один из белков аргонавтов, ZIPPY/AG07, играет специали- зированную роль в таком фазовом переходе. При скри- нинге мутантов с преждевременными изменениями в вегетативной фазе развития побега, аналогичных zip ago7 мутантам, были выявлены два гена (RDR6и SGS3), которые важны для PTGS (рис. 9.36) (Peregrine et al., 2004). Последующий анализ показал, что некоторые гены с контролируемой увеличенной экспрессией у rdrb и sgs3 мутантов замалчиваются посттранскрипционно с помощью ta-siPHK (Vazquez et al., 2004b). Эти данные свидетельствуют о том, что компоненты PTGS важны не
1Ь 6 Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений только для защиты растения от вирусов и замалчивания трансгенов, но также и для контроля за временем вклю- чения пусковых механизмов развития растения. Пока еще не известно, есть ли у животных такие ta-siPHK. 3.4. Путь 3: связанный с трансгенами транскрипционный сайленсинг, направляемое РНК метилирование ДНК и образование гетерохроматина Современные концепции обусловленного PHKi транс- крипционного замалчивания генов выросли из более ранних исследований гомологичного замалчивания генов, запускаемого множественными копиями про- моторных областей генома, и из результатов изучения направляемого РНК метилирования ДНК (Matzke and Matzke, 2004). Последующее изучение PHKi-зависимого образования гетерохроматина у делящихся дрожжей (главы 6 и 8) и индуцированных siPHK TGS в клетках млекопитающих заметно расширили представления о филогенетических масштабах этих процессов и под- твердили их перекрывание с PHKi. Направляемое РНК метилирование ДНК (RdDM) Впервые RdDM наблюдали у растений табака, заражен- ных вироидами (Wassenegger et al., 1994). Вироиды — небольшие патогены растений, содержащие только не- кодирующие белки циклические РНК, состоящие из нескольких сотен нуклеотидных остатков. В изначальных экспериментах было обнаружено, что реплицирующиеся вироиды запускают de novo метилирование вироидных кДНК, интегрированных в геном табака в качестве трансгенов. При изучении таких трансгенных систем было установлено, что для RdDM необходимы двутяже- вые РНК, которые процессируются с возникновением маленьких РНК (признак PHKi). Реплицирующиеся исключительно в цитоплазме РНК-содержащие вирусы индуцируют метилирование гомологичных участков в ядерной ДНК. Это указывало на то, что маленькие РНК, возникающие при PTGS, способны проникать в ядро и индуцировать в нем эпигенетические изменения. Содержащие премоторные последовательности двутя- жевые РНК могут направлять метилирование ДНК и вызывать транскрипционное замалчивание узнаваемых ими промоторов-мишеней (Mathieu and Bender, 2004: Matzke et al., 2005). У растений РНК индуцируют специфическое de novo метилирование цитозиновых остатков в разных нукле- отидных последовательностях ДНК преимущественно в областях комплементарного взаимодействия. Считает- ся, что в результате этого специфического спаривания РНК с ДНК возникает субстрат для de novo метилирова- ния ДНК, однако это еще требует экспериментальных доказательств. В то время как асимметричное CpNpN метилирование не поддерживается после удаления триггерной РНК, симметричные CpG и CpNpG мети- лирования сохраняются без РНК в области разных про- моторов Различия в эффективности поддерживающих метилирований ДНК могут быть связаны с разным со- ставом нуклеотидных последовательностей или разным характером модификаций гистонов. Молекулярные компоненты, необходимые для RdDM и TGS, выявлены в результате скрининга со- ответствующих трансгенов и эндогенных генетиче- ских систем. Трансгенные системы транскрибируемых инвертированных повторов или вирусов поставляют двутяжевые РНК, гомологичные соответствующим локусам ДНК-мишеней. В этом отношении информа- тивными эндогенными генами при генетическом скри- нинге оказались ген фосфорибозилантранилат изоме- разы (PAI) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN ven (Chan et al., 2005). Эти гены выполняют роль мишеней или индукторов RdDM и TGS. Например, в семействе из четырех PAI генов два представляют собой инверти- рованные повторы. Транскрипция инвертированных повторов в области непосредственно вышестоящего промотора приводит к появлению двутяжевых РНК, которые могут специфично связываться с синглетными копиями PAI генов для метилирования ДНК и сайлен- синга. Специфичная растительная машинерия направляемого РНК метилирования ДНК ( RdDM) Почти всегда консервативные ДНК-метилтрансферазы и гистон-модифицирующие ферменты необходимы для RdDM (разделы 2.1 и 2.2). De novo метилирование цито- зиновых остатков в различных нуклеотидных контекстах катализируется ДНК-метилтрансферазой из класса кон- сервативных DRM ферментов. Консервативная МЕТ1 и специфичная для растений ДНК-метилтрансфераза СМТЗ осуществляют прежде всего поддерживающее метилирование соответственно CpG и CpNpG сайтов, хотя они в небольшой степени могут быть вовлечены и в de novo метилирование. Консервативная гистоновая деацетилаза HDA6 и SWI2/SNF2 белок DDM1 помогают поддерживать CpG метилирование в некоторых локусах. Гистоновая метилтрансфераза KYP/SUVH4 вовлечена в поддержание локус-специфичного CpNpG метилирова- ния, индуцированного РНК (Chan et al., 2005). К удивлению, недавно было найдено, что для RdDM необходима специфичная для растений РНК- полимераза, называемая pol IV У всех изученных до сих пор эукариот имеются три ДНК-зависимых РНК- полимеразы (pol 1, pol II и pol III), которые содержат не- сколько субъединиц, закодированных в определенных генах. Первое свидетельство о существовании pol IV появилось в результате анализа нуклеотидной последо- вательности ДНК генома, когда были выявлены гены, кодирующие две самые большие субъединицы расти- тельной уникальной, атипичной РНК-полимеразы. Су- ществуют два функционально различных комплекса pol IV с самыми крупными специфичными уникальными субъединицами, каждая из которых взаимодействует с общей для них второй крупной субъединицей, pol IVa необходима для образования siPHK, по-видимому, из- начально в результате транскрипции генов-мишеней (Herr et al., 2005; Onodera et al., 2005). RDR2 использует исходный транскрипт в качестве матрицы для синте-
за двутяжевои РНК. которая процессируется DCL3 — ядерной активностью, которая специализирована на образовании 24-членных гетерохроматиновых siPHK с транспозонов и повторяющихся последовательно- стей генома (Xie et al., 2004). После образования siPHK фермент pol IVb вместе со специфичным для растений SWI2/SNF2-noao6HbiM белком DRD1 формируют сиг- нал для метилирования ДНК (Kanno et al., 2005), воз- можно это делается в кооперации с AG04 (рис. 9.Зв) (Chan et al., 2005). Пока не известно, действительно ли pol IVb транскрибирует РНК, ее главная роль состоит в формировании структуры хроматина, которая разре- шает ДНК-метилтрансферазам катализировать de novo цитозиновое метилирование в определяемых siPHK сайтах. Хотя у других эукариот нет субъединиц pol IV, у делящихся дрожжей две субъединицы pol II, транс- крибирующие предшественники мРНК, важны для на- правленного РНК образования гетерохроматина (главы 6 и 8). Несмотря на то, что направленные на промотор siPHK могут индуцировать TGS в человеческих клетках, пока еще точно не ясно, сопровождается ли это замет- ным метилированием ДНК (Kawasaki et al., 2005; Ting et al., 2005). Многие белки, необходимые для RdDM у растений, найдены только у представителей раститель- ного мира (рис. 9.Зв). Таким образом, если RdDM и происходит регулярно у млекопитающих, его механиз- мы и белковые участники должны быть иными, чем у растений. Замалчивание эндогенных генов РНК- зависимым транскрипционным сайленсингом (TGS) Многие транспозоны и повторяющиеся последова- тельности ДНК, включая наборы 5S рДНК и богатые транспозонами области гетерохроматина в хромосо- ме 4 Arabidopsis замалчиваются транскрипционно и метилируются по PHKi-направляемому механизму (Lippman and Martienssen, 2004; Chan et al., 2005). Эн- догенные ДНК-мишени отражают естественную роль РНК-направляемого TGS в подавлении транспозиции и упаковке нуклеотидных повторов в гетерохроматине. Однако содержащие вставки транспозонов растительные гены могут сами по себе становиться мишенями на- правляемых РНК! сайленсинга и метилирования ДНК. Например, возникшие из транспозонов повторы в про- моторе FWA гена цветка Arabidopsis служат мишенями для соответствующих siPHK (Lippman and Martienssen, 2004) и осуществляют замалчивание этого гена в вегетатив- ных тканях, где его работа вовсе не нужна. У некоторых растений Arabidopsis элемент Ми в интроне FLC гена (репрессор цветения) делает этот ген доступным для ре- прессивных модуляций хроматина, направляемых siPHK, возникшими из диспергированных копий Ми (Liu el al., 2004). В результате сниженная экспрессия гена FLC может ускорять цветение, что может иметь адаптивное значение при определенных условиях среды. Посколь- ку многие растительные гены имеют транспозонные вставки в области или поблизости от промоторов или в интронах, такая регуляция генной активности может быть довольно распространенной в мире растений Чем больше мы узнаем об эпигенетической регуляции, тем все более подтверждается идея Барбары МакКлинток о том, что транспозоны действуют как контрольные элементы хозяйских генов и развития (McClintock, 1956). 4. Эпигенетическая регуляция без участия РНК Несмотря на специфичность действия маленьких РНК, они все же не обеспечивают все эпигенетические моди- фикации у растений. Например, МОМ белок с частич- ным SNF2 доменом не участвует в PHKi-направляемом TGS. Также нет и доказательств того, что у растений PcG белки направляются к своим генам-мишеням маленькими РНК. Другие типы сигналов такие, как го- мологичное спаривание нетранскрибируемых повторов или специфические нуклеотидные последовательности, могли бы обусловливать образование гетерохроматина и привлекать ДНК-метилтрансферазы. Например, вся описанная PH Ki машинерия не нужна для метилирова- ния ДНК и гистонов у гриба Neurospora, у которого ТА- богатые сегменты служат предпочтительными мишенями для модификации (глава 6). Более того, у делящихся дрожжей существуют пути образования гетерохроматина, независимые от PHKi (главы 6 и 8). Не известно, вовлечена ли PHKi в такой необычный феномен, как парамутирование. Парамутирование про- исходит, когда некоторые аллели, называемые параму- тагенными, накладывают эпигенетический отпечаток (импринт) на восприимчивые (парамутабельные) алле- ли. Эпигенетический импринт наследуется через мейоз и сохраняется даже после того, как две взаимодейству- ющие аллели сегрегируют в потомстве. Парамутирова- ние — нарушение правила Менделя, согласно которому аллели сегрегируют неизменными. Парамутирование впервые наблюдали десятки лет назад у кукурузы и то- матов, однако его механизм(ы) оставался неизвестным. Подобный парамутированию феномен недавно наблю- дали у млекопитающих. Значит, это явление не является уникальным, свойственным только лишь представи- телям растительного царства (Chandler and Stam, 2004). Локус В у кукурузы — один из наиболее изученных случаев парамутирования, примерно на расстоянии в 100 т.о. от старта транскрипции он содержит серии пря- мых повторов, которые неизвестным пока образом уча- ствуют в парамутировании Хотя при этом нельзя пол- ностью исключать базирующийся на РНК сайленсинг, рассматриваются и некие альтернативные механизмы парамутирования, основанные на спаривании аллелей (Stam and Mittelsten Scheid, 2005). 5. Перспективы В этой главе мы рассмотрели то. что известно об основ- ных эпигенетических закономерностях у растений и как они соотносятся с эпигенетической регуляцией у других организмов. Несомненно, некоторые черты эпигенетиче- ского контроля у растений и других организмов довольно сходны, однако в ходе эволюции растения выработали
188 Глава 9. Эпигенетическая регуляция у растений свои специфические особенности и инновации. Это связано с уникальными аспектами развития растений и их экстраординарной способностью выживать и успешно размножаться в непредсказуемых условиях среды. Среди всех специфичных инноваций у растений четко выделяется врожденная система обратимых эпи- генетических модификаций, которые, по-видимому, играют ключевую роль в пластичности развития и адаптивности растений. Способность к индукции или стиранию репрессивных модификаций в неделящихся клетках, во-первых, с использованием RdDM и моди- фикаций гистонов и, во-вторых, благодаря активности ДНК-гликозилаз DME и ROS1 позволяет осуществлять эпигенетическое репрограммирование без нарушения циклов репликации ДНК. Довольно простое стирание эпигенетических маркеров с растительного генома, по-видимому, и определяет относительную простоту клонирования целого растения из единичной сомати- ческой клетки. Тем не менее, индукция и удаление эпи- генетических маркеров не являются совершенными и униформными у индивидуального растения, которое и формирует эпигенетическую вариабельность в попу- ляциях клонированных предполагаемых генетически идентичных растений. Такая сомаклональная изменчи- вость может быть использована в селекции растений. Аналогичным образом дифференциальное насле- дование эпигенетических свойств при половом раз- множении может приводить к эпигенетической ва- риабельности природных популяций. Отбор может действовать на эту вариабельность путем фиксации специфических эпиаллелей, которые могут иметь адаптивное значение. Как было описано, в процессе яровизации сигналы среды могут вызывать эпигенети- ческие модификации в растении и изменять его фи- зиологические ответы. Таким образом, растения могут «заучить», какие в клетках меристемы побега измене- ния, вызванные средой и стрессом, попадут в зароды- шевую линии и являются адаптивными. Определение всего набора условий, при которых эпигенетические изменения возникают спонтанно или запрограмми- рованно, выявит много нового относительно биоло- гических функций модификаций. Расшифровка меха- низмов мейотического наследования эпигенетических маркеров у растений в конечном счете позволит уче- ным манипулировать ими для совершенствования сельскохозяйственных культур и садоводства. В ответ на изменения среды, под влиянием эволюции и селек- ции растения претерпели многие генетические измене- ния. Полиплоидизация и гибридизация могут вносить большой вклад в эпигенетические изменения благо- даря пока еще плохо изученным процессам геномно- го шока, ответа на необычный стресс, приводящий к обширной мобилизации транспозонов (McClintock, 1983) Происхождение гетерозиса, природа значи- тельного превосходства гибридов по сравнению с ис- ходными родительскими линиями, пока еще остаются неизвестными, однако, по-видимому, в это вовлечены эпигенетические изменения, вызванные комбинаци- ей двух относительно родственных, но определенно разных геномов Подобным образом, полиплоидиза- ция объединяет и (или) преумножает целые геномы с бесчисленными возможностями для эпигенетических изменений Изучение эпигенетических последствий полиплоидизации у растений может помочь понять и нашу собственную эволюционную историю, которая включает в себя дупликации двух целых геномов (Fur- long and Holland, 2004). Ясно, что даже на сегодняш- нем уровне знаний, эпигенетика растений — «кудес- ников эпигенетической регуляции» может быть весьма информативной для биологии человека. Литература Adams K.L. and Wendel J.F. 2005. Polyploidy and genome evolution in plants. Curt. Opin. Plant Biol. 8: 135-141. Alleman M and Doctor J. 2000. Genomic imprinting in plants: Observations and evolutionary implications. Plant Mol. Biol. 43: 147-161. Allen E., Xie Z., Gustafson A.M., and Carrington J.C. 2005. mi- croRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: 207-221. Amedeo P., Habu Y., Afsar K., Mittelsten Scheid O., and Paszkowski J. 2000. Disruption of the plant gene MOM releases transcrip- tional silencing of methylated genes. Nature 405: 203-206. Autran D., Huanca-Mamani W., and Vielle-Calzada J.P. 2005. Ge- nomic imprinting in plants: The epigenetic version of an Oedipus complex. Curr. Opin. Plant Biol. 8: 19-25. Axtell M.J. and Bartel D.P. 2005. Antiquity of microRNAs and their targets in land plants. Plant Cell 17: 1658-1673. Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281-297. Baulcombe D.C. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356- 363. Baumberger N. and Baulcombe D.C. 2005. Arabidopsis ARGO- NAUTE 1 is an RNA sheer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11928- 11933. Baumbusch L.O., ThorstensenT, Krauss V., Fischer A., Naumann K., Assalkhou R„ Schulz 1., Reuter G., and Aalen R.B. 2001. The Arabidopsis thaliana genome contains at least 29 active genes encoding SET domain proteins that can be assigned to four evo- lutionarily conserved classes. Nucleic Acids Res. 29: 4319-4333. Burch-Smith T.M., Anderson J.C., Martin G.B., and Dinesh- Kumar S.P. 2004. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39: 734-746. Carmell M.A., Xuan Z., Zhang M.Q., and Hannon G.J. 2002. The Arg-onaute family: Tentacles that reach into RNAi, develop- mental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16: 2733- 2742. Chan S.W. L., Henderson I.R., and Jacobsen S.E. 2005. Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. Nat. Rev. Genet. 6:351-360. Chandler VL., and Stam M. 2004. Chromatin conversations: Mecha- nisms and implications of paramutation. Nat. Rev. Genet. 5: 532-544. Chandler V.L„ Eggleston W.B., and Dorweiler J.E. 2000. Paramuta- tion in maize. Plant Mol. Biol. 43: 121-145. Choi Y, Gehring M., Johnson L., Hannon M., Harada J. J., Goldberg R.B., Jacobsen S.E., and Fischer R.L. 2002. DEMETER, a DNA
gly-cosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in Arabidopsis. Cell 110: 33-42. Cubas P, Vincent C, and Coen E. 1999. An epigenetic mutation- responsible for natural variation in floral symmetry. Nature 401: 157-161. Du T. and Zamore P.D. 2005. micro RNAPrimer: The biogenesis and function of microRNA. Development 132: 4645-4652. Elmayan T, Proux E, and Vaucheret H. 2005. Arabidopsis RPA2: A genetic link among transcriptional gene silencing, DNA repair, and DNA replication. Curr. Biol. 15: 1919-1925. Fedoroff N.V and Chandler V1994. Inactivation of maize transpos- able elements. In Homologous recombination and gene silencing in plants (ed J. Paszkowski), pp. 349-385. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Floyd S.K. and Bowman J.L. 2004. Gene regulation: Ancient mi- croRNA target sequences in plants. Nature 428: 485-486. Furlong R.F. and Holland PW. 2004. Polyploidy invertebrate ances- try: Ohno and beyond. Biol. J. Linnean Soc. 82: 425-430. Gasciolli V, Mallory A.C., Bartel D.P, and Vaucheret H. 2005. Par- tially redundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs. Curr. Biol. 15: 1494- 1500. Gaudin V, Libault M., Pouteau S., Juul T, Zhao G., Lefebvre D., and Grandjean О 2001. Mutations in LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 affect flowering time and plant architecture in Ara- bidopsis. Development 128: 4847-4858. Gong Z., Morales-Ruiz T, Ariza R.R., Roldan-Arjona T, David L., and Zhu J.K. 2002. ROSI, a repressor of transcriptional gene silencing in Arabidopsis, encodes a DNA glycosylase/lyase. Cell 111: 803-814. HanM.H., Goud S., Song L., and Fedoroff N. 2004. The Arabidopsis double-stranded RNA-binding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated gene regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 101:1093-1098. Heitz E. 1928. Das Heterochromatin der Moose. I. Jahrb. Wiss. Bot. 69: 762-818. Hennig L., Bouveret R., and Gruissem W. 2005. MSll-like proteins: An escort service for chromatin assembly and remodeling com- plexes. Trends Cell Biol. 15: 295-302. Herr A.J., Jensen M.B., Dalmay T, and Baulcomte D.C. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA Science 308:118-120. Hsieh T.-F. and Fischer R.L. 2005. Biology of chromatin dynamics. Annu. Rev. Plant Biol. 56: 327-351. Hung M.S. and Shen C.-K. 2003. Eukaryotic methyl-CpG-binchng domain proteins and chromatin modification. Eukaryot. Cell 2: 841-846. Jackson J.P, Lindroth A.M., CaoX., and Jacobsen S.E. 2002. Con- trol of CpNpG DNA methylation by the KRYPTON ITE histone H3 methyltransferase. Nature 416: 556-556. Jeddeloh J.A., Stokes T.L.. and Richards E.J. 1999. Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNFs-like protein. Nat. Genet. 22: 94-97. Jorgensen R.A. 2003. Sense cosuppression in plants: Past, present, and future. In RNAi: A guide to gene silencing {ed. G.J. Hannon), pp. 5-22. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Kaeppler S.M., Kaeppler H.E, and Rhee Y. 2000. Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants. Plant Mol. Biol. 43: 59-68. Kanno T, Mette M.E, Kreil D.P., Aufsatz W., Matzke M., and Matzke A. J. 2004. Involvement of putative SNF2 chromatin remodeling protein DRD1 in RNA-directed DNA methylation. Curr. Biol. 14: 801-805 Kanno T, Huettel B., Mette M.E, Aufsatz W., Jaligot E., Daxinger L., Kreil D.P., Matzke M., and Matzke A.J.M. 2005. Atypical RNA polymerase subunits required for RNA-directed DNA methylation. Nat. Genet. 37: 761-765. Kapoor A., Agius E, and Zhu J.K. 2005a. Preventing transcriptional gene silencing by active DNA demethylation. FEES Lett. 579: 5889-5898. Kapoor A., Agarwal M., Andreucci A., Zheng X., Gong Z., Hasegawa P.M., Bressan R.A., and Zhu J.K. 2005b. Mutations in a con- served replication protein suppress transcriptional gene silencing in a DNA-methylation-independent mannerin Arabidopsis. Curt. Biol. 15: 1912-1918. Kawasaki H., Taira K., and Morris K.V. 2005. siRNA induced transcriptional gene silencing in mammalian cells. Cell Cycle 4: 442-448. Kidner C.A. and Martienssen R.A. 2005. The developmental role of microRNA in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 8: 1-7. Kim VN. 2005. MicroRNA biogenesis: Coordinated cropping and dicing Nat. Rev. Genet. 6: 376-385. Kohler C, Page D.R., Gagliardini V, and Grossniklaus U. 2005. The Arabidopsis thaliana MEDEA polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nat. Genet. 37: 28-30. Kotake T, Takada S., Nakahigashi K., Ohto M., and Goto K. 2003. Arabidopsis TERMINAL FLOWER 2gene encodes a heterochro- matin protein 1 homolog and represses both FLOWERING LOCUS T to regulate flowering time and several floral homeotic genes. Plant Cell Physiol. 44: 555-564. Kress C, Thomassin H., and Grange T. 2001. Local DNA demethyla- tion in vertebrates: How could it be performed and targeted? FEES Lett. 494: 135-140. Lecellier С.-H., Dunoyer P, Arar K., Lehmann-Che J > Eyquem S., Himber C, Saib A., and Voinnet O. 2005. A cellular mi- cro RNA mediates antiviral defense in human cells. Science 308: 557-560. Li J., Yang Z., Yu B., Liu J., and Chen X. 2005. Methylation protects miRNAs and siRNAs from З’-end uridylation activity in Ara- bidopsis. Curr. Biol. 15: 1501-1507. Lippman Z. and Martienssen R. 2004. The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature 431: 364-370. Liu J., He Y, Amasino R., and Chen X. 2004. siRNAs targeting an intronic transposon in the regulation of natural flowering behavior in Arabidopsis. Genes Dev. 18: 2873-2878. Loidl P. 2004. A plant dialect of the histone language. Trends Plant Sci. 9: 84-90. Malagnac E, Bartee L., and Bender J. 2002. An Arabidopsis SET domain protein required for maintenance but not establishment of DNA methylation. EMBO J. 21: 6842-6852. Mathieu O. and Bender J. 2004. RNA-directed DNA methylation. /.Cell Sci. 117:4881-4888. Matzke M.A. and Birchler J.A. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6: 24-35. Matzke M. and Matzke A.J.M. 2004. Planting the seeds of a new paradigm. PLoS Biol. 2: 528-586. Matzke M., Kanno T, Huettel B., Jaligot E., Mette M.E, Kreil D.P., Daxinger L., Rovina P., Aufsatz W., and Matzke A.J.M.
2005. RNA-directed DNA methylation. In Plant epigenetics (ed. P. Meyer), pp. 69-96. Blackwell Publishing, Oxford, United Kingdom. McClintock B. 1956. Intranuclear systems controlling gene action and mutation. Brookhaven Symp. Biol. 8: 58-74 McClintock B. 1983.The significance of responses of the genome to challenge. Nobel lecture, http://nobelprize.org/medicine/laureates/ 1983/ mcclintock-lecture.pdf Meins E, Si-Ammour A., and Blevins T. 2005. RNAsilencing systems and their relevance to plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21:297-318. Naumann K., Fischer A., Hofmann I., Krauss V, Phalke S., Irmler K., Hause C, Aurich A.-C, Dorn R., Jenuwein T, and Reuter G. 2005. Pivotal role of AtSUVH2 in heterochromatic histone methylation and gene silencing in Arabidopsis. EMBO J. 24: 1418-1429. Onodera Y., Haag J.R., Ream T., Nunes PC, Pontes O., and Pikaard C. 2005. Plant nuclear RNA polymerase IVmediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell 120: 613-622. Pandey R., Miiller A., Napoli C.A., Selinger D.A., Pikaard C.S., Richards E.J., Bender J., Mount D.W., and Jorgensen R.A. 2002. Analysis of histone acetyltransferase and histone deacetylase families of Arabidopsis thaliana suggests functional diversification of chromatin modification among multicellular eukaryotes. Nucl. Acids Res. 30: 5036-5055. Park M.Y., Wu G., Gonzalez-Sulser A., Vaucheret H., and Poethig R.S. 2005. Nuclear processing and export of microRNAs in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 3691-3696. Peregrine A., Yoshikawa M., Wu G., Albrecht H.L., and Poethig R.S. 2004. SGS3 and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the production of frans-acting siRNAs in Ara- bidopsis. Genes. Dev. 18: 2368-2379. Pikaard C.S. 2000. The epigenetics of nucleolar dominance. Trends Genet. 16:495-500. Rocha P.S., Sheikh M., Melchiorre R., FagardM., Boutet S., Loach R., Moffatt B., Wagner C, Vaucheret H., and Fumer I. 2005. The Arabidopsis HOMOLOGY-DEPENDENT GENE SILENC- ING) gene codes for an S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase required for DNA methylation-dependent silencing. Plant Cell 17: 404-417. Schubert D., Clarenz O., and Goodrich J. 2005. Epigenetic control of plant development by Polycomb-group proteins. Curr. Opin. Plant Biol. 8:553-561. Senda M., Masuta C, Ohnishi S., Goto K., Kasai A., Sano T, Hong /.-S., and MacFarlane S. 2004. Patterning of virus-infected Gly- cine max seed coat is associated with suppression of endogenous silencing of chaicone synthase genes. Plant Cell 16: 807-818. Souret EE, Kastenmayer J.P., and Green P.J. 2004. AtXRN4 degrades mRNA in Arabidopsis and its substrates include selected miRNA targets. Mot Cell 15: 173-183. Springer N.M. and Kaeppler S.M. 2005. Evolutionary divergence of monocot and dicot methyl-CpG-binding domain proteins Plant Physiol. 138: 92-104. Springer N.M., Napoli C.A., Selinger D.A., Pandey R., Cone K.C., Chandler V.L., Kaeppler H.E, and Kaeppler S.M. 2003. Compar- ative analysis of SET domain proteins in maize and Arabidopsis reveals multiple duplications preceding the divergence of mono- cots and dicots. Plant Physiol. 132: 907-925. Stam M. and Mittelsten Scheid 0.2005. Paramutation: An encounter leaving a lasting impression. Trends Plant Sci. 10: 283-290. Takeda S., Tadele Z., Hofmann I., Probst A.V., Angelis K.J., Kaya H„ Araki T, Mengiste T, Mittelsten Scheid O., Shibahara K., et al. 2004. BRU1, a novel link between responses to DNA dam- age and epigenetic gene silencing in Arabidopsis. Genes Dev. 18: 782-793. Tariq M. and Paszkowski J 2004. DNA and histone methylation in plants. Trends Genet. 20: 244-251. Ting A. H., Schuebel K.E., Herman J. G., and Baylin S.B. 2005. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation. Nat. Genet. 37:906-910. Vaucheret H., Vazquez E, Crete P., and Bartel D.P. 2004. The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development. Genes Dev. 18: 1187-1197. Vazquez P., Gasciolli V, Crete P., and Vaucheret H. 2004a. The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development, but not posttranscriptional trans-gene silencing. Curr. Biol. 14: 346-345. Vazquez R, Vaucheret H., Rajagopalan R., Lepers C, Gasciolli V, Mal-lory A.C., Hilbert J.-L, Bartel D.P., and Crete P. 2004b. Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol. Cell 16: 69-79. Voinnet O. 2005. Induction and suppression of RNA silencing: In- sights from viral infections. Nat. Rev. Genet. 6: 206-220. Wagner D. 2003. Chromatin regulation of plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 6:20-28. Wang X.J., Gaasterland T, and Chua N.H. 2005. Genome-wide prediction and identification of cis-natural antisense transcripts in Arabidopsis thaliana. Genome Biol. 6: R30. Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., and Sanger H.L. 1994. RNA- directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 76: 567-576. Xie Z., Johansen L.K., Gustafson A.M., Kasschau K.D.. Lellis A.D.. Hibernian D., Jacobsen S.E., and Carrington J.C. 2004. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol. 2: E104. Yoo B.-C, Kragler P., Varkonyi-Gasic E., Haywood V, Archer-Evans S., Lee Y.M., Lough T.J., and Lucas WJ. 2004. A systemic small RNA signalling system in plants. Plant Cell 16: 1979-2000. WWW источники http://asrp.cgrb.oregonstate.edu. Arabidopsis thaliana small RNA project http://mpss.dbi.udel.edu. MPSS (Massively parallel sig- nature sequencing) http://www.arabidopsis.org/abrc.Arabidopsis Biological Resource Center Stocks http://www.chromdb.org. Plant Chromatin Database
ГЛАВА 10 ON OFF МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА И МЕХАНИЗМ ИХ ДЕЙСТВИЯ Tony Kouzarides1 и Shelley L. Berger2 'The Gurdon Institute, University of Cambridge, United Kingdom 2The Wistar Institute, Philadelphia, Pensylvania 19104 Содержание Общее резюме 1. Гистоны и ацетилирование играют регулятор- ную роль в транскрипции 2. Ацетилирование и деацетилирование 3. Фосфорилирование 4. Метилирование 4.1. Метилирование лизинов 4.2. Деметилирование лизинов 4.3. Метилирование аргининов 5 Деиминирование 6. Убиквитилирование/деубиквитилирование и сумоилирование 7. Темы в модификациях 7.1. Гистоновый код 7.2. Паттерны модификаций 7.3. Изменения в структуре хроматина, связан- ные с активацией транскрипции и элонга- цией 8. Заключительные замечания Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Гистоны являются строительными блоками нуклеосом, образуя октамерную структуру, которая упаковывает ДНК у эукариот и формирует структуру, известную как хроматин Хроматин, однако, не является однородной структурой, и в последние годы произошел взрыв в на- ших знаниях о вариациях в структуре хроматина. Это, в свою очередь, углубило наше понимание механизмов, регулирующих геномные матричные процессы, в част- ности посттрансляционных модификаций гистоновых белков (центральная характеристика этого геномного ре- 1улирования). Действительно, существует большое число посттрансляционных модификаций гистонов (HPTMs, histone posttranslational modifications). Они разделяются на две группы. Во-первых, существуют малые химиче- ские группы, в том числе ацетилирование, фосфорили- рование и метилирование. Во-вторых, имеются гораздо более крупные пептиды, в том числе убиквитинирование и сумоилирование. Как представляют себе влияние HPTMs на регу- ляцию и функционирование генома? Обычно рас- сматриваются три механизма, и полезно держать эти механизмы в голове, поскольку в этой главе представ- лены обширная информация и данные по истории HPTMs. Во-первых, HPTMs могут каким-то образом влиять на структуру хроматина —например, предот- вращая ключевые контакты, облегчающие образование определенных конформаций хроматина или структур более высокого порядка (что может рассматриваться как cw-модифицирующие эффекты). Напротив, два других механизма считаются действующими в trans-
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия конфигурации. HPTMs могут разрушать связывание белков, которые ассоциируются с хроматином или гистонами. Или же HPTMs могут создавать изменен- ные связывающие поверхности, которые притягивают определенные эффекторные белки Этот третий меха- низм был охарактеризован наиболее детально, и такое рекрутирование белков определяется по отношению к его функциональным последствиям: так, оно может иметь активирующее или же репрессивное влияние на транскрипцию. Большое число обнаруженных HPTMs и их разнообразные комбинации привели к мысли, что HPTMs осуществляют регуляцию посредством комби- наторных паттернов, во временных последовательно- стях, и могут устанавливаться на коротких и длинных расстояниях. Эти разнообразные механизмы определя- ют разные функциональные результаты — одни из них временные, преходящие, другие стабильные и эпигене- тически наследуемые. В 1960-е годы Винсент Олфри (Vincent Allfrey) иден- тифицировал ацетилирование, метилирование и фос- форилирование гистонов, выделенных из многих эу- кариот. Гистоны были также первыми распознанными убиквитилированными белковыми субстратами. Тем не менее, хотя Олфри и наблюдал определенные кор- реляции между модификациями и источником транс- крипционно активного хроматина, генетические и функциональные доказательства в пользу роли HPTMs в регуляции генов были получены значительно позже Действительно, многие исследователи, изучавшие био- химию и генетику регуляции генов в 1980-е и 1990-е годы, скептически относились к мысли, что HPTMs играют причинную роль в регуляции генов 1. Гистоны и ацетилирование играют регуляторную роль в транскрипции Как показано в этой главе, гистоны подвержены многим разным посттрансляционным модификациям (PTMs), и со временем несомненно будут обнаружены новые, пока еще не известные HPTMs. Известные модификации можно классифицировать либо как малые химические группы, обсуждаемые в разделах 2—4 этой главы, либо как более крупные пептидные изменения в гистонах, что обсуждается в разделе 5 (табл. 10.1). Механизм, по- средством которого HPTMs влияют на хроматиновую матрицу и родственные процессы, такие как транскрип- ция или репрессия генов, рассматриваются в контексте трех концептуальных моделей, изображенных на рис. 10.1. Модель 1 предполагает, что посттрансляционно модифицированные гистоны могут каким-то образом изменять струкутру хроматина. В модели 2 НРТМ может подавлять связывание некоего фактора с хроматиновой матрицей, тогда как модель 3 предполагает, что НРТМ создает сайт связывания для определенного белка (см. также раздел 5 главы 3). Что, в историческом плане, изменило главенствую- щий взгляд, согласно которому хроматин является, в основном, материалом упаковки ДНК? Самые ранние Таблица 10.1. Типы ковалентных посттрансляционных модифи- каций гистонов* Роль в транскрипции Модифицируемые сайты гистона ГРУППА! Ацетилиро- вание Активация НЗ (К9,К14,К18,К56) Н4 (К5,К8К12,К16) Н2А Н2В (К6,К7,К16,К17) Фосфорили- рование Активация НЗ (S10) Метилиро- вание Активация НЗ (К4,К36,К79) Репрессия НЗ (К9,К27) ГРУППА 2 Н4 (К20) Убиквитили- рование Активация Н2В (КПЗ) Репрессия Н2А(К119) Сумоилиро- вание Репрессия НЗ (?) Н4 (К5, К8, К12, К16) Н2А(К126) Н2В (Кб, К7, К16, К17) *HPTMs разбиваются на две группы: группа 1 представляет модификации малыми химическими группами, а группа 2 включает более крупные химические модификации данные о том, что HPTMs регулируют активацию транс- крипции и сайленсинг, были получены в эксперимен- тах на Saccharomyces cerevisiae в конце 1980-х годов. Эти почкующиеся дрожжи являются весьма эффективной моделью для проведения генетических экспериментов (в области как прямой, так и обратной генетики) по вы- яснению значения гистонов Причина этого в том, что, в отличие от высших эукариот, где имеются множествен- ные копии каждого гистонового гена, с однокопийны- ми гистоновыми генами дрожжей можно легко прово- дить генетические манипуляции. Например, на фоне удаления с помощью делеций всех гистоновых генов можно ввести копию каждого гена, закодированную в эписоме, несущей такой селективный маркер, как ген URA3, для сохранения этой эписомы. Вторую копию гистонов можно ввести на второй эписоме, несущей другой селективный маркер. В этой второй копии мож- но вызвать мутацию с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем можно вызвать утерю первой ко- пии, копии дикого типа, из клетки, используя 5-FOA (5-фтороротовая кислота), делающую продукт гена URA3 токсичным для клетки. Конечным результатом будет присутствие в клетке единственной копии — из- мененной копии на второй эписоме, которая содержит любое число мутаций, подлежащих тестированию. У 5. cerevisiae гистоновые гены расположены парами НЗ/ Н4 и Н2А/Н2В, и их транскрипция в большой степени скоординирована таким образом, что совпадает с фазой S. Каждая нуклеосома собирается из тетрамера НЗ/Н4 и двух димеров Н2А/Н2В; когда одна пара любой двойки оказывается недо- или сверхтранскрибированной, ну-
2. Ацетилирование и деацетилирование Модель 1: структурное изменение хроматина 4Н4 —* W- Модель 2: ингибирование связывания негативно действующего фактора Модель 3: рекрутирование позитивно действующего фактора связка mod клеосомами, расположенными естественным образом «вверх по течению» от сайтов начала транскрипции, и эти позиционированные нуклеосомы становятся из- мененными, когда ген активируется (Svaren et al., 1994; Shim et al., 1998). В случае PHO5 изменение нуклеосом требовало активатора, показывая тем самым, что без транскрипции нуклеосомы не были изменены. Одна- ко было неясно, является ли это изменение причиной или же следствием транскрипции. Чтобы выяснить это, делегировали ТАТА-бокс, отменяющий транскрипцию у дрожжей. Положение нуклеосом, тем не менее, из- менилось, заставляя предположить, что это изменение нуклеосом предшествует транскрипции. В совокупности подобные эксперименты убедитель- но свидетельствовали о том, что для активации транс- крипции могут быть необходимы и репозиииониро- вание нуклеосом, и ацетилирование специфических остатков в гистоновых «хвостах» Рис. 10.1. Модели, показывающие, каким образом посттрансляци- онные модификации гистонов влияют на хроматиновую матрицу Модель 1 предполагает, что изменения в структуре хромати- на опосредуются cis-эффектами ковалентных модификаций гистонов, таких как ацетилирование или фосфорилирование гистонов. Модель 2 иллюстрирует подавляющее влияние НРТМ на связывание ассоциированного с хроматином фактора (CF) на примере фосфорилирования по H3S10, блокирующего связывание НР1 в метилированном НЗК9. В модели 3 НР1М может обеспечивать специфичность связывания для ассоции- рованного с хроматином фактора Классическим примером является связывание НР1 через посредство его хромодомена с метилированным НЗК9 клеосомы оказываются обедненными Это изменение дозы гистонов генетическими средствами явилось од- ним из первоначальных доказательств того, что струк- тура хроматина играет ключевую роль в регулировании экспрессии. Один такой подход использовал «прямую» генетику, когда были отселектированы случайные мута- ции, которые приводили к инактивации гена-маркера (Clark-Adams et al., 1988). Оказалось, что эти мутации изменяют количество пар гистонов. При втором под- ходе использовали «обратную» генетику, когда направ- ленное «истощение» гистоновых генов давало четкое доказательство того, что гистоны регулируют транс- крипцию генов (Han and Grunstein, 1988). Следующий этап заключался в том, чтобы провести делецию толь- ко аминотерминальных «хвостов» гистонов (сайты ло- кализации многих НРТМ) или выполнить мутации- замены сайтов ацетилирования в гистонах. Эти более тонкие «хирургические» изменения также вызывали уменьшение активации генов, позволяя предполагать, что ацетилирование необходимо для транскрипции ге- нов (Durrin et al., 1991). При других подходах исследовали, изменяются ли нуклеосомы естественным образом в ходе активации генов. Биохимические эксперименты показали, что ну- клеосомы играют репрессивную роль в транскрипции на матрицах ДНК in vitro (Workman and Roeder, 1987), но вопрос о том, происходит ли то же самое in vivo, яв- ляется спорным. Некоторые промоторы обладают ну- 2. Ацетилирование и деацетилирование Дополнительные экспериментальные подходы про- должали поставлять данные о том, что ацетилирование (versus отсутствие ацетилирования) коррелирует с транс- крипцией. Районы, транскрипционно активные или готовые к транскрипции, склонны иметь «открытую» конфигурацию хроматина и поэтому доступны для таких ферментов, как ДНКаза и MN-ase, которые при добавлении к изолированным, но интактным ядрам могут переваривать ДНК. В начале 1990-х годов иссле- дователи начали использовать иммунопреципитацию хроматина (ChIP, chromatin immunoprecipitation) — мощ- ный метод для анализа того, какие белки связываются с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК in vivo. Этот метод включает создание поперечных сшивок в белках, связанных с ДНК, с помощью таких проникающих в клетку химических реагентов, как фор- мальдегид, и последующую обработку ультразвуком для разрушения комплексов ДНК:белок до более мелких фрагментов. Интересующие исследователя комплексы ДНК:белок затем подвергаются иммунопреципитации с использованием специфических антител в качестве зонда. Затем поперечные сшивки ликвидируются, что- бы изолировать и идентифицировать нуклеотидные последовательности ДНК, ассоциированные с белком, который связался с антителом; при этом для анализа используется либо радиоактивно меченые ДНК-зонды, либо ПЦР Одна группа использовала этот метод, чтобы исследовать корреляцию между сайтами в ДНК вокруг активных глобиновых генов, которые гиперчувстви- тельны к перевариванию ДНКазой и ассоциируются с ацетилированными гистонами в эритроцитах курицы; корреляция оказалась очень тесной (Hebbes et al., 1994). У 5. cerevisiae аналогичные подходы были применены в транскрипционно «молчащих» районах генома, и были показаны очень низкие уровни ацетилирования ги- стонов (Braunstein et al., 1993). Наоборот, генетическое нарушение сайленсинга коррелировало с увеличенным ацетилированием.
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия Все эти эксперименты постепенно обнаруживали, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетили- рования играют роль в регуляции генов. Однако первые ферменты ацетилирования и деацетилирования ядер- ных гистонов не были идентифицированы вплоть до се- редины 1990-х годов, и они явились наиболее прямым доказательством того, что эти ферменты играют роль в ходе транскрипции. Первая ядерная ацетилтрансфе- раза гистонов (HAT) была выделена из так называемо- го макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микрону- клеуса) инфузории Tetrahymena, который характеризу- ется высокими скоростями транскрипции (Brownell et al., 1996). Ключевым подходом для выявления актив- ности HAT оказался анализ «в геле» («in-gel»): сложная смесь белков из клеточных экстрактов была разделена на пропитанном гистонами SDS-геле, затем пептиды были подвергнуты ренатурации, и белки с активно- стью фермента HAT метили этот гель путем переноса радиактивно меченного кофактора, ацетилкоэнзима А, на локализованные гистоны. Это делало возмож- ным последующее биохимическое фракционирование и очистку этого полипептида. Идентифицированный энзим HAT был гомологичен ранее изолированному у 5. cerevisiae коактиватору, называемому Gcn5, о котором было известно, что он взаимодействует с транскрипци- онными активаторами. Одновременно первая деацети- лаза гистонов (HDAC) была выделена посредством био- химической очистки (Taunton et al., 1996). В этом случае фермент был очищен из клеточных экстрактов с помо- щью ингибитора, связанного с нерастворимым матрик- сом, который физически связывался с каталитическим сайтом фермента. Энзим оказался гомологичным ранее выделенному гену, игравшему роль кофактора в репрес- сии генов. Эти замечательные параллельные открытия первых ферментов, которые, как оказалось, метаболи- зируют ацетильные группы на гистонах, привели к мо- дели, которая в настоящее время стала парадигмой для ген-специфичных гистоновых PTMs: связанные с ДНК активаторы рекрутируют HATs для того, чтобы ацети- лировать нуклеосомные гистоны, тогда как репрессоры рекрутируют YDACs для того, чтобы деацетилировать гистоны. Эти изменения ведут к изменениям нуклео- сомы и, соответственно, к ап- или даун-регуляции гена (рис. 10.2). Было показано, что многие другие хорошо извест- ные коактиваторы и корепрессоры обладают актив- ностью HAT или HDAC или ассоциируются с такими энзимами (Sterner and Berger, 2000; Roth et al., 2001). Бо- лее того, ферментативные активности HATs и HDACs являются критическими для их роли в активации и ре- прессии генов. Эти энзимы часто являются компонен- тами крупных комплексов, модулярных по структуре и функции; модифицирующая гистоны ферментатив- ная активность — это только одна функция, и в числе других, например, рекрутирование связывающегося с ТАТА белка (TBP. TATA-binding protein) (Grant et al., 1998). Интересно, что некоторые ядерные рецепто- ры гормонов функционируют и как связывающиеся с ДНК репрессоры транскрипции (когда они не связа- Активатор гена рекрутирует ацетилтрансферазу гистонов Репрессор гена рекрутирует деацетилазу гистонов Рис. 10.2. Энзимы, модифицирующие гистоны, рекрутируются к промоторам связывающимися с ДНК транскрипционными факторами Ацетилтрансферазы гистонов (HAT) рекрутируются активато- рами, которые связываются с активирующими нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (UAS, upstream activating sequences). Этот фермент катализирует ацетилирова- ние локальных гистонов, которые, как известно, вносят вклад в активацию транскрипции. Деацетилазы гистонов (HDAC) рекрутируются репрессорами транскрипции, которые связыва- ются с репрессивными нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (URS) и деацетилируют локальные гистоны Это вносит вклад в репрессию транскрипции ны с гормонами-лигандами), и как активаторы транс- крипции (когда связаны с гормонами-лигандами); эти рецепторы осуществляют эти функции отчасти через посредство РТМ хроматиновых участков-мишеней, ре- крутируя HDACs, когда они не связаны с лигандами, и HATs, когда связаны (Baek and Rosenfeld, 2004). Белки HAT могут ацетилировать остатки лизина на всех четырех коровых гистонах, но разные энзимы обладают разной специфичностью в отношении пред- почтительного субстрата (рис. 10.3; табл. 10.1), хотя каждый энзим редко «нацелен» только на один сайт. Одно главное семейство HAT — GNAT (сокращение для Gcn5 related acetyltransferase) «нацелено» на гистон НЗ как на свой основной субстрат. Второе главное се- мейство, семейство MYST, в качестве своего основного субстрата«нацелено» на гистон Н4. Третье главное се- мейство — СВР/рЗОО — «нацелено» и на НЗ, и на Н4 и является самым неразборчивым. Был выполнен струк- турный анализ для каталитических доменов первых двух главных семейств (GNAT и MYST), и они оказа- лись различающимися; структура семейства СВР/рЗОО пока еще не раскрыта. Между прочим, каждое из этих семейств ацетилтрансфераз способно также ацетилиро- вать негистоновые субстраты (Glozak et al., 2005). Как обсуждалось выше, существуют три модели, опи- сывающие роль Н PTMs в регулирование структуры хро- матина (рис. 10.1). Первая модель рассматривает струк- турные изменения в хроматине, индуцируемые прямыми влияниями HPTMs, такие как изменения заряда. В этом случае нейтрализация ацетилированием положительно заряженного лизина уменьшает силу связывания сильно
3. Фосфорилирование Рис. 10.3. Охарактеризованные сайты ацетилирования гистонов Гистоны ацетилируются главным обра- зом по лизиновым остаткам, локализо- ванным в амино-концах НЗ и Н4, за ис- ключением НЗК56, локализованного в глобулярном домене. Показаны белки, проявляющие специфичность связыва- ния с ацетилированными гистонами основных гистонов или гистоновых «хвостов» с отрица- тельно заряженной ДНК и таким образом открывает сай- ты связывания с ДНК (Vettese-Dadey et al., 1996). Име- ются также данные, все еше в пользу первой модели, что ацетилирование может декомпактизировать нуклеосом- ные порядки, что согласуется с ролью в открывании хро- матина для активации генов (Shorgen-Knaak et al., 2006). Третья модель предполагает, что HPTMs обеспечивают поверхность связывания, чтобы белки ассоциировались с хроматином и регулировали ДНК-матричные процессы; впервые это было показано для ацетилирования. Специ- ализированный белковый домен, названный бромодо- меном и обычно обнаруживаемый в ассоциированных с хроматином белках, специфически связывается с ацети- лированными лизинами (рис. 10.3) (Dhalluinet al., 1999). Бромодомены присутствуют во многих HATs, таких как Gcn5 и СВР/рЗОО. Белки с этим мотивом, когда они яв- ляются частью крупных комплексов, ассоциированных с хроматином или изменяющих его, — например, таких как зависимый от АТФ ремоделирующий комплекс, Swi/ Snf — стимулируют его связывание с хроматином (Has- san et al., 2002). Другими примерами белков, которые содержат бромодомены, обладающие специфичностью связывания с ацетилированными гистонами, являются Tafl и Bdfl в комплексе TFIID, Rsc4 в ремоделирующем комплексе Rsc и Brd2 в большом семействе бромодомен- ных белков Существуют многочисленные ферменты HDAC, уда- ляющие ацетильные группы (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Они распадаются на три ка- талитические группы, консервативные в эволюции от S. cerevisiae до млекопитающих, которые обозначаются как энзимы типа I, типа II и типа III, или родственные Sir2. Ферменты типа I и типа II обладают близким меха- низмом деацетилирования, который не связан с кофак- тором, тогда как ферменты, родственные Sir2, требуют кофактор NAD в качестве компонента их каталитическо- го механизма. Структура представителей всех этих трех семейств выяснена. Многие HDACs обнаруживаются в крупных мультисубъединичных комплексах, компонен- ты которых служат для «нацеливания» этих энзимов на гены, что ведет к репрессии транскрипции. Например, Rpd3 является частью крупного комплекса, включающе- го HDAC Sin3, которая взаимодействует с репрессорами, связанными с ДНК (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Rpd3 является также частью малого ком- плекса, «нацеленного» на открытые «рамки считывания» генов (ORFs) через ассоциацию хромодомена с НЗКЗбше (дальнейшее обсуждение хромодоменов см. в разделе 4). Результатом этого оказывается деацетилирование ги- стонов, частично подавляющее инициацию внутренней РНК-полимеразы II (pol II), а также регулирующее раз- личные этапы цикла транскрипции (Carrozza et al., 2005; Joshi and Struhl, 2005). 3. Фосфорилирование Фосфорилирование — лучше всего известная РТМ, поскольку уже давно поняли, что киназы регулируют проведение сигнала с клеточной поверхности через ци- топлазму и в ядро, приводя к изменениям в экспрессии генов Гистоны были одними из первых белков, фосфо- рилирование которых было обнаружено. К 1991 году от- крыли, что когда клетки стимулировали к пролиферации, происходила индукция так называемых «немедленных- ранних» [«immediate-early»] генов, и они становились транскрипционно активными и функционировали, сти- мулируя клеточный цикл. Эта повышенная экспрессия генов коррелирует с фосфорилированием гистона НЗ (Mahadevan et al., 1991). Остаток серина 10 гистона НЗ (H3S10) оказался важным сайтом фосфорилирования для транскрипции от дрожжей до человека и, по-видимому,
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия особенно важен у Drosophila (Nowak and Corces, 2004). Были идентифицированы многие киназы имеющие «мишенью» этот сайт, в том числе Mskl/2 и родственная ей Rsk2 у млекопитающих и SNF1 у S. cerevisiae (Sassone- Corsietal., 1999; Loetal., 2001; Soloagaetal., 2003). Иссле- дования линкерного гистона Н1 у Tetrahymena показали, что фосфорилирование этого гистона также может влиять на контроль транскрипции. Возможно, наперекор интуиции фосфорилирова- ние некоторых остатков коррелирует с конденсацией хромосом в митозе и мейозе. Неясно, каким образом фосфорилирование участвует в этом процессе, но не- давно было показано, что фосфорилирование H3S10 действует как временной [temporal] переключатель, из- влекающий НР1, связанный с метилированным по со- седству остатком НЗК9, и называемый «бинарным пе- реключателем methyl-phos» (Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005). Остается посмотреть, может ли это, возможно совместно с фосфорилированием H3S28 и НЗТ11, вли- ять на конденсацию хроматина посредством рекрути- рования конденсинового комплекса и митотического веретена (Nowak and Corces, 2004). Меньше известно о точной роли фосфорилирова- ния гистонов в механистических терминах. Имеются данные в пользу всех трех моделей, касающихся роли HPTMs. Во-первых, фосфорилирование гистонов из- меняет степень компактности хроматина in vivo (модель 1) Действительно, работы на Tetrahymena показали, что коллективный «пэтч отрицательных зарядов», образую- щийся в результате фосфорилирования кластеров, на- ходящихся по соседству с остатками в линкерном гисто- не Н1, влияет на сродство его связывания с ДНК. явно увеличивая транскрипционный потенциал локального хроматинового окружения (Dou and Gorovsky, 2002). В поддержку модели 2 говорят данные о том, что белки, связанные с хроматином, могут быть смещены фосфо- рилированием. Недавно это было продемонстрировано пониженной афинностью связывания НР1 во время митоза после митоз-специфичного фосфорилирования H3S10 (Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005). В поддерж- ку Модели 3 свидетельствуют данные о том, что адап- торный белок 14-3-3 (известный белок, связывающий фосфатную группу) распознает H3S10ph в промоторах индуцибельных генов (Macdonald et al., 2005). 4. Метилирование Метилирование как ковалентная модификация гистонов является более сложной, чем любая другая, поскольку оно может происходить как по лизинам, так и по арги- нинам. Кроме того, в отличие от любой другой моди- фикации в группе 1, последствия метилирования могут быть как позитивными, так и негативными по отноше- нию к транскрипционной экспрессии в зависимости от положения остатка в гистоне (табл. 10.1). Еще один уровень сложности связан с тем фактом, что по каждому остатку могут быть множественные метилированные со- стояния. Лизины могут быть моно- (mel), ди- (те2) или три- (теЗ) метилированными, тогда как аргинины могут быть моно- (mel) или ди- (те2) метилированными. По- скольку на НЗ, Н4, Н2А и Н2В имеются по меньшей мере 24 идентифицированных сайта метилирования лизинов и аргининов, число различающихся метилированных состояний нуклеосом невообразимо велико. Такой комбинаторный потенциал метилированных нуклеосом может быть необходим, по крайней мере отчасти, чтобы сделать возможным регулирование таких сложных и динамических процессов, как транскрипция, которая требует последовательных и точно размещенных во времени событий (Jenuwein and Allis, 2001; Y Zhang and Reinberg, 2001; Lee et al., 2005; Martin and Zhang, 2005; Wysocka et al., 2006a). 4.1. Метилирование лизинов Тот факт, что лизиновые остатки в гистонах метилиро- ваны, был известен многие десятилетия. Однако био- логическое значение этой модификации стало высве- чиваться лишь недавно, после идентификации первой метилтрансферазы лизинов, использующей гистоны в качестве своего субстрата (Rea et al., 2000). В настоящее время идентифицировано большее количество лизино- вых метилтрансфераз (HKMTs), и определены сайты, мо- дифицируемые ими на гистонах (Martin and Zhang, 2005). Все эти ферменты, за исключением Dot 1, имеют общий домен SET, который содержит каталитически активный сайт и делает возможным связывание с S-аденозил-L- метиониновым кофактором. Из большого числа известных метилированных сай- тов к сегодняшнему дню хорошо охарактеризованы шесть: пять на НЗ (К4, К9, К27, К36, К79) и один на Н4 (К20). Метилирование по НЗК4, H3K36 и НЗК79 в целом было связано с активацией транскрипции, а остальные варианты — с репрессией (табл. 10.1). Кроме того, два из этих сайтов — НЗК79те и Н4К20те — уча- ствуют, как считается, в процессе репарации ДНК. Были идентифицированы специфические белки-связки, рас- познающие каждый из шести охарактеризованных сай- тов метилирования (рис. 10.4). Эти белки имеют домен узнавания лизина, относящийся к одному из трех раз- ных типов: хромо, тюдор и PHD-повтор. Ниже каждая из этих охарактеризованных модификаций обсуждается более детально. Метилирование НЗК4 Метилирование НЗК4 связано с эухроматином, а именно с генами, которые активны или должны стать активными. Демонстрация того, что метилирование НЗК4 коррели- рует с активным хроматином, была получена при анализе локуса куриного р-глобина и локусов типа спаривания почкующихся дрожжей (Litt et al., 2001; Noma et al., 2001). ChlPs с использованием антител, специфичных к мети- лированным НЗК4, показали, что островки модифици- рованных гистонов метят активные гены. Последующая работа на дрожжах показала, что в процессе активной транскрипции появляется триметильное состояние (H3K4me3) (Santos-Rosa etal., 2002). У дрожжей во время активации транскрипции мо- дификация НЗК4теЗ наблюдается на 5’-концах генов.
4. Метилирование РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ РЕПАРАЦИЯ ДНК «Молчащий» Рис. 10.4. Сайты метилирования гистонов, их белковые связки и функциональная роль в геномных процессах Метилирование гистонов про- исходит по лизиновым остаткам в гистонах НЗ и Н4. Некоторые метилированные остатки лизи- на ассоциированы с активацией транскрипции (зеленый флажок Ме), тогда как другие участвуют в репрессивных процессах (красный флажок Ме). Показаны белки, свя- зывающиеся с определенными ме- тилированными остатками лизина Полагают, что за эту метку отвечают три компонента транскрипционной машины. Во-первых, RNA pol II, фосфорилированная по Ser-5 карбокситерминального домена (CTD), может рекрутировать Set 1 НКМТ, кото- рая метилирует НЗК4 поблизости от промоторов (рис. 10.5). Такое фосфорилирование в норме высвобождает RNApol II из комлекса инициации транскрипции в ком- плекс ранней элонгации (часто называемый promoter clearance или escape). Второй компонент, рекрутирую- щий НЗК4теЗ, это комплекс RAF, который регулирует различные этапы метаболизма РНК и также взаимодей- ствует с Set 1. Третьим компонентом, важным для уста- новления НЗК4теЗ, является моноубиквитилирование Н2В по Lys-123 (H2BK123ubl или H2BK120ubl у чело- века; обсуждается ниже, в разделе 6). Что остается неяс- ным, так это вопрос о том, какие процессы транскрип- ционной элонгации контролирует H3K4me3 (Hampsey and Reiberg, 2003); однако факторы, специфически свя- зывающиеся с метилированными НЗК4теЗ, начинают выявлять его роль В механистическом плане метилирование НЗК4 мо- жет приводить к рекрутированию таких специфических факторов, как белок CHD1, который, как было показа- но, связывается с НЗК4те2 и теЗ (рис. 10.4), и комплекс NURF, который, как известно, мобилизует нуклеосомы в активных генах у Drosophila. Домены, опосредующие связь с метилированными НЗК4, являются тандемным набором хромодоменов в Chdl (Sims et al., 2006) и «паль- цем» PHD в NURF (Li et al., 2006). Среди других белков, рекрутируемых метилированием НЗК4, — АТФ-аза ISWI, которая связывается непрямым образом, через посред- ство другого белка (белков) Напротив, имеются данные, что репрессорный комплекс NuRD у млекопитающих больше не связывается с метилированными «хвостами» НЗК4 (D.Y. Lee et al., 2005; Martin and Zhang, 2005). Метилирование по H3K4, по-видимому, взаимодей- ствует с другими модификациями. Например, метили- рование НЗК9 НКМТ SUV39H in vitro предотвращает- ся, если НЗК4 метилирован и H3S10 фосфорилирован. Это вполне может быть способом закрытия репрессив- ной модификации НЗК9 на активно транскрибируемых генах. При более сложной форме взаимодействия типа «trans-tail» моноубиквитинилирование Н2ВК123 влия- ет на уровни НЗК4теЗ. Как это происходит — неясно, но одно из предположений заключается в том, что ком- плекс Set 1 не может триметилировать НЗК4, если ну- клеосома (нуклеосомы) не находится в определенном конформационном состоянии, которое определяется убиквитилированием Н2В (Zhang and Reinberg, 2001; D.Y. Lee et al., 2005). Белок Setl/MLL/ALLl/HRX, который является го- мологом Setl у человека, может рекрутироваться к про- моторам гена НОХ. Другая НЗК4 НКМТ, SMYD3, ока- залась сцепленной с транскрипционной активацией. Метилирование с помощью SMYD3 также было свя- зано с индукцией клеточной пролиферации. В самом деле, ограниченный анализ человеческих энзимов, ме- тилирующих НЗК4, позволяет предполагать их участие в генезе рака (D.Y. Lee et al., 2005). Метилирование H3K36 Полученные данные привели к предположению, что метилирование H3K36 необходимо для эффективной элонгации RNA pol II через колирующий участок Ко- дирующий район активных генов очень обогащен этой модификацией в противоположность 5’-локализации метилирования НЗК4. Белок Set2 является НКМТ, спо- собной метилировать H3K36 Фермент Set2 связывается предпочтительно с RNA pol II, которая была фосфори-
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия лирована по Ser-2 в пределах его CTD (рис. 10.5). Эта форма RNA pol II, которая, между прочим, отличается от фосфорилированного состояния, связанного с очист- кой промотора, имеет тенденцию аккумулироваться в транскрибируемых районах так же, как на 3’-концах генов. Это согласуется с тем, что НЗКЗбтеЗ достигает пика на 3’-концах генов, которые активно транскриби- руются. Рекрутирование Set2 к активным генам требует также компонентов комплекса PAF, как в случае рекру- тирования Setl. Однако моноубиквитилирование Н2В играет негативную репрессивную роль в метилировании H3K36 (Zhang and Reinberg, 2001; Martin and Zhang, 2005). Действительно, комплекс SAGA, рекрутируемый к транскрибируемым генам у дрожжей, содержит Ubp8, деубиквиназу, которая специфична к Н2ВК123. Даль- нейшие исследования позволили предположить, что убиквитилирование и деубиквитилирование Н2ВК123 являются активным процессом в ходе транскрипционной элонгации. Продвижение RNA pol II через кодирующие участ- ки требует ацетилирования нуклеосом. Транскрипци- онное регулирование также нужно для подавления не- правильной внутренней инициации транскрипции с криптических стартовых сайтов, которые встречаются внутри кодирующих районов. Чтобы подавить этот про- цесс, метилирование по H3K36 с помощью Set2 создает сайт узнавания для белка EAF3 через его хромодомен, который в свою очередь опосредует рекрутирование комплекса Rpd3S HDAC. Деацетилазная активность Rpd3S удаляет затем ацетилирование гистонов, связан- ное с элонгацией, супрессируя таким образом внутрен- нюю инициацию (Carrozza et al., 2005; Joshi and Struhl, 2005; Keogh et al., 2005). Метилирование H3K36 также оказалось на гораздо более низком уровне в промото- рах индуцибельных генов, но в этом случае его влияние оказывается репрессивным (Zhang and Reinberg, 2001). Метилирование НЗК79 Метилирование по НЗК79 является необычным, потому что эта модификация лежит в коре нуклеосомы, а не в «хвосте», где находится большинство других охарактери- зованных сайтов метилирования Глобальный анализ по- казал, что НЗК79 метилируется в эухроматиновых районах дрожжей и ассоциируется главным образом с кодирующим участком активных генов. Ограниченный анализ у высших эукариот демонстрирует такой же профиль. Энзим млекопитающих, метилирующий НЗК79, hDOTIL, как было показано, опосредует лейкемоген- ные функции белка слияния MLL-AF10. Однако до сего дня не обнаружен белок, который связывается с НЗК79ше и связывает его с транскрипционными со- бытиями. Единственные данные механистического плана о том. как метилирование НЗК79 функционирует в активации транскрипции, были получены в работе с почкующимися дрожжами. Эта работа показывает, что данная модификация каким-то образом лимитирует та- кие репрессивные белки, как Sir2 и Sir3, в эухроматине, внося таким образом свой вклад в регулирование и под- держание «молчащего» гетерохроматина за счет усиле- ния их концентрации в репрессивных участках хрома- тина. Другой функцией, приписываемой НЗК79 НКМТ Doti у дрожжей, является опосредование «контрольной точки» репарации ДНК. В соответствии с этим послед- ним фактом в клетках человека был идентифицирован белок Р53ВР1, который может связываться с метилиро- ванным НЗК79 и играет роль в функции «контрольной точки» в репарации ДНК (Martin and Zhang, 2005). Метилирование НЗК9 Этот тип метилирования является сегодня наиболее изученной модификацией гистонов, главным образом УХОД С ПРОМОТОРА ТРАНСКРИПЦИОННАЯ ЭЛОНГАЦИЯ Рис. 10.5. Роль метилирования лизинов гистонов в транскрипционной элонгации РНК-полимераза II рекрутирует разные типы HKMTs в зависимости от состояния фосфорилирования его карбокситерминального домена (CTD) РНК-полимераза II активируется для инициации транскрипции поблизости от промотора, когда Ser-5 фосфори- лирован. Это рекрутирует Setl НКМТ для метилирования НЗК4. Фосфорилирование Ser-2 происходит в ходе транскрипционной элонгации, побуждая к метилированию H3K36 в результате рекрутирования Set2 НКМТ к хроматиновой матрице
4. Метилирование потому, что энзим, метилирующий НЗК9, — SUV39H1 — был первой идентифицированной НКМТ (Rea et al., 2000). Ее гомологу Drosophila, Su(var)3-9, первоначально был идентифицирован как супрессор мозаичности, что указывало на то, что он участвует в механизме сайленсин- га эффекта положения мозаичного типа (PEV), который связан с распространением гетерохроматина в соседние эухроматиновые гены (дополнительные детали см. в главе 5). Осознание того, что SUV39H1 по нуклеотидной последовательности сходен с метилтрансферазой расте- ний, субстратом для которой является Rubisco, привело к идентификации домена Suv39 SET как каталитического домена, способного метилировать НЗК9. Был достигнут прогресс в определении функции ме- тилирования НЗК9 в формировании перицентромер- ного гетерохроматина, что широко обсуждается также и в других главах (об исследованиях на Drosophila см. гла- ву 5, об исследованиях на 5. pombe см. главу 6 и об ис- следованиях по опосредованному RNAi формированию гетерохроматина см. главу 8). Эти результаты получены в основном в исследованиях на дробянковых дрожжах и млекопитающих, где гетерохроматиновые структуры, как полагают, достаточно консервативны (но обратите внимание на то, что у почкующихся дрожжей метили- рование НЗК9 не было обнаружено). Суммируя, можно сказать, что первый этап нашего понимания возник на основе исследований факторов, участвующих в уста- новлении гетерохроматина. В их число входит коопе- рация двух белков: SUV39H (или С1г4 у дробянковых дрожжей) и его партнер по связыванию НР1 (или Swi6 у дробянковых дрожжей [Nakayama et al., 2001; Nomaet al., 2001]). Была предложена модель, в которой SUV39H метилирует НЗК9, создавая платформу для связывания НР1 через его хромодомен (Bannister et al., 2001; Lach- ner et al., 2001). Коль скоро HP1 связался, он может распространяться на соседние нуклеосомы за счет его ассоциации с SUV39Y. который далее катализирует ме- тилирование соседних гистонов (Nakayama et al., 2001). Кроме того, НР1 ассоциируется сам с собой через до- мен «chromoshadow», облегчая распространение гете- рохроматина. Однако каким образом распространение НР1 диктует формирование плотно упакованных гете- рохроматиновых структур остается неизвестным. Вышеуказанная модель предсказывает, что должен быть специальный механизм основанного на гетерохро- матине рекрутирования для фермента SUV39H НКМТ. прежде чем станет возможным распространение НР1. Ключ к разгадке того, что бы это могло быть, был по- лучен в серии экспериментов на дробянковых дрожжах, которые продемонстрировали связь между формирова- нием гетерохроматина и образованием коротких интер- ферирующих РНК (siRNAs) (Hall et al., 2002; Volpe et aL, 2002). Эти РНК возникают в результате двунаправлен- ной транскрипции центромерных повторов, которые процессируются в siRNAs ферментом dicer. Эти siRNAs упаковываются затем в комплекс RITS, который содер- жит обладающий хромодоменом белок, Chpl, который связывается с метилированным НЗК9. Таким образом, «нацеливание» комплекса RITS на хроматин образу- ет начальную стадию формирования гетерохроматина. Распространение и поддержание гетерохроматина на участке, 20 т.п.н., как описано выше, требует метили- рования НЗК9 гистона С1г4 НКМТ и связывания Swi6 с метилированным по НЗК9 хроматином (Martin and Zhang, 2005; дополнительные детали см. в главе 8). Представление о взаимозависимости разных ре- прессивных эпигенетических механизмов возникло из исследований, проводившихся вначале на Neurospora crassa. но также и на растениях, особенно заметно про- демонстрировавших связь между метилированием НЗК9 и процессом метилирования ДНК (главы 6 и 8). Мети- лирование НЗК9 необходимо для того, чтобы имело место метилирование ДНК; по-видимому, действует и реципрокная связь, когда метилирование НЗК9 зависит от метилирования ДНК. Более того, недавние исследо- вания на раковых клетках млекопитающих, у которых нет ДНК-метилтрансферазных ферментов (Dnmts), по- казывают сниженные уровни метилирования НЗК9, и это можно приписать тому, что связывюшийся с метил- CpG белок 1 (MBD1, methyl-CpG-binding protein 1) ас- социируется с НЗК9 НКМТ SETDB1 (Zhang and Re- inberg, 2001; Martin and Zhang, 2005; дополнительные детали см. в главе 18). Метилирование по НЗК9 функционирует также в репрессии эухроматиновых генов ChlPs выявляют это метилирование в промоторе генов млекопитающих, когда эти гены «молчат». Механизм этой репрессии в эухроматиновых сайтах, по-видимому, слегка отличает- ся от механизмов, встречающихся в гетерохроматино- вых районах. Репрессорный белок RB предъявляет SU- V39H1 НКМТ и НР1 таким эухроматиновым генам, как ген регулируемого E2F циклина Е. Однако, в отличие от гетерохроматина, заполнение НР1, по-видимому, огра- ничено одной или немногими нуклеосомами вокруг сайта инициации, даже несмотря на то, что метилирова- ние НЗК9 происходит и в других местах на промоторе. В другом примере репрессор КАР1 приносит ESET/SET- DB1 НКМТ к промотору генов, регулируемых КАР1, и сайленсирует транскрипцию метилированием НЗК9 и рекрутированием НР1. То, что НР1 специфически ограничены этими эухроматиновыми промоторами, и предотвращение распространения позволяют предпо- лагать для НР1 наличие отдельного механизма действия по отношению к его гетерохроматиновой роли. Один возможный способ действия НР1, получивший неко- торую поддержку, заключается в том, что он действует как якорь, закрепленный в богатых гетерохроматином ядерных компартментах. В ходе репрессии эухрома- тиновых генов наблюдали движения, показывающие, что «молчащий» ген смешается в гетерохроматиновый район, и это перемещение зависит от гамма-изоформы НР1 (Martin and Zhang, 2005) Формирование гетерохроматина в теломерах, хотя и связано с НР1 и метилированием НЗК9, отличает- ся от вышеупомянутых перицентромерных и «мол- чащих» эухроматиновых районов. У Drosophila НР1 не рекрутируется к теломерным концам через его хромо- и «chromoshadow»-домен, и метилирование НЗК9 катализируется неизвестной НКМТ. У млеко- питающих другие гомологи НР1, СВХ1, СВХЗ и СВХ5
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия участвуют в связывании с метилированным НЗК9, преобразованным белками SUV39H1 и SUV39H2 для формирования репрессивных хроматиновых доменов на хромосомных концах (дополнительные детали см. в главе 14). Метилирование НЗК27 Метилирование НЗК27 является репрессивной модифи- кацией, обнаруживаемой в клетке в трех разных местах: (1) в эухроматиновых генных локусах, преимуществен- но там, где имеются реагирующие элементы Polycomb (PREs, Polycomb Response Elements) в случае Drosophila, (2) в перицентромерном гетерохроматине и (3) в неак- тивной Х-хромосоме у млекопитающих. В клетках человека ферментом, опосредующим ме- тилирование НЗК27, является EZH2 — гомолог белка ENHANCER OF ZESTE [E(Z)J у Drosophila. Этот энзим EZH2 обнаруживается в ряде отдельных репрессив- ных комплексов Polycomb (PRCs), которые ассоции- руются со специфичными репрессивными элементами Polycomb-ДНК в промоторах у Drosophila (глава 11). Что «нацеливает» содержащие EZH2 комплексы на специфические гены у млекопитающих — неизвест- но, поскольку репрессивные элементы Polycomb не были идентифицированы. Однако «нацеливание» этих EZH2-K0MiuieKC0B может быть опосредовано рядом транскрипционных факторов, в том числе GAGA и МУС. Механизмы репрессии, осуществляемой EZH2, включают метилирование НЗК27 и рекрутирование белка Polycomb (Рс) к этому модифицированному сайту (как в модели 3 на рис. 10.1). Важным аспектом пути, ведущего к метилированию НЗК27, является предпо- ложение о его роли в раковых заболеваниях. В ряде раковых тканей, в том числе при раке груди и проста- ты, обнаружена сверхэкспрессия НЗК27 НКМТ EZH2 (Martin and Zhang, 2005). Метилирование Н4К20 Очень мало что известно, в механистическом плане, о роли этой модификации в контроле транскрипции Что очевидно, так это то, что в перицентромерном гетерох- роматине присутствуют Н4К20те2 и Н4К20теЗ и что ферментами НКМТ, опосредующими эти модификации, являются SUV4-20H1 и SUV4-20H2. Для метилирования Н4К20, по-видимому, требуется метилирование НЗК9. Еще одним ферментом, который может мономети- лировать Н4К20 у высших эукариот, является PR-Set7, для которого предполагается участие в митотических событиях. Наконец, имеются функциональные доказа- тельства того, что у почкующихся дрожжей метилиро- вание Н4К20 сцеплено с репарацией ДНК через связы- вание белка «контрольной точки» повреждений ДНК, CrB2 (Martin and Zhang). 4.2. Деметилирование лизинов До недавнего времени было неясно, происходит ли в клетке деметилирование лизинов в гистонах. Поиски таких ферментов оказались бесплодными, и имелись данные о том, что метильные группы в гетерохроматино- вых районах могут быть весьма стабильными. Открытие LSD1 все это изменило (Shi et al., 2004). Было показано, что этот белок является энзимом, который специфически удаляет метильные группы с НЗК4 и участвует в репрес- сии. LSD1 присутствует в ряде различных репрессорных комплексов, и некоторые из них позволяют ему более эффективно деметилировать лизиновые остатки из ну- клеосомного гистона НЗ (M.G. Lee et al., 2005; Shi et al., 2005). Специфичность LSD1 может изменяться, если он связывается с таким партнером, как рецептор андрогена (AR). Комплекс LSD 1-AR деметилирует НЗК9 вместо НЗК4 и в этих условиях активирует, а не репрессирует транскрипцию (Metzger et al., 2005). Недавно ]были идентифицированы пять новых де- метилаз, которые обладают общей каталитической структурой, отличной от LSD1 и названной JmjC- доменом (рис. 10.6). Ранее было предсказано, что этот домен обладает ферментативной активностью (Trewick et al., 2005). Было обнаружено, что эти новые деметила- зы деметилируют разные метильные состояния НЗК9 и H3K36. JHDM1 деметилирует H3K36mel и те2, а JHDM2A деметилирует H3K9mel и me2 (Tsukada et al., 2006; Yamane et al., 2006). Триметильное состояние этих двух модифицированных остатков удаляется от- дельным набором энзимов. JHDM3A и JHDM2A мо- гут действовать как на НЗКЗбтеЗ, так и на НЗК9теЗ (Cloos et al., 2006; Fodor et al., 2006; Klose et al., 2006; Tsukada et al., 2006; Whetstine et al., 2006). Возможно, вызывает удивление, что существуют ферменты, ко- торые могут одновременно деметилировать активную (например, НЗКЗбте) и репрессивную (например, НЗК9те) метку. Это можно объяснить с помощью не- давно обнаруженных данных о том, что метилирование НЗК9 ассоциируется также с активно транскрибируе- мыми генами (Vakoc et al., 2005). В более классическом механизме энзим JHDM2A рекрутируется с помощью AR к промоторам, где он участвует в активировании транскрипции через деметилирование НЗК9 (Yamane et al., 2006). Структурный анализ JHDM2A показал, что четыре разных домена (JmjN, JmjC, необычный «цинковый палец» и карбокситерминальный домен), объединяясь, образуют каталитический кор. Этими объединившимися доменами формируется глубокая щель, которая требует конформационного изменения в энзиме или субстрате, чтобы приспособить метиль- ную группу для деметилирования. Такой конформаци- онный сдвиг может объяснить специфичность демети- лирования (Chen et al., 2006). Интересно отметить, что од на из вновь открытых де- метилаз, JMJD2C, была прежде известна как GASCI — ген, амплифицированный в чешуйчатой карциноме. В соответствии с каузативной ролью этого энзима в развитии рака было показано, что сверхэкспрессия GASCI индуцирует клеточную пролиферацию (Cloos et al., 2006). Эти результаты в совокупности означают, что деметилазы, как и HKMTs, могут быть «мишеня- ми» для разработки противораковых лекарств (глава 24).
4. Метилирование Рис. 10.6. Деметилазы лизинов гистонов и сай- ты деметилирования на гистоне НЗ Сайты метилирования лизинов гистонов мо- гут быт моно-, ди- или триметил ированными. Известные деметилазы лизинов гистонов обладают различной специфичностью при деметилировании остатков гистонов или ме- тилированных состояний, как это изображено на рисунке 4.3. Метилирование аргининов метилирование выявляется очень скоро после прибытия Понимание важной роли метилирования аргининов Энзимов и совпадает с появлением активной RNA pol II гистонов в контроле транскрипции пришло после идентификации CARM1, фермента, который может метилировать аргинины в НЗ in vitro (Chen et al., 1999). In vivo метилирование аргининов было впоследствии продемонстрировано в экспериментах с использова- нием антител, специфичных к сайтам метилированных аргининов (Strahl et al., 2001; Wang et al., 2001; Bauer et al., 2002) Участие метилирования аргининов предполагают как в позитивной, так и в негативной регуляции транс- крипции. Две метилтрансферазы, PRMT1 (protein argi- nine methyl-transferse) и PRMT4/CARM1, были связаны с активацией транскрипции. PRMT1 обладает способ- ностью метилировать H4R3 (Strahl et al., 2001; Wang et al., 2001), тогда как PRMT4/CARM1 может катализиро- вать метилирование H3R2, H3R17 и H3R26 (Schurter et al., 2001; Bauer et al., 2002). Специфические транскрип- ционные факторы (NR, p53, YY1, NFKB) рекрутируют эти ферменты к специфическим промоторам, где они активируют транскрипцию. Напротив, PRMT5 (кото- рая может метилировать H3R8 и H4R3) действует как репрессор многочисленных генов, в том числе некото- рых генов, регулируемых МУС (Fabbrizio et al., 2002; Pal et al., 2003). Большинство наших сведений о метилировании арги- нинов мы получаем при анализе эстрогенного сигналь- ного пути, регулирующего ген pS2 ChlPs показали, что вслед за стимуляцией этого гена эстрогеном происходит сложная и цикличная последовательность событий.Сна- чала, в течение ближайших после стимула минут, рецеп- тор эстрогена рекрутируется к промотору pS2 и приносит с собой много белковых комплексов и энзимов, которые модифицируют гистоны (Metivier et al., 2003). Важным здесь оказывается рекрутирование CARM1 и PRMT1, которые могут метилировать аргининовые остатки ги- стонов НЗ и Н4 (Ma et al., 2001; Bauer et al., 2002). Это на промоторе. Удивительно однако, что уже спустя ми- нуты после этих событий метилирование по аргининам больше не обнаруживается специфическими антитела- ми, a RNA pol II исчезает. Вскоре после этого метили- рование аргининов и RNA pol II появляются вновь (Me- tivier et al., 2003; Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Причины этих циклических событий неизвестны. Одна из возможностей заключается в том, что они представ- ляют собой механизм быстрого отключения транскрип- ции, если эстрогеновый сигнал исчезает. Эксперименты, проделанные на реконструирован- ных хроматиновых матрицах, помогли установить пря- мую роль метилирования аргининов в экспрессии генов. Анализ опосредованной р53 активации транскрипции in vitro показал, что имеет место синергизм между метили- рованием, обусловленным PRMT1 и CARM1, и ацетили- рованием с помощью СВР/рЗОО (An et al., 2004). Более того, эти тесты подтвердили наблюдения, сделанные in vitro на гене pS2, согласно которым во время активации имеет место специфический порядок событий, в ходе ко- торых необходима последовательная активность PRMT1, СВР/рЗОО и CARMI (Metivier et al., 2003). С учетом того, что метилирование аргининов пред- ставляет собой такой динамический процесс, были описаны несколько способов, которыми контроли- руется эффективность метилтрансферазы аргининов. Во-первых, взаимодействие этого фермента с другим белком может контролировать его субстратную специ- фичность. Во-вторых, имеется возможность конкурен- ции между энзимами за данный аргининовый субстрат. И PRMT1, и PRMT5 могут метилировать H4R3, но пер- вый фермент является активатором, а второй — репрес- сором транскрипции. Третий уровень регулирования метильного состояния может осуществляться демети- лированием аргининов. Такая активность все еще не была выделена, но имеются четкие свидетельства бы-
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия строго исчезновения метильных групп из аргининов, что делает такую активность весьма привлекательной возможностью (Zhang and Reinberg, 2001; D.Y. Lee et al., 2005; Wysocka et al., 2006a). 5. Деиминирование Отсутствие деметилазы аргининов навело на мысль, что в качестве антагонистов метилирования аргининов могут выступать другие типы ферментативных реакций (Bannister et al., 2002). Одну из таких реакций представ- ляет деиминирование — процесс, посредством которого аргинин может быть превращен в цитруллин за счет удаления иминогруппы. Если данный аргинин моно- метилирован, удаление метиламина эффективно при- водило бы к удалению метильной группы из аргинина. В настоящее время показано присутствие цитруллина в гистонах, и идентифицирован фермент, PADI4, ко- торый может превращать аргинины в составе гистонов в цитруллины (Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Более того, появление цитруллина в гистонах НЗ и Н4 коррелирует с исчезновением метилирования аргинина in vivo. Кроме того, анализ регулируемых эстрогеном промоторов, где метилирование аргининов совпадает с активным состоянием транскрипции, показал, что ци- труллин появляется, когда промотор выключен. Многие вопросы относительно этой модификации остаются без ответа. Действует ли цитруллин таким образом, что подавляет активное метилирование по аргининам, или же он репрессирует транскрипцию путем активного рекрутирования белков? Как обстоит дело с обратимо- стью вставки цитруллина? Это несомненно происходит на промоторах с очень высокой скоростью, но есть ли это ферментативно катализируемая реакция или же это просто обусловлено замещением нуклеосомных гистонов гистоновыми вариантами, которые содержат аргинин на месте цитруллина? 6. Убиквитилирование/ деубиквитилирование и сумоилирование Убиквитин и SUMO — совершенно иные PTMs по сранению с ацетилированием, фосфорилированием и метилированием. В то время как эти последние PTMs представляют собою малые химические группы, Ub и SUMO — это крупные полипептиды, которые увеличи- вают размеры гистона приблизительно на две трети. Ub и SUMO на 18 % идентичны по нуклеотидной последо- вательности и имеют общую трехмерную структуру, но различаются по поверхностному заряду. Гистоны были первыми белками, для которых было показано, что они моноубиквитилированы, хотя точное положение Ub не было идентифицировано до сравни- тельно недавнего времени (Robzyk et al., 2000; Wang et al., 2004). Подобно метилированию и в отличие от аце- тилирования и фосфорилирования (и, возможно, су- моилирования) убиквитилирование может быть либо репрессивным, либо активирующим в зависимости от специфических сайтов. Н2А и Н2В моноубиквити- лированы, что контрастирует с полиубиквитилиро- ванием, ассоциированным с протеолизом. Влияние моноубиквитилирования на каждый коровый гистон противоположно (рис. 10.7). Моноубиквитилирование Н2В является активирующим для транскрипции, пре- образованной RNF20/RNF40 + UbcH6) (Wood et al., 2003; Kim et al., 2005; Zhu et al., 2005), и ведет к метили- рованию НЗК4, как описано в предыдущем разделе и в следующем разделе (Henry et al., 2003; Као et al., 2004). Эта последовательность событий, хотя пока еще не- понятная в механистическом плане, консервативна от дрожжей до человека (Kim et al., 2005; Zhu et al., 2005). С другой стороны, у млекопитающих H2AK119ubl яв- ляется репрессивным для транскрипции и катализиру- ется белком Bmil/Ringl из группы Polycomb (Wang et al., 2004). Нет никаких данных в пользу эволюционного консерватизма репрессивного H2Aub у дрожжей. До сих пор не идентифицирован ни один специфич- ный для гистонов белок, связывающий убиквитин. Однако поскольку было документировано, что много- численные домены взаимодействия с убиквитином связываются с негистоновыми убиквитилированными субстратами, кажется весьма вероятным, что будут об- наружены эффекторы для убиквитилированных гисто- нов. Однако они могут взаимодействовать иным обра- зом, чем взаимодействующие с хроматином домены для ацетилирования и метилирования; т.е., вероятно, име- ются два типа одновременных связывающих взаимо- действий; одно с поверхностью на убиквитине и другое взаимодействие внутри гистоновых последовательно- стей для обеспечения специфичности взаимодействия. Деубиквитилирование сайта Н2ВК123 участвует и в активации, и в поддержании гетерохроматинового сайленсинга через действие двух различных протеаз, ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕПРЕССИЯ Рис. 10.7. Сайты убиквитилирования гистонов и его последствия для регулирования транскрипции Убиквитилирование Н2А по Lys-119 коррелирует с репрессией транскрипции. Убиквитилирование Н2ВК123, наоборот, свя- зано с активацией транскрипции
7 Темы в модификациях Ubp8 и UbplO. Ubp8 является субъединицей комплекса ацетилирования гистонов, SAGA (Sanders et al., 2002), и действует вслед за убиквитилированием, производи- мым Rad6 (Henry et al., 2003; Daniel et al., 2004). Эта по- следовательность убиквитилирования H2B. за которым следует деубиквитилирование, необходима для уста- новления соответствующих уровней метилирования НЗК4 (требуется H2Bub) и H3K36 (H2Bub не требуется) (Henry et al., 2003). UbplO функционирует в «молчащих» районах, поддерживая низкие уровни НЗК4те и ацети- лирования лизинов НЗ/Н4, и таким образом помогает предотвращать транскрипцию (Emre et al., 2005; Gard- ner et al., 2005). Сумоилирование является единственной HPTM, описанной у дрожжей в качестве репрессивной, и оно консервативно у млекопитающих (Shiio and Eisenman, 2003). Его роль может сводиться, в целом, к негатив- ному действию по предотвращению действия акти- вирующих HPTMs. Это подавление активных HPTMs может осуществляться двумя механизмами. Во-первых, SUMO-гистон может прямо блокировать лизиновые сайты-субстраты, которые могут ацетилироваться или же сумоилироваться (как в модели 2 на рис. 10.1). Во- вторых, сумоилированные гистоны могут рекрутиро- вать HDACs как к хроматину (модель 3), так и через группу SUMO, которая оказывается на связанных с ДНК репрессорах. 7. Темы в модификациях Предшествовавшее обсуждение многочисленных типов и сайтов гистоновых РТМ, происходящих в транскрип- ции, могло бы привести к выводу, что всеохватывающих руководящих принципов или идей здесь немного. Тем не менее, по-видимому, действительно есть некоторое число широких тем, которые повторяются, хотя специфика может меняться в зависимости от гистона, сайтов НРТМ и связывающихся белков. Действительно, регулирование хроматина может варьировать в разных промоторах и отдельных путях. 7.1. Гистоновый код После этого затянувшегося обсуждения сложностей HPTMs возникает один ключевой вопрос: почему су- ществует так много модификаций? Несомненно, что многие из них коррелируют с транскрипцией, а другие происходят во время различных матрицируемых ДНК процессов. Таким образом, одна гипотеза заключается в том, что существует гистоновый «код», сопрягающий специфические модификации с индивидуальными про- цессами (Strahl and Allis, 2000; Turner, 2000). Простейшим кодом могло бы быть бинарное отношение между HPTMs и активацией либо репрессией генов и отдельные HPTMs для других процессов. Данными в пользу такого кода является, как описано выше, наблюдаемая тенденция для одних HPTMs быть позитивно действующими, а для других — негативно действующими. Однако имеются на- блюдения, которые не согласуются с простым бинарным кодом. Например, фосфорилирование H3S10 является как активирующим транскрипцию, что предположитель- но связано с раскрытием хроматина, так и участвующим в конденсации хромосом, делая хроматин еще более недоступным (Nowak and Corces, 2004). Аналогично этому недавно было показано, что уровень НЗК9те возрастает во время индукции генов (Vakoc et al., 2005) в дополнение к его хорошо охарактеризованной роли в гетерохроматиновом сайленсинге. Наконец, многие из одних и тех же HPTMs возникают как в транскрипции, так и в репарации ДНК, которые в механистическом плане являются разными процессами. На основе некоторых из этих соображений была предложена более общая гипотеза, где HPTMs служат в качестве ядерного ассоциированного с ДНК пути проведения сигнала, подобного цитоплазматическому проведению сигнала, которое генерируется и воспро- изводится* в основном через фосфорилирование Ser/ Thr (Schreiber and Bernstein, 2002). В этой модели имеет место не строгий гистоновый код, а скорее узнавание и связывание НРТМ благодаря изобилию связывающих белок мотивов. Эта модель объясняет, каким образом любой сайт мог бы быть и активирующим, и репресси- рующим и участвовать в более чем одном процессе, по- тому что различные связывающиеся эффекторные бел- ки имеют сродство к одной и той же НРТМ для разных процессов. 7.2. Паттерны модификаций Некоторые экспериментальные данные указывают на структурное изменение хроматина определенными HPTMs (модель 1). Это может быть результатом изме- нения заряда одного гистонового остатка или кластера таких остатков. Это особенно верно в тех случаях, когда остатки ацетилированы или фосфорилированы, что уменьшает положительный заряд участков гистона (см. раздел 5 главы 3). Такие см-изменения могут менять меж- нуклеосомные интервалы и снижать сродство гистонов к отрицательно заряженной ДНК, примером чего являются отрицательно заряженные пэтчи, встречающиеся на линкерном гистоне (Dou and Gorovsky, 2002). Эти типы HPTMs могут быт кумулятивными по своему влиянию, например, на транскрипционную активацию или для соз- дания хроматиновых структур более высокого порядка, а не для производства двоичного эффекта «включено/ выключено» (Kurdistani et al., 2004; Henikoff, 2005). Еще одна модель для «конечного результата» [«out- put»] мириад HPTMs сводится к тому, что код являет- ся сложным и считывается паттернами, а нередко и в форме временных последовательностей. Согласно этим взглядам, сложность паттернов в трехмерном простран- стве и на протяжении какого-либо процесса, требую- щего многих связанных с хроматином этапов, таких, например, как транскрипция, дает осмысленный ме- ханистический результат. Были идентифицированы два типа паттернов НРТМ. Во-первых, имеются паттерны на одном и том же гистоновом «хвосте», или в «cis»- конфигурации, и, во-вторых, паттерны на разных ги- стоновых «хвостах», или в «/гаи£»-конфигурации. Лучше всего охарактеризованный czs-паттерн находится между
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия H3S10ph и НЗК14ас на аминотерминальном «хвосте» (Cheung et al., 2000; Lo et al., 2000), где H3S10ph ведет к НЗКМас. Механизм, лежащий в основе установления этого паттерна, выяснен в структурных деталях: ацети- лирующий фермент связывается с предварительно фос- форилированным «хвостом» НЗ, проявляя повышенное сродство благодаря большему числу контактных точек аминокислотной боковой цепи (Clements et al., 2003). Другими cfs-паттернами являются ацетилирование H3K23 и метилирование H3R17 (Daujat et al., 2002) и метилирование H3R3 и ацетилирование Н4К8 (Wang et al., 2001). Как описано выше, был идентифицирован один /гал$-«хвостовой» паттерн, где первоначальное убикви- тилирование Н2ВК123 ведет к метилированию НЗК4 (Briggs et al., 2002; Dover et al., 2002; Sun and Allis, 2002). Механизм, связывающий эти HPTMs, не выяснен, хотя существуют несколько возможных гипотез. Поскольку это связь от одной большой модификации (убиквитин) к несоседней НТРМ, одна из моделей предполагает, что убиквитин, как перемычка, закрепляет хроматин в от- крытом состоянии [ubiquitin wedges the chromatin open, like a crowbar] и делает возможным доступ метилирую- щего энзима к его сайту. Вторая общая модель сводится к тому, что H2BK123ubl функционирует таким обра- зом, что рекрутирует эффекторные белки, аналогично роли других HPTMs. Некаталитическая часть протеасо- мы требует для ассоциации хроматина убиквитилиро- вания Н2В (Ezhkova and Tansey, 2004), и функциониро- вание элонгационного комплекса FACT стимулируется убиквитилированием Н2В (Pavriet al., 2006), хотя еще не было показано, чтобы какой-либо комплекс непосред- ственно связывался бы с убиквитилированием Н2В. 7.3. Изменения в структуре хроматина, связанные с активацией транскрипции и элонгацией Транскрипционно активные эухроматиновые районы содержат нуклеосомы, но в «развернутом» состоянии, обозначаемом как «бусинки на нити», или 11-наноме- тровая фибрилла. Нуклеосомы в этом состоянии все еще оказывают присущее им подавляющее влияние на транс- крипционную машину. Некоторые транскрипционные факторы, будь то активаторы или репрессоры, могут получать доступ к своим сайтам, когда они содержатся в нуклеосомах, но другие этого не могут. Более того, ап- парат, рекрутируемый связанными с ДНК регуляторами и ответственный за доставку RNA pol II к промоторам, ограничен присутствием нуклеосом. Ряд различных механизмов служит для реконфигурирования хрома- тина, приведения генов в готовность для последующей транскрипции или стимулирования инициации или элонгации. Некоторые из этих механизмов изображены на рис. 10.8. Проблема с нуклеосомами во время транскрипции отчасти решается рекрутированием белковых комплек- сов для мобилизации и (или) изменения структуры нуклеосом. Эти комплексы делятся на два разных се- мейства: одно представлено SNF2H (или ISW1 и ISW2 у дрожжей), а другое — семейством Brahma-Swi/Snf (Nar- likar et al., 2002; Peterson, 2002; Flaus and Owen-Hughes, 2004) Первое семейство мобилизует нуклеосомы, тогда как Swi/Snf также временно изменяет структуру ну- клеосом. Ацетилированные нуклеосомы распознаются комплексом Swi/Snf через взаимодействие с бромодо- меном (модель 1 на рис. 10.8). Вторым механизмом, участвующим в активации ге- нов, является избирательная утеря октамеров в промо- торах. Например, у S. cerevisiae октамеры гистонов вы- тесняются в промоторе гена РНО5 во время индукции транскрипции (модель 2 на рис. 10.8) (Boeger et al., 2003; Reinke and Horz, 2003) Кроме того, промоторы S. cerevi- siae обладают конститутивно низкой плотностью нукле- осом, что делает возможным доступ для транскрипцион- ных факторов (Sekinger et al., 2005). Все еще неизвестно, способствуют ли комплексы АТФ-зависимого ремоде- линга генерированию и поддержанию этого редкого раз- мещения, и если способствуют, то как они это делают. Третий главный механизм, участвующий в уста- новлении транскрипционных состояний, — это на- личие вариантов гистонов. Имеются два типа вариан- тов гистонов, ассоциирующихся с активностью генов. Во-первых, вариант Н2А, называемый H2AZ, обнару- живается в нуклеосомах вокруг вокруг свободного от нуклеосом участка промотора [the promoter gap] и под- готавливает ген к активации (Santisteban et al., 2000; Raisner et al., 2005; Zhang et al., 2005); специфичный комплекс АТФ-зависимого ремоделинга, называемый Swrl, замещает Н2А вариантом H2AZ (модель 3 на рис. 10.8) (Mizuguchi et al., 2004; дополнительные детали см. в главе 13). Во-вторых, одна из изоформ НЗ, называемая Н3.1, во время репликации инкорпорируется в хрома- тин, тогда как изоформа НЗ.З инкорпорируется не за- висящим от репликации образом (Ahmad and Henikoff, 2002), с помощью шаперона HIRA (histone regulator А). Этот вариант преимущественно обнаруживается вну- три ORFs генов (Mito et al., 2005), заставляя полагать, что его размещение является процессом, сочетанным с транскрипцией. Для преодоления нуклеосомного барьера для элон- гации RNA pol II (и RNA pol I) существуют допол- нительные механизмы. Было изолировано большое число факторов, влияющих на транскрипционную элонгацию (Sims et al., 2004). Обнаружили, что один из этих факторов позволяет RNA pol II преодолевать нуклеосомы. Этот фактор известен как FACT (аббре- виатура от Facilitate Chromatin Transcription). Важно, что FACT функционирует исключительно через по- средство нуклеосом, связывается с ними и затем стиму- лирует смещение одного димера Н2А/Н2В (модель 4 на рис. 10.8) (Belotserkovskaya et al., 2003). Коль скоро транскрипция прекращается, FACT также стимулиру- ет реконституцию нуклеосомы. Интересно, что FACT осуществляет свои функции в отсутствие энергии, но физически взаимодействует с CHD1, белком, кото- рый гидролизует АТФ для мобилизации нуклеосом и связывания с активной меткой НЗК4те. Более того, FACT также взаимодействует с NuA4 — комплексом, содержащим активность HAT. Хотя FACT может спо-
РЕПРЕССИРОВАН (ПО УМОЛЧАНИЮ) тело гена Swi/ Swi/ Snf Snf Модель 1: рекрутирование Swi/Snf и ремоделинг нуклеосом -я- Рис. 10.8. Модели участия ремоделинга хроматина и обмена гистонов в процессах транскрипции В модели 1 семейство АТФаз Swi/Snf связывается с хроматином посредством узнавания ацетили- рованных гистонов с помощью бромодомена и действует таким образом, чтобы изменить локальную структуру хроматина. Модель 2 изображает замещение октамера [the reported octamer eviction], происходящее в некоторых локусах, таких как РНО5, с помощью неиз- вестного механизма. В модели 3 АТФаза SWR1 катализирует замещение гистона Н2А вариан- том H2AZ, который подготавливает хроматин к транскрипции. В модели 4 делается акцент на участии FACT в транскрипционной элонгации, что способствует развертыванию [unraveling] за счет смещения димера Н2А/Н2В. Это может сопровождаться обменом гистона НЗ на НЗ.З в ходе этого процесса Модель 2: вытеснение октамеров -I-ННИ1 # • Модель 3: обмен вариантных гистонов Модель 4: рекрутирование FACT и потеря димера Н2А/ Н2В —# * Н2А J42AZ SwH Н2М42В Н217Н2В -ЫНИ ♦ H2AZ H2AZ собствовать смещению димера Н2А/Н2В in vitro неза- висимым от АТФ образом, возможно, что это стимули- руется его взаимодействием с такими факторами, как CHD1, которые мобилизуют или изменяют структуру нуклеосом in vivo, а также взаимодействие с HPTMs (Reinberg and Sims, 2006). 8. Заключительные замечания Мы прошли долгий путь в эту «современную эпоху» мо- дификаций гистонов, охватывающую последние 10 лет. В это время были охарактеризованы шесть разных типов путей модификации гистонов и идентифицированы многочисленные сайты модификаций Тем не менее оче- видно, что это все еше лишь начало нашего понимания проблемы. В механистическом плане нам известно, что модификации влияют на связывание белков, но мы все еще не знаем, как именно эти белки приводят к реор- ганизации структуры хроматина. Мы все еще не знаем, существует ли код или же модификации являются просто частью сигнального пути. Кроме того, у нас недостает знаний о многих клеточных процессах помимо транс- крипции, в которых могут участвовать модификации. Таким образом, говоря коротко, мы узнали о сложно- сти этой системы, но мы все еще далеки от понимания смысла этой сложности. Одно можно сказать наверняка: усилия оправданны, ибо модификации гистонов играют фундаментальную роль и в нормальных процессах, и в процессах, связанных с заболеваниями. Литература Ahmad К. and Henikoff S., 2002. The histone variant НЗ.З marks active chromatin by replication-independent nucleosome as- sembly. Mot Cell 9:1191-1200. An W., Kim J., and Roeder R.G., 2004. Ordered cooperative func- tions of PRMT1, p300, and CARMI in transcriptional activation by p53. Cell 117: 735-748. Baek S.H. and Rosenfeld M.G.. 2004. Nuclear receptor coregulators: Their modification codes and regulatory mechanism by transloca-
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия tion. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319: 707-714. Bannister A.J., Schneider R., and Kouzarides T, 2002. Histone modification: Dynamic or static? Cell 109: 801-806. Bannister A. J., Zegerman P., Partridge J. E, Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C., and Kouzarides T, 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Ware 410: 120-124. Bauer U.M., Daujat S., Nielsen S.J., Nightingale K., and Kouzarides T., 2002. Methylation at arginine 17 of histone H3 is linked to gene activation. EMBO Rep. 3: 39-44. Belotserkovskaya R., Oh S., Bondarenko V.A., Orphanides G., Studitsky V.M., and Reinberg D., 2003. FACT facilitates transcription-dependent nucleosome alteration. Science 301: 1090-1093. Boeger H., Griesenbeck J., Strattan J.S.. and Kornberg R.D., 2003. Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter. Mol. Cell 11: 1587-1598. Braunstein M., Rose A.B., Holmes S.G., Allis C.D., and Broach J.R. 1993. Transcriptional silencing in yeast is associated with reduced nucleosome acetylation. Genes Dev. 7: 592-604. Briggs S.D., XiaoT, SunZ.W., Caldwell J.A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Allis C.D., and Strahl B.D., 2002. Gene silencing: Trans- histone regulatory pathway in chromatin. Nature 418: 498. Brownell J.E., Zhou J.. RanalliT, Kobayashi R.. Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltrans- ferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851. Carrozza M.J., Li B., Florens L., Suganuma T, Swanson S.K., Lee K.K., Shia W.J., Anderson S., Yates J., Washburn M.P., and Workman J.L., 2005. Histone H3 methylation by Set2 directs deacetylation of coding regions by Rpd3S to suppress spurious intragenic transcription. Cell 123: 581-592. Chen D., Ma H., Hong H.. Koh S.S.. Huang S.M., Schurter B.T., Aswad D.W, and Stallcup M.R. 1999. Regulation of transcription by a protein methyltransferase. Science 284: 2174-2177. Chen Z., Zang J., Whetstine J., HongX., Davrazou E, Kutateladze T.G., Simpson M., Mao Q., Pan C.H., Dai S., et al., 2006. Structural insights into histone demethylation by JM JD2 family members. Cell 125: 691-702. Cheung P, Tanner K.G., Cheung W.L., Sassone-Corsi P, Denu J.M., and Allis CD., 2000. Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation. Mol. Cell 5: 905-915. Clark-Adams C.D., Norris D., Osley M.A., Fassler J.S., and Winston F. 1988. Changes in histone gene dosage alter transcription in yeast. Genes Dev. 2: 150-159. Clements A., Poux A.N., Lo W.S., Pillus L., Berger S.L., and Mar- morstein R., 2003. Structural basis for histone and phosphohis- tone binding by the GCN5 histone acetyltransferase. Mol. Cell 12: 461-473. Cloos PA., Christensen J.. Agger K., Maiolica A., Rappsilber J.. Antal T, Hansen K.H., and Helin K., 2006. The putative oncogene GASCI demethylates tri- and dimethylated lysine 9 on histone m. Nature 442:307-311. Cuthbert G.L., Daujat S., Snowden A.W, Erdjument-Bromage H., Hagiwara T, Yamada M., Schneider R., Gregory P.D., Tempst P, Bannister A.J., and Kouzarides T, 2004. Histone deimina- tion antagonizes arginine methylation. Cell 118: 545-553 Daniel J.A., Torok M.S., Sun Z.W, Schieltz D., Allis C.D., Yates J.R., III, and Grant PA., 2004. Deubiquitination of histone H2B by a yeast acetyltransferase complex regulates transcription. J. Biol. Chem. 279: 1867-1871. Daujat S., Bauer U.M., Shah V, Turner B., Berger S., and Kouza- rides T, 2002. Crosstalk between CARM1 methylation and СВР acetylation on histone H3. Curr. Biol. 12:, 2090-2097. Dhalluin C., Carlson J.E., Zeng L., He C, Aggarwal A.K., and Zhou M.M. 1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature 399: 491-496. Dou Y. and Gorovsky M.A., 2002. Regulation of transcription by H1 phosphorylation in Tetrahymena is position independent and requires clustered sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 6142-6146. Dover J., Schneider J., Tawiah-Boateng M.A., Wood A., Dean K, Johnston M., and Shilatifard A., 2002. Methylation ofhistone H3 by COMPASS requires ubiquitination ofhistone H2B by Rad6 J. Biol. Chem. 277:28368-28371. Durrin L.K., Mann R.K., Kayne PS., and Grunstein M. 1991. Yeast histone H4 N -terminal sequence is required for promoter activa- tion in vivo. Cell 65: 1023-1031. Emre N.C., Ingvarsdottir K., Wyce A., Wood A., Krogan N. J., Henry K.W, Li K., Marmorstein R., Greenblatt J.F., Shilatifard A, and Berger S.L., 2005. Maintenance of low histone ubiquitylationby UbplO correlates with telomere-proximal Sir2 association and gene silencing. Mol. Cell 17: 585-594. Ezhkova E. and Tansey W.P., 2004. Proteasomal ATPases link ubiq- uitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Mol. Cell 13: 435-442. Fabbrizio E., El Messaoudi S., Polanowska J., Paul C., Cook J.R., Lee J.H., Negre V, Rousset M., Pestka S., Le Cam A., and Sardet C., 2002. Negative regulation of transcription by the type II ai’ginine methyltransferase PRMT5. EMBO Rep. 3: 641-645. Fischle W, Tseng B.S., Dormann H.L., Ueberheide B.M., Garcia B.A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Funabiki H., and Allis C.D., 2005. Regulation of HP 1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature 438: 1116-1122. Flaus A. and Owen-Hughes T, 2004. Mechanisms for ATP-depen- dent chromatin remodelling: Farewell to the tuna-can octamer? Curr. Opin. Genet Dev. 14: 165-173. Fodor B.D., Kubicek S., Yonezawa M., O’Sullivan R.J., Sengupta R., Perez-Burgos L., Opravil S., Mechtler K., Schotta G., and Jenuwein T, 2006. Jmjd2b antagonizes H3K9 tnmethylation at pericentric heterochromatin in mammalian cells. Genes Dev., 20:1557-1562. Gardner R.G., Nelson Z.W, and Gottschling D.E., 2005. UbplO/ Dot4p regulates the persistence of ubiquitinated histone H2B: Distinct roles in telomeric silencing and general chromatin. Mol. Cell. Biol. 25:6123-6139. Glozak M.A., Sengupta N., ZhangX., and Seto E., 2005. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene 363: 15-23. Grant P.A., Sterner D.E., Duggan L.J., Workman J.L., and Berger S.L. 1998. The SAGA unfolds: Convergence of transcription regulators in chromatin-modifying complexes. Trends Cell Biol. 8:193-197. Hall I.M., Shankaranarayana C.D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., and Grewal S.L, 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237. Hampsey M. and Reinberg D., 2003. Tails of intrigue: Phosphoryla- tion of RNA polymerase II mediates histone methylation. Cell 113: 429-432. Han M. and Grunstein M. 1988. Nucleosome loss activates yeast downstream promoters in vivo. Cell 55: 1137-1145.
Hassan A.H., Prochasson R, Neely K.E., Galasinski S.C, Chandy M., Carrozza M.J., and Workman J.L., 2002. Function and selectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes. Cell 111: 369-379. Hebbes T.R., Clayton A.L., Thome A.W., and Crane-Robinson C. 1994. Core histone hyperacetylation со-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBO J. 13: 1823-1830. Henikoff S., 2005. Histone modifications: Combinatorial complexity or cumulative simplicity? Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 5308-5309. Henry K.W., Wyce A., Lo W.S., Duggan L.J., Emre N.C., Kao C.F., Pillus L., Shilatifard A., Osley M.A., and Berger S.L., 2003. Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquityla- tion and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8. Genes Dev. 17: 2648-2663. Hirota T, Lipp J.J., Toh B.H., and Peters J.M., 2005. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora В causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature 438: 1176-1180. Jenuwein T and Allis C.D., 2001. Translating the histone code Sci- ence 293: 1074-1080. Joshi A.A. and Struhl K., 2005. Eaf3 chromodomain interaction with methylated H3-K36 links histone deacetylation to Pol II elongation. Mol. Cell, 20: 971-978. Kao C.F., Hillyer C., Tsukuda T, Henry K., Berger S., and Osley M.A, 2004. Rad6 plays a role in transcriptional activation through ubiquitylation of histone H2B. Genes Dev. 18: 184-195. Keogh M.C., Kurdistani S.K., Morris S.A., Ahn S.H., Podolny V, Collins S.R., Schuldiner M.. Chin K., Punna T, Thompson N.J., et al., 2005. Cotranscriptional set2 methylation of histone H3 lysine 36 recruits a repressive Rpd3 complex. Cell 123: 593- 605. Kim J., Hake S.B., and Roeder R.G., 2005. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Mol. Cell, 20: 759-770. Klose R.J., Yamane K., Bae Y, Zhang D., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Wong J., and Zhang Y, 2006. The transcriptional repressor JHDM3A demethylates trimethyl histone H3 lysine 9 and lysine 36. Nature 442: 312-316. Kurdistani S.K. and Grunstein M., 2003. Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4: 276-284. Kurdistani S.K., Tavazoie S., and Grunstein M., 2004. Mapping global histone acetylation patterns to gene expression Cell 117: 721-733. Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T, 2001. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120. Lee D.Y., Teyssier C, Strahl B.D., and Stallcup M.R., 2005. Role of protein methylation in regulation of transcription. Endocr, Rev. 26:147-170. Lee M.G., Wynder C., Cooch N., and Shiekhattar R., 2005. An essential role for CoREST in nucleosomal histone 3 lysine 4 demethylation. Nature 437: 432-435. Li H., Ilin S., Wang W, Duncan E.M., Wysocka J., Allis C.D., and Patel D.J., 2006. Molecular basis for site-specific read-out of histone H3K4me3 by the BPTF PHD finger of NURF. Nature 442:91-95. Litt M.D., Simpson M., Gaszner M., Allis C.D., and Felsenfeld G., 2001. Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293: 2453-2455. Lo W.S., Duggan L., Emre N.C, Belotserkovskya R., Lane W.S., Shiekhattar R., and Berger S.L., 2001. Snfl — A histone kinase that works in concert with the histone acetyltransferase Gcn5 to regulate transcription. Science 293: 1142-1146. Lo W.S., Trievel R.C, Rojas J.R., Duggan L., Hsu J.Y., Allis C.D., Marmorstein R., and Berger S.L., 2000. Phosphorylation of ser- ine 10 in histone H3 is functionally linked in vitro and in vivo to Gcn5-mediated acetylation at lysine 14. Mol. Cell 5: 917-926. Ma H., Baumann C.T., Li H., Strahl B.D., Rice R., Jelinek M.A., Aswad D.W, Allis C.D., Hager G.L., and Stallcup M.R., 2001. Hormone-dependent, CARMI-directed, arginine-specific methylation of histone H3 on a steroid-regulated promoter. Curr. Biol. 11: 1981-1985. Macdonald N., Welbum J.P., Noble M.E., Nguyen A., Yaffe M.B., Clynes D., Moggs J.G., Orphanides G., Thomson S., Edmunds J.W, et aL, 2005. Molecular basis for the recognition of phos- phorylated and phosphoacetylated histone H3 by 14-3-3. Mol. Cell, 20: 199-211. Mahadevan L.C., Willis A.C., and Barratt M.J. 1991. Rapid histone H3 phosphorylation in response to growth factors, phorbol esters, okadaic acid, and protein synthesis inhibitors. Cell 65: 775-783. Martin C. and Zhang Y, 2005. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6: 838-849. Metivier R., Penot C., Hubner M.R., ReidC., Brand H., Kos M., and Gannon F., 2003. Estrogen receptor-* directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell 115: 751-763. Metzger E., Wissmann M., Yin N., Muller J.M., Schneider R., Pe- ters A. H., Gunther T, Buettner R., and Schule R., 2005. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen- receptor-dependent transcription. Nature 437: 436-439. Mito Y., Henikoff J.G., and Henikoff S., 2005. Genome-scale profiling of histone НЗ.З replacement patterns. Nat. Genet. 37: 1090-1097. Mizuguchi C., Shen X., Landry J., Wu W.H., Sen S., and Wu C., 2004. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant cata- lyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science 303: 343-348. Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.L, 2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic con- trol of heterochromatin assembly. Science 292: 110-113. Narlikar G.J., Fan H.Y., and Kingston R.E., 2002. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and tran- scription. Cell 108: 475-487. Noma K., Allis C.D., and Grewal S.L, 2001. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293: 1150-1155. Nowak S.J. and Corces V.G., 2004. Phosphorylation of histone H3: A balancing act between chromosome condensation and tran- scriptional activation. Trends Genet., 20: 214-220. Pal S., Yun R., Datta A., Lacomis L., Erdjument-Bromage H., Ku- mar J., Tempst P, and Sif S., 2003. mSin3A/histone deacetylase 2- and PRMT5-containing Brgl complex is involved in transcrip- tional repression of the Мус target gene cad. Mol. Cell. Biol. 21: 7475-7487. Pavri R., Zhu B., Li G., Trojer P, Mandal S., Shiiatifard A., and Reinberg D., 2006. Histone H2B monoubiquitination func- tions cooperatively with FACT to regulate elongation by RNA polymerase II. Cell 125: 703-717.
Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия Peterson C.L., 2002. Chromatin remodeling: Nucleosomes bulging at the seams. Curr. Biol. 12: R245-R247. Raisner R.M., Hartley P.D., Meneghini M.D., Bao M.Z., Liu C.L., Schreiber S.L., Rando O.J., and Madhani H.D., 2005. Histone variant H2A.Z marks the 5’ ends of both active and inactive genes in euchromatin. Cell 123: 233-248. Rea S., Eisenhaber E, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W, Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P, Allis C.D., and Jenu- wein T., 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599. Reinberg D. and Sims R.J., III., 2006. de FACTo nucleosome dy- namics. J. Biol. Chem.(in press). Reinke H. and Horz W, 2003. Histones are first hyperacetylated and then lose contact with the activated PHO5 promoter. Mol. Cell 11: 1599-1607. Robzyk K., Recht J., and Osley M.A., 2000. Rad6-dependent ubiq- uitination of histone H2B in yeast. Science 287: 501-504. Roth S.Y., Demi J.M., and Allis C.D., 2001. Histone acetyltrans- ferases. Annu. Rev. Biochem. 70: 81-120. Sanders S.L., Jennings J., Canutescu A., Link A.J., and Weil P.A., 2002. Proteomics of the eukaryotic transcription machinery: Identification of proteins associated with components of yeast TEIID by multidimensional mass spectrometry. Mol. Cell. Biol. 22: 4723-4738. Santisteban M.S., Kalashnikova T, and Smith M.M., 2000. Histone H2A.Z regulates transcription and is partially redundant with nucleosome remodeling complexes. Cell 103: 411-422. Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzarides T, 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 419: 407-411. Sassone-Corsi P, Mizzen C.A., Cheung P, Crosio C, Monaco L., Jacquot S., Hanauer A., and Allis C.D. 1999. Requirement of Rsk-2 for epidermal growth factor-activated phosphorylation of histone H3. Science 285: 886-891. Schreiber S.L. and Bernstein B.E., 2002. Signaling network model of chromatin. Cell 111: 771-778. Schurter B.T., Koh S.S., Chen D., Bunick G.J., Harp J.M., Hanson B.L, Henschen-Edman A., Mackay D.R., Stallcup M.R., and Aswad D.W., 2001. Methylation of histone H3bycoactivator-asso- ciated arginine methyltransferase 1. Biochemistry №. 5747-5756. Sekinger E.A., Moqtaderi Z., and Struhl K., 2005. Intrinsic histone- DNA interactions and low nucleosome density are important for preferential accessibility of promoter regions in yeast. Mol. Cell 18:735-748. Shi Y, Lan E., Matson C., Mulligan P, Whetstine J.R., Cole P.A., Ca- sero R.A., and Shi Y, 2004. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953. Shi Y.J., Matson C., Lan E., Iwase S., Baba T, and Shi Y, 2005. Regulation of LSD 1 histone demethylase activity by its associated factors. Mol. Cell. 19: 857-864. Shiio Y. and Eisenman R.N., 2003. Histone sumoylation is associ- ated with transcriptional repression. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 13225-13230. Shim E.Y, Woodcock C., and Zaret K.S. 1998. Nucleosome posi- tioning by the winged helix transcription factor HNF3. Genes Dev. 12: 5-10. Shogren-Knaak M., Ishii H., Sun J.M., Pazin M.J., Davie J.R., and Peterson C.L., 2006. Histone H4-K16 acetylation controls chro- matin structure and protein interactions. Science 311: 844-847. Sims. R.J.. Belotserkovskaya R., and Reinberg D., 2004. Elongation by RNA polymerase II: The short and long of it. Genes Dev. 18: 2437-2468. Sims R.J., Chen C.F., Santos-Rosa H., Kouzarides T, Patel S.S., and Reinberg D., 2006. Human but not yeast CHD1 binds directly and selectively to histone H3 methylated at lysine 4 via its tandem chromodomains. J. Biol. Chem. 51: 41789-41792. Soloaga A., Thomson S., Wiggin G.R., Rampersaud N., Dyson M.H., Hazzalin C.A., Mahadevan L.C., and Arthur J.S., 2003. MSK2 and MSK1 mediate the mitogen- and stress-induced phosphory- lation of histone H3 and HMG-14. EMBO J. 22: 2788-2797. Sterner D.E. and Berger S.L., 2000. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:435- 459. Strahl B.D. and Allis C.D., 2000. The language of covalent histone modifications. Nature 403: 41-45. Strahl B.D., Briggs S.D., Brame C.J., Caldwell J.A., Koh S.S., Ma H., Cook R.G., Shabanowitz J., Hunt D.E., Stallcup M.R., and Allis C.D., 2001. Methylation of histone H4 at arginine 3 oc- curs in vivo and is mediated by the nuclear receptor coactivator PRMT1. Curr. Biol. 26: 996-1000. Sun Z.W and Allis C.D., 2002. Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418: 104-108. Svaren J., Schmitz J., and Horz W. 1994. The transactivation domain of Pho4 is required for nucleosome disruption at the PHO5 pro- moter. EMBO J. 13:4856-4862. Taunton J., Hassig C.A., and Schreiber S.L. 1996. A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p. Science 111:408-411. Trewick S.C., McLaughlin P.J., and Allshire R.C., 2005. Methylation: Lost in hydroxylation? EMBO Rep. 6: 315-320. Tsukada Y, Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borch- ers C.H., Tempst P, and Zhang Y, 2006. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. Nature 439: 811-816. Turner B.M., 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22: 836-45. Vakoc C.R., Mandat S.A., Olenchock B.A., and Blobel G.A., 2005. Histone H3 lysine 9 methylation and HP1* are associated with transcription elongation through mammalian chromatin. Mol. Cell 19:381-391. Vettese-Dadey M., Grant P.A., Hebbes T.R., Crane-Robinson C, Allis C.D., and Workman J.L. 1996. Acetylation of histone H4 plays a primary role in enhancing transcription factor binding to nucleosomal DNA in vitro. EMBO J. 15: 2508-2518. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.L, and Mar- tienssen R.A., 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837. Wang H., Wang L., Erdjument-Bromage H., Vidal M., Tempst P, Jones R.S., and Zhang Y, 2004. Role of histone H2A ubiquitina- tion in Polycomb silencing. Nature 431: 873-878. Wang H., Huang Z.Q., Xia L., Feng Q., Erdjument-Bromage H., Strahl B.D., Briggs S.D., Allis C.D., Wmg J., Tempst P, and Zhang Y, 2001. Methylation of histone H4 at arginine 3 facili- tating transcriptional activation by nuclear hormone receptor. Science 293: 853-857. Wang Y, Wysocka J., Sayegh J., Lee Y.H., Perlin J.R., Leonelli L., Sonbuchner L.S., McDonald C.H., Cook R.G., Dou Y, et al.,
2004. Human PAD4 regulates histone arginine methylation levels via demethylimination. Science 306: 279-283. Whetstine J.R., Noffice A., Lan E, Huarte M., Smolikov S., Chen Z., Spooner E., Li E., Zhang G., Colaiacovo М.» and Shi Y, 2006. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family ofhistone demethylases. Cell 125: 467-481. Wood A., Krogan N.J., Dover J., Schneider J., Heidt J., Boateng M.A., Dean K., Golshani A., Zhang Y, Greenblatt J.E, et al., 2003. Brel, an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Mol. Cell 11: 267- 274. Workman J.L. and Roeder R.G. 1987. Binding of transcription factor TFIID to the major late promoter during in vitro nucleosome assembly potentiates subsequent initiation by RNA polymerase II. Cell 51: 613-622. Wysocka J., Allis C.D., and Coonrod S., 2006a. Histone arginine methylation and its dynamic regulation. Front. Biosci. 11: 344- 355. Yamane K., Toumazou C., Tsukada Y, Erdjument-Bromage H., Tempst P., Wong J., and Zhang Y, 2006. JHDM2A, a JmjC- contaimng H3K9 demethylase, facilitates transcription activation by androgen receptor. Cell 125: 483-495. Yang X.J. and Seto E., 2003. Collaborative spirit ofhistone deacety- lases in regulating chromatin structure and gene expression. Curr. Opin. Genet. Dev. 13: 143-153. Zhang H., Roberts D.N., and Cairns B.R., 2005. Genome-wide dynamics of Htzl, a histone H2A variant that poises repressed/ basal promoters for activation through histone loss. Cell 123: 219-231. Zhang Y. and Reinberg D., 2001. Transcription regulation by histone methylation: Interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15: 2343-2360. Zhu B., Zheng Y, Pham A.D., Mandal S.S., Erdjument-Bromage H., Tempst P., and Reinberg D., 2005. Monoubiquitination of human histone H2B: The factors involved and their roles in HOX gene regulation. Mol. Cell, 20: 601-611.
ГЛАВА 11 ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ САЙЛЕНСИНГ, ОСУЩЕСТВИ Я ЕМ Ы Й БЕЛКАМИ ГРУППЫ POLYCOMB Ueli Grossniklaus1 и Renato Paro2 institute of Plant Biology and Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich, CH-8008 Zurich, Swizerland 2ZMBH, University of Heidelberg, D-69120 Heidelberg, Germany Содержание Общее резюме 1. Введение 1.1. Концепция клеточной памяти 1.2. Генетическая идентификация группы Poly- comb 2. Установка меток сайленсинга на хроматин 2.1. Компоненты PRC2 и его эволюционный кон- серватизм 2.2. Модифицирующая хроматин активность PRC2 2.3. Динамическая функция PRC2 в развитии 3. Поддержание транскрипционного сайленсинга 3.1. Компоненты PRC1 3.2. «Нацеливание» PRC1 на сайленсированные гены 3.3. Установление репрессивных функций с по- мощью PRC1 3.4. Предотвращение наследуемой репрессии антисайленсингом 4. Репрессия PcG в развитии млекопитающих 4.1. От репрессии гена к репрессии хромосомы 4.2. Последствия аберрантной активации транс- крипции 4.3. Поддержание судьбы стволовой клетки 5. Заключение и перспективы Литература
ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Органы человека, животных и растений сконструирова- ны из большого набора разных клеточных типов, каждый из которых выполняет специальную физиологическую или структурную функцию За очень немногими исклю- чениями все типы клеток содержат одну и ту же генети- ческую информацию, закодированную в их ДНК. Таким образом, отличие данного клеточного типа от других достигается посредством специфических программ экс- прессии генов. Однако линии клеток нуждаются в том, чтобы поддерживать эти программы экспрессии генов в ходе своего роста и клеточного деления. Это предпо- лагает существование системы памяти, обеспечивающей надежную передачу от материнской клетки к дочерним, информации о том, какой ген должен быть активным, а какой репрессированным. Существование такой систе- мы иллюстрируется тем фактом, что культивируемые ткани растений и животных обычно поддерживают свои дифференцированные признаки даже при росте в чужеродной среде. Можно привести в качестве примера, что растения плюща обыкновенного, регенерировавшие после тканевой культуры, продуцируют тип листьев, соответствующий фазе развития, в которой была взята исходная ткань (т.е. ювенильный или взрослый лист). Основной вопрос, рассматриваемый в этой и после- дующих главах, касается молекулярной идентичности факторов, вносящих вклад в механизм (или механиз- мы), поддерживающий детерминированные состоя- ния в ряду многих клеточных делений (процесс, назы- ваемый «клеточной памятью» или «транскрипционной памятью»). Генетический анализ у Drosophila позволил идентифицировать регуляторы, играющие критическую роль в поддержании судьбы индивидуальных сегментов тела и детерминируемые действием генов НОХ. У сам- цов Drosophila первый торакальный сегмент имеет ноги с половыми гребешками. Ноги на втором и третьем то- ракальном сегменте не имеют этих структур (см. левую часть рисунка на титульной странице). В 1940-е годы у Drosophila были идентифицированы мутанты {Polycomb и extra sex comb), у которых самцы имели половые греб- ни на всех ногах (см. правую часть рисунка на титульной странице). Они соответствуют гомеотическим транс- формациям идентичностей второй и третьей пары ног в идентичность первой пары ног. Генетические и молеку- лярные исследования показали, что эти мутации сами по себе не влияют на продукты самих генов НОХ\ ско- рее, они влияют на способ, которым активность генов НОХ контролируется пространственно. На протяжении ряда лет было идентифицировано большое число та- ких регуляторных генов, которые можно было разбить на две антагонистические группы — Poly comb (PcG) и trithorax (trxG). В то время как белки PcG необходимы для поддержания сайленсированного состояния ре- гуляторов развития, таких как гены НОХ, белки trxG обычно участвуют в поддержании активного состояния экспрессии генов. Таким образом, белки PcG и trxG об- разуют молекулярную основу клеточной памяти. Белки PcG и trxG организованы в крупные муль- тимерные комплексы, которые действуют на их гены- мишени, модулируя структуру хроматина В этой главе мы делаем акцент на молекулярной природе и функции двух главных репрессивных комплексов группы Poly- comb, PRC1 и PRC2; молекулярная природа комплек- сов trxG описывается в следующей главе. Комплексы PcG рекрутируются к генам-мишеням посредством нуклеотидной последовательности ДНК, называемой у Drosophila «Элементом ответа» PcG (PRE, PcG Response Element). Будучи рекрутированы, они устанавливают состояние «молчащего» хроматина, которое может на- следоваться в ряду многих клеточных делений. Члены PRC2 консервативны у растений и животных, тогда как PRC1 присутствуют только у Drosophila и позвоночных. Это предполагает консерватизм, но и разнообразие в основных строительных блоках системы клеточной памяти. В дополнение к их функции в поддержании клеточных типов комплексы PcG могут также играть важную роль в пластичности стволовых клеток. Их де- регуляция может приводить к неопластической транс- формации и раку у позвоночных. Таким образом, белки PcG играют ключевую роль во многих фундаменталь- ных процессах нормального развития и заболеваний у многоклеточных эукариот. 1. Введение Все многоклеточные организмы начинаются с одной клетки, зиготы, которая в ходе развития дает начало множеству различных клеточных типов со специализи- рованными функциями. Это ставит перед нами пробле- му: каким образом, будучи однажды детерминированы, клеточные типы могут поддерживаться на протяжении многих клеточных делений, происходящих в различных фазах роста? 1.1. Концепция клеточной памяти Взрослое животное обладает 200—300 структурно различ- ными клеточными типами, тогда как растение — где-то между 30 и 40. Если принять во внимание сложные пат- терны экспрессии генов, можно различить еще большее число разных клеточных популяций. Идентичность и функция данного клеточного типа определяются харак- терным для него профилем экспрессии генов, где соот- ветствующие группы генов являются либо активными, либо «молчащими». В ходе развития и в состоянии гомео- стаза взрослого организма критически важно помнить и надежно воспроизводить это состояние после каждого клеточного деления. Это особенно важно во время репли- кации генетического материала (фаза S) и расхождения хромосом в митозе (фаза М), которые являются собы- тиями, повторяющимися в каждом клеточном цикле и прерывающими процессы экспрессии генов Итак, каким же образом дифференциальные паттерны генной экспрессии могут поддерживаться от одного клеточного поколения до следующего? Мы знаем из экспериментов, проделанных в 1960— 1970-е годы, что ткани растений и животных «помнят» свое детерминированное состояние даже после продол- жительных пассажей в культуре (Hadom, 1968; Hackett
Глава 11 Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb et aL, 1987). Хадорн и сотрудники показали что клетки имагинальных дисков, обнаруживаемых в личинках Drosophila, обладают присущей им клеточной памя- тью, что позволяет им помнить состояния детермина- ции, фиксированные в эмбриогенезе. Имагинальные диски — это кластеры эпителиальных клеток, обосо- бливающиеся в развивающемся эмбрионе в качестве предшественников специфичных внешних структур и придатков во время метаморфоза. Например, из двух пар имагинальных дисков во втором торакальном сегмен- те одна образует среднюю пару ног, а другая — крылья (рис. 12.2). Имагинальные диски можно культивиро- вать путем трансплантации в гемоцель взрослых самок, где они продолжают пролиферировать, но не диффе- ренцируются. Когда такой диск пересаживают обратно в личинку перед началом метаморфоза, он в конечном счете дифференцируется в ожидаемые структуры взрос- лого организма даже после нескольких трансплантаци- онных пассажей. Позже было показано, что для под- держания этого детерминированного состояния клеток имагинальных дисков необходимы белки PcG и trxG (рис. 11.1). Однако в описанных выше экспериментах с культивированием наблюдали, что в редких случа- ях имагинальный диск может изменить свою судьбу в результате процесса, названного трансдетерминацией. Этот процесс включает даун-регуляцию репрессии PcG сигнальным каскадом INK в трансдетерминированных клетках (рис. 11.2а, б) (Lee et al., 2005). Мутанты по PcG также имеют повышенную частоту трансдетермина- ции, что, опять-таки, говорит в пользу роли белков PcG в поддержании судьбы имагинальных дисков (Klebes et al., 2005). Таким образом, белки PcG, по-видимому, играют ключевую роль в репрограммировании клеточ- ных судеб как в ходе нормального развития, так и в про- цессах регенерации (дополнительные детали см в раз- деле 4 3 далее в этой главе) 1.2. Генетическая идентификация группы Polycomb У всех многоклеточных передне-задняя ось специфици- руется посредством определенных паттернов экспрессии генов НОХ(рис. 12.2). У Drosophila во время эмбриогенеза активность произведенных матерью (т.е. унаследованных через ооцит) и произведенных в зиготе транскрипцион- ных факторов генерирует специфическую комбинацию экспрессии НОХ, необходимую для каждого сегмента. Этот сегмент-специфичный профиль активности генов НОХ поддерживается на протяжении всего развития мухи, спустя долгое время после того как исчезли регу- ляторы ранней транскрипции. Когда функция генов НОХ была охарактеризована генетически, были изолированы многие Zra/75-действующие регуляторы. Среди них Пам и Эд Льюс (Lewis, 1978) идентифицировали и генети- чески проанализировали Polycomb {Рс). Гетерозиготные мутантные по Рс самцы имели дополнительные половые гребешки на второй и третьей паре ног, тогда как самцы дикого типа несли половые гребешки только на первой паре ног (см. рисунок на титульной странице этой главы). Гомозиготные мутанты были детальны на стадии эмбрио- на, демонстрируя трансформацию всех кутикулярных сегментов в направлении самого заднего абдоминального выкл. Рис. 11.1. Концепция клеточной памяти Схема, иллюстрирующая участие комплексов PcG и trxG в детерминации активного и репрессированного состояний экспрессии генов и, тем самым, клеточной дифференцировки, которая поддерживается на протяжении многих клеточных делений: (ТА) транскрипционный активатор; (TR) транскрипционный репрессор
Рис. 11.2. Гомеотические трансформации у PcG-мутантов разных видов (а-г) Drosophila melanogaster, (д, е) Mus muse ulus, {ж, з) Arabidopsis thaliana. {а, б) Ножные имагинальные диски, претерпевающие трансдетерминацию, на что указывает экспрессия крыло-специфического гена vestigial (маркированного GFP). (в, г) Кутикулы эмбриона дикого типа (в) и мутанта Su(z)12 (г). У мутантного эмбриона Su(z)12 все абдоминальные, торакальные и несколько головных сегментов (не все из них видны в этой фокальной плоскости) гомеотически трансформированы в копии восьмого аб- доминального сегмента благодаря нарушенной экспрессии гена Abd-B в каждом сегменте, (д, е) Осевой скелет новорожденных мышей дикого типа (д) и RinglA-/- (е) Вид торакальных районов очищенных скелетов, показывающий кости (красный цвет) и хрящ (синий цвет). Мутант обнаруживает переднюю трансформацию восьмых торакальных позвонков, на что указывает наличие восьми (1—8) вертебростернальных ребер вместо семи (1—7), как у дикого типа, (ж, з) Цветок дикого типа (ж) и мутанта clf-2 (з). Цветок дикого типа демонстрирует нормальное расположение чашелистиков, лепестков, тычинок и плодолистиков. У цветка clf-2 лепестки отсутствуют или число их уменьшено, (а.б, с любезно предоставлено N. Lee and R. Paro; в, г, перепечатка, с любезного разрешения, из Birve et al., 2001 [©Company of Biologists Ltd.]; д, e, перепечатка, с любезного разрешения, из del Mar Lorente et al., 2000 [©Company of Biologists Ltd.]; з, любезно предоставлено J. Goodrich) сегмента (рис. 11.2в, г). Эти классические фенотипы PcG были интерпретированы как обусловленные экто- пической экспрессией генов НОХ. Таким образом, Рс и другие гены со сходными фенотипами были определены как репрессоры активности генов НОХ. Впоследствии детальный анализ позволил обнаружить, что белки PcG требуются лишь для поддержания репрессии НОХ, а не для установления активности НОХв ходе формирования паттерна, специфичного по отношению к положению Эта последняя задача выполняется транскрипционными факторами, закодированными в рано действующих генах сегментации. На основе их репрессирующего или акти- вирующего влияния на экспрессию генов НОХэт вновь идентифицированные /гаия-действуюшие регуляторы были разделены на два антагонистических класса, PcG и trxG, соответственно (рис. 11.1) (Kennison, 1995). Молекулярное выделение генов PcG Drosophila сде- лало возможным изучение функции ортологов позво- ночных у мышей, где они также оказались ключевыми регуляторами экспрессии генов НОХ(van der Lugt et al., 1994; Core et al., 1997). У млекопитающих мутации в ге- нах PcG приводят к гомеотическим трансформациям позвонков (Рис. 11.2д, е). Кроме того, гены PcG играют ключевую роль в контроле клеточной пролиферации, поддержания стволовых клеток и рака (см. разделы 4.2 и 4.3 далее в этой главе). Замечательный консерватизм генов PcG у мух и млекопитающих облегчил биохими- ческий анализ и привел к идентификации некоторых новых членов комплексов PcG, например белка RING 1 (Satijn and Otte, 1999). Направленная [targeted] мутация RING1 у мыши, например, привела к классической го- меотической трансформации фенотипа. Лишь впослед- ствии было обнаружено, что она соответствует гену Sex combs extra из группы PcG у Drosophila. У двух других модельных организмов, а именно у червя Caenorhabditis elegans и цветкового растения Arabi- dopsis thaliana, молекулярная характеристика мутантов, изолированных в ходе разных генетических скринин- гов, выявила существование других ортологов белков PcG. У С. elegans члены группы PcG были идентифи- цированы в ходе скрининга на мутантов maternal effect sterile (mes), и было показано, что они участвуют в сай- ленсинге Х-хромосомы в зародышевой линии гермаф- родитов (Fong et al., 2002; глава 15). У Arabidopsis гены PcG были идентифицированы в результате нескольких генетических скринингов при исследовании различных процессов развития (Hsieh et al/, 2003). Первый ген PcG у растений, CURLY LEAF (CLF), был идентифицирован как мутант с гомеотиче- скими трансформациями органов цветка (рис. 11.2ж, з) (Goodrich et al., 1997). Мутации в генах класса FERTIL- IZATION-INDEPENDENT SEED (FIS) были обнаруже- ны в ходе скрининга на мутанты, обнаруживающие ма- теринский эффект—недоразвитие семян (Grossniklaus et al., 1998) или допускающие некоторое развитие семян в отсутствие оплодотворения (Luo et al., 1999; Ohad et
Глава 11. Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb al., 1999). Наконец, гены PcG были идентифицированы в результате скрининга на мутанты по срокам цветения, например мутанты, зацветающие сразу после прорас- тания (Yoshida et al., 2001) или с нарушенной реакцией на яровизацию — процесс, делающий растения компе- тентными к цветению после продолжительного воздей- ствия холодом (Gendall et al., 2001). Разнообразие процессов, регулируемых белками PcG, иллюстрирует значение поддержания репрессированного состояния ключевых регуляторов развития у различных организмов. С одной стороны, имеет место удивитель- ный консерватизм некоторых биологических функций от растений до млекопитающих, например, регуляции таких ключевых регуляторов развития, как гомеотиче- ские гены, или участия в жесткой регуляции клеточной пролиферации. С другой стороны, комплексы PcG ока- зываются гибкими и динамичными молекулярными мо- дулями, которые используются для контроля большой группы клеточных процессов и процессов развития. 2. Установка меток сайленсинга на хроматин Белки PcG распадаются на два биохимически охарак- теризованных класса, образующих репрессивные ком- плексы Polycomb 1 и 2 (PRC1 и PRC2). Эти два комплекса необходимы для последовательных шагов в репрессии генной экспрессии. Сначала PRC2 обладает модифи- цирующей гистоны активностью и метилирует НЗК27 и (или) НЗК9 в генах, являющихся «мишенями» для сайленсинга. Компоненты PRC1 могут затем узнавать такие модификации, связываться с ними и индуцировать соответствующие структурные изменения в хроматине В то время как белки PRC2 имеются у всех многокле- точных модельных видов, компоненты PRC1 не были идентифицированы у С. elegans и Arabidopsis. 2.1. Компоненты PRC2 и его эволюционный консерватизм Несколько вариантов PRC2 были выделены из эм- брионов Drosophila, но все эти комплексы содержали четыре коровых белка (Levine et al., 2004): SET- гистонметилтрансфераза Enhancer of Zeste (E(Z)), \УЕ)40-белок ESC. связывающийся с гистонами белок p55 и SupressorofZestel2 (Su(Z)12) (табл. 11.1 ирис. 11.3). Исходя из такого состава, PRC2 первоначально называли комплексом E(Z)-ESC. В этом разделе освещаются мо- лекулярные и биохимические детали того, что известно о разных компонентах PRC2, идентифицированных до сегодняшнего дня у различных модельных организмов. Ген E(z) кодирует белок из 760 аминокислот, содер- жащий домен SET, который придает ему активность метилтрансферазы лизинов гистонов (НКТМ). Этому домену SET предшествует домен СХС, или Pre-SET (Tschiersch et al., 1994), содержащий девять консерва- тивных цистеинов, которые связывают три иона цинка и, как полагают, стабилизируют домен SET. В пользу та- кой структурной роли говорит тот факт, что несколько температурочувствительных аллелей E(z) затрагивают один из этих консервативных цистеинов (Carrington and Jones, 1996). Кроме того, E(z) содержит домены SANT, вовлеченные в связывание с гистонами, и домен С5, необходимый для физического взаимодействия с SU(Z)12. ESC — это короткий белок из 425 аминокислот, со- держащий пять повторов WD40, образующих структуру типа «p-пропеллер». Это создает платформу для белок- белковых взаимодействий, отводя ESC тем самым цен- тральную роль в PRC2: физически взаимодействовать как с E(z), так и с р55 во всех проанализированных мо- дельных системах. Белок SU(Z)12 состоит из 900 аминокислот и харак- теризуется структурой «цинковый палец» С2Н2-типа и карбокситерминальным доменом VEFS. Домен VEFS был идентифицирован как консервативный участок между SU(Z)12 и его тремя гомологами у растений: FRN2, EMF2, FIS2 (см. рис. 11.3). Несколько мутант- ных аллелей Su(z)12 изменяют этот домен, показывая тем самым, что он необходим для взаимодействия с до- меном С5 белка E(Z) (Chanvivattana et al., 2004; Yama- moto et al., 2004). Генетически белок p55 не был идентифицирован как член PcG — возможно потому, что он участвует во мно- P,me/anpgaster Mmusculus A.-..thaliana комплекс FIS комплекс EMF Рис. 11.3. Консервативные коровые комплексы PRC2 Показаны коровые члены PRC2 у D. melanogaster, М. musculus, A. thaliana и С. elegans. Предполагается, что у A. thaliana анцестральный комплекс диверсифицировал- ся на три варианта с дискретными функциями в развитии. У С. elegans коровый комплекс PCR2 содержит только три белка: MES-3 не обладает гомологией ни с каким другим идентифицированным белком PRC2. Различные цвета указывают гомологию, контакты указывают на взаимо- действия (из Reyes and Grossniklaus, 2003 и Chanvivattana et al., 2004, с изменениями) комплекс VRN
2 Установка меток сайленсинга на хроматин Таблица 11.1. Гены кора PcG в модельных системах D. melanogaster М. musculus A. thaliana C. elegans Связывающиеся с ДНК белки PcG pho Плейогомеотический Цинковый палец Yyl phol Подобный плейогомеотиче- скому Цинковый палец Psq Pipsqueak Домен BTB-POZ Dspl Дорзальный белок- переключатель 1 Белок с доменом HMG HMGB2 Коровый комплекс PRC2 esc Сверхчисленные половые гребешки Повторы WD 40 Eed FIE MES-6 E(z) Энхансер zeste Домен SET Ezhl/Enx2, Ezh2/Enxl CLF MEA SWN MES-2 Su(z)12 Супрессор zeste 12 Цинковый палец VEFS-бокс mSU(Z) 12 FIS2 VRN2 EMF2 p55 р55 Домен, связываю- щийся с гистонами RbAp48 RbAp46 MSI1(MSI2,3,4,5) Коровый комплекс PRC1 Pc Polycomb Хромодомен Cbx2/M33 Cbx4/MPc2 Cbx6 Cbx8/MPc3 Cbx7 Ph Полигомеотический Цинковый палец домен SAM/SPM Edrl/Mphl/Rae28 Edr2/Mph2 SOP-2 Psc Задние половые гребешки Цинковый палец домен НТН Bmil Rnfll0/Zfpl44/Mell8 dRing/ See dRing / половые гребешки экстра RING цинковый палец Ringl/Ringla Rnf2/Ringlb жестве других белковых комплексов, ассоциированных с хроматином (Hennig et al., 2005). Однако биохимиче- ски белок р55 был идентифицирован как часть PRC2. Он состоит из 430 аминокислот и содержит шесть по- второв WD40, которые физически взаимодействуют с ESC или его ортологами у млекопитающих и растений (Tie et al., 2001; КцЫегet al., 2003a). Кроме коровых белков PRC2 некоторые вариан- ты этого комплекса содержат деацетилазу гистонов (HDAC) RPD3. или Polycomb-подобный белок (PCL). Взаимодействие с RPD3 заслуживает особого внима- ния, поскольку деацетилирование гистонов коррели- рует с репрессированным состоянием экспрессии генов (глава 10). Различный состав PRC2 отражает, вероятно, динамические изменения в ходе развития или же ткане- специфичные варианты. PRC2 высоко консервативен у беспозвоночных, по- звоночных и растений (рис. 11.3). У С. elegans присут- ствуют только гомологи E(Z) и ESC: MES-2 и MES-6. Вместе с еще одним неконсервативным белком. MES- 3, они формируют маленький комплекс с мол. массой около 230 кДа, необходимый для сайленсинга в гермаф- родитной зародышевой линии (глава 15). У растений и млекопитающих присутствуют все четыре коровых бел- ка PRC2. Как и у Drosophila, комплекс млекопитающих имеет мол. массу около 600 кДа и играет роль не толь- ко в регуляции экспрессии гомеотических генов, но и в контроле клеточной пролиферации, инактивации Х-хромосомы и экспрессии импринтированных генов (см. дополнительные детали в разделе 4 этой главы и в главах, имеющих отношение к этому вопросу). У растений несколько генов, кодирующих компо- ненты PRC2, претерпели дупликацию, так что теперь они представлены небольшими семействами генов. У Arabidopsis имеется только один гомолог ESC, FERTIL- IZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE), но три гомолога E(Z), три гомолога SU(Z)12 и пять гомо- логов р55 (называемые MSI1-5) (табл. 11.1). Различные комбинации этих белков образуют по крайней мере три разных комплекса, контролирующие специфиче- ские процессы развития (рис. 11.3 и 11.4) (Reyes and Grossniklaus, 2003; Chanvivattana et al., 2004). Из этих комплексов лучше всего изучен комплекс, образованный членами класса FERTILIZATION-IN - DEPENDENT SEED (FIS), который играет ключевую роль в контроле клеточной пролиферации в семени (Grossniklaus et al., 2001). Этот комплекс FIS, или МЕА- FIE содержит MEDEA, FIE, FIS2 и MSI1. Как оказалось,
Глава 11 Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb комплекс FIS регулирует гены, кодирующие PHERES1 (РНЕ1), транскрипционный фактор с доменом MADS [MADS domain transcription factor]; и MEIDOS, гомолог Skpl, который у дрожжей играет ключевую роль в кон- троле клеточной пролиферации (КцЫег et al., 2003b). Интересно, что отцовская аллель РНЕ1 экспрессирует- ся на более высоких уровнях, чем материнская аллель. Эта регуляция экспрессии гена посредством геномного импринтинга находится под контролем комплекса FIS, который специфически репрессирует материнскую ал- лель (КцЫег et al., 2005). Таким образом, как описыва- ется ниже, комплекс FIS имеет общие с его аналогом у млекопитающих функции в регулировании клеточной пролиферации, а также экспрессии импринтированных генов Комплекс EMF содержит CLF и EMBRYONIC FLOWER2 (EMF2) (Chanvivattana et al., 2004). Мутации по любому из этих компонентов обнаруживают слабые гомеотические трансформации и фенотип раннего цве- тения. Комплекс EMF необходим для репрессии гомео- тических генов, чье комбинированное действие опреде- ляет идентичность органов цветка (Goodrich et al., 1997). Таким образом, комплекс EMF обладает функцией в поддержании репрессированного состояния гомеоти- ческих генов, сходной с функцией PRC2 у Drosophila и позвоночных (рис. 11.2). Однако гомеотические гены у растений кодируют не гомеодоменные белки, а, скорее, другие транскрипционные факторы, принадлежащие к семействам MADS-домена и специфичного для расте- ний АР2-домена. Сильные [strong] мутанты EMF2, одна- ко, имеют более резко выраженные [severe] фенотипы, когда их сеянцы производят цветки сразу же после про- растания, минуя вегетативную фазу развития (Yoshida et al., 2001). Таким образом, комплекс EMF играет роль как в раннем развитии, где он предотвращает немедленное цветение, так и позже, в ходе органогенеза цветка (Chan- vivattana et al., 2004). На обеих стадиях комплекс EMF репрессирует гомеотические гены цветка, такие как AG иАРЕТАЬАЗ (АРЗ) (рис. 11.4). Белки FIE и MSI1, отно- сящиеся к классу FIS, также вовлечены в контроль экс- прессии гомеотических генов (рис. 11.3 и 11.4). Посколь- ку мутации в обоих этих белках вызывают связанную с материнским эффектом эмбриональную летальность, эта функция была обнаружена лишь тогда, когда аллели типа частичной утраты функции можно было изучать на более поздних стадиях развития (Kinoshita et al., 2001; Hennig et al., 2003). Наконец, комплекс VRN играет ключевую роль в хо- рошо известном эпигенетическом процессе — яровиза- ции (продолжительное воздействие низкой температуры). Яровизация индуцирует цветение у озимых однолетников, но этот эффект виден только после многих клеточных де- лений (рис. 11.4). Клетка растения будет помнить, что она была яровизирована, на протяжении многих месяцев или даже лет после холодного периода. Эта клеточная память поддерживается при пассажах в клеточной культуре, но не от одного поколения к следующему (Sung and Amasino, 2004а). Этот ответ на яровизацию опосредуется генами VERNALIZATION{VRN). Обнаружили, что VRN2кодирует гомолог SU(Z)12 (Gendall et al., 2001), который взаимо- действует с гомологами E(Z) растений, CLF и SWINGER (SWN) в двугибридных тестах у дрожжей (Chanvivattana et al., 2004). Переход к цветению контролируется не только яровизацией, но включает восприятие эндогенных (ста- дия развития и возраст) и экзогенных (длина дня, условия освещения, температура) факторов. Генетический анализ позволил определить четыре пути: (1) автономный путь конститутивно репрессирует цветение, (2) фотопериоди- ческий путь ускоряет цветение в условиях длинного дня, (3) яровизационный путь индуцирует цветение в ответ на действие низкой температуры и (4) гиббереллины стиму- лируют цветение. Ген сроков цветения FLC, содержащий MADS-бокс, является ключевым интегратором реакции цветения: он репрессирует цветение. Экспрессия FLC^- дуцируется как яровизационным, так и автономным путя- ми. В то время как первоначальная репрессия FLC не за- висит от комплекса VRN, поддержание репрессии требует VRN2, который изменяет организацию хроматина в локусе FLC (Gendall et al., 2001). Важно отметить, что один из ком- понентов автономного пути — это гомолог р55, FVE (или MSI4), который влияет на реакцию по срокам цветения, но не действует в яровизационном пути (Ausin et al., 2004; Kim et al., 2004). Поскольку ни о каких биохимических исследо- ваниях комплекса VRN не сообщалось, его точный состав в настоящее время неизвестен (рис. 11.3 и 11.4). 2.2. Модифицирующая хроматин активность PRC2 Каким образом PRC2 опосредует свое репрессирующее действие? Несколько белков PcG и trxG имеют домены SET, в том числе компонент PRC2, E(Z). Обнаружение того факта, что белки с доменом SET обладают активно- стью НКМТ (Rea et al., 2000), позволило предположить, что в функцию PcG входит метилирование гистонов. Действительно, было показано, что комплексы PRC2 у млекопитающих и Drosophila метилируют гистон НЗ по лизину 27 (НЗК27) и, в меньшей степени, по НЗК9 как in vivo, так и in vitro (Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Mbller et al., 2002). Эти гистоно- вые метки обычно ассоциируются с транскрипционно «молчащим» состоянием. Более того, метилирование НЗК9 и НЗК27 было связано с репрессированными гомеотическими генами комплекса bithorax (Mbller et al., 2002). Однако лишь метилирование НЗК27 утра- чивалось у мутантов по E(z), подчеркивая тем самым значение метилирования НЗК27 в PcG-сайленсинге. В отличие от белка SU(VAR)3-9, который сам метилирует НЗК9, белки E(Z) сами по себе не обладают активностью НКМТ НЗК27. Наименьший комплекс, действующий как НКМТ, также требует ESC и SU(Z) 12, которые могут иметь модулирующие функции. Недавно было показано, что комплексы PRC2 могут также метилировать Н1К26 (Kuzmichev et al., 2004). Разные изоформы гомолога ESC у млекопитающих, Eed, определяют специфичность PRC2 млекопитающих по отношению к метилированию Н1К26 versus НЗК27 (Kuzmichev et al., 2004). Однако функциональное отношение метилирования Н1К26 к PcG-сайленсингу остается неясным. У растений НКМТ-активность комплексов PRC2
2. Установка меток сайленсинга на хроматин Рис. 11.4. Участие различных PRC2 на разных стадиях развития растений В жизненном цикле растения разные варианты PRC2 (см. рис. 11.3) контролируют процесс развития. (Л) Просветленная [cleared] семяпочка дикого типа с женским гаметофитом в центре. Комплекс FIS репрессирует гены-мишени, контролирующие пролифера- цию центральной клетки; как и у всех мутантов классаJis, эта клетка пролиферирует в отсутствие оплодотворения. Приблизительно во время оплодотворения требуется также МЕА для поддержания низкого уровня экспрессии МЕАт, но эта активность не зависит от других компонентов комплекса FIS. {Б) Срез семени дикого типа, содержащего зародыш и эндосперм, окруженный семенной оболочкой [seed coat]. После оплодотворения комплекс FIS участвует в контроле клеточной пролиферации в зародыше и эндо- сперме. Он поддерживает низкий уровень экспрессии РНЕ1 и необходим для удержания отцовской аллели МЕАР в «молчащем» состоянии. (В) Проростки дикого типа {справа) и мутанта emf2 {слева), 21-й день после прорастания. Проросток ет/2 произвел цветок с гомеотическими трансформациями, но не дал листьев. Комплекс EMF предотвращает цветение и репрессирует гомео- тические гены цветка, такие как AG, АРЗ и другие. {Г) Яровизированное (справа) и неяровизированное {слева) растения; второе из них характеризуется продолжительной вегетативной фазой и образованием многочисленных листьев. Во время вегетативной фазы развития экзогенные и эндогенные сигналы индуцируют цветение. Яровизация ведет к репрессии цветкового репрессора FLC и таким образом стимулирует цветение. Поддержание этой репрессии зависит от комплекса VRN. {Д) Цветок Arabidopsis дикого типа. Во время органогенеза цветка комплекс EMF регулирует цветковые гомеотические гены, определяющие идентич- ность органов цветка. {А — любезно предоставлено J.M. Moore и U. Grossniklaus; Б — любезно предоставлено J.-P. Vielle-Calzada и U. Grossniklaus; В — перепечатано, с любезного разрешения, из Moon et al., 2003 [©ASPB]; Г— перепечатано, с любезного раз- решения, из Page and Grossniklaus, 2002 [©Macmillan].)
Глава 11 Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb еще не была продемонстрирована in vitro. Однако иссле- дования регулирования FLC показали, что яровизация индуцирует утрату ацетилирования и увеличение мети- лирования НЗК9 и НЗК27, главным образом в первом интроне этого гена (Bastow et aL, 2004; Sung and Ama- sino, 2004b). У мутантов vm2 обе метки метилирования утрачены, что предполагает участие комплекса VRN в установлении этих репрессивных меток метилирования гистонов. У двух других мутантов, vml и vernalization in- sensitive3 (yin3), исчезает лишь метка H3K9me2. VRN1 и VIN3 кодируют транскрипционные факторы семейств ВЗ-домена и гомеодомена, соответственно, но точный молекулярный механизм их участия в модификации хроматина в настоящее время неизвестен Исходя из многочисленных исследований, выпол- ненных к сегодняшнему дню, основной функцией PRC2 представляется обладание активностью НКМТ, но у не- которых вариантов PCR2 имеются и другие активности, модифицирующие хроматин. Ген Rpd3 кодирует HDAC, которая, как полагают, участвует в PcG-сайленсинге (Tie et al., 2001). Однако, хотя мутации грd3 усиливают фено- типы PcG, сами они не обнаруживают типичных гомео- тических трансформаций. Тот факт, что RPD3 не присут- ствует во всех препаратах PRC2, может, таким образом, отражать либо слабое общее взаимодействие, либо тка- не- и стадиеспецифичное взаимодействие с коровыми компонентами PRC2. Взаимодействие RPD3 с PRC2 представляет собой интересное партнерство, поскольку активности и НКМТ, и HDAC ассоциируются с «молча- щим» хроматином и в сочетании могут еще больше укре- плять транскрипционно «молчащие» состояния. 2.3. Динамическая функция PRC2 в развитии Как указывалось выше, коровые комплексы PRC1 и PRC2 ассоциируются с разными факторами, которые могут играть роль в рекрутировании комплексов PcG к тканеспецифичным локусам-мишеням или в модулиро- вании их активности (Otte and Kwaks, 2003). Разные этапы PcG-репрессии, показанные на рис. 11.5, иллюстрируют стадиеспецифичные композиции комплексов PcG в эм- бриогенезе Drosophila. До сих пор было трудно охарактери- зовать различия в отношении разных тканей или клеточ- ных типов у мух, поскольку для биохимической очистки обычно используются экстракты из целых эмбрионов. Однако исследования, выполненные на млекопитающих и растениях, ясно показывают, что комплексы PcG пред- ставлены по разному в различных конкретных тканях и что их состав изменяется в ходе клеточной дифференцировки (Chanvivattana et al.. 2004; Kuzmichev et al.. 2005; Baroux et al., 2006). У млекопитающих уровни экспрессии генов PcG различаются в огромной степени от одной клеточной линии к другой. Комплексы PcG могут различаться даже между генами-мишенями в одной и той же клетке, что заставляет предположить высоко динамичное поведение на разных стадиях развития. У Drosophila белки PcG поддерживают репрессирован- ные состояния гомеотических генов, установившиеся в раннем эмбриогенезе, фиксируя тем самым «решения» Активация гена, регулируемого PRE «TXZXZVyRNA X1 «ВКЛ >» PRE V PcG-репрессия в гене, регулируемом PRE Рис. 11.5. Последовательность событий, ведущих к зависимому от PcG репрессированному состоянию экспрессии генов у эмбрионов Drosophila Исходное состояние экспрессии регулируемого PRE гена определяется активностью регуляторов транскрипции — либо репрессоров (TR), либо активаторов (ТА) транскрипции. Транс- крипция через PRE предотвращает установление состояния «OFF» («ВЫКЛ.») и приводит к зависимому от trxG состоянию «ON» («ВКЛ.») (детали см. рис. 12.8). {а—б) Нетранскриби- руемый PRE связывается со специфическими белками, связы- вающимися с ДНК (например. PHO. PHOL. DSP1 или GAF), которые участвуют в рекрутировании раннего комплекса PcG, содержащего белки и PRC1. и PRC2. (в) Этот ранний комплекс PcG маркирует хроматин путем зависимого от E(Z) метилиро- вания гистонов, (г) Поддержание «молчащего» состояния про- исходит через взаимодействия двух разных комплексов, PRC 1 и PRC2. в отсутствие исходного транскрипционного репрессора. Поддержание PRC1 стабилизируется посредством связывания через хромодомен ЗС. (д) PRC1 может компактизировать хроматин, устанавливая далее плотно конденсированный, «молчащий» хроматин
3. Поддержание транскрипционного сайленсинга по развитию. Коль скоро «молчащее» состояние мишени PcG зафиксировано, она будет оставаться в этом состоя- нии весь остаток жизни особи. У растений аналогичная ситуация может возникать с комплексом VRN: будучи од- нажды яровизирован, ген-мишень (гены-мишени) будет перманентно инактивированным и будет «переустанов- лен» только в следующем поколении. Однако другие рас- тительные комплексы PRC2, по-видимому, более быстро реагируют на стимулы, связанные с развитием или исходя- щие из окружающей среды. Например, одной из функций комплекса FIS является репрессия клеточной пролифера- ции в отсутствие оплодотворения. После оплодотворения, однако, клеточная пролиферация быстро индуцируется, предположительно через дерепрессию генов-мишеней PcG. Это показывает, что PcG-репрессия является состоя- нием «по умолчанию», которое должно быть преодолено неким неизвестным механизмом, чтобы стал возможным нормальный ход развития. Инактивация комплексов PcG как часть нормального жизненного цикла растения может объяснить отсутствие белков PRC1 у растений (рис. 11.4). PRC1 играет важную роль в перманентной, стабильной и длительной инактивации генов-мишеней. Такая перма- нентная инактивация была бы вредной для развития рас- тения, где нередко PcG-репрессия снимается после соот- ветствующих стимулов. 3. Поддержание транскрипционного сайленсинга 3.1. Компоненты PRC1 Молекулярный анализ продуктов генов PcG выявил структурно разнообразную группу ассоциированных с хроматином белков. PRC1 содержит четыре белка PcG: Polycomb (PC), Polyhomeotic (PH), Posterior Sex Combs (PSC) и Ring 1 (dRingl/SCE) (см. табл. 11.1) (Francis et al., 2001). Они встречаются в стоихометрических коли- чествах, и были идентифицированы дополнительные белки-партнеры в зависимости от материала, исполь- зуемого для очистки. Из млекопитающих был выделен и очищен родственный комплекс, что заставляет предпо- лагать, что эти четыре субъединицы образуют кор PRC1 (Levine et aL, 2002). Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila с использованием антител против белков PRC1 продемонстрировало перекрывающую- ся локализацию, которая показывала, что эти белки взаимодействуют на определенном и общем [defined and common] наборе генов-мишеней (рис. 11.6а). Кро- ме того, приблизительно 100 бэндов, наблюдаемых на хромосомах, дали доказательство того, что гены НОХ являются лишь частью более крупной регуляторной сети, включающей другие генные мишени, подверженные PcG-сайленсингу. Ген PC кодирует белок из 390 аминокислот, содержа- щий хромодомен на своем аминотерминальном конце. Этот консервативный мотив обладает гомологией с Н Р1, белком Drosophila, необходимым для формирования ге- терохроматина (Paro and Hogness, 1991; глава 5). Впо- следствии было найдено, что хромодомен связывается с метильными компонентами в НЗК27 и НЗК9 (Bannis- ter et al., 2001; Fischle et al., 2003). Еще один консерва- тивный домен присутствует на карбокситерминальном конце. Консерватизм, как и наличие нескольких абер- раций в мутантных аллелях, заставляет предполагать наличие важной, но все еще неизвестной регуляторной функции в этой части данного белка. Карбоксильный конец PC необязателен для «нацеливания» этого белка на «молчащие» гены (выполняемого хромодоменом), а t t ANT-C ВХ-С Сайты связывания PG Предсказанные PRE Рис. 11.6. «Нацеливание» PRC1 на PREs на политенных хромосомах (а) Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila для визуализации распределения белка PC. (б) Выравнивание хро- мосомных плечей, показывающее перекрывание между предсказанными сайтами PRE в геноме Drosophila и цитологически картированными сайтами связывания PC на политенных хромосомах Два кластера генов НОХ (ANT-C и ВХ-С) являются особо заметными сайтами для PRCls
Глава 11 Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Poly comb но, как оказалось, взаимодействует in vitro с нуклеосо- мами (Breiling et al., 1999). Предстоит выяснить, указы- вает ли это на еще не открытый узнающий мотив для еще одной модификации гистона. Для Рс2 человека была продемонстрирована SUMO ЕЗ-лигазная актив- ность, что указывает на SUMO-модификации как на важные метки в процессе PcG-сайленсинга (Kagey et al., 2003). Аминотерминальная часть белка PSC консервативна в протоонкогене bmi-1 позвоночных и гене-супрессоре опухолей mel-18. Этот район содержит мотив С3НС4 (RING finger), который может опосредовать белок- белковые взаимодействия. Этот мотив RING finger ока- зался связанным с субъядерной локализацией Bmi-1/ Mel-18, которая коррелирует с клеточной трансформа- цией. У Drosophila локус polyhomeotic (ph) дуплицирован и состоит из проксимального (ph-p) и дистального (ph-d) генов, сохранивших обширную гомологию. У мышей были идентифицированы гомологичные белки PH. У всех у них имеются общий консервативный «цинковый палец» и домен SAM (известный также как SEP или SPM). Этот домен обнаруживается в еще одном бел- ке PcG, SCM (Sex Combs on the Midleg). Домены SAM участвуют в белок-белковых взаимодействиях, по- скольку было продемонстрировано, что они участвуют в гомо- или гетеротипических взаимодействиях с дру- гими белками. Эти данные говорят в пользу предполо- жения о возможной функции в генерировании крупных ядерных комплексов, необходимых для сайленсинга. Действительно, белки PcG были локализованы в субну- клеарных фокусах, названных PcG-тельцами, которые могут функционировать как компартменты сайленсин- га (Saurin et al., 1998). Как упоминалось выше, dRINGl первоначально не был распознан как член PcG. Лишь биохимическая очист- ка обнаружила присутствие этого фактора с мотивом RING finger в PRC1, в котором, как полагают, он играет структурную роль (Francis et al., 2001; Lavigne et al., 2004). Было обнаружено, что белки Ring 1А и RING 1В из PRC1 млекопитающих ассоциированы с убиквитилированным Н2А на неактивной Х-хромосоме, и поддержание этой гистоновой метки зависит от белков Ringl (de Napoles et al., 2004; Fang et al., 2004; Cao et al., 2005; дополнительные детали см. в разделе 4.1 этой главы и в главе 17). Эти четыре белка составляют коровую структуру PRC1. Однако другие белки PcG, подобные SCM или белку Zeste, оказались связанными с этим комплек- сом (Otte and Kwaks, 2003). Их молекулярная функция в PRC1 остается неясной, поскольку они, по-видимому, играют дополнительные роли в ядре; в качестве приме- ра можно привести функцию активатора транскрипции, которую играет Zeste. Были идентифицированы еще и другие гены PcG по их роли как регуляторов транскрип- ции генов кора PcG (Ali and Bender, 2004). А именно, три гена PcG являются находящимися «вверх по течению» регуляторами генов, кодирующих компоненты PRC1. Петли отрицательной обратной связи между компо- нентами PRC1, а также положительная регуляция ком- понентов PRC1 со стороны PRC2 еще более заставляют предполагать сложную, кросс-регуляторную сеть между генами PcG для обеспечения тонкой настройки белко- вых уровней в этих комплексах (рис. 7а). Аналогичным образом, сложные регуляторные взаимодействия были описаны для генов комплекса FIS у Arabidopsis (Baroux et al., 2006). 3.2. «Нацеливание» PRC1 на сайленсированные гены Трансгенный анализ кластеров гомеотических генов у Drosophila обнаружил регуляторные элементы, необходи- мые для поддержания сегмент-специфичной экспрессии генов НОХ. Эти ДНК-элементы — названные Polycotnb Response Elements, или PREs — поддерживают сегмент- специфичную экспрессию генов НОХ за рамками фазы эмбриональной инициации. PREs привлекают белки PRC1, будучи интегрированы в эктопические сайты в политенных хромосомах; это позволяет предполагать что они определяют специфичность последовательно- сти для узнавания комплексом PRC1 генов-мишеней и заякоривания на них. Однако тема «нацеливания» PcG оказывается довольно сложной. Размеры функционально охарактеризованных PREs варьируют от нескольких со- тен до нескольких тысяч пар оснований, они содержат консенсусные сайты связывания для многих разных белков, связывающихся с ДНК, и обычно в данном локусе-мишени обнаруживаются два или более PREs. Все охарактеризованные до сих пор PREs происходят от Drosophila и ни один PRE пока еще не был определен у млекопитающих или растений. Несмотря на сложность PREs, удалось идентифицировать четыре консенсусные последовательности-мотива и показать, что они играют роль в функции PRE у Drosophila. Один из этих мотивов (GCCAT) связывается как с Плейогомеотическими (PHO, Pleiohomeotic), так и с Плейогомеотикоподоб- ными (PHOL) белками, которые обладают отчасти из- быточными функциями. РНО и PHOL функционируют в «нацеливании» PcG, поскольку они найдены в комплек- сах PcG, выделенных из экстрактов ранних эмбрионов, обнаруживают совместную иммунопреципитацию с чле- нами как PRC 1, так и PRC2 и связываются с PREs in vitro (рис. 11.5а) (Poux et al., 2001). Недавно значение в рекру- тировании PcG было продемонстрировано и для DSP1, который связывается с мотивом GAAA, обнаруженным во многих PREs (Dejardin et al., 2005). Наконец, белки trxG, Zeste и GAF (кодируемый геном Trithorax-like) могут помогать рекрутировать белки PcG к их мишеням. Вновь разработанный алгоритм, основывающийся на том, что собранные в кластер пары сайтов GAF, Zeste и PHO/PHOL характеризуют PRE, с высокой вероят- ностью предсказывает известные PREs и, таким обра- зом, может идентифицировать потенциальные гены- мишени PcG в геноме Drosophila (рис. 11.66) (Ringrose et al., 2003). Семейство генов, контролируемых PRE, включает элементы от генов хорошо известных и важ- ных для развития транскрипционных факторов, не- обходимых для формирования паттерна, до генов, ко- дирующих факторы, участвующие в регулировании клеточного цикла и старения.
3. Поддержание транскрипционного сайленсинга б PRE PRE 1 - ВЫКЛ. PRE 1 - ВЫКЛ. PRE 2 - ВКЛ. Движение по Рис. 11.7. Регуляция и функция PRC1 в ходе клеточного деления (а) Кросс-регуляторные взаимодействия между генами PcG, предполагаемые на основе генетических данных. Е(Рс), PclnAsx — позитивные регуляторы членов кора PRC1, действующих «вверх по течению» Члены PRC2 Esc и E(z) действуют как позитив- ные регуляторы транскрипции Рс. Видна отрицательная обратная связь от членов кора PRC1 на Psc и dRingl, а также на Su(z)2. Тонкая настройка уровня генного продукта, вероятно, необходима для хорошо сбалансированных процессов, базирующихся на химическом равновесии, (б) Факторы транскрипции, специфичные для нуклеотидной последовательности (TF) привязывают компоненты PRC1 к PRE. Стабильный сайленсирующий комплекс требует заякоривания PRC1 через хромодомен РС на соседних метилированных «хвостах» гистонов, (в) Возможная модель того, как могут наследоваться состояния дифференциальной экс- прессии генов. Процесс межгенной транскрипции помещает позитивные эпигенетические метки (например, ацетилированные хвосты гистонов, варианты гистонов) в PREs, которые контролируют активные гены (PRE 2). Все другие PREs сайленсируются «по умолчанию» (PRE 1). Во время репликации ДНК и митоза только позитивный эпигенетический сигнал нужно передать дочерним клеткам, что гарантирует, что в следующей интерфазе межгенная транскрипция возобновляется в PRE 2, прежде чем сайленсинг «по умолчанию» вновь устанавливается во всех других PREs (а — из Ali and Bender, 2004, переработано) PRC1, будучи однажды связанным, взаимодействует с соседними гистонами и генерирует стабильные сай- ленсирующие комплексы в PREs (Рис. 11.76). Метки НЗК27шеЗ, созданные PRC2, действуют как дополни- тельные места связывания для хромодомена РС (рис. 11.7в). В их отсутствие, как показывает конкуренция с растворимым пептидом метилированного «хвоста» ги- стона, PRCls диссоциируют со своих генов-мишеней (Czermin et al., 2002; Ringrose et al., 2004; Wang et al., 2004) Открытие у PRC2 активности НКМТ и ассо- циированных гистоновых меток, типичных для «мол- чащего» хроматина, позволило предположить новый механизм для установления репрессии PcG Вслед за катализируемой PRC2 модификацией НЗК27шеЗ PRC1 связывается через хромодомен белка РС и стабилизи- рует сайленсинг. Это подкрепляется данными о том, что (1) метки НЗК27шеЗ и РС колокализуются на поли- тенных хромосомах и (2) связывание РС утрачивается у мутантов E(z), у которых нет активности НКМТ моди- фицирующей НЗ метками НЗК27шеЗ в PREs, помогая
Глава 11 Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb рекрутировать PC к его мишеням (рис. L 1.5). Хотя такая модель несомненно привлекательна, ситуация в PRE», по-видимому, более сложная, поскольку PRC2s и PRC1 действуют не последовательно, а, скорее, присутствуют вместе на PREs в раннем эмбриогенезе (рис. 11.56, в). Таким образом, представляется вероятным, что метили- рование НЗК27 является событием «вниз по течению» после рекрутирования PcG, но играет ключевую роль в установлении «молчащего» состояния. Эта описанная выше модель демонстрирует парал- лели с формированием гетерохроматина, где Гетерох- роматиновый Белок 1 (НР1) рекрутируется через свой хромодомен к меткам НЗК9те, созданным SU(VAR)3-9 (глава 5). Таким образом, продуктивный сайленсирую- щий комплекс «нацеливается» транскрипционными факторами на определенные элементы нуклеотидных последовательностей ДНК, но, помимо этого, требует поблизости слой соответствующим образом модифи- цированных гистонов для генерации структуры репрес- сированного хроматина более высокого порядка (рис. 11.5). В ходе эволюции PREs оказались на удивление мало консервативными по последовательности. Даже в пределах близкородственных видов Drosophila число, положение и состав PREs существенно варьируют (L. Ringrose and R. Paro, неопубликовано). Это заставляет предполагать, что требования в отношении последова- тельности, а также положения PREs являются нежест- кими и могут быть адаптированными к видоспецифич- ным требованиям. Тем не менее, компоненты PRC1 высоко консервативны и предположительно исполь- зуют тот же самый базовый молекулярный механизм (механизмы) для индукции изменений более высокого порядка в хроматине «молчащих» генов-мишеней. 3.3. Установление репрессивных функций с помощью PRC1 Способ, которым связанные с PRE PRC Is взаимодей- ствуют с промотором и предотвращают транскрипцию, все еще неизвестен. Заякоривание временно останав- ливающихся [paused] комплексов РНК-полимеразы в промоторах, предотвращающее инициацию, было при- писано взаимодействиям PRE-PRC1, описанным для ре портерных конструктов (Dellino et al., 2004). Кроме того, было показано, что PRC1 противодействует ремо- делингу нуклеосом in vitro и индуцирует компактную структуру хроматина. Таким образом, PRC1 потенциаль- но блокирует доступ к ДНК транскрипционных факторов и других комплексов, необходимых для транскрипции (Francis et al., 2004). С помощью алгоритма, описанного выше, предсказывается существование PRE-подобных последовательностей в почти всех промоторах контро- лируемых PcG генов-мишеней Drosophila. Это позволяет предполагать, что размещение PRC1 и в промоторах, и в регуляторных сайтах могло бы благоприятствовать взаимодействиям между PREs и промоторами и уста- навливать стабильно репрессированные хроматиновые структуры, неблагоприятные для транскрипции (Ringrose et al., 2003). Стабильность сайленсирующих комплексов, как по- казывает заякоривание через метилированные «хвосты» гистонов, оказывается признаком долговременной ре- прессивной функции белков PcG. Однако при анализе in vivo на клеточном уровне наблюдается замечательно динамичное поведение. Белки PcG кластеризуются в PcG-тельца, которые варьируют между клетками по величине и составу, заставляя предполагать взаимо- действие сайленсирующих комплексов в ядре, которое регулируется в развитии. Более того, анализ динамики маркированных GFP белков PC и PH in vivo обнаружил очень высокую скорость обмена несвязанных белков с их комплексами в сайленсированных мишенях (Ficz et al., 2005). Эти результаты позволяют предполагать, что долговременная репрессия в основном базирует- ся на химическом равновесии между связанными и не связанными белками, а не на высокоаффинной защите сайтов, связывающихся с ДНК. 3.4. Предотвращение наследуемой репрессии антисайленсингом Связывание PRCls с PREs, по-видимому, индуцируется «по умолчанию», поскольку многие из заякориваюших- ся компонентов PcG и белков, связывающихся с ДНК, экспрессируются во всех клетках, и PREs глобально сайленсируют репортерные гены в трансгенных кон- структах. Противодействующие белки группы trxG в действительности функционируют не как активаторы, но, скорее, как антирепрессоры (Klymenko and Mbller, 2004; глава 12). Таким образом, для поддержания актив- ной транскрипции гена контролируемого PRE, сайлен- синг в этом PRE должен быть предотвращен ткане- и стадиеспецифическим образом. У Drosophila, например, активация генов НОХ контролируется ранним каска- дом транскрипционных факторов, кодируемых генами сегментации. Интересно, что эти факторы индуцируют транскрипцию не только генов НОХ, но и межгенных, некодирующих РНК, которые транскрибируются через ассоциированные PREs, часто обнаруживаемые «вверх по течению» или «вниз по течению» (рис. 11.5). Было показано, что транскрипция через PREs необходима для предотвращения сайленсинга и поддержания активного состояния репортерного гена с использованием транс- генных конструктов (Schmitt et al., 2005). Процесс транс- крипции, вероятнее всего, ремоделирует хроматин PRE и генерирует активное состояние, характеризующиеся, на- пример, отсутствием репрессивного метилирования ги- стонов и присутствием ацетилирования гистонов. Таким образом, даже несмотря на то, что белки, связывающиеся с ДНК. и привлекают PRC1 к этому конкретному акти- вированному PRE, гистоновое окружение не разрешает заякоривание PC через НЗК27шеЗ и никакой стабильный сайленсинг не будет установлен. Поскольку в системе PcG сайленсинг индуцируется «по умолчанию», эпиге- нетическое наследование паттерна дифференциальной экспрессии генов требует только передачи активного состояния PRE в ходе репликации ДНК и митоза (рис. 11.7в). Каким образом это достигается на молекулярном уровне и какая эпигенетическая метка (метки) отвечает
4. Репрессия PcG в развитии млекопитающих за поддержание активного состояния PRE — все эти во- просы пока еще остаются открытыми. Интересно, что недавно было показано, что в PRE гомеотического гена Ubx у Drosophila некодирующие РНК, продуцируемые на PREs, остаются ассоциированными с хроматином и рекрутируют регулятор trxG, Absent Small или Homeotic discs 1 (ASH1). Разрушение этих РНК с помощью RNAi ослабляет рекрутирование ASH 1 к PRE, заставляя пред- полагать, что это взаимодействие играет важную роль в эпигенетической активации гомеотических генов путем преодоления сайленсинга, индуцированного PcG «по умолчанию» (Sanchez-Elsner et al., 2006). 4. Репрессия PcG в развитии млекопитающих 4.1. От репрессии гена к репрессии хромосомы Мутации в компонентах мышиного PRC1 демонстрируют гомеотические трансформации аксиального скелета. Это может вызывать появление дополнительных позвонков как следствие дерепрессии генов НОХ(рис. 11.2д, е) (Core et al., 1997). Кроме того, мутантные мыши обнаруживают тяжелый комбинированный иммунодефицит, вызывае- мый отсутствием пролиферативных ответов гематопоэ- тических клеток (Raaphorst, 2005). Роль белков PcG была особенно хорошо изучена на клетках крови, в свете того факта, что большинство линий клеток крови характе- ризуются их хорошо описанными, специфичными для клеточного типа программами транскрипции. Однако коммитирование и рестрикция линии каким-то образом нуждаются в надежном поддержании при клеточном делении. Оказывается, что у нокаутных по PcG мышей популяции предшественников В- и Т-клеток продуциру- ются нормально, показывая, что контроль PcG не играет роли в установлении специфичных для линии паттернов генной экспрессии. Однако белки PcG вносят вклад в необратимость выбора линии, а не участвуют в решении следовать по определенному пути развития. Кроме контроля генов НОХ, паттерны экспрессии которых характеризуют разные линии клеток крови, белки PcG играют главную роль в контроле пролифе- рации. Ген bmil, ортолог гена Psc Drosophila, был перво- начально идентифицирован как онкоген, который, в кооперации с тус, индуцирует лимфомагенез у мышей (van Lohuizen et al., 1991). Белок Bmil контролирует ре- гуляторы клеточного цикла pl6INK4a и 319ARF (Jacobs et al., 1999). И Bmil, и родственный белок Mel-18 являются негативными регуляторами локуса 1NK4C-ARF, необ- ходимого для контроля нормальной лимфоидной про- лиферации. Мисрегуляция этой важной контрольной точки [checkpoint] клеточного цикла влияет на апоптоз и старение у мышей (Akasaka et al., 2001). Белки PcG млекопитающих ассоциированы также с классическим эпигенетическим феноменом инак- тивации Х-хромосомы (глава 17) Инактивация одной Х-хромосомы в ХХ-клетках самок сопровождается се- рией модификаций хроматина, в которых участвуют белки PcG (Heard, 2004). В частности, компоненты PRC2, подобно гомологу ESC, Eed (Embryonic ectoderm expression), или гомологу E(Z), Enxl (табл. 11.1), играют главную роль в установлении меток гистонов, ассоции- рованных с транскрипционным сайленсингом. Времен- ная [transient] ассоциация этого PRC2 с Х-хромосомой, покрытой РНК Xist, сопровождается метилированием НЗК27. Напротив, мутантные по eed эмбрионы мыши не обнаруживают рекрутирования НКМТ Fnxl, и у них не наблюдается никакого метилирования НЗК27. Однако отсутствие этих компонентов PRC2 не ведет к полной дерепрессии всей неактивной Х-хромосомы; скорее, в некоторых клетках наблюдаются спорадиче- ская реэкспрессия сцепленных с X генов и увеличение эпигенетических меток, ассоциированных с активным состоянием (НЗК9ас и НЗК4теЗ). Это происходит, ве- роятно, потому, что другие частично избыточные эпи- генетические механизмы взамен обеспечивают поддер- жание одной активной Х-хромосомы. Рекрутирование PRC2 к неактивной Х-хромосоме, по-видимому, зависит от РНК Xist. Поскольку связь PRC2 с неактивной X лишь временная, оказывается, что этот комплекс необходим лишь для установления эпигенетических меток (т.е. НЗК27шеЗ), чтобы под- держивать сайленсинг. В настоящее время неизвестно, узнает ли PRC1 эти метки непосредственно и требует- ся ли он для перманентного сайленсинга неактивной Х-хромосомы, но компоненты PRC1 оказываются связанными с неактивной Х-хромосомой Однако из- вестно, что метилирование ДНК сопровождает фазу поддержания и необходимо для перманентной инакти- вации X. PRC2 специфически участвует в регуляции моноал- лельной экспрессии Х-хромосомы как у эмбриона, где инактивация Х-хромосомы является случайной, так и в экстраэмбриональных тканях, где всегда инактивирова- на Х-хромосома, унаследованная от отца (инактивация импринтированной Х-хромосомы). Кроме того, недав- но было обнаружено, что PRC2 участвует в регуляции некоторых аутосомных импринтированных генов. На- пример, анализ 14 импринтированных локусов из ше- сти несцепленных импринтированных кластеров пока- зал, что четыре из них биаллельно экспрессировались у мутантных по eed мышей (Mager et al., 2003; допол- нительные детали см в главе, 19). Интересно, что все локусы, утратившие импринтированную экспрессию, были нормально репрессированы, когда наследовались от отца, тогда как ни один из локусов, репрессирован- ных по материнской линии, не был затронут Посколь- ку недавно было показано, что Ezh2 непосредственно взаимодействует с метилтрансферазами ДНК млекопи- тающих и требуется для их активности (Vim et al., 2006), не исключено, что PRC2 играет роль в регуляции этих импринтированных генов посредством метилирования ДНК (глава 18). Об участии PRC2 в регуляции экспрессии импринти- рованных генов сообщалось и для Arabidopsis, где локус РНЕ1 экспрессируется на гораздо более высоких уров- нях с отцовской аллели (КцЫег et al., 2005). У мутан- тов по МЕА, гомологу E(z), материнская аллель РНЕ1
Глава 11. Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb специфически дерепрессирована. Аналогичным обра- зом МЕА регулирует также свою собственную имприн- тированную экспрессию: на ранних стадиях репро- дуктивного развития материнская аллель МЕА сильно дерепрессирована у мутантов те а. Этот эффект, одна- ко, не зависит от других компонентов комплекса FIS (Baroux et al., 2006). Напротив, на более поздних ста- диях развития комплекс FIS обеспечивает стабильную репрессию отцовской аллели МЕА (Baroux et al., 2006; Gehring et al., 2006; Jullien et al., 2006). В этом последнем случае комплекс FIS участвует в сайленсинге репресси- рованных у отца импринтированных генов аналогично ситуации у млекопитающих. Кроме того, МЕА играет также роль в поддержании экспрессии материнских аллелей РНЕ1 и МЕА на низком уровне, как описано выше (рис. 11.4). Поскольку компоненты PRC2 имеются у растений, беспозвоночных и млекопитающих, PRC2 представляет собой древний молекулярный модуль, годящийся для репрессии генов, который имелся уже у одноклеточ- ного предка растений и животных, до развития много- клеточное™. Таким образом, эти примеры позволяют предполагать, что PRC2 был мобилизован независимо для регуляции экспрессии импринтированных генов у растений и животных, в двух линиях, где возник геном- ный импринтинг (Grossniklaus, 2005). 4.2. Последствия аберрантной активации транскрипции Обнаружение того, что мисрегуляция Bmil вызывает зло- качественные лимфомы у мышей, ставит вопрос о том, вносит ли ВМП человека (являющийся компонентом PRC1) сам по себе вклад в развитие рака аналогичным образом. Накапливаются данные о том, что измененная экспрессия гена PcG широко распространена в злокаче- ственных лимфомах человека (Raaphorst, 2005). Например, уровень сверхэкспрессии BMI1 в В-клеточных лимфомах коррелирует со степенью злокачественности, заставляя предполагать, что компоненты PRC1 играют-таки роль в развитии рака у человека. Однако гены-мишени ВМП в клетках человека, по-видимому, отличаются от генов- мишеней в мышиных лимфоцитах, поскольку никакую очевидную даун-ретуляцию pl6INK4a нельзя скоррелировать со сверхэкспрессией онкогенов. Сверхэкспрессия гена PcG наблюдается не только при гематологических злокачественных новообразованиях, но обнаруживается и в солидных опухолях, в том числе в медуллобластомах и опухолях, происходящих из печени, прямой кишки, груди, легкого, пениса и простаты (рис. 11.8). Высокий уровень экспрессии Ezh2, маркера PRC2, часто обнаруживается на ранних стадиях высокопроли- феративных легочных карцином. Это позволяет предпо- ложить, что хорошо известный каскад инициации PRC2 и поддержания PRC1 (рис. 11.5) мог бы также сопрово- ждать развитие линии опухолевых клеток Интересно, что компоненты PRC2 играют также ключевую роль в контроле клеточной пролиферации у Arabidopsis. Хотя у растений аберрантный рост не при- водит к раку и гибели, жесткий контроль клеточной Рис. 11.8. PRC2регулирует клеточную пролиферацию у млекопи- тающих и растений (а. б) Зародыши растения, происходящие из яйцеклеток ди- кого типа и мутанта шеа. МЕА кодирует белок комплекса FIS и регулирует клеточную пролиферацию. Гигантский зародыш шеа гораздо крупнее соответствующего зародыша дикого типа на той же стадии развития (поздняя стадия «сердечка» — late heart stage). Мутантные зародыши развиваются меделеннее и имеют примерно вдвое большее число клеточных слоев. (в, г) Нормальный и раковый эпителий простаты. В раковом эпителии экспрессия Ezh2 сильно увеличена (метка антите- лом против Ezh2). Таким образом, как утрата Е(7)-функции у растений, так и сверхэкспрессия функции E(Z) у человека может приводить к дефектам в клеточной пролиферации. (д, е) Контрольные крысиные фибробласты 1а и фибробласты со сверхэкспрессией RING1. Сверэкспрессия RING1 приводит к независимому от заякоривания росту в мягком агаре, типич- ному для неопластически трансформированных клеток, (а,б, любезно предоставлено J.-P. Vielle-Calzada and U. Grossniklaus; в, г, перепечатано, с любезного разрешения, из Kuzmichev et al., 2005 [©National Academy of Sciences]; d, e, перепечатано, с любезного разрешения, из Satijn and Otte, 1999 [©American Society for Microbiology].) пролиферации является существенным для нормально- го развития. У мутантов классаfis два продукта оплодот- ворения у цветковых растений, зародыш и эндосперм, пролиферируют избыточно, и получающиеся в резуль- тате семена абортируют (рис. 11.8) (Grossniklaus et al., 2001; Hsieh et al., 2003; Guitton and Berger, 2005). Влия- ние на клеточную пролиферацию наблюдается и у двой- ных мутантов elf и swn, двух гомологов E(z) у растений. Такие растения демонстрируют нормальное развитие семян после прорастания, но образуют массу пролифе- рирующей, недифференцированной ткани (каллус), а не листья (Chanvivattana et al., 2004). Хотя и неизвестно, каким образом PRC2 контролирует клеточную пролиферацию у растений, вполне вероятно, что он должен взаимодействовать с RBR1, раститель- ным гомологом ретинобластомного белка Rb (Ebel et aL 2004; Mosquna et al., 2004). Мутанты в /75-классс генов
4. Репрессия PcG в развитии млекопитающих не только обнаруживают дефекты пролиферации в ходе развития семян после оплодотворения, но и необходимы для предотвращения пролиферации эндосперма в отсут- ствие оплодотворения. Этот последний аспект фенотипа является общим с мутантами rbrl. обеспечивая связующее звено с Rb-путем. Замечательно, что сообщалось также о связи между Rb-путем и PRC2 у млекопитающих (Bracken et al., 2003), что иллюстрирует консерватизм регуляторных сетей между растениями и млекопитающими. 4.3. Поддержание судьбы стволовой клетки Стволовые клетки играют все возрастающую роль в ме- дицине. Их возможность обеспечивать прогениторные клетки для заживления поврежденной ткани включает их в высокоценимый инструментарий регенеративной меди- цины. Неудивительно, что больше всего об идентичности и локализации стволовых клеток мы знаем на примере лучше всего охарактеризованной линии клеток крови. Гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) под- держивают пул клеток крови путем самообновления, а также производства дочерних клеток, которые диф- ференцируются в лимфоидные, миелоидные и эритро- идные линии. Ниша стволовых клеток в костном мозге взрослого организма обеспечивает эти клетки специ- фическими внешними сигналами для поддержания их судьбы. С другой стороны, внутриклеточные сигналы для поддержания состояния «стволовости», базируют- ся, по-видимому, на системе PcG. Мутанты мышей с мутациями генов PRC 1 (например, bmil/mel-18, mphl/rae28 и тЗЗ\ см. табл. 11.1) страдают различными дефектами в гематопоэтической системе, такими как гиперплазия (т.е. увеличенная клеточная пролиферация) в селезенке и тимусе, уменьшение чис- ла В- и Т-клеток и нарушенный пролиферативный от- вет лимфоидных предшественников на цитокины. По- требность в Bmil и Mel-18 в процессе самообновления стволовых клеток на различных стадиях развития по- зволяет предполагать меняющийся пул генов-мишеней для эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Для нейральных стволовых клеток (NSCs) также не- обходима система PcG, как показывают дефекты нейро- нов, наблюдаемые у мутантов bmil мышей (Bruggeman et al., 2005; Zencak et al., 2005). В частности, в постна- тальном периоде мыши лишены церебральных NSCs, показывая тем самым потребность в Bmil in vivo в про- цессе обновления NSCs. Как было обнаружено для ге- матопоэтической системы, поддержание эмбриональ- ных NSCs находится, как оказывается, под контролем другой сети PcG, чем самообновление взрослых NSCs. Внешние сигналы, подобные сигнальному каскаду sonic Hedgehog, модулируют ответ Bmill в NSCs и обе- спечивают способность к пролиферации/самообновле- нию (Leung et al., 2004). Идентификация этих внешних сигналов, контролирующих репрессию PcG была до- стигнута посредством анализа развития прогениторов гранулярных нейронов мозжечка (CGNPs — cerebellar ganule neuron progenitors). Постнатальная волна про- лиферации индуцируется сигнальным фактором Sonic hedgehog (Shh), секретируемым клетками Пуркинье. Сигнал Shh разветвляется и контролирует уровни N-Myc и Bmil (рис. 11.9). Таким образом, CGNPs с нехваткой Bmil, демонстрируют дефектный пролиферативный от- вет на стимуляцию Shh. Сигнал Shh способен в конеч- ном счете контролировать пролиферацию этих ство- ловых клеток, модулируя и путь Rb «вниз по течению» (через N-myc и Bmil/pl6INK4a), и путь р53 (через Bmil/ pl9ARF) Этот механизм объясняет, почему гиперактива- ция Shh-сигналинга ведет к развитию медуллобластом (Leung et al., 2004). HSCs регулируются сходным путем, контролируемым Indian hedgehog. У NSCs экспрессия локусов Hoxd8, Hoxd9 и Нохс9 находится под контролем Bmil. Соответствующий профиль экспрессии НОХсо- общает стволовым клеткам необходимую судьбу. Действительно, поскольку стволовые клетки пред- ставляют определенную и коммитированную клеточную судьбу, неудивительно, что система PcG поддерживает эту конкретную судьбу наследуемым в митозе образом. В будущем будет интересно идентифицировать пул ми- шеней системы PcG в различных популяциях стволовых клеток и выяснить, каким образом можно влиять на си- стему поддержания, чтобы сделать возможным контро- лируемое репрограммирование судьбы стволовых кле- ток. В данный момент неясно, играет ли PcG какую-либо роль в поддержании стволовых клеток у растений. Воз- можно, однако, что репрограммирование растительных Сус-01 D2 >•* *.'3 Путь пролиферации / самообновления в стволовых клетках Рис. 11.9. Сигналит Sonic Hedgehog поддерживает пролиферацию самообновление прогениторных клеток мозжечка Сигнальный каскад Shh регулирует и путь Rb. и путь р53 через Bmil-контроль контрольную точку пролиферации Р16/р19. Подавление Smoothened (Smoh) Shh-рецептором Patched (Ptch) приводит к сигналингу «вниз по течению» в ядре Одна часть этого сигнала индуцирует N-Мус, Cyclin D1 и D2, тогда как другая часть активирует Bmil через эффекторы Gli (адаптиро- вано из Valk-Lmgbeek et al., 2004)
Глава 11. Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb клеток, которые являются тотипотентными и обладают потенциальной способностью образовывать, в соответ- ствующих условиях, полный новый организм, могло бы включать регуляцию PcG. Действительно, растения, ли- шенные гомологов E(z), CLF и SWN, продуцируют, по- сле прорастания, массу недифференцированных клеток; это позволяет предположить, что для поддержания диф- ференцированного состояния необходимы гены PcG (Chanvivattana et al., 2004). 5. Заключение и перспективы Было замечательно проследить развитие наших пред- ставлений об эпигенетической регуляции PcG, начиная с первоначальной генетической идентификации му- танта Drosophila, обладающего дополнительными по- ловыми гребешками на второй и третьей паре ног. Это в конечном счете привело к открытию нового класса регуляторов, которые, как оказалось, необходимы для таких фундаментальных эпигенетических процессов, как яровизация у растений и сайленсинг Х-хромосомы млекопитающих. Контроль генетической информации находится под сильным влиянием структуры хроматина и состава гистонов в их разнообразных модифицирован- ных формах. Белки PcG непосредственно участвуют в генерации эпигенетических меток, например НЗК27теЗ, вследствие «решений», принимаемых в ходе развития. Та же самая группа «считывает» эти эпигенетические метки (т.е. обнаруживает высокое сродство к ним) посредством действия белков PRC1 и транслирует их в стабильное, транскрипционно репрессированное состояние. У мо- дельного организма Drosophila мы имеем относительно ясную картину того, как комплексы PcG заякорены в PREs для определенной группы генов-мишеней, под- верженных долговременной репрессии. Однако до сегод- няшнего дня не было идентифицировано никаких PREs у других организмов. Хотя основная функция белков PcG остается той же, неясно, какая часть геномов рас- тений и позвоночных подвержена их репрессирующему действию и каким образом они «нацеливаются» на ме- сто их действия. Кроме того, нам нужно лучше понять, каким образом явно динамичная группа белков может навязывать стабильное состояние транскрипционной репрессии через химическое равновесие. Другой важный вопрос в исследованиях PcG каса- ется наследуемости репрессированного состояния, т.е. самого существа эпигенетики. Что представляет собой идентичность молекулярных меток, требующихся для передачи состояния экспрессии генов при репликации ДНК и митозе? Мы знаем, что активное или «молча- щее» состояния экспрессии генов поддерживается со- вместным действием белков trxG и PcG. Нужны ли для обоих этих состояний соответствующие эпигенетиче- ские метки, передающиеся дочерним клеткам, или же достаточно лишь одной, тогда как другая представляет собой состояние «по умолчанию»? Механизм, посред- ством которого белки PcG навязывают сайленсинг на транскрипцию во время интерфазы клеточного цикла, становится все более ясным. В будущем исследование будет сосредоточено на том, каким образом информа- ция относительно состояния экспрессии генов сохра- няется в процессе репликации ДНК и надежно переда- ется дочерним клеткам после митоза Литература Akasaka Т., van Lohuizen М., van der Lugt N., Mizutani-Koseki Y, Kanno M., Taniguchi M., Vidal M., Alkema M, Berns A., and Koseki H., 2001. Mice doubly deficient for the Polycomb Group genes Mel 18 and Bmil reveal synergy and requirement for maintenance but not initiation of T/QYgene expression. Development 128:1587-1597. Ali J.Y. and Bender W., 2004. Cross-regulation among the Polycomb group genes in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 24: 7737-7747. Ausin L, Alonso-Blanco C., Jarillo J.A., Ruiz-GarciaL., and Marti- nez-Zapater J.M., 2004. Regulation of flowering time by FVE, a retinoblastoma-associated protein. Nat. Genet. 36: 162-166. Bannister A. J., Zegerman P., Partridge J. E, MiskaE.A., Thomas J.O., Allshire R.C., and Kouzarides T, 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromodomain. Nature 41(k 120-124. Baroux C., Gagliardini V, Page D., and Grossniklaus U., 2006. Dynamic regulatory interactions of Polycomb group genes: MEDEA autoregulation is required for imprinted gene expression in Arabidopsis. Genes Dev., 20: 1081-1086. Bastow R., Mylne J.S., Lister C., Lippman Z., Martienssen R.A., and Dean C., 2004. Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation. Nature 427: 164-167. Birve A., Sengupta A.K., Beuchle D., Lairson J., Kennison J.A., Rasmuson-Lestander A., and Mbller J., 2001. Su(z)12, a novel Drosophila Polycomb group gene that is conserved in vertebrates and plants. Development 128: 3371-3379. Bracken A.P.. Pasini D.. Capra M., Prosperini E., Colli E., and Helin K., 2003. EZH2 is downstream of the pRB-E2F pathway, essential for proliferation and amplified in cancer. EMBO J. IT. 5323-5335. Breiling A., Bonte E., Ferrari S., Becker P.B., and Paro R., 1999. The Drosophila Polycomb protein interacts with nucleosomal core particles in vitro via its repression domain. Mol. Cell. Biol., 19: 8451-8460. Bruggeman S.W.M., Valk-Lingbeek M.E., van der Stoop P.P.M., Jacobs J.J.L., Kieboom K., Tanger E., Huisman D.. Leung C.. Arsenijevic Y., Marino S., and van Lohuizen M., 2005. Ink4a and Arfdifferentially affect cell proliferation and neural stem cell self- renewal in Bmil -deficient mice. Genes Dev., 19: 1438-1443. Cao R.. Tsukada Y, and Zhang Y, 2005. Role of Bmi-1 and RinglA in H2A ubiquitylation and HOX gene silencing. Mol. Cell, 20: 845-854. Cao R., Wang L.J., Wang H.B., Xia L., Erdjument-Bromage H.,Tempst P., Jones R.S., and Zhang Y, 2002. Role ofhistone H3 lysine 27 methylation in Po/ycowZ>-group silencing. Science 298: 1039-1043. Carrington E.A. and Jones R.S., 1996. The Drosophila Enhancer of zeste gene encodes a chromosomal protein: Examination of wild-type and mutant protein distribution. Development 122: 4073-4083. Chanvivattana Y, Bishopp A., Schubert D., Stock C., Moon Y.H., Sung Z.R., and Goodrich J., 2004. Interaction of 7b/ycowZ)-group proteins controlling flowering in Arabidopsis. Development 131: 5263-5276.
Core N., Charroux B., McCormick A., Vola C, Fasano L., Scott M.P., and Kemdge S., 1997. Transcriptional regulation of the Drosophila homeotic gene teashirt by the homeodomain protein Fushitarazu. Meeh. Dev. 68: 157-172. Czermin B., Melfi R., McCabe D., Seitz V, Imhof A., and Pirrotta V, 2002. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell 111:185-196. Dejardin J., Rappailles A., CuvierO., Grimaud C., Decoville M., Locker D., and Cavalli G., 2005. Recruitment of Drosophila Polycomb group proteins to chromatin by DSP1. Nature 434: 533-538. Dellino G.L, Schwartz Y.B., Farkas G., McCabe D., Elgin S.C., and Pirrotta V., 2004. Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol. Cell 13: 887-893. delMarLorente D., Marcos-Gutierrez G., Perez C., Schoorlemmer J., Ramirez A., Magin T, and Vidal M., 2000. Loss- andgain-of- function mutations show a Polycomb group function for RinglA in mice. Development 127: 5093-5100. de Napoles M., Mermoud J.E., Wakao R., Tang YA., Endoh M., Appanah R., Nesterova T.B., Silva J., Otte A.P., Vidal M., et al., 2004. Polycomb group proteins RinglA/В link ubiquitylation of histone H2A to heritable gene silencing and X inactivation. Dev. Cell 7: 663-676. Ebel C., Mariconti L., and Gruissem W., 2004. Plant retinoblastoma homologues control nuclear proliferation in the female gameto- phyte. Nature 429: 776-780. Fang J., Chen T.P., Chadwick B., Li E., and Zhang Y, 2004. Ringlb- mediated H2A ubiquitination associates with inactive X chro- mosomes and is involved in initiation ofX inactivation. J. Biol. Chem. 279:52812-52815. Ficz G., Heintzmann R., and Arndt Jovin D.J., 2005. Polycomb group protein complexes exchange rapidly in living Drosophila. Development 132: 3963-3976. Fischle W, Wang Y, Jacobs S.A., Kim Y, Allis C.D., and Khoras- anizadeh S., 2003. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev. 17: 1870-1881. FongY, Bender L., Wang W., and Strome S., 2002. Regulation of the different chromatin states of autosomes and X chromosomes in the germ line of C. elegans. Science 296: 2235-2238. Francis N.J., Kingston R.E., and Woodcock C.L., 2004. Chromatin compaction by a Polycomb group protein complex. Science 306: 1574-1577. Francis N.J., Saurin A.J., Shao Z., and Kingston R.E., 2001. Re- constitution of a functional core Polycomb repressive complex. Mol. CellS: 545-556. Gehnng M., Huh J.H., Hsieh T.F., Penterman J., Choi Y, Harada J.J., Goldberg R.B., and Fischer R.L., 2006. DEMETER DNA glycosylase establishes MEDEA Polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell 124: 495-506. Gendall A.R., Levy YY, Wilson A., and Dean C., 2001. The VERNALIZATION2 gene mediates the epigenetic regulation of vernalization in Arabidopsis. Cell 107: 525-535. Goodrich J., Puangsomlee P., Martin M., Long D., Meyerowitz E.M., and Coupland G., 1997. N Polycomb-group gene regulates homeotic gene expression in Arabidopsis. Nature 386: 44—51. Grossniklaus U., 2005. Genomic imprinting in plants: A predomi- nantly maternal affair. In Annual plant reviews: Plant epigenet- ics (ed. P. Meyer), pp. 174-200. Blackwell, Sheffield, United Kingdom. Grossniklaus U., Spillane C., Page D.R., and Kohler C., 2001. Ge- nomic imprinting and seed development: Endosperm formation with and without sex. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 21-27. Grossniklaus U., Vielle-Calzada J.P., Hoeppner M.A., and Gagliano WB. 1998. Maternal control of embryogenesis by MEDEA, a Polycomb group gene in Arahidopsis. Science 280: 446-450. Guitton A.E. and Berger E, 2005. Control of reproduction by Poly- comb Group complexes in animals and plants. I nt. J. Dev. Biol. 49:707-716. Hackett WR, Cordero R.E., and Sinivasan C., 1987. Apical meristem characteristics and activity in relation to juvenility in Hedera, In Manipulation of flowering (ed. J.G. Atherton), pp. 93-99. But- terworth, London. Hadom E., 1968. Transdetermination in cells. Sci. Am. 219: 110. Heard E., 2004. Recent advances in X-chromosome inactivation. Curr. Opin. Cell Biol. : 247-255. Hennig L., Bouveret R., and Gruissem W, 2005. MSI 1-like pro- teins: An escort service for chromatin assembly and remodeling complexes. Trends Cell Biol. 15: 295-302. Hennig L., Taranto P., Walser M., SchonrockN., and Gruissem W, 2003. Arahidopsis MSI 1 is required for epigenetic maintenance of reproductive development. Development 130: 2555-2565. Hsieh ТЕ, Hakim O., Ohad N., and Fischer R.L., 2003. From flour to flower: How Polycomb group proteins influence multiple aspects of plant development. Trends Plant Sci. 8: 439-445. Jacobs J.J.L., Scheijen B., Voncken J.W, Kieboom K., Berns A., and van Lohuizen M., 1999. Bmi-1 collaborates with c-Myc in tu- morigenesis by inhibiting c-Myc-induced apoptosis via INK4a/ ARF. Genes Dev. 13: 2678-2690. Jullien P.E., Katz A., Oliva M., Ohad N., and Berger E, 2006. Poly- comb group complexes self-regulate imprinting of the Polycomb group gene MEDEA in Arahidopsis. Curr. Biol. 16: 486-492. Kagey M.H., Melhuish T.A., and Wotton D., 2003. The Polycomb protein Pc2 is a SUMO E3. Cell 113: 127-137. Kennison J.A., 1995. The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: Trans-regulators of homeotic gene function. Annu. Rev. Genet. 29: 289-303. KimH.J., HyunY, ParkJ.Y, ParkM.J., ParkM.K., KimM.D., Kim H.J., Lee M.H., Moon J., Lee L, and Kim J., 2004. A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arahidopsis thaliana. Nat. Genet. 36: 167-171. Kinoshita T, Harada J.J., Goldberg R.B., and Fischer R.L., 2001. Polycomb repression of flowering during early plant development. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 14156-14161. Klebes A., Sustar A., Kechris K., Li H., SchubigerG., and Romberg T. В., 2005. Regulation of cellular plasticity in Drosophila imaginal disc cells by the Polycomb group trithorax group and lama genes. Development 132: 3753-3765. Klymenko T. and Muller J., 2004 The histone methyltransferases Trithorax and Ashl prevent transcriptional silencing by Polycomb group proteins. EMBO Rep. 5: 373-377. КцЫег C., Page D.R., Gagliardini V, and Grossniklaus U., 2005. The Arahidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nat. Genet. 37: 28-30. КцЫег C., Hennig L., Bouveret R., Gheyselinck J., Grossniklaus U., and Gruissem W, 2003a. Arahidopsis MSI 1 is a component of the MEA/FIE Polycomb group complex and required for seed development. EMBO J. 22: 4804-4814.
Глава 11. Транскрипционный сайленсинг, осуществляемый белками группы Polycomb KuhlerC., Hennig L., Spillane С., Pien S., Gruissem W, and Gross- niklaus U., 2003b. The Polycomb group protein MEDEA regulates seed development by controlling expression of the MADS-box gene PHERES1. Genes Dev. 17: 1540-1553. Kuzmichev A., Jenuwein T, Tempst P., and Reinberg D., 2004. Dif- ferent EZH2-containing complexes target methylation of histone Hl or nucleosomal histone H3. Mol. Cell 14: 183-193. Kuzmichev A., Nishioka K., Erdjument-Bromage H., Tempst P, and Reinberg D., 2002. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the Enhancer of Zeste protein. Genes Dev. 16: 2893-2905. Kuzmichev A., Margueron R., Vaquero A., Preissner T.S., Scher M., Kirmizis A., Ouyang X., Brockdorff N., Abate Shen C., Farnham P, and Reinberg D., 2005. Composition and histone substrates of Polycomb repressive group complexes change during cellular differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 1859-1864. Lavigne M., Francis N.J., King I.F., and Kingston R.E., 2004. Propagation of silencing; recruitment and repression of naive chromatin in trans by Polycomb repressed chromatin. Mol. Cell 13:415-425. Lee N., Maurange G, Ringrose L., and Paro R., 2005. Suppression of Polycomb group proteins by JNK signalling induces transdeter- mination in Drosophila imaginal discs. Nature 438: 234-237 Leung C., Lingbeek M., Shakhova O., Liu J., Tanger E., Saremaslani P., van Lohuizen M., and Marino S., 2004. Bmil is essential for cerebellar development and is overexpressed in human medullo- blastomas. Nature 428: 337-341. Levine S.S., King I.F., and Kingston R.E., 2004. Division of labor in Polycomb group repression. Trends Biochem. Sci. 29: 478-485. Levine S.S., Weiss A., Erdjument Bromage H., Shao Z., Tempst P, and Kingston R.E., 2002. The core of the Polycomb Repressive Complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans. Mol. Cell. Biol. 22: 6070-6078. Lewis E.B., 1978. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276: 565-570. Luo M., Bilodeau P, Koltunow A., Dennis E.S., Peacock W.J., and Chaudhury A.M., 1999. Genes controlling fertilization- independent seed development in Arahidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 296-301. Mager J., Montgomery N.D., de Villena F.P.M., and Magnuson T, 2003 Genome imprinting regulated by the mouse Polycomb group protein Eed. Nat. Genet. 33: 502-507. Marx J., 2005. Developmental biology — Combing over the Poly comb group proteins. Science 308: 624-626. Moon Y.H., Chen L., Pan R.L., Chang H.S., ZhuT, Maffeo D.M., and Sung Z.R., 2003. EMF genes maintain vegetative development by repressing the flower program in Arabidopsis. Plant Cell 15:681-693. Mosquna A., Katz A., Shochat S., Graft G., and Ohad N., 2004. Interaction of FIE, a Polycomb protein, with pRb: a possible mechanism regulating endosperm development. Mol. Genet. Genomics 271: 651-657. Mbller J., Hart C.M., Francis N.J., Vargas M.L., Sengupta A., Wild B., Miller E.L., O’Connor M.B., Kingston R.E., and Simon J.A., 2002. Histone methyltransferase activity of a Drosophila polycomb group repressor complex. Cell 111:, 197-208. Ohad N., Yadegari R., Margossian L., Hannon M., Michaeli D., Harada J.J., Goldberg R.B., and Fischer R.L., 1999. Mutations in FIE, a WD Polycomb group gene, allow endosperm develop- ment without fertilization. Plant Cell 11: 407-415. Otte A.P. and Kwaks TH., 2003. Gene repression by Polycomb group protein complexes: A distinct complex for every occasion? Curr. Opin. Genet Dev. 13: 448-454. Page D.R. and Grossniklaus U., 2002. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nat. Rev. Genet. 3: 124-136. Paro R. and Hogness D.S., 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 263-267. Poux S., McCabe D., and Pirrotta V, 2001. Recruitment of com- ponents of Polycomb group chromatin complexes in Drosophila. Development 128: 75-85 Raaphorst F.M, 2005. Deregulated expression of Po/ycoznZ>-group oncogenes in human malignant lymphomas and epithelial tu- mors. Hum. Mol. Genet. 14: R93-100. Rea S., Eisenhaber R., O’CarrollN., Strahl B.D., SunZ.W, Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Pouting C.P., Allis C.D., and Jenu- wein T, 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599. Reyes J.C. and Grossniklaus U., 2003. Diverse functions of Polycoml group proteins during plant development. Semin. Cell Dev. Biol 14: 77-84. Ringrose L., Ehret H., and Paro R., 2004. Distinct contributions о histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of Polycomb complexes. Mol. Cell 16: 641-653. Ringrose L, Rehmsmeier M., Dura J.M., and Paro R., 2003. Ge nome-wide prediction of Polycomb/Trithorax response element in Drosophila melanogaster. Dev. Cell 5: 759-771. Sanchez-Eisner T, Gou D., Kremmer E., and Sauer E., 2006. Non cod-ing RNAs of trithorax response elements recruit Drosophih Ashl to Ultrabithorax. Science 311: 1118-1123. Satijn D.P. and Otte A.P., 1999. RING1 interacts with multipli Po/ycowZ>-group proteins and displays tumorigenic activity. Moi Cell. Biol., 19: 57-68. Saurin A.J., Shiels C., Williamson J., Satijn D.P.E., Otte A.P, Shee D., and Freemont PS., 1998. The human polycomb group com plex associates with pencentromeric heterochromatin to form; novel nuclear domain. J. Cell Biol. 142: 887-898. Schmitt S., Prestel M., and Paro R., 2005. Intergenic transcriptioi through a Polycomb group response element counteracts silencing Genes Dev., 19: 697-708. Sung S. and Amasino R.M., 2004a. Vernalization and epigenetic* How plants remember winter. Curr. Opin. Plant Biol 7: 4-10. Sung S. and Amasino R.M., 2004b. Vernalization in Arabidopsi thaliana is mediated by the PHD finger protein VIN3. Natur 427:159-164. Tie E, FuruyamaT, Prasad-Sinha J., Jane E., and Harte P.J., 200] The Drosophila Polycomb group proteins ESC and E(Z) are pres ent in a complex containing the histone-binding protein p55 an the histone deacetylase RPD3. Development 128: 275-286. Tschiersch B., Hofmann A., Krauss V., Dorn R., Korge G., an Reuter G., 1994. The protein encoded by the Drosophila position effect variegation suppressor gene Su(var)3-9 combines domain of antagonistic regulators of homeotic gene complexes. EMBi J. 13: 3822-3831. Valk-Lingbeek M.E., Bruggeman S.W.M., and van Lohuizen M 2004. Stem cells and cancer: The Polycomb connection. Ce 118: 409-418. van der Lugt N.M., Domen J., Linders K., van Roon M., Robanus Maandag E., te Riele H., van der Valk M., Deschamps J Sofroniew M , van Lohuizen M., et al., 1994. Posterior trans
formation, neurological abnormalities, and severe hematopoi- etic defects in mice with a targeted deletion of the bmi-1 proto- oncogene. Genes Dev. 8: 757-769. van Lohuizen M., Verbeek S., Scheijen B., Wientjens E., van der Gulden H., and Berns A., 1991. Identification of cooperating oncogenes in Ep-myc transgenic mice by provirus tagging. Cell 65:737-752. Virft E., Brenner C., Deplus R., Blanchon L., Fraga M., Didelot C, Morey L., van Eynde A., Bernhard D., Vanderwinden J.M., et al., 2006. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439: 871-874. WangL., Brown J.L., Cao R., Zhang Y., Kassis J.A., and Jones R.S., 2004. Hierarchical recruitment of Polycomb group silencing complexes. Mol. Cell 14: 637-646. Yamamoto Z., Girard F., Bello B., Afiblter M., and Gehring W.J., 1997. The cramped gene of Drosophila is a member of the Po/ycowZ>-group, and interacts with mus209, the gene encoding proliferating cell nuclear antigen. Development 124: 3385-3394. Yamamoto K., Sonoda M., Tnokuchi J., Shirasawa S., and Sasazuki T, 2004. Polycomb group Suppressor of zeste 12 links Heterochro- matin Protein la and Enhancer of zeste 2. /. Biol. Chem. 279: 401-406. YoshidaN., Yanai Y, Chen L.J., Kato Y, Hiratsuka J., MiwaT, Sung Z.R., and Takahashi S., 2001. EMBRYONIC ELOWER2, a novel Polycomb group protein homolog, mediates shoot development and flowering in Arabidopsis. Plant Cell 13: 2471 -2481. ZencakD., Lingbeek M., Kostic С., Tekaya M., Tanger E., Homfeld D., Jaquet M., Munier F.L., Schorderet D.F., van Lohuizen M., and Arsenijevic Y, 2005. Bmil loss produces an increase in astroglial cells and a decrease in neural stem cell population and proliferation./. Neurosci. 25: 5774-5783.
ГЛАВА 12 РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ БЕЛКАМИ ГРУППЫ TRITHORAX Robert Е. Kingston1 и John W. Tamkun2 1 Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts 02114 department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz, California 95064 Содержание Общее резюме 1. Введение 1.1. Идентификация генов, участвующих в под- держании детерминированного состояния 1.2. Белки trxG у других организмов 1.3. Белки trxG играют разные роли в эукариоти- ческой транскрипции 2. Связи между белками trxG и хроматином 2.1. Белки trxG, участвующие в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Все клетки в организме должны обладать способностью «помнить», клетками какого типа они должны быть. Для этого процесса, называемого «клеточная память», или «транскрипционная память», необходимы механизмы двух основных классов. Первый класс, обсуждавшийся в предыдущей главе, функционирует таким образом, чтобы поддерживать состояние «ВЫКЛЮЧЕНО» у тех генов, которые, будучи включены, определяли бы непра- 2.2. Белки trxG, ковалентно модифицирующие нуклеосомные гистоны 3. Связи между белками trxG и общей транскрип- ционной машинерией 4. Биохимические функции других белков trxG 5. Функциональные взаимодействия между белка- ми trxG 6. Белки trxG: активаторы или антирепрессоры? 7. Выводы и перспективы Литература вильныи клеточный тип. Белки группы Polycomb (PcG — Polycomb-Group) играют, в качестве своей основной функции, эту репрессивную роль в клеточной памяти. Ко второму классу относятся те механизмы, которые требуются для поддержания ключевых генов в состоянии «ВКЛЮЧЕНО». Любой клеточный тип требует экспрес- сии главных регуляторных белков, которые управляют специфическими функциями, необходимыми для данно- го клеточного типа. Гены, кодирующие эти главные ре- гуляторные белки, должны поддерживаться в состоянии «ВКЛЮЧЕНО» на протяжении всей жизни организма,
чтобы поддерживать соответствующие клеточные типы в этом организме. Удивительная многокрылая мушка, изображенная в левой части рисунка в начале этой главы, иллюстри- рует эффектные фенотипы, которые могут получиться в результате неспособности поддерживать состояние «ВКЛЮЧЕНО» у главного регуляторного гена. Белки, участвующие в поддержании состояния «ВКЛЮЧЕ- НО», называются белками группы trithorax (trxG — trithorax-Group) в честь гена trithorax, члена-основателя этой группы регуляторных белков. Большая группа бел- ков с различными функциями составляет группу trxG. Роли, которые эти белки играют в эпигенетических ме- ханизмах, поддерживающих состояние «ВКЛЮЧЕНО», оказываются на данный момент более сложными, чем роли белков PcG в репрессии. Первая сложность состо- ит в том, что очень большое число белков и механизмов нужно для того, чтобы активно транскрибировать РНК с любого гена. Таким образом, в противоположность репрессии, которая может быть выполнена сравнитель- но простыми механизмами, блокирующими доступ всех белков, активация гена требует многочисленных шагов, любой из которых может играть роль в поддержании состояния «ВКЛЮЧЕНО». Таким образом, имеются многочисленные возможные стадии, на которых мог бы работать белок trxG. Вторая сложность в представлениях о белках trxG заключается в том, что белки, функпионируюшие в ак- тивации, могут также, в других контекстах, функцио- нировать в репрессии. Это могло бы показаться про- тиворечащим интуиции, но, в зависимости от точной архитектуры гена, один и тот же белок, выполняющий свою функцию, мог бы в одном случае помогать гену становиться активированным, а в другом — помогать другому гену становиться репрессированным. В на- стоящее время представляется, что белки trxG не пред- назначены исключительно для поддержания экспрес- сии гена, но что эти белки могут также играть в клетке множество ролей. Эти сложности порождают несколь- ко интересных вопросов, остающихся пока без ответа Почему лишь некоторые из этих белков, нужных для активации транскрипции, являются также критичны- ми для поддержания транскрипции? Обладают ли эти белки функциями, уникально приспособленными для поддержания активного состояния? Или же некоторые из этих белков нужны для поддержания исключительно благодаря эволюционной случайности, сделавшей их ключевыми регуляторами гена (генов), имеющего осо- бенно важное значение для развития? Как показано ниже, некоторые из белков trxG уча- ствуют в регулировании структуры хроматина в проти- воположность механизмам, используемым белками PcG. Белки trxG могут размещать ковалентные модификации на хроматине или могут изменять хроматин, изменяя структуру и положение нуклеосом, являющихся строи- тельными блоками хроматина Другие белки trxG функ- ционируют как часть транскрипционной машины. Таким образом, эти белки обнаруживаются в более широком ряду комплексов, чем белки PcG, и, вероятно, играют более сложные роли в эпигенетическом механизме. 1. Введение Многочисленные «решения» о ходе развития [develop- mental decisions] — включая детерминацию судьбы кле- ток — принимаются в ответ на временную позиционную информацию в раннем эмбрионе. Эти решения зависят от изменений в экспрессии генов. Это дает возможность клеткам с идентичными генетическими «синьками» при- обретать уникальные идентичности и следовать разными путями дифференцировки. Эти изменения в экспрессии генов, лежащие в основе детерминации клеточных судеб, являются наследуемыми; судьба клетки редко изменя- ется, коль скоро она была детерминирована, даже по- сле многочисленных клеточных делений и длительных периодов времени развития. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе детерминированного состояния, с давних пор было целью биологов развития и молекулярных биологов. Многие из регуляторных белков, участвующих в поддержании наследуемых состояний экспрессии ге- нов были идентифицированы в исследованиях гомео- тических {НОХ) генов у Drosophila. Гены НОХ кодируют гомеодоменные транскрипционные факторы, которые регулируют транскрипцию батарей генов-мишеней, расположенных «вниз по течению» и, в свою очередь, специфицирующих идентичности сегментов тела (Gelion and McGinnis, 1998). У Drosophila гены НОХ обнаруживаются в двух комплексах генов: комплексе Antennapedia (Ant-C), который содержит НОХ-гены labial (lab), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) и An- tennapedia (Antp); и комплекс bithorax (BX-C), содержа- щий ЯОХ-гены Ultrabithorax (Ubx), abdominalA (abdA) и abdominalB (abdB) (Duncan, 1987; Kaufman et al., 1990). Каждый ген НОХ специфицирует идентичность конкретного сегмента или группы сегментов вдоль передне-задней оси развивающейся мухи. Например, Antp специфицирует идентичность второго торакаль- ного сегмента, включая вторую пару ног, тогда как Ubx специфицирует идентичность третьего торакального сегмента, включая жужжальца, расположенные позади крыльев Таким образом, транскрипционные факторы, кодируемые генами НОХ, функционируют как главные регуляторные переключатели, определяющие выбор между альтернативными путями развития. Транскрипция генов НОХ должна регулироваться очень точно, потому что в результате их несоответству- ющей экспрессии могут возникать резкие изменения в клеточных судьбах (Simon, 1995; Simon and Tamkun, 2002). Например, дерепрессия Antp в головных сегмен- тах превращает антенны в ноги, а инактивация Ubx в торакальных сегментах превращает жужжальца в кры- лья. У Drosophila начальные паттерны транскрипции НОХ устанавливаются на ранних стадиях эмбриогенеза транскрипционными факторами, кодируемыми генами сегментации. Белки, кодируемые генами сегментации, — включая гены группы gap, группы pair-rule и группы segment-polarity — подразделяют ранний зародыш на 14 идентичных сегментов. Эти белки устанавливают также начальные паттерны транскрипции НОХ, что является первым шагом на пути к развитию сегментов с разными
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax Рис. 12.1. Концепция клеточной памяти Схематическая иллюстрция, освещающая роль комплексов trxG в поддержании наследуемых состояний активной экспрессии генов в противоположность наследуемому сайленсингу, обусловленному комплексами PcG, как это первоначально было определено для кластера НОХ-генов у Drosophila идентичностями и мофологией. Будучи установлены, эти ограниченные сегментами паттерны транскрипции НОХ должны поддерживаться на протяжении последующих эмбриональной, личиночной стадий и стадии куколки для того, чтобы поддерживать идентичность индивиду- альных сегментов тела. Поскольку большинство генов сегментации временно экспрессируются в раннем раз- витии, эта функция выполняется двумя другими группа- ми регуляторных белков: репрессорами группы Polycomb (PcG) и транскрипционными регуляторами группы trithorax (trxG) (рис. 12.1). Регуляция транскрипции НОХ состоит, следовательно, из по крайней мере двух различ- ных фаз: установления (генами сегментации) и поддер- жания (генами PcG и trxG) (рис. 12.2). 1.1. Идентификация генов, участвующих в поддержании детерминированного состояния Благодаря своей роли в поддержании клеточных судеб гены PcG и trxG на целые десятилетия стали объектом ин- тенсивных исследований. Как обсуждается в предыдущей главе, большинство генов PcG были идентифицированы по мутациям, вызывающим гомеотические трансформа- ции в силу неспособности поддерживать репрессиро- ванные состояния транскрипции НОХ. Классическим примером фенотипа, ассоциированного с мутациями PcG, является трансформация второй и третьей пары ног в ноги первой пары. Эта гомеотическая трансформация является результатом дерепрессии гена группы ANT-C, Scr, и проявляется как появление на второй и третьей парах ног щетинок, характерных для первой пары ног и известных как зубцы половых гребешков. Этот фенотип «Polycomb», или «избыточные половые гребешки» — вместе с другими гомеотическими трансформациями, являющимися результатом неспособности поддерживать репрессию генов НОХ, — привел к идентификации более чем дюжины генов PcG у Drosophila. Большинство генов PcG кодируют субъединицы двух комплексов, участвую- щих в репрессии транскрипции: Polycomb Repressive Complex (PRC) 1 и PRC2 (Levine et al., 2001). PRC1 и PRC2 «нацеливаются» на участки вблизи промоторов НОХ (и других) посредством c/s-регуляторных элемен- тов, известных как элементы ответа Polycomb (PREs — Polycomb-response elements). Большое число данных по- зволяет предполагать, что комплексы PcG репрессируют транскрипцию, модулируя структуру хроматина (Francis and Kingston, 2001; Ringrose and Paro, 2004). Члены группы trxG, в том числе trithorax (trx); absent, small или homeotic 1 (ash 1), absent, small или homeotic 2 (ash2) и female-sterile homeotic (fsh) изначально были идентифи- цированы по мутациям, имитирующим мутации НОХ типа «потери функции» у Drosophila (рис. 12.3) (Kenni- son, 1995). Например, мутации в trx — члене-основателе группы trxG — вызывают частичную трансформацию гальтеров в крылья (благодаря уменьшенной транскрип- ции Ubx); первой пары ног во вторую пару (благодаря сниженной транскрипции Scr); и задних абдоминальных сегментов в более передние образования (благодаря сни- женной транскрипции abdA и AbdB) Многочисленные
УСТАНОВЛЕНИЕ - (гены сегментации) ПОДДЕРЖАНИЕ Эмбриональное, личиночное, куколочное развитие Рис. 12.2. Регуляция транскрипции НОХ Границы транскрипции abd-A и других генов НОХустанавливаются белками сегментации. В число этих белков входят продукты генов gap и pair-rule, подразделяющие эмбрион на 14 идентичных сегментов. В ходе последующего развития состояния «ВЫКЛЮ- ЧЕНО» и «ВКЛЮЧЕНО» транскрипции НОХподдерживаются повсеместно экспрессированными членами группы активаторов trxG и репрессоров PcG посредством механизмов, которые остаются мало понятными Ранний эмбрион Взрослая особь другие члены trxG были идентифицированы в ходе скри- нинга на экстрагенные супрессоры мутаций Рс (Su(Pc)) (Kennison and Tamkun, 1988). Идея этих генетических скринингов заключалась в том, что снижение уровня белка, поддерживающего активное состояние, долж- но компенсировать снижение уровня репрессора PcG (рис. 12.4). Локус brahma (brm) и многочисленные другие локусы Su(Pc) были идентифицированы с помощью это- го подхода, что довело общее число членов trxG до более чем 16 (табл. 12.1). Многие другие белки были класси- фицированы как члены trxG на основе других, менее строгих критериев, в том числе гомологии по последова- тельности с известными белками trxG, физической ассо- циации с белками trxG, биохимической активности или влияния на транскрипцию WXin vitro или in vivo. Функциональные взаимоотношения между членами trxG и механистическая связь между функцией trxG и поддержанием клеточной судьбы являются сложными Имеются многочисленные механизмы, посредством которых белок мог бы поддерживать соответствую- щий высокий уровень экспрессии гомеотического гена (генетическое определение белка trxG), не буду- чи специально предназначенным [devoted] активато- ром транскрипции, или белком, предназначенным для эпигенетического контроля. Формальные возможности для функции trxG (в дополнение к способности непо- средственно активировать транскрипцию) включают способность усиливать функцию прямых активаторов, способность блокировать функцию репрессоров PcG и способность создавать «пермиссивное» состояние хро- матина, облегчающее функционирование других мно- гочисленных регуляторных комплексов. Более того, как обсуждается ниже, некоторые белки trxG играют сложную механистическую роль, которая на одних ге- нах вносит вклад в активацию, а на других генах может вносить вклад в репрессию. Два коротких примера иллюстрируют сложность потенциальных ролей в отношении белков trxG. Было высказано предположение, что комплексы АТФ- зависимого ремоделинга, такие как комплекс, содер- жащий белки trxG BRM и MOR, увеличивают способ- ность любого сиквенс-специфичного, связывающегося с ДНК белка связываться с хроматином. Нерешенной проблемой является вопрос о том, может ли этот АТФ- зависимый комплекс ремоделинга использовать эту способность стимулировать и активацию генов посред- ством увеличенного связывания активаторов, и репрес- сию посредством увеличенного связывания репрессо- ров. Другие исследования привели к гипотезе о том, что некоторые комплексы белков trxG могли бы функцио- нировать главным образом путем блокирования спо- собности PcG-репрессорного комплекса функциониро- вать, и что репрессия белками PcG является состоянием «по умолчанию». Таким образом, в этом последнем слу- чае роль в поддержании активного состояния некото- рыми белками trxG могла бы отражать косвенные, в противоположность прямым, действия. Эволюцион- ный консерватизм этого семейства и консервативные функции этого семейства наводят на мысль: механизмы какого типа нужны для поддержания соответствующего уровня активации главных регуляторных генов, опреде- ляющих клеточную судьбу. 1.2. Белки trxG у других организмов Функциональные аналоги по существу всех белков trxG Drosophila имеются у млекопитающих, в том числе у человека (табл. 12.1). Генетические и биохимические ис- следования показали, что белки мух и млекопитающих играют весьма консервативную роль и в экспрессии ге- нов, и в развитии. Хорошим примером функционального консерватизма белков trxG является MLL, ортолог trx Drosophila у млекопитающих Мутации в MLL вызывают гомеотические трансформации аксиального скелета мы- шей благодаря неспособности поддерживать активную транскрипцию генов//(2¥(Yu et al., 1995,1998). Функцио-
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax Рис. 12.3. Примеры трансформаций клеточной судьбы в развитии, связанных с мутациями в генах trxG у Drosophila (Л) Нога первой пары, дикий тип. Половой гребешок, уникальный для первой пары ног, помечен стрелкой. (Б) Участок мутантной по kis ткани {маркирован стрелкой) частично трансформирован от ног первой пары в ноги второй пары благодаря сниженной транс- крипции Scr, хотя и недостаточной, на что указывает уменьшение числа зубцов полового гребешка. (В) Участок мутантной по тог ткани (маркирован стрелкой) обнаруживает частичную трансформацию из жужжальца в крыло благодаря сниженной экспрессии Ubx. (Г) Участок мутантной по kis ткани (маркирован стрелкой) в пятом абдоминальном сегменте частично трансформирован к более передней идентичности благодаря сниженной экспрессии Abd В, на что указывает утрата темной пигментации, характерной для этого сегмента. (А, Б, Г — перепечатано, с любезного разрешения, из Daubesse et al., 1999) Экспрессия Scr в ножных имагинальных дисках Мутант PcG Дикий тип Двойной мутант PcG/trxG Первая нога Вторая нога Третья нога Фенотип взрослой особи Первая нога Вторая нога Третья нога Рис. 12.4. Мутации trxG блокируют дерепрессию генов Нох у мутантов PcG (а) Ножные имагинальные диски, окрашенные антителами против белка, кодируемого геном Нох, Scr, который специфицирует идентичность лабиального и первого торакального сегментов, в том числе первой пары ног. (б) Базитарзальные сегменты ног взрослых особей дикого типа и мутантных. Обратите внимание на присутствие зубцов полового гребешка на ноге первой, но не второй и третей пары у взрослых особей дикого типа. Ген Scr частично дерепрессирован во вторых и третьих ножных дисках, где в норме он «молчит», у особей, гетерозиготных по мутациям в генах PcG, что приводит к появлению эктопических зубцов поло- вого гребешка на ногах второй и третьей пары. Эти фенотипы супрессируются мутациями в Ьгт и многих других генах trxG (а — перепечатано, с любезного разрешения, из Tamkun et al., 1992 [©Elsevier]; б — часть с изменениями, с любезного разрешения, из Kennison, 2003 [©Elsevier].)
Таблица 12.1. Биохимические функции белков trxG Известная функция Организм Комплексируются с белками не-trxG? Drosophila человек дрожжи АТФ-зависимый ремо- делинг хроматина BRM BRG1/HBRM Swi2/Snf2, Sthl Да (5-10)’ OSA BAF250 Swi/Adr6 Да (5-10) MOR BAF155, BAF170 Swi3, Rsc8 Да (5-10) SNR1 hSNF5/INIl Snf5, Sfhl Да (5-10) Kismet (KIS) CHD7 — Неизвестно Метилтрансферазы гистонов Trithorax (TRX) MLL1, MLL2, hSETl Setl Да (5-20) Отсутствуют, маленькие или гомеотический 1 (ASH1) hASHl - Неизвестно Медиаторные субъеди- ницы Kohtalo (КТО) TRAP230 Srb8 Да (13-24) Skuld (SKD) TRAP240 Srb9 Да (13-24) Транскрипционный фактор Trithorax-like (TRL) BTBD14B - Нет Рецептор фактора роста Breathless (BTL) FGFR3 — Неизвестно Другие Sallimus (SLS) Titin Неизвестно ASH2 hASH2L6 Bre2 Да (5-20) aBRM, OSA, MOR и SNR1 все могут быть обнаружены в стабильной ассоциации друг с другом в едином комплексе ^Относительно низкое сходство с ASH2 по последовательности. нирование как MLL, так и trx в качестве метилтрансфераз лизинов в гистонах (HKMTs) и прямое доказательство функциональной гомологии между этими двумя белками было получено при использовании MLL человека для частичного «спасения» дефектов развития, возникающих в результате утраты функции trx у мух (Muyrers-Chen et al., 2004). Таким образом, механизмы, лежащие в осно- ве поддержания детерминированного состояния, были высококонсервативными в ходе эволюции. Рак и другие заболевания человека могут быть ре- зультатом неспособности поддерживать наследуемое состояние экспрессии генов. Неудивительно, что мно- гие гены PcG и trxG у человека функционируют как протоонкогены или гены-супрессоры опухолей. Напри- мер, ген MLL из группы trxG у человека первоначально был идентифицирован по хромосомным транслокаци- ям 1 lq23, ассоциированным с острой лимфобластозной (ALL) или миелоидной (AML) лейкемией. Мутации в других генах trxG млекопитающих также ассоцииру- ются с различными раковыми заболеваниями (допол- нительные детали см. в главе 23). Например, BRG1, аналог гена brm Drosophila у человека, физически взаи- модействует с белком-супрессором опухоли ретинобла- стомы; нарушение этого взаимодействия приводит к ускоренному клеточному делению и злокачественной трансформации в некоторых линиях опухолевых кле- ток человека (Dunaief et al, 1994; Strober et al., 1996). В согласии с ролью BRG1 в супрессии опухоли мыши, ге- терозиготные по мутациям в этом гене, склонны к обра- зованию разнообразных опухолей (Bultman et al., 2000). Мутации в INI 1, человеческом аналоге гена группы trxG SNF5-related gene 1 (SNRГ) у Drosophila, также делают их носителей предрасположенными к раку и были иден- тифицированы в большом проценте злокачественных рабдоидных опухолей (агрессивный рак у детей) (Ver- steege et al., 1998). Эти и другие связи с заболеваниями у человека дали исследователям дополнительную моти- вацию к пониманию механизма действия белков trxG. 1.3. Белки trxG играют разные роли в эукариотической транскрипции Группа активаторов trxG — это большая и функцио- нально разнообразная группа регуляторных белков. Это может отражать сложность эукариотической транскрип- ции, включающей высокорегулируемые взаимодействия между геноспецифичными активаторами транскрипции, многочисленными компонентами общей транскрип- ционной машины и транскрибируемой матрицей ДНК. Активация транскрипции включает связывание сиквенс- специфичных активирующих белков, рекрутирование этими белками общей транскрипционной машины, фор- мирование преинициационного комплекса, в котором РНК-полимераза II связывается с промотором, раскры- тие спирали ДНК возле этого промотора, эффективный уход РНК-полимеразы от промотора и эффективную элонгацию РНК-полимеразы через данный ген. Способность поддерживать состояние активной транскрипции могло бы включать любой из многочис- ленных этапов, необходимых для активации, поскольку на любом данном гене разные этапы могли бы играть роль, определяющую скорость процесса для транс- крипционной активности. Упаковка эукариотической ДНК в хроматин представляет еще один уровень, на котором белки trxG могут регулировать транскрипцию Нуклеосомы и другие компоненты хроматина обнару- живают тенденцию к подавлению связывания общих и ген-специфичных транскрипционных факторов с ДНК,
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax а также к подавлению элонгации РНК-полимеразы. Изменения в структуре хроматина — в том числе изме- нения в структуре и позиционировании нуклеосом — могут влиять практически на каждый этап в процессе транскрипции. Любой белок, необходимый для транскрипции, требуется для поддержания активного состояния. Действительно, некоторые белки trxG могут играть сравнительно общие роли в транскрипции, а не быть предназначенными исключительно для поддержания детерминированного состояния. Однако другие бел- ки trxG могут играть специализированные роли в этом процессе, либо непосредственно противодействуя ре- прессии, осуществляемой PcG, либо поддерживая на- следуемые состояния активности генов в ходе реплика- ции ДНК и митоза. Этот последний класс белков trxG представляет особый интерес для биологии развития. 2. Связи между белками trxG и хроматином Генетические исследования, показывающие, что гены trxG играют ключевые роли в транскрипции и развитии, стимулировали значительные услия, направленные на понимание биохимической функции их продуктов. Многие из этих экспериментов использовали в качестве своей концептуальной базы гипотезу, согласно которой хроматин является биологически релевантным субстра- том для белков trxG. Все гены упакованы в хроматин, и эта упаковка может создать компактное и недоступное состояние или же может находиться в открытом и пер- миссивном состоянии. И пермиссивное, и недоступное состояния, по-видимому, могут быть наследуемыми. Эти соображения привели к простой гипотезе, согласно которой белки trxG могли бы модулировать структуру хроматина и влиять на регуляцию. Более того, поскольку гены trxG были клонированы и секвенированы, стало очевидным, что некоторые из их продуктов родственны белкам, участвующим в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина или ковалентной модификации нуклеосом- ных гистонов у других организмов, в том числе у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, хотя у дрожжей отсутствуют гены НОХ или репрессоры PcG, этот орга- низм дал ценные сведения о потенциальной роли белков trxG в эукариотической транскрипции. Одна из первых связей между trxG и хроматином вытекала из открытия, показавшего, что trxG-ген brm у Drosophila является близкородственным SWI2/SNF2 дрожжей (Tamkun et al., 1992). SWI2/SNF2 был иден- тифицирован в ходе скрининга на гены, участвующие в переключении типа спаривания (гены switch [sw/]) и сбраживании сахарозы (гены sucrose-nonfermenting [snf]). Впоследствии было показано, что SWI2/SNF2 необхо- дим для активации многочисленных индуцибельных ге- нов дрожжей (Holstegeet al., 1998; Sudarsanametal., 2000). Дефекты транскрипции, наблюдаемые у мутантов swi2/ snf2, супрессируются мутациями в нуклеосомных гисто- нах; это раннее наблюдение впервые позволило пред- положить, что SWI2/SNF2 активирует транскрипцию путем противодействия репрессии хроматина (Kruger et al., 1995). Биохимические исследования, проведенные в начале 1990-х годов, подтвердили эту гипотезу; SWI2/ SNF2 и многие другие белки, идентифицированные в ходе скрининга на swi2/snf2, функционируют как субъе- диницы большого белкового комплекса (SWI/SNF), ис- пользующего энергию гидролиза АТФ для увеличения способности белков связываться с нуклеосомной ДНК (Cote et al., 1994; Imbalzano et al., 1994; Kwon et al., 1994). SWI2/SNF2 функционирует как субъединица АТФазы, или «двигатель», этой машины ремоделинга хроматина; другие субъединицы комплекса SWI/SNF опосредуют взаимодействия с регуляторными белками или с его хро- матиновым субстратом (Phelan et al., 1999). На еще одну связь между trxG и хроматином ука- зывало наличие доменов SET в белках Trithorax (TRX) и Absent (малый, или гомеотический — ASH1) группы trxG. Домен SET был первоначально определен по от- резку аминокислотной последовательности, обнаружи- вающему гомологию между Su(var)3-9, Enhancer of zeste (E(z)) и TRX; последние два белка являются членами PcG и trxG, соответственно. В конце 1990-х годов было показано, что белки семейства SET обладают актив- ностью НКМТ. Su(var)3-9 метилирует НЗК9, тогда как (E(z)) метилирует НЗК27 (Rea et al., 2000; Levine et al., 2004; Ringrose and paro, 2004) Как обсуждается в других главах, метилирование НЗК9 стимулирует сборку гете- рохроматина, тогда как метилирование НЗК27 оказыва- ется необходимым для PcG-репрессии (более детальное обсуждение см. в главах 5 и 11, соответственно). При- сутствие доменов SET в белках trxG позволило предпо- ложить, что метилирование «хвостов» гистонов могло бы иметь важное значение для поддержания активных транскрипционных состояний. Эти открытия, вместе с растущим пониманием, что ферменты ремоделинга и модификации хромати- на играют ключевую роль в активации транскрипции, побудили биохимиков идентифицировать белковые комплексы, содержащие белки trxG, и изучить влияние этих комплексов на структуру хроматина in vitro. Другие эксперименты имели своей целью проверку гипотезы о том, что белки trxG могли бы взаимодействовать непо- средственно с транскрипционной машиной (еще один хорошо установленный способ влиять на регуляцию) Как описано ниже, эти исследования показали, что не- которые белки trxG влияют на регуляцию посредством модификации структуры хроматина, тогда как другие функционируют путем прямых взаимодействий с ком- понентами транскрипционной машины. 2.1. Белки trxG, участвующие в АТФ- зависимом ремоделировании хроматина Участие комплексов ремоделинга хроматина предполага- лось в самых разных биологических процессах, в том числе в репрессии и активации транскрипции, сборке хроматина, регуляции структуры хроматина более высокого порядка и в клеточной дифференцировке. Наиболее всесторонне изученными белками trxG. участвующими в ремоделинге хроматина, являются BRM и его аналоги у человека, BRG1
2. Связи между белками trxG и хроматином и HBRM. Как и предсказывалось, эти белки функциониру- ют как АТФазные субъединицы комплексов, очень близко родственных SWI/SNF дрожжей (Kwon et al., 1994; Wang et al., 1996). Комплексы SWI/SNF сотержат от 8 до 15 субъе- диниц и были очень консервативны в ходе эволюции (рис. 12.5). АТФаза каждого из этих комплексов способна функ- ционировать как отдельная субъединица. Хотя на это се- мейство белков исторически ссылались как на содержащее «геликазный» мотив (в силу сходства их АТФазного домена с доменом истинных геликаз), никогда не было показано, что эти белки, родственные BRM, обладают геликазной активностью; скорее, для влияния на изменения в струк- туре хроматина они используют другие механизмы, такие как транслокацию вдоль ДНК (Whitehouse et al., 2003; Saha et al., 2005). Второй trxG-ген, идентифицированный при этом скрининге, moira (тог), кодирует еще один ключевой член этого АТФ-зависимого ремоделирующего комплекса у Drosophila, а гомологи BRM и MOR взаимодействуют не- посредственно и формируют функциональный кор SWI/ SNF у человека (Phelan et al., 1999). SWI/SNF и другие комплексы ремоделинга хромати- на используют энергию гидролиза АТФ для изменения структуры или позиционирования нуклеосом. Катали- зируя АТФ-зависимые изменения в структуре хромати- на, комплексы ремоделинга хроматина помогают транс- крипционным факторам и другим регуляторным белкам получить доступ к нуклеотидным последовательностям ДНК, которые в норме были бы закрыты гистоновыми белками (Polach and Widom, 1995; Logie and Peterson, 1997). Среди моделей создания доступа к специфи- ческим сайтам — «скольжение» гистонов по ДНК для перемещения сайта в линкерный участок, выпетлива- ние ДНК из гистонового октамера или же (самый край- ний вариант!) выселение всего гистонового октамера в другое место в ядре (рис. 12.6). АТФ-зависимый ремо- делинг может также приводить к изменениям в поло- жении нуклеосом вдоль нуклеотидной последователь- ности ДНК, к изменениям в спейсинге нуклеосом и к перемещениям гистонов в гистоновый октамер (являю- щийся кором нуклеосомы) и из него Другие ремодели- BRM АТФазный домен Человек BAF155 BAF170 BAF53 INI1 BAF57 BAF MOR MOR HAF55 SNR1 BAF1H РВАР polybromo ВАМ 55 BAF170 AAF53 ИМИ BAF57 PBAF Рис. 12.5. Семейство ремоделирующих комплексов SWI/SNF Каждый комплекс содержит член SNF2/SWI2-семейства АТФаз и по крайней мере восемь других субъединиц, (а) Схематическое изображение белка BRM, показывающее расположение АТФазного домена и карбокситерминального бромодомена (обнаружи- вающего сродство к ацетилированным остаткам лизина в гистоновых «хвостах»), которые консервативны у всех членов семейства SNF2/SWI2. Показаны цветом комплексы SWI/SNF у дрожжей (б), Drosophila (в) и человека (г). Дальнейшую информацию об этих комплексах и их субъединицах можно найти в Mohrmann and Verrijzer. 2005
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax а. Скольжение нуклеосом б Обмен гистонов в. Вытеснение нуклеосом г. Измененная структура нуклеосом Рис. 12.6. Механизмы АТФ-зависимого ремоделинга Модели ремоделирования хроматина иллюстрируются показом изменения в положении или составе нуклеосом относительно ДНК, обернутой вокруг них. Центральная часть рисунка показывает стартовый район хроматина, где линкерная ДНК изобра- жена желтым цветом, а нуклеосомная ДНК — красным, (а) Движение нуклеосомы трансляционно вдоль ДНК (скольжение) для открытия участка (отмеченного красным цветом), который ранее был закрыт; (б) обмен стандартного гистона на вариантный гистон для создания вариантной нуклеосомы; (в) вытеснение нуклеосом для открытия большого района ДНК. Этот механизм мог бы зависеть от других белков, таких как гистоновые шапероны или факторы, связывающиеся с ДНК, в дополнение к белкам ремоделлинга; (г) создание петли на поверхности нуклеосомы. Гипотетически предполагается, что ремоделеры семейства SWI/ SNF используют альтернативные механизмы, такие как создание стабильных петель ДНК на поверхности нуклеосомы, чтобы сделать доступными сайты, являющиеся центральными для этой нуклеосомы рующие комплексы обнаруживают разную склонность к выполнению каждой из этих функций. У высших эукариот комплексы SWI/SNF весьма многочисленны; например, каждое ядро млекопитаю- щих содержит около 25 000 копий комплексов семей- ства SWI/SNE Биохимические анализы показывают, что комплексы SWI/SNF способны открывать доступ к необычно широкому спектру сайтов в нуклеосоме по сравнению с другими АТФ-зависимыми комплексами ремоделинга хроматина (Fan et al., 2003). Например, комплексы SWI/SNF способны эффективно обеспечи- вать доступ к сайтам в центре мононуклеосомы, что в энергетическом отношении затруднительно, посколь- ку сайты в центре нуклеосомы имеют приблизительно 70 пар оснований ограниченной [constrained] нуклео- сомной ДНК с каждой стороны. Вызывается ли это не- обычно мощной способностью использовать энергию гидролиза АТФ по сравнению с другими ремоделерами или же, вместо этого, представляет другой механизм ремоделинга, является темой текущих исследований (Kassabov et al., 2003). Комплексы SWI/SNF не обна- руживают сколько-нибудь измеримой способности равномерно распределять [to space] нуклеосомы, что является отличительным признаком других комплексов ремоделинга хроматина. Они также не обнаруживают такой же степени эффективности в «свопинге» [swap- ping — обмен одних элементов на другие] димеров Н2А/ Н2В, как некоторые другие комплексы ремоделинга хроматина, хотя при тестировании in vitro они способ- ны осуществлять это и перемещать октамеры (Lorch et al., 1999). Какая из этих способностей имеет отношение к функции этих комплексов в поддержании активного состояния, еще не ясно. У каждого исследованного вида предполагалось уча- стие комплексов SWI/SNF в транскрипционной актива- ции. Это семейство комплексов может быть «нацелено» на гены взаимодействиями с транскрипционными акти- ваторами, может ремоделировать нуклеосомы, помогая в первоначальном связывании общих транскрипционных факторов и РНК-полимеразы II, и может становиться «нацеленным» на более поздних стадиях процесса акти- вации, способствуя транскрипционной элонгации. Та- ким образом, комплексы SWI/SNF, по-видимому, функ- ционируют на каждом этапе процесса транскрипционной активации, хотя, по-видимому, имеет место акцент на функцию, осуществляемую на ранних этапах, ведущих к
2. Связи между белками trxG и хроматином загрузке РНК-полимеразы II. Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) у дрожжей показывает, что помимо этих влияний, стимулирующих активацию, комплексы SWI/SNF могут также облегчать репрессию некоторых генов (Sudarsanam et al., 2000). Одна простая гипотеза, объясняющая эти широкие функции in vivo, заключается в том, что эти ремоде- лирующие комплексы изменяют структуру нуклеосом таким образом, что облегчается связывание и функ- ционирование широкого спектра разных регуляторных факторов и комплексов. Таким образом, эффективные [potent] характеристики ремоделинга, наблюдаемые in vitro, могли бы отражать способность существенно рас- ширять доступ к регуляторным факторам in vivo. Воз- можно, что комплексы SWI/SNF обладают уникальной способностью создавать широкий доступ, которая мо- жет объяснять их важное значение в поддержании ак- тивного состояния. Каждый изученный вид обладает по крайней мере двумя разными комплексами SWI/SNF, которые оба содержат BRM или близкородственную АТФазу ремо- делинга хроматина. Еще один белок trxG, OSA, обеспе- чивает различие между этими комплексами в том отно- шении, что один класс комплексов содержит OS А, а еще один эволюционно консервативный комплекс содержит белок с полибромодоменом (рис. 12.6) (Mohrmann and Verrijzer, 2005). Биохимическая функция OSA не ясна. Одна привлекательная возможность заключается в том, что он мог бы «нацеливать» комплекс SWI/SNF, в кото- ром он находится, на специфическую группу генов. SWI/SNF — не единственный фактор ремоделин- га хроматина, имеющийся в эукариотических клетках. Идентифицированы десятки различных комплексов реиоделинга хроматина, в том числе NURF, NURD, ACF и CHRAC (Vignali et al., 2000). Эти комплексы можно подразделить на несколько основных групп на основе идентичностей их АТФазных субъединиц. Комплексы SWI/SNF содержат АТФазы, родственные SWI2/SNF2; комплексы ISWI (например, NURF, CHRAC и ACF) со- держат АТФазы, родственные Imitation-SWI (ISWI); на- конец, комплексы CHD (например, NURD) содержат АТФазы, родственные CHD1 и Mi2. Недавние исследования позволили предположить участие имеющегося у Drosophila kismet (kis) — члена семейства CHD факторов ремоделинга хроматина — в поддержании активного состояния. Подобно brm, тог и osa, kis был идентифицирован в ходе скрининга на экс- трагенные супрессоры Рс; это позволяло предполагать, что он действует антагонистически по отношению к белкам PcG и поддерживает активные состояния НОХ- транскрипции (Kennison and Tamkun, 1988). Генетиче- ские исследования показали, что kis необходим как для сегментации, так и для поддержания //ОХ-транскрипции в ходе развития Drosophila (Daubresse et al., 1999; Ther- rien et al., 2000). Консервативные домены вне АТФазно- го домена (в том числе бромодомены и хромодомены) вносят свой вклад в функциональную специфичность ремоделирующих хроматин факторов, опосредуя взаи- модействия с нуклеосомами или другими белками. BRM и другие АТФазные субъединицы комплексов SWI/SNF содержат единственный бромодомен (белковый мотив, ассоциированный со связыванием определенных аце- тилированных гистонов), тогда как KIS-L содержит два хромодомена (белковых мотива, связывающихся с опре- деленными метилированными гистонами) и является, следовательно, более похожим на Mi2 и другие ремоде- лирующие хроматин факторы, члены семейства CDH. Хотя большие размеры KIS-L (~575 rLf) затруднили био- химический анализ этого белка, его последовательность убедительно свидетельствует о том, что он активирует транскрипцию, ремоделируя хроматин KIS-L не ассоциирован физически с BRM и хрома- тографически ведет себя так, как будто бы он находит- ся в другом белковом комплексе (Srinivasan et al., 2005). Однако эти два белка существенно перекрываются друг с другом и с РНК-полимеразой II на политенных хро- мосомах, что позволяет предполагать, что оба они игра- ют относительно глобальные роли в транскрипции (рис. 12.7) (Armstrong et al., 2002; Srinivasan et al., 2005). Утра- та функции BRM блокирует относительно ранний этап в транскрипции (Armstrong et al., 2002), тогда как утрата функции KIS-L ведет к снижению уровня элонгации, но не инициации форм РНК-полимеразы II (Srinivasan et al., 2005). Эти открытия заставляют предполагать, что BRM и KIS-L облегчают различные этапы в транс- крипции с помощью РНК-полимеразы II, катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре или спейсинге нуклеосом. Рис. 12.7. Распределение белков trxG в хро- мосомах Распределение белков trxG по всему ге- ному изучали с помощью окрашивания политенных хромосом слюнных желез Drosophila антителами против BRM (а) или TRX (б). В соответствии с относительно глобальной ролью BRM в активации транскрипции он связан с сотнями сайтов паттерн которых существенно перекры- вается с RNA pol II. Напротив, сильные сигналы TRX выявляются в значительно меньшем числе сайтов политенных хро- мосом
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax Важный вопрос для будущих исследований касается роли, которую АТФ-зависимый ремоделинг играет в под- держании активированного состояния. Весьма интригу- ет тот факт, что четыре члена trxG известны (BRM, KIS и OSA) или подозреваются (KIS) как члены больших АТФ- зависимых ремоделирующих хроматин комплексов, но ни один из других многочисленных АТФ-зависимых ре- моделирующих комплексов не был идентифицирован в ходе генетических скринингов на trxG-белки Drosophila. Две преобладающих гипотезы (не являющиеся взаимо- исключающими), предложенные для объяснения этого, заключаются в том, что ремоделирующие хроматин ком- плексы BRM и KIS «нацелены» на гены, важные для про- грессии развития, или что они обладают специальными характеристиками ремоделинга, которые являются уни- кально необходимыми для поддержания. Таким образом, возможно, что родовой [generic] АТФ-зависимый ремо- делинг требуется для всех активных состояний и что для поддержания активного состояния важных для развития генов оказываются необходимыми эти члены trxG, по- скольку они «нацелены» на эти гены. Возможно также, что поддержание требует специальных АТФ-зависимых функций, которые могут быть выполнены комплексами, содержащими члены trxG. Заманчиво также думать о механизмах, которые мо- гут использоваться ремоделерами для того, чтобы внести вклад в эпигенетическую регуляцию активного состоя- ния. Можно представить себе три класса механизмов, к которым это могло бы относиться. Во-первых, функция ремоделинга могла бы потребоваться в каком-то косвен- ном режиме для облегчения связывания (или повтор- ного связывания после репликации) генспецифичных активирующих белков, которые нужны для поддержа- ния активной транскрипции. В этом случае ремоделе- ры не были бы «мозгами» эпигенетического механиз- ма, но, вместо этого, действовали бы как инструмент, необходимый для эффективного функционирования требуемых белков. Во-вторых, ремоделеры могли бы работать одни или с гистоновыми шаперонами для вы- теснения нуклеосом из данного района, и эта незаня- тость нуклеосомами гипотетически заставляла бы этот район оставаться ненуклеосомным после репликации. Как упоминалось выше, способность машины репли- кации/смещения нуклеосом точно рекапитулировать модификации или локализацию нуклеосом является важным вопросом эпигенетики, на который пока нет ответа. Наконец, механизмы ремоделинга могли бы повторно позиционировать нуклеосомы и создавать структуру, поддающуюся активации. Этот последний механизм получил экспериментальную поддержку в исследованиях гена альбумина (Chaya et al., 2001; Cirillo et al., 2002). Несколько связывающихся с ДНК факто- ров необходимы для поддержания активности этого ключевого гена в печени. Один из этих факторов, FoxA, связывается с сайтом на нуклеосоме, и эта специфиче- ская конструкция «нуклеосома-FoxA» является ключе- вой для поддержания активного состояния гена альбу- мина. Хотя неясно, имеется ли необходимая роль для АТФ-зависимого ремоделинга, чтобы позиционировать эту специфическую нуклеосому в печени, этот пример показывает, что специфическое позиционирование нуклеосом обладает достаточным потенциалом, чтобы играть ключевую эпигенетическую роль [whether there is a required role for ATP-dependent remodeling to position this specific nucleosome in the liver, this example demon- strates the potential for specific nucleosome positioning to play a key epigenetic role]. 2.2. Белки trxG, ковалентно модифицирующие нуклеосомные гистоны Второй распространенный способ регулирования экс- прессии генов включает ковалентную модификацию аминотерминальных «хвостов» коровых гистонов, со- ставляющих белковый компонент нуклеосомы. Эти «хвосты», выступающие с поверхности нуклеосомы, могут опосредовать взаимодействия с другими нуклео- сомами, а также с весьма разнообразными структурными и регуляторными белками. Ковалентная модификация гистоновых «хвостов» с помощью ацетилирования, ме- тилирования или фосфорилирования может помогать «нацеливать» регуляторные комплексы на хроматин и может также непосредственно изменять способность ну- клеосом компакгизироваться в репрессивные структуры путем изменения заряда на этих «хвостах». Ковалентная модификация могла бы также обеспечивать метку, чтобы способствовать поддержанию специфического регули- руемого состояния (поскольку ковалентно модифициро- ванные гистоны обладают возможностью разделяться на две дочерние нити и тем самым воспроизводят инфор- мацию, содержащуюся в ковалентной метке) и переда- вать ее как материнской, так и дочерним клеткам после репликации. Остаются ли гистоны связанными с одной или с обеими дочерними нитями после репликации — это ключевой вопрос для потенциальных механизмов эпигенетического регулирования; вопрос этот остается спорным, по большей части в связи с поиском методов, которые позволили бы точно прослеживать индивиду- альные гистоны в живых клетках. Несколько белков trxG способны ковалентно моди- фицировать «хвосты» гистонов, и эти белки часто об- наруживаются в комплексах, способных осуществлять более чем один тип реакций модификации. Например, TRX Drosophila и его аналоги у других организмов мети- лируют гистон НЗ по лизину 4 (НЗК4): эта ковалентная метка прочно ассоциирована с активными генами у са- мых разных организмов, в том числе у дрожжей, мух и человека. Второй белок trxG, ASH1 (см. ниже), также обладает НЗК4-метилтрансферазной активностью (Bei- sel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Подразумевалось, что НЗК4-метилирование связано с поддержанием ак- тивной экспрессии генов у дрожжей, исходя из времени его появления и исчезновения на активных генах (San- tos-Rosa et al., 2002; Pokholok et al., 2005). Тот факт, что члены trxG обладают этой модификационной (в отно- шении гистонов) активностью, еще больше связывает метку НЗК4 с поддержанием активного состояния. У дрожжей и у человека аналоги TRX обнаружи- ваются в комплексе, который содержит также третий
2. Связи между белками trxG и хроматином белок группы trxG, Ash2, по последовательности не родственный Ashl Дрожжевой гомолог trithorax, Setl, обнаруживается в комплексе (COMPASS или SetlС), который имеет величину приблизительно 400 кДа и со- держит пять других белков кроме Setl и Ash2 (Miller et al., 2001; Roguev et al., 2001). Единственной известной биохимической активностью этого комплекса является метилирование НЗК4; пока еще не ясно, какова могла бы быть функция каждого из других белков, хотя один компонент мог бы способствовать воспроизведению метильной метки (см. ниже). У человека имеются три гомолога TRX, называемые MLL1, MLL2 и hSETl. Белок MLL1 привлек наиболь- шее внимание в биохимических анализах и обнаружи- вается в большом комплексе (>10 членов), который со- держит также человеческий гомолог ASH2 (Hughes et al., 2004; Yokoyama et al., 2004). Этот комплекс и дрожжевой комплекс оба содержат повторяющийся белок [repeat protein] WD40, который у человека называется WDR5 (Dou et al., 2005; Wysocka et al., 2005). Недавно было по- казано, что белок WDR5 может связываться с гистоном НЗ, который был метилирован по лизину 4 (Wysocka et al., 2005). Таким образом, связывание этого белка с мет- кой, созданной комплексом MLL1, в котором он нахо- дится, могло бы дать механизм для облегчения распро- странения этой метки. Это сходно с предположениями, сделанными относительно репрессивных комплексов, метилирующих НЗК9, которые содержат НР1, белок, специфически связывающийся с метилированным К9 (дополнительные детали см. в главах 5 и 6). Имеются данные, полученные как на Drosophila, так и на человеке, о том, что комплекс, содержащий TRX/ MLL, участвует также в ацетилировании. У человека MLL ассоциирован с ацетилтрансферазой MOF, кото- рая ацетилирует лизин 16 гистона Н4, что является еще одной модификацией, связанной в норме с активацией (Dou et al., 2005). У мух TRX ассоциирован с dCBR — ацетилтрансферазой с широкой специфичностью, ко- торая участвует в активации (Petruk et al., 2001). Ацети- лирование могло бы работать совместно [synergistically] с метилированием НЗК9, направляя активное состоя- ние после функционирования этих комплексов trxG. Известно также, что ацетилирование предотвращает метилирование таких остатков, как НЗК9 и НЗК27, ко- торые направляют репрессию матрицы. Белок ASH1, еще один член trxG, тоже является ме- тилтрансферазой гистонов, которая метилирует НЗК4 (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Состав ни у одного комплекса, содержащего ASH1, не был установ- лен; непонятно также, как координируются активности ASH1 и комплексов, содержащих TRX/MLL1/SET1. Однако наблюдали также, что ASH1 колокализуется и ассоциируется с семейством ацетилтрансфераз СВР (Bantignies et al., 2000), что опять-таки предполагает, что метилирование и ацетилирование идут рука об руку. Существуют захватывающие, но все еще остающие- ся без ответа вопросы относительно того, каким обра- зом ковалентная модификация гистонов могла бы вно- сить вклад в функцию trxG Какую функциональную роль играют метки? Ковалентная модификация может вносить свой вклад в эпигенетическое регулирование с помощью широкого спектра механизмов. Метки мети- лирования и ацетилирования могли служить для непо- средственного изменения компактизации хроматина (иногда это обозначается как czs-эффекты, как на рис. 3.8). На способность хроматина входить в компактизи- рованное состояние, которое, как обычно принимает- ся, является репрессивным для транскрипции, влияет распределение зарядов на гистоновых «хвостах». Мо- дификации, происходящие на лизине (например, аце- тилирование), могут устранять положительный заряд, в норме обнаруживаемый с этим остатком, и, следова- тельно, могут прямо снижать способность нуклеосом формировать компактные структуры, повышая таким образом способность матрицы к транскрипции. Предположили, что ковалентные метки создают сайты прочного связывания для комплексов, управ- ляющих [direct] транскрипционной активацией. Эти ковалентные модификации способны создавать специ- фические «выросты» [«knobs»] на поверхности нуклео- сом, которые соответсвуют «карманам» на комплексах, стимулирующих активацию, увеличивая таким образом энергию связывания и функцию этих комплексов. На- пример, ацетилирование гистоновых «хвостов» увели- чивает связывание гомологами белка BRM, стимулируя таким образом АТФ-зависимый ремоделинг ацетили- рованных матриц (Hassan et al., 2001). Механизм этого типа, часто обозначаемый как «гистоновый код» или /га/75-эффекты ковалентных модификаций гистонов, потенциально может быть центральной эпигенетиче- ской функцией. Нужны дальнейшие исследования, чтобы определить, какие именно метки, созданные белками trxG, усиливают связывание каких именно комплексов, определить степень, с какой энергия свя- зывания с одним модифицированным остатком может влиять на функцию и «нацеливание», и определить вре- менной порядок добавления этих меток и возможность их поддержания при митозе. Оборотная сторона этого механизма заключается в том, что эти метки могли бы подавлять связывание репрессивными комплексами. Ковалентная метка на ключевом остатке, необходимом для оптимального свя- зывания каким-то репрессивным комплексом, могла бы сильно ингибировать связывание этим репрессив- ным комплексом. Например, известно, что связыва- ние репрессивными комплексами увеличивается мети- лированием гистона НЗ по К9 и К27 (Khorasanizadeh, 2004). Ацетилирование этих остатков и блокировало бы метилирование, и создавало бы «вырост» неправильной формы на гистоне, ослабляющий связывание этим ре- прессивным комплексом. Таким образом, способность модификаций влиять на функцию других комплексов может работать в обоих направлениях [cut in both direc- tions], увеличивая действенность этого потенциального способа эпигенетической регуляции. Эти механизмы не только не являются взаимо- исключающими, но вероятно работают совместно, по- могая поддерживать активное состояние. Метки, кото- рые химически увеличивают возможность формировать компактное состояние (cz'5-эффект), могли бы также
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax увеличивать способность комплексов связываться (/гаиз-эффект) и еще более [further] стимулировать ком- пактное состояние. Наоборот, метки которые химиче- ски уменьшают компактизацию, могли бы увеличивать связывание комплексов, которые также декомпакти- зируют нуклеосомы. Это механистически экономное использование ковалентных меток для изменения не- скольких характеристик структуры хроматина и спо- собности регуляторных комплексов связываться могло бы создавать мощные средства поддержания активного состояния. 3. Связи между белками trxG и общей транскрипционной машинерией Тема частого обнаружения белков trxG в одном и том же комплексе продолжается белками skuld (skd) и kohtalo (kto). Эти два белка являются гомологами белков, био- химически идентифицированных как TRAP240 (Skuld) и TRAP230 (Kohtalo), которые оба являются членами комплекса «Mediator» (Janody et al., 2003). Этот ме- диаторный комплекс является крупным комплексом, функционирующим на поверхности раздела между ген-специфичными активаторными белками и образо- ванием преинициационного комплекса, содержащего PH К-полимеразу II (Lewis and Reinberg, 2003). Таким образом, эти белки участвуют в общих активационных процессах, во многом таким же образом, каким в общей активации участвуют ремоделеры семейства SWI/SNF. SKD и КТО могли бы иметь некоторую специальную функцию, связанную с поддержанием, поскольку другие компоненты этого медиаторного комплекса не были идентифицированы при скрининге на гены trxG. Наблюдение, согласно которому SKD и КТО взаимодействуют друг с другом и согласно которому двойные мутанты skd kto имеют такой же фенотип, что и одиночные мутанты, привело к гипотезе о том, что эти два белка вместе образуют функциональный модуль, который каким-то образом изменяет действие медиатора (Janody et al., 2003). 4. Биохимические функции других белков trxG Биохимические активности большинства других белков trxG остаются довольно таинственными. Ring3, челове- ческий аналог генаfemale -sterile homeotic (fsh) из группы trxG у Drosophila, кодирует ядерную протеинкиназу с двумя бромодоменами, для которой предполагается участие в продвижении по клеточному циклу и в лей- кемогенезе, но субстраты которой в настоящее время неизвестны (Denis and Green, 1996). Ген Tonalli (Тпа) из группы trxG кодирует белок, родственный белкам SP- RING finger, участвующим в сумоилировании, что по- зволяет предполагать, что он может также регулировать транскрипцию через ковалентную модификацию дру- гих, все еще неидентифицированных, белков (Gutierrez et al., 2003). Ген sallimus (sis) из группы trxG был иден- тифицирован при скрининге на экстрагенные супрес- соры Рс (Kennison and Tamkun, 1988) и впоследствии оказался кодирующим Titin у Drosophila (Machado and Andrew, 2000). Подобно своему аналогу у позвоночных, Titin у Drosophila помогает поддерживать целостность и эластичность саркомера. Кроме того, Titin является хромосомным белком, необходимым для конденсации и расхождения хромосом (Machado and Andrew, 2000). Эти интригующие открытия позволяют предположить потенциальную роль белков trxG в регулировании структуры хроматина более высокого порядка. 5. Функциональные взаимодействия между белками trxG Теперь, когда идентифицированы основные биохими- ческие активности многих членов trxG и PcG, внима- ние переключилось на способ, каким эти активности скоординированы для регулирования транскрипции и поддержания активного состояния. Несмотря на отсутствие систем in vitro для изучения поддержания детеминированного состояния, в этом направлении был достигнут значительный прогресс. Одна популяр- ная гипотеза заключается в том, что члены trxG и Peg облегчают последовательность зависимых событий, необходимых для поддержания активного или репресси- рованного состояния. Поддержка этой идеи пришла из недавних исследований PcG-комплексов PRC1 и PRC2; субъединица метилазы гистонов E(z) из комплекса PRC2, метилируя НЗК27, создает ковалентную метку, которая непосредственно распознается хромодоменом субъеди- ницы Рс комплекса PRC1 (Jacobs and Khorasanizadeh, 2002; Min et al., 2003). Таким образом, оказывается, что один комплекс PcG прямо стимулирует связывание дру- гого комплекса PcG с хроматином По аналогии возможно, что ковалентная моди- фикация нуклеосом членами trxG, обладающими активностями метилтрансферазы или ацетилтранс- феразы гистонов (например, TRX или ASH1), непо- средственно регулирует «нацеливание» или актив- ности членов trxG, участвующих в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина (например, BRM [SWI/SNF], или KIS) (рис. 12.8). С этой возможностью согласует- ся тот факт, что BRM и другие субъединицы комплек- сов SWI/SNF содержат бромодомены, которые могут непосредственно взаимодействовать с ацетилирован- ными «хвостами» гистонов, a KIS содержит два хро- модомена, которые могут прямо взаимодействовать с метилированными «хвостами» гистонов. Эта модель, в пользу которой свидетельствуют недавние исследо- вания факторов ремоделинга хроматина как у дрож- жей, так и у млекопитающих (Agalioti et al., 2000; Has- san et al., 2001), является особенно привлекательной, потому что она обеспечивает механизм, посредством которого наследуемая модификация гистонов могла бы воспроизводить конститутивно «открытую» кон- фигурацию хроматина, пермиссивную для активной транскрипции.
7. Выводы и перспективы 6. Белки trxG: активаторы или антирепрессоры? Еще одна важная проблема касается функциональных от- ношений между репрессорами PcG и активаторами trxG. Играют ли эти регуляторные белки независимые роли в активации и репрессии или же они функционируют в прямом противодействии, чтобы поддерживать насле- дуемое состояние? Недавние генетические исследования показывают, что удаление комплексов PcG обычно реак- тивирует гены даже в отсутствие TRX и ASH1 (Klymenko and Muller, 2004), что позволяет предположить, что белки trxG с активностью метилтрансферазы гистонов могут функционировать как антирепрессоры PcG в противо- положность активаторам (рис. 12.8). И биохимические, и генетические анализы дока- зывают, что могут существовать прямые связи между функцией trxG и функцией PcG. Одно интересное свой- ство белков PcG заключается в том, что они способны репрессировать транскрипцию, когда оказываются вблизи практически любого гена, транскрибируемого PH К-полимеразой II. Члены trxG, играющие глобаль- ную роль в транскрипции, — в том числе BRM, KIS и другие члены trxG, участвующие в ремоделинге хрома- тина, — оказываются таким образом превосходными кандидатами на роль прямых мишеней репрессоров PcG (рис. 12.8). Один из главных комплексов PcG, комплекс PRC1, блокирует функцию комплексов ремоделинга из семейства SWI/SNF, очевидно путем блокирования до- ступа этого комплекса к матрице (Francis et al., 2001). Это согласуется с представлением о том, что один меха- низм репрессии PcG мог бы заключаться в том, чтобы предотвращать АТФ-зависимый ремоделинг членами trxG. Комплекс Brahma и PRC1 связывает, сверх того, тот факт, что оба они непосредственно взаимодейству- ют с белком Zeste — белком, играющим сложную роль в регулировании экспрессии генов у Drosophila, который мог бы способствовать прямым «переговорам» между этими двумя комплексами. Вторым белком, связывающим белки PcG и белки trxG, является фактор GAGA, который кодируется ге- ном Trithorax-like и который, таким образом, является членом trxG (Farkas et al., 1994). Этот белок может функ- ционировать в некоторых промоторах как сиквенс- специфичный активаторный белок, но и является также заметным членом группы белков, которые связываются с репрессивным элементом Polycomb (PRE — Polycomb Repressive Element; глава 8). Нуклеотидные последова- тельности PRE управляют функцией PcG, и по край- ней мере один PRE может действовать как модуль па- мяти, будучи присоединен к репортерному конструкту, что подчеркивает важность этих последовательностей. Нуклеотидные последовательности, связывающиеся с фактором GAGA, играют важную роль в функциони- ровании PRE, и предполагается, что привязка белка GAGA к ДНК усиливает связывание и функционирова- ние PRC1 (Mahmoudi and Verrijzer, 2001). Таким образом, фактор GAGA мог бы играть ключевые роли в поддер- жании активации (через его активирующие транскрип- цию свойства) и в поддержании репрессии (через вза- имодействия с белками PcG). Важная проблема для будущих исследований — понять, почему такие белки, как GAGA и Zeste оказываются взаимодействующими как с активирующей, так и с репрессирующей машина- ми, обеспечивающими поддержание состояния. 7. Выводы и перспективы Две из основных проблем, касающихся функции белков trxG, остаются в значительной мере в области догадок. Во-первых, почему относительно небольшая подгруппа белков, необходимых для транскрипционной активации, генетически оцениваются как важные для поддержания активного состояния? Не происходит ли это потому, что эти белки играют глобальную роль в транскрипции, но экспрессируются в лимитирующих количествах, или случайно, благодаря счастливой способности эволю- ции к открытиям, стали особенно важными для генов, играющих важную роль в развитии? Во-вторых, каким образом активное состояние может поддерживаться при репликации и митозе? Репликация создает две дочерние нити, которые обе должны регулироваться идентично, а митоз требует конденсации и, тем самым, подавле- ния транскрипции большинства генов в клетке. Какие механизмы создают эпигенетическую метку (метки), обеспечивающую реактивацию гена на обеих дочерних нитях после митоза? Большинство белков trxG являются частью ком- плексов, широко используемых в экспрессии генов, и большинство этих комплексов содержат также многие другие белки, не входящие в trxG (табл. 12.1). Это ста- вит важный вопрос о том, существуют ли специальные функции, используемые для поддержания активной экспрессии генов. Возможно, что ремоделеры SWI/ SNF способны выполнять специальную функцию ре- моделинга, что метилирование НЗК4 «нацеливает» спе- циальные комплексы и (или) конформации хроматина и что Skuld/Kohtalo изменяют функционирование Me- diator каким-то специфическим образом, важным для поддержания. Как альтернатива, возможно, что каж- дый из этих белков осуществляет реакцию, в норме ис- пользуемую для активации генов всех типов, и что эти комплексы находятся среди тех, которые возникли как существенные для поддержания по относительно не- интересной причине (например, потому, что даже срав- нительно слабые изменения в экспрессии генов НОХ у Drosophila вызывают гомеотические трансформации) Для решения этих проблем нужно значительно больше сведений о точных механизмах, используемых каждым из этих белков в активации. Например, используют ли комплексы SWI/SNF энергию гидролиза АТФ таким же образом, как другие АТФ-зависимые комплексы, или же они отличаются каким-то важным образом в том, как эта энергия используется для изменения структуры ну- клеосом? Структурные методы, включающие кристал- лографию, биофизические методы, такие как анализ одиночных молекул [single-molecule analysis] и метод FRET (fluorescence resonance energy transfer) и получе- ние детальных изображений in vivo, могли бы помочь
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax Модификация нуклеосом белками trxG (ASH 1, TRX) Модификация нуклеосом белками PcG (PRC2) Узнавание модификации белками trxG с активностью ремоделинга хроматина (SWI/SNF, KIS) I------------- Ингибирование ремоделинга Узнавание модификации белками PcG (PRC1) Активная транскрипция I Наследуемая репрессия Рис. 12.8. Функции и взаимодействия группы Trithorax и группы Polycomb И семейство trxG, и семейство PcG включает белки, ковалентно модифицирующие гистоны, и белки, нековалентно модифицирую- щие хроматин. Ковалентные модификации на гистонах могут увеличивать связывание с такими нековалентно модифицирующими комплексами, как SWI/SNF, KIS или PRC1. Связывание с этими последними комплексами обладает возможностью приводить к дальнейшей ковалентной модификации, приводя таким образом к повторяющимся циклам ковалентной модификации и рас- познавания этих ковалентных меток пролить свет на то, существуют ли механизмы, специ- ально предназначенные для эпигенетического поддер- жания активации. Начальные функциональные иссле- дования, проведенные с комплексами trxG на простых модельных матрицах, являются всего лишь началом процесса поисков ответов на эти важные вопросы. Эпигенетические механизмы, которые могли бы поддерживать активное состояние, выяснены в еще меньшей степени. Распределены ли ковалентные мет- ки таким образом, чтобы помочь создать активную метку? Поддерживаются ли позиции нуклеосом по- сле репликации, чтобы создавать «открытые» отрезки хроматина или специально позиционированных ну- клеосом, которые увеличивают связывание актива- торов? Заставляет ли функционирование trxG актив- ные гены компартментализироваться в ядре в районы, благоприятные для активной транскрипции? Это все жизнеспособные гипотезы; существует еще больше гипотез, а иные еще даже не сформулированы. Неи- моверная сложность машинерии, транскрибирующей ДНК, обусловливает многочисленные возможности регулирования и развития механизмов, которые де- лают возможным эпигенетическое поддержание ак- тивной транскрипции Это пересечение двух богатых интеллектуальной историей областей, а именно акти- вации транскрипции и эпигенетического механизма будет благодатной почвой для экспериментаторов на протяжении многих лет
Литература Agalioti Т, Lomvardas S., Parekh В., Yie J., Maniatis T., and Th- anos D., 2000. Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-P promoter. Cell 103: 667-678. Armstrong J.A., Papoulas O., Daubresse G., Sperling A.S., Lis J.T., Scott M.P., and Tamkun J.W., 2002. The Drosophila BRM complex facilitates global transcription by RNA polymerase II. EMBO J. 21: 5245-5254. Bantignies R., Goodman R.H., and Smolik S.M., 2000. Functional interaction between the coactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH 1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers. Mol. Cell. Biol., 20: 9317-9330. Beisel C., Imhof A.. Greene J.. Kremmer E., and Sauer F, 2002. Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ashl. Nature A V): 857-862. Bultman S., Gebuhr T, Yee D., La Mantia C., Nicholson J., Gilliam A., Randazzo E, Metzger D., Chambon P., Crabtree G., and Magnuson T, 2000. A Brgl null mutation in the mouse reveals functional differences among mammalian SWI/SNF complexes. Mol. Cell6: 1287-1295. Byrd K.N. and Sheam A., 2003. ASH1, a Drosophila trithorax group protein, is required for methylation of lysine 4 residues on histone H3. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 11535-11540. Chaya D., Hayamizu T., Bustin M., and Zaret K.S., 2001. Tran- scription factor FoxA (HNF3) on a nucleosome at an enhancer complex in liver chromatin. J. Biol. Chem. 276: 44385-44389. Cirillo L.A., Lin F.R., Cuesta L, Friedman D., Jamik M., andZaret K.S., 2002. Opening of compacted chromatin by early develop- mental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Mol. Cell 9: 279-289. Cote J., Quinn J.. Workman J.L., and Peterson C.L., 1994. Stimu- lation of GAL4 derivative binding to nucleosomal DNA by the yeast SWI/SNF complex. Science 265: 53-60. Daubresse G., Deuring R., Moore L., Papoulas O., Zakrajsek L, Waldrip W.R., Scott M.P., Kennison J.A., and Tamkun J. W, 1999. The Drosophila kismet gene is related to chromatin-remodeling factors and is required for both segmentation and segment iden- tity. Development 126: 1175-1187. Denis G.V and Green M.R., 1996. A novel, mitogen-activated nuclear kinase is related to a Drosophila developmental regulator. Genes Dev. 10: 261 -271. Dou Y, Milne T.A., Tackett A.J., Smith E.R., Fukuda A., Wysocka J., Allis C.D., Chait B.T, Hess J.L., and Roeder R.G., 2005. Physical association and coordinate function of the НЗ K4 methyltransferase MLL1 and the H4 KI 6 acetyltransferase МОЕ Cell 121: 873-885. Dunaief J.L., Strober B.E., Guha S., KhavariP.A., Alin K., Luban J., Begemann M., Crabtree G.R., and GofTS.P., 1994. The retino- blastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell 79:119-130. Duncan L, 1987. The bithorax complex. Annu. Rev. Genet. 21: 285- 319. Fan H.Y, He X., Kingston R.E., and Narlikar G.J., 2003. Distinct strategies to make nucleosomal DNA accessible. Mol. Cell 11: 1311-1322. Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., and Karch E, 1994. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. Nature 371: 806-808. Francis N.J. and Kingston R.E., 2001. Mechanisms of transcriptional memory. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 409-421. Francis N.J., Saurin A.J., Shao Z., and Kingston R.E., 2001. Re- constitution of a functional core polycomb repressive complex. Mol. CellS: 545-556. Gellon G. and McGinnis W, 1998. Shaping animal body plans in development and evolution by modulation of Hox expression patterns. Bioessays, 20: 116-125. Gutierrez L., Zurita M., Kennison J.A., and Vazquez M., 2003. The Drosophila trithorax group gene tonalli (tna) interacts genetically with the Brahma remodeling complex and encodes an SP-R1 NG finger protein. Development 130: 343-354. Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L., 2001. Histone acetyl- transferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 104: 817-827. Holstege E.C., Jennings E.G., Wyrick J.J., Lee T.I., Hengartner C.J., Green M.R., Golub T.R., Lander E.S., and Young R.A., 1998. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95: 717-728. Hughes C.M., Rozenblatt-Rosen O., Milne T.A., Copeland T.D., Levine S.S., Lee J.C., Hayes D.N., Shanmugam K.S., Bhat- tachaijee A., Biondi C.A., et al., 2004. Memn associates with a trithorax family histone methyltransferase complex and with the hoxc8Yocus. Mol. Cell 13: 587-597. Imbalzano A.N., Kwon H., Green M.R., and Kingston R.E., 1994. Facilitated binding of TATA-binding protein to nucleosomal DNA. Nature 370: 481-485. Jacobs S.A. and Khorasanizadeh S., 2002. Structure of HP1 chro- modomain bound to a lysine 9-methylated histone H3 tail. Sci- ence 295:, 2080-2083. Janody E., Martirosyan Z., Benlali A., and Treisman J.E., 2003. Two subunits of the Drosophila mediator complex act together to control cell affinity. Development 130: 3691-3701. Kassabov S.R., Zhang B., Persinger J., and Bartholomew B., 2003. SWI/SNF unwraps, slides, and rewraps the nucleosome. Mol. Cell 11:391-403. Kaufman T.C., Seeger M.A., and Olsen G., 1990. Molecular and genetic organization of the antennapedia gene complex of Droso- phila melanogaster. Adv. Genet. 27: 309-362. Kennison J.A., 1995. The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: Trans-regulators of homeotic gene function. Annu. Rev. Genet. 29: 289-303. Kennison J. A., 2003. Introduction to Trx-G and Pc-G genes. Methods Enzymol. 377: 61-70. Kennison J.A. and Tamkun J. W, 1988. Dosage-dependent modifiers of Polycomb and Antennapedia mutations in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8136-8140. Khorasanizadeh S., 2004. The nucleosome: From genomic organiza- tion to genomic regulation. Cell 116: 259-272. Klymenko T. and Muller J., 2004. The histone methyltransferases Trithorax and Ashl prevent transcriptional silencing by Polycomb group proteins. EMBO Rep. 5: 373-377. Kruger W, Peterson C.L., Sil A., Cobum C, Arents G., Moudrianakis E.N., and Herskowitz L, 1995. Amino acid substitutions in the structured domains of histories H3 and H4 partially relieve the requirement of the yeast SWI/SNF complex for transcription. Genes Dev. 9: 2770-2779. Kwon H., Imbalzano A.N., Khavari P.A., Kingston R.E., and Green M.R., 1994. Nucleosome disruption and enhancement of activator binding by a human SWI/SNF complex. Nature
Глава 12. Регуляция транскрипции белками группы Trithorax 370: 477-481. Levine S.S., King I.F., and Kingston R.E., 2004. Division of labor in Polycomb group repression. Trends Biochem. Sci. 29: 478-485. Lewis B.A. and Reinberg D., 2003. The mediator reactivator complex: Functional and physical roles in transcriptional regulation. J. Cell Sci. 116: 3667-3675. Logie C. and Peterson C.L., 1997. Catalytic activity of the yeast SWI/SNF complex on reconstituted nucleosome arrays. EMBO J. 16: 6772-6782. Lorch Y., Zhang M., and Romberg R.D., 1999. Histone octamer transfer by a chromatin-remodeling complex. Cell 96: 389-392. Machado C. and Andrew D.J., 2000. D-Titin: A giant protein with dual roles in chromosomes and muscles. J. Cell Biol. 151: 639- 652. Mahmoudi T. and Verrijzer C.P, 2001. Chromatin silencing and activation by Polycomb and trithorax group proteins. Oncogene, 20:3055-3066. Miller T, Krogan N.J., Dover J., Erdjument-Bromage H., Tempst P, Johnston M., Greenblatt J.E, and Shilatifard A., 2001 COM- PASS: A complex of proteins associated with a trithorax-related SET domain protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 12902-12907. Min J., Zhang Y, and Xu R.M., 2003. Structural basis for specific binding of Polycomb chromodomain to histone H3 methylated at Lys 27. Genes Dev. 17: 1823-1828. Mohrmann L. and Verrijzer C.P, 2005. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling com- plexes. Biochim. Biophys. Acta 1681: 59-73. Muyrers-Chen L, Rozovskaia T, Lee N., Kersey J.H., Nakamura T, Canaani E., and Paro R., 2004. Expression of leukemic MLL fusion proteins in Drosophila affects cell cycle control and chro- mosome morphology. Oncogene 23: 8639-8648. Petruk S., Sedkov Y, Smith S., Tillib S., Kraevski V, Nakamura T, Canaani E„ Croce C.M., and Mazo A., 2001. Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Stance 294: 1331-1334. Phelan M.L., Sif S., Narlikar G.J., and Kingston R.E., 1999. Re- constitution of a core chromatin remodeling complex from SWI/ SNF subunits. Mol. Cell 3: 247-253. Pokholok D.K., Harbison C.T, Levine S., Cole M., Hannett N.M., Lee T.I., Bell G.W., Walker K., Rolfe Р.А., Herbolsheimer E., et al., 2005. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell 122: 517-527. Polach K.J. and Widom J., 1995. Mechanism of protein access to specific DNA sequences in chromatin: A dynamic equilibrium model for gene regulation. J. Mol. Biol. 254: 130-149. Rea S., Eisenhaber E, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W, Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P, Allis C.D., and Jenu- wein T, 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599. Ringrose L. and Paro R., 2004. Epigenetic regulation of cellular memory by the polycomb and trithorax group proteins. Annu. Rev. Genet. 38: 413-443. Roguev A.,. Schaft D., Shevchenko A., Pijnappel WW, Wilm M., Aasland R., and Stewart A.F., 2001. The Saccharomyces cerevi- siae Setl complex includes an Ash2 homologue and methylates histone 3 lysine 4. EMBO J., 20: 7137-7148. Saha A., Wittmeyer J., and Cairns B.R., 2005. Chromatin remodel- ing through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 747-755. Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzarides T, 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature WE 407-411. Simon J., 1995. Locking in stable states of gene expression: Tran- scriptional control during Drosophila development. Curr. Opin. Cell Biol. 7:376-385. Simon J. A. and Tamkun J.W, 2002. Programming off and on states in chromatin: Mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 210—218. Srinivasan S., Armstrong J.A., Deuring R., Dahlsveen I.K., McNeill H., and Tamkun J.W, 2005. The Drosophila trithorax group pro- tein Kismet facilitates an early step in transcriptional elongation by RNA Polymerase II. Development 132: 1623-1635. Strober B.E., Dunaief J.L., Guha S., and Goff S.P, 1996. Func- tional interactions between the hBRM/hBRGl transcriptional activators and the pRB family of proteins. Mol. Cell. Biol. 16: 1576-1583. Sudarsanam P., Iyer VR., Brown P.O., and Winston E, 2000. Whole- genome expression analysis of snf/swi mutants of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3364-3369. Tamkun J.W, Deuring R., Scott M.P., Kissinger M., Pattatucci A.M., Kaufman T.C., and Kennison J.A., 1992. brahma: A regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcriptional activator SNF2/SWI2. Cell 68: 561-572. Therrien M., Morrison D.K., Wong A.M., and Rubin G.M., 2000. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras- depend-ent rough eye phenotype in Drosophila Genetics 156: 1231-1242. Versteege L, Sevenet N., Lange J.. Rousseau-Merck M.E, Ambros P, Handgretinger R., Aurias A., and Delattre O., 1998. Truncat- ing mutations of hSNF5/INIl in aggressive paediatric cancer. Nature 394:, 203-206. Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L., 2000. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol. Cell. Biol., 20: 1899-1910. Wang W, Cote J., Xue Y, Zhou S., Khavari P.A., Biggar S.R., Muchardt C., Kalpana G.V., Goff S.P, Yaniv M., et al., 1996. Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex. EMBO J. 15: 5370-5382. White house L, Stockdale G., Flaus A., Szczelkun M.D., and Owen-Hughes T, 2003. Evidence for DNA translocation by the ISWI chromatin-remodeling enzyme. Mol. Cell. Biol. 23:. 1935-1945. Wysocka J., Swigut T, Milne T.A., Dou Y, Zhang X., Burlingame A.L., Roeder R.G., Brivanlou A.H., and Allis C.D., 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for НЗ K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872. Yokoyama A., Wang Z., Wysocka J., Sanyal M., Aufiero D.J., Ki- tabayashi L, Herr W, and Cleary M.L., 2004. Leukemia proto- oncoprotein MLL forms a SET 1-like histone methyltransferase complex with menin to regulate Hox gene expression. Mol. Cell. Biol. 24: 5639-5649. Yu B.D., Hanson R.D., Hess J.L., Homing S.E., and Korsmeyer S.J., 1998. MLL, a mammalian znV/zorax-group gene, functions as a transcriptional maintenance factor in morphogenesis. Proc. Natl Acad. Sci. 95: 10632-10636. Yu B.D., Hess J.L., Horning S.E., Brown G.A., and Korsmeyer S.J., 1995. Altered Hox expression and segmental identity in MU-mutant mice. Nature 378: 505-508.
ГЛАВА 13 ВАРИАНТЫ ГИСТОНОВ И ЭПИГЕНЕТИКА Steven Henikoff1 и Mitchell Smith2 1 Howard Hughes Medical Institute, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington 98169-1024 2Department of Microbiology, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908 Содержание: Общее резюме 1. У всех организмов ДНК упаковывается архитек- турными белками 2. Эукариотические коровые гистоны развились из гистонов архей 3. Основная масса гистонов откладывается после репликации ДНК 4. Варианты гистонов откладываются на протяже- нии всего клеточного цикла 5. Центромеры идентифицируются специальным вариантом НЗ 6. Замещение гистоновым вариантом НЗ.З обнару- живается в активном хроматине ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Гистоны упаковывают ДНК, собираясь в коровые ча- стицы нуклеосом, тогда как ДНК оборачивается вокруг них. На протяжении эволюционного времени белки с доменом «гистонового сворачивания» (histone fold domain proteins) диверсифицировались от своих предков, пред- ставленных у архей, в четыре различные субъединицы, которые составляют знакомый окгамер эукариотической нуклеосомы. Результатом дальнейшей диверсификации гистонов в разные варианты оказывается дифферен- цировка хроматина, могущая иметь эпигенетические следствия. Исследования эволюции, структуры и ме- 7. Фосфорилирование Н2АХ функционирует в ре- парации двунитевых разрывов ДНК 8. H2AZ играет роль в регулировании транскрип- ции 9. Белковые комплексы для откладки и замещения вариантов Н2А 10. Другие варианты Н2А дифференцируют хрома- тин, но их функции все еще неизвестны 11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК 12. Заключение и перспективы исследований Литература таболизма вариантов гистонов обеспечивают основу для понимания участия хроматина в важных клеточных процессах и эпигенетической памяти. Большинство гистонов синтезируются в фазе S для быстрой откладки позади репликационных вилок, что- бы заполнить пробелы, образовавшиеся в результате распределения предсуществовавших гистонов. Кроме того, замещение канонических гистонов S-фазы вари- антами, независимо от репликации, потенциально мо- жет дифференцировать хроматин. Дифференцировка хроматина вариантами гистонов особенно заметна в центромерах, где вариант гистона НЗ, CENP-A, собирается в специализированные ну-
гистонов и эпигенетика клеосомы, образующие фундамент для сборки кинето- хора (см. левую часть рисунка в начале главы). Центро- мерный аналог CENP-A, СепНЗ, обнаруживается у всех эукариот. У растений и животных правильная сборка содержащих СепНЗ нуклеосом в центромерах не требу- ет, оказывается, центромерных нуклеотидных последо- вательностей ДНК, что является замечательным при- мером эпигенетической наследственности Некоторые CenH3s развились адаптивно в участках, контактирую- щих с ДНК, что позволяет предполагать, что центроме- ры конкурируют друг с другом и что СепН3s и другие специфичные для центромеры белки, связывающиеся с ДНК, адаптировались в ответ на это. Этот процесс мог бы объяснить большие размеры и сложность центромер у растений и животных. Хроматин может быть дифференцированным и вне центромер путем включения конститутивно экспресси- руемой формы гистона НЗ, называемой НЗ.З, которая является субстратом для независимой от репликации сборки нуклеосом. Замещение вариантом НЗ.З проис- ходит в активных генах (см. правую часть рисунка в на- чале главы, где зеленым цветом изображен НЗ.З на хро- мосоме плодовой мушки); это динамический процесс с потенциальными эпигенетическими следствиями. Различия между НЗ и НЗ.З по их наборам ковалентных модификаций могут лежать в основе изменений в свой- ствах хроматина в активно транскрибируемых локусах. Несколько вариантов Н2А также могут дифферен- цировать или регулировать хроматин. Н2А.Х определя- ется как вариант по 4-аминокислотному карбокситер- минальному мотиву, в котором остаток серина является сайтом для фосфорилирования в сайтах двухнитевых разрывов ДНК. Фосфорилирование Н2АХ является ранним событием в репарации двухнитевых разрывов, где, как считают, он концентрирует компоненты репа- рационной машины. Фосфорилирование Н2АХ также маркирует неактивный бивалент XY во время сперма- тогенеза млекопитающих и требуется для конденсации, спаривания и фертильности. H2AZ — это структурно отклоняющийся вариант, который долгое время был загадкой. Исследования на дрожжах позволили считать, что H2AZ устанавливает транскрипционную компетентность и противодейству- ет сайленсингу гетерохроматина. Биохимический ком- плекс, замещающий Н2А вариантом H2AZ в нуклеосо- мах, является АТФ-зависимым ремоделером нуклеосом, представляя первый пример специфической функции у члена этого многообразного класса ассоциированных с хроматином машин. Два варианта, специфичных для позвоночных, шас- гоН2А и H2ABbd, проявляют контрастирующие осо- бенности, будучи упакованы в нуклеосомы in vitro: macroH2A препятствует, a H2ABbd облегчает транс- крипцию. Эти особенности согласуются с паттернами их локализации на эпигенетически инактивированной Х-хромосоме млекопитающих, где шасгоН2А много, а Н2Авммало. На основании результатов этих исследований скла- дывается представление, что варианты гистонов и про- цессы, откладывающие их в нуклеосомы, обеспечивают первичную дифференцировку хроматина, которая мо- жет служить основой для эпигенетических процессов. 1. У всех организмов ДНК упаковывается архитектурными белками Огромная длина двойной спирали ДНК по отношению к размерам содержащей ее органеллы требует плотной упаковки, и для этой цели развились архитектурные белки. Первый уровень упаковки укорачивает двойную спираль и защищает ее от повреждений, но все еще предоставляет ДНК-полимеразе полный доступ к каж- дой паре оснований в каждом клеточном цикле. Кроме того, эти архитектурные белки облегчают сворачивание более высокого порядка, чтобы еще больше сократить длину хромосомы. Возможно из-за жестких требований к упаковке ДНК почти у всех клеточных форм жизни обнаруживаются лишь два структурных класса архитек- турных белков (Malik and Henikoff, 2003). Бактериальная ДНК упакована белками HU, эукариотическая ДНК — гистонами, а ДНК архей упакована либо белками HU, либо гистонами. Гистоны упаковывают ДНК в нуклеосомные части- цы, и эта архитектурная роль может объяснить тот факт, что гистоны составляют половину массы эукариотиче- ской хромосомы. Однако было также обнаружено, что гистоны играют многообразные роли в экспрессии ге- нов, сегрегации хромосом, репарации ДНК и других ба- зовых хромосомных процессах у эукариот. Специфиче- ские требования, предъявляемые этими хромосомными процессами, привели к развитию разных вариантов ги- стонов. Включение вариантного гистона в нуклеосому представляет потенциально глубокое изменение хро- матина. Действительно, недавние работы показали, что некоторые варианты гистонов откладываются разными комплексами сборки нуклеосом, что позволяет предпо- лагать, что хроматин диверсифицируется, по крайней мере частично, включением и замещением вариантов гистонов. Четыре коровых гистона различаются в отношении их склонности диверсифицироваться в варианты. На- пример, у человека имеется только один изотип Н4, но несколько паралогов Н2А с разными свойствами и функциями. Очевидно, разное положение коровых гистонов в нуклеосомной частице подвергало их дей- ствию разных эволюционных сил, приводя к важным диверсификациям Н2А и НЗ, но не Н2В и Н4. Нали- чие геномных последовательностей от самых разно- образных эукариот позволяет нам сделать вывод, что эти диверсификации произошли в разное время в ходе эволюции эукариот. Однако явная диверсификация ан- цестрального белка «гистоновой свертки» (histone fold protein) в знакомые четыре коровых гистона должна была произойти на ранних этапах эволюции эукарио- тического ядра или даже, возможно, еще раньше. Рас- сматривая эти древние события, мы узнаем о тех силах, которые привели к последующей диверсификации в со- временные варианты
2. Эукариотические коровые гистоны развились из гистонов археи 2. Эукариотические коровые гистоны развились из гистонов архей Эукариотическая нуклеосома представляет собой слож- ную структуру, состоящую из октамера четырех коровых гистонов, обернутого почти два раза ДНК; «хвосты» гистонов и линкерные гистоны опосредуют разнообраз- ные упаковочные взаимодействия вне коровой частицы (Arents et al., 1991; Wolffe, 1992; Luger et al., 1997). Ну- клеосомы архей гораздо проще, и очевидно, что они по- хожи на анцестральную частицу, из которой развились эукариотические нуклеосомы (Malik and Henikoff, 2003). Нуклеосома архей состоит из белков с доменом «гистоно- вого сворачивания» (histone fold domain proteins), которые не имеют «хвостов» и образуют тетрамерную частицу, обернутую лишь одним витком ДНК. Родство между ну- клеосомами архей и эукариот можно видеть, сравнивая их структуры: остов [backbone] тетрамера архей почти накладывается на остов тетрамера (НЗ • Н4)2 (рис. 13.1). Когда нуклеосомы архей реконструируются и формируют хроматин, получающаяся фибрилла ведет себя подобно «тетрасомам» (НЗ • Н4). Поэтому полагают, что эукарио- тические нуклеосомы развились из нуклеосом архей путем добавления димеров Н2А • Н2В с каждой стороны тетрасо- мы, чтобы сделать возможным второй виток ДНК, и путем приобретения гистоновых «хвостов» Кроме того, ДНК сворачивается в правую суперспираль вокруг коров архей, но в левую суперспираль вокруг эукариотических коров. Дальнейшее проникновение в происхождение эу- кариотических нуклеосом становится возможным бла- годаря изучению субъединичных структур нуклеосом архей. В то время как большинство гистонов архей являются недиффернцированными мономерами или дифференцированы в структурно взаимозаменяемые варианты, которые сходятся вместе и формируют тетра- мер, некоторые из них представляют собой димерные слияния типа «голова к хвосту», которые сходятся вме- сте и образуют димер из слившихся димеров (рис. 13.1). Когда два из этих слившихся димеров собираются в нуклеосомную частицу, каждый член слившейся пары находится в структурно различимой позиции. Занимая различные позиции в частице, каждый член слившего- ся димера архей развивается независимо, давая ему воз- можность адаптироваться к одной позиции в нуклео- сомной частице. Напротив, мономеры, занимающие взаимозаменяемые позиции, не обладают свободой для адаптации к определенным позициям. Действительно, два члена димеров архей дивергировали друг от друга в обеих независимых линиях, в которых они обнаружи- ваются. Этот процесс представляет возможный сцена- рий дифференцировки анцестрального белка с доме- ном «гистонового сворачивания» (histone fold domain protein) в четыре различные субъединицы, занимаю- щие различные положения в эукариотической нуклео- соме. Подобно их предполагаемым предкам у архей эукариотические гистоны образуют димеры, где Н2А димеризуется сН2В, аНЗ — с Н4 (который также ста- бильно тетрамеризуется в растворе). При разрешении Гистоны архей «Дублетные» гистоны архей Эукариотный Эукариотный тетрамер окта мер $ э > Рис. 13.1. Модель эволюции эукариотической нуклеосомы из пред- кового дублетного гистона (doublet histone ancestor) архей Тетрамер архей с взаимозаменяемыми субъединицами А и В (A/В) мог развиться в димер слившихся димеров («дублет»). За этим могло бы следовать растепление [split] гена, чтобы дать начало эукариотическому тетрамеру НЗ и Н4, формирующему «тетрасому» (НЗ • Н4), которая занимает один виток ДНК. Н2А и Н2В могли возникнуть в результате аналогичного события, собираясь над тетрамером и пол ним, как предполагается на рисунке, в результате чего становятся возможными два витка ДНК (не изображено). Одиночные точки в верхней части диаграммы изображают контакты димеров, а двойные точ- ки — четырехспиральные пучки между соседними димерами (Перепечатано из: Malik and Henikoff 2003) 2 Е структурный остов (backbone) гистонового димера у архей накладывается на остовы Н2А • Н2В и НЗ • Н4, причем первый член этого димерного повтора наклады- вается на Н2А или НЗ, а второй член — на Н2В или Н4. Поэтому, хотя у всех четырех эукариотических гистонов отсутствует сколько-нибудь существенное сходство по нуклеотидной последовательности друг с другом и с гистонами архей, это поразительное структурное нало- жение димерных единиц заставляет предполагать, что эукариотические гистоны развились и дифференциро- вались из более простых предков, бывших у архей. Асимметрия димеров Н2А*Н2В и НЗ*Н4, проис- ходящая. по-видимому, от тандемных димеров архей. могла проложить путь для последующей диверсифика- ции вариантов эукариотических гистонов. И Н2А. и НЗ соответствуют первому члену тандемных гистоновых ди- меров у архей, и оба впоследствии многократно дивер- сифицировались в эволюции эукариот. Напротив, Н2В и Н4 соответствуют второму члену и продемонстрировали очень незначительную функциональную диверсифика- цию (Н2В) или вовсе никакой (Н4). И НЗ, и Н2А образу- ют гомодимерные контакты в октамере (рис. 13.2), тогда как Н4 и Н2В контактируют лишь с другими гистонами. В результате изменения в остатках, вовлеченных в гомо- димеризацию либо Н2А, либо НЗ, могут потенциально сопротивляться образованию смешанных октамеров, позволяя нуклеосомам, содержащим вариант Н2А или НЗ, развиваться независимо от родительских нуклео- сом. Например, четырехспиральный пучок (four-helix bundle), охватывающий интерфейс между молекулами НЗ, определяет левостороннее суперскручивание ДНК
Глава 13. Варианты гистонов и эпигенетика Петля 1 СепНЗ — а-спираль 2 НЗ.З N-терминальный «хвост» НЗ.З СепНЗ ч;а Рис. 13.2. Локализация гистона НЗ (синий цвет) и Н2А (корич- невый цвет) в коровой частице нуклеосомы Четыре остатка, различающиеся у вариантов НЗ, показаны желтым цветом (перепечатано, с любезного разрешения, из: Henikoff and Ahmad 2005) вокруг нуклеосомы (Arents et al., 1991; Luger et al., 1997), тогда как в нуклеосомах архей супервитки ДНК являют- ся правосторонними (Marc et al., 2002). Очевидно, мута- ция этого четырехспирального пучка у предка НЗ была ответственна за эту реверсию. В целом структурные осо- бенности, облегчавшие независимую эволюцию субъе- диниц, могли быть предпосылками для диверсификации нуклеосомных частиц. Хотя мы можем дать рациональное объяснение про- исхождению эукариотических коровых гистонов от тан- демных димеров архей, остаются другие основные вопро- сы. Откуда появились «хвосты» гистонов? Когда вышли на сцену Н2А • Н2В? Произошли ли эти события до, во время или после возникновения эукариотического ядра? Почему все известные нуклеосомы архей состоят из те- трамеров с одним витком, тогда как эукариотические нуклеосомы состоят из окгамеров с двумя витками? По- чему поменялось направление суперспирали? Возмож- но, изучение большего числа архей или примитивных эукариот позволит обнаружить промежуточные формы, которые смогут дать ответ на эти вопросы. 3. Основная масса гистонов откладывается после репликации ДНК Для упаковки по существу всей ДНК эукариотической клетки в нуклеосомы необходимо, чтобы хроматин ду- плицировался, когда реплицируется ДНК (рис. 13.3). Таким образом, канонические гистоны продуцируются в фазе синтеза ДНК клеточного цикла (фазе S). Сопряже- ние синтеза гистонов с синтезом ДНК в фазе S находится под строгим контролем клеточного цикла (Marzluff and Duronio, 2002). Это особенно очевидно у животных, где специальный процессинг гистоновых транскриптов ма- лым ядерным рибонуклеопротеидным комплексом U7 и стабилизация иРНК белком SLBP (stem-loop-binding protein) вносят вклад в тесную координацию синтеза гистонов с репликацией ДНК. Весьма вероятно, что необходимость в быстром и массивном производстве гистонов в фазе S ответственна за тот факт, что сопряжен- ные с репликацией (RC, replication-coupled) гистоны у животных закодированы в кластерах, содержащих много гистоновых генов.Например, в геноме человека имеется 14 генов Н4, большинство из которых находятся в двух главных кластерах, где эти гены Н4 чередуются с генами других гистонов RC (Marzluff et al., 2002). У животных гистоны RC узнаются по наличию 3’-последовательности длиной 26 п.о., которая образует структуру «стебель- петля (stem-loop)» для распознавания комплексом SLBP при транскрипции в гистоновую иРНК. Канонические гистоны растений тоже кодируются множественными генами и откладываются в фазе S, хотя транскрипты растительных гистонов полиаденилированы, а аналог SLBP, по-видимому, отсутствует. В той мере, в какой эпигенетическая наследствен- ность является результатом наследования «состояния» хроматина, процесс сборки нуклеосом RC представ- ляет исключительный интерес. Биохимия этого про- цесса была выяснена, когда были разработаны системы in vitro, способные собирать нуклеосомы на реплици- рующейся ДНК. Эти исследования показали, что трех- субъединичный комплекс, фактор сборки хроматина I (CAF-I, chromatin assembly factor I) действует как ги- стоновый шаперон, облегчающий включение НЗ • Н4 в качестве первого этапа сборки нуклеосом (Loyola and Almouzni, 2004). Было показано, что CAF-1 взаимодей- ствует с фиксатором репликационной процессивности (replication processivity clamp), PCNA, что означает, что репликация ДНК и сборка RC происходят в тесной близости. Работы на почкующихся дрожжах показали, что ни одна из субъединиц комплексов, участвующих в сборке RC in vitro, не является существенной для ро- ста; это позволяет предполагать, что in vivo существуют избыточные механизмы для сборки RC. Тот факт, что большая часть хроматина дрожжей собирается неза- висимым от репликации (RI, replication-independent)
4. Варианты гистонов откладываются на протяжении всего клеточного цикла Рис. 13.3. Старые нуклеосомы (темные диски) случайно рас- пределяются позади репликационной вилки, а новые нуклеосомы (светлые диски) откладываются в образующиеся бреши Опосредованная CAF-1 сборка нуклеосом изображена, с уве- личением, на ведущей и отстающей нитях. ДНК-полимераза (зеленый цвет); фиксатор поступательного хода репликации, PCNA (синее кольцо); тетрамеры гистонов НЗ • Н4 (розовый цвет); вновь синтезированная ДНК (красный цвет) образом (Altheim and Schultz, 1999), дает разумное объ- яснение для этой явной избыточности. Как показано ниже, варианты гистонов, как правило, откладываются путем RI-сборки нуклеосом. У почкующихся дрожжей RC-сборка не является полностью избыточной. Интригующим оказалось от- крытие, что отсутствие большой субъединицы CAF-1 ведет к утрате эпигенетического сайленсинга в тело- мерах (Loyola and Almouzni, 2004). Эта связь между RC-сборкой и эпигенетическим сайленсингом была распространена и на Arabidopsis, где утрата субъединиц CAF-1 приводит к ряду дефектов, которые можно при- писать утере эпигенетической памяти. Хотя механисти- ческая основа этих наблюдений неизвестна, кажется очевидным, что правильная откладка новых нуклеосом позади репликационной вилки важна для поддержания эпигенетически сайленсированного состояния. Предпосылкой эпигенетической наследственности нуклеосомного состояния является тот факт, что пред- существовавшие нуклеосомы после репликации долж- ны быть распределены по дочерним хроматидам (рис 13.3). Действительно, так оно и есть: детальные иссле- дования показали, что старые нуклеосомы наследуются дочерними хроматидами интактными и очевидно слу- чайным образом (рис. 13.3) (Annunziato, 2005). Однако этот процесс наследования плохо понят, как и процесс, посредством которого новые гистоны могли бы при- обретать эпигенетическую информацию. Популярная модель состоит в том, что новые нуклеосомы модифи- цируются в результате того, что они находятся вблизи старых нуклеосом (Jenuwein, 2001), однако данные в пользу этого гипотетического процесса отсутствуют, и необходимо рассматривать альтернативные средства воспроизведения эпигенетического состояния (He- nikoff and Ahmad, 2005). Каким образом эпигенетиче- ская информация наследуется дочерними клетками, остается главным невыясненным вопросом биологии, и изучение вариантов гистонов и механизмов их отклад- ки может дать ответ на этот вопрос 4. Варианты гистонов откл а д ы ва ются на протяжении всего клеточного цикла Как мы видели, коровые гистоны можно классифициро- вать на основе их анцестральной последовательности и положения в нуклеосоме. Линкерные гистоны характери- зуются доменом winged helix, а не доменом histone fold, и связываются с линкерной ДНК, разделяющей нуклеосомы (Wolffe, 1992). Хотя существуют минорные варианты этих канонических гистонов, они оказываются взаимозаме- нимыми с основной формой. Например, Н3.1 и Н3.2 различаются одной аминокислотой, и не известно, чтобы это придавало разные биологические свойства этим двум изоформам. Существование множественных генов, про- изводящих большие количества канонических гистонов для откладки в фазе S, является типичным для эукарио- тических геномов. Почти повсеместная встречаемость и подавляющее изобилие канонических S-фазных гистонов привело к тому, что до последнего времени вариантам гистонов уделяли относительно мало внимания. Возрождение интереса к вариантам гистонов яви- лось отчасти результатом осознания, что они отличают- ся от канонических S-фазных гистонов таким образом, что это может приводить к глубокой дифференциров- ке хроматина. Одно из различий между ними — раз- личие в способе их включения в хроматин. RC-сборка вставляет новые нуклеосомы в бреши между старыми нуклеосомами по всему геному, тогда как RI-сборка связана с локальным замещением существующей ну- клеосомы или субъединицы (Marzluff et al., 2002). По- этому RI-сборка потенциально способна переключать состояние хроматина путем замещения каноническо- го гистона его вариантом. Замещение одного гистона другим могло бы также стирать или изменять паттерн посттрансляционных модификаций. Следовательно, RI-сборка потенциально способна «перезагружать» эпигенетические состояния, которые, как полагают, опосредуются гистонами и их модификациями Не- давние успехи в изучении вариантов гистонов и про- цессов, с помощью которых они откладываются, при- вели к углублению наших представлений об основах эпигенетической наследственности и ремоделинга. Ниже мы обсудим особенности конкретных вариантов гистонов, обусловливающие их вклад в дифференци- ровку хроматина и, возможно, связанные с воспроиз- ведением эпигенетической информации.
гистонов и эпигенетика 5. Центромеры идентифицируются специальным вариантом НЗ Определяющей особенностью эукариотической хро- мосомы является центромера, которая служит местом прикрепления микротрубочек веретена во время митоза. Первыми центромерами, описанными на молекулярном уровне, были центромеры почкующихся дрожжей (Sac- charomyces cerevisiae}, где последовательность длиной 125 п.о. необходима и достаточна для формирования цен- тромеры (Amoret al., 2004а). Однако центромеры расте- ний и животных очень различаются, состоя, как правило, из мегабазных порядков коротких тандемных повторов. В отличие от ситуации с почкующимися дрожжами роль нуклеотидной последовательности ДНК в этих сложных центромерах неясна, поскольку известно, что полностью функциональные неоцентромеры образуются у человека спонтанно в эктопических сайтах, полностью лишенных последовательностей, похожих на центромерные повто- ры (рис. 13.4). Эти и другие наблюдения говорят против прямой роли последовательности ДНК в определении локализации центромер (глава 6) Ключевое проникновение в идентичность и наследо- вание центромер пришло в результате идентификации варианта гистона НЗ, CENP-A (рисунок в начале гла- вы). который оказался специфически локализованным в центромерах и включенным в нуклеосомные частицы вместо самогоНЗ (Palmer et al., 1991). Замечательно, что CENP-A остается связанным с центромерами при пере- ходе от гистонов к протаминам во время сперматогене- за, когда, в сущности, все другие гистоны утрачиваются (Palmer et al., 1990). Это раннее наблюдение в исследо- вании CENP-A позволяет предполагать, что CENP-A вносит вклад в центромерную идентичность мужского генома. Общее значение этого факта не было полно- стью оценено, пока не осознали, что CENP-A является гораздо более хорошим маркером для центромер, чем нуклеотидная последовательность ДНК (Armor et al., 2004а), и что аналоги CENP-A можно найти в геномах всех эукариот (рис. 13.5) (Malik and Henikoff, 2003). Та- ким образом, хотя центромеры почкующихся дрожжей определяются по консенсусной последовательности длиной 125 п.о., это также сайт центромерной нуклеосо- мы, который содержит вариант Cse4 центромерного НЗ (СепНЗ). У дробянковых дрожжей (Schizosaccharomyces pombe} группа содержащих СепНЗ нуклеосом занимает центральный коровый район центромеры, фланкиро- ванный содержащими НЗ нуклеосомами, обнаружива- ющими характерные черты гетерохроматина (Armor et al., 2004а). У мух и позвоночных CenH3s присутствуют в виде порядков [arrays], чередующихся с содержащими НЗ порядками, которые демонстрируют уникальный паттерн модификаций гистонов (Sullivan and Karpen, 2004). Чередование может объяснять тот факт, что цен- тромеры занимают лишь внешний край центромерной перетяжки метафазных хромосом (рисунок в начале главы) Это согласуется с наблюдением, что у «голоки- нетических» хромосом червей микротрубочки прикре- Рис. 13.4. Неоцентромеры человека (указаны стрелками) лишены центромерной а-сателлитной ДНК, но имеют CENP-A и гете- рохроматин AHTH-CENP-A-окрашивание зеленым цветом и анти- CENP-B-окрашивание красным цветом (который маркирует а-сателлитную ДНК) идентифицируют неоцентромеру хромо- сомы 4, которая лишена а-сателлита (основная часть рисунка} Эта хромосома 4 в остальных отношениях нормальна и пере- давалась на протяжении, по крайней мере, трех мейотических поколений нормальных особей Врезка изображает анти-HP 1 - окрашивание, которое показывает, что несмотря на отсутствие сателлитной ДНК гетерохроматин формируются вокруг актив- ных неоцентромер. (Перепечатано, с любезного разрешения, из: Armor et al., 2004b [©National Academy of Sciences]) пляются по всей длине каждой анафазной хромосомы, а СепНЗ занимает ведущий край по всей ее длине (рис. 13.5, справа) (Malik and Henikoff, 2003). Действительно, оказалось,что уникальный вариант СепНЗ точно мар- кирует центромеру у всех изученных в этом отношении эукариот. Эта очевидная повсеместность и присутствие центромер для осуществления митоза у всех эукариот указывает на возможность происхождения первого ка- нонического НЗ из СепНЗ. Генетические эксперименты на разных эукариотах подтвердили существенное значение СепНЗ для форми- рования кинетохора и для расхождения хромосом (Amor et al., 2004а). Поскольку СепНЗ-содержащие нуклеосо- мы остаются на месте на протяжении всего клеточно- го цикла, они образуют фундамент для сборки других кинетохорных белков во время митоза и мейоза (глава 6). Чрезвычайно важным вопросом в исследованиях хромосом является вопрос о том, каким именно обра- зом эти белки взаимодействуют, с тем чтобы обеспечить сцепление между центромерой и микротрубочками ве- ретена, которое может противостоять сильным тяну- щим силам, прилагаемым к кинетохорам в анафазе. У дрожжей были идентифицированы несколько десятков специфичных для кинетохора белков (дополнительные детали см. в главе 6), хотя то, каким образом они взаи- модействуют с содержащими СепНЗ нуклеосомами и другими базовыми белками, такими как CENP-C, в на- стоящее время неизвестно. Еще одним вызовом являет- ся расшифровка процесса сборки СепНЗ в нуклеосомы Тот факт, что центромеры составляют такую маленькую
5. Центромеры идентифицируются специальным вариантом НЗ Рис. 13.5. Центромерные варианты НЗ у модельных эукариот (Слева) Хромосома человека, окрашенная антителами против специфичного для центромеры варианта гистона НЗ, CENP-A (зеленый цвет), и анти-CENP-B (красный цвет), маркирующий а-сателлитную ДНК (любезно предоставлено Peter Warburton). (В центре) У Drosophila melanogaster анти-СепНЗ-антитела (красный цвет) окрашивают центромеры в метафазных хромосомах и на протяжении всей интерфазы (любезно предоставлено SusoPlatero). (Справа) У Caenorhabditis elegans анти-СепНЗ-антитела (зеленый цвет) окрашивают расположенные «конец в конец» голоцентромеры профазных хромосом (красный цвет) (любезно предоставлено Landon Moore) долю всего хроматина, затруднило биохимические под- ходы к этой замечательной проблеме, но мы надеемся, что совершенствующиеся технологии приведут к луч- шему пониманию структуры и динамики кинетохор Эволюция СепН3s не похожа на эволюцию гисто- нов любого другого класса. В то время как гистон НЗ инвариантен по последовательности, что отражает дей- ствие чрезвычайно сильного очищающего отбора на каждый остаток, CenH3s эволюируют быстро, особен- но в линиях растений и животных (Malik and Henikoff, 2003). Наиболее очевидным образом это демонстрируют аминотерминальные «хвосты», которые различаются по длине и последовательности до такой степени, что ста- новится невозможным выравнивание СепН3s разных таксономических групп. Даже домен histone fold в СепНЗ эволюирует на порядки быстрее, чем такой же домен НЗ. Какова же причина этого разительного эволюционного различия между НЗ, который функционирует в центро- мерах, и НЗ, который функционирует в других местах? Быстро эволюирующие участки генов СепНЗ Droso- phila и Arabidopsis обнаруживают избыток нуклеотид- ных замен типа replacement nucleotide substitutions по сравнению с тем, что можно было бы ожидать исходя из скорости синонимических замен (Malik and Henikoff, 2003). Этот избыток — признак адаптивной эволюции. Адаптивная эволюция у растений и животных видна также по еще одному главному центромерному фунда- ментальному белку [major centromere foundation protein], CENP-C (Talbert et al., 2004). Хотя адаптивная эволю- ция хорошо документирована для генов, участвующих в генетических конфликтах (таких, как «гонка вооруже- ний» между хозяином и паразитом), эти гены являются единственными известными существенными одноко- пийными генами, адаптивно эволюционирующими у любого организма. В случае СепНЗ и CENP-C участки адаптивной эволюции соответствуют участкам связы- вания и «нацеливания» на ДНК Это позволяет пред- полагать, что главные связывающиеся с центромерой белки адаптируются к эволюирующей центромерной ДНК, давая, таким образом, центромерному хроматину возможность взаимодействовать с консервативной ки- нетохорной машинерией, связывающей центромеру с микротрубочками веретена. Было высказано предполо- жение, что центромеры конкурируют в ходе женского мейоза за включение в ядро яйцеклетки, чтобы не быть утраченными в составе полярных телец (Talbert et al., 2004). Возникла бы «гонка вооружений», ведущая к экс- пансии центромер, вероятно путем неравного кроссин- говера между сестринскими хроматидами. Подавление хозяином этого процесса мейотического драйва с по- мощью СепНЗ и CENP-C приводило бы к избытку из- менений типа замен в участках, взаимодействующих с ДНК. Организмы, для центромер которых нет возмож- ности конкурировать, таких как почкующиеся дрожжи, не подвергались бы центромерному драйву, и это могло бы объяснить тот факт, что у них маленькие центроме- ры и их белки СепНЗ и CENP-C находятся под действи- ем сильного очищающего отбора Таким образом, мы видим, что специальный район генома, центромера, отличается одним классом вари- антов гистонов, последовательности которых обнару- живают остатки «гонки вооружений», которая могла привести к чрезвычайной сложности центромер. Про- цесс RI-сборки, в каждом клеточном цикле «нацели- вающий» новые нуклеосомы, содержащие СепНЗ, на центромеры, остается неизвестным (Amoret al., 2004а). Центромерные нуклеосомы демонстрируют примеча- тельное отсутствие специфичности по последователь- ности в том, что они не только могут надежно лока- лизоваться на неоцентромерах, которые совершенно непохожи на нативные центромеры (рис. 13.4), но и в том, что дрожжевой гомолог Cse4 может функциональ- но замещать CENP-A человека (Wieland et al., 2004) (ни один из них не является адаптивно эволюирующим;
Глава 13. Варианты гистонов и эпигенетика Talbert et al., 2004). Удивительно, что наши центромеры оставались в тех же самых положениях десятки мил- лионов лет без каких-либо очевидных детерминантов в виде специфических последовательностей, участву- ющих в поддерживающем их процессе. В той мере, в какой эпигенетика означает наследственность, не за- висящую от нуклеотидных последовательностей ДНК, наследование центромер в масштабах геологического времени является наиболее крайней формой, какую только можно себе представить. Тем не менее, мы все еще ищем механизм, чтобы объяснить, каким образом они поддерживают себя на протяжении даже одного клеточного цикла (дальнейшее обсуждение этой темы см. в главе 14). 6. Замещение гистоновым вариантом НЗ.З обнаруживается в активном хроматине Полагают, что транскрипционно активный хроматин, подобно центромерам, поддерживается эпигенетически и, подобно центромерам, активный хроматин обогащен вариантом гистона НЗ, называемым НЗ.З (Henikoff and Ahmad, 2005). НЗ.З очень похож по последовательности на канонические формы НЗ, отличаясь лишь четырьмя аминокислотами. При таких маленьких различиях можно было бы предположить, что эти две формы взаимозаме- няемы. Однако у Drosophila НЗ.З откладывается путем либо RC-, либо RI-сборки, тогда как НЗ откладывается толко в репликационных фокусах RC-способом. Это различие между двумя вариантами закодировано в са- мом белке, причем три из четырех различий между НЗ и НЗ.З явно участвуют в предотвращении откладки НЗ по способу RI (в а-спирали 2, рис. 13.2). Очистка раство- римых комплексов сборки у человека подтвердила, что эти две формы участвуют в разных процессах сборки: Н3.1 выделялся совместно с CAF-1 для RC-сборки, а НЗ.З выделялся вместе с другими компонентами, в том числе с HirA, и участвовал в RI-сборке. Хотя различия по четырем аминокислотам могли бы показаться практически несущественными, но если учесть, что человек, мухи и двустворчатые моллюски обладают НЗ.З , имеющими в точности одинаковую по- следовательность. эти отличия от НЗ становятся замет- ными. Филогенетический анализ показывает, что пара НЗ/НЗ.З возникала в разное время в ходе эволюции эу- кариот по меньшей мере четыре раза: у растений, у жи- вотных/грибов, у инфузорий и у Apicomplexa (Malik and Henikoff, 2003). Несмотря на отдельное происхождение от животных и грибов, пара НЗ/НЗ.З животных и пара от растений (называемая Н3.1 [RC] и Н3.2 [RI] — во из- бежание путаницы мы обозначаем все изоформы RC как НЗ. а все изоформы RI как НЗ.З) поразительно по- хожи друг на друга. Один и тот же кластер аминокислот (позиции 87—90, который препятствует отложению НЗ по RI-типу у Drosophila, оказался отличающимся у рас- тений, и другое различие у животных (в позиции 31 на- ходится Ala у НЗ и либо Ser, либо Thr у НЗ.З) также об- наруживается у растений. Грибы особенно интересны. Исходно [ancestrally] они имеют и НЗ, и НЗ.З; однако аскомицеты, к которым относятся дрожжи и плесневые грибы, утратили форму НЗ. Таким образом, облигатная RC-форма гистона НЗ, привлекшая наибольшее вни- мание у животных, даже не присутствует у дрожжей. Исследования НЗ.З в основной массе хроматина по- казали, что активные фракции обогащены им (Henikoff and Ahmad, 2005). Однако разнообразные факторы вно- сили свой вклад в ситуацию неопределенности с этой потенциальной «меткой» активного хроматина во вре- мена великого возбуждения в хроматиновой области, когда осознали, что модификации гистонов могут отли- чать активный хроматин от «молчащего». Прежде всего, отсутствовали какие-либо антитела, которые могли бы эффективно отличать НЗ от НЗ.З в хроматине (позиции 87—90 блокированы спиралями ДНК в нуклеосоме), тог- да как превосходные антитела против многих посттран- сляционных модификаций были легко доступными. Кроме того, различия по последовательности между НЗ и НЗ.З, казавшиеся незначительными, не предполагали каких-либо фундаментальных различий в хроматине, тогда как модификации гистонов были главным образом по лизинам «хвостов», о которых было известно, что они влияют на взаимодействия хроматина или связывают ассоциированные с хроматином белки. Ощущение, что эти две формы гистона 3 должны быть взаимозаменяе- мыми. получило подтверждение в открытой у Tetrahy- mena возможности замены S-фазной формой гистона ее замещающего аналога. Наконец, влиятельная гипотеза «гистонового кода» представляла нуклеосомы как фик- сированные мишени модификационных ферментов во время дифференцировки хроматина (Jenuwein and Allis, 2001). Однако становилось все более и более оче- видным, что хроматин является высокодинамичным, и даже ассоциированные с гетерохроматином белки свя- зываются с местами своего нахождения на минуты или даже менее (Phair et al., 2004). Оказывается, хроматин активно транскрибируемых генов находится в состоя- нии постоянного изменения, характеризующемся не- прерывным замещением гистонов (Henikoff and Ahmad, 2005). Три коровых различия, отличающие НЗ от НЗ.З, делают димеры НЗ.З • Н4 субстратом для RI-сборки, и сама по себе RI-сборка глубоко изменяет хроматин. В результате этого процесса активно транскрибируемые участки становятся маркированными НЗ.З (рис. 13.6). и доказательства в пользу этого процесса следуют из наблюдения RI-замещения НЗ, метилированного по лизину 9 (НЗК9те) меченым НЗ.З [with tagged НЗ.З] в транскрибируемых PH К-полимеразами I и II (pol I и II) локусах (Schwartz and Ahmad, 2005). Результатом динамичной природы хроматина в ак- тивных локусах является стирание предсуществовав- ших модификаций гистонов. Этим обеспечивается по- тенциальное решение вопроса о том, каким образом «молчащий» хроматин может становиться активиро- ванным, когда он гиперметилирован по НЗК9 и НЗК27 (модификации гистонов, обычно ассоциированные с репрессивным хроматином). Исследования времен- ной динамики показали, что метилы на гистонах столь
7. Фосфорилирование Н2АХ функционирует в репарации двунитевых разрывов ДНК Рис. 13.6. НЗ.З предпочтительно локализуется в активно транс- крибируемых участках политенных хромосом Drosophila Окрашивание DAPI (красный цвет} показывает паттерн бэндинга ДНК (слева), и H3.3-GFR (зеленый цвет) локализуется в межди- сковых промежутках (средняя часть), которые являются сайтами локализации РНК-полимеразы II. Правая часть рисунка — со- вмещение (перепечатано из: Schwartz and Ahmad. 2005) же стабильны, как и сами гистоны (Waterborg, 1993), хотя недавнее открытие деметил азы, специфичной для моно- и диметилированного НЗК4 (Shi et al., 2004), по- казывает, что некоторые метильные группы могут эн- зиматически удаляться с гистонов. В целом, паттерны ковалентных модификаций гистонов могли бы быть результатом модификаций, уже присутствующих на гистонах в то время, когда они откладываются. Таким путем модифицирующие ферменты шли бы по уже про- ложенному следу вместе с машиной сборки, возможно облегчая этот процесс (Henikoff and Ahmad, 2005). Эта модель динамической сборки предсказывает, что модификациями гистонов, которыми обогащен активный хроматин, должен быть обогащен и НЗ.З, и большинство измерений модификаций в НЗ и НЗ.З по- казали, что так оно и есть и у растений, и у животных. Более того, на основании этой модели ожидается, что активные модификации лизинов, такие как ацетилиро- вание НЗ и Н4 и метилирование НЗК4 и НЗК79, будут сильно коррелировать друг с другом, как наблюдалось в разных системах (O’Neill et al., 2003: Kurdistani et al., 2004; Schubeler et al., 2004). Наконец, динамическая RI- сборка в активных генах может объяснить, почему му- тации CAF-1 вызывают утрату сайленсинга (Loyola and Almouzni, 2004): считается, что лишь около 10 % генома дрожжей находится в «молчащем» состоянии, и это, воз- можно, единственный хроматин, который не замещает- ся динамически в геноме дрожжей. В отсутствие опосре- дуемой CAF-1 RC-сборки RI-сборка происходила бы по всему геному дрожжей, активируя прежде «молчащие» районы. Возможно, существование варианта НЗ, пред- назначенного для RC-сборки у многоклеточных эука- риот, является адаптацией для удержания подавляющей части хроматина клетки в эпигенетически «молчашем» состоянии Замещение дифференциально модифицированны- ми димерами НЗ.З • Н4 позволяет предложить простую модель наследования активного хроматина у делящихся клеток (Henikoff and Ahmad, 2005). Активный хроматин оставался бы активным после разбавления обычными ну- клеосомами после RC-сборки, если эта случайная смесь RI-отложенных и RC-отложенных нуклеосом не меша- ет таким активным процессам, как транскрипционная инициация и элонгация. Продолжение транскрипцион- ной активности в результате восстанавливало бы хрома- тин в следующем клеточном цикле, приводя к постоян- ному поддержанию активного хроматина на протяжении всего развития. Возможность того, что вариант гистона постоянно поддерживается процессом RI-сборки, может относиться и к CenH3s, которые вставлялись бы в бре- ши, создаваемые «развертыванием» обычных нуклеосом в результате анафазного натяжения. Когда клетки выходят из клеточного цикла и диффе- ренцируются, они больше не продуцируют и не включа- ют S-фазные гистоны, и в результате накапливается НЗ.З. Например, НЗ.З накапливается в мозге крыс до уровня, составляющего 87 % от уровня гистона НЗ, ко времени достижения крысами 400-дневного возраста (Henikoff and Ahmad, 2005). Имеет ли это градуальное замещение хроматина какое-нибудь функциональное значение или не имеет — неизвестно. Неизвестно также, является ли активный процесс, делающий возможным замещение, тем же самым, что и процесс, наблюдаемый в транс- крипционно активных локусах Одна из возможностей заключается в том, что разрушение хроматина прохо- дящей РНК-полимеразой или машиной ремоделинга хроматина вызывает локальное развертывание нуклео- сомы и случайную утрату димера НЗ.З • Н4 (рис. 13.7). Это сопровождалось бы воссозданием [reassembly] ну- клеосомы вслед за полимеразой с замещением утрачен- ного димера димером НЗ.З • Н4 с помощью комплекса HirA. Лишь тогда, когда полимеразы упакованы слиш- ком плотно для осуществления сборки, нуклеосомы полностью развертываются [unravel]. 7. Фосфорилирование Н2АХ функционирует в репарации двунитевых разрывов ДНК Гистоны Н2А также образуют семейство разных вари- антов, обнаруживаемых у всех эукариот. Вариант Н2АХ определяется по присутствию мотива карбокситерминаль- ной аминокислотной последовательности, SQ(E или D)0, где 0 означает гидрофобную аминокислоту. Серин в этой последовательности-мотиве является сайтом фосфори- лирования, продуцируя модифицированный белок, обо- значаемый «у-ШАХ». Динамическая природа хроматина и фосфорилирование Н2АХ особенно очевидны, когда в ДНК возникают двунитевые (ds, double-stranded) разрывы (Morrison and Shen, 2005). Летальность даже одиночного двунитевого разрыва требует немедленных действий по репарации повреждения и восстановления непрерывно- сти двойной спирали. Обнаружение ds-разрыва в норме происходит в пределах минуты или около того с момента его образования, и это, в свою очередь, включает быстрое фосфорилирование Н2АХ в непосредственной близости от сайта разрыва. Это фосфорилирование выполняется членами семейства фосфоинозитол 3-киназоподобных
гистонов и эпигенетика Рис. 13.7. Модель независимого от репликации замещения или обмена Большая молекулярная машина (либо комплекс SWR1, либо РНК-полимераза II) частично или полностью расвертывает нуклео- сому во время своего прохождения. Результатом этого оказывается либо сохранение гетеродимерных субъединиц, как, напри- мер, облегчаемый FACT перенос Н2А • Н2В из положения перед РНК-полимеразой в положение позади нее (Formosa et al. 2002; Belotserkovskaya et al. 2003), либо утрата гетеродимера. В последнем случае процесс репарации хроматина заменяет утраченный гетеродимер либо H2AZ • Н2В (верхняя часть рисунка), либо НЗ.З • Н4 (нижняя часть рисунка) киназ. Вслед за этим первоначальным событием фос- форилирование Н2АХ быстро распространяется вдоль по хромосоме, маркируя относительно большой хрома- тиновый домен, окружающий этот разрыв. Наконец, этот ds-разрыв в конце концов репарируется либо путем гомологичной рекомбинации, либо негомологичным воссоединением концов [nonhomologous end-joining], и метка-фосфорилирование удаляется. Фосфорилирование Н2АХ не является существен- ным для обнаружения или репарации ds-разрывов, по- тому что делеция гена или мутация «мишени» — серино- вого остатка не отменяет репарацию. Однако Н2АХ не просто маркер повреждения, поскольку такие мутанты уменьшили эффективность репарации и являются ги- перчувствительными к радиационному повреждению и генотоксическим агентам В настоящее время полага- ют, что Н2АХ функционирует в процессе репарации ds- разрывов по крайней мере двумя способами. Во-первых, он может помогать рекрутировать или сохранять белки, требующиеся для репарации в сайте разрыва (Morrison and Shen, 2005). Во-вторых, он может стабилизировать хромосому, окружая разорванные концы, путем рекру- тирования когезина, белкового комплекса, ответствен- ного за удерживание вместе сестринских хроматид (Lowndes and Toh, 2005). Эволюция Н2АХ не похожа на эволюцию других вариантов гистонов. Хотя ген Н2АХ обнаружен поч- ти у всех эукариот, он возникал неоднократно в отно- сительно недавнее время (Malik and Henikoff, 2003). Например, версия Н2АХ, обнаруженная у Drosophila, отличается от версии, обнаруживаемой у другого дву- крылого насекомого, Anopheles Предположительно, способность развивать новый Н2АХ из канонической формы Н2А является следствием простого мотива SQ(E или D)0. Ожидается, что развитие такого мотива на карбоксильном конце канонического Н2А происходи- ло неоднократно в ходе эволюции. Случайная утрата существующего Н2АХ с вновь отчеканенной версией могла бы подпитываться необходимостью для Н2АХ быть очень однородно распределенным, потому что ds-разрывы могут происходить в любом месте генома. Если в существующем гене Н2АХ происходят мутации, уменьшающие его сходство с каноническим Н2А таким образом, что его сборка становится менее эффективной или однородной, возникнет сильное давление отбора, чтобы заместить его версией, которая более похожа на канонический Н2А. Эта логика могла бы помочь объ- яснить исключительный случай Н2Ах Drosophila, ко- торый, в отличие от других эукариот, происходит не от своего канонического Н2А, а, скорее, от удаленной ли- нии H2AZ (описываемой ниже). Если все, что нужно, чтобы быть Н2АХ — это находиться в положении Н2А в нуклеосоме и иметь карбокситерминальный мотив для фосфорилирования, H2AZ может развить в себе эти способности. Репарация ds-разрывов представляет собой несо- мненно универсальную функцию фосфорилирования Н2АХ, и, казалось бы, у этого процесса нет никакого стабильного эпигенетического аспекта. Однако мыши с нуль-мутацией по Н2АХ стерильны, и цитологическое изучение сперматогенеза млекопитающих выявило яр- кую эпигенетическую особенность — специфическое фосфорилирование Н2АХ на биваленте XY (рис. 13.8) (Femandez-Capetillo et al., 2003). Эта хромосомная пара
8. H2AZ играет роль в регулировании транскрипции Рис. 13.8. Стадия похищены сперматогенеза, показывающая за- висимость формирования полового тельца от Н2АХ В нормальных сперматоцитах млекопитающих видно, что ядерная структура, называемая половым тельцем {стрелка, помечено зеленым цветом на правых рисунках}, охватывает не- спаренный бивалент XY (помечен на левых рисунках). Синап- тонемный комплекс, выравнивающий спаренные хромосомы, окрашен в красный цвет. Половое тельце в норме обогащено Н2АХ (Н2АХ+/+). В сперматоцитах Н2АХ-/- половое тельце не образуется, и эпитоп полового тельца становится дисперги- рованным по аутосомам (нижний правый рисунок). Масштабная линейка = 10 мкм. Фотографии любезно предоставлены Shantha Mahadevaiah и Paul Burgoyne (Fernandez-Capetillo et al., 2003) занимает отдельное «половое тельце» во время мейо- тической профазы, предположительно участвующее в сайленсинге сцепленных с полом генов во время муж- ского мейоза. Фосфорилирование Н2АХ играет суще- ственную роль в формировании нормального полового тельца, и дефектные по Н2АХ сперматоциты не спо- собны спариваться или конденсироваться и не могут инактивировать гены X и Y во время мейоза. Фосфори- лирование Н2АХ бивалента XY отличается от процес- са, происходящего в ds-разрывах. Фосфорилирование XY в половом тельце не требует разрывов; скорее, оно происходит наиболее заметным образом в неспаренных участках хромосом. Механизмы, посредством которых фосфорилирование Н2АХ «нацеливается» на неспарен- ные хромосомы, и то, как это событие приводит к кон- денсации, спариванию и сайленсингу, в настоящее вре- мя неизвестны. Однако интересно пофантазировать, что эта роль может иметь отношение к способности взаимодействовать с когезином и рекрутировать его. 8. H2AZ играет роль в регулировании транскрипции Возрождение интереса к вариантам гистонов оказалось особенно мощным в случае H2AZ (или H2A.Z) (Ката- kaka and Biggins, 2005). H2AZ почти повсеместен; он дивергировал от анцестрального Н2А на ранних этапах эволюции эукариот. В соответствии с этим отдельным происхождением генетические эксперименты с почкую- щимися дрожжами и мухами показали, что гистоны Н2А и H2AZ возникли для выполнения отдельных, непере- крывающихся функций. H2AZ является необходимым гистоном у большинства организмов, от ресничных простейших до млекопитающих. Однако почкующихся и дробянковых дрожжей делеция гена H2AZ дает жиз- неспособные клетки, хотя эти нуль-мутанты обладают разнообразными фенотипами. Эти свойства облегчили его генетическую и биохимическую характеристику у дрожжей. У большинства протестированных на сегодня орга- низмов H2AZ составляет приблизительно 10 % от обще- го белка Н2А. Он широко, но не однородно распределен по всем хромосомам. Это наиболее элегантно выглядит в случае политенных хромосом Drosophila, где он обра- зует отчетливый паттерн бэндинга. Результаты опытов по иммунопреципитации хроматина с использовани- ем дрожжевых и мышиных клеток согласуются с этим паттерном. Хотя H2AZ преимущественно локализуется в промоторных участках генов дрожжей, эта специфич- ность не соблюдается для всех сайтов его откладки. У Drosophila сколько-нибудь различимая связь между ло- кализацией H2AZ и экспрессией генов отсутствует. Та- ким образом, хотя механизм откладки H2AZ известен (обсуждается ниже), правила, определяющие места его концентрации, в настоящее время неясны. Ряд наблюдений указывают на важную роль в регули- ровании экспрессии генов (Kamakaka and Biggins, 2005). Мутационный анализ почкующихся дрожжей показал, что функция H2AZ частично является избыточной с двумя разными классами глобальных транскрипцион- ных факторов, комплексом ремоделинга нуклеосом, Swi/Snf, и комплексом модификации гистонов, SAGA. Хотя утрата по отдельности функции H2AZ, Swi/Snf или SAGA не лишает клетку жизнеспособности, одновре- менная потеря любой комбинации двух путей детальна. Дополнительные генетические и биохимические экспе- рименты позволяют предположить, что эта роль вклю- чает и функции как в инициации, так и в элонгации транскрипции (дополнительные детали см. в главе 10). Более того, баланс откладки H2AZ причинно связан с эпигенетикой через его роль как фактора антисайлен- синга Делеция гена H2AZ приводит к экстенсивному распространению «молчащего» хроматина внутрь от теломер, и этот дефект может быть подавлен дополни- тельной делецией генов, кодирующих сами факторы сайленсинга (рис. 4.7). Влияние делегирования H2AZ на глобальную экспрессию генов было протестировано с помощью микрочипов дрожжевых генов. Хотя боль- шинство регулируемых генов обнаруживают понижен- ную экспрессию в нуль-мутантах по H2AZ, существен- ная доля их демонстрирует увеличение экспрессии. Поскольку все еще не ясно, какие изменения отражают прямую регуляцию, а какие — косвенную, возможно, что нуклеосомы H2AZ функционируют как позитивно, так и негативно в регулировании транскрипции генов. Более того, неизвестно, лежит ли в основе этих разноо- бразных ролей H2AZ в транскрипции и гетерохромати-
258 Глава 13. Варианты гистонов и эпигенетика не один унифицирующий механизм или же более слож- ное сочетание разных путей. В противоположность современной картине, полу- ченной для почкующихся дрожжей, в клетках млекопи- тающих H2AZ предпочтительно локализуется в гетеро- хроматиновых участках. Действительно, было показано, что он физически взаимодействует с белком НР1 (Het- erochromatin associated Protein 1) (Fan et al., 2004). Хотя это могло бы наводить на мысль о возможной роли H2AZ в сайленсинге у многоклеточных животных, следует отметить, что у Drosophila подгруппа экспрес- сируемых генов, локализованных в гетерохроматине, действительно нуждается в НР1 для экспрессии (Weiler and Wakimoto, 1995). Если локализация H2AZ в клетках млекопитающих отражает аналогичный процесс, тогда четко установленные роли этого варианта в облегчении транскрипции и противодействии сайленсингу у дрож- жей вероятно отражали бы общие фундаментальные свойства этого варианта. H2AZ может играть еще одну роль в эпигенетике расхождения хромосом. Одним из первых фенотипов, обнаруженных у нуль-мутантов по H2AZ, был дефект расхождения хромосом в митозе, на- блюдавшийся у дробянковых дрожжей. Последующие эксперименты сделали эту связь более очевидной. Экс- периментальная делеция H2AZ в клетках млекопитаю- щих с помощью РНК-интерференции (RNAi) вызывает дефекты в перицентрической ассоциации НР1, неста- бильность генома и нарушения в сегрегации хромосом (Kamakaka and Briggins, 2005). Аналогичным образом, у почкующихся дрожжей нуль-мутанты по H2AZ об- наруживают повышенную частоту потери хромосом в митозе и существенные генетические взаимодействия с генами, кодирующими известные компоненты цен- тромеры и митотического веретена (Krogan et al., 2004). Остается формально возможным, что влияние H2AZ на расхождение хромосом является косвенным следствием его роли в установке программы транскрипции генов. Однако интригующая гипотеза заключается в том, что механизмы расхождения хромосом эволюционировали таким образом, чтобы использовать не только вариант НЗ, но и вариант Н2А. Каким образом H2AZ влияет на транскрипционную компетентность, сайленсинг, гетерохроматин и, воз- можно, сегрегацию хромосом? Структура содержащей H2AZ нуклеосомы, полученная с высоким разрешени- ем, позволяет выявить несколько уникальных свойств этого варианта (Suto et al., 2000). По сравнению с ну- клеосомами Н2А H2AZ обладает расширенным кислот- ным пэтч-доменом на поверхности нуклеосомы, и это отличие, вероятно, имеет функциональное значение Например, у Drosophila именно часть «докинг-домена» («docking domain») (рис. 13.2) взаимодействует с гисто- ном Н4 и определяет сегмент, существенный для функ- ции. Далее, результаты мутационных исследований и экспериментов по связыванию in vitro свидетельствуют о том, что этот расширенный кислотный пэтч вносит основной вклад во взаимодействие нуклеосомы с НР1 (Dryhurst et al., 2004). Интересно, что НР1 содержит хромодомен, белковый мотив, который может связы- ваться с НЗ, метилированным по лизину 9 (главы 3 и 4). Таким образом, Н2А7может действовать совместно с метилированием гистона НЗ, обеспечивая ассоции- рованным с хроматином белкам платформу для свя- зывания. В дополнение к своему расширенному кис- тотному пэтчу H2AZ имеет пару остатков гистидина, координирующих дополнительный ион металла в этой структуре, который, in vivo, мог бы обеспечивать уни- кальный физиологический ответ, недоступный нуклео- сомам, содержащим Н2А. Наконец, кристаллическая структура позволяет предсказать, что асимметричный гистоновый октамер, состоящий из одного главного димера Н2А • Н2В плюс одного вариантного димера H2AZ • Н2В, создавал бы конфликт белковых структур в петле 1 (рис. 13.2) и, по-видимому, вряд ли происходит in vivo. В совокупности эти новые особенности нуклеосом H2AZ свидетельствуют в пользу того, что этот вариант должен придавать хроматину уникальные физические свойства. Это предсказание подтверждается экспери- ментально. Например, H2AZ может стабилизировать димер-тетрамерные взаимодействия в нуклеосоме, и порядки нуклеосом, составленных из нуклеосом H2AZ, могут обнаруживать усиленное сворачивание более высокого порядка и уменьшенную межмолекулярную агрегацию (Dryhurst et al., 2004). Таким образом, H2AZ, вероятно, модулирует функцию хроматина по мень- шей мере тремя различными способами. Во-первых, он несомненно изменяет физические свойства своего хроматинового окружения, влияя таким образом на доступность или активность /^^-действующих фак- торов. Во-вторых, как и в случае с другими гистона- ми, посттрансляционные модификации в его амино- терминальном и карбокситерминальном доменах, вероятно, обеспечивают уникальные docking-сайты для ассоциированных с хроматином белков (так назы- ваемые trans-эффекты, с которыми мы познакомились в главе 3), или регулируемые изменения в плотности заряда (cw-эффекты) В-третьих, его ограниченная и специфическая откладка в хроматине, вероятно, «на- целивает» уникальные функции на специфические ло- кусы. 9. Белковые комплексы для откладки и замещения вариантов Н2А Хотя все еще остаются важные вопросы относительно того, как варианты гистона Н2А функционируют, не- давние исследования выяснили основу их включения в хроматин. Первый прорыв совершился, когда был биохимически очищен комплекс, катализирующий перенос димеров Н2А* Н2В в хроматин (Sarma and Reinberg, 2005). Этот мультисубъединичный комплекс, названный SWR1-C, содержит в качестве каталитической субъединицы белок Swrl, член семейства SWI/SNF FNA- зависимых ремоделеров хроматина. In vivo SWR1 -С, оказывается, предназначен для этой работы, потому что эффекты делетирования гена SWR1 сходны с эффектами делегирования гена, кодирующего сам H2AZ. Более того,
11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК 259^ у нуль-мутанта по swr 1 предпочтительная откладка H2AZ в специфических локусах полностью утрачена. In vitro, когда очищенный SWR1-C представлен с набором ну- клеосом, он специфически замещает димеры Н2А • Н2В димерами H2AZ • Н2В в АТФ-зависимой реакции (рис. 13.7). Интересный аспект этой реакции вытекает из предсказания кристаллической структуры, упомянутой выше: смешанные нуклеосомы, содержащие и Н2А, и H2AZ, не должны быть стабильными. Таким образом, замещение димера, опосредованное SWR1-C, может быть совместной реакцией, в которой замещение одного димера H2AZ • Н2В облегчает извлечение и замещение остающегося димера Н2А • Н2В. Второй мультисубъединичный белковый комплекс выполняет у Drosophila замещение фосфорилированно- го Н2АХ нефосфорилированной молекулой (Morrison and Shen, 2005). Замечательно, что этот единственный у Drosophila комплекс, названный dTip60, состоит из белков, обычно обнаруживаемых в двух отдельных ком- плексах: SWR1-C, АТФ-зависимом комплексе ремоде- лирования хроматина, описанном выше, и NuA4/ Tip60, комплексе модификации гистонов с ацетилтрансфераз- ной активностью. In vitro эта реакция требует и АТФ. и ацетил-СоА. Таким образом, один этот комплекс инте- грирует ацетилирование гистонов, ремоделинг нуклео- сом и замещение гистонов их вариантами. Это сочета- ние вероятно отражает тот факт, что Н2АХ Drosophila является также ее H2AZ, тогда как у других эукариот Н2АХ эволюционировал из канонического Н2А. Не- смотря на это различие, есть основания ожидать, что основной путь консервативен. У почкующихся дрож- жей и в клетках млекопитающих SWR1-C, NuA4/ Tip60 и еще один АТФ-зависимый комплекс ремоделинга ну- клеосом, INO80-C, имеют общие субъединицы. Одной из них является родственный актину белок Агр4. Инте- ресно, что было показано, что у почкующихся дрожжей Агр4 взаимодействует с фосфорилированным Н2АХ, результатом чего является последовательное рекрути- рование комплексов NuA4, SWR1 и INO80 (Downs et al., 2004). Это позволяет предполагать, что и у этих ор- ганизмов эти комплексы катализируют замещение как Н2АХ, так и H2AZ. Остается продемонстрировать это предсказание непосредственно. Открытие того, что комплексы ремоделинга хрома- тина предназначены для RI-сборки нуклеосом, важно не только для понимания того, как варианты гистонов включаются, но и для обеспечения первых специфиче- ских in vivo функций для машин ремоделинга хрома- тина. До этих открытий было неясно, почему клетки обычно имеют такое обилие крупных машин, облег- чающих движение нуклеосом (Becker and Horz. 2002). Разнообразие АТФаз SWI/SNF представляло загадку, которую теперь, возможно, легче понять, если некото- рые машины ремоделинга предназначены для сборки разных вариантов в нуклеосомы. Возможно, сборка ну- клеосом является согласованным процессом, в котором ферменты, модифицирующие гистоны, действуют на свои субстраты, в то время как АТФ-зависимые ремоде- леры обеспечивают рабочий ход и специфичность, не- обходимые для RI-замещения 10. Другие варианты Н2А дифференцируют хроматин, но их функции все еще неизвестны Дальнейшая диверсификация Н2А произошла у позво- ночных. У млекопитающих тасгоН2А и H2ABbd (Н2А Barr body deficient) представляют уникальные линии, которые, по-видимому, играют роль в эпигенетическом феномене компенсации дозы (детально обсуждается в главе 17). МасгоН2А называется так потому, что, кроме домена histone fold и карбокситерминальных «хвостов», он содержит большой карбокситерминальный глобу- лярный домен (Ladurner, 2003). С учетом того, что кар- бокситерминальный «хвост» Н2А выходит поблизости от линкерной ДНК, возможно, что этот глобулярный домен взаимодействует с линкерами, «хвостами» НЗ или с такими линкерными белками, как Н1 и белки HMG (High Mobility Group). В чем именно заключается это взаимодействие — неизвестно, хотя интригующая возможность заключается в том, что оно обладает фер- ментативной активностью. В пользу этой возможности говорит сходство глобулярного домена (имеющего длину, 200 аминокислотных остатков) с белками, обладающими гидролитической активностью по отношению к по- линуклеотидам и полипептидам. Другая возможность заключается в том. что глобулярный домен может просто действовать как препятствие для инициации транскрип- ции; на мысль о такой роли наводит его способность блокировать связывание транскрипционных факторов in vitro (Sarma and Reinberg, 2005). Домен histone fold macroH2A также обладает специфическими свойствами, поскольку он не действует на ремоделеры хроматина. Эти наблюдения позволяют предполагать, что нуклеосомы, содержащие шасгоН2А, менее мобильны и потому могут быть устойчивыми к активной транскрипции. Это мог- ло бы объяснить обогащенность дискретных районов факультативно неактивной Х-хромосомы вариантом macroH2A у женщин — районов, которые чередуются с участками конститутивного гетерохроматина (рис. 13.9а) (Chadwick and Willard, 2004). В противоположность macroH2A H2ABbd, по- видимому, не выявляется на тельце Бара, но в осталь- ном наблюдается повсеместно в ядре (рис. 13.96) (Chad- wick and Willard. 2001). Поведение in vitro нуклеосом, содержащих H2ABbd, согласуется с предположением, что он играет роль в облегчении транскрипции (Sarma and Reinberg, 2005). H2ABbd является быстро эволюциони- рующим белком по сравнению с другими известными изоформами Н2А, хотя причины этой ускоренной эво- люции неясны. 11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК Когда больше нет необходимости получать доступ к ДНК для репликации и транскрипции, хроматин обычно
Глава 13. Варианты гистонов и эпигенетика а 1 б 1 в Рис. 13.9. Варианты Н2А и неактивная Х-хромосома у женщин (a) macroH2A {красный цвет) окрашивает дискретные районы неактивной Х-хромосомы, которые чередуются с маркером гетерохроматина (гистоном НЗК9теЗ). {б) H2ABbd {зеленый цвет) исключается из неактивной Х-хромосомы {красная точка с указывающей на нее стрелкой), {в) То же самое ядро, что и на б, но окрашенное DAPI, чтобы показать хроматин {а — пере- печатано, с любезного разрешения, из: Chadwick and Willard, 2004 [© National Academy of Sciences]; б, в — перепечатано, с любезного разрешения, из: Chadwick and Willard, 2001 [©The Rockefeller University Press]) становится еще более конденсированным, и это нередко связано с замещением канонических гистонов. Это оче- видно для спермиев, и в некоторых линиях у паралогов гистонов выработалась специализированная роль упа- ковщиков. Например, сперии морского ежа содержат варианты Н1 и Н2В с повторяющимися «хвостовыми» мотивами, связывающимися с малой бороздкой ДНК (Malik and Henikoff, 2003), что предположительно явля- ется адаптацией к тому, чтобы более плотно упаковать хромосомы для включения в головки спермиев. Анало- гичная адаптация обнаруживается у специфичных для пыльцы вариантов Н2А у цветковых растений У позво- ночных специфичные для спермиев специализирован- ные варианты гистонов обнаруживаются в семенниках млекопитающих, в том числе паралог Н2В (SubH2Bv), локализующийся в акросоме, и специфичный для се- менников вариант НЗ (Witt et al., 1996). Замещение гистонов во время созревания спермиев протаминами и другими белками обеспечивает потен- циальные средства для стирания эпигенетической ин- формации в мужской зародышевой линии. Однако дан- ные о трансгенерационной наследственности (Rakyan and Whitelaw, 2003), особенно у животных, у которых нет метилирования ДНК, указывают на то, что некото- рая выборка нуклеосомных гистонов, возможно, сохра- няется при этом переходе и передает эпигенетическую информацию Как уже указывалось, это именно то, что происходите CENP-А в центромерах (Palmer et al., 1990), и возможно, что небольшая фракция других вариантов, таких как НЗ.З, остается в спермиях для эпигенетиче- ского наследования информации об экспрессии генов. Хотя наше понимание о процессе замещения гистонов в ходе развития спермиев является рудиментарным, мы надеемся, что многое удастся узнать, когда мы поймем, каким образом CENP-A переживает этот переход. Увеличенная компактизация происходит также в соматических клетках, прекративших деления и пре- терпевающих дифференцировку. В некоторых случаях компактизация включает количественные и качествен- ные изменения в линкерных гистонах. Стоихиометрия гистона Н1 относительно нуклеосом определяет сред- ний интервал в нуклеосомных порядках in vivo (Fan et al., 2003). Кроме того, присутствие Hl в хроматине способствует формированию структуры более высоко- го порядка, которая обычно подавляет транскрипцию (Wolffe, 1992). Линкерные гистоны in vivo гораздо более мобильны, чем коровые гистоны. Время пребывания [residence times] для Н2А и Н2В — часы, а для НЗ и Н4 оно даже не может быть измерено, тогда как время пре- бывания для Н1 — несколько минут (Phair et al., 2004). В результате крайне мало вероятно, что включение ва- риантных линкерных гистонов дифференцирует хрома- тин наследуемым образом. Скорее, роль вариантов Н1, как полагают, сводится к тому, чтобы изменять свойства основной массы хроматина, которые могут влиять на компактизацию (Wolffe, 1992). Варианты Н1 разделяют с коровыми гистонами разграничение между RC- и RI-формами (Marzluff et al., 2002). RC-вариантные формы Hl, по-видимому, взаимозаменяемы друг с другом — предположение, основывающееся на том факте, что нокаутные мыши, лишенные одного или двух из пяти RC-вариантов Н1, фенотипически нормальны (Fan et al., 2003). У птиц ва- риант линкерного гистона Н5 откладывается во время созревания эритроцитов, что сопровождает крайнюю степень компактизации ядра. Еще один вариант, кото- рый откладывается до высоких уровней в неделящихся клетках, — это Н1°, сильно дивергировавший от кано- нических форм. Сверхэкспрессия Н1° делает хроматин менее доступным для нуклеаз, чем аналогичная сверх- экспрессия канонической формы. Обычное накопле- ние Н1° в неделящихся клетках могло бы быть общим механизмом компактизации хроматина, по мере того как клетки переходят в состояние покоя. 12. Заключение и перспективы исследований Варианты гистонов обеспечивают наиболее фунда- ментальный уровень дифференцировки хроматина, и альтернативные механизмы откладки различных вариан- тов потенциально могут устанавливать и поддерживать эпигенетические состояния. Гистоны Н2А, Н2В, НЗ и Н4 занимают разные положения в коровой частице в результате эволюционного процесса, начавшегося до по- явления последнего общего предка эукариот. Ключевые эволюционные инновации остаются неопределенными, в том числе возникновение октамера из анйцестрального тетрамера типа НЗ • Н4, и мы ожидаем секвенирование большего числа геномов архей и примитивных эукариот, которые могли бы оказаться отсутствующими связующи- ми звеньями. Последующее усложнение четырех коровых гистонов в разные варианты обеспечило основу для эпи- генетических процессов, включая развитие и расхожде- ние хромосом. Для полного понимания эпигенетической наследственности нам нужно лучше понимать процессы включения вариантов путем замещения канонических
гистонов. Важным достижением последнего времени яв- ляется характеристика независимых от репликации путей сборки, предназначенных для конкретных вариантов. Центромеры представляют собой наиболее бросаю- щиеся в глаза примеры очень разного хроматина, кото- рые можно приписать особым свойствам того или иного варианта гистона. Хотя ясно, что нуклеосомы, содержа- щие СепНЗ, образуют фундамент центромеры, главным вызовом для будущих исследований остается вопрос о том, каким именно образом они откладываются в одно и то же место в каждом клеточном поколении в отсут- ствие даже намека на сиквенс-специфичность. Становится очевидным, что с вариантами гистонов связаны также эпигенетические свойства активных ге- нов. Транскриппионно активные локусы обогащены и НЗ 3, и H2AZ, и расшифровка процессов сборки, от- ветственных за это обогащение, представляет собой важную область текущих исследований. Динамическое поведение хроматина ведет к пониманию того, что транскрипция, ремоделинг хроматина и модификация гистонов могли бы быть сопряжены со сборкой и раз- боркой нуклеосом. Изучение динамических процессов, связанных с обновлением гистонов, находится лишь на ранней стадии, и мы ожидаем технологических дости- жений в молекулярной биологии, цитогенетике, био- химии и структурной биологии, которые можно будет использовать для лучшего понимания динамической природы хроматина. Помимо этих универсальных процессов варианты гистонов участвуют и в конкретных эпигенетических явлениях. В случае Х-хромосомы млекопитающих три разных варианта Н2А, фосфо-Н2АХ, тасгоН2А и H2ABbd, рекрутированы для участия в сайленсинге или активации генов в целях инактивации зародышевой ли- нии или компенсации дозы Понимание функции этих вариантов в эпигенетических процессах остается важ- ным вызовом на будущее Получение первой структуры коровой частицы ну- клеосомы с высоким разрешением (Luger et al., 1997) стало плодотворным достижением в выяснении свойств хроматина. Путем такого усложнения этой базовой структуры, которое имело биологические последствия, варианты гистонов дают возможность углубить наше понимание того, каким образом эти удивительные [fas- cinating] архитектурные белки эволюционировали, что- бы играть разнообразные роли в эпигенетических про- цессах Литература Altheim В.А. and Schultz М.С., 1999. Histone modification governs the cell cycle regulation of a replication-independent chromatin assembly pathway in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 1345-1350. Amor D.J., Kalitsis P., Sumer H., and Choo K.H., 2004a. Building the centromere: From foundation proteins to 3D organization. Trends Cell Biol. 14:359. Amor D.J., Bentley K., Ryan J., Perry J., Wong L., Slater H., and Choo K.H., 2004b. Human centromere repositioning “in prog- ress”. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 6542-6547. Annunziato A.T., 2005. Split decision: What happens to nucleosomes during DNA replication? J. Biol. Chem. 280: 12065-12068. Arents G., Burlingame R.W, Wang B.C., Love WE., and Moud- rianakis E.N., 1991. The nucleosomal core histone octamer at 3.1A resolution: A tripartite protein assembly and a left-handed superhelix. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 10148-10152. Becker P.B. and Horz W, 2002. ATP-dependent nucleosome remod- eling. Annu. Rev. Biochem. 71: 247-273. Belotserkovskaya R., Oh S., Bondarenko V.A., Orphanides G., Studitsky V.M., and Reinberg D., 2003. FACT facilitates transcription-dependent nucleosome alteration. Science 301: 1090-1093. Chadwick B.R and Willard H.R., 2001. A novel chromatin protein, distantly related to histone H2A, is largely excluded from the inactive X chromosome. J. Cell Biol. 152: 375-384. Chadwick B.R and Willard H.R., 2004. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 17450-17455. Downs J.A., Allard S., Jobin-Robitaille O., Javaheri A., Auger A., Bouchard N.. Kron S.J., Jackson S.P., and Cote J., 2004. Bind- ing of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol. Cell 16: 979-990. Dryhurst D., Thambirajah A.A., and Ausio J., 2004. New twists on H2A.Z: A histone variant with a controversial structural and functional past. Biochem. Cell Biol. 82: 490-497. Fan Y, Nikitina T, Morin-Kensicki E.M., Zhao J., Magnuson T.R., Woodcock C.L., and Skoultchi A.I., 2003. Hl linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell. Biol. 23: 4559-4572. Femandez-Capetillo O., Mahadevaiah S.K., Celeste A., Romanienko P.J., Camerini-Otero R.D., BonnerW.M., ManovaK., Burgoyne P, and Nussenzweig A., 2003. H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis. Dev. Cell 4: 497-508. Formosa T, Ruone S., Adams M.D., Olsen A.E., Eriksson P, Yu Y, Roades A.R., Kaufman P.D., and Stillman D.J., 2002. Defects in SPT16 or POB3 (yFACT) in Saccharomyces cerevisiae cause dependence on the Hir/Hpc pathway: Polymerase passage may degrade chromatin structure. Genetics 162: 1557-1571 Henikoff S. and Ahmad K., 2005. Assembly of variant histones into chromatin. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21: 133-153. Jenuwein T, 2001. Re-SET-ting heterochromatin by histone meth- yltransferases. Trends Cell Biol. 11:266-273. Jenuwein T. and Allis C.D., 2001. Translating the histone code Sci- ence 293: 1074-1080. Kamakaka R.T and Biggins S., 2005. Histone variants: Deviants? Genes Dev., 19: 295-310. Krogan N.J., Baetz K., Keogh M.C., Datta N., Sawa C, KwokTC., Thompson N.J., Davey M.G., Pootoolal J., Hughes T.R., et al., 2004. Regulation of chromosome stability by the histone H2A variant Htzl, the Swrl chromatin remodeling complex, and the histone acetyltransferase NuA4. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 13513-13518. Kurdistani S.K., Tavazoie S., and Grunstein M., 2004. Mapping global histone acetylation patterns to gene expression. Cell 117: 721-733. Ladurner A.G., 2003. Inactivating chromosomes: A macro domain that minimizes transcription. Mol. Cell 12: 1-3. Lowndes N.R. and Toh G.W, 2005. DNA repair: The importance of phosphorylating histone H2AX. Curr. Biol. 15: R99-R102.
Глава 13. Варианты гистонов и эпигенетика Loyola A. and Almouzni G., 2004. Histone chaperones, a supporting role in the limelight. Biochim. Biophys. Acta 1677: 3-11. Luger K., Mader A.W., Richmond R.K., Sargent D.R., and Rich- mond T. J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 E resolution. Nature 389: 251-260. Malik H.S. and Henikoff S., 2003. Phylogenomics of the nucleosome. Nat. Struct. Biol. 10: 882-891. Marc E, Sandman K., Lurz R., and Reeve J.N., 2002. Archaeal his- tone tetramerization determines DNA affinity and the direction of DNA supercoiling. J. Biol. Chem. 277: 30879-30886. MarzluffW.Rand Duromo R.J., 2002. Histone mRNAexpression: Multiple levels of cell cycle regulation and important develop- mental consequences. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 692-699. Marzluff W.R., Gongidi P, Woods K.R., Jin J., and Maltais L.J., 2002. The human and mouse replication-dependent histone genes. Genomics 80: 487-498. Morrison A.J. and Shen X., 2005. DNA repair in the context of chromatin. Cell Cycle 4: 568-571. O’Neill L.P, Randall T.E., Lavender J., Spotswood H.T., Lee J.T., and Turner B.M., 2003. X-linked genes in female embryonic stem cells carry an epigenetic mark prior to the onset of X inactivation. Hum. Mol. Genet. 12: 1783-1790. Palmer D.K., O’Day K., and Margolis R.L., 1990. The centromere specific histone CENP-A is selectively retained in discrete foci in mammalian sperm nuclei. Chromosoma 100: 32-36. Palmer D.K., O’Day K., Trong H.L., Charbonneau H., and Mar- golis R.L., 1991. Purification of the centromere-specific protein CENP-A and demonstration that it is a distinctive histone. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 3734-3738. Phair R.D., Scaffidi P, Elbi C, Vecerova J., Dey A., Ozato K., Brown D.T., Hager G., Bustin M., and Misteli T. 2004. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: Three-dimen- sional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell. Biol. 24: 6393-6402. Rakyan V. and Whitelaw E., 2003. Transgenerational epigenetic inheritance. Curr. Biol. 13: R6. Sarma K. and Reinberg D., 2005. Histone variants meet their match. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 139-149. Schubeler D., MacAlpine D.M., Scalzo D., WirbelauerC., Kooper- beig C., van Leeuwen R, Gottschling D.E., O’Neill L.P., Turner B.M., Delrow J., et al. The histone modification pattern of active genes revealed through genome-wide chromatin analysis of a higher eukaryote. Genes Dev. 18: 1263-1271. Schwartz B.E. and Ahmad K., 2005. Transcriptional activation trig- gers deposition and removal of the histone variant НЗ.З. Genes Dev., 19:804-814. Shi Y, Lan R., Matson C., Mulligan P, Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., and Shi Y, 2004. Histone demethylation medi- ated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953. Sullivan B.A. and Karpen G.H., 2004. Centromeric chromatin exhibits a histone modification pattern that is distinct from both euchromatin and heterochromatin. Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 1076-1083. Suto R.K., Clarkson M.J., Tremethick D.J., and Luger K., 2000. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nat. Struct. Biol. 7: 1121-1124. Talbert P.B., Bryson T.D., and Henikoff S., 2004. Adaptive evolution of centromere proteins in plants and animals. J. Biol. 3: 18. Waterborg J.H., 1993. Dynamic methylation of alfalfa histone H3. J. Biol. Chem. 268: 4918-4921. Weiler K.S. and Wakimoto B.T., 1995. Heterochromatin and gene expression in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 29: 577-605. Wieland G., Orthaus S., Ohndorf S., Diekmann S., and Hemmerich P, 2004. Functional complementation of human centromere protein A (CENP-A) by Cse4p from Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. Biol. 24: 6620-6630. Witt O., Albig W, and Doenecke D., 1996. Testis-specific expression of a novel human H3 histone gene. Exp. Cell Res. 229: 301 -306. Wolffe A.P., 1992. Chromatin: Structure andfunction. Academic Press, San Diego.
ГЛАВА 14 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ХРОМОСОМНОГО НАСЛЕДОВАНИЯ Gary Н. Karen1 и R. Scott Hawley2 1 Lawrence Berkeley National Laboratory, Department of Genome Biology, University of California at Berkeley Department of Molecular and Cell Biology, Berkeley, California 94720 2Stower Institute for Medical Research, Kansas City, Missouri 64110 and Department of Phisiology, University of Kansas Medical Center, Kansas City, Missouri 66160 Содержание Общее резюме 1. Введение 1.1. Как осуществляется хромосомная наслед- ственность? 1.2. Какие элементы требуются для хромосомной наследственности? 2. Эпигенетическая регуляция репликации ДНК, репарации и теломер 2.1. Инициация репликации ДНК контролируется эпигенетическими механизмами 2.2. Репарация ДНК включает эпигенетические изменения в структуре хроматина 2.3. Эпигенетический контроль структуры и функ- ции теломер 3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функ- ции центромер 3.1. Структура и функция центромеры у разных эукариот 3.2. Центромерные последовательности не яв- ляются необходимыми или достаточными для формирования и функционирования кинетохора 3.3. Необычный состав центромерного хроматина 3.4. Модели структуры , функции и воспроизве- дения центромеры 3.5. Эпигенетика и эволюция центромер 4. Гетерохроматин и мейотическое спаривание / расхождение 4.1. Обнаружение сайта гетерохроматинового спаривания у самцов Drosophila 4.2. Спаривание гетерохроматина облегчает рас- хождение у самок Drosophila 4.3. Роль центромеры в облегчении ахиазмати- ческой сегрегации у почкующихся дрожжей 4.4. Ассоциированный с гетерохроматином локус Ph1 у кукурузы и его роль в опосредовании гомологичного versus негомологичного спа- ривания 5. Гетерохроматин и мейотический драйв 5.1. Нарушитель сегрегации (Segregation Dis- torter) у самцов Drosophila 5.2. Утеря отцовской хромосомы у Sciara и кар- тирование реагирующего элемента 5.3. Утеря отцовских хромосом у Nasonia 5.4. Вздутие 10 у кукурузы — роль последователь- ностей, соответствующих гетерохроматино-
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования вым «вздутиям», в облегчении расхождения хромосом в мейозе I 6. Сайленсинг генов неспаренными ДНК в мейозе 6.1. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК в мейозе у Neurospora 6.2. Сайленсинг асинапсных хромосом у мыши 6.3. Дисфункция половой хромосомы у Droso- phila 7. Перспективы и выводы Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Удвоение и передача генетической информации выпол- няются двумя типами клеточного деления, митозом и мейозом, которые оба являются фундаментальными для жизни и эволюции. Митоз — это ядерное деление, про- исходящее в соматических клетках, включающее иден- тичное разделение в дочерние клетки дуплицированного генетического материала в форме хромосом. Мейоз — это редукционное ядерное деление, происходящее только в зародышевых клетках многоклеточных организмов или на определенных стадиях жизненного цикла однокле- точных, чтобы произвести клетки с гаплоидным геномом перед оплодотворением (или конъюгацией у некоторых эукариот). Аномальная репликация или репарация ДНК приводит к мутациям и хромосомным перестройкам. Вероятно, более важно, что неправильная сегрегация хромосом в ходе ядерного деления вызывает утерю или приобретение целых хромосом (анеуплоидия). Эти типы «геномной нестабильности» влияют на жизнеспособ- ность клеток и фертильность эукариот. Более того, они играют ключевую роль в этиологии врожденных дефек- тов и рака у человека. Ранние исследования позволяли предполагать, что нуклеотидная последовательность ДНК играет преобла- дающую роль в определении сайтов и функций хромо- сомных элементов, необходимых для собственно митоза и мейоза, таких как «ориджины» репликации ДНК, сай- ты прикрепления веретена (центромеры и кинетохоры), концы хромосом (теломеры) и сайты мейотического спа- ривания. Однако в последнее десятилетие мы пришли к пониманию того, что эпигенетические механизмы могут регулировать многие ключевые функции, необходимые для стабильности генома наследования хромосом. К ним относятся роли в инициации репликации ДНК, репара- ции и рекомбинации ДНК, защиты концов хромосом (те- ломеры), движения хромосом (центромеры) и сегрегации гомологичных хромосом в мейозе. На первый взгляд, эпи- генетическая регуляция оказывается в противоречии с тем фактом, что эти хромосомные функции существенны для изменчивости клеток и организмов, что означает, что они должны быть «зашиты» в нуклеотидной последователь- ности ДНК. Однако при взгляде сквозь «очки эволюции» эпигенетическая «пластичность» хромосом в ходе митоза и мейоза оказывается важной для компенсации тех типов изменений нуклеотидной последовательности и хромо- сомных перестроек. которые связаны с видообразованием. Понимание молекулярных основ эпигенетического регу- лирования наследственности является фундаментальным для выяснения этих основных биологических процессов и для диагностики и лечения болезней человека. 1. Введение 1.1. Как осуществляется хромосомная наследственность? Митоз является основным типом клеточного деления, который производит идентичные, диплоидные дочерние клетки и используется соматическими клетками и пре- мейотическими зародышевыми клетками (рис. 14.1а). В митотическом клеточном цикле выделяют четыре фазы, называемые G1 (gap 1, стадия «покоя» после митоза), S (synthesis — репликация ДНК и экспрессия генов), G2 (gap 2, «покой» после S, подготовка к митозу) и М (mitosis, со- стоящий из профазы, метафазы, анафазы и телофазы). Во время S-фазы ДНК реплицируется, и дуплицированные сестринские хроматиды удерживаются вместе за счет установления когезии. В начале митоза хромосомы кон- денсируются, а гистон НЗ становится фосфорилированным по Ser-10 (H3S10ph) (глава 10). Кроме того, у большинства организмов единичный сайт (центромера) на каждый се- стринской хроматиде формирует структуру, называемую кинетохором, которая опосредует прикрепление микро- трубочки веретена и служит в качестве «контрольной точки» (checkpoint) клеточного цикла (рис. 14.1а). В прометафазе пары сестринских хроматид собираются в метафазную пластинку и в анафазе расходятся к полюсам. Эти движения совершаются как за счет активности связанных с кинетохо- ром микротрубочковых моторов (кинезинов и динеинов) и регуляции сборки и разборки микротрубочек, а также требуют разрушения когезии сестринских хроматид при переходе из метафазы к анафазе. Мейоз происходит только в зародышевых клетках и характеризуется одним раундом репликации, за кото- рым следуют два деления (мейоз 1 и II, рис. 14.16); это дает гаплоидные яйцеклетки в женской зародышевой линии и гаплоидные спермин в мужской зародышевой линии многоклеточных животных, а не диплоидные до- черние клетки. В мейозе I реплицированные гомологи спариваются и расходятся вместе. Сестринские хрома- тиды каждого гомолога не расходятся друг с другом до мейоза II. Для нормальной сегрегации во время мейоза требуется частая рекомбинация между гомологами, а также специальная когезия в центромерном районе, ко- торая обеспечивает ассоциацию сестринских хроматид во время мейоза I (Watanabe, 2005). 1.2. Какие элементы требуются для хромосомной наследственности? И митотические, и меиотические клеточные деления нуждаются в активности специфических хромосомных
a DAPI CEN ТУБУЛЛи S-ФАЗА МИТОЗ Репликация Конденсация Когезия Конгрессия Утрата когезии Расхождение б ПРЕМЕЙОТИЧЕСКАЯ S-ФАЗА ПРОФАЗА МЕЙОЗА I Репликация Конденсация *..................Конденсация- Когезия Начало Спаривание Завершение рекомбинации и синапс рекомбинации Рис. 14.1. Стадии митоза и мейоза (а) Микрофотографии клеток Drosophila показывают поведение хромосом (синий цвет, описание см. ниже), микротрубочек (зеленый цвет) и центромер (красный цвет) в интерфазе и митозе, (б) Поведение хромосом показано для профазы мейоза I у кукурузы; это стадия, на которой происходят спаривание гомологов, синапсис и рекомбинация (микрофотографии предоставлены Hank Bass и Shaun Murphy, Университет штата Флорида). Ключевые функции хромосом на каждой стадии показаны внизу (синим шриф- том). Впоследствии, в анафазе мейоза 1, гомологи расходятся к противоположным полюсам, завершая редукционное деление. Сестринские хроматиды разделяются лишь во время мейоза II (рис. 14.9) элементов и связывающихся белков для выполнения точной дупликации генома и расхождения хромосом (рис. 14.2). Репликация ДНК начинается в «ориджинах» [точках начала репликации], которые у большинства эукариот не строго зависят от нуклеотидной последо- вательности (обсуждается в разделе 2 этой главы). В митотически делящихся клетках сцепление сестринских хроматид становится затем видимым по всей длине этих хроматид, хотя в перицентромерном гетерохроматине концентрация когезинов более высокая. Центромеры — это большие участки, состоящие из ДНК и специальных белков хроматина, которые служат в качестве фундамента для формирования кинетохора и играют ключевую роль в прикреплении веретена и нормальной сегерегации мейо- тических и митотических хромосом (обсуждается в разделе 3 этой главы). У большинства эукариот имеется одна и только одна центромера на хромосому. Утрата центромеры приводит к нарушениям в прикреплении веретена и к уте- ре хромосом, а присутствие более чем одной центромеры ведет к прикреплению одной и той же хроматиды к обоим полюсам, что вызывает образование хромосомных мостов и фрагментацию в анафазе. Изредка организмы (напри- мер, круглый червь Caenorhabditis elegans) содержат «по- лицентрические». или «голоцентрические» хромосомы, в которых кинетохоры присутствуют во многих районах (см., например, рис. 13.5). Такие хромосомы используют специальные механизмы для обеспечения прикрепления и расхождения сестринских хроматид к противоположным полюсам. Теломеры — это специализированные хрома- тиновые структуры, находящиеся на концах хромосом для защиты их от деградации или рекомбинации и для обеспечения полной дупликации ДНК. Для мейотиче- ской сегрегации требуются также центромеры, теломеры, сцепление (когезия) и «ориджины» репликации. Однако для обеспечения спаривания гомологов и их расхождения в мейозе I необходимы некоторые дополнительные эле- менты и изменение поведения центромер (обсуждется в разделе 4 этой главы). Точка начала Теломера (origin) Центромера Перицентромерный Рис. 14.2. Элементы хромосомной наследствен- ности Диаграмма показывает элементы хромосомы, существенные для нормальной дупликации («ориджины» репликации) и наследования (центромеры, сцепление, теломеры) в митозе и мейозе. Для нормального расхождения хромо- сом в мейозе требуются также сайты спарива- ния гомологов (не показаны) и, в большинстве случаев, рекомбинация
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования Сама природа хромосомной наследственности пред- полагает, что спецификация и локализация элементов наследственности должны быть «зашиты» в нуклео- тидной последовательности ДНК. Поэтому вызывает удивление, что многие элементы, в том числе пере- численные в этом разделе, вместо этого регулируются эпигенетически, особенно у многоклеточных эукариот Говоря коротко, элементами, предрасположенными к эпигенетической регуляции для обеспечения надеж- ной хромосомной наследственности, являются «орид- жины» репликации ДНК, теломеры, сайты сцепления (когезии) сестринских хроматид и сайты спаривания гомологов. 2. Эпигенетическая регуляция репликации ДНК, репарации и теломер Первым этапом в обеспечении наследования генетиче- ской информации является надежная дупликация всего генома, которая осуществляется процессом, известным как репликация ДНК. К сожалению, в ходе репликации происходят ошибки, вызывая изменения в ДНК (мута- ции), которые могут быть вредными для жизнеспособно- сти организма. Кроме того, такие агенты внешней среды, как радиация, производят мутации, в том числе измене- ния оснований в ДНК, делеции, инсерции (вставки) и перестройки. Клетки реагируют на повреждение ДНК активацией механизмов репарации ДНК, выполняющих удивительную работу по поддержанию надежности и ста- бильности генома. Наконец, дупликация линейных мо- лекул ДНК ставит задачи, которые решаются наличием специализированных последовательностей и структур на концах хромосомы, известных как теломеры. Недавние исследования показали, что на эти базовые процессы, необходимые для точного удвоения и поддержания ну- клеотидных последовательностей ДНК, влияют эпиге- нетические механизмы, регулирующие хроматин. 2.1. Инициация репликации ДНК контролируется эпигенетическими механизмами Надежное копирование ДНК осуществляется ДНК- полимеразами, действующими от 5’- к З’-концу, и начи- нается в специфических сайтах, называемых «ориджина- ми» [точками начала репликации ДНК]. В «ориджинах» образуется «пузырь», состоящий из двух репликационных «вилок», и репликация идет в двух направлениях, пока не встречаются «вилки», генерируемые следующими «ориджинами». Домены, реплицируемые с одного «орид- жина», обычно очень большие, длиной в сотни тысяч пар оснований (Aladjem and Fanning, 2004). «Ориджины» у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (известные также как ARSs — autonomously replicating sequences, автономно реплицирующиеся последовательности) функциони- руют эктопически, будучи клонированы в плазмиды, и обычно после интеграции в другие хромосомные сай- ты, показывая тем самым, что инициация репликации регулируется специфическими последовательностями нуклеотидов ДНК. ARSs имеют величину приблизитель- но 100—150 п.н. и содержат одну или несколько копий важной последовательности длиной приблизительно 11 п.н. и обогащенной АТ плюс другие консервативные элементы (Weireich et al., 2004). Для инициации не- обходим белковый комплекс, известный как комплекс распознавания «ориджинов» (ORC, origin recognition complex), который отвечает за рекрутирование пред- репликационного комплекса (PRC, prereplication com- plex), включающего белки поддержания минихромосом (МСМ, minichromosome maintenance proteins) (Prasanth et al., 2004). У многоклеточных «ориджины» реплика- ции можно идентифицировать in situ, но обычно после клонирования и реинтродукции они не активны, что по- зволяет предполагать, что у этих организмов инициация регулируется эпигенетически, а не строгой зависимостью от последовательности ДНК (Aladjem and Fanning, 2004). Хотя у многоклеточных белки ORC и МСМ консерватив- ны, факторы и механизмы, ответственные за регуляцию активности «ориджинов» у этих организмов, остаются загадкой. Кроме того, неясно, влияет ли структура хро- матина на работу репликационных «вилок». Ключ к тому, каким образом «ориджины» многокле- точных могли бы регулироваться эпигенетически, дают детальные исследования на S. cerevisiae. Хотя нуклеотид- ные последовательности ДНК в «ориджинах» необхо- димы и, по большей части, достаточны для инициации репликации у этого организма, имеются четкие данные о влиянии структуры хроматина на активность «орид- жинов» (Weinreich et al., 2004). Анализ с использовани- ем микрочипов (microarray analysis) показал, что не все из 332 сайтов двунаправленной репликации или из 429 сайтов связывания белков ORC и МСМ активны в каж- дом клеточном цикле. Хромосомный контекст и струк- тура хроматина влияют на способность предполагаемого «ориджина» быть активным в инициации репликации. Например, ARS, локализованная в «молчащих» локусах типа спаривания, не может инициировать репликацию, если не будет перемещена в другие места хромосомы. Другой пример эпигенетической регуляции «ориджинов» относится к приблизительно 100—200 генам, кодирую- щим рибосомную РНК (rDNA), которые расположены в виде тандемных повторов (Pasero et al., 2002). Каждая единица rDNA длиной 9.1 т.п.н. содержит ARS, которая инициирует репликацию, будучи вставлена в плазмиду или в другое место генома. Однако в каждой S-фазе ак- тивны лишь около 20 % «ориджинов» rDNA. «Ориджины» могут также регулироваться таким обра- зом, что будут работать [to fire] на разных стадиях S-фазы (Weinreich et al., 2004). Например, «ориджины» возле те- ломер обычно активны в поздней S-фазе (см. раздел 2.3 далее в этой главе), но вставка тех же самых последова- тельностей в кольцевые плазмиды приводит к реплика- ции в ранней S-фазе (рис. 14.3) (Ferguson and Fangman, 1992) Поздняя репликация может рекапитулировать в результате линеаризации такой плазмиды и добавления теломер, что помещает ARSs вблизи концов. Эти результаты показывают, что как активность «ориджинов», так и время начала работы «ориджина»
2. Эпигенетическая регуляция репликации ДНК, репарации и теломер Рано Поздно реплицирующаяся реплицирующаяся Рис. 14.3. Эпигенетическая регуляция сроков репликации у дрожжей Один из лучших примеров эпигенетических влияний на репликации был продемонстрирован у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вставка поздно реплицирующегося «ориджина» в кольцевую плазмиду приводит к ранней репликации в S-фазе, а поздняя ре- пликация восстанавливается после линеаризации этой плазмиды и добавления теломер (Ferguson and Fangman, 1992; Weinreich etaL, 2004) в ходе S-фазы регулируются эпигенетически. Дальней- шие доказательства вытекают из наблюдений, согласно которым «расписание» S-фазы, сайленсинг «ориджи- нов» в rDNA, теломеры и локусы типа спаривания ре- гулируются многими из модификаций гистонов и бел- ками, отвечающими за эпигенетический сайленсинг генов, в том числе белками SIR (глава 4). 2.2. Репарация ДНК включает эпигенетические изменения в структуре хроматина Накопление повреждений ДНК из-за ошибок реплика- ции или воздействия внешними агентами может при- водить к вредным мутациям, нестабильности генома, раку, старению клеток и смерти. Повреждения ДНК исправляются механизмами исправления ошибок в ходе репликации ДНК, а также независимыми механизмами, действующими в фазе G2. Клетки содержат «контрольные точки» («checkpoints»), выявляющие наличие повреж- дений ДНК и останавливающие или задерживающие клеточный цикл до тех пор, пока не завершится репа- рация; эти механизмы индуцируют также гибель клет- ки (апоптоз), если повреждение не исправляется, что способствует выживаемости организма за счет удаления дефектных клеток. Эти процессы в норме весьма эффек- тивны; например, клетки кожи человека, подвергнутые УФ-облучению солнечного света, содержат удивительно большое количество повреждений ДНК, подавляющее большинство которых должным образом вылечиваются (Friedberg et al., 1995). Индивидуумы, дефектные по ре- парации в силу мутаций в одном или нескольких компо- нентах механизмов «контрольной точки» или репарации, страдают от целого ряда заболеваний, в том числе пред- расположенностью к раку прямой кишки, груди и кожи и подвержены преждевременному старению. В ранних исследованиях были успешно идентифи- цированы молекулы и механизмы, распознающие раз- ные типы повреждений в ДНК, такие как двунитевые разрывы (DSBs) и пиримидиновые димеры, и рекрути- рующие специфические комплексы для исправления этих повреждений. Однако упаковка ДНК в хроматин могла бы потенциально блокировать доступ факторов, участвующих в распознавании сайтов повреждения или осуществляющих репарцию, подобно репрессивному влиянию гетерохроматина на экспрессию генов (Hassa and Hottiger, 2005). Однако репарация использует АТФ- зависимые комплексы ремоделинга хроматина, кото- рые, как предполагается, «экспонируют» дефектную ДНК для репарации Более недавние исследования показали, что специ- фические изменения в хроматиновой матрице, такие как присутствие вариантов гистонов и посттрансляци- онные модификации гистонов, играют ключевую роль в распознавании повреждений ДНК и в рекрутировании соответствующих механизмов репарации (Hassa and Hottiger, 2005). Например, присутствие DSBs имеет сво- им результатом быстрое фосфорилирование варианта гистона Н2А, Н2АХ, по серинам 136 и 139 (обозначает- ся уН2АХ). Фосфорилирование Н2АХ необходимо для накопления белков репарации в больших (мегабазы) районах, окружающих DBSs, и для сборки «фокусов» репарации, а не для первоначального рекрутирования репарационных комплексов к первичным сайтам по- вреждения ДНК (Bassing et al., 2002; Celeste et al., 2002). Эти наблюдения позволяют предполагать, что «рас- пространение» уН2АХ из DBSs действует для усиления сигнала, исходящего из DBSs, увеличивая рекрутирова- ние и, возможно, сохранение факторов репарации (Fer- nandez-Capetillo et al., 2004). В дополнение к участию в репарации DBSs фосфорилирование Н2АХ влияет на рекомбинацию V(D)J в лимфоцитах млекопитающих, а также действует как супрессор геномной нестабиль- ности и опухолей у мышей (Fernandez-Capetillo et al., 2004). Другие типы изменений хроматина, такие как аце- тилирование гистонов, БиМОилирование, убиквити- нирование и метилирование, также играют заметную роль в успешной репарации ДНК. Например, метили- рование гистона НЗ по лизину 79 (НЗК79те) необхо- димо для рекрутирования к DSBs белка репарационной «контрольной точки» 53ВР1 и опосредуется DOT1- метилтрансферазой лизинов гистонов (НКМТ) (Huyen et al., 2004). Интересно, что индуцированные поврежде- ния ДНК не изменяют уровни метилирования НЗК79, позволяя предполагать, что эта модификация не добав- ляется в ответ на DSBs Одна из возможностей заклю- чается в том, что рекрутирование 53ВР1 и «ощущение»
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования («sensing») DSBs связано с экспозицией предсушеству- ющего метилирования НЗК79 в ответ на ремоделинг хроматина в сайтах повреждений ДНК. Хотя наше современное понимание влияния этих и других факторов хроматина на репарацию ДНК пред- полагает участие в сигналинге и рекрутировании соот- ветствующих комплексов к повреждениям ДНК, впол- не вероятно, что будущие исследования выявят новые направления, по которым эпигенетические механизмы регулируют пути, поддерживающие стабильность гено- ма. Важно отметить, что роль хроматина в репарации ДНК является динамической и происходит в ответ на повреждение Хотя модификации гистонов и другие эпигенетические регуляторные белки играют ключевые роли, эти изменения не наследуются при клеточном делении, в отличие от других примеров, обсуждаемых в этой главе. 2.3. Эпигенетический контроль структуры и функции теломер Концы линейных эукариотических хромосом являются специализированными сайтами, известными как те- ломеры; они выполняют три существенные функции. Во-первых, теломеры обеспечивают включение самых дистальных концов хромосом в репликацию ДНК, решая тем самым «проблему репликации концов» (Lue, 2004). Во-вторых, теломеры защищают концы хромосом от де- градации и подавляют слияния с другими хромосомами. В-третьих, у многих, но не у всех, организмов теломеры облегчают спаривание хромосом в мейозе. У большин- ства эукариот теломеры состоят из простых, коротких повторов, которые восстанавливаются ферментом тело- меразой. Теломерные функции регулируются как меха- низмами на основе нуклеотидных последовательностей, так и эпигенетическими механизмами Проблема репликации концов возникает в связи с тем, что ДНК-полимеразе требуется праймер для ини- циации синтеза в направлении 5’ к 3’ «отстающей нити»; следствием этой ограниченной активности фермента оказывается тот факт, что репликация не может прохо- дить до самого конца хромосомы (Lue, 2004). Для пре- одоления этой проблемы используются два механизма. Преобладающий механизм, используемый большин- ством организмов, в том числе дрожжами, млекопита- ющими и растениями, включает необычный фермента- тивный комплекс, известный как теломераза. Теломеры у большинства эукариот состоят из простых повторов длиной 6 п.н., распространяющихся на расстояние от десятков до сотен тысяч пар оснований. Теломеразные комплексы содержат энзиматическую активность, по- добную обратной транскриптазе, а также РНК, обла- дающими гомологией с теломерными повторами. Суть дела состоит в том, что репликация конца выполняется путем «нацеливания» этого комплекса на теломерные повторы с помощью РНК-компонента; за этим следует обратная транскрипция (3’ к 5’), производящая новые повторы. Интересно, что утрата теломеразной активно- сти и укороченные теломеры коррелируют с клеточным дряхлением и старением и, наоборот, раковые клетки обнаруживают повышенную теломеразную активность и удлиненные теломеры (Blasco, 2005). Существуют также независящие от теломеразы ме- ханизмы поддержания хромосомных концов (Louis and \brshinin, 2005). Одна хорошо изученная альтернативная система, по-видимому, ограничена дрозофилой и други- ми двукрылыми. У этих организмов теломераза не иден- тифицируется, а концы не содержат простых, коротких повторов, обнаруживаемых у большинства других эука- риот. Вместо этого концы хромосом Drosophila состоят из перетасованных кластеров различных ретротранспозонов типа non-LTR (LTR — длинный терминальный повтор), размеры которых варьируют от 3 до 5 т.п.н., и других по- второв (TAS — telomere-associated repeats) (Biessmann and mason, 2003). Эти транспозоны кодируют ферменты типа обратной транскриптазы (отсюда re/rotransposon), позво- ляя предполагать, что здесь имеется эволюционное род- ство с более стандартными теломеразными механизма- ми. Основное различие, однако, заключается в том, что хромосомы Drosophila не реплицируются до самого кон- ца; они теряют примерно 70 п.н. на мушиное поколение, т.е. примерно то самое количество, которое ожидается в связи с проблемой репликации концов. Эта утрата не вы- бывает делеции существенных генов, потому что домены теломерных и субтеломерных повторов имеют длину около 50—100 т.п.н., и потребовалось бы много поколе- ний, чтобы потерялось достаточное количество ДНК и были достигнуты участки с генами. Эта утеря теломер- ных последовательностей компенсируется, однако, не- частым добавлением ретротранспозонов типа non-LTR (Biessmann and Mason, 2003). Эпигенетическая регуляция затрагивает функции те- ломер и экспрессию генов, находящихся в этом районе «Голая» теломерная ДНК или внутренние DSBs приво- дят к хромосомным слияниям и анеуплоидии. Барбара МакКлинток (Barbara McClintock) первой описала явле- ние, известное как цикл «разрыв-слияние-мостик», в ко- тором слияния между разорванными хромосомами или слияния концов хромосом производят дицентрические хромосомы и анафазные мосты, которые генерируют дальнейшие разрывы. Доказательства эпигенетической регуляции теломерной защиты концов хромосом выте- кает из исследований на Drosophila, показавших, что она не зависит от нуклеотидных последовательностей ДНК. Оторванный конец хромосомы у Drosophila может ве- сти себя как DSB в одном поколении, но действует как полностью функциональная теломера впоследствии, без какого-либо добавления ретротранспозонов или каких- либо изменений последовательности (Ahmad and Golic, 1998). Более того, любой конец, созданный у Drosophila (известно как терминальные делеции), может быть упа- кован как теломера и защищен от событий слияния (Karpen and Spradling, 1992). Кроме того, у Schizosaccha- romyces pombe теломерные функции зависят от белка Tazl (Miller and Cooper, 2003) и теломерного хроматина, и эта зависимость не связана с каноническими теломерными повторами (Sadaie et al., 2003). Теломерные районы содержат модификации хро- матина и обладают свойствами, сходными с перицен- тромерным гетерохроматином, описанным в разделе
3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функции центромер 3 далее в этой главе. Характеристика эпигенетических механизмов, регулирующих теломерные и субтеломер- ные районы, была получена в исследованиях экспрес- сии генов у дрожжей и Drosophila, но наблюдается также у человека Сайленсинг эухроматиновых генов, встав- ленных в теломерные районы, варьирует. Это явление называется теломерным эффектом положения (ТРЕ, te- lomere position effect); оно похоже на эффект положения мозаичного типа (PEV, position-effect variegation), инду- цируемый соседним центромерным гетерохроматином у мух и S. pombe (детали см. в главах 5 и 6, соответствен- но). У почкующихся дрожжей многие факторы, связан- ные с хроматином, такие как белки SIR, влияющие на сайленсинг типа спаривания, влияют также на сайлен- синг, индуцируемый теломерой (глава 4). Удивитель- но, что почти ни один из генов, регулирующих PEV у Drosophila (Супрессоры и Энхансеры Мозаицизма, Su(var) s и E(var)s, описанные в главе 5), никак не влияет на те- ломерный сайленсинг. Это заставляет предположить, что PEV и ТРЕ опосредованы, по крайней мере отчасти, разными механизмами (Cryderman et al., 1999; Donald- son et al., 2002). Гетерохроматиновый белок 1 (HP1, продукт гена Su(var)) и метилирвание НЗК9, которые являются клю- чевыми компонентами сайленсинга, опосредованного хроматином (глава 8), присутствуют в теломерах Droso- phila и необходимы для удлинения теломер (рис. 14.4) (Perrini et al., 2004). Результатом делеции НР1 или его партнера по связыванию НОАР (сокращение для НР1/ ORC-associated protein) оказывается очень высокая ча- стота теломерных слияний (Cenci et al., 2003). НР1 обыч- но рекрутируется к хроматину благодаря своему сродству к метилированному НЗК9 через хромодомен. Интерес- но, что кэпирование теломеры белком НР1 не зависит от метилирования НЗК9; это позволяет предполагать, что защита концов опосредуется альтернативным механиз- мом, в котором участвует прямое связывание с теломер- ной ДНК или нетеломерными последовательностями, присутствующими в терминальных делециях (рис. 14.4а) (Perrini et al., 2004). Одна из привлекательных моделей сводится к тому, что НР1 связывается и защищает концы независимо от нуклеотидной последовательности ДНК, затем рекрутирует неизвестную НКМТ НЗК9; локальное метилирование НЗК9 могло бы затем рекрутировать к этому участку большие количества НР1, что стимулирует распространение теломерного сайленсинга (рис. 14.4). Этот механизм, вероятно, не требует средств RNAi, уча- ствующих в установлении и сайленсинге центромерного гетерохроматина (глава 8), но этот компонент модели нуждается в прямой проверке. Недавние исследования показали, что у млекопи- тающих зависимое от теломеразы удлинение теломеры также регулируется эпигенетически (Lai et al., 2005). Например, мыши с делецией обеих копий HKMTs НЗК9. Suvar39hl/2, имеют теломеры с редуцированны- ми уровнями НЗК9те2 и НЗК9теЗ и демонстрируют аномально длинные теломеры (рис. 14.46) (Garcia-Cao et al., 2004). Эти результаты позволяют предполагать, что активность НКМТ Suvar39hl/2 превращает моди- фикацию НЗК9те в ди- и триметилированные формы, облегчая связывание гомологов НР1, СЬх 3 и 5, которые необходимы для сборки нормальной структуры тело- мерного хроматина и регуляции длины теломер. Наконец, эпигенетические модификации, проис- ходящие в теломерах, влияют также и на мейотическую рекомбинацию и передачу хромосом. Например, у поч- кующихся дрожжей утрата Ndjl, теломерного белка, необходимого как для формирования теломерного бу- кета (т.е. образования кластера), так и для мейотиче- ской рекомбинации (Wu and Burgess, 2006), приводит к резкой редукции частоты теломерных делеций (Jo- seph et al., 2005). Джозеф и сотрудники предполагают, что Ndj 1 облегчает теломерную делецию, «стимулируя взаимодействия теломер в ходе мейоза, что приводит к эффективному увеличению содержания факторов, не- обходимых для делеции» Аналогичным образом, му- танты, дефектные по транскрипционному сайленсингу генов, помещенных поблизости от теломер, демонстри- руют серьезные нарушения в мейотическом спарива- нии и рекомбинации, что приводит к неправильной агрегации во время мейоза (Nimmo et al., 1998). Таким образом, эпигенетические события, которые контроли- руют как длину теломер, так и транскрипционную ком- петентность, используются также в процессах, контро- лирующих поведение хромосом в ходе мейоза. 3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функции центромер Для нормального наследования генетического материала требуется, чтобы после того как геном точно дуплици- ровался и репарировался в S-фазе, хромосомы надежно расходились во время митоза и мейоза. Центромеры были впервые определены в 1880 году Флемингом (Flemming) как цитологически видимая «первичная» перетяжка в хро- мосоме. В начале 1900-х годов центромеры были определе- ны и генетически как хромосомные сайты, существенные для нормального наследования, и как участки с резко сниженной или даже вовсе отсутствующей мейотиче- ской рекомбинацией. В настоящее время мы определяем центромеру (CEN) как ДНК плюс белки хроматина, от- ветственные за формирование кинетохора. Кинетохор — это белковая структура, облегчающая прикрепление микротрубочек и движение вдоль них, обращенная к пластинке во время прометафазы и к полюсам во время анафазы митоза и мейоза. Кинетохор служит также местом действия ключевой для клеточного цикла «контрольной точки», известной как «контрольная точка сборки верете- на» (SAC, spindle assembly checkpoint), или «митотическая контрольная точка» (Cleveland et al., 2003). Ключевой вопрос для организмов с моноцентриче- скими хромосомами сводится к тому, каким образом один и только один сайт на хромосому ассоциируется с функцией центромеры (известной как «идентичность центромеры» — «centromere identity»). Здесь мы пред- ставим доказательства того, что у большинства эука- риот идентичность и воспроизведение центромеры регулируются эпигенетически посредством структуры
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования DROSOPHILA «»»» б МЛЕКОПИТАЮЩИЕ УВЕЛИЧЕННАЯ ДЛИНА ТЕЛОМЕР НР1 рекрутирует НКМТ, три метилирует НЗК9 Mi Опосредованное Suv39h метилирование НЗК9те2 и теЗ Хромодомен НР1 связывается сНЗК9теЗ Образование G-квартета Рис. 14.4. У мух и млекопитающих функции теломер регулируются эпигенетически (а) У Drosophila гетерохроматиновый белок 1 (НР1) связывается с теломерной ДНК независимо от ее хромодомена и «кэпирует» теломеры, что обеспечивает нормальное расхождение благодаря блокировке теломерных слияний (Fanti et al. 1998; Perrini et al. 2004). Затем HP1 рекрутирует неизвестную метилтрансферазу гистонов (НКМТ; не Su(var)3-9), которая триметилирует НЗК9 на близлежащих нуклеосомах; НР1 связывается с НЗК9теЗ через хромодомен, что, в свою очередь, рекрутирует большие количества НКМТ, а последовательные раунды связывания НР1 — рекрутирования НКМТ стимулируют распространение «молчащего» хрома- тина по субтеломерным районам. (6) У мышей нокаут обоих локусов НКМТ Suv39 понижает уровни НЗК9теЗ и те2 и увеличивает содержание модификаций НЗК9те, измененной структуры хроматина и изменений в уровнях белков, связывающихся с ди- и триметилированными НЗК9 (X СЬх 3 и 5), H3K9me (Т Cbx 1) и TERF 1 и 2 (не показано) в теломерах (Garcia-Cao et al. 2004). Эти изменения коррелируют с увеличенной длиной теломер, позволяя предполагать, что триметилирование НЗК9 с помощью Suv39hs необходимо для нормального функционирования теломеразы и регуляции размера теломер хроматина, а не специфическими нуклеотидными по- следовательностями ДНК (Carroll and Straight, 2006). Сводка этих ключевых данных включает следующие положения: (1) центромерные последовательности не являются консервативными даже у близкородственных видов и даже у хромосом одного какого-нибудь вида, (2) центромерная ДНК не является необходимой или достаточной для формирования кинетохора и (3) пози- ционирование центромеры на хромосоме обнаруживает удивительную пластичность в ходе эволюции. 3.1. Структура и функция центромеры у разных эукариот Исследования, проведенные на дрожжах S. cerevisiae в 1980-е годы, привели к первому клонированию и ана-
3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функции центромер лизу эукариотной центромеры Было показано, что структура размером 125 п.н., присутствующая на всех 16 хромосомах S. cerevisiae, необходима и достаточна для нормального функционирования центромеры (Bloom et al., 1989); даже однонуклеотидные изменения в высококонсервативных элементах I и III приводили к полной утрате функции. Таким образом, идентичность и воспроизведение центромеры у этого одноклеточного эукариотического организма определяются нуклеотид- ной последовательностью ДНК. Надежда на то, что аналогичные механизмы, бази- рующиеся на нуклеотидной последовательности, могли бы регулировать идентичность центромеры у других эу- кариот, впервые была развеяна исследованиями на дру- гом «простом» эукариотическом организме, S. pombe. Центромерные последовательности у этих дробянко- вых дрожжей структурно более крупные и более слож- ные, чем у S. cerevisiae (Clarke et al., 1986; Nakaseko et al., 1987). Негомологичные последовательности «централь- ного кора» длиной 4—5 т.п.н., являющиеся сайтами формирования кинетохора, фланкированы инвертиро- ванными повторами различных классов, общими для трех хромосом. Минимум 25 т.п.н., содержащие непо- вторяющийся центральный кор, внутренние повторы и часть внешних повторов, абсолютно необходимы для функционирования центромеры и стабильной переда- чи хромосом (Baum et al., 1994). Достаточная центро- мерная функция наблюдается для трансфицированных плазмидных конструктов, несущих центральный кор плюс внутренние повторы (т.е. центральный домен) и два фланкирующих внешних повтора. Интересно, что делеция внутренних повторов нарушает расхождение сестринских хроматид в мейозе, демонстрируя тем са- мым, что центромерные районы играют роль в процес- сах, отличающихся от сборки кинетохора. Действитель- но, и кинетохор, и домены когезии тесно сцеплены и важны для правильного расхождения хромосом. Хотя центромерные районы у многоклеточных эука- риот даже больше и более сложные, чем у S. pombe (сот- ни или тысячи тысяч пар оснований повторяющихся ДНК), общая организация и функционирование цен- тромер дробянковых дрожжей послужили превосхо- дной моделью центромер у млекопитающих, растений и насекомых. Центромеры у этих организмов заключе- ны в крупные гетерохроматиновые блоки, присутству- ющие на каждой хромосоме, которые преимуществен- но состоят из сателлитных ДНК (простые, короткие повторы) и транспозонов. Эти центромерные районы составлены из субдоменов, отвечающих за различные функции, прежде всего за формирование кинетохора и сестринскую когезию. Центромерные последователь- ности, однако, не консервативны у эукариот или даже у разных хромосом отдельного вида. Именно эпигенети- ческий состав функциональных субдоменов центроме- ры демонстрирует консерватизм, особенно по составу гистоновых вариантов и паттернам модификаций ги- стонов, которые, по-видимому, регулируются эпигене- тически У нематоды С. elegans и у других видов голоцентри- ческие хромосомы рекрутируют и собирают центромер- ные белки по всей длине хромосомы (Demburg, 2001). Специфические для червя последовательности не явля- ются, очевидно, необходимыми, поскольку конкатеме- ры лямбда и ДНК многих других типов стабильно пере- даются. Белки рекрутируются «пакетами» [«bundles»] в профазе, но к метафазе распределяются ровным слоем на обращенной к полюсу поверхности хромосомных плеч, заставляя предполагать, что многие области гено- ма С. elegans могут поддерживать сборку кинетохора в эпигенетическом режиме. Несмотря на очевидные раз- личия с моноцентрическими хромосомами, возможно, что организационные и структурные атрибуты, такие как ЗП-спирализация или выпетливание ДНК CEN, являют- ся консервативными (см. раздел 3.3 далее в этой главе). 3.2. Центромерные последовательности не являются необходимыми или достаточными для формирования и функционирования кинетохора Большая величина и сложность центромерных после- довательностей у многоклеточных эукариот сделали затруднительным анализ потребностей в нуклеотидной последовательности ДНК с помощью определенных конструктов, столь успешно использовавшихся в иссле- дованиях на дрожжах. Тем не менее, путем трансфекции клеток культуры ткани набором сателлитных ДНК были созданы с низкой частотой искусственные хромосомы человека (HACs), но они обнаружили высокий уровень митотической нестабильности (Rudd et al., 2003). Мы знаем, однако, что HACs образованы путем конкатеме- ризации введенных наборов сателлитов, и тем не менее некоторые альфа-сателлитные наборы не могут форми- ровать сентромеры de novo, что заставляет предположить потребность в множественных, неизвестных этапах или факторах. Более недавние исследования показали, что уникальные свойства и компоненты центромерного хроматина (как объясняется в разделе 3.3 далее в этой главе) имеются в HACs как в сателлитных наборах, так и в нецентромерных последовательностях (например, последовательностях плазмидного вектора и селектируе- мого маркера) (Lam et al., 2006). Таким образом, остается все еще неясным, насколько специфические последова- тельности ДНК достаточны для сборки и поддержания функциональных центромер человека. Первое указание на то, что идентичность и воспро- изведение центромер регулируются эпигенетически, было получено в исследованиях «минимальных» цен- тромерных конструктций у S. pombe (Steiner and Clarke, 1994). Небольшая доля трансформантов, полученных с помощью конструктов, обнаруживала переключение с редуцированной центромерной функции к высо- ко «активному» центромерному функционированию (0,6 % клеток), что впоследствии могло воспроизво- диться в линии на протяжении многих поколений. Таким образом, одни и те же нуклеотидные последо- вательности ДНК могут демонстрировать два функцио- нально различных, наследуемых состояния, аналогич- но наблюдениям эпигенетических влияний на генную экспрессию при PEV (глава 5) или ТРЕ (глава 4).
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования Другие наблюдения заставляют предполагать глав- ную роль эпигенетических механизмов в детерминации идентичности центромер и формировании кинетохоров у многоклеточных эукариот. Во-первых, нуклеотидные последовательности ДНК, в норме ассоциированные с центромерами, не достаточны для функционирования. Например, только подгруппа гетерохроматиновых са- теллитных последовательностей мыши и человека свя- зана с центромерной функцией (Lam et al., 2006). Кроме того, в функциональных хромосомах с двумя участками центромерных сателлитов (дицентрики), наблюдае- мых у мух и у человека, один из этих участков теряет способность формировать кинетохор (Sullivan and Wil- lard, 1998). Во-вторых, центромерные последователь- ности не являются необходимыми для формирования кинетохора, поскольку нецентромерная ДНК может приобретать и надежно воспроизводить центромерную функцию благодаря процессу, известному как «форми- рование неоцентромеры» (рис. 14.5а). У человека были идентифицированы многочисленные функциональные неоцентромеры, и анализ нуклеотидной последователь- ности показал, что эти новые районы формирования кинетохоров не приобрели сателлитных ДНК. Однако участки, фланкирующие новый кинетохор, приобрели эпигенетические свойства, сравнимые с соответствую- щими районами в эндогенных центромерах (т.е. пери- центрическом хроматине), такими как метилирование НЗЛ9 и связывание НР1 (Lo et al., 2001). Хотя механизм формирования неоцентромер у чело- века не известен, в модельной системе неоцентромеры были созданы экспериментально. У Drosophila неопентро- меры получаются из минихромосом, когда помещаются рядом нецентромерная ДНК и эндогенная центромера (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001) Таким образом, у Drosophila для активации неоцентромеры требуется бли- зость к функциональной центромере, заставляя предпо- лагать, что одним из механизмов приобретения центро- меры является распространение центромерных белков в сА-кон фигурации на соседние, нецентромерные участ- ки. Коль скоро это распространение произошло, цен- тромерная функция затем воспроизводится в этом новом сайте эпигенетически. Интересно, что формирование неоцентромеры подавляется, когда между эндогенной центромерой и участком формирования неоцентромеры присутствует гетерохроматин, заставляя предполагать, что в определении величины центромеры играют роль дополнительные эпигенетические механизмы. Наконец, признаком эволюции являются хромосом- ные перестройки. Эти изменения сопровождаются при- обретением, утратой и перемещениями центромер по отношению к нуклеотидным последовательностям гено- ма (Ferreri et al., 2005). Такую пластичность легче всего объяснить, если идентичность центромеры определяется эпигенетически, как это описано в разделе 3.5. 3.3. Необычный состав центромерного хроматина Данные об эпигенетическом регулировании центро- мерной идентичности и воспроизведении указывают a Drosophila • Теломера О Центромера ) Кинетохор О Неоцентромера Рис. 14.5. Формирование неоцентромер у человека и мух (а) Хромосомы человека, несущие неоцентромеры, которые демон- стрируют центромерную функцию и формирование кинтетохора в отсутствие центромерной ДНК, обычно связаны с крупными пере- стройками (Amor and Choo, 2002). В этом примере происходящая от хромосомы 10 неоцентромера (mar(del)lO), структура которой указывает на формирование посредством большой интерстициаль- ной делеции. удалившей эндогенную центромеру (серые пунктирные линий). Mar(del) 10 была открыта у индивидуума, в кариотипе кото- рого была также кольцевая хромосома (ring(del)lO, не показана), содержавшая ДНК из делегированного участка Последовательность событий для неоцентромер человека неясна; формирование неоцен- тромеры могло бы происходить вначале, давая дицентрическую хромосому, которая впоследствии подвергается перестройкам, или же формирование неоцентромеры могло бы происходить после делеции эндогенной центромеры, (б) У мух неоцентромеры могут создаваться экспериментально из минихромосомы, охарактеризо- ванной на молекулярном уровне. Фрагмент эухроматина величиной 320 т.п.н. и теломерный хроматин, не содержащий центромерной ДНК. можно отделить от остальной минихромосомы, используя об- лучение. Этот фрагмент, которыйдолжен бы быть «ацентрическим», может стать функциональной неоцентромерой, которая надежно воспроизводится в митозе и мейозе и содержит белки центромеры и кинетохора, в норме ограниченные эндогенной центромерой (Blower and Karpen, 2001). Однако для формирования неоцентромеры требуется близость к эндогенной неоцентромере (420 т.п.н.), как в инверсионном деривате у238; более того, формирование неоцен- тромеры не происходит по обе стороны от центромеры, когда при- сутствует перицентрический гетерохроматин (Maggert and Karpen, 2001) Эти результаты заставляют предполагать, что формирование неоцентромеры происходит через эпигенетическое распростране- ние центромерного хроматина в соседний эухроматин. за которым следует эпигенетическое воспроизведение центромерной идентич- ности и функции. Блокирование этого процесса гетерохроматином согласуется с наблюдением, что сверхэкспрессированная CENP-A включается эктопически в эухроматин. но не в гетерохроматин (Heun et al. 2006), и позволяет предполагать, что протяженность центромерного хроматина определяется двумя эпигенетическими процессами: загрузкой и распространением CENP-A и формиро- ванием — блокированием гетерохроматина
3. Эпигенетическая регуляиия идентичности и функиии центромер на вероятность того, что ключевыми детерминантами являются структура и состав хроматина, а не первичные последовательности ДНК. Здесь мы обсудим различные компоненты и структуры, обнаруживаемые в хроматине CEN, а также удивительное наблюдение, показывающее, что эти свойства консервативны у далеко отстоящих друг от друга эукариот. У всех эукариот в центромерных нуклеосомах при- сутствуют специфичные для центромер белки семей- ства CENP-A, подобные гистону НЗ (рис. 14.6а). Они служат и структурной, и функциональной основой для кинетохора и являются превосходными кандидатами на роль эпигенетической метки, устанавливающей и вос- производящей центромерную идентичность (Cleveland et al., 2003). В отличие от большинства белков кинетохо- ров, собирающихся во время митоза, CENP-A присут- ствует в центромерах на протяжении всего клеточного цикла, что является одним из первых указаний на его важность для центромерной идентичности. У дрожжей, червей, мух и млекопитающих хроматин, содержащий CENP-A, обеспечивает также основу, существенную для рекрутирования белков кинетохора, прикрепления веретена и нормального расхождения хромосом (Car- roll and Straight, 2006). Эксперименты по реципрокному эпистазу показали, что CENP-A является первым бел- ком на пути сборки кинетохора, что согласуется с его физической локализацией в хроматине в основании кинетохора в митотических хромосомах. Дальнейшие доказательства важности CENP-A для формирования кинетохора вытекают из опытов по сверхэкспрессии у мух, в которых неправильная локализация CENP-A в нецентромерных районах производит функциональные эктопические кинетохоры (Heun et al., 2006). Поэтому, коль скоро этот вариант гистона существен для центро- мерной функции, мы в настоящее время определяем CEN-хроматин как район ДНК и белков, связанных с CENP-A. Структура нуклеосом, содержащих CENP-A. нео- бычна по сравнению с каноническими гистоновыми корами, содержащими НЗ, Н2А, Н2В и Н4. Нуклео- сомы CENP-A можно собрать in vitro из очищенного CENP-A и гистонов Н2А, Н2В и Н4, что согласуется с предыдущими наблюдениями, показывающими, что in vivo они гомотипичны (т.е.содержат две копии CENP- А, а не одну копию НЗ и одну копию CENP-A) (Yoda et al., 2000). Детальный биофизический анализ показал, что интерфейс между CENP-A и Н4 отличается от ин- терфейса НЗ—Н4, и домен, взаимодействующий с Н4 достаточен для «нацеливания» CENP-A на центромеры в присутствии эндогенного CENP-A (Black et al., 2004). Замещение гистона НЗ белком CENP-A в центро- мерных нуклеосомах первоначально позволяло думать, что CENP-A составляет весь хроматин, связанный с кинетохором. У S. pombe CENP-A равномерно распре- делен по центральным коровым участкам величиной 5—7 т.п.н. Эти коры фланкируются крупными гетеро- хроматиновыми доменами, содержащими метилирова- ние НЗК9 и белки гетерохроматина (Pidoux and Allshire, 2004). Однако детальный цитологический анализ и ис- следования с использованием иммунопреципитации обнаружили, что у многоклеточных эукариот центро- мерный хроматин имеет более сложный состав и ор- ганизацию. Центромеры Drosophila, человека и риса содержат перемежающиеся блоки нуклеосом, содержа- щих НЗ и CENP-A (в совокупности называемые CEN- хроматином), фланкированные еще более крупными блоками (от тысяч до миллионов пар нуклеотидов) пе- рицентромерного гетерохроматина (рис. 14.66) (Blower et al., 2002; Yan et al., 2005). Чередование [interspersion] доменов НЗ и CENP-A ставит ключевые вопросы относительно эпигенетиче- ской природы CEN-хроматина. В частности, модифи- цированы ли субдомены НЗ в CEN-хроматине много- клеточных эукариот подобно гетерохроматину или эухроматину? Или же они маркированы уникальным образом? Далее, эквивалентна ли каждая перемежаю- щаяся единица CENP-A/НЗ в более крупных эукарио- тических центромерах единичной центромере S. ротЬеЧ К этим вопросам обратились, изучая посттрансляци- онные модификации, характеризующие перемежаю- щиеся блоки нуклеосом НЗ и CENP-A и обнаружившие еще большую сложность. Удивительно, что у человека и а б CENP-A DNA эухроматин CENP-A НЗ центромерный хроматин перицентромерный гетерохроматин «- ......--........-М-.......» 0.2-1.5 млн.н. многие млн.н. Рис. 14.6. Организация центромерного хроматина (a) CENP-A является высококонсервативным, специфичным для центромер вариантом гистона. Рисунок показывает его ло- кализацию исключительно в центромерах в митотических хромосомах Drosophila (б) CEN-хроматин у мух и человека содержит перемежающиеся блоки содержащих НЗ и содержащих CENP-A нуклеосом и фланкирован перицентромерным гетерохроматином (Blower et al. 2002)
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования мух перемежающиеся домены НЗ содержат НЗК9те2 — метку, обычно ассоциированную с эухроматином — и, более того, не имеют НЗК9те2 и НЗК9теЗ, ассоцииро- ванных с фланкирующим гетерохроматином (рис. 14.7а) (Sullivan and Karpen, 2004; Lam et al., 2006). Однако, как и в гетерохроматине, в перемежающихся нуклеосомах НЗ отсутствовали множественные формы ацетилиро- вания НЗ и Н4, как отсутствовал и НЗК4те 3. Таким образом, нуклеосомы НЗ в CEN-хроматине обнаружи- вают паттерн модификаций, отличающийся от канони- ческих эухроматина или гетерохроматина (рис. 14.76). Эти результаты наводят также на мысль, что центросо- мы мух и человека не составлены просто из повторяю- щихся S. pombe-подобных центромер. Важно, однако, отметить, что общая организация центромерных райо- нов консервативна, так что у всех многоклеточных эу- кариот и у S. pombe весь хроматиновый домен CENP-A фланкируется перицентромерным гетерохроматином, содержащим метилирование НЗК9. Какова возможная функциональная роль модифика- ций гистонов в CEN и фланкирующем хроматине? От- дельные состояния хроматина в районе CEN, вероятно, вносят вклад в разнообразные свойства центромерных доменов, такие как установление сроков для диффе- ренциальной репликации CEN и фланкирующего ге- терохроматина (Sullivan and Karpen, 2001; Blower et al., 2002). Модификации фланкирующего перицентромер- ного гетерохроматина могут также поддерживать раз- меры центромер, создавая барьер против расширения CEN-хроматина. У Drosophila CEN-хроматин легко рас- пространяется на соседние последовательности, когда фланкирующий гетерохроматин удаляется, делая воз- можной активацию неоцентромеры (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001), а сверхэкспрессия CENP-A приводит к неправильной локализации в эухроматин, но не гетеро- хроматин (Heun et al., 2006). Интересно, что результатом сверхэкспрессии CENP-A в клетках человека является распространение CEN-хроматина и изменения в мети- лировании НЗК9 во фланкирующих участках (Lam et al, 2006). Таким образом, размеры центромер, по-видимому, определяются балансом между двумя эпигенетическими состояниями: CEN-хроматином и фланкирующим пе- рицентромерным гетерохроматином. Концентрация белков, необходимых для сцепления (когезии) сестринских хроматид, которое устанавлива- ется одновременно с репликацией ДНК в фазе S, выше всего в гетерохроматине, фланкирующем центромеру. Это распределение, по-видимому, вносит вклад в со- ответствующую двойную ориентацию кинетохоров в митозе, а также в поддержание сцепления во время Эухроматин Перицентромерный ^ENP-A гетерохроматин + НЗК4те2 НЗК4теЗ НЗК9те2 & 3 Ацетилирование НЗ и Н4 ? Когезиновые белки Когезин Рис. 14.7. Различные паттерны модификаций гистонов в центромерном хроматине (а) Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител, рас- познающих специфические модификации гистонов на расправленных хромосомных фибриллах, показал, что перемежающиеся блоки нуклео- сом, содержащих НЗ, обладают паттерном модификаций, отличающимся от канонических эухроматина и гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2004). Например, несмотря на то, что центромеры у большинства эука- риот погружены в крупные блоки перицентрического гетерохроматина, перемежающиеся блоки НЗ содержат модификацию НЗК9те2, в норме ассоциирующуюся с «открытым» эухроматином (наверху) и лишены гете- рохроматинового маркера НЗК9те2, присутствующей в перицентрических фланкирующих участках (внизу), (б) Сводка «двумерной» организации центромерного хроматина в интерфазе, основывающаяся на исследованиях растянутых фибрилл хроматина у мух и человека. + и — обозначают при- сутствие и отсутствие указанных модификаций гистонов (соответственно) в эухроматине, перицентромерном гетерохроматине и перемежающихся блоках нуклеосом НЗ в центромерном хроматине (Sullivan and Karpen 2004; Lam et al., 2006). (в) Модель трехмерной организации хроматина в центромерном районе митотических хромосом. Предполагается, что ассоциации между сходным образом модифицированными нуклеосо- мами вносят вклад в формирование отдельных трехмерных структур в центромерном и фланкирующем хроматине. Перемежающиеся CENP-A/ CID и по-разному модифицированные НЗ и Н4 могут опосредовать формирование «цилиндрических» трехмерных структур, наблюдаемых в метафазных хромосомах (Blower et al., 2002; Sullivan and Karpen, 2004). Хроматин H3K9me2, рекрутирующий такие белки гетерохроматина, как НР1, и такие белки когезии, как RAD21/SCC1, присутствует во внутрен- нем кинетохорном пространстве между митотическими сестринскими хроматидами и в участках, фланкирующих центромерный хроматин. Это расположение может быть необходимо для «презентации» CENP-A на- правленной к полюсу поверхности митотической хромосомы и облегчения рекрутирования внешних кинетохорных белков, а также для стимуляции взаимодействия НР1 с самим собой и правильной конденсации/когезии хромосом. Когезины изображены в виде кольцевидных структур в соот- ветствии с последними моделями
3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функции центромер метафазы несмотря на развиваемые веретеном силы, концентрирующиеся в кинетохорах/центромерах (Wa- tanabe, 2005). Эпигенетическое регулирование сцепле- ния включает рекрутирование когезинов белками НР1 (5wz6у S. pombe), которое, в свою очередь, опосредуется высокими концентрациями метилирования НЗК9 в пе- рицентромерном гетерохроматине (Nonaka et al., 2002). Таким образом, специфичные для CEN комбинации модификаций гистонов тоже могли бы быть важными для рекрутирования когезионных комплексов к гете- рохроматину вблизи сестринских кинетохоров, обеспе- чивая в то же время пространственное разделение коге- зионных и кинетохорных доменов (Sullivan and Karpen, 2004; см. также главу 6). В митотических хромосомах человека и Drosophila субдомены CENP-A сливаются, образуя трехмерную цилиндрическую структуру, в значительной мере ис- ключающую нуклеосомы НЗ (Blower et al., 2002). Бло- ки нуклеосом CENP-A ориентированы на поверхности хромосом, направленной к полюсам, а блоки нуклеосом НЗ локализованы по направлению к внутреннему райо- ну хроматид. Внутренние и внешние белки кинетохора обернуты вокруг цилиндра CENP-A; это трехмерное расположение согласуется с CENP-A, играющим цен- тральную роль в рекрутировании других кинетохорных белков (Blower et al., 2002). Для того чтобы согласовать двумерное чередование блоков CENP-Аи НЗ (рис. 14.66 и 14.76) с разделением в трехмерных митотических хро- мосомах, предположили, что CEN-ДНК может закручи- ваться спиралью или выпетливаться в цилиндрической структуре, приводя к выравниванию нуклеосом с одним и тем же составом по одной линии [alignment] или в стопку (рис. 14.7в). Таким образом, раздельно модифицирован- ные перемежающиеся нуклеосомы НЗ и фланкирующий гетерохроматин могли бы отвечать за сборку трехмерной структуры CEN-хроматина в митозе (Sullivan and Karpen, 2004). Такое расположение может быть необходимо, что- бы экспонировать хроматин CENP-A внешней стороне хромосомы, где он может рекрутировать кинетохорные белки таким образом, который устанавливает правиль- ную двойную ориентацию сестринских кинетохоров по отношению к полюсам веретена. 3.4. Модели структуры , функции и воспроизведения центромеры Ключевым вопросом, исследуемым в настоящее время, является вопрос о том, как CENP-A и другие эпигене- тические маркеры специфически локализуются и вос- производятся в центромерах. Другой подход к этому же вопросу заключается в том, чтобы рассмотреть, каким образом CENP-A собирается только в центрмерном хро- матине. Одна из привлекательных моделей предполагает, что включение CENP-A специфически в центромеры ре- гулируется дифференциальными сроками и репликации CEN-ДНК, и экспрессии CENP-A по сравнению с основ- ной массой хроматина (Ahmad and Heniloff, 2001). Однако репликация CEN-ДНК у человека и мух происходит на протяжении всей фазы S, одновременно с репликацией основной ДНК (Shelby et al., 2000; Sullivan and Karpen, 2001), а включение CENP-A происходит в отсутствие репликации ДНК (Shelby et al., 2000; Ahmad and Heniloff, 2001). Эти наблюдения исключают механизм строгой привязки ко времени репликации для воспроизведения CENP-A и центромерной идентичности. Более привлекательный механизм вытекает из ин- тригующего наблюдения, согласно которому CENP-A активно инкорпорируется в нуклеосомы не зависящим от репликации образом с помощью комплекса обмена гистонов (Shelby et al., 2000; Ahmad and Heniloff, 2001). НЗ.З является вариантом НЗ, сборка которого, не за- висящая от репликации (Ahmad and Heniloff, 2002), опосредуется комплексом, известным как регулятор гистонов A (HIRA), а не комплексами фактора сборки хроматина (CAF, chromatin assembly factor), ответствен- ными за зависимое от репликации включение канони- ческих нуклеосом НЗ (Nakatani et al., 2004). У 5. cerevisiae устранение компонентов HIRA приводит к неправиль- ной локализации CENP-A (Sharp et al., 2002). Однако в настоящее время неясно, влияют ли компоненты HIRA на центромерный хроматин у многоклеточных эукари- от или у S. pombe, где центромерная идентичность опре- деляется эпигенетически. Более важно, что эти белки играют роль в сборке и структуре хроматина, например путем откладки НЗ.З; таким образом, широкая актив- ность идентифицированных компонентов HIRA не объясняет специфичности включения CENP-A в цен- тромеры. Возможно, что некая подгруппа комплексов HIRA содержит факторы, взаимодействующие только с CENP-A и распознающие существующие нуклеосомы CENP-A в реплицированном хроматине CEN; однако никаких таких факторов специфичности идентифици- ровать не удалось. Один из способов согласовать уча- стие неспецифических факторов сборки — это предста- вить себе, что специфичность обеспечивается CENP-A или нуклеосомами CENP-A. Например, определенные структурные взаимоотношения между CENP-A и Н4 могли бы обеспечить специфичность сборки новой CENP-A в центромерах; на эту мысль наводит спо- собность взаимодействующего домена «нацеливать» CENP-A на центромеры (Black et al., 2004). Неясно, однако, достаточны ли эти домены для «нацеливания» центромер в отсутствие эндогенной CENP-A. Сейчас очевидно, что требуется по-новому пред- ставлять себе эпигенетическую регуляцию центромер- ной идентичности и воспроизведения. У S. cerevisiae ре- зультатом дефектов в протеолизе CENP-A оказывается неправильное включение в нецентромерные в норме районы, что в норме удаляется неизвестным механиз- мом «очищения» отовсюду, кроме эндогенной центро- меры (Collins et al., 2004). Это позволяет предполагать, что центромерная идентичность может регулироваться после сборки нуклеосом. Однако неправильная лока- лизация CENP-A у мух приводит к эктопическому фор- мированию кинетохора (Heun et al., 2006), заставляя предполагать, что удаление неправильно включенного CENP-A может быть специфичным для S. cerevisiae. Тем не менее, вариации такой модели «негативной специфичности» стоит рассмотреть. Ключевой вопрос для всех моделей центромерной идентичности заклю-
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования чается в следующем: что обеспечивает специфичность? В данном случае, почему такие белки, как CENP-A, должны сохраняться только в одном сайте? Одна новая идея возникает в связи с тем фактом, что стабильная ас- социация с веретеном является тем свойством, которое уникально для функциональных центромер, кинетохо- ров (Mellone and Allshire, 2003). Таким образом, воспро- изведение центромеры и сайт включения CENP-A мо- гут определяться в ходе митоза, с помощью механизма, чувствующего продуктивные прикрепления кинетохора и веретена, или опосредованное веретеном натяжение. Другая идея, которую стоит рассмотреть, заключает- ся в том, что паттерн модификации перемежающихся нуклеосом НЗ белками, модифицирующими гистоны (т.е. ацетилтрансферазами, метилтрансферазами и ки- назами), может помогать воспроизводить центромер- ную идентичность вместо ассоциированных с CENP-A белков (или в дополнение к ним) (Sullivan and Karpen, 2004). По-разному модифицированные перемежающи- еся субдомены НЗ (рис. 14.7) могли бы создавать «пер- миссивную» структуру хроматина, необходимую для сборки новой CENP-A. Идентификация факторов, требующихся для поме- щения CENP-A в центромеры, независимо от конкрет- ной модели, является стратегией, которая, вероятно, обеспечит новое понимание. Биохимические и гене- тические исследования позволили идентифицировать некоторые из них как влияющие на сигналы CENP-A в центромерах, включая ранее известные факторы, уча- ствующие в не зависящей от хроматина сборке хромати- на. Однако ни один из идентифицированных до сих пор факторов не взаимодействует специфическим образом с CENP-A или другими белками центромерного хрома- тина или модификациями. Тем не менее, удивительно, что факторы все же идентифицируются, и должно скоро последовать выяснение специфических механизмов. 3.5. Эпигенетика и эволюция центромер При том значении, которое центромеры имеют для клетки и жизнеспособности организма, не может быть и речи о приобретении или утрате центромерной функции Тогда почему же центромеры используют эпигенетиче- ские механизмы регуляции, если существенным преиму- ществом для отдельной клетки и организма в целом было бы иметь центромеры «зашитыми» в первичную нуклеотидную последовательность ДНК? Можно возразить, что эпигенетическая регуляция центромерной идентичности необходима для подгон- ки к изменениям, происходящим в ходе эволюции с хромосомами, нуклеотидными последовательностями и белками. Исследования на млекопитающих (напри- мер, приматах и сумчатых), насекомых и организмах других таксонов показали, что приобретение и утрата центромер являются характерными событиями в эво- люции хромосом (Ferreri et al., 2005). Родственные виды часто различаются расположением и ассоциацией хро- мосомных плеч, даже в тех случаях, когда нуклеотид- ные последовательности ДНК почти идентичны. Эти приобретения и утраты центромер часто сопровождают транслокации и другие перестройки и, вероятно, под- держиваются ими. Например, потребность в одной, и только в одной, центромере делала бы многие из полу- чающихся в результате дицентрических и ацентрических хромосомных перестроек бесполезными, если бы цен- тромеры не могли инактивироваться, а неоцентромеры— активироваться (рис. 14.8а). Таким образом, способ- ность перемещать центромеры из одной нуклеотидной последовательности ДНК в другую путем распростра- нения, перескакивания или активации может ускорять эволюцию хромосом. Кроме того, в ходе эволюции в высокоповторяющихся сателлитных последователь- ностях очень часто происходят наращивания, сокра- щения и замены оснований и они могут быть связаны с изменениями в локализации центромер (рис. 14.86). Центромеры растений в особенности демонстрируют в ходе эволюции быстрые и значительные изменения в нуклеотидных последовательностях ДНК и в локализа- ции (Hall et al., 2006). Неясно, однако, вызывают ли из- менения ДНК перемещения центромер, или они про- исходят в ответ на перемещения центромер, или же и те и другие полностью независимы. Тем не менее, должен существовать механизм поддержания функции и вос- произведения центромер, не зависимый от изменений нуклеотидных последовательностей, и такой механизм обеспечивает эпигенетическая регуляция. Сравнение аминокислотных последовательностей у центромерных белков разных видов привело к пред- положению, что домены, связанные с CEN-ДНК, «коэ- волюируют», чтобы приспособиться к изменениям в сателлитных последовательностях (Malik and Henikoff, 2002; см. также главу 13). Интересный компонент этой модели предполагает, что эти изменения стимулиру- ются «мейотическим драйвом» — явлением аллельно- го отбора (а по умолчанию, отбора целой хромосомы), происходящего во время мейоза. Так, центромера, об- ладающая самым высоким сродством к белкам CEN- хроматина, достигает наибольшего успеха во вклю- чении в функциональные зародышевые клетки (т.е. в ооцит, а не в полярное тельце в случае женского мейоза) (см. другие примеры мейотического драйва в разделе 5). Это, в свою очередь, могло бы принуждать другие цен- тромеры к тому, чтобы приспосабливаться к тем же ва- риантам нуклеотидных последовательностей и белков, чтобы эффективно расходиться. Утрата такой эпигенетической метки, как CENP-A, дает другой механизм для инактивации центромеры без делеции центромерной ДНК, как показывают послед- ствия обеднения CENP-A у многочисленных организ- мов (Cleveland et al., 2003). Идентификация механизмов приобретения центромеры является большим вызовом, поскольку она требует приобретения эпигенетической метки в отсутствие изменений в нуклеотидных после- довательностях ДНК. Исследования экспериментально индуцированных центромер у мух позволяют предпо- ложить один такой молекулярный механизм для при- обретения центромеры — за счет с/я-распространения таких ключевых белков центромерного хроматина, как CENP-A (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001). Од- нако эта модель не может объяснить формирование
4. Гетерохроматин и меиотическое спаривание/расхождение < Теломера « ' ™™РаМ^ЫИ1 Повторяющиеся ^Центромера Кинетохор к в гетерохроматин ц к к к |||| Микротрубочки Рис. 14.8. Эволюция хромосом и эпигенетическая регуляция центромерной идентичности Пластичность центромер в отношении ассоциации со специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК может быть нужна для приспособления к тем изменениям нуклеотидных последовательностей и хромосомным перестройкам, которые про- исходят в ходе эволюции, (а) Транслокации, часто наблюдаемые в ходе эволюции, могут создавать ацентрические и дицентри- ческие хромосомы; и те, и другие в норме теряются при митотических или мейотических делениях Эпигенетическая регуляция и пластичность позволяют ацентрическим фрагментам приобрести неоцентромерную функцию, так же как инактивация одной центромеры в дицентрической хромосоме, что приводит к нормальному наследованию обоих продуктов транслокации (В.Р. = точки разрывов при транслокации). (6) У большинства эукариот центромеры погружены в гетерохроматин и повторяющиеся ДНК, особенно в высокоповторяющиеся сателлитные последовательности. В ходе эволюции эти последовательности изменяются с огромной частотой и претерпевают частые замены оснований, а также приращения и сокращения. Строгая зависимость центро- мерной идентичности от специфических нуклеотидных последовательностей ДНК приводила бы к утрате функций центромеры и кинетохора и к пагубной потере хромосомы. Напротив, эпигенетическая регуляция идентичности и локализации центромеры обеспечивает механизм поддержания центромер несмотря на изменения нуклеотидных последовательностей неоцентромер у человека или большинство примеров приобретения центромеры в эволюции, которое может происходить на больших расстояниях от родительской центромеры. Возможно, механизм, более соответству- ющий этим случаям приобретения центромеры, вклю- чает неправильную локализацию CENP-A в ответ на преходящую сверхэкспрессию, приводя к формирова- нию эктопических кинетохоров, как это наблюдали в опытах на мухах (Heun et al., 2006). Сверхэкспрессию CENP-A наблюдали в опухолях прямой кишки и груди, заставляя предполагать потенциальную связь с массив- ной нестабильностью генома, наблюдаемую при раке. Для прямой проверки этой гипотезы, а также ее роли в эволюции центромер необходимы дальнейшие ис- следования преобладания неправильной локализации CENP-A в различных типах рака у человека и сроков этой неправильной локализации в ходе инициации и прогрессии рака. Наконец, первые центромеры могли бы быть пред- ставлены голоцентрическими хромосомами; формиро- вание кинетохоров могло бы вначале развиваться со слу- чайной специфичностью в отношении нуклеотидной последовательности, за чем могла следовать эволюция моноцентрических хромосом, возникающих благодаря инвазии транспозонов, экспансии сателлитной ДНК и формированию фланкирующего гетерохроматина. Однако возможно также, что голоцентрические хромо- сомы развились из моноцентрических хромосом благо- даря утрате гетерохроматиновых граничных элементов и czs-распространению центромерного хроматина, при- мерно так же, как это происходит при возникновении неоцентромер у Drosophila (Maggert and Karpen, 2001). 4. Гетерохроматин и меиотическое спаривание / расхождение Меотический процесс у большинства организмов охва- тывает (1) спаривание, которое выравнивает гомологи относительно друг друга; (2) синапсис, которое соединяет гомологи структурой, известной как синаптонемный комплекс (SC); (3) рекомбинацию, которая физически сцепляет гомологичные хромосомы и осуществляет обмен генетической информацией; (4) расхождение го- мологов к противоположным полюсам в мейозе I и (5) разделение сестринских хроматид в мейозе II (рис. 14.9). Такие гетерохроматиновые элементы, как центромеры и теломеры, играют важную роль в контроле положения рекомбинационных событий в эухроматине; и наверняка гетерохроматиновые элементы (в особенности центроме- ра) играют критическую роль в расхождении Более того,
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования Мейоз I Мейоз II Профаза (внутри ядерной оболочки) Рекомбинация (связь) Расхождение гомологов (утрата эухроматиновой когезии) Расхождение сестринских хроматид (утрата центромерной когезии) Спаривание (сравнение) Рис. 14.9. Механистическое представление мейотического процесса Пара гомологичных хромосом во время первого мейотического деления должна совершить три вещи. Во-первых, гомологи должны спариться по всей своей длине. Практически у всех организмов кульминацией этого спаривания является интимная ассоциация, при которой эти гомологи соединены вдоль всей своей длины синаптонемным комплексом. Это состояние называется синапсисом. Во-вторых, практически у всех организмов гомологичные хромосомы соединяются вместе рекомбинацией, называемой также кроссинговером. События обмена (кроссоверы) формируют структуры, называемые хиазмами, которые физически соединяют хромосомы друг с другом посредством сестринской хроматиды, представленной на каждом гомологе на обеих сторонах кроссо- верного события. Как спаривание, так и рекомбинация происходят во время профазы (до разрушения ядерной оболочки). Третье важное событие, расхождение (сегрегация), происходит на MI-веретене, которое создается после разрушения ядерной оболочки. В ходе ранних стадий сборки веретена (прометафаза) хромосомы собираются вместе и образуют метафазную пластинку. У боль- шинства животных самцы содержат центриолярные мейотические веретена, тогда как у самок большинства животных веретено ацентриолярно. В этом случае сами хромосомы образуют массу, на месте которой в конечном счете формируется метафазная пла- стинка, и организуют вокруг нее биполярное веретено. Коль скоро хромосомы должным образом совместно ориентированы (т.е. уравновешены в метафазной пластинке гомологичными кинетохорами, прикрепленными к противоположным полюсам веретена), ряд механизмов включают начало анафазы. В анафазе соединение (когезия) сестринских хроматид ослабляется вдоль плеч (но не возле центромер). Это растворяет связи, называемые хиазмами и созданные кроссоверами, и таким образом дает гомологам воз- можность разделиться и отойти к противоположным полюсам в анафазе I. Мейоз II в основе своей является гаплоидным митозом, который происходит и без репликации, и без рекомбинации многочисленные недавние исследования убедительно свидетельствуют, что модификации гистонов и, воз- можно, другие эпигенетические компоненты и процессы играют критическую роль в облегчении мейотического процесса. Например, белок HIM-17 у С. elegans. который нужен для метилирования НЗК9, необходим для форми- рования DSBs, инициирующих рекомбинацию (Reddy and Villeneuve, 2004). Аналогичным образом, для инициа- ции DSBs у S. pombe требуется киназа гистонов (Ogino et al., 2006). Метилирование гистонов также необходимо чтобы сделать мейотические хромосомы компетентными к завершению мейотических делений у Drosophila (Cullen et al., 2005; Ivanovska et al., 2005) и млекопитающих (De La Fuente, 2006). Хотя использование рекомбинации для обеспечения расхождения мейотических хромосом является почти универсальным, существуют также мейотические си- стемы, в которых ассоциации гомологов могут устанав- ливаться без рекомбинации (т.е. так называемые ахиаз- матические мейотические системы). В таких системах гетерохроматиновые спаривания и, возможно, другие субстраты для эпигенетических модификаций оказыва- ются играющими критическую роль. Это в особенности верно в отношении самок и самцов Drosophila melano- gaster, но может быть верным и по отношению к дрож- жам. Наконец, известны многие системы мейотическо- го драйва — например, благоприятствование одной из аллелей в ходе мейотической сегрегации, — в которых модификация специфических гетерохроматиновых элементов вызывает или делает возможной последую- щую утрату инактивации специфической хромосомы или целого хромосомного набора. 4.1. Обнаружение сайта гетерохроматинового спаривания у самцов Drosophila Первым доказательством существования гетерохроматино- вого элемента, опосредующего спаривание и расхождение гомологов, была идентификация структур в перицентро- мерном гетерохроматине, опосредующих спаривание и расхождение ахиазматических пар половых хромосом в сперматогенезе у самцов Drosophila. Было показано, что эти структуры, известные как коллохоры, соответствую! повторам рДНК; было показано, что интеграция генов рДНК в лишенные коллохоров Х-хромосомы восстанав-
4. Гетерохроматин и мейотическое спаривание/расхождение ливает спаривание Х-Y в сайте вставки рДНК (McKee, 1998). Ключевым сегментом повтора рДНК в отношении спаривания является повторяющаяся последовательность длиной 240 п.о. в межгенном спейсере. Когда эта после- довательность в 240 п.о. присутствует во многих копиях, она облегчает спаривание и последующее расхождение хромосом X и Y в мейозе у самцов Drosophila. Хотя степень, с которой гетерохроматиновые ассоциации в сперматоцитах Drosophila облегчают эухроматиновое спаривание, остается открытым вопросом, ниже мы обсудим ряд наблюдений, позволяющих предполагать, что неспособность опосредо- вать или поддерживать спаривание приводит, оказывается, к неправильной активации или инактивации гетерохро- матина. Результатом такого события часто оказываются нарушения сперматогенеза (McKee, 1998). 4.2. Спаривание гетерохроматина облегчает расхождение у самок Drosophila Имеются два главных механизма для обеспечения рас- хождения (сегрегации) гомологов у самок Drosophila', си- стема хиазм, которая опосредует расхождение гомологов, которые подверглись кроссинговеру, и ахиазматическая система, которая обеспечивает расхождене тех пар гомо- логов. которые не претерпели кроссинговер. Например, мелкие точечные четвертые хромосомы никогда не пре- терпевают кроссинговер, и тем не менее они расходятся друг с другом во время мейоза с очень высокой степенью надежности. Цитологические и генетические экспери- менты показали, что для ахиазматического спаривания и расхождения необходим гетерохроматин. Спаривание гомологичных гетерохроматиновых участков ахиазмати- ческих хромосом поддерживается начиная с ранней про- фазы и до того момента, когда ахиазматические гомологи начинают отделяться от своих партнеров в прометафазе I (рис. 10) (Dernburg et al., 1996). Более того, опыты с использованием делеций показали, что гомологичная ахиазматическая сегрегация у Drosophila полностью за- висит от гетерохроматиновых гомологий (Hawley et al., 1993; Karpen et al., 1996). Все еще неясно, является ли способность опосредовать эти события спаривания и расхождения общим свойством гетерохроматиновых по- следовательностей или белков хроматина или же резуль- татом ряда специфических участков, диспергированных в гетерохроматине. 4.3. Роль центромеры в облегчении ахиазматической сегрегации у почкующихся дрожжей Хотя фланкирующие гетерохроматиновые районы, по- видимому, достаточны для того, чтобы опосредовать ахиазматическую сегрегацию у самок Drosophila, кажется вероятным, что у почкующихся дрожжей одни только центромерные последовательности могут быть способны играть эту роль. Дин Даусон (Dean Dawson) и его сотруд- ники проанализировали мейоз у дрожжей, несущих пару гомеологичных (т.е. частично гомологичных) хромосом, происходящих от разных видов дрожжей (Kemp et al., 2004). Несмотря на тот факт, что эти хромосомы несут сходные наборы генов, они дивергировали в достаточной степени, чтобы между ними не происходил кроссинго- вер; тем не менее, они надежно расходились. Хотя плечи этих гомеологичных хромосом соединяются друг с другом во время профазы мейоза не чаще, чем плечи гетероло- гичных хромосом. эти гомеологичные хромосомы, тем не менее, обнаруживают высокую степень центромерного Профаза w* Гетерохроматин — Эухроматин Рис. 14.10. У самок Drosophila melanogaster имеются два механизма обеспечения расхождения гомологов Верхний ряд изображений повторяет канонический процесс, как он показан на рис. 14.9. Нижний ряд описывает мейотический процесс у самок Drosophila, у которых необычная диплотена. При каноническом мейозе диплотена (иногда называемая «диплотена— диакинез») определяется как последняя стадия в профазе, на которой гомологи отталкиваются друг от друга и удерживаются вместе лишь хиазмами. Однако у самок Drosophila в конце профазы отталкиваются (или разделяются) лишь эухроматиновые плечи хромосом; гетерохроматиновые районы остаются тесно спаренными даже позже конца профазы (разрушения ядерной оболочки) и вплоть до прометафазы (Demburg et al., 1996). Как обсуждается в тексте, это спаривание гетерохроматина и необходимо, и до- статочно для обеспечения надежной сегрегации в отсутствие кроссинговера (Hawley et al., 1993; Karpen et al., 1996) Диплотена
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования спаривания (Kemp et al., 2004). Более того, это спари- вание уменьшается в присутствии третьей безобменной хромосомы, даже если она несет другой центромерный участок; это заставляет предполагать, что центромерное спаривание действительно является независимым от по- следовательности . Если для центромерного спаривания не требуется гомология последовательностей, почему тогда расхо- ждение гомеологичных хромосом у дрожжей является неслучайным? Кемп и сотрудники (Kemp et al., 2004) предполагают, что «Именно обмен и следующий за обменом синапсис помещают гомологичные центро- меры рядом и блокируют случайное спаривание цен- тромер». Согласно этой модели, центромеры могли бы первоначально спариваться полностью независи- мым от последовательности образом. По мере того как плечи гомологичных хромосом претерпевают обмены, их центромеры «выдергиваются» из потенциально не- гомологичных ассоциаций и принуждаются к гомоло- гичным спариваниям. Центромеры, оставляемые таким зависимым от обменов ресортингом как «синглеты», могут затем свободно реассоциироваться с другими не- спаренными центромерами, приводя в конечном счете к сприванию центромер тех хромосом, которые по тем или иным причинам не обменивались. В то время как Кемп и сотрудники приводят в качестве аналогии про- грессивное формирование пар из более привлекатель- ных танцоров на школьной танцевальной вечеринке, что, по умолчанию, заставляет менее привлекательных становиться партнерами по танцам, более формальный взгляд на этот процесс был описан Род ой Грелль (Rhoda Grell) десятилетия тому назад. Она предположила, что коль скоро обменные спаривания произошли, имею- щиеся в наличии хромосомы были бы свободны для реассоциации (Grell, 1976). Действительно, недавние исследования показали, что во время мейоза все дрож- жевые центромеры негомологично ассоциированы и подвергаются процессу ресортинга, соединяющего в пары гомологичные центромеры после рекомбинации (Tsubouchi and Roeder, 2005). В совокупности эти исследования свидетельствуют о том, что независимое от последовательности узнава- ние центромерных районов играет важную роль в соз- дании хромосомных ассоциаций в раннем мейозе. В то время как эти связи могут часто соединять негомоло- гичные хромосомы, негомологичные ассоциации могут корректироваться физическими связями между гомо- логичными хромосомами, создаваемыми при обменах. Механизм, посредством которого такие обмены, проис- ходящие на больших расстояниях от самих центромер, могут облегчать такую центромерную пересортировку, остается неясным. Однако соблазнительно по крайней мере высказать предположение, что «соединение» хиазм (физического выражения события обмена) с центроме- рами могло бы быть одной из функций синаптонемно- го комплекса (SC). В соответствии с такой моделью, SC служил бы для сообщения двум гомологичным центро- мерам о том, что хиазма действительно сформирована, индуцируя таким образом ее совместную ориентацию задолго до разрушения ядерной оболочки. 4.4. Ассоциированный с гетерохроматином локус Ph1 у кукурузы и его роль в опосредовании гомологичного versus негомологичного спаривания У пшеницы правильное спаривание гомологичных хро- мосом и предотвращение гомеологичных спариваний опосредуются локусом Phi (Griffiths et al., 2006). В от- сутствие гена Phi спаривание и обмен между гомеоло- гичными хромосомами становятся частыми (Luo et al., 1996) и уменьшается надежность как мейотического, так и митотического спаривания. Значение неправильного спаривания центромер в терминах более беспорядочного спаривания и обменов между плечами гомеологичных хромосом остается спорным (Dvorak and Lukaszewski, 2000). Однако ясно, что эффекты делегирования Phi могут быть супрессированы добавлением к геному гете- рохроматиновых сверхчисленных В-хромосом (Bennett et al., 1974). Недавно локус Phi был локализован в ин- тервале величиной 2,5 млн. п.о., в котором содержится субтеломерный гетерохроматин, вставленный в кластер генов, родственных cdc2, что произошло после поли- плоидизации, характерной для эволюции современных пшениц (Griffiths et al., 2006). Хотя в совокупности эти исследования локуса Phi позволяют предположить эпи- генетическое регулирование выбора партнера в мейозе пшеницы, роль (или роли) гетерохроматина в опосре- довании предотвращения гомеологичного спаривания и, таким образом, в стимулировании гомологичных спариваний остается несколько неясной. 5. Гетерохроматин и мейотический драйг Существуют многочисленные случаи, когда гетерох- роматиновые районы играют роль в опосредовании процесса, называемого мейотическим драйвом. Термин «мейотический драйв» обозначает способность одного гомолога увеличивать вероятность его передачи за счет своего партнера, так что в гетерозиготе А/а гаметы, не- сущие Л, производятся или используются чаще, чем гаметы, несущие а. Мы сосредоточимся прежде всего на тех случаях, где гетерохроматиновые элементы вы- зывают утрату или деструкцию их гомологов. Хотя мы детально описываем лишь систему CD у D. melanogaster и утерю хромосом у Sciara и Nasonia, существуют и другие системы связанного с гетерохроматином мейотического драйва, такие как гетерохроматинизация и последующая утеря хромосомы, ограниченной зародышевой линией, у зяблика, и накоплением В-хромосом у кукурузы. 5.1. Нарушитель сегрегации (Segregation Distorter) у самцов Drosophila Одним из наиболее впечатляющих примеров роли гетеро- хроматина в опосредовании мейотического драйва яв- ляется гаплотип у D. melanogaster, изолированный из природной популяции и названный Segregation Distorter [нарушитель сегрегации], или просто SD (Sandler and
5. Гетерохроматин и мейотический драйв Hiraizumi, 1959). Вторая хромосома плодовой мушки, несущая гаплотип SD, обладает способностью элимини- ровать свой гомолог дикого типа (обозначаемый SD+) в процессе созревания спермы и делает это, предотвращая правильную конденсацию этого гомолога. Только сперма, несущая SD, завершает созревание, становится зрелыми сперматидами и, следовательно, передается потомству. Хромосома с SD несет несколько дискретных гене- тических элементов, существенных для ее функции. Первым из них является сам эухроматиновый мутант SD, вызывающий дисфункцию сперматид, действуя на отдельный гетерохроматиновый элемент-мишень, рас- положенный на гомологе и называемый Rsp (Ganetzky, 1977). Сам Rsp включает повторяющийся элемент, ло- кализованный в перицентромерном гетерохроматине второй хромосомы (Wu et al., 1988). Чувствительность гомологичной хромосомы SD к нарушению конденса- ции зависит от числа копий повтора Rsp. Имеется также ряд других элементов, обычно локализованных в хро- мосомах, несущих SD и укрепляющих способность SD вызывать нарушение расхождения. Сама мутация SD является результатом небольшой тандемной дупликации, включающей ген RanGAP. Эта перестройка производит мутантный белок RanGAP, усе- ченный на 234 аминокислоты на карбоксильном конце и вызывающий дефект в ядерном транспорте (Kusano et al., 2003). Почему такой дефект может приводить к тому, что не происходит конденсация хроматина хромосом, несущих локус Rsp, остается неясным (но см. обсужде- ние возможных механизмов: Kusano et al., 2003). 5.2. Утеря отцовской хромосомы у Sciara и картирование реагирующего элемента Мухи-сциариды претерпевают сложные процессы эли- минации отцовской хромосомы и в соме, и в зародыше- вом пути. Все эмбрионы возникают из зигот генотипа АтАХтХХ, что означает, что они получили один набор аутосом и одну Х-хромосому от своих матерей и один набор аутосом и две копии Х-хромосом от своих отцов. Соматические клетки тех эмбрионов, которые должны стать самками, утрачивают одну из двух полученных от отца Х-хромосом, а соматические клетки эмбрионов, которые должны развиваться как самцы, утрачивают две полученные от отца Х-хромосомы. Критический прорыв в действительный механизм элиминации Х-хромосомы, включающий неполное разделение сестринских хрома- тид, был сделан Сен Фаллем и Салливаном (Saint Phalle and Sullivan, 1996). Утрата отцовской Х-хромосомы происходит и в клетках, составляющих зародышевый путь. На более поздних стадиях развития зародышевой линии един- ственная хромосома Хр отбрасывается у обоих полов. Вслед за утратой этой отцовской Х-хромосомы весь от- цовский хромосомный набор оказывается деконденси- рованным, как показывает его более светлая окраска. Это различие в конденсации поддерживается у обоих полов до позднего первого личиночного возраста, ина- че говоря до начала гениальных митотических делений. На этом этапе и материнские, и отцовские хромосомы выглядят полностью конденсированными. Хотя насту- пающий мейоз у самок цитологически нормален, мей- оз у самцов необычен в двух отношениях. Во-первых, элиминируется весь отцовский хромосомный набор и, во-вторых, полученная от матери Х-хромосома пре- терпевает направленное нерасхождение в мейозе 11, и формируется спермий с одним набором аутосом и дву- мя Х-хромосомами. Интересно, что с этими паттернами элиминации хромосом коррелирует ацетилирование гистонов НЗ и Н4 (Goday and Ruiz, 2002). Сначала, в ходе раннего развития зародышевой линии, лишь половина хромо- сом, а именно отцовский набор, высокоацетилирова- ны по НЗ и Н4. Как отмечают Годей и Руиц (Goday and Ruiz, 2002), «продемонстрированная здесь дифферен- циальная метка хромосом зародышевого пути ацети- лированием гистонов согласуется с ранними данными о существовании различий в окрашивании хроматина между обоими родительскими геномами в зародыше- вых клетках». Исключением из этого правила является отцовская Х-хромосома, которая будет элиминирована в ходе развития зародышевой линии: она не сильно аце- тилирована. На более поздних стадиях, перед началом гениальных митотических делений, все хромосомы, и материнские, и отцовские, ацетилированы в высокой степени. Интереснее всего, что в мейозе у самцов, в ходе которого утрачивается весь отцовский набор, этот отцовский набор весь недоацетилирован по НЗ и Н4 по сравнению с высокоацетилированным набором хромо- сом, происходящим от матери. Хотя отношение этих изменений в модификации гистонов к последующим элиминационным событиям в механистических терми- нах остается неясным, кажется вероятным, что такие различия маркируют хромосомы и для мейотической, и для митотической элиминации. 5.3. Утеря отцовских хромосом у Nasonia У паразитической осы Nasonia vitripennis из неоплодот- воренных (гаплоидных) яиц развиваются самцы, тогда как из оплодотворенных (диплоидных) яиц обычно раз- виваются самки (обзор см.: Beukeboom and Werren, 1993) Однако имеется сверхчисленная, или В-хромосома, известная как хромосома PSR, которая заставляет опло- дотворенные яйца развиваться в самцов. Хромосома PSR выполняет эту работу по реверсии пола, вызывая сверхконденсацию и утерю всех отцовских хромосом (кроме себя самой?) в оплодотворенных яйцах (Werren et al., 1987). Хромосома PSR в основном представлена гетерохроматином и содержит тандемно повторяющиеся последовательности, не представленные в аутосомах. По- пытки картировать эту хромосому с помощью делеций позволили получить нефункциональные хромосомы PSR, которые могут передаваться дочерним особям (Beuke- boom and Werren, 1993). Однако в этих исследованиях не удалось идентифицировать в этой хромосоме специфи- ческий домен или класс повторов, который отвечал бы за ее способность включать деструкцию отцовского генома. Следует, однако, отметить обнаружение одного
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования такого делеционного деривата, который ревертировал из нефункционального состояния в функциональное в пределах одной линии. Авторы (Beukeboom and Werren, 1993) предположили, что некоторый набор повторов на хромосоме PSR может функционировать как «сток» для продукта, в норме необходимого для правильного про- цессинга отцовских хромосом после оплодотворения. Действительное существование импринтированных «различий состояний» между отцовскими и матерински- ми наборами, на которые могла бы действовать хромо- сома PSR, позволяют предполагать исследования роли геномного импринтинга в детерминации пола у Nasonia (Dobson and Tanouye, 1998). 5.4. Зздутие 10 у кукурузы — роль последовательностей, соответствующих гетерохроматиновым «вздутиям», в облегчении расхождения хромосом в мейозе I Еще один пример гетерохроматиновых элементов, ас- социированных с мейотическим драйвом, наблюдается у растений, содержащих хромосомы с гетерохроматино- выми вставками, известными как «вздутия» (knobs), или «псевдокинетохоры»; они благоприятствуют передаче хромосомы, несущей такое вздутие, в женском мейозе. Молекулярная организация вздутий охватывает два набора тандемных повторов, каждый из которых, по- видимому, представлен в виде длинной непрерывной последовательности (Dawe and Hiatt, 2004). Функцио- нирование гетерохроматиновых вздутий как псевдоки- нетохоров зависит от варианта хромосомы 10, извест- ного как аномальная хромосома 10 (АЬЮ). Когда АЬ10 присутствует, вздутия формируют псевдокинетохоры, которые движутся к полюсам веретена мейоза I впере- ди эндогенных центромер, и скорость этого движения пропорциональна величине вздутия Однако вздутия проявляют псевдокинетохорную активность только тогда, когда они находятся в c/s-конфигурации с эндо- генной центромерой; они также обнаруживают только латеральные ассоциации с микротрубочками в отличие от ассоциаций «в торец», демонстрируемых полностью функциональными эндогенными кинетохорами Таким образом, несмотря на терминологическую путаницу, вздутия не являются «неоценгромерами» (см. раздел 3.3), поскольку они не способны стимулировать нормальное расхождение сами по себе, не рекрутируют белки и не обнаруживают функций, связанных с эндогенными центромерами и кинетохорами. В терминах мейотического драйва обмены в мейо- цитах, гетерозиготные по данному вздутию, приводят к формированию кроссоверного продукта, несущего это вздутие только на одной из двух его хроматид (Rhoades and Dempsey, 1966). Псевдокинетохорное поведение это- го вздутия направляет несущую вздутие хроматиду в один из четырех продуктов мейоза, известный как базальная мегаспора, который является одним из двух «внешних» ядер (из четырех мейотических продуктов) и который только один и имеется для оплодотворения (Rhoades and Dempsey, 1966; Yu et al., 1997). Таким образом, причина мейотического драйва в этой системе — опосредованное гетерохроматином направленное расхождение в функ- циональную гамету одной хроматиды за счет ее сестры. Каким образом эпигенетические механизмы регулируют поведение вздутий и псевдокинетохорную активность, в настоящее время неизвестно. 6. Сайленсинг генов неспаренными ДНК в мейозе Имеются многочисленные примеры случаев, в кото- рых отсутствие мейотического спаривания приводит к эпигенетическому сайленсингу неспаренной ДНК. В случае Neurospora этот сайленсинг обычно ограничен неспаренными участками. 6.1. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК в мейозе у Neurospora Необычный пример сайленсинга генов в ходе мейоза, который называют мейотическим сайленсингом, вы- зываемым неспаренной ДНК (MSUD, meiotic silencing by unpaired DNA), был описан у Neurospora crassa (обзор см. Hynes and Todd, 2003). Этот процесс позволяет не- спаренной копии данного гена сайленсировать и себя, и любые другие спаренные копии этого гена (рис. 14.11). Этот процесс был выявлен с помощью характеристики гетерозиготных делеций в гене ascospore maturation 1 (asm- 7). Однако, чтобы инициировать сайленсинг, неспаренная последовательность должна быть достаточного размера и обладать гомологией с продуктом (иРНК) этого гена (Lee et al., 2004). Такие последовательности, однако, не должны содержать соответствующий промоторный элемент для рассматриваемого гена. Сайленсинг ограничен геном, определяемым неспаренной последовательностью, и не распространяется на соседние, спаренные гены (Kutil et al., 2003). Мутации в гене sad-1, который кодирует белок, обладающий существенной гомологией с РНК- зависимыми РНК-полимеразами (RdRP), участвующи- ми в путях RNAi, блокируют процесс MSUD (Shiu and Metzenberg, 2002), что позволяет предположить, что «для MSUD необходимы синтез двунитевой РНК и, вероятно, амплификация РНК» (Hynes and Todd, 2003). Хотя при- меры MSUD наблюдались для генов, которые в норме экспрессируются в мейозе, MSUD не был выявлен для генов, экспрессирующихся только в вегетативных клетках, что является дополнительным доводом в пользу участия RNAi (Hynes and Todd, 2003). Дальнейшая поддержка этой идеи вытекает из наблюдений, согласно которым для MSUD необходим белок, подобный Argonaute и Dicer (LeeetaL, 2003). Предположили, что MSUD является кульминацией процесса, состоящего из двух частей: /гаия-узнавание [trans-sensing] и MSUD (Pratt et al., 2004). Процесс «trans-узнавания», который оказывается зависимым от метилирования ДНК. позволяет данной нуклеотидной последовательности ДНК «чувствовать» идентичность или гомологию спаренных районов в контексте мейо-
7. Перспективы и выводы Рис. 14.11. Модели, показывающие, каким образом транскрипция неспареннои ДНК приводит к различным уровням сайленсинга в мейозе В модели а предполагается, что одиночные транскрипцион- ные комплексы в более крупных петлях обладают большей транскрипционной активностью, чем в более мелких, что обозначается числом красных концентрических кругов. Мо- дель б предполагает, что более крупные петли могут содержать большее количество транскрипционных комплексов (красные шарики), чем более мелкие петли, (в) В обеих моделях не- спаренная ДНК в больших петлях продуцировала бы более высокие концентрации siRNAs (показано величиной стрелок) и, таким образом, больший объем сайленсинга (адаптировано, с любезного разрешения, из Lee et al., 2004 [©Genetics Society of America]) тической профазы. Коль скоро неспаренные районы оказываются идентифицированными таким образом, вступает в действие процесс MSUD, чтобы подавить экспрессию этих последовательностей. PH К-зависимый механизм мейотического сай- ленсинга неспаренной ДНК был также хорошо доку- ментирован у С. elegans. ДНК, у которой в мейозе нет спаривающегося партнера, становится мишенью ме- тилирования гистонов по НЗК9 (Bean et al., 2004). Для этого механизма сайленсинга требуется РНК-зависимая РНК-полимераза (EGO-1); однако ему не нужен Dicer (Maine et al., 2005). 6.2. Сайленсинг асинапсных хромосом у мыши Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК был продемонстрирован и у обоих полов мыши (Baarends et al., 2005; Turner et al., 2005). А именно, неспаренные хромосомные районы в мейозе самцов или неспаренные Х-хромосомы в мейозе самок являются транскрипцион- но «молчащими» и маркированы убиквитинированием гистона Н2А — оба эти свойства характерны для тельца XY, в норме присутствующего в мужских мейотических клетках (Baarends et al., 2005). Сообщалось также, что не- спаренная ДНК, возникающая в результате гетерозигот- ности по транслокациям у мышей, была сайленсирована рекрутированием киназы «контрольной точки» ATR со стороны BRCA1 примерно так же, как это наблюдается для сайленсинга X- и Y-хромосом в ходе нормального мужского мейоза (Turner et al., 2005). 6.3. Дисфункция половой хромосомы у Drosophila Эухроматиновые примеры MSUD не известны ни у того, ни у другого пола D. melanogaster. Более того, мас- штабное исследование эухроматиновых делеций и, что более важно, дупликаций делает крайне маловероятным, что такие гены существуют. С другой стороны, хорошо документировано, что делеции перицентромерного Х-гетерохроматина взаимодействуют с транслокациями «У — аутосома», вызывая полную мужскую стерильность (обзор см. McKee, 1998). Эту стерильность нельзя пода- вить, добавив назад либо полную Y-хромосому, либо пол- ную дупликацию Х-гетерохроматина. МакКи (McKee, 1998) предположил, что стерильность транслокаций типа «У — аутосома» обусловлена присутствием мейотической «контрольной точки», которая детектирует неспаренные или слабоспаренные половые хромосомы. Основываясь на описанных выше примерах MSUD у разных эукариот, мы предполагаем альтернативное объяснение, заклю- чающееся в том, что присутствие неспаренных последо- вательностей в X- и Y-хромосоме включает сайленсинг существенных элементов, функция которых необходима для нормальной фертильности. 7. Перспективы и выводы На эукариотические хромосомы некогда смотрели как на грузовики, полуприцепы, заполненные генами и приво- димые в движение «моторами» в кинетохоре и с теломе- рами в роли «бамперов». Ранние работы на почкующихся дрожжах подкрепляли точку зрения, согласно которой свойства ключевых элементов этих «транспортных средств» прямо и непосредственно вытекали из нуклео- тидных последовательностей их ДНК. Однако анализ таких структур, как центромеры высших организмов, привел нас к точке зрения, согласно которой элементы наследственности закодированы в большей степени как состояние хроматина, чем как просто нуклеотидная последовательность ДНК. Концепция факультативно- го гетерохроматина, разработанная, чтобы объяснить X-инактивацию, или распространение «инертности», чтобы объяснить мозаичность, обусловленную эффектом положения, сделались составными частями нашего по- нимания дупликаций генома, репарации, а также мито- тического и мейотического наследования и активностей соответствующих хромосомных районов. В некоторых отношениях удивительно, что такие су- щественные функции кодируются эпигенетически; «про-
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования шивка» в последовательностях ДНК кажется, на первый взгляд, более стабильным механизмом для обеспечения успешной хромосомной наследственности. Однако при- рода полна примерами функциональных «изменений состояния», связанных с дупликацией и расхождением хромосом, таких как неопентромеры у млекопитающих и мух, мейотический драйв в различных системах и ми- риады явлений направленной утери хромосом. Многие элементы наследственности связаны с высоконестабиль- ными повторяющимися ДНК, по причинам, которые в настоящее время неясны, и эволюция сопровождается крупно- и мелкомасштабными изменениями генома, такими как мутации и хромосомные перестройки. Воз- можно, удивительный объем пластичности в регуляции элементов наследственности существен для освоения изменений в нуклеотидных последовательностях ДНК и, может быть, необходим для протекания эволюции. В той мере в какой нам дозволено бросить беглый взгляд в будущее, мы можем догадываться, что обна- руженные до сих пор системы представляют лишь вер- хушку эпигенетического айсберга, что хромосомные функции связаны в большей степени с хроматином, чем просто с нуклеотидными последовательностями ДНК. Мы ожидаем появления на горизонте многих но- вых примеров этого. Литература Ahmad К. and Golic K.G., 1998. The transmission of fragmented chromosomes in Drosophila melanogaster. Genetics 148: 775-792. Ahmad K. and Henikoff S., 2001. Centromeres are specialized replica- tion domains in heterochromatin. J. Cell Biol. 153: 101-110. Ahmad K. and Henikoff S., 2002. The histone variant НЗ.З marks active chromatin by replication-independent nucleosome as- sembly. Mol. Cell 9: 1191-1200. Aladjem M.I. and Fanning E., 2004. The replicon revisited: An old model learns new tricks in metazoan chromosomes. EMBO Rep. 5:686-691. Amor D.J. and Choo K.H., 2002. Neocentromeres: Role in human disease, evolution, and centromere study. Am. J. Hum. Genet. 71:695-714. Baarends W.M., Wassenaar E., van der Laan R., Hoogerbrugge J., Sleddens-Linkels E., Hoeijmakers J.H., de BoerP., andGroote- goed J.A., 2005. Silencing of unpaired chromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis. Mol. Cell. Biol. 25: 1041-1053. Bassing C.H., Chua K.F., Sekiguchi J., Suh H., Whitlow S.R., Fleming J.C., Monroe B.C., Ciccone D.N., Yan C., et al., 2002. Increased ionizing radiation sensitivity and genomic instabil- ity in the absence of histone H2AX. Proc. Natl Acad. Sci. 99: 8173-8178. Baum M., Ngan V, and Clarke L., 1994. The centromeric K-type repeat and the central core are together sufficient to establish a functional Schizosaccharomyces pombe centromere. Mol. Biol. Cell 5: 747-761. Bean C.J., Schaner C.E., and Kelly W.G., 2004. Meiotic pairing and imprinted X chromatin assembly in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 36: 100-105. Bennett M.D., Dover G.A., and Riley R., 1974. Meiotic duration in wheat genotypes with or without homoeologous meiotic chromo- some pairing. Proc. R. Soc Lond. В Biol. Sci. 187:, 191-207. Beukeboom L.W. and Werren J.H., 1993. Deletion analysis of the selfish В chromosome, Paternal Sex Ratio (PSR), in the parasitic wasp Nasonia vitripennis. Genetics 133: 637-648. Biessmann H. and Mason J.M., 2003. Telomerase-independent mecha- nisms of telomere elongation. Cell. Mol. Life Sci. 60:2325-2333. Black B.E., Foltz D.R., Chakravarthy S., Luger K., Woods V.L., Jr., and Cleveland D.W, 2004. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature 430: 578-582. Blasco M.A., 2005. Telomeres and human disease: Ageing, cancer and beyond. Nat. Rev. Genet. 6: 611-622. Bloom K., Hill А., Кеппа M., and Saunders M., 1989. The structure of a primitive kinetochore Trends Biochem. Sci. 14: 223-227. Blower M.D. and Karpen G.H., 2001. The role of Drosophila CID in kinetochore formation, cell-cycle progression and heterochro- matin interactions. Nat. Cell Biol. 3: 730-739. Blower M.D., Sullivan B.A., and Karpen G.H., 2002. Conserved organization of centromeric chromatin in flies and humans. Dev. Cell 2: 319-330. Carroll C.W and Straight A.F., 2006. Centromere formation: From epigenetics to self-assembly. Trends Cell Biol. 16: 70-78. Celeste A., Petersen S., Romanienko P.J., Femandez-Capetillo O., Chen H.T., Sedelnikova O.A., Reina-San-Martin B., Coppola V., Meffre E., Difilippantonio M.J.. et al., 2002. Genomic instability in mice lacking histone H2AX. Science 296: 922-927. Cenci G., Siriaco G., Raffa G.D., Kellum R., and Gatti M., 2003. The Drosophila HOAP protein is required for telomere capping. Nat. Cell Biol. 5: 82-84. Clarke L., Amstutz H., Fishel B., and Carbon J., 1986. Analysis of centromeric DNA in the fission yeast Schizosaccharomycespombe. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8253-8257. Cleveland D.W, Mao Y, and Sullivan K.F., 2003. Centromeresand kinetochores: From epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell 112:407-421. Collins K.A., Furuyama S., and Biggins S., 2004. Proteolysis contrib- utes to the exclusive centromere localization of the yeast Cse4/ CENP-A histone H3 variant. Curr. Biol. 14:, 1968-1972. Cryderman D. E., Morris E., Biessmann H., Elgin S.C., and Willrath L.L., 1999. Silencing at Drosophila telomeres: Nuclear oiganization and chromatin structure play critical roles. EMBO J. 18: 3724-3735. Cullen C.F., Brittle A.L., Ito T, and Ohkura H., 2005. The conserved kinase NHK-1 is essential for mitotic progression and unifying acentrosomal meiotic spindles in Drosophila melanogaster. J. Cell Biol. 171: 593-602. Dawe R.K. and Hiatt E.N., 2004. Plant neocentromeres: Fast, fo- cused, and driven. Chromosome Res. 12: 655-669. De La Fuente R., 2006. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev. Biol. 292: 1-12. de Saint Phalle B. and Sullivan W, 1996. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimi- nation during early Sciara coprophila embryogenesis. Development 122:3775-3784. Demburg A.F., 2001. Here, there, and everywhere: Kinetochore func- tion on holocentric chromosomes. J. Cell Biol. 153: F33-38. Demburg A.F., Sedat J.W, and Hawley R.S., 1996. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segrega- tion. Cell 86: 135-146. Dobson S.L. and Tanouye M.A., 1998. Evidence for a genomic imprinting sex determination mechanism in Nasonia vitripennis (Hymenoptera; Chalcidoidea). Genetics 149: 233-242.
Donaldson KM., Lui A., and Karpen G.H., 2002. Modifiers of terminal deficiency-associated position effect variegation in Drosophila. Genetics 160: 995-1009. Dvorak J. and Lukaszewski A.J., 2000. Centromere association is an unlikely mechanism by which the wheat Phi locus regulates metaphase I chromosome pairing between homoeologous chro- mosomes. Chromosoma 109: 410-414 Fanti L., Giovinazzo G., Berloco M., and Pimpinelli S., 1998. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Droso- phila. Mol. Celli'. 527-538. Ferguson B.M. and Fangman W.L., 1992. A position effect on the time of replication origin activation in yeast. Cell 68: 333-339. Femandez-Capetillo O., Lee A., Nussenzweig M., and Nussenzweig A., 2004. H2AX: The histone guardian of the genome. DNA Repair 3:959-967. Ferreri G.C., Lise insky D.M., Mack J. A., Eldridge M.D., and O’Neill R.J., 2005. Retention of latent centromeres in the mam- malian genome. J. Hered. 96: 217-224. Fnedberg E., Walker G.. and Siede W.. 1995. DNA repair and muta- genesis. ASM Press, Washington D.C. Ganetzky B., 1977. On the components of segregation distortion in Drosophila melanogaster. Genetics 86: 321-355. Garcia-Cao M., O’Sullivan R., Peters A. H., Jenuwein T, and Blasco M.A., 2004. Epigenetic regulation of telomere length in mamma- lian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases. Nat. Genet. 36: 94-99. Goday C. and Ruiz M.F., 2002. Differential acetylation of histones H3 and H4 in paternal and maternal germline chromosomes dur- ing development of sciarid flies. J. Cell Sci. 115: 4765-4775. Grell R.F., 1976. Distributive pairing. In The genetics and biology of Drosophila (ed. E. Novitski and M. Ashbumer), pp. 436-483. Academic Press, New York. Griffiths S., Sharp R., Foote T.N., Bertin L, Wanous M., Reader S., Colas L, and Moore G., 2006. Molecular characterization of Ph 1 as a major chromosome pairing locus in polyploid wheat. Nature № 749-752. Hall A.E., Kettler G.C., and Preuss D.. 2006. Dynamic evolution at pericentromeres. Genome Res. 16: 355-364. Hassa P.O. and Hottiger M.O., 2005. An epigenetic code for DNA damage repair pathways? Biochem. Cell Biol. 83: 270-285. Hawley R.S., Irick H., Zitron A.E., Haddox D.A., Lohe A., New C, Whitley M.D., Arbel T, Jang J., McKim K., and Childs G., 1993. There are two mechanisms of achiasmate segregation in Drosophda females, one of which requires heterochromatic homology. Dev. Genet. 13: 440-467 Heun P, Erhardt S.. Blower M.D., Weiss S.. Skora A.D., and Karpen G.H., 2006. Mislocalization of the Drosophila centromere- specific histone CID promotes formation of functional ectopic kinetochores. Dev. Cell 10: 303-315. Huyen Y, Zgheib O., Ditullio R.A., Jr., Gorgoulis V.G., Zacharatos P., PettyT.J., Sheston E.A., Mellert H.S., Stavridi E.S., and Hala- zonetis T.D., 2004. Methylated lysine 79 ofhistone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature 432: 406-411. Hynes M.J. and Todd R.B., 2003. Detection of unpaired DNA at meio- sis results in RNA-mediated silencing. Bioessays 25: 99-103. Ivanovska L, Khandan T, Ito X, and Orr-Weaver T.L., 2005. A his- tone code in meiosis: The histone kinase, NHK-1, is required for proper chromosomal architecture in Drosophila oocytes. Genes Dev., 19: 2571-2582. Joseph L, Jia D., and Lustig A.J., 2005. Ndjlp-dependent epige- netic resetting of telomere size in yeast meiosis. Curr. Biol. 15: 231-237. Karpen G.H. and Spradling A.C. 1992. Analysis of subtelomeric hete-rochromatin in the Drosophila minichromosome Dpi 187 by single P element insertional mutagenesis. Genetics 132: 737- 753. Karpen G.H., Le M.H., and Le H., 1996. Centric heterochromatin and the efficiency of achiasmate disjunction in Drosophila female meiosis. Science 213: 118-122. Kemp B., Boumil R.M., Stewart M.N., and Dawson D.S., 2004. A role for centromere pairing in meiotic chromosome segregation. Genes Dev. 18:, 1946-1951. Kusano A., Staber C., Chan H.Y., and Ganetzky B., 2003. Closing the (Ran)GAP on segregation distortion in Drosophila. Bioessays 25:108-115. Kutil B.L., Seong K.Y., and Aramayo R., 2003. Unpaired genes do not silence their paired neighbors. Curr. Genet. 43: 425-432. Lai S.R., Phipps S.M., Liu L., Andrews L.G., and Tollefsbol TO., 2005. Epigenetic control of telomerase and modes of telomere maintenance in aging and abnormal systems. Front. Biosci. 10: 1779-1796. Lam A.L., Boivin C.D., Bonney C.F., Rudd M.K., and Sullivan B.A., 2006. Human centromeric chromatin is a dynamic chromosomal domain that can spread over noncentromeric DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 103:4186-4191. Lee D.W, Pratt R.J., McLaughlin M., and Aramayo R., 2003. An aigonaute-like protein is required for meiotic silencing. Genetics 164:821-828. Lee D.W, Seong K.Y, Pratt R.J., Baker K., and Aramayo R., 2004. Properties of unpaired DNA required for efficient silencing in Neurospora crassa. Genetics 167: 131-150. Lo A.W., Magliano D.J., Sibson M.C., Kalitsis R, Craig J.M., and Choo K.H., 2001. A novel chromatin immunoprecipitation and array (CIA) analysis identifies a 460-kb CENP-A-binding neo- centromere DNA. Genome Res. 11: 448-457. Louis E.J. and Vershinin A.V, 2005. Chromosome ends: Differ- ent sequences may provide conserved functions. Bioessays 27: 685-697 Lue N.F., 2004. Adding to the ends: What makes telomerase proces- sive and how important is it? Bioessays 26: 955-962. Luo M.C., Dubcovsky J., and Dvorak J., 1996. Recognition of ho- meology by the wheat Phi locus. Genetics 144: 1195-1203. Maggert K.A. and Karpen G.H., 2001. Neocentromere formation occurs by an activation mechanism that requires proximity to a functional centromere. Genetics 158: 1615-1628. Maine E.M., Hauth J.. RatliffX. Vought V.E., SheX„ and Kelly W.G., 2005. EGO-1, a putative RNA-dependent RNA polymerase, is required for heterochromatin assembly on unpaired dna during C. elegans meiosis. Curr. Biol. 15:, 1972-1978. Malik H.S. and Henikoff S., 2002. Conflict begets complexity: The evolution of centromeres. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 711-718. McKee B.D., 1998. Pairing sites and the role of chromosome pairing in meiosis and spermatogenesis in male Drosophila. Curr. Top. Dev. Biol. 37: 77-115. Mellone B.G. and Allshire R.C., 2003. Stretching it: Putting the CEN(P-A) in centromere. Curr. Opin. Genet. Dev. 13:, 191-198. Miller K.M. and Cooper J.P., 2003. The telomere protein Tazl is required to prevent and repair genomic DNA breaks. Mol. Cell 11: 303-313.
Глава 14. Эпигенетическая регуляция хромосомного наследования Nakaseko Y, Kinoshita N., and Yanagida M., 1987. Anovel sequence common to the centromere regions of Schizosaccharomycespombe chromosomes. Nucleic Acids Res. 15: 4705-4715. Nakatani Y, Ray-Gallet D., Quivy J.P., Tagami H., and Almouzni G., 2004. Two distinct nucleosome assembly pathways: Depen- dent or independent of DNA synthesis promoted by histone H3.1 and НЗ.З complexes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 273-280. Nimmo E.R., Pidoux A.L., Perry PE., and Allshire R.C., 1998. Defective meiosis in telomere-silencing mutants of Schizosac- charomyces pombe. Nature 392: 825-828. Nonaka N., Kitajima X, Yokobayashi S., Xiao G., Yamamoto M., Grewal S.L, and Watanabe Y, 2002. Recruitment of cohesin to heterochromatic regions by Swi6/HPl in fission yeast. Nat. Cell Biol. 4: 89-93. Ogino K., Hirota K., Matsumoto S., TakedaX., Ohta K., Arai K.I., and Masai H., 2006. Hskl kinase is required for induction of meiotic dsDNA breaks without involving checkpoint kinases in fission yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 103: 8131-8136. Pasero P, Bensimon A., and Schwob E., 2002. Single-molecule analysis reveals clustering and epigenetic regulation of replication origins at the yeast rDNA locus. Genes Dev. 16: 2479-2484. Perrini B., Piacentini L., Fanti L., Altieri E, Chichiarelli S., Berloco M., Turano C., Ferraro A., and Pimpinelli S., 2004. HP1 controls telomere capping, telomere elongation, and telomere silencing by two different mechanisms in Drosophila. Mol. Cell 15: 467-476. Pidoux A.L. and Allshire R.C., 2004. Kinetochore and heterochro- matin domains of the fission yeast centromere. Chromosome Res. 12:521-534. Prasanth S.G., Mendez J., Prasanth K.V., and Stillman B., 2004. Dynamics of pre-replication complex proteins during the cell di- vision cycle. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 359: 7-16. Pratt R.J., Lee D.W., and Aramaya R., 2004. DNA methylation af- fects meiotic trans-sensing, not meiotic silencing, in Neurospora. Genetics 168:, 1925-1935. Reddy K.C. and Villeneuve A.M., 2004. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell 118: 439-452. Rhoades M.M. and Dempsey E., 1966. The effect of abnormal chromosome 10 on preferential segregation and crossing over in maize. Genetics 53: 989-1020. Rudd M.K., Mays R.W., Schwartz S., and Willard H.F., 2003. Hu- man artificial chromosomes with alpha satellite-based de novo centromeres show increased frequency of nondisjunction and anaphase lag. Mol. Cell Biol. 23: 7689-7697. Sadaie M., Naito X., and Ishikawa E., 2003. Stable inheritance of telomere chromatin structure and function in the absence of telomenc repeats. Genes Dev. \T. 2271-2282. Sandler L. and Hiraizumi Y, 1959. Meiotic drive in natural popula- tions of Drosophila melanogaster. II. Genetic variation at the Seg- regation-distorter \ocms. Proc. Natl. Acad. Sci. 45: 1412-1422. Sharp J.A., Franco A.A., Osley M.A., and Kaufman P.D., 2002. Chromatin assembly factor I and Hir proteins contribute to building functional kinetochores in S. cerevisiae. Genes Dev. 16: 85-100. Shelby R.D., Monier K., and Sullivan K.E, 2000 Chromatin as- sembly at kinetochores is uncoupled from DNA replication. J. CellBiol. 151: 1113-1118. Shiu P.K. and Metzenberg R.L., 2002. Meiotic silencing by unpaired DNA: Properties, regulation and suppression. Genetics 161: 1483-1495. Steiner N .L. and Clarke L., 1994. A novel epigenetic effect can alter centromere function in fission yeast. Cell 79: 865-874. Sullivan B. and Karpen G., 2001. Centromere identity in Drosophila is not determined in vivo by replication timing. J. Cell Biol. 154: 683-690. Sullivan B.A. and Karpen G.H., 2004. Centromeric chromatin exhibits a histone modification pattern that is distinct from both euchromatin and heterochromatin. Nat. Struct. Mol. Biol. 11. 1076-1083. Sullivan B.A. and Willard H.F., 1998. Stable dicentric X chromosomes with two functional centromeres. Nat. Genet., 20: 227-228. Tsubouchi T. and Roeder G.S., 2005. A synaptonemal complex protein promotes homology-independent centromere coupling. Science 308: 870-873. Turner J.M., Mahadevaiah S.K., Femandez-Capetillo O., Nussen- zweig A., XuX., Deng C.X., and Buigoyne P.S., 2005. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat. Genet. 37: 41-47. Watanabe Y, 2005. Sister chromatid cohesion along arms and at centromeres. Trends Genet. 21: 405-412. Weinreich M., Palacios DeBeer M.A., and Fox C.A., 2004. The activities of eukaryotic replication origins in chromatin. Biochitn. Biophys. Acta 1677: 142-157. Werren J.H., Nur U., and Eickbush D., 1987. An extrachromo- somal factor causing loss of paternal chromosomes. Nature 327: 75-76. Wu H.Y and Burgess S.M., 2006. Ndjl, a telomere-associated pro- tein, promotes meiotic recombination in budding yeast. Mol. Cell Biol. 26: 3683-3694. Yan H., Jin W, Nagaki K., Tian S., Ouyang S., Buell C.R., Talbert P.B., Henikoff S., and Jiang J., 2005. Transcription and histone modifications in the recombination-free region spanning a rice centromere. Plant Cell 17: 3227-3238. Yoda K., Ando S., Monshita S., Houmura K., Hashimoto K., Takeyasu K., and Okazaki X, 2000. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 7266-7271. Yu H.G., Hiatt E.N., Chan A., Sweeney M., and Dawe R.K., 1997. Neocentromere-mediated chromosome movement in maize. J. CellBiol. 139:831-840.
ГЛАВА 15 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ Х-ХРОМОСОМ У С. ELEGANS Susan Strome1 и William G. Kelly2 1 Department of Biology, Indiana University, Bloomington, Indiana 47405 2Biology Department, Emory University, Atlanta Georgia 30322 Содержание Общее резюме 1. Дисбаланс половых хромосом у С. elegans 2. DDC похож на комплекс конденсина 3. Оценка отношения Х:А 4. Рекрутирование и распространение DCC 5. Эффекты DCC: даун-регуляция сцепленных с X генов и аутосомного гена her-1 6. Регулирование Х-хромосом в зародышевом пути 7. Развитие зародышевого пути и сайленсинг Х-хромосомы 8. Единственная Х-хромосома у самцов обнаружи- вает метки гетерохроматина 9. Влияние MSUD на паттерны экспрессии генов в зародышевом пути 10. Регуляция сайленсинга Х-хромосомы модифи- каторами гистонов MES 11. Х-хромосома спермия импринтирована 12. Заключительные замечания Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Механизм детерминации пола у почвенной немато- ды Caenorhabditis elegans базируется на соотношении Х-хромосом и наборов аутосом (отношение Х:А). Ди- плоидные животные с двумя Х-хромосомами (отноше- ние Х:А равно 1) развиваются как гермафродиты, тогда как животные с одной Х-хромосомой (отношение Х:А равно 0,5) развиваются в самцов. Это различие в дозе Х-хромосом между двумя полами, если оно не модули- руется, обычно ведет к разным уровням экспрессии сце- пленных с X генов и к летальности у одного пола В этой главе мы обсуждаем разные эпигенетические стратегии, используемые в соматических тканях и в зародышевом пути для модуляции экспрессии генов с Х-хромосом, находящихся в разном числе у червей двух полов, и мы сравниваем стратегии, используемые червями, со страте- гиями, используемыми другими организмами для реше- ния той же проблемы различий в дозе Х-хромосом. В соматических тканях червей выравнивание экс- прессии сцепленных с X генов между двумя полами, обо- значаемое как «компенсация дозы», происходит путем даун-регуляции экспрессии вдвое с обеих Х-хромосом у пола с XX. Эта даун-регуляция выполняется комплек- сом компенсации дозы (DCC, dosage compensation com- plex), который похож на комплекс конденсина. Этот последний участвует в конденсировании всех хромосом клетки для их сегрегации во время деления ядра и об- разования двух дочерних клеток. Таким образом, DCC может достигать репрессии сцепленных с X генов пу- тем частичной конденсации Х-хромосом. Ключевыми моментами в компенсации дозы у червей являются во- просы о том, как оценивается соотношение Х:А, о том, каким образом DCC собирается исключительно у жи-
Глава 15. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans вотных с XX, как DCC «нацеливается» на Х-хромосомы и как он осуществляет даун-регуляцию экспрессии сце- пленных с X генов точно вдвое. По каждой из этих по- зиций в плане механизмов были достигнуты существен- ные успехи. Стратегия компенсации дозы, используемая чер- вями, отличается от стратегий, применяемых мле- копитающими и плодовыми мушками {Drosophila). Млекопитающие достигают компенсации дозы путем глобального сайленсинга одной из Х-хромосом у пола с XX. Плодовые мушки ап-регулируют экспрессию генов с единственной Х-хромосомы у пола с XX. Это разно- образие стратегий вероятно отражает кооптацию разных предсуществующих систем для специализированной роли уравнивания экспрессии сцепленных с X генов у животных с разным числом Х-хромосом. В ткани заро- дышевого пути (т.е. в репродуктивных клетках) червей происходит более глубокая модуляция экспрессии ге- нов, сцепленных с X: единственная Х-хромосома у сам- цов и обе X у гермафродитов глобально сайленсируют- ся. В зародышевых клетках обоих полов Х-хромосомы не имеют модификаций гистонов, ассоциированных с активно экспрессируемым хроматином. Это регули- руется, по крайней мере отчасти, белками MES. Более того, у самцов единственная Х-хромосома в каждом за- родышевом ядре приобретает модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматиновым сайленсин- гом. Этот сайленсинг зависит от неспаренного статуса Х-хромосомы в мейозе самцов. Гены, экспрессируемые в зародышевом пути, поразительным образом недо- представлены в Х-хромосоме. Распространенная точ- ка зрения заключается в том, что сильная репрессия единственной Х-хромосомы в мужских мейотических зародышевых клетках вела к нехватке экспрессируемых генов зародышевого пути на Х-хромосоме и к необходи- мости сайленсинга Х-хромосомы у пола XX. Таким об- разом, зародышевый путь С. elegans представляет собой интересный случай для исследования того, как хромо- сомные дисбалансы между полами привели к эпигене- тической регуляции хромосомных состояний и сфор- мировали профиль генной экспрессии этой ткани. 1. Дисбаланс половых хромосом у С. elegans У Caenorhabditis elegans имеются два пола, которые ге- нетически различаются по набору Х-хромосом: черви XX являются гермафродитами, а черви ХО — самцами. Никакой пол-специфичной хромосомы (такой, как Y-хромосома) нет. Гермафродиты и самцы обнаруживают многочисленные пол-специфичные анатомические осо- бенности и обладают разными программами зародыше- вого пути (рис. 15.1). Эти бросающиеся в глаза различия между полами инициируются у раннего эмбриона и являются результатом подсчета числа Х-хромосом и со- ответствующего реагирования на эту оценку (Nigon, 1951; обзор см.: Меуег, 2000). Каким образом простая разница в числе половых хромосом или плоидности может транс- лироваться в такие резко различающиеся программы развития? Важный момент заключается в том, что каж- дая клетка С. elegans должна оценивать не только число своих Х-хромосом. но и число наборов аутосом В дей- ствительности пол определяется именно соотношением этих двух типов хромосом, так называемым отношением X:А. Диплоидные животные с двумя Х-хромосомами (от- ношение Х:А равно 1) развиваются как гермафродиты, тогда как животные с одной Х-хромосомой (отношение Х:А равно 0,5) развиваются как самцы Многие меха- нистические детали такого надлежащего реагирования на отношение Х:А были изящно проанализированы и описываются ниже. Разница в дозе Х-хромосом между полами без ее мо- дуляции приводила бы к разным уровням экспрессии сцепленных с X генов и к летальности у одного пола. Любопытно, что соматические клетки и зародышевые клетки выработали разные механизмы для решения этой проблемы дозы X (рис. 15.2). Зародышевый путь и соматические линии клеток полностью отделены друг от друга уже к 16—24-клеточной стадии эмбриогенеза. На стадии примерно 30 клеток соматические линии начи- нают процесс, обозначаемый как «компенсация дозы». Это схема, посредством которой обе Х-хромосомы у животных XX репрессируются в двукратном объеме. Напротив, млекопитающие, как это обсуждается в гла- вах 16 и 17, осуществляют компенсацию дозы путем гло- бального сайленсинга одной из Х-хромосом у пола XX. а плодовые мушки выполняют компенсацию дозы путем ап-регуляпии экспрессии с единственной Х-хромосомы у пола XY В ткани зародышевого пути С. elegans проис- ходит более экстремальная модуляция экспрессии сце- пленных с X генов: единственная X у самцов и обе X у гермафродитов глобально сайленсируются Предметом этой главы являются эпигенетические механизмы, осу- ществляющие компенсацию дозы в соме и сайленсинг Х-хромосомы в зародышевой линии. 2. DDC похож на комплекс конденсина Для понимания сборки и состава комплекса компенса- ции дозы (DDC, dosage compensation complex) требуется краткое введение, касающееся первых нескольких генов в пути, который регулирует как детерминацию пола, так и компенсацию дозы (обзор см.: Меуег, 1997). xol-l (xol означает XO-lethal), первый ген на этом пути, считается главным геном-переключателем, потому что его актив- ность определяется отношением Х:О, а он, в свою оче- редь, диктует, поведет ли этот путь к развитию самца или гермафродита. XOL-1 является негативным регулятором трех sdc генов (sdc означает дефект в детерминации пола и компенсации дозы — sex determination and dosage com- pensation defective). Гены sdc кодируют компоненты DCC и регулируют ген детерминации пола her-1 (Лег означает гермафродитизацию животных ХО). У эмбрионов ХО отношение Х:А, равное 0,5, ведет к высоким уровням содержания белка XOL-1 и низким уровням белка SDC; DCC не собирается, компенсации дозы не происходит и экспрессируется ген детерминации пола her-1, что ведет к мужскому половому развитию. У эмбрионов XX отноше- ние X: А, равное 1, приводит к низкому содержанию XOL-1
2. DDC похож на комплекс Гермафродит XX Рис. 15.1. Анатомия XX- и ХО-особей С. elegans В природе у С. elegans существуют два пола, гермафродиты XX и самцы ХО. Гермафродиты и самцы демонстрируют несколько пол-специфичных анатомических особенностей, наиболее заметными из которых является хвост самца, предназначенный для спаривания, и вульва на вентральной поверхности у гермафродитов для получения спермы самца и для откладки яиц Программы зародышевого пути у них также различаются. Двуплечая гонада у гермафродитов вначале продуцирует сперму, а затем ооциты на протяжении всей жизни взрослой особи. Одноплечая гонада самцов постоянно продуцирует сперму (адаптировано, с любезного разрешения авторов, из Hansen et al., 2004 [©Elsevier]) Эмбрион Сома' компенсация дозы ВЫКЛЮЧЕНА Сома компенсация дозы ВКЛЮЧЕНА Зародышевая линия X сайленсирована Зародышевая линия обе X сайленсированы [2 Соматические ядра у ХО: никакой даун-регуляции единственной Х-хромосомы Ц Ядра зародышевой линии: глобальный сайленсинг Х-хромосом ф Примордиальная зародышевая клетка Соматические ядра у XX: 50%- ная даун-регуляция обеих Х-хромосом Частичная реактивация Х-хромосом в оогенезе Ранние эмбрионы Рис. 15.2. Обзор регуляции Х-хромосомы Компенсация дозы происходит в соматических тканях исключительно у гермафродитов XX Сайленсинг Х-хромосом происходит и у самцов ХО, и у гермафродитов XX Гермафродиты демонстрируют позднюю и частичную активацию сцепленных с X генов во время поздней пахитены оогенеза. Стрелки указывают на единственную примордиальную зародышевую клетку в эмбрионе, которая генерирует зародышевую линию во взрослой гонаде
Глава 15. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans и высокому уровню содержания SDC; DCC собирается, компенсация дозы выполняется, a her-1 репрессируется, что приводит к развитию гермафродита. Особенно важ- ным для представлений о сборке DCC является тот факт, что белки SDC экспрессируются только у эмбрионов XX, в ответ на отношение Х:А, равное 1. В дополнение к белкам SDC (SDC-1, SDC-2 и SDC-3) DCC содержит также набор белков DPY (DPY-21, DPY- 26, DPY-27, DPY-28 и DPY-30; DPY означает dumpy) и белок MIX-1 (MIX означает «связанный с митозом и Х-хромосомой» — mitosis and X-associated) (табл. 15.1) (обзор см.: Меуег, 2005). Значительное углубление по- нимания механизма компенсации дозы у червей было достигнуто с открытием того, что часть DCC С. elegans похожа на 13S комплекс конденсина (табл. 15.1 и рис. 15.3) (обзор см.: Меуег, 2005). Комплекс конденсина консервативен у разных видов и играет существен- ную роль в правильной компактизации хромосом и их сегрегации в ходе митоза и мейоза (обзор см.: Hirano, 2002). MIX-1, DPY-27, DPY-28 и DPY-26, в частности, гомологичны существенным компонентам комплек- Таблица 15.1. Компоненты, регулирующие экспрессию генов с Х-хромосомы Белок Комплекс Гомолог и (или) консерватив- ные домены SDC-1 DCC С2Н2-домен типа «цинковый палец» SDC-2 DCC Новый белок SDC-3 DCC С2Н2-домен типа «цинковый палец» и миозиноподобный АТФ-связывающий домен DPY-21 DCC Консервативный белок; ни- каких распознаваемых мо- тивов DPY-26 DCC Субъединица конденсина ХСАР-Н DPY-27 DCC Субъединица конденсина SMC-4/XCAP-C DPY-28 DCC Субъединица конденсина XCAP-D2/Cnd 1/Ycs4p DPY-30 DCC Консервативный белок; ни- каких распознаваемых мо- тивов MIX-1 DCC Субъединица конденсина SMC-2/XCAP-E MES-2 MES-2/3/6 РКС2-субъединица E(Z)/ EZH2; домен SET MES-3 MES-2/3/6 Новый белок MES-6 MES-2/3/6 РКС2-субъединица ESC/ EED; домены WD40 MES-4 неизвестен NSD1; «пальцы» PHD и до- мен SET са конденсина; MIX-1 является также существенным компонентом канонического комплекса конденсина, который действует в митозе и мейозе. Белки SDC и DPY-30 не похожи на известные субъединицы конден- сина. Согласно современным взглядам, комплекс DCC был приспособлен из анпестрального комплекса кон- денсина для специфического «нацеливания» на гены Х-хромосомы и их даун-регуляции, вероятно, путем не- которой конденсации хроматина. Почему DCC собирается только у эмбрионов XX? Удивительно, что большинство компонентов DCC по- ставляются со стороны матери через ооцит как XX-, так и ХО-эмбрионам. Ключевым регулятором сборки DCC яв- ляется SDC-2 (Dawes et al., 1999). SDC-2 не поставляется со стороны матери и производится только у эмбрионов XX (рис. 15.4), где он, наряду с SDC-3 и DPY-30, рекру- тирует остальные субъединицы DCC к Х-хромосомам. Действительно, включения экспрессии SDC-2 у эмбрио- нов ХО достаточно, чтобы вызвать сборку DCC на един- ственной Х-хромосоме и включить компенсацию дозы, которая убивает эти эмбрионы. SDC-2, таким образом, направляет специфическое рекрутирование других ком- понентов DCC, большинство из которых играет другие роли в клетке, и кооптирует их активности для компен- сации дозы и детерминации пола. 3. Оценка отношения Х:А Как клетки червя считают Х-хромосомы и аутосомы и выполняют компенсацию дозы, когда отношение Х:А равно 1? Удалось идентифицировать четыре небольших участка Х-хромосомы, обозначаемые как сигнальные элементы X (XSEs), которые вносят вклад в числитель отношения X: A [contributing to the numerator portion of the X:A ratio]. В двух из этих четырех районов были иденти- фицированы ответственные за это гены: sex-1 и fox-1 (sex означает «сигнальный элемент на X» — signal element on X',fox означает «феминизирующий ген на X» — feminizing geneonX) (Carmi et al., 1998; Skipper et al., 1999). Продукты обоих генов подавляют экспрессию xol-1 — гена, наибо- лее удаленного «выше по течению» в пути детерминации пола и компенсации дозы, — в критическом «окне» эм- брионального развития (рис. 15.4). Поскольку эмбрионы XX продуцируют приблизительно вдвое больше SEX-1 и FOX-1, чем эмбрионы ХО, экспрессия xol-1 гораздо ниже у эмбрионов XX, чем у ХО. SEX-1 является ядерным ре- цептором гормона, который репрессирует транскрипцию xol-1 (Carmi et al., 1998). FOX-1 является связывающимся с РНК белком, который снижает уровень иРНК xol-1 с помощью посттранскрипционного механизма (Skipper et al., 1999). Доза Х-хромосом, следовательно, эквивалентна дозе сцепленных с X факторов, экспрессируемых с XSEs, которые действуют, подавляя экспрессию xol-1. До сих пор лишь один аутосомный сигнальный элемент (ASE) был идентифицирован как вносящий вклад в знаменатель от- ношения Х:А (Powell et al., 2005). Этот идентифицирован- ный ген, sea-1, кодирует фактор транскрипции Т-бокса, который активирует транскрипцию xol-1. Доза аутосом (доза ASE), следовательно, уравнове- шивает эффекты дозы X (дозы XSE) путем антагони-
3. Оценка отношения Конденсиновый комплекс червя DC-комплекс червя 135-комплекс конденсина Разделяет и конденсирует митотические хромосомы Разделяет и конденсирует мито- тические и мейотические хромо- сомы Уменьшает экспрессию сцепленных с X генов Рис. 15.3. Комплекс компенсации дозы (DCC) и комплекс конденсина DCC червей похож на комплекс конденсина, функционирующий в конденсации хромосом, когда они проходят через ядерное деление. В частности, DCC содержит несколько субъединиц, которые похожи на субъединицы ХСАР (ХСАР означает «полипептид, связанный с хромосомами, у Xenopus» — Xenopus chromosome-associated polypeptide) в 138-комплексе конденсина, первоначально охарактеризованном у Xenopus. Нативный комплекс конденсина у червей обнаруживает общее сходство с гомологичным функ- циональным 138-комплексом у Xenopus. Белки SDC и DPY-30 непохожи на известные субъединицы конденсина; вместо этого функционируют в локализации комплекса DCC на Х-хромосоме (Видоизменено из Меуег, 2005) стического действия на главный ген-переключатель, xol-1 (рис. 15.4). Рабочая гипотеза относительно того, как это разворачивается у обоих полов, заключается в следующем: диплоидные эмбрионы XX вырабатывают двойную дозу XSE-репрессоров xol-1, которые анну- лируют активирующее влияние ASEs Это удерживает XOL-1 на низком уровне и ведет к развитию гермафро- дита и осуществлению компенсации дозы. Наоборот, диплоидные эмбрионы ХО продуцируют единичную дозу репрессоров XSE, которая недостаточна для про- тиводействия активирующему влиянию ASEs Высокие уровни содержания XOL-1 приводят к развитию сам- ца и к невозможности выполнить компенсацию дозы XSEs и ASEs транслируют сдвиг в отношении Х:А от 0,5 к 1 в переключение пола и в решение, осуществлять ли компенсацию дозы или нет. сГ (ХО) Соотношение X аутосомы = 0,5 Соотношение Х/аутосомы = 1 1 х БЕ 2 х АБ 2.x АБ Компенсация дозы отсутствует Низкий XOL-1 Рис. 15.4. Путь детерминации пола и компенсации дозы у С. elegans Этот рисунок освещает предполагаемые роли сигнальных элементов X (XSEs) и аутосомных сигнальных элементов (ASEs) в ре- гулировании уровней XOL-1 и последующей половой дифференцировке и сборке комплекса компенсации дозы (DCC), который у гермафродитов XX подавляет экспрессию сцепленных с X генов примерно вдвое
Глава 15. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans 4. Рекрутирование и распространение DCC Исследования были сконцентрированы на идентифика- ции особенностей Х-хромосомы, участвующей в рекру- тировании DCC. Интересно отметить, что у млекопитаю- щих и плодовой мушки эквивалент DCC «нацеливается» на Х-хромосому комбинацией Х-специфичных не коди- рующих РНК и элементов нуклеотидной последователь- ности Х-хромосомы (см. главы 16 и 17). На сегодняшний день нет данных о том, что некодирующие РНК играют какую-нибудь роль в компенсации дозы у С. elegans. Из- ящный подход был использован для исследования во- проса о том, рекрутируется ли DCC червей независимо ко многим сайтам или же только к одному или немно- гим сайтам, после чего комплексы распространяются в примыкающие хромосомные районы (Csankovszki et al., 2004; Меуег, 2005). Черви из штаммов, содержащих дупликации различных участков Х-хромосомы, были окрашены на компоненты DCC. Согласно предложенной интерпретации, ассоциация DCC с дупликацией означа- ет, что дупликация и соответствующий район интактной Х-хромосомы содержат сайт рекрутирования DCC. От- сутствие ассоциации DCC с дупликацией, но связь DCC с соответствующим участком интактной Х-хромосомы, согласно этой трактовке, означают, что участок, вклю- ченный в Х-дупликацию, не имеет сайта рекрутирования DCC и, вместо этого, приобретает DCC за счет рас- пространения из соседних районов. Эти эксперименты позволили идентифицировать по крайней мере 13 участ- Рис. 15.5. Опосредованная DCC даун-регуляция Х-хромосом и локуса her-1 В соматических тканях гермафродита DCC уменьшает экс- прессию X наполовину и подавляет экспрессию her-1 в 20 раз. DCC собирается у животных XX. Он рекрутируется к узнаю- щим элементам и распространяется по обеим Х-хромосомам, уменьшая экспрессию многочисленных сцепленных с X генов вдвое. Он также связывается с участком аутосомного гена her-1, находящимся «вверх по течению», и уменьшает экспрессию в 20 раз (обозначается DCCH, чтобы показать, что комплекс, свя- зывающийся с her-l, не имеет белка DPY-21) (видоизменено, с любезного разрешения авторов, из Alekseyenko and Kuroda, 2004; иллюстрация Kathenne Sutliff[©AAAS]) ков, которые могут независимо рекрутировать DCC. и доказали, что DCC распространяется по Х-хромосоме (рис. 15.5) (Csankovszki et al., 2004). Некоторые из этих участков рекрутируют в сильной степени, другие — в слабой, заставляя предполагать либо присутствие варьирующего числа сайтов рекрутирования, либо при- сутствие сайтов с варьирующей способностью рекрути- ровать и (или) стимулировать распространение вдоль Х-хромосомы. Тестирование все более мелких участков сузило сайт рекрутирования DCC одного участка до 33 п.о. (Меуег, 2005). Эта последовательность длиной 33 п.о. является уникальной в геноме. Определение других минимальных сайтов рекрутирования — дело первосте- пенной важности. Другая важнейшая задача — выяснить, каким образом происходит распространение DCC из первоначальных сайтов рекрутирования. Распростра- нение может быть опосредовано кооперативными взаимодействиями между DCCs или же локальными видоизменениями хроматина в структуру, облегчающую связывание все бОлыпих количеств DCC в петле с поло- жительной обратной связью, как это было показано для распространения гетерохроматина у Schizosaccharomyces pombe (глава 8). 5. Эффекты DCC: даун-регуляция сцепленных с X генов и аутосомного гена her-1 Регулирование структуры хроматина для достижения скромного двукратного изменения экспрессии сцеплен- ных с X генов, как это происходит у червей и плодовых мушек, представляется, с механистической точки зре- ния, весьма интересным. У плодовых мушек модуляция экспрессии генов связана с определенными модифи- кациями гистонов и с утратой линкерного гистона из Х-хромосомы (см. Главу 16). В соматических клетках червей-гермафродитов не было отмечено никаких яв- ных различий ни в уровне, ни в спектре модификаций гистонов на двух Х-хромосомах с компенсацией дозы по сравнению с аутосомами. Млекопитающие, плодовые мушки и черви, по-видимому, приспособили разные предсуществовавшие системы для специализированной роли модуляторов экспрессии генов на Х-хромосоме. Млекопитающие адаптировали основанный на гетерох- роматине сайленсинг для инактивации одной из двух Х-хромосом у ХХ-пола. Плодовые мушки приспособили модифицирующую хроматин машинерию для изменения состояния единственной Х-хромосомы у животных XY, что приводит к ап-регуляции экспрессии генов. С. el- egans адаптировали механизм конденсации хромосом, используемый в митозе и мейозе, для даун-регуляции обеих Х-хромосом у ХХ-пола. Важнейшими вопросами являются механизм даун-регуляции у червей и то. каким образом она ограничена двукратными изменениями. При сходстве DCC и 13S комплекса конденсина ве- роятный механизм даун-регуляции экспрессии генов заключается в опосредованной DCC конденсации хро- матина. Это может ограничивать доступ РНК полиме-
7. Развитие зародышевого пути и сайленсинг Х-хромосомы разы и (или) транскрипционных факторов к премотор- ным районам, мешать продвижению РНК-полимеразы через транскрипционные единицы и (или) замедлять реинициацию транскрипции в каждом гене. Ключи к механизму репрессии могут оказаться в единственном аутосомном локусе her- 7, который является единствен- ной известной аутосомной мишенью DCC и который демонстрирует более экстремальную, 20-кратную даун- регуляцию экспрессии генов, опосредованную DCC (рис. 15.6) (Dawes et al., 1999; Chu et al., 2002). Репрессия her-1 стимулирует половое развитие по гермафродит- ному типу (рис. 15.4). Следовательно, DCC способен достигать в 10 раз большей репрессии в her-1, чем он до- стигает на Х-хромосомах. Одним известным различием между DCC, связанным с Х-хромосомами, и комплек- сом, связанным с her-1, является DPY-21. DPY-21 при- сутствует на Х-хромосомах, но не в локусе her-1 (Yonker and Меуег, 2003). 138-комплекс конденсина нужен для регулирования структуры хромосом в масштабах всего генома, чтобы облегчить сегрегацию хромосом. Адаптация и модифи- кация комплекса конденсина для формирования ВВС делают его эффекты более тонкими и сужают его регу- ляцию до (преимущественно) одной хромосомы. DCC с DPY-21 слабо репрессирует транскрипцию многих ге- нов на Х-хромосоме, тогда как DCC без DPY-21 каким- то образом сильно подавляет транскрипцию в локусе her-1. В будущем было бы крайне интересно проанали- зировать, каким образом разные комплексы конденсин/ DCC осуществляют свои различающиеся функции. 6. Регулирование Х-хромосом в зародышевом пути У С. elegans для регулирования экспрессии с Х-хромосом в зародышевом пути используются другие стратегии, чем в соматических тканях, поскольку соматический способ регуляции Х-хромосом (т.е. с помощью DCC) не дей- ствует в зародышевых клетках. Некоторые существенные компоненты соматического DCC не экспрессируются в зародышевой линии (например, SDC-2); другие же экспрессируются в зародышевых клетках, но обнаружи- ваются на всех хромосомах (например, MIX-1, DPY-26 и DPY-28). У С. elegans MIX-1, как упоминалось выше, является компонентом и DCC, и канонического ком- плекса конденсина. Согласно современным взглядам, конденсиноподобный комплекс был приспособлен к тому, чтобы играть специализированную специфич- ную для Х-хромосомы роль, но эта роль, по-видимому, осуществлялась лишь в соматических тканях. В зароды- шевом пути те белки DCC, которые экспрессируются, заняты, вероятно, на более общих ролях в митотической и мейотической организации и сегрегации хромосом. Отсутствие членов DCC в зародышевой линии ставит вопрос о том, действует ли в этой ткани какой-нибудь способ компенсации дозы. Напомним, что функция компенсации дозы заключается в том, чтобы достичь эк- вивалентной экспрессии сцепленных с X генов у обоих полов и обеспечить тем самым жизнеспособность и нор- мальное развитие. Современные данные позволяют пред- положить, что, в противоположность двукратной даун- регуляции обеих Х-хромосом в соматических клетках XX, Х-хромосомы глобально сайленсируются на большинстве стадий развития зародышевой линии как у животных XX, так и у животных ХО (рис. 15.6). Отсутствие транс- крипции с Х-хромосом в зародышевых клетках обоих по- лов, казалось бы, делает не нужной пол-специфическую регуляцию этой хромосомы. Тем не менее, существуют специфические механизмы, регулирующие Х-хромосомы в зародышевых клетках и, как подозревают, эти механиз- мы мало похожи по форме и функциям на соматические механизмы, уже описанные в этой главе. 7. Развитие зародышевого пути и сайленсинг Х-хромосомы У С. elegans взрослые гонады обоих полов содержат упо- рядоченный ряд последовательных стадий развития заро- дышевых клеток. Зародышевые клетки пролиферируют в дистальном участке, вступают в мейоз в средней части и завершают гаметогенез в проксимальном районе (рис. 15.1 и 15.7) (обзор см.: Schedl, 1997). У самцов ХО эта прогрессия имеет место в единственном тубулярном се- меннике, который постоянно производит сперму. У гер- мафродитов XX два тубулярных плеча гонады вначале, на поздней личиночной стадии, производят сперму, а затем, во взрослом состоянии, переключаются на производство ооцитов. Зрелые ооциты выталкиваются в сперматеки и оплодотворяются спермой, находясь здесь до последую- щей экструзии в матку. Таким образом, производство некоторого количества спермы червями XX делает воз- можным гермафродитный способ размножения взрослой особи. Однако яичник и некоторые другие соматические ткани у взрослых животных XX могут считаться по суще- ству женскими по своей идентичности и функции. Х-хромосомы в зародышевой линии сайленсируются и у гермафродитов XX. и у самцов ХО. Этот сайленсинг характеризуется такими репрессивными гистоновыми метками, как метилирование НЗК27; Х-хромосомы в за- родышевых клетках гермафродита особенно обогащены H3K27me3 (Bender et al., 2004). Имеет место также от- сутствие ацетилирования гистонов, обычно связанное с активным хроматином, и метилирование НЗК4, ко- торое, как показывает иммунофлуоресцентный анализ (рис. 15.7), коррелирует с активно транскрибируемыми районами (Kelly et al., 2002). Сайленсинг Х-хромосомы в зародышевой линии С. elegans достигается преиму- щественно с помощью двух механизмов, обсуждаемых ниже (рис. 15.6). Первый работает посредством мейоти- ческого сайленсинга неспаренной ДНК (MSUD), кото- рый включает единственную Х-хромосому у животных ХО. Второй механизм работает посредством модифи- каций гистонов, опосредованных белками MES; этот механизм сайленсинга наиболее интенсивно изучал- ся у животных XX, но, вероятно, действует и у живот- ных ХО. У ранних эмбрионов сайленсинг отцовской Х-хромосомы сохраняется на протяжении нескольких клеточных циклов после оплодотворения и обознача- ется как сайленсинг импринтированной Х-хромосомы (imprinted X silencing) (рис. 15.6).
Глава 15. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans Одноклеточный зародыш Сперматогенез Хр неактивна Хт неактивна Хр неактивна Эмбрион на стадии 2-24 клеток Оогенез Хт активна Митоз Обе Х-хромосомы неактивны Аутосомы активны MES Хт активна Хр неактивна РЕГУЛЯЦИЯ Х-ХРОМОСОМЫ В ЖИЗНЕННОМ ЦИКЛЕ ГЕРМАФРОДИТА Образующаяся зародышевая линия I - Инактивация импринтированной Хр DC Опосредованная DCC даун-регуляция " Х-хромосомы MES -Опосредованный MES сайленсингХ-хромосомы Хт неактивна Хр неактивна Аутосомы неактивны MES Более поздний эмбрион зародышевая линия Ранний эмбрион Хт активна Хр активна Хт|50% Хр <50 % DC MSUD - Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК Рис. 15.6. Регуляция Х-хромосом в жизненном цикле гермафродита XX Этот рисунок иллюстрирует, что Х-хромосомы регулируются разными механизмами на разных стадиях и в разных тканях: инак- тивация импринтированной X (I) отцовской Х-хромосомы у раннего эмбриона, компенсация дозы (DC) в соматических тканях эмбрионов и червей 30-клеточной и более поздних стадий и опосредованный MES сайленсинг в зародышевом пути. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК (MSUD) также происходит в зародышевой линии; это сайленсирует единственную Х-хромосому у самцов ХО 8. Единственная Х-хромосома у самцов обнаруживает метки гетерохроматина Самое раннее предположение, что в зародышевой линии Х-хромосома отличается от аутосом, вытекает из цито- логических наблюдений. Единственная Х-хромосома у червей-самцов приобретает характерную структуру во время пахитены в мейотической профазе — она ги- перконденсируется, формируя шаровидную структуру, напоминающую «половое тельце» XY, видимое во время мужского мейоза у млекопитающих (Goldstein and Slaton, 1982; Handel, 2004). Аутосомы конденсируются позже в мейотической профазе, близко к началу сперматогенеза. Преждевременная конденсация Х-хромосомы также видна во время мужского мейоза у гермафродитов XX и у сексуально трансформированных самцов XX; это по- зволяет предполагать, что преждевременная конденсация Х-хромосомы происходит в ответ на пол зародышевой клетки, а не на статус плоидности или спаренности Х-хромосомы. Соответственно, у гермафродитов XX зародышевые клетки, предназначенные для оогене- за, не обнаруживают преждевременной конденсации Х-хромосомы В дополнение к преждевременной конденсации единственная Х-хромосома у самцов ХО временно ак- кумулирует заметные количества НЗК9ше2, которые появляются во время пахитены и исчезают в диплотене (рис. 15.7) (Kelly et al., 2002). Это обогащение H3K9me2 не происходит в ходе сперматогенеза XX, как у гермаф- родитов, так и у трансформированных самцов XX. Од- нако обогащение Х-хромосомы НЗК9ше2 наблюдается в оогониях, проходящих стадию пахитены у трансфор- мированных по полу гермафродитов ХО, причем ди- намика этого процесса сходна с таковой у самцов ХО (Bean et al., 2004). Специфичное приобретение метки гетерохроматина на Х-хромосоме в мейозе ХО оказы- вается, таким образом, следствием ее неспаренного статуса, а не пола данной зародышевой линии, через которую она проходит. «Нацеливание» НЗК9ше2 на неспаренную ДНК не ограничивается нуклеотидными последовательностями Х-хромосомы; оно обнаружива- ется также на неспаренных аутосомных фрагментах и транслокациях (Bean et al., 2004). Такая «нацеливаемая» репрессия неспаренной ДНК в мейозе имеет место не только у С. elegans. Подобное распознавание и репрессия неспаренной ДНК про- исходят во время мейоза и у других организмов, в том числе у Neurospora и мыши. Это явление обозначается как MSUD (meiotic silencing of unpaired DNA — мейоти- ческий сайленсинг неспаренной ДНК) (Shiu et al., 2001; Baarends et al., 2005; Turner, 2005; Turner et al., 2005). У мышей, например, «половое тельце» XY со слабым си- напсом во время мужского мейоза аналогичным обра- зом обогащено НЗК9ше2, и это является следствием его неспаренного состояния (Cowell et al., 2002; Turner et al., 2005). Мейотический сайленсинг у Neurospora
8. Единственная Х-хромосома у самцов обнаруживает метки гетерохроматина Район Переходная Пахитена Диплотена Диакинез Сперматиды митозов зона Ооциты Метки хроматина на Х-хромосомах Эмбрионы НЗКЭте НЗК27теЗ НЗК4те XX Нет MSUD MES-сайленсинг Активация Х-хромосомы Район Переходная Пахитена Диплотена Мейотические Сперматиды митозов зона деления Метки хроматина на Х-хромосоме ----------- НЗКЭте НЗК27теЗ НЗК4те MSUD MES-сайленсинг «Молчащая» Х-хромосома Рис. 15.7. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом во время развития зародышевых клеток У обоих полов зардышевые клетки проходят митоз (слева), вступают в мейоз в переходной зоне и проходят профазу мейоза I. У обоих полов клетки, предназначенные для формирования спермы, завершают мейотические деления в гонаде. У гермафродитов клетки, предназначенные для формирования ооцитов, проходят через мейотическую профазу в гонаде и завершают мейотические деления после овуляции и оплодотворения. Присутствие разнообразных модификаций гистонов на Х-хромосоме (Х-хромосомах) в зародышевых клетках показано красными (для репрессивных модификаций) и зелеными (для активирующих модификаций) полосками. Как показано на врезках справа, антитела к конкретным модификациям гистонов показывают, что Х-хромосомы в зародышевых ядрах маркируются иначе, чем аутосомы, и сайленсированы. НЗК4те2 (зеленый цвет), метка активно экспресси- руемого хроматина, отсутствует в Х-хромосомах пахитенных ядер XX. НЗК9те2 (зеленый цвет), метка гетерохроматина, сконцен- трирован на Х-хромосоме в пахитенных ядрах ХО. ДНК окрашивается красным цветом. Стрелки указывают репрезентативные Х-хромосомы на каждом изображении требует активности белков с консервативными роля- ми в РНК-интерференции (RNAi). В их число входят РНК-направляемая РНК-полимераза (RdRP), белок, родственный белку Argonaute (консервативный компо- нент инуцируемых РНК сайленсирующих комплексов, RISCs) и нуклеаза Dicer (обзор см. Nakayashiki, 2005; см. главу 8). У С. elegans обогащение НЗК9те2 на не- спаренной ДНК нуждается в EGO-1, RdRP, которая ограничена зародышевой линией, но не требует Dicer (Maine et al., 2005). Это заставляет предполагать, что в то время как имеет место консерватизм мейотического сайленсинга (репрессии неспаренной ДНК), механизм, с помощью которого это достигается, мог по-разному развиваться у разных организмов. В противоположность тому, что происходит в мей- озе самцов ХО, Х-хромосомы либо в сперматогони- ях XX, либо в оогониях XX не накапливают НЗК9те2 в сколько-нибудь заметных количествах. Это раз- личие обусловлено, вероятно, полным синапсисом Х-хромосом в мейозе гермафродитов. Почему сайлен- синг неспаренных ДНК обычно оказывается консер- вативной чертой полового воспроизведения? У многих организмов спаривание гомологов ограничено исклю- чительно мейозом, и во время синапсиса новые вставки, уникальные для одного из гомологов, экспонировались бы как участки неспаренной ДНК. Предположили, что распознавание и сайленсинг неспаренных последова- тельностей во время мейоза обеспечивают механизм для самосканирования (self-scanning) диплоидного ге- нома и могли бы обеспечить защиту против инвазии (или экспансии) перемещаемых элементов. Как еще одно следствие, следует отметить, что гены, экспрес- сируемые во время мейоза, сталкивались бы с сильным отбором против нахождения их на неспаренной хромо- соме (такой, как Х-хромосома самца). Такой отбор при- водил бы к формированию уникального генетического профиля Х-хромосомы, наблюдаемого у С. elegans. Ин- тересно пофантазировать на тему о том, что геномная война между транспозонами и их хозяевами и эпигене- тические механизмы, развившиеся как оружие в этой битве, сформировали геномы и привели к генетической изменчивости. Эта генетическая изменчивость, в свою очередь, могла создать дефекты спаривания, достаточ- ные для включения мейотического сайленсинга суще- ственных локусов и, отсюда, мейотической несовме- стимости. Таким путем эпигенетический сайленсинг
Глава 15 Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans во время мейоза теоретически мог внести свой вклад в репродуктивную изоляцию и видообразование. 9. Влияние MSUD на паттерны экспрессии генов в зародышевом пути Исследования транскрипции в зародышевой линии в масштабах экспрессии всего генома показали, что име- ется замечательная разница в профилях накопления иРНК с генов, картирующихся на Х-хромосоме, по сравнению с генами аутосом (Reinke et al., 2000, 2004). Гены, необходимые для сперматогенеза, а также общие, или «внутренние» («intrinsic») гены, экспрессируемые в зародышевой линии, явно «недопредставлены» в Х-хромосоме. Гены с увеличенной экспрессией в за- родышевых линиях оогенеза также «недопредставле- ны» в Х-хромосоме, но не до такой степени, как гены сперматогенеза или «внутренние» гены зародышевой линии. Другими словами, гены, которые необходимы для жизнеспособности и функционирования зародышевых клеток, по большей части в Х-хромосоме отсутствуют. Действительно, большинство генов, связанных с ооге- незом и находящихся в Х-хромосоме, демонстрируют экспрессию на поздних стадиях мейоза, что коррелирует с активацией Х-хромосомы (рис. 15.6и15.7).О поздней мейотической активации свидетельствует накопление «активирующих» модификаций гистонов к концу па- хитены, в том числе ацетилирование НЗ и Н4 и мети- лирование НЗК4Ю до уровней, сравнимых с уровнями, которые наблюдаются в аутосомах (Kelly et al., 2002). Это позволяет предполагать, что тенденция к тому, чтобы гены не локализовались в Х-хромосоме, наиболее выра- жена для тех из них, которые функционируют на ранних стадиях развития зародышевых клеток, общих для обоих полов. Кроме того, идентифицировали ряд дупликаций генов с паралогами Х/аутосома, в которых аутосомная копия однозначно требовалась для функционирования зародышевых клеток. В этих примерах сцепленная с X копия функционирует в соматических линиях, но не требуется в зародышевых клетках, в которых активна ау- тосомная копия (Maciejowski et al., 2005). В совокупности вышеописанные данные позволяют предполагать, что Х-хромосома является недружелюбной средой для генов с функциями, существенными для ранних зародышевых клеток у обоих полов. Гены, которые требуются лишь во время позднего оогенеза (т.е. требующиеся только в жен- ских зародышевых клетках поздних стадий; рис. 15.2), были бы иммунными к давлению отбора, вызываемому асинапсисом в мужских зародышевых клетках, и таким образом их сцепление с X было бы возможным. Гены С. elegans с функциями, существенными для ран- них стадий зародышевой линии, очевидно были исклю- чены из Х-хромосомы. были утеряны из Х-хромосомы или подверглись дупликации, после чего зародышевая линия зависела уже от аутосомной копии. Последнее предполагает возможный путь для эволюции уникаль- ного генетического профиля Х-хромосомы. Аналогич- ные силы, по-видимому, действуют на сцепленные с X гены и у других видов, в том числе у плодовой мушки и у млекопитающих (Wu and Xu, 2003). Однако в настоящее время мы не понимаем механизмы, удаляющие гены за- родышевой линии из Х-хромосомы. 10. Регуляция сайленсинга Х-хромосомы модификаторами гистонов MES В предыдущем разделе описывалась репрессия посред- ством формирования гетерохроматина, специфичная для единственной Х-хромосомы у самцов ХО и ограниченная стадией пахитены мейоза благодаря MSUD. Каким об- разом Х-хромосомы поддерживаются в репрессирован- ном состоянии хроматина на протяжении других стадий развития зародышевой линии и у гермафродитов XX? Генетический скрининг мутантов со стерильностью, обусловленной материнским эффектом (mes — maternal- effect sterile), выявил группу из четырех генов mes, кото- рые участвуют в сайленсинге Х-хромосомы у животных XX, а также, вероятно, и у животных ХО. Совместное применение генетического и молекулярного анализа показало, что кодируемые белки MES влияют на сайлен- синг, регулируя часть спектра модификаций гистонов, обнаруживаемого на Х-хромосомах в зародышевых клетках. Их функции существенны для выживания и развития зародышевых клеток. Три белка MES — MES-2, MES-3 и MES-6 — функ- ционируют вместе в составе комплекса, похожего на Репрессивный Комплекс Polycomb (PRC2 у плодовой мушки и позвоночных (см. Xu et al., 2001; Bender et al., 2004; Ketel et al., 2005; глава 11). MES-2 и MES-6 червей — это ортологи двух субъединиц PRC2, E(Z) (Enhancer of zeste) и ESC (Extra sex combs) (табл. 15.1). E(Z) и ESC, во взаимодействии по крайней мере с двумя другими партнерами, катализируют метилирование НЗК27 ги- стона, которое, как упомянуто выше, является репрес- сивной модификацией гистонов. Аналогично этому, MES-2 и MES-6, в комплексе с новым белком MES-3, опосредуют метилирование НЗК27 (рис. 15.8). Домен SET белка MES-2 ответствен за метилтрансферазную (НКМТ) активность в отношении лизинов гистонов, тогда как MES-6 и MES-3 оказываются необходимыми либо для связывания с субстратом, либо для усиления каталитической активности. MES-2, MES-3 и MES-6 ответственны за все выявляемое ди- и триметилирова- ние по НЗК27 (НЗК27те2 и НЗК27теЗ) в большинстве районов зародышевой линии и у ранних эмбрионов, но еще одна НКМТ катализирует это метилирование в соматических тканях. Важно отметить, что в пределах зародышевой линии содержание полностью репрессив- ной метки, НЗК27шеЗ, в Х-хромосомах повышено (рис. 15.8) (Bender et al., 2004). Одним из последствий уни- чтожения метилирования НЗК27 в зародышевой линии является активация генов на Х-хромосоме; у мутантов mes-2, mes-З или mes-6 Х-хромосомы в зародышевой линии гермафродитов не имеют НЗК27те, приобрета- ют метки активного хроматина (например, НЗК4те и
10. Регуляция сайленсинга Х-хромосомы модификаторами гистонов Рис. 15.8. Модель, показывающая, каким образом MES- 2/3/6 и MES-4 участвуют в сайленсинге Х-хромосомы в зародышевой линии Комплекс MES-2/3/6 концентрирует метку репрес- сивного хроматина (НЗК27теЗ) на Х-хромосомах и отталкивает MES-4 от Х-хромосом. MES-4 кон- центрирует другую метку хроматина (H3K36me2) на аутосомах и, как предполагается, отталкивает неиз- вестный репрессор (желтый шестиугольник), помогая тем самым сфокусировать действие этого репрессора на Х-хромосомах. Результатом оказывается сайленсинг Х-хромосом в результате совместного действия репрес- сора «желтый шестиугольник» и катализируемого MES- 2/3/6 репрессивного метилирования гистонов Н4К12ас) и декорируются транскрипционно активной формой РНК-полимеразы (Fong et al., 2002; Bender et aL, 2004). Эти данные позволяют предположить, что комплекс MES-2/3/6 участвует, возможно даже непо- средственно, в сайленсинге Х-хромосом в зародыше- вой линии червей. Действительно, предполагается, что десайленсинг Х-хромосом является причиной дегене- рации зародышевой линии, наблюдаемой у гермаф- родитов мутантов mes. Аналогично участию MES-2 и MES-6 в сайленсинге Х-хромосом зародышевой линии гомологи MES-2 и MES-6 у позвоночных участвуют в инактивации соматической Х-хромосомы у животных XX (главы 11 и 17). Каким образом комплекс MES-2/3/6 «нацеливает- ся» на участки ДНК, предназначенные для репресси- рования, и как метилирование НЗК27 подавляет экс- прессию генов? Ответы на эти вопросы мы получаем на Drosophila (глава 11). У мух комплекс E(Z)/ESC ре- крутируется связывающимся с ДНК белком РНО к определенным сайтам, называемым элементами ответа Polycomb (PREs — Polycomb Response Elements) (Wang et al., 2004). После того как этот комплекс локально метилирует НЗК27, репрессия генов опосредуется, по крайней мере частично, рекрутированием репрессив- ного комплекса Polycomb 1 (PRC1) к H3K27me (Wang et al., 2004). Удивительно, что геном С. elegans не со- держит явных гомологов pho или большинства генов, кодирующих PRC1. Поэтому «нацеливание» комплекса MES-2/3/6 и то, как он достигает репрессии, связано, вероятно, со стратегиями, отличающимися от тех, что используются у Drosophila. Четвертым белком MES, участвующим в репрессии Х-хромосомы в зародышевой линии, является MES-4. Его распределение является нестандартным для связан- ных с хромосомой белков и полностью противополож- но тому, что можно было бы ожидать. В противополож- ность другим белкам MES, MES-4 связывается с пятью аутосомами, в виде бэндов, и совершенно отсутствует на большей части длины Х-хромосомы (рис. 15.8) (Fong et al., 2004). MES-4, подобно MES-2, содержит домен SET и тоже обладает активностью НКМТ (Bender et aL, 2006). Он отвечает за большую часть выявляемого ди- метилирования H3K36 (H3K36me2) в зародышевой ли- нии и у ранних эмбрионов. Как позволяет предсказать связь MES-4 с аутосомами, H3K36me2 заметно кон- центрируется на аутосомах. В соматических тканях и у эмбрионов на поздних стадиях развития за метилиро- вание H3K36 отвечает другая НКМТ. Эта последняя ак- тивность оказывается связанной с транскрипционной элонгацией, как и в случае дрожжей. Опосредованное MES-4 метилирование H3K36 на аутосомах не зависит от транскрипции и, вероятно, играет другую, нужную для зародышевой лини, эпигенетическую роль (Bender et aL, 2006). Ключевые нерешенные моменты определяют, каким образом MES-4 «нацеливается» на аутосомы и какую роль он там играет. Интересно, что исключение MES- 4 из Х-хромосом требует MES-2, MES-З и MES-6 (рис. 15.8); в отсутствие любого из этих белков MES MES-4 распространяется на X (Fong et aL, 2002). Полагают, что нормальная концентрация MES-4 на аутосомах уча- ствует в сайленсировании генов на X. Одна из моделей заключается в том, что MES-4 и (или) его метильная метка (H3R36me2) отталкивает глобальные репрессоры хроматина (желтые шестиугольники на рис. 15.8) с ау- тосом и таким образом фокусирует действие репрессо- ров на Х-хромосомах (Fong et aL, 2002). Утрата MES-4 вытитровывала бы эти репрессоры с Х-хромосомы на аутосомные районы, и это приводило бы к десаилен- сингу X. Комплекс MES-2/3/6 является логическим кандидатом на роль отталкиваемого MES-4 репрессора Однако распределение метилирования НЗК27, катали- зируемого MES-2/3/6, не изменяется видимым обра- зом у мутантов mes-4. Поэтому продолжаются поиски других репрессоров, которые могут принимать в этом участие. Эта модель действия MES-4 сходна с моделью «приобретения специфичности через предотвращение неоднородности» («gaining specificity by preventing pro- miscuity»), предложенной для Doti Saccharomyces cerevi- siae (van Leeuwen and Gottschling, 2002). Полагают, что опосредованное Doti метилирование H3K79 по хромо- сомам отталкивает репрессоры Sir и помогает сфоку- сировать их действие на теломерах. Утрата Doti делает возможным распространение Sirs от теломер и приво- дит к десайленсингу теломер. Фенотип mes представляет собой превосходный пример эпигенетического феномена с прямой связью с модификациями гистонов. Мутация, связанная с ма- теринским эффектом, определяется как такая мутация, мутантный фенотип которой не выявляется у гомози-
Глава 15. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans готных мутантов первого поколения, но зато обнару- живается у их потомства. В случае мутантов mes/mes первого поколения присутствие некоторых количеств продукта MES дикого типа, продуцируемых матерью mes/+ и упакованных в ооцит, достаточно для долж- ной экспансии двух примордиальных клеток в более чем тысячу полностью функциональных зародышевых клеток. Однако зародышевые клетки у этих фертиль- ных червей mes/mes не могут продуцировать функцио- нальный продукт MES для своего потомства. В резуль- тате у этого потомства примордиальные зародышевые клетки претерпевают незначительную пролиферацию и дегенерируют. Активности НКМТ, кодируемые mes-2 и mes-4, должны устанавливать наследуемое состояние хроматина, которое соответствующим образом под- держивается в многочисленных потомках двух перво- начальных примордиальных зародышевых клеток. Со- временная модель функционирования белка MES (рис. 15.8) сводится к тому, что MES-2, MES-3 и MES-6 дей- ствуют в комплексе и концентрируют репрессивную модификацию хроматина (НЗК27те) на Х-хромосомах в зародышевой линии и непосредственно участвуют в сайленсинге Х-хромосомы. Их активность отталкивает также MES-4 от X. В результате MES-4 покрывает ауто- сомы НЗКЗбте и модифицирует их — предполагается, что их активность отталкивает репрессивную актив- ность и помогает сфокусировать ее на X. Полагают, что эта система MES действует эпигенетически в зароды- шевой линии матери и в ранних эмбрионах и устанав- ливает домены хроматина, которые должным образом маркированы для последующей экспрессии (аутосом- ные районы) или сайленсинга (Х-хромосомы) в ходе развития зародышевой линии у личинок (см. рис. 15.6). Утрата этой системы MES ведет к гибели зародышевой линии и стерильности, вероятно благодаря, по крайней мере отчасти, десайленсингу Х-хромосом. 11. Х-хромосома спермия импринтирована Геномы, привнесенные разными гаметами, поступа- ют в зиготу с весьма различными эпигенетическими историями (рис. 15.6). Хотя Х-хромосома неактивна на ранних стадиях зародышевых клеток у обоих полов, в оогенезе эта X становится функционально активной (Fong et al. , 2002; Kelly et al., 2002). Напротив, в ходе мужского мейоза Х-хромосома никогда не активиру- ется, подвержена преждевременной конденсации и в мейозе особей ХО дополнительно обогащена НЗК9ше2 (рис. 15.7) (Kelly et al., 2002; Bean et al., 2004). Во время сперматогенеза модификации гистонов прогрессивно утрачиваются со всех хромосом по мере того, как они вступают в мейотические деления и становятся гипер- конденсированными для упаковки в сперматиды (рис. 15.7). Предполагают, что гиперконденсация обусловлена замещением гистонов специализированными, сильно основными белками, называемыми протаминами, как это происходит и у других организмов, хотя еще и не показано у червей. Таким образом, геном спермия посту- пает в яйцеклетку в основном лишенным модификаций гистонов (и, вероятно, лишенным самих гистонов). Это контрастирует с хроматином ооцита, который продолжа- ет демонстрировать значительные уровни большинства активирующих модификаций гистонов даже во время конденсации хромосом в диакинезе (рис. 15.7). Важно отметить, что РНК-полимераза отсутствует на ДНК во время созревания ооцитов и, следовательно, моди- фикации гистонов, сохраняемые хроматином, могут отражать скорее транскрипционный «потенциал», чем транскрипционную активность. Таким образом, зигота наследует два эпигенетически различных генома и, в частности, две Х-хромосомы с очень разными транс- крипционными историями — недавно активную, про- исходящую из ооцита Хш, и происходящую от спермия Хр с незначительной или вовсе никакой транскрипци- онной активностью в недавнем прошлом. Отметим, что благодаря гермафродитному способу воспроизведения С. elegans и способности гермафродитов спариваться с самцами потомки XX могут унаследовать Хр от своего родителя XX или от родителя ХО. Вскоре после вхождения в ооцит ДНК спермия одно- временно накапливает модификации гистонов и начи- нает деконденсироваться, образуя мужской пронуклеус. У эмбрионов XX хроматин Хр, в отличие от аутосом, не накапливает во время деконденсации ацетилирование гистона НЗ или НЗК4ше2 (рис. 15.6) (Bean et al., 2004). Однако между Хр и аутосомами нет различий в модифи- кациях гистона Н4. В пронуклеусе ооцита все хромосо- мы, включая Хш, модифицированы сходным образом и остаются такими в ходе всего эмбриогенеза. Удивитель- но, что специфичное для Хр отсутствие модификаций НЗ поддерживается после репликации ДНК и пережива- ет множественные циклы клеточных делений, а потому было названо «эпигенетическим импринтом». Однако постепенно этот импринт утрачивается; иначе говоря, на Хр все более и более начинают выявляться специфичные для НЗ модификации, пока не исчезнут какие-либо яв- ные различия между Хр и другими хромосомами в уровне НЗК4те2 (рис. 15.6). Природа этого импринта пока еще не известна, но его постепенная реверсия на протяже- нии нескольких циклов клеточных делений согласуется с разбавлением этой метки, связанным с репликацией. Поскольку отсутствие модификаций ограничено специ- фичными для гистона НЗ добавками, можно предполо- жить, что то, что замещается, является специфичной для Хр (или более многочисленной в Хр) молекулой, подоб- ной НЗ, которая либо не модифицирована, либо не спо- собна к модификации; например, это мог бы быть вари- ант гистона НЗ. Состав и структура хроматина во время сперматогенеза в настоящее время исследуются. Этот импринт Хр у эмбрионов XX выявляется как у потомства от скрещиваний (когда сперма происходит от родителя ХО), так и в потомстве от самооплодот- ворения (когда сперма происходит от родителя XX) Статус спаривания Х-хромосомы в ходе сперматоге- неза и, таким образом, «нацеливание» НЗК9ше2 на Х-хромосому и ее обогащение этой модификацией не играют, следовательно, явной роли в установлении им- принта Хр. Однако стабильность этого импринта — то есть число клеточных делений, после которых его все
12. Заключительные замечания еще можно легко наблюдать — существенно увеличи- вается в потомстве от спермы, происходящей от роди- теля ХО, по сравнению со спермой, происходящей от родителя XX (Bean et aL, 2004). Следовательно, сборка гетерохроматина на неспаренной ДНК во время мейоза имеет последствия, которые сохраняются на протяже- нии ранних эмбриональных стадий. Важно отметить, что у млекопитающих наблюдается консерватизм как базирующегося на спаривании мейотического сайлен- синга, так и инактивации импринтированной Хр, как это обсуждается в главе 17. Биохимическая основа этого импринта и его эффек- тов неизвестна. В противоположность тому, что имеет место у млекопитающих, последствия унаследования обеих Х-хромосом с таким импринтом или без него у червей не очевидны. В самом деле, давно считалось, что генетический импринтинг per se (детально рассмо- тренный в главе 19) у С. elegans отсутствует, поскольку однородительское наследование любой хромосомы не имеет никаких явных последствий для развития и жиз- неспособности. Сообщалось, однако, что Хр предпо- чтительно и часто теряется в ходе раннего развития в условиях стресса (Prahlad et al., 2003), хотя нет никаких данных о механизме, который мог бы вызывать столь необычное хромосомное поведение. У многих организ- мов обнаруживается предпочтительная утеря унаследо- ванных от отца хромосом, а в крайних случаях во время эмбрионального развития утрачивается весь отцовский геном (Goday and Esteban, 2001) Описание таких рез- ких различий в регулировании генома, основанных ис- ключительно на поле родителя, от которого происходит данный генетический вклад, дало начало оригинальной концепции генетического импринтинга (обзор см.: Нег- nck and Seger, 1999). Имеет ли это отношение к эпиге- нетическому импринтингу, наблюдаемому у С. elegans, предстоит еще выяснить. Хр оказывается неактивной в ранних эмбрионах XX, тем не менее никогда не сообщалось о каких-либо вред- ных последствиях патроклинного наследования X (т.е. у животных ХрХр; Haack and Hodgkin, 1991) Уникальный генетический состав Х-хромосомы может помочь объ- яснить, почему однородительское наследование у С. el- egans не является явно вредным. Кроме малого количе- ства спермы и экспрессируемых только в зародышевой линии локусов на Х-хромосоме гены, кодирующие ран- ние зиготические транскрипты, и гены, требующиеся для раннего эмбрионального развития, также резко «недопредставлены» на Х-хромосоме (Piano et al., 2000; Baugh et al., 2003). Таким образом, большинство генов, продукты которых являются существенными для самых ранних стадий, на протяжении которых Хр является не- активной, вряд ли находятся на X, тем самым оставляя Х-специфичное однородительское наследование без последствий в генетических тестах. Однако инактивация Хр позволяет понять, почему активация соматической компенсации дозы не полно- стью задействована у ранних эмбрионов. Сборка ком- понентов DCC на Х-хромосомах у эмбрионов XX не выявляется с помощью окраски антителами приблизи- тельно до 30-клеточной стадии. Это происходит вскоре после того, как Хр становится полностью декорирован- ной модификациями НЗ и, таким образом, предполо- жительно является полностью активированной Акти- вация соматической компенсации дозы чувствительна к уровням содержания сцепленных с X продуктов, назы- ваемых сигнальными элементами Х-хромосомы (XSEs— X signal elements), составляющей часть X соотношения Х:А. Полная или частичная репрессия этих элементов на Хр может сделать ранний эмбрион функционально ХО (т.е. отношение Х:А интерпретируется как равное 0,5). По мере того как Хр реактивируется в ходе все воз- растающего числа клеточных делений, уровень транс- крипции Х-хромосомы может, наконец, достичь кри- тического порога, при котором ощущается доза, равная двум Х-хромосомам, и X: А равняется 1, включая каскад компенсации дозы. Можно рассматривать это как пере- ключение с материнского/отцовского контроля ком- пенсации дозы на зиготический контроль. 12. Заключительные замечания В этой точке мы прошли полный круг в отношении специализированного регулирования сцепленных с X локусов у С. elegans. Предполагается, что специальная регуляция дозы этой хромосомы в соматических клет- ках возникла из различия в плоидности Х-хромосомы между двумя полами, как это произошло и у других ви- дов. Интересно, что зародышевая линия и сома у червей развили различные механизмы, чтобы справиться с этим различием в плоидности X, что может отражать различ- ные требования к экспрессии генов Х-хромосомы в этих тканях. В соматических линиях консервативный ком- плекс, который в норме используется для конденсации и сегрегации хроматина в митозе и мейозе, оказывается кооптированным и приспособленным для замечательно специфичной двукратной репрессии обеих Х-хромосом у животных XX. Хотя и привлекательно, в концептуальном отношении, представить себе дело так, что «неэффек- тивный» комплекс конденсина мог бы послужить для снижения транскрипционной эффективности вдвое, в настоящее время непонятно, каким образом эта репрес- сия ограничивается двукратным снижением. В зародышевой линии Х-хромосомы глобально сай- ленсированы на ранних стадиях развития зародышевых клеток у животных XX и на всех стадиях развития за- родышевых клеток у животных ХО. Система модифи- каторов хроматина MES участвует в этом сайленсинге у животных XX и, возможно, у животных ХО. Такой сай- ленсинг допускается отчасти потому, что Х-хромосомы «недонаселены» генами, экспрессируемыми в зароды- шевой линии. Полагают, что эта малочисленность сце- пленных с X генов, существенных для мейоза у обоих полов, возникла в результате отсутствия партнера по спариванию для Х-хромосомы в ходе мужского мейоза и как следствие репрессивных механизмов защиты ге- нома, которые «нацеливают» неспаренные хромосом- ные сегменты. Следствием глобального сайленсинга Х-хромосомы в зародышевой линии является то, что разница в плоидности X между полами имеет мало зна- чения для этой ткани. Если каким-то сцепленным с X
Глава 15. Эпигенетическая регуляция Х-хромосом у С. elegans генам, которые работают у обоих полов, фактически удается избежать сайленсинга, тогда возникает вопрос о том, действительно ли зародышевая линия уравнива- ет свою экспрессию у животных XX в сопоставлении с животными ХО. Ответ на этот вопрос неизвестен. Вы- равнивание в зародышевой линии было бы связано, ве- роятно, с иным, чем DCC, механизмом, который дей- ствует в соматических тканях. Зародышевая линия и сома различаются во многих фундаментальных отношениях, и в этой главе освещена различная регуляция Х-хромосомы в них. Одной из воз- никших интересных тем является кооптация различных предсуществовавших механизмов, таких как использо- вание комплекса, родственного конденсину, для тон- кой даун-регуляции экспрессии Х-хромосомы в соме в сравнении с использованием комплекса, родственного PRC2, для сайленсирования Х-хромосом в зародышевой линии. Полагают, что гетерохроматинизация единствен- ной Х-хромосомы у самцов резко изменила «представлен- ность» генов на Х-хромосоме, так что гены, необходимые для общих функций зародышевой линии и раннего эм- брионального развития, существенно «недопредставле- ны» на этой хромосоме. Х-хромосома и ее регулирование у С. elegans представляют, таким образом, интересный срез эпигенетической регуляции целых хромосом, ее влияния на эволюцию генома и реакций на эту эволюцию. Литература Alekseyenko A.A. and Kuroda M.I., 2004. Filling gaps in genome organization. Science 3^3'. 1148-1149. Baarends W.M., Wassenaar E., van der Laan R., Hoogerbrugge J., Sleddens-Linkels E., Hoeijmakers J.H., de Boer P., and Groote- goed J.A., 2005. Silencing of unpaired chromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis. Mol. Cell. Biol. 25: 1041-1053. Baugh L.R.. Hill A.A., Slonim D.K., Brown E.L., and Hunter C.P., 2003. Composition and dynamics of the Caenorhabditis elegans early embryonic transcriptome. Development 130: 889-900. Bean C.J., Schaner C.E., and Kelly W.G., 2004. Meiotic pairing and imprinted X chromatin assembly in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 36: 100-105. Bender L.B., Cao R., Zhang Y, and Strome S., 2004. The MES-2/ MES-3/MES-6 complex and regulation of histone H3 methyla- tion in C. elegans. Curr. Biol 14: 1639-1643. Bender L.B., Suth J.. Carroll C.R.. Fong Y, Fingerman I.M.. Cao R., Zhang Y, Briggs S.D., Reinke V., and Strome S., 2006. MES-4, an autosome-associated histone methyltransferase that participates in silencing the X chromosomes in the C. elegans germ line. Development. (In press.) Carmi I., Kopczynski J.B., and Meyer В J., 1998. The nuclear hor- mone receptor SEX-1 is an X-chromosome signal that determines nematode sex. Nature 396: 168-173. Chu D.S., Dawes H.E., Lieb J.D., Chan R.C., Kuo A.F., and Meyer B.J., 2002. A molecular link between gene-specific and chromo- some-wide transcriptional repression. Genes Dev. 16: 796-805. Cowell I.G., Aucott R., Mahadevaiah S.K., Burgoyne P.S., Huskisson N., Bongiomi S., Prantera G., Fanti L., Pimpinelli S., Wu R., et al., 2002. Heterochromatin, HP1 and methylation at lysine 9 of histone H3 in animals. Chromosoma 111: 22-36. Csankovszki G., McDonel P, and Meyer B.J.. 2004. Recruitment and spreading of the C. elegans dosage compensation complex along X chromosomes. Science 303: 1182-1185. Dawes H.E., Berlin D.S., Lapidus D.M., Nusbaum C, Davis T.L., and Meyer В J., 1999. Dosage compensation proteins targeted to X chromosomes by a determinant of hermaphrodite fate. Science 284: 1800-1804. Fong Y, Bender L., Wang W, and Strome S., 2002. Regulation of the different chromatin states of autosomes and X chromosomes in the germline of C. elegans. Science 296: 2235-2238. Goday C. and Esteban M.R., 2001. Chromosome elimination in sciarid flies. BioEssays 23: 242-250. Goldstein P. and Slaton D.E., 1982. The synaptonemal complexes of Caenorhabditis elegans: Comparison of wild-type and mutant strains and pachytene karyotype analysis of wild-type. Chromo- soma 84:585-597. Haack H. and Hodgkin J., 1991. Tests for parental imprinting in the nematode Caenorhabditis elegans. Mol. Gen. Genet. 228:482-485. Handel M.A., 2004. The XYbody: a specialized meiotic chromatin domain. Exp. Cell Res. 296: 57-63. Hansen D., Hubbard E.J.A., and Schedl T, 2004. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev. Biol. 268: 342-357. Herrick G. and Seger J., 1999. Imprinting and paternal genome elimination in insects. Results Probl. Cell Differ. 25: 41-71. Hirano T, 2002. The ABCs of SMC proteins: Two-armed ATPases for chromosome condensation, cohesion, and repair. Genes Dev. 16: 399-414. Kelly W.G., Schaner C.E., Demburg A.F., Но-Lee M., Kim S.K., Villeneuve A.M., and Reinke V., 2002. X-chromosome silencing in the germline of C. elegans. Development 129: 479-492. Ketel C.S., Andersen E.F., Vargas M.L., Suh J., Strome S., and Simon J.A., 2005. Subunit contributions to histone methyltransferase activities of fly and worm polycomb group complexes. Mol. Cell. Biol. 25: 6857-6868. Maciejowski J., Ahn J.H., Cipriani P.G., Killian D.J., Chaudhary A.L., Lee J.I., Voutev R., Johnsen R.C., Baillie D.L., Gunsalus K.C., et al., 2005. Autosomal genes of autosomal/X-linked du- plicated gene pairs and germ-line proliferation in Caenorhabditis elegans. Genetics 169:, 1997-2011. Maine E.M., Hauth J., Ratliff T, Vought V.E., She X., and Kelly WG., 2005. EGO-1, a putative RNA-dependent RNA poly- merase, is required for heterochromatin assembly on unpaired DNA during C. elegans meiosis. Curr. Biol. 15:, 1972-1978. Meyer B.J., 1997. Sex determination and X chromosome dosage compensation. In C. elegans II (ed. D.L. Riddle et al.), pp., 209-240. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Meyer B.J., 2000. Sex in the worm counting and compensating X- chromosome dose. Trends Genet. 16: 247-53. Meyer B.J., 2005. X-chromosome dosage compensation. In Worm- Book, http://www. wormbook. org/chapters/www_dosagecomp/ dosage-comp.html. Nakayashiki H., 2005. RNA silencing in fungi: Mechanisms and applications. EEBS Lett. 579: 5950-5957. Nigon V, 1951. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhaditis elegans maupas. Bull. Biol. Fr. Belg. 85: 187-255. Piano E, Schetter A.J., Mangone M., Stein L., and Kemphues K.J., 2000. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhab- ditis elegans. Curr. Biol. 10: 1619-1622.
Powell J.R., Jow M.M., and Meyer B.J., 2005. The T-box transcrip- tion factor SEA-1 is an autosomal element of the X:A signal that determines C. elegans sex. Dev. Cell 9: 339-349. Prahlad V., Pilgrim D., and Goodwin E.B., 2003. Roles for mating and environment in C. elegans sex determination. Science 302: 1046-1049. Reinke V., Gil LS., Ward S., and Kazmer K., 2004. Genome- wide germline-enriched and sex-biased expression profiles in Caenorhabditis elegans. Development 131: 311-323. Reinke V., Smith H.E., Nance J., Wang J., Van Doren C., Begley R., Jones S.J.M., Davis E.B., Scherer S., Ward S., and Kim S.K., 2000. A global profile of germ line gene expression in C. elegans. Mol. Cell 6:605-616. Schedl T, 1997. Developmental genetics of the germ line. In C. el- egans II(ed. D.L. Riddle et al.), pp. 241-269. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Shiu P.K., Raju N.B., Zickler D., and Metzenberg R.L., 2001. Mei- otic silencing by unpaired DNA. Cell 107: 905-916. Skipper M., Milne C.A., and Hodgkin J., 1999. Genetic and molecu- lar analysis offox-1, a numerator element involved in Caenorhab- ditis elegans primary sex determination. Genetics 151: 617-631. Turner J. M., 2005. Sex chromosomes make their mark. Chromosoma 114: 300-306. Turner J.M., Mahadevaiah S.K., Femandez-Capetillo O., Nussen- zweig A., XuX., Deng C.X., and Burgoyne P.S., 2005. Silencing of unsy-napsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat. Genet. 37:41-47. van Leeuwen E and Gottschling D.E., 2002. Genome-wide histone modifications: gaining specificity by preventing promiscuity. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 756-762. Wang L., Brown J.L., Cao R., Zhang Y., Kassis J.A., and Jones R.S., 2004. Hierarchical recruitment of polycomb group silencing complexes. Mol. Cell 14: 637-646. Wu C.I. and Xu Y, 2003. Sexual antagonism and X inactivation — The SAXI hypothesis. Trends Genet., 19: 243-247. Xu L., Fong Y, and Strome S., 2001. The Caenorhabditis elegans maternal-effect sterile proteins, MES-2, MES- 3, and MES-6, are associated in a complex in embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 5061-5066. Yonker S.A., and Meyer B.J., 2003. Recruitment of C. elegansdosage compensation proteins for gene-specific versus chromosome- wide repression. Development 130: 6519-6532.
ГЛАВА 16 КОМПЕНСАЦИЯ ДОЗЫ У DROSOPHILA John С. Lucchesi1 и Mitzi I. Kuroda2 'Department of Biology, Graduate Division of Biological and Biomedical Sciences, Emory University, Atlanta, Georgia 30322 2Harvard Partners Center for Genetics & Genomics, Brigham & Women’s Hospital, Department of Genetics, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02446 Содержание Общее резюме 1. Явление компенсации дозы было открыто у Drosophila 2. Компенсация дозы связана с модификациями хроматина 3. Регулирование компенсации дозы начинается с измерения отношения Х:аутосомы ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Механизм, ответственный за транскрипцию генети- ческой информации, т.е. за синтез информационных РНК, изучен в весьма значительной степени. Иден- тифицированы факторы, участвующие в активации индивидуальных генов, в поддержании активного со- стояния и в прекращении активности, когда она больше не нужна. Коль скоро они были открыты, были изучены и все еще являются предметом интенсивных исследова- ний взаимодействия этих факторов с регуляторными и кодирующими частями генов. В последние годы долго существовавшая догма, согласно которой клеточная диф- ференцировка и развитие требуют скоординированной регуляции различных наборов генов во времени и в про- странстве, привела к поискам регуляторных сигналов, которые влияли бы на активность групп функционально связанных генов. Задолго до того, как эти исследования были начаты, пример скоординированной регуляции был описан у Drosophila. В этом конкретном случае группа 4. Некодирующие РНК гоХ облегчают сборку и «на- целивание» комплекса MSL на Х-хромосому 5. Балансировка между антагонистическими актив- ностями ремоделинга хроматина 6. Перспективы Литература генов, активность которых регулировалась в унисон, не были связаны по функции, а скорее имели общую лока- лизацию в генетическом материале: все они находились на одной из половых хромосом, Х-хромосоме. Цель этого регулирования — обеспечить, чтобы самки с двумя Х-хромосомами и самцы с одной только Х-хромосомой имели бы равные уровни генных продуктов; другими словами, цель — компенсировать различия между по- лами в дозах сцепленных с X генов. В исследованиях этого уровня регуляции вопрос «Каким образом группы неродственных генов скоординировано регулируются?» превратился в вопрос «Каковы механизмы, которые мо- гут регулировать активность целой хромосомы?». Изучение компенсации дозы у Drosophila — механиз- ма, усиливающего транскрипцию большинства генов на единственной Х-хромосоме у самцов, — выявляет участие сайт-специфичного ацетилирования гистонов, специфические некодирующие РНК (называемые гоХ1 и гоХ2) и «нацеливание», в масштабах целой хромосомы, эволюционно консервативной машины, модифициру-
2. Компенсация дозы связана с модификациями хроматина ющей гистоны, которая, как показано на фотографии в начале этой главы, локализуется на Х-хромосоме 1 Явление компенсации дозы было открыто у Drosophila Кариотипы (т.е. ансамбль хромосом) многих организмов включают пару половых хромосом. У Drosophila самки име- ют две половые хромосомы, называемые Х-хромосомами, которые идентичны по форме и генетическому содержа- нию; обе Х-хромосомы активны во всех соматических клетках. Самцы имеют одну Х-хромосому и хромосому, отличающуюся от X по морфологии и генетической ин- формации, содержащейся в ней, — Y-хромосому (рис. 16.1). На этих половых хромосомах находятся гены, отвечающие за детерминацию пола и половую диффе- ренцировку. Кроме того, — и это особенно справедливо для Х-хромосомы — имеется много генов, участвующих в базовых клеточных функциях «домашнего хозяйства» или в развитии. Самки с двумя Х-хромосомами имеют вдвое больше этих генов; самцы с одной X имеют только одну их дозу. Тем не менее, уровень содержания продуктов большинства этих генов одинаков у двух полов. В начале 1930-х годов этот парадокс был впервые отмечен у Droso- phila Меллером (H.J. Muller), когда он изучал содержание глазного пигмента у особей, несущих сцепленные с X му- тации частичной утраты функции (рис. 16.2). Меллер рас- судил, что должен быть регуляторный механизм, который помогает мухам компенсировать различие между двумя полами в дозе сцепленных с X генов у самцов и самок путем уравнивания уровня продуктов генов, сцепленных с X. Он назвал этот гипотетический регуляторный механизм «компенсацией дозы». Первое доказательство, что компенсация дозы до- стигается путем регулирования транскрипции сцеплен- ных с X генов, было получено через 30 с лишним лет Мухерджи и Беерманом (A.S. Mukherjee and W. Веег- mann) Используя транскрипционную ауторадиографию [transcriptional autoradigraphy] гигантских политенных хромосом из слюнных желез личинок — молекулярную технику, представляющую методический уровень того времени — эти авторы наблюдали, что уровень включе- ния [’Н]уридина единственной Х-хромосомой у самцов и обеими Х-хромосомами у самок был одинаков. Полу- чалось, таким образом, что скорость синтеза РНК един- ственной Х-хромосомой у самцов была приблизитель- Рис. 16.1. Сделанный с помощью рисовального аппарата рисунок женской (слева) и мужской (справа) метафазнои пластинки Drosophila melanogaster Обратите внимание на то что Х-хромосома составляет ~20 % кариотипов (перепечатка, с любезного разрешения, из Morgan, 1932) но вдвое большей, чем скорость синтеза каждой из двух Х-хромосом у самок. Следующий экспериментальный прорыв состоял в том, что Белоте и Лучези (J. Belote and J Lucchesi) генетически идентифицировали четыре гена с мутациями типа «утраты функции», которые не име- ли никаких последствий у самок, но были летальными у самцов; последние обнаруживали приблизительно по- ловину нормального уровня включения [3Н]уридина в свою Х-хромосому. Более того, эта Х-хромосома утра- чивала свой нормальный более бледный и несколько «раздутый» [puffed] вид, что было истолковано как ука- зание на повышенный уровень транскрипционной ак- тивности по отношению к каждой из двух Х-хромосом у самок. Эти результаты заставляли предполагать, что уравнивание продуктов генов, сцепленных с X, дости- гается удвоением (в среднем) транскрипционной ак- тивности Х-хромосомы у самцов, а не снижением вдвое транскрипционной активности каждой Х-хромосомы у самок. Из этих четырех генов два были открыты заново (male-specific lethal 7, msll; и male-specific lethal 2, msl2), тогда как другие два (maleless, mle; и male-specific lethal 3, msl3) были прежде идентифицированы другими ис- следователями в природных популяциях (конкретные ссылки, относящиеся к этой ранней фазе исследования компенсации дозы, можно найти у Lucchesi and Man- ning, 1987). Все генные продукты, идентифицированные до сих пор на основе специфичного для самцов леталь- ного фенотипа соответствующих мутаций типа «утраты функции», для того чтобы было легче ссылаться на них, называются MSLs (male-specific lethal phenotype). Следующая фаза в исследовании компенсации дозы началась с клонирования mle, за чем вскоре последова- ло клонирование трех генов msl в лабораториях Бейке- ра, Курода и Лучези (В. baker, М. Kuroda and J. Lucchesi). С помощью цитоиммунофлуоресценции обнаружили, что четыре генных продукта связаны идентичным об- разом в многочисленных сайтах по всей длине поли- тенной Х-хромосомы самцов (Palmer et al., 1993; Bone et al., 1994; Gorman et al., 1995; Kelley et al., 1995; Gu et al., 1998; см. рис. в начале главы). Это наблюдение и взаи- мозависимость разных генных продуктов в связывании с Х-хромосомой заставляли предполагать, что они об- разуют комплекс (рис. 16.3). 2. Компенсация дозы связана с модификациями хроматина Присутствие комплекса MSL на Х-хромосоме у самцов коррелирует с присутствием специфической изоформы гистона Н4, ацетилированной по лизину 16((Tumer et al., 1992; Bone et al., 1994). У дрожжей было показано, что эта конкретная ковалентная модификация гистона Н играет ключевую роль в поддержании границы между «мол- чащим» хроматином и активным хроматином: утрата функции Sas2, ацетилтрансферазы гистонов (HAT), отве- чающей за Н4К16ас, делает возможным распространение теломерного гетерохроматина в соседний субтеломерный хроматин (Suka et al., 2002; дополнительные детали см. в главе 4). Обнаружили, что у Drosophila Х-хромосома по своей длине сильно обогащена Н4К16ас Недавние
Глава 16. Компенсация дозы у Drosophila 1 копия 2 копии ГЕНОТИП white white white ФЕНОТИП (цвет глаз) 2 копии white м white Рис. 16.2. Схематическое изображение результатов, которые привели Г.Дж. Меллера к формулировке гипотезы о компенсации дозы Мутантная аллель (w) сцепленного с X гена white является гипоморфом и делает возможным лишь частичный синтез глазного пигмента; ее присутствие на Х-хромосомах показано более темным прямоугольником. Уровень пигментации прямо пропорцио- нален дозе аллели wa у каждого пола; тем не менее, самцы с одной дозой и самки с двумя дозами имеют сравнимые количества пигмента благодаря компенсации дозы структурные исследования показали, что ключевое межнуклеосомное взаимодействие может происходить между кислотным «пятном» (patch) гистонового ди- мера Н2А-Н2В на одной нуклеосоме и положительно заряженным сегментом «хвоста» гистона Н4 (остатки 16—26), отходящего от соседней нуклеосомы (Schalch et al., 2005). Когда лизин 16 специфически ацетилирован, его положительный заряд становится нейтральным, позволяя предполагать, что ослабление репрессивной межнуклеосомной структуры могло бы играть ключевую роль в компенсации дозы. Ни один из первоначально идентифицированных факторов, участвующих в компенсации дозы, не обна- руживал характерных признаков HAT. Поскольку все предшествовавшие поиски мутантов были сконцентри- рованы на скрининге главных аутосом, был проведен новый поиск сцепленных с X специфичных для самцов летальных мутаций, и был идентифицирован новый ген, males absent on the first (mof) (Hilfiker et al., 1997). Рекомби- нантный белок, кодируемый mof, является HAT, специ- фически ацетилирующей гистон Н4 по лизину 16 (Akhtar and Becker, 2000); он является интегральной частью ком- плекса MSL и однозначно отвечает за эту изоформу Н4 на Х-хромосоме самцов (Smith et al., 2000). MOF являет- ся членом подсемейства в семействе HATs, обозначаемом как MYST. Это подсемейство, характеризующееся при- сутствием хромодомена, можно далее подразделить на ферменты, которые специфически ацетилируют Н4К16 in vivo (MOF и MOF человека; Smith et al., 2005) и такие ферменты, как Esal (essential SAS-related acetyltransferase 1 protein) у дрожжей, которые ацетилируют все четыре терминальных лизина в Н4 (Smith et al., 1998). Еще один член семейства MYST, SAS2, специфически ацетилирует Н4К16 у дрожжей, но не имеет хромодомена. В то же самое время, когда был открыт и охарак- теризован MOF, были установлены каталитические свойства MLE, другой субъединицы с предполагаемой ферментативной активностью. Оказалось, что MLE об- наруживает in vitro активности PHК/ДНК-геликазы, аденозинтрифосфатазы (АТФазы) и связывания с Рис. 16.3. Схема, иллюстррующая различные компоненты ком- плекса MSL В число известных функций компонентов MSL входит ацети- лирование гистона по Н4К16 с помощью MOF, MLE обладает АТФазной и РНК/ДНК-геликазной активностью, a JIL-1 фосфорилирует гистон НЗ. Неясно, является ли JIL-1 субъе- диницей этого комплекса
2. Компенсация дозы связана с модификациями хроматина однонитевой HYR|ssDNA (Lee et al., 1997), предрекая потенциальную роль РНК в функции MSL. Некото- рые мультибелковые комплексы, взаимодействующие с хроматином для контроля скорости транскрипции эухроматиновых генов, используют гидролиз АТФ для изменения нуклеосомной конформации. За гидролиз АТФ отвечает семейство белков, содержащих геликаз- ный домен (Sif, 2004); хотя это семейство может и не выполнять ту же самую функцию в комплексе MSL, оно представлено MLE. Ортологи MLE, в число кото- рых входит РНК-геликаза А человека (RHA), принад- лежат к подсемейству РНК-геликаз DEXH и характе- ризуются приобретением новых доменов (Kuroda et al., 1991) и консервативного аминотерминального участка длиной ~350 аминокислот (Pannuti and Lucchesi, 2000). MLE может осуществлять свою функцию в компенса- ции дозы скорее путем изменения структуры РНК, а не помогая в ремоделинге хроматина. Специфическая роль остальных компонентов ком- плекса MSL не вполне понятна. MSL3, субъединица комплекса MSL, характеризующаяся присутствием не- канонического хромодомена и домена «chromoshadow» (Aasland and Stewart, 1995; Koonin et al., 1995), являет- ся членом семейства белков, которые могли совместно эволюировать с HATs, несущими хромодомен (Pannuti and Lucchesi, 2000). У дрожжей член этого семейства, Eaf3 (Esal-associated factor-3 protein), обнаружен в ком- плексе NuA4 с энзимом Esal группы MYST (Eisen et al., 2001). У Drosophila мультибелковый комплекс Tip60 включает MRG15, паралог MSL3 (Kusch et al., 2004). У человека MRG15 связан с MOF в комплексе MAF2 (Pardo et al., 2002). Особый интерес представляет суще- ствование у человека еще одного комплекса, родствен- ного комплексу MSL и включающего человеческие гомологи MOF, MSL1, MSL2 и MSL3. Этот комплекс, специфически ацетилирующий Н4К16 гистонов и от- вечающий за большую часть этой изоформы гистонов в клетках человека, может включать одну из трех разных версий дрозофил иного гомолога MSL3, кодируемого двумя разными генами (Smith et al., 2005). У Drosophila MSL1 и MSL2, как оказалось, опосре- дуют связывание комплекса MSL с хроматином (Kelley et al., 1995; Copps et al., 1998; Gu et al., 1998). Ни один из этих белков не содержит какой-либо поддающий- ся идентификации домен, связывающийся с ДНК, и «нацеливание» на хроматин, как оказалось, требует их ассоциации. MSL1 взаимодействует с доменом «RING finger» VSL2 через аминотерминальный домен типа coiled-coil (Copps et al., 1998; Scott et al., 2000) и c MSL3 и MOF через соседние консервативные карбокситерми- нальные домены (Morales et al., 2004). Ассоциация MSL2 с Х-хромосомой оказывается замечательно стабильной (Straub et al., 2005с). О гомологах MSL1 и MSL2 у чело- века сообщил Мартин (Martin, 2003). Поскольку у Dros- ophila MSL1 и MSL2 отвечают за ассоциацию комплек- са MSL с Х-хромосомой, есть смысл пофантазировать, что hMSLl и hMSL2 могут играть роль в «нацеливании» комплекса MSL человека на сайты его действия. Вполне вероятно, что кроме специфичных для сам- ца факторов некоторые общие факторы, участвующие в организации хроматина и транскрипции у обоих по- лов, участвуют и в компенсации дозы JIL-1. тандемная киназа, обнаруживается на всех хромосомах и у самцов, и у самок, но ее концентрация выше на Х-хромосоме самцов Эта повышенная концентрация зависит от комплекса MSL. JIL-1 опосредует фосфорилирование гистона НЗ и поддерживает открытую структуру хрома- тина в транскрипционно активных районах генома (Jin et al., 1999; Wang et al, 2001); тем не менее, еще предсто- ит определить, играет ли он специфическую или общую роль в компенсации дозы Недавно было обнаружено, что ядерные белки, в том числе нуклеопорины и субъе- диницы экзосомного комплекса иммунопреципити- руются совместно с некоторыми MSL (Mendjou et al., 2006). Роль, которую эти белки могут играть в компен- сации дозы, не определена. Активность этого комплекса, должно быть, разви- лась для контроля предсуществовавших групп генов, каждая с их собственными специфическими регуля- торными сигналами и внутренне присущими уровнями экспрессии. В пользу того, что комплекс MSL может «нацеливаться» на активные гены, говорит следующее наблюдение: связывание эктопического MSL появляет- ся в регулируемых трансгенах, вставленных в X, только после индукции экспрессии (рис. 16.4) (Sass et al., 2003). На каком этапе общая транскрипция могла бы увели- чиваться (be up-regulated) до двукратного уровня? У самцов Drosophila Н4К16ас не ограничен промоторным участком компенсированных генов, сцепленных с X; скорее, он обнаруживается по всей длине сцепленных с X транскрипционных единиц, на которые «нацелен» комплекс MSL, с относительно скромными уровнями ацетилирования в промоторных участках и высокими уровнями в средних участках и (или) З’-концах (Smith et aL, 2001). Такое распределение ацетилирования застав- Активный трансген Неактивный трансген (+GAL) (-GAL) Рис. 16.4. Комплекс MSL «нацеливается» на активированные гены Конструкт, содержащий промотор под контролем trans- активатора GAL4 был вставлен в сайт, в норме лишенный комплекса MSL в хромосомах личиночной слюнной железы (правая часть рисунка}. Когда ген, экспрессирующий GAL4, вводится в геном (левая часть рисунка), trans-активатор связы- вается с конструктом (красный цвет) и рекрутирует комплекс MSL (зеленый цвет) (перепечатано, с любезного разрешения, из: Sass et al., 2003 [©National Academy of Sciences]
Глава 16. Компенсация дозы у Drosophila ляет предполагать, что комплекс MSL функционирует, чтобы увеличить экспрессию сцепленных с X генов, пу- тем облегчения транскрипционной элонгации и, воз- можно, рециклирования РНК-полимеразы, а не непо- средственного увеличения доступности промотора. Для объяснения функции комплекса MSL была пред- ложена альтернативная гипотеза (Birchler et al., 2003). Эта гипотеза основывается на представлении, что у са- мок активность всех хромосом устанавливается, наря- ду с другими факторами, однородным распределением МОЕ У самцов, в силу отсутствия одной Х-хромосомы, для аутосом и для единственной Х-хромосомы доступ- на более высокая концентрация MOF и неизвестных факторов, что приводит к более высоким уровням их активности; комплекс MSL образуется и рекрутирует- ся к Х-хромосоме для того, чтобы изолировать факторы гипертранскрипции, в том числе MOF, от аутосом. В этой модели главная роль комплекса MSL заключается в том, чтобы даун-регулировать аутосомные гены, а не в том, чтобы ап-регулировать гены, сцепленные с X. Од- нако этой гипотезе противоречат два независимых ис- следования; в них показано, что утрата «нацеливания» комплекса MSL клетках культуры ткани самца умень- шали транскрипцию генов на Х-хромосоме, в то время как уровень экспрессии аутосомных генов не изменялся (Hamada et al., 2005; Straub et al., 2005b). Аналогичные результаты были недавно опубликованы относительно экспрессии сцепленного с X гена в мужской зародыше- вой линии (Gupta et al., 2006). Сборка хроматина недавно была подразделена на связанную с репликацией и не зависимую от реплика- ции откладку [deposition] нуклеосом. Последняя проис- ходит в транскрипционно активных районах хромати- на и включает замещение гистона НЗ вариантом НЗ.З (глава 13). С этим наблюдением согласуется тот факт, что скорость включения гистона НЗ.З в Х-хромосому в клетках самца повышена по отношению к аутосомам (Mito et al., 2005). 3. Регулирование компенсации дозы начинается с измерения отношения Х:аутосомы Каждый эмбрион должен сосчитать свои Х-хромосомы, чтобы принять критическое решение, выполнять ли компенсацию дозы или нет. Неправильное решение, на- пример, неспособность ап-регулировать единственную Х-хромосому самца или аберрантная ап-регуляция обеих Х-хромосом самки, приводит к летальности. У Drosophila процесс счета Х-хромосом скоординирован с решением о детерминации пола (обзор см. Cline and Meyer, 1996). Фенотипический пол определяется числом Х-хромосом на ядро, так что эмбрионы XX являются самками, а эм- брионы XY — самцами. Y-хромосома необходима для фертильности, но, в отличие от млекопитающих, она не играет никакой роли в контроле фенотипического пола. Формально и пол, и компенсация дозы контролируются отношением Х:аутосомы, поскольку механизм счета Х-хромосом чувствителен к числу наборов аутосом. Это становится очевидным на триплоидах 2Х:ЗА, которые характеризуются отношением Х:А, промежуточным между самцами XY:2A и самками XX: 2А. Триплоиды 2Х:ЗА дифференцируются как интерсексы со смесью мужских и женских клеток. Отношение Х:А контролирует как детерминацию пола, так и компенсацию дозы, регулируя критический ген бинарного переключателя, Sex lethal (Sxl). Sxl коди- рует специфичный для самок белок, связывающийся с РНК, который регулирует сплайсинг и трансляцию клю- чевых иРНК в путях детерминации пола и компенсации дозы, соответственно (рис. 16.5). Sex lethal кодируется Х-хромосомой и позитивно регулируется транскрипци- онными факторами, кодируемыми X, так что эмбрионы с двумя Х-хромосомами способны инициировать экс- прессию Sxl с раннего, регулируемого промотора, Ре, тог- да как эмбрионы с одной Х-хромосомой на ядро не могут экспрессировать Sxl с Ре. Это первоначальное временное различие в активации Sxl у ранних эмбрионов стаби- лизируется авторегуляторной петлей, в которой белок SXL позитивно регулирует сплайсинг своей собствен- ной иРНК с поддерживающего промотора [maintenance promoter], который экспрессируется конститутивно. Sxl инициирует дифференцировку по женскому типу, регу- лируя сплайсинг гена transformer (tra) пол-специфичным образом. В свою очередь продукт этого гена (вместе с продуктом еще одного гена, transformed (tra2), представ- ленного у обоих полов) направляет сплайсинг первично- го транскрипта гена doublesex (dsx) на выработку регуля- торного белка, который репрессирует специфичные для самцов гены-реализаторы, достигая таким образом жен- ской половой дифференцировки. У мужских эмбрионов альтернативный способ сплайсинга транскриптов dsx происходит «по умолчанию» и ведет к выработке про- дукта, который репрессирует специфичные для самок гены-реализаторы, результатом чего является мужская половая дифференцировка. Ключевой мишенью SXL в пути компенсации дозы является иРНК msl2 (Bashaw and Baker, 1997; Kelley et al., 1997). Связывающие SXL сайты локализованы и в 5’-, и в З’-UTRs иРНК msl2. SXL в норме присутствует только у самок, у которых он репрессирует трансляцию иРНК msl2 путем ассоциации с ее UTRs (см. рис. 16.5). Если у самок SXL отсутствует, аберрантно включается [is turned on] компенсация дозы, и эти самки погиба- ют. Наоборот, если SXL эктопически экспрессируется у самцов, компенсация дозы выключается, и самцы погибают. Эктопическая экспрессия MSL2 у самок до- статочна для того, чтобы собрать комплексы MSL на обеих Х-хромосомах самки, показывая тем самым, что все другие компоненты MSL либо включены, либо ста- билизированы экспрессией MSL2. Например, MSL1 и MSL2 в норме экспрессируются у самок, но нестабиль- ны в отсутствие белка MSL2. MLE и MOF стабильны у самок, но не обнаруживают никакого специфического сродства к Х-хромосоме в отсутствие MSL2. Суммируя все сказанное, можно сказать, что компен- сация дозы должна реагировать на число Х-хромосом в ядре, и эти хромосомы подсчитываются на ранних ста- диях эмбрионального развития. Самцы экспрессируют
4. Некодирующие РНК гоХ облегчают сборку и «нацеливание» комплекса MSL на Х-хромосому Cf (ХО) Соотношение Х/аутосомы = 0,5 I Sx/ 9 (XX) Cue т ношение Х/аутосоми = 1 I Sxl КОМПЕНСАЦИЯ ДОЗЫ ОТСУТСТВИЕ КОМПЕНСАЦИИ ДОЗЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА СГ ПОЛОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ПОЛОВАЯ Рис. 16.5. Схема контроля детерминации пола и компенсации дозы Если отношение Х/А равно 1, регуляторный каскад ведет к женскому половому развитию У самок присутствие продукта гена Sxl предотвращает трансляцию информации msl2 и сборку комплекса MSL Если же отношение Х/А равно лишь 0,5, отсутствие каскада приводит «по умолчанию» к мужскому половому развитию и к формированию комплекса MSL белок MSL2 (и, таким образом, комплекс MSL) «по умолчанию», тогда как самки репрессируют трансля- цию MSL2, предотвращая несоответствующую компен- сацию дозы, когда присутствуют две Х-хромосомы. 4. Некодирующие РНК гоХ облегчают сборку и «нацеливание» комплекса MSL на Х-хромосому Одним из самых интригующих и таинственных аспектов компенсации дозы и у млекопитающих, и у Drosophila является роль некодирующих РНК в «нацеливании» ком- пенсации на правильную хромосому (обзор см.: Gilfillan et al., 2004; Kelley, 2004; Straub et al., 2005a; см. также главу 17). У Drosophila две некодирующие РНК, называемые «RNA on X» (гоХ), не похожи друг на друга по размерам и последовательности и, тем не менее, функционируют, дублируя друг друга и «нацеливая» комплекс MSL на Х-хромосому самца (Meller and Rattner, 2002). Традици- онный скрининг мутантов обычно не выявляет суще- ствование генов, кодирующих продукты с дублирующими функциями, такие как РНК гоХ. Скорее, РНК гоХ были открыты интуитивно как специфичные для самцов РНК в мозге взрослых особей (Amrein and Axel, 1997; Meller et al., 1997). При более близком рассмотрении у обеих РНК обнаруживается отсутствие существенных открытых ра- мок считывания и ко-локализация с комплексом MSL по длине Х-хромосомы. Функция РНК гоХ оставалась неиз- вестной, пока не были выделены мутанты и по гоХ1, и по гоХ2. Двойные мутанты-самцы погибали, демонстрируя совершенно неправильную локализацию комплексов MSL, тогда как одиночные мутанты-самцы не обладают известным фенотипом (Meller and Rattner, 2002). Это уди- вительно в свете того факта, что эти две РНК гоХ очень различны по величине (3.7 т.о. vs. 0.5—1.4 т.о.) и имеют мало сходства по нуклеотидным последовательностям Сверхэкспрессия белков MSL может частично преодолеть отсутствие РНК гоХ, что позволяет предположить, что эти белки обладают всеми существенными функциями ком- пенсации дозы, но нуждаются в этих РНК для облегчения сборки или локализации (Oh et al., 2003). РНК гоХ были выделены после совместной иммуно- преципитации белков MSL, демонстрируя тем самым фи- зическую ассоциацию этих РНК с данным комплексом (Meller et al., 2000; Smith et al., 2000). Неизвестно, сосуще- ствуют ли РНК гоХ или же образуют два отдельных типа MSL. Серия делеций гоХ1 показала, что нет ни одного сегмента длиной 300 нуклеотидов, который был бы абсо- лютно существенным для функции, что заставляет пред- полагать внутреннюю избыточность (Stickenholz et al., 2003). HYR гоХ демонстрируют удивительный уровень гибкости; это позволяет думать, что они, скорее, могут декорировать поверхность комплекса MSL, чем образуют в нем какую-то высокоинвариантную структуру Частич-
^308 Глава 16. Компенсация дозы у Drosophila ная очистка комплекса позволяет предполагать наличие плотного кора, состоящего из белков MSL1, MSL2, MSL3 и MOF, причем РНК гоХ и геликаза MLE сохраняются лишь при очень низких концентрациях солей (Smith et aL, 2000) Этот минимальный белковый коровый комплекс, лишенный РНК гоХ, все еще может in vitro специфиче- ски ацетилировать в нуклеосомах гистон Н4 по лизину 16 (Morales et al., 2004), что согласуется с идеей, что РНК гоХ участвуют в сборке или «нацеливании» компенсации дозы, а не играют прямую роль в регуляции генов. Как комплекс MSL связывается с Х-хромосомой и что он распознает? В отсутствие обеих РНК гоХ или же либо MLE, MSL3, либо MOF частичные комплексы MSL связываются с подгруппой из -35—70 сайтов (рис. 16.6). Эти «высокоаффинные» сайты сравнили у му- тантов mle, msl3 и mof и нашли, что на цитологическом уровне они в большой мере одинаковы, но их молеку- лярная идентичность пока еще неизвестна. Ключевым дефектом у мутантов mle может быть их неспособность инкорпорировать РНК гоХ в частичные комплексы, поскольку эти РНК ко-локализуются вместе с частич- ными комплексами в отсутствие MSL3 или MOF, но не в отсутствие MLE (Meller et al., 2000). В отсутствие либо MSL1, либо MSL2 ни один из остальных белков MSL или РНК гоХ не сохраняет способность распозна- вать Х-хромосому, что приводит к предположению, что MSL1 и MSL2 совместно обеспечивают по крайней мере первоначальную специфичность «нацеливания» на X. Тем не менее, ни один из этих белков не несет известный ДНК-связывающий мотив, и связывание с ДНК in vitro не было продемонстрировано. Что же могло бы быть сигналом специфичности на Х-хромосоме, что привлекало бы этот комплекс? Можно представить себе две очень общие модели ре- гулирования целой хромосомы. Одиночный сайт или ограниченное число сайтов могли бы контролировать хромосому в с/х-конфигурации. как это имеет место в случае Х-инактивации у млекопитающих (глава 17). Этот механизм требует либо компартментализации комплек- са в специфическом месте ядра, либо регулирования на очень больших расстояниях посредством распростра- нения факторов из центрального района на остальные части хромосомы. В соответствии с другим крайним ва- риантом, хромосома могла бы иметь уникальные иден- тифицирующие последовательности, разбросанные по всей ее длине. В этом случае любой сегмент хромосомы мог бы регулироваться автономно. Между этими двумя моделями находится целый спектр возможностей, вклю- чая комбинацию центральных контрольных районов с диспергированными последовательностями, которые облегчают регуляцию на больших расстояниях. РНК гоХ в норме кодируются Х-хромосомой: ген гоХ1 находится возле ее конца, а ген гоХ2 — около се- редины эухроматической части Х-хромосомы. Подобно гену Xist у млекопитающих гены гоХ могут находиться на Х-хромосоме для того, чтобы «нацеливать» сборку ком- плекса MSL на эту хромосому. Когда гены гоХ перемеща- ются на аутосомы как трансгены, они энергично привле- кают белки MSL к новым сайтам, в которые произошла вставка (рис. 16.7), где этот комплекс, по-видимому, а 15 16 П 18 119 Рис. 16.6. «Высокоаффинные» сайты Препараты хромосом слюнных желез из личинок, несущих ал- лель типа «утраты функции» гена msl3 {а, б), или из контрольных личинок дикого типа (в. г). На а и г показаны изображения полученные с фазовым контрастом, тогда как на б и в показ- ны те же хромосомы с иммуноокрашиванием на присутствие комплекса. На б комплекс {зеленый цвет) обнаруживается в меньшем числе сайтов, чем на в (перепечатано, с любезного разрешения, из: Demakova et al., 2003 [©Springer] распространяется в си-конфигурации на разные рас- стояния во фланкирующие последовательности (Kelley et al., 1999; Kageyama et al., 2001). В специфических гене- тических условиях, например когда на Х-хромосоме нет конкурирующих эндогенных генов гоХ, неизменно на- блюдается экстенсивное распространение с аутосомных трансгенов гоХ (рис. 16.7) (Park et al., 2002). Это экстен- сивное распространение усиливается сверхэкспрессией MSL1 и MSL2, ключевых лимитирующих белков MSL, и уменьшается сверхэкспрессией РНК гоХ с конкурирую- щих трансгенов, позволяя предполагать, что успешная ко-транскрипционная сборка комплексов MSI может управлять локальным распространением (Oh et al., 2003). Эффективная сборка функциональных комплексов MSL в ядре может быть первичной функцией РНК гоХ. Пер- воначальная сборка в генах гоХ на Х-хромосоме должна, вероятно, усиливать эффективность «нацеливания» на Х-хромосому, но очевидно не является существенной для окончательного «нацеливания», поскольку гены гоХ могут функционировать в trans-конфигурации (Meller and Rattner, 2002)
5 Балансировка между антагонистическими активностями ремоделинга хроматина X 83А л 85Е 8 в X 67С • 64А 6 Г Рис. 16.7. Распространение комплекса MSL от аутосомного трансгена пропорционально ослаблению функции эндогенных, сцепленных с X, генов гоХЬ Максимальное аутосомное распространение достигается тогда, когда трансген является единственным источником РНК гоХв клетке, (а) Хромосомы от самца с X дикого типа; присутствие аутосомного трансгена показывает узкая полоска MSL (крас- ный цвет), (б) Самец с одним только активным сцепленным с X геном гоХ. Комплекс MSL распространяется несколько больше, чем у дикого типа, (в, г) Экстенсивное распространение у сам- цов, несущих два разных трансгена и Х-хромосому с делецией обоих генов гоХ (перепечатано, с любезного разрешения, из: Park et al., 2002 [©AAAS]) Помимо высокоаффинных сайтов, упоминавшихся выше, очевидно, что этот комплекс обнаруживает раз- ные степени сродства к большому числу дополнительных сайтов вдоль всей Х-хромосомы (Demakova et al., 2003). В стабильных транслокационных штаммах распростра- нение комплексов MSL с Х-хромосомы в смежные ау- тосомные последовательности не является очевидным (Fagegaltier and Baker, 2004). Следовательно, даже если распространение комплексов MSL является главным ме- ханизмом покрытия [covering] Х-хромосомы, весьма веро- ятно, что имеется некая дополнительная характеристика Х-хромосомы, являющаяся причиной того, что комплекс MSL очень благоприятствует связыванию с X, а не с ау- тосомами. Действительно, в результате исследования транслокаций Х:А и ограниченного набора полученных из X трансгенов оказывается, что большинство сегмен- тов Х-хромосомы длиной ~30 т.о. обладают способностью привлекать комплекс MSL; более мелкие сегменты дают менее постоянные результаты (Oh et al., 2004). Каким образом эти разнообразные наблюдения мож- но согласовать с моделью «нацеливания» комплекса MSL на Х-хромосому? Модель узнавания Х-хромосомы, лучше всего согласующаяся с существующими данными, изо- бражена на рис. 16.8. В этой модели комплексы MSL со- бираются в сайтах транскрипции РНК гоХ и впоследствии получают доступ к фланкирующим и удаленным сайтам на Х-хромосоме на основе их относительного сродства к комплексу MSL. Происходит ли некоторая или даже основная часть «нацеливания» в норме исключительно в trans-конфигурации или же путем некоторого варианта локального распространения в cis-конфигурации —не- известно. Однако ясно, что комплекс MSL явно пред- почитает связываться с сегментами Х-хромосомы, а не с аутосомами. Хотя на сегодняшний день не известно, что- бы какая-то простая нуклеотидная последовательность однозначно определяла Х-хромосому, возможно, будет обнаружена некая вырожденная последовательность, ког- да целые геномы многочисленных видов Drosophila станут доступными для сравнения. 5. Балансировка между антагонистическими активностями ремоделинга хроматина Политенная Х-хромосома самцов обнаруживает особую чувствительность к изменениям в дозе или активности нескольких регуляторов хроматина, которые, как пола- гают, являются общими, хромосома-неспецифичными факторами. Например, выяснить функциональное взаи- модействие между комплексами, несущими ISWI, и ком- плексом MSL позволило наблюдение, что мутации гена Zsvw типа «утраты функции» приводят у самцов к глобаль- ному структурному эффекту в отношении Х-хромосомы: на препаратах слюнных желез эта хромосома выглядит чрезвычайно укороченной и толстой (рис. 16.9), причем комплекс MSL и Н4К16ас располагаются внешне непре- рывно, а не в виде тонких бэндов (Deuring et al., 2000). Молекулярная основа этого цитологического фенотипа неизвестна, но он совместим с моделью, в которой орга- низация хроматина в отдельные домены была утрачена. Нормальные политенные хромосомы демонстрируют характерный паттерн относительно конденсированных дисков и деконденсированных междисковых участков и пуфов, и эта организация оказывается полностью отсутствующей в Х-хромосоме мутантных самцов Iswi. Короткая длина этой X может быть обусловлена утратой структуры и конденсацией, результатом чего является аномальное увеличение толщины за счет длины. ISWI (imitation switch protein) — это АТФаза, обна- руженная у Drosophila в трех комплексах ремоделинга хроматина: NURF (nucleosome remodeling factor), ACF (ATP-dependent chromatin assembly and remodeling factor) и CHRAC (chromatin accessibility complex) (Smith and Pe- terson, 2005) Исследования in vitro показали, что ACF и CHRAC устанавливают регулярно упорядоченные цепоч- ки нуклеосом, тогда как NURF нарушает периодичность нуклеосом. In vivo ACF и CHRAC ведут себя как факто- ры сборки хроматина, способствующие формированию хроматина в целом и репрессивных состояний хроматина в частности. Напротив, NURF изменяет положение ну- клеосом на промоторе hsp 70, реконструированном in vitro, и его ремоделирующая активность существенно усилива- ется, если нуклеосомы сначала гиперацетилируются. Не- смотря на очевидную биохимическую активность NURF
Глава 16. Компенсация дозы у Drosophila Рис. 16.8. Модель «нацеливания» комплекса MSL на Х-хромосому Комплекс собирается в сайте транскрипции генов гоХ и получает доступ к различным сайтам по всей Х-хромосоме, сродство к которым у него варьирует от очень высокого до относительно низкого Обратите внимание на то, что эта модель приложима к аутосомному распространению комплекса от эктопического гена гоХ в том отношении, что он делает хроматин более доступ- ным, мутанты по nurf301 также обнаруживают аномально деконденсированную Х-хромосому у самцов, наблюдае- мую у мутантов Iswi (Badenhorst et al., 2002). Дефект Х-хромосомы, наблюдаемый в слюнных же- лезах мутантов Iswi и nurf. можно видеть у трансгенных самок, где было индуцировано присутствие комплек- са MSL; этот дефект не возникает в присутствии не- активного комплекса MSL у самцов, т.е. в отсутствие Н4К16ас. Более того, исследования методом конкури- рующего связывания in vitro [in vitro competition stud- ies] с очищенным ISWI позволяют предполагать, что его способность взаимодействовать с изолированными нуклеосомами снижается ацетилированием «хвоста» гистона Н4 по лизину 16 (Corona et al., 2002). Согласно выдвинутому этими авторами спекулятивному предпо- ложению, активность MOF изменяет экспрессию сце- пленных с X генов, уменьшая способности ISWI сти- мулировать формирование регулярных нуклеосомных последовательностей (Corona et al., 2002). Совершенно иной хромосомный фенотип наблю- дается тогда, когда имеет место сверхэкспрессия белка Рис. 16.9. Гипоморфныемутации гена Iswiзатрагивают преиму- щественно структурную организацию Х-хромосомы у самцов У самцов дикого типа Х-хромосома по своему общему виду сходна с плечом аутосомы (перепечатано, с любезного раз- решения, из. Deuring et al., 2000 [©Elsevier]) гетерохроматина, SU(VAR)3—7 (Delattre et al., 2004). Белок SU(VAR)3—7 является структурным компонен- том гетерохроматина, который ко-локализуется с НР1 (heterochromatin protein 1) и с метилтрансферазой лизи- на гистонов (НКМТ) SU(VAR)3-9 (глава 5). Хотя сверх- экспрессия Su(var)3—7 вызывает морфологические эф- фекты в хромосомах и самцов, и самок, Х-хромосома самцов затрагивается в наибольшей степени, поскольку она приобретает очень маленькие размеры и высоко- компакгизированный вид. Странно, что политенная Х-хромосома самцов более чувствительна, чем другие хромосомы, к изменениям в балансе компонентов хроматина с положительными либо отрицательными эффектами. Важным механиз- мом поддержания наследуемых состояний хроматина может быть конкуренция за повторную сборку [reassem- bly] факторов после синтеза ДНК. Возможно, гипер- активная политенная Х-хромосома самцов, в силу ее открытого в норме состояния, действует как ведущий индикатор, когда изменяется естественный баланс ключевых факторов, модулирующих хроматин (Luc- chesi et al., 2005). 6. Перспективы С ростом использования технологий микрочипов [mi- croarray technologies] мы начинаем определять точный паттерн связывания комплекса MSL в масштабах всего генома и отличительные особенности генов, которые он регулирует (Alekseyenko et al., 2006; Gilfillan et al., 2006; Legube et al., 2006). Эти сведения несомненно приведут к лучшему пониманию того, каким образом этот комплекс «нацеливается» на Х-хромосому Понимание такого «на- целивания» должно, в свою очередь, помочь нам иденти- фицировать механизмы, с помощью которых комплекс MSL увеличивает экспрессию генов. Недавно полученные результаты показали, что кодирующие районы генов, а не регуляторные районы «вверх по течению», связываются комплексом MSL, что видно по Н4К16ас на избранных генах. В этих результатах находит ключевую поддержку модель, согласно которой компенсация дозы происходит путем регулирования скорости транскрипционной элон- гации и рециклирования РНК (Smith et al., 2001).
Полное выяснение молекулярного механизмка, ответственного за компенсацию дозы, потребует точ- ного определения влияния комплекса MSL на общий механизм транскрипции. Белки MSL и РНК гоХ, по- видимому, предназначены для компенсации дозы, по- скольку ни один из этих компонентов не требуется для жизнеспособности самок. Тем не менее, возможно, что многие дополнительные факторы способствуют ком- пенсации дозы, но являются существенными и у сам- цов, и у самок в силу их общих ядерных, хромосомных или транскрипционных функций (Mendjan et al., 2006). В предстоящие годы идентификация этих факторов бу- дет иметь очень большое значение для понимания био- химических основ двукратного увеличения экспрессии сцепленных с Х-хромосомой генов, наблюдаемого у самцов Drosophila. В конечном счете, понимание ком- пенсации дозы даст ключевую информацию относи- тельно организации хроматина в транскрипционные домены у высших организмов и позволит глубже про- никнуть в молекулярные механизмы тонкой настройки наследуемой экспрессии генов в точных пределах. Литература Aasland R. and Stewart А.Е, 1995. The chromo shadow domain, a second chromo domain in heterochromatin-binding protein 1, HP1. Nucleic Acids Res. 23: 3168-3173. Akhtar A. and Becker P.B., 2000. Activation of transcription through histone H4 acetylation by MOF, an acetyltransferase essential for dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell5\ 367-375. Alekseyenko A.A., Larschan E., Lai W.R., Park P.J., and Kuroda M.I., 2006. High-resolution ChlP-chip analysis reveals that the Drosophila MSL complex selectively identifies active genes on the male X chromosome. Genes Dev., 20: 848-857. Amrein H. and Axel R., 1997. Genes expressed in neurons of adult male Drosophila. Cell 88: 459-469. Badenhorst P, Voas M.. Rebay L, and Wu C., 2002. Biological func- tions of the ISWI chromatin remodeling complex NURF. Genes Dev. 16:3186-3198. Bashaw G.J. and Baker B.S., 1997. The regulation of the Drosophila msl-2 gene reveals a function for sex-lethal in translational con- trol. Cell 89: 789-798. Birchler J.A., Pal-Bhadra M., and Bhadra U., 2003. Dosage depen- dent gene regulation and the compensation of the X chromosome in Drosophila males. Genetica 117: 179-190. Bone J.R., Lavender J.. Richman R.. Palmer M.J.. Turner B.M., and Kuroda M.L, 1994. Acetylated histone H4 on the male X chro- mosome is associated with dosage compensation in Drosophila. Genes Dev. 8: 96-104. Cline TW and Meyer B.J., 1996. Vive la difference: Males vs females in flies vs worms. Annu. Rev. Genet. 30: 637-702. Copps K., Richman R., Lyman L.M., Chang K.A., Rampersad- Ammons J., and Kuroda M.L, 1998. Complex formation by the Drosophila MSL proteins: Role of the MSL2 RING finger in protein complex assembly. EMBO J. 17: 5409-5417. Corona D.F., Clapier C.R., Becker P.B., and Tamkun J.W 2002. Modulation of ISWI function by site-specific histone acetylation. EMBO Rep. 3: 242-247. Delattre M., Spierer A., Jaquet Y., and Spierer P, 2004. Increased ex- pression of Drosophila Su(var)3-7 triggers Su(var)3-9-dependent hete-rochromatin formation. J. Cell Sci. 117: 6239-6247. Demakova O.V, Kotlikova I.V., Gordadze P.R., Alekseyenko A.A., Kuroda M.L, and Zhimulev l.E, 2003. The MSL complex levels are critical for its correct targeting to the chromosomes in Droso- phila melanogaster. Chromosoma 112: 103-115. Deuring R., Fanti L., Armstrong J.A., Sarte M., Papoulas O., Prestel M., Daubresse G., Verardo M., Moseley S.L., Berloco M., et al., 2000. The ISWI chromatin-remodeling protein is required for gene expression and the maintenance of higher order chromatin structure in vivo. Mol. Cell 5: 355-365. Eisen A., Utley R.T, Nourani A., Allard S., Schmidt P, Lane W.S., Lucchesi J.C., and Cote J., 2001. The yeast NuA4 and Drosophila MSL complexes contain homologous subunits important for transcription regulation. J. Biol. Chem. 276: 3484-3491. Fagegaltier D. and Baker B.S., 2004. X chromosome sites autono- mously recruit the dosage compensation complex in Drosophila males. PLoS Biol. 2: e341. Gilfillan G.D., Dahlsveen I.K., and Becker P.B., 2004. Lifting a chromosome: Dosage compensation in Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 567: 8-14. Gilfillan G.D., Straub T, de Wit E., Greil E., Lamm R., van Steensel B., and Becker P.B., 2006. Chromosome-wide gene-specific targeting of the Drosophila dosage compensation complex. Genes Dev., 20: 858-870. Gorman M., Franke A., and Baker B.S., 1995. Molecular character- ization of the male-specific lethal-3 gene and investigations of the regulation of dosage compensation in Drosophila Development 121: 463-475. Gu W, Szauter P, and Lucchesi J.C., 1998. Targeting of MOF, a putative histone acetyl transferase, to the X chromosome of Drosophila melanogaster. Dev. Genet. 22: 56-64. Hamada F.N., Park P.J., Gordadze P.R., and Kuroda M.L, 2005. Global regulation of X chromosomal genes by the MSL complex in Drosophila melanogaster. Genes Dev., 19: 2289-2294. HilfikerA., Hilfiker-Kleiner D., Pannuti A., and Lucchesi J.C., 1997. mof, a putative acetyl transferase gene related to the Tip60 and MOZ human genes and to the SAS genes of yeast, is required for dosage compensation in Drosophila. EMBO J. 16:, 2054-2060. Jin Y, Wang Y, Walker D.L., Dong H., Conley C, Johansen J , and Johansen K.M., 1999. JIL-1: A novel chromosomal tandem kinase implicated in transcriptional regulation in Drosophila. Mol. Cell 4: 129-135. Kageyama Y, Mengus G., Gilfillan G., Kennedy H.G., Stucken- holz C., Kelley R.L., and Kuroda M.L, 2001. Association and spreading of the Drosophila dosage compensation complex from a discrete roXl chromatin entry site. EMBO J., 20: 2236-2245. Kelley R.L., 2004. Path to equality strewn with roX. Dev. Biol. 269:18-25. Kelley R.L., Wang J., Bell L., and Kuroda M.L, 1997. Sex lethal controls dosage compensation in Drosophila by a non-splicing mechanism. Nature 387:, 195-199. Kelley R.L., Meller VH., Gordadze P.R., Roman G., Davis R.L., and Kuroda M.L, 1999. Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin. Ce//98: 513-522. Kelley R.L., Solovyeva L, Lyman L.M., Richman R., Solovyev V, and Kuroda M.L, 1995. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell 81: 867-877. Koonin E.V., Zhou S., and Lucchesi J.C., 1995. The chromo super- family: New members, duplication of the chromo domain and
Глава 16. Компенсация дозы у Drosophila possible role in delivering transcription regulators to chromatin. Nucleic Acids Res. 23: 4229-4233. Kuroda M.I., Kernan M.J., KreberR., Ganetzky B., and Baker B.S., 1991. The maleless protein associates with the X chromosome to regulate dosage compensation in Drosophila. Cell 66: 935-947. KuschT, Florens L., Macdonald W.H.. Swanson S.K.. Glaser R.L., Yates J.R., Ill, Abmayr S.M., Washbum M.R, and Workman J.L., 2004. Acetylation by Tip60 is required for selective histone variant exchange at DNA lesions. Science 306:, 2084-2087. Lee C.C., Chang K.A., Kurtoda M.I., and Hurwitz J., 1997. The NTPase/helicase activities of Drosophila maleless, an essential factor in dosage compensation. EMBO J. 16: 2671-2681. Legube G., McWeeney S.K., Lercher M.J., and Akhtar A., 2006. X-chromosome-wide profiling of MSL-1 distribution and dosage compensation in Drosophila. Genes Dev., 20: 871-883. Lucchesi J.C. and Manning J.E., 1987. Gene dosage compensation in Drosophila melanogaster. Adv. Genet. 24: 371-429. Lucchesi J.C., Kelly W.G., and Panning B., 2005. Chromatin remod- eling in dosage compensation. Annu. Rev. Genet. 39: 615-651. Marin L, 2003. Evolution of chromatin-remodeling complexes: Comparative genomics reveals the ancient origin of “novel” compensa-some genes. J. Mol. Evol. 56: 527-539. Metier V.H. and Rattner B.P., 2002. The roXgenes encode redundant male-specific lethal transcripts required for targeting of the MSL complex. EMBO J. 21: 1084-1091. Melter V.H., Wu K.H., Roman G., Kuroda M.L., and Davis R.L., 1997. roXl RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system. Cell 88:445-457. MellerVH., Gordadze PR., Park Y, ChuX., Stuckenholz C., Kelley R.L., and Kuroda M.L., 2000. Ordered assembly of roX RNAs into MSL complexes on the dosage-compensated X chromosome in Drosophila. Curr. Biol. 10: 136-143. Mendjan S., Taipalc M., Kind J., Holz H., Gebhardt P, Schelder M., Vermeulen M., Buscaino A., Duncan K., Mueller J., et al., 20бб. Nuclear pore components are involved in the transcrip- tional regulation of dosage compensation in Drosophila. Mol. Cellll: 811-823. ^Vlito Y, Henikoff J.G., and Henikoff S., 2005. Genome-scale profiling of histone H3 3 replacement patterns. Nat. Genet. 37: 1090-1097. Morales V., Straub X, Neumann M.F., Mengus G., Akhtar A., and Becker P.B., 2004. Functional integration of the histone acetyl- transferase MOF into the dosage compensation complex. EMBO J. 23: 2258-2268. Morgan TH., 1932. The scientific basis of evolution. Norton, New York, p. 80. Oh H., Bone J.R., and Kuroda M.L, 2004. Multiple classes of MSL binding sites target dosage compensation to the X chromosome of Drosophila. Curr. Biol. 14: 481-487. Oh H., Park Y, and Kuroda M.L, 2003. Local spreading of MSL complexes from roX genes on the Drosophila X chromosome. Genes Dev. 17: 1334-1339. Palmer M.J., MergnerVA., Richman R., Manning J.E., Kuroda M.L, and Lucchesi J. C., 1993. The male-specific lethal-one (msl-1) gene of Drosophila melanogaster encodes a novel protein that associates with the X chromosome in males. Genetics 134: 545-557. Pannuti A and Lucchesi J.C., 2000. Recycling to remodel: Evolution of dos- age-compensation complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 10:644-650. Pardo P.S., Leung J.K., Lucchesi J.C., and Pereira-Smith O.M., 2002. MRG15, a novel chromodomain protein, is present in two distinct multiprotein complexes involved in transcriptional activation. J. Biol. Chem. 277: 50860-50866. Park Y, Kelley R.L., Oh H., Kuroda M.L., and Meller V.H., 2002. Extent of chromatin spreading determined by roX RNA recruit- ment of MSL proteins. Science 298: 1620-1623 Sass G.L., Pannuti A., and Lucchesi J.C., 2003. Male-specific lethal complex of Drosophila targets activated regions ofthe X chromosome for chromatin remodeling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 8287-8291. Schalch T, Duda S., Sargent D.F., and Richmond T.J., 2005. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chro- matin fibre. Nature 436: 138-141. Scott M.J., Pan L.L., Cleland S.B., Knox A.L., and Heinrich J., 2000. MS LI plays a central role in assembly of the MSL com- plex, essential for dosage compensation in Drosophila. EMBO J.. 19: 144-155. Sif S., 2004. ATP-dependent nucleosome remodeling complexes: Enzymes tailored to deal with chromatin. J. Cell Biochem. 91: 1087-1098. Smith C.L. and Peterson C.L., 2005. ATP-dependent chromatin remodeling. Curr. Top. Dev. Biol. 65: 115-148. Smith E.R., Allis C.D., and Lucchesi J.C., 2001. Linking global histone acetylation to the transcription enhancement of X- chromosomal genes in Drosophila males. J. Biol.Chem. 276: 31483-31486. Smith E.R., Cayrou G., Huang R., Lane W.S., Cote J., and Lucchesi J.C., 2005. A human protein complex homologous to the Droso- phila MSL complex is responsible for the majority of histone H4 acety-lation at lysine 16. Mol. Cell. Biol. 25: 9175-9188. Smith E.R., Pannuti A., GuW, SteumagelA., Cook R.G., Allis C.D., and Lucchesi J.C., 2000. The Drosophila MSL complex acetylates histone H4 at lysine 16, a chromatin modification linked to dosage compensation. Mol. Cell. Biol., 20: 312-318 Smith E.R., Eisen A., GuW, Sattah M., Pannuti A., Zhou J.. Cook R.G., Lucchesi J.C., and Allis C.D., 1998. ESAI is a histone acetyltransferase that is essential for growth in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3561-3565. Straub T, Dahlsveen I.K., and Becker P.B., 2005a. Dosage com- pensation in flies: Mechanism, models, mystery. FEBS Lett. 579:3258-3263. Straub T, Gilfillan C.D., Maier V.K., and Becker P.B., 2005b. The Drosophila MSL complex activates the transcription of target genes. Genes Dev., 19: 2284-2288. Straub T, Neumann M.E, Prestel M., Kremmer E., Kaether C, Haass C, and Becker P.B., 2005c. Stable chromosomal association of MSL2 defines a dosage-compensated nuclear compartment. Chromosoma 114: 352-364. Stuckenholz C, Meller V.H., and Kuroda M.L, 2003. Functional re- dundancy within roXl, a noncoding RNA involved in dosage com- pensation in Drosophila melanogaster. Genetics 164:1003-1014. Suka N., Luo K., and Grunstein M., 2002. Sir2p and Sas2p op- posingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysinel6 and spreading of heterochromatin. Nat. Genet. 32: 378-383. Turner B.M., Birley A.J., and Lavender J., 1992. Histone H4 iso- forms acetylated at specific lysine residues define individual chromosomes and chromatin domains in Drosophila polytene nuclei. Cell 69: 375-384. Wang Y, Zhang W, Jin Y, Johansen J., and Johansen K.M., 2001. The JIL-1 tandem kinase mediates histone H3 phosphoryla- tion and is required for maintenance of chromatin structure in Drosophila. Cell 105:433-443.
ГЛАВА 17 КОМПЕНСАЦИЯ ДОЗЫ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Neil Brockdorff1 и Bryan М. Turner2 1Х Inactivation Group (Developmental Epigenetics Group), MRC Clinical Sciences Centre, ISCM Hammersmith Campus, London W12 CNN, United Kingdom zChromatin and Gene Expression Group, Institute of Biomedical Research, University of Birmingham Medical School, Birmingham B15 2TT, United Kingdom Содержание Общий обзор 1. Введение 1.1. Преимущества полового воспроизведения 1.2. Способы определения пола 1.3. Хромосомные способы детерминации пола создают необходимость в компенсации дозы 1.4. Идентификация неактивной Х-хромосомы у самок млекопитающих 2. Ключевые концепции 2.1. Инактивация X регулируется в ходе развития 2.2. Сайленсинг хромосомы включает множе- ственные уровни эпигенетической модифи- кации 2.3. Некоторые гены избегают Х-инактивации 2.4. Х-инактивация регулируется главным локусом-переключателем — центром Х-инактивации 3. Инициация Х-инактивации 3.1. Импринтированная versus случайная Х-инактивация 3.2. Регуляция импринтированной Х-инактивации 3.3. Регуляция случайной Х-инактивации — счет 3.4. Регуляция случайной Х-инактивации — выбор 3.5. Способы переключения инактивации в ран- нем эмбриогенезе 4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния 4.1. Xist-PHK, сайленсинг генов и сборка гете- рохроматина 4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы 4.3. Энзимология модификаций гистонов на Xi 4.4. Последовательность событий, приводящих к Х-инактивации; ES-клетки как модельная система 4.5. Распространение «молчащего» хроматина 4.6. Уход от инактивации Х-хромосомы 4.7. Х-инактивация у сумчатых млекопитающих 5 Реактивация и репрограммирование Х-хромосомы 5.1. Стабильность Х-инактивации в соматиче- ских клетках 5.2. Реактивация Х-хромосомы в нормальном развитии 5.3. Реактивация Х-хромосомы в ходе экспери- ментального репрограммирования 5.4. Уроки из опытов с индуцибельными транс- генами Xist 6 Резюме и направления будущих исследований Литература
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ ДНК человека упакована в 23 пары хромосом разного размера. Одна хромосома из каждой пары унаследова- на от наших отцов (отцовский гомолог), а другая — от наших матерей (материнский гомолог). Двадцать две пары, в совокупности называемые аутосомами и про- нумерованные числами 1—22 в порядке убывающей величины, одинаковы у самцов и самок, тогда как одна пара, половые хромосомы, различается между полами Самки обладают двумя копиями хромосомы среднего размера, обозначаемой как Х-хромосома, в то время как самцы имеют одну Х-хромосому и одну копию бо- лее мелкой, бедной генами хромосомы, обозначаемой Y. У самцов Х-хромосома всегда наследуется от мате- ри, а Y-хромосома — от отца, тогда как у самок одна Х-хромосома — материнская (Хт), а другая — отцовская (Хр). Это хромосомное различие между полами является обычным у млекопитающих и многих других организмов и представляет собой часть биологического механизма, посредством которого определяется пол. Однако для организма это связано с рядом эволюционных проблем, в том отношении, что два пола различаются по числу сце- пленных с X генов, которые они имеют; самки обладают вдвое большим их количеством, чем самцы. Это может приводить к дисбалансу в количестве генных продуктов (РНК и белков), который, в свою очередь, требовал бы различий в контроле метаболизма и других клеточных процессов. Чтобы избежать этого, возникли механизмы компенсации дозы генов, уравновешивающие уровни продуктов сцепленных с X генов у обоих полов. У млекопитающих механизм компенсации дозы связан с выключением (сайленсированием) большин- ства генов только на одной из двух Х-хромосом, так что у самок, как и у самцов, имеется только одна активная хромосома. Это радикальное решение, обычно назы- ваемое инактивацией Х-хромосомы, впервые было предложено в 1961 году Мэри Лайон для того чтобы объяснить паттерны экспрессии сцепленных с X генов окраски меха у мышей, сходные с паттерном окраски меха у кошки «calico», изображенной в начале этой гла- вы. С тех пор более 40 лет интенсивных исследований было посвящено попыткам разобраться в этих интри- гующих и сложных механизмах, осуществляющих этот процесс. Мы знаем, что инактивация X происходит на ранних этапах развития, но сложным образом. Очень рано, когда эмбрион состоит всего лишь из нескольких клеток, отцовская Х-хромосома избирательно инакти- вируется во всех клетках. Хр должна быть как-то марки- рована, «импринтирована» для инактивации. Позднее, на стадии бластоцисты (непосредственно перед им- плантацией), когда зародыш состоит из 50—100 клеток, в тех клетках, которые в дальнейшем сформируют сам эмбрион (локализованных во внутренней клеточной массе [ICM]), Хр вновь активируется, так что, говоря коротко, у самок имеются две активные Х-хромосомы. Затем либо Хр, либо Хш случайно выбирается для инак- тивации, и гены на ней сайленсируются. Любопытно, что в тех клетках бластоцисты, которые в дальнейшем формируют экстраэмбриональные ткани (плаценту и желточный мешок), Хр остается «молчашей». Вопрос о том, каким образом для инактивации «выбирается» одна из X в ICM, остается пока что без ответа. Х-хромосома, выбранная для инактивации, остается «молчащей» на протяжении всех последующих клеточ- ных генераций. Это одна из наиболее стабильных форм сайленсинга генов, которая нам известна, и попытки экспериментально добиться ее реверсии неизменно оказывались безуспешными. Однако ооциты (женские зародышевые клетки) способны ревертировать этот процесс инактивации, так что они обладают двумя ак- тивными X в мейозе, и единственная Х-хромосома в зрелом, гаплоидном яйце также активна. Исследования процесса инактивации X выявили новые молекулярные механизмы сайленсинга генов. Инициацию сайленсинга вызывает повышенная экс- прессия некодирующей РНК, транскрибируемой с гена, обозначенного XIST, с одной только из двух жен- ских Х-хромосом. Эта РНК покрывает Х-хромосому, содержащую ген XIST, которая включается, что выгля- дит как участок зеленой окраски на фотографии кле- точного ядра, изображенной в начале этой главы. Этим далее инициируется сайленсинг генов по всей этой хромосоме. Сам XIST остается включенным После по- крытия XIST неактивная, «молчащая» X претерпевает ряд изменений. Главные белки, упаковывающие ДНК, гистоны, подвергаются химическим модификациям в функционально важных сайтах. Например, уровни аце- тилирования избранных остатков лизина катастрофи- чески падают, тогда как метилирование других лизинов увеличивается. Вслед за этими изменениями проис- ходит метилирование избранных участков на неактив- ной Х-хромосоме, Xi, — процесс, часто связанный с долговременным сайленсингом генов Все эти и другие изменения придают неактивной Х-хромосоме очень ха- рактерную структуру, которая нередко описывается как конденсированная и которая видна в клеточном ядре как отчетливая глыбка плотной ДНК, известная как тельце Бара. На протяжении последних лет исследования инак- тивации Х-хромосомы позволили проникнуть в фунда- ментальные эпигенетические механизмы сайленсинга генов и в то, каким образом паттерны экспрессии генов регулируются в ходе развития. Можно с уверенностью предсказать, что так будет и дальше. 1. Введение 1.1. Преимущества полового воспроизведения Половое воспроизведение обычно у эукариот. Даже рас- тения, которые вполне могут размножаться отводками или побегами, часто обладают альтернативным половым способом воспроизведения. Как нередко бывает, эво- люция дает возможное объяснение этого, показывая, что половое воспроизведение дает огромное увеличение генетической изменчивости, с которой может работать естественный отбор, создавая эволюционные изменения. Перетасовка аллелей, происходящая в каждом половом
поколении, могла бы таким образом создавать популя- цию, способную справляться со сдвигами во внешней среде более эффективно, чем относительно гомогенная популяция, возникающая в результате бесполых спо- собов воспроизедения. Однако у высших эукариот пол усложнен, поскольку нуждается в развитии, ведущем к образованию мужских и женских половых органов, а также физиологического и биохимического аппарата, необходимого для мейоза, созревания зародышевых клеток, привлечения партнеров и спаривания (дальней- шее обсуждение этих тем см.: Marshall Graves and Shetty, 2001 и помещенные там ссылки). Критический момент и определенная мера эволюционного успеха заключаются в том, что изменчивые популяции способны лучше избе- гать конечной катастрофы, связанной с вымиранием. 1.2. Способы определения пола Генетические механизмы определения пола варьируют в значительной степени от одного организма к другому. Простейшая система включает один локус, который гомозиготен у одного пола (гомогаметный пол) и гете- розиготен у другого (гетерогаметный пол) (рис. 17.1). Эта простая система развивалась различными путями, достигнув разной степени сложности у разных организ- мов. У некоторых из них возникли механизмы, пода- вляющие мейотическую рекомбинацию (кроссинговер) определяющих пол аллелей у гетерогаметного пола (рис. 17.1) — шаг, помогающий предотвратить возникновение смесей аллелей, ведущих к интерсексуальным состояни- ям. Во многих случаях неспособность к рекомбинации распространилась на часть или даже на всю хромосому, что сопровождалось утратой генетической информации. Эволюционное давление, обусловившее эту дегенерацию хромосомы, все еще остается непонятным, но конечный результат у многих видов заключается в том, что два пола обнаруживают различия не просто по аллелям в одном или нескольких локусов, но по целым хромосомам. Это изображено в виде простой диаграммы на рис. 17.1. У большинства видов, включая наш собственный, такую дегенерировавшую хромосому несут самцы, хотя бывают и исключения. Половая дифференцировка обычно запускается включением или выключением одного или небольшого числа генов в ходе развития. Продукты этих генов ини- циируют каскад регуляторных событий, опосредующих дальнейшее продвижение по тому или иному пути де- терминации пола (см. детали для Caenorhabditis elegans в главе 15 и для Drosophila в главе 16). У человека су- ществует белковый продукт гена SRYна Y-хромосоме, который запускает ранний зародыш по мужскому пути полового развития (обзор см.: McElrevey et al., 1995). Механизм такого типа не нуждается в крупных хромо- сомных различиях для того чтобы успешно работать; почему же тогда такие различия возникали так часто? Возможно, что они произошли как побочный продукт супрессии кроссинговера, необходимой для предот- вращения интерсексуальных состояний (рис. 17.1). Математический анализ факторов, влияющих на рас- протстранение аллелей в популяциях, показывает, что Самец Самка Прото-самец Самец А А А А прото-Х прото-Y X Y Время эволюции я Аллель, детерминирующая Я Кроссинговер подавлен мужской пол Рис. 17.1. Эволюция Y-хромосомы На ранних этапах эволюции два пола могли различаться лишь по одному, аутосомному локусу, когда один пол (обозначаемый как протомужской) гетерозиготен по этому локусу, а другой пол (протоженский) гомозиготен. «Аллель, детерминирующая мужской пол», показана желтым цветом. Если для спаривания необходима одна особь каждого пола, тогда особи, гомози- готные по аллели, детерминирующей мужской пол, не могут возникать. На этой ранней стадии физиологические различия между полами будут еще слабыми, сравнимыми с различиями между двумя типами спаривания у дрожжей. Для предотвраще- ния образования интерсексуальных состояний кроссинговер в локусе, определяющем мужской пол, и вокруг него будет по- давлен (эти подавленные области показаны темным цветом) В пределах этого района будут накапливаться мутации, пото- му что подавление кроссинговера уменьшит их способность распространяться по популяции и, отсюда, давление отбора против них. Район дегенерации, в котором кроссинговер по- давлен, будет постепенно расширяться («храповик Меллера»), пока эта хромосома не утратит большую часть своих активных, функциональных генов. Должен остаться небольшой, актив- ный участок, гомологичный Х-хромосоме, для того, чтобы разрешить спаривание и кроссинговер при мейозе. Это псев- лоаутосомный район (PAR, pseudoautosomal region). Аутосома, первоначально гомологичная будущей Y («А» на диаграмме), будет сама эволюировать в основном путем транслокаций с других аутосом, в конечном счете формируя отличающуюся Х-хромосому. Эта Х-хромосома, подобно другим хромосомам, представляет собой мозаику из фрагментов ДНК, помещенных на место в разные периоды на протяжении эволюции; неко- торые из них являются древними, а некоторые относительно недавние. Это иллюстрируется по-разному расположенными пэтчами на прото-Х- и Х-хромосомах На Х-хромосоме чело- века более недавние участки обогащены генами, избежавшими инактивации X супрессия кроссинговера неизбежно приведет к по- степенному накоплению вредных мутаций (возможно даже, мутаций, вызывающих дальнейшее подавление кроссинговера). Это приведет к прогрессивной дегенера- ции одной из двух исходно гомологичных хромосом (рис 17.1). Этот процесс был назван «"храповиком" Меллера» в память генетика, впервые предложившего этот меха- низм. Для этого случая не существует отбора, он просто происходит как следствие начального принятия страте-
316 Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих гии двух полов для воспроизведения (обсуждение см.: Charlesworth, 1996 и помещенные там ссылки). Какая бы эволюционная тенденция ни стояла за дегенерацией хромосомы, тот факт, что она произошла (и, возможно, еще продолжается), требует коэволюции механизмов, чтобы справиться с крупными хромосомными разли- чиями между членами одного и того же вида. Для этого предназначены механизмы дозовой компенсации. 1.3 Хромосомные способы детерминации пола создают необходимость в компенсации дозы И у млекопитающих, и у Drosophila самцы имеют одну копию каждой половой хромосомы, X и Y, тогда как самки обладают двумя копиями X. В обеих группах орга- низмов Y бедна генами и в основном гетерохроматична. Она содержит всего несколько генов, необходимых для мужского развития или фертильности. Напротив, X яв- ляется крупной, богатой генами хромосомой. Двукратная разница в числе копий, если ее не скорректировать, при- вела бы к двукратному различию во внутриклеточных концентрациях продуктов нескольких тысяч генов между полами. Поэтому не удивительно, что эволюция не может терпеть такое крупное различие между членами одного и того же вида. Вместо этого она выработала способы устранения этого различия с помощью механизмов ком- пенсации дозы. Говоря в общих словах, существуют только три спо- соба уравнивания количеств транскриптов генов, сце- пленных с Х-хромосомой, между гетерогаметным и гомогаметным полами. Это (1) выключение генов на одной из двух женских Х-хромосом, (2) удвоение ско- рости транскрипции генов на единственной мужской Х-хромосоме и (3) снижение наполовину скорости транскрипции на каждой из двух женских Х-хромосом. Конечный результат как (2), так и (3) один и тот же в том отношении, что гены на единственной мужской Х-хромосоме транскрибируются вдвое быстрее, чем эк- вивалентные гены на двух женских Х-хромосомах, но пути для достижения этого состояния фундаменталь- но различны. Были найдены примеры всех трех меха- низмов. Млекопитающие используют первый способ, Drosophila — второй (глава 16), а червь- нематода С. el- egans — третий (глава 15). Тот факт, что получили разви- тие — и по-видимому, независимо — три очень разных механизма компенсации дозы, подтверждает важность конечной цели, а именно, уравнивания между полами уровней продуктов генов, сцепленных с X (обзор см.: Marin et al., 2000). Как следствие этого, мутации, нару- шающие компенсацию дозы у любого из этих трех орга- низмов, детальны у затронутого такой мутацией пола. 1.4. Идентификация неактивной Х-хромосомы у самок млекопитающих В 1949 году Барр и Бертрам описали тельце полового хроматина — структуру, видную в световой микроскоп в ядрах клеток самки (но не самца) разных видов млекопи- тающих (см. рисунок на титульной странице главы). Эта структура оказалась полезной в исследованиях половых аномалий, но лишь в 1959 году Оно и коллеги (см. Ohno, 1967) показали, что эта структура происходит из одной из двух Х-хромосом самки. В 1961 году Мэри Лайон описала генетические эксперименты по экспрессии сцепленных с X генов окраски меха у самок мышей. Чтобы объяснить паттерны наследования этой изменчивой пятнистости (мозаичности) окраски меха у индивидуальной самки мыши, Лайон высказала гипотезу, что в каждой женской клетке одна из двух женских Х-хромосом стабильно инактивируется на ранних стадиях развития (Lyon, 1961). Тельце полового хроматина, известное теперь как тельце Барра, является, таким образом, цитологическим проявлением неактивной Х-хромосомы. Элегантные эксперименты с использованием фибробластов кожи от самок, гетерозиготных по полиморфизму сцепленному с X ферменту глюкоза-6-фосфатдегидрогеназе (G6PD), показали, что только одна из двух возможных аллелей экспрессировалась в колониях, выращенных из инди- видуальных клеток (клонах), демонстрируя тем самым наследуемость неактивного состояния от одного клеточ- ного поколения следующему (Davidson et al., 1963) и под- тверждая инактивацию Х-хромосомы у женщин (Beutler et al., 1962). Дальнейшие исследования инактивации Х-хромосомы у женщин с множественными копиями X (с такими кариотипами, как 47ХХХ или 48ХХХХ) показали, что все Х-хромосомы сверх одной были инактивированы. Это было обобщено в виде «правила п— 1», гласящего, что если особь имеет п Х-хромосом, тогда п—1 из них будут инактивированы (Ohno et al., 1967). Это правило объясняет замечательно легкие клинические симптомы, связанные с анеуплоидиями по Х-хромосоме. Гипотеза инактивации Х-хромосомы продолжала служить объ- яснением особенностей экспрессии генов, сцепленных с X в клетках самок, и оставалась практически без из- менений с тех пор, как она была впервые предложена. Последние 40 лет или около того прошли в попытках разработать молекулярные механизмы, лежащие в основе этого явления. 2. Ключевые концепции 2.1. Инактивация X регулируется в ходе развития Инактивация Х-хромосомы у самок млекопитающих ре- гулируется в ходе развития. В ранней зиготе активны обе Х-хромосомы (Epstein et al, 1978), а затем инактивация протекает согласованно с клеточной дифференцировкой В норме существует равная вероятность того, что клетки инактивируют Х-хромосому, полученную ими от матери либо от отца (Хт и Хр, соответственно). Исключением из этого является инактивация импринтированной Х-хромосомы, которая происходит у всех сумчатых и в ранних предимплантационных эмбрионах мышей, где всегда инактивируется Хр. В последнем случае инакти- вация импринтированной Хр поддерживается в первых клеточных линиях, подлежащих дифференцировке, а именно в клетках экстраэмбриональной троходермы (ТЕ)
3. Инициация Х-инактивации и примитивной эндодермы (РЕ), но в клетках внутрен- ней клеточной массы (ICM), дающей начало эмбриону, эта неактивная Х-хромосома реактивируется. Реверсия инактивации X происходит также в развивающихся примордиальных зародышевых клетках (PGCs), что обе- спечивает вновь активность этой Х-хромосомы в гамете. Рис. 17.2 иллюстрирует цикл инактивации и реактивации X у самок мышей. 2.2. Сайленсинг хромосомы включает множественные уровни эпигенетической модификации На уровне структуры хроматина сайленсинг Х-хромосомы достигается путем модификации гистоновых «хвостов», включения или исключения вариантных гистонов и ме- тилирования ДНК в богатых CpG «островках»; все это вносит вклад в стабильную структуру гетерохроматина. Слои эпигенетической модификации устанавливаются прогрессивно в ходе онтогенеза, что в деталях описано в разделе 4.4. Все вместе они обеспечивают стабильное воспроизведение неактивной Х-хромосомы в ходе много- численных раундов клеточных делений. Вклад отдельных модификаций варьирует как во времени, так и в разных линиях клеток. Например, в соматических клетках высокие уровни НЗК27теЗ (три- метилирования гистона НЗ по лизину 27) требуются на Xi во время раннего развития, но не позже. Напротив, метилирование «островков» CpG необходимо лишь в позднем развитии или не требуется вовсе в клетках трофэктод ермы. 2.3. Некоторые гены избегают Х-инактивации Х-инакгивация затрагивает большую часть Х-хромосомы, но некоторые гены ускользают от сайленсинга. К ним от- носятся гены в небольшом районе Х-хромосомы, кото- рый спаривается с Y-хромосомой в ходе мейоза у самцов и известен как псевдоаутосомный район (PAR), или район спаривания XY (рис. 17.1). Гены, локализованные в этом районе, не требуют компенсации дозы, потому что и у самцов, и у самок присутствуют две копии. Были охарактеризованы и другие гены-«беглецы» [«дезертиры»], как имеющие сцепленных с Y го- мологов, так и не имеющие их. Недавнее исследо- вание показало, что приблизительно 15 % генов на Х-хромосоме человека избегают Х-инактивации (Car- rel and Willard, 2005). Интересно, что многие из этих генов лежат в коротком плече хромосомы (обозначае- мом как Хр), который относительно недавно приобре- тен Х-хромосомой в ходе эволюции. Исследования на мышах показывают, что «беглецы» могут быть в ран- нем онтогенезе инактивированы, а в ходе дальнейшего развития прогрессивно реактивируются (раздел 4.6). У сумчатых большинство изученных генов оказалось в той или иной степени избегающими Х-инактивацию. Это может быть отражением неспособности поддер- живать сайленсинг в ходе онтогенеза, которая, воз- можно, связана с утратой метилирования «островков» CpG на Xi у этих видов (дополнительные детали см. в Разделе 4.7). 2.4. Х-инактивация регулируется главным локусом-переключателем — центром Х-инактивации Классические генетические исследования продемон- стрировали, что Х-инактивация опосредуется одним czs-действуюшим главным локусом-переключателем [master switch locus], называемым «центр Х-инактивации (Х1с)». Было показано, что Xie требуется для сайленсин- га Х-хромосомы в czs-конфигурации и для обеспече- ния корректной и надлежащей инициации случайной Х-инактивации. В более поздних исследованиях Xie был охарактеризован на молекулярном уровне. Этот локус про- изводит большую некодирующую РНК, называемую Xist {Xinactive specific transcript), которая обладает уникальным свойством связываться в ds-конфигурации и накапливать- ся по всей длине хромосомы, с которой она транскриби- руется (см. рис. 17.3) (Brown et al., 1991, 1992; Brockdorff et al., 1992). Покрытие этой хромосомы У/st-PHK создает переключатель для сайленсинга Х-хромосомы (Lee et al., 1996; Реппу et al., 1996; Wutz and Jaenisch, 2000). Прове- денные до сегодняшнего дня исследования показывают, что это происходит, по крайней мере отчасти, благодаря опосредованному Xist рекрутированию комплексов, мо- дифицирующих хроматин (рис. 17.3). Вторая некодирующая РНК, Tsix, также локализует- ся в участке Xie (Lee et al., 1999) и играет ключевую роль в регуляции экспрессии Xist Tsix перекрывается с геном Xist, но транскрибируется в антисмысловом направле- нии — отсюда его название, соответствующее Xist, про- чтенному наоборот! 3. Инициация Х-инактивации 3.1. Импринтированная versus случайная Х-инактивация Решение инактивировать Х-хромосому должно жестко регулироваться. Мужские клетки должны избежать сай- ленсинга своей единственной Х-хромосомы, а женские клетки должны избежать сайленсинга обеих Х-хромосом или сохранения обеих Х-хромосом в активном со- стоянии. Было показано, что здесь используются два разных способа регуляции. Импринтированный способ Х-инактивации обеспечивает сайленсинг Х-хромосомы, полученной от отца. При случайном способе каж- дая клетка имеет равную вероятность инактивации либо материнской, либо отцовской Х-хромосомы. Млекопитающие-метатерии (сумчатые) используют только импринтированный способ Млекопитающие- эутерии (плацентарные), по крайней мере в некоторых случаях, используют импринтированный способ в экс- траэмбриональных клеточных линиях, но случайный способ в собственно эмбрионе (рис. 17.2). Имеются некоторые указания на то, что у человека используется только случайная Х-инактивация, но это остается не выясненным окончательно.
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих Спермий Хр активна А Зародышевая линия Ооцит Хт активна Плод Хт неактивна Хр активна или Хт активна Хр неактивна Гаструляция Хт неактивна Хр активна Хт активна Хр активна А ИНАКТИВАЦИЯ Х-ХРОМОСОМЫ В ЖИЗНЕННОМ ЦИКЛЕ САМОК МЫШЕЙ 2-клеточная стадия Хт активна Хр активна Морула Хт активна ИЛИ Хт активна Хр неактивна - инактивация случайной Х-хромосомы - инактивация импринированной Х-хромосомы Хр неактивна ICM и эпибласт Хт активна Хр активна А Рис. 17.2. Цикл Х-инактивации и Х-реактивации Х-хромосома в ходе развития проходит цикл Х-инактивации и Х-реактивации. Красные стрелки указывают на этапы Х-инактивации, а зеленые — на этапы Х-реактивации. Инактивация вначале происходит в ранних предимплантационных эмбрионах (импринти- рованная Х-инактивация), а впоследствии — в клетках эпибласта во время гаструляции (случайная Х-инактивация). Неактивная Х-хромосома реактивируется в клетках внутренней клеточной массы (ICM) когда они впервые обособляются на стадии бласто- цисты, а также в развивающихся зародышевых клетках А R I R 3.2. Регуляция импринтированной Х-инактивации Отцовски импринтированную Х-инактивацию впервые наблюдали у сумчатого (Sharman, 1971). Впоследствии Такаги и Сасаки (Takagi and Sasaki, 1975) продемонстри- ровали импринтированную Х-инактивацию в экстра- эмбриональных клеточных линиях ТЕ и РЕ мышиных эмбрионов. Именно происхождение Х-хромосомы от того или другого родителя управляет ее статусом; другими словами, инактивируются отцовские, но не материнские Х-хромосомы, независимо оттого, сколько Х-хромосом или хромосомных наборов присутствуют в клетке. Об- ратите внимание на то, что единственная Х-хромосома у самцов XYвсегда происходит от матери и, следовательно, не инактивируется в импринтированных тканях. Какова же тогда природа импринта? Исследования экспрессии Xist. регулирующего Х-инактивацию в cis- конфигурации, показывают, что у мышиных эмбрио- нов имеется репрессивный импринт на аллели, локали- зованной в Хт (рис. 17.4). Этот импринт препятствует экспрессии Xist, удерживая Х-хромосому в активном состоянии. Опыты с пересадкой ядер показали, что этот репрессивный Ли/-импринт устанавливается во время созревания ооцитов (Tada et al., 2000). Молекулярная основа этого импринта неизвестна, но метилирования ДНК не требуется, в отличие от многих других имприн- тированных генов (см. детали геномного импринтинга в главе 19). Одна из теорий предпочтительной инактивации Хр в зиготе заключается в том, что имеет место перенос сайлен- синга бивалента XY, который устанавливается на стадии пахитены мейоза у самцов (meiotic sex chromosome znacti- vation, MSCI) (Huynh and Lee, 2003). Недавние исследова- ния говорят против этого. Во-первых, было показано,что MSCI — отдельный и не зависимый от Xist механизм, включаемый в пахитене присутствием неспаренных участков хромосом, как на половых хромосомах, так и на аутосомах (Turner et al., 2005 и помещенные там ссылки). Во-вторых, анализ экспрессии ряда сцепленных с X генов в ранних зиготах показал, что сайленсинг Хр возникает de novo в ответ на экспрессию Xist зиготической Хр (Okamoto et al., 2005 и помещенные там ссылки). Экспрессия отцовского Xist (и получающийся в ре- зультате этого сайленсинг Хр), начинающаяся в начале зиготической активации гена (на 2—4-клеточной ста- дии), показывает, что аллель Xist хромосомы Хр готова к экспрессии (рис. 17.4). Однако в мужских соматических тканях Xist всегда репрессирована, откуда следует, что мужские зародышевые клетки должны каким-то обра- зом ремоделировать локус Xist. В соответствии с этим, имеет место специфичное в отношении района демети- лирование сайтов CpG в промоторе Xist во время спер- матогенеза (Norris et al., 1994).
3. Инициация Х-инактивации а iiiiiiiiaiiiaiiiiiaiiiiiiiiiiiiiiiiaiiiiaiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiaiiianiiiiii ОНТОГЕНЕЗ ' б Xist в метафазе Xist в интерфазе Рис. 17.3. Прогрессивная гетерохроматинизация всей хромосомы, индуцируемая Xist-РНК (а) Когда ген Xist экспрессируется, синтезируемая РНК связывается с Х-хромосомой, с которой она транскрибируется, и покрывает ее {зеленая прерывистая линия}. Считается, что AZsT-PHK включает сайленсинг этой хромосомы, рекрутируя активности, модифи- цирующие хроматин {красные и желтые кружки). Эта первоначальная волна сайленсинга, в свою очередь, приводит к рекрутиро- ванию дополнительных слоев эпигенетической модификации {серые кружки), еще более стабилизируя структуру гетерохроматина. Установление этих различных уровней эпигенетического сайленсинга достигается поэтапно в ходе всего развития и онтогенеза. (б) Локализацию Xist-PH К по всем Х-хромосомам показывает гибридизация in situ как в интерфазе, так и в метафазе У эмбрионов с анеуплоидией по Х-хромосоме ре- зультатом родительских импринтов, управляющих экспрессией Xist, оказываются неправильные паттер- ны Х-инактивации на ранних этапах развития. Так же обстоит дело у андрогенетических и гиногенетических (или партеногенетических) эмбрионов, у которых оба хромосомных набора происходят, соответственно, либо от отца, либо от матери. Хотя это обычно снижа- ет жизнеспособность эмбриона, некоторые эмбрионы выживают, очевидно исправляя несоответствующие паттерны Х-инактивации, чтобы обеспечить наличие одной активной Х-хромосомы во всех клетках. Пола- гают, что это связано с преодолением импринта с по- мощью механизма, в норме регулирующего случайную Х-инактивацию (см. ниже). Ген Tsix, антисмысловой регулятор Xist, необходим для импринтированной Х-инактивации, поскольку де- леция главного промотора приводит к ранней эмбрио- нальной летальности, когда передается материнской, но не отцовской гаметой (Lee, 2000). Летальность, по-видимому, можно приписать несоответствующей экспрессии Xist хромосомы Хтп, т.е. неспособности со- хранить активную Х-хромосому у эмбрионов как XmY, так и ХтХр. В настоящее время неясно, является ли экспрессия Ts/x-PHK первичным импринтом или же функционирует позже для поддержания импринта. 3.3. Регуляция случайной Х-инактивации — счет При случайном способе Х-инактивации клетки поль- зуются правилом п—1, при котором на каждый ди- плоидный! хромосомный набор инактивируются все Х-хромосомы кроме одной. Выбор X, которая будет сайленсирована (или сохранится активной) по существу является случайным, хотя некоторые факторы могут вли- ять на него (см. раздел 3.4). Регуляция Xist при случайной инактивации строго контролируется Исследования по- казали, что одиночные эмбриональные стволовые (ES) клетки XX при дифференцировке экспрессируют только лишь одну аллель Xist, тогда как клетки XY никогда не инициируют экспрессию.
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих Инактивационный статус Х-хромосомы: Xist: Ранняя/средняя Поздняя Активна Импринтирована Активна Рис. 17.4. Регуляция гена Xist в раннем развитии Рисунок иллюстрирует современные знания и модели импринтированной и случайной регуляции Xist у ранних мышиных эм- брионов XX. Аллель Хш гена Xist приходит в зиготу с репрессивным импринтом, возможно опосредованным антисмысловым локусом Tsix {черный квадратик}. Аллель Хр готова к тому, чтобы быть активной, и экспрессируется как только на 2-клеточной стадии происходит активация эмбрионального гена. Со стадии 2 клеток до стадии морулы Хр Xist экспрессируется во всех клет- ках (экспрессия показана открытым прямоугольником и стрелкой на 5’-конце). Этот паттерн поддерживается на стадии ранней бластоцисты и впоследствии в клетках ТЕ и РЕ и производных от них полностью дифференцированных тканей. В ICM поздней бластоцисты экспрессия Xist прекращается, возможно с помощью ICM-специфичного репрессорного фактора (голубой треуголь- ник). Впоследствии экспрессия Xist начинается во время гаструляции. Здесь блокирующий фактор (черный ромб) гарантирует, чтобы экспрессия Xist не могла происходить на одной из двух аллелей (счет) У анеуплоидных или полиплоидных по Х-хромосоме мышиных эмбрионов результат случайной и импринти- рованной Х-инактивации различен. Простую иллюстра- цию этого дают эмбрионы ХО. При импринтированной Х-инактивации эмбрионы ХшО являются нормальны- ми, но развитие эмбрионов ХрО замедлено, поскольку клетки пытаются инактивировать свою единственную Х-хромосому, нарушая тем самым развитие экстраэм- бриональных тканей. При случайной Х-инактивации клетки считают число своих Х-хромосом (подчиняясь правилу л—1) и таким образом поддерживают един- ственную Х-хромосому активной, независимо от того, является ли она Хгп или Хр. и поэтому не страдают. Случайный способ Х-инактивации требует, чтобы клетки обладали средствами для определения числа при- сутствующих Х-хромосом, нередко называемого «сче- том» Популярной моделью для объяснения счета является модель блокирующего фактора, предложенная Растаном (Rastan, 1983). Она предполагает, что единственный Xie (аллель Xist) блокирован во всех клетках, обозначая тем самым активную Х-хромосому. Дополнительные Xie (аллели Xist), там где они имеются, экспрессируются, индуцируя таким образом Х-инактивацию (рис. 17.5). Модель Растана предполагает, что Х-инактивация есть состояние «по умолчанию», заключающееся в том, что- бы сохранять одну Х-хромосому активной. Хотя может показаться, что модель противоречит интуиции, она обладает важным достоинством, объясняя большин- ство сделанных до сегодняшнего времени эксперимен- тальных наблюдений. Природа блокирующего фактора остается, однако, неизвестной. Наше понимание механизмов, регулирующих экс- прессию Xist и инициацию Х-инактивации, очень вы- играло от использования клеток ES, культивируемых in vitro. Клетки ES получаются из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, говоря конкретнее, из ICM (рис. 17.4). Они остаются недифференцированными при культивировании в сыворотке с добавкой лейкеми- ческого ингибиторного фактора (LIF, leukemia inhibi- tory factor). Дифференцировку in vitro можно включить удалением LIF из культуральной среды и пересевом клеток на чашки, изготовленные из неадгезивного пла- стика. В этих условиях они округляются, агрегируют и формируют эмбриоидные тела, внутри которых они дифференцируются, на протяжении всего нескольких дней, во много разных соматических клеточных типов В недифференцированном состоянии ES-клетки XX обладают двумя активными Х-хромосомами. Когда ин- дуцируют дифференцировку этих клеток, большинство клеток эмбриоидного тела претерпевают случайную Х-инактивацию. Напротив, в дифференцированных ES-клетках XY экспрессия Xist и Х-инактивация не про- исходят Таким образом, ES-клетки представляют собой ценную модельную систему, потому что они поддаются генетическому манипулированию с использованием «нацеливания» на гены, и, таким образом, на них мож- но изучать различные этапы процесса Х-инактивации. Ключевым экспериментом явилась демонстрация того, что делеция участка длиной 65 т.п.н., локализованного непосредственно «вниз по течению» от Xist, приводит к экспрессии Xist этой аллелью (и, как следствие, к инак- тивации) даже в дифференцирующихся ES-клетках XY (Clerc and Avner, 1998). Это означает, что делегирован- ные последовательности необходимы для связывания предполагаемого блокирующего фактора. Дальнейшая характеристика участка, ответственного за это, была до- стигнута с помошью стратегий «замещения — нацели- вания», позволяющих получать делеции более мелких участков в пределах этих 65 т.п.н. (рис. 17.6). Опреде- ление ключевых элементов и идентификация связы- вающихся с ними факторов являются главными целями будущих исследований.
3. Инициация Х-инактивации 6. Самка XX Рис. 17.5. Модель блокирующего фактора для случайной инакти- вации Х-хромосомы Модель блокирующего фактора предполагает, что имеется некий фактор (желтый кружок), который во всех клетках блокирует единственную аллель Xist (зеленый прямоугольник}, так что в начале Х-инактивации эта хромосома защищена от идущей Х-инактивации. В мужских клетках (а) присутствует только одна аллель, и блокирующий фактор всегда связывается с нею. В женских клетках (б) существует равная вероятность, что блоки- рующий фактор свяжется либо с аллелью XmXist (красный цвет}, либо с аллелью Хр Xist (синий цвет}. В начале Х-инактивации только незаблокированная аллель будет экспрессировать Xist —РНК (зеленая прерывистая линия}. Разные алели цетра Х-инактивации могут иметь большее или меньшее сродство к блокирующему фактору, так что у гетерозиготных самок этот фактор предпочтительно связывается с одной Х-хромосомой. В некоторых случаях это может лежать в основе отклонений от первичной неслучайной Х-инактивации (рис. 17.7) 3.4. Регуляция случайной Х-инактивации — выбор При некоторых обстоятельствах могут иметь место от- клонения от случайной Х-инактивации. Это происходит либо в результате нарушений в первоначальном выборе Х-хромосомы для инактивации («первичная неслучайная инактивация), либо в результате отбора против клеток, поддерживающих конкретную Х-хромосому в активном состоянии («вторичная» неслучайная Х-инактивация) (рис. 17.7). При первичной неслучайной Х-инактивации на выбор влияют вариации cis-действующих последова- тельностей или мутации, влияющие на вероятность того, что данная Х-хромосома будет выбрана у гетерозиготных животных как активная или неактивная X. Согласно предложенной Растаном модели блокирующего фактора, эти вариации могут проявлять свое влияние, изменяя вероятность связывания блокирующего фактора с дан- ной аллелью. Примером первичной неслучайной Х-инактивации является контролирующий Х-хромосому элемент (Хее, X controlling element) у мышей. Хее — классическим об- разом определенный локус, где разные аллели оказа- лись влияющими на вероятность того, что несущая этот локус Х-хромосома будет активной X у гетерозигот XX (Cattanach and Isaacson, 1967). Опыты по генетическому картированию помещают Асе непосредственно «вниз по течению» от Xist (рис. 17.6) и, следовательно, в правиль- ном положении для того, чтобы влиять на связывание блокирующего фактора, как определяется делецией 65 т.п.н. Лежащую в основе этого изменчивость последо- вательностей остается идентифицировать. Второй элемент, который у мышей может влиять на выбор, — это антисмысловой регулятор Tsix (Lee and Lu, 1999). Полагают, что он опосредуется антисмысловой РНК Tsix, которая транскрибируется через локус AZtf пе- ред инициацией случайной Х-инактивации (рис. 17.6). Хромосома, несущая делецию промотора Tsix, в клетках XX, претерпевающих случайную Х-инактивацию, инак- тивируется предпочтительно. Более слабые отклоне- ния наблюдаются у клеток с мутациями в энхансерных элементах (Xite-элементах), которые могут управлять уровнями экспрессии Tsix. Хотя промотор Tsix лежит в пределах района, определяющего предполагаемый сайт связывания блокирующего фактора, опыты с «прицель- ными» делециями не активируют Xist «по умолчанию» в ES-клетках ХУ. Это позволяет предположить, что эти локусы не синонимичны, но что делеция промотора Tsix оставляет интактными сайты связывания для бло- кирующего фактора. Транскрипция Tsix сопровождается транскрипци- ей Xist, идущей на низком уровне, перед инициацией случайной Х-инактивации, позволяя предполагать, что влияние на выбор может быть опосредовано двуните - вой РНК (т.е. гибридными нитями Tsix:Xist}. В согласии с этим повышение уровня смысловой транскрипции через промоторы Xist находится в противоречии с ре- прессивным эффектом Tsix и дает в результате аллель с меньшей вероятностью стать активной X в гетерози- готной клетке XX (Nesterova et al., 2003). Подытоживая этот материал, можно сказать, что на рис. 17.6 показаны все различные Xic-элементы, о которых известно, что они влияют на инициацию случайной и импринтиро- ванной Х-инактивации, и которые часто описываются с точки зрения их способности влиять на функции сче- та и (или) выбора
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих Счет Выбор (Хее) Выбор I (~х, ПХГэ-34, Xib: \ 10 т.н. Рис. 17.6. Гены и регуляторные элементы в районе центра Х-инактивации Ключевой район, регулирующим Х-инактивацию, изображен зеленым цветом. Фланкирующие гены показаны серым цветом Стрелки указывают на промоторы генов Xist (смысловой) и Tsix (антисмысловой). Протяженность соответствующих некоди- руюших РНК изображена прерывистыми зелеными линиями. Регуляторные элементы, контролирующие экспрессию Tsix, Xite и DXPas34, показаны черным. Районы и локусы, участвующие в выборе Х-хромосомы и счете Х-хромосом, показаны в верхней части рисунка 3.5. Способы переключения инактивации в раннем эмбриогенезе Каким образом ранние эмбрионы мыши осуществля- ют переключение с импринтированного на случайный способ регуляции? До недавнего времени думали, что в обоих случаях инициация Х-инактивации сцеплена с клеточной дифференцировкой (Monk and Harper, 1979). Так, полагали, что линии трофэктодермы и примитивной эндодермы инактивируют Хр в ответ на родительские импринты на Xist, когда они впервые дифференцируются на стадии бластоцисты, в то время как клетки ICM, даю- щие начало собственно эмбриону, сначала, как думали, стирают импринт Xist, а потом претерпевают случайную Х-инактивацию, когда они дифференцируются в три зародышевые линии на стадии гаструляции. Однако более свежие данные показывают, что инактивация ХР происходит до начала клеточной дифференцировки на стадии дробления зародышей и что она происходит во всех клетках, включая предшественников ICM (Mak et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Таким образом, имприн- тированная Х-инактивация в трофэктодерме и прими- тивной эндодерме представляет собой реликт паттерна Х-инактивации, устанавливаемого у эмбрионов на стадии раннего дробления. Клетки ICM должны, таким образом, запускать программу для реверсии этой начальной волны импринтированной Х-инактивации (см. рис. 17.4). База для реверсии инактивации Хр неизвестна, но может вклю- чать в себя специфичную для ICM программу, которая репрессирует экспрессию Xist на Хр (см. раздел 5). 4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния 4.1. Xist-PHK, сайленсинг генов и сборка гетерохроматина Так что же делает ген Xist? Имеются убедительные данные, что ген Xist и его продукт, РНК, обеспечивают как переключатель, инициирующий Х-инактивацию в с/5-конфигурации, так и средство распространения сайленсинга по хромосоме. Данные показывают, что (1) Xist уникален в том отношении, что он экспрессируется только с Xi, (2) уровни AXs7- PH К резко возрастают у пре- димплантационных эмбрионов во время Х-инактивации, (3) ап-регуляция Xist предшествует Х-инактивации и, по-видимому, является абсолютно необходимой для нее, (4) JZs/-PHK колокализуется с Xi в интерфазных ядрах и распределяется по одной из двух метафазных Х-хромосом (см. рис. 17.3) и (5) содержащие Xist трансгены, будучи вставлены в аутосомы, могут индуцировать по крайней мере некоторые свойства неактивного хроматина В ре- зультате (сверх)экспрессии аутосома в ш-конфигураиии покрывается продуктом, и параллельно возникает по- добная гетерохроматину, транскрипционно «молчащая» структура хроматина (Heard et al., 1999 и помещенные там ссылки). Эти открытия заставляют предположить, что А75/-РНК и необходима, и достаточна для включения формирования гетерохроматина и транскрипционного сайленсинга. Однако продолжающаяся экспрессия Xist не требуется для поддержания Х-инактивации. Напри- мер, у гибридов соматических клеток человека и грызуна, где экспрессия Xist утрачена на Xi-хромосоме человека, которая сохраняется на фоне хромосом грызуна, поддер- живается сайленсинг генов, сцепленных с Х-хромосомой (Brown and Willard, 1994). Эта тема обсуждается далее, в разделе 5. Важно отметить, что ассоциация Ам7-РНК с Xi из- бирательна. Она не обнаруживается вдоль PAR (которое остается активным и эухроматиновым) или в конститу- тивном (центрическом) гетерохроматине. Более того, анализ метафазных хромосом демонстрирует локализа- цию в виде бэндов, которая, по-видимому, коррелируете G-светлыми полосами (бэндами), обогащенными гена- ми (см. рис. 17.3) (Duthie et al., 1999). Эти наблюдения показывают, что Лм7-РНК покрывает лишь определен- ные районы хроматина (обсуждается далее в разделе 4.5) Механизм (механизмы), посредством которого Xist- РНК осуществляет изменения в структуре хроматина и связанный с ним сайленсинг генов в деталях остаются
4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния все еще непонятными. Мы знаем, что разные участки молекулы AZs7-PHK ответственны за сайленсинг генов и распространение вдоль Х-хромосомы. Эксперименты с системой индуцибельной экспрессии Xist в мышиных ES-клетках, в которой можно было протестировать функции молекул Xist, несущих определенные делеции, показали, что сайленсинг можно приписать консерва- тивной повторяющейся последовательности на 5’-кон- це этой молекулы, тогда как покрытие Х-хромосомы опосредуется последовательностями, разбросанными по всей остальной части молекулы (Wutz et al., 2002). 4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы Со времени самых ранних светомикроскопических исследований вполне осознавали, что Xi обладает свойствами, общими с гетерохроматином. Подобно конститутивному гетерохроматину, обнаруживаемому в центромерах и вокруг них, Xi остается видимой и, веро- ятно, конденсированной на протяжении всей интерфазы (в виде тельца Барра), и ее ДНК обычно реплицируется в поздней фазе S. Говорится, что Xi состоит из факуль- тативного гетерохроматина. Однако важно помнить, что ДНК конститутивного гетерохроматина обычно обогащена специфическими, повторяющимися сател- литными последовательностями, которые ответственны, по крайней мере частично, за его характерные свойства. ДНК Х-хромосомы не обнаруживает подобной обога- щенности, хотя и демонстрирует более слабые различия в специфических повторяющихся элементах, которые могут играть роль в процессе инактивации (см. раздел 4.5). Кроме того, хотя хроматин Xi часто описывается как «конденсированный», тщательный микроскопиче- ский анализ и SD-реконструкция хромосом Ха и Xi, по- меченных специфичным к ДНК Х-хромосомы зондом, позволяют предполагать, что различие между ними яв- ляется в большей мере вопросом формы, чем количества хроматина на единицу объема (Eils et al., 1996). Дальнейшие параллели между Xi и конститутивным гетерохроматином последовали в результате использо- вания непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для изучения распределения модификаций и вариантов гистонов по метафазным хромосомам и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной Х-хромосомы и в клетках человека, и в клетках мыши обеднен ацетилированным гистоном Н4 (Jeppesen and Turner, 1993) и в этом отношении напоминает конститу- тивный, центрический гетерохроматин. Это явилось пер- вой демонстрацией того, что неактивная Х-хромосома маркирована модификацией гистонов специфического типа. Последующие эксперименты, проведенные в не- скольких лабораториях, подтвердили эти наблюдения и показали далее, что ацетилированные изоформы всех четырех коровых гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4) обедне- ны и конститутивным, и факультативным гетерохрома- тином в интерфазных и метафазных клетках (O’Neill et al., 2003 и помещенные там ссылки). В частности, и цен- трический гетерохроматин, и Xi обеднены НЗ, ди- и три- метилированным по К4 (НЗК4те2 и НЗК4теЗ). Обыч- но полагают, что эти последние, как и ацетилирование, являются маркерами транскрипционно активного (или потенциально активного) хроматина. Ситуация становится сложнее, когда рассматривается появление меток, ассоциированных с транскрипцион- ным сайленсингом, а не изчезновение меток, связанных с транскрипционной активностью. Например, гистоны НЗ, ди- и триметилированные по К9 (H3K9me2/3), — характерные метки транскрипционно «активных» генов, и с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии не- редко можно видеть, что они обогащены центическим гетерохроматином (Lachner et al., 2003). Однако по ряду технических и биологических причин, обогащенность ими Xi выглядела неопределенной. По этой причине, сле- дует подчеркнуть значение специфичности антител для получения надежных результатов иммунофлуоресценции Например, лизины 9 и 27 в НЗ оба являются частью тетра- пептидного ARKS, и антитела, полученные против одно- го, могут давать перекрестную реакцию с другим. Такие перекрестные реакции должны быть тщательно исклю- чены, прежде чем полученные результаты можно будет надежно интерпретировать. Кроме того, использованная процедура иммунизации и использованный иммуноген могут влиять на тонкую специфичность антисывороток. Например, антисыворотки к НЗК9теЗ, полученные с по- перечносшитыми [cross-linked] пептидами, сильнее свя- зываются с этим модифицированным гистоном, когда он находится в гетерохроматиновом районе, чем когда он в эухроматине (Maison et al., 2002). Антисыворотки, полу- ченные таким образом, являются ценными реагентами для исследований по гетерохроматину, но не идеальными ддя количественных сравнений гетерохроматина и эухро- матина Наконец, было отмечено, что усиленное имму- нофлуоресцентное окрашивание в интерфазе может быть просто результатом более высокой плотности нуклеосом в гетерохроматине (Perche et al., 2000). Тщательный анализ распределения модификаций гистонов по Xi в культивируемых клетках человека позволил глубже проникнуть в сложность этой систе- мы (Chadwick and Willard, 2004). Определенные и не- перекрывающиеся районы в Xi обогащены НЗК9теЗ и НЗК27теЗ. Таким образом, в отличие от утраты аце- тилирования, обогащенность этими модификациями является региональным, а не общим свойством Xi. Лю- бопытно, что районы, обогащенные НЗК27теЗ, оказы- ваются также обогащенными АА/-РНК и вариантным гистоном макроН2А1.2 (Costanzi and Pehrson, 1998). Ка- ким образом макроН2А1.2 мог бы ассоциироваться с Xi и какова его возможная роль в процессе инактивации — эти вопросы обсуждаются далее, в разделе 4.4. Напро- тив, те районы Xi, которые обогащены НЗК9теЗ, по- казывают также повышенные уровни гетерохроматино- вого белка НР1 (о котором известно, что он связывается с метилированными НЗК9) и Н4К20гпеЗ (метка, также ассоциированная с конститутивным, центрическим гетерохроматином). Важно отметить, что иммуноокра- шивание тельца Барра в интерфазных клетках показало такие же паттерны совместного окрашивания, что за- ставляет предполагать, что различные домены сохраня- ются на протяжении всего клеточного цикла.
6. Вторичная неслучайная Рис. 17.7. Модели неслучайной Х-инактивации Первичной неслучайной X-инактивацией обозначают откло- нения в первоначальном выборе Х-хромосомы, которая будет инактивирована. Теоретически это могло бы происходить у гетерозиготных самок, где имеется отклонение в вероятности двух аллелей, связывающихся с блокирующим фактором. При вторичной неслучайной Х-инактивации выбор Х-хромосомы, которая будет инактивирована, является случайным, но собы- тия клеточного отбора приводят к прогрессивной утрате клеток, инактивирующих одну из двух Х-хромосом. Например, там, где на одной Х-хромосоме имеется вредная мутация, клетки, инактивирующие другую Х-хромосому, хромосому дикого типа, будут предпочтительно теряться Возникающая картина — это картина сочетания модификаций гистонов, вариантов гистонов, неги- стоновых белков и АА/РНК, взаимодействие которых формирует хроматин с его отличительными свойствами транскрипционного «молчания», репликации в позд- ней S-фазе, конденсированным внешним обликом и (возможно) ядерной локализацией, которые характер- ны для Xi. Однако точное функциональное значение отдельных хроматиновых доменов на Xi еще предстоит установить. Важное и беспокоящее наблюдение заклю- чается в том, что частота наблюдаемых доменов широко варьирует от одной клеточной линии человека к другой (Chadwick and Willard, 2004). Это может быть не более, чем подтверждением известной избыточности в систе- ме Х-инактивации (например, как отмечалось ранее, в зрелых клетках сайленсинг поддерживается даже тогда, когда ААГ-PH К утрачивается), но это также и предупре- ждение, что культивируемые клеточные линии, особен- но иммортализованные. не всегда являются надежным проводником в том. что происходит в первичных тка- нях, и уж точно не на ранних стадиях развития. Модификации гистонов, ассоциированные с эух- роматином и факультативным, и конститутивным ге- терохроматином, суммированы в табл. 17.1. До сих пор лишь Xi, но не конститутивный гетерохроматин, оказа- лась обогащенной метилированием НЗК27 и убиквити- нированием гистона Н2А по лизину 119 (H2AK119ub) (Plath et al., 2003; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004). Все модификации, перечисленные в табл. 17.1, ассоциированы с общей, гетерохроматиновой кон- формацией неактивной Х-хромосомы и были иден- тифицированы с помощью иммунофлуоресцентного анализа либо метафазных хромосом, либо тельца Барра
4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния Таблица 17.1. Модификации гистонов, характерные для консти- тутивного и факультативного гетерохроматина Гистон Модификация Количество (по отноше- нию к эухроматину) конститу- тивный гете- рохроматин (центриче- ский) факульта- тивный гетерхрома- тин (Xi) H2A, H2B, НЗ, Н4 Ацетилирова- ние3 - - Н2А К119 ubiquitylation + НЗ К4 me2/me3 — — НЗ К9 те2/теЗ + НЗ К27 те2/теЗ к +в Н4 К20 теЗ + Указаны модификации гистонов, которыми обогащен (+) или обеднен (-) конститутивный и факультативный гетерохроматин по сравнению с эухроматином. Символ ® означает, что уровень модификации неотличим сколько-нибудь от эухроматина. (те) — метилирование. Ютносится ко всем способным ацетилироваться лизинам. Обогащение в локальных «горячих пятнах», но не повсюду. вВременное обогащение в некоторых клеточных типах. в интерфазных клетках. Однако локальные изменения в модификациях гистонов могут также играть важную роль на различных этапах процесса Х-инактивации. Такие изменения могут быть идентифицированы с по- мощью микроскопии высокого разрешения или с по- мощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) для того, чтобы картировать модификации, которые объ- яснялись в главе 10, внутри или по соседству с кри- тичным районом Xie. Например, в недифференциро- ванных ES-клетках крупный домен, простирающийся более чем на 340 т.п.н. в 5’-направлении от гена Xist, характеризуется гиперметилированием НЗК9. Гипер- метилирование уменьшается по мере того, как клетки дифференцируются и продолжается Х-инактивация (Heard et al., 2004). В женских ES-клетках тот же об- щий район хроматина обогащен метилированными НЗК27 (Rougeulle et al., 2004), а сайты внутри него обогащены ацетилированными НЗ и Н4 (O’Neill et al., 1999). Проводимые в настоящее время исследо- вания должны показать, в какой мере эти локальные модификации гистонов в районе Xie являются ран- ними каузативными событиями, приводящими в дей- ствие процесс Х-инактивации, и в какой степени — событиями, совершающимися «вниз по течению» и являющимися (возможно, существенными) компо- нентами идущего процесса ремоделинга хроматина. Конститутивный центрический гетерохроматин обо- гащен метилированной ДНК, прежде всего 5’-метилци- тозином в димерах CpG (глава 18). Это согласуется с его низким уровнем транскрипционной активности Как это, возможно, ни удивительно, уровень метилирова- ния CpG на Xi в целом не является существенно более высоким, чем в остальном геноме. Однако специфиче- ские «островки» CpG, ассоциированные с «молчащими» генами, в высокой степени метилированы, и экспери- ментальные данные позволяют предполагать, что мети- лирование ДНК играет важную роль в стабилизации не- активного состояния. Так, мыши, у которых отсутствуют ферменты, которые либо метилируют немодифициро- ванные до этого CpG (de novo метилтрансферазы ДНК, Dnmta и Dnmtb), либо поддерживают модификацию прежде модифицированных остатков (поддерживающий энзим, Dnmtl), инициируют и осуществляют случайную Х-инактивацию нормальным образом (Sado et al., 2000, 2004). Однако гены на гипометилированной Xi у этих му- тантных мышей реактивируются легче, чем Xi у живот- ных дикого типа с нормальными уровнями метилирова- ния (Sado et al., 2000). 4.3. Энзимология модификаций гистонов на Xi Ферменты, отвечающие за ацетилирование коровых гистонов (HDACs) во время Х-инактивации или за деметилирование НЗК4, пока неизвестны. Поскольку ингибитор деацетилазы трихостатин A (TSA, trichos- tatin А) может предотвращать или, по крайней мере, задерживать появление деацетилированной X в диффе- ренцирующихся женских ES-клетках, есть основания предположить участие HDACs (O’Neill et al., 1999). Однако мы не знаем, какие из 11 HDACs класса I и II отвечают за это вероятнее всего (энзимы класса III не подавляются TSA). Мы не знаем также механизм, ответ- ственный за удаление метилирования НЗК4. Ферменты, способные удалять метильные группы с НЗК4, нахо- дящихся в моно- или диметилированном состоянии, были идентифицированы только недавно, а ферменты, способные деметилировать НЗК4 в триметилированном состоянии, еще предстоит открыть. На этом этапе мы не можем исключить, что метилирование НЗК4 и (или) деацетилирование гистонов удаляются с Xi путем за- мещения гистонов или же пассивным образом в ходе репликации ДНК. В настоящее время мы больше знаем об энзимах, ответственных за помещение модификаций гистонов в нужное место. Метилирование НЗК27 выполняется Ezh2/Enxl — гомологом белка группы polycomb (PcG) у Drosophila, энхансером zeste (E(Z)) (Silva et al., 2003) (E(Z)) является метилтрансферазой гистонов (HKTM), функционирующей в комплексе PRC2 PcG (глава 11). PRC2 рекрутируется к Xi во время дифференцировки ES-клеток с такой же кинетикой, что и метилирование НЗК27. Интересно, что белки PcG участвуют также в убиквитинизации Н2А по лизину 119 на Xi. В частно- сти, белок RinglA/RinglB, коровый компонент ком- плекса PRC2 PcG, функционирует как лигаза ЕЗ для убиквитинирования Н2А. Делеция и Ring 1 А, и Ring 1В приводит к потере убиквитинирования Н2А как на Xi, так и по всему геному (de Napoles et al., 2004).
326 Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих 4.4. Последовательность событий, приводящих к Х-инактивации; ES-клетки как модельная система Мышиные ES-клетки оказались бесценной модельной системой для исследования динамики инактивации Х-хромосомы. Повышенные уровни XzsZ-PHK и то, как она покрывает одну из Х-хромосом, впервые об- наруживаются в большой доле клеток спустя 1—2 дня дифференцировки. Имеются данные о том, что в ап- регуляции Xist играют роль как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997; Rougeulle et al., 2004). Од- нако в недифференцированных женских ES-клетках Xist транскрибируется с обеих Х-хромосом, а в мужских — с единственной X, но продукт транскрипции, РНК, быстро деградирует, и лишь небольшие его количества выявля- ются по соседству с локусом Xist. Были представлены данные о том. что по мере дифференцировки имеет место стабилизация ЛАГ-РНК на одной из двух Х-хромосом женских клеток (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997). Механизм, лежащий в основе этого этапа избира- тельной стабилизации РНК, остается неизвестным, как и его вклад в общее увеличение содержания AZtf-PHK и в покрытие ею хромосомы в cw-конфигурации. Было обнаружено, что ряд этапов Х-инактивации совпадает с началом аккумуляции АА/-РНК в диффе- ренцирующихся ES-клетках XX. В их число входят ре- крутирование белков PcG и ассоциированное с этим метилирование НЗК27, моноубиквитинирование Н2А, деацетилирование НЗК9 и утрата метилирования в НЗК4 (Heard et al., 2001; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Rougeulle et al., 2004). Глобальное деацетили- рование гистонов — относительно позднее событие, происходящее в большинстве клеток на 3—5-й день; поэтому весьма вероятно, что оно участвует в поддер- жании и (или) стабилизации неактивного состояния, а не в его инициации (Keohane et al., 1996). Такая трак- товка предполагает, что паттерны ацетилирования в промоторах отдельных генов, претерпевающих инакти- вацию, отражают паттерны, определяемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа целой хромосомы или крупных доменов. Первоначальные исследования с использованием ChIP, заставляют предполагать, что это действительно так, однако необходимы дальней- шие эксперименты с вовлечением большего числа ге- нов (O’Neill et al., 2003). Аккумуляция вариантного гистона шасгоН2А1.2 на Xi происходит в ходе дифференцировки ES-клеток XX гораздо позже (Mermoud et al., 1999). Этот вариантный гистон имеет более 200 дополнительных аминокислот- ных остатков в своем карбокситерминальном конце и несколько аминокислотных замен по всей молекуле. Интересно, что в соматических клетках экспрессия Xist- РНК требуется для того, чтобы сохранить шасгоН2А на Xi (Csankovski et al., 1999), но ее недостаточно, чтобы рекрутировать шасгоН2А на ранних этапах дифферен- цировки (Mermoud et al., 1999; Wutz et al., 2002). Избирательное метилирование ДНК на Xi — еше бо- лее позднее событие в ES-клетках, Динуклеотиды CpG, о которых известно, что они высокометилированы на Xi во взрослых клетках, не становятся метилированными в женских ES-клетках до гораздо более поздних стадий дифференцировки, 14—21-го дня (Keohane et al., 1996). Это согласуется с результатами в самом развивающем- ся эмбрионе (Lock et al., 1987) и с идеей, согласно ко- торой метилирование ДНК отвечает за стабилизацию, или фиксацию неактивного состояния, а не участует в инициации и распространении. Таким образом, возникающая картина — это кар- тина скоординированной и тщательно регулируемой последовательности событий, посредством которых из- менения хроматина на Xi помещаются на место по мере развития (суммировано на рис. 17.8). Замечательно, что некоторые из этих изменений, например деацетилиро- вание гистонов и метилирование ДНК, происходят по- сле того, как клетки начали продвигаться по различным дифференцировочным путям. Создается впечатление, что программа, отвечающая за завершение [comple- tion] Х-инактивации, выполняется независимо от дру- гих программ клеточной дифференцировки. Важно, однако, отметить, что в некоторых аспектах случайная Х-инактивация может происходить только после того, как дифференцировка началась. Например, включе- ние экспрессии AzsZ-трансгенов в недифференцирован- ных ES-клетках переключает различные модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматинизацией, а также переход к репликации в поздней S-фазе (Wutz and Jaenisch, 2000), но сколько-нибудь заметное вклю- чение шасгоН2А отсутствует; только после того как индуцирована дифференцировка клеток, тасгоН2А ко-локализуется с АА/-РНК на хромосоме, содержа- щей трансген Xist (Rasmussen et al., 2001). Ассоциация macroH2A с хроматином, покрытым Xist, зависит от ES-клетки Полностью дифференциро- ванные клетки в культуре: дни диффе- ренцировки 14 Плюрипотентные V клетки ............ эпибласта Xist РНК ....................................... 0 НЗК27 Гистон macro ДНК methil'n deacetyl'n Н2А methil'n Рис. 17.8. Слои эпигенетического сайленсинга накапливаются на Xi в ходе дифференцировки Диаграмма показывает, как пять разных эпигенетических изменений, связанных с транскрипционным сайленсингом, размещаются на неактивной Х-хромосоме на разных стадиях развития и дифференцировки каку развивающегося эмбриона, так и в клетках ES в культуре. В некоторых клеточных типах метилирование НЗК27 является временным, преходящим, обнаруживаемым лишь на ранних стадиях дифференцировки, но не у зрелых клеток
4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния постоянного присутствия AZtf-PHK (Csankovszki et al., 1999), но не требует транскрипционного сайленсинга, поскольку она видна также в хромосомах, покрытых мутантной A7s/-PHK, лишенной районов, необходи- мых для сайленсинга (Wutz et al., 2002). Таким образом, Х-инактивация может рассматриваться как конечный результат серии параллельных процессов, из которых лишь некоторые являются взаимозависимыми. Важно подчеркнуть, что конкретные энзимати- ческие комплексы или модификации гистонов мо- гут играть критическую роль на определенных этапах процесса Х-инактивации, но могут становиться менее важными или избыточными позднее, возможно, после того, как более постоянные механизмы сайленсинга, основанные на метилировании ДНК. будут помеше- ны в нужное место. Например, метилирование НЗК27, катализируемое PRC2, является существенным для успешной Х-инактивации на ранних этапах онтогенеза, но необязательным в более поздние сроки. Следует также отметить, что в ходе установления импринтированной Х-инактивации у предимпланта- ционных эмбрионов может иметь место иной порядок событий. В частности, обогащение НЗК27шеЗ не обнару- живается до 16-клеточной стадии, значительно позже на- чала экспрессии Xist (стадия 24 клеток) (Mak et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Это может указывать на потребность в специфических, ретулируемых в развитии кофакторов для рекрутирования комплекса PRC2 PcG к Xi. 4.5. Распространение «молчащего» хроматина XIC является существенным для Х-инактивации, и было высказано предположение, что сайленсинг распространя- ется с XIC; при этом проксимальные гены сайленсируются раньше, чем более дистальные. Одним из объяснений этого могло бы быть, что А/5/-РНК распространяется про- грессивно по хромосоме, начиная с сайта своего синтеза Это согласовывалось бы с результатами экспериментов, в которых трансгены Xist вставлялись в аутосомы и где покрытие такой аутосомы AZs/ PH К приводило к сайлен- сингу генов и изменениям хроматина (см. выше). Распространение неактивного состояния от XIC ши- роко исследовалось в естественно случающихся транс- локациях Х;аутосома. Действительно, такие трансло- кации прекрасно демонстрируют существование XIC (Rastan, 1983). Было показано, что хроматин, несущий характерные маркеры факультативного гетерохромати- на (например, утрата ацетилирования гистонов, позд- няя репликация и транскрипционный сайленсинг), распространяется от Xi в аутосомную часть гибридной хромосомы (White et al., 1998; Duthie et al., 1999; Sharp et al., 2002). Этим устанавливается важный принцип, согласно которому факультативный гетерохроматин не является исключительным для Х-хромосомы, что согласуется с результатами, полученными с трансгена- ми Xist, экспрессируемыми на аутосомах. Однако рас- пространение «молчащего» хроматина по аутосомному плечу хромосомы варьирует между транслокациями и ограничено по масштабам Существуют две модели, объясняющие ограничен- ное распространение сайленсинга в с/5-сцепленные аутосомы. Во-первых, аутосомы могут сопротивляться начальному распространению AzsZ-PHK и связанного с этим сайленсинга генов в начале Х-инактивации. В ка- честве альтернативы можно предположить, что перво- начальное распространение на аутосомы могло бы быть эффективным, но сайленсинг может плохо поддержи- ваться в онтогенезе, что обозначается как «распростра- нение и отступление» [«spread and retreat»]. На сегод- няшний день данные говорят в пользу «распространения и отступления», но эти две модели не исключают друг друга, и требуются дальнейшие исследования. Следует заметить, что в раннем развитии против тех клеток, в которых происходит обширный сайленсинг аутосомы, может действовать отбор из-за утраты экспрессии кри- тичных аутосомных генов. В некоторых транслокациях Х;аутосома распростра- нение является прерывистым, как будто бы перескакива- ет через определенные районы и оставляет транскрипци- онно активными эухроматиновые районы, окруженные «молчащими», гетерохроматиновыми районами (Sharp et al., 2002). Распространение конститутивного гетерох- роматина в соседние эухроматиновые районы, приводя- щее к эффекту положения мозаичного типа у Drosophila (глава 5), может обнаруживать сходное поведение. Такие наблюдения легче согласовать с механизмом раннего клеточного отбора, основанным на распространении и отступлении сайленсинга, чем с непрерывным распро- странением стабильного сайленсинга. Предположили, что есть элементы, распределенные вдоль Х-хромосомы, называемые «путевыми станция- ми» [«way stations»], которые служат пунктами сборки гетерохроматина и тем самым усиливают распростра- нение и (или) поддержание Х-инактивации (описано в: Gartler and Riggs, 1983). Эти элементы должны были бы быть менее обычными или, по крайней мере, менее регулярно распределенными на аутосомах. Было вы- сказано предположение, что семейство обычных дис- пергированных повторов, длинные перемежающиеся повторы (LINES) являются хорошими кандидатами на роль «путевых станций» (Lyon, 1998, 2003). Эти повто- ряющиеся последовательности обычны в геномах чело- века и мыши, но особенно часты вдоль Х-хромосомы Более того, элементы LINE наиболее обычны в более конденсированных, бедных генами, G-бэндированных районах геномов человека и мыши, позволяя предпо- ложить, что они могут каким-то образом благоприят- ствовать конформации хроматина, ассоциированной с транскрипционным сайленсингом Недавнее завер- шение определения нуклеотидной последовательности ДНК Х-хромосомы человека выявило такое распреде- ление элементов LINE, которое в целом согласуется с возможной ролью «путевых станций», но эта идея оста- ется недоказанной. 4.6. Уход от инактивации Х-хромосомы Как обсуждалось ранее, известно, что ряд генов избега- ют инактивации. Если использовать механистические
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих термины, уход от Х-инактивации приписали редкости «путевых станций» по соседству с этими генами или присутствию граничных элементов, блокирующих рас- пространение AzsZ-PHK и (или) других компонентов сай- ленсинга. Имеются некоторые данные о том, что гены, избегающие инактивации, в раннем развитии являются «молчащими», по крайней мере до некоторой степени. Например, в случае гена Smcx мыши уход от инактива- ции варьирует в зависимости от стадии развития и от типа ткани (Sheardown et al., 1996). Это, следовательно, в большей мере согласуется с обсужденной выше идеей распространения и отступления в контексте сайленсинга аутосомных генов в транслокациях Х;А. 4.7. Х-инактивация у сумчатых млекопитающих Эутерии и сумчатые млекопитающие разошлись около 130 миллионов лет тому назад. Сумчатые, как и эутерии, используют систему детерминации пола XY (самец) :ХХ (самка) и механизм компенсации дозы, в котором одна из двух женских Х-хромосом инактивирована. Как упо- миналось ранее, эта неактивная X у сумчатых всегда представлена гомологом, полученным от отца (Хр). Сле- дующее отличие сумчатых от плацентарных млекопитаю- щих заключается в том, что степень сайленсинга генов в отдельных локусах часто варьирует в разных тканях. Имеются также некоторые данные, что нестабильность сайленсинга возрастает в ходе развития и онтогенеза. Это опять-таки напоминает модель распространения и от- ступления, предложенную для сайленсинга аутосомных локусов у плацентарных млекопитающих. Интересно, что обогашенность элементами LINE на Х-хромосоме возникла после расхождения эутерий и метатерий, так что возможно, что нестабильность сайленсинга на Х-хромосоме сумчатых также связывается с идеей «путевых станций». Более того, отсутствие у сумчатых метилирования в островках CpG, ассоциированных с генами, сцепленными с X, могло бы вносить дополни- тельный вклад в нестабильность Xi. Относительно мало известно о молекулярном ме- ханизме Х-инактивации у сумчатых и пока еще не идентифицирован у сумчатых гомолог Xist. Отсутствие гомолога Xist не исключает, конечно, существования негомологичной РНК, выполняющей ту же функцию, что и инициатор Х-инактивации, но пока ничего по- добного не было найдено. Единственные два свойства, однозначно общие для неактивной X у эутерий и сумча- тых млекопитающих, — поздняя репликация в фазе S и маркировка низкими уровнями ацетилирования гисто- на Н4 (Wakefield et al., 1997). Ввиду мужской летальности по мутациям, нару- шающим компенсацию дозы у других организмов, в том числе у других млекопитающих, удивительно, что сумчатые толерантны к неполной компенсации дозы. Одно из возможных объяснений вытекает из того фак- та, что Х-хромосома сумчатых несет меньше генов, чем ее гомолог у плацентарных млекопитающих (Graves, 1996; Marshall Graves and Shetty, 2001). Лишь гены, на- ходящиеся на длинном плече Х-хромосомы эутерий, присутствуют на Х-хромосоме сумчатых. Гены, находя- щиеся на коротком плече, у сумчатых распределены по аутосомам. Большая часть X сумчатых является, таким образом, обедненной генами и конститутивно гете- рохроматиновой. Возможно, эта редукция числа генов сделала возможной толерантность некоторых типов клеток к ослаблению компенсации дозы; в то же время это ослабление недостаточно велико, чтобы организм вообще мог обходиться без компенсации. Кроме того сумчатые могут сайленсировать Xi более эффективно в раннем онтогенезе, когда различия в дозах являются, вероятно, наиболее критичными, аналогично тому, что имеет место для импринтированных локусов. Эти два объяснения могут оба играть свою роль 5. Реактивация и репрограммирование Х-хромосомы 5.1. Стабильность Х-инактивации в соматических клетках Множественные слои эпигенетических модифи- каций вносят свой вклад в сайленсинг неактивной Х-хромосомы, и в результате репрессированное со- стояние обычно очень стабильно. Иллюстрацию этого мы находим в ранних экспериментах, где прослежи- вали способность 5-азацитидина (5azaC), ингибитора метилирования ДНК, вызывать реверсию сайленсинга Х-хромосомы в линиях клеток XX (Mohandas et al., 1981). Наблюдали, что с низкой частотой происходит спорадическая реактивация отдельных генов. Однако анализ клеточных линий, в которых данный ген реакти- вировался, показал, что другие гены обычно оставались неактивными, как и вся хромосома, если судить о ней на цитогенетическом уровне. Аналогичные данные были получены с использованием TSA в качестве ингибитора деацетилаз гистонов I типа (Csankovszki et al., 2001). Спорадическая реактивация отдельных сцепленных с X генов наблюдалась также при старении у мышей. Еще резче это выражено у сумчатых, где Х-инактивация не столь стабильна и где в ходе онтогенеза происходит прогрессивная реактивация. Что можно сказать о роли AzsZ-PHK? Данные, полу- ченные с использованием клеточных линий человека, продемонстрировали, что утрата района Х-хромосомы, включающей Xist, не приводит к сколько-нибудь за- метной реактивации X (Brown and Willard, 1994). Эти результаты удалось подтвердить на линиях мышиных фибробластов, используя условно-нокаутную аллель Xist (Csankovszki et al., 1999). Здесь было показано, что утрата Xist приводит к делокализации вариантного ги- стона macroH2A с Xi. Более недавние исследования показали, что модификации гистонов, катализируе- мые комплексами PcG, триметилирование НЗ лизина 27 и убиквитинирование Н2А также утрачиваются в условно-нокаутных по Xist линиях фибробластов (Plath et al., 2004). Была выявлена редкая спорадическая ре- активация отдельных генов, которая была усилена
воздействием 5azaC или TSA. Однако, опять-таки, не наблюдалось никакой явной реактивации всей хромо- сомы. Таким образом, удаление множественных эпиге- нетических меток сайленсинга еще не достаточно для реверсии сайленсинга всей хромосомы. Избыточность механизмов сайленсинга Xi в сома- тических клетках часто называют системой «сдержек и противовесов» [«belts and braces»]. Предполагается, что индивидуальные уровни эпигенетического сай- ленсинга являются и самоподдерживаюшимися, и поддерживаемыми с помощью механизмов положи- тельной обратной связи. Аналогичные механизмы положительной обратной связи наблюдали и в дру- гих эпигенетических системах; например, связь под- держания метилирования гистонов и метилирования ДНК в перицентрическом гетерохроматине (главы 9 и 18). 5.2. Реактивация Х-хромосомы в нормальном развитии В то время как Х-инактивация в соматических клетках очень стабильна, существуют обстоятельства в ходе нормального развития, при которых вся Х-хромосома реактивируется. Лучше всего изученный пример — ре- версия Х-инактивации в развивающихся приморди- альных зародышевых клетках (PGSs, primordial germ cells). У мышей PGCs специфицируются примерно на 7—8-й день развития, вскоре после гаструляции В это время клетки эмбриона уже претерпели случайную Х-инактивацию. Впоследствии развивающиеся PGCs мигрируют вдоль района задней кишки эмбриона и приходят в генитальные гребни, структуры, дающие начало взрослым гонадам. Именно в это время PGCs реактивируют свою Xi (Monk and McLaren, 1981). Это событие совпадает во времени с более общим эпи- генетическим репрограммированием, включающим стирание родительских импринтов и деметилирование ДНК по всему геному (дополнительные детали см. главу 20). Реактивация X в PGCs может указывать на специ- ализированный механизм для ревертирования много- слойной структуры гетерохроматина. Наблюдали, что исчезновение экспрессии АмТ-РН К коррелирует с реак- тивацией X, но при условии, что сайленсинг в сомати- ческих клетках XX не зависит от Xist, не вполне очевид- но, что причина в этом. Возможно, что PGCs не могут установить все метки, ассоциированные с сайленсин- гом, и поэтому более чувствительны к реактивации. В соответствии с этим находятся данные о том, что в раз- вивающихся PGCs у мышей метилирование островков CpG на Xi не происходит (Grant et al., 1992). Второй пример реактивации X — это реверсия инак- тивации импринтированной Хр во время размещения линии ICM эмбрионов на стадии бластоцисты, обсуж- давшаяся в разделе 3.5, которая, опять-таки, ассоции- рована с более широким кругом явлений репрограмми- рования генома Эта реактивация также коррелирует с исчезновением ААГ-РНК и утратой многих эпигенети- ческих меток, связанных с сайленсингом 5. Реактивация и репрограммирование Х-хромосомы 329^ 5.3. Реактивация Х-хромосомы в ходе экспериментального репрограммирования Реактивацию X наблюдали также в специальных экспе- риментальных условиях. Она происходит при пересадке соматических ядер в неоплод отворенные ооциты (Eggan et al., 2000) и после слияния соматических клеток с таки- ми тотипотентными клетками, как ES, эмбриональные зародышевые (EG) клетки или клетки эмбриональной карциномы (ЕС) (см., например, Tada et al., 2001). Эмбрионы, полученные в результате пересадки ядер, представляют особенно интересный пример Экс- перименты на мышах (Eggan et al., 2000) продемонстри- ровали быструю реактивацию маркерного гена на Xi у эмбрионов-трансплантатов на стадии дробления. Не- смотря на это, ядро сохраняло некоторую память о том, которая X была неактивной, поскольку у клонирован- ных эмбрионов на стадии плода Xi клетки-донора была также Xi в клетках трофэктодермы плаценты. Напро- тив, клетки собственно эмбриона обнаруживали слу- чайную инактивацию X (рис. 17.9). Предположительно реактивация и репрограммирование X, происходящие в развивающихся ICM, дают эмбриону еще один шанс перенастроить эпигенетическую информацию от до- норского ядра. Реактивация X в продуктах слияния соматических клеток XX и плюрипотентных эмбриональных кле- ток изучена хуже. Предполагается, что она происходит также в результате воздействия на соматический геном факторов, присутствующих в клетках ЕС, ES или EG Было продемонстрировано, что реактивация проис- ходит относительно быстро, в пределах примерно 5 су- ток после слияния, и происходящая на высоком уров- не экспрессия Xist исчезает в слившихся клетках после длительного культивирования. Причинная связь этих событий не была показана 5.4. Уроки из опытов с индуцибельными трансгенами Xist Серия экспериментов с использованием индуцибель- ных трансгенов Xist в клетках ES очень углубила наше понимание стабильности versus реверсибельности Х-инактивации. Во-первых, было показано, что ААГ-РНК может установить Х-инактивацию в недиффернцирован- ных клетках ES и на очень ранних стадиях дифференци- ровки, но не в более позднее время (Wutz and Jaenisch, 2000). Это называется «окном возможности» [«window of opportunity»]. Оказалось, что эта способность клеток реагировать на АА/-РНК в общих чертах коррелирует с обратимостью Х-инактивации. Так, сайленсинг ревер- тировал, когда трансген выключался в клетках ES или на ранних стадиях дифференцировки, но не на более поздних этапах дифференцировки и не в соматических клетках. Возвращаясь к реактивации и репрограммированию X, можно сказать, что данные по индуцибельным транс- генам означают, что в определенных клеточных усло- виях, а именно, в недифференцированных клетках ES
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих ооцит СОМАТИЧЕСКОЕ СТИРАНИЕ XIST В ICM I ПОСТИМПЛАНТАЦИОННАЯ ИНАКТИВАЦИЯ СЛУЧАЙНОЙ Х-ХРОМОСОМЫ Рис. 17.9. Регуляция Х-инактивации у кло- нированных эмбрионов мыши Рисунок иллюстрирует донорскую клетку XX с инактивированной Х-хромосомой (А), покрытой AZsT-PH К (зеленая линия) В этой модели транскрипция с донорского ядра, включая Л7л/-РН К, репрессирована факторами ооцита до 2-клеточной ста- дии, приводя к реактивации X. Затем, на 2-клеточной стадии экспрессия Xist возобновляется. Затем Xist реэкспресси- руется вновь с аллели неактивной X от донорской клетки. Это можно было бы приписать сохранению такой метки, как метилирование ДНК в промоторе Xist Этот паттерн поддерживается в клетках, относящихся к линиям ТЕ и РЕ, но не в плюрипотентном эпибласте, где экс- прессия Xist вновь прекращается, приво- дя ко второму событию реактивации. В ICM стирание эпигенетических меток, управляющих экспрессией донорского Xist, делает возможной последующую случайную Х-инактивацию в собственно эмбрионе инактивация X произойдет, когда исчезает экспрессия ААг-РНК. Если мы посчитаем, что те клетки, для кото- рых документально доказано, что в них происходит реак- тивация X (т.е. клетки PGCs, ICM, клетки EG и ЕС), все сходны с клетками ES в отношении плюритпотентности и пластичности, тогда прекращение экспрессии Xist мо- жет во всех случаях лежать в основе реактивации X. 6. Резюме и направления будущих исследований В последние годы имел место значительный про- гресс в нашем понимании молекулярного механизма Х-инактивации. До сегодняшнего дня этот прогресс подпитывался успехами в смежных областях эпигене- тических исследований и, в свою очередь, стимулировал успехи в других областях. Примером последнего может служить растущее количество данных о том, что некото- рые кластеры импринтированных генов регулируются czs-активными некодирующими РНК во многом так же, как Xist регулирует Х-хромосому (глава 19). Имеются все основания думать, что этот взаимодополняющий про- гресс продолжится. Однако многие вопросы остаются без ответа, и за- мечательно, что несмотря на более чем 40-летние иссле- дования мы все еще не понимаем, даже в общих чертах, механизмы, участвующие в «счете» и «выборе». Гипоте- за блокирующего фактора, которой уже больше 20 лет, представляет собой привлекательное концептуальное руководство к действию, но природа самого блокирую- щего фактора, если он существует, остается неизвестной. Прогресс был достигнут в определении сЛ-действующих последовательностей и /гаиз-действующих факторов, регулирующих счет, и их дальнейшая расшифровка яв- ляется стимулирующим вызовом. Аналогичным обра- зом, хотя мы и знаем сейчас кое-что о модифицирую- щих хроматин комплексах, участвующих в поддержании Х-инактивапии — например, комплексах группы Poly- comb, — сигнал для установления сайленсинга по всей хромосоме, включаемый AzsZ-РНК, остается неизвест- ным. Возможно в связи с этим нам необходимо понять механизм деацетилирования и деметилирования гисто- нов на неактивной Х-хромосоме. Необходимо найти ответы и на другие ключевые вопросы: как сайленсинг распространяется по хромосоме и какую роль в этом процессе и в стабилизации — поддержании «молчащего» состояния — играют (если играют) «путевые станции» (возможно, элементы LINE). Это может иметь отно- шение к интригующему вопросу о том, каким образом Х-инактивация ревертирует в некоторых типах клеток и на некоторых стадиях развития, но оказывается по су- ществу необратимой в других случаях. Этот последний вопрос имеет отношение к более широкой и критически важной теме, связанной с пониманием пластичности ге- нома и репрограммирования в ходе развития. Литература Beutler Е., Yeh М. and Fairbanks V.F., 1962. The normal human female as a mosaic of X-chromosome activity: Studies using the gene for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency as a marker. Proc. Natl. Acad. Sci. 48: 9-16. Brockdorff N., Ashworth A., Kay G.F., McCabe V.M., Norris D.P., Cooper P.J., Swift S., and Rastan S., 1992. The product of the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus Cell 71: 515-526. Brown C.J. and Willard H.F., 1994. The human X-inactivation centre is not required for maintenance of X-chromosome inactivation. Nature 154-156.
Brown C.J., Ballabio A., Rupert J.L., Tafreniere R.G., Grompe M., Tonlorenzi R., and Willard H.F., 1991. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature 349: 38-44. Brown C.J., Hendnch B.D., Rupert J.L., Lafreniere R.G., Xing Y, Lawrence J., and Willard H.E., 1992. The human XISTgene: Analysis of a 17 kb inactive X-specific RNA that contains con- served repeats and is highly localized within the nucleus. Cell 71:527-542. Carrel L. and Willard H.E, 2005. X-inactivation profile reveals ex- tensive variability in X-linked gene expression in females. Nature 434: 400-404. Cattanach B.M., and Isaacson J.H., 1967. Controlling elements in the mouse X chromosome. Genetics 57: 331-346. Chadwick B.R and Willard H.E, 2004. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 17450-17455. Clerc P. and Avner P., 1998. Role of the region 3’ to Xist exon 6 in the counting process of X-chromosome inactivation. Nat. Genet., 19:249-253. Charlesworth B., 1996. The evolution of chromosomal sex determina- tion and dosage compensation. Curr. Biol. 6: 149-162. Costanzi C. and Pehrson J.R., 1998. Histone macroH2A is concen- trated in the inactive X chromosome of female mammals. Nature 393: 599-601. Csankovszki G., Nagy A., and Jaenisch R., 2001. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in main- taining X chromosome inactivation. J. Cell Biol. 153: 773-784. Csankovszki G., Panning B., Bates B., Pehrson J.R., and Jaenisch R., 1999. Conditional deletion of Xist disrupts histone macroH2A localization but not maintenance of X inactivation. Nat. Genet. 22:323-324 Davidson R.G., Nitowsky H.M., and Childs B., 1963. Demonstration of two populations of cells in the human female heterozygous for glucoses-phosphate dehydrogenase variants. Proc. Natl. Acad. Sci. 50: 481-485. de Napoles M.. Mermoud J.E., Wakao R., Tang Y.A., Endoh M., Appanah R., Nesterova T.B., Silva J., Otte A.P., Vidal M., et al. Polycomb group proteins RinglA/B link ubiquitylation of histone H2A to heritable gene silencing and X inactivation. Dev. Cell 7: 663-676. Duthie S.M., NesterovaTB., Formstone E.J., Keohane A.M., Turner B.M., Zakian S.M., and Brockdorff N., 1999. Xist RNA exhibits a banded localization on the inactive X chromosome and is excluded from autosomal material in cis. Hum. Mot Genet. 8:, 195-204. Eggan K.,Akutsu H.. Hochedlinger K, Rideout W., III. Yanagimachi R., and Jaenisch R., 2000. X-chromosome inactivation in cloned mouse embryos. Science 290: 1578-1581. Eils R., Dietzel S., Bertin E., Schrock E., and Speicher M.R., 1996. Three dimensional reconstruction of painted human interphase chromosomes: Active and inactive X chromosome territories have similar volumes but differ in shape and surface structure. J. Cell. Biol. 135: 1427-1440. Epstein C.J., Smith S., Travis B., and Tucker G., 1978. Both X chro- mosomes function before visible X-chromosome inactivation in female mouse embryos. Nature 274: 500-502. Gartler S.M. and Riggs A.D., 1983. Mammalian X-chromosome inactivation. Annu. Rev. Genet. 17: 155-190. Grant M., Zuccotti M., and Monk M., 1992. Methylation of CpG sites of two X-linked genes coincides with X-inactivation in the female mouse embryo but not in the germ line. Nat. Genet. 2; 161-166. Graves J.A., 1996. Mammals that break the rules: Genetics of mar- supials and monotremes. Annu. Rev. Genet. 30: 233-260. Heard E., Mongelard E., Arnauld D., Chureau C., Vourch C., and Avner P., 1999. Human XIST yeast artificial chromosome transgenes show partial X inactivation center function in mouse embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 6841-6846. Heard E., Rougeulle C., Arnaud D., Avner P, Allis C.D., and Spector D.L., 2001. Methylation of histone H3 at lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation. Cell 107: 727-738. Huynh K.D. and Lee J.T, 2003. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature 426: 857-862. Jeppesen P. and Turner B.M., 1993. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetyla- tion: A cytogenetic marker for gene expression. Cell 74: 281-289. Keohane A.M., Belyaev N.D., Lavender J.S., O’Neill L.P., and Turner B.M., 1996. X-inactivation and H4 acetylation in em- bryonic stem cells. Dev. Biol. 180: 618-630. Lachner M., O’Sullivan R.J., and Jenuwein T, 2003. An epigenetic road map for histone lysine methylation. J. Cell Sci. 116: 2117-2124. Lee J.T, 2000. Disruption of imprinted X inactivation by parent-of- origin effects at Tsix. Cell 103: 17-27. Lee J.T. and Lu N.E., 1999. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell 99: 47-57. Lee J.T, DavidowL.S., andWarshawsky D., 1999. Tsix, a gene antisense to AZtfat the X-inactivation centre. Nat. Genet. 21:400-404. Lee J.T, Strauss W.M., Dausman J.A., and Jaenisch R., 1996. A450 kb transgene displays properties of the mammalian X-inactivation center. Cell 86: 83-94. Lock L.E., Takagi N., and Martin G.R., 1987. Methylation of the Hprt gene on the inactive X occurs after chromosome inactiva- tion. Ce/Z 48: 39-46. Lyon M.F., 1961. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.). Nature, 190: 372-373. Lyon M.F., 1998. X-chromosome inactivation: A repeat hypothesis. Cytogenet. Cell Genet. 80: 133-137. Lyon M.F., 2003. The Lyon and the LINE hypothesis. Semin. Cell Dev. Biol. 14:313-318. Maison C., Bailly D., Peters A.H., Quivy J.P., Roche D., Taddei A., Lachner M., Jenuwein T, and Almouzni G., 2002. Higher- order structure in pericentric heterochromatin involves a distinct pattern of histone modification and an RNA component. Nat. Genet. 30: 329-334. Mak W., Nesterova T.B., de Napoles M., Appanah R., Yamanaka S., Otte A.P., and Brockdorff N., 2004. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science 303: 666-669. Marin L, Siegal M.L., and Baker B.S., 2000. The evolution of dosage- compensation mechanisms. BioEssays 22: 1106-1114. Marshall Graves J.A. and Shetty S., 2001. Sex from W to Z: Evolu- tion of vertebrate sex chromosomes and sex determining genes. J. Exp. Zool. 290: 449-462. McElreavey K., Barbaux S., Ion A., and Fellous M., 1995. The genetic basis of murine and human sex determination: A review. Heredity 75:599-611. Mermoud J.E., Costanzi C., Pehrson J.R., and BrockdorffN., 1999. Histone MacroH2A1.2 relocates to the inactive X chromosome after initiation and propagation of X-inactivation. J. Cell Biol. 147: 1399-1408.
Глава 17. Компенсация дозы у млекопитающих Mohandas Т, Sparkes R.S., and Shapiro L.J., 1981. Reactivation of an inactive human X chromosome: Evidence for X inactivation by DNA methylation. Science 211: 393-396. Monk M. and Harper М.1., 1979. Sequential X chromosome inactiva- tion coupled with cellular differentiation in early mouse embryos. Nature 281: 311-313. Monk M. and McLaren A., 1981. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J. Embryol. Exp. Morphol. 63: 75-84. Nesterova T.B., Johnston C.M., Appanah R., Newall A.E.T, Godwin J., Alexiou M., and BrockdorffN., 2003. SkewingXchromosome choice by modulating sense transcription across the Xist locus. Genes Dev. 17:2177-2190. Norris D.P., Patel D., KayG.F., Penny G.D., BrockdorffN., Shear- down S.A., and Rastan S., 1994. Evidence that random and imprinted Xist expression is controlled by preemptive methyla- tion. Cell 77: 41-51. Ohno S., 1967. Sex chromosomes and sex-linked genes. Springer- Verlag, Berlin pp. 1-140. Okamoto I., Otte A.P., Allis C.D., Reinberg D., and Heard E., 2004. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development. Science 303: 644-649. Okamoto I., Arnaud D., Le Baccon P, Otte A.P., Disteche C.M., Avner P, and Heard E., 2005. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature 438: 297-298. O’Neill L.P., Randall T.E., Lavender J., Spotswood H.T, Lee J.T, and Turner B.M., 2003. X-linked genes in female embryonic stem cells carry an epigenetic mark prior to the onset of X inactivation. Hum. Mol. Genet. 12: 1783-1790. O’Neill L.P, Keohane A.M., Lavender J.S., McCabe V, Heard E., AvnerP., BrockdorffN., and Turner B.M., 1999. A developmental switch in H4 acetylation upstream of Xist plays a role in X chro- mosome inactivation. EMBO J. 18: 2897-2907. Panning B., Dausman J. and Jaenisch R., 1997. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization. Cell 90: 907-916. Penny G.D., Kay G.F., Sheardown S.A., Rastan S., and Brockdorff N., 1996. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature 319’. 131-137. Perche P.Y., Vourc’h C., Konecny L., Souchier C., Robert-Nicoud M., Dimitrov S., and Khochbin S., 2000. Higher concentrations of histone macroH2A in the Barr body are correlated with higher nucleosome density. Curr Biol. 10: 1531-1534. Plath K., Talbot D., Harrier K.M., Otte A.P., Yang T.P., Jaenisch R., and Panning B., 2004. Developmentally regulated alterations in Polycomb repressive complex 1 proteins on the inactive X chro- mosome. J. Cell Biol 1025-1035. Plath K., Fang J.. Mlynarczyk-Evans S.K., Cao R., Worringer K.A., Wang H., de la Cruz C.C., Otte A.P, Panning B., and Zhang Y., 2003. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science 300: 131-135. Rasmussen TP, Wutz A.P., Pehrson J.R., and Jaenisch R.R., 2001. Expression of Xist RNA is sufficient to initiate macrochromatin body formation. Chromosoma 110: 411-420. Rastan S., 1983. Non-random inactivation in mouse X-autosome translocation embryos—Location of the inactivation centre. J. Embryol. Exp. Morphol. 78: 1-22. Rougeulle C., Chaumeil J., Sarma K., Allis C.D., Reinberg D., Avner P., and Heard E., 2004. Differential histone H3 Lys-9 and Lys-27 methylation profiles on the X chromosome. Mol. Cell. Biol. 24: 5475-5484 Sado T, Okano M., Li E., and Sasaki H., 2004. De novo DNA methylation is dispensable for the initiation and propagation of X chromosome inactivation. Development 131: 975-982. Sado T, Fenner M.H., Tan S.S., Tam P, ShiodaT, and Li E., 2000. X inactivation in the mouse embryo deficient for Dnmtl: Distinct effect of hypomethylation on imprinted and random X inactiva- tion. Dev. Biol. 225: 294-303. Sharman G. В., 1971. Late DNA replication in the paternally derived X chromosome of female Kangaroos. Nature 230: 231 -232. Sharp A.J., Spotswood H.T, Robinson D.O., Turner B.M., and Jacobs P.A., 2002. Molecular and cytogenetic analysis of the spreading of X inactivation in X;autosome translocations. Hum. Mol. Genet. 11: 3145-3156. Sheardown S., Norris D., Fisher A., and BrockdorffN., 1996. The mouse Smcx gene exhibits developmental and tissue specific variation in degreee of escape from X inactivation. Hum. Mol. Genet. 5: 1355-1360. Sheardown S.A., Duthie S.M., Johnston C.M., Newall A.E.T., Form- stone E.J., Arkell R.M., Nesterova ТВ., Alghisi G.-C., Rastan S., and BrockdorffN., 1997. Stabilization of Xist RNA mediates initiation of X chromosome inactivation. Cell 91: 99-107. Silva J., Mak W, Zvetkova 1., Appanah R., Nesterova ТВ., Webster Z., Peters A. H.F.M.. Jenuwein T. Otte A.P., and BrockdorffN., 2003. Establishment of histone H3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enxl polycomb group complexes. Dev. Cell 4: 481-495. Smith K.P., Byron M., Clemson C.M., and Lawrence J.B., 2004. Ubiquitinated proteins including uH2A on the human and mouse inactive X chromosome: Enrichment in gene rich bands. Chromosoma 113: 324-335. Tada M., Takahama Y, Abe K., Nakatsuji N., and Tada T, 2001. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol. 11: 1553-1558. Tada T, Obata Y, Tada M., Goto Y, Nakatsuji N., Tan S.S., Kono T, and Takagi N., 2000. Imprint switching for non-random X- chromosome inactivation during mouse oocyte growth. Zteve/qp- ment 127: 3101-3105. Takagi N. and Sasaki M., 1975. Preferential inactivation of the pater- nally derived X chromosome in the extraembryonic membranes of the mouse. Nature 256: 640-642. Turner J.M., Mahadevaiah S.K., Femandez-Capetillo O., Nussen- zweig A., Xu X., Deng C.X., and Burgoyne P.S., 2005. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat. Genet. 37:41-47. Wakefield M.J., Keohane A.M., Turner B.M., and Marshall Graves J.A., 1997. Histone underacetylation is an ancient component of mammalian X chromosome inactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9665-9668. White W.M., Willard H.F., Van Dyke D.L., and Wolff D.J., 1998. The spreading of X inactivation into autosomal material of an X; auto- some translocation: Evidence for a difference between autosomal and X chromosomal DNA. Am. J. Hum. Genet. 63:, 20-28. Wutz A. and Jaenisch R., 2000. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation Mol. Cell 5: 695-705. Wutz A., Rasmussen TP., and Jaenisch R., 2002 Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains of AZtf RNA. Nat. Genet. 30: 167-174.
ГЛАВА 18 МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК У МЛЕКОПИТАЮЩИХ En Li1 и Adrian Bird2 1 Novartis Institutes for BioMedical Research, Inc., Cambridge, Massachusetts 02139 2The Wellcome Trust Centre for Cell Biology, University of Edinburgh, Edinburgh, EH93JR, United Kingdom Содержание Общее резюме 1. Механизм клеточной памяти 1.1. Гипотеза 1.2. Данные о наследуемых паттернах метили- рования 1.3. Поддерживающая ДНК-метилтрансфераза млекопитающих 2. Происхождение паттернов метилирования ДНК 2.1. De novo метилирование ДНК у ранних эм- брионов 2.2. Открытие de novo метилтрансфераз 2.3. Островки CpG и паттерны метилирования ДНК 2.4. Динамические изменения в паттернах ме- тилирования ДНК в ходе развития 2.5. Активное деметилирование зиготического отцовского генома 2.6. Что защищает островки CpG от метилиро- вания ДНК? 2.7. Переключается ли метилирование ДНК структурой хроматина? 2.8. Роль SWI/SNF-подобных белков ремоде- линга хроматина 3. Регуляция экспрессии генов метилированием ДНК 3.1. Ранние данные 3.2. Интерференция со связыванием транс- крипционного фактора 3.3. Притяжение белков, связывающихся с метил-CpG 3.4. МеСР2 и синдром Ретта 3.5. MBD2 опосредует зависящую от метилиро- вания репрессию транскрипции 4. Метилирование ДНК, мутации и стабильность хромосом 4.1. Метилирование ДНК и мутации 4.2. Метилирование ДНК и нестабильность хро- мосом 5. Будущие направления исследований 5.1. Факторы внешней среды, индуцирующие эпигенетические изменения 5.2. Эпигенетическая нестабильность и ком- плексные заболевания 5.3. Модуляция обратимых эпигенетических состояний Литература
(Г334 Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ ДНК позвоночных животных ковалентно модифици- руется метилированием цитозина (основания) в дину- клеотидной последовательности 5’CpG3’. CpG — это сокращение для цитозина и гуанина, разделенных фосфатом, связывающим эти два нуклеотида вместе в ДНК. У млекопитающих паттерны метилирования устанавливаются в ходе эмбрионального развития и поддерживаются механизмом копирования при делении клеток. Наследуемость паттернов метилирования ДНК делает эпигенетическую маркировку стабильной в ряду многих клеточных делений и, следовательно, составляет одну из форм клеточной памяти. Молекулярные и генетические исследования показа- ли, что метилирование цитозина в ДНК связано с сай- ленсингом гена и играет важную роль в процессах раз- вития, таких как инактивация Х-хромосомы и геномный импринтинг. Метильная часть метилцитозина находится в большой бороздке спирали ДНК, где многие связы- вающиеся с ДНК белки могут контактировать с ДНК; она осуществляет свое влияние путем притягивания или отталкивания связывающихся с ДНК белков. Было по- казано, что семейство белков, способных связываться с ДНК, содержащей метилированные динуклеотиды CpG и известных как метил- CpG-связывающиеся белки, ре- крутирует репрессорные комплексы к метилированным промоторным участкам и тем самым вносит определен- ный вклад в транскрипционный сайленсинг. Некоторые транскрипционные факторы связываются с содержащи- ми CpG нуклеотидными последовательностями ДНК только тогда, когда они не метилированы. В этих случаях метилирование CpG может препятствовать связыванию белка и влияет на транскрипцию. Удаление генетическими методами генов, кодирую- щих ДНК-метилтрансферазы или белки, связывающиеся с метил-CpG, дало возможность выявить разнообразные функции метилирования ДНК в развитии млекопитаю- щих. Установление нормальных паттернов метилирова- ния генома играет существенную роль в эмбриональном развитии. Метилирование ДНК необходимо для под- держания дифференциальной экспрессии отцовской и материнской копий генов, подверженных геномному импринтингу, и для стабильного сайленсинга генов на неактивной Х-хромосоме. Кроме того, от метилиро- вания ДНК зависят стабильная транскрипционная ре- прессия провирусных геномов и эндогенных ретротран- спозонов. Мы знаем примеры участия метилирования ДНК в установлении и поддержании тканеспецифичных паттернов экспрессии генов в ходе развития. Имеются также данные о том, что отсутствие метилирования ДНК уменьшает надежность поддержания числа хромосом, что приводит к повышенной частоте их утери. Значение метилирования ДНК для клиники впервые стало очевидным в связи с раковыми заболеваниями. Пониженные уровни метилирования ДНК, достигну- тые либо благодаря генетическим манипуляциям, либо воздействием ингибиторов ДНК-метилтрансферазы, приводят к подавлению некоторых форм опухолей у мышей. Напротив, образование других типов опухолей усиливается при низких уровнях метилирования ДНК Несколько других заболеваний человека удалось свя- зать с мутациями генов, кодирующих критичные ком- поненты механизма метилирования ДНК Мутации ДНК-метилтрансферазы Dnmt3b приводят к иммуно- дефициту, а мутации белка МеСР2, связывющегося с метил-CpG, вызывают серьезное нейрологическое рас- стройство, известное как синдром Ретта. Совершенно очевидно, что целостность системы метилирования ДНК имеет первостепенное значение для здоровья мле- копитающих. Хотя паттерны метилирования ДНК могут переда- ваться от клетки к клетке, они не являются постоян- ными. В действительности на пртяжении жизни особи могут происходить изменения в паттернах метилирова- ния ДНК. Некоторые изменения могут быть физиоло- гической реакцией на изменения внешней среды, тогда как другие могут быть связаны с патологическим про- цессом, например онкогенной трансформацией или клеточным старением Однако внутренние и внешние факторы, индуцирующие изменения в метилировании ДНК, остаются, в основном, неизвестными. Исследо- вание метилирования ДНК при заболеваниях человека представляет новую важную область медицины и несо- мненно внесет свой вклад в наше понимание влияния эпигенетических модификаций на жизнь человека. 1. Механизм клеточной памяти 1.1. Гипотеза В клетках млекопитающих метилирование цитозина про- исходит преимущественно в динуклеотидах CpG (рис. 18.1). Мысль о том, что метилирование ДНК у животных могло бы представлять механизм клеточной памяти, воз- никла независимо в двух лабораториях (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Отдавая себе отчет в том, что динуклео- тид CpG является самокомплементарным, обе группы предположили, что паттерны метилированных и неме- тилированных CpG могли бы копироваться при делении клеток. Сразу же после репликации ДНК родительская нить ДНК сохраняла бы свой паттерн модифицирован- ных цитозинов, но вновь синтезированная нить была бы немодифицированной. Для того чтобы обеспечить копирование родительского паттерна на эту дочернюю нить, они постулировали существование «поддержи- вающей метилтрансферазы», которая метилировала бы исключительно те CpG, которые спарены основаниями с метилированным родительским CpG. Неметилированные CpG не являлись бы субстратом для поддерживающей ме- тилтрансферазы (рис. 18.2). Следствием работы этого про- стого механизма была бы полуконсервативная репликация паттернов метилирования ДНК, подобно нуклеотидной последовательности самой ДНК 1.2. Данные о наследуемых паттернах метилирования Паттерн метилирования ДНК в единичном геномном ло- кусе первоначально был установлен с помощью рестрик-
2. Происхождение паттернов метилирования ДНК Рис. 18.1. Метилирование цитозинов в ДНК (а) добавление метильной группы {красный цвет) в положении 5 пиримидинового кольца цитозина {черная стрелка) стериче- ски не интерферирует со спариванием оснований ПС {голубые линии). ДНК-метилтрансферазы ковалентно связываются с углеродом в положении 6 {зеленая стрелка) во время переноса метильной группы {б) Модель В-формы ДНК, метилированной по цитозинам в двух самокомплементарных последовательно- сях CpG. Спаренные метильные части {пурпурный и желтый цвета) лежат в большой бороздке двойной спирали процесса, по крайней мере у культивируемых клеток, меньше 100 %. 1.3. Поддерживающая ДНК- метилтрансфераза млекопитающих Прогресс в понимании любого биологического процес- са на молекулярном уровне зависит от выделения клю- чевых игроков. Активность ДНК-метилтрансферазы была довольно рано обнаружена в грубых клеточных экстрактах, но в конечном счете ее удалось очистить как белок с массой, 200 кД (Bestor and Ingram, 1983). Фермент Dnmtl специфичен для CpG и обладает зна- чительной активностью против неметилированной ДНК. Однако предпочтительным ДНК-субстратом для него является ДНК, метилированная по CpG только на одной нити (так называемая полуметилированная ДНК), в силу этого свойства казалось возможным, что это поддерживающая ДНК-метилтрансфераза. Последующие исследования существенно подкрепили этот взгляд, поскольку инактивация Dnmtl в эмбрио- нальных стволовых клетках мыши (табл. 18.1) ведет к утрате метилирования CpG по всему геному (Li et al., 1992). Имеющиеся данные согласуются с точкой зрения, согласно которой Dnmtl поддерживает ме- тилирование ДНК по CpG, завершая метилирование полуметилированных сайтов, как постулировали Риггс с Холлидеем и Пью (рис. 18.2). 2. Происхождение паттернов метилирования ДНК ционных эндонуклеаз, чувствительных к метилированию ДНК. Многие из этих ферментов не могут расщеплять сходные распознаваемые ими последовательности в ДНК, если имеет место метилирование специфического основания. Паттерн метилированных и неметилирован- ных сайтов был картирован в генах рибосомной РНК Xenopus laevis с помощью таких энзимов, о которых из- вестно, что они расщепляют ДНК по сайтам, содержа- щим CpG, но блокированы метилированием цитозинов (Bird and Southern, 1978). Нашли, что на конкретной нити ДНК большинство CpG метилированы, но что неметили- рованные сайты распределены случайным образом. Су- щественно, что эти сайты были всегда симметричными. Другими словами, либо оба CpG в комплементарной паре были метилированы, либо ни один из них не был метили- рован (Bird, 1978). Это открытие вполне соответствовало предсказаниям, сделанным на основе модели поддержа- ния (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Более прямая проверка наследуемости паттернов метилирования Д Н К стала возможной при использовании трансфекции искус- ственно метилированной ДНК в культивируемые клетки (Wigler, 1981). Неметилированные плазмиды обычно не становятся метилированными, даже после многих кле- точных поколений. Однако плазмиды, которые были метилированы по сайтам CCGG метилтрансферазой M.Hpall, сохраняют свой метилированный статус на протяжении многих поколений, хотя надежность этого 2.1. De novo метилирование ДНК у ранних эмбрионов Нам необходимо понять не только то, каким образом паттерны метилирования ДНК стабильно поддержи- ваются, но и то, как они вообще возникают Ранние эксперименты по трансфекции клеток показали, что неметилированная ДНК, введенная в культивируемые соматические клетки, имеет тенденцию оставаться в неметилированном состоянии спустя много клеточных делений. С другой стороны, ретровирусные провирусы и другие трансгены, введенные мышиным предим- плантапионным эмбрионам, становятся стабильно метилированными в клетках животного (Jahner et al., 1982). Это позволяло предполагать, что процесс de novo метилирования ДНК ограничен тотипотентными стадиями эмбриогенеза. Эта идея была проверена с помощью клеток эмбриональной карциномы (ЕС) мы- шей и, впоследствии, эмбриональных стволовых (ES) клеток в качестве модельной системы. Ретровирусная ДНК была неинфекционной, будучи введенной в эти клетки, в противоположность соматическим клеткам, которые поддерживали инфекционный цикл вируса (Stewart et al., 1982). Кроме того, провирусная ДНК становилась метилированной по динуклеотидам CpG, а уменьшение метилирования путем клонирования их метилированных геномов в бактериях (и тем самым
Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих Неметилир°ванная Метилирование de novo Dnmt3a Dnmt3b Рис. 18.2. Метилирование de novo и поддерживающее метили- рование ДНК Отрезок геномной ДНК показан как линия с самокомплемен- тарными парами CpG, маркированными как вертикальные штрихи. Неметилированная ДНК (верхняя часть рисунка) становится метилированной “de novo” благодаря Dnmt3a и Dnmt3b и дает в результате симметричное метилирование в определенных парах CpG. После полуконсервативной ре- пликации ДНК дочерняя нить ДНК спарена основаниями с одной из метилированных родительских нитей (другой про- дукт репликации не показан). Симметрия восстанавливается поддерживающей ДНК-метилтрансферазой Dnmtl, которая завершает метилирование полуметилированных сайтов, но не метилирует немодифицированные CpG стирание метилирования ДНК) восстанавливало спо- собность к экспрессии вирусного гена. Эти результаты показывали, что метилирование ДНК может сайленси- ровать экспрессию вирусного генома in vivo, а также что эмбриональные клетки действительно обладают спо- собностью метилировать ДНК de novo. Первоначально была известна только одна ДНК-метилтрансфераза, Dnmt 1, и поэтому считалось, что этот фермент способен de novo метилировать ДНК на этих стадиях развития. Делеция гена Dnmtl, однако, не интерферирует с de novo метилированием провирусной ДНК в ES-клетках (Lei et al., 1996), доказывая, что работают другие ДНК- метилтрансферазы. 2.2. Открытие de novo метилтрансфераз Все известные прокариотические цитозиновые ДНК- метилтрансферазы обладают общим набором диагно- стических белковых мотивов (Postfai et al., 1989). Эти особенности были обнаружены и у поддерживающей ДНК-метилтрансферазы Dnmtl. Поиски в базах данных по тегам экспрессируемых последовательностей (EST) выявили три транскрипта, которые потенциально могли кодировать дополнительные ДНК-метилтрансферазы (рис. 18.3). Один из кандидатов, белок Dnmt2, обладает миниальной ДНК-метилтрансферазной активностью in vitro и его отсутствие не оказывает никакого заметного влияния на уровни метилирования ДНК. Другие два кандидата, Dnmt3a и Dnmt3b, кодировали родствен- ные каталитически активные полипептиды, которые, в отличие от Dnmtl, in vitro не проявляли никакого предпочтения в отношении метилирования полумети- лированной ДНК (Okano et al., 1998). Дизрупция генов, кодирующих Dnmt3a и Dnmt3b у мышей, подтвердила, что эти белки представляют собой недостающие de novo метилтрансферазы (табл. 18.1), поскольку ES-клетки и эмбрионы, лишенные этих белков, были неспособны к метилированию de novo провирусных геномов и по- вторяющихся элементов (Okano et al., 1999). Более того, мужские и женские зародышевые клетки, лишенные белка Dnmt3a или ассоциированного регуляторного фактора, Dnmt3L, не могли установить отличающиеся паттерны метилирования в импринтированных генах (табл. 18.1) (Hata et al., 2002; Kaneda et al., 2004). В то время как инактивация и Dnmt3a, и Dnmt3b приводила к ранней эмбриональной летальности, утрата любого из этих генов вызывала серьезные дефекты, приводящие к постнатальной (Dnmt3a) или эмбриональной (Dn- mt3b) летальности. Доказательства аналогичной роли у человека появились с открытием, согласно которому синдром ICF, редкое состояние, характеризующееся иммунодефицитом, центромерной нестабильностью и лицевыми аномалиями, связан с мутациями в гене, кодирующем Dnmt3b (Ehrlich, 2003). Анализ геномной ДНК лимфобластоидных клеток, взятых от больных ICF, показало пониженный уровень метилирования генома, особенно в повторяющихся последователь- ностях ДНК, ассоциированных с перицентромерными районами хромосом. 2.3. Островки CpG и паттерны метилирования ДНК ДНК из соматических тканей млекопитающих ме- тилирована в 70 % всех сайтов CpG (Ehrlich, 1982). Исследования по картированию (см. врезку на с. 338) показывают, что в число высокометилированных по- следовательностей входят сателлитные ДНК, повто- ряющиеся элементы, в том числе транспозоны и их инертные остатки, неповторяющаяся межгенная ДНК и экзоны генов. Среди этих категорий нуклеотидных последовательностей ДНК при метилировании, по- видимому, нет очевидного предпочтения последователь- ностей какого-то одного типа по сравнению с другим. CpG в сателлитных ДНК метилируются в общем в той же степени, что и CpG в перемещающихся элементах или экзонах. Таким образом, большинство последо- вательностей метилируются в соответствии с часто- той находящихся в них динуклеотидов CpG, которая обычно отражает состав их оснований. Ключевыми исключениями из этого глобального метилирования являются островки CpG. Островки CpG были выявле- ны как фракция ДНК позвоночных, которая необычно часто расщепляется рестрикционными ферментами, чувствительными к метилированию ДНК (Cooper et al., 1983). Клонирование этих так называемых «крохотных HpaII-фрагементов» показало, что они происходят из
2. Происхождение паттернов метилирования ДНК Таблица 18.1. Функции ДНК-метилтрансфераз млекопитающих ДНК- метилтрансфераза Вид Основная активность Основные фенотипы мутаций, вызывающих утрату функции Dnmtl Мышь Поддерживаю- щее метилиро- вание CpG Общая утрата геномом метилирования ДНК, эмбриональная летальность на 9.5 день эмбрионального развития (Е9 5), аномальная экспрессия имприн- тированных генов, эктопическая инактивация Х-хромосомы. активация «молчащих» ретротранспозонов Dnmt2 Мышь Слабая активность Никаких изменений в метилировании CpG, никаких явных нарушений развития Dnmt3a Мышь De novo мети- лирование CpG Постнатальная летальность на 4—8-й неделе, мужская стерильность и неспособность устанавливать импринты метилирования в зародышевых клетках и самцов, и самок Dnmt3b Мышь De novo мети- лирование CpG Деметилирование минорных сателлитных ДНК, эмбриональная летальность примерно на Е14.5 с дефектами сосудистой системы и печени (эмбрионы, лишенные и Dnmt3a, и Dnmt3b, не могут инициировать de novo метилиро- вание после имплантации и погибают на Е9.5) DNMT3B Человек De novo мети- лирование CpG Синдром ICF: иммунодефицит, центромерная нестабильность и лицевые аномалии; утрата метилирования в повторяющихся элементах и перицен- тромерном хроматине последовательностей, обогащенных CpG и имеющих длину около 1 т.п.н., которые не метилированы в заро- дышевых клетках, у ранних эмбрионов и обычно также во всех соматических тканях (Bird et al.. 1985). Островки CpG (рис. 18.4) являются поэтому исключением из «глобального» метилирования CpG, преобладающего в большей части генома млекопитающих. Ранние работы по картированию промоторов индивидуальных генов выявили районы, обогащенные GC, вблизи промото- ров генов (McKeon et al., 1982), и сейчас очевидно, что большинство (если не все) островки CpG маркируют промоторы и 5’-домены генов Приблизительно 60 % генов человека имеют промоторы с островками CpG. 2.4. Динамические изменения в паттернах метилирования ДНК в ходе развития Паттерны метилирования ДНК обнаруживают видимое общее постоянство при исследовании разных типов соматических клеток, хотя локальные изменения в специфических последовательностях ДНК очевидны. Например, островки CpG на одной Х-хромосоме в боль- шом числе становятся de novo метилированными в ходе эмбрионального процесса инактивации Х-хромосомы у самок плацентарных млекопитающих (Wolf et al , 1984). Этот процесс имеет существенное значение для надежного сайленсинга генов на инактивированной Регуляторный домен I---------------------------------------- PCNA RFT СХХС BA Н Каталитический домен II--------------------------1 I IV VI IX X Dnmtl Dnmt2 1,620 415 PWW Р ATRX I IV VI IX X Dnmt3a ИИВЧ1 ИНВИИМИ Dnmt3b 859 Рис. 18.3. Метилтрансферазы ДНК у млекопитающих Каталитические домены членов семейства Dnmtl, Dnmt2 и ВтьеЗ консервативны (сигнатурные мотивы, I, IV, VI, IX и X, наиболее консервативны во всех цитозиновых метилтрансферазах), но между их аминотерминальными регуляторными доменами сходства мало. (PCNA) взаимодействующий с PCNA домен; (NLS) сигнал ядерной локализации; (RFT) домен, «нацеливающий» на фо- кусы репликации; (СХХС) богатый цистеином домен, который, как предполагается, связывается с последовательностями ДНК, содержащими динуклеотиды CpG; (ВАН) домен «bromo-adjacent homology», участвующий в белок-белковых взаимодействиях; (PWWP) домен, содержащий высококонсервативный мотив «пролин- триптофан-триптофан-пролин». участвующий в ассоциации с гетерохроматином; (ATRX) родственный ATRX богатый цистеином район, содержащий «цинковый палец» С2-С2 и атипичный домен PHD, участвующий в белок-белковых взаимодействиях
Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих Картирование метилирования ДНК Чтобы понять функции метилирования ДНК, необходимо сначала выяснить, где оно происходит в геноме. Для этого существуют несколько методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Поскольку метилирование ограничено в основном последовательностями CpG, для картирования широко использовали расщепление рестрикционными ферментами, распознающими содержащие CpG нуклеотидные последовательности ДНК (Bird and Southern, 1978). Преимущество этого метода заключается в том, что можно протестировать большие участки генома, но он ограничен динуклеотидами CpG, которые обнаруживаются в сайтах рестрикционных ферментов. Надежный метод тестирования всех цитозинов в данном участке включает бисульфитную модификацию одно- нитевой ДНК (Frommer et al., 1992). Это приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов, но 5-метилцитозин остается защищенным. В результате цитозины, сохраняющиеся после обработки бисульфитом, идентифицируются как метилированные. Благодаря своей высокой разрешающей способности и позитивной идентификации метилированных цитозинов этот метод является предпочтительным для анализа паттернов метилирования ДНК, хотя детальный анализ больших участков занимает много времени. Несколько методов, базирующихся на ПЦР, которые зависят от предшествующей бисульфитной обработки, были разработаны для того, чтобы ускорить анализ интересующих исследователя районов (см., например, Herman et aL, 1996). Эти методы очень удобны, но, фокусируясь на нескольких немногих сайтах CpG, они жертвуют детальной информацией, которая была бы получена при бисульфитном секвенировании. Недавно для картирования метилирования ДНК были использованы микрочипы (microarrays). Например, ДНК, устойчивая к деградации специфичной к 5-метилцитозину нуклеазой МсгВС, может быть использова- на как зонд для работы с последовательностями геномной ДНК методом tiled arrays, чтобы получить общую картину уровня метилирования в специфическом участке (Martienssen et al., 2005). Можно также провести иммунопреципитацию зондов для tiled arrays, используя специфичные к 5-метилцитозину антитела, что по- зволяет получить общую картину уровней метилирования ДНК (Weber et al., 2005). хромосоме (рис. 18.4), потому что дефектные по метили- рованию ДНК мыши или клетки обнаруживают частую транскрипционную реактивацию генов, сцепленных с Х-хромосомой. В транскрипционную активацию неко- торых генов во время дифференцировки также вовлечена запрограммированная утрата метилирования ДНК. На- пример, ген interleukin-2 утрачивает метилирование CpG в своем промоторном районе по мере того, как этот ген становится экспрессируемым в ходе дифференцировки Т-клеток (Bruniquel and Schwartz, 2003). Это деметили- рование оказывается существенным предварительным условием для активации гена и является поэтому ключе- вой частью программы дифференцировки Т-клеток. 2.5. Активное деметилирование зиготического отцовского генома Помимо этих локальных изменений в метилировании ДНК имеет место значительное изменение уровней глобального метилирования ДНК в оплодотворенном яйце. Анализ уровней метилирования хромосомной ДНК с использованием анти-5-метилцитозиновых антител первоначально показал, что один хромосомный набор на ранних стадиях эмбрионального дробления удиви- тельным образом дефектен в отношении метилирования ДНК (Rougier et al., 1998). Происхождение этого различия обнаружили, изучая зиготу до слияния материнского и отцовского пронуклеусов и используя для этого имму- ноокрашивание 5-метилцитозина (Mayer et al., 2000). Вначале и материнский, и отцовский пронуклеусы демонстрировали равное окрашивание, что позволяло предполагать, что геномы яйцеклетки и спермия имели, грубо говоря, эквивалентные уровни метилирования цитозинов. Однако через несколько часов после опло- дотворения наблюдали резкую утерю 5-метилцитозинов исключительно из отцовского генома. Бисульфитное секвенирование подтвердило, что один из двух геномов действительно деметилирован. Механизм утраты мети- лирования ДНК неизвестен, но он должен включать «ак- тивное» удаление этой модификации, поскольку в этот период нет никакой репликации ДНК Интересно, что материнский геном тоже теряет метилирование ДНК в раннем эмбриогенезе, но в этом случае процесс является «пассивным» благодаря отсутствию поддерживающего метилирования ДНК во время ранних делений дробле- ния. В целом предполагается, что в этот период удаляется более половины всего геномного метилирования. Затем, при имплантации происходит реметилирование, завися- щее от Dnmt3a и Dnmt3b. Об активном деметилировании ДНК сообщалось и в нескольких других случаях. Например, деметилиро- вание промотора гена interleukin-2 в дифференцирую- щихся Т-хэлперных клетках (см. выше и: Bruniquel and Schwartz, 2003) происходит быстро и в отсутствие ре- пликации ДНК. Сравнимый эффект был воспроизведен искусственно в системе ооцита лягушки, где сайленси- рованный, метилированный ген Oct-4 млекопитающего можно было транскрипционно реактивировать посред- ством процесса, зависящего от предшествующего деме- тилирования этого гена (Simonsson and Gurdon, 2004). Эта стадия, по-видимому, установлена для изоляции самой деметил азы.
2. Происхождение паттернов метилирования ДНК Сайленсированный Промотор CpG-островка Активный CpG-островок Рис. 18.4. Островки CpG Островки CpG — это участки высокой плотности CpG, лишенные метилирования CpG, обнаруживаемого на промоторах большин- ства генов человека Долговременный сайленсинг гена может быть обеспечен метилированием района островков CpG. Например, таким путем сайленсированы гены на неактивной Х-хромосоме и некоторые импринтированные гены. Кроме того, некоторые гены в раковых клетках аберрантно сайленсированы метилированием островков CpG 2.6. Что защищает островки CpG от метилирования ДНК? Исследования паттернов метилирования ДНК оказались сфокусированными на вопросе о том, каким образом островки CpG у млекопитающих в норме остаются им- мунными к метилированию ДНК, в остальном глобаль- ному. Простейшее возможное объяснение заключается в том, что (1) островки CpG внутренне не способны к ме- тилированию de novo метилтрансферазами ДНК, но это кажется невероятным, поскольку они становятся плотно метилированными на неактивной Х-хромосоме, тогда как островки на активной Х-хромосоме в той же клетке являются резистентными. Кроме того, в раковых клетках и клеточных линиях многие в норме неметилированные островки CpG поддаются метилированию. Поэтому были приняты во внимание несколько альтернативных (не обязательно взаимоисключающих!) объяснений паттер- на метилирования ДНК у млекопитающих; (2) островки CpG защищены от метилирования связыванием факторов, каким-то образом исключающих Dnmt. Имеются доказа- тельства, что связывающиеся факторы действительно исключают метилирование ДНК, но «футпринтинг» [footprinting, метод определения участков нуклеиновых кислот, образующих комплексы с белками] и тесты на чувствительность к нуклеазам показывают, что островки CpG (Lin et al., 2000) в ядре в высокой степени доступны; (3) островки CpG поддерживаются в свободном от мети- лирования состоянии с помощью ДНК-деметилаз, которые активно удаляют метил-CpG (Frank et al., 1991). Несмотря на несколько сообщений о деметилирующих активностях, все современные кандидатуры на роль ДНК-деметилаз не получили подтверждения. Однако этот сценарий нельзя исключить; (4) атипичный состав оснований и отсутствие метилирования отражают аномальный метаболизм ДНК в этих островках CpG. Например, имеются данные о том, что островки CpG являются ориджинами репликации [точка- ми начала репликации], и на н их может влиять структура интермедиата инициации репликации (Antequera and Bird, 1999). В качестве альтернативы можно предположить, что в этих сайтах может концентрироваться рекомбинация и (или) репарация, что приводит к высоким уровням обновления ДНК. Каким образом эти предполагаемые актвности могли бы исключать Dnmt — неясно. (5) Ранняя эмбриональная транскрипция с промотора островка CpG необходима для того, чтобы гарантировать, что метили- рование ДНК исключено. В тестах с трансгенозом мутации промотора провоцируют метилирование островков CpG (Brandeis et al., 1994; MacLeod et al., 1994), и у ранних эм- брионов промоторы островков CpG в высокой степени тканеспецифичных генов обычно экспрессируются, но формальные доказательства того, что транскрипция ис- ключает метилирование CpG, отсутствуют. 2.7. Переключается ли метилирование ДНК структурой хроматина? Вышеописанные сценарии предполагают, что метилиро- вание CpG является состоянием генома «по умолчанию» и что островки CpG поэтому возникают посредством исключения глобальной метилирующей активности. Недавно был предложен несколько иной взгляд: (6) паттерны метилирования ДНК определяются состоянием модификации лежащего в основе хроматина. В этом слу- чае метилирование ДНК или его отсутствие включалось бы более ранним решением определенным образом модифицировать гистоновые белки. У гриба Neurospora crassa и растения Arabidopsis thaliana получены серъезные данные в пользу этой идеи (главы 6 и 9). Метилирование в этих системах не ограничено сайтами CpG и, как было показано, зависит от наличия метилирования гистона НЗ по лизину 9 (H3K9me) (Tamaru and Selker, 2001; Jackson et al., 2002). У растений оказалось, что РНК-интерференция (RNAi) может служить «прицельным» механизмом для модификации хроматина, сайленсинга генов и мети- лирования ДНК (см.: Aufsatz et al., 2002; глава 8). Хотя у млекопитающих, у которых метилирование CpG пре- обладает, эти отношения были установлены хуже, от- сутствие двух метилтрансфераз, метилирующих лизины
34k Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих гистонов (HKMTs) и специфичных к остаткам НЗК9, как было показано, уменьшает метилирование CpG в повторяющихся последовательностях гетерохроматина (Lehnertz et al., 2003). Кроме того, было показано, что уменьшение содержания белка EZH2 из группы Polycomb (PcG), НКМТ, специфичной к остаткам НЗК27, вызывает утрату метилирования CpG промоторов, являющихся мишенями для EZH2 (Vire et al., 2006). Имеются также убедительные данные о том, что у млекопитающих анти- смысловая транскрипция включает метилирование ДНК. Хиггс и сотрудники (Tufarelli et al., 2003) показали, что проведение [driving] антисмыслового транскрипта через ген у-глобина в дифференцирующихся клетках мышиного эмбриона обеспечивает метилирование островков CpG Механизм, лежащий в основе этого эффекта, остается неясным, но высказывались спекулятивные соображе- ния, что здесь играет роль RNAi, подобно тому, что имеет место при некоторых событиях de novo метилирования у растений (Zilberman et al., 2003). Сообщалось о de novo метилировании, включаемом RNAi, в культивируемых клетках млекопитающих (Kawasaki and Taira, 2004), но со- временные данные заставляют считать, что этот феномен менее ясен, чем у растений или грибов 2.8. Роль SWI/SNF-подобных белков ремоделинга хроматина Данные о том, что для обеспечения соответствующего метилирования необходимы также вспомогательные факторы хроматина, первоначально были получены на растениях, где было показано, что для полного метили- рования геномаЛ. thaliana существенное значение имеет SNF2-mxao6Hbni белок DDM1 (Jeddeloh et al., 1999). Аналогичная зависимость наблюдается и у животных, поскольку мутации в генах ЛТАХчеловека (Gibbons et al., 2000) и Lsh2мыши (Dennis et al., 2001), которые оба коди- руют белки, родственные белку ремоделинга хроматина, SNF2, существенно влияют на паттерны глобального метилирования ДНК. В частности, утрата белка LSH2 соответствует фенотипу мутации DDM1 у Arabidopsis, по- скольку оба мутанта утрачивают метилирование высоко- повторяющихся последовательностей ДНК, но сохраняют некоторое метилирование в других местах генома. Воз- можно, эффективное глобальное метилирование генома требует изменений структуры хроматина этими ремо- делируюшими хроматин белками, чтобы DNMTs могли получить доступ к ДНК. «Сотрудничество» между DNMTs и факторами хроматина, позволяющее им получить до- ступ к специализированным участкам хромосом, может иметь особенно важное значение в районах, являющихся «гетерохроматиновыми» и недоступными. 3. Регуляция экспрессии генов метилированием ДНК 3.1. Ранние данные Влияние метилирования ДНК на экспрессию генов было протестировано несколькими способами В репортерном гене аденовируса искусственное метилирование под- группы сайтов CpG с помощью M.Hpall предотвращало экспрессию этого гена, когда его инъецировали в ядра ооцитов лягушки (Vardimon et al., 1982). Аналогичным образом ген аденинфосфорибозилтрансферазы (Stein et al., 1982) был сайленсирован метилированием CpG при трансфекции в культуральные клетки млекопитающих Исследования эффектов метилирования ДНК в при- родной геномной ДНК стали возможными с открытием того, что химический агент 5-азацитидин может по- давлять метилирование ДНК в живых клетках (Jones and Taylor, 1980). Этот аналог нуклеозида включается в ДНК вместо цитидина и формирует ковалентный аддукт с ДНК-метилтрансферазами, изымая их из круговорота и предотвращая дальнейшее метилирование ДНК. Ра- нее было показано, что сайленсинг нескольких генов, включая вирусные геномы (Harbers et al., 1981) и гены на неактивной Х-хромосоме (Wolf et al., 1984), коррелирует с их метилированием. Способность воздействия 5-аза- цитидином восстанавливать их экспрессию (Mohandas et al., 1981) свидетельствовала о том, что это метилирование ДНК играет причинную роль в их репрессии. То, что этот эффект действительно был обусловлен изменениями в метилировании ДНК, а не каким-то другим влиянием этого вещества, было продемонстрировано с помощью тестирования очищенной ДНК, выделенной из клеток, обработанных агентом. ДНК из клеток, обработанных 5-азацитидином, будучи трансфецированной в клетки, была способна к активной экспрессии «молчащего» гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, сцепленного с Х-хромосомой, тогда как ДНК из необработанных контрольных клеток не могла обеспечить экспрессию (Venoliaet al., 1982). 3.2. Интерференция со связыванием транскрипционного фактора Каким образом метилирование ДНК интерферирует с экспрессией генов? Одна очевидная возможность за- ключается в том, что присутствие метильных групп в большой бороздке (рис. 18.1) интерферирует со связы- ванием транскрипционных факторов, активирующих транскрипцию со специфического гена. Ряд транскрип- ционных факторов распознает мотивы обогащенных GC последовательностей, которые могут содержать GC-последовательности. Некоторые из них не способ- ны связываться с ДНК, когда последовательность GC метилирована (Watt and Molloy, 1988). Доказательства участия этого механизма в регуляции генов поступа- ют из исследований роли белка CTCF в импринтинге в локусе H19/Igf2 у мышей (Bell and Felsenfeld, 2000). CTCF ассоциирован с границами транскрипционного домена (Bell et al. 1999) и может изолировать промотор от влияния удаленных энхансеров. Полученная от матери копия гена Igf2 является «молчащей» из-за связывания CTCF между его промотором и энхансером, находя- щимся «вниз по течению». Однако в отцовском локусе богатые CpG сайты связывания CTCF метилированы, что предотвращает связывание CTCF и тем самым по- зволяет энхансеру находящемуся «вниз по течению»,
активировать экспрессию Igf2 Хотя имеются данные о том, что импринтинг H19/Igf2 включает дополнительные процессы, роль CTCF представляет собою яркий пример транскрипционного регулирования посредством мети- лирования ДНК (детали см. в главе 19). 3.3. Притяжение белков, связывающихся с метил-CpG Второй способ репрессии противоположен первому, по- скольку он связан с белками, которые притягиваются, а не отталкиваются метил-CpG (рис. 18.5 и табл. 18.2). Этот способ репрессии вначале был обнаружен в экстрактах из клеток млекопитающих, которые были способны поддер- живать транскрипцию добавленных генов. Добавление следовых количеств ДНК-матрицы сделало возможной транскрипцию с неметилированных репортерных генов, тогда как метилированные репортеры были репрессиро- ваны (Boyes and Bird, 1991). Увеличение количества добав- ляемой ДНК вызывало транскрипцию метилированных и неметилированных матриц на эквивалентных уровнях, что заставляло предполагать, что лимитирующие коли- чества транскрипционного ингибитора, специфичного к метилированию ДНК, раститровывались [were being titrated out]. В соответствии с этой интерпретацией на- ходящаяся в избытке метилированная неспецифическая конкурентная ДНК [excess methylated nonspecific competi- tor DNA] снимала репрессию метилированных генов в этих экстрактах. Доказательства непрямого подавления транскрипции также поступили из опытов, в которых ме- тилированная ДНК, введенная в клетки млекопитающих и ооциты лягушки, сделала возможной транскрипцию генов только в начале (Buschhausen et al., 1987; Kass et al., 1997). Сайленсинг происходил несколькими часами позже, заставляя предполагать, что сайленсинг может за- висеть от сборки хроматина Для того чтобы обнаружить белки, которые могли бы специфически связываться с метилированными генами и обусловливать наблю- даемую репрессию, были применен метод задержки в электрофорезном геле [bandshift assay] с использованием случайных метилированных последовательностей ДНК в качестве зондов. Комплекс ДНК—белок, специфичный к метилированной ДНК (MeCPl), наблюдали в ряде клеточных типов у млекопитающих (Meehan et al., 1989). Индивидуальный связывающийся с метил-CpG белок, МеСР2, был, однако, первым белком, подлежащим очистке и клонированию. Белки с мотивами связывания с ДНК, родственными мотивам МеСР2, были идентифи- цированы в результате поисков в базах данных и обозна- чены как семейство метил-CpG-связывающих доменов, охватывающее МеСР2, MBD1, MBD2, MBD3 и MBD4 (табл. 18.2) (Bird and Wolffe. 1999). Один из этих белков (MBD2) является связывающимся с ДНК компонентом комплекса MeCPl (см. выше). Из белков MBD три — MBD1, MBD2 и МеСР2 — уча- ствуют, как предположили, в зависимой от метилиро- вания репрессии транскрипции (Bird and Wolffe, 1999) Как было показано, неродственный белок, Kaiso, тоже связывается с метилированной ДНК и осуществляет зависящую от метилирования репрессию в модельных системах (табл. 18.2) (Prokhortchouk et al., 2001; Yoon et al., 2003). Понимание механизма репрессии пришло MBD TRD MeCP2 Mi CXX C TRD mbdi ЖМИ1ИИИИ1 GR- повтор MBD2 ИВ - MBD3 Гликозилаза MBD4 POZ KAISO «Цинковые пальцы» Рис. 18.5. Белки, связывающиеся с метил-CpG Пять членов белкового семейства MDB, выравненные по их MBD-доменам {пурпурный цвет). Обозначены и другие домены, в том числе домены репрессии транскрипции (TRD, transcriptional repression domains); домены СХХС, «цинковые пальцы» (предпо- лагается участие некоторых из них в связывании неметилированных CpG); повторы GR с неизвестной функцией; гликозилазный домен с неправильным спариванием оснований T:G, участвующий в репарации дезаминирования 5-метилцитозина. Белок Kaiso не имеет домена MDB, но связывается с метилированной ДНК через «цинковые пальцы» {оранжевый цвет) и обладает доменом РОВ/ВТВ, общим с другими транскрипционными репрессорами
Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих Таблица 18.2. Функции белков, связывающихся с метил-CpG МБР Основная активность Вид Основные фенотипы мутантов с потерей функции МеСР2 Связывает mCpG с соседней цепочкой А/Т; транскрипционный репрессор Мышь Задержанные нейрологические дефекты, в том числе инертность, hindlimb clasping, неритмичное дыхание и аномальная походка; продолжительность постнаталь- ной жизни ~ 10 недель МЕСР2 Связывает mCpG с соседней цепочкой АТ; транскрипционный репрессор Чело- век Гетерозиготы страдают синдромом Ретта — серьезным нейрологическим нарушением, характеризующимся апраксией, утратой целенаправленного использования рук, нарушениями дыхания и микроцефалией Mbdl Связывается с mCpG через MBD; основная сплайс-форма способна связываться также с CpG через домен СххС Мышь Никаких явных фенотипов, но выявляются небольшие дефекты в нейрогенезе Mbd2 Связывается с mCpG; транскрипционный ре- прессор Мышь Жизнеспособные и фертильные, но демонстрируют ослабленное поведение, связанное с материнским кормлением; дефектная регуляция генов при диффе- ренцировке Т-хелперных клеток, приводящая к из- мененной реакции на инфекцию; высоко устойчивы к образованию опухолей кишечника Mbd3 Коровый компонент корепрессорного комплек- са NuRD; не обнаруживает сильного связывания с mCpG Мышь Ранняя эмбриональная деталь Mbd4 Белок репарации ДНК, связывающийся с mCpG и неправильно спаренными основаниями T:G в сайтах mCpG; гликозилаза тимина в ДНК, вырезающая Т из неправильно спаренных оснований T:G Мышь Жизнеспособные и фертильные; 3-4-кратное увели- чение частоты мутаций в сайтах CpG; повышенная чувствительность к раку кишечника коррелирует с транзипиями С в Т в гене Ape; Mbd4 минимизирует мутабельность 5-метилцитозина Kaiso Связывается с mCGmCG и CTGCNA; транс- крипционный репрессор Мышь Никаких явных фенотипов; небольшая, но достоверная задержка туморогенеза на фоне Min вместе с осознанием, что МеСР2 связывается корепрес- сорным комплексом mSin3a и зависит в своем действии от деацетилирования гистонов (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998). Это открытие показало, что метилирование ДНК может «считываться» МеСР2 и служить сигналом к изменению структуры хроматина (рис. 18.6). С тех пор было показано, что каждый из этих четырех связываю- щихся с метил-CpG белков ассоциирован с отдельным корепрессорным комплексом. Особый интерес пред- ставляет MBD1, который связывается с метилтрансфе- разой лизина гистонов, SETDB1, лишь в ходе реплика- ции ДНК (Sarraf and Stancheva, 2004). Продолжающееся метилирование НЗК9 гистонов в последовательностях- «мишенях» хромосомной MBD1 и стабильный сайлен- синг ассоциированных генов зависят от периодическо- го рекрутирования этой активности, модифицирующей хроматин. Знание сайтов-«мишеней» MBD в геноме является предпосылкой для понимания его биологической роли. Можно было бы ожидать, что они конкурируют друг с другом за доступ к метилированным сайтам в силу их пе- рекрывающейся специфичности нуклеотидной после- довательности ДНК. Удивительно, что связывающиеся с MBD сайты в геноме в основном не перекрывались, когда их исследовали, используя клетки первичной клеточной линии человека; это позволяет предпола- гать, что каждый белок, связвающийся с метил-CpG, становится «мишенью» независимым образом (Klose et al., 2005). Это соответствует появляющимся данным, показывающим, что связывание MBD обнаруживает специфичность к нуклеотидной последовательности ДНК (см. табл. 18.2). Например, МеСР2 обнаруживает сильное предпочтение к сайтам mCpG. которые флан- кируются цепочкой ДНК, обогащенной AT (Klose et al., 2005). Более того, MBD1 обладает дополнительным связывающимся с ДНК доменом, специфичным к не- метилированным CpG, a Kaiso узнает пару соседних мотивов mCpG (Prokhortchouk et al., 2001). Пока что лишь MBD2, по-видимому, обладает эксклюзивным сродством к mCpG. 3.4 МеСР2 и синдром Ретта Существование множественных связывающихся с метил- CpG белков с репрессивными свойствами говорит о том, что эти белки могут быть важными медиаторами сигнала метилирования. Это наиболее поразительным образом ил- люстрируется тем, что мутации в гене Л/ЕСР2человека ока- зываются ответственными за серьезное нейрологическое нарушение, называемое синдромом Ретта (Rett syndrome, RTT). RTT поражает женщин, гетерозиготных по новым мутациям в сцепленном с Х-хромосомой гене МЕСР2 (табл. 18.2) (Amir et al., 1999). Благодаря инактивации случайной Х-хромосомы больные оказываются мозаиками по экс- прессии либо мутантного гена, либо гена дикого типа (w/). Пораженные синдромом девочки развиваются внешне
4. Метилирование ДНК, мутации и стабильность хромосом нормально 6—18 месяцев, после чего у них наступает кри- зис, после которого они остаются с сильно нарушенными моторными навыками, повторяющимися движениями рук, аномальным дыханием, микроцефалией и другими симпто- мами (табл. 18.2). Мужчины, гемизиготные по таким же му- тациям, не выживают. Лишенные Л/еср2мыши рождаются и развиваются нормально на протяжении нескольких недель, но в возрасте 6 недель приобретают ряд нейрологических симптомов, которые в возрасте приблизительно 10 недель приводят их к гибели. Несколько особенностей этого за- держанного фенотипа, который полностью пенетрантен, напоминают синдром Ретта у человека (Amir et al., 1999). Условная делеция гена Меср2, затрагивающая только мозг мыши, вызывает те же симптомы, что и делеция Меср2 в целой мыши (табл. 18.2) (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001). Следовательно, хотя MeCP2 экспрессируется клетках такой мыши повсеместно, «нулевой» по Меср2 фенотип, по-видимому, полностью обусловлен его отсутствием в мозге. В соответствии с этим открытием, биохимические и иммуноцитохимические исследования позволили уста- новить, что самые высокие уровни экспрессии МеСР2 — в мозге, особенно в нейронах. Существенно, что экспрессия МеСР2 в одних только нейронах предотвращает появление этого мышиного фенотипа (Luikenhuis et al., 2004). С учетом роли МеСР2 как транскрипционного ре- прессора привлекательная гипотеза, объясняющая это заболевание, заключается в том, что гены в мозге, кото- рые должны быть сайленсированы МеСР2, в его отсут- ствие избегают репрессии, и это приводит к аберрант- ной функции нейронов. Первый идентифицированный ген млекопитающих, служащий «мишенью» для МеСР2, кодирует нейротрофный фактор мозга (Bdnf) (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003). Bdnf принадлежит к группе белков, синтезируемых в ответ на активность нейронов; полагают, он важен для превращения вре- менных стимулов в долговременные изменения в ак- тивности мозга. Поэтому можно предполагать, что его неправильная регуляция играет роль в патологии RTT. Сообщалось об измененной экспрессии нескольких других генов у мышей, но масштабы этих эффектов невелики (менее чем трехкратные). Тем не менее, воз- можно, что одно или несколько этих изменений также вносят вклад в фенотип RTT. 3.5. MBD2 опосредует зависящую от метилирования репрессию транскрипции MBD2 является связывающимся с ДНК компонентом MeCPl (см. табл. 18.2), который, рассматривался вначале как репрессор транскрипции в клеточных экстрактах (Meehan et al., 1989; Boyes and Bird, 1991). MeCPl — крупный мультибелковый комплекс, включающий корепрессорный комплекс NuRD (или Mi-2) и MBD2 (Wade et al., 1999). В состав NuRD входят деацетилазы гистонов (HDAC) и крупный белокремоделинга хроматина (Mi-2). NuRD может рекрутироваться к ДНК несколь- кими связывающимися с ДНК белками помимо MBD2. (Интересно, что MBD3, который похож на MBD2, но не связывается с метилированной ДНК, является компо- нентом комплекса NuRD.) Клетки, не имеющие MBD2, не способны эффективно репрессировать метилирован- ные репортерные конструкты, несмотря на присутствие в этих клетках других связывающихся с метил-CpG белков; это говорит о том, что это важный компонент системы репрессии (Hendrich et al., 2001). Недостаточ- ные по MBD2 мыши жизнеспособны и фертильны, хотя и обнаруживают дефекты в материнском поведении (Hendrich et al., 2001), а тщательное исследование по- зволило обнаружить отклонения в тканеспецифичной экспрессии генов. Экспрессия генов interleukin-4 и interferon-y в ходе дифференцировки Т-хелперных клеток существенно нарушена (Hutchins et al., 2002). Например, значительное число клеток ТЫ, которые должны были бы экспрессировать только interferon--^ экспрессировали также interleukin-4 (табл. 18.2). Поскольку было обна- ружено, что MBD2 связан с геном interleukin-4, вполне вероятно, что его отсутствие ослабляет репрессию этого гена в клетках ТЫ. 4. Метилирование ДНК, мутации и стабильность хромосом 4.1. Метилирование ДНК и мутации Преимуществам метилирования ДНК как эпигенети- ческой системы клеточной памяти противостоит недо- статок, связанный с мутабильностью 5-метилцитозина. Цитозин (С) дезаминируется спонтанно, давая урацил (U), который затем неправильно спаривается с гуанином (Lindahl, 1974). Эта потенциальная мутация распознается урациловыми ДНК-гликозилазами, которые эффективно удаляют несоответствующее основание и инициируют репарацию, чтобы восстановить С на месте U. Однако, когда дезаминируется 5-метилцитозин, образуется тимин (Т) Результатом этого также оказывается неправильное спаривание, но тот факт, что Т, в отличие от U, является природным основанием ДНК, по-видимому, интерфе- рирует с эффективным устранением повреждения В результате мутантное тиминовое основание может со- храняться при репликации ДНК и передается дочерним клеткам как мутация типа транзиции С к Т. Мутации этого рода являются, по-видимому, одной из наиболее частых единичных причин генетического заболевания у людей, поскольку приблизительно одна треть всех точечных мутаций являются транзициями С к Т в по- следовательностях CpG (Cooper and Youssoufian, 1988). Эту нестабильность CpG в эволюционных масштабах демонстрирует далее 4—5-кратная недостача CpG в геноме млекопитающих (Bird, 1980). Единственным ис- ключением оказываются островки CpG, в которых CpG не метилированы и поэтому стабильны. Среди белков, связывающихся с метил-CpG, MBD4 остается пока уникальным в том отношении, что он об- ладает ферментативной активностью. Карбокситерми- нальный домен MBD4 является ДНК-гликозилазой, которая может in vitro избирательно удалять Т из не- правильно спаренных Т—G (Hendrich et al., 1999). Эту активность можно было бы ожидать от системы репара-
Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих Активный Рис. 18.6. Гипотетический переход между актив- ным, неметилированным генным промотором и ре- прессированным промотором, «молчание» которого обусловлено метилированием ДНК, опосредованным МеСР2 Эта переходная фаза представляет собой проме- жуточный этап, во время которого транскрипция сайленсирована и происходит метилирование ДНК. Предполагается, что МеСР2 рекрутирует комплекс деацетилазы гистонов (HDAC) Sin3A и активность метилтрансферазы лизинов гистонов (НКМТ) к метилированным сайтам. Кроме того, имеются некоторые данные о том, что МеСР2 может прямо репрессировать транскрипцию путем контакта с комплексом инициации транскрипции (DR). Другие связывающиеся с метил-CpG белки взаимодействуют с разными корепрессорами, включающими активность НКМТ и (или) HDAC, и потенциально рекрутируют их Переход ции ДНК, которая исправляет дезаминирование 5-ме- тилнитозина. В подтверждение этой гипотезы мыши, лишенные MBD4, обнаруживают повышенную мута- бельность метилированных остатков цитозина в хромо- сомной репортерной последовательности (Millar et al., 2002). Кроме того, мыши, лишенные МЬс14, приобрета- ют мутации типа транзиций С к Т в гене аденоматоз- ного полипоза coli (АРС) и обладают повышенной ча- стотой кишечных новообразований (табл. 18.2). Стоит отметить, что несмотря на существование специальной системы репарации, сайты метилирования цитозина сохраняются как «горячие точки» для мутаций. 4.2. Метилирование ДНК и нестабильность хромосом Хотя метилирование ДНК является явно мутагенным, имеются данные, что его наличие выгодно в отношении стабильности хромосом. Мыши, обладающие пример- но 10 % от нормального уровня метилирования ДНК благодаря гипоморфной мутации Dnmtl, приобретают агрессивные Т-клеточные лимфомы, которые нередко демонстрируют трисомию по хромосоме 15 (Gaudet et al., 2003). Мутации DNMT3B у пациентов с синдро- мом ICF или инактивация Dnmt3b у мышей приводят к различным хромосомным аберрациям, в том числе слиянию хромосом, разрывам и анеуплоидии (Ehrlich, 2003; Dodge et al., 2005). Эти результаты представляют интерес потому, что рак часто обнаруживает пониженные уровни метилирования ДНК, что может вносить свой вклад в инициацию или прогрессию опухолей. Одно возможное объяснение этих результатов заключается в том, что метилирование ДНК вносит вклад в точное расхождение хромосом и в его отсутствие чаще имеет место нерасхождение, приводящее к хромосомным на- рушениям. Альтернативная возможность состоит в том, что метилирование ДНК может подавлять экспрессию и рекомбинацию ретротранспозонов в геноме млеко- питающих, тем самым защищая хромосомы от вредо- носной рекомбинации. Действительно, было показано, что метилирование ДНК играет критическую роль в сайленсировании транскрипции ретротранспозонов во время эмбрионального развития и сперматогенеза (Walsh et al., 1998; Bourc’his and Bestor, 2004). 5. Будущие направления исследований Наше понимание биологических функций метилирова- ния ДНК у млекопитающих постоянно растет, но еще
далеко не является полным. Например, в отличие от генетических мутаций мы очень мало знаем о скорости изменений в метилировании CpG у млекопитающих и о внутренних и внешних факторах, индуцирующих изменения в паттернах метилирования ДНК. Накапли- вающиеся данные указывают на то, что изменения в метилировании ДНК и модификации гистонов могут вносить свой вклад в патогенез многих комплексных за- болеваний. Таким образом, модуляция эпигенетических состояний обладает определенным потенциалом, чтобы стать новым терапевтическим подходом для лечения этих заболеваний. В будущем мы ожидаем больших успехов в этих важных областях исследования. 5.1. Факторы внешней среды, индуцирующие эпигенетические изменения Твердо установлено, что паттерны метилирования ДНК генома млекопитающих в высокой степени регулируются в ходе развития. Каким образом факторы внешней сре- ды могут влиять на метилирование ДНК и экспрессию генов — понятно в гораздо меньшей мере Некоторые исследования последнего времени начинают проливать свет на то, как факторы внешней среды могут индуциро- вать эпигенетические изменения, которые могут иметь длительные биологические эффекты. Одним таким примером может служить наблюдение, что материнское поведение у крыс производит стабильные изменения в метилировании ДНК у потомства. Уивер и сотрудники сообщили, что крысята, получающие разные уровни ма- теринской заботы, обладают различным метилированием ДНК в промоторном участке гена рецептора глюкокорти- коида (GR), обнаруживающим обратную корреляцию с экспрессией GR, и эти различия сохраняются вплоть до взрослого состояния (Weaveret al., 2004). Другим приме- ром является сообщение о том, что диета взрослой самки мыши может изменять метилирование ДНК у потомков. У мышей agouti является доминантным признаком, при- дающим меху коричневатую (агути) окраску. Несколько аллелей agouti viable yellow возникают спонтанно благо- даря вставке перемещаемого ретровирусного элемента в этот ген. У мышей с такой аллелью экспрессия agouti контролируется длинным терминальным повтором (LTR) этого ретровирусного элемента. Окраска меха у этих мышей, варьирующая от желтой или пятнистой до агути дикого типа, определяется состояниями метилирования промотора LTR. Таким образом, в этой системе окраска меха может служить показателем метилирования ДНК. Когда беременные самки содержатся на диете, содержа- щей такие доноры метильной группы, как фолат, холин и бетаин, их потомство демонстрирует сдвиг окраски меха в сторону агути, что коррелирует с увеличенным метили- рованием промотора LTR (Cooney et al., 2002; Waterland and Jirtle, 2003). Эти результаты заставляют предполагать, что внешние факторы могут индуцировать стабильные изменения эпигенетических состояний, обеспечивая механизм, посредством которого факторы внешней среды могут вызывать долговременные биологические эффекты Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, в какой степени эпигенетические механизмы вовлечены в во взаимодействия генов и среды у млеко- питающих и как факторы внешней среды могут преоб- разовываться в эпигенетические состояния. 5.2. Эпигенетическая нестабильность и комплексные заболевания Многие комплексные заболевания, такие как диабет II типа, шизофрения, аутоиммунные болезни и рак, обнаруживают наследуемый компонент, но не прояв- ляют четкого менделевского паттерна наследования. Динамический эпигенетический механизм позволяет дать альтернативное объяснение некоторых особенно- стей комплексных заболеваний, в том числе позднего начала, гендерных эффектов, эффектов, связанных с происхождением от того или иного родителя, дис- кордантности монозиготных близнецов, и флуктуации симптомов при комплексных заболеваниях (Petronis, 2001). Хотя все увеличивающееся количество данных позволило связать аберрантное метилирование ДНК и модификации гистонов с раком, роль эпигенетических механизмов в этиологии многих других комплексных заболеваний в основном неизвестна. Сравнительные исследования общегеномных паттернов метилирова- ния ДНК в популяциях здоровых и больных могут по- зволить проникнуть в эпигенетические основы разных комплексных заболеваний, при которых трудно выявить генетические мутации. 5.3. Модуляция обратимых эпигенетических состояний Большинство, если не все эпигенетические модифика- ции являются обратимыми, что делает модуляцию эпи- генетических состояний новой потенциальной терапев- тической альтернативой для рака и других заболеваний Ряд агентов, изменяющих паттерны метилирования ДНК или подавляющих HDACs, испытываются в настоящее время в клинике (Egger et al., 2004). Некоторые из них продемонстрировали многообещающие противоопу- холевые эффекты. Действительно, деметилирующий агент 5-азацитидин был недавно одобрен U.S. Food and Drug Administration для лечения миелодиспластического синдрома — гетерогенного заболевания, характеризую- щегося морфологической дисплазией гематопоэтических клеток. Клиническое использование 5-азацитидина и других аналогов нуклеозидов ограничивается их токсич- ностью, отчасти потому что эти соединения включаются в ДНК Это вдохновило на поиски агентов, которые мотуг подавлять метилтрансферазы непосредственно или «на- целивать» другие эпигенетические регуляторы. Посколь- ку метилирование ДНК является всего лишь одним из компонентов сложной эпигенетической регуляторной сети, одним из подходов к тому чтобы максимизировать терапевтические эффекты и минимизировать токсич- ность, является комбинационная терапия, использующая ингибиторы ДНК-метилтрансфераз или HDAC в соче- тании с другими противораковыми терапевтическими средствами (детали см. в главе 24).
Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих Литература Amir R.E., Van den Veyver I.В., Wan M., Tran C.Q., Francke U., and Zoghbi H.Y., 1999. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat. Genet. 23: 185-188. Antequera F. and Bird A., 1999. CpG islands as genomic footprints of promoters that are associated with replication origins. Curr. Biol. 9: R661-667. Aufsatz W., Mette M.F., van der Winden J., Matzke A.J., and Matzke M., 2002. RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 16499-16506. Bell A.C. and Felsenfeld G., 2000. Methylation of a CTCF-depen- dent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 482-485. Bell A.C., West A.G., and Felsenfeld G., 1999. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insula- tors. Ce//98: 387-396. Bestor TH. and Ingram V.M., 1983. Two DNA methyltransferases from murine erythroleukemia cells: Purification, sequence specificity, and mode of interaction with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 5559-5563. Bird A.R., 1978. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation. II. The symmetry of methylated sites sup- ports semi-conservative copying of the methylation pattern. J. Mol. Biol. 118: 48-60. Bird A.R., 1980. DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucleic Acids Res. 8: 1499-1594. Bird A.P. and Southern E.M., 1978. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation. I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J. Mol. Biol. 118: 27-47. Bird A.P and Wolffe A.P., 1999. Methylation-induced repression — Belts, braces and chromatin. Cell 99: 451-454. Bird A., Taggart M., Frommer M., Miller O.J., and Macleod D., 1985 A fraction of the mouse genome that is derived from islands of non-methylated, CpG-rich DNA. Cell 40: 91-99. Bourc’his D. and Bestor TH., 2004. Meiotic catastrophe and ret- rotrans-poson reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature 431: 96-99. Boyes J. and Bird A., 1991. DNA methylation inhibits transcription indirectly via a methyl-CpG-binding protein. Cell 64: 1123- 1134. Brandeis M., Frank D., Keshet I., Siegried Z., Mendelsohn M., Nemes A., TemperV,RazinA., and Cedar H., 1994. Spl ele- ments protect a CpG island from de novo methylation. Nature 371:435-438. Bruniquel D. and Schwartz R.H., 2003. Selective, stable demethyla- tion of the interleukin-2 gene enhances transcription by an active process. Nat. Immunol. 4: 235-240. Buschhausen G., V/ittig B., Graessmann M., and Graessmann A., 1987. Chromatin structure is required to block transcription of the methylated herpes simplex virus thymidine kinase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1177-1181. Chen R.Z., Akbarian S., Tudor M., and Jaenisch R., 2001. Deficiency of methyl-CpG-binding protein-2 in CNS neurons results in a Rett-like phenotype in mice. Nat. Genet. 27: 327-331. Chen W.G., Chang Q., Lin Y, Meissner A., West A.E., Griffith E.C., Jaenisch R., and Greenberg M.E., 2003. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2. Science 302: 885-889. Cooney C.A., Dave A.A., and Wolff G.L., 2002. Maternal methyl supplements in mice affect epigenetic variation and DNA methy- lation of offspring. J. Nutr. 132: 2393S-2400S. Cooper D.N. and Youssoufian H., 1988. The CpG dinucleotide and human genetic disease. Hum. Genet. 78: 151-155. Cooper D.N., Taggart M.H., and Bird A.R, 1983. Unmethylated domains invertebrate DNA. Nucleic Acids Res. 11: 647-658. Dennis K., Fan T, Geiman T, Yan Q., and Muegge K., 2001. Lsh. a member of the SNF2 family, is required for genome-wide methylation. Genes Dev. 15: 2940-2944. Dodge J.E., Okano M., Dick R., Tsujimoto N., Chen T, Wang S., Ueda Y, Dyson N., and Li E., 2005. Inactivation of Dnmt3b in mouse embryonic fibroblasts results in DNA hypomethylation, chromosomal instability, and spontaneous immortalization. J. Biol. Chem. 280: 17986-17991. Egger G., Liang G., Aparicio A., and Jones RA., 2004. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457-463. Ehrlich M., 1982. Amount and distribution of 5-methycytosine in human DNA from different types of tissues or cells. Nucleic Acids Res. 10: 2709-2721. Ehrlich M., 2003. The ICF syndrome, a DNA methyltransferase 3B deficiency and immunodeficiency disease. Clin. Immunol. 109:17-28. Frank D., Keshet L, Shani M., Levine A., Razin A., and Cedar H., 1991. Demethylation of CpG islands in embryonic cells. Nature 351:239-241. Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis C.M., Watt J., Grigg G.W, Molloy P.L., and Paul C.L., 1992. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methyl- cytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1827-1831. Gaudet E., Hodgson J.G., Eden A., Jackson-Grusby L., Dausman J., Gray J.W, Leonhardt H., and Jaenisch R., 2003. Induction of tumors in mice by genomic hypomethylation. Science 300: 489-492. Gibbons R.J., McDowell XL., Raman S., O’Rourke D.M., Gar- rick D., Ayyub H., and Higgs D.R., 2000. Mutations in ATRX, encoding a SWI/SNF-like protein, cause diverse changes in the pattern of DNA methylation. Nat. Genet. 24: 368-371. Guy J., Hendrich B., Holmes M., Martin J.E., and Bird A., 2001. A mouse Mecp2-x\\A\ mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat. Genet. 27: 322-326. Harbers K., Schnieke H., Stuhlmann H., Jahner D., and Jaenisch B., 1981. DNA methylation and gene expression; endogenous retroviral genome becomes infectious after molecular cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 7609-7613. Hata K., Okano M., Lei H., and Li E., 2002. Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice. Development 129:, 1983-1993. Hendrich B., Guy J., Ramsahoye B., Wilson V. A., and Bird A., 2001. Closely related proteins Mbd2 and Mbd3 play distinctive but in- teracting roles in mouse development. Genes Dev. 15: 710-723. Hendrich B., Hardeland U., Ng H.-H., Jiricny J., and Bird A., 1999. The thymine glycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG sites. Nature 401: 301-304. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S., Nelkin B.D., and Baylin S.B., 1996. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 9821-9826.
Holliday R. and Pugh J.E., 1975. DNAmodification mechanisms and gene activity during development. Science 186: 226-232. Hutchins A., Mullen A., Lee H., Barner K., High E, Hendrich B., Bird A., and Reiner S., 2002. Gene silencing quantitatively controls the function of a developmental /raws-activator. Mol. Cell 10: 81-91. Jackson J.P., Lindroth A.M., Cao X., and Jacobsen S.E., 2002. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416: 556-560. Jahner D., Stuhhnann H., Stewart C.L., Harbers K., Lohler J., Simon I., and Jaenisch R., 1982. De novo methylation and expression of retroviral genomes during mouse embryogenesis. Nature 298: 623-628. Jeddeloh J.A., Stokes T.L., and Richards E.J., 1999. Maintenance of genomic methylation requires a SW12/SNF2-like protein. Nat. Genet. 22: 94-97. Jones P.A. and Taylor S.M., 1980. Cellular differentiation, cytidine analogues and DNA methylation. Cell, 20: 85-93. Jones P.L., Veenstra G.J., Wade P.A., Vermaak D., Kass S.U., Lands- bergerN., Strouboulis J., and Wolffe A. P, 1998. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat. Genet., 19: 187-191. Kaneda M., Sado T, Hata К., Okano M., Tsujimoto N., Li E., and Sasaki H., 2004. Role of de novo DNA methyltransferases in initiation of genomic imprinting and X-chromosome inactivation. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 125-129. KassS.U., LandsbergerN., and Wolffe A.P., 1997. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation. Curr.Biol. 7: 157-165. Kawasaki H. and Taira K., 2004. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature 431: 211-217. Klose R.J., Sarraf S.A., Schmiedeberg L., McDermott S.M., Stancheva L, and Bird A.P., 2005. DNA binding specificity of MeCP2 due to a requirement for A/T sequences adjacent to methyl-CpG. Mol. Cell, 19: 667-678. Lehnertz B., Ueda Y, Derijck A.A., Braunschweig U., Perez-Burgos L., Kubicek S., Chen T, Li E., Jenuwein T, and Peters A.H., 2003. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation di- rects DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochro-matin. Curr. Biol. 13: 1192-1200. Lei H., Oh S.P., Okano M., Juttermann R., Gos K.A., Jaenisch R., and Li E., 1996. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development 122: 3195-3205. Li E„ Bestor TH., and Jaenisch R., 1992. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69:915-926. Lin LG., Tomzynski T.J., Ou Q., and Hsieh C.L., 2000. Modula- tion of DNA binding protein affinity directly affects target site demethylation. Mol. Cell. Biol., 20: 2343-2349. Lindahl T, 1974. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proc. Natl. Acad. Sci. 71: 3649-3653. Luikenhuis S., Giacometti E., Beard C.E, and Jaenisch R., 2004. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syn- drome in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 6033-6038. MacLeod D., Charlton J., Mullins J., and Bird A.P., 1994. Spl sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes Dev. 8: 2282-2292. Martienssen R.A., Doerge R.W., and Colot V, 2005. Epigenomic mapping in Arabidopsis using tiling microarrays. Chromosome Res. 13: 299-308. Martinowich K., Hattori D., Wu H., Fouse S., He E, Hu Y, Fan G., and Sun Y.E., 2003. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation Sci- ence 302:890-893. Mayer W, Niveleau A., Walter J., Fundele R., and Haaf T, 2000. Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403: 501-502. McKeon C., Ohkubo H., Pastan L, and de Crombrugghe B., 1982. Unusual methylation pattern of the alpha 2(1) collagen gene. Cell29:, 203-210. Meehan R.R., Lewis J.D., McKay S., Kleiner E.L., and Bird A.P., 1989. Identification of a mammalian protein that binds specifi- cally to DNA containing methylated CpGs. Cell 58: 499-507. Millar C.B., Guy J., Sansom O.J., Selfridge J., MacDougall E., Hendrich B., Keightley P. D., Bishop S.M., Clarke A.R., and Bird A., 2002. Enhanced CpG mutability and tumorigenesis in MBD4-deficient mice. Science 297: 403-405. Mohandas T, Sparkes R.S., and Shapiro L.J., 1981. Reactivation of an inactive human X-chromosome: Evidence forX-inactivation by DNA methylation. Science 211: 393-396. Nan X., Ng H.-H., Johnson C.A., Laherty C.D., Turner B.M., Eisenman R.N., and Bird A., 1998. Xranscriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature 393: 386-389. Okano M., Xie S., and Li E., 1998. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltrans- ferases. Nat. Genet., 19:219-220. Okano M., Bell D.W, Haber D.A., and Li E., 1999. DNA meth- yltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99: 247-257. Petronis A., 2001. Human morbid genetics revisited: Relevance of epigenetics. Trends Genet. 17: 142-146. Posfai J„ Bhagwat A.S., Posfai G., and Roberts R.J., 1989. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res. 17: 2421-2435. Prokhortchouk A., Hendrich B., Jorgensen H., Ruzov A., Wilm M., Georgiev G., Bird A., and Prokhortchouk E., 2001. The pl20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes Dev. : 1613-1618. Riggs A.D., 1975. X-inactivation, differentiation and DNAmethyla- tion. Cytogenet. Cell Genet. 14: 9-25. Rougier N., Bourc’his D., Gomes D.M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., and Viegas-Pequignot E., 1998. Chromosome methyla- tion patterns during mammalian preimplantation development. Genes Dev. 12:2108-2113. Sarraf S.A. and Stancheva L, 2004. Methyl-CpG-binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SEXDB1 to DNA replication and chromatin assembly. Mol. Cell 15: 595- 605. Simonsson S. and Gurdon J., 2004. DNAdemethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nat. Cell Biol. 6: 984-990. Stein R., Razin A., and Cedar H., 1982. In vitro methylation of the hamster adenine phosphorybosy transferase gene inhibits its ex- pression in mouse L cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4418-3422. Stewart C.L., Stuhlmann H., Jahner D., and Jaenisch R., 1982. De novo methylation and infectivity of retroviral genomes intro-
Глава 18. Метилирование ДНК у млекопитающих duced into embryonal carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4098-4102. Tamaru H. and Selker E.U., 2001. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414: 277-283. Tufarelli C., Stanley J.A., Garrick D., Sharpe J.A., Ayyub H., Wood W.G., and Higgs D.R., 2003. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nat. Genet. 34: 157-165. Vardimon L., Kressmann A., Cedar H., Maechler M., and Doerfler W., 1982. Expression of a cloned adenovirus gene is inhibited by in vitro methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 1073-1077. Venolia L., Gartler S.M.. Wasserman E.R., Yen P., Mohandas X., and Shapiro L.J., 1982. Xransformation with DNA from 5 azacytidine-reactivated X chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 2352-2354. Vire E., Brenner C., Deplus R., Blanchon L., Fraga M., Didelot C., Morey L., Van Eynde A., Bernard D., Vanderwinden J.M., et al., 2006. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439: 871-874. Wade P.A., Gegonne A., Jones P.L., Ballestar E., Aubry R., and Wolffe A.P, 1999. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodeling and histone deacetylation. Nat. Genet. 23: 62-66. Walsh C.P., Chaillet J.R., and BestorX.H., 1998. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat. Genet., 20: 116-117. Waterland R.A. and Jirtle R.L., 2003. Transposable elements: Targets for early nutritional effects on epigenetic gene regulation. Mol Cell. Biol. 23: 5293-5300. Watt F. and Molloy P.L., 1988. Cytosine methylation prevents bind- ing to DNA of a HeLa cell transcription factor required for optimal expression of the adenovirus late promoter. Genes Dev. 2: 1136-1143. Weaver I.C., Cervoni N., Champagne F.A., D’Alessio A.C., Sharma S., Seckl J.R., Dymov S., Szyf M., and Meaney M.J., 2004. Epigenetic programming by maternal behavior. Nat. Neurosci. 7: 847-854. Weber M., Davies J.J., Wittig D., Oakeley E.J., Haase M., Lam W.L., and Schubeler D.. 2005. Chromosome-wide and promoter- specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat. Genet. 37: 853-862. Wigler M.H., 1981. The inheritance of methylation patterns in ver- tebrates. Cell 24: 285-286. Wolf S.E., Jolly D.J., Lunnen K.D., FriedmanT, and Migeon B.R., 1984. Methylation of the hypoxanthine phosphoribosyltransferase locus on the human X-chromosome: Implications for X-chromo- some inactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 2806-2810. Yoon H.G.. Chan D.W. Reynolds A.B.. Qin J., and Wong J.. 2003. N- CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG-binding protein Kaiso. Mol. Cell 12: 723-734. Zilberman D., Cao X., and Jacobsen S.E., 2003. ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299: 716-719.
ГЛАВА 19 ГЕНОМНЫЙ ИМПРИНТИНГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Denise Р. Barlow1 и Marisa S. Bartolomei2 1СеММ Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences, Institute of Genetics, Max Perutz Laboratories, A-1030 Vienna, Austria 2Departament of Cell & Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, 19104-6148 Содержание Общее резюме 1. Исторический обзор 2. Геномный импринтинг — эпигенетическая система регуляции генов 3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга 3.1. Импринтированные гены контролируют эмбриональный и неонатальный рост 3.2. Функция геномного импринтинга у млекопи- тающих 3.3. Импринтированные гены собраны в класте- ры и контролируются импринтными контрольными элементами ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Млекопитающие являются диплоидными организмами, чьи клетки обладают двумя совмещенными [matched] наборами хромосом, один из которых унаследован от матери, а другой — от отца. Таким образом, млеко- питающие обладают двумя копиями каждого гена. В норме и материнская, и отцовская копии каждого гена имеют одну и ту же возможность быть активной в любой клетке. Геномный импринтинг — это эпигенетический механизм, который изменяет эту потенцию, потому что он ограничивает экспрессию гена одной из двух родительских хромосом. Это явление демонстрируют 3.4. Кластеры импринтированных генов содер- жат по меньшей мере одну ncRNAb 3.5. Роль метилирования ДНК в геномном им- принтинге 3.6. Два типа cis-действующего сайленсинга, идентифицированного в кластерах имприн- тированных генов 4. Геномный импринтинг — модель эпигенетиче- ской регуляции у млекопитающих 5. Направления будущих исследований Благодарности Литература лишь несколько сотен из примерно 25 000 генов в на- шем геноме, а большинство экспрессируются в равной степени, будучи унаследованы от любого из родителей. Геномный импринтинг затрагивает и мужское, и женское потомство и поэтому является следствием родительского наследования, а не пола. Как пример того, что под этим подразумевается, можно сказать, что импринтированный ген, активный на хромосоме, унаследованной от матери, будет активным на материнской хромосоме и «молча- щим» на отцовской хромосоме у всех самцов и самок. Определение геномного импринтинга ограничено здесь «специфичной, в отношении родителя, экспрес- сией генов в диплоидных клетках». Таким образом,
(Г350 Глава 19. Геномный импринтинг у млекопитающих диплоидные клетки, содержащие по две родительские копии всех генов, будут экспрессировать только одну родительскую копию импринтированного гена и сай- ленсировать другую родительскую копию. Напротив, неимпринтированные гены будут экспрессироваться в диплоидной клетке обеими родительскими копиями. Для понимания концепции импринтированных генов важно различать импринтированные гены и гены, де- монстрирующие кажущуюся специфичную в отношении родителя экспрессию из-за неравного родительского генетического вклада в зародыш. Примерами неравно- го родительского генетического вклада являются гены, сцепленные с Y-хромосомой и присутствующие только у самцов, гены, избежавшие Х-инактивации у самок, митохондриальные гены, привносимые в основном ма- терью, и иРНК и белки, присутствующие в цитоплазме только спермия или только яйцеклетки. Многие особенности геномного импринтинга у мле- копитающих делают его весьма привлекательной биоло- гической проблемой в постгеномную эпоху. Например, он дает ключ к пониманию возможной эволюционной реакции на родительский конфликт, к адаптации мате- ринского родителя к внутренней воспроизводительной системе; возможно, он дает также хотя бы некоторое представление о способах, которыми геном млекопи- тающих защищает себя от вторжения [чужеродных] ну- клеотидных последовательностей ДНК. Геномный им- принтинг — явление, бросающее вызов интеллекту не в последнюю очередь потому, что он ставит вопрос о том. почему у диплоидного организма развивается система сайленсинга, отвергающая преимущества диплоидного состояния. Возможно, самым интригующим является то обстоятельство, что выборка генов, подверженных геномному импринтингу, в основном кодирует фак- торы, регулирующие эмбриональный и неонатальный рост. Таким образом, кажется весьма вероятным, что геномный импринтинг развился для того, чтобы играть специфическую роль в репродукции млекопитающих. На этом этапе наших знаний геномный импринтинг не выглядит широкораспространенным в четырех эука- риотных царствах, включающих протистов, грибы, рас- тения и животных. Однако он существует, возможно в родственной форме, у двух групп беспозвоночных — у членистоногих Coccidae и Sciaridae, а также в эндоспер- ме некоторых семенных растений, таких как кукуруза и Arabidopsis. Такое распределение показывает, что ге- номный импринтинг возникал независимо по меньшей мере трижды в эволюции живого Удивительно, что, несмотря на эту предсказываемую независимую эволю- цию геномного импринтинга, вырисовываются некото- рые черты сходства в механизмах импринтинга. Весь- ма вероятно, что это отражает консерватизм базовых эпигенетических регуляторных механизмов, лежащих в основе как геномного импринтинга, так и нормального регулирования генов. 1. Исторический обзор Наличие геномного импринтинга у млекопитающих имеет существенное медицинское, социальное и интел- лектуальное значение в плане (1) клиники генетических признаков и заболеваний, (2) возможности контролиро- вать репродукцию человека и животных с помощью вспо- могательных репродуктивных технологий и (3) прогресса биотехнологии и постгеномных медицинских исследова- ний. При любом современном обсуждении генетических проблем, будь то исследования или медицина, обяза- тельно необходимо считаться с тем, обнаруживает ли данный ген двуродительский (т.е. диплоидный) характер экспрессии или же подвержен геномному импринтингу и демонстрирует специфичную в отношении родителя (т.е. гаплоидную) экспрессию. Как это ни удивительно, после того как было однозначно показано, что три гена у мышей обнаруживают специфичную в отношении ро- дителя экспрессию, широкого признания существование и значение геномного импринтинга не получили вплоть до начала 1990-х годов, несмотря на его важность для здоровья и благополучия человека. Однако специфичное в отношении родителя пове- дение целых хромосом уже наблюдали в цитогенетиче- ских исследованиях хромосом у членистоногих еще в 1930-е годы (Chandra and Nanjundiah, 1990). Интересно, что термин «хромосомный импринтинг» впервые был предложен для описания элиминации хромосом от- цовского происхождения у некоторых видов артропод (Crouse et al., 1971). Был также замечен хромосомный импринтинг Х-хромосомы млекопитающих, который приводит к инактивации одной из двух Х-хромосом, а именно хромосомы отцовского происхождения, во всех клетках самок сумчатых и в экстраэмбриональных тка- нях мыши (Cooper et al., 1971). В тот же самый период классические генетики получали у мышей мутантов с хромосомными транслокациями, которые заложили фундамент для наблюдений экспрессии импринтиро- ванных генов Некоторые из этих «транслокационных» мышей, первоначально использовавшихся для карти- рования генов на хромосомах, демонстрировали специ- фичный в отношении родителя фенотип, когда опреде- ленные хромосомные участки были унаследованы как дупликации хромосомы одного родителя в отсутствие хромосомы другого родителя (что известно как одноро- дительскя дисомия, или UPD, рис. 19.1). Эти результаты указывали на возможность того, «что для нормального развития мыши важна гаплоидная экспрессия опреде- ленных материнских или отцовских генов» (Searle and Beechey, 1978) В то же самое время другие генетики ис- пользовали необычного мутанта мыши, известного как “Hairpin-tail”, который имел большую делению хро- мосомы 17, для того чтобы однозначно опровергнуть основной принцип генетики, согласно которому « ор- ганизмы, гетерозиготные по данному локусу феноти- пически идентичны независимо от того, какая гамета внесла в генотип ту или иную аллель» (Johnson, 1974). Вместо этого потомство, получившее делецию Hairpin- tail от матери, имело увеличенные размеры и погибало в середине эмбрионального развития, тогда как переда- ча генетически идентичной хромосомы от отца давала жизнеспособных и фертильных мышей (рис. 19.1). В ретроспективном плане можно отметить, что несмотря на существование инактивации импринтированной
1. Исторический обзор диплоидный хромосомный набор эмбрион дикого типа Рис. 19.1. Модели (мышь) для исследования геномного импринтинга, позволяющие различать материнскую и отцовскую хромосомы Млекопитающие являются диплоидными и наследуют полный хромосомный набор от матери и от отца. Однако можно создать мышей, которые (1) наследуют обе копии хромосомной пары от одного родителя и ни одной от другого (явление, известное как однородительская дисомия, или UPD); (2) наследуют частич- ную хромосомную делецию от одного родителя и хромосому дикого типа от другого; (3) наследуют хромосомы, несущие однонуклеотидные полиморфизмы (известные как SNPs) от одного родителя и хромосому дикого типа от другого. Потом- ки с UDPs или делениями склонны обнаруживать летальные фенотипы, тогда как SNPs обычно обеспечивают получение жизнеспособного потомства: (mat) — материнский; (запре- щающий знак) — импринт Х-хромосомы у млекопитающих пользовавшаяся наи- большим вниманием трактовка этих экспериментов с генетическими транслокациями и делениями своди- лась к тому, что гены на этих аутосомах в гаплоидном яйце или спермии действовали главным образом, чтобы модифицировать белки, используемые позже в эмбрио- нальном развитии. Несмотря на это концепция диф- ференциального функционирования материнского и отцовского геномов обретала почву, и было выдвинуто предположение, что «материнский геном мог бы быть в норме активным в хромосомном участке Hairpin-tail, в то время как его отцовский партнер преимущественно инактивирован» (McLaren, 1979). Важный шаг к уста- новлению существования геномного импринтинга у млекопитающих был сделан несколькими годами позже с разработкой улучшенной технологии ядерных пере- садок, с помощью которой тестировалась возможность получения диплоидных однородительских эмбрионов с использованием исключительно ядер из мышиных яй- цеклеток С помощью техники ядерных пересадок до- норский мужской или женский пронуклеус извлекали из только что оплодотворенной яйцеклетки и тонкой микропипеткой переносили его внутрь оплодотворен- ной яйцеклетки хозяина, из которой был предвари- тельно удален материнский или отцовский пронуклеус. Таким путем воссоздавались диплоидные эмбрионы, с той лишь разницей, что они обладали двумя материн- скими или двумя отцовскими геномами (известные, соответственно, как гиногенетические и андрогенети- ческие эмбрионы) (рис. 19.2). Эта техника была внача- ле использована для того, чтобы показать, что ядра от оплодотворенных мутантных эмбрионов Hairpin-tail нельзя было «спасти», пересадив их в хозяйскую яйце- клетку дикого типа. Это доказывало, что именно геном эмбриона, а не цитоплазма ооцита, несет дефект Hair- pin-tail. Это также подтверждало предположение о том, что гены на материнской и отцовской копиях хромосо- мы 17 функционируют по-разному в ходе эмбриональ- ного развития (McGrath and Solter, 1984b). Впослед- ствии ядерные пересадки были использованы, чтобы продемонстрировать, что эмбрионы, реконструиро- ванные из двух материнских пронуклеусов (известные как гиногенетические эмбрионы) или двух отцовских пронуклеусов (андрогенетические эмбрионы), были нежизнеспособными; только эмбрионы, реконструи- рованные из одного материнского и одного отцовского пронуклеуса давали жизнеспособное и фертильное по- томство (McGrath and Solter, 1984а; Surani et al., 1984). Эта работа опровергла предшествующее мнение, что однородительские мыши могут развиваться до взрос- лого состояния (Hoppe and Illmensee, 1982). Гиногине- тические эмбрионы в момент гибели были дефектны- ми по экстраэмбриональным тканям, которые входят в состав плаценты, а андрогенетические эмбрионы были дефектными по эмбриональным тканям Это привело к гипотезе о том, что для эмбрионального развития тре- буются импринтированные гены, экспрессируемые с материнского генома, тогда как отцовский геном экс- прессирует импринтированные гены, необходимые для экстраэмбрионального развития (Barton et al., 1984). Последующая идентификация импринтированных ге- нов у мыши не подтвердила такое смещение в функ- ционировании импринтированных генов, показывая, что наблюдаемые различия между гиногенетическими и андрогенетическими эмбрионами можно объяснить доминантным эффектом одного или нескольких им- принтированных генов. Эксперименты с пересадкой ядер, в сочетании с подкрепляющими данными генетики мышей, дали убе- дительное доказательство того, что для эмбриогенеза у мышей требуются оба родительских генома, и заложи- ли прочный фундамент для существования геномного импринтинга у млекопитающих (рис. 19.2). Широкий обзор вкладов родительских хромосом в эмбриональное развитие с использованием «транслокационных» мы- шей для создания UPD-хромосом (рис. 19.1) позволили идентифицировать у мыши два участка на хромосомах 2 и 11, которые демонстрировали противоположные фе- нотипы, когда присутствовали в виде двух материнских либо двух отцовских копий. Это еще более усилило до-
Глава 19. Геномный импринтинг у млекопитающих Яйцеклетка Гиногенетически й летальный Дикий тип жизнеспособный Андрогенетический летальный Рис. 19.2. Для репродукции млекопитающих нужны материнский и отцовский геномы Техника ядерных пересадок использовала микропипетки и микроскопы с большим увеличением для удаления мужского или женского ядра из только что оплодотворенной яйцеклетки и введения их в разных комбинациях во вторую оплодотворен- ную яйцеклетку («хозяна»), которая уже была денуклеирована; тем самым создавались снова диплоидные эмбрионы с двумя материнскими (гиногенетические) или двумя отцовскими (андрогенетические) геномами или двуродительским геномом (дикий тип). Гиногенетические и андрогенетические эмбрионы были летальными на ранних эмбриональных стадиях. Лишь те реконструированные эмбрионы, которые получили и материн- ское, и отцовское ядро (дикий тип), выживали и давали живых мышат. Эти эксперименты показывают, что при воспроизведе- нии млекопитающих необходимы и материнский, и отцовский геномы и что эти два родительских генома экспрессируют разные наборы генов, нужных для полного эмбрионального развития воды в пользу экспрессии специфичных в отношении родителя генов у млекопитающих (Cattanach and Kirk, 1985). Кроме того, накапливались клинические данные по генетике человека, которые убедительно свидетель- ствовали о том, что некоторые генетические состояния, в особенности синдром Прадера—Уилли (Prader-Willi), который, по-видимому, возникает исключительно пу- тем передачи от отца, лучше всего объясняются экс- прессией генов, специфичных в отношении родителя (Reik, 1989). Дальнейшие ключевые данные были по- лучены в результате применения вновь разработанной технологии получения трансгенных мышей путем ми- кроинъекции генных последовательностей в оплодот- воренные яйцеклетки мышей. Этому нередко препят- ствовала проблема метилирования ДНК, неожиданно вызывающего сайленсинг трансгена в соматических тканях. Эта «проблема», однако, придала вес аргумен- там в пользу того, что родительские хромосомы ведут себя различно, когда было показано, что некоторые трансгены обнаруживают специфичные в отношении родителя различия по их способности приобретать ме- тилирование ДНК. Обычно трансгены, переданные ма- терью [matemal-transmitted transgenes], метилировались, тогда как трансгены, переданные отцом, — нет. Однако лишь в нескольких случаях различия в метилировании ДНК коррелировали со специфичной в отношении ро- дителя экспрессией. Хотя позднее было обнаружено, что существуют многочисленные черты сходства между импринтингом метилирования «трансгена» и геномным импринтингом эндогенных генов у мышей, по некото- рым признакам они различаются (Reik et al., 1990). К их числу относятся высокая чувствительность к эффектам фона, что в большинстве случаев требует смешанного генетического фона для выявления импринтированно- го поведения, неспособность поддерживать имприн- тированную экспрессию в разных сайтах интеграции хромосом и потребность в чужеродных нуклеотидных последовательностях ДНК для производства имприн- тированного эффекта (Chaillet et al., 1995). Несмотря на обилие данных в пользу существования геномного импринтинга у млекопитающих его окон- чательное доказательство зависело от идентификации генов, демонстрирующих специфичную в отношении родителя экспрессию. Это случилось в 1991 году, ког- да были описаны три импринтированных гена мыши. Первый из них, lgf2r (Insulin-like growth factor type 2 re- ceptor, то есть рецептор-«мусорщик» [«scavenger» recep- tor] для ростового гормона Igf2y был идентифицирован как матерински экспрессируемый импринтированный ген. Позднее было показано, что этот ген объясняет фе- нотип чрезмерного роста мутанта Hairpin-tail у мышей (Barlow et al., 1991). Спустя несколько месяцев ген Igf2 (Insulin-like growth factor type 2), о котором было извест- но, что он функционирует как гормон роста, был иден- тифицирован как отцовски экспрессируемый имприн- тированный ген (DeChiara et al., 1991; Ferguson-Smith et al., 1991). Наконец, впоследствии было показано, что ген Н19 (клон № 19 сДНК, выделенный из библиоте- ки фетальной печени), необычная некодирующая РНК (ncRNA), является матерински экспрессируемым им- принтированным геном (Bartolomei et al., 1991). Чтобы идентифицировать эти три импринтированных гена, были использованы разнообразные стратегии, каждая из которых зависела от новых технологий, появляющихся в генетике мыши. Что касается /§/2,гбыло использовано позиционное клонирование [positional cloning], чтобы идентифицировать гены, которые картировались в де- леции Hairpin-tail на хромосоме 17, и мыши, унаследо- вавшие эту делецию от одного родителя, были исполь- зованы для идентификации генов, обнаруживающих матерински-специфичную экспрессию (рис. 19.1). Что касается Igf2, физиологическую роль этого ростового фактора в эмбриональном развитии тестировали ме- тодом инсерционного мутагенеза. Удивительно, что мыши, несущие мутантную нефункциональную аллель, демонстрировали характерный фенотип после переда- чи от отца, но не обнаруживали его после передачи от матери. В свете ранее полученных данных о том. что ну- клеотидные последовательности чужеродной ДНК мо-
2. Геномный импринтинг — эпигенетическая система регуляции генов гут индуцировать импринтированную экспрессию мы- шиных генов, отцовски-специфичную экспрессию Igf2 с ^модифицированных хромосом дикого типа удалось подтвердить также, используя мышей, несущих реци- прокные родительские дупликации и нехватки в хромо- соме 7 (рис. 19.1). ncRNA Я79была идентифицирована как импринтированный ген в ходе проверки гипотезы о том, что импринтированные гены могут быть собра- ны в кластеры, после того как этот ген был картирован вблизи локуса Igf2 на хромосоме 7 Хотя все эти стра- тегии должны были оказаться полезными в последую- щих попытках идентифицировать импринтированные гены, демонстрация того, что импринтированные гены собраны в плотные кластеры, оказалась центральным открытием для нашего понимания механизма, контро- лирующего геномный импринтинг у млекопитающих. 2. Геномный импринтинг — эпигенетическая система регуляции генов Определяющей характеристикой геномного импринтин- га является то, что он действует в czs-конфигурации (см. врезку внизу). Таким образом механизм импринтинга действует только на одну хромосому. Это контрастирует с /гаи5-действуюшими механизмами регуляции генов, которые могут воздействовать на любую хромосому в ядре. Две родительские хромосомы в норме обычно со- держат многочисленные однонуклеотидные различия (известные как однонуклеотидные полиморфизмы, SNPs), если данная популяция является аутбредной, но они могут быть генетически идентичны, если использу- ются инбредные линии мышей. Поскольку геномный импринтинг наблюдается у инбредных мышей, имеющих идентичные родительские хромосомы, этот процесс должен использовать некий эпигенетический механизм, чтобы модифицировать информацию, содержащуюся в нуклеотидной последовательности ДНК и создать разли- чие в экспрессии между двумя родительскими копиями гена. Эти наблюдения показывают также, что работает cis-действующий механизм сайленсинга, который огра- ничен одной хромосомой, так что факторы сайленсинга не могут свободно диффундировать в ядре и достигать активную копию гена. Хотя импринтированные гены репрессированы на одной родительской хромосоме и активны на другой, мы не знаем a priori, что геномный импринтинг—это только механизм сайленсинга. Наобо- рот, мы должны также иметь в виду, что он может быть неким активирующим механизмом, направленным на ген, который «по умолчанию» является сайленсирован- ным в геноме млекопитающих. Стартовая точка для геномного импринтинга долж- на, следовательно, зависеть от эпигенетической систе- мы, которая модифицирует, или «импринтирует» одну из двух родительских хромосом (рис. 19.3). Мы можем приводить доводы в пользу того, что этот импринт впо- следствии используется для привлечения или отталки- вания транскрипционных факторов и, таким образом, для изменения экспрессии импринтированного гена на одной родительской хромосоме. Поскольку мы знаем, что инбредные мыши с генетически идентичными хро- мосомами также обнаруживают геномный импринтинг, мы можем говорить, что родительские импринты не могут быть приобретены после того, как эмбрион ста- новится диплоидным, потому что у эпигенетической машинерии клетки не было бы способа различить иден- тичные родительские копии генов. Таким образом, ро- дительские импринты должны быть приобретены, ког- да два родительских хромосомных набора разделены, а это имеет место только во время формирования гамет и в течение примерно 12 часов после оплодотворения (рис. 19.3). Наиболее вероятный сценарий заключается в том, что гаметические импринты накладываются на отцовски-импринтированные гены во время образова- ния спермиев и на матерински-импринтированные гены во время формирования яйцеклетки. Ключевая особен- ность «импринтированой» последовательности ДНК за- ключается в том, чтобы она была бы модифицирована только в одной из двух родительских гамет; таким об- разом, требуются системы узнавания двух типов, одна спермий-специфичная, а другая ооцит-специфичная, и каждая была бы направлена на другую нуклеотидную последовательность ДНК. Для импринта требуются еще несколько особенностей. Во-первых, будучи однажды установлен, он должен оставаться на той же самой ро- дительской хромосоме после оплодотворения, когда эмбрион становится диплоидным. Во-вторых, этот им- принт должен наследоваться той же родительской хро- мосомой после каждого клеточного деления у эмбриона и взрослого животного. Наконец, он должен «стираться». Последнее необходимо, потому что эмбрион примерно с середины своего развития последует либо по мужскому, либо по женскому пути развития, и его гонадам нужно будет производить только один тип импринтированных гаплоидных родительских гамет. Поскольку зародыше- вые клетки возникают из эмбриональных диплоидных клеток (рис. 19.3), они должны сперва потерять унасле- Ключевые особенности геномного импринтинга у млекопитающих с/5-действующий механизм Результат особенностей наследования, а не пола. Импринты являются эпигенетическими модификациями, приобретаемыми одной родительской гаметой Импринтированные гены в основном собраны в кластеры вместе с некодирующей РНК. Импринты могут модифицировать удаленные регуляторные элементы, которые действуют на множественные гены. Импринтированные гены играют роль в развитии млекопитающих
2-е поколение: 2-е поколение: материнские импринты, приобретенные в ооцитах отцовские импринты, приобретаемые в сперматозоиде Рис. 19.3. Приобретение и стирание импринтов в ходе развития млекопитающих Импринты приобретаются гаметами; таким образом, ооциты и спермин уже несут импринтированные хромосомы (импринты 1-й генерации). После оплодотворения, когда эмбрион стано- вится диплоидным, данный импринт поддерживается на той же самой родительской хромосоме после каждого клеточного деления в клетках эмбриона, оболочках, плаценте, а также у взрослого животного. Зародышевые клетки формируются в эмбриональной гонаде, и импринты стираются только в этих клетках до детерминации пола. Коль скоро эмбрион развивает- ся в самца, гонады дифференцируются в семенники, продуци- рующие гаплоидные сперматозоиды, которые приобретают от- цовский импринт на своих хромосомах. Аналогичным образом, у развивающихся самок хромосомы в яичниках приобретают материнские импринты (импринты 2-й генерации) дованные ими материнские и отцовские импринты, пре- жде чем они приобретут импринты гамет. Каким образом идентифицируются гаметические импринты? Не слиш- ком вдаваясь в семантику, импринт можно определить как эпигенетическую модификацию, отличающую мате- ринскую копию гена от отцовской копии гена. Импринт, будучи однажды сформирован, должен также позволять транскрипционной машине по-разному обрабатывать материнскую и отцовскую копии гена, находящиеся в одном и том же ядре. Можно предсказать, что гаметиче- ский импринт будет непрерывно присутствовать на всех стадиях развития (рис. 19.3); таким образом, импринты можно обнаружить, сравнивая эпигенетические мо- дификации на материнских и отцовских хромосомах в эмбриональных или взрослых тканях (с использова- нием стратегий, изображенных на рис. 19.1) и просле- живая их в развитии обратно, до одной из двух гамет. Гаметические импринты могли бы быть модификация- ми ДНК или гистоновых белков, которые упаковывают ДНК в хромосомы. Хотя у млекопитающих известен лишь один тип эпигенетических модификаций ДНК, а именно метилирование ДНК (глава 18), гистоны могут нести множественные типы модификаций, в том числе метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, сумоилирование и убиквитилирование (дополнитель- ные детали см. в главе 10). Они могут также замещаться вариантными гистонами со специфическими функция- ми (главы 3 и 13). Любые из этих эпигенетических мо- дификаций можно было бы теоретически квалифици- ровать как импринт. Мы можем считать, что ферменты, ответственные за эти эпигенетические модификации, могли бы экспрессироваться в одной из двух гамет и специфически ассоциироваться с одной родительской хромосомой, чтобы скопировать данную модифика- цию, когда клетка делится. Однако, как описывается в разделе 3, лишь метилирование ДНК было четко про- демонстрировано в качестве гаметического импринта для импринтированных генов у млекопитающих и, на сегодняшний день, является единственной наследуе- мой модификацией. Каким образом действует гаметический импринт, чтобы контролировать импринтированную экспрес- сию? Как обсуждалось выше, нам необходимо «быть открытыми» в вопросе о том, ведет ли импринт к акти- вации или же к репрессии одной родительской копии импринтированного гена. Чтобы понять, как действует импринт, нам нужна информация по трем вопросам: какая родительская хромосома несет данный импринт, какая родительская хромосома несет экспрессируемую аллель импринтированного гена и каково положение импринтированной последовательности по отношению к экспрессируемой или «молчащей» аллели имприн- тированного гена. Используя подходы этого типа, мы теперь знаем, что гаметические импринты могут дей- ствовать на целые кластеры генов сразу. Эти имприн- тированные кластеры содержат от 3 до 10 импринтиро- ванных генов и имеют протяженность от 100 т.п.н. до 3000 т.п.н. геномной ДНК (дополнительные детали см. http://www. mgu. har. mrc. ас. uk/research/imprinting/). Боль- шинство генов в любом одном кластере — это имприн- тированные гены иРНК, кодирующих белки; однако по меньшей мере один из них — всегда ген импринтиро- ванной ncRNA (некодирующей РНК). Из-за расположения импринтированных генов в виде кластеров, при том что некоторые гены экспрес-
3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга сируются с одной родительской хромосомы, а некото- рые с другой, не всегда просто определить, как действу- ет импринт. Можно исследовать влияние импринта на единичные гены в кластере, но может оказаться более информативным изучать влияние импринта на весь кластер. Более детально это описывается в разделе 3. Одно, тем не менее, очевидно. Природа не выбрала са- мую простую модель, по которой импринт направляет- ся к промотору, чтобы преимущественно [preemptively] сайленсировать импринтированный ген в одной гаме- те. Вместо этого оказывается, что импринты, в целом, направляются к удаленным c/s-действующим репрес- сорам, которые влияют на экспрессию множественных генов, локализованных на больших расстояниях на той же хромосоме. 3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга 3.1. Импринтированные гены контролируют эмбриональный и неонатальный рост Какова же функция геномного импринтинга у млекопи- тающих? Одним из способов ответить на этот вопрос было бы определение функции известных импринтированных генов in vivo. Современные технологии позволяют сейчас определять функционирование генов у мышей путем индукции мутаций в нуклеотидной последовательности гена, чтобы нарушить его функцию. С помощью этой тех- ники «гомологичной рекомбинации» были определены функции 26 из 78 известных импринтированных генов (оригинальные ссылки см. по адресу http://wwyv.mgu.har. mrc.ac.uk/research/imprinting/function.html). В табл. 19.1 эти гены перечисляются соответственно их функции в развитии мышей и их экспрессии с материнской или отцовской аллели. Самая большая категория на сегодня охватывает импринтированные гены, которые влияют на рост эмбриона, или плаценту, или на новорожден- ного, полностью зависящего от материнского молока В этой категории приблизительно половина — это отцовски-экспрессируемые импринтированные гены, которые функционируют как ростовые промоторы (как показывает задержка роста у эмбрионов, дефектных по этому гену). Другая половина — это матерински - экспрессируемые импринтированные гены, которые функционируют как ростовые репрессоры (что демон- стрируется усилением роста у эмбрионов, дефектных по этому гену). Следующая по величине категория включает гены, не вызывающие никаких очевидных дефектов в эмбриональном развитии; за нею следует категория с поведенческими или нейрологическими дефектами. Остающиеся три испытанных гена обладают разнообраз- ными, внешне не связанными дефектами. Эти результаты являются, на одном уровне, разочаровывающими, по- скольку они не не позволили идентифицировать одну какую-нибудь функцию для всех импринтированных ге- нов. Однако все же может быть свет в конце туннеля, по- тому что эти результаты говорят нам, что более чем 50 % импринтированных генов функционируют как регуля- торы эмбрионального или неонатального роста. Более интересно, что способность регулировать рост оказыва- ется четко разделенной: матерински-экспрессируемые регулирующие рост гены действуют как репрессоры роста потомства, тогда как отцовски-экспрессируемые гены в этой категории действуют, усиливая рост, 20 % протестированных импринтированных генов являются активными в нейрологических процессах, некоторые из них влияют на скорость неонатального роста, меняя материнское поведение. Наиболее загадочной категори- ей, принимая во внимание попытки идентифицировать селективную силу, направляющую приобретение экс- прессии импринтированных генов у всех ныне живущих млекопитающих, является категория импринтированных генов, не имеющих никаких очевидных биологических функций в эмбриональном развитии, и эта категория содержит 25 % протестированных импринтированных генов. 3.2. Функция геномного импринтинга у млекопитающих Могут ли анализы функции гена помочь нам понять, по- чему гены импринтированы у млекопитающих? Взгляд на геномный импринтинг у разных типов млекопитающих проливает некоторый свет на эту проблему. Плацентарные млекопитающие, такие как мыши и человек, и сумчатые, такие как опоссум и валлаби, демонстрируют геномный импринтинг. Яйцекладущие млекопитающие, такие как утконос и ехидна, по-видимому, не имеют импринтиро- ванных генов, хотя экстенсивные исследования все еще не были проведены. Плацентарные млекопитающие и сумчатые различаются в отношении их репродуктивной стратегии, которая позволяет зародышу непосредственно влиять на объем материнских ресурсов, используемых для его собственного роста. Напротив, эмбрионы, развивающиеся в яйце, не способны прямо влиять на материнские ресурсы. Большинство беспозвоночных и позвоночных используют репродуктивную стратегию, связанную с откладкой яиц. Важно отметить, что они могут также претерпевать партеногенез — форму репро- дукции, при которой женская гамета развивается в новую диплоидную особь без оплодотворения мужской гаметой (обратите внимание на то, что партеногенетические эмбрионы возникают в результате дупликации одного и того же материнского генома, тогда как гиногенетиче- ские эмбрионы, изображенные на рис. 19.3, возникают из двух разных материнских геномов). Эта способность проходить партеногенез, вероятнее всего, указывает на полное отсутствие геномного импринтинга, поскольку она показывает, что без отцовского генома можно обой- тись. У млекопитающих, однако, прямым следствием экспрессии импринтированного гена, контролирующего рост плода, является невозможность партеногенеза. Для того чтобы произвести жизнеспособное потомство, не- обходимы и мать, и отец, что делает млекопитающих в этом деле полностью зависимыми от полового воспроиз- ведения (рис. 19.4). У млекопитающих партеногенез пока еще не наблюдался, несмотря на противоположные за-
Рис. 19.4. Импринтированные гены играют роль в репродукции млекопитающих Млекопитающие диплоидны, и репродукция требует оплодот- ворения гаплоидной женской яйцеклетки гаплоидным мужским сперматозоидом для того, чтобы воссоздать диплоидный эмбри- он. Только самки анатомически приспособлены для воспроиз- ведения, но они не могут использовать для этого партеногенез, поскольку существенные импринтированные гены, необходи- мые для роста плода, импринтированы и сайленсированы на материнских хромосомах. Эти гены экспрессируются только с отцовских хромосом; таким образом, у млекопитающих для репродукции необходимы обе родительские хромосомы. Пар- теногенез — это образование диплоидного потомства из двух копий одного и того же материнского генома явления, хотя редкие мыши с диплоидным материнским геномом недавно были созданы путем манипулирования с экспрессией импринтированного кластера Igf2 (Kono et al., 2004). Почему геномный импринтинг развился лишь у не- которых млекопитающих, но не у позвоночных в целом? Три особенности геномного импринтинга — функция регуляции роста у многих импринтированных генов, ограничение импринтированных генов плацентарны- ми и сумчатыми млекопитающими и, наконец, необхо- димость отцовского генома для развития плода — могут соответствовать двум в равной мере привлекательным гипотезам. Первая гипотеза предполагает, что геномный им- принтинг развился в ответ на ситуацию «родительского конфликта» (Moore and Haig, 1991). Эта ситуация воз- никает в силу противоположных интересов материн- ского и отцовского геномов: эмбриональный рост за- висит от одного родителя, но на него влияет эмбрион, чей геном происходит от двух родителей. Предполага- ется, что отцовски-экспрессируемые гены стимули- руют эмбриональный рост, тем самым максимизируя конкуретноспособность индивидуального потомка, несущего конкретный отцовский геном. Матерински- экспрессируемые импринтированные гены, как пред- полагается, подавляют рост плода. Это могло бы сде- лать возможным более равномерное распределение материнских ресурсов между всеми потомками и уве- личивало бы шансы на передачу материнского генома более многочисленным потомкам, которые могут иметь разные отцовские геномы. Вторая гипотеза называется «трофобластная защита» (Varmuza and Mann, 1994). Она предполагает, что мате- ринский геном находится в условиях повышенного ри- ска вследствие того, что мать анатомически приспосо- блена к внутриутробному воспроизведению; этот риск возникает, если спонтанная активация ооцита приво- дит к полному эмбриональному развитию. Поскольку у самцов отсутствуют необходимые анатомические пред- посылки для внутриутробного воспроизведения, они не рискуют в той же мере, если происходит спонтан- ная активация сперматозоидов. Таким образом, пред- полагается, что импринтинг либо сайленсирует гены на материнской хромосоме, стимулирующие развитие плаценты, либо активирует гены, лимитирующие этот процесс. Те гены, которые необходимы для формирова- ния плаценты, экспрессировались бы, следовательно, только с отцовского генома, после того как произошло оплодотворение. Если хотя бы одна из этих гипотез является пра- вильным объяснением эволюции геномного имприн- тинга у млекопитающих, го какая из них? Обе гипо- тезы указывают на роль импринтированных генов в регулировании развития и функции плаценты; однако ни модель родительского конфликта, ни модель тро- фобластной защиты не могут полностью объяснить все имеющиеся данные (Wilkins and Haig, 2003). Интерес- но отметить, что импринтированные гены были также идентифицированы в эндосперме растений — ткани, которую сравнивали с плацентой эмбрионов у млеко- питающих, поскольку она переносит пищевые ресурсы от родительского растения к зародышу (более подроб- но о геномном импринтинге у растений см. в главе 11). Это открытие делает более сильными доводы в пользу того, что геномный импринтинг развился как средство регулирования переноса питательных веществ между родителем и потомством, но не объясняет, почему. Бо- лее полные или альтернативные объяснения функции геномного импринтинга у млекопитающих могли бы быть получены из двух источников Первым таким источником могло бы быть исследование функции «импринтинга» по всему генному кластеру per se — в противоположность изучению фенотипа мышей, ли- шенных продукта какого-то одного импринтирован- ного гена. Это потребовало бы умения ревертировать импринт и генерировать двуродительскую экспрессию генов по всему импринтированному кластеру. Второй подход заключается в том, чтобы узнать в деталях, как гены импринтируются. Возможно, что не все гены в кластере являются предумышленной мишенью для механизма импринтинга и что некоторые из них могут быть просто «безучастными свидетелями» процесса, так что их функция мало что говорила бы о роли ге- номного импринтинга. Существование генов — «без- участных наблюдателей», затрагиваемых механизмом импринтинга, может удовлетворительно объяснить странное обилие импринтированных генов без какой- либо очевидной биологической функции в развитии (табл. 19.1).
3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга Таблица 19.1. Функция импринтированных генов, определяемая путем инактивации генов Материнский Функция гена Отцовский -/g/2r -Gnas - Tssc3/lpl -Mash2 -GrblO Megi -/+ Cdknlc Дефекты роста у эмбриона, в плаценте или на постнатальной стадии +Igf2 +Cnasxl +Pegl Mest +Peg3/Pwl +Rasgtfl +Dlk Nesp Ube3a Kcnql* Поведенческие или нейрологические де- фекты +Pegl Mest +Peg3 Pwl +Rasgtfl yfcfy ppermatogenesis Den ^umor suPPressor Другие дефекты J^^jqStrain-spectfic lethality H19 ncRNA Slc22a2 Slc22a3 Никаких очевидных дефектов у эмбрионов или новорожденных Snrpn Snurf Frat3 Ins2 (Материнский) — матерински-экспрессированный имприн- тированный ген, (отцовский) — отцовски-экспрессированные импринтированные гены. (+) — стимулирующее рост влияние, (-) — подавляющее рост влияние, (-/+) —дефект в дифферен- цировке, но регуляторный статус роста неясен, (*) дополнитель- ный дефект дифференцировки (ссылки на первичные данные можно найти по адресу http://www.mgu.har тгс, ас. uk/research/ imprinting/function.html) 3.3. Импринтированные гены собраны в кластеры и контролируются импринтными контрольными элементами На сегодня около 80 импринтированных генов карти- рованы в десяти хромосомах мыши, и оказалось, что большинство из них собраны в кластеры (Verona et aL, 2003). Одиннадцать кластеров импринтированных генов были приписаны к восьми хромосомам (номера 2,6,7,9, 11,12,15 и 17), тогда как одиночные импринтированные гены были идентифицированы лишь на трех хромосомах (номера 2, 14 и 18). Существование кластеров имприн- тированных генов — сильный аргумент в пользу того, что некий общий ДНК-элемент может регулировать импринтированную экспрессию множественных генов в ^-конфигурации. На сегодняшний день хорошо охарак- теризованы только шесть импринтированных кластеров и они перечислены в табл. 19.2 по имени основного им- принтированного гена иРНК в кластере (т.е. кластеры импринтированных генов Igf2r, Igf2, Kcnql. Gnas. DlkT) или по ассоциации с тем или иным заболеванием (кла- стер Pws — синдром Прадера — Вилли, более детально обсуждаемый в главе 23). Эти шесть кластеров содержат от трех до десяти импринтированных генов и простира- ются на более чем 100—3000 т.п.н. ДНК. На рис. 19.5 изображен специфичный в отноше- нии родителя паттерн экспрессии в типичном кластере импринтированных генов. Общей чертой этих шести кластеров является присутствие нуклеотидной после- довательности ДНК, несущей гаметический импринт метилирования, который известен как гаметический DMR (Differentially DNA-Metylated Region). Гаметиче- ский импринт метилирования определяется как им- принт метилирования, устанавливаемый в одной гаме- те и поддерживаемый в диплоидных клетках эмбриона только на одной родительской хромосоме. В четырех кластерах (Igf2r, Kcnql, Gnas и Pws) гаметический DMR имеет материнский импринт метилирования, приоб- ретенный в оогенезе, тогда как в двух кластерах (Tgf2 и DlkT) он имеет отцовский импринт метилирования, приобретенный во время сперматогенеза. Во всех ше- сти примерах было показано, что гаметический DMR контролирует импринтированную экспрессию всего кластера или его части и поэтому обозначается как эле- мент контроля импринта (ICE, imprint control element) для этого кластера (Spahn and Barlow, 2003). Табл. 19.2 показывает, что каждый кластер имприн- тированных генов содержит множественные иРНК и по меньшей мере одну ncRNA. Четыре кластера (Igf2r, Kcnql, lgf2 и DlkT) демонстрируют простой паттерн, в котором хромосома, несущая метилированный гамети- ческий DMR, экспрессирует множественные иРНК, но не экспрессирует ncRNA (как показано на рис. 19.5 для материнского гаметического DMR). Хромосома, несу- щая неметилированный гаметический DMR, обнару- живает реципрокный паттерн экспрессии: репрессию множественных иРНК и экспрессию ncRNA. Осталь- ные два кластера (Gnas и Pws) обладают сложным пат- терном, где импринтированные иРНК экспрессируются с обеих хромосом, тогда как импринтированная ncRNA экспрессируется только с хромосомы, несущей немети- лированный гаметический DMR. Табл. 19.2 показывает, что в трех кластерах (Tgrf2r, Kcnql и Gnas) промотор ncR- NA расположен в интроне одной из импринтированных иРНК, в то время как в остальных кластерах промотор ncRNA отделен от импринтированных генов иРНК, хотя и лежит близко к ним. Это тесное перемешивание активных и «молчащих» генов в импринтированном кластере показывает, что механизмы сайленсинга и активации, влияющие на импринтированные гены, не распространяют свое действие и могут быть ограничены затрагиваемым геном. В частности, тот факт, что про- мотор «молчащей» ncRNA может находиться в интроне активно транскрибируемого гена, показывает, что меха- низмы сайленсинга, могут даже не распространять свое действие на всю длину гена, но могут быть ограничены лишь регуляторными элементами. Какова же роль гаметического DMR? Несмотря на тот факт, что гаметические DMR могут матерински или отцовски метилироваться, эксперименты по удалению этих элементов дали в целом сходные результаты, хотя и за несколькими исключениями (рис. 19.6). Что касается трех кластеров (Igf2r, Kcnql, DlkT), экспериментальная делеция метилированного гаметического DMR не дала никакого эффекта. Однако делеция неметилирован- ного гаметического DMR полностью ревертировала картину специфичной в отношении родителя экспрес- сии, так что экспрессия ncRNA была утрачена, а биал- лельная экспрессия иРНК была приобретена (Lin et al.,
Глава 19. Геномный импринтинг у млекопитающих Таблица 19.2. Особенности кластеров импринтированных генов в геноме мыши Тип кла- стера Имя кластера Хромосома (мышь/че- ловек) Гаметический импринт мети- лирования Размер кластера (т.п.н.) Число генов в кластере иРНК и экспрессия ncRNA и экспрессия Ориентация ncRNA Тип 1 IgPr 17/6 М 400 4 W(M) Slc22a2(M) Slc22a3(M) Л/г(Р) Антисмысловая к lgl2r Kcnql 7/11 М 700 10 Mash2(M) Kaiql (M) Cd81 (M) Cdknlc (M) Msuit (M) Slc221I(M) Ipl(N[) Tssc4 (M) Obphl (M) Kcnqotl (P) Антисмысловая к Kcnql Pws 7/15 М 3000 ~7 Ube3a (M) AtplOc (M) Erat3(P) Mkm3 (P) Ndn (P) Magel2(P) Snrpn (P) *Ube3aas (P) *IPW(P) *Mkm3as (P) *PEC2(P) *PEC3(P) *Pwcrl (P) *может быть одной длинной ncPHK Антисмысловая к ЦЬеЗа (перекрывает также Snrpn в смыс- ловой ориентации) Gnas 2/, 20 м (х2) 100 5 Nesp (M) Gnas (M) GrtOKf(P) espas (P) 2Exon 1 A (P) ’Антисмысловая к Nesp 2Смысловая к Gnas Тип 11 Igf2 7/11 р 100 3 ДО(Р) Ins2(P) Я79(М) Смысловая нет прекрытий Dlkl 9/14 р 1000 7 Dlkl (P) Dio3(P) Rtll (P) Gtl2(M)' Rian (M)* Rtllas (M)* Mirg (M)* *район может содержать бо- лее длинные ncRNAs Смысловая к Dlkl и также антисмыс- ловая к Rtll (М) — материнский, (Р) — отцовский, (DMR) — дифференциально метилированный район. Детали даны в тексте (из: Beecheyet al., 2005, с изменениями [http://www.mgu.har.mrc.ас.uk/research/imprinting}) Рис. 19.5. Импринтированные гены экспрессируются с одной родительской аллели и часто собраны в кластеры Большинство импринтированных генов обнаруживаются в кластерах, которые включают множественные иРНК, кодирующие белки, и по крайней мере одну некодирующую РНК (ncRNA). Могут также присутствовать неимпринтированные гены. Механизм импринтинга действует в с/5-конфигурапии, и импринтированная экспрессия контролируется элементом контроля импринта, который несет эпигенетический импринт, унаследованный от одной родительской гаметы. Одна пара диплоидных хромосом показана розовым цветом и синим цветом (отцовски-экспрессированный импринтированный ген): (IG) — импринтированный ген иРНК, (IG-nc) — импринтированный ген ncRNA, (NG) — неимпринтированный ген, (ICE) — элемент контроля импринта (стрелка) — экспрессирванный ген, (заполненный кружок) — репрессированный ген
3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга 1995; Zwart et al., 2001; Fitzpatnck et al., 2002). Два кла- стера (Gnas и Pws), оказывается, содержат более одного гаметического DMR и демонстрируют более ложное поведение, которое все еще обнаруживает некоторое сходство с этим паттерном (Williamson et al., 2006). Кла- стер Igf2, однако, ведет себя иначе: делеция и метили- рованного, и неметилированного гаметического DMR вызывает изменения в экспрессии иРНК и ncRNA в cis- конфигурации (Thorvaldsen et al., 1998). Результаты вышеупомянутых экспериментов с деле- цией гаметического DMR, на первый взгляд, не указы- вают на общую функцию гаметических DMR. Однако понимание их точной функции зависит от знания по- ложения DMR по отношению к импринтированным генам в каждом кластере. В этих трех кластерах с про- стейшим паттерном (Igf2r, Kcnql и Dlkl) гаметический DMR либо ограничивает, либо контролирует экспрес- сию ncRNA; так, делеция этого элемента явно приве- дет к утрате экспрессии ncRNA. Однако гаметический DMR в кластере Igf2 не прямо контролирует промотор Н19, но изменяет взаимодействие между Igf2 и Н19 и их общими энхансерами и таким путем регулирует их экс- прессию. Несмотря на эти различия, в целом неметили- рованный гаметический DMR рассматривается во всех шести кластерах как позитивный регулятор экспрессии ncRNA, а присутствие импринта метилирования ДНК ассоциируется с репрессией ncRNA. Данные, получен- ные в опытах с делениями гаметических DMR, четко идентифицируют эти районы как главные ICE, чья ак- тивность регулируется метилированием ДНК. Хотя эти данные все еще находятся на ранней ста- дии, уже были сделаны попытки определить два типа импринтированных кластеров (табл. 19.2). Кластеры типа I и типа II демонстрируют одинаковое общее по- ведение реципрокной специфичной в отношении ро- дителя экспрессии между ncRNA и множественными генами иРНК, но могут быть дифференцированы троя- ким образом. Во-первых, кластеры типа I несут мате- ринский импринт метилирования ДНК (Igf2r, Kcnql, Pws и Gnas), тогда как кластеры типа II несут отцовский импринт метилирования ДНК (Igf2 и Dlkl). Во-вторых, кластеры типа I экспрессируют ncRNA с отцовской хромосомы, тогда как кластеры типа II экспрессируют ncRNA с материнской хромосомы. В-третьих, в кла- стерах типа I промотор ncRNA расположен в интроне и генерирует транскрипт в антисмысловой ориентации по отношению к одному из множественных имприн- тированных генов иРНК, тогда как в кластерах типа II промотор лежит «вниз по течению» и имеет смысловую ориентацию по отношению, по крайней мере, к одному импринтированному гену иРНК (Regha et al., 2006). 3.4. Кластеры импринтированных генов содержат по меньшей мере одну ncRNAb Из 12 известных кластеров импринтированных генов восемь ассоциированы с ncRNA (O’Neill, 2005). Раньше считалось, что ncRNAs, за исключением тех, которые участвуют в процессинге и трансляции РНК. т.е. таких как РНК сплайсинга, траспортные и рибосомные, яв- ляются раритетом в геноме млекопитающих. Теперь, благодаря доступности нуклеотидных последователь- ностей геномов мыши и человека, может быть выполнен анализ транскриптома, дающий перечень всех РНК- транскриптов в данной клеточной популяции. Уже пока- зано, что большая часть транскриптома млекопитающих (не считая ncRNAs, связанные с процессингом и транс- НЕИМПРИНТИРОВАННАЯ ХРОМОСОМА ИМПРИНТИРОВАННАЯ ХРОМОСОМА Никаких изменений в экспрессии генов Рис. 19.6. Импринтированная экспрессия регулируется гаметическими DMR На левой части рисунка показан эффект делегирования гаметического DMR из импринтированной хромосомы (зеленый цвет). Правая часть демонстрирует эффект делегирования гаметического DMR из неимпринтированной хромосомы (желтый цвет). Во многих импринтированных кластерах (например, lgf2r, Kcnql и Dlkl) экспериментальная делеция G-DMR влияет лишь на хромосому, несущую неимпринтированныйВМК. Результатом этого является утрата репрессии импринтированных генов иРНК, кодирующих белки (IG) и приобретение репрессии импринтированного гена ncRNA (IG-NC). Следует обратить внимание на то, что в некоторых импринтированных кластерах (Igf2 и Pws). которые здесь не изображены, метилированный G-DMR оказывается также необходимым для экспрессии некоторых из импринтированных иРНК в с/5-конфигурации: (del) — делегированная ДНК, (G-DMR) — гаметический диффернциально ДНК-метилированный район, (NG) — неимпринтированный ген. (стрелка) — экс- прессируемая аллель (черный запрещающий знак) — репрессированная аллель, (IMPRINT) — эпигенетическая модификация, ведущая к изменению экспрессии гена в с/5-конфигурации Экспрессия напоминает «импринтированную» хромосому й. Яш
Q60 Глава 19. Геномный импринтинг у млекопитающих ляцией) в основном, как это ни удивительно, состоит из ncRNAs, а не иРНК, кодирующих белки. Большой объем транскрипции ncRNAs в геноме млекопитающих и тот факт, что большое число ncRNAs перекрываются с известным кодирующим белок геном, показывают, что это не может рассматриваться как «транскрипционный шум», но представляет, вероятно, новую, до сих пор не- известную систему регуляции генов (Mattick, 2005). Был создан Web-сайт, названный NON CODE, чтобы собирать данные о функциональных ncRNAs по всем организмам (http://noncode.bioinfo.org.cn/). Имеются несколько типов ncRNAs млекопитающих, которые, как было показано, обладают регуляторными функциями по отношению к генам, в том числе «короткие» ncRNAs от 21 до 30 п.о., участвующие в путях РНК-интерференции (глава 8), «межгенные» непроцессируемые транскрипты, регули- рующие локальную активность хроматина (Haussecker and Proudfoot, 2005), и «длинные» процессируемые ncRNAs, такие как Xist, которая участвует в инактивации Х-хромосомы (глава 17). Какие типы ncRNAs связаны с кластерами имприн- тированных генов? Анализ ncRNAs, ассоциирующихся с шестью хорошо охарактеризованными импринтиро- ванными кластерами, перечисленными в табл. 19.2, все еще неполон, выявляя некоторые черты сходства, но и некоторые различия. Три импринтированные ncRNAs являются необычно длинными зрелыми РНК: Air имеет длину 108 т.о. (Lyle et al., 2000), Kcnqlotl — по крайней мере 60 т.о., но окончательный размер еще не определен (Mitsuya et al., 1999), a Ube3aas может превышать 1000 т.о. (Landers et al., 2004). Напротив, ncRNA Н19 имеет дли- ну всего 2.3 т.о. (Brannan et al., 1990). ncRNA Gtl2 содер- жит множественные альтернативно сплайсированные транскрипты; однако была отмечена также межгенная транскрипция «вниз по течению», позволяя предпола- гать, что вероятны и более длинные транскрипционные единицы (Tierling et al., 2005). ncRNa Nespas крупнее, чем можно определить на РНК-блотах, и ее полный размер неизвестен (Wroe et al., 2000). Все эти импринтирован- ные ncRNAs бедны интронами, имеют низкое отноше- ние «интрон — экзон» или не сплайсированы как зрелые транскрипты Ранее предполагалось, что все импринти- рованные гены бедны интронами; однако это может быть верно лишь для импринтированных ncRNAs (Hurst et al., 1996). Еще одной особенностью является то, что две им- принтированные ncRNAs (Ube3aas и &12-транскрипты «вниз по течению») действуют как хозяйские транскрип- ты для snoRNAs (малых ядрышковых РНК, которые на- правляют модификации к рРНК, snRNAs и, возможно, иРНК, действуя тем самым как посттранскрипционные регуляторы). snoRNAs не направляются к импринтиро- ванным генам иРНК в кластере, и вполне вероятно, что они не играют никакой роли в самом механизме имприн- тинга (Seitz et al., 2004). Аналогичным образом, miRNAs в кластере Dlkl участвуют в посттранскрипционной ре- прессии одного из генов иРНК в кластере, но их роль в регулировании импринтированной экспрессии кластера еще не проверена (Davis et al., 2005). Две особенности импринтированных ncRNAs по- казывают, что они могут играть роль в сайленсинге импринтированных генов иРНК (т.е. генов, кодирую- щих белки) в кластере. Первая заключается в том что ncRNA обычно обнаруживает реципрокную специфич- ную в отношении родителя экспрессию по сравнению с импринтированными генами иРНК (табл. 19.2). Во- вторых, DMR, несущий гаметический импринт мети- лирования, который контролирует импринтированную экспрессию целого кластера, перекрывается с промото- ром ncRNA в трех случаях (Air, Kcnqlotl, Gnas Exon la). Это могло бы служить указанием на то, что эти имприн- ты возникли для регуляции ncRNA в каждом имприн- тированном кластере В пользу такой интерпретации свидетельствуют эксперименты, в которых делегиро- вали неметилированную последовательность, несущую гаметический DMR, вызывая тем самым утрату экс- прессии ncRNA одновременно с приобретением экс- прессии импринтированных генов иРНК (рис. 19.6), как было проверено в кластерах Igf2r, Kcnql, Gnas, Pws и Dlkl (Wutz et al., 1997; Bielinska et al., 2000; Fitzpatrick et al., 2002; Lin et al., 2003; Williamson et aL, 2006). Кластер Igf2 представляет собой исключение, потому что оказы- вается, что неметилированный гаметический DMR не является непосредственным регулятором ncRNA Н19 (Thorvaldsen et al., 1998). Эксперименты, в которых прямо тестируется роль самой ncRNA, были проведены сейчас для двух ncR- NAs из кластеров импринтированных генов типа I (Air и Kcnqlotl) и одной ncRNA (Н19) из кластера типа II. Укорочение ncRNA Air длиной 108 т.о. до 3 т.о. показа- ло, что сама ncRNA необходима для сайленсирования всех трех генов иРНК в кластере Igf2r, указывая тем са- мым на четкую регуляторную роль этой ncRNA (Sleutels et al., 2002). Кроме того, укорочение ncRNA Kcnqlotl, имеющей длину 60 т.о., до 1.5 т.о. также показало, что эта ncRNA прямо нужна для сайленсирования всех десяти генов иРНК в более крупном кластере Kcnql (Mancini- DiNardo, 2006). Напротив, точная делеция ncRNA Н19 и промотора не оказала никакого влияния на имприн- тинг в кластере lgf2 в тканях эндосперма, хотя в мезо- дермальной ткани наблюдалась некоторая потеря им- принтинга (Schmidt et al., 1999). Таким образом, два из матерински-импринтированных кластеров типа I име- ют общий механизм сайленсинга, зависящий от ncRNA, тогда как единственный отцовски-импринтированный кластер типа II, изученный до настоящего времени, ис- пользует другую модель, зависящую от инсулятора. Мы с нетерпением ждем результаты по другим импринти- рованным кластерам, чтобы посмотреть, указывает ли все это на существование только двух типов базовых ме- ханизмов импринтинга у млекопитающих — один для отцовски-импринтированных кластеров, а другой для матерински-импринтированных кластеров. 3.5. Роль метилирования ДНК в геномном импринтинге Идентификация первых трех эндогенных импринти- рованных генов в 1991 году позволила исследователям изучить, каким образом эпигенетическая машинерия клетки маркирует импринтированный ген в отношении
3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга его родительской идентичности. Первым и наиболее легко тестируемым кандидатом было метилирование ДНК — модификация у млекопитающих ковалентно добавляющая метильную группу к остатку цитозина в любом динуклеотиде CpG. Метилирование ДНК до- стигается благодаря действию de novo метилтрансфераз и сохраняется in situ каждый раз, когда клетка делится, действием поддерживающих метилтрансфераз (описано в главе 18). Следовательно, эта модификация удовлет- воряет критериям, очерченным на рис. 19.3 для метки родительской идентичности, или «импринта», поскольку (1) она может быть установлена либо в спермии, либо в ооците de novo метилтрансферазами, которые дей- ствуют лишь в одной гамете, (2) она может стабильно воспроизводиться при каждом делении эмбриональной клетки с помощью поддерживающей метилтрансферазы и (3) она может быть стерта в зародышевой линии для перезагрузки импринта в следующем поколении либо путем пассивного деметилирования, либо, возможно, действием деметилазы. Метилирование ДНК потенциально могло бы вы- полнять две функции в геномном импринтинге. Оно могло бы действовать как импринтирующая метка, бу- дучи приобретаемой de novo только хромосомами одной гаметы. Оно могло бы также служить для сайленсинга одной из родительских аллелей, поскольку метилирова- ние ДНК связано с репрессией гена. Чтобы определить, какой же функцией оно обладает, необходимо сначала показать, что метилирование ДНК присутствует только на одной родительской хромосоме (т.е., что оно являет- ся DMR). Во-вторых, необходимо идентифицировать, какой импринтированный ген в кластере и какая часть регуляторного аппарата этого гена маркированы мети- лированием ДНК. Локализация меток метилирования на промоторе или на удаленных позитивных или нега- тивных регуляторных элементах будет иметь разные по- следствия для экспрессии гена. Наконец, необходимо идентифицировать, когда в ходе развития формируется DMR. Если он формируется во время гаметогенеза и стабильно поддерживается в соматических клетках (что известно как гаметический DMR), он может служить маркером импринтинга Если, однако, он помещается на ген после того как эмбрион стал диплоидным, когда обе родительские хромосомы находятся в одной и той же клетке (известно как соматический DMR), он вряд ли служит в качестве метки идентичности, но может служить для поддержания специфичного в отношении родителя сайленсинга. Родительское аллель-специфичное метилирование ДНК обнаружено в большинстве импринтированных изученных кластеров. Например, кластер Igf2 имеет гаметический DMR, расположенный в 2 т.о. «вверх по течению» от промотора ncRNA Н19, который метили- рован только в родительской гамете и поддерживается после этого во всех соматических тканях (Bartolomei et al., 1993; Ferguson-Smith et al., 1993). Был идентифи- цирован похожий гаметический DMR, который по- крывал промотор ncRNA Air, присутствовал только на «молчащей» материнской копии гена и был приобретен в женской гамете (Stoger et aL, 1993). Удивительно, что гаметические DM Rs не были идентифицированы в про- моторах главных импринтированных кодирующих бе- лок генов в этих кластерах (соответственно, lgf2 и lgf2r). Вместо этого сайленсированный промотор /g/2оказался свободным от метилирования ДНК, тогда как сайлен- сированный промотор Igf2r лежит внутри соматическо- го DMR (Sasaki et al., 1992; Stoger et al., 1993). Подобные находки гаметических DM Rs, метилированных на хро- мосоме, несущей «молчащую» копию импринтирован- ной ncRNA, были сделаны для четырех других хорошо изученных кластеров импринтированных генов, Pws, Kcnql, Gnas и Dlkl (Shemer et aL, 1997; Liu et aL, 2000; Takada et aL, 2002, Yatsuki et aL, 2002). Соматические DMRs возникают реже и были опи- саны лишь на нескольких импринтированных коди- рующих белки генах в каждом кластере, что указыва- ет на то, что метилирование ДНК может играть лишь ограниченную роль в поддержании экспрессии им- принтированного гена (Stoger et aL, 1993; Moore et aL, 1997; Yatsuki et aL, 2002). Делеции гаметических DMRs у мышей приводят к полной утрате импринтинга для множественных генов, доказывая тем самым, что этот класс DMRs служит также как основной ICE для все- го кластера (рис. 19.6) (Wutz et aL, 1997; Thorvaldsen et aL, 1998; Bielinska et aL, 2000; Fitzpatrick et aL, 2002; Lin et aL, 2003; Williamson et aL, 2006). Напротив, делеция соматических DMRs влияет на экспрессию связанного импринтированного гена, кодирующего белок, но им- принтированная экспрессия поддерживается другими генами в кластере (Constancia et aL; Sleutels et aL, 2003). Нехватка метилирования ДНК по всему геному, вы- зываемая мутациями в генах семейства Dnmt, подчер- кивает его существенную роль в регулировании экс- прессии импринтированного гена. Мутации в de novo метилазе Dmnt3a, в факторе Dmnt3L, стимулирующем метилазу, или в поддерживающей метилазе Dmntl дают дефектных по метилированию ДНК эмбрионов, все из которых обнаруживают изменения в экспрессии импринтированных генов (глава 18). Нарушения того типа, который был показан для четырех импринтиро- ванных кластеров (Igf2, Igf2r, Kcnql и Dlkl), показывает, что метилирование ДНК обычно действует, супрессируя действие гаметического DMR на той же родительской хромосоме, которая экспрессирует собранные в кластер гены иРНК. Таким образом, в отсутствие метилирова- ния ДНК гаметический DMR не может функциони- ровать должным образом. Вследствие этого несколько импринтированных генов, кодирующих белки, в том числе Igf2, lgf2r, Kcnql и Dlkl, становятся репрессиро- ванными на обеих родительских хромосомах. Это пока- зывает, что эти гены и РНК в геноме млекопитающих сайленсированы «по умолчанию» и требуют активации для своей экспрессии. Примечательно, что ncRNA Н19, которая в норме экспрессируется лишь на хромосоме, несущей неметилированный гаметический DMR, ста- новится экспрессируемой на обеих родительских хро- мосомах (глава 18) Некоторые исключения из этого общего правила сообщались для генов, демонстрирую- щих импринтированную экспрессию только в плаценте (Lewis tu aL, 2004).
Глава 19. Геномный импринтинг у млекопитающих Используются ли другие типы эпигенетических мо- дификаций в качестве гаметических импринтов? При явном изобилии эпигенетических механизмов, дей- ствие которых модифицирует генетическую инфор- мацию в геноме млекопитающих (описаны в главе 3), маловероятно, чтобы метилирование ДНК было един- ственным импринтирующим механизмом. Модифи- кации гистонов, влияющие на состояния активности хроматина, также являются вероятными кандидатами на роль родительских импринтов, поскольку они мог- ли бы выполнять многие условия, показанные на рис. 3. На сегодняшний день, однако, показано, что лишь бе- лок — компонент группы Polycomb, известный как Eed (который облегчает метилирование лизина 27 гистона НЗ), влияет на несколько отцовски-репрессированных генов. Однако влияние Eed на геномный импринтинг довольно незначительно по сравнению с метилирова- нием ДНК, и это может служить лишь функцией под- держания (Mager et al., 2003). Каким образом DM Rs выбираются механизмом гаме- тического метилирования? Сравнение известных гамети- ческих DMRs по нуклеотидным последовательностям не выявляет сколько-нибудь явного консерватизма после- довательностей, хотя сообщалось, что некоторые из них содержат ряд прямых повторов, которые могут приобре- тать вторичную структуру, привлекающую метилирова- ние ДНК (Neumann et al., 1995). Нуклеотидная последо- вательность DMRs заметно богаче CpG, чем остальной геном, и напоминает последовательность островков CpG, связанную с промоторами более чем половины ге- нов в геноме млекопитающих (глава 18). Поразительно, что ключевой особенностью промоторов с островками CpG является то, что в норме в них отсутствует метили- рование ДНК и что в ранних эмбриональных клетках су- ществуют механизмы для поддержания островков CpG промотора свободными от метилирования (Antequera, 2003). Однако в опухолях и при старении островки CpG могут становиться метилированными. Два наблюдения пролили свет на то, каким образом метилирование ДНК могло бы «нацеливать» последо- вательности DMR. Первое наблюдение заключается в том, что отцовская специфичность метилирования в гаметическом DMR Н19 зависит от предотвращения метилирования «по умолчанию» в этом районе в мате- ринской гамете с помощью белка CTFC (Fedoriw et al., 2004; смотри также раздел 3.6). Это может указывать на отсутствие сиквенс-специфичности системы метили- рования ДНК. Второе наблюдение заключается в том, что вспомогательный белок метилирования, Dnmt3L, играет разные роли в мужских и женских гаметах. В мужских гаметах Dnmt3L играет главную роль в мети- лировании и сайленсинге ретротранспозонов и незна- чительную роль в метилировании DMR. Напротив, в ооцитах Dnmt3L играет основную роль в метилирова- нии DMR и не играет никакой роли в метилировании ретротранспозонов (Bourc’his and Bestor, 2006). Ретро- транспозоны являются мобильными генетическими элементами, присутствующими в очень большом чис- ле в геноме млекопитающих и могут копироваться по- средством промежуточных РНК и вставляться в новые геномные сайты (Kazazian, 2004). Обнаружение того факта, что тот же самый белок, который направляет метилирование, чтобы сайленсировать ретротранспо- зоны, может также направлять метилирование DMR, показывает, что механизмы, нужные для защиты генома от чужеродных ДНК, были использованы, чтобы делать импринты в материнской зародышевой линии (Barlow, 1993). 3.6. Два типа c/s-действующего сайленсинга, идентифицированного в кластерах импринтированных генов В настоящее время предполагается, что импринтингом в разных кластерах управляют два класса c/s-действуюших механизмов сайленсинга: это модель инсулятора, прило- жимая к кластеру Igf2, и модель опосредованного ncRNA сайленсинга, приложимая к кластерам Igf2r и Kcnql. Хотя это еще не полностью определено, большинство кластеров, перечисленных в табл. 19.2, демонстрируют те или иные аспекты одной из двух моделей. Прорывом, приведшим к определению модели инсулятора в локусе Igf2, была делеция гаметического DMR, который ло- кализован на расстоянии 2 т.о. «вверх по течению» от старта транскрипции Н19 и на расстоянии 80 т.о. «вниз по течению» от Igf2 (рис. 19.7) (Thorvaldsen et al., 1998). Будучи делегированы, Н19 и lgf2 обнаруживали утрату импринтинга безотносительно к тому, наследовалась ли эта делеция от матери или от отца, что позволяло иден- тифицировать этот DMR как ICE. Впоследствии было показано, что этот ICE связывается с CTCF — белком, который, как было показано, опосредует активность инсулятора в локусе beta-globin, и что сам ICE фунпио- нирует как инсулятор (Bell and Felsenfeld, 2000; Hark et al., 2000). В этом контексте инсулятор определяется как элемент, который блокирует взаимодействия промотора и энхансера, будучи помешен между ними Таким об- разом, модель экспрессии импринтированного гена в этом локусе следующая: на материнской аллели CTCF связывается с ICE и блокирует доступ lgf2 и Ins2 к эн- хансерам, общим с ncRNA Н19, которые расположены «вниз по течению» от этих трех генов. Тем самым это предоставляет Н19 исключительный доступ к энхансе- рам (рис. 19.7). На отцовской аллели ICE приобретает метилирование ДНК в мужской зародышевой линии, предотвращая связывание CTCF с ним. Таким образом, на отцовской хромосоме Igf2 и Ins2 взаимодействуют с энхансерами и экспрессируются с этой хромосомы. Присутствие метилирования ДНК на отцовском ICE ведет ко вторичному метилированию промотора Н19 с помощью неизвестного механизма, и он становится сайленсированным на отцовской хромосоме. Участие CTCF в модели инсулятора привело к идентификации сайтов связывания CTCF в других импринтированных генах, таких как Rasgrfl, GrblOvi Kcnqlotl, показывая тем самым, что модель инсулятора может работать в других импринтированных кластерах. ncRNA-класс моделей импринтинга может, однако, быть более обычным. Прорывом, приведшим к иден- тификации функциональных ncRNAs в импринтиро-
3. Ключевые открытия в области геномного импринтинга а МОДЕЛЬ ИНСУЛЯТОРА - Igf 2-кластер Mat (J Инсулятор блокирует активацию иРНК, энхансеры активируют псРНК Отцовский СНЗ метил-импринтсайленсирует ICE и иРНК б МОДЕЛЬ псРНК — Igf2г-кластер Рис. 7. Два cis-действующих механизма сайленсинга в кластерах импринтированных генов (а) Модель инсулятора для кластера Igf2. Показан паттерн экспрессии для эндодермы. На материнской хромосоме неметилирован- ный ICE связывается с белком CTFC и формирует инсулятор, который не дает общим энхансерам эндодермы (Е) активировать Igf2 и Ins2. Вместо этого эти энхансеры активируют близлежащий промотор ncRNA Н19. На отцовской хромосоме метилированный ICE не может связываться с СТСЕ и инсулятор не образуется, вследствие чего гены иРНК Igf2 и Ins2 экспрессируются только на этой хромосоме. ncRNA Н19 метилируется, скорее всего, из-за распространения с удаленного на 2 т.о.метилированного ICE и является «молчащей», (б) модель ncRNA для кластера Igf2r. Показан паттерн экспрессии для плаценты. На материнской хромосоме метилированный ICE содержит промотор ncRNA Air, который прямо сайленсирован импринтом метилирования ДНК. Гены иРНК Igf2r, Slc22a2и Slc22a3 экспрессируются только на этой хромосоме. Masi и Slc22al в плаценте не экспрессируются. На отцовской хромосоме промотор ncRNA Air, лежащий в неметилированном ICE, экспрессируется и сайленсирует Igf2r, Slc22a2 и Slc22a3 в cis. Заметьте, что в обеих моделях импринт метилирования ДНК сайленсирует ncRNA и делает возможной экспрессию иРНК: (ICE) — элемент контроля импринта {серый прямоугольник) — импринтированный ген иРНК, (ген-NC) — импринтированный ген ncRNA, (стрелка) экспрессированная аллель импринтированного гена, (черный запрещающий знак) — репрессированная аллель импринтированного гена, (заполненныйромб) — тканеспецифичныи ген, сайленсированныи на обеих родительских хромосомах, (серые стрелки) — удаленный эффект в cis-конфигурации ванных кластерах, явился эксперимент с укорочением ncRNA Air, имеющей длину 108 т.о., до 3 т.о. (Sleutels et al., 2002). Эта укороченная ncRNA сохраняла имприн- тированную экспрессию, и промотор Air сохранял им- принтированное метилирование ДНК — тем не менее, сайленсинг всех трех генов иРНК в кластере Igf2г был утрачен (рис. 19.7). Сейчас было показано, что сай- ленсинг, опосредованный ncRNA, действует также в кластере Kcnql (Mancini-DiNardo. 2006) В настоящее время неизвестно, каким образом ncRNA Air или Kcn- qlotl сайленсируют гены в соответсвующих импринти- рованных кластерах. Возможны многие модели, приме- нимые к обоим кластерам. Две возможности возникают из факта перекрывания смысловой и антисмысловой последовательности иРНК и ncRNA, имеющего место в каждом кластере. Первая возможность заключается в том, что между иРНК и ncRNA может образовываться двунитевая РНК и индуцировать РНК-интерференцию (RNAi) (глава 8). Вторая возможность состоит в том, что это перекрывание смысловой и антисмысловой по-
(Г364 Глава 19 Геномный импринтинг у млекопитающих следовательности становится причиной одной из форм транскрипционной интерференции между двумя про- моторами, которая затрагивает лишь транскрипцию с промотора иРНК. В обоих этих случаях первым собы- тием был бы посттранскрипционный сайленсинг пере- крывающейся иРНК, сопровождаемый накоплением репрессивного хроматина, способного распространять- ся и индуцировать транскрипционный сайленсинг ге- нов во всем кластере. Однако возможно также, что импринтированные ncRN As действуют, покрывая локальный участок хромо- сомы и непосредственно рекрутируя репрессивные бел- ки хроматина к репрессированному кластеру примерно таким же образом, как это описано для действия ncRNA Xist в инактивации Х-хромосомы (глава 17) Имеет место большое сходство между сайленсингом, опосредуемым импринтированной ncRNA, и сайленсингом, опосре- дуемым ncRNA Xist. Наиболее существенно, что оба эти случая представляют ^-действующие эпигенетические механизмы сайленсинга и оба демонстрируют положи- тельную корреляцию между экспрессией ncRNA и сай- ленсингом множественных генов иРНК. Предположи- ли также, что геномный импринтинг и Х-инактивация развились из общего эпигенетического механизма (Reik and Lewis, 2005). Если бы это было так, можно было бы предсказать, что импринтированные ncRNAs могут сай- ленсировать гены путем «нацеливания» репрессивного хроматина на кластер импринтированных генов Одна- ко у нас все еще нет четкой информации относительно того, как импринтированные ncRNAs осуществляют свою сайленсирующую функцию И мы все еще не зна- ем, сколько других импринтированных ncRNAs также играют функциональную роль в сайленсинге генов. 4. Геномный импринтинг — модель эпигенетической регуляции у млекопитающих Геномный импринтинг имеет преимущество перед другими моделями эпигенетического регулирования генов у млекопитающих, поскольку и активная, и не- активная родительские аллели расположены в одном и том же ядре и находятся в одной и той же транскрип- ционной среде. В результате любое эпигенетическое различие между этими двумя родительскими аллелями должно с большей вероятностью коррелировать с их транскрипционным состоянием в противоположность эпигенетическим системам типа «до и после» [«before and after» epigenetic systems], где эпигенетические из- менения могут также отражать измененное состояние дифференцировки клетки. Присутствие и активной, и «молчащей» родительской аллели в одном и том же ядре делает геномный импринтинг идеальной системой для изучения эпигенетической регуляции генов, но и создает некоторые трудности, поскольку необходимо сначала отличить одну из родительских аллелей, чтобы иденти- фицировать специфические особенности, связанные с активностью и сайленсингом генов. Эти трудности были в основном преодолены у мышей в связи с разработкой модельных систем, позволяющих различать материнские и отцовские хромосомы (рис. 19.1). Несмотря на тот факт, что пути эпигенетической ре- гуляции генов весьма консервативны в эволюции, для каждого организма должны, вероятно, существовать отличия, связанные с типом организации генома. Геном млекопитающих демонстрирует необычную организа- цию. где гены чередуются [intersperse] с высококопии- ными повторами (известными также как перемещае- мые элементы). Это существенно увеличивает длину большинства генов, как и расстояние между соседними генами Kazazian, 2004). Это контрастирует с другими модельными организмами, такими как дрожжи, инфу- зории, грибы, нематоды, растения и Drosophila, геномы которых обнаруживают тенденцию оставаться свобод- ными от повторов или, по крайней мере, отделять по- вторы от генов (Rabinovicz et al., 2003). Было замечено, что у многих организмов высоко- копийные повторы привлекают метилирование ДНК и репрессивные модификации гистонов. Полагали, что это является, главным образом, защитной адаптацией против вторжения нуклеотидных последовательностей чужеродной ДНК (т.е., ретропозонов, транспозонов и вирусов). При обсуждении того, каким образом эпиге- нетические механизмы действуют у млекопитающих, необходимо, следовательно, принимать во внимание эту «перемежающуюся» природу повторов и генов (Goll and Bestor, 2005). Примечательно, что то обстоятельство, что интроны млекопитающих богаты повторами и, тем не менее, гены способны весьма интенсивно транскриби- роваться, делает менее вероятным, что геном млекопи- тающих организован в крупные блоки «молчащего» ге- терохроматина или активного эухроматина. Этот взгляд получает некоторую поддержку при анализе паттернов хроматина у человека в масштабах всего генома, который показывает, что активные модификации гистонов обыч- но ограничены промоторами или короткими участками, предположительно являющимися регуляторными эле- ментами (Kim et al., 2005). Расположение импринтиро- ванных генов кластерами, которые содержат реципрок- но экспрессируемые перекрывающиеся гены, а также гены, вовсе избегающие импринтинга, говорит в пользу возникающего в последнее время представления о том, что модификации хроматина в геноме млекопитающих могут не распространяться сколько-нибудь далеко. Что может дать геномный импринтинг для пони- мания эпигенетики млекопитающих? Хотя характери- стика кластеров импринтированных генов далека от завершения, они явно могут дать информацию о том, как гены контролируются в локальных участках или доменах. На сегодняшний день кластеры импринти- рованных генов уже дали примеры с/5-действующих нуклеотидных последовательностей ДНК, которые регулируются метилированием ДНК; генов, которые сайленсируются «по умолчанию» в геноме млекопи- тающих и требуют эпигенетической инактивации для своей экспрессии; удаленных регуляторных элементов, которые могут действовать как инсуляторы, и необыч- ных ncRNAs, которые сайленсируют крупные домены генов в с/5-конфигурации. Время покажет, являются ли
эти типы эпигенетических регуляторных механизмов уникальными для импринтированных кластеров или же можно обнаружить, что они регулируют экспрессию неимпринтированных генов в геноме млекопитающих. 5. Направления будущих исследований Геномный импринтинг вызвал острый интерес со времени открытия первых импринтированных генов у млекопи- тающих в 1991 году. Некоторые вопросы все еще ожидают окончательных ответов, в особенности те из них, которые касаются того, почему среди позвоночных только мле- копитающие используют импринтированные гены для регуляции эмбрионального и неонатального роста Это контрастирует со значительным прогрессом на протя- жении последних 15 лет по выяснению эпигенетических механизмов, контролирующих импринтированную экс- прессию у млекопитающих. Исходя из этой информации, мы думаем, что понимаем общие принципы того, как механизм импринтинга действует в кластерах импринти- рованных генов, хотя все детали этого все еще неясны. На этом этапе мы знаем, что геномный импринтинг использует нормальные эпигенетические механизмы [machinery] клетки для регуляции специфичной в отно- шении родителя экспрессии и что все приводится в дей- ствие путем ограничения этой машинерии в гамете толь- ко одной родительской аллелью. Мы знаем, что имеется общее сходство в механизме, контролирующем имприн- тированную экспрессию разных кластеров генов, но мы все еще не понимаем, сколько вариантов этого механиз- ма существует в геноме млекопитающих. В будущем мы очень хотели бы знать, в какой степе- ни неимпринтированные гены контролируются эпиге- нетическими механизмами, описанными для кластеров импринтированных генов. Наконец, нам хотелось бы знать, можем ли мы переносить эти знания на человека для целей терапии; например, индуцируя реэкспрессию «молчащих» генов иРНКу пациентов с синдромом Пра- дера — Вили и Энгельмана, обнаруживающих дефекты поведения и роста, благодаря делеции хромосомы, не- сущей экспрессируемые аллели импринтированных генов иРНК (Jiang et al., 2004). Понимание путей, ко- торыми клетка контролирует эпигенетическую инфор- мацию, приобретает все более важное значение в свете осознания того, что эпигенетическая регуляция может быть нарушена и при раковых заболеваниях (глава 24), при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (глава 22) и в процессах старения (Egger et al., 2004). Мы ожидаем, что лучшее понимание геном- ного импринтинга и далее послужит важной моделью для исследования того, как геном млекопитающих ис- пользует эпигенетические механизмы для регуляции экспрессии генов. Благодарности Мы благодарны бывшим и нынешним сотрудникам ла- бораторий Барлоу и Бартоломеи (Barlow and Bartolomei) за обсуждение представленных здесь идей Мы приносим извинения за то, что ограничения числа ссылок не по- зволили процитировать все оригинальные данные. На- конец, мы очень благодарны Mane-Laure Caparros, Anne Ferguson-Smith, Thomas Jenuwein, Davor Solter и Shirley Tilghman за их замечания к рукописи. Литература Amequera Е, 2003. Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell. Mol. Life Sci. 60: 1647-1658. Barlow D.R, 1993. Methylation and imprinting: From host defense to gene regulation? Science 260: 309-310. Barlow D.R, Stoger R., Herrmann B.G., Saito K., and Schweifer N., 1991. The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is im- printed and closely linked to the Tme locus. Nature 349: 84-87. Bartolomei M.S., Zemel S., and Tilghman S.M., 1991. Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature 351: 153-155. Bartolomei M.S., Webber A.L., Brunkow M.E., and Tilghman S.M., 1993. Epigenetic mechanisms underlying the imprinting of the mouse H19 gene. Genes Dev. T. 1663-1673. Barton S.C., Surani M.A., and Norris M.L., 1984. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature 311: 374-376. Bell A.C. and Felsenfeld G., 2000. Methylation of a CTCF-depen- dent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature №. 482-485. Bielinska B., Blaydes S.M., Buiting K., Yang T, Krajewska-Walasek M., Horsthemke B., and Brannan C.I., 2000. De novo deletions of SNRPN exon 1 in early human and mouse embryos result in a paternal to maternal imprint switch. Nat. Genet. 25: 74-78. Bourc’his D. and Bestor TH., 2006. Origins of extreme sexual dimor- phism in genomic imprinting. Cytogenet. Genome Res. 113: 36-40. Brannan C.I., Dees E.C., Ingram R.S., and Tilghman S.M., 1990. The product of the H19 gene may function as an RNA. Mol. Cell Biol. 10: 28-36. Cattanach B.M. and Kirk M., 1985. Differential activity of mater- nally and paternally derived chromosome regions in mice Nature 315:496-498. Chaillet J. R., Bader D. S., and Leder P., 1995. Regulation of genomic imprinting by gametic and embryonic processes. Genes Dev. 9: 1177-1187. Chandra H.S. and Nanjundiah V., 1990. The evolution of genomic imprinting. Dev. Suppl., 1990:47-53. Constancia M., Dean W., Lopes S., Moore T, Kelsey G., and Reik W., 2000. Deletion of a silencer element in Igf2 results in loss of imprinting independent of Hl9. Nat. Genet. 26:, 203-206. Cooper D.W., VandeBerg J.L., Sharman G.B., and Poole W.E., 1971. Phosphoglycerate kinase polymorphism in kangaroos provides further evidence for paternal X inactivation. Nat New Biol. 230: 155-157. Crouse H.V., Brown A., and Mumford B.C., 1971 Chromosome inheritance and the problem of chromosome “imprinting” in Sciara (Sciaridae, Diptera). Chromosoma 34: 324-398. Davis E., Caiment E., TordoirX., Cavaille J., Ferguson-Smith A., CockettN., Georges M., and Charlier C., 2005. RNAi-mediated allelic /^^-interaction at the imprinted Rtll/Pegll locus. Curr. Biol. 15: 743-739. DeChiaraT.M., Robertson E.J., and Efstratiadis A., 1991. Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell 64: 849-859.
Глава 19. Геномный импринтинг у млекопитающих Egger G., Liang G., Aparicio A., and Jones P.A., 2004. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457-463. Fedoriw A.M., Stein P., Svoboda P., Schultz R.M., and Bartolomei M.S., 2004. Transgenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting. Science 303: 238-240. Ferguson-Smith A.C., Sasaki H., Cattanach B.M., and Suram M.A., 1993. Parental-origin-specific epigenetic modification of the mouse H19 gene. Nature 362: 751-755. Ferguson-Smith A.C.. Cattanach B.M., Barton S.C.. Beechey C.V. and Surani M.A., 1991. Embryological and molecular investiga- tions of parental imprinting on mouse chromosome 7. Nature 351: 667-670. Fitzpatrick G.V, Soloway P.D., and Higgins M.J., 2002. Regional loss of imprinting and growth deficiency in mice with a targeted deletion tfKvDMRl. Nat. Genet. 32: 426-431. Goll M.G. and BestorT.H., 2005. Eukaryotic cytosine methyltrans- ferases. Annu. Rev. Biochem. 74: 481-514. Hark A.T., Schoenherr C.J.. Katz D.J., Ingram R.S.. Levorse J.M., and Tilghman S.M., 2000. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19 Igf 2 locus. Nature 405: 486-489. Haussecker D. and Proudfoot N.J., 2005. Dicer-dependent turnover of intergenic transcripts from the human y-globin gene cluster. Mol Cell Biol. 25: 9724-9733. Hoppe PC. and Illmensee K., 1982. Full-term development after transplantation of parthenogenetic embryonic nuclei imo fertil- ized mouse eggs. Proc. Natl. Acad. Sci., 19:. 1912-1916. Hurst L.D., McVean C, and Moore T, 1996. Imprinted genes have few and small introns. Nat. Genet. 12: 234-237. Jiang Y.H., Bressler J., and Beaudet A.L., 2004. Epigenetics and hu- man disease. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 5: 479—510. Johnson D.R., 1974. Hairpin-tail: A case of post-reductional gene action in the mouse egg. Genetics 76: 795-805. Kazazian H.H., Jr., 2004. Mobile elements: Drivers of genome evolu- tion. Science 303: 1626-1632. Kim TH., Barrera L.O., Zheng M., Qu C., Singer M.A.. Richmond T.A., Wu Y., Green R.D., and Ren B., 2005. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature 436: 876-880. Kono T.. Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo J.S., and Ogawa H., 2004. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood. Nature 428: 860-864. Landers M., Bancescu D.L., Le Meur E., Rougeulle C., Glatt-Deeley H., Brannan C., Muscatelli F. and Lalande M., 2004. Regula- tion of the large (-1000 kb) imprinted murine Ube3a antisense transcript by alternative exons upstream of Snurf/Snrpn. Nucleic Acids Res. 32: 3480-3492. Lewis A., Mitsuya K., Umlauf D., Smith P, Dean W, Walter J., Higgins M., Feil R. and Reik W, 2004. Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation. Nat. Genet. 36:1291-1295. Lin M.S., Zhang A., and Fujimoto A., 1995. Asynchronous DNA replication between 15ql 1.2ql 2 homologs: Cytogenetic evidence for maternal imprinting and delayed replication. Hum. Genet. 96:572-576. Lin S.P., Youngson N., Takada S., Seitz H., Reik W, Paulsen M., Cavaille J , and Ferguson-Smith A.C., 2003. Asymmetric regula- tion of imprinting on the maternal and paternal chromosomes at the Dlkl-Gtl2 imprinted cluster on mouse chromosome 12. Nat. Genet. 35: 97-102. Liu J., Litman D., Rosenberg M.J., Yu S., Biesecker L.G., and Weinstein L.S., 2000. A GNAS1 imprinting defect in pseudohy- poparathyroidism type IB. J. Clin. Invest. 106: 1167-1174. Lyle R., Watanabe D., te Vruchte D., Lerchner W, Smrzka O.W., Wutz A., Schageman J., HahnerL., Davies C., and Barlow D.R, 2000. The imprinted antisense RNA at the Igf2r locus overlaps but does not imprint Masi. Nat. Genet. 25:, 19-21 Mager J., Montgomery N.D., de Villena F.P.. and Magnuson T. 2003. Genome imprinting regulated by the mouse Polycomb group protein Eed. Nat. Genet. 33: 502-507. Mancini-DiNardo D.S., Levorse J,M., Ingram R.S., and Tilghman S.M., 2006. Elongation of the Kcnqotl transcript is required for genomic imprinting of neighboring genes. Genes Dev., 20: 1268-1282. Mattick J.S., 2005. The functional genomics of noncoding RNA. Stance 309: 1527-1528. McGrath J. and Solter D.. 1984a. Completion of mouse embryo- genesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 37:179-183. McGrath J. and Solter D., 1984b. Maternal Thp lethality in the mouse is a nuclear, not cytoplasmic, defect. Nature 308: 550-551. McLaren A., 1979. Maternal effects in development: The fourth sym- posium of the British Society for Developmental Biology (ed. D.R. Newth and M. Balls). Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom. Mitsuya K., Meguro M.. Lee M.P, Katoh M., Schulz T.C.. Kugoh H., Yoshida M.A., Niikawa N., Feinberg A.P, and Oshimura M., 1999. LIT1, an imprinted antisense RNA in the human KvLQTl locus identified by screening for differentially expressed transcripts using monochromosomal hybrids. Hum. Mol. Genet. 8: 1209-1217. Moore T. and Haig D., 1991. Genomic imprinting in mammalian development: A parental tug-of-war. Trends Genet. 7: 45-49. Moore T, Constancia M., Zubair M., Bailleul B., Feil R., Sasaki H., and ReikW. 1997. Multiple imprinted sense and antisense transcripts, differential methylation and tandem repeats in a putative imprinting control region upstream of mouse Igf2. Proc Natl. Acad. Sci. 94: 12509-12514. Neumann B., Kubicka P, and Barlow D.P, 1995. Characteristics of imprinted genes. Nat. Genet. 9: 12-13. O’Neill M.J., 2005. The influence of non-coding RNAs on allele- specific gene expression in mammals. Hum. Mol. Genet. 14: R113-120 Rabinowicz P.D., Palmer L.E., May B.P.. Hemann M.T.. Lowe S.W.. McCombie W.R., and Martienssen R.A., 2003. Genes and transposons are differentially methylated in plants, but not in mammals. Genome Res. 13:2658-2664. Regha K.. Latos P.A., and Spahn L., 2006. The imprinted mouse Igf2r/Air cluster—A model maternal imprinting system. Cytogenet. Genome Res. 113: 165-177. Reik W, 1989. Genomic imprinting and genetic disorders in man Trends Genet 5: 331-336. Reik W. and Lewis A.. 2005. Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals. Nat. Rev. Genet. 6: 403-410. ReikW, Howlett S.K., and Surani M.A., 1990. Imprinting by DNA methylation: From transgenes to endogenous gene sequences. Dev. Suppl., 1990: 99-106.
Sasaki E.L., Jones P.A., Chaillet J.R., Ferguson-Smith A.C., Barton S.C., Reik W., and Surani M.A., 1992. Parental imprinting: Potentially active chromatin of the repressed maternal allele of the mouse insulin-like growth factor II (Igf2) gene. Genes Dev. 6: 1843-1856. Schmidt J.V., Levorse J.M., and Tilghman S.M., 1999. Enhancer competition between H19 and Igf2 does not mediate their im- printing. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 9733-9738. Searle A.G. and Beechey C.V., 1978. Complementation studies with mouse translocations. Cytogenet. Cell Genet., 20: 282-303. Seitz E.L., Royo E.L., Lin S.P., Youngson N., Ferguson-Smith A.C., and Cavaille J., 2004. Imprinted small RNA genes. Biol. Chem. 385: 905-911. Shemer R., Birger Y., Riggs A.D., and Razin A., 1997. Structure of the imprinted mouse Snrpn gene and establishment of its parental-specific methylation pattern. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10267-10272. Sleutels E, Zwart R., and Barlow D.P., 2002. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes. Nature 415:810-813. Sleutels E, Tjon G., Ludwig T, and Barlow D.P., 2003. Imprinted silencing of Slc22a2 and Slc22a3 does not need transcriptional overlap between lgf2r and Air. EMBO J. 22: 3696-3704. Spahn L. and Barlow D.P., 2003. An ICE pattern crystallizes. Nat. Genet. 35: 11-12. Stoger R., Kubicka R, Liu C.G., Kafri T., Razin A., Cedar H., and Barlow D.P., 1993. Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal. Cell 73: 61-71. Surani M.A., Barton S.C., and Norris M.L., 1984. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting ot the genome during gametogenesis. Nature 308: 548-550. Takada S., Paulsen M., Tevendale M., Tsai C.E., Kelsey G., Catta- nach B.M., and Ferguson-Smith A.C., 2002. Epigenetic analysis of the Dlkl-Gtl2 imprinted domain on mouse chromosome 12: Implications for imprinting control from comparison with Igf2- H19. Hum. Mol. Genet. 11:77-86. Thorvaldsen J.L., Duran K.L., and Bartolomei M.S., 1998. Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of im- printed expression of H19 and lgf2. Genes Dev. 12: 3693-3702. Tierling S., Dalbert S., Schoppenhorst S., Tsai C.E., Oliger S., Ferguson-Smith A.C., Paulsen M., and Walter J., 2005. High- resolution map and imprinting analysis of the Gtl2-Dnchcl domain on mouse chromosome 12. Genomics. 87: 225-235. Varmuza S. and Mann M., 1994. Genomic imprinting — Defusing the ovarian time bomb. Trends Genet. 10: 118-123. Verona R.E., Mann M.R., and Bartolomei M.S., 2003. Genomic imprinting: Intricacies of epigenetic regulation in clusters. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 19: 237-259. Wilkins J.F. and Haig D., 2003. What good is genomic imprinting: The function of parent-specific gene expression. Nat. Rev. Genet. 4:359-368. Williamson CM., Turner M.D., Ball S.T, Nottingham W.T., Glenister R, Fray M., Tymowska-Lalanne Z., Plagge A., Powles-Glover N., Kelsey C., et al., 2006. Identification of an imprinting control region affecting the expression of all transcripts in the Gnas cluster. Nat. Genet. 38: 350-355. Wroe S.T, Kelsey C., Skinner J.A., Bodie D., Ball S.T, Beechey C.V., Peters J., and Williamson C.M., 2000. An imprinted transcript, antisense to Nesp, adds complexity to the cluster of imprinted genes at the mouse Gnas locus. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3342-3346. Wutz A., Smrzka O.W, Schweifer N., Schellander K., Wagner E.F., and Barlow D.P., 1997. Imprinted expression of the lgf2rggnc, depends on an intronic CpG island. Nature 389: 745-749. Yatsuki H., Joh K., Higashimoto K., Soejima H., Arai Y. Wang Y, Hatada E., Obata Y, Morisaki H., Zhang Z., et al., 2002. Do- main regulation of imprinting cluster in Kip2/Litl subdomain on mouse chromosome 7F4/F5: Large-scale DNA methylation analysis reveals that DMR-Litl is a putative imprinting control region. Genome Res. 12: 1860-1870. Zwart R., Sleutels E, Wutz A., Schinkel A.H., and Barlow D.P, 2001. Bidirectional action of the lgf2r imprint control element on upstream and downstream imprinted genes. Genes Dev. 15: 2361-2366. WWW-ресурсы Beechey C.V., Cattanach B.M., Blake A., and Peters J., 2005. MRC Mammalian Genetics Unit, Harwell, Oxfordshire. World Wide Web Site — Mouse Imprinting data and references (http://www. mgu. har. mrc. ac. uk/research/imprinting/). http://nocode. bioinfo. org.cn/ NONCODE — the database of non-coding RNA.
ГЛАВА 20 ЗАРОДЫШЕВАЯ ЛИНИЯ И ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ М. Azim Surani1 и Wolf Reik2 1 Wellcome Trust Cancer Research UR Gurdon Institute, University of Cambridge, Cambridge CB2 1QN, United Kingdom 2The Babraham Institute, Babraham Research Campus, Cambridge CB2 4AT, United Kingdom Содержание Общее резюме 1. Введение. Жизнь млекопитающих: генетиче- ская и эпигенетическая непрерывность 2. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие спецификацию половых клеток (от раннего эмбриона к половым клеткам) 2.1. Принципы развития линии половых клеток в различных группах животных 2.2. Раннее развитие линии половых клеток у млекопитающих 2.3. Роль Blimpl в спецификации PGC 2.4. Репрессия соматической программы в половых клетках — явление эволюционно консервативное 2.5. Регуляция эпигенетической программы у мышей после спецификации PCG, 2.6. Линия половых клеток и стволовые клет- ки — обратимый фенотип 2.7. Развитие половых клеток из плюрипотент- ных ES-клеток, 2.8. От примордиальных половых клеток к гаме- там 3. От ооцита к раннему эмбриону 3.1. Материнская наследственность и потенци- ально ассиметрическое деление? 3.2. Эпигенетические события при оплодотво- рении 3.3. От зиготы к бластоцисте 4. От плюрипотентных стволовых клеток к сомати- ческим клеткам и обратно к половым клеткам 4.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток 4.2. Эпигенетические свойства плюрипотент- ных стволовых клеток 4.3. Способность стволовых клеток к репро- граммированию 5. Перспективы Благодарности Литература
1. Введение. Жизнь млекопитающих: генетическая и эпигенетическая непрерывность ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Яйцо, или ооцит, представляет особую клетку, поскольку является единственной клеткой, потенциально способ- ной к развитию в целый организм. Вильям Харвей был первым, кто осознал это в 1651 году, когда заметил «Ех Ovo Omni» или «все происходит из яйца». Он считал, что яйцо, возможно, прогрессивно развивается в организм. Такая точка зрения оказалась важной для концепции эпигенеза или прогрессивного развития. Это. в конце концов, привело к преформатинисткому взгляду на развитие — теории, предполагающей, что индивидуумы развиваются за счет увеличения крошечных, полностью сформированных организмов (так называемых гомунку- лусов), которые находятся в половых клетках. Конрад Уоддингтон позднее отобразил эту концепцию в своей знаменитой иллюстрации как «эпигенетический ланд- шафт», символическое представление последовательного развития из яйца. Развитие целого организма из яйца без участия мужского начала у некоторых организмов возможно и называется партеногенезом. Однако у млекопитающих это не происходит благодаря явлению генетического импринтинга, когда оплодотворение яйца спермой является обязательным для развития взрослого организма. У большинства организмов развитие начинается по- сле слияния спермы с ооцитом и образования зиготы. Это дает не только нового индивидуума, но и, по край- ней мере, теоретически бесконечной серии генераций. Таким образом, половые клетки обеспечивают стойкую связь между всеми поколениями. Вновь оплодотворен- ное яйцо, или зигота, является уникальной клеткой, поскольку никакая другая клетка не имеет потенции к развитию полностью нового организма Это свойство называют тотипотентностью. Как передатчики гене- тической и эпигенетической информации следующим поколениям половые клетки являются уникальными. Для того чтобы реализовать этот потенциал, эти клет- ки обладают многими особыми свойствами. Ооцит об- ладает также удивительным свойством передавать то- типотентность ядрам соматических клеток, например нервным клеткам, при трансплантации их в яйцо, про- цесс, который называют клонированием или ядерным репрограммированием. В процессе развития зиготы происходит прогрессив- ное уменьшение тотипотентности вновь образующихся делящихся клеток. У млекопитающих продукты толь- ко очень ранних делений сохраняют тотипотентность, когда каждая клетка в отдельности в принципе способ- на генерировать целый организм. Ранним этапом развития эмбриона млекопитаю- щих является бластоциста (левый рисунок в заголовке), структура, у которой наружный слой клеток трофэк- тодермы в будущем формирует плаценту, а внутренняя группа клеток дает начало всему зародышу и. в конце концов, новому организму. Внутренние клетки будут, следовательно, дифференцироваться во все извест- ные 200 (или около того) специализированные сома- тические клетки, найденные у взрослых организмов, и поэтому относятся к плюрипотентным клеткам. Эти плюрипотентные клетки могут быть изолированы из ранних эмбрионов и при определенных условиях куль- тивирования могут постоянно расти in vitro, сохраняя способность дифференцироваться в любые специали- зированные клеточные типы, найденные у эмбрионов и взрослых организмов, включая спермин и яйцеклетки. Такие клетки были получены из эмбрионов человека и мыши и называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками или ES-клетками. Способность генерировать плюрипотентные стволовые клетки бы- стро теряется после имплантации >мбриона и начала программы эмбрионального развития Одними из наиболее ранних клеточных типов, за- кладывающимися во время эмбрионального развития, являются предшественники спермиев и яйцеклеток, на- зываемые примордиальными половыми клетками (PGC), видимые как зеленые клетки на правом рисунке заго- ловка. Это событие гарантирует, чтобы клетки, которые впоследствии дадут начало последующим поколениям развивающегося эмбриона, возникали первыми. При- мордиальные половые клетки являются высокоспециа- лизированными клетками, которые впоследствии раз- виваются в зрелые спермии или яйцеклетки во взрослом организме, таким образом, повторяя цикл, в то время как остальные клетки тела, в конце концов, погибают. PGC, таким образом, являются особыми клетками. Они также могут быть использованы для получения плюрипотентных клеток, называемых эмбриональными половыми клетками или EG. Стволовые клетки присутствуют и во взрослом ор- ганизме. Например, взрослые стволовые клетки об- разуют миллиарды различных клеток крови, которые происходят из стволовых клеток крови костного мозга. Наши клетки кожи или желудочно-кишечного тракта постоянно обновляются за счет дифференцировки со- ответствующих стволовых клеток. Взрослые стволовые клетки нормально способны генерировать клетки спе- циализированных тканей, а не различные клеточные типы, которые могут быть получены из плюрипотент- ных стволовых клеток. Очень важно понимать сходство и различия между плюрипотентными ES и взрослыми стволовыми клетками, включая эпигенетические меха- низмы, которые регулируют эти свойства Понимание эпигенетических свойств половых клеток и плюрипо- тентных стволовых клеток поможет нам выработать новые подходы для терапии, особенно для регенератив- ной медицины. 1. Введение. Жизнь млекопитающих: генетическая и эпигенетическая непрерывность Генетическая информация, закодированная в геноме индивидуума, закладывается в момент оплодотворения и не изменяется при развитии, за исключением мутаций и направленных изменений последовательностей, проис-
Глава 20. Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки ходящих, например, в иммунной системе. Яйцеклетка, или ооцит, женский вклад в оплодотворенную зиготу, вносит три типа наследственной информации в раз- вивающийся эмбрион (рис. 20.1). Она вносит половину генетический информации, дополняемой гаплоидным геномом спермия. Кроме того, поскольку она являет- ся основой развивающегося эмбриона, определенные ранние этапы развития контролируются материнской наследственностью через материнские РНК и белки. Наконец, есть эпигенетическая информация, содержа- щаяся в ооците, которая оказывает влияние на регуляцию генома в развитии. Эпигенетическая информация кодируется метили- рованием ДНК, модификацией гистонов, вариантами гистонов, негистоновыми белками хроматина и подвер- гается большим изменениям во время развития и диф- ференцировки. Главной чертой эпигенетических меток является их способность наследоваться от одного кле- точного поколения к другому и регулировать экспрессию генов. Считается, что эпигенетическая информация яв- ляется наиболее важной для детерминации и поддержа- ния определенной и стабильной программы экспрессии генов, которая определяет решение клеточной судьбы во время развития. Предполагается, что в тотипотент- ных и плюрипотентных клетках эпигенетические метки менее стабильны и более пластичны. Однако в процес- се развития клеточные потенции становятся все более и более ограниченными, а эпигенетические метки все бо- лее устойчивыми и ограничительными. Тотипотентные и плюрипотентные клетки, такие как половые клетки и эмбриональные стволовые клетки (рис. 20.16), обладают уникальной способностью репрограммировать геном и удалять эпигенетические метки. Эта способность, воз- можно, лежит в основе их пластичности в развитии. Взаимозависимость решений в развитии и эпиге- нетической генной регуляции устанавливает непре- рывность генетических и эпигенетических событий у млекопитающих. Это происходит потому, что события, происходящие в развитии, например, сигналинг меж- ду клетками, приводят к появлению специфической программы экспрессии генов, которые могут фикси- роваться эпигенетически. Кроме того, они могут уста- навливать новые эпигенетические события (например, метилирование или деметилирование импринтных генов в половых клетках). Установление или удаление эпигенетических меток, в свою очередь, определяет но- вую генетическую программу и, следовательно, влияет на то, как клетки индивидуума отвечают на команды во время развития. Возникающая непрерывность разви- тия и эпигенетических событий особенно поразитель- на, когда включает линии половых клеток, потому что это передается следующему поколению, а может быть и дальше. Действительно ли жизнь начинается с оплодотворе- ния? Действительно, новый индивидуум генетически может быть идентифицирован во время оплодотворе- ния яйцеклетки спермием. В этот момент гаплоидный набор хромосом матери соединяется с отцовским га- плоидным набором хромосом; образуется диплоидный геном потомка. Однако, в гаметах присутствует также эпигенетическая информация, которая будет передана потомству. Например, гены импринтинга несут мети- а б Ооциты млекопитающих 2 Генетическая информация ES EG Бластоциста Плюрипотент- соматические ные эпибласт- ные клетки Рис. 20.1. Яйцеклетка и зигота млекопитающих (а) Ооцит млекопитающих содержит материнские РНК и белки (материнская наследственность), которые могут определять ран- нее развитие, генетическую (материнские хромосомы) и эпигенетическую информацию (ДНК метилирование и хроматиновые метки), (б) Из зиготы получается бластоциста, внутренняя масса которой дает начало ES клеткам (в культуре), все соматические клетки и примордиальные половые клетки (PGC). из которых получаются EG клетки в культуре
1. Введение. Жизнь млекопитающих’ генетическая и эпигенетическая непрерывность лированные ДНК метки, которые отличают женские и мужские половые клетки и эти предсуществующие пат- терны наследуются потомством (глава 9). Эти эпигене- тические метки включаются в геномы половых клеток во время эмбрионального или раннего постнатального развития родителей. Программа эпигенетических модификаций зависит от генетической детерминации закладки и развития по- ловых клеток в ранних постимплантационных зароды- шах. Самые ранние предшественники половых клеток возникают из небольшой группы клеток в ранних пост- имплантационных эмбрионах в результате получения сигнальных молекул из другой части зародыша, экстра- эмбриональных линий, включая плаценту. Развитие по- ловых клеток после их выделения регулируется генети- чески, определяя их эпигенетическую программу таким образом, что генные продукты, необходимые в сомати- ческих клетках, в половых клетках репрессированы. С другой стороны, половые клетки нуждаются в специ- альных генетически управляемых функциях, например, таких как эпигенетическое репрограммирование, уста- новление импринтинга, хромосомная рекомбинация во время мейоза и редукционные деления для формирова- ния гаплоидных гамет. До начала развития половых клеток в эмбрионе происходит установление наиболее ранних линий. Плюрипотентные клетки эпибласта ранних постим- плантационных эмбрионов являются источником всех соматических клеток, а также примордиальных поло- вых клеток. Дифференцировка соматических тканей в три первичные клеточные линии (эктодерма, мезодер- ма и эндодерма) начинается в ответ на сигналы экстра- эмбриональных тканей. В это же время примордиаль- ные половые клетки также возникают из специального набора клеток, локализованных в проксимальной части эпибласта. Трофэктодерма (ТЕ) бластоцисты возникает раньше и является первым событием выделения линии в эмбрионах млекопитающих, которая в будущем дает плаценту (рис. 20.2). Из ICM развивается весь взрослый организм; плюрипотентные стволовые клетки (ES) про- исходят из клеток внутренней клеточной массы (ICM). Эта группа клеток возникает в развитии эмбриона на стадии морулы перед имплантацией, когда ICM клет- ки и слой трофэктодермы (ТЕ) разделены и формиру- ют бластоцисту, которая затем имплантируется в матку. Эпигенетическая регуляция экстраэмбриональных (ТЕ) и эмбриональных (ICM) линий существенно различа- ется. Например, общий уровень метилирования ДНК в экстраэмбриональных тканях ниже. Могут отличаться поддержание импринтинга и инактивация импринт- ной X хромосомы с импринтингом ICM и ТЕ-клетки, так же как примордиальные половые клетки (PGC) детерминируются генетической программой, включая транскрипционные факторы и плюрипотентные гены. Половые клетки Развитие эмбриона Материнский PN 5МеС НЗК9те2 НЗК27те 3 Отцовский PN 4,5МеС | 5МеС Т 5МеС Т НеК9те 2 Т НЗК27теЗ Рис. 20.2. Цикл эпигенетического репрограммирования в развитии млекопитающих Сразу после оплодотворения упаковка отцовского пронуклеуса (PN) в зиготе происходит без НЗК9те2 и НЗК27теЗ, в то время как материнский хроматин содержит эти метки. Отцовский PN быстро теряет также 5-метилцитозин (5МеС) в разных участках гена, в то время как в материнском геноме этого не происходит. Пассивная утрата 5МеС происходит во время преимплантацион- ного развития до стадии бластоцисты, когда клетки внутренней массы (ICM) начинают приобретать высокий уровень НЗК9те2 и НЗК27теЗ. Плацента, которая происходит в основном из трофэктодермы (ТЕ) бластоцисты, остается относительно гипометили- рованной. Примордиальные половые клетки (PGC) подвергаются деметилированию 5МеС и НЗК9те2 перед и после вхождения в гонады. De novo ДНК метилирование, включая родитель-специфический импринтинг, происходит на более поздних стадиях развития половых клеток
Глава 20. Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки Как эти различные генетические программы впервые возникают в ранних эмбрионах и какой вклад вносят в установление этих программ межклеточные взаимодей- ствия, эпигенетические модификации или цитоплазма- тические факторы яйцеклеток, пока неясно. В дополнение к эпигенетической информации, ко- торая переносится генами при импринтинге из гамет в эмбрион, в момент оплодотворения происходят другие важные эпигенетические события. В оплодотворенной зиготе геном спермия быстро теряет метилирование ДНК, а затем приобретает модификации ДНК и гисто- нов при последующих клеточных делениях (рис. 20.2). Материнский геном устойчив к зиготическому ДНК деметилированию и подвергается более растянутому деметилированию во время дробления ранних эмбрио- нов. Хотя эти в какой-то степени противоположные и разные эпигенетические программы приводят к общей потере эпигенетической информации в гаметах, веро- ятно, такое динамическое репрограммирование собы- тий взаимодействует с клеточными и генетическими процессами, которые определяют ранние процессы клеточного разделения в ICM и ТЕ линиях, соответ- ственно. Таким образом, эпигенетический жизненный цикл никогда не заканчивается и никогда не начи- нается, а постоянно взаимодействует с генетической программой, которая определяет развитие ICM и ТЕ, плюрипотентных стволовых клеток, половых клеток и, возможно, других линий. 2. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие спецификацию половых клеток (от раннего эмбриона к половым клеткам) 2.1. Принципы развития половых клеток в различных группах животных У животных спецификация половых клеток, сегрегация половых клеток от соматических клеток, является од- ним из наиболее ранних событий в развитии (Surani et al., 2004). Половые клетки приобретают тотипотентное состояние. Существует два основных способа закладки линии половых клеток, относящихся к преформации (этот термин от старого использования слова префор- мизм) и эпигенезу (Extravour and Akam, 2003). Первый включает наследование предсуществующих детерми- нант половых клеток специфическими клетками так, как это происходит у Caenorhabditis elegans и Drosophyla melanogaster (Leatherman and Jongens, 2003; Blackwell, 2004).В противоположность этому эпигенетический способ спецификации половых клеток является про- цессом, в котором потенциально эквивалентная группа плюрипотентных клеток приобретает способность стать половыми клетками в ответ на индуктивные сигналы, в то время как оставшиеся клетки становятся в будущем со- матическими клетками (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Такой механизм спецификации половых клеток действует у мышей и, возможно, у других млекопитаю- щих, включая человека. 2.2. Раннее развитие линии половых клеток у млекопитающих Примордиальные половые клетки у мышей впервые обнаруживаются на стадии Е7.5 (на стадии раннего за- чатка, ЕВ) как скопление примерно 40 клеток, которые являются основателями популяции линии половых кле- ток (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Эти клетки позитивны по щелочной фосфатазе и локализуются в пределах экстраэмбриональной мезодермы у основа- ния аллантоиса (рис. 20.4, правая панель). Клональный анализ показал, что проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5, стадии пре-полоски (PS) и первичной полоски (ES) дают начало PGC, а также тканям экс- траэмбриональной мезодермы (Lawson and Hage, 1994). PGC формируются под влиянием сигнальных молекул, продуцируемым экстраэмбриональной эктодермой и первичной эндодермой (рис. 20.3). Втр4 и Втр8Ь являются сигнальными молекулами, которые регули- руют компетентность и спецификацию половых клеток (Lawson etal., 1999). Чтобы понять генетическую программу специфи- кации PGC, из единичных клеток PGC-основателей и окружающих их соматических клеток была получена кДНК (Saitou et al., 2002). Для того чтобы различить PGC и соматические клетки был использован ряд мар- керов. При таком скрининге сначала был идентифи- цирован fragilis, новый белок семейства интерферон- Эмбрион i i i Сигналы (BMP4) WWWWW Плюрипотентные проксимальные клетки эпибласта Blimp 1 Fragilis * * > ' * * Е6.25 \ Stella Blimpl I Е7.25 PGC (-40 клеток) Рис. 20.3. Ранняя детерминация половых клеток у мыши Плюрипотентные проксимальные клетки эпибласта (синий) которые происходят из ICM (см. рис. 20.1 и 20.2) получают экстраклеточный сигнал В MP4 и становятся компетентными к развитию половых клеток (розовый). Активация Blimpl ком- митирует эти клетки к развитию в линию примордиальных половых клеток (красный), в то время как остальные клетки становятся соматическими
2. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие спецификацию половых клеток индуцируемых трансмембранных белков, и Stella, ядерно-цитоплазматический белок. Дальнейшие иссле- дования показали, чтоfragilis экспрессируется в прокси- мальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 (рис. 20.3), когда они становятся компетентными для образования как PGC, так и окружающих их клеток экстраэмбрио- нальной мезодермы Frag/7/л-позитивные клетки во вре- мя гаструляции перемещаются в задний проксималь- ный район. Впоследствии среди этой популяции клеток обнаруживается популяция основателей PGC, экспрес- сирующих Stella Одновременно в основателях PGC обнаруживается экспрессия плюрипотентных генов, включая Sox2 и Oct4, что дает основание полагать, что PGC проявляют плюрипотентность, которая утрачива- ется соседними соматическими клетками. Напротив, в основателях PGC ряд генов репрессированы, включая НахЫ и Haxal, экспрессия которых в этот период зна- чительно повышается в соседних соматических клет- ках. Репрессия Нах генов является частью механизма, который лежит в основе репрессии соматической судь- бы основателей PGC (Saitou et al., 2002). Основываясь на анализе выхода основателей ППК, очевидно, что так же как и у других организмов, ре- прессия соматической программы является основной особенностью специализации PGC у мышей (Seydoux and Strome. 1999; Blackwell, 2004; Surani et al., 2004). Для определения кандидатов генной репрессии были проанализированы гистон лизин метилтрансферазы (НКМТ) с целью выяснить, существуют ли различия в их экспрессии в PGC и соседних соматических клет- ках. Экспрессия некоторых их этих генов, G9a, Pfml, Setl и E7h2 была выявлена как в PGC-основателях, так и в соматических клетках. Однако один ген, Blimp/(В- lymphocyte maturation-induced protein 1), кодирующий белок, индуцирующий созревание лимфоцитов, экс- прессировался только в основателях PGC, но не в со- седних соматических клетках на стадии Е7 (Obinata et al., 2005). Blimp 1 является репрессором транскрипции, содержит SET/PR домен, пролин-богатый район, ко- торый может рекрутировать Groucho и HDAC26, пять С2Н2 цинковых пальца, формирующих комплекс с G9a и кислым концом (Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Gyori et al., 2004; Sciammas and Davis, 2004). Blimp I впервые был идентифицирован, благодаря его роли при специализации плазматических клеток после репрессии В-клеточной программы в клетках-предшественниках (Turner et al., 1994). Blimp 1 активно экспрессируется во время развития мыши (Chang et al., 2002). Детальный анализ Blimp 1 в ранних эмбрионах мыши привел к неожиданным открытиям. Было установлено, что Blimp 1 начинает экспрессироваться в проксималь- ных клетках эпибласта на стадии Е6.25 в начале гастру- ляции, сначала только в 4—6 клетках, которые находятся в непосредственном контакте с клетками экстраэмбри- ональной эктодермы (рис. 20.3) (Obinata et al., 2005). Экспрессия Blimp 1 обнаруживается на одном конце короткой оси в участке, в котором будет сформирован задний проксимальный район. Число прогрессивно увеличивается, так что на стадии средней полоски их число достигает примерно 20; они формируют плот- ное скопление в заднем проксимальном районе на ста- дии Е6.75. На стадии Е7.5, раннего зачатка (ES), число Blimp /-позитивных клеток увеличивается примерно до 40 (рис. 20.4). Эти клетки являются основателями PGC, экспрессируют классический PGC-маркер, щелочную фосфатазу, и в них начинается синтез Stella (рис. 20.3). Эксперименты по генетическому прослеживанию ли- нии подтвердили, что все Blimp /-позитивные клетки, происходящие из эпибласта на стадии Е6.25 и далее, действительно являются клетками-предшественниками линии PGC. Эти данные находятся в противоречии с ранее существовавшей гипотезой, основанной на кло- нальном анализе, согласно которой проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5 не являются линиями ограниченными, дающими только PGC, по- скольку клональные потомки индивидуальных клеток могут давать начало как соматическим, так и половым клеткам (Lawson and Hage, 1994; McLaren and Lawson, 2005). Это противоречие, вероятно, объясняется тем, что при клональном анализе маркированные клетки С. elegans D. melanogaster Полярные клетки (НЗК9 М musculus метилирование) Pie-1 pgs' Полярный гранулярный компонент Blimp! Рис. 20.4. Развитие половых клеток у разных видов животных У С. elegans специализация линии половых клеток (красный) начинается после первого деления зиготы с экспрессией Pie /, ко- торая приводит к транскрипционному покою Другая клетка (синий) дает начало соматическим клеткам. У D. melanogaster пред- шественниками половых клеток являются так называемые полюсные клетки, находящиеся на одной стороне зиготного синцития (многоядерного); транскрипционный покой в этих клетках зависит от локализации РНК гена Pgc У Mus musculus самые ранние предшественники половых клеток видны по экспрессии Blimp 1 в основании аллантоиса. Blimp! инициирует транскрипционный покой в этих клетках
Глава 20. Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки исходно могут быть Blimp /-негативными, но при по- следующих делениях возникают позитивные клетки, которые дают PGC-клетки, в то время как дочерняя клетка дает соматических потомков. Механизм, кото- рый регулирует увеличение Blimp /-позитивных клеток, пока неизвестен 2.3. Роль Blimp 1 в спецификации PGC Дальнейший анализ роли Blimp 1 в спецификации PGC помог пониманию механизмов, лежащих в осно- ве спецификации половых клеток у мышей. Утрата функции Blimp 1 показала, что она является решающим фактором PGC спецификации у мышей (Ohinata et al., 2005; Vincent et al., 2005). У Blimp 1 мутантов эмбрионы на стадии Е7.5 содержат аберрантный кластер почти PGC-подобных клеток, в то время как в контрольных эмбрионах PGC продолжают пролиферировать и на- чинают мигрировать из кластера. Более того, число аберрантных PGC-подобных клеток на стадии Е8.5 не увеличивается (Obinata et al., 2005). Одноклеточный анализ мутантных PGC-клеток по- казал отсутствие репрессии Нох генов. Следовательно, Blimp 1, вероятно, играет роль в репрессии соматиче- ской программы в основателях PGC. У мутантов на- блюдалось также нарушение в регуляции активации PGC специфических генов, таких как Stella и Nanos3, а также некоторых плюрипотентных генов, таких как Sox2. Эти данные свидетельствуют, что Blimp / играет важную роль как транскрипционный регулятор в про- цессе спецификации PGC и препятствует приобрете- нию соматической программы в этих клетках. Исследования на В-клетках показали, что Blimp 1 ин- дуцирует их дифференцировку в плазматические клет- ки, репрессируя основные молекулы, необходимые для их поддержания (Turner et al., 1994; Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Sciammas and davis, 2004; бо- лее детально, см. гл. 21). Это происходит через образо- вание Grouch и HDAC2 репрессорного комплекса (Ren et al., 1999). По-видимому, их «цинковые пальцы» так- же важны для образования комплекса с G9a (Gyory et al., 2004), являющейся НКМТ, которая необходима для НЗК9те2. Однако функционирует ли Blimp / в процес- се спецификации PGC через образование нового ком- плекса, по-прежнему неясно, поскольку нет данных о НКМТ активности домена Blimp /SET/PR. Blimp / является эволюционно консервативным ге- ном как у позвоночных, так и у беспозвоночных живот- ных и обладает различными функциями. Например, он играет роль в развитии разных линий у позвоночных, таких как рыба-зебра и шпорцевая лягушка (de Souza et al., 199; Roy and Ng, 2004; Hernandez-Lagunas et al., 2005). хотя и не является высоко специфичным для раз- вития половых клеток. Это означает, что этот ген при- обрел новую функцию в спецификации PGC у мышей и, возможно, у всех млекопитающих. Это предполага- ет. что для этого крайне консервативного гена должны были эволюционировать дополнительные контролиру- ющие элементы, чтобы регулировать его экспрессию в PGC-предшественниках и клетках-основателях. 2.4. Репрессия соматической программы I в половых клетках - явление, эволюционно консервативное Механизм спецификации половых клеток не являетсяв эволюционно консервативным, что становится очевид- ным при сравнении его у мышей и двух других хорошо! исследованных видов, D. melanogaster и С. elegans (Seydoux and Strome, 1999). Различия в механизмах спецификации] половых клеток сначала объясняли различиями в ранних I этапах развития у разных организмов, а также дополни-1 тельными сложностями, возникающими в результате! феномена геномного импринтинга у млекопитающих. Важно отметить, что репрессия программы экспрессии соматических генов во время спецификации половых клеток является общим феноменом для разных организ- мов, хотя их молекулярные механизмы могут различаться (Seydoux and Strome, 1999; Leatherman and Jongens, 2003; Saitou et al., 2003; Blackwell, 2004). У C. elegans первое клеточное деление зиготы является ассиметричным. В результате него появляется соматиче- ская клетка (АВ); вторая клетка (Р1) отделяется и дает начало линии половых клеток (рис. 20.4). Действитель- но, каждая из этих Pl, Р2 и РЗ клеток при делении дает соматические клетки; последние начинают транскрип- цию и дифференцировку. Клетки Р1—РЗ, которые дадут линию половых клеток, остаются транскрипционно не- активными. Транскрипционная активность подавляет- ся цинк-пальцевым белком PIE-L который ингибирует элонгацию транскрипции за счет конкуренции за фос- форилирование Ser-2 карбокситерминального домена (CTD) РНК-полимеразы II (pol II) (Van Doren et al., 1998; Seydoux and Strome, 1999: Zhang et al., 2003; детали см. гл. 10). Однако и соматические, и половые бластомеры имеют транскрипционно пермиссивное состояние хро- матина, что было показано высоким уровнем НЗК4те в геноме. Позднее, когда бластомер Р4 делится и образует две клетки половой линии, Z2 и Z3, репрессивное состо- яние хроматина становится выраженным, утрачивается НЗК4те и выявляется высокий уровень репрессивного H3K9me (Schaner et al., 2003). Таким образом, в процессе становления линии половых клеток у С. elegans хроматин из транскрипционно пермиссивного состояния меняет- ся в неактивное состояние. Становление линии половых клеток у D. melanogaster отличается от того, что наблюдается у мышей и червя. Предшественники линии половых клеток, которые называются полюсными клетками, выявляются до на- чала эмбрионального развития в оплодотворенном многоядерном яйце (рис. 20.4). Они тоже являются транскрипционно неактивными из-за отсутствия фос- форилирования pol II CTD, так же как это наблюдает- ся у С. elegans (Seydoux and Dunn, 1997; Van Doren et al., 1998; Schaner et al., 2003). Хотя транскрипционный сай- ленсинг связан также и с репрессивной модификацией хроматина с помощью НЗК9те, полярные клетки будут формировать только половые клетки. Таким образом, эти клетки подобны Z2 и Z3 клеткам С. elegans, которые предназначены только для образования линии половых клеток. Кроме того, транскрипционный сайленсинг в
2. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие спецификаиию половых клеток полярных клетках, по-видимому, регулируется геном полярного гранулярного компонента pgc (polar granule component), поскольку потеря pgc приводит к утрате ре- прессии, хотя полярные клетки по-прежнему обнару- живаются. В мутантных полярных клетках происходит фосфорилирование pol II CTD по Ser-2 (Deshpande et al., 2004; Martinho et al., 2004). Предполагается, что pgc может блокировать ключевой компонент, необходимый для фосфорилирования pol II CTD, ингибируя таким образом переход от комплекса преинициации к ком- плексу элонгации. АнализЧшецификации половых клеток во время раз- вития у мышей, мух и червей четко показывает, что ре- прессия транскрипции, которая, по-видимому, необхо- дима для подавления программы соматических клеток, выявлена во всех трех организмах, хотя механизмы, с помощью которых это достигается, существенно раз- личаются. Это, очевидно, объясняется различиями в ранних этапах развития разных видов 2.5. Регуляция эпигенетической программы у мышей после спецификации PGC Активное эпигенетическое программирование и репро- граммирование в линии половых клеток продолжается после спецификации PGC (Seki et al., 2005). Этот период развития отмечен стиранием некоторых репрессивных эпигенетических модификаций, что позволяет клеткам половой линии приобрести плюрипотентные характе- ристики, которые, возможно, являются предпосылкой последующей тотипотентности. Основными наблюдаемыми изменениями являются исчезновение НЗК9те2 на стадии Е8.0 и уменьшение уровня HP 1а на стадии Е 9.0 в эухроматиновых и пе- рицентрических гетерохроматиновых районах (Seki et al., 2005). Вместе с тем в PGC, начиная со стадии Е8 0 и далее, происходит уменьшение общего уровня метили- рования ДНК. В то время как происходит уменьшение НЗК9те2 и ДНК метилирования, наблюдается прогрес- сивное увеличение НЗК27теЗ, репрессивной модифи- кации, опосредованной Ezh-белком группы polycomb в, Ezh (рис. 20.5). Потеря ДНК метилирования сопро- вождается репрессией de novo ДНК-метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmt3b, а также временным уменьшением Dnmtl. Следует заметить, что потеря ДНК метилиро- вания НЗК9те2 также совпадает с возобновлением экспрессии гена Nanog, который является ключевым геном, связанным с плюрипотентностью (Yamaguchi et aL, 2005). Nanog впервые экспрессируется во внутрен- них клетках на стадии поздней морулы и в клетках вну- тренней массы бластоцисты. Однако экспрессия этого гена быстро уменьшается после имплантации и возоб- новляется только после спецификации PGC. Вместе с экспрессией других плюрипотентных генов, включая Oct4, Sox2 и Esgl, это показывает, что половые клетки приобретают плюрипотентные свойства (рис. 20.5). Дополнительные события интенсивного эпигене- тического программирования происходят после по- падания PGC в развивающиеся гонады (Surani et al., 2004). Во-первых, происходит увеличение метилиро- вания НЗК4 и ацетилирования НЗК9, что является характерным для пермиссивного состояния хромати- на, исключающего НЗК9те. Кроме того, происходит повсеместное геномное деметилирование ДНК (рис. 20.5), включающее стирание родительских импринтов и метилирования в единичных копиях генов В женских эмбрионах в это время происходит реактивация неак- тивной Х-хромосомы. Хотя существует эффективный механизм стирания «приобретенных» эпигенетических модификаций, не все эпигенетические метки полностью удаляются во время развития половых клеток. Например, метили- рование ДНК семейства транспозонов IAP репрограм- мируется только частично (Lane et al., 2003). Неполное удаление эпигенетических меток, очевидно, может привести к эпигенетическому наследованию через ли- нию половых клеток. И этому имеется ряд примеров у млекопитающих (Chong and Whitelaw, 2004) Чтобы по- нять, насколько широко этот феномен распространен и сколько генов могут быть в него вовлечены, нужны дальнейшие исследования. Эпибласт Рис. 20.5. Ранние эпигенетические события во время спецификации половых клеток Экспрессия Blimpl в потомках эпибластных клеток приводит к подавлению экспрессии соматической генной программы (красный). За этим следует экспрессия Stella, Nanog м Esgl, увеличение H3K27me3, H3K4me3 и H3K9ac, утрата H3K9me2 и 5МеС Примор- диальные половые клетки входят в гонады после чего происходит дальнейшее эпигенетическое репрограммирование
Глава 20. Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки 2.6. Линия половых клеток и стволовые клетки - обратимый фенотип Половые и ICM-клетки являются теми клетками, из которых происходят плюрипотентные клетки в культуре. При культивировании в присутствии FGF2 PGC под- вергаются изменениям и становятся плюрипотентными эмбриональными половыми (EG) клетками (Matsui et aL, 1992; Resnick etaL, 1992). Они во многих отношениях сходны с плюрипотентными ES-клетками, за исключе- нием того, что в EG-клетках в процессе их получения происходит интенсивное стирание родительских им- принтов (Tada et aL, 1998). Поскольку PGC проявляют свойства плюрипотент- ности, можно предположить, что существуют меха- низмы, позволяющие PGC сохранять специфические характеристики разных линий Каким образом это до- стигается, пока неясно. Возможно, что функция Blimp 1 сохраняется после PGC спецификации для ее гарантии. Предполагается, что при получении EG-клеток это ограничение ослабляется и PGC приобретают явные плюрипотентные свойства, в том числе способность дифференцироваться в разные клеточные типы, что редко происходит с половыми клетками in vivo. Следует заметить, что получение EG становится прогрессивно менее эффективным при использовании PGC со ста- дий Е11.5 и Е12.5, что также свидетельствует о том, что свойства этих клеток изменяются со стадии Е11.5, ког- да они начинают дифференцироваться в дефинитивные мужские и женские половые клетки. 2.7. Развитие половых клеток из плюрипотентных ES клеток Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из бластоцист, могут дифференцироваться во все типы соматических тканей, включая половые клетки (рис. 20.7). Большие усилия прилагаются для эффективного получения из ES-клеток в культуре разных тканей. Не- давно было показано, что из культивируемых ES-клеток можно получить PGC и, возможно, спермий- и ооцит- под обные структуры (Hubner et aL, 2003; Toyooka et aL, 2003; Geijsen et aL, 2004). Следовательно, с углублением знаний о генетической программе спецификации PGC и гамет механизм спецификации половых клеток может быть изучен in vitro. Это, возможно, позволит создать модельную систему для изучения эпигенетического репрограммирования в этой линии клеток. Такой под- ход, в конечном итоге, поможет пониманию того, что происходит с линией половых клеток у человека Более того, если станет возможной направленная дифферен- цировка культивируемых ES-клеток человека в ооциты, их можно будет использовать для «терапевтического» клонирования, и, таким образом, отпадет необходимость в донорских ооцитах, которые трудно получать. Эти ооциты могут быть использованы для трансплантации ядер соматических клеток и получения бластоцист, а за- тем ES-клеток. Ядра соматических клеток, перенесенные в ооциты, подвергаются репрограммированию в тоти- потентное состояние (подробно о трансплантации ядер и репрограммировании см. главу 22). Такая процедура, вероятно, окажет огромное влияние на биомедицину, так как позволит создавать «персонифицированные» ES-клетки от больных. Кроме того, она позволит иметь большое разнообразие ES-клеток от больных со спец- ифическими заболеваниями Такие ES-клетки, в свою очередь, открывают возможность исследовать причины, лежащие в основе заболеваний человека. Они могут быть использованы, например, для тестирования терапевти- ческих препаратов, купирующих болезнь. Использование человеческих эмбрионов и ES-клеток в исследованиях и терапии поднимает много этических проблем. В различных странах существуют законода- тельства и руководства для исследований в этой области. Если получение жизнеспособных гамет из ES-клеток че- ловека станет возможным и они будут способны к опло- дотворению и дальнейшему развитию, это поднимет новые этические вопросы о том, может ли такой подход быть использован в медицине и каким образом. 2.8. От примордиальных половых клеток к гаметам Следующим этапом в развитии линии половых клеток яв- ляется начало гаметогенеза и вступление половых клеток в мейоз. Соматическое окружение в гонадах регулирует время этого события. У самок половые клетки останав- ливаются в мейотической профазе, в то время как у сам- цов половые клетки останавливаются в митозе. Многие сигналы окружающей среды диктуют, войдут ли половые клетки в мейоз или нет. Недавно был идентифицирован новый ген Meisetz и было показано, что он играет важную роль в инициации мейоза (Hayasshi et aL, 2005). Этот ген также содержит SET/PR и многочисленные «цинковые пальцы», которые, как было установлено, каталитически активны по отношению к НЗК4те. Экспрессия Meisetz специфична для половых клеток и обнаруживается во время входа их в мейотическую профазу у самок на стадии Е13.5 и в постнатальных семенниках Мутация в гене Meisetz приводит к стерильности и самцов, и самок, что свидетельствует о его важной роли в половых клетках. В мутантных половых клетках наблюдается заметное нарушение в репарации двухнитевых разрывов ДНК и спаривании гомологичных хромосом во время мейоза. Эти исследования демонстрируют важную роль эпи- генетических механизмов в половых клетках во время мейоза. Обширные эпигенетические изменения продолжа- ются во время гаметогенеза и, в конце концов, сома- тические линкерные гистоны заменяются вариантами, специфичными для семенников (Kimmins and Sassone- Corsi, 2005), а затем происходит замена большинства гистонов на протамины. Исследования показали, что в репрессию генов и хромосомное спаривание вовле- чены Suv39 и НЗК9 метилтрансфераза. Кроме того, два белка, Suv39hln Suv39h2, имеющие SET-домен, имеют важное значение для мужских половых клеток, причем последний экспрессируется преимуществен- но в семеннике, накапливаясь в половом тельце. Му- тации в Suv39hln Suv39h2 приводят к стерильности,
3. От ооцитов к раннему эмбриону поскольку происходит остановка спемаююниальных клеток (Peters et al., 2001). В мужских половых клет- ках присутствует также хроматоидное тельце, об- лакоподобная цитоплазматическая структура. Она является цитоплазматической органеллой, специфич- ной для половых клеток, которая взаимодействует с ядром, содержит компактную мРНК и является РНК- процессинговым тельцем, содержащим белки Dicer и Argonaute и микроРНК. В самообновление стволовых клеток половой ли- нии вовлечены некодирующие РНК в сперматогенезе, роль которых, возможно, опосредована механизмом интерференции РНК (иРНК) и гистон метилтрансфе- разами (НМТазы). Сообщалось, что члены семейства Piwi/Argonaute (у мышей они называются Miwi) играют роль в явлении иРНК. Утрата Miwi-подобных белков (Mill) приводит к стерильности у мышей (Kuramochi- Miyagawa et al., 2004), вызывая высокий уровень транс- криптов ретротранспозонов IAP и Line 1 Однако напря- мую вовлечение Miwi-подобных белков в их репрессию показано не было. Недавние исследования продемонстрировали воз- можность получения плюрипотентных стволовых клеток из спематогониальных стволовых клеток се- менников новорожденных и даже взрослых животных (Kanatsu-Shinohara et al, 2004; Guan et al., 2006). Такие клетки можно постоянно поддерживать в культуре, но в отличие от ES-клеток они имеют родительский (ан- дрогенный) импринт. Эти клетки способны дифферен- цироваться в разные соматические клетки in vitro и in vivo и являются жизнеспособными половыми клетками in vivo. Такие клетки должны стать важным объектом для изучения разных аспектов сперматогенеза и роли эпигенетических механизмов, которые регулируют их свойства как стволовых клеток и дифференцировку в мужские половые гаметы Стирание импринтов в ранних половых клетках де- лает родительские хромосомы эпигенетически эквива- лентными, что происходит в первый и последний раз в жизни млекопитающих. Трансплантация таких «сво- бодных от импринтов» ядер непосредственно в ооциты приводит в развитию аберрантных эмбрионов, которые погибают на ранних эмбриональных стадиях, вероятно вследствие того, что из-за отсутствия соответствующих эпигенетических модификаций происходит наруше- ние экспрессии генов, которые в норме подвергаются импринтингу. Этот эксперимент также показывает, что импринты не могут приобретаться ядрами без имприн- тов при их трансплантации непосредственно в ооцит. ДНК метилирование импринтов начинается после рож- дения в процессе роста ооцитов из женских половых клеток. В мужских половых клетках это происходит на более поздних стадиях эмбриогенеза. В этом процессе важную роль играют de novo Dnmt3a метилтрансфераза и ее кофактор Dnm3L (детали см. в главе 19). Имприн- тинг является главным барьером партеногенетического развития у млекопитающих. Попытки манипулировать эпигенотипом женских гамет, возможно, позволят по- лучать у млекопитающих эмбрионы полностью мате- ринского происхождения. 3. От ооцитов к раннему эмбриону В предыдущих разделах мы рассмотрели, как зрелые спермии и ооциты приобретают различные специфи- ческие эпигенетические метки во время гаметогенеза. Некоторые из этих различий, такие как родительские импринты, точно поддерживаются в эмбрионах после оплодотворения. Многие другие репрограммируются, поскольку геном эмбрионов приобретает тотипотент- ность. Важно знать, какую роль играют эпигенетические метки, унаследованные от родительских гамет, на самых ранних этапах дифференцировки эмбрионов. Если вы начинаете жизнь с одной клетки (оплодотворенная зи- гота) с полным геномом, которая затем делится, как вы достигаете различий в генной экспрессии и программах развития в дочерних клетках? 3. 1. Материнская наследственность и потенциальное асимметричное распределение? У организмов (таких как дрозофила, шпорцевая лягушка, цыпленок), у которых яйцеклетка имеет большой размер, некоторые материнские белки и РНК располагаются в яйце ассиметрично Они на- следуются только некоторыми клеточными потом- ками, которые впоследствии имеют особую судьбу, в то время как другие потомки, не унаследовавшие эти детерминанты, развиваются по-другому (Huynh and St Johnston, 2004). Такая стратегия возможна для относительно больших яйцеклеток (таких, как у дрозофилы), но затруднительна для млекопитающих с более мелкими яйцеклетками. Однако программа развития может диктоваться не только размерами яйцеклеток, но, что более важно, необходимостью формировать бластоцисту у млекопитающих, которая должна имплантироваться и образовывать плаценту для поддержания эмбриона. С точки зрения развития, ICM можно считать эквивалентной ооциту дрозофи- лы, поскольку их онтогенетичекое разнообразие на начальных этапах развития регулируется сигналами из экстраэмбриональной соматической ткани. Хотя не- давно появились предположения, которые связывают симметрию оплодотворенной зиготы с симметрией бластоцисты и даже постимплантационных эмбрио- нов (Gardner et al., 1997; Weber et al., 1999), никаких детерминант дифференцировки, ассиметрично рас- положенных в яйцеклетке, у млекопитающих пока не найдено. Более того, эмбрионы млекопитающих обла- дают удивительной способностью «регулировать» раз- витие, т.е. если удалить или нарушить клетки, компен- саторный рост или клеточные движения позволяют поддерживать нормальное развитие эмбриона (Kelly, 1977). Тем не менее, небольшие различия в предрас- положенности индивидуальных клеток (бластомеров) развиваться в ICM и ТЕ линии, вероятно, существуют уже на четырехклеточной стадии (Fujimori et al., 2003; Piotrowska-Nitsche et al., 2005).
линия и плюрипотентные стволовые клетки 3.2. Эпигенетические события при оплодотворении Во время развития и дифференцировки клетки сомати- ческих линий приобретают специфическое и специали- зированное ДНК метилирование и модифицирование гистонов. Эти модификации, по-видимому, трудно стереть или обратить при пересадке соматических ядер в ооциты (глава 22). Эпигенетические метки в ооцитах и спермиях также специализированы, но они репрограммируются при оплодотворении таким образом, что геном эмбрио- на приобретает новую функцию, а именно становится тотипотентным (Reik et al., 2001; Surani, 2001). Известен ряд характеристик эпигенетического рисунка гамет и ге- нетического репрограммирования после оплодотворения (рис. 20.2). Геномы и спермиев, и ооцитов имеют высокий уровень метилирования ДНК. Как пример особого класса последовательностей можно привести семейство ретро- транспозонов, внутрицистерные А частицы (intracistemal A particles, IAP), число копий которых в мышином геноме составляет около 1000 и которые имеют высокий уровень метилирования и в ооцитах, и в спермиях (Lane et al., 2003). Однако имеются определенные последовательности, особенно дифференциально метилированные районы (differentially methylated regions, DMR) в импринтных генах, которые являются метилированными только в ооцитах или спермиях (глава 19). Геном ооцитов имеет высокий уровень модифика- ций гистонов, как активных (например, НЗК9 ацети- лирование, НЗК4 метилирование), так и репрессивных (НЗК9, НЗК27 метилирование) (Morgan et al., 2005). Перед оплодотворением геном ооцита транскрипци- онно неактивен. Однако в ооците содержатся транс- крипты и белки, необходимые для первых нескольких делений дробления, в том числе те, которые имеют важное значение для репрограммирования (рис. 20.1а). Геном спермия высоко специализирован, поскольку большинство гистонов во время сперматогенеза заме- нилось на протамины, способствующие, по-видимому, упаковке ДНК в компактную головку спермия (McLay and Clarke, 2003). В настоящее время неизвестно, какие модификации есть в оставшемся хроматине и где они раположены, что создает трудности для изучения этих немногочисленных районов хроматина. Вскоре после оплодотворения в геноме спермия происходит четко отрегулированное репрограммиро- вание. Протамины замещаются гистонами. Вероятно, будучи независимым от репликации (RI, replication independent), это состоит во включении гистонового варианта НЗ.З гистоновым шапероном HIRA (van der Heijden et al, 2005; см. гл 13). В то время в мужском про- нуклеусе происходит обширное ДНК метилирование, затрагивающее как однокопийные последовательно- сти, так и повторы, но не мужские метилированные им- принтные гены (Olek and Walter, 1997; Mayer et al., 200; Oswald et al., 2000; Dean et al., 2001; Santos et al., 2002; Lane et al., 2003). В мужском пронуклеусе перед репликацией ДНК НЗ и Н4 гистоны ацетилированы, НЗК4 метилирован; быстро появляются НЗК9те и H3K27mel (Атеу et al, 2002: Santos et al.. 2002: Lepikov and Walter, 2004). Одна- ко H3K9me2/3 и НЗК27те2/Зпоявляются только после репликации ДНК, по всей видимости, вместе с включе- нием корового гистона Н3.1 вместо НЗ.З (Santos et al., 2005). Во время первого митоза большинство проанали- зированных к настоящему времени гистоновых меток в женских и мужских хромосомах становятся очень схо- жими, по крайней мере, на низком уровне разрешения с использованием иммунофлуоресцентного окрашива- ния (Santos et al., 2005). Ферментативная активность, ответственная за ран- ние этапы репрограммирования, вероятно, уже при- сутствует в ооците в виде белков или молекул РНК, которые могут быстро транслироваться. Мы уже упо- минали HIRA, но после репликации ДНК участвует CAF-1, который необходим для включения зависимого от репликации (RD, replication dependent) Н3.1. Su (var) ферменты метилируют H3K9, a Ezh2 вместе с его ко- фактором Eed метилируют НЗК27 (Eehardt et al. 2003: Santos et al, 2005). Вероятно, существенное деметили- рование ДНК мужского генома вызывается процессом «активного деметилирования», для которого предложе- ны различные механизмы, однако определенного фер- мента (ферментов) пока не изолировано (Morgan et al, 2005). Возможным кандидатом для участия в механизме деметилирования является семейство ферментов Aid/ Apobec, способных дезаминировать 5-метилцитозин в ДНК, превратив его в тимидин. Возникающее T:G не- соответствие может репарироваться за счет механизма репарации с помощью эксцизии оснований (Morgan et al., 2004). У растений процесс деметилирования также включает эксцизионную репарацию, которая иници- ируется ДНК гликозидазой Demeter (Gerhing et al , 2006). Подобные деметилазы могут присутствовать и в цитоплазме ооцита при оплодотворении. Отсюда воз- никает вопрос, почему материнский геном не демети- лируется одновременно с отцовским? Материнский хроматин или пронуклеус должны обладать неким ме- ханизмом специфической протекции; колокализация метилированной ДНК в материнском пронуклеусе вме- сте с НЗК9те2 дает основание предполагать, что эта модификация гистона и есть кандидат для протекции (Arney et al., 2002; Santos et al., 2002, 2005). Хотя имеющиеся данные предполагают, главным образом, приобретение гистонами модификаций, а не их утрату на глобальном уровне в этот период, возмож- но, что метилирование гистонов по аргинину является более динамичным. Действительно, в ооцитах присут- ствует Padi4, кандидат на вырезание метилированных аргининов в гистонах с помошью «деаминирования» (Sacramento et al., 2004). Представляется, что основной результат быстрых изменений хроматина при оплодотворении заключает- ся в том, что на двухклеточной стадии отцовский геном становится схожим с материнским. Это исключает ме- тилирование ДНК, которое значительно отличается у двух геномов, в основном вследствие деметилирования генома спермиев. Кроме того, проведенный анализ не исключает, что на этой стадии устанавливается геноспе- цифические различия в модификации гистонов
4. От плюрипотентных клеток к соматическим клеткам и обратно к половым клеткам 3.3 От зиготы к бластоцисте Дальнейшее репрограммирование, в частности ДНК метилирование по всему геному, продолжается от двух- клеточной стадии через стадию дробления преимплан- тационного развития до достижения эмбрионом стадии бластоцисты (Monk et al. 1987; Howlett and Reik, 191; Rougier et al., 1998). Точная динамика модификаций ги- стонов у мышей пока не описана, однако метилирование ДНК постепенно уменьшается с каждым клеточным делением до стадии 16-клеточной морулы. Причина за- ключатся в том, что Dnmtl, метилтрансфераза, которая полуконсервативно поддерживает метилирование CpG динуклекотидов во время репликации ДНК, исключается из ядра (Carlson et al., 1992). Следовательно, при каждом делении теряется 50% всей геномной метилированной ДНК. Единственным, хорошо документированным ис- ключением из этого являются DMR в импринтных генах. Не ясно, поддерживается ли их метилирование в этот период неизвестной Dnmt или за счет небольшого коли- чества Dnmtl, способной попадать в ядро и специфиче- ски узнавать DMR. Примечательно, что на 8-клеточной стадии Dnmtl белок, по-видимому, появляется в ядре на один клеточный цикл. Если этот Dnmtl белок удалить (с помощью генетического элиминирования в ооците, который обеспечивает большую часть, если не целиком, этого белка, деления дробления), метилирование DMR, действительно, уменьшается на 50%, что согласуется с представлением о его необходимости для поддержания метилирования в течение только одного цикла реплика- ции (Howell et al., 2001). На стадии 8—16 клеток наружные клетки морулы уплощаются и становятся эпителиальными. Это явле- ние называют компактизацией и оно является первым внешним признаком дифференцировки эмбрионов млекопитающих. В течение последующих 2—3 делений в моруле происходит кавитация ( например, образуется полость) и бластоциста становится различимой по сво- ей внутренней массе (ICM) и наружной трофэктодер- ме (ТЕ). Клетки ICM формируют все линии эмбриона и плода, в то время как ТЕ клетки дают начало боль- шинству (но не всем) линиям плаценты (экстраэмбрио- нальные линии). Вскоре после этой стадии на поверх- ности ICM образуется еще один слой эпителиальных клеток, которые являются примитивной энтодермой, клетки которой тоже вносят вклад в развитие плацен- ты и желточного мешка, но не эмбриона. Известно не- сколько генетических детерминант распределения этих ранних событий: Oct4, Nanog и Sox2 важны для поддер- жания клеток ICM , в то время как Cdx2 необходим для детерминации или поддержания ТЕ клеток (Nichols et al.2003; Avilion et al., 2003; Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003; Niwa et al., 2005). В какой степени материн- ский белок (присутствующий в ооците) или эпигене- тическая регуляция этих генов могут вносить вклад в решение судьбы этих ранних клеток, пока не известно (Ferguson-Smith, 2001). Однако большинство эпигенетических программ- ных событий происходят как раз на этой стадии раз- вития. Клетки ICM приобретают высокий уровень метилирования ДНК, по крайней мере, на основании данных иммунофлуоресценции (красные клетки внутри бластоцисты на левом рисунке титульной страницы), который возникает de novo с помощью метилтрансфе- разы Dnmt3b (Santos et. al., 2002). Это сопровождается усилением метилирования НЗК9 и НЗК27 гистонов с помощью G9a, Eset и Ezh2, соответственно (Erhardt et al., 2003). Хотя метилирование ДНК de novo не являет- ся критичным для начального этапа становления ICM клеток, метилирование гистонов с помощьюEzh2 и Eset является необходимым: при нокауте любого из этих ге- нов развитие клеток ICM нарушается (O’Carroll et al., 2001; Dodge et al., 2004). В противоположность увеличению эпигенетических модификаций в ДНК ICM, в ДНК в ТЕ, так же, как и в большинстве клеточных линий поздней плаценты, в основном остается гипометилированной (Chapman et al., 1984; Santos et al., 2002). Считается, что клетки пла- центарного типа меньше нуждаются в эпигенетической стабильности, поскольку время их жизни более ограни- чено по сравнению с плодом, который развивается во взрослый организм. Помимо этих крупномасштабных эпигенетических событий по всему геному, на этих стадиях также про- исходит репрограммирование более локус-специфи- ческое. В женских эмбрионах XX на стадии дробления X хромосома, унаследованная от отца, инактивируется и в этом состоянии остается в экстраэмбриональных тка- нях, т.е. в ТЕ и плаценте (Huynh and Lee, 2003; Okamoto et al., 2005). Однако в ICM инактивированная X хромо- сома реактивируется, а затем после дифференцировки ICM в различные линии происходит случайная инак- тивация одной из X хромосом (Mak et al., 2004; более детально см. рис. 17.4). Механистически, импринтная X инактивация в преимплантационном эмбрионе связана с экспрессией некодирующей Xist РНК родительской хромосомы, чье «покрытие» хромосомы, как предпо- лагают, приводит к сайленсингу генов и установлению репрессивных эпигенетических модификаций (Heard, 2004). Во вновь образующихся клетках ICM Xist транс- крипция подавляется, репрессивные гистоновые моди- фикации, в конце концов, утрачиваются, и хромосома реактивируется (Mak et al, 2004; Okato et al., 2004). Вско- ре после этого происходит случайная X инактивация в клетках эпибласта. В следующем разделе мы покажем, что ES клетки «заморожены» на стадии реактивации X хромосомы и поэтому женские ES клетки содержат две активные X хромосомы. 4. От плюрипотентных клеток к соматическим клеткам и обратно к половым клеткам 4.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток В предыдущей главе мы выяснили, что в зиготе, а затем на стадии дробления и в бластоцисте происходят важные эпигенетические события, в результате чего эпигене-
линия и плюрипотентные стволовые клетки тический рисунок в ICM и ТЕ отличается Сейчас мы рассмотрим генетические и эпигенетические свойства культивируемых ранних стволовых клеток, полученных из бластоцисты и более поздних линий, таких как эмбри- ональные стволовые клетки (Smith, 2001), трофобластные стволовые клетки (TS) (Rossant, 2001), эндодермальные клетки (XEN) (Kunath et al., 2005), эмбриональные по- ловые клетки (EG) (Matsui et al, 1992). Общим для этих клеточных типов является то, что их можно изолировать из интактных эмбрионов и по- лучить из них культуру при определенных условиях культивирования. Такие культуры можно поддерживать длительное время и в них отсутствуют признаки ста- рения. С ними можно осуществлять генетические ма- нипуляции, затем вводить в живые эмбрионы, где они участвуют в развитии разных линий. Одним из наиболее важных открытий в эмбриологии млекопитающих в 1980-е годы было развитие методов получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ES) из ICM. ES-клетки, эксплантированные из мышиных бластоцист в культуры, могут поддерживаться длительное время, а затем снова вводиться с помощью микроинъекпий в бластоцисты. Они колонизируют все эмбриональные линии, формируя таким образом хи- меры (рис. 20.6; Evansand Kaufman, 1981; Martin, 1981). Наиболее удивительным оказалось то, что потомки ES клеток могут колонизировать линию половых клеток и давать нормальное потомство, которое целиком проис- ходит из генотипа ES-клеток. Это, а также возможность генетической манипуляции с геномом ES клеток с помо- щью гомологичной рекомбинации (что приводит к ген- ному нокауту) произвело революцию в генетике мыши и сделало мышь генетической моделью организма. ES-клетки имеют сходные свойства с клетками ICM/ эпибласта, однако имеются и существенные различия, что указывает на то, что они являются «синтетическим» клеточным типом, который, вероятно, не существует в нормальном эмбрионе (по-видимому, это относится и к другим плюрипотентным клеткам) (Smith, 2001). Бластоциста Середина беременности Рис. 20.6. Получение Es и Ts клеток из бластоцисты ES-клетки получают из клеток внутренней массы (ICM) и они могут поддерживаться в культуре без дифференцировки. Культивируемые клетки могут подвергаться генетическому ма- нипулированию. ES-клетки могут быть введены в бластоцисты и колонизировать все ткани эмбриона, в том числе линию поло- вых клеток, за исключением трофобластных клеток плаценты. TS-клетки получают из клеток трофэктодермы бластоцисты и при введении их в бластоцисты они вносят вклад в развитие клеток плацентарного типа Например, для самообновление мышиных ES-клеток требуется Lif/gpl30/Stat3 сигналинг, однако эмбрионы с мутацией этого сигнального пути развивают нормаль- ную ICM (Smith, 2001). Вероятно, при получении и поддержании ES из ICM происходят эпигенетические изменения, которые, возможно являются необходи- мыми. ICM клетки, растущие в культуре, довольно бы- стро теряют экспрессию Oct4 и только единственный штамм мышей, 129Sv, из которого относительно легко получить ES-клетки, сохраняет экспрессию Oct4 при культивировании (Buer et al., 2003). Сообщалось также об эпигенетических изменениях в импринтных генах в ES-клетках мыши и макаки; в мышиных клетках это может приводить к нарушению развития клеток в химе- рах (Dean et al., 1998; Humphreys et al., 2001; Fujimoto et al, 2005). 4.2. Эпигенетические свойства плюрипотентных стволовых клеток ES-клетки могут дифференцироваться в разные клеточ- ные линии (рис. 20.7). В какой мере эпигенетические ме- ханизмы поддерживают клетки в дифференцированном или недифференцированном состоянии? Очевидно, что существуют эпигеномные различия между недифферен- цированными ES-клетками, дифференцированными ES-клетками и соматическими клетками. Плюрипо- тентные клетки частично характеризуются гиперди- намической пластичностью хроматина (Meshorer et al, 2006). Делеция в ES-клетках Parp (poly-ADP ribosylase, пол и-АД Ф рибозилаза), которая участвует в контроле изменения гистоновых меток, приводит с низкой часто- той к трансдифференцировке в клетки трофобласта. Это предполагает, что гистоновые маркеры необходимы для поддержания идентичности ES-клеток (Hemberger et aL, 2003). Для этого необходимо также ДНК метилирование, поскольку сильная потеря ДНК метилирования приводит к частичному блокированию способности ES-клеток к дифференцировке, а те, которые дифференцируются, экспрессируют маркеры ткани трофэктодермы (Jackson et al., 2004). Поддержание плюрипотентности ES-клеток зави- сит от транскрипционных факторов Oct4, Nanog и Sox2 (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Дифференцировка ES клеток in vitro характеризуется подавлением транс- крипции плюрипотентных генов, которые репресси- рованы во всех соматических тканях. Для их молчания важное значение имеют эпигенетические механизмы: промотор Oct4, например, накапливает при диффе- ренцировке репрессивные гистоновые модификации и ДНК метилирование (Feldman et al., 2006). Утрата ДНК метилирования, например, в эмбрионах с нокаутом Dnmtl приводит к репрессии Oct4 при дифференциров- ке (Feldman et al., 2006). ES-клетки и их дифференцированные производные служат моделью эпигенетической регуляции инактива- ции X хромосомы. В женских ES-клетках и ICM Xist ген инактивирован и имеются две активные X хромосомы. При дифференцировке in vitro Xist на одной из X хро- мосом активируется, Xist РНК начинает «покрывать»
4. От плюрипотентных клеток к соматическим клеткам и обратно к половым клеткам Рис. 20.7. Дифференцировка ES-клеток в различные клеточные типы in vitro ES-клетки при определенных условиях культивирования мо- гут дифференцироваться в различные типы клеток, такие как нейроны, мышечные клетки и даже половые клетки (ооциты) На вставке показаны нейроглиальные клетки, полученные из ES-клеток в культуре Плюрипотентные клеточные линии получают так- же из примордиальных половых клеток (PGG) либо в период их миграции в эмбрионе (Е8-Е10.5), либо после того, как они оказываются в эмбриональных гонадах (El 1.5-Е13.5) (рис. 20.8) (Matsuietal, 1992). PGG на ста- дии развития Е8.5-12.5 подвергаются обширному эпи- генетическому репрограммированию, включая ДНК метилирование импринтных генов и других последова- тельностей в геноме (Haikova et al., 2002; Lee et al., 2002). Большинство EG линий подвергается стиранию мети- лирования ДНК в импринтных генах и других после- довательностях и это изменяет их потенциал развития, что обнаруживается при образовании химер (Tada et al., 1998). Пока неясно, имеются ли эпигенетические раз- личия между эндогенными PGG и культивируемыми in vitro EG клетками, подобные тем, которые, как предпо- лагается, сушествуют между ICM и ES-клетками. 4.3. Способность стволовых клеток к репрограммированию эту хромосому в положении cis, в результате чего на со- путствующей хромосоме происходит «молчание» генов, аккумуляция репрессивных гистоновых модификаций и метилирование ДНК (Heard, 2004). Другие плюрипотентные клетки тоже могут быть переведены в культуру, но их эпигенетические свойства охарактеризованы меньше, чем у ES-клеток. Однако из исследований эпигенетической инактивации X хромо- сомы известно, что в женских TS-клетках имеется от- цовская инактивированная X хромосома, содержащая репрессивные гистоновые метки (Hyynh and Lee, 2003). Женские XEN-клетки тоже имеют отцовскую X хромо- сому, которая инактивирована (Kunath et al., 2005). Постоянное поддержание плюрипотентности в культуре без признаков старения вполне возможно требует посто- янного эпигенетического репрограммирования стволовых клеток. То, что эти клетки имеют репрограммирующую активность, было показано в экспериментах по слиянию EG или ES-клеток с дифференцированными сомати- ческими клетками (Tada et al., 1997, 2001; Cowan et al., 2005). Было установлено, что в тетраплоидных клеточных линиях, получившихся в результате слияния, соматиче- ский эпигенотип был репрограммирован (рис. 20.9). При слиянии EG и соматических клеток соматический геном утрачивал ДНК метилирование импринтных генов, а Взрослый Рис. 20.8. Связь между развитием половых клеток и плюрипотентностью Ооцит и зигота, а также клетки морулы до определенной стадии являются тотипотентными (ооцит имеет ограничения, налагае- мые родительским импринтингом). Плюрипотентные клетки можно получить из клеток внутренней клеточной массы (ICM), примордиальных половых клеток (PGC) и сперматогониальных стволовых клеток (SS) новорожденных и взрослых семенников. Таким образом, существует тесная связь между половыми клетками в процессе развития и плюрипотентностью
Рис. 20.9. Плюрипотентные клетки обладают способностьюрепрограмми- ровать соматические клетки ES- или EG-клетки могут сливаться с соматическими клетками с об- разованием тетраплоидных клеток. Это приводит к эпигенетическому репрограммированию соматических ядер, в которых происходят измене- ния, например, в 5теС, НЗас, Н4ас и НЗК4те. Тетраплоидные ядра в результате слияния и репрограм- мирования приобретают плюрипо- тентный фенотип: при инъекции в бластоцисты они вносят вклад в раз- личные клеточные типы эмбриона также других последовательностей в геноме (Tada et aL, 1997). Напротив, при слиянии ES-клеток с соматически- ми ДНК метилирование импринтных генов сохранялось, но инактивированная X хромосома (в женских клетках) реактивировалась, промотор гена Oct4 становился ДНК деметилированным, что приводило к реэкспрессии Oct4 (Tada et aL, 2001; Cowan et aL, 2005; Surani, 2005) Факторы репрограммирования, влияющие на ДНК метилирование и модификацию гистонов в этих гибри- дах, пока неизвестны. Например, неясно, требует ли де- метилирование в EG или ES клетках активности ДНК деметилазы или репликация ДНК происходит в от- сутствие Dnmtl, в результате чего происходит пассив- ное деметилирование. Тем не менее, ES- и EG-клетки должны рассматриваться как важный источник для вы- деления и характеристики эпигенетических факторов репрограммирования. 5. Перспективы В ближайшие несколько лет мы станем свидетелями убедительных успехов в понимании генетических и эпигенетических факторов, которые определяют то- типотентность и плюрипотентность половых и ство- ловых клеток. Становятся доступными высокопроиз- водительные и чувствительные методы определения различных уровней эпигенетической информации. Будут идентифицированы факторы, которые регулируют эпигенетическую информацию, особенно те, которые требуются для репрограммирования эпигенетических меток в соматических клетках в те, которые обнаружены в плюрипотентных клетках. Необходимо также развивать методы селективного и безопасного манипулирования эпигенетического состояния in vivo. Плюрипотентные стволовые клетки представляют много удивительных возможностей как для фундамен- тальных исследований, так и для их потенциального применения в биомедицине. Что касается фундамен- тальных исследований, уникальность плюрипотентного состояния дает возможность проникнуть в механизмы, которые регулируют решение клеточной судьбы. Спо- собность дифференцироваться в разнообразные кле- точные типы дает возможность создавать заместитель- ные клетки для восстановления поврежденной ткани. Они могут быть также использованы для моделирова- ния болезней, чтобы исследовать, как развиваются раз- личные заболевания у человека, вызванные специфиче- скими мутациями или эпимутациями (т.е., мутациями, вызванными изменениями ДНК метилирования или хроматиновых матриц без изменений последователь- ностей ДНК), что в свою очередь может способствовать развитию новых лекарств для лечения и даже предот- вращения болезней. При использовании плюрипотентных стволовых клеток человека возникли критические этические про- блемы, которые обсуждаются широкой общественно- стью. Очень важно установить адекватные этические рамки и правила использования стволовых клеток для исследований и биомедицинского применения, по- скольку получение плюрипотентных стволовых клеток связано с использованием ранних эмбрионов. Более глубокое познание эпигенетических механиз- мов, которые регулируют плюрипотентность и репро- граммирование генома, когда-нибудь позволят получать плюрипотентные стволовые клетки непосредственно из взрослых стволовых клеток и даже из дифференци- рованных клеток без использования эмбрионов* Это один из аспектов, когда успехи в понимании эпигене- тических механизмов могут оказаться решающими для развития медицины в будущем. *Это предположение авторов, которое во время подготовки рукописи к печати, казалось довольно смелым, очень скоро стало реальностью. Клетки, обладающие всеми свойствами плюрипотентных стволовых клеток, были получены из диффе- ренцированных клеток человека (Science, 2007,318:1917—1920) и мыши (Cell, 2006, 126:663—676). {Прим, перев.)
Благодарности М.А.С. благодарит всех членов лаборатории, нынешних и в прошлом, за их работу, которая финансировалась Wellcome Trust, BBSRC, EU, DTI и CellCentric. B.P. благо- дарит всех своих коллег в лаборатории, особенно Wendy Dean, за их вклад в работу и идеи, обсуждаемые в этой главе. Работа в лаборатории В.Р. финансово поддержи- валась BBSRC, MRC, EU, DTI и CellCentric. Литература Arney K.L., Bao S., Bannister A. J., KouzaridesТ, and Surani М.А., 2002. Histone methylation defines epigenetic asymmetry in the mouse zygote. Int. J. Dev. Biol. 46: 317-320. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N., and Lovell-Badge R., 2003. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev. 17: 126- 140. Blackwell T.K., 2004. Germ cells: Finding programs of mass repres- sion. Curr. Biol. 14: R229-230. Boyer L.A., Lee T.L., Cole M.F., Johnstone S.E., Levine S.S., Zucker J.P., Guenther M.G., Kumar R.M., Murray H.L., Jenner R.G., et al., 2005. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 122: 947-956. BuehrM., Nichols J., Stenhouse E, Mountford P., GreenhalghC.J., Kantachuvesiri S., Brooker G., Mullins J., and Smith A.G., 2003. Rapid loss of Oct-4 and pluripotency in cultured rodent blasto- cysts and derivative cell lines. Biol. Reprod. 68: 222-229. Carlson L.L., Page A.W, and Bestor TH., 1992. Properties and lo- calization of DNA methyltransferase in preimplantation mouse embryos: Implications for genomic imprinting. Genes Dev. 6: 2536-2541. Chambers L., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Xweedie S., and Smith A., 2003. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 113: 643-655. Chang D.H., Cattoretti C., and Calame K.L., 2002. The dynamic expression pattern of В lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) during mouse embryonic development. Meeh. Dev. 117: 305-309. Chapman V. Forrester L., Sanford J.. Hastie N., and Rossant J., 1984. Cell lineage-specific undermethylation of mouse repetitive DNA. Nature 307: 284-286. Chong S. and Whitelaw E., 2004. Epigenetic germline inheritance. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 692-696. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., and Eggan K., 2005. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embry- onic stem cells. Science 309:1369-1373. Dean W. and Ferguson-Smith A., 2001. Genomic imprinting: Mother maintains methylation marks. Curr. Biol. 11: R527-530. Dean W, Santos E., Stojkovic M., Zakhartchenko V, Walter J., Wolf E., and Reik W, 2001. Conservation of methylation reprogram- ming in mammalian development: Aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 13734-13738. Dean W, Bowden L., Aitchison A., Klose J., Moore X., Meneses J.J., Reik W, and Feil R., 1998. Altered imprinted gene methylation and expression in completely ES cell-derived mouse fetuses: Association with aberrant phenotypes. Development 125: 2273- 2282. Deshpande G., Calhoun G., and Schedl P., 2004. Overlapping mechanisms function to establish transcriptional quiescence in the embryonic Drosophila germline. Development 131:1247- 1257. de Souza F.S., Gawantka V, Gomez A.R, Delius EL, Ang S.L., and Niehrs C., 1999. The zinc finger gene Xblimpl controls anterior endomesodermal cell fate in Spemann’s organizer. EMBO J. 18: 6062-6072. Dodge J.E., Kang Y.K., Beppu E.L., Lei E.L., and Li E., 2004. Histone H3-K9 methyltransferase ESET is essential for early develop- ment. Mol. Cell. Biol. 24: 2478-2486. Erhardt S., Su I.H., Schneider R., Barton S., Bannister A.J., Perez- Burgos L., Jenuwein T, Kouzarides X, Tarakhovsky A., and Surani M.A., 2003. Consequences of the depletion of zygotic and embryonic enhancer of zeste 2 during preimplantation mouse development Development 130: 4235-4248. Evans M.J: and Kaufman M.H., 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154-156. Extavour C.G. and Akam M., 2003. Mechanisms of germ cell specification across the metazoans: Epigenesis and preformation. Development 130: 5869-5884. Feldman N.T., Gerson A., Fang J., Li E., Zhang Y, Shinkai Y, Cedar H., and Bergman Y., 2006. G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. Nat. Cell. Biol. 8: 188-194. Fujimori T, Kurotaki Y, Miyazaki J., and Nabeshima Y, 2003. Analysis of cell lineage in two- and four-cell mouse embryos. Development 130: 5113-5122. Fujimoto A., Mitalipov S.M., Kuo H.C., and Wolf D.P., 2005. Aber- rant genomic imprinting in rhesus monkey ES cells. Stem Cells 24:595-603. Gardner R.L., 1985. Clonal analysis of early mammalian develop- ment. Philos. Trans. R. Soc. Land. В Biol. Sci. 312: 163-178. Gardner R.L., 1997. The early blastocyst is bilaterally symmetrical and its axis of symmetry is aligned with the animal-vegetal axis of the zygote in the mouse. Development 124: 289-301. Gehring M., Huh J.H., Hsieh T.F., Penterman J., Choi Y, Harada J.J., Goldberg R.B., and Fischer R.L., 2006. DEMETER DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell 124: 495-506. GeijsenN., HoroschakM., KimK., Gribnau J., Eggan K., and Daley G.Q., 2004. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature 427: 148-154. Guan K., Nayemia K., Maier L.S., Wagner S., Dressel R., Lee J.H., Nolte J., Wolf E., Li M., Engel W, and Hasenfuss G., 2006. Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature Mfr. 1199-1203. Gyory L, Wu J., FejerG., Seto E., and Wright K.L., 2004. PRDI-BF1 recruits the histone H3 methyltransferase G9a in transcriptional silencing. Nat. Immunol. 5: 299-308. Hajkova P, Erhardt S., Lane N., HaafX., El-Maarri O., Reik W, Walter J., and Surani M.A., 2002. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Meeh. Dev. 117: 15-23. Hayashi K., Yoshida K., and Matsui Y, 2005. A histone H3 meth- yltransferase controls epigenetic events required for meiotic prophase. Nature 438: 374-378. Heard E., 2004. Recent advances in X-chromosome inactivation. Curr. Opin. Cell Biol. 16: 247-255. Hemberger M., Nozaki T, Winterhager E., Yamamoto E.L., Nakagama H., Kamada N., Suzuki F.L., Ohta T, Ohki M.,
Глава 20 Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки Masutani М., and Cross J.C., 2003. Parpl-deficiency induces differentiation of ES cells into trophoblast derivatives. Dev. Biol. 257: 371-381. Hernandez-Lagunas L., Choi I.E, Kaji T, Simpson P., Hershey C., Zhou Y, Zon L., Mercola M., and Artinger К. B., 2005. Zebrafish narrow-minded disrupts the transcription factor prdml and is required for neural crest and sensory neuron specification. Dev. Biol. 278: 347-357. Howell C.Y., Bestor Т.Н., Ding E., Latham K.E., Mertineit C., Trasler J.M., and Chaillet J.R., 2001. Genomic imprinting disrupted by a maternal effect mutation in the Dnmtl gene. Cell 104: 829-838. Howlett S.K. and Reik W., 1991. Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development. Develop- ment 113: 119-127. Hubner K., Fuhrmann G., Christenson L.K., Kehler J., Reinbold R., De La Fuente R., Wood J., Strauss J.F., III, Boiani M., and Scholer H.R., 2003. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 300: 1251-1256. Humpherys D., Eggan K., Akutsu P.L., Hochedlinger K., Rideout W.M., III, Biniszkiewicz D., Yanagimachi R., and Jaenisch R., 2001. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science 293:95-97. Huynh J.R. and St Johnston D., 2004. The origin of asymmetry: Early polarisation of the Drosophila germline cyst and oocyte. Curr. Biol. 14: R438-449. Huynh K.D. and Lee J.T, 2003. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature 426: 857-862. Jackson M., Krassowska A., Gilbert N., Chevassut T, Forrester L., Ansell J., and Ramsahoye B., 2004. Severe global DNA hypom- ethylation blocks differentiation and induces histone hyperacety- lation in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 24: 8862-8871. Kanatsu-Shinohara M., Inoue K., Lee J., Yoshimoto M., Ogonuki N., Miki H., Baba S., Kato T, Kazuki Y, Toyokuni S., et al., 2004. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 119: 1001-1012. Kelly S.J., 1977. Studies of the developmental potential of 4- and 8-cell stage mouse blastomeres. J. Exp. Zool., 200: 365-376. Kimmins S. and Sassone-Corsi P, 2005. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature 434: 583-589 KunathT, Arnaud D., Uy G.D., Okamoto I., Chureau C., Yamanaka Y, Heard E., Gardner R.L., Avner P, and Rossant J., 2005. Im- printed X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts. Development 132: 1649-1661. Kuramochi-Miyagawa S., Kimura T. Ijiri T.W., Isobe T, Asada N., Fujita Y, Ikawa M., Iwai N., Okabe M., Deng W., et al., 2004. Mili, a mammalian member of piwi family gene, is essential for spermatogenesis. Development 131: 839-849. Lane N., Dean W., Erhardt S., Hajkova P, Surani A., Walter J., and Reik W, 2003. Resistance of IAPs to methylation reprogram- ming may provide a mechanism for epigenetic inheritance in the mouse. Genesis 35: 88-93. Lawson K.A. and Hage W.J., 1994. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. CIBA Found. Symp. 182: 68-84. Lawson K.A., DunnN.R., Roelen B.A., Zeinstra L.M., Davis A.M., Wright C.V, Korving J.R., and Hogan B.L., 1999. Bmp4 is re- quired for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev. 13: 424-436. Leatherman J.L. and Jongens T.A., 2003. Transcriptional silencing and translational control: Key features of early germline develop- ment. Bioessays 25: 326-335. Lee J., Inoue K., Ono R., Ogonuki N., Kohda T, Kaneko-Ishino T, Ogura A., and Ishino E, 2002. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5 pri- mordial germ cells. Development 129: 1807-1817. Lepikhov K. and Walter J., 2004. Differential dynamics of histone H3 methylation at positions K4 and K9 in the mouse zygote. BMC Dev. Biol. 4: 12. Loh Y.H., Wu Q., Chew J.L., Vega V.B., Zhang W, ChenX., Bourque G., George J., Leong B., Liu J., et al., 2006. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat. Genet. 38: 431-440. Mak W, Nesterova T.B., de Napoles M., Appanah R.. YamanakaS.. Otte A.P., and Brockdorff N., 2004. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science 303: 666-669. Martin G.R., 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarci- noma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 7634-7638. Martinho R.G., Kunwar PS., Casanova J., and Lehmann R., 2004. A noncoding RNA is required for the repression of RNApolII- dependent transcription in primordial germ cells. Curr. Biol. 14: 159-165. Matsui Y, Zsebo K., and Hogan B.L., 1992. Derivation of pluripo- tential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 70, 841-847. Mayer W, Niveleau A., Walter J., Fundele R., and Haaf T, 2000. Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403: 501-502. McLaren A., 2003. Primordial germ cells in the mouse. Dev. Biol. 262:1-15. McLaren A. and Lawson K.A., 2005. How is the mouse germ-cell lineage established? Differentiation 73: 435-437. McLay D.W and Clarke H.J., 2003. Remodelling the paternal chro- matin at fertilization in mammals. Reproduction 125: 625-633. Meshorer E., Yellajoshula D.. George E., Scambjer P.J., Brown D.T., and Misteli T, 2006. Hyperdynamic plasticity of chroma- tin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev. Cell. 10: 105-116. Mitsui K., Tokuzawa Y, Itoh H., Segawa K., Murakami M., Taka- hashi K., Maruyama M., Maeda M., and Yamanaka S., 2003. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 113: 631-642. Monk M., Boubelik M., and Lehnert S., 1987. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. De- velopment 99*. 371-382. Morgan H.D., Dean W, Coker H.A., ReikW, and Petersen-Mahrt S.K., 2004. Activation-induced cytidine deaminase deaminates 5-methylcytosine in DNA and is expressed in pluripotent tissues. Implications for epigenetic reprogramming. J. Biol. Chem. 279: 52353-52360. Morgan H.D., Santos E., Green K., Dean W, and ReikW, 2005. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum. Mol. Genet. 14: R47-58 Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers L, Scholer H., and Smith A., 1998. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 379-391.
Niwa H., Toyooka Y, Shimosato D., Strumpf D., Takahashi K., Yagi R., and Rossant J., 2005. Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell 123: 917-929. O’CarroU D., Erhardt S., Pagani M., Barton S.C., Surani M.A., and Jenuwein T, 2001. The polycomb-group gene Ezh2 is required for early mouse development. Mol. Cell. Biol. 21: 4330-4336. OhinataY, Payer B., O’Carroll D., Ancelin K., Ono Y, Sano M„ Barton S.C., ObukhanychT, Nussenzweig M., Tarakhovsky A., et al., 2005. Blimp 1 is a critical determinant of the germ cell lineage in mice. Nature 436:, 207-213. Okamoto I., Otte A.P, Allis C.D., Reinberg D., and Heard E., 2004. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development. Science 303: 644-649. Okamoto I., Arnaud D., Le Baccon P, Otte A.P., Disteche CM., Avner P, and Heard E., 2005. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature 438: 369-373. Olek A. and Walter J., 1997. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat. Genet. 17: 275-276. Oswald J., Engemann S., Lane N., Mayer W, Olek A., Fundele R., Dean W., Reik W., and Walter J., 2000. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr. Biol. 10:475-478. Peters A.H., O’Carroll D., Scherthan H., Mechtler K., Sauer S., Schofer C., Weipoltshammer K., Pagani M., Lachner M., Kohlmaier A., et al., 2001. Loss of the Suv39h histone methyl- transferases impairs mammalian heterochromatin and genome stability. Cell 107: 323-337. Piotrowska-Nitsche K., Perea-Gomez A., Haraguchi S., and Zer- nicka-Goetz M., 2005. Four-cell stage mouse blastomeres have different developmental properties. Development 132: 479-490. ReikW, Dean W, and Walter J., 2001. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science 293: 1089-1093. Ren B., Chee K.J., Kim TH., and Maniatis T, 1999. PRD1-BF1/ Blimp-1 repression is mediated by corepressors of the Groucho family of proteins. Genes Dev. 13: 125-137. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., and Donovan P.J., 1992. Long- term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature^. 550-551. Rossant J., 2001. Stem cells from the mammalian blastocyst. Stem Cells, 19: 477-482. Rougier N., Bourc’his D., Gomes D.M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., and Viegas-Pequignot E., 1998. Chromosome methyla- tion patterns during mammalian preimplantation development. Genes Dev. 12:2108-2113. Roy S. and Ng T, 2004. Blimp-1 specifies neural crest and sensory neu- ron progenitors in the zebrafish embryo. Curr. Biol. 14:1772-1777. Saitou M., Barton S.C., and Surani M.A., 2002. A molecular pro- gram for the specification of germ cell fate in mice. Nature 418: 293-300. Saitou M., Payer B., Lange U.C., Erhardt S., Barton S.C, and Surani M.A., 2003. Specification of germ cell fate in mice. Philos. Trans. R. Soc. bond. В Biol. Sci. 358: 1363-1370. Santos R., Hendrich B., Reik W, and Dean W, 2002. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Dev. Biol. 241: 172-182. Santos E., PetersA.H.. Otte A.P., ReikW, and Dean W, 2005. Dy- namic chromatin modifications characterise the first cell cycle in mouse embryos. Dev. Biol. 280: 225-236. Sarmento O.F., Digilio L.C., Wang Y, Perlin J., Herr J.C., Allis C.D., and Coonrod S.A., 2004. Dynamic alterations of specific histone modifications during early murine development. J. Cell Sci. 117: 4449-4459. Schaner C.E., Deshpande G., Schedl P.D., and Kelly W.G., 2003. A conserved chromatin architecture marks and maintains the restrict- ed germ cell lineage in worms and flies. Dev. Cell 5: 747-757. Sciammas R. and Davis M.M., 2004. Modular nature of Blimp-1 in the regulation of gene expression during В cell maturation. J. Immunol. 172: 5427-5440. Seki Y, Hayashi K., Itoh K., Mizugaki M., Saitou M., and Matsui Y, 2005. Extensive and orderly reprogramming of genome-wide chromatin modifications associated with specification and early development of germ cells in mice. Dev. Biol. 278: 440-458. Seydoux G. and Dunn M.A., 1997. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development 124: 2191-2201. Seydoux G. and Strome S., 1999. Launching the germline in Caenorhabditis elegans: Regulation of gene expression in early germ cells. Development 126: 3275-3283. Shaffer A.L., Lin K.I., Kuo T.C., Yu X., Hurt E.M., Rosenwald A., Giltnane J.M., Yang L., Zhao H., Calame K., and Staudt L.M., 2002. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature В cell gene expression program. Im- munity 17: 51-62. Shapiro-Shelef M., Lin K.I., McHeyzer-Williams L.J., Liao J., McHeyzer-Williams M.G., and Calame K., 2003. Blimp-1 is required for the formation of immunoglobulin secreting plasma cells and pre-plasma memory В cells. Immunity, 19: 607-620. Short R.V., 2000. Where do babies come from? Nature 403: 705. Smith A.G., 2001. Embryo-derived stem cells: Of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:435-462. Surani M.A., 2001. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. Nature 414: 122-128. Surani M.A., 2005. Nuclear reprogramming by human embryonic stem cells. Cell 122: 653-654. Surani M.A., Ancelin K., Hajkova P., Lange U.C., Payer B., Western P, and Saitou M., 2004. Mechanism of mouse germ cell specifi- cation: A genetic program regulating epigenetic reprogramming. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 1-9. Tada M., TadaT, Lefebvre L., Barton S.C., and Surani M.A., 1997. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of so- matic nucleus in hybrid cells. EMBO J. 16: 6510-6520. Tada M., Takahama Y, Abe K., Nakatsuji N., and Tada T, 2001. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol. 11: 1553-1558. Tada T, Tada M., Hilton K., Barton S.C., Sado T, Takagi N., and Surani M.A., 1998. Epigenotype switching of imprintable loci in embryonic germ cells. Dev. Genes Evol., 207: 551-561. Toyooka Y, Tsunekawa N., Akasu R., and Noce T, 2003. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 11457-11462 Turner C.A., Jr., Mack D.H., and Davis M.M., 1994. Blimp-1, a novel zinc finger-containing protein that can drive the matura- tion of В lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells. Cell 77: 297-306. van der Heijden G.W, Dieker J.W, Derrick A.A., Muller S., Berden J.H., Braat D.D., van der Vlag J., and de Boer P, 2005. Asym- metry in histone H3 variants and lysine methylation between paternal and maternal chromatin of the early mouse zygote. Meeh. Dev. 122: 1008-1022.
Глава 20. Зародышевая линия и плюрипотентные стволовые клетки Van Doren М., Williamson A.L., and Lehmann R., 1998. Regulation of zygotic gene expression in Drosophila primordial germ cells. Curr. Biol. 8 243-246. Vincent S.D., Dunn N.R., Sciammas R., Shapiro-Shalef M., Davis M.M.. Calame K., Bikoff E.K., and Robertson E.J., 2005. The zinc finger transcriptional repressor Blimp 1/Prdml is dispensable for early axis formation but is required for specification of primor- dial germ cells in the mouse. Development 132: 1315-1325. Waddington C., 1956. Principles of embryology Allen & Unwin, London, United Kingdom. Weber R.J., Pedersen R.A., Wianny E., Evans M.J., and Zemicka- Goetz M., 1999. Polarity of the mouse embryo is anticipated before implantation. Development 126: 5591-5598. Yamaguchi S., Kimura H., Tada M., Nakatsuji N., and TadaT, 2005. Nanog expression in mouse germ cell development. Gene Expr Patterns 5: 639-646. Zhang E., Barboric M., Blackwell T.K., and Peterlin B.M., 2003. A model of repression: CTD analogs and PIE-1 inhibit transcrip- tional elongation by P-TEFb. Genes Dev. 17: 748-758.
ГЛАВА 21 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ ЛИМФОЦИТОПОЭЗА Meinrad Busslinger1 и Alexander Tarakhovsky2 Research Institute of Molecular Pathology, Vienna Biocenter, A-1030 Vienna, Austria 2 Laboratory of Lymphocyte Signaling, The Rockefeller University, New York, New York 10021 СОДЕРЖАНИЕ Общее резюме 1. Введение 2. Коммитирование линий в раннем лимфопоэзе 2.1. Внеклеточные сигналы 2.2. Транскрипционные факторы 2.3. Эпигенетический контроль экспрессии генов 3. Эпигенетический контроль разнообразия ре- цепторов антигенов 3.1. Регуляция перестроек генов рецепторов антигенов в процессе развития 3.2. Субъядерное перемещение генов иммуно- глобулинов 3.3. Сокращение локуса генов иммуноглобулина 3.4. Контроль исключения аллелей в локусах IgH и IgK 4. Конечная дифференцировка зрелых В-клеток 4.1. Дифференцировка плазматических клеток 4.2. Пластичность зрелых В-клеток в процессе развития 5. Заключительные замечания Литература ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Каждый иммунолог знает простую истину—для изучения любого загадочного биологического процесса нет лучше- го объекта, чем лимфоциты. Этому правилу следуют эпи- генетические механизмы, задействованные в регуляции клетки. Обычный предшественник лимфоцита на раннем этапе развития выбирает, стать («boring») В-клеткой или («terrific») Т-клеткой. Для тех, кто интересуется физио- логией эпигенетики, развивающиеся лимфоциты предо- ставляют широкие возможности для наиболее четкого выделения дискретных стадий развития Благодаря вы- сокой эффективности методов сортировки клеток, даже минимальная субпопуляция развивающихся и зрелых клеток может быть выделена в количестве, достаточном для наиболее требовательных технологий. Таким обра- зом, лимфоциты дают возможность идентифицировать те гены и их регуляторы, которые принимают участие в перепрограммировании стволовых клеток в зрелые. Ре- шающую роль в этом выборе играют транскрипционные факторы, но к ним быстро присоединяются «писатели» и «читатели» «кода модификации гистонов». В ходе развития В- и Т- клеток, каждый развиваю- щийся лимфоцит должен продекларировать свою «со- циальную» идентичность, т.е. антигенную специфич- ность. Экспрессия рецептора какого-то уникального антигена развивающимися В- или Т-клетками крайне важна для их последующего отбора против опасных ау- тореактивных клеток, и она облегчает развитие клеток с четкими рецепторами, которые распознают неограни-
ченное количество внешних антигенов. Для того чтобы достичь такой удивительной специфичности, каждая В- или Т-клетка проходит процесс рекомбинации гена им- муноглобулина или рецептора Т-клетки. Для того чтобы этот процесс стал возможным, локусы иммуноглобули- на или рецепторов Т-клетки, охраняемые хроматином, становятся доступны механизму генной рекомбинации. Генные сегменты, разделенные количеством ДНК до 3 млн о., сближаются и лигируются, образуя уникальный ген рецептора антигенов. Процесс рекомбинации генов иммуноглобулина характеризуется всеми возможными особенностями, взывающими к ветеранам (истокам?) эпигенетики. Тот факт, что локусы иммуноглобули- нов должны быть транскрибированы перед рекомби- нацией, очевидным образом напоминает транскрип- цию гена Xist , который индуцирует эпигенетические изменения, ведущие к инактивации Х-хромосомы. В поддержку этой точки зрения можно сказать, что ме- тилтрансфераза гистонов Ezh2, участвующая в инак- тивации Х-хромосомы, также играет важную роль и в рекомбинации генов иммуноглобулинов. Для тех, кто увлечен малыми РНК, отметим, что развивающиеся В клетки обнаруживают двунаправленную транскрипцию в пределах локуса иммуноглобулина; таким образом по- является возможность вырабатывать дуплексы малых РНК, которые могут работать как направляющие РНК, маркируя хроматин метками, пермиссивными для ре- комбинации. Однажды появившись, В- и Т-клетки должны оста- ваться живыми достаточно долго, чтобы получить уор- холовские 15 минут славы. В мире иммунных клеток это означает встречу с антигеном и ответ на него Для достижения этой благородной цели В- и Т-клетки ис- пользуют все возможные средства, от транскрипцион- ных факторов до ферментов, модифицирующих гисто- ны. После активации антигеном В- и Т-клетки следуют очень различными путями Активированные Т-клетки дифференцируются в эффекторные клетки, которые продуцируют набор цитокинов, в свою очередь либо по- могающих другим иммунным клеткам выполнять свои функции, либо содействующих прямому поражению мишеней. В отличие от Т-клеток, которые сохраняют свою линейную идентичность до смерти, конечная цель В-клеток — потерять свою идентичность и стать источ- ником высокоспецифичных растворимых антител, ней- трализующих патогены. Для достижения этой цели, ак- тивированные В-клетки вступают на путь оптимизации антител и гены иммуноглобулинов в них претерпевают мутации, повышающие сродство рецепторов к антиге- нам. Этот процесс выполняет индуцированная актива- цией дезаминаза (AID), но механизм, который нацели- вает такой мощный «мутатор» на крошечный сегмент двухметровой геномной ДНК, неизвестен и, вероятнее всего, контролируется эпигенетически. В-клетки, кото- рые экспрессируют высокоаффинные рецепторы анти- генов, вступают в следующий раунд AID-зависимого удара по ДНК, результатом чего является переключение класса иммуноглобулинов и выработка антител других изотипов, обладающих другими возможностями защи- ты организма. Любопытные эпигенетики несомненно найдут, что в этой, так называемой, рекомбинации- переключателе класса иммуноглобулинов много такого, что напоминает явления, которые имеют место при эли- минации ДНК у Tetrahymena, теломерном сайленсинге у дрожжей и инактивации Х-хромосомы у млекопита- ющих. Рано или поздно В-клетки, которые исчерпали возможность улучшение антител, встретят антиген. Это событие ведет к значительному перепрограммированию генома, что лишает В-клетки их идентичности и приво- дит к генерации плазматических клеток, продуцирую- щих антитела. Хотя транскрипционный контроль этого жизненно важного процесса хорошо известен, механизм массовой дедифференцировки В-клеток представляет большой интерес для тех, кто ищет способы по желанию изменять идентичность клетки. Трудно переоценить практическое значение изучения эпигенетических ме- ханизмов, лежащих в основе дифференцировки и функ- ционирования лимфоцитов. При многих лимфоидных раках происходит избыточная экспрессия различных метилтрансфераз гистонов, и их таргетинг специфиче- скими ингибиторами может помочь остановить рост и распространение раковых клеток. Имея обширные зна- ния о факторах, контролирующих дифференцировку лимфоцитов из стволовых клеток, можно ожидать, что лимфоциты будут в числе первых клеток, которые будут перепрограммированы из стволовых клеток для тера- певтических целей Итак, волнения, связанные с наукой полезно для иммунитета, и эта важная истина делает эпигенетику лучшим иммуностимулятором. 1. Введение Тканеспецифичные стволовые клетки ответственны за развитие и регенерацию целых органов, таких как кожа, кишечник и кровеносная система, в течение всей жизни. Для этого стволовые клетки снабжены двумя уникальными свойствами. Во-первых, они обладают мощным потенциалом самообновления и поэтому могут воспроизводиться в своем некоммитированном состоя- нии. Во-вторых, они плюрипотентны и поэтому служат источником клеток всех типов данного органа путем дифференцировки в мультипотентные прогениторные клетки с постепенно сокращающимся потенциалом развития (рис. 21.1). Эти прогениторные клетки по- следовательно проходят коммитирование по одной из нескольких линий, а затем дифференцируются по вы- бранному пути в функционально специализированные типы клеток этого органа (рис. 21.1). То, каким образом линейное коммитирование муль- типотентных прогениторов регулируется на молеку- лярном уровне, является важным вопросом биологии развития. Важную роль в этом процессе играют транс- крипционные факторы, так как они способны к репро- граммированию экспрессии больших групп генов. С этой целью они используют множественные механиз- мы активации или репрессии транскрипции генов в от- вет на внеклеточные сигналы (рис. 21.2) (Fisher, 2002). Они могут косвенно влиять на программы экспрессии генов, противодействуя другим транскрипционным факторам через белок-белковые взаимодействия. Чаще
Рис. 21.1. Схема развития органов из одной стволовой клетки Развитие органа инициируется тканеспецифичными стволовыми клетками, которые обладают мощ- ным потенциалом самообновления и являются плюрипотентными и дают начало всем типам клеток этого органа. Стволовые клет- ки сначала дифференцируются в мультипотентные прогениторы (известные также как переходные делящиеся клетки) с нарастающим ограничением потенциала разви- тия. Эти прогениторы впоследствии претерпевают коммитирование в один из нескольких клонов и затем дифференцируются по выбранному пути в функционально специали- зированный тип клеток данного органа транскрипционные факторы регулируют транскрип- цию генов непосредственно, рекрутируя к регулятор- ным элементам ДНК коактиваторы или корепрессоры, обладающие активностью модификации гистонов или ремоделинга хроматина (рис. 21.2). Экспрессия генов определяется не только наличием совокупности транс- крипционных факторов, но и хроматиновым контек- стом, который отражает онтогенетическую предысто- рию клетки. В частности, на активность гена влияют локальный рисунок метилирования ДНК, ситуация с модификацией гистонов хроматина, позиция гена по отношению к репрессивным гетерохроматиновым до- менам в ядре и архитектура локуса данного гена (рис. 21.2) (Fisher, 2002). Система гематопоэза, а особенно развитие лимфо- цитов, хорошо подходит для изучения эпигенетических механизмов, контролирующих линейное коммитиро- вание и дифференцировку, по следующим причинам. Линейная диаграмма гемопоэтической системы в зна- чительной степени была прояснена по мере того, как были охарактеризованы различные стадии развития между гемопоэтической стволовой клеткой (ГСК) и различными зрелыми клетками крови разных типов (рис. 21.3) (Akashi et al, 2000; Busslinger, 2004). Как след- ствие, клетки на разных стадиях развития можно изо- лировать из гемопоэтических органов путем сорти- ровки с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS), культивировать in vitro, иссле- довать на молекулярном уровне, модифицировать ви- русными системами экспрессии и снова инъецировать мышам-реципиентам для выяснения функциональных последствий генетических манипуляций in vivo. Несмо- тря на то, что эпигенетические механизмы, лежащие в основе гемопоэтического развития, еще только начали изучать, большая часть наших знаний об эпигенети- ческом регулировании в настоящее время относится к В-лимфопоэзу. Развитие В-клеток может быть грубо разделено на три фазы, характеризуемые (1) входом прогениторов в СИГНАЛЫ HAT + HDAC + /юделяторы метилирование ДНК '' 1111 Ген Ген Ядерное Архитектура включен выключен перемещение локуса Рис. 21.2. Центральная роль транскрипционных факторов в эпи- генетическом контроле генов Транскрипционные факторы (TF), которые часто регулируют- ся в ответ на внеклеточные сигналы, отвечают за активацию генов, транскрипционную репрессию, перемещение генов в пределах компартментов ядра и за архитектонику хроматина генного локуса. Транскрипционные факторы выполняют эти разнообразные функции посредством взаимодействия с коак- тиваторами (включая ацетилтрансферазы гистонов [HATs]), с корепрессорами (включая деацетилазы гистонов [HDACs]), с аппаратом ремоделинга хроматина и с белковыми комплексами Polycomb
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза линию при коммитировании В-клеток, (2) выработкой разнообразных рецепторов антигенов путем соматиче- ской рекомбинации (V(D)J) и (3) терминальной диф- ференцировкой зрелых В-клеток в секретирующие им- муноглобулин плазматические клетки (рис. 3). В этой главе мы обсуждаем эпигенетические механизмы, кон- тролирующие эти три аспекта развития, которые выя- вили основные принципы с возможностью применения их и для других систем развития. 2. Коммитирование линий в раннем лимфопоэзе 2.1. Внеклеточные сигналы Гемопоэтическое развитие инициируется в костном мозге взрослой мыши путем решения гемопоэтических стволовых клеток (HSCs) дифференцироваться в общие миелоидные прогениторы (CMP) (Akashi et al., 2000) или в лимфоид-праймированные мультипотентные прогениторы (LMPP) (Adolfsson et al., 2005). Клетки эритроидных типов возникают только из СМР, в то время как миелоидные клетки могут происходить как из СМР, так и из LMPP. Активация лимфоидных генов RAG1 или RAG2 в клетках LMPP характеризует появление самых ранних прогениторов лимфоцитов (ELP), которые диф- ференцируются в обычные лимфоидные прогениторы (CLP) с характерным для них В-, Т-, и NK-клеточным потенциалом развития (рис. 21.3) (Busslinger, 2004). Как внеклеточные сигналы, так и транскрипци- онные факторы существенны для дифференцировки HSCs в CLPs и в ранние прогениторы В-клеток (про-В- клетки) в костном мозге. Выработка лимфоидных про- гениторв и В-лимфоцитов зависит от сигнала с рецеп- торов c-Kit, Flt3, и IL-7 (Waskow et al., 2002; Vosshenrich et al., 2003). В частности, мышь с двойным дефицитом по Flt3 и IL совершенно не может вырабатывать про-В клетки (Vosshenrich et al., 2003). Сигналы от Flt3 и IL-7R активируют близко родственные транскрипционные факторы Stat5a и Stat5b, которые, в свою очередь, об- легчают дифференцировку лимфоидных прогениторов до стадии про-В-клеток (рис. 21.4) (Zhang et al, 2000: Kovanen и Leonard, 2004). Развитие В-клеток чем дальше, тем больше зависит от факторов транскрипции с доменами типа «цинковые пальцы», Ikaros, и Ets-домена белка PU.1, так как CLP с характерной для них экспрессией IL-7R отсутствуют в костном мозге мутантных мышей Ikaros и PU.I (рис. 21.4) (Ariman et al., 2003; Dakic et al., 2005). 2.2. Транскрипционные факторы Вступление лимфоидных прогениторов на путь В-клеток зависит от транскрипционного фактора Е2А (Tcfe2a) типа «спираль-петля-спираль», раннего фактора В-клеток EBF1 и от белка Рах5 (BSAP), имеющего парный (спа- ренный) домен (paired domain protein) (рис. 21.4). Е2Аи EBF1 координированно активируют экспрессию генов, специфичных для В-клеток, которые важны для выработ- ки ранних про-В-клеток (Busslinger, 2004). Тем не менее, активация транскрипционной программы, специфичной для В-клеток, недостаточна для коммитирования ранних прогениторов к В-лимфоидной линии в отсутствие Рах5. В костном мозге гомозиготная мутация Рах5 останавливает развитие В-клеток на стадии ранней про-В-клетки (Nutt et al., 1997). Pax5 f про-В-клетки сохраняют мощный по- тенциал самообновления и развития, характерный для некоммитированных лимфоидных прогениторов (Nutt et al., 1999). Интересно, что эктопическая экспрессия миелоидных факторов транскрипции эффективно инду- цирует переключение линии с лимфоиднои на миелоид- ную дифференциацию в прогениторах Рах5',\ показывая, что про-В-клетки Рах5 in vitro являются клонируемыми лимфоидными прогениторами с латентным потенциалом миелоидной дифференцировки (Busslinger, 2004). Важно, pre-BCR Перестройки тяжелой цепи 1д (антитела) Пролиферативный рост клеток Эритроидный ряд Часть I всту- пление на путь дифференци- ровки В-клетки Часть II формирование многообразия рецепторов Перестройки легкой цепи 1д Антитела) Часть III окончательная дифференцировка в плазматические клетки Рис. 21.3. Схема развития В-клеток Гематопоэтические стволовые клетки (HSC) дифференцируются через обозначенные стадии развития в секретирующие иммуно- глобулин плазматические клетки: LMPP — лимфоид-праймированные мультипотентные прогениторы; СМР — общий миелоидный прогенитор; ELP — самые ранние прогениторы лимфоцитов; CLP — общий лимфоидный прогенитор. Части 1-111. указанные внизу рисунка, обозначают стадии лимфопоэтического развития эпигенетические механизмы которых были исследованы и которые обсуждаются в этой главе
2. Коммитирование линий Notch 1 HSC (hematopoietic stem cell) - гемопоэтическая стволовая клетка CLP (Common Lymphoid Progenitor) - общий лимфо- идный предшественник Pro-NK - предшественник НК-клетки Pro-В - предшественник В-клетки Pro-Т - предшественник Т-клетки Рис. 21.4. Транскрипционный контроль раннего лимфопоэза Прогениторы естественных киллеров (NK), линий В- и Т-клеток развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (HSC) под контролем обозначенных факторов транскрипции. Детальное описание см. Bussinger (2004) что восстановление экспрессии Рах5 подавляет этот муль- тилинейный потенциал про-В-клеток Рах5~'\ одновремен- но стимулируя их развитие в зрелые В-клетки (Nutt et al., 1999). Эти эксперименты позволяют определить РохЛкак критичный фактор коммутирования В-линии, который ограничивает возможности развития лимфоидных про- гениторов только путем развития В-клеток. Некоммитированные гематопоэтические прогени- торы беспорядочно экспрессируют гены с различными программами посредством процесса, который известен как «праймирование линии» (Miyamoto et al., 2002). В соответствии с этим открытием, про-В-клетки Рах5'/~ экспрессируют не только гены, характерные для про-В- клеток, но и гены программ, специфичных для других линий (Nutt et al., 1999). При линейном коммитировани Рах5 выполняет двойную роль, активируя специфичные для В-клеток гены и одновременно подавляя гены, не подходящие для линии (рис. 21.5) (Nutt et al., 1999). Рах5 активирует несколько генов-мишеней, кодирующих су- щественные компоненты сигнального пути, связанного с рецептором пре-В-клеток (BCR), такие, как трансду- цирующая сигнал цепь Iga (mb-1, Cd79a), стимулирую- щие корецепторы CD, 19 и CD1, а также центральный адаптерный белок BLNK (рис. 21.5) (Busslinger). Таким образом, функция трансактивации Рах5 облегчает пере- дачу сигнала от pre-BCR и BCR, образуя важные кон- трольные точки в развитии В-клеток. С другой стороны, гены, репрессированные Рах5, кодируют избыток выде- ленных белков, молекулы клеточной адгезии, передат- чики сигналов и белков ядра, которые экспрессируют- ся в эритроидных, миелоидных и (или) Т-лимфоидных клетках (рис. 21.5) (Delogu et al., 2006). Среди них — гены Csflr (М-CSFR) и NotchL что является хорошим приме- ром того, как их Рох5-зависимая даун-регуляция делает коммитированные В-клетки больше не реагирующими на миелоидный цитокин M-CSF (Nutt et al., 1999) или на Notch лиганды, индуцирующие Т-клетки (Busslinger, 2004). Следовательно, репрессивная функция Рах5 со- действует коммитированию В-клеток, прекращая рабо- ту ненужных сигнальных систем Взаимодействуя с ко- репрессорами белкового семейсва Groucho, Pax5 может рекрутировать деацетилазы гистонов (HDACs) к регуля- торным элементам, результатом чего является репрессия генов (Linderson et al., 2004). Е2А, EBF1 и их гены-мишени обычно экспрессиру- ются в Рах5 ! про-В-клетках, указывая, что Рах5 в раз- витии В-клеток функционирует «вниз по течению» от Е2Аи EBFT1 (Nutt et al., 1997; Busslinger, 2004). Соглас- но этим наблюдениям, транскрипты Рох5 отсутствуют и в прогениторах Е2А~' или EBF1 (Ikawa et al., 2004; Гены, несоответствующие В-линии дифференцировки Несоответствующая передача сигнала Передача сигнала с npeBCR Гены, специфичные для В-клетки Рис. 21.5. Двойная роль Рах5 в развитии В-клеток Рах5 активирует гены, специфичные для В-клеток, участвую- щие в (пре)ВСЕ-сигналинге и подавляет неприемлемые для линии гены, необходимые для трансдукции сигнала в миело- идных (FcRy, Csfr) или Т-лимфоидных (Notchl, CD28, Grap2) клетках
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза Medina et al., 2004). Прогениторы Е2А~/~экспрессируют EBF1 на низком уровне, в то время как Е2А нормаль- но транскрибируются в прогениторах EBF1 (Medina et. al., 2004). Более того, ретровирусное восстановле- ние экспрессии EBF1 в прогениторах Е2А ’ активиру- ет транскрипцию Рах5 и таким образом инициирует дифференцировку про-В-клеток (Seet et al., 2004). От- сюда следует, что эти три транскрипционных фактора стимулируют раннее развитие В-клеток в генетической иерархии E2A-EBF1-Pax5. Тем не менее, в пределах В-лимфоидной линии экспрессия EBFI поддержива- ется благодаря регуляции белком Рах5, основанной на обратной связи (рис. 21.4) (Horher et al., 2001; Fuxa et al., 2004). 2.3. Эпигенетический контроль экспрессии генов В любой клетке многоклеточного эукариотного организма большая часть генов транскрипционно подавлена и изби- рательно активируется только в специфичных путях раз- вития. Репрессия генов опосредуется многочисленными слоями эпигенетических механизмов, включая метилиро- вание ДНК, модификации гистонов, позиционирование нуклеосом и структуру хроматина более высокого порядка (Smale, 2003). Первое проникновение в то, как снимается репрессия генов в начале развития В-клеток, было обе- спечено анализом специфичного для В-клеток гена Cd79a (mb-Г Iga; Maier et al., 2004) Промотор гена Cd79a со- держит функциональные узнающие последовательности для трех транскрипционных факторов Е2А, EBF1 и Рах5, в дополнение к Ets и Runx-связывающим сайтам (рис. 21.6) (Maier et al., 2004). Этот участок транскрипционного контроля метилирован по динуклеотидам CpG в HSCs, частично деметилирован в CLPs и полностью демети- лирован в коммитированых про-В-клетках (Maier et al., 2004). Промотор Cd79a также полностью метилирован в прогениторах Е2А~/ или EBF1 , но может быть деметили- рован синергическим действием EBF1 и Runxl, что вместе с Рах5 ведет к транскрипционной активации гена mb-1 в коммитированных про-В-клетках (рис. 21.6) (Maier et al., 2004). Таким образом, в раннем развитии В-клеток EBF1 и, возможно. Е2А функционируют как «пионерские» факто- ры, инициируя эпигенетические изменения, необходимые для активации генов в процессе дифференцировки ранних прогениторов в коммитированные про-В-клетки. Не- смотря на то, что изменения в модификации гистонов и структуре хроматина еще не были исследованы, вполне вероятно, что Е2А и Рах5 вносят вклад в локальное об- разование открытого ацетилированного хроматина путем их взаимодействия с комплексами ацетилтрансфераз гистонов (HAT) SAGA и p300/CBR (Massari et al., 1999; Barlev et al., 2003). 3. Эпигенетический контроль разнообразия рецепторов антигенов 3.1. Регуляция перестроек генов рецепторов антигенов в процессе развития Ведущий принцип в системе приобретенного иммуни- тета заключается в том, что каждый вновь образованный лимфоцит узнает уникальный антиген и что общее раз- промотор Cd79a me me me me me me me me me Деметилирование ДНК и ремоделирование хроматина Сборка функционального промотора Рис. 21.6. Эпигенетическая активация гена Cd79a в раннем лимфопоэзе На схеме промотор Cd79a(mb-1, Iga) показан вместе с паттерном метилирования (me) CpG и последующим связыванием с раз- личными факторами транскрипции в процессе перехода HSCs в коммитированные про-В-клетки (Maier et al., 2003)
3. Эпигенетический контроль разнообразия рецепторов антигенов нообразие лимфоцитов достаточно велико, чтобы ней- трализовать любой возможный антиген С этой целью, В- и Т-клетки экспрессируют специфичные для данной клеточной линии рецепторы антигенов, опосредующие зависимый от антител гуморальный или клеточный им- мунитет. BCR состоит из тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) и легкой цепи (IgL) типа IgK или IgX. Т-клетки ли- нии ар, составляющие у мыши и у человека большинство Т лимфоцитов, экспрессируют рецептор Т-клеток (TCR, T-cell receptor) — р-полипептид, связанный с TCRa, тогда как функционально отличающиеся Т-клетки уб содержат на своей поверхности ТС Ry, спаренный с TCR5. Эти белки-рецепторы антигенов кодируются большими генными локусами, содержащими дискретные генные сегменты: V (variable), D (diversity) и J (joining), которые в процессе развития лимфоцита собираются посредством У(В)1-рекомбинации в функциональный ген. Многооб- разие генных сегментов D, J и особенно V, в сочетании с случайным характером их рекомбинации, отвечает за практически неограниченное разнообразие иммунного репертуара (Bassing et al., 2002). Механика V(D)J-рекомбинации на уровне ДНК довольно проста. Все V, D и J генные сегменты флан- кированы рекомбинационными сигнальными после- довательностями (RSSs), которые состоят из относи- тельно консервативных гептамерных и нонамерных элементов, разделенных спэйсерами либо из 12, либо из 23 пар нуклеотидов. Лимфоид-спепифичные белки- рекомбиназы RAG1 и RAG2 при помощи белков группы высокой мобильности собирают 12 и 23 нуклеотидные RSSs в синаптический комплекс и затем производят двухцепочечные разрывы ДНК между RSSs и кодиру- ющими сегментами. Эти разрывы ДНК впоследствии обрабатываются и вновь связываются вездесущими факторами репарации, относящимися к механизму негомологичного соединения концов с образованием кодирующих и сигнальных соединений (Bassing et al., 2002). Простота процесса У(В)3-рекомбинации на уров- не матрицы ДНК выдвигает логистические проблемы в отношении сборки различных рецепторов антигенов, потому что белки RAG экспрессируются во всех незре- лых В- и Т-лимфоцитах. Следовательно, должна иметь место строгая регуляция, чтобы ограничить доступ бел- ков RAG только к специфичным подгруппам всех суб- стратов рекомбинации (Yancopoulos and Alt, 1985; Stan- hope-Baker et al., 1996). У(О)3-рекомбинация строго контролируется специфичным для клеточной линии и стадии развития образом. В пределах В-лимфоидной линии локус IgH в про-В-клетках реорганизуется до рекомбинации ге- нов IgK and IgL в пре-В-клетках, тогда как гены TCRp> и TCRa перестраиваются, соответственно, в про-Т- и пре-Т-клетках. Более того, У(В)1-рекомбинация гена IgH осуществляется в определенном временном порядке с перестройками DH-JH, предшествующими Ун-В1н-рекомбинации Перестройки локуса TCR0 в ходе развития про-Т-клетки происходят в таком же порядке (Dp- Jp перед yp-DJp). Таким образом, должны сушествовать контрольные механизмы, чтобы защитить все гены от опосредованного RAG- расщепления в ходе D-J-рекомбинании и облегчить перестройку лишь одного из сотни генов У во время y-DJ-рекомбинации Следовательно, процесс про- изводства рецептора антигена полностью зависит от точной регуляции доступности RSSs для действия ре- комбиназы RAG S Успешная У-DJ-peкомбинация гена IgH или TCRp ведет к экспрессии белка lg\\ или TCR0 как части пре- BCR- или npe-TCR-комплекса, который работает как важная контрольная точка, чтобы ингибировать У-DJ- рекомбинацию второй DJ-реорганизованной аллели и стимулировать развитие пре-В или пре-Т-клеток, инициирующее перестройки в генах IgL или TCRa, соответственно. Наконец, экспрессия BCR или TCR, компетентных к сигналингу, полностью блокирует y(D)J-peкомбинацию с помощью транскрипционной репрессии генов RAG S в незрелых В- или Т-клетках (Jankovic et al., 2004). Сигналинг ауто реактивного BCR может, однако, возобновить перестройку гена легкой цепи иммуноглобулина, что приводит к производству BCR с новой антигенной специфичностью (редактиро- вание рецептора; Jankovic et al., 2004). Более того, сиг- налинг цитокина IL-7 необходим для стимулирования рекомбинации гена TCRp в про-Т-клетках (Schlissel et al., 2000). Следовательно, У(О^-рекомбинация контро- лируется не только изнутри (ядерными механизмами, специфичными к типу клеточной линии и стадии разви- тия), но также и извне (сигналами, образуемыми на по- верхности клетки). Ограничения У(О^-рекомбинации, специфичные для данных стадии развития и локуса, в значительной степени накладываются на эпигенетиче- ском уровне (Krangel, 2003). В не-лимфоидных клетках гены Ig и TCR присутствуют в недоступном хроматине, так как в клетках почек белки RAG, экспрессирующие- ся экзогенно, без труда расщепляют субстраты рекомби- нации, привнесенные с трансфецированной эписомой, но не эндогенные гены рецепторов антигена (Romanow et al., 2000). Более того, рекомбинантные белки RAG, добавленные к изолированным ядрам лимфоцитов, мо- гут расщеплять только ген Ig или TCR, который активно подвергается У(ОД-рекомбинации на стадии развития, используемой для подготовки ядра (Stanhope-Baker et al., 1996). Следовательно, линейная специфичность и времен- ное упорядочение перегруппировки генов вызывается последовательным открыванием локального хромати- на, что делает специфичные RSSs доступными для V(D) J-рекомбиназы. Способность хроматина как защищать RSSs, так и управлять их расщеплением, предполагает существование «хроматинового кода», который марки- рует сайты рекомбинации и (или) облегчает опосредо- ванное RAG расщепление. Ацетилирование гистонов на лизиновых остатках является не только характерной чертой открытого хро- матина, но также играет важную роль в определении доступности хроматина локусов Ig и TCR, так как оно разделяет домены рекомбинационно-компетентных сегментов генов (McMurry and Krangel, 2000; Chowd- hury and Sen, 2001). Анализ состояния ацетилирования гистонов выявил ступенчатую активацию дискретных
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза доменов хроматина в локусе IgH (Chowdhury and Sen, 2001). Перед рекомбинацией V(D)J первым гипераце- тилируется геномный участок длиной 120 тыс. пар ну- клеотидов, окружающий генные сегменты DH, JH и С. Вслед за этим перестройки DH-JH индуцируют ацети- лирование гистонов и перестройки генов VH, прокси- мальных по отношению к DH (Chowdhury and Sen, 2001). Наконец, дистальный домен длиной 2 млн. пар нуклео- тидов, содержащий большинство генов VH, оказывается активированным сигналом IL-7 (Chowdhury and Sen, 2001). Детальный анализ локуса TCRa/b в развиваю- щихся Т-клетках также выявил полное перекрывание участков, характеризующихся гиперацетилированием гистона НЗ и доступностью для рекомбиназы V(D)J (McMurry and Krangel, 2000). Следовательно, ацетили- рование гистонов оказывается существенной частью паттерна модификации хроматина, который контроли- рует инициацию и (или) развитие рекомбинации (Kran- gel, 2003). Однако самого по себе ацетилирования недостаточно для того, чтобы облегчить рекомбинацию, поскольку ин- гибиторы деацетилаз гистонов имеют слабое влияние на рекомбинацию V(D)J in vivo (McBlane and Boyes, 2000). Более того, в про-В-клетках наблюдалось поражающее несоответствие между высоким уровнем ацетилирования гистона НЗ и слабой рекомбинацией НЗ (Hesslein et al., 2003; Suet al., 2003). Нормальные уровни ацетилирования гистонов в кластере генов VH, дистальных по отношению к DH, не поддерживают дистальную рекомбинацию VM- DJH в про-В-клетках без метилтрансферазы гистоновых лизинов (НКМТ) Ezh2, которая триметилирует гистон НЗ по лизину 27 (H3K27me3) (Su et al., 2003). Тот факт, что более высокие уровни НЗК27шеЗ ассоциируются с дистальными, а не проксимальными генами VH, пред- полагает домен-специфическую роль метилирования НЗК27 в рекомбинации генов VH (Su et al., 2003). Изби- рательность регуляции, осуществляемой Ezh2 для локуса IgH, подчеркивается равной эффективностью рекомби- нации гена TCRp у дикого типа и у дефицитных по Ezh2 про-Т-клеток (Su el al., 2005). Следовательно, дополни- тельные модификации хроматина, вероятно, участвуют в контроле V(D)J-рекомбинации проксимальных генов Vhb про-В-клетках и TCRp-перестроек в про-Т-клетках. Диметилирование гистона НЗ по лизину 4 (НЗК4ше2) — это активная гистоновая метка, которая также корре- лирует с доступным состоянием сегментов генов IgH и TCRft (Morshead et al., 2003). Напротив, диметилирова- ние НЗ по лизину 9 (НЗК9ше2) — это репрессивная хро- матиновая метка, которая обнаруживает отрицательную корреляцию с V(D)J-рекомбинацией сегментов генов IgHvt TCRft (Morshead et al., 2003). Важная роль H3K9me2 в подавлении рекомбинации была недавно продемон- стрирована путем таргетинга НЗК9 НКМТ G9a на PDp 1 - промотор зародышевой линии (минилокус TCRp), что предотвратило перестройки V(D)J посредством перевода локального хроматина в недоступное состояние (Osipov- ich et al., 2004). Паттерн модификации гистонов, облегчающий до- ступ V(D)J-рекомбиназе, должен быть установлен с по- мощью процессов, которые происходят в пределах ло- кусов рецептора антигена до перестройки. Прежде чем картирование модификаций гистонов стало экспери- ментально осуществимым, уже было известно, что в за- родышевой линии транскрипция короткой смысловой РНК с сегмента неперестроенного гена предшествует ре- комбинации V(D)J (Yancopoulos and Alt, 1985). Возмож- ная роль транскрипции в контролировании доступности локуса была в дальнейшем подтверждена рядом откры- тий, демонстрирующим, что энхансеры и промоторы, расположенные в пределах локусов рецептора антигена, необходимы для того, чтобы осуществилась рекомбина- ция V(D)J. Делеция эндогенных энхансеров и промо- торов уменьшает или аннулирует рекомбинацию V(D) J локусов рецептора антигена, тогда как вставка допол- нительных энхансеров, специфичных для линии, ведет к новому паттерну рекомбинации V(D)J (Bassing et al., 2002; Krangel, 2003). Многочисленные промоторы, ассо- циированные с сегментами V, D и J, контролируют пере- стройки последовательностей, проксимальных по отно- шению к промотору, в пределах относительно коротких расстояний, тогда как энхансеры приводят в действие контроль над рекомбинацией V(D) J на больших расстоя- ниях (Bassing et al., 2002; Krangel, 2003). Сборка на про- моторе комплекса пре-инициации может локально раз- рушить нуклеосомы и таким образом облегчить доступ ферментам рекомбинации, даже в отсутствие изменений в модификации гистонов. Более вероятно, однако, что промоторы активно принимают участие в установлении хроматиновой структуры, разрешающей рекомбинацию, так как элонгирующий комплекс РНК-полимеразы II несет свою собственную гистоновую ацетилтрансферазу, которая может способствовать распространению ацети- лирования гистонов вдоль транскрибируемых участков (Orphanides and Reinberg, 2000). Транскрипция генов также приводит к локальному обмену зависимого от ре- пликации гистона НЗ на замещающий его вариант НЗ.З, который предположительно поддерживает доступное со- стояние хроматина транскрибируемых участков (Chow et al., 2005; Mito et al., 2005). Как было упомянуто выше, каждый локус рецептора антигена содержит сотни RSSs, хотя лишь немногие из них будут расщеплены в индивидуальном лимфоците на определенной стадии развития. Таким образом, потенци- ально возможно, что вариации в последовательности ну- клеотидов ДНК индивидуальных сайтов RSS также могут вносить свой вклад в эффективность их расшепления. Анализ искусственных субстратов V(D)J-рекомбинации в самом деле продемонстрировал, что встречающиеся в естественных условиях различия в элементах гептамера и нонамера RSS, так же как и в менее консервативном спэйсере и во фланкирующих кодирующих последова- тельностях, влияют на частоту рекомбинации и таким образом вносят свой вклад в дифференциальное исполь- зование конкретных — V, D и J-сегментов гена в первич- ном ассортименте рецептора антигена (Lee et al., 2003). В рамках модели «гистонового кода» избирательность расщепления должна определяться процессом, который транслировал бы уникальные свойства индивидуальных RSS или соседних последовательностей в специфический паттерн модификации гистонов, маркирующий сайт для
3. Эпигенетический контроль разнообразия рецепторов антигенов растепления, осуществляемого RAG. Этот код может быть установлен с помощью антисмысловых транскрип- тов. Конечно, антисмысловая межгенная транскрипция по всему кластеру гена VH предваряет рекомбинацию VH- DJH локуса IgHв про-В-клетках (Bolland et al., 2004). Эти длинные антисмысловые транскрипты могут направлять ремоделинг хроматина таким образом, чтобы открыть большой домен гена VH перед рекомбинацией. В качестве альтернативы эти антисмысловые транскрипты могли бы сформировать двухцепочечные гибриды РНК с ко- роткими смысловыми транскриптами VH зародышевой линии и затем быть подвергнутыми процессингу с помо- щью механизма РНК-интерференции, чтобы произве- сти микроРНК, которые рекрутируют HKMTs к сайтам рекомбинации (Bolland et al., 2004, см. о деталях аппарата RNAi в главе 8). В развитие этой гипотезы мы допускаем, что специфическая смысловая транскрипция определен- ного сайта RSS зародышевой линии может генерировать двухцепочечную РНК. которая могла бы «нацеливать» ферменты, модифицирующие гистоны, на эту , но не на все другие последовательности RSS. Если это будет под- тверждено экспериментально, данный гипотетический механизм мог бы объяснить точность и избирательность расщепления индивидуальных сайтов RSS, осущест- вляемое RAG. Интересно, что недавно было показано, что белок RAG2 непосредственно взаимодействует с ги- стонами и может, таким образом, играть важную роль в считывании специфического паттерна модификации ги- стонов на индивидуальных последовательностях нуклео- тидов RSS (West et al., 2005). 3.2. Субъядерное перемещение генов иммуноглобулинов Периферическое пространство ядра и перицентромерный гетерохроматин — это два главных репрессивных компар- тмента в ядре, которые важны для воспроизведения и для неактивного состояния генов в гематопоэтических клетках (Brown et al., 1997; Baxter et al., 2002). В зависимости от степени своей активности, гены перемещаются между этими репрессивными компартментами и центральными позициями в ядре, что облегчает транскрипцию генов. Интересно, что локусы IgH к IgK «по умолчанию» располо- жены на периферии ядра во всех не-В клетках, включая некоммитированные лимфоидные прогениторы (Kosak et al., 2002). Таким образом, локус IgH заякорен через дистальные гены VHHa периферии ядра и сориентирован проксимальным доменом IgH по направлению к центру ядра, что облегчает перестройки DH-JH в лимфоидных про- гениторах (Fuxa et al., 2004). Начальный этап активации локуса IgH состоит из перемещения локусов IgH и IgK с периферии ядра в более центральную позицию внутри ядра в начале развития В-клеток (Kosak et al., 2002). Эта субъядерная передислокация, по-видимому, облегчает открывание хроматина и транскрипцию, характерную для зародышевой линии, ведущих к проксимальным перестройкам VH-DJH. Косвенные доказательства пред- полагают, что EBF1 и Рах5 играют определенную роль в центральном перемешении локусов IgH и IgK, соответ- ственно (Fuxa et al., 2004; Sato et al., 2004). Хотя в про-В-клетках обе аллели локусов IgH и IgK перемещаются в центральные позиции ядра (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004) совместно, эти две аллели ведут себя по-разному после успешной рекомбинации V(D)J в зрелых В-клетках (Skok et al., 2001). Вслед за актива- цией В-клеток продуктивно реорганизованные аллели Ig остаются расположенными вдали от центромерных кластеров, усиливая, таким образом, их экспрессию (Skok et al., 2001). В то же время нефункциональные ал- лели IgHи IgK после активации В-клеток перемещены в центромерный хроматин и таким образом засайленси- рованы там. Интересно, что центромерное рекрутиро- вание нефункциональных локусов IgH и IgK происходит через дистальный участок их гена V, что предполагает, что те же самые последовательности ДНК участвуют в рекрутировании «молчащих» локусов Ig либо на пе- риферию ядра, либо в центромерный гетерохроматин (Roldan et al., 2005). 3.3. Сокращение локуса генов иммуноглобулина Приблизительно 200 генов УИ локуса IgH распростра- нены по участку длиной более 2,4 миллионов пар ну- клеотидов и могут быть разделены на 15 дистальных, центральных или проксимальных семейств генов VH в соответствии со сходством их последовательности и по- зицией относительно проксимальных сегментов DH. В не-В-лимфоидных клетках и лимфоидных прогениторах две аллели IgH присутствуют в удлиненной конформа- ции на периферии ядра (Kosak et al., 2002) Напротив, в коммитированных про-В-клетках локус IgH подверга- ется сокращению, что сближает дистальные гены VH с перестроенным проксимальным доменом DJH, облегчая таким образом перестройки VH-DJH (рис. 21.7) (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004). Локус IgK с его примерно 140 генами также растя- гивается по участку длиной более 3 млн. о. и, таким об- разом, является таким же большим, как локус IgH. Так же, как и ген IgH в про-В-клетках, локус IgK подверга- ется сокращению в малых пре-В- и незрелых В-клетках, демонстрируя, что оба локуса Ig в перестраивающихся клетках находятся в состоянии сокращения (Roldan et al., 2005). Более того, анализ с помощью флуоресцент- ной гибридизации in situ (FISH) с зондами к дисталь- ным, центральным и проксимальным генам показал, что выпетливание отдельных субдоменов Ig отвечает за протяженное сокращение локусов IgH и IgK (рис. 21.7) (Roldan et al., 2005). Дистальные перестройки VH-DJH не имеют места в про-В-клетках Pax5 f (Nutt et al., 1997), несмотря на тот факт, что в гиперацетилированном состоянии хромати- на гены VH доступны на всем протяжении кластера ге- нов VH, включая наиболее дистальное семейство VHJ558 (Hessleinetal., 2003). Отсутствие перестроек дистального VH- D J коррелирует с отсутствием сокращения локуса IgH (рис. 21.7), которое, однако, может быть восстановлено посредством экспрессии ретровирусного Рах5 в про-В- клетках Рах5' (Fuxa et al., 2004). Следовательно, Рах5 — это ключевой регулятор сокращения локуса IgH в про-
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза В-клетках. Метилтрансфераза гистонов Ezh2 предполо- жительно также участвует в сокращении локуса IgH, так как условная активация Ezh2 в HSCs приводит к редук- ции дистальных перестроек Ун- DJH, несмотря на полную доступность хроматина дистальных генов VH в про-В- клетках, дефектных по Ezh2 (Su et al., 2003). Интерес- но, что между Рах5 and Ezh2 не имеется генетической связи, несмотря на сходный фенотип /g//-перестройки соответствующих мутантных про-В-клеток (Fuxa et al., 2004). Поэтому, возможно, что Рах5 функциониру- ет как сиквенс-специфичный фактор «нацеливания», чтобы рекрутировать ЕгЬ2-содержащий репрессивный комплекс Polycomb 2 (PRC2) к избранным участкам на локусе IgH. Возникающее метилирование локального хроматина в гистоне НЗ на лизине 27 (НЗК27теЗ) мо- жет привлекать комплекс PRC1, чтобы индуцировать сжатие хроматина целевых участков (Francis et al., 2004; обсуждается в главе 11), приводя, таким образом, к вы- петливанию и к сокращению локуса IgH. В качестве альтернативы сокращение локуса может не зависеть от модификации гистонов в ядре, но предпочтительнее требует метилирования лизина сигнальных белков ци- топлазматическим Ezh2-содержащим метилтрансфе- разным комплексом, про который известно, что он ре- гулирует полимеризацию актина путем присоединения к фактору обмена GTP/GDP, Vavl, (Su et al., 2005). 3.4. Контроль аллельного исключения в локусах 1дН и 1дк Аллельное исключение обеспечивает продуктивную перестройку только одной из двух аллелей Ig. что при- водит в В-клетках к экспрессии одиночной молекулы антитела с уникальной антигенной специфичностью. Процесс аллельного исключения может быть разделен на два отдельных этапа. В течение фазы инициации одна из двух аллелей Ig выбирается посредством дифферен- циального эпигенетического маркирования, чтобы быть реорганизованной в первую очередь, что препятствует одновременной рекомбинации в двух аллелях. Экспрес- сия продуктивно реорганизованной аллели впослед- ствии предотвращает рекомбинацию во второй аллели посредством ингибирования по типу обратной связи, таким образом поддерживая аллельное исключение. Процесс аллельного исключения уже инициирован на ранних стадиях развития во время имплантации, когда две аллели гена рецептора антигена начинают асинхрон- но реплицироваться в каждой клетке. Отцовский или материнский ген Ig, который стохастически выбирается для ранней репликации посредством пока не известной хромосомной метки, почти всегда представляет собой ту первую аллель, которая претерпевает перестройки в не- зрелых В-лимфоцитах (Mostoslavsky et al., 2001). Вторая Ун-В5н-реорганизация локуса IgHявляется, таким обра- зом, регулируемым этапом, так как Он-1н-рекомбинация осуществляется в обеих аллелях IgH в процессе развития про-В-клеток (Bassing et al., 2002). Однако пока так ни- чего и неизвестно про то, как эта аллель-специфичная эпигенетическая метка, установленная на ранних стадиях развития зародыша, транслируется в последовательную активацию Ун-ВЗн-рекомбинации на двух аллелях IgH. Успешная перестройка одной аллели IgH ведет к экс- прессии на поверхности клеток белка Ign как части ре- цептора пре-В-клетки. Этот рецептор функционирует как важная контрольная точка, чтобы просигналить от- носительно пролиферативной экспансии больших пре-В- клеток. индуцировать последующую дифференцировку в малые пре-В-клетки и поддержать аллельное исключение в аллели IgH, реорганизованной по типу DJH (Kitamura Рах5 л рго-В Ezh2 pro-B Рис. 21.7. Сокращение локуса тяжелой цепи иммуноглобулина в про-В-клетках Локус IgH состоит из проксимального домена, содержащего следующие генные сегменты: разнообразия (diversity, D), соедини- тельные (joining, J) и константные (constant, С), а также большой кластер вариабельных (variable, У) генов с ~200 генами V, рас- положенными на участке длиной более 2,4 млн. о. Локус IgH находится в растянутой конфигурации в про-В-клетках Рах57 или EzhZ7', что позволяет У(О)1-рекомбинации осуществиться только в проксимальном домене. В про-В-клетках дикого типа все гены УН участвуют в перестройках УН-DH благодаря сокращению локуса IgH путем выпетливания
3 Эпигенетический контроль разнообразия рецепторов антигенов and Rajewsky, 1992; Bassing et al., 2002). Экспрессия белка RAG быстро утрачивается под воздействием сигнала пре- BCR (рис. 21.8), который останавливает всю дальнейшую рекомбинацию V(D)J и подготавливает почву для уста- новки аллельного исключения в больших пре-В-клетках (Grawunder et al., 1995). Сигнал пре-BCR также ведет к деацетилированию гистонов и, таким образом, к пони- женной доступности генов VH в малых пре-В-клетках, что может быть механизмом обратной связи, лежащим в основе аллельного исключения (Chowdhury and Sen, 2003). Однако более правдоподобный механизм осуществляется быстрой реверсией сокращения локуса IgH к ответ на сиг- нал пре-BCR, что физйчески отделяет гены VH от прок- симального домена IgH (рис. 21.8), предотвращая, таким образом, перестройку типа VH-DJH на второй аллели IgH, реорганизованной по типу DTH (Roldan et al., 2005). Более того, пре-BCR сигнал ведет к быстрому пере- мещению нефункционирующей аллели IgH к репрес- Большая Ранняя Поздняя пре-В-клетка Малая пре-В- клетка Рис. 21.8. Аллельное исключение путем устранения сокращения локуса IgH в пре-В-клетках В ранних про-В-клетках реорганизации типа DH-JH проис- ходят одновременно в обеих аллелях IgH, тогда как в поздних про-В-клетках только одна аллель в это время подвергается рекомбинации по типу VH-DJH. Ядра рассортированных про-В- и пре-В-клеток были проанализированы трехмерным DNA-FISH с флуоресцентными зондами из дистального (красный} и проксимального (зеленый} участков локуса IgH. Две аллели IgH одной и той же клетки показаны на двух репрезен- тативных конфокальных срезах. Пре-BCR сигнал приводит не только к быстрой потере белка RAG, но и к устранению сокращения локуса IgH. Хотя обе аллели не находятся в со- стоянии сокращения, локус IgH полностью растянут только в случае не окончательно DJH-перестроенной аллели. Эти два сигнала функционально перестроенной аллели (VDJ+) разделены более коротким расстоянием благодаря делении внедренной последовательности ДНК. Данные по FISH взяты из Roldan et al. (2005) сивным центромерным доменам (Roldan et al., 2005). Следовательно, утрата сокращения локуса и центро- мерное рекрутирование изменяют реорганизованную по типу DJH аллель IgH во время образования свободно- го от RAG окна пре-В-сигнала таким образом, что она не может более подвергаться перестройкам типа VH-DJH после последующей реэкспрессии белков RAG в малых пре-В-клетках (рис. 21.8). Инициация аллельного исключения в локусе IgK изучалась, в значительной степени, посредством ис- следования паттерна метилирования ДНК с помощью рестрикционных ферментов, чувствительных к метилу (Mostoslavsky et al., 1998; Goldmit et al., 2002;, 2005), и, наряду с этим, посредством анализа гетерозиготных по репортеру k°-GFP мышей, содержащих вставку гена GFP в элементе Jk1 эндогенного локуса IgK (Liang et al., 2004). Локус IgK. сильно метилирован в динуклеотидах CpG во всех не-В и про-В-клетках, но становится специфиче- ски деметилирован только на одной аллели в пре-В- клетках (рис. 21.9) (Mostoslavsky et al., 1998; Liang et al., 2004). Это моноаллельное деметилирование предваряет перестройку и зависит от активности как интронных, так и 3' к — энхансеров (Mostoslavsky et al., 1998). Эта деметилированная аллель находится в доступном хро- матине, так как он чувствителен к ДНКазе I, гипераце- тилирован по гистонам НЗ и Н4 и расположен в пре-В- клетках вдали от центромерного хроматина (рис. 21.9) (Goldmit et al., 2002, 2005). Как следствие, только не- метилированная аллель IgK инициирует транскрипцию зародышевой линии и перестройки типа Vk-Jk (Goldmit et al., 2002; Liang et al., 2004), тогда как в малых пре-В- клетках обе аллели подвергаются сокращению локуса (рис. 21.9) (Roldan et al., 2005). На удивление, в пре-В- клетках вторая аллель IgK перемещается в центромер- ный гетерохроматин (Goldmit et al., 2005), аналогично локусу IgH (Roldan et al., 2005). Это моноаллельное центромерное рекрутирование (рис. 21.9) может объяснить, почему для аллели с ме- тилированной ДНК характерно пониженное ацетили- рование гистонов и почему она связана с белками НР1у и Ikaros, которыми наряду с комлексами деацетилазы гистонов обогащен центромерный хроматин (Goldmit et al., 2005). Интересно, что именно поздно реплици- рующаяся аллель IgK перемещается в центромерные кластеры (Goldmit et al., 2005) в соответствии с тем, что паттерн асинхронной репликации, уже установленный на ранних стадиях развития эмбриона, коррелирует с моноаллельной инициацией перестроек IgK в пре- В-клетках (Mostoslavsky et al., 2001). Удивительно, что только очень малая доля (5%) всех пре-В-клеток под- вергается активации локуса IgK у мышей k°-GFP (Liang et al., 2004). На основании этого результата была выдвинута гипо- теза, что в пре-В-клетках определенные транскрипци- онные факторы, присоединяющиеся к сА-регуляторным элементам локуса IgK, присутствуют в лимитирующих количествах и что совместное присоединение таких факторов к энхансерам IgK является редким событием, происходящим стохастически только в одной аллели. Следовательно, стохастическая активация энхансера
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитпопоэза Антиген Рис. 21.9. Механизмы, контролирующие аллельное исключение в локусе IgK В пре-В-клетках субъядерное перемещение, деметилирование ДНК и ацетилирование гистонов вносят свой вклад в выбор одной аллели IgK для VK-JK-рекомбинации. Для детального объяснения см. текст. Обозначены: дистальный участок VK (красный) и проксимальный домен JK-CK (зеленый) локуса IgK, и их расположение относительно репрессивного компартментов на периферии ядра (серый) и центромерным хроматином (синий). У этих двух аллелей состояния сокращения локуса, метилирования ДНК (те) и ацетилирования гистонов (ас) схематично показаны для разных стадий развития, включая активированные зрелые В-клетки посредством аллельной конкуренции за лимитирую- щие транскрипционные факторы может внести свой вклад в аллельное исключение в локусе IgK (Liang et al., 2004). Успешная перестройка одной аллели IgK ве- дет к экспрессии BCR на поверхности клетки, которая впоследствии поддерживает аллельное исключение во второй аллели IgK посредством подавления экспрессии рекомбиназы RAG 1/2 (Jankovic et al.. 2004). 4. Конечная дифференцировка зрелых В-клеток 4.1. Дифференцировка плазматических клеток Завершение рекомбинации V(D) J и экспрессия рецептора иммуноглобулина (Ig) на поверхности В-клетки марки- руют конец антиген-независимой фазы В-лимфопоэза. Начиная с этой точки отсчета, судьба В-клеток начинает зависеть от сигнала рецептора, индуцированного анти- геном (Rajewsky, 1996). В отсутствие антигена перифери- ческие В-клетки поддерживаются в покоящемся состоя- нии, где их выживание обеспечивается тонизирующими сигналами с BCR клеточной поверхности (Kraus et al., 2004). Сравнение организации хроматина в покоящих- ся и активированных В-клетках показывает, что покой В-клеток характеризуется низкими уровнями общего ме- тилирования гистонов (Baxter et al., 2004). Относительно высокие уровни ацетилирования гистонов в покоящихся В-клетках остаются стабильными в процессе активации клеток (Baxter et al., 2004). Общее снижение метилиро- вания лизинов гистонов, включая возможное отсутствие метилирования гистона НЗК9, коррелирует с отсутствием других признаков конститутивного хроматина, таких как ассоциация Ikaros и связывание НР1 в покоящихся В-клетках (Baxter et al., 2004). Активация В-клеток вос- станавливает метилирование гистонов, которое приво- дит к увеличению активной метки НЗК4теЗ на генах, требующихся для функционирования В-клетки (Рах5), и к одновременному повышению репрессивной моди- фикации НЗК9ше2 на «молчащих» генах (Dntt) (Baxter et al., 2004). Реорганизация хроматина, индуцированная активацией, может поддерживать идентичность В-клетки в течение иммунного ответа. Однако геном В-клетки должен оставаться подверженным перепрограммирова- нию, вызванному антигеном, так как активированные В-клетки после первой встречи с антигеном способны дифференцироваться прямо в плазматические клетки, продуцирующие антитела (Calame et al., 2003). Как альтернатива, антигенная стимуляция может инициировать реакцию зародышевого центра. В про- цессе этой реакции зрелые IgMlow IgDhlgh В-клетки вклю- чают свои иммуноглобулиновые изотипы и производят мутации в своих генах Ig с помощью цитидиндеамина- зы, индуцированной активированием (AID; Honjo et al., 2004). Белки Ig, возникшие в результате этих процессов, идеально подходят для дифференцировки и поддерж- ки В-клеток памяти, или для развития плазматиче- ских клеток, которые продуцируют антитела с высо- ким сродством к определенному антигену (Honjo et al., 2004). Время реакций зародышевого центра и превра- щение В-клеток в плазматические клетки регулируют- ся двумя взаимоисключающими репрессорами транс- крипции — Вс16 и Blimp 1 (рис. 21.10) (Turner et al., 1994; Ye et al., 1997). Bcl6 экспрессируется на низком уровне в зрелых наивных В-клетках, но быстро ап-регулируется в некоторых В-клетках после антигенной стимуляции (Fukuda et al., 1997). Клетки, которые не ап-регулируют Вс16, после встречи с антигеном дифференцируются в плазматические клетки, которые служат начальным ис- точником антител с низкой аффинностью (Fukuda et aL, 1997). Наоборот, В-клетки, которые ап-регулируют Вс16, входят в реакцию зародышевого центра (Fukuda et al., 1997) и поддерживаются как В-клетки за счет Вс16- опо- средованной репрессии генов, которые контролируют дифференцировку плазматических клеток (Shaffer et al., 2000). Одной из ключевых мишеней Вс16 является ген Prdml, кодирующий транскрипционный фактор
4. Конечная дифференцировка зрелых В-клеток В-клетки гермина- тивного центра Плазматическая клетка Рис. 21.10. Транскрипционная репрессия определяет судьбу В-клеток зародышевого центра и плазматических клеток Рах5 и Вс16 (вместе с МТАЗ) регулируют программу экспрессии генов В-клеток и поддерживают судьбу В-клеток зародышевого центра (GC) посредством транскрипционной репрессии Blimp 1 — регулятора плазматических клеток. Сильный сигнал BCR в конце развития В-клеток GC ведет к деградации белка Вс16 и сопровождающей ее экспрессии Blimp 1, которая впоследствии репрессирует Вс16 и Рах5 и вместе с ХВР1 индуцирует програм- му транскрипции, характерную для плазматических клеток. Наиболее вероятно, что Blimpl активирует экспрессию ХВР1 косвенно как часть реакции на развернутый белок, посредством индукции экспрессии секретируемых иммуноглобулинов. Де- тальное описание см. в тексте Blimpl (рис. 21.10). Интересно, что, оказывается, Рах5 помогает Вс16 в репрессии гена Blimpl (Prdml) (рис. 21.10) (Delogu et al., 2006). Однако, начав однажды экс- прессироваться, Blimp 1 аннулирует транскрипцион- ную программу В-клеток, включая экспрессию Вс16 и Рах5, и одновременно вызывает транскрипцию генов, специфичных для плазматических клеток (Shaffer et al., 2002; Calame et al., 2003). Bcl6 и Blimp 1 используют ши- рокий арсенал репрессивных механизмов для инакти- вации транскрипции генов. Один характерный аспект Вс16 — это использование ацетилирования лизина за рамками модификации гистонов, чтобы контролиро- вать репрессию генов (Bereshchenko et al., 2002). Вс16 взаимодействует с МТАЗ, субъединицей корепрессор- ного комплекса Mi-2/NuRD, который в высокой степе- ни экспрессируется в В-клетках зародышевого центра (Fujita et al., 2004). Ассоциация Вс16 с комплексом Mi-2/ NuRD, содержащим МТАЗ, необходима для репрессии гена, так как истощение МТАЗ, опосредованное RNAi, ведет к реактивации репрессированных Вс16 генов- мишеней в В-клетках (Fujita et al., 2004). Функция ре- прессии комплекса Вс16/МТАЗ/ Mi-2/NuRD зависит от статуса ацетилирования остатков лизина как в Вс16, так и в гистонах, связанных с локусом репрессированного гена. Для осуществления взаимодействия центрального домена Вс16 с МТАЗ он должен быть деацетилирован, тогда как репрессия гена посредством комплекса МТАЗ/ Mi-2/NuRD зависит от деацетилаз гистонов HDAC1 и HDAC2 класса I (Fujita et al., 2004). Вс16 далее связывается через свой амино-концевой домен POZ с тремя корепрессорами SMRT, NCoR и BCoR взаимоисключающим образом (Huynh and Bard- well, 1998; Huynh et al., 2000). Эти три корепрессора, которые дополнительно взаимодействуют с ферментом класса II — HDAC3 (Huynh et al., 2000), могут усили- вать репрессию, опосредованную МТАЗ, тех же генов, служащих мишенями для Вс16, или сайленсировать другой набор генов в В-клетках зародышевого центра. Антигенная стимуляция высокоаффинных рецепторов Ig на В-клетках зародышевого центра сопровождается редукцией уровня белка Вс16. Активация рецептора, та- ким образом, ведет к фосфорилированию Вс16, индуци- рованному MAP-киназой, которое включает быструю деградацию белка Вс16 по убиквитин-протеосомному пути (Niu et al., 1998). Падение уровня Вс16 смягчает репрессию гена Prdmll, что приводит к увеличению экспрессии бел- ка Blimp 1 и последующему развитию в плазматиче- ские клетки (рис. 21.10) (Shaffer et al., 2000; Calame et al., 2003). Blimp 1 контролирует множество аспектов дифференцировки плазматических клеток. Во-первых, Blimp 1 нацеливает глубинную транскрипционную про- грамму дифференцировки В-клеток с помощью репрес- сирующего Рах5 (рис. 10) (Shaffer et al., 2002), который необходим для поддержания функции и идентичности В-клеток (Horcher et al., 2001; Mikkola et al., 2002). Во- вторых, с помощью даун-регуляции экспрессии других транскрипционных факторов (таких как Spi-B, EBF1, СИТА, Id3, Oct2, и OBF1) Blimp 1 косвенно заканчивает транскрипцию генов, которые кодируют белки, необхо- димые для сигналинга с рецептора антигена и для пре- зентации антигена (Shaffer et al., 2002). В-третьих, что- бы обеспечить покоящееся состояние плазматических клеток, Blimp 1 напрямую репрессирует транскрипцию с-тус (Shaffer et al., 2002). В-четвертых, гены, несоот- ветствующие линии, зарепрессированные в В-клетках при помоши Рах5, реактивируются после того, как в плазматических клетках произошла опосредованная Blimp 1 даун-регуляция экспрессии Рах5 (Delogu et al., 2006). Следовательно, подавляя остальные репрессо- ры, Blimp 1 может косвенно активировать экспрессию дополнительных генов с важными для плазматических клеток функциями. В-пятых, Blimpl необходим для экспрессии секретируемых иммуноглобулинов (Calame et al., 2003), которые накапливаются в эндоплазмати- ческом ретикулуме, активируя тем самым экспрессию ХВР1, как часть реакции на развернутый белок. Транс- крипционный фактор ХВР1 регулирует секрецию анти- тел, и, таким образом, он важен для дифференцировки плазматических клеток (Reimold et al., 2001; Shaffer et al., 2004). Интересно, что Blimp 1 также является ключевым де- терминантом спецификации примордиальных зароды- шевых клеток на ранних стадиях эмбриогенеза, как это обсуждается в главе 20. Механизм Blimp 1-опосредован- ной репрессии в развивающихся примордиальных за- родышевых и плазматических клетках в основном неясен. Похоже, однако, что Blimp 1 использует в плаз- матических клетках те же принципы репрессии, что и в фибробластах, где PRDI-BF1, человеческий ортолог мышиного Blimp 1, участвует в постиндукционной ре- прессии гена p-интерферона (IFNB1) во время вирус- ной инфекции (Keller and Maniatis, 1991). Несколько механизмов отвечают за репрессию гена IFNB1, опо- средованную PRDI-BF1 Присоединение PRDI-BF1 способно переместить активаторы транскрипции с про- мотора /J7V2?7(Keller and Maniatis, 1991). Кроме того, PRDI-BF1 взаимодействует с корепрессорами белково- го семейства Groucho, которое использует деацетилазы
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза гистонов как часть своего репрессионного механизма (Ren et al., 1999). Дальнейший сайленсинг достигает- ся через ассоциацию PRDI-BF1 с белком G9a (Gyory et al., 2004), который принадлежит подсемейству ме- тилтрансфераз гистонов со специфичностью к лизину 9 гистона НЗ (Tachibana et al., 2002). В отличие от Su- v39hl, который использует НЗК9гпеЗ для построения транскипционно репрессивной среды в центромерном гетерохроматине (Peters et al., 2001), G9a вносит свой вклад в НЗК9гпе2 и генный сайленсинг в эухромати- новых участках (Tachibana et al., 2002). Каталитическая активность G9a требуется для подавления функции PRDI-BF1, так как каталитически неактивный белок G9a аннулирует ингибирующее влияние PRDI-BF1 на транскрипцию IFNB1 (Gyory et al., 2004). Далее делеция домена, взаимодействующего с G9a, предотвращает ме- тилирование НЗК9 и транскрипционный сайленсинг посредством PRDI-BF1 (Gyory et al., 2004). В свете этих данных вероятно, что метилирование гистонов, опосре- дованное G9a, является необходимым механизмом, с помощью которого Blimp 1 генерирует стабильный пат- терн экспрессии генов в плазматических клетках. Ин- тересно, что белок Blimp 1 также содержит домен SET подсемейства PR (RIZ). Предположили, что домен SET родственного белка RIZ1 (Prdm2) участвует в супрессии опухоли и метилировании гистона НЗ по лизину 9 (Kim et al., 2003). Следовательно, остается проверить, вносит ли также домен SET белка Blimp 1 свой вклад в репрес- сию гена в процессе дифференцировки плазматических клеток. 4.2. Пластичность зрелых В-клеток в процессе развития Возникновение плазматических клеток обычно считается конечной стадией развития В-клетки, так как экспрессия генов иммуноглобулина — это необходимая функция как В-клеток. так и плазматических клеток. Интересно, что в клетках обоих типов гены иммуноглобулина экспресси- руются под комбинированным контролем убиквитных, а не В-лимфоидных транскрипционных факторов Од- нако, помимо генов иммуноглобулина, В-клетки и плаз- матические клетки радикально различаются по своим паттернам генной экспрессии (Shaffer et al., 2002, 2004). Что касается функции Рах5, плазматические клетки даже как бы дают «задний ход», так как специфический для плазматических клеток сайленсинг экспрессии Рах5 ведет к реактивации генов, нехарактерных для В-линии, которые в норме репрессированы при помощи Рах5 в на- чале развития В-клеток (Delogu et al., 2006). Эти данные по генной экспрессии поддерживают, таким образом, альтернативный взгляд, что дифференцировка В-клеток, простимулированных антигеном, в плазматические клетки — это действительно «линейный» переключатель. Эта гипотеза предсказывает, что потенциал развития зрелой В-клетки не должен быть ограничен судьбой В-лимфоцита, но должен быть более пластичным, что подтверждается следующими данными. Эктопическая экспрессия транскрипционного фак- тора Вс16 В-клетки и его корепрессора МТАЗ в устано- вившихся линиях плазматических клеток ведет к репрес- сии генов, специфических для плазматических клеток, в том числе регуляторных генов Blimpl и ХВР1 (Fujita et al., 2004). В то же время реактивируются множествен- ные гены, специфичные для В-клеток, включая гены- мишени для Рах5 (СИТА and BLN К), и сам ген Рах5 (Fujita et al., 2004). Следовательно, белка Вс16 и его партнера - белка МТАЗ достаточно, чтобы перепрограммировать плазматические клетки в клетки с судьбой В-клеток, по меньшей мере в проанализированных условиях культи- вирования in vitro (рис. 21.11). Транскрипционный фактор С/ЕВРа, который не- обходим для развития гранулоцитов, экспрессируется исключительно в миелоидных прогениторах и их диф- ференцированных потомках (Akashi et al., 2000). При- нудительная экспрессия С/ЕВРа в В-лимфоцитах из костного мозга или селезенки ведет к эффективной трансдифференцировке инфицированных В-клеток в функциональные макрофаги в течение 5 дней (Xie et al., 2004). Таким образом, С/ЕВРа активирует миелоидную генную программу и параллельно репрессирует гены, специфичные для В-клеток, интерферируя с транс- крипционной активностью Рах5 (Xie et al., 2004). Сле- довательно, потеря функции Рах5, по-видимому, об- легчает превращение В-клеток, присущее миелоидной клеточной линии в ответ на эктопическую экспрессию С/ЕВРа (рис. 21.11). Условная инактивация гена однозначно указы- вает на решающую роль Рах5 в контроле идентич- ности В-клеток в процессе В-лимфопоэза. Сге- опосредованная генная делеция в коммитированных про-В-клетках показывает, что Рах5 необходим не толь- ко для того, чтобы инициировать свою В-лимфоидную программу транскрипции, но и для поддержания ее на ранних этапах развития В-клетки (Mikkola et al., 2002). Как следствие инактивации Рах5, ранее коммитирова- ные про-В-клетки восстанавливают способность диф- ференцироваться в макрофаги in vitro и возрождать раз- витие Т-клеток in vivo (рис. 21.11) (Mikkola et al., 2002). Условная) делеция Рах5 в зрелых В-клетках также ведет к утрате Рах5-зависимой программы экспрессии гена (Horcher et al., 2001; Delogu et al., 2006). Однако более удивительно то, что зрелые В-клетки с делецией Рах5 все время ретродифференцируются in vivo в мутантные по Рах5 прогениторы после того, как их инъецируют в мы- шей, дефектных по RAG2. Эти мутантные по Рах5 про- гениторы возвращаются в костный мозг, из которого они заселяют тимус и полностью восстанавливают развитие Т-клеток в RAG2-дeфицитнoм хозяине (рис. 21.11) Тот факт, что соответствующие дважды-позитивные тимоциты CD4+CD8+ несут IgH и IgK и перестройки TCRa and TCRfi, однозначно демонстрирует, что зрелые В-клетки после потери Рах5 могут быть превращены в Т-клетки через ретродифференцировку в стадию не- коммитированной клетки-прогенитора (С. Cobaleda and М. Busslinger, неопубл.). Следовательно, экспрессия Рах5 постоянно требуется для поддержания идентично- сти В-лимфоцитов от стадии про-В-клетки до стадии зрелой В-клетки. На основании анализа других систем развития у мух и позвоночных животных, предпола-
Делеция Рах5 /|\ Т-клетки перестраивают гены 1g (антител) | С/ЕВ Р Макрофаги Рис. 21.11. Пластичность В-лимфоцитов на разных этапах развития Эктопическая экспрессия Вс16 и МТАЗ в установившихся линиях клеток плазмы сайленсирует транскрипцию генов, специфических для плазматических клеток, и одновременно реактивирует программу экспрессии В-клеток (оранжевая стрелка) (Fujita et aL, 2004). CD19+ В лимфоциты, которые не были далее охарактеризованы относительно их стадии развития, подвергаются стремительной трансдифференцировке в макрофаги in vitro в ответ на принудительную экспрессию С/ЕВРа (красная стрелка) (Xie et aL, 2004). Условная делеция Рах5 позволяет коммитированным про-В-клеткам и даже зрелым В-клеткам ретродифференцироваться in vivo в некоммитированные прогениторы, которые затем развиваются в остальные типы гематопоэтических клеток в костном мозге или в Т-клетки в тимусе (черные стрелки) (Mikkola et aL, 2002; С. Cobaleda и М. Busslinger, неопубликованные данные) Синий цвет означает экспрессию Рах5 во время развития В-клетки гается, что транскрипционные факторы инициируют «решение» о той или иной судьбе клетки посредством изменения паттернов экспрессии генов, тогда как транскрипционное состояние коммитированных кле- ток впоследствии поддерживается эпигенетическими факторами, кодируемыми группами генов Polycomb и Trithorax (Ringrose and Раго, 2004; обсуждается подроб- нее в главах 11 и 12). Постоянная потребность в транс- крипционном факторе Рах5 могла бы свидетельство- вать против важной роли этих систем эпигенетической памяти в развитии В-клеток. Однако более вероятно, что Рах5 может поддерживать идентичность В-клеток, выступая ключевым фактором рекрутирования, чтобы нацелить белковые комплексы Polycomb или Trithorax на регуляторные элементы генов. 5. Заключительные замечания Резюмируя вышеизложенное, заметим, что в регуляции и направлении развития лимфоцита участвуют разно- образные эпигенетические механизмы. Из всех раз- личных эпигенетических регуляторов мы в настоящее время больше всего знаем о роли транскрипционных факторов, которые контролируют общие паттерны ген- ной экспрессии, рекрутируя модифицирующие хроматин активности (такие, как ацетилтрансферазы гистонов или деацетилазы гистонов) к регуляторным элементам генов. Меньше известно про контроль над генной экс- прессией метилтрансферазами гистонов, белками групп Trithorax и Polycomb или путями microRNA и siRNA. Расшифровка роли этих регуляторных систем потребует экспериментально сконструированной условной инак- тивации гена, потому что метилтрансферазы гистонов, белки Trithorax и Polycomb так же, как и компоненты аппарата RNAi, являются фундаментально важными не только для лимфопоэза, но также и для эмбрионального развития. Более того, развитие и доступность методов иммунопреципитации хроматина на микрочипе (ChlP- on-chip) позволят с высоким разрешением картировать эпигенетические модификации в целых хромосомах и сложных локусах (таких, как локусы рецепторов анти- генов) на разных стадиях лимфопоэза. Эти недавние достижения, по-видимому, обеспечат новое понимание механизмов эпигенетического контроля, лежащих в основе развития лимфоцитов Литература Adolfsson J., Mansson R., Buza-Vidas N., Hultquist A., Liuba K., Jensen C.T., Bryder D., Yang L., Borge O.J., Thoren L.A.M., et aL, 2005. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythromegakaryocytic potential: A revised road map for adult blood lineage commitment. Cell 121: 295-306. Akashi K., Traver D., Miyamoto T., and Weissman LL., 2000. A clono-genic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature 404:, 193-197. Allman D., Sambandam A., Kim S., Miller J.P., Pagan A., Well D., Meraz A., and Bhandoola A., 2003. Thymopoiesis independent of common lymphoid progenitors. Nature Immunol. 4: 168-174. Barlev N. A., Emelyanov A. V, Castagnino P., Zegerman P., Bannister A. J., Sepulveda M.A., Robert E, Tora L., Kouzarides T, Birshtein B.K., and Berger S.L., 2003. A novel human Ada2 homologue functions with Gcn5 or Brg 1 to coactivate transcription. Mol. Cell. Biol. 23: 6944-6957.
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза Bassing С.Н., Swat W., and Alt E.W., 2002. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell (suppl.) 109: S45-S55. Baxter J., Merkenschlager M., and Fisher A.G., 2002. Nuclear organisation and gene expression. Curr Opin. Cell Biol. 14: 372-376. Baxter J., Sauer S., Peters A., John R., Williams R., Caparros M.L., Arney K., Otte A., Jenuwein T, Merkenschlager M., and Fisher A.G., 2004. Histone hypomethylation is an indicator of epigenetic plasticity in quiescent lymphocytes. EMBO J. 23: 4462-4472. Bereshchenko O.R., Gu W., and Dalia-Favera R., 2002. Acetyla- tion inactivates the transcriptional repressor BCL6. Nat. Genet. 32: 606-613. Borland D.J., Wood A.L., Johnston CM., Bunting S.F., Morgan G., Chakalova L., Fraser P.J. and Corcoran A.E., 2004. Antisense inter-genic transcription in V(D)J recombination. Nat. Immunol. 5: 630-637. Brown K.E., Guest S.S., Smale S.T., Hahm K., Merkenschlager M., and Fisher A.G., 1997. Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin. Ce//91: 845-854. Busslinger M., 2004. Transcriptional control of early В cell develop- ment. Annu Rev. Immunol 22: 55-79. Calame K.L., Lin К.1., and Tunyaplin C., 2003. Regulatory mecha- nisms that determine the development and function of plasma cells. Annu. Rev. Immunol. 21:, 205-230. Chow CM., Georgiou A., Szutorisz H., Maia e Silva A., Pombo A., Barahona I., Dargelos E., Canzonetta C. and Dillon N., 2005. Variant histone НЗ.З marks promoters of transcriptionally active genes during mammalian cell division. EMBO Rep. 6: 354-360. Chowdhury D. and Sen R., 2001. Stepwise activation of the immu- noglobulin p heavy chain gene locus. EMBO J., 20: 6394-6403. Chowdhury D. and Sen R., 2003. Transient IL-7/IL-7R signaling provides a mechanism for feedback inhibition of immunoglobulin heavy chain gene rearrangements. Immunity 18: 229-241. Dakic A., Metcalf D., Di Rago L., Mifsud S., Wu L., and Nutt S.L., 2005. PU.l regulates the commitment of adult hematopoietic progenitors and restricts granulopoiesis./. Exp. Med., 201:1487- 1502. Delogu A., Schebesta A., Sun Q., Aschenbrenner K., Perlot T, and Busslinger M., 2006 Gene repression by Pax5 in В cells is es- sential for blood cell homeostasis and is reversed in plasma cells. Immunity 24: 269-281. Fisher A.G., 2002. Cellular identity and lineage choice. Nat. Rev. Immunol. 2: 977-982. Francis N.J., Kingston R.E., and Woodcock C.L., 2004. Chromatin compaction by a polycomb group protein complex. Science 306: 1574-1577. Fujita N., Jaye D.L., Geigerman C., Akyildiz A., Mooney M.R., Boss J.M., and Wade P.A., 2004. МТАЗ and the Mi-2/NuRD complex regulate cell fate during В lymphocyte differentiation. Ce//119: 75-86. Fukuda T, Yoshida T, Okada S., Hatano M., Miki T, Ishibashi K., Okabe S., Koseki H., Hirosawa S., Taniguchi M., et al., 1997. Disruption of the Bcl6gpr\e results in an impaired germinal center formation. /. Exp. Med. 186: 439-448. Fuxa M., Skok J., Souabni A., Salvagiotto G., Roldan E., and Bus- slinger M., 2004. Pax5 induces V-to-DJrearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18:411-422. Goldmit M., Ji Y, Skok J., Roldan E., Jung S., Cedar H., and Berg- man Y., 2005. Epigenetic ontogeny of the IgK. locus dunng В cell development. Nat. Immunol. 6:, 198-203. Goldmit M., Schlissel M., Cedar H., and Bergman Y, 2002. Dif- ferential accessibility at the к chain locus plays a role in allelic exclusion. EMBO 7.21:5255-5261. Grawunder U., Leu T.M.J., Schatz D.G., Werner A., Rolink A.G., Melchers E, and Winkler TH., 1995. Down-regulation of RAG1 and RAG2 gene expression in pre В cells after func- tional immunoglobulin heavy chain rearrangement. Immunity 3: 601-608. Gyory L, Wu J., Fejer G., Seto E., and Wright K.L., 2004. PRDLBF1 recruits the histone H3 methyltransferase G9a in transcriptional silencing. Nat. Immunol. 5: 299-308. Hesslein D.G.T.. Pflugh D.L., Chowdhury D., Bothwell A.L.M., Sen R., and Schatz D.G., 2003. Pax5 is required for recombination of transcribed, acetylated, 5’ IgH V gene segments. Genes Dev. 17:37-42. Honjo T, Muramatsu M., and Fagarasan S., 2004. AID: How does it aid antibody diversity? Immunity, 20: 659-668. Horcher M., Souabni A., and Busslinger M., 2001. Pax5/BSAP maintains the identity of В cells in late В lymphopoiesis. Im- munity 14: 779-790. Huynh K.D. and Bardwell V.J., 1998. The BCL-6 POZ domain and other POZ domains interact with the co-repressors N-CoR and SMRT. Oncogene 17: 2473-2484. Huynh K.D., Fischle W, Verdin E., and Bardwell V.J., 2000. BCoR, a novel corepressor involved in BCL-6 repression. Genes Dev. 14: 1810-1823. Ikawa T, Kawamoto H., Wright L.Y.T., and Murre C., 2004. Long- term cultured E2A-deficient hematopoietic progenitor cells are pluripotent. Immunity, 20: 349-360. Jankovic M., Casellas R., Yannoutsos N., Wardemann H., and Nussen-zweig M.C., 2004. RAGs and regulation of autoantibod- ies. Annu. Rev. Immunol. 22: 485-501. Keller A.D. and Maniatis T, 1991. Identification and characteriza- tion of a novel repressor of p-interferon gene expression. Genes Dev. 5: 868-879. Kim K.C., Geng L., and Huang S., 2003. Inactivation of a histone methyltransferase by mutations in human cancers. Cancer Res. 63:7619-7623. Kitamura D. and Rajewsky K., 1992. Targeted disruption of p chain membrane exon causes loss of heavy-chain allelic exclusion. Nature 556:154-156. Kosak S.T., Skok J.A., Medina K.L., Riblet R., Le Beau M.M., Fisher A.G., and Singh H., 2002. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science 296:158-162. Kovanen PE. and Leonard W.J., 2004. Cytokines and immunode- ficiency diseases: Critical roles of the yc-dependent cytokines interleukins 2, 4,7,9,15, and 21, and their signaling pathways. Immunol. Rev., 202: 67-83. Krangel M.S., 2003. Gene segment selection in V(D)J recombina- tion: Accessibility and beyond. Nat. Immunol. 4: 624-630. Kraus M., Alimzhanov M.B., Rajewsky N., and Rajewsky K., 2004. Survival of resting mature В lymphocytes depends on BCR signal- ing via the Iga/p heterodimer. Cell 117: 787-800. Lee А.1., Fugmann S.D., Cowell L.G., Ptaszek L.M., Kelsoe G., and Schatz D.G., 2003. A functional analysis of the spacer of V(D)J recombination signal sequences. PLoS Biol. 1: 56-69.
Liang H.E., Hsu L.Y., Cado D., and Schlissel M.S., 2004. Variegated transcriptional activation of the immunoglobulin к locus in pre-B cells contnbutes to the allelic exclusion of light-chain expression. Ce//118:, 19-29. Linderson Y, Eberhard D., Malin S., Johansson A., Busslinger M., and Pettersson S., 2004. Corecruitment of the Grg4 repressor by PU.l is critical for Pax5-mediated repression of B-cell-specific genes. EMBO Rep. 5:291-296. Maier H., Colbert J., Fitzsimmons D., Clark D.R., and Hagman J., 2003. Activation of the early B-cell-specific mb-1 (Ig-a) gene by Pax-5 is dependent on an unmethylated fits binding site. Mol. Cell. Biol. 23:, 1946-1960. Maier H., Ostraat R., Gao H., Fields S., Shinton S.A., Medina K.L., Ikawa T, Murre C., Singh H., Hardy R.R., and Hagman J., 2004. Early В cell factor cooperates with Runx 1 and medi- ates epigenetic changes associated with mb-1 transcription. Nat. Immunol. 5: 1069-1077. Massari M.E., Grant P.A., Pray-Grant M.G., Berger S.L., Workman J.L., and Murre C., 1999. A conserved motif present in a class of helix-loop-helix proteins activates transcription by direct recruit- ment of the SAGA complex. Mol. Cell. 4: 63-73. McBlane F. and Boyes J., 2000. Stimulation ofV(D)J recombination by histone acetylation. Curr. Biol. 10: 483-486. McMurry M.T. and Krangel M.S., 2000. A role for histone acetyla- tion in the developmental regulation of V(D)J recombination. Science 287: 495-498. Medina K.L., Pongubala J.M., Reddy K.L., Lancki D.W., DeKoter R., Kieslinger M., Grosschedl R., and Singh H., 2004. Assem- bling a gene regulatory network for specification of the В cell fate. Dev. Cell 7:607-617. Mikkola I., Heavey B., Horcher M., and Busslinger M., 2002. Reversion of В cell commitment upon loss of Pax5 expression. Science 291: 110-113. Mito Y.. Henikoff J.G.. and Henikoff S.. 2005. Genome-scale profiling of histone НЗ.З replacement patterns. Nat Genet. 37: 1090-1097. Miyamoto T, Iwasaki H., Reizis B., Ye M., Graf T, Weissman I.L., and Akashi K., 2002. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev. Cell 3: 137-147. Morshead K.B., Ciccone D.N., Taverna S.D., Allis C.D., and Oettinger M.A., 2003. Antigen receptor loci poised for V(D)J rearrangement are broadly associated with BRG1 and flanked by peaks of histone H3 dimethylated at lysine 4. Proc. Natl. Acad. Sci. tt£4100: 11577-11582. Mostoslavsky R., Singh N., Kirillov A., Pelanda R., Cedar H., Chess A., and Bergman Y., 1998. К chain monoallelic demethylation and the establishment of allelic exclusion. Genes Dev. 12: 1801- 1811. Mostoslavsky R., Singh N., Tenzen T, Goldmit M., Gabay C, Elizur S., Qi P., ReubinoffB.E., Chess A., Cedar H., and Bergman Y, 2001. Asynchronous replication and allelic exclusion in the im- mune system. Nature 414: 221-225. Niu H., Ye B.H., and Dalla-Favera R., 1998. Antigen receptor signaling induces MAP kinase-mediated phosphorylation and degradation of the BCL-6 transcription factor. Genes Dev. 12:, 1953-1961. Nutt S.L., Heavey B., Rolink A.G., and Busslinger M., 1999. Com- mitment to the B-lymphoid lineage depends on the transcription factor Pax5 Nature 401: 556-562. Nutt S.L., Urbanek P, Rolink A., and Busslinger M., 1997. Essential functions of Pax5 (BSAP) in pro-В cell development: Difference between fetal and adult В lymphopoiesis and reduced V-to-D] recombination at the IgH locus. Genes Dev. 11: 476—491. Orphanides G. and Reinberg D., 2000. RNA polymerase II elonga- tion through chromatin. Nature 407: 471-475. Osipovich O., Milley R., Meade A., Tachibana M., Shinkai Y., Krangel M.S., and Oltz E.M., 2004. Targeted inhibition ofV(D) J recombination by a histone methyltransferase. Nat. Immunol. 5:309-316. Peters A.H., O’Carroll D., Scherthan H., Mechtler K., Sauer S., Schufer C., Weipoltshammer K., Pagani M., Lachner M., Kohlmaier A., et al., 2001. Loss of the Suv39h histone methyl- transferases impairs mammalian heterochromatin and genome stability. Cell 107: 323-337. Rajewsky K., 1996. Clonal selection and learning in the antibody system. Nature 381: 751-758. Reimold A.M., Iwakoshi N.N., Manis J., Vallabhajosyula P., Szo- molanyl-Tsuda E., Gravallese E.M., Friend D., Grusby M.J., Alt R, and Glimcher L.H., 2001. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature 412: 300-307. Ren B., Chee K.J., Kim TH., and Maniatis T, 1999. PRDI-BF1/ Blimp-1 repression is mediated by corepressors of the Groucho family of proteins. Genes Dev. 13: 125-137. Ringrose L. and Paro R.. 2004. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins. Annu. Rev. Genet. 38: 413-443. Roldan E., Fuxa M., Chong W, Martinez D., Novatchkova M., Busslinger M., and Skok J.A., 2005. Locus ‘decontraction’ and cen-tromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nat. Immunol. 6: 31-41. Romanow W.J., Langerak A.W., Goebel P, Wolvers-Tettero LL.M., van Dongen J.J.M., Feeney A.J., and Murre C., 2000. E2A and EBF act in synergy with the V(D)J recombinase to generate a diverse immunoglobulin repertoire in nonlymphoid cells. Mol. Cell 5: 343-353. Sato H., Saito-Ohara R, Inazawa J., and Kudo A., 2004. Pax-5 is essential for к sterile transcription during IgK chain gene rear- rangement. J. Immunol. 172: 4858-4865. Schlissel M.S., Durum S.D., and Muegge K., 2000. The interleukin 7 receptor is required for T cell receptor у locus accessibility to the V(D)J recombinase. J. Exp. Med., 191: 1045-1050. Seet C.S.. Brumbaugh R.L., and Kee B.L., 2004. Early В cell factor promotes В lymphopoiesis with reduced interleukin 7 responsive- ness in the absence of E2A. J. Exp. Med., 199: 1689-1700. Shaffer A.L., YuX., He Y., Boldrick J., Chan E.P., and Staudt L.M., 2000. BCL-6 represses genes that function in lymphocyte dif- ferentiation, inflammation and cell cycle control. Immunity 13:, 199-212. Shaffer A.L., Lin K.I., Kuo T.C., Yu X., Hurt E.M., Rosenwald A., Giltnane J.M., Yang L., Zhao H., Calame K., and Staudt L.M.. 2002. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature В cell gene expression program. Im- munity 17:51-62. Shaffer A.L., Shapiro-Shelef M., Iwakoshi N.N., Lee A.-H., Qian S.B., Zhao H., Yu X., Yang L., Tan B.K., Rosenwald A., et al., 2004. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity 21:81-93.
Глава 21. Эпигенетическое регулирование лимфоцитопоэза Skok J.A., Brown К.Е., Azuara V, Caparros M.L., Baxter J., Takacs K., Dillon N., Gray D., Perry R.P., Merkenschlager M., and Fisher A.G., 2001. Nonequivalent nuclear location of immuno- globulin alleles in В lymphocytes. Nat. Immunol. 2: 848-854. Smale S.T., 2003. The establishment and maintenance of lymphocyte identity through gene silencing. Nat Immunol. 4: 607-615. Stanhope-Baker P, Hudson KM., Shaffer A.L., Constantinescu A., and Schlissel M.S., 1996. Cell type-specific chromatin structure determines the targeting of V(D)J recombinase activity in vitro. Cell 85: 887-897. Su I.H., Basavaraj A., KrutchinskyA.N., Hobert O., Ullrich A., Chait B.T., and Tarakhovsky A., 2003. Ezh2 controls В cell develop- ment through histone H3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4: 124-131. Su I.H., Dobenecker M.W., Dickinson E., Osier M., Basavaraj A., Marqueron R., Viale A., Reinberg D., Wiilfing C., and Tarak- hovsky A., 2005. Polycomb group protein Ezh2 controls actin polymerization and cell signaling. Cell 121: 425-436. Tachibana M., Sugimoto K., Nozaki M., Ueda J., Ohta T, Ohki M., Fukuda M., Takeda N., Niida H., Kato H., and Shinkai Y., 2002. G9a histone methyltransferase plays a dominant role in euchromatic histone H3 lysine 9 methylation and is essential for early embryogenesis. Genes Dev. 16: 1779-1791. Turner C.A.J., MackD.H., and Davis M.M., 1994. Blimp-1, a novel zinc finger-containing protein that can drive the maturation of В lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells Cell 77: 297-306. Vosshenrich C.A.J., Cumano A., Muller W., Di Santo J.P, and Vieira R, 2003. Thymic stroma-derived lymphopoietin distinguishes fetal from adult В cell development. Nat. Immunol. 4: 773-779. Waskow C, Paul S., Haller C, Gassmann M., and Rodewald H., 2002. Viable c-Kitw/w mutants reveal pivotal role for c-Kit in the main- tenance of lymphopoiesis. Immunity Yl: 277-288. West K.L., Singha N.C., De loannes P, Lacomis L., Erdjument- Bromage H., Tempst P, and Cortes P, 2005. A direct interaction between the RAG2 C terminus and the core histones is required for efficient V(D)J recombination. Immunity 23:, 203-212. Xie H., Ye M., Feng R., and Graf T, 2004. Stepwise reprogramming of В cells into macrophages. Cell 117: 663-676. Yancopoulos G.D. and Alt F.W., 1985. Developmentally controlled and tissue-specific expression of unrearranged VH gene segments. Cell 40:271-281. Ye B.H., Cattoretti C., Shen Q., Zhang J., Hawe N., de Waard R., Le- ung C., Nouri-Shirazi M., Orazi A., Chaganti R.S.K., et al., 1997. The BCL-6proto-oncogene controls germinal-centre formation and Th2-type inflammation. Nature Genet. 16: 161-170. Zhang S., Fukuda S., Lee Y, Hangoc G., Cooper S., Spolski R., Leonard W.J., and Broxmeyer H.E., 2000. Essential role of signal transducer and activator of transcription (Stat) 5a but not Stat5b for Flt3-dependent signaling. J. Exp. Med., 192: 719-728.
ГЛАВА 22 ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЯДЕР И РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ГЕНОМА Rudolf Jaenisch и John Gurdon Whitehead Institute, and Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts 02142-1479 The Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, The Henry Wellcome Building of Cancer and Developmental Biology, University of Cambridge. Camebridge CB2 1QN, United Kingdom СОДЕРЖАНИЕ Общее резюме 1. История 2. Процедуры пересадки ядер 2.1. Амфибии 2.2. Млекопитающие 3. Фенотип клонированных животных 3.1. Амфибии 3.2. Млекопитающие 3.3. Получение клонированных млекопитающих от терминально дифференцированных клеток 4. Изменения, связанные с репрограммировани- ем ядра ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ План тела животных сконструирован из сотен разных ти- пов клеток, выполняющих различные физиологические функции организма. Ключевым вопросом, поставлен- ным уже давно, является вопрос о механизме диффе- ренциальной экспрессии генов, который обеспечивает активность или «молчание» генов, нужных для нормаль- ного функционирования данной дифференцированной клетки. В прежние дни, до того как удалось оценить молекулярные основы генной экспрессии, гипотетиче- ски предполагали, что основой тканеспецифичной экс- 4.1. Амфибии 4.2. Млекопитающие 5. Эпигенетическая память 6. Значение ядерной трансплантации для медици- ны 6.1. Репродуктивное клонирование 6.2. Применение ядерной трансплантации в терапии 6.3. Репродуктивное versus терапевтическое клонирование: в чем разница? Литература прессии генов могла бы быть генетическая элиминация или перманентная инактивация «молчащих» генов из тех тканей, которые не экспрессировали «молчащие» гены, и сохранение тех генов, которые экспрессируются. Действительно, у некоторых организмов, таких как на- секомое Sciara. генетический материал элиминируется из соматических тканей, и полный генетический набор сохраняется только в клетках зародышевого пути. Это ставит вопрос об «эквивалентности ядер», т. е. о том, сохраняет ли геном соматических клеток полный набор генетического материала. Самым прямым подходом к решению этого вопроса является ядерное клонирование,
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома тле возможности ядра соматической донорской клетки направлять развитие нового организма проверяются пу- тем его трансплантации в денуклеированную яйцеклетку. В самом деле, получение клонированных животных из ядер соматических клеток доказало, вне всякого сомне- ния, что главные генетические изменения, не даюшие соматическому ядру генерировать все клеточные типы, не являются частью нормального процесса развития. 1. История Первый успех в трансплантации ядра одной клетки в другую у многоклеточного организма был достигнут Бриггсом и Кингом в 1952 году (Briggs and King, 1952), хотя до этого пересадка ядра была сделана у однокле- точных организмов, в том числе у амебы, инфузорий и Acetabularia (Gurdon, 1964). Бриггс и Кинг (Briggs and King, 1952) получили нормальных плавающих голова- стиков в результате пересадки ядер клеток бластулы в денуклеированное яйцо Ranapipiens. В этой и последую- щих работах с R. pipiens до 30 % пересадок ядер бластулы давали морфологически нормальные постнейральные стадии. Значение этого раннего достижения заключалось в том, что оно открыло способ протестировать, могут ли ядра дифференцированных клеток также поддержи- вать нормальное развитие реципиентных яйцеклеток, т. е. замещать зиготическое ядро нормально оплодот- воренных яиц. В следующей важной статье Бриггса и Кинга (Briggs and King, 1957) сообщалось, что очень скоро после стадии бластулы ядра соматических клеток (в этом случае эндодермы) утрачивают способность поддерживать нормальное развитие. Действительно, к стадии хвостовой почки ядра эндодермы больше не обе- спечивали нормальное развитие. Вскоре после этого сообщили об успешной пересадке 44epyAeA7O/w5(Fischberget al., 1958). У этого вида для дока- зательства того, что развитие эмбрионов-трансплантатов обеспечивалось исключительно активностью пересажен- ного ядра без какого-либо вклада со стороны ядра яйце- клетки, которое было убито ультрафиолетовым облуче- нием, был использован генетический маркер. У Xenopus полученные в результате трансплантации ядер эмбрио- ны развивались более нормально, чем у Rana, и очень быстро достигали стадии взрослого животного. Первые половозрелые взрослые клонированные животные были получены у Xenopus в результате пересадки ядер эндодер- мы (Gurdon et al., 1958), и большая их часть выглядела нормальной во всех отношениях. Чтобы ядерное клонирование оказалось успешным, яйцеклетка должна «репрограммировать» соматическое донорское ядро в «эмбриональное» эпигенетическое состояние, чтобы могла быть активирована генетиче- ская программа, необходимая для эмбрионального раз- вития. Современные исследования сфокусированы в основном на том, чтобы понять молекулярные основы репрограммирования в экспериментах с транспланта- цией ядер. Поскольку эмбриональное развитие у амфи- бий и у млекопитающих очень различается, каждая из этих систем может обеспечить проникновение в разные аспекты проблемы репрограммирования в опытах по трансплантации ядер. Например, благодаря тому, что у амфибий легко можно получить огромное число круп- ных яиц, эта система особенно полезна для проведения биохимических анализов. Напротив, млекопитающие, в особенности мыши, позволяют применять, в первую очередь, тканевые культуры и генетические подходы. По этим причинам наблюдения, сделанные на амфибиях и на млекопитающих, являются взаимодополняющими и обсуждаются совместно, чтобы подчеркнуть сходства и различия этих двух систем. Прежде всего мы описываем фенотип клонированных амфибий и млекопитающих и как на него влияет состояние дифференцировки до- норского ядра. За этим следует описание молекулярных механизмов, признанных важными для репрограмми- рования. В конце обсуждаются потенциальные возмож- ности трансплантации ядер для терапии. 2. Процедуры пересадки ядер 2.1. Амфибии Доступность яиц Xenopus на протяжении всего года и легкость содержания этого водного животного в лабора- тории обусловили то обстоятельство, что большая часть работ по пересадкам ядер у амфибий, после первоначаль- ного успеха с Rana, была предпринята тXenopus Следует различать два рода экспериментов в соответствии с тем, инъецируются ядра в денуклеированные яйцеклетки или же в неденуклеированные ооциты (рис. 22.1). Пересадка ядра требует инъекции всей донорской клетки, плаз- матическую мембрану которой предварительно делают проницаемой либо физическими методами, например всасыванием этой клетки в пипетку, слишком маленькую по сравнению с размерами клетки, либо химическими методами, за счет кратковременной обработки интегри- рующим мембрану веществом. Количество цитоплазмы донорской клетки, вводимое с ядром, равно приблизи- тельно 10'5 объема яйцеклетки и никакого влияния не оказывает. Яйцеклетки, получившие пересаженное ядро, культивируются в простом непитательном солевом рас- творе, эквивалентном прудовой воде, и, следовательно, развиваются независимо от культурального раствора. Пересадка ядер в ооциты выглядит совершенно ина- че. Полностью выросшие ооциты, взятые из яичника самки, находятся в профазе первого мейоза (рис. 22.1). Ядра примерно 50 соматических клеток, инъецирован- ные в ядро (зародышевый пузырек) этих растущих ооци- тов, не реплицируют ДНК и не делятся, но на протяже- нии нескольких дней становятся все более активными в отношении транскрипции. Ооциты, получившие пере- саженные ядра, культивируются подобно яйцеклеткам в непитательной солевой среде и не претерпевают ника- ких морфологических изменений на протяжении всего периода культивирования (две недели и больше) 2.2. Млекопитающие Самые ранние попытки клонировать млекопитающих были выполнены с эмбрионами кроликов. В этих экс- периментах ооциты сливали с клетками, взятыми от
2. Процедуры пересадки ядра Яйцеклетка Плавающий головастик (3 дня) Экспрессия новых генов и новые типы клеток Ядра соматических клеток, Ооцит инъецированные в заро- дышевый пузырек ооцита Полностью выросший ооцит Культивирование in vitro Нет репликации ДНК или клеточных делений Интенсивная транскрипция генов Полностью выросший ооцит (4+ дня) Экспрессия новых генов Рис. 22.1. Схема, изображающая два типа экспериментов по трансплантации ядер у Xenopus Верхняя часть рисунка иллюстрирует пересадки одиночных ядер в яйцеклетки, денуклеированные ультрафиолетовым облучением (УФ). Спустя три дня после пересадки ядра формируется плавающий головастик Нижняя часть рисунка показывает множествен- ные пересадки ядер в растущие ооциты на стадии первой мейотической профазы (GV) Зародышевый пузырек, или ядро ооцита. Подвергшиеся инъекции ооциты не делятся и могут культивироваться в течение многих дней. Инъецированные ядра соматических клеток претерпевают изменения в экспрессии генов на протяжении первых четырех дней культивирования эмбрионов на стадии морулы, и было видно, что по- лучающиеся в результате этого триплоидные клоны проделывали несколько делений дробления (Bromhall, 1975). В 1984 году МакГрат и Солтер применили слияние с помощью вируса Сендай для эффективной пересадки донорских ядер в денуклеированные зиготы. Этот метод был использован для экспериментов двух типов: (1) по- лучают однородительские эмбрионы, замещая мужской пронуклеус женским (что дает начало гиногенетическому зародышу) или замещая женский пронуклеус муж- ским (что дает начало андрогенетическому эмбриону) (McGrath and Solter, 1984а,b; Surani et al., 1984). Одноро- дительские эмбрионы не развиваются и неизменно поги- бают, давая первое доказательство того, что нормальное развитие млекопитающих критическим образом зависит отродительски-специфичного геномного импринтинга (2) Клонированные эмбрионы были получены путем пересадки ядер от эмбрионов-доноров, находящихся на стадии дробления, в денуклеированные зиготы. Ни один из таких реконструированных эмбрионов не развивался дальше поздней стадии дробления, из чего следует, что тотипотентность генома в ходе раннего развития быстро утрачивается и что клонирование млекопитающих, в противоположность амфибиям, может быть невозмож- ным (McGrath and Solter, 1984b). Однако результаты, полученные на других видах млекопитающих, вскоре поставили этот вывод под сомнение В 1986 году Вилладсену (Willandsen) удалось клони- ровать живых ягнят из ядер 4—16-клеточного эмбриона и вскоре после этого последовало создание клонирован- ных телят и свиней (Robi et al., 1987; Prather et al., 1989). Почему клонирование сельскохозяйственных живот- ных оказалось успешным в противоположность хоро- шо контролируемым экспериментам по клонированию мышей (McGrath and Solter, 1984b)? Основное различие в развитии этих видов животных заключается в сроках перехода от материнского контроля развития (на основе запасенной матерью РНК) к зиготическому контролю развития (на основе зиготически продуцируемой РНК). Этот основной переход, по-видимому, происходит на 8—16-клеточной стадии у овец и крупного рогатого ско- та (Calarco and McLaren, 1976; Camous et al., 1986), но уже на 2-клеточной стадии у эмбрионов мышей (Bolton et al., 1984). Таким образом, у клонируемых эмбрионов овец или коров временные ограничения для активации донорского генома могут быть менее жесткими, чем у клонируемых эмбрионов мышей, где для того, чтобы происходило дробление, донорское ядро должно быть активировано вскоре после пересадки. Первым успешным получением клонированных жи- вотных путем пересадки ядра соматической клетки, а не пересадки ядра из клеток-доноров эмбриона на стадии дробления, было получение овцы из культивируемых фибробластов донора (Campbell et al., 1996b). За этим
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома вскоре последовало создание «Долли» из донорско- го ядра клетки молочной железы (Wilmut et al., 1997); «Долли» оказалась первым млекопитающим, клониро- ванным из донорской клетки взрослого животного. С тех пор были клонированы всего 15 видов млекопитаю- щих, в том числе мыши, козы, свиньи, коровы, кроли- ки, крысы, кошки и собаки (обзор см. Campbell et al., 2005). Процедура клонирования млекопитающего, как и клонирование амфибий, включает два этапа. В боль- шинстве, если не во всех успешных экспериментах по пересадке ядра соматической клетки, донорские ядра переносились в денуклеированные ооциты ( в отличие от ранних опытов по клонированию мышей, где донор- ское ядро от эмбриона на стадии дробления вводилось в денуклеированную зиготу; McGrath and Solter, 1984). На первом этапе пипеткой удаляли метафазное веретено яйцеклетки-реципиента, вслед за чем в денуклеирован- ное яйцо пересаживали донорское ядро. У большинства млекопитающих донорское ядро вводилось в яйцеклет- ку путем электрослияния с денуклеированным яйцом. У мышей яйцеклетки особенно легко повреждаются, и пересадка ядра у этого вида наиболее эффективна путем физического переноса донорского ядра в яйцо (Wakaya- ma et al., 1998). Как изображено на рис. 22.2, донорское ядро вводится в денуклеированное яйцо с помошью пьезоэлемента, который облегчает проникновение че- рез zona pellucida и цитоплазматическую мембрану (Wa- kayama et al., 1998). Клонированные бластоцисты либо имплантируются в матку псевдобеременной приемной матери, чтобы получить клонированных мышей, либо эксплантируются в тканевую культуры, чтобы получить эмбриональные стволовые клетки от пересадки ядра (NT-ES, nuclear transfer embryonic stem cells). Клетки a Выделение NT-мышь эмбриональные стволовые клетки NT-мышь 8-16 клеток Морула Бластоциста Рис. 22.2. Пересадка ядер у мышей с помощью микроинъекций (а) Схематическое изображение процедуры ядерной пересадки. Когда бластоциста эксплантируется на облученные клетки-фидеры, внутренняя клеточная масса (ICM) дает начало клеткам ES. Будучи перенесенной в синхронизированную псевдобеременную самку, такая бластоциста может развиться в мышь. Наружные клетки бластоцисты — трофэктодерма (ТЕ) — дают начало экстра- эмбриональным тканям (плаценте), а клетки ICM генерируют эмбрион, (б) Те же этапы, что и на а, показаны с помощью световой микроскопии (воспроизведено, с любезного разрешения, из Meissner, 2006) NT-ESCs б
3. Фенотип клонированнных животных NT-ES генетически идентичны донору и могут, следо- вательно, использоваться для «заказной» («customized») клеточной терапии, называемой также «терапевтиче- ским клонированием» (см. ниже). 3. Фенотип клонированных животных Получение животных путем пересадки донорских ядер соматических клеток не эффективно, и те редкие живот- ные, которые доживают до взрослого состояния, часто обнаруживают множественные аномалии В отличие от этого, когда в качестве доноров ядер используются эмбриональные клетки, выживаемость клонов и у ам- фибий, и у млекопитающих гораздо выше В следующей главе акцент делается на отношении между возрастом донорского ядра и его влиянием на выживаемость клона в сопоставлении с фенотипом клонов амфибий и млеко- питающих, полученных из взрослых и эмбриональных донорских клеток. 3.1. Амфибии Когда ядра бластулы трансплантируются в хорошего ка- чества репипиентные яйца Xenopus, свыше 30 % таких яиц развиваются в нормальных головастиков, и большинство этих последних можно вырастить до стадии фертильных взрослых животных. По мере того как донорские клетки дифференцируются, степень нормальности развития трансплантантных эмбрионов снижается (рис. 22.3), не столь быстро в случае эндодермальных донорских ядер, как при использовании других. У амфибий оказались ин- формативными серийные ядерные пересадки, в которых донорские ядра берутся из бластулы, которая сама была получена в результате пересадки ядра соматической клет- ки (рис. 22.4). Это делается потому, что клетки эмбриона от первой пересадки часто представляют собой мозаику Рис. 22.3. Выживаемотъ эмбрионов Xenopus, полученных в ре- зультате пересадки ядер снижается по мере того, как донорские ядра берутся из все более и более спеииализированных донорских клеток Сокращения, обозначающие стадию: (В) бластула; (G) гастру- ла: (N) нейрула; (ТВ) стадия хвостовой почки: (НВ) стадия биения сердца; (ST) стадия плавающего головастика; (FT) стадия питающегося головастика (перепечатано, с любезного разрешения, из Gurdon, 1960) клеток, нормальных и ненормальных по хромосомам, из-за различий в скорости репликации ДНК между со- матической клеткой и активированным яйцом; серийные трансплантации ядер демонстрируют возможности раз- вития у ядер эмбриона от первой пересадки, которые меньше повреждены ядерной пересадкой. Несколько нормальных половозрелых, генетически маркированных лягушек, самцов и самок, были получены даже при ис- пользовании кишечного эпителия питающихся личинок (Gurdon and Uehlinger, 1966). Этот результат показывал, что процесс дифференцировки не обязательно связан с утратой способности обеспечивать нормальное развитие, и, следовательно, принцип сохранения генома по мере дифференцировки клеток не нарушается. В опытах по трансплантации ядер у амфибии ока- залось невозможным получить нормальное взрослое животное из ядра другой взрослой особи. Однако мор- фологически нормальные головастики были получены из ядер клеток многих различных тканей взрослых осо- бей (Laskey and Gurdon, 1970), и эти головастики имели нормальный набор функционирующих специализиро- ванных типов клеток. Следовательно, клетки, коммити- рованные в направлении одного пути дифференциров- ки, содержат, тем не менее, генетический потенциал, обеспечивающий в комбинации с цитоплазмой яйца большинство неродственных типов клеточных диффе- ренцировок. Способность ядер одного клеточного типа обеспе- чивать другие типы клеточных дифференцировок мож- но оценить количественно, проверив, в какой степени функциональная мышечная и нервная дифференциров- ка, о которой можно судить по эмбрионам, совершаю- щим плавательные движения после стимуляции, может быть достигнута при использовании ядер кишечного эпителия от плавающих головастиков. Такие эмбрионы часто могут быть получены с помощью серийных пере- садок ядер от эмбрионов, полученных в результате пер- вой пересадки, которые не совсем нормальны (см. рис. 22.4) (Gurdon, 1962). Кроме того, клетки бластулы от морфологически дефектных эмбрионов от первой пере- садки могут формировать мышцы, будучи пересажены нормальным хозяевам, выращенным из оплодотворен- ных яиц (рис. 22.4) (Byrne et al., 2003). Этот результат показывает, что до 30 % клеток кишечного эпителия мо- гут приводить, после пересадки ядер, к формированию функциональных аксиальных мышечных клеток (табл. 22.1). Спектр аномалий, возникающих в результате пе- ресадки ядер у амфибий, не обнаруживает какого-либо постоянного характера, который на морфологическом Таблица 22.1. Эффективность ядерного репрограммирования: клетки личиночной эндодермы Xenopus Только первые пересадки Мышцы и нервы эмбриона 15% Первые + серийные пере- садки 22 % Первые + серийные пересад- ки с пересадками хозяевам Мышцы и нервы эмбриона 30%
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома Рис. 22.4. Серийные пересадки ядер и пересадки ткани у Xenopus Для стандартных первых пересадок единичное ядро соматической клетки трансплантируют в денуклеированное яйцо, которое затем выращивается прямо до стадии личинки Для серийных пересадок ядер эмбрион от первой пересадки на ранней стадии раз- вития используется как донор ядер для дальнейшей серии пересадок ядер в яйцеклетки. Эти эмбрионы, полученные в результате серийных ядерных пересадок, выращиваются до стадии головастика. Наконец, от эмбриона, полученного в результате первой пересадки, который частично дефектен, берут кусочек ткани для пересадки эмбриону-хозяину, выращенному из оплодотворенного яйца. Пересаженная ткань становится частью вырастающего головастика уровне можно было бы соотнести с происхождением донорской клетки. Независимо от типа клеток и ста- дии развития донорских ядер эмбрионы, полученные в результате трансплантации ядер, погибают со сходным набором дефектов, включающим неполное дробление, неспособность к гаструляции, дефектное формиро- вание оси и отсутствие структур головы Внешне бес- порядочная природа этих дефектов не удивительна, по- скольку известно, что в клетках эмбрионов от первой пересадки часто наблюдаются крупные хромосомные аномалии (см. раздел 4.1, подраздел «Репрограммиро- вание в клонах»). 3.2. Млекопитающие Обычные аномалии у клонированных животных Большинство клонированных эмбрионов млекопитаю- щих вскоре после имплантации перестают развиваться. Те же, которые доживают до рождения, часто обнаруживают общие аномалии вне зависимости от типа донорских клеток (табл. 22.2). Например, новорожденные клоны часто оказываются «переростками» и обнаруживают уве- личенную плаценту; эти симптомы называют Синдромом Крупного Потомства (Large Offspring Syndrome) (Young et al., 1998; Hill et al., 2000; Tanaka et al., 2001). Более того, новорожденные клоны часто страдают респираторным дистрессом и дефектами почек, печени, сердца и мозга. Даже особи, выживающие длительное время, могут об- наруживать аномалии на последующих стадиях жизни. Например, стареющие клонированные мыши часто становятся ожиревшими, у них развиваются серьезные проблемы с иммунитетом или они преждевременно по- гибают (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Как схематически представлено на рис. 22.5, две стадии, когда большинство клонов погибают, — это стадия не- посредственно после имплантации и при рождении. Эти две стадии являются критичными для развития и могут быть особо чувствительными к ошибочной экспрессии генов (см. ниже). Однако получение взрослых и внешне здоровых клонированных животных было воспринято как доказательство, что пересадка ядер может давать нормаль- ных клонированных животных, хотя и с низкой эффек- тивностью. Важно отметить, что серьезные аномалии у клонированных животных могут часто проявляться лишь при старении животных (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Стохастическое возникновение заболеваний и других дефектов в более позднем возрасте у многих или даже у большинства взрослых клонов означает, что ком- пенсаторные механизмы, позволяющие клонированным животным выжить, не гарантируют их «нормальность». Скорее, фенотип выживающих клонированных живот- ных оказывается распределенным по широкому спектру,
3. Фенотип клонированнных животных Таблица 22.2. Обратное отношение между состоянием дифференцировки клетки-донора и эффективностью репрограммирования Клетка-донор Бластоцисты (% ооцитов) Клонированные мыши (% имплантированных бластоцист) Получение ES-клеток (% эксплантированных бластоцист) Ссылка Оплодотворенная яйцеклетка 60-80 25-65 1 ES-клетки 6-15 10-26 50 2 ES-клетки 6-15 Не определялось 50 3 Клетки Сертоли 10-50 6 25 4 Кумулюс 10-50 1-3 13-33 5 Фибробласт 10-50 1 13-33 5 NKT 70 4 Не определялось 6 В-, Т-клетки 4 Не определялось 7 7 Нейроны 15 Не определялось 6-28 8 Меланома 1 5 Не определялось 25 9 Ссылки: ’Wakayama et al., 2005.2Wakayama et al., 1999; Rideout et al., 2000; Eggan et al., 2001; 3Blelloch et al., 2004.4Ogura et al., 2000. 5Wakayama et al., 1998, 2005;.Wakayama and Yana gimachi, 1999.6Inoue et al., 2005.7Hochedlinger and Jaenisch, 2002.8Eggan et al., 2004; Li et al., 2004.9Hochedlinger et al., 2004. который включает как аномалии, вызывающие внезапную смерть в раннем постнатальном возрасте, так и более лег- кие аномалии, позволяющие дожить до более преклонного возраста (рис. 22.5). Эти соображения иллюстрируют сложность определения легких дефектов генной экс- прессии и подчеркивают необходимость более сложных тест-критериев, таких как тесты на стресс, вызываемый внешними факторами, или поведенческие тесты. Эпигенетические versus генетические причины Аномалии, характерные для клонированных животных, не наследуются потомством клонов, показывая, что их причиной являются «эпигенетические», а не генети- выше ниже Степень ненормальности Рис. 22.5. Выживаемость клонов млекопитающих Фенотипы клонов распределяются в широком диапазоне ано- малий. Большинство клонов погибают на двух определенных стадиях развития — при имплантации и при рождении. Более мелкие аномалии генной экспрессии приводят к заболеваниям и смерти в более позднем возрасте ческие отклонения. Это потому, что эпигенетические изменения, в противоположность генетическим, явля- ются обратимыми модификациями ДНК или хроматина, которые «стираются» при прохождении генома через зародышевый путь (Ogonuki et aL, 2002; Tamashiro et aL, 2002). Таким образом, проблемы, связанные с клониро- ванием, обусловлены ошибочным «эпигенетическим/ геномным репрограммированием» трансплантирован- ного донорского ядра, а не соматическими мутациями, приобретаемыми в соматических донорских клетках. 3.3. Получение клонированных млекопитающих из терминально дифференцированных клеток Состояние дифференцировки донорской клетки и эффективность репрограммирования ядра Вопрос, уже возникавший в плодотворных экспериментах по клонированию у амфибий, заставлял предполагать наличие обратной зависимости между состоянием кле- точной дифференцировки донорского ядра и его способ- ностью направлять развитие после пересадки в яйцеклетку (см. выше и рис. 22.3). Важно было выяснить, влияет ли состояние дифференцировки донорской клетки на эф- фективность репрограммирования и у млекопитающих. Как показано в табл. 22.2, репрограммирование можно измерить функционально, оценив развитие клонов на не- скольких разных уровнях, включая (1) скорость формиро- вания бластоцисты после пересадки ядра в яйцо, (2) долю клонированных эмбрионов, выживающих до рождения или до взрослого состояния после имплантации в матку, и (3) частоту, с которой из клонированных бластоцист, эксплантированных в культуру, можно получить плюри- потентные эмбриональные стволовые (ES) клетки. Эффективность предимплантационного развития реконструированных ооцитов в бластоцисты особенно
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома чувствительна к таким экспериментальным параме- трам, как стадия клеточного цикла и физическое со- стояние пересаживаемого ядра. Например, клонирова- ние неделящихся донорских клеток более эффективно, чем клонирование активно пролиферирующих клеток (Campbell et al., 1996а; Cibelli et al., 1998). Так, как и ожидалось из этого отношения, яйцеклетки, рекон- струированные с использованием донорских ядер из фибробластов, клеток Сертоли, кумулюса или клеток NKT, находящихся в фазе Gt или Go клеточного цик- ла, достигают стадии бластулы с относительно высокой эффективностью в противоположность клеткам ES или клеткам эмбриональной карциномы (ЕС), которые ак- тивно делятся и большая доля которых находится в фазе S (табл. 22.2). Благодаря экспериментальной вариабель- ности в ходе дробления измерение доли бластоцист, по- лученных из реконструированных ооцитов, не является надежным критерием для количественной оценки «спо- собности к репрограммированию». Однако, коль скоро клонированный эмбрион достиг стадии бластоцисты, после имплантации в матку его развитие до рождения зависит от состояния дифференцировки донорского ядра. Клонированные эмбрионы, полученные от таких эмбриональных доноров, как клетки ES или ЕС, разви- ваются до рождения с эффективностью в 10—20 раз бо- лее высокой, чем эмбрионы, полученные от донорских клеток кумулюса или фибробластов (Eggan et al., 2001; Wakayama and Yanagimachi. 2001). предположительно потому, что ядро недеференцированной клетки более склонно к репрограммированию или нуждается в нем в меньшей степени, чем ядро дифференцированной со- матической клетки. Это указывает на обратное отноше- ние между стадией дифференцировки донорской клет- ки и эффективностью репрограммирования. Наконец, коль скоро эмбрион достиг стадии бластоцисты, он с довольно существенной вероятностью может дать нача- ло клеткам ES; это показывает, что получение клеток ES из эксплантированных бластоцист гораздо меньше за- висит от состояния дифференцировки донорского ядра (табл. 22.2). Можно ли ядра терминально дифференцированных клеток репрограммироватъ до состояния тотипотентности ? В ранних экспериментах по клонированию амфибий и млекопитающих популяции донорских клеток, исполь- зуемых для трансплантации ядер, были гетерогенными, и нельзя было исключить, что начало редким выживающим клонам дали редкие взрослые стволовые клетки, при- сутствующие в донорской популяции, а не ядра диффе- ренцированных клеток. Например, эпигенетическое со- стояние соматических стволовых клеток может походить на состояние эмбриональных стволовых клеток, легче репрограммируется и, таким образом,может предпочти- тельно давать выживающие клоны. Чтобы решить вопрос о том, можно ли ядро терминально дифференцированной клетки репрограммировать в достаточной мере для по- лучения взрослого животного, требовались генетические маркеры, по которым можно было бы ретроспективно идентифицировать донорское ядро выжившего клона. Такие маркеры были использованы для однозначной демонстрации того, что ядра из зрелых иммунных кле- ток, из терминально дифференцированных нейронов и из злокачественных раковых клеток могут быть репро- граммированы и могут дать взрослых клонированных мышей. Моноклональные мыши из зрелых иммунных клеток Моноклональные мыши были получены с использовани- ем ядер периферических лимфоцитов, где генетические перестройки генов иммуноглобулина (1g) и рецептора Т-клеток (TCR) можно было использовать в качестве ста- бильных маркеров, позволяющих выявлять идентичность и состояние дифференцировки донорского ядра данного клона. Поскольку предшествовавшие попытки получить моноклональных мышей были безуспешными, исполь- зовали процедуру двухэтапного клонирования, чтобы сначала получить клетки ES из клонированных бласто- цист, а затем, на втором этапе, моноклональных мышей из клонированных клеток ES (рис. 22.6). Животные, полученные из донорских ядер В- и Т-клеток, были жиз- неспособными и несли полностью перестроенные гены иммуноглобулина или TCR во всех тканях (Hochedlinger and Jaenisch, 2002). Как и ожидалось, иммунные клетки моноклональных мышей экспрессировали только те аллели локуса 1g и TCR, которые были продуктивно перестроены в соответствующих донорских клетках, использованных для пересадки ядер, а перестройка других генов 1g или TCR была подавлена. Эти резуль- таты однозначно показывают, что ядра из терминально дифференцированных донорских клеток могут быть репрограммированы до состояния плюрипотентности с помощь клонирования ядер. Частота непосредственно получаемых клонированных эмбрионов из зрелых В- и Т-клеток (вместо двухэтапной процедуры, использован- ной в наших экспериментах), хотя ее и трудно оценить, была, вероятно, существенно ниже, чем частота клонов, полученных из фибробластов или клеток кумулюса (воз- можно, меньше 1 на 2000 оперированных эмбрионов; табл. 22.2). Недавно были непосредственно клонированы терминально дифференцированные клетки NKT (Inoue et al., 2005). Клетки NKT, подобно В- и Т-клеткам, об- ладают генетическими перестройками, делающими воз- можной ретроспективную идентификацию состояния дифференцировки этих клеток. Однако, хотя Т- клетки и клетки NKT и являются частью одной и той же клеточ- ной линии, соответствующая эффективность ядерных пересадок существенно различалась (Hochedlinger and Jaenisch, 2002; Inoue et al., 2005). Клонированные мыши из зрелых обонятельных нейронов В противоположность В- и Т-клеткам ядра постмито- тических нейронов необратимо выходят из клеточного цикла; в этом заключается часть программы их диффе- ренцировки. Для проверки того, можно ли ядро зрелого нейрона репрограммировать до состояния тотипотент-
3. Фенотип клонированнных животных 1 б. Пересадка ES- клеток в клониро- ванную бластоцисту Explanted ES-клетки бластоциста Рис. 22.6. Двухэтапная процедура для получения моноклональных мышей из зрелых лимфоидных до- норских клеток (1) Ядра из клеток перифериче- ского лимфатического узла пере- саживали в денуклеированные яйцеклетки и получали клониро- ванные бластоцисты. Эти бласто- цисты эксплантировали in vitro и получали клонированные клетки ES. (2) На втором этапе получали моноклональных мышей путем тетраплоидной комплементации (Eggan et al., 2001; Hochedlinger and Jaenisch, 2002) 2. Получение клони- рованной мыши дароороо' ности, были получены фертильные клонированные взрослые мыши из постмитотических обонятельных ней- ронов с использованием такого же подхода, какой был применен для получения моноклональных мышей (см. рис. 22.6) (Eggan et al., 2004; Li et al., 2004). Как показано в табл. 22.2 , эффективность получения клонированных клеток ES из обонятельных нейронов была в том же диа- пазоне, что и эффективность для ядер иммунных клеток. Эти наблюдения показывают, что постмитотическое ней- рональное ядро может вновь вступить в клеточный цикл и его можно репрограммировать к плюрипотентности. У мыши каждая из двух миллионов клеток в обоня- тельном эпителии экспрессирует только один из при- близительно 1500 генов рецепторов запаха (OR, odor- ant receptor), так что функциональная идентичность нейрона определяется природой рецептора, который он экспрессирует (это аналогично моноаллельной экс- прессии генов иммунного глобулина или TCR в В- или Е-клетках, которая обсуждалась в главе 21). Один из механизмов, который обеспечивал бы стохастический выбор единственного обонятельного рецептора, мог бы быть связан с перестройками ДНК. Получение мышей, клонированных из зрелых обонятельных нейронов, по- зволило исследовать, связан ли выбор обонятельного рецептора с необратимыми перестройками ДНК. Если выбор обонятельного рецептора связан с необратимыми перестройками ДНК, можно было бы предсказать, по аналогии с описанными выше моноклональными мы- шами, что мышь, клонированная из нейрона, экспрес- сирующего Р2, будет экспрессировать этот рецептор во всех обонятельных нейронах и репертуар экспрессии рецепторов будет изменен (это были бы моносомные мыши, которые могли бы чувствовать только один за- пах) (рис. 22.7). Наоборот, если выбор OR связан с обра- тимым эпигенетическим механизмом, клонированные животные должны демонстрировать картину экспрес- сии Р2, идентичную той, которую демонстрирует мышь- донор, и нормальный репертуар экспрессии рецептора. Анализ экспрессии обонятельного рецептора показал, что механизм выбора рецептора полностью обратим и не связан с генетическими изменениями, как это видно при созревании В- и Т-клеток (Eggan et al., 2004). Рак и реверсия злокачественного состояния с помощью трансплантации ядер Клонирование мышей из терминально дифференци- рованных лимфоцитов и постмитотических нейронов продемонстрировало, что пересадка ядер дает нам в руки инструмент для избирательного репрограммирования эпигенетического состояния клеточного генома без из- менения его генетического состава. Рак вызывается ге- нетическими, а также эпигенетическими изменениями, но влияние эпигенетики на злокачественный фенотип раковой клетки не было определено. Трансплантацию ядер раковых донорских клеток использовали как прямой подход к оценке обратимости трансформированного со- стояния. Действительно, предыдущие эксперименты с амфибиями показали, что ядра из клеток карциномы поч- ки можно репрограммировать, и они будут поддерживать раннее развитие до стадии головастика (McKinnell, 1962). Аналогичный результат был получен на мышах, где ядра из линии клеток медуллобластомы смогли обусловить, хотя и с низкой эффективностью, раннее развитие, в результате чего были получены эмбрионы с задержкой дальнейшего развития (Li et al., 2003). Однако эти экс- перименты не были однозначной демонстрацией того, что эти клоны были получены из раковых клеток, а не из загрязняющих культуру нетрансформированных клеток. Когда ядра целого ряда опухолевых клеток, в том числе клеток лейкемии, лимфомы, рака груди и меланомы, пересадили в денуклеированные мышиные яйцеклетки, большинство из них оказались способными поддерживать предимплатационное развитие до стадии нормально вы- глядящих бластоцист (Hochedlinger et al., 2004). Следова- тельно, внутриклеточная среда ооцита смогла подавить злокачественный фенотип этих опухолевых клеток и сделать возможным внешне нормальное раннее развитие Однако лишь геном от модельной меланомы, индуциро- ванной RAS, дал начало линии клонированных клеток
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома Обонятельные нейроны Клонированная ES-клетка Клонированная мышь все включены (моносомик) 0 1 % ВКЛЮЧЕНО Перспектива (временная/обратимая) Р2 IRES GFP 0.1 % ВКЛЮЧЕНО меченых (нейроны Р2) Рис. 22.7. Клонирование ядер зрелых обонятельных нейронов Мыши, клонированные из зрелых обонятельных нейронов имели нормальный репертуар экспрессии обонятельных рецепторов (OR), в котором лишь 0,1% нейронов экспрессируют рецептор Р2 — как и у мышей-доноров Экспрессию рецептора Р2 опреде- ляли, используя мышей-доноров, имевших ген маркера GFP, вставленный в ген рецептора Р2. Результаты этого опыта показали, что выбор экспрессии рецептора определяется не генетическими изменениями, а обратимым эпигенетическим механизмом ES, способных дифференцироваться в большинство, если не во все линии соматических клеток в химерных мышах. Тем не менее, из-за генетических изменений, имевшихся в донорских клетках, у всех этих химер развивался рак. Эти результаты показывали, что раковое ядро после взаимодействия с цитоплазмой яйцеклетки обеспечивало дифференцировку всех линий, показывая тем самым, что злокачественный фенотип этих раковых клеток в основ- ном определялся эпигенетическими изменениями. Другой вывод был сделан из экспериментов по клонированию ядер донорских клеток ЕС. В противоположность ядру соматической раковой клетки злокачественный фенотип эмбриональных опухолей был обусловлен генетическими изменениями, поскольку его не удавалось обратить экспо- зицией с цитоплазмой яйцеклетки (Blelloch et al., 2004). 4. Изменения, связанные с репрограммированием ядра Стратегии, используемые в раннем развитии, у амфи- бий и у млекопитающих очень различаются. Напри- мер. дробление эмбриона лягушки проходит быстро, примерно по 30 минут на каждый клеточный цикл, в противоположность эмбриону млекопитающих, который проходит всего лишь одно деление дробления за 24 часа после оплодотворения. Кроме того, зиготический геном лягушки начинает экспрессироваться лишь спустя 12 митотических циклов, на переходе к средней бластуле, в противоположность геному мышиного эмбриона, ак- тивирующемуся на 2-клеточной стадии. Таким образом, можно не удивляться тому, что эти различные стратегии развития, используемые у амфибий и млекопитающих, влияют и на репрограммирование соматического донор- ского ядра. В этой главе эпигенетическое репрограмми- рование, имеющее место в нормальном развитии, сопо- ставляется с репрограммированием у клонов лягушек и млекопитающих. Интересный вопрос заключается в том, влияет ли эпигенетическое состояние соматического донорского ядра на картину экспрессии генов у клони- рованных эмбрионов. Это называется «эпигенетической памятью» и будет обсуждаться далее в этой главе. 4.1. Амфибии Репрограммирование в нормальном развитии У амфибий ядра и хромосомы ооцитов и яйцеклеток находятся в состоянии, совершенно ином, чем ядра и хромосомы соматических клеток. Зародышевый пузырек ооцита содержит максимально расправленные [expanded] хромосомы типа ламповых щеток, очень активные в отношении транскрипции (Callan and Lloyd, 1960), что. очевидно, отражает не только высокую долю транскри- бируемых генов, но и плотную упаковку РНК-полимераз на ДНК большинства генов. Это исключительное транс- крипционное состояние достигается во время раннего оогенеза и вероятно продолжается в яичнике на про- тяжении всей жизни взрослой самки. Зрелые спермин, напротив, максимально конденсированы и полностью неактивны в отношении транскрипции. Обычные гистоны хромосом в сперме заменены протаминами, которые обмениваются в ядрах спермиев, которые вхо- дят в яйцеклетку при оплодотворении, и ядра спермиев претерпевают необычайно быструю деконденсацию приблизительно за 20 минут. У амфибий отсутствуют процессы, эквивалентные инактивации Х-хромосомы и импринтингу, которые имеют место у млекопитающих Снижение уровня метилирования ДНК имеет место в пе- риод от оплодотворения до перехода к средней бластуле (5 часов), после чего этот уровень постепенно повышает- ся по мере развития (Meehan, 2003). Резюмируя, можно сказать, что в нормальном развитии во время гаметогене- за и в течение нескольких часов непосредственно после оплодотворения имеют место существенные события репрограммирования ядра. Наиболее очевидным изменением, которое претер- певают трансплантированные ядра у амфибий, являет- ся увеличение объема и дисперсия хроматина. В ядрах эмбриональных клеток это происходит быстрее, чем в ядрах дифференцированных илц взрослых клеток. Во всех отношениях эти трансплантированные ядра в кон- це концов принимают состояние ядер, присутствующих в яйцеклетках или ооцитах в норме. После транспланта- ции ядра наступают также йзменения в синтезе нуклеи-
4. Изменения, связанные с репрограммированием ядра новых кислот. В ядрах неделящихся клеток, таких как клетки мозга взрослых животных, яйцеклетки быстро индуцируют синтез ДНК. Эмбрионы-трансплантаты, полученные в результате пересадок одиночных ядер в яйцеклетки, синтезируют рибосомную РНК и тРНК в такой же степени, что и эндогенные ядра эмбрионов, выращенных из оплодотворенных яиц. Картина транс- крипции генов изменяется от характерной для донор- ских клеток к свойственной ранним эмбрионам; напри- мер, вся генная транскрипция выключается во время дробления эмбрионов-трансплантатов и затем реакти- вируется у выживших трансплантатов в соответствии с клеточным типом. Мышечные гены экспрессируются в мышцах эмбрионов-трансплантатов даже в том случае, если они получены от ядер кишечника (Gurdon et al., 1984). В случае пересадок ядер в ооциты в транспланти- рованных ядрах имеют место обширные изменения в транскрипции без какой-либо репликации ДНК. На- пример, у Xenopus ядра из клеток почки подавляют гены, специфичные для почки, и активируют гены, специфичные для ооцита. Некоторые из этих заново активированных генов специфичны для эмбриона, как и в случае ядер тимуса мыши, которые экспрессируют маркерный для стволовых клеток ген Oct-4, но пода- вляют активность специфичного для тимуса гена Thy-1 (Byrne et al., 2003). В заключение можно сказать, что у амфибий при пересадках ядер в яйцеклетки или ооци- ты наблюдается обширное репрограммирование транс- крипции генов, так что ядра соматических клеток (и. в случае яйцеклеток, их митотическое потомство) изме- няют свою транскрипцию в соответствии с транскрип- цией клетки-реципиента. Репрограммирование в клонах С давних пор думали, что наиболее вероятное объяснение возрастающей доли связанных с развитием аномалий, наблюдаемой в экспериментах с пересадкой ядер у амфибий, связано с неполной репликацией ДНК. При нормальном развитии Xenopus пронуклеусы яйцеклетки и спермия начинают удвоение хромосом спустя 20 минут после оплодотворения, и оно завершается 20 минутами позже. В противоположность этому ядрам делящихся клеток в культуре требуется около 6 часов для заверше- ния одного раунда репликации ДНК. Неудивительно поэтому, что часто можно наблюдать продолжение син- теза ДНК пересаженными ядрами соматических клеток гораздо дольше 40 минут после инъекции ядра — вплоть до начала конденсации хромосом для первого митоза. В результате репликция хромосом может быть неполной, и неполностью реплицированные хромосомы разрываются на части, когда трансплантированные ядра вынуждены вступать в свой первый митоз. Фрагменты разорванных хромосом наблюдали в эмбрионах, полученных в ре- зультате пересадки ядер (Di Berardino and Hoffner, 1970), и эта несовместимость между скоростью репликации ДНК и клеточного деления в зиготе по сравнению с соматическими ядрами, приводящая к анеуплоидии, по-видимому, скорее всего объясняет многие аномалии развития эмбрионов, полученных путем пересадки ядер, и в особенности высокую долю яйцеклеток, вообще не- способных пройти регулярное дробление; эти последние могут составить до 75 % всех яиц, получивших ядра от неделящихся дифференцированных клеток. Было от- мечено, что серийные пересадки ядер из частично дро- бящихся эмбрионов, полученных в результате первой пересадки, часто дают нормальное развитие головастиков (см. выше). Это хорошо объясняется тем, что инкубация ядер соматических клеток в экстракте из яйцеклеток, находящихся в фазе митоза, значительно увеличивает число сайтов начала репликации ДНК, тем самым давая таким ядрам возможность завершить репликацию хро- мосом быстрее, чем это могут ядра из таких терминально дифференцированных клеток, как эритроциты (Lemaitre et al., 2005). Два других предположения могут помочь объяснить аномалии ядерных трансплантатов, которые возникают после начала зиготической транскрипции при переходе к средней бластуле. Первое связано с количественной нерегулярностью активации ранних зиготических генов (Byrne et al., 2003), а второе — с сохранением специфич- ной для донора экспрессии генов в некорректной заро- дышевой линии эмбрионов-трансплантатов (см. ниже). Однако не было показано, что эти отличия от нормаль- ной экспрессии генов прямо отвечают за наблюдаемые аномалии развития. Механизмы репрограммирования Большие количества и крупные размеры яиц и ооцитов амфибий вдохновили исследователей на попытки понять молекулярные основы репрограммирования. Наиболее предпочтительным путем было получение бесклеточ- ных экстрактов, с помощью которых можно было бы воспроизвести in vitro события, происходящие после пересадки ядер в живые яйцеклетки и ооциты. Последо- вательное обеднение этих экстрактов могло бы позволить идентифицировать необходимые компоненты. Этот подход оказался особенно успешным при идентифика- ции компонентов яйцеклетки, инициирующих синтез ДНК. В особенности можно отметить идентификацию нуклеоплазмина (Laskey et al., 1978; Philpott et al., 1991), присутствующего в больших количествах компонента яйцеклетки Xenopus, который может деконденсировать спермий и стимулировать обмен гистоновых белков. Такие же процессы имеют место, когда соматические ядра добавляются в экстракты из яйцеклеток (Dimitrov and Wolffe, 1996; Tamada et al., 2006). Другие компонен- ты экстракта яйцеклеток, возможно вносящие вклад в процесс репрограммирования ядра, включают комплекс ремоделинга ISWI (Kikyo et al., 2000) и белки зароды- шевой клетки ERGY2, функция которых — обратимая разборка ядрышек (Gonda et al, 2003). Было высказано предположение, что ремоделирующий комплекс BRG-1 может играть роль в яйцеклетках и у ранних эмбрионов путем пермеабилизации и ресилинга [by permeabilizing and resealing] ядер в экстрактах (Hansis et al., 2004). Эти опыты трудно интерпретировать, потому что пока еще не известно, чтобы бесклеточные экстракты были способны
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома инициировать транскрипцию ядер. Поэтому лучшее, что можно сделать, — это воздействовать на ядра in vitro и затем пересадить их в живой ооцит, чтобы испытать на транскрипцию (Byrne et al., 2003; Tamada et al., 2006). В настоящее время представляется, что для успешно- го репрограммирования ядер необходимы три этапа: (1) удаление эпигенетических меток на ДНК или белках, которые характеризуют данное дифференцированное состояние; (2) обеспечение транскрипционными фак- торами, необходимыми для тех генов, которые долж- ны быть заново экспрессированы; и (3) деконденсация хроматина для того, чтобы транскрипционные факторы получили доступ к генам, на которые они действуют. 4.2. Млекопитающие Последовательное эпигенетическое репрограммирова- ние является важным аспектом нормального развития (Rideout et al., 2001). В ходе гаметогенеза на два родитель- ских генома последовательно накладываются изменения метилирования ДНК, а также гистонов. После оплодот- ворения геном эмбриона модифицируется далее в ходе дробления и после имплантации. В табл. 22.3 дается сводка данных о некоторых эпигенетических отличиях клонированных животных от нормальных, которые воз- никают в результате ошибочного репрограммирования. Для последующего обсуждения мы подчеркиваем эти эпигенетические различия между эмбрионами, получен- ными в результате нормального оплодотворения и клони- рования, на разных стадиях развития. Стадии развития, указанные в табл. 22.3 и обсуждаемые по порядку, — это (1) гаметогенез, (2) дробление, (3) постимплантация и (4) постнатальное развитие Гаметогенез Наиболее важное эпигенетическое репрограммиро- вание в нормальном развитии происходит во время гаметогенеза — процесса, который делает и геном спермия, и геном ооцита «эпигенетически компе- тентными» для последующего оплодотворения и для надежной активации генов, критичных для раннего развития (Latham et al., 1999). При клонировании этот процесс сокращается, и большинство проблем, затра- гивающих «нормальность» клонированных животных, может быть связано с неадекватным репрограммиро- ванием соматического ядра после трансплантации в яйцеклетку. Поскольку плацента развивается из тро- фоэктодермальной линии, составляющей первый диф- ференцированный тип клеток эмбриона, можно было бы предположить, что у большинства клонированных животных репрограммирование и дифференцировка в эту раннюю клеточную линию нарушены. Действи- тельно, как подытожено ниже, доля аномально экс- прессируемых генов у клонированных новорожденных животных существенно выше в плаценте по сравнению с соматическими тканями. Дробление В ходе дробления проходящая по всему геному волна де- метилирования удаляет эпигенетические модификации, присутствующие в зиготе, так что ДНК бластоцисты в основном лишена метилирования. Между имплантаци- ей и гаструляцией волна глобального метилирования de novo заново устанавливает общую картину метилирова- ния, которая затем поддерживается на протяжении всей жизни в соматических клетках данного животного. У клонированных эмбрионов метилирование повторяю- щихся последовательностей является ненормальным (Bourc’his et al., 2001; Dean et al., 2001; Kang et al., 2003; Mann et al., 2003). Чтобы исследовать экспрессию генов, активность таких «генов плюрипотентности», как Oct-4, которые «молчат» в соматических клетках, но активны в эмбриональных клетках, была изучена у клонированных эмбрионов. Удивительно, но реактивация Oct-4 и «Oct- 4-подобных» генов оказалась ошибочной и случайной у большой доли соматических клонов (Boiani et al., 2002; Bortvin et al., 2003). Поскольку эмбрионы без Ос/-4рано останавливаются в развитии, неполная реактивация «Ос/-4-подобных» генов у клонов могла быть причи- ной частой неспособности большей части эмбрионов, полученных в результате пересадки ядер, выжить в постимплантационном периоде. Более того, в ряде исследований обнаружено аномальное метилирование ДНК у клонированных эмбрионов. Хотя остается все Таблица 22.3. Нормальные versus клонированные эмбрионы Стадия Нормальные эмбрионы Клонированные эмбрионы Гаметогенез Геном «компетентен» для активации «ранних» генов, установление импринтов Нет Дробление Глобальное деметилирование ДНК Активация эмбриональных («Oct4- подобных») генов Аномальное метилирование ДНК Стохастическая / ошибочная активация «Oct4- подобных» генов П остимплантационное развитие Подгонка длины теломер Глобальное метилирование ДНК de novo. Х-инактивация Нормальный импринтинг и экспрессия генов Норма Аномальное у некоторых клонированных животных Аномальный импринтинг, глобальная дисрегуля- ция генов Постнатальное раз- витие Нормальное животное Синдром крупного потомства, преждевременная гибель и т.п.
5. Эпигенетическая память еще невыясненным, в какой степени эпигенетическая модификация структуры хроматина и метилирование ДНК, происходящие в нормальном развитии, долж- ны имитироваться при ядерном клонировании, для того чтобы оно было успешным, имеющиеся данные полностью согласуются с представлением о том, что причиной аномальной экспрессии генов у клонирован- ных животных является ошибочное эпигенетическое репрограммирование. Постимплантационное развитие После имплантации и перед гаструляцией три ключевых события формируют эпигенетическое состояние генома эмбриона: (1) волна глобального метилирования de novo заново устанавливает общую картину метилирования, характерную для взрослого животного и поддерживаемую в дальнейшем в соматических клетках на протяжении всей жизни (Dean et al., 2003); (2) у эмбрионов жен- ского пола выполняется компенсация доз посредством случайной инактивации одной из двух Х-хромосом; (3) теломеры приобретают длину, характерную для сомати- ческих клеток. Поскольку все эти события инициируются только у постзиготического эмбриона, у клонированных животных можно ожидать мало нарушений в регуляции этих эпигенетических событий. Тем не менее, у клони- рованных эмбрионов коровы наблюдали более низкие уровни общего метилирования по сравнению с пост- натальными телятами (Cezar et al., 2003). Инактивация Х-хромосомы была случайной и ненарушенной у здо- ровых, но не у аномальных клонированных эмбрионов мышей (Eggan et al., 2000; Senda et al., 2004; Nolen et al., 2005). Однако неясно, действительно ли эти нарушения являются причиной аномального развития клонов, а не просто следствием аномального репрограммирования в ходе предимплантационного развития. Напротив, кор- рекция длины теломер у клонированных коров и мышей надежно выполнялась (Lanza et al., 2000; Tian et al., 2000; Wakayama et al., 2000; Betts et al., 2001) и, таким образом, не могла быть причиной нарушенной жизнеспособности клонированных животных. Постнатальное развитие Самый масштабный анализ экспрессии генов был выпол- нен на новорожденных клонированных мышах. Профиль экспрессии показал, что 4—5 % всего генома и 30—50 % импринтированных генов аномально экспрессируются в плацентах новорожденных клонированных мышей (Humpherys et al., 2002; Kohda et al., 2005). Это говорит о том, что развитие млекопитающих удивительно толе- рантно к широко распространенной дисрегуляции и что компенсаторные механизмы обеспечивают выживание некоторых клонированных особей вплоть до рождения. Однако эти результаты заставляют предполагать, что даже выживающие клоны могут иметь легкие дефекты, которые, хотя и не настолько серьезны, чтобы создавать риск для непосредственного выживания, в более позднем возрасте могут послужить причиной возникновения не- нормального фенотипа. 5. Эпигенетическая память Известно, что в развитии позвоночных имеют место два рода эпигенетических модификаций генома. Это метили- рованный цитоцин во многих участках ДНК, где имеется CpG, и разнообразные модификации «хвостов» гистонов. Эти изменения приобретаются в ходе гаметогенеза и ран- него развития и тесно связаны с активностью или неак- тивностью генов. Поэтому можно было ожидать, что эти эпигенетические модификации подвергнутся реверсии в результате пересадки ядра, а если нет, то могут помочь объяснить некоторые дефекты развития эмбрионов, по- лученных в результате трансплантации ядер. У амфибий некоторое понимание деметилирования ДНК было достигнуто в экспериментах, где ядра сома- тических клеток млекопитающих были инъецированы в ооциты Xenopus (Simonsson and Gurdon, 2004). Промотор Oct-4 мышей метилирован в клетках взрослого тимуса, где Oct-4 не экспрессируется. Однако, когда ядра тимуса были инъецированы в ооциты, этот промоторный рай- он, но не энхансерный район регуляторной части этого гена, был деметилирован. Этот результат показывает из- бирательный характер процесса деметилирования. Ког- да были инъецированы целые ядра, деметилирование ДНК, по-видимому, предшествовало индуцированной транскрипции Oct-4. Весьма вероятно, что активность ДНК-деметилазы является специальным свойством оо- цитов (см. выше) и что деметилирование промоторной ДНК репрессированных в развитии генов может также быть важным и необходимым этапом, когда ядра сома- тических клеток репрограммируются в экспериментах с пересадкой ядер в яйцеклетки. Изменения в модифи- кациях гистонов пока еще не были исследованы в экс- периментах по пересадкам ядер у амфибий. Эксперимент по пересадкам ядер у амфибий, по- ставленный по другой схеме, показал, что реверсия эпи- генетического состояния соматических клеток никоим образом не наблюдается всегда. Ввиду невозможности получить ядерных трансплантантов у R. pip tens, даже от клеток-доноров с ранней стадии хвостовой почки (см выше), Бриггс и Кинг (Briggs and King, 1957) задались во- просом, не отражает ли морфология аномальных эмбри- онов их происхождение; они описали предпочтитель- ное выживание эндодермальных тканей у эмбрионов эндодермального ядерного происхождения и назвали это «эндодермальным синдромом». Указывалось, одна- ко, что эндодерма дифференцируется позже, чем другие зародышевые листки, и что этим можно было бы объ- яснить ее лучшее выживание (Gurdon, 1963). Действи- тельно, Симнет (Simnet, 1964) сообщил, что эмбрионы- трансплантаты нейрального происхождения также обнаруживали такое же предпочтительное выживание их эндодермы. Тот же вопрос недавно был снова исследован с использованием специфичных для клеточного типа маркерных генов. В этих опытах (Ng and Gurdon, 2005) ядра из клеток нейроэктодермы или эндодермы, уже экс- прессирующих специфичные для клеточного типа марке- ры Sox2 или эндодермин, соответственно, транспланти- ровали в денуклеированные яйцеклетки; получившиеся в результате эмбрионы-трансплантанты были разделены
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома Район- донор Пересадка NT- Анализируемый ядра эмбрион район Судьба клеток Эмбрион- донор Стадия 21 Эндодерма Edd + Нейроэктодерма Эндодерма Стадия 26 Нейроэктодерма Sox2 + Рис. 22.8. Схема эксперимента по тестированию эпигенетической памяти об экспрессии генов, специфичной для данного клеточного типа Донорские ядра берутся из клеток эндодермы (стадия 21) или нейроэктодермы (стадия 26) Получающиеся в результате пересадки ядер эмбрионы обычно формируют частичную бластулу, нормально дробившиеся части которой разделяют на будущие нейро- эктодермальные или эндодермальные участки и анализируют по экспрессии генов. См. табл. 22.4 (перепечатано, с любезного разрешения, из Ng and Gurdon, 2005) Нейроэктодерма Эндодерма на нейроэктодермальную или эндодермальную части, и эти части были протестированы на те же маркеры, Sox2 или эндодермин (рис. 22.8 и табл. 22.4). Оказалось, что оба гена преимущественно экспрессировались в клетках «не своего» типа. Например, более половины эмбрио- нов нейроэктодермального происхождения обнаружили суперэкспрессию нейрального маркера Sox2 в своих эн- додермальных клетках. У некоторых клонированных эм- брионов не было снижения уровня экспрессии гена Sox2 по сравнению с уровнем донорских клеток. Транспланти- рованные ядра, как и ядра нормальных эмбрионов, были совершенно неактивными в отношении транскрипции вплоть до стадии бластулы. Следовательно, как это ни удивительно, активное состояние генной транскрипции, установившееся в ходе клеточной дифференцировки, может поддерживаться в клонированных эмбрионах при полном отсутствии условий, которые индуцировали этот ген на протяжении более 12 митотических клеточных делений (от яйцеклетки до бластулы). Этот поразитель- ный пример эпигенетической памяти наблюдается лишь у некоторых эмбрионов-трансплантатов, но полностью отсутствует у других, у которых экспрессия гена была успешно репрограммирована. 6. Значение ядерной трансплантации для медицины Важно различать «репродуктивное клонирование» и «терапию с помощью трансплантации ядер» (на- зываемую также SCNT, или терапевтическое клони- рование). При репродуктивном клонировании путем пересадки соматического ядра в денуклеированную яйцеклетку получают эмбрион с целью создать кло- нированную особь. Напротив, целью терапии с помо- щью трансплантации ядер является получение линии эмбриональных стволовых клеток (обозначаемых как клетки ntES), «скроенных» для нужд пациента, послужившего донором ядер (Hochedlinger and Jae- nisch, 2003). Клетки ntES могли бы быть использованы как ис- точник функциональных клеток, пригодных для ле- чения соответствующего заболевания путем транс- плантации. На рис. 22.9 сопоставляются нормальное развитие из оплодотворенного эмбриона, репродук- тивное клонирование и терапевтическое клонирова- ние. Табл. 22.4. Эпигенетическая память о клеточно-специфичной экспрессии генов Экспрессия гена Edd Sox2 Эндодермальные ядра _____— нейроэктодерма 45 5 (edd+) ► NT-эмбрионы — ~ эндодерма 12 0 Нейроэктодермальные - нейроэктодерма 6 22 ядра (Sox2+) NT-эмбрионы эндодерма 0 81 В процентах представлена доля эмбрионов, полученных путем трансплантации ядер (каждый тестировался методом RT-PCR индивидуально), экспрессирующих гены Edd и Sox2 в два и более раза интенсивней нормального (или фонового) уровня (дан- ные из NG and Gurdon, 2005)
6. Значение ядерной трансплантации для медицины Нормальное развитие Репродуктивное клонирование Терапевтическое клонирование Сперматозоид (1 п) Ооцит (In) Клетка взрослого Денуклеированный ооцит Клетка пациента Денуклеированный ооцит Нейроны Рис. 22.9. Сравнение нормального развития с «репродуктивным клонированием» и «терапевтическим клонированием» Во время нормального развития {слева) гаплоидная (In) клетка спермия оплодотворяет гаплоидный ооцит, в результате чего формируется диплоидная (2п) зигота, которая подвергается дроблению и становится зародышем-бластоцистой. Бластоцисты, имплантированные в матку, в конечном счете дают начало новорожденным животным. В ходе «репродуктивного клонирования» {в центре) диплоидное ядро донорской клетки взрослого животного вводится в денуклеированный реиипиентный ооцит, который, после искусственной активации, делится и превращается в клонированную бластоцисту. После пересадки суррогатным матерям некоторые из этих клонированных бластоцист дают начало новорожденному клону. В противоположность этому, получение клеток ntES с помощью пересадки ядер {справа) требует эксплантации клонированных бластоцист в культуру для получения линии клеток ES, которая может дифференцироваться in vitro в клетки потенциально любого типа, входящие в состав тела, и использоваться для исследовательских или терапевтических целей (перепечатано, с любезного разрешения, из Hochedlinger and Jaenisch, 2003 [© Massachusetts Medical Society]) 6.1. Репродуктивное клонирование Как представлено выше, все данные, полученные в экспериментах по клонированию восьми разных видов млекопитающих, показывают, что получение нормаль- ных особей с помощью пересадки ядер сталкивается с несколькими важными препятствиями. В общественных дебатах ключевым вопросом является вопрос о том, будет ли когда-нибудь возможно путем ядерного клонирова- ния получить нормальную особь. Имеющиеся данные заставляют предполагать, что получение нормальных клонов может оказаться затруднительным, если не невоз- можным, по следующим причинам: (1) Как подытожено выше, все проанализированные клоны при рождении обнаруживают дисрегуляцию сотен генов. Тем не ме- нее, развитие клонов до рождения и далее, несмотря на широко распространенные эпигенетические аномалии, позволяет предполагать, что развитие млекопитающих способно выдерживать дисрегуляцию многих генов. (2) Некоторые клоны выживают до взрослого состоя- ния за счет компенсации дисрегуляции генов. Хотя эта «компенсация» обеспечивает выживание, она не может предотвратить возникновение расстройств, проявляю- щихся в более позднем возрасте. Следовательно, можно ожидать, что большинство клонов, если не все, будут иметь по крайней мере легкие аномалии, которые мо- гут быть не настолько серьезными, чтобы проявиться в виде очевидного фенотипа при рождении, но вызовут серьезные проблемы в последующем, как это видно у стареющих мышей. Разные клоны могут различаться по степени аномальной экспрессии генов: если клю- чевые «Oct-4-подобные» гены не активируются, клоны погибают немедленно после имплантации. Если же эти гены активированы, клон может выжить до момента рождения и дольше. Эти соображения показывают, что клонированные животные, даже если при поверхностном обследовании они выглядят «нормальными», могут не быть таковыми, но обладать слабыми аномалиями, ко-
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома торые фенотипически проявятся лишь в более позднем возрасте (Jaenisch, 2004). Эти соображения не позволяют рассматривать этот подход как потенциальную репродук- тивную технологию у человека. 6.2. Применение ядерной трансплантации в терапии Иммунное отторжение — частое осложнение при транс- плантациях аллогенных органов, обусловленное им- мунологической несовместимостью Для лечения этой болезни «хозяин против прививки» реципиентам с транс- плантатами обычно дают лекарства-иммунодепрессанты, что дает серьезные побочные эффекты. Эмбриональные стволовые клетки, полученные с помощью трансплан- тации ядер, генетически идентичны клеткам пациента, устраняя, таким образом, риск иммунной реакции и по- требность в подавлении иммунитета. Что особенно важ- но, разрабатываются протоколы, позволяющие получать такие функциональные клетки, как нейроны, мышечные клетки и островковые клетки, которые можно использо- вать для лечения пациентов, страдающих такими серьез- ными нарушениями, как болезнь Паркинсона, сердечная недостаточность или диабет. Более того, эмбриональные стволовые клетки обеспечивают возобновляемый источ- ник замещения тканей, позволяя проводить повторное лечение, когда это необходимо. Действительно, осуществимость терапевтического клонирования была продемонстрирована на животных моделях болезней. Для этого в качестве «пациента» был использован штамм мышей, несущих делецию гена Rag2 (Rideout et al., 2002). Мыши, мутантные по Rag2. страдали серьезной комбинированной иммунной недо- статочностью (SCID) из-за мутации в гене, катализиру- ющем перестройки иммунорецептора в лимфоцитах. У этих мышей не было зрелых В- и Т-клеток, и это состоя- ние было похоже на заболевание у человека («bubble ba- bies»). На рис. 22.10 суммированы этапы этого экспери- мента. На первом этапе ядра соматических донорских клеток (фибробластов) из хвостов дефектных по Rag2 мышей инъецировали в денуклеированные яйцеклетки Получившиеся в результате эмбрионы культивировали до стадии бластоцисты и изолировали аутологичные клетки ES. Затем одна из мутантных аллелей Rag2 была «сделана мишенью» для восстановления нормальной структуры гена с помощью гомологичной рекомбина- ции в клетках ES Чтобы получить соматические клетки для лечения, эти клетки ES были дифференцированы в эмбриоидные тела (эмбриоподобные структуры, содер- жащие различные типы соматических клеток) и далее в предшественники гематопоэза путем экспрессии НохВ4. Получившиеся в результате предшественники гемато- поэза трансплантировали облученным животным, де- фектным по Rag2, для лечения заболевания. Эти клетки 7 Диссоциация EBs и заражение векто- ром HoxB4iGFP Rag2-/- 8. Размножение культуры HSC и трансплантация 6. Дифференцировка в EBs . Пересадка ядра денуклеированный ооцит 5. Репарация гена Rag2 в ES-клетках с помощью гомологичной рекомби- нации 3. Активация и культиви- рование до клонирован- ной бластоцисты 4. Выделение изогенных ES-клеток Rag2-/- Рис. 22.10. Схема терпевтического клонирования в сочетании с генной и клеточной терапией Культивировали кусочек хвоста от мыши, гомозиготной по мутации активирующего рекомбинацию гена 2 (Rag2). Когда вы- росли фибробластоподобные клетки, они были использованы в качестве доноров для пересадки ядер путем прямой инъекции в денуклеированные ооциты МП с помощью микроманипулятора с пьезоэлектрическим управлением. Эмбриональные стволовые (ES) клетки, изолированные из полученных пересадкой ядер бластоцист, были генетически репарированы методом гомологичной рекомбинации. После репарации клетки ntES были дифференцированы in vitro в эмбриоидные тела (EBs), инфецированы ре- тровирусом HoxB4iGFP. размножены и инъецированы в хвостовую вену облученных, дефектных по Rag2 мышей (перепечатано, с любезного разрешения, из Hochedlinger and Jaenisch, 2003 [© Massachusetts Medical Society]) 1. Культивирование клеток кончика хвоста
генерировали функциональные В- и Т-клетки, которые проделали соответствующие перестройки своих алле- лей иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора, как и сывороточных иммуноглобулинов, в трансплантных мышах Rag2. Этот эксперимент продемонстрировал, что пересадку ядер, в сочетании с генной терапией, можно использовать для лечения генетических нару- шений. Следовательно, терапевтическое клонирование должно быть применимо и в случае других заболеваний с известным генетическим дефектом, таких как сер- повидноклеточная анемия или бета-талассемия. Не- решенным остается вопрос, будет ли трансплантация ядер у человека столь же эффективной, как у коров, или такой же неэффективной, как у мышей. Использование ядерного клонирования для полу- чения «заказных» [«customized»] клеток ES для восста- новления тканей вызывает противоречивые оценки, поскольку, как утверждают его противники, само полу- чение клеток ES с необходимостью было бы связано с разрушением потенциального человеческого существа. В качестве возможного решения этой этической дилем- мы была предложена измененная пересадка ядра (ANT, altered nuclear transfer) как модификация обычной про- цедуры пересадки ядра (Hurlbut, 2005). ANT включает инактивацию гена в соматических донорских клетках, который необходим для развития плаценты, и тем са- мым предотвращает образование плода, поскольку ANT-бластоциста была бы не способна к имплантации (и, таким образом, не разрушалась бы никакая потен- циальная человеческая жизнь), но все еще позволяла бы получать «заказные» ES-клетки. Используя Cdx2 в качестве гена-мишени, провели эксперимент на мы- шах по принципиальной проверке этого подхода, ANT (Meissner and Jaenisch, 2006). Остается посмотреть, удо- влетворит ли эта модификация ANT тех, кто возражает против получения клеток ES из клонированных бласто- цист человека. 6.3. Репродуктивное versus терапевтическое клонирование: в чем разница? Почемы ошибочное репрограммирование порождает столько проблем для репродуктивного клонирования, но не для терапевтических приложений? Наиболее важная причина этого кажущегося парадокса заключается в том, что, в отличие от репродуктивного клонирования, использование ядерных пересадок для целей терапии не требует формирования плода, основываясь вместо этого на прямой дифференцировке функциональных клеток в культуре. Поскольку нет потребности в развитии плода, не следует ожидать, что функциональность дифферен- цированных клеток, получающихся в результате этого процесса, будет затронута нарушенным импринтингом, который в значительной мере определяет неспособность клонов к развитию (Jaenisch, 2004). Поскольку клетки ES, полученные из оплодотворенных эмбрионов, способны участвовать в формировании всех нормальных эмбрио- нальных тканей, клетки ES, полученные с помощью пересадки ядер, должны обладать такой же способно- стью генерировать полный спектр нормальных тканей. Действительно, все имеющиеся данные согласуются с выводом о том, что клетки ES, полученные из клониро- ванных эмбрионов, биологически и молекулярно неот- личимы от клеток ES, полученных из оплодотворенных эмбрионов (Brambrink et al., 2006). Таким образом, если человеческие клетки ES, полученные из IVF-эмбрионов, пригодны для лечения болезней, то это же относится и к «заказным» клеткам ES, полученным с помощью ядер- ного клонирования из клеток пациента. Литература Betts D., Bordignon V, Hill J., Winger Q., Westhusin M., Smith L., and King W, 2001. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 1077-1082. Blelloch R.H., Hochedlinger K., Yamada Y, Brennan C., Kim M., Mintz B., Chin L., and Jaenisch R., 2004. Nuclear cloning of embryonal carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 13985- 13990. Boiani M., Eckardt S., Scholer H.R., and McLaughlin K.J., 2002. Oct4 distribution and level in mouse clones: Consequences for pluripotency. Genes Dev. 16: 1209-1219. Bolton V.N., Oades P.J., and Johnson M.H. J984. The relationship between cleavage, DNA replication, and gene expression in the mouse 2-cell embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 79: 139-163. Bortvin A., Eggan K., Skaletsky H., Akutsu H., Berry D.L., Yanagi- machi R., Page D.C., and Jaenisch R., 2003. Incomplete reac- tivation of Ocr4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei. Development 130: 1673-1680. Bourc’his D., Le Bourhis D., Patin D., Niveleau A., Comizzoli P., Renard J.P., and Viegas-Pequignot E., 2001. Delayed and in- complete reprogramming of chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos. Curr. Biol. 11: 1542-1546. Brambrink T, Hochedlinger K., Bell C., and Jaenisch R., 2006. ES cells derived from cloned and fertilized blastocysts are transcrip- tionally and functionally indistinguishable. Proc. Natl. Acad. Sci. 103:933-938. Briggs R. and King T.J., 1952. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’ eggs. Proc. Natl. Acad. Sci 38: 455-463. Briggs R. and King T.J., 1957. Changes in the nuclei of differentiat- ing endoderm cells as revealed by nuclear transplantation. J. Morphol. 100: 269-312. Bromhall J.D.. 1975. Nuclear transplantation in the rabbit egg. Nature 258: 719-722. Byrne J.A., Simonsson S., Western P.S., and Gurdon J.B., 2003. Nu- clei of adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by amphibian oocytes. Curr Biol. 13: 1206-1213. Calarco P.G. and McLaren A., 1976. Ultrastructural observations of preimplantation stages of the sheep. J. Embryol. Exp. Morphol. 36: 609-622. Callan H.G. and Lloyd L.. 1960. Lampbrush chromosomes of crested newts Triturus cristatus (Laurenti). Philos. Trans. R. Soc. bond. В Biol. Sci. 243: 135-219. Camous S., Kopecny V, and Flechon J.E., 1986. Autoradiographic detection of the earliest stage of [3H]-uridine incorporation into the cow embryo. Biol. Cell 58:, 195-200.
Глава 22. Трансплантация ядер и репрограммирование генома Campbell К.Н., Loi Р., Otaegui P.J., and Wilmut I., 1996a. Cell cycle coordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev. Reprod. 1: 40-46. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., and Wilmut I., 1996b. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64-66. Campbell K.H., Alberio R., Choi I., Fisher P., Kelly R.D., Lee J.H., and Maalouf W., 2005. Cloning: Eight years after Dolly. Reprod. Domest. Anitn. 40: 256-268. Cezar G.G., Bartolomei M.S., Forsberg E.J., First N.L., Bishop M.D., and Eilertsen KJ., 2003. Genome-wide epigenetic altera- tions in cloned bovine fetuses. Biol. Reprod. 68: 1009-1014. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C., Ponce de Leon F.A., and Robl J.M., 1998. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 1256-1258. Dean W, Santos R., and Reik W, 2003. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Semin. Cell Dev. Biol. 14: 93-100. Dean W., Santos R., Stojkovic M., Zakhartchenko V, Walter J., Wolf E., and Reik W, 2001. Conservation of methylation reprogram- ming in mammalian development: Aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 13734-13738. Di Berardino M.A. and Hoffner N., 1970. Origin of chromosomal abnor- malities in nuclear transplants—A reevaluation of nuclear differentia- tion and nuclear equivalence in amphibians. Dev. Biol. 23:185-209. Dimitrov S. and Wolffe A.P., 1996. Remodeling somatic nuclei inXe- nopus laevis egg extracts: Molecular mechanisms for the selective release of histones H1 and H1° from chromatin and the acquisi- tion of transcriptional competence. EMBO J. 15: 5897-5906. Eggan K., Akutsu H., Hochedlinger K., Rideout W, Yanagimachi R., and Jaenisch R., 2000. X-Chromosome inactivation in cloned mouse embryos. Science 290: 1578-1581. Eggan K., Akutsu H., Loring J., Jackson-Grusby L., Klemm M., Rideout W.M., HI, Yanagimachi R., and Jaenisch R., 2001. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetrapioid embryo complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 6209-6214. Eggan K., Baldwin K., Tackett M., Osborne J., Gogos J.. Chess A., Axel R., and Jaenisch R., 2004. Mice cloned from olfactory sensory neurons. Nature 428: 44-49. Fischberg M., Gurdon J.B., and Elsdale T.R., 1958. Nuclear trans- plantation in Xenopus laevis. Nature 181: 424. Gonda K., Fowler J., Katoku-Kikyo N., Haroldson J., Wudel J., and Kikyo N., 2003. Reversible disassembly of somatic nucleoli by the germ cell proteins FRGY2a and FRGY2b. Nat. Cell Biol. 5:, 205-210 Gurdon J.B., 1960. The developmental capacity of nuclei taken from differentiating endoderm cells of Xenopus laevis. J. Embryol. Exp. Morphol. 8: 505-526. Gurdon J.B., 1962. Thedevelopmental capacity ofnucleitakenfromin- testmal epithelium cells offeeding tadpoles. J. EmbryolExp. Morphol. 10: 622-640. Gurdon J.B., 1963. Nuclear transplantation in Amphibia and the importance of stable nuclear changes in cellular differentiation. Q. Rev.Biol. 38: 54-78. Gurdon J.B., 1964. The transplantation of living cell nuclei. Adv. Morphog. 4: 1-43. Gurdon J.B. and Uehlinger V., 1966. “Fertile” intestine nuclei. Nature 2W. 1240-1241. Gurdon J.B., Elsdale T.R., and Fischberg M., 1958. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature 182: 64-65 Gurdon J.B., Brennan S., Fairman S., and Mohun T.J., 1984. Transcription of muscle-specific actin genes in early Xenopus development: Nuclear transplantation and cell dissociation. Ce//38: 691-700. Hansis C., Barreto G.. Maltry N., and Niehrs C., 2004. Nuclear reprogramming of human somatic cells by Xenopus egg extract requires BRG1. Curr. Biol. 14: 1475-1480. Hill J.R., Burghardt R.C., Jones K., Long C.R., Looney C.R., Shin T, Spencer T.E., Thompson J.A., Winger Q.A., and Westhusin M.E., 2000. Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol. Reprod. 63: 1787-1794. Hochedlinger K. and Jaenisch R., 2002. Monoclonal mice gener- ated by nuclear transfer from mature В and T donor cells. Nature 415:1035-1038. Hochedlinger K. and Jaenisch R., 2003. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. N. Engl. J. Med. 349: 275-286. Hochedlinger K., Blelloch R., Brennan C., Yamada Y, Kim M., Chin L., and Jaenisch R., 2004. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes Dev. 18: 1875-1885. Humpherys D., Eggan K., Akutsu H., Friedman A., Hochedlinger K., Yanagimachi R., Lander E., Golub T.R., and Jaenisch R., 2002. Abnormal gene expression in cloned mice derived from embryonic stem cell and cumulus cell nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. 99:12889-12894. Humpherys D., Eggan K., Akutsu H., Hochedlinger K., Rideout W, Biniszkiewicz D., Yanagimachi R., and Jaenisch R., 2001. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science 293: 95-97. Hurlbut W.B., 2005. Altered nuclear transfer as a morally acceptable means for the procurement of human embryonic stem cells. Perspect. Biol. Med. 48: 211-228. Inoue K., Wakao H., Ogonuki N., Miki H., Seino K., Nambu-Wakao R., Noda S., Miyoshi H., Koseki H., Taniguchi M., and Ogura A., 2005. Generation of cloned mice by direct nuclear transfer from natural killer T cells. Curr. Biol. 15: 1114-1118. Jaenisch R., 2004 Human cloning — The science and ethics of nuclear transplantation. N. Engl. J. Med. 351: 2787-2791. Kang Y.K., Lee K.K., and Han Y.M., 2003. Reprogramming DNA methylation in the preimplantation stage: Peeping with Dolly’s eyes. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 290-295. Kikyo N., Wade P.A., Guschin D., Ge H., and Wolffe A.P., 2000. Active remodeling of somatic nuclei in egg cytoplasm by the nucleosomal ATPase ISWI. Science 289: 2360-2362. Kohda T, Inoue K., Ogonuki N., Miki H., Naruse M., Kaneko- Ishino T, Ogura A., and Ishino P, 2005. Variation in gene ex- pression and aberrantly regulated chromosome regions in cloned mice. Biol. Reprod. 73: 1302-1311. Lanza R., Cibelli J., Blackwell C., Cristofalo V., Francis M., Baerlocher G., Mak J., Schertzer M., Chavez E., Sawyer N., et al., 2000. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science 288: 665-669. Laskey R.A. and Gurdon J.B., 1970. Genetic content of adult somatic cells tested by nuclear transplantation from cultured cells Nature 228:1332-1334.
Laskey R.A., Honda B.M., Mills A.D., and Finch J.T, 1978. Nu- cleosomes are assembled by an acidic protein which binds his- tones and transfers them to DNA. Nature 275: 416-420. Latham K.E., 1999. Mechanisms and control of embryonic ge- nome activation in mammalian embryos. Int. Rev. Cytol., 193: 71-124. Lemaitre J.M., Danis E., Pasero P., Vassetzky Y., and Mechali M., 2005. Mitotic remodeling of the replicon and chromosome structure. Cell 123: 787-801. Li J., Ishii T, Feinstein P, and Mombaerts P, 2004. Odorant recep- tor gene choice is reset by nuclear transfer from mouse olfactory sensory neurons. Nature 428: 393-399. Li L., Connelly M.C., Wetmore C., Curran T, and Morgan J.I., 2003. Mouse embryos cloned from brain tumors. Cancer Res. 63:2733-2736. Mann M.R., Chung Y.G., Nolen L.D., Verona R.L, Latham K.E., and Bartolomei M.S., 2003. Disruption of imprinted gene methy- lation and expression in cloned preimplantation stage mouse embryos. Biol. Reprod. 69: 902-914. McGrath J. and Solter D., 1984a. Completion of mouse embryo- genesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 37:179-187. McGrath J. and Solter D., 1984b. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science 226: 1317-1319. McKinnell R.G., 1962. Development of Rana pipiens eggs trans- planted with Lucke tumor cells. Am. Zool. 2: 430-431. Meehan R.R., 2003. DNA methylation in animal development. Semin. Cell Dev. Biol. 14: 53-65. Meissner A., 2006. “Conditional RNA interference, altered nuclear transfer and genome-wide DNA methylation analysis.” Ph.D. thesis University Saarland, Saarbrucken, Germany. Meissner A. and Jaenisch R., 2006. Generation of nuclear transfer- derived pluripotent ES cells from cloned G7x2-deficient blasto- cysts. Nature 439: 212-215. Ng R.K. and Gurdon J.B., 2005. Epigenetic memory of active gene transcription is inherited through somatic cell nuclear transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. 102:, 1957-1962. Nolen L.D., Gao S., Han Z., Mann M.R., Gie Chung Y, Otte A.P., Bartolomei M.S., and Latham K.E., 2005. X chromosome reactivation and regulation in cloned embryos. Dev. Biol. 279: 525-540. Ogonuki N., Inoue K., Yamamoto Y, Noguchi Y, Tanemura K, Suzuki O., Nakayama H., Doi K., Ohtomo Y, Satoh M., et al., 2002. Early death of mice cloned from somatic cells. Nat. Genet. 30:253-254. Ogura A., Inoue K., Ogonuki N., Noguchi A., Takano K., Nagano R., Suzuki O., Lee J., Ishino P, and Matsuda J., 2000. Produc- tion of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature Sertoli cells. Biol. Reprod. 62: 1579-1584. Philpott A., Leno G.H., and Laskey R.A., 1991. Sperm deconden- sation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Ce//65: 569-578. Prather R.S., Sims M.M., and First N.L., 1989. Nuclear transplanta- tion in early pig embryos. Biol. Reprod. 41: 414-418. Rideout W.M., III, Eggan K., and Jaenisch R., 2001. Nuclear clon- ing and epigenetic reprogramming of the genome. Science 293: 1093-1098. Rideout W.M., III, Hochedlinger K., Kyba M., Daley G.Q., and Jaenisch R., 2002. Correction of a genetic defect by nuclear trans- plantation and combined cell and gene therapy. Cell 109:17-27. Rideout W.M., HI, Wakayama T, Wutz A., Eggan K., Jackson- Grusby L., Dausman J., Yanagimachi R., and Jaenisch R., 2000. Generation of mice from wild-type and targeted ES cells by nuclear cloning. Nat. Genet. 24: 109-110. Robi J.M., Prather R., Barnes E., Eyestone W, Northey D., Gilli- gan B., and First N.L., 1987. Nuclear transplantation in bovine embryos. J. Anim. Sci. 64: 642-647. Senda S., Wakayama T., Yamazaki Y., Ohgane J., Hattori N., Tanaka S., Yanagimachi R., and Shiota K., 2004. SkewedX-inactivation in cloned mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 321: 38-44. Simnett J.D., 1964. The development of embryos denved from the transplantation of neural ectoderm cell nuclei in Xenopus laevis. Dev. Biol. 10: 467-486. Simonsson S. and Gurdon J., 2004. DNA demethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nat. CellBiol. 6: 984-990. Surani M.A., Barton S.C., and Norns M.L., 1984. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 308: 548-550. Tamada E.L., Van Thuan N., Reed P, Nelson D., Katoku-Kikyo N., Wudel J., Wakayama T, and Kikyo N., 2006. Chromatin decondensation and nuclear reprogramming by nucleoplasmin. Mol. Cell. Biol. 26: 1259-1271. Tamashiro K.L., Wakayama T, Akutsu H., Yamazaki Y, Lachey J.L., Wortman M.D., Seeley R.J., D’Alessio D.A., Woods S.C., Yanagimachi R., and Sakai R.R., 2002. Cloned mice have an obese phenotype not transmitted to their offspring. Nat. Med. 8: 262-267. Tanaka S., Oda M., Toyoshima Y, Wakayama T, Tanaka M., Yoshida N., Hattori N., Ohgane J., Yanagimachi R., and Shiota K., 2001. Placentomegaly in cloned mouse concept! caused by expansion of the spongiotrophoblast layer. Biol. Reprod. 65: 1813-1821 Tian X.C., Xu J., and Yang X., 2000. Normal telomere lengths found in cloned cattle. Nat. Genet. 26: 272-273. Wakayama S., Ohta H., Kishigami S., Van Thuan N., Hikichi T, Mizutani E., Miyake M., and Wakayama T, 2005. Establish- ment of male and female nuclear transfer embryonic stem cell lines from different mouse strains and tissues. Biol. Reprod. 72: 932-936. Wakayama T. and Yanagimachi R., 1999. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat. Genet. 22: 127-128. Wakayama T. and Yanagimachi R., 2001. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol. Reprod. Dev. 58:376-383. Wakayama T, Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K.R., and Yanagi- machi R., 1998. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394: 369- 374 WakayamaT, Rodriguez L, Perry A.C, Yanagimachi R., and Mom- baerts P, 1999. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14984-14989. WakayamaT, Shinkai Y, Tamashiro K.L., Niida H., Blanchard D.C., Blanchard R.J., Ogura A., Tanemura K., Tachibana M., Perry A.C., et al., 2000. Cloning of mice to six generations. Nature 407:318-319. Wilmut L, Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., and Campbell K.H., 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813. Young L.E., Sinclair K.D., and Wilmut L, 1998. Large offspring syndrome in cattle and sheep. Rev. Reprod. 3: 155-163.
ГЛАВА 23 ЭПИГЕНЕТИКА И БОЛЕЗНИ ЧЕЛОВЕКА Huda Y. Zoghbi1 и Arthur L. Beaudet2 1 Howard Hughes Medical Institute и department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas 77030 СОДЕРЖАНИЕ: Общее резюме 1. Введение 2. Исследования болезней человека вскрывают роль эпигенетики в биологии 3. Заболевания человека 3.1. Нарушения геномного импринтинга 3.2. Нарушения, влияющие на структуру хрома- тина в trans-конфигурации ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Последние два десятилетия мы были свидетелями бес- прецедентного успеха в идентификации генетических основ многих болезней человека. Изучение взаимоотно- шений генотипа и фенотипа бросает вызов клиницистам и исследователям, поскольку некоторые наблюдения не так просто поддаются объяснению. Например, однояй- цевые близнецы, несущие мутацию, которая приводит к одному и тому же заболеванию, могут отличаться друг от друга по клиническим показателям. Мутация, передаю- щаяся в семье, представляющей ряд поколений, может вызывать довольно сильно различающиеся заболевания, в зависимости от пола родителя, передающего эту мута- цию. Изучение таких необычных случаев вскрыло роль эпигенома (измененной генетической информации, возникшей без изменения в нуклеотидной последова- тельности ДНК) в вопросах здоровья и болезней. Эти исследования показали, что некоторые области генома млекопитающих функционально неравноценны, в зави- симости оттого, представлены ли они материнскими или 3.3. Расстройства, влияющие на структуру хро- матина в c/s-конфигурации 3.4. Взаимодействие эпигенетики и окружаю- щей среды 4. Глядя в будущее Литература отцовскими аллелями. У пациентов, наследующих обе гомологичные хромосомы (или их сегменты) от одного и того же родителя (однородительская дисомия — uni- parental disomy, UPD), наблюдается потеря экспрессии некоторых генов, которые экспрессируются только в материнских аллелях ( в случае отцовской UPD), и по- вышение уровня экспрессии отцовских генов. Довольно скоро стало общепризнанным, что UPD, как и изменен- ные ДНК-модификации (эпигенетические мутации, которые могут изменять метилирование ДНК), являются молекулярной основой целого ряда неврологических нарушений и нарушений развития. Интересно, что для многих нарушений такого рода либо эпигенетические, либо генетические мутации могут приводить к одному и тому же фенотипу Это часто происходит потому, что генетические мутации нарушают функцию гена, не- правильно регулируемую в тех случаях, когда на данный локус влияют эпигенетические дефекты. В другом классе заболеваний, где генетические му- тации вызывают утрату функций белков, участвующих в метилировании ДНК или ремоделинге хроматина,
фенотипы возникают в результате изменения эпигене- тических состояний в одном или нескольких локусах. Взаимоотношения между геномом и эпигеномом рас- ширили круг типов молекулярных событий, вызываю- щих заболевания человека. Они могут возникать de novo или быть унаследованными, могут быть генетическими или эпигенетическими и, что особенно интересно, не- которые из них могут быть подвержены влиянию фак- торов внешней среды. Обнаружение того факта, что внешние факторы, такие как режим питания или «жиз- ненный опыт», изменяют эпигеном (в частности, мети- лирование ДНК), вероятно дает нам механистическое понимание нарушений с генетической предрасполо- женностью и сильным влиянием окружающей среды. В число таких нарушений входят дефекты нервной труб- ки и заболевания, лежащие в сфере психиатрии. Уста- новление внешних факторов, влияющих на эпигеном, внушает надежду на разработку медицинских вмеша- тельств, которые смогут снизить риск нарушений раз- вития раковых заболеваний и нервно-психических рас- стройств или уменьшить их тяжесть. 1. Введение У двух генетически идентичных однояйцевых близнецов мужского пола, росших в одних и тех же условиях, про- являлись очень разные неврологические функции. Оба близнеца несли одну и ту же мутацию в сцепленном с Х-хромосомой гене адренолейкодистрофии (ALD), од- нако у одного из близнецов наблюдались: слепота, про- блемы с равновесием и утрата миелина в головном мозге — черты, типичные для прогрессирующего и летального неврологического заболевания, тогда как второй близнец оставался здоровым. Вывод исследователей, сообщавших об этой ситуации, был таков: «для разных фенотипов ADL могут быть важны какие-то негенетические факторы» (Korenke et al., 1996). Для 1996 года это был поистине очень важный вывод, при том, что внимание медицинской ци- тогенетики было сфокусировано на последовательности нуклеотидов ДНК. Если фенотипические вариации нельзя объяснить нуклеотидной последовательностью ДНК, то их можно объяснить внешними факторами. По аналогии с ALD-дискордантными однояйцевыми близнецами, было обнаружено множество однояйцовых близнецов, дискордантных по шизофрении, несмотря на сходные внешние условия, в которых они росли (Petronis, 2004). К счастью, исследования последнего десятилетия окон- чательно сфокусировали внимание на эпигенетических изменениях (модификациях генетической информации, не затрагивающих последовательность нуклеотидов в ДНК) как на потенциальном объяснении дискордантных фенотипов у однояйцовых близнецов и у индивидуумов, имеющих, по тем или иным причинам, одинаковые из- менения в последовательности ДНК (Dennis, 2003; Fraga et al., 2005). Эпигенетические модификации контролируют пат- терны экспрессии генов в клетке. Эти модификации стабильны и наследуемы, так что материнская клетка печени после деления, безусловно, даст начало другим клеткам печени В случае с неделящимися клетками, такими как нейроны, адаптация участков хромосомы посредством модификаций хроматина дает механизм для поддержания (сохранения) эпигенетической ин- формации и, возможно, опосредует воспроизводимый ответ нейронов на специфические раздражители Эпи- генотип (эпигенетическое состояние геномного локуса) устанавливается на основе наличия или отсутствия ме- тилирования ДНК, модификаций хроматина и разно- образной активности некодирующих РНК, требующей дальнейшего прояснения. У млекопитающих метилирование ДНК, являю- щееся наиболее хорошо изученным эпигенетическим сигналом, осуществляется преимущественно по угле- роду-5 симметричных динуклеотидов CpG. Состояние метилирования ДНК сохраняется после деления клет- ки посредством активности ДНК-метилтрансферазы 1, которая метилирует полуметилированные динуклеоти- ды CpG в дочерних клетках. Модификации хроматина включают ковалентные посттрансляционные моди- фикации торчащих амино-терминальных гистоновых «хвостов» путем добавления к ним ацетильных, метиль- ных, фосфатных, убиквитиновых или других групп. Метильные модификации могут представлять собой моно-, ди-, или три-метилирование. Эти модификации составляют потенциальный «гистоновый код», лежа- щий в основе специфической хроматиновой структуры, которая, в свою очередь, влияет на экспрессию соседних генов. Так как хроматин состоит из плотно упакован- ных цепей ДНК, завернутых вокруг гистонов, паттерн укладки ДНК в хроматин несомненно лежит в основе изменений генной активности. Хотя гистоновые коды и хроматиновые структуры могут стабильно переда- ваться от родительской в дочерние клетки, механизмы, лежащие в основе репликации таких структур, поняты не полностью. Эпигенотип проявляет пластичность во время эмбрионального развития и постнатально, в за- висимости от факторов внешней среды и жизненного опыта (см. раздел 3.4); таким образом, не удивительно, что эпигенотипы могут вносить свой вклад не только в нарушения эмбрионального развития человека, но также в постнатальную патологию и даже заболевания взрослых людей. Обнаруженный совсем недавно класс молекул, играющих роль в эпигенетическом сигнале, — это молекулы некодирующих РНК. Многие годы класс не кодирующих белки РНК (non-protein-coding RNA — ncRNA) включал в себя только транспортные, рибо- сомные и сплайсосомную РНК. Недавно, благодаря тому, что стали доступны нуклеотидные последователь- ности геномов множества разнообразных организмов, а также благодаря молекулярно-генетическим межви- довым исследованиям (от Escherichia coli до человека), список ncRNA расширился, и это привело в результа- те к идентификации сотен малых ncRNAs, в том числе малой ядрышковой РНК (small nucleolar RNA - snoR- NA), микроРНК (micro RNA — miRNA), коротко- интерферирующей РНК (short-interfering RNA—siRNA) и малой двунитевой РНК Некоторые из этих молекул малых РНК регулируют модификации хроматина, им- принтинг, метилирование ДНК и транскрипционный сайленсинг, что детально обсуждается в главе 8.
Глава 23. Эпигенетика и болезни человека Первое определенное свидетельство роли, которую эпигенетика играет в заболеваниях человека, имело место после того, как поняли геномный импринтинг и нашли, что некоторые гены регулируются с помощью этого механизма (Reik, 1989). Геномный импринтинг — это форма эпигенетической регуляции, при которой экспрессия гена зависит от того, унаследован ли этот ген от матери или же от отца. Таким образом, в им- принтированном диплоидном локусе имеет место не- равная экспрессия материнской и отцовской аллелей. В каждом поколении родительски-специфичные им- принтные метки должны стираться, «перезагружаться» и поддерживаться, делая, таким образом, импринтные локусы уязвимыми по отношению к любого рода ошиб- кам, которые могут происходить во время этого про- цесса. Такие ошибки, как и мутации генов, кодирую- щих белки, которые участвуют в метилировании ДНК, связывании с метилированной ДНК и модификациях гистонов, — все это вместе вносит свой вклад в быстро растущий класс нарушений, влияющих на эпигеном че- ловека (рис. 23.1). 2. Исследования болезней человека вскрывают роль эпигенетики в биологии Нет сомнений в том, что изучение модельных организмов явилось ключевым фактором для понимания многих биологических принципов, особенно в области гене- тики, биологии развития и нейрологии. Однако часто забывают, что, каких бы аспектов биологии мы не каса- лись, одним из наиболее важных модельных организмов является человек. Описание тысяч болезней человека представляет собой наиболее полную картину мутаций, по сравнению с любым другим видом; и если эти фено- типы будут систематически и тщательно изучены, то, возможно, они позволят не только добиться медицин- ских успехов, но и проникнуть в биологическую суть заболевания. Не удивительно поэтому, что отношения между генотипом и фенотипом, которые поставили под вопрос менделевское наследование в случае «динами- ческих мутаций», были выявлены в процессе изучения пациентов с синдромом ломкой Х-хромосомы (Pieretti et al., 1991). Нередко пациенты с уникальными особен- ностями и наблюдающие их врачи открывают новую область в биологии, выявляя неизвестные генетические и молекулярные механизмы. И действительно, именно таким образом и была выявлена роль эпигенетики в раз- витии и в заболеваниях человека. Такова история болезни одной пациентки, о кото- рой дважды сообщалось в литературе врачами, наблю- давшими ее на протяжении более 10 лет. Когда ей было 7 лет, ее случай был упомянут в медицинской литера- туре в связи с тем, что она страдала циститным фибро- зом (CF, cystic fibrosis) и недостаточностью гормона роста и была очень невысокого роста (Hubbard et al., 1980). В поисках гена, отвечающего за CF, Боде (Beau- det) с сотрудниками разыскивали необычных пациен- тов с CF, у которых были бы при этом дополнительные особенности, в надежде идентифицировать небольшие делеции или хромосомные перестройки, которые мог- ли бы облегчить картирование и идентификацию гена CF. Поэтому данная пациентка привлекла их внима- ние. В16 лет ее рост составлял 130 см, умственное раз- витие соответствовало норме, но у нее явно была не- которая асимметрия тела (см. правую часть рисунка на титульной странице). Анализ ее ДНК показал, что она гомозиготна по множественным полиморфным ДНК- маркерам на хромосоме 7, включая центромерные аль- фоидные повторы (Spence et al., 1988). После того, как были исключены отсутствие отцовских элементов и гемизиготность, и после изучения ДНК бабушки па- циентки (мать уже скончалась) Спенс (Spence) с кол- Заболевания, связанные с хроматином Эпигенетический генетический Измененное метилирование ДНК Trans- эффекты Мутация эффектора хроматина C/s- эффекты Регуляторная последовательность (например мутация промотора) Рис. 23.1. Генетические и эпигенетические механизмы, лежащие в основе нарушений, связанных с хроматином Эпигенетические механизмы обычно включают изменения метилирования ДНК или изменения хроматина в им- принтированных локусах, что нарушает моноаллельную экспрессию. Генетиче- ские механизмы можно разделить на два класса. Trans-эффекты включают в себя потерю или дисфункцию факторов, ас- социированных с хроматином, которые, в свою очередь, могут изменять структуру хроматина и экспрессию генов в опреде- ленных участках генома, c/s-эффекты представляют собой мутации в некоди- рующих участках, которые могут быть необходимы для регуляции Результатом этих мутаций, которые могут включать в себя увеличение повторов ДНК, может быть изменение хроматина, влияющее на стабильность генома и экспрессию генов
3. Заболевания человека легами сделали вывод, что данная пациентка унасле- довала две идентичные копии центромерного района хромосомы 7 от своей бабушки по материнской линии (Spence et aL, 1988). Учитывая теоретическое предпо- ложение Энгела (Engel), что однородительская дисо- мия (uni-parental disomy — UPD) возможна у человека (Engel, 1980), Боде (Beaudet) с коллегами сразу же до- гадался, что материнская UPD по хромосоме 7 выяв- ляет рецессивную мутацию в гене CF и объясняет все дополнительные соматические особенности. Совокуп- ность клинических характеристик пациента вместе с лабораторными оценками не только привели в резуль- тате к идентификации первого случая UPD у челове- ка, но и проиллюстрировали тот факт, что отцовский и материнский геномы не эквивалентны в отношении по крайней мере некоторой части хромосомы 7. Таким образом был установлен новый механизм неменделев- ской наследственности для объяснения причин забо- леваний и аномалий развития (рис. 23.2). Хотя в 1988 г. некоторые считали, что однородитель- ская дисомия (UPD) хромосомы это редкое явление, сейчас мы знаем, что случаи UPD отмечались до сих Отцовский Ген А Ген В Материнский пор практически для всех человеческих хромосом, кро- ме хромосом 3 и 19. Изучение необычных пациентов не только устано- вило случаи UPD для дополнительных хромосом, но и привело в 1989 г. к предположению, что UPD вызыва- ет заболевания благодаря изменениям в эпигенотипе и нарушению геномного импринтинга (Nicholls et al., 1989). Николс (Nicholls) с соавторами изучали паци- ента с синдромом Прад ера-Уилл и (PWS, Prader-Willi syndrome), у которого была сбалансированная роберт- соновская транслокация t(13;15), которая также при- сутствовала у его матери, не имевшей симптоматики, и у родственников по материнской линии. Тот факт, что пробанд унаследовал свою вторую свободную хромо- сому 15 от своей матери (тогда как все индивидуумы, не имевщие симптоматики, наследовали ее от отцов), привело авторов к заключению, что материнская UPD привела к фенотипу PWS. После того, как наличие ма- теринской UPD по хромосоме 15 подтвердилось у вто- рого пациента с PWS и с внешне нормальным кариоти- пом, авторы предположили, что в этиологии PWS свою роль играет геномный импринтинг. Более того, они за- ключили, что либо отцовские делеции, либо материн- ская UPD с 15ql 1-13 обычно приводит к PWS, и они предсказали, что отцовская UPD15 точно так же, как материнские делеции данного района, может вызвать синдром Ангелмана (Angelman syndrome). Все эти пред- сказания оказались верными (рис. 23.3). 3. Заболевания человека Отцовская UPD (ОРД) Рис. 23.2. Последствия однородителъской дисомии Состояния метилирования ДНК островков CpG, лежащих «вверх по течению», обозначены розовыми кружками, если ДНК метилирована и пустыми кружками, если неметилиро- вана. Состояние метилирования ДНК влияет на экспрессию гена, лежащего «вниз по течению». Аллели, наследуемые по материнской линии, дублированы (ген В); тогда как гены, которые находятся на отцовской аллели утрачены (ген А) 3.1. Нарушения геномного импринтинга Открытие UPD было клинической «точкой входа» в на- рушения геномного импринтинга у людей. В то время как PWS и синдром Ангелмана были первыми изучен- ными нарушениями геномного импринтинга, синдром Беквита-Видемана (Beckwith-Wiedemann syndrome), псевдогипопаратироидизм и синдром Сильвера-Рассела (Silver-Russell syndrome) расширили этот список и поста- вили множество интригующих вопросов относительно того, как эпигенетические дефекты приводят к фенотипу, характерному для того или иного заболевания В следую- щем разделе мы даем краткий обзор клинических харак- теристик каждого нарушения, приводим разнообразные механизмы, ведущие к эпигенетипическим дефектам, а также описываем фенотипы и биологическую суть яв- лений, установленную в результате изучения этого типа нарушений (табл. 23.1). Сестринские синдромы: синдром Прадера-Уилли и синдром Ангелмана Синдром Прадера-Уилли (PWS; OMIM 176270) и синдром Ангелмана (AS; OMIM 105830) в большинстве случаев вызываются одной и той же делецией 15qll-ql3, разме- ром 5—6 млн. нуклеотидов, но их фенотипы во многом различны. Геномный импринтинг в области 15qll-ql3 объясняет эти фенотипические различия, с учетом того, что PWS вызывается делециями, унаследованными по
человека Таблица 23.1. Выборочные нарушения геномного импринтинга Нарушение Ген Комментарии Затронутые ген(ы) Синдром Prader-Willi Делеция, UPD, дефект импринта 15qll-ql3 snoRNAs и другие (?) Синдром Angelman Делеция, UPD, дефект импринта, точечная мутация, дупликация3 15qll-ql3 UBE3A Синдром Beckwith-Wiede- mann Дефект импринта, UPD, дупликация! 1 pi 5.5, 11 pi 5.5 ICF2, CDKN7C Транслокация, точечная мутация Синдром Silver-Russell UPD, транслокация дупликации, инверсия 7pll,2 Несколько возможных кандида- тов на участке Эпимутация 11 pi 5.5 Биаллельная экспрессия Н19 и уменьшение 1CF2 Псевдогипопаратироидизм Точечная мутация, дефект импринта, UPD 20ql3.2 GNAS1 аМатеринские дупликации, трисомия и тетрасомия по этому участку вызывают аутизм и другие аномалии развития. отцовской линии, тогда как при AS делеции имеют мате- ринское происхождение (Ledbetter et al., 1981; Magenis et al., 1987; Nicholls et al., 1989). PWS, который случается с частотой примерно 1/10000, был описан почти 50 лет назад и характеризуется младенческой гипотонией, задержкой развития, невозможностью роста вследствие плохого пи- тания, апатией, за которыми следуют гиперфагия, тяжелое ожирение, низкорослость, вторичный гипогонадизм с гипоплазией гениталий и ослабление познавательных способностей. Пациенты с PWS также имеют отличи- тельные физические черты, такие как небольшой размер кистей и стоп, миндалевидные глаза и тонкая верхняя губа. Большинство пациентов с PWS имеют слабое или среднее замедление умственного развития, подавляю- щее большинство из них проявляет разнообразные типы навязчиво-маниакального поведения, беспокойства, и иногда они замкнуты и несчастливы (рис. 23.4а). Наобо- рот, пациенты с AS имеют «счастливый настрой», часто улыбаются, и подвержены необъяснимым приступам смеха. Они страдают тяжелыми задержками развития, минимальными (если вообще имеют их) речевыми навы- ками. проблемами с равновесием (атаксией), производят аномальные похлопывающие движения кистями, харак- теризуются микроцефалией, припадками и некоторыми искаженными чертами, такими как выдающаяся нижняя челюсть и широкий рот (рис. 23.46). При обоих нарушениях могут наблюдаться гипото- ния, гипопигментация кожи и радужной оболочки и косоглазие. Большинство PWS и AS (~70%) вызваны отцовскими и материнскими делениями 15qll-ql3, соответственно. Около 25% случаев PWS вызвано ма- теринской UPD 15qll-ql3, тогда как отцовская одно- родительская дисомия этого участка отвечает за 2—5% пациентов с AS (рис. 23.3). Разница в частоте однороди- тельской дисомии между PWS и AS обычно иницииру- ется материнским нерасхождением, поскольку на него влияет возраст матери, приводящий к зачатиям с три- сомией или моносомией по хромосоме 15. Эти случаи затем подвергаются «спасению», что приводит к мате- ринской UPD и PWS или отцовской UPD и AS, соот- ветственно. Разница в частоте встречаемости этих двух однородительских дисомий предположительно связана с частотой образования двух аномальных яйцеклеток и с вероятностью «спасения» при обоих этих обстоятель- ствах. Транслокации в пределах критического PWS/AS участка отвечают менее чем за 10% таких случаев, но Отцовская одно- Материнская родительская Дефект Мутация делеция дисомия (ОРД) импринтинга в UBE3A Причина: генетическая эпигенетическая смешанная генетическая Рис. 23.3. Синдром Прадера-Вилли и синдром Ангелмана Оба синдрома могут быть вызваны генетиче- скими, эпигенетическими или смешанными дефектами СИНДРОМ ПРАДЕ РА-ВИЛЛ И Отцовская делеция Материнская однородитель ская дисомия (ОРД)
3. Заболевания человека Рис. 23.4. Пациент с синдромом Прадера-Уилли (а) и пациент с синдромом Ангелмана (б) Эти фотографии иллюстрируют существенные различия в клинической картине нарушений, вызванных дефектами в им- принтированном участке. Фотографии любезно предоставлены Д-рами Daniel J Driscoll (а) и Carlos A. Bacino (б) следует заметить, что такие транслокации связаны с высоким риском рецидива (до 50%), в зависимости от пола передающего родителя. Действительно, PWS и AS сосуществовали в некоторых семьях благодаря трансло- кациям или другим структурным аномалиям 15ql l-ql3, и фенотип при этом определялся полом передающего родителя (Hasegawa et al., 1984; Smeets et aL, 1992). Дефекты импринтинга представляют еще один класс мутаций, ведущих к фенотипам PWS или AS. Та- кие дефекты, которые включают в себя разделенный на две части центр импринтинга (1 С) в пределах 15q 11 -q 13 (Ohtaet al., 1999), являются причиной того, что хромо- сома, принадлежащая по происхождению одному из родителей, имеет измененный эпигенотип, как прави- ло, эпигенотип хромосомы, происходящей от друго- го родителя. Дефекты импринтинга часто включают в себя делецию 1С, но есть случаи, когда такие дефекты оказываются имеющими место благодаря эпигенети- ческой мутации, не затрагивающей последователь- ность нуклеотидов ДНК. Итог таких разнообразных нарушении импринтинга один и тот же, и он включа- ет в себя изменения в метилировании ДНК, структуре хроматина и, в конечном счете, паттерны экспрессии генов. Дефекты импринтинга объясняют 2—5% случа- ев PWS и AS, а делеции в 1С обычно ассоциируются с 50%-ным риском рецидива, в зависимости от пола ро- дителя, передающего аномалию, тогда как риск реци- дива в семьях без делеции в 1С невысок. Идентифика- ция дефектов импринтинга у небольшого количества пациентов с AS, которые были зачаты после инъекции спермы в цитоплазму яйцеклетки (ICSI, intracytolasmic sperm injection), поставила вопрос о том, что, возможно, этот способ оплодотворения in vitro вызывает дефекты импринтинга (Сох et al., 2002; Orstavik et al., 2003). Об- наружение дефектов импринтинга среди случаев AS у пациентов, родившихся у субфертильных родительских пар, не прошедших процедуру ICSI (но подвергнутых гормональной стимуляции), порождает дальнейшие во- просы относительно того, имеют ли бесплодие и дефек- ты импринтинга общие механизмы, или действительно вспомогательные репродуктивные технологии [гормо- ны и (или) ICSI] имеют эпигенетические последствия (Ludwig et al., 2005). Какой конкретно ген (гены) затрагивается геном- ным импринтингом в 15ql 1 -ql3, известно лишь для AS, но не для PWS. Около 10—15% случаев AS вызываются мутациями потери функции в гене лигазы ЕЗ убикви- тина (UBE3A), кодирующем белок, связанный с Е6 (Е6- АР, E6-associated protein) (Kishino et al., 1997; Matsuura et al., 1997). Изучение экспрессии показало, что Ube3a экспрессируется исключительно с материнской аллели в мозжечковых клетках Пуркинье и в нейронах гип- покампа. Более того, мыши Ube3a , лишенные мате- ринской аллели, воспроизводят черты AS (Jiang et al., 1998). Эти результаты, так же как и данные по челове- ку, указывают на ген UBE3A, как на первопричину AS. Отцовская UPD или материнские делеции в 15ql 1 -ql3, ведут к потере экспрессии UBE3A в клетках Пуркинье. В случае дефектов импринтинга в 1С оказывается, что потеря сайленсинга антисмыслового транскрипта ведет к подавлению экспрессии гена UBE3A (Rougeulle et al., 1998). Интересно, что около 10% случаев AS остаются без молекулярного диагноза. Оказывается, что у ряда пациентов имеются мутации в белке ремоделинга хро- матина — белке 2, связывающемся с метил-CpG, — что обсуждается ниже. В случае PWS есть несколько кандидатов на роль им- принтирующих генов, которые экспрессируются только с отцовской аллели, однако не ясно, которые из этих ге- нов ответственны за фенотип PWS. Наиболее подходя- щими кандидатурами до сих пор являются гены в класте- ре некодирующих малых ядрышковых РНК (snoRNAs). Из белок-кодирующих генов наилучшими кандидатами являются SNURF-SNRPN и Necdin (NDN). Главный сайт старта транскрипции SNURF-SNRPN расположен в 1С и он кодирует малый ядерный рибонуклеопротеин (SN- RPN) , который функционирует в регуляции сплайсинга. Считается, что главным сайтом дефектов импринтинга является еще один ген «рамка считывания вверх по те- чению от SNRPN» (или SNURF), наряду с некодирую- щими экзонами, расположенными «вверх по течению», потому что разрушение (дизрупция) этого гена ведет к изменению импринтинга SNRPN и других импринти- рованных генов 15qll-ql3. Мыши с отсутствием Snrpn выглядят нормальными, а мыши с делециями, захва- тывающими Snrpn и другие гены, гомологичные генам в 15qll-ql3, характеризуются гипотонией, задержкой роста, и погибают еще до окончания вскармливания (Tsai et al., 1999). Несколько генов малых ядрышковых РНК (snoRNA) экспрессируются с отцовской аллели и, возможно, вносят свой вклад в фенотип PWS (Meguro et al., 2001). Недавние исследования показали, что потеря отцовской аллели из одного кластера этих генов (НВП- 52) не вызывает PWS (Runte et al., 2005). Однако иссле- дования на мышах заставляют предполагать, что утрата малой ядрышковой РНК Pwcrl/MBII-85, вероятно, от- вечает за неонатальную смертность в моделях PWS, раз-
человека работанной на мышах (Ding et al., 2005). Следовательно, PWS может вызываться потерей одного и более генов малых ядрышковых РНК, возможно, в сочетании с по- терей других генов, экспрессирующихся в 15ql l-ql3 по отцовской линии. Тщательное исследование редких се- мей с транслокациями и делециями поддерживает мне- ние, что недостаточность по малым ядрышковым РНК PWCR1/HBII-85вызывает PWS (Schulc ct al., 2005). Синдром Беквита-Видемана История синдрома Беквита-Видемана (BWS; OMIM 130650) представляет собой блестящий пример того, как заболевание человека вскрыло значение эпигенетики не только в нормальном развитии, но и при регуляции роста клеток и при опухолеобразовании. Синдром Беквита- Видемана характеризуется быстрым и гипертрофическим соматическим ростом, врожденными аномалиями и предрасположенностью к эмбриональным злокаче- ственным перерождениям в детском возрасте (Weksberg et al., 2003). У пациентов с BWS в типичных случаях про- является гигантизм, макроглоссия (увеличенный язык), гемигипертрофия разнообразные степени аномалии ушей и других органов и пупочная грыжа (выпячивание органов брюшной полости через пупок). Кроме того, многие пациенты страдают увеличенным размером вну- тренних органов; эмбриональными опухолями, такими как опухоль Уилмса (Wilms’ tumor), гепатобластома или рабдомиосаркома, а также гиперплазией и гипертрофией островков поджелудочной железы, часто приводящей к неонатальной гипогликемии. Большинство случаев BWS носят спорадический ха- рактер, но наличие небольшого числа семей с паттерном аутосомно-доминантного наследования (в ретроспек- тиве, после модификации геномным импринтингом) наводит на мысль о его генетической этиологии и связи синдрома с 11р15 (Ping et al., 1989). Преимущественная потеря материнских аллелей в опухолях, связанных с BWS, избыток женщин, передающих данное заболе- вание при его доминантной форме, и отцовская UPD по 11р15.5 в некоторых случаях BWS, свидетельствуют в пользу того, что эпигенетика и импринтинг должны играть важную роль в этиологии BWS, и что это забо- левание может быть результатом смеси генетических и эпигенетических аномалий, либо возникших de novo, либо унаследованных. Кластер импринтированных ге- нов, связанных с BWS, картируется в 11р15.5 в участке размером приблизительно 1 млн о. и включает в себя по меньшей мере 12 импринтированных генов. Считается, что эти гены регулируются двумя центрами имприн- тинга, разделенными неимпринтированным участком (Weksberg et al., 2003). Предполагается, что реципрокно импринтированный Н19 и инсулиноподобный фактор роста (IGF2) и дифференциально метилированный рай- он представляют собой один участок контроля имприн- тинга (ICR1- imprinting control region) (Joyce et al., 1997; Weksberg et al., 2003). H19кодирует экспрессируемую по материнской линии некодирующую РНК pol [I, a IGF2 кодирует экспрессируемый по отцовской линии фактор роста У этих двух генов общий стандартный набор эн- хансеров, на доступ к которым влияют статус метилиро- вания ICR1 и связывание с белком CTCF (белком типа «цинкового пальца») (Hark et al., 2000). Второй участок контроля импринтинга (ICR2) содержит несколько генов, экспрессирующихся по материнской линии, в том числе: ингибитор пиклин-зависимой киназы (CD- KN1C, кодирующий p57kip2), компонент калиевого ка- нала (KCNQT) и предполагаемый переносчик катионов (SLC22A1L). Дифференциально метилированный рай- он в ICR2 картируется в интроне KCNQhx на отцовских аллелях он не метилирован, что ведет к экспрессии КС- NQIOTI в антисмысловом направлении KCNQ1. Пред- полагается, что метилирование ICR2 на материнской аллели сайленсирует материнскую экспрессию KCN- QIOTI, делая возможной экспрессию KCNQ1 и CDKN1C, экспрессирующихся по материнской линии (Lee et al, 1999; Smilinichet al., 1999). Различные эпигенетические, а также генетические молекулярные дефекты дают некоторое понимание относительно того, какие гены вносят вклад в фено- тип BWS. На неметилированных материнских аллелях CTCF связывается с ICR1 и устанавливает границу, по- средством чего промотор IGF2 изолируется от энхан- серов. Эти энхансеры могут потом получить доступ к промотору Н19 (более проксимальное положение от- носительно границы), разрешая транскрипцию И19. Метилирование ICR1 на отцовских аллелях аннулирует связывание с CTCF, разрешая экспрессию IGF2 и сай- ленсинг Н19. Обнаружение того, что либо дупликации в Пр 15.5, распространяющиеся на локус IGF, либо от- цовская UPD данного участка (ожидается, что она при- водит к сверхэкспрессии IGF2), в сочетании с данными, показывающими, что у трансгенных мышей со сверхэк- спрессией IGF2 развиваются чрезмерно быстрый рост и увеличенный язык, подразумевает, что сверхэкспрессия IGF2 является одной из возможных причин гипертро- фированного роста при BWS (Henry et al., 1991; Weksberg et al., 1993; Sun et al., 1997). Любопытно, что мутации типа потери функции в гене CDKN1C дают начало BWS, аналогично мутациям, вызываемым сверхрэкспрессией IGF2. У мышей, не имеющих Cdknlc, развиваются пупоч- ные грыжи, но не усиленный рост. Однако, когда утрата Cdknlc сочетается с повышенной экспрессией Igf2, жи- вотные воспроизводят многие черты BWS (Caspary et al., 1999). К настоящему времени к молекулярным наруше- ниям, которые вызывают BWS, относятся: 1) отцовские дупликации, включающие IGF2, 2) отцовскую UPD по 11р15.5,3) мутации типа потери функции в материнской аллели CDKN1C, 4) трансляции на материнской хромо- соме, нарушающие KCNQ1, влияющие на импринтинг IGF2, но. как ни странно, не на ICR2. и 5) чаше всего — потеря импринтинга ICR2/KCNQiOTi, что, опять- таки, изменяет импринтинг IGF2 и предполагает не- которые регуляторные взаимодействия между ICR1 и ICR2 (Cooper et al., 2005). Некоторые эпигенетические изменения, идентифицированные при BWS, такие как дефекты метилирования в ICR1 гена Н19, также были подтверждены у пациентов с опухолью Уилмса, но не с BWS; это предполагает, что хронометраж эпигенети- ческого дефекта может диктовать, будет ли аномальная
3. Заболевания человека регуляция роста затрагивать весь организм или только какой-то специфический орган. Тот факт, что аберрант- ное метилирование в IRC1 часто приводит к опухоли Уилмса, а в ICR2 — часто приводит к рабдомиосаркоме и гепатобластоме при BWS, предполагает, что в Пр 15.5 имеется более чем один локус, обусловливающий пред- расположенность к канцерогенезу (Weksberg et al., 2001; DeBaun et al., 2003; Prawitt et al., 2005). Синдром Силвера-Рассела Синдром Силвера-Рассела (SRS, Silver-Russell syndrome; OMIM 180860) — это нарушение развития, характери- зующееся замедлением роста, невысокой фигурой, часто ассиметричной, и несколько бесформенными чертами лица и черепа, а также аномалиями пальцев. Наиболее заметная характеристика — это аномалии соматиче- ского роста, другие характеристики сильно варьируют. Генетически SRS гетерогенен, но подсчитано, что около 10% случаев являются результатом материнской UPD по хромосоме 7 (Eggermann et al., 1997). Предполагается, что SRS вызывается потерей функции гена, экспресси- рованного у отца (возможно, того, который способствует росту); но нельзя исключить альтернативную модель, а именно, сверхэкспрессию гена, подавляющего рост и экспрессированного у матери Интересно, что у не- которых индивидуумов с SRS была обнаружена эпи- генетическая мутация, вызывающая деметилирование ICR1 на хромосоме Пр 15. Этот эпигенетический дефект вызывает биаллельную экспрессию Н19 и пониженную экспрессию IGF2 (Gicquel et al., 2005). Псевдогипопаратироидизм Псевдогипопаратироидизм (PHP, pseudohypoparathyroid- ism) представляет собой группу фенотипов, являющихся результатом функционального гипопаратироилизма, несмотря на нормальный уровень паратироидного гормона (РТН, parathyroid hormone). Такие пациенты устойчивы к РТН (паратироидному гормону). Суще- ствует несколько клинических подтипов — la, 1b, 1с, II и наследуемая остеодистрофия Олбрайта (OMIM 103580). Кроме функционального псевдогипопарати- роидизма и остеодистрофии эти клинические варианты могут проявлять ряд соматических дефектов и дефектов развития. Гетерогенные с клинической точки зрения фенотипы являются результатом мутаций в гене GNAS1, кодирующем полипептид 1 (Gsa) — белок, обладающий а-стимулирующей активностью и связывающийся с гуанином. GNAS1 картируется в хромосоме 20ql3.2. Локус GNAS1 имеет три альтернативных первых экзона, расположенных «вверх по течению» (экзоны 1А, XL, и NESP55), которые сплайсированы с экзонами 2-13 и про- изводят разные транскрипты, и в случае с NESP55 и XL этот альтернативный сплайсинг продуцирует уникальные белки Около этих экзонов имеются дифференциально метилированные участки, принуждающие NESP55 экс- прессироваться исключительно с материнских аллелей, тогда как XL, экзон 1А и антисмысловой транскрипт для NESP55 экспрессируются у отца. Хотя транскрипт, кодирующий белок Gsa, экспрессирован биаллельно, в некоторых тканях, таких как проксимальные почечные канальцы, преимущественно экспрессирована материн- ская аллель. Сочетание геномных и тканеспецифичных импринтингов объясняет изменчивые фенотипы и эффект происхождения от одного или другого родителя даже для тех мутаций, которые имеют ясный аутосом- ный доминантный паттерн наследования (Hayward et al., 1998). Следует отметить, что у одного пациента с от- цовской UPD участка GNAS1 развилось заболевание по типу lb (Bastepe et al., 2003). Изучение генотипов и фенотипов этих клиниче- ских нарушений показало, что за исключением SRS все остальные геномные нарушения импринтинга (PWS, AS, BWS, и PHP) могут быть вызваны смесью генетиче- ских или эпигенетических аномалий, либо возникших de novo, либо унаследованных. Трудно поверить, что та- кая смешанная генетическая модель заболевания будет оставаться уникальной для этого небольшого набора нарушений. Немногим более десятилетия назад UPD была лишь теоретической возможностью, но сейчас установлено, что она имеет место на многих участках хромосом и приводит к разнообразным заболеваниям и фенотипам, касающимся развития. Одна из задач ис- следований генетики человека — выявить, какие гены отвечают за те или иные из ассоциированных с UPD фе- нотипов с целью установить список болезней, которые, вероятно, являются результатом смешанных генетико- эпигенетических механизмов. 3.2. Нарушения, влияющие на структуру хроматина в trans-конфигурации Значение тонко отлаженной структуры хроматина для здоровья человека выдвинулось на первое место в связи с быстро растущим списком заболеваний человека, вы- званных мутациями в генах, кодирующих белки, необ- ходимые для структуры и ремоделинга хроматина. Сами по себе эти нарушения не являются эпигенетическими мутациями, но они изменяют состояния хроматина, являющиеся критическими компонентами эпигено- типа. Значительные различия между фенотипами, так же как тот факт, что едва уловимые изменения в уровне белка или даже консервативная аминокислотная за- мена могут приводить к заболеванию человека, все эти данные уже дают ключ к проблеме, касающейся строго контролируемой регуляции и взаимодействий белков ремоделинга хроматина. Нарушения, которые влияют на хроматин в trans-конфигурации, являются результа- том либо нарушения функции белков, непосредственно участвующих в ремоделинге хроматина (таких, как бе- лок, связывающийся с CREB, или СВР, ЕР300, а также белок, связывающийся с метил-CpG, или МеСР2), либо потери функции белков, участвующих в метилировании ДНК (таких, как de novo ДНК-метилтрансфераза ЗВ. DNMT3B, или метилентетрафолатредукгаза, MTHFR) (табл. 23.2). Нарушение функции любого из этих генов вызывает комплексные мультисистемные фенотипы или неоплазии, благодаря эффектам мисрегуляции экспрес- сии большого числа генов-мишеней, находящихся «ниже
человека Таблица 23.2. Выборочные генетические нарушения, влияющие на структуру хроматина в trans-конфигурации Нарушение Ген Комментарии Синдром Рубинштейна-Тайби CREBBP, ЕР300 Синдром Ретта МЕСР2 Потеря функции, так же как и дупликация, вызывает широкий спектр фенотипов а-талассемия и замедленное умственное раз- витие, сцепленное с Х-хромосомой ATRX Соматические мутации вызывают а-талассемию и миелоди- спластический синдром Синдром ICF DNMT3B Иммунно-костная дисплазия Шимке SMARCAL1 Замедление умственного развития MTHFR по течению». Вполне возможно, что существует множе- ство заболеваний, которые вызываются мутациями в не- кодирующих РНК, действующими в Ггаля-конфигурапии, хотя их еще предстоит обнаружить. Синдром Рубинштейна-Тайби Синдром Рубинштейна-Тайби (RSTS, Rubinstein-Taybi syndrome; ОМ IM 180849) характеризуется задержкой ум- ственного развития, широкими большими пальцами рук и ног, аномалиями лица, врожденными пороками сердца и повышенным риском образования опухолей. Высокая частота конкордантности у монозиготных близнецов, на- ряду с несколькими случаями передачи от матери к плоду, предполагают, что это заболевание имеет генетическую основу, и что наиболее вероятно аутосомное доминант- ное наследование. У некоторых пациентов с RSTS были установлены цитогенетические аномалии, включающие 16р13.3 (Tommerup et al., 1992), которые картируются в участке, содержащем ген белка, связывающегося с CREB (CREBBP, или СВР). Гетерозиготные мутации в CREBBP демонстрируют, что гапло-недостаточность СВР вызы- вает RSTS (Petrij et al., 1995). СВР впервые был описан как коактиватор реагирующего на с АМР белка CREB При повышении внутриклеточных уровней сАМР про- теинкиназа А (РКА) перемещается в ядро и фосфорили- рует CREB, что приводит к его активации и связыванию его с элементами ответа на количество сАМР (Мауг and Montminy, 2001). СВР — это крупный белок (~250 кДа) с бромодоменом, который, как показано, связывает РКА- фосфорилированный CREB (Chrivia et al., 1993). СВР, в свою очередь, активирует транскрипцию с промотора, содержащего CRE через ацетилирование всех четырех коровых гистонов в соседних нуклеосомах (Ogryzko et al., 1996). Кроме того, СВР взаимодействует непосредственно с основным транскрипционным фактором TFIIIB через участок на своем карбоксильном конце (Anas et al., 1994; Kwok et al., 1994). Функциональный анализ in vitro одной из миссенс-мутаций СВР (замена Arg-1378 на пролин), вызы- вающей RSTS, выявил, что эта мутация подавляет гистон- ацетилтрансферазную (HAT) активность СВР (Murata et al., 2001). Эти данные, в сочетании с тем, что мыши, гаплонедостаточные по СВР, имеют ослабленную память и обучаемость, измененную синаптическую пластичность и аномальное ацетилирование хроматина, поддерживают вывод о том, что ослабленная НАТ-активность СВР — это главная причина RSTS фенотипа (Alarcon et al., 2004). В соответствии с ролью, которую играет в заболевании по- нижение НАТ-акгивности, находится недавнее открытие того, что мутация во втором гене, рЗОО, кодирующем эффективную HAT и транскрипционный коактиватор, вызывает некоторые случаи RSTS (Roelfsema et al., 2005). Выявление того, что некоторые дефекты синаптической пластичности, как и недостатки обучаемости и памяти у СВР мышей, могут быть ревертированы с помощью ингибиторов деацетилазы гистонов (HDAC) (Alarcon etal., 2004), вызывает вопрос о том, может ли лекарственная те- рапия, использующая эти реагенты, устранить некоторые ментальные проблемы при RSTS. Синдром Рэтта Синдром Рэтта (RTT, Rett syndrome; OMIM 312750) — это доминантное сцепленное с Х-хромосомой постнатальное нарушение развития и нервной системы, характеризую- щееся двигательными аномалиями, атаксией, припадка- ми, бесцельными движениями рук и речевой регрессией (Hagberg et al., 1983). RTT классифицируется no DSMIV как одно из нарушений, входящих в разряд аутизма (ASD, autistic spectrum disorder), и имеет три основные общие с ASD черты: оба заболевания проявляются постнатально, часто после периода внешне нормального развития, оба нарушают социальное и речевое развитие и оба сопрово- ждаются необычными стереотипными движениями ки- стей или рук (рис. 23.5а). Хотя RTT — это в подавляющем большинстве случаев (>99%) спорадическое заболевание, обнаружение небольшого числа семей, в которых ген передается по материнской линии, предполагает, что оно имеет генетическую основу. Такие семьи, наряду с тем фактом, что RTT, как правило, наблюдается у особей женского пола, а женщины облигатные носители могут не иметь симптомов, привело к гипотезе, что RTT это доминантное нарушение, сцепленное с Х-хромосомой. С помошью метода «Ап exclusion mapping strategy» ген RTT был локализован в Xq27-qter, и анализ генов- кан- дидатов (candidate gene analysis) на эту роль указал на ген, кодирующий белок 2, связывающийся с метил- CpG ({МЕСР2), как на ген, вызывающий данное заболевание (Amir etal., 1999).
3. Заболевания человека Рис. 5. Генетические нарушения, влияющие на хроматин в cis- конфигурации (а) Эта фотография пациента с синдромом Рэтта иллюстрирует необычные стереотипные движения рук, жевательные движе- ния и аномальную осанку. Фото любезно предоставлено Д-ром Даниэлем Г. Глэйзом (Dr. Daniel G. Glaze), (б) Микрофото- графии хромосом пациента с ICF , любезно предоставленные Д-рами Тимоти Г. Бестором Робертом А. Роллинсом и Деборой Буркхис (Drs. Timothy Н. Bestor, Robert A. Rollins, and Deborah Bourc’his.) Обнаружение того, что мутации в МЕСР2 являются основной причиной RTT, служит молекулярным свиде- тельством наличия связи между RTT и аутизмом. Сей- час известно, что мутации в МЕСР2 вызывают широкий спектр фенотипов у женщин, в том числе неспособность к обучению, обособленное (isolated) замедленное ум- ственное развитие, синдром, похожий на синдром Ан- гелмана и ASD. Паттерны инактивации Х-хромосомы (XCI) — это главные молекулярные детерминанты дан- ной клинической изменчивости. Женщины с мутация- ми в МЕСР2 и со сбалансированным паттерном XCI, как правило, страдают классическим RTT, за исклю- чением нескольких гипоморфных аллелей. Женщины с несбалансированными паттернами XCI, благопри- ятствующими аллели дикого типа, в типичном случае имеют более мягкие фенотипы (Wan et al., 1999; Carney et al., 2003). Мужчины с мутациями MECP2 проявляют более широкий спектр фенотипов, чем женщины, бла- годаря их гемизиготности по данному локусу. Мутации, вызывающие RTT, как правило, вызывают летальность новорожденных, если только пациент мужского пола не является мозаиком по мутациям или не имеет карио- типа XXY — в этом случае все фенотипы, наблюдаемые у женщин, наблюдаются также и у таких мужчин (Zeev et al., 2002; Neul and Zoghbi, 2004). С другой стороны, у мужчин с гипоморфными аллелями, которые фено- типически едва проявляются у женщин, развиваются любые сочетания признаков, включая умственную от- сталость, припадки, треморы, увеличенные семенники, маниакальную депрессию или шизофрению (Meloni et al., 2000; Convert et al., 2001). MeCP2 был идентифицирован на основании его способности связываться с симметрично метилирован- ными динуклеотидами CpG (Lewis et al., 1992). Он лока- лизуется в гетерохроматине и действует как репрессор транскрипции, зависимый от метилирования (Nan et al., 1997). МеСР2 связывается с метилированной ДНК через ее метил-СрО-связывающий домен и взаимо- действует с корепрессорами Sin3A и HDACs через свой домен транскрипционной репрессии. МеСР2 также ас- социируется с Brahma — компонентом комплекса SWI- SNF ремоделинга хроматина (Harikrishnan et al., 2005). Интригующей чертой RTT является отсроченное постнатальное проявление фенотипов в отсутствие нейродегенерации. Изучение распределения и распро- страненности МеСР2 выявило, что он определяется в зрелых нейронах, возможно, после формирования си- напсов (Shahbazian et al., 2002а; Kishi and Macklis, 2004; Mullaney et al., 2004). Такое распределение предполага- ет, что нейронная функция МеСР2 играет существен- ную роль после того, как установились созревание и активности нейронов, и что эта его функция важна для регуляции деятельности нейронов. Начинается иденти- фикация некоторых мишеней МеСР2, но еще предсто- ит определить, какими именно из этих мишеней опо- средуются разнообразные фенотипы RTT (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003; Horike et al., 2005; Nuber et al., 2005). Исследования с применением клеточного экстракта от пациентов с RTT или экстракта мозга мы- шей, не имеющих функционального МеСР2, выявили измененный характер ацетилирования гистонов (Wan et al., 2001; Shahbazian et al., 2002b; Kaufmann et al., 2005), что согласуется с предполагаемой ролью данного белка в деацетилировании гистонов, учитывая его взаимодей- ствия с HDACs. Интересно, что удвоение дозы МеСР2 у мышей и человека приводит к прогрессивным постна- тальным фенотипам, которые, в сущности, более резко выражены, чем некоторые из фенотипов, обусловлен- ных потерей функции (Collins et aL, 2004; Meins et aL, 2005; Van Esch et aL, 2005). Остается еще проверить, приводит ли увеличение уровней МеСР2 к титрованию ключевых взаимодействующих компонентов и (или) к аберрантной экспрессии его мишеней Стремясь выявить потенциально новые функции МеСР2, Янг с коллегами обнаружили, что МеСР2 взаимодействует с белком 1, связывающимся с Y-боксом (YB-1), — бел- ком, связывающимся с РНК, и влияющим на сплай- синг (Young et aL, 2005). МеСР2 регулирует сплайсинг РНК репортерных минигенов, но, что наиболее важно, он влияет на сплайсинг РНК in vivo, учитывая данные об изменении паттернов сплайсинга РНК в ткани мозга мышей, моделирующих RTT (Young et aL, 2005). Важ-
человека ность МеСР2 в эпигенетической регуляции экспрессии нейрональных генов и его влияние на сплайсинг РНК, по-видимому, лежат в основе потери основных вех при развитии и при аномальной неврологической функции при RTT и родственных ему нарушениях. Сцепленная с Х-хромосомой а-талассемия, сопровождающаяся умственной отсталостью Мужчины с синдромом сцепленной с Х-хромосомой а-талассемией, сопровождающейся умственной отстало- стью (ATRX; OMIM 301040), проявляют а-талассемию, умеренную (до тяжелой) умственную отсталость, бесфор- менные черты лица, микроцефалию, аномалии скелета и половых органов и, обычно, неспособность к ходьбе. Ге- терозиготные пациенты женского пола обычно не имеют симптомов. Мутации в гене ATRX, которые картируются в Xql3, вызывают этот синдром, так же как и совокуп- ность дополнительных фенотипов, включающих в себя разные степени сцепленной с Х-хромосомой умственной отсталости (XLMR), тяжелую MR со спастической пара- плегией и благоприобретенную в связи с соматическими мутациями а-талассемию в миело-диспластическом синдроме (ATMDS) (Gibbons et al., 1995, 2003; Villard et al., 1996; Yntemaet al., 2002). Белок ATRX содержит харак- терный для растений гомеодоменный (PHD-подобный) мотив «цинкового пальца», равно как и ДНК-зависимую АТФазу семейства SNF2. Это, в сочетании с локализаци- ей в перицентромерных гетерохроматиновых доменах и ассоциацией с гетерохроматином la (HP 1а) (McDowell et al., 1999), предполагает, что данный белок играет какую- то роль в ремоделинге хроматина. Мутации в ATRX вы- зывают даун-регуляцию локуса а-глобина и аномальное метилирование нескольких высокоповторяющихся по- следовательностей нуклеотидов, в том числе субтеломер- ных повторов, специфичного для Y-хромосомы саттелита и рибосомных последовательностей ДНК. Недавние исследования показали, что ATRX необходим для вы- живания кортикальных нейронов, и это служит намеком на то, что повышенная потеря нейронов может вносить свой вклад в развитие тяжелой умственной отсталости и мышечной спастичности, наблюдаемых у пациентов с мутациями ATRX (Berube et al., 2005). Интересно, что уровни ATRX строго регулируются и что как уменьшение, так и увеличение его количества, вызывают основные проблемы в развитии нервной системы. Например, пациенты, у которых в результа- те мутаций имеется 10—30% ATRX от его нормального уровня, проявляют полный фенотип, характерный для ATRX, несмотря на наличие значительного количества нормального белка ATRX (Picketts et al., 1996). Слиш- ком большое количество ATRX, похоже, тоже являет- ся разрушительным. У трансгенных мышей с сверхэк- спрессией ATRX развиваются дефекты нервной трубки, наблюдается замедление роста и гибель в процессе эмбриогенеза. У тех, кто выживает, наблюдаются кра- ниофасциальные аномалии, непроизвольное царапанье морды и припадки. Эти характеристики напоминают клиническую картину у пациентов с мутациями ATRX типа «потери функций», что указывает на возможность того, что уровни ATRX строго регулируются для функ- циональной целостности белкового комплекса, внутри которого он находится. Синдром иммунодефицита, нестабильности центромерного участка и лицевых аномалий Синдром иммунодефицита, нестабильности центромер- ного участка и лицевых аномалий (ICF, OMIM 242860) — это редкое аутосомное рецессивное нарушение, связан- ное с разрывом хромосом. Пациенты с ICF проявляют два неизменных фенотипа: иммунодефицит и цитогене- тические аномалии. Высокоизменчивые и менее пене- трантные фенотипы включают в себя черепно-лицевые дефекты, такие как широкую и плоскую переносицу, складки эпикантуса, высокий лоб и низко посаженные уши, задержку психомоторного развития и кишечную дисфункцию (Smeets et al., 1994). В типичном случае им- мунодефицит представлен в тяжелых формах и часто вы- зывает смерть в детстве, до достижения зрелого возраста, в результате респираторных или желудочно-кишечных инфекций. Наиболее обычный иммунологический дефект — это снижение уровня сывороточных иммуно- глобулинов (IgG), но наблюдается также и уменьшение числа В- или Т-клеток (Ehrlich, 2003). Цитогенетические аномалии, в первую очередь затрагивающие хромосомы 1 и 16, и, в меньшей степени, 9, видны при обычном карио- типическом анализе крови и в культивируемых клетках пациентов с ICF (рис. 5b) (Tuck-Muller et al., 2000). Гипометилирование околоцентромерных повторя- ющихся последовательностей на хромосомах 1, 9 и 16 было обнаружено задолго до идентификации гена ICF (Jean-pierre et al., 1993). Эти хромосомы содержат наи- более крупные блоки классических сателлитных (са- теллиты 2 и 3) тандемных повторов около центромеров. Тот факт, что ICF вызывается мутациями типа «потери функции» в гене ДНК метилтрансферазы (DNMT3B), метилирующей ДНК de novo, способствовало понима- нию роли ослабления метилирования в центромерных сателлитах 2 и 3 (Hansen et al., 1999; Okano et al., 1999; Xu et al., 1999). Однако остается неясным, почему поте- ря функции у повсеместно экспрессирующейся de novo метилтрансферазы избирательно затрагивает специфи- ческие повторяющиеся последовательности. Одно из возможных объяснений связано с внутриклеточным распределением и (или) контекст-специфичным белко- вым взаимодействием DNMT3B (Bachman et al., 2001). Другая возможность состоит в том, что каталитическая активность DNMT3B в большей степени необходима для метилирования последовательностей нуклеотидов с высокой плотностью CpGs на больших геномных участ- ках, как в случае с сателлитом 2 (Gowher and Jeltsch, 2002) или повторяющейся последовательностью D4Z4, что подразумевается при плече-лопаточно-лицевой миопатии (Kondo et al., 2000). Остается определить, являются ли гипометилированными дополнительные специфические последовательности, но прогнозиру- ется, что гипометилирование ДНК ведет к изменению экспрессии генов, которые играют важную роль в раз-
3. Заболевания человека витии черепно-лицевой области, нервной и иммунной систем. Изучение экспрессии генов с использованием РНК из лимфобластоидных клеточных линий от пациентов с ICF и от здоровых контрольных людей выявило не- сколько изменений в генах, участвующих в созревании, миграции, активации и хоминге лимфоцитов (Ehrlich et al., 2001). Не понятно, однако, вызывает ли потеря DNMT3B дисрегуляцию таких генов, потому что пат- терны метилирования в их промоторах не кажутся из- мененными. Притом, что единственное выявленное пока гипометилирование при ICF имеет место на сатте- литной ДНК, предполагается, что некоторые из генов, измененных при ICF, могут связываться с саттелитной ДНК. Такие нуклеотидные последовательности в ти- пичном случае, будучи метилированными, ведут себя как гетерохроматин; таким образом, при ICF имеет место разрегулированная экспрессия генов, благодаря транс-эффектам гетерохроматиновых участков, обога- щенных доменами с сателлитами 2 и 3 (Bickmore and van der Maarel, 2003). Спондилоэпифизарная дисплазия Шимке Дисплазия Шимке (SIOD, OMIM 242900) — это аутосом- ное рецессивное мультисистемное нарушение, характе- ризующееся дисплазией позвоночника и концов длинных костей, недостаточностью роста, функциональными почечными аномалиями вследствие очагового (централь- ного) гломерулосклероза, гипотироидизмом и дефектным Т-клеточным иммунитетом (Schimke et al, 1971; Spranger et al., 1991). SIOD вызывается мутациями в SMARCAL1 (SWl/SNF2-CB43aHHbih, ассоциированный с матриксом; актин-зависимый регулятор хроматина, подсемейство а- like 1), который кодирует белок, регулирующий транскрип- ционную активность посредством ремоделинга хроматина (Boerkoel et al., 2002). Нонсенс-мутации и мутации сдвига рамки считывания вызывают тяжелые нарушения фено- типа, тогда как некоторые из миссенс-мутаций вызывают возникновение более мягких, или частично выраженных фенотипов (Boerkoel et al., 2002). Недавно у пациента с лимфомой В-клеток и с SIOD была обнаружены мутации в SMARCAL; это предполагает, что потеря функции данного белка может вызывать фатальное лимфопролиферативное расстройство (Taha et al., 2004). Остается прояснить точ- ный механизм, посредством которого утрата SMARCAL1 вызывает фенотип SIOD. Дефицит метилентетрагидрофолатредуктазы Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) участвует в превращении 5, 10-метилентетрагидрофолата (5,10- MTHF) в 5-метилтетрафолат (5MTHF). Метильная груп- па приобретается затем от 5MTHF во время превращения гомоцистеина в метионин с помощью метионинсинтазы. Метионин далее превращается в S-аденозилметионин (SAM), основной донор метила для всех метилтранс- фераз. Дефицит MTHFR вызывает редкое аутосомное рецессивное расстройство, характеризующееся ум- ственной отсталостью (Rozen, 1996). Обычный термо- лабильный полиморфизм (677ОТ, который изменяет аланин на валин) вызывает понижение активности MTHFR и ассоциировался, особенно у гомозоготных пациентов, в диете которых низкое содержание фолатов, с гипергомоцистеинемией (Goyette et al., 1994). Этот по- лиморфизм изучался как фактор риска возникновения атеросклероза, дефектов нервной трубки и рака (Ma et al., 1997; Brattstrometal., 1998; Chenetal., 1999; Bottoand Yang, 2000; Schwahn and Rozen, 2001). Мыши, гетерози- готные или гомозиготные по нулевой аллели MTHFR, имеют пониженный уровень SAM, пониженное общее метилирование ДНК. Более того, такие нуль-мутанты имеют липидные отложения на аорте и дегенерацию нейронов (Chen et al., 2001). Общее изменение метилиро- вания ДНК, связанное с частичной или полной потерей MTHFR, позволяет предположить, что некоторые из фенотипов, ассоциирующиеся с этими дисфункциями, могут являться следствием нарушений хроматина благо- даря пониженному метилированию ДНК (и, возможно, гистонов). Имеется одно сообщение о том, что дефицит MTHFR вызывает фенотип, характерный для синдрома Ангелмана (Arn et al., 1998), и имеются существенные совпадения тяжелой недостаточности по MTHFR с AS и RTT (Fattal-Valevski et al., 2000). 3.3 Расстройства, влияющие на структуру хроматина в c/s-конфигурации Гены большинства менделирующих нарушений обычно идентифицируются путем обнаружения мутаций либо в экзонах, либо в сайтах сплайсинга, в результате чего продукты данного гена, РНК или белок, изменяются или не производятся. Однако для многих из этих расстройств мы нередко имеем небольшую группу пациентов, у ко- торых мутации не могут быть идентифицированы после секвенирования кодирующих и некодирующих участков гена несмотря на сцепление со специфическим локусом. Становится все более ясно, что эпигенетические или генетические аномалии, которые влияют на экспрессию генов в cis-конфигурации, лежат в основе некоторых мен- делирующих нарушений и случаев отсутствия экзонных мутаций. Следующие три примера демонстрируют, как с/5-сцепленные изменения в структуре хроматина при- водят к заболеванию человека (табл. 23.3). абр- и Ъ^-талассемия Талассемии — это самые обычные в мире моногенные нарушения. Они представляют собой гетерогенную группу нарушений синтеза гемоглобина, вызываемую пониженным уровнем содержания одной или несколь- ких глобиновых цепей гемоглобина. Дисбаланс синтеза различных глобиновых цепей ведет к аномальному эритропоэзу и тяжелой анемии (Weatherall et al., 2001). Были идентифицированы сотни кодирующих мутаций и мутаций сплайсинга, но именно делеции регуляторных повторностей заострили внимание на том, как изменения в структуре хроматина могут объяснить некоторые подти- пы талассемий. Тот факт, что делеции примерно 100 т.о., которые удаляли часть гена р-глобина, расположенную
человека Таблица 23.3. Выборочные генетические нарушения, влияющие на структуру хроматина в cis-конфигурации Нарушение Комментарии Ген aS|3- и 5р4талассемия делеция LCR вызывает пониженную экспрессию глобина премутации аллелей (60-200) вызывают нейрогенеративное нарушение Синдром хрупкой X экспансия CCG повтора ведет к аномальному метилированию и сайленсингу FMR1 FSH дистрофия соращение повторов D4Z4 вызывает менее репрессирующий- ся хроматин Множественный рак Эпимутация MLH1 зародышевой линииГ «вверх по течению» (оставляя ген интактным), вызывали абр-талассемию, помогло идентифицировать участок контроля локуса (LCR), который регулирует экспрес- сию Р-глобина (Kioussis et al., 1983; Forresteret al., 1990). Меньшие делеции, включающие часть LCR, вызывали бр-талассемию (Curtin et al., 1985; Driscoll et al., 1989). Эти делеции приводили к изменению состояния хроматина в локусе р-глобина, несмотря на то, что они находились на десятки тысяч пар нуклеотидов «вверх по течению» от кодирующего участка (Grosveld, 1999). Синдром ломкой Х-хромосомы Умственная отсталость, связанная с ломкой Х-хромосомой (OMIM 309550), — это один из наиболее обычных слу- чаев (causes) наследуемой умственной отсталости. Более 60 лет назад Мартин и Белл описали семью, в которой было показано, что умственная отсталость расщепляется как нарушение, сцепленное с Х-хромосомой (Martin and Bell, 1943). В 1969 году Лабе сообщал о сужении на длинном плече Х-хромосомы у некоторых умственно отсталых пациентов мужского пола и у бессимптомных пациентов женского пола (Lubs, 1969). Такой хромо- сомный вариант был картирован в Xq27.3 и был назван ломкой Х-хромосомой (Harrison et al., 1983). Цитогене- тические исследования, особенно те, в которых исполь- зовались культуральные среды с дефицитом фолиевой кислоты и тимидина, выявили ломкий сайт в семьях с Х-сцепленной умственной отсталостью; впоследствии эти семьи были диагносцированы как несущие синдром ломкой Х-хромосомы (Sutherland, 1977; Richards et al., 1981). Мужчины с этим синдромом имеют умственную отсталость от умеренной до тяжелой, макроорхидизм, аномалии соединительных тканей, такие как сверх- растяжимость суставов, и большие уши (рис. 23.6) (Hagerman et al., 1984). Ген, отвечающий за синдром ломкой Х-хромосомы,— это ген FMR1, который кодирует белок FMRR Наиболее обычный механизм мутации — это экспансия нестабильного некодирующего повтора CGG (Warren and Sherman, 2001). Нормальные аллели содержат 6—60 повторов, премутационные — 60—200, а полная мутация содержит более 200 повторов. Увели- чение количества повторов на 5'UTR гена FMR1 пред- ставляет собой превосходный пример генетического расстройства, опосредованного изменением структуры хроматина в czs-конфигурации. Островок CpG в 5'-регуляторном участке FMR1 становится в случае полной мутации аберрантно ме- Рис. 23.6. Пример генетичесского нарушения, влияющего на хро- матин в trans-конфигурации. Фотография пациента с синдромом ломкой Х-хромосомы, который, помимо умственной отсталости, обладает типичными признаками, а именно выдающимся лбом и большими ушами. Фотография любезно предоставлена доктором Стивеном Уор- реном (Dr. Stephen Т. Warren) тилированным после экспансии повторов (Verkerk et al., 1991). Пониженное ацетилирование гистонов на 5’ конце было установлено в клетках пациентов с ломкой Х-хромосомой при сравнении со здоровыми контроль- ными пациентами (Coffee et al., 1999). В свою очередь, измененные паттерны метилирования ДНК и ацетили- рования гистонов приводят к потере экспрессии FMR1, и, соответственно, к потере функции белка FMRP у па- циентов с синдромом ломкой Х-хромосомы. Таким об- разом, эти пациенты имеют первичную генетическую мутацию и вторичную эпигенетическую мутацию. Интересный эпигенетический механизм был предло- жен для объяснения того, как повтор CGG в гене FMR1 метилируется и впоследствии сайленсируется. Тот факт, что премутационный повтор CGG формирует одиночную и стабильную шпилечную структуру (Handa et al., 2003), наряду с данными о том, что повторы rCGG могут рас-
3. Заболевания человека щепляться Dicer, обусловил возможность того, что обна- ружившие экспансию повторы CGG (которые в период раннего развития не метилированы) могут транскриби- роваться и что получающаяся в результате РНК образует шпильку, которая может расщепляться Dicer дня образо- вания малых некодирующих РНК. Эти молекулы малых РНК связываются с РНК-индуцированным инициатором транскрипционного сайленсинга генов (RITS) и рекрути- руют de novo метилтрансферазы ДНК и (или) метилтранс- феразы гистонов к 5’UTR гена FMR1, что приводит к пол- ному метилированию повтора CGG и транскрипционной репрессии FMRlm мере развития (Jin et al., 2004а). FMRP — это селективный РНК-связывающий бе- лок, который содержит два домена КН и бокс RGG. Он связывается с полисомами РНК-зависимым способом посредством информационных рибонуклеопротеино- вых частиц и предположительно участвует в супресси- рующей трансляции как in vitro, так и in vivo (Laggerbauer et al., 2001; Li et al., 2001). Локализация белка FMRP совместно с иРНК и полирибосомами в дендритных шипиках (dendritic spines) свидетельствует о его роли в регуляции локального белкового синтеза в ответ на стимуляцию синапса (Feng et al., 1997; Weiler and Greenough. 1999: Brown et al., 2001; Darnell et al., 2001, 2005). Были идентифицированы предполагаемые ми- шени FMRP, которые играют роль в развитии синапса и которые могли бы частично объяснить возникновение фенотипов, связанных с нарушением развития нервной системы (Brown et al., 2001; Darnell et al., 2001). Некоторые исследования позволяют предположить, что основной механизм, с помощью которого FMRP регулирует трансляцию — это PH К-интерференция (RNAi) Гомолог ломкой Х-хромосомы у дрозофилы (Dfmrl) связывается с Argonaute (ARG02) и с комплексом РНК-индуцированного сайленсинга (RISC), a FMRP млекопитающих взаимодействует с EIF2C2 и связыва- ется с активностью Dicer (Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002; Jin et al., 2004b). Наиболее вероятный меха- низм, предполагаемый для роли FMRP как супрессора трансляции, состоит в том, что FMRP связывается со специфическими иРНК-лигандами, рекрутирует RISC вместе с miRNAs и облегчает узнавание между miRNAs и иРНК-лигандами (Jin et al., 2004а). У носителей предмутации ломкой Х-хромосомы (60— 200 повторов) развивается отчетливый нейродегенератив- ный синдром, характеризующийся тремором и атаксией (Hagerman and Hagerman, 2004). Интересно, что эти пред- мутации могут индуцировать патогенез на уровне РНК, поскольку присутствуют РНК и белок гена FMR. Иссле- дования на модельных животных предполагают, что РНК, кодируемая повторами CGG, присоединяется к некото- рым клеточным белкам, изменяет их функцию, вызывая их накопление (Jin et al., 2003; Willemsen et al., 2003). Плече-лопаточно-лицевая миопатия Плече-лопаточно-лицевая миопатия (FSHD; OMIM 158900) — это аутосомная доминантная мышечная дистрофия, характеризующаяся прогрессирующим разрушением мускулов лица, предплечья и плеча. Бо- лее тяжелые случаи характеризуются потерей слуха, и очень небольшая доля детей, имеющих тяжелую форму заболевания, страдают умственной отсталостью и при- падками (Mathews, 2003). Основной локус для FSHD (FSHD1) картируется в субтеломерном участке хромо- сомы 4q35 рядом с D4Z4 — низкокопийном повторе, который содержит совокупность единиц, обогащенных GC и имеющих длину 3.3 т.о. Эта повторяющаяся со- вокупность полиморфна и содержит 11—150 единиц на нормальных хромосомах, тогда как на FSHD хро- мосомах данная совокупность находится в диапазоне 1—10 единиц. (Wijmenga et al., 1992; van Deutekom et al., 1993). Второй вариабильный саттелитный повтор — последовательность (р-68 п.о. *5ямЗА) дистальнее D4Z4 — оказывается, принимает участие в развитии FSHD. Вариант 4qA в р-саттелитном повторе, наряду с со- кращением повтора D4Z4 необходим для проявления FSHD (Lemmers et al., 2002). Пока не вполне понятно, как именно сокращение D4Z4 вместе с вариантом 4qA (р-саттелит) вызывет болезнь. Участок4q35, содержащий D4Z4, имеет сходство с другими субтеломерами и прояв- ляет черты, типичные для гетерохроматиновых участков (Flint et al., 1997; Tuplerand Gabellini, 2004). Исследования in vitro и in vivo выявили в D4Z4 последовательность 27 п.о., которая связывается с комплексом, называемым «D4Z4-penpeccHpyion[Hft комплекс» (DRC), который включает в себя транскрипционный репрессор Ying Yangl (YY1), бокс 2 группы высокой подвижности (HMGB2) и нуклеолин (Gabellini et al., 2002). Бикмор и ван дер Маарель, а также Габеллини с коллегами предположили, что сокра- щение повторов вызывает менее репрессивное состояние хроматина, что приводит к усиленной транскрипции генов 4q35-qter (Bickmore and van der Maarel, 2003; Tupler and Gabellini, 2004). Обнаружение повышенной экспрессии трех генов — FRGIvl 2 (участок FSHD, гены 1 и 2) и пере- носчик нуклеотида аденина 1 (ANTI) — в мышцах паци- ентов с FSHD по сравнению с нормальной мускулатурой, согласуется с этой гипотезой (Gabellini et al., 2002). Остается еще выяснить, являются ли изменения в экспрессии этих генов прямым или косвенным следствием сокращений D4Z4 и влияет ли разрегулировка дополнительных генов на фенотип, связанный с заболеванием. Эпимутации и заболевания человека У двух индивидуумов, страдавших множественными ра- ковыми заболеваниями, были обнаружены эпимутации в гене MLH1 (ген, исправляющий неправильно спаренные основания в ДНК — DNA mismatch repair gene) (Suter et al., 2004). Во всех нормальных тканях, полученных от этих двух пациентов, было выявлено аномальное мети- лирование промоторного участка гена MLH. Делеция MLH1 или утрата гетерозиготности по этому гену в ткани опухоли вела к полной утрате белка MLH1. Оба эти па- циента страдали раком толстой и прямой кишки, один из них имел рак двенадцатиперстной кишки, а у другой развились рак эндометрия и молочной железы, а также меланома. Степень участия эпимутаций в заболеваниях человека прояснится лишь тогда, когда исследователи начнут систематические поиски таких мутаций.
человека 3.4. Взаимодействие эпигенетики и окружающей среды Данные, полученные на человеке и модельных животных, свидетельствуют, что факторы окружающей среды могут влиять на эпигенетические метки, и, в результате, на функцию гена. Тот факт, что однояйцевые близнецы име- ют сходные эпигенотипы в течение первых лет жизни, но демонстрируют существенные различия по содержанию и распределению 5-метилцитозинов и ацетилированных гистонов, является хорошим доказательством того, что эпигенотип метастабилен и проявляет вариабельность во времени (Fraga et al., 2005). Вероятно, многие факторы окружающей среды и стохастические события могут спо- собствовать изменчивости эпигенома (рис. 23.7) (Anway et al., 2005), но потенциальными ключевыми игроками выступают диета и ранний опыт. Диета и эпигенотипы при старении и болезнях Несколько сообщений указывают на то, что существует зависящее от возраста уменьшение глобального мети- лирования ДНК, тогда как одновременно может иметь место сайт-специфическое гиперметилирование (Hoal-van Helden and van Helden, 1989; Cooney, 1993; Rampersaud et al., 2000). Притом, что имеется большой массив данных, связывающих изменения в метилировании ДНК с риском возниковения или развития раковых заболеваний (Mays- Hoopes, 1989; Issa et al., 1994), такие эпигенетические изменения могут вносить свой вклад в возрастание риска раковых заболеваний, связанное с возрастом. Роль диеты как фактора, участвующего в контроле статуса глобально- го метилирования, лучше всего проиллюстрировано на взрослых пациентах мужского пола, страдающих уремией и подвергнутых гемодиализу. Наличие у таких пациентов гипергомоцистинемии предполагает низкое содержание метионина, возможно, преимущественно из-за истощения фолатов У этих мужчин имело место редуцированное общее и локус-спепифическое метилирование ДНК, ко- торое изменялось на противоположное после назначения высоких доз фолиевой кислоты (Ingrosso et al., 2003). Из-за того, что некоторые нейропсихиатрические характеристики, происходящие вследствие недостатка фолатов и витамина В12, перекрываются со свойствами, наблюдаемыми при спорадических нейропсихиатри- ческих нарушениях, было высказано предположение, что последние могут быть вызваны изменениями в пат- тернах метилирования в центральной нервной системе (Reynolds et al., 1984). Низкие уровни содержания SAM были обнаружены при фолат-зависимой депрессии; бо- лее того, добавление SAM помогает как дополнительная терапия при некоторых формах депрессии (Bottiglieri et al., 1994). Наконец, хотя и непонятно, каким образом прием повышенного количества фолиевой кислоты беременными женщинами уменьшает риск дефектов нервной трубки плода, соблазнительно было бы пред- положить какое-то эпигенетически опосредованное влияние на метилирование ДНК или гистонов Обнару- жение того, что у мышей agouti viable yellow обогащение диеты самок фолиевой кислотой, В12 и бетаином изме- няет эпигенотип и фенотип потомства, по-видимому, является первым из множества примеров, которые еще предстоит обнаружить у людей и других млекопитаю- щих (Wolff et al., 1998; Waterland and Jirtle, 2003). Ранний опыт и эпигенотипы Наилучший пример того, как ранний опыт и материнское поведение могут изменить эпигенотип млекопитающего, пока описан только у крыс. Частое облизывание крысами своих детенышей и груминг изменяют статус метилиро- вания ДНК в промоторном участке гена рецептора глю- кокортикоидов (GR) в гиппокампе крысят. У крысят, ко- торых часто вылизывали и подвергали груммингу, имеет Рис. 23.7. Эпигенотип, наряду с генотипом и факторами окружающей среды, играет критическую роль в определении фенотипов Известные эпигенетические факторы, влияющие на экспрессию генов и стабильность генома, включают метилирование ДНК. комплексы ремоделинга хроматина, ковалентные модификации гистонов, наличие вариантов гистонов или некодирующих ре- гуляторных РНК (ncRNA)
место пониженное метилирование ДНК и повышенное ацетилирование гистонов в промоторе GR по сравнению с крысятами, выращенными крысами, которые их редко вылизывали (Weaver et al., 2004). Повышенные уровни содержания GR у крысят, в свою очередь, влияют на ре- гуляцию у них уровня гормона стресса и на их реакцию на стресс в течение всей жизни (Liu et al., 1997; Weaver et al., 2004). Хотя такие данные для человека пока отсутствуют, они безусловно поднимают вопрос относительно роли раннего опыта в модулировании эпигенотипов и риске психиатрических расстройств у людей. 4. Глядя в будущее Мы ожидаем, что в следующем десятилетии мутации, из- меняющие эпигенотип, все больше и больше будут при- знаваться мутационными механизмами, вызывающими ряд нарушений у человека. Традиционно, идентификация генов, вызывающих заболевания, была сфокусирована на таких расстройствах, при которых семейные случаи или случаи у пациентов с хромосомными аномалиями облег- чали позиционное клонирование (positional cloning) гена, ответственного за данное расстройство. Мы оказываемся перед вызовом, когда пытаемся обнаружить мутационную основу для некоторых наиболее обычных и разрушительных расстройств, таких как шизофрения, аутизм и нарушения настроения. Семейные случаи не являются такими уж обычными, очень вероятна генетическая гетерогенность, и последнее, но не менее важное, это то, что генетические данные — особенно частота дискордантности у однояйце- вых близнецов — не всегда согласуются с моделью простого менделевского наследования Эти данные, вместе с сильным влиянием факторов окружающей среды на пенетрантность некоторых из этих расстройств, подчеркивают важность изучения эпигеномов при такого рода заболеваниях. Даже такие моногенные расстройства, как синдром Ангелмана, синдром Беквита-Видеманна. синдром Сильвера-Рассела, могут быть вызваны либо геномными мутациями, либо мутациями, которые влияют на эпигенотип и могут быть как унаследованными, так и возникающими de novo Такие молекулярные вариации безусловно будут вскрыты для остальных нарушений у человека. Более того, есть основания предполагать, что эпигенетические мутации, которые будут влиять на транскрипцию, сплайсинг РНК или модификации белков, могут вызывать болезни, поскольку существуют данные, показывающие, что уровни содержания нескольких белков, участвующих в эпигенетической регуляции, строго контролируются и что нарушения этих уровней либо из-за мутаций типа утраты функции, либо из-за дупликаций вы- зывают расстройства у человека. Благодарности Мы благодарим Д-ра Тимоти Бестора, Д-ра Роберта Рол- линза и Д-ра Дебору Буркхис за микрофотографию хромо- сом пациента с ICF синдромом, Д-ра Даниеля Дрисколла за фотографию пациента с синдромом Прадера-Вилли, Д-ра Карлоса Басино за изображение пациента с синдромом Ангелмана. Д-ра Даниеля Глейза за фотографию пациента с синдромом Ретта и Д-ра Стивена Уоррена за фотографию пациента с синдромом ломкой Х-хромосомы. Мы благо- дарны коллегам из лаборатории Зогби (Zoghbi) за прочтение данной главы и сделанные великолепные предложения. Мы также благодарим бывших и ныне работающих сотрудни- ков лаборатории, которые участвовали в нашей работе над синдромом Ретта, синдромом Прадера-Вилли и синдромом Ангелмана. И последняя по списку, но не последняя по значению, благодарность нашим пациентам с синдромом Ретта, унипарентной дисомией по 7 хромосоме, синдромом Прадера-Вилли, синдромом Ангелмана и аутизмом, и их семьям за то, что они помогли нам прояснить роль эпиге- нетики в заболеваниях человека. Наша работа была поддер- жана грантами Национальных институтов здоровья (NIH) (5 Р01 HD040301-05; 5 РЗО HD024064-17; 5 Р01 HD37283); Международной ассоциацией синдрома Ретта; Фондом ис- следования синдрома Ретта; организацией «Исцели аутизм сейчас»; Фондом Симонса, March of Dimes (12-FY03-43); и Центром Ретта, клиникой «Синяя птица». H.Y.Z. является исследователем в the Howard Hughes Medical Institute. Мы сожалеем, что из-за ограниченности места мы вынуждены были убрать многие важные и значимые ссылки. Литература Alarcon J.M., Malleret G., Touzani К., Vronskaya S., Ishii S., Kan- del E.R., and Barco A., 2004. Chromatin acetylation, memory, and LTP are impaired in CBP+/ mice: A model for the cogni- tive deficit in Rubinstein-Taybi syndrome and its amelioration. Neuron 42: 947-959. Amir R.E., Van den Veyver L.B., Wan M., Tran C.Q., Francke U., and Zoghbi H.Y., 1999. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat. Genet. 23: 185-188. Anway M.D., Cupp A.S., Uzumcu M., and Skinner M.K., 2005. Epigenetic transgenerational actions of endocrine disrupters and male fertility. Science 308: 1466-1469. Anas J., Alberts A.S.. Brindle P., Claret EX.. Smeal T„ Kann M.. Feramisco J., and Montminy M., 1994. Activation of cAMP and mitogen responsive genes relies on a common nuclear factor Nature 370: 226-229. Am P.H., Williams C.A., Zori R.T, Driscoll D.J., and Rosenblatt D.S., 1998. Methylenetetrahydrofolate reductase deficiency in a patient with phenotypic findings of Angelman syndrome. Am. J. Med. Genet. 77:, 198-200. Bachman K.E., Rountree M.R., and Baylin S.B., 2001 Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin. J. Biol. Chem. 276:32282-32287. Bastepe M., Frohlich L.E, Hendy G.N., Indridason O.S., Josse R.G., Koshiyama H., Korkko J., Nakamoto J.M., Rosenbloom A.L., Slyper A.H., et al., 2003. Autosomal dominant pseudo- hypoparathyroidism type lb is associated with a heterozygous microdeletion that likely disrupts a putative imprinting control element of GNAS. J. Clin. Invest. 112: 1255-1263. Berube N.G., Mangelsdorf M., Jagla M., Vanderluit J., Garrick D., Gibbons R.J.. Higgs D.R., Slack R.S., and Picketts D.J., 2005. The chro-matin-remodeling protein ATRX is critical for neuronal survival during corticogenesis. J.Clin. Invest. 115: 258-267. Bickmore W.A. and van der Maarel S.M., 2003. Perturbations of chromatin structure in human genetic disease: Recent advances. Hum. Mol. Genet. 12: R207-R213.
человека Boerkoel С.Е, Takashima Н., John J., Yan J., Stankiewicz P., Rosen- barker L., Andre J.L., Bogdanovic R., Burguet A., Cockfield S., et al., 2002. Mutant chromatin remodeling protein SMAR- CAL1 causes Schimke immuno-osseous dysplasia. Nat. Genet. 30:215-220. Bottiglieri T, Hyland K., and Reynolds E.H., 1994. The clinical po- tential of ademethionine (S-adenosylmethionine) in neurological disorders. Drugs 48: 137-152. Botto L.D. and Yang Q., 2000. 5,10-Methylenetetrahydrofolate re- ductase gene variants and congenital anomalies: A HuGE review. Am. J. Epidemiol. 151: 862-877. Brattstrom L., Wilcken D.E., Ohrvik J., and Brudin L., 1998. Com- mon methylenetetrahydrofolate reductase gene mutation leads to hyperhomocysteinemia but not to vascular disease: The result of a meta-analysis. Circulation 98: 2520-2526. Brown V, Jin P., Ceman S., Darnell J.C., O’Donnell W.T., Tenen- baum S.A., Jin X., Feng Y, Wilkinson K.D., Keene J.D., et al., 2001. Microarray identification of FMRP-associated brain mRNAs and altered mRNA translational profiles in fragile X syndrome. Cell 107: 477-487. Carney R.M., Wolpert CM., Ravan S.A., Shahbazian M., Ashley- Koch A., Cuccaro M.L., Vance J.M., and Pericak-Vance M.A., 2003. Identification of MeCP2 mutations in a series of females with autistic disorder. Pediatr. Neurol. 28:, 205-211. Caspary T, Cleary M.A., Perlman E.J., Zhang P, Elledge S.J., and Tilgh-man S.M., 1999. Oppositely imprinted genes p57Kip2 and Igf2 interact in a mouse model for Beckwith-Wiedemann syn- drome. Genes Dev. 13:3115-3124. Caudy A.A., Myers M., Hannon G.J., and Hammond S.M., 2002. Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA in- terference machinery. Genes Dev. 16: 2491-2496. Chen J., Giovannucci E.L., and Hunter D.J., 1999. MTHFR polymorphism, methyl-replete diets and the risk of colorectal car- cinoma and adenoma among U.S. men and women: An example of gene-environment interactions in colorectal tumorigenesis. J.Nutr. 129: S560-S564. ChenW.G., Chang Q., Lin Y, Meissner A., West A.E., Griffith E.C., Jaenisch R., and Greenberg M.E., 2003. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2. Science 302: 885-889. Chen Z., Karaplis A.C., Ackerman S.L., Pogribny LP, Melnyk S., Lussier-Cacan S., Chen M.F., Pai A., John S.W., Smith R.S., et al., 2001. Mice deficient in methylenetetrahydrofolate reductase exhibit hyperhomocysteinemia and decreased methylation capac- ity, with neuropathology and aortic lipid deposition. Hum. Mol. Genet. 10: 433-443. Chrivia J.C., Kwok R.P., Lamb N., Hagiwara M., Montminy M.R., and Goodman R.H., 1993. Phosphorylated CREB binds specifi- cally to the nuclear protein СВР. Nature 365: 855-859. Coffee B., Zhang E, Warren S.T, and Reines D., 1999. Acetylated histones are associated with FMRI in normal but not fragile X-syndrome cells (erratum Nat. Genet. 22:, 209 [1999]). Nat. Genet. 22: 98-101 Collins A.L., Levenson J.M., Vilaythong A.P., Richman R.D., Armstrong L., Noebels J.L., Sweatt J.D.. andZoghbi H.Y, 2004. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Hum. Mol. Genet. 13: 2679-2689. Cooney C.A., 1993. Are somatic cells inherently deficient in methyla- tion metabolism? A proposed mechanism for DNA methylation loss, senescence and aging. Growth Dev. Aging 57: 261-273. CooperW.N., LuhanaA., EvansG.A., RazaH., Haire A.C., Grundy R., Bowdin S.C., Riccio A., Sebastio G., Bliek J., et al., 2005. Molecular subtypes and phenotypic expression of Beckwith- Wiedemann syndrome. Eur. J. Hum. Genet. 13: 1025-1032. Convert P, Bienvenu T, Aquaviva C., Poirier K., Moraine C., Gen- drot C., Verloes A., Andres C., Le Fevre A.C., Souville L, et al.. 2001. MECP2 is highly mutated in X-linked mental retardation. Hum. Mol. Genet. 10: 941-946. Cox G.F., Burger J., Lip V, Mau U.A., Sperling K., Wu B.L., and Horsthemke B., 2002. Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects. Am. J. Hum. Genet. 71: 162-164 Curtin P, Pirastu M., Kan Y.W, Gobert-Jones J.A., Stephens A.D., and Lehmann H., 1985. A distant gene deletion affects p-globin gene function in an atypical y^p-thalassemia. J.Clin. Invest. 76: 1554-1558. Darnell J.C., Jensen K.B., Jin P, Brown V, Warren S.T, and Darnell R.B., 2001. Fragile X mental retardation protein targets G quartet mRNAs important for neuronal function. Cell 107: 489-499. Darnell J.C., Fraser C.E., Mostovetsky O., Stefani G., Jones T.A., Eddy S.R., and Darnell R.B., 2005. Kissing complex RNAs mediate interaction between the Fragile-X mental retardation protein KH2 domain and brain polyribosomes. Genes Dev., 19: 903-918. DeBaun M.R., Niemitz E.L., and Feinberg А.Р., 2003. Association of in vitro fertilization with Beckwith-Wiedemann syndrome and epigenetic alterations of LIT1 and Hl9. Am. J. Hum. Genet. 72:156-160. Dennis C., 2003. Epigenetics and disease: Altered states. Nature 421:686-688. Ding E, Prints Y, Dhar M.S., Johnson D.K., Gamacho-Montero C., Nicholls R.D., and Francke U., 2005. Lack of Pwcrl/MBH-85 snoRNA is critical for neonatal lethality in Prader- Willi syndrome mouse models. Mamm. Genome 16: 424-431. Driscoll M.C., Dobkin C.S., and Alter В.Р., 1989. y^p-thalassemia due to a de novo mutation deleting the 5’ p-globin gene activation- region hypersensitive sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 7470-7474. Eggermann T, Wollmann H.A., Kuner R., Eggermann K., Enders H., Kaiser P, and Ranke M.B., 1997. Molecular studies in 37 Silver-Russell syndrome patients: Frequency and etiology of uniparental disomy. Hum. Genet. 100:415-419. Ehrlich M., 2003. The ICF syndrome, a DNA methyltransferase 3B defi- ciency and immunodeficiency disease. Clin. Immunol. 109:17-28. Ehrlich M., Buchanan K.L., Tsien E, Jiang G., Sun B., Uicker W., Weemaes C.M., Smeets D., Sperling K., Belohradsky B.H., et al., 2001. DNA methyltransferase 3B mutations linked to the ICF syndrome cause dysregulation of lymphogenesis genes. Hum. Mol. Genet. 10:2917-2931. Engel E., 1980. A new genetic concept: Uniparental disomy and its potential effect, isodisomy. Am. J. Med. Genet. 6: 137-143. Fattal-Valevski A., Bassan H., Korman S.H., Lerman-Sagie T, Gutman A., and Harel S., 2000. Methylenetetrahydrofolate reductase deficiency: Importance of early diagnosis./. Child Neurol. 15: 539-543. Feng Y, Absher D., Eberhart D.E., Brown V, Maker H.E., and Warren S.T, 1997. FMRP associates with polyribosomes as an mRNP, and the I304N mutation of severe fragile X syndrome abolishes this association. Mol Cell 1: 109-118. Flint J., Thomas K., Micklem G., Raynham H., Clark K., Doggett N.A., King A., and Higgs D.R., 1997. The relationship between
chromosome structure and function at a human telomeric region. Nat. Genet. 15: 252-257. Forrester W.C., Epner E., Driscoll M.C., Enver T, Brice M., Papa- yannopoulouT, andGroudine M., 1990. A deletion of the human beta-globin locus activation region causes a major alteration in chromatin structure and replication across the entire beta-globin locus. Genes Dev. 4: 1637-1649. Fraga M.E., Ballestar E., Paz M.E., Ropero S., Setien E., Ball- estar M.L., Heine-Suner D., Cigudosa J.C., Urioste M., Benitez J., et al., 2005. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 10604-10609. Gabellini D., Green M.R., and Tupler R., 2002. Inappropriate gene activation in FSHD: A repressor complex binds a chromosomal repeat deleted in dystrophic muscle. Cell 110: 339-348. Gibbons R.J., Picketts D.J., Villard L., and Higgs D.R., 1995. Muta- tions in a putative global transcriptional regulator cause X-linked mental retardation with alpha-thalassemia (ATR-X syndrome). Ce//80: 837-845. Gibbons R.J., Pellagatti A., Garrick D., Wood W.G., Malik N., Ayyub H., Langford C., Boultwood J.. Wainscoat J.S., and Higgs D.R., 2003. Identification of acquired somatic mutations in the gene encoding chromatin-remodeling factor ATRX in the a-thalassemia myelodysplasia syndrome (ATMDS). Nat. Genet. 34: 446-449. Gicquel C., Rossignol S., Cabrol S., Houang M., Steunou V, Baibu V, Danton R., Thibaud N., Le Merrer M., Buiglen L., et al., 2005. Epimutation of the telomeric imprinting center region on chromosome 1 lpl5 in Silver-Russell syndrome. Nat. Genet. 37:1003-1007. Gowher H. and Jeltsch A., 2002. Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyl- transferases. J. Biol. Chem. 277:, 20409-20414. Goyette P., Sumner J.S., Milos R., Duncan A.M., Rosenblatt D.S., Matthews R.G., and Rozen R., 1994. Human methylenetetrahy- drofolate reductase: Isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat. Genet. 7:, 195-200. Grosveld E., 1999. Activation by locus control regions? Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 152-157. Hagberg B.. Aicardi J., Dias K., and Ramos O., 1983. A progressive syndrome of autism, dementia, ataxia, and loss of purposeful hand use in girls: Rett’s syndrome: Report of 35 cases. Ann. Neurol. 14: 471-479. Hagerman P.J. and Hagerman R.J., 2004. The fragile-X premutation: A maturing perspective. Am. J. Hum. Genet. 74: 805-816. Hagerman R.J., Van Housen K., Smith A.C., and McGavran L., 1984. Consideration of connective tissue dysfunction in the fragile X syndrome. Лаи. J. Med. Genet. 17: 111-121. Handa V, Saha T, and Usdin K., 2003. The fragile X syndrome repeats form RNA hairpins that do not activate the interferon- inducible protein kinase, PKR, but are cut by Dicer. Nucleic Acids Res. 31: 6243-6248. Hansen R.S., Wijmenga C., Luo P, Stanek A.M., Canfield T.K., Weemaes CM., and Gartler S.M., 1999. The DNMT3B DNA methyltransferase gene is mutated in the ICF immunodeficiency syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14412-14417. Harikrishnan K.N., Chow M.Z., Baker E.K., Pal S., Bassal S., Bra- sacchio D., Wang L.. Craig J.M., Jones PL., Sif S., and El-Osta A., 2005. Brahma links the SWI/SNF chromatin-remodeling complex with MeCP2-dependent transcriptional silencing. Nat. Genet. 37: 254-264. Hark A.T., Schoenherr C.J., Katz D.J., Ingram R.S., Levorse J.M., andTilghman S.M., 2000. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. Nature 405: 486-489. Harrison CJ., Jack E.M., Allen T.D., and Harris R., 1983. The fragile X: A scanning electron microscope study. /. Med. Genet., 20:280-285. Hasegawa T, Hara M., Ando M., Osawa M., Fukuyama Y, Taka- hashi M., and Yamada K., 1984. Cytogenetic studies of familial Prader-Willi syndrome. Hum. Genet. 65: 325-330. Hayward B.E., Kamiya M., Strain L., Moran V, Campbell R., Hayashizaki Y, and Bonthron D.T., 1998. The human GNAS1 gene is imprinted and encodes distinct paternally and biallelically expressed G proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 10038-10043. Henry L, Bonaiti-Pellie C., Chehensse V, Beldjord C, Schwartz C, Utermann G., and Junien C., 1991. Uniparental paternal disomy in a genetic cancer-predisposing syndrome. Nature 351: 665-667. Hoal-van Helden E.G. and van Helden P.D., 1989. Age-related methylation changes in DNA may reflect the proliferative po- tential of organs. Mutat. Res. 219: 263-266. Horike S., Cai S., Miyano M., Cheng J.E, and Kohwi-ShigematsuT, 2005. Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nat. Genet, 37: 31-40. Hubbard V.S., Davis P.B., di Sant’Agnese PA., Gorden P, and Schwartz R.H., 1980. Isolated growth hormone deficiency and cystic fibrosis: A report of two cases. Am. J. Dis. Chdd 134: 317- 319. Ingrosso D., Cimmino A., Perna A.E, Masella L., De Santo N.G., De Bonis M.L., Vacca M., D’Esposito M., D’Urso M., Galletti P., and Zappia V, 2003. Folate treatment and unbalanced methy- lation and changes of allelic expression induced by hyperhomo- cysteinaemia in patients with uraemia. Lancet 361: 1693-1699. Ishizuka A., Siomi M.C., and Siomi H., 2002. A Drosophila fragile X protein interacts with components of RNAi and ribosomal proteins. Genes Dev. 16: 2497-2508. Issa J.P., Ottaviano Y.L., Celano P, Hamilton S.R., Davidson N.E., and Baylin S.B., 1994. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. Nat. Genet. 7: 536-540. Jeanpierre M., Turleau C., Aurias A., Prieur M., Ledeist E., Fis- cher A., and Viegas-Pequignot E., 1993. An embryonic-like methylation pattern of classical satellite DNA is observed in ICF syndrome. Hum. Mol. Genet. 2: 731-735. Jiang Y.H., Armstrong D., Albrecht U., Atkins C.M., Noebels J.L., Eichele C., Sweatt J. D., and Beaudet A. L., 1998. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation (see comments). Neuron 21: 799-811. Jin P., Alisch R.S., and Warren S.T, 2004a. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat. Cell Biol. 6: 1048-1053. Jin P, Zamescu D.C., Zhang E., Pearson C.E., Lucchesi J.C., Moses K., and Warren S.T, 2003. RNA-mediated neurodegeneration caused by the fragile X premutation rCGG repeats in Drosophila. Neuron 39: 739-747. Jin P., Zamescu D.C, Ceman S., Nakamoto M., Mowrey J., Jongens T.A., Nelson D.L., Moses K., and Warren S.T, 2004b. Bio- chemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the micro RNA pathway. Nat. Neurosci. 7:113-117.
Глава 23. Эпигенетика и болезни человека Joyce J.A., Lam W.K., Catchpoole D.J., Jenks P., Reik W, Maher E.R., and Schofield P.N., 1997. Imprinting of IGF2 and H19: Lack of reciprocity in sporadic Beckwith-Wiedemann syndrome. Hum. Mol. Genet. 6: 1543-1548. Kaufmann W.E., Jarrar M.H., Wang J.S., Lee Y.J., Reddy S., Bibat G., and Naidu S., 2005. Histone modifications in Rett syn- drome lymphocytes: A preliminary evaluation. Brain Dev. 27: 331-339. Kioussis D., Vanin E., deLange T, Flavell R.A., and Grosveld E.G., 1983. Beta-globin gene inactivation by DNA translocation in gamma beta-thalassaemia. Nature 306: 662-666. Kishi N. and Macklis J.D., 2004. MECP2 is progressively expressed in post-migratory neurons and is involved in neuronal maturation rather than cell fate decisions. Mol. Cell. Neurosci. 27: 306-321. KishinoT, Lalande M., and Wagstaff J., 1997. UBE3A/E6-AP muta- tions cause Angelman syndrome. Nat. Genet. 15: 70-73. Kondo T, Bobek M.P., Kuick R., Lamb B., Zhu X., Narayan A., Bourc’his D., Viegas-Pequignot E., Ehrlich M., and Hanash S.M., 2000. Whole-genome methylation scan in ICF syndrome: Hypomethyla-tion of non-satelhte DNA repeats D4Z4 and NBL2. Hum. Mol. Genet. 9: 597-604. Korenke G.C., Fuchs S., Krasemann E., Doerr H.G., Wilichowski E., Hunneman D.H., and Hanefeld E, 1996. Cerebral adreno- leukodystrophy (ALD) in only one of monozygotic twins with an identical ALD genotype. Ann. Neurol. 40: 254-257. Kwok R.P., Lundblad J.R., Chrivia J.C., Richards J.P., Bachinger H.P., Brennan R.G., Roberts S.G., Green M.R., and Good- man R.H., 1994. Nuclear protein GBP is a coactivator for the transcription factor CREB. Nature 370: 223-226. Laggerbauer B.. Ostareck D.. Keidel E.M.. Ostareck-Lederer A., and Fischer U., 2001. Evidence that fragile X mental retardation protein is a negative regulator of translation. Hum. Mol. Genet. 10: 329-338. Ledbetter D.H., Riccardi VM., Airhart S.D., Strobel R.J., Keenan B.S., and Crawford J. D., 1981. Deletions of chromosome 15 as a cause of the Prader-Willi syndrome. N. Engl. J. Med. 304: 325-329. Lee M.P., DeBaun M.R., Mitsuya K., Galonek H.L., Brandenburg S., Oshimura M., and Feinberg A. P., 1999. Loss of imprinting of a paternally expressed transcript, with antisense orientation to KVLQT1, occurs frequently in Beckwith-Wiedemann syndrome and is independent of insulin-like growth factor II imprinting. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 5203-5208. Lemmers R.J., de Kievit P, Sandkuijl L., Padberg G.W, van Ommen G.J., Frants R.R., and van der Maarel S.M., 2002. Facioscapulo- humeral muscular dystrophy is uniquely associated with one of the two variants of the 4q subtelomere. Nat. Genet. 32: 235-236. Lewis J.D., Meehan R.R., Henzel W.J., Maurer-Fogy L, Jeppesen P., Klein E, and Bird A., 1992. Purification, sequence, and cel- lular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. Cell 69: 905-914. Li Z., Zhang Y, Ku L., Wilkinson K.D., Warren S.T, and Feng Y, 2001. The fragile X mental retardation protein inhibits translation via interacting with mRNA. Nucleic Acids Res. 29: 2276-2283. Liu D., Diorio J., Tannenbaum B., Caldji C., Francis D., Freedman A., Sharma S., Pearson D., Plotsky P.M., and Meaney M.J., 1997. Maternal care, hippocampal glucocorticoid receptors, and hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress Science 277:1659-1662. Lubs H.A., 1969. A marker X chromosome. Am. J. Hum. Genet. 21: 231-244. Ludwig M., Katalinic A., Gross S., Sutcliffe A., Varon R., and Horst- hemke B., 2005. Increased prevalence of imprinting defects in patients with Angelman syndrome bom to subfertile couples. J. Med. Genet. 42: 289-291. Ma J., Stampfer M.J., Giovannucci E., Artigas C, Hunter D.J., Fuchs C, Willett W.C., Selhub J., Hennekens C.H., and Rozen R.. 1997. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism, dietary interactions, and risk of colorectal cancer. Cancer Res. 57: 1098-1102. Magenis R.E., Brown M.G., Lacy D.A., Budden S., and LaFranchi S., 1987. Is Angelman syndrome an alternate result of del( 15) (qllql3)?Am J. Med. Genet. 28: 829-838. Martin J. and Bell J., 1943. A pedigree of mental defect showing sex-linkage. Arch. Neurol. Psychiat. 6: 154-157. Martinowich K., Hattori D., Wu EL., Fouse S., He E., Hu Y, Fan G., and Sun Y.E., 2003. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent Bdnf gene regulation. Science 302:890-893. Mathews K.D., 2003. Muscular dystrophy overview. Genetics and diagnosis. Neurol Clin. 21: 795-816 MatsuuraT, Sutcliffe J.S., Fang P., Galjaard R.J., Jiang Y.H.. Benton C.S., Rommens J.M., and Beaudet A.L., 1997. De novo truncat- ing mutations in E6-AP ubiquitin-protein ligase gene (UBE3A) in Angelman syndrome. Nat. Genet. 15: 74-77. Mayr B. and Montminy M., 2001. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 599-609. Mays- Hoopes L.L., 1989. Age-related changes in DNA methylation: Do they represent continued developmental changes? Int. Rev. Cytol. 114: 181-220. McDowell T.L., Gibbons R.J., Sutherland EL, O’Rourke D.M., Bickmore W.A., Pombo A., Turley H., Gatter K., Picketts D.J., Buckle V.J., et al., 1999. Localization of a putative transcriptional regulator (ATRX) at pericentromeric heterochromatin and the short arms of acrocentric chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13983-13988. Meguro M., Mitsuya K., Nomura N., Kohda M., KashiwagiA., Nishigaki R., Yoshioka H., Nakao M., Oishi M., and Oshimura M., 2001. Large-scale evaluation of imprinting status in the Prader-Willi syndrome region: An imprinted direct repeat cluster resembling small nucleolar RNA genes. Hum. Mol. Genet. 10: 383-394. Meins M., Lehmann J., Gerresheim E, Herchenbach J., Hagedorn M., Hameister K., and Epplen J.T., 2005. Submicroscopic duplication in Xq28 causes increased expression of the MECP2 gene in a boy with severe mental retardation and features of Rett syndrome. J. Med. Genet. 42: el2. Meloni L, Bruttini M., Longo L, Mari E., Rizzolio E. D’Adamo P.. Den-vriendt K., Fryns J.P., Toniolo D., and Renieri A., 2000. A mutation in the Rett syndrome gene, MECP2, causes X-linked mental retardation and progressive spasticity in males. Am. J. Hum. Genet. 6T. 982-985. Mullaney B.C., Johnston M.V, and Blue M.E., 2004. Developmental expression of methyl-CpG binding protein 2 is dynamically regu- lated in the rodent brain. Neuroscience 123: 939-949. Murata T, Kurokawa R., Krones A., Tatsumi K., Ishii M., Taki T, Masuno M., Ohashi H. Yanagisawa M., Rosenfeld M.G.. et al., 2001. Defect of histone acetyltransferase activity of the nuclear transcriptional coactivator СВР in Rubinstein-Taybi syndrome Hum. Mol. Genet. 10: 1071-1076.
Nan X., Campoy F.J., and Bird A., 1997. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Ce//88: 471-481. Neul J.L. and Zoghbi H.Y., 2004. Rett syndrome: A prototypical neurodevelopmental disorder. Neuroscientist 10: 118-128. Nicholls R.D., Knoll Butler M.G., Karam S., and Lalande M., 1989. Genetic imprinting suggested by maternal hetero- disomy in nondeletion Prader-Willi syndrome. Nature 342: 281-285. Nuber U.A., Kriaucionis S., RoloffT.C., Guy J., Selfridge J., Stein- hoff G, Schulz R., Lipkowitz B., Ropers H.H., Holmes M.C., and Bird A., 2005. Up-regulation of glucocorticoid-regulated genes in a mouse model of Rett syndrome. Hum. Mol. Genet. 14: 2247-2256. Ogryzko V.V., Schiltz R.L., Russanova V., Howard B.H., and Naka- tani Y, 1996. The transcriptional coactivators p300 and СВР are histone acetyltransferases. Cell KT. 953-959. Ohta T, Gray T.A., Rogan P.K., Buiting I.C., Gabriel J.M., Saitoh S., Muralidhar B., Bilienska B., Krajewska-Walasek M., Driscoll D.J., et al., 1999. Imprinting-mutation mechanisms in Prader- Willi syndrome. Am. J. Hum. Genet. 64: 397-413. Okano M., Bell D.W, Haber D.A., and Li E., 1999. DNA meth- yltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99: 247-257. Orstavik K.H., Eiklid K., van der Hagen C.B., Spetalen S., Kierulf K., Skjeldal O., and Buiting K., 2003. Another case of imprint- ing defect in a girl with Angelman syndrome who was conceived by intracytoplasmic semen injection. Am. J. Hum. Genet. 72: 218-219. Petrij E., Giles R.H., Dauwerse H.G., Sans J.J., Hennekam R.C., Masuno M., Tommerup N., van Ommen G.J., Goodman R.H., Peters D.J., et al., 1995. Rubinstein-Taybi syndrome caused by mutations in the transcriptional co-activator СВР. Nature 376: 348-351. Petroms A., 2004. The origin of schizophrenia: Genetic thesis, epigenetic antithesis, and resolving synthesis. Biol. Psychiatry 55: 965-970. Picketts D.J., Higgs D.R., Bachoo S., Blake D.J., Quarrell O.W, and Gibbons R.J., 1996. ATRX encodes a novel member of the SNF2 family of proteins: Mutations point to a common mechanism underlying the ATR-X syndrome. Hum. Mol. Genet. 5: 1899-1907. Pieretti M., Zhang E., Fu Y.-H., Warren S.T, Oostra B.A., Caskey C.T., and Nelson D. L., 1991. Absence of expression of the FMR-1 gene in fragile X syndrome. Cell 66: 817-822. Ping A.J., Reeve A.E., Law D.J., Young M.R., Boehnke M., and Feinberg A.P., 1989. Genetic linkage of Beckwith-Wedemann syndrome to 1 Ip 15. Am. J. Hum. Genet. 44: 720-773. Prawitt D., Enklaar T, Gartner-Rupprecht B., Spangenberg C., Oswald M., Lausch E., Schmidfke P, Reutzel D., Fees S., Lucito R., et al., 2005. Microdeletion of target sites for insulator protein CTCF in a chromosome 11 p 15 imprinting center in Beckwith- Wiedemann syndrome and Wilms’ tumor. Proc. Natl. Acad. Sci. 102:4085-4090. Rampersaud G.C., Kauwell G.P., Hutson A.D.. Cerda J.J., and Bailey L.B., 2000. Genomic DNA methylation decreases in response to moderate folate depletion in elderly women. Am. J. Clin. Nutr.1T. 998-1003. Reik W, 1989. Genomic imprinting and genetic disorders in man. Trends Genet. 5: 331-336. Reynolds E.H., Carney M.W, and Toone B.K.. 1984. Methylation and mood. Lancet!., 196-198. Richards B.W., Sylvester PE., and BrookerC., 1981. FragileX-linked mental retardation: The Martin-Bell syndrome. J. Merit. Defic. Res. 25: 253-256. Roelfsema J.H., White S.J., Ariyurek Y, Bartholdi D., Niedrist D., Papadia E., Bacino C.A., den Dunnen J.T, van Ommen G.J., Breuning M.H., et al., 2005. Genetic heterogeneity in Rubin- stein-Taybi syndrome: Mutations in both the СВР and EP300 genes cause disease. Am. J. Hum. Genet. 76: 572-580. Rougeulle C., Cardoso C., Fontes M., Colleaux L., and Lalande M., 1998. An imprinted antisense RNA overlaps UBE3A and a second maternally expressed transcript. Mat Genet., 19:15-16. Rozen R., 1996. Molecular genetics of methylenetetrahydrofolate reductase deficiency. /. Inherit. Metab. Dis., 19: 589-594 Runte M., Varon R., Hom D., Horsthemke B., and Buiting K., 2005. Exclusion of the C/D box snoRNA gene cluster HBH-52 from a major role in Prader-Willi syndrome. Hum. Genet. 116: 228-230. Schimke R.N., Horton W.A., and King C.R., 1971. Chondroitin-6- sulphaturia, defective cellular immunity, and nephrotic syndrome. Lancet!: 1088-1089. Schule B., Albalwi M., Northrop E., Francis D.L., Rowell M., Slater H.R., Gardner R.J., and Francke U., 2005. Molecular breakpoint cloning and gene expression studies of a novel translocation t(4; 15)(q27 ;ql 1.2) associated with Prader-Willi syndrome. BMC Med. Genet. 6:18. Schwahn B. and Rozen R., 2001. Polymorphisms in the methylenete- trahydrofolate reductase gene: Clinical consequences. Am. J. Pharmacogenomics 1. 189-201. Shahbazian M.D., Antalffy B., Armstrong D.L., and Zoghbi H.Y, 2002a. Insight into Rett syndrome: MeCP2 levels display tis- sue- and cell-specific differences and correlate with neuronal maturation. Hum. Mol. Genet. 11: 115-124. Shahbazian M., Young J., Yuva-Paylor L., Spencer C., Antalffy B., Noebels J., Armstrong D., Paylor R., and Zoghbi H., 2002b. Mice with truncated MeCP2 recapitulate many Rett syndrome features and display hyperacetylation ofhistone H3. Neuron 35: 243-254. Smeets D.F., Moog U., Weemaes C.M.. Vaes-Peeters G., Merkx G.F., Niehof J.P., and Hamers G., 1994. ICF syndrome: A new case and review of the literature. Hum. Genet. 94: 240-246. Smeets D.F., Hamel B.C., Nelen M.R., Smeets H.J., Bollen J.H., Smits A.P, Ropers H.H., and van Dost B.A., 1992. Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome in cousins from a family with a translocation between chromosomes 6 and 15. TV. Engl. J. Med. 326: 807-811. Smilinich N.J., Day CD., Fitzpatrick G.V, Caldwell G.M., Lossie A.C., Cooper PR., Smallwood A.C., Joyce J.A., Schofield P.N., Reik W, et al., 1999. A maternally methylated CpG island in KvLQTl is associated with an antisense paternal transcript and loss of imprinting in Beckwith-Wedemann syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8064-8069. Spence J.E., Perciaccante R.G., Greig G.M., Willard H.F., Ledbetter D.H., Hejtmancik J.E, Pollack M.S., O’Brien W.E., and Beau- det A.L., 1988. Uniparental disomy as a mechanism for human genetic disease. Am. J. Hum. Genet. 42: 217-226. Spranger J., Hinkel G.K., Stoss H.. Thoenes W, Wargowski D., and Zepp E., 1991. Schimke immuno-osseous dysplasia: A newly recognized multisystem disease./. Pediatr. 119: 64-72. Sun F.L., Dean W.L., Kelsey G., Allen N.D., and Reik W, 1997. Transactivation of Igf2 in a mouse model of Beckwith-Wede- mann syndrome. Nature 389: 809-815.
Глава 23. Эпигенетика и болезни человека Suter С.М., Martin D.L., and Ward R.L., 2004. Germline epimuta- tion of MLH1 in individuals with multiple cancers. Nat. Genet. 36: 497-501. Sutherland G.R., 1977. Fragile sites on human chromosomes: Demonstration of their dependence on the type of tissue culture medium. Science, 197: 265-266. Taha D., Boerkoel C.F., Balfe J.W., Khalifah M., Sloan E.A., Barbar M., Haider A., and Kanaan H., 2004. Fatal lymphoproliferative disorder in a child with Schimke immuno-osseous dysplasia. Am. J. Med. Genet. A 131:, 194-199. Tommerup N., van der Hagen C.B., and Heiberg A., 1992. Tentative assignment of a locus for Rubinstein-Taybi syndrome to 16p 13.3 by a de novo reciprocal translocation, t(7; 16)(q34;pl3.3). Am. ]. Med. Genet. 44: 237-241 Tsai T.E., Jiang Y.H.. Bressler J., Armstrong D.. and Beaudet A.L., 1999. Paternal deletion from Snrpn to Ube3a in the mouse causes hypotonia, growth retardation and partial lethality and provides evidence for a gene contributing to Prader-Willi syndrome. Hum. Mol. Genet. 8: 1357-1364. Tuck-Muller C.M., Narayan A., Tsien E., Smeets D.F., Sawyer J., Fiala E.S., Sohn O.S., and Ehrlich M., 2000. DNAhypomethyla- tion and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients. Cytogenet. Cell Genet. 89: 121-128. Tupler R. and Gabellini D.. 2004. Molecular basis of facioscapulo- humeral muscular dystrophy. Cell. Mol. Life Sci. 61: 557-566. van Deutekom J.C, Wijmenga C., van Tienhoven E.A., Gruter A.M., Hewitt J.E., Padberg G.W, van Ommen G.J., Hofker M.H., and Frants R.R., 1993. FSHD associated DNA rearrangements are due to deletions of integral copies of a 3.2 kb tandemly repeated unit. Hum. Mol. Genet. 2:, 2037-2042. Van Esch H., Bauters M., Ignatius J., Jansen M., Raynaud M., Hol- landers K., Lugtenberg D., Bienvenu T, Jensen L.R., Geez J., et al., 2005. Duplication of the MECP2 region is a frequent cause of severe mental retardation and progressive neurological symptoms in males. Am. J. Hum. Genet. 77: 442-453. VerkerkA. J.M.H., PierettiM., Sutcliffe J.S., FuY-H., KuhlD.PA., Pizutti A., Reiner O., Richards S., Victoria M.E, Zhang R., et al., 1991. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell 65: 905-914. Villard L., Geez J., Mattel J.F., Fontes M., Saugier-Veber P, Mun- nich A., and Lyonnet S., 1996. XNP mutation in a large family with Juberg-Marsidi syndrome. Nat. Genet. 12: 359-360. Wan M., Zhao K, Lee S.S., and Francke U., 2001. Л/ЕСР2truncating mutations cause histone H4 hyperacetylation in Rett syndrome. Hum Mol. Genet. 10: 1085-1092. Wan M., Lee S.S., Zhang X., Houwink-Manville L, Song H.R., Amir R.E., Budden S., Naidu S., Pereira J.L., Lo I.F., et al., 1999. Rett syndrome and beyond: Recurrent spontaneous and familial MECP2 mutations at CpG hotspots. Am. J. Hum. Genet. 65: 1520-1529. Warren S.T. and Sherman S.L., 2001. The fragile X syndrome. In The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8th edition (ed. C.R. Scriver et al.), vol. 1, pp. 1257-1289. McGraw-Hill, New York. Waterland R.A. and Jirtle R.L., 2003. Transposable elements: Targets for early nutritional effects on epigenetic gene regulation. Mol. Cell. Biol. 23: 5293-5300. Weatherall D.J., Clegg M.B., Higgs D.R., and Wood W.G., 2001. The hemoglobinopathies. In The metabolic & molecular bases of inherited disease, 8th edition (ed. C.R. Scriver et al.), pp. 4571- 4636. McGraw-Hill, New York. Weaver I.C., CervoniN., Champagne F.A., D’Alessio A.C., Sharma S., Seckl J.R., Dymov S., Szyf M., and Meaney M.J.. 2004. Epigenetic programming by maternal behavior. Nat. Neurosci. 7: 847-854. Weiler I.J. and Greenough WT, 1999. Synaptic synthesis of the Fragile X protein: Possible involvement in synapse maturation and elimination. Am. J. Med. Genet. 83: 248-252. Weksberg R., Smith A.C., Squire J., and Sadowski P., 2003. Beckwith- Wiedemann syndrome demonstrates a role for epigenetic control of normal development. Hum. Mol. Genet. 12: R61-R68 Weksberg R., Nishikawa J.. Caluseriu O., Fei Y.L.. Shuman C, Wei C, Steele L., Cameron J., Smith A., Ambus L, et al., 2001. Tumor development in the Beckwith-Wiedemann syndrome is associ- ated with a variety of constitutional molecular 1 Ip 15 alterations including imprinting defects of KCNQIOTI. Hum. Mol. Genet. 10: 2989-3000. Weksberg R., Teshima L, Williams B.R., Greenberg C.R., Pueschel S.M., Chemos J.E., Fowlow S.B., Ноуте E., Anderson I.J., Whiteman D.A., et al., 1993. Molecular characterization of cy- togenetic alterations associated with the Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) phenotype refines the localization and suggests the gene for BWS is imprinted. Hum. Mol. Genet. 2: 549-556. Wijmenga C., Hewitt J.E., Sandkuijl L.A., Clark L.N., Wnght T.J., Dauwerse H.G., Gruter A.M., Hofker M.H., Moerer P, Wil- liamson R., et al., 1992. Chromosome 4q DNA rearrangements associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy. Nat. Genet. 2:26-30. Willemsen R., Hoogeveen-Westerveld M., Reis S., Holstege J., Severij-nen L.A., Nieuwenhuizen I.M.. Schrier M., Van Unen L., Tassone E., Hoogeveen A.T., et al., 2003. The FMRI CGG repeat mouse displays ubiquitin-positive intranuclear neuronal inclusions; implications for the cerebellar tremor/ataxia syn- drome. Hum. Mol. Genet. 12: 949-959. Wolff G.L., Kodell R.L., Moore S.R., and Cooney C.A., 1998. Maternal epigenetics and methyl supplements affect agouti gene expression in A^a mice. Faseb J. 12: 949-957. Xu G.L., Bestor TH., Bourc’his D., Hsieh C.L., Tommerup N , Bugge M.. Hulten M.. QuX., Russo J.J., and Viegas-Pequignot E., 1999. Chromosome instability and immunodeficiency syn- drome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene. Nature AMa 187-191. Yntema H.G., Poppelaars F.A., Derksen E., Oudakker A.R., van Roos-malen T, Jacobs A., Obbema H., Brunner H.G., Hamel B.C., and van Bokhoven H., 2002. Expanding phenotype of XNP mutations: Mild to moderate mental retardation. Am. J. Med. Genet. 110: 243-247. Young J.I.. Hong E.P., Castle J., Crespo-Barreto J.. Bowman A.B., Rose M.F., Kang D., Richman R., Johnson J.M., Berget S., and Zoghbi H.Y, 2005. Inaugural article: Regulation of RNA splicing by the methylation-dependent transcriptional repres- sor methyl-CpG binding protein 2. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 17551-17558. Zeev B.B., Yaron Y, Schanen N.C., Wolf H., Brandt N., Ginot N., Shomrat R., and Orr-Urtreger A., 2002. Rett syndrome: Clinical manifestations in males with MECP2 mutations. J. Child Neurol. 17:, 20-24.
ГЛАВА 24 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПРИ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Stephen В. Baylin1 и Peter A. Jones2 1 Cancer Biology Program, The Sidney Kimmel Cancer Center, Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland 21231 2Department of Urology Biochemistry and Molecular Biology, USC/Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, California 90089-9181 СОДЕРЖАНИЕ Общее резюме 1. Биологическая основа раковых заболеваний 2. Значение хроматина для раковых заболеваний 3. Роль метилирования ДНК при раковых заболеваниях 4. Гиперметилированные промоторы генов при ра- ковых заболеваниях 4.1. Гены, участвующие в процессе 4.2. Поиск новых генов, эпигенетически сайлен- сированных при раке 4.3. Определение функциональной важности генов, гиперметилированных при раковых заболеваниях ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ Рак вызывается наследуемым нарушением регуляции генов, которые определяют, когда клетки делятся, по- гибают и перемещаются из одной части тела в другую. В процессае канцерогенеза гены могут становиться активированными таким образом, что усиливают проли- ферацию клеток или предотвращают клеточную гибель, 5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака - значение для ранних стадий развития опухоли 6. Молекулярная анатомия эпигенетически сайлен- сированных раковых генов 7. Резюме главных результатов исследований по осмыслению эпигенетического сайленсинга ге- нов при раке 8. Выявление рака посредством метилирования ДНК 9. Эпигенетическая терапия Литература или, наоборот, гены могут инактивироваться так, что они не могут более сдерживать эти процессы. Первый класс генов называется «онкогены», а второй — гены- суппрессоры опухолей («tumor suppressor genes»). Между этими двумя классами генов существует взаимодействие, которое и приводит к образованию раковой опухоли. Гены могут инактивироваться как минимум тремя способами, включающими в себя (1) возможную мута-
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях цию гена, делающую его неспособным выполнять свою функцию, (2) полную утрату гена, что, таким образом приводит к неспособности его нормально работать и (3) ген. который не мутировал и не был утрачен, может быть наследственно выключен вследствие эпигенети- ческих изменений. Такой эпигенетический сайленсинг может включать в себя модификации гистонов, связы- вание белков-репрессоров и неправильное метилиро- вание остатков цитозина (С) в СрС-мотивах, которые находятся внутри контрольных участков, управляющих экспрессией генов. В данной главе делается акцент на на этом третьем пути. Основные молекулярные механизмы, отвечающие за поддержание «молчащего» состояния, довольно хо- рошо понятны, что и представлено в этой книге. Далее, мы также знаем, что эпигенетический сайленсинг имеет важное значение для профилактики, диагностики и тера- пии раковых заболеваний. В нашем распоряжении сейчас имеются лекарства, одобренные американской FDA, ко- торые могут ревертировать эпигенетические изменения и восстановить генную активность в раковых клетках. По- скольку изменения в метилировании ДНК можно анали- зировать с высокой степенью чувствительности, многие стратегии в ранней диагностике раковых заболеваний базируются на выявлении изменений в метилировании ДНК Поэтому возможности эпигенетики в исследовани- ях, диагностике, профилактике и лечении рака у челове- ка, являются совершенно исключительными. 1. Биологическая основа раковых заболеваний В конечном счете, рак является заболеванием экспрессии генов, при котором нарушается нормальная работа слож- ных сетей, управляющих гомеостазом у многоклеточных организмов, что позволяет клеткам расти вне связи с нуж- дами организма как целого. Большие успехи были достиг- нуты в описании той подгруппы клеточных контрольных путей, которые нарушаются при раке у человека (табл. 24.1). Тот факт, что почти при всех раковых заболеваниях, наследуемым нарушениям подвержено это ограниченное число клеточных контрольных путей, и является ключе- вой идеей, которая продвинула данную область исследо- ваний (Hanahan and Weinberg, 2000). Основное внимание до последних нескольких лет было сосредоточено на генетических основах раковых заболеваний, в частности, на мутационной активации онкогенов или инактивации генов-супрессоров опухолей. Однако увеличивающийся массив данных, появившихся с середины 1990-х годов, показывает, что наследуемые изменения, регулируемые эпигенетическими модификациями, также могут играть критическую роль в эволюции раковых заболеваний всех типов у человека (рис. 24.1) (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Эти данные, в частности паттерны метилирования ДНК и хроматина, которые при раке фундаментально изменяются, привели к новым возможностям в понимании, диагностике, ле- чении и профилактике раковых заболеваний Генетические и эпигенетические аномалии могут вызывать наследуемые нарушения путей обеспечения гомеостаза при помощи двух различных механизмов. Может иметь место либо активация онкогенов, в основ- ном, через активацию точечных мутаций, либо могут быть инактивированы гены-супрессоры опухолей (Jones and Laird, 1999; Hanahan and Weinberg, 2000; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Например, при раковых заболеваниях человека часто обнаруживаются мутации в сигнальном гене (онкогене), таком как RAS, которые усиливают активность генного продукта в сти- муляции роста. Эти мутации часто являются доминант- ными и стимулируют возникновение онкологических заболеваний. С другой стороны, генетические мута- ции и эпигенетический сайленсинг генов-супрессоров опухолей, часто являются рецессивными, требующими разрушительных событий в обеих аллельных копиях гена для полной экспрессии трансформированного фе- нотипа. Идея о том, что в малигнизированной клеточ- ной линии должны быть выведены из строя обе копии гена-супрессора опухолей была предложена Кнудсоном (Knudson, 2001) и широко принята. Сейчас понятно. Табл. 24.1. Ключевые клеточные пути, которые нарушаются генетическими и эпигенетическими механизмами при раковых заболева- ниях человека Путь Пример генетической модификации Пример эпигенетической модификации Самообеспеченность ростовыми сигналами Мутации в гене RAS Метилирование гена RASSFIA Нечувствительность к антиростовым сигна- лам Мутация в генах TGFp-рецептора Даун-регуляция рецепторов TGFp Тканевая инвазия и метастазирование Мутация в гене E-Cadhenn Метилирование промотора E-Cadherin Неограниченный репликативный потенциал Мутации в генах pl6uRb Сайленсинг генов р16 или Rb путем метилирования промотора Поддерживаемый ангиогенезис Сайленсинг тромбоспондина-1 Уход от апоптоза Мутация в р53 Метилирование DAP-киназы, ASC/TMS1 иШС1 Способность к репарации ДНК Мутации в MLH1, MSH2 Метилирование GST Pi, O6-MGMT, MLH1 Мониторинг геномной стабильности Мутации в Chfr Метилирование Chfr Функции убиквитинирования белка Мутации в Chfr Метилирование Chfr
2. Значение хроматина для раковых заболеваний Метилирование ДНК meCpG I TpG 2222 Нестабильность генома «Замалчивание» (сайленсинг) промотора Более частые Уф-индуцированные мутации Мутации, индуцированные канцерогеном Рис. 24.1. Эпигенетические изменения, связанные с метилированием ДНК, могут приводить к раковым заболеваниям при помощи раз- личных механизмов Утрата метилирования по цитозину в ДНК (гипо) приводит к нестабильности генома. Локальное гиперметилирование в про- моторе гена (гипер) вызывает наследуемый сайленсинг и, следовательно, инактивацию генов-супрессоров опухоли. Кроме того, метилированные сайты CpG представляют собой горячие точки для мутаций типа транзиций С-»Т , вызванных спонтанным ги- дролитическим дезаминированием. Метилирование сайтов CpG также повышает связывание некоторых химических канцерогенов с ДНК и повышает частоту мутаций, индуцированных УФ-излучением что три класса «ударов» могут действовать в различных комбинациях, вызывая полную потерю активности генов-супрессоров опухолей Прямые мутации в коди- рующей последовательности, потеря частей или целых копий генов, или эпигенетический сайленсинг могут взаимодействовать друг с другом, что может приводить ключевые контрольные гены в нерабочее состояние (рис. 24.2). 2. Значение хроматина для раковых заболеваний Несмотря на важнейшие достижения в понимании клю- чевых молекулярных повреждений путей клеточного контроля, способствующих возникновению раковых заболеваний, остается истиной то, что микроскопическое исследование цитологом-патологом структуры ядра по- прежнему является золотым стандартом в диагностике раковых заболеваний Человеческий глаз может точно разглядеть изменения в архитектонике ядра, которая, в основном, отражает состояние конфигурации хромати- на, и определенно диагносцировать раковый фенотип в одиночной клетке. В качестве признаков патологи в первую очередь используют величину ядра, его очерта- ния, конденсированную ядерную мембрану, отчетливые ядрышки, плотный «гиперхроматиновый» хроматин и высокие значения ядерно-плазменного отношения Эти структурные характеристики, которые видны под микроскопом (рис. 24.3), по-видимому, коррелируют с глубокими изменениями функций хроматина и полу- чающимися в результате этого изменениями состояний экспрессии генов и (или) стабильности хромосом. Уста- новление связи между изменениями, наблюдаемыми на микроскопическом уровне, с молекулярными метками, обсуждаемыми повсюду в этой книге, остается одной из главных проблем в онкологических исследованиях. В этой главе мы рассматриваем эпигенетические метки, типичным примером которых являются изменения в метилировании цитозина ДНК, метилирование в ди- нуклеотидах CpG и модификации гистонов, которые в раковых клетках распределены аномально. Их все чаще связывают с наследуемыми событиями, которые за- трагивают стабильность и функционирование генома, и, таким образом, вносят весьма существенный вклад в злокачественный фенотип. Известны несколько примеров роли хроматин мо- дифицирующей активности при раковых заболеваниях у человека (Wolffe, 2001). Например, и острая миелоид- ная лейкемия (AML), и острая промиелоцитная лей- кемия (PML) вызываются хромосомными транслока- циями. которые изменяют использование диацетилаз гистонов (HDACs). При PML ген PML объединяется с рецептором ретиноидной кислоты (RAR). Этот ре- цептор рекрутирует активность HDAC и метилирова- ние ДНК и вызывает состояние транскрипционного сайленсинга, что было показано с помощью экспери- ментальных промоторных конструктов. Эти данные предполагают, что такое «нацеливание» изменения хроматина может потенциально приводить к сайлен- сингу гена-супрессора опухоли, который участвует в блокировке клеточной дифференциации (Di Croce et al., 2002). При AML, ДНК-связывающий домен транс- крипционного фактора AML-1 объединен с белком, который называется ЕТО и который взаимодействует с
Глава 24. Эпигенетические детерминанты, при раковых заболеваниях Мутация & LOH Мутация & метилирование Метилирование & LOH Биаллельное метилирование Рис. 24.2. Как метилирование ДНК может участвовать в инактивации генов-супрессоров опухоли Две активные аллели гена-супрессора опухоли показаны как два синих прямоугольника в верхней части рисунка Первый шаг инактивации гена показан как локализованная мутация (слева) или генный сайленсинг за счет метилирования ДНК (справа). Следующий «удар» показан или как потеря гетерозиготности (LOH), или как транскрипционный сайленсинг в результате до- полнительных эпигенетических событий. В этом случае метилирование ДНК может играть роль одного из путей, что согласуется с гипотезой Кнудсона HDAC. Репрессия клеточной дифференцировки непра- вильно нацеленной HDAC способствует абберантной репрессии гена и, в конечном счете, лейкемии (Amann et al., 2001). Это всего два примера прямого включения модификаций хроматина в онкогенный фенотип. Одна- ко становится ясно, что модификации хроматина могут прямо и косвенно изменять паттерны метилирования цитозина — эпигенетического изменения ДНК, которое может либо инициировать, либо «запереть» сайленсинг ключевых генов, что ведет к наследуемым нарушениям важнейших клеточных путей. 3. Роль метилирования ДНК при раковых заболеваниях Первое открытие того, что ДНК кроме четырех осно- ваний, содержит 5-метилцитозин, непосредственно включенный в ДНК, вскоре привело к предположению, что изменения в метилировании ДНК могут играть роль в онкогенезе (табл. 24.2). За последние 40 лет было про- ведено много исследований, которые показывали раз- личия в паттернах распределения 5-метилцитозина ДНК человека между раковыми и нормальными клетками. Среди них есть как минимум три основных способа, с помощью которых метилирование CpG может уча- ствовать в онкогенном фенотипе. Они включают в себя гипометилирование ракового генома, локальное гипер- метилирование промоторов генов-супрессоров опухоли и прямой мутагенез (рис. 24.1) (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Хотя каждое из этих отклонений само по себе могло бы способство- вать возникновению раковых заболеваний у человека, может быть, особенно важно то, что они все имеют место одновременно, показывая, таким образом, что нарушения гомеостаза эпигенетических механизмов — это главные причины, вызывающие рак у людей. Наиболее известное и раньше других установленное изменение в паттернах метилирования ДНК у раковых клеток — это общее уменьшение данной модификации, приводящее к нестабильности генома (дополнительное обсуждение см. в главе 18). Хорошо известно, что это является ключевым признаком рака у человека (Fein- berg and Vogelstein, 1983; Feinberg et al., 1988; Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). В более поздний период времени возрастающий объем данных показал, что аномальное метилирова- ние островков CpG в 5’-районах генов, относящихся к раковым заболеваниям, является составной частью их транскрипционного сайленсинга, обеспечивая альтер- нативный механизм мутаций для инактивации генов с функциями подавления опухоли (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Нако-
4. Гиперметилированные промоторы генов при раковых заболеваниях Нормальная кожа Карцинома сквамозных клеток (сквамозно- клеточная карцинома) Рис. 24.3. Структурные изменения хроматина в раковых клетках Эти две микрофотографии сделаны у пациента со сквамоз- ноклеточной карциномой кожи. На левой части показаны нормальные эпидермальные клетки, расположенные в одном миллиметре от прилегающей опухоли и показанные при том же увеличении на правой части рисунка. Хроматин, окрашенный пурпурным цветом, благодаря его сродству к гематоксилину, оказывается гораздо более грубым и гранулярным в раковых клетках, чем в нормальном эпидермисе. Такие различия в окраске хроматина используются патологами в качестве диа- гностических критериев раковых заболеваний нец, в дополнении к вышеописанной роли метилирова- ния цитозина в дестабилизации генома и генном сай- ленсинге, 5-метилцитозин сам по себе является высоко нестабильным и, поэтому, мутабельным основанием. Это напрямую может вносить свой вклад в развитие раковых заболеваний, вызывая мутации типа транзи- ций, при которых meCpG превращается в TpG (Rideout et al., 1990). Тот факт, что эти модификации столь рас- пространены при раковых заболеваниях, и, как сейчас известно, приводят напрямую к канцерогенезу, также создает новые возможности терапевтической реверсии, направленной на эпигенетические изменения (Egger et al., 2004). Таким образом, в настоящее время признается, что критическую роль в канцерогенезе человека играет ме- тилирование цитозина в ДНК. Почти все гены человека содержат остатки метилированного цитозина в своих кодирующих областях, для которых в течение некото- рого времени известно непропорциональное участие в образовании болезнетворных мутаций. Метилирование 5 углерода в цитозиновом кольце повышает частоту ги- дролитического дезаминирования этого основания в двунитевой ДНК. Однако продуктом дезаминирования 5-метилцитозина является в тимин, а не урацил (см. рис. 3.12). Механизмы репарации ДНК впоследствии менее эффективны при восстановлении неправильных сочетаний оснований в ДНК, вызванных дезамини- рованием. Известно, что метилированные сайты CpG производят более 1/3 всех мутаций типа транзиций, возникающих в зародышевой линии человека (Rideout et al., 1990). Это также справедливо для генов, вызы- вающих рак, таких какр53 (Rideout et al., 1990). Более удивительным является наблюдение, что этот механизм также принимает существенное участие в образовании инактивирующих мутаций в генах-супрессорах опухоли в соматических тканях. Например, более 50% всех му- таций р53, которые приобретаются при спорадических раковых заболеваниях толстой и прямой кишки, име- ют место в сайтах метилирования цитозина (Greenblatt et al., 1994). Таким образом, модификация ДНК ДНК- метилтрансферазами (DNMTs) существенно повышает риск получения рака с помощью такого эндогенного механизма. Было также показано, что метилирование цитози- новых остатков поддерживает образование канцеро- генных аддуктов присоединения между ДНК и канце- рогенами, такими как бензопирен из сигаретного дыма. В этом случае, метилирование цитозинового остатка повышает образование канцерогенных аддуктов между соседним гуаниновым остатком и бензопирендиолэ- поксидом, приводящее к повышению вероятности му- таций в сайтах CpG в легких курильщиков (Greenblatt et al., 1994; Pfeifer et al., 2000). Интересно, что метили- рование может также изменять частоту мутаций в гене р53 в коже, экспонированной солнечному свету (Green- blatt et al., 1994; Pfeifer et al., 2000). Это происходит из-за того, что метиловая группа смещает спектр поглощения цитозина в диапазон падающего солнечного света, тем самым повышая образование пиримидиновых димеров в ДНК клеток кожи. Таким образом, эта эпигенетиче- ская модификация ДНК не только повышает спонтан- ный мутагенез, но также может влиять на то, как ДНК взаимодействует с канцерогенами и ультрафиолетом (Pfeifer et al., 2000). Гипометилирование ДНК, которое было дав- но отмечено в опухолях животных и человека (табл. 24.2), влияет на стабильность хромосом и повыша- ет шанс анеуплоидии. Геномная нестабильность — это признак ракового заболевания, и повышенная лом- кость хромосом, вызываемая гипометилированием саттелитных и других последовательностей, может, по- видимому, приводить к образованию раковых заболева- ний путем уменьшения стабильности генома (Narayan et al., 1998; Gaudet et al., 2003). Конкретные механизмы, с помощью которых достигается эта нестабильность, все еще не полностью поняты, но они легко могут быть результатом измененных взаимодействий ДНК и бел- ков, вызванных гипометилированием. 4. Гиперметилированные промоторы генов при раковых заболеваниях 4.1. Гены, участвующие в процессе Наиболее понятный механизм, при помощи которого метилирование ДНК приводит к раковым заболева- ниям, это локальное гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухоли. Конкретные механизмы, при помощи которых осуществляется это гипермети- лирование, детально обсуждаются ниже. Однако ясно, что это важнейший путь, приводящий к наследуемому сайленсингу генов, которые подавляют развитие рака (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Обычно, гиперметилирование ДНК осуществляется в участках, обогащенных CpG, или в или CpG-островках, которые локализованы внутри и вокруг транскрипционного стартового сайта аномально
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях Таблица 24.2. Временная шкала, проясняющая роль метилирования ДНК при раковых заболеваниях Наблюдение Ссылка Гипотеза «метилазы как онкогенные агенты» Srinivasan and Borek (1964) Пониженные уровни 5-метилцитозина в опухолях животных Lapeyre and Becker (1979) 5-азацитидин и 5-аза-2’-деоксицитидин ингибируют метилирование и активируют гены Jones and Taylor (1980) Пониженное общегеномное и геноспецифичное метилирование в опухолях человека Ehrlich et al. (1982); Feinberg and Vogelstein (1983); Flatau et al. (1983) Ингибиторы метилирования ДНК изменяют канцерогенный фенотип Frost et al. (1984) Метилирование островка CpG при раке Baylin et al. (1987) Горячие точки для мутаций р53 — это метилированные сайты CpG Rideout et al. (1990) Аллель-специфичное метилирование гена супрессора опухоли при ретинобластоме Sakai et al. (1991) Утрата импринтинга при раке Rainier et al. (1993) Гиперметилирование островков CpG связано со старением Issa et al. (1994) У мышей с пониженным метилированием развивается меньше опухолей Laird et al. (1995) Сочетание метилирования ДНК и ингибиторов HDAC приводит к быстрой изоляции генов-супрессоров опухолей Suzuki et al. (2002); Yamashita et al. (2002) Ген репарации ДНК (MLH1) в соматических клетках метилирован Gazzoli et al. (2002) 5-Азацитидин одобрен FDA для лечения миелодиспластического синдрома Kaminskas et al. (2005) «молчащих» генов при раковых заболеваниях. Важно знать, что метилирование цитозина в CpG-островках поблизости от местоположения стартового сайта гена особенно критично, так как эта же самая модификация ДНК, имеющая место внутри генов, обычно не коррели- рует с транскрипционным статусом (Jones, 1999). Перечень связанных с раком генов, на которые влияет упомянутое выше нарушение транскрипции, неуклонно растет. Как было описано ранее, сюда вклю- чаются гены в любых положениях на хромосомах (Jones and Baylin, 2002). Действительно, данное эпигенетиче- ское изменение может сейчас численно превосходить те гены, которые часто мутируют в опухолях человека. Как было упомянуто ранее (табл. 24.1), потеря функции гена-супрессора опухоли как результат вызывающего сайленсинг данного гена метилирования CpG, по су- ществу, затрагивает все известные пути. Чтобы понять значение генов для процесса канцерогенеза и сформу- лировать проблему в этой области на будущее, гены, по-видимому, могут быть разделены на три группы. Первая группа содержит те гены, которые участву- ют в определении гиперметилирования промотора и сайленсинга генов, как одного из важных механизмов потери функции гена-супрессора опухоли при рако- вых заболеваниях (табл. 24.3). Эти гены уже были рас- познаны как классические гены-супрессоры опухоли, которые при мутации в зародышевой линии семьи вы- зывают наследуемые формы рака (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Они также часто мутируют при спорадических формах рака, но в таких опухолях они нередко могут быть гипермети- лированы по одной или обеим аллелям (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Кроме того, для этих генов гиперметилирование про- мотора может иногда составлять «второй удар» (по ги- потезе Кнудсона) в связи с тем, что они ассоциированы с потерей функции второй копии этого гена при семей- ных опухолях, где «первым ударом» является мутация в зародышевой линии (Grady et al., 2000; Esteller et al., 2001b). В некоторых случаях было показано, что инду- цированная 5-азацитидином реактивация этих генов в культуре опухолевых клеток восстанавливает ключевую функцию гена-супрессора опухоли, утраченную в про- цессе роста опухоли. Таким примером является функ- ция коррекции неправильного спаривания оснований ДНК в клетках рака толстой кишки, где имеет место сайленсинг гена MLH1 (Herman et al., 1998). Вторая группа эпигенетически сайленсированных генов — это те гены, которые, благодаря их функции, ранее были идентифицированы как кандидатуры на роль генов-супрессоров опухоли, но для них не было показана сколько-нибудь существенная частота инак- тивации за счет мутаций Эти гены могут рассматри- ваться как потенциальные супресоры, потому что они находятся в таких позициях на хромосомах, которые при раковых заболеваниях часто подвергаются делени- ям (табл. 24.3). Примерами являются RASFF1A и FHIT на хромосоме Зр при раке легких и опухолях других ти- пов (Dammann et al., 2000; Burbee et al., 2001). Остальные гены — это те, про которые известно, что они кодируют белки, содействующие функциям, существенным для предотвращения роста опухоли, такие как ген проапоп- тоза, DAP-киназы (Katzenellenbogen et al., 1999). Эти гены бросают вызов всей области эпигенетики рака, поскольку, несмотря на то, что при опухолях в них обнаружено частое гиперметилирование промотора, должно быть специально доказано (поскольку многие из этих генов часто, если не всегда, мутируют) каким
4. Гиперметилированные промоторы генов при раковых заболеваниях Таблица 24.3. Классы гиперметилированных генов 1 Классические гены-супрессоры опухоли, мутирующие в зародышевой линии семей с наследуемыми синдро- мами рака: некоторые примеры =УН1, E-cadherin,pl6lnk4a, MLH1, A PC, Stk4, Rb 2 Кандидаты на роль генов-супрессоров опухоли: некоторые примеры = FHIT, RASSF1A, 06-MGMT. Gst-Pi, G4TAs4m5, DAP-kinase 3. Гены, обнаруженные путем случайного скрининга на гиперметилированные гены: некоторые примеры = HIC-1, SFRPs 1,2,4,5, ВМР-3, SLC5A8, SSI1 именно образом эти гены участвуют в генезе опухоли. Мы вернемся к этому вопросу в дальнейшем. Третья группа генов идентифицируется по страте- гиям, применяемым для случайной идентификации аберрантно сайленсированных генов, ассоциирован- ных с гиперметилированием промотора (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). По сравне- нию с генами из второй группы, трудно поместить их в функциональный контекст развития рака, поскольку их функции могут быть совершенно неизвестны. 4.2. Поиск новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке Чаще всего используемый подход при идентификации новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке, заключается в том, чтобы рассматривать в качестве кандидата любой потенциальный ген-супрессор опухоли, если мутации не обнаружены, или если экспрессия гена в изучаемых опухолях низкая, или вообще отсутствует. Другой используемый подход — это применить технику случайного скриннинга раковых геномов на гипер- метилированные гены (Toyota et al., 1999; Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). Этот путь предоставляет огромные возможности для обогащения наших знаний в области биологии рака, но также вызы- вает много проблем. Как недавно было сказано в обзоре (Ushijima, 2005), каждый подход имеет свои сильные и слабые стороны. Несколько подходов зависят от первого этапа, когда ДНК переваривается одним или несколькими рестрик- ционными ферментами, которые дифференциально расщепляют сайты CpG, в зависимости от того, метили- рованы ли они. Затем, чтобы определить потенциально гиперметилированные гены, продукты анализируют при помощи двухмерного электрофореза (Restriction Land- mark Genomic Sequencing, RLGS), случайно амплифи- цируют, применяя случайные праймеры, или технику вычитания, чтобы дифференцировать метилированные последовательности нуклеотидов нормальной ДНК и ДНК из опухоли. Эти методы способны идентифи- цировать большое количество гиперметилированных генов, и каждый из них добавляет новые сведения от- носительно важных потенциальных кандидатов на роль генов-супрессоров опухоли. Однако идентифицирован- ные последовательности нуклеотидов могут быть либо связаны, либо на связаны с островками CpG, которые стратегически расположены так, чтобы участвовать в сайленсинге генов. Повторяющиеся последовательно- сти, которые часто бывают высокометилированными, иногда включены в конечные продукты. В результате, эффективность идентификации гиперметилированных генов-супрессоров опухоли часто бывает не очень вы- сока и затруднительна в масштабах целого генома. Другие подходы связаны с опознаванием на микро- чипах нуклеотидных последовательностей содержа- щихся в геноме островков CpG (С.М. Chen et al., 2003), поскольку они часто связаны со стартовыми сайтами гена, и с зондированием чипов с помощью геномной ДНК, которая была переварена чувствительными к ме- тилированию ферментами, либо с помощью кДНК, с учетом статуса экспресии генов. Этот подход обладает мощным потенциалом для идентификации гиперме- тилированных супрессоров опухоли, но он ограничен числом возможных островков CpG, которые могут быть чипированы. Еще один подход состоит в том, чтобы обрабатывать культуры опухолевых клеток агентами, которые вызы- вают деметилирование ДНК, такими как 5-азацитидин или 5-аза-2’-деоксицитидин, и проводить гибридиза- цию РНК до и после обработки препаратами на генных микрочипах для выявления ап-регурированных генов (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002). Этот подход потенциально может идентифицировать все гиперме- тилированные гены в культурах клеток всех типов чело- веческого рака. Однако изменения в генах, вызванные другими причинами, нежели деметилирующая актив- ность используемых препаратов, может понизить эф- фективность идентификации гиперметилированных генов. Меньше всего осознается тот факт, что самый низкий уровень экспрессии разыскиваемых генов, как до, так и после обработки препаратами резко ставит под вопрос чувствительность большинства генов микрочи- пов, заметно снижая эффективность данного подхода (Suzuki et al., 2002). Применение метода вычитания по- сле обработки препаратами для обогащения генными транскриптами, содержание которых повышено, может повысить чувствительность подхода, основанного на генных микрочипах (Suzuki et al., 2002), но он должен быть адаптирован таким образом, чтобы удовлетворять требованиям флуоресцентного мечения зондов для микрочипов, что легко позволит покрыть весь геном Одновременное применение препаратов, модифици- рующих изменения хроматина, которые действуют совместно с метилированием промотора ДНК, напри- мер, такими как ингибиторы HDAC, может помочь в подходах, основанных на генных микрочипах. Данный маневр помогает более специфично идентифицировать разыскиваемые гены, принимая во внимание ту роль, которую изменения хроматина играют в сайленсирова- нии гиперметилированных генов, что детально обсуж- дается в последующем разделе. Этот последний подход позволил недавно идентифицировать важные гены, сайленсированнные при раке толстой кишки (Suzuki et al., 2002).
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях 4.3. Определение функциональной важности генов, гиперметилированных при раковых заболеваниях Стремительность, с которой стали обнаруживаться ги- перметилированные гены при раке, представляет собой исследовательскую проблему, вызывающую опасения. Частое гиперметилирование промотора данного гена не гарантирует само по себе функционального значе- ния для сайленсинга сопутствующего гена, что обычно бывает при потере функции, обусловленной генетиче- ской мутацией. Это имеет место особенно в том случае, когда гиперметилированный ген не является известным классическим супрессором опухоли и когда нет свиде- тельств тому, что этот ген также может часто мутировать при различных видах рака. Итак, обязательно, чтобы рассматриваемый ген изучался таким образом, чтобы важность потери функции определялась и с точки зрения процессов, контролируемых кодируемым белком, и с точки зрения последствий этого для развития опухоли. Есть несколько возрастающих по значению стадий таких исследований, очерченных в табл. 24.4; целью этих ис- следований является строгое документирование роли в образовании раковых заболеваний. Первая, это, конечно, документирование гиперме- тилирования и его последствий для состояния экспрес- сии гена, включая способность гена подвергаться реэк- спрессии при деметилировании промотора. Вторая — наличие гиперметилирования и сайленсинга данного гена должны быть хорошо установлены как в первич- ных пробах из опухолей, так и в культуре опухолевых клеток. Третья, как объясняется ниже, часто необходи- мо знать, в какой точке развития опухоли осуществля- ется сайленсинг гена (рис. 24.4). Четвертая — следует напрямую оценить, насколько канцерогенной являет- ся потеря функции гена. Можно начать с рутинного изучения культур клеток через оценку влияния восста- новления гена на свойства клеток, такие как индук- ция апоптоза, эффект клонирования на мягком агаре, и влияние на канцерогенность клеток, растущих как ксенотрансплантат (гетеротрансплантат) в безтимусо- вых мышах. Пятая должна быть определена функция кодируемого белка либо через предварительные сведе- ния относительно типа белка — через распознование его предполагаемых функций исходя из природы его структуры, или через изучение биологических свойств белка на моделях культур клеток. В конечном счете, однако, должен быть сделан шестой шаг, который мо- жет часто включать в себя трангенные нокаутные под- ходы, чтобы установить роль гена как гена-супрессора опухоли и чтобы понять, каковы функции кодируемых белков в развитии, обновлении клеток у взрослого ор- ганизма и т.д. Изучение нокаутных мышей оказались чрезвычайно полезными для подтверждения функции HIC-1 как гена-супрессора опухоли, после того как он был идентифицирован посредством отбора тех участ- ков генома раковых клеток, которые утратили гетеро- зиготность (W.Y. Chen et al., 2003, 2004). Эти сомнения и особенно шестой этап, показывают, насколько важно Таблица 24.4. Этапы документирования важности гипермети- лированного гена для опухолеобразования 1. Обосновать метилирование промотора островка CpG и скоррелировать с транскрипционным сайленсингом гена и способностью отменять сайленсинг деметилирующими препаратами в культуре клеток 2. Обосновать корреляцию гиперметилирования промотора со специфичностью к этому изменению в раковых клетках (культура клеток и первичные опухоли) против аналогов среди нормальных клеток и случаев изменения гиперме- тилирования в первичных опухолях 3. Обосновать положение измененного метилирования для развития опухоли рака данного типа 4. Обосновать потенциальное значение генного сайленсинга при опухолеобразовании при помощи изучения реинсер- ции генов в культуре клеток и влияния на клонирование на мягком агаре, при росте опухолевых клеток в голых мышиных эксплантах и т.п. 5. Установить функцию белка, кодируемого сайленсным геном — либо через известные свойства, либо путем те- стирования активности узнаваемых белковых мотивов в культуре и т.п. 6. Обосновать супрессорную активность и функцию гена при обновлении клетки и т.п., особенно для совершенно неизвестных генов, посредством изучения нок-аутных мышей. обнаружить гены, эпигенетически сайленсированные при раке, но создают широкий фронт работы, который следует рассмотреть исследователям в этой области. 5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака - значение для ранних стадий развития опухоли Согласно классическому взгляду на развитие рака, сформулированному Фогельштейном и его коллегами (Kinzler and Vogelstein, 1997), серия генетических изме- нений стимулирует продвижение от ранних предмалиг- низованных стадий через появление инвазивного рака к началу метастазирующей стадии заболевания (рис. 24.4). Это развитие у разных опухолей не обязательно всегда осуществляется именно в таком порядке Мы знаем, что на всем протяжении такого хода событий, также имеют место эпигенетические изменения: наблю- дается раннее появление как широко распространенных утрат нормального метилирования ДНК, так и его более локального прироста в промоторах генов, которые мы обсуждаем. Таким образом, имеется потенциальная возможность для взаимодействия эпигенетических и генетических событий, чтобы направлять последо- вательные клеточные аномалии на всем протяжении неопластической прогрессии. В соответствии с этим сценарием, данные, касающиеся двух эпигенетических аспектов — потери импринтинга (LOI — loss of imprint- ing) (как это обсуждалось в главе 23) и сайленсинга ге-
5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака — значение для ранних стадий развития опухоли Рис. 24.4. Ранняя роль аномального метилирования ДНК в развитии опухоли Описано в класической модели (Kinzler and Vogelstein, 1997) генетических изменений в процессе эволюции рака толстой кишки. Показано, что измененное метилирование ДНК имеет место очень рано (красная стрелка), как сказано в тексте, во время пре- вращения нормального эпителия в гиперпластический. Этот факт определяет его стратегическое положение (левая нижняя черная стрелка и левый нижний прямоугольник)', стволовые клетки направляются на путь аномальной клональной экспансии (рис. 24.5) при содействии ключевых генетических изменений. Эти эпигенетические аномалии также имеют смысл маркеров, как показано в нижнем левом черном прямоугольнике. Аномальное метилирование ДНК продолжает накапливаться в процессе превращения опухолей из неинвазивных в инвазивные и, наконец, метастазирующие (правая нижняя стрелка и правый прямоугольник). Это создает дополнительную основу для лечения рака и для поисков маркеров, используемых в прогнозировании заболевания нов — оказываются крайне важными для ранних стадий развития рака. Потеря импринтинга включает в себя процесс, при котором «молчащая» аллель импринтированных генов активируется во время канцерогенеза таким образом, что устанавливается двуаллельная экспрессия гена и избыток продукта данного гена (Rainier et al.. 1993). Наиболее изученный пример касается гена IGF2 в таких опухолях, как рак толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005). В этом случае гиперметилирование промотора в импринтированном гене Н19 на краю хромосомы явля- ется результатом сложного процесса контролирования хроматина (глава 19), чтобы аномально активировать «молчащую» аллель 7GF2 (Kaneda and Feinberg, 2005). Получающяяся в результате двуаллельная экспрессия IGF2 приводит к переизбытку белка IGF2, стимулиру- ющего рост. Экспериментальные свидетельства пред- полагают, что это может играть роль на очень ранних стадиях образования рака толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005; Sakatani et al., 2005). И действительно, недавние исследования на мышиных моделях пред- полагают, что сама по себе LOI может быть достаточ- на, чтобы инициировать процесс опухолеобразования (Holm et al., 2005). Второй обычный неопластический переход — эпиге- нетический сайленсинг генов — происходит на ранних фазах неопластического развития. Это очень тесно связа- но с вопросами о роли клеточного стресса и экспозиции в развитии болезненных состояний. Часто оказывается, что гены, участвующие в процессе, устанавливают те ста- дии, на которых клетки, подвергнутые стрессу, выживают при повреждении ДНК и(или) хронических нарушени- ях, увеличиваются, как клон стволовых или прогенитор- ных клеток и затем делаются предрасположенными к более поздним генетическим и эпигенетическим собы- тиям, чтобы осуществить развитие опухоли (рис. 24.5). Первое свидетельство такого участия исходит из данных по нескольким классичесим генам-супрессорам опу- холи, которые могут быть либо мутантными, либо эпи- генетически сайленсированными в раковых опухолях человека. Например, эпигенетический сайленсинг гена р/б^^очень рано осуществляется в популяциях предма- лигнизованных клеток, во время начальных изменений, которые предваряют образование опухолей, таких, на- пример, как рак легких (Belinsky et al., 1998), а также в маленьких популяциях гиперпластических эпителиаль- ных клеток нормальных во всем остальном молочных желез некоторых женщин (Hoist et al., 2003). В экспери- менте, когда нормальные человеческие клетки эпителия молочной железы выращиваются в культуре (на пласти- ке). этот тип сайленсинга р16 является предпосылкой для самых начальных этапов трансформации клеток (Kiyono et al., 1998; Romanov et al., 2001). Такая потеря функции гена сопровождает неспособность групп клеток молоч- ной железы достичь точки смертности и, по мере того, как эти клетки продолжают пролиферировать, в них раз- виваются усиливающиеся хромосомные аномалии и экс- прессия теломеразы. Второй пример касается MLHF гена, устраняющего неправильное спаривание оснований. Этот ген мути- рует в зародышевой линии тех семей, члены которых предрасположены к раку толстой кишки, такого типа, при котором имеются множественные генетические из- менения; это называется фенотип «микросаттелитной» нестабильности (Liuet al., 1995). Однако, 10—15% паци- ентов с несемейным раком толстой кишки, также име- ют опухоли с таким фенотипом, и в большинстве этих раковых опухолей обнаруживается эпигенетический
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях Нормальная дифференцировка Компартмент стволовой/ Прогениторной клетки Ненормальный клональный рост Прогрессия опухоли Рис. 24.5. События эпигенетического сайленсинга генов и опухолеобразование Самые ранние этапы опухолеобразования описываются как аномальная клональная экспансия, которая разворачивается при стрессовом воздействии на клеточное обновление. Она вызывается такими факторами, как старение и хронические нарушения, связанные, например, с воспалением. Это как раз те клеточные клоны, в которых могут произойти последующие генетические и эпигенетические события, направляющие развитие опухоли. Такие аномальные эпигенетические события, как аберрантный генный сайленсинг, о котором говорится в данной главе, могли бы быть во многих случаях наиболее ранними наследуемыми причинами, вызывающими аномальную клональную экспансию из компартментов стволовых (или прогениторных) клеток в обновляющейся системе клеток взрослого организма. Сайленсинг генов включается модификациями хроматина, которые репрессируют транс- крипцию, а гиперметилирование ДНК этого хроматина служит «надежным запором», чтобы стабилизировать наследуемый сай- ленсинг, как сказано в тексте главы. Генный сайленсинг, в свою очередь, нарушает нормальный гомеостаз, удерживая стволовые клетки и прогениторные клетки от того, чтобы должным образом двигаться по пути дифференцировки, существующей в данной системе эпителиальных клеток (верхние клетки все более темного синего цвета) и направляя их (большие красные стрелки) к аномальной клональной экспансии сайленсинг немутировавшего гена MLH1 (Herman et al., 1998; Veigl et al., 1998). В культуре клеток реэкспрес- сия этого «молчащего» гена MLH1 вызывает появление вновь функционального белка, который восстанавли- вает значительную часть поврежденной способности репарировать неправильно спаренные основания (Her- man etal., 1998). Совсем недавно было показано, что ген Chfr, регу- лирующий чекпойнт, который также контролирует еще один тип целостности генома, хромосомную стабиль- ность и плоидность, мутирует в опухолях, но чаще про- являет эпигенетический сайленсинг при раке легких и других видах рака, и, что особенно важно, на ранних ста- диях развития рака толстой кишки (Mizuno et al., 2002). Изучение нокаутных мышей выявило роль этого гена, как супрессора опухоли, основываясь на его функции какубиквитинлигазы ЕЗ, которая регулирует Aurora А — ген, контролирующий митоза. Эмбриональные клетки мыши характеризуются хромосомной нестабильностью и предрасположенностью к трансформации. Поскольку список гиперметилированных генов при раке расширился, ключевые события сайленсин- га на ранних стадиях развития опухоли определяются теперь для возможных генов-супрессоров опухоли, у которых имеется лишь история эпигенетических из- менений, но не мутаций. Например, сайленсинг гена репарации ДНК 06-MGMT происходит на ранних стадиях развития рака толстой кишки (Esteller et al., 2001а), и эта потеря функции может обусловливать возможность сохранения клетками алкилирующего повреждения по гуанозинам, и, таким образом, пред- расположенность к точечным мутациям — заменам G-А. В самом деле, сайленсинг этого гена имеет место в предраковых полипах толстой кишки перед появле- нием высокой частоты таких мутаций как в гене р53, так и в гене RAS, на более поздних стадиях развития опухоли толстой кишки (Esteller et al., 2001а; Wolf et al., 2001). Аналогично этому, сайленсинг гена GST-Pi име- ет место практически при всех предраковых поврежде- ниях, предрасполагающих к раку простаты, подвергая клетки риску окислительного повреждения аденинов (Lee etal., 1994). Третий тип «молчащих» генов — обнаруженных ме- тодом беспорядочного скрининга раковых геномов на
6. Молекулярная анатомия эпигенетически сайленсированных раковых генов эпигенетически сайленсированные гены — также на- чинает вносить существенный вклад в наше понимание ранней роли генного сайленсинга при раке. Особенно интригующий сценарий был установлен в процессе развития рака толстой кишки: эпигенетическая по- теря функции происходит в семействе генов (обна- руженных методом микрочипирования, описанного ранее — Suzuki et al., 2002), которые могут допустить раннюю аномальную активацию пути развития, всегда связанную с возникновением и дальнейшей прогрес- сией этого заболевания. Транскрипционный сайлен- синг генов группы secreted frizzled related protein genes (SFRPs) (Suzuki et al., 2004) удаляет антагонистический сигнал к взаимодействию Wnt-лиганд с их мембранны- ми рецепторами (Finch et al., 1997). Этот сайленсинг коррелирует с Wnt-управляемой апрегуляцией общих уровней р-катенина в клетке, особенно благодаря по- вышенному присутствию и увеличенной активности в ядре этого транскрипционного фактора (Suzuki et al., 2004). Такая транскрипция — это каноническое считы- вание для повышенной активности Wnt-пути (Morin et al., 1997; Gregorieff and Clevers, 2005). Наиболее важным является тот факт, что сайленсинг SFRP происходит в очень ранних повреждениях, которые предрасполагают к раку толстой кишки, прежде чем происходят обычные мутации в белках Wnt-пути «вниз по течению», которые тоже приводят к активации р-катенина в ядре (Morin et al., 1997; Gregorieff and Clevers, 2005) Таким образом, ранняя активация Wnt пути, обусловленная эпигене- тическими событиями, оказывается сбалансирован- ной, чтобы позволить раннее распространение клеток, предрасположенных к тому, чтобы и далее активировать этот путь посредством мутаций. Сохранение как эпиге- нетических (действующих через Wnt-управляемое уве- личение клеточного р-катенина), так и генетических (действующих через повреждение белкового комплек- са, разрушающего р-катенин. или через активирование Wnt мутаций) изменений, похоже, позволяют им до- полнять друг друга при контроле развития заболевания (Suzuki et al., 2004). Еще один пример из данной группы генов — это HIC-1 (hypermethylated-in-cancer I), который кодирует транскрипционный репрессор типа «цинкового паль- ца» HIC-1 был обнаружен методом случайного скри- нинга на гиперметилированные островки CpG в го- рячей точке для потери хромосомы в раковых клетках (Wales et al., 1995). Оказалось, что этот ген, который сайленсирует на ранней стадии развития рака, но не мутирует, играет роль гена-супрессора опухоли при ис- пользовании модели нокаутной мыши (WY. Chen et al., 2003, 2004). Он служит дополнением к мутациям р53 частично, через потерю функции, которая приводит к апрегуляции SIRT1 (Chen et al., 2005), ключевого белка, воспринимающего клеточный стресс, и участвующего в росте стволовых или прогениторных клеток (Howitz et al., 2003; Nemoto et al., 2004; Kuzmichev et al., 2005). Таким образом, приведенные выше данные вносят свой вклад в тематические гипотезы, представленные на рис. 24.4. Это предполагает, что некоторые из наиболее ранних наследуемых изменений в развитии опухолей Таблица 24.5. Главные задачи исследований молекулярных собы- тий, связанные с эпигенетическим сайленсингом генов при раке 1 Выяснить связи между одновременным появлением и утратой метилирования ДНК в одних и тех же раковых клетках 2. Определить молекулярную природу границ (и то, как они изменяются при опухолеобразовании), которые отделяют области транскрипционно активных зон от транскрипци- онно репрессивных областей, окружающих промоторы генов и которые могут препятствовать распространению репрессивного хроматина через активную зону. Роль воз- можных механизмов могут играть ключевые модификации гистонов, инсуляторные белки, белки, осуществляющие ремоделинг хроматина, и т. д. 3. Определить, какова последовательность событий в эво- люции генного сайленсинга при раке, по отношению к модификации гистонов, метилированию ДНК и т. д. Что идет вначале и каковы ключевые белковые комплексы (ферменты метилирования ДНК, ферменты деацетилиро- вания и метилирования гистонов, белки, связывающиеся CpG с метилом, комплексы сайленсинга группы Polycomb и т. д.), которые нацеливают вышеупомянутые процессы, определяющие данные события 4. Какие специфические ферменты, метилирующие ДНК, требуются для инициации и(или) поддержания наибо- лее стабильного генного сайленсинга, и какие белковые комплексы содержат их. с учетом их взаимодействие с ключевыми компонентами гистонового кода 5. Каковы все компоненты аппарата метилирования ДНК и хроматина и какова иерархия их участия, необходимого для поддержания генного сайленсинга, и насколько об- ратимы их действия? могут представлять собой эпигенетические изменения, которые часто включают в себя жесткий транскрипци- онный сайленсинг генов, поддерживаемый метилиро- ванием промотора ДНК. Сложные задачи по дальней- шему пониманию этих сценариев целиком связаны с ключевыми задачами по изучению эпигенетических из- менений при раковых заболеваниях, которые обрисова- ны в табл. 24.5 и более полно обсуждаются далее. Ре- шение этих задач, в особенности для понимания роли эпигенетических изменений на самых ранних стадиях неопластического формирования, может удивительно обогатить молекулярные стратегии, имеющие целью предотвращение и раннее вмешательство при раковых заболеваниях. 6. Молекулярная анатомия эпигенетически сайленсированных раковых генов Гены, сайленсированные в неопластических клетках, важны для понимания инициации и дальнейшего под- держания рака. Они также служат великолепными моде- лями для понимания того, как может инициироваться и
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях поддерживаться сайленсинг гена, и как упакован геном млекопитающих, чтобы облегчить доступ к участкам транскрипции и репрессии транскрипции. В свою очередь, понимание функции хроматина, на которой сосредоточено основное внимание во многих главах этой книги, облегчает наше понимание того, что может служить триггером для аберрантного сайленсинга генов при раке, и того, как компоненты этого сайленсинга поддерживают сопутствующую ему транскрипционную репрессию. Работа нескольких лабораторий внесла свой вклад в текущее понимание конфигурации хроматина, который окружает гиперметилированные островки CpG в про- моторах многочисленных генов, аберрантно сайленси- рованных в раковых клетках. Эти исследования также показали, каким образом этот хроматин отличается от хроматина, окружающего те же самые гены, когда они обнаруживают базовую экспрессию. В нормальных клетках или в раковых клетках, где гены транскрипци- онно не репрессированы, эти гены характеризуются на- личием зоны открытого хроматина, где островки CpG в ДНК не метилированы, нуклеосомы расположены с нерегулярными промежутками, так что могут быть определены гиперчувствительные сайты, и ключевые гистоновые остатки маркированы посттрансляционны- ми модификациями, типичными для активных генов. Активные ковалентные гистоновые метки включают в себя ацетилирование НЗ по 9 и 14-му лизинам (НЗК9ас НОРМА (активный) граница граница SAHA ОПУХОЛЬ («молчащий») Рис. 24.6. Модель взаимоотношений между метилированием ДНК и модификациями гистонов в районе островков CpG генного про- мотора в нормальных и опухолевых клетках В экспрессируемом гене показана граница (сверху), молеуклярная природа которой пока не охарактеризована и которая защи- щает островок CpG, окружая сайт начала транскрипции (зеленая стрелка) от метилирования ДНК. Сайты . CpG в CpG-участках, фланкирующих эту защитную зону, наоборот, имеют метилированную ДНК (розовый шестиугольник, обозначенный М) и ас- социированы с такими ключевыми метками сайленсинга, как метилирование НЗК9 (красный шестиугольник, обозначенный Ме). Ключевые аминокислоты «хвостов» гистонов в защищенной зоне, такие как НЗК9, находятся в ацетилированом состоянии (синие флажки, обозначенные Ас) и транскрипционные факторы (желтый овал, обозначенный TF) имеют доступ к участку сайта начала транскрипции. Когда в раковой клетке тот же ген аберрантно находится в состоянии сайленсинга (внизу), островок CpG характеризуется гиперметилированием ДНК, т.к. защитные границы теперь разорваны и отсутствуют. Это метилирование под- держивается комплексами ДНК-метилтрансферазы (розовые овалы, обозначены DMMT) и белковыми комплексами, связываю- щимися с метилцитозином, которые содержат гистон-ацетилазы (синие овалы, обозначены HDAQ), и гистон-метилтрансферазы (красные овалы, обозначены НКМТ), которые катализируют ключевые метки метилирования при сайленсинге на аминокислот- ных «хвостах» гистонов (таких как НЗК9). TF-комплексы более не активны (отсутствие зеленой стрелки). Отображены главные подходы проводимых в настоящее время клинических испытаний по раковой эпигенетике, которые включают либо ингибиторы метилтрансфераз ДНК для блокирования гиперметилирования ДНК, либо ингибиторы HDAC для восстановления статуса ацети- лирования ключевых аминокислотных остатков гистонов Как сказано в тексте, наиболее многообещающая антираковая терапия включает комбинированное использование ингибиторов DNMT1 и HDAC
6. Молекулярная анатомия эпигенетически сайленсированных раковых генов and НЗК14ас) и метилирование НЗК4 (Nguyen et al., 2001; Fahmeret aL, 2002). Ha 5’ и 3’ границах вышеупомянутого участка от- крытого хроматина обнаруживается резкий переход в структуре хроматина с характерными для транскрипци- онно репрессированных геномных участков чертами, фланкирующими островок CpG (рис. 24.6). В этих по- граничных участках имеет место метилирование менее частых сайтов CpG и рекрутирование белков, связыва- ющихся с метилпитозином (MBDs). и их партнеров (на- пример, деацетилаз гистонов, или HDACs) к метилиро- ванным CpGs (глава 18) Участки вне островков CpG оказываются, таким образом, доступны для ферментов, которые катализируют метки метилирования гисто- нов, коррелирующие с сайленсингом гена. В результате действия всех этих факторов происходит деацетили- рование ключевых гистоновых остатков и обнаружи- ваются репрессивные метки метилирования гистонов, связанные с транскрипционной репрессией, особенно H3K9me2 (Nguyenet al., 2001; Fahmeret al., 2002; Kondo etal., 2003). Эти соседние участки активных и репрессирован- ных паттернов хроматина (рис. 24.6) предполагают, что промоторы активных генов, содержащие островки CpG, присущи зоне, которая «защищена», или, ины- ми словами, не является мишенью для репрессивных меток хроматина и метилирования ДНК (Nguyen et al., 2001; Fahmeretal., 2002; Kondo et al., 2003). Неотъемле- мой частью этих концепций является вероятность того, что в экспрессируемых генах молекулярные «границы» существуют на 5’ и 3’ концах промоторных островков CpG. Главная проблема — это определить точную при- роду этих границ. В настоящее время кандидатами на эту роль могут быть: сами модификации гистонов, ко- торые маркируют защищенный участок промотора, транскрипционные активаторные и коактиваторные комплексы, которые прямо поддерживают активную транскрипцию, комплексы белков, которые выпол- няют размещение нуклеосом и(или) их движение (т.е. ремоделеры нуклеосом), которые могут маркировать гены для активной транскрипции. Эти факторы могут стимулировать доступ активирующих транскрипцион- ных комплексов, замену классических гистонов их раз- новидностями, такими, как НЗ.З (глава 13), который, как оказалось, поддерживает активную транскрипцию, и действие инсуляторных белковых комплексов и их узнающих последовательностей. Именно с точки зре- ния определения того, как один или несколько этих процессов поддерживают зоны транскрипционно пер- миссивного хроматина вокруг промоторов активных генов, содержащих неметилированные по ДНК остров- ки CpG, гены, сайленсированные при раковых заболе- ваниях, представляют собой великолепную модель для изучения и понимания модуляций генной экспрессии в геномах млекопитающих. Способ, которым вышеупомянутая траскрипци- онно активная организация хроматина промоторов, содержащих островки CpG, преобразуется в процессе развития опухоли, остается в основном неизвестным, расшифровка этого преобразования остается одной из главных проблем в области эпигенетики рака. Как было упомянуто ранее, аномально метилированные по ДНК островки CpG в промоторах генов, сопровожда- ющиеся генным сайленсингом, часто обнаруживаются на самых ранних и предраковых стадиях развития опу- холи, делая наше понимание лежащих в основе факто- ров потенциально очень важным для изучения биоло- гии рака. Это также открывает новые возможности для выявления факторов риска при раке, для облегчения ранней диагностики рака и для выдвижения новых стратегий предупреждения и раннего вмешательства в канцерогенез. Какой бы конкретный механизм, из тех, что будут рассматриваться далее в этом разделе, не был задей- ствован. конечным результатом, проявляющимся в процессе развития опухоли, является «разлад» меха- низмов, которые охраняют участки островков CpG в генном промоторе от «вторжения» хроматина репрес- сивного типа, расположенного на 5’ и 3’ границах. Ре- зультатом является превращение конфигурации про- мотора из транскрипционно открытой в закрытую с более плотно упакованными нуклеосомами и потерей гиперчувствительных сайтов, а также появление мно- жественных состояний деацетилирования и метили- рования гистонов, характерных для транскрипционно репрессивного хроматина (рис. 24.6). Иерархия всех этих событий, в том смысле, которое из них является наиболее значимым в поддержке этой репрессии, все еще нуждается в определении. Однако одна важная черта, которая всплывает из анализа множественных генов, состоит в том, что какой бы ни была роль ком- поненты ДНК-метилирования в инициации и (или) поддержании генного сайленсинга, однажды состо- явшись, она играет доминирующую роль в наследуе- мости транскрипционно-репрессивного состояния. Соответственно, такие терапевтические приемы как ингибирование активности HDAC специфическими лекарственными препаратами, не могут индуцировать реэкспрессию раковых генов, промоторы которых со- держат в себе плотно метилированнные островки CpG Однако, если сначала применяется низкая доза такого деметилирующего агента, как 5’-деокси-аза-цитидин (DAC), то затем ингибиторы HDAC обнаруживают при реэкспрессии «молчащих» генов эффект аддитивности и(или) синнергизма (Cameron et al., 1999; Suzuki et al., 2002). Данная парадигма в сочетании с использовани- ем микрочипов для поиска, реэкспрессии сайленсных базально генов доказала свою ценность даже для иден- тификации новых эпигенетически сайленсированных генов при раке (Suzuki et al., 2002). Аналогично этому, реэкспрессия генов, следующая за назначением DAC, может привести к устранению меток сайленсирующе- го метилирования гистонов из промоторных участ- ков эпигенетически сайленсированых раковых генов (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo et al., 2003). В этом смысле, как показано на рис. 24.6, мети- лирование ДНК может служить «замком», чтобы ста- билизировать эпигенетический сайленсинг раковых генов и обеспечить его стабильное наследование, при- водящее к потере функции генов.
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях Еще один ключевой вопрос из области эпиге- нетического сайленсинга раковых генов касается того, какая из DNMT ответственна за установление и поддержание аномального метилирования ДНК промотора, которое часто сопровождает этот про- цесс. Современные данные позволяют предполагать, что эти этапы могут быть опосредованы каким-то другим способом, нежели это можно было бы пред- положить, исходя из классической роли Dnmt, уста- новленной при исследовании развития мышей. При развитии мышей, как вытекает из исследований но- каутов трех известных биологически активных ДНК- метилтрансфераз — Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b — два последних фермента отвечают за установление ме- тилирования (метилирование ДНК de novo), тогда как Dnmtl ответственна за дальнейшее поддержание установленных паттернов (поддерживающее метили- рование ДНК) (Li et al., 1992; более детально см. гла- ву 18). Однако в культуре клеток рака толстой кишки исследования по генетическому разрушению DNMTs показывают, что поддержание большинства случа- ев общего метилирования ДНК, в том числе гипер- метилирование промоторов и сопровождающий его сайленсинг генов, требует наличия как DNMT1, так и DNMT3b (Rhee et al., 2000, 2002). Изучение рако- вых клеток других типов дали более разнообразные результаты — от указания на некоторую степень парт- нерства этих двух ферментов в таком поддержании до описания генов, которые деметилируются и транс- крипционно реактивируются при уменьшении коли- чества одной только DNMT1 (Leu et al., 2003). Таким образом, вопрос о том, как DNMTs устанавливают и поддерживают аномальные паттерны метилирования ДНК в раковых клетках, требует того, чтобы иссле- дования были продолжены. Особенно мы нуждаемся в прояснении того, посредством каких комплексов эти ферменты могли бы кооперироваться и с помо- щью каких механизмов они нацеливаются на промо- торы генов. Несколько последних исследований по- казывают, что для такого рекрутирования ключевыми являются комплексы транскрипционной репрессии (Di Croce et al., 2002; Fuks et al., 2003: Brenner et al., 2005) Каковы бы ни были эти механизмы, следует помнить, что в эксперименте DNMTs млекопитаю- щих обладают сложными функциями, включающими не только каталитическую активность, связанную с карбокситерминальными участками в отношении ме- тилирования ДНК, но и активность, непосредственно связанную с транскрипционной репрессией в амино- терминальных доменах (см. рис. 18.3) (Robertson et al., 2000; Rountree et al., 2000; Fuks et al., 2001). Эти фермен- ты также могут связываться с ключевыми медиаторами транскрипционной репрессии, в том числе с HDAC и с белками, связывающимися с метилцитозином (MBDs), и потенциально рекрутировать их. Таким образом, роль DNMT в транскрипционном сайленсинге потенциаль- но имеет много граней (от инициации до поддержива- ния), которые могут включать этапы метилирования ДНК, а могут и не включать их. Сайленсинг генов при раке поможет рассортировать эти возможности. 7. Резюме главных результатов исследований по осмыслению эпигенетического сайленсинга генов при раке Приведенное выше обсуждение показывает, что мы узнали довольно много относительно молекулярных событий, которые лежат в основе появления метилиро- ванной ДНК промотора, а также генного сайленсинга в процессе развития опухоли, но едва ли не больше явле- ний еще требует прояснения. В табл. 24.5 суммированы как минимум некоторые наиболее важные вопросы, которые должны быть решены в будущих исследованиях. Во-первых, должны быть прояснены молекулярные со- бытия, определяющие одновременное появление общего гипометилирования ДНК и более локализованное гипер- метилирование ДНК промотора. Эти перекрывающиеся состояния предполагают масштабные ошибки в наце- ливании хроматина (мистаргетинг) в раковых клетках. Этиология этого явления должна послужить разъясне- нию того, как клетки млекопитающих укладывают свои геномы для создания соответствующих паттернов генной экспрессии и для поддержания целостности хромосом. Во-вторых, необходимо обрисовать детерминанты границ хроматина вокруг промоторов индивидуальных генов и их корреляцию как с нормальным, так и с ано- мальным состоянием транскрипции. Сами ли белки- инсуляторы, вовлеченные в защиту активных в норме генов от вторжения транскрипционно-репрессивного хроматина, и(или) модификации гистонов, устанавли- вают границы? Как могли бы эти детерминанты границ изменяться в процессе развития опухоли? В-третьих, каков порядок событий для появления аномального генного сайленсинга в раковых клетках? Требуется ли начальная даун-регуляция транскрипции гена? Пред- шествуют ли таргетному метилированию ДНК ключевые модификации хроматина, в том числе деацетилирование и метилирование гистоновых аминокислот и рекрутиро- вание ферментов, которые служат связующим звеном в этом процессе (см. главу 10)? Если да, то каковы мо- лекулярные взаимодействия, лежащие в основе такого таргетинга, и какую роль играют ключевые комплексы сайленсинга (такие как белки группы Polycomb, — см. главу 11), важные для нормальных и раковых стволовых клеток. В-четвертых, какие именно DNMT требуются для инициации и поддержания аномального метилиро- вания ДНК промотора при раке, и как они взаимодей- ствуют? Какой из компонентов хроматина, описанных выше, может взаимодействовать с этими ферментами и направлять их? Наконец, если аномальный генный сайленсинг уже установился при раке, какова точная иерархия молекулярных этапов, которые поддерживают его? Этот последний вопрос является не только ключе- вым фундаментальным вопросом, но и центральным в плане использования в медицине (что будет обсуждено далее) для реверсии аномального генного сайленсинга при профилактике и лечении рака.
9. Эпигенетическая терапия 8. Выявление рака посредством метилирования ДНК Тот факт, что локальное гиперметилирование островков CpG является таким обычным в раковых клетках, в соче- тании с возможностью определять метилирование с вы- сокой степенью чувствительности, привело к развитию нескольких подходов по определению рака с использова- нием жидкостей организма. Приобретенные изменения в метилировании островков CpG могут быть определены на фоне, характерном для нормальных клеток, после кон- версии цитозинов в урацилы, при том, что 5-метилцито- зин в ДНК, обработанной бисульфитом натрия остается интактным. Очень чувствительными являются методы ПЦР, например ПЦР, специфическая к метилированию (MSP-methylation-specific PCR), при которой праймеры сконструированы так, чтобы амплифицировать только метилированные участки. Другие методы включают способы, основанные на ПЦР в реальном времени, такие как «MethyLight», где флуоресцентный зонд, который может связываться только с метилированной ДНК, ис- пользуется для выявления паттернов метилирования (как показано на левом рисунка титульной страницы, где на оси Y — гены, а на оси X — типы опухолей). Эти методики могут выявлять одну метилированную аллель на фоне примерно 1,000-10,000 аллелей. Таким образом, приобретение аномального паттерна метилирования может быть легко определено; эти подходы применимы к смесям клеток или даже к разным биологическим жидко- стям, таким как плазма крови, моча или мокрота (Laird, 2003). Диагностика рака посредством идентификации измененного метилирования цитозина довольно надеж- ная из-за свойственной ДНК стабильности, в отличие от РНК и белков. Кроме того, из-за того что измененные паттерны метилирования часто канцеро-специфичны, эти методы могут быть способны отличить один тип рака от другого. Сейчас имеется целый ряд исследований, как было упомянуто выше, обеспечивающих «proof of principle» для многообещающего использования гипер- метилированных последовательностей ДНК промотора как исключительно чувствительной стратегии для пред- сказания риска раковых заболеваний или выявления их. Окончательное доказательство того, насколько ценным этот подход окажется для клиники, дожидается более ши- роких исследований, в которых будет дана полная оценка современных гипотез. Такие исследования безусловно будут проведены в ближайшие несколько лет. 9. Эпигенетическая терапия Наследуемая инактивация генов, имеющих отношение к раку, при помощи измененного метилирования ДНК и модификации хроматина привела к осознанию того, что сайленсированный хроматин может представлять собой жизнеспособную мишень для терапии. Таким образом, был разработан новый терапевтический поход под названием «эпигенетическая терапия», при котором лекарственные препараты, способные модифицировать хроматин или паттерны метилирования ДНК. исполь- зуются либо по одному, либо в комбинации (рис. 24.7), чтобы повлиять на терапевтический результат (Egger et al., 2004). Аналоги нуклеозидов, 5-азацитидин, 5-аза-2’- дезоксицитидин, и зебуларин, являются мощными, основанными на известных механизмах (mechanism- based) ингибиторами метилирования цитозина ДНК (рис. 24.7а). Эти препараты включаются в ДНК деля- щихся клеток после того, как в ходе метаболизма они превращаются в соответствующие дезоксинуклеозид- трифосфаты. Будучи включены в ДНК, они взаимо- действуют со всеми тремя известными метилтрансфе- разами ДНК и образуют ковалентные промежуточные продукты, которые в конечном счете ингибируют мети- лирование ДНК в последующих раундах синтеза ДНК. Механизм действия этих веществ вполне понятен и их использовали в течение некоторого времени, чтобы ре- активировать «молчащие» гены в культуре ткани или в моделях с ксенотрансплантациями (xenograft). Однако недавно они нашли применение при лечении некото- рых гематологических злокачественных заболеваний, в частности, миелоидного диспластического синдрома (MDS), который является предлейкемическим состоя- нием, возникающим, в основном, у пожилых пациентов (Lubbert, 2000; Wijermans et al., 2000; Silverman et al., 2002; Issa et al., 2004). Клинические реакции для пациентов с таким нарушением и с лейкемиями, которые могут раз- виться из предлейкемического состояния, становятся все более драматичными. Соответственно, лекарства на основе 5-азацитидина и 5-аза-2’-деоксицитидина (их клинические названия — Видаза (Vidaza) и Децитабин (Decitabine), соответственно) сейчас одобрены Ameri- can Food and Drug Administration (FDA) для лечения пациентов с данными нарушениями. Зебуларин (Zebu- larine), который также является основанным на извест- ных механизмах (mechanism-based) ингибитором ДНК- метилтрансфераз, находится на более ранней стадии клинической разработки. К настоящему моменту не обнаружены эффективные ингибиторы, не требующие включения в ДНК, но для клинических целей они мог- ли бы быть более желательны, так как могли бы давать меньше побочных эффектов. Сейчас предпринимаются многочисленные попытки синтезировать и (или) обна- ружить такие препараты. Хотя было показано, что Видаза и Децитабин клини- чески эффективны, оказалось труднее четко установить, что мишенями действия этих лекарств являются про- моторы метилированных генов. Предварительные экс- перименты позволили предположить, что ген-супрессор опухоли, р 15, становится деметилированным после лече- ния Децитабином (Daskalakis et al., 2002); однако, оста- ется показать, действуют ли эти препараты, индуцируя экспрессию гена, или по какому-нибудь другому меха- низму. Клинические испытания проходят также с использо- ванием HDACs (рис. 24.76). Известно несколько препа- ратов, способных вызывать существенное ингибирование HDACs. Некоторые из них, такие как фенилбутановая кислота или вальпроевая кислота, в течение некоторого времени использовались для лечения других заболеваний
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях Вещество Структура Тип рака Клинические испытания ИНГИБИТОРЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК 5-азацитидин 5-аза-СЯ «Видаза» h к нск л— он он 1На А 1 MDS; злокачествен- ные болезни крови 1, II, и III; одобрено FDA (food and drug administration) для MDS (МДС) 5-аза-2'-дезоксицитидин Б-аза-CdR «Дакоген» I ( но. ну и | f i ОН н QH н MDS; злокачествен- ные болезни крови 1, II, и III «Зебуларин» 1 -p-D-рибофуранозил- 2(1 Н)-пиримидинон ( иск Н | I » .он он А 4 N/A Доклинические ИНГИБИТОРЫ ГИСТОНОВЫХ ДЕАЦЕТИЛАЗ 4-фен и л бутират (РВА) .jj ° Солидные опухоли 1 Субероиланилидгидро- ксамовая кислота (САГА) о Н I Солидные опухоли и злокачественные болезни крови 1, II NVP-LAQ824 ОН N/A 1 Депсипептид FK-228 FR901228 'V'Vv Развитые неоплазмы и Т-клеточные лимфомы 1, И MS-275 А'А,5 Компактные опухоли и лимфома 1, И Рис. 24/7. Структуры аналогов нуклеозидов — ингибиторов метилирования ДНК (а) и ингибиторов деацетилирования гистонов (б) (а) Известно три нуклеозидных аналога, которые могут ингибировать метилирование ДНК после включения в ДНК 5-аза-цитидин (Видаза) и 5-аза-2’-дезоксицитидин (Децитабин) одобрены для лечения лейкемии. Зебуларин находится на более ранней стадии разработки; (б) несколько примеров многих ингибиторов гистоновых деацетилаз, некоторые из них в настоящее время находятся на стадии клинических испытаний (Marks et al., 2001; Richon and O’Brien, 2002). Эти препа- раты ингибируют все деацетилазы, и неясно, связана ли их эффективность в лечении определенных форм зло- качественных заболеваний именно с ингибированием деацетилирования гистонов, а не с какой-либо другой реакцией. Более новые соединения, такие как субероила- нилидгидроксамовая кислота (SAHA) и депсипептид, яв- ляются более специфичными ингибиторами гистоновых деацетилаз и показывают хорошие клинические результа- ты (рис. 24.8). Однако, опять же, трудно быть уверенным в том, что эти лекарства действуют на пациентов только в соответствии с теоретическими механизмами. Новейшие клинические испытания, основанные на взаимодействии хроматина с метилированием ДНК, обсуждавшемся в предыдущих разделах (Cam- eron et al., 1999; Suzuki et al., 2002), сфокусированы на комбинировании ингибиторов метилирования ДНК и ингибиторов HDACs, в попытке использовать более низкие дозы препаратов обоих классов, но по- лучить при этом сильный синергистический эффект. Несколько интригующих клинических испытаний проводятся в настоящее время для проверки данных гипотез, однако все еще не ясно, будут ли работать эти подходы.
Рис. 24.8. Ингибиторы деаиетилаз гистонов могут вызывать регрессию опухоли Компьютерные томограммы (СТ) пациента с мезотелиомой (левый снимок) Перед лечением в правом легком наблюдалась боль- шая плоская белая масса, сжимавшая аэрируемую черную часть легкого (см. стрелку). (Правый снимок) Спустя 4 месяца после лечения препаратом SAHA; наблюдается сморщивание опухоли и гораздо более расправленное правое легкое (снимки любезно предоставлены Др Полом Марксом — Paul Marks, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NY.) Хотя метод эпигенетической терапии имеет хорошую теоретическую базу отсутствие специфичности в действии некоторых агентов дает повод для беспокойства. Напри- мер, аналоги нуклеозидов являются неспецифическими ингибиторами ДНК-метилтрансфераз и ингибируют мети- лирование ДНК во всем геноме. Поэтому существует воз- можность непреднамеренной реактивации генов в резуль- тате такой терапии, хотя это не представляется проблемой для тех пациентов с серьезными заболеваниями, которые уже были пролечены. Точно так же, есть несколько допол- нительных модификаций хроматина помимо деацетилиро- вания, такие как метилирование ключевых аминокислот гистонов, о которых говорилось в предыдущих главах, ко- торые потенциально могут быть мишенями для терапии. Существует, следовательно, значительная заинтересован- ность в поиске новых мишеней для терапии с целью акти- вировать «молчащие» гены, и в ближайшие годы ожидают- ся волнующие результаты на этом поприще. Литература Amann J.M., Nip J., Strom D.K., Lutterbach В., Harada H., Lenny N., Downing J.R., Meyers S., and Hiebert S.W., 2001. ETO, a target of t(8 ;21) in acute leukemia, makes distinct contacts with multiple histone deacetylases and binds mSin3A through its oligomerization domain. Mol. Cell. Biol. 21: 6470-6483. Baylin S.B., Fearon E.R., Vogelstein B., de Bustros A., Sharkis S.J., Burke P.J., Staal S.P., and Nelkin B.D., 1987. Hypermethylation of the 5' region of the calcitonin gene is a property of human lymphoid and acute myeloid malignancies. Blood 70: 412-417. Belinsky S.A., Nikula K.J., Palmisano W.A., Michels R., Sacco- manno G., Gabrielson E., Baylin S.B., and Herman J.G., 1998. Aberrant methylation of pl6INK4a is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 11891-11896. Brenner C., Deplus R., Didelot C., Loriot A., Vire E., De Smet C., Gutierrez A., Danovi D., Bernard D., Boon T, et al., 2005. Мус represses transcription through recruitment of DNA methyltrans- ferase compressor. EMBO J. 24. 336-346. Burbee D.G., Forgacs E., Zochbauer-Muller S., Shivakumar L., Fong K., Gao B., Randle D., Kondo M., Virmani A., Bader S., et al., 2001. Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression./. Natl. Cancer Inst. 93: 691-699. Cameron E.E., Bachman K.E., Myohanen S., Herman J.G., and Baylin S.B., 1999. Synergy of demethylation and histone deacety- lase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nat. Genet. 21: 103-107. Chen CM., ChenH.L., HsiauT.H., HsiauA.H., ShiH„ Brock G.J., Wei S.H., Caldwell C.W., Yan P.S., and Huang TH., 2003. Methy- lation target array for rapid analysis of CpG island hypermethyla- tion in multiple tissue genomes. Am. J. Pathol. 163: 37-45. Chen W, Cooper T.K., Zahnow C.A., Overholtzer M., Zhao Z., Ladanyi M., Karp J.E., Gokgoz N., Wunder J.S., Andrulis I.L., et al., 2004. Epigenetic and genetic loss of Hid function accentuates the role ofp53 in tumorigenesis. Cancer Cell 6: 387—398. Chen WY, Wang D.H., Yen R.C., Luo J., Gu W, and Baylin S.B., 2005. Tumor suppressor HIC1 directly regulates S1RT1 to modulate p53- dependent DNA-damage responses. Cell 123:437-448. Chen WY, Zeng X., Carter M.G.. Morrell C.N.. Chiu Yen R.W, Esteller M., Watkins D.N., Herman J.G., Mankowski J.L., and Baylin S.B., 2003. Heterozygous disruption of Hie /predisposes mice to a gender-dependent spectrum of malignant tumors. Nat. Genet. 33:, 197-202. Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S., and Pfeifer G.P., 2000. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat. Genet. 25: 315-319. Daskalakis M., Nguyen TT, Nguyen C., Guldbeig P, Kohler G., Wijermans P., Jones P.A., and Lubbert M., 2002. Demethylation of a hypermethylated P15/INK4B gene in patients with my- elodysplastic syndrome by 5-Aza-2’-deoxycytidine (decitabine) treatment. Blood 100: 2957-2964. Di Croce L., Raker V.A., Corsaro M., Fazi E, Fanelli M., Faretta M., Fuks E, Lo Coco E, Kouzarides T, Nervi C., et al., 2002. Methyl-transferase recruitment and DNA hypermethylation of target promoters by an oncogenic transcription factor. Science 295: 1079-1082.
Глава 24. Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях Egger G., Liang G., Aparicio A., and Jones P.A., 2004. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457-463. Ehrlich M., Gama-Sosa M.A., Huang L.H., Midgett R.M., Kuo K.C., McCune R.A., and Gehrke C., 1982. Amount and distri- bution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10: 2709-2721. Esteller M., Risques R.A., Toyota M., Capella G., Moreno V, Peinado M.A., Baylin S.B., and Herman J.G., 2001a. Promoter hypermethylation of the DNA repair gene O(6)-methylguanine- DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumori- genesis. Cancer Res. 61: 4689-4692. EstellerM., Fraga M.F., Guo M., Garcia-Foncillas J., Hedenfalkl., Godwin A.K., Trojan J., Vaurs-Barriere C., Bignon Y.J., Ramus S., et al., 2001b. DNA methylation patterns in hereditary hu- man cancers mimic sporadic tumorigenesis. Hum. Mol. Genet. 10: 3001-3007. Fahmer J.A., Eguchi S., Herman J.G., and Baylin S.B., 2002. Depen- dence of histone modifications and gene expression on DNA hypermethylation in cancer. Cancer Res. 62: 7213-7218. Feinberg A.P. and Vogelstein B., 1983. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 301: 89-92. Feinberg A.P, Gehrke C.W., Kuo K.C., and Ehrlich M., 1988. Reduced genomic 5-methylcytosine content in human colonic neoplasia. Cancer Res. 48: 1159-1161. Finch P.W., He X.. Kelley MJ., Uren A.. Schaudies R.P., Popescu N.C., RudikoffS., Aaronson S.A., Varmus H.E., and Rubin J.S., 1997. Purification and molecular cloning of a secreted, Frizzled-related antagonist of Wnt action. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 6770-6775. Flatau E., Bogenmann E., and Jones P.A., 1983. Variable 5-methylcy- tosine levels in human tumor cell lines and fresh pediatric tumor explants. Cancer Res. 43: 4901-4905. Frost P, Liteplo R.G., Donaghue TP, and Kerbel R.S., 1984. Selec- tion of strongly immunogenic “turn” variants from tumors at high frequency using 5-azacytidine. J. Exp. Med. 159: 1491-1501. Fuks E., Hurd P.J., Deplus R., and Kouzarides T, 2003. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res. 31: 2305-2312. Fuks E., Burgers W. A., Godin N., Kasai M., and Kouzarides T, 2001. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription. EMBO J., 20: 2536-2544. Gaudet E., Hodgson J.G., Eden A., Jackson-Grusby L., Dausman J., GrayJ.W, Leonhardt H., and Jaenisch R., 2003. Induction of tumors in mice by genomic hypomethylation. Science 300:489-492. Gazzoli L, Loda M., Garber J., Syngal S., and Kolodner R.D., 2002. A hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma case as- sociated with hypermethylation of the MLH1 gene in normal tissue and loss of heterozygosity of the unmethylated allele in the resulting microsatellite instability-high tumor. Cancer Res. 62: 3925-3928. Grady W.M., Willis J., Guilford P.J., Dunbier A.K., Toro T.T., Lynch H., Wiesner G., Ferguson K., Eng C, Park J.G., et al., 2000. Methylation of the CDH1 promoter as the second genetic hit in hereditary diffuse gastric cancer. Nat. Genet. 26: 16-17. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., and Harris C.C., 1994. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clues to cancer eti- ology and molecular pathogenesis. Cancer Res. 54: 4855-4878. Gregorieff A. and Clevers H., 2005. Wnt signaling in the intestinal epi- thelium: From endoderm to cancer. Genes Dev., 19: 877-890. Hanahan D. and Weinberg R.A., 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70. Herman J.G. and Baylin S.B., 2003. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N. Engl. J. Med. 349:, 2042-2054. Herman J.G., Umar A., Polyak K., Graff J.R., Ahuja N., Issa J.P., Markowitz S., Willson J.K., Hamilton S.R., Kinzler K.W, et al., 1998. Incidence and functional consequences of hMLHl promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci 95: 6870-6875. Holm T.M., Jackson-Grusby L., Brambrink T, Yamada Y, Rideout W.M., III, and Jaenisch R., 2005. Global loss of imprinting leads to widespread tumorigenesis in adult mice. Cancer Cell 8: 275-285. Holst C.R., Nuovo GJ., EstellerM., Chew K., Baylin S.B., Herman J.G., and Tlsty T. D., 2003. Methylation ofpl6INK4a promoters oc- curs in vivo in histologically normal human mammary epithelia. Cancer Res. 63: 1596-1601. Howitz K.T., Bitterman K.J., Cohen H.Y, Lamming D.W, Lavu S., Wood J.G., Zipkin R.E., Chung P, Kisielewski A., Zhang L.L., et al., 2003. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature 425:, 191-196. Issa J.P, Ottaviano Y.L., Celano P, Hamilton S.R., Davidson N.E., and Baylin S.B., 1994. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon Nat. Genet. 7:536-540. Issa J.P, Garcia-Manero G., Giles F.J., Mannari R., Thomas D., Faderl S., Bayar E., Lyons J., Rosenfeld C.S., Cortes J., and Kantaqian H.M. 2004. Phase 1 study of low-dose prolonged exposure schedules of the hypomethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (decitabine) in hematopoietic malignancies. Blood 103: 1635-1640. Jones P.A., 1999. The DNA methylation paradox. Trends Genet. 15: 34-37. Jones PA. and Baylin S.B., 2002. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat. Rev. Genet. 3: 415-428. Jones P.A. and Laird P.W, 1999. Cancer epigenetics comes of age. Nat. Genet. 21: 163-167. Jones P.A. and Taylor S.M., 1980. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell, 20: 85-93. Kaminskas E., Farrell A., Abraham S., Baird A., Hsieh L.S., Lee S.- L., Leighton J.K., Patel H., Rahman A., Sridhara R., et al., 2005. Approval summary: Azacitidine for treatment of myelodysplastic syndrome subtypes. Clin. Cancer Res. 11: 3604-3608. Kaneda A. and Feinberg A.P., 2005. Loss of imprinting of IGF2: A common epigenetic modifier of intestinal tumor risk. Cancer Res. 65: 11236-11240. Katzenellenbogen R.A., Baylin S.B., and Herman J.G., 1999. Hypermethylation of the DAP-kinase CpG island is a common alteration in В-cell malignancies. Blood 93:4347-4353. Kinzler K.W. and Vogelstein B., 1997. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature 386: 761-763. Kiyono T, Foster S.A., Koop J.I., McDougall J.K., Galloway D.A., and Klingelhutz A.J., 1998. Both Rb/pl6INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. Nature 396: 84-88. Knudson A.G., 2001. Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat. Rev. Cancer 1: 157-162.
Kondo Y., Shen L., and Issa J.R, 2003. Critical role ofhistone methy- lation in tumor suppressor gene silencing in colorectal cancer. Mol. Cell. Biol. 23:, 206-215. Kuzmichev A., Margueron R., Vaquero A., PreissnerTS., Scher M., KirmizisA., OuyangX., BrockdorffN., Abate-Shen C., Farnham P., and Reinberg D., 2005. Composition and histone substrates of polycomb repressive group complexes change during cellular differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 1859-1864. Laird P.W., 2003. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat. Rev. Cancer 3: 253-266. Laird P.W, Jackson-Grusby L., Fazeli A., Dickinson S.L., Jung W.E., Li E., Weinberg R.A., and Jaenisch R., 1995. Suppression of in- testinal neoplasia by DNA hypomethylation. Cell 81:, 197-205. Lapeyre J.N. and Becker F.F., 1979. 5-Methylcytosine content of nuclear DNA during chemical hepatocarcinogenesis and in carcinomas which result. Biochem. Biophys. Res. Commun. 87: 698-705. Lee W.H., Morton R.A., Epstein J.I., Brooks J.D., Campbell P.A., Bova G.S., Hsieh W.S., Isaacs W.B., and Nelson W.G., 1994. Cytidine methylation of regulatory sequences near the о-class glutathione S-transferase gene accompanies human prostatic carcinogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11733-11737. Leu Y.W., Rahmatpanah E, Shi H., Wei S.H., Liu J.C., Yan P.S., and Huang TH., 2003. Double RNA interference of DNMT3b and DNMT1 enhances DNA demethylation and gene reactivation. Cancer Res. 63:6110-6115. Li E., Bestor TH., and Jaenisch R., 1992. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69:915-926. Liu B., Nicolaides N.C., Markowitz S., Willson J.K., Parsons R.E., Jen J., Papadopolous N., Peltomaki P, de la Chapelle A., Hamilton S.R., et al., 1995. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat. Genet. 9: 48-55. Lubbert M., 2000. DNA methylation inhibitors in the treatment of leukemias, myelodysplastic syndromes and hemoglobinopathies: Clinical results and possible mechanisms of action. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 249: 135-164. Marks P, Rifkind R.A., Richon V.M., Breslow R., Miller T, and Kelly WK., 2001. Histone deacetylases and cancer: Causes and therapies. Nat. Rev. Cancer 1:, 194-202 Mizuno K., Osada H., Konishi H., Tatematsu Y, Yatabe Y. Mitsu- domi T, Fujii Y, and Takahashi T, 2002. Aberrant hypermethy- lation of the CHFR prophase checkpoint gene in human lung cancers. Oncogene 21: 2328-2333. Morin P.J., Sparks A.B., KorinekV., Barker N., Clevers H., Vogelstein B., and Kinzler K.W, 1997. Activation of p-catenin-Tcf signal- ing in colon cancer by mutations in p-catenin or APC Science 275: 1787-1790. Narayan A., Ji W, Zhang X.Y., Marrogi A., Graff J.R., Baylin S.B., and Ehrlich M., 1998. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int. J. Cancer 77: 833-838. Nemoto S., Fergusson M.M., and Finkel T, 2004. Nutrient avail- ability regulates SIRT1 through a forkhead-dependent pathway. Science 306:2105-2108. Nguyen C.T., Gonzales F.A., and Jones P.A., 2001. Altered chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: Correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation Nucleic Acids Res. 29: 4598-4606. Pfeifer G.P., Tang M., and Denissenko M.F., 2000. Mutation hotspots and DNA methylation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 249:1-19. Rainier S., Johnson L.A., Dobry C.J., Ping A.J., Grundy P.E., and Feinberg A.P., 1993. Relaxation of imprinted genes in human cancer. Nature 362: 747-749. Rhee L, Bachman K.E., Park B.H., Jair K.W, Yen R.W., Schuebel K.E., Cui H., Feinberg A.P, Lengauer C., Kinzler K.W, et al., 2002. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in hu- man cancer cells. Nature 416: 552-556. Rhee L, Jair K.W., Yen R.W, Lengauer C., Herman J.G., Kinzler K.W., Vogelstein B., Baylin S.B., and Schuebel K.E., 2000. CpG methylation is mamtained in human cancer cells lacking DNMTL Nature 404: 1003-1007. Richon V.M. and O’Brien J.P, 2002. Histone deacetylase inhibitors: A new class of potential therapeutic agents for cancer treatment. Clin. Cancer Res. 8: 662-664. Rideout W.M., III, Coetzee G.A., Olumi A.F., and Jones P.A., 1990. 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen in the human LDL receptor and p53 genes. Science 249: 1288-1290. Robertson K.D., Ait-Si-Ali S., Yokochi T, Wade P.A., Jones P.L., and Wolffe A.P., 2000. DNMT1 forms a complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters. Nat. Genet. 25: 338-342. Romanov S.R., Kozakiewicz B.K., Hoist C.R., Stampfer M.R., Haupt L.M., and Tlsty T.D., 2001. Normal human mammary epithelial cells spontaneously escape senescence and acquire genomic changes. Nature 409: 633-637. Rountree M.R., Bachman K.E., and Baylin S.B., 2000. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a com- plex at replication foci. Nat. Genet. 25: 269-277. Sakai T, Toguchida J., Ohtani N., Yandell D.W, Rapaport J.M., and Dryja T.P., 1991. Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Am. J. Hum. Genet. 48: 880-888. Sakatani T, Kaneda A., lacobuzio-Donahue C.A., Carter M.G., de Boom Witzel S., Okano H., Ko M.S., Ohlsson R., Longo D.L., and Feinberg A.P., 2005. Loss of imprinting of Igf2 alters intestinal maturation and tumorigenesis in mice. Science 307:, 1976-1978. Silverman L.R., Demakos E.P., Peterson B.L., Komblith A.B., Hol- land J.C., Odchimar-Reissig R., Stone R.M., Nelson D., Powell B.L., DeCastro CM., et al., 2002. Randomized controlled trial of azacitidine in patients with the myelodysplastic syndrome: A study of the cancer and leukemia group B. J. Clin. Oncol., 20: 2429-2440. Srinivasan P.R. and Borek E., 1964. Enzymatic alteration of nucleic acid structure. Science 145: 548-553. Suzuki H., Gabrielson E., Chen W, Anbazhagan R., van Engeland M., Weijenberg M.P., Herman J.G., and Baylin S.B., 2002. A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer. Nat. Genet. 31: 141-149. Suzuki H., Watkins D.N., Jair K.W., Schuebel K.E., Markowitz S.D., Chen W.D., Pretlow T.P., Yang B., Akiyama Y, Van Engeland M., et al., 2004. Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer. Nat. Genet. 36: 417-422. Toyota M., Ho C., Ahuja N., Jair K.W, Li Q., Ohe-Toyota M., Baylin S.B., and Issa J.P., 1999. Identification of differentially
Глава 24 Эпигенетические детерминанты при раковых заболеваниях methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res. 59: 2307-2312. Ushijima T, 2005. Detection and interpretation of altered methyla- tion patterns in cancer cells. Nat. Rev. Cancer 5: 223-231. Veigl M.L., Kasturi L., Olechnowicz J., MaA.H., LutterbaughJ.D., Periyasamy S., Li G.M., Drummond J., Modnch P.L., Sedwick W.D., and Markowitz S.D., 1998. Biallelic inactivation ofhMLHl by epigenetic gene silencing, a novel mechanism causing human MSI cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 8698-8702. Wales M.M., Biel M.A., el Deiry W., Nelkin B.D., Issa J.P., Cavenee W.K., Kuerbitz S.J., and Baylin S.B., 1995. p53 activates ex- pression of HIC-1, a new candidate tumour suppressor gene on 17pl3.3. Nat. Med. 1: 570-577. Wijermans P, Lubbert M., Verhoef G., Bosly A., Ravoet C, Andre M., and Ferrant A., 2000. Low-dose 5-aza-2’-deoxycytidine, a DNA hypomethylating agent, for the treatment of high-risk myelodys-plastic syndrome: A multicenter phase II study in elderly patients. J. Clin. Oncol. 18: 956-962. Wolf P, Hu Y.C., Dofiek K., Sidransky D., and Ahrendt S.A., 2001. O-methylguanine-DNA methyltransferase promoter hyperm- ethylation shifts the p53 mutational spectrum in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 61: 8113-8117. Wolffe A.P., 2001. Chromatin remodeling: Why it is important in cancer. Oncogene, 20: 2988-2990. Yamashita K., Upadhyay S., Osada M., Hoque M.O., Xiao Y., Mori M., Sato R., Meltzer S. J., and Sidransky D., 2002. Pharmacologic unmasking of epigenetically silenced tumor suppressor genes in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Cell 2:485-495.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 WWW-РЕСУРСЫ Web-сайты, имеющие отношение к хроматину и эпигенетике Chromatin Structure and Function Страница ресурсов по хроматину Джима Боуна http://www. chromatin, us Epigenome Network of Excellence Web-сайт Европейской междисциплинарной сети иссле- дований по эпигенетике http://www. epigenome-noe. net HEP Исследовательский консорциум по проекту «Эпигеном человека» http://www. epigenome, org/ ENCODE Энциклопедия элементов ДНК: идентификация функ- циональных элементов у человека http://www.gen0me.gov/12513456 ChromDB База данных по хроматину растений http://www. chromdb. org/ Ресурсы по гистонам The NHGRI histone database Содержит информацию по последовательностям ги- стонов http://research.nhgn. nih.gov/histones/ Abeam histone page Содержит загрузки карт модификаций гистонов http://www.abcam.com/chromatin Histone.com page (Upstate) Карта модификаций гистонов, созданная Upstate http://www.histone.com/modification_map htm Белки хроматина NPD-Nuclear Protein Da- tabase Коллекция известных белков позвоночных, локали- зованных в ядре http://npd. hgu. mrc. ac. uk/index. html Chromatin proteins Линк с исследованиями on the NPD site ограничен- ными семействами белков хроматина http://www. epigenome-noe. net/ researchtools/ structure.php Flybase chromatin page Покрывает Polycomb, trithorax и другие белки хрома- тина у Drosophila http://flybase. bio. indiana. edu/allied-data/lk interactive-fly/aignfam/polycomb.htm Метилирование ДНК MethDB База данных по метилированию ДНК человека http://www. methdb. de/ DNA methylation society Web-сайт. посвященный аспектам биологического метилирования http://www. dnamethsoc. com/ CpG island searcher Алгоритм поиска последовательности островков CpG http://www. uscnorris.com/cpgislands2/ cpg.aspx Импринтинг Mouse genomic imprinting Хромосомные карты мыши, показывающие извест- ные импринтированные районы http://www. mgu. har. mrc. ac. uk/research/ imprinting/ Gene Imprint Информационные ресурсы WWW по геномному импринтингу http://www.geneimprint. сот/index, html Imprinted Gene Catalogue База данных по импринтированным генам http://igc. otago. ac. nz/home.html Candidate imprinted tran- scripts Ресурс предсказанного импринтированного транс- криптома человека и мыши http://fantom2.gsc.riken.go.jp/imprinting/ (продолжение на следующей странице)
RNA NONCODE База данных, посвященных некодирующим РНК http://www. bioinfo. org. cn/NONCODE RNAdb База данных по некодирующим РНК млекопитающих http://research. imb. uq. edu. au/madb Micro RNAdb База данных по микроРНК эукариот http://166.111.30.65/micromadb/ miRBase Ресурс данных по микроРНК http://microma.sangen ас. uk/ NARNA Платформа для поиска природных антисмысловых транскриптов http://www.nama.ncl. ас. uk/ ASRP Ресурс данных по малым siPHK и miPHK Arabidopsis thaliana http://asrp. cgrb. oregonstate. edu/ Коммерческие сайты ресурсов по эпигенетике Abeam Поставщики антител к гистонам http://www. abeam, сот/ Upstate Поставщики антител к гистонам http://www. upstatebiotech, сот/ Epigenomics Диагностический скрининг метилирования ДНК http://www. epigenomics, сот/ Ресурсы и базы данных по геномам организмов Все эукариоты NCBI Портал к сайтам по множественному геномному анализу и ссылкам s http://www. ncbi.nlm. nih.gov ENSEMBL Браузер по эукариотическим геномам http://www. ensembl. org UCSC Genome Bioinformatics Портал геномных последовательностей и ресурсов http://genome. ucsc. edu EBI Портал к различным ресурсам по компьютерному анализу генома и протеома http://www. ebi. ac. uk/services Sanger Institute Портал к ресурсам по последовательностям, биоинформатике и про- теомике http://www.sanger. ac. uk/ BCM Search Launcher Портал для поиска последовательностей и средств анализа http://searchlauncher. bcm. tmc. edu/ docs/ si_links. html zPicture Средства сравнительного анализа последовательностей http ’.//^picture.dcode.org iHOP Информация с гиперссылками по ресурсам белок — белок http://www. ihop-net. org/UniPub/iHOP/ Repeat Masker Алгоритм повторящихся последовательностей для идентификации по- вторяющихся последовательностей ДНК http‘.//repeatmasker, org Primer 3 Базирующаяся на Web программа конструирования праймеров http://frodo. wi.mit. edu/cgi-bin/primer3/ primer3.cgi Отдельные организмы S cerevisiae SGD — база данных по геному Saccharomyces http://www.yeastgenome. org ENSEMBL-портал анализа генома S. cerevisiae http://www. ensembl. org/Saccharomyces_ cerevisiae/ index.html S pombe Портал к сайтам по геномным последовательностям, родственным 5. pombe, и по их анализу http://www.sanger. ac. uk/Projects/S_pombe/ T. thermophila TGD — база данных по геному Tetrahymena http://www. ciliate. org/ Проект по секвенированию макронуклеарного генома Tetrahymena http://www.genome.gov/12512294 A. thaliana TAIR — ресурс информации по Arabidopsis GRAMENE — сравнительная геномика трав http://www. arabidopsis. org http://www.gramene. org/ Ресурс по геному риса http://www. tigr. org/tdb/e2kl/osa 1/
C elegans Портал к ресурсам по С. elegans http://www. wormbase, org/ ENSEMBL портал по анализу генома С. elegans http://www. ensembl. org/Caenorhabditis_ elegans/index. html Портал к сайтам по геномным последовательностям, родственным С elegans, и их анализу http://www.sanger. ac. uk/Projects/C_elegans/ Drosophila База данных по тупому Drosophila http://www.flybase.net ENSEMBL-портал геномного анализа/), melanogaster http://www. ensembl. org/Drosophda_ X. laevis Информационная база данных http://www.xenbase. org/ Мышь Информатика генома мыши http://www. informatics.jax. org Ресурс по штаммам мышей http://jaxmice.jax. org/index.html Проект Бейлора по геному мыши http://www. mouse-genome, bcm.tmc. edu/ ENSEMBL-pecypc по мыши http://www.ensembl.org/Mus_musculus/ index html Портал ресурсов по геному человека http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide human/ Человек ENSEMBL-портал ресурсов по геному человека http://www. ensembl. org/Homo_sapiens/ index.html GDB-база данных по геному человека http://www.gdb. org
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ И ЛИТЕРАТУРА HISTONE Н2А Сайт Модель Энзим Функция Ссылка K5ac Hs,Sc Tip60, p300/CBP,Hatl Активация транскрипции Yamamoto and Horikoshi, 1997; Kimura and Horikoshi, 1998; Veneault etaL, 1998 K9bio HCS-биотинидаза Зависимая от ацетилирования и метили- рования. Участвует в клеточной пролифе- рации, сайленсинге генов и в клеточном ответе на повреждение ДНК Stanley et al., 2001; Kothapalli et al., 2005b; Chew et al., 2006 K7ac Sc Hatl Esal Активация транскрипции Suka et al., 2001 K13bio HCS-биотинидаза Зависимая от ацетилирования и метилиро- вания. Участвует в клеточной пролифера- ции, сайленсинге генов и клеточном ответе на повреждение ДНК Stanley et al., 2001; Kothapalli et al., 2005b; Chew et al., 2006 K119ubl Dm. Hs dRing, RING IB Polycomb-сайленсинг Реакция на УФ-повреждение Wang et aL, 2004; Kapetanaki et al., 2006 S121ph Sc Mecl PIKK Ответ на повреждение ДНК. Теломерный сайленсинг Wyatt et aL, 2003; Harvey et aL, 2005 T125ph Sc Mecl PIKK Ответ на повреждение ДНК. Теломерный сайленсинг Wyatt et aL, 2003 K126bio Hs HCS-биотинидаза Зависимая от ацетилирования и метилиро- вания. Участвует в клеточной пролифера- ции, сайленсинге генов и клеточном ответе на повреждение ДНК Stanley et aL, 2001; Kothapalli et aL, 2005b, Chewet aL, 2006 K126su Sc Репрессия транскрипции Блокирует ацетилирование и убиквитини- рование гистонов Nathan et aL, 2006 K127bio Hs HCS-биотинидаза Зависимая от ацетилирования и метилиро- вания. Участвует в клеточной пролифера- ции, сайленсинге генов и клеточном ответе на повреждение ДНК Stanley et aL, 2001; Kothapalli et aL, 2005b; Chew et aL, 2006 S128ph Sc Med PIKK Ответ на повреждение ДНК. Теломерный сайленсинг Downs et aL, 2000; Redon et aL, 2003; Wyatt et aL, 2003; Downs et aL, 2004 K130bio Hs HCS-биотинидаза Зависимая от ацетилирования и метилиро- вания. Участвует в клеточной пролифера- ции, сайленсинге генов и клеточном ответе на повреждение ДНК Stanley et aL, 2001; Kothapalli et aL, 2005b; Chew et aL, 2006 Дополнительные модификации Н2А: Slph, К4ас, К13те, К15ас, К21ас, КЗбас, К74те, К75те, R77me, К95те, T120ph, карбонилирование Н2А (Pantazis and Bonner, 1981; Song et al., 2003; Alhara et aL, 2004).
Приложение 2. Модификации гистонов и литература Гистон Н2В Сайт Модель Энзим Функция Ссылка К5ас Hs Активация транскрипции Puerta et al., 1995; Galasinski et al., 2002 SlOph Sc Ste20 Апоптоз Ahn et al., 2005 S14ph Hs. Mm Mstl/krs2 киназа Апоптоз Соматическая гипермутация и рекомбинация с переключением классов Ajiro, 2000; Cheung et al., 2003; Odegard et al., 2005 K16su Sc Репрессия генов Nathan et al., 2006 K17su Sc Репрессия генов Nathan et al., 2006 S33ph Dm CTK Активация транскрипции Maile et al., 2004 K120ub Hs Прогрессия по клеточному циклу в сочетании с SAGA для транскрипционной активации по- средством метилирования НЗ, мейоз Robzyk et al., 2000; Sun and Allis, 2002; Kao et al., 2004 K123ub Sc Rad6(E2) Brel(E3)-ubl Теломерный сайленсинг путем снижения ме- тилирования гистонов по НЗК4 и НЗК79 Emre et al, 2005 Дополнительные модификации Н2В: E2am, K5me. K6su. K7su, KI lac, K12ac. K15ac. К16ас, К20ас. К23те, К24ас. S32ph, К43те, К85ас, R99me, К108ас, КПбас, кар- бонилирование Н2В, биотинилирование Н2В (Rouleau et al., 2004). Гистон НЗ Сайт Модель Энзим Функция Ссылка R2me Hs Mm CARMI -me2a Экспрессия генов Chen et al., 1999; Schurter et al., 2001 T3ph HsAt Haspin Центромерная функция митотическо- го веретена Polioudaki et al., 2004; Dai et al., 2005 K4me Sc Setl-me3 Сайленсинг rDNA, теломерный сай- ленсинг. Активация транскрипции Briggs et al., 2001; Roguev et al., 2001; Nagy et al., 2002; Bryk et al., 2002; Bernstein et al., 2002; Santos-Rosa et al., 2002 Tt Активация транскрипции Strahl et al. 1999 Hs SET7/Set9-mel Активация транскрипции H. Wang et al., 2001a; Nishioka et al., 2002a; Wilson et al., 2002; Zegerman et al., 2002 Ds Hs MLL MLL2 -me3 MLL3 Активация Trithorax Milne et al., 2002; Nakamura et al., 2002 Ds Hs Ashl-me2 Активация Trithorax Beisel et al., 2002; Sanchez-Eisner et al., 2006 Hs SMYD3-me3 Активация транскрипции Hamamoto et al., 2004 K9ac Mm Sc Meisetz-me3 SAGA Прогрессия мейотической профазы Активация транскрипции Hayashi et al., 2005 Grant et al., 1999 Hs SRC1 Коактиватор ядерного рецептора Spencer et al. 1 997; Schubeler et al., 2000: Vaquero et al., 2004 Dm Активация транскрипции Nowak et al., 2000 K9me Mm, Hs G9a-mel,me2 Активация транскрипции Имприн- тинг Tachibana et al., 2001, 2002; Ogawa et al., 2002; Xin et al., 2003 Dm Su(var)3-9-me2 Доминантный модификатор PEV Czermin et al., 2001; Schotta et al., 2002; Ebert et al., 2004 Mm Suv39hl-me3 Suv39h2-me3 Перипентрический гетерохроматин O’Carroll et al., 2000; Rea et al., 2000; Lachner et al., 2001; Peters et al., 2001 Hs SUV39Hl-me3 Rb-опосредованный сайленсинг Nielsen et al., 2001; Vandel et al., 2001 Sp Clr4-mel,me2 Сайленсинг центромеры и типа спа- ривания Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001
Сайт Модель Энзим Функция Ссылка Nc Dim5-me3 Метилирование ДНК Tamaru and Selker, 2001 At KRYPTONITE- me2 Метилирование ДНК Jackson et al., 2002, 2004 Hs EuHMTase 1 -mel, me2 Репрессия транскрипции Ogawa et al., 2002; Tachibana et al., 2005 Hs, Mm ESET-me2,me3 Репрессия транскрипции Schultz et al., 2002; Yang et al., 2002; Dodge et al., 2004; Wang et al., 2004 Dm, Hs Ashl-me2 Активация Trithorax Beisel et al., 2002 Hs RlZl-me2 Супрессия опухоли и ответ на жен- ские половые гормоны Kim et al., 2003; Carling et al., 2004 SlOph Sc Snfl Активация транскрипции Lo et al., 2001 Dm lil-l Транскрипционная ап-регуляция мужской Х-хромосомы Jin et al., 1999; Y. Wang et al., 2001 Hs Rsk2 Активация транскрипции немед- ленных ранних генов (в сочетании с ацетилированием НЗК14) Sassone-Corsi et al., 1999; Thomson et al. Mskl 1999; Cheung et al., 2000; Clayton et al. Msk2 2000 Hs IKKa Транскрипционная ап-регуляция Anest et al., 2003; Yamamoto et al, 2003 Sc, Ce Ipll/AuroraB Конденсация митотических хромосом Hendzel et al., 1997; Wei et al.. 1999: Hsu et al., 2000 An NIMA Конденсация митотических хромосом De Souza et al., 2000 Hs, Ce Fyn kinase UVB-индуцированный МАР- киназный путь He et al., 2005 Tllph Hs Dlk/ZIP Митоз-специфичное фосфорили- рование Preuss et al. 2003 K14ac Sc, Tt, Mm Gcn5 Активация транскрипции Brownell et al., 1996; Kuo et al., 1996 Hs, Dm TAF„230TAF„250 Активация транскрипции Mizzen et al., 1996 Hs p300 Активация транскрипции Schiltz et al., 1999 Hs PCAF Активация транскрипции Schiltz et al., 1999 Mm SRC1 Коактиватор ядерного рецептора Spencer et al., 1997 R17me Hs, Mm CARMI Активация транскрипции (в сочета- нии с ацетилированием H3K18/23) Chen et al., 1999; Schurter et al., 2001; Bauer et al., 2002; Daujat et al., 2002 K18ac Sc SAGA Ada Активация транскрипции Grant et al., 1999 Hs p300 Активация транскрипции Schiltz et al., 1999 Hs СВР Активация транскрипции (в сочета- нии с метилированием H3R17) Daujat et al., 2002 K23ac Sc SAGA Активация транскрипции Grant et al., 1999 Hs СВР Активация транскрипции (в сочета- нии с метилированием H3R17) Daujat et al., 2002 R26me Hs CARMI Сайт метилирования in vitro Chen et al., 1999; Schurter et al., 2001 K27me Hs. Dm E(z)/EZH2-me3 Polycomb-репрессия Инактивация Х-хромосомы ранних В-клеток Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Muller et al., 2002; Su et al., 2003 S28ph Hs Aurora-В Конденсация митотических хромосом Goto et al., 1999,2002 Hs MSK1 UVB-индуцированное фосфорили- рование Zhong et al., 2001 K36me Sc Set2-me2 Репрессия генов Strahl et al., 2002; Kizer et al., 2005 Nc Set2-me2 Активация транскрипции Adhvaryu et al., 2005 Sp Set2-me2 Элонгация транскрипции Morris et al., 2005 K79me Sc Hs Dot! /DOT! L-me2 Теломерный сайленсинг, пахитен- ный checkpoint Feng et al., 2002; Lacoste et al., 2002; Ng et al., 2002; van Leeuwen et al., 2002 Дополнительные модификации НЗ: K14me, К23те, К27ас, T32ph, К37те, К56те, К64те, К115ас, К118ас, К118те, К122ас, R128me (Hyland et al., 2005).
Приложение 2. Модификации гистонов и литература Гистон Н4 Сайт Модель Энзим Функция Ссылка Slph Hs, Sc Casein kinase II Реакция на повреждение ДНК Ruiz-Carrillo et al., 1975; Cheung et al., 2005; van Attikum and Gasser, 2005 R3me Hs Sc PRMT1 Активация транскрипции H.Wanget al., 2001 a,b K5ac It, Dm, Hs Hatl Откладка гистонов Sobelet al., 1995; Parthunetal., 1996; Taplicket al., 1998; Turner, 2000; Kruhlak et al., 2001 Sc Esal/NluA4 Прогрессия по клеточному циклу Smith et al., 1998; Allard et al., 1999; Clarke et al., 1999; Bird et al., 2002; Miranda et al., 2006 Hs, Mm ATF2 Сиквенс-специфичный TF Kawasaki et al., 2000a Hs p300 Активация транскрипции Turner and Fellows, 1989; Schiltz et al., 1999 K8ac Hs.Mm Y-ATF2 Исключен из Xi Сиквенс-специфичный транскрипци- онный фактор Jeppesen et al., 1993: Choy et al., 2001: Kruhlak et al., 2001; Kawasaki et al., 2000b Hs PCAF/p300 Активация транскрипции Turner and Fellows, 1989; Schiltz et al., 1999 К12ас Sc. Hs Hatl Исключен из Xi Откладка гистонов Turner and Fellows, 1989; Jeppesen et al., 1993; Kleffetal., 1995; Sobel et al., 1995; Parthunetal., 1996; Chang et al., 1997; Kruhlak et al., 2001 Sc NuA4 Прогрессия в митозе и в мейозе Choy et al., 2001 K12bio Hs HCS Биотинидаза Уменьшение реакции на двунитевые разрывы ДНК. Влияние на пролифера- цию клеток Stanley et al., 2001; Kothapalli et al., 2005a,b К16ас Mm Исключен из Xi Зависимое от клеточного цикла ацети- лирование leppesen et al., 1993; Taplick et al., 1998 Dm MOF Транскрипционная ап-регуляция муж- ской Х-хромосомы Akhtar and Becker, 2000; Hsu et al., 2000 Hs, Mm ATF2 Сиквенс-специфичный транскрипци- онный фактор Turner and Fellows, 1989; Kawasaki et al., 2000a; Turner, 2000; Kruhlak et al., 2001; Vacquero et al., 2004 К20те Mm, Dm Suv4-20hl -me2,me3 Suv4-20h2-me2,me3 Сайленсинг генов Schotta et al., 2004 Hs, Dm Pr-SET7/Set8-mel Транскрипционный сайленсинг, мито- тическая конденсация Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b; Rice et al., 2002 Dm Ashl-me2 Trithorax-активация в сочетании с ме- тилированием НЗК4 и НЗК9 Beisei et al., 2002 К59те Sc Формирование «молчащего» хрома- тина Zhang et al., 2003 Su Hs SUMO-1 SUMO-3 Репрессия транскрипции Shiio and Eisenman, 2003 Дополнительные модификации Н4: K12me, S47ph, K31ubl, К59те, К77ас, К79ас, К79те, K91ubl, R92me (Hyland et al., 2005). Гистон Н1 Сайт Модель Энзим Функция Ссылка E2arl Rn PARP-1 Участие в нейротрофной активности Ogata et al., 1980; Visochek et al., 2005 TIOph Hs Митоз-специфичная транскрипционная активация Н1Ь Chadee et al., 1995; Garcia et al., 2004; Sarg et al., 2006 E14arl Rn PARP-1 Участие в нейротрофной активности Ogata et al., 1980: Visochek et al., 2005 S17ph Hs Интерфаза-специфичная транскрипцион- ная активация Н1Ь Garcia et al., 2004; Chadee et al., 1995; Sarg et al., 2006 K26me Hs EZH2-me2 Опосредует связывание НР1 Kuzmichev et al., 2004; Daujat et al., 2005 S27ph Hs Блокирует связывание НР1 Garcia et al., 2004; Daujat et al., 2005
Сайт Модель Энзим Функция Ссылка T137ph Hs Митоз-специфичная транскрипционная активация Hlb Chadee et al., 1995; Garcia et al., 2004; Sarg et al., 2006 T154ph Hs Митоз-специфичная транскрипционная активация Hlb Chadee et al., 1995; Garcia et al., 2004; Sarg et al., 2006 S172ph Hs Интерфаза-спепифичная транскрипцион- ная активация Hlb Chadee et al., 1995; Garcia et al., 2004; Sarg et al., 2006 S188ph Hs Интерфаза-специфичная транскрипцион- ная активация Hlb Chadee et al., 1995; Garcia et al., 2004; Sarg et al., 2006 K213arl Rn PARP-1 Участие в нейротрофной активности Ogata et al., 1980; Visochek et al, 2005 Дополнительные модификации Hl: К26ас, El 14am, убиквитинирование Hl, карбонилирование Hl (Pham and Sauer, 2000: Rouleau et al., 2004). Гистон H2AX Сайт Модель Энзим Функция Ссылка S139ph Hs, Sc, Dm. XI ATM DNA-PK Репарация ДНК Связана с М-фазой Известна также как уН2АХ Rogakou et al., 1998,1999; Burma et al., 2001 ; Stiff et al., 2004; Ichijima et al., 2005; Mukherjee et al., 2006 Дополнительные модификации H2AX: T136ph. Гистон macroH2A Сайт Модель Энзим Функция Ссылка K17me Hs Chu et al., 2006 K115ubl Hs Ogawa et al., 2005; Chu et al., 2006 K122me Hs Chu et al., 2006 T128ph Hs Chu et al., 2006 K238me Hs Chu et al., 2006 Гистон НЗ.З Сайт Модель Энзим Функция Ссылка K4me Dm mel, me2, me3 Активация транскрипции McKittrick et al., 2004 K9me Dm mel,me2 Репрессия транскрипции McKittrick et al., 2004 K9ac Dm,Hs Активация транскрипции McKittrick et al., 2004; Hake and Allis, 2006 K14me Dm mel, me2 McKittrick et al., 2004 K14ac Dm,Hs Активация транскрипции McKittrick et al., 2004; Hake and Allis, 2006 K18ac Hs Активация транскрипции Hake and Allis, 2006 K23ac Hs Активация транскрипции Hake and Allis, 2006 K27me Dm mel, me2, me3 Репрессия транскрипции McKittrick et al., 2004 K36me Dm,Hs mel,me2,me3 Активация транскрипции McKittrick et al., 2004; Hake and Allis, 2006 K37me Dm mel, me2 McKittrick er al., 2004 K79me Dm,Hs mel,me2 Активация транскрипции McKittrick et al., 2004; Hake and Allis, 2006 S31ph Млекопи- тающие Митоз-спепифичное фосфорилирование Hake et al., 2005
Приложение 2. Модификации гистонов и литература CEN-НЗ/ CENP-A Сайт Модель Энзим Функция Ссылка S7ph Hs Митоз Zeitlin et al. 2001 Дополнительные модификации CENP-A: S17ph. Сокращения для модельных организмов: (An) Aspergillus nidulans, (At) Arabidopsis thaliana, (Ce) Caenorhabditis elegans, (Dm) Drosophila melanogaster, (Hs) Homo sapiens, (Mm) Mus musculus, (Nc) Neurospora crassa, (Rn) Rattus norvegicus, (Sc) Saccharomyces cerevisiae, (Sp) Schizosaccharomyces pombe, (Tt) Tetrahymena thermophila, (XI) Xenopus laevis. Модификации гистонов — по номенклатуре, предложенной Тернером (Turner, 2005). В таблицах перечисляются все известные модификации гистонов и известные энзимы с первичными ссылками (до мая, 2006 г.). Дополнительные модификации с пока еще неизвестными функциями перечислены под таблицами. Эти модификации взяты из разных источников: обзорных статей, информации от Abeam Cambridge, UK и Upstate Charlottesville, USA, а также из неопубликованных данных лаборатории Рейнберга (Reinberg) Эта таблица была составлена на основе оригинального варианта, взятого из (Lachner et al., 2003) и значительно расширенного Roop-sha Sengupta и Mario Richter (Лаборатория Jenuwein, IMP Vienna). Д-р Patrick Trojer (Лаборато- рия Reinberg, HHMI, New Jersey) проверил содержимое таблиц. Эта таблица была проверена и дополнена информацией, предоставленной д-ром Steven Gray (Dept, of Clinical Medicine, Institute of Molecular Medicine, St. James Hospital, Dublin). Литература Adhvaryu K.K., Morris S.A., Strahl B.D., and Selker E.U., 2005. Methylation ofhistone H3 lysine 36 is required for normal devel- opment in Neurospora crassa. Eukaryot. Cell 4: 1455-1464. Ahn S.H., Cheung W.L., Hsu J.Y, Diaz R.L., Smith M.M., and Allis C.D., 2005. Sterile, 20 kinase phosphorylates histone H2B at serine 10 during hydrogen peroxide-induced apoptosis in S. cerevisiae. Cell 120: 25-36. Aihara H., Nakagawa T, Yasui K., Ohta T, Hirose S., Dhomae N., Takio K., Kaneko M., Takeshima Y, Muramatsu M., and Ito T, 2004. Nucleosomal histone kinase-1 phosphorylates H2A Thr 119 during mitosis in the early Drosophila embryo. Genes Dev. 18: 877-888. Ajiro K., 2000. Histone H2B phosphorylation in mammalian apop- totic cells. An association with DNA fragmentation. J. Biol. Chem. 275: 439-443. Akhtar A., and Becker P.B., 2000. Activation of transcription through histone H4 acetylation by MOF, an acetyltransferase essential for dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell 5: 367-375. Allard S., Utley R.T., Savard J., Clarke A., Grant P., Brandl C.J., Pillus L., Workman J.L., and Cote J., 1999. NuA4, an essential transcription adaptor/histone H4 acetyltransferase complex containing Esalp and the ATM-related cofactor Tralp. EMBO J. 18:5108-5119. Anest V, Hanson J.L., Cogswell P.C, Steinbrecher K.A., Strahl B.D., and Baldwin A.S., 2003. A nucleosomal function for IkB kinase-a in NF-KB-dependent gene expression. Nature 423: 659-663. Bannister A.J., Zegerman P, Partridge J.E., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C., and Kouzarides T, 2001. Selective recogni- tion of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature АМУ. 120-124. Bauer U.M., Daujat S., Nielsen S.J., Nightingale K., and Kouzarides T, 2002. Methylation at arginine 17 ofhistone H3 is linked to gene activation. EMBO Rep. 3: 39-44. Beisel C, Imhof A., Greene J., Kremmer E., and Sauer E, 2002. Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash 1. Nature 857-862. Berger S.L., 2002. Histone modifications in transcriptional regula- tion. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 142-148. Bernstein B.E., Humphrey E.X., Erlich R.L., Schneider R., Bouman P., Liu J.S., Kouzarides T, and Schreiber S.L., 2002. Methylation ofhistone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 8695-8700. Bird A.W., Yu D.Y, Pray-Grant M.G., Qiu Q., Harmon K.E., Me- gee P.C., Grant P.A., Smith M.M., and Christman M.E, 2002. Acetylation ofhistone H4 by Esal is required for DNA double- strand break repair. Nature 419: 411-415. Briggs S.D., Bryk M., Strahl B.D., Cheung W.L., Davie J.K., Dent S.Y, Winston E, and Allis C.D., 2001. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Setl and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 15: 3286-3295 Bryk M., Briggs S.D., Strahl B.D., Curcio M.J., Allis C.D., and Winston E., 2002. Evidence that Setl, a factor required for methy- lation ofhistone H3, regulates rDNA silencing in S. cerevisiae by a Sir2-independent mechanism. Curr. Biol. 12: 165-170. Brownell J.E., Zhou J., RanalliT, Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y, and Allis C.D., 1996. Tetrahymena histone acetyltrans- ferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851. Burma S., Chen B.P., Murphy M., Kurimasa A., and Chen D.J., 2001. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. J. Biol. Chem. 276: 42462-42467. Cao R., Wang L., Wang H., Xia L., Erdjument-Bromage H., Tempst P, Jones R.S., and Zhang Y, 2002. Role ofhistone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing. Science 298: 1039- 1043. Carling T, Kim K.C., Yang X.H., Gu J., Zhang X.K., and Huang S., 2004. A histone methyltransferase is required for maximal re- sponse to female sex hormones. Mol. Cell. Biol. 24: 7032-7042.
Chadee D.N., Taylor W.R., Hurta R.A., Allis C.D., Wright J.A., and Davie J.R., 1995. Increased phosphorylation of histone Hl in mouse fibroblasts transformed with oncogenes or constitutively active mitogen-activated protein kinase kinase. J. Biol. Chem. 270:, 20098-20105. Chang L., Loranger S.S., Mizzen C., Ernst S.G., Allis C.D., and Annunziato A.T., 1997. Histones in transit: Cytosolic histone complexes and diacetylation of H4 during nucleosome assembly in human cells. Biochemistry 36: 469-480. Chen D., Ma H., Hong H., Koh S.S., Huang S.M., Schurter B.T., Aswad D.W., and Stallcup M.R., 1999. Regulation of transcrip- tion by a protein methyltransferase. Science 284: 2174-2177. Cheung P., Tanner K.G., Cheung W.L., Sassone-Corsi P., Denu J.M., and Allis C.D., 2000. Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation. Mol. Cell 5: 905-915. Cheung W.L., Turner F.B., Krishnamoorthy T, Wolner B., Ahn S.H., Foley M., Dorsey J.A., Peterson C.L., Berger S.L., and Allis C.D., 2005. Phosphorylation of histone H4 serine 1 during DNA damage requires casein kinase II in S. cerevisiae. Curr. Biol. 15: 656-660. Cheung W.L., Ajiro K., Samejima K., Kloc M., Cheung R, Mizzen C.A., Beeser A., Etkin L.D., Chemoff J., Earnshaw W.C., and Allis C.D., 2003. Apoptotic phosphorylation of histone H2B is mediated by mammalian sterile twenty kinase. Cell 113: 507- 517. Chew Y.C., Camporeale G., Kothapalli N., Sarath G., andZempleni J., 2006. Lysine residues in N -terminal and C-terminal regions of human histone H2A are targets for biotinylation by biotinidase. J. Nutr. Biochem. 17: 225-233. Choy J.S., Tobe B.T, Huh J.H., and Kron S.J., 2001. Yng2p-depen- dent NuA4 histone H4 acetylation activity is required for mitotic and meiotic progression. J. Biol. Chem. 276: 43653-43662. Chu E, Nusinow D.A., Chalkley R.J., Plath K., Panning B., and Bur- lingame A.L., 2006. Mapping post-translational modifications of the histone variant MacroH2Al using tandem mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics 5:, 194-203. Clarke A.S., Lowell I.E., Jacobson S.J., and Pillus L., 1999. Esalp is an essential histone acetyltransferase required for cell cycle progression. Mol. Cell. Biol., 19: 2515-2526. Clayton A.L., Rose S., Barratt M.J., and Mahadevan L.C., 2000. Phosphoacetylation of histone H3 on c-fos- and c-jun- associated nucleosomes upon gene activation. EMBO J., 19: 3714-3726. Coffee B., Zhang E., Warren S.T, and Reines D., 1999. Acetylated histones are associated with FMRI in normal but not fragile X- syndrome cells. Nat. Genet. 22: 98-101. Czermin B., Melfi R., McCabe D., Seitz V, Imhof A., and Pirrotta V, 2002. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell 111: 185-196. Czermin B., Schotta C., Hulsmann B.B., Brehm A., Becker P.B., Reuter C., and Imhof A., 2001. Physical and functional associa- tion of SU(VAR)3-9 and HDAC1 in Drosophila. EMBO Rep. 2: 915-919. Dai J., Sultan S., Taylor S.S., and Higgins J.M., 2005. The kinase haspin is required for mitotic histone H3 Thr 3 phosphorylation and normal metaphase chromosome alignment. Genes Dev., 19: 472-488. Daujat S., Zeissler U., Waldmann T, Happel N., and Schneider R., 2005. HP1 binds specifically to Lys26-methylated histone Hl.4, whereas simultaneous Ser27 phosphorylation blocks HP1 bind- ing. J. Biol. Chem. 280: 38090-38095. Daujat S., Bauer U.M., Shah V., Turner B., Berger S., and Kouza- rides T., 2002. Crosstalk between CARM1 methylation and СВР acetylation on histone H3. Curr. Biol. 12:, 2090-2097. De Souza C.P., Osmani A.H., Wu L.P., Spotts J.L., and Osmani S.A., 2000. Mitotic histone H3 phosphorylation by the NIMA kinase in Aspergillus nidulans. Cell 102: 293-302. Dodge J.E., Kang Y.K., Beppu H.. Lei H., and Li E., 2004. Histone H3-K9 methyltransferase ESET is essential for early develop- ment. Mol. Cell. Biol. 24: 2478-2486. Downs J.A., Lowndes N.E, and Jackson S.P., 2000. A role for Sac- charomyces cerevisiae histone H2A in DNA repair. Nature 408: 1001-1004. Downs J.A., Allard S., Jobin-Robitaille O., Javaheri A., Auger A., Bouchard N., Kron S.J., Jackson S.P., and Cote J., 2004. Bind- ing of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol. Cell 16: 979-990. Ebert A., Schotta G., Lein S., Kubicek S., Krauss V, Jenuwein T, and Reuter G., 2004. Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila. Genes Dev. 18: 2973-2983. Emre N.C., Ingvarsdottir K., Wyce A., Wood A., Krogan N.J., Henry K.W, Li K., Marmorstein R., Greenblatt J.E, ShilatifardA., and Berger S.L., 2005. Maintenance of low histone ubiquitylation by UbplO correlates with telomere-proximal Sir2 association and gene silencing. Mol. Cell 17: 585-594. Fang J., Feng Q., Ketel C.S., Wang H., Cao R., Xia L., Erdjument- Bromage H., Tempst P., Simon J.A., and Zhang Y, 2002. Puri- fication and functional characterization of SET8, a nucleosomal histone H4-lysine, 20-specific methyltransferase. Curr. Biol. 12: 1086-1099. Feng Q., Wang H., Ng H.H., Erdjument-Bromage H., Tempst R, Struhl K., and Zhang Y, 2002. Methylation of H3-lysine 79 is mediated by a new family of HMTases without a SET domain. Curr. Biol. 12: 1052-1058. Galasinski S.C., Louie D.E., Gloor K.K., Resing K.A., and Ahn N.G., 2002. Global regulation of post-translational modifications on core histones. J. Biol. Chem. 277: 2579-2588. Garcia B.A., Busby S.A., Barber C.M., Shabanowitz J., Allis C.D., and Hunt D.E., 2004. Characterization of phosphorylation sites on histone H1 isoforms by tandem mass spectrometry. J. Proteome Res. 3: 1219-1227. Goto H., Yasui Y, Nigg E.A., and Inagaki M., 2002. Aurora-В phosphorylates Histone H3 at serine28 with regard to the mitotic chromosome condensation. Genes Cells 7: 11-17. Goto H., Tomono Y, Ajiro K., Kosako H., Fujita M., Sakurai M., Okawa K., Iwamatsu A., Okigaki T., Takahashi T, and Inagaki M., 1999. Identification of a novel phosphorylation site on histone H3 coupled with mitotic chromosome condensation. J. Biol. Chem. 274: 25543-25549 Grant P.A., Eberharter A., John S., Cook R.G., Turner B.M., and Workman J.L., 1999. Expanded lysine acetylation specificity of Gcn5 in native complexes. J. Biol. Chem. 274: 5895-5900. Hake S.B. and Allis C.D., 2006. Histone H3 variants and their po- tential role in indexing mammalian genomes: The “H3 barcode hypothesis”. Proc. Natl. Acad. Sci. 103: 6428-6435. Hake S.B., Garcia B.A., Kauer M., Baker S.P., Shabanowitz J., Hunt D.F., and Allis C.D., 2005. Serine 31 phosphorylation of histone
Приложение 2. Модификации гистонов и литература variant НЗ.З is specific to regions bordering centromeres in meta- phase chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 6344-6349. Hamamoto R., Furukawa Y., Morita M., limura Y, Silva F.P., Li M., Yagyu R., and Nakamura Y, 2004. SMYD3 encodes a histone methyltransferase involved in the proliferation of cancer cells. Nat. CellBiol. 6: 731-740. Harvey A.C., Jackson S.P., and Downs J.A., 2005. Saccharomyces cerevisiae histone H2A Seri22 facilitates DNA repair. Genetics 170: 543-553. Hayashi K.. Yoshida K., and Matsui Y, 2005. A histone H3 meth- yltransferase controls epigenetic events required for meiotic prophase. Nature 438: 374-378. He Z., Cho Y.Y., Ma W.Y., Choi H.S., Bode A.M., and DongZ., 2005. Regulation of ultraviolet В-induced phosphorylation of histone H3 at serine 10 by Fyn kinase. J. Biol. Chem. 280: 2446-2454. Hendzel M.J., Wei Y, Mancini M.A., Van Hooser A., Ranalli T., Brinkley B.R., Bazett-Jones D.P., and Allis C.D., 1997. Mitosis- specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensa- tion. Chromosoma 106: 348-360. Hsu J.Y., Sun Z.W, Li X., Reuben M., Tatchell K., Bishop D.K., Grushcow J.M., Brame C.J., Caldwell J.A., Hunt D.E, et al., 2000. Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipl 1/ aurora kinase and Glc7/PPl phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell 102: 279-291. Hyland E.M., Cosgrove M.S., Molina H., Wang D., Pandey A., Cot- tee R.J., and Boeke J.D., 2005. Insights into the role of histone H3 and histone H4 core modifiable residues in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 25: 10060-10070. Ichijima Y, Sakasai R., Okita N., Asahina K., Mizutani S., and Te- raoka H., 2005. Phosphoiylation of histone H2AXat M phase in human cells without DNA damage response. Biochem. Biophys. Res. Commun. 336: 807-812. Jackson J.P., Lindroth A.M., Cao X., and Jacobsen S.E., 2002. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416: 556-560. Jackson J.P., Johnson L., JasencakovaZ., ZhangX., PerezBurgos L., Singh P.B., Cheng X., Schubert L, Jenuwein T, and Jacobsen S.E., 2004. Dimethylation of histone H3 lysine 9 is a critical mark for DNA methylation and gene silencing in Arabidopsis thaliana. Chromsoma 112: 308-315. Jeppesen P. and Turner B.M., 1993. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression Cell 74: 281-289. Jin Y, Wang Y, Walker D.L., Dong H., Conley C., Johansen J., and Johansen K.M., 1999. JIL-1: A novel chromosomal tandem kinase implicated in transcriptional regulation in Drosophila. Mol. Cell 4. 129-135. Kao C.F., Hillyer C., Tsukuda T, Henry K., Berger S., and Osley M.A., 2004. Rad6 plays a role in transcriptional activation through ubiquitylation of histone H2B. Genes Dev. 18: 184-195. Kapetanaki M.G., Guerrero-Santoro J., Bisi D.C., Hsieh C.L., Rapic-Otrin V, and Levine A.S., 2006. The DDB1-CUL4AD- DB2 ubiquitin ligase is deficient in xeroderma pigmentosum group E and targets histone H2A at UV-damaged DNA sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 103: 2588-2593. Kawasaki H., Taira K., and Yokoyama K., 2000. Histone acetyl- transferase (HAT) activity of ATF-2 is necessary for the CRE-dependent transcription. Nucleic Acids Symp. Ser., 2000: 259-260. Kawasaki H., Schiltz L., Chiu R., Itakura K., Taira K., Nakatani Y, and Yokoyama K.K., 2000. ATF-2 has intrinsic histone acetyltransferase activity which is modulated by phosphorylation. Nature 405:, 195-200. Kim K.C., Geng L., and Huang S., 2003. Inactivation of a histone methyltransferase by mutations in human cancers. Cancer Res. 63: 7619-7623. Kimura A. and Horikoshi M., 1998. Tip60 acetylates six lysines of a specific class in core histones in vitro. Genes Cells 3: 789-800. KizerK.O., Phatnani H.P., ShibataY, Hall H., GreenleafAL., and Strahl B.D., 2005. A novel domain in Set2 mediates RNA poly- merase II interaction and couples histone НЗ K36 methylation with transcript elongation. Mol. Cell. Biol. 25: 3305-3316. KleffS., Andrulis E.D., Anderson C.W, and Stemglanz R., 1995. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltrans- ferase. J. Biol. Chem. 270: 24674-24677. Kothapalli N., Sarath G., and Zempleni J., 2005a. Biotinylation of KI2 in histone H4 decreases in response to DNA double-strand breaks in human JAr choriocarcinoma cells. J. Nutr. 135: 2337- 2342. Kothapalli N., Camporeale G., Kueh A., Chew Y.C., Oommen A.M., Griffin J.B., and Zempleni J., 2005b. Biological functions of biotinylated histones. J. Nutr. Biochem. 16: 446-448. Kruhlak M.J., Hendzel M.J., Fischle W, Bertos N.R., Hameed S., Yang X.J., Verdin E., and Bazett-Jones D.P., 2001 Regulation of global acetylation in mitosis through loss of histone acetyl- transferases and deacetylases from chromatin. J. Biol Chem. 276: 38307-38319. Kuo M.H., Brownell I.E., Sobel R.E., RanalliT.A., Cook R.G., Ed- mondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D., 1996. Transcription- linked acetylation by Gcn5p of histones H3 and H4 at specific lysines Nature 383: 269-272. Kuzmichev A., Jenuwein T, Tempst R, and Reinberg D., 2004. Dif- ferent EZH2-containing complexes target methylation of histone Hl or nucleosomal histone H3. Mol. Cell 14: 183-193. Kuzmichev A., Nishioka K., Erdjument-Bromage H., Tempst P, and Reinberg D., 2002. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the Enhancer of Zeste protein. Genes Dev. 16: 2893-2905. Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T, 2001 Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120. Lacoste N., Utley R.T, Hunter J.M., Poirier G.G., and Cote J., 2002. Disrupter of telomeric silencing-1 is a chromatin-specific histone H3 methyltransferase.J. Biol. Chem.lll: 30421-30424. Lo W.S., Duggan L., Emre N.C, Belotserkovskya R., Lane W.S., Shiekhattar R., and Berger S.L., 2001. Snfl — A histone kinase that works in concert with the histone acetyltransferase Gcn5 to regulate transcription. Science 293: 1142-1146. Maile T, Kwoczynski S., Katzenberger R.J., Wassarman D.A., and Sauer E, 2004. TAF1 activates transcription by phosphorylation of serine 33 in histone H2B. Science 304: 1010-1014. McKittrick E., Gafken PR., Ahmad K., and Henikoff S., 2004. His- tone НЗ.З is enriched in covalent modifications associated with active chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 1525-1530. Milne T.A., Briggs S.D., Brock H.W., Martin M.E., Gibbs D., Allis C.D., and Hess J.L., 2002 MLL targets SET domain methyltransferase activity to Hox gene promoters. Mol. Cell 10:
1107-1117 Miranda ТВ., Sayegh J., Frankel A., Katz J.E., Miranda M., and Clarke S., 2006 Yeast Hsl7 (histone synthetic lethal 7) catalyses the in vitro formation of co-NG-monomethylarginine in calf thymus histone H2A. Biochem. J. 395: 563-570. Mizzen C.A., Yang X.J., Kokubo T, Brownell J.E., Bannister A.J., Owen-Hughes T. Workman J.. Wang L., Berger S.L., Kouza- rides T, et al., 1996. The TAFn250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity. CellKT. 1261-1270. Morris S.A., Shibata Y, Noma K., Tsukamoto Y, Warren E., Temple B., Grewal S.L, and Strahl B.D., 2005. Histone НЗ K36 methy- lation is associated with transcription elongation in Schizosac- charomyces pombe. Eukaryot. Cellfr. 1446-1454. Mukherjee B., Kessinger C., Kobayashi J., Chen B.P., Chen D.J., Chatterjee A., and Burma S., 2006. DNA-PK phosphorylates histone H2AX during apoptotic DNA fragmentation in mam- malian cells. DNA Repair 5: 575-590. Muller J., Hart CM., Francis N.J., Vargas M.L., Sengupta A., Wrld B., Miller E.L., O’Connor M.B., Kingston R.E., and Simon J.A., 2002. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell 111:, 197-208. Nagy P.L., Griesenbeck J., Kornberg R.D., and Cleary M.L., 2002. A trithorax-group complex punfred from Saccharomyces cerevisiae is required for methylation ofhistone H3. Proc. Natl. Acad. Sci. 99:90-94. Nakamura T., Mori T., Tada S., Krajewski W., Rozovskaia T., Wassell R., Dubois G., Mazo A., Croce C.M., and Canaani E., 2002. ALL-1 is a histone methyltransferase that assembles a super- complex of proteins involved in transcriptional regulation. Mol. Cell 10: 1119-1128. Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.L, 2001. Role ofhistone H3 lysine 9 methylation in epigenetic con- trol of heterochromatin assembly. Science 292: 110—113. Nathan D., Ingvarsdottir K., Sterner D.E., Bylebyl G.R., Dok- manovic M., Dorsey J.A., Whelan K.A., Krsmanovic M., Lane W.S., Meluh P.B., et al., 2006. Histone sumoylation is a nega- tive regulator in Saccharomyces cerevisiae and shows dynamic interplay with positive-acting histone modifications. Genes Dev., 20: 966-976. Ng H.H., Xu R.M., Zhang Y, and Struhl K., 2002. Ubiquitination ofhistone H2B by Rad6 is required for efficient Doti -mediated methylation ofhistone H3 lysine 79. J. Biol. Chem. 277: 34655- 34657. Nielsen S.J., Schneider R., Bauer U.M., Bannister A.J., Morrison A., O’Carroll D., Firestein R., Cleary M., Jenuwein T, Herrera R.E., and Kouzarides T., 2001. Rb targets histone H3 methylation and HP1 to promoters. Nature 412: 561-565. Nishioka K., Chuikov S., Sarma K., Erdjument-Bromage H., Allis C.D., Tempst P, and Reinberg D., 2002a. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin forma- tion. Genes Dev. 16: 479-489. Nishioka K., Rice J.C., Sarma K., Erdjument-Bromage H , Werner J., Wang Y, Chuikov S., Valenzuela P., Tempst P, Steward R., et al., 2002. PR-Set7 is a nucleosome-specific methyltransferase that modifies lysine, 20 ofhistone H4 and is associated with silent chromatin. Mol. Cell9: 1201-1213. Nowak S.J. and Corces V.G., 2000. Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci. Genes Dev. 14: 3003-3013. О Carroll D., Scherthan H., Peters A.H., Opravil S., Haynes A.R., Laible G., Rea S., Schmid M., Lebersorger A., Jerratsch M., et al., 2000. Isolation and characterization of Suv39h2, a second histone H3 methyltransferase gene that displays testis-specific expression. Mol. Cell. Biol., 20: 9423-9433 Odegard V.H., Kim S.T, Anderson S.M., Shlomchik M.J., and Schatz D.G., 2005. Histone modifications associated with somatic hy- permutation. Immunity 23: 101-110. Ogata N., Ueda K., Kagamiyama H., and Hayaishi O., 1980. ADP-ribosylation of histone H1. Identification of glutamic acid residues 2, 14, and the COOH-terminal lysine residue as modification sites. J. Biol. Chem. 255: 7616-7620. Ogawa H., Ishiguro K., Gaubatz S., Livingston D.M., andNakatani Y., 2002. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in Go cells. Science 296: 1132-1136. Ogawa Y, Ono T, Wakata Y. Okawa K.. Tagami H.. and Shibahara K.I., 2005. Histone variant macroH2Al .2 is mono-ubiquitinated at its histone domain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 336:, 204-209. Pantazis P. and Bonner W.M., 1981. Quantitative determination of histone modification. H2A acetylation and phosphorylation. J. Biol. Chem. 256: 4669-4675. Parthun M.R., Widom J., and Gottschling D.E., 1996. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: Links to chromatin replication and histone metabolism. Cell 87: 85-94. Peters A.H., O’Carroll D., Scherthan H., Mechtler K., Sauer S., Schofer C , Weipoltshammer K., Pagani M., Lachner M., Kohlmaier A., et al., 2001. Loss of the Suv39h histone methyl- transferases impairs mammalian heterochromatin and genome stability. Cell 107: 323-337. Pham A.D. and Sauer E, 2000. Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFn250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila. Science 289: 2357-2360. Polioudaki H., Markaki Y. Kourmouli N., Dialynas G., Theodoro- poulos P.A., Singh P.B., and Georgatos S.D., 2004. Mitotic phosphorylation ofhistone H3 at threonine 3. FEES Lett. 560: 39-44. Preuss U., Landsberg G., and Scheidtmann K.H., 2003. Novel mitosis-specific phosphorylation ofhistone H3 atThrl 1 mediated by Dlk/ZIP kinase Nucleic Acids Res. 31: 878-885. Puerta C., Hernandez E, Lopez-Alarcon L., and Palacian E., 1995. Acetylation ofhistone H2A.H2B dimers facilitates transcription. Biochem. Biophys. Res. Cotnmun. 210: 409-416. Rea S., Eisenhaber E, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W, Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., AllisC.D., and Jenu- wein T, 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599. Redon C., Pilch D.R., Rogakou E.P., Orr A.H., Lowndes N.F., and Bonner W.M., 2003. Yeast histone 2A serine 129 is essential for the efficient repair of checkpoint-blind DNA damage. EMBO Rep. 4: 678-684. Rice J.C., Nishioka K., Sarma K., Steward R., Reinberg D., and Allis C.D., 2002. Mitotic-specific methylation ofhistone H4 Lys, 20 follows increased PR-Set7 expression and its localization to mitotic chromosomes. Genes Dev. 16: 2225-2230. Robzyk K., Recht ]., and Osley M.A., 2000. Rad6-dependent ubiquitina-tion ofhistone H2B in yeast. Science 287: 501-504. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., and Bonner W.M., 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146; 905-916.
Приложение 2. Модификации гистонов и литература Rogakou Е.Р., Pilch D.R., Orr А.Н., Ivanova VS., and Bonner W.M., 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phos- phorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273: 5858-5868. Roguev A., Schaft D., Shevchenko A., Pijnappel W.W., Wilm M., Aasland R., and Stewart A.F., 2001. The Saccharomyces cerevi- siae Setl complex includes an Ash2 homologue and methylates histone 3 lysine 4. EMBO J., 20: 7137-7148. Rouleau M., Aubin R.A., and Poirier G.G., 2004. Poly(ADP-ribosyl) ated chromatin domains: Access granted. J. Cell Sci. 117: 815- 825. Ruiz-Carrillo A., Wangh L.J., and Allfrey V.G., 1975. Processing of newly synthesized histone molecules. Science, 190: 117-128. Sanchez-Eisner T., Gou D., Kremmer E., and Sauer E, 2006. Non- coding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science 311: 1118-1123. Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., SherrifTJ., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzarides T, 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 419: 407-411. Sarg B., Helliger W., Talasz H., Forg B., and Lindner H.H., 2006. Histone Hl phosphorylation occurs site-specifically during in- terphase and mitosis: Identification of a novel phosphorylation site on histone Hl. J. Biol. Chem. 281: 6573-6580 Sassone-Corsi P., Mizzen C.A., Cheung P, Crosio C, Monaco L., Jacquot S., Hanauer A., and Allis C.D., 1999. Requirement of Rsk-2 for epidermal growth factor-activated phosphorylation of histone H3. Science 2^5'. 886-891. Schiltz R.L., Mizzen C.A., Vassilev A., Cook R.G., Allis C.D., and Nakatani Y, 1999. Overlapping but distinct patterns of histone acetylation by the human coactivators p300 and PCAF within nucleosomal substrates. J. Biol. Chem. 274: 1189-1192. Schotta G., Ebert A., Krauss V, Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T, Dorn R., and Reuter G., 2002. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. EMBO J. 21: 1121-1131. Schotta G., Lachner M., Sarma K., Ebert A., Sengupta R., Reuter G., Reinberg D.. and Jenuwein T, 2004. A silencing pathway to induce H3-K9 and H4-K20 trimethylation at constitutive heterochromatin. Genes Dev. 18: 1251-1262. Schubeler D., Francastel C., Cimbora D.M., Reik A., Martin D.L, and Groudine M., 2000. Nuclear localization and histone acety- lation: A pathway for chromatin opening and transcriptional ac- tivation of the human p-globin locus. Genes Dev. 14: 940-950. Schultz D.C., Ayyanathan K., Negorev D., Maul G.G., and Rauscher F.J., III., 2002. SETDB1: A novel КАР-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1- mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes Dev. 16: 919-932. Schurter B.T., Koh S.S., Chen D., Bunick G.J., Harp J.M., Hanson B.L., Henschen-Edman A., Mackay D.R., Stallcup M.R., and Aswad D.W, 2001. Methylation of histone H3 by coactivator-asso- ciated arginine methyltransferase 1. Biochemistry 4ХУ. 5747-5756. Shiio Y. and Eisenman R.N., 2003. Histone sumoylation is associ- ated with transcriptional repression. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 13225-13230. Smith E.R., Eisen A., Gu W, Sattah M., Pannuti A., Zhou J., Cook R.G., Lucchesi J.C., and Allis C.D., 1998. ESAI is a histone acetyltransferase that is essential for growth in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3561-3565. Sobel R.E., Cook R.G., Perry C.A., Annunziato A.T., and Allis C.D., 1995. Conservation of deposition-related acetylation sites in newly synthesized histones H3 and H4. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1237-1241. Song O.K., Wang X., Waterborg J.H., and Stemglanz R., 2003. An Na-acetyltransferase responsible for acetylation of the N- terminal residues of histones H4 and H2A. J. Biol. Chem. 278: 38109-38112. Spencer T.E., Jenster G., Burcin M.M., Allis C.D., Zhou J., Miz- zen C.A., McKenna N.J., Onare S.A., Tsai S.Y, Tsai M.J., and O’Malley B.W, 1997. Steroid receptor coactivator-1 is a histone acetyltransferase. Nature 194-198. Stanley J.S., Griffin J.B., and Zempleni J., 2001. Biotinylation of histones in human cells. Effects of cell proliferation. Eur. J. Biochem. 268: 5424-5429. Stiff T, О’Driscoll M., Rief N., Iwabuchi K., Lobrich M., and Jeggo P.A., 2004. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation. Cancer Res. 64: 2390-2396. Strahl B.D., Ohba R.. Cook R.G.. and Allis C.D., 1999. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 14967-14972. Strahl B.D., Briggs S.D., Brame C.J., Caldwell J.A., Koh S.S., Ma H., Cook R.G., Shabanowitz J., Hunt D.E, Stallcup M.R., and Allis C.D., 2001.Methylation ofhistone H4 at arginine 3 occurs in vivo and is mediated by the nuclear receptor coactivator PRMT1. Curr. Biol. 11:996-1000. Strahl B.D.. Grant P.A., Briggs S.D., Sun Z.W, Bone J.R., Caldwell J.A., Mollah S., Cook R.G., Shabanowitz J., Hunt D.E, and Allis C.D. 2002. Set2 is a nucleosomal histone НЗ-selective methyltransferase that mediates transcriptional repression. Mol. Cell. Biol. 22: 1298-1306. Su I.H., Basavaraj A., KrutchinskyA.N., HobertO., Ullrich A., Chait B.T, and Tarakhovsky A., 2003. Ezh2 controls В cell develop- ment through histone H3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4: 124-131. SukaN., SukaY, CarmenA.A., Wu J., and Grunstein M., 2001. Highly specific antibodies determine histone acetylation site usage in yeast heterochromatin and euchromatin. Mol. Cell 8:473-479. SunX.J., Wei J., WuX.Y, Hu M., Wang L., Wang H.H., Zhang Q.H., Chen S.J., Huang Q.H., and Chen Z., 2005. Identification and characterization of a novel human histone H3 lysine 36-specific methyltransferase. J. Biol. Chem. 280: 35261-35271. Sun Z.W and Allis C.D., 2002. Ubiquitination ofhistone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418: 104-108. Sung YJ. and Ambron R.T, 2004. PolyADP-ribose polymerase-1 (PARP-1) and the evolution of learning and memory. Bioessays 26:1268-1271. Swerdlow P.S., Schuster T, and Finley D., 1990. A conserved se- quence in histone H2A which is a ubiquitination site in higher eucaryotes is not required for growth in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 10: 4905-4911 Tachibana M., Sugimoto K., Fukushima T, and Shinkai Y, 2001. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 ofhistone H3. /. Biol. Chem. 276:25309-25317. Tachibana M., Ueda J., Fukuda M., TakedaN., OhtaT, Iwanari H ,
Sak-ihama T, Kodama T, Hamakubo T, and Shinkai Y, 2005. Histone methyltransferases G9a and GLP form heteromeric complexes and are both crucial for methylation of euchromatin at H3-K9. Genes Dev., 19: 815-826. Tachibana M., Sugimoto K., Nozaki M.. Ueda J., Ohta T. Ohki M., Fukuda M., Takeda N., Niida H., Kato H., and Shinkai Y, 2002. G9a histone methyltransferase plays a dominant role in euchromatic histone H3 lysine 9 methylation and is essential for early embryo-genesis. Genes Dev. 16: 1779-1791. Takechi S. and Nakayama T, 1999. Sas3 is a histone acetyltransferase and requires a zinc finger motif. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:405-410. Tamaru H. and Selker E.U., 2001. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414: 277-283. Taplick J., Kurtev V, Lagger G., and Seiser C., 1998. Histone H4 acetylation during interleukin-2 stimulation of mouse T cells. FEBS Lett. 436: 349-352. Thomson S., Clayton A.L., Hazzalin C.A., Rose S., Barratt M.J., and Mahadevan L.C., 1999. The nucleosomal response associated with immediate-early gene induction is mediated via alternative MAP kinase cascades: MSK1 as a potential histone H3/HMG-14 kinase. EMBO J. 18:4779-4793. Turner B.M., 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22: 836-845. Turner B.M.2005. Reading signals on the nucleosome with a new nomenclature for modified histones. Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 110-112. Turner B.M. and Fellows G., 1989. Specific antibodies reveal ordered and cell-cycle-related use of histone-H4 acetylation sites in mam- malian cells. Eur. J. Biochem. 179: 131-139. van Attikum H. and Gasser S.M., 2005. The histone code at DNA breaks: A guide to repair? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 757-765. van Leeuwen F, Gafken PR., and Gottschling D.E., 2002. Dotlp modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core. Cell 109: 745-756. Vandel L., Nicolas E., Vaute O., Ferreira R., Ait-Si-Ali S., and Trouche D., 2001. Transcriptional repression by the retinoblas- toma protein through the recruitment of a histone methyltrans- ferase. Mol. Cell. Biol. 21: 6484-6494. Vaquero A., Scher M., Lee D., Erdjument-Bromage H., Tempst P., and Reinberg D., 2004. Human SirTl interacts with histone Hl and promotes formation of facultative heterochromatin. Mol. Cell 16: 93-105. Verreault A., Kaufman P.D., Kobayashi R., and Stillman B., 1998. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hatl acetyltransferase. Curr. Biol. 8: 96-108. Visochek L., Steingart R.A., Vulih-Shultzman I., Klein R., Priel E., Gozes I., and Cohen-Armon M., 2005. PolyADP-ribosylation is involved in neurotrophic activity. J. Neurosci. 25: 7420-7428. Wang H., Cao R., Xia L., Erdjument-Bromage H., Borchers C., Tempst P., and Zhang Y, 2001a. Purification and functional characterization of a histone H3-lysine 4-specific methyltrans- ferase. Mol. Cell 8: 1207-1217. Wang H., Wang L., Erdjument-Bromage H., Vidal M., Tempst P., Jones R.S., and Zhang Y, 2004. Role of histone H2Aubiquitina- tion in Polycomb silencing. Nature 431: 873-878. Wang H., An W, Cao R., Xia L., Erdjument-Bromage H., Chatton B., Tempst P, Roeder R.G., and Zhang Y, 2003. mAM facilitates conversion by ESET of dimethyl to trimethyl lysine 9 of histone H3 to cause transcriptional repression. Mol. Cell 12: 475-487. Wang H., Huang Z.Q., Xia L., Feng Q., Erdjument-Bromage H , Strahl B.D., Briggs S.D., Allis C.D., Wong J., Tempst P., and Zhang Y, 2001b. Methylation of histone H4 at arginine 3 facili- tating transcriptional activation by nuclear hormone receptor 5с/елсе293: 853-857. Wang Y, Zhang W, Jin Y, Johansen J., and Johansen K.M., 2001. The JIL-1 tandem kinase mediates histone H3 phosphorylation and is required for maintenance of chromatin structure in Drosophila. Cell 105: 433-443. Wei Y, Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A., and Allis C.D., 1999. Phos- phorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99-109. Wilson J.R., Jing C, Walker P.A., Martin S.R., Howell S.A., Black- burn G.M., Gamblin S.J., and Xiao B., 2002. Crystal structure and functional analysis of the histone methyltransferase SET7/9. Ce/Zlll: 105-115. Wyatt H.R., Liaw H.. Green G.R., and Lustig A.J.. 2003. Multiple roles for Saccharomyces cerevisiae histone H2A in telomere position effect, Spt phenotypes and double-strand-break repair. Genetics 164: 47-64. Xin Z., Tachibana M., Guggiari M., Heard E., Shinkai Y, and Wag- staff J., 2003. Role of histone methyltransferase G9a in CpG methylation of the Prader-Willi syndrome imprinting center. J. Biol. Chem. 278: 14996-15000. Yamamoto T. and Horikoshi M., 1997. Novel substrate specificity of the histone acetyltransferase activity of HIV-1-Tat interactive protein Tip60. J. Biol. Chem. 272: 30595-30598. Yamamoto Y, Verma U.N., Prajapati S., Kwak Y.T., and Gaynor R.B., 2003. Histone H3 phosphorylation by IKK-alpha is critical for cytokine-induced gene expression. Nature 423: 655-659. Yang L., Xia L., Wu D.Y, Wang H., Chansky H.A., Schubach W.H., Hickstein D.D., and Zhang Y, 2002. Molecular cloning of ESET, a novel histone H3-specific methyltransferase that interacts with ERG transcription factor. Oncogene 21. 148-152. Zegerman P., Canas B., Pappin D., and Kouzarides T, 2002. Histone H3 lysine 4 methylation disrupts binding of nucleosome remodel- ing and deacetylase (NuRD) repressor complex. J. Biol. Chem. 277:11621-11624 Zeitlin S.G., Barber C.M., Allis C.D., and Sullivan K.E, 2001. Dif- ferential regulation of CENP-A and histone H3 phosphorylation in G2/M. J. Cell Sci. 114: 653-661. Zhang L., Eugeni E.E., Parthun M.R., and Freitas M.A., 2003. Identification of novel histone post-translational modifi- cations by peptide mass fingerprinting. Chromosoma 112: 77-86. Zhong S., Jansen C, She Q.B., Goto H., Inagaki M., Bode A.M., Ma WY, and Dong Z., 2001. Ultraviolet В-induced phosphorylation of histone H3 at serine 28 is mediated by MSK1. J. Biol. Chem. Zlfc 33213-33219. Обзоры Bannister A. J. and Kouzarides T, 2005. Reversing histone methyla- tion. Nature 436: 1103-1106. Berger S.L., 2002. Histone modifications in transcriptional regula- tion. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 42-148. Davie J.R. and Spencer V.A., 2001. Signal transduction pathways
Приложение 2. Модификации гистонов и литература and the modification of chromatin structure. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 65: 299-340. Cosgrove M.S., Boeke J.D., and Wolberger C., 2004. Regulated nucleosome mobility and the histone code. Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 1037-1043. Dobosy J.R. and Selker E.U., 2001. Emerging connections between DNA methylation and histone acetylation. Cell. Mol. Life Sci. 58:721-727. Dunleavy E., Pidoux A., and Allshire R., 2005. Centromeric chro- matin makes its mark. Trends Biochem. Sci. 30: 172-175. Elgin S.C and Grewal S.I., 2003. Heterochromatin: Silence is golden. Curr. Biol. 13: R895-R898. Emre N.C. and Berger S.L., 2004. Histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation in genomic regulation. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 289-299. Esteller M., 2006. Epigenetics provides a new generation of onco- genes and tumour-suppressor genes. Br. J. Cancer 94: 179-183. Feinberg A.P. and Tycko B., 2004. The history of cancer epigenetics. Nat. Rev. Cancer 4: 143-153. Fischer A., Hofmann I., Naumann K., and Reuter G., 2006. Het- erochromatin proteins and the control of heterochromatic gene silencing in Arabidopsis. J. Plant Physiol. 163: 358-368. Fischle W, Wang Y, and Allis C.D., 2003. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature 425:475-479. Fischle W., Wang Y, and Allis C.D., 2003. Histone and chromatin cross-talk. Curr. Opin. Cell. Biol. 15: 172-183. Grewal S.I. and Elgin S.C., 2002. Heterochromatin: New possibili- ties for the inheritance of structure. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 178-187. Grunstein M., 1997. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389: 349-352. Grunstein M., 1997. Molecular model for telomeric heterochromatin in yeast. Curr. Opin. Cell Biol. 9. 383-387. Grunstein M., 1998. Yeast heterochromatin: Regulation of its as- sembly and inheritance by histones. Cell 93: 325-328. Henikoff S. and Ahmad K., 2005. Assembly of variant histones into chromatin. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21: 133-153 Hild M. and Paro R., 2003. Anti-silencing from the core: A histone H2A variant protects euchromatin. Nat. Cell Biol. 5: 278-280. Jenuwein T and Allis C.D., 2001. Translating the histone code. Sci- ence!^: 1074-1080 Kimmins S. and Sassone-Corsi P, 2005. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature 434: 583-589. Kurdistani S.K. and Grunstein M., 2003. Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. A: 276-284. Lachner M., O’Sullivan R.J., and Jenuwein T, 2003. An epigenetic road map for histone lysine methylation. J. Cell Sci. 116:2117- 2124. Luger K. and Richmond T.J., 1998. The histone tails of the nu- cleosome. Curr. Opin. Genet. Dev. 8: 140-146. Mellone B.G. and Allshire R.C., 2003. Stretching it: Putting the CEN (P-А) in centromere. Curr. Opin. Genet. Dev. 13:, 191-198. Millar C.B., Kurdistani, S.K. and Grunstein M., 2004. Acetylation of yeast histone H4 lysine 16: A switch for protein interactions in heterochromatin and euchromatin. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69:, 193-200. Nightingale K.P., O’Neill L.P, and Turner B.M., 2006. Histone modifications: Signalling receptors and potential elements of a heritable epigenetic code. Curr. Opin. Genet. Dev. 16: 125-136. Peterson CL. and Laniel M.A., 2004. Histones and histone modifica- tions. Curr. Biol. 14: R546-551. Reinberg D., Chuikov S., Farnham R, Karachentsev D., Kirmizis A., Kuzmichev A., Margueron R. Nishioka K., PreissnerT.S., Sarma K., et al., 2004. Steps toward understanding the inheritance of repressive methyl-lysine marks in histones. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 171-182. Sarma K. and Reinberg D., 2005. Histone variants meet their match. Nat Rev. Mol. Cell Biol. 6: 139-149. Spencer V.A. and Davie J.R., 2000. Signal transduction pathways and chromatin structure in cancer cells. J. Cell. Biochem. Suppl. 35: 27-35. Stemglanz R., 1996. Histone acetylation: Agateway to transcriptional activation. Trends Biochem. Sci. 21: 357-358. Turner B.M., 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22: 836-845. van Attikum H. and Gasser S.M., 2005. The histone code at DNA breaks: A guide to repair? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 757-765. Vaughn M.W, Tanurdzic M., and Martienssen R., 2005. Replication, repair, and reactivation. Dev. Cell 9: 724-725. Wade P.A. and Wolffe A.P., 1997. Histone acetyltransferases in con- trol. Curr. Biol. 1: R82-R84. Wade P.A., Pruss D., and Wolffe A.P., 1997. Histone acetylation: Chromatin in action. Trends Biochem. Sci. 22: 128-132. Zilberman D. and Henikoff S., 2005. Epigenetic inheritance va Ara- bidopsis: Selective silence. Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 557-562.
Алфавитный указатель 4-Фенилбутират (РВА), 460 5-Аза-2’-дезоксицитидин, 459-460 5-Азацитидин, 459-460 Abfl, 76, 81 Absent Small или Homeiotic (ASH) семейство, 179, 223, 232, 235-236, 240-242 ACF, компенсация дозы и, 309 Ade2 как репортерный ген у дрожжей, 72-73 Ade6, 109-110 Air ген, 358, 360-361,363 Alcohol dehydrogenase (Adh) трансгены, 99 ат гены, RIP и 120 ANT См. Измененная Ядерная Пересадка (ANT); комплекс An- tennapedia (ANT-С) Antennapedia (ANT-С) комплекс, 231 Arabidopsis Arabidopsis RNAi у, 156-157, 162-165 веб-сайты с информацией о, 466 как модельный организм, 35-37 клеточная пролиферация и, 224 компоненты эпигенетической регуляции у, 171-177 организация генома, 54 формирование гетерохроматина, 101-102 Argonaute белки, 121, 145, 149, 154-156, 162-164, 282, 295, 377 Argonaute-подобные белки, 121, 123, 145, 149,155-156, 163-164, 282,295 Агр. См. Белок 4, родственный актину ASH семейство. См. Absent Small или Homeotic Asm-1, 122-123,282 ATRXreH, 434 Aubergine, 100 BCR, 393, 397 Bithorax комплекс (BX-C), 231 Blimpl, 372-374, 398-400 Bmil, 223-225 Brahma, 49, 233, 243 BRG1, 235-236 BRM. Cm Brahma Brown доминантный (Ы)), 98 В-клетки, 388-392, 398-401 c-Kit рецептор (CD117) 390 C. elegans MES-модификаторы гистонов у, 296-298 MSUD у, 296 PcG-гены у, 215 PRC2 и, 214-215 RNAi и, 164 Х-хромосомная регуляция у 292, 294-298 анатомия, 289 веб-сайты с информацией о, 467 гетерохроматиновые метки на единственной Х-хромосоме, 294-295 детерминация пола у, 287-288 зародышевых клеток спецификация у, 294, 373-374 импринтинг Х-хромосомы сперматозоида у, 298-299 компенсации дозы комплекс у, 288, 290-293 неклеточно-автономныи сайленсинг и транзитивность, у 184 оценка отношения Х:А у, 290-291 половых хромосом дисбаланс у, 288 сайленсинг у, 283 центромеры структура и функция У, 271 САЕ См. Фактора Сборки Хроматина комплекс CARM 1, 201 Cd79a, клетки 391 CDKN1C, Беквита-Видеманна синдром и, 428, 430-431 Cdx2, 379 CenH-район. См. CENP-A CENP-A RNAi и, 157 общий обзор, 247-248 поддержание, 114 сайленсинги, 115 центромерный хроматин, 252-253, 272-275 цетромеры дробянковых дрожжей и, 113-116 эволюция центромеры и, 276-277 CHD белки, 197, 239 Chfr, 454 Chpl,109-110, 112, 114, 156,158-161 Chp2, 109-110 CHRAC, 309 Chromoshadow-домены, 93, 199, 305 Cidl2, 112, 114, 159-160 cis-модификаций паттерны H2AZ и, 258 MSL комплекс и, 308 болезни и, 426, 435-437 геномный импринтинг и, 353-355, 363-364 посттрансляционная модификация гистонов и, 204 CKcnplotl, 360 CLE См. Курчавый лист С1г4 siRNA продукция и, 113 гетерохроматина формирование. 110-114, 156-162 рекрутирование энзимов, модифицирующих хроматин. 161-162 СМТЗ, 178 CpG динуклеотиды CpG-островки, раковые заболевания, 448-449, 451-452, 456-457 МеСР2 и, 342-343, 432-433 веб-сайты с информацией о, 465 геномный импринтинг и, 362 гиперметилирование, 449 метилирование ДНК и, 51, 326, 334-338, 361,425 модификации гистонов и. 455 раковые заболевания и, 447 у растений, 169 CPSF-A. См. Фактор-А специфичности расщепления- полиаденилирования CREBBP, 432 CTCF, 340-341, 362-363 Cul4, 160 D. Melanogaster, спецификация зародышевых клеток у 373-374 D1, 101 d48, клеточная линия, 141-142, 147 DDM1. См. Сниженное метилирование ДНК1 DDP1, 101 Demeter (DME), 174, 178, 181, 188, 378 Dicer MSUD и, 123 RNAi-опосредованный сайленсинг у растений и, 182-187 scnRNA модель и, 147 siRNAs и, 112, 158-161 модификации гетерохроматина и, 161-162 подавление и, 121 сперматогенез и, 377 Dicer-подобные (DCL) белки, 182-183 DIM-2, 120-123, DIM-5, 121-122 Dlkl кластер, 357-359 DMRs, 357-359 Dnmts. См. Метилтрансферазы ДНК (DNMTs) Docking-домены, 258 DOTI, 198,267, 297 DPY белки 290
Алфавитный указатель dRingl (dRingl/SCE) белки, 219-220 DRM. Cw.Метилтрансферазы с перестроенными доменами Drosha, 185 Drosophila kismet (kis) и, 239-240 MSUD отсутствие у, 283 PcG гены у, 55, 216, 218, 220 polyhomeotic (ph) дупликация у, 220 PRC1 «нацеливание» у, 220-222 RNAi и, 164 веб-сайты с информацией о, 467 гетерохроматину, 93, 100-101, 278- 279 дисфункция половой хромосомы У, 283 как модельный организм, 36-37 кариотип,303 клеточная память и, 211 компенсация дозы у, 288, 302-311 метилирование и, 51 модификации гистонов, сайленсинг и, 95-96 мозаичные фенотипы у, 88-90 «нацеливание» формирования гетерохроматина ,97-100 неоцентромеры у, 272 организация генома, 55 процесс сегрегации у, 279 сайленсинги, 95-96, 101-102 утрата отцовской хромосомы у, 281 фактор нарушения сегрегации, 280-281 хромосомные белки и модификаторы у, 90-93, 96-97, 268 центромерный хроматин и, 274 dsRNA. См. Двухнитевая РНК dsx гены, 306-307 DTip60, 259 E(var) (Enhancer of variegation), 90-92 E(Z) семейство. См. Энхансера zeste (E(Z)) семейство E(Z)-ESC комплекс, 296-297. См. также PRC2 Е2А, 391-392 ЕЗ убиквитинлигаза, 429, 454 EBF1, 390-392 EMF. См. Эмбриональный Цветок (EMF) ENCODE, 465 Enxl,223, 325 ERC, 84 ESC. См. Сверхчисленные половые гребешки (ESC) Eversporting displacements (Хромосомные перестройки, обусловливающие мозаичное проявление признака), 14, 27. См. также Мозаицизм, обусловленный эффектом положения EZH2, 200, 224, 325, 388, 394 Ezh2/Enxl. 325 FACT. См. Облегчение транскрипции хроматина Female-sterile homeotic (fsh) ген, 232 Flamenco, 164 Flt3, 390 FMRP белок, 436-437 FOX-1, 290 FR901,228 460 Fragilis, 373 FWA, 164 G9a, 400 GAGA фактор, 243 GASCI. Cm. jumonji-деметилаза гистонов (JHDM1) Gnas семейство, 357-359, 428, 431 GNAT семейство, 194 Groucho семейство, 399-400 Gtl2, 360 Hl, 260, 472 H19 ген, 352-353, 360, 362-363, 428, 430-431 H2A дефектный по тельцу Бара (H2ABbd), 248, 259 определение, 248 откладка и замещение, 258-259 Н2АХ, 255-257, 267, 472 H2AZ 248, 257-259 локализация, 250 макро,259, 323 формирование вариантов, 248 Н2В 258-259, 469 НЗ, 196, 247-248, 251-254, 273-275, 469-471 НЗ.З, 248, 254-255, 275 репрограммирование сперматозоидов, 378 НЗК27, метилирование MES белки и, 296-298 PRC «нацеливание» и, 221 V(D)J рекомбинация и, 394 Х-инактивация и, 325-327 гетерохроматиновый сайленсинг и, 95-96 общий обзор, 200 развитие примордиальных зародышевых клеток и, 375 H3K36, 197-198,297 НЗК4, 196-197, 325-326 НЗК79, 198, 267 НЗК9 siRNAs и, 154 su(var) и, 95-96 в единственных Х-хромосомах самцов С. elegans, 294-295 метилирование ДНК и, 339-340 «нацеливание» на гетерохроматин и, 87 общий обзор, 198-200 развитие примордиальных зародышевых клеток и, 375 распределение репрессированной ДНК, 138 сайленсинги, 95-96, 101-102, 109- 111, 145-146 сперматогенез и, 376 у растений, 179 центромерный хроматин и, 274 Н4 KYP/SUVH4, 180 MSL комплекс и, 304 SIR комплексы и, 79-80 общий обзор, 200 таблица, включая ссылки, 471 формирование вариантов и, 248 Нах гены развитие примордиальных зародышевых клеток и. 373 HBRM, 237 HDAC. См. Деацетилазы гистонов (HDACs) HDOT1L, 198 her-1 ген, 291-293 HIC-1,455 HIRA. См.Регулятор гистонов А HKMTs. См. Метилтрансферазы лизинов гистонов (HKMTs) HML, 74-75 HMR, 74-75 НО эндонуклеаза, 74-77 НОАР (HP1/ORC ассоциированный белок). 269 Homeless, 99-100 HOTHEAD ген, 21 Нох гены PcG белки и 212-213 PcG сайленсинг и 219 PREs и 220 Sex combs reduced (Scr) и 234 клеточная память и 211, 231 регуляция у Drosophila 231-233 НР1. См. Белок гетерохроматина 1 Hpall крошечные фрагменты, 336-337, 340 НРопе, 121 Hrrl, 112, 114, 159-160 hSET, 241 HU белки, 248 IAP ретротранспозон, 375, 377 ICE, 358-359. 361-363 ICF синдром. См. Иммунодефицитная Центромерная Нестабильность IFNB1, 399 IGF2 Беквита-Видеманна синдром и 428, 430-431 геномный импринтинг и 352-353, 357-359, 362-363 рак толстой кишки и 453
Алфавитный указатель IgH, 393 Ikaros-ассоциация, 398 IL-7, рецептор 390 In(l)wm4, 91. См. также white ген INI 1, раковые заболевания и, 235 INO80-C, 259 ISWI комплексы, 239, 309-310, 415. См. также Brahma семейство; SNF2H семейство JIL1 киназа, 97-98, 102, 305 Jumonji-деметилаза гистонов (JHDM1), 47,200 К79 метилирование, общий обзор, 198 KCNQ, 357-359, 430 killer штаммы, 133 Kismet (kis), 234-235, 239-240 КТО белок, 242 KYP/SUVH4, 180 Light, 98 Like heterochromatin protein (LHP1), 182 Linaria vulgaris, 170 LSD1 аминоксидаза, 97 LSD1. См. Лизин-специфичная деметилаза LSH2, 340 mb-1 ген, 392 MBD белки. См. Метил-CpG- связывающиеся белки МеСР2, 342-343, 432-434 Medea (МЕА), 178, 180-181,215,217, 223-224 Medea/Fertilization independent seed formation (MEA/FIS1), 180 MEIDOS, 216 Meisetz, 376 MES белки, 215, 296-298 MIP. Cm. miRNAs, премейотически индуцированные метилированием Miwi-подобные белки, 377 MIX-1 белки, 290 MLE, 304-306, 308 MLH1 ген, 437, 450, 453-454 MLL, 233, 235, 241 MN аза. См. Микрококковая нуклеаза MOF, 304-306, 308 Morpheus-молекула (МОМ), 181, 187 MS-275, 460 MSCI, 318 MSP, 459 MSUD. См. Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК /Лагены, 143-144 MYST семейство, 194 л-1 правило, 316, 319-320 Nanog, 375, 379-380 Nasonia vitripennis, 281 ncRNA-опосредованного сайленсинга модель, 362-364 Ndjl, 269 Necdin, 429 NESP55, 431 Neurospora crassa MSUD у, 117, 122-124, 282-283 RIP и, 119-120, 123-124 жизненный цикл, 116-117 изображения, 118, 124 как инструмент, 107 как модельный организм, 36-37 метилирование у, 117-119 общий обзор, 116-117 подавление у, 121-122 сайленсинг у, 282-283 NONCODE веб-сайт, 360, 466 Notch!. 391 Nowal, 146 NT-ES, 418-421 NuA4/Tip60, 259 NuRD, 343 NURF, 309, 429 NVP-LAQ824, 460 Oct4, 379-380, 416 Oenothera blandina, 101 OSA, 239 P53BP1, 198 p55, 214 PADI4, 202, 378 PAF комплекс, 198 PAI2, 162 Paramecia, 36, 130-132. См. также Инфузории Parp, 380 Pasha, 185 Pax5, 390-392, 396, 400-401 PcG белки. См. Polycomb белки PGC-клетки, развитие примордиальных зародышевых клеток и, 372-375 Ph 1 локус, 280 PHERES 1,216 Pickle (PKL), 181 Piwi, 100, 154-156, 160, 164 PML-лейкемия, 56 Pol IV. См. РНК-полимераза IV Polar granule component (pgc) ген, 374 Polycomb (PcG) белки CpG метилирования и, 339-340 HP1 и, 98 Х-инактивация и 58, 325-326 генетическая идентификация, 212-214 геномный импринтинг и, 362 клеточная память и, 56, 212, 230 метилтрансферазы гистонов растений и, 180 метки сайленсинга хроматина и. 214-219 модификация хроматина у животных и, 164-165 общий обзор, 54, 219 поддержание транскрипционного сайленсинга и, 219-223 развитие млекопитающих и, 223- 226 функция, 55-57 хроматин растений и, 180-181 эпигенетическая регуляция у Arabi- dopsis и, 176 Polycomb репрессивные комплексы (PRCs) НЗК27 метилирование и, 200 Х-инактивация и, 57, 223 клеточная память и, 211 компоненты, 219-220 компоненты и эволюционный консерватизм, 214-216 модификация хроматина, 218 «нацеливание» на сайленсиро- ванные гены, 220-222 предотвращение наследуемой репрессии, 222-223 репрессивные функции и, 222 транскрипционная репрессия и, 231 у растений, 180 функция в развитии, 218-219 Polycomb элементы ответа GAGA фактор и, 243 НЗК27 метилирование и, 200 антисайленсинг и. 223 клеточная память и, 211 Polycomb-подобный (PCL) белок 215 PRC1 «нацеливание» и, 220-222 транскрипционная репрессия и, 232 PRC2. См. Пререпликационный комплекс 2 Prdml, 398-399 Priming, линия, 391 PRMTs. См. Метилтрансферазы аргининов белков PSR хромосома, 281-282 PTGS. См. Посттранскрипционный сайленсинг генов Pws кластер, 357-359 RAG, 393, 420-421 RanGAPvevi, 281 Rapl. См. Репрессор-активаторный белок 1 (Rapl) RC гистоны, 250-251 RdDM. См. РНК-направляемое метилирование ДНК rDNA, 84, 266, 278-279 rDNA кольца, 84 RDRP. См. РНК-зависимая РНК- полимераза Replication processivity clamp (PCNA) 250 Rid ген, 120 Rikl, 160
Алфавитный указатель Ring-белки, 213. 219-220, 242. 325 RIP. См. Индуцируемая повторами точечная мутация RISC. См. РНК-индуцируемый сайленсирующий комплекс RITS. См. РНК-индуцируемый эффектор транскрипционного сайленсинга RITS и сборка гетерохроматина и, 158-160 сайленсинг и, 46 сайленсинг у S. pombe и, 112, 115-116 сайленсинг у инфузорий и, 139, 147 сайленсинг у растений и, 182-187 сборка «молчащего» хроматина и, 112 сперматогенез и, 376 RNAi, 269. См. также Меиотический сайленсинг неспаренной ДНК (MSUD); Посттранскрипционный сайленсинг генов; Подавление Arabidopsis и, 162-164 Chpl и, 109 Drosophila и, 99 dsRNA и siRNA и, 158-161 НР1 локализация и, 121 N. crassa и S. pombe и, 107 ncRNAs и, 358-359 PTGS у растений vs., 177 геномные перестройки и, 139 доказательства роли в сайленсинге, 156 ломкой Х-хромосомы синдром и, 437 метилирование ДНК млекопитающих и, 339-340 RNAi, модели распознавания и. 160-161 модификация хроматина и, 113, 162-164 общий обзор, 52-53, 153-154 развитие многоклеточных и, 36 рекрутирование хроматин- модифицирующих энзимов, 161-162 сборка гетерохроматина и. 87-88, 102,153-165 структура хроматина и, 156-158 у инфузорий, 130, 139, 147 Rolled, 93 roXRNAs, 48-49 Rsp, 281 RTT. См. Ретта синдрома R-делеционные элементы, 143-144 Saccharomyces cerevisiae /галз-взаимодействие у, 81-82 trxG белки и, 236 ацетилирование гистонов и, 80 веб-сайты с информацией о, 466 выпетливание теломер и. 80-81 генетические инструменты. 72-73 гетерохроматин, 74-78 деацетилирование гистонов и, 78-79 жизненный цикл, 73-74 идентичность центромеры и, 275 как модельный организм, 36-37 наследование эпигенетических состояний у, 82-83 нестабильность рДНК-повторов У, 84 общий обзор, 71-72 описание, 72-73 организация генома, 54 репрессия и, 79-80 сайленсинг у vs. у S. pombe, 107-108 структура и функция центромеры у, 270-271 тайминг репликации. 266 Sad-1 (Супрессор доминирования аска) ген, 123-124, 282 SAGA, 49, 257 Sallimus (sis) ген, 242 Sas2, 80, 303-304 Sccl, 83 Schizosaccharomyces pombe RNAiy, 112-114 Sir2 белок и, 75 веб-сайты с информацией о, 466 гетерохроматин и RNAi и, 156-158 гетерохроматиновая организация хромосому, 156-158 идентичность центромер и, 271 как модельный организм, 36-37 кинетохоры и, 271 общий обзор, 107-108 организация генома. 54 сайленсинг генов и, 52 сайленсинг хроматина у, 108 сборка «молчащего» хроматина и, 111-113 состав центромер, 113-115 супрессия эпигенетического мозаицизма, 62 транскрипция центромерных повторов у, 113 эпигенетическая наследственность центромерного состояния у, 114-115 SCID-мыши, 420 Scmx ген, 328 scnRNA модель, 52, 147 SCNT. См. Терапевтическое клонирование SDC белки, 288, 290 sea-1, 290 SEP-домены. См. S-аденозил- метионин (SAM) SET-домены trxG белки и, 236 модификации гистонов и, 179-180, 196,241 развитие зародышевых клеток и, 376 ремоделинг хроматина и, 216 формирование плазматических клеток и, 400 Sex combs reduced (Scr), 232, 234 SEX-1, 290 SFRPs, 455 SIR белки. См. Белки-регуляторы «молчащей» информации siRNAs dicer-подобные (DCL) белки и. 184 RITS и, 158-160 scnRNAs vs., 145 генерация, 158-159, 161-162 подавленней, 121 сборка гетерохроматина и. 159 SKD белок, 242 SLC22A1L, 430 SMARCAL1, 435 SMYD3, 197 SNF2, 49, 204, 340 snoRNAs, 360, 428-429 SNURF-SNRPN, 429 Sonic hedgehog (Shh), 225 Sox2, 379-380 Splayed (SPD), 181 SPM-домены, 14. См. также S-аденозил-метионин (SAM) SRY ген. 315 Stella, 99, 372-375 Su(var) гены Drosophila и, 90-93 H3K9 метилирование и, 95-96 компенсация дозы и, 309 метки сайленсинга хроматина и, 214 репрограммирование сперматозоидов и, 378 сперматогенез и, 376 эффект положения мозаичного типа, 37 SubH2Bv, 260 SUPERMAN, 36, 162. 186 SUVH белки, 101, 180, 199-200 SWI/ISWI энзимы. См. Brahma- семейство SWI2/SNF2, репрессия хроматина и, 235-236, 239 Swi6, 110-112, 114, 156-161 Switch2/Sucrose Non-Fermentable2 (SWI2/SNF2) H2AZ и, 257. 260 МеСР2 и, 433 метилирование ДНК и, 340 метилирование и, 49 модификации гетерохроматина и, 163 ремоделинг хроматина и. 181
Алфавитный указатель структура нуклеосом и, 204 SWR1-C, 259 SXL, 306-307 S-аденозил-метионин (SAM), 179, 215, 220, 445, 448 S-фаза митоза, 83, 266-267 Т. thermophila, веб-сайты с информацией о, 466 “ТА” внутренние элиминируемые сегменты (IES), 137 ta-siPHK, 185 TCRp, 393 Tetrahymena, 36, 52, 131-132. См. также Инфузории TGS. См. Транскрипционный сайленсинг генов (TGS) Tip60, 259, 305 Toll-подобные рецепторы, 51 Tonalli (Тпа) ген, 2452 tra гены, 306-307 Trans-sensing, 282 Тгаял-эффекты, 41, 191-192, 258, 426, 431-435 Trithorax (trxG) белки PcG белка рекрутирование и, 220 SET-домены в, 236 идентификация, 232-235 как активаторы или антирепрессоры, 243 клеточная память и, 54, 56, 211-212, 231 метилтрансферазы гистонов и, 179 модификации гистонов и, 242 общий обзор, 55-57,231-236,242-244 транскрипция и, 235-236, 243 функциональные взаимодействия между, 242 хроматин и, 236-242 Tsix ген, 317, 319, 321-322 7к/7ген, 145-146, 156 U7 малый ядерный рибосомный комплекс, 250 Ube3aas, 360 Ura3, 72-73 V(D)J рекомбинация, 390, 393-394 Variable Surface antigen Genes (VSG). 16 VRN-комплекс, 180, 214-219 white ген, 71, 88-89, 98-99 Winged helix домены, 000 wm4. Cm. white ген Wnt путь, 455 Х-инактивации центр (XIC), 57, 317, 325, 327 Х-инактивация, 57, 223, 314, 317-322 H2A варианты и, 259-260 PcG репрессия и, 224 болезни и, 434 воспроизведение и поддержание у млекопитающих, 317-322 идентификация у млекопитающих, 316 импринтированная, 317-319, 321- 322 инициация у млекопитающих. 317-322 исторические симпозиумы и, 16 клонирование и, 417 общий обзор, 28, 57-58, 314, 317 определение, 287-288 переключаемые режимы у млекопитающих, 322 поддержание, 371 реактивация и репрограммирование и. 328- 330,337,375,380 регуляция у млекопитающих, 318- 322 случайная vs. импринтированная, 317-322 у С. elegans, 294-299 факультативный гетерохроматин и 57-58 Х:А отношение 290-291, 306-307 Х-реактивация, 328-330 Х-сигнальные элементы (XSEs), 290- 291,299 Х-элементы. 81 ХВР1,399 Хее, 321 Xenopus, веб-сайты с информацией о, 478. См. также Амфибии Xist ген геномный импринтинг и, 364 исторические симпозиумы и, 16 плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки и, 380 регуляция у млекопитающих, 322- 323 эмбриональные стволовые клетки и, 319 ХО эмбрионы, 320 XOL-1, 288, 290-291 Хр импринты, 298-299, 316 Yellow ген. 91 YKu, 76, 78, 80 Y-хромосомы, 90, 315 Y’-элементы, 81 £-Т| район, 119 Автогамия, 131-133, 141-143 Автономно Реплицирующиеся Последовательности (ARS). 266 Автономный путь, 216 Адаптивная эволюция, 253 Адренолейкодистрофия, сцепленная с Х-хромосомой, 425 Активный хроматин, 46, 135-136, 254- 255 Аллельное исключение, 396-398 Альтернативные перестройки, 141 Амфибии, 406, 409-410, 414-416 Ангельмана синдром, 427-430 Ангиогенез, 446 Анеуплоидия, определение, 264 Аномалии, клонирование животных и. 410-411 Аномальная хромосома 10 (АЬЮ), 282 Антигенная специфичность, 387 Антирепрессоры, 243 Антисайленсинг, 222-223 Антисмысловая транскрипция, 340, 395 Антител разнообразие гены рецепторов антигенов, 389- 390 метилирование и, 51 развитие лимфоцитов и, 392-398 рекомбинация и, 389-390, 392-395 соматические клетки и, 28 эпигенетика и, 30 Апоптоз, 267, 446 Аскоспоры, 116 АТФ-hook белок D1, 101 АТФ-зависимые комплексы ремоделинга, 42, 49, 233, 237-240, 309 Аутизм, 432 Аутосомные гены, 290-293, 306-307 Аутосомные сигнальные элементы (ASEs), оценка отношения Х:А и, 290-293 Ахиазматическая сегрегация, 278-279 Ацетилирование PRC2 и, 218 trxG белки и, 240-241 V(D)J рекомбинация, 394 активный хроматин и, 46 варианты гистонов и, 135-136 гистоны и, 28, 40 ломкой Х-хромосомы синдром и, 436-437 распространение комплекса SIR и, 80 регулирование транскрипции [этой модификацией], 192-193 репарация ДНК и, 267 репрограммирование сперматозоидов и, 378
Алфавитный указатель транскрипция и 193-195 Ацетилтрансферазы гистонов (HATs) компенсация дозы и, 304 модификации гистонов и, 46 очистка, 36 Рубинштейна-Тайби синдром и, 432 у инфузорий, 135-136 экспрессия генов и, 28-29, 80, 194 Б База данных по хроматину растений, 172-175 Барра тельца Н2Аи, 248,259 Х-инактивация и, 57, 314, 316 Беквита-Видеманна синдром, 440-442 Белки Группы Высокой Подвижности (HMG), 259 Белок 1 гетерохроматина (НР1) H2AZ и, 258 НЗК9 метилирование и, 198-200 PcG и, 55 RNAi и, 121 su(var) и, 37, 91-93, 101, 199, 309, 378 сайленсинг и, 181-182, 222 функция, 96 Белок 4, родственный актину (Агр4), 259 Бидл и Тэйтум (Beadle, Tatum), 116 Бисульфитная модификация, 338 Бластоцисты, ES- и TC-cells, 380 Близнецы, изменчивость у, 35 Блокирующего фактора модель, Х-инактивация и, 320 Болезни. См. также конкретные болезни внешняя среда и, 438-439 геномный импринтинг и, 357, 427- 439 исследования болезней человека, 426-427 клонирование и, 410-411 метилирование и, 51, 344 общий обзор роли эпигенетики в, 426-427 структура хроматина в cis- конфигурации и, 435-437 структура хроматина в trans- конфигурации и, 431-435 Большая бороздка, 340 Бромодомены, 42, 195, 239 В Важное значение эпигенетики, 34 Важный (I) сайленсер, 77-78 Вальпроевая кислота, 459 Варианты гистонов. См. также конкретные варианты CENP-Аи, 275 Х-инактивация и, 317, 323-325 геномный импринтинг и, 354 общий обзор, 49-50, 247-248 определение. 34 репрограммирование сперматозоидов и, 377-378 роли для, 135 транскрипционные состояния, 204 центромеры и, 252-254 энзимы для, 18, 21, 48, 158 Веб-сайты, 358, 360, 465-467 Видаза [ингибитор метилирования ДНК], 459 Видообразование, MSUD и, 122-123 Вилки, репликация ДНК и, 266 Вироиды, 186 Внутренние элиминируемые сегменты segments siRNAs и, 145 ингибирование элиминации, 143- 144 материнская наследственность и, 143 перестройки у инфузорий, 136 распределение гетерохроматина и, 136-137 транскрипция и, 52 элиминация чужеродных последовательностей, 142-143 Внутренняя клеточная масса (ICM), 318, 371-372, 379-380 Выбор, случайная Х-инактивация и, 319-321 Выпетливание, теломера, 80-81 Г Гаметические импринты, 353, 357-359 Гаметогенез, 376-377, 416 Геликазы, 100, 112, 121, 159, 164, 237, 304-305, 308 Гематопоэтическая система. См Лимфоциты Гематопоэтические стволовые клетки (HSC), 225 Гемиметилированная ДНК, 51 Ген А, 140-141,437 Генетика, эпигенетика vs., 27, 34-35 Геномный импринтинг ncRNAs и, 359-360 PRC2 и, 223 Х-хромосомы сперматозоида у С elegans, 298-299 Ангельмана синдром и, 427-430 Беквита-Видеманна синдром и, 428,430-431 болезни и, 426 веб-сайты с информацией о, 465 исторические симпозиумы и, 18 исторический обзор 16, 350-353 как cis-действующая регуляторная система, 353-355, 363 как модель эпигенетической регуляции у млекопитающих, 364-365 как моноаллельный сайленсинг, 58 компоненты у растений, 181 метилирование ДНК и, 354, 360-362 определение, 349, 369 Прадера-Вилли синдром и, 427-430 псевдогипопаратиреоидизм и, 428, 431 Сильвера-Рассела синдром и, 428, 431 утрата, 60-61, 452 функция гена и, 356 функция у млекопитающих, 355- 357 элементы контроля импринтов и, 357-359 эмбрионального и неонатального роста контроль, 355 Гены рецепторов антигенов, 389-390, 392-395 Гены-супрессоры опухоли, 446-447 Гептобластома, 430 Гермафродиты, 131, 213, 287-299 Гетерогаметный пол, определение, 315 Гетерозиготность, утрата, 452 Гетерокариотическая фаза, 116, 122 Гетероталличные штаммы дрожжей, 74 Гетерохроматин. См. также «Молчащий» хроматин H2AZ и, 257-258 НЗК9 метилирование и. 87 RITS и RNAi и, 158-160 RNAi и, 52-53, 153-165 Х-инактивация и, 319, 322-325 белки, ассоциированные с, 93-94 в неоцентромерах человека, 252 изменчивость у, 100-101 исторические симпозиумы и, 17 конститутивный, 40. 44. 57-58, 323-325 мейотический дрейф и, 280-282 метилирование и, 51 «нацеливание», 99-100 определение, 34, 40, 71 перестройки генома и, 139-140 перинуклеарное прикрепление, 81-82 репрессия активности генов и. 75-77 сборка, 77-78 сегрегация хромосом и, 113 спаривание и 277-280 типы спаривания дрожжей и. 75-77
Алфавитный указатель упаковка, 88-89 факультативный, 40, 57-58, 323-325, 327 центромеры дрожжей и, 109-111 эухроматин vs., 44-46, 97, 100, 177 Гиббереллины, 216 Гипергомоцистеинемия, 435, 438 Гиперметилирование, 61, 254, 449-452 Гипермутация, 51 Гипометилирование, 60, 435, 449 Гипопаратиреоидизм, 431 Гипотеза гистонового кода trxG белки и, 242 ассоциированные с гетерохро- матином белки и, 254 вариации в, 101-102 общий обзор, 19-20, 46-47, 205, 425 разнообразие рецепторов антигенов и, 394 Гистоны CENP-Аи, 272-274 RAG2 и, 392, 395 ацетилирование и, 28 варианты у инфузории, 135 веб-сайты с информацией о, 465 исторические симпозиумы и, 17 линкер, 260, 376 метилирование, 19-20 обзор модификаций, 46-48 общий обзор, 191-192 поддерживающее метилирование и, 120-121 разнообразие у, 247-248 структура, 49-50 функция, 248 хромосомная организация и, 34 эволюция, 259-260 Гликозидазы, 178-179, 181, 188, 341, 343, 378 Голокинетические хромосомы, 252 Голоцентрические хромосомы ,265, 277 Гомеологичное спаривание, 280 Гомеотические гены, 233. См. также Trithorax (trxG) белки Гомеотические трансформации, 212- 213 Гомогаметичный пол, определение, 315 Гомологичная рекомбинация, 72, 355 Гомология, 139-141, 143-144 Гомоталлические штаммы дрожжей, 74 Граничные элементы, 17, 19. 80-81 д Дарвиновская теория эволюции, 25 Двухнитевая РНК (dsRNA). См. также RNAi RNAi-опосредованный сайленсинг у растений и, 182-187 геномный импринтинг и, 363 образование разрывов, 267 сайленсинг у инфузорий, 139 синтез, 159-160 Деацетилазы гистонов (HDACs) МеСР2 и, 432-433 NuRD и, 343 PRC2 и, 215 Sir2 семейство, 75-76, 79-80 ингибиторы, 459-460 исторические симпозиумы и, 19 лейкемии и, 447 модификации гистонов и, 46 раковые заболевания и, 61, 345, 456-458 рефляция генов и, 194-195, 391 формирование гетерохроматина и 114, 156-158 Деацетилирование, 68, 194-196, 472- 473. См. также Деацетилазы гистонов Дезаминазы, 51, 388, 398 Деиминирование, 47, 202 Делеции. См. Внутренние элиминируемые сегменты (IES) Деметилазы ДНК. См. Деметилирование Деметилирование jumonji-деметилаза гистонов (JHDMI)h, 47 аномальное в клонированных эмбрионах, 416 зиготического отцовского генома, 338 лизинов, 47, 180, 200 ооциты и, 417 развитие млекопитающих и, 337- 338 репрограммирование сперматозоидов и, 377-378 у растений, 178 Депсипептиды, 460 Детерминация пола, 291, 306. 316 Деубиквитилирование, общий обзор, 202-203 Дефектный по РНК-направляемому метилированию 1 (DRD1), L81 Дефекты нервной трубки, 425 Децитабин, 459-460 Диета, 438 Димеризация, 249, 267 Диморфизм, 131, 135-136 Дисомия, однородительская, 424, 427- 428 Дифференциально метилированные по ДНК районы (DMR), 357-362, 378 Дифференцировка, 60-61, 329, 377-379, 398-401,411-413 Длинные перемежающиеся (диспергированные) повторы (LINES), 327 Длинных терминальных повторов (LTR) ретротранспозоны 345 ДНК архей, упаковка, 248-250 Догма, центральная, 34 Долли, 59, 408 Дробление, Дрожжи, 235. См. также Типы спаривания (МАТ); конкретные виды Дупликация, 120, 123-124, 220. См. также Точечная мутация, индуцированная повторами 3 Зависимый от гомологии сайленсинг 139 Задних Половых Гребешков (PSC) белки, 215, 219-220 Запрограммированная элиминация ДНК, 36 Зародышевые клетки. См. также Примордиальные зародышевые клетки X-реактивация у, 329 механизмы, регулирующие спецификацию, 372-377 наследование перестроек ресничек и, 140-144 плюрипотентность и, 379-381 развитие,369-374 тотипотентность и, 54 Защитные механизмы. 50. 146-148 Зебуларин, 459-460 Зигзаг-модели организации хроматина, 43 Зиготы, 370 И Избыточность, элементы сайленсера и, 78 Измененная Ядерная Пересадка (ANT), 421 Имагинальные диски, 212 Иммуноглобулины, 388, 395-398 Иммунодефицитная Центромерная Нестабильность (ICF), 336, 432, 434-435 Иммуноотторжение, 420 Иммунопреципитация, 22, 79-80. 95, 138,145, 193 Импринтинг. См. Геномный импринтинг Импринтинг хромосомный. См. Импринтинг геномный Импринтированная Х-инактивация, 317-319, 321-322 Инвазивные элементы, 53 Ингибиторы, 60-61, 459-461
Алфавитный указатель Индуцированная повторами точечная мутация (RIP) MSUD и, 122-123 RNAi и, 156 исторические симпозиумы и, 16 как модель, 36 метилирование и, 50 у Neurospora crassa, 117, 119-120, 123-124 Индуцированного-антигеном рецептора сигналинг, 398 Индуцированный вирусом сайленсинг генов (VIGS), 177, 183 Индуцированный повторами сайленсинг генов (RIGS), 101 Индуцируемая активацией дезаминаза (AID), 51, 388, 398 Инсулятора модель, 362-363 Инфузории RNAi у 145, 147 активный vs. «молчащий» хроматин у, 135-136 жизненный цикл, 132 зависимый от гомологии сайленсингу, 139 как модельный организм, 27, 36 коньюгация и, 131-132 общий обзор, 130 патгернинг кортикальный у. 133-134 перестройки у, 138-139 поддержание двух геномов, 131 системы защиты генома у, 146-148 цитоплазматическая наследственность у, 27, 132- 133, 142-143 История эпигенетических исследований генетика и развитие и. 27 геномный импринтинг и, 350-353 гиперметилирование и, 449-450 ДНК соматических клеток и, 28 Колд Спринг Харбор и, 14-19 метилирование и, 28, 448-450 механистическая взаимосвязанность и, 30-31 общий обзор, 26 трансплантация ядер и. 406 хроматин и, 28-30 К Канцерогены, метилирование цитозина и, 449 Кариогамия, 107, 116-118, 120, 131-132 Кариотип Drosophila, 303 Киназы JIL1 киназа, 97-98, 102, 305 модификации гистонов, 47 фосфоинозитол 3-киназа-подоб- ных киназ семейство, 255 Кинетохоры СепНЗ и, 252-253 CENP-Аи, 273-275 идентичность центромер и, 275 сайленсинги, 108-111, 113-114 формирование и функция 271-272 функция. 269 хромосомная наследственность и, 264 центромеры дробянковых дрожжей и, 108-109 Клетки крови, PcG-репрессия и, 223 Клеточная память Нох гены и, 211, 231 PcG и trxG и, 55-57 метилирование ДНК и, 334-335, 343 общий обзор, 211-212, 230-232 повторяющиеся элементы и, 54 трансплантация ядер и, 417-418 Клеточные судьбы. См. Соматическое репрограммирование Клеточный цикл, 49, 82, 221, 412 Клонирование. См. Трансплантация ядер; Репродуктивное клонирование Клоны, 35, 409, 414-417 Кнудсона (Knudson) двухударная теория, 60 Ковалентная модификация, 34, 241 - 242,244 Когезины, 83, 114-115, 165, 256-257 Коллохоры, 278-279 Кольца повторов экстрахромосомной рДНК(ЕКС), 84 Коммитирование линий, 390-392 Компактизация<эволюция гистонов и, 259-260 Компартментализация у инфузорий. 130 Компенсация, 419. См. также Компенсация дозы Компенсация дозы клонирование и 417 механизмы 58 определение 287 у С. elegans 288, 290-293 у Drosophila 302-311 у млекопитающих 288, 313-330 Комплекс компенсации дозы (DCC), 288, 290-293 Конденсация, 33,16-Т1, 294, 298-300 Конденсины, их сходство с DCC, 288, 290 Конститутивный гетерохроматин, 40, 44, 57-58, 323-325 Контролирующие элементы, 14 Контрольная Точка Сборки Веретена (SAC), 269 Коньюгация, 131-132 Координация, ремоделин хроматина и, 49 Корепрессоры, 342 Короткие интерферирующие РНК (siRNA), 52, 112-114, 139 Кортикальный патгернинг, 133-134 Косупрессия, 121, 177. Си. также Посттранскрипционный сайленсинг генов Кошки, клонирование, 35 Крючки аскогенных гиф, Кукуруза, 280, 282 Курчавый лист (CLF), 180, 213, 215-216 Кэпирование, 80 Л Лейкемия, 56, 235, 413, 447-448, 459 Лизин-специфичная деметилаза (LSD1),47, 180, 200 Лизины. См. также Метилтрансферазы лизинов гистонов (HKMTs) ацетилирование, 194 деметилирование, 200 метилирование, 47, 180, 200 Лимфомагенез, 223 Лимфоциты ICF синдром и, 434 В-клеток дифференцировка и, 398-401 клонирование мышей из, 412-413 коммитирование линий в, 390-392 плюрипотентность и, 390 разнообразие рецепторов антигенов и, 392-398 Линкерные гистоны, 251, 260, 376 Локализация, экспрессия генов и, 20 Ломкой Х-хромосомы синдром, 426, 436-437 М МакКлинток (McClintock), Барбара. 268 МакроН2А, 259, 323, 472 Макронуклеусы активный vs. «молчащий» хроматин и,135-135 деление у инфузорий, 140-144 индукция специфических делеций у инфузорий, 140-141 определение, 130 перестройки у инфузорий и, 131 «спасение» наследуемых делеций в. 142-143 фрагментация хромосом и, 138 М-делеционные элементы, 143-144 Медицина, трансплантация ядер и, 413-414 Межгенные повторы. См. Неточные делеции
Алфавитный указатель Мейоз гетерохроматин и, 280-282 зародышевых клеток эпигенетические механизмы и, 376 процесс, 264-265, 288, 290 хромосомная наследственность и, 264-265 Мейотический дрейф, 277-278, 280-282 Мейотический сайленсинг неспаренной ДНК (MSUD) RNAi и, 156 у С. elegans, 296 у Drosophila, 283 у Neurospora crassa, 117, 122-124. 282-283 у мышей, 283 Меллер (Muller, H.J.), 303 Менделевская наследственность, 34- 35,133,187 Метил-CpG-связывающиеся белки 5-метилцитозин, 448-449 метилирование и, 51, 178-179, 341- 342 репарация ДНК и, 343 репликация ДНК и, 341-342 Ретта синдром и, 342-343, 432-434 сводка функций, 342 транскрипционный контроль и. 343 функция, 334 Метилентетрагидрофолат редуктазы недостаточность, 435 Метилирование. См. также Метилирование ДНК В-клеток развитие и, 392-395 MSUD и, 122-123 PRC2h, 218 RIP и, 119-120 trxG белки и, 242 Х-инактивация и, 318, 325 аномальное у клонированных эмбрионов, 416 аргининов, 47, 201-202 болезни и, 435 в трофоэктодермальных клетках, 380 гетерохроматиновый сайленсинг у Drosophila и, 95-96 гипотеза гистонового кода и, 19 исторические симпозиумы, 15-17 история эпигенетики и, 28 кластеры импринтированных генов и, 359-360 контроль у Neurospora, 120-121 модификации гетерохроматина, 163 модификации гистонов и, 40,47, 135 «молчащий» хроматин и, 254 наследуемость, 334 неопластическая трансформация и, 60-61 общий обзор, 50-51, 196-202 определение, 34 отсутствие у S. pombe и, 108 поддержание, 118, 120, 178, 335, 361 распределение репрессированной ДНК и, 138 регуляторы у растений, 53, 177-178 репарация ДНК и, 267 репликация ДНК и, 30 сайленсинг растений и, 53 сайты в гистоновых «хвостах», 41 транскрипционный контроль и, 236 у Neurospora crassa, 117-119 функция, 34 эпигенетическая регуляция у Arabi- dopsis и, 174 Метилирование de novo, 177-178, 186- 187,335-337 Метилирование ДНК CpG-островки и 455-456 N. crassa и, 107 siRNAs и, 154 Х-инактивация и, 325 аллельное исключение, 396-398 болезни и, 424-426, 430-431 в ICM клетках, 379 в эмбриональных стволовых клетках, 380 веб-сайты с информацией о, 465 внешняя среда и, 345, 438-439 геномный импринтинг и, 354, 360- 362 нт ибиторы, 459-460 картирование, 338 клеточная память и, 334-335 мутации и, 343-344 происхождение паттернов, 335-340 развитие примордиальных зародышевых клеток и, 375 раковые заболевания и, 446, 448- 449, 452, 459 регуляция экспрессии генов, 340- 343 репрограммирование и, 378-379 у млекопитающих, 334 у растений, 170 хромосомная стабильность и, 344 Метилирование, индуцированное премейотически (MIP) 120, 156 Метилтрансфераз (МЕТ1) семейство. 178 Метилтрансферазы. См. также ДНК- метилтрансферазы (DNMTs); Метилтрансферазы лизинов гистонов (HKMTs) de novo, 335-336 Х-инактивация. 325 болезни и, 435 метилирование аргининов и, 47, 201-202 модификации гетерохроматина и, 162-164 модификации гистонов и, 121-122, 235, 388 поддержание у млекопитающих 335 РНКи, 51-53, 177-178, 186-187 у растений, 177-179 Метилтрансферазы аргининов белков (PRMTs) 47,61,201-202 Метилтрансферазы ДНК (DNMTs) НЗК9 метилирование и, 198-200 ICF синдром и, 434 RIP и, 119-120 геномный импринтинг и, 361, 377 гомология у. 118 защита CpG-островков и, 339 ингибирование, 459 исключение из ядра, 378-379 метилирование и, 50 млекопитающих, 335 подавленней, 121-122 полуметилированная ДНК и, 335 развитие примордиальных зародышевых клеток и, 375 раковые заболевания и, 61, 449, 459 у Drosophila, 97 Метилтрансферазы лизинов гистонов (HKMTs) В-клетки и, 398-399 CpG метилирование и, 339 Drosophila и, 37 Ezh2 и, 200, 224, 325, 388, 394 MLL как, 233, 235 SET домены и, 236 SUVH белки и, 101 trxG белки и, 235 варианты гистонов инфузорий и. 135 компенсация дозы и, 310 метилирование ДНК у N. crassa и. 121 модификации гистонов и, 47 развитие примордиальных зародышевых клеток и, 373 раковые заболевания и, 61, 388 репарация ДНК и, 267 РНК-полимераза II и, 198 сайленсинг и, 95-96 у растений, 179 формирование гетерохроматина и. 109-110 Метилтрансферазы с перестроенными доменами (DRM), 178, 186 Методы лечения, эпигенетические, 459-461 Миелоидные клетки, 390, 459 Миелоидный диспластический синдром, 459 Микроиньекция, 408
Алфавитный указатель Микрококковая нуклеаза, 89-90, ПО Микронуклеусы, 130-132, 135-138, 140-141 МикроРНК, 377 Микрочипы, 338, 451 Минус (-) тип спаривания, 108 Митоз, 264-265, 273-276 Митотическая контрольная точка. См. Контрольная точка сборки веретена (SAC) Млекопитающие trxG белки у, 235-236 веб-сайты с информацией о, 467 геномный импринтинг у, 349-365 изменения, ассоциированные с репрограммированием ядер у, 416-417 компенсация дозы у, 288, 313-330 организация генома, 54 получение из терминально дифференцированных клеток, 411-414 процедуры пересадки ядер для, 406-409 репрограммирование у, 369, 371 фенотипы клонированных. 410-411 формирование неоцентромер у, 272 Модели распознавания, RNAi и, 160- 161 Модельные системы, 36-38, 170-171 Модификации, 60-61, 317. См. также Модификация гистонов; Конкретные процессы Модификация гистонов В-клетки, 398-399 CpG-островки и, 455-456 PcG и trxG и, 54-57, 231-232 RAG2 и, 395 Х-инактивация и, 296-298, 325-327 геномный импринтинг и, 353-354, 362 конститутивный VS. факультативный гетерохроматин, 323-325 ломкой Х-хромосомы синдром и, 436-437 общий обзор, 36, 46-48, 192 репрограммирование сперматозоидов и, 377-378 сайленсинг у С. elegans и, 296-98 сайленсинг у Drosophila и. 95-96 сайленсинг у S. pombe и, 108 сайты для, 41 сокращение локуса и, 395-396 сперматогенез и, 298 таблица, включая ссылки, 468-473 темы в, 203-205 транскрипционные факторы и, 388 утрата отцовской хромосомы и. 281-282 центромерный хроматин и, 274-275 энзимы для модификации у растений, 178 эпигенетическая регуляция у Arabi- dopsis и, 174 Мозаицизм, обусловленный эффектом положения (PEV) Drosophila и, 27,37 ТРЕ и, 269 исторические симпозиумы и, 14-15 общий обзор, 90-91, 101 определение, 88 супрессия, 269 Х-инактивация и, 88 хромосомные белки. 90-91, 97-98 «Молчащие» кассеты, типы спаривания и, 75-77 исторические симпозиумы и. 15 Мутагенез, 173, 176, 344 Мухи-сциариды, 281 Мыши Blimp 1 и, 372-374 MSUD у, 283 PcG гены у, 220 Х-инактивация у, 317-318, 329 веб-сайты с информацией о, 467 геномный импринтинг и, 350-351, 356 исследования раковых заболеваний и, 452 как модельный организм, 37 организация генома, 54 получение моноклональных из зрелых клеток, 412-413 ранняя детерминация зародышевых клеток у, 372 регуляция функции теломер у, 269-270 сайленсингу, 283 со «шпилечными» хвостами, 350-351 Н Нанохромосомы, 138 Наследственность, 34, 82- 83,133-134, 187-188. См. также Цитоплазматическая наследственность Негенетические различия, примеры, 35 Независимая от репликации (RI) сборка нуклеосом, 250-251 Независимый от оплодотворения эндосперм (fie), 215 Нейральные стволовые клетки (NSC) 225 Нейроны, 30, 412-413, 434-435 Нейротрофный фактор из мозга (Bdnf), 343 Неклеточно-автономный сайленсинг 184 Некодирующие РНК siRNAs и, 112 Х-инактивация и, 317 болезни и, 430 геномный импринтинг и. 359-362 гетерохроматинизапия и, 53 компенсация дозы и, 307-309 сперматогенез и, 377 функция, 34, 425-426 Неопластическая трансформация, 35, 60-61, 224, 452-453. См. также Раковые заболевания Неоцентромеры, 272, 276-277 Неслучайная Х-инактивация, 324. См. также Импринтированная Х-инактивация Неспаренная ДНК, 282-283 Неточные делеции, 137-138 Нокауты, 37, 124, 135, 270, 379-380 Нуклеазы, 71, 74, 89-90, ПО Нуклеосомы CENP-Аи, 274-275 H3K36 метилирование и, 197-198 trxG белки и, 240-241 архей vs. эукариот, 248-250 ацетилирование и, 194 исторические симпозиумы и, 15 определение, 39 ремоделинг хроматина, 49 структура, 40 О Облегчение транскрипции хроматина (FACT), 49, 204 Оболочки ядра, 81-82 Обонятельные нейроны, 30, 412-413 Общие миелоидные прогениторы (CMPs), 390 Овцы, клонирование, 407-408 Ограничение по калориям, 84 Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs), 353 Однородительская дисомия, 424, 427- 428 Окно возможностей, 329 Онкогенез, 18, 60-61, 235. См. также Раковые заболевания Ооциты 1АР ретротранспозон у 377 асимметричное распределение и, 377 деметилазы ДНК и, 417 млекопитающих, 369-370 процедуры ядерных пересадок и, 406-407,417-418 Оплодотворение, 131-132, 170, 378 Опухоли, 35, 60-61, 224, 362, 452-455. См. также Раковые заболевания Организация генома веб-сайты с информацией, 466-467
Алфавитный указатель гетерохроматин и, 45 сравнение, 54 эпигенетический контроль и, 62 Остановки, Х-инактивация и, 327 Острая миелоидная лейкемия, 447 Острая промиелоцитарная лейкемия. 56,447 Осы, утрата отцовских хромосом у, 281-282 Отбор,34, 315, 321 П Память, 20. Gw. также Клеточная память Парамутация, 14, 30, 35, 177, 187 Паратиреоидизм, 431 Партеногенез, 355-356, 369 Первичная неслучайная Х-инактивация, 321, 324 Перекрестное оплодотворение, 131 Перемещаемые элементы. Gw. также Ретротранспозоны N. crassa и, 116 P-элементы как, 89 RIP и, 123-124 RNAi у растений и, 186 геномные перестройки и, 139-140 геномы млекопитающих и, 53-54 исторические симпозиумы, 21, 27 метилирование ДНК и 50 модификации гетерохроматина и, 164 «нацеливание» формирования гетерохроматина и, 99-100 неопластическая трансформация и, 59-60 растения и, 36, 184 ремоделинг хроматина и, 163, 364 сайленсинг и, 53 Перестройки, 133, 138-139, 272 Перицентромерные фокусы, 56 Петунии, 153, 156, 173, 177 Пиримидиновые димеры, 267 Плазма, Blimpl и, 372-374 Плазматические клетки, 398-400 Плазмодесмы, 172 Пластичность, 54, 56, 59, 400-401 Плейогомеотические (РНО) белки, 220 Плече-лопаточно-лицевая миопатия. 436-437 Плюрипотентность лимфоциты и, 390 определение, 369 развитие лимфоцитов и, 390 развитие примордиальных зародышевых клеток и, 372- 374 развитие стволовых клеток и. 379- 382 репрограммирование и, 58-59, 381-382 сперматогенез и, 376 Плюрипотентные стволовые клетки, 379-382 Плюс (+) тип спаривания, 108 Повторяющиеся элементы, 54, 108- 109, 111-112, 137 Подавление, 116, 121-122 Подвижные генетические элементы. См. Перемещающиеся элементы Поддержания минихромосом (МСМ) белки, 266 Поддерживающее метилирование, 120, 178,335,361 Подобные плейогомеотическим (PHOL) белки, 220 Полигомеотические (PH) белки, 219 Полимеразы, 186. Gw. также конкретные РНК-полимеразы Полиплоидия, 170, 172 Политенные хромосомы, 35 Полицентричные хромосомы, определение, 265 Половое воспроизведение, преимущества, 314-315 Половые тельца, 257 Посттранскриппионный сайленсинг генов (PTGS). См. также RNAi Drosophila и, 99 RNAi-опосредованный сайленсинг у растений и, 182-183 деградация РНК и, 52 дробянковые дрожжи и, 113 как эквивалент RNAi у растений, 177 общий обзор, 153 Посттрансляционные модификации ацетилирование, деацетилирование и, 193-195 гистоны и, 192-193 деиминирование, 47, 202, 379-380 метилирование и, 196-202 темы в, 203-205 убиквитинирование, сумоилирование и, 202-203 фосфорилирование и, 195 Почкующиеся дрожжи. 74-77. См. также Saccharomyces cerevisiae Прадера-Вилли синдром, 427-430 Пре-BCR, 397 Превращение пола, 281-282 Пререпликационный комплекс 2 (PRC2) Х-инактивация и, 325, 327 геномный импринтинг и, 223 деацетилазы гистонов (HDACs) и. 215 развитие растений и, 217 ремоделинг хроматина и, 218 ретинобластомы (Rb) белки и, 224-225 Преформизм, 369, 372 Примордиальные зародышевые клетки Blimpl и, 372-374, 398-400 Х-реактивация, 329 детерминация, 372 плюрипотентные, 369, 374-375 плюрипотентные клеточные линии из,380-381 развитие, 372-374 Прионы, 19, 21, 31, 34 Проблемы исследований, 64-65 Прогениторы Гранулярных Нейронов Мозжечка (CGNPs), 225 Прогерия, 56 Продолжительность жизни. См. Старение Происхождение распознающих комплексов (ORC), 75-76, 78, 80, 266, 269 Пролиферация, 55, 223-225 Промоторы, CpG-островки и, 339 Протоперитеции, 116 Процесс репликации ДНК MBD1 и, 341-342 варианты гистонов и, 49 контроль, 266-267 метилирование и, 30 откладка гистонов и, 250-251 ретротранспозоны и, 268 у растений, 182 Псевдоаутосомный район. 317 Псевдогипопаратиреоидизм, 428, 431 Псевдокинетохоры, 282 Психические болезни, внешняя среда и, 425 Пузырьки, 266 ПЦР, 338, 459 Рабдомиосаркома, 430 Развитие В-клеток,390-392 PcG-репрессия и, 218-219, 223-226 история эпигенетики и, 27 метилирование ДНК и, 337-338 органа из одной клетки, 388-390 регуляция Х-инактивации у млекопитающих и, 317 репрограммирование и, 417 Размеры геномов, 54 Разнообразие. Gw. Разнообразие антител Раковые заболевания CpG-островков метилирования 339 НЗК27 метилирование и, 200 MLH1 ген и, 437, 450, 453-454
Алфавитный указатель PRC комплексы и, 57, 219-223 trxG гены и, 223, 235 гиперметилирование и, 61, 449-452 деметилазы и, 200 исторические симпозиумы и, 18 метилирование ДНК и, 334, 344. 448-449, 459 метилтрансферазы и, 61, 388, 449, 459 обзор 60-61 причины их, 446-447 сайленсинг и, 452-458 темы исследований, 458 трансплантация ядер и, 413-414 хроматин и, 447-448 эпигенетические методы лечения, 459-461 Распространение гетерохроматина, 79- 80, 88-89, 96-97 Распространения и отступления модель, 327 Растана модель блокирующего фактора, 320-321 Растения. См. также Arabidopsis RNAi-опосредованного сайленсинга пути, 182-187 выгоды от использования для исследований, 170-177 геномный импринтинг и, 350 жизненный цикл, 172 как модельные организмы,. 36 молекулярные компоненты хроматина у, 177-182 не-РНК эпигенетическая регуляция, 187 участие PRC2s в развитии, 217 эволюция центромер у, 276 эпигенетическая регуляция у, 170 Реверсия, 20 Регулятор гистонов A (HIRA), 275, 378 Регуляторы «Молчащей» Информации (SIR) белки ацетилирование гистонов и, 80 ацетилирование, деацетилирование и, 79-80, 195, 198 гетерохроматиновая репрессия и, 75-77 деацетилирование гистонов и, 78-79 заякоривание гетерохроматина и, 83 исторические симпозиумы и, 17-19 как пример, 36 «молчащий» хроматин и, 78 репрессия и, 75, 77-80 старение и. 83-84 структура семейства, 75-76 теломерный эффект положения (ТРЕ) и, 79 ядерная локализация, 81-82 Рекомбинация, 72, 355, 388, 382-395 Релокализация, генов иммуноглобулинов, 395 Ремоделинг хроматина В-клетки и, 398-399 PRC2 и, 218 trxG белки и, 236-240 Xist и, 57 АТФ-зависимые комплексы, 42, 49, 233, 237-240, 309 белки ремоделинга хроматина у растений, 181 болезни и, 34 варианты гистонов и, 49-50 исторические симпозиумы и, 29 компенсация дозы и, 303-306 метилирование ДНК и, 340 неопластическая трансформация и, 59-60 определение, 34 перемещающиеся элементы и, 364 разнообразие рецепторов антигенов и, 392-395 транскрипционный контроль и, 204 факторы ремоделинга и, 49 эпигенетическая регуляция у Arabi- dopsis и, 174-175 Ремоделинга хроматина комплексы, 49-50 Репарация ДНК ШАХ и, 255-257 MBD4 и, 343-344 раковые заболевания и, 446 структура хроматина и, 267-268 Репликационного Белка А комплекс, 181 Репликация. См. Процесс репликации ДНК Репортерные гены, дрожжи и, 72-73, 75 Репрессия. См. также Polycomb репрессивные комплексы В-клеток развитие и, 392, 399 Вс16 и Blimpl и, 399-400 LSD1 и, 200 SIR-белка концентрация и, 79-80 trxG белки и, 243 выпетливание теломер и, 80-81 гетерохроматина, 75-77 консерватизм, 374-375 метилирование ДНК и, 340-344 метилирование и, 199-200 модификации гистонов и, 192 сумоилирование и, 202-203 типы спаривания дрожжей и. 75-77 Репрессор сайленсинга (ROS1), 178 Репрессор-активатор-белок 1 (Rapl), 77-80 Репрограммирование. См. также Трансплантация ядер в клонах, 409, 416 общий обзор, 58-59 от зиготы до бластоцисты, 379 плюрипотентность и, 58-59, 375- 376,381-382 после оплодотворения, 378 потенциал для тотипотентности и 412 состояние дифференцировки донорской клетки и, 411-413 стабильность Х-инактивации, 328-329 стволовых клеток, 381-382 тотипотентность и плюрипотентность, 369 у амфибий, 414-416 у млекопитающих, 416-417 Репродуктивное клонирование, 418- 421 Рестрикционные энзимы, 338 Ресурсы и базы данных по геномам организмов, 466-467 Ретинобластомные (Rb) белки, 224-225 Ретродифференцировка, 411 Ретротранспозоны, 44. 94, 271, 385, 387 Ретта синдром, 334, 342-343, 432-434 Рецепторы ростового фактора, 235 РНК-зависимая РНК-полимераза (RDRP), 52, 123, 155, 162, 282, 295 РНК-зависимый сайленсинг у С. Elegans, 283 РНК-индуцируемый сайленсирующий комплекс (RISC), 154, 183, 185 РНК-индуцируемый эффектор транскрипционного сайленсинга (RITS), НО, 112, 114, 154, 158-161, 199, 437 PH К - метилтрансферазы, 51 РНК-направляемое метилирование ДНК (RdDM), 52-53, 183, 186-187 РНК-направляемое РНК- полимеразный комплекс (RDRC), 114, 159-161 РНК-нокдаун. См. Посттранскрипционный сайленсинг РНК-полимераза, 162-163, 165, 175 РНК-полимераза II H3K36 метилирование и, 197-198 НЗК4 метилирование и, 196-197 HKMTs и, 198 PcG белки и, 243 факторы, влияющие на элонгацию, 204 центромерные повторы и, 113 РНК-полимераза IV, 53, 186-187 Родительские геномы, 338 Родительский импринтинг. См. Импринтинг Родительского конфликта теория, 181, 356
Алфавитный указатель Рост, регуляция геномным импринтингом, 355 Ростовые сигналы, раковые заболевания и. 446 Рубинштейна-Тайби синдром, 432 С Сайленсерные элементы, Т5-Т1 Сайленсинг генов. См. Сайленсинг Сайленсинг у инфузорий и источники 154 Сайленсинг у инфузорий и теломеры и 52 Сайленсинг у инфузорий и 139 Сайленсинг. См. также Компенсация дозы; Посттранскрипционный сайленсинг; RNAi; Транскрипционный сайленсинг генов (TGS); Индуцируемый вирусом сайленсинг генов; Х-инактивация PcG и trxG и, 55, 57, 223 PRC1 и, 223 RNAi и, 36, 52-53, 139 Х-инактивация как, 314 Х-хромосом у С. elegans, 289, 296- 298 аккумуляция в Xi, 326 белки кинетохорных доменов и, 110-111 в центромерах дробянковых дрожжей, 108 геномный импринтинг и 353-365 гетерохроматин и, 40, 88-90 движение экспрессируемых генов и, 44 зависимый от гомологии у инфузорий, 139 избыточность и, 329 исторические симпозиумы и, 17 компенсация дозы и, 287-288 ломкой Х-хромосомы синдром и, 436-437 мейотический посредством неспаренной ДНК (MSUD) 122-123 метилирование ДНК и, 340-344 метилирование и, 51-52 механизмы, 115-116, 177 модификации гистонов и, 95-96 наследование измененного расположения ресничек у, 27, 133-134 неклеточно-автономныи, 184 паттерны в теломерах, 80 посредством неспаренной ДНК во время мейоза, 282-283 раковые заболевания, 452-458 растения и, 53 субнуклеарная релокализация и. 395 температура и, 90 транскрипция неспаренной ДНК и, 282-283 у S. pombe, 108 формирование субкомпартментов и, 83 хромосомные белки и, 90-93 центромерные внешние повторы и. 111-112 эпигенетика и, 31 Сателлитная ДНК, ICF синдром и, 434-435 Сверхчисленные половые гребешки (ESC), 215, 296-297 Сдержек и противовесов механизм, 329 Сегрегация СепНЗ и, 252-253 H2AZ и, 258 ахиазматическая, 278-280 в мейотическом процессе, 278-281 гетерохроматиновое спаривание и, 270-281 нормальная, 265 результаты аномальной, 264 у Drosophila, 279-281 утрата гетерохроматина, 115, 156 Серотипы, 133 Сигналинг, лимфопоэз и, 400-403 Сигнатуры, модификации гистонов и, 46 Силвера-Рассела синдром, 428, 431 Синаптонемные комплексы, 277-278 Сканирования генома модель. См. scnRNA модель Сканирования транскриптома модель, 147-148 Случайная Х-инактивация, 319-321 Сниженное метилирование ДНК 1 (DDM1), 161-162, 179, 348 События мозаичной экспрессии. См. Мозаицизм, обусловленный эффектом положения Сокращение локуса, 395-396 Соленоидные модели организации хроматина, 43 Сомаклональная изменчивость, растения и, 172, 188 Соматическая гипермутация, метилирование и, 51 Соматические DMRs, геномный импринтинги, 361 Соматические клетки, 27-28, 141-144, 405-409 Соматическое репрограммирование. См. Репрограммирование Соннеборн (Sonnebom, Т.М.), 131-132 Состояние покоя, репрограммирование и, 58-59 Сперматогенез ШАХ и, 257 IAP ретротранспозон в, 378 Х-инактивация и, 319-320 геномный импринтинг и, 354 гетерохроматиновые сайты спаривания и, 278-279 гиперконденсация во время, 298 замещение гистонов и, 260 эпигенетическая модификация во время, 376-377 Специфичных для мужского пола летальных (MSL) генов комплекс, 303-309 Спиротрихи, 138 Споруляция, 74 Старение, 56, 83-84, 362, 438 Стволовые клетки, 54-55, 225-226, 379- 382. См. также Эмбриональные стволовые клетки «Стебель-петля»-связывающийся белок (SLBP), 250 Стихотрихи, 137 Структурная наследственность. 133- 134 Субероиланил ид-гидроксамовая кислота (SAHA), 460 Субтрактивные методы, 451 Судьбы. См. Соматическое репрограммирование Сумоилирование, 192, 202-203, 354 Сумчатые, 51, 276, 316-318, 328, 355-356 Супрессорные гены, раковые заболевания и, 449-450 Сцепленная с Х-хромосомой адренолейкодистрофия, 425 Сцепленная с Х-хромосомой задержка умственного развития, 434 Сцепленные с Х-хромосомой гены, возможные способы уравнивания для, 316-317. См. также Компенсация дозы Т Талассемии, 421, 432, 434-436 Теломера-ассоциированные последовательности (TAS), 99, 112, 268 Теломеразы, 78, 268 Теломерный эффект положения. 72. 93, 269 Теломеры Drosophila и, 99 siRNAs и, 53 Ггаля-взаимодействие, 81-82 выпетливание, 80-81 исторические симпозиумы и. 17 контроль структуры и функции. 268-269
Алфавитный указатель репрессия и, 82 сборка, 78 функция, 44 хромосомная наследственность и, 266 Температура, сайленсинг и, 90 Терапевтическое клонирование, 418- 421 Терапия с использованием трансплантации ядер, 418-421 Терминальный цветок 2 (TFL2), 182 Тесты с иммунопреципитацией хроматина (СЫР), 17, 20, 48, 193, 197, 199, 201 Типы спаривания (МАТ). См. также Коньюгация N. crassa, 116 RNAi и, 158 S. pombe и, 108 инфузории, 133, 143 переключение, 36, 74-75 эпигенетический контроль репрессии, 75-77 Титин,242 Т-клеток развитие, 388 Токсины, Caedibacter, 133 Токсины, Р. aurelia, 133 Толстой кишки рак, 451, 453-455 Тотипотентность, 54, 369, 412 Точные делеции, 137 Транзитивность, 184 Транс-активные siPHK (ta-siRNAs), 186 Трансгеном индуцируемый сайленсинг 139-140 Трансдетерминация 212 Транскрипционная интерференция, 364 Транскрипционная память. См. Клеточная память Транскрипционного фактора (TF) размещение, 46 Транскрипционные факторы Rapl, 77-80 SWI/SNF-комплексы как, 239-240 trithorax (trxG) белки как, 243 trxG белки как, 243 варианты гистонов у инфузорий. 135 интерференция метилирования ДНК с, 340-341 лимфопоэз и, 389, 390-392 модификации гистонов и, 192 роль в эпигенетическом контроле. 390-392 Транскрипционный контроль, 257-258, 343 Транскрипционный сайленсинг генов (TGS). См. также ДНК и метилирование гистонов Alcohol dehydrogenase (Adh) трансгены и, 99 PcG-комплексы и, 219-223 RNAi и, 112 RNAi-опосредованный сайленсинг у растений и, 182-183 Х-инактивация, 323-324 гетерохроматин и, 52 общий обзор, 153-154 Транскрипция Вс16 и Blimp 1 и, 398 PRC1 и, 219 SWI/SNF-комплексы и, 236-239 trithorax (trxG) белки и, 242 trxG белки и, 235-236 аберрантная активация, 224-225 ацетилирование и деацетилирование и, 193-195 внутренний элиминируемый сегмент (IES) и, 53 выравнивание генных продуктов и, 302, 305-306 зависимая от метилирования репрессия, 343 изменения в структуре хроматина и, 204-205 изменения у с репрограмми- рованием, 414-417 метилирование ДНК и, 340 механизм, 302 модификации гистонов и, 40 регуляция гистонами и ацетилированием, 193-195 сайленсинг и, 52-53 эухроматин и. 45 Транслокации, 327-328, 350-351, 447 Трансплантация ядер геномный импринтинг и, 352 изменения, ассоциированные с, 414-417 медицинские следствия, 418-421 процедуры для, 406-409 раковые заболевания и, 413-414 соматическое репрограммирование и, 58-59 фенотипы клонированных животных и, 409-414 эпигенетическая память и, 417-418 Трансформирующая ДНК, 121-122 Трихлоростатин A (TSA), 113, 115, 121, 325, 328-329 Трихогины, 116 тРНК, 109 Трофобласта защиты теория. 356 Трофэктодермы (ТЕ) слои, 371-372, 379-380 Т-хелперные клетки, 338, 343 Тэйтум и Бидл (Tatum, Beadle), 116 У Убиквитин ЕЗ лшаза (UBE3A), 429, 454 Уби квитинирование Х-инактивация и, 324-325, 328 общий обзор, 192, 202-203 репарация ДНК, 267, 446 сайты в гистоновых «хвостах», 41 Уилмса опухоли, 430. См. также Прадера-Вилли синдром Упаковка, 248 Урацил-ДНК-гликозилазы, 343 Уремия, 438 Утрата гетерозиготности, 452 Утрата импринтинга (LOI), 60, 452 Утрата окгамера, 204 Ф Фактора Сборки Хроматина (CAF) комплекс, 83, 181, 250-251, 275, 378 Фактор-A специфичности расщепления- полиаденилирования (CPSF-A), 162 Факторы связывания, зашита CpG- островков и, 339 Факультативный гетерохроматин, 40, 57-58, 323-325, 327 Фибробласты, 407, 411 Фолат, 435, 438 Фосфатазы (РРТазы), 42, 97 Фосфоинозитол 3-киназа-подобных киназ семейство, 255 Фосфорилирование, 40, 195-196, 255- 257 Фотопериода путь, 216 Фотопериод-независимое раннее цветение (PIE), 181 Фрагментация. См. Фрагментация хромосом Фрагментация хромосом, 138 X Хиазматическая сегрегация, 278 Химеры, растения и, 172 «Храповик Меллера», 315 Хроматин. См. также «Молчащий» хроматин ICF синдром и, 434-435 PcG и trxG и, 55-57 Т-клеточные рецепторы (TCR) и 388 trxG белки и, 236-242 Х-инактивация и, 322-325 Xist ген и, 322 АТФ-зависимые комплексы ремоделинга и, 235 болезни и, 426 в центромерах, 272-275 веб-сайты с информацией о. 465
Алфавитный указатель влияние RNAi на структуру. 158-165 влияние структуры на транскрипцию, 204-205 ДНК vs., 40 изменения при репрограммировании ,415 история эпигенетики и, 14, 18, 34 как матрица, 39-40 клеточная память и, 63-65 ломкой Х-хромосомы синдром и. 426, 436-437 метилирование ДНК и, 339-340 модификации гистонов, 49-50, 192 молекулярные компоненты у растений, 177-182 недостаточность по метилентетра- гидрофолатредуктазе и, 435 общий обзор, 34, 38, 192 определение, 191 организация, 39-44 плече-лопаточно-лицевая миопатия, 437 раковые заболевания и, 447-448 Ретта синдром и, 432-434 Рубинштейна—Тайби синдром и, 432 талассемии и, 435-436 функция, 34 Шимке спондилоэпифизарная дисплазия и, 435 эпимутации и, 437 эухроматин vs. гетерохроматин и, 44-46 Хроматоидные тельца, 377 Хромодомены H2AZ и, 258 H3K36 метилирование и, 197-198 ORF «нацеливание» и, 195 PcG и trxG и, 55,218,220 компенсация дозы и, 304-305 Хромометилазы, 178 Хромосомных разрывов последовательности (CBS), 137-138 Хромосомы. См. также Сегрегация аномальная, 264 изменения при репрограммировании, 415 метилирование, 51 метилирование ДНК, 343-344 механизм наследования, 264-266 «нацеливание» компенсации дозы», 307-309 обзор организации, 35 организация, 314 перестройки, 272 полиплоидия и, 170 политения, 35 последовательности вздутий, 282 разрывы хромосом и болезни 434- 435 распределение trxG белков, 239 родительская утрата, 281-282 родительское происхождение и, 16 стабильность, 344 фрагментация у инфузории, 138- 139 эволюция Y-хромосомы, 315 элементы, необходимые для наследования, 264-266 ц Цветение, яровизация и, 216-217 Центромерные внешние повторы, сайленсинг и, 111-112 Центромеры НЗ-варианты и, 252-254 ахиазматическая сегрегация и, 278-280 регуляция идентичности, 276 состав у дробянковых дрожжей, 113-115 структура, функция и воспроизведение. 275-276 функция, 44 хроматина состав в, 272-275 хромосомная наследственность, 265 эволюция, 276-277 эукариотная структура и функция, 270-271 Цикл «разрыв-слияние-мостик», 268 Цитозин дезаминирование, 51, 388, 398 метилирование и, 51, 177-178, 334- 335 раковые заболевания и, 448-449, 459 Цитоплазматическая наследственность scnRNA модель и, 147 менделевская наследственность vs., 133 перестройки ресничек, 142-143 серотипов, 133 сканирования транскриптома модель и, 147-148 следствия, 144 у инфузорий, 132-133, 142-143 Цитоплазматические мостики. См. Плазмадесмы Цитруллин, 202 Ч Человеческие искусственные хромосомы (HACs), 271 Членистоногие, геномный импринтинг и, 350 Чужеродные последовательности, элиминация, 142-143 Ш Шапероны, 83, 378 Шимке спондилоэпифизарная дисплазия и, 432, 435 «Шму» (Schmoos) [форма клеток у дрожжей], 73 «Шпилечная» РНК, 159 Э Эволюционно консервативные хромосомные сегменты (ECCS) 254. См. также Адаптивная эволюция Экспрессия PcG-гена сверхэкспрессия и, 224 ацетилтрансферазы гистонов (HATs) и, 29 в В-клетках и плазматических клетках, 400-401 геномный импринтинг и. 349-350 импринтированных генов, 223-224 клонирование и, 417 контроль в лимфоцитах, 392 локализация и, 20 программы развития и, 377-379 регуляция метилированием ДНК, 340-343 регуляция Х-хромосом, 290 эмбриональной эктодермы (Eed), 223 Экстраклеточный сигналинг, 390 Эксцизии. См. Внутренние элиминируемые сегменты Элементы контроля импринтов, 357- 359 Элементы повторов, 81 Элонгация, PcG-сайленсинг и, 58 Эмбриогенез, 58, 322 Эмбриональные зародышевые клетки, плюрипотентные, 369 Эмбриональные стволовые клетки генерирование, 379-380 использование в терапии, 418, 420 метилирование de novo и, 335 от ядерных пересадок (NT-ES), 418-421 плюрипотентные, 369, 376, 379-382 соматическое репрограммирование и, 58-59 терапевтическое клонирование и, 418-421 Эмбриональный Цветок (EMF), 180, 216 Эмбрионы, 355-356, 406-407, 418 Эндонуклеазы, переключение типа спаривания и, 74-75 Энзимы, 18, 21, 29, 40, 46-48. См. также конкретные энзимы
Алфавитный указатель Энхансеры zeste (E(Z)) семейство, 96, 179-180, 214, 224, 296-297 аллельное исключение, 397 мозаичности (E(var)), 90-92 сайленсинг у С. elegans и, 296-297 Эпиаллели, 36, 177 Эпигенез, 369, 372 Эпигенетика, определение, 13, 27, 34, 38-39 Эпигенетическая память. См. Клеточная память Эпигенетические импринты, определение, 298, 299 Эпигенетические методы терапии, для раковых заболеваний, 459-461 Эпигенетические состояния, определение, 38 Эпигенетический код, 38 Эпигенетический контроль, 62-64, 75-77 Эпигенетический ландшафт, развитие, 39 Эпигеномы, определение, 424 Эпимутации, болезни человека и, 437 Эписостояния, TSA-индуцированный сайленсинги, 113 Эпифенотипы, 35 Эритроидные клетки, CMPs и, 390 Эссенциальный (Е) сайленсер, 77-78 Эстрогенный сигналинг, метилирование аргининов и. 201 Эухроматин НЗК27 метилирование и, 200 НЗК4 метилирование и, 196-197 НЗК9 метилирование и, 198-200 гетерохроматин vs., 44-46, 97, 100, 177 «молчащий» хроматин и, 57 определение, 34, 40, 71 Я Ядерная организация, общий обзор, 20-21 Ядерная эквивалентность, 405 Ядерный диморфизм, 36, 131, 135-136 Ядрышковое доминирование, 177 Яйцеклетки, 377, 407, 417-418 Яровизация (VRN), 180, 188, 214, 216- 217 Брно-номенклатура для модификаций гистоноь Модифицирующая группа Модифицируемая аминокислота (аминокислоты) Уровень модификации Аббревиатура для модификации8 Примеры модифицированных остатковь Ацетил- лизин моно- ас H3K9ac АДФ-рибозил- глутамат моно- arl H2BE2arl глутамат поли- агп Н2ВЕ2ат d Биотин- лизин моно- bio H4K12bio Метил- аргинин моно- mel H3R17mel аргинин ди-, симметрично me2s H3R2me2s аргинин ди-, асимметрично me2a H3R17me2a Метил- лизин моно- mel H3K4mel лизин ди- me2 H3K4me2 лизин три- me3 H3K4me3 Фосфорил- серин или треонин моно- ph H3S10ph Убиквитил- лизин моно-с ubl H2BK120ubl Сумоил- лизин моно- su H4K5sud а Использование строчных букв для обозначения модификаций помогает отличать их как от аминокислот (идентифицируемых по их однобуквенным кодовым обозначениям), так и от гистонов (таких, например, как Н2А), для которых всегда используются прописные буквы. ь Номенклатурное обозначение начинается (слева направо) с гистона, затем пишется остаток, затем — модификация В тех слу- чаях, где модифицированный остаток не известен или не важен, модификация должна следовать за гистоном, например: Н4ас и Н2Ваг1. Множественные модификации можно обозначать, просто расширяя список (например, H3K4me3K9acS10ph...) по мере необходимости. Поскольку каждый отдельный модифицированный остаток начинается с прописной буквы, обозначающей аминокислоту, и поскольку сами модификации все обозначаются строчными буквами, нет необходимости в использовании за- пятых или точек, чтобы разделять отдельные модифицированные остатки в «слове», обозначающем комбинацию остатков; в этом случае остаток следует вставлять без добавлений (например, H3K9S10ph, чтобы указать НЗ, не модифицированный по Lys-9 и фосфорилированный по Ser-10). с Полиубиквитилированные гистоны обозначаются ubn. d В настоящее время гипотетично. С изменениями и с любезного разрешения из: Turner В.М., Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 110-112. (2005).